(57)【要約】ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを接触させることを含む、ＥＳ細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
2008150030.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを接触させることを含む、ＥＳ細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
【請求項２】
ＥＳ細胞をＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニスト存在下で培養することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストがＧ−ＣＳＦである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法：
（ａ）細胞培養液にＧ−ＣＳＦを添加する工程および
（ｂ）（ａ）の培養液を用いてＥＳ細胞を培養する工程。
【請求項５】
ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦの接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行なわれる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを接触させる前に、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する物質の存在下でＥＳ細胞を培養する工程をさらに含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＢＭＰシグナル伝達を抑制する物質がノギンである請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により得られる心筋細胞。
【請求項９】
Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを含有する、ＥＳ細胞から心筋細胞への分化誘導剤。
【請求項１０】
Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストがＧ−ＣＳＦである請求項９記載の分化誘導剤。
【請求項１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる請求項９または１０に記載の分化誘導剤。
【請求項１２】
ＥＳ細胞を心筋細胞に分化させる為のＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストの使用。
【請求項１３】
Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストがＧ−ＣＳＦである請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる請求項１２または１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＥＳ細胞を心筋細胞に分化誘導する方法、及び当該方法により得られる心筋細胞、及び心筋細胞への分化誘導剤等を提供する。
【背景技術】
【０００２】
心筋細胞は、出生前は自律拍動しながら活発に細胞分裂を行っているが、出生直後よりその分裂能を喪失し、また未分化な前駆細胞を持つこともないため、心筋梗塞や心筋炎等の各種ストレスに曝されることにより心筋細胞が死滅すると、喪失した心筋細胞は補充されることがないとされている。その結果、残存心筋細胞は代償性肥大により心機能を保とうとするが、各種ストレスが持続し、その許容範囲を超えてしまうと、さらなる心筋細胞の疲弊、死滅を誘起して心筋機能の低下（即ち心不全）を呈するようになる。
そのため、衰弱又は失われた心筋細胞を補充的に移植する方法は、心不全の治療に極めて有用であると考えられる。事実、動物を用いた実験では、胎児から未成熟な心筋細胞を取得し、それを成体心組織に移植すると、移植細胞は心筋細胞として有効に機能することが知られている（非特許文献１参照）。しかしながら、この方法で大量の心筋細胞を取得することは困難であり、倫理的観点からも臨床医療への応用は難しい。
そこで、心筋細胞を未分化な幹細胞から分化誘導し、これを移植用細胞として利用する方法が近年、特に注目されている。現在のところ、成体心組織中に心筋細胞を産生し得る前駆細胞もしくは幹細胞として明らかに同定できる細胞集団は見出されていないため、上記の方法を実施するためには、より未分化で多彩な分化能を有している多能性幹細胞の使用が考えられる。
多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）とは、試験管内培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的又は長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、および内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞と定義される。現在、多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ：ＥＧ細胞）、そして成体骨髄から単離される成人型多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｕｌｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ＭＡＰＣ）の３種が最もよく知られている。
特にＥＳ細胞は、試験管内培養により、心筋細胞に分化誘導できることが以前から知られている。初期の研究はその殆どがマウス由来のＥＳ細胞を用いて行われている。ＥＳ細胞を単一細胞状態（酵素処理等を施すことで細胞同士の接着がない個々の細胞が分散した状態）下で、白血病阻害因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）等の分化抑制因子を存在させずに浮遊培養を行うと、ＥＳ細胞同士が接着、凝集し、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ  ｂｏｄｙ：ＥＢ）とよばれる初期胚類似の構造体を形成する。その後、ＥＢを浮遊状態もしくは接着状態で培養することにより、自立拍動性を有した心筋細胞が出現することが知られている。
上記の様に作製されたＥＳ細胞由来心筋細胞は、胎児心臓由来の未成熟な心筋細胞ときわめてよく似た形質を呈している（非特許文献２、３参照）。また、実際にＥＳ細胞由来心筋細胞を成体心組織に移植した動物実験例では、胎児心筋を移植した例とほぼ変わらない、極めて高い有効性を示すことも確認されている（特許文献１、非特許文献４参照）。
１９９５年、Ｔｈｏｍｓｏｎらが初めて霊長類からＥＳ細胞を樹立したことにより、多能性幹細胞に由来する心筋細胞を用いた心筋再生治療法の実用化が現実味を帯びてきた（特許文献２、非特許文献５参照）。引き続き彼らは、ヒト初期胚からヒトＥＳ細胞株の単離・樹立にも成功した（非特許文献６参照）。また、Ｇｅａｒｈａｒｔらは、ヒト始原生殖細胞からｈＥＧ細胞株を樹立した（非特許文献７、特許文献３参照）。
マウスＥＳ細胞と同様、ヒトＥＳ細胞からも心筋細胞が分化誘導できることは、Ｋｅｈａｔら（非特許文献８参照）およびＣｈｕｎｈｕｉら（特許文献４、非特許文献９参照）により報告されている。これらの報告によると、ヒトＥＳ細胞から分化誘導した心筋細胞は、自立拍動能を有することはもちろん、ミオシン重鎖／軽鎖やα−アクチニン、トロポニンＩ、心房性利尿ペプチド（ａｒｔｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ；ＡＮＰ）等の心筋特異的蛋白質や、ＧＡＴＡ−４やＮｋｘ２．５、ＭＥＦ−２ｃ等の心筋特異的転写因子を発現・産生しているとともに、微細解剖学的観察および電気生理学的解析からも、胎生期の未成熟な心筋細胞の形質を保持しており、再生医療への利用が期待される。
一方、多能性幹細胞に由来する心筋細胞を、細胞移植治療やその他の目的のために使用する際の重要な問題として、従来の方法によりＥＳ細胞又はＥＧ細胞より形成されたＥＢからは、心筋細胞以外にも血球系細胞や、血管系細胞、神経系細胞、腸管系細胞、骨・軟骨細胞等の別種細胞が混在して発生してくることが挙げられる。更に、これらの分化した細胞の中で心筋細胞が占める割合はあまり高くなく、全体の５〜２０％程度に過ぎない。
別種の細胞が混在している中から、心筋細胞のみを選択的に選別する方法としては、ＥＳ細胞の遺伝子に人為的な修飾を加え、薬剤耐性もしくは異所性発現能を付与することにより、心筋細胞又はその前駆細胞としての形質を有する細胞を回収する方法が挙げられる。例えば、Ｆｉｅｌｄおよび共同研究者らは、α型ミオシン重鎖プロモーターの制御下でネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子を発現し得る遺伝子カセットを、マウスＥＳ細胞に導入することにより、そのＥＳ細胞が心筋細胞に分化し、それに伴いα型ミオシン重鎖遺伝子を発現した時のみ、Ｇ４１８を添加した培地中で生存し得る系を構築した（特許文献１、非特許文献４参照）。この方法によりＧ４１８耐性細胞として選別された細胞は、９９％以上の確率で心筋細胞であることが確認されている。しかし、この方法では、心筋細胞の純度はきわめて高くなるものの、最終的に得られる心筋細胞数は、全細胞数の数パーセント程度に過ぎず、移植治療に必要な心筋細胞を得るのは容易なことではない。
