(57)【要約】  本発明は、ペプチド又はタンパク質を高感度かつ簡便に検出することができる試薬として有用な新規スクエア酸誘導体を提供すること、及び該化合物を含むタンパク質検出用試薬、並びに該試薬を用いた効率的かつ網羅的にペプチド濃度又はタンパク質濃度を測定する方法を提供すること、を目的とする。  本発明では、下記式（Ｉ）で表される構造を有する新規化合物を、タンパク質分析用試薬として使用する。【化１】2008023489.tif 000010（式中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基を表し；ｍ１及びｍ２は１〜３の整数；ｎ１＝５−ｍ１、ｎ２＝５−ｍ２の整数である。）
2008023489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される化合物。
【化１】
2008023489.tif 000008
（式中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基を表し；ｍ１及びｍ２は１〜３の整数；ｎ１＝５−ｍ１、ｎ２＝５−ｍ２の整数である。）
【請求項２】
上記式（Ｉ）で表される化合物が、下記式（ＩＩ）で表される化合物であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【化２】
2008023489.tif 000009
【請求項３】
請求項１又は２に記載の化合物を含有するタンパク質検出用試薬。
【請求項４】
試薬が、前記化合物を溶媒に溶解したものであることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質検出用試薬。
【請求項５】
試薬が、前記化合物を担体に固定したものであることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質検出用試薬。
【請求項６】
被検サンプルと請求項３〜５のいずれか１項に記載のタンパク質検出用試薬とを接触させ、該タンパク質検出用試薬の色の変化又は該タンパク質検出用試薬から生じる蛍光を検出することを特徴とする被検サンプル中のタンパク質の検出方法。
【請求項７】
タンパク質の検出を蛍光光度法、吸光光度法、及び試験紙光電光度法からなる群より選択される方法で行こなうことを特徴とする請求項６に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なスクエア酸誘導体化合物、及び該化合物を含むタンパク質検出用試薬、並びに該試薬を用いたタンパク質の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
体内のタンパク質を網羅的に調べて病気の状態や原因を探るプロテオーム研究の進展に伴って、癌マーカータンパク質のように疾患の目印となるタンパク質を決定しようとする研究が急速に加速している。とりわけ、タンパク質表面の分子認識、タンパク質表面間の分子認識は、生命現象における共通の言語と考えられ、細胞外からの情報の多くは、細胞膜や細胞内部でのタンパク質表面を介した相互作用によって、増幅し伝達される。近年、ＤＮＡチップ技術の向上により、ＲＮＡの発現を網羅的に解析するトランスクリプトーム解析が盛んに行われている。しかしながら、このＲＮＡ発現プロファイルとタンパク質の発現プロファイルは必ずしも一致するわけでなく、その相関は５０％以下であると言われている。そこで、ＲＮＡの網羅的解析に加え、タンパク質の網羅的解析が重要となり、最近、著しく発達している二次元電気泳動法や質量分析計、さらにはプロテインチップのようなゲノム解析に匹敵するハイスループット分析を駆使して、タンパク質の機能を明らかにしようとしている。今後、その成果を医療や健康管理の現場で役立てるためには、疾患のマーカーとなるタンパク質を、簡便かつ迅速に分析する技術を確立しておくことが重要となってくる。【０００３】
試料中のタンパク質を定量する代表的な方法として、（ｉ）吸光光度法、（ｉｉ）Ｂｉｕｒｅｔ試薬を用いたＢｉｕｒｅｔ法、（ｉｉｉ）フェノール試薬とＢｉｕｒｅｔ法を組み合わせたＬｏｗｒｙ法、（ｉｖ）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法が挙げられる。以下にそれぞれの方法の原理、長所、及び短所について記す。【０００４】
（１）吸光光度法
この方法の原理は、タンパク質中のチロシンやトリプトファンに起因する２８０ｎｍ付近の吸収帯を利用してタンパク質濃度を算出するものである。タンパク質の種類によってチロシンやトリプトファンの含量が異なるので２８０ｎｍにおける吸光度は変動するが、通常１ｍｇ／ｍｌの濃度の時Ａ２８０ｎｍは１．０として計算できる。この方法の長所は、操作が簡便であり、測定後サンプルの回収が可能であることである。また短所は、タンパク質の種類により吸光度が変動すること、また２８０ｎｍに吸収を持たないタンパク質（コラーゲン、ゼラチンなど）は測定できないこと、さらに紫外部に吸収を持つ物質の混入は定量を妨害することなどである（非特許文献１）。【０００５】
