(57)【要約】〔課題〕本発明は、活性型ヘプシジンを指標とした急性虚血性疾患の検査方法、該疾患の治療に使用するための薬剤の投与時期を判別する方法、および、これら方法に用いるキットを提供することを目的とする。〔解決手段〕本発明者らは、上記の課題を解決するために、SELDI-TOF-MSを用いて急性心筋梗塞患者特有の血清プロテオームパターンを解析した。その結果、ヘプシジン20が、急性心筋梗塞と非常に高い相関性を有していることが明らかになった。さらに、疾患発生時、特にヘプシジン20の血中濃度が、疾患発症時に急激に上昇し、発症から6時間以内、特に4時間以内において高い値を示すことを見出した。本発明により急性の虚血性疾患の早期診断が可能である。
2008146903.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者から採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、急性虚血性疾患の検査方法。
【請求項２】
被験者から経時的に採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、急性虚血性疾患の治療に使用するための薬剤の投与時期を判別する方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、急性虚血性疾患の治療に最適な薬剤の選別方法；
（ａ）被験薬剤を投与された対象から採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で用いた被験薬剤とは異なる1種類以上の被験薬剤の各々について、工程（ａ）と同じ作業を行う工程、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で測定された各々の活性型ヘプシジンの量と対照サンプルにおける活性型ヘプシジンの量を比較する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の比較結果に基づき、対照サンプルにおける活性型ヘプシジンの量に最も近い活性型ヘプシジンの量を導く被験薬剤を選別する工程。
【請求項４】
活性型ヘプシジンがヘプシジン２０である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記急性虚血性疾患が急性虚血性心疾患である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記急性虚血性心疾患が急性心筋梗塞である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記急性心筋梗塞が発症から6時間以内の急性心筋梗塞である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記被験者から採取されたサンプルが血漿、血清、血液、尿または組織抽出物のいずれかである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型ヘプシジンを指標とした、急性虚血性疾患の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄代謝の調節に関する現在の理解は、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、フェリチン、鉄調節タンパク質、二価金属輸送体1、フェロポルチンおよびヘプシジンを含むいくつかの重要なタンパク質の生物学に基づいている（非特許文献１から４）。これらの因子のうち、血漿トランスフェリンおよびフェリチンは一般に、それぞれ総鉄結合能力および全般的な鉄保存の指標として臨床的に測定されている。ペプチドヘプシジンは肝臓によって産生されるが、食物に含まれる鉄の腸からの吸収ならびにマクロファージからの鉄の放出を調節することにより、血漿鉄レベルを制御する。さらに、ヘプシジンは炎症によって誘導される抗菌活性を有する急性相反応体でもある（非特許文献５から７）。鉄代謝、炎症、貧血、および低酸素症におけるヘプシジンの役割を確認しているほとんどの試験はマウス実験または培養実験で行われており（非特許文献５および８）、したがってヒト疾患におけるその役割は不明である。【０００３】
血液透析患者において、腎性貧血はヒト組換えエリトロポエチンの投与により臨床上軽減することができる（非特許文献９）が、これらの患者における鉄代謝の正確なメカニズムはほとんど知られていない。いくつかの臨床試験で、ヘプシジンの量が尿（非特許文献６および１０から１３）もしくは血清（非特許文献１４から１６）中のプロヘプシジンのレベル、または肝臓におけるmRNA発現のレベル（非特許文献１０）に基づいて推定された。しかし、血清プロヘプシジン濃度はいかなる赤血球指数または鉄の状態とも明白な相関を有しておらず（非特許文献１４）、プロヘプシジンの濃度はその蓄積によって上昇しうることが報告されている。加えて、プロヘプシジンは酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によって測定されるが、これは生理活性を持たず、特定の機能はまったく確認されていない。ヘプシジン-20、-22、および-25はプロヘプシジンから変換酵素によって切断された活性体である（非特許文献６）。しかし、密に折りたたまれた構造のヘプシジン生理活性体に対する特異抗体を開発することに伴う困難が主な原因で、ヘプシジンの生理活性体の定量的評価に関する報告はわずかしかない（非特許文献１７）。【０００４】
ヘプシジンは鉄代謝の重要な調節因子であり、肝臓で発現され、血中に分布し、尿中に排出される。これまでに、ヘプシジンを指標とした診断法が報告されている（特許文献１から４）が、血清中のヘプシジンの生理活性体を測定する、信頼性があって実用的な方法は開発されていない。【０００５】
