(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト制御性Ｔ細胞に刺激を与えるための経口投与用医薬品の調製方法であって、該医薬品はヒトに対して非病原性の寄生蠕虫である豚鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｓｕｉｓ）の生虫卵が懸濁している保存可能な懸濁液を含み、経口摂取後に十分な数の蠕虫が発育するものであり、第１のステップで蠕虫卵懸濁液をｐＨ２以下の酸処理に付し、さらなるステップでｐＨを４以上に調整し、薬理学的に許容できる防腐剤を加えることを特徴とする、経口投与用医薬品の調製方法。
【請求項２】
前記酸処理を硫酸の添加により行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
防腐剤が、ソルビン酸、安息香酸、これらの酸の塩、ｐ−安息香酸エステル、プロピレングリコール、およびこれらの防腐剤の組み合わせから成る群より選択されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
０．０１〜０．２％ソルビン酸、
０．１〜０．３％安息香酸、
０．０２〜０．３重量％ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、
５〜２０重量％プロピレングリコール、および
上述の濃度域にある上述の防腐剤の組み合わせ
から成る群より選択される１種以上の防腐剤を加えることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
薬学的に許容できる添加物をさらに懸濁液に加えることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒト制御性Ｔ細胞に刺激を与えるための経口投与用医薬品であって、該医薬品はヒトに対して非病原性の寄生蠕虫である豚鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｓｕｉｓ）の生虫卵が懸濁している保存可能な懸濁液を含み、経口摂取後に十分な数の蠕虫が発育するものであり、コロニーを形成する微生物数が懸濁液１ｍｌ当たり１，０００未満であり、請求項１〜５に記載のいずれかの方法により調製されることを特徴とする、経口投与用医薬品。
【請求項７】
懸濁液１ｍｌ当たりに含まれる微生物数が１００コロニー形成単位未満であることを特徴とする、請求項６に記載の経口投与用医薬品。
【請求項８】
懸濁液１ｍｌ当たりに含まれる微生物数が１０コロニー形成単位未満であることを特徴とする、請求項７に記載の経口投与用医薬品。
【請求項９】
前記微生物が、細菌、ウイルス、真菌、酵母、および原虫から成る群より選択されることを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の経口投与用医薬品。
【請求項１０】
腸管の炎症性疾患の治療用医薬品を製造するための、請求項１〜５のいずれかに記載の方法により調製した、寄生蠕虫である豚鞭虫の虫卵を懸濁した、保存可能な懸濁液の使用。
【請求項１１】
腸管の炎症性疾患がクローン病であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、寄生蠕虫卵を含み、該虫卵が発育可能な生きた状態にある、治療用に適した懸濁液を製造するための浄化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
寄生虫感染が、動物宿主の免疫系活性化に影響を及ぼすことは公知である（Ｄ．Ｍ．ＭｃＫａｙ，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ２００６，１３２：１−１２参照）。この活性化は免疫系疾患の発症および経過にも影響する。疫学的調査において、衛生状態が良いため寄生虫感染率が低い地域と比べ、寄生虫感染率の高い地域では、自己免疫疾患がまれにしか発症しないことが証明されている。腸管の慢性炎症性疾患であるクローン病患者のサイトカインプロファイルにおいては、蠕虫感染によりＴｈ２免疫細胞が刺激されうることが証明されている。Ｔｈ１優位の自己免疫疾患であるクローン病は、蠕虫感染により予防できる、または影響を及ぼすことができる（Ｓｕｍｍｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ２００３，９８：２０３４−２０４１参照）。また、Ｔｈ１免疫細胞により引き起こされる他の疾患も、ヘリコバクターによる胃炎や自己免疫性脳脊髄炎がそうであるように、蠕虫感染により影響を受けうる。
