(57)【要約】  下記式（１）で示されるペプチドフラグメント（成分Ａ）を有するポリペプチドを有効成分とする血小板凝集惹起物質。    −（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−              （１）（式中、ＸはＰｒｏまたはＨｙｐであり、ｎは２０〜５０００の整数である。）【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）で示されるペプチドフラグメント（成分Ａ）を有するポリペプチドを有効成分とする血小板凝集惹起物質。
−（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−              （１）
（式中、ＸはＰｒｏまたはＨｙｐであり、ｎは２０〜５０００の整数である。）
【請求項２】
ペプチドフラグメント（成分Ａ）が、式（２）で示されるペプチドユニット（成分Ｂ）および式（３）で示されるペプチドユニット（成分Ｃ）からなるペプチドフラグメントであって、成分Ｂと成分Ｃとの割合（成分Ｂ／成分Ｃ、モル比）が、９５／５〜０／１００の範囲である、請求項１記載の血小板凝集惹起物質。
−（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）−              （２）
−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）−              （３）
【請求項３】
ポリペプチドが、さらに、式（４）で示されるペプチドユニット、式（５）で示されるペプチドユニット、およびそれらから選ばれた１種以上のペプチドユニットからなるペプチドフラグメントから選ばれた１種以上（成分Ｄ）を有する、請求項１または２に記載の血小板凝集惹起物質。
−（Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｙ）−                        （４）
−（Ｐｒｏ−Ｚ１−Ｇｌｙ−Ｚ２−Ａｌａ−Ｇｌｙ）−  （５）
（式中、Ｙ１はＡｓｐまたはγ位にカルボキシル基を有していてもよいＧｌｕであり、Ｙ２はＰｒｏまたはＨｙｐであり、Ｚ１はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり、Ｚ２はＩｌｅまたはＬｅｕである。）
【請求項４】
ペプチドフラグメント（成分Ａ）と、式（４）で示されるペプチドユニット、式（５）で示されるペプチドユニット、およびそれらから選ばれた１種以上のペプチドユニットからなるペプチドフラグメントから選ばれた１種以上（成分Ｄ）の割合（成分Ａ／成分Ｄ、モル比）が、９９／１〜３０／７０の範囲である、請求項３に記載の血小板凝集惹起物質。
【請求項５】
ポリペプチドが、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す、請求項１〜４の何れか１項に記載の血小板凝集惹起物質。
【請求項６】
ポリペプチドが、１０，０００〜５００，０００，０００の範囲の分子量を有する、請求項１〜５記載の何れか１項に記載の血小板凝集惹起物質。
【請求項７】
ポリペプチドが、０．０１〜１０００μｍの範囲の粒子径を有する、請求項１〜６記載の何れか１項に記載の血小板凝集惹起物質。
【請求項８】
ポリペプチドが、１０〜１０，０００ｍＰａ・ｓの範囲の粘度を有し、その際の粘度がポリペプチド１重量％水溶液、２０℃の条件でＥ型粘度計により測定された値である、請求項１〜７記載の何れか１項に記載の血小板凝集惹起物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板の機能評価に用いることができる血小板凝集惹起物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、出血時の止血作用に不可欠な生体内物質であるが、その機能が過剰に働いた場合には、血栓を形成し、ひいては心筋梗塞や脳梗塞などの重篤な疾病の原因となる。反対に、血小板が機能しない場合には出血傾向を誘導する。したがって、血液中の血小板の機能評価（血小板凝集能の測定）を行いその状態を把握することは、健康管理や治療を遂行する上で重要なことである。【０００３】
一般に血小板凝集能の測定は、低ズリ速度下で多血小板血漿にコラーゲンなどの凝集惹起物質を添加することにより血小板凝集を惹起させ、この凝集に伴って上昇する透過度を測定することにより行われている。【０００４】
血小板凝集能の測定に使用されるコラーゲンは、動物由来のものが使用されるのが一般的であるが、人工的に合成されたコラーゲンにも血小板凝集を惹起するものが知られている。【０００５】
非特許文献１、２および３には、３重螺旋構造を有するポリペプチド−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）10−、およびこのポリペプチドを架橋し４次構造とした物質が開示され、さらに、それらの物質の血小板凝集惹起活性が開示されている。【０００６】
前述の非特許文献に開示されたポリペプチド−（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）10−は血小板凝集惹起活性が弱く、血小板凝集能の測定に使用し得ないものであった。
一方、このポリペプチドを架橋し４次構造とした物質は、前述のポリペプチドに比べ高い血小板凝集惹起活性を有し、血小板凝集能の測定に使用し得るものである。しかしながら、この物質を得るためには、脱保護とアミノ酸の結合とを繰返すペプチド合成反応を行わなければならず、さらに架橋反応も必要であった。これらの反応は、それが繰返される度に目的とする反応生成物の収率が低下する。最終的に収率の低下はコストの上昇を招く。【０００７】
【非特許文献１】THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 1994 May13 ;269(19):13899-18903
【非特許文献２】The Biochemcial Journal 1995;306;337-344
【非特許文献３】Cardiovascular Reseach1999;41;450-457
【発明の開示】
【０００８】
