(57)【要約】  本発明は、癌細胞由来のＤＮＡを定量して癌の診断を高精度に行う方法の提供に関し、（１）被験者から採取した血漿より遊離ＤＮＡを抽出する工程と、（２）抽出した遊離ＤＮＡを定量して、血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を算出して第一の算出値とする工程と、（３）前記第一の算出値を、第一の閾値以上の第二の閾値と比較する工程と、（４）前記第一の算出値が、第一の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定し、第一の閾値以上かつ第二の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患している可能性があると判定し、第二の閾値以上の場合には、正常細胞由来のＤＮＡが定量に用いた血漿中に混入していると判定する工程と、を含むことを特徴とする癌の診断方法。
2008090930.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）被験者から採取した血漿より遊離ＤＮＡを抽出する工程と、
（２）抽出した遊離ＤＮＡを定量して、血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を算出して第一の算出値とする工程と、
（３）前記第一の算出値を、第一の閾値以上の第二の閾値と比較する工程と、
（４）前記第一の算出値が、第一の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定し、第一の閾値以上かつ第二の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患している可能性があると判定し、第二の閾値以上の場合には、正常細胞由来のＤＮＡが定量に用いた血漿中に混入していると判定する工程と、
を含むことを特徴とする癌の診断方法。
【請求項２】
前記工程（４）に次いで、さらに
（５）正常細胞由来のＤＮＡが定量に用いた血漿中に混入していると判定した場合には、正常細胞由来のＤＮＡを該血漿から除去する操作を行い、得られた血漿から遊離ＤＮＡを抽出し、抽出した該ＤＮＡを定量して、前記除去操作後の血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を算出して再算出値とするか、または新たに被験者からの血漿採取、遊離ＤＮＡの抽出、抽出した遊離ＤＮＡの定量および血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量の算出を行って再算出値とし、該再算出値を前記第一の閾値および第二の閾値と比較する工程と、
（６）前記再算出値が第二の閾値以上の場合には、正常細胞由来のＤＮＡが定量に用いた血漿中に混入していると判定して、前記工程（５）に戻る工程と、
（７）前記再算出値が、第一の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定し、第一の閾値以上かつ第二の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患している可能性があると判定する工程と、
（８）被験者が癌に罹患している可能性があると判定した場合には、該判定に用いた遊離ＤＮＡ中の変異の有無を検出する工程と、
（９）変異が検出された場合には、被験者がその変異に起因する特定の臓器の癌に罹患している可能性が高いと判定する工程と、
を含むことを特徴とする癌の診断方法。
【請求項３】
前記血漿が、被験者から採血後にキレート剤が混合された全血から分離されたものであることを特徴とする請求項１または２に記載の癌の診断方法。
【請求項４】
前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびヘパリンからなる群から選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項３に記載の癌の診断方法。
【請求項５】
前記血漿が、被験者からの採血直後の全血または被験者からの採血直後より冷蔵保存された全血を遠心分離して回収された上澄みであるか、または該上澄みをさらに一回以上遠心分離して得られた上澄みであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の癌の診断方法。
【請求項６】
前記工程（１）に次いで、抽出した遊離ＤＮＡを濃縮する工程を行ってから、前記工程（２）を行うことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の癌の診断方法。
【請求項７】
被験者が特定の臓器の癌に罹患している可能性が高いと判定した場合に、さらに該臓器の画像診断を行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の癌の診断方法。
【請求項８】
遊離ＤＮＡ中に変異が検出されなかった場合に、被験者が前記特定の臓器の癌以外の癌に罹患している可能性が高いと判定することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の癌の診断方法。
【請求項９】
被験者が前記特定の臓器の癌以外の癌に罹患している可能性が高いと判定した場合に、さらに全身を対象に画像診断を行うことを特徴とする請求項８に記載の癌の診断方法。
【請求項１０】
前記画像診断が、放射線を用いるものであることを特徴とする請求項７または９に記載の癌の診断方法。
【請求項１１】
前記変異が、点突然変異、マイクロサテライト不安定性および染色体異常からなる群から選ばれる一以上であることを特徴とする請求項２〜１０のいずれか一項に記載の癌の診断方法。
【請求項１２】
前記染色体異常の有無を、ＬＯＨ解析で検出することを特徴とする請求項１１に記載の癌の診断方法。
【請求項１３】
前記ＬＯＨ解析を、マイクロサテライトマーカーを用いて行うことを特徴とする請求項１２に記載の癌の診断方法。
【請求項１４】
前記ＬＯＨ解析を、ＳＮＰマーカーを用いて行うことを特徴とする請求項１２に記載の癌の診断方法。
【請求項１５】
前記ＬＯＨ解析を、変異を有さないことが既知であるＤＮＡとの比較により行うことを特徴とする請求項１２に記載の癌の診断方法。
【請求項１６】