【０００３】
早くも１９７３年には、Ｂｅｅｒ（Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １９７３，６７：２５３−２６２）により、線虫自体による病原性感染を伴うことなくヒトに免疫処置を施すのに適した線虫として、豚鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｓｕｉｓ）が適している可能性が報告されている。豚鞭虫はヒト鞭虫と近縁にあり、ヒトの消化管中で生存するが、増殖することはない。この自己限定性の感染は、治療手段を必要としない。したがって、豚鞭虫に感染させることにより免疫処置を施すことができる。
【０００４】
Ｒ．Ｊ．Ｓ．Ｂｅｅｒ，Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １９７２，６５：３４３−３５０には、虫卵の回収および浄化方法についての記載がある。幼虫包蔵卵を３２℃、０．２％重クロム酸カリウム溶液中で培養し、毎日通気する。同様の浄化方法は独国特許発明第１０６３１１５号明細書に記載がある。ヒドロキシルラジカルあるいは酸素ラジカルを生ずる化学反応により、いかなる微生物およびウイルスも虫卵から取り除かれる。具体的には、いわゆるフェントン反応が記載されている。該反応では、塩化鉄（ＩＩ）（ＦｅＣｌ２）が過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）に作用して発生期酸素を生成し、その殺菌活性が利用される。
【０００５】
Ｂｏｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  １９９８：１８１−１９０には、雌虫から得られ、硫酸中で幼虫形成させた、豚回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｓｕｕｍ）卵の幼虫形成状態および感染力についての記載がある。
【０００６】
Ｓｕｍｍｅｒｓら（ＧＵＴ  ２００５，５４：８７−９０）も、前もって抗生物質（ペニシリン／ストレプトマイシン／アムホテリシンＢ）を含む緩衝液中で虫卵を５〜６週間かけて幼虫形成させた後、０．２％重クロム酸溶液を含むｐＨ６〜７リン酸緩衝液により豚鞭虫卵を浄化した。
【０００７】
このような殺菌・殺ウイルス性の薬品の使用には、一連の重大な欠点がある。
重クロム酸溶液またはフェントン試薬のいずれを使用した場合も、虫卵の損傷を回避するためには、該溶液は短時間のうちに除去されなければならない。さらに、実験により、あらかじめ浄化ステップを経ているにもかかわらず、浄化後の幼虫形成期間（２２〜２５℃、３カ月）に微生物が大量増殖することも、その後の幼虫包蔵卵保存期間（２〜８℃）に微生物が増殖することも、避けられないことが明らかになった。したがって、一旦このような殺菌・殺ウイルス性の薬品が除去されれば、豚鞭虫卵懸濁液中で微生物が新たに増殖すると考えられる。
【０００８】
さらに、前記懸濁液からの重クロム酸塩の完全除去は必須である。しかしながら、その除去方法は極めて煩雑である。
【０００９】
Ｓｕｍｍｅｒｓが述べているように、虫卵の幼虫形成期間における微生物の大量増殖を防止する目的の抗生物質の添加が、この段階での微生物の大量増殖を防いでいる。その一方、この抗生物質の添加により微生物が確実に死滅するわけではない。次の浄化および保存ステップにおいて、抗生物質が除去されると、懸濁液を使用するまでに微生物が新たに大量増殖する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ウイルスおよび微生物、特に細菌による汚染から浄化され、真菌胞子および酵母が増殖することなく保存できる幼虫包蔵卵懸濁液を調製することである。本明細書記載の方法により、虫卵が成虫へと発育する能力は保持される。この虫卵懸濁液は治療用に適している。
