(57)【要約】導入遺伝子が一部の細胞、例えば花弁のＬ１層の細胞等に存在し、他の細胞、例えば花粉細胞や胚珠細胞などの生殖細胞には存在しないバラを作出する。このバラは他のバラと交雑しても導入遺伝子が他のバラに伝播しないので、導入遺伝子拡散の可能性を完全に否定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
外来遺伝子を一部の細胞に含み、他の細胞には含まない花卉植物。
【請求項２】
前記一部の細胞が一部の細胞層を構成している、請求項１に記載の花卉植物。
【請求項３】
前記他の細胞が、花粉の細胞又は胚珠の細胞である、請求項１又は２に記載の花卉植物。
【請求項４】
前記他の細胞が、Ｌ２層を構成する細胞である、請求項１又は２に記載の花卉植物。
【請求項５】
前記一部の細胞層が、Ｌ１層であるか、またはＬ１層とＬ３層である、請求項２又は３に記載の花卉植物。
【請求項６】
花卉植物が、アグロバクテリウムを介して外来遺伝子を導入可能な花卉植物である請求項１ないし５記載の花卉植物。
【請求項７】
花卉植物が、バラ、カーネーション、ペチュニア、トレニア、タバコ、バーベナ、ニーレンベルギア、キク、ユリ、アサガオ、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、チューリップ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、カリフラワーのいずれかである請求項６記載のの花卉植物。
【請求項８】
前記外来遺伝子が、導入後にＬ１層の細胞で機能する遺伝子である請求項１ないし７いずれか１項に記載の花卉植物。
【請求項９】
前記外来遺伝子が花色に関する遺伝子である、請求項８に記載の花卉植物。
【請求項１０】
前記外来遺伝子が、フラボノイドの合成に係る遺伝子である請求項９に記載の花卉植物。
【請求項１１】
前記外来遺伝子が、スミレ科植物由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子、ゴマノハグサ科植物由来の芳香族アシル基転移酵素遺伝子、サルビア由来のフラボノイド３’、５’−水酸化酵素遺伝子ｃＤＮＡ、ペチュニアのジヒドロフラボノール４−還元酵素の染色遺伝子、カーネーション由来のアントシアニジン合成酵素遺伝子の一ないし複数の遺伝子である請求項１０に花卉植物。
【請求項１２】
前記外来遺伝子が選択マーカーの遺伝子、または転写因子をコードする遺伝子である請求項８に記載の花卉植物。
【請求項１３】
花卉植物がバラである請求項７記載の花卉植物。
【請求項１４】
前記バラが、Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａである、請求項１３に記載の花卉植物。
【請求項１５】
前記バラが、ハイブリッドティー、フロリバンダ又はミニバラである１４に記載の花卉植物。
【請求項１６】
前記外来遺伝子が花色に関する遺伝子である、請求項１３ないし１５のいずれか１項に記載の花卉植物。
【請求項１７】
前記外来遺伝子が、フラボノイドの合成に係る遺伝子である請求項１６のいずれか１項に記載の花卉植物。
【請求項１８】
前記外来遺伝子が、スミレ科植物由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子、ゴマノハグサ科植物由来の芳香族アシル基転移酵素遺伝子のいずれか一方、またはその両方である、請求項１７記載の花卉植物。
【請求項１９】
前記スミレ科植物がスミレ科パンジーである、請求項１８に記載の花卉植物。
【請求項２０】
前記ゴマノハグサ科植物がゴマノハグサ科トレニアである、請求項１８記載の花卉植物。
【請求項２１】
遺伝子導入前のバラと比べて花色が青色方向に変化している、請求項１３ないし２０のいずれか１項に記載の花卉植物。
【請求項２２】
花卉植物がカーネーションである請求項７記載の花卉植物。
【請求項２３】
前記カーネーションが、スプレータイプまたはスタンダードタイプである請求項２２に記載の花卉植物。
【請求項２４】
前記外来遺伝子が花色に関する遺伝子である、請求項２２または２３に記載の花卉植物。
【請求項２５】
前記外来遺伝子が、フラボノイドの合成に係る酵素の遺伝子である請求項２４に記載の花卉植物。
【請求項２６】
前記外来遺伝子が、サルビア由来のフラボノイド３’、５’−水酸化酵素遺伝子ｃＤＮＡ、ペチュニアのジヒドロフラボノール４−還元酵素の染色遺伝子、カーネーション由来のアントシアニジン合成酵素遺伝子の一ないし複数の遺伝子である、請求項２５に記載の花卉植物。
【請求項２７】
遺伝子導入前のカーネーションと比べて花色が青色方向に変化している、請求項２２ないし２６のいずれか１項に記載の花卉植物。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の花卉植物と同じ性質を有するそれらの組織、及びこれらの栄養増殖体。
【請求項２９】
請求項１〜２７のいずれか１項に記載の花卉植物の製造方法において、外来遺伝子をアグロバクテリウムを介して植物に導入し、そして当該外来遺伝子が一部の細胞にのみ存在する植物を選択する工程を含む方法。
【請求項３０】
請求項３〜２７のいずれかに１項に記載の、生殖細胞に外来遺伝子をもたない花卉植物を作出することにより自然界への導入遺伝子の拡散を防止する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一部の細胞にのみ導入遺伝子を有するキメラの遺伝子組換え植物を作出する方法を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
複数の遺伝的に異なる細胞群よりなる個体はキメラと呼ばれる。植物のキメラはその構造から周縁キメラ、部分キメラ及び区分キメラに分けられ、たとえば接木のほかに偶発的あるいは放射線照射による体細胞変異や薬剤処理による染色体倍加によって作製されうる。
区分キメラ（ｓｅｃｔｏｒｉａｌ  ｃｈｉｍｅｒａ）は植物の積み重ね構造に起因する非構造的キメラで、成長点に非構造的に混在する変異細胞の増殖により生じる。すなわち、ひとつの組織層自体がキメラであるものを指し、花・葉・茎などの器官に異色の縞として現れることが多い。区分キメラは通常不安定で消失することが多いが、稀に周縁キメラに発展することもある。
周縁キメラ（ｐｅｒｉｃｌｉｎａｌ  ｃｈｉｍｅｒａ）は、植物の組織層構造に起因する構造的キメラで区分キメラが発展し、ひとつの細胞層が変異細胞で完全に置換された状態のものを言う。周縁キメラの場合、ひとつの組織層自体は均一であり、キメラではない。周縁キメラは安定しており、消失する頻度は小さいと言われている。植物の細胞組織は基本的に３つの細胞層より構成されており、外側から第１層（Ｌ１），第２層（Ｌ２）、第３層（Ｌ３）という組織層構造を持っている。
