(57)【要約】  本発明はコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の蓄積を検討する例として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの側鎖であるアセチルガラクトサミンの硫酸基転移酵素であるN-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase:N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase-1, N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase-2, N-acetylgactosamine-4-sulfate 6-O-sulfotransferase（GalNAc4ST-1, GalNAc4ST-2, GALNAC4S-6ST）のsiRNAと側鎖であるコンドロイチン硫酸の分解酵素であるコンドロイチナーゼABCによる治療であり、異常タンパク質の蓄積に伴いニューロンの細胞死を誘発する神経線維性変性疾患の遺伝子治療又は予防に好適な、神経線維性変性抑制剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、神経線維性変性抑制剤。
【請求項２】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
脳においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
神経線維性変性疾患の治療用または予防用の、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
前記神経線維性変性疾患が脳脊髄神経または末梢神経線維性変性疾患である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記神経線維性変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、または多発性硬化症である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項１０】
被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、神経線維性変性抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
【請求項１２】
前記神経線維性変性抑制剤が、神経線維性変性疾患の治療用または予防用である、請求項１０または１１に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG:Chondroitin Sulfate Proteoglycans）の蓄積制御に基づく神経線維性変性疾患の治療薬と予防薬、神経線維性変性の抑制方法、及び該方法に基づくアルツハイマー病（AD:Alzheimer's disease）やパーキンソン病（PD:Parkinson's disease）、また筋萎縮性側索硬化症（ALS：Amyotrophic Lateral Sclerosis）等を含む神経線維性変性疾患の治療又は予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経線維性変性疾患における脳神経線維性変性疾患はニューロンの細胞死による減少から生じる難病として認識されている。そして、この神経線維性変性疾患には大きく記憶と痴呆に関する症状、また動作に関する症状を表す二つのグループに分けられる。代表的な例として、前者はアルツハイマー病が挙げられ、後者はパーキンソン病が挙げられる。アルツハイマー病は、全世界で1800万人以上の患者で20年後では3400万人へと増加すると予測されている（国際アルツハイマー病協会：ADI）。現在、日本全国では少なくとも30万人の患者であと４年後の2010年には80万人を超すと推測されている。この疾患は遺伝子解析と統計学的では男性より女性に多く発症することが多く、高齢者に多く見られる病気である（丸美屋和漢薬研究所の調査）。【０００３】
アルツハイマー病には遺伝的に発症する家族性アルツハイマー病とアミロイドβペプチド（Aβ）の産生やその分解に関与する因子の不具合により引き起こされる代謝バランス（アセチルコリンの減少）の異常による孤発性アルツハイマー病の二種類が存在する。どちらの因子においてもAβの脳内蓄積の根本原因によるもので、神経細胞に老人班が現れてくる症状である。Aβはアミロイド前駆体タンパク質（APP:Amyloid precursor protein）からプロテアーゼで切り出されることによって生成され、β-シート構造の割合が増加して不溶、凝集することが報告されている。また、近年の大きな発見としてアミロイドの蓄積を防ぐ分解酵素であるネプライシンの同定がなされ、この活性が減少すると脳内にAβの蓄積が多くなることが実証された。これに付随して、アデノウイルスによるネプライシンの脳内発現を起こし脳内のAβ量の減少を確認した報告がある（非特許文献１）。さらに、アルツハイマー病の危険因子としてアポリポタンパク質（アポE）を発現する遺伝子が大きく関わっていることが報告されている（非特許文献２）。以上の知見以外にも様々な要因に対して精力的に研究されいくつかの原因タンパク質や遺伝子の変異等が見つかっている。その例として、高度にリン酸化されているタウタンパク質の蓄積による神経原線維変性とアミロイド前駆体タンパク質（APP:Amyloid precursor protein）とプレセニリン１および２をコードする遺伝子の変異によりAβの蓄積を促進することが報告されている（非特許文献３）。上記のように多数の研究報告がされているが、まだ日本国内で発売が認められているアルツハイマー病の治療薬は塩酸ドネペジル（商品名：アリセプト）しかなく、アルツハイマー病の症状には痴呆の進行を約９ヶ月遅らせる効果があるものの認知機能の回復を促す効果はない。この治療薬は記憶や学習に関係している神経伝達物質であるアセチルコリンを分解する酵素のアセチルコリンエステラーゼを阻害することにより脳内において減少したアセチルコリン濃度を高める目的のものである。塩酸ドネペジルはアルツハイマー病の根治薬としての役割を持たず軽度の患者にのみ投与されるといった薬でしかない。現在、アルツハイマー病に関して各研究機関において病気の発症因子を発見するため動物モデルを作製し、試行錯誤しているが多種の因子が関わっているためにまだ決め手となるような治療法や治療薬は確立されていない。【０００４】
次に、中枢神経線維性変性疾患のうちアルツハイマー病の患者数よりは少ない疾患であるが難病疾患として挙げられているパーキンソン病がある。これは、中脳の黒質として知られている脳の一部に存在するドーパミンニューロンの細胞死が原因となりドーパミン（黒質内のニューロンにて作られる神経伝達物質）の量が減少し、もう一つの神経伝達物質であるアセチルコリンとのバランスが崩れアセチルコリンが相対的に多くなることにより引き起こされる病気で、その症状としては振戦（ふるえ）、筋肉の固縮、動作の緩慢および姿勢保持障害と言われる4大症状がある。日本において、この病気は男女比1：1.5〜2でやや女性に多い傾向があり30代〜80代といった幅広い年齢層で発症されている。現在の患者数は、人口10万人に対して100人前後の割合（厚生科学審議会疾病対策部会難病対策委員会議事録）で発症しており日本全国で約12万人の患者がいると推測されている。また、その全体の5〜10％が遺伝性パーキンソン病として占めている。現在、病因究明の研究が世界各国で盛んに進んでおり、家族性パーキンソン病の患者における遺伝子の解析の結果から、その原因遺伝子としてα-synuclein（タンパク質のフォールディングの異常と蓄積）、parkin（タンパク質分解システムとミトコンドリア機能）、PINK1（ミトコンドリア機能）、DJ-1（酸化ストレス）、LRRK2（リン酸化）が同定されているが、これらの遺伝子がどのようにパーキンソン病に関与しているのかについてはまだ解明されていない。また、脳内におけるミスフォールディングや凝集した蛋白質の蛋白分解機構に関わる遺伝子の突然変異により蛋白質の蓄積が神経線維性変性疾患の要因であるという研究が報告されている（非特許文献４〜８）。近年、上述の他に報告されている神経線維性変性疾患としてポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病そして多発性硬化症などがあるがこれらも異常タンパク質の蓄積による小胞体ストレスが神経細胞を死に至らせることが報告されている。本来、異常タンパク質はタンパク質分解システム（UPR: unfolded protein response, ERAD: ER associated degrdation, ユビキチン-プロテアソーム）により分解され排除されるが、過剰な異常タンパク質に対しては十分な反応ができず細胞は細胞死のシグナルを発するようになる（非特許文献９）。このように細胞内では複雑なシグナル伝達が起こり様々な経路を経て神経線維性変性を誘導させている。そこで、各々の疾患においてシグナル伝達等の研究が行われているがどれも複雑でシグナル伝達に対する治療薬の開発は困難を極めている。【０００５】
現在、多種の神経線維性変性疾患における治療の中ではパーキンソン病における治療が進んでおり、運動理学療法、外科的治療と薬物療法に分けられているが、薬物療法が一般に広く用いられている。特に、振戦や他の症状に最も効果があるL-ドーパ（ドーパミンの前駆体）、ドーパミン受容体刺激薬（L-ドーパ効果の上昇）、抗コリン薬（アセチルコリン抑制剤）、ドーパミン放出促進薬、ノルアドレナリン補充薬（すくみ現象の対処薬）、ドーパミン分解阻害剤（MAO-B阻害剤、COMT阻害剤）などが症状に合わせて使用されている。しかしながら、これらの治療薬は根治薬としての働きは無く症状の緩和に対する薬として用いられている。また、長期投与によりさまざまな問題が現れてくる場合が確認されている。例えばL-ドーパの場合5-10年といった長期投与によって、wearing off現象（薬効時間の短縮）、on-off現象（薬効喪失）、ジスキネジア（不随意運動）、幻覚・妄想などの精神症状が出現する。これから更なる高齢化社会になりつつある現在、これまでとは全く違った視点、つまり薬物治療による一時的な症状の緩和だけではなく、病気の根本となる原因を探り阻止するようなメカニズムで安全性に優れ、有効的に阻止又は副作用を抑制させることが出来る新しい薬剤の開発が切望されている。現在、脳神経疾患は世界中の中枢となる研究所を中心として研究が進められている。そして様々な創薬が考えられていて、最近では「脳の遺伝子治療」が根本的な治療法のひとつとして期待を集めている（非特許文献10〜12）。【０００６】
ここで、上述の神経線維性変性疾患治療の為に着目したプロテオグリカンは、コア蛋白質と呼ばれる蛋白質に、1本以上のグリコサミノグリカン（GAG）鎖が共有結合した構造をもつ分子で、GAG鎖の特異的な糖鎖構造がプロテオグリカンの多彩な機能を担うと考えられており、プロテオグリカンはGAG鎖の種類に基づいて、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG:chondroitin sulfate proteoglycans）、デルマタン硫酸プロテオグリカン（DSPGs:dermatan sulfate proteoglycans）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPGs:heeparan sulfate proteoglycans）、ケタラン硫酸プロテオグリカン（KSPGs:keratan sulfate proteoglycans）と4つに大別される。（非特許文献13〜19）この中で、HSPGsに関しては、多彩なサイトカイン、接着分子、ケモカインと結合し、その機能を大きく修飾するため幅広く研究されてきた。脳内における働きとして、HSPGsとコア蛋白質から側鎖として伸長しているGAG鎖は非線維化アミロイドβ-プロテインを神経毒性線維化アミロイドβ-プロテインに転換、そして蛋白分解機構に逆らいアミロイドβ-プロテイン（Aβ）を保護するという報告がある（非特許文献20〜22）。同様に、ヘパラン硫酸プロテオグリカンとグリコサミノグリカンはパーキンソン病の病因として最も有力視されているα-synucleinをも線維化するのではないか、またアルツハイマー病の原因タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質（APP）をも変性させているのではないかと考えられている（非特許文献23）。【０００７】
一方、CSPGに関しては、胎生時期には必須分子で、各臓器に豊富に存在する。神経幹細胞の分化誘導剤（特許文献１）、ヒト／骨形成蛋白を用いる神経再生（特許文献２）、ヒト、骨形態形成蛋白を用いる神経再生（特許文献３）のような神経再生に関わる過程を制御している分子として考えられている一方、中枢神経系の損傷の治療（特許文献４）、神経組織の修復を促進するための材料および方法（特許文献５）や血管平滑筋細胞の治療阻害因子（特許文献６）などの様々な箇所における神経再生の阻害にも関与している。その例として、まず中枢神経の損傷時に発現してくる再生阻害物質であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン群としてニューロン、プレビカン、NG2が同定され（非特許文献24）、これらにコンドロイチナーゼABC（GAG鎖の一種であるコンドロイチン硫酸を選択的に除去する酵素）投与によりCSPGを分解して中枢神経の再生を促す（特許文献４）という報告例がある。また、このCSPGの発現において、パーキンソン病患者の脳内のレビー小体（LB：Lewy body）に蓄積していると報告されているがその生体内機能は未だ明らかとなっていない（非特許文献25）。また、脳内でのCSPG増加における意義もまだわかっていない（非特許文献23）。【０００８】
【特許文献１】特許公開2005-278641
【特許文献２】特許公開2005-007196
【特許文献３】特許公表平09-501932
【特許文献４】特許公表2005-526740
【特許文献５】特許公表2005-500375
【特許文献６】特許公表平08-510209
【非特許文献１】Iwata et al. J.Neurosci. (2004) 24(4) 991-998
【非特許文献２】Strittmatter, W.J et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90 8098-8102
【非特許文献３】Forman et al. Nat. Med. (2004) 10(10) 1055-1063
【非特許文献４】Matthew, J. F. Nature. review (2006) 7 306-318
【非特許文献５】Gsponer, J. et al. Protein Pept Lett. (2006) 13(3) 287-293
【非特許文献６】McNaught, K.S.P. et al. Neurobiol. Aging (2006) 27 530-545
【非特許文献７】Hattori, N. et al. Lancet. (2004) 364(9435) 722-724
【非特許文献８】Murakami, T. et al. Ann neurol. (2004) 55(3) 439-442
【非特許文献９】門脇寿枝et al.実験医学（2006）24, 10173-180
【非特許文献１０】Muramatsu、S. et al. Rinsho Shinkeigaku. (2005) 45 (11) 902-904
【非特許文献１１】Iwata. N. et al. J. Neurosci. (2004) 24(4) 991-998
【非特許文献１２】Hadaczek P, et al. Hum Gene Ther. (2006)17(3) 291-302
【非特許文献１３】Lindahl, U et al. (1972) In Glycoproteins (Gottschalk, A. ed)  pp. 491-517, Elsevier, New York.
【非特許文献１４】Oegema, T et al. J. Biol. Chem. (1984) 259 1720-1726
【非特許文献１５】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1988) 263 10168-10174
【非特許文献１６】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1992) 267 6027-6035
【非特許文献１７】De Waard et al. J. Biol. Chem. (1992) 267 6036-6043
【非特許文献１８】Moses, J, Oldberg et al. Eur. J.Biol. (1992) 248 521-526