SELDIによる登録商標ProteinChip System（Ciphergen Biosystems, Inc. Freemont, CA, USA）アレイ技術を用いて、免疫学的状態、癌、神経学的状態、心血管状態、および涙腺の疾患などの広範な疾患における適切なバイオマーカーがうまく検出されている（非特許文献１８から２１）。SELDI技術は伝統的な固相抽出クロマトグラフィと直接レーザー脱離イオン化質量分析検出との組み合わせに基づいており、前処理をしていない生物体液の必要量は最小限ですむ。この技術は、疾患と対照との間の、血清、尿、涙、または脳脊髄液などの様々な体液における個々のタンパク質またはタンパク質群の発現におけるわずかな差を評価することを可能にする。さらに、これは高処理量の能力、タンパク質をピコモルからフェントモルの範囲で検出するための非常に高い感度、低分子量、すなわち20kDaよりも小さいタンパク質の高い分解能、および操作の容易さを含むいくつかの利点を有する。【０００６】
一般的にヘプシジン-20は抗菌ペプチド（非特許文献２２）、ヘプシジン-25は鉄制御ペプチド（非特許文献２３）として知られている。【０００７】
近年、上記SELDI-TOF MS法を用いることにより、血清中のヘプシジン-20および-25を半定量的に測定することを可能とし、血液透析患者のヘプシジン-20及び25が血清フェリチンレベルと有意な相関関係を示すこと、ヘプシジン-25が血液透析患者の血清中に蓄積することが報告されている。さらに、活性型ヘプシジン、特にヘプシジン-25が腎性貧血の病因に寄与している可能性があることも報告している（非特許文献２４）。【０００８】
しかしながら、急性虚血性疾患とヘプシジンとの関連性、特にヘプシジン-20との関連性については報告がない。【０００９】
尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Andrews NC. Best Pract Res Clin Haematol. 2005;18:159-169.
【非特許文献２】Philpott CC. Hepatology. 2002;35:993-1001.
【非特許文献３】Fleming RE. Curr Opin Gastroenterol. 2005;21:201-6.
【非特許文献４】Ganz T. Blood. 2003;102:783-788.
【非特許文献５】Pigeon C, Ilyin G, Courselaud B, et al. J Biol Chem. 2001 16;276:7811-7819.
【非特許文献６】Park CH, Valore EV, Waring AJ, Ganz T. J Biol Chem. 2001;276:7806-7810.
【非特許文献７】Krause A, Neitz S, Magert HJ, et al. FEBS Lett. 2000;480:147-150.
【非特許文献８】Nicolas G, Chauvet C, Viatte L, et al. J Clin Invest. 2002;110:1037-1044.
【非特許文献９】National Kidney Foundation. Am J Kidney Dis. 1997;30(Suppl 3):S192-240.
【非特許文献１０】Detivaud L, Nemeth E, Boudjema K, et al. Blood. 2005;106:746-748.
【非特許文献１１】Kemna E, Tjalsma H, Laarakkers C, Nemeth E, Willems H, Swinkels D. Blood. 2005 Jul 19; [Epub ahead of print]
【非特許文献１２】Nemeth E, Rivera S, Gabayan V, et al. J Clin Invest. 2004;113:1271-1276.
【非特許文献１３】Nemeth E, Valore EV, Territo M, Schiller G, Lichtenstein A, Ganz T. Blood. 2003;101:2461-2463.
【非特許文献１４】Taes YE, Wuyts B, Boelaert JR, De Vriese AS, Delanghe JR. Clin Chem Lab Med. 2004;42:387-9.
【非特許文献１５】Kulaksiz H, Gehrke SG, Janetzko A, et al. Gut. 2004 May;53(5):735-43.
【非特許文献１６】Dallalio G, Fleury T, Means RT. Br J Haematol. 2003;122:996-1000.
【非特許文献１７】Hunter HN, Fulton DB, Ganz T, Vogel HJ. J Biol Chem. 2002;277:37597-37603.
【非特許文献１８】Petricoin EF, Ardekani AM, Hitt BA, et al. Lancet. 2002;359:572-577.
【非特許文献１９】Sanchez JC, Guillaume E, Lescuyer P, et al. Proteomics. 2004;4:2229-2233.
【非特許文献２０】Stanley BA, Gundry RL, Cotter RJ, Van Eyk JE. Dis Markers. 2004;20:167-78.
【非特許文献２１】Tomosugi N, Kitagawa K, Takahashi N, Sugai S, Ishikawa I. J Proteome Res. 2005;4:820-825.
【非特許文献２２】Krause A, FEBS LETT. 2000 Sep 1; 480(2-3):147-50
【非特許文献２３】Park CH, J Biol Chem. 2001 Mar 16;276(11):7806-10. Epub 2000 Dec 11.
【非特許文献２４】Tomosugi N,  Blood. 2006 Aug 15; 108(4):1381-7. Epub 2006 Apr 18.