成長点の２層の外皮（ｔｕｎｉｃａ）から生じるのがＬ１とＬ２であり、内体（ｃｏｒｐｕｓ）から生じるのがＬ３である。ほとんどの植物種において、表皮は全てＬ１層から生成し、Ｌ２層は生殖細胞系に関係する。これらの細胞層ごとに異なる性質をもつ周縁キメラは園芸的に重要なものが多く産業的価値は高いが、偶発的に、あるいは放射線照射や薬剤処理のような人為的に変異を誘発する手段によっても周縁キメラが得られる確率は極めて低い。
外来遺伝子を植物体へ導入する際に人為的に一部の細胞のみ導入遺伝子を有するキメラ植物を作出するのは容易ではない。これまでには、パーテイクルガンを用いた方法によりトウモロコシの未成熟胚に遺伝子を導入し、生殖細胞またはＬ２細胞層にのみ導入遺伝子を有するキメラ植物を作出した例がある（特表平１０−５０３３７４号公報）。しかし、アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入する場合には、キメラ植物を作出するのは一層難しい。アグロバクテリウムを介して遺伝子を導入する方法においては、マーカー遺伝子の発現による薬剤耐性などの形質を指標として、遺伝子が導入された単一の細胞を選別し、当該単一の遺伝子導入細胞から一個体の形質転換体植物を得る。
よって、通常得られる遺伝子組換え植物は遺伝的に単一の細胞からなり、すべての細胞において導入遺伝子を有するものである。仮に一部の細胞にしか外来遺伝子を有しない植物（キメラ植物）が得られたとしても、それは偶然の結果であり、現在の技術を以って植物体の特定の部分の細胞にのみ遺伝子が導入されるように制御することは非常に困難である。また偶然得られたとしても、前述のように、一部の細胞層にのみ遺伝子を有する周縁キメラとなる確率は極めて低いと考えられる。
遺伝子導入細胞を選抜する過程において、その一部にのみ外来遺伝子導入されたキメラ細胞塊あるいはキメラ植物体が出現することはあるが、この場合、全細胞層を通してキメラ、もしくはひとつの組織層自体がキメラとなっており、完全な周縁キメラ（特定の細胞層にのみ外来遺伝子が導入され、その細胞層自体は均一なもの）ではない。これまでに完全な周縁キメラ形質転換植物を作出し、それを分子生物学的手法で証明した例は極めて少ない。これまでにはｒｏｌ遺伝子と脱離因子を含むベクターを用いることにより、周縁キメラ体が作出できることを見出した例が報告されている（特開２００２−３１５４６０号）が、この場合はＬ３層の周縁キメラである。
遺伝子組換え植物においては、染色体に取り込まれた導入遺伝子はメンデルの法則に従いその子孫にまで安定して伝達される。これらの遺伝子組換え植物を交配親として用いることにより、導入遺伝子に由来する形質を利用してさらに新たな品種が作り出せる。
また、遺伝子組換え植物に関しては、生態系（環境）への影響（自然界への導入遺伝子の拡散等）が懸念されている。遺伝子組換え植物から非形質転換体や野生植物への遺伝子拡散を防ぐ技術としては、（１）母性遺伝の利用、（２）雄性不稔の利用、（３）不稔種子の利用などが知られている。母性遺伝の利用とは、花粉細胞には伝わらない葉緑体のゲノムに外来遺伝子を導入することで、花粉による遺伝子拡散を防ぐ方法である。
雄性不稔の利用とは、花粉形成を阻害したり、花粉に生殖能を持たせない方法をいい、これにより遺伝的隔離を行うことができる。例えば雄性生殖器官特異的に発現するプロモーターを使って有害な遺伝子産物を組織特異的に作らせて、花粉形成を阻害する方法などがある。不稔種子の利用とは遺伝子組換え植物の種子形成を直接阻害することにより、交雑あるいは種子の拡散の両方を防ぐ方法であり、自家採種を不可能にする「ターミネーターテクノロジー」等はこれに該当する。
仮に生殖細胞には導入遺伝子を持たない遺伝子組換え植物を作出することができれば、その組換え植物を花粉親とした場合あるいは種子親とした場合いずれにおいても、交雑による導入遺伝子拡散の可能性を完全に排除できることになる。このことは、遺伝子組換え植物を野外で栽培したり、産業利用したりする者にとっては、遺伝子組換え植物の栽培のための手続きに係る負担を軽減することにもなる。このような手続は、日本国内においては、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（カルタヘナ法）」に基づく生物多様性影響評価などであり、他の国においては同様の法律に基く評価がある。
【特許文献１】特表平１０−５０３３７４号公報
【特許文献２】特開２００２−３１５４６０号
【特許文献３】ＵＳＰ  ５４８０７８９
【特許文献４】ＷＯ  ２００５／０１７１４７
【特許文献５】ＰＣＴ／ＪＰ９６／００３４８
【非特許文献１】Ｆｉｒｏｏｚａｂａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８８３−８８８  １９９４
【非特許文献２】Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６３−９６７，１９９１
【非特許文献３】Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６  ４２１−４３１，１９９８
【非特許文献４】Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５−５９  １９９６
【発明の開示】
【０００３】
従って、本発明は、導入遺伝子が植物体の一部分の細胞にのみ存在し、例えば生殖細胞には存在しない遺伝子導入のバラ等の花卉植物を提供するものである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく種々検討した結果、外来遺伝子をアグロバクテリウム・ツメファシエンスを介して花卉植物に導入し、再生した花卉植物がキメラ植物となる場合があることを見出した。さらに、その中から周縁キメラの植物を選択することにより、目的とする遺伝子組換え花卉植物が得られることを見出し、本発明を完成した。従って本発明は、外来遺伝子が一部の細胞に存在し、他の細胞には存在しないバラ等の花卉植物を提供する。
好ましくは、前記一部の細胞は一部の細胞層を構成している。例えば、上記他の細胞は、例えば花粉又は胚珠である。より具体的な例として、前記一部の細胞層が、Ｌ１層であるか、またはＬ１層とＬ３層とである。外来遺伝子としては、フラボノイドの合成に係る遺伝子、中でもアントシアニンの合成に係る遺伝子等の花色に関する遺伝子が挙げられる。
