(57)【要約】本発明によれば、抗体を発現又は結合する免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤が内包された脂質小胞体であって当該小胞体の外表面に前記抗体に対する抗原が結合された脂質小胞体を含む、免疫調節剤及び免疫疾患治療剤が提供される。これにより、アレルギー性疾患及び自己免疫疾患などの免疫疾患を有効に治療するための手段が提供される。
2008026781.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体を発現又は結合する免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤が内包された脂質小胞体であって当該小胞体の外表面に前記抗体に対する抗原が結合された脂質小胞体を含む、免疫調節剤。
【請求項２】
免疫調節が免疫抑制である請求項１記載の調節剤。
【請求項３】
抗体を発現又は結合する免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤が内包された脂質小胞体であって当該小胞体の外表面に前記抗体に対する抗原が結合された脂質小胞体を含む、免疫疾患治療剤。
【請求項４】
免疫疾患がアレルギー性疾患又は自己免疫疾患である、請求項３記載の治療剤。
【請求項５】
抗体を発現又は結合する免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤が内包された脂質小胞体であって当該小胞体の外表面に前記抗体に対する抗原が結合された脂質小胞体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫の調節及び免疫疾患の治療に用い得る脂質小胞体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、血中に投与した薬剤を目的の部位に到達させる薬物送達システム（ＤＤＳ）としては、例えば、腫瘍における血管透過性亢進を利用して腫瘍部位に受動的に薬剤キャリアを集積させるタイプ（パッシブターゲティング）のＤＤＳ製剤が知られていた（１）（２）。このタイプのＤＤＳ製剤は薬剤の細胞内導入効率が低かったため、次世代ＤＤＳとして、腫瘍部位を始めとする標的組織に対し能動的に薬剤キャリアを集積させるタイプ（アクティブターゲティング）のＤＤＳ製剤が開発され、薬剤導入効率の点でも有効であることが報告されている（３）。
一方、抗体医療については、標的物質となる抗原に対し抗体分子が高い親和性を有することを利用して、すでに様々な形で実用化されており、ＤＤＳのターゲティングプローブとしての利用も注目されている。
ところで、アレルギー性疾患や自己免疫疾患などのいわゆる免疫疾患については、その治療法として、ステロイド性又は非ステロイド性の抗炎症剤、肥満細胞から放出されるヒスタミンを始めとしたケミカルメディエーター受容体の阻害剤、及び肥満細胞からのヒスタミン等の遊離抑制剤などの投与により症状を軽減する方法や、免疫抑制剤を用いて免疫システムを抑制し自己免疫反応を抑制する方法などが知られている。
しかしながら、従来の方法では、アレルギー症状を十分に低減することが困難であり、また免疫システムの抑制により様々な感染症を患うおそれもあり、免疫疾患の根本的な治療手段や治療法の開発が望まれていた。
（１）Ｏｋｕ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，２６６２−２６６９，２００２
（２）Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ，９，６３−７６，２００５
（３）Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１６６９，６９−７４，２００５
【発明の開示】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、免疫レベルを容易かつ効果的に調節するための手段、及びアレルギー性疾患及び自己免疫疾患などの免疫疾患を有効に治療するための手段を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、免疫疾患の原因となる抗体を発現又は結合する免疫細胞を標的とするため、その抗体に対する抗原を結合させたリポソームにより、上記免疫細胞を傷害し得ることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）抗体を発現又は結合する免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤が内包された脂質小胞体であって当該小胞体の外表面に前記抗体に対する抗原が結合された脂質小胞体を含む、免疫調節剤。
本発明の調節剤において、免疫調節は、例えば免疫抑制を例示することができる。
（２）抗体を発現又は結合する免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤が内包された脂質小胞体であって当該小胞体の外表面に前記抗体に対する抗原が結合された脂質小胞体を含む、免疫疾患治療剤。
本発明の治療剤において、免疫疾患としては、例えばアレルギー性疾患又は自己免疫疾患が挙げられる。
（３）抗体を発現又は結合する免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤が内包された脂質小胞体であって当該小胞体の外表面に前記抗体に対する抗原が結合された脂質小胞体を投与することを含む、免疫の調節方法。
（４）抗体を発現又は結合する免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤が内包された脂質小胞体であって当該小胞体の外表面に前記抗体に対する抗原が結合された脂質小胞体を投与することを含む、免疫疾患の治療方法。
（５）抗体を発現又は結合する免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤が内包された脂質小胞体であって当該小胞体の外表面に前記抗体に対する抗原が結合された脂質小胞体。
