(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのキットであって、
非メチル化シトシン変換処理を行なう対象である生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットと、
前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットと
を含有し、
前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体の同一染色体上に存在する塩基配列であり、
前記生体ＤＮＡががん細胞のＤＮＡであるキット。
【請求項２】
前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体ＤＮＡの塩基配列において、３００ｂｐ以内の塩基配列内に含まれる、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
第１プライマーセットに含まれる少なくとも一つのプライマーが、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸にハイブリダイズするプライマーである請求項１又は２に記載のキット。
【請求項４】
第２プライマーセットに含まれる少なくとも一つのプライマーが、第１プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである請求項１又は２に記載のキット。
【請求項５】
非メチル化シトシン変換処理が、亜硫酸水素塩によるＤＮＡの処理である、請求項１〜４のいずれかに記載のキット。
【請求項６】
シトシン以外の塩基が、ウラシルである、請求項１〜５のいずれかに記載のキット。
【請求項７】
前記生体ＤＮＡが、ヒトのゲノムＤＮＡである、請求項１〜６のいずれかに記載のキット。
【請求項８】
第１プライマーセットが、配列番号：１に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、請求項１〜７のいずれかに記載のキット。
【請求項９】
第２プライマーセットが、配列番号：３に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、請求項１〜８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
（Ａ）  生体から採取したがん細胞に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における、前記生体ＤＮＡの非メチル化シトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸の割合を算出する工程、及び
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた算出結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程、
を含み、
前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体の同一染色体上に存在する塩基配列である、
非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定する方法。
【請求項１１】
（Ａ）  生体から採取したがん細胞に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における、前記生体ＤＮＡの非メチル化シトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸の割合を算出する工程、
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた算出結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程、及び
（Ｆ）  前記工程（Ｅ）において、前記工程（Ａ）が適切に行なわれていると判定された場合に、前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料を用いてメチル化ＤＮＡの解析を行なう工程、
を含み、
前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体の同一染色体上に存在する塩基配列である、
メチル化ＤＮＡの解析方法。
【請求項１２】
（Ａ）  生体から採取したがん細胞に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、及び
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程
を含み、
前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体の同一染色体上に存在し、
前記シトシンを含まない塩基配列及び前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列の何れもが、前記生体ＤＮＡの塩基配列において３００ｂｐ以内の塩基配列内に位置する、
非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定する方法。
【請求項１３】
（Ａ）  生体から採取したがん細胞に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、及び
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程
を含み、
前記第１プライマーセットによって増幅される核酸と、前記第２プライマーセットによって増幅される核酸との間に重複する領域がある、
非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定する方法。
【請求項１４】
前記第１プライマーセットが、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸にハイブリダイズするプライマーである前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸の相補鎖にハイブリダイズするプライマーをさらに含む請求項１〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
前記第１プライマーセットが、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸にハイブリダイズするプライマーである前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸の相補鎖にハイブリダイズするプライマーをさらに含む請求項１０、１２及び１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記第１プライマーセットが、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸にハイブリダイズするプライマーである前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸の相補鎖にハイブリダイズするプライマーをさらに含む請求項１１に記載のメチル化ＤＮＡの解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのキット及び方法、並びにそれを用いたメチル化ＤＮＡの解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト等の高等真核生物の染色体ＤＮＡにおいて、ＣＧジヌクレオチド配列からなるＣｐＧ部位のシトシンは、メチル化されていることがある。このＣｐＧ部位のシトシンのメチル化は、遺伝子の発現制御機構として機能している。例えば、遺伝子のプロモーター領域には、ＣｐＧ部位を多く含む領域が存在しており、この遺伝子のプロモーター領域におけるシトシンのメチル化の有無により、当該遺伝子のＤＮＡからの転写のオン・オフが制御されている。【０００３】
ＤＮＡのメチル化による遺伝子発現の制御は、初期胚発生、組織特異的な遺伝子の発現、遺伝子刷り込み、Ｘ染色体の不活性化、染色体の安定化、ＤＮＡ複製のタイピング等の事象において、重要な役割を果たしている。また、ＤＮＡのメチル化は、がん等の疾患に大きく関与している可能性が報告されている。【０００４】
上記のＤＮＡのメチル化を解析する方法として、一般的にメチル化特異的ＰＣＲ法やバイサルファイトシークエンシング法が用いられている。これらの方法では、解析対象のＤＮＡのメチル化されていないシトシン（非メチル化シトシン）を、非メチル化シトシンを別の塩基に変換する試薬（非メチル化シトシン変換剤）である亜硫酸水素塩を用いて、別の塩基に変換する処理（非メチル化シトシン変換処理）を行なう。メチル化特異的ＰＣＲ法は、非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡを用いて、シトシンが別の塩基に変換された場合のプライマーセット及びシトシンが別の塩基に変換されなかった場合のプライマーセットそれぞれによりポリメラーゼ連鎖反応を行ない、増幅産物の有無を調べることにより、ＤＮＡのメチル化を解析する。また、バイサルファイトシークエンシング法では、非メチル化シトシン変換処理後のＤＮＡの塩基配列を決定することにより、ＤＮＡのメチル化を解析する。【０００５】
したがって、メチル化特異的ＰＣＲ法やバイサルファイトシークエンシング法では、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていないと、メチル化ＤＮＡを正確に検出することができない。そのため、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定することは、正確なメチル化ＤＮＡの検出を行なううえで必要である。【０００６】
なお、特許文献１には、重亜硫酸塩処理が適切に行われているか否かを確認するプライマーとして、ＣＧ配列を含まない領域に基づき設計され、かつ塩基配列中のシトシンをチミンに変換した塩基配列を有するプライマーが開示されている。
【特許文献１】特開２００５−５８２１７号公報
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを、正確に判定することができるキット及び方法を提供することを目的とする。また、本発明は、メチル化ＤＮＡを、正確に、かつ効率よく解析することができるメチル化ＤＮＡの解析方法を提供することを他の目的とする。
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのキットであって、