前記正常細胞がリンパ球であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか一項に記載の癌の診断方法。
【請求項１７】
前記点突然変異の有無を検出する対象の遺伝子がＫ−ｒａｓ遺伝子であることを特徴とする請求項１１に記載の癌の診断方法。
【請求項１８】
前記特定の臓器の癌が、肺癌、膵臓癌または乳癌であることを特徴とする請求項２〜１７のいずれか一項に記載の癌の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿中の遊離ＤＮＡを用いる癌の診断方法に関する。
本願は、２００７年１月２３日に、日本に出願された特願２００７−０１２４７１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、癌の診断方法の一つとして、血液中に現れる腫瘍マーカーを検出する方法が用いられている。腫瘍マーカーとは、癌化した細胞が破壊されたりした場合に血液中に遊離してくる、その破壊された癌細胞由来のタンパク質のことである。そして、従来の癌の診断方法では、血液中の腫瘍マーカーの定量値がある一定値以上の場合に、被験者が癌に罹患している可能性があると判定される。【０００３】
一方、このように癌化した細胞の破壊等によって血液中に遊離してくるのは、タンパク質だけではなく、ＤＮＡも同様に遊離してくることが知られている。そして、健常人と癌患者とで比較すると、血液中の癌細胞由来の遊離ＤＮＡの量は、癌患者の方が健常人よりも有意に多いことが報告されている。したがって、血液などの体液中の癌細胞由来の遊離ＤＮＡを定量することで、被験者が癌に罹患しているか否か診断することが可能になると考えられる。このような癌の診断方法として、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法等で増幅される２００ｂｐ以上の核酸が、体液や体外に排出された糞便中などに検出された場合、被験者が癌に罹患している可能性があると診断し、さらにその核酸の変異を解析する方法（特許文献１参照）、体液などに含まれる細胞残渣由来のゲノムＤＮＡを定量し、その値がある一定値以上の場合に、さらにＤＮＡ検査を行う方法（特許文献２参照）が提案されている。【０００４】
ところで、診断によって癌に罹患していることが判明しても、体液中の核酸を定量するだけでは、癌が発生している臓器を特定するまでには至らない。そして、癌が発生している場合には、その発生している臓器により、特異的な核酸の変異が生じていることが知られている。したがって、核酸の変異の種類を明らかにすることで、癌が発生している臓器を特定できる可能性がある。ここで核酸の変異としては、ＤＮＡの点突然変異、染色体の欠失や増幅などの構造異常が挙げられる。例えば、膵臓癌の約７割には、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に点突然変異が生じていることが知られている。また、ヘテロ接合の欠失（Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ、以下、ＬＯＨと略記する）の解析でも、各癌種に特異的な染色体腕の欠損が報告されており、例えば、肺癌では３番染色体の短腕にＬＯＨが集中していることが知られている。また、乳癌では８番染色体の長腕の増幅や、ＲＢ２の増幅が知られている。
【特許文献１】米国特許第６１４３５２９号明細書
【特許文献２】米国特許２００４／０２５９１０１Ａ１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、例えば、全血中の癌細胞由来の遊離ＤＮＡを定量しようとしても、その量は微量であるのに対して、全血中には正常細胞であるリンパ球由来のＤＮＡが大量に含まれていることがある。したがって、全血からそのままＤＮＡを抽出しても、癌細胞由来の遊離ＤＮＡを定量することは困難である。そこで、例えば、全血ではなく全血から分離した血漿を用い、血漿中の癌細胞由来の遊離ＤＮＡを抽出して定量する方法が考えられる。しかし、この方法でも、ＤＮＡの抽出方法によっては、リンパ球等の正常細胞由来のＤＮＡが混入することがあり、癌細胞由来の遊離ＤＮＡではなく、正常細胞由来のＤＮＡを定量してしまう場合があり、癌の診断を誤る可能性がある。そしてこのように、正常細胞由来のＤＮＡが混入した場合には、ＬＯＨ解析やＫ−ｒａｓ遺伝子解析などの、遺伝子の変異部位の検出感度を下げてしまう。【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、癌細胞由来の遊離ＤＮＡを定量することで、癌の診断を高精度に行う方法を提供すること課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、
本願に係る第１の発明は、（１）被験者から採取した血漿より遊離ＤＮＡを抽出する工程と、（２）抽出した遊離ＤＮＡを定量して、血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を算出して第一の算出値とする工程と、（３）前記第一の算出値を、第一の閾値以上の第二の閾値と比較する工程と、（４）前記第一の算出値が、第一の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定し、第一の閾値以上かつ第二の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患している可能性があると判定し、第二の閾値以上の場合には、正常細胞由来のＤＮＡが定量に用いた血漿中に混入していると判定する工程と、を含む癌の診断方法である。
本願に係る第２の発明は、前記工程（４）に次いで、さらに（５）正常細胞由来のＤＮＡが定量に用いた血漿中に混入していると判定した場合には、正常細胞由来のＤＮＡを該血漿から除去する操作を行い、得られた血漿から遊離ＤＮＡを抽出し、抽出した該ＤＮＡを定量して、前記除去操作後の血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を算出して再算出値とするか、または新たに被験者からの血漿採取、遊離ＤＮＡの抽出、抽出した遊離ＤＮＡの定量および血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量の算出を行って再算出値とし、該再算出値を前記第一の閾値および第二の閾値と比較する工程と、（６）前記再算出値が第二の閾値以上の場合には、正常細胞由来のＤＮＡが定量に用いた血漿中に混入していると判定して、前記工程（５）に戻る工程と、（７）前記再算出値が、第一の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定し、第一の閾値以上かつ第二の閾値未満の場合には、被験者が癌に罹患している可能性があると判定する工程と、（８）被験者が癌に罹患している可能性があると判定した場合には、該判定に用いた遊離ＤＮＡ中の変異の有無を検出する工程と、（９）変異が検出された場合には、被験者がその変異に起因する特定の臓器の癌に罹患している可能性が高いと判定する工程と、を含む癌の診断方法である。
