(57)【要約】  本発明は、サッカロミセス属酵母種を、正確、迅速、かつ簡便に識別できるプライマーセットの提供を目的とする。本発明によれば、配列番号１〜１７または２３〜３０の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドからなる群から選択されるプライマーを含んでなる、サッカロミセス酵母種の検出に用いられるプライマーセットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、または配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）検出用プローブまたはプライマー。
【請求項２】
請求項１に記載の二種以上のプライマーからなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）検出用ＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項３】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、請求項２に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項３に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット。
【請求項５】
請求項１に記載の二種以上のプライマーからなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）検出用ＰＣＲ法プライマーセット。
【請求項６】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項７】
下記ポリヌクレオチドのいずれか一方あるいは両方を更に含んでなる、請求項６に記載のＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項８】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）の検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット：
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項８に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセット：
配列番号２３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセット：
配列番号２５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセット：
配列番号２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）の検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセット：
配列番号２９の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号３０の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１５】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１６】
配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列において１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項１に記載のプローブまたはプライマー。
【請求項１７】
配列番号１〜５、７〜１７または２３〜３０の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項３、４、および６〜１３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１８】
配列番号１〜５、７〜１７、または２３〜３０の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有するポリヌクレオチドである、請求項３、４、および６〜１３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項１９】
配列番号１〜５、７〜１７、または２３〜３０の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドが、それぞれ、対応する塩基配列において、１または数個のヌクレオチドが改変された改変塩基配列からなり、かつ対応する塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項３、４、および６〜１３のいずれか一項に記載のプライマーセット。
【請求項２０】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のプライマーセットと、サッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出用キット。
【請求項２１】
サッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが、請求項８または９のＬＡＭＰ法プライマーセットである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のＬＡＭＰ法プライマーセットと、サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出用キット。
【請求項２３】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが下記ポリヌクレオチドを含んでなるＬＡＭＰ法プライマーセットである、請求項２２に記載の検出キット：
配列番号１８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーとして、配列番号２２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項２３に記載の検出キット。
【請求項２５】
請求項２〜４のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法。
【請求項２６】
サッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を更に含んでなる、請求項２５に記載の検出方法。
【請求項２７】
サッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが、請求項８または９のＬＡＭＰ法プライマーセットである、請求項２６に記載の検出方法。
【請求項２８】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を更に含んでなる、請求項２５に記載の検出方法。
【請求項２９】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが、下記ポリヌクレオチドを含んでなるプライマーセットである、請求項２８に記載の検出方法：
配列番号１８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーとして、配列番号２２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでなる、請求項２９に記載の検出方法。
【請求項３１】
請求項５に記載のＰＣＲ法プライマーセットまたは請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のＰＣＲ法プライマーセットを用いてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法。
【請求項３２】
請求項１に記載のプローブを用いてハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法。
【請求項３３】
請求項６または７に記載のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・セレビシエの検出方法。
【請求項３４】
請求項８または９に記載のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・バヤヌスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、サッカロミセス属酵母の検出用プライマーセットに関し、より詳細には、サッカロミセス属酵母の検出用のＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセットに関する。本発明はまた、このプライマーセットを使用するサッカロミセス属酵母の検出および定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サッカロミセス属酵母は、パン製造の他、ビール、ワイン、日本酒、焼酎、ウィスキー等のアルコール飲料製造に広く用いられている。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）はエールのような上面発酵タイプのビール、ワイン、日本酒、サイダーのような果実酒等の醸造酒、また焼酎、ウィスキー等の蒸留酒製造に用いられる。サッカロミセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）はワイン、シェリー酒、あるいは発泡性ワイン等の製造に用いられる。ピルスナータイプのビール製造に用いられる下面発酵酵母は、現在ではサッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）に分類されている（Kurtzman, C.P. & Fell, J.W. The Yeasts, A Taxonomic Study, 4th edition, 1998, Elsevier Science B.V., The Netherlands、Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg、Barnett, J.A. et al.：Yeasts, characteristics and identification, 3rd edition, 2000, Cambridge University Press, UK、清酒酵母・麹研究会：「清酒酵母の研究」2003, 新日本印刷, 東京）。このように製造に用いる酵母が適切な酵母かどうか把握するために、サッカロミセス属酵母の菌種を同定する技術は重要である。【０００３】
しかし、これらの酵母がろ過済みの酒類製品に残存したり、あるいは外部から混入した場合には、過剰に発酵して混濁を起こし、特徴的な臭いを生産し、刺激的な苦い味に変質させて製品品質に影響を与える（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil I, 1994, Verlag Hans Carl, Nuernberg、European Brewery Convention：ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg）。【０００４】
また、サッカロミセス属酵母は清涼飲料、特に果汁飲料からも分離される事がある。これらの酵母が混入すると、グルコースやサッカロース等の糖から炭酸ガス、エタノール、不快な臭気を生成し、製品品質を大きく損ねる（Back, W.：Farbatlas und Handbuch der Geraenkebiologie, Teil II, 1999, Verlag Hans Carl, Nuernberg）。 
このようにサッカロミセス属酵母が製品中で増殖すると産業に与える影響が大きいために、これら酵母を迅速に検出・同定する技術は、品質管理上重要である。また製品から分離されたサッカロミセス属酵母が製造工程で使用していた酵母である場合には、製造工程上流からのリーク、ろ過工程不良等に原因があると考えられ、外部から混入した酵母であった場合には充填機の洗浄不良や配管中の溜まり等の原因が考えられる。従って、汚染があったときに製品から分離された酵母を同定する技術は、対処する目標を明確にするために重要である。【０００５】