非メチル化シトシン変換処理を行なう対象である生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットと、
前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットと
を含有し、
前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体の同一染色体上に存在する塩基配列であり、
前記生体ＤＮＡががん細胞のＤＮＡである、前記キット、
（２）前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体ＤＮＡの塩基配列において、３００ｂｐ以内の塩基配列内に含まれる、前記（１）に記載のキット、
（３）第１プライマーセットに含まれる少なくとも一つのプライマーが、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸にハイブリダイズするプライマーである前記（１）又は（２）に記載のキット、
（４）第２プライマーセットに含まれる少なくとも一つのプライマーが、第１プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーである前記（１）又は（２）に記載のキット、
（５）非メチル化シトシン変換処理が、亜硫酸水素塩によるＤＮＡの処理である、前記（１）〜（４）のいずれかに記載のキット、
（６）シトシン以外の塩基が、ウラシルである、前記（１）〜（５）のいずれかに記載のキット、
（７）前記生体ＤＮＡが、ヒトのゲノムＤＮＡである、前記（１）〜（６）のいずれかに記載のキット、
（８）第１プライマーセットが、配列番号：１に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、前記（１）〜（７）のいずれかに記載のキット、
（９）第２プライマーセットが、配列番号：３に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセットである、前記（１）〜（８）のいずれかに記載のキット、
（１０）（Ａ）  生体から採取したがん細胞に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における、前記生体ＤＮＡの非メチル化シトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸の割合を算出する工程、及び
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた算出結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程、
を含み、
前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体の同一染色体上に存在する塩基配列である、
非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定する方法、
（１１）（Ａ）  生体から採取したがん細胞に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における、前記生体ＤＮＡの非メチル化シトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸の割合を算出する工程、
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた算出結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程、及び
（Ｆ）  前記工程（Ｅ）において、前記工程（Ａ）が適切に行なわれていると判定された場合に、前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料を用いてメチル化ＤＮＡの解析を行なう工程、
を含み、
前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体の同一染色体上に存在する塩基配列である、
メチル化ＤＮＡの解析方法、
（１２）（Ａ）  生体から採取したがん細胞に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、及び
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程
を含み、
前記シトシンを含まない塩基配列と、前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体の同一染色体上に存在し、
前記シトシンを含まない塩基配列及び前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列の何れもが、前記生体ＤＮＡの塩基配列において３００ｂｐ以内の塩基配列内に位置する、
非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定する方法、
（１３）（Ａ）  生体から採取したがん細胞に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、及び
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程
を含み、
前記第１プライマーセットによって増幅される核酸と、前記第２プライマーセットによって増幅される核酸との間に重複する領域がある、
非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定する方法、
（１４）前記第１プライマーセットが、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸にハイブリダイズするプライマーである前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸の相補鎖にハイブリダイズするプライマーをさらに含む前記（１）〜（９）のいずれかに記載のキット、
（１５）前記第１プライマーセットが、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸にハイブリダイズするプライマーである前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸の相補鎖にハイブリダイズするプライマーをさらに含む前記（１０）、（１２）及び（１３）のいずれかに記載の方法、並びに
（１６）前記第１プライマーセットが、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸にハイブリダイズするプライマーである前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸の相補鎖にハイブリダイズするプライマーをさらに含む前記（１１）に記載のメチル化ＤＮＡの解析方法
に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の判定方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図２】本発明の解析方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図３】実施例１において、分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を算出した結果を示すグラフである。
【図４】（Ａ）は、配列番号：７に示される塩基配列における、核酸量確認用プライマーセット１及び変換処理確認用プライマーセット２の各プライマーの結合領域を示す概略説明図である。（Ｂ）は、配列番号：８に示される塩基配列における、核酸量確認用プライマーセット１及び変換処理確認用プライマーセット２の各プライマーの結合領域を示す概略説明図である。
【図５】試験例１において、分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を算出した結果を示すグラフである。
【図６】実施例２において、分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を算出した結果を示すグラフである。
【図７】実施例３において、分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を算出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、１つの側面では、非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定するためのキットであって、非メチル化シトシン変換処理を行なう対象である生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む、複数のプライマーで構成される第１プライマーセットと、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを含有しているキットに関する。
【００１１】
本発明のキットは、前記第１プライマーセットと第２プライマーセットとを含有している。前記第１プライマーセットは、非メチル化シトシン変換試料中の全核酸の量に関する情報を、非メチル化シトシン変換処理の影響を実質的に受けることなく正確に求めることができるプライマーセットである。また、前記第２プライマーセットは、前記非メチル化シトシン変換試料中の全核酸のうち、非メチル化シトシン変換処理により非メチル化シトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸の量に関する情報を、正確に求めることができるプライマーセットである。したがって、本発明のキットは、全核酸中に含まれる、非メチル化シトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸の割合を正確に求めることができるため、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを、正確に判定することができるという優れた効果を奏する。【００１２】
本明細書において、「メチル化シトシン」とは、シトシンの５位がメチル化されたシトシンを示す。また、「非メチル化シトシン」とは、シトシンの５位がメチル化されていないシトシンを示す。【００１３】
本明細書において、シトシン以外の塩基としては、例えば、ウラシル、チミン、アデニン、グアニン等が挙げられる。なお、後述する亜硫酸水素塩を用いて非メチル化シトシン変換処理を行なった場合においては、前記シトシン以外の塩基は、ウラシルである。【００１４】
