(57)【要約】スイートピー抽出物を含有するアポトーシス抑制剤、ＤＮＡ障害抑制剤。
2008120551.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スイートピー抽出物を含有するアポトーシス抑制剤。
【請求項２】
スイートピー抽出物を含有するＤＮＡ損傷抑制剤。
【請求項３】
スイートピー抽出物を含有する紫外線障害抑制剤
【請求項４】
スイートピー抽出物を含有するＤＮＡ損傷修復促進剤。
【請求項５】
スイートピー抽出物を含有する突然変異抑制剤。
【請求項６】
スイートピーの花から抽出した抽出物を含有するアポトーシス抑制剤。
【請求項７】
スイートピーの花から抽出した抽出物を含有するＤＮＡ損傷抑制剤。
【請求項８】
スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する紫外線障害抑制剤。
【請求項９】
スイートピーの花から抽出した抽出物を含有するＤＮＡ損傷修復促進剤。
【請求項１０】
スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する突然変異抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス抑制剤及びＤＮＡ損傷抑制剤又はＤＮＡ損傷修復促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシスは様々な疾患と深い関わりを有する生命現象であり、アルツハイマー病、パーキンソン病、痴呆症、ハンチントン病、脳虚血等の神経性疾患は神経細胞のアポトーシスにより引起される。エイズなどの疾患において生じる正常細胞（例えば、リンパ球など）の減少もアポトーシスにより生じる。放射線や紫外線、又は抗ガン剤を用いたがん治療において正常細胞にもアポトーシスが誘導される。アポトーシスを抑制することによりこれらの疾患の治療効果を高めるためにＢＬＤを有するペプチドがアポトーシス抑制剤として知られている（特許文献１：特開２００６−６２９８１号公報）。シェーグレン症候群（ドライアイ、ドライマウス）、角結膜障害などの治療に有用なアポトーシス抑制剤としてＮ，Ｎ'−ビス［５−（３，４，５−トリメトキシフェニル）−４−ペンテニル］ホモピペラジンが知られている（特許文献２：ＷＯ０２／０２０４７７号公報）。癌、ＡＩＤＳ、ＡＩＤＳ関連疾患、成人Ｔ細胞白血病、毛様細胞性白血病、脊髄症、呼吸障害、関節症、ブドウ膜炎等のＨＩＶ又はＨＴＬＶ−１関連疾患やＣ型肝炎等のレトロウイルス関連疾患、全身性エリテマトーデスや慢性関節リウマチ等の膠原病、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、重症筋無力症、橋本病、インスリン依存型糖尿病等の自己免疫疾患、骨髄異形成症候群、周期性血小板減少症、再生不良性貧血、突発性血小板減少症、汎発性血管内凝固症等の血小板減少を伴う各種疾患、Ｃ型、Ａ型、Ｂ型、Ｆ型等のウイルス性や薬剤性の肝炎及び肝硬変等の肝疾患、アルツハイマー病及びアルツハイマー型老年痴呆症、心筋炎、成人呼吸急迫症候群、感染症、前立腺肥大症、子宮筋腫、気管支喘息、動脈硬化症、各種先天性奇形症、腎炎、老人性白内障、慢性疲労症候群及び筋ジストロフィー等の各種疾患に好適に使用できるアポトーシス調整剤としてカルボスチリル誘導体が知られている（特許文献３：ＷＯ９４／４５０４号公報）。細胞死に起因する肝炎、虚血性脳疾患、アルツハイマー氏病及び抗腫瘍剤投与による副作用を治療する抗細胞死剤としてヒト  キャスペース阻害物質が知られている（特許文献４：特開平１１−１８０８９１号公報）。アポトーシス起因性疾患の治療、すなわち、アルツハイマー病、老人性神経症、退行性神経変性症、パーキンソン氏病、精神分裂症（破瓜病）、小脳変性症、ウィルキンソン氏病、ダウン症候群、網膜色素変性症及び老化予防等に有効な薬物として当帰芍薬散を含有するアポトーシス抑制剤が知られている（特許文献５：特開平９−８７１８７号公報）。肝機能障害等の改善、回復のための肝臓保護剤としてローヤルゼリーからなるアポトーシス抑制剤が知られている（特許文献６：特開２００３−６３９８３号公報）。