花卉植物がバラの場合においては、外来遺伝子は、例えばスミレ科植物由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子、ゴマノハグサ科植物由来の芳香族アシル基転移酵素遺伝子が重要である。前記スミレ科植物は例えばスミレ科パンジーであり、前記ゴマノハグサ科植物は例えばゴマノハグサ科トレニアである。前記バラは、例えばバラ品種ＷＫＳ８２などのハイブリッドティー、フロリバンダ、ミニバラである。本発明のバラは導入遺伝子の効果によって、たとえば遺伝子導入前のバラと比べて花色が青色方向に変化している。
花卉植物がカーネーションの場合においては、外来遺伝子は、例えば前記外来遺伝子が、キンギョソウ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター制御下にあるサルビア由来のフラボノイド３’、５’−水酸化酵素遺伝子ｃＤＮＡ、ペチュニアのジヒドロフラボノール４−還元酵素の染色遺伝子、カーネーション由来のアントシアニジン合成酵素遺伝子のうちの一ないし複数の遺伝子である。前記カーネーションは、スタンダードタイプまたはスプレータイプのものである。本発明のカーネーションは導入遺伝子の効果によって、たとえば遺伝子導入前のカーネーションと比べて花色が青色方向に変化している。
しかし、外来遺伝子は上記のような遺伝子に限定されるものではなく、広く色素合成系で機能する遺伝子、例えばフラボノイド合成系で機能する遺伝子であってもよい。また外来遺伝子はＧＦＰ遺伝子やＮＰＴＩＩ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ＳＵＲＢ遺伝子のような選択マーカーの遺伝子であってもよい。さらに外来遺伝子は転写因子をコードする遺伝子でもよく、例えばｍｙｂ様転写因子をコードする遺伝子、具体的にはＰＨＲ１遺伝子やＰｓｒ１遺伝子であってもよい。
本発明はまた、上記のバラ等の花卉植物と同じ性質を有するそれらの組織、及びこれらの栄養増殖体を提供する。
本発明は更に、前記のバラ等の花卉植物の製造方法において、外来遺伝子をアグロバクテリウムを介してバラに導入し、そして当該外来遺伝子が一部の細胞にのみ存在するバラを選択する工程を含む方法を提供する。本発明はさらに、請求項３〜２７のいずれかに１項に記載の、生殖細胞に外来遺伝子をもたない花卉植物を作出することにより自然界への導入遺伝子の拡散を防止する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、導入された遺伝子の、バラの各器官における存在の有無を示す図である。
図２は、導入された外来遺伝子がＬ１層の細胞においてのみ発現しており、Ｌ２層及びＬ３層には発現していないことを示す。
図３は、実施例２において使用するバイナリーベクターｐＳＰＢ１３０の構造を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明で用いられる花卉植物は、アグロバクテリウムを介して外来遺伝子を導入可能な花卉植物であれば特に限定されない。例えば、バラ、カーネーション、ペチュニア、トレニア、タバコ、バーベナ、ニーレンベルギア、キク、ユリ、アサガオ、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、チューリップ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、カリフラワーなどが挙げられる。なかでも、バラ、カーネーション、ペチュニア、トレニア、タバコ、バーベナ、ニーレンベルギアが好ましい。中でも、バラとカーネーションは特に好適に用いることができる。
本発明で用いる外来遺伝子としては、導入後にＬ１層の細胞で機能する酵素の遺伝子であることが望ましい。例えば花色に関する遺伝子や選択マーカーの遺伝子、あるいは転写因子をコードする遺伝子が好ましい。花色に関する遺伝子としては、フラボノイドの合成に係る酵素の遺伝子、たとえばアントシアニン合成に関わる遺伝子やオーロン合成に関する蛋白質をコードする遺伝子、液胞のｐＨを制御する蛋白質をコードする遺伝子、脂肪族アシル基転移酵素をコードする遺伝子、フラボン合成酵素をコードする遺伝子などが挙げられる。選択マーカー遺伝子としてはＧＦＰ遺伝子やＮＰＴＩＩ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ＳＵＲＢ遺伝子などが挙げられる。転写因子をコードする遺伝子としては、例えばＭＹＢ様の転写因子をコードする遺伝子、具体的にはＰＨＲ１遺伝子やＰｓｒ１遺伝子が挙げられる。しかし、これら具体的に挙げた遺伝子に限定されるものではない。
本発明で用いるバラは、園芸種または野性種のいずれでもよい。なかでも、商業的に有用なハイブリッドティー、フロリバンダ、グランディ・フローラまたはミニバラ等の園芸種（Ｒｏｓａ  ｈｙｂｒｉｄａ）が望ましい。これらの品種は特に限定されない。
バラのカルスに一定の条件下で、アグロバクテリウムを介して、パンジー由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子の発現カセットならびにトレニア由来の芳香族アシル基転移酵素遺伝子ＮＰＴＩＩ遺伝子の発現カセットからなるＴ−ＤＮＡを導入した。得られた形質転換は導入遺伝子の作用により花色が変化したことから、導入遺伝子が花弁の細胞、とくに色素合成を行っている花弁のＬ１層の細胞には存在することが示唆された。バラの各々の器官にわけて抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、花粉細胞には導入遺伝子が存在しないことが示唆された。
また、当該組換え植物から得られた花粉を用いて他の園芸種ならびに野生種のバラと交雑試験を行った場合において、得られた種子には導入遺伝子が全く検出されなかった。このことからも、導入遺伝子が花粉細胞には含まれていないことが示唆された。更にｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、導入遺伝子がＬ１細胞層にのみ存在することが明かとなった。このことは、Ｌ２細胞層を起源として形成される花粉などの生殖細胞には導入遺伝子が存在しないことを裏付けるものである。よって、上記のようにしてバラカルスに外来遺伝子を導入することにより、一部の細胞にのみ導入遺伝子を有するキメラ植物を作出することができる。
このうち、フラボノイド類の合成に係る酵素の遺伝子としては、フラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子や芳香族アシル基転移酵素遺伝子が挙げられる。これらの由来は特に限定されないが、バラで機能することが確認されている、パンジーなどスミレ科植物由来のフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子、あるいは、トレニアなどゴマノハグサ科植物由来の芳香族アシル基転移酵素遺伝子が好ましい。