人工的に合成されたコラーゲンであれば、従来血小板凝集の惹起物質として用いられてきた動物由来のコラーゲンに比べ、再現性、安定性、保存性などの点において有利であると考えられる。しかしながら、非特許文献１、２および３に記載の合成コラーゲンにおいては、収率が低く、コストが高いなどの課題があった。また、血小板凝集惹起活性においても、構造によっては充分な活性が得られないものもあった。
【０００９】
また、血栓形成の予防を目的としてアスピリンが服用されることがあるが、アスピリンの血中における存在は、コラーゲンをはじめとする血小板凝集惹起物質の機能を損ない、アスピリン服用者の血小板凝集能の測定を甚だ困難なものとしている。前述のように、血小板の機能評価（血小板凝集能の測定）は、健康管理や治療を遂行する上で不可欠なものであり、アスピリンの共存下であっても有効に血小板凝集を惹起する物質が求められていた。
【００１０】
本発明者らは、前述の従来技術の問題点に鑑み鋭意研究を重ねた。その結果、本発明に用いる式（１）で表されるポリペプチドは、−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）−のトリゴマーを溶媒中で重合させるだけで得られることから、反応工程が最小限で済み、収率、コストの面で有利なこと、血小板凝集能の測定に充分に使用可能なレベルの血小板凝集惹起活性を有すること、さらには、アスピリンの共存下であっても血小板凝集を有効に惹起し得ることなどを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
即ち、本発明は下記の（１）〜（８）の構成を有する。
【００１２】
（１）式（１）で示されるペプチドフラグメント（成分Ａ）を有するポリペプチドを有効成分とする血小板凝集惹起物質。
−（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−              （１）
（式中、ＸはＰｒｏまたはＨｙｐであり、ｎは２０〜５０００の整数である。）
（２）ペプチドフラグメント（成分Ａ）が、式（２）で示されるペプチドユニット（成分Ｂ）および式（３）で示されるペプチドユニット（成分Ｃ）からなるペプチドフラグメントであって、成分Ｂと成分Ｃとの割合（成分Ｂ／成分Ｃ、モル比）が、９５／５〜０／１００の範囲である、前記第１項記載の血小板凝集惹起物質。
−（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）−              （２）
−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）−              （３）
（３）ポリペプチドが、さらに、式（４）で示されるペプチドユニット、式（５）で示されるペプチドユニット、およびそれらから選ばれた１種以上のペプチドユニットからなるペプチドフラグメントから選ばれた１種以上（成分Ｄ）を有する、前記第１項または第２項に記載の血小板凝集惹起物質。
−（Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｙ）−                        （４）
−（Ｐｒｏ−Ｚ１−Ｇｌｙ−Ｚ２−Ａｌａ−Ｇｌｙ）−  （５）
（式中、Ｙ１はＡｓｐまたはγ位にカルボキシル基を有していてもよいＧｌｕであり、Ｙ２はＰｒｏまたはＨｙｐであり、Ｚ１はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり、Ｚ２はＩｌｅまたはＬｅｕである。）
（４）ペプチドフラグメント（成分Ａ）と、式（４）で示されるペプチドユニット、式（５）で示されるペプチドユニット、およびそれらから選ばれた１種以上のペプチドユニットからなるペプチドフラグメントから選ばれた１種以上（成分Ｄ）の割合（成分Ａ／成分Ｄ、モル比）が、９９／１〜３０／７０の範囲である、前記第３項に記載の血小板凝集惹起物質。
（５）ポリペプチドが、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示す、前記第１項〜第４項の何れか１項に記載の血小板凝集惹起物質。
（６）ポリペプチドが１０，０００〜５００，０００，０００の範囲の分子量を有する、前記第１項〜第５項記載の何れか１項に記載の血小板凝集惹起物質。
（７）ポリペプチドが、０．０１〜１０００μｍの範囲の粒子径を有する、前記第１項〜第６項記載の何れか１項に記載の血小板凝集惹起物質。
（８）ポリペプチドが、１０〜１０,０００ｍＰａ・ｓの範囲の粘度を有し、その際の粘度がポリペプチド１％水溶液、２０℃の条件でＥ型粘度計により測定された値である、前記第１項〜第７項の何れか１項に記載の血小板凝集惹起物質。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実験例２における血小板凝集能測定結果。
【図２】実験例３における血小板凝集能測定結果。
【図３】実験例４における血小板凝集能測定結果。
【図４】実験例４における血小板凝集能測定結果。
【図５】実験例５における血小板凝集能測定結果。
【図６】実験例５における血小板凝集能測定結果。
【図７】実験例６における血小板凝集能測定結果。
【図８】実験例６における血小板凝集能測定結果。
【図９】実験例７における血小板凝集能測定結果。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。
Ａｌａ：Ｌ−アラニン残基
Ａｒｇ：Ｌ−アルギニン残基
Ａｓｎ：Ｌ−アスパラギン残基
Ａｓｐ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Ｃｙｓ：Ｌ−システイン残基
Ｇｌｎ：Ｌ−グルタミン残基
Ｇｌｕ：Ｌ−グルタミン酸残基
Ｇｌｙ：グリシン残基
Ｈｉｓ：Ｌ−ヒスチジン残基
Ｈｙｐ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ｉｌｅ：Ｌ−イソロイシン残基
Ｌｅｕ：Ｌ−ロイシン残基
Ｌｙｓ：Ｌ−リジン残基
Ｍｅｔ：Ｌ−メチオニン残基
Ｐｈｅ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Ｐｒｏ：Ｌ−プロリン残基
Ｓａｒ：サルコシン残基
Ｓｅｒ：Ｌ−セリン残基
Ｔｈｒ：Ｌ−トレオニン残基
Ｔｒｐ：Ｌ−トリプトファン残基
Ｔｙｒ：Ｌ−チロシン残基
Ｖａｌ：Ｌ−バリン残基
また、本明細書においては、常法に従って、アミノ末端またはＮ末端を左側に、カルボキシ末端またはＣ末端を右側に位置させて記述する。【００１５】
