(57)【要約】  電気化学的応答の測定により検出対象生体分子を検出する生体分子検出方法であって、前記検出対象生体分子に対して直接的あるいは間接的に結合性を有する電気化学的活性物質を含む基準溶液の前記電気化学的応答を測定する基準溶液測定ステップと、前記検出対象生体分子を含む被検試料と前記電気化学的活性物質とを含む被検溶液の電気化学的応答を測定する被検溶液測定ステップと、前記基準溶液の電気化学的応答の測定結果と前記被検溶液の電気化学的応答の測定結果とを比較して比較結果を導出する比較ステップと、前記比較結果を基に前記被検溶液中の前記検出対象生体分子の含有情報を検出する生体分子含有情報検出ステップとを含む生体分子検出方法。
2008096757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気化学的応答の測定により検出対象生体分子を検出する生体分子検出方法であって、
前記検出対象生体分子に対して直接的あるいは間接的に結合性を有する電気化学的活性物質を含む基準溶液の前記電気化学的応答を測定する基準溶液測定ステップと、
前記検出対象生体分子を含む被検試料と前記電気化学的活性物質とを含む被検溶液の前記電気化学的応答を測定する被検溶液測定ステップと、
前記基準溶液の前記電気化学的応答の測定結果と前記被検溶液の前記電気化学的応答の測定結果とを比較して比較結果を導出する比較ステップと、
前記比較結果を基に前記被検溶液中の前記検出対象生体分子の含有情報を検出する生体分子含有情報検出ステップとを含む生体分子検出方法。
【請求項２】
電気化学的応答の測定により検出対象生体分子を検出する生体分子検出方法であって、
検出対象生体分子に対して直接的あるいは間接的に結合性を有する電気化学的活性物質を含む基準溶液の前記電気化学的応答を測定する基準溶液測定ステップと、
前記基準溶液測定ステップで測定の終了した前記基準溶液に前記検出対象生体分子を含む被検試料を加え被検溶液を調製する被検溶液調製ステップと、
前記被検溶液の前記電気化学的応答を測定する被検溶液測定ステップと、
前記基準溶液の前記電気化学的応答の測定結果と前記被検溶液の前記電気化学的応答の測定結果とを比較して比較結果を導出する比較ステップと、
前記比較結果を基に前記被検溶液中の前記検出対象生体分子の含有情報を検出する生体分子含有情報検出ステップとを含む生体分子検出方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の生体分子検出方法であって、
前記被検溶液が、前記検出対象生体分子の濃度が未知な２以上の前記被検溶液からなり、
前記被検溶液測定ステップが、未知濃度の２以上の前記被検溶液の各々の前記電気化学的応答の測定を含み、
前記比較ステップが、前記基準溶液の前記電気化学的応答の測定結果と各前記被検溶液の前記電気化学的応答の測定結果とを相対比較して比較結果を導出するステップであり、
前記生体分子含有情報抽出ステップが、前記比較結果を基に各前記被検溶液中の前記検出対象生体分子の含有情報を検出するステップである生体分子検出方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の生体分子検出方法であって、
前記被検溶液測定ステップの後に、
前記基準溶液又は前記基準溶液と同組成の基準溶液の前記電気化学的応答を測定する第２の基準溶液測定ステップと、
前記基準溶液測定ステップの測定結果と、前記第２の基準溶液測定ステップの測定結果とを比較した結果に基づいて、前記電気化学的応答の測定の較正を行う較正ステップとを含む生体分子検出方法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の生体分子検出方法であって、
前記被検溶液測定ステップの後に、
前記基準溶液又は前記基準溶液と同組成の基準溶液の前記電気化学的応答を測定する第２の基準溶液測定ステップと、
前記基準溶液測定ステップの測定結果と、前記第２の基準溶液測定ステップの測定結果とを比較した結果に基づいて、前記電気化学的応答の測定手段の異常を検知する異常検知ステップとを含む生体分子検出方法。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の生体分子検出方法であって、
試料に対して当該検出対象生体分子を直接的あるいは間接的に増幅及び／又は変性させる反応を行って前記被検試料を得る生体分子検出方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の生体分子検出方法であって、
