(57)【要約】本発明は、植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードする核酸を発現可能に含む早生化形質転換植物を提供する。
2008020645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質
をコードする核酸を発現可能に含む、早生化形質転換植物。
【請求項２】
前記核酸が、
（ｄ）配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｅ）配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は
（ｇ）配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、請求項１に記載の形質転換植物。
【請求項３】
前記植物が、双子葉植物又は単子葉植物である、請求項１に記載の形質転換植物。
【請求項４】
前記核酸が、植物ゲノムに組み込まれている、請求項１に記載の形質転換植物。
【請求項５】
前記タンパク質が、野生型と比べて植物体のサイズを増加させる活性をさらに有する、請求項１に記載の形質転換植物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換植物由来の組織、細胞又は種子。
【請求項７】
請求項１又は２に定義した核酸を植物の組織又は細胞に導入して植物体を再生することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の早生化形質転換植物を作製する方法。
【請求項８】
前記核酸が、それを含む組換えベクターを用いて導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換植物において、請求項１又は２に定義した核酸を過剰発現させて早生化を誘導することを含む、植物の早生化方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の形質転換植物において、請求項１又は２に定義した核酸を過剰発現させて、野生型と比べて植物体のサイズの増加を誘導することを含む、植物のサイズ増加方法。
【請求項１１】
請求項１に定義したタンパク質を土壌または植物体に施用して早生化を誘導することを含む、植物の早生化方法。
【請求項１２】
請求項１に定義したタンパク質を土壌または植物体に施用して、野生型と比べて植物体のサイズの増加を誘導することを含む、植物のサイズ増加方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、早生化形質転換植物、その作製方法及び植物の早生化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、遺伝子の機能を解析するための方法の１つに、Ｔ−ＤＮＡ内に組み込まれた転写エンハンサー配列を利用して、植物遺伝子の転写を活性化した突然変異体を作製し、その転写活性化された遺伝子のクローニングをする、アクティベーションタギング法が用いられている（非特許文献１）。この方法を用いて、側根形成抑制遺伝子が見出されている（特許文献１）。
しかし、アクティベーションタギング法を網羅的な遺伝子機能の解析（ゲノムに存在する遺伝子の機能をまとめて解析すること）に用いるには問題があった。例えば、シロイヌナズナのようなモデル植物では、１０Ｋｂのゲノム領域の中に平均２個以上の遺伝子が存在するが、アクティベーションタギング法では、タグ内のアクチベータとしてエンハンサー配列が用いられており、転写活性化可能なゲノム領域は挿入部位前後５Ｋｂにも及ぶため、エンハンサーによる遺伝子活性化の効果が１つの遺伝子に限定されず、複数の遺伝子の転写が活性化され、複合表現型が生じていた（非特許文献２）。
この問題を避けるため、本発明者らは、「Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）」と命名した手法を開発した（特許文献２）。Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍとは、強発現させる遺伝子ソースとして完全長ｃＤＮＡライブラリーを用い、これを混合物のまま強発現型のＴ−ＤＮＡベクターを有するアグロバクテリウムを介して植物に遺伝子導入し、得られたＴ１種子を播種し、表現型のスクリーニングを行う方法である。興味深い表現型が現れた場合、その系統に挿入されていた完全長ｃＤＮＡをＰＣＲ及びシーケンスによって調べ、原因遺伝子を同定する。
Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍの利点として、例えば、（ｉ）完全長ｃＤＮＡライブラリーは、遺伝子が機能するときに必要な全アミノ酸情報を含むため、導入する遺伝子が本来有する全機能を発揮することができ、従って通常のｃＤＮＡライブラリーに比べ、機能発現の効率がはるかに高いこと、また全てのｃＤＮＡ断片が本来の開始コドン及び停止コドン情報を備えているため、発現のためのタンパク質融合化などの必要がなく、タンパク質発現効率が高いこと、（ｉｉ）何億クローンものライブラリーに感染させても１植物には１〜２クローンしか導入されないので、形質転換植物体には別々のクローンが導入され、ｃＤＮＡの単離と表現形質の確認は２回程度で少なくてすむこと、（ｉｉｉ）従来のｃＤＮＡライブラリーでは、全てのｍＲＮＡ分子がそのままの量比でｃＤＮＡ分子に置き換わるため、発現量の多い構造タンパク質遺伝子群や通常は発現量の少ない情報伝達関連遺伝子群などの各ｃＤＮＡ存在比が発現量によって大きく異なっているが、Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍのライブラリーでは、遺伝子の発現量にかかわらず全てのクローンが同一の割合で含まれる「標準化」されたライブラリーを使用でき、ゲノムをタギングするときよりも高効率で別種遺伝子の機能検定を行うことができること（但し、シロイヌナズナやイネなど標準化完全長ｃＤＮＡが整備されつつあるものはそれを利用してもよい。また、構造タンパク質等の発現量の多いタンパク質の機能を解析したい場合は、標準化されていない通常の完全長ｃＤＮＡライブラリーを利用してもよい。）、（ｉｖ）完全長ｃＤＮＡを含んだ植物集団を一度全て揃えるという「ライン化」をすることなく、ライブラリー内の全ての遺伝子機能検索をひとまとめに行えるので、簡単に目的の変異体を得ることができ、わずかな労力で特定の性質を付与する遺伝子（本来その遺伝子が有している機能であるか否かを問わない）のスクリーニングを行うことができる、などが挙げられる。
植物の早生化については、例えば非特許文献３、４に以下のように報告されている。
少なくともモデル植物シロイヌナズナにおいては、ＦＴと呼ばれる遺伝子が葉において活性化されると、そのｍＲＮＡが師部を移動して茎頂に花芽を誘導する。そのため、この遺伝子を異所的に強発現させると花芽を早く誘導させることができる。しかし、その誘導のためには形質転換による遺伝子導入についで、細胞内における遺伝子発現が必要なため、組換体の作成が必要になるのと、当該遺伝子を発現させる時期、すなわち花成を誘導する時期をコントロールすることが困難である。
【特許文献１】特開２００２−０１０７８６号公報
【特許文献２】再公表２００３／０１８８０８号公報
【非特許文献１】Ｗａｌｄｅｎ，Ｒら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，１９９４，２６（５）：ｐ．１５２１−８
【非特許文献２】Ｉｃｈｉｋａｗａら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ，２００３，３６：ｐ．４２１−４２９
【非特許文献３】Ｈｅａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００５，３０９，ｐｐ１６９４−１６９６
【非特許文献４】Ｈａｎｚａｗａら、ＰＮＡＳ  ２００５，１０２，ｐｐ７７４８−７７５３
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、植物早生化遺伝子を見出し、その遺伝子を形質転換した植物を提供することを目的とする。
本発明者らは、前記Ｆｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いて、約１５，０００のシロイヌナズナの形質転換体系統を作製し、その突然変異表現型系統を観察したところ、早生化を示す形態学的変異体を見出し、その変異の原因となる遺伝子を単離することに成功し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕  （ａ）配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸配列を含むタンパク質、
（ｂ）配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質、又は
（ｃ）配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質
をコードする核酸を発現可能に含む、早生化形質転換植物。
〔２〕  前記核酸が、
（ｄ）配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｅ）配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｆ）配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は
（ｇ）配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
を含む、〔１〕に記載の形質転換植物。
〔３〕  前記植物が、双子葉植物又は単子葉植物である、〔１〕に記載の形質転換植物。
〔４〕  前記核酸が、植物ゲノムに組み込まれている、〔１〕に記載の形質転換植物。
〔５〕  前記タンパク質が、野生型と比べて植物体のサイズを増加させる活性をさらに有する、〔１〕に記載の形質転換植物。
〔６〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の形質転換植物由来の組織、細胞又は種子。
〔７〕  〔１〕又は〔２〕に定義した核酸を植物の組織又は細胞に導入して植物体を再生することを含む、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の早生化形質転換植物を作製する方法。
〔８〕  前記核酸が、それを含む組換えベクターを用いて導入される、〔７〕に記載の方法。
〔９〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の形質転換植物において、〔１〕又は〔２〕に定義した核酸を過剰発現させて早生化を誘導することを含む、植物の早生化方法。
〔１０〕  〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の形質転換植物において、〔１〕又は〔２〕に定義した核酸を過剰発現させて、野生型と比べて植物体のサイズの増加を誘導することを含む、植物のサイズ増加方法。
〔１１〕  〔１〕に定義したタンパク質を土壌または植物体に施用して早生化を誘導することを含む、植物の早生化方法。
〔１２〕  〔１〕に定義したタンパク質を土壌または植物体に施用して、野生型と比べて植物体のサイズの増加を誘導することを含む、植物のサイズ増加方法。
本明細書中で使用する用語「核酸」は、ＤＮＡまたはＲＮＡを指し、例えば遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ及びそれらの化学修飾体を含む。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−２２１０６１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１（ａ）は、完全長ｃＤＮＡを導入したバイナリーベクター構築物を示す。図１（ｂ）は、増幅ｃＤＮＡの電気泳動像を示す。図１（ｃ）は、ＲＡＦＬ  ｃＤＮＡのサイズ分布を示す。