【特許文献１】特開2005-134387号公報
【特許文献２】US 2004/0096987 A1
【特許文献３】US 2004/0096990 A1
【特許文献４】US 2006/0019339 A1
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、急性虚血性疾患のマーカータンパク質を見出し、そのマーカータンパク質を利用した発明を提供することを課題とする。より具体的には、活性型ヘプシジンを指標とした急性虚血性疾患の検査方法、該疾患の治療に使用するための薬剤の投与時期を判別する方法、および、これら方法に用いるキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、表面改良型レーザー脱離イオン化飛行時間質量分析（SELDI-TOF-MS）を用いて急性心筋梗塞患者特有の血清プロテオームパターンを解析した。その結果、ヘプシジン20が、急性心筋梗塞と非常に高い相関性を有しており、その相関性は、ヘプシジン25よりも高いことが明らかになった。これまでヘプシジン20は抗菌ペプチド、ヘプシジン25は鉄制御ペプチドと考えられていたことを考えると、予想に反した結果である。【００１２】
さらに本発明者らは、疾患発生時、特にヘプシジン20の血中濃度が、疾患発症時に急激に上昇し、発症から6時間以内、特に4時間以内、さらに3.5時間以内において高い値を示すことを見出した。したがって、血中のヘプシジン量の測定により、急性の虚血性疾患の早期診断が可能であることを見出した。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の〔１〕から〔９〕を提供するものである。
〔１〕被験者から採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、急性虚血性疾患の検査方法。
〔２〕被験者から経時的に採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、急性虚血性疾患の治療に使用するための薬剤の投与時期を判別する方法。
〔３〕以下の工程を含む、急性虚血性疾患の治療に最適な薬剤の選別方法；
（ａ）被験薬剤を投与された対象から採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で用いた被験薬剤とは異なる1種類以上の被験薬剤の各々について、工程（ａ）と同じ作業を行う工程、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で測定された各々の活性型ヘプシジンの量と対照サンプルにおける活性型ヘプシジンの量を比較する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の比較結果に基づき、対照サンプルにおける活性型ヘプシジンの量に最も近い活性型ヘプシジンの量を導く被験薬剤を選別する工程。
〔４〕活性型ヘプシジンがヘプシジン２０である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕前記急性虚血性疾患が急性虚血性心疾患である〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕前記急性虚血性心疾患が急性心筋梗塞である〔５〕に記載の方法。
〔７〕前記急性心筋梗塞が発症から6時間以内の急性心筋梗塞である〔６〕に記載の方法。
〔８〕前記被験者から採取されたサンプルが血漿、血清、血液、尿または組織抽出物のいずれかである、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法に用いるためのキット。【００１４】
〔発明の実施の形態〕
本発明者らは、活性型ヘプシジンが急性虚血性疾患のマーカータンパク質であることを見出し、これにより、急性の虚血性疾患の早期診断が可能であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。【００１５】
本発明は、被験者から採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、急性虚血性疾患の検査方法を提供する。【００１６】
本発明の検査方法では、被験者から採取されたサンプルにおける活性型ヘプシジンの量が、対照サンプルにおける活性型ヘプシジンの量より高い場合に、急性虚血性疾患を発症していると判定または診断される。
ここで、対照サンプルとは、例えば、健常人から採取されたサンプルを挙げることができる。【００１７】
被験者がヒトである場合、疾患の診断は、通常、医師（医師の指示を受けた者も含む。以下同じ。）によって行われるが、本発明の検査方法によって得られる活性型ヘプシジンの量に関するデータは、医師による診断に役立つものである。よって、本発明の検査方法は、医師による診断に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。【００１８】
また、本発明は、被験者から経時的に採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、急性虚血性疾患の治療に使用するための薬剤の投与時期を判別する方法を提供する。【００１９】
