(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然皮革製品からサンプル核酸を調製する方法において、天然皮革製品由来の皮革片に、Vibrio hollisae1706B株（NITE P-776）を作用させる分解処理を行った後に、核酸を抽出することを特徴とするサンプル核酸の調製方法。
【請求項２】
Vibrio hollisae1706B株（NITE P-776）による分解処理が、15〜55℃で2時間以上培養する請求項１記載の方法。
【請求項３】
皮革片を有機酸に浸漬し、所望により中和処理した後、Vibrio hollisae1706B株（NITE P-776）を作用させる請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
天然皮革製品が、クロム鞣し又はタンニン鞣し皮革製品である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
有機酸、Vibrio hollisae1706B株（NITE P-776）及び核酸抽出溶液を含有する請求項１〜４のいずれか１項記載の方法を行うためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然皮革製品から核酸を解析するためのサンプル核酸の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然皮革製品は、皮革の種類によって価値が異なるために、皮革の種類を科学的に証明することは重要である。しかしながら、従来は、光学顕微鏡もしくは電子顕微鏡による表面および断面の観察が主であり、当該手段では種の断定には至らなかった。
【０００３】
最近では、コラゲナーゼを利用することで天然皮革を溶解し、ＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ反応にて所望の配列を増幅させ生物種を同定する方法が報告されている（特許文献１）。
【０００４】
しかしながら、この方法でも、ＤＮＡ抽出効率が十分でない、コラゲナーゼが希少品であり高価であるためコストがかかる、鋏等による裁断操作を要することから手間がかかる、という問題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特許第３８９６２７２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、天然皮革製品から核酸増幅反応等に用いられるサンプル核酸を効率的に調製する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、斯かる実情に鑑み、天然皮革製品から核酸を調製する方法について種々検討したところ、天然皮革製品由来の皮革片にコラゲナーゼ産生微生物を作用させて、皮革を分解した後に核酸抽出操作を行った場合に、核酸の増幅反応における増幅効率がコラゲナーゼを用いた場合に比べて優れることを見出した。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の１）〜７）の発明に係るものである。
１）天然皮革製品からサンプル核酸を調製する方法において、天然皮革製品由来の皮革片にコラゲナーゼ産生微生物を作用させる分解処理を行った後に、核酸を抽出することを特徴とするサンプル核酸の調製方法。
２）コラゲナーゼ産生微生物がビブリオ属細菌である上記１）の方法。
３）ビブリオ属細菌が、Vibrio hollisae 1706B株（NITE P-776）である上記２）の方法。
４）コラゲナーゼ産生微生物による分解処理が、15〜55℃で2時間以上培養する上記１）〜３）のいずれかの方法。
５）皮革片を有機酸に浸漬し、所望により中和処理した後、コラゲナーゼ産生微生物を作用させる上記１）〜４）のいずれかの方法。
６）天然皮革製品が、クロム鞣し又はタンニン鞣し皮革製品である上記１）〜５）のいずれかの方法。
７）有機酸、コラゲナーゼ産生微生物及び核酸抽出溶液を含有する上記１）〜６）のいずれかの方法を行うためのキット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、天然皮革製品から、より簡便且つ安価に、ＰＣＲ(Polymerase chain reaction)、ＬＡＭＰ(Loop-mediated isothermal amplification)などの各種核酸増幅反応に適したサンプル核酸を調製することが可能となり、本発明のサンプル核酸を用いることにより、ＤＮＡ鑑定等の核酸解析をより高精度で行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターン。Ａ：微生物処理、Ｂ：コラゲナーゼ処理
【図２】ＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターン。