【非特許文献１９】Yamada, S et al. Trends in Glycoscience and Glycotechnology,(1998) 10, 95-123
【非特許文献２０】Castillo、G. M. et al. J. Neurochem. (1997) 69 2452-2465
【非特許文献２１】Cotman, S. L. et al. Mol. Cell. Neurosci. 15 (2000) 183-198
【非特許文献２２】Snow, A.D. et al. Neurobiol. Aging (1989)10 481-497
【非特許文献２３】Horsen, J.V. et al. J. Alzheimers Dis.（2004）6 469-474
【非特許文献２４】Rhodes KE, Fawcett JW J. Anat. (2004) 204 33-48
【非特許文献２５】DeWitt, D.A. et al. Brain Res. (1994) 656 205-209
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、神経線維性変性抑制剤、および該薬剤を有効成分とする神経線維性変性疾患の治療剤、並びに、神経線維性変性抑制剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、そのような薬剤を開発するため鋭意研究を重ねるうち、これまで神経線維性変性疾患の病因とはされていなかったCSPGの過剰な蓄積が、ニューロンの死やシナプスの欠損（アルツハイマー病）、ドーパミンニューロンの細胞死（パーキンソン病）、また運動ニューロンの変性（筋萎縮性側索硬化症）を促進させる他にも、多種の神経線維性変性疾患の因子に働いているのではないかと考えた。本発明者らは、この考えに基づいて神経線維性変性疾患の一つであるパーキンソン病モデルマウスでの研究を進めた結果、CSPGの硫酸基転移酵素のうちGalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6STの遺伝子らをsiRNAによってノックダウンする処置、または、コンドロイチン硫酸における糖鎖を除去するコンドロイチナーゼ（コンドロイチネース）ABCによる処置により、ドーパミンニューロンにおけるCSPG過剰発現または過剰蓄積が抑制し、グリア細胞におけるアストロサイトの役割である神経細胞機能制御が活発化することを見出した。その他にも、線維化細胞の浸潤を抑制し、ドーパミンニューロンの細胞死を防ぎドーパミン合成酵素であるチロシンハイドロキシラーゼ（TH：Tyrosine hydroxylase）の分泌を顕著にさせ、パーキンソン病の症状を治療することを見出した。即ち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積あるいは生合成を阻害することによって、神経線維性変性を抑制させることができることを実証し、本発明を完成させた。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質は、神経線維性変性抑制剤として有用である。また、該薬剤は、神経線維性変性疾患の治療もしくは予防のための薬剤となる。【００１１】
上述したコンドロイチン硫酸を分解するコンドロイチナーゼABCと硫酸化転移酵素のノックダウンを概念としたsiRNAを用いてプロテオグリカン蓄積を制御し、脳神経線維性変性疾患における病態変化を観察した実際の臨床治療は報告されていない。今回、その一例としてコア蛋白質からのらせん状側鎖を伸長するグリコサミノグリカンに対して硫酸化転移酵素であるN-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase:N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferae-1, N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase-2, N-acetylgactosamine-4-sulfate 6-O-sulfotransferase（GalNAc4ST-1, GalNAc4ST-2, GALNAC4S-6ST）のsiRNAとコンドロイチン硫酸の分解酵素であるコンドロイチナーゼABC投与に着目しその実施例を示す。【００１２】
本発明は、神経線維性変性抑制剤、および該薬剤を有効成分とする神経線維性変性疾患の治療剤、並びに、神経線維性変性抑制剤のスクリーニング方法等に関し、より具体的には、
〔１〕  コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、神経線維性変性抑制剤、
〔２〕  前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔３〕  前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔４〕  前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔５〕  前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔６〕  脳においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬剤、
〔７〕  神経線維性変性疾患の治療用または予防用の、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の薬剤、
〔８〕  前記神経線維性変性疾患が脳脊髄神経または末梢神経線維性変性疾患である、〔７〕に記載の薬剤、
〔９〕  前記神経線維性変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、または多発性硬化症である、〔７〕に記載の薬剤、
〔１０〕  被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、神経線維性変性抑制剤のスクリーニング方法、
〔１１〕  以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、〔１０〕に記載のスクリーニング方法、
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
〔１２〕  前記神経線維性変性抑制剤が、神経線維性変性疾患の治療用または予防用である、〔１０〕または〔１１〕に記載のスクリーニング方法、
を、提供するものである。
さらに本発明は、以下に関する。
〔１３〕  〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤の、神経線維性変性抑制剤の製造における使用、
〔１４〕  〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤を、個体（患者等）へ投与する工程を含む、神経線維性変性疾患の治療方法、
〔１５〕  〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤および薬学的に許容された担体を含んでなる組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、神経線維性変性の発症にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積が関係していることが明らかになった。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積を阻害することにより神経線維性変性が抑制されることが示された。これまでにない新しいコンセプトの神経線維性変性疾患の治療薬が提供できることになる。特に神経線維性変性は現代社会で患者数が増大している、パーキンソン病、アルツハイマー病などと密接に関連しており、新しいコンセプトの治療薬剤は医療上また産業上も重要な意義を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6 tetrahydropyridine（MPTP）によって誘導されたパーキンソン病（Parkinson's disease）モデルマウスにおける未治療群、コンドロイチナーゼABC、GalNAcST siRNA処置群における8日目（最終日）のRT-PCRによるβ-actin、GalNAc4ST-1とGALNAC4S-6STの発現を検討した写真である。
【図２】MPTPによって誘導されたパーキンソン病モデルマウスにおける未治療群、GalNAcST siRNA処置群とコンドロイチナーゼABC処置群におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の脳内における沈着について示した写真である。
【図３】MPTPによって誘導されたパーキンソン病モデルマウスでの未治療群、GalNAcST siRNA処置群とコンドロイチナーゼABC処置群におけるF4/80陽性炎症性マクロファージの浸潤について示した写真である。
【図４】MPTPによって誘導されたパーキンソン病モデルマウスにおける未治療群、GalNAcST siRNA処置群とコンドロイチナーゼABC処置群における脳内の線維芽細胞について示した写真である。
【図５】MPTPによって誘導されたパーキンソン病モデルマウスでの未治療群、GalNAcST siRNA処置群とコンドロイチナーゼABC処置群においてグリア細胞のアストロサイトについて示した写真である。
【図６】MPTPによって誘導されたパーキンソン病モデルマウスでの未治療群、GalNAcST siRNA処置群とコンドロイチナーゼABC処置群におけるチロシンハイドロキシラーゼ（TH：Tyrosine hydroxylase）の分泌について示した写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
代表的な神経線維性変性疾患の一つであるパーキンソン病に伴う病態として、脳の神経細胞におけるマクロファージ・線維芽細胞などの浸潤などによる線維化などの変性状態がある。本発明者らは、脳の神経細胞における変性状態の改善をパーキンソン病治療の有効な方法の一つとするため、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの機能に着目した。そして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積を抑制する状態をパーキンソン病モデルマウスにおいて作出し、詳細に解析したところ、野生型の脳の神経細胞に比してコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積が改善している細胞が多数観察されるとともに、炎症状態などが改善された。即ち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害すると、パーキンソン病に深く関与している脳の神経細胞におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの異常蓄積状態の改善が促進され、神経線維性変性の改善につながることを見出した。【００１６】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、神経線維性変性抑制剤に関する。【００１７】
本発明の「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、プロテオグリカンの一つであり、代表的な硫酸化ムコ多糖であるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸とタンパク質（コアタンパク質）との共有結合化合物の総称である。本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質（ホモログ・オルソログ等）も本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」に含まれる。例えば、ヒトコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに相当するタンパク質を有し、かつ、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは可能である。また本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンには、炎症などで一時的にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合しプロテオグリカンになるもの、いわゆるパートタイムプロテオグリカンも含まれる。【００１８】
以下の記載において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして、aggrican、versican、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbを例示する。本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンはこれらに限られず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を持つ物質であればよい。ここでコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの活性とは、例えば細胞接着能、または細胞増殖促進などが挙げられる。当業者は次のような方法でコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を評価することができる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのアミノ酸配列の一部の領域を含むタンパク質、または一部の領域と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有するタンパク質の存在下で腫瘍細胞（例えばCaco-2、HT-29細胞など）の分裂増殖を測定する。分裂増殖を促進する効果を持つタンパク質をコンドロイチン硫酸プロテオグリカン活性を有するタンパク質として判定できる（Int J Exp Pathol. 2005 Aug;86(4):219-29およびHistochem Cell Biol. 2005 Aug;124(2):139-49）。ここで高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上（例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上）の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7）によって決定することができる。【００１９】
本発明における「神経線維性変性」とは、神経組織における異常状態を指す。例えば、線維化を生じている状態、炎症を生じている状態、線維芽細胞・炎症細胞などが浸潤している状態、神経組織中の特定の細胞種の脱落・細胞死を起こしている状態などが挙げられるが、これらには限られない。【００２０】
本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する」とは、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」、「合成阻害」、「脱硫酸化」、「硫酸化阻害」などが挙げられるが、これらには限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量、機能または活性が比較対象よりも低下または消失させることをいう。本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する物質」とは、特に制限されないが、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進作用を有する物質」、「合成阻害作用を有する物質」、「脱硫酸化作用を有する物質」、または「硫酸化阻害作用を有する物質」である。【００２１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」とは、たとえばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現の阻害・存在の減少が挙げられる。ここで「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質が挙げられる。また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばβglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質が挙げられる。これらはいずれも例示であり、これらに限らず広くコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質であればよい。【００２２】
