(57)【要約】  ホップ組織の冷水抽出物を有効成分とする美白剤が提供される。この冷水抽出物は、アストラガリン、アストラガリンマロニルグルコシド、イソケルシトリン、イソケルシトリンマロニルグルコシド、ケルセチンマロニルグルコシド、ケンフェロールルチノシド、ケンフェロールマロニルグルコシド、ルチン及びフロロアシルフェノン配糖体からなる群より選ばれるフラボノイド配糖体の少なくとも１種を含有することが好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホップ組織の冷水抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項２】
前記冷水抽出物は、アストラガリン、アストラガリンマロニルグルコシド、イソケルシトリン、イソケルシトリンマロニルグルコシド、ケルセチンマロニルグルコシド、ケンフェロールルチノシド、ケンフェロールマロニルグルコシド、ルチン及びフロロアシルフェノン配糖体からなる群より選ばれるフラボノイド配糖体の少なくとも１種を含有する請求項１記載の美白剤。
【請求項３】
前記フロロアシフフェノン誘導体は、フロロイソブチロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フロロ−２−メチルブチロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド及びフロロイソバレロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群より選ばれる少なくとも１種を含有する、請求項１又は２記載の美白剤。
【請求項４】
前記ホップ組織は、ホップの茎、球花又は葉である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の美白剤。
【請求項５】
前記ホップ組織は、乾燥されたホップ苞の粉砕物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の美白剤。
【請求項６】
前記ホップ組織は、乾燥されたホップ球花の粉砕物から、ルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の美白剤。
【請求項７】
前記乾燥されたホップ球花の粉砕物は、乾燥されたホップ球花の凍結物の粉砕物である、請求項６記載の美白剤。
【請求項８】
前記ホップ組織は、乾燥されたホップ球花から有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出によって抽出される物質の少なくとも一部を、当該ホップ球花から除いて得られたホップ残渣である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の美白剤。
【請求項９】
経口摂取型美白剤である請求項１〜９のいずれか一項に記載の美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、美白剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホップはビール製造に欠かせない原料であり、ビールに苦味や香りを与え、泡立ち・泡持ちを向上させるとともに、清澄性を高め、雑菌の繁殖も抑制すると言われている。また、ホップは健胃、消化促進等の薬理作用があり、従来、薬用植物としても利用されてきた。【０００３】
近年、このようなホップの有用性に着目して、その抽出物をビール以外の用途に適用する試みがなされている。例えば、ホップ抽出物を有効成分とする耐熱性好酸性菌増殖抑制剤（特許文献１）、ホップ抽出物を有効成分とする米加工食品用香味改良剤（特許文献２）、ホップ抽出物を含有する入浴剤（特許文献３）、活性酸素消去作用を有するホップ抽出物（特許文献４）等の用途が提案されている。【０００４】
ホップ抽出物については皮膚外用剤に用いることも検討されており、例えば、ハンニチバナ科の植物体から抽出された成分を含有する皮膚外用剤において、この成分と併用するための植物抽出物の一例としてホップ抽出物が挙げられている（特許文献５）。
【特許文献１】特開２００５−１３７２４１