本発明の有効成分であるポリペプチド（以下「有効成分ポリペプチド」と言うことがある。）は、式（１）で表されるペプチドフラグメント（成分Ａ）を含有しているポリペプチドであれば特に限定されない。
−（Ｐｒｏ−Ｘ−Ｇｌｙ）ｎ−              （１）
繰り返し数（ｎ）は２０〜５０００の整数であり、血小板凝集惹起活性および構造（３重螺旋）の安定性の面から、２０〜３０００の整数であることが好ましい。【００１６】
式（１）のＸは、ＰｒｏまたはＨｙｐである。したがって、ペプチドフラグメント（成分Ａ）は、式（２）で示されるペプチドユニット（成分Ｂ）のみからなる場合、式（３）で示されるペプチドユニット（成分Ｃ）のみからなる場合、そしてペプチドユニット（成分Ｂ）とペプチドユニット（成分Ｃ）からなる場合がある。
−（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）−              （２）
−（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）−              （３）【００１７】
本発明において、ペプチドフラグメント（成分Ａ）を構成する成分Ｂと成分Ｃとの割合（成分Ｂ／成分Ｃ、モル比）は、特に限定されるものではないが、血小板凝集惹起活性および構造（３重螺旋構造）の安定性の面から、９５／５〜０／１００の範囲であることが好ましく、より好ましくは、５０／５０〜０／１００の範囲であり、さらに好ましくは１０／９０〜０／１００の範囲である。なお、本発明においてＨｙｐは、４Ｈｙｐ（例えば、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）残基である。【００１８】
さらに、有効成分ポリペプチドは、式（４）で示されるペプチドユニットから選ばれた１種以上を含むものであっても良く、式（５）で示されるペプチドユニットから選ばれた１種以上を含むものであっても良く、さらには、式（４）で示されるペプチドユニットおよび式（５）で示されるペプチドユニットから選ばれた１種以上のペプチドユニットからなるペプチドフラグメントを含むものであってもよい。
−（Ｙ１−Ｙ２−Ｇｌｙ）−                        （４）
−（Ｐｒｏ−Ｚ１−Ｇｌｙ−Ｚ２−Ａｌａ−Ｇｌｙ）−  （５）【００１９】
式（４）において、Ｙ１はカルボキシル基を有するアミノ酸残基（例えば、カルボキシル基を有するα−アミノ酸残基など）であってもよく、具体的にはＡｓｐ、Ｇｌｕなどが挙げられ、本発明においては、Ａｓｐまたはγ 位にカルボキシル基を有していてもよいＧｌｕである。Ｙ２はＰｒｏまたはＨｙｐである。【００２０】
式（５）において、Ｚ１はＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＡｌａであり、より好ましくは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｌａであり、更に好ましくはＧｌｎ，Ｌｅｕである。Ｚ２は、ＩｌｅまたはＬｅｕであり、好ましくはＩｌｅである。【００２１】
Ｚ１とＺ２との組合せは特に限定されるものではなく、例えば、Ｚ１がＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＡｌａから選択された一種（例えば、Ｇｌｎ又はＬｅｕ）であり、Ｚ２がＩｌｅである組合せや、Ｚ１がＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＡｌａから選択された一種（例えば、Ｇｌｎ又はＬｅｕ）であり、Ｚ２がＬｅｕである組合せが挙げられる。【００２２】
ペプチドフラグメント（成分Ａ）と、式（４）で示されるペプチドユニット、式（５）で示されるペプチドユニット、およびそれらから選ばれた１種以上のペプチドユニットからなるペプチドフラグメントから選ばれた１種以上（成分Ｄ）の割合（成分Ａ／成分Ｄ、モル比）は特に限定されるものではないが、血小板凝集惹起活性および構造（３重螺旋構造）の安定性の面から、９９／１〜３０／７０の範囲であることが好ましく、より好ましくは９９／１〜５０／５０の範囲であり、さらに好ましくは９９／１〜７０／３０の範囲である。【００２３】
有効成分ポリペプチドは、その物理的および生物学的性質を損なわない範囲であれば、他のアミノ酸残基やペプチド残基を含んでいてもよい。【００２４】
有効成分ポリペプチドは、血小板凝集の惹起を阻害しない限り、無機酸（塩酸、硫酸など）、有機酸（酢酸、乳酸、マレイン酸、シュウ酸、クエン酸など）、金属（ナトリウム、カリウムなど）、有機塩基（トリメチルアミン、トリエチルアミンなど）との塩であってもよい。本発明に使用するポリペプチドの塩化合物は、単独または二種類以上の組合せであってもよい。【００２５】
有効成分ポリペプチドは、円二色性スペクトルにおいて、波長２２０〜２３０ｎｍに正のコットン効果を示し、波長１９５〜２０５ｎｍに負のコットン効果を示すものであることが好ましい。このようなコットン効果を示す有効成分ポリペプチドを用いれば、実用充分な活性を有する血小板凝集惹起物質が得られる。なお、コットン効果とは、旋光性物質において特定の波長で左右の円偏光に対する吸収係数が異なるために起こる現象をいう。【００２６】
有効成分ポリペプチドは３重螺旋構造をとり得る。その３重螺旋構造を形成しているポリペプチド鎖は、直線状または１以上の分岐を有していてもよい。分岐を有する場合、分岐点以降に３重螺旋構造が形成されていてもよく、更に、その３重螺旋構造の後ろに分岐を有していてもよい。【００２７】
有効成分ポリペプチドの分子量は特に限定されるものではないが、血小板凝集惹起活性および構造（３重螺旋構造）の安定性の面から、１０，０００〜５００，０００，０００の範囲であることが好ましい。【００２８】
有効成分ポリペプチドの粒子径は特に限定されるものではないが、血小板凝集惹起活性へ影響の面から、動的光散乱法粒径分布測定装置またはレーザー回折／散乱式粒子径測定装置で測定した径が、０．０１〜１０００μｍの範囲であることが好ましい。【００２９】
有効成分ポリペプチドの粘度は、血小板凝集惹起活性へ影響の面から、１重量％水溶液、２０℃の条件でＥ型粘度計による測定された値で１０〜１０，０００ｍＰａ・ｓの範囲であることが好ましい。【００３０】