癌や種々の老化症状に関与しているＤＮＡの損傷を防ぎ、これらの疾患を未然に防止するＤＮＡ損傷保護剤としてハイゴケ属、イトゴケ属、シノブゴケ属の植物抽出物が知られている（特許文献７：特開２００６−１９３４７２号公報）。ＤＮＡ損傷抑制剤としてゲンチアナ属植物の花の抽出物が知られている（特開２００６−１５１８３１号公報）。しかしながら、スイートピー抽出物にＤＮＡ損傷抑制効果があることは知られていない。【０００３】
【特許文献１】特開２００６−６２９８１号公報
【特許文献２】ＷＯ０２／０２０４７７号公報
【特許文献３】ＷＯ９４／４５０４号公報
【特許文献４】特開平１１−１８０８９１号公報
【特許文献５】特開平９−８７１８７号公報
【特許文献６】特開２００３−６３９８３号公報
【特許文献７】特開２００６−１９３４７２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、アポトーシス抑制剤、ＤＮＡ障害抑制剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）スイートピー抽出物を含有するアポトーシス抑制剤。
（２）スイートピー抽出物を含有するＤＮＡ損傷抑制剤。
（３）スイートピー抽出物を含有する紫外線障害抑制剤
（４）スイートピー抽出物を含有するＤＮＡ損傷修復促進剤。
（５）スイートピー抽出物を含有する突然変異抑制剤。
（６）スイートピーの花から抽出した抽出物を含有するアポトーシス抑制剤。
（７）スイートピーの花から抽出した抽出物を含有するＤＮＡ損傷抑制剤。
（８）スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する紫外線障害抑制剤。
（９）スイートピーの花から抽出した抽出物を含有するＤＮＡ損傷修復促進剤。
（１０）スイートピーの花から抽出した抽出物を含有する突然変異抑制剤。
本発明は、スイートピー抽出物からなるアポトーシス抑制剤、ＤＮＡ障害抑制剤、ＤＮＡ損傷修復促進剤、突然変異抑制剤又は紫外線障害抑制剤であり、スイートピー植物体、特に、花からの抽出物が有効である。
【発明の効果】
【０００６】
アポトーシス抑制、ＤＮＡ障害抑制、ＤＮＡ損傷修復促進、突然変異抑制及び紫外線障害抑制の有効成分としてスイートピー抽出物を提供することができる。特に、花の抽出物に効果があることが確認できた。更に又、紫外線などの光によるダメージに対する防御又は修復効果があることが確認できた。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】TUNNEL染色（アポトーシス）試験の結果を示すグラフ。「ＳＥ」はスイートピーエキスの略。スイートピーエキスのアポトーシス抑制効果を示すグラフである。
【図２】Thymine Dimer染色（DNA損傷）試験の結果を示すグラフ。「ＳＥ」はスイートピーエキスの略。スイートピーエキスのＤＮＡ障害抑制効果を示すグラフである。
【図３】紫外線を照射した細胞の生存率を示すグラフ。スイートピーエキスによる細胞生存率の向上を示すグラフである。
【図４】スイートピーエキスのシクロブタン型ダイマー（ＣＰＤ）DNA損傷の修復率を示すグラフである。
【図５】紫外線照射によるＤＮＡ損傷修復の試験の結果を表すグラフ。「ＳＥ」はスイートピーエキスの略。スイートピーエキスのＤＮＡ損傷修復促進効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
スイートピー（Lathyrus odoratus L.）は、マメ科レンリソウ属の植物であり、別名、麝香蓮理草、麝香豌豆とも呼ばれる。主に観賞用に用いられる地中海を原産とする園芸品種である。花の色は白、ピンク、青、紫等があり、芳香がある。
スイートピー抽出物については、その植物の全草又は花、茎、葉、根、種子のうちの一つ以上を常温又は加温下にて溶剤に浸漬して抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出することにより得られる。さらにクロマトグラフィー等を用いて成分を精製しても良い。老化の予防、改善効果により優れる抽出物を得るためには、抽出部位は花が特に好ましい。花びら、がく片、雄しべ、雌しべを含む花全体から抽出しても良く、花びらのみ選択的に採取し、花びらから抽出しても良い。スイートピー抽出物は各種溶剤抽出液、その希釈液、その濃縮液又は抽出液を乾燥や凍結乾燥して得られる乾燥末あるいはペーストの形態で使用することができる。【０００９】
