(57)【要約】  高リスク群ヒトパピローマウイルスに対する交差性中和抗体を誘導し得るワクチン抗原を提供する。  ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質およびこのキメラ蛋白質の集合体であるキャプシド。L2エピトープを挿入するループ部位は、アミノ酸430と433の間であり、L2エピトープは、LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(18-38 L2エピトープ)、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(56-75 L2エピトープ) またはDPVGPLDPSIVSLVEESSFI(96-115 L2エピトープ)で表されるアミノ酸配列を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープを1つ挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドであって、
前記L2エピトープを挿入するループ部位は、アミノ酸430と433の間であり、
前記L2エピトープは、
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下、18-38 L2エピトープという)
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下、56-75 L2エピトープという)または
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下、96-115 L2エピトープという)
で表されるアミノ酸配列を有する、キャプシド。
【請求項２】
前記L2エピトープは、前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ前記キャプシドに元となるL2エピトープを有するHPVの交差性と同様の交差性を付与するアミノ酸からなる請求項1に記載のキャプシド。
【請求項３】
前記集合体は、キメラ蛋白質が５個集合した５量体キャプソメアーの複数個の集合体である請求項１または２に記載のキャプシド。
【請求項４】
前記５量体キャプソメアーの複数個の集合体は、粒子構造を有する請求項３に記載のキャプシド。
【請求項５】
前記集合体を構成する５量体キャプソメアーの個数は６５〜８０個の範囲である請求項４に記載のキャプシド。
【請求項６】
前記集合体を構成する５量体キャプソメアーの個数は７２個である請求項４に記載のキャプシド。
【請求項７】
L1-キャプシドワクチンの製造に用いられる請求項１〜６のいずれかに記載のキャプシド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のキャプシドの２種以上を含有するキャプシド混合物。
【請求項９】
18-38 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
56-75 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物である請求項８に記載のキャプシド混合物。
【請求項１０】
18-38 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
96-115 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物である請求項８に記載のキャプシド混合物。
【請求項１１】
56-75 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
96-115 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物である請求項８に記載のキャプシド混合物。
【請求項１２】
18-38 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
56-75 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
96-115 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物である請求項８に記載のキャプシド混合物。
【請求項１３】
L1-キャプシドワクチンの製造に用いられる請求項８〜１２のいずれかに記載のキャプシド混合物。
【請求項１４】
少なくとも16型、18型、31型、52型、および58型のヒトパピローマウイルスに対する中和抗体を誘導し得るL1-キャプシドワクチンの製造に用いられる請求項８〜１２のいずれかに記載のキャプシド混合物。
【請求項１５】
ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープを1つ挿入したキメラ蛋白質であって、
前記L2エピトープを挿入するループ部位は、アミノ酸430と433の間であり、
前記L2エピトープは、
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下、18-38 L2エピトープという)
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下、56-75 L2エピトープという)または
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下、96-115 L2エピトープという)
で表されるアミノ酸配列を有するキメラ蛋白質。
【請求項１６】
前記L2エピトープは、前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ前記キメラ蛋白質から構成されるキャプシドにL2エピトープを有するHPVの交差性と同様の交差性を付与するアミノ酸からなる請求項１５に記載のキメラ蛋白質。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載のキメラ蛋白質を集合させることでキャプシドを形成させることを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のキャプシドの製造方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法で２種以上のキャプシドを製造し、製造されたキャプシドを混合することを含む、請求項８〜１４のいずれかに記載のキャプシド混合物の製造方法。
【請求項１９】
キーホールリンペットヘモシアニンとヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープの複合体であり、前記L2エピトープは、
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下、18-38 L2エピトープという)
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下、56-75 L2エピトープという)または
