(57)【要約】  本発明は、新規な心筋梗塞の予防および／または治療薬に関する。  アデノシンを保持する脂質膜構造体を含有する心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノシンを保持する脂質膜構造体を含有する心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項２】
脂質膜構造体の構成成分が、リン脂質およびステロール類である請求項１記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項３】
脂質膜構造体の構成成分が、リン脂質、ステロール類および血中滞留性脂質誘導体である請求項１記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項４】
リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲンおよびホスファチジン酸から選ばれる１種または２種以上である請求項２または３記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項５】
ステロール類が、コレステロールおよび／またはコレスタノールである請求項２〜４のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項６】
血中滞留性脂質誘導体が、グリコフォン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体およびポリエチレングリコール誘導体から選ばれる１種または２種以上である請求項３〜５のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項７】
血中滞留性脂質誘導体が、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、およびＮ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンから選ばれる１種または２種以上である請求項３〜５のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項８】
アデノシンを保持する脂質膜構造体が、脂質膜構造体の脂質膜の中、脂質膜構造体の内部または脂質層中にアデノシンが存在するものである請求項１〜７のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項９】
血中滞留性脂質誘導体が、脂質膜構造体の脂質膜の表面に存在するものである請求項３〜８のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項１０】
脂質膜構造体が、リポソーム、エマルション、ミセルおよび／または不定型の層状構造物の形態である請求項１〜９のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項１１】
脂質膜構造体が、リポソームである請求項１〜９のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
【請求項１２】
アデノシンを保持する脂質膜構造体の、心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬製造のための使用。
【請求項１３】
脂質膜構造体の構成成分が、リン脂質およびステロール類である請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
脂質膜構造体の構成成分が、リン脂質、ステロール類および血中滞留性脂質誘導体である請求項１２記載の使用。
【請求項１５】
リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲンおよびホスファチジン酸から選ばれる１種または２種以上である請求項１３または１４記載の使用。
【請求項１６】
ステロール類が、コレステロールおよび／またはコレスタノールである請求項１３〜１５のいずれか１項記載の使用。
【請求項１７】
血中滞留性脂質誘導体が、グリコフォン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体およびポリエチレングリコール誘導体から選ばれる１種または２種以上である請求項１４〜１６のいずれか１項記載の使用。
【請求項１８】
血中滞留性脂質誘導体が、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、およびＮ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンから選ばれる１種または２種以上である請求項１４〜１６のいずれか１項記載の使用。
【請求項１９】
アデノシンを保持する脂質膜構造体が、脂質膜構造体の脂質膜の中、脂質膜構造体の内部または脂質層中にアデノシンが存在するものである請求項１２〜１８のいずれか１項記載の使用。
【請求項２０】
血中滞留性脂質誘導体が、脂質膜構造体の脂質膜の表面に存在するものである請求項１４〜１９のいずれか１項記載の使用。
【請求項２１】
脂質膜構造体が、リポソーム、エマルション、ミセルおよび／または不定型の層状構造物の形態である請求項１２〜２０のいずれか１項記載の使用。
【請求項２２】
脂質膜構造体が、リポソームである請求項１２〜２０のいずれか１項記載の使用。
【請求項２３】
アデノシンを保持する脂質膜構造体を投与する心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項２４】
脂質膜構造体の構成成分が、リン脂質およびステロール類である請求項２３記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項２５】
