(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球とリンパ球により外来と認識される物質との間の免疫反応を調節するための医薬組成物であって、該免疫反応を抑制または減少させるために有効な量の臍帯脈管周囲細胞を含んでなる上記組成物。
【請求項２】
個体に免疫を調節する有効量の臍帯脈管周囲細胞を含んでなる、有害な免疫反応を発症しているか、またはその危険性がある個体を処置するための請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
個体が対宿主性移植片病を有するか、またはその危険性がある請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
個体が混合リンパ球反応を有するか、またはその危険性がある請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
個体が移植片拒絶を有するか、またはその危険性がある請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
移植片が皮膚移植片である請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
移植片が臓器移植片である請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
移植片が骨髄移植片である請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
移植片が末梢血移植である請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
個体が自己免疫障害を有する請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
個体が白血病を患い、そして対宿主性移植片病の危険性がある請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
移植片受容体における対宿主性移植片病を減少するための医薬組成物であって、免疫を調節する有効量の臍帯脈管周囲細胞を含んでなり、移植片へのその移植前の暴露用に製剤化される、上記組成物。
【請求項１３】
作用物質がヒト臍帯脈管周囲細胞（ＨＵＣＰＶＣ）である請求項１ないし１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
臍帯脈管細胞が目的タンパク質をコードする導入遺伝子を含んでなる請求項１ないし１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
臍帯脈管周囲細胞が実質的にＭＨＣダブルネガティブＨＵＣＰＶＣである請求項１ないし１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
ＨＵＣＰＶＣが単位用量中に１キログラムの個体あたり０．０１〜５百万個のＨＵＣＰＶＣ細胞の範囲で存在する、請求項１３ないし１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
作用物質がＨＵＣＰＶＣにより生産される免疫調節可溶性因子である、請求項１ないし１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
免疫調節可溶性因子がＨＵＣＰＶＣの成長によりコンディショニングされた培地の抽出物として提供される請求項１７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は免疫学的寛容（ｉｍｍｕｎｏｐｒｉｖｉｌｅｇｅｄ）および／または免疫調節性（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ）である前駆細胞、それらの生産、それらの製剤およびそれらの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
成人の骨髄（ＢＭ）は、インビトロで骨格組織；骨２−４、軟骨５−７、脂肪８および筋肉９に分化する能力により機能的に定義される間葉系幹／前駆細胞（ＭＳＣ）（間葉系ストローマ細胞とも呼ばれる１）の最も通常の供給源である。ＭＳＣは古典的には組織培養プラスチックへの接着および繊維芽細胞コロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ  ｕｎｉｔ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＣＦＵ−Ｆｓ）の形成を介して異質な環境の細胞から識別され、その頻度は成人の骨髄で１：１００，０００〜１：５００，０００の有核細胞であり１０、そして現在の研究ではＭＳＣを分類する一揃いのマーカーが同定されている１０、１１。この低比率のＭＳＣは、任意の種類の細胞療法に適する細胞数を達成するために使用前に培養による拡大および選択を必要とする。脂肪組織１２、海綿質１３および胎児肝臓１４のような他の新たに生じたＭＳＣ源があり、これらはそれぞれ１：３２１５、１：６３６１３および１：８８，４９５１４のＣＦＵ−Ｆ頻度を有する。脂肪組織が最高頻度の前駆細胞を有するようであるが、これら細胞の倍加時間は３．６〜４．４日１５の間の範囲であり、そして抽出手順が複雑で侵襲的かつ長い１２。海綿質の収穫は、低い細胞収量（若年の供与体に由来する骨の８９ｘ１０６細胞／グラム１３）を生じ、これはＣＦＵ−Ｆ頻度と合わせると特に低く、しかも極度に侵襲的で供与体の部位を病的状態にする。
【０００３】
これらの新規ＭＳＣ源の中でも独自であるのはヒト臍帯脈管周囲細胞（ＨＵＣＰＶＣ）であり、これは容易に入手でき、２０時間の細胞倍加時間を持つ高度に増殖性の細胞供給源である（血清に依存する）１６。ＨＵＣＰＶＣ中のＣＦＵ−Ｆの頻度は、継代０で１：３００だが、継代１で１：３に増加し１７、この規模の次元は骨髄よりも高い１６。したがってＨＵＣＰＶＣは大変早く分裂が進む非常に高いＭＳＣ比率を有する細胞集団を表し、これによりそれらは臨床的な間葉系療法の優れた候補となる。これらの細胞はマーカー発現の表現型および分化能を決定するために様々なアッセイに使用され１６、１８、そしてＢＭ−ＭＳＣと生物学的等価であるか、またはより良い性能であることが分かった。
【０００４】
それらの分化能力に加えて、ＢＭ−ＭＳＣが免疫学的寛容および免疫調節性の両方となることが示されたので、ＭＳＣも有望な免疫学的用途を有する１９−２１。これらの用語は、ミスマッチの宿主免疫系からの認識を逃れる細胞の能力、およびその系により進行している応答を和らげる能力をそれぞれ指している。骨髄以外の幾つかの供給源に由来するＭＳＣがそれらの免疫原性についてインビトロ培養で試験された。成人の皮および脂肪吸引（ｄｅｒｍｏｌｉｐｅｃｔｏｍｙ）に由来する脂肪組織からのＭＳＣは、インビトロで免疫学的寛容および免疫調節性の両方となり得ることが示され２２、一方、胎児肝細胞はミスマッチの免疫応答を避けることができることが分かったが、それらはリンパ球の２つのミスマッチした集団により引き起こされるアロ反応性（ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）することができなかった２３、２４。このようにＭＳＣの供給源はこれら細胞の免疫原性能力に直接影響を及ぼす。
【０００５】
このインビトロの研究は、臨床的な設定で確認するために始まった；例えばある少年は彼の母親に由来するハプロ同一性骨髄ＭＳＣの移植により重篤な急性の対宿主性移植片病
