(57)【要約】本発明は、発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる試験において、発がんプロモーターを簡便かつ短期間に検出できる、Orm1、Scarb1、Stmn1、Rad21、Nup54、Jun、Dmp1、Abi1、6530403A03Rik、Slc2a1、Plf（Plf2、Mrpplf3）、Fosl1、Chek1、Pik3r5、Junb、Vegfa、Rif1(LOC671598)、Il1rl1、Phex、Tfrc、Zfhx1b、Rad51ap1、Hells、Mcm3、Orm2、Car13、Ccnb1からなる27種のマーカー遺伝子、並びにこれらのマーカー遺伝子を用いたプロモーター検出方法を提供する。
2009001939.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養細胞を用いた発がんプロモーター検出方法においてマーカーとして使用するための遺伝子であって、
下記遺伝子グループAから選ばれる１又は２以上の遺伝子からなるマーカー遺伝子。
遺伝子グループA：
2009001939.tif 000022
【請求項２】
マーカー遺伝子が、少なくとも下記遺伝子グループA-1の3遺伝子を含んでなる請求項１に記載の遺伝子。
遺伝子グループA-1：
2009001939.tif 000023
【請求項３】
マーカー遺伝子が、少なくとも下記遺伝子グループA-2の7遺伝子を含んでなる請求項１に記載の遺伝子。
遺伝子グループA-2：
2009001939.tif 000024
【請求項４】
マーカー遺伝子が、少なくとも下記遺伝子グループA-3の22遺伝子を含んでなる請求項１に記載の遺伝子。
遺伝子グループA-3：
2009001939.tif 000025
【請求項５】
マーカー遺伝子が、Orm1 遺伝子である請求項１に記載の遺伝子。
【請求項６】
培養細胞に被験物質を接触させる工程、
被験物質を接触させた細胞におけるマーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
測定した発現量を、被験物質を含まない溶媒のみを接触させた対照と比較する工程、
前記比較において、被験物質を接触させた細胞における（i）マーカー遺伝子の発現量の総和、又は（ii）発現量が大きいマーカー遺伝子の数が対照より多い場合、被験物質が発がんプロモーション活性を有すると評価する工程
を備えた発がんプロモーターの検出方法であって、
マーカー遺伝子が請求項１〜５のいずれかに記載のマーカー遺伝子である方法。
【請求項７】
培養細胞が、BALB/c 3T3細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
培養細胞を用いた発がんプロモーター検出方法に使用するためのキットであって、
請求項１〜５のいずれかに記載のマーカー遺伝子を測定するための試薬を含むキット。
【請求項９】
培養細胞を用いた発がんプロモーター検出方法におけるマーカーとしての請求項１〜５のいずれかに記載のマーカー遺伝子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発がんプロモーター検出用のマーカー遺伝子及び発がんプロモーター検出方法に関する。より詳細には、発がんプロモーターとしてのがん原性を有するかどうかを予測するための培養細胞を用いる形質転換試験において、フォーカス形成の観察に代えて、培養細胞中の特定遺伝子の発現量を指標として発がんプロモーターを検出する方法に利用することのできるマーカー遺伝子及び本マーカー遺伝子の発現量を指標とする発がんプロモーター検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品をはじめ環境中に存在する様々な物質は、発がん性を有する可能性がある。このため、発がん性を迅速に検査する方法は、以前より求められてきたものである。【０００３】
発がん性（がん原性）を検出する簡易試験法として様々な遺伝毒性試験が使用されている。しかし、遺伝毒性試験では検出できない発がん性物質（非変異原性発がん物質）の存在が問題となっている。その多くが発がんプロモーターと呼ばれるものである。【０００４】
すなわち、発がんのメカニズムには、２段階の主要なプロセスが関係していることが確認されており、１段階目は発がんイニシエーションと称され、遺伝毒性（変異原性）物質などでDNAが損傷をうける過程である。２段階目は発がんプロモーションと称され、メカニズムは様々であるが、発がんプロモーター（発がんプロモーション活性を有する物質）によって、DNA損傷を有する細胞がさらに増殖し、がん形成を促進する過程として知られている。【０００５】
発がんプロモーターとしては、体内で生成されるホルモンや多種の有機化合物、無機化合物等が知られており、必ずしも遺伝毒性を伴わない。このため、遺伝毒性試験では検出できないという難点がある。【０００６】
また、発がんプロモーターとして知られている化合物の作用メカニズムは、細胞増殖を亢進するもの、細胞傷害性を示すもの、プロテインキナーゼＣなど、ある種の酵素を亢進するもの、また、ある種の酵素を阻害するものなど一様ではなく、発がんプロモーションの詳細な分子メカニズムは解明されていない。【０００７】
発がんプロモーター検出のために汎用されている方法として動物であるげっ歯類を用いた二段階発がん試験がある。しかし、動物飼育施設が必要であり、8週間から24週間、あるいは、それ以上と試験期間が長く、かつ、判定に剖検等が必要であり、専門性と熟練が要求されるため、より簡便で多数の検体を検査できるin vitro試験が望まれている。【０００８】
現在、in vitro試験系としては、培養細胞であるBALB/c 3T3細胞（非特許文献１）、または、BALB/c 3T3細胞にv-Ha-Ras遺伝子を導入したBhas細胞を用いた形質転換試験などがある（非特許文献２）。これらの試験法は、動物試験よりも操作は簡便であり、優れた発がんプロモーター検出方法である。【０００９】
しかし、これらの試験法は、動物試験よりは操作は簡便であるが、試験期間がBALB/c 3T3細胞形質転換試験で25日間、Bhas細胞形質転換試験で21日間と長く、細胞準備期間を除いた期間においても、被験物質の添加から結果を得るまでに約20日間という長期間を必要とする。かつ、判定に培養細胞のフォーカス形成能の顕微鏡観察が必要で専門性と熟練が要求される。【００１０】
また、その他、発がんプロモーターを検出する試験法として、代謝共同試験、EBウイルスを用いた試験なども使用されているが、検出力・操作性の煩雑さなどに問題点があり、上記の試験に比べ信頼性に劣る。【００１１】
一方、近年のゲノム情報に関する技術の発達により、遺伝子レベルで、化学物質の発がん性を含む有害性の評価が行われている。通常、動物を用いた発がん試験は2年間を要し、発がんしやすい動物を用いても数ヶ月を要することに加え、その判定には剖検等の専門性を必要とする。これに対し、遺伝子発現による評価は、発がん物質投与後数日で発がんの兆候を捉えることができ、数値データを読み取ることで発がんを予測するため、試験期間の短縮、操作の簡便化、熟練度の必要性の低さにおいて、有利である。【００１２】
遺伝子発現解析には、様々なレベルのものがあるが、動物を用いた発がん試験などに使用されるDNAマイクロアレイを用いた数万の遺伝子の網羅的発現解析は（特許文献１,２）、発現する数千から数万の遺伝子を解析対象にできること、発がんのようにメカニズムが不明な現象を検出する上で、全遺伝子の発現パターンを解析、比較すること、未知の遺伝子群も対象にできることなどの点で、非常に優れた手段である。しかし、評価に不要な遺伝子も多数含まれることや、試験装置、試薬、解析のコストが高いなどの欠点があり、多数の検体の評価には使用困難である。【００１３】
一方、網羅的遺伝子解析や既知のメカニズムから対象とする病態の発生を予測することができるマーカー遺伝子群を用いて、定量的RT-PCR法などで、それら特定のマーカー遺伝子群の発現を評価する方法が知られている（特許文献３,４）。このような方法は、簡便で比較的コストも低く、数多くの検体を検査するスクリーニングに適している。
【非特許文献１】「化学物質のがん原性を予測するためのBALB/c 3T3細胞を用いる短期2段階形質転換試験」, TR Z 0023  日本規格協会発行，2002
【非特許文献２】Mutat. Res., vol. 557, 191-202, 2004
【特許文献１】特開2007-54022号公報
【特許文献２】WO2005/024020
【特許文献３】特開2006-162446号公報
【特許文献４】特開2004-248575号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明者らは、発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するためのin vitro試験系である培養細胞を用いた形質転換試験において、発がんプロモーターの検出に利用できるマーカーとなる遺伝子群を見出すこと、また、これらのマーカー遺伝子を用いた遺伝子レベルの発がんプロモーター検出方法を確立することを目的とした。さらに、この検出方法を、培養細胞を用いた形質転換試験に利用することで、発がんプロモーターを簡便かつ短期間に確認できるin vitroの試験系を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記の目的を達成するためにまず、形質転換試験において、発がんプロモーション活性の評価の際に利用できるマーカーとなる遺伝子群の探索をDNAマイクロアレイで検討した。尚、発がんプロモーションのメカニズムは、複雑で、かつ、未知な部分が多いため、マーカー遺伝子の選抜に際しては、性質・構造が異なる様々な発がんプロモーターを９種用いて実施した。【００１６】
