(57)【要約】  in vitroで力学的負荷による細胞組織の生物反応を観察しながら、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングを行うことができるようにした退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法を提供することを目的とし、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、培養容器に載置した細胞組織に、スクリーニング対象の薬剤を添加するとともに力学的負荷刺激を付与したときの細胞組織の変化を測定することにより、薬剤の評価を行う。
2008096842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、培養容器に載置した細胞組織に、スクリーニング対象の薬剤を添加するとともに力学的負荷刺激を付与したときの前記細胞組織の変化を測定することにより、前記薬剤の評価を行うことを特徴とする退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記力学的負荷刺激が、鉛直方向の荷重負荷刺激であることを特徴とする請求項１記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
鉛直方向の荷重負荷刺激を、荷重負荷用ピストンの重量を細胞組織にかけることにより付与することを特徴とする請求項２記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
細胞組織に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、細胞組織を載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力刺激を付与するようにしたことを特徴とする請求項２又は３記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞組織が、三次元形状をもつことを特徴とする請求項１、２、３又は４記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項６】
細胞組織が、軟骨細胞組織であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項７】
細胞組織が、筋細胞組織であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項８】
細胞組織が、血管細胞組織であることを特徴とする請求項１、２、３、４又は５記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項９】
細胞組織の変化を、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９、アグリカン、Ｓｏｘ９、ＣＤ４４、ＴＧＦ−β１及びＨＡＳ２の少なくとも１種の遺伝子発現を検出することにより測定することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１０】
細胞組織の変化を、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の少なくとも１種の蛋白発現を検出することにより測定することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
細胞組織の変化を、アグリカン、Ｓｏｘ９、ＣＤ４４、ＴＧＦ−β１及びＨＡＳ２の少なくとも１種の遺伝子発現を検出することにより測定することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疲労性疾患等の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会において健康的で活動的な生活を維持するためには、骨や関節等の運動器、心筋等の循環器の機能維持が重要である。
例えば、関節疾患では、変形性関節症、関節リウマチ等の予防、治療が重要であるが、これらの関節疾患の病因、病態には、関節にかかる荷重や過大な力学的ストレスが関節に影響を与え、特に、力学的負荷により関節軟骨の変性、損傷、摩耗等が、関節の退行性変性、破壊を引き起こし、関節疾患が進行することが知られている。
活動的な生活やスポーツ活動が盛んになるに従い、健康な関節機能の維持が社会的な要請であり、関節疾患の予防用又は治療用の薬剤が求められているが、この種の薬剤で現在用いられているものは、鎮痛剤、消炎剤等の関節疾患の副次的症状である炎症を緩和するものが大多数である。つまり、これらの薬剤は、関節軟骨の変性、損傷、摩耗等の予防又は治療を目的としたものはなく、新薬の開発が待たれているのが現状である。
