(57)【要約】本発明は、高力価のセービン株ポリオウイルスを製造する工程を含む、不活化セービン株ポリオウイルス、百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを含有する混合ワクチンの製造方法を提供する。本発明のセービン株ポリオウイルスを接種するＶｅｒｏ細胞を、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養する工程を含む混合ワクチンの製造方法は、不活化セービン株ポリオウイルスを含有する混合ワクチンの効率的な製造方法として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）不活化セービン株ポリオウイルス、
（Ｂ）百日せき菌の防御抗原、
（Ｃ）ジフテリアトキソイド、および
（Ｄ）破傷風トキソイド、
を含有する混合ワクチンの製造方法であって、
（ａ）セービン株ポリオウイルスを接種するＶｅｒｏ細胞を、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養する工程、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
さらに、
（ｂ）前記Ｖｅｒｏ細胞にセービン株ポリオウイルスを感染させる工程、
（ｃ）該ポリオウイルスを増殖させる工程、
（ｄ）該ポリオウイルスを含有するウイルス液を回収する工程、および
（ｅ）該ポリオウイルスを不活化させる工程、
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロキャリアーの濃度が、約５ｇ／Ｌである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロキャリアーが、デキストラン製マイクロキャリアーである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
Ｖｅｒｏ細胞を培養する工程（工程（ａ））が、約３Ｌ以上のスケールで行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
Ｖｅｒｏ細胞を培養する工程（工程（ａ））が、約３０Ｌ以上のスケールで行われることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項７】
さらに、
（ｄ−２）前記ウイルス液を精製する工程、
を含む、請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記精製工程（工程（ｄ−２））が、
（ｉ）前記工程（ｄ）で回収したウイルス液の超遠心によるペレット化、
（ｉｉ）該ペレットの再浮遊液に対する超音波処理、
（ｉｉｉ）カラムクロマトグラフィーによる精製、
を含むことを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記（ｉｉｉ）カラムクロマトグラフィーによる精製が、１回だけ行われることを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
請求項１記載の方法で製造されるワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、混合ワクチン、特に不活化セービン株ポリオウイルス（ｓＩＰＶ）を含有する混合ワクチン、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリオは、ポリオウイルスによる感染症である。ポリオウイルスは、ヒトには経口的に感染し、腸管で増殖し、血液を介して中枢神経系に進入する。中枢神経系に進入したポリオウイルスが大型運動神経細胞で増殖することによって、運動神経細胞が変性・壊死を起こし、四肢に急性弛緩性麻痺を起こす。また、ポリオウイルスが延髄の呼吸中枢を侵した場合、呼吸麻痺から死に至る場合がある。このような重篤な症状を引き起こすポリオの発症を抑制するために、ポリオワクチンが広く使用されている。
ポリオワクチンとしては、経口生ポリオワクチンと不活化ポリオワクチンの２種類が用いられている。経口生ポリオワクチンは、ポリオウイルスの弱毒株（セービン株）を用いたワクチンである。経口投与された弱毒株ポリオウイルスは、通常の感染を起こす。経口生ポリオワクチン由来のポリオウイルスは、ヒトの腸管でよく増殖し、その結果腸管局所での免疫を形成する。さらに、経口生ポリオワクチン由来のポリオウイルスが血液中に進入してウイルス血症を起こすことによって、血中抗体の産生も促す。しかし、弱毒株ポリオウイルスの中枢神経系での増殖能は非常に弱いため、通常は麻痺を起こすことはない。また、被接種者の体内では、接種後約４〜６週間、経口生ポリオワクチン由来のポリオウイルスが増殖し、便より排出される。この排出ウイルスが、被接種者の周囲のポリオに対する免疫が弱いか又は免疫がないヒトに感染し、被接種者の場合と同様に免疫賦与または増強効果を示す。
ところが、経口生ポリオワクチン由来の弱毒株ポリオウイルスが、被接種者の体内で増殖を繰り返す間、または前記の排出ウイルスに感染したヒトの体内で増殖を繰り返す間に、強毒性方向への変異を起こすことがある。その変異株によって、極稀にワクチン関連麻痺を起こすことがある。
不活化ポリオワクチンは、ポリオウイルスをホルマリンにより不活化し、感染力を失わせたワクチンである。不活化ポリオワクチンは、被接種者の体内での増殖も、被接種者の周囲のヒトへの感染もしないので、ワクチン関連麻痺を起こすことはない。不活化ポリオワクチンの製造には、従来より強毒株が用いられているが、近年では弱毒株（セービン株）の開発もすすめられてきた（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３４（２００６）１５１−１５４、Ｄｅｖ  Ｂｉｌ．Ｂａｓｅｌ．Ｋａｒｇｅｒ，２００１，ｖｏｌ．１０５，ｐｐ  １６３−１６９、臨床とウイルス  Ｖｏｌ．３０  Ｎｏ．５（２００２．１２）３３６−３４３）。弱毒株（セービン株）の増殖性は強毒株の増殖性よりもやや悪いことが、デメリットと考えられていた。
百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドを含有するワクチンは、百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンとして広く用いられている。
無細胞性百日咳ワクチン、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよび不活性化ポリオウイルスからなる多価ワクチンが知られている（特表２０００−５０４０３２号公報）。
Ｖｅｒｏ細胞は、ミドリザルの腎臓由来の継代細胞であり、各種ウイルスに対して幅広い感受性を有することから、ウイルス培養に広く使用されている。Ｖｅｒｏ細胞をマイクロキャリアー上で培養し、培養したＶｅｒｏ細胞を用いてエンテロウイルス７１を増殖させることを含むエンテロウイルス７１ワクチンの製造方法が報告されている（Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ７１  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｓｕｈ−Ｃｈｉｎ  Ｗｕ，ｅｔｃ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，２２，３８５８−３８６４，２００４）。マイクロキャリアーを用いた一般的な細胞培養条件も報告されている（Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ＆  ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８）。
【発明の開示】
【０００３】
上記状況において、高力価のセービン株ポリオウイルスを製造する工程を含む、不活化セービン株ポリオウイルス（ｓＩＰＶ）、並びに百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイド（ＤＰＴ）を含有する混合ワクチンの製造方法が望まれていた。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、セービン株ポリオウイルスを接種するＶｅｒｏ細胞を、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養することによって、高力価のセービン株ポリオウイルスを製造することができることを見出した。これらの知見に基づいて検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）不活化セービン株ポリオウイルス、
（Ｂ）百日せき菌の防御抗原、
（Ｃ）ジフテリアトキソイド、および
（Ｄ）破傷風トキソイド、
を含有する混合ワクチンの製造方法であって、
（ａ）セービン株ポリオウイルスを接種するＶｅｒｏ細胞を、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養する工程、
を含むことを特徴とする方法；
（２）  さらに、
（ｂ）前記Ｖｅｒｏ細胞にセービン株ポリオウイルスを感染させる工程、
（ｃ）該ポリオウイルスを増殖させる工程、
（ｄ）該ポリオウイルスを含有するウイルス液を回収する工程、および
（ｅ）該ポリオウイルスを不活化させる工程、
を含む、上記（１）記載の方法；
（３）  前記マイクロキャリアーの濃度が、約５ｇ／Ｌである、上記（１）記載の方法；
（４）  前記マイクロキャリアーが、デキストラン製マイクロキャリアーである、上記（１）記載の方法；
