(57)【要約】  工業的に有用な改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ、その製造方法、及びそれを用いたエピハロヒドリン又は４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供する。本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、所定のアミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列IIを含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して特定のアミノ酸置換変異が導入されたアミノ酸配列からなるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のアミノ酸配列Ｉ：
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15 （配列番号７４）
（Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
及び以下のアミノ酸配列II：
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21 （配列番号７５）
（Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の（A）〜(D)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
（A）開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（B）α14残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（C）α15残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（D）β21残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
【請求項２】
以下のアミノ酸配列Ｉ：
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15 （配列番号７４）
（Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
及び以下のアミノ酸配列II：
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21 （配列番号７５）
（Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の（E）〜(H)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
（E）開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基がリジン又はアスパラギンに置換されたアミノ酸変異
（F）α14残基がアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
（G）α15残基がアラニン、セリン又はトリプトファンに置換されたアミノ酸変異
（H）β21残基がグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンに置換されたアミノ酸変異
【請求項３】
前記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼがグループＢに分類されるものである、請求項１又は２記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
【請求項４】
前記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌又はマイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌由来のものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
【請求項５】
前記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列が、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
【請求項６】
前記野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の（i）〜（iii）より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、請求項１〜５いずれか１項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
（i）開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基、α14残基、α15残基及びβ21残基以外のアミノ酸残基より選択される１個もしくは数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（ii）開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基、アミノ酸配列Ｉに含まれるアミノ酸残基及びアミノ酸配列IIに含まれるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基より選択される１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸変異
（iii）開始アミノ酸残基より２残基以上Ｃ末端側のアミノ酸残基からなる領域のうちアミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列IIからなる領域以外の領域中に、１個もしくは数個の任意のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸変異
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子。
【請求項８】
請求項７記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項９】
請求項８記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体又は形質導入体。
【請求項１０】
請求項９記載の形質転換体又は形質導入体を培養して得られる培養物。
【請求項１１】
請求項１０記載の培養物から採取される改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
【請求項１２】
請求項９記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物から改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することを特徴とする、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの製造方法。
【請求項１３】
請求項１〜６及び１１のいずれか１項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／又は請求項１０記載の培養物を、１，３−ジハロ−２−プロパノールと接触させることによりエピハロヒドリンを生成させることを特徴とする、エピハロヒドリンの製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜６及び１１のいずれか１項に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／又は請求項１０記載の培養物を、シアン化合物存在下、１，３−ジハロ−２−プロパノール又はエピハロヒドリンと接触させることにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させることを特徴とする、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及びその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハロヒドリンエポキシダーゼは、ハロヒドリンハイドロゲンハライドリアーゼ、ハロヒドリンデハロゲナーゼ又はハロアルコールデハロゲナーゼとも称され、１，３−ジハロ−２−プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性及びその逆反応を触媒する活性を有する酵素（EC number: 4.5.1.-）である。ハロヒドリンエポキシダーゼは、アミノ酸配列の相同性などから、３つのグループ（グループＡ、グループＢ、グループＣ）に大別されることが知られている（非特許文献１：J. Bacteriology, 183 (17), 5058-5066, 2001）。グループＡに分類されるハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheA（非特許文献２：Biosci. Biotechnol. Biochem., 58 (8), 1451-1457, 1994）、アースロバクター属（Arthrobacter sp.）AD2株由来のHheAAD2（非特許文献１）、アースロバクター属（Arthrobacter sp.）PY1株由来のDeh-PY1（非特許文献３：J. Health. Sci., 50 (6), 605-612, 2004）などが挙げられる。グループＢに分類されるハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB（非特許文献２）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）GP1株由来のHheBGP1（非特許文献１）、アースロバクター  エリシー（Arthrobacter erithii）H10a株由来のDehA（非特許文献４：Enz. Microbiol. Technol., 22, 568-574, 1998）などが挙げられる。グループＣに分類されるハロヒドリンエポキシダーゼとしては、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）DH094株由来のHheC（特許文献１：特開平10-210981号公報）、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheC（非特許文献）、アグロバクテリウム  チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のHalB（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=protein&val=4960076#feature 4960076）（非特許文献５：Thesis (1996) University of Wales, Cardiff, United Kingdom）などが挙げられる。【０００３】
エピハロヒドリンは種々の医薬品や生理活性物質の合成原料として有用な物質である。例えば、(Ｒ)−エピハロヒドリンの開環シアノ化によって得られる(Ｒ)−(−)−４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、Ｌ−カルニチンの合成原料として有用であることが知られている（特許文献２：特開昭57-165352号公報）。少なくとも一部のハロヒドリンエポキシダーゼについては、上述した１，３−ジハロ−２−プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性及びその逆反応を触媒する活性に加え、シアン化合物の存在下にエピハロヒドリンを開環シアノ化して４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成する反応を触媒することが明らかになっており、その反応を利用した例として、１，３−ジハロ−２−プロパノールから光学活性4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献３：特開平3-053889号公報、特許文献４：特開2001-25397号公報）及びエピハロヒドリンから光学活性4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを製造する方法（特許文献５：特開平3-053890号公報）が知られている。【０００４】
ところで、自然界より分離された微生物の菌体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性は、工業的利用の見地からは必ずしも十分に高いものではない。この課題を解決すべく、遺伝子組み換え技術を利用して形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性を向上させる試みが行われている。例えば、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のハロヒドリンエポキシダーゼHheBをコードする遺伝子をクローン化した種々発現プラスミドを導入することによって得られる種々の形質転換体を用いて、効率よく光学活性４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造できることが示されている（特許文献６：特開平4-278089号公報、特許文献７：特開平5-317066号公報、及び特許文献８：特開2007-049932号公報）。これらの形質転換体では、菌体内にハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を多コピー保有させることによって、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性を大きく向上させることに成功している。【０００５】
一方、近年の遺伝子工学技術の進歩により、酵素タンパク質の構成アミノ酸の１個以上を欠失、付加、挿入、もしくは他のアミノ酸で置換した変異体を意図的に作製することが可能となっている。これら変異体は、該変異の種類によっては、変異の導入されていない酵素と比較して、活性、安定性、有機溶媒耐性、耐熱性、耐酸性、耐アルカリ性、基質特異性などの性能が向上することが知られている。これら性能の向上は、活性あたりの酵素触媒製造コスト低減、酵素触媒の安定化、反応工程の簡略化、反応収率の向上等を通じて、酵素反応を利用した工業的生産における大幅な生産コスト低減をもたらすことがある。従って、多くの酵素において様々な性能が向上した有用な改良酵素の創製が行われている。ハロヒドリンエポキシダーゼにおいても、構成アミノ酸の１個以上を欠失、付加、挿入、もしくは他のアミノ酸で置換した変異体の報告がなされている。例えば、特許文献９（国際公開第2005/017141号パンフレット）には、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCの変異体369種及びコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheBの変異体1種類がが記載されている。また、特許文献１０（米国特許出願公開第2005/0272064号明細書）には、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCの変異体570種類及びコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheBの変異体1種類が記載されている。さらに、特許文献１１（米国特許出願公開第2006/0099700号明細書）には、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCの変異体1422種類及びコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheBの変異体1種類が記載されている。これらのうちのいくつかの変異体については、エチル(Ｒ)−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレイトからエチル(Ｓ)−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレイトへの変換反応における活性が向上したことが示されている。また、非特許文献６（J. Bacteriol., 183 (17) , 5058-5066, 2001）には、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCの変異体Ser132Ala、Ser132Cys、Tyr145Phe、Arg149Lys、Arg149Glu及びArg149Glnが記載されている。非特許文献７（Enz. Microbiol. Technol., 30, 251-258, 2002）には、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCの変異体C30A、C153S、C229A及びC153S/C229Aが記載されており、変異体C30A及びC153Sは野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも安定性が向上したことが示されている。非特許文献８（EMBO J., 22 (19) , 4933-4944, 2003）には、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCの変異体Asp80Asn及びAsp80Alaが記載されている。非特許文献９（Biochemistry, 42 (47), 14057-14065, 2003）には、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCの変異体W139F、W192F、W238F及びW249Fが記載されている。非特許文献１０（Biochemistry, 44 (17), 6609-6618, 2005）には、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCの変異体N176A、N176D及びY187Fが記載されている。これらはいずれもアグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のハロヒドリンエポキシダーゼHheCの変異体に関するものである。【０００６】
【特許文献１】特開平10-210981号公報
【特許文献２】特開昭57-165352号公報
【特許文献３】特開平3-053889号公報
【特許文献４】特開2001-25397号公報
【特許文献５】特開平3-053890号公報
【特許文献６】特開平4-278089号公報
【特許文献７】特開平5-317066号公報
【特許文献８】特開2007-049932号公報
【特許文献９】国際公開第2005/017141号パンフレット
【特許文献１０】米国特許出願公開第2005/0272064号明細書
【特許文献１１】米国特許出願公開第2006/0099700号明細書
【非特許文献１】J. Bacteriol., 183 (17), 5058-5066, 2001
【非特許文献２】Biosci. Biotechnol. Biochem., 58 (8), 1451-1457, 1994
【非特許文献３】J. Health. Sci., 50 (6), 605-612, 2004
【非特許文献４】Enz. Microbiol. Technol., 22, 568-574, 1998
【非特許文献５】Thesis (1996) University of Wales, Cardiff, United Kingdom
【非特許文献６】J. Bacteriol., 183 (17), 5058-5066, 2001
【非特許文献７】Enz. Microbiol., Technol. 30, 251-258, 2002
【非特許文献８】EMBO J., 22 (19), 4933-4944, 2003
【非特許文献９】Biochemistry, 42 (47), 14057-14065, 2003
【非特許文献１０】Biochemistry, 44 (17), 6609-6618, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ハロヒドリンエポキシダーゼを工業的に利用する場合には、酵素触媒として更なる高度化が望まれる。例えば、上述したように形質転換体内におけるハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の高コピー化により、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性をある程度まで高めることができるが、経済性・実用性の見地から、さらなる活性向上が望まれる。従って、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性の向上をもたらすようなハロヒドリンエポキシダーゼが望まれる。また、光学活性な4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルの製造を目的とする場合、既知のハロヒドリンエポキシダーゼにより製造される4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルの光学純度は必ずしも十分に高いものではない。従って、より光学純度の高い4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを生成するような、立体選択性が向上したハロヒドリンエポキシダーゼが望まれる。また、１，３−ジハロ−２−プロパノールを出発原料としてハロヒドリンエポキシダーゼにより4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルの製造を行う場合、生成物（塩化物イオン及び4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリル）の阻害による反応速度の低下が生じうる。従って、生成物阻害を受け難いハロヒドリンエポキシダーゼが望まれる。また、4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリルを安価に製造するためには、通常、反応系内の基質及び／又は生成物（4−ハロ−3−ヒドロキシブチロニトリル）濃度を高くして装置あたりの生産性を向上させることが望ましいが、既知のハロヒドリンエポキシダーゼによる生成物蓄積濃度は必ずしも十分に高いものではない。従って、高濃度の生成物を蓄積できるハロヒドリンエポキシダーゼが望まれる。【０００８】
そこで、本発明の目的は、これら課題を解決しうるハロヒドリンエポキシダーゼ、及びその製造方法、ならびにそれを用いたエピハロヒドリン又は４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために誠意研究を行った。その結果、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列、特にグループＢに分類される野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において、特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することにより、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性、立体選択性、生成物阻害耐性、生成物蓄積能などの属性が向上した改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを創出できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） 以下のアミノ酸配列Ｉ：
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15（配列番号７４）
（Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
及び以下のアミノ酸配列II：
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21（配列番号７５）
（Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の（A）〜(D)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
（A）開始アミノ酸残基（通常はメチオニン残基）より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（B）α14残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（C）α15残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（D）β21残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異【００１１】
（２） 以下のアミノ酸配列Ｉ：
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15（配列番号７４）
（Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
及び以下のアミノ酸配列II：
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21（配列番号７５）
（Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
を含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の（E）〜(H)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
（E）開始アミノ酸残基（通常はメチオニン残基）より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基がリジン又はアスパラギンに置換されたアミノ酸変異
（F）α14残基がアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
（G）α15残基がアラニン、セリン又はトリプトファンに置換されたアミノ酸変異
（H）β21残基がグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンに置換されたアミノ酸変異【００１２】
上記（１）及び（２）に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼにおいて、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、例えば、グループＢに分類されるものが挙げられる。
上記（１）及び（２）に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼにおいて、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、例えば、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌又はマイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌由来のもの等が挙げられる。【００１３】
上記（１）及び（２）に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼにおいて、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列としては、例えば、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列等が挙げられる。
上記（１）及び（２）に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、例えば、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の（i）〜（iii）より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなるもの等が挙げられる。
（i）開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基、α14残基、α15残基及びβ21残基以外のアミノ酸残基より選択される１個もしくは数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（ii）開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基、アミノ酸配列Ｉに含まれるアミノ酸残基及びアミノ酸配列IIに含まれるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基より選択される１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸変異
（iii）開始アミノ酸残基より２残基以上Ｃ末端側のアミノ酸残基からなる領域のうちアミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列IIからなる領域以外の領域中に、１個もしくは数個の任意のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸変異【００１４】
（３） 上記（１）又は（２）に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子。
（４） 上記（３）に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（５） 上記（４）に記載の組換えベクターを宿主に導入して得られる形質転換体又は形質導入体。
（６） 上記（５）に記載の形質転換体又は形質導入体を培養して得られる培養物。【００１５】
（７） 上記（６）に記載の培養物から採取される改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ。
（８） 上記（５）に記載の形質転換体又は形質導入体を培養し、得られる培養物から改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することを特徴とする、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの製造方法。
（９） 上記（１）、（２）又は（７）に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ、及び／又は上記（６）に記載の培養物を、１，３−ジハロ−２−プロパノールと接触させることによりエピハロヒドリンを生成させることを特徴とする、エピハロヒドリンの製造方法。【００１６】
（１０） 上記（１）、（２）又は（７）に記載の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ、及び／又は上記（６）に記載の培養物を、シアン化合物存在下、１，３−ジハロ−２−プロパノール又はエピハロヒドリンと接触させることにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させることを特徴とする、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性、立体選択性、生成物阻害耐性、生成物蓄積能などが向上した改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ得ることができるとともに、これらを利用してエピハロヒドリン又は４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体（JM109/pST111、JM109/pSTK001及びJM109/pSTT001）及び改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体（JM109/pSTK002、JM109/pSTK003 、JM109/pSTT002及びJM109/pSTT003）由来の粗酵素液を、SDS-PSGEで分析した結果を表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下に本発明の実施の形態について説明するが、本実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2007-057854号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。【００２０】
（Ｉ）ハロヒドリンエポキシダーゼ活性
本発明において、「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」とは、１，３−ジハロ−２−プロパノールをエピハロヒドリンに変換する活性及びその逆反応を触媒する活性を意味する。１，３−ジハロ−２−プロパノールは、下記一般式（１）で示される化合物である。
【化１】
2008108466.tif 000002
（式中、Ｘ1及びＸ2は、それぞれ独立して同一の又は異なるハロゲン原子を表す。）
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール（以下、「ＤＣＰ」と称することがある）、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。【００２１】
エピハロヒドリンは、下記一般式（２）で示される化合物である。
【化２】
2008108466.tif 000003
（式中、Ｘはハロゲン原子を表す。）
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン（以下、「ＥＣＨ」と称することがある）、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。【００２２】
本発明においては、「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」は、時間あたりの１，３−ジハロ−２−プロパノールからのエピハロヒドリン生成量又は塩化物イオン生成量を測定することにより求めることができる。エピハロヒドリン生成量は、例えば、液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィーなどによって定量することができる。また、塩化物イオン生成量は、例えば、その塩化物イオンの生成に伴って低下するpHをある一定の値に保つように連続的又は断続的にアルカリ溶液を添加し、時間あたりに要したアルカリの量から便宜的に求めることができる。この方法により算出されるハロヒドリンエポキシダーゼ活性を特に「脱クロル活性」と呼ぶことがある。また、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼに対する抗体を作製し、ウェスタンブロットやELISA法などの免疫学的手法によっても算出することが可能である。その他、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性が形質転換体内における発現量と比例すると仮定する場合は、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性が既知であるサンプルと比較することなどにより、SDS-PAGEなどの分析手段によっても間接的に求めることができる。SDS-PAGEは当業者であれば公知の方法を用いて行うことができる。【００２３】
なお、少なくとも一部のハロヒドリンエポキシダーゼについては、上述の「ハロヒドリンエポキシダーゼ活性」に加え、シアン化合物の存在下にエピハロヒドリンを開環シアノ化して４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成する反応を触媒する活性を有する。この場合におけるシアン化合物としては、シアン化水素、シアン化カリウム（以下、「ＫＣＮ」と称することがある）、シアン化ナトリウム、シアン酸又はアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン（ＣＮ−）又はシアン化水素を生じる化合物又はその溶液等が挙げられる。また、４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、下記一般式（３）で示される化合物である。
【化３】
2008108466.tif 000004
（式中、Ｘはハロゲン原子を表す。）【００２４】
ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には４−フルオロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（以下、「ＣＨＢＮ」と称することがある）、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ヨード−３−ヒドロキシブチロニトリル等が挙げられ、好ましくは、４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、４−ブロモ−３−ヒドロキシブチロニトリルである。【００２５】
（II）ハロヒドリンエポキシダーゼ
（II-1）野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ
本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ（特に好ましくは、グループＢに分類されるもの）に変異（アミノ酸変異）を導入することによって改良したものあり、その由来は特に限定されるものではない。ここで、「野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ」とは、自然界の生物より分離されうるハロヒドリンエポキシダーゼを指し、該酵素を構成するアミノ酸配列において、意図的又は非意図的なアミノ酸の欠失又は他のアミノ酸による置換もしくは挿入がなく、天然由来の属性を保持したままのハロヒドリンエポキシダーゼを意味する。【００２６】
さらに、本発明において用いる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼは、以下のアミノ酸配列Ｉ（19アミノ酸残基）：
S-α1-α2-α3-α4-α5-α6-α7-α8-α9-α10-α11-α12-Y-α13-α14-A-R-α15 （配列番号７４）
（Sはセリン残基、Yはチロシン残基、Aはアラニン残基、Rはアルギニン残基を表し、α1〜α15はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
及び以下のアミノ酸配列II（10アミノ酸残基）：
L-β16-R-L-β17-β18-β19-β20-E-β21 （配列番号７５）
（Lはロイシン残基、Rはアルギニン残基、Eはグルタミン酸残基を表し、β16〜β21はそれぞれ独立して同一の又は異なる任意のアミノ酸残基を表す。）
を含むアミノ酸配列からなる。野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、アミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列IIを含むアミノ酸配列からなるものであるか否かは、公共の配列データベース、例えば、米国生物工学情報センター (NCBI; National Center for Biotechnology Information) により提供されるGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein）においてハロヒドリンエポキシダーゼとして登録されているものを検索し、該当したもののアミノ酸配列中に、上記アミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列IIが含まれるか否かを調べればよい。必要に応じて、遺伝子情報解析用ソフトウェアを用いて行うことができる。また、公知文献で野生型ハロヒドリンエポキシダーゼアミノ酸配列について記載されているものがあればそれを参考にしてもよい。例えば、J. Bacteriology, 183 (17), 5058-5066, 2001に記載されている各種野生型ハロヒドリンエポキシダーゼアミノ酸配列のアラインメント情報を参考にすることで、アミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列IIが含まれるか否か、及び全アミノ酸配列中のどの位置に含まれるかを知ることができる。なお、アミノ酸配列Ｉにおけるセリン残基、チロシン残基、アルギニン残基及びアラニン残基、ならびにアミノ酸配列IIにおけるロイシン残基、アルギニン残基及びグルタミン酸残基は、既知の各種野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において高度に保存されている。【００２７】
野生型ハロヒドリンエポキシダーゼは、アミノ酸配列の相同性などから、３つのグループ（グループＡ、グループＢ、グループＣ）に大別されることが知られている（J. Bacteriology, 18 3(17), 5058-5066, 2001）。なかでも、本発明において用いる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼとしては、グループＢの属するものが特に好ましい。
グループＡに分類されるハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheA（Biosci. Biotechnol. Biochem., 58 (8), 1451-1457, 1994）、アースロバクター属（Arthrobacter sp.）AD2株由来のHheAAD2（J. Bacteriology, 183 (17), 5058-5066, 2001）及びアースロバクター属（Arthrobacter sp.）PY1株由来のDeh-PY1（J. Health. Sci., 50 (6), 605-612, 2004）などが挙げられる。
グループＢに分類されるハロヒドリンエポキシダーゼとしては、コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB（Biosci. Biotechnol. Biochem., 58 (8), 1451, 1994）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）GP1株由来のHheBGP1（J. Bacteriology, 183 (17), 5058-5066, 2001）、アースロバクター  エリシー（Arthrobacter erithii）H10a株由来のDehA（Enz. Microbiol. Technol., 22, 568-574, 1998）などが挙げられる。グループＣに分類されるハロヒドリンエポキシダーゼとしては、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）DH094株由来のHheC（特開平１０−２１０９８１号公報）、アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheC（J. Bacteriology, 183 (17), 5058-5066, 2001）、アグロバクテリウム  チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）由来のHalB（Thesis (1996) University of Wales, Cardiff, United Kingdom）などが挙げられる。
なお、これらハロヒドリンエポキシダーゼのうち、アミノ酸配列が明らかにされているものについては、米国生物工学情報センター(NCBI; National Center for Biotechnology Information)により提供されるGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=protein）において、以下のAccession No.により登録されている。【００２８】
「Accession No. BAA14361」：コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheAのアミノ酸配列
「Accession No. AAK92100」：アースロバクター属（Arthrobacter sp.）AD2株由来のHheAAD2のアミノ酸配列
「Accession No. BAA14362」：コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheBのアミノ酸配列
「Accession No. AAK73175」：マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）GP1株由来のHheBGP1のアミノ酸配列
「Accession No. AAK92099」：アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCのアミノ酸配列
「Accession No. AAD34609」：アグロバクテリウム  チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens） 由来のHalBのアミノ酸配列【００２９】
なお、本発明において主として例示するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のハロヒドリンエポキシダーゼHheBについては、その遺伝子（HheB）が２つの開始コドンを有するため、結果的に、Ｎ末端近傍の８アミノ酸残基の有無のみが異なる２種のハロヒドリンエポキシダーゼが存在することが報告されている（Biosci. Biotechnol. Biochem., 58 (8), 1451-1457, 1994）。本発明において、両者（上記２種のハロヒドリンエポキシダーゼ）を区別して称するときは、最初の開始コドンから翻訳されたアミノ酸配列（配列番号１）からなるHheBを「HheB(1st)」と称し、２番目の開始コドンから翻訳されたアミノ酸配列（配列番号２）からなるHheBを「HheB(2nd)」と称することとし、これらはいずれも野生型ハロヒドリンエポキシダーゼであるものとする。【００３０】
ここで、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるHheB(1st)において、アミノ酸配列Ｉは、第126番目〜第144番目のアミノ酸残基からなる配列に相当し、アミノ酸配列IIは、第198番目〜第207番目のアミノ酸残基からなる配列に相当する。同様に、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるHheB(2nd)において、アミノ酸配列Ｉは、第118番目〜第136番目のアミノ酸残基からなる配列に相当し、アミノ酸配列IIは、第190番目〜第199番目のアミノ酸残基からなる配列に相当する。また、HheB(2nd)のアミノ酸配列は、前述した２つの開始コドンの影響により、HheB(1st)のアミノ酸配列におけるＮ末端近傍の８アミノ酸残基（具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列中の第１番目〜第８番目のアミノ酸残基）が欠失した状態のアミノ酸配列からなるものである。【００３１】
本明細書においては、主にコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来の野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheBを例に挙げて説明するが、前述のように、ハロヒドリンエポキシダーゼの由来は限定されず、HheB以外のハロヒドリンエポキシダーゼであっても前記アミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列IIを含むアミノ酸配列からなるものであれば、同様の説明が適用され得る。また、本発明で示した変異の位置又は変異するアミノ酸種若しくは塩基配列を操作することによって、いずれの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを得ることもできる。なお、本発明において、「高い相同性」というときは、例えば60％以上の相同性をいい、好ましくは75％以上の相同性であり、特に好ましくは90％以上の相同性である。【００３２】
（II-2）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ
本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ」は、主として遺伝子組換え技術を利用して、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換変異が導入されたアミノ酸配列からなるものであり、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性、立体選択性、生成物阻害耐性、生成物蓄積能などが向上したハロヒドリンエポキシダーゼである。
本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも高いものが含まれる。ここで言う形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性の向上の本質的な原因としては、アミノ酸置換変異に起因するものであれば如何なるものでもよく、例えば、酵素タンパク質あたり比活性自体の向上、活性型コンフォメーション形成能の向上、形質転換体内における発現量増加、形質転換体内における酵素の安定性向上、対基質耐性の向上、生成物阻害感受性の低下などが挙げられる。【００３３】
なお、「形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」とは、「形質転換体乾燥菌体単位重量あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」を意味し、「菌体比活性」とも称するものとする（なお、本明細書中、乾燥菌体を「DC」と称することがある）。また、「可溶性タンパク質あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」とは、「可溶性タンパク質単位重量あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」を意味し、「タンパク比活性」とも称するものとする。さらに、本発明においては、便宜的に、一定量の形質転換体からは一定量の可溶性タンパク質を得ることができるものとし、「形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」（「菌体比活性」）は「可溶性タンパク質あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」（「タンパク比活性」）に比例するものとする。すなわち、「可溶性タンパク質あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」（「タンパク比活性」）が高ければ（低ければ）、「形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」（「菌体比活性」）が高い（低い）ものとする。また、本発明において、「液活性」とは、単位溶液量あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性を意味する。該溶液としては、ハロヒドリンエポキシダーゼを生産する形質転換体を培養して得られる「培養物」から得ることができるものを含有する溶液が挙げられる。具体的には、培養液、培養液上清、細胞若しくは菌体懸濁液、細胞若しくは菌体破砕液、粗酵素液及びこれらの処理物などが挙げられる。「液活性」を、その溶液の菌濃度あるいは可溶性タンパク質濃度で除することにより、「形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」（「菌体比活性」）あるいは「可溶性タンパク質あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性」（「タンパク比活性」）を算出することができる。また、本発明において「活性回収率」とは、一定の操作前の活性を100％として、操作後に回収された活性の相対比（％）を意味する。【００３４】
また、本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、基質１，３−ジハロ−２−プロパノール又はエピハロヒドリンから、エピハロヒドリン又は４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させた場合の該生成物の光学純度が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにより同基質から同生成物を生成させた場合の該生成物の光学純度よりも高くなるという属性を有するものが含まれる。すなわち、基質である１，３−ジハロ−２−プロパノール及び／又はエピハロヒドリンに対する立体選択性が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも向上しているものが含まれる。立体選択性向上の本質的な原因としては、アミノ酸置換変異に起因するものであれば如何なるものでもよい。【００３５】
なお、本発明において、「光学活性」とは、一方の鏡像異性体が他方の鏡像異性体よりも多く含まれている物質の状態、又はいずれか一方の鏡像異性体のみから成っている物質の状態を言う。また、「光学純度」とは、「鏡像異性体過剰率（％ee）」にほぼ等しいものであるとし、次式で定義する。
光学純度 ≒ 鏡像異性体過剰率＝100×(|[R]-[S]|)/([R]+[S]) （％ee）
ここで、[R]及び[S]は試料中の鏡像異性体のそれぞれの濃度を示す。また、本発明において、「立体選択性」とは、ハロヒドリンエポキシダーゼが、基質から生成物を生成する際に、いずれか一方の鏡像異性体が生成する反応を優先的に触媒する性質を言う。【００３６】
また、本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、１，３−ジハロ−２−プロパノール又はエピハロヒドリンからの生成物である塩化物イオン又は４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルによる反応阻害に対する耐性が野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも向上しているもの、すなわち生成物阻害耐性が向上したものが含まれる。生成物阻害耐性向上向上の本質的な原因としては、アミノ酸置換変異に起因するものであれば如何なるものでもよい。
また、本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、基質１，３−ジハロ−２−プロパノール又はエピハロヒドリンから、エピハロヒドリン又は４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを生成させる場合に、生成物を高濃度生成及び蓄積させることができるという属性を有するもの、すなわち生成物蓄積能が向上したものが含まれる。生成物蓄積能向上の本質的な原因としては、アミノ酸置換変異に起因するものであれば如何なるものでもよい。【００３７】
本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ」は、具体的には、前述したアミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列IIを含む野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の（A）〜(D)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなるものである。
（A）開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（B）アミノ酸配列Ｉ中のα14残基が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（C）アミノ酸配列Ｉ中のα15残基が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（D）アミノ酸配列II中のβ21残基が、他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異【００３８】
なお、上記(A)において「開始アミノ酸残基」とは、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼを遺伝子（DNA又はmRNA）中の翻訳開始コドンがコードするアミノ酸に対応するアミノ酸残基を意味し、すなわち、翻訳後の野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列におけるＮ末端アミノ酸残基（通常はメチオニン残基）を意味する。【００３９】
上記（A）〜（D）のアミノ酸変異は、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において最もＮ末端側に位置する開始アミノ酸残基（通常はメチオニン残基）を１番目と定義したときに、当該開始アミノ酸残基からＣ末端側に向かって何番目のアミノ酸残基におけるアミノ酸変異であるかによっても特定することができる。例えば、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB(1st)である場合は、（A）における「開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基」、（B）における「α14残基」、（C）における「α15残基」及び（D）における「β21残基」は、それぞれ、（A）２番目のアミノ酸残基（アラニン残基）、（B）141番目のアミノ酸残基（スレオニン残基）、（C）144番目のアミノ酸残基（フェニルアラニン残基）及び（D）207番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸残基）に該当する。また、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB(2nd)である場合は、（A）における「開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基」、（B）における「α14残基」、（C）における「α15残基」及び（D）における「β21残基」は、それぞれ、（A）２番目のアミノ酸残基（アラニン残基）、（B）133番目のアミノ酸残基（スレオニン残基）、（C）136番目のアミノ酸残基（フェニルアラニン残基）及び（D）199番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸残基）に該当する。しかし、HheB(2nd)は、前述した通り、HheB(1st)のアミノ酸配列におけるＮ末端近傍の８アミノ酸残基が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質に過ぎず、HheB(1st)及びHheB(2nd)の両アミノ酸配列における各アミノ酸残基の絶対的役割は実質的に同一である。【００４０】
本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ」の好ましい態様としては、例えば、以下の（E）〜(H)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなるものが挙げられる。
（E）開始アミノ酸残基（通常はメチオニン残基）より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基が、他のアミノ酸としてリジン又はアスパラギンに置換されたアミノ酸変異
（F）アミノ酸配列Ｉ中のα14残基が、他のアミノ酸としてアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
（G）アミノ酸配列Ｉ中のα15残基が、他のアミノ酸としてアラニン、セリン又はトリプトファンに置換されたアミノ酸変異
（H）アミノ酸配列II中のβ21残基が、他のアミノ酸としてグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンに置換されたアミノ酸変異
ここで、上記（E）〜(H)のアミノ酸変異は、それぞれ順に、前述した（A）〜(D)のアミノ酸変異の具体的態様を例示したもの（詳しくは「他のアミノ酸」の具体例を示したもの）である。【００４１】
そのため、前述した（A）〜（D）の場合と同様に、上記（E）における「開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基」、（F）における「α14残基」、（G）における「α15残基」及び（H）における「β21残基」は、それぞれ、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼアミノ酸配列において最もＮ末端側に位置する開始アミノ酸残基（通常はメチオニン残基）を１番目と定義したときに、当該開始アミノ酸残基からＣ末端側に向かって何番目のアミノ酸であるかによっても特定することができる。すなわち、例えば、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB(1st)である場合は、上記（E）〜（H）のアミノ酸変異の態様は、以下のように特定することができる。【００４２】
（E）２番目のアミノ酸残基（アラニン残基）がリジン又はアスパラギンに置換されたアミノ酸変異
（F）141番目のアミノ酸残基（スレオニン残基）がアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
（G）144番目のアミノ酸残基（フェニルアラニン残基）がアラニン、セリン又はトリプトファンに置換されたアミノ酸変異
（H）207番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸残基）がグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニンに置換されたアミノ酸変異【００４３】
また、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB(2nd)である場合は、上記（E）〜（H）のアミノ基変異の態様は、以下のように特定することができる。
（E）２番目のアミノ酸残基（アラニン残基）がリジン又はアスパラギンに置換されたアミノ酸変異
（F）133番目のアミノ酸残基（スレオニン残基）がアラニン、システイン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
（G）136番目のアミノ酸残基（フェニルアラニン残基）がアラニン又はセリンに置換されたアミノ酸変異
（H）199番目のアミノ酸残基（アスパラギン酸残基）がグルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、セリン、スレオニン、イソロイシン又はチロシンに置換されたアミノ酸変異【００４４】
本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ」のさらに具体的かつ好ましい態様としては、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB(1st)である場合は、配列番号３〜１５及び７６〜７９に示されるアミノ酸配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼが挙げられる。また、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB(2nd)である場合は、配列番号１６〜２８及び８０〜８３に示されるアミノ酸配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼが挙げられる。【００４５】
以下、配列番号３〜１５及び７６〜７９に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸変異（アミノ酸置換）の態様を表Ａに示し、配列番号１６〜２８及び８０〜８３に示されるアミノ酸配列におけるアミノ酸変異（アミノ酸置換）の態様を表Ｂに示す。ここで、表Ａ中、「Ala2」、「Thr141」、「Phe144」及び「Asp207」との表記は、配列番号１のアミノ酸配列におけるアミノ酸置換の対象となるアミノ酸残基の位置と種類（３文字表記）を表しており、例えば「Thr141」は第141番目のスレオニン残基を意味する。また、これら「Ala2」等の下欄中の表記は、配列番号３〜１５及び７６〜７９の各アミノ酸配列におけるアミノ酸置換後のアミノ酸残基を表しており、例えば、配列番号３のアミノ酸配列であれば、「Ala2」の下欄に「Lys」と表記されていることから、第２番目のアラニン残基がリジン残基に置換されたアミノ酸配列であることを意味する。なお、「−」との表記はアミノ酸置換がなかったことを意味する。さらに、アミノ酸置換後の各アミノ酸配列をコードする塩基配列（後述する）の配列番号を表の最右欄に併記する。以上の表Ａ中の表記の説明は、表Ｂについても同様に適用される。【００４６】
【表Ａ】
2008108466.tif 000005
【００４７】
【表Ｂ】
2008108466.tif 000006
【００４８】
本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記（A）〜（D）、好ましくは（E）〜（H）より選択されるアミノ酸変異を１つ以上有するアミノ酸配列からなるものであればよい。従って、本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼには、上記（A）〜（H）の特徴（すなわち（A）〜（H）のアミノ酸変異）を複数組み合わせて有するアミノ酸配列からなるものも含まれる。また、上記（A）〜（H）のアミノ酸変異の態様は維持しつつ、さらに、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのベースとなる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列に対して以下の（i）〜（iii）より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列からなる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼも、本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの範囲に含まれる。【００４９】
（i）開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基、アミノ酸配列Ｉ中のα14残基、アミノ酸配列Ｉ中のα15残基及びアミノ酸配列II中のβ21残基以外のアミノ酸残基より選択される１個もしくは数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸変異
（ii）開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基、アミノ酸配列Ｉに含まれるアミノ酸残基及びアミノ酸配列IIに含まれるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基より選択される１個もしくは数個のアミノ酸残基が欠失したアミノ酸変異
（iii）開始アミノ酸残基より２残基以上Ｃ末端側のアミノ酸残基からなる領域のうちアミノ酸配列Ｉ及びアミノ酸配列IIからなる領域以外の領域中に、１個もしくは数個の任意のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸変異【００５０】
上記（i）〜（iii）の態様において、「１個もしくは数個」とは、例えば１個〜10個程度、好ましくは１個〜５個程度を指す。
なお、本発明において、アミノ酸の種類を３文字又は１文字のアルファベット表記で表すことがある。さらに、数字の前又は前後に、３文字又は１文字のアルファベットを配して表記することがあり、この場合は、アミノ酸残基の箇所及び置換前後のアミノ酸の種類を表す。すなわち、数字は、特に断りがない限り、上述したように、翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基（通常はメチオニン）を１番目と定義した場合に、何番目のアミノ酸残基であるかを示すものである。また、数字の前に表示した３文字又は１文字のアルファベットは、アミノ酸置換前のアミノ酸の３文字又は１文字表記を表し、数字の後に表示した３文字又は１文字のアルファベットは、アミノ酸置換が生じた場合の置換後のアミノ酸の３文字又は１文字表記を表すものとする。例えば、207番目のアスパラギン酸残基は「Asp207」又は「D207」と、207番目のアスパラギン酸残基がヒスチジンに置換された場合は「Asp207His」又は「D207H」と表記することがある。【００５１】
（III）ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子
（III-1）野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子
野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのうち、その遺伝子配列（塩基配列）が明らかにされているものについては、米国生物工学情報センター (NCBI; National Center for Biotechnology Information) により提供されるGenBankデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide）において、以下のAccession No.により登録されている。【００５２】
「Accession No. D90349」：コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheAをコードする遺伝子の塩基配列
「Accession No. AF397297」：アースロバクター属（Arthrobacter sp.）AD2株由来のHheAAD2をコードする遺伝子の塩基配列
「Accession No. D90350」：コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheBをコードする遺伝子の塩基配列
「Accession No. AY044094」：マイコバクテリウム属（Mycobacterium sp.）GP1株由来のHheBGP1をコードする遺伝子の塩基配列
「Accession No. AF397296」：アグロバクテリウム  ラジオバクター（Agrobacterium radiobacter）AD1株由来のHheCをコードする遺伝子の塩基配列
「Accession No. AF149769」：アグロバクテリウム  チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens） 由来のHalBをコードする遺伝子の塩基配列【００５３】
本発明においては、これらを「野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子」と呼ぶものとする。ここで、当該「野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子」における「野生型」の語は、「ハロヒドリンエポキシダーゼ」に係る語であり、ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列が「野生型」であることを意味する。本発明における「野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子」を構成する塩基配列は、形質転換体宿主において利用可能なコドンをコードするものであればよく、必ずしも由来生物ゲノムDNA上にコードされている野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列に限定はされない。なお、（II-1）野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにおいて述べたHheB(1st)をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子をHheB(1st)と称し、HheB(2nd)をコードする遺伝子をHheB(2nd)と称するものとする。HheB(1st)の塩基配列は配列番号２９に示され、HheB(2nd)の塩基配列は配列番号３０に示される。【００５４】