しかし、サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・バヤヌスは分類学的に非常に近縁であり、サッカロミセス・パラドクサス、サッカロミセス・ミカタエ等の数種の酵母とともにSaccharomyces sensu strictoという分類学上のグループを形成している（Naumov, G.I. et al.：Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000, vol. 50, 1931-1942）。さらにサッカロミセス・パストリアヌスは、サッカロミセス・セレビシエとサッカロミセス・バヤヌスの交雑により形成した種であると考えられており、遺伝子レベル、染色体レベルで両者のハイブリッドであることが確認されている（Kielland-Brandt, M.C. et al.：Genetics of brewing yeast. The Yeast, 2nd edn, vol. 6, pp223-254, Edited by Wheals, et al., Academic Press, New York、Ryu, S.-L. et al.：Yeast, 1996, vol.12, 757、Tamai, Y. et al.：Yeast, 1998, vol. 14, 923-933、Tamai, Y. et al.：Yeast, 2000, vol. 16, 1335-1343）。伝統的な酵母の同定法としては形態学的、生理学的、生化学的手法が用いられ、特に様々な糖の資化能、発酵能を調査する事が多いが、Saccharomyces sensu strictoに属する菌種は表現型的に互いに非常に似通っているため、このような伝統的な方法では区別する事は難しい（Naumova, E.S. et al.：Antonie van Leeuwenhoek, 2003, vol. 83, 155-166）。これらの株を見分ける分子生物学的なアプローチとしては、ＰＣＲフィンガープリンティング、ＤＮＡ／ＤＮＡ再結合キネティクス、核型解析、ミトコンドリアＤＮＡ制限酵素切断解析、ｒＲＮＡ遺伝子塩基配列解析、ｒＤＮＡ制限酵素切断解析、ＵＰ−ＰＣＲ、アイソザイム解析、ＰＣＲ−温度勾配ゲル電気泳動、リアルタイムＰＣＲ等が知られている。【０００６】
これまでに、サッカロミセス属酵母のＦＬＯ１遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅させる、あるいはｒＲＮＡ遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅させ、ＲＦＬＰでサッカロミセス属酵母かそれ以外の属の酵母か、あるいは醸造用酵母か非醸造用酵母か識別する方法が開発された（特開平１１−５６３６６号公報）。また、下面発酵ビール酵母の２６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と５Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子とのスペーサー領域の配列が２種類存在するという知見に基づいて、それぞれに対して特異的なＰＣＲプライマーセットが開発された（特開２００１−８６８４号公報）。更に、下面発酵酵母の検出のために、Ｌｇ−ＦＬＯ１のＮ末端部分と酵母第ＩＸ番染色体の遺伝子が連結したＬｇ−ＦＬＯ１類似遺伝子に特異的なプライマーが開発された（特開２００２−２３３３８２号公報）。【０００７】
しかし、ＰＣＲやリアルタイムＰＣＲは高度な温度制御や蛍光観察が必要なため、高価な機器を必要とする。またＰＣＲは反応後に電気泳動、染色、写真撮影等が必要であり、遺伝子増幅工程後の結果判定までに時間がかかる。さらにＲＡＰＤ  ＰＣＲ、増幅産物の制限酵素処理、塩基配列解析、アイソザイム解析、温度勾配ゲル電気泳動等は通常のＰＣＲ以上に時間と煩雑な操作が必要であり、日々の微生物検査業務の中で行うことには問題があった。【０００８】
一方、サッカロミセス・パストリアヌスは、サッカロミセス・セレビシエ由来のサブゲノム（Ｓｃ型）と、サッカロミセス・バヤヌス由来のサブゲノム（Ｌｇ型）を併せ持っているが、最近の研究によると、下面発酵酵母では、Ｓｃ型のＸＶＩ番染色体の右腕の一部が存在しないこと、Ｌｇ型のＩＩＩ番染色体の右腕の一部が存在しないこと、Ｌｇ型のＶＩＩ番染色体の左腕の一部が存在しないことが報告されている（梅基直行ら「ビール酵母の物理地図作成と比較ゲノム科学」第24回 日本分子生物学会年会（2001）；Nakao et al. Proceedings of the 29th EBC Congress (2003)；中尾嘉宏：化学と生物, 2005, vol. 43, No. 9, 559-561；および特開２００４−２８３１６９号公報）。しかし、サッカロミセス・パストリアヌスの染色体転座に関する詳細な情報は依然として得られていないのが現状であった。【０００９】
また、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ（loop mediated isothermal amplification）法プライマーセットが開発されているが（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）、検出精度の点で更に改善の余地を残すものであった。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、サッカロミセス・パストリアヌスのＸＶＩ番染色体右腕、ＩＩＩ番染色体右腕、およびＶＩＩ番染色体左腕の染色体転座の位置を特定するとともに、転座位置周辺のゲノムを分析した。本発明者らは、また、その情報に基づいてサッカロミセス属酵母を正確に検出できるプライマーセットを開発することに成功した。
【００１１】
以下、ＸＶＩ番染色体右腕の染色体転座に関連する発明を第一の態様および第二の態様とし、ＩＩＩ番染色体右腕の染色体転座に関連する発明を第三の態様とし、ＶＩＩ番染色体左腕の染色体転座に関連する発明を第四の態様とする。
【００１２】
第一の態様
本発明者らは、今般、サッカロミセス・パストリアヌスに属する下面発酵酵母のゲノム解析を行い、下面発酵酵母のＳｃ型のＸＶＩ番染色体は、右腕のＧＰＨ１のＯＲＦ内でＬｇ型染色体へ転座を起こし、更に、右腕末端方向のＱＣＲ２のＯＲＦ内で再度転座し、Ｓｃ型に戻っていることを見いだした。すなわち、本発明者らは、下面発酵酵母中にはＸＶＩ番染色体右腕のＧＰＨ１とＱＣＲ２に挟まれた領域はＬｇ型の塩基配列しか存在しないことを見いだした。
【００１３】
本発明者らは、ＧＰＨ１とＱＣＲ２に挟まれた領域に存在するＬｇ型ＭＥＴ１６遺伝子の配列（配列番号６）に基づいて、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってサッカロミセス・パストリアヌスを正確に検出できることを見いだした。Ｌｇ型ＭＥＴ１６遺伝子の配列は、これまでに公のデータベースにおいて開示されていない新規な配列である。
【００１４】
すなわち、本発明の第一の態様によれば、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、または配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドからなる、サッカロミセス・パストリアヌス（Saccharomyces pastorianus）検出用プローブまたはプライマーが提供される。
【００１５】
本発明の第一の態様によれば、また、二種以上の上記プライマーからなる、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される。
【００１６】
本発明の第一の態様によれば、また、二種以上の上記プライマーからなる、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００１７】
本発明の第一の態様によれば、好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００１８】
本発明者らは、また、下面発酵酵母のＸＶＩ番染色体右腕の染色体転座位置に基づいて、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＰＣＲ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってサッカロミセス・パストリアヌスを正確に検出できることを見いだした。
【００１９】
すなわち、本発明の第一の態様によれば、配列番号２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドと、配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００２０】
本発明の第一の態様によれば、また、配列番号２９の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドと、配列番号３０の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００２１】
本発明の第一の態様によれば、また、サッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットであって、一方のプライマーが配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、または配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドであり、もう一方のプライマーが下面発酵酵母のＸＶＩ番染色体右腕のＧＰＨ１とＱＣＲ２に挟まれた領域外のＳｃ型塩基配列またはその相補配列のいずれかにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドである、ＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００２２】
本発明の第一の態様によれば、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法が提供される。
【００２３】
本発明の第一の態様によれば、また、第一の態様のＰＣＲ法プライマーセットを用いてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法が提供される。
【００２４】
本発明の第一の態様によれば、更に、第一の態様のプローブを用いてハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法が提供される。
【００２５】
第二の態様
本発明者らは、下面発酵酵母中にはＸＶＩ番染色体右腕のＧＰＨ１とＱＣＲ２に挟まれた領域はＬｇ型の塩基配列しか存在しないことを見いだした。すなわち、ＸＶＩ番染色体右腕のＧＰＨ１とＱＣＲ２に狭まれた領域のＳｃ型の塩基配列は、サッカロミセス・パストリアヌスやサッカロミセス・バヤヌスには存在せず、サッカロミセス・セレビシエに特異的であることが判明した。
【００２６】
本発明者らは、ＧＰＨ１とＱＣＲ２に挟まれた領域に存在するＳｃ型ＭＥＴ１６遺伝子の配列に基づいて、サッカロミセス・セレビシエ検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってサッカロミセス・セレビシエを正確に検出できることを見いだした。
【００２７】
すなわち、本発明の第二の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・セレビシエの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００２８】
本発明の第二の態様によれば、第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・セレビシエの検出方法が提供される。
【００２９】
第三の態様
本発明者らは、下面発酵酵母のＬｇ型のＩＩＩ番染色体は、右腕のＭＡＴ座でＳｃ型染色体と転座を起こしていること、そして、下面発酵酵母中にはＩＩＩ番染色体右腕のＭＡＴ座から右腕末端にかけてＳｃ型の塩基配列しか存在しないことを見いだした。すなわち、ＩＩＩ番染色体右腕のＭＡＴ座から右腕末端にかけてのＬｇ型の塩基配列は、サッカロミセス・セレビシエやサッカロミセス・パストリアヌスには存在しないため、その領域に相当するサッカロミセス・バヤヌスの塩基配列はサッカロミセス・バヤヌスに特異的であることが判明した。
【００３０】
本発明者らは、ＭＡＴ座から末端に挟まれた領域に存在するＲＡＤ１８相同遺伝子の配列に基づいて、サッカロミセス・バヤヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってサッカロミセス・バヤヌスを正確に検出できることを見いだした。
【００３１】
すなわち、本発明の第三の態様によれば、下記ポリヌクレオチドを含んでなる、サッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットが提供される：
配列番号１３の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１４の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号１６の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【００３２】