しかしながら、in vitro（体外実験）で力学的負荷による軟骨の生物反応を観察できるシステムが存在しないため、力学的刺激により発生する関節軟骨の変性、損傷、摩耗等を予防、治療する薬剤をスクリーニングすることができなかった。
なお、従来の関節疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングには、in vitroでは培養軟骨細胞等を用いて細胞レベルでサイトカイン等の生理的活性分子を用いて生化学的な刺激を与えた上で薬剤の薬効を評価する方法や関節疾患モデル実験動物を用いる方法があるが、前者は力学的負荷刺激による関節の退行性変性、破壊を評価することができない点で問題があり、後者は、実験動物を用いるものであり、数万種類以上といわれる多数の候補物質のスクリーニングには適切でないという問題があった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、上記従来の薬剤のスクリーニング方法の有する問題点に鑑み、in vitroで力学的負荷による細胞組織の生物反応を観察しながら、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングを行うことができるようにした退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成するため、本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法は、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、培養容器に載置した細胞組織に、スクリーニング対象の薬剤を添加するとともに力学的負荷刺激を付与したときの前記細胞組織の変化を測定することにより、前記薬剤の評価を行うことを特徴とする。【０００５】
この場合において、前記力学的負荷刺激として、鉛直方向の荷重負荷刺激を用いることができる。【０００６】
また、鉛直方向の荷重負荷刺激を、荷重負荷用ピストンの重量を細胞組織にかけることにより付与することができる。【０００７】
また、細胞組織に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、細胞組織を載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力刺激を付与するようにすることができる。【０００８】
また、細胞組織として、三次元形状をもつ細胞組織を用いることができる。【０００９】
また、対象とする細胞組織として、軟骨細胞組織、筋細胞組織、血管細胞組織を用いることができる。【００１０】
そして、細胞組織の変化を、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の少なくとも１種の遺伝子発現又は蛋白発現を検出することにより測定することができる。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法によれば、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法であって、培養容器に載置した細胞組織に、スクリーニング対象の薬剤を添加するとともに力学的負荷刺激を付与したときの前記細胞組織の変化を測定することにより、前記薬剤の評価を行うようにしているので、in vitroで力学的負荷刺激を付与することによって、生体内の組織の環境に近似した状態で細胞組織の生物反応を観察しながら、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングを行うことができる。
これによって、関節疾患、心筋等の筋疾患、血管疾患を始めとする疲労性疾患等の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングを容易に行うことができるとともに、その信頼性を高めることができるため、これらの予防用又は治療用の薬剤の開発スピードを飛躍的に速めることが可能となる。【００１２】
また、前記力学的負荷刺激として、鉛直方向の荷重負荷刺激を、例えば、荷重負荷用ピストンの重量を細胞組織にかけることにより付与するようにしたり、さらに、細胞組織に鉛直方向の荷重負荷刺激を付与しながら、細胞組織を載置した培養容器を水平面内で移動又は振動させることにより、横方向の剪断応力刺激を付与するようにすることにより、生体内で組織に生じている力学的負荷刺激と同様の刺激を細胞組織に付与することができ、薬剤のスクリーニングの信頼性を著しく高めることができる。【００１３】
また、細胞組織として、三次元形状をもつ細胞組織を用いることにより、生体内の組織の環境により近似した状態を再現でき、薬剤のスクリーニングの信頼性を著しく高めることができる。【００１４】