本明細書において、「非メチル化シトシン変換処理」とは、ＤＮＡに含まれる非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する処理を意味する。また、非メチル化シトシン変換処理は、非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する非メチル化シトシン変換剤とＤＮＡとを接触させることにより行なわれる。以下、前記非メチル化シトシン変換処理により非メチル化シトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸を、変換核酸ともいう。【００１５】
本明細書において、「非メチル化シトシン変換試料」とは、非メチル化シトシン変換処理により得られた試料を意味する。非メチル化シトシン変換剤としては、非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する薬剤であれば、特に限定されるものではない。例えば、亜硫酸水素塩等が挙げられる。亜硫酸水素塩としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸水素カリウム等が挙げられる。非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩を用いた場合、非メチル化シトシンは、ウラシルに変換される。【００１６】
本明細書において、生体ＤＮＡは、生体から調製されたＤＮＡであれば、特に限定されるものではない。生体ＤＮＡは、血液、リンパ球、尿、生検より採取された組織等から調製することができる。本発明において、前記生体ＤＮＡは、ヒトのゲノムＤＮＡが好ましく、特に癌細胞のＤＮＡが好ましい。癌細胞のＤＮＡには、ＤＮＡのメチル化異常が観察されることが多い。前記非メチル化シトシン変換処理によりＤＮＡのメチル化異常を検出するに際して、本発明のキットを用いた場合、前記非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていることを確認することができるので、癌細胞のＤＮＡのメチル化ＤＮＡの解析をより正確に行うことができる。【００１７】
本明細書において、「ハイブリダイズ」とは、プライマーが、核酸とストリンジェントな条件下にハイブリダイズすることをいう。プライマーが核酸にハイブリダイズした状態は、プライマーと核酸が互いに相補的な塩基配列でアニーリングした状態である。プライマーが核酸にハイブリダイズすることで、核酸増幅反応を進行させるに適した状態となる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、すなわち、プライマーと標的の核酸とのハイブリダイゼーションを行なう際に当業者が一般的に用いる条件である。より具体的には、第１プライマー及び第２プライマーが、非メチル化シトシン変換処理後の生体ＤＮＡとハイブリダイズすることができる条件であれば特に限定されない。ハイブリダイゼーション時のストリンジェンシーは、温度、塩濃度、プライマーの鎖長、プライマーの塩基配列のＧＣ含量及びハイブリダイゼーション緩衝液中のカオトロピック剤の濃度の関数であることが知られている。ストリンジェントな条件としては、例えば、Sambrook, J. et al. (1998) Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd ed.), ColdSpringHarborLaboratory Press, New Yorkに記載された条件等を用いることができる。【００１８】
第１プライマーセット及び第２プライマーセットは、核酸増幅反応により核酸を増幅するためのプライマーセットである。核酸増幅反応は、核酸増幅法により行なうことができる。かかる核酸増幅法は、増幅産物の量を定量的に測定できる方法であれば、特に限定されない。前記核酸増幅法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）法、転写増幅法等が挙げられる。ＰＣＲ法は、慣用の手法により実施することができる。鎖置換反応法としては、例えば、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ（登録商標）法、ＳＭＡＰ法等が挙げられる。転写増幅法としては、例えば、ＴＡＳ法等が挙げられる。なお、第１プライマーセットを用いた核酸増幅反応及び第２プライマーセットを用いた核酸増幅反応では、亜硫酸水素塩による非メチル化シトシン変換処理により生じたウラシルは、チミンに変換される。【００１９】
第１プライマーセット及び第２プライマーセットは、使用する核酸増幅法の種類に応じて、公知の方法で設計することができる。例えば、市販のプライマー設計用ソフトウエアに、後述する各プライマーセットの条件を入力することで、容易に各プライマーセットを設計することができる。定量的ＰＣＲ法であるリアルタイムＰＣＲ法に用いるプライマーセットを設計するためのソフトウエアとしては、例えば、ＧＥＮＥＴＹＸやｐｒｉｍｅｒ３等が挙げられる。また、鎖置換反応法であるＬＡＭＰ法に用いるプライマーセットを設計するためのソフトウエアとしては、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ等が挙げられる。設計された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを公知の方法で合成することにより、各プライマーセットのプライマーを得ることができる。なお、各プライマーセットを構成するプライマーの数は、使用する核酸増幅法の種類に応じて異なる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法であれば、各プライマーセットは、それぞれ２つのプライマーで構成される。ＬＡＭＰ法であれば、各プライマーセットは、それぞれ少なくとも４つのプライマーで構成される。【００２０】
前記プライマーセットが、ＰＣＲ法に用いられるプライマーセットである場合、フォワードプライマーとリバースプライマーのＴｍ値の差は、好ましくは２℃以内が望ましい。また、プライマーセットの各プライマーの塩基配列のＧＣ含量は、好ましくは４０〜６０％が望ましい。プライマーセットの１つのプライマーの塩基配列中において、グアニンは４以上連続していないことが望ましい。プライマーセットの各プライマーの長さは、１０〜４０ヌクレオチド長が望ましく、特に好ましくは１５〜３５ヌクレオチド長が望ましい。なお、かかるプライマーセットを用いてＰＣＲ法を行なう場合、ＰＣＲの際のアニーリング温度を、好ましくはプライマーセットの各プライマーのＴｍに近い温度に設定することが望ましい。【００２１】
本発明における第１プライマーセットは、非メチル化シトシン変換処理を行なう対象である生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む、複数のプライマーで構成されている。シトシンを含まない塩基配列からなる核酸では、非メチル化シトシン変換処理により変換されるシトシンが存在せず、塩基配列が変換されない。したがって、第１プライマーセットに含まれるプライマーは、非メチル化シトシン変換処理の影響を実質的に受けることなく前記核酸にハイブリダイズすることができる。よって、非メチル化シトシン変換試料に含まれる核酸を鋳型とし、第１プライマーセットを用いた核酸増幅反応により得られた増幅産物の量を測定することで、非メチル化シトシン変換試料に含まれる全核酸の量に関する正確な情報を取得することができる。なお、生体ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを用いる場合の具体的な第１プライマーセットとしては、例えば、配列番号：１に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：２に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット等が挙げられる。
【００２２】
本発明における第２プライマーセットは、生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成されている。上述のように、シトシンのメチル化は、ＣｐＧ部位のシトシンに生じるため、生体ＤＮＡにおいて、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列は、メチル化シトシンを含むことは無い。したがって、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列からなる生体ＤＮＡでは、非メチル化シトシン変換処理により全てのシトシンがシトシン以外の塩基に変換され、塩基配列が変換されることになる。よって、第２プライマーセットに含まれるプライマーは、非メチル化シトシン変換処理により、ハイブリダイズの対象となる生体ＤＮＡのシトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸に相補的にハイブリダイズすることができる。しかし、ハイブリダイズの対象となる生体ＤＮＡのシトシンがシトシン以外の塩基に変換されていない核酸では、第２プライマーセットに含まれるプライマーは、シトシンがシトシン以外の塩基に変換されなかった部分に相補的にハイブリダイズすることができない。結果として、非メチル化シトシン変換処理により、ハイブリダイズの対象となる生体ＤＮＡのシトシンがシトシン以外の塩基に変換された場合、第２プライマーセットと非メチル化シトシン変換試料とを用いた核酸増幅反応により増幅産物が効率的に生成される。一方、ハイブリダイズの対象となる生体ＤＮＡのシトシンがシトシン以外の塩基に変換されなかった場合、効率的な増幅産物の生成が行なわれない。よって、非メチル化シトシン変換試料に含まれる核酸を鋳型とし、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により得られた増幅産物の量を測定することで、非メチル化シトシン変換試料に含まれる変換核酸の量に関する正確な情報を取得することができる。生体ＤＮＡとしてヒトゲノムＤＮＡを用いる場合の具体的な第２プライマーセットとしては、例えば、配列番号：３に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマーとからなるプライマーセット等が挙げられる。【００２３】