（２）Ｂｉｕｒｅｔ法
この方法の原理は、タンパク質をアルカリ性条件下でＣｕ２＋溶液と反応させると、Ｃｕ２＋がポリペプチド鎖中の窒素原子と配位結合して赤色に発色する現象を利用して、５４０ｎｍにおける吸光度を測定するものである。この方法の長所は、タンパク質の違いによる発色率の差が少なく、操作が簡単であることである。また短所は、感度が低く、低濃度試料には向かないことである（非特許文献１）。【０００６】
（３）Ｌｏｗｒｙ法
この方法の原理は、リンモリブデン酸とリンタングステン酸を酸性溶液に溶解したフェノール試薬を用いて、タンパク質中のチロシン、トリプトファン及びシステインと反応させることにより、青色を呈色させるものである。この方法では、ペプチド結合に由来する発色効果が強く表れるためＢｉｕｒｅｔ法よりはるかに感度が高い。この方法の長所は、感度が高く、最も一般に使用されていることである。一方短所は、還元反応によって呈色させるため、他の還元物質により発色が妨害されること、操作が煩雑で測定までに時間がかかること、タンパク質によって発色率に差があることなどである（非特許文献２）。【０００７】
（４）Ｂｒａｄｆｏｒｄ法
酸性溶液中、トリフェニルメタン系青色色素のクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０がタンパク質と結合すると、極大吸収波長が４６５ｎｍから５９５ｎｍにシフトし、色調が赤紫色から青色に変化することに基づく方法である。この現象を利用してタンパク質を定量する。この方法の長所は、妨害物質の影響を受けにくく、操作が非常に簡単であることである。短所は、タンパク質の種類により発色率に差があり、また界面活性剤の混入により発色が妨害されることである（非特許文献３）。【０００８】
（５）ＥＬＩＳＡ法
この方法は、特定のタンパク質とだけ結合する抗体を利用した免疫学的な手法である。この方法の短所は、対象となるタンパク質（抗原）と抗体の結合反応を繰り返す必要があるため、測定に６時間以上かかるなど、迅速に結果を求めることができないことである（非特許文献４）。【０００９】
一方、蛍光光度法は、種々の化学物質を分析する慣習的な方法である。この方法は、高感度である、試料が少量ですむ、大掛かりな装置、熟練した技術を必要としないといった利点がある。また、比色分析法に至っては、目視で判断が出来るため、試料中のタンパク質を迅速かつ簡易に分析することが出来る。【００１０】
これまでにも蛍光光度法を利用したタンパク質定量の報告はある。例えば、フルオレサミンは１級アミンと反応すると、４９５ｎｍに蛍光を発する強い蛍光物質となることを利用した方法や、シアニン系色素を用いた分析が代表的である。しかしながらこれまでの方法は色素とタンパク質を共有結合を介して反応させるため、反応時間が遅い、タンパク質の種類によって反応性が変わる、検量線が直線でない、色素同士の会合による測定誤差、ストークスシフトが小さいといった問題点がある。また、比色分析方法を利用した例として、ＣＢＢを用いた分析が代表的である。しかしながら、タンパク質間ごとの測定誤差が大きい、色の変化が明瞭でない、酸性条件下においてのみしか、タンパク質を認識することが出来ない、といった問題点がある（非特許文献５〜８）。さらに、従来の分析試薬は、蛍光分析試薬であれば蛍光分析しか適用できない、あるいは比色分析試薬であれば、比色分析にしか適用できず、一つの分析試薬で両方の分析方法を行うことが出来る試薬は無い。【００１１】
【非特許文献１】岡田雅人、宮崎香編：改訂タンパク質実験ノート（上）,pp29, 羊土社, 1999
【非特許文献２】Lowry, O. H. et al. J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951).
【非特許文献３】Bradford, M. M., Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976).
【非特許文献４】生化学辞典（第３版）、東京化学同人、1998.
【非特許文献５】R. P. Haugland, V. L. Singer, L. J. Jones, T. H. Steinberg, U. S. Patent 5616502 (1997).
【非特許文献６】Haugland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 9th ed.; Molecular Probes Inc.: Leiden, 2002.
【非特許文献７】L. J. Jones, R. P. Haugland, V. L. Singer, Biotechniques, 34, 850 (2003).