本発明によれば、免疫レベルを容易かつ効果的に調節するための手段、並びにアレルギー性疾患及び自己免疫疾患などの免疫疾患を有効に治療するための手段として、抗原特異的な免疫細胞に結合し且つ当該免疫細胞を抑制又は傷害して細胞活性を抑制又は阻害し得る脂質小胞体を含む、免疫調節剤及び免疫疾患治療剤を提供することができる。また、本発明によれば、抗原特異的な免疫細胞に結合し且つ当該免疫細胞を抑制又は傷害して細胞活性を抑制又は阻害し得る脂質小胞体を投与することを含む、免疫の調節方法及び免疫疾患の治療方法を提供することができる。
本発明の調節剤及び治療剤、ならびに免疫の調節方法及び免疫疾患の治療方法は、例えば、従来は困難であった免疫疾患の根本的な治療を実現し且つ優れた効果を発揮し得るものである点で極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、薬剤内包リポソームによる副作用（体重減少）の影響の有無を示すグラフである（Ａ，Ｂ）。
図２は、各種リポソームの投与によるＩｇＧ産生量（Ａ）及びＩｇＥ産生量（Ｂ）への影響を示すグラフである。
図３は、各種リポソームの投与によるＩｇＥ産生量への影響を示すグラフである。（Ａ）２２日目、（Ｂ）３６日目。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
１．本発明の概要
本発明は、薬剤キャリアに目的組織・細胞を認識させ当該組織・細胞に到達させる標的化ＤＤＳとは全く逆の着想に基づき、目的細胞に薬剤キャリアを認識させるインテリジェントな逆標的化ＤＤＳ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＤＤＳ，ＲＴ−ＤＤＳ）のコンセプトを提案及び実証するものであり、特に免疫調節及び免疫疾患治療のための手段を提供する。
すなわち、本発明は、抗原抗体反応を逆手にとり、抗原修飾（抗原結合）ＤＤＳ製剤を用いて、免疫細胞（抗体発現細胞若しくは抗体結合細胞）に逆標的化させ、これら免疫細胞を特異的に傷害することにより、免疫レベルを容易かつ効果的に調節するための手段、あるいはアレルギー性疾患や自己免疫疾患の根本的な治療をするための手段を提供するものである。
具体的には、本発明において使用されるリポソームなどの脂質小胞体は、その内水相又は脂質相に、該抗体を発現若しくは結合する免疫細胞を傷害し得る薬剤を内包したものであり、小胞体の外表面に、前記抗体に対する抗原を結合させたものである。この脂質小胞体は、免疫調節剤及び免疫疾患治療剤として使用することができる。
「免疫細胞を抑制又は傷害し得る」とは、免疫細胞の機能又は活性を抑制又は阻害すること、及び細胞が有する恒常性を低下又は消失させることのいずれをも意味し、細胞の形態を破壊すること、細胞に対してアポトーシス等の細胞死を誘導し得ることが含まれる。
免疫調節剤の使用態様は、アレルギー性疾患もしくは自己免疫疾患の罹患者に対して、注射剤やその他として点眼剤、点鼻剤、噴霧吸入剤、坐剤、塗布剤、貼付剤などの剤型によって投与され、治療効果を期待する。
上記免疫細胞としては、白血球に含まれるものをすべて包含しうるが、これに限定はされない。例えば、細胞表面に免疫疾患に関わる抗体又は抗体と同様に抗原を認識する分子を保持する細胞が挙げられ、抗体発現細胞及び抗体結合細胞が好ましい。「抗体発現細胞」とは、アレルギー性疾患や自己免疫疾患等の免疫疾患の原因物質（抗原）に対する抗体を細胞表面に保持し、産生する細胞であり、例えばＢ細胞が挙げられる。また、抗体発現細胞は、抗原を直接的又は間接的に認識することによりＢ細胞の抗体産生に影響を与えるＴ細胞なども含む。「抗体結合細胞」とは、抗体発現細胞で産生された、アレルギー性疾患の原因物質（抗原）に対する抗体を細胞表面に保持する細胞を意味し、例えば抗体を結合した肥満細胞、抗体を結合したＢ細胞等が挙げられる。
２．本発明に使用される脂質小胞体
本発明の免疫調節剤及び免疫疾患治療剤に使用される脂質小胞体は、構成成分として、脂質、内包される薬剤、及び小胞体の外表面に結合する抗原を含むものである。
（１）脂質小胞体
小胞体の膜構成脂質としては、水性媒体中で二分子膜構造を形成し得る公知の種々の両親媒性分子から選ばれる１種以上の脂質を用いることができ、好ましくは、天然又は合成の飽和リン脂質及び不飽和リン脂質、並びにこれらの組合せであり、なかでも合成の飽和リン脂質がより好ましい。
飽和リン脂質としては、限定はされないが、例えば、水添卵黄レシチン、水添大豆レシチン、肝形質膜、赤血球膜、大腸菌膜等の細胞外膜の抽出物及び細胞内膜の抽出物等の天然リン脂質並びにその誘導体のほか、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンなどのジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルイノシトール、スフィンゴリン脂質類等が好ましく挙げられ、なかでも、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンがより好ましい。
不飽和リン脂質としては、限定はされないが、例えば、卵黄レシチン、大豆レシチンなどの天然不飽和リン脂質、１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリンなどの合成不飽和リン脂質、１，２−ジ（オクタデカ−ｔｒａｎｓ−２，ｔｒａｎｓ−４−ジエノイル）ホスファチジルコリン、１，２−ビスエレオステアロイルホスファチジルコリン等の重合性リン脂質などが好ましく挙げられる。上記重合性リン脂質は、非重合性の長鎖を有していてもよく、該非重合性の長鎖としては、限定はされないが、例えば、炭素数２〜２４の直鎖又は分枝鎖のアルキル基、アシル基、非重合性アルケニル基、非重合性アルケノイル基等が挙げられる。
飽和リン脂質及び不飽和リン脂質を組合せて用いる場合は、限定はされないが、例えば、水添卵黄リン脂質と卵黄リン脂質との組合せ、合成飽和リン脂質であるジパルミトイルホスファチジルコリンやジステアロイルホスファチジルコリンと合成不飽和リン脂質である１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリンやジオレオイルホスファチジルコリンとの組合せ等が挙げられ、なかでもジパルミトイルホスファチジルコリンと１−パルミトイル，２−オレオイルホスファチジルコリンとの組合せが好ましい。