脂質膜構造体の構成成分が、リン脂質、ステロール類および血中滞留性脂質誘導体である請求項２３記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項２６】
リン脂質が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲンおよびホスファチジン酸から選ばれる１種または２種以上である請求項２４または２５記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項２７】
ステロール類が、コレステロールおよび／またはコレスタノールである請求項２４〜２６のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項２８】
血中滞留性脂質誘導体が、グリコフォン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体およびポリエチレングリコール誘導体から選ばれる１種または２種以上である請求項２５〜２７のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項２９】
血中滞留性脂質誘導体が、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、およびＮ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンから選ばれる１種または２種以上である請求項２５〜２７のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項３０】
アデノシンを保持する脂質膜構造体が、脂質膜構造体の脂質膜の中、脂質膜構造体の内部または脂質層中にアデノシンが存在するものである請求項２３〜２９のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項３１】
血中滞留性脂質誘導体が、脂質膜構造体の脂質膜の表面に存在するものである請求項２５〜３０のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項３２】
脂質膜構造体が、リポソーム、エマルション、ミセルおよび／または不定型の層状構造物の形態である請求項２３〜３１のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【請求項３３】
脂質膜構造体が、リポソームである請求項２３〜３１のいずれか１項記載の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な心筋梗塞の予防および／または治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、年間、急性心筋梗塞症により約４万人が死亡していると考えられ、米国では、毎年約１５０万人の心筋梗塞症が発生し、そのうち約６０万人が死亡しているとされている。急性心筋梗塞は、血栓などにより冠動脈が閉塞し、その支配下の心筋への血流が途絶することにより心筋壊死に至る疾患であるから、その治療法としては、心室細動などの不整脈への処置とともに、閉塞した冠動脈を再開通させて血流を回復させる治療法（以下、心筋虚血再灌流療法と呼ぶ。）が取られる。心筋虚血再灌流療法としては、ｔ−ＰＡなどを用いた血栓溶解療法とバルーン・カテーテルを用いたＰＴＣＡがある。この心筋虚血再灌流療法は、心筋梗塞の発症から６時間以内に行われると救命率も高く効果的である。【０００３】
しかしながら、心筋虚血再灌流をすると、活性酸素などのフリーラジカルや血管内皮細胞の傷害、好中球の活性化などによる炎症反応が起こり、その結果、心筋に対して新たなダメージを引き起こす結果となることが知られている。したがって、心筋虚血再灌流障害を抑制する薬剤の開発が望まれている。【０００４】
心筋虚血再灌流障害を抑制する化合物の１つとして、アデノシンが知られている（非特許文献１参照）。外因性のアデノシンは、Ａ２受容体を介して冠血流量を増加し、活性化された好中球により産生されるフリーラジカルの生成を抑制する。また、Ａ１受容体の活性化により、アドレナリンβ受容体を介する心筋収縮力の上昇、心筋へのＣａ２＋イオン流入の上昇、およびノルエピネフリン遊離の上昇を抑制する。アデノシンのこれらの作用は、いずれも心筋虚血による心筋の傷害や心筋虚血再灌流障害を抑制する方向に働く。【０００５】
しかしながら、アデノシンの半減期は血中において１０秒未満と短いため、その作用時間も短い。そのため、末梢静脈内投与により心筋保護作用を発現するためには、大量かつ長時間（３０分〜１時間）の投与が必要である（非特許文献２）。また、アデノシンは、血圧低下や心拍数減少などの副作用を引き起こすことが知られているが、そのような循環動態への影響を心筋梗塞患者へ与えることは好ましくない。
なお、アデノシンは、現在の医療現場においては、心臓疾患の診断補助剤として使用されている（非特許文献３参照）。【０００６】
【非特許文献１】Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８巻，４３２−４３７，１９９３年
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１７７５−１７８０，２００５年
【非特許文献３】ＪＡＰＩＣ  医療用医薬品集２００７  財団法人  日本医薬情報センター編集・発行  平成１８年９月１日  第８８−９０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、アデノシンの優れた心筋虚血再灌流障害抑制効果を利用するべく、アデノシンの副作用を改善した、アデノシンを有効成分とする心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究の結果、アデノシンを脂質膜構造体に保持させることにより、アデノシンの優れた薬理効果を有し、かつアデノシンの副作用が改善され、心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬となり得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、以下の発明に係るものである。
