(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用し、角膜を通して前眼房へ浸透する、免疫グロブリンのFcを含まない免疫グロブリン断片またはミニボディ、眼または角膜上皮中への前記免疫グロブリン断片またはミニボディの浸透を改良するための浸透増強剤、および担体を含む、眼障害を治療または診断するための局所組成物。
【請求項２】
眼中の標的抗原と免疫的に相互作用し、角膜を通して前眼房へ浸透する、免疫グロブリンのFcを含まない免疫グロブリン断片またはミニボディ、眼または角膜上皮中への前記免疫グロブリン断片またはミニボディの浸透を改良するための浸透増強剤、および製薬的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む、眼の局所投与用に製剤化された眼用医薬組成物。
【請求項３】
免疫グロブリン断片が、合成されたFv断片、合成され安定化されたFv断片、または一本鎖Fv断片を含む、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
標的抗原が、ＭＨＣ分子、補助的刺激分子、接着分子、受容体関連分子、サイトカイン受容体及びウイルス表面抗原から成る群より選択される、請求項１〜３のいずれか1項記載の組成物。
【請求項５】
補助的刺激分子がＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ１５２から成る群より選択される、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
接着分子が、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ５４及びＣＤ６２Ｌから成る群より選択される、請求項４または５記載の組成物。
【請求項７】
受容体関連分子が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ及びＣＴＬＡ４から成る群より選択される、請求項４〜６のいずれか1項記載の組成物。
【請求項８】
サイトカイン受容体が、インターロイキン２受容体、インターロイキン２受容体のサブユニット、及びインターフェロンγ受容体から成る群より選択される、請求項４〜７のいずれか1項記載の組成物。
【請求項９】
ウイルス表面抗原がヘルペスウイルス表面抗原を含む、請求項４〜８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
ヘルペスウイルス表面抗原がｇＤ２又はｇＢ２である、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
免疫グロブリン断片がその半減期を延長するために修飾されている、請求項１〜１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
免疫グロブリン断片がポリエチレングリコールで化学的に修飾されている、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
透増強剤が、カプリン酸、ＤＭＳＯ、ジヒドロサイトカラシンＢ、ジギトニン、界面活性剤及びそれらの任意の組合せから成る群より選択される、請求項１〜１２のいずれか1項記載の組成物。
【請求項１４】
イオン導入法用に製剤化された、請求項１〜１３のいずれか1項記載の組成物。
【請求項１５】
目薬またはコラーゲン・シールドの形態で製剤化された、請求項１〜１４のいずれか1項記載の組成物。
【請求項１６】
眼障害が、角膜移植拒絶反応、ブドウ膜炎、炎症性または感染性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選ばれる、請求項１〜１５のいずれか1項記載の組成物。
【請求項１７】
炎症性または感染性疾患がウイルス性、細菌性若しくはクラミジア性結膜炎若しくは角膜炎、眼腫瘍、新生血管形成増殖病、新生血管形成黄斑症、リュウマチ性角膜融解疾患からなる群より選ばれる、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
自己免疫疾患が眼類天疱瘡である、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
免疫グロブリン断片が前記分子に結合した検出可能な標識を有する、請求項１〜１８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項２０】
標識が蛍光色素を含む、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
蛍光色素がフルオレセインである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
眼障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用し、角膜を通して前眼房へ浸透する、免疫グロブリンのFcを含まない免疫グロブリン断片またはミニボディの、該眼障害の治療用の医薬の調製のための使用であって、前記免疫グロブリン断片またはミニボディが局所投与用に眼または角膜上皮中への前記免疫グロブリン断片またはミニボディの浸透を改良するための浸透増強剤と共に製剤化されている、前記使用。
【請求項２３】
眼障害の指標となる標的抗原と免疫的に相互作用し、角膜を通して前眼房へ浸透する、免疫グロブリンのFcを含まない免疫グロブリン断片またはミニボディの、該眼障害の診断用の医薬の調製のための使用であって、前記免疫グロブリン断片またはミニボディが局所投与用に眼または角膜上皮中への前記免疫グロブリン断片またはミニボディの浸透を改良するための浸透増強剤と共に製剤化されている、前記使用。
【請求項２４】
免疫グロブリン断片が、合成されたFv断片、合成され安定化されたFv断片、一本鎖Fv断片を含む、請求項２２または２３記載の使用。
【請求項２５】
標的抗原が、ＭＨＣ分子、補助的刺激分子、接着分子、受容体関連分子、サイトカイン受容体及びウイルス表面抗原から成る群より選択される、請求項２２〜２４のいずれか１項記載の使用。
【請求項２６】
補助的刺激分子がＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ１５２から成る群より選択される、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
接着分子が、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ５４及びＣＤ６２Ｌから成る群より選択される、請求項２５または２６記載の使用。
【請求項２８】
受容体関連分子が、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ及びＣＴＬＡ４から成る群より選択される、請求項２５〜２７のいずれか１項記載の使用。
【請求項２９】
サイトカイン受容体が、インターロイキン２受容体、インターロイキン２受容体のサブユニット、及びインターフェロンγ受容体から成る群より選択される、請求項２５〜２８のいずれか１項記載の使用。
【請求項３０】
ウイルス表面抗原がヘルペスウイルス表面抗原を含む、請求項２５〜２９のいずれか１項記載の使用。
【請求項３１】
ヘルペスウイルス表面抗原がｇＤ２又はｇＢ２である、請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
免疫グロブリン断片がその半減期を延長するために修飾されている、請求項２２〜３１のずれか１項記載の使用。
【請求項３３】
免疫グロブリン断片がポリエチレングリコールで化学的に修飾されている、請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
浸透増強剤が、カプリン酸、ＤＭＳＯ、ジヒドロサイトカラシンＢ、ジギトニン、界面活性剤及びそれらの任意の組合せから成る群より選択される、請求項２２〜３３のいずれか1項記載の使用。
【請求項３５】
医薬がイオン導入法用に製剤化される、請求項２２〜３４のいずれか１項記載の使用。
【請求項３６】
医薬が目薬またはコラーゲン・シールドの形態である、請求項２２〜３５のいずれか１項記載の使用。
【請求項３７】
免疫グロブリン断片が前記分子に結合した検出可能な標識を有する、請求項２３〜３６のいずれか１項記載の使用。
【請求項３８】
標識が蛍光色素を含む、請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
蛍光色素がフルオレセインである、請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
眼障害が、角膜移植拒絶反応、ブドウ膜炎、炎症性または感染性疾患、および自己免疫疾患からなる群より選ばれる、請求項２２〜３９のいずれか１項記載の使用。
【請求項４１】
炎症性または感染性疾患がウイルス性、細菌性若しくはクラミジア性結膜炎若しくは角膜炎、眼腫瘍、新生血管形成増殖病、新生血管形成黄斑症、リュウマチ性角膜融解疾患からなる群より選ばれる、請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
自己免疫疾患が眼類天疱瘡である、請求項４０記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の分野
本発明は、一般的に、眼障害の治療及び診断に関する。より具体的には、本発明はサブ−免疫グロブリン抗原結合分子を用いる眼障害の治療方法及び診断方法に関する。
発明の背景
【０００２】  種々の眼障害が知られているが、これらの多くについての利用可能な治療方法又は診断方法は最適というには程遠い。例えば、急性前部ブドウ膜炎、すなわち虹彩及び毛様体の炎症は、一般的集団において０．４％の生涯累積発生率を有する普通に見られる状態である（ロトバら，1987，Am. J. Opthalmol. 103: 137-145)。この病気は小児期又は若い成人で始まる傾向があり、しばしば両側性であり、一般に再発する。急性前部ブドウ膜炎は苦痛が激しく、ほとんど常に何らかの病的状態と関連し、そして盲目ともなりうる。この病気は、Ｔリンパ球が制御する抗原により誘導される、遅延型過敏症応答である（スミスら，1998, Immunol. Cell Biol. 76: 497-512)。炎症を制御するため局所的コルチコステロイド類が使用されるが、それ自体白内障、ステロイド誘導性緑内障及び感染などの重大な合併症と関連する。
【０００３】  角膜移植拒絶反応は有効な治療の不足に悩まされるもう一つの眼障害である。オーストラリアにおける角膜移植の成功率は１０年で６２％である（ウィリアムズら，1993, Aust. NZ. J. Opthalmol. 21: 1-48)。不可逆的拒絶反応は角膜移植失敗の主な原因であり、全ての症例の少なくとも３０〜５０％の原因であり、そして局所的糖質副腎皮質ステロイドの普遍的使用にもかかわらず起こっている（ウィリアムズら，1993, Aust. NZ. J. Opthalmol. 21: 1-48)。シクロスポリンＡなどの全身的免疫抑制剤を用いる補助的治療が時には用いられるが、おそらく移植生存には殆ど利益を与えないであろうし、深刻な病的状態と関連し得る（ウィリアムズら，1993, Transplantation Reviews, 7: 44-64)。
【０００４】  ヘルペス性の角膜炎は三叉神経神経節の単純ヘルペスウイルス感染により惹起される（ストライラインら，1997, Immunol. Today, 18: 443-9 、ヘンドリクス, アール．エル．1997, Cornea 16: 503-6) 。ヘルペス性眼病は先進国における最も普通の感染性盲目原因であり（ストライラインら，1997, Immunol. Today 18: 443-9)、そして苦痛、虹彩炎、細菌重複感染、角膜穿孔及び盲目などの深刻な後遺症が感染した個体の３％に生ずる。上皮のヘルペス性疾患（例えば、樹枝状角膜潰瘍）は、中でもポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系テストにより容易に診断され、抗ウイルス剤でかなりの成功率で治療できる。眼ヘルペスを患う患者の５分の１で生ずる円板状の内皮炎、又は間質病（stromal disease)（例えば、円板状角膜炎、不整間質角膜炎、角膜−ブドウ膜炎）の診断及び治療は遙かに困難である。間質の生検標本中でウイルス粒子を発見することは通常はなく、このような標本からウイルスを培養することは極めて困難である。診断は通常臨床的根拠に基づき、そして排除によってなされる。局所的アシクロビルの適用はヘルペス性角膜炎に対する第一選択の治療であり（薬物耐性株の出現は懸念材料であるが）、長期間の経口予防により再発の頻度は半減する（ヘルペス性眼病研究グループ，1998, N. Engl. J. Med. 339: 300-6)。しかしながら、角膜損傷はアシクロビルでは防止されない。上皮疾患の病因は、角膜上皮細胞の増殖性の、溶解性の感染から生ずる。対照的に、間質細胞又は上皮細胞のヘルペス性疾患の病因は、角膜細胞上で発現した又は間質へ放出されたウイルス抗原に対する免疫反応から生ずる（ストライラインら，1997, Immunol. Today 18: 443-9 、ヘンドリクス, アール. エル. 1997, Cornea 16: 503-6) 。
【０００５】  アカントアメーバ角膜炎についても言及しうる。これは感染した眼の視力喪失を生じ得る極めて深刻な、苦痛を伴う病気である。普通の、自由に生きている土壌又は淡水のアメーバ（アカントアメーバ）によって惹起されるこの状態は、かっては稀であると考えられたが、過去５〜１０年の間に報告された症例の数は指数関数的に増加した。症例の９０％以上が、推奨されたレンズ洗浄や殺菌操作を守らなかったコンタクトレンズ使用者に生じた。良好な、目に見える成果を挙げるには、初期診断が最も重要である。感染の初期段階では、アメーバは角膜上皮で見出され、しばしば抗微生物薬の必要もなしに、デブリドマン（創からの異物の除去）により除去され得る（ブルックスら，1994, Cornea 13, 186-189) 。不幸にも、臨床図は感染性角膜炎、殊にヘルペス性角膜炎の他の形態に類似しうるので、この診断は遅れ勝ちである。これはこの微生物の角膜間質への浸入を許し、そこで角膜実質細胞を攻撃することを許し（バデノッホら，1995, Int. J. Parasitol. 25: 229-239) 、不可逆的な組織破壊を惹起することを許すことになる。この状態では、角膜削り取りによる研究室診断を行う試みは通常不成功に終わり、それ自体が損傷を与える深い生検は信頼性がない。
