(57)【要約】本発明は、顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含む、靭帯損傷の回復促進剤または治療剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含む、靭帯損傷の回復促進剤または治療剤。
【請求項２】
顆粒球コロニー刺激因子が、配列番号１〜３のうちいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド若しくは糖タンパク質である、請求項１に記載の靭帯損傷の回復促進剤または治療剤。
【請求項３】
請求項１または２に記載の靭帯損傷の回復促進剤または治療剤を含む医薬組成物。
【請求項４】
局所投与用である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
靭帯損傷の回復促進剤または治療剤がゲル基材と混合されている、請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（以下、Ｇ−ＣＳＦと略記する）を有効成分とする靭帯損傷の回復促進剤または治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
靭帯とは関節を形成する骨と骨を支える組織のことで、靭帯損傷は主にスポーツや交通事故により引き起こされる。特に膝靭帯を損傷する場合が多く、損傷する靭帯の種類により、外側側副靭帯損傷、内側側副靭帯損傷、前十字靭帯損傷、後十字靭帯損傷に分けられる。損傷の程度により、１〜３度に分けられ、３度になると治療に数ヶ月を要し、痛みや日常生活に支障をきたす場合がある。膝靭帯損傷の中で特に、膝前十字靭帯損傷は前方、および回旋において不安定となりスポーツ活動への復帰が困難となることはもとより、半月板、関節軟骨の損傷をも誘発し、日常生活動作にも影響がでることも少なくない。その治療法として現在は自家腱による再建手術が主となっている。前十字靭帯再建術における力学的アプローチとして靭帯の固定材料（スクリューなど）の開発はさかんに行われている。現在数多くの材料が臨床で使用されているにもかかわらず、未だスポーツ活動復帰までの期間を短縮させるに至っていない。
一方、生物学的アプローチでは、Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＭＰ）、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、間葉系幹細胞、骨膜を利用して移植腱の関節内の骨への固着の促進、あるいは損傷した靭帯の治癒促進に関する基礎研究（非特許文献１〜５）が行われたが、副作用やコストの問題から臨床応用できていない。
過去の動物実験や臨床データから、移植腱が関節内の骨に固着し、移植腱そのものが成熟するためには長い時間がかかり、損傷前の膝機能を再獲得するのに再建手術後約８〜１０ヶ月を要する。
【非特許文献１】Ａｓｐｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．ら，Ａｃｔａ  ｏｒｔｈｏｐ  Ｓｃａｎｄ．１９９９  Ｆｅｂ；７０（１）：５１−４
【非特許文献２】Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｗ．ら，Ａｒｃｈ  Ｏｒｔｈｏｐ  Ｔｒａｕｍａ  Ｓｕｒｇ  ２００３；１２３：１６８−１７４
【非特許文献３】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｄ．ら，Ｋｎｅｅ  Ｓｕｒｇ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌ  Ａｒｔｈｒｏｓｃ  １９９７；５：１８９−１９４
【非特許文献４】Ｌｉｍ，Ｊ．−Ｋ．ら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｒｔｈｒｏｓｃｏｐｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ２００４  Ｎｏｖ；２０（９）：８９９−９１０
【非特許文献５】Ｃｈｅｎ，Ｃ．−Ｈ．ら，Ｋｎｅｅ  Ｓｕｒｇ  Ｓｐｏｒｔｓ  Ｔｒａｕｍａｔｏｌ  Ａｒｔｈｒｏｓｃ  ２００４；１２：３９８−４０５
【発明の開示】
【０００３】
現在、靭帯損傷治療において、回復を明らかに早めるような治療はない。重症の靭帯損傷においては腱の移植が行なわれているが治癒までには６〜９ヶ月を要し、長期間日常生活に不自由を強いられ、あるいは早期のスポーツ復帰が出来ないことが問題となっている。