（ＧｖＨＤ）から救済された２５。処置から１年後、同じ重篤度レベルのこの疾患に罹患している患者のコホートと比較して、彼だけが生存していた。この初期の患者から、８名の患者が揃ってＢＭ−ＭＳＣで処置され、そのうちの６名が症状の完全な寛解を示した２６。同種異系のＢＭ−ＭＳＣも現行の処置に難治性の患者を処置するためにクローン病で使用され、そしてこの処置は米国で臨床試験中である２７、２８。胎児肝臓ＭＳＣは骨形成不全症（ＯＩ）の初期の処置に効力を示した。男性胎児肝臓に由来するＭＳＣが、数箇所の子宮内骨折を患っている無関係な３２週齢の重篤なＯＩの女性胎児に移植された２９。移植後、残る妊娠期間は正常に進み、そしてさらに骨折することはなかった。この患者を出生後２年間追跡し、そして子供は正常な成長曲線を示し、そして３カ所の骨折を起こしただけだった。ＸＹ−特異的プローブを使用して、患者は骨の生検で０．３％移植されている（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）ことが分かった。
【０００６】
未分化細胞に加えて、骨形成的に誘導されたウサギのＢＭ−ＭＳＣがインビトロで免疫学的寛容および免疫調節性であることが分かったが、インビボに移植すると免疫調節能が失われた３０。しかしながらそれらはＢＭ−ＭＳＣの役割を果たすために免疫応答からの保護を必要とするだけなので、細胞の機能に影響を及ぼさないだろう。さらに難しい誘導では、マウス骨髄ＭＳＣがエリスロポイエチンを放出するように操作され、そしてマウスに移植され、これは未操作対照に比べて有意に少ない移植を生じた３１。このようにＭＳＣの操作はそれらの免疫調節および／または免疫学的寛容の損失を導く可能性があり、そして移植片の生存および機能に決定的となり得る。
【０００７】
ＭＳＣの免疫学的寛容が種の境界を越え、そしてそれらが異種移植に使用できることを支持する証拠がある。これはヒトＢＭ−ＭＳＣをヒヒに使用したＢａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ
ｅｔ  ａｌにより初めて証明され、そして強化された皮膚移植片の生存が示された２１。この実験の最終結果はポジティブであったが、投与された細胞の具体的運命は決定されなかった。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌはＧＦＰトランスフェクト細胞、および試験した異種移植ＢＭ−ＭＳＣの生存に対して組織学的分析を利用し、そして細胞が免疫抑制なしに１１週の時点まで生存することを示したが、上昇した宿主免疫反応があった３２。ＭＳＣは２つの心臓モデルで異種移植において生存することも報告された３３、３４。ＨＵＣＰＶＣを用いた予備実験では、細胞は透過性容器中、腹膜に送達された。３週間後、肉眼で見て注目すべき炎症はなかった３５。これはＨＵＣＰＶＣの免疫学的寛容だけでなく、それらを拒絶なしに動物モデルで試験するための能力に可能性を示す有望な予備実験である。
【０００８】
本発明者は、ＨＵＣＰＶＣとマッチしないリンパ球との共存培養、および２つのＨＬＡミスマッチ供与体に存在する混合リンパ球培養（ＭＬＣ）の両方を行うことにより、インビトロでＨＵＣＰＶＣの免疫学的寛容および免疫調節性を調査した。また実験は、ナイーブなおよび活性化リンパ球の環境の両方において、存在するＨＵＣＰＶＣのレベルを変えたＨＵＣＰＶＣの死、リンパ球の増殖および活性化であった。さらに免疫学的効果の観察のために、細胞接触の必要性を調査した。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
本発明者はここに、１および２方向（ｏｎｅ  ａｎｄ  ｔｗｏ−ｗａｙ）のインビトロ混合リンパ球培養（ＭＬＣ）で試験した時、ＨＵＣＰＶＣの免疫学的寛容および免疫調節能の両方を具体的に説明する一連の実験を本明細書に報告する。さらにＭＬＣは前以て刺激したリンパ球の活性化にＨＵＣＰＶＣが誘導する低下を明らかにすることも行った。さらに発明者は細胞接触が、観察される免疫調節効果に必要でないので、ＨＵＣＰＶＣの免疫調節機能がＨＵＣＰＶＣの培養で生産される可溶性因子（１もしくは複数）を介して媒介されることを示す。さらに発明者はＨＵＣＰＶＣが２方向のインビトロＭＬＣを調節できることを具体的に説明し、そして特に免疫応答を調節するための細胞療法にこれら細胞
を応用する用途を記載する。
【００１０】
このように本発明の１つの観点では、本発明は個体に免疫を調節する有効量の（１）ヒト臍帯脈管周囲細胞（ＨＵＣＰＶＣ）を含んでなる、そして好ましくは本質的にそれからなる細胞集団、および／または（２）該細胞の培養で生産される免疫調節可溶性因子を投与する工程を含んでなる、有害な免疫反応を発症しているか、またはその危険性がある個体を処置する方法を提供する。関連する態様では、この方法は細胞、組織および臓器を含む同種異系もしくは異種異系移植片の受容体の、対宿主性移植片病を含むそれらに対する有害免疫反応の発症または重症化を下げるための処置に応用される。一般的な観点では、本発明はこのように末梢血リンパ球のようなリンパ球と、リンパ球に外来と認識される物質（ｂｏｄｙ）との間の免疫反応を調節する方法を提供し、この方法は生理学的に許容され得る媒体およびＨＵＣＰＶＣ細胞、またはそれらから抽出可能な免疫調節可溶性因子を含んでなる製剤を、その免疫反応を調節し、そして特に抑制もしくは下げるために有効な量で導入する工程を含んでなる。
【００１１】
関連する観点では、本発明は有害免疫反応を発症しているか、その危険性がある個体を処置するために、あるいは移植片と受容体との間の免疫反応を軽減または減少するために、移植前の移植片を処置する薬剤の製造において、ＨＵＣＰＶＣ細胞またはそれにより生産される免疫調節可溶性因子の使用を提供する。
【００１２】
本発明の別の観点では、本発明は免疫調節に有効量のＨＵＣＰＶＣおよび／またはそれらにより生産される免疫調節可溶性因子、および生理学的に許容され得るそれらの媒体を含んでなる単位剤形または多用量剤形（ｍｕｌｔｉｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍ）で製剤を提供する。
【００１３】
さらなる観点では、本発明は培養したＨＵＣＰＶＣにより生産された１もしくは複数の可溶性因子を含んでなる免疫調節抽出物、またはその免疫調節画分を提供する。
【００１４】
別の観点では、本発明は上記の処置法を提供し、ここで投与される細胞は低温保存なしで得られ、そして投与される。
【００１５】
本発明のさらなる観点では、投与されるＨＵＣＰＶＣは免疫学的寛容および免疫調節細胞である。態様では、ＨＵＣＰＶＣは実質的にＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ表現型の両方を欠いている。関連する態様では、投与されるＨＵＣＰＶＣは凍結ＨＵＣＰＶＣ集団を解凍することにより得られる。
【００１６】
本発明のさらなる態様では、投与される免疫学的寛容ＨＵＣＰＶＣは遺伝的に操作され、そして目的の異種タンパク質をコードする導入遺伝子を包含し、これには限定するわけではないが免疫調節を強化するタンパク質のような免疫系を管理するために効果的なタンパク質、そして特にＣＴＬＡ４のような有害免疫反応を抑制するタンパク質を含む。
【００１７】
本発明のこれらのおよび他の観点を添付する図面を参照にしながら以下にさらに詳細に記載する。
【００１８】
詳細な説明および好適な態様
本発明は、特に宿主による有害免疫反応から、または宿主に対して抗原性の物質による有害免疫反応のいずれかから生じる同種抗原および異種抗原性物質により誘導される有害反応の減少が有益となる状態の処置に、ＨＵＣＰＶＣの新規かつ臨床的に有用な応用を提供する。より一般的には本発明は、リンパ球と外来と認識される物質との間の免疫反応を抑制または下げるために、ＨＵＣＰＶＣおよび／またはそれらにより生産される可溶性因
子が導入される方法を提供する。
【００１９】
本明細書で使用するように、そのような物質にはヒトを含む哺乳動物の身体に送達されるか、またはそれに侵襲的な任意の生きているまたは死んだ生物学的物質を含むことができる。抗原性のそのような物質は、正常な過程で受容体または物質のいずれかによる免疫応答を誘導し、例えばここで物質自体が骨髄、組織もしくは臓器移植片のようなリンパ球を含む免疫細胞を含んでなる。同種抗原性物質は、同じ種内の個体間で抗原性である物質であり；異種抗原性物質は異なる種の個体間で抗原性である物質である。自家移植物質は、受容体からの物質である。態様では、物質はＨＬＡミスマッチ物質である。他の態様では、物質はＨＬＡミスマッチリンパ球を含んでなる。