本発明者らは、また、下面発酵酵母のＩＩＩ番染色体右腕の染色体転座位置に基づいて、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＰＣＲ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってサッカロミセス・パストリアヌスを正確に検出できることを見いだした。
【００３３】
すなわち、本発明の第三の態様によれば、配列番号２３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドと、配列番号２４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００３４】
本発明の第三の態様によれば、第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・バヤヌスの検出方法が提供される。
【００３５】
本発明の第三の態様によれば、また、第三の態様のＰＣＲ法プライマーセットを用いてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法が提供される。
【００３６】
第四の態様
本発明者らは、下面発酵酵母のＬｇ型のＶＩＩ番染色体は、左腕のＫＥＭ１遺伝子のＯＲＦ内でＳｃ型染色体と転座を起こしていることを見いだした。すなわち、本発明者らは、下面発酵酵母中には、ＶＩＩ番染色体左腕のＫＥＭ１遺伝子座から左腕末端にかけてＳｃ型の塩基配列しか存在しないことを見いだした。
【００３７】
本発明者らは、また、下面発酵酵母のＶＩＩ番染色体左腕の染色体転座位置に基づいて、サッカロミセス・パストリアヌス検出用ＰＣＲ法プライマーセットを設計し、そのプライマーセットによってサッカロミセス・パストリアヌスを正確に検出できることを見いだした。
【００３８】
すなわち、本発明の第四の態様によれば、配列番号２５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドと、配列番号２６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドとを含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＰＣＲ法プライマーセットが提供される。
【００３９】
本発明の第四の態様によれば、第四の態様のＰＣＲ法プライマーセットを用いてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程を含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法が提供される。
【００４０】
本発明によるプライマーセットによれば、サッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確に検出することができる。特に、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応に使用することができ、増幅産物の有無により対象菌種を検出することができる。従って、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットによれば、サッカロミセス属酵母を、菌種レベルで、正確、迅速、かつ簡便に識別することができる。
【００４１】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットによれば、更に、試料中の菌体数を測定することができる。従って、本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットによれば、サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシエ、およびサッカロミセス・バヤヌスを、正確に定量することができる。
【００４２】
サッカロミセス属酵母は、酒類および清涼飲料などの各種飲料を混濁させる原因菌であり、これらの菌の存在・不存在は各種飲料の品質管理の指標となりうる。従って、本発明によるプライマーセットは、各種飲料（例えば、酒類および清涼飲料、特に、ビール、発泡酒、ワイン）の品質管理や環境試料の検査に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】サッカロミセス・パストリアヌス検出用プライマーセット（ＬＧＭ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシエＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシエ・ディアスタティカスＤＳＭ７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【図２】サッカロミセス・パストリアヌスのコロニー形成数とＬＧＭ１ＬＢ１によるＬＡＭＰ法検出時間の近似曲線を示した図である。横軸の検出時間（Threshold time）は、濁度が０．１を超えたときの反応時間を示す。
【図３】サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシエＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシエ・ディアスタティカスDSM７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【図４】下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）の検出対象菌種への反応特異性を示した図である。使用菌株は次の通りである。サッカロミセス・セレビシエＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１１０２２、サッカロミセス・パストリアヌスＮＢＲＣ１１０２４、ＮＢＲＣ１１０２３、ＮＢＲＣ１０６１０、サッカロミセス・セレビシエ・ディアスタティカスDSM７０４８７、サッカロミセス・パラドクサスＮＢＲＣ１０６０９、サッカロミセス・カリオカヌスＮＢＲＣ１０９４７、サッカロミセス・ミカタエＮＢＲＣ１８１５、サッカロミセス・クドリアヴゼヴィＮＢＲＣ１８０２、サッカロミセス・エクシグスＮＢＲＣ１１２８、サッカロミセス・セルバジーＮＢＲＣ１８３８、サッカロミセス・ウニスポラスＮＢＲＣ０３１６、サッカロミセス・ダイレネンシスＮＢＲＣ０２１１、サッカロミセス・クルイベリＮＢＲＣ１６８５、Ｎｅｇａ：ゲノムＤＮＡ無添加。
【発明の具体的説明】
【００４４】
プライマーおよびプライマーセット
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３の４種類のプライマーからなり、これらのプライマーは標的ヌクレオチド配列の６つの領域に対応している。具体的には、標的塩基配列について、３’末端側から５’末端側に向かって順番にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３という領域をそれぞれ規定し、この６領域に対し、４種類のプライマー、すなわちＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰおよびＢ３を作製する。ここで、Ｆ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの各領域に相補的な領域はそれぞれＦ３、Ｆ２、Ｆ１であり、またＢ１、Ｂ２、Ｂ３の各領域に相補的な領域はそれぞれＢ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃである。
【００４５】
ＦＩＰは、標的配列のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＦ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＦＩＰプライマーのＦ１ｃとＦ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００４６】
Ｆ３は、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００４７】
ＢＩＰは、標的配列のＢ２ｃ領域と相補的なＢ２領域を３’末端側にもち、５’末端側に標的遺伝子のＢ１ｃ領域と同じ配列を持つように作製されたプライマーである。必要ならば、ＢＩＰプライマーのＢ１ｃとＢ２の間に制限酵素部位を導入することもできる。
【００４８】
Ｂ３は、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域をもつように作製されたプライマーである。
【００４９】
ＦＩＰおよびＢＩＰプライマーに制限酵素部位が含まれる場合、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応後に増幅産物を制限酵素で処理することによって、電気泳動後に１つのバンドとして観察することができる。この場合、もし標的配列に制限酵素部位があれば、プライマーに人為的に制限酵素部位を導入しなくてもよい。  
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットの実施に当たっては、核酸の増幅反応を加速するためにループプライマー（ＬＦプライマーまたはＬＢプライマー）を１種類あるいは２種類追加してもよい。ループプライマーをＦ１−Ｆ２間の領域、あるいはＢ１−Ｂ２間の領域にアニールするように設計し、ＬＡＭＰ法反応系に追加して使用すると、これらのプライマーが核酸増幅工程で利用されていないループ部分に結合することにより、全てのループ部分を起点として核酸反応が進み、核酸増幅反応が加速される（例えば、特開２００２−３４５４９９号公報参照）。
【００５０】
具体的には、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットのうち、配列番号１〜４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはそれらの相同ポリヌクレオチドからなるＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００５１】
第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＦ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドのいずれか一方あるいは両方を、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００５２】
第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、更に含んでいてもよい。
【００５３】
本発明では、配列番号１〜５および７〜３０の塩基配列で表されるポリヌクレオチドのみならず、配列番号１〜５および７〜３０の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（本明細書において「相同ポリヌクレオチド」と言うことがある）も、プライマーやプローブとして用いることができる。
【００５４】
本発明では、また、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを、ＬＡＭＰ法プライマー、ＰＣＲ法プライマー、およびプローブとして使用できる。
【００５５】
本明細書において「ハイブリダイズする」とは、標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドには、実質的にはハイブリダイズしないことを意味する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施することができる。ここで「ストリンジェントな条件」は、プライマー配列とその相補鎖との二重鎖のＴｍ（℃）および必要な塩濃度などに依存して決定でき、プローブとなる配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等参照）。ストリンジェントな条件としては、ハイブリダイゼーションに通常用いられる適切な緩衝液中で、ヌクレオチド配列によって決定されるＴｍよりわずかに低い温度（例えば、Ｔｍよりも０〜約５℃低い温度）においてハイブリダイゼーション反応を実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件としてはまた、ハイブリダイゼーション反応後の洗浄を高濃度低塩濃度溶液で実施することが挙げられる。ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム溶液中で、３７℃（約１４塩基のオリゴヌクレオチドについて）、４８℃（約１７塩基のオリゴヌクレオチドについて）、５５℃（約２０塩基のオリゴヌクレオチドについて）、６０℃（約２３塩基のオリゴヌクレオチドについて）の洗浄条件が挙げられる。
【００５６】
相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、少なくとも１０塩基である。
【００５７】