靭帯損傷、特に膝前十字靭帯損傷を中心とする重症の靭帯損傷に対してその回復を早めることが望まれているが、未だ、これを解決できる薬剤や治療法は存在しない。移植腱が関節内の骨に固着するのに要する期間を短縮すれば、術後の早期リハビリテーションが可能となり、スポーツ活動への復帰が短縮できる。
そこで、本発明は、靭帯損傷の治療において、移植腱が関節内の骨に固着するのに要する期間及び／または移植腱が成熟するのに要する期間を短縮すること、並びに断裂等の損傷を受けた靭帯の治癒を促進することを課題とする。
本発明者等は、膝前十字靭帯損傷を反映したイヌモデルを用い、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）がその損傷治癒を改善するかどうかを検討したところ、Ｇ−ＣＳＦの局所投与によって靭帯の損傷治癒が促進されることを見出し、本発明を完成するに到った。
すなわち、本発明は、その一の態様において、顆粒球コロニー刺激因子を有効成分として含む、靭帯損傷の回復促進剤または治療剤を提供する。
本発明は、単独あるいは現存の治療法との併用により靭帯損傷の回復及び／または治癒を早める薬剤を提供するという優れた効果を奏するものである。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００６−２２１６８４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、イヌ膝十字靭帯損傷モデルに腱を移植した様子を示す。
図２は、力学的評価における引張り試験の様子を示す。屈曲位４５°にて固定している。脛骨側縫合部は切除してある。
図３は、Ｇ−ＣＳＦ投与群とコントロール群について、力学的引っ張り試験における最大破断強度を測定結果を示す。
図４は、Ｇ−ＣＳＦ投与群とコントロール群について、ヘマトキシリンエオジン染色をした靭帯−骨間の観察結果を示す。
図５は、Ｇ−ＣＳＦ投与群とコントロール群について、ＶＥＧＦ発現を比較した結果を示す。
図６は、Ｇ−ＣＳＦ投与群とコントロール群について、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）発現を比較した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下に本発明をより詳細に説明する。
Ｇ−ＣＳＦは顆粒球系造血前駆細胞の分化増殖因子として発見された造血因子であり、好中球前駆細胞に作用し、その分化・増殖を促進させるほか、骨髄からの成熟好中球の放出促進及び好中球機能を亢進させる作用を有することから、造血幹細胞移植後の好中球数の増加促進、骨髄移植や癌化学療法後の好中球減少症治療剤として臨床適用されている。Ｇ−ＣＳＦはがん化学療法後の好中球減少症治療剤としても既に臨床応用されている。また、Ｇ−ＣＳＦは骨髄中の造血幹細胞を末梢血中へ動員する作用を有することから、同種及び自家末梢血幹細胞採取時における造血幹細胞の末梢血中への動員剤としても臨床応用されている。さらに、最近では、血管新生の促進効果や心筋梗塞あるいは脳梗塞後の細胞死を抑制する効果があることが報告されている。
しかしながら、腱の再生や骨孔への効果は未知で、損傷した靭帯に対してその回復を早めることはまったく知られていない。
本発明者等は、今回、驚くべきことに、Ｇ−ＣＳＦが膝前十字靭帯切離によるイヌ膝靭帯損傷モデルに対する靭帯再建を改善することを見出した。
膝前十字靭帯切離によるイヌ膝靭帯損傷モデルとして体重約１０ｋｇのビーグル犬を使用した。全身麻酔下に四肢を紐で手術台に括り、仰臥位で膝部付近の毛をバリカンで刈り、イソジンを用いて消毒する。下肢後内側（内顆とアキレス腱の間）に縦切開を加え、約８ｃｍの浅趾屈筋腱を採取し移植腱とする。移植腱を二重束とし、ループ側を移植時に脛骨側端とし、逆側を移植時に大腿骨側端とし、両側に糸を通しておく。傍膝蓋骨内側侵入にて関節内に達し、膝蓋骨を外側に手で脱臼させる。膝蓋骨下脂肪体の両端をかんしで噛み、膝蓋骨下脂肪体を切開する。さらに横靭帯を切開し、膝前十字靭帯を露出させ、大腿骨起始部、脛骨付着部より鋭的に切離する。４ｍｍの手回しドリルを使用し、膝前十字靭帯の付着部より大腿骨外果、脛骨前内側に向け骨孔を作成し、脛骨側および大腿骨側の螺子挿入部に２ｍｍの手回しドリルで穴を開け、各々に螺子を挿入する。骨孔内に移植腱を通し、両端の糸を各螺子頭部に結びつける。なお、大腿骨側は膝屈曲４５°で結びつける。生理食塩液で施術部を洗浄した後縫合する。
上記モデルは膝前十字靭帯切離による膝靭帯損傷の病態を代表するモデルであると同時に現在行われている自家腱を用いた再建手術モデルでもあり、移植した腱が充分な強度（最大引っ張り強度が１００Ｎ以上）を示すには約２ヶ月程を要する。