【０００６】  免疫グロブリンは様々な医学分野で広汎な診断及び治療の適用を獲得してきた。例えば、全長のモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体は移植拒絶反応の抑制に、異なる自己免疫疾患の調節に、腫瘍形成の治療に、そして感染性疾患の防止及び治療に使用されてきた。これらの目的のために抗体の全身投与が要求されるのが典型的であり、これは深刻な全身性副作用を惹き起こしうる。これらの副作用のため、眼のような絶対に必要とはいえない器官に影響する病気を治療するために抗体を全身投与することは妨げられてきた。しかしながら、上記のように、抗体治療が有利な多数の眼疾患が存在する。
【０００７】  上記の見地から、ホィットカップら（ＷＯ９３／０６８６５）は眼の炎症を治療するため細胞接着分子に対するモノクローナル抗体の使用を開示する。とりわけ、ホィットカップらは、静脈内注射により、眼房内又は眼周囲注射により、貯蔵物の外科移植により、そして目薬又は眼軟膏を用いる局所投与により、眼へのこのような抗体の投与を意図する。ホィットカップらは動物モデルで抗細胞接着分子抗体の非経口投与を可能にする方法を提供する。しかしながら、彼らはこのような抗体の局所的投与を可能にする方法を提供しておらず、そしてこのような方法の有用性を確立するためのデータについては全く沈黙している。実際、本発明者らは、通常の全長抗体のみでは局所的経路により角膜又は眼の強膜に浸入することはできないことを発見した。
【０００８】  眼に関する種々の解剖学的障壁が全長抗体の眼内浸入の困難さの根底に横たわっている。この点で、角膜は異物の浸入に対する主要な障壁である。それは二つの異なる浸入障壁を持っている。角膜上皮と角膜間質である（バースタイン及びアンダーソン，1985, J. Ocul. Pharmacol. 1(3): 309-26、モーリス，ディー．エム., 1980, Int. Ophthalmol. Clin. 20(3): 7-20、ミシマ，エス., 1981, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 21(4): 504-41)。角膜上皮は親水性物質に対する主要な障壁である。３５０Ｄａよりも小さい親水性分子は細胞側路を経て浸入することができるが、それより大きな親水性分子は実質的に阻止される。この障壁機能は浸透増強剤の使用によりある程度まで調節することができる。第二の障壁である角膜間質は親油性薬物及び大きな親水性薬物の浸入を妨害する。角膜間質は５００ｋＤａまでの親水性分子に対して「透過性」であると一様に引用されている（バートレット及びヤーヌス，Clinical Ocular Pharmacology) 。この数値は、しかし、オルソンら（1995，Inv. Ophthal. Vis. Sci., 36(9): 1893-1903)の研究とは矛盾する。オルソンらはヒトの強膜の透過性が約４０ｋＤａまでは親水性化合物の分子量の増加と共に直線的に減少し、その後その透過性は急速に減少することをイン・ビトロで明らかにした。ウシ及びウサギの間質と強膜での比較研究は、間質は僅かに透過性が高いが類似していることを示唆する（モーリス及びポルガー，1977，Exp. Eye Res. 25: 577-582)。従って、オルソンらの発見（1995, 上掲）はヒトの角膜間質に当てはまると期待されよう。
【０００９】  適用が局所（プレーヤーら、1995, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 36(1):52-6）、結膜下（オススキーら、1993, Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 231(2):122-128）又は全身（ベルハーゲンら、1990, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31(8):1519-1525）であるか否かにかかわらず、全長のＩｇＧによる無傷の目の強膜又は間質への浸入は起きるにしても非常に緩慢である。例えばリポソーム内などの脂質環境への全長のＩｇＧの製剤化は、角膜上皮を横切る移送を促進し得るが（プレーヤーら、1995, 上掲）、このサイズの分子についての間質又は強膜への緩慢な通過の問題は解決しない。
【００１０】  リポソームの被包を用いるプレーヤーら（1995、上掲）の励みになるデータにも関わらず、本発明者らはモノクローナル抗体の眼房内注射が前眼房における有害なフィブリン反応を惹起することを示した（ウイリアムズら、1992, Transplantation, 54:38-43）。この前炎症性副作用は、該抗体のＦｃ部分による局所性補体活性を反映しているかもしれない。この眼は、このような炎症性副作用により不可逆的に損傷される多数の非再生構造を含む。少なくとも一つの報告症例では、眼内抗体の炎症性副作用により患者が盲目となる結果が生じた（エム・ベンケ，バーンによる報告例、角膜移植についての国際会議での発表、ハイデルバーグ、1994年９月）。
【００１１】  上記から、長年痛感されている眼内免疫治療戦略の必要性にも関わらず、抗体は眼障害の有効な治療に対する臨床潜在能力は限られていたようである。
【００１２】 発明の概要
本発明者らは、Ｆｖ免疫グロブリン断片、ミニボディ等のサブ−免疫グロブリン抗原結合分子が、角膜に浸入し、副作用の著しく低減した眼障害の有効な治療及び／又は診断を提供できることを発見した。
【００１３】  従って、一つの側面において、本発明は、眼障害を治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、該障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子の有効量を投与する工程を含む方法を提供する。
【００１４】  本発明の別の一側面において、眼状態を診断する方法であって、
眼の一部と、該状態を示す標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子とを接触させる工程、及び
該抗原結合分子と該標的抗原を含む複合体の存在を検出する工程、
を含む方法が提供される。
【００１５】  本発明のさらなる別の一側面において、眼障害を治療又は診断するための組成物であって、担体と共に該障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子を含む組成物が提供される。
【００１６】  さらなる側面において、本発明は、眼の中の標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子を含む眼科用組成物にある。
【００１７】 発明の詳細な説明
１．定義
他に定義しない限り、本明細書で用いられる全ての専門用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の熟練者に通常理解されているものと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は等価の任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験において使用できるが、好ましい方法及び材料が記述される。本発明のために、下記の用語が以下に定義される。
【００１８】  「親和性」は、免疫反応性分子上にある個々の抗原結合部位と該抗原上にあるその対応部位との間の相互作用の強さを意味する。
【００１９】  「該障害と関連のある」とは、該標的抗原が該障害と直接的に又は間接的に結びつきうることを意味する。例えば、該標的抗原は、該眼障害を間接的に惹起する、又は該眼障害の一因となる、又は該眼障害を示すシグナル分子のエピトープでありうる。
【００２０】  「診断」という用語は、本明細書中、最も広い意味で用いられ、サブ−免疫グロブリン抗原結合分子に反応する抗原の検出を包含する。眼障害と関連のある障害機構の分析もその範囲内に包含される。従って、「診断」という用語は、眼障害と関連のある機構を検出し、理解するための道具として研究目的用にサブ−免疫グロブリン抗原結合分子を使用することを包含する。
【００２１】  本明細書で用いられるとき「有効量」という用語は、サブ−免疫グロブリン抗原結合分子の眼障害を治療又は予防する量である。該有効量は、該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子が反応する標的抗原の作用を阻害できる量でありうる。作用を阻害する方法には、眼の中の標的抗原をサブ−免疫グロブリン抗原結合分子で飽和することにより該標的抗原を無効にする工程を含みうる。
【００２２】  本明細書中の「免疫的に相互作用する」という言及には、とりわけ該分子の一つが免疫系の構成要素又はその疑似物質である場合の分子間の任意の相互作用、反応、又は他の形の会合についての言及が含まれる。
【００２３】  「眼状態」という用語は、眼の任意の状態を記載するために本明細書中で使用される。これは健康な状態又は眼の障害（眼障害）などの不健康な状態を含みうる。
【００２４】  「患者」という用語は、ヒト又は他の動物血統の患者を指し、本発明の方法を用いて検査又は治療することが望まれる任意の個体を含む。しかしながら、「患者」は症状があることを意味するものではないことが理解されよう。
【００２５】  「薬学的に許容しうる担体」とは、全身投与で安全に使用されうる固体若しくは液体の充填剤、希釈剤又は被包物質を意味する。
【００２６】  「サブ−免疫グロブリン抗原結合分子」は、免疫グロブリン分子より小さく且つ標的抗原に対して結合親和性を有する分子を意味する。この用語は抗原結合活性を呈し且つ非免疫グロブリンに由来するタンパク質の枠組みにまで及ぶことが理解されよう。この用語は、該抗原結合分子をコードする任意のヌクレオチド配列がそれから得られる供給源又は該抗原結合分子がそれから発現する若しくは単離される供給源によって制限されるものではないことも理解されよう。
【００２７】  「標的抗原」とは、治療又は診断が求められる眼障害と関連のある抗原を意味する。
【００２８】  「治療する」という用語は、本明細書中では最も広い意味で用いられ、該眼障害を改善することを意図した治療処置及び予防（即ち、防止）処置の両方を含む。
【００２９】  この明細書を通して、文脈が他の意味を要求しない限り、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」及び「含む(comprising)」は、明記した完全体又は完全体の群を包含するが任意の他の完全体又は完全体の群を排除しないことを意味するものであることが理解されよう。
【００３０】２．サブ−免疫グロブリン抗原結合分子
本発明は、サブ−免疫グロブリン抗原結合分子が眼に局所的に適用された場合相当のレベルまで角膜に浸入できるという予期せぬ発見に由来する。この発見に基づき、本発明者らは、このような分子の眼への浸入が非経口投与及び眼周囲注射を含む代替経路によっても達成できると考える。
【００３１】  眼障害を治療するためには、本発明のサブ−免疫グロブリン抗原結合分子が下記の条件を満たすことが好ましい。第一に、何らかの全身性副作用を回避又は少なくとも部分的に軽減するように該分子を眼に適用することが望ましい。第二の条件は、これらの結合分子が眼の内部に如何なる潜在的に有害な前炎症性副作用をも惹起してはならないことである。
【００３２】  適切なサブ−免疫グロブリン抗原結合分子は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2の免疫グロブリン断片を含むが、これらに限定されない。該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子は免疫グロブリン分子のＦｃ部分を含まないことが好ましい。
【００３３】  該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子は合成されたＦｖ断片を含むことが好ましい。この合成されたＦｖ断片は安定化されていることが好ましい。合成され安定化されたＦｖ断片の例には、ペプチドリンカーを用いてＶHドメインのＮ末端又はＣ末端とＶLドメインのＣ末端又はＮ末端とをそれぞれ架橋した一本鎖Ｆｖ断片が含まれる（ｓＦｖ、しばしばｓｃＦｖと称する）。ＳｃＦｖは全長の抗体の定常部を全て欠き補体を活性化できない。ＶHドメインとＶLドメインを連結するための適切なペプチドリンカーは、該Ｆｖ断片が由来する全長の抗体の抗原結合部位のものと類似した三次元構造の抗原結合部位を有する一本鎖ポリペプチド鎖になるように、ＶHドメインとＶLドメインを折りたためるリンカーである。所望の性質を有するリンカーは米国特許第4,946,778号に開示されている方法によって得てもよい。この開示は参照により本明細書にインコーポレートされる。しかしながら、リンカーが存在しない場合もある。合成されたＦｖ断片の例は図１に示される。
【００３４】  ｓｃＦｖは、例えばクレーバーら（クレーバーら、1997、J. Immunol. Methods; 201(1):35-55）で略述される方法に従って調製されうる。この開示は参照により本明細書にインコーポレートされる。または、ｓｃＦｖは、米国特許第5,091,513号、欧州特許第239400号、又はウィンターとミルスタイン（1991、Nature 349:293）及びプリュックツンら（1996, In Antibody engineering: A practical approach 203-252）による論文に記載されている方法により調製されうる。これらは参照により本明細書にインコーポレートされる。