【図３】ＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターン。
【図４】公知の肉種鑑別用プライマーを用いて増幅させたＰＣＲ増幅産物の電気泳動パターン。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書において、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びこれらの誘導体を含む概念として用いられる。
【００１２】
本発明において、「天然皮革」とは、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、シカ、オーストリッチ、ヘビ、ワニ、トカゲ等、様々な動物種由来の皮革を意味する。また、「天然皮革製品」とは、主としてなめし処理が施された天然皮革を用いて製造された各種製品を意味し、染色処理、表面コーティング処理の有無を問わない。
【００１３】
また、製品には、最終製品の形に縫製されたものの他、最終製品製造のための材料として供給される半製品、更には、天然皮革のトリミング屑（皮や革の周囲を切り整える時に生ずる小片）やシェービング屑（革の肉面側の表面を回転する刃で削った際に発生する屑）等の天然皮革繊維を圧着・接着等して再構築された再生皮革製品（リサイクルレザー）等が包含される。
【００１４】
本発明における処理を行うに当たり、上記天然皮革製品は、表面皮膜等のコーティングを、ヤスリを用いて剥がしたり、ハサミ、ナイフ等により適当な大きさに切断する等の物理的処理を適宜施すことができるが、特に皮革片を細切する必要はない。
【００１５】
また、天然皮革製品（皮革片）は、クロム鞣し、タンニン鞣し等の鞣し処理が行われており、例えばクロム含有量が高い場合（例えば２％以上）には、微生物による分解処理が妨害されるおそれがあることから、予め斯かる鞣し剤を除去しておくことが好ましい。
通常、脱クロム処理には、硫酸、シュウ酸等が用いられるが、核酸増幅反応への影響を考慮すると、コハク酸、マレイン酸、クエン酸、酢酸、ギ酸等の有機酸を用い、皮革片をこれに一定時間浸漬するのが好ましい（実施例２参照）。
【００１６】
有機酸への浸漬は、通常、皮革片を、有機酸を1〜10％濃度、好ましくは2〜7％濃度に調製した溶液中に、例えば浴比 1:10〜1:1000で投入し、20〜95℃、好ましくは30〜70℃で、8時間以上、好ましくは12〜72時間程度、静置することにより行うことができる。
【００１７】
有機酸に浸漬した後、遠心分離することにより皮革片を沈澱させて有機酸と分離し、後述する微生物処理に付すことができるが、有機酸を除去した後、適当な中和処理を行っても良い。
中和処理は、例えば、皮革片に、リン酸緩衝液（pH7.0）、ホウ酸緩衝液(pH7.0)等の中和溶液を添加し、ボルテックスミキサー等で撹拌し、遠心分離により皮革片を沈澱させ溶液を除去する処理を数回繰り返す方法が挙げられる。
【００１８】
皮革片の微生物による分解処理は、コラゲナーゼ産生微生物を用いて行われる。
ここで、コラゲナーゼ産生微生物は、コラゲナーゼを産生する微生物であればいずれでもよいが、例えばクロストリジウム（Clostridium）属、ビブリオ（Vibrio）属、バチルス（Bacillus）属、ストレプトマイセス(Streptomyces)属に属する細菌が挙げられる。
より具体的には、例えば、Clostridium histolyticum、Clostridium perfringens、Vibrio alginolyticus、Vibrio hollisae、Bacillus licheniformis、Streptomyces sp.等が挙げられ、好適には、2009年6月29日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(郵便番号２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８)に、NITE P-776として寄託されたVibrio hollisae 1706B、Vibrio alginolyticum等が挙げられる。
【００１９】
コラゲナーゼ産生微生物による皮革片の分解処理は、上記微生物の培養液を皮革片に添加し、コラゲナーゼ産生微生物が生育可能な温度、例えば15〜55℃、好ましくは20〜55℃、より好ましくは25〜35℃で、2時間以上、好ましくは8〜72時間、より好ましくは6〜24時間作用させることにより行うことができる。
尚、培養液を調製するための培地としては、例えば、ゼラチン培地(組成：ゼラチン2.0g、ペプトン5.0g、酵母抽出物1.0g、リン酸二水素カリウム0.5g、リン酸水素二カリウム0.2g、硫酸マグネシウム７水和物0.2g、塩化ナトリウム5.0g、蒸留水1000mL、pH7.0)  等が挙げられる。
微生物培養液は、例えば10〜50ｍｇ皮革片に対して、浴比1:10〜1:100となるように、使用するのが好ましい。
【００２０】