上記モデルでの有効性が証明されたＧ−ＣＳＦは、膝前十字靭帯損傷をはじめとしてさまざまな部位の靭帯損傷に使用できる。
本発明のＧ−ＣＳＦを有効成分とする靭帯損傷の回復促進剤または治療剤並びに医薬組成物が対象とする靭帯損傷としては、例えば、膝靭帯損傷、より具体的には、外側側副靭帯損傷、内側側副靭帯損傷、前十字靭帯損傷、後十字靭帯損傷などが挙げられる。本発明の対象として好ましい靭帯損傷は、足関節の靭帯損傷や肘関節の靭帯損傷、特に好ましくは重度膝靭帯損傷である。本発明は、膝靭帯や肘靭帯の損傷に限らず、他の靭帯損傷の治療にも使用できる。
［Ｇ−ＣＳＦ］
本発明に用いることができる有効成分であるＧ−ＣＧＦとして、特に好ましいものはヒトＧ−ＣＧＦである。ヒトＧ−ＣＳＦの例としては、例えば配列番号１〜３のいずれかのアミノ酸配列、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を含み、かつヒトＧ−ＣＳＦ活性（すなわち、好中球増加活性、及び靭帯損傷の回復促進または治療活性）を有するポリペプチド、又はこれに糖鎖が結合した糖タンパク質を挙げることができる。更に、同配列のアミノ酸配列の一部が改変（置換、欠失、挿入、および／または付加）されたＧ−ＣＳＦ活性を有するＧ−ＣＳＦ誘導体も本発明におけるＧ−ＣＳＦに含まれる。このようなＧ−ＣＳＦ誘導体は、好ましくは、配列番号１または２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである。上記改変は、例えば公知の部位特異的突然変異誘発法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用する方法を含む）によって行うことができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＵＳＡ）。改変には、保存的アミノ酸置換が含まれる。すなわち、このような置換は、電気的または構造的に類似した性質をもつアミノ酸間の置換であり、例えば塩基性アミノ酸間、酸性アミノ酸間、疎水性アミノ酸間、あるいは極性アミノ酸間でのアミノ酸置換である。
これらのＧ−ＣＳＦは天然由来のもの、および遺伝子組換えによって得られたものを含むが、遺伝子組換えで得られたものが好ましい。この場合、宿主細胞としては大腸菌、哺乳動物細胞（Ｃ１２７、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３細胞等）を挙げることができる。これらの詳細な製造方法については、例えば、特表昭６３−５００６３６号、特開昭６２−２３６４９７号、特開昭６２−２３６４８８号、及び特開昭６３−２６７２９２号等に開示されている。
また、上記の配列番号１〜３のアミノ酸配列で示されるポリペプチドまたは糖タンパク質およびＧ−ＣＳＦ誘導体に、さらにポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを少なくとも１分子結合させたもの（例えば、ＷＯ９０／０６９５２、ＷＯ９６／１１９５３、特開平１−３１６４００）も含まれる。特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールであり、例えば分子量２，０００〜１００，０００程度、好ましくは６，０００〜２５，０００程度のポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールの付加は、一般にＰＥＧ（ペグ）化と呼ばれているが、Ｇ−ＣＳＦのアミノ末端アミノ基および／またはリシン残基のεアミノ基に、アシル基やアルデヒド基などのアミノ基と反応性の基を介して結合することによって行うことができる。市販品としては、例えばＡｍｇｅｎ社がＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）として販売しているＰＥＧ化Ｇ−ＣＳＦが挙げられる。