【００３５】  または、合成され安定化された該Ｆｖ断片は、完全に折りたたまれたＦｖ分子においてこれら二つのシステイン残基が該ドメイン間でジスルフィド結合を形成するようにシステイン残基がＶHドメインとＶLドメインに導入されている、ジスルフィド安定化されたＦｖ（ｄｓＦｖ）を含む。ｄｓＦｖを作製する適切な方法は、例えば（グロックスクーザーら、Biochem. 29:1363-1367；ライターら、1994、J. Biol. Chem. 269: 18327-18331；ライターら、1994、Biochem. 33: 5451-5459；ライターら、1994、Cancer Res. 54:2714-2718；ウェバーら、1995、Mol. Immunol. 32:249-258）に記載されている。これらは参照により本明細書にインコーポレートされる。
【００３６】  例えば（ヴァードら、1989、Nature 341:544-546；ハマース−キャスターマンら、1993、Nature. 363:446-448；デービス＆リーッチマン、1994、FEBS Lett. 339:285-290）に開示されたような一本鎖可変領域ドメイン（ｄＡｂｓと称される）もサブ−免疫グロブリン抗原結合分子として意図されている。これらは参照により本明細書にインコーポレートされる。
【００３７】  該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子は「ミニボディ」であることが好ましい。この点において、ミニボディは全長の抗体の小型版であり、全長の抗体の必須要素を一本鎖の中にコードしている。該ミニボディは、例えば参照により本明細書にインコーポレートされる米国特許第5,837,821号で開示されたように、ヒンジ領域と融合した天然抗体のＶHドメイン及びＶLドメイン並びに該免疫グロブリン分子のＣＨ３ドメインを含む。
【００３８】  代替の実施態様において、該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子は非免疫グロブリンに由来するタンパク質枠組みを含みうる。例えば、抗原結合について選択された相補性決定領域（ＣＤＲ）を生み出すため無作為抽出された二つのループを有する４ヘリックス束タンパク質であるチトクロームｂ５６２を開示する（クー＆シュルッツ、1995, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 92:652-6556）を参照してもよい。
【００３９】  該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子は修飾部分を含んでもよい。一つの形態において、該修飾部分は該分子のエフェクター機能を可変しうる。例として、該修飾部分は、例えば免疫検定法における該抗原結合分子の検出用のペプチドを含みうる。または、該修飾部分は該抗原結合分子の精製を促進しうる。この場合、該修飾部分は、アフィニティークロマトグラフィーによる該抗原結合分子の単離に特に有用なグルタチオン−S−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルト−ス結合タンパク質（ＭＢＰ）及びヘキサヒスチジン（ＨＩＳ6）を含むが、これらに限定されない。アフィニティークロマトグラフィーにより精製するために、アフィニティークロマトグラフィー用に適切な媒体は、当分野でよく知られているようにグルタチオン、アミロース、及びニッケル又はコバルトにそれぞれ結合した樹脂である。該修飾部分は、少なくとも眼の一部を標的とする治療剤を含みうる。または、該修飾部分は、例えばフィブリン溶解酵素（ホルボエットら、1991, J. Biol. Chem. 366:19717-19724；ヤングら、1994, Biochem. 33:606-612）又はプロドラッグ活性化剤（ボスレットら、1992, Br. J. Cancer, 65: 234-238；ゴスホーンら、1993, Cancer Res., 53:2123-2127；ロッドリギュースら、1995, Cancer Res., 55:63-70）等の潜在的な治療上の利点をもつ酵素及び免疫検定法で用いるために比色検定を可能とする酵素などの酵素類をを含みうる。他の形態において、該修飾部分は該抗原結合分子の眼内浸入を増加させうる。この場合、該修飾部分は、例えばバールら（1998, Adv. Drug Delivery Reviews 32: 247-271、参照により本明細書にインコーポレートされる）により記述されているような脂質部分又は脂質尾部を含みうる。または、該修飾部分は、例えば、参照により本明細書にインコーポレートされるシュヴァルゼら（1999, Science 285: 1569-1572）により記載されているようなＨＩＶ・ｔａｔタンパク質を含みうる。
【００４０】該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子が、非経口的に若しくは局所的に投与される際に、又は結膜下、眼球周囲若しくは眼球後のスペースに注射される際に、又は眼に直接注射される際に、それが眼へ浸入できるならば、多価（即ち、一つ以上の抗原結合部位を有する）であってもよい。このような多価分子は一つ以上の抗原に対して特異的でありうる。この型の多価分子は、例えば、参照により本明細書にインコーポレートされる（アダムスら、1993, Cancer Res. 53:4026-4034；カンバーら、1992, J. Immunol. 149:120-126）により開示されているようにシステイニルを含むペプチドを介する二つの抗体断片の二量体化により調製されうる。または、二量体化は、自然に二量体化する両親媒性ヘリックスへの該抗体断片の融合（パック・ピイ・プリュンクツム、1992, Biochem. 31:1579-1584、参照により本明細書にインコーポレートされる）により又は好ましくはヘテロ二量体化するドメイン（ロイシン・ジッパーのｊｕｎ及びｆｏｓ等の）の使用（コステルニーら、1992, J. Immunol. 148: 1547-1553、参照により本明細書にインコーポレートされる）により促進されうる。代替の実施態様において、該多価分子は、ペプチドリンカーにより互いに連結された少なくとも二つのｓｃＦｖを含む多価の一本鎖抗体（多価−ｓｃＦｖ）を含みうる。この点において,「ジアボディズ（diabodies）」と称される非共有結合で又は共有結合で連結したｓｃＦｖ二量体が使用されてもよい。多価ｓｃＦｖは、異なる抗原結合特異性を有するｓｃＦｖの使用数に応じて二以上の特異性を有しうる。多価ｓｃＦｖは、例えば、参照により本明細書にインコーポレートされる米国特許第5,892,020号に開示されている方法により調製されうる。
【００４１】３．組成物
本発明は眼障害の治療又は診断で使用するための組成物にも及び、該組成物は該障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子を担体と共に含む。
【００４２】  該担体は薬学的に許容しうる担体が好ましい。具体的な投与経路に応じて、当分野で周知の種々の薬学的に許容しうる担体が使用されうる。これらの担体は、糖、澱粉、セルロース及びその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、燐酸緩衝溶液、乳化剤、等張食塩水、及びパイロジェン・フリーの水を含む群から選択されうる。
【００４３】  本発明の組成物を患者に投与するために任意の適切な投与経路が使用されうる。例えば、経口、直腸、非経口、舌下、頬、静脈内、関節内、筋肉内、皮内、皮下、吸入、眼内、腹腔内、脳室内、経皮等が使用されうる。非経口的経路又は局所的経路を用いることが好ましい。または、該組成物は結膜下、眼球周囲、又は眼球後のスペースへの注射により投与されることが好ましい。
【００４４】  投与剤形には、錠剤、分散液、懸濁液、注射液、溶液、シロップ、トローチ、カプセル、及び座薬、エアロゾル、コラーゲンシールド、経皮貼付薬等が含まれる。これらの投与剤形は、この目的のため特に設計された注射若しくは移殖用の制御放出装置又はさらにこの様式で作用するよう修飾された移殖片の他形態も含みうる。該抗原結合分子の制御放出は、例えば、アクリル樹脂、ワックス、高級脂肪族アルコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの幾つかのセルロース誘導体で上記のものを被覆することにより達成されうる。さらに、制御放出は、他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又は微小球の使用により達成されうる。
【００４５】  経口投与又は非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、各々が予め決められた量の一つ以上の本発明の治療薬を含んでいるカプセル、サシェ若しくは錠剤などの個別の単位として、粉末若しくは顆粒として、又は水溶液、非水溶液、水中油乳濁液、若しくは油中水乳濁液の溶液若しくは懸濁液として提供されうる。このような組成物は任意の製薬方法により調製されうるが、全ての方法には上記の一つ以上の免疫原薬物と一つ以上の必要成分から成る担体とを混合する工程が含まれる。一般的に、該組成物は、本発明の抗原結合分子を液体の担体若しくは微細に粉砕された固体の担体若しくはそれら両方と均一によく混合した後、必要ならば該産物を所望の体裁に形状化することにより調製される。
【００４６】  上記の組成物は、投与製剤に適合する様式で、そして患者の眼障害を軽減するために治療上有効な量で投与されうる。患者に投与される用量は、本発明の文脈において、血液流失の減少又は停止などの有益な応答を患者に長期間にわたって生じさせるのに充分なものであるべきである。投与される該抗原結合分子（単数又は複数）の量は、治療される患者の年齢、性別、体重及びその一般健康状態を含め、該患者に応じて決定されうる。この点で、投与のための該抗原結合分子の正確な量は、開業医の判断によって決まる。眼障害の治療で投与される該抗原結合分子の有効量を決定する際に、医師は長期間にわたる該障害の経過を評価してもよい。いずれにしても、当業者は、本発明の該抗原結合分子の適切な用量を容易に決定しうる。このような用量は該抗原結合分子のナノグラムからミリグラムのオーダーでありうる。
【００４７】  該組成物は、７．０から８．０までｐＨを高める、塩化ベンザルコニウム、ジギトニン、ジヒドロサイトカラシンＢ、カプリン酸などの浸透増強剤を含むことが好ましい。該浸透増強剤は、角膜上皮を通り抜ける該抗原結合分子の浸入を増強させるものであることが好ましい。
【００４８】  該組成物は、本発明の抗原結合分子が被包されているリポソームを含むことが好ましい。活性物をリポソーム被包する任意の適切な手法が意図される。この点で、例となる方法は、フラスタら（1999, J. Pharm. Pharmacol. 51(5):565-576）及びマスダら（1996, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37(9): 1914-1920）によって開示されており、これらは参照により本明細書にインコーポレートされる。
【００４９】  本発明の抗原結合分子の半減期は、所望ならば任意の適切な手法により延長されうる。このような分子は、例えば、参照により本明細書にインコーポレートされるチャップマンら（1999, Nature Biotechnology 17: 780-783）により開示されているように、モノメトキシ−ポリエチレングリコールを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学的に修飾されていることが好ましい。
【００５０】  適切な標的抗原には、クラスＩ又はクラスIIに限定されるＭＨＣ分子を含むＭＨＣ分子、補助的刺激分子（例えばＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ１５２）、接着分子（例えば、ＣＤ１１b/e、ＣＤ１８、ＣＤ５４及びＣＤ６２Ｌ）、受容体関連分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ及びＣＴＬＡ４）、サイトカイン受容体（例えば、インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）、又はＣＤ２５などのそのサブユニット、及びインターフェロンγ受容体（ＩＦＮ−γＲ）、並びにウイルス表面抗原（例えば、ヘルペス単純ウイルスのｇＤ２抗原及びｇＢ２抗原又はヘルペス性角膜炎を惹起するヘルペスウイルスの表面抗原）が含まれることが好ましいが、これらに限定されない。
【００５１】  本発明は、眼の中の標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子を含む眼科用組成物も提供する。
【００５２】４  投与方法
本発明のさらなる特徴は、眼障害を治療する方法であって、このような治療を必要とする患者に、該障害と関連のある標的抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子の有効量を投与する工程を含む方法である。
【００５３】  該眼障害は、眼と関連のある任意の病気又は障害でありうる。一般的に、該障害は、眼に直接影響を及ぼす眼の病気である。眼と関連のある病気又は障害は、他の身体部分に起因し、且つ、主となる病気若しくは障害の副作用として間接的に眼に影響を及ぼす病気又は障害でありうる。
【００５４】
典型的な病気又は障害には、角膜移植拒絶反応、ブドウ膜炎、任意の眼の感染、ウイルス性（ヘルペス性角膜炎及びアデノウイルス性）、細菌性若しくはクラミジア性結膜炎などの炎症性及び感染性疾患、眼腫瘍、糖尿病網膜症などの新生血管形成増殖病、新生血管形成黄斑症、リュウマチ性角膜融解疾患及び眼類天疱瘡などの自己免疫障害が含まれる。
【００５５】  本方法は、有効量の該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子を患者に投与する工程を含む。該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子は、局所的に眼の一部に投与するか、又は、例えば結膜下、眼球周囲若しくは眼球後のスペースなどの眼内に若しくは直接眼内に注射しうる。あるいは、該抗原結合分子を非経口的投与 (parental administration)により全身に投与してもよい。