ＬＡＭＰ法プライマーでは、ＦＩＰおよびＢＩＰの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも３０塩基（例えば、３０〜６０塩基）、より好ましくは少なくとも４２塩基（例えば、４２〜５７塩基）とすることができる。
【００５８】
また、Ｆ３、Ｂ３、ＬＦ、およびＬＢの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１２塩基（例えば、１２〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも１８塩基（例えば、１８〜２５塩基および１８〜３０塩基）とすることができる。
【００５９】
ＰＣＲ法プライマーでは、配列番号２３〜３０の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドのヌクレオチド長は、好ましくは、少なくとも１５塩基（例えば、１５〜３０塩基）、より好ましくは、少なくとも１８塩基（例えば、１８〜２４塩基および１８〜３０塩基）、特に好ましくは、少なくとも２０塩基（例えば、２０〜２５塩基および２０〜３０塩基）とすることができる。
【００６０】
相同ポリヌクレオチドは、それぞれ、対応する塩基配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも１８個、特に好ましくは少なくとも２０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであることができる。
【００６１】
配列番号１〜５および７〜３０の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチドの例を示すと以下の通りである。
【００６２】
・配列番号１の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１の連続する少なくとも４２個（４２〜５２個）、より好ましくは、少なくとも４７個（４７〜５２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）。
【００６３】
・配列番号２の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２の連続する少なくとも１５個（１５〜１９個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜１９個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２１塩基とすることができる）。
【００６４】
・配列番号３の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号３の連続する少なくとも３６個（３６〜４２個）、より好ましくは、少なくとも３８個（３８〜４２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基、より好ましくは最大で４７塩基とすることができる）。
【００６５】
・配列番号４の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号４の連続する少なくとも１９個（１９〜２３個）、より好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００６６】
・配列番号５の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号５の連続する少なくとも１８個（１８〜２２個）、より好ましくは、少なくとも２０個（２０〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００６７】
・配列番号７の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号７の連続する少なくとも３８個（３８〜４７個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基とすることができる）。
【００６８】
・配列番号８の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号８の連続する少なくとも１８個（１８〜２２個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００６９】
・配列番号９の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号９の連続する少なくとも４２個（４２〜５７個）、より好ましくは、少なくとも４７個（４７〜５７個）、特に好ましくは、少なくとも５１個（５１〜５７個）、最も好ましくは、少なくとも５３個（５３〜５７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基とすることができる）。
【００７０】
・配列番号１０の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１０の連続する少なくとも１９個（１９〜２５個）、より好ましくは、少なくとも２２個（２２〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基とすることができる）。
【００７１】
・配列番号１１の塩基配列で表されるＬＦの相同ポリヌクレオチド：配列番号１１の連続する少なくとも１９個（１９〜２５個）、より好ましくは、少なくとも２２個（２２〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基とすることができる）。
【００７２】
・配列番号１２の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号１２の連続する少なくとも１９個（１９〜２５個）、より好ましくは、少なくとも２２個（２２〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基とすることができる）。
【００７３】
・配列番号１３の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１２の連続する少なくとも４２個（４２〜５３個）、より好ましくは、少なくとも４８個（４８〜５３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）。
【００７４】
・配列番号１４の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１３の連続する少なくとも１８個（１８〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００７５】
・配列番号１５の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１４の連続する少なくとも３７個（３７〜４４個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基、より好ましくは最大で４７塩基とすることができる）。
【００７６】
・配列番号１６の塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１５の連続する少なくとも１９個（１９〜２５個）、より好ましくは、少なくとも２２個（２２〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基とすることができる）。
【００７７】
・配列番号１７の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号１６の連続する少なくとも１４個（１４〜１８個）、より好ましくは、少なくとも１６個（１６〜１８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）。
【００７８】
・配列番号１８の塩基配列で表されるＦＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号１８の連続する少なくとも３８個（３８〜４７個）、より好ましくは、少なくとも４２個（４２〜４７個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基とすることができる）。
【００７９】
・配列番号１９の塩基配列で表されるＦ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号１９の連続する少なくとも１８個（１８〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）。
【００８０】
・配列番号２０の塩基配列で表されるＢＩＰの相同ポリヌクレオチド：配列番号２０の連続する少なくとも３６個（３６〜４２個）、より好ましくは、少なくとも３８個（３８〜４２個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５３塩基、より好ましくは最大で４７塩基とすることができる）。
【００８１】
・配列番号２１塩基配列で表されるＢ３の相同ポリヌクレオチド：配列番号２１の連続する少なくとも１８個（１８〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）。
【００８２】
・配列番号２２の塩基配列で表されるＬＢの相同ポリヌクレオチド：配列番号２２の連続する少なくとも１８個（１８〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２２塩基とすることができる）。
【００８３】
・配列番号２３の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１７の連続する少なくとも１９個（１９〜２３個）、より好ましくは、少なくとも２１個（２１〜２３個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００８４】
・配列番号２４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１８の連続する少なくとも２０個（２０〜２４個）、より好ましくは、少なくとも２２個（２２〜２４個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００８５】
・配列番号２５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号１９の連続する少なくとも１８個（１８〜２１個）、より好ましくは、少なくとも１９個（１９〜２１個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）。
【００８６】
・配列番号２６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２０の連続する少なくとも１４個（１４〜１８個）、より好ましくは、少なくとも１６個（１６〜１８個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００８７】
・配列番号２７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２１の連続する少なくとも１６個（１６〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００８８】
・配列番号２８の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２２の連続する少なくとも１６個（１６〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００８９】
・配列番号２９の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２３の連続する少なくとも１６個（１６〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００９０】
・配列番号３０の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの相同ポリヌクレオチド：配列番号２４の連続する少なくとも１６個（１６〜２０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（１８〜２０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２３塩基とすることができる）。
【００９１】
本発明では、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドは、それぞれ、配列番号６の塩基配列の相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド、および配列番号６の塩基配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドとすることができる。
