(57)【要約】  本発明は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、式（Ｉ）で示される色素及び式（ＩＩ）で示される色素（式（Ｉ）及び（ＩＩ）において、Ｘ-は、アニオンである）から選択される少なくとも１種の核酸染色色素とを含む幼若白血球の分析用試薬を提供する。2009001869.tif 0000202009001869.tif 000021
2009001869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、
損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2009001869.tif 000015
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素及び以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2009001869.tif 000016
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素から選択される少なくとも１種の核酸染色色素と
を含む幼若白血球の分析用試薬。
【請求項２】
前記界面活性剤が、少なくとも２種類の界面活性剤である請求項１に記載の分析用試薬。
【請求項３】
前記界面活性剤の少なくとも１種類が、ノニオン界面活性剤である請求項１に記載の分析用試薬。
【請求項４】
前記ノニオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤である請求項３に記載の分析用試薬。
【請求項５】
前記ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が、以下の式（ＩＩＩ）：
Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ （ＩＩＩ）
（式中、Ｒ1は炭素数９〜２５のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｒ2は−Ｏ−、−ＣＯＯ−又は
【化３】
2009001869.tif 000017
であり、ｎは１０〜４０の整数である）
で示されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤である請求項４に記載の分析用試薬。
【請求項６】
前記ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンオレイルエーテル又はポリオキシエチレンステアリルエーテルである請求項５に記載の分析用試薬。
【請求項７】
前記ポリオキシエチレンオレイルエーテルが、ｎが１５〜２０である式（ＩＩＩ）を有するポリオキシエチレンオレイルエーテルである請求項６に記載の分析用試薬。
【請求項８】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルとポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルとの組み合わせ、又はポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルとポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテルとの組み合わせである請求項１に記載の分析用試薬。
【請求項９】
前記可溶化剤が、サルコシン誘導体、コール酸誘導体、及びメチルグルカンアミドからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１に記載の分析用試薬。
【請求項１０】
ｐＨが５．０〜９．０である請求項１に記載の分析用試薬。
【請求項１１】
糖類をさらに含む請求項１に記載の分析用試薬。
【請求項１２】
糖類が、キシリトール、アラビノース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、リビトールからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１１に記載の分析用試薬。
【請求項１３】
アミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の分析用試薬。
【請求項１４】
前記アミノ酸が、バリン、プロリン、グリシン及びアラニンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１３に記載の分析用試薬。
【請求項１５】
赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤とを含む第１試薬、及び
以下の式（Ｉ）：
【化４】
2009001869.tif 000018
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素及び以下の式（ＩＩ）：
【化５】
2009001869.tif 000019
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素から選択される少なくとも１種の核酸染色色素を含む第２試薬
を含む幼若白血球の分析用試薬キット。
【請求項１６】
前記第１試薬が、少なくとも２種類の界面活性剤を含む請求項１５に記載の分析用試薬キット。
【請求項１７】
