(57)【要約】  本発明の機能性コンポストの製造方法は、細菌類の活動制限状態、例えば、栄養制限状態、制限ｐＨ状態及び制限水分状態からなる群より選択された少なくとも１つの状態であるコンポストに、機能を有する糸状菌、例えば、ヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３７）のような植物病害防除機能を有する糸状菌を接種すること、この糸状菌を、前記コンポスト内で培養して選択的に増殖させることを含む。また、本発明では、上記製造方法によって得られた機能性コンポスト及び、細菌類の活動制限状態にある糸状菌増殖用コンポストも提供される。
2008149846.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌類の活動制限状態にあるコンポストに、機能を有する糸状菌を接種すること、
前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して選択的に増殖させること、
を含む機能性コンポストの製造方法。
【請求項２】
糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を含むコンポストであって前記糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類の活動制限状態のコンポストに、機能を有する糸状菌を接種すること、
前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して前記糸状菌共存生育可能細菌類と共に選択的に増殖させること、
を含む、機能性コンポストの製造方法。
【請求項３】
前記細菌類の活動制限状態が、栄養制限状態、ｐＨ制限状態及び水分制限状態からなる群より選択された少なくとも１つの状態である請求項１又は２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項４】
前記細菌類の活動制限状態が、以下の（１）〜（３）：
（１）ｐＨ４〜７である制限ｐＨ状態
（２）２０％〜４０％である制限水分状態
（３）ＣＯ２発生速度が最大となった後にＣＯ２発生速度１×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト〜３×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポストである栄養制限状態
からなる群より選択された少なくとも１つの状態である請求項１又は２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項５】
前記細菌類の活動制限状態のコンポストを作製する工程を更に含む請求項１又は２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項６】
前記細菌類の活動制限状態のコンポストを作製する工程が、有機廃棄物を栄養制限状態となるまで腐熟させる工程である請求項５記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項７】
前記コンポスト内で糸状菌を培養する際の培養温度が、１０℃〜３５℃である請求項１又は２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項８】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、バージバチラス・ハロフィラスである請求項２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項９】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、Ｉ３０−１株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９７５）である請求項２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１０】
前記機能を有する糸状菌が、植物病害防除機能及び土壌改質機能の少なくとも一方を有する糸状菌である請求項１又は２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１１】
前記植物病害防除機能を有する糸状菌がヒトヨタケである請求項１０記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１２】
前記ヒトヨタケは、ヒメツブヒトヨタケ（Coprinus curtus）、ウシグソヒトヨタケ(Coprinus cinereus)、イヌセンボンダケ(Coprinus disseminatus)、ササクレヒトヨタケ(Coprinus comatus)、ヒトヨタケ(Coprinus atramentarius)、コキララタケ(Coprinus radiatns)、センボンクヌギタケ(Psathyrella multissima)、イタチタケ(Psathyrella candolliana)およびムジナタケ(Psathyrella velutina)からなる群より選択された少なくとも１つである請求項１１記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１３】
ヒトヨタケは、ヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３７）である請求項１１記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１４】
糸状菌を植物病原菌とする植物病害防除機能を有する請求項１１記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１５】
前記植物病原性糸状菌がリゾクトニア属及びフザリウム属の少なくとも一方に属する糸状菌である請求項１４記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１６】
前記植物病原性糸状菌がリゾクトニア属及びフザリウム属の少なくとも一方に属する糸状菌であり、前記植物病害防除機能を有する糸状菌がヒトヨタケである請求項１４記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１７】
機能を有する糸状菌を含む請求項１記載の製造方法により得られた機能性コンポスト。
【請求項１８】
機能を有する糸状菌と糸状菌共存生育可能細菌とを含む請求項２記載の製造方法により得られた機能性コンポスト。
【請求項１９】
前記機能を有する糸状菌が、植物病害防除機能及び土壌改質機能の少なくとも一方を有する糸状菌である請求項１７又は１８記載の機能性コンポスト。
【請求項２０】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、バージバチラス・ハロフィラスである請求項１８記載の機能性コンポスト。
【請求項２１】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、Ｉ３０−１株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９７５）である請求項１８記載の機能性コンポスト。
【請求項２２】
細菌類の活動制限状態にある糸状菌増殖用コンポスト。
【請求項２３】
糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を含み、前記糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類の活動制限状態にある糸状菌増殖用コンポスト。
【請求項２４】
栄養制限状態、制限ｐＨ状態及び制限水分状態からなる群より選択された少なくとも１つの細菌類の活動制限状態にある請求項２２又は２３記載の糸状菌増殖用コンポスト。
【請求項２５】
前記細菌類の活動制限状態が、以下の（１）〜（３）：
（１）ｐＨ４〜７である制限ｐＨ状態
（２）２０％〜４０％である制限水分状態
（３）ＣＯ２発生速度が最大となった後にＣＯ２発生速度１×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト〜３×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポストである栄養制限状態
からなる群より選択された少なくとも１つの状態である請求項２２又は２３記載の糸状菌増殖用コンポスト。
【請求項２６】
前記糸状菌が、植物病害防除機能及び土壌改質機能の少なくとも一方を有する糸状菌である請求項２２又は２３記載の糸状菌増殖用コンポスト。
【請求項２７】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、バージバチラス・ハロフィラスである請求項２３記載の糸状菌増殖用コンポスト。