【００９２】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（ＦＩＰおよびＢＩＰ）として用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも４２個（例えば、４２〜５７塩基）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で６０塩基、好ましくは最大で５７塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００９３】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＬＡＭＰ法プライマー（Ｆ３、Ｂ３、ＬＢ、およびＬＦ）として用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１８個（例えば、１８〜２５個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００９４】
配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドをＰＣＲ法プライマーとして用いる場合には、配列番号６の塩基配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個（例えば、１５〜３０個）、より好ましくは、少なくとも１８個（例えば、１８〜２４個および１８〜３０個）、特に好ましくは、少なくとも２０個（例えば、２０〜２５個および２０〜３０個）のヌクレオチド（１または数個の変異が導入されていてもよい）を含んでなるポリヌクレオチド（ヌクレオチド長は最大で３０塩基、好ましくは最大で２５塩基、より好ましくは最大で２４塩基とすることができる）をプライマーとして使用できる。
【００９５】
本発明においては、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、サッカロミセス・パストリアヌスを検出するためのＰＣＲ法プライマーペアを選択することができる。具体的には、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方が配列番号６の塩基配列に対合し、他方のプライマーが配列番号６の塩基配列の相補配列に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。
【００９６】
本発明においては、また、配列番号６の塩基配列で表されるポリヌクレオチドに基づいて、サッカロミセス・パストリアヌスを検出するためのＬＡＭＰ法プライマーセットを選択することができる。具体的には、ＬＡＭＰ法の実施に必要な４種類のプライマー、すなわち、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３を、前述のように設計し、必要に応じてループプライマー、すなわち、ＬＦおよびＬＢを使用することもできる。
【００９７】
相同ポリヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドは、また、それぞれ、対応する塩基配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリヌクレオチドであることができる。同一性の数値は、当業界において周知のアルゴリズムに従って算出することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-j.html）を使用して同一性の数値を算出することができる。
【００９８】
相同ポリヌクレオチドおよび配列番号６の塩基配列に基づいて作製されたポリヌクレオチドは、更に、対応するの塩基配列に１または数個の変異が導入された改変塩基配列からなり、かつ対応するの塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドであることができる。
【００９９】
ここで「変異」は、同一または異なっていてもよく、置換、欠失、挿入、および付加から選択でき、好ましくは、ある１個の塩基を他の１個の塩基に置換する「一塩基置換」、ある１個の塩基を欠失させる「一塩基欠失」、ある１個の塩基を挿入する「１塩基挿入」、およびある１個の塩基を付加する「一塩基付加」から選択できる。また、変異の個数は、１〜６個、１、２、３、または４個、１または２個、あるいは１個とすることができる。
【０１００】
本発明において「ポリヌクレオチド」とはＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ（peptide nucleic acid）を含む意味で用いられる。
【０１０１】
本発明によるプライマーセット等を構成するポリヌクレオチドは、例えばホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310,105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製してもよいし、検出対象の菌株の全ＤＮＡを取得し、本明細書に開示されるヌクレオチド配列に基づいて目的のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法等で適宜取得してもよい。
【０１０２】
本発明による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。より具体的には、以下の通りである。
【０１０３】
本発明による第一の態様によれば、
（ａ）本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｂ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス・パストリアヌスの存在を示す、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法が提供される。
【０１０４】
本発明による第二の態様によれば、
（ｃ）本発明による第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｄ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス・セレビシエの存在を示す、サッカロミセス・セレビシエの検出方法が提供される。
【０１０５】
本発明による第三の態様によれば、
（ｅ）本発明による第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｆ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス・バヤヌスの存在を示す、サッカロミセス・バヤヌスの検出方法が提供される。
【０１０６】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【０１０７】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応については後述する。
【０１０８】
試料中に検出対象菌種が存在する場合には、標的とする特定の領域が増幅され、増幅産物が生成する。増幅産物が生成した場合には、核酸増幅反応が実施された試料溶液が白濁することから、試料溶液の濁度を測定することにより増幅産物の有無を決定することができる。ＬＡＭＰ法における濁度の測定は周知であり、市販のエンドポイント濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−１００）やリアルタイム濁度測定装置（例えば、テラメックス社製ＬＡ−２００）を用いて濁度の測定をすることができる。
【０１０９】
後記実施例で示すように、試料溶液がある一定の濁度に達するまでの時間を測定することにより、検定試料中の菌体数を決定することができる。すなわち、本発明による検出方法の別の面によれば、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施するとともに、核酸増幅反応の開始から試料がある一定の濁度に達するまでの時間を測定し、その時間から検体中の菌体数を求める工程を含む、サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシエ、およびサッカロミセス・バヤヌスの定量方法が提供される。具体的には、以下の通りである。
【０１１０】
本発明による第一の態様によれば、
（ａ）本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｂ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｂ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの定量方法が提供される。
【０１１１】
本発明による第二の態様によれば、
（ｃ）本発明による第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｄ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｄ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、サッカロミセス・セレビシエの定量方法が提供される。
【０１１２】
本発明による第三の態様によれば、
（ｅ）本発明による第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程；
（ｆ’）核酸増幅反応の開始から一定の濁度に達するまでの時間を測定する工程；および
（ｆ”）測定した時間から検体中の菌体数を求める工程
を含んでなる、サッカロミセス・バヤヌスの定量方法が提供される。
【０１１３】
本発明による定量方法においては、菌体数と一定の濁度に達するまでの時間との検量線を予め作成しておき、この検量線に基づいて、測定した時間から検体中の菌体数を求めることができる。検量線は、例えば、菌体を段階的に希釈した試料を準備し、それぞれについてＬＡＭＰ法による核酸増幅法を実施し、菌体のコロニー形成数の対数に対して、核酸増幅反応の開始から濁度が０．１になるまでの時間をプロットすることにより作成することができる。
【０１１４】
本発明による検出方法および定量方法においては、ＦＩＰ、Ｆ３、ＢＩＰ、およびＢ３からなるプライマーセットに、ループプライマー（ＬＦおよび／またはＬＢ）を追加して、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施してもよい。具体的には、本発明による第一の態様の検出方法および定量方法のうち、配列番号１〜４の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはそれらの相同ポリヌクレオチドからなるＬＡＭＰ法プライマーセットにおいては、配列番号５の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。本発明による第二の態様の検出方法および定量方法においては、配列番号１１の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドおよび配列番号１２の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドのいずれか一方あるいは両方を、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。本発明による第三の態様の検出方法および定量方法においては、配列番号１７の塩基配列で表されるポリヌクレオチドまたはその相同ポリヌクレオチドを、ループプライマーとして、追加し、使用してもよい。
【０１１５】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、それぞれ単独で使用しても、適宜組み合わせて使用してもよい。本発明によるプライマーセットを組み合わせて実施することにより、サッカロミセス・パストリアヌスと、サッカロミセス・セレビシエと、サッカロミセス・バヤヌスとをより正確に区別して検出することが可能となる。
【０１１６】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、また、単独で、あるいは組み合わせて、キットの形態で提供することができる。従って、本発明によれば、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；およびこれらの一部または全部の組み合わせからなる群から選択されるプライマーセット含んでなる、サッカロミセス属酵母の検出キットが提供される。
【０１１７】
ＬＡＭＰ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、反応用試薬混合液）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【０１１８】
ＰＣＲ法プライマーセットを含む本発明によるキットは、ＰＣＲ法による核酸増幅反応の実施に必要な試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、精製水）や器具（例えば、反応用チューブ）を含んでいてもよい。