本願に係る第３の発明は、上記第１または２の発明において前記血漿が、被験者から採血後にキレート剤が混合された全血から分離されたものである癌の診断方法でも良い。
本願に係る第４の発明は、上記第３の発明において前記キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびヘパリンからなる群から選ばれる一種以上である癌の診断方法でも良い。
本願に係る第５の発明は、上記第１〜４の発明において前記血漿が、被験者からの採血直後の全血または被験者からの採血直後より冷蔵保存された全血を遠心分離して回収された上澄みであるか、または該上澄みをさらに一回以上遠心分離して得られた上澄みである癌の診断方法でも良い。
本願に係る第６の発明は、上記第１〜５の発明において前記工程（１）に次いで、抽出した遊離ＤＮＡを濃縮する工程を行ってから、前記工程（２）を行う癌の診断方法でも良い。
本願に係る第７の発明は、上記第１〜６の発明において被験者が特定の臓器の癌に罹患している可能性が高いと判定した場合に、さらに該臓器の画像診断を行う癌の診断方法でも良い。
本願に係る第８の発明は、上記第１〜６の発明において遊離ＤＮＡ中に変異が検出されなかった場合に、被験者が前記特定の臓器の癌以外の癌に罹患している可能性が高いと判定する癌の診断方法でも良い。
本願に係る第９の発明は、上記第８の発明において被験者が前記特定の臓器の癌以外の癌に罹患している可能性が高いと判定した場合に、さらに全身を対象に画像診断を行う癌の診断方法でも良い。
本願に係る第１０の発明は、上記第７または９の発明において前記画像診断が、放射線を用いるものである癌の診断方法でも良い。
本願に係る第１１の発明は、上記第２〜１０の発明において前記変異が、点突然変異、マイクロサテライト不安定性および染色体異常からなる群から選ばれる一以上である癌の診断方法でも良い。
本願に係る第１２の発明は、上記第１１の発明において前記染色体異常の有無を、ＬＯＨ解析で検出する癌の診断方法でも良い。
本願に係る第１３の発明は、上記第１２の発明において前記ＬＯＨ解析を、マイクロサテライトマーカーを用いて行う癌の診断方法でも良い。
本願に係る第１４の発明は、上記第１２の発明において前記ＬＯＨ解析を、ＳＮＰマーカーを用いて行う癌の診断方法でも良い。
本願に係る第１５の発明は、上記第１２の発明において前記ＬＯＨ解析を、変異を有さないことが既知であるＤＮＡとの比較により行う癌の診断方法でも良い。
本願に係る第１６の発明は、上記第１〜１５の発明において前記正常細胞がリンパ球である癌の診断方法でも良い。
本願に係る第１７の発明は、上記第１１の発明において前記点突然変異の有無を検出する対象の遺伝子がＫ−ｒａｓである癌の診断方法でも良い。
本願に係る第１８の発明は、上記第２〜１７の発明において前記特定の臓器の癌が、肺癌、膵臓癌または乳癌である癌の診断方法でも良い。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、癌の診断を高精度に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明における、血漿の採取から診断終了までの工程を例示するブロック図である。
【図２】本発明における、判定に用いたＤＮＡ中の変異の有無を検出する工程を例示するブロック図である。
【図３】癌の診断を行った後、さらに画像診断を行う場合を例示するブロック図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について、詳しく説明する。
被験者が癌患者であると、全血中には、癌細胞が破壊されて漏出した癌細胞由来の遊離ＤＮＡが含まれることが多い。この場合、全血から血漿を分離すれば、該血漿中に癌細胞由来の遊離ＤＮＡが含まれる。したがって、癌が進行するほどすなわち癌細胞の数が多くなるほど、破壊される癌細胞の数も多くなるので、血漿中の癌細胞由来の遊離ＤＮＡ含有量は多くなる。そこで、血漿中の遊離ＤＮＡを定量し、これをある特定の閾値と比較して、血漿中の遊離ＤＮＡ含有量が多いか少ないかを確認することで、被験者が癌に罹患しているか否か診断を下すことができる。ただし、全血の保存の仕方、あるいは血漿の分離の仕方等によっては、白血球等の血球成分に代表される正常細胞が破壊されることがある。
この場合、これら破壊された正常細胞由来のＤＮＡが全血中に漏出するので、血漿中には癌細胞由来のものだけでなく正常細胞由来のＤＮＡが含まれる。したがって、このような血漿を用いても高精度な癌診断を行うことはできない。
本発明は、血漿中への、正常細胞由来ＤＮＡの明らかな混入の有無を判断し、混入が認められた場合にはこれを除去するか、または新たに血漿を採取して、血漿中の癌細胞由来の遊離ＤＮＡ含有量を定量し、得られた定量値を癌発生有無の判断基準となる閾値と比較することで、高精度に癌の診断を行う方法に関するものである。また、本発明は、このような高精度な診断に基づいて、さらに癌が発生している臓器を特定する方法に関するものである。以下、各工程ごとに本発明を詳しく説明する。【００１１】
本発明では、まず、（１）被験者から採取した血漿より遊離ＤＮＡを抽出する。
本発明で用いる血漿は、全血から分離されたものであり、例えば、全血から血球成分を除去する操作を経て得られる。より具体的には、例えば、被験者から採血した全血を遠心分離して回収された上澄みか、または該上澄みをさらに一回以上遠心分離して得られた上澄みを血漿として用いれば良い。すなわち、全血を遠心分離して上澄みを回収し、これを血漿として用いても良いし、得られた上澄みをさらに遠心分離して上澄みを再回収する操作を一回以上行って回収されたものを血漿として用いても良い。前記上澄み回収工程は一回よりも複数回の方が、血球成分をより確実に除去できるが、通常は二回で十分である。