【請求項２８】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、Ｉ３０−１株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９７５）である請求項２３記載の糸状菌増殖用コンポスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性コンポストの製造方法、機能性コンポスト及び糸状菌増殖用コンポストに関する。
【背景技術】
【０００２】
糸状菌すなわちカビには種々の機能があることが知られており、これらの機能を種々の分野で有効利用することが行われている。
例えば糸状菌の中には病原性糸状菌によって引き起こされる植物病害を防除する機能を有するものがある。病原性糸状菌は、キャベツ、キュウリ、トマト、ナス、小松菜などの多くの野菜、稲などの農産物の他、花、樹木、芝生等に、立枯病、根腐病、葉腐病、萎凋病などの病害を発病させる原因となる。これらの糸状菌としては、リゾクトニア属、フザリウム属、ピシウム属、トリコデルマ属、スクレロチウム属などがよく知られている。また、これらの糸状菌による植物病害を防除するためには、一般に薬剤、いわゆる化学農薬が散布されるが、より環境への安全性が高いと想定される微生物を利用した生物防除（いわゆる微生物農薬）方法が提案され、その一部は実用化されている。【０００３】
その例としては、シュードモナス属細菌を利用して糸状菌による植物病害の防除を行う技術（例えば特開平１１−１８７８６６号公報参照）、非病原性トリコデルマ属やムコール属の糸状菌を利用する技術（例えば特開平１０−１５０９７８号公報参照）や非病原性フザリウム属糸状菌を利用する技術（例えば国際公開第９７／３１５２１号パンフレット参照）が知られている。
その一方で、このような病原性糸状菌に対して防除機能を有する特定の糸状菌が見出されており、残留性がなく安定して防除効果を有する植物病害防除剤として利用する技術が開発されている（例えば国際公開第２００６／０８５５６７号パンフレット参照）。このような植物病害防除剤をコンポストに担持させれば、植物病害防除効果を安定して得ることができると共に、土壌改良効果まで期待できる。【０００４】
また、その他の機能を有する糸状菌として担子菌である白色腐朽菌を、Ｃ／Ｎ比３０〜３５の菌床で増殖させることによって得られるダイオキシンなどの有機塩素化合物分解材が知られている（例えば、特開２００３−３３４０６１号公報参照）。またトリコデルマ属に属する糸状菌には、石油類、特に原油やその難分解成分である芳香族炭化水素画分に対して顕著な分解活性を有することが知られている（例えば、特開平０６−３１９５２９号公報参照）。【０００５】
しかしながら、上記のように機能を有する糸状菌を、土壌改良効果を有するコンポストに担持させたとしても、目的とする糸状菌が安定してコンポストに担持されるには時間がかかる。また、コンポスト化には細菌も関与するため、コンポスト化処理中に特定の糸状菌を単に添加しただけでは効率よく増殖しない場合や、目的とする機能が発揮されない場合もある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記状況を鑑みなされたものであり、機能性コンポストの製造方法、機能性コンポスト及び糸状菌増殖用コンポストを提供する。
本発明の第一の態様は、細菌類の活動制限状態にあるコンポストに、機能を有する糸状菌を接種すること、前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して選択的に増殖させること、を含む機能性コンポストの製造方法を提供する。
本発明の第二の態様は、糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を含むコンポストであって前記糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類の活動制限状態のコンポストに、機能を有する糸状菌を接種すること、前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して前記糸状菌共存生育可能細菌類と共に選択的に増殖させること、を含む機能性コンポストの製造方法を提供する。【０００７】
本発明の第三の態様は、機能を有する糸状菌を含む上記製造方法により得られた機能性コンポストを提供する。
本発明の第四の態様は、細菌類の活動制限状態にある糸状菌増殖用コンポストを提供する。
本発明の第五の態様は、糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を含み、前記糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類の活動制限状態にある糸状菌増殖用コンポストを提供する。【０００８】
本発明において、上記細菌類の活動制限状態としては以下の（１）〜（３）からなる群より選択された少なくとも一つをあげることができる：
（１）ｐＨ４以上７以下である制限ｐＨ状態
（２）２０％以上４０％以下である制限水分状態
（３）ＣＯ２発生速度が最大となった後にＣＯ２発生速度１×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト以上３×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト以下。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施例１にかかるＧＭ−２１株の至適温度条件を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例２にかかるコンポスト製造工程における炭素変化率の変化を経時的に示したグラフである。
【図３】本発明の実施例３にかかる機能性コンポストによるチンゲンサイ尻腐病の防除効果を確認したグラフである。
【図４】本発明の実施例５にかかるコンポスト製造工程におけるｐＨ変化を示したグラフである。
【図５】本発明の実施例５にかかるコンポスト製造工程における炭素ガス発生速度の変化を経時的に示したグラフである。
【図６】本発明の実施例５にかかるコンポスト製造工程における炭素変化率の変化を経時的に示したグラフである。
【図７】本発明の実施例６にかかる機能性コンポスト製造工程におけるコンポスト内の細菌類濃度の変化を経時的に示したグラフである。
【図８】本発明の実施例６にかかる機能性コンポスト製造工程におけるコンポスト内のＧＭ−２１株濃度の変化を経時的に示したグラフである。
【図９】本発明の実施例７にかかる機能性コンポストによるチンゲンサイ尻腐病防除効果を確認したグラフである。
【図１０】本発明の実施例８にかかるレタスすそ枯病に対する防除効果を確認した発病状態を示す図である。
【図１１】本発明の実施例９にかかるシバ葉腐病に対する防除効果を確認した発病状態を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の第一の態様である機能性コンポストの製造方法は、細菌類の活動制限状態にあるコンポストに、機能を有する糸状菌を接種すること（接種工程）、前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して選択的に増殖させること（増殖工程）、を含むものである。【００１１】
また本発明の第二の態様である機能性コンポストの製造方法は、糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を含むコンポストであって前記糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類の活動制限状態のコンポストに、機能を有する糸状菌を接種すること（接種工程）、前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して前記糸状菌共存生育可能細菌類と共に選択的に増殖させること（増殖工程）、を含むものである。【００１２】
本発明では、糸状菌と細菌類との活動環境の違いから、機能を有する糸状菌を、細菌類の活動制限状態にあるコンポストに接種して培養することにより、コンポスト内で細菌類よりも糸状菌を選択的に且つ効率よく増殖させることができる。この結果、増殖した糸状菌をコンポストに安定して定着させることができ、機能性コンポストを効率よく製造することができる。これにより、目的とする機能を安定して有する機能性コンポストを効率よく得ることができ、またそのために有効なコンポストを提供することができる。【００１３】
特に本発明の第二の形態では、糸状菌共存生育可能細菌類を含むコンポストに、機能を有する糸状菌を接種して培養するので、糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類に対しては活動を制限すると共に、糸状菌共存生育可能細菌類と機能を有する糸状菌とを選択的に且つ効率よく増殖させることができる。このように、機能を有する糸状菌が糸状菌共存生育可能細菌類と共に増殖することによって、機能性コンポスト内では、機能を有する糸状菌と糸状菌共存生育可能細菌類とが協働して環境を形成し、これを維持するため、機能を有する糸状菌にとって有利な環境が機能性コンポスト内に安定して形成される。この結果、より効率よく機能性コンポストを製造することができると共に、目的とする機能がより安定化した機能性コンポストを提供することができる。【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書中数値範囲における「〜」はその前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を表す。また、本明細書において「工程」は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。【００１５】