前記界面活性剤の少なくとも１種類が、ノニオン界面活性剤である請求項１５又は１６に記載の分析用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体から採取された試料中の白血球を分類し、計数するための試薬及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血球細胞は骨髄で産生され、未熟な細胞から分化して成熟し、末梢血に移行する。健常人の場合、幼若な白血球（幼若白血球）が末梢血に出現することはない。一方、白血病、癌の骨髄転移、多発性骨髄腫、重症感染症などの患者の末梢血には、幼若白血球が出現することがある。このため、生体試料中の成熟白血球や幼若白血球を分類して測定することは、これらの疾患を診断する上で極めて重要である。【０００３】
幼若白血球を測定するための試薬として、特開平１０−２０６４２３号（特許文献１）に開示される試薬が知られている。この試薬と生体試料とを混合した測定試料をフローサイトメータに導入し、特定の波長の光を照射して得られる光学的情報に基づいて検体中の成熟白血球と幼若白血球とを分類し、それぞれを計数することができる。また、幼若白血球を、骨髄芽球、幼若顆粒球などに細分類してそれぞれを計数することも可能である。
【特許文献１】特開平１０−２０６４２３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、従来の試薬を用いる血球分析では、分類すべき幼若白血球のうち骨髄芽球のシグナル領域と、溶血した赤血球の破片（赤血球ゴースト）のシグナル領域とが、一部重複することがある。その結果、骨髄芽球と赤血球の破片とがスキャッタグラムにおいて重なる領域に検出され、骨髄芽球が実際よりも多く検出される。たとえば、多発性骨髄腫、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、糸球体腎炎、胸膜炎などの特定の疾患に罹患した患者の末梢血には骨髄芽球が含まれていない。しかし、従来の分析試薬を用いてこれらの患者の血液試料を分析すると、赤血球の破片のシグナルが骨髄芽球のシグナルとして誤って認識され、正確な血球分析結果を得ることができなかった。これは、このような特定の患者からの試料に含まれる赤血球が、健常な人やこれらの疾患以外の疾患の患者の試料中の赤血球とは異なり、うまく溶血されないことが原因ではないかと考えられる。末梢血中に実際よりも多い量の骨髄芽球が検出されると、正しい診断及び治療がなされない恐れがある。なお、本明細書において、「赤血球ゴースト」とは、血液試料と血液分析用試薬との反応の結果、ヘモグロビンを喪失したが、十分収縮しなかった赤血球を意味する。【０００５】
そこで、このような特定の疾患の患者から採取した血液試料であっても、より正確な幼若白血球の分類及び計数を行うことができる試薬を提供することを本発明の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
このような問題を解決するために研究を重ねた結果、本発明者らは、以下の式（Ｉ）：
【化１】
2009001869.tif 000003
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素及び以下の式（ＩＩ）：【０００７】
【化２】
2009001869.tif 000004
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素から選択される少なくとも１つの核酸染色色素を含む試薬を用いることにより、上記の課題を解決できることを見出した。【０００８】
よって、本発明の１つの側面は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、
損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、
上記の式（Ｉ）で示される色素及び式（ＩＩ）で示される色素から選択される少なくとも１つの核酸染色色素と
を含む幼若白血球の分析用試薬である。【０００９】
また、本発明の１つの側面は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤とを含む第１試薬、及び
上記の式（Ｉ）で示される色素及び式（ＩＩ）で示される色素から選択される少なくとも１つの核酸染色色素を含む第２試薬
を含む幼若白血球の分析用試薬キットである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の幼若白血球の分析用試薬及び試薬キットを用いることにより、多発性骨髄腫、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、糸球体腎炎、胸膜炎などの特定の疾患に罹患した患者の生体試料であっても、従来の試薬に比べてより正確な幼若白血球及び成熟白血球の分類及び計数を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の試薬又は試薬キットを用いて幼若白血球の分析を行う際に用いることができるフローサイトメータの一例を示す模式図である。
【図２】実施例３で得られたスキャッタグラムを表す。
【図３】実施例４で得られたスキャッタグラムを表す。
【図４】実施例５で得られたスキャッタグラムを表す。
【図５】実施例６で得られたスキャッタグラムを表す。
【図６】実施例７で得られたスキャッタグラムを表す。
【符号の説明】
【００１２】
６    ノズル
２１  光源
２２  コリメートレンズ
２３  フローセル
２４  集光レンズ
２５  ピンホール板
２６  前方散乱光検出器
２７  集光レンズ
２８  ダイクロックミラー
２８’  フィルター
２９  側方散乱光検出器
３０  ピンホール板
３１  側方蛍光検出器