また、細胞組織の変化は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９の少なくとも１種の遺伝子発現又は蛋白発現、さらには、アグリカン、Ｓｏｘ９、ＣＤ４４、ＴＧＦ−β１及びＨＡＳ２の少なくとも１種の遺伝子発現を検出することにより測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法に使用する力学的負荷刺激付与装置の一例を示す全体説明図である。
【図２】同要部説明図である。
【図３】荷重負荷用ピストンを示す分解した説明図である。
【図４】内部培養容器と受容基を示す説明図である。
【図５】三次元形状の細胞組織を作製する工程の説明図である。
【図６】力学的負荷刺激付与装置を用いて鉛直方向の荷重負荷刺激を付与する工程の説明図である。
【図７】実験結果の説明図で、力学刺激を与えた細胞による各種の遺伝子発現である、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＴＩＭＰ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＧ３ＰＤＨを示し、力学刺激により遺伝子発現が亢進したことを示す。
【図８】力学刺激を与えた細胞による蛋白発現と蛋白機能の亢進を示し、（ａ）はＭＭＰ−１、（ｂ）はＭＭＰ−３のそれぞれ抗体による免疫組織化学法による検出結果を、（ｃ）はＭＭＰ−２のザイモグラフィーであり力学刺激によりＭＭＰ−２酵素活性が上昇したことを示す。
【図９】力学刺激を与えた組織の生体力学的解析結果で、繰り返し力学刺激を与えることにより組織の剛性が変化したことを示す。
【図１０】ヒアルロン酸を添加して繰り返し力学刺激を与えたヒト滑膜由来幹細胞を含む三次元培養組織中の組織標本（ヘマトキシリン・エオジン染色）の写真である。
【図１１】ヒアルロン酸を添加して繰り返し力学刺激を与えたヒト滑膜由来幹細胞を含む三次元培養組織中より抽出したＤＮＡ含量（ＨＡ＋：ヒアルロン酸添加群、ＨＡ−：ヒアルロン酸非添加群）を示すグラフである。
【図１２】ヒアルロン酸を添加して繰り返し力学刺激を与えたヒト滑膜由来幹細胞を含む三次元培養組織中の遺伝子発現を示すグラフである。
【図１３】ヒアルロン酸を添加して繰り返し力学刺激を与えたヒト滑膜由来幹細胞を含む三次元培養組織中の遺伝子発現を示すグラフである。
【図１４】ヒアルロン酸を添加して繰り返し力学刺激を与えたヒト滑膜由来幹細胞を含む三次元培養組織の培養上清のヒアルロン酸の濃度を示すグラフである。
【図１５】ヒアルロン酸を添加して繰り返し力学刺激を与えたヒト滑膜由来幹細胞を含む三次元培養組織の培養上清のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の濃度を示すグラフである。
【符号の説明】
【００１６】
１    炭酸ガスインキュベーター
２    力学的負荷刺激付与装置
２０  ガイド部材
２１  ピストン上下移動用ステージ
２１ａ  孔部
２２  ステージ昇降機構
２２ａ  電動アクチュエーター
２２ｂ  ワイヤー
２３  ピストン載置用ステージ
２３ａ  孔部
２３ｂ  ピストン載置用ステージ駆動機構
２４  培養容器固定ステージ
２５  剪断応力ステージ
２６  剪断応力負荷機構
３    培養容器
３０  内部培養容器
３１  受容基
３２  培地槽（注入用）
３３  培地槽（排出用）
４    制御用コンピューター
５    荷重負荷用ピストン
５ａ  荷重負荷用ピストン
５ｂ  荷重負荷用ピストン
５１  加圧体
５１Ａ  加圧体
５２  ガイド軸部
５３  大径部
５４  重鎮装着部
５５  追加荷重重鎮
Ｃ    細胞組織
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法の実施の形態を説明する。【００１８】
本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法は、培養容器に載置した細胞組織に、スクリーニング対象の薬剤を添加するとともに力学的負荷刺激を付与したときの前記細胞組織の変化を測定することにより、前記薬剤の評価を行うものである。
具体的には、次の（１）〜（３）の工程により、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングを行う。
（１）軟骨細胞、間葉系幹細胞、筋細胞（心筋細胞）、血管細胞等を含む力学的強度をもつ細胞組織、好ましくは、三次元形状をもつ細胞組織を多数個作製し、培養容器としてマルチウェルプレート培養皿を用いて独立して培養を行う。
（２）培養したそれぞれの細胞組織（サンプル）にスクリーニング対象の薬剤（薬剤候補物質）を添加するとともに、各細胞組織に種々の条件の力学的負荷刺激を付与することにより力学的負荷を与える。
（３）一定期間の（２）の力学的負荷培養を行った後に、各細胞組織の培養上清（うわずみ）の蛋白分析、培養細胞の遺伝子発現、組織学的な細胞組織の力学的解析等を行い、力学的負荷刺激の細胞組織の分解に対する抑制効果を評価し、薬剤（薬剤候補物質）の絞り込み、選択を行う。【００１９】