さらに、マーカー遺伝子の選抜にあたっては、（１）全ての発がんプロモーターで共通性が高く増加する遺伝子であること、（２）文献等で実際の発がんで発現増加が確認できる遺伝子であること、（３）細胞増殖関連、がん遺伝子、アポトーシス阻害、細胞骨格の変化など発がんプロモーションの性質に深く関連していると考えられる遺伝子であること、（４）機能未知であるが、発がんプロモーターの検出力が高い遺伝子であること、（５）非発がんプロモーターで陰性対照比1.5倍以上の発現量を示さない遺伝子であること、などの点を考慮して実施した。その結果、２７種の遺伝子を選抜することができた。【００１７】
さらに、培養細胞を用いた形質転換試験において、被験物質、即ち、発がんプロモーターの候補物質を細胞に暴露後、所定時間経過後において培養細胞より回収したm-RNAを含む総RNAについて、選抜されたマーカー遺伝子の発現量を調べることで、培養細胞を用いた形質転換試験におけるフォーカス形成を実際に観察することなく、発がんプロモーターの検出を簡便、短期間に判定する方法を完成するに至った。【００１８】
本発明は、以下の事項に関する。【００１９】
１.培養細胞を用いた発がんプロモーター検出方法においてマーカーとして使用するための遺伝子であって、
下記遺伝子グループAから選ばれる１又は２以上の遺伝子からなるマーカー遺伝子。
遺伝子グループA：
2009001939.tif 000003
2009001939.tif 000004
項１には、マーカー遺伝子が、前記グループAから選ばれる3遺伝子からなる遺伝子セットである場合、前記グループAから選ばれる7遺伝子からなる遺伝子セットである場合、或いは、前記グループAから選ばれる11遺伝子からなる遺伝子セットである場合が含まれる。【００２０】
2．マーカー遺伝子が、少なくとも下記遺伝子グループA-1の3遺伝子を含んでなる項１に記載の遺伝子。
遺伝子グループA-1：
2009001939.tif 000005
【００２１】
3.マーカー遺伝子が、少なくとも下記遺伝子グループA-2の7遺伝子を含んでなる項１に記載の遺伝子。
遺伝子グループA-2：
2009001939.tif 000006
【００２２】
3-1.マーカー遺伝子が、少なくとも下記遺伝子グループA-2'の11遺伝子を含んでなる項１に記載の遺伝子。
遺伝子グループA-2'：
2009001939.tif 000007
【００２３】
4.マーカー遺伝子が、少なくとも下記遺伝子グループA-3の22遺伝子を含んでなる項１に記載の遺伝子。
遺伝子グループA-3：
2009001939.tif 000008
【００２４】
5. マーカー遺伝子が、Orm1 遺伝子である項１に記載の遺伝子。【００２５】
6．培養細胞に被験物質を接触させる工程、
被験物質を接触させた細胞におけるマーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
測定した発現量を、被験物質を含まない溶媒のみを接触させた対照と比較する工程、
前記比較において、被験物質を接触させた細胞における（i）マーカー遺伝子の発現量の総和、又は（ii）発現量が大きいマーカー遺伝子の数が対照より多い場合、被験物質が発がんプロモーション活性を有すると評価する工程
を備えた発がんプロモーターの検出方法であって、
マーカー遺伝子が項１〜５のいずれかに記載のマーカー遺伝子である方法。【００２６】
特に、培養細胞に発がんイニシエーターを接触させる工程、
前記発がんイニシエーターに接触させた細胞に被験物質を接触させる工程、
被験物質を接触させた細胞におけるマーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
測定した発現量を、被験物質を含まない溶媒のみを接触させた対照と比較する工程、
前記比較において、被験物質を接触させた細胞における（i）マーカー遺伝子の発現量の総和、又は（ii）マーカー遺伝子のうち発現量が大きい遺伝子の数が、対照より多い場合、被験物質が発がんプロモーション活性を有すると評価する工程
を備えた発がんプロモーターの検出方法であって、
マーカー遺伝子が項1〜5のいずれかに記載のマーカー遺伝子である方法。【００２７】
7.培養細胞が、BALB/c 3T3細胞である、項6に記載の方法。【００２８】
8.培養細胞を用いた発がんプロモーター検出方法に使用するためのキットであって、
項1〜5のいずれかに記載のマーカー遺伝子を測定するための試薬を含むキット。
特に、項6又は7に記載の方法に使用するためのキットであって、
項1〜5のいずれかに記載のマーカー遺伝子を測定するための試薬を含むキット。【００２９】
9.培養細胞を用いた発がんプロモーター検出方法におけるマーカーとしての項1〜5のいずれかに記載のマーカー遺伝子の使用。
特に、項6又は7に記載の方法におけるマーカーとしての項1〜5のいずれかに記載のマーカー遺伝子の使用。
また、本発明は、下記項10〜19を含む。【００３０】
10．発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる形質転換試験において、
フォーカス形成の観察に代えて、培養細胞中の特定遺伝子の発現量の変動を測定することによって発がんプロモーターを検出する方法に利用することのできるマーカー遺伝子であって、以下の少なくとも１種の遺伝子からなるマーカー遺伝子：
2009001939.tif 000009
【００３１】
11．発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる形質転換試験において、
項10に記載の遺伝子のうち、いずれか1つの遺伝子の発現量を指標とする発がんプロモーター検出方法。【００３２】
12．発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる形質転換試験において、
項10に記載の遺伝子 Orm1（NM_008768）の発現量を指標とする発がんプロモーター検出方法。【００３３】
13. 発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる形質転換試験において、
項10に記載の遺伝子から選択される２種以上のマーカー遺伝子の総発現量を指標とする発がんプロモーター検出方法であって、
項10に記載の遺伝子 Scarb1(NM_016741), Stmn1（NM_019641），Plf ; Plf2 ; Mrpplf3（NM_011118 ; NM_011954 ; NM_031191），Fosl1 (NM_010235), Il1rl1(NM_001025602 ; NM_010743)のうち少なくとも１種の遺伝子を含む発がんプロモーター検出方法。【００３４】
14.発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる形質転換試験において、
項10記載の遺伝子全ての発現量を指標とする発がんプロモーター検出方法。【００３５】
15.前記培養細胞が、BALB/c 3T3細胞である項11ないし14のいずれか記載の発がんプロモーター検出方法。【００３６】
16.項10ないし15記載のいずれか記載の発がんプロモーター検出方法を利用した発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる形質転換試験。【００３７】
17.項10に記載の遺伝子から選択される以下の3種の遺伝子全ての発現量を指標とする、項11に記載の方法。
2009001939.tif 000010
【００３８】
18. 項10に記載の遺伝子から選択される以下の7種の遺伝子全ての発現量を指標とする、項11に記載の方法。
2009001939.tif 000011
【００３９】
19．項10に記載の遺伝子から選択される以下の22種の遺伝子全ての発現量を指標とする、項11に記載の方法。
2009001939.tif 000012
【００４０】
以下、本発明を詳細に説明する。【００４１】
尚、本明細書において、発がんプロモーターとは、発がんプロモーション活性を有する物質を意味する。【００４２】
また、発がんプロモーション活性は、イニシエーションされた潜在的腫瘍細胞（DNA損傷を受けた細胞）の増殖、悪性化を亢進する作用を意味する。遺伝毒性を持たない発がん物質の多くは、発がんプロモーターである。【００４３】
発がんプロモーターの多くは、二段階発がん試験などの動物試験で見出され、発がんプロモーターの濃度の低さや腫瘍や前がん病変の数によって、その活性の強度を推測することができる。例えば、一定の病変を示す際の被験物質の濃度が低いほど、その被験物質は強い発がんプロモーション活性を有すると判断できる。また被験物質を一定の濃度とする場合の腫瘍や前がん病変の数が多いほど、その被験物質は強い発がんプロモーション活性を有すると判断できる。【００４４】
より具体的に、本願実施例に示されるようなBALB/c 3T3細胞を用いた形質転換試験において、フォーカス数が多い及び／又は濃度が低いとの結果が得られる被験物質は、発がんプロモーション活性が強い物質と判断される。【００４５】
１．マーカー遺伝子
本発明のマーカー遺伝子、換言すると、培養細胞を用いる試験において利用することのできるマーカー遺伝子は、以下の少なくとも1種の遺伝子からなる。【００４６】
尚、本明細書において、遺伝子とは、遺伝形質を発現するもとになるものであって、単離されたDNA分子、RNA分子、もしくはDNAの転写産物の形態で表される場合を含む。【００４７】
また、本明細書において、マーカー遺伝子とは、マーカーとなる単一の遺伝子又は遺伝子の組み合わせを意味するものであって、マーカー遺伝子又はそのセットとも換言し得るものである。【００４８】
下記の各遺伝子の塩基配列は公知のデータベース（NCBI）のAccession Noで確認できる。
2009001939.tif 000013
【００４９】
NM_001077190、NM_001077192、NM_001077193、NM_007380、NM_145994は、いずれもAbi1の複数の転写産物（トランスクリプト バリアント）であり、DNAマイクロアレイ、RT-PCRのプローブもこれら５つの遺伝子を同一のものとして検出する。【００５０】
即ち、Abi1は、NM_001077190、NM_001077192、NM_001077193、NM_007380又はNM_145994のいずれかの配列で表すことのできる遺伝子を意味する。【００５１】