【特許文献２】特開２００５−２６９９８８
【特許文献３】特開平９−６７２４５
【特許文献４】特開平４−２０２１３８
【特許文献５】特開２００３−３００８５９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、ホップには抽出可能な成分が多く含有されていることから、抽出媒体や抽出温度等の抽出条件が異なれば組成の異なった抽出物が得られることとなり、抽出物が奏する効果も異質なものとなる。したがって、ホップ抽出物を皮膚外用剤の一成分として適用した場合においても、抽出条件により美白効果等の外用剤の効果が不十分となる場合も多い。【０００６】
そこで、本発明の目的は、ホップ抽出物を含有し、美白効果に特に優れた美白剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、ホップ組織の冷水抽出物を有効成分とする美白剤を提供する。【０００８】
ここで、冷水抽出によるホップ抽出物は、アストラガリン、アストラガリンマロニルグルコシド、イソケルシトリン、イソケルシトリンマロニルグルコシド、ケルセチンマロニルグルコシド、ケンフェロールルチノシド、ケンフェロールマロニルグルコシド、ルチン及びフロロアシルフェノン配糖体からなる群より選ばれるフラボノイド配糖体の少なくとも１種を含有するものが良く、フロロアシフフェノン誘導体としては、フロロイソブチロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、フロロ−２−メチルブチロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド及びフロロイソバレロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドからなる群より選ばれる少なくとも１種が好適である。【０００９】
上記成分が高含有率で抽出できることから、ホップ組織は、ホップの茎、球花又は葉であることが好ましく、乾燥されたホップ苞の粉砕物が特に好ましい。同様の観点から、ホップ組織は、乾燥されたホップ球花の粉砕物から、ルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものが好適であり、乾燥されたホップ球花の粉砕物は、乾燥されたホップ球花の凍結物の粉砕物を用いることができる。なお、ホップ組織としては、乾燥されたホップ球花から有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出によって抽出される物質の少なくとも一部を、当該ホップ球花から除いて得られたホップ残渣を用いてもよい。【００１０】
このような美白剤は、皮膚外用剤又はその一成分として用いることができるのはもちろんであるが、経口摂取型美白剤としても機能する。
【発明の効果】
【００１１】
ホップ抽出物を含有し、美白効果に特に優れた美白剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ホップ（国産フラノ１８号）の葉から水抽出したフラボノール画分のＨＰＬＣチャートである。
【図２】ホップ（チェコ産ザーツ種）のペレットから水抽出したフラボノール画分のＨＰＬＣチャートである。
【図３】冷水抽出物Ａ及び冷水抽出物Ｂのチロシナーゼ活性阻害率（％）を示すグラフである。
【図４】冷水抽出物Ｃのチロシナーゼ活性阻害率（％）を、コントロールのチロシナーゼ活性阻害率を０％としたときの相対値として示すグラフである。
【図５】実施例２において冷水抽出物Ａを添加した場合のメラノーマ細胞の細胞生存率（％）を、コントロールの細胞生存率を１００％としたときの相対値として示すグラフである。
【図６】実施例２において冷水抽出物Ａを添加した場合のメラノーマ細胞の白色化状況と目視判定の結果を示す写真図である。
【図７】実施例２において冷水抽出物Ｂを添加した場合のメラノーマ細胞の細胞生存率（％）を、コントロールの細胞生存率を１００％としたときの相対値として示すグラフである。
【図８】実施例２において冷水抽出物Ｂを添加した場合のメラノーマ細胞の白色化状況と目視判定の結果を示す写真図である。