（１）アデノシンを保持する脂質膜構造体を含有する心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬。
（２）アデノシンを保持する脂質膜構造体の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬製造のための使用。
（３）心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療のためのアデノシンを保持する脂質膜構造体の提供。
（４）アデノシンを保持する脂質膜構造体を投与する心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療方法。
【発明の効果】
【００１０】
後記実施例から明らかなように、本発明の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬は、アデノシンの血圧低下や心拍数減少などの副作用を改善し、優れた心筋虚血再灌流障害抑制効果を示した。特に効果の面では、アデノシン単独の投与では、有効性を示さなかったが、本発明にかかるアデノシンを保持する脂質膜構造体は、虚血前投与および虚血再灌流前投与により有意に梗塞サイズを抑制し、心室細動の発生頻度を抑制した。したがって、本発明にかかるアデノシンを保持する脂質膜構造体は、心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬として有用である。特に、心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】薬剤を投与した時の血圧を示すグラフである。
【図２】薬剤を投与した時の心拍数を示すグラフである。
【図３】ラット虚血再灌流モデルに薬剤を投与した時の危険領域に対する作用を示すグラフである。
【図４】ラット虚血再灌流モデルに薬剤を投与した時の梗塞サイズに対する作用を示すグラフである。
【図５】イヌ虚血再灌流モデルに薬剤を投与した時の危険領域に対する作用を示すグラフである。
【図６】イヌ虚血再灌流モデルに薬剤を投与した時の梗塞サイズに対する作用を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬は、アデノシンを保持する脂質膜構造体を含有するものである。
本発明にかかるアデノシンを保持する脂質膜構造体は、アデノシンとこれを保持する脂質膜構造体を含むものである。
本発明にかかる脂質膜構造体は、リン脂質およびステロール類、所望によりさらに血中滞留性脂質誘導体や温度変化感受性脂質誘導体などを含んで構成されるものである。【００１３】
リン脂質としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種または２種以上を組合せて用いることができる。本発明において、リン脂質としてはホスファチジルコリンが好ましい。これらリン脂質における脂肪酸残基としては、特に限定されるものではなく、炭素数１２〜１８の飽和または不飽和脂肪酸残基を挙げることができ、ミリストイル基、パルミトイル基、オレオイル基、ステアロイル基、リノレイル基等が好ましい。本発明において、リン脂質としては、水素添加大豆レシチンが特に好ましい。【００１４】
ステロール類としては、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールコハク酸、コレスタノール、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール、チモステロール、エルゴステロールなどを挙げることができ、これらは１種または２種以上を組合せて用いることができる。本発明において、ステロール類としては、コレステロール、コレスタノールが好ましい。【００１５】
所望成分である血中滞留性脂質誘導体は、このものを脂質膜構造体に含ませることにより、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織による脂質膜構造体の補足率を低下させ、脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させることができる。また、温度変化感受性脂質誘導体は、このものを脂質膜構造体に含ませることにより、脂質膜構造体に保持されたアデノシンの放出性やターゲッティング効果を高めることができる。【００１６】
血中滞留性脂質誘導体としては、血中滞留性機能を付与することができ、脂質膜構造体を構成でき得る脂質誘導体であれば特に限定されるべきものではないが、例えば、グリコフォン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、ポリエチレングリコール誘導体が挙げられる。このうち、ポリエチレングリコール誘導体としては、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシ−ポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン等のポリエチレングリコール誘導体などを挙げることができ、これらは１種または２種以上を組合せて用いることができる。中でも、ポリエチレングリコール誘導体が好ましい。【００１７】
温度変化感受性脂質誘導体としては、温度変化感受性機能を付与することができ、脂質膜構造体を構成でき得る脂質誘導体であれば特に限定されるべきものではないが、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリンなどを挙げることができる。【００１８】