そこで、まず、本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法に使用する細胞組織に力学的負荷刺激を付与するための力学的負荷刺激付与装置の一例を、図１〜図２に示す。【００２０】
この力学的負荷刺激付与装置は、炭酸ガスインキュベーター１内に設置される力学的負荷刺激付与装置２及び培養容器３と、制御用コンピューター４とで構成されている。
なお、力学的負荷刺激付与装置２の操作は、すべて炭酸ガスインキュベーター１の外から行えるようにし、これにより、炭酸ガスインキュベーター１内の滅菌状態を保って長時間に亘っての培養を可能にすることができる。【００２１】
炭酸ガスインキュベーター１は、その内部を滅菌し、温度、湿度、酸素、二酸化炭素、窒素分圧等を制御した環境で使用するようにする。【００２２】
この炭酸ガスインキュベーター１内に設置される力学的負荷刺激付与装置２は、荷重負荷用ピストン５と、この荷重負荷用ピストン５を所定の範囲内で上下方向に移動可能に支持するピストン上下移動用ステージ２１と、このピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させるためのステージ昇降機構２２とを備え、制御用コンピューター４によってステージ昇降機構２２を所定のサイクルで駆動することにより、ピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させ、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の細胞組織Ｃにかかるように構成している。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を細胞組織Ｃに付与することができるようにしている。【００２３】
ピストン上下移動用ステージ２１を上下方向に移動させるためのステージ昇降機構２２は、例えば、電動アクチュエーター２２ａと、この電動アクチュエーター２２ａに接続され、ピストン上下移動用ステージ２１を吊り下げるワイヤー２２ｂとからなる。
そして、制御用コンピューター４の指令で電動アクチュエーター２２ａを操作することにより、ピストン上下移動用ステージ２１をワイヤー２２ｂを介して、ガイド部材２０に沿って上下方向に移動できるようにしている。【００２４】
そして、本例においては、ピストン上下移動用ステージ２１に載置したピストン載置用ステージ２３を介して、複数（例えば、５個×５個の合計２５個）の荷重負荷用ピストン５を支持するようにしている。
この場合、ピストン上下移動用ステージ２１は、ピストン載置用ステージ２３を載置するためのものであるので、中央部に荷重負荷用ピストン５が自由に上下方向に移動できるようにするための孔部２１ａを形成するようにする。
これにより、種々の荷重負荷用ピストン５の支持を簡易に行うことができる。
なお、ピストン載置用ステージ２３を省略して、ピストン上下移動用ステージ２１に荷重負荷用ピストン５を直接支持するようにすることもできる。【００２５】
荷重負荷用ピストン５は、下端部に細胞組織Ｃに対応した形状の加圧部５１を、中間部にピストン載置用ステージ２３に形成した孔部２３ａに嵌挿されるガイド軸部５２を、その上部に大径部５３を、上端部に追加荷重重鎮５５を装着するための重鎮装着部５４を形成するようにする。
これにより、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態から、ピストン上下移動用ステージ２１を下方向に移動させ、図２（ｂ）に示すように、ピストン上下移動用ステージ２１の降下時に、荷重負荷用ピストン５の大径部５３によるピストン載置用ステージ２３への支持が解除されるようにして、荷重負荷用ピストン５の重量が培養容器３内の細胞組織Ｃに直接かかるようにする。
その後、ピストン上下移動用ステージ２１を上方向に移動させることによって、図２（ａ）に示すように、ピストン載置用ステージ２３に荷重負荷用ピストン５を支持した状態に復帰させる。
この荷重負荷用ピストン５による鉛直方向の荷重負荷刺激は、制御用コンピューター４の操作で荷重サイクル、荷重時間を自由に操作できる。
また、追加荷重重鎮５５は、必要に応じて、重鎮装着部５４に装着することができ、また、その重さも自由に設定できることから、細胞組織Ｃに付与する鉛直方向の荷重負荷刺激の大きさを簡易に調節することができる。【００２６】
また、荷重負荷用ピストン５の加圧部５１の形状は、細胞組織Ｃに対応した任意の形状とすることができ、さらに、図３に示す荷重負荷用ピストン５の変形例のように、細胞組織Ｃに対応した形状の加圧体５１Ａを別部材で形成し、荷重負荷用ピストン５の下端部５１Ｂに装着するようにすることもできる。
これにより、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を細胞組織Ｃに正確に付与することができる。【００２７】
また、荷重負荷用ピストン５が、上下方向に移動する際に、回転しないようにピストン載置用ステージ２３（又はピストン上下移動用ステージ２１）に支持するようにすることができる。
