(57)【要約】本発明の目的は、Ｔ細胞サブセットが産出するサイトカインの所定の比を用いて妊娠体質や妊娠状態を有効に検査することである。上記目的は、哺乳動物のＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３のＣＤ４ＳＰ（シングル・ポジティブ）細胞内ゴルジ装置又は粗面小胞体内におけるＴｈサイトカイン産生量を測定する第１の工程と、ＢＬ比とＰＬ比を求め、これにより不妊娠体質（ＢＬ比）と妊娠状態（ＰＬ比）を判定する第２の工程と、を含む、哺乳動物の不妊娠体質及び／又は妊娠状態の検査方法によって達成される。  ＢＬ比：Ｔｈ１／Ｔｈ２ＰＬ比：（Ｔｈ２／Ｔｈ３）／Ｔｈ１【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３のＣＤ４ＳＰ（シングル・ポジティブ）細胞内ゴルジ装置又は粗面小胞体内におけるＴｈサイトカイン産生量を測定する第１の工程と、
ＢＬ比とＰＬ比を求め、これにより不妊娠体質（ＢＬ比）と妊娠状態（ＰＬ比）を判定する第２の工程と、
を含む、哺乳動物の不妊娠体質及び／又は妊娠状態の検査方法。
ＢＬ比：Ｔｈ１／Ｔｈ２
ＰＬ比：（Ｔｈ２／Ｔｈ３）／Ｔｈ１
【請求項２】
前記Ｔｈ１サイトカインがインターフェロン−γであり、前記Ｔｈ２サイトカインがインターロイキン−４であり、前記Ｔｈ３サイトカインがＴＧＦ−β１である、請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
前記各Ｔｈ生体反応は、ＣＤ４ＳＰ（シングル・ポジティブ）細胞（Ｔｈ）とＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３の各サイトカインとの反応量（ダブルプロファイリング）である、請求項１記載の検査方法。
【請求項４】
前記サイトカイン産生量は、細胞刺激時におけるＣＤ４ＳＰ細胞と内在型Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３の各サイトカインとの反応量である、請求項１記載の検査方法。
【請求項５】
前記ＰＬ比が０．１６以上である場合に妊娠体質が正常である、と判定する請求項１記載の検査方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の判定結果に基き、哺乳動物に海産タンパク質を投与して、ＰＬ比を調整する、哺乳動物の妊娠又は出産の調整方法。
【請求項７】
哺乳動物にインターフェロン−γを経口投与し、内在型インターフェロンのバランスを優位にする、哺乳動物の避妊方法。
【請求項８】
前記経口投与量が０．１〜４．０ＭＵ／頭である、請求項７記載の哺乳動物の避妊方法。
【請求項９】
哺乳動物にインターフェロン−γを経口投与する、哺乳動物の免疫介在性疾患の予防・治療方法。
【請求項１０】
前記海産タンパク質を前記哺乳動物に投与して、妊娠不能判定とされた前記ＰＬ比を正常値に上げて妊娠体質を正常化させる、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記海産タンパク質が鮭由来のタンパク質である、請求項６又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記海産タンパク質が鮭の白子である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物に投与されることによって、請求項１記載のＰＬ比を調整して当該哺乳動物を妊娠体質に向上させる海産タンパク質を含んだ製剤又は食品。
【請求項１４】
前記海産タンパク質が鮭由来のタンパク質である、請求項１３記載の製剤又は食品。
【請求項１５】
前記海産タンパク質が鮭の白子である、請求項１４記載の製剤又は食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の不妊娠体質又は妊娠状態の検査方法、妊娠又は出産の調整方法、避妊方法、並びに免疫介在性疾患の予防・治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
適応免疫に関与するヘルパーＴ（Ｔｈ）リンパ球は、生産するサイトカインの相違によりＴｈ１、Ｔｈ２をはじめとするいくつかのサブセットに分類される。インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−２などを作るものをＴｈ１細胞と、主としてＩＬ−４を作るものをＴｈ２細胞と呼んでいる。Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γは、Ｔｈ２反応を、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−４はＴｈ１反応を相互に抑制する事が知られている。【０００３】