本発明の薬剤の投与時期を判別する方法では、測定される活性型ヘプシジンの量が、健常人と比較して増加した場合に、薬剤を投与する時期であると判別される。また、前記薬剤の投与後に測定される活性型ヘプシジンの量が、最初の測定時と比較して増加した場合または変化がみられない場合にも、薬剤を投与する時期であると判別される。【００２０】
対象がヒトである場合、薬剤の投与時期は、通常、医師によって判別されるが、本発明の薬剤の投与時期を判別する方法によって得られるデータは、医師による薬剤の投与時期の判別に役立つものである。よって、本発明の薬剤の投与時期を判別する方法は、医師による薬剤の投与時期の判別に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。【００２１】
本発明の薬剤の投与時期を判別する方法において、対象とは、例えば、急性虚血性疾患を発症している対象である。【００２２】
また、本発明は、対象から経時的に採取された各々のサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程を含む、急性虚血性疾患の治療に使用するための薬剤の投与量を判別する方法を提供する。【００２３】
本発明の薬剤の投与量を判別する方法では、前記薬剤の投与後に測定される活性型ヘプシジンの量が、健常人または最初の測定時と比較して変化した場合に、適切な投与量であるか否かを判別することができる。より具体的には、前記薬剤の投与後に活性型ヘプシジンの量が健常人とまたは最初の測定時と比較して減少した場合に、適切な投与量であると判別することができる。【００２４】
対象がヒトである場合、薬剤の投与量は、通常、医師によって判別されるが、本発明の薬剤の投与量を判別する方法によって得られるデータは、医師による薬剤の投与量の判別に役立つものである。よって、本発明の薬剤の投与量を判別する方法は、医師による薬剤の投与量の判別に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。【００２５】
本発明の薬剤の投与量を判別する方法において、対象とは、例えば、急性虚血性疾患を発症している対象である。【００２６】
また、本発明は、以下の（ａ）から（ｄ）の工程を含む、急性虚血性疾患の治療に最適な薬剤の選別方法を提供する。
（ａ）被験薬剤を投与された対象から採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程、
（ｂ）工程（ａ）で用いた被験薬剤とは異なる1種類以上の被験薬剤の各々について、工程（ａ）と同じ作業を行う工程、
（ｃ）工程（ａ）および工程（ｂ）で測定された各々の活性型ヘプシジンの量と対照サンプルにおける活性型ヘプシジンの量を比較する工程、および
（ｄ）工程（ｃ）の比較結果に基づき、対照サンプルにおける活性型ヘプシジンの量に最も近い活性型ヘプシジンの量を導く被験薬剤を選別する工程【００２７】
対象がヒトである場合、疾患の治療に最適な薬剤は、通常、医師によって選別されるが、本発明の薬剤の選別方法によって得られるデータは、医師による薬剤の選別に役立つものである。よって、本発明の薬剤の選別方法は、医師による薬剤の選別に役立つデータを収集し、提示する方法とも表現しうる。【００２８】
また、本発明の薬剤の選別方法において、各々の被験薬剤は同一の対象に投与される。複数種（2種類以上）の被験薬剤について、本発明の薬剤の選別方法を実施することにより、複数種の被験薬剤から最適な薬剤を選別することができる。【００２９】
本発明の薬剤の選別方法は、より詳細には、急性虚血性疾患を発症している対象であって、活性型ヘプシジンの量が増加している対象の治療に最適な薬剤の選別方法であって、以下の（１）から（４）の工程を含む方法である。
（１）被験薬剤を投与された対象から採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程、
（２）工程（１）で用いた被験薬剤とは異なる1種類以上の被験薬剤の各々について、工程（１）と同じ作業を行う工程、
（３）工程（１）および工程（２）で測定された各々の活性型ヘプシジンの量と対照サンプルにおける活性型ヘプシジンの量を比較する工程、および
（４）工程（３）の比較結果に基づき、対照サンプルにおける活性型ヘプシジンの量に最も近い量まで、活性型ヘプシジンの量を減少させる被験薬剤を選別する工程【００３０】
本発明の薬剤の選別方法、および薬剤の投与時期または投与量を判別する方法において、被験薬剤とは、急性虚血性疾患の治療剤として公知のものである。そのような治療剤としては、例えば、エリスロポエチン、血栓溶解剤、硝酸薬、アドレナリンβ受容体遮断薬、カルシウム拮抗薬等が挙げられるが、これに限定されるものではない。【００３１】
血栓溶解剤としては好ましくは、ウロキナーゼ、t-PA等が挙げられる。
硝酸薬としては好ましくは、ニトログリセリン、硝酸イソソルビド、亜硝酸アミル、ニコランジル等が挙げられる。【００３２】
アドレナリンβ受容体遮断薬としては好ましくは、プロプラノロール、アルプレノロール、インデノロール、オクスプレノロール、ブニトロロール、ブフェトロール、ブプラノロール、ブクモロール、ピンドロール、カルテオロール、チモロール、ナドロール、チリソロール、アセブトロール、セリプロロール、メトプロロール、アテノロール、ビソプロロール、ベタキソロール、カルベジロール、アロチノロール、ニプラジロール等が挙げられる。【００３３】