具体的には、ピストン載置用ステージ２３に形成した孔部２３ａを多角形に形成し、ガイド軸部５２をこの多角形の孔部２３ａに適合した多角形の断面形状を有するように形成する。
これにより、荷重負荷用ピストン５の下端部５１Ｂに細胞組織Ｃに対応した形状（円形以外）の加圧体５１Ａを装着するようにした場合等でも、地上における生体内で組織に生じている鉛直方向の荷重負荷刺激と同様の刺激を細胞組織Ｃに正確に付与することができる。【００２８】
培養容器３は、力学的負荷刺激付与装置２の培養容器固定ステージ２４に着脱可能に装着するようにする。
これにより、種々の培養容器３の装着を簡易に行うことができる。
また、培養容器３には、必要に応じて、培地槽（注入用）３２と、培地槽（排出用）３３とを接続し、培地の注入及び排出を制御用コンピューター４によって制御するようにすることもできる。【００２９】
また、培養容器３を水平面内で移動又は振動させる剪断応力負荷機構２６を設けるようにしている。
具体的には、培養容器固定ステージ２４上に、培養容器固定ステージ２４に対して水平面内で移動可能に剪断応力ステージ２５を配設し、この剪断応力ステージ２５上に培養容器３を装着するようにするとともに、剪断応力ステージ２５を、剪断応力負荷機構２６により水平面内で移動又は振動させるようにする。
なお、水平面内で移動又は振動の方向は、１方向に限定されず、Ｘ、Ｙ方向の２方向や円運動等、任意の方向とすることができる。
剪断応力負荷機構２６としては、例えば、電動アクチュエーターや永久磁石と電磁石を組み合わせた移動機構又は振動機構を用いることができ、この剪断応力負荷機構２６の駆動は、制御用コンピューター４によって制御するようにする。
これにより、地上における生体内で組織に生じている横方向の剪断応力刺激、例えば、膝関節に屈曲、伸展の運動時に加わる刺激と同様の刺激を細胞組織Ｃに付与することができる。
この場合、荷重負荷用ピストン５による培養容器３内の細胞組織Ｃへの鉛直方向の荷重負荷刺激の付与方法を調整しながら、剪断応力負荷機構２６によって培養容器３を水平面内で移動又は振動させることにより、斜め方向の剪断応力刺激を付与するようにすることもできる。【００３０】
培養容器３内には、図２（ｂ）及び図４に示すように、細胞組織Ｃに適合した任意の形状の内部培養容器３０を設置し、この内部培養容器３０の荷重負荷用ピストン５の加圧部５１と相対する位置に受容基３１を装着し、受容基３１の上に細胞組織Ｃを載置するようにする。
図３に示す荷重負荷用ピストン５の加圧体５１Ａ及び図４に示す内部培養容器３０の受容基３１は、細胞組織Ｃに適した形状とすることができ、細胞組織Ｃに鉛直方向の荷重負荷刺激と、横方向の剪断応力刺激を、それぞれ付与することができるようにしている。【００３１】
次に、本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法のより具体的な実験例について説明する。【００３２】
［実験１］
［実験方法］
図５に示すように、ヒト膝関節由来滑膜をコラゲナーゼ処理し、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）添加ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）培養液にて単層培養を行い、接着細胞を幹細胞として継代した培養細胞（１×１０７個）をコラーゲン溶液とともにスポンジ状のコラーゲン細胞担体（collagen scaffold）（直径９ｍｍ、高さ４ｍｍ）に播種し、三次元形状の細胞組織を作製し、光顕、電顕にて形態学的観察を行った。
５日間培養した後、図６に示すように、上記力学的負荷刺激付与装置を用いて、最大負荷量１０ｋＰａ又は３０ｋＰａ、０．５Ｈｚの鉛直方向の荷重負荷刺激を１時間／日×５日間与えた（１０ｋＰａ、３０ｋＰａ負荷群）。
細胞組織の変化は、負荷前、無負荷を対照群とし、４群で組織学的観察、ＴＵＮＥＬ染色、Ｔｏｔａｌ  ＤＮＡ量、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９等の遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて検出することにより測定することができる。
この場合、上記遺伝子発現の検出方法には、ノーザンブロット法やリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法等を用いることもできる。
また、細胞組織の変化は、同様に、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９等の蛋白発現を、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＺＡ法、免疫組織化学法等を用いて検出することにより測定したり、発現酵素活性、組織学的変化、力学的強度変化、細胞死（アポトーシス）等の各種指標を用いて測定することができる。【００３３】