３２、３３、３４  アンプ
３５  解析部
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本実施形態の幼若白血球の分析用試薬（以下、「試薬」ともいう）を用いると、生体試料に含まれる白血球を成熟白血球と幼若白血球とに分類し、それぞれを計数することができる。また、成熟白血球をリンパ球、単球、顆粒球などの少なくとも２種以上に分類し、それぞれを計数することができる。さらに、この試薬を用いると、幼若白血球を幼若顆粒球と骨髄芽球とに細分類し、それぞれを精度良く計数することもできる。【００１４】
本明細書において、「幼若白血球」とは、健常人において末梢血には存在せず骨髄に存在する未成熟な白血球のことを指す。幼若白血球としては、例えば、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球などが挙げられる。前骨髄球、骨髄球及び後骨髄球をまとめて「幼若顆粒球」と称することもある。骨髄芽球は、骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＮ）、好中球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、好酸球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＥＯＳ）などの白血球系の造血前駆細胞を含む。【００１５】
本実施形態の試薬を用いて分析する生体試料としては、白血球を含む試料であれば特に限定されず、血液、尿、骨髄穿刺液、アフェレーシスで採取した試料などを例示することができる。【００１６】
本実施形態の試薬は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、上記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で表される色素から選択される核酸染色色素とを含む。
生体試料と試薬とを混合すると、界面活性剤の作用により試料に含まれる血球の細胞膜が損傷を受ける。この界面活性剤は、赤血球や成熟白血球の細胞膜に損傷を与えやすく、幼若白血球の細胞膜は実質的に損傷しにくい。赤血球や成熟白血球などの損傷した血球は、可溶化剤の作用により収縮する。一方、幼若白血球の細胞膜はほとんど損傷されにくいので、赤血球や成熟白血球よりも可溶化剤による細胞の収縮が起こりにくい。損傷を受けた血球のうち、白血球の核は、核酸染色色素の作用により強く染色されやすい。しかし、損傷を受けていない幼若白血球は染色されにくい。また、赤血球は核を持たないので、上記の核酸染色色素によっては染色されにくい。よって、幼若白血球、成熟白血球、赤血球をそれぞれ弁別できる。【００１７】
今回、上記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の色素から選択される少なくとも１種の核酸染色色素を含む試薬を用いることにより、多発性骨髄腫、胆管癌、腹膜炎、糖尿病、糸球体腎炎、胸膜炎などの特定の疾患の患者からの生体試料であっても、赤血球の破片と測定すべき血球とを、明確に区別できることがわかった。また、骨髄芽球を含む血液試料を用いた場合でも、骨髄芽球と赤血球の破片とをより明確に弁別できることがわかった。また、この試薬は、上記の特定の疾患以外の疾患に罹患している患者からの生体試料であっても、従来の試薬と同様に幼若白血球と成熟白血球とを明確に区別することができる。【００１８】
上記の核酸染色色素の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）において、Ｘ-のアニオンとしては、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ4-、ＢＣｌ4-、ＢＢｒ4-等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環ハロゲン若しくはハロゲンを有するアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオンなどが挙げられる。これらのうちヨウ素イオンが好ましい。【００１９】
上記の色素の試薬中の濃度は、０．０１〜５００ｐｐｍが好ましく、より好ましくは０．１〜２００ｐｐｍである。【００２０】
赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤は、少なくとも２種類の界面活性剤が好ましい。より好ましくは、２種類の界面活性剤を用いることである。２種以上の界面活性剤を用いることにより、幼若白血球及び成熟白血球の弁別をより明確に行うことができる。【００２１】
上記の界面活性剤の少なくとも１種類は、ノニオン界面活性剤が好ましい。より好ましくは、用いる界面活性剤の全種類がノニオン界面活性剤である。該ノニオン界面活性剤は、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましく、以下の式（ＩＩＩ）：
Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ （ＩＩＩ）
（式中、Ｒ1は炭素数９〜２５のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｒ2は−Ｏ−、−ＣＯＯ−又は
【化３】
2009001869.tif 000005
であり、ｎは１０〜４０の整数である）
で示されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤がより好ましい。【００２２】