最近、Ｃｈｕｎｈｕｉらは、ヒトＥＳ細胞を５−アザシチジンで処理することにより、ＥＢ中のトロポニンＩ陽性（心筋）細胞が１５％から４４％に増加することを報告した（非特許文献９参照）が、本法においても、心筋細胞の占める割合がＥＢ中の５０％を越えることはない。また、脱メチル化剤である５−アザシチジンは、ＤＮＡに結合したメチル基を離脱させることにより遺伝子の発現状態を変化させる薬剤であり、薬剤が直接染色体に作用するため、移植用細胞を作製する薬剤としては適当ではない。
その他、ＥＳ細胞から心筋細胞をより高率に発生させる方法としては、例えば、マウスＥＳ細胞では、レチノイン酸（非特許文献１０参照）やアスコルビン酸（非特許文献１１参照）、ＴＧＦβ、ＢＭＰ−２（非特許文献１２参照）、ＰＤＧＦ（非特許文献１３参照）、Ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ  Ｂ（非特許文献１４参照）の添加、又は細胞内の活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ：ＲＯＳ）（非特許文献１５参照）やＣａ２＋（非特許文献１６参照）を増加させる処理が心筋細胞の分化誘導に促進的に働くことが知られている。しかし、これらのいかなる方法においても、心筋細胞特異的又は選択的な分化誘導は成功していない。
本発明者らは、培養時のある期間、培地中に骨形成因子（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＭＰ）のシグナル伝達を抑制する物質、特にノギンを添加することにより、拍動能を有し心筋細胞と認められる細胞が、従来法よりも極めて選択的且つ高率に産生されることを見出している（特許文献５参照）。
顆粒球コロニー刺激因子（以下においてＧ−ＣＳＦという）は顆粒球系造血幹細胞の分化誘導因子として発見された造血因子であり、生体内では好中球造血を促進することから、骨髄移植や癌化学療法後の好中球減少症治療剤として臨床応用されている。また、上記作用のほかにもヒトＧ−ＣＳＦは幹細胞に作用してその分化増殖を刺激する作用や骨髄中の幹細胞を末梢血中に動員する作用があることが報告されている。Ｉｎ  ｖｉｖｏの実験でＧ−ＣＳＦにより動員された骨髄幹細胞が、動員された組織で心筋細胞に分化することは報告されている（特許文献６、非特許文献１７）。しかし、Ｇ−ＣＳＦが直接、骨髄幹細胞を心筋細胞に分化するという報告はなく、さらに、Ｇ−ＣＳＦが胎仔期の心筋細胞に発現していることや心筋細胞の分化誘導に直接的に用いられるとの報告はない。さらには、Ｇ−ＣＳＦがＥＳ細胞に直接作用し、心筋細胞への分化誘導に用いられるとの報告は全くない。
上述したように、従来の方法単独では、心筋誘導効率にばらつきが生じており、より効率的且つ選択的に心筋細胞に分化誘導する方法が求められている。
【特許文献１】米国特許第６，０１５，６７１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８４３，７８０号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０９０，６２２号明細書
【特許文献４】国際特許公開第０３／０６９５０号パンフレット
【特許文献５】国際特許公開第０５／０３３２９８号パンフレット
【特許文献６】国際特許公報第０４／０５４６０４号パンフレット
【非特許文献１】Ｓｏｏｎｐａａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：９８、１９９４
【非特許文献２】Ｍａｌｔｓｅｖら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．、４４：４１、１９９３
【非特許文献３】Ｍａｌｔｓｅｖら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７５：２３３、１９９４
【非特許文献４】Ｋｌｕｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９８：２１６、１９９６
【非特許文献５】Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：７８４４、１９９５
【非特許文献６】Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８２：１１４、１９９８
【非特許文献７】Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１３７２６、１９９８
【非特許文献８】Ｋｅｈａｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８：４０７、２００１
【非特許文献９】Ｃｈｕｎｈｕｉら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、９１：５０８、２００２
【非特許文献１０】Ｗｏｂｕｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、２９：１５２５、１９９７
【非特許文献１１】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０７：１９１２、２００３
【非特許文献１２】Ｂｅｈｆａｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、１６：１５５８、２００２
【非特許文献１３】Ｓａｃｈｉｎｉｄｉｓら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．、５８：２７８、２００３
【非特許文献１４】Ｖｅｎｔｕｒａら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、９２：６２３、２００３
【非特許文献１５】Ｓａｕｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４７６：２１８、２０００
【非特許文献１６】Ｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１５８：１０３、２００２
【非特許文献１７】Ｍｉｎａｔｏｇｕｃｈｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０９：２５７２、２００４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、未分化なＥＳ細胞を高率且つ選択的に心筋細胞に分化誘導する方法、当該方法により得られる心筋細胞、及び心筋細胞への分化誘導剤等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らはＧ−ＣＳＦ受容体がマウス胎仔期の心筋細胞に強く発現していること、およびＧ−ＣＳＦが胎仔期の心筋細胞の増殖に関与していることを発見した。さらに本発明者らは、ＥＳ細胞を用い、心筋細胞への分化誘導条件について種々検討を重ねた結果、培養時のある期間、培地中にＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを添加することにより、拍動能を有し心筋細胞と認められる細胞が産生され、またＧ−ＣＳＦがＥＳ細胞から心筋細胞に分化する際に、心筋細胞に強い増殖活性を有することを見出した。本発明者らはかかる知見に基づき本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを接触させることを含む、ＥＳ細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
（２）ＥＳ細胞をＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニスト存在下で培養することを含む前記（１）に記載の方法。
（３）Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストがＧ−ＣＳＦである前記（１）または（２）記載の方法。
（４）以下の工程を含む前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法：
（ａ）細胞培養液にＧ−ＣＳＦを添加する工程および
（ｂ）（ａ）の培養液を用いてＥＳ細胞を培養する工程。
（５）ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦの接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行なわれる前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを接触させる前に、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する物質の存在下でＥＳ細胞を培養する工程をさらに含む前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）ＢＭＰシグナル伝達を抑制する物質がノギンである前記（６）記載の方法。
（８）前記（１）〜（７）のいずれかに記載の方法により得られる心筋細胞。
（９）Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを含有する、ＥＳ細胞から心筋細胞への分化誘導剤。