すなわち、全血を遠心分離して得られた上澄みを再度遠心分離に供して回収された上澄みは、血球成分が十分に除去されている。
なお、ここで上澄み成分とは、遠心分離時に赤血球層およびバフィーコートよりも上層に分布する成分のことである。また、遠心分離の条件は、前記血球成分が破壊されない限り特に限定されず、通常全血の遠心分離に汎用される条件で良い。そして、本発明において血球成分とは、リンパ球等の白血球、赤血球等のことである。【００１２】
本発明においては、血漿からの血球成分除去が不完全であると、後記する正常細胞由来のＤＮＡの除去を行う際、特に膜を用いて血漿をろ過する際に、血球成分が破壊されることがあり、血球成分由来のＤＮＡが血漿中に混入する可能性があるので、好ましくない。
すなわち、血球成分をより確実に除去された血漿は、癌診断をより高精度に行うのに好適である。【００１３】
全血は、採血後すぐに血漿の分離に供するか、血漿の分離に供するまで冷蔵保存することが好ましい。全血を冷蔵することなく保存したり、冷凍保存後に解凍したりすると、血球成分等の正常細胞が破壊されることがある。また、全血を特に激しく撹拌したりしても正常細胞が破壊されることがあるが、通常の遠心分離を行う程度であれば、このような正常細胞の破壊は起こらないと考えて良い。【００１４】
また全血は、採血後直ちに従来公知のキレート剤を添加しておくと、凝固等を防止でき、血漿の分離に好適である。また、ＤＮＡ分解酵素の活性を阻害でき、安定的にＤＮＡを抽出するのに好適である。
キレート剤としては、体内または体外で血液の抗凝固剤として通常用いられるもので良く、具体的には、ヘパリンや、カルシウムイオンとの結合能を有するクエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸ナトリウムおよびＡｃｉｄ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ等が例示できる。これらのなかでも、クエン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸ナトリウムおよびヘパリンが好ましい。キレート剤は、単独で用いても良いし、二種以上を併用しても良い。
これらキレート剤の添加量は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されない。【００１５】
血漿から遊離ＤＮＡを抽出する方法は特に限定されず、従来公知の如何なる方法でも良い。例えば、市販の核酸抽出キットを用いても良い。【００１６】
次いで本発明では、（２）抽出した遊離ＤＮＡを定量して、血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を算出して第一の算出値とする。
抽出した遊離ＤＮＡを定量する方法は特に限定されない。例えば、ＵＶ吸収値を測定して定量しても良いし、二本鎖ＤＮＡと相互作用する蛍光試薬等を用いて蛍光シグナルを測定して定量しても良い。蛍光試薬としては特に限定されず、例えば、フルオレセイン、ローダミン、アクリフラビン、アレクサ等従来公知のもので良く、市販品を用いても良い。【００１７】
例えば、血漿中に正常細胞由来ＤＮＡの明らかな混入が無い限り、被験者が癌に罹患していれば、健常者よりも第一の算出値は大きくなるし、癌が進行するほど第一の算出値は大きくなる。【００１８】
本発明においては、血漿から抽出した遊離ＤＮＡは濃縮しても良い。すなわち、被験者から採取した血漿より遊離ＤＮＡを抽出する工程に次いで、抽出された遊離ＤＮＡを濃縮する工程を行ってから、抽出した遊離ＤＮＡを定量して、血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を算出して第一の算出値とする工程を行っても良い。このようにすることで、第一の算出値を精度良く得られる。【００１９】
血漿から抽出した遊離ＤＮＡは、通常水溶液等の溶液中に溶解した状態なので、遊離ＤＮＡの濃縮は、具体的には、溶媒の一部を除去する方法、溶液中から遊離ＤＮＡを取り出したのち、これを適当な濃度となるように水等の溶媒を用いて再溶解する方法等が例示できる。
溶媒の一部を除去する方法としては、逆浸透膜（ＲＯ膜）等を用いてろ過する方法が例示できる。また、スピードバックなどの遠心濃縮装置を用いて減圧乾燥する方法も例示できる。遊離ＤＮＡを取り出す方法としては、前記遊離ＤＮＡ溶液中にエタノール等の有機溶剤を添加して遊離ＤＮＡを沈殿させてこれをろ過することにより抽出する方法等が例示できる。取り出した遊離ＤＮＡは、その定量に適した溶媒に再溶解させれば良い。【００２０】
次いで本発明では、（３）前記第一の算出値を、第一の閾値以上の第二の閾値と比較する。
ここで第一の閾値とは、被験者が癌に罹患しているか否かを判断する値のことである。
そして第二の閾値とは、血漿中への正常細胞由来ＤＮＡの明らかな混入の有無を判断する値のことである。第一の閾値および第二の閾値は、通常、癌の種類によって異なるので、適宜設定することが必要である。例えば、好ましくはなるべく多数の健常者と癌患者について、血漿単位体積あたりの癌細胞由来のＤＮＡ含有量を予め調査しておき、健常者と癌患者とを最も明確に区別できるＤＮＡ含有量を第一の閾値に設定すれば良い。そして、癌患者の血漿単位体積あたりの癌細胞由来のＤＮＡ含有量から、その上限値を見積もり、該上限値を少し超える値を第二の閾値に設定すれば良い。例えば、乳癌、肺癌、膵臓癌等の場合、第一の閾値は血漿１ｍｌあたり１０ｎｇ程度、第二の閾値は血漿１ｍｌあたり１００ｎｇ程度にそれぞれ設定することが好ましい。【００２１】
第一の算出値が、第一の閾値以上かつ第二の閾値未満である場合は、定量に用いた血漿中において、癌細胞由来の遊離ＤＮＡが健常者よりも多く、かつ正常細胞由来のＤＮＡの明らかな混入が認められないことを示す。（４）この場合、本発明では、被験者が癌に罹患している可能性があると判定する（以下、判定Ａと略記することがある）。
一方、（４）第一の算出値が第二の閾値以上の場合には、本発明では、定量に用いた血漿中に正常細胞由来のＤＮＡが混入していると判定する（以下、判定Ｂと略記することがある）。
第一の算出値が第二の閾値よりも大きくなる原因は、先に述べた通り、例えば、正常細胞が破壊され、この正常細胞由来のＤＮＡが全血中に漏出し、全血から分離した血漿中に混入することにある。または、抽出した遊離ＤＮＡの定量を行うまでの間、操作の如何によっては、血漿中の正常細胞が破壊されて該正常細胞由来のＤＮＡが血漿中に混入することが原因となることもある。ここでＤＮＡ混入の原因となり易い正常細胞としては、白血球、なかでもリンパ球等の血球成分が例示できる。