本発明で用いるカーネーションは、商業的に有用なスタンダードタイプまたはスプレータイプが望ましい。これらの品種は特に限定されない。フィーリングホワイト、ブレクロスドゥジィ、スターザール、コルティナシャネルなどいずれの品種でもよい。
カーネーションについて、一定の条件下で、アグロバクテリウムを介して、キンギョソウ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター制御下にあるサルビア由来のフラボノイド３’、５’−水酸化酵素遺伝子ｃＤＮＡ、ペチュニアのジヒドロフラボノール４−還元酵素の染色遺伝子、カーネーション由来のアントシアニジン合成酵素遺伝子ＳＵＲＢ遺伝子を導入した。得られた形質転換は導入遺伝子の作用により花色が変化したことから、導入遺伝子が花弁の細胞、とくに色素合成を行っている花弁のＬ１層の細胞には存在することが示唆された。カーネーションの各々の器官にわけて抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、導入遺伝子がＬ１層にのみ存在するキメラ植物であること判断された。
【実施例】
【０００６】
次に、本発明を実施例により、更の具体的に説明する。
実施例１． バラへの遺伝子導入方法
バラの形質転換に関してはすでに多くの方法が報告されており（たとえばＦｉｒｏｏｚａｂａｂｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：８８３−８８８  １９９４，ＵＳ  ５４８０７８９、ＷＯ  ２００５／０１７１４７）、これらの方法に従ってバラへ外来遺伝子を導入することができる。
具体的にはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ａｇｌ０株（Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６３−９６７，１９９１）の菌液中に、無菌苗の葉から誘導したバラのカルスを５分間浸し、滅菌濾紙で余分な菌液を拭き取った後、継代用培地に移植し、２日間暗所で共存培養した。
その後、カルベニシリンを４００ｍｇ／ｌ加えたＭＳ液体培地で洗浄し、継代用培地にカナマイシン５０ｍｇ／ｌとカルベニシリン２００ｍｇ／ｌを加えた選抜・除菌用培地へ移植した。選抜培地上で生育阻害を受けず、正常に増殖する部分の移植と培養を繰り返し、カナマイシン耐性カルスを選抜した。
カナマイシン耐性を示した形質転換カルスを、カナマイシン５０ｍｇ／ｌ、カルベニシリン２００ｍｇ／ｌを添加した再分化用の培地で培養し、カナマイシン耐性シュートを得た。得られたシュートは１／２ＭＳ培地（カナマイシンを添加していない）で発根させた後、馴化を行った。馴化個体は鉢上げ後、閉鎖系温室で栽培して開花させた。その後、通常の栄養増殖（挿し木）にて維持・増殖を行った。
実施例２． バイナリーバクターｐＳＰＢ１３０の構築
アントシアニンを芳香族アシル基により修飾することによりアントシアニンを安定化させ、かつその色を青くすることができる（たとえば、ＰＣＴ／ＪＰ９６／００３４８）。アシル化したデルフィニジン型アントシアニンの生産を目指して以下の実験を行った。
トレニア（商品名：サマーウェーブ（商標））の花弁からｔｏｔａｌＲＮＡを得、さらにこれからｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを調製した。このｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をベクターとするｃＤＮＡライブラリーをｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃＤＮＡライブラリー作製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて製造者が推奨する方法で作製した。
トレニアの主要アントシアニンはその５位のグルコースが芳香族アシル基により修飾されている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ６，２３９−２４６，２０００）ので、トレニア花弁においてはアントシアニンアシル基転移酵素が発現している。アントシアニンアシル基転移酵素はＡｓｐ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ．というアミノ酸配列が保存されており、これに対応する合成ＤＮＡをプライマーとして用いることによりアントシアニンアシル基転移酵素遺伝子を取得することができる（ＰＣＴ／ＪＰ９６／００３４８）。
具体的には、トレニアｃＤＮＡライブラリー作製の際に合成した１本鎖ｃＤＮＡ１０ｎｇを鋳型とし、１００ｎｇのＡＴＣプライマー（５’−ＧＡ（ＴＣ）ＴＴ（ＴＣ）ＧＧＩＴＧＧＧＧＩＡＡ−３’，Ｉはイノシン、（ＴＣ）はいずれか一方を意味する）（配列番号：１）、１００ｎｇのオリゴｄＴプライマー（５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＧＡＧ−３’）（配列番号：２）をプライマーとし、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラ、日本）を用いて製造者の推奨する条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９５度１分、５５度１分、７２度１分を１サイクルとする反応を２５サイクル行った。得られた約４００ｂｐのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ（ＢＩＯ，１０１．Ｉｎｃ．）により製造者の推奨する方法で回収し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯにサブクローニングした。
その塩基配列を決定したところリンドウのアシル基転移酵素遺伝子（Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６  ４２１−４３１，１９９８）に相同な配列が見られた。なお塩基配列はダイプライマー法（アプライドバイオシステムズ社）を用い、シークエンサー３１０あるいは３７７（いずれもアプライドバイオシステムズ社）を用いて決定した。