（１０）Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストがＧ−ＣＳＦである前記（９）記載の分化誘導剤。
（１１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる前記（９）または（１０）に記載の分化誘導剤。
（１２）ＥＳ細胞を心筋細胞に分化させる為のＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストの使用。
（１３）Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストがＧ−ＣＳＦである前記（１２）記載の使用。
（１４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる前記（１２）または（１３）に記載の使用。
なお、本発明の実施において、ＥＳ細胞を用いた細胞培養及び発生、細胞生物学実験の一般的方法については、当該分野の標準的な参考書籍を参照し得る。これらには、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｈｏｇａｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｙｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｔｕｒｋｓｅｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２）が含まれる。本明細書において参照される細胞培養、発生・細胞生物学実験のための試薬及びキット類はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＧＩＢＣＯ社やＳｉｇｍａ社等の市販業者から入手可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、マウス胎仔の心臓におけるマウスＧ−ＣＳＦ受容体（ｃｓｆ３ｒ）および心筋特異的転写因子Ｎｋｘ２．５の発現を示すｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの写真である。
図２は、マウス胎仔の心臓切片におけるＧ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）または心筋特異的タンパク質であるα−アクチニンの発現を示す免疫染色の写真である。核酸はＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｅ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。
図３は、Ｅ９．５，Ｅ１０．５およびＥ１３．５のマウス胎仔心臓、新生仔マウス心臓、成体マウス心臓およびマウス肝臓におけるＧ−ＣＳＦＲ、Ｇ−ＣＳＦの発現をＲＴ−ＰＣＲで試験した写真である。コントロールとして、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を用いた。
図４は、妊娠マウスにＧ−ＣＳＦまたはコントロールとしてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を投与し、次いで母体にＢｒｄＵ（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を腹腔内投与したときの、胎仔心臓切片の免疫染色の写真である。
図５は、妊娠マウスにＧ−ＣＳＦを投与したときの効果を示すものであり、図５ａは、図４と同じ心臓切片をヘマトキシン・エオジン染色して顕微鏡観察した写真である。図５ｂは、Ｇ−ＣＳＦＲノックアウトマウスと野生型マウスの心臓切片をヘマトキシン・エオジン染色して顕微鏡観察した写真である。図中、ＬＶは左心室、ＲＶは右心室、ＬＡは左心房、ＲＡは右心房を示す。
図６は、ＢｒｄＵラベリング・インデックスを算出し、これを図示したグラフである。
図７は、妊娠マウス母体にＧ−ＣＳＦを投与した後、胎仔を取り出して心臓の切片を作製し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｉｓｔｏｎ  Ｈ３による免疫染色を行った写真である。
図８は、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｉｓｔｏｎ  Ｈ３ラベリング・インデックスを算出し、これを図示したグラフである。
図９は、胎生１０．５日目の心臓をＴｕｎｅｌ染色した写真である。
図１０は、ノギン処理を行った（ノギン（＋）群）ＥＳ細胞に由来するＥＢと、ノギン処理をしなかった（ノギン（−）群）ＥＳ細胞に由来するＥＢを作製し、ＥＢでのＧ−ＣＳＦＲの発現をＲＴ−ＰＣＲにより試験した結果を示す写真である。心筋細胞に特異的な遺伝子であるＧＡＰＤＨをコントロールとして用いた。
図１１は、ノギン処理を行った（ノギン（＋）群）ＥＳ細胞に由来するＥＢと、ノギン処理をしなかった（ノギン（−）群）ＥＳ細胞に由来するＥＢを作製し、ＥＢでのＧ−ＣＳＦＲの発現を免疫染色により試験した結果を示す写真である。
図１２は、ＥＢ形成後６日目、７日目および８日目のＥＢにおける、Ｇ−ＣＳＦＲまたは心筋特異的タンパク質であるα−アクチニンの発現を示す免疫染色の写真である。
図１３は、Ｇ−ＣＳＦを用いた心筋細胞の分化誘導試験の方法を示す図である。
図１４は、心筋細胞の分化誘導におけるＧ−ＣＳＦ投与の最適時期を示すグラフである。
図１５は、ＥＢ形成後９日目のＥＢを用いて、各種心筋に特異的な遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法および免疫染色法により試験した結果を示す写真である。
図１６は、Ｇ−ＣＳＦの至適濃度を検討するために、種々の濃度のＧ−ＣＳＦをＥＢ６日目に添加して、各心筋マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果を示す写真である。
図１７は、心筋細胞の分化誘導におけるＧ−ＣＳＦの至適濃度を示すグラフである。
図１８は、Ｇ−ＣＳＦ処理によるＥＳ細胞の心筋分化誘導促進効果に及ぼす抗Ｇ−ＣＳＦ抗体の影響を検討するために、各種濃度の抗Ｇ−ＣＳＦ抗体を共存させ、各種心筋マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果を示す写真である。
図１９は、Ｇ−ＣＳＦのＥＳ細胞由来の心筋細胞に及ぼす増殖促進作用を試験するために、ＥＢ６日目にＧ−ＣＳＦの添加群と無添加群およびＧ−ＣＳＦ＋ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）添加群において、各種心筋マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた結果を示す写真である。
図２０は、Ｇ−ＣＳＦの添加群と無添加群において、抗ＢｒｄＵ抗体及び抗ｍｅｆ２ｃ抗体で二重免疫染色を行った結果を示す写真（左側）及び、ＢｒｄＵラベリング・インデックスを算出し、これを図示したグラフ（右側）である。
図２１は、コモン・マーモセットＥＳ（ＣＭＥＳ）細胞に及ぼすＧ−ＣＳＦの効果を示すものであり、図２１ａは、コモン・マーモセットＥＳ（ＣＭＥＳ）細胞の自立拍動性を観察した結果を示す。図２１ｂは、マウスＧ−ＣＳＦ又はヒトＧ−ＣＳＦを添加し、ＣＭＥＳ細胞中における各種心筋マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた結果を示す写真である。図２１ｃは、Ｇ−ＣＳＦ添加群と無添加群において、ＣＭＥＳ由来ＥＢの心臓トロポニンＩ及びＮｋｘ２．５の発現を免疫染色で調べた結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明に用いられるＥＳ細胞としては、既に培養細胞として広く使用されているマウス、サル、ヒト等の哺乳動物由来ＥＳ細胞を挙げることができる。マウス由来ＥＳ細胞の具体例としては、ＥＢ３細胞、Ｅ１４細胞、Ｄ３細胞、ＣＣＥ細胞、Ｒ１細胞、１２９ＳＶ細胞、Ｊ１細胞等が挙げられる。サル由来ＥＳ細胞の具体例としては、コモン・マーモセットＥＳ細胞が挙げられる。また、ＥＳ細胞の作製、継代、保存法については、すでに標準的なプロトコールが確立されており、実施者は、前項で挙げた参考書籍に加えて、複数の参考文献（Ｍａｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ  ７０：８４１，１９９２；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６，１９９８；米国特許第６，０９０，６２２号；Ｊｉａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：４１，２００２；国際特許公開０１／１１０１１）を参照することにより、これらのＥＳ細胞を容易に使用し得る。
本発明において、「心筋細胞」とは、将来、機能的な心筋細胞となり得る能力を有した心筋前駆細胞や、胎児型心筋細胞、成体型心筋細胞のすべての分化段階の細胞を含み、以下に記載する少なくとも１つ、好ましくは複数の方法により、少なくとも１つ、好ましくは複数のマーカーや基準が確認できる細胞を意味する。