【図９】実施例２において冷水抽出物Ｃを添加した場合のメラノーマ細胞の細胞生存率（％）を、コントロールの細胞生存率を１００％としたときの相対値として示すグラフである。
【図１０】実施例２において冷水抽出物Ｃを添加した場合のメラノーマ細胞の白色化状況と目視判定の結果を示す写真図である。
【図１１】（ａ）は皮膚モデルカップの構造を示す斜視図であり、（ｂ）は皮膚モデルカップの構造を示す断面図である。
【図１２】実施例３において、冷水抽出物Ａを添加した場合の組織細胞の生存率を、コントロールの生存率を１００％としたときの相対値として示すグラフである。
【図１３】実施例３におけるコントロールのメラニン生成状況を示す写真である。
【図１４】実施例３において、冷水抽出物Ａの０．０８質量％溶液を添加した場合のメラニン生成状況を示す写真である。
【図１５】実施例３において、冷水抽出物Ａの０．００８質量％溶液を添加した場合のメラニン生成状況を示す写真である。
【符号の説明】
【００１３】
２…組織培養ウェル、４…培養インサート、６…培養液、８…膜、１０…組織、１００…皮膚モデルカップ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明に係る美白剤の好適な実施形態について説明する。【００１５】
本発明の美白剤の有効成分はホップ組織の冷水抽出物であり、いずれの品種のホップも冷水抽出の対象とすることができる。しかしながら、得られる抽出成分の美白効果が高いことから、チェコ産ザーツ種、ドイツ産ハラタウ・トラディション種、国産フラノ１８号、中国産等のビール醸造用ホップ品種が好ましく、チェコ産ザーツ種が特に好ましい。【００１６】
本発明においてホップ組織とは、ホップのいずれかの組織又はその一部を意味する。冷水抽出に用いるホップ組織は、葉、茎及び球花のいずれでもよく、球花が好ましく、ホップ苞がより好ましい。ホップ苞は、球花を構成する苞葉のことであって、球花からルプリン部分（黄色の顆粒）の少なくとも一部を取り除いて得ることができる。このため、本発明の冷水抽出に用いるホップ組織は、ビール等発泡性アルコール飲料の醸造に用いるホップペレットを加工する際に規定の大きさに粉砕されずに廃棄されるホップ苞であってもよく、後述するホップ球花を超臨界流体又は有機溶媒で抽出した後に残るホップ残渣であってもよい。【００１７】
ホップ組織の冷水抽出物は、ホップ組織を冷水で抽出する工程を備える製造方法により得られる。ここで「冷水」とは室温以下の水を意味し、通常、０℃超５０℃以下の水のことをいう。冷水の温度は、０℃超４０℃以下が好ましく、５℃以上３０℃以下がより好ましく、１０℃以上３０℃以下がよりいっそう好ましく、２０±５℃（さらには２０±３℃）が特に好ましい。このような温度の冷水を用いることによって、抽出が効率的になり、抽出物収量が多くなる。０℃以下の冷水を用いると、冷却コストが増大してしまい、４０℃超の水を用いると、炎症作用を誘発するような成分までもが溶出されてしまう傾向がある。なお、抽出時間を短縮するためには、水に少量のアルコール、好ましくはエタノールを、１０質量％以下添加することができる。【００１８】
ホップ組織から抽出物を得る方法としては、植物から天然物を水抽出する方法が広く採用でき、例えば、ホップ組織と一定量の冷水とを容器に入れ、適宜撹拌しながら所定時間静置し、抽出液を濾過して残渣を取り除く方法が挙げられる。混入する残渣や不純物等を完全に取り除くためには、濾過した抽出液をさらに遠心分離すればよく、その上澄（以下、遠心上澄）を冷水抽出物として使用できる。なお、得られた冷水抽出物は、濃縮し、乾燥して使用することもできる。【００１９】
ホップ組織の冷水抽出物は、合成吸着剤を充填したカラムに通して、精製して使用することもできる。合成吸着剤としては、例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４、７及び１６（オルガノ社）、活性炭、ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ；ポリフェノール吸着剤）が挙げられ、この中でもＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤ−４が好ましく用いられる。具体的には、ホップ組織の冷水抽出物を、合成吸着剤を充填したカラムに通し、その吸着成分を、例えば、水及びメタノールの混合溶媒で溶出させ、溶出した画分を使用できる。【００２０】