【００１１】
驚いたことに、従来公知の方法とは対照的に、毒物（例えば重クロム酸カリウム、Ｋ２Ｃｒ２Ｏ７）や殺菌剤を必要としないことから、浄化および保存を組み合わせた方法が上記問題の解決に特に適切であることが、本発明の範囲内で判明した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の浄化方法では、分離された蠕虫卵、好ましくは豚鞭虫卵を、ｐＨ２以下の酸性溶液中、好ましくは硫酸（Ｈ２ＳＯ４）溶液中で１〜７２時間培養する（実施例１参照）。最適な培養時間は２〜８時間、好ましくは３時間である。培養温度は４〜３７℃、好ましくは２５〜３５℃である。
【００１３】
ヒトに対して非病原性である寄生蠕虫の生虫卵が懸濁している保存可能な懸濁液を含み、該懸濁液の経口摂取後、十分な数の蠕虫が発育し、結果としてヒト制御性Ｔ細胞に刺激を与える、経口投与可能な医薬品を調製する方法の第１ステップにおいて、蠕虫卵懸濁液は最初にｐＨ２以下の酸処理に付される。さらなるステップで、ｐＨを４以上に上げ、薬理学的に許容できる防腐剤を加える。原理的には、最初に防腐剤を加え、次に酸処理を行なうことも可能である。しかしながら、最初に酸処理を行ない、次に防腐剤を加えることが好ましい。
【００１４】
酸処理は、硫酸を加えることにより行うことが好ましい。該酸処理では、ｐＨを約０．５〜２の範囲に低下させるのに十分な量の酸を加える。さらなる実施形態では、ｐＨを約０〜１未満に低下させる。適切な酸は、塩酸、硝酸、好ましくは硫酸である。該酸処理は、虫卵への過度の損傷を回避するために、比較的短時間で行なうだけでもよい。また、この場合、酸処理における酸濃度と処理時間には関連性がある。ｐＨを２未満、特に好ましくは０．６〜０．８にまで低下させることが好ましい。酸処理の処理時間は、数分から数時間、好ましくは１２０〜３６０分である。さらに虫卵が耐容できる短期の処理時間としては、虫卵の幼虫形成工程（２２〜２５℃、３カ月）も包含する。
【００１５】
前記酸処理の後、適切な塩基、例えば水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）の添加により、再びｐＨを４より高くする。その後、１つ以上の防腐剤を加えるが、原則として、食品あるいは医薬品の保存に適したあらゆる物質を使用することができる。クローン病の患者が確実に良好な耐容性を示す防腐剤を使用することが好ましい。
【００１６】
前記防腐剤は、ソルビン酸、安息香酸、これらの酸の塩、パラ安息香酸エステル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、プロピレングリコール、およびこれらの防腐剤の組み合わせから成る群から選択することが好ましい。
【００１７】
前記防腐剤としては、
０．０１〜０．２％、特に０．１〜０．２％ソルビン酸、
０．１〜０．３％安息香酸、
０．０２〜０．３重量％ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、
５〜２０重量％プロピレングリコール、および
上述の濃度域にある上述の防腐剤の組み合わせ
から成る群より選択される１種以上の防腐剤を使用することが特に好ましい。
【００１８】
また、強酸の代替として、上述の防腐剤、好ましくはソルビン酸およびその塩を添加した弱酸性溶液が、微生物およびウイルスの迅速な不活化にも適している。しかしながら、強酸よりも該弱酸溶液を使用すると、酸性度の低いｐＨであるため、虫卵の浄化、幼虫形成（２２〜２５℃、３カ月）、保存、患者への投与が単一の培地で実施できるという利点がある。このような長期的処理を弱酸を用いて行うと、虫卵の生存能力に及ぼす悪影響がない（実施例５参照）。この温和な方法では、ｐＨ１以上好ましくはｐＨ２の防腐剤含有培地を使用するため、虫卵懸濁液の微生物学的純度は制限されない。
【００１９】
前記方法により得られた、幼虫包蔵卵を含む防腐剤含有懸濁液は、液状の飲み薬として患者に投与するのに適している。適切な場合、着色剤、香料あるいは増粘剤のような薬学的に許容できる添加物を、虫卵懸濁液にさらに加えてもよい。
【００２０】
