(57)【要約】非常に簡便にかつ大量に製造でき、特異的にピロリ菌増殖を抑制する化合物を含み安全で、耐性菌を生じさせないピロリ菌増殖抑制剤、この増殖抑制剤を含む飲食品及び医薬製剤を提供する。ピロリ菌増殖抑制剤は、下記化学式（１）  ＧｌｃＮＡｃ１−α−Ｏ−Ｙ        ・・・（１）（式（１）中、Ｙは、炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、若しくは炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアシル基を示す）で表されるα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体を含有している。飲食品又は医薬製剤は、このピロリ菌増殖抑制剤を含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式（１）
ＧｌｃＮＡｃ１−α−Ｏ−Ｙ        ・・・（１）
（式（１）中、Ｙは、炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、若しくは炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアシル基を示す）
で表されるα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体を含有していることを特徴とするピロリ菌増殖抑制剤。
【請求項２】
下記化学式（１）
ＧｌｃＮＡｃ１−α−Ｏ−Ｙ        ・・・（１）
（式（１）中、Ｙは、炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、若しくは炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアシル基を示す）
で表されるα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体を含有しているピロリ菌増殖抑制剤を含んでいることを特徴とする飲食品。
【請求項３】
下記化学式（１）
ＧｌｃＮＡｃ１−α−Ｏ−Ｙ        ・・・（１）
（式（１）中、Ｙは、炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、若しくは炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアシル基を示す）
で表されるα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体を含有しているピロリ菌増殖抑制剤を含んでいることを特徴とする医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、消化性潰瘍や胃癌等の原因となるピロリ菌の増殖を抑制するα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体を含有する増殖抑制剤に関するものである。
【背景技術】  ヘリコバクターピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）は、慢性胃炎患者の胃粘膜から分離培養されたグラム陰性のらせん菌である（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＢＪ，Ｗａｒｒｅｎ  ＪＲ．Ｌａｎｃｅｔ  １９８４；Ｉ：１３１１−１３１５．）。このようなピロリ菌は、慢性胃炎や消化性潰瘍だけでなく、胃癌や胃悪性リンパ腫等の重篤な胃疾患の発症にも密接に関連していることが明らかとなっている（Ｐｅｅｋ  ＲＭ  Ｊｒ，Ｂｌａｓｅｒ  ＭＪ．Ｎａｔｕｒｅ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００２；２：２８−３７．）。
ピロリ菌感染者は世界人口の半数にも達すると言われているが、全ての感染者が重篤な胃疾患に進展するわけではない。この事実は、ピロリ菌感染から防御する機構が胃粘膜自体に備わることを、示唆している。
ピロリ菌は、胃粘膜の表層から分泌される表層粘液内に棲息するが、粘膜中ないし粘膜深層から分泌される腺粘液中に棲息していない。この腺粘液は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニル残基（αＧｌｃＮＡｃ残基）を末端に有するＯ−グリカンの糖鎖を特徴的に含んでいる。そのため、この糖鎖は、胃粘膜をピロリ菌感染から防御しているという可能性が、示唆されている。
Ｋａｗａｋｕｂｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４；３０５：１００３−１００６．には、ピロリ菌増殖に対するαＧｌｃＮＡｃ残基の影響について記載されている。αＧｌｃＮＡｃ結合を非還元末端に持つコア２分岐型Ｏ−グリカン（ＧｌｃＮＡｃα１−４Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６（ＧｌｃＮＡｃα１−４Ｇａｌβ１−３）ＧａｌＮＡｃ−Ｒ）が結合した糖タンパク質類は、ピロリ菌の増殖や運動能を著しく抑制し、同時に菌体の伸長や輪郭の不整・断片化等の著しい変化を起こす旨、記載されている。これら一連の変化は、αＧｌｃＮＡｃ残基を持たないＯ−グリカンでは認められない。また、前記のαＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖鎖が存在している時のピロリ菌の形態観察から推察したとおり、菌体の細胞表層にあるグリコシルコレステロール成分（ＣＧＬ）が有意に減少しているとも記載されている。
ピロリ菌は、ＣＧＬを必須とするが、自らＣＧＬを合成できない（Ｈｉｒａｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９５；１７７：５３２７−５３３３．）。このためピロリ菌は、外界からコレステロールを摂取し、菌の細胞膜付近でグルコースを付加して細胞壁を構築すると、考えられている。前記のαＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖鎖には、この細胞壁の構築を阻害する性質があると推察される。しかし、前記のαＧｌｃＮＡｃ結合を非還元末端に持つコア２分岐型Ｏ−グリカンの化学合成や酵素合成は、多工程を要するうえ、コストがかかり実用的ではない。
また、特表２００３−５１７０１５号公報には、より小さなＧａｌβ３ＧｌｃＮＡｃまたはＧａｌβ３ＧａｌＮＡｃを包含する糖鎖のピロリ結合性物質が開示されているが、この調製手法は、煩雑であるため、大量に調製できる手法でない。
一方、現在のピロリ菌感染の治療法は、これらの糖鎖を用いたものではなく、１種類のプロトンポンプ阻害薬と２種類の抗生物質との３剤併用による除菌が中心である。３剤併用療法では、耐性菌が出現して再発したり、副作用が発現したりするという問題がある。