上記の式（ＩＩＩ）で表される界面活性剤としては、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）セチルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテルなど挙げられる。【００２３】
本実施形態の試薬に用いられる界面活性剤は、ポリオキシエチレンオレイルエーテル及びポリオキシエチレンステアリルエーテルが好ましく、特に、少なくとも１種類はポリオキシエチレンオレイルエーテルであることが好ましい。また、該ポリオキシエチレンオレイルエーテル及びポリオキシエチレンステアリルエーテルは、ｎが１５〜２０の式（ＩＩＩ）を有するものがより好ましい。さらに好ましくは、上記のポリオキシエチレンオレイルエーテルは、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル又はポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルである。上記の界面活性剤の組み合わせとしては、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルとポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルとの組み合わせ、又はポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルとポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテルとの組み合わせを例示することができる。【００２４】
試薬中の界面活性剤の濃度は、界面活性剤の種類に応じて適宜選択できる。好ましくは、１種又は複数の界面活性剤の試薬中の濃度は、合計で５００〜５００００ｐｐｍであり、３５００〜３５０００ｐｐｍがより好ましい。界面活性剤の少なくとも１種がポリオキシエチレンオレイルエーテルである場合、１種又は複数の界面活性剤の試薬中の濃度は、合計で５００〜５００００ｐｐｍが好ましく、３５００〜３５０００ｐｐｍがより好ましい。
上記の界面活性剤としてポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルとポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルとを用いる場合、試薬中のこれらの濃度が合計で５００〜５００００ｐｐｍが好ましく、３５００〜３５０００ｐｐｍがより好ましい。【００２５】
複数の界面活性剤を用いる場合、これらの界面活性剤の混合比は、界面活性剤の水酸基価に応じて適宜選択できる。例えば、水酸基価６４．８のポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルと水酸基価５２．４のポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルとを用いる場合、混合比は１：１が好ましい。
複数種の界面活性剤を用い、かつその少なくとも１種類がポリオキシエチレンオレイルエーテルである場合、該ポリオキシエチレンオレイルエーテルは、複数の界面活性剤の合計量の５０％を超える量で用いることが好ましい。このことにより、幼若白血球と成熟白血球との弁別をより明確に行うことができる。【００２６】
上記の可溶化剤としては、例えばサルコシン誘導体、コール酸誘導体、メチルグルカンアミドなどが挙げられる。これらから選択される１種又は複数種を用いることができる。
サルコシン誘導体としては、以下の構造式に示すサルコシン誘導体及びその塩を含む。具体的には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサルコシンなどが挙げられる。コール酸誘導体としては、以下の構造式に示すコール酸及びその塩を含む。具体的には、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）などが挙げられる。メチルグルカンアミドとしては、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）などが挙げられる。【００２７】
サルコシン誘導体は、次の構造式を有する。
【化４】
2009001869.tif 000006
（式中、Ｒ1はＣ10-22のアルキル基であり、ｎは１〜５である。）【００２８】
コール酸誘導体は、次の構造式を有する。
【化５】
2009001869.tif 000007
（式中、Ｒ1は水素原子又は水酸基である。）【００２９】
メチルグルカンアミドは、次の構造式を有する。
【化６】
2009001869.tif 000008
（式中、ｎは５〜７である。）【００３０】
可溶化剤の試薬中の濃度は、用いる可溶化剤の種類に応じて適宜選択できる。
可溶化剤としてサルコシン誘導体を用いる場合、試薬中の可溶化剤の濃度は５０〜３０００ｐｐｍであることが好ましい。コール酸誘導体を用いる場合、１００〜１００００ｐｐｍであることが好ましい。メチルグルカンアミドを用いる場合、１０００〜８０００ｐｐｍであることが好ましい。【００３１】
また、可溶化剤としては、ｎ−オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレート、Ｎ−ホルミルメチルロイシルアラニンなどを用いることもできる。これらを用いる場合、試薬中の濃度は１０〜５００００ｐｐｍであることが好ましい。可溶化剤は単独で用いてもよいし、２種類以上の可溶化剤を併用してもよい。【００３２】