「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、またはこれらの転写・翻訳によりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質が生成されることを意味する。また、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の機能」とは、例えば、該タンパク質がコンドロイチン硫酸と結合する機能や、その他の細胞中の構成要素との結合等を挙げることができる。上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価（測定）することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。【００２３】
さらにまた、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素の発現の上昇であってもよい。これらの酵素の例としては、メタロプロテイナーゼ（例えばADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5など）やコンドロイチナーゼ、Calpain Iなどが挙げられるが、これらには限られない。また「分解促進」は、これらの酵素または酵素の一部の投与により生ずる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量の減少であってもよい。【００２４】
また「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現の抑制を促す物質の投与により生じるものであってもよい。これらの物質には例えばn-butylate、Diethylcarbamazepine、Tunicamycin、non-steroidal estrogen、Cyclofenil deiphenolなどが挙げられるが、これらには限られない。【００２５】
「分解促進作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸【００２６】
また「分解促進作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する低分子化合物【００２７】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「合成阻害」とは、たとえばグリコサミノグリカンの生合成の阻害、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成に関わる酵素の阻害などが挙げられるが、必ずしもこれらに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程のいずれかを阻害することを指す。【００２８】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を阻害する物質として、グリコサミノグリカンの生合成を阻害する物質としては、たとえば、β-D-xyloside、2-deoxy-D-glucose（2-DG）、ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate（ETDP）、5-hexyl-2-deoxyuridine（HUdR）などが挙げられる。これらをはじめとした物質によりグリコサミノグリカンの生合成が阻害され、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。【００２９】
一方、コンドロイチン合成に関わる酵素としては、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどが挙げられる。これらをはじめとした酵素を阻害、発現の抑制等を行うことにより、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。【００３０】
「合成阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸【００３１】
また「合成阻害作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する低分子化合物【００３２】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「脱硫酸化」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン中の硫酸基が除かれることを指し、例えば内在性あるいは外部から投与される脱硫酸化酵素による脱硫酸化、または硫酸化を抑制する化合物による硫酸化の抑制などが挙げられるが、これらに限られず、硫酸基が除去される過程を指す。【００３３】
脱硫酸化酵素としては、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseが挙げられる。また、硫酸化を抑制する化合物としては、たとえばChlorate、EGF receptor antagonistなどが挙げられる。【００３４】
「脱硫酸化作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸【００３５】
また「脱硫酸化作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質に対して、ドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化抑制タンパク質変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する低分子化合物【００３６】
ここで「脱硫酸化抑制化合物」は、タンパク質には限られず、例えば補酵素など非タンパク質化合物を含む。【００３７】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「硫酸化阻害作用」とは、例えば、硫酸基転移酵素の阻害が挙げられるが、これに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程に生じる硫酸化が阻害されることを指す。【００３８】
硫酸基転移酵素としては、例えば、C4ST-1（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1）、C4ST-2（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2）、C4ST-3（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3）、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などが挙げられる。【００３９】
「硫酸化阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸【００４０】
また「硫酸化阻害作用を有する物質」としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する低分子化合物【００４１】
上記例示した酵素は、一遺伝子に対応する一酵素を示すのみならず、ある特徴を共有する酵素群をも含む。例えばコンドロイチナーゼは、ムコ多糖分解酵素という特徴は共有するが基質特異性などの異なるABC、AC、Bなどの酵素の総称である。例えば、コンドロイチナーゼAC Iは、コンドロイチン硫酸類（A、CまたはE）、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸-デルマタン硫酸ハイブリッド型およびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-グルクロン酸残基を持つオリゴ糖を生成する。本酵素はデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B，ヘキスロン酸としてL-イズロン酸を持つもの）、ケタラン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンには作用しない。また、コンドロイチナーゼAC II は、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸CのN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、Δ4-不飽和二糖（ΔDi-0S、ΔDi-4SおよびΔDi-6S）を生成する。本酵素はヒアルロン酸にもよく作用する。デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B）には作用せず、本酵素の競合的阻害剤となる。コンドロイチナーゼB（デルマタナーゼ）は、デルマタン硫酸のL-イズロン酸に結合したN-アセチルガラクトサミニド結合を脱離反応的に切断し、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つオリゴ糖（2糖および4糖）を生成する。本酵素はL-イズロン酸を含まないコンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸Cには作用しない。デルマタン硫酸の硫酸基を除去した誘導体であるデルマタンは、この酵素の基質とはならない。デルマタン硫酸のL-イズロン酸単位の第2位が硫酸化されている箇所はこの酵素によってよりよく切断される。コンドロイチナーゼABCは、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、コンドロイチンおよびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つ二糖を主に生成する。本酵素はケタラン硫酸、ヘパリンおよびヘパラン硫酸には作用しない。コンドロイチナーゼはこのような、異なる性質を持っていながらもムコ多糖分解酵素という共通の性質を持つ酵素の総称であり、必ずしもここで例示したChondroitinase ACI、Chondroitinase AC II、Chondrotinase B、Chondroitinase ABCには限られない。【００４２】
また、このような特徴を共有する酵素群は、必ずしもゲノムDNA上の一遺伝子に対応するものではない。例えば、chondroitin-4-sulfatase、chondroitin-6-sulfataseは、ともにゲノムデータベース上の複数のアクセッション番号で参照される配列（例えばGenbankアクセッション番号NT_039500（その一部はアクセッション番号CAAA01098429（配列番号：８３）としてあらわされる）、NT_078575、NT_039353、NW_001030904、NW_001030811、NW_001030796、NW_000349）として公共遺伝子データベースGenbank上で検索される。【００４３】
上記に例示したもののうち個別の遺伝子に対応しているものは下記のように示される。すなわち、上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして例示した、aggrican、versican、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lb、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素として例示した、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Calpain I、コンドロイチン合成に関わる酵素として例示した、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylT、硫酸基転移酵素として例示した、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3、D4ST、C6ST-1、C6ST-2をそれぞれヒトにおいてコードする遺伝子の公共遺伝子データベースGenbankにおけるアクセッション番号、塩基配列、アミノ酸配列は、次の通りである。
aggrican（アクセッション番号NM_007424、塩基配列の配列番号：１、アミノ酸配列の配列番号：２）
versican（アクセッション番号BC096495、塩基配列の配列番号：３、アミノ酸配列の配列番号：４）
neurocan（アクセッション番号NM_010875、塩基配列の配列番号：５、アミノ酸配列の配列番号：６）
brevican（アクセッション番号NM_007529、塩基配列の配列番号：７、アミノ酸配列の配列番号：８）
βglycan（アクセッション番号AF039601、塩基配列の配列番号：９、アミノ酸配列の配列番号：１０）
Decorin（アクセッション番号NM_007833、塩基配列の配列番号：１１、アミノ酸配列の配列番号：１２）
Biglycan（アクセッション番号BC057185、塩基配列の配列番号：１３、アミノ酸配列の配列番号：１４）
Fibromodulin（アクセッション番号NM_021355、塩基配列の配列番号：１５、アミノ酸配列の配列番号：１６）
PG-Lb（アクセッション番号NM_007884、塩基配列の配列番号：１７、アミノ酸配列の配列番号：１８）
ADAMTS-1（アクセッション番号NM_009621、塩基配列の配列番号：１９、アミノ酸配列の配列番号：２０）
ADAMTS-4（アクセッション番号NM_172845、塩基配列の配列番号：２１、アミノ酸配列の配列番号：２２）
ADAMTS-5（アクセッション番号AF140673、塩基配列の配列番号：２３、アミノ酸配列の配列番号：２４）
Calpain I（アクセッション番号NM_007600、塩基配列の配列番号：２５、アミノ酸配列の配列番号：２６）
GalNAc4ST-1（アクセッション番号NM_175140、塩基配列の配列番号：２７、アミノ酸配列の配列番号：２８）
GalNAc4ST-2（アクセッション番号NM_199055、塩基配列の配列番号：２９、アミノ酸配列の配列番号：３０）
GALNAC4S-6ST（アクセッション番号NM_029935、塩基配列の配列番号：３１、アミノ酸配列の配列番号：３２）
UA2OST（アクセッション番号NM_177387、塩基配列の配列番号：３３、アミノ酸配列の配列番号：３４）
GalT-I（アクセッション番号NM_016769、塩基配列の配列番号：３５、アミノ酸配列の配列番号：３６）
GalT-II（アクセッション番号BC064767、塩基配列の配列番号：３７、アミノ酸配列の配列番号：３８）
GlcAT-I（アクセッション番号BC058082、塩基配列の配列番号：３９、アミノ酸配列の配列番号：４０、またはアクセッション番号NM_024256、塩基配列の配列番号：４１、アミノ酸配列の配列番号：４２）
XylosylT（アクセッション番号NM_145828、塩基配列の配列番号：４３、アミノ酸配列の配列番号：４４）
C4ST-1（アクセッション番号NM_021439、塩基配列の配列番号：４５、アミノ酸配列の配列番号：４６）
C4ST-2（アクセッション番号NM_021528、塩基配列の配列番号：４７、アミノ酸配列の配列番号：４８）
C4ST-3（アクセッション番号XM_355798、塩基配列の配列番号：４９、アミノ酸配列の配列番号：５０）
D4ST（アクセッション番号NM_028117、塩基配列の配列番号：５１、アミノ酸配列の配列番号：５２）
C6ST-1（アクセッション番号NM_016803、塩基配列の配列番号：５３、アミノ酸配列の配列番号：５４）
C6ST-2（アクセッション番号AB046929、塩基配列の配列番号：５５、アミノ酸配列の配列番号：５６）【００４４】
上記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつ、上記タンパク質が有する機能（例えば細胞内の構成成分と結合する機能等）を持つタンパク質は、本発明の上記タンパク質に含まれる。上記タンパク質とは、例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。【００４５】
本発明における上記遺伝子には、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトの上記遺伝子のホモログ等）が含まれる。【００４６】
また、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上（例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上）の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7）によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。【００４７】