本発明に用いられる機能を有する糸状菌には、特定の機能が期待できる糸状菌であれば特に制限されず、例えば、植物病害防除機能を有する糸状菌や、トリクロロエチレン、有機溶剤、ダイオキシン、ＰＣＢ、石油、炭化水素、火薬、農薬、生分解性プラスチックなどを浄化・分解可能な土壌改質機能を有する糸状菌を挙げることができる。これらのうち、特にコンポストの肥料効果をより有効利用できる植物病害防除機能を有する糸状菌であることが好ましい。【００１６】
植物病害防除機能を有する糸状菌は、病害防除機能を有するものであれば特に制限されず、例えば、ヒトヨタケ（ヒトヨタケ属、ナヨタケ属）、トリコデルマ属、ムコール属、フザリウム属、ヘテロコニウム属、アカウロスポラ属等が該当する。これらの植物病害防除機能を有する糸状菌については、防除効果が期待される植物病害の種類に応じて適宜選択可能であるが、植物病害防除効果の安定性及び効果が期待される植物病害防除の広さの観点からヒトヨタケ（ヒトヨタケ属及びナヨタケ属）であることが好ましい。【００１７】
ヒトヨタケは、ヒトヨタケ科に属するものであって、安全性の観点から、いわゆる毒キノコとされるヒカゲタケ属を除いたヒトヨタケ属（Coprinus）並びにナヨタケ属（Psathyrella）に属するものであることが好ましい。その中でも、ヒメツブヒトヨタケ（Coprinus curtus）、ウシグソヒトヨタケ(Coprinus cinereus)、イヌセンボンダケ(Coprinus disseminatus)、ササクレヒトヨタケ(Coprinus comatus)、ヒトヨタケ(Coprinus atramentarius)、コキララタケ(Coprinus radiatns)、センボンクヌギタケ(Psathyrella multissima)、イタチタケ(Psathyrella candolliana)、ムジナタケ(Psathyrella velutina)が好ましく、これらを単独で又は組み合わせて用いることができる。中でも、ヒメツブヒトヨタケ（Coprinus curtus）の分離菌ＧＭ−２１（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３７）が植物病害防除に効果的であり、特に好ましい。【００１８】
土壌改質機能を有する糸状菌としては、例えばリグニン分解能を有する白色腐朽菌を挙げることができる。このような白色腐朽菌には、例えばカワラタケ属（Coriolus）、ファネロキーテ属（Phanerochaete）、ヒラタケ属（Pleurotus）が該当する。また、褐色腐朽菌は芳香族化合物に対する分解能を有しており、タイロマイセス属（Tyromyces）、グロエオフィルラム属（Gloeophyllum）が挙げられる。またその他の腐朽菌としてはトリコデルマ属（Tricoderma）が挙げられる。これら腐朽菌以外にもフザリウム属（Fusarium）糸状菌等を挙げることができる。【００１９】
コンポストに接種される糸状菌は、糸状菌の菌糸体、胞子体又は子実体であってもよく、これらの粉砕物であってもよい。粉砕にあたっては、そのままでも、乾燥してからでもよいが、好ましくはそのままの状態で、刃物状のもので撹拌するなどして適宜な大きさとすればよい。菌子体をホモジナイザーで粉砕する場合には、一般に、大きいものでも直径３ｍｍ程度であり、多くはそれ以下となる。胞子の場合には胞子一つひとつの大きさであり、子実体であれば、例えば１ｍｍ角の大きさなどとすることができる。勿論、それらの寸法より大きくても細かくてもよいが、細かければ細かい程、均一に接種するのに好都合である。【００２０】
糸状菌又はその粉砕物をコンポストに接種する際には、糸状菌の生育状態によって異なるが、例えば約８×１０−６ｇ乾燥菌体／ｇ乾燥コンポスト以上、生育安定性の観点から好ましくは約８×１０−４ｇ乾燥菌体／ｇ乾燥コンポスト以上となるように糸状菌又はその粉砕物を接種すればよい。【００２１】
本発明においてコンポストとは、有機廃棄物を腐熟させることによって得られる堆肥であり、コンポスト化とは、有機廃棄物中の有機物を微生物の作用により分解処理し、農耕地への施用に適した状態に変化させる工程を意味する。コンポスト化処理とは、一般に、適当な通気及び撹拌条件下に有機物を、所定期間、貯留して、微生物によって発酵させることをいう。
本発明において「コンポスト」との語は、腐熟の進行に伴って有機物が完全に分解した完熟状態のものだけでなく、未熟状態のものを指す場合にも用いる。【００２２】
コンポスト化に用いられる有機廃棄物としては、生ごみ、下水汚泥、及び／又は家畜排泄物等を挙げることができ、魚粉、鶏糞、牛糞、油粕、おがくず、木片、野菜くず、落ち葉、汚泥等が一般に用いられる。
またコンポスト化に用いられる種菌としては、細菌、放線菌など雑多な微生物を挙げることができ、これらを含む製剤やコンポスト製品そのものを種菌として用いることができる。これらのコンポスト化に用いられる種菌は、市販されているものをそのまま利用することができる。【００２３】
接種工程では、機能を有する糸状菌を、細菌類の活動制限状態にあるコンポストに接種する。コンポスト内に混在する大多数の細菌や放線菌類（本明細書では、これらを単に「細菌類」と称することがある）と、植物病害防除機能を有する糸状菌とでは、生育及び活動のための環境に対する要求性が異なるので、細菌類が活動制限状態であっても糸状菌が増殖・活動可能な状態の環境とすることで、目的とする糸状菌を選択的に増殖させることができる。【００２４】
このとき、糸状菌と同一環境下でも活動が可能であり糸状菌と共存することができる細菌類（本明細書では、「糸状菌共存生育可能細菌類」と称する。）が存在していることがさらに好ましい。この糸状菌共存生育可能細菌類は、コンポスト化を行う他の細菌類が活動制限される環境下であっても活動が制限されないので、糸状菌と共にコンポスト内で安定的な菌叢を形成することができる。このような糸状菌共存生育可能細菌類としては、バージバチラス・ハロフィラス（Virgibacillus halophilus）を挙げることができる。バージバチラス・ハロフィラスとしては、バージバチラス・ハロフィラスＩ３０−１株を挙げることができる。この菌株は２００８年５月２９日に、茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９７５として受領されている。【００２５】
本発明における細菌類の活動制限状態とは、コンポスト中の細菌類の活動が制限されて生育、活性が抑制される条件であればよく、例えば、栄養制限状態、ｐＨ制限状態及び水分制限状態からなる群より選択された条件を挙げることができる。これらの各制限条件は、用いられる糸状菌又は細菌類（種菌）の種類や、コンポストの製造を行う環境等に応じて、単独又は２つ以上を組み合わせて適宜選択することができる。【００２６】
栄養制限状態とは、コンポストの腐熟度が進行して有機廃棄物中の有機物がわずかに残存している所謂「完熟」寸前の状態をいう。このような完熟寸前の状態は、例えばコンポストのＣ／Ｎ比やＣＯ２発生速度の低下（高レベルの炭素変化率）、微生物叢の遷移等によって判定することができる。このような完熟寸前のコンポストでは、栄養状態が非常に乏しいため細菌類の活動が制限されるが、糸状菌は、細菌類の増殖が制限される栄養状態のコンポストであっても増殖することができる。【００２７】
ＣＯ２発生速度は、コンポスト単位乾燥重量あたり、単位時間あたりのＣＯ２発生量として定義され、重量が既知のコンポスト堆積層への通気速度と排出されるＣＯ２濃度の測定値から容易に求めることができる。なお、ＣＯ２の濃度はフローセル型の赤外吸収式ＣＯ２メータであれば連続測定ができる。また排気ガスを一旦、テドラーバッグのようなプラスチック製バッグに捕集して、ガスクロやガス検知管で測定してもよい。捕集する排気ガス量には特に制限はないが、例えば５Ｌ容のテドラーバッグを用いて捕集可能な量あればよい。【００２８】
使用可能な完熟寸前のコンポストの一例としては、ＣＯ２発生速度が最大となった後のＣＯ２発生速度が１×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト〜３×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポストのものを挙げることできる。本発明におけるＣＯ２発生速度は、光明理化学工業株式会社製１２６ＳＡ又は１２６ＳＨ、北川式検知管を用いた測定で得られた値を基準とする。【００２９】
ｐＨ制限状態とは、細菌類の至適ｐＨ条件よりも低いｐＨ状態をいう。このような制限ｐＨ状態としては、例えばｐＨ４〜７、好ましくはｐＨ５〜６を挙げることができる。【００３０】