試薬の浸透圧は、特に限定されないが、１０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇが好ましい。試薬の浸透圧は、糖類、アミノ酸、塩化ナトリウムなどを加えることにより適宜調整できる。また、緩衝剤の濃度を調節することによっても調整できる。
糖類としては、特に限定されないが、単糖類（例えばグルコース、フルクトースなど）、多糖類（例えばアラビノースなど）、糖アルコール（例えばキシリトール、ソルビトール、マンニトール、リビトールなど）などが挙げられる。糖類は、キシリトール、アラビノース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、リビトールからなる群より選択される少なくとも１種を用いることがより好ましい。【００３３】
試薬中の糖類の濃度は、所望の浸透圧に応じて適宜選択できる。例えばキシリトールを用いる場合、試薬中に０〜７５ｇ／Ｌが好ましく、より好ましくは２０〜５０ｇ／Ｌである。【００３４】
上記のアミノ酸としては、バリン、プロリン、グリシン、アラニンなどが挙げられる。アミノ酸は、バリン、プロリン、グリシン及びアラニンからなる群より選択される少なくとも１種を用いることが好ましく、グリシン及びアラニンの何れか又は両方を用いることがより好ましい。【００３５】
試薬中のアミノ酸の濃度は、所望の浸透圧に応じて適宜選択できる。例えばグリシンを用いる場合、試薬中に０〜５０ｇ／Ｌが好ましく、１０〜３０ｇ／Ｌがより好ましい。【００３６】
本実施形態の試薬は、上記のように、浸透圧を調整するために、塩化ナトリウムを含んでもよい。しかしながら、試薬に塩化ナトリウムが多量に含まれていると、試薬と生体試料の混合後、反応時間が経過するほど、或いは反応温度が高いほど幼若白血球のうちの骨髄芽球の損傷が促進され、骨髄芽球の核が色素で染色される。骨髄芽球が染色されると、検出される蛍光強度が成熟白血球の蛍光強度と同等となってしまい、成熟白血球と骨髄芽球の分類の精度が低下する。よって、試薬中の塩化ナトリウムの濃度は、測定に悪影響を及ぼさないように、０．０１〜３ｇ／Ｌであることが好ましく、０ｇ／Ｌである（含まれない）ことがより好ましい。【００３７】
本実施形態の試薬は、ｐＨが５．０〜９．０であることが好ましい。試薬のｐＨは、緩衝剤を添加して調整できる。緩衝剤としては、例えばＨＥＰＥＳなどのグッド緩衝剤、リン酸緩衝剤などと、水酸化ナトリウムなどのｐＨ調整剤を用いることができる。【００３８】
本実施形態の試薬は、上記の界面活性剤、可溶化剤及び核酸染色色素と、所望により任意の成分とを上記の濃度になるように適切な溶媒に溶解することにより得ることができる。上記の適切な溶媒としては、上記の成分を溶解できるものであれば特に限定されないが、水、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、これらの混液などが挙げられる。【００３９】
上記の界面活性剤、可溶化剤及び核酸染色色素は、上記のように単独の試薬として生体試料と混合して幼若白血球の分析を行うことができる。あるいは、界面活性剤と可溶化剤とを含む第１試薬、及び核酸染色色素を含む第２試薬とを含む試薬キットとして用いて、幼若白血球の分析に用いることもできる。
よって、本発明は、赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤とを含む第１試薬、及び上記の式（Ｉ）で示される色素及び式（ＩＩ）で示される色素から選択される少なくとも１種の核酸染色色素を含む第２試薬を含む幼若白血球の分析用試薬キットも提供する。【００４０】
上記の第１試薬中の界面活性剤及び可溶化剤の濃度は、第２試薬と混合したときに、上記の幼若白血球の分析用試薬について述べた濃度になるようなものであればよい。該第１試薬は、界面活性剤及び可溶化剤を上記のような適切な溶媒に溶解することにより得ることができる。【００４１】
上記の第２試薬中の核酸染色色素の濃度は、第１試薬と混合したときに、上記の幼若白血球の分析用試薬について述べた濃度になるようなものであればよい。第２試薬は、色素の保存安定性を向上させることができるので、核酸染色色素をエチレングリコールなどの有機溶媒に溶解したものが好ましい。【００４２】
上記の試薬及び試薬キットは、生体試料と混合して測定用試料を調製し、フローサイトメータに供することにより、幼若白血球の分析を行うことができる。生体試料と該試薬又は試薬キットの第１試薬及び第２試薬の合計との混合比（容量比）は、１：１０〜１：１０００が好ましい。
また、試薬キットにおいて、第１試薬と第２試薬との混合比（容量比）は、１０００：１〜１０：１程度が好ましい。【００４３】
上記の試薬キットを用いる場合、試薬キットの各試薬と生体試料とを混合する順序としては特に限定されないが、第１試薬及び第２試薬とを混合し、次いで生体試料を混合することが好ましい。【００４４】
上記の試薬又は試薬キットと生体試料との混合は、２０〜４０℃の温度において３〜１５秒間行うことが好ましい。反応温度が高いときは反応時間を短くし、反応温度が低いときは反応時間を長くすることができる。【００４５】
上記の分析にフローサイトメータを用いる場合、フローセル中を流れる測定試料中の血球に光を照射して散乱光や蛍光などの光学的情報を取得し、これに基づいて血球の種類及び数を測定できる。【００４６】
具体的には、上記の分析は、図１に示すようなフローサイトメータを用いて行うことができる。以下、図１に基づき、本実施形態の一例として骨髄芽球の測定について詳述する。