図２は、シロイヌナズナでの腫瘍遺伝子の高発現表現型又は野生型の表現型を示す。図２（ａ）は、同じ期間成長させた、ｉａａＭ  高発現植物と野生型（ＷＴ）植物を比較したものである。図２（ｂ）は、ｉａａＭ  高発現植物の写真である。図２（ｃ）は、ｔｍｓ１高発現植物の写真である。
図３（ａ）〜（ｄ）は、Ｆ０３０２４系統の表現型を示す。図３（ｅ）〜（ｆ）は、Ｆ０１９０７系統の表現型を示す。図３（ｇ）は、各系統の葉緑素量を示す。図３（ｈ）は、各系統の光合成活性を示す。
図４は、ＲＴ−ＰＣＲで増幅した遺伝子の電気泳動像を示す。図４（ａ）において、１９及び２１はＡｔＰＤＨ１に特異的なＰＣＲフラグメントである。チューブリンは、内部標準遺伝子として使用したβ−チューブリンＰＣＲフラグメントである。レーン１及び２：野生型Ｃｏｌｕｍｂｉａ植物、レーン３及び４：薄緑色の表現型を示すＴ２世代のＦ０３０２４植物。図４（ｂ）において、上のバンドはＡｔ３ｇ５５２４０に特異的なＰＣＲ断片、下のバンドはローディング調整に使用したＡＨＡ１  ＰＣＲ断片（ＡＨＡ１：シロイヌナズナ形質膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）を示す。図４（ｃ）において、上のバンドはＲＴ−ＰＣＲで増幅（サイクル数４０）したＡｔ３ｇ５５２４０に特異なＰＣＲ断片（ｐ０１９０７）であり、下のバンドはＲＴ−ＰＣＲで増幅（サイクル数２８）で増幅したローディング調整に使用したＡＨＡ１（シロイヌナズナ形質膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）のＰＣＲ断片である。
図５（ａ）は、Ｆ０１９０７系統の相対的発現レベルを示す。図５（ｂ）は、Ｆ０１９０７系統の相対的葉緑素量を示す。図５（ｃ）は、Ｆ０１９０７系統のロゼット葉の数を示す。図５（ｄ）は、Ｆ０１９０７系統の表現型を示す。
図６はＡＴ３Ｇ５５２４０タンパク質とその類縁（関連）タンパク質のアラインメントを示す。ＡＴ３Ｇ５５２４０、ＡＴ３Ｇ２８９９０及びＡＴ５Ｇ０２５８０はシロイヌナズナのタンパク質であり、ＯＳ０１Ｇ０８３７６００（旧名称：Ｐ００３１Ｄ１１．２）はイネＥＳＴのタンパク質である。
図７は、ＡＴ３Ｇ５５２４０タンパク質とその類縁（関連）タンパク質の系統樹を示す。ＡＴ３Ｇ５５２４０、ＡＴ３Ｇ２８９９０及びＡＴ５Ｇ０２５８０はシロイヌナズナのタンパク質であり、ＯＳ０１Ｇ０８３７６００（旧名称：Ｐ００３１Ｄ１１．２）はイネＥＳＴのタンパク質である。
図８は、Ｆ０１９０７系統等の葉肉細胞の電子顕微鏡像である。パネル１及び２は、野生型、パネル３及び４は、Ａｔ１ｇ７００７０形質転換植物、パネル５及び６は、Ａｔ３ｇ５５２４０形質転換植物の葉肉細胞の電子顕微鏡像をそれぞれ示す。
図９（ａ）は、ＧＦＰを発現するシロイヌナズナ培養細胞の蛍光顕微鏡像を示す。図９（ｂ）は、キメラＮ９８−ＧＦＰタンパク質を発現するシロイヌナズナ培養細胞の蛍光顕微鏡像を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
１．植物早生化遺伝子の単離
植物早生化遺伝子は、例えば、シロイヌナズナを用いたＦｏｘ  ｈｕｎｔｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍにより取得できる。しかし、以下の手法はシロイヌナズナに限定されず、他の植物（特に被子植物）にも適用可能である。
具体的には、以下の手順で行うことができる。
（１）完全長ｃＤＮＡ及び内部標準遺伝子を含むｃＤＮＡ混合物の作製
完全長ｃＤＮＡとは、ある遺伝子から転写されたｍＲＮＡと同じ配列（但しＵ→Ｔ）を持つＤＮＡ、すなわちｍＲＮＡの完全なコピーを意味し、得られたｃＤＮＡよりも長いｃＤＮＡが存在する場合でも完全長ｃＤＮＡに含めることができる。
完全長ｃＤＮＡは、当業者に公知の方法により、目的のｍＲＮＡから調製することができる。例えば、シロイヌナズナに由来するｍＲＮＡから、Ｃａｐ−ｔｒａｐｐｅｒ法（Ｃａｒｎｉｎｃｉ，Ｐ．，ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１９９６．３７（３）：Ｐ．３２７−３６）、Ｃａｐ−ｆｉｎｄｅｒ法（Ｚｈａｏ，Ｚ．，ら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９９．７３（１）：ｐ．３５−４１）等の手法で調製することができる。また、全ゲノムｃＤＮＡの配列決定がされている、独立行政法人理化学研究所（和光市、日本）のシロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡコレクションを用いてもよい。
完全長ｃＤＮＡをクローニングするためのベクターとしては、例えばＳｆｉＩのような、８塩基以上を認識し、かつ挿入ＤＮＡの方向を一方向に規定できる制限酵素部位を、ｃＤＮＡ挿入部位の両側に持つものを用いるのが好ましい。
当業者に公知の手法を利用して、前記完全長ｃＤＮＡを担持する完全長ｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。ライブラリーを調製するためのベクターとして、例えばＬａｍｂｄａ  Ｚａｐ  ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ  ＦＬＣ−１−Ｂ、ｐＴＡＳ、ｐＢＩＧなどが挙げられる。
また、後に表現型をスクリーニングするための内部標準として、例えば細菌由来の腫瘍遺伝子（ｔｍｓ１、ｉａａＭ、ｒｏｌＢ、ｔｍｒ等）を用いてもよい。ｔｍｓ１及びｉａａＭは、それぞれ、シュードモナス・シリンゲ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）、アグロバクテリウム・チューメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のトリプトファン２−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子であり、高発現するとオーキシンが多量に生産される。ｒｏｌＢは、アグロバクテリウム・リゾゲネシス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｙｚｏｇｅｎｅｓｉｓ）由来のオーキシン感受性に関係する遺伝子である。ｔｍｒは、アグロバクテリウム・チューメファシエンス由来のサイトカイニン生合成で働く遺伝子である。これらの腫瘍遺伝子は、多くの植物の形態に劇的な影響を与えることが知られている（Ｃａｓａｎｏｖａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｄｖ，２３，２００５，３−３９；Ｒｏｍａｎｏら，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２７，１９９５，１０７１−８３；Ｓｍａｒｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，３，１９９１，６４７−６５６）。腫瘍遺伝子は、ライブラリーｃＤＮＡの均一性の指標として使用できるが、シロイヌナズナに形質転換後は、これらの腫瘍遺伝子は第二世代において突然変異系統から排除される。これらの腫瘍遺伝子はＰＣＲで増幅できる。
（２）完全長ｃＤＮＡライブラリーの標準化
背景技術で述べたように、従来のｃＤＮＡライブラリーでは、遺伝子の発現量によって各ｃＤＮＡクローンの存在比が大きく異なる。そこで、遺伝子の発現量にかかわらず全てのクローンが同一の割合で含まれるようにライブラリーを作製する「標準化」を行うことが好ましい。
完全長ｃＤＮＡを、各クローンにつき等量ずつ混合すれば、標準化完全長ｃＤＮＡ混合物を得ることができる。これを行うには、合成された完全長ｃＤＮＡの５’末端配列と３’末端配列を決定（シングルパスシーケンス）して、重複の無い（末端部における一部の領域の配列が共通しない）完全長ｃＤＮＡクローンを選別し、これをデータベース化しておく。
標準化された完全長ｃＤＮＡライブラリーは、それぞれ互いに異なるｃＤＮＡを選別した上で等量ずつ混合したものであり、従来のｃＤＮＡライブラリーが有する分子種の不均一性はなく、全体的に均一である。従って、ゲノム遺伝子の多コピー遺伝子群をも考慮すると、ゲノムをタギングするときよりも公平に、すなわち高効率に、別種遺伝子の機能検定を行うことができる。
シロイヌナズナでは全ゲノムの５０％以上に相当する標準化完全長ｃＤＮＡが現在整備されており、本発明においては、これらの整備された標準化完全長ｃＤＮＡを使用することができる。
（３）発現ベクターへの完全長ｃＤＮＡのクローニング
得られた完全長ｃＤＮＡ又は標準化完全長ｃＤＮＡを、アグロバクテリウム・チューメファシエンスによる植物形質転換のためのＴ−ＤＮＡ発現ベクターにクローニングすることができる。Ｔ−ＤＮＡとは、双子葉植物の腫瘍であるクラウンゴールの病原細菌であるアグロバクテリウムの病原性株に見出されるＴｉプラスミドが有する特定領域であり、この細菌が植物に感染すると、Ｔ−ＤＮＡが植物細胞に転移し、ゲノムＤＮＡ中に組み込まれる。
このＴ−ＤＮＡの内部には、完全長ｃＤＮＡの発現を調節するための配列が含まれる。発現調節配列としては、植物細胞内で、恒常的に若しくは条件的に発現を引き起こすプロモーター配列と、ターミネーターが連結したカセットを組込むのが好ましい。好ましい恒常発現型プロモーター配列としては、カリフラワーモザイクウイルス（Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｖｉｒｕｓ）の３５Ｓプロモーター配列（Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１９８７．１５（４）：ｐ．１５４３−５８）が挙げられ、誘導型プロモーターとしてはグルココルチコイド誘導型プロモーター配列（Ａｏｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１９９７．１１（３）：ｐ．６０５−１２）、エストロゲン誘導型プロモーター配列（Ｚｕｏ，Ｊ  ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ，２０００．２４（２）：ｐ．２６５−２７３）などが挙げられる。本発明においては、これらのプロモーターを任意に組み合わせて（連結して）使用することも可能である。プロモーターの組合せは、恒常発現型又は誘導型同士でもよく、両者を組合せたものでもよい。
また、後の植物体選抜のために、例えばハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入してもよい。
前述の完全長ｃＤＮＡ又は標準化完全長ｃＤＮＡをそのプロモーター配列の下流にセンス方向、又はアンチセンス方向になるように、酵素反応により、例えばＴ４リガーゼを用いて挿入する。これにより、センス鎖を発現させた場合は、当該ｃＤＮＡをコードする遺伝子の過剰発現がもたらす表現形質の変化を、アンチセンス鎖を発現させた場合は、当該ｃＤＮＡをコードする遺伝子の過少発現がもたらす表現形質の変化を知ることができる。
（４）完全長ｃＤＮＡライブラリーの植物への導入
次に、前記完全長ｃＤＮＡ又は標準化完全長ｃＤＮＡ、あるいは腫瘍遺伝子が挿入されたＴ−ＤＮＡの集団（Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｏｒ  ｌｉｂｒａｒｙ；ＦＯＸ  ｌｉｂｒａｒｙ）を常法によりアグロバクテリウムに導入し、ライブラリーを作製した後、そのライブラリー中のｃＤＮＡを、アグロバクテリウムによる感染を介して、植物（例えばシロイヌナズナ）に導入（形質転換）する。
植物へのアグロバクテリウムの感染は、ディッピング法、フローラルディッピング法などを用いることができる。ディッピング法の場合は、植物体の束を、アグロバクテリウムが含まれる液体中に３０〜６０秒浸漬する。フローラルディッピング法の場合は、直接植物宿主の花芽を浸漬し、鉢をトレイに移し、覆いをして一晩湿度を保つ。翌日覆いを取り、植物をそのまま生育させて種子を収穫する。