なお、第２プライマーセットのプライマーの３’末端側の配列、特に３’末端が、非メチル化シトシン変換処理により変換された塩基と相補的であることが好ましい。プライマーの３’末端側に、鋳型となる核酸と相補的ではない部分が存在すると、核酸増幅反応の効率が低下する。つまり、第２プライマーセットのプライマーの３’末端側を、非メチル化シトシン変換処理により変換された塩基と相補的になるように設計すれば、生体ＤＮＡのシトシンがシトシン以外の塩基に変換されなかった核酸を鋳型とした場合、核酸増幅反応の効率が低下する。したがって、第２プライマーセットによれば、非メチル化シトシン変換試料に含まれる変換核酸を鋳型とした、より特異的な核酸増幅反応が可能となる。結果として、上記のように設計されたプライマーを有する第２プライマーセットを用いた核酸増幅により得られた増幅産物の量を測定することで、より正確な非メチル化シトシン変換試料に含まれる変換核酸の量に関する情報を取得することができる。【００２４】
なお、癌細胞では、一部の染色体の数が異常に増える染色体異常を起こす場合がある。そのため、第１プライマーセット及び第２プライマーセットが、それぞれ異なる染色体のＤＮＡを非メチル化シトシン変換処理して得られる核酸を鋳型とするプライマーセットである場合、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを正確に判定できないことがある。したがって、前記生体の同一染色体のＤＮＡを非メチル化シトシン変換処理して得られる核酸が、第１プライマーセットと第２プライマーセットの両方の鋳型となることが好ましい。すなわち、本発明においては、生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列と、前記生体ＤＮＡ中におけるシトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列とが、前記生体の同一染色体上に存在する塩基配列であることが好ましい。このように、第１プライマーセットと第２プライマーセットが、同一染色体を由来とする核酸を鋳型とするプライマーセットである場合、染色体数に異常を起こした癌細胞のＤＮＡを非メチル化シトシン変換処理して得られる核酸を用いた場合であっても、正確に非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定することができる。【００２５】
また、癌細胞では、その他の染色体異常、例えば、欠失、逆位、特定配列のコピー数の増減等を起こす場合がある。そのため、第１プライマーセット及び第２プライマーセットの一方の鋳型となる核酸が、染色体異常を起こした領域に由来する場合、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを正確に判定できないことがある。したがって、第１プライマーセット及び第２プライマーセットは、核酸増幅反応において、非メチル化シトシン変換試料に含まれる核酸中の互いに近い領域を鋳型とするものであることが好ましい。具体的には、非メチル化シトシン変換処理の対象となる生体ＤＮＡの塩基配列において、第１プライマーセットに含まれる少なくとも１つのプライマーと相補的な前記シトシンを含まない塩基配列と、第２プライマーセットに含まれる少なくとも１つのプライマーと相補的な前記シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列とが、３００ｂｐ以内の塩基配列内に含まれることが好ましい。つまり、非メチル化シトシン変換試料に含まれる核酸の塩基配列において、第１プライマーセットに含まれる少なくとも１つのプライマーがハイブリダイズする塩基配列と、第２プライマーセットに含まれる少なくとも１つのプライマーがハイブリダイズする塩基配列とが、３００ｂｐ以内の塩基配列内に含まれることが好ましい。【００２６】
さらに、第１プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸と第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸との間に、重複する領域があることで、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かの判定に対する染色体異常の影響をより軽減することができる。すなわち、非メチル化シトシン変換試料及び第１プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸の塩基配列と、非メチル化シトシン変換試料及び第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸の塩基配列には、同一の塩基配列が存在することが好ましい。より具体的には、
〔１〕第１プライマーセットに含まれる少なくとも１つのプライマーが、第２プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸にハイブリダイズするプライマーであること、又は
〔２〕第２プライマーセットに含まれる少なくとも１つのプライマーが、第１プライマーセットを用いた核酸増幅により増幅される核酸のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーであること、
が好ましい。【００２７】
本発明のキットにおいては、第１プライマーセットの各プライマー及び第２プライマーセットの各プライマーは、それぞれ別の容器に入れて提供することができる。プライマーは、乾燥した状態で提供してもよく、溶媒に溶解させた状態で提供してもよい。プライマーを溶解させる溶媒としては、ヌクレアーゼフリーの精製水（例えば、ＰＣＲグレードの水）や核酸を安定に保持するに適した緩衝液が挙げられる。核酸を安定に保持するに適した緩衝液としては、例えば、熱処理され、ヌクレアーゼ、微生物等を不活化させたＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕等が挙げられる。【００２８】
本発明のキットに含まれる第１プライマーセット及び第２プライマーセットは、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かの判定に好適に使用することができる。本発明には、かかる第１プライマーセット及び第２プライマーセットを用いて非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定する方法も含まれる。【００２９】
本発明の非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定する方法（以下、「本発明の判定方法」ともいう）は、
（Ａ）  試料に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む、複数のプライマーで構成される第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における、前記生体ＤＮＡの非メチル化シトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸（変換核酸）の割合を算出する工程、及び
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた算出結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程、
を含むことを特徴としている。
【００３０】
本発明の判定方法は、非メチル化シトシン変換試料におけるＤＮＡ量の測定のために、非メチル化シトシン変換試料と第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応が行なわれているとともに、非メチル化シトシン変換試料における変換核酸の量の測定のために、非メチル化シトシン変換試料と第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応が行なわれている点に１つの大きな特徴がある。【００３１】
図１に本発明の判定方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。【００３２】
本発明の判定方法では、まず、試料に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る（ステップＳ１）。ステップＳ１は、前記工程（Ａ）に該当する。【００３３】
生体ＤＮＡを含有する試料は、公知の方法により得ることができる。例えば、生体の組織や細胞から、ＤＮＡを抽出し、水や緩衝液に溶解して生体ＤＮＡを含む試料を調製することができる。ＤＮＡの抽出は、例えば、フェノール抽出法、フェノール・クロロホルム抽出法等の公知の方法の他、市販のＤＮＡ抽出用キットを使用して行なうことができる。ＤＮＡを溶解するための水や緩衝液としては、溶解したＤＮＡを安定に保持することができるものが好ましい。前記ＤＮＡを溶解するための水や緩衝液としては、例えば、ヌクレアーゼを含まないＰＣＲグレードの水や、ＴＥ緩衝液〔組成：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ〕等が挙げられる。【００３４】
試料に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンの変換は、前述の非メチル化シトシン変換剤と生体ＤＮＡとを接触させる非メチル化シトシン変換処理により行なうことができる。非メチル化シトシン変換剤として、亜硫酸水素塩を用いる場合、前述のように、メチル化シトシンは、変換されず、非メチル化シトシンは、ウラシルに変換される。【００３５】
ステップＳ１では、例えば、亜硫酸水素塩である亜硫酸水素ナトリウムを用いる非メチル化シトシン変換処理の場合、生体ＤＮＡを含有した試料に亜硫酸水素ナトリウム溶液を添加し、適切な温度条件下にインキュベーションすることにより、生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをウラシルに変換することができる。生体ＤＮＡを含有した試料への亜硫酸水素塩の添加量は、亜硫酸水素塩と生体ＤＮＡとを含む未反応の混合物における亜硫酸水素塩の濃度として３Ｍ以上となる量であることが好ましい。前記非メチル化シトシン変換処理では、例えば、生体ＤＮＡ  ２μｇを含有した試料に対して、終濃度５Ｍとなるように、亜硫酸水素ナトリウム溶液を添加する場合、亜硫酸水素ナトリウム溶液と生体ＤＮＡを含有した試料との反応時間は、４０分〜１６時間、反応温度は、５０℃〜８０℃とすることができる。なお、非メチル化シトシン変換処理の反応条件は、上記の反応条件に限定されるものではなく、適宜設定することができる。【００３６】