本発明の美白剤は、乾燥されたホップ苞の粉砕物の冷水抽出物を有効成分とすることが好ましく、また、乾燥されたホップ球花の粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものの冷水抽出物を有効成分とすることが好ましい。冷水抽出に用いる乾燥ホップ球花の粉砕物は、例えば、ホップ球花を乾燥して乾燥ホップ球花を得る乾燥工程と、乾燥ホップ球花を粉砕して粉砕物を得る粉砕工程と、この粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物を取り除く選別工程と、を備える製造方法により得られる。【００２１】
乾燥工程では、ホップ球花を１００℃以下の温度で乾燥させ、ホップ球花を保存可能な程度にまで水分を除去できればよいが、５５℃以下の温度で水分含量を７〜９％まで乾燥することが好ましい。粉砕工程では、ホップ球花を効率的に微粉状に粉砕できればよく、例えば、ピンミル、ハンマーミル、ボールミル等の粉砕機を用いればよい。選別工程では、粉砕物をふるいにかけ、例えば、長径が０．１ｍｍ以上の粉砕物を「ルプリンを超える大きさ」のものとして選別することができる。この場合において、ふるいを通過させない大きさを長径０．３ｍｍ以上とすることが好ましく、長径０．５ｍｍ以上とすることがより好ましい。乾燥ホップ球花の粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物を取り除くには、例えば、目開き０．１、０．３又は０．５ｍｍのふるいで乾燥ホップ球花の粉砕物をふるい分け、ふるいを通過しなかった粉砕物を回収すればよい。なお、乾燥ホップ球花の粉砕物からルプリンの大きさ以下の粉砕物の少なくとも一部が除かれたものの冷水抽出物は、こうして選別された乾燥ホップ球花の粉砕物を、上述した冷水で抽出する工程で記載した方法で抽出すればよい。【００２２】
さらに、本発明において使用する乾燥されたホップ球花の粉砕物は、乾燥されたホップ球花の凍結物の粉砕物であることが好ましい。乾燥されたホップ球花を凍結する方法は、特に制限されないが、凍結温度は−１０℃以下が好ましく、−３５℃以下がより好ましい。【００２３】
また、冷水抽出物は、乾燥されたホップ球花から有機溶媒抽出又は超臨界流体抽出によって抽出される物質の少なくとも一部を、当該ホップ球花から除いて得られたホップ残渣の冷水抽出物であってもよい。有機溶媒抽出に用いる有機溶媒としては、例えば、アルコール又はヘキサンが挙げられ、炭素数１〜４の低級アルコールが好ましく、エタノールがより好ましい。超臨界流体抽出に用いる超臨界流体としては、例えば、二酸化炭素、水、メタン、エタン、エチレン、プロパン、ペンタン、メタノール、エタノールが挙げられ、二酸化炭素が好ましい。【００２４】
冷水抽出物は、典型的には、アストラガリン、アストラガリンマロニルグルコシド、イソケルシトリン、イソケルシトリンマロニルグルコシド、ケルセチンマロニルグルコシド、ケンフェロールルチノシド、ケンフェロールマロニルグルコシド、ルチン及びフロロアシルフェノン配糖体からなる群より選ばれるフラボノイド配糖体の少なくとも１種を含有する。【００２５】
ここで、フロロアシルフェノン配糖体は、下記一般式（１）で表すことができる。
【化１】
2008026507.tif 000003
［式（１）中、Ｒ１はイソプロピル基、イソブチル基又はｓｅｃ−ブチル基を示す。］【００２６】
式（１）において、Ｒ１がイソプロピル基である場合は、フロロアシルフェノン配糖体は下記式（２）で表されるフロロイソブチロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドであり、Ｒ１がイソブチル基である場合は、フロロアシルフェノン配糖体は下記式（３）で表されるフロロ−２−メチルブチロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドであり、Ｒ１がｓｅｃ−ブチル基である場合は、フロロアシルフェノン配糖体は下記式（４）で表されるフロロイソバレロフェノン−２−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである。