（５）表現形質によるスクリーニング
アグロバクテリウムのＦＯＸライブラリーを用いてシロイヌナズナなどの植物を形質転換した形質転換植物（Ｔ０世代）から得られた種子を、例えばハイグロマイシンを含む培地に播種する。発芽約１週間以内に形質転換植物を選択することができるので、ハイグロマイシン耐性苗を選択するために更に培養する必要はない。選択された植物（Ｔ１世代）は土壌に移植し、種子を回収する。
（６）表現形質の再確認及び変異形質の原因となる遺伝子の同定
興味のある形質転換植物（例えば、他の形質転換植物と比較して植物体の伸長が早いもの、開花が早いもの等、早生に関係すると思われる形質を有する植物）からゲノムＤＮＡを抽出し、このＤＮＡから、Ｔ−ＤＮＡ中に含まれるプロモーター配列とターミネーター配列の近傍の塩基配列情報をもとにプライマーを設計し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、これらの転写制御領域に挟まれたｃＤＮＡを単離する。このｃＤＮＡを、再び前記と同様のプロモーター配列とターミネーター配列を持ったＴ−ＤＮＡに挿入し、これを、正常植物に再導入して、表現形質の再確認を行う。そして、ｃＤＮＡの配列決定を行うことにより、変異形質の原因となる遺伝子を同定することができる。
２．単離同定された早生化遺伝子
前記手法により単離同定された植物早生化遺伝子は、シロイヌナズナのＡｔ３ｇ５５２４０（系統名：Ｆ０１９０７）である。また、本発明において、早生化遺伝子には、Ａｔ３ｇ５５２４０と同等の植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードする、シロイヌナズナの遺伝子Ａｔ３ｇ２８９９０、Ａｔ５ｇ０２５８０、およびイネＥＳＴのＯｓ０１ｇ０８３７６００（旧名称：Ｐ００３１Ｄ１１．２）も含まれる。さらに、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質は、野生型と比べて植物体のサイズを増加させる活性を有する。
ここで、本発明において「植物体を早生化させる活性」とは、早生化遺伝子を発現させたときの植物体を、野生型よりも早く成長させる活性を意味する。また、「植物体を早生化させる活性を有する」とは、前記活性が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。このような早生化活性（又は早生化能力）を有する植物を、本明細書では早生化植物という。
また、本発明において「野生型と比べて植物体のサイズを増加させる活性」とは、対応する野生型植物と比べて、背丈などの植物体のサイズを大きくする活性を意味する。また、「野生型と比べて植物体のサイズを増加させる活性を有する」とは、前記活性が、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
Ａｔ３ｇ５５２４０  の塩基配列を配列番号１、アミノ酸配列を配列番号２に示す。Ａｔ３ｇ２８９９０  の塩基配列を配列番号３２、アミノ酸配列を配列番号３３に示す。Ａｔ５ｇ０２５８０  の塩基配列を配列番号３４、アミノ酸配列を配列番号３５に示す。Ｏｓ０１ｇ０８３７６００（旧名称：Ｐ００３１Ｄ１１．２）の塩基配列を配列番号３６、アミノ酸配列を配列番号３７に示す。
前記早生化遺伝子は、配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードする遺伝子でもよい。ここで「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３または２の整数をいう。例えば、配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸配列の１〜１０個、１〜８個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、付加あるいは置換してもよい。
また、前記アミノ酸配列に保存的アミノ酸置換が含まれてもよい。このような置換は、例えば、構造的又は電気的性質の類似するアミノ酸間で起こる。そのようなアミノ酸グループは、（１）酸性アミノ酸：アスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性アミノ酸：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性アミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；（４）非荷電極性アミノ酸：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン；及び（５）芳香族アミノ酸：フェニルアラニン、チロシントリプトファンを含む。
あるいは前記早生化遺伝子は、配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードする遺伝子でもよい。同一性は、７０％以上、好ましくは８０％以上、８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上である。ここで「％同一性」とは、整列させた２つのアミノ酸配列において、全アミノ酸数に対する同一アミノ酸数のパーセンテージをいう。％同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのホモロジー検索プログラムを用いて決定され得る。ホモロジー検索においてアラインメントはギャップを導入してあるいはギャップを導入しないで行うことができる。また、配列のデータベースとして、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬなどを利用することができる。
前記早生化遺伝子は、配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列を含むＤＮＡでもよい。
また前記早生化遺伝子は、配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでもよい。ここで「数個」とは、約１０、９、８、７、６、５、４、３または２の整数をいう。
あるいは、前記早生化遺伝子は、配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡであって、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでもよい。ここで「％同一性」とは、整列させた２つのヌクレオチド配列において、全ヌクレオチド数に対する同一ヌクレオチド数のパーセンテージをいう。％同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのホモロジー検索プログラムを用いて決定され得る。ホモロジー検索においてアラインメントはギャップを導入してあるいはギャップを導入しないで行うことができる。また、配列のデータベースとして、例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬなどを利用することができる。
さらにまた、前記早生化遺伝子は、配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ植物体を早生化させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡでもよい。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、約４５℃、５〜６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、その後の約５０〜約６５℃、０．１〜１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄が挙げられ、或いはそのような条件として、約６５〜約７０℃、１×ＳＳＣでのハイブリダイゼーション、その後の約６５〜約７０℃、０．３×ＳＳＣでの洗浄、を挙げることができる。
上記配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子、上記配列番号２、３３、３５又は３７に示すアミノ酸に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、上記配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列において１若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換もしくは付加された塩基配列を含むＤＮＡ、前記配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列に対して９０％以上の同一性を有する塩基配列を含むＤＮＡ、前記配列番号１、３２、３４又は３６に示す塩基配列を含むＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡは、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって作製することができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴａＫａＲａ社製、京都、日本）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴａＫａＲａ社製））などを用いて、あるいは、ＴａＫａＲａ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  シリーズキットを用いて変異が導入され得る。また、変異を導入したプライマーを用いるＰＣＲによる部位特異的変異導入法を用いてもよい（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｉｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）。
上記早生化遺伝子の塩基配列が一旦確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、早生化遺伝子を得ることができる。
上記早生化遺伝子と相同性の高い遺伝子として、例えば以下のＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のアクセッションナンバーで特定される遺伝子が挙げられる。このような遺伝子及びその改変体もまた、本発明の早生化形質転換植物を作製するために使用することができる。
イネ：ＸＭ＿４７５３７７．１
トウモロコシ：ＡＹ１０６９６２．１  ＧＩ：２１２１００４０
３．組換えベクター及び形質転換植物の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明に用いる組換えベクターは、前記早生化遺伝子を適当なベクターに挿入することによって作製できる。早生化遺伝子を植物細胞へ導入し、発現させるためのベクターとしては、ｐＢＩ系のベクター、ｐＵＣ系のベクター、ｐＴＲＡ系のベクターが好適に用いられる。ｐＢＩ系及びｐＴＲＡ系のベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる。ｐＢＩ系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３等が挙げられる。ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
ベクターに早生化遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
前記早生化遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、プロモーター、早生化遺伝子のほか、所望によりターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、５’−ＵＴＲ配列などを連結することができる。