塩基配列が明らかになっている野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を取得する方法としては、由来生物からゲノムDNAを調製し、明らかにされている野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子配列情報をもとにプライマーを設計し、該プライマーを用いてPCR法でハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子を増幅する方法が挙げられる。由来生物として、例えば、N−1074株が挙げられ、当該株は、受託番号「FERM BP-2643」として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６（以下、本明細書において同様））に昭和６３年１１月１０日付で寄託されている。また、公知の遺伝子配列情報を基に、合成オリゴDNAを組み合わせたPCR法(assembly PCR)などを利用して、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の全長を化学的に合成することも可能である。例えば、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子をいくつかの領域（例えば、50塩基程度）に分割し、隣り合う領域とのオーバーラップ（例えば、20塩基程度）を両端に有する複数のオリゴヌクレオチドを設計及び合成する。該オリゴヌクレオチドをPCR法で互いにアニールさせることにより野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を増幅することができる。【００５５】
また、必要に応じて、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子のコドンを変更してもよい。コドンを変更する手段としては、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の部位特異的変位誘発法や、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばQuickChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製））等を用いて行うことができる。この他、上述したように、合成オリゴDNAを組み合わせたPCR法(assembly PCR)を行う際に、コドンを変更したプライマーを用いることでコドンを変更することも可能である。【００５６】
（III-2）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子
本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子とは、（II-2）で述べた改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ酵素タンパク質をコードする遺伝子を意味する。本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子とは、例えば、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼに対して前記（II-2）の（A）〜(D)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子であり、より好ましくは、前記（II-2）の（E）〜(H)より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼをコードする遺伝子である。野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子及び上記アミノ酸変異導入後のアミノ酸残基を構成する塩基配列は、形質転換体宿主において利用可能なコドンをコードするものであればよく、必ずしも由来生物ゲノムDNA上にコードされている野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列に限定されない。なお、前記（II-1）の野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにおいて述べたHheB(1st)をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子であるHheB(1st)、及びHheB(2nd)をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子であるHheB(2nd)は、いずれも、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を得るためのベースとなる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子としても用いることができる。本発明における「改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子」のさらに具体的かつ好ましい態様としては、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB(1st)である場合は、配列番号３１〜４３及び８４〜８７に示される塩基配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が挙げられる。また、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するコリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来のHheB(2nd)である場合は、配列番号４４〜５６及び８８〜９１に示される塩基配列を有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が挙げられる。【００５７】
本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子は、前記（II-2）の（A）〜（H）より選択されるアミノ酸変異が１つ以上導入された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子であればよく、従って、前記（II-2）の（A）〜（H）の特徴（すなわち（A）〜（H）のアミノ酸変異）を複数組み合わせて有する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子も含まれる。また、前記（II-2）の（A）〜（H）のアミノ酸置換の態様は維持しつつ、さらに、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのベースとなる野生型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列において前記（II-2）の（i）〜（iii）より選択されるいずれかのアミノ酸変異が導入された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子も、本発明における改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の範囲に含まれる。【００５８】
さらに、本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子としては、前記（II-2）の（A）〜（H）より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAも含まれる。このようなDNAは、例えば、上記（A）〜（H）より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子DNA若しくはその相補配列、又はこれらの断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、cDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。ライブラリーは、公知の方法で作製されたものを利用することができ、また市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを利用することもできる。【００５９】
「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄時の条件であって塩濃度が300〜2000mM、温度が40〜75℃、好ましくは塩濃度が600〜900mM、温度が65℃の条件を意味する。例えば、2×SSCで50℃等の条件を挙げることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、前記（II-2）の（A）〜（H）より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを得るための条件を設定することができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))等を参照することができる。ハイブリダイズするDNAとしては、例えば、前記（II-2）の（A）〜（H）より選択されるいずれか又は複数のアミノ酸変異が導入されたアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して、少なくとも40％以上、好ましくは60％、さらに好ましくは90％以上の同一性を有する塩基配列を含むDNA又はその部分断片が挙げられる。【００６０】
本発明において、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の調製を行う方法は変異を導入する既知の如何なる方法でもよく、通常は、公知の方法で行なうことができる。例えば、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を基に、市販のキットを利用して部位特異的な置換を生じさせる方法や、遺伝子DNAを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去・付加し連結する方法等が挙げられる。これらの部位特異的変異誘発法は「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997))、Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 488-492 (1985)、Kramer and Fritz Method. Enzymol., 154: 350-367(1987)、Kunkel, Method. Enzymol., 85: 2763-2766 (1988)等に記載されている。近年では、Kunkel法や Gapped duplex法を基にした部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ（株）社製）等を用いて行うことができる。また、目的とする変異導入箇所が、対象遺伝子配列において消化・連結が容易な制限酵素部位の近隣に存在する場合、目的変異を導入したプライマー（合成オリゴDNA）を用いてPCRを行うことで、目的変異が導入された遺伝子DNA断片を容易に得ることができる。さらには、合成オリゴDNAを組み合わせたPCR法(assembly PCR)で伸長させて合成遺伝子として得ることもできる。また、ハイドロキシルアミンや亜硝酸等の変異源となる薬剤を接触・作用させる方法、紫外線照射により変異を誘発する方法、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いてランダムに変異を導入する方法などのランダムな変異導入法によっても、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子から改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を得ることができる。【００６１】
（IV）組換えベクター、形質転換体
（IV-1）組換えベクター
上記の方法によって得た本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を宿主で発現させるために、遺伝子の上流に転写プロモーターを、下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することができる。あるいは、当該改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を導入する発現ベクターに転写プロモーターとターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーターとターミネーターを利用してその間に当該変異遺伝子を挿入すればよい。ベクターに当該改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。なお、本発明においては、このような組み込み操作を、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の調製操作と兼ねて行うこともできる。すなわち、他のアミノ酸をコードする塩基配列に置換した塩基配列を有するプライマーを用い、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子がクローニングされた組換えベクターを鋳型としてPCRを行い、得られた増幅産物をベクターに組み込むことができる。【００６２】
プロモーターの種類は宿主において適切な発現を可能にするものであれば特に限定されるものではないが、例えば、大腸菌宿主において利用できるのものとしては、トリプトファンオペロンのtrpプロモーター、ラクトースオペロンのlacプロモーター、ラムダファージ由来のPLプロモーター及びPRプロモーターなどが挙げられ、tacプロモーター、trcプロモーターのように改変、設計された配列も利用できる。枯草菌宿主において利用できるものとしては、グルコン酸合成酵素プロモーター（gnt）、アルカリプロテアーゼプロモーター（apr）、中性プロテアーゼプロモーター（npr）、α−アミラーゼプロモーター（amy）などが挙げられる。ロドコッカス属細菌宿主において利用できるものとしては、発現ベクターpSJ034に含まれるロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）SK92-B1株由来のニトリラーゼ発現調節遺伝子に係るプロモーターが挙げられる。pSJ034はロドコッカス(Rhodococcus)属細菌においてニトリルヒドラターゼを発現するプラスミドであり、特開平10-337185号公報に示す方法でpSJ023より作製することができる。なお、pSJ023は、形質転換体ATCC12674/pSJ023（受託番号「FERM BP-6232」）として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に平成９年３月４日付けで寄託されている。【００６３】
ターミネーターは必ずしも必要ではなく、その種類も特に限定されるものではなく、例えばρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、trpオペロンターミネーター、rrnBターミネーター等が挙げられる。
また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、SD配列やKozak配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することもできる。原核生物を宿主に用いるときにはSD配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはKozak配列をPCR法などにより付加してもよい。SD配列としては、大腸菌由来又は枯草菌由来の配列などが挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、16SリボゾームRNAの３'末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をDNA合成により作製して利用してもよい。
一般に、ベクターには目的とする形質転換体を選別するための因子（選択マーカー）が含まれる。選択マーカーとしては、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子、資化性付与遺伝子などが挙げられ、目的や宿主に応じて選択されうる。例えば大腸菌で選択マーカーとして用いられる薬剤耐性遺伝子としては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。【００６４】
本発明において使用されるベクターは、上記の変異遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージDNA、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNAなどが挙げられる。例えば、大腸菌を宿主とする場合には、大腸菌内での自律複製可能な領域を有するpTrc99A（Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)、オランダ；http://www.cbs.knaw.nl/）、pUC19（タカラバイオ、日本）、pKK233-2（Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)、オランダ；http://www.cbs.knaw.nl/）、pET-12（Novagen社、ドイツ）、pET-26b（Novagen社、ドイツ）などを用いることができる。また、必要に応じてこれらベクターを改変したものも用いることができる。また、発現効率の高い発現ベクター、例えばtrcプロモーター、lacオペレーターを有する発現ベクターpTrc99A又はpKK233-2などを用いることもできる。【００６５】
上記の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターは、本発明の範囲に含まれる。改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターの具体的なものとしては、例えば、本発明で例示するpSTK002、pSTK003、pSTT002、pSTT003、pSTT002-T133A、pSTT002-T136C、pSTT002-T133S、pSTT002-F136A、pSTT002-F136S、pSTT002-F136W、pSTT002-D199Q、pSTT002-D199E、pSTT002-D199H、pSTT002-D199S、pSTT002-D199T、pSTT002-D199Y、pSTT002-D199L、pSTT002-D199M、pSTT002-D199Iなどが挙げられる。【００６６】
（IV-1）形質転換体
本発明の組換えベクターを宿主に形質転換又は形質導入することで、形質転換体又は形質導入体（以下、これらをまとめて「形質転換体」という）を作製する。当該形質転換体も本発明の範囲に含まれる。
本発明において使用する宿主は、上記組換えベクターが導入された後、目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現することができる限り特に限定されるものではない。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、ロドコッカス属細菌などの細菌、酵母(Pichia、Saccharomyces)、カビ（Aspergillus）、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。【００６７】
細菌を宿主とする場合、本発明においては、大腸菌、ロドコッカス属細菌を好ましい宿主として用いることができる。大腸菌としては、例えば、大腸菌K12株やB株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるJM109株、XL1-Blue株、C600株などを挙げることができる。特に、上述したようなラクトースオペロンのlacプロモーター及びその派生プロモーターを発現プロモーターとして用いる場合、lacIレプレッサー遺伝子を有する宿主を用いれば発現が誘導型となり（IPTG等で誘導）、lacIレプレッサー遺伝子を有しない宿主を用いれば発現は構成型となるので、必要に応じた宿主を利用することができる。これら菌株は、例えば、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ATCC）などから容易に入手可能である。枯草菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などが挙げられる。ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌としては、例えば、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC999株、ATCC12674株、ATCC17895株、ATCC15998株、ATCC33275株、ATCC184、ATCC4001株、ATCC4273株、ATCC4276株、ATCC9356株、ATCC12483株、ATCC14341株、ATCC14347株、ATCC14350株、ATCC15905株、ATCC15998株、ATCC17041株、ATCC19149株、ATCC19150株、ATCC21243株、 ATCC29670株、ATCC29672株、ATCC29675株、ATCC33258株、ATCC13808株、ATCC17043株、ATCC19067株、ATCC21999株、ATCC21291株、ATCC21785株、ATCC21924株、 IFO14894株、IFO3338株、NCIMB11215株、NCIMB11216株、JCM3202株、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株（受託番号「FERM BP-1478」）、ロドコッカス・グロベルルス（Rhodococcus globerulus）IFO14531株、ロドコッカス・ルテウス（Rhodococcus luteus）JCM6162株、JCM6164株、ロドコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）IFO12538株、IFO12320株、ロドコッカス・エクイ（Rhodococcus equi）IFO3730株、JCM1313株が挙げられる。好ましくはロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J1株（受託番号「FERM BP-1478」）が挙げられる。なお、上記ＡＴＣＣ株はアメリカンタイプカルチャーコレクションから、ＩＦＯ株は独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）から、ＪＣＭ株は、独立行政法人 理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室から、ＦＥＲＭ株は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターからそれぞれ入手可能である。【００６８】
細菌への組換えベクターの導入方法としては、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、ピヒア・パストリス(Pichia pastoris)等が用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞COS-7、Vero、CHO細胞、マウスL細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする場合は、Sf9細胞、Sf21細胞等が用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等が用いられる。植物細胞を宿主とする場合は、タバコBY-2細胞等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、PEG法、エレクトロポレーション法等が用いられる。【００６９】