NM_011118、NM_011954、NM_031191は、Plf2、Mrpplf3、Plfの３つの遺伝子を表す。これらは、最近、prolactin family 2, subfamily c（prl2c）のメンバーとして別名prl2c3, prl2c4, prl2c2として知られて、ほとんど同じ配列を有する。DNAマイクロアレイ、RT-PCRのプローブもこれら３つの遺伝子を同一のものとして検出する。【００５２】
即ち、Plf2、Mrpplf3又はPlfは、NM_011118、NM_011954又はNM_031191のいずれかの配列で表すことのできる遺伝子を意味する。【００５３】
NM_001025250、NM_001025257、NM_009505は、いずれもVegfaの複数の転写産物（トラン  スクリプト バリアント）であり、DNAマイクロアレイ、RT-PCRのプローブもこれら３つの遺伝子を同一のものとして検出する。【００５４】
即ち、Vegfaは、NM_001025250、NM_001025257又はNM_009505のいずれかの配列で表すことのできる遺伝子を意味する。【００５５】
NM_175238 、XR_003484は、Rif1、LOC671598の２つの遺伝子を表す。LOC671598は、Rif1のホモログであり、ほとんど同じ配列を有する。DNAマイクロアレイ、RT-PCRのプローブもこれら３つの遺伝子を同一のものとして検出する。【００５６】
即ち、Rif1又はLOC671598は、NM_175238 又はXR_003484のいずれかの配列で表すことのできる遺伝子を意味する。【００５７】
NM_001025602、NM_010743は、いずれもIl1rl1の複数の転写産物（トランスクリプト バリアント）であり、DNAマイクロアレイ、RT-PCRのプローブもこれら２つの遺伝子を同一のものとして検出する。【００５８】
即ち、Il1rl1は、NM_001025602又はNM_010743のいずれかの配列で表すことのできる遺伝子を意味する。【００５９】
これらのマーカー遺伝子は、BALB/c 3T3細胞を用いる形質転換試験においてイニシエーションを施した細胞に対して、発がんプロモーターとして知られている複数の物質を細胞に添加した後、一定時間経過後の細胞より回収された総RNAを用いて、DNAマイクロアレイを用いて発現する遺伝子を網羅的に解析することで見出した。【００６０】
特に、DNAマイクロアレイの実施に際しては、発がんプロモーションのメカニズム自体が明らかでないこと、また、あらゆる発がんプロモーターも対応できるマーカー遺伝子群を見出すために、性質の異なる9種類の以下の発がんプロモーターを選択した。【００６１】
具体的には、形質転換細胞のフォーカス形成を示し、かつ、遺伝毒性を有さない発がんプロモーターとして、（i）典型的な発がんプロモーターでプロテインキナーゼCを活性化するホルボールエステルであるTPA、（ii）プロテイン脱リン酸化酵素１、２Aの阻害活性を有するオカダ酸、（iii）様々な薬物代謝酵素を活性化させるフェノバルビタールナトリウム、（iv)高濃度で膀胱がんを発生させるサッカリンナトリウム、（v）プロテインチロシン脱リン酸化酵素の阻害活性を有するバナジン酸塩であるオルトバナジン酸ナトリウム、
（vi）生体由来成分の二次胆汁酸であるリトコール酸、及び、（vii）細胞増殖を亢進するインスリン、
また、遺伝毒性を有する発がんプロモーターとして、（viii）メタロチオネインを増加させる塩化亜鉛、及び、（ix)酸化的リン酸化阻害により様々な毒性を示す亜ヒ酸ナトリウムを選択して用いた。【００６２】
これらの様々な性質、構造を有する９種類の発がんプロモーターをそれぞれ添加した試験系で、細胞のRNAを採取し、DNAマイクロアレイを用いて発現する遺伝子の網羅的解析を実施した。【００６３】
RNAの採取時間は、被験物質特有の発がんプロモーションとの関わりの低い薬物代謝酵素遺伝子群の発現の影響を排除するため、この場合、被験物質添加後48時間とした。また、発がんプロモーションのメカニズムは、複雑で、かつ、未知な部分が多いため、DNAマイクロアレイ上の約４万種類の遺伝子からのこれらのマーカー遺伝子群の選抜は以下の法則に従い実施した。【００６４】
まず、定法に従い発現値の信頼性が高く、かつ、いずれかひとつの発がんプロモーターで発現が増加するものとして約6700種類の遺伝子を得た。換言すると、（１）各発がんプロモーターを添加した試験系の１つ以上で、陰性対照比1.5倍以上の発現を示した、約6700種の遺伝子を選択した。【００６５】
次いで、全ての発がんプロモーターで共通性が高く増加する遺伝子として、325種類の遺伝子を得た。換言すると、（２）前記（１）で得られた遺伝子の中から、各発がんプロモーターを添加した試験系の５つ以上で、陰性対照比1.5倍以上の発現を示した、325種類の遺伝子を選択した。【００６６】
さらに、（ａ）文献等で実際のがんで発現増加が確認できる遺伝子、（ｂ）細胞増殖関連、がん遺伝子、アポトーシス阻害、細胞骨格の変化など発がんプロモーションの性質に深く関連していると考えられる遺伝子、（ｃ）機能未知であるが、発がんプロモーターの検出力が高い遺伝子、（ｄ）非発がんプロモーターで陰性対照比1.5倍未満の発現量を示す遺伝子を選抜した。【００６７】
換言すると、（３）前記（２）で選択した遺伝子の中から、発がんプロモーターを添加していない試験系で、陰性対照比1.25倍以下の発現を示した98種類の遺伝子を選択した。更に、（３）で選択した遺伝子の中から、（４）（ｉ）発現量が十分な遺伝子、及び、（ii）細胞増殖関連、がん遺伝子、アポトーシス阻害、細胞骨格の変化など、発がん又は発がんのプロモーションの仕組みに関連していると考えられる遺伝子であることを参酌して、27種類の遺伝子を選択した。【００６８】
この結果、27種類の遺伝子を選択することができた。各遺伝子の主要な機能は表1に示すとおりである。【００６９】
【表１】
2009001939.tif 000014
【００７０】
本発明におけるマーカー遺伝子は、表１に示される遺伝子、即ち、下記遺伝子グループAから選択される１又は２以上の遺伝子又はそのセットである。【００７１】
換言すると、本発明のマーカー遺伝子には、遺伝子グループA に属する27種の遺伝子全てからなる遺伝子セット、遺伝子グループA から選ばれる数個の遺伝子からなる遺伝子セット、または、遺伝子グループAから選ばれるいずれか1つの遺伝子が含まれる。
遺伝子グループA：
2009001939.tif 000015
本発明のマーカー遺伝子の一例は、少なくとも下記遺伝子グループA-1の3遺伝子を全て含んでなる遺伝子セットA-1である。
遺伝子グループA-1：
2009001939.tif 000016
遺伝子セットA-1は、上記3遺伝子からなるセットであってもよく、上記3遺伝子以外に遺伝子グループAから選ばれる１又は２以上の遺伝子を更に含んでいてもよい。【００７２】
例えば、Fosl1、Ccnb1、Hells、及びRad51ap1の４遺伝子からなる遺伝子セットが挙げられる。【００７３】
また、本発明のマーカー遺伝子の他の例は、少なくとも下記遺伝子グループA-2の7遺伝子を全て含んでなる遺伝子セットA-2である。
遺伝子グループA-2：
2009001939.tif 000017
遺伝子セットA-2は、上記7遺伝子からなるセットであってもよく、上記7遺伝子以外に遺伝子グループAから選ばれる１又は２以上の遺伝子を更に含んでいてもよい。【００７４】
本発明のマーカー遺伝子の他の例は、少なくとも下記遺伝子グループA-2'の11遺伝子を全て含んでなる遺伝子セットA-2'である。
遺伝子グループA-2'：
2009001939.tif 000018
遺伝子セットA-2'は、上記11遺伝子からなるセットであってもよく、上記11遺伝子以外に遺伝子グループAから選ばれる１又は２以上の遺伝子を更に含んでいてもよい。【００７５】
本発明のマーカー遺伝子の他の例は、少なくとも下記遺伝子グループA-3の22遺伝子を全て含んでなる遺伝子セットA-3である。
遺伝子グループA-3：
2009001939.tif 000019
遺伝子セットA-3は、上記22遺伝子からなるセットであってもよく、上記22遺伝子以外に遺伝子グループAから選ばれる１又は２以上の遺伝子を更に含んでいてもよい。【００７６】
また、本発明のマーカー遺伝子の他の例は、マーカー遺伝子が Orm1 遺伝子である場合である。【００７７】
尚、上記マーカー遺伝子の例示は、本発明におけるマーカー遺伝子の種々の態様の一部を示したものにすぎず、本発明を限定的に解釈させるものではない。【００７８】
本発明のマーカー遺伝子は、培養細胞を用いた発がんプロモーター検出方法においてマーカーとして使用することができる。【００７９】
培養細胞を用いた発がんプロモーター検出方法としては、下記項目２に記載される検出方法が挙げられる。【００８０】
具体的に、本願発明のマーカー遺伝子は、後述するように、被験物質（発がんプロモーター）に細胞を暴露後、所定時間経過後において培養細胞より回収した総RNAに含まれるm-RNAについてその発現量を測定するために使用することができる。【００８１】
また、これ以外にも、当該マーカー遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体を用いて、培養細胞内での当該タンパク質を定量により発現量を測定するために使用することができる。例えば、各種のエンザイムイムノアッセイやラジオイムノアッセイ、固相酵素免疫検定法等を利用することができる。前記抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。【００８２】
２．発がんプロモーター検出方法
本発明は、上記マーカー遺伝子を用いた、遺伝子発現レベルでの発がんプロモーター検出方法を提供する。【００８３】
本発明の検出方法は、
培養細胞に被験物質を接触させる工程、
被験物質を接触させた細胞におけるマーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