心筋細胞に特異的な種々のマーカーの発現は、従来の生化学的又は免疫化学的手法により検出される。その方法は特に限定されないが、好ましくは、免疫組織化学的染色法や免疫電気泳動法の様な、免疫化学的手法が使用される。これらの方法では、心筋前駆細胞又は心筋細胞に結合する、マーカー特異的ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を使用することができる。個々の特異的マーカーを標的とする抗体は市販されており、容易に使用することができる。心筋前駆細胞又は心筋細胞に特異的なマーカーは、例えば、ミオシン重鎖／軽鎖やα−アクチニン、トロポニンＩ、ＡＮＰ、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ−２ｃ等が挙げられる。
あるいは、心筋前駆細胞又は心筋細胞特異的マーカーの発現は、特にその手法は問わないが、逆転写酵素介在性ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）やハイブリダイゼーション分析といった、任意のマーカー蛋白質をコードするｍＲＮＡを増幅、検出、解析するための従来から頻用される分子生物学的方法により確認できる。心筋前駆細胞又は心筋細胞に特異的なマーカー（例えば、ミオシン重鎖／軽鎖やα−アクチニン、トロポニンＩ、ＡＮＰ、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、ＭＥＦ−２ｃ）蛋白質をコードする核酸配列は既知であり、ＧｅｎＢａｎｋの様な公共データベースにおいて利用可能であり、プライマー又はプローブとして使用するために必要とされるマーカー特異的配列を容易に決定することができる。
更に、ＥＳ細胞の心筋細胞への分化を確認するために、生理学的基準も追加的に使用される。即ち、ＥＳ細胞由来の細胞が、自立的拍動性を有することや、各種イオンチャンネルを発現しており電気生理的刺激に反応し得ること等も、その有用な指標となる。
本発明における「Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニスト」は、Ｇ−ＣＳＦ受容体に結合し、Ｇ−ＣＳＦ受容体のシグナル伝達を誘起することができるものであれば特に限定されない。Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストは、ペプチド、アゴニスト抗体、低分子化合物など、如何なる物質でもよい。Ｇ−ＣＳＦ受容体のアミノ酸配列は公知である（国際公開番号ＷＯ９１／１４７７６）。
Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストの好ましい例としてＧ−ＣＳＦを挙げることができる。本発明に用いるＧ−ＣＳＦは、どのようなＧ−ＣＳＦでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたＧ−ＣＳＦであり、より具体的には、哺乳動物Ｇ−ＣＳＦ、特にヒトＧ−ＣＳＦと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。Ｇ−ＣＳＦの由来は特に限定されず、天然由来のＧ−ＣＳＦ、遺伝子組換え法により得られたＧ−ＣＳＦなどを用いることができるが、好ましくは遺伝子組換え法により得られたＧ−ＣＳＦである。遺伝子組換え法により得られるＧ−ＣＳＦには、天然由来のＧ−ＣＳＦとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のＧ−ＣＳＦと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。天然由来のＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列は公知である（配列番号：１）。アミノ酸の欠失、置換、付加などは当業者に公知の方法により行うことが可能である。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６；Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ，Ｈ．Ｊ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２，４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸に適宜変異を導入することにより、Ｇ−ＣＳＦと機能的に同等なポリペプチドを調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。置換、欠失、付加等されるアミノ酸数は特に限定されないが、好ましくは３０アミノ酸以内であり、より好ましくは２０アミノ酸以内であり、さらに好ましくは１０アミノ酸以内（例えば５アミノ酸以内）である。又、一般的に、Ｇ−ＣＳＦと機能的に同等なポリペプチドは配列番号：１のアミノ酸配列と高い相同性を有する。本発明において高い相同性とは、配列番号：１のアミノ酸配列と７０％以上の相同性、好ましくは８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上の相同性、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有することを意味する。アミノ酸の相同性は、例えば、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがって決定することが可能である。一般的に、置換されるアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に置換されることが好ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有��るアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００；Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３；Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
又、Ｇ−ＣＳＦと他のタンパク質との融合タンパク質を用いることも可能である。融合ポリペプチドを作製するには、例えば、Ｇ−ＣＳＦをコードするＤＮＡと他のタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよい。本発明のＧ−ＣＳＦとの融合に付される他のタンパク質としては、特に限定されない。
又、化学修飾したＧ−ＣＳＦを用いることも可能である。化学修飾したＧ−ＣＳＦの例としては、例えば、糖鎖の構造変換・付加・欠失操作を行ったＧ−ＣＳＦや、ポリエチレングリコール・ビタミンＢ１２等、無機あるいは有機化合物等の化合物を結合させたＧ−ＣＳＦなどを挙げることができる。
又、Ｇ−ＣＳＦの部分ペプチドを用いることも可能である。Ｇ−ＣＳＦの部分ペプチドは特に限定されないが、通常、Ｇ−ＣＳＦ受容体への結合活性を有している。
本発明で用いるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、例えば、ヒト腫瘍細胞やヒトＧ−ＣＳＦ産生ハイブリドーマの細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦ、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌、イースト菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞、ミエローマ細胞、ＢＨＫ細胞、昆虫細胞、などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したＧ−ＣＳＦなどを用いることができる。本発明において用いられるＧ−ＣＳＦは、遺伝子工学的手法により製造されたＧ−ＣＳＦが好ましく、哺乳動物細胞（特にＣＨＯ細胞）を用いて製造されたＧ−ＣＳＦが好ましい（例えば、特公平１−４４２００号公報、特公平２−５３９５号公報、特開昭６２−１２９２９８号公報、特開昭６２−１３２８９９号公報、特開昭６２−２３６４８８号公報、特開昭６４−８５０９８号公報）。
本発明者らは後述する実施例に記載するように、Ｇ−ＣＳＦ受容体がマウス胎仔期の心筋細胞に強く発現していること、およびＧ−ＣＳＦが胎仔期の心筋細胞の増殖に関与していることを発見した。また、Ｇ−ＣＳＦがｉｎ  ｖｉｖｏで胎仔期に心筋細胞の増殖を顕著に促進することを初めて確認した。さらに、本発明では、Ｇ−ＣＳＦが霊長類の心筋細胞増殖に必須であることも示され、ヒトを含む全ての哺乳動物におけるＧ−ＣＳＦの役割が示唆された。
本発明において、ＥＳ細胞から心筋細胞を作製する培養法としては、心筋細胞の分化誘導に適した方法であれば、いずれも用いることができ、例えば、浮遊凝集培養法、懸滴（ｈａｎｇｉｎｇ  ｄｒｏｐ）培養法、支持細胞との共培養法、旋回培養法、軟寒天培養法、マイクロキャリア培養法等を挙げることができる。具体的な方法の例としては、例えば浮遊凝集培養法の場合、単一細胞状態（酵素消化等を施すことで細胞同士の接着がない個々の細胞が液相中で分散した状態）としたＥＳ細胞を、好ましくは、培地に１０細胞／ｍＬ〜１×１０７細胞／ｍＬ、より好ましくは１００細胞／ｍＬ〜１×１０６細胞／ｍＬの細胞密度になるように懸濁し、培養プレートに播種後、４〜３０日間、好ましくは６〜１５日間、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２条件下にて培養する方法を挙げることができる。