水分制限状態とは、細菌類の至適水分率よりも低い水分率の状態をいう。このような水分制限状態としては、例えば水分率２０％〜４０％（質量比）の状態を挙げることができる。水分率は、コンポストを１０５℃、４８時間の条件下で乾燥させた後に、乾燥コンポストの質量を測定することにより得ることができる。【００３１】
これらの活動制限状態それぞれについては、対象となる糸状菌の生育状態に応じて単独又は組み合わせを適宜選択することができる。これらの活動制限状態は、いずれか１つを律速とすることにより他の条件を緩和することができるが、目的とする糸状菌をより確実に且つ選択的に増殖させることができる観点から、上記の栄養制限状態、ｐＨ制限状態及び水分制限状態からなる群から少なくとも１つを選択することがより好ましく、栄養制限状態とすることが、コンポスト化処理の過程で糸状菌の接種時期を調整することにより簡単に得ることができるため、更に好ましい。【００３２】
本発明のコンポストの製造方法では、上記のような細菌類の活動制限状態のコンポスト（即ち、後述する糸状菌増殖用コンポスト）を入手することによって行ってもよいが、このようなコンポストを作製する工程を更に含んでいるものであってもよい。
コンポストの作製工程は、有機廃棄物にコンポスト化微生物を接種して培養することにより、有機廃棄物中の有機物を分解させる工程をいう。【００３３】
原料としての有機廃棄物に微生物を接種すれば、所定期間の培養によって有機物の分解が進行してコンポストが作製されるが、より効率よくコンポスト化を行うには、水分率、ｐＨ等を、コンポスト中の細菌類にとって最適な増殖条件に設定することが好ましい。これにより、細菌類によるコンポスト化を迅速に行うことができる。早期にコンポスト化を行うために水分率及びｐＨ等を細菌類の最適増殖条件に設定してコンポスト化することを、本発明では適宜「高速コンポスト化」という。【００３４】
このような高速コンポスト化の条件としては、例えば、コンポストの内部の温度、水分率、ｐＨなどを調整することが好ましい。最適活動条件としては、細菌類及び有機廃棄物の種類によって異なるが、一般には通常の好熱性細菌や放線菌の増殖に適した条件であればよく、温度は６０℃付近（例えば、５０〜６５℃）とすることができ、水分率４０％〜６０％、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．５の条件を挙げることができる。このような最適条件下の有機廃棄物に種菌を接種して培養することによって、早期に、例えば７日間程度で、上記糸状菌を接種可能なコンポストを得ることができる。【００３５】
例えば、栄養制限状態のコンポストを得るには、栄養制限状態となるまで有機廃棄物を腐熟させればよい。細菌類の種類及び活動状態並びに細菌数によって異なるが、一般に、細菌類に対する上記最適条件下での培養を５日間〜７日間行うことによって完熟寸前まで腐熟が進行し、栄養制限状態のコンポスト（完熟寸前のコンポスト）を容易に得ることができる。糸状菌の接種は、上述したようにＣ／Ｎ比、ＣＯ２発生速度等を指標に栄養制限状態であることを確認しながら行えばよい。【００３６】
またｐＨ制限状態のコンポストを得るには、有機廃棄物の腐熟中に適切なｐＨ調整剤を用いてコンポストのｐＨを調整すればよい。このために使用可能なｐＨ調整剤としては、硫酸、塩酸、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム等を挙げることができる。【００３７】
細菌類の活動制限状態にあるコンポスト内に糸状菌を接種した後、培養して、この糸状菌を選択的に増殖させる（増殖工程）。細菌類の活動制限状態のコンポストでは、細菌類に対する選択圧によって、コンポストに細菌類が存在しているとしても、接種した糸状菌が選択的に増殖する。【００３８】
このとき、糸状菌共存生育可能細菌類がコンポスト内に存在している場合には、糸状菌が選択的に増殖する際に糸状菌共存生育可能細菌類も同様に選択的に増殖する。この糸状菌共存生育可能細菌類は、糸状菌と共に増殖し且つ糸状菌の機能発揮を阻害しない。また糸状菌共存生育可能細菌類は、増殖によって糸状菌と共に安定した菌叢を形成するので、コンポストが土壌に施用されたときには、土壌中に元々存在する微生物のコンポスト内への侵入を効果的に抑制することができる。これにより、本発明の機能性コンポストを土中に使用しても機能性糸状菌を安定に存在させることができる。【００３９】
培養温度は、細菌類の活動制限状態が継続可能となるように行うことが好ましく、例えば１０℃〜３５℃とすることができ、２０℃〜３５℃がより好ましく、２７℃〜３０℃が特に好ましい。３５℃以下であれば、細菌類の増殖を効果的に抑制でき、一方、１０℃以上であれば糸状菌の適度な増殖速度を維持することができる。また培養は通気条件下であればよく、ｐＨは４〜７、好ましくはｐＨ５〜６とすることができる。【００４０】
培養期間は、目的とする糸状菌がコンポスト内で充分増殖するのに必要な期間であればよく、例えば５日間〜７日間とすることができる。この間に、糸状菌による有機物の分解も進行し、栄養制限状態のコンポストを用いた場合には培養期間終了と同時に完熟したコンポストも得ることができる。
培養期間終了後のコンポストでは、糸状菌が充分に存在している。一例として、乾燥コンポスト１ｇあたりのＤＮＡ量として約５μｇ／ｇ乾燥コンポスト程度以上、好ましくは３０μｇ／ｇ乾燥コンポスト以上とすることができる。【００４１】
このように本発明の製造方法では、コンポストの製造と同時に糸状菌のコンポスト内での増殖も行うため、機能を安定して発揮できる機能性コンポストを効率よく製造することができる。
即ち、本発明の製造方法によって得られた本発明のコンポストは、機能を有する糸状菌を含むものである。本コンポストには、このような糸状菌が機能的に且つ充分量存在していることから、安定して機能を発揮できる機能性コンポストである。また、糸状菌共存生育可能細菌類も含むコンポストの場合には、糸状菌の機能に基づく機能がより安定した機能性コンポストとすることができる。
本機能性コンポストに含まれる糸状菌共存生育可能細菌としては、前述したようにバージバチラス・ハロフィラスであることが好ましく、例えばバージバチラス・ハロフィラスＩ３０−１株とすることができる。【００４２】
本発明の機能性コンポストは、例えば植物病害防除機能を有する糸状菌を用いた場合には、植物病害防除機能を有する糸状菌の種類に応じて種々の植物病害に対する防除効果を有するものとすることができるが、病原菌が植物病原性糸状菌である植物病害用のコンポストであることが、より効果的に防除効果を発揮できるため好ましい。特に、コンポストに接種する糸状菌としてヒトヨタケを選択した場合には、植物病原性糸状菌がリゾクトニア属及びフザリウム属の少なくとも一方に属する糸状菌である場合に、特に顕著な植物病害防除効果を発揮できる。本発明の植物病害防除剤を使用可能な植物病害としては、チンゲンサイ尻腐病、シバ葉腐病、メロンつる割病、トマト根腐萎凋病等を挙げることができる。【００４３】
この機能性コンポストを使用する場合には、機能性コンポスト中の糸状菌の種類及び目的によって異なるが、一般に、対象となる土壌、培地、培養土に適当量混合すればよい。例えば、植物病害防除対象となる植物の場合には、植物の根元付近の土壌、培地や培養土に混合する。このときの混合比については病原菌の濃度などの相対的条件によって変化するが、一般に、植物病害防除機能を有する糸状菌をＤＮＡ量として５μｇ／ｇ乾燥コンポストの菌体量で適当量、例えば１〜２０質量％程度土壌中に混合することが望ましい。【００４４】
また本発明に用いられる細菌類の活動制限状態にあるコンポストは、上述したように、コンポスト化のために細菌類を含むコンポストにおいて糸状菌を効果的に増殖させるには、最適なコンポストである。即ち、本発明の糸状菌増殖用コンポストは、細菌類の活動制限状態にあるコンポストである。本発明の糸状菌増殖用コンポストは、糸状菌を効率よく増殖させることができるので、上記の本発明の機能性コンポストを効率よく提供することができる。また糸状菌共存生育可能細菌類を含む糸状菌増殖用コンポストは、糸状菌を一層効率よく増殖させることができ且つより安定した菌叢を形成することができる。本糸状菌増殖用コンポストに含まれる糸状菌共存生育可能細菌としては、前述したようにバージバチラス・ハロフィラスであることが好ましく、例えばバージバチラス・ハロフィラスＩ３０−１株とすることができる。【００４５】
この糸状菌増殖用コンポストにおける細菌類の活動制限状態とは、前述した事項がそのまま該当し、栄養制限状態、ｐＨ制限状態及び水分制限状態からなる群より選択された少なくとも１つを挙げることができる。また、このような活動制限状態であれば、細菌類の活動を制限すると共に、糸状菌を選択的に増殖させることができる。
このような糸状菌増殖用コンポストは、上述したように、接種可能な糸状菌の種類に限定はなく、広範囲の用途に使用可能な機能を有する糸状菌を接種して効率よく増殖させることができる。【００４６】