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下、96-115 L2エピトープという)
で表されるアミノ酸配列を有する複合体。
【請求項２０】
キーホールリンペットヘモシアニンと前記L2エピトープはシステインを介して結合している請求項１９に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００７年６月２６日出願の日本特願２００７−１６７１５４号の優先権を主張し、それらの全記載は、ここに特に開示として援用される。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、高リスク群ヒトパピローマウイルスに対する交差性中和抗体を誘導するワクチン抗原に関する。特に本発明は、ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質の特定の部位に、ヒトパピローマウイルス16型の特定のL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質及びこのキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドに関する。本発明のキャプシドは、子宮頸癌の原因となるヒトパピローマウイルス群の感染を予防するためのワクチンとして使う抗原として有用である。【０００３】
背景技術
ヒトパピローマウイルス(HPV)(図1)は、小型のDNAウイルスで、100以上の遺伝子型が存在する。15の型（高リスク型：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73型）が子宮頚癌の原因となる。HPV16型は50-60％の子宮頚癌で検出される。次いで、欧米では18型が多く、日本では52、58型が多い。我が国は集団検診で早期発見に努めているにもかかわらず年間15000人の発症と2500人の死亡が報告されている。【０００４】
HPVキャプシドは、L1蛋白質の5量体（キャプソメア）72個で形成される正20面体の骨格に12分子のL2蛋白質が加わった構造をしている。L2蛋白質の両端はキャプシド内部にあるが、N末端側の一部はキャプシド表面に出ている（L2-表面領域）（図2）。組換えDNA技術を応用してL1蛋白質のみを大量に発現させるとウイルス様粒子（Virus-like particle; VLP）ができる。ウシパピローマウイルスやワタノオウサギパピローマウイルスのVLPやL2蛋白質を動物に接種すると、ウイルスチャレンジに抵抗性となる。尚、図2のHPVおよびVLPは断面の概略図である。【０００５】
HPVの増殖を許す培養細胞系は無い。HPVの感染をモニターするために偽ウイルスが作られている。SV40T抗原を発現しているヒト293細胞に、SV40複製開始点を持つ分泌性アルカリフォスファターゼ(SEAP)発現プラスミドと、L1及びL2蛋白質の発現プラスミドを導入すると、複製したSEAP発現プラスミドがL1/L2-キャプシドに組み込まれ、感染性偽ウイルスが形成される（図3）。偽ウイルスの感染性を阻害する活性で中和抗体が測定されている。(非特許文献１)【０００６】
HPVのVLPを動物に接種して得た抗血清は、型特異的な中和活性を持つ。メルク社ではHPV16、18型VLPと尖型コンジローマ（良性）の原因となる6、11型VLPを混合したワクチンを、グラクソスミスクライン社ではHPV16、18型VLPを混合したワクチンを開発した。(非特許文献２、非特許文献３）【０００７】
これらのワクチンは大規模臨床試験で、型特異的な感染予防効果を示し、メルク社のワクチンは2006年にFDAと欧州委員会の認可を受け発売されている。【０００８】
上記のように、HPVのL1-キャプシドを動物に免疫すると、型に極めて特異的な免疫応答を誘導する。16型のL1-キャプシドワクチンを用いた臨床試験の中間成績は、16型の感染予防に有効性が示されている一方で、他の型の予防には効果が殆どないことを示している。従ってワクチンで子宮頚癌の発症を阻止するには、少なくとも高リスク型すべてに対応できるワクチン抗原の開発が必要である。【０００９】
本発明者らはこれまでにHPV16型L2蛋白質のアミノ酸108-120領域にある高リスク型共通中和エピトープを用いたワクチン抗原を開発した。しかし、このエピトープのアミノ酸配列は、高リスク型L2蛋白質間で約60から75%程度の相同性であり、誘導される抗体は複数の高リスク型HPVに結合するものの、HPV16型に比べ結合能は劣っていた。そこで、型共通性がより高い抗原の出現が望まれていた。【００１０】
本発明者らは、HPV16L1蛋白質に、HPV16型L2蛋白質のアミノ酸64-81領域を追加したキメラ蛋白質にすることで、さらに強力な型共通中和抗体を誘導できるワクチン抗原が作製でき、このワクチン抗原は、少なくとも高リスク型すべてに対応でき得る抗原であって、なおかつ型共通性がより高い抗原であることを見いだして、先に特許出願した（ＷＯ２００７／０１８０４９、特許文献１）。さらに、特許文献１では、上記のように、HPV16L1蛋白質に、HPV16型L2蛋白質のアミノ酸108-120領域を挿入したキメラ蛋白質による粒子は、強い免疫原性と高リスクHPV群に共通の中和抗体誘導能を持つことを勘案して、上記アミノ酸64-81領域を追加したキメラ蛋白質に、HPV16型L2蛋白質のアミノ酸109-117領域を挿入したキメラ蛋白質も提供した。【００１１】
非特許文献１：  Pastrana, D.V., Buck, C.B., Pang, Y.Y., Thompson, C.D., Castle, P.E., FitzGerald, D.C., Kruger, Kjaer, S., Lowy, D.R., Schiller, J.T., 2004. Reactivity of human sera in a sensitive, high-throughput pseudovirus-based papillomavirus neutralization assay for HPV16 and HPV18. Virology. 321:205-216.
非特許文献２：  Villa, L.L., et al.: Prophylactic quadrivalent human papillomavirus types 6, 11, 16, and 18) L1 virus-like particle vaccine in young women: a randomised double-blind placebo-controlled multicentre phase II efficacy trial.  Lancet Oncology6, 271-278, 2005
非特許文献３：  Harper, D.M., et al.: Sustained efficacy up to 4.5years of a bivalent L1 virus-like particle vaccine against human papillomavirus type 16 and 18 : follow up from a randomized control trial. Lancet 367(9518), 1247-1255.