前記被検溶液が複数種の前記検出対象生体分子及び複数種の前記電気化学的活性物質を含む生体分子検出方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の生体分子検出方法であって、
前記基準溶液測定ステップ又は前記被検溶液測定ステップにおける前記電気化学的応答の測定が、基準溶液又は被検溶液の拡散電流値の測定である生体分子検出方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の生体分子検出方法であって、
前記電気化学的活性物質は、FND（Ferrocenyl naphthalene diimide）、Hoechst、Distamycin、Nuclear yellow、DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）、Berenil、Methylene blue、Mitoxantrone、Daunomycin、Ethidium bromide、Propidium iodide、9-Aminoacridine、Ellipticine、Amsacrine、Hycanthone、Actinomycin D、Chromomycin、Mithramycin A、Echinomycin、Quinacrine、Nogalamycin、Proflavine、Amiloride、Trioxalen、Chloroquineからなる群より選択される一の物質である生体分子検出方法。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の生体分子検出方法であって、
前記検出対象生体分子は、電荷あるいは電気陰性度を有する分子である生体分子検出方法。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の生体分子検出方法であって、
前記検出対象生体分子は、核酸、蛋白質、脂質、糖質からなる群より選択される一の物質である生体分子検出方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の生体分子検出方法であって、
前記検出対象生体分子が、核酸である、生体分子検出方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の生体分子検出方法であって、
前記検出対象生体分子が、一本鎖の核酸である、生体分子検出方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の生体分子検出方法であって、
前記検出対象生体分子が、二本鎖の核酸である、生体分子検出方法。
【請求項１５】
電気化学的応答の測定により検出対象生体分子を検出する生体分子検出用チップであって：
前記検出対象生体分子に対して結合性を有する電気化学的活性物質を含む基準溶液又は、
被検試料と前記電気化学的活性物質とを含む被検溶液を収容可能なチャンバと；
前記チャンバに前記基準溶液又は前記被検溶液を送る送液装置と；
前記チャンバに収容されている前記基準溶液又は前記被検溶液の電気化学的応答を測定する電気化学的応答測定装置と；
前記チャンバから前記基準溶液又は前記被検溶液を排液する排液装置と；を備える生体高分子検出用チップ。
【請求項１６】
請求項１５に記載の生体分子検出用チップであって、
前記チャンバは、前記被検溶液中の前記検出対象生体分子を増幅又は変性させる温度調節装置を更に備える、生体分子検出用チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子に結合可能な電気化学的活性物質（酸化還元試薬）を用いて生体分子を電気化学的に検出する方法及びこれに用いる生体分子検出用チップに関する。
本願は、２００７年２月６日に出願された日本国特願２００７−２７２２２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療、食品衛生、環境保全といった分野で、遺伝子や蛋白質などの生体分子を低コストかつ簡便・迅速に分析する技術が求められている。従来、蛍光試薬を用いた生体分子センサ、中でもＤＮＡセンシングの光学検出法が広く利用されている。しかしながら、この技術には、高価な蛍光試薬や蛍光検出機構を用いるためコスト増大を抑えることができず、また、標的生体分子の捕捉分子を固相上に固定するための前処理及び固相反応を制御するための操作が必要なため簡便・迅速な分析が行えないといった問題があった。【０００３】