更にまた、Ｇ−ＣＳＦの糖鎖結合部位を改変することにより、糖鎖の構造を変えたり、糖鎖を付加あるいは欠失させたようなＧ−ＣＳＦ糖鎖改変体、あるいは、アルブミン、ビタミンＢ１２、または免疫グロブリン等と融合させたタンパク質も含まれる。Ｇ−ＣＳＦ糖鎖改変体は、例えばＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列にＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列（ここで、ＸはＰｒｏ以外のアミノ酸である。）を新たに付加したり、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列から該Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列を欠失したりすることによって得ることができる。このような付加や欠失は、例えばＰＣＲを利用する部位特異的突然変異誘発法（Ａｕｓｕｂｅｌら，上記）を用いることによって容易に実施可能である。また、融合タンパク質は、一般的な遺伝子組換え技術を用いて、Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡと、これに融合させるタンパク質をコードするＤＮＡとを融合したＤＮＡを合成し、プロモーターの調節下にある該融合ＤＮＡを適当なベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入し、該融合ＤＮＡを発現させることを含む手法によって得ることができる。
［靭帯損傷の回復促進剤または治療剤並びに医薬組成物］
本発明の靭帯損傷の回復促進剤または治療剤は、単独で、あるいは薬学的に許容される担体、賦形剤、安定化剤等を含む医薬組成物として患者に投与することができる。
すなわち、本発明はまた、上記の医薬組成物を用いて、靭帯損傷の回復を促進または治療するための方法を提供する。
このような医薬組成物は、当分野で通常用いられている形態のいずれを用いることもできるが、特に局所投与注射製剤あるいは腱移植時に局所に埋め込む製剤が好ましい。局所投与注射製剤は溶液状態でもかまわないが、関節腔内に滞留するように医療用に用いられる適切な基材と混合しても良い。医療用に用いられる適切な基材としては、ゼラチン（ゼラチンハイドロゲルなどの架橋体も含む）、生分解性ポリマー（ポリアミノ酸、ポリ乳酸などを含む）、アルギン酸、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、カンテン末、アラビアゴム、ヒアルロン酸またはその塩、ヒドロキシプロピルセルロース、結晶セルロース等が挙げられるがこれに制限されるものではない。これらの医療用の基材は、局所に埋め込む製剤（例えば、有効成分をゲル基材と混合した製剤）の調製にも用いることができる。
本発明の靭帯損傷の回復促進剤または治療剤において、Ｇ−ＣＳＦの投与量、投与回数は患者の状態に応じて決めることができ、特に限定するものではないが、通常０．０１〜２００μｇ／ｋｇ、好ましくは１〜１０μｇ／ｋｇであり、投与回数は、１ないし２回／週投与で１〜８週間投与することができる。
本発明の靭帯損傷の回復促進剤または治療剤はまた、手術による一時的靭帯の修復、自家の腱、同種の腱、人工靭帯の移植、ギプス固定、装具療法、筋力強化訓練、あるいは抗炎症外用剤等の従来から行なわれている靭帯損傷の治療法１種以上との併用も可能である。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
膝前十字靭帯切離によるイヌ膝靭帯損傷モデルとして体重約１０ｋｇのビーグル犬を使用した。全身麻酔下（ネンブタール）に四肢を紐で手術台に括り、仰臥位で膝部付近の毛をバリカンで刈り、イソジンを用いて消毒する。下肢後内側（内顆とアキレス腱の間）に縦切開を加え、約８ｃｍの浅趾屈筋腱を採取し移植腱とする。移植腱を二重束とし、ループ側を移植時に脛骨側端とし、逆側を移植時に大腿骨側端とし、両側に糸を通しておく。脛骨側の移植腱にＧ−ＣＳＦ（キリンビール社製（東京、日本）のＦｉｌｇｒａｓｔｉｍＴＭ、配列番号１のアミノ酸配列で示されるペプチド）５μｇを包埋させたゼラチンハイドロゲル（１５×４×０．２５ｍｍ）を挟み糸で巻きつける。なお、ゼラチンハイドロゲルへのＧ−ＣＳＦの包埋は、投与１時間前にゼラチンハイドロゲルにＧ−ＣＳＦ溶液を滴下し３７℃でインキュベーションすることにより得られる。傍膝蓋骨内側侵入にて関節内に達し、膝蓋骨を外側に手で脱臼させる。膝蓋骨下脂肪体の両端をかんしで噛み、膝蓋骨下脂肪体を切開する。さらに横靭帯を切開し、膝前十字靭帯を露出させ、大腿骨起始部、脛骨付着部より鋭的に切離する。４ｍｍの手回しドリルを使用し、膝前十字靭帯の付着部より大腿骨外果、脛骨前内側に向け骨孔を作成し、脛骨側および大腿骨側の螺子挿入部に２ｍｍの手回しドリルで穴を開け、各々に螺子を挿入する。骨孔内にＧ−ＣＳＦ包埋ゼラチンハイドロゲルを挟み込んだ移植腱を通し、両端の糸を各螺子頭部に結びつける。なお、大腿骨側は膝屈曲４５°で結びつける。生理食塩液で施術部を洗浄した後縫合する。