特許文献１：  ＷＯ２００７／０１８０４９
上記非特許文献１〜３及び特許文献１の全記載は、ここに特に開示として援用される。【００１２】
現在発売されているHPVワクチンは、15の高リスクHPV群のうち、16型と18型にしか効果がない。VLPは型特異的な中和抗体を誘導するので、全ての高リスクHPV群に対応するには、15種のVLPのカクテルが必要となり、実用的なワクチン抗原とすることは困難である。従って、交差性中和抗体を誘導するワクチン抗原の開発が望まれている。【００１３】
特許文献１に記載の抗原は、少なくとも高リスク型すべてに対応でき得る抗原であって、なおかつ型共通性がより高い抗原である。しかし、以下の問題があった。
特許文献１における検討で使用した感染性偽ウイルスは16、18型のみであり、これら感染性偽ウイルスに対しては、特許文献１に記載の抗原は優れた中和活性を示した。しかし、その後、本発明者らが新たに開発した31、52、58型の感染性偽ウイルスについて、中和実験を行ったところ、上記特許文献１に記載の抗原は、31、52、および58型に対する中和活性があまり高くないことが判明した。【００１４】
そこで本発明の目的は、高リスク群ヒトパピローマウイルスに対する交差性中和抗体を誘導し得るワクチン抗原を提供することにある。【００１５】
発明の開示
本発明の第1の態様は、ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープを1つ挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドであって、
前記L2エピトープを挿入するループ部位は、アミノ酸430と433の間であり、
前記L2エピトープは、
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下、18-38 L2エピトープという)
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下、56-75 L2エピトープという)または
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下、96-115 L2エピトープという)
で表されるアミノ酸配列を有する、キャプシドである。【００１６】
上記本発明の上記キャプシドにおいては、以下の具体的な態様を挙げることができる。
１）前記L2エピトープは、前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ前記キャプシドに元となるL2エピトープを有するHPVの交差性と同様の交差性を付与するアミノ酸からなる。
２）前記集合体は、キメラ蛋白質が５個集合した５量体キャプソメアーの複数個の集合体である。
３）前記５量体キャプソメアーの複数個の集合体は、粒子構造を有する。
４）前記集合体を構成する５量体キャプソメアーの個数は６５〜８０個の範囲である。
５）前記集合体を構成する５量体キャプソメアーの個数は７２個である。
６）前記キャプシドはL1-キャプシドワクチンの製造に用いられるものである。【００１７】
本発明の第2の態様は、上記本発明のキャプシドの２種以上を含有するキャプシド混合物である。【００１８】
上記本発明の上記キャプシド混合物においては、以下の具体的な態様を挙げることができる。
１）18-38 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと56-75 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物である。
２）18-38 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと96-115 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物である。
３）56-75 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと96-115 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物である。
４）18-38 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと56-75 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと96-115 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物である。
５）上記キャプシド混合物は、L1-キャプシドワクチンの製造に用いられるものである。
６）上記キャプシド混合物は、少なくとも16型、18型、31型、52型、および58型のヒトパピローマウイルスに対する中和抗体を誘導し得るL1-キャプシドワクチンの製造に用いられるものである。【００１９】
本発明の第3の態様は、ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープを1つ挿入したキメラ蛋白質であって、
前記L2エピトープを挿入するループ部位は、アミノ酸430と433の間であり、
前記L2エピトープは、
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下、18-38 L2エピトープという)
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下、56-75 L2エピトープという)または
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下、96-115 L2エピトープという)
で表されるアミノ酸配列を有するキメラ蛋白質である。【００２０】
上記本発明の上記キメラ蛋白質においては、前記L2エピトープは、前記アミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ前記キメラ蛋白質から構成されるキャプシドにL2エピトープを有するHPVの交差性と同様の交差性を付与するアミノ酸からなる態様を、具体的な態様として挙げることができる。【００２１】
本発明の第4の態様は、上記本発明のキメラ蛋白質を集合させることでキャプシドを形成させることを含む、上記本発明のキャプシドの製造方法である。【００２２】
本発明の第５の態様は、上記本発明のキャプシドの製造方法に記載の方法で２種以上のキャプシドを製造し、製造されたキャプシドを混合することを含む、上記本発明のキャプシド混合物の製造方法である。【００２３】
本発明の第６の態様は、キーホールリンペットヘモシアニンとヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープの複合体であり、前記L2エピトープは、