一方で、生体分子に結合可能な電気化学的活性物質（酸化還元試薬）を用いて生体分子を電気化学的に検出する方法及びこれに用いる生体分子検出用チップが提案されている。このような電気化学的検出法は、高額な試薬を必要とせず、反応操作も比較的簡便であることから、ＰＯＣ（Point of care）分野での応用が期待されている。【０００４】
特許文献１には、二重鎖ＤＮＡに特異的に結合する電気化学活性試薬を試料溶液に加え、その電気化学的応答（溶液抵抗の変化）を測定することにより、試料溶液中の遺伝子を検出する方法が記載されている。より詳細には、電気化学活性試薬（酸化還元試薬）としてHoechst33258（miner groove binder）を用い、対象遺伝子を含む被検試料に電気化学活性試薬及び遺伝子結合反応用試薬を加えた混合液を作り、この混合液の遺伝子合成反応前の電気抵抗と遺伝子合成反応後の電気抵抗とを比較することにより、標的遺伝子を低濃度で含む試料溶液からも確実に標的遺伝子を検出することができるものとされている。
【特許文献１】特許第３５１１５９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記した特許文献１に記載の遺伝子検出方法では、遺伝子合成反応（核酸増幅反応）前の混合液の電気化学的測定と、遺伝子合成反応後の電気化学的測定とを行い、それぞれの測定結果を比較するという手順をとる（特許文献１の第００２６段落参照）。このため、貴重な試料や高価な試薬類を２セット分準備する必要があり、コストが増大してしまうほか、遺伝子合成反応のための混合液を調製するやいなや反応が進行してしまう恐れの有る等温合成反応系、例えばNASBA（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）法、ICAN法（Isothermal and Chimeric Primer initiated Amplification of Nucleic Acids）、LAMP法（Loop mediated Isothermal Amplification）等では、遺伝子合成反応前の混合液がいつも不変であるとは限らず、このような場合、遺伝子合成反応の前後の測定結果比較では、正確な判断が下せない。また、上記した特許文献１に記載の遺伝子検出方法では、混合液に含まれる不純物などが原因で電気化学的応答を測定するセンサ部等に異常が生じた場合であっても、測定結果から異常を検知することができないため、信頼性の高い遺伝子検出を行うことができない。【０００６】
本発明は、このような実情に鑑みてなされたものであり、生体分子を電気化学的に検出する方法であって低コストで信頼性の高い検出を行うことができる方法及びこれに用いる生体分子検出用チップの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記解決課題に鑑みて鋭意研究の結果、本発明者は、電気化学的活性物質を含み生体分子を含まない基準溶液と、電気化学的活性物質と生体分子が反応した被検溶液との間で電気化学的応答を比較することにより、上記従来技術と同様に生体分子の検出を行うことができ、また、混合液を調整するやいなや反応が進行してしまう恐れのある等温合成反応（NASBA法、ICAN法、LAMP法）を行う場合にも、正確な比較が可能となることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、電気化学的応答の測定により検出対象生体分子を検出する生体分子検出方法であって、検出対象生体分子に対して直接的あるいは間接的に結合性を有する電気化学的活性物質を含む基準溶液の電気化学的応答を測定する基準溶液測定ステップと、前記基準溶液測定ステップで測定の終了した前記基準溶液に前記検出対象生体分子を含む被検試料を加え被検溶液を調製する被検溶液調製ステップと、前記被検溶液の電気化学的応答を測定する被検溶液測定ステップと、前記基準溶液の電気化学的応答の測定結果と前記被検溶液の電気化学的応答の測定結果とを比較して比較結果を導出する比較ステップと、前記比較結果を基に前記被検溶液中の前記検出対象生体分子の含有情報を検出する生体分子含有情報検出ステップとを含む生体分子検出方法を提供する。