そして、第一の算出値が、第一の閾値未満である場合は、定量に用いた血漿中において、正常細胞由来のＤＮＡの明らかな混入が認められず、かつ癌細胞由来の遊離ＤＮＡが健常者同等以下の量であることを示す。この場合、本発明では、被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定する（以下、判定Ｃと略記することがある）。【００２２】
先に述べた通り、判定Ｂの場合は、正しい癌診断を行うことができない。そこで、本発明においては、（５）判定Ｂの場合は続いて、新たに被験者からの血漿採取、遊離ＤＮＡの抽出、抽出した遊離ＤＮＡの定量および血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量の算出を行って再算出値を得る（以下、再試行と略記する）ことが好ましい。判定Ｂとなった原因が、抽出した遊離ＤＮＡの定量を行うまでの間の操作に起因していた場合には、前記再算出値が第二の閾値未満となることがある。【００２３】
または、（５）判定Ｂの場合は、前記再試行に代わり、血漿中に混入している正常白血球細胞由来のＤＮＡを除去する操作を行い、前記と同様の方法で、得られた血漿から遊離ＤＮＡを抽出し、抽出した該ＤＮＡを定量して、前記除去操作後の血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を算出して再算出値としても良い。通常、正常白血球細胞由来のＤＮＡは、少なくとも１００００塩基対以上の分子サイズであるのに対し（即ち、断片化されていないのに対し）、癌細胞由来のＤＮＡは、これよりも少ない塩基対に断片化されている。したがって、この分子サイズの相違を利用して、血漿中から正常細胞由来のＤＮＡを除去できる。除去方法としては、この分子サイズの相違を利用できるものであればいずれでも良く、具体的には、限外ろ過膜（ＵＦ膜）や精密ろ過膜（ＭＦ膜）等の膜を用いて血漿をろ過する方法、アガロースゲル等のゲルスライスを用いて血漿をろ過する方法等が例示できる。そして用いる膜等に応じて適した公知の方法を適用すれば良い。また、このようなＤＮＡの分離には、各種市販品の膜やゲルスライスを用いることができ、ゲルスライスであれば、例えば、１００００塩基対以上の核酸が除去可能なＵｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（商品名、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）が好適である。また、ゲルスライスでなくても、同様なろ過方法で分子サイズに基づいて分画することができる。【００２４】
続いて、得られた再算出値を第一の閾値および第二の閾値と比較する（以下、再比較と略記する）。【００２５】
通常は、前記再試行において血漿中の正常細胞の破壊が回避されることで、または前記除去操作によって正常細胞由来のＤＮＡが血漿から除去されることで、再算出値は第一の算出値よりも小さくなる。しかし、例えば、再試行においても正常細胞の破壊が起こったり、前記除去操作時にろ過方法等によっては、正常細胞由来のＤＮＡの除去効率が低下することがある。したがって、一回の再試行または除去操作によっても、再算出値が第二の閾値よりも大きくなることもある。（６）この場合は、正常細胞由来のＤＮＡが定量に用いた血漿中に混入していると判定して、前記工程（５）に戻る。すなわち、前記再試行または除去操作と前記再比較とを再び行う。この場合、再試行または除去操作と再比較とは、再算出値が第二の閾値未満となるまで何回でも行っても良いが、例えば、複数回繰り返して行っても再算出値が第二の閾値未満とならない場合には、別の診断方法を併用しても良い。【００２６】
再算出値が第二の閾値未満である場合には、再算出値の判定は、上記の第一の算出値の判定の場合と同様に行えば良い。
すなわち、再算出値が、第一の閾値以上かつ第二の閾値未満の場合には、定量に用いた血漿中において、癌細胞由来の遊離ＤＮＡが健常者よりも多く、かつ正常細胞由来のＤＮＡの明らかな混入が認められないことを示す。（７）この場合、本発明では、被験者が癌に罹患している可能性があると判定する（以下、判定ＢＡと略記することがある）。
一方、再算出値が、第一の閾値未満である場合には、被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定する（以下、判定ＢＣと略記することがある）。【００２７】
本発明では、（８）被験者が癌に罹患している可能性があると判定した場合には、次いで、該判定に用いた遊離ＤＮＡ中の変異の有無を検出する。ここで変異とは、癌発症の原因となるものであれば特に限定されず、具体的には、点突然変異、マイクロサテライト不安定性および染色体異常等が例示できる。そして変異の有無の検出は、複数の変異を対象にして行っても良い。【００２８】
ＤＮＡ中の変異の有無の検出は、従来公知の方法で行えば良く、特に限定されない。例えば、染色体異常の有無の検出であれば、ＬＯＨ解析等が好適である。そしてＬＯＨ解析は、マイクロサテライトマーカーやＳＮＰマーカー等の各種マーカーを用いて行うことができ、このようにマーカーを用いることで、変異の有無を効率的に検出できる。ここで、ＳＮＰとは、１塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）のことである。また、変異を有していないことが既知であるＤＮＡを用いて塩基配列を比較することで、ＬＯＨ解析を行っても良い。
変異の有無を検出する手法は、単独で適用しても良いし、複数の手法を組み合わせて適用しても良い。【００２９】
ＤＮＡの変異は癌の種類に応じて異なるので、疑われる癌の種類や確認すべき癌の種類に応じて、標的とするＤＮＡを選択してから、変異の有無の検出を行う。
例えば、膵臓癌の約７割には、Ｋ−ｒａｓ遺伝子に点突然変異が生じていることが知られているので、被験者が膵臓癌であるか否かを高精度に診断するためには、Ｋ−ｒａｓ遺伝子上の点突然変異の有無を検出することが好ましい。また、ＬＯＨの解析でも、各癌種に特異的な染色体腕の欠損または増幅等が報告されている。例えば、肺癌では３番染色体の短腕に欠損が集中していることが知られており、乳癌では８番染色体の長腕の増幅とＲＢ２の増幅が生じることが知られている。したがって、これらＬＯＨ解析を癌種に応じて行うと良い。【００３０】