本発明にかかる脂質膜構造体において、リン脂質とステロール類の比（モル比）が１：４〜４：１であるものが好ましく、３：２〜２：３であるものがより好ましい。
また、脂質膜構造体の構成成分として、血中滞留性脂質誘導体、温度変化感受性脂質誘導体などを含む場合、リン脂質とステロール類の合計と血中滞留性脂質誘導体、温度変化感受性脂質誘導体などの比（モル比）が１０：０．０１〜１０：２であるものが好ましく、１０：０．１〜１０：０．５であるものがより好ましい。【００１９】
本発明にかかるアデノシンを保持する脂質膜構造体において、アデノシンの含有量は、心筋虚血再灌流障害抑制効果あるいは心筋梗塞の予防および／または治療効果が発現するのに充分な量であればよく、脂質膜構造体の形態や患者の症状、性別、年齢、体重等に応じて適宜決定すればよいが、例えば、脂質膜構造体におけるリン脂質とステロール類の合計脂質量に対してアデノシンを０．０１〜２（モル比）含むものが好ましく、０．０５〜０．２（モル比）含むものがより好ましい。【００２０】
本発明にかかるアデノシンを保持する脂質膜構造体における当該脂質膜構造体は、リン脂質およびステロール類、所望によりさらに血中滞留性脂質誘導体、温度変化感受性脂質誘導体などを含んだ単なる混合物としての形態でもよいし、リン脂質およびステロール類、所望によりさらに血中滞留性脂質誘導体などとの組み合わせで脂質膜構造体を形成した形態でもよい。【００２１】
本発明の脂質膜構造体とは、極性脂質の極性基が界面の水相側に向かって配列した膜構造を有する粒子を意味し、その例としてはリポソーム、ミセル、マイクロエマルション等が挙げられる。
当該脂質膜構造体の形態は、特に限定されないが、例えば、乾燥した脂質混合物形態、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態などを挙げることができる。【００２２】
このうち、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、例えば、一枚膜リポソーム、多重層リポソームなどのリポソーム；Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルションなどのエマルション；球状ミセル、ひも状ミセルなどのミセル；不定型の層状構造物などを挙げることができる。これらのうちリポソームが好ましい。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には粒子径が５０ｎｍ〜５μｍであり、球状ミセルの場合、粒子径が５〜１００ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５〜１０ｎｍであり、これらが層を形成しているものが好ましい。本発明においては、脂質膜構造体がリポソームであることが好ましく、中でもリポソームの粒子径が２００ｎｍ以下のものが特に好ましい。【００２３】
以下に、各種の脂質膜構造体について、その製造例を説明する。
Ｉ）乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の構成成分全てを一旦クロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。【００２４】
ＩＩ）脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。【００２５】
水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されるべきものではなく、例えば、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）等を加えてもよい。この水系溶媒（分散媒）に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）中の電解質を極力なくすことが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３〜８、好ましくはｐＨ５〜７）に設定することや窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが望ましい。【００２６】
ここで、糖または多価アルコールの濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した状態において、例えば、糖（水溶液）は、２〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５〜１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコール（水溶液）は、１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２〜２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）として、緩衝液を用いる場合には、緩衝剤の濃度が５〜５０ｍＭが好ましく、１０〜２０ｍＭがさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）における脂質膜構造体の濃度は特に限定されないが、脂質膜構造体の構成成分として用いるリン脂質、ステロール類、所望により血中滞留性脂質誘導体を含む全脂質の濃度は、０．２〜５０ｍＭが好ましく、１〜１０ｍＭがさらに好ましい。【００２７】
ＩＩＩ）脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態を乾燥または凍結させた形態は、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体を通常の凍結乾燥や噴霧乾燥による乾燥または凍結方法等により製造することができる。水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体にアデノシン含有水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるためにアデノシンを効率よく脂質膜構造体に保持させることができる長所がある。【００２８】