本発明は、また、電気化学的応答の測定により検出対象生体分子を検出する生体分子検出方法であって、検出対象生体分子に対して直接的あるいは間接的に結合性を有する電気化学的活性物質を含む基準溶液の電気化学的応答を測定する基準溶液測定ステップと、前記基準溶液測定ステップで測定の終了した前記基準溶液に前記検出対象生体分子を含む被検試料を加え被検溶液を調製する被検溶液調製ステップと、前記被検溶液の電気化学的応答を測定する被検溶液測定ステップと、前記基準溶液の電気化学的応答の測定結果と前記被検溶液の電気化学的応答の測定結果とを比較して比較結果を導出する比較ステップと、前記比較結果を基に前記被検溶液中の前記検出対象生体分子の含有情報を検出する生体分子含有情報検出ステップとを含む生体分子検出方法を提供する。【０００９】
本発明の生体分子検出方法によれば、貴重な試料と高価な試薬類を含む溶液を２セット分準備する必要がないため、従来の生体分子検出方法に比べて、検出にかかるコストが低減される。また、混合液を調整するやいなや反応が進行してしまう恐れのある等温合成反応（NASBA法、ICAN法、LAMP法）を行う場合でも、基準溶液を設けることで、正確な比較が可能となる。
また、本発明の生体分子検出方法によれば、必ずしも検出対象生体分子を増幅するステップを経ずに測定ができるため、迅速で低コストな測定が可能であり、増幅に適さない分子や増幅の必要のない場合も含め、広い範囲の対象分子に応用できる。【００１０】
本発明の生体分子検出方法では、前記被検溶液が、前記検出対象生体分子の濃度が未知な２以上の前記被検溶液からなり、前記被検溶液測定ステップが、未知濃度の２以上の前記被検溶液の各々の前記電気化学的応答の測定を含み、前記比較ステップが、前記基準溶液の前記電気化学的応答の測定結果と各前記被検溶液の前記電気化学的応答の測定結果とを相対比較して比較結果を導出するステップであり、前記生体分子含有情報抽出ステップが、前記比較結果を基に各前記被検溶液中の前記検出対象生体分子の含有情報を検出するステップであってもよい。【００１１】
本発明の生体分子検出方法では、前記被検溶液測定ステップの後に、前記基準溶液又は前記基準溶液と同組成の基準溶液の電気化学的応答を測定する第２の基準溶液測定ステップと、前記基準溶液測定ステップの測定結果と、前記第２の基準溶液測定ステップの測定結果とを比較した結果に基づいて、電気化学的応答の測定の較正を行う較正ステップとを含んでもよい。
上記の方法によれば、生体分子検出を行った後に、同じ反応槽で電気化学的活性物質を含む基準溶液を用いた電気化学的測定を行うことによりキャリブリレーションが可能となるので、センサ部等の異常を検知することができ、信頼性の高い検出を行うことができる。【００１２】
本発明の生体分子検出方法では、前記被検溶液測定ステップの後に、前記基準溶液又は前記基準溶液と同組成の基準溶液の電気化学的応答を測定する第２の基準溶液測定ステップと、前記基準溶液測定ステップの測定結果と、前記第２の基準溶液測定ステップの測定結果とを比較した結果に基づいて、電気化学的応答の測定手段の異常を検知する異常検知ステップとを含んでもよい。
上記の方法によれば、生体分子検出を行った後に、同じ反応槽で電気化学的活性物質を含む基準溶液を用いた電気化学的測定を行うことによりキャリブリレーションが可能となるので、センサ部等の異常を検知することができ、信頼性の高い検出を行うことができる。
本発明の生体分子検出方法では、試料に対して当該検出対象生体分子を直接的あるいは間接的に増幅及び／又は変性させる反応を行って前記被検試料を得てもよい。
検出対象生体分子を微量に含む試料であっても、ＰＣＲ反応などにより増幅すれば検出可能となる。また、二本鎖の核酸鎖を一本鎖にさせるなどの変性により検出を容易にすることもできる。【００１３】
本発明の生体分子検出方法では、前記被検溶液が複数種の前記検出対象生体分子及び複数種の前記電気化学的活性物質を含んでもよい。また、前記基準溶液が複数種の前記電気化学的活性物質を含んでもよい。
電気化学的応答の測定では、溶液の電流値及び電圧値を測定する。このとき電気化学的活性物質（酸化還元試薬）の特性により、特異な電圧領域（電位領域）に電流ピークが現れる。そこで、例えば、複数の異なる生体分子にそれぞれ特異的に結合し、かつ、それぞれ特有の電位活性を有する電気化学的活性物質を用いれば、各生体分子に特異的な電流ピークが現れ、そのときの電位領域より定性が可能となり、また、そのときの電流値より定量も可能となる。すなわち、一度の測定で複数の異なる検出対象生体分子の含有情報を同時に検出することが可能となる。【００１４】