血漿から抽出した遊離ＤＮＡは、そのまま変異の有無の検出に供しても良いが、検出を高精度に行うためには、抽出した遊離ＤＮＡを増幅してから変異の有無の検出に供することが好ましい。ＤＮＡの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下、ＰＣＲと略記する）法等、従来公知の手法で行えば良い。
例えば、ＰＣＲ法では、変異の有無を検出したい標的ＤＮＡを増幅するようにプライマーを選択して、その増幅産物について変異の有無を検出すれば良い。【００３１】
次いで本発明では、（９）抽出した遊離ＤＮＡ中の変異が検出された場合には、被験者がその変異に起因する特定の臓器の癌に罹患している可能性が高いと判定する。なぜなら、被験者は癌に罹患している可能性があると判定されているのであり、かつＤＮＡ中の変異が検出されたのであるから、この判定はこの変異によるものと考えられるからである。
一方、変異が検出されなかった場合には、被験者が前記特定の臓器の癌以外の癌に罹患している可能性が高いと判定することが好ましい。なぜなら、被験者は癌に罹患している可能性があると判定されているにもかかわらず、ＤＮＡ中の変異が検出されなかったのであれば、それは変異の有無の検出を行ったＤＮＡが適切なものではなく、変異を生じているのは他のＤＮＡであると考えられるからである。【００３２】
本発明においては、被験者が癌に罹患している可能性があると判定された場合（判定ＡおよびＢＡ）には、さらに画像診断を行うことが好ましい。ここで画像診断とは従来公知のもので良く、Ｘ線検査、核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）検査、コンピュータ断層（ＣＴ）検査、核医学（ＲＩ）検査、超音波内視鏡検査等が例示できる。画像診断は単独で行っても良いし、複数種類を組み合わせて行っても良い。複数種類を組み合わせて行うと、診断を一層高精度に行える点で好ましい。また画像診断としていずれの方法を適用するかは、以下に述べるように、目的に応じて適宜選択することが好ましい。【００３３】
被験者が前記特定の臓器の癌以外の癌に罹患している可能性が高いと判定した場合には、画像診断をあわせて行うことで、癌の発生部位を特定できる。この場合画像診断は、広範囲な領域を対象に行うことが好ましく、全身を対象に行うことがより好ましい。このようにすれば、癌の発生部位の特定だけでなく、癌転移の有無の確認にも十分である。また、このように診断部位が広範囲に渡る場合には、幅広い領域を精密に解析可能なＭＲＩ検査、ＣＴ検査等で画像診断を行うことが好ましい。【００３４】
一方、被験者が特定の臓器の癌に罹患している可能性が高いと判定した場合にも、画像診断をあわせて行うことが好ましい。なぜなら、癌が発生している臓器が特定されても、それだけでは臓器のどの部位に癌が発生しているのか特定できないからである。この場合画像診断は、癌が発生していると考えられる臓器を対象に集中的に行うことが好ましい。
さらに近傍の臓器も対象にして行えば、癌転移の有無の確認が可能である。このように診断部位が狭い範囲に限定される場合には、画像診断はいずれの方法も好適であり、診断対象の臓器の種類に応じて適宜選択すれば良いが、ヘリカルＣＴ検査、Ｘ線検査および超音波内視鏡検査等を用いることがより好ましい。また、診断部位の範囲が狭いので、例えば、Ｘ線検査、ＣＴ検査、ＲＩ検査等の放射線照射を伴う検査においても、放射線被爆量を低減でき、被験者の負担を一層軽減できる。【００３５】
被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定した場合（判定ＣおよびＢＣ）には、該被験者の血漿から抽出した遊離ＤＮＡ中の変異の有無を検出する工程は行わなくても良い。【００３６】
以下、図１〜３を参照しながら、本発明の癌の診断方法について具体例を挙げて説明する。
図１は、血漿の採取から診断終了までの工程を例示するブロック図である。被験者から採取した血漿より遊離ＤＮＡを抽出して、抽出したＤＮＡを定量し、血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を定量して第一の算出値とする。第一の算出値が第一の閾値未満である場合は、被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定し、診断を終了して良い（判定Ｃの工程、以下工程Ｃと略す）。一方、第一の算出値が第一の閾値以上かつ第二の閾値未満の場合は、被験者が癌に罹患している可能性があると判定し、判定に用いたＤＮＡ中の変異の有無を検出する工程に入る（判定Ａの工程、以下工程Ａと略す）。第一の算出値が第二の閾値以上の場合は、正常細胞由来のＤＮＡが定量に用いた血漿中に混入していると判定し、前記再試行または除去操作を行って正常細胞由来のＤＮＡを除去して、再度、血漿単位体積あたりの遊離ＤＮＡ含有量を定量して再算出値とする（判定Ｂの工程、以下工程Ｂと略す）。再算出値が第二の閾値未満の場合には、前記工程ＡまたはＣに進み、第二の閾値以上の場合には、工程Ｂを繰返し、次いで前記工程ＡまたはＣに進む。【００３７】
図２は、工程Ａにしたがって、判定に用いたＤＮＡ中の変異の有無を検出する工程を例示するブロック図である。具体的には、マイクロサテライトマーカーを用いた３番染色体短腕のＬＯＨ解析により、肺癌に起因する染色体異常の有無を検出する工程を例示している。
前記判定に用いるために被験者から採取および抽出して保存しておいた遊離ＤＮＡを用いて濃度調整をして溶液を調製し、このＤＮＡを鋳型に用いて、変異の有無を検出したい標的塩基配列を増幅するプライマーを選択し、ＰＣＲにより増幅反応（マイクロサテライトＰＣＲ）を行う（工程Ａ１）。一方、被験者から全血を採取してここから正常細胞であるリンパ球を分離し、このリンパ球からＤＮＡを抽出する。溶液中のリンパ球由来ＤＮＡを定量および希釈して、このＤＮＡを鋳型に用い、前記と同様にマイクロサテライトＰＣＲにより増幅反応を行う（工程Ａ２）。次いで、血漿由来の遊離ＤＮＡおよびリンパ球由来のＤＮＡについて、得られた増幅産物のフラグメントパターンをキャピラリー電気泳動等により比較し、血漿由来の遊離ＤＮＡ中におけるＬＯＨの有無を検出する。血漿由来の遊離ＤＮＡについてシグナルパターンの明らかな変化（シグナル強度の低下）が見られれば、ＬＯＨが生じているので、被験者は特定の臓器の癌に罹患している可能性が高いと判定する。これに対し、血漿由来の遊離ＤＮＡおよびリンパ球由来のＤＮＡ間でシグナルパターンの明らかな相違が見られなければ、被験者は検出対象の染色体異常に起因する癌以外の癌に罹患している可能性が高いと判定することが好ましい。【００３８】