また本発明は、機能性コンポストを作製するために用いられる植物病害防除機能を有する糸状菌を、機能性コンポスト中で認定し、同定するために適切なプライマー対を提供することができる。このプライマー対を用いることによって、糸状菌に特有な配列をＰＣＲ法にて簡便に増幅することができる。ここで用いられるＰＣＲ法には、プライマー対を用いて増幅することができる方法であれば、特に制限はない。【００４７】
本プライマー対は、糸状菌のｒＤＮＡのうち当該糸状菌に特有な配列部分を増幅できるものであり、具体的にはヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１株を検出するには、ＩＴＳ１領域のポリヌクレオチド配列に対するプライマー対、例えば後述するGM-21_F及びGM-21_R（配列番号１及び２）を用いることができる。特に配列番号１及び２で示されるGM-21_F及びGM-21_Rは、ＧＭ−２１株に対する選択性が高いので、ＧＭ−２１株を効率よく且つ正確に検出するために好適に使用することができ、定量的ＰＣＲによりＧＭ−２１株を検出する際に特に好ましく用いることができる。【００４８】
このプライマー対は、例えば、ＧＭ−２１株を検出するためのキットの一構成要素として用いることができる。すなわち、ヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１株を検出するためのキットは、配列番号１及び配列番号２としてそれぞれ示されるGM-21_F及びGM-21_Rである検出用プライマーセットを含むことができる。このキットは、プライマーセットに加えて、検出に必要な取扱説明書、検出に用いられる緩衝液、反応液等の試薬類などからなる群より選択された追加要素を適宜含んでいてもよい。このキットを使用することにより、ＧＭ−２１株の存在有無、その濃度の測定などを簡便に行うことができる。【００４９】
さらに本発明は、糸状菌共存生育可能細菌を検出し、同定するためのプライマー対を提供することができる。このような糸状菌共存生育可能細菌検出用のプライマー対としては、１６Ｓ ｒＤＮＡのうち当該細菌に特有な配列部分を増幅できるものであり、例えば、バージバチラス・ハロフィラスを検出するためには、例えばI30-1_348F（配列番号３）及びI30-1_475R（配列番号４）や、16S_F（配列番号５）や16S_R（配列番号６）で示されるプライマー対を挙げることができる。特に、I30-1_348F（配列番号３）及びI30-1_475R（配列番号４）で示されるプライマー対は、バージバチラス・ハロフィラスＩ３０−１株に対する選択性が高いので、Ｉ３０−１株を効率よく且つ正確に検出するために好適に使用することができ、定量的ＰＣＲによりＩ３０−１株を検出する際に特に好ましく用いられる。【００５０】
このプライマー対は、例えば、糸状菌共存生育可能細菌を検出するためのキットの一構成要素として用いることができる。すなわち、糸状菌共存生育可能細菌を検出するためのキットは、配列番号３及び配列番号４としてそれぞれ示されるI30-1_348F及びI30-1_475Rである検出用プライマーセットを含むことができる。このキットは、プライマーセットに加えて、検出に必要な取扱説明書、検出に用いられる緩衝液、反応液等の試薬類などからなる群より選択された追加要素を適宜含んでいてもよい。このキットを使用することにより、糸状菌共存生育可能細菌の種類の特定、その濃度の測定などを簡便に行うことができる。【００５１】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００５２】
［実施例１］
＜ＧＭ−２１株の至適温度条件の検討＞
ＰＤＡ培地上で十分に生育したヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１株(Coprinus curtus Kalchbr. ex Thum. GM-21：ＮＩＴＥ  ＢＰ−３７)を、培地ごと３ｍｍ四方を切り取り、ＰＤ液体培地１００ｍＬに接種して、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃の各培養温度下、振盪幅７ｃｍ、１１０ｓｐｍの往復振盪培養装置（ＴＡ−１２Ｒ、高崎科学器械株式会社）を用いて３日間培養した。培養後、それぞれの培養条件下のサンプルを回収して、増殖したＧＭ−２１株の乾燥重量を測定した。結果を図１に示す。【００５３】
図１に示されるように、増殖量は３５℃が最大となっており、この温度付近に良好に増殖することがわかった。
ただし、コンポスト化に使用する細菌類は、４０℃では増殖が旺盛であるため、細菌類との共存下において機能性コンポストを効率よく得るのに好ましい温度条件は、３５℃以下であることがわかった。以下の実施例２では、３５℃で、１１０ｓｐｍの条件で３日間振盪培養したＧＭ−２１株を使用した。【００５４】
［実施例２］
＜機能性コンポストの製造方法Ｉ＞
市販の油粕コンポスト（油かす：富士見園芸株式会社製）を原料として、初期ｐＨを８．４４、水分率を５９．４％にし、種菌（オーレスＧ：松本微生物研究所製）を乾燥重量比で５％となるように接種した。接種後０〜１２時間かけて３０℃から６０℃まで昇温し、その後６０℃として培養し、高速コンポスト化を行った。
この間のＣＯ２発生速度を、測定器（光明理化学工業株式会社製、１２６ＳＡ、あるいは１２６ＳＨ、北川式検知管）で測定し、ＣＯ２発生速度が２×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト以下となった時点（接種後７日目）で、オートクレーブ滅菌（１２１℃、９０ｍｉｎ）を行った。この時点でのｐＨは、高速コンポスト化を担う細菌類の増殖に適した約ｐＨ８、また水分率は６２．３％であった。炭素変化率は４７．４％と高い値であり、この段階のコンポストは、所謂完熟寸前のコンポストであった（図２、表１参照）。【００５５】
完熟寸前のコンポストを滅菌後、硫酸水溶液を用いてｐＨを５．７５に調節し、ＧＭ−２１株（０．００７６ｇ乾燥菌体／ｍＬ）を０．５ｍＬ接種した。このときの水分率は５８．８％であった。引き続いて、３０℃で５日間コンポスト化した。培養終了後のコンポストは、ｐＨ５．８、水分率６３．５％、炭素変化率は５０％であった（図２、表１）。【００５６】
【表１】
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【００５７】
培養後、菌体を回収してＧＭ−２１株の菌体量をＤＮＡ量として測定した。簡単に説明すれば、土壌抽出キット  ISOIL for Beads Beating (NIPPON GENE CO.,LTD. 319-06201)をマニュアルとおりに使用して、コンポスト中のＤＮＡを抽出した。次いで、抽出したＤＮＡ量を、Quant-iT（商品名） PicoGreen dsDNA Reagent and Kits （インビトロジェン社）をマニュアルとおりに使用して、蛍光分光光度計を用いて蛍光を測定し、コンポスト中のＤＮＡ量を求めた。完熟寸前のコンポストには滅菌を行っているため、コンポスト中で増加したＤＮＡは、接種したＧＭ−２１株のものと考えられる。コンポスト化後のＧＭ−２１株の菌体量を表２に示す。【００５８】
表２に示されるように、コンポスト化終了後のコンポストでは、大量のＧＭ−２１株が存在しており、細菌類でコンポスト化した完熟寸前のコンポスト内においてＧＭ−２１株が約１００倍増殖していた。コンポスト中の細菌類はＧＭ−２１株接種直前の滅菌処理によって除去されているため、得られた機能性コンポストには存在していない。【００５９】
【表２】
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【００６０】
［比較例］
市販の油粕コンポスト（油かす：富士見園芸株式会社製）を原料として、初期ｐＨを６、水分率を約６０％にし、ＧＭ−２１株（０．００５２ｇ乾燥菌体／ｍＬ）を１．０ｍＬ接種した。接種後３５℃で５日間培養した。５日後にコンポストを回収し、希釈平板法を用いＰＤＡ培地上でＧＭ−２１株の増殖を確認したところ、培養後のコンポストでは糸状菌が充分に増殖してないことは明らかであった。【００６１】
このことは、市販コンポストでは、細菌類の活動が制限されてないので、植物病害防除機能を有する糸状菌を増殖に好適な条件、例えば至適温度で接種し、培養しても、糸状菌のみを選択的に充分に増殖させることができないことを示している。この結果、得られたコンポストには充分な且つ安定な機能性が期待できないことがわかる。【００６２】
［実施例３］
実施例２で得られた機能性コンポストによる植物病害防除効果を確認した。
チンゲンサイの尻腐病の病原菌たるRhizoctonia solaniチンゲン２株をＰＤ液体培地に接種し、２５℃、１１０ｓｐｍ（往復振盪）の条件で７日間振盪培養したものを、ホモジナイズして病原菌懸濁液を作製した。引き続いて育苗用土４７ｇを植物試験用ポット（旭テクノグラス社製）に入れてオートクレーブ滅菌し、実施例２で得られた機能性コンポストを３ｇ混合して、チンゲン２株の接種濃度が０．０００５２８ｇ乾燥菌体／ｇ乾燥土壌となるように、上記の病原菌懸濁液と滅菌水を合わせて１２ｍＬとして加えて、よく混合した後、無菌処理したチンゲンサイの種子を１５粒播種した。このポットを植物環境試験装置（島津理化器社製）に入れ、昼３０℃、夜２０℃、湿度５５％の条件で栽培し、播種後６日目にチンゲンサイの苗が１０苗となるように間引きし、２０日間にわたり発病状態を観察した。【００６３】