当業者は、上記の高い相同性を持つタンパク質から、上記のタンパク質に機能的に同等なタンパク質を、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用、合成阻害作用、脱硫酸化作用または硫酸化阻害作用の活性測定方法を用いることにより適宜取得することができる。具体的な活性測定方法は、後出の本発明におけるスクリーニング方法の項にて記載される。また当業者においては、他の生物における上記遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、上記遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物における上記タンパク質および遺伝子に相当する上記タンパク質および遺伝子、あるいは、上述のタンパク質および遺伝子と機能的に同等な上記タンパク質および遺伝子も、単に上記の名称で記載する場合がある。【００４８】
本発明の上記タンパク質は、天然のタンパク質としてのほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質としては、例えば上記タンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、上記タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、例えば、上記タンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより、調製することが可能である。本発明の上記タンパク質は、例えば、後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。【００４９】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA（peptide nucleic acid）等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。【００５０】
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。【００５１】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素のいずれかをコードする遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有する内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば100塩基以上、または500塩基以上であってもよい。【００５２】
本発明のアンチセンス核酸は特に制限されないが、例えばVersican遺伝子の塩基配列（GenBankのアクセッション番号BC096495、配列番号：３）、C4ST-1（GenBankのアクセッション番号NM_021439、配列番号：４５）、C4ST-2（GenBankのアクセッション番号NM_021528、配列番号：４７）、C4ST-3（GenBankのアクセッション番号XM_355798、配列番号：４９）等をもとに作成することができる。【００５３】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。【００５４】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。【００５５】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y.& Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。【００５６】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。【００５７】
近年のゲノムプロジェクトの完了によってヒトの全塩基配列が解読され数多くの疾患関連遺伝子が盛んに同定されている現在、特定の遺伝子を標的とした治療法、創薬開発が盛んに実施されている。中でも特異的転写後抑制効果を発揮するsmall interfering RNA（siRNA）の遺伝子治療への応用が注目されている。RNAiは、2本鎖RNA（dsRNA）が直接細胞内に取り込まれると、このdsRNAと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖dsRNA（siRNA）を用いることにより、RNAiを誘導する事が可能で、RNAiは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。【００５８】
RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、dsRNAを細胞内に導入すると、そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。【００５９】
siRNAの設計にあたっては、ターゲットとしては上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば、Versican遺伝子の塩基配列（配列番号：３）、C4ST-1遺伝子の塩基配列（配列番号：４５）、C4ST-2遺伝子の塩基配列（配列番号：４７）、C4ST-3遺伝子の塩基配列（配列番号：４９）等をもとに作成することができる。より具体的には、その配列の一部の領域をターゲット候補とすることが可能であり、例えば、Versican遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５７）、C4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５８）、C4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５９）、C4ST-3遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６０）、C6ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６１）、C6ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６２）、GalNAc4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６３）、GalNAc4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６４）、GALNAC4S-6STの塩基配列の一部領域（配列番号：６５）等をもとに作成することができる。さらに具体的には、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：７１〜８２）を標的とするsiRNAが例示できる。【００６０】
siRNAを細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。【００６１】
また上記２本のRNA分子は、ここで一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA（shRNA）であってもよい。shRNAとは、ショートヘアピンRNA（short hairpin RNA）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子もまた本発明のsiRNAに含まれる。【００６２】
また本発明の好ましい態様としては、Versican、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）であって、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：７１〜８２）を標的とするsiRNAにおいて、例えば、１もしくは少数のRNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖RNAであっても、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明のsiRNAに含まれる。【００６３】
RNAi（siRNA）のために使用されるRNAは、上記タンパク質をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一（相同）である必要はないが、完全な同一（相同）性を有することが好ましい。【００６４】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。【００６５】
例えば、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子（siRNA）が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明の上述の遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。【００６６】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：７１に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：７１に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。【００６７】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖RNAである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の２本鎖RNAの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのsiRNAは、当業者においては市販の核酸合成機およびDICER酵素を用いて適宜作成することが可能であり、また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のsiRNAには、所謂「カクテルsiRNA」が含まれる。【００６８】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（RNA）でなくともよい。即ち、本発明において、siRNAを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。【００６９】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。【００７０】
また、本発明の発現阻害物質には、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現調節領域（例えば、プロモーター領域。具体的な例としては、PG-Lbのプロモーター領域である配列番号：６６で表される塩基配列が挙げられる。）と結合することにより、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また当業者においては、所望の化合物について、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するか否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。【００７１】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。【００７２】
本発明の上記ベクターの好ましい態様としては、Versican、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）を発現するベクターを挙げることができる。【００７３】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然の上述のタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素やその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素のタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【００７４】
本発明の抗体は、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合するものであれば特に制限はなく、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかにヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物であってもよい。【００７５】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質はその由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて適宜取得することができる。【００７６】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味する。【００７７】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。【００７８】
本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に対する抗体は、該タンパク質と結合することにより、該タンパク質の発現もしくは機能を阻害する効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型化抗体が好ましい。【００７９】
さらに本発明は、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素の機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。該低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。【００８０】
さらに本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する変異体（ドミナントネガティブタンパク質）を挙げることができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する該タンパク質変異体」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。このようなドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、コンドロイチン硫酸との結合を野生型Versicanコアタンパク質と競合阻害するようなVersicanコアタンパク質変異体を挙げることができる。【００８１】
また本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する臓器、組織または細胞は特に限定はされないが、好ましくは神経細胞を含む臓器、組織であり、より好ましくは脳、脳組織または脳組織における神経細胞である。【００８２】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する化合物は、神経線維性変性疾患の治療または予防のための薬剤となることが期待される。ここで「治療または予防」は、神経線維性変性を呈する臓器、組織、または細胞に対して、必ずしも完全な治療効果または予防効果を有する必要はなく、部分的な効果を有する場合であってよい。【００８３】
本発明において神経線維性変性疾患は、神経線維性変性を伴う疾患であれば特に限定はされないが、好ましくは脳神経線維性変性疾患であり、より好ましくは脳脊髄神経線維性変性疾患または末梢神経線維性変性疾患であり、さらに好ましくはパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、または多発性硬化症等を挙げることができる。【００８４】
本発明の神経線維性変性抑制剤は、神経線維性変性の原因であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害することにより神経線維性変性を抑制する作用を有する。従って、本発明の好ましい態様としては、例えば、本発明の神経線維性変性抑制剤を有効成分とする、脳神経線維性変性疾患治療剤、脳脊髄神経線維性変性疾患治療剤、末梢神経線維性変性疾患治療剤、パーキンソン病治療剤、アルツハイマー病治療剤、筋萎縮性側索硬化症治療剤、ポリグルタミン病治療剤、脊髄性筋萎縮症治療剤、ハンチントン病治療剤、または多発性硬化症治療剤を提供する。【００８５】
また本発明の「神経線維性変性抑制剤」は、「神経線維性変性治療剤」、「神経線維性変性阻害剤」、または「神経線維性変性改善剤」等と表現することも可能である。また、本発明において「抑制剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。【００８６】