そこで、人体に副作用等の悪影響を与えず、大量に製造でき、しかも調製し易いαＧｌｃＮＡｃ残基を含む糖鎖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤が求められていた。
【発明の開示】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、非常に簡便にかつ大量に製造でき、特異的にピロリ菌増殖を抑制する化合物を含み安全で、耐性菌を生じさせないピロリ菌増殖抑制剤、この増殖抑制剤を含む飲食品及び医薬製剤を提供することを目的とする。
前記の目的を達成するためになされたピロリ菌増殖抑制剤は、下記化学式（１）
ＧｌｃＮＡｃ１−α−Ｏ−Ｙ        ・・・（１）
（式（１）中、Ｙは、炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、若しくは炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアシル基を示す）
で表されるα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体を含有している。
また、前記の目的を達成するためになされた飲食品は、前記のピロリ菌増殖抑制剤を含んでいる。
また、前記の目的を達成するためになされた医薬製剤は、前記のピロリ菌増殖抑制剤を含んでいる。
このα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、ピロリ菌の増殖を抑制して、抗菌的に作用するというものである。この糖誘導体は、抗生物質投与時のような耐性菌出現の恐れがない。この糖誘導体は、簡便に製造でき、大量の工業的生産に適している。
この糖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤は、その糖誘導体がピロリ菌の細胞壁構築を阻害してピロリ菌の増殖を特異的に抑制するので、抗ピロリ菌の薬効を示す。また、ピロリ菌増殖抑制剤は、この糖誘導体を単独で使用し、または抗生物質等と併用することにより、ピロリ菌を胃内から完全に除去したり、慢性胃炎・消化性潰瘍・胃癌・胃悪性リンパ腫等の胃疾患の再発を防止したりすることができる。さらに、この糖誘導体の構造は、アグリコン部位が低級乃至高級の飽和又は不飽和のアルキル基やコレスタニル基で例示される脂肪族炭化水素基、アシル基のような非毒性の基で構成されるものであるので、ピロリ菌増殖抑制剤は、人体に対する安全性が極めて高いというものである。
ピロリ菌増殖抑制剤を含有する飲食品は、胃疾患の症状緩和や予防のために有用である。この糖誘導体が強いピロリ菌増殖抑制作用を発現するので、飲食品に少量添加するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏する。
また、ピロリ菌増殖抑制剤を含有する医薬製剤は、ピロリ菌に由来する慢性胃炎や胃潰瘍等の胃疾患の治癒のために有用である。この糖誘導体が強いピロリ菌増殖抑制作用を発現するので、この医薬製剤を少量服用するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏し、胃疾患の治療・症状緩和・予防のために有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明を適用するα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体（化合物１）からなるピロリ菌増殖抑制剤の抗ピロリ菌作用を示すグラフである。
図２は、本発明を適用するα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体（化合物２）からなるピロリ菌増殖抑制剤の抗ピロリ菌作用を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明のピロリ菌増殖抑制剤に含有されるα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、前記化学式（１）のとおりＧｌｃＮＡｃ１−α−Ｏ−Ｙで示され、Ｙがアルキル基のような脂肪族炭化水素基で示されるもので、Ｎ−アセチルグルコサミニル（ＧｌｃＮＡｃ）基がαで結合した構造を持っている。
α−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、ピロリ菌に対して優れた増殖抑制効果を有している。例えば、エチル基を持つ単糖誘導体（ＧｌｃＮＡｃ−α−ＯＥｔ）の１．８ｍＭ以上の濃度の培養液がピロリ菌と共存している場合、ピロリ菌の増殖を５０％以下に抑える。特に７．２ｍＭ以上の濃度の培養液では、増殖を完全に抑える。この単糖誘導体は、培養液中でも、また胃内でも、分解しない。このα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体（ＧｌｃＮＡｃ−α−ＯＥｔ）は、単糖であることに加えて、１段階の合成方法で簡便に得ることができるので、その大規模な製造が可能である。さらにこの単糖誘導体は、Ｎ−アセチルグルコサミンの脂肪族炭化水素基置換体であって、その置換部位がエーテル結合であるので、安定である。また、アルキル基のようなこの脂肪族炭化水素基は極めて安全な残基である。この単糖誘導体は、芳香族残基のような人体に有害な残基がないために、その安全性が高く飲食品や医薬製剤に含ませることが可能である。
なお、化学式（１）中のα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体のＹ基は、炭素数１〜２７の基で、エチル基のような直鎖アルキル基の他、分岐鎖アルキル基、ステリン由来基・ステロイド環含有基例えばコレスタニル基で例示される脂環アルキル基のような脂肪族炭化水素基であってもよい。同じくＹ基は、炭素数１〜２７の基、例えば炭素数３の基で、直鎖アシル基、分岐鎖アシル基、ステリン由来基含有アシル基・ステロイド環含有アシル基例えばコレスタニル含有アシル基のような脂環アシル基であってもよい。
コレスタニル基を有する単糖誘導体（ＧｌｃＮＡｃ−α−Ｏ−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌ）は、上記と同様の実験において、少なくとも１８０ｕＭ以下の濃度で４０〜５０％のピロリ菌の増殖抑制効果がある。この単糖誘導体も、ＧｌｃＮＡｃ−α−ＯＥｔと同様の性質を持ち、ＧｌｃＮＡｃ−α−ＯＥｔよりは多少低いが優れた安全性が期待できる。
これらのα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、ピロリ菌増殖抑制剤として用いられる。これらの糖誘導体は、単独で用いられてもよく、複数を混合して用いてもよく、またランソプラゾールやオメプラゾールのようなプロトンポンプ阻害薬の１種とアモキシシリンおよびクライリストマイシンのような抗生物質の２種とを併用してもよい。