有効成分ポリペプチドは、前述のペプチドフラグメント（Ａ成分）のみからなるものであってもよいが、本発明の効果を損なわない範囲において、それ以外に以下のようなアミノ酸残基やアルキルレンを含むものであってもよい。【００３１】
アミノ酸残基としては、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓａｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌから選択された少なくとも１種のアミノ基、またはそれらが数個結合したペプチド残基が挙げられる。【００３２】
アルキレンは、直鎖状、分岐状の何れであってもよく、特に限定されるものではないが、具体的には炭素数１〜１８のアルキレンが挙げられ、実用的には炭素数２〜１２のアルキレンである。【００３３】
本発明の血小板凝集惹起物質は、本発明の効果を損なわない範囲であれば、有効成分ポリペプチド以外の物質を含むものであってもよい。その他の物質は、保存性、取扱い易さ、活性の安定性、などを考慮して選定すればよく、特に限定されるものではないが、例えば、後述のような保存溶媒を挙げることができる。【００３４】
以下、有効成分ポリペプチドの製造方法について詳述する。
有効成分ポリペプチドは、何れの方法により得られたものであってもよい。しかしながら、有効成分ポリペプチドは、ペプチドフラグメントを溶媒中において縮合すれば重合が進み、脱保護とアミノ酸結合とを繰返すことなく得られることから、有効成分ポリペプチドを構成するアミノ酸からなるペプチドフラグメントを用いて溶媒中において縮合反応を行う方法が好ましく用いられる。【００３５】
本発明でいうところのペプチドフラグメントとは、３残基〜９０残基のペプチドフラグメントのことである。有効成分ポリペプチドの製造に使用できるペプチドフラグメントとしては、たとえば下記のペプチドフラグメントを挙げることができる。【００３６】
NO.1：（Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.2：（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.3：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.4：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.5：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.6：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.7：（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.8：（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.9：（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.10：（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.11：（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.12：（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.13：（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.14：（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.15：（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.16：（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.17：（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
NO.18：（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｏ
但し、ｏは１〜１０の整数である。【００３７】
NO.19：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.21：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.22：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.23：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.24：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.25：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.26：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.27：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.28：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.29：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.30：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.31：（Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.32：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.33：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.34：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.35：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.36：