凍結乾燥や噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定に長期間保存することができる。また、凍結する場合には、例えば、前記した糖（水溶液）やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール（水溶液）をそれぞれ用いると安定に長期間保存することができる。糖と多価アルコールとを組み合わせて用いてもよい。【００２９】
以下に、本発明にかかるアデノシンを保持する脂質膜構造体について説明する。
アデノシンを保持する脂質膜構造体の形態としては、アデノシン、リン脂質およびステロール類、所望によりさらに血中滞留性脂質誘導体などを含んだ単に混合物として存在していてもよいし、リン脂質およびステロール類、所望によりさらに血中滞留性脂質誘導体などとの組み合わせで形成された脂質膜構造体とアデノシンとが混合した形態でもよいし、さらに脂質膜構造体にアデノシンが脂質膜構造体の脂質膜の中、脂質膜の表面、脂質膜構造体の内部、脂質層中、および／または脂質層の表面に存在した形態でもよい。脂質膜構造体が、例えばリポソームなどの微粒子である場合には、アデノシンが微粒子内部に封入された形態でもよい。【００３０】
本発明においては、アデノシンを保持する脂質膜構造体を投与するにあたり、アデノシンが血中で暴露しない形態が好ましく、アデノシンを保持した脂質膜構造体の形態としては、アデノシンが脂質膜構造体の脂質膜の中、脂質膜構造体の内部および／または脂質層中に存在したものが好ましい。中でもアデノシンが封入されたリポソームが好ましい。【００３１】
アデノシンを保持する脂質膜構造体の形態は、前述の脂質膜構造体と同様に、混合乾燥物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態などを挙げることができる。【００３２】
以下に、アデノシンを保持する各種脂質膜構造体について、その製造例を説明する。
１）脂質膜構造体とアデノシンを含む水系溶媒に分散した形態とする場合には、その製造方法としてはいくつかの方法が知られており、脂質膜構造体におけるアデノシンの保持様式や混合物の性状などに応じて、下記１−１〜１−４のように製造法を適宜選択することができる。【００３３】
１−１）製造法１
脂質膜構造体の構成成分を有機溶媒で一旦溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に、さらにアデノシンを含む水系溶媒を添加して乳化を行い製造する方法である。大きさ（粒子径）を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解するアデノシンに適用できる。脂質膜構造体がリポソームの場合、内水相部分にもアデノシンを保持できる長所がある。【００３４】
１−２）製造法２
水系溶媒に既に分散したリポソーム、エマルション、ミセル、または層状構造物などの脂質膜構造体に、さらにアデノシンを含む水系溶媒を添加して製造する方法である。既にでき上がっている脂質膜構造体に外部からアデノシンを添加する方法であることから、アデノシンが脂質膜構造体の内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に存在（結合）した存在様式をとる可能性がある。しかし、リポソームの分散媒のｐＨを中性にしてリポソーム内外にｐＨ勾配を構築することで、より高濃度のアデノシンをリポソームに保持することができる。脂質膜構造体としてリポソームを用いた場合、この製造法２を用いると、アデノシンがリポソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造（一般的には複合体あるいはコンプレックスと呼ばれている。）をも形成することが知られている。この製造法では、脂質膜構造体単独の水分散液をあらかじめ製造するため、乳化時におけるアデノシンの分解等を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。したがって、製造法１と比較して容易に製造することができる。【００３５】
１−３）製造法３
水系溶媒に分散した脂質膜構造体を製造して乾燥することにより得られた乾燥物に、さらにアデノシンを含む水系溶媒を添加して製造する方法である。製造法２との相違点は、脂質膜構造体とアデノシンとの存在様式にあり、この製造法３では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥させた乾燥物を製造することから、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるためには、前記したように水系溶媒に、さらに糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。ここで、アデノシンを含む水系溶媒を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに速やかに水和し始め、脂質膜構造体を再構築することができる。この時、アデノシンが脂質膜構造体内部に保持された形態の構造体が製造できる。【００３６】
製造法２では、アデノシンが脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとる可能性があるが、製造法３はこの点で大きく異なる。すなわち、アデノシンの一部または全部は脂質膜構造体内部に取り込まれる。この製造法３は、脂質膜構造体単独の分散液をあらかじめ製造するため、乳化時のアデノシンの分解を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。従って、製造法１と比較して製造が容易である。また、この他に、一旦凍結乾燥または噴霧乾燥を行うため、製剤（アデノシン含有脂質膜構造体製剤）としての保存安定性を保証し易く、乾燥製剤をアデノシンの水溶液で再水和しても大きさ（粒子径）を元に戻せること、脂質膜構造体内部にアデノシンを保持させ易いことなどの長所がある。【００３７】