手術を施行した後、２または４週後にビーグルを安楽死させ評価を行った。力学的・組織学的・放射線学的・分子生物学的評価をした。力学的評価では、大腿骨・脛骨から切断し関節周囲の軟部組織を前十字靭帯以外除去した後、引っ張り試験を行い、最大破断強度を測定した（図２及び３参照）。組織学的評価では、脱灰しパラフィン包埋した後、ヘマトキシリンエオジン染色をし靭帯−骨間を観察した（図４参照）。また、フォンウィルブランドファクターで免疫染色した後、１視野内の血管内皮を定量した。放射線学的評価では脛骨の骨孔に垂直で脛骨関節面から１０ｍｍ部をＣＴ撮影し、その面積を測定した。分子生物学的評価では、脛骨の骨孔とその周囲組織を一塊として取り出し、ＲＮＡを抽出した後に、血管新生の指標である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と骨新生の指標であるオステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）のｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲで定量した。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーの組み合わせは、配列番号４および５（イヌ  ＶＥＧＦ）、配列番号６および７（イヌオステオカルシン）、ならびに配列番号８および９（イヌＧＡＰＤＨ）である。
その結果、コントロール群（ゼラチンハイドロゲルにリン酸緩衝液を包埋させたもの）とＧ−ＣＳＦ群では４週間後の最大破断強度はＧ−ＣＳＦ投与群で顕著に増加した。なお、２週間後に測定した最大破断強度は、Ｇ−ＣＳＦ投与群がコントロール群に比べて有意な差はないものの低い値を示した。これは本モデルにおける損傷治癒過程で破断強度は一時的に低下した後に回復を示す経過を示すため、Ｇ−ＣＳＦ投与群が治癒を促進したためコントロール群よりも早く一時的な破断強度低下が見られたためと考えられる。また、４週間後の靭帯−骨間組織を観察したところ、コントロール群に比べてＧ−ＣＳＦ群でＳｈａｒｐｅｙ’ｓ  ｆｉｂｅｒの豊富な発生が見られ、また２週間後の移植組織ではＧ−ＣＳＦ群で高い血管密度が観察された。さらに４週間後の骨孔の面積をＣＴ撮影したところ、Ｇ−ＣＳＦ投与群はコントロール群にくらべて明らかに狭くなり再生が進んでいることが明らかとなった。これらを裏付けるように、ＲＴ−ＰＣＲで、２週間後の骨孔とその周囲組織ではＧ−ＣＳＦ群で有意にＶＥＧＦとオステオカルシンの発現量が上昇していた。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
現在、靭帯損傷治療において、回復を明らかに早めるような治療はない。重症の靭帯損傷においては腱の移植が行なわれているが治癒までには６〜９ヶ月を要し、長期間日常生活に不自由を強いられ、あるいは早期のスポーツ復帰が出来ないことが問題となっている。したがって、本発明により単独あるいは現存の治療法との併用により靭帯損傷の回復を早める薬剤を提供できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０００８】
配列番号１：  天然型ヒトＧ−ＣＳＦに関して−１位にＭｅｔ残基を含むアミノ酸配列。
配列番号３：  天然型ヒトＧ−ＣＳＦに関して−１位にＭｅｔ残基を含み、かつ、天然型ヒトＧ−ＣＳＦ中の＋１位のＴｈｒ残基、＋３位のＬｅｕ残基、＋４位のＧｌｙ残基、＋５位のＰｒｏ残基及び＋１７位のＣｙｓ残基がそれぞれＡｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ａｒｇ及びＳｅｒに置換されているアミノ酸配列。
配列番号４：  プライマー。
配列番号５：  プライマー。
配列番号６：  プライマー。
配列番号７：  プライマー。
配列番号８：  プライマー。
配列番号９：  プライマー。
［配列表］
2008020638.tif 000002
2008020638.tif 000003
2008020638.tif 000004
2008020638.tif 000005
2008020638.tif 000006
【図５】
2008020638.tif 000007
【図６】
2008020638.tif 000008
【図１】
2008020638.tif 000009
【図２】
2008020638.tif 000010
【図３】
2008020638.tif 000011
【図４】
2008020638.tif 000012
【国際調査報告】
2008020638.tif 000013
2008020638.tif 000014
2008020638.tif 000015
2008020638.tif 000016