カルシウム拮抗薬としては好ましくは、ジルチアゼム、ベラパミル、ニフェジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、エホニジピン、アムロジピン等が挙げられる。【００３４】
本発明において、「活性型ヘプシジン」とは、例えば、被験者または対象がヒトの場合、ヘプシジン20（配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）及び／又はヘプシジン25（配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を指す。また、本発明において、「活性型ヘプシジン」とは、例えば、被験者または対象がラットの場合、ヘプシジン（配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を指し、被験者または対象がマウスの場合、ヘプシジン-1（配列番号：４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）及び／又はヘプシジン-2（配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド）を指す。【００３５】
本発明において、「活性型ヘプシジン」としては、好ましくはヘプシジン20またはヘプシジン25であり、さらに好ましくはヘプシジン20である。【００３６】
本発明において「急性虚血性疾患」とは、急性の外傷、移植時の拒絶反応、虚血性脳血管障害（脳卒中、脳梗塞など）、虚血性腎疾患、虚血性肺疾患、感染症に関連する虚血性疾患、四肢の虚血性疾患、虚血性心疾患（虚血性心筋症、心筋梗塞症、虚血性心不全など）などが挙げられる。本発明において急性虚血性疾患として、好ましくは急性虚血性心疾患であり、さらに好ましくは急性虚血性心筋梗塞が挙げられる。【００３７】
また、本発明の診断方法においては、上記急性虚血性疾患が発症から1日以内、好ましくは12時間以内、より好ましくは6時間以内、さらに好ましくは4時間以内、さらにより好ましくは3.5時間以内、最も好ましくは2.5時間以内であることが好ましい。【００３８】
本発明の方法に使用される被験者から採取されたサンプルとしては、血漿、血清、血液、尿または組織抽出物などが挙げられるが、好ましくは血清である。例えば、被験者がヒトである場合においてサンプルが血清の場合には、本発明の方法は医療機関で調製された血清サンプルあるいは血液を用いて実施される。後者の場合、本発明の方法の実施者は、当業者に公知の方法を使用して血液から血清サンプルを調製することができる。例えば、採取された血液を遠心処理し、血清部分を回収する。得られた血清は、特に前処理することなく、適当な濃度に希釈してサンプルとすることができる。【００３９】
本発明において、被験者または対象は、好ましくはヒト、ラット、マウスであるが、これに制限されるものではなく、例えば、サル、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ハムスター等の非ヒト動物も含まれる。【００４０】
本発明の方法において、「被験者から採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程」は、例えば、以下の工程を含む。
（ａ）以下の（１）及び／又は（２）の活性型ヘプシジンに結合する性質を有する担体、および、サンプルを混合する工程、および
（１）ヘプシジン20
（２）ヘプシジン25
（ｂ）担体に結合した活性型ヘプシジンの量を測定する工程。【００４１】
上記（ａ）の工程を行う際、上記担体に実質的にpI値が8以上のポリペプチドのみが結合する条件下で行うことが好ましい。例えば、陽イオン交換基を有するCM10のようなチップを用いて、ｐH8以上で希釈したサンプルをチップと接触させた後、ｐH8以上の洗浄緩衝液で洗浄することにより得ることができる。pI値が8以上のポリペプチドが陽性荷電を有するよう調整することで、活性型ヘプシジン測定の際のノイズが減少し、急性虚血性疾患の診断、急性虚血性疾患の治療薬を投与する時期や急性虚血性疾患の治療に最適な薬剤の選別が、より正確で、簡便に行うことが可能となるが、好ましくはpI値9.2以上、更に好ましくはpI値10以上である。【００４２】
このような方法としては、質量分析法等が例示できる。質量分析法としては、例えば、SELDI-TOF-MS法、MALDI-TOF-TOF法などを挙げることができるが、好ましくは、SELDI-TOF-MS法である。【００４３】
SELDI-TOF-MS法とは、飛行時間型質量分析計に使用するチップ表面に担体を固定し、この担体が固定化されたチップ表面と被検試料を接触させ、適当な条件で洗浄した後、該チップ表面に捕捉されたタンパク質の質量を該飛行時間型質量分析計で測定する方法である。【００４４】
SELDI-TOF-MSは、表面改良型レーザー脱離イオン化法（surface-enhanced laser desorption/ionization: SELDI）を使用した飛行時間型質量分析計（time of flight-mass spectrograph: TOF-MS）の略である。【００４５】