次に、ステップＳ１で得られた非メチル化シトシン変換試料を用いて、第１プライマーセットでの核酸増幅反応（ステップＳ２）及び第２プライマーセットで核酸増幅反応（ステップＳ３）を行なう。ステップＳ２は、工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）に該当する。また、ステップＳ３は工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉｉ）に該当する。前記ステップＳ２の核酸増幅反応は、全核酸量の確認のためのものであり、前記ステップＳ３の核酸増幅反応は、変換核酸の量の確認のためのものである。【００３７】
ステップＳ２及びステップＳ３の核酸増幅反応は、上述した核酸増幅法、例えば、ＰＣＲ法、鎖置換反応法、ＬＣＲ法、転写増幅法等により行なわれる。かかる核酸増幅法のなかでは、後述する増幅産物の測定が迅速かつ簡便にできる観点から、前記ＰＣＲ法の１つであるリアルタイムＰＣＲ及び前記鎖置換反応法の１つであるリアルタイムＬＡＭＰが好ましい。ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法により核酸を増幅すると、核酸の増幅に伴って反応液の光学的状態（濁度、吸光度、蛍光強度等）が変化する。したがって、前記リアルタイムＰＣＲ法や、リアルタイムＬＡＭＰ法では、この光学的状態を、リアルタイムに測定することにより、増幅産物の量を定量的に測定することができる。【００３８】
次に、ステップＳ２及びステップＳ３の核酸増幅反応で得られた増幅産物の量を測定する（ステップＳ４）。ステップＳ４は、工程（Ｃ）に該当する。【００３９】
上記のステップＳ２及びステップＳ３における核酸増幅法として、リアルタイムＰＣＲ法を用いた場合、増幅産物のＤＮＡをリアルタイムでモニタリングし、指数関数的増幅領域で、該ＤＮＡの定量を行なうため、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅速度論に基づき、正確に、該ＤＮＡを定量することができる。リアルタイムＰＣＲ法としては、蛍光を発するインターカレーターを用いるインターカレーター法、及び増幅産物の配列に特異的な蛍光色素標識オリゴヌクレオチドからなるプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、サイクリングプローブ等）を用いるプローブ法が挙げられる。これらのなかでは、増幅産物の検出及び定量を簡便に行なうことができる観点から、インターカレーター法が好ましい。インターカレーター法では、インターカレーターは、ポリメラーゼ連鎖反応により合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する物質である。インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡとして得られる増幅産物に結合しているインターカレーターの蛍光に基づく蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。インターカレーターとしては、例えば、モレキュラープローブインコーポレーティッド製ＳＹＢＲ（登録商標）  ｇｒｅｅｎ等が挙げられる。【００４０】
上記のステップＳ２及びステップＳ３における核酸増幅法として、リアルタイムＬＡＭＰ法を用いた場合、核酸の増幅に伴い副産物として生成されるピロリン酸マグネシウムを増幅産物の指標として測定することができる。より具体的には、ピロリン酸マグネシウムは、水に対して不溶であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液の濁度（又は吸光度）をリアルタイムで光学的に測定することにより、増幅産物の量を定量的に測定することができる。また、リアルタイムＬＡＭＰ法においても、上記インターカレーター法を用いることができる。【００４１】
なお、ステップＳ４では、増幅産物の量は、検量線に基づき算出される。前記検量線は、公知の方法により作成することができる。前記検量線は、例えば、標準ＤＮＡと各プライマーセットとを用いた核酸増幅反応を行ない、それぞれ増幅産物の量をリアルタイムにモニタリングすることにより得られた増幅曲線、標準ＤＮＡのコピー数、反応のサイクル数等から作成することができる。【００４２】
次に、ステップＳ４における増幅産物の量の測定結果に基づいて、非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における変換核酸の割合を算出する（ステップＳ５）。ステップＳ５は、工程（Ｄ）に該当する。【００４３】
非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における変換核酸の割合は、例えば下記式（１）：【００４４】
〔第２プライマーセットを用いた核酸増幅反応（ｉｉ）の増幅産物の量〕／〔第１プライマーセットを用いた核酸増幅反応（ｉ）の増幅産物の量〕×１００（％）            （１）【００４５】
に従って算出することができる。【００４６】
次に、ステップＳ５の算出結果に基づいて、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定する（ステップＳ６）。ステップＳ６は、工程（Ｅ）に該当する。【００４７】
上記の式（１）で、非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における変換核酸の割合を算出した場合、算出結果が１００％に近いほど、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていると判定することができる。一方、算出結果が、０％に近いほど、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていないと判定することができる。また、閾値を設定し、閾値よりも算出結果が高い場合に非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていると判定し、閾値よりも算出結果が低い場合に非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていないと判定することもできる。ここで、閾値は、非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における変換核酸の割合と、その非メチル化シトシン変換試料を用いたメチル化ＤＮＡの解析結果に関するデータの蓄積とから導き出すことができる。閾値は、データの蓄積量、核酸増幅反応の種類、使用する各プライマーセットの種類、及び非メチル化シトシン変換処理の反応条件等により変動しえるが、例えば、５％〜２５％、好ましくは１０％〜２０％に設定することができる。【００４８】
本発明の判定方法は、本発明のキットを用いることにより、簡単に行なうことができる。【００４９】
本発明のキット及び本発明の判定方法によれば、メチル化ＤＮＡの解析に際して行なわれる非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定することができる。したがって、本発明のキット及び判定方法を使用することにより、メチル化ＤＮＡの解析を正確に行なうことができる。よって、本発明には、メチル化ＤＮＡの解析方法も含まれる。【００５０】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析方法は、
（Ａ）  試料に含まれる生体ＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換して、非メチル化シトシン変換試料を得る工程、
（Ｂ）  下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む、複数のプライマーで構成される第１プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ）前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料と、前記生体ＤＮＡの塩基配列における、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のシトシンがシトシン以外の塩基に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする、複数のプライマーで構成される第２プライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｃ）  前記工程（Ｂ）の核酸増幅反応（ｉ）で得られた増幅産物の量と、核酸増幅反応（ｉｉ）で得られた増幅産物の量とを測定する工程、
（Ｄ）  前記工程（Ｃ）で得られた測定結果に基づいて、前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料中に含まれる全ての核酸における、前記生体ＤＮＡの非メチル化シトシンがシトシン以外の塩基に変換された核酸の割合を算出する工程、
（Ｅ）  前記工程（Ｄ）で得られた算出結果に基づいて、前記工程（Ａ）が適切に行なわれたか否かを判定する工程、及び
（Ｆ）  前記工程（Ｅ）において、前記工程（Ａ）が適切に行なわれていると判定された場合に、前記工程（Ａ）で得られた非メチル化シトシン変換試料を用いてメチル化ＤＮＡの解析を行なう工程、
を含む。
【００５１】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析方法は、メチル化ＤＮＡの解析に先立って、上述の判定方法を用いて、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたか否かを判定し、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれた場合にメチル化ＤＮＡの解析を行なう点に１つの大きな特徴がある。したがって、本発明のメチル化ＤＮＡの解析方法は、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれた非メチル化シトシン変換試料をメチル化の解析に用いるため、メチル化ＤＮＡを、正確に、かつ効率よく解析することができるという優れた効果を奏する。【００５２】
図２に本発明の解析方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。【００５３】
前記工程（Ａ）〜（Ｅ）は、本発明の判定方法の操作と同様である。また、図２のステップＳ７〜Ｓ１２は、図１のステップＳ１〜Ｓ６の操作と同様である。【００５４】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析方法では、ステップＳ１２〔工程（Ｅ）〕において、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていると判定された場合に、非メチル化シトシン変換試料を用いてメチル化ＤＮＡの解析を行なう（ステップＳ１３）。なお、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていない場合は、ステップＳ７〔工程（Ａ）〕に戻り、非メチル化シトシン変換試料を得る操作から再度行なえばよい。【００５５】