近年Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞の応答性に対して抑制的に機能するＴｈ細胞とＴ細胞（Ｔｒ）の存在が証明され、特に潜在型ＴＧＦ−β1を高濃度に生産する細胞をＴｈ３細胞と呼んでいる。腫瘍やアレルギーをはじめとする様々な疾患において、このようなＴｈ生体反応の強弱やバランスの破綻と疾患の関連性が示唆されている。【０００４】
ホルモンや排卵が正常である獣医学的には正常な家畜やペットにおいて、不妊は相当の頻度で見受けられ、畜産業やペット産業においては大きな問題である。しかし、その原因を調べることは行われておらず、ホルモン剤の投与等が行われているに過ぎず、その効果は十分でない場合が多いのが現状である。また、ホルモン支配以外の原因も指摘されているが、その本態は不明である。【０００５】
一方で、家畜やペットの避妊を有効に行うことが望まれる場合も多い。【０００６】
関連する従来例として、Ｔｈ２及びＴｈ３のバランスがヒトの不妊に関連するとの報告がある（非特許文献１）。
また、Ｔｈ１タイプ生体反応やＴｈ２タイプ生体反応がヒトの妊娠に関連すること、Ｔｈ２／Ｔｈ３シフトが妊娠に関連するとの報告がある（非特許文献２）。【０００７】
【非特許文献１】Costeas PA他、Hum Immunol. 2004 Feb; 65(2):135-41
【非特許文献２】Raphupthy R、Semin Immunol. 2001 Aug; 13(4):219-27
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これまでに、哺乳動物において不妊娠体質又は妊娠状態を有効に検査する方法やその調整方法、また有効な避妊方法は、確立されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、哺乳動物のＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３のＣＤ４ＳＰ（シングル・ポジティブ）細胞内ゴルジ装置又は粗面小胞体に対するサイトカイン反応量を測定し、Pregnancy Loss ratio（ＰＬ比；（Ｔｈ２／Ｔｈ３）／Ｔｈ１）を求めることによって、妊娠のしやすさ（妊娠体質）や妊娠状態を検査することができること、また、ＰＬ比を上昇させる処置を行うことにより哺乳動物の妊娠又は出産を促進できることを見出した。
また、Birth Living ratio（ＢＬ比；Ｔｈ１／Ｔｈ２）を下げる処置を行うことにより、哺乳動物の避妊（バースコントロール）を促進できることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は、（１）哺乳動物のＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３のＣＤ４ＳＰ（シングル・ポジティブ）細胞内ゴルジ装置又は粗面小胞体内におけるＴｈサイトカイン産生量を測定する第１の工程と、ＢＬ比とＰＬ比を求め、これにより不妊娠体質（ＢＬ比）と妊娠状態（ＰＬ比）を判定する第２の工程と、を含む、哺乳動物の不妊娠体質及び／又は妊娠状態の検査方法
ＢＬ比：Ｔｈ１／Ｔｈ２
ＰＬ比：（Ｔｈ２／Ｔｈ３）／Ｔｈ１；
（２）前記Ｔｈ１サイトカインがインターフェロン−γであり、前記Ｔｈ２サイトカインがインターロイキン−４であり、前記Ｔｈ３サイトカインがＴＧＦ−β１である、前記（１）記載の検査方法；
（３）前記各Ｔｈ生体反応は、ＣＤ４ＳＰ（シングル・ポジティブ）細胞（Ｔｈ）とＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３の各サイトカインとの反応量（ダブルプロファイリング）である、前記（１）記載の検査方法；
（４）前記サイトカイン産生量は、細胞刺激時におけるＣＤ４ＳＰ細胞と内在型Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３の各サイトカインとの反応量である、前記（１）記載の検査方法；
（５）前記ＰＬ比が０．１６以上である場合に妊娠体質が正常である、と判定する前記（１）記載の検査方法；