なお、本発明における「治療」には、神経線維性変性の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、神経線維性変性発現細胞（組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。【００８７】
本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、吸入剤（ネブライザー）あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、頭蓋内投与注射剤、鼻腔内投与注射剤、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。【００８８】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。【００８９】
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。【００９０】
また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。【００９１】
また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。【００９２】
本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。【００９３】
また、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。siRNAやshRNAを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。神経線維性変性組織等に局所的に投与することもできる。siRNAに関して、in vitroにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、in vivoにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまう。それゆえ、生体内にて持続時間が限られることが問題となり最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例として、Ochiya, Tら（Ochiya,T et al. Nat. Med. (1999) 5 707-710; Ochiya,T et al. Curr.Gene Ther. (2001) 1 31-52）により生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありsiRNAのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されている。また別の例として、直接脳内にリポソームやウイルスを用いたデリバリーシステム等が開発されている（Xia, H et al. Nat. Biotechnol. (2002) 20 1006-1010; Brummelkamp, T. R. et al. Cancer Cell (2002) 2 243-247; Barton, G.M. and Medzhitov, R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2002) 99 14943-14945; Abbas-Terki, T. et al. Hum. Gene. Ther. (2002) 13 2197-2201）。そして、上記の方法等によりsiRNAが神経線維性変性疾患の遺伝子治療薬に向けて開発されている。その例としてBACE1（Beta-site APP Cleaving Enzyme: β-secretase）のsiRNAがin vivoのトランスジェニックマウスを用いてアミロイドの形成を減少させるために開発された。デリバリーシステムとしてはそのBACE1 siRNAをレンチウイルスのベクターに組み込み脳内で発現させる系にて報告されている（Singer et al. Nat. Neurosci. (2005) 8(10) 1343-1349）。これらはいずれも例示であり、本発明におけるデリバリー方法はこれらに限られない。【００９４】
本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり106〜1013個程度であり、1週〜8週間隔で投与される。【００９５】
また、siRNAまたはshRNAを目的の組織または器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。【００９６】
本発明の薬剤を使用する場合は、神経線維性変性を発現する疾患であれば適用部位もしくは疾患の種類は特に限定されず、例えば脳脊髄神経線維性変性疾患、末梢神経線維性変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、または多発性硬化症等を対象として適用される。上記疾患は、他の疾患と併発したものであってもよい。【００９７】
また本発明は、被検試料からコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする神経線維性変性抑制剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法によって、神経線維性変性抑制剤もしくは神経線維性変性抑制剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。【００９８】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、神経線維性変性抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用【００９９】
これらに共通したスクリーニングの基本的な原理として、代表的な例として、下記の工程を含むものが挙げられる。
（１）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）そのもの／もしくはグリコサミノグリカン（GAG）鎖／もしくはCSPGやGAG鎖を合成（生成）する細胞
（２）被検化合物（例えば、製薬企業の有する莫大な化合物ライブラリー）
（３）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の切断断面／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）量／遊離グリコサミノグリカン（GAG）量を検出する方法
上記3種のツールを用いる。（１）と（２）を試験管内、もしくは培養皿上で混合させ、その効果を（３）により簡便に検出するという手順が望ましい。【０１００】
以下、本発明のスクリーニング方法の態様を例示する。なお、以下に記載の態様においては、用いられるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、脱硫酸化酵素の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来するものが挙げられるが、これらに由来するものに特に制限されない。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一部とは、グリコサミノグリカン鎖、コアタンパク質などの構成要素またはその一部であり、特に限定されない。【０１０１】
また以下に記載の態様に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。【０１０２】
また以下に記載の態様における被検化合物への「接触」は、通常、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、その一部、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素を被検化合物と混合することによって行うが、この方法に限定されない。例えば、これらのタンパク質またはその一部を発現する細胞を被検化合物と接触させることにより、上記「接触」を行うことができる。【０１０３】
また以下に記載の態様における「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、それぞれの態様において用いられるタンパク質を発現するように形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。例えば、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを発現する細胞」としては、内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子を発現している細胞、または外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が発現した細胞は、通常コンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。【０１０４】
また以下の記載において、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質、また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばDecorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質である。また「合成酵素」は、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどである。また「硫酸基転移酵素」は、例えば、C4ST-1（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1）、C4ST-2（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2）、C4ST-3（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3）、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などである。また、「分解促進酵素」とは、例えば、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Chondroitinase ABC（ChABC）、Chondroitinase AC、Chondroitinase B、Calpain Iなどである。また「脱硫酸化酵素」は、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseなどである。【０１０５】
本発明のスクリーニング方法の態様として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用を有する化合物を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、存在量を低下させる物質を選択する工程【０１０６】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。【０１０７】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に結合する標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。【０１０８】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は神経線維性変性治療のための薬剤となる。【０１０９】
被検化合物が上記(a)分解促進作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。【０１１０】
上記(a) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用に関するスクリーニング方法態様：
CS-GAGとして、コンドロイチン硫酸A（CS-A）、CS-B、CS-C（生化学工業社、ICN社、Sigma社など）、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。【０１１１】
検出方法としては、例えばWFAレクチン（ノダフジレクチン）結合法が簡便な手法として挙げられる。WFAレクチンはCS-GAG鎖のGalNAc残基に結合するため、CS-GAGを簡便に検出できる。被検化合物の陽性コントロールとしてはコンドロイチナーゼABCを使用する。コンドロイチナーゼABC添加により、CS-GAG鎖が分解されるとWFAレクチンが結合できなくなるため、その原理を利用する。より具体的には、FITC標識WFAレクチン（EY社など）を、被検化合物混合前後でCSコーティング・ウェルに添加し、CS-GAGが分解される事により、ウェル中のFITC蛍光強度の変化を蛍光プレートリーダーあるいは蛍光顕微鏡などの検出機器により極めて簡便に定量・数値化できる。混合前後で最も蛍光数値を減少させた化合物が、本コンセプトを満たす新規の治療候補化合物として判定できる。【０１１２】
また、他の検出方法として、CS-GAGそのものを直接的に標識する抗CS抗体（クローン：CS56、生化学工業社製）を使用する事ができる。WFAレクチンと同様に、FITC標識抗CS抗体をCSコーティング・ウェルに添加する事で、蛍光数値の変化を見れば、極めて短時間かつ簡便に大量スクリーニングができる。【０１１３】
より詳細な検出方法として、被検化合物混合前後のプレートをそのまま使用し、sGAG Assay Kit（WIESLAB社製）、Sulphanated Glycosaminoglycans, ELISA Kit（FUNAKOSHI社製）などを適用することにより、GAG含有量を正確に定量・数値化する方法がある。【０１１４】
さらに詳細には、被検化合物混合前後のプレートに2-AB（2-aminobenzamide）や2-AP（2-aminopyridine；いずれもLUD社製など）を添加することにより、遊離GAG鎖の還元末端を簡便に蛍光標識し、糖鎖の各タイプや、各タイプの含有率までを、HPLC、MALDI-MS、LC-MSなどで解析する事により、より詳細な解析が可能である。候補化合物の特性を詳細に調べるという、スクリーニングの次の段階の方法である。【０１１５】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群における、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記合成量を低下させる化合物を選択する工程【０１１６】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる。【０１１７】
次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する。測定は当業者においては公知の手法、例えば、標識した抗体による方法、質量分析法、クロマトグラフィー法等によって適宜実施することができる。【０１１８】
さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、合成量を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は神経線維性変性治療のための薬剤となる。【０１１９】
被検化合物が上記(b)合成阻害作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。【０１２０】
上記(b) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸を合成する細胞、細胞株は当該研究者には既知である。ヒトでは例えば、健常人の末梢血を採取後、単核球を分離・培養するという標準的な方法により、16時間の細胞培養でコンドロイチン硫酸を産生してくる（Uhlin-Hansen L et al., Blood 82:2880, 1993.など）。また、より簡便には、既知の細胞株、例えば、線維芽細胞株NIH3T3（Phillip HA, et al. J. Biol. Chem. 279:48640, 2004など）、腎尿細管由来癌細胞株ACHN（Kawashima H et al., J. Biol. Chem. 277:12921, 2002）、腎遠位尿細管由来細胞株MDCK（Borges FT et al., Kidney Int. 68:1630, 2005.など）、血管内皮細胞株HUVEC（Schick BP et al., Blood 97:449, 2001など）など、多数挙げられる。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後のCS-GAG量の変化を上記（a）の方法で簡便に数値化できる。細胞培養後のCS-GAG量の増加（すなわち、CS-GAG合成量を反映する）を抑制する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。【０１２１】