【００２０】
ＨＵＣＰＶＣの免疫調節作用のメカニズムが完全に解明されているわけではないが、ＨＵＣＰＶＣおよびそれらにより生産される可溶性因子は、抗原提示細胞、細胞傷害性Ｔ細胞を含むＴ細胞およびナチュラルキラー細胞のような同種抗原認識および排除に関与する主要な細胞集団に効果を有する。
【００２１】
本発明の方法に有用なＨＵＣＰＶＣは、これまでに注記した文献に記載され、そして限定するわけではないが特にヒト臍帯を含む臍帯の脈管周囲領域から抽出可能な前駆細胞としてさらに特徴付けられる。本明細書に記載するプロトコールを使用して、臍帯脈管周囲細胞はウマ、ウシ、ブタ、霊長類等を含む他の哺乳動物の臍帯脈管からも抽出できると考えられる。脈管周囲領域は臍帯脈管構造に付随するか、またはその外部のホウォートンゼリーを含んでなる。ＨＵＣＰＶＣは脈管周囲領域にあるホウォートンゼリーから、コラゲナーゼもしくは例えばＳａｒｕｇａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（この内容は引用により全部、本明細書に編入する）に記載されているような付随する結合組織を除去するために適する関連する酵素のような標準的な消化法を使用して抽出することができる。好ましくはＨＵＣＰＶＣは脈管周囲領域を越えて伸びるホウォートンゼリーからではなく、脈管周囲細胞からのみ回収され、あるいは脈管自体の部分もしくは内部にある組織もしくは流体から回収される。これは一般的に帯にある他の細胞の混入を回避する。他の方法では、脈管周囲細胞の選択なしにホウォートンゼリーからの抽出を行うことができるが、ただし生じた細胞集団は本明細書に記載する表現型および特徴を有する前駆細胞を濃縮するために、例えばフローサイトメトリーを使用してＨＵＣＰＶＣについて濃縮される。ＨＵＣＰＶＣはさらに比較的急速な増殖により特徴付けられ、標準的な接着条件下で培養した場合、各２〜７継代で約２０時間の倍加時間を表す（血清依存的）。表現型的には、ＨＵＣＰＶＣは収穫時にＯｃｔ４−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ４９ｅ＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５（ＳＨ２）＋、ＣＤ７３（ＳＨ３）＋、ＣＤ７９ｂ−、ＨＬＡ−Ｇ−、ＣＸＣＲ４＋、ｃ−ｋｉｔ＋と特性付けられる。さらにＨＵＣＰＶＣは脈管周囲領域以外のホウォートンゼリー源から抽出された細胞集団中よりも高レベルでＣＫ８、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１４６および３Ｇ５（周皮細胞マーカー）に陽性の細胞を含む。
【００２２】
またＨＵＣＰＶＣは操作に依存して０〜１００％の変動性のレベルでＭＨＣクラスＩを発現することもできる。回収した細胞を、例えばＳａｒｕｇａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５（引用により本明細書に編入する）により記載されるように凍結−解凍サイクルにかけることにより、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの両方に実質的にネガティブなＨＵＣＰＶＣ集団を得る（９５％）。本明細書で使用するように、ＨＵＣＰＶＣが所定の集団にあり、そして１もしくは両方の表現型を表している細胞の数が細胞集団中の約２０％よりも多くなければ、例えば全ＨＵＣＰＶＣ集団の１５％、１０％、５％以下ならば、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの両方に「実質的に」ネガティブであると考えられる。決定は適切な標的抗体を用いて標準的技術のフローサイトメトリーを使用して行うことができる。このＭＨＣダブルネガティブＨＵＣＰＶＣ集団は、本発明の方法に特に
有用である。本方法では、投与されるＨＵＣＰＶＣ集団が新たに抽出された（場合により拡大された）ＭＨＣクラスＩネガティブ細胞または解凍したＭＨＣダブルネガティブＨＵＣＰＶＣのいずれかを含んでなることができると考えられる。ＭＨＣダブルネガティブＨＵＣＰＶＣは、受容体で免疫応答を刺激する見込みがさらに低く、したがってそれらの臨床的使用は本発明で好適となる。しかしＭＨＣの表現型の操作は本質的ではないと考えるべきである。免疫学的寛容および免疫調節的特性は場合により保存された新たに抽出されたＨＵＣＰＶＣにも見られ、凍結／解凍により操作されたＨＵＣＰＶＣで見られるだけではない。
【００２３】
本方法で、ＨＵＣＰＶＣは、それらの免疫学的寛容および免疫調節性から有益となる臨床的設定で活用される。本明細書で用語「免疫学的寛容」とは、末梢血リンパ球とインキュベーションした時、特にこの分野で確立され、そして本明細書中に例示するいわゆる１方向ＭＬＣアッセイを使用して試験した時に、ＰＢＬの増殖を統計的に有意な程度まで刺激しないか、またはそれらの生存能を統計的に有意なレベルで維持するいずれかのＨＵＣＰＶＣのような細胞を称する。
【００２４】
本明細書で「免疫調節」とは、リンパ球集団の死亡率における減少により、または例えばいわゆる１方向もしくは２方向の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を使用して測定されるようなリンパ球集団の生存能の上昇のいずれかにより明らかにされるようなリンパ球のミスマッチした集団間の反応を軽減、減少または抑制するＨＵＣＰＶＣの能力を指す。
【００２５】
さらに培養したＨＵＣＰＶＣにより滲出する因子は単独で無傷（ｉｎｔａｃｔ）のＨＵＣＰＶＣが使用された時に見られる種類の免疫調節効果を発揮できることが見いだされた。すなわち本発明の観点および態様では、ＨＵＣＰＶＣの培養で生産される抽出された可溶性因子が免疫調節物質（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）として単独またはＨＵＣＰＶＣ細胞と組み合わせて使用される。
【００２６】
ＨＵＣＰＶＣ培養で滲出する１もしくは複数の免疫調節因子を本明細書では可溶性因子と呼び、そしてＨＵＣＰＶＣが培養される培地から抽出可能である。１つの態様では免疫調節可溶性因子は、ＨＵＣＰＶＣ細胞がそれらの増殖によりコンディショニングされた培地から遠心などにより除去される時に得られる抽出物として提供される。遠心が使用される場合、抽出物は上清として提供される。適切なＨＵＣＰＶＣ培養条件を本明細書に例示する。抽出物は細胞をコンディショニングした培養基から遠心などにより分離することにより得られる。他の態様では、可溶性因子は抽出物のような免疫調節画分として提供される。ここで免疫調節活性を有する抽出画分も有用であり、そして本明細書に記載する混合リンパ球反応を使用して同定することができる。もちろんこれらの抽出画分は、溶媒抽出、ＨＰＬＣ分画、遠心、サイズ排除、塩もしくは浸透圧勾配分画等を含む便利な技術を使用してＨＵＣＰＶＣ抽出物を分画することにより得ることができる。次いで溶出もしくは集めた画分はそれぞれＭＬＲにかけられ、そして免疫調節について活性な画分を同定することができ、そして免疫調節活性を有する画分を本明細書に記載する様式で臨床的に使用することができる。
【００２７】
このように態様では本発明はＨＵＣＰＶＣの培養中に滲出する可溶性画分を含んでなる免疫調節抽出物またはその免疫調節画分の使用を含んでなる。
【００２８】
ＨＵＣＰＶＣ、および免疫学的寛容および／または免疫調節性のそれらの集団を本発明に従い使用することは、それらの収集、場合によりそれらの拡大、さらに場合によりそれらの低温保存そして凍結状態からの再生、および引き続きそれらの意図する受容体への投与のための製剤を包含する。もちろん特定の操作、投薬および処置計画は、処置する疾患もしくは状態の種類および重篤度を含む多くの因子に依存する。免疫学的状態（例えばＧ