【００５６】  該抗原結合分子は局所的に且つ目薬として眼に適用することが最も好ましい。この目薬は角膜（眼の中心にある透明な部分）に適用されることにより該分子が眼内に浸入できうる。眼の後部に影響を及ぼす病気の治療のためには、該抗原結合分子を結膜の下に又は眼球の周囲に注射する際に該分子が強膜に浸入することがおそらく最も望ましい。
【００５７】  該抗原結合分子の投与は、該分子の浸入を改良するため眼の表面を調節する予備工程後に実施されうる。角膜上皮などの上皮層は、例えば上記の分子を十分に且つ迅速に浸入させるために、浸透増強剤により調節されることが好ましい。
【００５８】  または、該投与工程は、該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子が所望の眼内領域に浸入するよう眼の少なくとも一部をイオン電気導入法に付す工程により特徴付けられる。この点で使用されうる適切な方法には、例えば、参照により本明細書にインコーポレートされるベハール−コーエンら（1998, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39(6): 897-904）及びフルヒト−ペリーら（1996, Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 234(12): 765-9）により開示されているものが含まれる。
【００５９】  該抗原結合分子を投与するのに好ましい眼内部分又は眼上部分は、該抗原結合分子が浸入できる部分である。上述したように、投与は角膜上及び結膜上に施されることが好ましく、又は該物質は結膜下、眼球周囲若しくは眼球後のスペース内に注射され、強膜を通って浸入した後に眼の内側に到達しうる。
【００６０】５  診断方法
本発明は、眼状態を診断する方法であって、該状態を示す抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子と眼の一部を接触させる工程、及び該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子と該抗原を含む複合体の存在を検出する工程を含む方法にも及ぶ。
【００６１】  好ましい側面において、本発明は、眼障害を診断する方法であって、該障害と関連のある抗原と免疫的に相互作用するサブ−免疫グロブリン抗原結合分子と眼の一部を接触させる工程、及び該サブ−免疫グロブリン抗原結合分子と該抗原を含む複合体の存在を検出する工程を含む方法を提供する。
【００６２】  該状態を示す抗原は、該眼状態と直接的又は間接的に関連のある抗原でありうる。これは標的抗原又は該眼状態の副産物として生じる分子の抗原でありうる。
【００６３】  眼の中に標的抗原が存在するか否かは、例えば上記の第４節に記載されているように該抗原結合分子を眼に投与することにより決定されうる。該抗原結合分子は目薬として又は眼周囲注射により眼に投与されることが好ましい。
【００６４】  続いて、該複合体の検出が行われる。該複合体の形成を測定するために任意の適切な技法が使用されうる。例えば、標的抗原のインビボ検出に適用できる免疫検定において、検出可能な標識を有する本発明のサブ−免疫グロブリン抗原結合分子が利用されうる。免疫検定は、当分野で理解されるような競合検定を含みうる。
【００６５】  該抗原結合分子と結合した標識は、下記のものを含みうる：
（ｉ）該抗原結合分子への該標識の直接的な付着；
（ii）該抗原結合分子への該標識の間接的な付着、即ち、他の検定試薬に該標識を付着させた後、該試薬を該抗原結合分子に結合させる；
（iii)該抗原結合分子の後の反応生産物への付着。
該標識は、色素原、触媒、酵素、蛍光色素、化学発光分子、ユーロピウム（Ｅｕ34）などのランタニドイオン、放射性同位元素、及び直接的可視標識を含む群から選択されうる。
【００６６】  直接的可視標識の場合、コロイド金属粒子若しくは非金属粒子、色素粒子、酵素若しくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、又はシグナルを生じる基質等を含む他の小胞が使用されうる。
【００６７】  標識としての使用に適した多数の酵素が合衆国特許明細書U.S.4,366,241、U.S.4,843,000及びU.S.4,849,338に開示されており、これらは全て参照により本明細書にインコーポレートされる。本発明に適した有用な酵素標識には、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等が含まれる。この酵素標識は、単独で又は溶液中に存在する第二の酵素と組合わせて使用されうる。
【００６８】  該蛍光色素は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＬ）又はＲ−フィコエリスリン（ＲＰＥ）を含む群から選択されることが好ましい。
【００６９】  画像適用に好ましい同位元素は、その物理的性質、入手費用及び安全性から99mＴｃである。この放射金属による標識を促進するために、ｓｃＦｖなどの抗原結合分子を、Ｎ3Ｓ配位部位内で99mＴｃとキレートするように設計された短鎖ペプチドと融合する（フストンら、1996, Quarterly Journal of Nuclear Medicine,印刷中；ジョージら、1995, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 92:8358-8363）。得られる分子は一工程反応で容易に標識され、元のｓｃＦｖの免疫原性を保持する極めて安定な生産物を生じる。
【００７０】  本発明は以下の実施例を参照してより詳細に記述される。しかしながら、下記の記述は単に説明上のものであり、いかなる意味でも、上述した本発明の一般性を限定するものと解釈されるべきでないことを理解すべきである。
【００７１】 実施例
実施例１
ｓｃＦｖ抗体断片及び二価ミニ抗体の眼内侵入
ｓｃＦｖ抗体断片及び二価ミニ抗体の工学及び発現
該抗体工学用の出発材料はＯＸ３８であった。これはラットのＣＤ４抗原に対して特異的に結合する全長の抗体を生産するハイブリドーマ細胞系統であった。該ｓｃＦｖ抗体断片のための工学工程は、クレーバーら（1997, J Immunol Methods 201(1):35-55）及びプリュックツンら（大腸菌における抗体の生産：ＰＣＲから発酵まで、マックカフェリー・ジェイ、フーゲンブーム・エイチ、チスウェル・ディ編、抗体工学：実践的アプローチ、オックスフォード：オックスフォードユニバーシティープレス、１９９６年：２０３−２５２（ハーメス・ビイ編、実践的アプローチシリーズ））により記載されている技法通りに行った。要するに、ｍＲＮＡを増殖中のハイブリドーマ細胞系統から抽出し、該ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。該抗体の軽鎖及び重鎖の可変部についての遺伝情報は、クレーバーら（上掲）及びプリュックツンら（上掲）によって記載されているように、伸長されたプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により個別に増幅した。両鎖のＤＮＡ生産物は共にスプライシングしｐＡＫ１００ベクターに挿入した。該ベクターは大腸菌ＪＭ８３（エイ・プリュックツンから贈与された）を形質転換するために使用した。ｓｃＦｖ断片を大腸菌中で発現し培養上清から回収した。これらの断片は、ラットＣＤ４抗原の供給源としてラットの胸腺細胞を用いてフローサイトメーターでそれらの結合活性について試験した。
【００７２】  大規模生産のため、機能的ｓｃＦｖをコードする挿入物を該ｐＡＫＩ１００ベクターから切り出しｐＨＢ４００ベクターに組込んだ。このｐＨＢ４００ベクターは、ｐＨＢ１１０ベクター（ボスマンら、1998, Nat. Biotechnol. 16(4):376-80）から得られるｓｋｐ共発現カセットをｐＡＫ４００ベクター（クレーバーら、上掲）に組込んで誘導した。該ｐＨＢ４００ベクターは、ｓｃＦｖ発現を最適化するための強力な翻訳開始領域（シャイン−ダルガーノＳＤＴ７ｇ１０配列）、固定化金属イオン−アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製のための６−ヒスチジン標識、及びｓｋｐの共発現用のカセットを含む。ｓｋｐは細胞周辺腔における正しいｓｃＦｖの折りたたみを改良するシャペロンである。
【００７３】  二価ミニ抗体としてのｓｃＦｖ断片の発現のため、ｓｃＦｖ配列をもつ該挿入物をｐＨＢ５４０ベクターに連結した。該ベクターはｐＡＫ５００（クレーバーら、上掲）から得られるｓｃＦｖ二量体化カセットをｐＨＢ４００ベクターに添加することにより構築した。この手段により、二つの一価断片を非共有結合的に二量体化して６６ｋＤａのサイズをもつ二価ミニ抗体を形成させる抗体のヒンジ領域に由来するさらなる二重らせんモチーフを備えたｓｃＦｖ断片を発現させることができる。。
【００７４】大腸菌の発酵
ｓｃＦｖ又はミニ抗体を発現させるため、上記ベクターを用いて大腸菌ＨＢ２１５１又は大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。細菌培養物は、非常に良いブロス複合培地を用いてプリュックツンら（上掲）により記載されているものと類似した２０Ｌ容のベンチトップ型発酵槽中で培養した。培養物は、２５℃で、２０の光学密度（ＯＤ600nm）で、0.1ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加によりタンパク質の発現を誘導した。３から４時間の発現の後、培養物をベックマンＪ２１遠心分離機（4000×ｇ、４℃で２５分間）で回収し、細菌ペレットは即座に処理するか又は−７０℃で保存した。
【００７５】ｓｃＦｖ及びミニ抗体の精製
正しく折りたたまれ且つ機能的なｓｃＦｖ又はミニ抗体を得るために、該細菌ペレットを、１グラムのペレットにつき２ｍＬの抽出緩衝液を用いて50ｍＭのホウ酸ナトリウム（ＮａＢｏ）、0.15ＭのＮａＣｌ、ｐＨ8.0に再懸濁し、細菌をマントン−ガウリン・フロースルーホモジナイザーでの超音波処理により破砕した。溶菌液は４℃で３０分間13,000ｘｇで遠心分離した後、該ｓｃＦｖ又はミニ抗体を含む上清を0.2μｍのフィルターに通し、そして１％のトリトンＸ−100、１％のトゥィーン−２０及び２０ｍＭのイミダゾールで補足した。清澄化された溶菌液をニッケル−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂（キアーゲン社、キアイクスプレッショニスト、キアーゲン、ドイツ、1999年）で充填したＩＭＡＣカラムにかけた。このカラムを２０カラム容量（ＣＶ）の平衡緩衝液（５０ｍＭのＮａＢｏ、１％のトリトンＸ−１００、１％のトゥィーン−２０、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）及び５ＣＶの５０ｍＭのＮａＢｏ、２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０で洗浄した。結合タンパク質は２０〜５００ｍＭのイミダゾ−ルの直線勾配を用い１０ＣＶ以上でカラムから溶出した。タンパク質を含む画分をプールし、Ｑ−セファロース−ＨＰ陰イオン交換カラムにかけ、２０ｍＭのヘペス緩衝液（Ｎ−[２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ′−[４−ブタンスルフォン酸]）ｐＨ８．０で平衡化した。非結合タンパク質を３ＣＶの平衡緩衝液で洗浄した後、結合タンパク質を０〜１ＭのＮａＣｌの直線勾配を用い７ＣＶ以上の２０ｍＭのヘペス、ｐＨ８．０中に溶出した。精製されたｓｃＦｖ又はミニ抗体を含む画分をプールし、滅菌濾過しそして４℃で２×１５０容量の２０ｍＭのヘペス、ｐＨ8.0、0.15ｍＭのＮａＣｌに対して透析した。試料は精製工程間で採取しＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を用いて分析した。好ましい実施態様においては、この精製分子は、その半減期を延長するためにチャップマンら（1999, Nature Biotechnology 17: 780-783）の手法を用いてモノメトキシ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で化学的に修飾される。
【００７６】抗原結合についてｓｃＦｖを試験する
抗原結合についてのｓｃＦｖ断片に関する全ての試験は、ラットの胸腺細胞を基にフローサイトメトリーにより実施した。胸腺細胞の懸濁液を、採取したばかりのラットの胸腺組織を基にして標準的な実施要綱により調製した。５０μＬのＲＰＭＩ培養液に懸濁された胸腺細胞（５ｘ１０5）を検定チューブごとに使用した。高感受性フローサイトメトリー検定は、ｓｃＦｖ（５０μＬの試料）、抗ポリＨｉｓマウス抗体（５０μＬ、２００倍に希釈、シグマ社）、ビオチン化ヤギ抗マウス抗体（５０μＬ、５０倍に希釈、ベクター社）及びストレプトアビジンＲ−フィコエリスリン複合体（５０μＬ、５０倍に希釈、シグマ社）について３０分間のインキュベーション工程を用いて４℃で実施した。細胞はインキュベーションの間に３０容量のＰＢＳ−アジドで洗浄した。検定は５０μＬの固定液（ＰＢＳ、０．５％のホルムアルデヒド）を添加することにより固定し、フローサイトメーターで読み取った。
【００７７】角膜浸透実験
角膜組織
ｓｃＦｖ、ミニ抗体及び全長のＩｇＧ抗体の浸透は、実験の２〜５時間前に地方の食肉処理場で食用に屠殺された正常な８〜１４月齢のブタの眼で試験した。移殖の臨床用途に適さなかったヒトの眼１個を地方のアイバンクから入手し、摘出後２時間以内に使用した。他の実験上の理由で医学及び獣医学研究所（アデレード、南オーストラリア）の動物小屋で飼育され屠殺されたネコから得た四つの角膜を摘出の３時間以内に使用した。