【０１１９】
本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、Ｌｇ型ＭＥＴ１６遺伝子を標的にしており、ゲノム構造的に均一ではないサッカロミセス・バヤヌスと反応する可能性がある。一方、本発明による第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットは、サッカロミセス・セレビシエやサッカロミセス・パストリアヌスには存在しない、サッカロミセス・バヤヌスのＲＡＤ１８相同遺伝子を標的にしており、サッカロミセス・バヤヌスを高い精度で検出することができる。従って、サッカロミセス・パストリアヌスをより正確に検出したい場合には、本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットと、サッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセット（好ましくは、第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット）とを組み合わせて使用することが好ましい。この場合、本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットと、サッカロミセス・バヤヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットとの両方で増幅反応が認められた場合、あるいは第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットに増幅反応が認められず、サッカロミセス・バヤヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットに増幅反応が認められた場合には、試料中にサッカロミセス・バヤヌスが存在すると判断することができる。本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットに増幅反応が認められ、サッカロミセス・バヤヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットに増幅反応が認められなかった場合には、試料中にサッカロミセス・パストリアヌスが存在すると判断することができる。
【０１２０】
従って、本発明によれば、本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットと、サッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出用キットが提供される。
【０１２１】
本発明によればまた、本発明による第一の態様のサッカロミセス・パストリアヌスの検出方法において、サッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を更に含んでいてもよい。この工程は、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施する工程と、核酸増幅産物の有無を検出する工程と有していてもよい。
【０１２２】
上記において、サッカロミセス・バヤヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットは、好ましくは、本発明による第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットである。
【０１２３】
本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてサッカロミセス・パストリアヌスを正確に検出した場合には、また、本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットを、サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスを検出できるＬＡＭＰ法プライマーセットと組み合わせて使用することが好ましい。本発明による第一の態様のサッカロミセス・パストリアヌス用ＬＡＭＰ法プライマーは、ゲノム構造が均一でないサッカロミセス・バヤヌスと交差反応することがある。サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットは、サッカロミセス・パストリアヌスに含まれるサッカロミセス・セレビシエのゲノム配列と反応するが、サッカロミセス・バヤヌスはこのサッカロミセス・セレビシエのゲノム配列を持たないため、サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットはサッカロミセス・バヤヌスとは反応しない。この場合、本発明によるサッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットと、サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットとの両方で増幅反応が認められた場合には、試料中にサッカロミセス・パストリアヌスが存在すると判断することができる。本発明によるサッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーで増幅反応が起こり、サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌス検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットで増幅反応が認められない場合には、試料中にサッカロミセス・バヤヌスが存在すると判断することができる。
【０１２４】
従って、本発明によれば、本発明による第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットと、サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットとを組み合わせて含んでなる、サッカロミセス・パストリアヌスの検出用キットが提供される。
【０１２５】
本発明によればまた、本発明による第一の態様のサッカロミセス・パストリアヌスの検出方法において、サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットを用いてＬＡＭＰ法により核酸増幅反応を実施する工程を更に含んでいてもよい。この工程は、核酸試料に対してＬＡＭＰ法による核酸増幅反応を実施する工程と、核酸増幅産物の有無を検出する工程と有していてもよい。
【０１２６】
上記において、サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出に用いられるＬＡＭＰ法プライマーセットは、好ましくは、下記ポリヌクレオチドを含んでなるＬＡＭＰ法プライマーセットである。
配列番号１８の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＦＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号１９の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｆ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；
配列番号２０の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＢＩＰ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド；および
配列番号２１の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（Ｂ３）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチド。
【０１２７】
上記のサッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌスの検出用ＬＡＭＰ法プライマーセットは、ループプライマーとして、配列番号２２の塩基配列で表されるポリヌクレオチド（ＬＢ）またはその塩基配列の相補配列で表されるポリヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１０塩基のポリヌクレオチドを更に含んでいてもよい。
【０１２８】
本発明による検出方法のうちＰＣＲ法による検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対してＰＣＲ法による核酸増幅反応を実施した後、核酸増幅産物の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【０１２９】
より具体的には、
（ｇ）本発明による第一の態様、第三の態様、または第四の態様のＰＣＲ法プライマーセットを用いて、試料中の核酸についてＰＣＲ法により核酸増幅反応を実施する工程；および
（ｈ）増幅産物の有無を検出する工程
を含んでなり、増幅産物の生成がサッカロミセス・パストリアヌスの存在を示す、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法が提供される。
【０１３０】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程に供される試料は、試料中の菌体を培養してから核酸を抽出しても、培養せずに核酸を抽出してもよい。菌体の培養や核酸の抽出など核酸試料の調製については後述する。
【０１３１】
ＰＣＲ法による核酸増幅工程では、試料中の核酸に対して増幅反応が実施される。ＰＣＲ法による核酸増幅反応は周知であり、当業者であればＰＣＲ法およびその改変方法の実施条件等を適宜設定し、ＰＣＲ法を実施することができる。
【０１３２】
本発明による検出方法のうちプローブによる検出方法の具体的な態様としては、核酸試料に対する本発明によるプローブのハイブリダイゼーションを実施した後、核酸複合体の有無を検出する工程を含む検出方法が挙げられる。
【０１３３】
より具体的には、
（ｉ）本発明による第一の態様のプローブと、試料中の核酸とを接触させる工程；および
（ｊ）ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する工程
を含んでなり、ハイブリダイゼーション複合体の生成がサッカロミセス・パストリアヌスの存在を示す、サッカロミセス・パストリアヌスの検出方法が提供される。
【０１３４】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射性元素（例えば、３２Ｐおよび１４Ｃ）、蛍光化合物（例えば、ＦＩＴＣ）、酵素反応に関与する分子（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。
【０１３５】
ハイブリダイゼーション複合体の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。
【０１３６】
本発明によるプライマーセットを用いて核酸増幅反応を実施すると、酒類や清涼飲料の品質低下の原因となるサッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確に識別することができる。従って、本発明によるプライマーセットおよびキットは、酒類（例えば、ビール、発泡酒、ワイン、果実酒、日本酒）および／または清涼飲料（例えば、果汁飲料）の品質管理や、環境試料（例えば、原料用水）の検査に用いることができる。
【０１３７】
サッカロミセス・パストリアヌス、サッカロミセス・セレビシエ、およびサッカロミセス・バヤヌスは、ビールおよび発泡酒の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、第一の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセット；第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセットおよびＰＣＲ法プライマーセット；第四の態様のＰＣＲ法プライマーセット；並びにこれらの一部または全部の組み合わせは、好ましくは、ビールおよび発泡酒の品質管理に用いることができる。
【０１３８】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・バヤヌスは、ワインの製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；およびこれらの組み合わせは、好ましくは、ワインの品質管理に用いることができる。
【０１３９】
サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・バヤヌスは、清涼飲料（特に、果汁飲料）の製造工程あるいは最終製品に、品質劣化の原因酵母種として見いだされることがある。従って、第二の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；第三の態様のＬＡＭＰ法プライマーセット；およびこれらの組み合わせは、好ましくは、清涼飲料（特に、果汁飲料）の品質管理に用いることができる。