ｖＨＤ、自己免疫状態）には、ＨＵＣＰＶＣ集団のサイズ、すなわち受容体へ投与する用量は一般に受容体の体重１キログラムあたり０．０１〜約５百万個の細胞の範囲になる。送達には細胞は、生理学的に許容され得る媒体、すなわち細胞だけでなく受容体によっても許容され得る媒体をさらに含んでなる製剤として適切に提供される。細胞は担体として塩水、ＰＢＳのような緩衝化生理食塩水、細胞培養基または：必須アミノ酸、増殖因子、サイトカイン、ビタミン、抗生物質もしくは無血清の化学的に定められた培地等もしくは滅菌水を含有する類似の液体のような生理学的に許容され得る媒体を含んでなる滅菌製剤で適切に提供される。配合された細胞は注入により、または例えば１〜２５ｍＬの範囲の容量を使用する注射により投与することができる。
【００２９】
ＨＵＣＰＶＣにより生産され、そして消耗されたＨＵＣＰＶＣ培養基から抽出できる免疫調節可溶性因子は、無傷のＨＵＣＰＶＣに関して上に記載した様式において同様に有用である。１つの態様では、抽出物自体が製薬学的組成物を構成し、これは免疫調節可溶性因子の状態での活性剤、および生理学的に許容し得る媒体を構成する培地を含んでなる。他の態様では、抽出物を乾燥して可溶性因子（１もしくは複数）を保持し、そしてリン酸緩衝化生理食塩水のような種々の媒体で再構成することができる。臨床的応用のための投薬用量サイズおよび投薬計画は、無傷のＨＵＣＰＶＣについて効果的な投薬を参照にして定めることができる。抽出物の用量等価物は、ＭＬＲアッセイで抽出物および無傷な細胞の相対的効力を算出することにより、あるいは標的とする兆候の適切な動物モデルにおけるような、療法が活用される臨床的環境を反映するその任意の代替により決定することができる。
【００３０】
使用では、配合されたＨＵＣＰＶＣまたはそれにより生産された可溶性因子が、有害免疫反応を経験しているか、またはそれを発症する危険性がある個体を処置するために投与される。そのような個体には特に、骨髄および末梢血のような細胞、皮膚および冠状組織および胃腸管組織を含む脈管組織を含む組織、または肝臓、腎臓、心臓、肺等のような臓器の状態の同種もしくは異種移植または移植片を受けているか、正に受けようとしている個体を含む。配合されたＨＵＣＰＶＣは、特に対宿主性移植片病、供与体移植片に存在するリンパ球により媒介される宿主組織の免疫攻撃から生じる状態の発症または重篤度を下げるために有用である。本発明の１つの態様では、ＨＵＣＰＶＣは移植前に移植片中に存在するリンパ球の活性を下げるまたは止めるために十分な期間、移植片とインキュベーションすることにより移植片を処理するために使用することができる。このインキュベーションにはＨＵＣＰＶＣ（新鮮または凍結ストックからの）が、移植前に増殖を停止するために、４から１０日の間、全移植片リンパ球の５〜６０％（移植片中に存在する血液の容量により定められる）、好ましくは１０〜４０％の用量で含まれることが求められる。臓器移植片の場合、臓器は新鮮な、または凍結ストックに由来するＨＵＣＰＶＣ（上に述べた生理学的に許容され得る媒体に懸濁された）と１グラムの臓器塊あたり０．０１〜５ｘ１０３細胞の用量で、移植前に臓器のリンパ球を不活性とするために十分な期間インキュベーションされる。移植片の受容体である個体に関して、ＨＵＣＰＶＣは望ましくは同種移植臓器を直接囲む組織中に移植の前（例えば数時間以内）、移植と同時、または移植後（数時間以内、そしてその後、免疫反応を防御するために必要な時）に受容体に投与される。ＨＵＣＰＶＣは最適には移植片の部位に、例えば皮下、筋肉内、脈管内、静脈内、動脈内または腹腔内のいずれかによる注入もしくは注射により投与することができる。１つの態様では、受容体は移植時に体重１キログラムあたり５ｘ１０４〜５ｘ１０７個の細胞の範囲、例えば約１〜５ｘ１０６細胞のＨＵＣＰＶＣ用量を注入することにより処置される。細胞は５％ヒト血清アルブミンを含む１０ｍｌの生理食塩水中に配合される。２回以上の注入を使用することができ、各々が約１０〜１５分間続く。また細胞は生きている細胞を移植部位（腹腔、筋肉内等のような）に経時的に放出できるようにする遅効性（ｓｌｏｗ  ｒｅｌｅａｓｅ）製剤で移植することもできる。この目的に適する担体には、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギン酸等がある。本発明の他の態様では、ＨＵＣＰＶＣを利用
して進行中で、そして恐らくは他の処置には難治性のＧｖＨＤのような免疫学的状態を処置することができる。ＨＵＣＰＶＣまたは滲出した可溶性因子は、このように免疫細胞もしくはそれを含有する組織の移植が示される白血病、再生不良性貧血および酵素もしくは免疫不全症に罹患している個体を処置するために有用である。
【００３１】
またＨＵＣＰＶＣまたは可溶性因子の投与は、クローン病、狼瘡および多発性硬化症、ならびに慢性関節リウマチ、１型インスリン依存性糖尿病、成人呼吸促進性症候群、炎症性腸疾患、皮膚炎、髄膜炎、血栓性血小板減少性紫斑病、ショーグレン症候群、脳炎、ブドウ膜炎、白血球接着不全、リウマチ熱、ライター症候群、乾癬性関節炎、進行性全身性効果症、原発性胆汁性肝硬変、重症筋無力症、エリテマトーデス、脈管炎、悪性貧血、抗原−抗体複合体媒介疾患、レイナード（Ｒｅｙｎａｒｄ’ｓ）症候群、糸球体腎炎、慢性活動性肝炎、腹膜疾患、ＡＩＤＳの自己免疫合併症、強直性脊椎炎およびアディソン病のような自己免疫疾患の処置に応用がある。この場合ＨＵＣＰＶＣの投与は、生理学的に許容され得る媒体（前に述べたような）中で静脈内に０．１〜１０ｘ１０６細胞／ｋｇ体重の投薬範囲である。１回より多くの投薬が必要とされ、そして投与は必要に応じで反復できる。
【００３２】
第２に、ＨＵＣＰＶＣはタンパク質／酵素不全症を処置するために使用することができ、ここでＨＵＣＰＶＣは所望するタンパク質／酵素を生産するために必要な遺伝子でトランスフェクトされる。この工程には遺伝子導入（限定するわけではないがレンチウイルスの、レトロウイルスのおよびアデノウイルスのものを含む）；およびトランスフェクション（限定するわけではないがヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）の、エレクトロポレーションの、リポソームのものを含む）を含むことができ、そして不全症に罹患している患者に輸注される。受容体に投与される用量は、一般に受容体の体重１キログラムあたり０．０１〜約５百万個の範囲の細胞となる。次いでＨＵＣＰＶＣが目的のタンパク質または酵素を構成的に生産する。
【００３３】
最後にＨＵＣＰＶＣは、特定のウイルス／抗原に暴露される危険性がある人への投与に大量に生産するために、ワクチンとして使用するため導入遺伝子を上に挙げたトランスフェクション法を介して導入するために工作することができる。
【００３４】
材料および方法
細胞の収集
ＨＵＣＰＶＣ
この研究に関する倫理的承認はトロント大学ならびにサニーブロック  アンド  ウィメンズ  カレッジ  ヘルス  サイエンスセンター（Ｓｕｎｎｙｂｒｏｏｋ  ＆  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ）から得た。臍帯は両親の十分な説明に基づく同意を得て、月満ちた赤子の無菌的帝王切開から集めた。帯は直ちにトロント大学に輸送し、ここで細胞を以前に報告されたように脈管周囲領域から無菌的条件下で抽出した１６。簡単に説明すると、４ｃｍの帯切片を切り出し、そして上皮を取り出した。次いで脈管をそれらの周囲にあるホウォートンゼリーを含めて摘出し、平滑筋消化を防止するためにループに結び、そしてコラゲナーゼ溶液中で一晩消化した。翌日、消化物を除去した際、細胞を塩化アンモニウム中ですすいで帯の血液から赤血球を溶解した。この後、細胞をすすぎ、そして５％のウシ胎児血清および１０％の抗生物質（ペニシリンＧを１６７単位／ｍｌ；シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ゲンタマイシンを５０μｇ／ｍｌ；シグマ、およびアンフォテリシンＢを０．３μｇ／ｍｌ）を含有する８５％のα−ＭＥＭに４，０００細胞／ｃｍ２の密度でまいた。細胞はそれらが７５〜８０％の集密度になった時に植え継ぎ、これはおよそ６〜７日毎である。