［実験結果と考察］
図７〜図９に示すように、滑膜由来幹細胞は、単層培養で紡錘形又は多角形を示し、電顕にて細胞内にオスミウム濃染封入体を多数認めた。
三次元形状の細胞組織内では、細胞は均一に分布し、電顕にてゲル内の細胞は丸く突起も短く、コラーゲン細胞担体と接した細胞は接着面が広がっていた。
力学的負荷刺激にて組織内ＤＮＡ量は変化なく、ＴＵＮＥＬ陽性細胞は４群とも１０％以下で有意差はなかった。
ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＩＭＰ−１のｍＲＮＡ発現を認め、前３者では１０ｋＰａ負荷群での発現上昇をみた。【００３４】
［結論］
ヒト滑膜由来幹細胞とコラーゲン細胞担体よりなる三次元形状の細胞組織は、鉛直方向の繰り返し荷重負荷刺激を与えることにより遺伝子発現に変化が認められた。
これらの遺伝子発現の変化は、変形性関節症でみられる変化に類似したものであった。
このことから、細胞組織にスクリーニング対象の薬剤を添加することにより、当該薬剤の評価を行うことができるものと考えられる。【００３５】
［実験２］
ヒアルロン酸は、骨髄由来幹細胞の軟骨細胞の分化を促進することや、抗炎症作用、軟骨保護作用等があること、さらには、間葉系幹細胞からの軟骨修復に対して効果があること等が知られており、臨床的に変形性関節症に対して既に用いられている。
そこで、ここでは、ヒト滑膜由来培養細胞を用いた三次元培養組織への力学刺激下での軟骨分化にヒアルロン酸を添加し、その作用を検討することにより、ヒアルロン酸の評価と併せて、本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法の評価を行うこととした。【００３６】
［実験方法］
１．ヒト滑膜由来幹細胞と三次元培養組織の構築方法
ヒト滑膜組織を用いて、０．２％コラゲナーゼ酵素処理により得られた細胞を、１０％ＦＢＳ（fetal bovine serum）添加ＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）培養液にて培養した接着細胞を６継代増殖培養した幹細胞を用いた。このようにして培養した１×１０７個の細胞を２％アテロコラーゲン溶液０．５ｍＬに氷上で混和し、別に作製したアテロコラーゲン溶液を凍結乾燥して架橋を導入した細胞が入るポア構造をもつ直径９ｍｍ、高さ４ｍｍのディスク状のコラーゲンスキャフォールドに細胞播種し、３７℃に加温してゲル化し、最終細胞濃度１×１０７／ｍＬの三次元組織を作製した。このヒト滑膜由来細胞からなる三次元培養組織を１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培養液中で５日間、４８ウェル培養皿を用いて静置培養を行った。
２．繰り返し力学刺激培養方法
上記の三次元培養組織を力学刺激下で培養するため、上記力学的負荷刺激付与装置を用いて、変形を伴う鉛直圧縮刺激を与えた。
与えた刺激は、５ｋＰａ又は２０ｋＰａの荷重を０．５Ｈｚで、１日１時間、連続して５日間又は１５日間培養を行った。ここで、５ｋＰａ又は２０ｋＰａの荷重量は、三次元培養組織に対し、それぞれ約５％又は約１５％の変形を与える荷重量であり、比較的軽い負荷及び過負荷として用いた。なお、培養液は、毎日、力学刺激を与える前に交換した。
３．ヒアルロン酸添加下の力学刺激培養方法
分子量６００〜１、２００ｋＤａのヒアルロン酸ナトリウムを培養液に最終濃度１０００μｇ／ｍＬとなるように溶解し、三次元培養組織作製直後から培養液に加えた群（ＨＡ添加群）と、ヒアルロン酸を添加しない群（ＨＡ非添加群）を作製し、それぞれ５日間静置培養後に５日間の力学刺激（１０日培養群）又は５日間の静置培養後に１５日間の力学刺激（２０日培養群）を行った。各群３個の培養組織を作製した。
４．力学刺激による効果の評方法価
繰り返し力学刺激を与えることによる効果をみるために、力学刺激終了後直ちに培養上清を採取し、凍結保存した後に、ヒアルロン酸濃度とＧＡＧ含量を測定した。
三次元培養組織は、ヘマトキシリン・エオジン染色による組織学的観察と、ＤＮＡ含量及び組織からｍＲＮＡを抽出して逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを作製し、ＲＴ−ＰＣＲ法にてｍＲＮＡを検出した。ｍＲＮＡ量は、Ｇ３ＰＤＨに対するバンド濃度を画像解析ソフトを用いて半定量化した。【００３７】
［実験結果と考察］
１．ヒアルロン酸添加による組織学的変化
ヒト滑膜由来幹細胞は、コラーゲンゲルとコラーゲンスキャフォールドにより三次元組織内に比較的均一に分布した。細胞は、球状の形態を示し、ヒアルロン酸添加群では、培養１０日、２０日群ともにヒアルロン酸非添加群に比して、大きな細胞が集簇するのがみられた（図１０）。細胞周囲のヘマトキシリンに濃く染色される細胞外マトリックスが多かった。力学刺激によるコラーゲンスキャフォールドの物理的破断はみられなかった。