チップ表面に担体を固定したものは、一般的には、プロテインチップと称される。本発明のプロテインチップとしては、例えば、疎水性型、陽イオン交換型、陰イオン交換型、金属イオン型、順相型等の化学的性質を有するケミカルチップ、特異的な結合（相互作用）を分析するために用いられる活性化型チップ、抗体型、レセプター型、ＤＮＡ型等のバイオロジカルチップが例示できるが、好ましくは、陽イオン交換基がチップに固定化されたケミカルチップ（より好ましくはCM10）、金属イオンがチップに固定化されたケミカルチップ（より好ましくはIMAC30-Cu）、または、疎水性基がチップに固定されたケミカルチップ（より好ましくはH4）が挙げられる。CM10は、チップ表面にカルボキシメチル基が結合されたチップであり、IMAC30-Cuは、チップ表面にNTAが結合されたチップであり、H4は、C16 逆相カラムと同様の結合特性を有するチップである。【００４６】
また、本発明においては、ヘプシジン20またはヘプシジン25に結合する抗体がチップに固定化されたバイオロジカルチップも使用することができる。通常、抗体は、カルボニルジイミダゾールまたはエポキシ活性基を介してチップに固定される。【００４７】
SELDI-TOF-MS法は、通常、下記（１）から（５）の工程を含むが、本発明のSELDI-TOF-MS法は、活性型ヘプシジンが検出できる限り、これら工程に限定されるものではない。【００４８】
（１）プロテインチップに対してサンプルを添加する工程
プロテインチップに対して緩衝液で希釈した（本実施例の場合血清を20倍に希釈）サンプルを添加し、インキュベートする（本実施例の場合30分間）。【００４９】
（２）サンプル添加後のプロテインチップを洗浄する工程
チップ表面を洗浄し、チップ表面に結合していないタンパク質等を除去する。【００５０】
（３）洗浄後のプロテインチップに対してエネルギー吸収分子（EAM）を添加する工程
チップ表面に捕捉されたタンパク質のイオン化を促進するために、エネルギー吸収分子（Energy Adsorption Molecule: EAM）をチップに添加して、乾燥させる。本発明のEAMとは、レーザー脱離／イオン化源由来のエネルギーを吸着でき、それから接触する分析分子の脱離とイオン化に寄与できる分子を表す。本発明のEAMとしては、プロテインチップシステムで使用できるEAMであれば、特に制限なく使用することができる。例えば、ケイ皮酸誘導体、シナピン酸（SPA）、シアノ−ヒドロキシ−ケイ皮酸（CHCA）およびジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、ならびにヒドロキシアセト−フェノン誘導体などが例示できる。より好ましくはCHCAである。【００５１】
上記のプロテインチップの表面に血清サンプル中のタンパク質を結合させる際、pI値が8以上、好ましくは9.2以上、更に好ましくは10以上のポリペプチド以外のポリペプチド等をできる限り除去する若しくは予め除去しておくことにより、活性型ヘプシジンを測定する際のノイズが減少し、急性虚血性疾患の診断、当該疾患に罹患している対象に治療薬を投与する時期や当該疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別が、より正確で、簡便に行うことが可能となる。上記の除去方法は、特に限定されるものではないが、例えば、CM10等の陽イオン交換基が固定化されたケミカルチップにpH8〜10の条件下で吸着させることによって活性型ペプシジンの測定に適したサンプルを得ることが可能である。【００５２】
（４）タンパク質の質量と量を測定する工程
TOF-MSによって、タンパク質の質量数を測定する。EAM添加後のプロテインチップに対して、UVパルスレーザーを照射することにより、エネルギーを受けてイオン化したタンパク質は、一定の電圧で加速されて真空管の対極にあるイオン検出器に向かって飛行する。イオン検出器は、検出したイオンの情報を、質量対電荷の割合（質量電荷比m/z）へと翻訳する。また、シグナル強度も検出される。従って、タンパク質の質量（mass）と量（quantity）の両方が決定されうる。また、「タンパク質の量」は、データ出力画面において、ピークの高さで判断する。このような測定には、Protein Chip(SELDI-TOF-MS, サイファージェン社)、AXIM-TOF2（MALDI-TOF-TOF，島津製作所）等を使用することができる。【００５３】
（５）タンパク質の発現解析を行う工程
SELDI-TOF-MS法では、通常、測定や解析に使用するソフトウエアがインストールされたコンピューターが使用される。当該コンピューターによって、データを分析し、検出されたタンパク質の数を表示し、検出されたタンパク質についてのシグナル強度および決定された分子量を表示できる。また、当該コンピューターは、生じたデータを種々のフォーマットにて表示しうる。本発明においては、標準的なスペクトルが表示され得るが、有用なフォーマットとしては、Biomarker Wizard（サイファージェン社）、Biomarker PatternsTM Software(ＢＰＳ)（サイファージェン社）等を使用することができる。このような解析には、Protein Chip(SELDI-TOF-MS, サイファージェン社)、AXIM-TOF2（MALDI-TOF-TOF，島津製作所）等を使用することができる。【００５４】