さらに、より選択的には、例えばGalNAc4ST-1やXylosylTなどのCS-GAG合成酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的にCS-GAGを合成する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。【０１２２】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、硫酸化を受けていた量を低下させる物質を選択する工程【０１２３】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。【０１２４】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に残存する脱硫酸化の構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。【０１２５】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は神経線維性変性治療のための薬剤となる。【０１２６】
被検化合物が上記(c)脱硫酸化作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。【０１２７】
上記(c) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用に関するスクリーニング方法態様：
基本的に上記（a）の方法と同様、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。【０１２８】
検出方法は、脱硫酸化する事により、プロテオグリカンのコア蛋白側に残存した脱硫酸化断片の２糖構造を、抗プロテオグリカンΔdi４S抗体（クローン；2-B-6、4位に硫酸化を受けていた部分を認識する）あるいは抗プロテオグリカンΔdi6S（クローン；3-B-3、6位に硫酸化を受けていた部分を認識する。ともに生化学工業社製）と反応させることで、脱硫酸化を受けた部分の検出が容易にできる。したがって、混合培養前後のプレートにおいて、FITC標識した2-B-6や3-B-3抗体を反応させ、その蛍光数値の変化を簡便に検出できる。反応前後の蛍光強度を増加させた化合物が、より脱硫酸化を促進する物質であると判定でき、本コンセプトを満たす新規治療候補化合物として簡便に同定できる。【０１２９】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は、例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞もしくは細胞抽出液あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化過程を構成する酵素、基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程【０１３０】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検物質を接触させる。【０１３１】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。【０１３２】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は神経線維性変性治療のための薬剤となる。【０１３３】
被検化合物が上記(d)硫酸化阻害の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。【０１３４】
上記(d) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸の硫酸化を促進する細胞、細胞株は上記（c）に記載の細胞、細胞株と一致する。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後の硫酸化の程度を、例えば、4位硫酸化を検出する抗体（クローン；LY111）や6位硫酸化を検出する抗体（クローン；MC21C、いずれも生化学工業社製）で簡便に確認できる。蛍光標識抗体を用いて、培養前後の蛍光数値を比較しても良いし、上記（c）同様に、培養前後で2-B-6や3-B-3抗体を使用した検出法を行っても良い。細胞培養後の硫酸化の増加（LY111やMC21Cの蛍光数値増加）を抑制する化合物、もしくは細胞培養後の脱硫酸化の進行（2-B-6や3-B-3の蛍光数値増加）を促進する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。【０１３５】
さらに、より選択的には、例えばC4ST-1やC6ST-1などの硫酸基転移酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的に硫酸基を付加する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。【０１３６】
本発明の他の好ましい態様は、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む神経線維性変性抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞における遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）該発現量を被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下している化合物、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している化合物を選択する工程【０１３７】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。【０１３８】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。【０１３９】
例えば、上記いずれかのタンパク質を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、RT- PCR法、DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、上記いずれかのタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、上記いずれかのタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、上記いずれかのタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。【０１４０】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と該遺伝子の発現量を比較する。【０１４１】
本方法においては、次いで、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、神経線維性変性抑制のための薬剤もしくは神経線維性変性治療のための候補化合物となる。【０１４２】
また、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、神経線維性変性抑制のための薬剤もしくは神経線維性変性治療のための候補化合物となる。【０１４３】
また、本発明のスクリーニング方法の一態様としては、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。本発明の上記方法は例えば以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下している化合物、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素に機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇している化合物を選択する工程【０１４４】
本方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。【０１４５】
ここで「機能的に結合した」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。【０１４６】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。【０１４７】
「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。【０１４８】
ここで「接触」は、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。【０１４９】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。【０１５０】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する。【０１５１】
本方法においては、次いで、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、神経線維性変性抑制のための薬剤もしくは神経線維性変性治療のための候補化合物となる。【０１５２】
また、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素にと機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、神経線維性変性抑制のための薬剤もしくは神経線維性変性治療のための候補化合物となる。【０１５３】
本発明のスクリーニング方法において見出される神経線維性変性抑制剤は、好ましくは、神経線維性変性疾患の治療用または予防用のものである。【０１５４】
また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。【０１５５】
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。【０１５６】
本発明の好ましい態様においては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されているかどうかを検出する工程を含む、神経線維性変性抑制剤のスクリーニング方法である。従って、該スクリーニング方法において、例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの検出の際に利用可能な、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識する抗体（抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体）も、本発明の神経線維性変性抑制剤スクリーニング用キットの構成要素に含めることができる。【０１５７】
上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のVersicanコアタンパク質遺伝子のDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のVersicanコアタンパク質遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。【０１５８】
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer（Amersham Life Science）を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution（CLONTECH）中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。【０１５９】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15 bp〜100 bpであり、好ましくは17 bp〜30 bpである。プライマーは、例えば配列番号：６９または７０に記載のものであるが、上記本発明中の遺伝子のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。【０１６０】
また本発明は、本発明の薬剤を個体（例えば、患者等）へ投与する工程を含む、神経線維性変性疾患の治療もしくは予防方法を提供する。【０１６１】
本発明の予防もしくは治療方法の対象となる個体は、神経線維性変性疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。【０１６２】
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。【０１６３】
さらに本発明は、本発明の薬剤の、神経線維性変性抑制剤の製造における使用に関する。【０１６４】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１６５】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１６６】
実施例１  MPTP誘発性 C57BL/6JcLパーキンソン病モデルマウスによるGalNAcST（siRNA）処置とコンドロイチナーゼABC処置におけるGalNAc4ST-1とGALNAC4S-6ST遺伝子発現の検討
本実施例では1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridine（MPTP）によりドーパミンニューロンを選択的に変性させたパーキンソン病のマウスモデルを作成（Amende et al. (2005）Journal of NeuroEngineering and Rehabilitation 2(20) 1-13）してGalNAcST siRNA薬とコンドロイチナーゼABC薬を投与し、治療後における遺伝子発現と組織の様子を比較検討した。【０１６７】
妊娠14日目 C57BL/6JcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させ、8週令 C57BL/6JcLマウス雌（日本クレア社製）、各々にコンドロイチナーゼABC（Sigma Aldrich Japan）4 U/ml 100μlとGalNAcST（GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2とGALNAC4S-6STのカクテル配列を混合したもの）siRNA 1μg（GeneWorld社製）をsiRNA媒体である1% Atelocollagen（高研社製）と混合させたもの200μL腹腔内投与した。その後、二日、三日そして四日後の三度にわたりドーパミンニューロンのみを選択的に破壊するMPTP（Sigma Aldrich Japan社製）を30 mg/kgで体内へ投与したものを飼育した。実験8日目にBrdU 5 mg/mL（ZyMED Laboratory.Inc社製）100μlを尾静脈内投与処置し、1時間後、解剖し、脳を摘出し、免疫染色用サンプル、遺伝子発現解析用サンプルを得た。以上より摘出した臓器（脳）50 mg当たりに対し、RNA-Bee（TEL-TEST社製）1 mLを加え、電動ホモジナイザー（DIGITAL HOMOGENIZER、ASONE社製）にて粉砕させた後、chloroform 200μl（Sigma Aldrich Japan社製）を加え穏やかに混合後、約5分氷冷し、12,000 rpm、4℃、15分間  遠心分離機（Centrifuge 5417R、eppendorf社製）を用い遠心分離を行った。遠心分離後の上澄み液500μLを別のエッペンドルフチューブに移し、上澄み液と同等量のisopropannol 500μL（Sigma Aldrich Japan社製）を加え混合後、1μLのglycogen（Invitrogen社製）を加え、15分間氷冷した。氷冷15分後、12,000 rpm、4℃、15分間遠心し、その後、75% Ethanol 1000μl（Sigma Aldrich Japan社製）で3回洗浄して得られたRNA沈殿物を30分間〜1時間、自然乾燥させた後、大塚蒸留水50μl大塚製薬社製）に溶解させ、さらに大塚蒸留水（大塚製薬社製）にて100倍希釈し、UVプレート（Corning Costar社製）上でプレートリーダー（POWER Wave XS、BIO-TEK社製）により抽出したサンプル中のRNA濃度を算出した。【０１６８】