したがって、本発明は、ヒトに対して非病原性である寄生蠕虫の生虫卵が懸濁している保存可能な懸濁液を含み、該寄生蠕虫が特に豚鞭虫であり、該懸濁液の経口摂取後、十分な数の蠕虫が発育し、結果として制御性Ｔ細胞に刺激を与え、コロニーを形成する微生物数（ｃｆｕ＝ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）が、懸濁液１ｍｌ当たり１，０００未満である、経口投与用医薬品に関する。該経口投与用医薬品に含まれる微生物数が、懸濁液１ｍｌ当たり１００コロニー形成単位未満であることが好ましい。特に、該経口投与用医薬品に含まれる微生物数が、懸濁液１ｍｌ当たり１０コロニー形成単位未満であることが好ましい。コロニー形成単位数は、慣用の微生物学的手法を用いて決定される。
【００２１】
本明細書中では、微生物とは、細菌、ウイルス、真菌、酵母および原虫を意味し、健康に害を及ぼすような微生物は含まれてはならない。
【００２２】
本発明の方法により、ヒトに対して非病原性である寄生蠕虫の虫卵が懸濁している保存可能な懸濁液を、医薬品投与に適した形態で提供することが可能となる。本発明による処理は、第１に、医薬品としての用途に適合する程度にまで、汚染微生物、特に細菌のみならず、真菌、ウイルス、適切な場合には、原虫をも死滅させる。しかしながら、第２に、この処理は十分に温和であるため、一旦経口摂取されれば該虫卵が患者の腸管内で発育する能力を保持でき、その結果免疫系に所望の刺激を引き起こす。
【発明の効果】
【００２３】
本発明による医薬品は、特に腸管の様々な炎症性疾患、特に腸管の慢性炎症性疾患の治療に適している。該医薬品は、クローン病と呼ばれる腸管炎症性疾患の治療に特に有利な方法で利用することができる。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００２４】
豚鞭虫卵懸濁液中の微生物の除去
ドイツ薬局方（ＤＡＢ）（Ｇｅｒｍａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，ｓｅｃｔｉｏｎ  ２．６．１２，ｌａｓｔ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ２４ｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ２００６）の規定に従い、豚鞭虫卵（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｓｕｉｓ  ｏｖａ：ＴＳＯ）を２，４００虫卵／ｍｌの濃度でリン酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、該懸濁液中の微生物数を測定した。その結果、微生物数は１９０，０００ｃｆｕ／ｍｌであった。次に、該懸濁液を希Ｈ２ＳＯ４溶液を用いてｐＨ２に再度調整した。３０℃で３時間保存後、微生物数は２０ｃｆｕ／ｍｌ未満に減少した。
【００２５】
次に、本方法の質を調査するために、ドイツ薬局方（ＤＡＢ）に従い、規定の細菌、酵母および真菌の試験株を使用した。実施例２ａ、２ｂおよび２ｃに、試験結果を示す。
【実施例２】
【００２６】
微生物数の測定
ａ．ＤＡＢ２．６．１３に規定されている栄養懸濁液に、表１に詳述する胞子形成試験細菌株および胞子非形成試験細菌株を植菌した。次に、これらを希Ｈ２ＳＯ４溶液を用いてｐＨ２に再度調整し、３０℃で６時間保存した。その後、微生物数を測定し、表１に示すデータを得た。
【００２７】
【表１】
0005483731.tif 000002
【００２８】
ｂ．ＤＡＢ２．６．１３に規定されている栄養懸濁液に、表２に詳述する試験酵母株を植菌した。次に、これらを希Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて、ｐＨ２あるいはｐＨ１に再度調整し、２５℃で３時間あるいは４８時間保存した。その後、微生物数を測定し、表２に示すデータを得た。
【００２９】
【表２】
0005483731.tif 000003
【００３０】
ｃ．ＤＡＢ２．６．１３に規定されている栄養懸濁液に、表３に詳述する試験糸状菌株を植菌した。次に、これらを希Ｈ２ＳＯ４溶液を用いて、ｐＨ２、ｐＨ１およびｐＨ０に再度調整し、２５℃で３時間あるいは４８時間保存した。その後、微生物数を測定し、表３に示すデータを得た。
【００３１】