（５）  Ｖｅｒｏ細胞を増殖させる工程（工程（ａ））が、約３Ｌ以上のスケールで行われることを特徴とする、上記（１）記載の方法；
（６）  Ｖｅｒｏ細胞を増殖させる工程（工程（ａ））が、約３０Ｌ以上のスケールで行われることを特徴とする、上記（１）記載の方法；
（７）  さらに、
（ｄ−２）前記ウイルス液を精製する工程、
を含む、上記（２）記載の方法；
（８）  前記精製工程（工程（ｄ−２））が、
（ｉ）前記工程（ｄ）で回収したウイルス液の超遠心によるペレット化、
（ｉｉ）該ペレットの再浮遊液に対する超音波処理、
（ｉｉｉ）カラムクロマトグラフィーによる精製、
を含むことを特徴とする、上記（７）記載の方法；
（９）  前記（ｉｉｉ）カラムクロマトグラフィーによる精製が、１回だけ行われることを特徴とする、上記（８）記載の方法；
（１０）  上記（１）記載の方法で製造されるワクチン
（１１）  Ｖｅｒｏ細胞を培養する工程（工程（ａ））が、約３Ｌ以上のスケールで行われることを特徴とする、上記（１）記載の方法；
（１２）  Ｖｅｒｏ細胞を培養する工程（工程（ａ））が、約３０Ｌ以上のスケールで行われることを特徴とする、上記（１）記載の方法；
などを提供する。
セービン株ポリオウイルスを接種するＶｅｒｏ細胞を、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養することによって、高力価のセービン株ポリオウイルスを得ることができる。高力価のセービン株ポリオウイルスを用いることによって、不活化セービン株ポリオウイルスを効率的に製造することができる。よって、セービン株ポリオウイルスを接種するＶｅｒｏ細胞を、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養する工程を含む混合ワクチンの製造方法（本発明の製造方法）は、不活化セービン株ポリオウイルスを含有する混合ワクチンの効率的な製造方法として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、マイクロキャリアー法によるＶｅｒｏ細胞の培養における、Ｖｅｒｏ細胞の増殖曲線を示すグラフである。３Ｌは、出発細胞数約２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（低濃度）でマイクロキャリアー３ｇ／Ｌを示す。３Ｈは、出発細胞数約１０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（高濃度）でマイクロキャリアー３ｇ／Ｌを示す。５Ｌは、出発細胞数約２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（低濃度）でマイクロキャリアー５ｇ／Ｌを示す。５Ｈは、出発細胞数約１０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（高濃度）でマイクロキャリアー５ｇ／Ｌを示す。
図２は、種々の条件で培養したＶｅｒｏ細胞で得られたＩ型ポリオウイルスの感染価（ウイルス力価）を示すグラフである。３Ｌは、出発細胞数約２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（低濃度）でマイクロキャリアー３ｇ／Ｌで培養したＶｅｒｏ細胞で得られたＩ型ポリオウイルスを示す。５Ｌは、出発細胞数約２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（低濃度）でマイクロキャリアー５ｇ／Ｌで培養したＶｅｒｏ細胞で得られたＩ型ポリオウイルスを示す。５Ｈは、出発細胞数約１０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（高濃度）でマイクロキャリアー５ｇ／Ｌで培養したＶｅｒｏ細胞で得られたＩ型ポリオウイルスを示す。Ｒｅｆ．は、ミドリザル腎臓細胞を用いて増殖したＩ型ポリオウイルスを示す。
本発明は、高力価のセービン株ポリオウイルスを製造しうる工程を含む、不活化セービン株ポリオウイルス（ｓＩＰＶ）、並びに百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイド（ＤＰＴ）を含有する混合ワクチンの製造方法を提供する。
以下、本発明について詳細に説明する。
１．不活化セービン株ポリオウイルス
（１）セービン株ポリオウイルス
本明細書において、セービン株ポリオウイルスとは、アルバート  Ｂ．セービン博士（Ｄｒ．Ａｌｂｅｒｔ  Ｂ．Ｓａｂｉｎ）によって単離されたポリオウイルスの弱毒株に由来するポリオウイルス株を意味する（Ｓａｂｉｎ  ＡＢ，Ｂｏｕｌｇｅｒ  ＬＲ．Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｓａｂｉｎ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｏｒａｌ  ｌｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｔｒａｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄ  １９７３，１，１１５−１１８など参照）。
セービン株ポリオウイルスには、セービンＩ型株ポリオウイルス、セービンＩＩ型株ポリオウイルスおよびセービンＩＩＩ型株ポリオウイルスが含まれる。セービンＩ型株ポリオウイルスとしては、例えば、ＬＳｃ，２ａｂ株などが挙げられる。セービンＩＩ型株ポリオウイルスとしては、例えば、Ｐ７１２，Ｃｈ，２ａｂ株などが挙げられる。セービンＩＩＩ型株ポリオウイルスとしては、例えば、Ｌｅｏｎ，１２ａ１ｂ株などが挙げられる。
（２）不活化
本明細書において、ウイルスの「不活化」とは、ウイルスの感染能力を失わせることを意味する。不活化方法としては、物理的方法（例えば、Ｘ線照射、熱、超音波などを用いた方法）、化学的方法（例えば、ホルマリン、水銀、アルコール、塩素などを用いた方法）などが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリオウイルスの不活化は、公知の方法により行うことができる（例えば、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３４（２００６）１５１−１５４など参照）。具体的には、例えば、ポリオウイルスをホルマリンで処理することによって不活化することができる。
（３）不活化セービン株ポリオウイルスの免疫原性
不活化されたセービン株ポリオウイルスには、通常、Ｄ抗原およびＣ抗原と呼ばれる２つのウイルス抗原が混在している。Ｄ抗原は完全ウイルス粒子である。Ｄ抗原に対する抗体は生きたウイルスの感染性を中和する能力があり、防御抗体として機能する。Ｃ抗原は欠損粒子と呼ばれ、完全ウイルス粒子から中心の核酸ＲＮＡとウイルスたん白の一部がかけた粒子であり、中空状粒子である。Ｃ抗原に対する抗体には生きたウイルスの感染性を中和する能力はないかあっても非常に低い。したがって、不活化セービン株ポリオウイルスをワクチンとして使用する場合には、Ｄ抗原が必要である。
ポリオウイルスには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の３つの型がある。ポリオウイルスの感染に対する免疫は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の３つのウイルス型に特異的で、型間で交差免疫があったとしてもわずかである。Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の不活化セービン株ポリオウイルスのＤ抗原は、それぞれＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の野生株（強毒株）ポリオウイルスに対する中和抗体を産生させうる免疫原性を有している。不活化セービン株ポリオウイルスのＤ抗原は、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型それぞれに免疫原性に差があり、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の野生株（強毒株）ポリオウイルスを中和するのに十分な抗体を産生させるために必要なＤ抗原量はウイルス型によって異なる。
上述のように、ポリオウイルスにはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の３つの型があり、どの型でも同じポリオを引き起こす。したがって、不活化セービン株ポリオウイルスをワクチン（不活化ポリオワクチン）として使用する場合には、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型それぞれの野生株（強毒株）のポリオウイルスを中和するのに十分な抗体を産生させうる免疫原性を有することが必要であり、また従来から用いられている強毒株由来の不活化ポリオワクチンの免疫原性に近い免疫原性であることが好ましい。このような免疫原性を示すためには、ワクチンは、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の不活化セービン株ポリオウイルスを、Ｄ抗原量で、２〜４：８０〜１２０：８０〜１２０の割合で含有するのが好ましく、特に、約３：約１００：約１００の割合で含有するのが好ましい。本発明で用いられる不活化セービン株ポリオウイルスは、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型が上記のような特定の比率を有することによって、強毒株由来の不活化ポリオワクチン（例、ソークワクチン）と同様の免疫原性を示す。