このピロリ菌増殖抑制剤は、飲食品に添加する飲食品添加剤として用いられる。飲食品は、ヨーグルト等の乳製品のような食品、水やココアやジュースのような飲料品が挙げられる。飲食品には、ピロリ菌増殖抑制剤が０．０２〜０．２％添加されることが好ましい。これら飲食品は、継続して摂取するものであると、ピロリ菌増殖抑制効果が高まり、慢性胃炎のような胃疾患等の消化性疾患の予防をすることができるので、一層好ましい。
このピロリ菌増殖抑制剤は、医薬製剤に含有させる薬効成分として用いられる。医薬製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、乳剤、散剤、シロップ剤、液剤、又は注射剤であってもよい。このような医薬製剤は、賦形剤、蒸留水、生理食塩水等の製剤成分や、別な医薬成分を含んでいてもよい。これら医薬製剤を単回服用、又は継続服用すると、ピロリ菌増殖抑制効果が高まり、慢性胃炎のような胃疾患等の消化性疾患を治癒又は症状軽減をすることができるので、一層好ましい。
以下に、α−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合糖誘導体を調製し、本発明のピロリ菌増殖抑制剤を調製した例を示す。
（調製例１：化学合成によるＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−Ｅｔ（１）の調製）
本発明を適用する前記化学式（１）のα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体の一例であるエトキシ２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド（ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−Ｅｔ（１））について詳細に説明する。この誘導体は、下記化学反応式のようにして合成される。
2008084561.tif 000002
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン３．２８６４ｇ（１４．８６ｍｍｏｌ）を２００ｍｌナス型フラスコに入れ、ＨＣｌガスを吹き込んだＥｔＯＨ（５０．０ｍｌ）に溶解させ、塩化カルシウム管を取り付け室温で攪拌させた。反応の確認は、薄層クロマトグラフ（ＴＬＣ）（展開溶媒  クロロホルム／メタノール（３：１））で行った。８５時間後、濃縮しピンク色の結晶が析出した。これを少量取り、薄層クロマトグラフ（展開溶媒  クロロホルム／メタノール（３：１））を行い、ヨウ素で１２時間呈色させた。この結晶をカラムクロマトグラフ（展開溶媒  クロロホルム／メタノール（３：１））で精製することにより、白色結晶状の生成物（α体）を収率７５％で得た。生成物の確認は６００ＭＨｚ−核磁気共鳴スペクトル法（ＮＭＲ）にて行った。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  １．０６（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，−ＣＨ２ＣＨ３），１．９０（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３ＣＯ），３．３４（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−４），３．３５−３．４１（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），３．５７−３．６６（４Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−３，Ｈａ−６，−ＣＨａＣＨｂＨ３），３．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，−ＣＨａＣＨｂＨ３），３．７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，Ｈｂ−６），４．７３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，Ｈ−１
１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  １４．６７（−ＣＨ２ＣＨ３），２２．５１（ＣＨ３ＣＯ），５４．２９（Ｃ−２），６１．２１（−ＣＨ２ＣＨ３），６４．５８（Ｃ−６），７０．６９（Ｃ−５），７１．７７（Ｃ−３），７２．３９（Ｃ−４），９７．２９（Ｃ−１），１７５．０８（ＣＨ３ＣＯ）
この分光学的データは、この生成物がＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−Ｅｔ（１）であることを支持する。
（化合物１（ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−Ｅｔ（１））の抗ピロリ菌作用の確認）
ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−Ｅｔのピロリ菌への効果を以下の手順で確認した。−８０℃でブルセラブロス培養液中に凍結保存されているピロリ菌（ＡＴＣＣ  ４３５０４）を、ウマ血清１０％入り同培養液中（３ｍＬ）で３５℃、ＣＯ２１５％で４０時間震盪培養し、顕微鏡下で菌の動きを観察した後、非コッコイド型であるピロリ菌を得た。ＯＤ６００を測定し、ウマ血清５．５％入りミューラーヒントン培養液に菌数４×１０７になるように希釈し、計３ｍＬを３５℃、ＣＯ２１５％で２４時間震盪培養した後顕微鏡で確認し、上記化合物の効果を確認するための試験に用いるピロリ菌含有培養液（菌濃度；２×１０７／ｍＬ）とした。一方、上記のＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−Ｅｔの９０２．６μＭ〜１４．４ｍＭのウマ血清５％入りミューラーヒントン培養液（ピロリ菌を含有しない）をそれぞれ作製し、これらをそれぞれのピロリ菌含有培養液に体積比１：１（全容積１００μＬ、９６ｗｅｌｌプレート上）で添加、混和した後、３５℃、ＣＯ２１５％で、９６時間培養した。一定時間培養後、増殖した菌の濃度をＯＤ６００ｎｍで測定し、化合物を添加したものと、添加していないネガティブコントロール（図１中のコントロール）とを比較し、増殖抑制効果を見積もった。尚、１Ｕは２．９μｍｏｌ／ｍＬである。
ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−Ｅｔを用いた結果を図１に示す。
図１から明らかな通り、ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−Ｅｔを６２５ｍＵ／ｍＬ（１．８ｍＭ）以上添加した場合、ピロリ菌の増殖が５０％以上阻害されることが示された。
（調製例２：化学合成によるＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌ（２）の調製）