【００３５】
ＭＨＣ−／−ＨＵＣＰＶＣ
１ｘ１０５個の細胞より多い試験細胞集団（＞１ｘ１０５）は、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中で洗浄し、そして飽和濃度（１：１００希釈）の以下の結合化マウスＩｇＧ１  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ−ＰＥ（ＢＤバイオサイエンス：Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃５５５５５３、Ｌｏｔ  Ｍ０７６２４６）（ＭＨＣ  Ｉ）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＰ，ＤＱ−ＦＩＴＣ（ＢＤバイオサイエンス＃５５５５５８、Ｌｏｔ  Ｍ０７４８４２）（ＭＨＣ  ＩＩ）およびＣＤ４５−Ｃｙ−チトクローム（ＢＤバイオサイエンス＃５５５４８４、Ｌｏｔ  ０００００３５７４６）を含むＰＢＳ＋２％ＦＢＳに４℃で３０分間懸濁した。細胞懸濁液をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで２回洗浄し、そしてＥｘｐｏＡＤＣＸＬ４ソフトウェア（ベックマン−コールター：Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用したフローサイトメーター（ＸＬ、ベックマン−コールター、マイアミ、フロリダ州）での分析のためにＰＢＳ＋２％ＦＢＳに懸濁した。陽性染色は、対となるアイソタイプ抗体（ＦＩＴＣ−，ＰＥ−およびＣｙ−チトクローム結合化マウスＩｇＧ１，κモノクローナルアイソタイプ標準、ＢＤバイオサイエンス）で染色した対照集団からの９９％より多くの細胞により得られるレベルを越えた蛍光シグナルの発光と定め、これはヒトＢＭサンプルの陽性蛍光により確認された。各サンプルについて、少なくとも１０，０００のリストモードイベント（ｌｉｓｔ  ｍｏｄｅ  ｅｖｅｎｔ）を集めた。すべてのプロットはＥＸＰＯ３２ＡＤＣ分析ソフトウェアで作成した。
【００３６】
付着した細胞は、７日後に０．１％トリプシン溶液を使用してサブカルチャー（継代）し、この時点でそれらは光学顕微鏡により観察した時、８０〜９０％の集密度を現した。継代で細胞はＭＨＣ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＭＨＣ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱおよびＣＤ４５の発現に関してフローサイトメーターにより観察された。次いでそれらをＴ−７５組織培養ポリスチレンフラスコに４ｘ１０３細胞／ｃｍ２（ＳＭ中）でまき、そして１０−８Ｍ  Ｄｅｘ、５ｍＭ  β−ＧＰおよび５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸で処理してこれら細胞の骨形成能を試験した。これらのフラスコは培養の２、３、４、５および６日目にＣＦＵ−Ｏ、または骨小節の形成について観察した。継代手順で存在するいかなる細胞も後の使用に低温保存した。
【００３７】
１ｘ１０６個のＰＶＴ細胞を、９０％ＦＢＳ、１０％ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）（シグマＤ−２６５０、Ｌｏｔ＃１１Ｋ２３２０）からなる１ｍｌ総容量に調製し、そして１ｍｌのポリプロピレンクリオ−バイアル（ｃｒｙｏ−ｖｉａｌ）にピペットで入れた。このバイアルを−７０℃の冷凍庫に一晩置き、そして翌日、長期保存用の−１５０℃の冷凍庫に移した。低温保存から１週間後、ＰＶＴ細胞を解凍し、そしてフローサイトメーターによりＭＨＣ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＭＨＣ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱおよびＣＤ４５の発現について観察した。ＰＶＴ細胞を１週間の低温保存後に解凍する第２プロトコールを使用し、１週間再培養し、サブカルチャーし、次いでフローサイトメーターによりＭＨＣ−Ａ，Ｂ，Ｃ、ＭＨＣ−ＤＲ、ＤＰ、ＤＱおよびＣＤ４５の発現について再分析した。
【００３８】
新たな細胞集団中のＭＨＣ−／−の頻度は、数回の継代を通して維持されることに注目した。新たな細胞が継代後に−１５０℃で１週間凍結され、次いでＭＨＣの表現型について直ちに分析される場合、この分析した集団は、ＭＨＣ−／−表現型の細胞について顕著に強化された頻度を提示する。特に低温保存した細胞の第１代は、ＭＨＣ−／−細胞の相対的集団を５０％より多くまで上げ、そして続いてこれら細胞の凍結および継代で８０％、８５％、９０％および９５％より高いＭＨＣ−／−集団を生じる。
【００３９】
リンパ球
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）は、健康な供与体のヘパリン処理した血液から抽出した。細胞の分離は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ密度勾配（アマシャム  バイオサイエンス：Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃１７−１４４０−０３）により行い、ここで細胞を３８０  ｘ  ｇで３５分間遠心した。軟膜を除去し、そしてＶｉＣｅ
ｌｌ−ＸＲ（商標）（ベックマン  コールター）を使用して、細胞および核のサイズにより決定されるようなリンパ球に特異的なプロトコールを用いてカウントした。次いで細胞はアッセイの要件毎に、ＨＥＰＥＳ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、１０％ウシ胎児血清および１０％抗生物質を含有する８０％ＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ＃Ｒ５８８６）中にまいた。
【００４０】
混合リンパ球培養
マイトマイシンＣ
１方向ＭＬＣを行うために、ＨＵＣＰＶＣおよびＰＢＬ集団の１つを休止させておかなければならない。これはＭＭＣがＤＮＡに結合し、そして分割を防止できるようにするために細胞を一定濃度および時間でマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を用いて処理することにより達成される。この濃度は、９６ウェルプレートのウェル中に５０００個の細胞の細胞集団から出発して、３７℃（５％ＣＯ２）で２０分間インキュベーションするＭＭＣの滴定曲線により決定された。１０、２０、３０、４０、５０および７５μｇ／ｍＬ濃度のＭＭＣを基準培地（８５％α−ＭＥＭ、５％ＦＢＳ、１０％抗生物質）中で試験し、そしてＰＢＳで２回洗浄し、その後にいかなる微量のＭＭＣも除去した。ウェルは１週間後にカウントして増殖について評価した。細胞集団をＭＬＣ中で合わせる時、リンパ球の増殖能に影響しないように、すべての微量ＭＭＣも除去することが必須である。これを確実にするために、９６ウェルプレート（ファルコン：Ｆａｌｃｏｎ）の空のウェルをＭＭＣで処理し、そしてプロトコール毎に洗浄した。次いでリンパ球を加え、そして対照標準ウェルと比べてそれらの増殖をアッセイした。
【００４１】
免疫学的寛容アッセイ