「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。
「ターミネーター」は、前記プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよい。具体例としては、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、カリフラワーモザイクウイルスポリＡターミネーター等が挙げられる。
「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好適である。
「選択マーカー」は、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子等が挙げられる。
（２）早生化形質転換植物の作製
本発明の早生化形質転換植物は、前記早生化遺伝子又はそれを含む組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
本発明において「形質転換植物」は、遺伝子操作により作製された形質転換植物およびその後代を含む。また、後代には交雑種も含み、それらは早生化能力を保持するものである。
形質転換植物（トランスジェニック植物）は以下のようにして得ることができる。
本発明における形質転換の対象は、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）を含む）又は植物細胞である。
形質転換に用いられる植物としては、双子葉植物、単子葉植物、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
アブラナ科：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、アブラナ、キャベツ、ハクサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）など。
ナス科：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、ナス、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｅｕｍ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）など。
バラ科：バラ（Ｒｏｓａ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ）、サクラ（Ｐｒｕｎｕｓ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ）など。
キク科：キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）など。
ナデシコ科：カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ  ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）など。
イネ科：トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）など。
ラン科：カトレア（Ｃａｔｔｌｅｙａ）、コチョウラン（Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ）など。
ユリ科：チューリップ（Ｔｕｌｉｐａ）など。
マメ科：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ）、ソラマメ（Ｖｉｃｉａ）、フジ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ）など。
前記早生化遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合と組織片を用いる場合がある。プロトプラストを用いる場合は、Ｔｉプラスミドをもつアグロバクテリウムと共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、リーフディスクにより対象植物の無菌培養葉片に感染させる方法（リーフディスク法）やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。また、単子葉植物のアグロバクテリウム法による形質転換には、アセトシリンゴンが形質転換率を高めるのに使用できる。
遺伝子が植物に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。
形質転換の結果得られる腫瘍組織やシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。植物体の再生は、一般的には、適当な種類のオーキシンとサイトカイニンを混ぜた培地の上で根を分化させてから、サイトカイニンを多く含む培地に移植させシュートを分化させた後にホルモンを含まない土壌に移植することによって行う。
このようにしてＡｔ３ｇ５５２４０などの上記早生化遺伝子が導入された形質転換植物は、早生の表現型を示す。また、野生型と比べて植物体のサイズを増加させる表現型を示す。さらに、Ａｔ３ｇ５５２４０の遺伝子が導入されたシロイヌナズナは、薄緑色の表現型も有する。
本明細書において早生とは、生育期間、つまり播種してから、開花・熟成・結実するまでの期間の短いものをいう。
なお、本明細書における「表現型」という用語は、「表現形質」と同義で用いる。これらは、容易に観察または測定できる植物の形態学的特徴を意味する。
早生の表現形質は、早く収穫できるため、台風などの自然環境による被害にさらされる可能性が減るなどの利点がある。また、鑑賞用植物においても出荷までの栽培時期を大きく短縮することができるので生育のためのコストを大幅に減少させることができる。また、野生型と比べて植物体のサイズを増加させる表現形質は、バイオマスを増加させることが可能であり、例えば産業資源として利用される植物に有用な形質である。
本発明はまた、上記のようにして作製された本発明の早生化形質転換植物由来の組織、細胞又は種子も包含する。これらの組織、細胞又は種子もまた、本発明の核酸又は早生化遺伝子を含み、とりわけ種子はその遺伝子型及び形質を後代に子孫伝達することができる。
４．早生化遺伝子によりコードされるタンパク質の生産
上記数種の早生化遺伝子をＴａｒｇｅｔＰ  Ｖ１．０と呼ばれるアルゴリズムで解析すると、Ｎ末端部位に膜構造に結合するモチーフがあり、輸送され、後に切り出される可能性のある配列が、配列番号２に示すアミノ酸配列の場合、Ｎ末端から３４個目のアミノ酸残基にあると予想された。また、配列番号３３、３５又は３７に示すアミノ酸配列においても同様のアミノ酸残基が存在する（図６参照）。このような部分アミノ酸配列を有するタンパク質は、植物を早生化する活性および／または野生型と比べて植物体のサイズを増加させる活性を有すると考えられる。
従って、配列番号２に示すアミノ酸配列の場合、活性部分と思われるアミノ酸は、９５（配列番号２の全アミノ酸）−３３（Ｎ末端から３４個目で切断される）＝６２アミノ酸、すなわち３４位のアミノ酸残基〜９５位のアミノ酸残基であり、少なくともこの配列を含むペプチドを合成しても活性があるだろう。同様に、配列番号３３、３５及び３７に示すアミノ酸配列の場合、配列番号２の３４位〜９５位のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を少なくとも含むペプチドを合成しても活性があると考えられる。
早生化遺伝子によりコードされるタンパク質は、前記１．で単離した早生化遺伝子をプラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等の宿主中で複製可能な組換えベクターに連結（挿入）し、該ベクターを、好ましくは大腸菌等の植物宿主以外の宿主に導入して形質転換体を得、該形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。ここで、「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
前記プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
植物宿主以外の宿主としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ９等の昆虫細胞などを用いることができる。
大腸菌、枯草菌等の細菌を宿主とする場合は、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＤＨ１０Ｂなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが用いられるが、これらに限定されるものではない。この場合、プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであれば特に限定はされず、例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターを用いることができる。前記組換えベクターは、該細菌中で自律複製可能であると同時に、上記プロモーター、リボソーム結合配列、前記早生化遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばカルシウムイオンを用いる方法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２））、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｅａ  ｐａｓｔｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターは酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等を用いることができる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞などが用いられる。この場合、プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。この場合、プロモーターとしてポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーターが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
前記の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
例えば、大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはＩＡＡ等を培地に添加することができる。
例えば、動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜３０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、前記タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を採取する。また、前記タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からタンパク質を単離精製することができる。
上記遺伝子組換え技術を使用する以外に、例えば小麦胚芽抽出液、大腸菌抽出液、又はウサギ網状赤血球抽出液中での無細胞タンパク質合成法を用いて本発明のタンパク質又はその活性なペプチドを合成することも可能である（特開平１０−８０２９５号公報）。
５．植物の早生化／サイズ増加方法