本発明を適用する前記化学式（１）のα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体の一例である３−β−コレスタニル２−アセトアミド−３，４，６トリ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコサミニド（ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌ（２））について詳細に説明する。この誘導体は、下記化学反応式のようにして合成される。
2008084561.tif 000003
（２−１．  ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌ中間体（３−β−コレスタニル２−アセトアミド−３，４，６トリ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコサミニド（３）の合成）
オイルバス１８５℃で６時間減圧乾燥させたＹｂ（ＯＴｆ）３（１２９ｍｇ，０．２０８０ｍｍｏｌ）を２０ｍｌ二口フラスコに入れ、Ａｒ存在下でＣＨ２Ｃｌ２を０．５ｍｌ加えた。ＣＨ２Ｃｌ２で溶解させたグリコシルアセテート（４）（１３３．２ｍｇ，０．２４９６ｍｍｏｌ）と３−β−Ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌ（８０．８ｍｇ，０．２０８０ｍｍｏｌ）を加え、メスフラスコで０．１Ｍに調製したＢＦ３・Ｅｔ２Ｏ（６２μｌ、６．２４μｍｏｌ）を加えた。室温で２１時間攪拌し薄層クロマトグラフ（展開溶媒  Ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝１：２）で反応の進行を確認し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で反応を停止させた。ＣＨ２Ｃｌ２とＡｃＯＥｔの混合溶媒で抽出を行い、得られた有機層を食塩水で洗いＮａ２ＳＯ４で乾燥した。濾過、濃縮を行い未精製の結晶を得た。分取薄層クロマトグラフ（展開溶媒  Ｂｅｎｚｅｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝５：１）で精製を行い、グリコシド体混合物が収率７０％で得られた（α／β比＝２３／７７，α体（３）の収率１６．１％））。
この分離したα体の１Ｈ−ＮＭＲと１３Ｃ−ＮＭＲ（日本電子社製）とによる分光学的データは、下記に示すとおりであり、化合物３で示した構造であることを支持している。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  １．８６（３Ｈ，ｓ，Ｈ−８），０．５７−１．９７（４７Ｈ，ｍ，３−β−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｙｌ），３．５０（１Ｈ，ｔｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，Ｈ−１’），３．６８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．５Ｈｚ，Ｈ−３），３．６７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，Ｈ−６ａ），３．７２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，Ｈ−４），３．７６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，Ｈ−６ｂ），３．８９（１Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，Ｈ−５），４．２４（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，Ｊ＝９．８Ｈｚ，Ｈ−２），４．９１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．８Ｈｚ，Ｈ−１），５．３２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ，−ＮＨＡｃ），４．５０−４．８５（６Ｈ，ｍ，−ＯＣＨ２Ｐｈ），７．１６−７．３５（１５Ｈ，ｍ，−ＯＣＨ２Ｐｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（１５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  ２３．４８（Ｃ−８），１２．０７−５６．４４（３−β−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｙｌ），５２．５４（Ｃ−２），６８．７４（Ｃ−６），７０．９３（Ｃ−５），７６．９８（Ｃ−１’），７８．５０（Ｃ−４），８０．８２（Ｃ−３），９６．１６（Ｃ−１’），１６９．６２（Ｃ−７），７０．４０−７５．０３（−ＯＣＨ２Ｐｈ），１２７．５９−１２８．５１（−ＯＣＨ２Ｃ（ＣＨＣＨ）２ＣＨ），１３８．１０−１３８．５７（−ＯＣＨ２Ｃ（ＣＨＣＨ）２ＣＨ）
（２−２．  ３−βコレスタニル２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド（ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌ（２））の合成）
（３）の３２．１ｍｇ（０．０３７ｍｍｏｌ）を２０ｍｌ二又ナス型フラスコに入れ、ＴＨＦ３ｍｌに溶解し、水酸化パラジウム５４．７ｍｇ（０．３９ｍｍｏｌ）を加え、室温にて水素ガスでバブリングしながら攪拌した。反応の確認は薄層クロマトグラフ（展開溶媒  クロロホルム／メタノール（５：１））にて行った。１５時間後、水酸化パラジウムを濾別し、シリカゲルカラムクロマトグラフ（展開溶媒  クロロホルム／メタノール（５：１））により精製し、白色結晶状の生成物が得られた。この生成物を１Ｈ−ＮＭＲにより解析した結果、化合物２で示される構造を持つことが支持された。
１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ  ０．６８−１．８５（３−β−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｙｌ），２．１５（３−β−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｙｌ），３．５２−３．５７（３−β−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｙｌ），１．９７（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３ＣＯ），３．６３−３．６８（４Ｈ，ｍ，Ｈ−３，Ｈ−４，Ｈ−５，Ｈａ−６），３．７８−３．８４（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈｂ−６），４．９３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−１）