【化２】
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【００２７】
美白剤における、ホップ組織の冷水抽出物の含有量は、抽出媒体を除いた成分として美白剤全質量基準で０．０００１〜１００質量％が好ましく、０．０１〜１００質量％がより好ましく、１〜１００質量％が更に好ましく、５〜１００質量％が特に好ましい。【００２８】
美白剤は、ホップ組織の冷水抽出物の他、浸潤剤、油性成分、保湿剤、粉体、色素、乳化剤、分散助剤、可溶化剤、洗浄剤、紫外線吸収剤、増粘剤、薬剤、香料、樹脂、賦形剤、防菌防黴剤、消臭・脱臭剤、酵素、精製水、アルコールを含有していてもよい。また、他の美白剤を添加してもよい。【００２９】
本発明の美白剤はそれ単独で美白効果を有する皮膚外用剤として皮膚等に適用でき、化粧料や薬剤に添加してこれらに美白効果を付与させる美白効果付与剤としても使用できる。更に、服用して美白効果を発揮させる経口摂取型美白剤としても利用できる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例及び比較例に基づき本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。【００３１】
［製造例１］
冷水抽出：
ホップ（国産フラノ１８号）の葉を刻み１０倍量（ｗ／ｖ）の蒸留水に浸して５℃にて一晩静置した。これを、９２００Ｇにて１５分間遠心分離した後、上澄を回収して、ホップの葉の冷水抽出物を得た。【００３２】
冷水抽出物の同定：
得られた冷水抽出物を分液ロートに移し、ヘキサンを加えヘキサン移行成分を廃棄した。さらに、水層に酢酸エチルを加え、酢酸エチル移行成分を廃棄した。最後に水層にｎ−ブタノールを加えブタノール抽出操作を３回繰り返して得たブタノール層を合併し、減圧濃縮してフラボノール画分（ホップの組織の冷水抽出物から分離されたフラボノイド配糖体）を得た。【００３３】
得たフラボノール画分を、まず、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣによる分析は、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ）を４０℃にて使用し、流速を０．２ｍＬ／分とした。移動相は、０．０５％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏを１液とし、アセトニトリルを２液とし、２液の割合を１０％〜５０％まで１６分間で変化させるリニアグラジェントとした。検出は３５０ｎｍのＵＶ検出器で行った。【００３４】
さらに、上記フラボノール画分の各ピークを分取用ＨＰＬＣで分離し、各ピークの成分を同定した。ＨＰＬＣによる分取用分離は、Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＳｕｎＦｉｒｅ）を４０℃にて使用し、流速を６ｍＬ／分とした。移動相は、１０％ＭｅＣＮを１０分間保持し、さらに１５０分間かけて６０％ＭｅＣＮまで変化させるリニアグラジェントとした。検出は３５０ｎｍのＵＶ検出器で行った。ＨＰＬＣの分析結果を図１に示す。【００３５】
図１に示すように、ホップの葉の冷水抽出物のフラボノール画分には主ピークが３つ存在し、これらは全てケンフェロール配糖体であることが同定された。詳しくは、図１の１で示すピークはケンフェロールルチノシド、２で示すピークはアストラガリン、３で示すピークはケンフェロールマロニルグルコシドであった。【００３６】
［製造例２］
冷水抽出：
ホップ（チェコ産ザーツ種）のタイプ９０ペレット１ｋｇを蒸留水１０Ｌに入れ、２０℃にて適宜撹拌しながらペレットを消失させて一晩静置した。これを、９２００Ｇにて１５分間遠心分離した。遠心分離機は日立社製のＣＲ２１Ｇを用いた。遠心分離後、上澄を回収し、それをさらに濃縮して、１５０ｇの濃縮液（以下、冷水抽出物Ａという。）を得た。【００３７】
冷水抽出物の同定：