測定した発現量を、被験物質を含まない溶媒のみを接触させた対照と比較する工程、
前記比較において、被験物質を接触させた細胞における（i）マーカー遺伝子の発現量の総和、又は（ii）発現量が大きいマーカー遺伝子の数が対照より多い場合、被験物質が発がんプロモーション活性を有すると評価する工程
を備える。【００８４】
（１）使用する細胞
使用する培養細胞は、一般の形質転換試験に用いる培養細胞であれば、種々のタイプを用いることができる。  【００８５】
本発明においては、マーカー遺伝子の選抜にあたって使用したDNAマイクロアレイ実験にマウス遺伝子を使用したため、マウスの培養細胞、即ち、マウス由来細胞を用いることが好ましい。【００８６】
具体的には、BALB/cマウスの全胚由来の線維芽細胞株であるBALB/c 3T3細胞や、そのクローン株、BALB/c 3T3細胞にv-Ha-Ras遺伝子を導入したBhas細胞などの形質転換株が挙げられる。尚、BALB/c 3T3系統マウス以外にC3H10T1/2系統の細胞も使用することが可能である。【００８７】
（２）被験物質
被験物質の種類は特に限定されない。低分子化合物、高分子化合物等の他に、例えば、食品、食品加工物、廃棄物、ゴミ焼却物等の複数種類の物質の混合物であってもよい。【００８８】
また、陽性対照としては、例えば、強力な発がんプロモーターであるTPA（phorbol 12-myristate 13-acetate）を用いることができる。【００８９】
また、陰性対照としては、通常、溶媒のみを用いる。尚、本明細書において、陰性対照とは、特記しない限り、被験物質を含まない溶媒のみを接触させた対照を意味する。【００９０】
（３）発現量の測定
発現量の測定方法は、特に限定されないが、マーカー遺伝子をターゲットとして、mRNAを逆転写したcDNAを増幅して定量的RT-PCRを用いた方法、プローブを用いてmRNAを直接的に定量するノーザンブロッティング法や、マーカー遺伝子群を搭載したDNAマイクロアレイを用いてその発現量を解析する方法などがある。いずれの方法を使用しても良い。この中でも、定量的RT-PCR法が、運用コストが低く、数時間で結果が得られるため、好ましい。【００９１】
またmRNAの回収方法も公知の方法に従って行うことができるが、例えば、被験物質を添加して、一定時間、通常36〜72時間、経過させた後、各被験物質投与群の培地を抜き取り、PBSで洗浄した後、総RNAを抽出し、この総RNA中のうちマーカー遺伝子のm-RNAの発現量等を調べる。尚、総RNAを抽出する際には、DNase処理を実施したほうが好ましい。  【００９２】
（４）発現量の比較
上記（３）で測定したマーカー遺伝子の発現量を、被験物質を含まない溶媒のみを接触させた対照細胞の発現量、即ち、陰性対照と比較する。この際、常法に従って、適当な標準曲線を作成したり、内部標準遺伝子を用いて補正を行ったりしてもよい。また陽性対照の発現量も測定し、それとの比較を組み合わせて行うこともできる。【００９３】
例えば、陰性対照、又は、陽性対照のcDNAの希釈系列でスタンダードカーブを作成し、スタンダードカーブに対する相対的発現量を算出し、これを内部標準遺伝子であるβ-Actinの発現量で補正し、さらに陰性対照群の発現量で除す。陰性対照群の発現量に対する相対的発現量として個々の遺伝子の発現量を算出し、マーカー遺伝子の発現量を得る。得られた発現量を、陰性対照の発現量と対比することで、被験物質を添加した系のマーカー遺伝子の発現量の比較結果を得ることができる。【００９４】
（５）発がんプロモーターの評価
上記（４）で得られた比較結果に基づき、被験物質が発がんプロモーション活性を有するか、即ち、発がんプロモーターとして陽性であるかの評価を行うことができる。具体的に、被験物質を接触させた細胞における（i）マーカー遺伝子の発現量の総和、又は（ii）発現量が大きいマーカー遺伝子の数が、対照より多い場合、被験物質が発がんプロモーション活性を有すると評価する。【００９５】
発がんプロモーターとして陽性と判断する場合の判断基準については、発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子の発現量の様々な解析方法に従って設定可能である。【００９６】
発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群の発現解析には、（１）陰性対照群に対し1.5倍以上の発現量の発現量を示したマーカー遺伝子の個数による解析（２）マーカー遺伝子の発現量の総和による解析、（３）クラスター解析などを用いた方法が挙げられる。但し、その他の係数を乗じた方法などを使用しても良い。【００９７】
具体的に、被験物質を接触させた細胞におけるマーカー遺伝子の発現量の総和が、陰性対照、即ち、被験物質を含まない溶媒のみを接触させた対照細胞におけるマーカー遺伝子の発現量の総和より多い場合、被験物質が発がんプロモーション活性を有すると評価することができる。【００９８】
また、被験物質を接触させた細胞におけるマーカー遺伝子と、陰性対照におけるマーカー遺伝子について、遺伝子の種類ごとに発現量を比較し、被験物質を接触させた細胞における、陰性対照の発現量に対し1.5倍以上の発現量を示すマーカー遺伝子の個数が、陰性対照より多い場合、被験物質が発がんプロモーション活性を有すると評価することができる。【００９９】
また、上記結果から、発がんプロモーターの強度についての評価も行うことができる。即ち、被験物質を接触させた細胞におけるマーカー遺伝子の発現量の総和が、陰性対照におけるマーカー遺伝子の発現量の総和に対して多いほど、被験物質の発がんプロモーター活性が強いと評価できる。【０１００】
また、被験物質を接触させた細胞における、陰性対照の発現量に対し1.5倍以上の発現量を示すマーカー遺伝子の個数が、陰性対照より多いほど、被験物質の発がんプロモーター活性が強いと評価できる。【０１０１】
尚、本発明の方法においては、上記以外の工程を必要に応じて付加することができる。例えば、培養細胞に発がんイニシエーターを接触させる工程を付加することができる。【０１０２】
具体的には、培養細胞を用いる形質転換試験においてイニシエーションを施した細胞に対して、発がんプロモーターとして知られている複数の物質を細胞に添加した後、一定時間経過後、培養細胞より回収したRNAを用いて、各マーカー遺伝子の発現量を調べる。【０１０３】
また、被験物質（発がんプロモーター）の種類や構造や、培養細胞の種類によって、マーカー遺伝子の種類を設定することができる。【０１０４】
例えば、マーカー遺伝子のうち、いずれか１種の遺伝子の発現量を調べることによって、これを指標として発がんプロモーターを検出することができる。【０１０５】
特に、BALB/c 3T3細胞においては、Orm1遺伝子（NM_008768）の発現量を指標とする場合には、プロモーターを検出する被験物質の種類や構造にかかわらず、検出することができる。但し、この遺伝子はBhas細胞で発現量が低いため、Bhas細胞では使用することができない。【０１０６】
BALB/c 3T3細胞の場合は、マーカー遺伝子が、少なくともOrm1遺伝子（NM_008768）を含んでいることが好ましく、特に、遺伝子グループA-2、更には遺伝子グループA-3で示される遺伝子を含む場合が好ましい。一方、Bhas細胞を用いる場合は、マーカー遺伝子が、少なくとも、Fosl1（NM_010235）、Hells（NM_008234）、Ccnb1（NM_172301）を含んでいることが好ましく、特に、遺伝子グループA-2、更には遺伝子グループA-3で示される遺伝子を含む場合が好ましい。【０１０７】
また、任意に複数の遺伝子の遺伝子発現量を指標として発がんプロモーション活性を検出することができる。【０１０８】
例えば、２種以上のマーカー遺伝子の総発現量を指標とする場合においては、マーカー遺伝子 Scarb1(NM_016741), Stmn1（NM_019641），Plf ; Plf2 ; Mrpplf3（NM_011118 ; NM_011954 ; NM_031191），Fosl1 (NM_010235), Il1rl1(NM_001025602 ; NM_010743)のうち少なくとも１種の遺伝子を含む２種以上の遺伝子の発現量を指標とする方法が好ましい。【０１０９】
さらに、好ましくは、遺伝子グループAに示す27種全ての遺伝子の発現量を指標として発がんプロモーターを検出する方法である。【０１１０】
尚、被験物質の種類や構造にもよるが、一般には発がんプロモーターとしての発がんプロモーション活性の強度を調べるには、全てのマーカー遺伝子を用いるか、数個のマーカー遺伝子を指標とする条件下であっても、より多くのマーカー遺伝子で判断する方が好ましい。【０１１１】
なお、必要に応じて、本発明のマーカー遺伝子以外の遺伝子の発現量に基づく解析結果や、被験物質の他の物性に関する解析結果を組み合わせて、評価を行うこともできる。【０１１２】
（６）発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いた形質転換試験における利用
本発明のマーカー遺伝子を用いた検出方法は、従来の発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いた形質転換試験における、フォーカス形成の観察に代えて、培養細胞中の遺伝子の発現量の変動を測定することにより、発がんプロモーターを検出する方法として、利用できる。【０１１３】
ここで、発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる形質転換試験とは、例えば、「化学物質のがん原性を予測するためのBALB/c 3T3細胞を用いる短期２段階形質転換試験」, TR Z 0023  日本規格協会発行，2002、に規定されているように、培養細胞に発がんイニシエーターを暴露させ、所定時間培養後に、発がんプロモーション活性を調べる被験物質に暴露させた後、20日程度培養した後の細胞を染色して、シャーレ上に形成されたフォーカス（細胞塊）を観察・計数（計測）して、形質転換頻度を求め、これによって発がんプロモーション活性を予測する方法をいう。【０１１４】