本発明の生体分子検出方法では、前記基準溶液測定ステップ又は被検溶液測定ステップにおける電気化学的応答の測定が、基準溶液又は被検溶液の拡散電流値の測定であってもよい。
また、前記電気化学的活性物質は、FND（Ferrocenyl naphthalene diimide）、Hoechst（Hoechst33258、Hoechst33342等を含む）、Distamycin、Nuclear yellow、DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）、Berenil、Methylene blue、Mitoxantrone、Daunomycin、Ethidium bromide、Propidium iodide、9-Aminoacridine、Ellipticine、Amsacrine、Hycanthone、Actinomycin D、Chromomycin、Mithramycin A、Echinomycin、Quinacrine、Nogalamycin、Proflavine、Amiloride、Trioxalen、Chloroquineからなる群より選択される一の物質であってもよい。
また、本発明の生体分子検出方法では、電荷あるいは電気陰性度を有する分子を検出対象としてもよく、さらに、一本鎖又は二本鎖の核酸、蛋白質、脂質や糖質を検出対象としてもよい。【００１５】
尚、本発明の生体分子検出方法では、基準溶液と被検溶液の測定結果の比較に基づいて、未知濃度の同種生体分子を含む他の被検溶液を相対的に定量評価できることも特徴とする。これらは、塩基変異検出にも応用でき、例えば、LAMP法、UCAN法、ASP（Allele Specific Primer）法などは塩基変異を識別して核酸鎖増幅が起こるため、遺伝子変異の有無によりその増幅量が異なる。したがって、正常遺伝子を増幅した試料が含まれる被検溶液と基準溶液とを比較測定し、未知の遺伝子を増幅反応させた試料が含まれる被検溶液を測定し、先の比較測定結果と相対評価することで、未知の遺伝子が正常なものか、変異を起こしているものかを判別することが可能となる。
また、基準溶液及び被検溶液の電気化学的応答の測定は、同一の電極で検出しても、異なる電極で検出してもよく、さらに、測定を複数回行ってもよい。測定方法は、対極及び作用極の２極からなる２電極法、これらに参照電極を加えた３電極法、これら３電極法のうち対極及び作用極が電界トランジスタとなる電気検出法などを利用することができる。【００１６】
また、本発明は、電気化学的応答の測定により検出対象生体分子を検出する生体分子検出用チップであって：前記検出対象生体分子に対して結合性を有する電気化学的活性物質を含む基準溶液又は前記検出対象生体分子を含む可能性のある被検試料と前記電気化学的活性物質とを含む被検溶液を収容可能なチャンバと；前記チャンバに前記基準溶液又は前記被検溶液を送液する送液装置と；前記チャンバに収容されている前記基準溶液又は前記被検溶液の電気化学的応答を測定する電気化学的応答測定装置と；前記チャンバから前記基準溶液又は前記被検溶液を排液する排液装置と；を備える生体高分子検出用チップを提供する。
上記の生体高分子検出用チップによれば、基準溶液と被検溶液を同一のチャンバに順次送液し、電気化学的応答を測定して比較できるため、迅速、かつ安価に検出対象生体分子を検出できる。【００１７】
なお、本発明の生体高分子検出用チップで、前記チャンバは、前記被検溶液中の前記検出対象生体分子を増幅又は変性させる増幅変性装置を更に備えてもよい。
また、前記増幅変性装置は温度調節装置であってもよい。
上記の構成によれば、検出対象生体分子を増幅又は変性させることによって、検出の感度を上げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明の生体分子検出方法の原理を説明する図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明の生体分子検出方法の原理を説明する図である。