スイートピー抽出物を得るために用いられる抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。例えば、水、アルコール類のメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等、多価アルコール類のプロピレングリコール、ブチレングリコール等、ケトン類のアセトン、メチルエチルケトン等、エステル類の酢酸メチル、酢酸エチル等、鎖状及び環状エーテル類のテトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等、ポリエーテル類のポリエチレングリコール等、ハロゲン化炭化水素類のジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等、炭化水素類のヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等、芳香族炭化水素類のベンゼン、トルエン等、ピリジン類等が挙げられ、これらは２種以上を混合して用いることもできる。
上記の抽出溶剤の中でも、アポトーシス抑制効果又はＤＮＡ障害抑制効果又はＤＮＡ損傷修復促進効果又は突然変異抑制効果あるいは紫外線障害抑制効果に優れる抽出物を得るためには水または水溶性有機溶剤が好ましい。水溶性有機溶剤としてはメタノール、エタノール、プロパノール、２−プロパノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、アセトン等が挙げられる。【００１０】
スイートピー抽出物からなるアポトーシス抑制剤、ＤＮＡ損傷抑制剤、ＤＮＡ損傷修復剤、突然変異抑制剤あるいは紫外線障害抑制剤とすることができる。あるいは、スイートピー抽出物を含有するアポトーシス抑制剤、ＤＮＡ損傷抑制剤、ＤＮＡ損傷修復剤あるいは紫外線障害抑制剤とすることができる。
本発明のアポトーシス抑制剤、ＤＮＡ損傷抑制剤、ＤＮＡ損傷修復剤、突然変異抑制剤あるいは紫外線障害抑制剤は医薬、食品、医薬部外品に配合して使用することができる。また、経口投与、皮膚外用等の非経口投与のいずれも可能である。
以下に本発明を実施例に基づき、さらに具体的に説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。【００１１】
〔抽出液１〕
スイートピーの花びら（紫色）４５．９ｇと蒸留水４５９ｇを瓶に入れ、９０〜１００℃の湯煎中で３０分加熱した。冷却後、ガーゼで搾り取り、さらに３０００ｒｐｍ×１０分間、遠心分離した。上清を湯煎温度約６５℃のロータリーエバポレータで濃縮し、水を加えて４５．９ｇに定容した。抽出液中の可溶性固形分は４．８７％であった。【００１２】
〔抽出液２〕
抽出液１をロータリーエバポレータで濃縮し、５倍の濃度の濃縮液を得た。可溶性固形分の濃度は２４．４％である。【００１３】
〔抽出液３〕
スイートピーの茎１４８．２ｇと蒸留水７４１ｇを瓶に入れ、９０〜１００℃の湯煎中で６０分加熱した。冷却後、ガーゼで搾り取り、さらに３０００ｒｐｍ×１０分間、遠心分離した。上清を湯煎温度約６５℃のロータリーエバポレータで濃縮し、水を加えて２９．６ｇに定容した。抽出液中の可溶性固形分は１３．６％であった。【００１４】
〔アポトーシス阻害試験及びＤＮＡ損傷抑制試験〕
3次元皮膚モデルTOYOBO  LSE-high  （LSE-003）（東洋紡績社製）を精製水で０．２％、１．０％、５．０％に希釈した前記抽出液２及びブランクとして精製水各１００μlに曝露した。24時間後に培地を回収、検体を除去し、PBS(-)で洗浄後、PBS(-)100μlに置き換え、UVB200mJ/cm2を照射した。PBS(-)を検体に置き換え、新しい培地中で24時間培養し、TUNNEL染色、Thymine Dimerの染色を行った。