（化合物２（ＧｌｃＮＡｃα−Ｏ−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌ（２））の抗ピロリ菌作用の確認）
ＧｌｃＮＡｃα−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌのピロリ菌への効果を以下の手順で確認した。−８０℃でブルセラブロス培養液中に凍結保存されているピロリ菌（ＡＴＣＣ  ４３５０４）を、ウマ血清１０％入り同培養液中（３ｍＬ）で３５℃、ＣＯ２１５％で４０時間震盪培養し、顕微鏡下で菌の動きを観察した後、非コッコイド型であるピロリ菌を得た。ＯＤ６００を測定し、ウマ血清５．５％入りミューラーヒントン培養液に菌数４×１０７になるように希釈し、計３ｍＬを３５℃、ＣＯ２１５％で２４時間震盪培養した後顕微鏡で確認し、上記化合物の効果を確認するための試験に用いるピロリ菌含有培養液（菌濃度；２×１０７／ｍＬ）とした。一方、上記のＧｌｃＮＡｃα−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌの４５μＭ〜３６０μＭのウマ血清５％入りミューラーヒントン培養液（ピロリ菌を含有しない）をそれぞれ作製し、これらをそれぞれのピロリ菌含有培養液に体積比１：１（全容積１００μＬ、９６ｗｅｌｌプレート上）で添加、混和した後、３５℃、ＣＯ２１５％で、９６時間培養した。一定時間培養後、増殖した菌の濃度をＯＤ６００ｎｍで測定し、化合物を添加したものと、添加していないネガティブコントロール（図２中のコントロール）とを比較し、増殖抑制効果を見積もった。尚、１Ｕは２．９μｍｏｌ／ｍＬである。尚、ＧｌｃＮＡｃα−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌは、培養液に上記の濃度では溶解しにくいために、溶解しないものについてはあらかじめフィルターで除去してある。従って、上記の濃度はすべて溶解したものとして表記してあるために、実際の濃度は表記の濃度以下である。
ＧｌｃＮＡｃα−ｃｈｏｌｅｓｔａｎｏｌを用いた結果を図２に示す。最大限溶解した濃度をＡと記した。従って、少なくとも６２．５ｍＵ／ｍＬ（１８０μＭ）以上添加した場合、ピロリ菌の増殖が約４０〜５０％程度（１．５日〜２日）阻害されることが示された。
【産業上の利用可能性】  α−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、従来の抗生物質とは全く異なり、あらゆるピロリ菌の生育に必須の増殖活動を抑制するという機序でピロリ菌に対する抗菌作用を示すから、抗ピロリ菌剤の有効成分として有用である。
これらの糖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤は、医薬成分やサプリメントや飲食品添加物として有用である。
またピロリ菌増殖抑制剤を含む飲食品は、機能性飲食品や健康飲食品として有用である。ピロリ菌増殖抑制剤を含む医薬製剤は、ピロリ菌に由来する慢性胃炎や胃潰瘍等の胃疾患、消化性疾患の治癒や症状緩和や予防のために有用である。
【図１】
2008084561.tif 000004
【図２】
2008084561.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月27日(2007.3.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、消化性潰瘍や胃癌等の原因となるピロリ菌の増殖を抑制するα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体を含有する増殖抑制剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヘリコバクターピロリ菌(Helicobacter  pylori)は、慢性胃炎患者の胃粘膜から分離培養されたグラム陰性のらせん菌である（Marshall  BJ,  Warren  JR.  Lancet  1984;I:1311-1315.）。このようなピロリ菌は、慢性胃炎や消化性潰瘍だけでなく、胃癌や胃悪性リンパ腫等の重篤な胃疾患の発症にも密接に関連していることが明らかとなっている（Peek  RM  Jr,  Blaser  M  J.  Nature.  Rev.  Cancer  2002;2:28-37.）。
【０００３】
ピロリ菌感染者は世界人口の半数にも達すると言われているが、全ての感染者が重篤な胃疾患に進展するわけではない。この事実は、ピロリ菌感染から防御する機構が胃粘膜自体に備わることを、示唆している。
【０００４】
ピロリ菌は、胃粘膜の表層から分泌される表層粘液内に棲息するが、粘膜中ないし粘膜深層から分泌される腺粘液中に棲息していない。この腺粘液は、α−Ｎ−アセチルグルコサミニル残基（αGlcNAc残基）を末端に有するO-グリカンの糖鎖を特徴的に含んでいる。そのため、この糖鎖は、胃粘膜をピロリ菌感染から防御しているという可能性が、示唆されている。
【０００５】
Kawakubo  M,  et  al.  Science  2004;305:1003-1006.には、ピロリ菌増殖に対するαGlcNAc残基の影響について記載されている。αGlcNAc結合を非還元末端に持つコア２分岐型O-グリカン（GlcNAcα1-4Galβ1-4GlcNAcβ1-6(GlcNAcα1-4Galβ1-3)GalNAc-R）が結合した糖タンパク質類は、ピロリ菌の増殖や運動能を著しく抑制し、同時に菌体の伸長や輪郭の不整・断片化等の著しい変化を起こす旨、記載されている。これら一連の変化は、αGlcNAc残基を持たないO-グリカンでは認められない。また、前記のαGlcNAc残基を有する糖鎖が存在している時のピロリ菌の形態観察から推察したとおり、菌体の細胞表層にあるグリコシルコレステロール成分(CGL)が有意に減少しているとも記載されている。
【０００６】
ピロリ菌は、CGLを必須とするが、自らCGLを合成できない（Hirai  Y,  et  al.  J.Bacteriol.  1995;177:5327-5333.）。このためピロリ菌は、外界からコレステロールを摂取し、菌の細胞膜付近でグルコースを付加して細胞壁を構築すると、考えられている。前記のαGlcNAc残基を有する糖鎖には、この細胞壁の構築を阻害する性質があると推察される。しかし、前記のαGlcNAc結合を非還元末端に持つコア２分岐型O-グリカンの化学合成や酵素合成は、多工程を要するうえ、コストがかかり実用的ではない。
【０００７】
また、特表２００３−５１７０１５号公報には、より小さなGalβ3GlcNAcまたはGalβ3GalNAcを包含する糖鎖のピロリ結合性物質が開示されているが、この調製手法は、煩雑であるため、大量に調製できる手法でない。