また、別の実施態様として、支持細胞との共培養法を用いる場合、支持細胞としては、特にこれを限定しないが、好ましくは間葉系細胞の性質を有した細胞、さらに好ましくはＳＴ２細胞、ＯＰ９細胞、ＰＡ６細胞等の骨髄ストローマ細胞様の形質を有する細胞が挙げられる。これらの支持細胞を高密度培養、マイトマイシンＣ処理、又は放射線照射等の方法によりフィーダー化し、その上に、培地に１細胞／ｍＬ〜１×１０６細胞／ｍＬ、好ましくは１００細胞／ｍＬ〜１×１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは１×１０３細胞／ｍＬ〜１×１０４細胞／ｍＬの細胞密度になるように懸濁した単一細胞状態のＥＳ細胞を播種後、４〜３０日間、好ましくは６〜１５日間、３７℃で５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２条件下にて培養することができる。
本発明では、ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニスト、好ましくはＧ−ＣＳＦを接触させることによって、ＥＳ細胞を心筋細胞に分化誘導することが促進される。好ましくは精製組換えＧ−ＣＳＦを培地中に添加する方法が挙げられる。その他にも、精製組換えＧ−ＣＳＦを培地中に添加する方法と同様の効果を示す方法であれば、いずれも用いることができる。例えば、Ｇ−ＣＳＦの遺伝子発現ベクターをＥＳ細胞自身に導入する方法、Ｇ−ＣＳＦの遺伝子発現ベクターを支持細胞に導入し、その導入細胞を共培養細胞として用いる方法、又はその導入細胞の培養上清等の細胞産生物を用いる方法、等が挙げられ、本発明に係る方法においては何れもＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを培地中に添加する実施形態として含まれる。
具体的には、例えば、本発明は以下の工程を含む：
（ａ）細胞培養液にＧ−ＣＳＦを添加する工程および
（ｂ）（ａ）の培養液を用いてＥＳ細胞を培養する工程。
本発明の実施において、使用するＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストは、ＥＳ細胞が由来する種と同種の動物由来のものが好ましいが、異種動物由来のものも使用することができる。
また、本発明では、ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦの接触をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことが好ましい。
本発明の実施においては、ＥＳ細胞を未分化状態に維持するため、当該ＥＳ細胞の動物種に応じて、通常用いられる条件下で培養することが好ましい。即ち、マウスＥＳ細胞の場合は、培地中に１００〜１００００Ｕ／ｍＬ、好ましくは５００〜２０００Ｕ／ｍＬ濃度の白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を添加しておくことが好ましい。
その後、ＬＩＦを除去した分化用培地でＥＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導する。分化誘導の開始においては、ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを接触させる前に、ＥＳ細胞とＢＭＰシグナル伝達を抑制する物質の存在下でＥＳ細胞を培養することが好ましい。ＢＭＰシグナルを抑制する物質としてＢＭＰアンタゴニスト（例えば、ノギン蛋白質、コーディン蛋白質等）を用いる場合、古い培地を無菌的に除去した上で、１ｎｇ／ｍＬ〜２μｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬの濃度のノギン蛋白質、又はコーディン蛋白質を含有する培地で置換し、好ましくは数日間、より好ましくは３日間培養を継続する。
次いで、Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストとしてＧ−ＣＳＦを用いる場合には、古い培地を無菌的に除去した上で、培地中の最終濃度が０．０１ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．０５ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは０．７５ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬあるいは２．５ｎｇ／ｍＬ〜２５ｎｇ／ｍＬになるようにＧ−ＣＳＦを添加し、培養を継続する。Ｇ−ＣＳＦを添加する時期は分化開始後３〜１０日目、より好ましくは５〜８日目であるが、至適濃度や適用日数は適宜変更しうる。
上記の方法により、ＥＳ細胞から分化誘導した心筋細胞は、引き続き、公知の方法による細胞回収、分離、精製法を用いることにより、高純度の心筋細胞を効率的かつ多量に得ることができる。
心筋細胞の精製方法は、公知となっている細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、その具体的例として、フローサイトメーターや磁気ビーズ、パンニング法等の抗原−抗体反応に準じた方法（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，１９９３）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）や、ショ糖、パーコール等の担体を用いた密度勾配遠心による細胞分画法を挙げることができる。また、別の心筋細胞選別法としては、元となるＥＳ細胞等の多能性幹細胞の遺伝子に前もって人為的な修飾を加え、薬剤耐性もしくは異所性蛋白質の発現能を付与することにより、心筋細胞としての形質を有する細胞を回収する方法が挙げられる。例えば、Ｆｉｅｌｄおよび共同研究者らは、α型ミオシン重鎖プロモーターの制御下でネオマイシン（Ｇ４１８）耐性遺伝子を発現し得る遺伝子カセットを、マウスＥＳ細胞に導入することにより、そのＥＳ細胞が心筋細胞に分化し、それに伴いα型ミオシン重鎖遺伝子を発現した時のみ、Ｇ４１８を添加した培地中で生存し得る系を構築し、この方法によりＧ４１８耐性細胞として選別された細胞は、９９％以上の確率で心筋細胞であることが確認されている（米国特許第６，０１５，６７１号；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２１６，１９９６）。
別の実施態様において、本発明は、上記の本発明の分化誘導方法を用いてＥＳ細胞を分化誘導することにより作製された心筋細胞、すなわち心筋細胞の形態学的、生理学的及び／又は免疫学的特徴を示す細胞に関する。生理学的及び／又は免疫学的特徴は、特にこれを限定しないが、本発明の方法によって作製された細胞が、心筋細胞として認識される、心筋細胞に特異的な１つ又はそれ以上のマーカーを発現していればよい。
また別の実施態様において、本発明は、Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを含有する、ＥＳ細胞から心筋細胞への分化誘導剤に関する。好ましいＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストはＧ−ＣＳＦであり、またｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いることが好ましい。
また別の実施態様において、本発明は、ＥＳ細胞を心筋細胞に分化させる為のＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストの使用に関する。好ましいＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストはＧ−ＣＳＦであり、またｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いることが好ましい。
本発明により調製された心筋細胞は、心筋再生薬又は心臓疾患治療薬として用いることができる。心臓疾患としては、心筋梗塞、虚血性心疾患、うっ血性心不全、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、慢性心不全などを挙げることができる。心筋再生薬又は心臓疾患治療薬としては、本発明により調製された心筋細胞を高純度で含むものであれば、細胞を培地等の水性担体に浮遊させたもの、細胞を生体分解性基質等の支持体に包埋したもの、あるいは単層もしくは多層の心筋細胞シート（Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９０：ｅ４０，２００２）に加工したもの等、どの様な形状のものでも用いることができる。
上記の治療薬を障害部位に輸送する方法としては、開胸し、注射器を用いて直接心臓に注入する方法、心臓の一部を外科的に切開して移植する方法、さらにはカテーテルを用いた経血管的方法により移植する方法等（Ｍｕｒｒｙら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．６７：５１９，２００２；Ｍｅｎａｓｃｈｅ、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７５：Ｓ２０，２００３；Ｄｏｗｅｌｌら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５８：３３６，２００３）が挙げられるが、特にこれを限定しない。この様な方法により、胎児心臓から回収した心筋細胞を心傷害動物の心臓に移植すると、きわめて良い治療効果を示すことが報告されている（Ｍｅｎａｓｃｈｅ、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７５：Ｓ２０，２００３；Ｒｅｆｆｅｌｍａｎｎら、Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．Ｒｅｖ．８：２０１，２００３）。ＥＳ細胞由来の心筋細胞は、胎児心臓由来の心筋細胞ときわめてよく似た形質を呈している（Ｍａｌｔｓｅｖら、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．４４：４１，１９９３：Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７５：２３３，１９９４）。また、実際にＥＳ細胞由来の心筋細胞を成体心臓に移植した動物実験例では、胎児心筋を移植した例とほぼ変わらない、極めて高い生着性を示すことも確認されている（Ｋｌｕｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２１６，１９９６）。そのため、心筋細胞の疲弊および脱落に起因する上記の心疾患において、本発明記載の方法により調製した心筋細胞を、病的心臓組織に補充的に移植することにより、心機能の改善を促すことが期待できる。