発病状態を発病度として測定した。発病度は下記のようにして数値化した。
発病度（％）＝（１ａ+２ｂ+３ｃ+４ｄ+５ｅ）×１００／（５×播種数）
ａ：発病が少し認められる固体数
ｂ：発病が認められる固体数
ｃ：発病が大きく認められる固体数
ｄ：枯れている固体数
ｅ：未発芽または枯死した固体数【００６４】
実施例２の機能性コンポストと病原菌を使用したものを試験区Ａ、病原菌のみのものを試験区Ｂ、病原菌を接種していないものを試験区Ｃとした。結果を図３に示す。図３中、試験区Ａは白丸、試験区Ｂは四角、試験区Ｃは菱形で表す。
図３で明らかなように、実施例２で得られた機能性コンポスト（白丸）による病害発生の防除効果は顕著であった。【００６５】
［実施例４］
＜機能性コンポストの製造方法II＞
原料は市販の油粕コンポスト（油かす：富士見園芸株式会社製）を用いた。初期ｐＨを７．８６、含水率を６０％に調整して種菌（オーレスＧ：松本微生物研究所製）を乾燥重量比で１９：１となるように油粕コンポストに接種し、得られたコンポスト混合原料を、１ミニリアクタ当り１５ｇ投入してコンポスト化を行った。
条件は０〜１２時間かけて３０℃から６０℃まで昇温し、１９２時間まで６０℃で高速コンポスト化した。８日（１９２時間）経過後、コンポストの一部を１２１℃、９０ｍｉｎの条件でオートクレーブを用いて滅菌処理した。【００６６】
滅菌していないコンポストと滅菌したコンポストを適宜混合し、細菌類濃度が１０６ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト、１０３ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポストとなるように調整したそれぞれの試料のｐＨを、１０容量％の硫酸を用いて人為的にｐＨ６付近に調節した。次いで、事前にＰＤ液体培地を用いて３５℃、１１０ｒｐｍの条件で３日間振盪培養したＧＭ−２１株（０．００６８ｇ乾燥菌体／ｍＬ）を各試料に１ｍＬ接種して、最終濃度０．００１１３ｇ乾燥菌体／ｇ乾燥コンポストとした。
このように細菌類濃度を１０６ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト、および１０３ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポストに変化させＧＭ−２１株を接種したそれぞれの試料を、３０℃で５日間培養してコンポスト化を行い、機能性コンポスト試料１及び２を得た。なお、機能性コンポスト試料１及び２のいずれも、ＧＭ−２１株接種前のコンポストのときからＧＭ−２１株と共存生育可能な細菌類が含まれている。【００６７】
［実施例５］
＜コンポストの評価＞
コンポスト化終了後、機能性コンポスト試料１及び２それぞれの細菌類濃度を希釈平板法（ＴＳ培地、３０℃）によって測定した。また、細菌類が高濃度に存在するコンポスト中のＧＭ−２１株濃度を定量的ＰＣＲ法によって測定した。また実施例２と同様にして北川式検知管を用いてＣＯ２濃度を測定し、コンポストの病害防除効果は植物試験をおこなって評価した。なお、５日間切り返しは行わなかった。【００６８】
ＧＭ−２１株の接種時期については、コンポスト化におけるＣＯ２発生速度に基づいて判断した。即ち、本実施例では、ＣＯ２発生速度が２×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト付近となったところで行った。
結果を図４〜図７に示す。【００６９】
図４に示されるように機能性コンポスト試料１及び２の高速コンポスト化の過程ではｐＨが８から８．５に上昇し、コンポスト化は順調に進行していた。一方、各コンポスト試料についてもＧＭ−２１株接種時にはｐＨを６付近まで下げたが、高速コンポスト化によって有機物が十分に分解されていたため、ｐＨが再び上昇することはなく、ＧＭ−２１株の増殖にとっては有効な条件となった。【００７０】
図５は、コンポスト化におけるＣＯ２発生速度の経時変化を示している。図５に示されるように、ＧＭ−２１株接種後のＣＯ２発生速度が小さいことから、ＧＭ−２１株接種時の有機物の残存量が少なくＧＭ−２１株が貧栄養条件でも増殖可能であることがわかる。【００７１】
図６は、コンポスト化における炭素変化率の経時変化を示す。炭素変化率は最終的に４０％程度の大きな値となり、原料中の有機物は十分に分解されていることがわかった。
図７は、コンポスト化における細菌類濃度の経時的変化を示している。ＧＭ−２１株接種時の細菌類濃度は、機能性コンポスト試料１の場合では１０６ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト、機能性コンポスト試料２の場合では１０３ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト程度であったが、機能性コンポスト試料１及び２はいずれも、コンポスト化終了時には１０９ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト以上と高濃度になっていた。なお、コンポスト化前後で細菌類の種類が異なる、すなわち、増殖した細菌類はＧＭ−２１株接種時に優勢であったものとは異なることを確かめている。【００７２】
＜コンポスト中のＧＭ−２１株濃度の確認＞
上記機能性コンポスト試料１及び２の製造工程におけるＧＭ−２１株濃度を、定量的ＰＣＲ法を用いて測定した。リアルタイムＰＣＲ装置としてはSmart Cycler II（タカラバイオ株式会社）、ＤＮＡを増幅させるためのＴａｑとしてはSYBR Premix Ex Taq（タカラバイオ株式会社）、プライマーとしては、フォワード（GM-21_F）：GTGTTGCATGTAGCTGCCTCCTC（配列番号１）及びリバース（GM-21_R）：TGACGCGAGAGTTATCCAGACCTAC（配列番号２）を用いて、定量的ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応条件は、まず９５℃、１０秒で熱変性を行った後に、９５℃、５秒（熱変性）、６０℃、２０秒（アニーリング・伸張）をそれぞれ４０サイクル行った（表３参照）。結果を図８に示す。【００７３】
【表３】
2008149846.tif 000005
【００７４】
図８には、コンポスト化におけるＧＭ−２１株濃度の経時変化が示されている。図８に示されるように、機能性コンポスト試料２の場合、ＧＭ−２１株接種時に比べて培養終了時には１００倍以上にＧＭ−２１株が増殖していた。このように、本実施例の機能性コンポスト試料の場合、高速コンポスト化の工程から糸状菌共存生育可能細菌類が共存し、この糸状菌共存生育可能細菌類の生存下で試料へのＧＭ−２１株の接種を行っても、ＧＭ−２１株が増殖可能であることが明らかであった。また、ＧＭ−２１株は、糸状菌共存生育可能細菌類の量に変わりなく増殖可能であることも明らかであった。
さらに、本実施例ではＧＭ−２１株を接種する際に試料を一部滅菌して用いたが、滅菌をまったく行わない高速コンポスト化後の試料にＧＭ−２１株を接種しても、同様にＧＭ−２１株の増殖が認められた。
従って、ＧＭ−２１株接種時に糸状菌共存生育可能細菌類が存在する場合、この糸状菌共存生育可能細菌類とＧＭ−２１株が共に増殖していくことがわかった。【００７５】
［実施例６］
＜糸状菌共存生育可能細菌類の同定＞
実施例４で得られた機能性コンポスト試料１について、コンポスト化終了時（細菌類濃度１０９ＣＦＵ／ｇ乾燥コンポスト）のサンプル中の細菌類を、Trypticase soy（以下、ＴＳ）培地を用いた希釈平板法（ＴＳ培地、３０℃）により、培養した。３日後プレートから優勢な菌を単離した。単離した細菌をＩ３０−１株とした。【００７６】
Ｉ３０−１株は、ＴＳ寒天培地を用いて３０℃の条件で２日間培養することにより、２ｍｍ直径の淡黄色で円形、半レンズ状の隆起状態、全周縁で、表面はスムーズ、バター様の粘稠度のコロニーを形成する。Ｉ３０−１株は、グラム染色性は陽性で運動性のある芽胞形成桿菌であり、カタラーゼとオキシダーゼが陽性である。【００７７】
細菌は、ＴＳ液体培地を用いて、３０℃、１１０ｓｐｍ（往復振盪）の条件で７２時間培養し、１５０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎの条件で遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体から、ISOIL for Beads Beating kit (Nippon Gene Co.) を用いて、ＤＮＡを抽出した。また、抽出したＤＮＡはMicrospin S-300 HR Columns(GE Healthcare UK Ltd.)を用いてマニュアルに従い精製した。【００７８】