このＤＮＡ断片をＤＩＧ標識検出キット（日本ロシュ）を用いてＤＩＧにより標識し、製造者が推奨する方法でトレニアのｃＤＮＡライブラリーをプラークハイブリダイゼーション法によりスクリーニングした。得られたポジティブシグナルをもたらしたクローンを無作為に１２個選択し、そこからプラスミドを回収し、塩基配列を決定した。これらはアントシアニンアシル基転移酵素によい相同性を示した。これらのクローンのうちｐＴＡＴ７としたクローンに含まれるｃＤＮＡの全塩基配列を決定した（配列番号：３）。
ｐＢＥ２１１３−ＧＵＳ（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４５−５９  １９９６）をＳａｃＩで消化した後、平滑末端化し、８ｂｐのＸｈｏＩリンカー（ＴａＫａＲａ）を挿入した。このプラスミドのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位にｐＴＡＴ７をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化して得られる約１．７ｋｂのＤＮＡを挿入し、ｐＳＰＢ１２０を得た。ｐＳＰＢ１２０をＳｎａＢＩとＢａｍＨＩで消化した後平滑末端化しライゲーションすることによりｐＳＰＢ１２０’を得た。一方、パンジー由来のＦ３’，５’Ｈ＃４０ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＣＧＰ１９６１をＢａｍＨＩで完全消化し、さらにＸｈｏＩで部分消化し得られる約１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、これとＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化したｐＵＥ５Ｈとライゲーションし得られたプラスミドをｐＵＥＢＰ４０とした。
ｐＵＥＢＰ４０をＳｎａＢＩとＢａｍＨＩで消化した後平滑末端化しライゲーションすることによりｐＵＥＢＰ４０’を得た。ｐＵＥＢＰ４０をＨｉｎｄＩＩＩで部分消化し得られる約２．７ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、ＨｉｎｄＩＩＩで部分消化したＤＮＡ断片と連結した。得られたプラスミドのうち、バイナリ−ベクター上でライトボーダー側から、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、パンジーＦ３’５’Ｈ＃４０、トレニア５ＡＴ遺伝子の順にそれぞれが同方向に連結されたバイナリ−ベクターをｐＳＰＢ１３０とした（図３）。本プラスミドは植物においてはパンジーＦ３’５’Ｈ＃４０遺伝子と５ＡＴ遺伝子構成的に発現し、遺伝子を花弁特異的に転写するように工夫されている。このプラスミドをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  Ａｇｌ０株に導入した。
実施例３． ＷＫＳ８２へのパンジーＦ３’，５’Ｈ＃４０遺伝子とトレニアアントシアニン５−アシル基転移酵素遺伝子の導入
藤色系バラ「ＷＫＳ８２」へｐＳＰＢ１３０を導入し、８９個体の形質転換体を得た。色素分析を行った４４個体全てでデルフィニジンの蓄積を確認した。デルフィニジン含有率は最高９１％（平均４９％）であった。花色はＲＨＳカラーチャート１８６ｄ（ＧＲＥＹＥＤ−ＰＵＲＰＬＥ  ＧＲＯＵＰ）から８０ｃ（ＰＵＲＰＬＥ−ＶＩＯＬＥＴ  ＧＲＯＵＰ）へ変化した。代表的な形質転換体の分析値を下表に示す。
【表１】
2008120820.tif 000002
Ｄｅｌ：デルフィジニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍ：ミリセチン、Ｑ：ケルセチン、Ｋ：ケンフェロール、Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合、Ａｃｙｌ（％）：総アントシアニン中のアシル化された色素の割合、ｎａ：分析未実施
【表２】
2008120820.tif 000003
Ｄｅｌ：デルフィジニジン、Ｃｙａ：シアニジン、Ｐｅｌ：ペラルゴニジン、Ｍ：ミリセチン、Ｑ：ケルセチン、Ｋ：ケンフェロール、Ｄｅｌ（％）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合、Ａｃｙｌ（％）：総アントシアニン中のアシル化された色素の割合、ｎａ：分析未実施
実施例４． 各器官における導入遺伝子の存在の有無確認
「ＷＫＳ８２」（以下、宿主という）及び実施例３で作出した組換え体Ｎｏ．５及びＮｏ．２４（ＷＫＳ８２／１３０−４−１及びＷＫＳ８２／１３０−９−１；以下、組換え体という）の花弁、葉、茎、根及び花粉よりＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて製造業者推奨の方法に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）によりＰＣＲ法にて導入遺伝子（パンジーＦ３’５’Ｈ遺伝子（配列番号４）、トレニア５ＡＴ遺伝子（配列番号３）、大腸菌ＮＰＴＩＩ遺伝子）の増幅を行った。
さらに、内在性コントロールとしてバラのアントシアニジン合成酵素（ＡＮＳ）遺伝子の増幅を行った。ＰＣＲの反応条件は、熱変性が９４℃で５分間、続いて９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２５回繰り返し、その後、伸長反応が７２℃で７分である。得られた増幅産物をアガロースゲルにて電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色によって増幅断片の検出を行った。
なお、パンジーＦ３’５’Ｈ遺伝子の増幅にはＢＰ４０−Ｆ２とＢＰ４０−Ｒ３を、トレニア５ＡＴ遺伝子の増幅にはＴＡＴ７−５０ＦとＴＡＴ７−Ｒ１を、ＮＰＴＩＩ遺伝子の増幅にはＮＰＴＩＩ−ＦとＮＰＴＩＩ−Ｒを、ＡＮＳ遺伝子の増幅にはＲｈＡＮＳ６９−ｒ１とＲｈＡＮＳ６９−ｍ１をプライマーとして用いた。
パンジーＦ３’５’Ｈ特異的プライマー
2008120820.tif 000004
トレニア５ＡＴ遺伝子特異的プライマー
2008120820.tif 000005
ＮＰＴＩＩ遺伝子特異的プライマー
2008120820.tif 000006
ＡＮＳ  特異的プライマー
2008120820.tif 000007
ＰＣＲによる解析の結果、本組換え体の花弁、葉、茎のゲノム中には導入遺伝子が検出されたが、根、花粉のゲノムにおいてはこれら導入遺伝子は検出されなかった。表３及び図１に結果を示した。