ノズル６から吐出された測定用試料は、フローセル２３のオリフィス部を流れる。このとき、試料中の血球は一列になってオリフィス部を通過する。光源２１から射出した光は、コリメートレンズ２２を介してフローセル２３を流れる血球に照射される。血球に光を照射することによって側方散乱光、側方蛍光及び前方散乱光が生じる。側方散乱光は、集光レンズ２７とダイクロックミラー２８とを介して側方散乱光検出器（フォトマルチプラアチューブ）２９に入射する。側方蛍光は、集光レンズ２７とダイクロックミラー２８とフィルター２８’とピンホール板３０とを介して側方蛍光検出器（フォトマルチプライアチューブ）３１に入射する。前方散乱光は、集光レンズ２４とピンホール板２５とを介して前方散乱光検出器（フォトダイオード）２６に入射する。【００４７】
前方散乱光検出器２６から出力される前方散乱光信号と、側方散乱光検出器２９から出力される側方散乱光信号と、側方蛍光検出器３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２、アンプ３３及びアンプ３４により増幅され、解析部３５に入力される。【００４８】
解析部３５は、受信した前方散乱光信号、側方散乱光信号及び側方蛍光信号から、前方散乱光強度、側方散乱光強度及び蛍光強度を算出する。解析部３５は、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第一の二次元分布図を作成し、この二次元分布図上で試料中の全白血球が出現する領域（全白血球領域）を特定する。さらに、全白血球領域に出現する細胞について側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第二の二次元分布を作成する。この二次元分布図上で、成熟白血球が出現する領域（成熟白血球領域）、リンパ球が出現する領域（リンパ球領域）、単球が出現する領域（単球領域）、顆粒球が出現する領域（顆粒球領域）を設定する。さらに、骨髄芽球が出現する領域（骨髄芽球領域１）及び幼若顆粒球が出現する領域（幼若顆粒球領域）を特定する。【００４９】
次に、側方散乱光強度及び前方散乱光強度を二軸とする第三の二次元分布を作成し、この二次元分布上で骨髄芽球が出現する領域（骨髄芽球領域２）を特定する。骨髄芽球領域１及び骨髄芽球領域２に出現する細胞数を試料に含まれる骨髄芽球数として計数し、幼若顆粒球領域に出現する細胞数を試料に含まれる幼若顆粒球数として計数する。なお、骨髄芽球は細胞サイズが大きく、単核であるため、前方散乱光強度が強く、側方散乱光強度が弱い。また、上述したようにほとんど染色されないので蛍光強度が弱い。幼若顆粒球は、細胞サイズが大きく、核が分葉しているので、前方散乱光強度及び側方散乱光強度が強い。また、上述したようにほとんど染色されないので蛍光強度が弱い。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例により限定されるものではない。
（実施例１）
以下の組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。
＜第１試薬＞
ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル（日光ケミカルズ）  １２，５００ｐｐｍ
ポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテル（日光ケミカルズ）  １２，５００ｐｐｍ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（市販品）              ７５０ｐｐｍ
キシリトール（市販品）                                      ３５．５ｇ／Ｌ
ＨＥＰＥＳ（市販品）                                            ３０ｍＭ
精製水                                                          １Ｌ
上記の各成分を混合し、さらにＮａＯＨを添加してｐＨを７．０に調整した。第１試薬の浸透圧は３００ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度は０．５９ｍＳ／ｃｍであった。【００５１】
＜第２試薬＞
核酸染色色素                                              ５０ｐｐｍ
エチレングリコール                                        １Ｌ
色素をエチレングリコールに溶解して、第２試薬を調製した。なお、核酸染色色素は、表１に示す式で示される色素（ＮＫ−３２１）を用いた。【００５２】
第１試薬９８０μＬ、第２試薬２０μＬ、及び多発性骨髄腫の患者から採取した骨髄芽球を含まない血液試料２０μＬを混合し、３５℃で７秒間反応させて、測定用試料を得た。得られた測定用試料を用いて、図１に示すフローサイトメータで、側方散乱光強度、前方散乱光強度及び蛍光強度を測定した。なお、光源は赤半導体レーザーを用いた。【００５３】
得られた前方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第一の二次元分布図を作成した（図示せず）。この第一の二次元分布図に基づいて、全白血球領域を特定した（図示せず）。特定した全白血球領域に出現する細胞数を、試料に含まれる全白血球数として計数した。特定した全白血球領域に出現した細胞を対象として、側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第二の二次元分布図（スキャッタグラム）を作成した。このスキャッタグラムにおいて、側方散乱光強度が小さく、蛍光強度が小さい領域を骨髄芽球領域として特定できる。得られたスキャッタグラムを、表１に示す。表１において、スキャッタグラムの横軸は側方散乱光強度、縦軸は蛍光強度を表す。また、スキャッタグラムにおける「Ly」はリンパ球が出現する区画を、「Mo」は単球が出現する区画を、「Gran」は顆粒球が出現する区画を、「BL」は骨髄芽球が出現する区画を、「IG」は幼若顆粒球が出現する区画を表す。実施例１では、スキャッタグラム上で、骨髄芽球領域にシグナルは、ほぼ検出されなかった。【００５４】