一般的な操作手順としては、細胞を、細胞培養用60mmディッシュまたはプレートに播種し、細胞に発がんイニシエーション処理後、数日間培養する；発がんイニシエーション処理を必ずしも必要としない細胞の場合、播種後、数日間培養する；次に、被験物質を含む培地に交換し、通常であれば20日程度培養した後の細胞を染色して、シャーレ上に形成されたフォーカス（細胞塊）を観察・計測して、形質転換頻度を求める；ことにより、行うものである。【０１１５】
一方、本発明によれば、上記の方法において、フォーカス形成に代えて、所定時間培養した細胞に、発がんプロモーション活性を調べる被験物質に暴露させた後、36〜72時間程度後の細胞よりRNAを回収し、マーカー遺伝子をターゲットとしてその発現量等を調べることにより、これを指標として、発がんプロモーターの検出を行うことができる。【０１１６】
より詳細に、本発明は、これまでの発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる形質転換試験における、
所定時間培養した細胞に、発がんプロモーション活性を調べる被験物質に暴露させた後、20日程度培養した後の細胞を染色し、及び、シャーレ上に形成されたフォーカス（細胞塊）を観察・計数（計測）していた工程に代えて、
所定時間培養した細胞に、発がんプロモーション活性を調べる被験物質に暴露させた後、36〜72時間程度後の細胞よりRNAを回収し、マーカー遺伝子をターゲットとしてその発現量等を測定する工程を行うことにより、
遺伝子発現のレベルで発がんプロモーターの検出を行うことができる。【０１１７】
（７）発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための試験
従来までの培養細胞を用いた形質転換試験においては、被験物質（発がんプロモーター）を、イニシエーションを施した培養細胞に暴露後、20日程度の培養後のフォーカス形成を必要としていた。【０１１８】
一方、本発明の発がんプロモーター検出方法を利用することで、被験物質（発がんプロモーター）に暴露後、３から４日程度で、発がんプロモーターの検出が可能となり、短期間で、発がんプロモーターのがん原性を予測するための試験を行うことができる。【０１１９】
例えば、以下の方法を挙げることができる：
1)培養したBALB/c 3T3細胞に発がんイニシエーターを接触させる工程、
2)発がんイニシエーターを接触させた細胞に、被験物質を接触させる工程、
3)被験物質を接触させた細胞を一定期間培養後、RNAを抽出する工程、
4)前記3)で抽出したRNAに対し、表２に記載するプライマー又はそのセットを用いてPCRを行い、被験物質を接触させた細胞におけるマーカー遺伝子の発現量を測定する工程、
5)測定した発現量を、被験物質を含まない溶媒のみを接触させた対照と比較する工程、
6)前記比較において、被験物質を接触させた細胞における（i）マーカー遺伝子の発現量の総和、又は（ii）発現量が大きいマーカー遺伝子の数が対照より多い場合、被験物質を発がんプロモーターと評価する工程を備えた、
被験物質の発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための試験方法であって、
マーカー遺伝子として、上記本発明のマーカー遺伝子を用いる方法。【０１２０】
尚、前記発がんイニシエーターとしては、公知のものを用いることができるが、一般には、MCA（3−メチルコラントレン）が用いられる。【０１２１】
また、工程3)における細胞の培養期間は、適宜設定し得るが、通常、36〜72時間程度である。【０１２２】
また、工程4)におけるマーカー遺伝子を検出するためのPCR用プライマーは、表２に開示された配列に限定されず、任意に設計したものを使用しても良い。【０１２３】
具体的に、以下の手順が一例として挙げられる。尚、本発明は本手順に限定して解釈されるものではない。【０１２４】
1)細胞播種（０日）
対数増殖期にあるＢＡＬＢ/c３Ｔ３細胞をＭＥＭ+１０％ＦＢＳ培地（以下、試験培地とする。）を用いて所定枚数のシャーレに１．０×１０４個／シャーレで播種する。【０１２５】
2)ＭＣＡ処理(１日)
二酸化炭素インキュベータ内で２４時間培養後、発がんイニシエーターであるＭＣＡを添加する。【０１２６】
3)培地交換（４日）
ＭＣＡ添加７２時間後にすべてのシャーレについて培地を吸引除去し、通常培地または、ＤＭＥ/F１２+ＩＴＥＳ+２％ＦＢＳ培地（以下、試験培地とする。）を５ｍｌづつ加える。【０１２７】
4)被験物質処理（１回目）(７日)
各群のシャーレの培地を吸引除去し、被験物質群にそれぞれ各用量の被験物質添加培地を、ＴＰＡ添加群にＴＰＡ添加培地を、溶媒添加群に溶媒添加培地を５ｍｌずつ添加する。【０１２８】
5)RNAの抽出
上記のように被験物質処理後の各シャーレについて、二酸化炭素インキュベータ内で３６〜７２時間培養後、RNAを抽出する。RNAの抽出には、市販の抽出キットを用いることができる。【０１２９】
6)定量的RT-PCRによるマーカー遺伝子の発現解析
前記5)で得た総RNAを用いて、マーカー遺伝子の発現を調べるために、後述する表２に記載する発がんプロモーター検出用のマーカー遺伝子群のプライマーを用いて、Real Time PCR Systemを用いて定量的RT-PCRを行う。尚、表１に記載の遺伝子を検出するPCR用プライマーは、表２に開示された配列に限定されず、任意に設計したものを使用しても良い。【０１３０】
定量的RT-PCRには、まず、各被験物質添加群から抽出したRNAを用いて逆転写反応を行い、cDNAを得る。【０１３１】
次に、表２に示した発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群に含まれる個々の遺伝子のプライマーでReal Time PCRを実施し、解離曲線解析を実施する。
陰性対照、または、陽性対照のcDNAの希釈系列でスタンダードカーブを作成し、スタンダードカーブに対する相対的発現量を算出し、これを内部標準遺伝子であるβ-Actinの発現量で補正し、さらに陰性対照群の発現量で除し、陰性対照群の発現量に対する相対的発現量として、個々の遺伝子の発現量を得ることができる。これらの発現量から表１に記載の各遺伝子の発現量を求めることができる。これらを陰性対象群の発現量と対比することで各遺伝子群の発現量を調べることができる。【０１３２】
7)発がんプロモーターとしてのがん原性評価
遺伝子発現量の対比結果に基づき、被験物質を接触させた細胞におけるマーカー遺伝子の発現量の総和が、陰性対照におけるマーカー遺伝子の発現量の総和より多い場合、被験物質が発がんプロモーション活性を有すると評価することができる。また、遺伝子の種類ごとに発現量を比較し、被験物質を接触させた細胞における、陰性対照の発現量に対し1.5倍以上の発現量を示すマーカー遺伝子の個数が、陰性対照より多い場合、被験物質が発がんプロモーション活性を有すると評価することができる。【０１３３】
被験物質の発がんプロモーション活性の評価においては、フォーカス形成を用いた形質転換試験や他の試験の結果を組み合わせて評価してもよい。【０１３４】
また、上記試験を、培養細胞を用いた形質転換試験におけるフォーカス形成を予測するための試験として用いることもできる。【０１３５】
５．発がんプロモーター検出用キット
本発明のキットは、上記マーカー遺伝子の発現量を測定するための試薬を含む。【０１３６】
発現量を測定するための試薬としては、例えば、PCRにより測定を行う場合、プライマー又はそのセットを挙げることができる。具体的には、表２に示される、各マーカー遺伝子のセンスプライマー、アンチプライマー又はそのセットの１又は２以上を挙げることができる。【０１３７】
また、ノーザンブロッティングで測定する場合の試薬としては、各マーカー遺伝子に対するプローブを挙げることができる。【０１３８】
また、DNAマイクロアレイで測定する場合の試薬としては、各マーカー遺伝子に対するプローブが搭載されたアレイを挙げることができる。【０１３９】
また、免疫学的測定法を用いる場合の試薬としては、各マーカー遺伝子の転写産物に対する抗体や、その抗体を固相化したマイクロプレート等を挙げることができる。【０１４０】
また、本発明のキットには、前記マーカー遺伝子の発現量を測定するための試薬以外に、他の試薬又は成分を本発明の目的を阻害しない範囲で含めることができる。例えば、β-Actin、GAPDH、又は18srRNAなどの内部標準遺伝子に対するプライマーセット、プローブ或いは抗体等を含めることもできる。また、陽性対照となるTPA、酵素、緩衝液、検出用蛍光試薬等を含めることもできる。
【発明の効果】
【０１４１】
本発明は、従来までのin vitro試験系である培養細胞を用いた方法において、マーカー遺伝子群を利用することで、長期間の培養やフォーカス形成の観察を必要とせずに迅速・簡便にかつコスト面においても優れた発がんプロモーターを検出する方法や試験系を提供する。【０１４２】
本発明は、発がんプロモーターとしてのがん原性を予測するための培養細胞を用いる形質転換試験において、フォーカス形成の観察に代えて、培養細胞中の特定遺伝子の発現量の変動を測定することによって発がんプロモーターを検出する方法に利用することのできるマーカー遺伝子を提供する。【０１４３】
また、本遺伝子の発現量を調べることで発がんプロモーターを検出することができる。      【０１４４】
この発がんプロモーター検出方法を従来の培養細胞を用いる形質転換試験に利用することで、高価な測定装置や顕微鏡観察や剖検、換言すると、病理学検査の専門性や熟練を持つ技術者を必要とせず、簡便に、試験を行うことができる。かつ従来被験物質添加後20日程度必要とされていた試験に必要な日数を３日〜４日程度まで、大幅に短縮することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