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.37：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.38：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.39：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.40：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.41：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.42：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.43：（Ａｓｐ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.44：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.45：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.46：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.47：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.48：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.49：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.50：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.51：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.52：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.53：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.54：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.55：（Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.56：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.57：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.58：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.59：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.60：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.61：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.62：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.63：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.64：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.65：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.66：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
NO.67：（Ｇｌｕ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｐ−（Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ）ｑ
但し、ｐは１〜１０の整数であり、ｑは１〜１０の整数である。【００３８】
このうち、有効成分ポリペプチドの製造には、Ｎｏ．１またはＮｏ．２のペプチドフラグメントは必ず用いられる。Ｎｏ．３からＮｏ．６７のペプチドフラグメントは適宜使用すればよい。さらに、上記以外のペプチドフラグメントも、本発明の効果を損なわない範囲であれば使用することができる。【００３９】
さらに、有効成分ポリペプチドの製造には、Ｎｏ．１またはＮｏ．２のペプチドフラグメントと、Ｎｏ．３からＮｏ．６７のペプチドフラグメント、さらにはそれら以外のペプチドフラグメントとが予め結合したペプチドフラグメントを用いてもよい。【００４０】
上記ペプチドフラグメントにおけるｏ、ｐ、ｑ、および縮合反応に用いられるペプチドフラグメントのそれぞれの割合は特に限定されるものではなく、所望する有効成分ポリペプチドの成分Ｂと成分Ｃとの割合や、成分Ａと成分Ｄとの割合に基づいて決定される。【００４１】
但し、縮合反応の容易さ、ペプチドフラグメントの入手の容易さから、ｏ、ｐ、およびｑは独立して１〜１０の整数であることが好ましく、さらに好ましくは１〜５の整数であり、特に好ましくは１である。【００４２】
上記Ｎｏ．１からＮｏ．６７に示したペプチドフラグメントは、既知の固相合成法または液相合成法を用いて得ることができる。【００４３】
これらのペプチドフラグメントの縮合反応は、通常、溶媒中で行われる。溶媒は、原料となるペプチドフラグメントを溶解（一部または全部を溶解）または懸濁可能なものであればよく、通常、水または有機溶剤が使用できる。具体的には、水、アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ヘキサメチルホスホロアミドなど）、スルホキシド類（ジメチルスルホキシドなど）、窒素含有環状化合物（Ｎ−メチルピロリドン、ピリジンなど）、ニトリル類（アセトニトリルなど）、エーテル類（ジオキサン、テトラヒドロフランなど）、アルコール類（メチルアルコール、エチルアルコール、プロピルアルコールなど）、およびこれらの混合溶媒などである。これらの溶媒のうち、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが好ましく使用される。【００４４】