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下、18-38 L2エピトープという)
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下、56-75 L2エピトープという)または
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下、96-115 L2エピトープという)
で表されるアミノ酸配列を有する複合体である。【００２４】
上記本発明の上記複合体においては、前記キーホールリンペットヘモシアニンと前記L2エピトープはシステインを介して結合している態様を、具体的な態様として挙げることができる。【００２５】
本発明によれば、粒子構造が強い免疫誘導活性を持つことと併せ、HPVのL2-エピトープを強力に抗原提示でき、特に、16型、18型、31型、52型、および58型のヒトパピローマウイルスに対する中和抗体を誘導し得るL1-キャプシドワクチン抗原を提供できる。さらに、前述の15種類の高リスク型ヒトパピローマウイルスのL2アミノ酸配列の相同性から推測すると、本発明の16型、18型、31型、52型、および58型のヒトパピローマウイルスに対する中和抗体を誘導し得るL1-キャプシドワクチン抗原は、上記15種類の高リスク型にほぼ対応できる抗原であると強く推測される。【００２６】
VLPワクチンは既に実用化され、型特異的な感染予防効果が示されている。本発明者らが開発したキメラVLPは、現行ワクチン抗原に交差性L2-エピトープを追加した抗原で、現行ワクチンの中和エピトープが残されていることから、16型に型特異的な中和抗体を誘導し、さらに18型、31型、52型、および58型に対する交差性中和抗体も誘導できる。360分子のL1蛋白質によってVLPが形成されることから、キメラVLPは360個の交差性L2-エピトープを持つ。粒子構造が強い免疫誘導活性を持つことと併せ、交差性L2-エピトープを強力に提示できる新たなワクチン抗原となる。【００２７】
発明を実施するための最良の形態
(L1-キャプシド)
本発明のL1-キャプシドは、ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープを1つ挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドである。【００２８】
前述のようにHPV粒子は、5分子のL1蛋白質が集合したキャプソメアが72個集まって正20面体のキャプシドを形成する。L1蛋白質を細胞で高発現させると、L1蛋白質は核に集まって、自律的にキャプシドを形成する。L1蛋白質のみで形成されるキャプシドをL1-キャプシドまたはウイルス様粒子（virus-like particle: VLP）と呼ぶ。L1蛋白質とL2蛋白質を同時に発現させると12分子のL2蛋白質がL1-キャプシドに取り込まれてL1/L2-キャプシド（またはL1/L2-VLP）ができる。但し、L1-キャプシドとL1/L2-キャプシドは、電子顕微鏡では識別できない。【００２９】
本発明のL1-キャプシドは、HPV16型のL1-キャプシドをベースとするキャプシドである。HPVは遺伝子型が多いので、一般にHPV16やHPV58等の表示で型とともに記載する。ここではHPV16型のL1-キャプシドは16L1-キャプシドのように記載する。【００３０】
本発明のL1-キャプシドは、HPV16型L1蛋白質に、HPV16型のL2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体である。以下、キメラ蛋白質とは、「ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位に、ヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープを1つ挿入したキメラ蛋白質」を意味し、本発明は、このキメラ蛋白質も包含する。【００３１】
本発明のキメラ蛋白質を作るためにL1蛋白質に挿入されるヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープは、
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(18-38 L2エピトープ)
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(56-75 L2エピトープ)または
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(96-115 L2エピトープ)
で表されるアミノ酸配列を有する。【００３２】
18-38 L2エピトープは、HPV16型のL2蛋白質のアミノ酸18-38領域の21個のアミノ酸からなる。56-75 L2エピトープは、HPV16型のL2蛋白質のアミノ酸56-75領域の20個のアミノ酸からなる。96-115 L2エピトープは、HPV16型のL2蛋白質のアミノ酸96-115領域の20個のアミノ酸（但し、101番目をロイシンに、112番目をセリンに置換）からなる。【００３３】
尚、本発明においては、蛋白質のアミノ末端から順にアミノ酸残基に番号を付け、例えば50番目のアミノ酸をアミノ酸50と記載した。【００３４】
L2-表面領域は複数の細胞蛋白質と結合する。アミノ酸置換変異を導入すると感染性を失うことから、L2-表面領域はHPVの感染に不可欠な機能を担っていることが示されている（図４）。この領域のアミノ酸配列は全ての高リスク型HPVのL2蛋白質に極めて良く保存されている（図5）。本発明者らは、HPV16型L2-表面領域のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドをウサギに免疫して得た抗血清を調べた。結果は実施例において示す（表1）。表１の結果から、アミノ酸18-38、49-75、96-115領域に交差性エピトープが存在することを見出した。【００３５】
すなわち、表1に示す結果から、アミノ酸18-38、56-75、96-115領域に、16型、18型、31型、および58型に対する交差性エピトープが存在することが明らかとなった。但し、52型に対する交差性は、この段階では検討していない。【００３６】
96-115領域については、101番目のSをLに変換し、112番目のTをSに変換したものとした。これは、天然型の96-115領域に比べて、101番目のSをLに変換し、112番目のTをSに変換したものの方が、交差性に優れるからである。【００３７】
尚、表１の結果は、49-68領域についても、16型、18型、31型、および58型に対する交差性エピトープが存在することを示す。しかし、49-68領域を含む49-75領域を挿入したキメラ蛋白質を作製したが、粒子構造を取らなかったこと、さらには、図5に示すように、49-55領域は15種類のHPVにおいてL2アミノ酸の相同性があまり高くないために、49-68領域は本発明の対象から排除した。【００３８】