２．力学刺激とヒアルロン酸添加によるＤＮＡ含量の変化
１つの三次元培養組織当たりのＤＮＡ含量はヒアルロン酸添加群とヒアルロン酸非添加群、また、１０日培養群と２０日培養群ともに、有意な差を認めなかった（図１１）。
３．遺伝子発現
力学刺激によるアグリカンの遺伝子発現は、ヒアルロン酸非添加群では５ｋＰａでは変化なかったが、２０ｋＰａにて約２．７倍に上昇した。一方、ヒアルロン酸添加により、５ｋＰａ負荷群、２０ｋＰａ負荷群ともに、５倍から７倍上昇した。Ｓｏｘ９の遺伝子発現は、ヒアルロン酸添加群で５ｋＰａ負荷群でわずかに上昇し、２０ｋＰａ負荷群ではヒアルロン酸添加群、非添加群ともに遺伝子発現量が充進した（図１２）。さらに、real time ＲＴ−ＰＣＲによる定量的遺伝子発現解析により、ＣＤ４４、ＴＧＦ−β１は、５ｋＰａ負荷群で、ＨＡＳ（ヒアルロン酸合成酵素）２遺伝子発現は２０ｋＰａ負荷群にて、ｍＲＮＡ量が上昇していた（図１３）。
４．培養上清中のヒアルロン酸濃度及びＧＡＧ含量計測
培養上清中のヒアルロン酸濃度は、ヒアルロン酸非添加で力学刺激無負荷、５ｋＰａ負荷群では変化はなかったが、２０ｋＰａ負荷群で培養１０日目から２０日にかけて上昇した。ヒアルロン酸を添加することにより、２０ｋＰａ負荷群では培養２０日に有意に上昇した（図１４）。培養上清中のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）量は、ヒアルロン酸非添加群では培養１０日目と２０日目に差は認められなかったが、ヒアルロン酸添加により、５ｋＰａ、２０ｋＰａ群ともに上昇した（図１５）。【００３８】
［結論］
ヒアルロン酸は、既に変形性関節症に対し関節内投与により臨床使用の実績がある薬剤であり、その薬理作用は、in vitroでは滑膜細胞への抗炎症作用や軟骨細胞の生化学的ストレスに対するＮＯ産生抑制等が知られている。
そして、本実験により、今回、コラーゲンを担体とする滑膜由来幹細胞を用いて三次元培養を行い、細胞増殖や三次元組織の組織学的な破壊等に影響を与えない強度の繰り返し力学刺激を与えることにより、アグリカンやＳｏｘ９等の軟骨分化に関する遺伝子発現が上昇し、ＣＤ４４、ＴＧＦ−β１、ＨＡＳ２遺伝子発現が上昇し、培養上清中のヒアルロン酸量やＧＡＧ量が増大することを見出した。
このことは、ヒアルロン酸が軟骨に分化しうる幹細胞組織において、繰り返し力学刺激を与える環境下ではオートクリン（autocrine）、パラクリン（paracrine）のメカニズムにより、ヒアルロン酸産生を促進し、軟骨分化に促進的に働く可能性が考えられた。このことは、組織工学を用いた軟骨修復において、体外での間葉系幹細胞から軟骨分化において力学刺激とヒアルロン酸を用いた治療への応用のみならず、体内で幹細胞からの軟骨分化において力学刺激下にヒアルロン酸を用いることにより、よりよい軟骨治療に利用できる可能性を示していると考えられる。
また、薬効が確認されているヒアルロン酸を用いて行った本実験により、本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法が、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングに用いることができることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニング方法は、in vitroで力学的負荷による細胞組織の生物反応を観察しながら、退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングを行うことができることから、関節疾患、心筋等の筋疾患、血管疾患を始めとする疲労性疾患等の退行性疾患の予防用又は治療用の薬剤のスクリーニングを容易に行うことができるとともに、その信頼性を高めることができ、これらの予防用又は治療用の薬剤の開発に好適に利用することができる。
【図１】
2008096842.tif 000003
【図２】
2008096842.tif 000004
【図３】
2008096842.tif 000005
【図４】
2008096842.tif 000006
【図５】
2008096842.tif 000007
【図６】
2008096842.tif 000008
【図７】
2008096842.tif 000009
【図８】
2008096842.tif 000010
【図９】
2008096842.tif 000011
【図１０】
2008096842.tif 000012
【図１１】
2008096842.tif 000013
【図１２】
2008096842.tif 000014
【図１３】
2008096842.tif 000015
【図１４】
2008096842.tif 000016
【図１５】
2008096842.tif 000017
【国際調査報告】
2008096842.tif 000018
2008096842.tif 000019