上記４．のようにして作られるタンパク質又はその活性なペプチドは、植物体または土壌に施用（振りかける、または散布するなど）して植物を早生化および／または野生型と比べて植物体のサイズを増加し得る。特に、ペプチドのうち、切断配列以降の活性部分と思われる配列番号２のアミノ酸配列中の６２アミノ酸は、わずか６２個のアミノ酸からなる親水性のペプチドであるので、容易に水に溶けることが考えられる。配列番号３３、３５及び３７のアミノ酸配列中の対応するアミノ酸についても同様である。したがって、水に混ぜて茎頂に散布するか、水に溶かして土壌もしくは栽培用水溶液に加えることにより根から吸わせることが効果的と考えられる。
また、上記タンパク質及びペプチドのもう一つのメリットは、このようなペプチド性活性物質は化学物質などとは違い簡単に環境によって分解されるので、局所的な散布などを行うことにより、環境にやさしい生理活性物質であるといえる。
上記タンパク質又はペプチドを有効成分として含む植物早生化誘導剤または植物サイズ増加誘導剤は、上記タンパク質又はペプチドと、農業分野で一般的に使用される担体、添加剤など、その他植物の生育に有用な成分を組み合わせて製造することができる。
上記誘導剤の剤形は、固形製剤、例えばペレット、粒剤、顆粒、粉剤、水和剤、顆粒水和剤などでもよいし、または液体製剤、例えば液剤、乳剤などでもよく、特に限定されない。
上記タンパク質又はペプチドの含量は、対象の植物を早生化および／またはサイズを増加させるのに有効な量であれば特に限定されないが、固形製剤の場合、例えば２〜６０重量％、液体製剤の場合、散布濃度で例えば約０．１〜１０ｐｐｍになるように本発明の有効成分を含有させればよい。
担体は、固形製剤の場合、例えば、カオリンクレー、珪藻土、ベントナイト、ゼオライト、珪酸カルシウム、酸性白土、活性白土、アタパルガスクレーなどの鉱物質担体、硫酸アンモニウム、塩酸アンモニウムなどのアンモニウム塩、リン酸二カリウムなどのリン酸塩、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウムなどの炭酸塩、ブドウ糖、果糖、ショ糖、乳糖、デキストリン等の糖類、尿素、食塩、硫酸ナトリウム、常温で固体のポリエチレングリコール等の水溶性担体が挙げられる。液体製剤の場合、例えば水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液などが挙げられる。担体の含量は特に限定されないが、固形製剤の場合、例えば５〜４０重量％、液体製剤の場合、例えば８０〜９９％である。
また添加剤として、分散剤、増量剤、結合剤、滑助剤、界面活性剤、希釈剤などを加えてもよい。
上記誘導剤は公知の方法で製造することができる。例えば粉剤は、上記タンパク質又はペプチド、水、必要に応じて分散剤及び担体などを含有する懸濁液を噴霧乾燥して製造できる。また、例えば液剤は、上記タンパク質又はペプチドを水又は緩衝液に溶解し、添加剤等を適宜添加して製造できる。
本発明によれば、上記形質転換植物において、植物早生化遺伝子を過剰発現させて、早生化および／または野生型と比べて植物体のサイズ増加を誘導することを含む、植物の早生化および／またはサイズ増加方法もまた提供される。
早生化遺伝子を過剰発現させる方法は、例えば、成長期の植物に対し物質投与、環境ストレス付与などがある。
【実施例】
【０００６】
実施例１
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
１．方法
（１）標準化完全長ｃＤＮＡ及びマーカー遺伝子から構成されるｃＤＮＡ混合物の調製
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ株）完全長ｃＤＮＡライブラリーを次の２つのベクターを用いて構築した。ライブラリーＲＡＦＬ２〜ＲＡＦＬ６（ＲＡＦＬ：ＲＩＫＥＮ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ）にはベクターＬａｍｂｄａ  Ｚａｐ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）を、ライブラリーＲＡＦＬ７〜ＲＡＦＬ１１にはベクターＬａｍｂｄａ  ＦＬＣ−１−Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＵＳＡ）を用いた。
これらのライブラリーからのクローンをシングルパスシーケンスして（Ｓｅｋｉら，２００２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，３１，２７９−９２）、重複しないクローンを選択し、各クローンについて平均最終濃度が１４ｎｇ／ｍｌの約１５，０００ｃＤＮＡから成る完全長ｃＤＮＡ混合物を調製した。
これらのクローンの約３分の１は、ある重複したｃＤＮＡを含んでいることがＲＡＦＬ  ｃｌｏｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｊｅｃｔ（Ｙａｍａｄａら，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００３：Ｖｏｌ．３０２．ｎｏ．５６４６，ｐｐ．８４２−８４６）からわかっていたので、このクローン混合物は約１０，０００の重複しない完全長ｃＤＮＡから成ることになる。
ＲＡＦＬ２及びＲＡＦＬ３ライブラリー（全部で１，６２３クローンに対応）におけるＳｆｉＩクローニング部位に対する完全長ｃＤＮＡの向きは、ＲＡＦＬクローンの残りのＳｆｉＩクローニング部位と反対向きであった。表現型スクリーニングのための内部標準とするために、オーキシン合成（ｔｍｓ１，ｉａａＭ）（Ｃｏｍａｉら，１９８２，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１４９，４０−６；Ｋｌｅｅら，１９８４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８１，１７２８−３２）、オーキシン感受性（ｒｏｌＢ）（Ｆｕｒｎｅｒら，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，４２２−４２７）、及びサイトカイン合成（ｔｍｒ）（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎら，１９８４，Ｊ  Ｎｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ，２，３５４−６２）に関連する４つの細菌遺伝子をＰＣＲにて増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−由来ベクターのＳｆｉＩ部位にクローニングした。各内部標準プラスミドを別々に完全長ｃＤＮＡ混合物に３０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた。増幅に用いる内部標準遺伝子のＤＮＡ鋳型およびＰＣＲプライマーは以下のとおりである。
2008020645.tif 000003
（２）標準化完全長ｃＤＮＡのアグロバクテリウムライブラリーの調製
前記（１）で調製したｃＤＮＡ混合物をＳｆｉＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）で消化し、アグロバクテリウムバイナリーベクターｐＢＩＧ２１１３ＳＦのＳｆｉＩ部位にＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）を用いてクローニングした。ｐＢＩＧ２１１３ＳＦベクターはｐＢＩＧ２１１３Ｎ（Ｔａｊｉら，２００２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，２９，４１７−２６）を由来とし、完全長ｃＤＮＡが３５Ｓプロモーターに対してセンス方向に挿入されるように２つのＳｆｉＩ部位をｐＢＩＧ２１１３ＮのＸｂａＩ部位に挿入した。
図１（ａ）にバイナリーベクターの例を示す。ＥｌはＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの５’−上流配列（−４１９から−９０）、Ｐ３５ＳはＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（−９０から−１）、ΩはＴＭＶの５’−上流配列、ＮＯＳ−ＴはＴｉプラスミドのノパリン合成遺伝子のポリアデニル化シグナル、Ｈｙｇはハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。矢印は、ｃＤＮＡを回収するのに使用されるＧＳ４プライマーとＧＳ６プライマーの位置を示す。
ライゲーションは、バイナリーベクターに対して６倍モル過剰量のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔで組み立て、そのライゲーション産物でＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ１０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をエレクトロポレーション法によって形質転換し、コロニーを混合してプラスミドライブラリーを単離した。
アグロバクテリウムＧＶ３１０１を、プラスミドライブラリーでエレクトロポレーションによって形質転換し、生じた細菌コロニーを混合してアグロバクテリウムライブラリーを調製した。
（３）形質転換及び植物の生育
形質転換及び植物の生育は、既報（Ｉｃｈｉｋａｗａら，２００３，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，３６，４２１−４２９）に記載されている。
短い野生型シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）及び形質転換株をｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｒａｓｙｓｔｅｍ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で長日条件（１６時間明期、８時間暗期）下で２２℃にて生育させた。野生型植物を、アグロバクテリウムライブラリーを用いてフローラルディッピング法（Ｃｌｏｕｇｈら，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１６，７３５−４３）により形質転換した。
ハイグロマイシン耐性Ｔ１苗を５０ｍｇ／ｌハイグロマイシンを含む基本寒天培地（ＢＡＭ）上で７日間選択し、土壌に移した（Ｎａｋａｚａｗａら，２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４，２８−３０）。目に見える表現型（例えば、成長率、植物体の色、開花期、稔性の変化等）をスコアし、表現型（ＦＴ１Ｐ）を示す全ての植物を新しいＡｒａｓｙｓｔｅｍトレイに移し、更に観察した。
ＤＮＡ分析のために、ロゼット葉か花のいずれかを全ＦＴ１Ｐ植物から採取した。
（４）ＤＮＡゲルブロット分析及びハイグロマイシン耐性試験
サザンブロッティングは、既報（Ｍｅｙｅｒら，１９９５，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ，２４９，２６５−７３）に従って実施した。２０系統を無作為に選んで、Ｔ２植物を前記（３）形質転換及び植物の生育に記載の条件と同様にして、３週間土壌生育させた。１系統につき３つの植物体から葉を採取し、液体窒素内でホモジナイズした。
ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、指示書に従って単離した。ハイグロマイシン耐性遺伝子の部分を含むｐＢＩＧ２１１３ＳＦから増幅した０．５ｋｂ  ＰＣＲ断片を  ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて標識した。
ＤＮＡ鋳型用ＰＣＲプライマーとして以下のものを用いた。
2008020645.tif 000004