（実施例２）
第２試薬の核酸染色色素を、表１に示す式で示される色素に変えた以外は実施例１と同様にして、分析を行った。
得られたスキャッタグラムを、表１に示す。【００５５】
【表１】
2009001869.tif 000009
【００５６】
（比較例１〜２３）
第２試薬の色素を、表２に示す色素に変えた以外は、実施例１と同様にして分析を行った。得られたスキャッタグラムを、表２に示す。【００５７】
【表２−１】
2009001869.tif 000010
【００５８】
【表２−２】
2009001869.tif 000011
【００５９】
【表２−３】
2009001869.tif 000012
【００６０】
【表２−４】
2009001869.tif 000013
【００６１】
上記の結果から、実施例１及び２では、上記の特定の色素を含む幼若白血球の分析用試薬を用いることにより、多発性骨髄腫の患者から採取した血液であっても、骨髄芽球と溶血した赤血球の破片（赤血球ゴースト）とを分類して、計数できることがわかる。一方、比較例の試薬を用いた場合、骨髄芽球のシグナルと赤血球ゴーストのシグナルあるいは他の細胞のシグナルとがスキャッタグラム上で重複してしまい、明確に弁別できなかったことがわかる。【００６２】
（実施例３）
実施例１に記載の第１試薬と、核酸染色色素の濃度を１００ｐｐｍに変更した以外は実施例１と同様の第２試薬を調製した。
第１試薬９８０μＬ、第２試薬２０μＬ、及び以下のいずれかの検体２０μＬを混合し、３５℃で７秒間反応させて、測定用試料を得、実施例１と同様にしてスキャッタグラムを作製した。
検体としては、骨髄芽球を含む白血病患者の血液（以下、「骨髄芽球サンプル」ともいう）、又は骨髄芽球を含まない多発性骨髄腫患者の血液（赤血球が溶血不良を起している）（以下、「溶血不良サンプル」ともいう）を用いた。【００６３】
得られたスキャッタグラムに基づいて、以下の手順で全白血球数に対する骨髄芽球の比率（骨髄芽球比率＝骨髄芽球／全白血球数×１００）を算出した。
測定試料中の粒子の前方散乱光強度及び蛍光強度に基づいて、前方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第一の二次元分布図（スキャッタグラム）を作成した。この第一のスキャッタグラムに基づいて、全白血球領域を特定した。特定した全白血球領域に出現する細胞数を、試料に含まれる全白血球数として計数した。全白血球領域に出現した細胞を対象として、側方散乱光強度及び蛍光強度を二軸とする第二のスキャッタグラムと側方散乱光強度及び前方散乱光強度を二軸とする第三のスキャッタグラムを作成した。第二のスキャッタグラム上で骨髄芽球領域１を設定し、第三の二次元分布図上で骨髄芽球領域２を設定した。そして設定した骨髄芽球領域１及び骨髄芽球領域２の双方に出現する細胞の数を、試料に含まれる骨髄芽球数として計数した。
全白血球数に対する骨髄芽球の比率（骨髄芽球比率＝骨髄芽球／全白血球数×１００）を算出した。【００６４】
得られたスキャッタグラム及び全白血球に対する骨髄芽球の比率（「BL領域」という）を、図２に示す。図２において、（Ａ）骨髄芽球サンプル、（Ｂ）溶血不良サンプルを用いた場合の結果を示す。
これらの結果から、本発明の分析用試薬を用いて、骨髄芽球サンプルを測定した結果と、溶血不良サンプルを測定した結果とにおいて、骨髄芽球領域と赤血球ゴースト領域が、スキャッタグラム上で重複しなかったことがわかる。また、骨髄芽球サンプルでは骨髄芽球が検出され、溶血不良サンプルでは、骨髄芽球比率が極めて低い値であることがわかる。すなわち、本発明の分析用試薬を用いると、多発性骨髄腫のような疾患の患者からの血液であっても、スキャッタグラム上で赤血球ゴーストが骨髄芽球の領域に出現しないので、骨髄芽球を赤血球ゴーストから明確に区別して、幼若白血球を正確に測定できることがわかる。【００６５】
（実施例４〜７）
以下の表３に示す組成の第１試薬及び第２試薬を調製した。
【表３】
2009001869.tif 000014
【００６６】
上記の第１試薬９８０μＬ、第２試薬２０μＬ、及び白血病患者の血液試料２０μＬを混合し、３５℃で１３秒間（実施例４は７秒間）反応させて、測定用試料を得、実施例１と同様にしてスキャッタグラムを作製した。各実施例中のＡとＢには、同じ患者から採取した血液を、試料として用いた。なお、各実施例でそれぞれ別の白血病患者からの血液を用いた。【００６７】
実施例４〜７で得られたスキャッタグラムを、図３〜６にそれぞれ示す。これらの図において、（Ａ）及び（Ｂ）は各実施例のＡ及びＢの試薬にそれぞれ相当する結果である。これらのスキャッタグラムにおいて、横軸は側方散乱光強度、縦軸は蛍光強度を示す。
また、図３〜６では、実施例３と同様にして算出した全白血球数に対する骨髄芽球の比率を、「ＢＬ領域」として示す。各図において、スキャッタグラムの横軸は側方散乱光強度、縦軸は蛍光強度を表す。【００６８】
実施例４〜７の結果から、本発明の分析試薬中の界面活性剤の合計濃度、又は２種類の界面活性剤の混合比が変化しても、試料中の赤血球の溶血不良を起すことなく、骨髄芽球領域を特定できたことがわかる。【００６９】
本出願は、２００７年６月２５日に出願された日本国特許出願特願２００７−１６６６３９号に関し、この特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