【非特許文献８】R. F. Pasternack, C. Fleming, S. Herring, P. J. Collings, J. DePaula, G. DeCastro, E. J. Gibbs, Biophys. J., 79, 550 (2000).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上記問題点を解決し、ペプチド又はタンパク質を高感度かつ簡便に検出することができる試薬として有用な新規化合物を提供することを目的とする。また、本発明は効率的かつ網羅的にペプチド濃度又はタンパク質濃度を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、スクエア酸に基づいて合成した新規化合物が色素として有用であり、タンパク質と結合することにより発色変化及び蛍光発光を生じることを発見した。そして、このスクエア酸誘導体を利用してタンパク質を高感度かつ簡便に検出することができるという知見を得、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち本発明は、つぎの１〜７の構成を採用するものである。
１．下記式（Ｉ）で表される化合物。
【化１】
2008023489.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基を表し；ｍ１及びｍ２は１〜３の整数；ｎ１＝５−ｍ１、ｎ２＝５−ｍ２の整数である。）
２．上記式（Ｉ）で表される化合物が、下記式（ＩＩ）で表される化合物であることを特徴とする１に記載の化合物。
【化２】
2008023489.tif 000004
３．請求項１又は２に記載の化合物を含有するタンパク質検出用試薬。
４．試薬が、前記化合物を溶媒に溶解したものであることを特徴とする３に記載のタンパク質検出用試薬。
５．試薬が、前記化合物を担体に固定したものであることを特徴とする３に記載のタンパク質検出用試薬。
６．被検サンプルと３〜５のいずれか１項に記載のタンパク質検出用試薬とを接触させ、該タンパク質検出用試薬の色の変化又は該タンパク質検出用試薬から生じる蛍光を検出することを特徴とする被検サンプル中のタンパク質の検出方法。
７．タンパク質の検出を蛍光光度法、吸光光度法、及び試験紙光電光度法からなる群より選択される方法で行こなうことを特徴とする６に記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、タンパク質分析用試薬として有用なスクエア酸誘導体が提供される。この化合物は、タンパク質と混合するだけで瞬時に反応し、蛍光の発光と色変化が同時に生じることから、タンパク質の高感度検出が可能となるばかりでなく、目視定量分析が可能となる。従って、タンパク質の検出を、高価な装置や熟練した技術を必要とせずに、迅速にかつ簡便に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本分析用試薬とタンパク質との複合体形成による蛍光発光及び発色変化の模式図を示す。
【図２】分析用試薬に種々の濃度のＢＳＡを添加したときの吸収スペクトルを示す。
【図３】ＢＳＡ添加前後の分析用試薬溶液の色の変化を示す。Ａは試薬のみ、Ｂは試薬＋ＢＳＡを示す。
【図４】６００ｎｍにおける吸光度をＢＳＡ濃度に対してプロットしたグラフである。
【図５】分析用試薬に種々の濃度のＢＳＡを添加したときの、試薬の蛍光スペクトルを示す。
【図６】６１０ｎｍにおける蛍光強度をＢＳＡ濃度に対してプロットしたグラフである。
【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質の染色画像である。Ａは本分析用試薬を用いた場合を示し、ＢはＣＢＢ法を用いた場合を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のスクエア酸誘導体は、下記の一般式（Ｉ）で表される新規化合物である。
【化３】
2008023489.tif 000005
（式中、Ｒ１及びＲ２は互いに独立して水素原子、又は炭素数１〜１０のアルキル基を表し；ｍ１及びｍ２は１〜３の整数；ｎ１＝５−ｍ１、ｎ２＝５−ｍ２の整数である。）【００１８】
上記式（Ｉ）で表されるスクエア酸誘導体としては、例えば下記式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【化４】
2008023489.tif 000006
【００１９】