上記の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターにより得られる形質転換体は、本発明の範囲に含まれる。改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターによる形質転換体の具体的なものとしては、例えば、本発明で例示するJM109/pSTK002、JM109/pSTK003、JM109/pSTT002、JM109/pSTT003、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T133C、JM109/pSTT002-T133S、JM109/pSTT002-F136A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-F136W、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199Y、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199Iなどが挙げられる。【００７０】
（Ｖ）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの製造方法
本発明において、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記形質転換体を培養して得られる培養物自体として、又は培養物から採取することにより製造することができる。本発明において、「培養物」とは、培養液、培養液上清、細胞若しくは菌体、細胞若しくは菌体懸濁液、細胞若しくは菌体破砕液、粗酵素液及びこれらの処理物など、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを生産する形質転換体を培養することによって得られるもの及びそれらに起因するもののいずれをも含む意味である。本発明の形質転換体を培養して得られる培養物は、本発明の範囲に含まれる。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、上記培養物中のいずれかに蓄積される。【００７１】
本発明の形質転換体を培養する培地は、宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられる。その他、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。また、必要に応じ、培養中の発泡を防ぐために消泡剤を添加してもよい。また、ビタミン等を必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００７２】
培養中、ベクター及び目的遺伝子の脱落を防ぐために選択圧を掛けた状態で培養してもよい。すなわち、選択マーカーが薬剤耐性遺伝子である場合に相当する薬剤を培地に添加してもよく、選択マーカーが栄養要求性相補遺伝子である場合に相当する栄養因子を培地から除いてもよい。また、選択マーカーが資化性付与遺伝子である場合は、相当する資化因子を必要に応じて唯一因子として添加することができる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌を培養する場合、培養中に、必要に応じてアンピシリンを培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、IPTG等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸(IAA)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときには、IAA等を培地に添加することができる。【００７３】
形質転換体の培養条件は、目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの生産性及び宿主の生育が妨げられない条件であれば特に限定されるものではないが、通常、培養温度は10℃〜45℃、好ましくは10℃〜40℃、さらに好ましくは15℃〜40℃、さらにより好ましくは20℃〜37℃で行い、必要に応じて、培養中に温度を変更してもよい。培養時間は５〜120時間、好ましくは５〜100時間、さらに好ましくは10〜100時間、さらにより好ましくは15〜80時間程度行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行い、大腸菌であれば通常６〜９に調整する。培養方法としては、固体培養、静置培養、振盪培養、通気攪拌培養などが挙げられる。【００７４】
特に大腸菌形質転換体を培養する場合には、振盪培養又は通気攪拌培養（ジャーファーメンター）により好気的条件下で培養することが好ましく、この場合、通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。培養に用いる培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ポリペプトン、コーンスティープリカー、大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄若しくは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。なお、培地の初発pHは７〜９に調整するのが適当である。また、培養は、５℃〜40℃、好ましくは10℃〜37℃で５〜100時間行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施するのが好ましい。特に、工業的規模での改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ生産を行う場合は、通気攪拌培養を利用することができる。さらに、通気攪拌培養の操作方式としては限定されることなく、回分式（batch culture）、半回分式（fed-batch culture, semi-batch culture）及び連続式（continuous culture）のいずれで行ってもよい。特に、高濃度培養により、装置あたり、時間あたり、費用あたり、又は操作あたりの生産性を高めたい場合には、半回分式培養を行うことができる。半回分式で用いられる流加（fed）培地成分は、初発（batch）培地成分と同一の組成のものを用いても、組成を変更してもよいが、初発培地と比較して培地成分濃度はより高濃度であることが好ましい。流加培地の体積は特に限定されることはないが、通常、初発培地の1/2以下の体積を添加させることができる。流加培地を添加していく方法（feeding mode）としては、例えば、定流的流加法（constant）、指数的流化法（exponential）、段階的増加流化法（stepwise increase）、比増殖速度制御流化法（specific growth-rate control）、pHスタット流化法（pH-stat）、DOスタット流化法（DO-stat）、グルコース濃度制御流化法（glucose concentration control）、酢酸濃度モニタリング流化法（acetate concentration monitoring）、ファジー神経回路流化法（fuzzy neural network）などが挙げられるが（Trends in Biotechnology(1996), 14, 98-105）、所望のハロヒドリンエポキシダーゼ活性が得られれば特に限定されるものではない。なお、半回分式培養実施時の培養終了時期は、流化培地の投入終了後に限定される必要はなく、必要に応じて培養を継続し、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性が最も高い時点で培養終了とすることができる。【００７５】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI1640培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％CO2存在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン及びペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。形質転換（導入）体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばMS基本培地、LS基本培地等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、培養は、通常の植物培養用培地、例えばMS基本培地、LS基本培地等を用いることにより行うことができる。培養方法は、通常の固体培養法、液体培養法のいずれをも採用することができる。
上記培養条件で培養すると、本発明の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを上記培養物中、すなわち、培養液、培養上清、細胞、菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物の少なくともいずれかに蓄積させることができる。【００７６】
培養後、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞のまま物質生産における触媒として用いることもできるし、あるいは菌体又は細胞を破砕することにより、目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することもできる。いずれの場合にも、必要であれば、遠心分離や膜ろ過などの固液分離操作により、培地除去及び洗浄を行うことができる。遠心分離は、菌体又は細胞を沈降させる遠心力が供給できるものであれば特に限定されることはなく、円筒型や分離板型などを利用することができる。遠心力としては、例えば、500G〜20,000G程度で行うことができる。また、本工程に利用し得る膜ろ過は、目的とする固液分離を達成できれば、精密ろ過（MF）膜、限外ろ過（UF）膜いずれでもよいが、通常、精密ろ過（MF）膜を用いることが好ましい。精密ろ過は、例えば、流動方向に基づけば、デッドエンド方式やクロスフロー（タンジェンシャルフロー）方式に分類することができ、圧力の加え方に基づけば、重力式、加圧式、真空式、遠心力式などに分類することができ、操作様式に基づけば、回分式と連続式などに分類することができるが、固液分離操作を行うことができるものであれば、そのいずれを利用することもできる。MF膜の材質としては、高分子膜、セラミック膜、金属膜、及びそれらの複合型に大別でき、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性及び固液分離操作時の該活性回収率を低下させるものでなければ特に限定はされないが、特に高分子膜、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリアクリロニトリル、混合セルロースエステル、銅アンモニア法再生セルロースエステル、ポリイミド、ナイロン、テフロン（登録商標）などが好ましい。膜の孔径としては、菌体又は細胞を捕捉し、濃縮操作が可能であればよく、通常、0.1〜0.5μm程度のものを用いることができる。【００７７】
上記の遠心分離及び膜ろ過による固液分離操作時には、水、又は必要に応じて緩衝液、等張液を添加して希釈洗浄を行うこともできる。用いられる緩衝液は、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性及び固液分離操作時の該活性回収率を低下させるものでなければ特に限定はされず、例えば、塩濃度は５〜500mM、好ましくは５〜150mM程度であり、pHは５〜９程度のものであればよい。緩衝液成分としては、例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）、リン酸ナトリウム又はカリウム塩、クエン酸塩、酢酸塩、などを挙げることができる。具体的には、例えば、20mM Tris-硫酸緩衝液（pH８）、20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７）などが挙げられる。また、等張液としては例えば、0.7〜0.9％塩化ナトリウム溶液などが挙げられる。その他、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを安定しうる物質等があればそれらを添加してもよい。【００７８】
上記の培地除去及び洗浄操作を行った後、菌体又は細胞を再度水、あるいは必要に応じて緩衝液、等張液に懸濁し、菌体又は細胞懸濁液を調製することができる。菌体又は細胞懸濁液は、そのまま物質生産における触媒として用いることもできるが、必要に応じ、処理を行った後に用いることができる。処理方法としては、例えば、上述の培養から得られる培養物に界面活性剤が終濃度0.01％〜10％になるように加え、ハロヒドリンエポキシダーゼが失活しない温度で攪拌すればよい。界面活性剤の終濃度は、0.05％〜１％とすることが好ましく、0.1％〜0.5％とすることが特に好ましい。処理温度は、０℃〜40℃とすることが好ましく、４℃〜20℃とすることが特に好ましい。処理時間は菌体処理の効果が認められる時間内であればよく、15分〜24時間とすることが好ましく、30分〜２時間とすることが特に好ましい。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤又はノニオン性界面活性剤を用いることができる。陰イオン性界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム等を用いることができる。陽イオン性界面活性剤としては、塩化ベンゼトニウム等を用いることができる。ノニオン性界面活性剤としては、トリトンX100等を用いることができる。界面活性剤で処理した菌は、バッファーで洗浄して用いてもよいし、洗浄せずそのまま用いてもよい。また、上述した培地除去及び洗浄操作を行わずに、直接、菌体又は細胞の界面活性剤等による処理を行うこともできる。また、菌体又は細胞は、固定化して用いることもできる。具体的には、例えば、培養後の細胞又は菌体をアクリルアミド等のゲルで包含したもの、アルミナ、シリカ、ゼオライト、珪藻土等の無機担体に担持したもの等が挙げられる。【００７９】
一方、菌体又は細胞を破砕することにより、目的の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することもできる。菌体又は細胞の破砕方法としては、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ビーズミルによる磨砕処理、衝撃破砕装置による衝突処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等が挙げられ、いずれかの方法を単独又は必要に応じ組み合わせて利用することができる。工業的規模で菌体又は細胞の破砕を行う場合は、操作性、回収率、コスト等を勘案し、主に高圧処理や磨砕処理、衝突処理を利用することが好ましく、場合によってはこれら物理的破砕操作に酵素処理などを組み合わせてもよい。各破砕処理方法において、菌体又は細胞からの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ回収率が十分高いものであれば、操作条件は特に限定されることはない。十分高い改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ回収率とは、例えば、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%、最も好ましくは99%以上である。【００８０】
ビーズミルによる磨砕処理を行う場合、用いられるビーズは、例えば、密度2.5〜6.0g/cm3、サイズ0.1〜1.0mmのものを通常80〜85%程度充填することにより破砕を行うことができ、運転方式としては回分式、連続式いずれをも採用することができる。菌体又は細胞濃度も特に限定されないが、例えば、細菌であれば６〜12%程度、酵母であれば14〜18%程度とすればよい。
高圧処理を行う場合、処理圧力は、菌体又は細胞からの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ回収率が十分高いものであれば特に限定されないが、例えば、40〜150MPa程度の圧力で破砕を行うことができる。菌体又は細胞濃度も特に限定されないが、例えば、20%以下程度であればよい。必要に応じて、装置を直列に配置したり、複数ステージ構造の装置を用いたりすることにより、多段階処理を行い、破砕及び操作効率を向上させることも可能である。通常、処理圧力10MPaあたり２〜３℃の温度上昇が生じることから、必要に応じて冷却処理を行うことが好ましい。
衝突処理の場合、例えば、被破砕菌体又は細胞スラリーを予め噴霧急速凍結処理（凍結速度：例えば１分間当たり数千℃）などによって凍結微細粒子（例えば50μm以下）にしておき、これを高速（例えば約300ｍ/s）の搬送ガスによって衝突板に衝突させることで菌体又は細胞を破砕することができる。【００８１】
上記のような菌体又は細胞破砕処理の結果、細胞内の核酸が流出することにより、処理液の粘度が上昇してハンドリングが困難になる場合、あるいは、後段の残渣分離工程での活性回収率向上に効果がある場合は、必要に応じて、核酸除去又は核酸分解により、処理液の粘度低減や残渣分離工程での活性回収率の向上を期待することができる。細胞破砕液中の核酸を除去又は分解する方法としては、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性又は該活性回収率を低下させず、かつ、核酸を除去又は分解することができる方法であればいかなる方法でもよいが、例えば、生化学実験講座５巻200〜201頁に記載されているように、細胞破砕液にプロタミン硫酸あるいはストレプトマイシンを添加することにより核酸を沈澱させる方法、核酸分解酵素で核酸を分解する方法、デキストラン−ポリエチレングリコールを用い液々分離を行う方法などが挙げられる。また、物理的破砕処理をさらに追加することも有効な場合がある。これら方法のうち、特に、工程の煩雑化を避けつつ迅速に核酸を分解したい場合には、核酸分解酵素で核酸を分解する方法を採ることができる。核酸分解酵素処理に用いる核酸分解酵素は、少なくともデオキシリボ核酸（DNA）に作用し、核酸分解反応触媒能力を有し、DNA重合度を下げるものであればいかなるものでもよく、該形質転換体細胞内に本来存在する核酸分解酵素を利用してもよいが、別途、外因性の核酸分解酵素を添加してもよい。別途添加する核酸分解酵素としては、例えば、ウシ脾臓由来DNaseI（タカラバイオ、日本）、ブタ脾臓由来DNaseII（和光純薬、日本）、Serratia marcescens由来核酸分解酵素Benzonase（登録商標） Nuclease（タカラバイオ、日本）、Nuclease from Staphylococcus aureus（和光純薬、日本）などが挙げられる。添加する酵素量は、酵素の種類やユニット数（U）の定義により異なるが、当業者であれば適宜設定することができる。必要に応じて、核酸分解酵素に要求されるマグネシウムなどの補因子を該酵素溶液に添加してもよい。処理温度は、用いる核酸分解酵素によって異なるが、常温生物種由来の核酸分解酵素であれば、通常20〜40℃の温度に設定すればよい。【００８２】
得られた破砕液から菌体又は細胞破砕残渣を除去する必要がある場合は、例えば、遠心分離やろ過（デッドエンド方式あるいはクロスフロー方式）などにより除去することができる。
遠心分離操作は、前述の通り行うことができる。菌体又は細胞破砕残渣が微細であり、容易に沈降し難い場合は、必要に応じて、凝集剤を使用して残渣沈殿効率を上げることもできる。有機高分子凝集剤は、イオン性に基づけば、カチオン系凝集剤、アニオン系凝集剤、両性系凝集剤、ノニオン系凝集剤を挙げることができ、成分に基づけば、アクリル系、ポリエチレンイミン、縮合系ポリカチオン（ポリアミン）、ジメチルジアリルアンモニウムクロライド、キトサンなどを挙げることができるが、本発明において使用する凝集剤は、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性又は該活性回収率を低下させず、かつ、残渣分離効率を向上させることができるものであればいずれの凝集剤でもよい。アクリル系凝集剤の成分となるアクリル系水溶性モノマーとしては、例えば、アクリルアミド、アクリル酸ナトリウム、アクリルアミド２メチル−プロパンスルホン酸ナトリウム、ジメチルアミノエチル−メタクリレート、メタクリロイロキシエチル−トリメチルアンモニウム−クロライド、メタクリロイロキシエチル−ベンジルジメチル−アンモニウムクロライド、ジメチルアミノエチル−アクリレート、アクリロイロキシエチル−トリメチルアンモニウム−クロライド、ジメチルアミノプロピル−アクリルアミド、アクリルアミドプロピル−トリメチルアンモニウム−クロライド、ポリアミジン−クロライドなどが挙げられ、これらモノマーの単一重合物、多様な組成による共重合物又は高分子変性物がアクリル系凝集剤として挙げられる。特に代表的なカチオン系高分子凝集剤としては、ポリアミノアルキルメタアクリレート類，ポリアムノアルキルメタアクリレートとアクリルアミドの共重合物類，ポリアクリルアミドのマンニツヒ変性物類，ポリジメチルジアリルアンモニウム塩類，ポリビニルイミダゾリン類，ポリアクリルアミド類，アミン系重縮合物類などがあげられ、すでに多くの商品が市販されている。その主なものとしては，例えば，サンポリ−K-601，K-602（主成分ポリアミン，三共化成），クリフロツクLC-599（主成分：ポリアミン及びポリアミド，栗田工業），ハイモロツクM-166，M-566，M-９66，（主成分：アクリルアミド変性物，協立有機工業），ユニフロツカ−UF-301，UF-304，UF-305，（主成分：ポリアクリルアミド，ユニチカ），UF-330，UF-340，（主成分：アミノメタアクリル酸エステル，ユニチカ），UF-505（主成分：ジシアンアミン，ユニチカ），リユーフロツクC-110（主成分：ポリアミン，大日本インキ化学），ピユリフロツクC-31（主成分：ポリアミン，ダウケミカル）が挙げられる。また、ダイヤニトリックス社（日本）製 K-400シリーズ、KM-200シリーズ、KM-1200シリーズ、KAM-200シリーズ、KD-200シリーズ、KP-000シリーズ、KP-100シリーズ、KP-200シリーズ、KP-300シリーズ、KP-500シリーズ、KP-1200シリーズ、KA-000シリーズ、KA-200シリーズ、KA-300シリーズ、KA-400シリーズ、KA-600シリーズ、KA-700シリーズ、KA-800シリーズなども挙げられる。これら凝集剤は単独で又は２種以上を併用して使用できる。本発明において使用する凝集剤は、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性又は該活性回収率を低下させず、かつ、残渣分離効率を向上させることができるものであれば上述のいずれの凝集剤でもよいが、具体的には、例えば、ダイヤニトリックス社（日本）製K-403B、K-408、K-415などが挙げられる。凝集剤の添加量としては、凝集剤の種類や菌体又は破砕液の液状によっても異なるが、例えば、破砕した微生物乾燥重量%濃度の1/200〜1/5の濃度、好ましくは1/100〜1/10濃度である。添加方法としては、例えば、凝集剤を予め水に溶解した後、菌体又は細胞破砕液に添加して少なくとも５分〜24時間、好ましくは30分〜10時間程度、静置又は撹拌すればよい。そのときの温度としては、例えば、０℃〜60℃、特に０℃〜50℃、さらに０℃〜40℃が好ましい。また、pHの調整が必要な場合には、適宜、無機塩終濃度が５〜200mMとなるよう添加して緩衝液化することもできるし、必要に応じて、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを安定化する物質を添加してもよい。【００８３】
ろ過により残渣分離を行う場合、目的とする残渣分離を達成できれば、精密ろ過（MF）膜、限外ろ過（UF）膜いずれの膜を使用してもよいが、通常、精密ろ過（MF）膜を用いることが好ましい。精密ろ過膜は、前述の通り、残渣分離操作を行うことができるものであれば、いずれをも利用することができる。膜の孔径としては、菌体又は細胞残渣を捕捉し、かつ、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性がろ液側に回収できるものであればよく、例えば、0.1〜0.5μm程度のものを用いることができる。さらに、ろ過助剤、必要に応じて凝集剤を用いれば、孔径0.5μm以上の膜あるいはろ紙を利用することもできる。ろ過助剤としては、珪藻土やセルロースパウダー、活性炭などが挙げられる。凝集剤は上述の通りである。【００８４】