３連の１ｘ１０４のＨＵＣＰＶＣ（新鮮および凍結の両方をアッセイした）を９６ウェルプレートにまいた（ｎ＝５）。いったん細胞が接着したら（約２時間後）、それらを２０μｇ／ｍＬのＭＭＣで処理した。次いでＨＵＣＰＶＣをすすぎ、そして供与体１からの１０５ＰＢＬを各ウェルに加えた。プレートを３７℃にて５％ＣＯ２空気中で、ＨＥＰＥＳ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、１０％ウシ胎児血清および１０％抗生物質を含有する８０％ＲＰＭＩ−１６４０培地中でインキュベーションした。６日後、ＨＵＣＰＶＣを含むカルチャーに存在するリンパ球をＶｉＣｅｌｌカウンターを使用してカウントし、そして対照と比較した。細胞死アッセイについては、プレートを４時間インキュベーションし、そしてＨＵＣＰＶＣが初期および後期段階の細胞死マーカー（アネキシン５（Ｒ＆Ｄ  システムズ：Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＴＡ４６３８）および７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）についてそれぞれアッセイされた。これらのレベルはベックマンコールターのＦｌｏｗＣｅｎｔｅｒでフローサイトメトリーを使用して測定そして比較された。ＰＢＬ増殖アッセイについて、細胞を６日間インキュベーションし、その後、細胞を５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（チミジンの塩基類似体）で染色し、そしてフローサイトメトリーを使用して測定した。ＰＢＬ単独およびＨＵＣＰＶＣ単独の対照を両アッセイに使用した。
【００４２】
１方向ＭＬＣには、ＨＵＣＰＶＣは始めに９６ウェルプレートに３連（ウェルあたり１，２，３および４ｘ１０４細胞）でまき、ＭＭＣで処理し、そしてＰＢＳで洗浄した。ＰＢＬは潜在的供与体のプールから選択した２つのミスマッチ供与体から回収した（試験した６つのＨＬＡのうちの５つのミスマッチについて：供与体１  ＨＬＡ−Ａ＊０１、＊０２；Ｂ＊０７、＊１８；ＤＲＢ１＊１５、＊−−；供与体２  Ａ＊０１、＊−−；Ｂ＊０８、＊−−；ＤＲＢ１＊０３、＊−−）。タイピングはＲｅｇｉｏｎａｌ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（トロントジェネラルホスピタル、トロント、オンタリオ州）で、低い解像度のＤＮＡ割り当て（ＤＮＡ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）技術を使用して行った。  Ｆｉｃｏｌｌで処理した後、供与体２のリンパ球をＭＭＣで処理して休止させた。次いで細胞を遠心で落とし、そして洗浄し、そして９６ウェルプレートにウェルあたり１０５細胞で加えた。供与体１のリンパ球をウェルあたり１０５細胞で加え、そして３つの細胞集団を６日間コーインキュベーションし、その後、それらを５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、チミジンの塩基類似体で染色した。次いでＢｒｄＵに関するフローサイトメトリーをリンパ球について行って増殖をアッセイした。これに続いて、類似のアッセイを、リンパ球の毎日のカウント（１〜６日）を使用して測定された結果を用いて、ＶｉＣｅｌｌ−ＸＲ（商標）細胞カウンターを使用してリンパ球特異的プロトコールで行った。すべての結果は両供与体の同種および異種対照について比較した。
【００４３】
免疫調節アッセイ
２方向ＭＬＣは、両方とも増殖できるミスマッチ供与体（上記と同じ供与体）に由来する２つのＰＢＬ集団を含む。簡単に説明すると両供与体に由来する１ｘ１０５のＰＢＬを９６ウェルプレートの各ウェルに加え、そして６日間インキュベーションした。実験の過程で、免疫反応がすでに始まっていればＨＵＣＰＶＣの効果を分析するために１または４ｘ１０４ＨＵＣＰＶＣをウェルに３連で０、３または５日に加えた。両方とも陽性の結果を以前に示したので、１０および４０％のＨＵＣＰＶＣ：ＰＢＬ比を選択し、すなわちこれは低および高レベルのＨＵＣＰＶＣ包含として選択した。各プレートからのサンプルは、ＶｉＣｅｌｌ−ＸＲ（商標）細胞カウンターを使用して毎日カウントし、そして自己由来および同種異系対照と比較した。
【００４４】
可溶性因子
２方向ＭＬＣアッセイは、ＨＵＣＰＶＣをＰＢＬ細胞接触に向けずに再度行って、この効果が可溶性因子によるのかどうか、または細胞−細胞接触が必要であるのかどうかを決定した。ＨＵＣＰＶＣ（ウェルあたり１および４ｘ１０４細胞）をＴｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）インサート（コーニング）で２４ウェルプレートについて培養し、そして約２時間付けた。細胞がいったん付けば、インサートは供与体１／供与体２（上と同じ供与体）からのＰＢＬ集団の共存培養を含む２４ウェルプレートに移した（ｎ＝３）。リンパ球細胞数は６日間、毎日カウントし、そして自己由来および同種異系対照とＶｉＣｅｌｌ−ＸＲ（商標）を使用して比較した。
【００４５】
リンパ球活性化
免疫学的寛容アッセイおよび２方向ＭＬＣの両方は、前述したように行った。このアッセイの終点は活性化されたリンパ球のマーカーであるＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）（ベクトン
デッキンソン、＃５５５４３１）の存在に関するリンパ球のフローサイトメトリーによる分析であった。このアッセイを６日にわたり行ってＨＵＣＰＶＣがリンパ球の活性化の上昇または減少を引き起こすかどうかを決定した。またリンパ球はＣＤ４５で同時染色して、適性な細胞集団が得られることを確認した。陰性対照はＨＵＣＰＶＣを加えないリンパ球カルチャーであり、そして染色しなかった。
【００４６】
活性化Ｔ細胞株の生成
ＰＢＬは供与体１および２から前記のように抽出し、そしてＦｉｃｏｌｌ勾配を使用して分離した。細胞をカウントし、そして供与体２からの細胞をＭＭＣで休止させた。供与体１からの１０６細胞を２４ウェルプレートにまき、そして１：１の比の供与体２からの休止ＰＢＬで刺激した。細胞に２ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地を供給し（以前のように１０％血清および１０％補充物を補給した）、そして活性化させた。培地はその色が黄色になったと気づいた時に交換した（〜３日）。〜１１日後（または培地の色が３日以内で変わった時）、細胞を回収し、そしてカウントした。それらはウェルあたり１０６で再度まき、そして１：１の比の供与体２に由来する休止ＰＢＬで再刺激した。第２の刺激で、ＩＬ−２を１００Ｕ／ｍＬの濃度で加え（ＢＤバイオサイエンス＃３５４０４３）、２日毎に供給した。培地が３日前に黄色に変わった時、細胞を回収し、カウントし、そして分
離（ｓｐｌｉｔ）した。この手順後、細胞は供与体２に対する特異的抗体を用いて活性化Ｔリンパ球（ＡＴＬ）として使用される準備ができた。ＰＢＬ共存培養および２方向ＭＬＣは前記のように行い、そして細胞の増殖およびＣＤ２５の発現についてアッセイした。
【００４７】
リンパ球標識
２つのリンパ球集団間の差異を視覚化し、そして定量するために、ＰＫＨ２６（シグマ＃ＰＫＨ２６−ＧＬ）を使用した。ＰＨＫ２６は長い半減期（〜１００日）を持つ非細胞傷害性膜染料である。細胞は製品に提供されたプロトコールにより染色した：リンパ球はトリプシン処理し、プールし、そしてペレット化した；次いで希釈した染料を細胞懸濁液に２〜５分間加えた（２ｍＬの２ｘ１０−６モルＰＨＫ２６溶液）。染色後、等容量の血清を反応を止めるために加えた；細胞を培地に懸濁し、遠心して落とし、そして数回洗浄した。次いで染色は蛍光顕微鏡で視覚化して、適切な染料の取り込みが生じたことを確認した。染色に使用した細胞は供与体１から得たＡＴＬであった；これらの赤血球をＭＬＣ中に供与体２からの非染色細胞、およびＨＵＣＰＶＣと含んだ。アッセイの終点は、ＰＨＫ２６の存在または不存在で振り分ける（ｇａｔｅｄ）ＣＤ４５（ＢＤ＃５５５４８２）およびＣＤ２５に関するフローサイトメトリーであった。陰性対照は非染色細胞、およびＨＵＣＰＶＣを含まないＭＬＣであった。
【００４８】
トランスフェクション