ハイブリダイゼーションは、溶液（５×ＳＳＣ，５０％ホルムアミド，０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン，０．０２％ＳＤＳ，２％ブロッキング試薬（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を用いてプローブ濃度を５ｎｇ／ｍｌ、４４℃にて行い、第２洗浄を０．１ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳの溶液を用いて行う以外は、指示書に従った。
化学発光は、ハイブリダイゼーション膜をＤＩＧ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にて処理した後、ＬｕｍｉＶｉｓｉｏｎＰＲＯ（Ａｉｓｉｎ）によって検出した。
（５）ＦＴ１Ｐ植物からの完全長ｃＤＮＡの増幅とクローニング
ロゼット葉又は花の約２００ｍｇ（生体量）を採取した。
５つのセラミック粒（ＣＥＲＡＭＩＣＳ  ＹＴＺ  ｂａｌｌ，Ｄ：２．３ｍｍ，Ｎｉｋｋａｔｏ，Ｊａｐａｎ）及び３００μｌの溶解バッファーを植物材料に加え、Ｓｈａｋｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｓｈａｋｅ  Ｍａｓｔｅｒ  ｖｅｒ．１．０，Ｂｉｏ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いてホモジナイズした。ゲノムＤＮＡをＷｉｚａｒｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ９６  ＤＮＡ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて抽出した。ワークステーションシステム（Ｔｅｃａｎ  ｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ１５０，Ｔｅｃａｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を導入して抽出キットに記載されている抽出プロトコールを実行した。
Ｇａｔｅｗａｙベクターへのクローニングの際にはｃＤＮＡ  ＰＣＲに以下のプライマーを用いた。
2008020645.tif 000005
ｐＢＩＧ２１１３ＳＦベクターへのクローニングの際には以下のプライマーペアを用いた：
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短い断片に対するＰＣＲ条件は、９４℃３０秒変性、６２℃３０秒アニーリング、７２℃１２０秒伸長とした。長い断片に対するＰＣＲ条件は、９４℃３０秒変性、５８℃３０秒アニーリング、６８℃１８０秒伸長とした。両ケースとも、反応前にＤＮＡを８分間９５℃にて変性した。
（６）ＰＣＲ断片の発現ベクターへのクローニング及び配列決定
ＧａｔｅｗａｙベクターＰＣＲ断片をまずＢＰ  ｃｌｏｎａｓｅによって指示書に従ってｐＤＯＮＲ−２０７ベクターにクローニングし（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）、挿入した完全長ｃＤＮＡ断片を下記のａｔｔＬ１およびａｔｔＬ２プライマーを用いて配列を決定した。
2008020645.tif 000007
ｐＢＩＧ２１１３ＳＦへのクローニングのために、Ｔ１植物からのＰＣＲ断片をＳｆｉＩで消化し、ベクターのＳｆｉＩ部位にクローニングした。得られた構築物を、例えばＦ０１９０７系統の場合、ｐＦ０１９０７とした。挿入した完全長ｃＤＮＡ断片をＧＳ６プライマーを用いて配列を決定した。
（７）ＲＴ−ＰＣＲ
Ｆ０３０２４系統のＴ１植物（Ｔ１−Ｆ０３０２４）、Ｆ０１９０７系統のＴ１植物（Ｔ１−Ｆ０１９０７）、６つの独立したＴ１−Ｒ０１９０７系統及び野生型植物の種を土壌に播き、Ｆ０３０２４については約６週間、Ｆ０１０９７とＲ０１９０７については４週間生育させた。
各系統から少なくとも３つの異なる植物体のロゼット葉を採取し、ｍＲＮＡをＤｙｎａｂｅａｄｓ  ｍＲＮＡ  ＤＩＲＥＣＴ  Ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いて指示書に従い抽出した。組織特異性試験のために、発芽後５週齢の野生型コロンビア植物を採取し、対応する組織からｍＲＮＡを同様にして単離した。ｍＲＮＡをＲＱ１Ｄｎａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で３７℃にて１時間処理した。ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を用いて製造業者の指示に従い合成した。
ＲＴ−ＰＣＲは、野生型及び個々の系統間のｃＤＮＡの割合を調節するためにまず以下のβ−チューブリン特異的プライマー（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，２００１，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，１２６，７３１−４１）、またはシロイヌナズナ形質膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ（ＡＨＡ１）特異的プライマー（Ｋｉｎｏｓｈｉｔａら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１４，６５６−６０）にて行った。
2008020645.tif 000008
Ｆ０３０２４の遺伝子特定プライマーは、３０２４−Ｎ及び３０２４−Ｃ：５’−ＴＣＡＡＡＧＴＣＴＴＧＣＣＡＣＴＡＣＴＡＧＴＣＧ−３’  （配列番号３１）である。
Ｆ０１９０７の遺伝子特定プライマーは、１９０７Ｎ：５’−ＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＴＧＴＴＴＧＡＴＣＴＴＣＣＡＴ−３’，（配列番号２３）及び１９０７Ｃ：５’−ＴＣＴＴＧＣＴＴＧＴＴＧＧＡＣＣＧＡＴＧＣＴＡＡＧ−３’  （配列番号２４）である。
ＰＣＲは常に以下の条件：９４℃３０秒変性、６０℃３０秒アニーリング、及び７２℃１２０秒伸長にて実施した。
（８）定量的リアルタイムＰＣＲによる遺伝子発現解析
一つのＴ１  Ｒ０１９０７系統由来のＴ２  Ｒ０１９０７植物の１か月齢のロゼット葉からＲＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  Ｐｌａｎｔ  ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ  ＧｍｂＨ，Ｄｕｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて単離した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を用い、その指示書に従い合成した。
リアルタイムＰＣＲ解析をＭＸ３０００Ｐ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ）を用いて行った。
ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏ．Ｌｔｄ，Ｊａｐａｎ）を、増幅断片の検出に用いた。
参照ＤＮＡの増幅プライマーとして、ＡＣＴ２：５’−ＣＴＧＧＡＴＣＧＧＴＧＧＴＴＣＣＡＴＴＣ−３’（配列番号２５）と５’−ＣＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴＣＡＴＡＣ−３’（配列番号２６）を用いた。
リアルタイムＰＣＲのための遺伝子特異的プライマーとして、ＲＰ−１９０７−２：５’−ＣＡＴＧＣＧＴＣＡＧＧＧＡＴＡＡＡＴＣＧＴ−３’（配列番号２７）及びＬＰ−１９０７−２：５’−ＡＣＴＧＴＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡ−３’（配列番号２８）を用いた。
（９）ＧＦＰ融合タンパク質の構築と蛍光顕微鏡観察
ｐＦ０３０２４Ｓクローンを用い、以下のプライマーを用いて後述のＡｔＰＤＨ１（Ｆ０３０２４系統から回収されたｃＤＮＡ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＥＶＨ  ｂｏｘ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  １））のＮ末端の９８アミノ酸配列に対応するＤＮＡ断片を増幅した。
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増幅したＤＮＡ断片をｐＤＯＮＲ−２０７ベクターを介してＧａｔｅｗａｙ指示書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）に従いｐＧＷＢ５（Ｓａｉｔｏら、１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，４０，７７−８７）にクローニングした。
生じた構築物ｐＧＷＢ３０２４Ｎ９８は合成緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（Ｃｈｉｕら、１９９６，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ，６，３２５−３０）のＮ末端と融合した９８アミノ酸からなるＮ末端の領域をＣａＭＶ３５Ｓ転写プロモーターの制御下で過剰発現することができる（キメラＮ９８−ＧＦＰタンパク質）。
ＧＦＰ遺伝子のみを３５Ｓプロモーターによって発現するネガティブな対照構築物として、ｐＳＡ７０１（島根大学、Ｄｒ．Ｔ．Ｎａｋａｇａｗａから供与）を用いた。
これらのプラスミドを、Ｈｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ−Ｇｕｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い、標準的なプロトコールに従い、シロイヌナズナＣｏｌ−０葉のパーティクルボンバードメント法に用いた。
個々の葉を蛍光顕微鏡（ＢＸ  ６０，Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて観察した（ＧＦＰ蛍光についてはＵ−ＭＮＩＢＡ、葉緑素蛍光についてはＵ−ＭＷＩＧフィルターをそれぞれ使用）。
（１０）電子顕微鏡観察
Ｆ０３０２４、Ｆ０１９０７、野生型の４週齢植物のロゼット葉を４％グルタルアルデヒドにて固定し、それを２０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．０で２０時間４℃にて緩衝化し、同緩衝液で４時間４℃にて洗浄した。次に、それらを２％四酸化オスミウムの２０ｍＭ  カコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）溶液で２０時間４℃にて後固定した。固定した試料をアルコール系で脱水し、Ｓｐｕｒｒレジン（Ｔａａｂ，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，ＵＫ）に包埋した。超薄切片をＵＬＴＲＡＣＵＴ  ＵＣＴ  ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ，Ｗｉｅｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）上でダイヤモンドナイフでカットし、Ｆｏｒｍｖａｒ−被覆グリッドに移した。それらを４％酢酸ウラニルで１５分間、クエン酸鉛溶液で室温にて１０分間二重染色した。蒸留水で洗浄後、試料をＪＥＭ−１２００  ＥＸ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｊｅｏｌ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用い８０ｋＶにて観察した。
（１１）葉緑素含量測定
葉緑素含量を二つの方法で測定した：