２．不活化セービン株ポリオウイルスの製造
本発明で用いられる不活化セービン株ポリオウイルスは、下記の方法によって製造することができる。
まず、Ｖｅｒｏ細胞を約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養し、ポリオウイルス培養用細胞を得る。得られたポリオウイルス培養用細胞に種ウイルス（セービン株ポリオウイルス）を接種し、ウイルスを培養することによって増殖させたセービン株ポリオウイルスを得る。得られたセービン株ポリオウイルスを不活化し、不活化セービン株ポリオウイルスを得る。用いられる種ウイルス（セービンＩ型株、セービンＩＩ型株またはセービンＩＩＩ型株）によって、対応する不活化セービン株ポリオウイルスを得ることができる。ウイルスの不活化の前または後に、ウイルスを濃縮および／または精製してもよい。
上述のように、不活化ポリオワクチンにおいては、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型それぞれの野生株（強毒株）を中和するのに十分な抗体を産生させうる免疫原性を有することが必要である。しかしながら、不活化セービン株ポリオウイルスのＤ抗原は、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型それぞれで免疫原性に差がある。したがって、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型それぞれの野生株（強毒株）を中和するのに十分な抗体を産生させうる免疫原性を有する不活化ポリオワクチンは、含有するＩ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の不活化ポリオウイルス量を調節することによって得ることができる。
（Ｖｅｒｏ細胞）
Ｖｅｒｏ細胞は、ミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓ）の腎臓由来の継代細胞であり、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に登録されている。Ｖｅｒｏ細胞は、線維芽細胞様の形態を示し、各種ウイルスに対して幅広い感受性を有し、継代培養と維持が容易であるため、ウイルス培養に広く使用されている。ＡＴＣＣから入手可能なＶｅｒｏ細胞としては、例えば、ＡＴＣＣ  番号  ＣＣＬ−８１、ＣＲＬ−１５８７などが知られている。
（マイクロキャリアー）
本明細書において、「マイクロキャリアー」とは、表面に細胞を付着させ、液体培地中で懸濁状態で細胞培養ができる担体を意味する。表面に細胞を付着させ、液体培地中で懸濁状態で細胞培養ができる担体であれば、材質、形状、大きさなどに特に制限はない。
マイクロキャリアーの材質としては、デキストラン、ゼラチン、コラーゲン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ガラス、セルロースなどが挙げられる。マイクロキャリアーの材質としては、デキストランが好ましい。
マイクロキャリアーの形状としては、球状（ビーズ）、円盤状などが挙げられる。マイクロキャリアーの形状としては、球状が好ましい。
球状のマイクロキャリアーの大きさは、例えば約０．０１〜１ｍｍ、好ましくは約０．０５〜０．５ｍｍ、より好ましくは約０．１〜０．３ｍｍである。
マイクロキャリアーは多孔性であってもよい。
本発明で用いられる球状のマイクロキャリアーとしては、例えば、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３（商品名）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商品名）（以上、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などが挙げられる。円盤状のマイクロキャリアーとしては、例えば、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ  １（商品名）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ  ２（商品名）（以上、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などが挙げられる。多孔性のマイクロキャリアーとしては、例えば、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ（商品名）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ  １（商品名）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ  ２（商品名）（以上、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などが挙げられる。本発明で用いられるマイクロキャリアーとしては、特に球状のデキストラン製マイクロキャリアーが好ましい。球状のデキストラン製マイクロキャリアーとしては、Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）、Ｃｙｔｏｄｅｘ  ３（商品名）およびＣｙｔｏｐｏｒｅ（商品名）が好ましく、さらにＣｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）およびＣｙｔｏｄｅｘ  ３（商品名）が好ましく、特にＣｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）が好ましい。
（Ｖｅｒｏ細胞の培養）
本発明においては、Ｖｅｒｏ細胞を、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養することによって増殖させる。マイクロキャリアー濃度は、好ましくは約４．５ｇ／Ｌ〜約５．５ｇ／Ｌであり、より好ましくは、約５ｇ／Ｌである。
上記のＶｅｒｏ細胞を増殖させる工程は、液量として、好ましくは３Ｌ以上、より好ましくは３０Ｌ以上、特に好ましくは１５０Ｌ以上のスケールで行われる。また、Ｖｅｒｏ細胞を増殖させる工程は、通常１０００Ｌ以下のスケールで行われる。
Ｖｅｒｏ細胞をマイクロキャリアー存在下で培養する場合、培地としては、例えば、約５〜２０ｖｏｌ％の仔ウシ血清または胎児牛血清を含むＭＥ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕、ＤＭＥ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕、ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９９巻，５１９（１９６７）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。培地としては、ＤＭＥ培地が好ましく、さらに仔ウシ血清を含むＤＭＥ培地が好ましく、特に約５ｖｏｌ％の仔ウシ血清を含むＤＭＥ培地が好ましい。培地は、細胞培養期間中、必要に応じて交換する。ｐＨは約６〜８であるのが好ましく、さらに約６．５〜７．５であるのが好ましく、特に約７であるのが好ましい。培養は通常約３５℃〜４０℃で約５〜９日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。細胞培養時の溶存酸素濃度（ＤＯ）は、約６０〜９０％であるのが好ましく、さらに約７０〜８０％であるのが好ましく、特に約７５％であるのが好ましい。
マイクロキャリアー存在下での培養開始時における培地中のＶｅｒｏ細胞の細胞数（出発細胞数）は、培地やマイクロキャリアーの種類、培養スケール等に応じて適宜設定することができる。出発細胞数は２×１０４個／ｍＬ〜１０×１０５個／ｍＬであるのが好ましく、特に２×１０５個／ｍＬ〜１０×１０５個／ｍＬが好ましい。
（ポリオウイルスの培養）
ポリオウイルスの培養は、Ｖｅｒｏ細胞の培養細胞にセービン株ポリオウイルス（種ウイルス）を接種して感染させ、ポリオウイルスを細胞内で培養することによって行うことができる。感染細胞の培養は、上述のＶｅｒｏ細胞の培養と同様にして行うことができる。ポリオウイルスの培養に用いられる培地としては、１９９培地が好ましく、さらに炭酸水素ナトリウムを添加した１９９培地が好ましく、特に０．３ｗ／ｖ％炭酸ナトリウムを添加した１９９培地が好ましい。
ウイルス培養時の培養温度は、約３０℃〜３８℃であるのが好ましく、さらに約３２℃〜３６℃であるのが好ましく、特に約３３℃〜３５℃であるのが好ましい。ウイルス培養の期間は、好ましくは約１〜５日間、より好ましくは約２〜４日間、特に好ましくは約３日間である。なお、ウイルス培養は、ポリオウイルスによる細胞変性効果（ポリオウイルス感染細胞が、細胞の円形化をおこし、マイクロキャリアーから離脱すること）を指標として、終了させることができる。
種ウイルスとしては、予めミドリザル初代腎培養細胞を用いて培養したセービン株ポリオウイルスを用いてもよい。
（ポリオウイルスを含有するウイルス液の回収）
ウイルス培養終了後、マイクロキャリアーを除き、ポリオウイルスを含有するウイルス液（ポリオウイルス液と称することがある。）を回収する。
マイクロキャリアーの除去は、例えば、テフロンメッシュ（例えば、孔径１２０μｍ）などを用いて行うことができる。メッシュに残ったマイクロキャリアーにはポリオウイルスが残存（付着）しているので、ウイルス培養液などで洗浄してポリオウイルスを回収してもよい。
得られたポリオウイルス液は、ろ過膜（例えば０．２μｍのろ過膜）などでろ過し、細胞屑を除いてもよい。