ホルマリン固定、パラフィン包埋した組織を用い、5μmの切片を作成し、染色に用いた。TUNEL染色はIn situ Apoptosis Detection Kit  (Takara)を用いて行った。Thymine DimerはProteinase  K処理、マイクロウェーブ処理後、1次抗体として100倍希釈したMonoclonal anti-Thymine dimmer clone H3  (Sigma)を、2次抗体として100倍希釈したRabbit anti-mouse Immunoglobulin-FITC (DAKO)を用いた。TUNNEL染色、Thymine Dimer染色ともに核が染色されるため、陽性像は緑色蛍光の点状に見える。尚、角層が全体的に緑色蛍光を発する場合があるが、これはアポトーシスやＤＮＡ損傷を反映するものではなく、陽性像とはみなさない。【００１５】
（TUNEL染色（アポトーシス）の結果）
TUNEL染色（アポトーシス）の結果、ブランクとして精製水に曝露した3次元皮膚モデルではUVB照射により基底層からその上部にかけて陽性像が確認され、今回用いた線量でアポトーシスが起こっていることが画像解析の結果確認できた。陽性像の計数値（平均値）を表１、図１に示す。【００１６】
【表１】
2008120551.tif 000003
【００１７】
抽出液２を０．２％の抽出液２に曝露しても影響がみられなかったが、１．０％、５．０％の抽出液２に曝露するとTUNEL陽性細胞が明らかにに減少し、抽出液２がUVBによるアポトーシスを抑制することが確認された。【００１８】
（Thymine Dimer染色（DNA損傷）の結果）
Thymine Dimer染色（DNA損傷）の結果、ブランクではUVB照射により基底層からその上部にかけて陽性像が確認され、今回用いた線量でDNA損傷が起こっていることが画像解析の結果確認できた。陽性像の計数値（平均値）を表２、図２に示す。【００１９】
【表２】
2008120551.tif 000004
【００２０】
０．２％、１．０％の抽出液２に曝露した結果、陽性像が明らかに減少し、５．０％の抽出液２に曝露すると陽性像が殆ど認められず、抽出液２がUVBによるDNA損傷を抑制することが確認された。【００２１】
〔紫外線照射による細胞死の抑制効果〕
HaCaT細胞を35mmディッシュにて2日間培養後、培地をPBS(-)に置換し、10 mＪ/cm2のUVBを照射した。照射後、直ちに前記「抽出液１」を０．１％含む培地及び「抽出液１」を含まない培地に交換し、さらに3日間培養した後、PBS(-)で洗浄し、ニュートラルレッド含有培地に交換し、3時間培養した。PBS(-)で洗浄後、1%酢酸含有50%エタノール溶液でニュートラルレッドの抽出を行い、細胞量の指標として570nmにおける吸光度を測定した。
HaCaT細胞を35mmディッシュにて2日間培養後、培地をPBS(-)に置換し、UVBを照射せずに、直ちに前記「抽出液１」を含まない培地に交換し、さらに3日間培養した後、PBS(-)で洗浄し、ニュートラルレッド含有培地に交換し、3時間培養した。PBS(-)で洗浄後、1%酢酸含有50%エタノール溶液でニュートラルレッドの抽出を行い、細胞量の指標として570nmにおける吸光度を測定した。この紫外線を照射していない細胞の生存率を１００％とした。
紫外線を照射した細胞の生存率（ｘ）を次式により算出した。結果を表３、図３に示す。
（ｘ）＝570nm吸光度（紫外線照射）／570nm吸光度（紫外線非照射）×100（％）【００２２】
【表３】
2008120551.tif 000005
【００２３】
この結果、抽出液１無添加では生存率が５６％であるところ、０．１％添加では７９％であり、無添加を１００％とすると１４１％になり、４０％以上向上することが認められる。スイートピー抽出液の紫外線障害抑制効果を確認できた。【００２４】
〔紫外線照射によるＤＮＡ損傷修復の促進確認〕
10%FBSを含むDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）にて表皮角化細胞(HaCaT)を35mmのディッシュに播種し、48時間培養後に、抽出液１を0%、0.3%、1%含む培地に交換した。
さらに24時間培養後、培地を除去、PBS(-)で洗浄し、PBS(-)1mlを加えUVB10mJ/cm2を照射した。
その後、PBS(-)を吸引し、DMEMに交換しさらに培養した。