そこで上記交差性エピトープをL1蛋白質のアミノ酸430と433の間に挿入して、キメラ蛋白質を作製し、さらにキメラVLPを作製した。【００３９】
即ち、本発明は、ヒトパピローマウイルス（HPV）16型L1蛋白質のループ部位のアミノ酸430と433の間に、ヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープを1つ挿入したキメラ蛋白質に関し、
前記L2エピトープは、
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(以下、18-38 L2エピトープという)
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(以下、56-75 L2エピトープという)または
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(以下、96-115 L2エピトープという)
で表されるアミノ酸配列を有する。【００４０】
さらに本発明は、上記キメラ蛋白質の集合体であるキャプシドに関する。この集合体は、キメラ蛋白質が５個集合した５量体キャプソメアーの複数個の集合体であり、さらに、５量体キャプソメアーの複数個の集合体は、粒子構造を有することが、抗原性を発揮する上で適当である。前記集合体を構成する５量体キャプソメアーの個数は、例えば、６５〜８０個の範囲であり、好ましくは、天然型と同じ、７２個である。【００４１】
VLPは、天然型は、一般的に、360分子のL1蛋白質から形成され、その場合、粒子あたり360個の交差性エピトープを持つことになる（図6）。HPV16L2蛋白質のアミノ酸18から38、56から75、96から115（101番目をロイシンに、112番目をセリンに置換）の配列をHPV16L1蛋白質のアミノ酸430から433の間に挿入したキメラ蛋白質を、組換えバキュロウイルスを使って昆虫のsf9細胞で発現させ、キメラVLPを作製し、それぞれCh18/38、Ch56/75、Ch96/115(101L、112S）と名付けた（図7）。図7の電子顕微鏡写真は、各キメラVLPが粒子を形成していることを示す。これらのキメラVLPを抗原とするELISAでは、挿入エピトープに対する抗体が特異的に結合し（後述の実施例中の表2）、エピトープがVLP表面に提示されていることが示された。【００４２】
これらのキメラVLPをウサギに免疫して抗血清を得た。交差性エピトープと同じ配列を持つ合成ペプチドを抗原とするELISAでは、各抗血清が挿入エピトープと特異的に反応した。96/115(101L,112S)のペプチドは凝集しやすく、ELISAプレートへの結合量が少なかったため、力価は低めに示されている（後述の実施例中の表3）。【００４３】
HPV16、18、31、52、58型偽ウイルスの中和活性を調べると、Ch18/38に対する抗体は16、18、31型を、Ch56/75に対する抗体は全ての型を、Ch96/115(101L、112S)に対する抗体は16、18、31、58型（力価の低い抗血清での58型の中和はみられなかった）を中和した（後述の実施例中の表4、5）。【００４４】
全ての抗血清は、キメラVLPの骨格となったHPV16型に対しては強く反応し、VLPが持つ中和エピトープがキメラVLPで保存されていることが示された。感染性偽ウイルスは360分子のL1蛋白質と12分子のL2蛋白質で構成されるため、試料中に過剰に合成されたL2蛋白質が遊離の状態で存在する。従って、抗L2抗体の中和力価は低く示される。【００４５】
動物パピローマウイルスの実験では、VLPワクチンとL2蛋白質ワクチンの効果は同程度であることから、本発明のキメラVLPは交差性エピトープに対する抗体を誘導する実用的なワクチン抗原となりうることを示す。【００４６】
前記L2エピトープは、前記アミノ酸配列、即ち、配列番号2〜4のいずれかに記載されたアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドに、元となるL2エピトープ(配列番号2〜4のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有する)を有するVLPの交差性と同様の交差性を付与するアミノ酸からなることもできる。【００４７】
即ち、18-38 L2エピトープは、LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG (配列番号2)で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドに、18-38 L2エピトープを有するHPV16型のVLPの交差性と同様の交差性を付与するアミノ酸配列を有するL2エピトープの変異体を含むことができる。18-38 L2エピトープを有するHPV16型のVLPの交差性は、表4に示される。【００４８】
56-75 L2エピトープは、GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(配列番号3)で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドに、56-75 L2エピトープを有するHPV16型のVLPの交差性と同様の交差性を付与するアミノ酸配列を有するL2エピトープの変異体を含むことができる。56-75 L2エピトープを有するHPV16型のVLPの交差性は、表4に示される。【００４９】
同様に、96-115 L2エピトープは、DPVGPLDPSIVSLVEESSFI (配列番号4)で表されるアミノ酸配列において、1または数個のアミノ酸が、欠失、置換、または付加されたアミノ酸からなり、かつ本発明のキャプシドに、96-115 L2エピトープを有するHPV16型のVLPの交差性と同様の交差性を付与するアミノ酸配列を有するL2エピトープの変異体を含むことができる。96-115 L2エピトープを有するHPV16型のVLPの交差性は、表4に示される。尚、本明細書において、アミノ酸の欠失、置換、または付加における数個のアミノ酸とは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個を意味する。【００５０】
本発明のキメラ蛋白質において、L2エピトープが挿入されるL1蛋白質は、L1蛋白質のループ部位であるアミノ酸430と433の間である。即ち、L1蛋白質のアミノ酸430〜433の4つのアミノ酸に代えて、上記アミノ酸20〜21個のL2エピトープを挿入する。HPV16型L1蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号1に示す。アミノ酸430と433の間を含む426-446領域は、HPV16L1蛋白質の構造解析、中和抗体エピトープの分布、及びキャプシド形成に必須なシステイン残基の位置等の観点から、L1蛋白質の外側にあって、抗原として認識されうる領域の1つであると推定されている。【００５１】