小胞体の膜構成脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）型脂質、すなわちＰＥＧ鎖が結合した脂質を含むことが好ましい。ＰＥＧ型脂質を含有することにより、形成される脂質小胞体はその表面にＰＥＧ鎖を有するものとなる。これによって、乾燥後の小胞体を水性溶液に再分散させるとき又は保存時等において、小胞体の凝集又は融合による粒子径変化を効果的に抑制することができるほか、例えば粒径制御のための押出法を行う際のフィルター透過性の低下や目詰まりを防止することができる。さらに、血中での血流動態を効果的に改善することもできる。
ＰＥＧ型脂質を含有する場合、その含有割合は、限定はされないが、膜構成脂質全体に対し、１〜２０モル％であることが好ましく、より好ましくは２〜１０モル％である。ＰＥＧ型脂質におけるＰＥＧ鎖の分子量は、限定はされないが、例えば５００〜１２，０００であり、より好ましくは１，５００〜５，０００である。ＰＥＧ鎖の分子量が上記範囲を満たしていれば、上述した粒子径変化や凝集の抑制効果をより効果的に得ることができる。
小胞体の膜構成脂質は、多糖等の糖鎖が結合した脂質を含んでいてもよい。当該脂質を含む場合、その含有割合は、限定はされないが、膜構成脂質全体に対し、１〜５０モル％であることが好ましく、より好ましくは５〜２０モル％である。
小胞体の膜構成脂質は、負電荷脂質（アニオン性脂質）を含んでいてもよい。負電荷脂質としては、限定はされないが、例えば、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジン酸、ジアシルホスファチジルイノシトール、ジアシルホスファチジルセリン、及び脂肪酸等が挙げられる。ここで、脂肪酸としては、限定はされないが、例えば、炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和脂肪酸、具体的には、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸又はオクタデカ−２，４−ジエン酸等が挙げられる。
負電荷脂質を含有する場合、その含有割合は、限定はされないが、膜構成脂質全体に対し、１〜５０モル％であることが好ましく、より好ましくは５〜２０モル％である。
さらに小胞体の膜構成脂質は、安定化剤としての脂質成分を含んでいてもよい。このような安定化剤としては、限定はされないが、例えばステロール類が挙げられる。具体的には、コレステロール、エルゴステロール、胆汁酸、プロビタミンＤ及びステロイドホルモン等の、ペルヒドロシクロペンタノフェナントレン骨格を有する全てのステロイド誘導体等が挙げられ、なかでもコレステロールが好ましい。
上記安定化剤としての脂質成分を含む場合、小胞体膜を効果的に安定化するためには、その含有割合は、膜構成脂質全体に対し、５〜５０モル％であり、好ましくは２０〜３３．３モル％である。
（２）薬剤
脂質小胞体に内包される薬剤は、免疫細胞を抑制又は傷害し得るものであれば限定されるものではない。例えば諸種の細胞に対してアポトーシス等の細胞死を誘導し得る薬剤が好ましい。
免疫細胞を抑制又は傷害することにより免疫抑制を引き起こすことを目的とする場合は、免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤である限り特に限定はされず、公知の種々の薬剤を採用することができ、さらに、核酸医薬品及び生物医薬品などを含む薬剤を採用することができる。
このような免疫細胞を抑制又は傷害し得る薬剤としては、例えば、アドリアマイシン、ダウノマイシン、抗リンパ球抗体、グルココルチコイド類、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、シクロホスファミド、サイクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）及びデオキシスパガリンその他の免疫抑制剤、細胞傷害性タンパク質であるＦａｓ−Ｌ及びＴＮＦ−α、種々の核酸医薬品、抗癌剤、抗生物質等が挙げられ、これらのうちの１種又は２種以上を用いることができる。但し、上記列挙した薬剤に限定されるものではない。
水溶性の高い薬剤は、通常、水溶液の状態で脂質小胞体に内包される。当該水溶液に用いられる水性媒体としては、限定はされないが、少なくとも血流中での生体適合性を有し、内包する薬剤物質を安定な状態に保持し得るものが好ましく、例えば、水のほか、ｐＨ緩衝液、生理食塩水等が挙げられる。ｐＨ緩衝液としては、例えば、グリシン緩衝液、フタル酸一カリウム緩衝液、コハク酸緩衝液、クエン酸一カリウム緩衝液等が挙げられる。
上記水溶液における薬剤濃度（脂質小胞体の内水相における薬剤濃度）は、限定はされず、免疫疾患の病態等を考慮した上で、適宜決定することができる。
本発明に使用されるタクロリムスは、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、例えばストレプトミセス・ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）Ｎｏ．９９９３（寄託機関：日本国茨城県つくば市東１丁目１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（旧名称：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所）、寄託日：１９８４年１０月５日、受託番号：微工研条寄第９２７号）もしくは、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス・サブスペシース・ヤクシマエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｙａｋｕｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ）Ｎｏ．７２３８（寄託機関：日本国茨城県つくば市町東１丁目１−３、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所、寄託日：１９８５年１月１２日、受託番号：微工研条寄第９２８号）（ＥＰ−Ａ−０１８４１６２）等により産生される物質である。
本発明に使用されるタクロリムスの構造式および化学名は次の通りである。
2008026781.tif 000003