上記微生物処理終了後、分解された皮革片を含む培養物をホモジナイザーで粉砕し、粉砕物から核酸の抽出が行われる。核酸の抽出は、汎用されている公知の方法を採用することができる。当該方法としては、Ｍａｒｍｕｒ法、酵素法、塩化ベンジル法、ＣＴＡＢ法等が挙げられるが、市販のＤＮＡ抽出キット（例えば、「QIAamp DNA Stool Mini Kit」（QIAGEN社）等）を用いて行っても良い。
また、核酸抽出液からの核酸の単離・精製は、公知のフェノール／クロロホルム法、エタノール沈殿を用いた方法により行うことができる。
【００２１】
斯くして得られる核酸調製液は、後記実施例１に示すように、コラゲナーゼを用いた場合と比較し、核酸増幅反応における増幅率が優れている。従って、本発明のサンプル核酸の調製方法は、天然皮革製品のＤＮＡ鑑定等、核酸の解析を行う際に行われるＰＣＲ法やＬＡＭＰ法等の核酸増幅反応に好適なサンプル調製方法であると云える。そして、得られた調製液中のゲノムＤＮＡを鋳型にして、従来公知の種特異的プライマー（例えば、肉種判定用プライマー（松永孝光ら，平成９年度畜産物需要開発調査研究事業報告書，p131-137，農畜産業振興事業団））を用いて、ＰＣＲ法等により特定部位（例えば、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｂ遺伝子領域）の増幅を行うことにより、より高精度で当該皮革の動物種を判定することができる。
【００２２】
本発明のキットは、上述した本発明のサンプル核酸の調製方法を行うためのキットであり、少なくとも、有機酸、コラゲナーゼ産生微生物、培地及び核酸抽出溶液、エタノールを含有するものであり、この他に、中和処理のための溶液、反応容器、ホモジナイザー等を包含するものであってもよい。
【実施例】
【００２３】
実施例１
（１）クロム鞣し天然牛革製品を刃物で７カ所裁断し、更に細切して、5%濃度のクエン酸溶液に浸漬し、60℃で12時間以上静置した後、遠心分離し、皮革片とクエン酸溶液とに分離した。
上清のクエン酸溶液を除去して、リン酸バッファー溶液と置換した。ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離により皮革片を沈澱させた。前記リン酸バッファーによる溶液置換を2回以上行い、皮革片を中性化した。
【００２４】
（２）Vibrio hollisae 1706B（NITE P-776）株の培養液の調製
L字型試験管にVibrio hollisae 1706B（NITE P-776）株とゼラチン液体培地(組成：ゼラチン2.0g、ペプトン5.0g、酵母抽出物1.0g、リン酸二水素カリウム0.5g、リン酸水素二カリウム0.2g、硫酸マグネシウム７水和物0.2g、塩化ナトリウム5.0g、蒸留水1000mL、pH7.0)を添加した。この試験管を30℃で6時間振蕩培養した。白濁が目視で確認できたところで皮革分解用に供した。
【００２５】
（３）（１）で調製した７つの中性化済み皮革片それぞれ50mgを、2.0mLエッペンドルフチューブに入れ、これに（２）で調製したVibrio hollisae 1706B株の培養液1mLを添加し、30℃で24時間インキュベートした。インキュベート終了後、試料を12,000rpm、5分間遠心分離し、上清を除去した。
【００２６】
（４）沈澱した試料をホモジナイザーで粉砕し、粉砕後の試料からDNA抽出キット（QIAGEN社、QIAamp DNA Stool Mini Kit）によりDNAを抽出した。
得られたDNA抽出液200μLをエタノール沈澱により10μLに濃縮し、このDNA溶液を鋳型として用い、PCR反応に供した。
プライマーは、ウシのミトコンドリアDNA、シトクロムb領域のcDNA配列情報に基づき、以下のとおり設計した。
Forward側：5’-TCT CCT CTG TTA CCC ATA TCT GCC GAG ACG-3’（配列番号１）
Reverse側：5’-TTT GTG CCG ATG TAT GGG ATT GCT GAT AAG-3’（配列番号２）
尚、公知の肉種鑑別用プライマー（「日本食品科学工学会誌  46(３)」、(1999年)、松永孝光、柴田清弘、山田順一、新村裕著、（社）日本食品科学工学会発行、187頁〜194頁）を使用することも可能であった（図４参照）。
【００２７】
PCR反応は、98℃ 2分間 1サイクル、98℃ 15秒間、66℃ 15秒間、72℃ 45秒間 35サイクル、72℃ 2分間 1サイクルとし、DNAポリメラーゼは、タカラバイオ（株）製 TaKaRa 
Ex Taq を、サーマルサイクラーは、Applied Biosystems 2720サーマルサイクラーを使用し、上記条件で実施した。
ただし、上記PCR反応でDNA増幅が確認できなかった時は、上記PCR産物を鋳型にし、98℃ 2分間 1サイクル、98℃ 15秒間、68℃ 15秒間、72℃ 45秒間 35サイクル、72℃ 2分間 1サイクルの条件で２次PCRを行った。