L1蛋白質に挿入されるL2エピトープは、1つのL1蛋白質に1つである。但し、種類の異なる少なくとも2種類のL2エピトープが1つのL1蛋白質の異なるループ部位に挿入されることもできる。例えば、上記3つの交差性エピトープ以外のペプチドを、L1蛋白質のアミノ酸430〜433以外の部位に挿入することもできる。あるいは、上記3つの交差性エピトープのいずれかを、L1蛋白質のアミノ酸430〜433以外の部位に挿入することもできる。【００５２】
(L2エピトープを含むペプチドの作製)
L2ペプチド(アミノ酸18-38、56-75または96-115)の作製は、常法により、96カラム自動ペプチド合成装置でのFmoc固相法により合成することができる。なお、このペプチドは抗体作製を目的としたため、KLH(キーホールリンペットヘモシアニン)接合されており、このKLHによるペプチド領域のマスキングを防ぐためにN末にシステイン残基を付加してある。【００５３】
本発明は、キーホールリンペットヘモシアニンとヒトパピローマウイルス16型のL2エピトープの複合体を包含する。前記L2エピトープは、
LYKTCKQAGTCPPDIIPKVEG(18-38 L2エピトープ)
GGLGIGTGSGTGGRTGYIPL(56-75 L2エピトープ) または
DPVGPLDPSIVSLVEESSFI(96-115 L2エピトープ)
で表されるアミノ酸配列を有する。キーホールリンペットヘモシアニンとL2エピトープは、好ましくはシステインを介して結合している。【００５４】
(L2エピトープの挿入されたL1蛋白質(キメラ蛋白質)の作製)
キメラL1遺伝子を作製し、作製したキメラL1遺伝子を、バキュロウイルスベクターを用いて発現させて、キメラL1蛋白質、キメラキャプシドを作製した。キメラL1遺伝子の作製は、PCRによった。詳細は以下の通りである。【００５５】
(A)挿入したい部分を持つプライマー対を作成する。
(B)挿入部分を持つプライマーの一方とプライマー１またはプライマー２を組み合わせてPCRを行う。
(C)片側に挿入断片を持つDNAを2つ合成した。それぞれの相補部分をアニールさせ、伸長反応を行う。
(D)挿入DNAを持つキメラ遺伝子を作成する。
(E)このDNAを鋳型にプライマー１とプライマー２を用いてPCRを行う。
(F)挿入遺伝子を持つDNAを増幅できる。【００５６】
本発明は、本発明のキメラ蛋白質を集合させることでキャプシドを形成させることを含むキャプシドの製造方法を包含する。上述の様に、キメラL1遺伝子を作製し、これを、バキュロウイルスベクターを用いて発現させて、キメラL1蛋白質を作製する。そして、キメラL1蛋白質が作製されると、自律的にキメラキャプシド(本発明のキャプシド)が形成される。バキュロウイルスベクターを用いる発現は、常法で行うことができるが、キメラキャプシドの自律的な形成を促進するという観点から、条件を設定することが好ましい。【００５７】
本発明のキャプシドは、L1-キャプシドワクチンの製造に用いられる。L1-キャプシドワクチンの製造は、例えば、バキュロウイルス発現系を用いたものであることができる。【００５８】
本発明は、上記本発明のキャプシドの２種以上を含有するキャプシド混合物を包含する。本発明の３種類のキャプシドは、それぞれ有する交差性が異なり、これらの交差性の異なるキャプシドの２種類以上を混合して用いることで、より高い中和活性を得ることができるという利点かある。【００５９】
本発明のキャプシド混合物は、例えば、
18-38 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
56-75 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物であることができる。この2種類のキャプシドは、質量比で例えば、1：100〜100：1の範囲の混合物とすることができる。但し、2種類のキャプシドの混合比は、上記範囲に限定されるものではなく、免疫原性や中和活性を考慮して、適宜決定できる。【００６０】
本発明のキャプシド混合物は、例えば、
18-38 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
96-115 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物であることができる。この2種類のキャプシドは、質量比で例えば、1：100〜100：1の範囲の混合物とすることができる。但し、2種類のキャプシドの混合比は、上記範囲に限定されるものではなく、免疫原性や中和活性を考慮して、適宜決定できる。【００６１】
本発明のキャプシド混合物は、例えば、
56-75 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
96-115 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物であることができる。この2種類のキャプシドは、質量比で例えば、1：100〜100：1の範囲の混合物とすることができる。但し、2種類のキャプシドの混合比は、上記範囲に限定されるものではなく、免疫原性や中和活性を考慮して、適宜決定できる。【００６２】
本発明のキャプシド混合物は、例えば、
18-38 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
56-75 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドと
96-115 L2エピトープを挿入したキメラ蛋白質の集合体であるキャプシドとの混合物であることができる。この3種類のキャプシドは、2種類のキャプシドの質量比のそれぞれについて、例えば、1：100〜100：1の範囲とすることができる。但し、3種類のキャプシドの混合比は、上記範囲に限定されるものではなく、免疫原性や中和活性を考慮して、適宜決定できる。【００６３】
本発明のキャプシド混合物も、L1-キャプシドワクチンの製造に用いられる。キャプシド混合物を用いたワクチンの製造方法は、上記と同様である。【００６４】
本発明のキャプシド混合物は、16型、18型、31型、52型、および58型のヒトパピローマウイルスに対する中和抗体を誘導し得るL1-キャプシドワクチンの製造に用いられる。【００６５】
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。【００６６】
例１
ウサギペプチド抗血清の作製
日本白色ウサギ（2.5kg〜3.0kg）2羽に免疫した。抗原は化学合成したペプチドとKLH（keyhole limpet hemocyanin）を結合させたものを用いた。初回感作は0.5mgの抗原をコンプリートフロイントアジュバンドと共に皮下投与した。初回投与後2週間後に0.25mgの抗原をコンプリートフロイントアジュバンドと共に皮下投与した。さらに2週間後、4週間後、6週間後に同様に（0.25mg）感作し計５回感作した。最終感作の1週間後に全採血し血清を得た。（株式会社スクラムに委託して行った。）【００６７】