化学名：（−）−（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｒ，１８Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２４Ｒ，２５Ｓ，２７Ｒ）−１７−アリル−１，１４−ジヒドロキシ−１２−［（Ｅ）−２−［（１Ｒ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルビニル］−２３，２５−ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ［２２．３．１．０４．９］オクタコス−１８−エン−２，３，１０，１６−テトラオン
本発明に使用されるタクロリムスは、溶媒和物とすることができる。溶媒和物としては、例えば、水和物、アルコール和物（エタノール和物など）、アセトン和物が挙げられる。
ここで、本発明に用いられるタクロリムスは、次のような疾患の治療または予防に有用である。
自己免疫疾患の眼疾患（例えば角結膜炎、春季結膜炎、ベーチェット病に伴うブドウ膜炎、角膜炎、ヘルペス性角膜炎、円錐形角膜炎、角膜上皮異栄養症、角膜白斑、眼天疱瘡、モーア潰瘍、強膜炎、グレーブス眼障害、フォークトー小柳−原田症候群、乾性角結膜炎（ドライアイ）、フリクテン、虹彩毛様体炎、類肉腫症、内分泌眼障害等）；
皮膚疾患（例えば皮膚筋炎、尋常性白斑症、尋常性魚鱗癬、光線過敏症および皮膚Ｔ細胞リンパ腫、炎症性および増殖亢進性皮膚病、ならびに免疫学的仲介皮膚疾患（具体的には、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、湿疹状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、扁平苔癬、天疱瘡、水疱瘡類天疱瘡、表皮水疱症、じんま疹、血管性水腫、脈管炎、紅斑、皮膚好酸球増加症、紅斑性狼瘡、座瘡および円形脱毛症等）、関節症性乾癬、環状乾癬、広汎性乾癬、円板状乾癬、ツンブッシュ汎発性膿疱性乾癬、地図状乾癬、滴状乾癬、花環状乾癬、陳旧性乾癬、硬貨状乾癬、輪状乾癬、カキ殻状乾癬、点状乾癬、膿疱性乾癬、脊椎炎性乾癬、汎発性乾癬などの乾癬）；
外傷、熱傷、手術等による肥厚性瘢痕やケロイド等；
心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚、角膜、肺、膵臓、小腸、肢、筋肉、神経、椎間板、気管、筋原細胞、軟骨等の臓器あるいは組織の移植による拒絶反応；
骨髄移植後の移植片対宿主反応；
リウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病等；
病原細菌（例えばアスペルギルス・フミガーツス、フサリウム・オキシスポルム、トリコフィトン・アステロイデス等）を要因とする感染症；
可逆的閉塞性気道疾患［喘息（例えば気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、外因性喘息および塵埃喘息）、特に慢性または難治性喘息（例えば遅発性喘息および気道機能亢進性気管支炎）等］；
粘膜または血管の炎症（例えば胃潰瘍、虚血性または血栓性血管損傷、虚血性腸疾患、腸炎、壊死性全腸炎、熱傷に伴う腸損傷、ロイコトリエンＢ４媒介疾患）；
腸炎／アレルギー（例えば腹腔疾患、直腸炎、好酸球性胃腸炎、肥満細胞症、クローン病および潰瘍性大腸炎）；
胃腸管から遠くで症候性発現を伴う食物関連アレルギー性疾患（例えば偏頭痛、鼻炎および湿疹）；
腎臓病（例えば間質性腎炎、グッドパスチャー症候群、溶血性尿毒症症候群および糖尿病性腎障害）；
神経疾患（例えば多発性筋炎、ギラン・バレー症候群、メニエール病、多発性神経炎、孤立性神経炎、脳梗塞、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側鎖硬化症（ＡＬＳ）および神経根障害）；
脳虚血性疾患（例えば頭部損傷、脳内出血（例えばクモ膜下出血、脳出血）、脳血栓、脳塞栓、心拍停止、発作、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、高血圧性脳症、脳梗塞）；
内分泌性疾患（例えば甲状腺亢進症およびパセドウ病）；
血液疾患（例えば純赤血球無形成症、無形成性貧血、形成不全性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、無顆粒球症、悪性貧血、巨大赤芽球性貧血および赤血球形成不全）；
骨疾患（例えば骨粗鬆症）；
呼吸器疾患（例えばサルコイドーシス、肺線維症および特発性間質性肺炎；
皮膚病（例えば皮膚筋炎、尋常性白斑、尋常性魚鱗癬、光過敏症および皮膚Ｔ細胞性リンパ腫）；
循環器疾患（例えば動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、大動脈炎症症候群および多発性動脈炎）；
コラーゲン病（例えば皮膚硬化症、ヴェグナー肉芽腫およびシェーグレン症候群）；
肥満症；
好酸球性筋膜炎；
歯周疾患（例えば歯肉、歯周組織、歯槽骨または歯骨質の損傷）；
ネフローゼ症候群（例えば腎炎）；
男性型脱毛症、老人性脱毛症；
筋ジストロフィー症；
膿皮症およびセザール症候群；
染色体異常に伴う疾患（例えばダウン症候群）；
アディソン病。
（特開昭６１−１４８１８１号公報、ヨーロッパ特許公開第０１８４１６２号および第０３２３０４２号等参照）。
本発明に使用されるタクロリムスの量は、治療上または予防上患者個々の年齢および疾病の種類、疾病の程度、あるいはその他の要因により適宜調整すれば特に制限されないが、通常１日あたりの投与量が約０．０５〜５００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇが用いられる。また、１回あたりの投与量としては、通常平均０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、または１００ｍｇが投与される（但し、水和物等の溶媒和物として供される場合、タクロリムスの量として記載。）。投与回数は通常１日２回である。
（３）抗原
脂質小胞体の外表面に結合する抗原は、前記薬剤により傷害される免疫細胞（具体的には、当該免疫細胞の表面に存在するレセプター又は抗体）に結合しうる物質であれば特に限定はされず、例えば当該免疫細胞が関わる免疫疾患の原因物質であることが好ましい。上記原因物質は、免疫疾患がアレルギー性疾患の場合は、アレルゲン物質又はこれと同一のエピトープを有する物質が挙げられ、また免疫疾患が自己免疫疾患の場合は、自己抗原又はこれと同一のエピトープを有する物質が挙げられる。