培養0、2、24時間後にQIAamp DNA Blood Mini Kit を用いDNAを抽出し、分光光度計でDNA量を正確に定量した後(260nmの吸光度1.0が50μg／mlに相当)、DNA溶液を密閉して100℃で10分加熱、氷水中で15分間冷却し、DNAを１本鎖とし、96穴硫酸プロタミン付着マイクロタイタープレートに分注入し、37℃の恒温器に16時間以上放置し、DNA10 ng /well乾燥固着させた。96穴硫酸プロタミン付着マイクロタイタープレートは硫酸プロタミン水溶液をプレートのウェルに分注し、37℃で一晩インキュベートして乾燥付着させたものである。【００２５】
以下、ELIZA法によるシクロブタン型ダイマーの分析手順を示す。DNAを固着させたプレートをPBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、2%FBS（牛胎児血清）／PBS(-)溶液を加えて37℃で60分間インキュベートして抗体の非特異的吸着部位をブロックした。PBS(-)・0.05% 
Tween 20で洗浄し、一次抗体として0.05% TDM-2(シクロブタン型ダイマーを特異的に認識するマウス由来モノクローナル抗体) (D194-1, MBL)／PBS(-)溶液を100μl加え、37℃で30分間反応させた。
PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、2次抗体として0.02% Biotin-F(ab')2 fragment of Goat anti-mouse IgG(H+L) (710-1632, Rockland, コスモ・バイオ)／PBS(-)溶液を100μl加え、37℃で30分間反応させた。
PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、0.01% Peroxidase-Streptavidin (43-4323, Zymed, コスモ・バイオ)／PBS(-)溶液を100μl加え37℃で30分間反応させた。
PBS(-)・0.05%  Tween 20、次いでクエン酸・リン酸バッファー（pH5.0）で洗浄し、基質溶液(o-Phenylene diamine 0.4 mg/ml,  H2O2  0.02 %,  クエン酸・リン酸バッファー(pH5.0)に溶解)を100μl加え37℃で30分間反応させた。2M硫酸を50μl添加し、反応を停止した。
96穴マイクロプレート用光度計を用いて492nmにおける吸光度を測定し、これをシクロブタン型ダイマー量の指標とした。
また、紫外線未照射の場合の吸光度をO.D.(C1)、紫外線照射後0時間の吸光度をO.D.(C2)、一定時間後の吸光度をO.D.(S)として以下の式によりDNA修復率を算出した。
修復率(%)=100-[(O.D.(S)-O.D.(C1))/(O.D.(C2)-O.D.(C1))]*100
結果を表４及び図４に示す。【００２６】
【表４】
2008120551.tif 000006
【００２７】
結果
抽出液１を1%添加することにより、シクロブタン型ダイマー（ＣＰＤ）の修復率が増加したことから、スイートピーエキスにDNA修復促進能があることがわかった。【００２８】
〔紫外線照射による突然変異に対する抑制確認〕
（突然変異試験）
スイートピー花抽出物（抽出液 1 を凍結乾燥して得た固形分）の紫外線誘発突然変異に対する抑制効果を、サルモネラ・ティフィムリウム TA 102（以下 「TA102」 と略す）菌株を用いたエームズ法（エームズ等、ミューテーション  リサーチ．，Ａmes．B．N．et al．，Mutation Res ．，31 巻， 347 頁， 1975 年）によって測定した。【００２９】
（１）測定試料の調製
スイートピー花抽出物（抽出液 1 の凍結乾燥物（抽出液固形分））をジメチルスルホオキサイド（以下 DMSO と略す）に任意の濃度となるように溶解し、測定試料を調製した。
（２）突然変異原性試験法