また、花弁、葉や茎の表皮系、がく片、雄ずい、雌ずいはＬ１層及びＬ２層、花粉と卵細胞はＬ２層、葉や茎の内部組織、根はＬ３層に由来することが知られている。根及び花粉のゲノムにおいて導入遺伝子が検出されなかったことより、本組換え体は導入遺伝子がＬ１層にのみ存在するキメラ植物であることが示唆された。
【表３】
2008120820.tif 000008
実施例５． 園芸種との人工交配（温室内）
常法に従い、園芸種の開花直前に除雄、袋かけをした後、雌しべが十分に成熟した時点で晴天日の午前中に温室内で栽培した宿主あるいは実施例３で作出した組換え体Ｎｏ．２４（ＷＫＳ８２／１３０−９−１；以下、組換え体という）の花粉を付着させた。その後、他の花粉が付着しないように再度袋かけを行い、種子形成の有無を調査した。なお、花粉は開裂前の葯を回収後、シリカゲルを入れたデシケータ内で１日間室温放置し、翌日開裂した葯から回収した新鮮な花粉を用いた。交雑母本として、グランディ・フローラ系四季咲きバラ品種「クイーンエリザベス」、フロリバンダ系四季咲きバラ品種「ゴールドバニー」を用いた。
交配後１ヶ月以上経過した時点で、生理落果せず、結実が認められた果実について種子形成の有無を確認した。さらに組換え体との交配により得られた種子については、後代における導入遺伝子の伝達性を確認するため、得られた種子よりＮｕｃｌｅｏｎ  ＰＨＹＴＯＰＵＲＥ  ｆｏｒ  ＰＬＡＮＴ  ＤＮＡ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ  ＫＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、さらにＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてこれを増幅後、ＰＣＲ法にて導入遺伝子（パンジーＦ３’５’Ｈ遺伝子）を検出した。
結果を表４に示した。結実率は、宿主及び組換え体間でほとんど差異は認められなかった。さらに組換え体との交配により得られた種子を解析した結果、これらの種子からは導入遺伝子は全く検出されなかった。このことから、花粉の受精能力については宿主と組換え体間で差異はないものの、組換え体の花粉細胞中には導入遺伝子が含まれていない等の理由により、導入遺伝子は後代に伝達されないことが示唆された。
【表４】
2008120820.tif 000009
実施例６． 園芸種との人工交配（野外）
常法に従い、園芸種の開花直前に除雄、袋かけをした後、雌しべが十分に成熟した時点で晴天日の午前中に野外で栽培した宿主あるいは実施例３で作出した組換え体Ｎｏ．２４（ＷＫＳ８２／１３０−９−１；以下、組換え体という）の花粉を付着させた。その後、他の花粉が付着しないように再度袋かけを行い、種子形成の有無を調査した。なお、花粉は開裂前の葯を回収後、シリカゲルを入れたデシケータ内で１日間室温放置し、翌日開裂した葯から回収した新鮮な花粉を用いた。
交雑母本として、グランディ・フロ−ラ系四季咲きバラ品種「クイーンエリザベス」、フロリバンダ系四季咲きバラ品種「ゴールドバニー」を用いた。
交配後３ヶ月以上経過した時点で、生理落果せず、結実が認められた果実について種子形成の有無を確認した。さらに組換え体との交配により得られた種子を回収し、４℃で３ヶ月間低温処理した後、播種した。これらにおける導入遺伝子の伝達の有無を確認するため、得られた実生の葉よりＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法にて導入遺伝子（パンジーＦ３’５’Ｈ遺伝子）の検出を行った。なお、内在性コントロール遺伝子としてバラのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の検出を行った。
また、種子を低温処理した場合、通常は１ヶ月程度で発芽が認められるが、３ヶ月経過してもその一部しか発芽が認められなかった。そこで、発芽しなかった播種種子の一部を再回収し、種子を用いて同様の解析を行った。再回収した種子より、Ｎｕｃｌｅｏｎ  ＰＨＹＴＯＰＵＲＥ  ｆｏｒ  ＰＬＡＮＴ  ＤＮＡ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ  ＫＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、さらにＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてこれを増幅後、ＰＣＲ法にて導入遺伝子（パンジーＦ３’５’Ｈ遺伝子）の検出を行った。
結果を表５及び表６に示す。結実率は、宿主及び組換え体間でほとんど差異は認められなかった。さらに、組換え体との交配により得られた実生をＰＣＲ法にて解析したが、これらの実生からは組換え体由来の導入遺伝子は検出されなかった。さらに、いずれの種子においても組換え体由来の導入遺伝子は検出されなかった。このことから、花粉の受精能力については宿主と組換え体間で差異はないものの、組換え体の花粉細胞中には導入遺伝子が含まれていない等の理由により、導入遺伝子は後代に伝達されないことが示唆された。
【表５】
2008120820.tif 000010
【表６】
2008120820.tif 000011
実施例７． 野生種との人工交配（野外）
常法に従い、園芸種の開花直前に除雄、袋かけをした後、雌しべが十分に成熟した時点で晴天日の午前中に野外で栽培した宿主あるいは実施例３で作出した組換え体Ｎｏ．２４（ＷＫＳ８２／１３０−９−１；以下、組換え体という）の花粉を付着させた。
その後、他の花粉が付着しないように再度袋かけを行い、種子形成の有無を調査した。なお、花粉は開裂前の葯を回収後、シリカゲルを入れたデシケータ内で１日間室温放置し、翌日開裂した葯から回収した新鮮な花粉を用いた。
交雑母本として、野生種はノイバラ（Ｒ．ｍｕｌｔｉｆｌｏｒａ  Ｔｈｕｎｂ．ｅｘ  Ｍｕｒｒａｙ）、テリハノイバラ（Ｒ．ｗｉｃｈｕｒａｉａｎａ  Ｃｒｅｐ．）、ハマナス（Ｒ．ｒｕｇｏｓａ  Ｔｈｕｎｂ．ｅｘ  Ｍｕｒｒａｙ）を用いた。
交配後２ヶ月以上経過した時点で、生理落果せず、結実が認められた果実について種子形成の有無を確認した。さらに得られた種子を回収し、４℃で３ヶ月間低温処理した後、播種した。これらにおける宿主あるいは組換え体との交雑の有無、導入遺伝子の伝達の有無を確認するため、得られた実生の葉よりＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法にて解析を行った。宿主あるいは組換え体との交雑の有無については四季咲き性に関与する遺伝子（ＫＳＮ遺伝子）を指標とし、導入遺伝子の伝達の有無については組換え体由来の導入遺伝子であるパンジーＦ３’５’Ｈ遺伝子を指標とした。なお、内在性コントロール遺伝子としてバラのＧＡＰＤＨ遺伝子を用いた。