【０１４０】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応のプライマーとして用いることができる。本発明によるプライマーセットはまた、ＬＡＭＰ法のみならず、ＬＡＭＰ法を改良した核酸増幅反応のプライマーとしても用いることができる。
ＬＡＭＰ法の原理およびそれを利用した核酸増幅方法は周知であり、ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の実施に当たっては、例えば、ＷＯ００／２８０８２号公報やNotomi T. et al., Nucleic Acids Research, 28(12),e63(2000)の開示を参照することができる。
【０１４１】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キットに従って実施することができるが、例えば、サンプルのＤＮＡ、プライマー溶液、および市販のＬＡＭＰ法遺伝子増幅試薬キット（例えば、栄研化学社製Loopamp ＤＮＡ増幅キット）で提供される試薬を、キットに添付されている説明書に従って混合して一定温度（６０〜６５℃）に保ち、一定時間（標準で１時間）反応させることにより実施できる。
【０１４２】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、以下のような工程を経て実施することができる。
（ｉ）鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きにより、ＦＩＰのＦ２領域の３’末端を起点として鋳型ＤＮＡと相補的なＤＮＡ鎖が合成される。
（ii）ＦＩＰの外側に、Ｆ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されているＦＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（iii）Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となる。
（iv）ＦＩＰから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからのＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は、５’末端側に相補的な領域Ｆ１ｃ、Ｆ１をもち、自己アニールを起こし、ループを形成する。
（ｖ）上記（iv）の過程でループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰがアニールし、このＢＩＰの３’末端を起点として相補的なＤＮＡが合成される。この過程でループが剥がされて伸びる。さらに、ＢＩＰの外側にＢ３プライマーがアニールし、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによって、先に合成されたＢＩＰからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ合成が伸長する。
（vi）上記（ｖ）の過程で二本鎖ＤＮＡが形成される。
（vii）上記（ｖ）の過程で剥がされたＢＩＰから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニールし、ループを形成してダンベル様の構造となる。
（viii）上記ダンベル構造のＤＮＡ鎖を起点として、ＦＩＰ次いでＢＩＰのアニ−リングを介して所望ＤＮＡの増幅サイクルが行われる。
【０１４３】
ＬＡＭＰ法による核酸増幅反応は、上記の工程を適宜改変して実施できることは当業者に自明であろう。本発明によるプライマーセットはそのような改変された方法にも用いることができる。
【０１４４】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットは、約６０〜約６５℃（例えば６５℃）においてアニーリングと同時にＤＮＡ鎖の合成も起こす。アニ−リング反応およびＤＮＡ鎖合成により約１時間反応を行うことにより１０９〜１０１０倍に核酸を増幅させることができる。
【０１４５】
本発明によるＬＡＭＰ法プライマーセットをＬＡＭＰ法による核酸増幅反応の条件の下で試料核酸と反応させると、検出対象の菌株のターゲット領域が増幅される。このような増幅反応が起こると、副産物として形成されるピロリン酸マグネシウムの影響で反応液が白濁するため、この濁度に基づき増幅の有無が目視により判定できる。増幅の有無は、濁度測定装置を用いて濁度を光学的に測定してもよく、また、アガロースゲル電気泳動法などを利用してＤＮＡ断片の有無を確認し検出してもよい。
【０１４６】
核酸増幅が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【０１４７】
ＰＣＲ法による核酸増幅反応
本発明によるＰＣＲ法プライマーセットは、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ等の核酸増幅法を利用して、サッカロミセス属酵母の識別に用いることができる。
【０１４８】
核酸増幅物が観察されるならば、標的塩基配列が存在することを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陽性（＋）を表す。逆に、核酸増幅が観察されない場合には、標的塩基配列が不存在であることを意味し、プライマーセットの検出対象である菌種陰性（−）を表す。
【０１４９】
ＰＣＲ法では、アガロースゲル電気泳動など周知の方法に従って核酸増幅物を検出することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法では、インターカレーターや蛍光標識プローブを使用し、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計とが一体化された装置において、核酸増幅物を経時的に検出することができる。
【０１５０】
検出対象試料とその調製
本発明によるプライマーセットおよびキットの検出の対象となる試料としては、ビール、発泡酒、ワインなどの酒類；サイダー、ラムネ、炭酸水などの清涼飲料；原料用に採取された水等の環境試料；酒類や清涼飲料等の製造工程から採取された半製品などが挙げられる。
【０１５１】
これらをＬＡＭＰ法やＰＣＲ法の試料として用いる場合には、試料中に存在する菌の濃縮、分離、および培養、菌体からの核酸分離、核酸の濃縮などの操作を前処理として実施してもよい。試料中に存在する菌の濃縮や分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが挙げられ、適宜選択できる。また試料から濃縮、分離した菌を、さらに培養して菌数を増やしてもよい。培養には、対象とする酵母株の増殖に適切な寒天固体培地や液体培地を用いることができ、また対象とする酵母菌株を選択するために硫酸銅などの薬剤を添加してもよい。飲料試料や環境試料などに存在する菌体、あるいは培養した菌体から核酸を遊離させるためには、例えば、市販のキットを使用する方法や、アルカリ溶液などによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法を選択することができる。また、核酸を更に精製する必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（European Brewery Convention:ANALYTICA - MICROBIOLOGICA - EBC, 2nd ed. 2005 Fachverlag Hans Carl, Nuernberg、Rolfsら:PCR - Clinical diagnostics and research, Springer-Verlag, Berlin, 1992、大嶋泰治ら：蛋白  核酸  酵素， vol. 35, 2523-2541, 1990）。
【０１５２】
本発明によるプライマーセットおよびキットを用いたサッカロミセス属酵母の検出は、例えば、以下のように実施することができる。
【０１５３】
まず、試料中に存在すると考えられるサッカロミセス属酵母を適切な培地で増菌培養する。次いで、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡを分離し、このＤＮＡに対して本発明によるプライマーセットを用いたＬＡＭＰ法またはＰＣＲ法を実施し、サッカロミセス属酵母の特定遺伝子領域を増幅する。遺伝子増幅産物の存在は、プライマーセットが標的とする菌種の存在を示す。
【実施例】
【０１５４】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１５５】
実施例１：サッカロミセス属酵母の検出
（ａ）ゲノムＤＮＡ抽出法
寒天平板培地上で培養した菌体をかき取り、滅菌蒸留水に懸濁した。この懸濁液を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを捨てた。沈殿した菌体に再度滅菌蒸留水を添加、懸濁し、遠心分離した。上澄みを捨て、得られた菌体にＰｒｅｐＭａｎ  Ｕｌｔｒａ（アプライドバイオシステムズ社製）の溶液１００μｌを添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１５０００ｒｐｍ、１分間遠心分離し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。あるいは洗浄した菌体に０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液を１００μｌ添加し、９５℃、１０分間加熱した。その後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて中和し、上澄みをゲノムＤＮＡ溶液として使用した。【０１５６】
（ｂ）ＬＡＭＰ用プライマー
以下のサッカロミセス属酵母各菌種用プライマーを、富士通システムソリューションズ社のeGenome Order（http://genome.e-mp.jp/index.html）、あるいはそれと同等の方法で化学合成し、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）で１００μＭの濃度になるように溶解した。これらの溶液を、ＦＩＰ、ＢＩＰプライマー：１６μＭ、Ｆ３、Ｂ３プライマー：２μＭ、ＬＦ、ＬＢプライマー：８μＭとなるように混合し、希釈した。
［下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＬＧＭ１ＬＢ１）］ 
FIP：  CCTTCAGTGTTAAAGTCTGTGGGAAATGACTATCCGGGAAATACTATATGCC （配列番号１） 
F3：   TCACCATCGACATGCTGTC （配列番号２） 
BIP：  TCAGCCCCAGAAGCAAACTATCCAAATTCCGCCTCTGAGACG （配列番号３） 
B3：   CCATAGGAAATCACCGTACTTCG （配列番号４） 
LB：   ATGTTTATAAGCCAGATGGATG （配列番号５）  
［サッカロミセス・セレビシエ検出用プライマーセット（ＳＣＭ１ＬＦ２ＬＢ１）］ 
FIP：  GGCAGAACCTTGTGATTTTCTTCTACCAAAGTGGAACCTGCACATCG （配列番号７） 
F3：   TGACAAGTACGATTATCTGGCC （配列番号８） 
BIP：  ACTGTCGATTATTGAAATAGACGAACTTAATGGAATACTGTTTAACCTGCTCGAACG （配列番号９） B3：   GTTGTATGGTACATTGTTTGCATCT （配列番号１０） 
LF：   CACTTATATGTAGCTCTTTGTAGGC （配列番号１１）  
LB：   AAAAATAAATCCATTGATCAATTGG （配列番号１２）
［サッカロミセス・バヤヌス検出用プライマーセット（ＳＢＲ２ＬＢ１）］
FIP：  TCCCTCATTACCATCTTCATGAATATGCAACTGAAAATAAAAACCAGTTCGCC （配列番号１３）
F3：   CCAGGCTCATAAAGGAAGCAA （配列番号１４）
BIP：  CCGCAAGGTGTTCAAGAAACCTTCACCTCTTGTTCTTCTGTGAG （配列番号１５）
B3：   CTGCATCTGTTAAATCTTCATTTGG （配列番号１６）
LB：   CAAATGGAGGAGGGGCAA （配列番号１７）
［サッカロミセス・セレビシエおよびサッカロミセス・パストリアヌス検出用プライマーセット（ＳＣＣ１ＬＢ１）］
FIP：  CCTCTTCCAGTTCTTGACTCTTTTCCTAAGATGAAAGTGCCGGGAGA （配列番号１８） 
F3：   ACGAAGATGAGAAAGAGGCG （配列番号１９） 