以下に示す中和実験を用いてHPV16型L2-表面領域のアミノ酸配列を持つ合成ペプチドをウサギに免疫して得た抗血清を調べた。結果を表１に示す。表1に示す結果から、アミノ酸18-38、49-75、96-115領域に交差性エピトープが存在することが分かる。【００６８】
中和実験
１．中和実験前日に96穴細胞培養用プレートに10000個/wellの293FT細胞（インイトロジェン社から購入）を植えておく。
２．Neautralization Buffer（フェノールレッド抜きのDMEM培地に10%FCS、1% non-essentialアミノ酸、1%L-グルタミン酸、10mM HEPESを添加したもの）で血清を希釈し感染性偽ウイルスと混合させ1時間4℃にて反応させ、前日に植えておいた293FT細胞に加えた。
３．約72時間培養後に上清20μl回収し、Rodenらの方法（http://home.ccr.cancer.gov/lco/ColorimetricSEAP.htmを参照）によりアルカリフォスファターゼ活性を測定した。【００６９】
【表１】
2009001867.tif 000002
【００７０】
例２
キャプシド抗原の作製法
16L1、16L1/L2遺伝子を組み換えバキュロウイルス系で発現させた。Bac-to-Bac baculovirus expression system(GIBCO-BRL Inc.、New York, NY)を用いて組み換えウイルスを作り、sf9細胞（夜盗蛾由来細胞）で発現させた。16L1遺伝子をpFastbac1 vectorにクローニングしてpFsatbac1/16L1を得た。16L1/L2はpFastbac dual vectorにクローニングしてpFastbac dual/16L1/L2を得た。次にそれぞれクローニングしたpFastbacベクターをDH10BAC大腸菌(Max Efficiency competent cell containing baculovirus DNA and helper plasmid, GIBCO BRL)に導入してBacmidを作成した。 Bacmid DNAをEffectene Transfection Reagent(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)を用いてsf-9細胞に導入し、キャプシド蛋白質を発現する組み換えバキュロウイルスを得た。【００７１】
組み換えバキュロウイルスをsf-9細胞に感染させ72時間後に細胞を回収した。感染細胞を0.5%NP40溶液に縣濁し、10分間室温放置後、遠心(9000rpm、15分、4℃)して核分画（沈殿）と細胞質分画に分けた。核分画を1.28g/mlの塩化セシウム-PBS溶液に縣濁し、超音波(Sonifier250, Branson)破砕後、SW50.1 roter(Beckman Coulter Inc., Fulleron, CA)で超遠心（34000rpm、20時間、20℃）を行った。塩化セシウム勾配中で比重1.28g/ml付近に集まった蛋白質を回収し、0.5M NaCl-PBSで透析したものを、キャプシド蛋白質溶液とした。【００７２】
上記キャプシド抗原の作製法を用いて、HPV16L2蛋白質のアミノ酸18から38、56から75、96から115（101番目をロイシンに、112番目をセリンに置換）の配列をHPV16L1蛋白質のアミノ酸430から433の間に挿入したキメラ蛋白質を、組換えバキュロウイルスを使って昆虫のsf9細胞で発現させ、キメラVLPを作製し、それぞれCh18/38、Ch56/75、Ch96/115(101L、112S）と名付けた。図7の電子顕微鏡写真は、各キメラVLPが粒子を形成していることを示す。これらのキメラVLPを抗原とするELISAでは、挿入エピトープに対する抗体が特異的に結合し、エピトープがVLP表面に提示されていることが示された。【００７３】
キャプシド ELISA測定法
１．各キャプシド抗原を1μg/100μl/well加え、4℃で一晩静置。
２．抗原液除去後にブロッキング液（5% skim milk in PBS）を350μl加え、37℃2時間静置した。
３．ブロッキング液除去後に洗浄液（0.05% Teen20/0.05% NP40 in PBS）にて3回洗浄した。
４．ブロッキング液にて抗血清を500倍希釈したものを各wellに50μl加え、室温で1時間静置した。
５．血清試料を除去した後に9回洗浄し、HRP結合抗ウサギIgG抗体を2000倍希釈したものを各wellに50μl加える。室温で30分静置し、液除去後に洗浄液で6回洗浄。
６．基質液 （0-フェニレンジアミン24mgをクエン酸一リン酸緩衝液(pH 5.0)12mlにて溶解し、H2O2 1.2μl加えたもの）50μlを加え、15分間発色後にImmuno readerで450nmの波長を測定した。【００７４】
キャプシド抗原の作製法（例２）を用いて、HPV16L2蛋白質のアミノ酸18から38、56から75、96から115（101番目をロイシンに、112番目をセリンに置換）の配列をHPV16L1蛋白質のアミノ酸430から433の間に挿入したキメラ蛋白質を、組換えバキュロウイルスを使って昆虫のsf9細胞で発現させ、キメラVLPを作製し、それぞれCh18/38、Ch56/75、Ch96/115(101L、112S）と名付けた。図7の電子顕微鏡写真は、各キメラVLPが粒子を形成していることを示す。これらのキメラVLPを抗原とするELISAでは、挿入エピトープに対する抗体が特異的に結合し、エピトープがVLP表面に提示されていることが示された。結果を表2に示す。【００７５】
【表２】
2009001867.tif 000003
【００７６】
さらに、上記のキメラVLPをウサギに免疫して抗血清を得た。抗血清の調製は例１の方法と同様とした。（ただし、キメラキャプシドの１回投与量は50μgでアジュバントにはTiterMax（米国TiterMax社製）を使用した。）交差性エピトープと同じ配列を持つ合成ペプチドを抗原とするELISAでは、各抗血清が挿入エピトープと特異的に反応した。結果を表3に示す。尚、96/115(101L,112S)のペプチドは凝集しやすく、ELISAプレートへの結合量が少なかったため、他の２つの結果に比べて力価は低めに示されている。【００７７】
【表３】
2009001867.tif 000004
【００７８】
例３
感染性偽ウイルスの作製
１．293TT細胞にHPV16L1蛋白質発現プラスミド、HPV16L2蛋白質発現プラスミド、分泌型アルカリフォスファターゼ発現プラスミドを、Fugene HDを用いてトランスフェクションした。トランスフェクション72時間後に細胞を回収した。