本発明で使用される脂質小胞体において、抗原が脂質小胞体の外表面に結合した態様は、脂質小胞体を構成する脂質分子に抗原が直接結合している態様には限定はされず、脂質分子と直接結合している他の物質に抗原が結合することにより当該他の物質を介して間接的に脂質分子に結合している態様なども含まれる。この間接的な結合態様としては、例えば、脂質小胞体を構成する脂質分子に結合しているＰＥＧ鎖に抗原が結合した態様などが挙げられる。
（４）その他の成分
本発明で使用される脂質小胞体は、上述した脂質小胞体、小胞体に内包される薬剤、及び小胞体の外表面に結合する抗原のほか、適宜他の成分を含んでいてもよい。他の成分は、例えば、脂質小胞体の内水相に含有させるものとして、アミノ酸類、還元剤、ビタミン剤、塩基類等が挙げられる。
さらに、脂質小胞体表面に、抗原以外に、治療効果を高める目的で、適宜脂質小胞体表面修飾物質を含んでいてもよい。表面修飾物質としては、例えば標的の細胞との親和性を高め得るタンパク質、ペプチド、糖鎖、合成高分子化合物及び合成低分子化合物等が挙げられる。
（５）脂質小胞体の製造方法
本発明において使用される脂質小胞体の製造方法は、特に限定されるものではなく任意の方法を採用することができる。通常は、まず脂質二分子膜で形成される小胞体を調製し、当該調製と同時に又は調製後に薬剤を小胞体に封入する。その後、当該小胞体の外表面に抗原を結合させるか、あるいは、抗原を結合させた脂質分子を異質小胞体と反応させる。以下に具体的に説明する。
薬剤を脂質二分子膜で形成される小胞体に内包する方法としては、例えば、一旦脂質小胞体を調製した後、この小胞体の内水相又は脂質相に薬剤（薬剤水溶液）を封入する方法を採用することができる。このような方法としては、例えば、リモートローディング法（“Ｎ．Ｏｋｕ，Ｋ  Ｄｏｉ，Ｙ  Ｎａｍｂａ，Ｓ．Ｏｋａｄａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｏｎ  Ｍｅｔｈ−Ａ−Ｓａｒｃｏｍａ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，５８（３），４１５−４１９，１９９４”を参照）などが好ましく挙げられる。
また、薬剤を脂質小胞体に内包する他の方法としては、脂質小胞体の調製に用いられる公知の一般的な方法を採用することもでき、例えば、ボルテックス法、超音波照射法、高圧吐出法、高圧押出法、強制撹拌法、凍結融解法、有機溶媒注入法、界面活性剤除去法、逆相蒸発法等を、適宜選択し又は適宜組み合せることができる。なお、各方法の実施における手段及び条件等は、当業者の技術常識に基づき適宜選択し設定することができる。具体的には、所望の膜形成脂質（一般には粉末状）を、内包しようとする薬剤の水溶液に添加して、該脂質を水和及び膨潤させた後、静置し、ボルテックスミキサー、強制攪拌機、超音波照射機（ホモジナイザー等）、マイクロフルイダイザー、高圧押出機（エクストルーダー）又は凍結融解等により脂質を分散させることにより、内水相として薬剤水溶液を含む（薬剤を内包する）脂質小胞体の分散体を得ることができる。
一般に、最終的に得られる脂質小胞体の粒子径は、薬剤を内包した段階で得られるものより小さくなることが多いため、予めその減少分を見越した粒径に調製しておくことが生産性の面でも好ましい。なお、最終的に得られる脂質小胞体の粒子径（数平均粒子径）は、限定はされないが、全身性に投与する場合には、内包効率、除菌処理、血中動態等の効果がより高くなる点で、５０〜４００ｎｍが好ましく、より好ましくは８０〜２００ｎｍである。局所投与においては、その限りではなく約５μｍでも使用可能である。
次いで、薬剤を内包した脂質小胞体の外表面に、抗原を結合させる。脂質小胞体の外表面に抗原を結合させる方法は、限定はされず、例えば、脂質小胞体を含む分散体に抗原を添加して直接反応させる方法でもよいし、あるいは、予め抗原を直接的又は間接的に結合させた脂質分子を調製しておき、この脂質分子を、脂質小胞体を含む分散体に添加して反応させる方法でもよい。以上の操作により、薬剤を内包した脂質小胞体の外表面に抗原を結合させた脂質小胞体を得ることができる。
その後、必要に応じ、ゲル濾過クロマトグラフィー、遠心分離（超遠心分離）及び限外濾過膜処理等により、未内包の薬剤、及び未反応の抗原又は未反応の脂質分子を分離除去することが好ましい。
（６）脂質小胞体の有用性
本発明において使用される脂質小胞体は、前述したような構成成分及び構造を有するものであるため、例えば、血流を介して免疫疾患に関わる各種免疫細胞の抗体又はレセプターに結合し、当該免疫細胞を薬剤により傷害して細胞の活性を抑制又は阻害しうる、いわゆる逆標的化ＤＤＳ製剤の有効成分として機能するものである。したがって、以下に説明するように、免疫調節剤、並びにアレルギー性疾患及び自己免疫疾患などの各種免疫疾患治療剤の有効成分として極めて有用なものである。
３．免疫調節剤及び免疫疾患治療剤
本発明の免疫調節剤及び免疫疾患治療剤は、上記２．で説明した脂質小胞体を含むことを特徴とするものである。また本発明は、免疫調節剤を製造するための、又はアレルギー性疾患及び自己免疫疾患などの各種免疫疾患の治療剤を製造するための、上記２．で説明した脂質小胞体の使用も含むものでもある。ここで、上記免疫調節は、免疫抑制であることが好ましい。また上記免疫疾患は、先天的なものであっても後天的なものであってもよく、限定はされない。
本発明の調節剤又は治療剤は、一般には、生体内への投与に際し点滴静注等が可能なように、上記２．で説明した脂質小胞体を適当な分散媒に分散させたもの（分散体）が好ましい。分散媒としては、限定はされず、例えば、純水、水溶液、及び緩衝溶液等の水性媒体が挙げられ、用法や疾患の種類等応じて適宜選択できる。一般には、注射用水や生理食塩水が生体内における安全性が高い点で好ましい。分散媒のｐＨは、生理的ｐＨとして許容される範囲であればよく、脂質小胞体の安定性の低下や集合形態の変化等に顕著な支障がない範囲で適宜設定することができる。生理的ｐＨ範囲とは、生体内、血液内等のｐＨ範囲であり、例えば、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ７〜８（ほぼ中性）である。