【００７８】  角強膜ボタンは標準的なアイバンク技法を用いて解剖した。組織の調製又はチャンバー上への載積の間の角膜変形を防ぐために格別の注意が払われた。なぜなら、これは障壁機能の無傷状態に悪影響を及ぼしうるからである。間質浸透のみを研究するため使用した眼において、この角膜上皮は角強膜ボタンの調製前にno.11の外科用メス及び乾燥した綿棒を用いて慎重に取出した。
【００７９】角膜浸透の実験設定
角膜潅流チャンバー
ネコ及びブタの角膜を通過するｓｃＦｖのインビトロの浸透を角膜潅流チャンバーで研究した（図２）。該潅流チャンバーは、本体、クランピングスリーブ（clamping sleeve）及び固定リングの三つの部分から構成される。全ての部分がポリカーボネートから作製される（生物医学工学センターで製造された、フリンダース・メディカル・セントレ、アデレード）。該クランプの後側部を形成する該本体の「肩」は、ヒト、ブタ及びネコなどの異なる種から得られる角膜の元々の湾曲を支持するため３０°曲げられている。載せられた角膜と共に受容側上のチャンバーを形成する中心腔は直径１２ｍｍで深さ３ｍｍである。本体には潅流の流入及び流出のためのチャンネルもある。上皮側から本体へ角膜を留める該クランピングスリーブは、ねじれのない垂直移動を指示するためそして組立て中に起こりうる角膜へのせん断応力及び角膜の縁の損傷を防ぐために二つのステンレス製のガイドピンを有する。該クランピングスリーブは、涙液排水を模倣して適用された目薬を吸収し得る流体チャネルをも含む。その表面上にある角膜及びクランピングスリーブは固定リングにより本体のチャンバーに押しつけられており、該リングは非常に精確な固定力の調整ができる細い糸（１ｍｍのピッチ）を有する。一度、該角膜を適切に載せると、全チャンバーは暖水が水浴から循環している熱交換ブロックに連結される。
【００８０】角膜組織の評価
組織の生存能力は、角膜の厚さを携帯型厚度計（ＢＶＩポケット厚度計、Ｂ．Ｖ．インターナショナル、６３１００クラーモント−フェランド、フランス）で測定することにより全実験中３０分ごとに機械的に評価した。各実験の初めに、該角膜を一時間潅流し、次の３０分間で３以上の個別の測定により角膜の厚さの基線値を確立した。次の実験中に基線値から１０％以上の厚さの増加があれば、上皮の機能障害とみなされ、この角膜は廃棄された。
【００８１】  ｓｃＦｖ、ミニ抗体、全長のＩｇＧ抗体又はフルオレセインなどの実験用の薬物は、純粋な形で又は異なる浸透増強剤を補足して、該角膜の上皮側に２０から３０分ごとに目薬として投与した。該潅流チャンバーは、該角膜の受容側上に、ＢＳＳ−プラス（アルコン社）で充填された人工眼内スペースを形成した。該人工眼及び該貯蔵庫を連続的に循環するＢＳＳ−プラス溶液の総容量は４ｍＬであった。該人工眼のレベルより２５ｃｍ上まで該溶液貯蔵庫を上昇させるとチャンバー内に１２ｍｍＨｇの陽圧を生じ、生理状態を刺激した（図２）。
【００８２】  薬剤浸透を評価するために、一時間ごとに100μLの試料を該受容側上の該循環液から採取し同容量の新鮮なＢＳＳ−プラスと置き換えた。ｓｃＦｖ、ミニ抗体及び全長のＩｇＧ抗体の浸透は、ＣＤ４抗原の供給源としてのラットの胸腺細胞及びマウスの抗ポリＨＩＳ標識第二抗体（シグマ社）を用いて標準的なフローサイトメトリー（ゾラら、1990, J Immunol Methods 135(1-2):247-55）法により測定した。フルオレセインナトリウムの浸透は、適切なフィルターを備えたＥＬＩＳＡ読み取り機を用いて４９３ｎｍの吸収を測定することにより評価した。
【００８３】全眼浸透の実験設定
無傷の結膜組織をもつヒト又はブタの眼全体を、ウエル中で角膜が下方に向くように置くためにテフロンの表面に造形されたくぼみを備えるテフロンブロック上に配置した（図３）。このウエルは100μＬのｓｃＦｖ又はミニ抗体で部分的に満たされていた。角膜を除く他の組織が該薬物と接触しないよう注意を払った。全眼は湿潤チャンバーを形成するように伏せたプラスチックの容器で覆い、この実験設定全体を３５〜３７℃の温度に該眼を保つよう水浴上に配置した。インキュベーション期間の最後に、全眼球をＢＳＳで数回洗浄し、ティッシュペーパーで乾燥し、そして再度洗浄した。前眼房液の試料は、角膜から前眼房へ通り抜ける２７Ｇの注射針を用いて回収した。浸透したｓｃＦｖ及びミニ抗体の濃度は、潅流チャンバー実験設定の場合と同様にＦＡＣＳ検定で評価した。
【００８４】  全実験の最後に、角膜を緩衝ホルマリン（ＰＢＳ中１０％のホルマリン）で固定し、パラフィンに包埋した。標準的な１０μｍの切片はＰＡＳで染色し、顕微鏡の下で調べた。
【００８５】結果
ｓｃＦｖ及びミニ抗体の精製
ニッケル−ＮＴＡ精製カラムから得られた溶出液は、ＯＸ３８ｓｃＦｖについては５２％の純度で0.5ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を、そしてＯＸ３８ミニ抗体については２１％の純度で0.74ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度をそれぞれ有した。Ｑ−Sepharose(商標）陰イオン交換カラムでの次の精製により、９８％の純度で３．９８ｍｇ／ｍＬの最終濃度のｓｃＦｖ及び７５％の純度で１．８３ｍｇ／ｍＬの濃度のミニ抗体を得た。ニッケルカラム及び次のイオン交換カラムの二工程精製計画により、内毒素のレベルがわずか1.08内毒素単位（ＥＵ）／ｍｇのｓｃＦｖ及び３６ＥＵ／ｍｇのミニ抗体という臨床グレードの純度を得た。
【００８６】  ニッケルカラムでの第一精製工程の後、ｓｃＦｖバッチ内の主な夾雑物はロタマーゼ（ペプチジル−プロピルシス−トランスイソメラーゼ、ＳＬＹＤ）及びヒストン様タンパク質のＨＬＰ１であった。ロタマーゼはヒスチジンの豊富なタンパク質であり、ニッケルカラム上のｓｃＦｖ断片とは無関係に共精製されるらしい。これは次のＱ−セファロースカラムでの精製により効率よく除去された。第二の夾雑物であるＨＬＰ１はヒスチジン、システインを含まず、トリプトファンも含まない。そのため、ＨＬＰ１は該ｓｃＦｖか又はロタマーゼに付着してニッケルカラムで共精製されたと仮定した。ＨＰＬ１が9.5の等電点を有することに基づき、本発明者らはこの夾雑物をｐＨ８．０のＱ−Sepharose（商標）陰イオン交換クロマトグラフィーにより除去できると予測した。しかしながら、ＨＬＰ１はこのクロマトグラフィー工程後の最終産物中にも見出された。このことは、ＨＬＰ１が精製工程でＯＸ３８ｓｃＦｖ断片の一部に結合して運ばれたに違いないことを示している。ＨＬＰ１は15.6ｋＤａのサイズを有し、夾雑ｓｃＦｖ分子の有効サイズを４３ｋＤａまで増大する。
【００８７】  本研究において浸透実験に使用したｓｃＦｖ断片はニッケルカラムのみで精製し、0.2〜0.25ｍｇ／ｍＬの最終ｓｃＦｖ濃度を有していた。浸透実験に使用したミニ抗体は完全な二工程精製プロトコルを受け、1.8ｍｇ／ｍＬの最終ミニ抗体濃度を有していた。
【００８８】ラットのＣＤ４抗原に対するｓｃＦｖの特異性
ラットのＣＤ４抗原へのｓｃＦｖの結合は、ラットの胸腺細胞を用いてフローサイトメトリー検定で試験した。全長のモノクローナル抗体であるＯＸ３８を用いたフローサイトメトリー検定で示されるように、全胸腺細胞の９５％以上がその表面上にＣＤ４抗原を発現した。ＯＸ３８はラットのＣＤ４に特異的に結合する。このＣＨＲＩ−ｒ４−Ｆｖ１・ｓｃＦｖは同一の様式で全ての胸腺細胞に結合した。ＣＨＲＩ−ｒ４−Ｆｖ１・ｓｃＦｖの試料の最大蛍光強度はＯＸ３８で見られた該強度の約三分の二であった。しかしながら、希釈系列での該蛍光強度は、ＯＸ３８抗体及びＣＨＲＩ−ｒ４−Ｆｖ１・ｓｃＦｖにおいて同一様式で低下した。このことは、両者が類似の結合特性を持つことを示している（図４）。
【００８９】  細胞膜へのＣＨＲＩ−ｒ４−Ｆｖ１・ｓｃＦｖのＣＤ４非依存的又は非特異的な結合を排除するために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ヒトのＴ細胞系統）及びＪ５．ＣＤ４（その表面上にラットの全長ＣＤ４を発現するトランスフェクションされたＪｕｒｋａｔ細胞系統）を用いるフローサイトメトリー検定を実施した。ＣＨＲＩ−ｒ４−Ｆｖ１・ｓｃＦｖは、Ｊｕｒｋａｔ細胞を用いるフローサイトメトリー検定が負であったことによって示されるように、非特異的な結合を全く示さなかった。ラットＣＤ４に対する結合特異性は、トランスフェクションされたＪ５．ＣＤ４についてのフローサイトメトリー検定で証明された。該検定では、ｓｃＦｖがＯＸ３８と同様に結合した。
【００９０】ｓｃＦｖ（２８ｋＤａ）の角膜浸透
角膜間質を通るｓｃＦｖの浸透は、該角膜潅流チャンバーを用いる最初の一連の実験で試験した。該角膜上皮はこの実験前に除去した。図５に示すように、このｓｃＦｖはブタの角膜間質を首尾よく透通しその特異的な抗原結合活性を保持していた。供与側上でのｓｃＦｖの最初の一滴と受容チャンバー側上での明確な結合活性の検出との間に４時間の間隔があった。
【００９１】  薬物が溶解している緩衝液のｐＨは、しばしば薬物の溶解度及び角膜浸透に影響を及ぼし得る。ＯＸ３８ｓｃＦｖは6.1の等電点を有し、このｐＨではｓｃＦｖの浸透は最も低いと予想される。したがって、本発明者らは、8.0、7.0及び3.5のｐＨにおいてブタの角膜間質を横切るＯＸ３８ｓｃＦｖ断片の浸透を調べた。7.0から8.0までのｐＨの上昇は浸透を促進したが、一方、等電点から3.5までのｐＨの低下は浸透の減少を惹起した（図６）。
【００９２】  種に無関係な間質の浸透を証明するために、正常なネコの角膜を用いて該実験を反復した。該潅流チャンバーから得られた結果は、ネコでもブタと同様なｓｃＦｖの浸透を示した。２５％薄いネコの角膜を横切る浸透後のｓｃＦｖの結合活性は２時間後に検出可能になった（図７）。
【００９３】  これらの陽性の浸透結果が、間質浸透と類似の効果を生じるであろう該角膜の固定端における組織の損傷又は載積された角膜周囲からの漏出により惹起されたものではないことを立証するために、全長のＯＸ３８ＩｇＧ抗体を負の対照として使用した。全長の抗体は、約１５０ｋＤａの分子サイズであるため該間質を浸透しないと推測される。これは明らかに間質浸透のための６０〜９０ｋＤａの分子遮断範囲を上回る。２００万分の１の希釈で陽性検出ができる濃度のモノクローナル抗体を２０分毎に目薬として投与した。１４時間までの試料採取期間には受容側に結合活性は見出されなかった（図６及び図１０）。
【００９４】  潅流チャンバーの浸透実験は、浸透プロセスの動力学を評価するために受容側の試料採取を反復しながら、より長い期間にわたって個々の角膜を研究できる。しかしながら、角膜を横切って潅流チャンバーへ浸透した該断片は大容量（４ｍＬ）中で希釈されるので、その結果は、前房容積が0.3〜0.5ｍＬである本物の眼で到達できるｓｃＦｖ及びミニ抗体の濃度より過小評価してしまう。潅流チャンバー実験で得られる浸透結果と生きているヒトの眼での推定値とを大雑把に比較するために、フルオレセインナトリウムの目薬を用いて潅流チャンバーでの更なる浸透実験を実施した。フルオレセインナトリウムは３３２Ｄａの分子であり、ヒトの眼内へのその浸透はインビボで広く研究されてきた。２％（w/v)フルオレセインを一滴投与した後、該薬物は３０分後にヒトの眼の中で検出可能になる（アライエら、1983, Jpn J Ophthalmol 27(3): 421-33）。フルオレセインの投与を反復することにより、前房に見出される量の相当の増加をさらに惹起する（アドラーら、1971, Exp Eye Res 11(1):34-42）。ブタの眼で得られた該ｓｃＦｖ浸透結果を比較可能にするために、正常な上皮をもつブタの角膜を１４時間の間２０分毎に２％フルオレセインの目薬で処理した。１００マイクロリットルの試料を、ｓｃＦｖ及びミニ抗体の実験と同様な様式で該チャンバー容器から取り出した。フルオレセインナトリウム濃度は、１００万分の２の検出閾値をもつＥＬＩＳＡ読取り機で４９２ｎｍで測定した。ブタの角膜受容側上において、フルオレセインナトリウムはわずか３時間後に検出可能になり、図８に示すように残りの実験時間で指数的な増加が続いて起きた。
【００９５】  正常な眼で得られうるｓｃＦｖ濃度をよりよく評価するために、ｓｃＦｖ浸透を全眼モデルでも試験した。このモデルでは、個々の眼は一回しか試料採取できないので、何らかの動力学的情報を得るために異なる曝露時間を与えた多数の眼を必要とする。しかしながら、生理学的な意味で、眼の前房部分は残りの本体と最低限の薬理学的相互作用しかもたない明確に規定された構造であるため、このような全眼実験から得られる結果はインビボで得られうる浸透量により近いものを反映している。
【００９６】  この実験では、ブタの全眼の角膜上皮を除去し、この角膜をＯＸ３８ｓｃＦｖを含むテフロンウェルに７時間浸漬した。該表面を完全に洗浄した後、100μＬの前房液の試料を２７Ｇの針をつけた注射器により採取した。この結合活性は２千分の１の検出閾値をもつラットの胸腺細胞上でのＦＡＣＳ検定で試験した。７時間後に試料採取された前房液は、２５０分の１のｓｃＦｖ濃度と等価な強力な結合活性を示した（図９）。
【００９７】  角膜上皮を通るｓｃＦｖ浸透の動力学は、無傷の角膜を用いる潅流チャンバー内で、より詳細に研究した。純粋なＰＢＳ溶液（ｐＨ7.2〜7.4）中のｓｃＦｖが目薬として適用された場合、８時間の浸透期間にわたって結合活性は検出できなかった。ｓｃＦｖ／ＰＢＳ溶液が目薬用の保存剤として通常用いられる0.01％の塩化ベンザルコニウムを補足した場合、ブタの角膜において８時間の試料採取期間の最後に弱い結合活性が観察された（データ示さず）。
【００９８】  （１ＭのＮａＯＨで調整した）ｐＨ8.0のＰＢＳ中のｓｃＦｖを用いて同一実験を繰り返した。これらの条件下において、ｓｃＦｖは浸透増強剤がないときでさえ、健常な上皮及び間質を通って浸透し、８時間後に受容側上で結合活性の増大を示した。0.5％のカプリン酸の添加により、角膜浸透が促進され、６時間後に検出可能な結合活性が増大した（図１０）。
【００９９】ＯＸ３８ミニ抗体（66.8ｋＤａ）の角膜浸透
66.8ｋＤａの分子サイズをもち角膜間質を通るＯＸ３８ミニ抗体の浸透を、該潅流チャンバー内での一価ｓｃＦｖ断片と同じ方法で試験した。負の対照として使用された全長のＯＸ３８ＩｇＧ抗体の浸透は、１４時間の全実験期間の間検出できなかった。対照的に、ＯＸ３８ミニ抗体の結合は３時間後に陽性となり、フローサイトメーター検定が８時間以降の試料で飽和に達するまで更に指数的に増加した（図１１）。