PCR反応終了後、得られたPCR産物（289bp）を8%のアクリルアミドゲル又は2%のアガロースゲルを用いた電気泳動により分析した。電気泳動条件は、アクリルアミドゲル使用時は20mA、60分間、アガロースゲル使用時は100V、40分間とした。分子量マーカーとして、Promega社製ｐGEM DNA マーカーを同時に電気泳動にかけた。電気泳動後、常套法によりバンドの位置を観察した。結果を図１Ａに示す。
また、（１）〜（３）と同様の方法で試料を調製し、上記の肉種鑑別用プライマーを用いて、PCR反応（98℃ 2分間 1サイクル、98℃ 10秒間 35サイクル、62℃ 15秒間、72℃ 1分間、72℃ 3分間 1サイクル）を行った場合のPCR産物の電気泳動パターンを図４に示す。
【００２８】
比較例１
（１）実施例１（１）で調製した中性化済み皮革片それぞれ50mgを、2.0mLエッペンドルフチューブに入れ、これにDNA抽出液（400mM Tris-HCl pH8.0、60mM EDTA、 1% SDS、 0.1% PEG-400、 5mM DTT）を1mL投入した。溶出してくる染料を除去するために、室温で数回上下転倒攪拌した後、12000rpm, 5分間遠心分離し、上清を500μl捨てた。この操作は、染料の溶出がなくなるまで行った。
Proteinase Kを投入し、50℃で12時間インキュベートした。続いてコラゲナーゼ（Clostridium histolyticum由来、生化学工業製使用）10ユニットを投入し、37℃で12時間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。
再度コラゲナーゼ10ユニットを投入し、12時間インキュベートした後、試料を12,000rpm、5分間遠心分離し、上清を除去した。
（２）沈澱した試料をホモジナイザーで粉砕し、粉砕後の試料から、実施例１と同様にして、DNAを抽出し、PCR反応に供し、PCR産物を確認した。結果を図１Ｂに示す。
【００２９】
図１Ａ及び図１Ｂより、本発明の微生物による分解処理を行って調製された試料は、コラゲナーゼ処理を行った試料に比べて、ＤＮＡの増幅効率が良いことが示された。
【００３０】
実施例２
（１）クロム鞣し天然牛革製品を刃物で裁断し、細切せずにそのまま、5%濃度の有機酸溶液（コハク酸、マレイン酸、クエン酸、ギ酸）に浸漬し、60℃で12時間以上静置した後、遠心分離し、皮革片と有機酸溶液とに分離した。
上清の有機酸溶液を除去して、リン酸バッファー溶液と置換した。ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離により皮革片を沈澱させた。前記リン酸バッファーによる溶液置換を2回以上行い、皮革片を中性化した。
【００３１】
（２）（１）で調製した中性化済み皮革片それぞれ50mgを、2.0mLエッペンドルフチューブに入れ、これに実施例１（２）で調製したVibrio hollisae 1706B株の培養液1mLを添加し、30℃で24時間インキュベートした。インキュベート終了後、試料を12,000rpm、5分間遠心分離し、上清を除去した。
【００３２】
（３）沈澱した試料をホモジナイザーで粉砕し、粉砕後の試料から実施例１と同様にして、DNAを抽出し、PCR反応に供し、PCR産物を確認した。結果を図２に示す。
【００３３】
図２より、いずれの有機酸処理においても、効率良くＤＮＡを増幅できることが示された。
【００３４】
実施例３
（１）性質の異なる２層からなる再生牛革製品を各層（上層と下層）に分け、それぞれの層から裁断して２つの皮革片を得た。当該皮革片を細切せずにそのまま、それぞれ5%濃度のクエン酸溶液に浸漬し、60℃で12時間以上静置した後、遠心分離し、皮革片とクエン酸溶液とに分離した。
上清のクエン酸溶液を除去して、リン酸バッファー溶液と置換した。ボルテックスミキサーで撹拌した後、遠心分離により皮革片を沈澱させた。前記リン酸バッファーによる溶液置換を2回以上行い、皮革片を中性化した。
【００３５】
（２）（１）で調製した中性化済み皮革片それぞれ50mgを、2.0mLエッペンドルフチューブに入れ、これに実施例１（２）で調製したVibrio hollisae 1706B株の培養液1mLを添加し、30℃で24時間インキュベートした。インキュベート終了後、試料を12,000rpm、5分間遠心分離し、上清を除去した。
【００３６】
（３）沈澱した試料をホモジナイザーで粉砕し、粉砕後の試料から実施例１と同様にして、DNAを抽出し、PCR反応に供し、PCR産物を確認した。結果を図３に示す。
【００３７】
図３より、いずれの層の皮革片からも効率良くＤＮＡを増幅できることが示された。
【図１】
0005403463.tif 000002
【図２】
0005403463.tif 000003
【図３】
0005403463.tif 000004
【図４】
0005403463.tif 000005
【配列表】
0005403463000001.app