メチル化ＤＮＡの解析は、例えば、メチル化特異的ＰＣＲ法、非メチル化シトシン変換試料中の核酸の塩基配列を解析する方法、及び疾患関連遺伝子のＤＮＡ、転写因子のＤＮＡ、発現制御因子のＤＮＡ、プロモーター領域のＤＮＡ等を固定化したＤＮＡチップを用いた解析方法等により行なわれる。ＤＮＡチップとしては、遺伝子の発現情報で、解読済みのゲノムデータから等間隔に抜き出した塩基配列を検出用プローブとしてタイル状に固定化したタイリングアレイが好ましい。【００５６】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析方法では、適切な非メチル化シトシン変換試料を用いてメチル化ＤＮＡの解析を行なうことができる。そのため、例えば、ＣｐＧ部位のメチル化に起因して生体内での動態が変化する遺伝子、疾患の発症、疾患状態の進行の指標となる因子、薬物の標的となる因子等のハイスループット解析やハイスループットスクリーニングを可能にすることができる。【００５７】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
（実験例１）
ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列に基づき、該ヒトゲノムＤＮＡの一部からなる塩基配列（配列番号：７）を標的配列とするプライマーセットとして、シトシンを含まない塩基配列からなる核酸にハイブリダイズするプライマーを含む２種のプライマーからなるプライマーセットを設計し、各プライマーを合成した。
【００５９】
その結果、配列番号：１に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号：２に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが得られた。得られたプライマーセットを、ヒト由来の試料中に含まれる全核酸の量を確認するためのプライマーセット（以下、「核酸量確認用プライマーセット１」という）とした。得られた核酸量確認用プライマーセット１のフォワードプライマー及びリバースプライマーそれぞれを、終濃度１０μＭとなるように、別々のヌクレアーゼフリーの精製水に溶解させ、核酸量確認用プライマーセット１のフォワードプライマー水溶液及びリバースプライマー水溶液を得た。【００６０】
また、ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列に基づき、シトシンを含みかつＣｐＧ部位を含まない塩基配列のうち、シトシンが、シトシン以外の他の塩基（ウラシル）に変換された塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする２種のプライマーからなるプライマーセットを設計し、各プライマーを合成した。【００６１】
その結果、配列番号：５に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号：６に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが得られた。得られたプライマーセットを、全核酸中に含まれる変換核酸の量を確認することにより、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていることを確認するためのプライマーセット（以下、「変換処理確認用プライマーセット１」という）とした。得られた変換処理確認用プライマーセット１のフォワードプライマー及びリバースプライマーそれぞれを、終濃度１０μＭとなるように、別々のヌクレアーゼフリーの精製水に溶解させ、変換処理確認用プライマーセットのフォワードプライマー水溶液及びリバースプライマー水溶液を得た。【００６２】
核酸量確認用プライマーセット１のフォワードプライマー水溶液及びリバースプライマー水溶液を、それぞれ、別々のヌクレアーゼフリーの容器に封入した。また、変換処理確認用プライマーセット１のフォワードプライマー水溶液及びリバースプライマー水溶液を、それぞれ、別々のヌクレアーゼフリーの容器に封入した。核酸量確認用プライマーセット１と変換処理確認用プライマーセット１との組み合わせを、実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットとした。【００６３】
（実施例１）
（分析用試料の調製）
ヒト正常乳腺組織由来ゲノムＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）２μｇに、０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３００μＬを添加し、得られた混合物を、３７℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後の産物に、１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液３００μＬを添加し、得られた混合物を８０℃で４０分間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。その後、亜硫酸水素塩処理により得られた産物に含まれる核酸を、核酸精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Columns）で精製し、分析用試料１を得た。【００６４】
前述の分析用試料１の調製方法で用いたヒト正常乳腺組織由来ゲノムＤＮＡとは異なる種類のヒト正常乳腺組織由来ゲノムＤＮＡ（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を用いて、同様の操作を行ない、分析用試料２を得た。【００６５】
（核酸量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量の測定）
つぎに、分析用試料１及び２それぞれにおいて、亜硫酸水素塩処理が適切に行なわれているかどうかを判定するために、実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いて、以下の定量的ＰＣＲを行なった。【００６６】
分析用試料１又は分析用試料２  １μＬに対して、核酸増幅用試薬〔ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製、商品名：FastStart SYBR Green Master Mix〕１２．５μＬと、実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットに含まれる核酸量確認用プライマーセット１のフォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、この核酸量確認用プライマーセット１のリバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと水９．５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。前記ＰＣＲ用反応液を用いて、定量的ＰＣＲを行なった。なお、定量的ＰＣＲにおける反応条件は、９５℃１０分間の保温後、９５℃３０秒間と６２℃３０秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行ない、つぎに、９５℃６０秒間と６２℃３０秒間と９５℃３０秒間とからなる反応を行なう条件である。【００６７】
核酸量確認用プライマーセット１を用いた定量的ＰＣＲによる増幅産物の量は、核酸量確認用プライマーセット１と、配列番号：９に示される塩基配列からなる標準ＤＮＡによる定量的ＰＣＲにより作成した検量線に基づき算出した。【００６８】
（変換核酸の量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量の測定）
つぎに、核酸量確認用プライマーセット１に代えて、実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットに含まれる変換処理確認用プライマーセット１を用いることを除き、同様の操作で定量的ＰＣＲを行なった。【００６９】
変換処理確認用プライマーセット１を用いた定量的ＰＣＲによる増幅産物の量は、変換処理確認用プライマーセットと、配列番号：１０に示される塩基配列からなる標準ＤＮＡとを用いた定量的ＰＣＲにより作成した検量線に基づき算出した。【００７０】
（全核酸中に含まれる変換核酸の量の割合の算出）
全核酸量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量と、変換核酸の量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量とから、式（２）：【００７１】
〔変換核酸の量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量〕／〔全核酸量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量〕×１００（％）            （２）【００７２】
に基づき、「分析用試料１又は分析用試料２に含まれる全核酸の量に対する変換核酸の量の割合」として、分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を算出した。その結果を図３に示す。図３中、バー１は、分析用試料１及び実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いた場合の結果を示す。バー２は、分析用試料２及び実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いた場合の結果を示す。【００７３】
図３に示される結果から、実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いることで、組織由来のＤＮＡについて、亜硫酸水素塩処理後の試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を求めることができることが明らかとなった。また、かかる結果より、前記分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合に基づき、ＤＮＡの亜硫酸水素塩処理等の非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれているかどうかを判定することができることが示唆される。【００７４】