BIP：  TGACAGCAAGGAGAAGAGCACCCCTCGTTGTTTTCCTCCTCA （配列番号２０） 
B3：   GTGCTGTATGCTCGTTTTCG （配列番号２１） 
LB：   GAGCAAGGGGACGAAGGTGA （配列番号２２）【０１５７】
（ｃ）ＬＡＭＰ増幅反応溶液調製
ＬＡＭＰ法のための遺伝子増幅試薬キットとして、栄研化学社製Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅キットを使用した。反応用チューブに、ゲノムＤＮＡ溶液：２．５μｌ、プライマー溶液：２．５μｌ、２倍濃度反応用緩衝液：１２．５μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ：１μｌ、滅菌水：６．５μｌを添加し、全量２５μｌの反応液を調製した。【０１５８】
（ｄ）ＬＡＭＰ反応
ＬＡＭＰ反応には、テラメックス社製リアルタイム濁度計ＬＡ−２００、あるいは栄研化学社製ＬＡ−３２０Ｃを使用した。反応チューブをセットし、６５℃一定（ボンネットは７５℃）で反応させ、その間の濁度変化を６秒毎に計測した。濁度が上昇するものを陽性、濁度の上昇が認められないものを陰性とした。【０１５９】
（ｅ）各菌種用プライマーの特異性評価
下面発酵酵母、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・バヤヌスに対して作成したそれぞれの菌種特異的なプライマーについてSaccharomyces sensu strictoの各菌種を含むサッカロミセス属酵母標準株を使ってＬＡＭＰ法で特異性を評価した。その結果、ＬＧＭ１ＬＢ１を用いた場合はサッカロミセス・パストリアヌス（下面発酵酵母）に、ＳＣＭ１ＬＦ２ＬＢ１を用いた場合はサッカロミセス・セレビシエとサッカロミセス・セレビシエ・ディアスタティカス（Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus）に、ＳＢＲ２ＬＢ１を用いた場合はサッカロミセス・バヤヌスに、ＳＣＣ１ＬＢ１を用いた場合にサッカロミセス・セレビシエとサッカロミセス・パストリアヌス（下面発酵酵母）に、反応開始６０分以内にＤＮＡ増幅に伴う濁度の上昇が見られた（表１）。また、プライマーが検出対象にしている菌株と反応させた場合に、反応開始から６０分以内に増幅が起こり、反応チューブ内の濁度が上昇した（図１）。【０１６０】
表１：各種サッカロミセス属酵母標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし、nt：not tested）
【表１】
2008044358.tif 000002
【０１６１】
さらに、ＬＧＭ１ＬＢ１、ＳＣＭ１ＬＦ２ＬＢ１、ＳＢＲ２ＬＢ１について各種酵母標準株、ビール醸造用酵母、ビール工場分離野生酵母、ワイン分離野生酵母株を使用して各プライマーの特異性を評価したところ、各プライマーが検査対象にしている株以外からはほとんど増幅が見られなかった（表２、表３、および表４）。【０１６２】
表２：各種酵母標準株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし
【表２】
2008044358.tif 000003
【０１６３】
表３：各種ビール醸造用酵母、ビール醸造所分離野生酵母株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表３】
2008044358.tif 000004
【０１６４】
表４：各種ワイン分離野生酵母株を使ったプライマーの評価（マス内の数字：増幅が起こるまでの反応時間、−：反応８０分以内に増幅なし）
【表４】
2008044358.tif 000005
【０１６５】
以上により、サッカロミセス属酵母各菌種に対して作成した本発明によるプライマーセットは、検査対象とするサッカロミセス属酵母を菌種レベルで正確に検出できることが示された。従来の報告では共通プライマーを用いて酵母から遺伝子断片を増幅し、その後塩基配列の違いを制限酵素切断パターンやＤＧＧＥ等で解析することが多かったが、本発明によるプライマーを用いれば、遺伝子増幅の有無を確認するだけでこれら３種のサッカロミセス属酵母が同定・検出できる。【０１６６】
実施例２：ＬＡＭＰ法の検出限界
ＬＡＭＰ法の増幅効率を検討するために、寒天平板培地で培養した下面発酵酵母（ＢＦＹ７０、サッカロミセス・パストリアヌス）、サッカロミセス・セレビシエＮＢＲＣ１０２１７、サッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１９４８の菌体を滅菌水で段階的に希釈して上記した方法でＤＮＡ抽出し、これをＬＡＭＰ法に供した。その結果、ＬＡＭＰ法では１０２〜１０３ｃｆｕレベルの少ない菌体量からも増幅が観察された。
また、菌体の各段階の希釈液から抽出したゲノムＤＮＡを使ったときにＬＡＭＰ反応で濁度が０．１を越えた時間を検出時間として、各プライマーの検出時間とコロニー形成数の対数をグラフにしたところ、累乗近似により高い相関係数の近似曲線を描くことが出来た（Ｒ２＝０．９８−０．９９）。ＬＧＭ１ＬＢ１について得られた近似曲線は図２に示される通りである。また、各プライマーの検出限界と検量線の相関係数との関係は下記に示される通りである。これを検量線とすることにより、１０２〜１０７ｃｆｕあるいは１０３〜１０７ｃｆｕの範囲で、サンプル中のサッカロミセス属酵母の存在を定量的にある程度推測することが可能であることが示された。
［各プライマーの検出限界と検量線の相関係数］
検出限界        検量線近似式      検量線相関係数(R2)
LGM1LB1        5.2 x 102 cfu   y = 28179x-2.4039          0.992
SCM1LF2LB1     4.4 x 103 cfu   y = 6875x-1.8959           0.981
SBR2LB1        1.9 x 102 cfu   y = 1431.3x-1.8361         0.982【０１６７】
実施例３：ワインおよびビールからの検出
ワイン製造では、通常、果汁にワイン酵母であるサッカロミセス属酵母を多量に添加して発酵させるが、外部から汚染する酵母の菌数はサッカロミセス属酵母に比べると圧倒的に少ない。そこでワインに多量のサッカロミセス・セレビシエを懸濁し、そこへワインで希釈して作成したサッカロミセス・バヤヌスＮＢＲＣ１９４８の菌体希釈液を混合して集菌洗浄後、まとめてＤＮＡ抽出し、プライマーセットとしてＳＢＲ２ＬＢ１を使用してＬＡＭＰ法を実施し、サッカロミセス・バヤヌスが検出可能かどうか検討した。その結果、ワインによる反応阻害およびサッカロミセス・セレビシエの存在に関係なく、滅菌水に懸濁した場合とほとんど同じ検出限界でサッカロミセス・バヤヌスが検出出来ることがわかった。また、ビールに下面発酵酵母を懸濁して、サッカロミセス・バヤヌスの菌体希釈液を混合した場合でも同じ結果が得られた。
サッカロミセス・バヤヌスの検出限界
ワイン＋サッカロミセス・セレビシエ（5 x 107 cells）   3.9 x 102 cfu
ビール＋下面発酵酵母（1 x 107 cells）                 3.2 x 102 cfu【０１６８】
実施例４：特許文献にあるプライマーの評価
（ａ）特許文献のプライマー
土屋らの特許文献（ＷＯ２００５／０９３０５９号公報）に記載されていた以下のサッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）および下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）を、実施例１（ｂ）と同様にＬＡＭＰ法用プライマー溶液を調製した。サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）はｒＲＮＡ遺伝子のＤ２領域を、下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）はメリビアーゼ遺伝子を標的としている。
［サッカロミセス属検出用プライマーセット（ＳＳＣ１ＬＢ１）］
FIP：  TGCGAGATTCCCCTACCCCAGACATGGTGTTTTGTGCC（配列番号３１）
F3：   AGACCGATAGCGAACAAGTA （配列番号３２）
BIP：  CTGTGGGAATACTGCCAGCTGGCCGTGTTTCAAGACGGGCGG（配列番号３３）
B3：   CTTGGTCCGTGTTTCAAGAC（配列番号３４）
LB：   CAAGGATGCTGGCATAATGGTT （配列番号３５）
［下面発酵酵母検出用プライマーセット（ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１）］
FIP：  GCAATTGCTCACTGACGTCGCACACCCCTCAAATGGGTTGG （配列番号３６）
F3：   CCGAGTTACAATGGCCTTGG（配列番号３７）
BIP：  ACCGCTGACCGGATTTCTGAAAACTAGACCAGCAGTCATCCA（配列番号３８）
B3：   CCTTGTCTGCAACGAGTGT （配列番号３９）
LF：   GGCAAATGTGTTCCAATTGTC （配列番号４０）
LB：   GGACTAAAGGATTTGGGTTACAC（配列番号４１）【０１６９】
実施例１（ｃ）および（ｄ）の記載に従って、上記プライマーセットを用いて、ＬＡＭＰ法により各種菌株の検出を行った。結果は図３および図４に示される通りであった。【０１７０】
（ｂ）プライマーの評価
その結果、ＳＳＣ１ＬＢ１は試験したサッカロミセス属酵母のほとんどの菌種と反応し、サッカロミセス属酵母の中での識別は出来ないことが分かった。また、ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１は下面発酵酵母以外にサッカロミセス・バヤヌスと反応した。ＳＢＦＹ１ＬＦ１ＬＢ１は下面発酵酵母のメリビアーゼ遺伝子から設計されているが、設計に使用された領域はサッカロミセス・バヤヌスのゲノム中にも９６％相同性がある塩基配列が存在していたため、交差反応したと考えられた。【０１７１】
実施例３：Ｓｃ型-Ｌｇ型染色体転座領域を利用したＰＣＲ法プライマーの評価
上述したように、下面発酵酵母のＳｃ型のＸＶＩ番染色体は、右腕のＧＰＨ１のＯＲＦ内からＱＣＲ２のＯＲＦ内の範囲でＬｇ型染色体と転座を起こしていた。下面発酵酵母のＬｇ型のＩＩＩ番染色体は、右腕のＭＡＴ座から右腕末端までＳｃ型染色体と転座を起こしていた。また、下面発酵酵母のＬｇ型のＶＩＩ番染色体は、左腕のＫＥＭ１遺伝子ＯＲＦ内から左腕末端までＳｃ型染色体と転座を起こしていた。これらの下面発酵酵母のＩＩＩ番染色体、ＶＩＩ番染色体、ＸＶＩ番染色体の染色体転座位置を挟み込む形で、Ｓｃ型染色体側の塩基配列、およびＬｇ型染色体側の塩基配列からＰＣＲ法用プライマーを設計し、各種サッカロミセス属酵母で評価した。【０１７２】
ＰＣＲ法にはタカラバイオ社製Ｅｘ  Ｔａｑを用いた。ＰＣＲに用いた各プライマーの塩基配列は次の通りである。
［ＩＩＩ番染色体転座領域用プライマーセット（増幅産物：約３．２ｋｂ）］
IIIjunc1（Ｌｇ型側）：  TGTTGGGGTGTACTATGGTCTTT （配列番号２３）
IIIjunc2（Ｓｃ型側）：  ACAAAGAATGATGCTAAGAATTGA （配列番号２４）
［ＶＩＩ番染色体転座領域用プライマーセット（増幅産物：約３５０ｂｐ）］
VIISL1（Ｌｇ型側）：  CGACTCAAACTGTATTACTCC （配列番号２５）
VIISL2（Ｓｃ型側）：  AATTTTGATGTTCAAGCG （配列番号２６）
［ＸＶＩ番染色体転座領域用プライマーセット（増幅産物：ＸＶＩＳＬ１−２約７２０ｂｐ、ＸＶＩＳＬ３−４約６３０ｂｐ）］
XVISL1（Ｌｇ型側）：  CGACAGAGTTGACCAGTTTG（配列番号２７）
XVISL2（Ｓｃ型側）：  GTTCTTCTTGCAAGATGTGG（配列番号２８）
XVISL3（Ｌｇ型側）：  CCTTGGCAGATGTGTTGTAT（配列番号２９）
XVISL4（Ｓｃ型側）：  CTTGCCCTTCTTCAAATCCG（配列番号３０）【０１７３】
これらの試薬をタカラバイオ社製Ｅｘ  Ｔａｑの説明書に従って混合し（全量１５μl）、サーマルサイクラーにセットして９４℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・１分（ＩＩＩ番染色体転座領域用プライマーセットの場合は、７２℃を２分とした）の温度プログラムを３０回繰り返してＰＣＲ反応を実施した。その結果、各ＰＣＲプライマーセットを下面発酵酵母に使用した際に予想された分子量のバンドが出現した。増幅産物の有無は表５に示される通りである。【０１７４】
表５：各種サッカロミセス属酵母株を使ったプライマーの評価（＋：増幅あり、−：増幅なし）
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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