（６）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の判定結果に基き、哺乳動物に海産タンパク質を投与して、ＰＬ比を調整する、哺乳動物の妊娠又は出産の調整方法；
（７）哺乳動物にインターフェロン−γを経口投与し、内在型インターフェロンのバランスを優位にする、哺乳動物の避妊方法；
（８）前記投与量が０．１〜４．０ＭＵ／頭である、前記（７）記載の避妊方法；
（９）哺乳動物にインターフェロン−γを経口投与する、哺乳動物の免疫介在性疾患の予防・治療方法；
（１０）前記海産タンパク質を前記哺乳動物に投与して、妊娠不能判定とされた前記ＰＬ比を正常値に上げて妊娠体質を正常化させる、前記（６）記載の方法；
（１１）前記海産タンパク質が鮭由来のタンパク質である、前記（６）又は（１０）記載の方法；
（１２）前記海産タンパク質が鮭の白子である、前記（１１）記載の方法；
（１３）哺乳動物に投与されることによって、前記（１）記載のＰＬ比を調整して当該哺乳動物を妊娠体質に向上させる海産タンパク質を含んだ製剤又は食品；
（１４）前記海産タンパク質が鮭由来のタンパク質である、前記（１３）記載の製剤又は食品；
（１５）前記海産タンパク質が鮭の白子である、前記（１４）記載の製剤又は食品；を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、哺乳動物の不妊娠体質や妊娠状態を有効に検査し、また、妊娠又は出産を有効に調整することができる。また、本発明によれば、哺乳動物を有効に避妊することができる。さらに、本発明によれば、哺乳動物の免疫介在性疾患、特にアレルギー／アトピー性皮膚炎の予防・方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】雄ビーグル成犬に対するインターフェロン−γ経口投与時におけるＰＬ比を示すグラフである。
【図２】ビーグル成犬に対するインターフェロン−γ経口投与時におけるＢＬ比を示すグラフである。
【図３】（Ａ）は非妊娠群のＢＬ比を示すグラフであり、（Ｂ）は正常群人工授精成犬時のＢＬ比を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
次に、本発明の実施の形態について説明する。以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。【００１４】
本発明の哺乳動物の不妊娠体質及び／又は妊娠状態の検査方法は、哺乳動物のＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３のＣＤ４ＳＰ（シングル・ポジティブ）細胞内ゴルジ装置又は粗面小胞体内におけるＴｈサイトカイン産生量を測定する第１の工程と、ＢＬ比とＰＬ比を求め、これにより不妊娠体質（ＢＬ比）と妊娠状態（ＰＬ比）を判定する第２の工程と、を含む。
ＢＬ比：Ｔｈ１／Ｔｈ２
ＰＬ比：（Ｔｈ２／Ｔｈ３）／Ｔｈ１【００１５】
Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３のＴｈサイトカイン産生量を測定する第１の工程は、末梢血を用いてＣＤ４ＳＰ細胞とＴｈサイトカイン濃度を測定し、末梢血中から分離された前記各Ｔｈサイトカイン存在率と細胞内の前記各Ｔｈサイトカイン存在率とのパラダイムパターンを求める工程である。
Ｔｈ生体反応とは、ＣＤ４という印のついたリンパ球（ヘルパーＴ細胞）と各Ｔｈサイトカインの作用と機能を併せ持った集合体のことであり、各Ｔｈ反応を有する細胞数を散布図のなかからカウントして、Ｔｈ細胞（ＣＤ４ＳＰ）とＴｈサイトカイン存在率を測定する。【００１６】
本発明における哺乳動物は、ヒト、ヒト以外の犬、ネコなどの家畜などをいう。【００１７】
前記Ｔｈ１サイトカインはＩＦＮ−γであり、Ｔｈ２サイトカインはＩＬ−４であり、Ｔｈ３サイトカインはＴＧＦ−β１であることが好ましい。
ＴＧＦ-β１は活性型（酸化）と潜在型（latent form）があり、酸やプラスミンなどにより活性型（activated form）に変換される。【００１８】
前記各Ｔｈ生体反応は、ＣＤ４ＳＰ（シングル・ポジティブ）細胞（Ｔｈ）とＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３の各サイトカインとの反応量（ダブルプロファイリング）であってもよい。
あるいは、前記サイトカイン産生量は、細胞刺激時におけるＣＤ４ＳＰ細胞と内在型Ｔｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ３の各サイトカインとの反応量であってもよい。【００１９】