冷水抽出物Ａを製造する際に得た上澄を分液ロートに移し、製造例１と同様の方法でフラボノール画分を取得し、ＨＰＬＣで分析して成分の同定を行った。ＨＰＬＣ分析の結果を図２に示す。図２に示すように、冷水抽出物Ａのフラボノール画分には主要ピークが３つ存在し、これらはケンフェロール配糖体（アストラガリン及びケンフェロールマロニルグルコシド）とケルセチンマロニルグルコシドであることが同定された。詳しくは、図２の１で示すピークはケンフェロールマロニルグルコシド、２で示すピークはアストラガリン、３で示すピークはケルセチンマロニルグルコシドであった。なお、図２の４で示すピークはルチン、５で示すピークはイソケルシトリン、６で示すピークはケンフェロールルチノシドであった。【００３８】
［製造例３］
冷水抽出：
乾燥したホップ（中国産）の球花を超臨界ＣＯ２抽出して、その残渣をペレット化した。このペレット１０００ｋｇを市水２０ｋＬに入れ、２０℃にて適宜撹拌しながらペレットを消失させて１２時間静置した。これを５００Ｇにて遠心分離した後、上澄を回収し、それをさらに濃縮して、９６０ｋｇの濃縮液（以下、冷水抽出物Ｂという。）を得た。冷水抽出物Ｂ中の固形分は、１９２ｋｇであった。以下、実施例においては、この固形分を該濃度に調製して使用した。【００３９】
冷水抽出物の同定：
冷水抽出物Ｂを製造する際に得た上澄について、製造例２と同様の方法でＨＰＬＣ分析を行ったところ、冷水抽出物Ｂのフラボノール画分には主要ピークが３つ存在し、これらはケンフェロール配糖体（アストラガリン及びケンフェロールマロニルグルコシド）とケルセチンマロニルグルコシドであることが同定された。【００４０】
［実施例１−１］  チロシナーゼ活性阻害試験１
本試験には、冷水抽出物Ａ（製造例２で得られたもの）及び冷水抽出物Ｂ（製造例３で得られたもの）を試料として用いた。試験は、以下の手順で行った。【００４１】
容器に、Ｌ―チロシン４０ｍｇとＭｉｌｌｉＱ水を加えて１００ｍＬとした。その容器を、熱湯を入れたビーカーの中で温めた。さらに超音波を用いて、Ｌ−チロシンをＭｉｌｌｉＱ水に溶解させ、チロシン溶液とした。チロシン溶液は、分注し冷凍保存した。【００４２】
リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）４．５３６ｇを含む酸性のＭｉｌｌｉＱ水溶液を５００ｍＬ調製し、Ａ液とした。リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）４．７３ｇ又はリン酸水素二ナトリウム１２水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ）１１．９３８ｇを含むｐＨ９程度のＭｉｌｌｉＱ水溶液を５００ｍＬ調製し、Ｂ液とした。Ａ液とＢ液とを１：１の割合で混合し、ＰＨ６．８の１／１５Ｍリン酸緩衝液を調製した。【００４３】
冷水抽出物Ａ及び冷水抽出物ＢそれぞれをＭｉｌｌｉＱ水で希釈し、各濃度の試料溶液を調製した。各濃度の試料溶液ごとに、１０ｍＬねじ口試験管を４本用意した。４本の試験管のうち、２本をサンプル（＋）用とし、残りの２本をサンプル（−）用とした。また、コントロール用のねじ口試験管を４本用意し、そのうち２本をコントロール（＋）用とし、残りの２本をコントロール（−）用とした。ここで、（＋）はチロシン溶液添加を、（−）はチロシン溶液不添加を意味する。以下、それぞれの試験管の反応溶液を調製していく。表１は、それぞれの試験管の反応溶液の組成を示すものである。
【表１】
2008026507.tif 000005
【００４４】
表１に従って、サンプル（＋）用試験管及びサンプル（−）用試験管に、試料溶液を２ｍＬずつ添加した。コントロール（＋）用試験管及びコントロール（−）用試験管には、試料溶液の代わりにＭｉｌｌｉＱ水を２ｍＬずつ添加した。続いて全ての試験管に、ＰＨ６．８の１／１５Ｍリン酸緩衝液を２ｍＬずつ添加した。【００４５】
サンプル（＋）用試験管及びコントロール（＋）用試験管に、チロシン溶液を０．５ｍＬずつ添加した。サンプル（−）用試験管及びコントロール（−）用試験管には、チロシン溶液の代わりにＭｉｌｌｉＱ水を０．５ｍＬずつ添加した。【００４６】