本発明の式（Ｉ）で表されるスクエア酸誘導体は、いわゆるシアニン色素の１種であり、スクエアレート環を含む発色団を有することから色素として有用である。そして、これらの色素化合物は、特にタンパク質検出用試薬として好適に用いられる。【００２０】
本発明の新規化合物をタンパク質検出用試薬として使用するには、被検サンプルと上記式（Ｉ）で表されるスクエア酸誘導体とを接触させ、該スクエア酸誘導体の色の変化又は該スクエア酸誘導体から生じる蛍光を検出する。この検出方法は、例えば蛍光光度法、吸光光度法、試験紙光電光度法などの方法によって行うことができる。【００２１】
以下、本発明のスクエア酸誘導体を用いたタンパク質検出用試薬について、詳細に説明する。
１．タンパク質分析用試薬
本発明では、一般式（Ｉ）で表されるスクエア酸誘導体をタンパク質検出用試薬として使用する。【００２２】
本発明は、式（Ｉ）の構造を有する化合物とタンパク質とを接触させると、それらが疎水性相互作用により複合体を形成することによって発色の変化及び蛍光発光が生じることに基づいている。この色素変化又は蛍光強度を測定することにより、タンパク質の定性分析及び定量分析等を行うことができる。【００２３】
本発明者は、（ｉ）タンパク質と複合体を形成し、ソルバトクロミズム効果によって蛍光の変化と色調の変化を同時に引き起こす部位として、スクエア酸を選択し、（ｉｉ）共役系を伸長し、かつ高いモル吸光係数及び高い蛍光量子収率を促すために、スクエア酸部位にオレフィン基を導入し、オレフィン基の先に、フェニル基を導入し、（ｉｉｉ）さらに水溶性を付与するため、かつ電子を供与するために水酸基を選択することによって、上記式（Ｉ）の構造を設計した。【００２４】
なお、ソルバトクロミズム効果とは、通常は溶液状態において溶媒の種類の変化によりスペクトルが変化する現象を指すが、本発明においては、液相に限らず、遊離状態からタンパク質との結合状態への、色素分子の周囲に存在する環境の変化によってスペクトルが変化することも意味する。【００２５】
式（Ｉ）で表される構造を有する化合物の好適な具体例としては、上記の式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。【００２６】
これらのスクエア酸誘導体は、式（Ｉ）の構造を有することによって、疎水性相互作用によってタンパク質と結合し、複合体を形成することができる。したがって、タンパク質検出用試薬として好適に用いられる。【００２７】
本発明のタンパク質分析用試薬は、図１に示すように、式（Ｉ）の構造を有することによって、遊離状態における呈色と他の物質との結合状態における呈色とに変化が生ずる。色の変化については、色素分子のπ電子軌道のエネルギー準位が、タンパク質の疎水場に入り込むことによって安定化し、光の吸収波長が長波長側に移動するためと考えられる。式（Ｉ）で示した構造は、タンパク質との結合によって、例えば、黄色→緑色、黄色→赤色、緑色→青色といった色調の変化が生じると考えられる。また、タンパク質分析用試薬は、図１に示すように、遊離状態においては無蛍光であるが、他の物質との結合状態では蛍光を発する。蛍光の発光については、色素がタンパク質の疎水場に入ることによって、蛍光量子収率が増加するため考えられる。【００２８】
例えば式（ＩＩ）で表される化合物は、遊離状態において赤色を呈色し、無蛍光であるが、タンパク質と複合体形成した際には、青色を呈色し、蛍光を発する。【００２９】
式（Ｉ）の構造を有する化合物は、例えば、３，４−ジヒドロキシ−３−シクロブテン−１，２−ジオンと相当する芳香族化合物をトルエン−ｎ−ブタノール混合溶媒に溶解後、アルゴン雰囲気下、２４時間、還流を行うことによって合成することができる（例えば、K. T. Arun and D. Ramaiah, J. Phys. Chem. A, 109, 5571-5578 (2005)参照）。溶媒を減圧留去後、再結晶、最沈殿、あるいはカラムクロマトグラフィーなどの操作を用いて、精製を行う。
例えば、式（ＩＩ）で表される化合物は、フェノールとスクエア酸とを適当な溶媒中で反応させることにより生成することができる。【００３０】
２．タンパク質の検出方法
本発明のタンパク質検出用試薬は、タンパク質と疎水性相互作用により複合体を形成し、ソルバトクロミズム効果によって発色の変化及び蛍光発光を生じる。従って、本分析用試薬とタンパク質を含む可能性のあるサンプルとを接触させ、生じる発色の変化又は蛍光を検出することによって、サンプル中のタンパク質を検出することができる。本分析用試薬とタンパク質との反応は、モル吸光係数と蛍光量子収率が高いため、極微量のタンパク質でも検出することができる。本発明において、タンパク質の「検出」とは、サンプルにおけるタンパク質の存在の有無を検出することだけではなく、タンパク質を定量的に検出することも含む。【００３１】