【０００８】
一方、現在のピロリ菌感染の治療法は、これらの糖鎖を用いたものではなく、１種類のプロトンポンプ阻害薬と２種類の抗生物質との３剤併用による除菌が中心である。３剤併用療法では、耐性菌が出現して再発したり、副作用が発現したりするという問題がある。
【０００９】
そこで、人体に副作用等の悪影響を与えず、大量に製造でき、しかも調製し易いαGlcNAc残基を含む糖鎖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤が求められていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は前記の課題を解決するためになされたもので、非常に簡便にかつ大量に製造でき、特異的にピロリ菌増殖を抑制する化合物を含み安全で、耐性菌を生じさせないピロリ菌増殖抑制剤、この増殖抑制剤を含む飲食品及び医薬製剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前記の目的を達成するためになされたピロリ菌増殖抑制剤は、下記化学式（１）
GlcNAc1-α-O-Ｙ      ・・・（１）
（式（１）中、Ｙは、炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状の脂肪族炭化水素基、若しくは炭素数１〜２７の直鎖状、分岐鎖状又は環状のアシル基を示す）
で表されるα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体を含有している。
【００１２】
また、前記の目的を達成するためになされた飲食品は、前記のピロリ菌増殖抑制剤を含んでいる。
【００１３】
また、前記の目的を達成するためになされた医薬製剤は、前記のピロリ菌増殖抑制剤を含んでいる。
【発明の効果】
【００１４】
このα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、ピロリ菌の増殖を抑制して、抗菌的に作用するというものである。この糖誘導体は、抗生物質投与時のような耐性菌出現の恐れがない。この糖誘導体は、簡便に製造でき、大量の工業的生産に適している。
【００１５】
この糖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤は、その糖誘導体がピロリ菌の細胞壁構築を阻害してピロリ菌の増殖を特異的に抑制するので、抗ピロリ菌の薬効を示す。また、ピロリ菌増殖抑制剤は、この糖誘導体を単独で使用し、または抗生物質等と併用することにより、ピロリ菌を胃内から完全に除去したり、慢性胃炎・消化性潰瘍・胃癌・胃悪性リンパ腫等の胃疾患の再発を防止したりすることができる。さらに、この糖誘導体の構造は、アグリコン部位が低級乃至高級の飽和又は不飽和のアルキル基やコレスタニル基で例示される脂肪族炭化水素基、アシル基のような非毒性の基で構成されるものであるので、ピロリ菌増殖抑制剤は、人体に対する安全性が極めて高いというものである。
【００１６】
ピロリ菌増殖抑制剤を含有する飲食品は、胃疾患の症状緩和や予防のために有用である。この糖誘導体が強いピロリ菌増殖抑制作用を発現するので、飲食品に少量添加するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏する。
【００１７】
また、ピロリ菌増殖抑制剤を含有する医薬製剤は、ピロリ菌に由来する慢性胃炎や胃潰瘍等の胃疾患の治癒のために有用である。この糖誘導体が強いピロリ菌増殖抑制作用を発現するので、この医薬製剤を少量服用するだけで優れた抗ピロリ菌作用を奏し、胃疾患の治療・症状緩和・予防のために有用である。
【発明の実施の形態】
【００１８】
以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１９】
本発明のピロリ菌増殖抑制剤に含有されるα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、前記化学式（１）のとおりGlcNAc1-α-O-Ｙで示され、Ｙがアルキル基のような脂肪族炭化水素基で示されるもので、Ｎ−アセチルグルコサミニル(GlcNAc)基がαで結合した構造を持っている。
【００２０】
α−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、ピロリ菌に対して優れた増殖抑制効果を有している。例えば、エチル基を持つ単糖誘導体(GlcNAc-α-OEt)の１．８ｍＭ以上の濃度の培養液がピロリ菌と共存している場合、ピロリ菌の増殖を５０％以下に抑える。特に７．２ｍＭ以上の濃度の培養液では、増殖を完全に抑える。この単糖誘導体は、培養液中でも、また胃内でも、分解しない。このα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体(GlcNAc-α-OEt)は、単糖であることに加えて、１段階の合成方法で簡便に得ることができるので、その大規模な製造が可能である。さらにこの単糖誘導体は、Ｎ−アセチルグルコサミンの脂肪族炭化水素基置換体であって、その置換部位がエーテル結合であるので、安定である。また、アルキル基のようなこの脂肪族炭化水素基は極めて安全な残基である。この単糖誘導体は、芳香族残基のような人体に有害な残基がないために、その安全性が高く飲食品や医薬製剤に含ませることが可能である。
【００２１】
なお、化学式（１）中のα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体のＹ基は、炭素数１〜２７の基で、エチル基のような直鎖アルキル基の他、分岐鎖アルキル基、ステリン由来基・ステロイド環含有基例えばコレスタニル基で例示される脂環アルキル基のような脂肪族炭化水素基であってもよい。同じくＹ基は、炭素数１〜２７の基、例えば炭素数３の基で、直鎖アシル基、分岐鎖アシル基、ステリン由来基含有アシル基・ステロイド環含有アシル基例えばコレスタニル含有アシル基のような脂環アシル基であってもよい。
【００２２】
コレスタニル基を有する単糖誘導体(GlcNAcα-cholestanol)は、上記と同様の実験において、少なくとも１８０μＭ以下の濃度で４０〜５０％のピロリ菌の増殖抑制効果がある。この単糖誘導体も、GlcNAc-α-OEtと同様の性質を持ち、GlcNAc-α-OEtよりは多少低いが優れた安全性が期待できる。
【００２３】
これらのα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、ピロリ菌増殖抑制剤として用いられる。これらの糖誘導体は、単独で用いられてもよく、複数を混合して用いてもよく、またランソプラゾールやオメプラゾールのようなプロトンポンプ阻害薬の１種とアモキシシリンおよびクライリストマイシンのような抗生物質の２種とを併用してもよい。
【００２４】