前記妊娠体質及び／又は妊娠状態を判定する第２の工程は、例えば、ＰＬ比が０．１６以上である場合に妊娠体質が正常である、又は妊娠不能時の２倍のＰＬ比を示す場合である、と判定するものである。【００２０】
本発明の哺乳動物の妊娠又は出産の調整方法は、上記判定結果に基き、哺乳動物に海産タンパク質を投与して、ＰＬ比を調整するものである。
このように、白子、フグの精巣等の海産タンパク質を哺乳動物に投与することにより、ＰＬ比を上昇させ、発情出血を誘導し人工授精させる等、妊娠又は出産を促進することができる。【００２１】
本発明の哺乳動物の避妊方法は、哺乳動物にインターフェロン−γを経口投与し、内在型インターフェロンのバランスを優位にするものである。経口投与量は０．１〜４．０ＭＵ（メガユニット）／頭であることが好ましく、より好ましくは０．５〜２．５ＭＵ／頭であり、一層好ましくは１ＭＵ／頭である。
哺乳動物にインターフェロン−γを経口投与し、内在型インターフェロンのバランスを優位にすることにより、ＢＬ比を下げ、哺乳動物の避妊を促進することができる。【００２２】
本発明の哺乳動物の免疫介在性疾患の予防・治療方法は、哺乳動物にインターフェロン−γを経口投与するものである。
哺乳動物にインターフェロン−γを経口投与することにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２比（イヌの衛生仮設の調節）を上げ、哺乳動物のアレルギー性疾患やアトピー性疾患等の免疫介在性疾患を予防・治療することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は、以下に示す実施例のみならず様々な変更を加えて実施することが可能であり、かかる変更も本特許請求の範囲に包含される。【００２４】
（実施例１）
２才令未満の正常犬７頭、２〜８才令の正常犬７頭、８才令以上の正常犬４頭について、Ｔｈ１，２，３の各生体反応を測定し平均値を求めた（表現型）。
下記表１に示すように、ＰＬ比を求めたところ０．１６以上であり、正常であると判定した。【００２５】
次に、白子粉末を100mg/Kg（経口投与）SID、インターフェロン−γを１ＭＵ（メガユニット）/頭（経口投与）週２回、及び有機ゲルマニュームを30mg /Kg （経口投与）SID毎日、それぞれ経口投与した後、Ｔｈ１、２、３の各生体反応を測定し平均値を求めた（内在型）。また、ＰＬ比を求めた。その結果を表１に示す。【００２６】
なお、表１において、例えば、１頭はニューファンドランド（７才令、メス、ニューファンドランド）であり、そのＰＬ比は０．０８であり、１頭は山本メイ（６才令、メス、ロットワイマラナー）であり、そのＰＬ比は０．０５であった。【００２７】
【表１】
2008059798.tif 000002
【００２８】
表１に示すように、年令によりＰＬ比の変化が異なることが判明した。白子を経口投与することにより、年令によるが妊娠可能な２〜８才令のＰＬ比が上昇し、妊娠の成立が可能となることが判った。
本実施例の各犬には性ホルモン等の異常はなく、ＰＬ比を用いることにより不妊状態の数値による診断が可能であった。【００２９】
（実施例２）
雌ビーグル成犬（Ａ）、雄ビーグル成犬（Ｂ）、雄ビーグル成犬（Ｃ）、についてインターフェロン−γを投与前、経口投与開始から１週間後、投与開始から２週間後（ここで投与終了）、投与終了から２週間後におけるＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３を測定した。
各犬に１ＭＵ（メガユニット）／頭を毎日１回を週２回の隔日に経口投与した。
そして、ＰＬ比及びＢＬ比を求め、その結果を表２、図１及び図２に示す。【００３０】
【表２】
2008059798.tif 000003
【００３１】
図１に示すように、インターフェロン−γの経口投与により持続的にＰＬ比が低下し、着床不全の誘導が可能となることが判った。
図２に示すように、インターフェロン−γの経口投与により持続的にＢＬ比が上昇し、避妊の増強が可能となることが判った。【００３２】
（比較例）
雌ビーグル成犬（Ａ）、雄ビーグル成犬（Ｂ）、雄ビーグル成犬（Ｃ）、についてインターフェロン−γ及びＧｅ−１３２を投与前、及び経口投与開始から３週間後におけるＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３を測定した。そして、下記表３に示すようにＢＬ比及びＰＬ比を求めた。【００３３】
【表３】
2008059798.tif 000004
【００３４】