１−４）その他
脂質膜構造体とアデノシンとの混合物が水系溶媒に分散した形態を製造するための他の方法としては、リポソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば逆相蒸発法などを採用できる。大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。【００３８】
２）上記の脂質膜構造体とアデノシンとの混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに乾燥させる形態とする場合には、凍結乾燥や噴霧乾燥等する方法を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上述の糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。脂質膜構造体とアデノシンとの混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられるが、この場合の水系溶媒としては、糖（水溶液）や多価アルコール（水溶液）を添加した溶媒を用いるのが好ましい。【００３９】
３）脂質膜構造体に血中滞留性機能や温度感受性機能を付与させる場合、血中滞留性脂質誘導体や温度変化感受性脂質誘導体は、脂質膜構造体の脂質膜の表面に存在させることが好ましい。この場合、（ｉ）リン脂質およびステロール類などで構成する脂質膜構造体に、アデノシンと血中滞留性脂質誘導体などが水系溶媒に溶解（分散）した溶液（または分散液）を添加したり、（ｉｉ）アデノシン、リン脂質およびステロール類などで構成する脂質膜構造体に、血中滞留性脂質誘導体などが水系溶媒に溶解（分散）した溶液（または分散液）を添加したり、（ｉｉｉ）リン脂質、ステロール類および血中滞留性脂質誘導体などで構成する脂質膜構造体にアデノシンが水系溶媒に溶解した溶液を添加したり、（ｉｖ）リン脂質およびステロール類などで構成する脂質膜構造体にアデノシンが水系溶媒に溶解した溶液を添加した後、血中滞留性脂質誘導体などが水系溶媒に溶解（分散）した溶液（または分散液）を添加することで製造することができる。大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。また、このものを乾燥形態とするには、上述の２）と同様の方法を用いればよい。【００４０】
上述のようにして得られる本発明にかかるアデノシンを保持する脂質膜構造体を用いれば、アデノシンの心筋虚血再灌流障害抑制効果を活用でき、心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療剤として有用である。中でも、アデノシンを保持する脂質膜構造体において、脂質膜構造体の脂質膜の中、脂質膜構造体の内部または脂質層中にアデノシンが存在し、血中滞留性脂質誘導体が、脂質膜構造体の脂質膜の表面に存在するものが、特に心筋梗塞もしくは心筋虚血再灌流障害の予防および／または治療薬として有用である。【００４１】
本発明にかかるアデノシンを保持する脂質膜構造体を投与することにより、心筋虚血再灌流障害抑制や心筋梗塞を予防および／または治療することができる。投与手段としては、非経口投与でも、経口投与でもよく、非経口投与の剤形としては、通常知られているものであれば特に限定されるものではなく、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、坐剤等を挙げることができる。経口投与の剤形としては、通常知られているものであれば特に限定されるものではなく、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤等を挙げることができる。本発明において、好ましくは非経口投与である。中でも、注射剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、動脈注射、点滴などが好ましい。
【実施例】
【００４２】
以下に実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。【００４３】
実施例１
１．混合脂質の調製
水素添加大豆レシチン（ＬＩＰＯＩＤ  Ｓ  ＰＣ−３，日清製油社）およびコレステロール（和光純薬社）をモル比６：４の割合で量りとり、クロロホルムで溶解させた。クロロホルム溶液を加圧濾過（フィルター：ミリポア社製ＰＶＤＦ  ＧＶ  ０．２２μｍ）した。得られた濾液を約８０℃で減圧濃縮乾固し、更に減圧下で一晩放置した。【００４４】
２．アデノシン溶液の調製
アデノシン（ＳＩＧＭＡ社）を３００ｍＭクエン酸水溶液（ｐＨ３．０）で溶解させ、６０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、加圧濾過（フィルター：ミリポア社製ＰＶＤＦ  ＧＶ  ０．２２μｍ）した。【００４５】
３．リポソームの調製
３−１．リポソーム化アデノシンの調製
混合脂質にアデノシン溶液を加え、６５℃（設定温度）で３０分間超音波処理し脂質濃度が１３０ｍＭあるいは２６０ｍＭの粗乳化液とした。この液を６５℃（設定温度）保温下の濾過器で窒素ガス加圧によりサイジング（フィルター：ポリカーボネート  ０．２μｍ×５回、０．１μｍ×５回、０．０５μｍ×３回）してリポソーム液を得た（Ｉ法）。
水酸化ナトリウムでｐＨを約３に調整した３００ｍＭクエン酸水溶液を混合脂質に加え、６５℃（設定温度）で３０分間超音波処理し脂質濃度が２６０ｍＭの粗乳化液とした。この液を６５℃（設定温度）保温下の濾過器で窒素ガス加圧によりサイジング（フィルター：ポリカーボネート  ０．２μｍ×５回、０．１μｍ×５回、０．０５μｍ×３回）した。この液に２倍量のアデノシン溶液を加えてリポソーム液を得た（ＩＩ法）。【００４６】