発明の効果
本発明方法を用いることにより、ＥＳ細胞から心筋細胞が効率的かつ選択的に生産できる。特に、本発明の方法は分化直後の心筋に作用するため、既存の方法と組み合わせることによって、より誘導効率を上げることが可能となる。この様にして作製された心筋細胞は、心疾患治療に有効な薬剤の探索・開発に利用できるとともに，重篤な心疾患に対する心筋移植治療に適用できる可能性がある。
【実施例】
【０００７】
次に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、以下の実施例は本発明の単なる例示を示すものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１：マウス胎仔心臓由来の心筋におけるＧ−ＣＳＦ受容体の発現
以下の方法を用いてマウス胎仔心臓由来の心筋におけるＧ−ＣＳＦ受容体の発現を検討した。
（１）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる検討
妊娠したＩＣＲ野生型マウスを日本ＣＬＥＡから購入した。胎生（日）Ｅ７．５，Ｅ８．５，Ｅ９．５およびＥ１０．５で胎仔を取り出し、ジゴキシゲニン標識ＲＮＡプローブを用いて、文献記載の方法（Ｓａｓａｋｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８，４７−５９（１９９３））によって心臓のｗｈｏｌｅ−ｍｏｕｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＳＨ）を行った。マウスＧ−ＣＳＦ受容体（ｃｓｆ３ｒ）および心筋特異的転写因子Ｎｋｘ２．５（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒはそれぞれＮＭ＿００８７１１  ＮＭ＿００８７００）の全長ｃＤＮＡを逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により得て、これをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにサブクローニングした。ｃｓｆ３ｒのｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして５’−ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＣＣＴ  Ｃ−３’（配列番号：２）、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして５’−ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＡＡＴ  Ｇ−３’（配列番号３）、Ｎｋｘ２．５のｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして５’−ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＣＣ−３’（配列番号：４）、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒとして５’−ＴＡＧ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＣＡ−３’（配列番号：５）を使用した。プローブはＴ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写した。得られた結果を図１に示す。Ｇ−ＣＳＦ受容体（ｃｓｆ３ｒ）はＥ７．５およびＥ８．５で強く発現しているが、それ以後のステージでは検出されなかった。一方Ｎｋｘ２．５は後半のステージで発現していた。
（２）免疫染色による検討
Ｅ８．５，Ｅ９．５およびＥ１０．５のマウス心臓を４％パラホルムアルデヒドで４５分固定し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ）を用いて包埋して、切片を作製した。各サンプルをＧ−ＣＳＦ受容体（Ｇ−ＣＳＦＲ）（Ｈ１７６：ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社）または心筋特異的タンパク質であるα−アクチニンに対する１次抗体と結合させた。さらにＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）と順次反応後、蛍光顕微鏡下にて観察を行った。核酸はＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｅ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。結果を図２に示す。心臓および体節に胎生８．５日目からＧ−ＣＳＦ受容体が発現し、その後９．５日目でピークに達することが確認された。
（３）逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応による検討
Ｅ９．５，Ｅ１０．５およびＥ１３．５のマウス胎仔心臓、新生仔マウス心臓、成体マウス心臓およびマウス肝臓におけるＧ−ＣＳＦＲ、Ｇ−ＣＳＦの発現を検討した。心筋細胞に特異的な遺伝子であるＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）をコントロールとして用いた。各組織から全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ）で抽出し、文献記載の方法（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２４，３７２−３７６（２０００））を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。得られた結果を図３に示す。Ｇ−ＣＳＦＲはＥ９．５，Ｅ１０．５の胎仔心臓で強く発現していることが認められた。
実施例２：心臓発生におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＧ−ＣＳＦの作用（１）
妊娠９．０日目にマウスを開腹し、子宮内に直接Ｇ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｋｇ）またはコントロールとしてＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を投与した。次いで妊娠９．５日目に母体にＢｒｄＵ（ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を腹腔内投与した。ＢｒｄＵはＤＮＡ合成の際に取り込まれ、免疫染色により増殖を評価することができる。妊娠１２．５日目に胎仔を取り出して心臓の切片を作製した。実施例１（２）に記載した免疫染色と同様の方法で試験した結果を図４に示す。Ｇ−ＣＳＦは胎仔の心筋増殖を促進することが確認できた。
また、心臓切片をヘマトキシン・エオジン染色して顕微鏡観察した結果を図５ａに示す。Ｇ−ＣＳＦ投与した胎仔の心臓では、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｌａｙｅｒが延長していることが観察された。
さらに、同様の試験をＧ−ＣＳＦ受容体を欠損させたＧ−ＣＳＦＲノックアウトマウス（以下において、Ｇ−ＣＳＦ−／−マウスと記載する）（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  ＭｅｄｉｓｏｎのＤｒ．Ｄａｎｉｅｌ  Ｃ．Ｌｉｎｋから恵与された）（Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０２，３５６２−３５６８，（２００３））で実施して、野生型マウスと比較した。心臓切片をヘマトキシン・エオジン染色して顕微鏡観察した結果を図５ｂに示す。Ｇ−ＣＳＦ−／−マウスでは、胎仔心臓の心房壁及び心室壁が野生型マウスと比較して有意に薄くなっており、いくつかのマウスでは心房中隔欠損が見られた。これらのマウスの約５０％が後期胚ステージで死亡した。
さらに、心筋増殖促進効果を定量するために、以下の式によりＢｒｄＵラベリング・インデックスを算出した。なお、本試験では、野生型マウスを用い、妊娠１０．５日目にＢｒｄＵを投与し、１２．５日目に解析した。