ペプチドフラグメントの反応は、脱水剤（脱水縮合剤）の存在下で行うことが好ましい。脱水縮合剤と縮合助剤との存在下で反応させると、二量化や環化を抑制しつつ円滑に縮合反応が進む。【００４５】
脱水縮合剤は、前記溶媒中で脱水縮合を効率よく行える限り特に限定されるものではなく、例えば、カルボジイミド系縮合剤［ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ＝ＷＳＣＩ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩(ＷＳＣＩ・ＨＣｌ)、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）など］、フルオロホスフェート系縮合剤［Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩（ＢＯＰ）］など］、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）が例示できる。【００４６】
これらの脱水縮合剤は単独で又は二種以上組み合わせて混合物として使用できる。好ましい脱水縮合剤は、カルボジイミド系縮合剤［例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩］である。【００４７】
縮合助剤は、縮合反応を促進する限り特に制限されず、例えば、Ｎ−ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類［例えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＮＳｕ）、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）などのＮ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類］、Ｎ−ヒドロキシトリアゾール類［例えば、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）などのＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール類］、３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯｂｔ）などのトリアジン類、２−ヒドロキシイミノ−２−シアノ酢酸エチルエステルが例示できる。【００４８】
これらの縮合助剤も単独で又は二種以上組み合わせて使用できる。好ましい縮合助剤は、Ｎ−ヒドロキシジカルボン酸イミド類［ＨＯＮＳｕなど］、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアジン類［ＨＯＢｔなど］である。【００４９】
脱水縮合剤と縮合助剤とは適当に組み合わせて使用することが好ましい。脱水縮合剤と縮合助剤との組合せとしては、例えば、ＤＣＣ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔまたはＨＯＯＢｔ）、ＷＳＣＩ−ＨＯＮＳｕ（ＨＯＢｔ又はＨＯＯＢｔ）が例示できる。【００５０】
脱水縮合剤の使用量は、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、水を含まない非水系溶媒を用いる場合０．７〜５モル、好ましくは０．８〜２．５モル、さらに好ましくは０．９〜２．３モル（例えば１〜２モル）の範囲である。水を含む溶媒（水系溶媒）においては、水による脱水縮合剤の失活があるので、脱水縮合剤の使用量は、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、２〜５００モル、好ましくは５〜２５０モル、さらに好ましくは１０〜１２５モルの範囲である。【００５１】
縮合助剤の使用量は、溶媒の種類に関係なく、ペプチドフラグメントの総量１モルに対して、通常、０．５〜５モル、好ましくは０．７〜２モル、さらに好ましくは０．８〜１．５モルの範囲である。【００５２】
上記縮合反応においては、反応系のｐＨを調節してもよく、反応に関与しない塩基を添加してもよい。ｐＨの調節は、通常、無機塩基（水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど）、有機塩基、無機酸（塩酸など）や有機酸を用いて行うことができ、通常、反応溶液が中性付近（ｐＨ＝６〜８程度）にｐＨ調整される。縮合反応に関与しない塩基としては、第三級アミン類、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミンなどのトリアルキルアミン類、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジンなどの複素環式第三級アミン類などが例示できる。このような塩基の使用量は、通常、ペプチドフラグメントの総モル数の１〜２倍程度の範囲から選択できる。【００５３】
以上のようにして得られたポリペプチドには、反応に用いた試薬が残存している。これは有効成分ポリペプチドの血小板凝集惹起活性や血小板自体の機能に影響するため、透析法、カラム法、限外ろ過法等の既知の手法を用いて残存している試薬を除去することが好ましい。また、ポリペプチドの安定性および取扱いの容易さから考えると、反応溶媒を保存溶媒に置換することが好ましい。反応溶媒から目的とする保存溶媒への置換は、透析法においては、目的とする保存溶媒を透析外液として使用することにより、カラム法においては、目的とする保存溶媒を移動相として用いることにより置換することができる。【００５４】
保存溶媒としては、得られた有効成分ポリペプチドの物理的性質および生物的性質の変化を抑えられるものであれば特に限定されない。例えば、水、生理食塩水、弱酸から弱アルカリに緩衝能を有するバッファーを挙げることができる。但し、血小板自体の機能や血液凝固因子に影響を与える物質を含有しないことが好ましい。例えば、血小板自体の機能に影響を与える物質としては、血漿中のカルシウムイオンをキレートするエチレンジアミン４酢酸、クエン酸ナトリウム等のキレート剤、血小板の機能を低下させる抗血小板薬、さらには血小板の活性化物質が挙げられる。また、血液凝固因子に影響を与える物質としては、抗凝固処理してある血液や多血小板血漿の凝固を促進させるカルシウムイオンを含有する物質などが挙げられる。【００５５】