次に、RT reaction（cDNA合成）を行うため以下の手技を行った。算出して得られたRNAサンプルを500 ng/20μlの濃度に調整し、68℃、3分間、BLOCK INCUBATOR（ASTEC製）にて加温し、10分間、氷冷した。氷冷後、予め調製していたRT Pre Mix 液（組成：25 mM MgCl2  18.64μl（Invitrogen社製）、5×Buffer 20μl（Invitrogen社製）、0.1 M DTT 6.6μl（Invitrogen社製）、10 mM dNTP mix 10μl（Invitrogen社製）、RNase Inhibitor 2μl（Invitrogen社製）、MMLV Reverse transcriptase 1.2μl（Invitrogen社製）、Random primer 2μl（Invitrogen社製）、滅菌蒸留水19.56μl（大塚蒸留水：大塚製薬社製）を80μl加えBLOCK INCUBATOR（ASTEC社製）にて42℃、1時間、加温反応させ、1時間後、BLOCK INCUBATOR（ASTEC社製）にて99℃、5分間、加熱した後、氷冷し求めるcDNA 100μlを作製し、合成して得られたcDNAを用いて、以下の組成でPCR反応を行った。【０１６９】
PCR Buffer 2μl [組成：166 mM (NH4)2SO4（Sigma Aldrich Japan社製）、670mM Tris -HCl pH8.8（Invitrogen社製）、67 mM MgCl2・6H2O（Sigma Aldrich Japan社製）、100 mM 2-mercaptoethanol]（WAKO社製））、25 mM dNTP mix 0.8μl（Invitrogen社製）、DMSO 0.6μl（Sigma Aldrich Japan社製）、Primer Forward 0.2μl（GeneWorld社製）、Primer Reverse 0.2μl（GeneWorld社製）、大塚蒸留水 15.7μl（大塚製薬社製）、Taq polymerase 0.1μl（Perkin Elmer社製）、上述のようにして得られたcDNA 1μlを混合させAuthorized Themal Cycler（eppendorf社製）により94℃ 45second、55℃  45 sec、72℃ 60second 30cycle 反応させた。反応終了後、得られたPCR産物に2μl Loading Dye（Invitrogen社製）を加え、1.5% UltraPure Agarose（Invitrogen社製）ゲルを作製し、Mupid-2 plus（ADVANCE社製）により100 V、20分間電気泳動を行った。泳動後、1×LoTE[組成：3 mM Tris-HCl（pH7.5）（Invitrogen社製）、0.2 mM EDTA（pH7.5）（Sigma Aldrich Japan社製）]にて10000倍希釈Ethydium Bromide（Invitrogen社製）染色液中で20分間振とうさせた後、I-Scope WD（ADVANCE社製）に設置したEXILIM（CASIO社製）にてゲル撮影し遺伝子発現の確認を行った。【０１７０】
図１にRT-PCRによる未治療群、GalNAcST siRNA処置群とコンドロイチーゼABCにおけるβ-actin、GalNAc4ST-1とGALNAC4S-6STの遺伝子発現結果を示した。今回、用いたGalNAcST siRNA（GalNAc4ST-1 siRNAカクテル、GalNAc4ST-2 siRNAカクテルとGALNAC4S-6ST siRNAカクテルの混合siRNA；GeneWorld社製）、Primer（Forward、Reverse）（北海道システム・サイエンス社製）を以下に示す。【０１７１】
[Primer配列]
*β-actin（Gene world社製）
Forward : 5’-GACCCAGATCATGTTTGAGAC -3’（配列番号：６７）
Reverse : 5’-ATGCCTGGGTACATGGTGGTA -3’（配列番号：６８）
*GalNAc4ST-1（北海道システム・サイエンス社製）
Forward : 5’-ACGTGCCTTTTACACCCAAG-3’（配列番号：６９）
Reverse : 5’-GTGTGCCCTTTTCTGTGGAT-3’（配列番号：７０）
[GalNAc4ST-1 siRNAカクテル配列]（GenBank accession number NM_175140）
（Gene world社製）
5’-ACCCCCAACTCGGAACGATGCGGCT-3’（配列番号：７１）
5’-TGCATGTTCTCGTCCATCCTGCTG-3’（配列番号：７２）
5’-CGCCACCGTGTACTGTACTGTGAAGT-3’（配列番号：７３）
5’-AGGCT GCTCCAACTG GAAGAGGGTG-3’（配列番号：７４）
[GalNAc4ST-2 siRNAカクテル配列]（GenBank accession number NM_199055）
（Gene world社製）
5’-ATATAGTATCTAGGATATATGTAG-3’（配列番号：７５）
5’-GAAGTACCAAAAGCTGGCTGCTCTA-3’（配列番号：７６）
5’-TTCTATCACTTGGACTATTTGATGTT-3’（配列番号：７７）
5’-TACACAACTCCACATTTGTAATTTG-3’（配列番号：７８）
[GALNAC4S-6ST siRNAカクテル配列]（GenBank accession number NM_029935）
（Gene world社製）
5’-CCAGAAGCCAAGCTCATTGTTATG-3’（配列番号：７９）
5’-CTGTGGAGAGGTTGTACTCAGACTA-3’（配列番号：８０）
5’-ATTTGCCTGGAAGACAACGTGAGAGC-3’（配列番号：８１）
5’-GTCCCTTCTGCAGAAGCTGGGCCCACT-3’（配列番号：８２）【０１７２】
図１のRT-PCRにより内因性コントロールであるβ-actinの発現が未治療群、GalNAcST（siRNA）、コンドロイチナーゼABC処置群ともに同レベルでの発現で認められた。これに対してGalNAc4ST-1とGALNAC4S-6STにおいて未治療群と比較しGalNAcST（siRNA）処置群において発現減少が認められAtellocollagen媒体GalNAcST siRNA投与による遺伝子発現抑制（減少）が確認された。【０１７３】
実施例２  MPTP誘発性 C57BL/6JcL パーキンソン病モデルマウスによるコンドロイチナーゼABCとGalNAcST siRNA処置におけるCSPGの脳内沈着抑制効果の比較検討
この実施例ではパーキンソン病モデルマウスの脳組織サンプルを使用してCSPGの沈着抑制効果について比較検討を行った。実施例１にて得られた脳組織を凍結用包埋剤OCTコンパウンド（Miles社製）に包埋して液体窒素にて凍結ブロックを作成した。その凍結ブロックからクリオスタット（Microm社製）を用いて厚さ10μmの切片を作成した。得られた切片をアセトン（Sigma Aldrich Japan社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）抗体（クローンCS５６、マウスモノクローナル抗体、10μg/ml; 生化学工業社製）を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイ社製；マウスモノクローナル抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質（ニチレイ社製）を添加し酵素色素反応を行った。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）にて観察した。この組織像を図２として示した（原図はカラーである）。未治療群における陽性のシグナルは歯状回付近にて対照群のCSPG蓄積より強く示していることがわかる。そして、GalNAcST siRNAとコンドロイチナーゼABC治療群におけるCSPGの蓄積は抑制されていることが見受けられる。つまり、以上の結果を考察すると、MPTP誘導型パーキンソン病マウスモデルの脳組織におけるCSPGの沈着はGalNAcST siRNAとコンドロイチナーゼABCの生体内投与において抑制される所見が明らかにされた。【０１７４】
実施例３  MPTP誘発性 C57BL/6JcLパーキンソン病モデルマウスによるコンドロイチナーゼABCとGalNAcST siRNA処置におけるマクロファージ浸潤に伴う炎症抑制効果の比較検討
実施例2で示したCSPGの沈着はマクロファージなどの炎症細胞を誘導する生体内物質であるケモカインを吸着することが知られている。さらにCSPGの沈着が結果的に炎症細胞を引き寄せて脳組織の破壊を誘発させることにつながると推測し、実施例２と同様に脳組織のサンプルを用いて、脳内マクロファージの集積動態に対してGalNAcST投与とコンドロイチナーゼABCの効果を比較した。実施例2と同様の方法で得られた切片を4％PFA（Paraformaldehyde）リン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で10分間固定後、脱イオン水で洗浄し、一次抗体としてラット由来抗マウスマクロファージ抗体（クローンF4/80；1：200希釈；BMA社製）を添加し、4℃にて一晩反応させた。次に二次抗体であるAlexa488標識抗ラットIgGヤギ抗体（1：200希釈；Invitrogen社）を添加し、室温で30分反応させた。以上の手法にて得られた組織像を図３に示した（原図はカラーである）。未治療群での強い陽性シグナルは組織辺縁部にて対照群より多数のマクロファージの集積を示している結果であった。さらに、GalNAcST siRNAとコンドロイチナーゼABCによる治療群における染色結果にて比較してみると対照群とほぼ同程度であった。以上の結果より、パーキンソン病マウスモデルの脳組織におけるマクロファージの集積は、GalNAcST siRNAとコンドロイチナーゼABCの生体内投与により顕著に抑制されることが明らかになった。（マクロファージ集積は緑色、核はSytox-Orange（invitrogen）を用いて赤色にて表示）【０１７５】
実施例４  MPTP誘発性 C57BL/6JcLパーキンソン病モデルマウスによるコンドロイチナーゼABCとGalNAcST siRNA処置における線維芽細胞浸潤抑制効果の比較検討
実施例２で示したCSPGの沈着はさらに細胞の線維化を促進させる可能性があると考え、実施例２、３と同様に脳組織のサンプルを用いて、脳内の神経細胞における線維化に対してGalNAcST投与とコンドロイチナーゼABCの生体内投与により得られる組織所見を比較した。実施例２、３と同様の方法で得られた切片を4％PFAリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で１０分間固定後、脱イオン水で洗浄し、一次抗体として線維芽細胞抗体（ER-TR7; 1:100希釈；BMA社製）を添加し、4℃で一晩反応させた。次に二次抗体であるAlexa488標識抗ラットIgGヤギ抗体（1：200希釈；Invitrogen社）を添加し、室温で30分反応させた。以上の手法にて得られた組織像を図４に示した（原図はカラーである）。未治療群での強い陽性シグナルは脳梁膨大後部顆粒皮質付近にて対照群より脳内における線維芽細胞の浸潤を示している結果であった。さらに、GalNAcST siRNAとコンドロイチナーゼABC治療群における所見と比較すると対照群と同様に線維芽細胞の陽性所見は確認できなかった。以上の結果より、パーキンソン病マウスモデルの誘導される脳組織におけるER-TR7の陽性シグナルの所見は、GalNAcST siRNAとコンドロイチナーゼABCの生体内投与により顕著に抑制されることが明らかになった。また、本実施例と実施例２と３にて明らかにされたCSPGの沈着と、その沈着により誘導されるマクロファージの浸潤を含めて考察するとCSPGの過剰発現を抑制することで炎症細胞の誘導、また細胞の線維化を阻止することができた。その結果、神経線維性変性の抑制につながることが可能であると結論づけられる。（線維芽細胞は緑色、核はSytox-Orange（invitrogen）を用いて赤色にて表示）【０１７６】
実施例５  MPTP誘発性 C57BL/6JcLパーキンソン病モデルマウスによるGalNAcST（siRNA）とコンドロイチナーゼABC処置におけるアストロサイトの活性効果の比較検討
脳には多数の神経細胞の他にグリア細胞という栄養素の供給の働きを持つ細胞が存在している。本実施例では抗GFAP抗体を用いてグリア細胞におけるアストロサイトの染色を行い、GalNAcST投与とコンドロイチナーゼABCの生体内投与により得られる組織所見を比較した。実施例２、３、４と同様の方法で得られた切片を4％PFAリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で１０分間固定後、脱イオン水で洗浄し、一次抗体として抗GFAP抗体（1：20希釈；Santa Cruz Biotechnology）を添加し、4℃で一晩反応させた。次に二次抗体であるAlexa488標識抗ヤギIgG-ロバ抗体（1：200希釈；Invitrogen社）を添加し、室温で30分反応させた。図５に対照群、未治療群、GalNAcST siRNA、コンドロイチナーゼABC処置群各々の組織画像を示した（原図はカラーである）。脳梁膨大後部顆粒皮質付近において、対照群では正常にアストロサイトが存在していることが確認できるが未治療群においては陰性のシグナルとして現れた。これは、MPTPにより選択的にグリア細胞のアストロサイトが破壊されたことを示唆する所見である。一方、GalNAcST siRNAとコンドロイチナーゼABC処置を行った処置群におけるシグナルは未治療群に比べて強く現れていることが確認できた。グリア細胞におけるアストロサイトの役割として神経細胞の機能維持を中心とした働きを行うことで知られている。この所見ではCSPGの抑制によりグリア細胞のアストロサイト働きが回復したことが示唆され、神経細胞における機能の向上が考えられる。（アストロサイトは緑色、核はSytox-Orange（invitrogen）を用いて赤色にて表示）【０１７７】
実施例６  MPTP誘発性 C57BL/6JcLパーキンソン病モデルマウスによるGalNAcST（siRNA）処置におけるドーパミンニューロンの活性効果の比較検討
以上の実施例で示された結果を最終的に明らかにするために得られた組織サンプル切片をドーパミンニューロンのマーカとする抗チロシンハイドロキシラーゼ抗体にてドーパミンニューロンを染め、組織所見を比較検討した。このチロシンハイドロキシラーゼ（TH: thyrosine hydroxylase）はドーパミン前駆体をドーパミンへ転換する酵素である。実施例２、３、４と同様の方法で得られた切片を4％PFAリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で10分間固定後、脱イオン水で洗浄し、一次抗体としてラビットポリクローナル抗チロシンハイドロキシラーゼ抗体（1：50希釈；Calbiochem社）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるAlexa488標識抗ラビット-ロバ抗体（1：200希釈；Invitrogen社）を添加し、室温で30分反応させた。図６に対照群、未治療群、GalNAcST siRNA、コンドロイチナーゼABC処置群各々の組織画像を示した（原図はカラーである）。中脳上丘付近において、対照群では正常にチロシンハイドロキシラーゼが発現していることが確認できるが未治療群においては陰性のシグナルとして現れた。これは、MPTPにより選択的にドーパミンニューロンが破壊されたことが示唆される所見である。一方、GalNAcST siRNAとコンドロイチナーゼABC処置を行った処置群におけるシグナルは未治療群に比べて強く現れていることが確認できた。つまり、GalNAcST siRNAとコンドロイチナーゼABCの生体内投与によって実施例５にて示したアストロサイトの活性化に伴いドーパミンニューロンの機能回復が期待できる結論が得られた。（THは緑色、核はSytox-Orange（invitrogen）を用いて赤色にて表示）
【産業上の利用可能性】
【０１７８】
本発明に係る、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の蓄積の影響を検討する例として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの側鎖であるアセチルガラクトサミンの硫酸基を転移する酵素であるN-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase:N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase-1, N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase-2, N-acetylgactosamine-4-sulfate 6-O-sulfotransferase（GalNAc4ST-1, GalNAc4ST-2, GALNAC4S-6ST）のsiRNAと側鎖であるアセチルガラクトサミンの分解酵素であるコンドロイチナーゼABCは脳の視床下部におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに付随するGAG鎖の硫酸化とその蓄積を抑え、ドーパミンニューロンの細胞死を抑制することによりパーキンソン病の治療又は予防に効果を有する。さらに、異常タンパク質の蓄積により発症されると考えられる神経線維性変性疾患；アルツハイマー病、ポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病そして多発性硬化症などに対しても本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの過剰発現および蓄積が脳機能を低下させる要因であると考える。本発明に係る神経線維性変性抑制剤は、これまでにない作用機序、薬剤療法によって病変を有効に改善出来る事から、患者のQOLのさらなる向上、医療に役立つ優れた療法と成り得る。【０１７９】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【図１】