【表３】
0005483731.tif 000004
【００３２】
実施例１および２ａ〜ｃから、ｐＨ２の希Ｈ２ＳＯ４溶液が、細菌を短時間に効率よく死滅させることが明らかになった。酵母および真菌を効率よく死滅させるには、培養時間を長くするか、あるいは酸性度の高いｐＨ価にすることが必要である。
【００３３】
驚いたことに、上述の浄化ステップは、さらに、ウイルスが除去された豚鞭虫卵懸濁液の調製に適している。
【実施例３】
【００３４】
ウイルス除去
豚鞭虫卵（ＴＳＯ）懸濁液の調製における、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒｕｓ：ＭｕＬＶ）、仮性狂犬病ウイルス（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ：ＰＲＶ）、ブタパルボウイルス（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ：ＰＰＶ）およびネコカリシウイルス（Ｆｅｌｉｎｅ  ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ：ＦＣＶ）の不活化。使用したこれらのウイルスはモデルウイルスである。
【００３５】
植菌したサンプル中のウイルス力価を、終点滴定により測定した。この方法自体は公知であり、容易に識別可能な標識細胞を含むマイクロタイタープレートに、希釈サンプルを添加する。該希釈サンプルに含まれるウイルスが標識細胞に感染すると、細胞を融解するため、細胞の形態が変化する。該標識細胞の融解は、顕微鏡下で容易に観察することができる。
【００３６】
ＴＳＯを含む０．０１ＮのＨ２ＳＯ４溶液（ｐＨ２、３０℃）に、エンベロープ試験ウイルス株および非エンベロープ試験ウイルス株を高濃度で加えた。１０分、３時間および７２時間培養後、ウイルス力価を測定した。１０分後には、エンベロープウイルスであるＰＲＶおよびＭｕＬＶはもはや感染力を持たなかった。また、３時間後には、非エンベロープウイルスであるＦＣＶおよびＰＰＶはもはや感染力を持たなかった。１ＮのＮａＯＨで中和した対照試料においては、３時間培養後も、４種のウイルスすべてが毒性を保持していた。０．２％重クロム酸カリウムを含む０．０１Ｎ硫酸溶液においては、重クロム酸カリウムの細胞傷害性により、該溶液を対照として分析することは不可能であった。
【００３７】
ｐＨ０、好ましくは１未満に低下させたｐＨでの長時間培養においてのみ、真菌および酵母を顕著に減少させることが可能であった（実施例２、表２および表３参照）。強酸性培地中で行われるこの浄化方法は、新規ではあるが、虫卵の懸濁液における生存能力に悪影響を及ぼすという欠点がある。
【００３８】
本発明の第２の特徴として、驚いたことに、保存目的で用いられる経口摂取可能な化学物質の添加が、高い幼虫形成率（ｅｍｂｒｙｏｎａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ：ＥＣ）をもたらすことが判明した。幼虫形成率は、虫卵の懸濁液における生存能力の明白な指標である。さらに、防腐剤の使用により、ｐＨ４においても、汚染微生物を不活性化することが可能であった。好ましいと判明した経口摂取可能な防腐剤は、安息香酸、ソルビン酸、これらの塩およびプロピレングリコールである（実施例４ａ〜ｅ参照）。
【００３９】
防腐剤の添加によってのみ、虫卵がより良好な耐容性を示す、酸性度が相当に低い培地の使用が可能となる。このようにして、単一の培地を用いて、虫卵を浄化し、幼虫形成し、保存し、患者に投与することが可能となる。したがって、培地を長期的に利用できる。希酸の使用および防腐剤の添加により、新たに発生する微生物によるＴＳＯ懸濁液の再汚染を防ぐことができる。新たに発生する微生物の増殖は、ＴＳＯ懸濁液の不活性化および保存を組み合わせた上述の方法によって回避される。このように、この極めて温和な方法は、強酸の使用に基づく方法よりも明らかな利点がある。
【実施例４】
【００４０】
様々な微生物のコロニー数の測定
ｐＨ２からｐＨ４へのｐＨ上昇および防腐剤の添加
実施例４ａ〜４ｅの実験条件：
各実施例において、各試料は、ｐＨ４のリン酸緩衝液中に、０．２％安息香酸、０．１％ソルビン酸、１５％プロピレングリコールのいずれか、および１０，０００ＴＳＯ／ｍｌ（±１０％）を含むものであった。これらの試料に、以下の微生物を加えた。：
−アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のみ
−シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）およびエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）をアスペルギルス・ニガーと併用
【００４１】
培養温度は２５℃とした。テストプレートを１〜７日後に評価した。次の結果が得られた：
【００４２】
【表４】
0005483731.tif 000005
【００４３】
【表５】
0005483731.tif 000006
【００４４】
【表６】
0005483731.tif 000007
【００４５】
【表７】
0005483731.tif 000008
【００４６】
【表８】
0005483731.tif 000009
【００４７】
真菌汚染が激しい場合、ソルビン酸、安息香酸および／またはｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルを使用するか、またはこれらの防腐剤とプロピレングリコールとを組み合わせて使用することが好ましい。
【００４８】
希酸および防腐剤を併用した微生物不活化のさらなる利点は、ＴＳＯ懸濁液をさらに利用する際に、新たに発生する微生物による再汚染を防ぐことができることである。該微生物の増殖は、ＴＳＯ懸濁液の不活性化および保存を組み合わせた上述の方法により回避される。
【００４９】
さらに発展させて患者に投与するために調製する場合、ｐＨを２〜７、好ましくは４〜６の範囲まで上げることが必要である。また、この第３ステップでは、適切な防腐剤の添加が必要である。使用する防腐剤は、経口投与に適していなければならない。この目的に適していることが確認されている防腐剤は、０．１〜０．２％ソルビン酸、０．１〜０．３％安息香酸、０．０２〜０．３％ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、あるいは５〜２０％プロピレングリコール水溶液である。また、上述の防腐剤の混合物も適している。
【００５０】
驚いたことに、虫卵の懸濁液における生存能力がこの浄化方法により悪影響を受けないことが判明した。
【実施例５】
【００５１】
虫卵の生存能力
４０，０００虫卵／ｍｌの未成熟卵を、種類の異なる培地中で懸濁し、幼虫形成させた（２２〜２５℃）。６０日および９０日間かけて幼虫形成させた後、各々の懸濁液を顕微鏡下で観察し、幼虫形成率（ｅｍｂｒｙｏｎａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ：ＥＣ）を、虫卵総数および形態学的に無傷な幼虫包蔵卵数に基づいて計算した。幼虫形成率は虫卵の生存能力の指標である。幼虫形成初期には、未成熟卵のみが存在するため、幼虫形成率はゼロである。幼虫形成率は幼虫形成期間中に増加し、選択した培養条件において６０日以降で最大に達する。概して、９０％程度の数値が得られる。
【００５２】
【表９】
0005483731.tif 000010
【００５３】
６０日間かけて幼虫形成させた後、すべての培地において、幼虫包蔵卵が９０％以上の割合を占めることが確認された。さらに３０日間かけて幼虫形成させた後、防腐剤含有培地においては、防腐剤の濃度に関わらず、幼虫形成率は減少しなかった。一方、硫酸のｐＨが０．５である場合は、幼虫包蔵卵の割合の低下を早くも確認することができる。したがって、経口摂取可能な防腐剤、好ましくはソルビン酸およびその塩の添加により、虫卵に無害なｐＨ価の利用が可能となる。したがって、本方法は安定保存に適した医薬品の製造に使用することができる（温和な方法）。
【００５４】
さらに発展させて調製する場合、ｐＨを２〜７、好ましくは４〜６の範囲まで上げ、適切な防腐剤の添加が必要である。使用する防腐剤は経口投与に適していなければならない。この目的に適していることが確認されている防腐剤は、０．１〜０．２％ソルビン酸、０．１〜０．３％安息香酸あるいは５〜２０％プロピレングリコール水溶液である。また、上述の防腐剤の混合物も適している。