本発明は、また、上記検査方法に用いるためのキットを提供する。該キットには、例えば、上記検査方法に用いるプロテインチップ、洗浄溶液、指示書などが含まれる。【００５５】
さらに、本発明は、被験者から採取されたサンプルより精製された、実質的にpI値が8以上であるポリペプチドを含む、本発明の方法に使用するための組成物を提供する。「実質的にpI値が8以上のポリペプチドを含む組成物」を用いることによって、活性型ヘプシジン測定の際のノイズが減少し、急性虚血性疾患の診断、当該疾患に罹患している対象に治療薬を投与する時期や当該疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別が、より正確で、簡便に行うことが可能となる。pI値が8以上のポリペプチドを含む組成物であれば、所望の効果を得ることが可能であるが、好ましくはpI値9.2以上、更に好ましくはpI値10以上である。【００５６】
また、「被験者から採取されたサンプルにおいて、活性型ヘプシジンの量を測定する工程」として、LC-MS/MSを用いたペプチド定量分析法を挙げることができる。LC-MS/MSを用いたペプチド定量分析法を行うことにより、簡便で高感度に活性型ヘプシジンの定量を行うこと可能となり、急性虚血性疾患の検査、当該疾患に罹患している対象に治療薬を投与する時期や当該疾患に罹患している対象の治療に最適な薬剤の選別が、正確で且つ簡便に行うことが可能となる。例えば、被験者から採取されたサンプルをトリクロロ酢酸を添加して攪拌後、遠心分離を行い夾雑物を沈殿させ、得られた上清を液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析装置、例えばAPI4000（商標登録）（Applied Biosystems社）を用いて当該サンプル中の活性型ヘプシジンを定量分析することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】急性心筋梗塞患者におけるヘプシジン20強度の経時変化の平均値を示す図である。
【図２】急性心筋梗塞患者におけるヘプシジン25強度の経時変化の平均値を示す図である。
【図３】急性心筋梗塞患者における疾患発症から治療開始までの時間とHep20の関係を比較した結果を示す図である。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。【００５９】
〔実施例１〕
1  材料と方法
これまで動物の急性心筋梗塞モデルによる基礎検討（Mitsuma W, Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jun 9;344(3):987-94. Epub 2006 Apr 19.; Soda T, Int J Cardiol. 2007 Jan 22; [Epub ahead of print.]; Ozawa T, J Mol Cell Cardiol. 2006 May;40(5):629-38.; Kato K, J Jpn Coll Angiol,2006,46:595-601.）を種々の薬剤等を用いて行ってきた中で、造血因子であるErythropoietin(以下EPOと略す)製剤の投与により梗塞巣の有意な縮小効果を認めており、EPO非投与群ではこの効果は全く認められていないことに着目して、急性心筋梗塞患者の急性期治療としてEPO製剤を用いた。【００６０】
対象患者は、ST上昇型１枝病変で発症後24時間以内の急性心筋梗塞患者で年齢80歳以下のPerformance status0-3を対象とした。除外基準は多肢病変患者、Killip分類のIII&IV以上、心原性ショックを合併した患者、進行した腎肝を有する患者、高血圧を合併する患者、経カテーテル的インターベンション治療時採血にてHct値M>60%、F>55%異常の患者とした。治療法は、経カテーテル的インターベンション後に経カテーテル下にEPO製剤のOne-shot投与・非投与の2群により予後を比較する。2群の割付は患者同意取得後、封筒による無作為割付で、症例選択のバイアスを避けるため24時間以内発症の該当症例を連続的に登録し治療法を選択した。【００６１】
各ポイントにおいて採血された血清の内、病院に搬入された時点から１４日後の検体について、SELDI TOF-MS を用いたProteomicsによる質量解析した。【００６２】
血清のSELDI-TOF-MS解析