最初に２９３細胞を所望のＤＮＡおよびプラスミド（ベクターＤＮＡ、１０μｇのｇａｇ／ｐｏｌ発現プラスミド、１０μｇのｒｅｖ発現プラスミド、１０μｇのｔａｔ発現プラスミド、５μｇのＶＳＶ−Ｇ発現プラスミド、２．５ＭのＣａＣｌ２で）でトランスフェクトした。これらを一晩インキュベーションし、その後、培地を交換する。次いで細胞をこの培地中に３日以上おいた後、細胞上清を集め、そして濾過する。次いでウイルス上清を超遠心（５００００ｇで９０分）またはＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒデバイス（１００，０００ＭＷＣＯ；ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））により濃縮する。この工程が完了した時、ウイルス上清はＨＵＣＰＶＣと濃縮したウイルスを滴定することにより決定された濃度で合わせることができ、そして一晩インキュベーションする。翌日、さらに培地を加え、そして細胞を６時間以上インキュベーションした後に培地を交換する。この様式でＨＵＣＰＶＣは、有害免疫反応を管理するために有用なタンパク質（免疫抑制タンパク質）を含む任意のタンパク質をコードする導入遺伝子を導入し、そして発現するように工作され得る。そのようなタンパク質にはＣＴＬＡ４、ＶＣＰ、ＰＬＩＦ、ＬＳＦ−１、Ｎｉｐ、ＣＤ２００およびＵｒｏｍｏｄｕｌｉｎがある。
【００４９】
マイクロアレイ分析
Ｏｌｉｇｏ  ＧＥＡｒｒａｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（スーパーアレイ  バイオサイエンス（Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、フレデリック、メリーランド州、Ｃａｔ＃：ＯＨＳ−８０２）を使用して、ガンの進行中に頻繁に変化する代表的な幾つかの異なる経路の遺伝子の発現に変化を見いだした。ヒトのガンに関するＯｌｉｇｏ  ＧＥＡｒｒａｙは、４４０の代表的なガン遺伝子を有し、そしてアポトーシス、細胞サイクル、細胞成長および分化、シグナル伝達および他のガン関連遺伝子を含む機能的遺伝子のグループに組織化されている。
【００５０】
ＨＵＣＰＶＣおよびヒト骨髄由来ＭＳＣを２継代まで成長させ、そしてＲＮＡをこれらの細胞から単離した。精製したＲＮＡは製造元のプロトコール（スーパーアレイ  バイオサイエンス社）に従い処理し、そしてＯｌｉｇｏ  ＧＥＡｒｒａｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙにハイブリダイズさせた。Ｏｌｉｇｏ  ＧＥＡｒｒａｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙは、正常ヒト骨髄由来ＭＳＣに比べてＨＵＣＰＶＣ中でガンに関連する遺伝子の示差的発現を測定するために使用した。
【００５１】
結果
マイトマイシンＣはＨＵＣＰＶＣに対する効果的な抗増殖剤である
ＨＵＣＰＶＣをある範囲の濃度のＭＭＣで３７℃にて２０分間処理した（５％ＣＯ２）。図１は、ＭＭＣ処置から１週間後のカルチャー中のＨＵＣＰＶＣの細胞数を示す（ｎ＝２）。すべての細胞が対照に比べて増殖に顕著な減少を示し（ｐ＜０．００１）、処置間で差異はない。したがって２０μｇ／ｍＬを文献に従い選択した。図２は、未処理ウェルに対してＭＭＣで処理し、そして洗浄したウェルにまいた細胞の効果の欠如を具体的に説明する（ｎ＝２、ｐ＝０．１６）。したがってＭＭＣはＭＭＣで前以て処理したウェルで得られた実験の結果には効果がないだろう。本明細書に提示するすべての統計は、Ｒ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇを介した平均を比較するためにＡＮＯＶＡを使用して得た。
【００５２】
ＨＵＣＰＶＣはリンパ球により外来とは認識されない
ＨＵＣＰＶＣ集団とリンパ球（供与体１）とのコーインキュベーションで、アネキシン５平均蛍光強度（ＭＦＩ）により測定されるように、１０％のＨＵＣＰＶＣ：ＰＢＬ（ｎ＝５、ｐ＝０．０１）の集団で、ＨＵＣＰＶＣ死に統計的に有意な上昇があった。図３はこの上昇した細胞死が１０％より高いＨＵＣＰＶＣ用量では記録されず、すなわち正しい比率では、ＨＵＣＰＶＣはミスマッチのリンパ球により攻撃されないことを示す。これはＢｒｄＵ  ＭＦＩ（ｐ＝０．０２）により測定される時、１０％ＨＵＣＰＶＣ：ＰＢＬに応答してリンパ球が増殖するが、より高いＨＵＣＰＶＣ濃度では増殖しないことが分かるリンパ球増殖アッセイを使用して確認された（図４）。ＴおよびＢリンパ球の両方の分割が活性化カスケードで起こるので、リンパ球の増殖は活性化の標準的尺度である。したがって、より低い比率でＨＵＣＰＶＣは十分な存在を提供しないので、それらの免疫学的回避能が実現される。しかしより高濃度（２０〜４０％）では、ＰＢＬは増殖せず、そしてＨＵＣＰＶＣは殺されない。
【００５３】
またＨＵＣＰＶＣは、休止ＰＢＬまたはＡＴＬとの共存培養に含まれた時にそれらがリンパ球細胞数に及ぼす効果についても分析された。両方の場合で、ＨＵＣＰＶＣは対照細胞数を超える有意な増加を生じず（ＰＢＬ：３５．２±３．１ｘ１０３、＋１０％ＨＵＣＰＶＣ４５．０±５．７ｘ１０３；ＡＴＬ：３８．８±１８．２ｘ１０３、＋１０％ＨＵＣＰＶＣ４０．８±４．８ｘ１０３）、休止または刺激条件のいずれにおいてもそれらの免疫学的寛容を示す（図７）。
【００５４】
ＨＵＣＰＶＣは１方向ＭＬＣにおいて１０、２０、３０および４０％のＰＢＬ集団中に含まれ、そしてそれらの増殖を６日後のＢｒｄＵ発現で評価した。図８は含まれるＨＵＣＰＶＣの比率にかかわらず増殖している細胞数に有意な増加が無いことを示す。
【００５５】
ＨＵＣＰＶＣは免疫調節物質である
図５は６日目に同種異系の共存培養リンパ球の数が上昇したにとを示し、一方ＨＵＣＰＶＣを含むすべてのカルチャーでは；それらが加えられた時または加えられた比率にかかわらず、対照よりも有意に低いリンパ球の細胞カウントを有したことを示す（ｎ＝３）。
【００５６】
ＨＵＣＰＶＣは可溶性因子を介してそれらの作用を発揮することができる
ＴｒａｎｓＷｅｌｌ（商標）インサートは、２方向ＭＬＣでＰＢＬからＨＵＣＰＶＣを分離するために使用した。対照と比べたリンパ球数の有意な減少は、１０％または４０％ＨＵＣＰＶＣを用いたいずれの日にも見られなかった（ｎ＝３）（図６）。しかしサンプル数が増えると、１０％ＨＵＣＰＶＣの添加は対照に比べて６日間の培養期間にわたりリンパ球細胞の数に有意な減少を示した（ＭＬＣ：４０．７±３２．９ｘ１０３細胞、１０％ＨＵＣＰＶＣな２１．３±１４．７ｘ１０３細胞）（図９）。ゆえに因子（１もしくは
複数）はＨＵＣＰＶＣの免疫調節に貢献できるが、どの因子（１もしくは複数）が、およびそれらがどのようにリンパ球に影響するかは未だ不明である。
【００５７】
ＨＵＣＰＶＣはリンパ球の活性化状態を下げる
ＰＫＨ２６で染色したＡＴＬを、１０％ＨＵＣＰＶＣとの共存培養に加え、そしてそれらのＣＤ２５（ＩＬ−２５受容体）（リンパ球活性化のマーカー）の発現についてアッセイした。ＨＵＣＰＶＣの包含で、ＣＤ２５を発現している細胞の割合（対照：１００％±０、１０％ＨＵＣＰＶＣ：９６．９％±０．７）、および平均蛍光強度（対照：２８．６±０．１、１０％ＨＵＣＰＶＣ：３．７６％±０．１）の両方が有意に低下した（図１０）。すなわちＨＵＣＰＶＣはリンパ球の活性化状態を下げることにより活性化リンパ球に対する身体的効果を有する。
【００５８】
さらにＨＵＣＰＶＣはリンパ球のＣＤ４５の発現を下げ、割合（対照：１００％±０、１０％ＨＵＣＰＶＣ：９９．６％±０．１、４０％ＨＵＣＰＶＣ：９８．４％±０．３６）、および平均蛍光強度（対照：２８．２０±４．２４、１０％ＨＵＣＰＶＣ：１６．３３±１．２７、４０％ＨＵＣＰＶＣ：１４．７０±１．２２）の両方が有意に異なった（ｐ＜０．０５）（図１１）。これらの結果はＣＤ４５がすべてのリンパ球上で発現するので予測されなかった。しかしこれはＣＤ４５がリンパ球の発生および機能に決定的であると分かっており３６、さらにＨＵＣＰＶＣの添加によるリンパ球の低下した機能のさらなる表示かもしれない。
【００５９】
トランスフェクション