図３は、図２の工程にしたがって癌の診断を行った後、さらに画像診断を行う場合を例示するブロック図である。ＬＯＨが検出された場合には、特定の臓器において癌の発生が疑われるので、対象である臓器に対して集中的に画像診断を行うことが好ましい。例えば、肺癌が疑われる場合には、ヘリカルＣＴによる胸部画像診断や胸部Ｘ線検査等が好適である。一方、ＬＯＨが検出されなかった場合には、癌が発生している臓器が特定できていないので、広範囲に画像診断を行うことが好ましい。【００３９】
本発明は、癌患者の全血中に、その癌細胞由来のＤＮＡが高頻度に見られる癌種に対して好適である。このような癌として具体的には、肺癌、膵臓癌および乳癌等が例示できる。これに対し、大腸癌や胃癌などには本発明は適さない。【００４０】
以上の説明のように、本発明の癌の診断方法によれば、血漿中への正常細胞由来ＤＮＡの明らかな混入の影響を排除でき、癌細胞由来の遊離ＤＮＡ含有量の精度の高い定量値を特定の閾値と比較するので、癌の診断を高精度に行うことができる。
【実施例】
【００４１】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。また、以下の実施例において、「／ｍｌ  ｐｌａｓｍａ」とは「血漿１ｍｌあたり」を指す。【００４２】
（ＤＮＡの定量）
１３人の被験者から採取し凍結させた１ｍｌの血漿（サンプルＮｏ．１〜１３）を解凍し、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（商品名、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて公知の手法に従い、血漿から核酸を抽出した。抽出は、前記ｋｉｔに付属の１００μＬ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＡＥ（商品名、Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて行った。抽出後、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商品名、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて公知の手法に従い、抽出した核酸の定量を行い、該定量値から、血漿１ｍｌあたりの遊離ＤＮＡ含有量（第一の算出値）を算出した。そして、第一の閾値を１０ｎｇ／ｍｌ  ｐｌａｓｍａと設定し、第二の閾値を１００ｎｇ／ｍｌ ｐｌａｓｍａと設定した。すなわち、前記第一の算出値が１０ｎｇ／ｍｌ  ｐｌａｓｍａ未満の場合には、被験者が癌に罹患していない可能性が高いと判定し（判定Ｃ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ｐｌａｓｍａ以上かつ１００ｎｇ／ｍｌ ｐｌａｓｍａ以下の場合には、被験者が癌に罹患している可能性があると判定し（判定Ａ）、１００ｎｇ／ｍｌ ｐｌａｓｍａよりも大きい場合には、正常細胞由来のＤＮＡが血漿中に混入していると判定（判定Ｂ）することにした。【００４３】
遊離ＤＮＡ含有量の算出結果を表１に示す。Ｎｏ．７および１３のサンプルは、第一の算出値が第二の閾値よりも大きかったため、正常細胞由来のＤＮＡが血漿中に混入していると判定した。そこで、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＤＡ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ（商品名、ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて公知の手順に従い、Ｎｏ．７および１３のサンプルから１００〜１００００ｂｐのＤＮＡ断片を除去した。除去後のサンプルについて、再度ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて核酸の定量を行い、該定量値から、血漿１ｍｌあたりの遊離ＤＮＡ含有量（再算出値）を算出した。結果を表１に示す。表１に示すように、Ｎｏ．７のサンプルの再算出値は、第一の閾値以上かつ第二の閾値未満（判定Ａ）となり、Ｎｏ．１３のサンプルの再算出値は、第一の閾値未満（判定Ｃ）となった。【００４４】
Ｎｏ．１〜１３のサンプルの判定結果は以下の通りである。
Ｎｏ．１〜３および９〜１２のサンプルは、第一の算出値が第一の閾値未満（判定Ｃ）であり、Ｎｏ．１３のサンプルは再算出値が第一の閾値未満（判定ＢＣ）であるため、これらサンプルを採取した被験者は癌に罹患していない可能性が高いと判定した。実際に、Ｎｏ．１〜３のサンプルを採取した被験者はいずれも癌に罹患していない健常者であり、Ｎｏ．１０〜１３のサンプルを採取した被験者はいずれも癌ではなく良性腫瘍の患者であって、これら被験者はすべて癌患者ではなかった。一方、Ｎｏ．９のサンプルを採取した被験者は実際には癌患者であった。【００４５】
また、Ｎｏ．４〜６および８のサンプルは、第一の算出値が第一の閾値以上かつ第二の閾値未満（判定Ａ）であり、Ｎｏ．７のサンプルは再算出値が第一の閾値以上かつ第二の閾値未満（判定ＢＡ）であるため、これらサンプルを採取した被験者は癌に罹患している可能性があると判定した。実際に、Ｎｏ．４〜６および８のサンプルを採取した被験者は癌患者であった。【００４６】
以上の結果から、本発明の診断方法による癌診断の確度（正しい診断数／被験者数×１００）は９２％であり、癌患者の的中率（正しい癌診断数／癌患者数×１００）は８３％であった。【００４７】
【表１】
2008090930.tif 000003
【００４８】
（点突然変異解析）
続いて、被験者が癌に罹患している可能性があると判定したＮｏ．４〜８のサンプルを用いて、Ｋ−ｒａｓコドン１２、１３の点突然変異解析を行った。