直径 35mm のシャーレに 100mM リン酸ナトリウム緩衝溶液（ pH7.4） 2mｌとＴ A102 株の前培養液 0.4ｍｌ（あらかじめ 100mM リン酸ナトリウム緩衝溶液（ pH7.4） にて洗浄した。）を添加した後、中央値 254nmの紫外線として殺菌灯（ SANKYODENKI． GE RM 1 CＩDAL  LAMP  GT15  T８ ） 15W を用い、 24J / m2照射した。（ただし、コントロールは未照射。）照射後直ちに、（１）の項で調製した測定試料 0.4ｍｌを添加した。（ただし、コントロールは DMSＯのみ添加した。）この溶液を 0.7ｍｌずつ3 本の試験管に分取した後、それぞれに 2ｍｌの軟寒天を加えて、最小グルコース寒天平板培地に重層固化し、 37℃にて2日間培養した。培養後、プレート上の復帰変異コロニー数をカウントした。突然変異していない（突然変異が抑制された） TA102 株は最小グルコース寒天平板培地でコロニーを形成しない。【００３０】
突然変異抑制効果の評価は、変異原及び試料を加えた系でカウントしたプレート当たりのコロニー数（ A ）、変異原のみのコロニー数（ B ）、 DMSOのみの自然復帰コロニー数（ C ）をもとに次式により突然変異率を算出することによって行った。
突然変異率（ % ）＝  [ ( A − C )／ ( B − C )] × 100
【００３１】
結果
下記の表５に、スイートピー花抽出物の短波長紫外線（ 24J / m2 ）に対する紫外線誘発突然変異抑制効果をそれぞれ示した。【００３２】
【表５】
2008120551.tif 000007
【００３３】
表５に示すように変異原のみの場合の突然変異率を 100 ％とした場合、試料添加量の増大と共に突然変異率の減少が認められた。従って、これらのスイートピー花抽出物の紫外線に対する突然変異抑制効果が認められた。【００３４】
〔紫外線照射によるＤＮＡ損傷修復の促進確認（ＵＶＢ照射後にスイートピー花抽出物を添加）〕
10%FBSを含むDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地）にて表皮角化細胞(HaCaT)を35mmのディッシュに播種し、72時間培養後に、UVB10mJ/cm2を照射した。次いで、スイートピー花抽出物（抽出液 1 を凍結乾燥して得た固形分）を0mg/mL、0.02 mg/mL、0.1 mg/mL含む培地に交換した。
培養0、2、24時間後にQIAamp DNA Blood Mini Kit を用いDNAを抽出し、分光光度計でDNA量を正確に定量した後(260nmの吸光度1.0が50μg／mlに相当)、DNA溶液を密閉して100℃で10分加熱、氷水中で15分間冷却し、DNAを１本鎖とし、96穴硫酸プロタミン付着マイクロタイタープレートに分注入し、37℃の恒温器に16時間以上放置し、DNA200 ng /well乾燥固着させた。96穴硫酸プロタミン付着マイクロタイタープレートは硫酸プロタミン水溶液をプレートのウェルに分注し、37℃で一晩インキュベートして乾燥付着させたものである。【００３５】
以下、ELIZA法による（６−４）型ダイマーの分析手順を示す。DNAを固着させたプレートをPBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、2%FBS（牛胎児血清）／PBS(-)溶液を加えて37℃で60分間インキュベートして抗体の非特異的吸着部位をブロックした。PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、一次抗体として0.05% 64M-2(6-4)型ダイマーを特異的に認識するマウス由来モノクローナル抗体(D195-1, MBL社製)／PBS(-)溶液を100μl加え、37℃で30分間反応させた。
PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、2次抗体として0.02% Biotin-F(ab')2 fragment of Goat anti-mouse IgG(H+L) (710-1632, Rockland, コスモ・バイオ)／PBS(-)溶液を100μl加え、37℃で30分間反応させた。
PBS(-)・0.05%  Tween 20で洗浄し、0.01% Peroxidase-Streptavidin (43-4323, Zymed, コスモ・バイオ)／PBS(-)溶液を100μl加え37℃で30分間反応させた。