抽出・精製した雑菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡ領域を16S_F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA：配列番号５）と16S_R（GGTTACCTTGTTACG：配列番号６）のプライマー、TaKaRa Ex Taq Hot Start Version  (TaKaRa Bio INC.)を用い、PTC-100 thermal cycler (TaKaRa Shuzo CO.)によりＰＣＲ法で増幅した。ＰＣＲは、最初に９５℃、５分の変性をおこなった後、９５℃、１分（変性）、４９℃、４５秒（アニーリング）、７２℃、１分３０秒（伸長）を３０サイクル、最後に７２℃、５分の伸長を行った。【００７９】
ＰＣＲ産物の塩基配列は、ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems）を用いて解析した。その後決定した塩基配列については、DNA Data Bank of Japan（以下、DDBJ）に登録されている配列に対して相同性検索（nucleotide Blast）を行って、最も相同性の高いものを選定した。その結果、Ｉ３０−１株はバージバチラス・ハロフィラス（Virgibacillus halophilus）と同定できた（表４）。なお、Ｉ３０−１株についてのＢＬＡＳＴ検索の結果を表５に示す。【００８０】
Ｉ３０−１株は、I30-1_348F（GTAGGGAATC TTCCGCAATG：配列番号３）及びI30-1_475R（GTCAAGGTGC CGCCTTATT：配列番号４）を検出用プライマーとして使用し、前述のＧＭ−２１株の検出と同様の条件で定量的ＰＣＲを行った。簡単に説明すると、リアルタイムＰＣＲ装置としてSmart Cycler II（タカラバイオ株式会社）を用いて、最初に９５℃、１０秒の熱変性をおこなった後、９５℃、５秒（熱変性）、６０℃、２０秒（アニーリング・伸長）をそれぞれ４０サイクル行った。これにより、Ｉ３０−１株を高い精度で定量的に検出できた。【００８１】
【表４】
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【００８２】
【表５】
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【００８３】
［実施例７］
＜植物病害防除試験＞
次に、実施例４で得られた機能性コンポスト試料１及び機能性コンポスト試料２の植物病害防除効果を確認した。
チンゲン２株の接種濃度が０．０２９ｇ乾燥菌体／ポットとなるようにした以外は上記実施例３と同様にして、コンポストを６質量％で混合した滅菌土壌に１５粒の無菌処理したチンゲンサイ種子を播種し、播種後６日目に１０苗となるように間引きして、発病状態を発病度として測定し、評価した。結果を図９に示す。なお、図９中、実施例４で得られた機能性コンポスト試料１と病原菌を使用した試験区Ｄは黒菱形、実施例４で得られた機能性コンポスト試料２と病原菌を用いた試験区Ｅは黒三角、病原菌のみの試験区Ｆは黒四角、病原菌を接種していない試験区Ｇを黒丸で示す。【００８４】
図９に示されるように、細菌類の生存下でＧＭ−２１株を接種することにより実施例４で作製された本発明にかかる機能性コンポスト試料１及び２には、チンゲンサイ尻腐病を防除する効果があることがわかった。この結果から、細菌類が存在し、コンポスト中で糸状菌共存生育可能細菌類が高濃度に増殖していてもＧＭ−２１株の増殖も同時に可能であり、ＧＭ−２１株を高濃度に含む本製品は、確実な病害防除効果のあることが確かめられた。【００８５】
［実施例８］
次に、機能性コンポストが利用可能な他の植物病害防除作用の確認を行った。
（ａ）  レタスすそ枯病病原菌に対する植物病害防除効果
ＧＭ−２１株の菌糸２ｇに対して、５０ｍｌの滅菌水を加えてホモジナイズし、懸濁液を作成した。
レタスすそ枯病の病原菌たる Rhizoctonia solani レタス２株をＰＤ寒天培地上に一面に生育させたものに滅菌水５０ｍｌを加え、ホモジナイズして得た懸濁液を滅菌水で１０００倍希釈し、病原菌懸濁液とし、レタスすそ枯病に対するヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１株の糸状菌懸濁液の防除効果を検討した。育苗土入り滅菌ポットに、上記の病原菌懸濁液２ｍｌ、糸状菌懸濁液４ｍｌ、滅菌水の６ｍｌをよく混合した後、無菌処理したレタス種子を２０粒播き、上記と同様にして苗を１０苗に間引いて１か月間にわたり発病状態を観察した。結果を図１０に示す。図１０において、病原菌のみを用いた試験区は黒丸、ＧＭ−２１株と病原菌を用いた試験区は黒四角でそれぞれ示す。【００８６】
図１０で明らかなように、ＧＭ−２１株は、レタスすそ枯病病原菌 Rhizoctonia solani レタス２株に対して病害発生を強く抑制することができた。従って、上記実施例２及び実施例４と同様にして作製されるＧＭ−２１株を含む機能性コンポストは、レタスすそ枯病に対しても植物病害防除効果を有しうる。【００８７】
（ｂ）種々のヒトヨタケ属糸状菌による植物病害防除効果
上記ヒメツブヒトヨタケ（ＧＭ−２１株）と同様に、ウシグソヒトヨタケ(Coprinus cinereus NBRC30114)、イヌセンボンダケ（Coprinus disseminatus NBRC30972）を用いて、Rhizoctonia solani K1株によるシバ葉腐病に対する防除効果を確認した。その結果を図１１に示す。図１１において、病原菌のみを用いた試験区は黒丸、ＧＭ−２１株と病原菌を用いた試験区は黒菱形、ウシグソヒトヨタケと病原菌を用いた試験区は白三角、イヌセンボンダケと病原菌を用いた試験区はＸでそれぞれ示す。【００８８】
図１１で明らかなように、ヒメツブヒトヨタケ（ＧＭ−２１株）、ウシグソヒトヨタケ(Coprinus cinereus NBRC30114)、イヌセンボンダケ（Coprinus disseminatus NBRC30972）は、Rhizoctonia solani K1株によるシバ葉腐病に対する病害発生を抑制することができた。従って、ヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１株を用いた上記実施例２及び実施例４と同様にして作製されうるウシグソヒトヨタケ(Coprinus cinereus NBRC30114)、イヌセンボンダケ（Coprinus disseminatus NBRC30972）を含む機能性コンポストは、シバ葉腐病に対しても植物病害防除効果を有しうる。【００８９】
（ｃ）種々の糸状菌による植物病害に対する防除効果
ＰＤ寒天培地上に生育したRhizoctonia solaniチンゲン２株と、ＰＤ寒天培地上に生育したＧＭ−２１株からそれぞれ小片を取り、別に用意したＰＤ寒天培地プレート上に約５ｃｍ離して置き、２７℃で５日間培養した。
また同様にメロンつる割病病原菌 Fusarium oxysporum f. sp. melonis Ｆ０−Ｍｅ−２株、トマト根腐萎凋病病原菌 Fusarium oxysporum f. sp. redicus-lycopersici Ｆ０−Ｔ−３株についても、それぞれ、上記と同様にしてＧＭ−２１株と同じＰＤ寒天培地プレート上に置き、２７℃で５日間培養した。【００９０】
その結果、いずれの病原菌を用いた場合でも、病原菌菌糸とＧＭ−２１株菌糸が対峙している接点では、明確な境界線が生じた。また病原菌菌糸は形態も変化し、変色した。これらのことは、いずれも、ＧＭ−２１株と接することによって病原菌が強いダメージを受けていることを示している。
従って、上記実施例２及び実施例４と同様にして作製されるＧＭ−２１株を含む機能性コンポストは、レタスすそ枯病以外にも、メロンつる割病及びトマト根腐萎凋病に対しても植物病害防除効果を有しうる。【００９１】
上記のように本発明による植物病害防除は、ヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１株を含む機能性コンポストによるチンゲンサイ尻腐病の病原菌（Rhizoctonia solani）に対する植物病害防除効果に限定されない。【００９２】
本発明の一実施形態によれば、コンポスト化の工程において植物病害防除糸状菌を選択的に増殖させながら製造するので、優れた植物病害防除効果を有する機能性コンポストを、効率よく製造することができる。
また本発明の一実施形態により得られた機能性コンポストは、機能を有する糸状菌が充分量存在しており、目的とする機能が充分に発揮されるコンポストとして利用可能である。
さらにまた、細菌類が生存していても活動制限状態にある本発明の一実施形態のコンポストは、糸状菌の増殖に適しており、糸状菌増殖用コンポストとして利用可能である。【００９３】
日本出願番号第２００７−１４５６９７号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月25日(2009.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）からなる群より選択された少なくとも１つとして示される細菌類の活動制限状態にあるコンポストに、機能を有する糸状菌を接種すること、
（１）ｐＨ５〜７である制限ｐＨ状態
（２）２０％〜４０％である制限水分状態