このピロリ菌増殖抑制剤は、飲食品に添加する飲食品添加剤として用いられる。飲食品は、ヨーグルト等の乳製品のような食品、水やココアやジュースのような飲料品が挙げられる。飲食品には、ピロリ菌増殖抑制剤が０．０２〜０．２％添加されることが好ましい。これら飲食品は、継続して摂取するものであると、ピロリ菌増殖抑制効果が高まり、慢性胃炎のような胃疾患等の消化性疾患の予防をすることができるので、一層好ましい。
【００２５】
このピロリ菌増殖抑制剤は、医薬製剤に含有させる薬効成分として用いられる。医薬製剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、乳剤、散剤、シロップ剤、液剤、又は注射剤であってもよい。このような医薬製剤は、賦形剤、蒸留水、生理食塩水等の製剤成分や、別な医薬成分を含んでいてもよい。これら医薬製剤を単回服用、又は継続服用すると、ピロリ菌増殖抑制効果が高まり、慢性胃炎のような胃疾患等の消化性疾患を治癒又は症状軽減をすることができるので、一層好ましい。
【実施例】
【００２６】
以下に、α−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合糖誘導体を調製し、本発明のピロリ菌増殖抑制剤を調製した例を示す。
【００２７】
（調製例１：化学合成によるGlcNAcα-O-Et(１)の調製）
本発明を適用する前記化学式（1）のα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体の一例であるエトキシ２−アセトアミド-２-デオキシ-Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド（GlcNAcα-O-Et（１））について詳細に説明する。この誘導体は、下記化学反応式のようにして合成される。
【００２８】
【化１】
2008084561.tif 000006
【００２９】
Ｎ-アセチル-Ｄ-グルコサミン3.2864g(14.86mmol)を200mlナス型フラスコに入れ、HClガスを吹き込んだEtOH(50.0ml)に溶解させ、塩化カルシウム管を取り付け室温で攪拌させた。反応の確認は、薄層クロマトグラフ(TLC)(展開溶媒  クロロホルム/メタノール(3:1))で行った。85時間後、濃縮しピンク色の結晶が析出した。これを少量取り、薄層クロマトグラフ(展開溶媒  クロロホルム/メタノール(3:1))を行い、ヨウ素で12時間呈色させた。この結晶をカラムクロマトグラフ（展開溶媒  クロロホルム/メタノール(3:1)）で精製することにより、白色結晶状の生成物(α体)を収率75%で得た。生成物の確認は600MHz-核磁気共鳴スペクトル法(NMR)にて行った。
1H-NMR(600MHz,  CDCl3);  δ  1.06(3H,  t,  J=7.6Hz,  -CH2CH3),  1.90(3H,  s,  CH3CO),  3.34(1H,  t,  J=9.6Hz,  H-4),  3.35-3.41(1H,  m,  H-5),  3.57-3.66(4H,  m,  H-2,  H-3,  Ha-6,  -CHaCHbH3),  3.72  (1H,  dd,  J=1.4Hz,  J=8.3Hz,  -CHaCHbH3),  3.77(1H,  dd,  J=2.5Hz,  J=10.3Hz,  Hb-6),  4.73(1H,  d,  J=4.2Hz,  H-1)
13C-NMR(150MHz,  CDCl3);  δ  14.67(-CH2CH3),  22.51(CH3CO),  54.29(C-2),  61.21(-CH2CH3),  64.58(C-6),  70.69(C-5),  71.77(C-3),  72.39(C-4),  97.29(C-1),  175.08(CH3CO)
この分光学的データは、この生成物がGlcNAcα-O-Et(１)であることを支持する。
【００３０】
（化合物１（GlcNAcα-O-Et(１)）の抗ピロリ菌作用の確認）
GlcNAca-O-Etのピロリ菌への効果を以下の手順で確認した。−８０℃でブルセラブロス培養液中に凍結保存されているピロリ菌(ATCC  43504)を、ウマ血清１０％入り同培養液中（３ｍＬ）で３５℃、ＣＯ２１５％で４０時間震盪培養し、顕微鏡下で菌の動きを観察した後、非コッコイド型であるピロリ菌を得た。ＯＤ６００を測定し、ウマ血清５．５％入りミューラーヒントン培養液に菌数４×１０７になるように希釈し、計３ｍＬを３５℃、ＣＯ２１５％で２４時間震盪培養した後顕微鏡で確認し、上記化合物の効果を確認するための試験に用いるピロリ菌含有培養液（菌濃度；２×１０７／ｍＬ）とした。一方、上記のGlcNAca-O-Etの９０２．６μＭ〜１４．４ｍＭのウマ血清５％入りミューラーヒントン培養液（ピロリ菌を含有しない）をそれぞれ作製し、これらをそれぞれのピロリ菌含有培養液に体積比１：１（全容積１００μＬ、９６ｗｅｌｌプレート上）で添加、混和した後、３５℃、ＣＯ２１５％で、９６時間培養した。一定時間培養後、増殖した菌の濃度をＯＤ６００ｎｍで測定し、化合物を添加したものと、添加していないネガティブコントロール（図１中のコントロール）とを比較し、増殖抑制効果を見積もった。尚、１Ｕは２．９μｍｏｌ／ｍＬである。
【００３１】
GlcNAca-O-Etを用いた結果を図１に示す。
図１から明らかな通り、GlcNAca-O-Etを６２５ｍＵ／ｍＬ（1.8ｍＭ）以上添加した場合、ピロリ菌の増殖が５０％以上阻害されることが示された。
【００３２】
（調製例２：化学合成によるGlcNAcα-cholestanol(２)の調製）
本発明を適用するα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体の別な一例である3-β-コレスタニル2-アセトアミド-3,4,6トリ-O-ベンジル-2-デオキシ-α−Ｄ−グルコサミニド（GlcNAcα-cholestanol(２)の中間体）とGlcNAcα-cholestanol(２)とについて詳細に説明する。この誘導体は、下記化学反応式のようにして合成される。
【００３３】
【化２】
2008084561.tif 000007
【００３４】
(2-1.  GlcNAcα-cholestanol中間体(3-β-コレスタニル2-アセトアミド-3,4,6トリ-O-ベンジル-2-デオキシ-α−Ｄ−グルコサミニド(３)の合成)
オイルバス185℃で6時間減圧乾燥させたYb(OTf)3(129mg,  0.2080mmol)を20ml二口フラスコに入れ、Ar存在下でCH2Cl2を0.5ml加えた。CH2Cl2で溶解させたグリコシルアセテート(４)(133.2mg,  0.2496mmol)と3-β-Cholestanol(80.8mg,  0.2080mmol)を加え、メスフラスコで0.1Mに調製したBF3・Et2O(62μl、6.24μmol)を加えた。室温で21時間攪拌し薄層クロマトグラフ(展開溶媒  Hexane:AcOEt=1:2)で反応の進行を確認し、飽和NaHCO3溶液で反応を停止させた。CH2Cl2とAcOEtの混合溶媒で抽出を行い、得られた有機層を食塩水で洗いNa2SO4で乾燥した。濾過、濃縮を行い未精製の結晶を得た。分取薄層クロマトグラフ(展開溶媒  Benzene:  AcOEt=5:1)で精製を行い、グリコシド体混合物が収率70%で得られた(α/β比=23/77,  α体(３)の収率16.1%))。