ファルコンチューブに必要量程度のチロシナーゼを入れ、重さを量った。チロシナーゼの量に応じてＭｉｌｌｉＱ水を加え、１０００ｕｎｉｔ／ｍＬの酵素溶液を調製した。なお、酵素溶液は使用する直前に調製した。全ての試験管について、酵素溶液０．５ｍＬを添加し、試験管のふたを閉め、ボルテックスで撹拌する作業を１５秒おきに行った。【００４７】
全ての試験管を、３７℃に保たれた恒温振とう器内にセットし、７０／ｍｉｎにて１時間振とうした。恒温振とう器から全ての試験管を取り出し、２、３度混ぜてから、酵素反応を停止させるために５分間氷冷した。十分に冷やした９６ウェルプレートに、各試験管の溶液を、温めないように注意しながら３００μＬずつ添加し、プレートリーダーを用いて４７５ｎｍの吸光度を測定した。なお、ゼロ合わせはＭｉｌｌｉＱ水で行った。【００４８】
サンプル（＋）、コントロール（＋）、サンプル（−）、コントロール（−）用試験管の溶液から測定された吸光度の値をそれぞれＡｓ、Ａｂ、Ａｓ´、Ａｏとしたとき、下式によって求めた値をチロシナーゼ活性阻害率とした。図３は、冷水抽出物Ａ及び冷水抽出物Ｂのチロシナーゼ活性阻害率（％）を示すグラフである。なお、ポジティブコントロールとしてコウジ酸のＭｉｌｌｉＱ水希釈液を用いた。
［（Ａｂ−（Ａｓ−Ａｓ´））／（Ａｂ−Ａｏ）］×１００（％）【００４９】
図３が示すように、冷水抽出物Ａ及び冷水抽出物Ｂの試料溶液でチロシナーゼ活性阻害率が上昇した。すなわち、冷水抽出物Ａ及び冷水抽出物Ｂにチロシナーゼ活性阻害作用があることが明らかになった。特に、冷水抽出物Ａを４００ｐｐｍ添加したサンプルでは、コントロールと比べて顕著なチロシナーゼ活性阻害作用が認められた。【００５０】
［実施例１−２］  チロシナーゼ活性阻害試験２
本試験には、冷水抽出物Ｃ（製造例１で得られたもの）を試料として用いた。試験は、実施例１−１とほぼ同様の手順で行った。【００５１】
試料溶液としては、冷水抽出物ＣをＭｉｌｌｉＱ水で希釈し、冷水抽出物Ｃの１倍希釈溶液（原液）（×１）、２倍希釈溶液（×１／２）、及び１０倍希釈溶液（×１０）を調製した。また、酵素反応後の各試験管の溶液は、９６ウェルプレートに２００μＬずつ添加した。その他は実施例１−１と同様の手順により、チロシナーゼ活性阻害率を求めた。図４は、冷水抽出物Ｃのチロシナーゼ活性阻害率（％）を、コントロール（ＭｉｌｌｉＱ水）のチロシナーゼ活性阻害率を０％としたときの相対値として示すグラフである。【００５２】
図４が示すように、冷水抽出物Ｃの試料溶液で濃度依存的にチロシナーゼ活性阻害率が減少した。すなわち、冷水抽出物Ｃに濃度依存的なチロシナーゼ活性阻害作用があることが明らかになった。【００５３】
［実施例２］  Ｂ１６メラノーマ培養細胞に対するメラニン生成抑制試験
本試験には、冷水抽出物Ａ、冷水抽出物Ｂ及び冷水抽出物Ｃを試料として用いた。試験は、以下の手順で行った。【００５４】
１０％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むイーグルＭＥＭ培地に、Ｂ１６メラノーマ細胞（ヒューマンサイエンス資源バンク  ＪＣＲＢ０２０２）を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにサスペンドし、プレートに播種した。５％ＣＯ２に調整したインキュベーターにプレートを入れ、３７℃にて２４時間培養した。プレートに、ＤＭＳＯに溶解した試料を添加し、同じ条件で３日間培養した。なお、試料の代わりにＤＭＳＯを添加した場合をコントロールとし、アルブチンを添加した場合をポジティブコントロールとした。【００５５】
培養後、トリプシン処理により細胞を回収し、血球計算盤により細胞数を測定した。それに基づいて１ウェル当りの細胞数を算出し、細胞生存率を求めた。図５、図７、図９はそれぞれ、冷水抽出物Ａ、冷水抽出物Ｂ、冷水抽出物Ｃを添加した場合のメラノーマ細胞の細胞生存率を、コントロールの細胞生存率を１００％としたときの相対値として示すグラフである。【００５６】