ＢｒｄＵ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ  ＝  ＢｒｄＵ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｉ／ｔｏｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉ  ｘ  １００（％）
得られた結果を図６に示す。Ｇ−ＣＳＦ投与によって心筋の増殖が亢進することが観察された。
実施例３：心臓発生におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＧ−ＣＳＦの作用（２）
妊娠マウス母体に妊娠９．０日目に子宮内にＧ−ＣＳＦを２ｎｇ直接投与した。妊娠１３．５日目に胎仔を取り出して心臓の切片を作製し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｉｓｔｏｎ  Ｈ３による免疫染色を行った。Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｉｓｔｏｎ  Ｈ３は細胞増殖過程で特異的に染色される色素である。得られた結果を図７に示す。Ｇ−ＣＳ投与によって胎仔の心筋増殖が亢進することが観察された。
次に、以下の式によりラベリング・インデックスを算出した。
Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｉｎｄｅｘ  ＝  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈｉｓｔｏｎ  Ｈ３  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｉ／ｔｏｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉ  ｘ  １００（％）
得られた結果を図８に示す。Ｇ−ＣＳＦは胎生８．５日目から１０．５日目にかけて心筋増殖を強く亢進することが観察された。
また、胎生期心臓のアポトーシスに及ぼすＧ−ＣＳＦの影響を調べるために、胎生１０．５日目の心臓をＴｕｎｅｌ染色した。Ｔｕｎｅｌ染色はアポトーシスの間に生じるＤＮＡ断片を識別できる染色法である。得られた結果を図９に示す。胎生１０．５日目の心臓でアポトーシスはほとんど観察されなかった。
実施例４：ＥＳ細胞由来心筋細胞におけるＧ−ＣＳＦ受容体の発現
以下の実験には、ＥＳ細胞として、ＥＢ３細胞（丹羽仁史博士〔理科学研究所〕より恵与）およびＲ１細胞（Ａｎｄｒｅｗ  Ｎａｇｙ博士〔Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ病院；カナダ〕より恵与）を用いた。これらのＥＳ細胞は、１０％仔牛胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸液、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールおよびを２０００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社）を含むＧｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ社）培地中で、ゼラチンコートしたプレート中に維持した。
ＥＳ細胞からＥＢを形成させるための浮遊培養は以下の様にして行った。ＥＳ細胞を１０％仔牛胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸液、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２０００Ｕ／ｍＬ白血病抑制因子および０．１５μｇ／ｍｌノギン（Ｎｏｇｇｉｎ−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ社）を含むα−ＭＥＭ培地中、ゼラチンコートしたプレートで３日間培養した。次にＥＳ細胞をトリプシン溶液で処理をすることにより単一細胞状態にし、引き続き、コートしていないペトリ皿上で、三次元培養システムを用いて上記と同じ分化培地（ただしＬＩＦを含まない）中で培養してスフェロイド（球状体）を形成させ、ＥＢ（肺様体）を誘導する。本実験条件では、浮遊培養直後からＥＳ細胞が凝集してＥＢの形成が認められ、浮遊培養後７〜８日目ごろから一部のＥＢで自立拍動性が観察されるようになる。
上記の方法により、ノギン処理を行った（ノギン（＋）群）ＥＳ細胞に由来するＥＢと、ノギン処理をしなかった（ノギン（−）群）ＥＳ細胞に由来するＥＢを作製し、ＥＢでのＧ−ＣＳＦＲの発現をＲＴ−ＰＣＲにより試験した。心筋細胞に特異的な遺伝子であるＧＡＰＤＨをコントロールとして用いた。得られた結果を図１０に示す。ノギン処理を行った（ノギン（＋）群）ＥＳ細胞に由来するＥＢではＧ−ＣＳＦＲがＥＢ形成後５日目以降に発現することが観察された。
また、ＥＢ形成後６日目のＥＢを用いて、免疫染色を行った結果を示すのが図１１である。ノギン処理を行った（ノギン（＋）群）ＥＳ細胞に由来するＥＢではＧ−ＣＳＦＲの発現が増加しており、これはノギンによる心筋誘導によってＧ−ＣＳＦＲの発現が増加することを示している。
次に、ＥＢ形成後６日目、７日目および８日目のＥＢを用いて、実施例１（２）と同様な方法を用いて免疫染色した結果を図１２に示す。ＥＢをＯＣＴで包埋することで切片を作成し、１次抗体として上記Ｇ−ＣＳＦ受容体抗体を１：５０、抗αアクチニン抗体（ＥＡ−５３，Ｓｉｇｍａ）を１：８００の比率で反応させ、２次抗体としてＡｌｅｘａ４８８及びＡｌｅｘａ５４６と反応させた後、核染した。ＥＢ形成後６日目、７日目および８日目のＥＢでは、心筋マーカーのα−アクチニンとＧ−ＣＳＦは共発現しており、これはＥＳ細胞を心筋細胞に分化誘導する際に、Ｇ−ＣＳＦは心筋マーカーと共発現することを示している。
実施例５：Ｇ−ＣＳＦのＥＳ細胞由来の心筋細胞に及ぼす分化誘導作用
Ｇ−ＣＳＦを用いた心筋細胞の分化誘導試験を図１３に示す方法で行った。すなわち、ゼラチンコーティングしたディッシュ上でＥＳ細胞をＬＩＦの存在下に未分化な状態に維持しておき、０日目にＬＩＦ非存在下で浮遊培養して、ＥＳ細胞の分化を開始すると９日目で心筋細胞に分化したＥＢが得られる。５日目、６日目、７日目および８日目にＧ−ＣＳＦ（２．５ｎｇ／ｍｌ）を添加してＥＢの形成に及ぼす作用を検討した結果を図１４に示す。本作用については、自律拍動しているＥＢ数を全ＥＢ数で除すことにより算出した。６日目でＧ−ＣＳＦを投与したときが最もＥＢ形成に効果があり、Ｇ−ＣＳＦ投与の最適時期は６日目であることが示された。
次に、９日目のＥＢを用いて、各種心筋に特異的な遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ法および免疫染色法により試験した。ＲＴ−ＰＣＲ法で用いた心筋マーカーはＴｂｘ−５、ＭＥＦ−２ｃ（ｍｕｓｃｌｅ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒ−２ｃ）、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ−４、βＭＨＣ（β  ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）、ＭＬＣ−２ｖ（ｍｙｏｓｉｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ−２ｖ）、αＭＨＣ（α−ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）、ＢＮＰ（ｂｒａｉｎ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＡＮＰ（ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）およびＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）であった。免疫染色法で用いた心筋マーカーは、α−アクチニン、アクチン、トロポニン１−Ｃ、ＭＦ２０およびＡＮＰであった。得られた結果を図１５に示す。Ｇ−ＣＳＦ投与群ではいずれの心筋マーカーの発現も増加していた。
さらに、Ｇ−ＣＳＦの至適濃度を検討するために、種々の濃度（０．２５、０．７５、２．５、７．５、２５、７５ｎｇ／ｍｌ）のＧ−ＣＳＦをＥＢ６日目に添加して、各心筋マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲ法で調べた。なお、試験にはＨ（２ｘ１０３ｃｅｌｌ／ｍｌ）とＬ（５ｘ１０４ｃｅｌｌ／ｍｌ）の２つの細胞密度のＥＢを用いた。得られた結果を図１６に示す。細胞密度に依らず、収縮蛋白、転写因子、分泌蛋白ともに０．２５〜２５ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦ添加によって対象群に比して発現が上昇しており、この濃度が至適濃度と考えられる。
上記結果からＧ−ＣＳＦの至適濃度を求めた結果を図１７に示す。至適濃度の検討は、自律拍動しているＥＢ数を全ＥＢ数で除すことにより求めた数値を比較することにより実施した。この結果、Ｇ−ＣＳＦの至適濃度は０．７５ｎｇ／ｍｌであることが観察された。
実施例６：Ｇ−ＣＳＦの心筋分化誘導作用に対するＧ−ＣＳＦ抗体の阻害効果
Ｇ−ＣＳＦ処理によるＥＳ細胞の心筋分化誘導促進効果が、内因性Ｇ−ＣＳＦシグナリング経路を介している可能性を確認するため、Ｇ−ＣＳＦ処理と同時に抗Ｇ−ＣＳＦ抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社）を培地中に添加し、その効果を検討した。ＥＢ６日目にＧ−ＣＳＦ（７．５ｎｇ／ｍＬ）の添加と同時に各種濃度（０、１、３、９ｎｇ／ｍｌ）の抗Ｇ−ＣＳＦ抗体を共存させ、その影響を各種心筋マーカーを用いて調べた結果を図１８に示す。抗Ｇ−ＣＳＦ抗体は濃度依存的に、心筋マーカーの発現を低下させることが観察された。