Ｉ法あるいはＩＩ法で調製したリポソーム液を６０℃（設定温度）に加温し、３００ｍＭクエン酸ナトリウム含有２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを５〜６に調整した。ｐＨ調整後、混合脂質に対するモル比０．０３１相当量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を添加し、６０℃（設定温度）で３０分間インキュベートした。得られたリポソーム化アデノシン液を５倍量の５％ブドウ糖液で希釈した後、超遠心分離（３×１０５ｇ、４℃、６０分）した。得られたペレットに５０ｍＭ乳酸ナトリウム含有９％ショ糖液（ｐＨ約５）あるいは１００ｍＭ乳酸ナトリウム含有９％ショ糖液（ｐＨ約５）を加え再懸濁した。懸濁液を５℃で一晩放置後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、４℃、１０分）して析出したアデノシンを除去した。この液を再び５倍量の５％ブドウ糖液で希釈した後、超遠心分離（３×１０５ｇ、４℃、６０分）した。得られたペレットに５０ｍＭ乳酸ナトリウム含有９％ショ糖液（ｐＨ約５）あるいは１００ｍＭ乳酸ナトリウム含有９％ショ糖液を添加しアデノシン濃度を１．５ｍｇ／ｍＬに調整し、リポソーム化アデノシンを調製し、評価用試料とした。【００４７】
３−２．空リポソームの調製
水酸化ナトリウムでｐＨを約３に調整した３００ｍＭクエン酸水溶液を混合脂質に加え、６５℃（設定温度）で３０分超音波処理し脂質濃度が２６０ｍＭの粗乳化液とした。この液を６５℃（設定温度）保温下の濾過器で窒素ガス加圧によりサイジング（フィルター：ポリカーボネート  ０．２μｍ×３回、０．１μｍ×５回、０．０５μｍ×３回）してリポソーム液を得た。【００４８】
このリポソーム液に３００ｍＭクエン酸ナトリウム含有２Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加しｐＨを５〜６に調整した。ｐＨ調整後、混合脂質に対するモル比０．０３１相当量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を９％ショ糖溶液として添加し、６０℃（設定温度）で３０分間インキュベートした。得られた液を５倍量の５％ブドウ糖液で希釈した後、超遠心分離（３×１０５ｇ、４℃、６０分）した。得られたペレットに１００ｍＭ乳酸ナトリウム含有９％ショ糖液（ｐＨ約５）を加え再懸濁し、空リポソームを調製し、対照用試料とした。【００４９】
４．リポソームの品質試験
４−１．測定方法
得られた各リポソーム（リポソーム化アデノシンおよび空リポソーム）について、試験例で用いた各リポソームの平均粒子径をＮＩＣＯＭＰ  ３８０  ＺＬＳを用いて測定した。【００５０】
４−２．測定結果
平均粒子径の測定結果を以下に示す。【００５１】
【表１】
2008114513.tif 000002
【００５２】
試験例１．血行動態試験
雄性ＳＤラット（９週齢、体重２７０ｇ〜３２０ｇ、供給源；日本エスエルシー株式会社）を使用した。ラットをペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）で麻酔後、背位に固定し、気道に経口的にチューブを挿入し、小動物用人工呼吸器により人工呼吸を行った。大腿動脈、大腿静脈にカテーテル（ＩＮＴＲＡＭＥＤＩＣ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｔｕｂｉｎｇ  ＰＥ５０、ＣＬＡＹ  ＡＤＡＭＳ）を挿入し、大腿動脈より収縮期血圧、拡張期血圧、平均血圧を測定した。また心電図計を用いて心拍数の測定を行った。大腿静脈留置カテーテルより、シリンジポンプ（Ｍｏｄｅｌ  ＰＨＤ  ４４００，ＨＡＲＶＡＲＤ）を用いて薬液の注入を行った。血行動態の安定後、経静脈的に空リポソーム（ｎ＝８）、アデノシン単独（ｎ＝８）、リポソーム化アデノシン（ｎ＝８）の各液の投与を行った。【００５３】
空リポソーム群は０．０５ｍｌ／分にて１０分間の投与（１分後、５分後、１０分後に体血圧、心拍数を評価）を行い、投与終了後５分間の血圧、心拍数の評価を行った。以後０．１ｍｌ／分、０．２ｍｌ／分、０．４ｍｌ／分にて同様に検討した。アデノシン単独群、リポソーム化アデノシン群も０．０５ｍｌ／分（アデノシン量として２２５μｇ／ｋｇ／分）にて投与を開始し、中空リポソームと同じプロトコールにて累積投与を行った。【００５４】
結果を図１および図２に示した。図１および図２から明らかなように、空リポソーム群では有意な血行動態の変化は認められなかった。アデノシン２２５μｇ／ｋｇ／分投与開始１０分後、アデノシン単独群で平均血圧；１０１±１２ｍｍＨｇ、心拍数；３５７±２５ｂｐｍ、リポソーム化アデノシン群で平均血圧；１１７±１７ｍｍＨｇ、心拍数；３７３±２０ｂｐｍであった。アデノシン４５０μｇ／ｋｇ／分投与開始１０分後値にて、アデノシン単独群で平均血圧；９３±１４ｍｍＨｇ、心拍数；３２４±２５ｂｐｍ、リポソーム化アデノシン群で平均血圧；１１７±２０ｍｍＨｇ、心拍数；３７２±１８ｂｐｍであった。以下同様に、アデノシン９００μｇ／ｋｇ／分投与開始１０分後値で、アデノシン群ｖ．ｓ．リポソーム化アデノシン群；平均血圧；８４±１１ｖ．ｓ．１０６±１１ｍｍＨｇ、心拍数；２９６±１２ｖ．ｓ．３６１±１６ｂｐｍ、１８００μｇ／ｋｇ／分で平均血圧；７５±１１ｖ．ｓ．９７±１０ｍｍＨｇ、心拍数；２３６±１７ｖ．ｓ．３２８±１３ｂｐｍあった。リポソーム化アデノシン群は、アデノシン群と比較して血圧低下、心拍数減少を有意に抑制した。【００５５】
試験例２．虚血再灌流試験（ラット）
１）試験方法