（実験例２）
配列番号：７に示される塩基配列に基づき、ＣｐＧ部位を含まずシトシンを含む塩基配列のうち、シトシンがシトシン以外の他の塩基（ウラシル）に置換されている塩基配列からなる核酸にハイブリダイズする２種のプライマーからなるプライマーセットを設計し、各プライマーを合成した。【００７５】
その結果、配列番号：３に示される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号：４に示される塩基配列からなるリバースプライマーとからなるプライマーセットが得られた。得られたプライマーセットを、全核酸中に含まれる変換核酸の量を確認することにより、非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれていることを確認するためのプライマーセット（以下、「変換処理確認用プライマーセット２」という）とした。【００７６】
変換処理確認用プライマーセット２のフォワードプライマー及びリバースプライマーそれぞれを、終濃度１０μＭとなるように、別々のヌクレアーゼフリーの精製水に溶解させ、変換処理確認用プライマーセット２のフォワードプライマー水溶液及びリバースプライマー水溶液を得た。【００７７】
核酸量確認用プライマーセット１のフォワードプライマー水溶液及びリバースプライマー水溶液を、それぞれ、別々のヌクレアーゼフリーの容器に封入した。また、変換確認用プライマーセット２のフォワードプライマー水溶液及びリバースプライマー水溶液を、それぞれ、別々のヌクレアーゼフリーの容器に封入した。核酸量確認用プライマーセット１と変換確認用プライマーセット２との組み合わせを、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットとした。【００７８】
配列番号：７に示される塩基配列における、核酸量確認用プライマーセット１及び変換処理確認用プライマーセット２の各プライマーの結合領域を図４（Ａ）に示す。図４（Ａ）中、Ｇｅｃ−Ｆ結合領域は、核酸量確認用プライマーセット１のフォワードプライマーの結合領域を示す。Ｇｅｃ−Ｒ結合領域は、核酸量確認用プライマーセット１のリバースプライマーの結合領域を示す。ＢＳｃ−Ｆ結合領域は、変換処理確認用プライマーセット２のフォワードプライマーの結合領域を示す。ＢＳｃ−Ｒ結合領域は、変換処理確認用プライマーセット２のリバースプライマーの結合領域を示す。なお、変換処理確認用プライマーセット２の各プライマーの結合領域は、標的配列中のシトシンがウラシルに変換された核酸に各プライマーがハイブリダイズする領域として示している。【００７９】
（調製例１）
ＤＮＡ抽出キット（キアジェン社製、商品名：QIAmp Blood Maxi Kit）を用いて、乳癌細胞株ＭＣＦ７からゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡ  ２μｇに、０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３００μＬを添加し、得られた混合物を、３７℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後の産物に、１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液３００μＬを添加し、得られた混合物を８０℃で４０分間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。得られた産物に含まれる核酸を、核酸精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Columns）で精製し、調製例１の分析用試料を得た。【００８０】
（調製例２）
調製例１と同様の操作を行なうことにより乳癌細胞株ＭＣＦ７から抽出されたゲノムＤＮＡ  ２μｇに、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液５６μＬを添加し、得られた混合物を、３７℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後の産物に、０．１１ｇ／Ｌのヒドロキノン水溶液３０μＬと、３Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液５２０μＬとを添加し、得られた混合物を５０℃で１６時間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。得られた産物に含まれる核酸を、核酸精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Columns）で精製し、調製例２の分析用試料を得た。【００８１】
（試験例１）
調製例１の分析用試料及び調製例２の分析用試料の亜硫酸水素塩処理が適切に行なわれているかどうかを確認するために、実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キット又は実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用い、核酸量の確認のための定量的ＰＣＲ及び変換核酸の量の測定のための定量的ＰＣＲを行なった。【００８２】
（核酸量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量の測定）
核酸量の測定のための定量的ＰＣＲは、実施例１において、分析用試料１又は分析用試料２に代えて、調製例１の分析用試料又は調製例２の分析用試料を用いることを除き、実施例１と同様の操作を行なうことにより行なった。【００８３】
核酸量確認用プライマーセット１を用いた定量的ＰＣＲによる増幅産物の量は、核酸量確認用プライマーセット１と、配列番号：８に示される塩基配列からなる標準ＤＮＡによる定量的ＰＣＲにより作成した検量線に基づき算出した。なお、前記配列番号：８に示される塩基配列からなる標準ＤＮＡにおける核酸量確認用プライマーセット１の各プライマーの結合領域を、図４（Ｂ）に示す。図４（Ｂ）中、Ｇｅｃ−Ｆ結合領域は、核酸量確認用プライマーセット１のフォワードプライマーの結合領域を示す。Ｇｅｃ−Ｒ結合領域は、核酸量確認用プライマーセット１のリバースプライマーの結合領域を示す。【００８４】
（変換核酸の量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量の測定）
変換核酸の量の確認のための定量的ＰＣＲは、実施例１において、分析用試料１又は分析用試料２に代えて、調製例１の分析用試料又は調製例２の分析用試料を用いることを除き、実施例１と同様の操作を行なうことにより行なった。【００８５】
変換処理確認用プライマーセット２を用いた定量的ＰＣＲによる増幅産物の量は、変換処理確認用プライマーセット２と、配列番号：８に示される塩基配列からなる標準ＤＮＡによる定量的ＰＣＲにより作成した検量線に基づき算出した。なお、前記配列番号：８に示される塩基配列からなる標準ＤＮＡにおける変換処理確認用プライマーセット２の各プライマーの結合領域を、図４（Ｂ）に示す。図４（Ｂ）中、ＢＳｃ−Ｆ結合領域は、変換処理確認用プライマーセット２のフォワードプライマーの結合領域を示す。ＢＳｃ−Ｒ結合領域は、変換処理確認用プライマーセット２のリバースプライマーの結合領域を示す。【００８６】
（全核酸の量における変換核酸の量の割合の算出）
核酸量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量と、変換核酸の量の確認のための定量的ＰＣＲの増幅産物の量とから、前記式（２）に基づき、分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を算出した。その結果を図５に示す。【００８７】
図５中、バー１は、調製例１の分析用試料及び実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いた場合の結果を示す。バー２は、調製例１の分析用試料及び実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いた場合の結果を示す。バー３は、調製例２の分析用試料及び実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いた場合の結果を示す。バー４は、調製例２の分析用試料及び実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いた場合の結果を示す。【００８８】
実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットの変換処理確認用プライマーセット１に含まれるプライマーの結合領域は、配列番号：７に示される領域が存在する染色体とは異なる種類の染色体に存在している。そのため、実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットの核酸量確認用プライマーセット１及び変換処理確認用プライマーセット１に含まれるプライマーにより増幅される領域のコピー数のいずれかが、染色体異常により変化していた場合、核酸量確認用プライマーセット１を用いた核酸増幅反応による増幅産物及び変換処理確認用プライマーセット２を用いた核酸増幅反応による増幅産物それぞれの絶対量の変化の度合いが異なることになる。したがって、実験例１の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いた場合、全核酸中に含まれる変換核酸の割合が異常な値となったのは、癌細胞における染色体異常が原因であると考えられる。【００８９】
これに対して、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットの核酸量確認用プライマーセット１及び変換処理確認用プライマーセット２に含まれる全てのプライマーの結合領域は、ヒトゲノムＤＮＡにおける配列番号：７に示される極めて限定された標的配列からなる領域（２２４ｂｐ）に存在している（図４参照）。すなわち、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットでは、核酸量確認用プライマーセット１に含まれるプライマーがハイブリダイズする部分の塩基配列と、変換処理確認用プライマーセット２に含まれるプライマーがハイブリダイズする部分の塩基配列とは、２２４ｂｐの塩基配列内に含まれている。