予備的試験のために、弱い陽イオン交換、強い陰イオン交換、および二価陽イオン銅を結合するタンパク質分子の金属固定化アフィニティークロマトグラフィを含む、様々な表面特性を有する複数のタイプのプロテインチップを用いた。金属固定化アフィニティークロマトグラフィの登録商標ProteinChipアレイ（IMAC 30-Cu）が血清のタンパク質種検出において再現性があったため、本発明者らは最終的にすべての試験でこれを選んだ。SELDI解析を、製造者のマニュアルに従い、若干の変更を加えて実施した。すなわち、血清試料を結合緩衝液（リン酸緩衝化食塩水、pH7.4）でそれぞれ20倍および10倍希釈した。バイオプロセッサーを用いて、希釈試料40μlを100mM硫酸銅結合緩衝液で前処理したIMAC 30-Cuチップの異なるアレイに添加し、室温で絶えず水平振盪しながら30分間インキュベートした。再現性を確認するために、各試料をIMAC 30-Cuチップ上の二つの別のスポットに添加した。結合緩衝液で5分間の洗浄を三回行って結合していないタンパク質を除去した。アレイを水400μlで二回洗浄し、風乾し、50％アセトニトリルおよび0.5％トリフルオロ酢酸中のアルファ-シアノ-4-ヒドロキシ-ケイ皮酸（CHCA；Ciphergen）0.5μlを表面に二回加えた。次に、アレイをCiphergen登録商標ProteinChip Reader PBS IIで解析した。CHCAを加えたタンパク質をイオン化し、それらの分子質量をTOF解析により求めた。アレイ表面に捕捉された各タンパク質/ペプチドの質量と電荷の比（m/z）を外部較正した標準：Arg8-バソプレシン（1,084.25Da）、ソマトスタチン（1,637.9Da）、ダイノルフィン（2,147.5Da）、ウシインスリンベータ鎖（3,495.94Da）、ヒトインスリン（5,807.65Da）、ウシユビキチン（8,564.8Da）、およびウシチトクロムC（12,230.9Da）によって求めた。試料の質量スペクトルを、レーザー強度180および検出器感度10で平均80のレーザーショットを用いて得た。合成ヘプシジン-25（ペプチド研究所、大阪）を2,789Daのマーカーとして用いた。ピーク強度からのデータを、Biomarker Wizard（Ciphergen 登録商標ProteinChip Software 3.1.1）を用いて全イオン量により標準化し、スポット上に添加した試料濃度のばらつきを補正した。【００６３】
2  結果
これまでに治療された14例の背景には、特徴的な項目は無かった（表１）。【００６４】
【表１】
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【００６５】
測定したHep20値とHep25の平均値は、Hep20が治療開始前採血時136.24AU（±107）で、治療後4日後28.7AU（±52.7）、7日後7.8AU（±2.9）、14日後7.9AU（±3.4）と治療経過と共に低下し、14日目で健常人（7.5AU±3.1）のレベルに復した（図１）。また、Hep25は、治療開始前採血時81.4AU（±80.3）で、治療4日後50.6AU（±43.4）、7日後34.6AU（±20.8）、14日後29.5AU（±22.4）と治療経過とともに低下したが、Hep20の動態とは異なり健常人（18.1AU±13.0）のレベルにまでは復しなかった（図２）。【００６６】
また、14例の疾患発症から治療開始までの時間とHepの関係を比較した結果（図３）、発症から6時間以内、特に4時間以内、さらに3.5時間以内において、Hep20の値が高いことが示された。【００６７】
3  考察
今回の検討で血中Hepが確かに梗塞時に上昇していたことが突き止められた。これは、心筋に鉄が相当量含有されているが、梗塞時にこの鉄が虚血再灌流時に組織の崩壊や梗塞巣の広がりをもたらしていると考えられる。特に、血中ヘプシジン20の動態は心筋のダメージをダイレクトに現しており、虚血および再灌流以降治療と心筋ダメージの回復程度すなわち治療効果の判定が可能となりうると考えられた。今回の検討で急性虚血性心疾患、特に急性心筋梗塞の治療に伴い経時的な血中Hepの測定が有効であることが示唆され、血中Hepが急性虚血性心疾患の治療マーカーとして、また、急性虚血における心筋ダメージの程度を知る上で非常に有効なマーカーとなり得ることが示唆された。特に血中Hep20の値は、疾患発症から6時間以内において非常に高いことから、Hep20をマーカーとすることで、急性虚血性心疾患の早期診断が可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明により、活性型ヘプシジンを指標とした、急性虚血性疾患の診断方法が提供された。ヘプシジンmRNAの発現量と血中のヘプシジン蛋白濃度には相関がないことが見出されており、血中のヘプシジン蛋白濃度を直接測定しない方法、例えば、ヘプシジンのmRNAの発現量の測定方法を利用した疾患の診断方法では、正確に急性虚血性疾患を診断することができない。しかしながら、本方法を用いれば、より臨床に即した正確な急性虚血性疾患の診断、急性虚血性疾患の治療薬を投与する時期及び投与量の判別が可能である。【００６９】
また、本発明により疾患発生時、特にヘプシジン20の血中濃度は、疾患発症時に急激に上昇し、発症から6時間以内、特に4時間以内、さらに3.5時間以内において高い値を示すことから、急性の虚血性疾患の早期診断が可能である。特に心筋梗塞等においては、これまで、糖尿病患者等、痛みなどの症状が乏しく、診断が困難であったが、このような患者の場合でも容易に疾患を診断することが可能であり、早期に治療を行うことが可能である。【００７０】
また、本発明の診断方法に用いるキットを利用することにより、急性の虚血性疾患の診断をより早期に行うことが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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