【０１００】  無傷の上皮障壁をもつブタの角膜を通るＯＸ３８ミニ抗体の浸透は、浸透増強剤がないと、はるかに遅くなり１１時間後にのみ微弱に検出できた。
【０１０１】  一価のｓｃＦｖと同様に、正常な眼の前房内における達成可能なミニ抗体濃度を全眼モデルで研究した。角膜上皮が除去されたブタの眼の場合は、まず３時間後の試料採取で最大シグナル強度の半値を既に呈した。ミニ抗体と接触させた５時間後及び７時間後の試料は最大の試験シグナルの範囲内の結合活性を示した。次に、正常な上皮障壁をもつ六つのブタの眼を、0.5％のカプリン酸を補足したミニ抗体に曝した。ミニ抗体の結合活性は５時間の接触時間の後に試料採取された眼で明らかに検出可能であり、７時間後及び８時間後の活性は上皮障壁のない眼よりもごく僅かに低かった（図１２）。
【０１０２】  上記の全ての実験で最も難しい条件は、比較的大きなミニ抗体が無傷の上皮障壁をもつ角膜を通って浸透することであった。これらの全結果は、ヒトの角膜より２５％厚い間質を有する若いブタの眼から得られた。しかしながら、最も重要な浸透障壁は上皮表面であり、ブタの眼でのこの障壁の微細構造についての知識は限られている。ブタとネコの眼で得られた上記の浸透結果とヒトの角膜を通るサブ−免疫グロブリン断片の潜在的な浸透とを比較するために、得られたばかりのヒトの眼で最も難しい実験条件を用いた。無傷の上皮をもつこの眼を、全眼の実験設定においてＯＸ３８ミニ抗体で処理した。該角膜はｐＨ8.0の0.5％カプリン酸を補足した1.8ｍｇ／ｍＬの標準濃度のミニ抗体１００μＬに５時間接触させた。５時間後に得られた眼内試料はフローサイトメーターで最大のシグナル強度を呈し、１ｍＬ当たり1.5ｘ106個の胸腺細胞を完全に飽和した。この試料における結合活性の滴定は、実験したこのヒトの眼の前房で0.8μｇ／ｍＬのミニ抗体濃度を示した（図１３及び図１４）。
【０１０３】考察
本研究は、遺伝子工学的組換え抗体断片が目薬として局所的に投与された後に該角膜に首尾よく浸透して眼の内側に到達できたことを証明する。さらに、これらの断片は十分な抗原結合活性を保持し、抗体に基づく眼の治療介入及び診断介入の可能性を提供する。同時に、本研究は、以前の多数の人たち（ベルハーゲンら、1990, Invest Ophthalmol Vis Sci 31(8): 1519-25；オススキーら、1993 ,Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 231(2): 122-8）と同様に天然に生じる全長の抗体が該角膜を浸透せず又は治療に有用な程には少なくとも浸透しないことを示し、そして該角膜を通って浸透できる最大分子サイズの遮断がしばしば引用されるが再現されない研究（モーリス・ディ、ミシマ・エス、眼の薬物速度論、スプリンガー−ベルラグ、ベルリン、1984年、シアーズ・エム編、眼の薬理学）で見出される５００ｋＤａよりはるかに小さいことを明らかにした。
【０１０４】  該角膜は、表面の角膜上皮と角膜間質という二つの重要な浸透障壁を含んでいる。この角膜上皮は、親油性小分子以外の全てに対して強力な浸透障壁を形成する。より大きな分子は、通常密着結合により遮断される細胞間スペースを通って浸透しなければならない（モーリス・ディーエム、1980, Int Ophthalmol Clin 20(3): 7-20;バースタインら、1985, J Ocul Pharmacol 1(3): 309-26）。これらの密着結合内の孔は１〜５ｋＤａのサイズまでの分子の浸透を可能とする（エーデルハウザーら、1998, Adv Exp Med Biol 438: 265-71）。該角膜上皮の浸透障壁は健常な細胞構造に依存する。ヒトの上皮障壁機能が加齢（チャングら、1993 Cornea 12(6): 494-9（コメント参照））及び糖尿病又はドライアイなどの多くの一般病（ゴッベルら、1989, Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 227(2): 142-4；ヨコイら、1998, Br J Ophthalmol 82(7):797-800）により著しく低下することはよく知られている。これに加えて、幾つかの研究は、緑内障を治療するための角膜移植（シマザキら、1999, Cornea 18(5): 559-64; チャングら、1994, Ophthalmic Res 26(5):283-9）又は柵状織切除（タニハラら、1997, Am J Ophthalmol 123(4): 487-93）などの外科的介入により、何ヶ月間又は何年間もの間該障壁機能が破損することを示した。
【０１０５】  第二の障壁である角膜間質は、より大きな断片を浸透させることができ、該組織が浮腫になる場合５００ｋＤａまでの分子又は更に大きな分子さえも浸透させることができる（バースタインら、1985、上掲）と引用されてきた。しかしながら、５００ｋＤａの数値は、同じ専門分野でない総説文献で公表された単独研究（モーリスら、1984、上掲）に由来するものである。事実、幾つかの研究は、１５０ｋＤａのサイズをもつＩｇＧ抗体の浸透に取り組んできた。これらの研究は、このサイズの分子が該角膜に浸透しない又は非常に遅い速度でのみ浸透し角膜間質を横切るために１〜２週間の時間間隔を要することを繰り返し示した（ベルハーゲンら、1990、上掲；オススキーら、1993、上掲）。該上皮障壁とは対照的に、角膜間質を通る薬物送達を改良するための浸透増強剤は知られていない。
【０１０６】  上に示したデータは、少なくとも６６ｋＤａまでのサイズの組換え抗体断片は迅速に角膜間質に浸透でき、眼の内側で完全な抗原結合能力を保持できることを証明している。浸透はブタ、ネコ及びヒトで報告されているので、これらの抗原断片の浸透は種に無関係であるようである。間質の薬物浸透は、間質の厚さ及び薬物のサイズと間接的な直線的相関関係を有し且つ薬物濃度と直接的相関関係を有する（バースタインら、1985、上掲）。ブタの角膜を通るより２５％薄いネコ及びヒトの角膜を通る方がｓｃＦｖの浸透がより早いことは、上記の発見とよく一致しているように思われる。２．５倍大きいミニ抗体が、ｓｃＦｖ小断片と同様な時間間隔の後に該角膜潅流チャンバーの受容側上で検出されたという事実は、おそらく本研究で使用された目薬中の７〜８倍高い濃度のミニ抗体によるものであろう。従って、本発明者らが臨床グレード材料について二段階精製工程を用いて証明したように、ｓｃＦｖ濃度の増大は本研究で見出されるものよりはるかに高い眼内濃度さえも生ずるように思われる。
【０１０７】  上述したように、表面の上皮は薬物浸透に対するより強力な障壁であるので、無傷の上皮障壁をもつ角膜を通るｓｃＦｖ断片及びミニ抗体断片の浸透がかなり遅いことは驚くに当たらない。事実、ｓｃＦｖ及びミニ抗体が非常に遅い速度ながらも無傷の上皮障壁を通って浸透すると示され得たことの方がむしろ驚きである。しかしながら、この上皮障壁は、現在使用されている大部分の眼科用薬物が幾つかの浸透増強剤形で補足されている程に、はるかに小さい分子でさえ妨げる。これらの浸透増強剤は最上位の上皮細胞の密着結合を緩めることにより作用する（バースタイン・エヌエル、1985, Trans Ophthalmol Soc UK 104(Pt4): 402-9；アシュトンら、1991, J Pharmacol Exp Ther 259(2): 719-24；グリーンら、1971, Am J Ophthalmol 72(5): 897-905）。最も一般的に使用される浸透増強剤は塩化ベンザルコニウムであり（タングら、1994, J Pharm Sci 83(1): 85-90；バースタイン・エヌエルら、1980, Invest Ophthalmol Vis Sci 19(3): 308-13）、これは微生物の混入に対する保存剤としても作用する。それは通常０．０１〜０．０５％の最終濃度まで添加される。目薬の形態での組換え抗体断片の将来的な医薬調製物はそれらの上皮浸透特性に左右されない保存剤を必要とするであろう。そのため、本発明者らは、本研究のｓｃＦｖ断片及びミニ抗体断片の幾つかに0.5％のカプリン酸を補足した。該カプリン酸は、通常の乳製食品の成分であり、該角膜上皮と同様に腸粘膜での密着結合の透過性を可逆的に増大させる（モリモトら、1989, Arch Int Pharmacodyn Ther 302: 18-26、ゾーデルホームら、1998, Dig Dis Sci, 43(7): 1547-52 、ササキら、1995, Pharm Res 12(8): 1146-50）。カプリン酸は無傷の上皮を通るｓｃＦｖ及びミニ抗体の浸透をかなり改良した。塩化ベンザルコニウム、ジギトニン又はトゥィーン２０などの他の浸透増強剤とは対照的に、0.5％のカプリン酸で処理された角膜は従来の組織学で調べた場合上皮の変化を示さなかった。
【０１０８】  これらの浸透実験用に得られたヒトの１個の眼には、0.5％のカプリン酸で補足されたミニ抗体を受けさせた。ヒトの前房液中に5時間後に見出されたミニ抗体結合活性は、同時間後のブタの眼で見出される浸透をはるかに上回った。これは、８〜１４月齢のブタの眼と比較してこの７７歳のヒトの角膜の浸透障壁が最初から低下していることを反映するのか、又は一般的にヒトの角質におけるカプリン酸の効果がより強いことを反映するものであろう。しかしながら、これは、より多くのヒトの眼が研究できるまで推論の域を出ない。
【０１０９】  要するに、本研究は、ｓｃＦｖ抗体断片が目薬として提供された場合に眼内に浸透できることを示している。このことは、該断片を、多数の眼病の治療、とりわけ以下の本明細書に記載するように角膜移植拒絶反応、炎症性若しくは感染性の角膜炎、結膜炎、及びブドウ膜炎の予防並びに治療のための新規なクラスの薬物の潜在的な候補とする。ｓｃＦｖは異なるタグで標識できるので、これらも診断の潜在能力を有すると考えられる。
【０１１０】実施例２
実験動物モデル
動物
６〜１６週齢の雌雄のフィッシャー３４４、ＤＡ、ルイスとウィスター−フルスの同系交配のラット及びポートンの異系交配のラットを南オーストラリアのフリンダーズ大学（アデレード、オーストラリア）内で飼育する。ラットは２１℃及び５０％の湿度で１２時間の明期と１２時間の暗期の周期で飼われ、随意に水と乾燥飼料（ニュー・ジョイント・ストック、リドレー・アグリプロダクツ、ムレー・ブリッジ、南オーストラリア、オーストラリア）を与えられる。成体の雌雄のＢＡＬＢ／ｃマウス又はＯＬＡマウスは２１℃及び５０％の湿度で１２時間の明期と１２時間の暗期の周期で飼育され、水と乾燥飼料（ニュー・ジョイント・ストック、リドレー・アグリプロダクツ、ムレー・ブリッジ、オーストラリア）を与えられる。全ての手順及び安楽死は吸入による全身麻酔（ハロセイン；ゼネカ社、マックレスフィールド、英国）の下で実施される。実験プロトコルはナショナル・ヘルス・アンド・メディカル・リサーチ・カウンシル・オブ・オーストラリアの「研究における動物使用のガイドライン」に従って開発された。該プロトコルは承認のため南オーストラリアのフリンダーズ大学の動物福祉委員会に常に提出する。
【０１１１】内毒素誘導性ブドウ膜炎（ＥＩＵ）の誘導
ラットは、ローゼンバームら（1980, Nature 286:611-613）の方法に従って、100マイクログラムの標準食塩水に溶解した200マイクログラムの大腸菌０５５：Ｂ５５リポ多糖類（シグマ・ケミカル社）を片方の後足に注射される。炎症は注射１２時間後に明白となり２４時間で最大となり４８時間までに消散する。動物は検診され２４時間で細隙灯で評点される。本発明者らはこのモデルについて広範な経験を有する（スミスら、1998, Invest Ophthalmol Vis Sci 39:658-661; Immunol Cell Biol 76: 497-512）。
【０１１２】実験的メラニン誘導性ブドウ膜炎（ＥＭＩＵ）の誘導
実験的メラニン誘導性ブトウ膜炎（ＥＭＩＵ）は急性前部ブドウ膜炎の確固たる関連モデルである（スミスら、1998, Immunol. Cell. Biol. 76:497-512；スミスら、1999, Clin. Exp. Immunol. 115:64-71）。眼のメラニンは、ブリュックヒュイゼら（1984, Curr Eye Res 3:1405-1412）により記述されたプロトコルに従ってウシの脈絡膜から抽出され、乾燥重量として定量される。ＥＭＩＵは、百日咳毒素コアジュバントと共に、ハンターのアジュバント中で乳化された２５０μｇの精製されたウシの脈絡膜メラニンで免疫化することにより、フィッシャー３４４ラットで誘導する（ブリュックヒュイゼと同僚、1984、上掲；1995, Ocul Immunol Inflamm 3: 149-155; 1996, Jpn J Ophthalmol 40: 459-468）。具体的には、ラットには、滅菌済みでパイロジェン・フリーの０．９％標準食塩水とフンターの TitreMax （商標）アジュバント（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州、米国）との１：１乳濁液中の１２５マイクログラムのウシの眼のメラニンを６０マイクロリットルの総容量で右後足に注射することにより投与する。その直後に、該ラットは、総容量４０マイクロリットルの標準食塩水中の１マイクログラムの百日咳毒素（シグマ・ケミカル社）と混合した同量のメラニンで腹膜腔内注射される。ブドウ膜炎は一般的に二側性であり注射後１０〜２０日で明白となり２〜３週後に消散し動物の２０％に再発する。
【０１１３】ブドウ膜炎のモニタリング及びブドウ膜炎の眼の収集
動物は毎日細隙灯で検診しブトウ膜炎の発症及び経過を同定する。重篤度は、水溶性の細胞及び発赤、フィブリンの存在、癒着、瞳孔の反応性、虹彩の充血及び蓄膿が全て評点されるよく実証された系に従って記録する。使用する尺度は以下の通りである。
炎症なし：  正常な外観、
軽病：      前部ブドウ膜の腫脹は無いが明白な浸潤、前房若しくは後房における細胞浸出物は±、
中度の病気：軽症又は中度の前部ブドウ膜の腫脹及び浸潤、前房及び後房における中皮の細胞浸出物、
重病：      重度の前部ブドウ膜の腫脹及び浸潤、硝子炎を伴う前房及び後房における大きな細胞浸出物。