表３に示すように、インターフェロン−γ及びＧｅ−１３２の経口投与により持続的にＰＬ比が上昇し、着床不全の誘導の効果は得られなかった。【００３５】
（実施例３）
健常な成犬（雌：２〜６才令）の繁殖期をホルモン値により発情前期、発情中期、発情休止期および発情休止期の４期に分けた。この際、発情前期は発情出血により確認し、発情中期はLHサージ後5日目、発情休止期（前半）は同１５日目、発情休止期（後半）は同４０日目とした。
それぞれの末梢血を採取し、各期における内在型Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３生体反応の測定を行った。また、一部の個体ではLHサージ後に人工授精を行った。Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３の測定は、採取した末梢血からFicoll比重遠心法により分離した単核球を用い、これにPMAおよびionomycinを添加してリンパ球を刺激した。この細胞を４時間培養し、培養終了時間前にBrefeldin Aを加えてサイトカインの細胞外への遊走を阻害、これらを抗CD4抗体によりTh細胞を選別した後、抗サイトカイン蛍光標識抗体（Th1:抗IFN-γ抗体、Th2:抗IL-4抗体）によりそれぞれのThサイトカインを染色した。ついで、フローサイトメトリー法によりＴｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ３生体反応（存在率％）を測定した。
そして、Ｔｈ１／Ｔｈ２細胞の存在率（％）を求めた。また、常法により血中プロジェステロン値を測定した。
その結果を図３に示す。【００３６】
その結果、人工授精後に妊娠が成立した個体を含むグループと、明らかに不受胎に終わったグループとの間で、性周期中のＴｈ１／Ｔｈ２比は異なる変動を観察した。
すなわち、図３（Ａ）に示すように、妊娠鑑定（−）の不妊個体群においては、ＢＬ比の顕著な上昇を示した。なお、血中プロジェステロン値は割合は正常範囲内であった。
一方、図３（Ｂ）に示すように、正常個体群においては、発情休止期においてＢＬ比は下降する傾向を示した。【００３７】
以上のことより、イヌの妊娠時（着床、妊娠維持時、偽妊娠を含む）には、Ｔｈ２生体反応が優位になることによりＴｈ１生体反応を抑制しており、これが精子、胚および胎児に対する拒絶を避ける一助となっていることが推察され、Ｔｈパラダイムパターンが妊娠の成否に関与する可能性が明らかにされた。また、このバランスの崩れた個体では、妊娠の不成立、あるいは流産を起こす。【００３８】
この結果は、ＣＤ４ＳＰ＋rγ型ＩＦＮ（インターフェロン）におけるＩＦＮのゴルジ装置並びに小胞体の増加による作用が主として働き、イヌの不妊と受胎のバースコントロールが可能となる。この事実は、ホルモン支配と関係なくバースコントロールできる点で、極めて優れた手法である。
これにより、正常個体群にインターフェロン−γを経口投与することにより、イヌの避妊をすることができる。【００３９】
（実施例４）
アトピー成犬について、Ｔｈ１、２、３の各生体反応を測定し平均値を求めた。
次に、インターフェロン−γを１ＭＵ（メガユニット）／頭（経口投与）週２回、及び有機ゲルマニュームを30mg /Kg（経口投与）SID毎日、それぞれ経口投与した後、Ｔｈ１，２，３の各生体反応を測定し平均値を求めた。また、Ｔｈ１／Ｔｈ２比を求めた。
これらの結果を表４に示す。【００４０】
【表４】
2008059798.tif 000005
【００４１】
表４に示すように、アトピー成犬については、インターフェロン−γを経口投与することにより、内在型Ｔｈ２生体反応が低下（内在性のＣＤ４／８比を2.97から2.17へ抑制)し、正常犬に近づくことが判った。
アトピーやアレルギー等の免疫介在性はＴｈ３生体反応がトリガーとなって発生し、Ｔｈ２生体反応が優位になることを特徴としている。インターフェロン−γを経口投与（１ＭＵ／頭）したところ、アトピー又はアレルギーの本病態であるＴｈ２生体反応の抑制とトリガーであるＴｈ３生体反応の抑制をも誘導した。
一方、４ＭＵ/頭で経口投与したところ、副作用の発現がみられた。
また、インターフェロン−γを注射法にて投与した場合には、ＣＤ４／８比に対する効果が弱かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2008059798.tif 000013
2008059798.tif 000014
2008059798.tif 000015
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