本発明の調節剤又は治療剤においては、上記分散媒中における脂質小胞体の含有割合は、疾患の種類や進行の度合い、患者の容態、及び小胞体に内包する薬剤の種類等に応じて適宜設定すればよい。
本発明の調節剤又は治療剤は、脂質小胞体及び分散媒以外に他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、薬剤製造上一般に用い得る賦形剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等のほか、各種注射剤とする場合は、グリセロール及びプロピレングリコールや、ポリエチレングリコール等の脂肪族ポリアルコール等が挙げられ、常法により含有させ調製することができる。
本発明の調節剤又は治療剤が注射剤等の非経口剤として用いられる場合、一般にその形態は限定されず、例えば、静脈内注射剤（点滴を含む）、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、及び皮下注射剤等のいずれであってもよい。各種注射剤の場合、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態や、使用時に溶解液に再溶解させる凍結乾燥粉末の状態で提供され得る。
４．免疫の調節方法、及び免疫疾患の治療方法
本発明は、例えばアレルギー性疾患及び自己免疫疾患などの各種免疫疾患の患者に、前記本発明の調節剤又は免疫疾患治療剤を投与することを特徴とする、免疫の調節方法、又は免疫疾患の治療方法を含むものである。
本発明において、患者体内への投与方法は特に限定はされず任意の方法を採用することができるが、非経口の用法が好ましく、例えば、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内注射、及び皮下注射等の注射剤、その他点眼剤、点鼻剤、噴霧吸入剤、坐剤、塗布剤、貼付剤等が挙げられる。
また投与量、投与時間、投与間隔、投与回数（／１日）は、投与する製剤中の有効成分（脂質小胞体、さらには小胞体に内包される薬剤）の含有割合等を考慮した上で、投与対象（患者）の年齢、体重及び容態、並びに疾患の種類及び進行状況等を勘案し、適宜設定することができる。
尚、本発明の免疫調節剤又は免疫疾患治療剤は、免疫の調節及び免疫疾患の治療を必要とするヒト以外の哺乳動物にも投与することができる。投与の対象となるヒト以外の哺乳動物としては、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ等の家畜、イヌ、ネコ等の愛玩動物、マウス、ラット、モルモット、ウサギ等の実験動物が挙げられるが、これらの動物に限定されるものではない。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
＜卵白アルブミン（ＯＶＡ）過敏モデルマウスにおける免疫抑制＞
１．概要
本実施例では、まず、モデル系としてＩｇＧ産生型及びＩｇＥ産生型のオブアルブミン（ＯＶＡ）感作マウスを用い、ＯＶＡをコンジュゲートしたインテリジェントリポソームを、当該マウスに投与して、抗体産生細胞又は抗体結合肥満細胞に認識させ、リポソームに内包した薬剤（アドリアマイシン）によりこれら細胞を傷害することによって、ＩｇＧ及びＩｇＥの産生低下を来たすかどうかを検討した。
その結果、薬剤を内包しＯＶＡをコンジュゲートしたリポソームを投与した場合は、ＩｇＧ及びＩｇＥの産生量は有意に低下させることができた。この結果は、本発明の調節剤及び治療剤を用いたＲＴ−ＤＤＳによる免疫調節及び免疫疾患治療の有用性を示すものである。
２．方法及び結果
（１）リポソームの調製
リポソームの調製は薄層法にて行った。具体的には、ジステアロイルホスファチジルコリン（日本精化株式会社）とコレステロール（シグマアルドリッチジャパン）とを２：１のモル比で混合した後、クエン酸緩衝液を用いて水和することにより、脂質二分子膜からなるリポソームを調製した。リポソームは、１００ｎｍのポリカーボネート膜を透過させ、粒径約１００〜２００ｎｍに整粒した。
次いで、調製したリポソームに薬剤としてのアドリアマイシンを内包した。リポソーム内へのアドリアマイシン封入は、リモートローディング法により行った（“Ｎ．Ｏｋｕ，Ｋ  Ｄｏｉ，Ｙ  Ｎａｍｂａ，Ｓ．Ｏｋａｄａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｏｎ  Ｍｅｔｈ−Ａ−Ｓａｒｃｏｍａ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，５８（３），４１５−４１９，１９９４”を参照）。リポソームへのアドリアマイシンの内包量は、リポソーム１×１０１１個（ジステアロイルホスファチジルコリン及びコレステロールの合計量：３．９μｇ）あたり、約１μｇとなるようにした。
（２）リポソーム外表面へのＯＶＡ修飾
３３．２ｍｇのＯＶＡ（シグマアルドリッチジャパン）をホウ酸緩衝液に溶解し、この溶液に０．１４９ｍｇの３−（Ｎ−スクシニミジルオキシグルタリル）アミノプロリル，ポリエチレングリコール−カルバミルジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（日本油脂株式会社）を混合して、４℃で１８時間反応を行った。その後、反応液を、先に調製したリポソーム溶液と混合し、６５℃で１５分間反応を行った。以上の反応により、リポソームの外表面にＯＶＡを修飾（結合）した。次いで、未反応物を、セファロースＣＬ−４Ｂカラム液体クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）により除去した。
リポソームの外表面に結合したＯＶＡの定量は、ｎ−オクチル−ｂ−Ｄ−グルコシド（同仁化学株式会社）を用いて可溶化した後に、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所）；カラムＧ３０００ＳＷ（東ソー株式会社）を用いて行った。リポソームの外表面のＯＶＡの結合量は、リポソーム１個（ジステアロイルホスファチジルコリン及びコレステロールの合計量：３．９×１０−１６ｇ）あたり、約５００個であった。
以上により、アドリアマイシンを内包し且つ外表面にＯＶＡ修飾がなされたリポソーム（ＯＶＡ−ＡＤＭ）を調製した。
なお、対照として、アドリアマイシン内包リポソーム（ＯＶＡ未修飾，Ｌｉｐｏ−ＡＤＭ）、及びＯＶＡ修飾リポソーム（アドリアマイシン未内包，ＯＶＡ−Ｌｉｐｏ）も併せて調製した。