ポリオウイルス液は、不活化の前または後に、濃縮および／または精製してもよい。
濃縮方法としては、限外ろ過法、超遠心法、透析法などが挙げられる。濃縮方法としては、限外ろ過法、超遠心法が好ましく、さらに限外ろ過法と超遠心法を行なうのが好ましく、さらに、限外ろ過法を行った後、超遠心法を行なうのが好ましい。
限外ろ過法に用いられる限外ろ過膜としては、ウイルスの濃縮に通常用いられる限外ろ過膜を使用することができる。限外ろ過膜の分画分子量としては、１００ｋＤａ程度が好ましい。限外ろ過膜の材質としては、ポリエーテルスルホンなどが好ましい。
超遠心法によるポリオウイルスの濃縮は、例えば、ポリオウイルス液を、４℃で、１００，０００ｇ、４時間の超遠心によりペレット化することにより行なうことができる。ペレットは、リン酸緩衝液などに再浮遊させてもよい。ペレットの再浮遊液を超音波処理することによって、凝集塊をほぐすこともできる。超音波処理は、市販されている装置、例えば、ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ＭＯＤＥＬ  ２００Ｍ（クボタ）などを使用して行うことができる。超音波処理の条件は、凝集塊がほぐれる程度であればよく、超音波処理に使用する容器、超音波出力、再浮遊液の濃度、などに応じて適宜設定することができる。超音波処理の条件としては、例えば、２００Ｗで３〜１０分間の超音波処理などが挙げられる。このような超音波処理を行なっても、セービン株ポリオウイルスの免疫原性は失われず、ポリオウイルスワクチンとして好適に使用することができる。
精製方法としては、例えば、精製対象物の大きさ、密度、沈降係数などの物理的性質を利用する方法、化学または物理化学的反応（吸脱着など）を利用する方法などが挙げられるが、特に限定されない。精製方法としては、より具体的には、例えば、密度勾配遠心法、ろ過（限外ろ過を含む）、イオン交換カラムクロマトグラフ法、アフィニティークロマトグラフ法、ゲルろ過クロマトグラフ法、塩析法などが挙げられる。精製方法としては、カラムクロマトグラフ法が好ましく、さらにイオン交換カラムクロマトグラフ法が好ましく、特にＤＥＡＥ−イオン交換カラムクロマトグラフ法が好ましい。カラムクロマトグラフィーによる精製回数は、必要な純度になるまで行なえばよく、特に制限はないが、生産効率などの点で、最小限の工程で行うのが好ましい。
濃縮および精製としては、ポリオウイルス液の超遠心によるペレット化、該ペレットの再浮遊液に対する超音波処理、およびカラムクロマトグラフィーによる精製を行なうのが好ましい。さらに、カラムクロマトグラフィーによる精製は、１回だけ行われるのが、生産効率などの点で好ましい。ポリオウイルス液の超遠心によるペレット化、該ペレットの再浮遊液に対する超音波処理およびカラムクロマトグラフィーによる精製を１回だけ行うことによって、ポリオウイルス液を、効率的に、かつ十分に濃縮および精製することができる。
（ポリオウイルスの不活化）
ポリオウイルスの不活化は、通常用いられている方法によって行うことができる。より具体的には、例えば、ポリオウイルス液に不活化剤を添加し、ポリオウイルスと不活化剤を反応させることによってポリオウイルスを不活化することができる。不活化剤としては、ホルマリンが好ましい。不活化条件は、ポリオウイルスが不活化されればよく、特に制限はない。不活化処理の期間は、不活化不十分なポリオウイルスの残存を避けるため、通常、ポリオウイルスの不活化が確認された期間の約２〜４倍、好ましくは約２．５〜３．５倍、より好ましくは約３倍とする。
例えば、不活化剤としてホルマリンを用いる場合、その添加量は、好ましくは約０．００１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％、さらに好ましくは約０．００５ｗ／ｖ％〜０．０５ｗ／ｖ％、特に好ましくは約０．０１ｗ／ｖ％である。不活化温度は、特に好ましくは約３７℃である。不活化期間は、不活化剤の種類、不活化剤の濃度、不活化温度などによっても異なる。例えば、不活化剤として約０．０１ｗ／ｖ％のホルマリンを使用し、不活化温度が約３７℃の場合、不活化期間は、好ましくは約８日〜１６日、より好ましくは約１０日〜１４日、特に好ましくは約１２日である。約０．０１ｗ／ｖ％のホルマリンを使用し、不活化温度が約３７℃である場合、セービン株ポリオウイルスは、通常４日までに不活化される。
３．百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイド（ＤＰＴ）
本発明で用いられる百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドは、特に限定されるものではない。
百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドは、百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンとして、市販品として入手することができる（例えば、武田薬品工業株式会社製、阪大微生物病研究会製、化学及血清療法研究所製など）。また、百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドは、公知の方法によって得ることができる。具体的には、百日せき菌の防御抗原は、例えば、百日せき菌Ｉ相菌（東浜株）の培養液を硫安分画法・蔗糖密度勾配遠心分画法などの物理化学的方法で感染防御抗原画分を抽出・分離・精製したのち、残存する毒性をホルマリンで減毒することによって得ることもできる。ジフテリアトキソイドは、例えば、ジフテリア菌（Ｐａｒｋ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｎｏ．８株）の産生する毒素をカラムクロマトグラフ法などの物理化学的方法で精製濃縮した後、ホルマリンで無毒化することによって得ることもできる。破傷風トキソイドは、例えば、破傷風菌（Ｈａｒｖａｒｄ株）の産生する毒素をカラムクロマトグラフ法などの物理化学的方法で精製濃縮した後、ホルマリンで無毒化することによって得ることもできる
百日せき菌の防御抗原には、百日せき毒素（ＰＴ抗原）、繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ抗原）、外膜たん白（６９ＫＤ抗原）、線毛（ＦＢ抗原、凝集原（ＦＧＧ）とも呼ばれる）が含まれる。百日せき菌の防御抗原としては、必ずしも上記各抗原の全てを含んでいる必要はなく、これらの抗原のうち１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上を含んでいればよい。前記防御抗原に対する抗体は、百日せきから宿主を防御する。
４．混合ワクチン
本発明の混合ワクチンは、不活化セービン株ポリオウイルス、百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドを含有する。百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドは、上述のように、百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンとして、市販品として入手することができる。したがって、本発明の混合ワクチンは、不活化セービン株ポリオウイルスと、百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンとを混合することによって製造することもできる。
不活化セービン株ポリオウイルスは、不活化セービンＩ型株ポリオウイルス、不活化セービンＩＩ型株ポリオウイルス、および不活化セービンＩＩＩ型株ポリオウイルスを混合することによって製造することができる。上述のように、不活化セービン株ポリオウイルスは、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型の不活化セービン株ポリオウイルスを、Ｄ抗原量で、２〜４：８０〜１２０：８０〜１２０の割合で含有するのが好ましく、特に、約３：約１００：約１００の割合で含有するのが好ましい。
本発明の混合ワクチンにおける百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドの含有量は、百日せき、ジフテリアおよび破傷風の予防に有効な量であればよい。より具体的には、上述した、市販品として入手可能な百日せきジフテリア破傷風混合ワクチンにおける含有量と同様の含有量としてもよい。なお、不活化セービン株ポリオウイルスその他の成分によって百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイドまたは／および破傷風トキソイドの免疫原性が影響をうける場合には、適宜含有量を調節することにより、各疾患の予防に有効な混合ワクチンを製造することができる。
本発明の混合ワクチンは、常套手段に従って製造し、使用することができる。具体的には、以下に記載するようにして製造し、使用することができる。
本発明の混合ワクチンは、常套手段に従って、注射剤として製剤化することができる。注射剤は、自体公知の方法に従って、例えば、上記物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられる。調製された注射液は、通常、適当なアンプル、シリンジなどに充填される。
本発明の混合ワクチンは、必要に応じて、保存剤、抗酸化剤、キレート剤などの製剤添加剤を含有していてもよい。保存剤としては、例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノールなどが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン４酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸などが挙げられる。
本発明の混合ワクチンは、さらにアジュバントを含有していてもよい。アジュバント化剤としては、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウムなどが挙げられる。
本発明の混合ワクチンは、さらに不活化セービン株ポリオウイルス、百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイド以外の免疫原性成分を含んでいてもよい。そのような免疫原性成分としては、例えば、ポリオウイルス、百日せき菌、ジフテリア菌および破傷風菌以外のウイルスまたは菌に対する免疫原性成分が挙げられる。免疫原性成分としては、例えば、トキソイド、弱毒化ウイルス、不活化ウイルス、タンパク質、ペプチド、ポリサッカライド、リポポリサッカライド、リポペプチド、またはこれらの組み合わせなどが挙げられる。ポリオウイルス、百日せき菌、ジフテリア菌および破傷風菌以外のウイルスまたは菌としては、例えば、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、耳下腺炎ウイルス、風疹ウイルス、ヘルペスウイルス、水疱瘡ウイルス、狂犬病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、肺炎双球菌、髄膜炎菌、チフス菌、インフルエンザｂ菌などが挙げられる。
本発明の混合ワクチンは、例えば、皮下注射もしくは筋肉注射によって、好ましくは皮下注射によって、非経口的に投与することができる。
本発明の混合ワクチンの１回投与量は、投与対象者の年齢、体重など種々の条件に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、百日せき菌の防御抗原を４国際単位以上、ジフテリアトキソイドを約１５Ｌｆ、破傷風トキソイドを約２．５Ｌｆ、不活化セービンＩ型ポリオウイルスをＤ抗原として約２〜４単位（好ましくは約３単位）、不活化セービンＩＩ型ポリオウイルスをＤ抗原として約８０〜１２０単位（好ましくは約１００単位）、不活化セービンＩＩＩ型ポリオウイルスをＤ抗原として約８０〜１２０単位（好ましくは約１００単位）含有していてもよい。
本発明の混合ワクチンの投与回数は、例えば、初回免疫として、３〜８週の間隔で、２〜３回投与してもよい。初回免疫として本発明の混合ワクチンを２回投与した場合には、さらに３〜８週の間隔で百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン（ＤＰＴワクチン）を１回投与するのが好ましい。追加免疫として、初回免疫後６ヶ月以上の間隔をおいて（例えば、初回免疫終了後１２ヶ月から１８ヶ月までの間に）、さらに１回投与してもよい。
【実施例】
【０００５】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
参考例１（ポリオワクチンウイルス製造用保存細胞バンクの樹立）
ワクチンウイルス製造用の保存細胞バンクは、ＡＴＣＣから入手したＶｅｒｏ細胞から、下記の手順により作製した。
（ｉ）種細胞バンク（ＭＣＢ：Ｍａｓｔｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）の調製
ＡＴＣＣより受領したアンプル入り凍結細胞（ＣＣＬ  ８１  Ｖｅｒｏ，Ｆ−６５７３、継代数：１２４代）を融解し、空の４オンス瓶（容量１５４ｍＬ、細胞増殖面積５４ｃｍ２の培養瓶）に移した。細胞入り４オンス瓶に細胞増殖液（５ｖｏｌ％仔ウシ血清、０．０７５％炭酸水素ナトリウム、２０μｇ／ｍＬエリスロマイシン、１００μｇ／ｍＬカナマイシン（最終濃度）添加ＤＭＥ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、シグマ、カタログＮｏ．Ｄ５５２３））を滴下で、約５分位かけて１５ｍＬ加えた。細胞と細胞増殖液を入れた瓶を３６℃で静置培養した（４オンス瓶１本、１２５代）。翌朝細胞増殖液を新たな１５ｍＬと交換し、更に３６℃で静置培養した。静置培養を開始してから６日目に継代を行った（４オンス瓶１本から４オンス瓶４本、１２６代）。継代方法は、以下の手順に従って行った。
継代方法
（１）培養液を捨てる。
（２）継代用０．２５％トリプシン液５ｍＬを４オンス瓶に入れる。
（３）約１分間細胞面を浸して継代用０．２５％トリプシン液を捨てる。
（４）４オンス瓶を３６℃に静置し、細胞のガラス面よりの剥離を待つ。
（５）細胞が剥がれだしたら、細胞増殖液を５ｍＬ入れ、ピペッティングで全ての細胞を剥離させる。
（６）更にピペッティングで細胞を均一に浮遊させ、細胞増殖液を遠心管に移す。
（７）６００ｒｐｍ、５分間の遠心を行い、上清を捨て、沈渣となった細胞を新たな約８ｍＬの細胞増殖液にピペッティングで均一に浮遊させる。
（８）新たな４本の４オンス瓶（新たな細胞増殖液を１３ｍＬずつ分配してある）に１本当たり２ｍＬの細胞浮遊液を加える。
（９）４本の４オンス瓶を３６℃に静置し細胞培養を行う。
継代用０．２５％トリプシン液の組成は以下の通りであった。
５％トリプシン＊１    ５０ｍＬ／Ｌ
５％Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ  ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ（９０Ｋ）    ２０ｍＬ／Ｌ
０．２４７ｍｏｌ  エデト酸ナトリウム＊２    ５６ｍＬ／Ｌ
ＥＫ＊３    ２ｍＬ／Ｌ
トリプシン希釈液＊４    ８７２ｍＬ／Ｌ
＊１：トリプシンは、ブタ膵臓由来１：３００活性のものを使用した。
＊２：０．２４７ｍｏｌエデト酸ナトリウムの組成は以下の通りであった。
エデト酸ナトリウム−２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ    ９１．９５ｇ／Ｌ
ＮａＯＨ    ９．８８ｇ／Ｌ
＊３：ＥＫの組成は以下の通りであった。
Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ  Ｌａｃｔｏｂｉｏｎａｔｅ    １０，０００μｇ／ｍＬ
Ｋａｎａｍｙｃｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ    ５０，０００μｇ／ｍＬ
＊４：トリプシン希釈液の組成は以下の通りであった。
ＮａＣｌ    ８，０００ｍｇ／Ｌ
ＫＣｌ    ４００ｍｇ／Ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ    １５０ｍｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４    ６０ｍｇ／Ｌ
以降も同様の方法（培養面積比で１回の継代で約３〜４倍とするので、培養瓶と扱う液量は異なる）３〜６日間隔で継代を行い、１２９代の細胞を作製した（１回継代につき継代数は１つ多くなる）。ＳＲ瓶（Ｓｍａｌｌ  Ｒｏｕｘ瓶：容量７２７ｍＬ、細胞増殖面積１５６ｃｍ２の培養瓶）３３本に、培養した１２９代の細胞を継代時と同様にトリプシン処理、遠心を行い、沈渣を凍結保存培地（１０％ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  Ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）、１０ｖｏｌ％仔ウシ血清、０．０７５％炭酸水素ナトリウム、２０μｇ／ｍＬエリスロマイシン、１００μｇ／ｍＬカナマイシン（最終濃度）添加ＤＭＥ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、シグマ、カタログＮｏ．Ｄ５５２３））に約１．５×１０７個／ｍＬとなるように再浮遊させた。アンプルに上記細胞浮遊液を１ｍＬ分注し、スローフリーザー（約１分で１℃低下する）で−３２℃まで温度を下げた後、液体窒素中に移し保存した。上記のようにして得た１２９代の細胞を種細胞バンク（ＭＣＢ）として使用した。
（ｉｉ）製造用保存細胞バンク（ＭＷＣＢ：Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ’ｓ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ）の調製
上記（ｉ）で調製し、保存した種細胞バンク（ＭＣＢ）を使用して、上記（ｉ）の種細胞バンク（ＭＣＢ）の調製方法と基本的には全く同じ方法で、アンプル中の細胞の融解から細胞の継代による増殖を１３４代まで行った（出発細胞数が多いため、取扱い液量、培養瓶種と数は異なる）。前記の１３４代の細胞も、種細胞バンク（ＭＣＢ）と同様に液体窒素中で保存した。上記のようにして得た１３４代の細胞を製造用保存細胞バンク（ＭＷＣＢ）として使用した。
実施例１（ポリオワクチンウイルス製造用細胞の作製）
（ｉ）静置培養工程
上記参考例１で調製し、保存した製造用保存細胞バンク（ＭＷＣＢ）の１アンプル（１３４代の細胞）を、上記参考例１の種細胞バンク（ＭＣＢ）及び製造用保存細胞バンク（ＭＷＣＢ）の調製の場合と同様の方法で解凍し、細胞をＬＲ瓶（Ｌａｒｇｅ  Ｒｏｕｘ瓶、容量約１５４０ｍＬ、細胞増殖面積約２７４ｃｍ２の培養瓶）×３本にて７日間静置培養した（１３５代）。静置培養を開始してから７日目に継代を行い、ＬＲ瓶１８本（１３６代）へと培養スケールを拡大して静置培養した。静置培養とその継代は、上記参考例１の種細胞バンク（ＭＣＢ）の調製及び製造用保存細胞バンク（ＭＷＣＢ）の調製と同様の方法で行った。