したがって、仮に前記標的配列からなる領域において、染色体異常が生じたとしても、前記染色体異常は、核酸量確認用プライマーセット１を用いた核酸増幅反応及び変換処理確認用プライマーセット２を用いた核酸増幅反応のいずれに対しても、同様に影響を与えることになる。すなわち、核酸量確認用プライマーセット１を用いた核酸増幅反応による増幅産物及び変換処理確認用プライマーセット２を用いた核酸増幅反応による増幅産物それぞれの絶対量が変化したとしても、全核酸中に含まれる変換核酸の割合は変化しないことになる。
このように、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットによれば、染色体に異常が生じていることが多い癌の細胞のゲノムＤＮＡの非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれたかどうかを正確に判断できることが明らかとなった。【００９０】
（調製例３）
調製例１と同様の操作を行なうことにより乳癌細胞株ＭＣＦ７から抽出されたゲノムＤＮＡ  ２μｇに、健常人の血清３００μＬを添加し、血清含有試料を調製した。調製した血清含有試料に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製した。精製したＤＮＡに、０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３００μＬを添加し、得られた混合物を、３７℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後の産物に、１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液３００μＬを添加し、得られた混合物を８０℃で４０分間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。得られた産物に含まれる核酸を、核酸精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：MicroSpin S-300 HR Columns）で精製し、調製例３の分析用試料を得た。【００９１】
（調製例４）
調製例１と同様の操作を行なうことにより乳癌細胞株ＭＣＦ７から抽出されたゲノムＤＮＡ  ２μｇに、健常人の血清３００μＬを添加し、血清含有試料を調製した。調製した血清含有試料に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製した。精製したＤＮＡに、０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３００μＬを添加し、得られた混合物を、３７℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後の産物に、０．１１ｇ／Ｌのヒドロキノン水溶液３０μＬと、３Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液５２０μＬとを添加し、得られた混合物を５０℃で１６時間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。得られた産物に含まれる核酸を、核酸精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−３００  ＨＲ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、調製例４の分析用試料を得た。【００９２】
（調製例５）
調製例１と同様の操作を行なうことにより乳癌細胞株ＭＣＦ７から抽出されたゲノムＤＮＡ  ２μｇに、健常人の血清３００μＬと、１８Ｍグアニジン−ＨＣｌ  ３００μＬと、２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（シグマ社製）  ２０μＬとを添加し、得られた混合物を５０℃で６０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後に得られた産物に、１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２０μＬを添加し、得られた混合物を、３７℃で１０分間インキュベーションした。その後、インキュベーション後に得られた産物に、１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液６４０μＬを添加し、得られた混合物を８０℃で４０分間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。得られた産物に含まれる核酸を、核酸精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−３００  ＨＲ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、調製例５の分析用試料を得た。【００９３】
（実施例２）
実施例１において、分析用試料１又は分析用試料２に代えて、調製例３〜５の分析用試料のいずれかを用いたことを除き、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いて、実施例１と同様の操作を行ない、分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を算出した。その結果を図６に示す。図６中、バー１は、調製例３の分析用試料を用いた場合の結果を示す。バー２は、調製例４の分析用試料を用いた場合の結果を示す。バー３は、調製例５の分析用試料を用いた場合の結果の結果を示す。【００９４】
図６に示される結果から、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いることにより、染色体に異常が生じていることが多い乳癌細胞株由来のＤＮＡについて、亜硫酸水素塩処理後の試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を求めることができることが明らかとなった。また、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットによれば、亜硫酸水素塩処理の手法に関わらず、亜硫酸水素塩処理後の試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を求めることができることが明らかとなった。かかる結果より、前記分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合に基づき、種々の非メチル化シトシン変換処理の場合であっても、当該非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれているかどうかを判定することができることが示唆される。【００９５】
（調製例６〜８）
異なる患者から得られた３種類のヒト乳癌組織ゲノムＤＮＡ１〜３〔それぞれ、バイオチェイン（ＢｉｏＣｈａｉｎ）社製〕を用い、以下のようにして、調整例６〜８の分析用試料を得た。【００９６】
前記ヒト乳癌組織ゲノムＤＮＡ２μｇに、０．３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液３００μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後の産物に、１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液３００μＬを添加し、８０℃で４０分間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。その後、得られた産物に含まれる核酸を、核酸精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製した。得られた核酸に、最終濃度０．３Ｍとなるように水酸化ナトリウムを添加し、室温で５分間インキュベートした。得られた産物を、核酸精製用スピンカラム（ＧＥヘルスケア社製、商品名：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−３００  ＨＲ  Ｃｏｌｕｍｎｓ）で精製し、調製例６〜８の分析用試料を得た。【００９７】
（実施例３）
実施例１において、分析用試料１又は分析用試料２に代えて、調製例６〜８の分析用試料のいずれかを用いたことを除き、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いて、実施例１と同様の操作を行ない、それぞれの分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を算出した。その結果を図７に示す。図７中、バー１は、調製例６の分析用試料を用いた場合の結果を示す。バー２は、調製例７の分析用試料を用いた場合の結果を示す。バー３は、調製例８の分析用試料を用いた場合の結果の結果を示す。【００９８】
図７に示される結果から、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットにより、細胞由来のＤＮＡ試料だけでなく、乳癌組織由来のＤＮＡ試料も、亜硫酸水素塩処理後の試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を求めることができることが明らかとなった。【００９９】
以上のように、実験例２の非メチル化シトシン変換処理の判定用キットを用いれば、生体試料の種類及び亜硫酸水素塩処理の手法に関わらず、亜硫酸水素塩処理後の試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合を求めることができることが明らかとなった。かかる結果より、前記分析試料中の全核酸中に含まれる変換核酸の割合に基づき、種々の非メチル化シトシン変換処理の場合であっても、当該非メチル化シトシン変換処理が適切に行なわれているかどうかを判定することができることが示唆される。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号：１は、プライマーの配列である。
配列番号：２は、プライマーの配列である。
配列番号：３は、プライマーの配列である。
配列番号：４は、プライマーの配列である。
配列番号：５は、プライマーの配列である。
配列番号：６は、プライマーの配列である。
配列番号：７は、標的配列である。
配列番号：８は、標準ＤＮＡの配列である。
配列番号：９は、核酸量確認用プライマーセット１に対応する標準ＤＮＡの配列である。
配列番号：１０は、変換処理確認用プライマーセット１に対応する標準ＤＮＡの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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