（３）ＯＶＡ過敏マウスモデルの作製
Ｂａｌｂ／ｃ系マウス雌性（日本ＳＬＣ株式会社）６週齢に、一匹あたり１００μｇ／０．０５ｍＬのＯＶＡと０．０５ｍＬのＩｍｊｅｃｔ（登録商標）Ａｌｕｍ（ＰＩＥＲＣＥ社）との混合物を、腹腔内注射により投与し、ＯＶＡに対する感作を行った。感作日を０日目として換算し、１５日目及び２９日目に、感作時と同様の操作により追加免疫を行った。
（４）アドリアマイシンによる副作用の影響
リポソームに内包したアドリアマイシンにより、副作用として体重減少が認められるかどうか確認した。投与する被験薬としては、コントロールである０．３Ｍグルコース（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、１０ｍｇ／ｋｇ体重アドリアマイシン（ＡＤＭ（１０ｍｇ／ｋｇ））及び１０ｍｇ／ｋｇ体重アドリアマイシン内包リポソーム（ＯＶＡ未修飾，Ｌｉｐｏ−ＡＤＭ（１０ｍｇ／ｋｇ））の３種を用い、それぞれを各群のマウスに対し、前記感作日（０日目）から８、１０及び１２日目に尾静脈内投与した（計３回）。また、前述の通り追加免疫を行った。なお、１０ｍｇ／ｋｇ体重のアドリアマイシンは、癌化学療法剤として薬効が得られる用量である。
その結果、アドリアマイシンのみでは明らかな体重減少が認められたが、アドリアマイシン内包リポソームではＶｅｈｉｃｌｅと有意差は認められず、副作用を回避することができた（図１（Ａ）参照）。
（５）ＩｇＧ及びＩｇＥ産生量への影響
前述したＯＶＡ過敏マウスモデル及び各種リポソームを用いて、ＩｇＧ及びＩｇＥの産生量を有意に低下させることができるかどうか確認した。併せて、副作用として体重減少が認められるかどうかも確認した。
投与する被験薬としては、コントロールである０．３Ｍグルコース（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、１ｍｇ／ｋｇ体重アドリアマイシン内包リポソーム（ＯＶＡ未修飾，Ｌｉｐｏ−ＡＤＭ（１ｍｇ／ｋｇ））、ＯＶＡ修飾リポソーム（アドリアマイシン未内包，ＯＶＡ−Ｌｉｐｏ）及び１ｍｇ／ｋｇ体重アドリアマイシン内包ＯＶＡ修飾リポソーム（ＯＶＡ−ＡＤＭ（１ｍｇ／ｋｇ））の４種を用い、それぞれを各群のマウスに対し、前記感作日（０日目）から８、１０及び１２日目に尾静脈内投与した（計３回）。また、前述の通り１５日目及び２９日目に追加免疫を行った。マウス血清の採取は、３６日目に、眼底動脈よりヘマトクリット毛細管（テルモ株式会社）を用いて採血し、静置後に遠心分離をして行った。マウス血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ及びＩｇＥの定量は、ＥＬＩＳＡ法により行った。
以上の結果、まず、マウスの体重減少については、いずれの被験薬を用いた場合もＶｅｈｉｃｌｅとの有意差は認められず、副作用を回避することができた（図１（Ｂ）参照）。Ｖｅｈｉｃｌｅ以外は全てリポソームを含むものであり、またアドリアマイシンの用量が少なかったためであると考えられる。
次に、血清中で最も量の多い免疫グロブリンであるＩｇＧの産生量への影響については、ＯＶＡ−ＡＤＭ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した場合は、Ｖｅｈｉｃｌｃ、Ｌｉｐｏ−ＡＤＭ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した場合に比べてＩｇＧ産生量が有意に減少した（図２（Ａ）参照）。この結果から、ＯＶＡ−ＡＤＭ（１ｍｇ／ｋｇ）は、免疫担当細胞に対して直接的もしくは間接的に認識され、生体反応を引き起こし、選択的かつ効果的にＩｇＧの産生量を抑制する作用をもつことが示された。
さらに、様々なアレルギー反応と関連の深い免疫グロブリンであるＩｇＥの産生量への影響については、ＯＶＡ−ＡＤＭ（１ｍｇ／ｋｇ）を投与した場合は、Ｖｅｈｉｃｌｅ、Ｌｉｐｏ−ＡＤＭ（１ｍｇ／ｋｇ）、ＯＶＡ−Ｌｉｐｏを投与した場合に比べてＩｇＥ産生量が有意に減少した（図２（Ｂ）参照）。この結果から、ＯＶＡ−ＡＤＭ（１ｍｇ／ｋｇ）は、単にアドリアマイシンを内包しただけのもの（Ｌｉｐｏ−ＡＤＭ）やＯＶＡを修飾しただけのもの（ＯＶＡ−Ｌｉｐｏ）とは異なり、選択的かつ効果的にＩｇＥの産生量を抑制する作用をもつことが示された。
【実施例２】
【０００７】
＜卵白アルブミン（ＯＶＡ）過敏モデルマウスにおける免疫抑制＞
１．概要
モデル系としてＩｇＥ産生型のオブアルブミン（ＯＶＡ）感作マウスを用い、ＯＶＡをコンジュゲートしたインテリジェントリポソームを、当該マウスに投与して、抗体産生細胞又は抗体結合肥満細胞に認識させ、リポソームに内包した薬剤（タクロリムス）によりこれら細胞を傷害することによって、ＩｇＥの産生低下を来たすかどうかを検討した。
その結果、薬剤を内包しＯＶＡをコンジュゲートしたリポソームを投与した場合は、ＩｇＥの産生量は有意に低下させることができた。この結果は、本発明の調節剤及び治療剤を用いたＲＴ−ＤＤＳによる免疫調節及び免疫疾患治療の有用性を示すものである。
２．方法及び結果
（１）リポソームの調製
リポソームの調製は凍結乾燥法にて行った。具体的には、ジパルミトイルホスファチジルコリンとジパルミトイルホスファチジルグリセロール（日本精化株式会社）とタクロリムスを９：１：０．２のモル比で混合した後クロロホルムおよび適量のｔ−ブタノールに溶解しエバポレーションによりクロロホルムを留去後、液体窒素を用いて凍結乾燥した。等張リン酸緩衝液を用いて水和することにより、脂質二分子膜からなるリポソームを調製した。リポソームは、孔径１００ｎｍのポリカーボネート膜を透過させ、粒径約１００〜２００ｎｍに整粒した。
（２）リポソーム外表面へのＯＶＡ修飾
３３．２ｍｇのＯＶＡ（シグマアルドリッチジャパン）をホウ酸緩衝液に溶解し、この溶液に０．１４９ｍｇの３−（Ｎ−スクシニミジルオキシグルタリル）アミノプロリル，ポリエチレングリコール−カルバミルジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン（日本油脂株式会社）を混合して、４℃で１８時間反応を行った。その後、反応液を、先に調製したリポソーム溶液と混合し、６５℃で１５分間反応を行った。以上の反応により、リポソームの外表面にＯＶＡを修飾（結合）した。次いで、未反応物を、セファロースＣＬ−４Ｂカラム液体クロマトグラフィー（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社）により除去した。