PBS(-)・0.05%  Tween 20、次いでクエン酸・リン酸バッファー（pH5.0）で洗浄し、基質溶液(o-Phenylene diamine 0.4 mg/ml,  H2O2  0.02 %,  クエン酸・リン酸バッファー(pH5.0)に溶解)を100μl加え37℃で30分間反応させた。2M硫酸を50μl添加し、反応を停止した。
96穴マイクロプレート用光度計を用いて492nmにおける吸光度を測定し、これを（６−４）型ダイマー量の指標とした。
また、紫外線未照射の場合の吸光度をO.D.(C1)、紫外線照射後0時間の吸光度をO.D.(C2)、一定時間後の吸光度をO.D.(S)として以下の式によりDNA修復率を算出した。
修復率(%)=100-[(O.D.(S)-O.D.(C1))/(O.D.(C2)-O.D.(C1))]*100
結果を表６及び図５に示す。【００３６】
【表６】
2008120551.tif 000008
【００３７】
結果
表皮角化細胞にＵＶＢを照射して、ＤＮＡを損傷させた後で、スイートピー花抽出物を添加した培地を用いて培養することにより、（６−４）型ダイマーの修復率が有意に増加した。従って、スイートピーエキスにＤＮＡ修復促進能があると言える。【００３８】
[処方例１]
＜錠剤＞
常法に従って、下記の組成の錠剤を製造した。
2008120551.tif 000009
【００３９】
[処方例２]
＜外用剤＞
2008120551.tif 000010
［製法］Ａに属する水相成分とＢに属する油相成分をそれぞれ加熱溶解し、油相成分を水相成分に混合し、乳化機にて乳化する。冷却後、Ｃに属する成分を混合して得た。
【図１】
2008120551.tif 000011
【図２】
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【図３】
2008120551.tif 000013
【図４】
2008120551.tif 000014
【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年2月6日(2009.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
スイートピーの花から熱水抽出した可溶性固形分０．２４４重量％以上を含有するアポトーシス抑制剤。
【請求項２】
スイートピーの花から熱水抽出した可溶性固形分１．２２重量％以上を含有するＤＮＡ損傷抑制剤。
【請求項３】
スイートピーの花から熱水抽出した可溶性固形分０．００４８７重量％以上を含有する紫外線障害抑制剤。
【請求項４】
スイートピーの花から熱水抽出した可溶性固形分０．０４８７重量％以上を含有するＤＮＡ損傷修復促進剤。
【請求項５】
スイートピーの花から熱水抽出した抽出物を含有する突然変異抑制剤。
【請求項６】
スイートピーの花から熱水抽出した可溶性固形分０．１ｍｇ／ｍｌ以上を含有するＤＮＡ損傷修復促進剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）スイートピーの花から熱水抽出した可溶性固形分０．２４４重量％以上を含有するアポトーシス抑制剤。
（２）スイートピーの花から熱水抽出した可溶性固形分１．２２重量％以上を含有するＤＮＡ損傷抑制剤。
（３）スイートピーの花から熱水抽出した可溶性固形分０．００４８７重量％以上を含有する紫外線障害抑制剤。
（４）スイートピーの花から熱水抽出した可溶性固形分０．０４８７重量％以上を含有するＤＮＡ損傷修復促進剤。
（５）スイートピーの花から熱水抽出した抽出物を含有する突然変異抑制剤。
（６）スイートピー花から熱水抽出した可溶性固形分０．１ｍｇ／ｍｌ以上を含有するＤＮＡ損傷修復促進剤。
本発明は、スイートピー抽出物からなるアポトーシス抑制剤、ＤＮＡ障害抑制剤、ＤＮＡ損傷修復促進剤、突然変異抑制剤又は紫外線障害抑制剤であり、スイートピー植物体、特に、花からの抽出物が有効である。
【国際調査報告】
2008120551.tif 000016
2008120551.tif 000017
2008120551.tif 000018
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