ＨＵＣＰＶＣはＧＦＰにより成功裏にトランスフェクトされ、そして細胞は高レベルのプロテインＡを発現した。９７％のトランスフェクション効率が達成され（図１２）、良好な増殖率が維持された。この成功率は細胞をトランスフェクトした継代に従い変動する。このように機能するトランスフェクションプロトコールを用いて細胞を任意のタンパク質でトランスフェクトし、そしてそれを構成的に発現させることが可能である。
【００６０】
マイクロアレイ分析
ＨＵＣＰＶＣは検出可能なレベルの腫瘍形成に関連する遺伝子を発現しない。遺伝子アレイ分析はヒトのガンに関連する機能的遺伝子の不存在をもたらし、そしては輸入されたことが既知の遺伝子（例えば細胞サイクルの調節ではサイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、ＣＣＮＤ２およびＣＣＮＤ３のような）を発現した（図１３）。
【００６１】
考察
ここで記載したことは骨髄以外の供給源であるヒト臍帯に由来するＭＳＣ集団のインビトロでの免疫学的寛容および免疫調節性である。ＨＵＣＰＶＣは、帯の脈管周囲領域が細胞の最も迅速に増殖している集団であると考えられるので、そこから抽出される。以前には臍帯静脈の壁に由来する内皮細胞がリンパ球をインビトロで刺激することが示された３７。これは報告する結果とは全く対照的で、そしてＨＵＣＰＶＣが異なる領域から回収されることを強要する。
【００６２】
このようにＨＵＣＰＶＣは特に臨床的使用によく適するが、対宿主性移植片病の発症および／または重篤度を下げ、そして宿主による移植片拒絶を下げ、または排除し、そして混合リンパ球反応の抑制から利益を受ける他の免疫媒介傷害の処置に適するだけではない。さらに目的のタンパク質／酵素の遺伝子を含むためにトランスフェクションにより操作される場合、ＨＵＣＰＶＣはこの産物を構成的に生産することもでき、すなわちタンパク質／酵素不全症が患者に有害な効果をもたらす状態の処置に、特に拒絶なしにミスマッチの患者においてそれらを同種異系的に使用できるので有用である。加えてＨＵＣＰＶＣは必要な遺伝子でトランスフェクションした後に目的のワクチンを生成するためにも使用す
ることができる。
【００６３】
前駆細胞は、それらの成長環境により規定された様々な間葉系組織に経時的に拡大そして分化する傾向を有するので、他の間葉系前駆細胞または幹細胞のようにＨＵＣＰＶＣはそれらのインビボでの成長および分化が制御されないという危険性を持つかもしれない。注目すべきは、ＨＵＣＰＶＣの臨床的使用のさらなる利点として、ＨＵＣＰＶＣは極端に低いテロメラーゼ活性（腫瘍形成性に関するそれらの傾向の指標）を現すことが決定された。さらにＨＵＣＰＶＣは腫瘍形成性の太鼓判が押される多くの遺伝子マーカーを欠いている。腫瘍形成は生物学的経路を統制解除し、細胞の抑制されていない成長および分割を引き起こし、アポトーシス（プログラムされた細胞死）を回避し、増殖因子に異常に応答し、血液供給を受け（脈管形成）、そして１つの場所から別の場所へ移動する（転移および侵襲性）突然変異により起こる。多くの遺伝子がこれらの各制御メカニズムに関与し、そしてそれらの１つの突然変異が統制解除を引き起こす可能性がある。
【００６４】
以下の参考文献は引用により全部、本明細書に編入する：
【００６５】
【表１】
0005431146.tif 000002
【００６６】
【表２】
0005431146.tif 000003
【００６７】
【表３】
0005431146.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】ＭＭＣ処理後のカルチャー中、７日後のＨＵＣＰＶＣの細胞カウント（ｎ＝２）。細胞はＭＭＣ濃度を上げながら５％ＣＯ２で３７℃にて２０分間処理し、そしてそれらの増殖をアッセイした。すべてが対照よりも有意に低いと思われる（ｐ＜０．００１）。
【図２】ＭＭＣで処理した、および未処理のウェルにまいた細胞の増殖。増殖はＢｒｄＵについてフローサイトメトリーを使用して測定し、そして平均蛍光強度を使用して定量した。これらには処理と未処理ウェルとの間に有意な差異が無かった（ｐ＝０．６２）。
【図３】ＨＵＣＰＶＣ死を、供与体１に由来するＰＢＬとのコーインキュベーションから４時間後、初期細胞死マーカーであるアネキシン５について平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して測定した（ｎ＝５）。対照に比べて１０％ＨＵＣＰＶＣを含むカルチャーでの平均アネキシン５発現に有意な上昇があった（ｐ＝０．０１、＊により示す）；これはわずかに有意な上昇であった。
【図４】リンパ球の増殖は、ＨＵＣＰＶＣのレベルを変動させたコーインキュベーションの６日後にＢｒｄＵについて平均蛍光強度を使用して測定した（ｎ＝５）。対照に比べて１０％ＨＵＣＰＶＣを含むカルチャーでの平均ＢｒｄＵ発現に有意な上昇があった（ｐ＝０．０２、＊により示す）。
【図５】総リンパ球細胞数を１日目から６日目まで、１０および４０％ＨＵＣＰＶＣを０、３または５日目に加えた処置にわたり測定した（ｎ＝３）。６日までに、対照リンパ球の数は互いに応答して増加したが、ＨＵＣＰＶＣでの処置は加えた割合および日にかかわらず有意に低かった（ｐ＜０．０５、＊により示す）。
【図６】総リンパ球カウントを１日目から６日目まで、１０および４０％ＨＵＣＰＶＣをＴｒａｎｓＷｅｌｌ（商標）インサートに加えた処置にわたり測定した（ｎ＝３）。いかなる日にも同種対照とＨＵＣＰＶＣ処置との間に有意な差異が無いことがわかる。
【図７】ＨＵＣＰＶＣは休止または活性化リンパ球細胞数を増加しない。ＨＵＣＰＶＣの添加はカルチャー中６日間にわたり対照に比べてリンパ球細胞数に有意な増加がないことを示した（ｎ＝６）。この図は平均細胞数、＋標準偏差を示す。
【図８】フローサイトメトリーで測定したＨＵＣＰＶＣを含むコーカルチャー中のＰＢＬのＢｒｄＵ発現。細胞分割の割合は、用量にかかわらずＨＵＣＰＶＣの添加で増加しない（ｎ＝３）。対照はＨＵＣＰＶＣなしでのＰＢＬのＢｒｄＵ発現であった。
【図９】ＨＵＣＰＶＣは可溶性因子を介して作用する。ＨＵＣＰＶＣは、ＴｒａｎｓＷｅｌｌインサートを使用して分離した時、ＭＬＣでリンパ球細胞数を有意に減少することができる。図では平均対照リンパ球細胞数を１００％に設定し、実験間のカウントにおける変動を減らした。この図はリンパ球細胞カウントの平均パーセント、＋標準偏差を示す（ｎ＝６）（ｐ＊＜０．０５）。
【図１０】ＨＵＣＰＶＣは活性化リンパ球のコーカルチャー中、ＣＤ２５発現を下げる。この図面は、１０％ＨＵＣＰＶＣと、またはそれを含まず共存培養したリンパ球上のＣＤ２５発現の発現の平均パーセント（棒）および平均蛍光強度（線）の両方を具体的に説明する。リンパ球はＰＫＨ２６で染色して確実に集団の適切な検出を行い、そして結果はＰＫＨ２６発現で分けた。平均は±標準偏差（ｎ＝３）。（＊ｐ＜０．０５）
【図１１】ＨＵＣＰＶＣを用いた１方向ＭＬＣにおけるＣＤ４５の発現（活性化リンパ球での）。活性化リンパ球はＰＨＫ２６で染色して不活性集団からそれらを線引きし（ｄｅｌｉｎｅａｔｅ）、そして結果をＰＫＨ２６発現で分ける。発現のパーセント（棒＊ｐ＜０．０５）およびＭＦＩ（線＋ｐ＜０．０５）の両方を示す（ｎ＝３）。対照はＨＵＣＰＶＣを含まないＡＴＬのＣＤ４５発現であった。
【図１２】（Ａ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）でトランスフェクトしたＨＵＣＰＶＣ、９７．８９％の発現レベルであった（Ｂ）。これらの細胞はレンチウイルスベクターで確立された技術の使用してトランスフェクトされた。および
【図１３】骨髄由来ＭＳＣ（Ａ）およびＨＵＣＰＶＣ（Ｂ）に関する高処理Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｈｆｉｎｄｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｒｒａｙの結果。括弧内の遺伝子は存在しないそれら遺伝子を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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