リポソームの外表面に結合したＯＶＡの定量は、ｎ−オクチル−ｂ−Ｄ−グルコシド（同仁化学株式会社）を用いて可溶化した後に、高速液体クロマトグラフィー（島津製作所）；カラムＧ３０００ＳＷ（東ソー株式会社）を用いて行った。リポソームの外表面のＯＶＡの結合量は、リポソーム１個（ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジパルミトイルホスファチジルグリセロール合計量：１．２×１０−１４ｇ）あたり、約８８個であった。以上により、タクロリムスを内包し且つ外表面にＯＶＡ修飾がなされたリポソーム（ＯＶＡ−ＦＫ）を調製した。なお、対照として、タクロリムス内包リポソーム（ＯＶＡ未修飾，ＦＫ−Ｌｉｐｏ）及びＯＶＡ修飾リポソーム（タクロリムス未内包，ＯＶＡ−Ｌｉｐｏ）も併せて調製した。
（３）ＯＶＡ過敏マウスモデルの作製
Ｂａｌｂ／ｃ系マウス雌性（日本ＳＬＣ株式会社）６週齢に、一匹あたり１００μｇ／０．０５ｍＬのＯＶＡと０．０５ｍＬのＩｍｊｅｃｔ（登録商標）Ａｌｕｍ（ＰＩＥＲＣＥ社）との混合物を、腹腔内注射により投与し、ＯＶＡに対する感作を行った。感作日を０日目として換算し、１５日目及び２９日目に、感作時と同様の操作により追加免疫を行った。
（４）タクロリムスによる副作用の影響
リポソームに内包したタクロリムスにより、副作用として体重減少が認められるかどうか確認した。投与する被験薬としては、コントロールである０．３Ｍグルコース（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、５μｇ／ｋｇ体重タクロリムス内包リポソーム（ＯＶＡ未修飾，ＦＫ−Ｌｉｐｏ（５μｇ／ｋｇ））、ＯＶＡ修飾リポソーム（タクロリムス未内包，ＯＶＡ−Ｌｉｐｏ）及び５μｇ／ｋｇ体重タクロリムス内包ＯＶＡ修飾リポソーム（ＯＶＡ−ＦＫ（５μｇ／ｋｇ））の４種を用い、それぞれを各群のマウスに対し、前記感作日（０日目）から８、１０及び１２日目に尾静脈内投与した（計３回）。また、前述の通り追加免疫を行った。
（５）ＩｇＥ産生量への影響
前述したＯＶＡ過敏マウスモデル及び各種リポソームを用いて、ＩｇＥの産生量を有意に低下させることができるかどうか確認した。投与する被験薬としては、コントロールである０．３Ｍグルコース（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、５μｇ／ｋｇ体重タクロリムス内包リポソーム（ＯＶＡ未修飾，ＦＫ−Ｌｉｐｏ（５μｇ／ｋｇ））、ＯＶＡ修飾リポソーム（タクロリムス未内包，ＯＶＡ−Ｌｉｐｏ）及び５μｇ／ｋｇ体重タクロリムス内包ＯＶＡ修飾リポソーム（ＯＶＡ−ＦＫ（５μｇ／ｋｇ））の４種を用い、それぞれを各群のマウスに対し、前記感作日（０日目）から８、１０及び１２日目に尾静脈内投与した（計３回）。また、前述の通り１５日目及び２９日目に追加免疫を行った。マウス血清の採取は、２２日目及び３６日目に、眼底動脈よりヘマトクリット毛細管（テルモ株式会社）を用いて採血し、静置後に遠心分離をして行った。マウス血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥの定量は、ＥＬＩＳＡ法により行った。
（６）ＥＬＩＳＡ法によるＩｇＥ産生量の測定
Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にｒａｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢＤ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（２μｇ／ｍＬ）を室温で２時間反応させることでコートした。１％ｇｅｌａｔｉｎ−ＰＢＳにより室温で２時間ブロッキングを行った後、３倍希釈した血清サンプルを加え、４℃でｏｖｅｒ  ｎｉｇｈｔインキュベートした。Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ｃｌｏｎｅ  ２Ｃ６）（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＯＶＡ特異的ＩｇＥの検量線として用いた。ＥＺ−ＬＩＮＫ  ｓｕｌｐｈｏ−ＮＨＳ−ＬＣ  ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いビオチン化したＯＶＡ（１０μｇ／ｍＬ）を室温で１時間反応させた。その後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を入れ、室温で１時間反応させた。基質としてＳＩＧＭＡ  ＦＡＳＴＴＭ  ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｔａｂｌｅｔ  ｓｅｔｓを用い、４９０ｎｍの吸光度を測定することにより抗体濃度を求めた。
以上の結果、まず、マウスの体重減少については、いずれの被験薬を用いた場合もＶｅｈｉｃｌｅとの有意差は認められず、副作用は認められなかった。次に、様々なアレルギー反応と関連の深い免疫グロブリンであるＩｇＥの産生量への影響について、ＯＶＡ−ＦＫ（５μｇ／ｋｇ）を投与した場合は、Ｖｅｈｉｃｌｅ、ＦＫ−Ｌｉｐｏ（５μｇ／ｋｇ）、ＯＶＡ−Ｌｉｐｏを投与した場合に比べてＩｇＥ産生量が減少することを確認した（図３（Ａ）（Ｂ）参照）。この結果から、ＯＶＡ−ＦＫ（５μｇ／ｋｇ）は、単にタクロリムスを内包しただけのもの（Ｌｉｐｏ−ＦＫ）やＯＶＡを修飾しただけのもの（ＯＶＡ−Ｌｉｐｏ）とは異なり、選択的かつ効果的にＩｇＥの産生量を抑制する作用をもつことが示された。
以上のデータより、ＲＴ−ＤＤＳはリポソーム内に封入した薬物を外因性の異物として認識する細胞に選択的かつ効果的に送達することが可能であることが示された。このことはＲＴ−ＤＤＳが、新薬又は既存薬にＲＴ−ＤＤＳを組み合わせることで、様々な外因性異物に対するアレルギー反応や内因性の自己免疫疾患等への治療効果の向上に寄与することの可能性を示すものでもある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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