動物は麻酔ハロセインの過剰投与により殺し、これらの眼をさらなる工程のため即座に取り出す。
【０１１４】角膜移植のラットモデル
本発明者らは、広範に使用されている同系交配ラットの眼科角膜移植モデル（ウィリアムズとコースター、1985, Invest Ophthalmol Vis Sci 26:23-30；ウィリアムズら、小動物の角膜移植。小動物の実験的移殖モデル、エムケイ・グリーン、ティーイー・マンデル、チュア，スウィッツアーランド編：ハワード・アカディミック・パブリッシャーズ、1995年、５章、107〜132頁）を発展させた最初の者となった。同系交配のフィッシャー３４４ラット（Ｆ３４４；主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプＲＴｖ ）及び同系交配のウィスター−フルス・ラット（ＷＦ；ＭＨＣハロタイプＲＴｕ ）を角膜移植用に用いる。成体のＦ３４４ラットは、成体のＦ３４４ラット（同種同系移殖片）又は成体のＷＦラット（同種異系移殖片）のいずれかからの角膜移植片の受容動物である。移植片は性差にまたがって実施されないが、同種異系移殖片はＭＨＣのクラスＩ及びクラスII及び少数の抗原障壁にまたがって実施される。
【０１１５】  片側の右眼に浸透する直径３ｍｍの角膜移植は前述したように全身麻酔の下で実施される。１％のクロラムフェニコール軟膏が術後に該移殖片に適用されるが特定の実験で明記する以外は免疫抑制剤は投与されない。移殖縫合糸は除去しない。受容動物は、角膜の透明度、前区の炎症、癒着、及び角膜の新性血管形成について毎日細隙灯で検診される。とりわけ、透明度及び浮腫はそれぞれ０〜４の尺度で評点する。０は完全に透明（透明度について）又は薄い（浮腫について）、そして４は完全に不透明（透明度について）又は最大限に厚い（浮腫について）である。任意の段階で術後の白内障を発症するか又は術後五日目に角膜が不透明になるラットはいずれも技術的に失敗であると考えられ分析から除かれる。
【０１１６】  拒絶は、元々薄くて透明な角膜移植片において角膜の不透明性が増大するにつれ現れ、常に移殖の新性血管形成と関連している。拒絶の日数は、瞳孔の縁が移殖された角膜を通してもはや明確に見えない日を第一日目として定義する。ＷＦとＦ３４４の同系交配株の組合わせにおいて、拒絶は中央値で移植後１６日目に起きる。透明な移殖片をもったまま１００日に達するラットは長命な移植片とみなされる。
【０１１７】ＨＳＶ間質性角膜炎のマスモデル
ＢＡＬＢ／ｃマウスの角膜を針を用いて乱切し、１０６ ｐｆｕのＨＳＶ−１（臨床的単離物）を含む４μＬを局所的に適用する（トーマスら、1998, J Immunol 160:3965-70）。病気は３週間の期間にわたって間質性角膜炎に進行する。臨床的評点システムを細隙灯で病気を追跡するために使用する。０は透明な角膜、１は軽度のかすみ、２は中度の不透明又は傷、３は重度の不透明化だが虹彩の縁は見える、４は虹彩が見えない、５は間質性角膜炎の壊死。よく特徴付けられたＮＩＨ／ＯＬＡマウス（ハルランド社）の再発性ＨＳＶ角膜炎モデルも用いられる（レイコックら、1991, Invest Ophthalmol Vis Sci 32: 2741-2746）。一つの角膜が乱切され上記のように接種される。同時に、ＨＳＶに対する抗体（ケミコン社、テメキュラ、カリフォルニア州）を含むプールされたヒトの血清０．５ｍＬを腹膜腔内に投与すると感染の急性期の間損傷から眼を保護する。次いで、潜伏期を確立するため該マウスを５週間放置する。ウイルスの再活性化はＵＶＢトランスイルミネーター（ＦＳ４０ウェスティングハウスランプ）を用いて行う。麻酔されたマウスは該眼だけが照射されるように遮蔽される。５５秒間にわたる２４８ｍＪ／ｃｍ2 の線量はＨＳＶの再活性化に最適である。
【０１１８】アカントアメーバ角膜炎のラットモデル
アカントアメーバ角膜炎は、本発明者らの研究室で開発されたモデル（バデノックら、1990, Arch Ophthalmol 108: 107-112）に従って、異系交配ラットの角膜にアカントアメーバ及びコリネバクテリウム・エスピイを接種することにより誘導される。成体の雌のポートンラットに麻酔をかける。縁から約１ｍｍの角膜周辺に、メス刃を用い、２ｍｍの部分厚で切開した。手術用顕微鏡の下で、３１ゲージの針を固定した微量注射器を用いて、１０6 個のコリネバクテリウム・ゼロシスと混合した１０4 個のアカントアメーバ・キャステラニイ（＞９０％栄養型、＞９０％生存能）１μＬ容積を接種する。この針を該傷を通して中心の角膜薄膜内に挿入する。全ての動物は接種後毎日観察される。アカントアメーバ角膜炎は全動物で発症し、５日目に白血球の浸潤が見え、７日目までに化膿性角膜炎が十分に確立される。
【０１１９】統計分析
実験群は１０匹の動物を含む。移殖片の生存及び病気の発症率のデータを、つなぎ線について補正されたマン−ウィットニーＵ試験を用いて分析する。明確なデータ（例えば、病気の重篤度の評点）を二元フィッシャーの直接確立検定を用いて分析する。
【０１２０】角膜の写真撮影、免疫細胞化学、組織病理学及びフローサイトメトリー
手術用顕微鏡に連結されたワイルド・ヒールブルグ・フォトオートマットＭＰＳ４５カメラを用いて、麻酔をかけた動物の角膜の写真撮影を実施する（ラット、マウスについて）。免疫組織化学は、ＰＬＰで固定された組織の凍結切断切片について、免疫ペルオキシダーゼ技法を用いて実施する。即ちラット及びマウスの白血球に対するモノクローナル抗体及び角膜の白血球浸潤物の組成を正確に同定させる他の細胞表面マーカーに対する広範囲のモノクローナル抗体を用いる。組織病理学的相関関係はホルマリン固定され、パラフィン包埋された全眼のＨ＆Ｅ切片について行う。フローサイトメトリーは標準的な単色間接的免疫蛍光法及び高感度法を用いて実施する。
【０１２１】抗体工学に使用される追加の抗体
抗ラットＢ７−１（ＣＤ８０：３Ｈ５；ＩｇＧ１）及び抗Ｂ７−２（ＣＤ８６：２４Ｆ；ＩｇＧ１）のハイブリドーマはエイチ・ヤギタ博士（順天堂大学、東京、日本）から恵与された。抗ＣＤ２８ハイブリドーマ（ＪＪ３１９；ＩｇＧ１）はティ・フニグ博士（インスティチュート・フォ・ヴァイロロジー・アンド・イミュノロジー、ヴルツブルグ大学、ドイツ）から恵与された。抗−ポリ−ヒスチジン抗体（ＨＩＳ−１；マウス；ＩｇＧ２ａ）はシグマ・ケミカル社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗−マウス免疫グロブリンはシレナス・ラボラトリーズ（メルボルン、ＶＩＣ）から購入した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン及びビオチン化ヤギ抗−マウス免疫グロブリンはＤＡＫＯコーポレーション（カルピンテリア、カリフォルニア州、米国）から購入した。
【０１２２】抗体試薬の投与
全身投与は、担体として加えられた１％の牛胎児血清（ＦＣＳ）とともに緩衝化生理食塩水中の抗体を腹膜腔内（ｉｐ）注射することにより実施され得る。注射の計画は実験に応じて決定する。局所投与は、１％のＦＣＳ及び一つ以上の浸透増強剤で補足され且つ眼科用バランスド・ソルト・ソリューション中の抗体を直接角膜に適用することにより実施され得る。
【０１２３】腹水の生産
モノクローナル抗体を腹水として作製するために、標準的な方法に従ってプリスタン処理した個々のＢＡＬＢ／ｃマウス群にハイブリドーマ細胞を腹膜腔内投与する。腹水は該マウスを安楽死させた後に無菌的に回収する。得られる腹水は１％v/vの牛胎児血清を含み且つ滅菌済みでパイロジェン・フリーのＰＢＳで希釈する。
【０１２４】免疫組織化学に使用されるモノクローナル抗体
ラット又はマウスの細胞表面抗原の免疫組織化学的同定に使用されるマウスのモノクローナル抗体は、定常期のハイブリドーマから得られる無希釈の上清として生産される。ハイブリドーマＸ６３（特異性は未知、ＩｇＧ１イソ型の負の対照）、ＯＸ−１（抗−ＣＤ４５[白血球に共通の抗原 ]、ＩｇＧ１イソ型）、ＯＸ−３５及びＯＸ−３８（抗ＣＤ４、それぞれＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａイソ型）、ＯＸ−８（抗ＣＤ８、ＩｇＧ１イソ型）、ＮＤＳ６１（抗ＣＤ２５[インターロイキン−２受容体（ＩＬ−２Ｒ）]、ＩｇＧ１イソ型）、Ｒ７３（抗Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＩｇＧ１イソ型）、ＯＸ−２６（抗ＣＤ７１[トランスフェリン受容体]、ＩｇＧ２ａイソ型）、ＯＸ−４２（抗ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８[Ｃ３ｂ受容体]、ＩｇＧ２ａイソ型）、ＥＤ−１（抗ラット単球、マクロファージ及び樹状細胞の細胞質抗原、ＩｇＧ１イソ型）並びにＯＸ−６（抗ＭＨＣ単形態クラスII決定基、ＩｇＧ１イソ型）はヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャーズから入手し、ハイブリドーマＳＡＬ５（抗サルモネラ抗原、ＩｇＧ２ａイソ型の負の対照）はエル・アシュマン博士（アデレード大学、アデレード、オーストラリア）から恵与された。種々のマウスの表面マーカー（マウスのＣＤ４（ＧＫ１．５）、ＣＤ８（ＴＩＢ１５０）、ＣＤ１１ｂ／ｃ（ＴＩＢ２１３、ＨＢ８４６６）及びＩＬ−２受容体（ＰＣ６１））に対するモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは両方とも、フリンダーズ大学のピイ・マカルドル博士とピイエイチ・ハート博士から恵与された。
【０１２５】細胞表面抗原の免疫組織化学染色
ラット又はマウスの安楽死の後、眼は毛様体輪の後部に穴をあけ、２％重量／容量（w/v）パラホルムアルデヒド−０．０７５Ｍリシン−０．０３７５Ｍ燐酸ナトリウム−０．０１Ｍ過ヨウ素酸ナトリウムに４℃で４時間浸漬することにより前固定し、ダルベッコのＡ燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に７％と１５％w/vのショ糖の逐次変化で脱水し、ＯＣＴ化合物（マイルス、エルクハート、インディアナ州、米国）中に包埋し、そして液体窒素中ですばやく凍結した。眼の横断面を５〜８ミクロンの厚さで低温装置により切断した。切片はダルベッコＡ燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中１０％v/vの正常なブタの血清（カモンウェルス・シーラム・ラボラトリーズ、メルボルン、オーストラリア）と室温で１０分間インキュベートした後、該第一抗体と１８時間インキュベートした。この時点及びその後に、該切片を０．２％w/vのゼラチンを含むＰＢＳで洗浄した。これらを、１％v/vの正常なラットの血清を含むＰＢＳで１：５００の割合に希釈されたビオチン化親和性で単離されたヤギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯコーポレーション、カルピンテリア、カリフォルニア州、米国）と３０分間インキュベートし、洗浄した後、ＰＢＳで１：１０００の割合に希釈されたホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（ＤＡＫＯコーポレーション〉と共にさらに３０分間インキュベートした。切片を洗浄し、４０ｍＭのアジ化ナトリウム、２０ｍＭの３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド、９ｍＭのイミダゾ−ル、及び０．０７％v/vの過酸化水素（シグマ・ケミカル社）を加えたｐＨ７．６の９ｍＭトリス−塩酸緩衝液中で５分間呈色させた。抗体の反応性及び特異性は、免疫組織化学で使用する前に適切なラット又はマウスの標的細胞（正常細胞及び／又はトランスフェクタント）上で、及び眼で使用する前に眼以外の組織の固定切片上で、フローサイトメトリーにより確認した。
【０１２６】ラット及びマウスの眼の組織学的評価
摘出した眼を、１０％の緩衝ホルマリン中で最低２４時間固定し、１００％エタノールにより脱水し、さらにクロロホルム中で１８時間固定し、そしてパラフィンワックスに包埋する。組織横断面を５ミクロンの厚さに切断しヘマトキシリンとエオシンで染色する。
【０１２７】インビボにおけるラットの末梢Ｔ細胞部分集合のモニタリング
末梢Ｔ細胞の部分集合を尾の血液調製物のフローサイトメトリーにより監視した。試料は、該第一抗体の注射の直前並びに疾患誘導の７日、１４日及び２８日後にラットから採取した。１ｍＬ以下の末梢血をリチウムヘパリン被覆したチューブ内に採取し、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００マイクログラム／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン及び１０％v/vの牛胎児血清を含むヘペス緩衝化ＲＰＭＩ１６４０培地（ＩＣＮバイオメディカル社、オーロラ、オハイオ州、米国）で５ｍＬまで希釈した。リンパ球は、Lymphoprep （商標）（ニコムド・ファーマ・アズ、オスロ、ノルウェイ）の比重を１．０９に調整するために、４０ｍＭのメグルミンジアトリゾエート（アンジオグラフィン、シェーリング・エイジイ・ベルリン、ドイツ）を使用した以外は、製造業者の記載通りにリンフォプレップを用いて単離した。回収した細胞を１ｘ１０7細胞／ｍＬでＰＢＳ−０．０２Ｍアジ化ナトリウム（ＰＢＳ−アジド）中に懸濁し、そしてリンパ球懸濁液のこの５０マイクロリットルに５０マイクロリットルのモノクローナル抗体を添加した。この混合物を３０分間氷上でインキュベートした後、ＰＢＳ−アジドで洗浄し、４℃で５分間４００×ｇで遠心分離した。そのペレットを２５マイクロリットルの正常なラットの血清及びＰＢＳ−アジドで５０倍に希釈した５０マイクロリットルのＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス免疫グロブリン（シレナス・ラボラトリーズ、メルボルン、オーストラリア）に再懸濁した。氷上で３０分間インキュベートした後、連続して二回洗浄した。この細胞ペレットを、ＰＢＳ中に１０ｍＭのグルコース、５％v/vのホルムアルデヒド及び５ｍＭのアジ化ナトリウムを含む５０ｍＬの固定液に再懸濁した。抗体結合は標準的な蛍光フィルターセット（ FACScan（商標）、ベクトン・ディッキンソン、マウンテン・ビュー、カリフォルニア州、米国）を用いてフローサイトメトリーにより測定した。