有効成分ポリペプチドは血小板凝集惹起活性を有する。したがって、それを含有する本発明の血小板凝集惹起物質は、血小板凝集能の評価に用いることができる。血小板の凝集能の測定方法は、惹起物質を用いる方法であれば特に限定されない。例えば、血小板の凝集の程度を吸光度（透過率）で判定する吸光度法（透過光法）、白金電極間の電気抵抗の変化として捉えるインピーダンス法、粒子計測器を用いて血小板凝集に関与しない単一血小板の数から血小板凝集の程度を推定する粒子算定法、散乱光を用いる散乱光法、またフィルターを用いるマイクロメッシュフィルター法などにもちいることができる。【００５６】
現在、臨床においては透過光法が汎用されている。透過光法は、遠心分離により多血小板血漿(以下「ＰＲＰ」ということがある)を得た後、さらに遠心分離により乏血小板血漿(以下「ＰＰＰ」ということがある)を得る。ＰＲＰ中の血小板数を２０〜４０万／μＬに調整し、一定量のＰＲＰ（２００〜５００μＬ）とＰＰＰを円柱状のキュベットに入れ３７℃に加温し、マグネチックスターラーで攪拌しながら惹起物質を加え、その後、凝集に伴い増加するＰＲＰの透過性を、ＰＰＰを対照として分光光度計で測定するのが原理である。血小板凝集の評価としては、透過光変化率の最大値、また血小板凝集曲線の最大変化率などがもちいられるが、低濃度から高濃度にいたる２〜３種類の濃度を用いる方法などがある。通常、２種の濃度を用いる検査が多用されており、市販されているコラーゲンでは、低濃度は０．２〜１μｇ／ｍｌ(終濃度)であり、高濃度は２〜４μｇ／ｍｌ（終濃度）である。【００５７】
本発明の血小板凝集惹起物質を透過光法で用いる場合、濃度の調整を除いては、上記の従来操作をそのまま用いることが可能である。本発明の血小板凝集惹起物質の濃度を調整する場合、希釈液は、水、生理食塩水、また保存液と同組成のバッファーから任意に選択することができるが、好ましくは水または生理食塩水である。水で希釈した溶液は、０．０５μｇ／ｍｌの終濃度において、市販されているコラーゲン（ＭＣメディカル社製）２μｇ／ｍｌと同等の血小板凝集の惹起能を有している。【００５８】
本発明の血小板凝集惹起物質は、市販のコラーゲンと比べ充分に高い血小板凝集惹起活性を有しており、架橋する必要性がない。また、本発明に使用する有効成分ポリペプチドは未架橋であるため、残存する架橋剤が血小板自体の機能に与える影響が無いことより、正確に血小板凝集能の評価が可能である。更に、架橋の必要性がないことより、工程を大幅に削減することも可能である。【００５９】
本発明の血小板凝集惹起物質は、血小板への粘着能を有することより、血小板の粘着能の評価および流動下で血小板のコラーゲンへの粘着の確認試験等に用いることも可能である。血小板の凝集能を測定する方法は、ＢＡＵＭＧＡＲＴＮＥＲ法、陰性電荷を有するガラスビーズ菅法などが知られているが、血管内皮下組織を用いない方法であれば限定されず、例えば、コラーゲンをガラスビーズ等にコートしたコラーゲンコート・ビーズ法などが挙げられる。また、流動下で血小板のコラーゲンへの粘着を確認する方法は、ガラス等のチャーンバー内にコラーゲンをコートしたフローチャンバー法、また毛細管等の内面にコートしての使用などが挙げられる。コラーゲンのビーズ等への固定化方法は、共有結合により固定化する方法、および共有結合を介さないで固定化させる方法から任意に選択できる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００６１】
実験例１：ポリペプチドの合成
液相法で合成したPro-Hyp-Glyで示されるペプチドフラグメント１ｇを２０ｍＬの１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、４℃まで冷却した。これに４℃の４７３ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３．３５ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を加え、４℃で２時間、その後２０℃まで加温し４６時間撹拌した。反応終了後、反応液に超純水を加えて２倍に希釈し、この溶液を透析用セルロースチューブ（ビスケース社製  ＵＣ２７−３２−１００）に入れ、純水２Ｌに対して４８時間透析した。その際純水は６時間以上の間隔を空け４回交換した。
透析後、溶液を水で５０倍（容積比）に希釈し、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィー：アジレント社製１１００シリーズ、カラム：ショウデックス製 OHpak SB-806m HQ、流速：１．０mL/min、移動相：２０mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ３．０）／メタノール＝８／２（容積比））に供したところ、分子量が１０，０００〜５００，０００，０００の範囲にポリペプチドのピークが認められた。【００６２】
一方、透析後、溶液を水で６０倍（容積比）に希釈し、円二色性スペクトル（日本分光製  円二色性分散計  Ｊ−８２０、光路長1mm）を測定したところ、２２５ｎｍに正のコットン効果、１９８ｎｍに負のコットン効果が確認された。【００６３】
実験例２
被験者Ａより３．８重量％クエン酸ナトリウム０．５ｍｌを含んでいる真空採血管を用いて４．５ｍｌ採血し、よく混和して抗凝固処理を行った。次いで、この抗凝固処理された血液を１００ｇで１５分間遠心分離を行った後、上澄みを回収してＰＲＰを得た。更に、２０００ｇで１５分間遠心分離を行い、上澄みを回収してＰＰＰを得た。凝集能の評価は、血小板凝集測定装置Ｅａｓｙ  ＴＲＡＣＥＲ  ＥＴ−８００(東京光電株式会社)を用い、凝集惹起物質添加前のＰＲＰの透過率を０％、ＰＰＰの透過率を１００％とし、実験例１で調製したポリペプチド溶液を添加してからの透過率の経時変化を記録することにより行った。ポリペプチド溶液を、ポリペプチドの終濃度がそれぞれ２μｇ／ｍｌになるように添加し、透過率の経時変化を記録した。また、コントロールとして市販されているコラーゲン（ＭＣメディカル社）の凝集惹起物質を、コラーゲンの終濃度が２μｇ／ｍｌになるように添加し、透過率の経時変化を記録した。結果を図１に示す。【００６４】
実験例３