残渣を除去した後に得られた上清は、細胞抽出液可溶性画分であり、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを含む粗酵素溶液とすることができる。その後、必要に応じて、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー（例えばSephadexカラム）、イオン交換クロマトグラフィー（例えばDEAE-Toyopearl）、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー（例えばbutyl Toyopearl）、陰イオンクロマトグラフィー（例えばMonoQカラム）等）、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からハロヒドリンエポキシダーゼを単離精製することができる。【００８５】
本発明の形質転換体が遺伝子組換え体であり、かつ、製造工程での形質転換体の環境への漏出、製品への混入、又は使用後の取り扱い等で、二次的に微生物汚染を引き起こす可能性を危惧する場合には、必要に応じて不活化処理を行うことができる。不活化方法としては、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性又は該活性回収率を低下させず、かつ、形質転換体を不活化できる方法であればいかなる方法でも良く、例えば、熱処理、菌体破砕処理、薬剤処理などの方法を単独又は組み合わせて利用できる。例えば、菌体破砕処理の前又は後に、薬剤処理を行うことで、不活化を行うことができる。使用する薬剤としては、形質転換体の宿主種類により異なるが、例えば、塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化メチルステアロイル、臭化セチルトリメチルアンモニウム等の陽イオン系界面活性剤、塩酸アルキルジアミノエチルグリシンなどの両性イオン系界面活性剤などが挙げられる。また、エタノール等のアルコール類、２−メルカプトエタノール等のチオール類、エチレンジアミン等のアミン類、システイン、オルニチン、シトルリン等のアミノ酸類なども挙げられる。薬剤の濃度は、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性又は該活性回収率を低下させず、かつ、不活化できる濃度であればよいが、例えば、微生物乾燥重量%濃度の1/100〜1/2の濃度、好ましくは1/10〜1/5濃度程度が好ましい。処理温度は、０〜50℃、好ましくは０〜40℃で行われる。また、pHは、５〜９程度、好ましくは６〜８程度で行われる。【００８６】
一方、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、上述したような遠心分離やろ過等により菌体又は細胞を除去する。その後、必要に応じて硫安沈澱による抽出等により前記培養物中から改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取し、さらに必要に応じて透析、各種クロマトグラフィー（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等）を単独又は適宜組み合わせて用いることにより、精製することもできる。
形質転換体が植物細胞又は植物組織である場合は、セルラーゼ、ペクチナーゼ等の酵素を用いた細胞溶解処理、超音波破砕処理、磨砕処理等により細胞を破壊する。その後、必要であれば、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、各種クロマトグラフィー（例えばゲル濾過クロマトグラフィー（例えばSephadexカラム）、イオン交換クロマトグラフィー（例えばDEAE-Toyopearl）、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー（例えばbutyl Toyopearl）、陰イオンクロマトグラフィー（例えばMonoQカラム）等）、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からハロヒドリンエポキシダーゼを単離精製することができる。単離したハロヒドリンエポキシダーゼは、上述の細胞又は菌体と同様に、適当な担体に保持し固定化酵素として使用することもできる。【００８７】
以上のようにして得られる培養物及び改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、本発明の範囲に含まれる。得られる培養物及び改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの生産収率は、（I）記載のハロヒドリンエポキシダーゼ活性を測定し、培養装置あたり、培養液あたり、菌体（形質転換体）湿重量又は乾燥重量あたり、酵素液中タンパク質重量あたりなどの活性算出することにより求めることができる。
また、本発明においては、上記改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子又は改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を含む組換えベクターから改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを採取することも可能である。すなわち、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを産生することが可能である。無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系である。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。この場合、上記の宿主に対応する生物は、下記の細胞抽出液の由来する生物に相当する。ここで、上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。細胞抽出液は、例えば限外濾過、透析、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿等によって得ることができる。さらに本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTM System（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
上記のように無細胞タンパク質合成によって得られる改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、例えば前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。【００８８】
（VI）エピハロヒドリン及び４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルの製造方法
上述のようにして製造された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、酵素触媒として物質生産に利用することができる。すなわち、以下の（VI-1）〜（VI-3）に示す反応に供することができる。【００８９】
（VI-1）１，３−ジハロ−２−プロパノールのエピハロヒドリンへの変換
本変換反応は、１，３−ジハロ−２−プロパノールを、上述の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／又は上述の培養により得られる培養物と接触させることにより行うことができる。
基質である１，３−ジハロ−２−プロパノールは、前述した一般式（１）で示される化合物である。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的には１，３−ジフルオロ−２−プロパノール、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール、１，３−ジヨード−２−プロパノール等が挙げられ、好ましくは、１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノールである。
変換反応液中の基質濃度は、0.01〜15(W/V) ％が好ましい。この範囲内であると酵素安定性の観点から好ましく、0.01〜10％が特に好ましい。基質は反応液に一括添加あるいは分割添加することができる。分割添加により基質濃度を一定にすることが蓄積性の観点から望ましい。【００９０】
反応液の溶媒としては、酵素活性の最適pH４〜10の付近である水又は緩衝液が好ましい。緩衝液としては、例えば、リン酸、ホウ酸、クエン酸、グルタル酸、リンゴ酸、マロン酸、ｏ-フタル酸、コハク酸又は酢酸等の塩等によって構成される緩衝液、Tris緩衝液あるいはグッド緩衝液等が好ましい。
反応温度は、５〜50℃、反応pHは４〜10の範囲で行うことが好ましい。
反応温度は、より好ましくは10〜40℃である。反応pHは、より好ましくはpH６〜９である。反応時間は基質等の濃度、菌体濃度あるいはその他の反応条件等によって適時選択するが、１〜120時間で終了するように条件を設定するのが好ましい。尚、本反応においては、反応の進行に伴い生成する塩素イオンを反応系内から取り除くことにより、光学純度をより一層向上させることができる。この塩素イオンの除去は、硝酸銀等の添加によって行うことが好ましい。
反応液中に生成、蓄積したエピハロヒドリンは公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することによりエピハロヒドリンのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。【００９１】
（VI-2）１，３−ジハロ−２−プロパノールの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルへの変換
本変換反応は、１，３−ジハロ−２−プロパノールを、上述の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／又は上述の培養により得られる培養物と接触させることにより行うことができる。
基質である１，３−ジハロ−２−プロパノールは、前述した一般式（１）で示される化合物であり、好ましくは１，３−ジクロロ−２−プロパノール、１，３−ジブロモ−２−プロパノール等である。
また、シアン化合物としては、シアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン酸又はアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン（CN-）又はシアン化水素を生じる化合物又はその溶液を用いることができる。反応液中の基質濃度は、酵素安定性の観点から0.01〜15(W/V) ％が好ましく、0.01〜10％が特に好ましい。【００９２】
また、シアン化合物の使用量は、酵素安定性の観点から基質の１〜３倍量（モル）が好ましい。
反応条件は、上記（VI-1）と同様に行うことができる。
反応液中に生成、蓄積した４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルは、公知の方法を用いて採取及び精製することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法を用いて菌体を除いた後、酢酸エチルなどの溶媒で抽出を行い、減圧下に溶媒を除去することにより４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルのシロップを得ることができる。また、これらのシロップを減圧下に蒸留することによりさらに精製することもできる。【００９３】
（VI-3）エピハロヒドリンの４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルへの変換
本変換反応は、エピハロヒドリンを、上述の改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び／又は上述の培養により得られる培養物と接触させることにより行う。
基質であるエピハロヒドリンは、前述した一般式（２）で示される化合物である。ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素が好ましく、塩素、臭素が特に好ましい。具体的にはエピフルオロヒドリン、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、エピヨードヒドリン等が挙げられ、特に好ましくはエピクロロヒドリン、エピブロモヒドリンである。
また、シアン化合物はシアン化水素、シアン化カリウム、シアン化ナトリウム、シアン酸又はアセトンシアンヒドリン等の反応液中に添加した際にシアンイオン（CN-）又はシアン化水素を生じる化合物又はその溶液を用いることができる。
反応条件、採取及び精製方法は、上記（VI-2）と同様に行うことができる。【００９４】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００９５】
開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換された、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの取得及びその評価【００９６】
（１）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体の作製（発現ベクターpKK233-2）
コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来の野生型ハロヒドリンエポキシダーゼであるHheB(2nd)において、翻訳開始コドンによりコードされるアミノ酸残基の１残基下流のアミノ酸残基（２番目のアミノ酸残基）がそれぞれリジン及びアスパラギンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する発現プラスミド（発現ベクターpKK233-2）及び該発現プラスミドを含む改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体を以下のように作製した。
まず、ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子HheB(2nd)をPCRにより増幅した。PCR反応液組成（全量50μl）は以下の表の通りとし、3系列調製した（3系列の違いは、センスプライマーが各々異なることである）。【００９７】
【表ａ】
2008108466.tif 000007
【００９８】
プライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
DH-08：GGCCATGGCTAACGGAAGACTGGCAGGC（配列番号５７：28ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素NcoI認識部位（CCATGG）及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子HheB(2nd)の翻訳開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはGCTでアラニンをコードする）
DH-09：GATCATGAAAAACGGAAGACTGGCAGGCAAGCG（配列番号５８：33ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素BspHI認識部位（TCATGA）及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子HheB(2nd)の翻訳開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはAAAでリジンをコードする）【００９９】
DH-10：GATCATGAACAACGGAAGACTGGCAGGCAAGCG（配列番号５９：33ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素BspHI認識部位（TCATGA）及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子HheB(2nd)の翻訳開始コドン以降を有し、２番目のアミノ酸に対応するコドンはAACでアスパラギンをコードする）
DH-07：CGCCTGCAGGCTACAACGACGACGAGCGCCTG (配列番号６０：32ヌクレオチドからなり、その配列中に制限酵素Sse8387I兼PstI認識部位（CCTGCAGG）及びハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子HheB(2nd)終止コドン下流領域を有する)【０１００】
また、鋳型として用いたpST111は、特公平５−３１７０６６公報に記載されており、pST111を含む組換えベクターによる大腸菌形質転換体JM109/pST111は、受託番号「FERM BP-10922」として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに平成３年３月１日付けで寄託されている。
調製した50μlのPCR反応液をそれぞれ以下の熱サイクル処理に供した。【０１０１】
【表ｂ】
2008108466.tif 000008
【０１０２】
熱サイクル処理を行った3系列のPCR反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit（GEヘルスケアバイオサイエンス）によりそれぞれ精製した後、系列1のPCR増幅産物については制限酵素NcoIとPstIで、系列２及び系列３のPCR増幅産物については制限酵素BspHIとPstIで、それぞれ二重消化を行った。それぞれの消化産物をアガロースゲル電気泳動で分離後、ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子全長を含むバンド（約0.8kb）をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）で精製した。一方、pKK233-2（Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS)、オランダ；http://www.cbs.knaw.nl/）の誘導体であり、WO 2006/41226号パンフレットに記載の方法により調製することができる発現ベクターpKK233-2(+Sse)を、制限酵素NcoIとPstIで消化後、フェノール抽出・クロロホルム抽出・エタノール沈殿（Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))）により精製した。これを、上述のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子全長を含む3種のPCR増幅産物と各々混合した後、該混合液にSolution I（DNA Ligation Kit ver.2（タカラバイオ）を添加してライゲーション混合物を作った。この混合物を12時間、16℃でインキュベートすることでPCR増幅産物と発現ベクターpKK233-2(+Sse)を結合した。【０１０３】
予め調製しておいた大腸菌JM109株コンピテントセル（大腸菌 JM109株をLB培地(1% バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、0.5% NaCl) １mlに接種し37℃、5時間好気的に前培養した後、前培養液 0.4mlをSOB培地 40ml(2%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、10mM NaCl 、2.5mM KCl 、1mM MgSO4 、1mM MgCl2 ) に加え、18℃で20時間培養し、得られた培養物を遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）により集菌した後、冷TF溶液 (20 mM PIPES−KOH (pH6.0)、200 mM KCl 、10 mM CaCl2 、40mM MnCl2)を13 ml加え、0℃で10分間放置し、再度遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）して上清を除いき、得られた大腸菌菌体を冷TF溶液 3.2 mlに懸濁し、0.22 mlのジメチルスルホキシドを加え0℃で10分間放置した後、液体窒素を用いて-80℃にて保存しておいたもの）200μlを、上記ライゲーション産物10μlに加え、0℃で30分放置した。続いて、当該コンピテントセルに42℃で30秒間ヒートショックを与え、0℃で2分間冷却した。その後、SOC 培地 (20 mM グルコース、2%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM MgSO4、1mM MgCl2)を１ml添加し、37℃にて1時間振盪培養した。培養後の培養液を各200μlずつ、LB Amp寒天培地（アンピシリン 100mg/L 、1.5％寒天を含有するLB培地）に塗布し、37℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を、1.5mlのLB Amp培地（アンピシリン 100mg/Lを含有するLB培地）にて37℃で一晩培養した。得られた培養液を各々集菌後、Flexi Prep（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーDNAシーケンサーCEQ2000(ベックマン・コールター)を用いて、添付のマニュアルに従って、３種のプラスミド中にクローニングされているPCR増幅産物の塩基配列を解析し、PCR反応におけるエラー変異が生じていないことを確認した。系列１のPCR増幅産物由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpSTK001と、系列２のPCR増幅由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpSTK002と、系列３のPCR増幅産物由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpSTK003と命名し、また、それらプラスミドを含む大腸菌JM109株形質転換体を、JM109/pSTK001、JM109/pSTK002及びJM109/pSTK003とそれぞれ命名した。【０１０４】
上記各プラスミドの特徴は以下の通りである。
pSTK001：２番目のアミノ酸残基がアラニン残基である野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpKK233-2上にクローニングされている
pSTK002：２番目のアミノ酸残基（アラニン残基）がリジンに置換されている改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpKK233-2上にクローニングされている
pSTK003：２番目のアミノ酸残基（アラニン残基）がアスパラギンに置換されている改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpKK233-2上にクローニングされている【０１０５】
（２）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体の作製（発現ベクターpTrc99A）
コリネバクテリウム属（Corynebacterium sp.）N-1074株由来の野生型ハロヒドリンエポキシダーゼであるHheB(2nd)において、開始アミノ酸残基より１残基Ｃ末端側のアミノ酸残基（２番目のアミノ酸残基）がそれぞれリジン及びアスパラギンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する発現プラスミド（発現ベクターpTrc99A）及び該発現プラスミドを含む改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体を作製した。作製は、実施例１（１）において用いる発現ベクターpkk233-2の代わりにpTrc99Aを用い、他は実施例１（１）と同様に行った。系列１のPCR増幅産物由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpSTT001と、系列２のPCR増幅由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpSTT002と、系列３のPCR増幅産物由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpSTT003と命名し、また、それらプラスミドを含む大腸菌JM109株形質転換体を、JM109/pSTT001、JM109/pSTT002及びJM109/pSTT003とそれぞれ命名した。【０１０６】