ＫＳＮ遺伝子は一季咲きのバラのｋｓｎ遺伝子（茎頂を維持する働きをもつ）に約９ｋｂのトランスポゾンが挿入されて生じたもので、これにより当該遺伝子の発現が抑制され、茎頂における花芽の形成抑制が解除されるため、花芽形成が促進され、四季咲き性となることが報告されている１）。園芸種はＫＳＮ遺伝子をホモで有する。一方、一季咲きの野生種はｋｓｎ遺伝子をホモで有する。従って、野生種（一季咲き）においては、ＫＳＮ遺伝子は園芸種と交雑した場合にのみ検出されると考えられる。
また、種子を低温処理した場合、通常は１ヶ月程度で発芽が認められるが、３ヶ月経過してもその一部しか発芽が認められなかった。そこで、発芽しなかった播種種子の一部を再回収し、種子を用いて同様の解析を行った。再回収した種子より、Ｎｕｃｌｅｏｎ  ＰＨＹＴＯＰＵＲＥ  ｆｏｒ  ＰＬＡＮＴ  ＤＮＡ  ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ  ＫＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、さらにＲＥＰＬＩ−ｇ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にてこれを増幅後、ＰＣＲ法にて宿主あるいは組換え体との交雑の有無、導入遺伝子の伝達の有無について解析を行った。
結果を表７及び表８に示す。結実率は宿主、組換え体いずれを花粉親とした場合でも極めて低かった。得られた実生をＰＣＲ法にて解析したが、宿主あるいは組換え体と野生種との交雑は認められたものの、組換え体由来の導入遺伝子は検出されなかった。さらに、発芽しなかった播種種子を再回収し、種子の充実について観察を行ったところ、そのほとんどが「しいな（種子の中身がないもの）」であり、正常な胚が確認できた個体はごくわずかであった。これらについても同様にＰＣＲ法にて解析を行ったが、宿主あるいは組換え体と野生種との交雑は認められたものの、組換え体由来の導入遺伝子は検出されなかった。このことから、組換え体の花粉細胞中に導入遺伝子が含まれていない等の理由により、導入遺伝子が後代に伝達されなかったものであると考えられた。
よって、本組換え体と野生種（ノイバラ、テリハノイバラ、ハマナス）が交雑したとしても、組換え体の花粉細胞中に導入遺伝子が含まれていない等の理由から、導入遺伝子が後代に伝達される可能性はないことが示唆された。
なおテリハノイバラについては、いずれの種子も正常な胚を確認できなかった。
【表７】
2008120820.tif 000012
【表８】
2008120820.tif 000013
実施例８． ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
導入遺伝子の局在性をさらに詳しく調べるために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。５ｍｍ程度の大きさの蕾を垂直方向に半分に切断後、ホルムアルデヒド固定液に浸して固定した。次に脱水を行うため、固定液を５０％エタノールから１００％エタノールに順に置換し、さらに２５％レモゾールに置換（透徹）した。その後パラフィンを徐々に浸潤させ、包埋した。包埋サンプルをミクロトームで薄切し、スライドグラスに接着させた。スライドグラスを水和し、プロテネースＫ処理、アセチル化などの前処理を行った後、脱水、乾燥させた。ＤＩＧラベルしたプローブ（ＢＰ４０、ＴＡＴ、ＮＰＴＩＩ、各遺伝子のアンチセンス及びセンスプローブ）をハイブリダイゼーション溶液に溶解し、乾燥させたスライドグラスにのせ反応させた。ハイブリダイゼーション後、スライドグラスを洗浄し、ＤＩＧを検出した。
図２の写真に示されるように、導入遺伝子はＬ１層の細胞でのみ発現しており、Ｌ２層、Ｌ３層の細胞では発現が見られない。このことから、導入遺伝子はＬ１層にのみ存在しＬ２層、Ｌ３層には存在しないこと、ゆえにＬ２層から生じる生殖細胞（花粉細胞や胚珠の細胞）には導入遺伝子が存在しないことが証明された。
実施例９：組換えカーネーションの作製と解析
導入遺伝子がＬ１層にのみ存在するカーネーションを作成した。
組換えカーネーションは、アグロバクテリウムを用いる遺伝子導入により、以下のように作製した。プラスミドｐＣＧＰ２４４２（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＵＳ６０／９８８，２９３  出願日２００７年１１月１５日に記載）はそのＴ−ＤＮＡ領域に、キンギョソウ由来のカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター制御下にあるサルビア由来のフラボノイド３’、５’−水酸化酵素遺伝子ｃＤＮＡ、ペチュニアのジヒドロフラボノール４−還元酵素の染色遺伝子、カーネーション由来のアントシアニジン合成酵素遺伝子、さらに形質転換の選抜マーカーとしてカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター制御下にあるタバコのアセトラクテート合成遺伝子ＳＵＲＢｃＤＮＡが含まれている。これを特許出願特表平１１−５０５１１６に記載されている方法でアグロバクテリウムに導入し、さらにカーネーション品種コルティナシャネルに導入した。得られた組換えカーネーションの花弁には、天然のカーネーションには含まれないデルフィニジンが検出された。これは導入遺伝子が少なくとも花弁の上皮細胞で機能していることを示している。このうち１系統（系統１９９０７）について詳細に解析した。また、系統１９９０７から染色体ＤＮＡを抽出し、上述のｐＣＧＰ２４４２のＴ−ＤＮＡ上の遺伝子をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーション法により解析したところ、導入遺伝子が染色体に挿入されていることが確認された。
５μｇ／Ｌ  Ｇｌｅａｎを含むホルモンフリーＭＳ固形培地に系統１９９０７と系統２６８９８のシュートを植えることにより組織培養物を作製した。４−５週間に発根の有無を観察したところ、系統２６８９８は発根していたが、系統１９９０７は発根していなかった。