【図２】図２は、本発明の生体分子検出方法の実験結果を示す図であって、一本鎖オリゴDNA濃度とFND拡散電流値の関係を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明の生体分子検出方法の実験結果を示す図であって、ヒトゲノムDNA分子数とFND拡散電流値の関係を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明の生体分子検出方法の実験結果を示す図であって、ヒトゲノムDNA分子数とFND拡散電流値変化率の関係を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、本発明の生体分子検出方法の実験結果を示す図であって、FND拡散電流による遺伝子検出の結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明の生体分子検出方法の実験結果を示す図であって、FND拡散電流による遺伝子検出の結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明の生体分子検出方法の実験結果を示す図であって、FND拡散電流による遺伝子検出の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、本発明の生体分子検出方法の実験結果を示す図であって、FND拡散電流による遺伝子検出の結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、添付図面を参照しながら、本発明の生体分子検出方法及び生体分子検出用チップを実施するための一形態を詳細に説明する。図１Ａ〜図５Ｂは、本発明の実施の形態を例示する図であり、これらの図で、同一の符号を付した部分は同一物を表わし、基本的な構成及び動作は同様であるものとする。【００２０】
本発明の生体分子検出方法の原理は以下のとおりである。
図１Ａに示すような電極センサ部を備えた反応槽に、基準溶液として対象生体分子に結合できる酸化還元試薬を含む電解溶媒を充填し、電圧を掃引して電流測定を行う。すると酸化還元試薬が電解溶媒中にほぼ均一に拡散しているので、酸化還元試薬の濃度に応じた拡散電流が測定される。
一方、図１Ｂに示すように、上記同様の反応槽に対象生体分子が存在する場合には、酸化還元試薬はその生体分子にトラップされるため、酸化還元試薬が電解溶媒中に不均一に拡散された状態となる。このとき、図１Ａに示す状態に比べると、電極センサ部近傍に存在する酸化還元試薬の量は減少しているため、電圧を掃引して電流測定を行うと、酸化還元試薬の濃度に応じた拡散電流よりも低い電流値が測定されることになる（電気化学的応答の測定）。【００２１】
したがって、本発明の生体分子検出方法では、まず、反応槽に酸化還元試薬（電気化学的活性物質）を含む電解溶媒、すなわち基準溶液を充填して拡散電流値を測定し（基準溶液測定ステップ）；次に、反応槽に検出対象試料（被検試料）及び酸化還元試薬を含む電解溶媒、すなわち被検溶液を充填して拡散電流値を測定し（被検溶液測定ステップ）；次に、両測定値の差異を比較し（比較ステップ）；この比較結果に基づいて生体分子の有無及び存在量（濃度）を知ることができる（生体分子含有情報検出ステップ）。
尚、上記の生体分子検出方法で、基準溶液測定ステップを終えたあと、この基準溶液測定ステップで使用した基準溶液に、検出対象試料を加えて被検溶液を調製してもよい（被検溶液調製ステップ）。
尚、対象試料中に含まれる生体分子の量が少ない場合には、増幅反応を利用することができる（たとえば、標的生体分子が核酸の場合には、LAMP法、ICAN法、PCR法、NASBA法などが挙げられる）。この場合、酸化還元試薬を含む電解溶媒と、酸化還元試薬、増幅反応試薬、対象試料を含む電解溶媒とについて拡散電流値を測定し、両測定値を比較することにより生体分子の検出を行うことができる。また、これらの測定後に、再度、酸化還元試薬を含む電解溶媒の拡散電流値を測定し（第２の基準溶液測定ステップ）、先に同様の電解溶媒について測定した拡散電流値と比較することにより、電極センサのキャリブレーション（較正ステップ）や異常検知（異常検知ステップ）を行うこともできる。
本発明の生体分子検出方法で、生体分子として核酸を用いる場合には、使用する電気化学的活性物質は核酸に直接的又は間接的に結合する物質であれば特に限定はされず、例えば、FND（Ferrocenyl naphthalene diimide）、Hoechst （Hoechst33258、Hoechst33342等を含む）、Distamycin、Nuclear yellow、DAPI、Berenil、Methylene blue、Mitoxantrone、Daunomycin、Ethidium bromide、Propidium iodide、9-Aminoacridine、Ellipticine、Amsacrine、Hycanthone、Actinomycin D、Chromomycin、Mithramycin A、Echinomycin、Quinacrine、Nogalamycin、Proflavine、Amiloride、Trioxalen、Chloroquine等を用いることができる。この中でも特に、FND又はHoechst33258を用いることが好ましい。