２．回収した細胞をDetergent buffer (0.5%Briji58, 0.5%Benzonase, 1%ATP dependent plasmid safe exonuclease C in D-PBS(CaCl2 1mM, MgCl2 10mM))にて懸濁し、37℃で一晩静置した。
３．その後、4℃、10分静置したのち、最終850mM NaClとなるように、5M NaClを加えた。
４．1500g、10分間遠心し、上清を回収した。
５．回収した上清は、27%, 33%, 39%のoptiprep（AXIS-SHIELD PoC AS製）溶液（PBSで希釈）の上に重層し、50000rpm、3時間、16℃にて超遠心した。
６．超遠心後、底面より約300μlずつ分画を回収し、一番力価の高い分画を感染性偽ウイルス分画として感染実験に使用した。【００７９】
中和実験
１．中和実験前日に96穴細胞培養用プレートに10000個/wellの293FT細胞（インイトロジェン社から購入）を植えておく。
２．Neautralization Buffer（フェノールレッド抜きのDMEM培地に10%FCS、1% non-essentialアミノ酸、1%L-グルタミン酸、10mM HEPESを添加したもの）で血清を希釈し感染性偽ウイルスと混合させ1時間4℃にて反応させ、前日に植えておいた293FT細胞に加えた。
３．約72時間培養後に上清20μl回収し、Rodenらの方法（http://home.ccr.cancer.gov/lco/ColorimetricSEAP.htmを参照）によりアルカリフォスファターゼ活性を測定した。【００８０】
上記方法を用いて、HPV16、18、31、35、52、58型偽ウイルスの中和活性を調べた。結果を表4に示す。Ch18/38に対する抗体は16、18、31型を中和した。Ch56/75に対する抗体は６つ全ての型を中和した。Ch96/115(101L、112S)に対する抗体は16、18、31、58型（力価の低い抗血清での58型の中和はみられなかった）を中和した。比較として示した抗HPV16VLPは、16、31、35型を中和した。【００８１】
【表４】
2009001867.tif 000005
【００８２】
さらに、上記抗体の混合系(質量比1:1)についての、HPV16、18、31、52、58型偽ウイルスの中和活性を調べた。結果を表5に示す。Ch18/38に対する抗体とCh56/75に対する抗体の混合系は、およびCh56/75に対する抗体とCh96/115(101L、112S)に対する抗体の混合系は、５つ全ての型を中和した。Ch18/38に対する抗体とCh96/115(101L、112S)に対する抗体の混合系は、HPV16、18、31、58型の偽ウイルスを中和した。【００８３】
【表５】
2009001867.tif 000006
【００８４】
明細書の実施例の各実験を実施するにあたっては、下記の文献を参照できる。下記の文献の全記載は、ここに特に開示として援用される。
引用文献
１）Matsumoto. K, et al. : Antibodies to human papillomavirus 16, 18, 58, and 6b major capsid proteins among Japanese females. Jpn. J. Cancer Res., 88, 369-375,1997.
２）Xiaojiang S. Chen, et al. : Structure of small virus-like particles assembled from the L1 protein of human papillomavirus 16. Mol. Cell., 5, 557-567, 2000.
３）Jean-Remy Sadeyen, et al. : Insertion of a foreign sequence on capsid surface loops of human papillomavirus type 16 virus-like particles reduces their capacity to induce neutralizing antibodies and delineates a conformational neutralizing epitope. Virology., 309, 32-40, 2003.
４）Ishii. Y, et al, : Mutational analysis of human papillomavirus type 16 major capsid protein L1: the cysteines affecting the intermolecular bonding and structure of L1-capsids. Virology., 308, 128-136, 2003【００８５】
産業上の利用可能性
本発明のキャプシドは、HPV16型VLPにL2の型共通エピトープを追加した抗原である。現行ワクチンの抗原性は維持したまま、新たなエピトープを粒子あたり360個含んでいる。抗L2抗体による感染防御活性に関する実証試験を経れば、発癌性HPVの感染を全て予防できるワクチン抗原として使うことができる。子宮頚癌を中心に世界の女性の悪性腫瘍の11％（45万人）の原因とされる高リスクHPV群の感染を予防する第二世代HPVワクチン抗原となる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ヒトパピローマウイルス(HPV)の説明図。ゲノム：環状２本鎖ＤＮＡ、粒子：正二十面体(55nm)、種々の哺乳動物に固有のPapillomavirusが持続感染、HPVには100以上の遺伝子型がある15の型（高リスク群）の感染が子宮頸癌発症の原因となる。
【図２】ウイルス様粒子（Virus-like particle; VLP）の説明図。HPVの増殖する実用的な培養細胞系は無い。組換えバキュロウイルス等でL1蛋白質を発現させると、核内で集合しVLPが形成される。第一世代ワクチンは、16型、18型VLPを抗原としている。VLPの抗原性は型特異性が高い。
【図３】感染性偽ウイルス形成の説明図。
【図４】L2-表面領域の説明図。発癌性HPVの L2表面領域のアミノ酸配列は相同性が高いHPV感染に不可欠な役割を果たしている。
【図５】HPV16L2-表面領域のアミノ酸配列。
【図６】交差性エピトープをL1蛋白質に挿入して作製したキメラVLPの説明図。Chimera VLPは 360個 の 交差性 L2epitopeを持つ。VLPの抗原性、安全性は実証済み。
【図７】キメラVLP、Ch18/38、Ch56/75、Ch96/115(101L、112S）の説明図(アミノ酸配列)と粒子の写真。16L1 WT-VLPは、非キメラVLP粒子の写真。
【図１】
2009001867.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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