【０１２８】内毒素の検定
内毒素のレベルは、製造業者の説明書に従ってマルチ−テスト・リムラス・アメーボサイト・ライセート・アッセイ（ウィッタッカー・バイオプロダクツ、ウォーカーズビレ、ミズーリ州、米国）（感度＝０．１２５ＥＵ／ｍＬ）により測定した。
【０１２９】タンパク質の評価
試薬中の全タンパク質量は、製造業者の説明書に従って市販のタンパク質評価キット（シグマ・ダイアグノティックス、セントルイス、ミズーリ州、米国）を用いて改変ラウリー法により測定した。吸光度は７５０ｎｍで測定した。
【０１３０】ラットの混合リンパ球の反応
単核細胞画分は、リンフォプレップ（ニコメド・ファーマ、オスロ、ノルウェイ）上での密度遠心分離により単離した。２万個の生きた応答者である脾細胞を、９６穴の丸底マイクロタイタープレート内の最終容量２５０μＬの全ＲＰＭＩ培地（２０％v/vＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン、５ｘ１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール）中、２ｘ１０5のマイトマイシンＣ（２５０ｎｇ／ｍｌ、３７℃、３０分間、協和発酵工業株式会社、協和、日本）で不活性化された刺激物質とインキュベートした。モノクローナル抗体試薬又は断片を添加し、培養物を５％ＣＯの湿潤大気中で３７℃で６日間インキュベートした。細胞増殖を測定するため、１μＣｉのトリチウム化チミジン（アマシャム、バッキンガムシャー、英国）を合計１８時間該培養物に添加した。採取後、しみ込ませたグラスファイバー紙をマスク内に置き、２０μＬのシンチレーション液を各ウェルに添加した。紙を Topcount （商標）カウンター中で算定した。全ての培養は三連で実施した。
【０１３１】実施例３
インビトロにおける工学抗体断片の評価
インビトロにおける一価又は二価の抗体の機能的活性を、親の全長モノクローナル抗体及び関連のない対照のｓｃＦｖと比較する。断片は単独で及び組合わせて試験されうる。ｓｃＦｖが「タグ」配列のポリ−Ｈｉｓを含む場合、フローサイトメトリー及び免疫組織化学での検出は該タグに対するモノクローナル抗体（ＨＩＳ−１、シグマ社）の使用により達成できる。しかしながら、他の同定用タグが同様に使用できることは理解されよう。工学構築物の適切な特異性を確認するため、結合を、未固定の正常なラット細胞又はトランスフェクタントについてのフローサイトメトリーにより、及び／又は固定されたトランスフェクタント、ラット又はマウスの正常細胞、分裂促進因子で刺激されたラットの脾細胞、ＨＳＶに感染したＨｅｐ−２細胞及びＭＲＣ−５線維芽細胞、若しくは培養したアカントアメーバ細胞の細胞遠心分離調製物についての免疫組織化学により、評価する。適切ならば活性はフローサイトメトリーにより滴定する。組織の結合は、ＰＬＰ固定され低温装置で５〜８μｍに切断された正常なラットの眼、リンパ節、脾臓、腎臓、心臓及び肝臓の切片について免疫ペルオキシダーゼ染色により評価する。尾の静脈から採取された末梢血についてのフローサイトメトリーは、断片がインビボｓｃＦｖ投与で循環細胞に結合したか否かを決定するために使用される。ｓｃＦｖ親和性のオン／オフ率は精製された抗原を固相として用いて光学バイオセンサー（ BIAcore（商標））で試験される。
【０１３２】実施例４
ｓｃＦｖによるＥＭＩＵの調節
本発明者らは全長の抗ＣＤ４（ＣＤ８ではない）モノクローナル抗体がＥＭＩＵにおける新たな病気の発症を遮断し、病気の再発を遮断しうることを既に示したので（スミスら、1999, Clin. Exp. Immunol. 115: 64-71）、本発明者らは、まず、抗ＣＤ４・ｓｃＦｖを試験する。次いで、抗ＩＣＡＭ−１・ｓｃＦｖが試験される。対照は、病気の誘導、病気の誘導と負の対照のｓｃＦｖ、及び病気の誘導と全長のモノクローナル抗体以外の治療を受けない群を含む。全身投与のために、ラットには、病気誘導の３日前、０日並びに３、５、７、９、及び１１日後に、１ｍｇ／ｍＬ未満のｓｃＦｖタンパク質（１ｍＬ容量）を腹膜腔内に注射し、細隙灯試験によりブドウ膜炎の発症率及び重篤度を測定した。適切な治療用量を決定するための実験を実施する必要がある。予備実験において、総タンパク質量１ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ４・ｓｃＦｖを全身投与することにより試験動物の３０％以上でＥＭＩＵが防止された（表１参照）。
【０１３３】
【表１】
0005483789.tif 000002
【０１３４】  ｓｃＦｖの局所投与は病気誘導の当日に開始し２８日間続行する。両実験において、メラニンで免疫した後、特定の時点で幾匹かの動物を屠殺し、組織学及び免疫組織化学用に眼を摘出し、細胞浸潤物の組成及びそれが治療により変化したか否かを決定する。どちらかがｓｃＦｖが有意にブドウ膜炎の発症率を低下させることを示すときは、メラニンでさらに免疫することにより病気の再誘導を試み、無応答性が誘導されたか否かを決定することになる。本発明者らは、細胞及び発赤が後眼房に観察された第一日目、及びその後五日間毎日ｓｃＦｖを投与することにより既存の病気に対する治療効果を試験することになる。細隙灯でラットの経過を追い幾つかの眼を組織学用に採取することになる。
【０１３５】実施例５
ｓｃＦｖによる角膜同種異系移植片拒絶の調節
ＷＦからＦ３４４への同種異系移殖における角膜移植拒絶の予防においてＣＤ４、ＣＤ５４、ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ２８、ＣＤ８０及びＣＤ８６に対するｓｃＦｖの有効性が試験される。補助的刺激分子（co-stimulatory molecule)のＣＤ８０及びＣＤ８６に対して、ｓｃＦｖの混液が使用される。対照には、無治療のラット、関連する特異性をもたないｓｃＦｖによる治療、抗ＣＤ８・ｓｃＦｖによる治療、及び全長の抗体による治療を受けるラットが含まれる。少数の同種同系移殖が毒性又は他の副作用を確認するために実施される。全長の抗体に関して有効であることが知られている実験計画を用いて全身投与を試験する。移殖の３日前、当日、３、５、及び７日後にラットに腹膜腔内注射する。インビボでの効果に必要な工学断片量の見積りは、ｓｃＦｖ活性の滴定とともに、同様な効果に必要な全長の抗体量に基づいて予備実験で確立する。次いで、拒絶開始を防止する能力（移殖の日から２８日間毎日該移殖片に直接適用する）及び進行中の拒絶反応を治療する能力（角膜の血管が移植片−宿主接合部を最初に交差した第一日目から又は前部節の炎症の兆候が観察された日から、どちらが最初に起ころうと５日間毎日直接適用する）について、ｓｃＦｖを局所的に試験する。移植後特定の時点で幾匹かの動物を屠殺し、組織学用及び免疫組織化学用に眼を摘出し任意の細胞浸潤物の組成を決定する。
【０１３６】  上述したように約０．２ｍｇ／ｍＬで全身投与された場合、ラットのＣＤ４に対する全長のモノクローナル抗体は、下記の表２及びアイリフェら（1992, Brit J Ophthalmol 76: 602-6）及びヒーら（1991, Invest Ophthalmol Vis Sci 32: 2723-8）に示されるように角膜移植片の生存を延長できる。
【０１３７】
【表２】
0005483789.tif 000003
【０１３８】実施例６
抗体断片によるヘルペス性角膜炎の診断及び治療
間質のヘルペス性角膜炎に対する治療薬としてのｓｃＦｖの可能性を調べるために、病気の壊死モデル及び再発性モデルの両方を用いる。マウスに、目薬としてｓｃＦｖ（抗−ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ／ｃ、ＩＬ−２Ｒ又はＨＳＶｇｐＤ抗原）又は関係のある特異性をもたないｓｃＦｖを、毎日１滴ずつ四回、局所適用する。追加の対照群には、０．５％の眼科用燐酸プレドニソロンン及び３％のアシクロビル眼科用軟膏（ゾビラックス、グラクソ−ウェルカム）を局所的に毎日四回与える。壊死病の動物は接種後１４日から２１日まで治療し、再発病の動物は再活性化後２日から４日まで治療する。ｓｃＦｖの全身投与も調査する。有効性は細隙灯で臨床的に測定し、終点の免疫組織化学及び組織学により白血球の湿潤物の組成を決定する。診断目的で、ＨＳＶｇｐＤに対するｓｃＦｖをフルオレセインに結合する。フルオレセインは局所的な眼科用調製物で既に使用されている蛍光色素で、細隙灯で青の光源を用いて容易に視覚化できる。蛍光色素で標識化されたｓｃＦｖを目薬として感染した角膜に投与した後、本発明者らは、直接的試験によりそして青色フィルターを備えた細隙灯の写真撮影によりインサイチュで角膜内におけるウイルス抗原の存在を検出することを試みる。壊死するＨＳＶ角膜炎モデルにおいて、ｓｃＦｖによる迅速診断の可能性が接種後三週間目に調べられる。再発性の角膜炎モデルにおいて、再活性化後３日目に目薬を与える。直接的試験の結果は組織病理学及びウイルス培養の結果と相関する。
【０１３９】実施例７
抗体断片によるアカントアメーバ角膜炎の診断及び治療
栄養型及び嚢の両方の表面上に存在することが知られている４０ｋＤａのタンパク質に対する蛍光色素標識されたｓｃＦｖ及び二量化断片が作製される。適切なＩｇＧハイブリドーマをＡＴＣＣから入手する。ポートン・ラットに、アカントアメーバ・キャステラニ・ネフを接種し、その４、７又は１０日後にｓｃＦｖの目薬を与える。この段階で、これらの角膜は、それぞれ、大半が栄養型、栄養型と嚢、又は大半が嚢である。毎日、種々の濃度の該結合ｓｃＦｖを含む目薬を与え、細隙灯を用いて眼を調べ写真を撮影する。その後、動物を屠殺し組織学用に眼を処理する。これによって病理学と細隙灯の観察とを相関づけることができる。断片の潜在的な治療用途を調べるため、感染したラットに接種６日後から１０日後にかけて毎時間非結合二量体断片を用いて局所的に治療する。他のラットには、対照の断片のみ、又はアメーバ角膜炎の現在の第一選択の治療であるプロパミジンとポリヘキサメチレンビグアニドの組合わせを与える。治療効果は臨床評点、組織病理学、及びホモジナイズされた角膜の限界希釈による生存アメーバの定量により評価される。
【０１４０】  本明細書を通して、目的は、本発明を任意の一実施態様又は特定性質の集合に限定することなく本発明の好ましい実施態様を記載することであった。従って、当業者は、本開示に照らし、本発明の範囲を逸脱することなく例示した特定の実施態様に種々の修飾及び変更が施され得ることを理解するであろう。このような全ての修飾及び変更は添付の請求の範囲内に含められることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、プリュックツンら（1996、抗体工学：実践アプローチ、２０３〜２５２）から引用した、大腸菌での機能的な高レベルの発現並びに本発明の使用に適したサブ−免疫グロブリン抗原に結合する分子の図式的表示である。
【図２】  図２は、角膜潅流チャンバーを図示するものである。即ち、角強膜ボタンは解剖され該潅流チャンバー内に堅く固定される。細糸により組織損傷の危険性なくクランピング調整できる。この「受容」角膜側上の流体は連続的に循環している。この流体の全体積は3.5〜４ｍＬである。該容器内へのチャンバーの流出が増大すると、チャンバー内の絶対圧力は生理的な眼の状態に近くなる。
【図３】  図３は、ヒト又はブタの全眼への薬物の浸透を測定するよう順応されたチャンバーを図示するものである。無傷の結膜組織をもつ全眼は、該角膜がテフロンブロック内に形成されたウェル内に留まるようテフロンブロック上に配置される。このウェルは、該角膜が該薬物と接触する唯一の組織となるように該薬物で充填されている。この全眼は伏せたプラスチック容器で覆われ湿潤なチャンバーを形成し、並びにこの一式は３５〜３７℃の温度で該眼を保持するため水浴上に配置される。
【図４】  図４は、フローサイトメトリー検定で測定された抗原結合活性を示すグラフである。このｓｃＦｖはその標的抗原に対して濃度依存性の結合を示し、全長の抗体で得られるパターンと類似している。
【図５】  図５は、ブタの角膜間質（上皮障壁は除去される）を通るｐＨ7.0でのｓｃＦｖの浸透を示すグラフである。
【図６】図6は、pH8.0、ｐＨ7.0及びｐＨ3.5においてのブタの角膜間質（上皮障壁は除去される）を通るｓｃＦｖの浸透を示すグラフである。7.0から3.5にｐＨを下げることにより、浸透に逆効果を及ぼす。無傷の上皮をもつ角膜において、3.5のｐＨでｓｃＦｖの浸透は検出できなかった。
【図７】  図７は、上皮障壁のないネコの角膜において純粋なｓｃＦｖが迅速に浸透し３時間後に受容側上での結合活性が増大することを示すグラフである。ネコの角膜はブタの角膜より２０〜４０％厚く、これはより迅速な浸透の説明となる。全長の抗体（ｍＡｂ）は８時間の観察時間内に浸透しなかった。
【図８】  図８は、該潅流チャンバー内において無傷のブタの角膜を通るフルオレセインナトリウムの浸透を示すグラフである。ブタの角膜の受容側上で、フルオレセインナトリウムは僅か３時間後に検出可能となり、続いて残りの実験中に指数的に増加した。
【図９】  図９は、角膜潅流におけるｓｃＦｖの浸透と全眼球の浸透実験との関係を示すグラフである。矢印は全眼（上皮なし）の前房におけるｓｃＦｖ結合活性を示す。
【図１０】    図１０は、0.5％のカプリン酸の存在下及び不在下において潅流チャンバー内での無傷のブタの角膜を通るＯＸ３８ｓｃＦｖの浸透を示すグラフである。
【図１１】  図１１は、潅流チャンバー内でのブタの角膜間質を通るミニ抗体及び全長のＩｇＧ抗体の浸透を示すグラフである。
【図１２】  図１２は、ブタの全眼における角膜間質及び無傷の角膜を通るミニ抗体の浸透を示すグラフである。
【図１３】  図１３は、全眼浸透の一式における無傷のヒトの角膜を通るＯＸ３８ミニ抗体の浸透を示すグラフである。
【図１４】  図１４は、目薬中のミニ抗体の結合活性及び前房内での浸透後のミニ抗体の結合活性の滴定を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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