（３）ＣＯ２発生速度が最大となった後にＣＯ２発生速度１×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト〜３×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポストである栄養制限状態
前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して選択的に増殖させること、
を含む機能性コンポストの製造方法。
【請求項２】
糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を含むコンポストであって、以下の（１）〜（３）からなる群より選択された少なくとも１つとして示される前記糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類の活動制限状態のコンポストに、機能を有する糸状菌を接種すること、
（１）ｐＨ５〜７である制限ｐＨ状態
（２）２０％〜４０％である制限水分状態
（３）ＣＯ２発生速度が最大となった後にＣＯ２発生速度１×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト〜３×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポストである栄養制限状態
前記糸状菌を、前記コンポスト内で培養して前記糸状菌共存生育可能細菌類と共に選択的に増殖させること、
を含む、機能性コンポストの製造方法。
【請求項３】
前記細菌類の活動制限状態が、少なくとも前記（３）栄養制限状態を含む請求項１又は２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
前記細菌類の活動制限状態のコンポストを作製する工程を更に含む請求項１又は２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項６】
前記細菌類の活動制限状態のコンポストを作製する工程が、有機廃棄物を栄養制限状態となるまで腐熟させる工程である請求項５記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項７】
前記コンポスト内で糸状菌を培養する際の培養温度が、１０℃〜３５℃である請求項１又は２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項８】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、バージバチラス・ハロフィラスである請求項２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項９】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、Ｉ３０−１株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９７５）である請求項２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１０】
前記機能を有する糸状菌が、植物病害防除機能及び土壌改質機能の少なくとも一方を有する糸状菌である請求項１又は２記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１１】
前記植物病害防除機能を有する糸状菌がヒトヨタケである請求項１０記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１２】
前記ヒトヨタケは、ヒメツブヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｕｒｔｕｓ）、ウシグソヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、イヌセンボンダケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｕｓ）、ササクレヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｏｍａｔｕｓ）、ヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ａｔｒａｍｅｎｔａｒｉｕｓ）、コキララタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔｎｓ）、センボンクヌギタケ（Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｉｓｓｉｍａ）、イタチタケ（Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ  ｃａｎｄｏｌｌｉａｎａ）およびムジナタケ（Ｐｓａｔｈｙｒｅｌｌａ  ｖｅｌｕｔｉｎａ）からなる群より選択された少なくとも１つである請求項１１記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１３】
ヒトヨタケは、ヒメツブヒトヨタケＧＭ−２１株（ＮＩＴＥ  ＢＰ−３７）である請求項１１記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１４】
糸状菌を植物病原菌とする植物病害防除機能を有する請求項１１記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１５】
前記植物病原性糸状菌がリゾクトニア属及びフザリウム属の少なくとも一方に属する糸状菌である請求項１４記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１６】
前記植物病原性糸状菌がリゾクトニア属及びフザリウム属の少なくとも一方に属する糸状菌であり、前記植物病害防除機能を有する糸状菌がヒトヨタケである請求項１４記載の機能性コンポストの製造方法。
【請求項１７】
機能を有する糸状菌を含む請求項１記載の製造方法により得られた機能性コンポスト。
【請求項１８】
機能を有する糸状菌と糸状菌共存生育可能細菌とを含む請求項２記載の製造方法により得られた機能性コンポスト。
【請求項１９】
前記機能を有する糸状菌が、植物病害防除機能及び土壌改質機能の少なくとも一方を有する糸状菌である請求項１７又は１８記載の機能性コンポスト。
【請求項２０】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、バージバチラス・ハロフィラスである請求項１８記載の機能性コンポスト。
【請求項２１】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、Ｉ３０−１株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９７５）である請求項１８記載の機能性コンポスト。
【請求項２２】
以下の（１）〜（３）からなる群より選択された少なくとも１つとして示される細菌類の活動制限状態にある糸状菌増殖用コンポスト：
（１）ｐＨ５〜７である制限ｐＨ状態
（２）２０％〜４０％である制限水分状態
（３）ＣＯ２発生速度が最大となった後にＣＯ２発生速度１×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト〜３×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポストである栄養制限状態。
【請求項２３】
糸状菌の生育条件で活動可能な糸状菌共存生育可能細菌類を含み、以下の（１）〜（３）からなる群より選択された少なくとも１つとして示される前記糸状菌共存生育可能細菌類以外の細菌類の活動制限状態にある糸状菌増殖用コンポスト：
（１）ｐＨ５〜７である制限ｐＨ状態
（２）２０％〜４０％である制限水分状態
（３）ＣＯ２発生速度が最大となった後にＣＯ２発生速度１×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポスト〜３×１０−５ｍｏｌ／ｈ／ｇ乾燥コンポストである栄養制限状態。
【請求項２４】
前記細菌類の活動制限状態が、少なくとも前記（３）栄養制限状態を含む請求項２２又は２３記載の糸状菌増殖用コンポスト。
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
前記糸状菌が、植物病害防除機能及び土壌改質機能の少なくとも一方を有する糸状菌である請求項２２又は２３記載の糸状菌増殖用コンポスト。
【請求項２７】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、バージバチラス・ハロフィラスである請求項２３記載の糸状菌増殖用コンポスト。
【請求項２８】
前記糸状菌共存生育可能細菌が、Ｉ３０−１株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９７５）である請求項２３記載の糸状菌増殖用コンポスト。
【国際調査報告】
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