血行動態試験と同様に雄性ＳＤラットを使用し、麻酔、人工呼吸開始後、胸部側壁を開胸し、糸付き縫合針を用いて、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を３０分間結紮した。その後、血流を再開させることによって虚血再灌流モデルを作製した。大腿静脈に留置したカテーテル（ＩＮＴＲＡＭＥＤＩＣ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｔｕｂｉｎｇ  ＰＥ５０、ＣＬＡＹ  ＡＤＡＭＳ）より各液の投与を行った。【００５６】
リポソーム化アデノシン群に関しては、投与は虚血前投与群（虚血前１０分間）と再灌流前投与群（再灌流５分前から１０分間投与）の２群の実験を行った。その他の群については虚血前投与（虚血前１０分間）を行った。各群における投与量は１）コントロール群（生理食塩水、０．２ｍｌ／分；ｎ＝７）、２）空リポソーム群（０．２ｍｌ／分；ｎ＝９）、３）アデノシン単独群（０．２ｍｌ／分（９００μｇ／ｋｇ／分）；ｎ＝８）、４）リポソーム化アデノシン虚血前投与群（０．２ｍｌ／分（９００μｇ／ｋｇ／分）；ｎ＝１０）、５）リポソーム化アデノシン再灌流前投与群（０．２ｍｌ／分（９００μｇ／ｋｇ／分；ｎ＝１０）である。【００５７】
２）心筋梗塞サイズの測定方法
再灌流７２時間後にラットを麻酔後、再度開胸し前回結紮部位と同場所に糸付き縫合針にて再結紮を行った。その後２％エバンスブルー液を１〜２ｍｌ、留置した大腿静脈から注入、非虚血部位の染色を行った後、心臓を摘出した。左心室を短軸方向に４分割し、１％ＴＴＣ液にて３７℃にて５分間の染色を行った。染色後、標本の写真撮影を行い、Ｗｉｎ  ＲＯＯＦ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５．５（三谷商事（株））を用いて、虚血危険領域（エバンスブルー非染色領域）、梗塞領域（ＴＴＣ非染色領域）の測定を行った。梗塞サイズは梗塞領域を虚血危険領域にて除して算出した。【００５８】
３）試験結果
結果を図３および図４に示した。図３に示すように、虚血危険領域はそれぞれ、コントロール群；４５．４±３．５％、空リポソーム群；４１．５±２．６％、アデノシン単独群；３５．５±２．７％、リポソーム化アデノシン群（虚血前投与）；３７．２±１．６％、リポソーム化アデノシン群（再灌流投与）；４０．５±１．７％であり、各群とも有意な差異は認めなかった。【００５９】
心筋梗塞サイズは、図４に示すように、コントロール群；２４．３±２．４％、空リポソーム群；２１．２±３．５％、アデノシン単独群；２５．２±１．９％、リポソーム化アデノシン群（虚血前投与）；１１．６±２．５％、リポソーム化アデノシン群（再灌流前投与）；１１．４±３．１％であり、リポソーム化アデノシンは虚血前投与、再灌流前投与のいずれの投与タイミングにおいても梗塞サイズを有意に抑制した。【００６０】
試験例３．虚血再灌流試験（イヌ）
１．心室細動抑制試験
１）試験方法
ビーグル成犬（体重８〜１２ｋｇ、供給源；オリエンタル酵母株式会社）を使用した。イヌをペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、静脈注射）で麻酔後、背位に固定し、気管内挿管を行い動物用人工呼吸器により人工呼吸を行った。その後頸動脈を剥離、胸部側壁を開胸、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を剥離、双方の血管にカニューレ管を挿入し頸動脈−ＬＡＤへのバイパスチューブを接続した。このバイパスチューブを遮断、開放させることで虚血再灌流モデルを作製した。９０分間の虚血、３６０分間の再灌流を行った。頸静脈に留置したカテーテルより薬液の投与を行った。試験中を通じて心電図による不整脈、動脈圧計測による血圧のモニタリングを行った。またマイクロスフェア方法を用いた側副血行血流の測定を行った。【００６１】
投与は再灌流１０分前から１２０分間行った。各群における投与量は１）コントロール群（空リポソーム、１２ｍｌ／時間；ｎ＝７）、２）リポソーム化アデノシン群（１２ｍｌ／時間（３０μｇ／ｋｇ／分）；ｎ＝７）、３）リポソーム化アデノシン群（３６ｍｌ／時間（３００μｇ／ｋｇ／分）；ｎ＝５）（リポソーム化アデノシンのアデノシン濃度は、２）に関して１．５ｍｇ／ｍＬ、３）に関して５ｍｇ／ｍＬとした。）とした。【００６２】
２）試験結果
試験の結果、コントロール群では７匹中４匹が再灌流中に心室細動を発生したのに対し、２）のリポソーム化アデノシン群では、７匹中２匹、３）のリポソーム化アデノシン群では、６匹中１匹が心室細動を発生した。【００６３】
このことから、本発明のリポソーム化アデノシンは再灌流中の心室細動を抑制することが確認された。【００６４】
２．心筋梗塞サイズ抑制試験
１）試験方法
心室細動抑制試験と同様の試験を行い、以下のようにして心筋梗塞サイズを測定し、抑制効果を確認した。【００６５】
２）心筋梗塞サイズの測定方法
再灌流３６０分後にイヌを麻酔後、心臓を摘出、２％エバンスブルー液を回旋枝ならびに右冠動脈から注入、非虚血部位の染色を行った後、左心室を短軸方向に５分割した。その後、試験例２と同様に梗塞サイズを算出した。【００６６】
３）試験結果
結果を図５および図６に示した。図５に示すように、虚血危険領域はそれぞれ、コントロール群；４８±５％、２）のリポソーム化アデノシン群；４１±４％、３）のリポソーム化アデノシン群；５２±５％であり、各群とも有意な差異は認めなかった。また側副血流量は、各群とも有意な差異は認めなかった。【００６７】
心筋梗塞サイズは、図６に示すように、コントロール群；４０±５％、２）のリポソーム化アデノシン群；１７±７％、３）のリポソーム化アデノシン群；１２±６％であった。このことから、本発明のリポソーム化アデノシンは梗塞サイズを有意に抑制することが確認された。
【図１】
2008114513.tif 000003
【図２】
2008114513.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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