第１法（図３（ｇ））は、既報（Ｐｏｒｒａら，１９８９，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，９７５，３８４−３９４）に記載される色素の直接測定による。短い葉では材料を８０％アセトンにてホモジナイズした。アセトン溶液を分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ３０００，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＫ）を用い波長６６３ｎｍ、６４５ｎｍ、７２０ｎｍにて測定した。
第２法は（図５（ｂ））、２波長ハンディクロロフィルメーター（ＳＰＡＤ−５２０；Ｍｉｎｏｌｔａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた葉面積１ユニットあたりの葉緑素含量の相対値の測定による。
葉緑素測定後、同材料を定量的リアルタイムＰＣＲに用いた。
（１２）葉緑素蛍光測定
ＰＳＩＩの量子収量は次式：
［Ｐｍ’＝（Ｆｍ’−Ｆｓ）／Ｆｍ’］（Ｇｅｎｔｙ−パラメーター）
（Ｆｍ’およびＦｓ＝光照射葉における最大及び定常状態葉緑素蛍光）にて算出することができるので、三週齢植物の葉の葉緑素蛍光をパルス振幅変調（ＰＡＭ）蛍光光度計（ＭＩＮＩ−ＰＡＭ，Ｗａｌｚ，Ｅｆｆｅｌｔｒｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて室温にて測定した。結果を少なくとも４つの異なる葉の測定の平均とした。
（１３）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析
ＢＬＡＳＴサーチをＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔプログラムを用いて実施した。
細胞内局在性をＴａｒｇｅｔＰ  Ｖ１．０（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎら，２０００，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，３００，１００５−１６）及びＣｈｌｏｒｏＰ  １．１（Ｅｍａｎｕｅｌｓｓｏｎら，１９９９，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ，８，９７８−８４）を用いて予想した。
マルチプルアラインメントをｃｌｕｓｔａｌＸ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２５，４８７６−８２）及びＧｅｎｅＤｏｃ（Ｎｉｃｈｏｌａｓら，１９９７，ＥＭＢＮＥＷ．ＮＥＷＳ，４，１４）によって実施した。
Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇ系統樹をＣＬＵＳＴＡＬＸおよびＴＲＥＥＶＩＥＷ（Ｐａｇｅ，１９９６，Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ，１２，３５７−８）を使って構築した。
２．結果
（１）約１０，０００の標準化シロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡを含むアグロバクテリウム発現ライブラリーの構築
シロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製するのと同じモル比で約１０，０００の独立したシロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡを混合した。ｃＤＮＡは理研のシロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡコレクション由来であり、各ｃＤＮＡは配列決定されている（Ｓｅｋｉら、２００２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，３１，２７９−９２）。また、内部標準として、形態的表現型及び不稔を誘発することが知られている４つの細菌の腫瘍遺伝子を混合した。この内部標準は、ライブラリーのｃＤＮＡ発現量の指標として使用できるが、シロイヌナズナに形質転換後は、腫瘍遺伝子は第２世代で突然変異系統から排除される。ｔｍｓ１（Ｋｌｅｅら、１９８４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，８１，１７２８−３２）、ｉａａＭ（Ｃｏｍａｉら、１９８２，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１４９，４０−６）、ｒｏｌＢ（Ｆｕｒｎｅｒら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，４２２−４２７）及びｔｍｒ（Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎら、１９８４，Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ，２，３５４−６２）を使用した。これらの腫瘍遺伝子は多くの植物の形態に劇的影響を持つことが知られている。これら４つの腫瘍遺伝子を、個々の完全長ｃＤＮＡに対してモル比で約２倍量を添加すると、約７，５００のｃＤＮＡクローン毎に１つ、各腫瘍遺伝子が出現すると予測される。
アグロバクテリウムライブラリー（ＦＯＸアグロバクテリウムライブラリー）を作製後、Ｔ−ＤＮＡ特異的プライマーを設計し、ランダムに選択したアグロバクテリウムコロニーから単離したＤＮＡで、ＰＣＲを行った。３４のアグロバクテリウムコロニーから得られたＰＣＲ断片を増幅し、電気泳動を行ったところ、２０コロニーが単鎖ｃＤＮＡ構築物を含み、１１コロニーが２つの異なるｃＤＮＡ構築物を含み、１コロニーが３つの異なるｃＤＮＡ構築物を含み、２コロニーが空のベクターを含んでいた（図１（ｂ））。図１（ｂ）のレーン１，２，５，６，７，９，１０，１３，１５，１７，１９及び２２で、複数のバンドが増幅されたことが示された（レーンＭはＬａｍｂｄａ／ＨｉｎｄＩＩＩマーカー）。
また、これらの４５の増幅されたｃＤＮＡ断片の平均サイズは１．４Ｋｂであり、０．３Ｋｂ〜３．０Ｋｂの範囲内であった。４５のｃＤＮＡ断片を配列決定したところ、すべてのｃＤＮＡが互いに独立していた（データは示さず）。
（２）シロイヌナズナＦＯＸ系統の作製
シロイヌナズナＦＯＸ系統を作製するために、ＦＯＸアグロバクテリウムライブラリーを使用して、シロイヌナズナＣｏｌｕｍｂｉａ−０（Ｃｏｌ−０）生態型を形質転換した。フローラルディッピング法後、Ｔ０植物から得られた種子を集め、ハイグロマイシン含有ＢＡＭプレート上で選択した（Ｎａｋａｚａｗａら、２００３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，３４，２８−３０）。プレートにより発芽１週間以内に形質転換植物が選択されるので、ハイグロマイシン耐性苗を選択するために更に培養をする必要がない。ハイグロマイシン耐性Ｔ１苗を、土壌に移植し、１５，０００を超えるシロイヌナズナ稔性ＦＯＸ系統を作製した。導入遺伝子の存在を確認するため、２４のランダムに選択された植物を、プローブとしてハイグロマイシン遺伝子を用いたマーカー遺伝子の存在についてサザン法で分析した。全ての系統がハイグロマイシン耐性遺伝子を含んでおり、シロイヌナズナＦＯＸ系統に平均２．６のＴ−ＤＮＡが挿入されていた（データは示さず）。
（３）シロイヌナズナＦＯＸ系統の完全長ｃＤＮＡのサイズ分布及び配列の相違
完全長ｃＤＮＡが発現ベクターに組み込まれ、そのサイズ分布が平均１．４Ｋｂで、０．３〜３Ｋｂの範囲内であったため、このサイズ分布がシロイヌナズナＦＯＸ系統に反映されているかを調べた。
ＦＯＸ系統で組み込まれたｃＤＮＡのサイズ分布とばらつきを調べるため、Ｔ−ＤＮＡ特異的プライマーを使って、ランダムに選択したＦＯＸ植物から単離したゲノムＤＮＡでＰＣＲを行った。１０６の系統でのサイズ分布は、０．３Ｋｂ〜４．２Ｋｂの範囲内で、平均１．４Ｋｂであった。図１（ｃ）に、Ｌａｍｄｂａベクターにおいて２７７のランダムに選択されたＲＡＦＬ  ｃＤＮＡ（白のバー）と比較した、シロイヌナズナＦＯＸ植物から増幅された１０６のＲＡＦＬ  ｃＤＮＡ断片のサイズ分布を示す。分布パターンの類似性をはっきりさせるため、Ｌａｍｂｄａベクターから得られた値を２で割り、グラフにプロットした。
これらの系統から増幅されたＰＣＲ断片の平均数は、１植物当たり１．２であった。またＤＮＡゲルブロット分析を行ったところ、１系統当たり平均２．６のＴ−ＤＮＡが挿入されていた。しかし、ＦＯＸ植物からは平均１．２のＰＣＲ断片しか回収されなかった。この低いＰＣＲ断片回収率は、集団内に空のベクターが存在することよって部分的には説明できるが、主に、Ｔ−ＤＮＡタンデムまたは逆位反復などの２重のＴ−ＤＮＡの組み込みが生じたことによると考えられる（Ｄｅ  Ｂｕｃｋら，１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，２０，２９５−３０４；Ｄｅ  Ｎｅｖｅら，１９９７，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１１，１５−２９；Ｋｒｉｚｋｏｖａら，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊ，１６，６７３−８０）。
ｃＤＮＡの分布の平均サイズと範囲は、ＦＯＸアグロバクテリウムライブラリーで観察されるものと非常に似ており、また２７７のランダムに選択されたシロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡで観察されるものとも類似していた（図１（ｃ））。
また、４０のＰＣＲ断片を配列決定したところ、これらは異なる完全長ｃＤＮＡ由来であり、内部標準としてｃＤＮＡ混合物に添加した細菌腫瘍遺伝子とも同一ではなかった（表１）。
【表１】
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（４）シロイヌナズナＦＯＸ系統の表現型のモニタリング
１５，５４７のＴ１ＦＯＸ系統を作製する過程で、表現型（成長率、植物の色、開花期、稔性等）をモニターし、表現型が変化した１，４８７系統を集めた。
これらの見かけ上の形態的突然変異体系統と、シロイヌナズナのアクチベーションタグ系統に現れた形態的突然変異体と比較したところ、様々なカテゴリーでの突然変異体の出現頻度の高低はほとんど同じであったが、Ｆｏｘ系統の方が全般的に高い効率で変異が現れた（データは示さず）。これはＦｏｘ系統の効率性を示しており、主に、強力なＣａＭＶプロモーターとノパリン合成（ＮＯＳ）ターミネーターの制御下で、完全長ｃＤＮＡが適切に発現することによると考えられる。
Ｔ２世代の突然変異表現型の遺伝率を確認するため、Ｔ１世代で現れた１１７の薄緑色の突然変異系統（表２）を生育し、Ｔ２世代の突然変異の表現型を探した。
【表２】
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これらの表現型をモニターするために、各２０苗ずつ生育した。２０苗から優性がはっきりと確立されるのは難しいにもかかわらず、６０系統が薄緑色の表現型を示した（即ち、表２でＴ２表現型率が５０％以上示した系統の数が６０）。また、４０の形態的突然変異体についても調べ、元の突然変異体の表現型を示す７系統を見出した。これはＴ２世代の導入遺伝子の抑制によるものか、Ｔ１ＦＯＸ植物のうち誤って突然変異体と同定されたものと考えられる。特に矮小化及び葉形の突然変異体は選択プレートから移動した後、環境ストレスにより生じたものと考えられる。
（５）腫瘍遺伝子により生じる形態
内部標準として４つの腫瘍遺伝子ｔｍｓ１、ｉａａＭ、ｒｏｌＢ及びｔｍｒを、完全長ｃＤＮＡライブラリーと混合した。ｉａａＭ及びｔｍｓ１は、それぞれＰ．ｓｙｒｉｎｇａｅ及びＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のトリプトファン２−モノオキシゲナーゼをコードし、これらの遺伝子が高発現してオーキシン応答が増強される（Ｃｏｍａｉら，１９８２，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１４９，４０−６）。ｒｏｌＢは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｙｚｏｇｅｎｅｓｉｓ由来であり、オーキシンに対する感受性に関係している。ｔｍｒは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来の腫瘍遺伝子であり、サイトカイニンの生合成に機能する。各腫瘍遺伝子を、完全長ｃＤＮＡと比較して２倍のモル等量の割合で完全長ｃＤＮＡと混合した。