図中の略号は、controlまたはcont；陰性対照、VitCNa;アスコルビン酸ナトリウム、TBHQ；t-ブチルヒドロキノン、As；亜ヒ酸ナトリウム、Ins；インスリン、LA;リトコール酸、PB；フェノバルビタールナトリウム、NaVO；オルトバナジン酸ナトリウム、ZnClまたはZn；塩化亜鉛、TPA；ホルボール12-ミリステート13-アセテート、SS；サッカリンナトリウム、OK；オカダ酸、Per；ペリレン、BA；ベンズ[a]アントラセン、Chr；クリセン、1-NN；１-ニトロナフタレン、Nap；ナフタレン、MNNG；N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、Mannit；D-マンニトール、Menth；DL-メンソール、Pro；プロゲステロン、TGFβ1；トランスフォーミング成長因子、SDM；スルファジメトキシン、KA；コウジ酸、BHA；ブチルヒドロキシアニソール、Atz；アトラジン、VitE；DL-α-トコフェロール、1NP；1-ニトロピレン、Phorb；ホルボール、Eug；オイゲノール、PG；プロピルガレート、Cys；L-システイン塩酸塩、Phen；フェナセチンである。【０１４６】
【図１】DNAマイクロアレイで計測した、遺伝子グループAとして示すマーカー遺伝子群の個々の遺伝子の陰性対照に対する相対的発現量が1.5倍以上を示す遺伝子の個数とBALB/c 3T3形質転換試験におけるフォーカス形成数との関係を示した図。２個以上の遺伝子が陰性対照比1.5倍以上の発現量を示した時、フォーカス数が増加し、発がんプロモーション活性陽性と判断できる。
【０１４７】
【図２】DNAマイクロアレイで計測した、遺伝子グループAとして示すマーカー遺伝子群の個々の遺伝子の陰性対照に対する相対的発現量の総和とBALB/c 3T3形質転換試験におけるフォーカス形成数との関係を示した図。陰性対照に対する相対的発現量の総和が38以上の時、フォーカス数が増加し、発がんプロモーション活性陽性と判断できる。
【０１４８】
【図３】遺伝子グループAとして示すマーカー遺伝子群を用いたクラスター解析図。図上部の系統樹より、発がんプロモーター（太線）を判別できる。
【０１４９】
【図４】定量的RT-PCRで計測した、遺伝子グループAとして示すマーカー遺伝子群の個々の遺伝子の陰性対照に対する相対的発現量が1.5倍以上を示す遺伝子の個数とBALB/c 3T3形質転換試験におけるフォーカス形成数との関係を示した図。２個以上の遺伝子が陰性対照比1.5倍以上の発現量を示した時、フォーカス数が増加し、発がんプロモーション活性陽性と判断できる。
【０１５０】
【図５】定量的RT-PCRで計測した、遺伝子グループAとして示すマーカー遺伝子群の個々の遺伝子の陰性対照に対する相対的発現量の総和とBALB/c 3T3形質転換試験におけるフォーカス形成数との関係を示した図。陰性対照に対する相対的発現量の総和が40以上の時、フォーカス数が増加し、発がんプロモーション活性陽性と判断できる。
【０１５１】
【図６】定量的RT-PCRで計測した、遺伝子グループAとして示すマーカー遺伝子群のうち、4遺伝子について、個々の遺伝子の陰性対照に対する相対的発現量が1.5倍以上を示す遺伝子の個数とBhas形質転換試験におけるフォーカス形成数との関係を示した図。1個以上の遺伝子が陰性対照比1.5倍以上の発現量を示した時、フォーカス数が増加し、発がんプロモーション活性陽性と判断できる。
【０１５２】
【図７】定量的RT-PCRで計測した、遺伝子グループAとして示す発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群のうち、３遺伝子について、個々の遺伝子の陰性対照に対する相対的発現量とTPA、または、塩化亜鉛添加時のBALB/c 3T3形質転換試験におけるRNA抽出時間の関係を示した図。TPA、または、塩化亜鉛添加後36〜72時間で、いずれのマーカー遺伝子も陰性対照比1.5倍以上の発現量を示した。
【０１５３】
【図８】定量的RT-PCRで計測した、遺伝子グループA-3として示すマーカー遺伝子の個々の遺伝子の陰性対照に対する相対的発現量が1.5倍以上を示す遺伝子の個数とBALB/c 3T3形質転換試験におけるフォーカス形成能との関係を示した図。２個以上の遺伝子が陰性対照比1.5倍以上の発現量を示した時、フォーカス形成能が高くなり、発がんプロモーション活性陽性と判断できる。
【０１５４】
【図９】定量的RT-PCRで使用した96穴プレートの各遺伝子に対するプライマー、及び、検体（被験物質添加後48時間後に得られたRNAの逆転者反応で得られたcDNA）配置図。1枚の96穴プレートで12検体の発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群による発がんプロモーターの検出ができる。
【０１５５】
【図１０】定量的RT-PCRで計測した、遺伝子グループA-2として示す7種類の発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群の個々の遺伝子の陰性対照に対する相対的発現量が1.5倍以上を示す遺伝子の個数とBALB/c 3T3形質転換試験におけるフォーカス形成能との関係を示した図。２個以上の遺伝子が陰性対照比1.5倍以上の発現量を示した時、フォーカス形成能が高くなり、発がんプロモーション活性陽性と判断できる。
【０１５６】
【図１１】定量的RT-PCRで計測した、遺伝子グループA-2'として示す11種類の発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群の個々の遺伝子の陰性対照に対する相対的発現量が1.5倍以上を示す遺伝子の個数とBALB/c 3T3形質転換試験におけるフォーカス形成能との関係を示した図。２個以上の遺伝子が陰性対照比1.5倍以上の発現量を示した時、フォーカス形成能が高くなり、発がんプロモーション活性陽性と判断できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５７】
以下、実施例を示して、本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１５８】
BALB/c 3T3を用いた形質転換試験、および、総RNA抽出
BALB/c 3T3 A31-1-1細胞(財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より分与)を10000細胞/dishになるようにMEM培地（日水製薬製）に牛胎児血清（FBS）を10%含む培地（通常培地）を用いて調製し、細胞培養用60mmディッシュ（コーニング製）に5mL/dishで１被験物質あたり12枚ずつ播種し（試験開始0日目）、37℃で1晩培養した。試験開始1日目に、細胞に発がんイニシエーターである3-methylcholanthleneを終濃度0.2μg/mLで添加し3日間培養した。試験開始4日目に細胞を洗浄後、通常培地に交換し、さらに3日間培養し、試験開始7日目に培地を抜き取り、被験物質を含むD-MEM/F-12培地(GIBCO；Invitrogen製)にFBS2%、ITS-X 0.2%（GIBCO）を含む培地（試験培地）に交換した。被験物質は、BALB/c 3T3細胞形質転換試験でフォーカス形成能を有する発がんプロモーターとして、TPA 0.1μg/mL、塩化亜鉛7.5μg/mL、オルトバナジン酸ナトリウム1μg/mL、サッカリンナトリウム5000μg/mL、オカダ酸0.0075μg/mL、亜ヒ酸ナトリウム0.15μg/mL、インスリン 30μg/mL、フェノバルビタールナトリウム500μg/mL、リトコール酸7.5μg/mLを用い、今回のBALB/c 3T3細胞形質転換試験でフォーカス形成能がなかった物質としてアスコルビン酸ナトリウム100μg/mL、TBHQ  (tert-butylhydroquinone)  2μg/mL、陰性対照として溶媒のみを用いた。被験物質添加後48時間目に各被験物質投与群12枚のディッシュのうち、1枚の培地を抜き取り、PBSで洗浄した後、DNase工程を含むRNeasy Mini kit（QIAGEN製）を用いて総RNAを抽出した。残りのディッシュのうち１枚は、被験物質添加後96時間目に培地を抜き取り、Crystal violetで染色後、細胞毒性を測定した。さらに残りの10枚は、通常のBALB/c 3T3を用いた形質転換試験を実施し、試験開始25日目に形質転換細胞のフォーカス数を計測した。被験物質添加群が陰性対照群に比べ、フォーカス数が有意（P<0.05、Wilcoxon(Mann-Whitney)test）に増加した時、発がんプロモーション活性陽性と判断した。【０１５９】
DNAマイクロアレイによるマーカー遺伝子の発現解析
上述で得た総RNAを用いてDNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を実施した。DNAマイクロアレイ実験には、AFFYMETRIX社のGeneChip、Mouse Genome 430 2.0 arrayを用い、そのデータ解析にはAgilent社のGeneSpring GX ver.7.3.2を使用した。各被験物質添加群のDNAマイクロアレイデータをノーマライズ後、DNAマイクロアレイに含まれる約４万種類の個々の遺伝子について、得られた発現量を陰性対照群（BALB/c 3T3細胞の形質転換試験における、溶媒のみを添加した群）の発現量で除し、陰性対照群の発現量に対する相対的発現量を得た。これら約4万遺伝子から、上述のマーカー遺伝子選抜の法則に従い、遺伝子グループAとして示す27種類の発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群を選抜した。【０１６０】
得られた27種類の発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群から、陰性対照群の発現量に対し1.5倍以上の発現量を示す遺伝子の個数を測定し、BALB/c 3T3細胞形質転換試験におけるフォーカス数と比較した（図１）。図１より、1.5倍以上発現したマーカー遺伝子数の増加に比例して、フォーカス数が増加し、発がんプロモーターを検出できると共に発がんプロモーション活性の強度を計測できた。【０１６１】