次に、４０段セルファクトリー（ヌンク、カタログＮｏ．１３９４４６）で７日間静置培養した（１３７代）。静置培養を開始してから７日目に継代し、更に４０段セルファクトリー４台で７日間静置培養した（１３８代）。
（ｉｉ）マイクロキャリアー培養工程
次に、上記（ｉ）の静置培養工程で得た１３８代の細胞を、上記（ｉ）の継代時と同様にトリプシン処理、遠心し、沈渣となった細胞を１，０００ｍＬのマイクロキャリアー培養用細胞増殖液（５ｖｏｌ％仔ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ社製）、０．１１％炭酸水素ナトリウム、０．１％フルクトース、２０μｇ／ｍＬエリスロマイシン、１００μｇ／ｍＬカナマイシン（最終濃度）添加ＤＭＥ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ、シグマ、カタログＮｏ．Ｄ５５２３））にピペッティングで均一に浮遊させた。細胞浮遊液を、予めＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）で膨潤させ、マイクロキャリアー培養用細胞増殖液で平衡化したマイクロキャリアー（Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社）と混合（Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（商品名）は、膨潤前の重量で５ｇ／Ｌを使用した）し、５０Ｌ容量培養器３台で、３７℃、ｐＨ７．１５で撹拌しながら培養した。培養２日目より１日につき細胞増殖液の半量を新たな細胞増殖液と継続的に交換した。７日間培養した細胞を、ポリオワクチンウイルス製造用細胞（１３９代）として使用した。
実施例２（不活化ポリオワクチンＩ型の製造）
（ｉ）ウイルス培養工程
実施例１で得たポリオワクチンウイルス製造用細胞（１３９代）は、種ウイルスを接種する直前に撹拌を止めて細胞を沈殿させ、０．０７５％炭酸水素ナトリウム、２０μｇ／ｍＬエリスロマイシン、１００μｇ／ｍＬカナマイシン（最終濃度）添加ＥＢＳＳ（Ｅａｒｌ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で１回洗浄した。マイクロキャリアーごと採取した細胞培養液５ｍＬの上清を除いた後、０．２５％トリプシン液を加え再び５ｍＬとし、細胞をビーズから剥がし浮遊させ、細胞数を計測し、５０Ｌ容量培養器全体の細胞数を推定した。細胞１個当たり、弱毒Ｓａｂｉｎ株のＩ型（ＬＳｃ，２ａｂ株）の種ウイルスを約１０−３ＣＣＩＤ５０の濃度で接種した。種ウイルス接種後、直ちにウイルス培養液（０．３％炭酸水素ナトリウム、２０μｇ／ｍＬエリスロマイシン、１００μｇ／ｍＬカナマイシン（最終濃度）添加Ｍ１９９（Ｍｅｄｉｕｍ  １９９））５０Ｌを培養器に注入した。なお、種ウイルスは、予めアフリカミドリザル初代腎培養細胞を用いて約３３．３℃で培養した後、小分けして−７０℃で凍結保存したものを用いた。
ウイルス培養は、３４℃±１℃で３日間行った。ポリオウイルスによる細胞変性効果（ポリオウイルス感染細胞は細胞の円形化をおこし、その後マイクロキャリアーから離脱する）を指標とし、細胞がマイクロキャリアーから９５〜１００％離脱した時点でウイルス培養を終了させた。ウイルス培養終了後、テフロンメッシュ（孔径１２０μｍ）を介してマイクロキャリアーを除き、ウイルス浮遊液を回収した。メッシュに残ったマイクロキャリアーは、５０Ｌ容量培養器１台につき約３Ｌのウイルス培養液で１回洗浄した。回収したウイルス浮遊液にこの洗浄液を加えて「Ｉ型ポリオウイルス液」とした。
（ｉｉ）ウイルス濃縮・精製工程
上記（ｉ）で得たＩ型ポリオウイルス液約１５０Ｌを、０．２μｍのろ過膜（ポール、ＳＬＫ７００２ＮＲＰ）でろ過し、細胞屑を除いた。ろ液を限外ろ過膜（ザルトリウス、ＰＥＳＵ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒｓｕｌｆｏｎｅ）１００ｋＤａ、０．１ｍ２、３０５１４６６８０１Ｅ−−ＳＧ）で１．２Ｌまで濃縮した。濃縮されたウイルス液を６℃で１００，０００ｇ、４時間の超遠心によりペレット化し、ＰＢ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ，０．１ｍｏｌ／Ｌ）に再浮遊した（１本の遠心管（約１００ｍＬ）のペレットを５ｍＬのＰＢに再浮遊した）。ペレットの再浮遊液を４℃で一晩振とうした後、２００Ｗで８分間超音波処理（クボタ、ＩＮＳＯＮＡＴＯＲ  ＭＯＤＥＬ  ２００Ｍ）を行って凝集塊をほぐした。そして、１５，０００ｒｐｍ、３０分間の遠心後、上清を採取した。得られた上清をＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（商品名、ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社、ＧＥ  １７−０７１０−０５）により精製した。溶出液としてＰＢ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ，０．１ｍｏｌ／Ｌ）を用いた。２８０ｎｍの吸光度でモニターして、初めのピークを回収し、「精製Ｉ型ポリオウイルス液」とした。採取したピークについては、吸光度の値で２６０／２８０ｎｍを計算し、１．５以上であることを確認した（ポリオウイルス完全粒子の２６０／２８０ｎｍは１．６〜１．７である）。
（ｉｉｉ）不活化工程
上記（ｉｉ）で得た精製Ｉ型ポリオウイルス液を不活化前希釈液（５％アミノ酢酸（最終濃度）を添加した、Ｃａ、Ｍｇ、Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ、炭酸水素ナトリウムを含まないＭ１９９）で約１０倍希釈し、０．２μｍのろ過膜（ポール、ＳＬＫ７００２ＮＲＰ）でろ過し、ウイルス凝集塊を除いた。ろ液を調製後、再度ウイルスが凝集しないよう速やかに不活化を開始した。不活化開始１時間前に、ろ液と１：２００に希釈されたホルマリンを別々に３７℃で加温しておいた。ろ液を十分撹拌しながら、ホルマリンを最終濃度１：４，０００になるように添加し、３７℃に加温し不活化を開始した。ホルマリン処理中、液の撹拌を毎日午前及び午後の２回行うことによりウイルスの不活化を一様に進行させた。不活化不十分なウイルスが、容器の栓や容器のある特定の場所に付着する場合を想定して、不活化開始２、４日目には栓の交換を、６日目には容器の交換を行った。また、不活化工程中にウイルスが凝集する可能性を考慮して、不活化６日目に０．２μｍのろ過膜（ポール、ＳＬＫ７００２ＮＲＰ）でろ過を行った。ホルマリン処理工程は１２日間で終了とした。１２日目にホルマリン処理ウイルス液の遊離ホルマリンを亜硫酸ナトリウム（０．０２６４ｍｏｌ／Ｌとなるように添加）で中和後、安定剤としてエデト酸ナトリウムを添加（０．０００９ｍｏｌ／Ｌ）し、「不活化ポリオワクチンＩ型」の原液とした。
（ｉｖ）Ｄ抗原量の測定は型及びＤ抗原に特異性の高い抗体を用いた間接ＥＬＩＳＡ法よって行う。間接ＥＬＩＳＡ法は、先ず、１次抗体として被検抗原と同型のＤ抗原特異的モノクロナール抗体（マウス由来）をマイクロプレートにコーティングする。次に、被検抗原を希釈して乗せる。次に、２次抗体として被検抗原と同型のウサギポリクロナール抗体を乗せ、更に、ＨＲＰＯ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を乗せ反応させる。反応後、オルトフェニレンジアミン溶液を用いて発色させた後、４９２ｎｍの吸光度を測定する。被検抗体の吸光度の測定値と対照抗原の測定値との平行線定量法による比較により、被検抗原のＤ抗原量を求める。
実施例３（不活化ポリオワクチンＩＩ型の製造）
種ウイルスとして、弱毒Ｓａｂｉｎ株のＩ型（ＬＳｃ，２ａｂ株）に代えて弱毒Ｓａｂｉｎ株のＩＩ型（Ｐ７１２，Ｃｈ，２ａｂ株）を使用した他は、実施例２と同様にして、「不活化ポリオワクチンＩＩ型」の原液を製造した。
実施例４（不活化ポリオワクチンＩＩＩ型の製造）
種ウイルスとして、弱毒Ｓａｂｉｎ株のＩ型（ＬＳｃ，２ａｂ株）に代えて弱毒Ｓａｂｉｎ株のＩＩＩ型（Ｌｅｏｎ，１２ａ１ｂ株）を使用した他は、実施例２と同様にして、「不活化ポリオワクチンＩＩＩ型」の原液を製造した。
実施例５（百日せき菌の防御抗原の製造）
（１）百日せき菌の培養
百日せき菌Ｉ相菌（東浜株）をコーエンウイラー培地で３０〜３４℃、２０〜２４時間撹拌培養した。コーエンウイラー培地で培養した百日せき菌を更に、ステイナーショルト培地で３０〜３４℃、４８〜６８時間培養した。
培養液を、限外ろ過法により１／１０量まで濃縮を行い、遠心分離により上澄液と菌体に分離した。
（２）百日せき毒素の調製
上記（１）で得た上澄液に１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）を１／１０量になるように添加し、２５ｗ／ｖ％酢酸カルシウム溶液を０．１〜２．０ｗ／ｖ％になるよう加え、ろ過により百日せき毒素（感染防御抗原）を含むろ液を得た。ろ液をＳＰカラムクロマトグラフ法（平衡化溶液：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０））によりカラムを通し、吸着した百日せき毒素を０．４１５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出し、百日せき毒素を含む液を分画した。次いで、百日せき毒素を含む液をゲルカラムクロマトグラフ法（平衡化溶液：０．２５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム添加０．０２５ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム液（ｐＨ８．７））によりカラムを通した後、ろ過（孔径０．２μｍ）したものを精製百日せき毒素（ＰＴ抗原）液とした。