2008029493.tif 000002
【図２】
2008029493.tif 000003
【図３】
2008029493.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2008029493000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月20日(2007.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
一方、CSPGに関しては、胎生時期には必須分子で、各臓器に豊富に存在する。神経幹細胞の分化誘導剤（特許文献１）、ヒト／骨形成蛋白を用いる神経再生（特許文献２）、ヒト、骨形態形成蛋白を用いる神経再生（特許文献３）のような神経再生に関わる過程を制御している分子として考えられている一方、中枢神経系の損傷の治療（特許文献４）、神経組織の修復を促進するための材料および方法（特許文献５）や血管平滑筋細胞の治療阻害因子（特許文献６）などの様々な箇所における神経再生の阻害にも関与している。その例として、まず中枢神経の損傷時に発現してくる再生阻害物質であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン群としてニューロカン、プレビカン、NG2が同定され（非特許文献24）、これらにコンドロイチナーゼABC（GAG鎖の一種であるコンドロイチン硫酸を選択的に除去する酵素）投与によりCSPGを分解して中枢神経の再生を促す（特許文献４）という報告例がある。また、このCSPGの発現において、パーキンソン病患者の脳内のレビー小体（LB：Lewy body）に蓄積していると報告されているがその生体内機能は未だ明らかとなっていない（非特許文献25）。また、脳内でのCSPG増加における意義もまだわかっていない（非特許文献23）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明者らは、そのような薬剤を開発するため鋭意研究を重ねるうち、これまで神経線維性変性疾患の病因とはされていなかったCSPGの過剰な蓄積が、ニューロンの死やシナプスの欠損（アルツハイマー病）、ドーパミンニューロンの細胞死（パーキンソン病）、また運動ニューロンの変性（筋萎縮性側索硬化症）を促進させる他にも、多種の神経線維性変性疾患の因子に働いているのではないかと考えた。本発明者らは、この考えに基づいて神経線維性変性疾患の一つであるパーキンソン病モデルマウスでの研究を進めた結果、CSPGの硫酸基転移酵素のうちGalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6STの遺伝子らをsiRNAによってノックダウンする処置、または、コンドロイチン硫酸における糖鎖を除去するコンドロイチナーゼ（コンドロイチネース）ABCによる処置により、ドーパミンニューロンにおけるCSPG過剰発現または過剰蓄積が抑制し、グリア細胞におけるアストロサイトの役割である神経細胞機能制御が活発化することを見出した。その他にも、線維芽細胞の浸潤を抑制し、ドーパミンニューロンの細胞死を防ぎドーパミン合成酵素であるチロシンハイドロキシラーゼ（TH：Tyrosine hydroxylase）の分泌を顕著にさせ、パーキンソン病の症状を治療することを見出した。即ち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積あるいは生合成を阻害することによって、神経線維性変性を抑制させることができることを実証し、本発明を完成させた。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質は、神経線維性変性抑制剤として有用である。また、該薬剤は、神経線維性変性疾患の治療もしくは予防のための薬剤となる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
本発明に係る、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の蓄積の影響を検討する例として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの側鎖であるアセチルガラクトサミンの硫酸基を転移する酵素であるN-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase:N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase-1, N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase-2, N-acetylgactosamine-4-sulfate 6-O-sulfotransferase（GalNAc4ST-1, GalNAc4ST-2, GALNAC4S-6ST）のsiRNAと側鎖であるコンドロイチン硫酸の分解酵素であるコンドロイチナーゼABCは脳の視床下部におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに付随するGAG鎖の硫酸化とその蓄積を抑え、ドーパミンニューロンの細胞死を抑制することによりパーキンソン病の治療又は予防に効果を有する。さらに、異常タンパク質の蓄積により発症されると考えられる神経線維性変性疾患；アルツハイマー病、ポリグルタミン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病そして多発性硬化症などに対しても本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの過剰発現および蓄積が脳機能を低下させる要因であると考える。本発明に係る神経線維性変性抑制剤は、これまでにない作用機序、薬剤療法によって病変を有効に改善出来る事から、患者のQOLのさらなる向上、医療に役立つ優れた療法と成り得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経線維性変性を抑制する薬剤であって、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成または蓄積を阻害する物質を有効成分として含み、ここで該物質は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解を促進するか、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を阻害するか、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有するか、および／またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化を阻害することを特徴とする、薬剤。
【請求項２】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素またはその一部、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する抗体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン変異体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する低分子化合物、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する抗体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素変異体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する低分子化合物、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する抗体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化抑制タンパク質変異体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する低分子化合物、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する抗体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素変異体、およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する低分子化合物、からなる群から選択される物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに対する遺伝子サイレンサーまたはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素である、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
脳においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成または蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤。
【請求項５】
脳組織のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン沈着を抑制することを特徴とする、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
神経線維性変性疾患の治療用または予防用の、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
前記神経線維性変性疾患が脳脊髄神経または末梢神経線維性変性疾患である、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
前記神経線維性変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、または多発性硬化症である、請求項６に記載の薬剤。
【請求項９】
神経線維性変性を抑制する物質をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程と、
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を測定する工程と、
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、存在量を低下させる物質を選択する工程と、
を含む方法。
【請求項１０】
前記神経線維性変性抑制剤が、神経線維性変性疾患の治療用または予防用である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月28日(2007.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経線維性変性を抑制する薬剤であって、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成または蓄積を阻害する、酵素、抗体、核酸、または低分子化合物である物質を有効成分として含み、ここで該物質は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解を促進するか、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を阻害するか、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有するか、および／またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化を阻害することを特徴とする、薬剤。
【請求項２】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解酵素、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する抗体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する抗体、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸、およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する抗体、からなる群から選択される物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質が、ＧａｌＮＡｃ４ＳＴ−１、ＧａｌＮＡｃ４ＳＴ−２、またはＧａｌＮａｃ４Ｓ−６ＳＴの遺伝子発現を抑えるｓｉＲＮＡである、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
脳においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成または蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤。
【請求項５】
脳組織のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン沈着を抑制することを特徴とする、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
神経線維性変性疾患の治療用または予防用の、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
前記神経線維性変性疾患が脳脊髄神経または末梢神経線維性変性疾患である、請求項６に記載の薬剤。
【請求項８】
前記神経線維性変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、または多発性硬化症である、請求項６に記載の薬剤。
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月31日(2008.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経線維性変性を抑制する薬剤であって、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成または蓄積を阻害する物質を有効成分として含み、ここで該物質は、ＧａｌＮＡｃ４ＳＴ−１、ＧａｌＮＡｃ４ＳＴ−２、またはＧａｌＮａｃ４Ｓ−６ＳＴの遺伝子発現を抑えるｓｉＲＮＡであり、該物質は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解を促進するか、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を阻害するか、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有するか、および／またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化を阻害することを特徴とする、薬剤。
【請求項２】
脳においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成または蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
脳組織のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン沈着を抑制することを特徴とする、請求項２に記載の薬剤。
【請求項４】
神経線維性変性疾患の治療用または予防用の、請求項１〜３のいずれかに記載の薬剤。
【請求項５】
前記神経線維性変性疾患が脳脊髄神経または末梢神経線維性変性疾患である、請求項４に記載の薬剤。
【請求項６】
前記神経線維性変性疾患がパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、ポリグルタミン病、脊髄性筋萎縮症、ハンチントン病、または多発性硬化症である、請求項５に記載の薬剤。