被験者Ｂから４．５ｍｌ採血し、この血液を用いたことと以外は実験例２に記載の方法に準じて血小板の凝集能の評価を実施した。結果を図２に示す。【００６５】
実験例４
被験者Ｃから４．５ｍｌ採血し、この血液を用いたことと、ポリペプチドの終濃度を２．０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、比較のコラーゲンの終濃度を２．０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌとした以外は実験例２に記載の方法に準じて血小板の凝集能の評価を実施した。結果を図３、４に示す。【００６６】
実験例５
被験者Ｄから４．５ｍｌ採血し、この血液を用いたことと、ポリペプチドの終濃度を２．０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．０２μｇ／ｍｌ、比較のコラーゲンの終濃度を２．０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌとした以外は実験例２に記載の方法に準じて血小板の凝集能の評価を実施した。結果を図５、６に示す。【００６７】
実験例６
被験者Ａから１３．５ｍｌ採血し、この血液を用いたことと、ポリペプチドの終濃度を０．０５μｇ／ｍｌ、０．０２５μｇ／ｍｌ、０．０１５μｇ／ｍｌ、比較のコラーゲンの終濃度を２．０μｇ／ｍｌ、０．２５μｇ／ｍｌとした以外は実験例２に記載の方法に準じて血小板の凝集能の評価を実施した。結果を図７、図８に示す。【００６８】
実験例７：アスピリン存在下、非存在下における血小板凝集測定
１）ポリペプチドの合成
液相法で合成したPro-Hyp-Glyで示されるペプチドフラグメント１ｇを２０ｍＬの１０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、４℃まで冷却した。これに４℃の４７３ｍｇの１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３．３５ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を加え、４℃で２時間、その後２０℃まで加温し４６時間撹拌した。反応終了後、反応液を透析用セルロースチューブ（ビスケース社製  ＵＣ２７−３２−１００）に入れ、純水２Ｌに対して４８時間透析した。その際純水は６時間以上の間隔を空け４回交換した。
透析後、溶液を生理食塩水で100倍（容積比）希釈した。この100倍希釈溶液をフィルター濾過（0.2μm  アドバンテック東洋  酢酸セルロース膜  ２５ＣＳ０２０ＡＳ）したのち、更に生理食塩水で50倍（容積比）希釈した。50倍希釈後のこの溶液中のポリペプチドの濃度を、吸光度法（波長：215nm）により求めたところ、0.29 μg/mlであった。【００６９】
２）血小板凝集測定
血小板凝集の測定には、アスピリン処理したＰＲＰ（アスピリン処理ＰＲＰ）とアスピリン処理がされていないＰＲＰ（非アスピリン処理ＰＲＰ）を用いた。ＰＲＰは実験例２で得られたＰＲＰを用い、これにアスピリン（アセチルサリチル酸、和光純薬工業製、特級試薬）を生理食塩水を用いて希釈した10ｍＭアスピリン溶液を１／１０量（容積比）加え、３７℃で３０分間加温しアスピリン処理ＰＲＰとした。また、実験例２で得られたＰＲＰに生理食塩水を１／１０量（容積比）加え、３７℃で３０分間加温し非アスピリン処理ＰＲＰとした。【００７０】
凝集能の評価は、血小板凝集測定装置Ｅａｓｙ  ＴＲＡＣＥＲ  ＥＴ−８００(東京光電株式会社)を用い、凝集惹起物質添加前のＰＲＰの透過率を０％、ＰＰＰの透過率を１００％とし、本実験例で調製したポリペプチド溶液を添加してからの透過率の経時変化を記録することにより行った。
ポリペプチド溶液(ポリペプチド濃度：０．２９μｇ／ｍｌ)２２μｌを、２００μｌのアスピリン処理ＰＲＰと２００μｌの非アスピリン処理ＰＲＰのそれぞれに添加し、透過率の経時変化を記録した。次いで、コントロールとして、天然コラーゲンであるモリヤ産業製コラーゲンリエージェント“ホルム”（1mg/ml）を付属の希釈液で１０倍（容積比）希釈した後、さらに生理食塩水で5倍（容積比）希釈した溶液（コラーゲン濃度２０μｇ／ｍｌ）を、２００μｌのアスピリン処理ＰＲＰと２００μｌの非アスピリン処理ＰＲＰのそれぞれに添加し、透過率の経時変化を記録した。結果を図９に示す。【００７１】
天然コラーゲンを凝集惹起物質として用いた場合、非アスピリン処理ＰＲＰでは血小板の凝集が見られるものの、アスピリン処理ＰＲＰでは血小板の凝集は認められなかった。それに対し本実験例のポリペプチドを用いた場合には、その濃度が天然コラーゲンの１／７０ほどであっても、アスピリン処理ＰＲＰ、非アスピリン処理ＰＲＰともに血小板の凝集が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明のトロンビン変異体は血管壁に存在するへパリン様物質（へパラン硫酸）、トロンボモジュリン及び／またはインテグリンへの親和性が顕著に低下し、且つ高い抗血栓能を有しているため、血栓症などの治療に副作用なく効果的に用いることができる。
【図１】
2008075589.tif 000002
【図２】
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【図３】
2008075589.tif 000004
【図４】
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【図５】
2008075589.tif 000006
【図６】
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【図７】
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【図８】
2008075589.tif 000009
【図９】
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【配列表】
2008075589000001.app
【国際調査報告】
2008075589.tif 000011
2008075589.tif 000012
2008075589.tif 000013
2008075589.tif 000014
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