（３）繊維状赤血球凝集素の調製
上記（１）で分離した菌体を１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム添加０．０５ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）で溶解し、次いで遠心分離により上澄液と菌体に再分離した。再分離した上澄液に２５ｗ／ｖ％酢酸カルシウム溶液を０．１〜２．０ｗ／ｖ％になるよう加え、ろ過により繊維状赤血球凝集素（感染防御抗原）を含む液を得た。ろ液を硫酸アンモニウム濃縮した後、密度勾配遠心法で精製し、精製繊維状赤血球凝集素（ＦＨＡ抗原）を分画した。
（４）外膜たん白の調製
上記（３）で再分離した菌体を０．１４５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム添加０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解し、６０℃で９０分間加熱し、次いで遠心分離により上澄液と菌体に再々分離した。再々分離した上澄液に１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）を１／１０量になるように添加し、２５ｗ／ｖ％酢酸カルシウム溶液を０．１〜２．０ｗ／ｖ％になるよう加え、ろ過し、外膜たん白（感染防御抗原）を含むろ液を得た。外膜たん白（感染防御抗原）を含む液をＳＰカラムクロマトグラフ法（平衡化溶液：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０））により素通り液を回収した。次いで、ゲルカラムクロマトグラフ法（平衡化溶液：０．２５ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム添加０．０２５ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム液（ｐＨ８．７））によりカラムを通した後、ろ過（孔径０．２μｍ）したものを精製外膜たん白（６９Ｋ抗原）とした。
（５）線毛（凝集原（ＡＧＧ））の調製
上記（４）で外膜たん白を含む液を採取した後の残渣に１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム添加０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）を上澄液の１／１０量加え、ろ過し、線毛（感染防御抗原）を含むろ液を得た。得られた線毛を含む液を硫酸アンモニム濃縮後、密度勾配遠心法で精製し、精製線毛（ＦＢ抗原）を分画した。
（６）防御抗原の調製（減毒）
上記（２）〜（５）で得たＰＴ抗原、ＦＨＡ抗原、６９ＫＤ抗原およびＦＢ抗原を、下記実施例８で調製するＤＰＴ混合ワクチン０．５ｍＬあたりＰＴ抗原１．８９μｇ、ＦＨＡ抗原３．００μｇ、６９Ｋ抗原０．７６μｇおよびＦＢ抗原０．３６μｇの抗原比率を目標品質に混合した液を精製感染防御抗原液とした。精製感染防御抗原液にホルマリンを０．２〜０．５ｖｏｌ％および必要に応じて塩酸リジンを１ｗ／ｖ％以下になるように加え、３７〜４１℃で７日間以上加温して減毒したものを百日せきの防御抗原液とした。限外ろ過法を用いて余分なホルマリンおよび塩酸リジンを取り除き、百日せきの防御抗原の原液とした。
実施例６（ジフテリアトキソイドの製造）
（１）ジフテリア菌の培養
ジフテリア菌（Ｐａｒｋ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｎｏ．８）をレフレル培地で３２．０〜３４．０℃、５日間培養した。
（２）ジフテリア毒素の調製
上記（１）で得られた培養液に硫酸アンモニウムを加えた後の上澄液をろ過（孔径０．４５μｍ）し、得られたろ液をフェニル疎水性カラムクロマトグラフ法（平衡化溶液：１．２５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム添加０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム液（ｐＨ６．５））によりカラムを通し、得られた毒素液をＤＥＡＥイオン交換カラムクロマトグラフ法（平衡化溶液：０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０））によりカラムに通し、次いでゲルカラムクロマトグラフ法（平衡化溶液：０．１４５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム添加０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０））によりカラムに通してジフテリア毒素を分画し、これを精製毒素液とした。
（３）ジフテリア毒素のトキソイド化
上記（２）で得られた精製毒素液に、塩酸リジンを１ｗ／ｖ％以下、ホルマリンを０．３ｖｏｌ％になるように加え３８．０〜４０．０℃で２１日間加温してトキソイド化した。
（４）ジフテリアトキソイドの調製
上記（３）でトキソイド化した後、限外ろ過法を用いて余分なホルマリンおよび塩酸リジンを取り除き、ジフテリアトキソイド液とした。
実施例７（破傷風トキソイドの製造）
（１）破傷風菌の培養
破傷風菌（Ｈａｒｖａｒｄ４７−Ａ）を肝肝ブイヨンで３４．５℃〜３６．５℃、５日間培養した。
（２）破傷風毒素の調製
上記（１）で得られた培養液１Ｌあたり１．２５ｍｏｌ／Ｌになるよう硫酸アンモニウムを加えた。次いで、フェニル疎水性カラムクロマトグラフ法（平衡化溶液：１．２５ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウム添加０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム液（ｐＨ６．５））によりカラムに通し、得られた毒素液をＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフ法（平衡化溶液：０．０１ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５））によりカラムに通し、次いでゲルカラムクロマトグラフ法（平衡化溶液：０．１４５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム添加０．００４ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０））によりカラムに通して破傷風毒素を分画し、これを精製毒素液とした。
（３）破傷風毒素のトキソイド化
上記（２）で得られた精製毒素液に、ホルマリンを０．３ｖｏｌ％になるように加え、ｐＨ７．０に修正し、３９℃で１５〜２３日間加温してトキソイド化した。
（４）破傷風トキソイドの調製
上記（３）でトキソイド化した後、限外ろ過法を用いて余分なホルマリンおよび塩酸リジンを取り除き、破傷風トキソイド液とした。
実施例８（混合ワクチンの製造）
（ｉ）混合不活化ポリオワクチンの調製
上記実施例２、３および４で得た不活化ポリオワクチンＩ型、不活化ポリオワクチンＩＩ型および不活化ポリオワクチンＩＩＩ型の原液を、Ｄ抗原量がそれぞれ３、１００、１００となるように、１９９培地（Ｍ１９９）、最終濃度０．５ｖｏｌ％の２−フェノキシエタノール、および最終濃度０．０９ｗ／ｖ％の塩化アルミニウムを混合した。得られた混合液を、水酸化ナトリウム又は塩酸でｐＨを７に調整し、混合不活化ポリオワクチンとした。
（ｉｉ）ＤＰＴ混合ワクチンの調製
上記実施例５、６および７で得た百日せき菌の防御抗原、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドの原液を、１９９培地（Ｍ１９９）、最終濃度０．５ｖｏｌ％の２−フェノキシエタノール、および最終濃度０．２４ｗ／ｖ％の塩化アルミニウムと混合した。得られた混合液を、水酸化ナトリウムおよび塩酸でｐＨを７に調整し、ＤＰＴ混合ワクチンとした。
（ｉｉｉ）混合ワクチンの製造
上記（ｉ）で得た混合不活化ポリオワクチンと、上記（ｉｉ）で得たＤＰＴ混合ワクチンとを等量混合し、混合ワクチンを製造した。
実施例９（混合ワクチンの安定性）
実施例８で得た混合ワクチンにつき、２５℃で加速試験を行ない、安定性を測定した。安定性は、各ウイルスに対する力価試験によって評価した。
（１）沈降精製百日せきワクチンの力価試験
検体、標準百日せきワクチン及び百日せき菌１８３２３株を用いる。検体及び標準液をそれぞれ希釈し、これをもととしてそれぞれ４倍又は他の適当な対数的等間隔で合計３段階希釈以上の希釈を作る。４週齢のマウス１６匹以上を１群とし、各希釈に１群ずつを用いる。１匹当たり希釈液０．５ｍＬを１回腹腔内に注射する。免疫注射の２１日後に、１匹当たり攻撃用菌浮遊液０．０２５ｍＬを脳内に注射して、１４日間観察し、死亡匹数を算出する。試験の成績を統計学的に処理して比較するとき、検体の力価は８単位／ｍＬ以上でなければならない。
（２）沈降ジフテリアトキソイドの力価試験
検体、参照沈降ジフテリアトキソイド及び適当な毒素液を用いる。検体及び参照品の希釈は、生理食塩液に、また、毒素液の希釈は、０．２ｗ／ｖ％ゼラチン加０．０１７ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝塩化ナトリウム溶液（ｐＨ７．０）による。検体及び参照品をそれぞれ希釈し、対数的等間隔の段階希釈を作る。５週齢のマウス１０匹以上を１群とし、検体及び参照品の各希釈に１群ずつを用い、１匹当たり０．５ｍＬを皮下に注射する。免疫注射の４〜６週間後にそれぞれの動物から採血し、血中抗毒素価を測定する。試験の成績を統計学的に処理して比較するとき、検体の力価は４７単位／ｍＬ以上でなければならない。