【図１】
2009001869.tif 000022
【図２】
2009001869.tif 000023
【図３】
2009001869.tif 000024
【図４】
2009001869.tif 000025
【図５】
2009001869.tif 000026
【図６】
2009001869.tif 000027
【手続補正書】
【提出日】平成21年12月28日(2009.12.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、
損傷した血球を収縮させる可溶化剤と、
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2009001869.tif 000028
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素及び以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2009001869.tif 000029
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素から選択される少なくとも１種の核酸染色色素と
を含む幼若白血球の分析用試薬。
【請求項２】
前記界面活性剤が、少なくとも２種類の界面活性剤である請求項１に記載の分析用試薬。
【請求項３】
前記界面活性剤の少なくとも１種類が、ノニオン界面活性剤である請求項１又は２に記載の分析用試薬。
【請求項４】
前記ノニオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤である請求項３に記載の分析用試薬。
【請求項５】
前記ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が、以下の式（ＩＩＩ）：
Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ （ＩＩＩ）
（式中、Ｒ1は炭素数９〜２５のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり、Ｒ2は−Ｏ−、−ＣＯＯ−又は
【化３】
2009001869.tif 000030
であり、ｎは１０〜４０の整数である）
で示されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤である請求項４に記載の分析用試薬。
【請求項６】
前記ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンオレイルエーテル又はポリオキシエチレンステアリルエーテルである請求項５に記載の分析用試薬。
【請求項７】
前記ポリオキシエチレンオレイルエーテルが、ｎが１５〜２０である式（ＩＩＩ）を有するポリオキシエチレンオレイルエーテルである請求項６に記載の分析用試薬。
【請求項８】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルとポリオキシエチレン（２０）オレイルエーテルとの組み合わせ、又はポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルとポリオキシエチレン（２０）ステアリルエーテルとの組み合わせである請求項１〜７のいずれか１項に記載の分析用試薬。
【請求項９】
前記可溶化剤が、サルコシン誘導体、コール酸誘導体、及びメチルグルカンアミドからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜８のいずれか１項に記載の分析用試薬。
【請求項１０】
ｐＨが５．０〜９．０である請求項１〜９のいずれか１項に記載の分析用試薬。
【請求項１１】
糖類をさらに含む請求項１〜１０のいずれか１項に記載の分析用試薬。
【請求項１２】
糖類が、キシリトール、アラビノース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、リビトールからなる群より選択される少なくとも１つである請求項１１に記載の分析用試薬。
【請求項１３】
アミノ酸をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の分析用試薬。
【請求項１４】
前記アミノ酸が、バリン、プロリン、グリシン及びアラニンからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１３に記載の分析用試薬。
【請求項１５】
赤血球及び成熟白血球の細胞膜に損傷を与える界面活性剤と、損傷した血球を収縮させる可溶化剤とを含む第１試薬、及び
以下の式（Ｉ）：
【化４】
2009001869.tif 000031
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素及び以下の式（ＩＩ）：
【化５】
2009001869.tif 000032
（式中、Ｘ-は、アニオンである。）
で示される色素から選択される少なくとも１種の核酸染色色素を含む第２試薬
を含む幼若白血球の分析用試薬キット。
【請求項１６】
前記第１試薬が、少なくとも２種類の界面活性剤を含む請求項１５に記載の分析用試薬キット。
【請求項１７】
前記界面活性剤の少なくとも１種類が、ノニオン界面活性剤である請求項１５又は１６に記載の分析用試薬キット。
【国際調査報告】
2009001869.tif 000033
2009001869.tif 000034
2009001869.tif 000035
2009001869.tif 000036