上記各プラスミドの特徴は以下の通りである。
pSTT001：２番目のアミノ酸残基がアラニン残基である野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpTrc99A上にクローニングされている
pSTT002：２番目のアミノ酸残基（アラニン残基）がリジンに置換されている改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpTrc99A上にクローニングされている
pSTT003：２番目のアミノ酸残基（アラニン残基）がアスパラギンに置換されている改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)をコードする改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子が発現ベクターpTrc99A上にクローニングされている【０１０７】
（３）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体の評価
実施例１（１）及び（２）で作製した形質転換体6株（JM109/pSTK001、JM109/pSTK002、JM109/pSTK003 、JM109/pSTT001、JM109/pSTT002、JM109/pSTT003）及び特公平5-317066号公報記載のJM109/pST111の計7株を、IPTG（イソプロピル-1-チオ-D-β-D-ガラクトシド）の評価を次のように行った。LBAmp培地をワッセルマン試験管に１mlずつ分注し、各試験管に、二次評価選抜株6株及びJM109/pST111のコロニーをそれぞれ植菌した。37℃、210rpmで約8時間培養した後、得られた各培養液100μlを、IPTGを終濃度として1mM含むLBAmp培地（500ml容三角フラスコ中の100ml）に植菌し、37℃、210rpmで24時間培養した。得られた培養液から遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）により各菌体を回収し、20mM Tris-硫酸緩衝液（pH8.0）で洗浄した後、菌濃度が12.5gDC/Lとなるように同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の１mlを、超音波破砕機VP−15S（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール4、DUTY CYCLE 40%、PULS、TIMER＝Bモード10sの条件で氷冷しながら3分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を遠心分離（23,000×g、5分間、4℃）に供し、上清を粗酵素液として採取した。得られた粗酵素液を、それぞれ破砕前の（菌体懸濁液時点での）菌濃度として6.25gDC/Lとなるよう、20mM Tris-硫酸緩衝液（pH8.0）で希釈した。希釈した各形質転換体由来の粗酵素液を等量のポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー（0.1M Tris-HCl(pH6.8)、4%w/v SDS、12%v/vβメルカプトエタノール、20%v/vグリセロール、微量ブロモフェノールブルー）と混合し、5分間煮沸し変性処理を行った。10%ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを1レーンあたり５μlずつアプライし、電気泳動分析を行った（図１）。ハロヒドリンエポキシダーゼは30kDa強のバンドとして各々観察された（図１中の矢印）。野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)を発現するJM109/pST111由来粗酵素液と比較して、同野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)を発現するJM109/pSTK001由来粗酵素液及びJM109/pSTT001由来粗酵素液は、発現量が増加していることが確認された（これは発現ベクターの違いによるものであると考えられる）。一方、JM109/pSTK001由来粗酵素液及びJM109/pSTT001由来粗酵素液と比較して、２番目のアミノ酸残基がアスパラギンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)を発現するJM109/pSTK003由来粗酵素液及びJM109/pSTT003由来粗酵素液は、ぞれぞれさらに発現量が増加しており、また、２番目のアミノ酸残基がリジンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)を発現するJM109/pSTK002由来粗酵素液及びJM109/pSTT002由来粗酵素液は、ぞれぞれさらに大幅に発現量が増加していることが確認された。【０１０８】
続いて、上記粗酵素液を用い、以下の方法によりハロヒドリンエポキシダーゼ活性（脱クロル活性）を測定した。100mlの活性測定用反応液（50mM ＤＣＰ、50mM Tris-硫酸(pH8)）を調製して、温度を20℃に調整した。該反応液に、希釈した各形質転換体由来の粗酵素液添加し、反応を開始した。ハロヒドリンエポキシダーゼ活性による塩化物イオンの遊離に伴うpHの低下を、pH自動コントローラーを用い、0.01規定の水酸化ナトリウム水溶液を用いて、pHを８に保つよう連続的に調整した。10分間の反応の間に、pHを8に保つために投入された0.01規定の水酸化ナトリウム水溶液の量から、塩化物イオン生成量を算出し、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性（脱クロル活性）（U）を算出した。１Uは上記条件下でＤＣＰから１分間あたり１μmol塩化物イオンの脱離する酵素量に相当するものと定義し、活性測定に用いた各粗酵素液の活性、及び該活性を活性測定に用いた各粗酵素液の液量で除することにより各粗酵素溶液の液活性を算出した。さらに、上記超音波処理により菌体が完全に破砕されているものと仮定し、該液活性を破砕前の（菌体懸濁液時点での）菌濃度で除することによって菌体比活性を算出した。各形質転換体についての菌体比活性の結果を表１に示した。野生型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(２nd)を発現するJM109/pSTK001及びJM109/pSTT001と比較して、２番目のアミノ酸残基がアスパラギンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)を発現するJM109/pSTK003及びJM109/pSTT003は、それぞれ菌体比活性が約12倍及び約5倍に向上しており、さらに、２番目のアミノ酸残基がリジンに置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(2nd)を発現するJM109/pSTK002及びJM109/pSTT002は、それぞれ菌体比活性が約25倍及び約17倍に向上していることが確認された。すなわち、開始アミノ酸残基より１残Ｃ末端側のアミノ酸残基（配列番号２で示されるアミノ酸配列の第２番目のアミノ酸残基）が他のアミノ酸に置換された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体は、形質転換体あたりのハロヒドリンエポキシダーゼ活性が、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも高いことが確認された。【０１０９】
【表１】
2008108466.tif 000009
【実施例２】
【０１１０】
ランダム変異による改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング【０１１１】
（１）ハロヒドリンエポキシダーゼ変異体ライブラリーの作製
さらに有用な改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを取得するため、エラー誘発PCRによりランダム変異が導入されたハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリーを作製し、該ライブラリーからの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ及びその遺伝子のスクリーニングを行った。
実施例１（２）で作製したpSTT002を鋳型として用い、エラー誘発PCRによるハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリーの作製を次のように行った。以下の表の組成のPCR反応液を100μl調製した。【０１１２】
【表ｃ】
2008108466.tif 000010
【０１１３】
プライマーとして用いたTrc-03の配列は以下の通りである。
Trc-03：GGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGCC（配列番号６１：25ヌクレオチドからなり、pTrc99Aのマルチクローニングサイトの下流領域に対応する）
調製した100μlのPCR反応液を10μl×10本のPCR反応用チューブに分注した後、それぞれを以下の熱サイクル処理に供した。【０１１４】
【表ｄ】
2008108466.tif 000011
【０１１５】
熱サイクル処理を行った10本のPCR反応液を混合し、実施例１（２）と同様に、PCR反応液の精製と制限酵素消化（NcoIとPstIによる二重消化）及びゲルからの精製、現ベクターpTrc99Aの制限酵素消化（NcoIとPstIによる二重消化）及び精製、ライゲーション反応及び形質転換を行った。プレート上に出現したコロニーをハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリーとした。【０１１６】
（２）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング（一次評価）
実施例２（１）で作製したハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリーを用い、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング（一次評価）を次のように行った。96ウェルプレート（ディープウェル）に、IPTGを終濃度として1mM含むLBAmp培地をウェルあたり500μlずつ分注し、各ウェルにハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異体ライブラリーのコロニーを植菌した。なお、96ウェル中1〜2個のウェルについては、評価の対照として用いるJM109/pSTT002コロニーを植菌した。37℃、800rpmで約16時間培養した後、得られた培養液のうち20μlを平型96ウェルプレートに分注した。遠心分離機（佐久間製作所50A-IVD）及びローター（佐久間製作所  HM-2HLS）を用い、平型96ウェルプレートを遠心分離（3000rpm、5分間、4℃）に供した。培養液上清を除去した後、評価用反応液１（400mM ＤＣＰ、800mM (Ｒ)−ＣＨＢＮ、0.025% ブロモクレゾールパープル（BCP）、50mM Tris-硫酸(pH8)）40μlを各ウェルに添加した。懸濁後、室温で静置し、反応液の呈色変化を経時的に観察し（ハロヒドリンエポキシダーゼ活性による塩化物イオンの生成に伴うpH低下により、BCPの色が紫から黄色に変化する）、対照であるJM109/pSTT002よりも有意に早く変色が見られた株を選抜した。約20,000株のコロニーについて該一次評価を行い、77株を選抜した。【０１１７】
（３）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング（二次評価）
実施例２（２）で選抜された一次評価選抜株77株について、次のように二次評価を行った。一次評価選抜株77株について、実施例２（２）と同様に、96ウェルプレート（ディープウェル）による培養を行った後、得られた各培養液につき（20μl、15μl、10μl、5μl）×2サンプルずつを平型96ウェルプレートに分注した。遠心分離機（佐久間製作所50A-IVD）及びローター（佐久間製作所  HM-2HLS）を用い、平型96ウェルプレートを遠心分離（3000rpm、5分間、4℃）に供した。培養液上清を除去した後、各培養液沈殿（菌体）につき、実施例２（２）記載の評価用反応液１及び評価用反応液２（400mM ＤＣＰ、0.025% ブロモクレゾールパープル（BCP）、50mM Tris-硫酸(pH8)）40μlを各ウェルに添加した。懸濁後、室温で静置し、反応液の呈色変化を経時的に観察し、評価用反応液１を添加した系で対照であるJM109/pSTT002よりも有意に早く変色が見られた株、及び各株について評価用反応液１添加系における呈色速度と評価用反応液２添加系における呈色速度の差が少ない株を選抜した。一次評価選抜株77株について該二次評価を行い、20株を選抜した。【０１１８】
（４）二次評価選抜株のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異確認
実施例２（３）で選抜した二次評価選抜株20株について、各株が有するハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の変異を解析した。実施例２（３）で得られた各株培養液から、Flexi Prep（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いてプラスミド回収し、キャピラリーDNAシーケンサーCEQ2000(ベックマン・コールター)を用い、添付のマニュアルに従って、各プラスミド中のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列を解析した。その結果を表２に示した。
【０１１９】
【表２】
2008108466.tif 000012
【０１２０】
解析を行った20株のうち、12株（#1007、#1009、#1014、#1019、#1023、#1024、#1034、#1037、#1038、#1066、#1068、#1072）がアミノ酸置換変異F136Sを有するハロヒドリンエポキシダーゼを、２株（#1002、#1005）がアミノ酸残換変異T133Aを有するハロヒドリンエポキシダーゼを、２株（#1020、#1055）がアミノ酸置換変異V75Aを有するハロヒドリンエポキシダーゼを、１株（#1018）がアミノ酸置換変異D199Hを有するハロヒドリンエポキシダーゼを、１株（#1029）がアミノ酸置換変異V25Iを有するハロヒドリンエポキシダーゼを、１株（#1057）がアミノ基置換変異H57R及びY87Fを有するハロヒドリンエポキシダーゼをそれぞれ発現していることが確認された。各形質転換体、それらが発現しているハロヒドリンエポキシダーゼ及びそれをコードするハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を表２のように命名した。【０１２１】
（５）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング（三次評価）
実施例２（３）で選抜され、実施例２（４）でそのハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異が確認された6株（JM109/pSTT002-V25I、JM109/pSTT002-H57R+Y87F、JM109/pSTT002-V75A、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S 及びJM109/pSTT002-D199H）及び対照とするJM109/pSTT002の計7株について、次のように三次評価を行った。LBAmp培地をワッセルマン試験管に１mlずつ分注し、各試験管に、二次評価選抜株6株及びJM109/pSTT002のコロニーをそれぞれ植菌した。37℃、210rpmで約8時間培養した後、得られた各培養液100μlを、IPTGを終濃度として1mM含むLBAmp培地（500ml容三角フラスコ中の100ml）に植菌し、37℃、210rpmで16時間培養した。得られた各培養液100mlから遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）により各菌体を回収し、20mM Tris-硫酸緩衝液（pH8.0）で洗浄した後、菌濃度が12.5gDC/Lとなるように同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液を用いて、実施例１（３）記載の方法において反応液のＤＣＰ濃度を400mMとした反応液を用いた方法、及び実施例１（３）記載の方法において反応液のＤＣＰ濃度を400mMとし、かつ、(Ｒ)−ＣＨＢＮを終濃度800mMとなるように添加した反応液を用いた方法により、(Ｒ)−ＣＨＢＮ非存在下及び(Ｒ)−ＣＨＢＮ存在下におけるハロヒドリンエポキシダーゼ活性（脱クロル活性）をそれぞれ測定した。１Ｕを上記各条件下でＤＣＰから１分間あたり1μmol塩化物イオンの脱離する酵素量に相当するものと定義して活性測定に用いた各菌体懸濁液の活性を、該活性を活性測定に用いた各菌体懸濁液の液量で除することにより各菌体懸濁液の液活性を算出した。さらに、該液活性を菌濃度で除することによって各株の菌体比活性を算出した。その結果を表３に示した。
【０１２２】
【表３】
2008108466.tif 000013
【０１２３】
JM109/pSTT002-H57R+Y87F、JM109/pSTT002-V75A、JM109/pSTT002-F136S及びJM109/pSTT002-D199Hについては、(Ｒ)−ＣＨＢＮ非存在下における菌体比活性が、JM109/pSTT002の該菌体比活性よりも高いことが確認された。また、JM109/pSTT002-H57R+Y87F 、JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S及びJM109/pSTT002-D199Hについては、(Ｒ)−ＣＨＢＮ存在下における菌体比活性が、JM109/pSTT002の該菌体比活性よりも高いことが確認された。すなわち、これら形質転換体が発現するハロヒドリンエポキシダーゼは、(Ｒ)−ＣＨＢＮ非存在下又は(Ｒ)−ＣＨＢＮ存在下における、形質転換体あたりハロヒドリンエポキシダーゼ活性向上をもたらす改良型ハロヒドリンエポキシダーゼであることが確認された。
【実施例３】
【０１２４】
部位特異的ランダム変異による改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング【０１２５】
（１）部位特異的ランダム変異体ライブラリーの作製
実施例２（５）で見出された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのうち、形質転換体あたりハロヒドリンエポキシダーゼ活性向上効果をもたらすアミノ酸変異箇所として、ハロヒドリンエポキシダーゼHheb(2nd)(配列番号２)の133番目のスレオニン残基（T133）、136番目のフェニルアラニン残基（F136）及び199番目のアスパラギン酸残基（D199）が見出された。これらの箇所のアミノ酸をランダムに変異させ、さらなる有用な改良型ハロヒドリンエポキシダーゼの取得を試みた。
T133、F136及びD199を20必須アミノ酸に変異させうるランダムプライマーとして、以下のものを作製した。【０１２６】
MDH-14：CGCTGGCCTACAGCNNNGCGCGTTTCGCT（配列番号６２：29ヌクレオチドからなり、ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)（配列番号１）の141番目のアミノ酸又はHheB(2nd)の133番目（配列番号２）のアミノ酸をコードするコドンがランダム塩基（NNN；Nはアデニン、チミン、グアニン又はシトシンのいずれか）であるセンスプライマー）
MDH-15：AGCGAAACGCGCNNNGCTGTAGGCCAGCG（配列番号６３：29ヌクレオチドからなり、MDH-14の相補配列を有するアンチセンスプライマー）【０１２７】
MDH-16：CAGCACGGCGCGTNNNGCTCAGCGCGGGT（配列番号６４：29ヌクレオチドからなり、ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)(配列番号１)の144番目のアミノ酸又はHheB(2nd)(配列番号２)の136番目のアミノ酸をコードするコドンがランダム塩基（NNN；Nはアデニン、チミン、グアニン又はシトシンのいずれか）であるセンスプライマー）
MDH-17：ACCCGCGCTGAGCNNNACGCGCCGTGCTG（配列番号６５：29ヌクレオチドからなり、MDH-16の相補配列を有するアンチセンスプライマー）【０１２８】
MDH-18：CGACTGCCCGAGAGNNNGCGCTGCTCGCG（配列番号６６：29ヌクレオチドからなり、ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)(配列番号１)の207番目のアミノ酸又はHheB(2nd)(配列番号２)の199番目のアミノ酸ををコードするコドンがランダム塩基（NNN；Nはアデニン、チミン、グアニン又はシトシンのいずれか）であるセンスプライマー）
MDH-19：CGCGAGCAGCGCNNNCTCTCGGGCAGTCG（配列番号６７：29ヌクレオチドからなり、MDH-18の相補配列を有するアンチセンスプライマー）【０１２９】
上記のプライマー及び鋳型pSTT002を用い、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社)により部位特異的変異導入を行った。反応液組成（全量50μl）は以下の表の通りとした（系列１はT133ランダム変異体、系列２はF136ランダム変異体、
系列３はD199ランダム変異体の取得をそれぞれ目的とする）。【０１３０】
【表ｅ】
2008108466.tif 000014
【０１３１】
各系列に用いたプライマーの組み合わせは次の通りである。
系列１：センスプライマーMDH-14、アンチセンスプライマーMDH-15
系列２：センスプライマーMDH-16、アンチセンスプライマーMDH-17
系列３：センスプライマーMDH-17、アンチセンスプライマーMDH-18
上記組成の各反応液について、以下の表の熱サイクル処理を行った。【０１３２】
【表ｆ】
2008108466.tif 000015
【０１３３】
添付のマニュアルに従い、熱サイクル処理を行った各反応液にDpnIを1μl添加し、37℃で１時間インキュベートした。DpnI処理液を用い、実施例２（１）と同様に形質転換を行った。プレート上に出現したコロニーをハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子部位特異的（T133、F136、D199）変異体ライブラリーとした。【０１３４】
（２）部位特異的ランダム変異体からの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニング
実施例３（１）で作製したハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子部位特異的（T133、F136、D199）変異体ライブラリーから、さらなる有用な改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのスクリーニングを行った。96ウェルプレート（ディープウェル）に、IPTGを終濃度として1mM含むLBAmp培地をウェルあたり500μlずつ分注し、実施例３（１）で作製したハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子部位特異的（T133、F136、D199）変異体ライブラリーの各系列につき200コロニーを、各ウェルに植菌した。なお、評価の対照として用いるJM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-D199H及びJM109/pSTT002を併せて植菌した。37℃、800rpmで約16時間培養した後、得られた培養液のうち20μlを平型96ウェルプレートに分注した。遠心分離機（佐久間製作所50A-IVD）及びローター（佐久間製作所  HM-2HLS）を用い、平型96ウェルプレートを遠心分離（3000rpm、5分間、4℃）に供した。培養液上清を除去した後、実施例２（２）記載の評価用反応液１及び評価用反応液３（200mM (Ｓ)-ＣＨＢＮ、0.025% ブロモクレゾールパープル（BCP）、50mM Tris-硫酸(pH8)）40μlを各ウェルに添加した。懸濁後、室温で静置し、反応液の呈色変化を経時的に観察し、評価用反応液１を添加した系で対照であるJM109/pSTT002よりも有意に早く変色が見られた株、評価用反応液３を添加した系で対照であるJM109/pSTT002よりも有意に早く変色が見られた株、及び各株の評価用反応液１添加系における呈色速度と評価用反応液３添加系における呈色速度の比率が、対照であるJM109/pSTT002の該比率と異なる株を選抜した。各系列200コロニーについて該評価を行い、系列１（T133ランダム変異体ライブラリー）から7株、系列２（F136ランダム変異体ライブラリー）から7株、系列３（D199ランダム変異体ライブラリー）から19株を選抜した。【０１３５】