本分析用試薬を用いて分析の対象となるタンパク質は、連結した複数のアミノ酸を含み、疎水性相互作用によって本分析用試薬と結合可能な化合物であれば特に限定されるものではない。分析対象のタンパク質としては、例えば、ペプチド、タンパク質、タンパク質複合体（例：糖タンパク質、タンパク質−核酸複合体、標識タンパク質）などが挙げられる。【００３２】
またサンプルとしては、タンパク質を含有することが疑われるサンプルであれば特に限定されるものではなく、液体サンプル又は固体サンプルのいずれでもよい。具体的には、例えばタンパク質を含有する可能性のある溶液、タンパク質を電気泳動したゲル、タンパク質を移した膜（ＰＶＤＦ膜など）、細胞又は組織、糞尿、血液などが挙げられる。【００３３】
使用する本分析用試薬は、適当な溶媒（ＮａＣｌ溶液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯなど）に溶解させて使用してもよいし、又は適当な担体（膜、試験紙など）に固定して使用してもよい。【００３４】
タンパク質の検出は、典型的には、サンプルを本分析用試薬と接触させ、分析用試薬の発色の変化及び／又は蛍光発光を検出することを含む。本発明において「接触」とは、サンプル中に存在するタンパク質と本分析用試薬とが複合体を形成することができるように近接する状態にすることを意味する。例えば、液体サンプルと本分析用試薬の溶液とを混合すること、本分析用試薬を固定した担体（膜、試験紙など）に液体サンプルを浸潤させること、固体サンプルに対して本分析用試薬を塗布すること、本分析用試薬に固体サンプルを浸漬することなどの操作が含まれる。【００３５】
サンプルと本分析用試薬とを接触させる条件は、使用するサンプルの種類及び量、接触形態などを考慮して当業者であれば適宜選択することができる。例えばサンプル中に含まれるタンパク質量が０〜１０００μｇ／ｍＬ程度であると推定される場合には、１０〜１００μＭ、好ましくは１５〜８０μＭ（例えば約２０〜３０μＭ）の本分析用試薬を使用する。また接触は、室温（約２０〜３０℃）で、約１〜３０分、好ましくは約１〜１５分行う。【００３６】
サンプルと本分析用試薬とを接触させた後、当技術分野で公知の方法を用いて分析用試薬の発色の変化及び／又は蛍光発光を検出する。発色の変化は、例えば目視観察、吸光光度法（分光光度計、プレートリーダーなどを用いる）、反射スペクトル分析法などによって検出することができる。また蛍光発光は、例えば蛍光光度法（蛍光光度計、蛍光プレートリーダー、蛍光スキャナーなどを用いる）などによって検出することができる。【００３７】
反応後は、例えば加熱操作、溶媒のアルカリ性化（例えばｐＨ１０以上とする）などによって、結合した本分析用試薬とタンパク質とを脱離することができる。【００３８】
本発明に係るタンパク質の検出方法は、タンパク質を高感度、迅速に、かつ複雑な機器を用いることなく検出することが可能である。また本分析用試薬は、特定のタンパク質と一定割合で結合するため、検量線を作成することによって簡便に定量することが可能である。さらに本分析用試薬は、特定のタンパク質と特異的に結合する抗体などとは異なり、あらゆるタンパク質と結合することができることから、複数種のタンパク質を網羅的に分析することが可能である。従って、本検出方法は、生化学、医療、分析化学の分野において有用である。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００４０】
（実施例１）
本実施例においては、タンパク質分析用試薬（色素）として用いるためのスクエア酸誘導体を合成した。この色素の合成は、下記反応式に従って行った。【００４１】
【化５】
2008023489.tif 000007
【００４２】
具体的には、５０ｍｌ三口フラスコに、フェノール（０．２ｇ，１．７ｍｍｏｌ）、スクエア酸（０．１ｇ，０．９ｍｍｏｌ）、ｎ−ブタノール：トルエン＝１：３ｖ／ｖの混合溶媒４０ｍＬを加え、アルゴン気流下、２４時間還流した。溶媒を減圧留去後、大型薄層クロマトグラフィー（ＳｉＯ２，アセトン：ＡｃＯＥｔ＝１：１ｖ／ｖ）で精製し、褐色固体を得た。【００４３】
収率５５％
1H-NMR (400 MHz, Acetone-d6, TMS, r.t., d/ppm) 5.5〜5.8 (m, 4H)。
ESI(+) ［M+Na］＋=353【００４４】
（実施例２）