DNAマイクロアレイ解析より得られた27種類のマーカー遺伝子群の相対的発現量の総和とBALB/c 3T3細胞形質転換試験におけるフォーカス数と比較した（図２）。図２より、マーカー遺伝子群に含まれる個々の遺伝子の相対的発現量の総和の増加に比例して、フォーカス数が増加し発がんプロモーターを検出できると共に発がんプロモーション活性の強度を計測できた。【０１６２】
27種類の発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群についてクラスター解析を実施した結果を図３に示した。クラスター解析はAgilent社のGeneSpring GX ver.7.3.2を用いて、similarity measure；distance, clustering algorism； average linkageの条件で実施した。図３上部の系統樹から、BALB/c 3T3細胞形質転換試験において有意にフォーカスが出現した発がんプロモーション陽性群と、フォーカスが出現しなかった発がんプロモーション陰性群が異なるグループに属することから、発がんプロモーターを判別できた。
【実施例２】
【０１６３】
BALB/c 3T3細胞形質転換試験でフォーカス形成能を有する発がんプロモーターとして、TPA 0.1μg/mL、メゼレイン0.1μg/mL、塩化亜鉛7.5μg/mL、オルトバナジン酸ナトリウム 1μg/mL、サッカリンナトリウム5000μg/mL、オカダ酸0.0075μg/mL、リトコール酸7.5μg/mL、フェノバルビタールナトリウム500μg/mL、プロゲステロン2μg/mL、亜ヒ酸ナトリウム0.15μg/mL、インスリン 30μg/mL、を用い、今回のBALB/c 3T3細胞形質転換試験でフォーカス形成能がなかった物質としてTBHQ 2μg/mL、アスコルビン酸ナトリウム100μg/mL、ペリレン1μg/mL、ベンゾ[a]アントラセン5μg/mL、クリセン1μg/mL、1-ニトロナフタレン10μg/mL、ナフタレン3μg/mL、MNNG （N-methyl-N’- nitro-N- nitrosoguanidine） 1μg/mL、D-マンニトール 300μg/mL、DL-メントール100μg/mL、陰性対照として溶媒のみを用い、BALB/c 3T3細胞形質転換試験を実施した。被験物質添加後48時間目に各被験物質投与群12枚のディッシュのうち、1枚の培地を抜き取り、PBSで洗浄した後、DNase工程を含むRNeasy Mini kit（QIAGEN製）を用いて総RNAを抽出した。残りのディッシュのうち１枚は、細胞毒性を測定し、さらに残りの10枚について、フォーカス数を計測した。被験物質添加群が陰性対照群に比べ、フォーカス数が有意（P<0.05、Wilcoxon  (Mann-Whitney) test）に増加した時、発がんプロモーション活性陽性と判断した。【０１６４】
定量的RT-PCRによるマーカー遺伝子の発現解析
この試験で得た総RNAを用いて表２に示す発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群のプライマーで、Applied Biosystems社製7500 Real Time PCR Systemを使用して定量的RT-PCRを実施した。尚、これらの遺伝子を検出するPCR用プライマーは、この配列に限定されず、この遺伝子の発現を検出するものであれば、市販品など、任意に設計したものを使用しても良い。定量的RT-PCRには、まず、各被験物質添加群から総RNA 100ngをApplied Biosystems社製High Capacity cDNA Reverse Transcription Kitを用いて逆転写反応を行い、cDNAを得た。PCR用96穴プレートの1穴あたり、cDNA 1μL、表２に示した発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群に含まれる個々の遺伝子のプライマーで 5μM 1.3μL、Applied Biosystems社製Power SYBR Green PCR Master Mix 10μLと超純水7.7μLを添加し、Applied Biosystems社製7500 Real Time PCR Systemを使用して、50℃2分、95℃10分後95℃ 15秒と60℃ 60秒の反応を35〜40サイクル繰り返した後、解離曲線解析を実施した。陰性対照、または、陽性対照のcDNAの希釈系列でスタンダードカーブを作成し、スタンダードカーブに対する相対的発現量を算出した。これを内部標準遺伝子であるβ-Actinの発現量で補正し、さらに陰性対照群の発現量で除し、陰性対照群の発現量に対する相対的発現量として、個々の遺伝子の発現量を得た。【０１６５】
【表２】
2009001939.tif 000020
【０１６６】
陰性対照群の発現量に対し1.5倍以上の発現量を示すマーカー遺伝子の個数を測定し、BALB/c 3T3細胞形質転換試験におけるフォーカス数と比較した（図４）。図４より、1.5倍以上発現したマーカー遺伝子数の増加に比例して、フォーカス数が増加し、発がんプロモーターを検出できると共に発がんプロモーション活性の強度を計測できた。【０１６７】
定量的RT-PCRより得られたマーカー遺伝子群の相対的発現量の総和とBALB/c 3T3細胞形質転換試験におけるフォーカス数と比較した（図５）。図５より、マーカー遺伝子群の相対的発現量の総和の増加に比例して、フォーカス数が増加し、発がんプロモーターを検出できると共に発がんプロモーション活性の強度を計測できた。
【実施例３】
【０１６８】
実施例２で得たRNAについて、定量的RT-PCR法によりOrm1遺伝子の発現量を調べた。尚、定量的RT-PCR法の条件は実施例２に示したものと同様である。下表３に示すように、Orm1が陰性対照比1.5倍以上発現したとき、有意な形質転換細胞のフォーカス形成を予測できた。尚、被験物質添加群が陰性対照群に比べ、フォーカス数が有意（P<0.05、Wilcoxon  (Mann-Whitney) test）に増加した時、有意なフォーカス形成あり（発がんプロモーション活性陽性）と判断した。【０１６９】
【表３】
2009001939.tif 000021
【実施例４】
【０１７０】
Bhas細胞を用いた形質転換試験における発がんプロモーター検出
Bhas細胞(財団法人ヒューマンサイエンス振興財団より分与)を20000細胞/mLになるようにD-MEM/F-12培地にFBS  5%含む培地を用いて調製し、細胞培養用6ウェルプレート（コーニング製＃3910）に2mL/ウェルで１被験物質あたり7ウェルずつ播種し（試験開始0日目）、37℃で3日間晩培養した。試験開始３日目に培地を抜き取り、被験物質を含むD-MEM/F-12培地にFBS  2%を含む培地に交換した。被験物質は、Bhas細胞形質転換試験でフォーカス形成能を有する発がんプロモーターとしてTPA 0.05μg/mL、メゼレイン0.001μg/mL、塩化亜鉛10μg/mL、ペリレン1μg/mL、インスリン50μg/mL、プロゲステロン10μg/mL、TBHQ 5μg/mL、クリセン1μg/mL、リトコール酸15μg/mLを用い、Bhas細胞形質転換試験でフォーカス形成能がない発がんプロモーション活性陰性物質としてMNNG 0.1μg/mL、ナフタレン10μg/mL、陰性対照として溶媒のみを用いた。被験物質添加後48時間目に各被験物質投与群8ウェルのうち、1ウェルの培地を抜き取り、PBSで洗浄した後、DNase工程を含むRNeasy Mini kit（QIAGEN製）を用いて総RNAを抽出した。残りの６ウェルは、通常のBhas細胞を用いた形質転換試験を実施し、試験開始21日目に形質転換細胞のフォーカス数を計測した。【０１７１】
発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子の発現解析には、上述したBhas細胞を用いた形質転換試験で得た総RNAから、発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群のうち、Fosl1遺伝子を含むCcnb1、Hells、Rad51ap1の４遺伝子の表２に示すプライマーで、Applied Biosystems社製7500 Real Time PCR Systemを使用して定量的RT-PCRを実施した。発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子の発現量を内部標準遺伝子であるβ-Actinの発現量で補正し、さらに陰性対照群の発現量で除し、陰性対照群の発現量に対する相対的発現量として、４遺伝子の個々の遺伝子発現量を得た。尚、定量的RT-PCR法の条件は実施例２に示したものと同様である。4遺伝子のうち、陰性対照群の発現量に対し1.5倍以上の発現量を示すマーカー遺伝子の個数を測定し、Bhas細胞形質転換試験におけるフォーカス数と比較した（図６）。図６より1.5倍以上発現したマーカー遺伝子数の増加に比例して、フォーカス数が増加し、発がんプロモーターを検出できると共に発がんプロモーション活性の強度を計測できた。
【実施例５】
【０１７２】
RNA採取時間の検討
実施例１と同様のBALB/c 3T3細胞形質転換試験を実施し、被験物質としてTPA 0.1μg/mL、または、塩化亜鉛7.5μg/mLを添加した。被験物質添加後36, 48, 60, 72, 80時間目の各時間毎に各被験物質投与群15枚のディッシュのうち、1枚の培地を抜き取り、PBSで洗浄した後、DNase工程を含むRNeasy Mini kit（QIAGEN製）を用いて総RNAを抽出した。残りのディッシュのうち１枚は、細胞毒性を測定し、さらに残りの10枚は、BALB/c 3T3細胞を用いた形質転換試験を実施し、試験開始25日目に形質転換細胞のフォーカス数を計測し、TPA、塩化亜鉛添加群ともに有意なフォーカス形成を認めた。【０１７３】