【実施例１】
【００２２】
上記した本発明の生体分子検出方法の実施例として、下記のような実験を行った。
＜電極調製＞
単電極（金電極／直径1mm／BAS社製）の電極表面をダイヤモンド研磨（4〜6μmダイヤモンドスラリー）し、次いでALS650（BAS社製）を用いて、硫酸水溶液中にて電解研磨（サイクリック・ボルタンメトリー）を行った。研磨終了後、蒸留水にて流水洗浄した。この電極表面に、メルカプトヘキサノール溶液2μLを滴下し、保湿箱に入れ、2時間インキュベーションした。電極は、使用直前に蒸留水にて流水洗浄し、実験に共試した。【００２３】
＜FND溶液調製＞
フェロセンナフタレンジイミドに酢酸を加えて攪拌溶解し、本溶液中に酢酸カリウム、塩化カリウムを加え、十分に攪拌溶解後、蒸留水を用いて適当な濃度に調製した。【００２４】
＜ＤＰＶ測定＞
測定環境：測定器／ALS650（BAS社製）
三電極法測定／作用電極＝単電極、対電極＝白金線、参照電極＝銀・塩化銀
測定条件：ＤＰＶ（Differential Pulse Voltammetry）
初期電位＝0mV、最終電位＝600mV、電位増加＝20mV、振幅＝50mV、パルス幅＝0.05sec、
サンプリング幅＝0.0167sec、パルス時間＝0.2sec、静止時間＝2sec、感度＝1e-6A/V【００２５】
＜実験１＞
マスキング処理（電極調製）が施された単電極２本を用いて、下記の３種類の調製溶液（300μL）のFND拡散電流をＤＰＶにて測定した。
１．FND溶液270μL＋ＤＤＷ 30μL
２．FND溶液270μL＋10pmol/μL 一本鎖オリゴＤＮＡ(120mer) 30μL
３．FND溶液270μL＋100pmol/μL一本鎖オリゴＤＮＡ(120mer) 30μL
ＤＤＷは再蒸留水（Double Distilled Water）。一本鎖オリゴＤＮＡはオペロン社製のものを用いた。
この実験の結果を図２に示す。このグラフから、調製溶液中の一本鎖オリゴＤＮＡの濃度が高くなるに従って、拡散電流値が減少する傾向にあることが確認された。【００２６】
＜実験２＞
マスキング処理が施された単電極２本を用いて、下記の８種類の調製溶液（300μL）のFND拡散電流をＤＰＶにて測定した。
１．FND溶液150μL＋ヒトゲノムＤＮＡ（0 copy）溶液150μL
２．FND溶液150μL＋ヒトゲノムＤＮＡ（10 copies）溶液150μL
３．FND溶液150μL＋ヒトゲノムＤＮＡ（102 copies）溶液150μL
４．FND溶液150μL＋ヒトゲノムＤＮＡ（103 copies）溶液150μL
５．FND溶液150μL＋ヒトゲノムＤＮＡ（104 copies）溶液150μL
６．FND溶液150μL＋ヒトゲノムＤＮＡ（105 copies）溶液150μL
７．FND溶液150μL＋ヒトゲノムＤＮＡ（106 copies）溶液150μL
８．FND溶液150μL＋ヒトゲノムＤＮＡ（107 copies）溶液150μL
ヒトゲノムＤＮＡ溶液は、ロッシュ社製のHuman Genome DNAを用いた。
この実験の結果を図３Ａ，３Ｂに示す。
図３Bは、ゲノムDNA分子数が０コピーの調製溶液の拡散電流値を基準拡散電流値i0とし、各ゲノム分子数存在下における拡散電流値をiとするとき、以下の式で算出される各調製溶液の拡散電流値変化率Δi(%)を示す。
Δi(%)  =  ［ (i0 − i) ／ i0 ］ × 100
これらのグラフから、ヒトゲノムＤＮＡの濃度が10〜105copies/300μLの調製溶液（上記２〜６）について測定された拡散電流値は、ヒトゲノムＤＮＡを含まない調製溶液の測定値とほぼ同じである。一方、ヒトゲノムＤＮＡの濃度が106 copies/300μLを超える調製溶液（上記７，８）については、濃度にしたがって拡散電流値が減少することが確認された。これにより、本発明の生体分子検出方法によりヒトゲノムＤＮＡを検出する際の検出限界が明らかとなった。【００２７】
＜実験３＞
マスキング処理が施された単電極２本を用いて、下記の３種類の調製溶液（300μL）のFND拡散電流をＤＰＶにて測定した。