（３）部位特異的ランダム変異ライブラリー選抜株のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子変異確認
実施例３（２）で選抜した系列１（T133ランダム変異体ライブラリー）からの7株、系列２（F136ランダム変異体ライブラリー）からの7株、系列３（D199ランダム変異体ライブラリー）からの19株、計33株について、各株が有するハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の変異を解析した。実施例３（２）で得られた各株培養液から、Flexi Prep（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いてプラスミド回収し、キャピラリーDNAシーケンサーCEQ2000(ベックマン・コールター)を用い、添付のマニュアルに従って、各プラスミド中のハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子の塩基配列を解析した。その結果を表４に示した。【０１３６】
【表４】
2008108466.tif 000016
【０１３７】
解析を行った33株が発現しているハロヒドリンエポキシダーゼ及びそれをコードするハロヒドリンエポキシダーゼ遺伝子を、アミノ酸置換変異の態様として既に取得されたものとの重複を考慮し、表２のように命名した。
【実施例４】
【０１３８】
改良型ハロヒドリンエポキシダーゼによる(Ｒ)−ＣＨＢＮ合成反応【０１３９】
（１）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ粗酵素液の調製
実施例２及び実施例３で取得された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼによって合成した(Ｒ)−ＣＨＢＮの光学純度を調べるため、まず、各改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体より粗酵素液を調製した。改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する15株の形質転換体株（JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T136C、JM109/pSTT002-T133S、JM109/pSTT002-F136A、JM109/pSTT002-F136S、JM109/pSTT002-F136W、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199I、JM109/pSTT002-D199Y）及び対照とするJM109/pSTT002の計16株について、次のように三次評価を行った。LBAmp培地をワッセルマン試験管に１mlずつ分注し、各試験管に、二次評価選抜株15株及びJM109/pSTT002のコロニーをそれぞれ植菌した。37℃、210rpmで約8時間培養した後、得られた各培養液100μlを、IPTGを終濃度として１mM含むLBAmp培地（500ml容三角フラスコ中の100ml）に植菌し、37℃、210rpmで16時間培養した。得られた各培養液100mlから遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）により各菌体を回収し、20mM Tris-硫酸緩衝液（pH8.0）で洗浄した後、菌濃度が12.5gDC/Lとなるように同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の3mlを、超音波破砕機VP−15S（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール4、DUTY CYCLE 40%、PULS、TIMER＝Bモード10sの条件で氷冷しながら10分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を遠心分離（23,000×g、5分間、4℃）に供し、上清を粗酵素液として採取した。得られた各粗酵素液について、実施例１（３）記載の方法において反応液のＤＣＰ濃度を400mMとした反応液を用いた方法により、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性（脱クロル活性）をそれぞれ測定した。１Ｕを上記各条件下でＤＣＰから1分間あたり1μmol塩化物イオンの脱離する酵素量に相当するものと定義して活性測定に用いた各菌体懸濁液の活性を、該活性を活性測定に用いた各菌体懸濁液の液量で除することにより各菌体懸濁液の液活性を算出した。【０１４０】
（２）分析方法
後述する改良型ハロヒドリンエポキシダーゼによる(Ｒ)−ＣＨＢＮの合成反応において実施する反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度分析及び生成ＣＨＢＮの光学純度分析は、以下のように行った。
＜反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度分析＞
反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度分析は、逆相系ＨＰＬＣにより行った。逆相系HPLC分析条件を下表に示す。【０１４１】
【表ｇ】
2008108466.tif 000017
【０１４２】
反応終了液100μlを、上表記載の移動層400μlにより希釈混合した後、上表記載の分析条件により分析を行った。予め、濃度既知のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ溶液を用いて検量線を作成し、該検量線を用いて反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度を求めた。
＜生成ＣＨＢＮの光学純度分析＞
生成ＣＨＢＮの光学純度分析は、ＣＨＢＮをエステル化後、順相系ＨＰＬＣにより行った。順相系ＨＰＬＣ分析条件を下表に示す。【０１４３】
【表ｈ】
2008108466.tif 000018
【０１４４】
反応終了液約400μlに等量のジイソプロピルエーテル（以下、ＩＰＥと称することがある）を加えて抽出を行った。ＩＰＥ層を分取し、少量の無水硫酸ナトリウムを加えて撹拌した。ＩＰＥ層を100μl分取し、10μlの(Ｒ)−α−メトキシ―α―（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロライド（以下、(Ｒ)−ＭＴＰＡと称することがある）及び40μlのピリジンを添加した。室温で一晩反応させた後、ＩＰＥを添加して約400μlとした。1規定の塩酸を400μl加えて抽出を2回行った後、分取したＩＰＥ層に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を400μl加えて抽出を2回行った。分取したＩＰＥ層に少量の無水硫酸ナトリウムを加えて撹拌した後、アスピレーターによりＩＰＥ層を揮発させた。残存物を上表記載の移動層により懸濁した後、上表記載の分析条件により分析を行った。(Ｒ)−ＣＨＢＮ−(Ｒ)−ＭＴＰＡエステル及び(Ｓ)-ＣＨＢＮ−(Ｒ)−ＭＴＰＡエステルのエリア面積比から各濃度を算出し、本明細書において説明した要領（前述）でＣＨＢＮの光学純度を算出した。【０１４５】
（３）改良型ハロヒドリエポキシダーゼによる(Ｒ)−ＣＨＢＮの合成
実施例４（１）で調製した各改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体由来粗酵素液を用い、シアン化カリウム存在下、ＤＣＰからのＣＨＢＮ合成反応を行った。反応液基本組成は以下の表のようにし、反応スケールは2mlで行った。
【０１４６】
【表ｉ】
2008108466.tif 000019
【０１４７】
反応は20℃にて3時間行った。反応終了後、実施例４（２）記載の分析条件により、反応液中のＤＣＰ、ＥＣＨ及びＣＨＢＮ濃度及び生成ＣＨＢＮの光学純度を分析した。その結果を表５に示した。【０１４８】
【表５】
2008108466.tif 000020
【０１４９】
野生型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体株JM109/pSTT002由来粗酵素液を用いた反応ではＣＨＢＮが77mMしか蓄積してなかったのに対し、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する各形質転換体株由来粗酵素液を用いた反応では87〜149mMのＣＨＢＮが蓄積していた。従って、これら改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも高濃度の生成物を蓄積できることが示された。
また、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体株JM109/pSTT002由来粗酵素液を用いて合成された(Ｒ)−ＣＨＢＮの光学純度が91.6%eeであったのに対し、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体株（JM109/pSTT002-T133A、JM109/pSTT002-T133C、JM109/pSTT002-D199Q、JM109/pSTT002-D199E、JM109/pSTT002-D199H、JM109/pSTT002-D199S、JM109/pSTT002-D199T、JM109/pSTT002-D199L、JM109/pSTT002-D199M、JM109/pSTT002-D199I 及びJM109/pSTT002-D199Y）由来粗酵素液を用いて合成された(Ｒ)−ＣＨＢＮの光学純度は93.1％ee〜97.8％eeであり、これらの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼにより合成される(Ｒ)−ＣＨＢＮは、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼにより合成される(Ｒ)−ＣＨＢＮよりも光学純度が高いことが確認された。従って、これらの改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、ＤＣＰ及び／又は中間体ＥＣＨに対する立体選択性が向上していることが考えられた。
【実施例５】
【０１５０】
塩化物イオン存在下での改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ活性確認【０１５１】
塩化物イオンは、１，３−ジハロ−２−プロパノールとシアン化合物からハロヒドリンエポキシダーゼによって４−ハロ−３−ヒドロキシブチロニトリルを合成する際の生成物であり、ハロヒドリンエポキシダーゼによる該合成反応を阻害しうる。高濃度の塩化物イオン存在下における、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ及び改良型ハロヒドリンエポキシダーゼのハロヒドリンエポキシダーゼ活性を調べ、比較した。実施例４で調製した、野生型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体株JM109/pSTT002由来粗酵素液及び改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体株JM109/pSTT002-D199H由来粗酵素液を用い、実施例１（３）記載の方法において反応液のＤＣＰ濃度を400mMとした反応液を用いた方法、及び実施例１（３）記載の方法において反応液のＤＣＰ濃度を400mMとし、かつ、塩化ナトリウムを終濃度100mM又は200mMとなるように添加した反応液を用いた方法により、塩化ナトリウム非存在下（0mM）及び存在下（100mM及び200mM）におけるハロヒドリンエポキシダーゼ活性（脱クロル活性）を測定し、各形質転換体由来粗酵素液の塩化ナトリウム非存在下（0mM）における該活性を100%として相対活性値を算出した。その結果を表６に示した。【０１５２】
【表６】
2008108466.tif 000021
【０１５３】
野生型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体株JM109/pSTT002由来粗酵素液のハロヒドリンエポキシダーゼ活性は、塩化物イオン100mM及び200mMの存在下ではそれぞれ44%及び40%に低下してしまったのに対し、改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体株JM109/pSTT002-D199H由来粗酵素液のハロヒドリンエポキシダーゼ活性は、塩化物イオン100mM及び200mMの存在下でもそれぞれ91%及び78%の残存活性を示した。従って、該改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、塩化物イオンによる反応阻害に対する耐性が野生型ハロヒドリンエポキシダーゼよりも向上していることが確認された。
【実施例６】
【０１５４】
改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現形質転換体（ロドコッカス属細菌宿主）の作製とその評価【０１５５】
（１）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体（ロドコッカス属細菌宿主）の作製
改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体（ロドコッカス属細菌宿主）を作製し、該形質転換体の評価を行った。まず、特開２００７−４９９３２号記載の発現プラスミドpJHB057を鋳型として、ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)（配列番号１）の141番目のスレオニン残基のアラニンへの置換変異（T141A）、144番目のフェニルアラニン残基のセリンへの置換変異（F144S）及び207番目のアスパラギン酸残基のヒスチジンへの置換変異（D207H）がそれぞれ導入された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼ発現プラスミドを作製した。変異導入に用いるプライマーとして、以下のものを作製した。【０１５６】
MDH-05：CGCTGGCCTACAGCGCGGCGCGTTTCGCT（配列番号６８：29ヌクレオチドからなり、ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)の141番目のアミノ酸をコードするコドンがGCG（アラニンをコードする）であるセンスプライマー）
MDH-06：AGCGAAACGCGCCGCGCTGTAGGCCAGCG（配列番号６９：29ヌクレオチドからなり、MDH-05の相補配列を有するアンチセンスプライマー）【０１５７】
MDH-07：CAGCACGGCGCGTTCCGCTCAGCGCGGGT（配列番号７０：29ヌクレオチドからなり、ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)の144番目のアミノ酸をコードするコドンがTCC（セリンをコードする）であるセンスプライマー）
MDH-08：ACCCGCGCTGAGCGGAACGCGCCGTGCTG（配列番号７１：29ヌクレオチドからなり、MDH-07の相補配列を有するアンチセンスプライマー）【０１５８】
MDH-09：CGACTGCCCGAGAGCACGCGCTGCTCGCG（配列番号７２：29ヌクレオチドからなり、ハロヒドリンエポキシダーゼHheB(1st)の207番目のアミノ酸をコードするコドンがCAC（ヒスチジンをコードする）であるセンスプライマー）
MDH-10：CGCGAGCAGCGCGTGCTCTCGGGCAGTCG（配列番号７３：29ヌクレオチドからなり、MDH-09の相補配列を有するアンチセンスプライマー）【０１５９】
上記のプライマー及び鋳型pJHB057を用い、QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社)により部位特異的変異導入を行った。反応液組成（全量50μl）は以下の表の通りとした（系列１はT141A変異体、系列２はF144S変異体、系列３はD207H変異体の取得をそれぞれ目的とする）。【０１６０】
【表ｊ】
2008108466.tif 000022
【０１６１】
各系列に用いたプライマーの組み合わせは次の通りである。
系列１：センスプライマーMDH-05、アンチセンスプライマーMDH-06
系列２：センスプライマーMDH-07、アンチセンスプライマーMDH-08
系列３：センスプライマーMDH-09、アンチセンスプライマーMDH-10
上記組成の各反応液について、以下の表の熱サイクル処理を行った。【０１６２】
【表ｋ】
2008108466.tif 000023
【０１６３】
添付のマニュアルに従い、熱サイクル処理を行った各反応液にDpnIを1μl添加し、37℃で１時間インキュベートした。DpnI処理液を用い、実施例２（１）と同様に大腸菌の形質転換を行った。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を 1.5mlのLB Amp培地（アンピシリン 100mg/Lを含有するLB培地）にて37℃で一晩培養した。得られた培養液を各々集菌後、Flexi Prep（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーDNAシーケンサーCEQ2000(ベックマン・コールター)を用いて、添付のマニュアルに従って、3種のプラスミド中にクローニングされているPCR増幅産物の塩基配列を解析し、PCR反応におけるエラー変異が生じていないことを確認した。系列１のPCR増幅産物由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpJHB057-T141Aと、系列２のPCR増幅由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpJHB057-F144Sと、系列３のPCR増幅産物由来DNA断片がクローニングされたプラスミドをpJHB057-D207Hと命名し、また、それらプラスミドを含む大腸菌JM109株形質転換体を、JM109/ pJHB057-T141A、JM109/ pJHB057-F144S及びJM109/ pJHB057-D207Hとそれぞれ命名した。(前記アミノ酸残基の位置を示す数字は、HheB(1st)(配列番号１)におけるアミノ酸残基の位置を表す数字としている。)
得られたpJHB057-T141A、pJHB057-F144S及びpJHB057-D207Hを用い、特開２００７−４９９３２号記載の方法により、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous） J1株（受託番号「FERM BP-1478」）の形質転換を行った。得られたコロニーのプラスミドをそれぞれ確認し、3種の形質転換体J1/pJHB057-T141A、J1/pJHB057-F144S及びJ1/pJHB057-D207Hを得た。【０１６４】
（２）改良型ハロヒドリンエポキシダーゼを発現する形質転換体（ロドコッカス属細菌宿主）の評価
実施例６（１）で得られた3種の形質転換体（J1/pJHB057-T141A、J1/pJHB057-F144S 及びJ1/pJHB057-D207H）の評価を次のように行った。該3株の形質転換体及び対照とするJ1/pJHB057の計4株を、それぞれGGPK培地（1.5％ グルコース、1％ グルタミン酸ナトリウム、0.1％ バクトイーストエキス、0.05％ K2HPO4、0.05％ KH2PO4、0.05％ MgSO4・7H2O、カナマイシン 50μg／ml、pH7.2）100mlに植菌し、30℃で72時間振盪培養した。得られた各培養液100mlから遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）により各菌体を回収し、20mM Tris-硫酸緩衝液（pH8.0）で洗浄した後、菌濃度が12.5gDC/Lとなるように同緩衝液に懸濁した。得られた菌体懸濁液の3mlを、超音波破砕機VP−15S（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール4、DUTY CYCLE 40％、PULS、TIMER＝Bモード10sの条件で氷冷しながら10分間破砕した。破砕した菌体懸濁液を遠心分離（23,000×g、5分間、4℃）に供し、上清を粗酵素液として採取した。得られた各粗酵素液について、実施例１（３）記載の方法において反応液のＤＣＰ濃度を400mMとした反応液を用いた方法により、ハロヒドリンエポキシダーゼ活性（脱クロル活性）をそれぞれ測定した。１Ｕを上記各条件下でＤＣＰから1分間あたり1μmol塩化物イオンの脱離する酵素量に相当するものと定義して活性測定に用いた各粗酵素液の活性を、該活性を活性測定に用いた各粗酵素液の液量で除することにより各粗酵素液の液活性を算出した。さらに、該液活性をタンパク濃度で除することによって各株のタンパクあたり比活性を算出した。タンパク濃度は、バイオラッドプロテインアッセイ（バイオラッド）を用いて測定した。その結果を表７に示した。【０１６５】
【表７】
2008108466.tif 000024
【０１６６】
HheB(1st)(配列番号１)における141番目のスレオニン残基のアラニンへの置換変異（T141A）、144番目のフェニルアラニン残基のセリンへの置換変異（F144S）及び207番目のアスパラギン酸残基のヒスチジンへの置換変異（D207H）がそれぞれ導入された改良型ハロヒドリンエポキシダーゼは、ロドコッカス属細菌を宿主とする場合においても、形質転換体あたりハロヒドリンエポキシダーゼ活性向上をもたらす改良型ハロヒドリンエポキシダーゼであることが確認された。
【配列表フリーテキスト】
【０１６７】
配列番号３〜２８：変異ペプチド
配列番号３１〜５６：変異ＤＮＡ
配列番号５７〜６１：合成ＤＮＡ
配列番号６２：合成ＤＮＡ
配列番号６２：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置：15〜17）
配列番号６３：合成ＤＮＡ
配列番号６３：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置：13〜15）
配列番号６４：合成ＤＮＡ
配列番号６４：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置：14〜16）
配列番号６５：合成ＤＮＡ
配列番号６５：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置：14〜16）
配列番号６６：合成ＤＮＡ
配列番号６６：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置：15〜17）
配列番号６７：合成ＤＮＡ
配列番号６７：ｎはａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置：13〜15）
配列番号６８〜７３：合成ＤＮＡ
配列番号７４：Xaaは任意のアミノ酸残基を表す（存在位置：2〜13、15，16、19）
配列番号７５：Xaaは任意のアミノ酸残基を表す（存在位置：2、5〜8、10）
配列番号７６〜８３：変異ペプチド
配列番号８４〜９１：変異ＤＮＡ
【図１】
2008108466.tif 000025
【配列表】
2008108466000001.app
【国際調査報告】
2008108466.tif 000026
2008108466.tif 000027
2008108466.tif 000028
2008108466.tif 000029
2008108466.tif 000030
2008108466.tif 000031
2008108466.tif 000032