実施例７：Ｇ−ＣＳＦのＥＳ細胞由来の心筋細胞に及ぼす増殖促進作用
Ｇ−ＣＳＦのＥＳ細胞由来の心筋細胞に及ぼす増殖促進作用を試験するために、ＥＢ６日目にＧ−ＣＳＦ（７．５ｎｇ／ｍＬ）の添加群と無添加群およびＧ−ＣＳＦ＋ノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）（０．２μｇ／ｍＬ）添加群を作製した。ノコダゾールは紡錘糸形成阻害作用によって細胞分裂を特異的に阻害する薬剤である。これらの３群につき、各種心筋マーカーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより調べた結果を図１９に示す。ＥＢにＧ−ＣＳＦを作用させると同時にノコダゾールを添加して細胞分裂を阻害することによって心筋マーカーの発現上昇がキャンセルされる結果となった。このことはＧ−ＣＳＦの作用が心筋の前駆細胞の増殖を促進するものであることを示す。
また、ＥＢ６日目にＧ−ＣＳＦ（２．５ｎｇ／ｍＬ）の添加群と無添加群を作製し、次いでＢｒｄＵと一緒に１８時間インキュベートした。これらにつき抗ＢｒｄＵ抗体（Ｒｏｃｈｅ社製）及び抗ｍｅｆ２ｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）で二重免疫染色を行った結果を図２０（左）に示す。また、ＢｒｄＵラベリング・インデックスを算出した結果を図２０（右）に示す。Ｇ−ＣＳＦが心筋細胞の細胞増殖を促進することが確認された。
実施例８：霊長類の心臓発生におけるＧ−ＣＳＦの作用
コモン・マーモセットＥＳ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ  ＥＳ：ＣＭＥＳ）細胞の作製
霊長類の心臓発生におけるＧ−ＣＳＦの作用を試験するために、コモン・マーモセットＥＳ（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｍａｒｍｏｓｅｔ  ＥＳ：ＣＭＥＳ）細胞（＃２０）（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３，１３０４−１３１３（２００５））を用いた。ＣＭＥＳ細胞をＫｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）培地（２０％  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ；ＧＩＢＣＯ），１ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（ＧＩＢＣＯ），０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ），０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（２−ＭＥ；Ｓｉｇｍａ），１０ｎｇ／ｍｌ線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０ｎｇ／ｍｌヒト白血病抑制因子（ｈＬＩＦ；Ａｌｏｍｏｎｅ  ｌａｂｓ）を補充）中で、有糸分裂不活性化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）の層上で維持した。ＣＭＥＳ細胞を５日ごとに継代して未分化状態を維持した。
ＥＢの作製
未分化のＣＭＥＳ細胞をＭＥＦフィーダー層から剥離し、ヒト及びサルＥＳ細胞用剥離液（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ，ＪＡＰＡＮ）を用いて小さなコロニーに分離し、次いでこれをｂＦＧＦ及びｈＬＩＦを含まない培地中で、ＨｙｄｒｏＣｅｌｌ（登録商標）培養プレート（ＣｅｌｌＳｅｅｄ，ＪＡＰＡＮ）を用いて懸濁培養してＥＢを得た。
Ｇ−ＣＳＦの作用の検討
ＥＢ形成後、４日目、６日目および９日目にＧ−ＣＳＦ（２．５ｎｇ／ｍＬ）を添加して、自立拍動性を観察した。得られた結果を図２１ａに示す。最も良好であったのはＥＢ形成後６日目に添加した場合であり、Ｇ−ＣＳＦ添加群と無添加群との違いは１４日目で明らかとなった。Ｇ−ＣＳＦ添加の心臓形成に及ぼす作用はＥＢ形成後６日目が最も大きく、それよりも前であっても後であっても小さくなることが観察された。
マウスＧ−ＣＳＦ又はヒトＧ−ＣＳＦを添加し、ＣＭＥＳ細胞中における各種心筋マーカーの発現をＲＴ−ＰＣＲにより調べた結果を図２１ｂに示す。マウスＧ−ＣＳＦ及びヒトＧ−ＣＳＦのいずれも心筋マーカーの発現を強く増強することが観察された。また、免疫染色で調べた結果を図２１ｃに示す。Ｇ−ＣＳＦはＣＭＥＳ由来ＥＢの心臓トロポニンＩ及びＮｋｘ２．５陽性領域を増強した。
これらの結果から、Ｇ−ＣＳＦが霊長類の心筋細胞増殖に必須であることが示され、ヒトを含む全ての哺乳動物におけるＧ−ＣＳＦの役割が示唆された。
［配列表］
2008150030.tif 000003
2008150030.tif 000004
【図６】
2008150030.tif 000005
【図８】
2008150030.tif 000006
【図１４】
2008150030.tif 000007
【図１７】
2008150030.tif 000008
【図１】
2008150030.tif 000009
【図２】
2008150030.tif 000010
【図３】
2008150030.tif 000011
【図４】
2008150030.tif 000012
【図５】
2008150030.tif 000013
【図７】
2008150030.tif 000014
【図９】
2008150030.tif 000015
【図１０】
2008150030.tif 000016
【図１１】
2008150030.tif 000017
【図１２】
2008150030.tif 000018
【図１３】
2008150030.tif 000019
【図１５】
2008150030.tif 000020
【図１６】
2008150030.tif 000021
【図１８】
2008150030.tif 000022
【図１９】
2008150030.tif 000023
【図２０】
2008150030.tif 000024
【図２１】
2008150030.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月30日(2008.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを接触させることを含む、ＥＳ細胞を心筋細胞に分化誘導する方法。
【請求項２】
ＥＳ細胞をＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニスト存在下で培養することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストがＧ−ＣＳＦである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
以下の工程を含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法：
（ａ）細胞培養液にＧ−ＣＳＦを添加する工程および
（ｂ）（ａ）の培養液を用いてＥＳ細胞を培養する工程。
【請求項５】
ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦの接触がｉｎ  ｖｉｔｒｏで行なわれる請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＥＳ細胞とＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを接触させる前に、ＢＭＰシグナル伝達を抑制する物質の存在下でＥＳ細胞を培養する工程をさらに含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ＢＭＰシグナル伝達を抑制する物質がノギンである請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により得られる心筋細胞。
【請求項９】
Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストを含有する、ＥＳ細胞から心筋細胞への分化誘導剤。
【請求項１０】
Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストがＧ−ＣＳＦである請求項９記載の分化誘導剤。
【請求項１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる請求項９または１０に記載の分化誘導剤。
【請求項１２】
ＥＳ細胞を心筋細胞に分化させる為のＧ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストの使用。
【請求項１３】
Ｇ−ＣＳＦ受容体に対するアゴニストがＧ−ＣＳＦである請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法により心筋細胞を製造する方法。
【国際調査報告】
2008150030.tif 000026
2008150030.tif 000027
2008150030.tif 000028
2008150030.tif 000029