また、細胞数測定後、リン酸緩衝液ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄して回収した。回収したメラノーマ細胞の白色化状況を肉眼にて目視判定した。表２は、目視判定の基準を示すものである。図６、図８、図１０はそれぞれ、冷水抽出物Ａ、冷水抽出物Ｂ、冷水抽出物Ｃを添加した場合のメラノーマ細胞の白色化状況と目視判定の結果を示す写真図である。
【表２】
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【００５７】
図５〜図１０より、冷水抽出物Ａ、冷水抽出物Ｂ及び冷水抽出物Ｃは、毒性のない範囲で、濃度依存的にメラニン生成抑制作用を示すことが明らかとなった。【００５８】
［実施例３］  正常ヒト皮膚３次元モデルに対するメラニン生成抑制試験
本試験には、冷水抽出物Ａを試料として用いた。試験は、以下の手順で行った。【００５９】
ヒト正常皮膚３次元モデル（ＭＥＬ−３００Ａ（Ａｓｉａｎ  ｄｏｎｏｒ）、Ｌｏｔ、Ｎｏ．６７６１、クラボウ）に、３１．５ｍＪ／ｃｍ２にてＵＶＢを照射した。ＵＶ照射はトランスイルミネーターＤＴ−２０ＭＰ（ＡＴＴＯ）で行った。ＵＶ量の測定は、ＵＶＸデジタルラジオメーター（ＵＶＰ  Ｉｎｃ．）にＵＶＸ−３１検出器を取り付け、ＵＶ３１０ｎｍの強度を測定した。【００６０】
図１１は、皮膚モデルカップの構造を示す斜視図（ａ）及び断面図（ｂ）である。皮膚モデルカップ１００は、組織培養ウェル２の内部に培養インサート４を備えてなる。培養インサートの内側には水平方向に膜８が張られており、組織培養ウェル２は、膜８の高さまで培養液６で満たされている。培養インサート４中の膜８上には、ヒト正常表皮角化細胞やメラノサイトからなる組織１０が設置されている。皮膚モデルカップ１００においては、培養液６から膜８を通して組織１０に栄養が与えられる。【００６１】
ＵＶ照射後、皮膚モデルカップの培養液に試料溶液を添加した。試料溶液の代わりに培養液を添加した場合をコントロールとした。５％ＣＯ２に調整したインキュベーターに皮膚モデルカップを入れ、３７℃にて培養を開始した。培養は、ＥＰＩ−１００−ＬＬＭＭ長期維持培地を用いて行った。２４時間培養後、培地交換し、再び試料溶液を添加した。３日後、再び培地交換し、試料溶液を添加した。さらに２日後、培地交換と試料添加を行い、２４時間後に細胞毒性試験を行った。【００６２】
細胞毒性試験は、ＭＴＴアッセイにより行った。ＭＴＴアッセイは、以下の手順で行った。皮膚モデルカップをＰＢＳ２５０μＬで３回洗浄した。ＭＴＴ溶液３００μＬが入った２４ウェルプレートに組織を入れ、５％ＣＯ２に調整したインキュベーターで３７℃にて３時間培養した。再び皮膚モデルカップをＰＢＳにて洗浄した。０．０４ＮのＨＣＬを含むイソプロパノール２ｍＬが入った２４ウェルプレートに組織を入れ、２時間抽出した。抽出液２００μＬを９６ウェルプレートに移し、５６０ｎｍの吸光度を測定した。なお、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅは６５５ｎｍとした。吸光度の値から、組織細胞の生存率を求めた。図１２は、冷水抽出物Ａを添加した場合の組織細胞の生存率を、コントロールの生存率を１００％としたときの相対値として示すグラフである。【００６３】
また、培養後、それぞれの組織の写真撮影を行った。図１３は、コントロールのメラニン生成状況を示す写真、図１４は、冷水抽出物Ａの０．０８質量％溶液を添加した場合のメラニン生成状況を示す写真、図１５は、冷水抽出物Ａの０．００８質量％溶液を添加した場合のメラニン生成状況を示す写真である。【００６４】
図１２〜図１５より明らかなように、冷水抽出物Ａを添加した場合は、コントロールと比べて組織が黒化していなかった。特に、冷水抽出物Ａの０．０８％溶液を添加した場合は、コントロールと比べてかなり白かった。すなわち、冷水抽出物Ａは、細胞毒性のない範囲で、濃度依存的にメラニン生成抑制作用を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明によれば、ホップ抽出物を含有し、美白効果に特に優れた美白剤が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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