本実施例では、実施例１で合成した色素の特性評価（吸収スペクトル測定）を行った。
吸収スペクトル測定は、下記条件にて、吸光光度計（（株）島津製作所製ＵＶ−１６５０ＰＣ）を用いて行った：
濃度：［色素］＝２５μＭ
［ＢＳＡ］＝０〜１０００μｇ／ｍＬ
溶媒：０．９％ＮａＣｌ水溶液
測定温度：２５℃【００４５】
濃度０，６０，１２０，２５０，５００，１０００（μｇ／ｍＬ）のＢＳＡを添加した時の、色素の吸収スペクトルを下から順に図２に示す。ＢＳＡの濃度の増加と共に、吸光度が増加した。さらに極大蛍光波長はＢＳＡの濃度の増加と共に、５３０ｎｍから６００ｎｍへシフトした。この極大吸収波長の大きなシフトによって、色素の溶液の色は、図３に示したように、ＢＳＡの添加前（Ａ）と後（Ｂ）で、赤色から青色へと変化した。【００４６】
６００ｎｍにおける吸光度をＢＳＡ濃度に対してプロットした結果を、図４に示す。６００ｎｍにおける吸光度とＢＳＡの濃度との間には、下記の式で表される良好な直線関係が得られた。
ｙ＝０．０００４ｘ＋０．０１０１
Ｒ２＝０．９９７【００４７】
（実施例３）
本実施例では、実施例１で合成した色素の特性評価（蛍光スペクトル測定）を行った。
蛍光スペクトル測定は、下記条件にて、蛍光光度計（日本分光（株）製ＦＰ−６５００）を用いて行った：
濃度：［色素］＝２５μＭ
［ＢＳＡ］＝０〜１０００μｇ／ｍＬ
溶媒：０．９％ＮａＣｌ水溶液
測定温度：２５℃
励起波長：５９５ｎｍ【００４８】
色素に濃度０，６０，１２０，２５０，５００，１０００（μｇ／ｍＬ）のＢＳＡを添加したときの蛍光スペクトル変化を測定した結果を、図５に下から順に示した。図５に示したように、ＢＳＡ濃度の増加に伴い、蛍光強度の増加が観察された。ＢＳＡを１０００μｇ／ｍＬ添加した時の蛍光強度は、色素単独の蛍光強度と比較して、約４５００倍増加した。【００４９】
色素にＢＳＡを添加した時の６１０ｎｍにおける蛍光強度をＢＳＡ濃度に対してプロットしたところ、図６に示したように、良好な直線関係が得られた。また検出限界は１００ｎｇ／ｍＬであり、Ｂｒａｄｆｏｌｄ法よりも約２０倍感度が良いことが分かった。【００５０】
（実施例４）
本実施例では、実施例１で合成した色素の特性評価（電気泳動実験）を行った。
電気泳動実験は、下記条件にて行った：
濃度：［色素］＝０．１ｍｇ／ｍＬ（３０％ＥｔＯＨ中）
［ＢＳＡ］＝０〜５μｇ／ウエル
固定化液及び洗浄液；Ｈ２Ｏ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ＝８７：１０：３ｖ／ｖ
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）システム：Sureblot F1 Gel System【００５１】
電気泳動終了後、ゲルを取り出し、固定化液中で３０分間洗浄した。その後、染色液中で３０分間、ゲルを浸した後、洗浄液中で３０分間洗浄した。【００５２】
結果を図７のＡに示す。電気泳動によって泳動されたゲル中のタンパク質は、分析用試薬と複合体を形成することによって、図７のＡに示したような、赤色のバンドが観察された。【００５３】
さらに、現在、市販されている電気泳動のタンパク質染色剤であるＣＢＢ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ法）（図７のＢ）と比較したところ、ＣＢＢよりも検出感度が高いことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明により、タンパク質分析用試薬として有用な新規スクエア酸誘導体が提供される。この化合物を含有するタンパク質分析用試薬は、タンパク質と混合するだけで瞬時に反応し、蛍光の発光と色変化が同時に生じることから、タンパク質の高感度検出が可能となるばかりでなく、目視定量分析が可能となる。従って、タンパク質の検出を、高価な装置や熟練した技術を必要とせずに、迅速にかつ簡便に行うことが可能となる。
【図１】
2008023489.tif 000011
【図２】
2008023489.tif 000012
【図３】
2008023489.tif 000013
【図４】
2008023489.tif 000014
【図５】
2008023489.tif 000015
【図６】
2008023489.tif 000016
【図７】
2008023489.tif 000017
【国際調査報告】
2008023489.tif 000018
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