（３）沈降破傷風トキソイドの力価試験
検体、参照沈降破傷風トキソイド及び適当な毒素液を用いる。検体及び参照品の希釈は、生理食塩液に、また、毒素液の希釈は、０．２ｗ／ｖ％ゼラチン加０．０１７ｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝塩化ナトリウム（ｐＨ７．０）による。検体及び参照品をそれぞれ希釈し、対数的等間隔の段階希釈を作る。５週齢のマウス１０匹以上を１群とする。検体及び参照品の各希釈に１群ずつを用い、１匹当たりマウスでは０．５ｍＬを１回皮下に注射する。免疫注射の４〜６週後に、それぞれのマウスを約１００ＬＤ５０の毒素で攻撃して、４日間観察する。試験の成績を統計学的に処理して比較するとき、検体の力価は２７単位／ｍＬ以上でなければならない。
（４）ラット免疫原性試験
検体、ＩＰＶ力価試験用参照品、各型の標準血清及び中和試験攻撃用セービン株ポリオウイルス（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ型）を用いる。検体及び参照品をそれぞれ希釈して、対数的等間隔の希釈を作る。Ｗｉｓｔｅｒ系８週齢、雌ラット１０匹以上を１群とし、各希釈に１群ずつを用いる。１匹当たり０．５ｍＬを後肢大腿部に筋肉内接種する。接種の２１日後に、個体別に全ての動物から採血し、血清を採り５６℃３０分間加熱する。個体別血清及び標準血清を各血清につき２ウエル以上添加し、ＭＥＭ培地で２倍段階希釈する。更に、各ウエルに各型の中和用ウイルス浮遊液を約１００ＣＣＩＤ５０となるように接種する。その後、全てのプレートを３６±１℃のＣＯ２インキュベータに３時間置いた後、約４℃で一晩反応させる。翌日、各ウエルに１×１０４ｃｅｌｌｓとなるように細胞浮遊液を添加し、３６±１℃のＣＯ２インキュベータで７日間培養する。培養終了後、各ウエルのＣＰＥを観察し、５０％中和点の血清希釈倍数を算出し、その逆数を中和抗体価とする。試験の成績を統計学的に処理して比較するとき、検体の力価は参照品と同等以上でなければならない。
加速試験の結果を表１に示す。参照ＩＰＶとしては、ロット０４Ｃ（日本ポリオ研究所製）を用いた。
【表１】
2008044611.tif 000002
実施例１０（マイクロキャリアー法によるＶｅｒｏ細胞の培養及びポリオウイルスの培養）
（ｉ）Ｖｅｒｏ細胞の培養
Ｖｅｒｏ細胞のワーキングバンク（ＭＷＣＢ９３）から出発し、静置培養で継代培養した細胞をトリプシン―ＥＤＴＡ溶液（０．２５％トリプシン、０．０１４Ｍ  ＥＤＴＡ）を用い剥離した後、６００ｒｐｍ、１０分間の遠心後、細胞増殖用培地（５ｖｏｌ％仔ウシ血清、０．１１％炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、０．１％フルクトース、２０μｇ／ｍＬエリスロマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカナマイシン添加Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥ））に浮遊させた。
マイクロキャリアー（Ｃｙｔｏｄｅｘ  １（商品名））は、ＰＢＳ（−）で膨潤後、１２１℃、１５分間オートクレーブ滅菌し、細胞増殖用培地に置換して使用した。
培養装置はＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製セリジェンプラス及びセリジェンを使用し、マイクロキャリアー、細胞浮遊液を加えた後、細胞増殖用培地で最終４．８Ｌ（セリジェンの場合は３．５Ｌ）とし、培養温度：３７．０℃、溶存酸素濃度（ＤＯ）：１５％、ＰＨ：７．１５、回転数：３５〜５０ｒｐｍで行った。培地交換は、交換用培地としてＮａＨＣＯ３濃度を０．１５％とした細胞増殖用培地を用い、培養２日目から約４Ｌ／ｄａｙの量を連続的に行った（セリジェンの場合は１日おきに全量）。また、細胞数の測定はコールターカウンター（商品名）を用いて行った。
細胞培養の結果を図１に示す（３Ｈの実験のみセリジェンを使用した）。キャリアー３ｇ／Ｌでは低濃度の出発細胞数（３Ｌ、約２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で７日目に、高濃度の出発細胞数（３Ｈ、約１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）で８日目に細胞数が最大となり、その後低下を示した。また、キャリアー５ｇ／Ｌでは低濃度の出発細胞数（５Ｌ、約２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では１１日間細胞数の増加がみられたが、１２日目で細胞数は低下した。低濃度の出発細胞数の場合、キャリアー５ｇ／Ｌの総細胞数は３ｇ／Ｌと比べると１０日目で優位となったが、その差は大きくはなかった。キャリアー５ｇ／Ｌでの高濃度の出発細胞数（５Ｈ、約１０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）では９日目ではまだ細胞数の増加段階にあり、この時点で細胞数は約２．８ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなり、出発細胞数の約２．７倍に増殖した。
（ｉｉ）ポリオウイルスの培養
シードウイルスは１型ポリオウイルス（ＩＳ−９０Ｃ）を用いた。細胞数計測の最終日に、培養容量の４倍量の０．０７５％ＮａＨＣＯ３添加ＥＢＳＳで細胞を洗浄後、０．３％ＮａＨＣＯ３、２０μｇ／ｍＬエリスロマイシンおよび１００μｇ／ｍＬカナマイシン添加  Ｍ−１９９（Ｅ）培地（ウイルス培養用培地）１Ｌにシードウイルスを希釈調製した。これを洗浄後の細胞に接種し、ウイルス培養用培地をそれぞれの培養装置の培養容量まで加えた。ウイルス培養は、培養温度：３３．３℃、ＤＯ：１５％、ｐＨ：７．４０、回転数：３５〜５０ｒｐｍで行った。ウイルスのＣＰＥ（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ：細胞変性効果）によって細胞が完全にマイクロキャリアーから離脱した時点でウイルス培養を中止し、ウイルス液をハーベストした。ハーベストしたウイルス液は、−８０℃に凍結保存した。
本試験でウイルス培養は図１に示した細胞増殖曲線でのそれぞれの最終計測日に開始した。
ウイルス力価の測定は、次のようにして行なった。ローラーチューブに３日間培養したＧＭＫ−２細胞を０．０７５％ＮａＨＣＯ３、２００ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシン添加  ＨＢＳＳ  １ｍＬで２回洗浄後、細胞維持液（０．１％ウシ血清アルブミン、０．２２５％ＮａＨＣＯ３、２００ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬストレプトマイシン添加  Ｍ−１９９培地）を１ｍＬ加えた。試験ウイルス液は細胞維持液で０．５ｌｏｇ１０階段希釈し、１０−７〜１０−８．５のウイルス液を各チューブ当たり０．２ｍＬ、各希釈当たり５本のチューブに接種した。接種後、３６℃フラン室で７日間培養し、７日目のＣＰＥ観察の判定をもとにＲｅｅｄ＆Ｍｕｅｎｃｈ法により感染価（ＣＣＩＤ５０／０．２ｍＬ）を算出した。
各条件で培養したＶｅｒｏ細胞で得られたＩ型ポリオウイルスの感染価（ウイルス力価）を図２に示す。ウイルス培養の結果、９日目で約２．８ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度であったキャリアー５ｇ／Ｌの高濃度の出発細胞数の系（５Ｈ）で最も高い感染価が得られた。感染価は５Ｈ、５Ｌ、３Ｌの順であったが、これは総細胞数に一致する成績であった。また、対照においたミドリザル腎臓細胞で培養して得られたウイルス液と比べ、５Ｈの系では１０倍以上の感染価が得られた。図２に示したウイルス力価（ｌｏｇ１０ ＣＣＩＤ５０／０．２ｍＬ）は、具体的には、３Ｌが８．１８、５Ｌが８．５１、５Ｈが８．５９、Ｒｅｆ．（対照）が７．５０である。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
セービン株ポリオウイルスを接種するＶｅｒｏ細胞を、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養することによって、高力価のセービン株ポリオウイルスを得ることができる。高力価のセービン株ポリオウイルスを用いることによって、不活化セービン株ポリオウイルスを効率的に製造することができる。よって、セービン株ポリオウイルスを接種するＶｅｒｏ細胞を、約４ｇ／Ｌ〜約６ｇ／Ｌのマイクロキャリアー存在下で培養する工程を含む混合ワクチンの製造方法（本発明の製造方法）は、不活化セービン株ポリオウイルスを含有する混合ワクチンの効率的な製造方法として有用である。また、本発明の混合ワクチンは、ポリオ、百日せき、ジフテリアおよび破傷風の発症を効果的に抑制することができるので、ポリオ、百日せき、ジフテリアおよび破傷風に対するワクチンとして有用である。
【図１】
2008044611.tif 000003
【図２】
2008044611.tif 000004
【国際調査報告】
2008044611.tif 000005
2008044611.tif 000006
2008044611.tif 000007
2008044611.tif 000008