１．FND溶液270μL＋ＤＤＷ 30μL
２．FND溶液270μL＋ＰＣＲ反応前溶液 30μL
３．FND溶液270μL＋ＰＣＲ反応後溶液 30μL
ＰＣＲ反応前溶液は、増幅対象のヒトゲノムＤＮＡ及びＰＣＲ試薬を下記の通り調製した溶液である。ＰＣＲ反応後溶液は、このＰＣＲ反応前溶液に対して下記の条件でＰＣＲ反応を行って得られた溶液である。
【表１】
2008096757.tif 000003
この実験の結果を図４Ａ，４Ｂに示す。なお、図４Bは図３Bと同様の方法で算出された、拡散電流値変化率Δi(%)を示す。これらのグラフから、FND溶液にＰＣＲ反応前溶液を加えた調製溶液（上記２）の拡散電流値は、FND溶液に蒸留水を加えた調製溶液（上記１）の拡散電流値とほぼ同じである一方で、これらに比べて、FND溶液にＰＣＲ反応後溶液を加えた調製溶液（上記３）の拡散電流値は顕著に低いことが確認された。これにより、FND溶液のみを用いた調製溶液の拡散電流値と、FND溶液にＰＣＲ反応後溶液を加えた調製溶液の拡散電流値とを比較することにより、調製溶液中の対象生体分子の検出を行うことができることが分かった。【００２８】
＜実験４＞
マスキング処理が施された単電極１本を用いて、下記の３種類の調製溶液（300μL）のFND拡散電流を氷温下（４℃）にてＤＰＶ測定した。
１．FND溶液200μL＋ＤＤＷ 100μL
２．FND溶液200μL＋200ng/μL ヒトゲノムＤＮＡ溶液 100μL
３．FND溶液200μL＋200ng/μL 変性ヒトゲノムＤＮＡ溶液 100μL
上記１〜３の調製溶液は、それぞれ４℃下で10分間放置した後にＤＰＶ測定を行った。ここで、２の調製溶液には二本鎖のヒトゲノムＤＮＡを用いている。一方、３の調製溶液は２と同じ二本鎖のヒトゲノムＤＮＡを含む溶液100μLを95℃で5分間加熱した直後に氷水に3分間浸して急冷却処理を施した後に、200μLのFND溶液と混合して得た。この処理により、３の調製溶液中のヒトゲノムＤＮＡは一本鎖に変性されている。
この実験の結果を図５Ａ，５Ｂに示す。なお、図５Bは図３Bと同様の方法で算出された、拡散電流値変化率Δi(%)を示す。これらのグラフから、FND溶液に蒸留水を加えた調製溶液（上記１）に比べて、ヒトゲノムＤＮＡ、変性ヒトゲノムＤＮＡ溶液を含む調製溶液（上記２，３）は拡散電流値が低いこと、さらには、二本鎖ヒトゲノムＤＮＡを含む調製溶液（上記２）に比べて、この二本鎖ヒトゲノムＤＮＡを一本鎖に変性させたものを含む調製溶液（上記３）の方が、FND溶液のみを含む調製溶液に対する拡散電流値の変化率が高いことが確認された。
【実施例２】
【００２９】
一方、本発明の生体分子検出用チップの実施例として、検出対象生体分子に対して結合性を有する電気化学的活性物質を含む基準溶液、又は検出対象生体分子を含む可能性のある被検試料と前記電気化学的活性物質とを含む被検溶液を収容可能であるチャンバと、前記チャンバに基準溶液又は被検溶液を送液する手段と、前記チャンバに収容されている基準溶液又は被検溶液の電気化学的応答を測定する手段と、前記チャンバから基準溶液又は被検溶液を排液する手段とを有する生体高分子検出用チップを利用することができる。
また、上記のチャンバは、前記被検溶液中の検出対象生体分子を直接的あるいは間接的に増幅又は変性させる変性装置を備えてもよく、変性装置は温度調節装置であってもよい。
このようなチップを用いれば、温度調節装置による検出対象生体分子の増幅と電気化学的測定とを１つのチャンバ内で行うことができるため、実験作業が簡略化され、試薬の使用量を最低限に抑えることが可能である。【００３０】
以上、本発明の生体分子検出方法及び生体分子検出用チップについて、具体的な実施の形態を示して説明したが、本発明はこれらに限定されるものではない。当業者であれば、本発明の要旨を逸脱しない範囲内で、検出の手順やチップの各構成部に様々な変更・改良を加えることが可能である。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の生体分子検出方法及び生体分子検出用チップは、医療、食品衛生、環境保全等の産業分野で、遺伝子や蛋白質などの生体分子を低コストかつ簡便・迅速に分析する技術として利用することができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【国際調査報告】
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