発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子の発現解析には、この試験で得た総RNAから、発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群のうち、Fosl1遺伝子を含むCcnb1、Hellsの３遺伝子の表２に示すプライマーで、Applied Biosystems社製7500 Real Time PCR Systemを使用して定量的RT-PCRを実施した。発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群に含まれる個々の遺伝子の発現量を内部標準遺伝子であるβ-Actinの発現量で補正し、さらに陰性対照群の発現量で除し、陰性対照群の発現量に対する相対的発現量として、３遺伝子の個々の発現量を得た。尚、定量的RT-PCR法の条件は実施例２に示したものと同様である。【０１７４】
図7に３遺伝子の発現量と被験物質添加後RNA採取時間との関係を示した。被験物質添加後、36時間目から72時間目に得られたRNAでこれらのマーカー遺伝子が陰性対照比1.5倍以上発現し、発がんプロモーターを検出できることがわかる。
【実施例６】
【０１７５】
定量的RT-PCRによる22種のマーカー遺伝子による発現解析
実施例1と同様のBALB/c 3T3細胞形質転換試験を実施し、被験物質として、TPA 0.1μg/mL、メゼレイン0.1μg/mL、塩化亜鉛7.5μg/mL、オルトバナジン酸ナトリウム 1μg/mL、サッカリンナトリウム5000μg/mL、オカダ酸0.0075μg/mL、リトコール酸7.5μg/mL、フェノバルビタールナトリウム500μg/mL、プロゲステロン2μg/mL、亜ヒ酸ナトリウム0.15μg/mL、インスリン 30μg/mL、トランスフォーミング成長因子0.003μg/mL、スルファジメトキシン100μg/mL、コウジ酸100μg/mL、ブチルヒドロキシアニソール30μg/mL、アトラジン30μg/mL、DL-α-トコフェロール3μg/mL、フェナセチン3μg/mL 、TBHQ 2μg/mL、アスコルビン酸ナトリウム100μg/mL、ベンゾ[a]アントラセン5μg/mL、クリセン1μg/mL、1-ニトロナフタレン10μg/mL、ナフタレン3μg/mL、MNNG （N-methyl-N’- nitro-N- nitrosoguanidine） 1μg/mL、D-マンニトール 300μg/mL、DL-メントール100μg/mL、1-ニトロピレン1μg/mL、ホルボール1μg/mL、オイゲノール3μg/mL、没食子酸プロピル1μg/mL、ペリレン1μg/mL、L-システイン塩酸塩100μg/mL、の33物質を使用した。被験物質添加後48時間目に各被験物質投与群12枚のディッシュのうち、1枚の培地を抜き取り、PBSで洗浄した後、DNase工程を含むRNeasy Mini kit（QIAGEN製）を用いて総RNAを抽出した。残りのディッシュのうち１枚は、細胞毒性を測定し、さらに残りの10枚は、BALB/c 3T3細胞を用いた形質転換試験を実施し、試験開始25日目に形質転換細胞のフォーカス数を計測した。さらにフォーカス形成能（発がんプロモーション活性の強度）を指標に簡易的に３つにクラス分けした。陰性対照と比較し、フォーカス数が有意（P<0.05、Wilcoxon  (Mann-Whitney) test）に増加し、かつ、陽性対照TPAの50%以上のフォーカス数が認められた被験物質添加群を強い発がんプロモーション活性有（＋＋＋）とした。「＋＋＋」と判定した被験物質はTPA、メゼレイン、塩化亜鉛、オルトバナジン酸ナトリウム、オカダ酸、トランスフォーミング成長因子であった。陰性対照と比較し、フォーカス数が有意（P<0.05、Wilcoxon  (Mann-Whitney) test）に増加し、かつ陽性対照TPAの50%未満のフォーカス数が認められた被験物質添加群を発がんプロモーション活性有（＋＋）とした。「＋＋」と判定した被験物質は、リトコール酸、フェノバルビタールナトリウム、亜ヒ酸ナトリウム、サッカリンナトリウム、スルファジメトキシン、コウジ酸、インスリン、ブチルヒドロキシアニソール、フェナセチンであった。陰性対照と比較し、2倍以上のフォーカス数が認められたが、有意（P<0.05）な差が認められなかった被験物質添加群を弱い発がんプロモーション活性有（＋）とした。「＋」と判定した被験物質は、プロゲステロン、アトラジン、DL-α-トコフェロールであった。その他全ての被験物質は陰性対象と比べ2倍以上のフォーカス数は認められず、かつ、有意なフォーカス数の変化は認められなかったため、発がんプロモーション活性陰性（-）とした。【０１７６】
発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子の発現解析には、この試験で得た総RNAから、遺伝子グループA-3として示す22種類の発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群に対応する表２に示すプライマーで、Applied Biosystems社製7500 Real Time PCR Systemを使用して定量的RT-PCRを実施した。発がんプロモーター検出用マーカー遺伝子群に含まれる個々の遺伝子の発現量を内部標準遺伝子であるβ-Actinの発現量で補正し、さらに陰性対照群の発現量で除し、陰性対照群の発現量に対する相対的発現量として、22遺伝子の個々の発現量を得た。尚、定量的RT-PCR法の条件は実施例２に示したものと同様である。【０１７７】
陰性対照群の発現量に対し1.5倍以上の発現量を示すマーカー遺伝子の個数を測定し、BALB/c 3T3細胞形質転換試験におけるフォーカス形成能と比較した（図８）。図８より、1.5倍以上発現したマーカー遺伝子数の増加に比例して、フォーカス形成能が増加し、発がんプロモーターを検出できると共に、1.5倍以上発現したマーカー遺伝子数から簡易的に発がんプロモーション活性の強度を計測できることがわかる。
【実施例７】
【０１７８】
定量的RT-PCRによる7種のマーカー遺伝子による発現解析
実施例６で得たRNAについて、定量的RT-PCR法により、7種類の発がんプロモーターマーカー遺伝子(Orm1; NM_008768, Jun; NM_010591, Plf; Plf2; Mrpplf3; NM_011118; NM_011954; NM_031191, Fosl1; NM_010235, Il1rl1; NM_001025602; NM_010743, Hells; NM_008234, Ccnb1; NM_172301)の発現量を調べた。より具体的には、PCR用96穴プレートのA, B, C, D, E, F, G列（横列）に上述の7遺伝子に対する個々のプライマーを各列に、H列に内部標準遺伝子であるβ-Actinのプライマーを添加し、1〜12列（縦列）に各検体から得られたcDNA 1μL/穴を添加した（12検体/96穴プレート試験可能）（図９）。尚、定量的RT-PCR法の条件は実施例２に示したものと同様である。【０１７９】
陰性対照群の発現量に対し1.5倍以上の発現量を示すマーカー遺伝子の個数を測定し、BALB/c 3T3細胞形質転換試験におけるフォーカス形成能と比較した（図10）。図10より、1.5倍以上発現したマーカー遺伝子数の増加に比例して、フォーカス形成能が増加し、発がんプロモーターを検出できると共に、1.5倍以上発現したマーカー遺伝子数から簡易的に発がんプロモーション活性の強度を計測できることがわかる。
【実施例８】
【０１８０】
定量的RT-PCRによる11種のマーカー遺伝子による発現解析
実施例６で得たRNAについて、定量的RT-PCR法により、11種類の発がんプロモーターマーカー遺伝子(Orm1; NM_008768, Jun; NM_010591, Plf ; Plf2 ; Mrpplf3; NM_011118; NM_011954; NM_031191, Fosl1; NM_010235, Il1rl1; NM_001025602; NM_010743, Hells; NM_008234, Ccnb1; NM_172301, Slc2a1; NM_011400, Phex; NM_011077, Scarb1; NM_016741, Vegfa; NM_001025250; NM_001025257; NM_009505)の発現量を調べた。より具体的には、PCR用96穴プレートの1〜11列,（縦列）に上述の11遺伝子に対する個々のプライマーを各列に、12列目に内部標準遺伝子であるβ-Actinのプライマーを添加し、A〜H列（横列）に各検体から得られたcDNA 1μL/穴を添加した（8検体/96穴プレート試験可能）。尚、定量的RT-PCR法の条件は実施例２に示したものと同様である。
陰性対照群の発現量に対し1.5倍以上の発現量を示すマーカー遺伝子の個数を測定し、BALB/c 3T3細胞形質転換試験におけるフォーカス形成能と比較した（図11）。図11より、1.5倍以上発現したマーカー遺伝子数の増加に比例して、フォーカス形成能が増加し、発がんプロモーターを検出できると共に、1.5倍以上発現したマーカー遺伝子数から簡易的に発がんプロモーション活性の強度を計測できることがわかる。
【図１】
2009001939.tif 000026
【図２】
2009001939.tif 000027
【図３】
2009001939.tif 000028
【図４】
2009001939.tif 000029
【図５】
2009001939.tif 000030
【図６】
2009001939.tif 000031
【図７】
2009001939.tif 000032
【図８】
2009001939.tif 000033
【図９】
2009001939.tif 000034
【図１０】
2009001939.tif 000035
【図１１】
2009001939.tif 000036
【配列表】
2009001939000001.app
【国際調査報告】
2009001939.tif 000037
2009001939.tif 000038
2009001939.tif 000039
2009001939.tif 000040
2009001939.tif 000041
2009001939.tif 000042