この分離したα体の1H-NMRと13C-NMR（日本電子社製）とによる分光学的データは、下記に示すとおりであり、化合物３で示した構造であることを支持している。
1H-NMR(600MHz,  CDCl3);  δ  1.86(3H,  s,  H-8),  0.57-1.97(47H,  m,  3-β-cholestanyl),  3.50(1H,  tt,  J=5.4Hz,  J=10.9Hz,  H-1’),  3.68(1H,  t,  J=9.5Hz,  H-3),  3.67(1H,  dd,  J=1.9Hz,  J=10.9Hz,  H-6a),  3.72(1H,  t,  J=9.3Hz,  H-4),  3.76(1H,  dd,  J=4.3Hz,  J=8.8Hz,  H-6b),  3.89(1H,  ddd,  J=1.9Hz,  J=4.1Hz,  J=9.4Hz,  H-5),  4.24(1H,  td,  J=3.8Hz,  J=9.8Hz,  H-2),  4.91(1H,  d,  J=3.8Hz,  H-1),  5.32(1H,  d,  J=9.3Hz,  -NHAc),  4.50-4.85(6H,  m,  -OCH2Ph),  7.16-7.35(15H,  m,  -OCH2Ph)
13C-NMR(150MHz,  CDCl3);  δ  23.48(C-8),  12.07-56.44(3-β-cholestanyl),  52.54(C-2),  68.74(C-6),  70.93(C-5),  76.98(C-1’),  78.50(C-4),  80.82(C-3),  96.16(C-1’),  169.62(C-7),  70.40-75.03(-OCH2Ph),  127.59-128.51(-OCH2C(CHCH)2CH),  138.10-138.57(-OCH2C(CHCH)2CH)
【００３５】
(2-2.  3-βコレスタニル2−アセトアミド-2-デオキシ-Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド（GlcNAcα-cholestanol(２)）の合成)
(３)の32.1mg(0.037mmol)を20ml二又ナス型フラスコに入れ、THF3mlに溶解し、水酸化パラジウム54.7mg(0.39mmol)を加え、室温にて水素ガスでバブリングしながら攪拌した。反応の確認は薄層クロマトグラフ(展開溶媒  クロロホルム/メタノール(5:1))にて行った。１５時間後、水酸化パラジウムを濾別し、シリカゲルカラムクロマトグラフ(展開溶媒  クロロホルム/メタノール(5:1))により精製し、白色結晶状の生成物が得られた。この生成物を1H-NMRにより解析した結果、化合物２で示される構造を持つことが支持された。
1H-NMR(600MHz,  CDCl3);  δ  0.68-1.85(3-β-cholestanyl),  2.15(3-β-cholestanyl),  3.52-3.57(3-β-cholestanyl),  1.97(3H,  s,  CH3CO),  3.63-3.68(4H,  m,  H-3,  H-4,  H-5,  Ha-6),  3.78-3.84(2H,  m,  H-2,  Hb-6),  4.93(1H,  d,  J=3.4Hz,  H-1)
【００３６】
（化合物２（GlcNAcα-cholestanol(２)）の抗ピロリ菌作用の確認）
GlcNAca-cholestanolのピロリ菌への効果を以下の手順で確認した。−８０℃でブルセラブロス培養液中に凍結保存されているピロリ菌(ATCC  43504)を、ウマ血清１０％入り同培養液中（３ｍＬ）で３５℃、ＣＯ２１５％で４０時間震盪培養し、顕微鏡下で菌の動きを観察した後、非コッコイド型であるピロリ菌を得た。ＯＤ６００を測定し、ウマ血清５．５％入りミューラーヒントン培養液に菌数４×１０７になるように希釈し、計３ｍＬを３５℃、ＣＯ２１５％で２４時間震盪培養した後顕微鏡で確認し、上記化合物の効果を確認するための試験に用いるピロリ菌含有培養液（菌濃度；２×１０７／ｍＬ）とした。一方、上記のGlcNAca-cholestanolの４５μＭ〜３６０μＭのウマ血清５％入りミューラーヒントン培養液（ピロリ菌を含有しない）をそれぞれ作製し、これらをそれぞれのピロリ菌含有培養液に体積比１：１（全容積１００μＬ、９６ｗｅｌｌプレート上）で添加、混和した後、３５℃、ＣＯ２１５％で、９６時間培養した。一定時間培養後、増殖した菌の濃度をＯＤ６００ｎｍで測定し、化合物を添加したものと、添加していないネガティブコントロール（図２中のコントロール）とを比較し、増殖抑制効果を見積もった。尚、１Ｕは２．９μｍｏｌ／ｍＬである。尚、GlcNAca-cholestanolは、培養液に上記の濃度では溶解しにくいために、溶解しないものについてはあらかじめフィルターで除去してある。従って、上記の濃度はすべて溶解したものとして表記してあるために、実際の濃度は表記の濃度以下である。
【００３７】
GlcNAca-cholestanolを用いた結果を図２に示す。最大限溶解した濃度をAと記した。従って、少なくとも６２．５ｍＵ／ｍＬ（１８０μＭ）以上添加した場合、ピロリ菌の増殖が約４０〜５０％程度(1.5日〜２日)阻害されることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
α−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体は、従来の抗生物質とは全く異なり、あらゆるピロリ菌の生育に必須の増殖活動を抑制するという機序でピロリ菌に対する抗菌作用を示すから、抗ピロリ菌剤の有効成分として有用である。
【００３９】
これらの糖誘導体を含有するピロリ菌増殖抑制剤は、医薬成分やサプリメントや飲食品添加物として有用である。
【００４０】
またピロリ菌増殖抑制剤を含む飲食品は、機能性飲食品や健康飲食品として有用である。ピロリ菌増殖抑制剤を含む医薬製剤は、ピロリ菌に由来する慢性胃炎や胃潰瘍等の胃疾患、消化性疾患の治癒や症状緩和や予防のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１は、本発明を適用するα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体（化合物１）からなるピロリ菌増殖抑制剤の抗ピロリ菌作用を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明を適用するα−Ｎ−アセチルグルコサミニル結合単糖誘導体（化合物２）からなるピロリ菌増殖抑制剤の抗ピロリ菌作用を示すグラフである。