まず、鋳型としてＮｏ．４〜８のサンプルから抽出したＤＮＡを用い、Ｋ−ｒａｓ癌遺伝子プライマーとして、配列番号１に示す塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号２に示す塩基配列からなるリバースプライマーをそれぞれローダミンでラベルしたものを用いて、ＰＣＲ増幅フラグメントを調製した。すなわち、ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ（５Ｕ／μｌ）（タカラバイオ株式会社製）０．５μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）８μｌ、前記鋳型ＤＮＡ５ｎｇおよび前記フォワードプライマー並びにリバースプライマー（各２０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌを混合し、液量が１００μｌとなるように滅菌蒸留水を加えた。そしてこれをサーマルサイクラーにセットし、「９４℃／３０秒→５５℃／２分→７２℃／１分」の加熱条件を１サイクルとして２５サイクル行い、ＰＣＲ増幅を行った。
次いで、ＰＣＲ反応液１μｌを「９５％ホルムアミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ」溶液で３０倍に希釈した。このうち１μｌを下記条件で電気泳動し、蛍光バイオイメージアナライザーＦＭＢＩＯシステム（商品名、タカラバイオ株式会社製）を用いて蛍光シグナルの検出を行った。なお、マーカーとして、正常型コントロールＰＣＲ増幅フラグメントを同時に泳動することによって、各サンプルから抽出したＤＮＡの変異の有無を確認した。解析結果を表２に示す。
＜電気泳動条件＞緩衝液：０．５×ＴＢＥ、ゲル： ５％ポリアクリルアミドゲル（１％架橋０．５×ＴＢＥ）１６０×４５０×０．３５（ｍｍ）、温度：４℃、色素マーカー：３０Ｗ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（キシレンシアノール、ブロモフェノールブルー）【００４９】
解析の結果、Ｎｏ．５、７および８のサンプルから抽出したＤＮＡにはＫ−ｒａｓの変異が見られたので、これらのサンプルを採取した被験者は、膵臓癌に罹患している可能性が高いと判定した。実際に、これら被験者は膵臓癌患者であった。
一方、Ｎｏ．４および６のサンプルから抽出したＤＮＡにはＫ−ｒａｓの変異が見られなかったので、このサンプルを採取した被験者は、膵臓癌以外の癌に罹患している可能性が高いと判定した。実際に、Ｎｏ．４のサンプルを抽出した被験者は乳癌患者であり、Ｎｏ．６のサンプルを抽出した被験者は肺癌患者であった。【００５０】
【表２】
2008090930.tif 000004
【００５１】
（マイクロサテライトマーカーを用いたＬＯＨ解析）
前記Ｎｏ．４〜９のサンプルについて、以下の手順により、マイクロサテライトマーカーを用いたＬＯＨ解析による肺癌の検出を試みた。
まず、鋳型としてＮｏ．４〜９のサンプルから抽出したＤＮＡ２μｇを用い、Ｄ３Ｓ１２３４を検出するプライマーとして配列番号３に示す塩基配列からなるフォワードプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列からなるリバースプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅フラグメントを調製した。なお、これらのプライマーは、Ｇｅｎｅ  Ｓｃａｎ用蛍光プライマーペアであり、Ｇｅｎｅ  Ｓｃａｎ用蛍光テイルドプライマーペア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＪＡＰＡＮ社製、Ｎｏ．４５００５６、４３０４９７９）である。
すなわち、１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ２μｌ、Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社製、♯ＲＲ００１Ａ）０．１μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）１．６μｌ、前記鋳型ＤＮＡ（５ｎｇ／μｌ）１μｌ、前記フォワードプライマーおよびリバースプライマー（各５μｍｏｌ／ｌ）１μｌ並びに滅菌蒸留水１３．３μｌを混合し、ＰＣＲ反応溶液とした。そしてこれをサーマルサイクラーにセットし、９４℃／５分で熱変性後、「９４℃／３０秒→５５℃／３０秒→７２℃／３０秒」の加熱条件を１サイクルとして３０サイクル行い、次いで７２℃／５分の条件で最終伸張（Ｆｉｎａｌ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を行うことで、ＰＣＲ増幅を行った。
次いで、専用の９６穴プレートに、Ｈｉ−Ｄｉ  Ｆｏｒｍａｎｉｄｅ（商品名、♯４３１１３２０、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＪＡＰＡＮ社製）／Ｇｅｎｅ  Ｓｃａｎ  −５００  ＲＯＸ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ（商品名、♯４０１７３４、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＪＡＰＡＮ社製）ｍｉｘを１０μｌずつ予め分注しておき、そこにＰＣＲ反応液を１μｌずつ分注した。そして、サーマルサイクラーで９５℃／５分の加熱条件で熱変性処理し、すぐに氷上で５分以上静置した。次いで、ＡＢＩ３１００の手順書に従い熱変性処理した前記サンプルを用いて、キャピラリー電気泳動を行った。電気泳動後のデータ解析は、Ｇｅｎｅ  Ｓｃａｎ  ３．７（商品名、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＪＡＰＡＮ社製）により行った。【００５２】
解析の結果、Ｎｏ．６のサンプルから抽出したＤＮＡでは、３番染色体短腕の３ｐ２１．１−３ｐ１４．２に存在するマイクロサテライトマーカーの欠失がみられた。この欠失は肺癌で多く見られるものであり、実際に臨床所見でＮｏ．６のサンプルは肺癌サンプルとされていたので、このＬＯＨ解析の結果は、肺癌の特定に有効であった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明は、医療分野における癌の診断に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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