完全長ｃＤＮＡの発現量と分布をモニターするため、シロイヌナズナＦＯＸ系統における腫瘍遺伝子の出現を調べた。まず、腫瘍遺伝子によって生じた突然変異について形質転換植物の形態をモニターした。実際に形態的表現型を有していたのは以下の２つの遺伝子だけであった。ｔｍｓ１及びｉａａＭのいずれの場合でもオーキシン応答が増強されるので、これらの遺伝子を含む植物では、頂芽優性と矮性の表現型が促進されていた（図２）。これらの形態的な特徴は、他の形態的突然変異と非常にはっきりと容易に区別される。図２（ａ）は、同じ期間成長させた、ｉａａＭ高発現植物と野生型（ＷＴ）植物を比較したものである。図２（ｂ）は、ｉａａＭ高発現植物の写真である。図２（ｃ）は、ｔｍｓ１高発現植物の写真である。
ｔｍｒの高発現は、植物苗を致死させたが、ｒｏｌＢの高発現は、はっきりとした表現型を示さなかった。１５，５４７のシロイヌナズナＦＯＸ系統のうち、１３のｔｍｒ１及びｉａａＭの高発現突然変異体が存在した。見かけ上のこれらの突然変異体は、理論値（１５，０００のうち４）と比較して高かった。これは、細菌培養における、形質転換されたアグロバクテリアの増殖の差に依存している可能性があると考えられる。前記腫瘍遺伝子の利点の１つは、突然変異体は不稔なので、ｒｏｌＢ以外は、次の世代に持ち越されないことである。
（６）植物早生化遺伝子による突然変異体の特徴
Ｔ２世代で薄緑色の表現型を示した前記５９系統のうち、２つの系統を代表として選択した（Ｆ０３０２４系統（成長の遅い系統）、Ｆ０１９０７系統（早生化遺伝子が高発現している早生化系統））。Ｆ０３０２４植物体は薄緑色及び成長の遅い表現型を示し（図３（ａ）、Ｆ０３０２４系統のＴ１世代の表現型）、薄緑色の表現型は、自家受粉後Ｔ２世代において半優性であった（図３（ｂ）、一部薄緑色の表現型を示すＴ２世代のＦ０３０２４系統植物、図３（ｃ）、左：Ｔ２世代の薄緑色の茎を示すＦ０３０２４植物、右：Ｔ２世代のＦ０３０２４系統の野生型分離個体）。また、Ｆ０１９０７は薄緑色の突然変異体として単離され、その表現型はＴ２世代において優性であった（図３（ｅ）、Ｔ１世代のＦ０１９０７の表現型）。図３（ｇ）にこれらの系統の葉緑素量の比較を示す（図３（ｇ）において、Ｘ軸１：野生型植物、２：Ｆ０１９０７系統のＴ１植物、３：Ｆ０３０２４系統のＴ１植物、Ｙ軸：相対的葉緑素量）。
Ｔ−ＤＮＡプライマーセットを用いたゲノムＰＣＲにより、導入された完全長ｃＤＮＡを回収した。Ｆ０３０２４及びＦ０１９０７植物体から、それぞれ、３．０Ｋｂ及び０．８ＫｂのｃＤＮＡ断片を回収した。挿入された完全長ｃＤＮＡ断片を増幅するためプライマーを設計した。回収したｃＤＮＡ断片をアグロバクテリウムＴｉプラスミドベクターにもどしてクローニングし、再構築されたプラスミドを使って、シロイヌナズナ（Ｃｏｌ−０）植物体を形質転換した。
土壌で成長させた後、Ｆ０３０２４から回収されたｃＤＮＡを使って作製された４８の形質転換植物のうち、３２が、元のＦ０３０２４植物体に見られた薄緑色で成長の遅い表現型を示した（図３（ｄ）、左：形質転換していない野生型植物、右：同じ期間成長させた、薄緑色の表現型を示す後述のＡｔＰＤＨ１遺伝子で形質転換された野生型植物）。Ｆ０３０２４から回収されたｃＤＮＡを配列決定し、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のデータベースで調べたところ、Ａｔ１ｇ７００７０であり（理研（理化学研究所）シロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡ番号ＡＦ３８７００７）、ＤＥＶＨ  ｂｏｘヘリカーゼをコードするものであった。Ａｔ１ｇ７００７０はＦ０３０２４で高発現していた（図４（ａ））。ＤＥＶＨ  ｂｏｘヘリカーゼはＤＥＡＤ及びＤＥＡＨ  ｂｏｘ  ＲＮＡヘリカーゼを含む遺伝子ファミリーのメンバーである。Ｆ０３０２４から回収されたｃＤＮＡをＡｔＰＤＨ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ＤＥＶＨ  ｂｏｘ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  １）と命名した。タバコＤＥＡＤ  ｂｏｘヘリカーゼ（ＶＤＬ）は葉緑体をターゲットとし、葉緑体発達を調節するという報告がある（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＡｔＰＤＨ１は、原核生物のＤＥＡＤ  ｂｏｘヘリカーゼで構成される小クレードに属する、Ｎ末端領域に推定上の葉緑体ターゲットシグナルを有する。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）にＮ末端の９８アミノ酸を融合することによりこのタンパク質の細胞内局在を試験し、葉緑体に位置することがわかった（図９（ａ）、（ｂ））。ＡｔＰＤＨ１高発現植物体の薄緑色の葉の葉緑体構造と光合成活性を試験すると、光合成活性は有意に減少し（図３（ｈ））、これは、葉緑体の内膜構造の不十分な発達によるものである（図８）。
Ｆ０１９０７から回収されたｃＤＮＡを含む５１の形質転換植物のうち、４７が、元のＦ０１９０７の表現型を再現し、長日光条件下で薄緑色と早咲きの表現型を示した（図３（ｆ）、左：形質転換していない野生型植物、右：同じ期間成長させた、薄緑色で背の高い表現型を示すＴ２世代のＡｔ３ｇ５５２４０形質転換植物）。ｃＤＮＡを配列決定し、ＮＣＢＩのデータベースで調べたところ、機能が知られていないＡｔ３ｇ５５２４０であった。
Ｆ０１９０７植物体は、薄緑色の表現型を示しただけでなく、野生型植物体よりも速い植物発育を示し、かつ大きく成長した（図３（ｅ）、図３（ｆ））。このような植物の発育は、弱い光条件下で成長した野生型の発育を想起させたので、この表現型をＰＥＬ（ｐｓｅｕｄｏ−ｅｔｉｏｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｇｈｔ）とした。ＰＥＬ表現型は、機能が未知である遺伝子のＡｔ３ｇ５５２４０の高発現によって生じる（図４（ｂ）、上のバンドはＡｔ３ｇ５５２４０に特異的なＰＣＲ断片、下のバンドはローディング調整に使用したＡＨＡ１  ＰＣＲ断片（ＡＨＡ１：シロイヌナズナ形質膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）、レーン１：野生型コロンビア植物、レーン２−７：薄緑色の表現型を示したＴ２−Ｒ０１９０７植物、レーン８：薄緑色の表現型を示したＴ２−Ｆ０１９０７植物）。Ｆ０３０２４植物体とは対照的に、これらのＰＥＬ植物体は、正常な光合成活性及び正常な葉緑体構造を有する（図３（ｈ）、レーン１−４：Ａｔ１ｇ７００７０の４つの独立した形質転換植物、レーン５−７：Ａｔ３ｇ５５２４０の３つの独立した形質転換植物、Ｙ軸：野生型に対して表される相対的光合成活性、Ｘ軸：個々の植物；図８、野生型（１及び２）、Ａｔ１ｇ７００７０形質転換植物（３及び４）及びＡｔ３ｇ５５２４０形質転換植物（５及び６）の葉肉細胞の電子顕微鏡観察。矢印はｐｌａｓｔｇｒｏｂｕｌｅの凝集を示す。１、３、５のバーは、１μｍを示す。２、４、６のバーは２００ｎｍを示す。）。Ａｔ３ｇ５５２４０の遺伝子は小さいタンパク質（９５アミノ酸）をコードし、比較的長い３’−ＵＴＲ（３３０ｂｐ）を有していた。哺乳動物の遺伝子には存在せず、シロイヌナズナ由来で２つ、またイネ及びマメ由来でこの小さいタンパク質と相同性を示す遺伝子があるので、これらはいずれも植物に特異的な遺伝子であることがわかった。図６に、ＡＴ３Ｇ５５２４０タンパク質とその類縁（関連）タンパク質のアラインメントを示す。ＡＴ３Ｇ５５２４０、ＡＴ３Ｇ２８９９０及びＡＴ５Ｇ０２５８０はシロイヌナズナのタンパク質であり、ＯＳ０１Ｇ０８３７６００（旧名称：Ｐ００３１Ｄ１１．２）はイネＥＳＴのタンパク質である。図６中の数は、各タンパク質のアミノ酸の位置を示す。図７にＡＴ３Ｇ５５２４０タンパク質とその類縁（関連）タンパク質の系統樹を示す。ＡＴ３Ｇ５５２４０、ＡＴ３Ｇ２８９９０及びＡＴ５Ｇ０２５８０はシロイヌナズナのタンパク質であり、ＯＳ０１Ｇ０８３７６００（旧名称：Ｐ００３１Ｄ１１．２）はイネＥＳＴのタンパク質である。これらの遺伝子を細胞内局在性予測プログラムＴａｒｇｅｔＰ  Ｖ１．０にかけると、遺伝子はすべて、Ｎ末端の膜貫通領域及び近接した切断部位を有する分泌タンパク質に特有の特性を示した。しかしながら、タンパク質の機能は報告されていない。Ａｔ３ｇ５５２４０のノックアウト系統は、公開されているリソースセンターでは見つからなかったので、該遺伝子に対応するＲＮＡｉ構築物を作製し、野生型シロイヌナズナ植物体に形質転換した。形質転換植物のほとんどは発育の非常に初期の段階で枯れ、残った形質転換植物のうちどれにも標的化遺伝子の転写レベルの減少は見られなかった。従って、Ａｔ３ｇ５５２４０遺伝��群のノックアウト表現型は致死性と考えられる。
（７）導入遺伝子及び突然変異の表現型の発現レベル
ＦＯＸ系統は、個々のシロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡの異所性発現によって作製されることから、導入遺伝子の発現レベルと突然変異体の表現型との相関を調べた。
幾つかの再形質転換植物のＡｔ３ｇ５５２４０の発現レベルを調べた。発現レベルは、野生型と比較して、１．０Ｅ＋３倍〜１．０Ｅ＋８倍以上異なっていた（図５（ａ）、リアルタイムＰＣＲにより評価したＡｔ３ｇ５５２４０遺伝子の相対的発現レベルを示す）。これらの突然変異体の葉緑体量及びとう立ちする時期（とう立ち前の葉の数）を調べた（図５（ｂ）、葉の相対的葉緑体量、図５（ｃ）、とう立ち前のロゼット葉の数を示す）。Ａｔ３ｇ５５２４０の発現レベルと、葉緑体量及びとう立ちの時期との間で逆の相間が見られた（図５（ａ）〜（ｃ））。図５（ａ）〜（ｃ）において、Ｘ軸の系統番号は、Ｔ２世代のＡｔ３ｇ５５２４０の再形質転換植物の番号であり、１９、２１及び２２の系統番号の植物はハイグロマイシン感受性を示す野生型分離個体である。図５（ｄ）は、それぞれの系統番号のＴ２植物体の写真である。
これらの結果から、突然変異体の形態は導入遺伝子の影響であり、表現型は導入遺伝子の発現レベルに応じて変化することが示された。興味深いことに、この遺伝子の転写は野生型植物体ではロゼット型の葉で選択的に発現された（図４（ｃ）、上のバンドはＲＴ−ＰＣＲで増幅（サイクル数４０）したＡｔ３ｇ５５２４０に特異なＰＣＲ断片（ｐ０１９０７）であり、下のバンドはＲＴ−ＰＣＲで増幅（サイクル数２８）したローディング調整に使用したＡＨＡ１（シロイヌナズナ形質膜Ｈ＋−ＡＴＰａｓｅ）のＰＣＲ断片である。レーン１：葉、レーン２：茎、レーン３：根、レーン４：花弁、レーン５：種子）。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明により、植物早生化遺伝子を各種植物に形質転換して植物を早生化することが可能となり、これによって作物等の収穫時期を早めることができる、或いは、この遺伝子産物の全体或いは一部をペプチド合成などによって人工合成し、土壌または植物体に水分とともに添加することによって花成を促すことができる、などの利点が付与される。また、前記遺伝子による形質転換植物は、野生型に比べ植物体のサイズが増加されるので、例えば産業資源として利用される場合に有用である。
本発明の早生化形質転換植物は、農業・園芸分野等で応用できる。
［配列表］
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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