次に系統１９９０７と系統２６８９８および品種コルティナシャネルから得た葉の切片を５μｇ／Ｌ  Ｇｌｅａｎを含むｈａｌｆ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ＭＳ固形ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ０．５ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡとＧｌｅａｎを含まないｈａｌｆ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ  ＭＳ固形ｍｅｄｉｕｍ  ｗｉｔｈ  ０．５ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ上において５週間培養した。５μｇ／Ｌ  Ｇｌｅａｎを含む培地で培養した系統１９９０７と品種コルティナシャネルの葉片はいずれも褐変した。系統２６８９８の得られた葉片は緑色で発根が見られた。
系統１９９０７の葉と根からＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡ１００ｎｇを鋳型にし、ＳｕＲＢ遺伝子を増幅するための合成プライマー（＃  ９６０    ５’−ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＴＣＡＴＴＡ  ＧＡＡ  ＧＧ−３’，＃  １４６８  ５’−ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＴＧＣ−３’）  を用いてＰＣＲを行った。反応はＨｏｔ  Ｓｔａｒ  Ｔａｑを用い、２５μｌの反応体積で、９５度の反応を１５分行った後、  ９６度の反応を  １分，５２度の反応３０秒，７２度の反応を２分からなる１サイクルを３５サイクル行い、さらに７２度の反応を７分おこなった。この反応物をアガロースゲル電気泳動で解析したところ、葉由来のＤＮＡを鋳型とした場合には、ＳＵＲＢのバンドが観察されたが、根由来のＤＮＡを鋳型とした場合には、ＳＵＲＢのバンドが観察されなかった。
葉はＬ１、Ｌ２、Ｌ３細胞からなり、根はＬ２、Ｌ３細胞からなることが知られている。以上の結果から、系統１９９０７はＬ１細胞には導入遺伝子が入っているがＬ２，Ｌ３細胞には導入遺伝子が入っていないこと、すなわち、系統１９９０７は導入遺伝子がＬ１層にのみ存在するキメラ植物であること判断された。
実施例１０
各種植物について、本発明の技術の応用の可能性を検討した。
（１）ペチュニアへの感染例
花卉植物としてペチュニアを用いて、外来遺伝子としてフラボノイドの合成に係る遺伝子を導入した。
カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター上流にエンハンサー配列を２回繰り返し持つＥｌ２３５Ｓプロモーター配列（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９−５９（１９９６））と、チョウマメのＦ３’５’Ｈ  ｃＤＮＡ配列（特許出願番号ＷＯ  ２００４／０２０６３７に記載）、ノパリン合成酵素（ｎｏｓ）のターミネーター配列をバイナリーベクターｐＢｉｎＰｌｕｓ（Ｔｒａｎｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４，２８８−２９０（１９９５））に導入してあるｐＳＰＢ７４８（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３，ｓ２２７（２００２））より、チョウマメＦ３’５’Ｈ  ｃＤＮＡとｎｏｓターミネーターの連結したＤＮＡ断片（約２．０ｋｂ）をＢａｍＨＩ消化とＥｃｏＲＩの部分消化によって回収し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに導入することにより、プラスミドｐＢ−Ｂｎとした。マウスの異物応答配列（ＸＲＥ）を６回繰り返し持つ６ｘＸＲＥプロモーター配列と、ＧＵＳ遺伝子、ｎｏｓターミネーターをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｋｓ＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に導入してあるｐＢｌｕｅＳＸＸＲＥＧＵＳ（Ｋｏｄａｍａ（２００３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｎｔｓ，Ｄｉｓｓ．）よりＧＵＳ遺伝子とｎｏｓターミネーターの遺伝子カセットをＸｂａＩとＫｐｎＩで抜き出し、同サイトにｐＢ−ＢｎからＸｂａＩとＫｐｎＩ消化で切り出したチョウマメＦ３’５’Ｈとｎｏｓターミネーターの連結したＤＮＡ断片（約２．０ｋｂ）を挿入し、ｐＢ−Ｘ６Ｂｎを得た。バイナリーベクターｐＢｉｎ１９上に、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとｎｏｓターミネーターからなる発現ユニット２組にアルファルファモザイクウイルスの５’非翻訳（ＵＴＲ）配列をそれぞれ付加させたＡｈＲＶ及びＡｒｎｔを順方向に挿入したベクターｐＳＫＡＶＡｔ（Ｋｏｄａｍａ（２００３））のＳａｌＩサイトに、ｐＢ−Ｘ６ＢｎをＸｈｏＩ消化して切り出した６ｘＸＲＥプロモーター配列とチョウマメＦ３’５’Ｈ  ｃＤＮＡ、ｎｏｓターミネーター配列の遺伝子カセット（２．２ｋｂ）を導入することにより、ｐＳＰＢ１４５９を構築した。
ｐＳＰＢ１４５９をアグロバクテリウムツメファシエンスＡｇｌ０株（ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，９６３−９６７（１９９１））に導入し、ペチュニア（品種ＰＬ，Ｓｋｒ４  ｘＳｗ６３（Ｎａｔｕｒｅ，３６６，２７６−２７９と同じ））をリーフディスクを用いるアグロバクテリウム法で形質転換した。アグロバクテリウムへのプラスミドの導入、形質転換の方法は公知の方法（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５，ｐ８１−９２（１９９４））によった。品種ＰＬはフラボノイド３’，５’−水酸化酵素遺伝子、フラボノイド３’−水酸化酵素遺伝子を欠損しているため花色は白ないし薄いピンクであるが、本実験の目的には使用するペチュニア品種はＰＬに限定されるものではない。独立した形質転換ペチュニアＰＡＢを３８系統取得した。
（２）：トレニアへの感染例  その１
花卉植物としてトレニアを用いて、外来遺伝子として選択マーカーの遺伝子であるＧＦＰ遺伝子を導入した。
ＣａＭＶ３５Ｓ−ＳＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）−ＮＯＳ３’  （Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６，３２５−３３０（１９９６））をＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｓＧＦＰ遺伝子とｎｏｓターミネーター遺伝子の連結ＤＮＡ（１．０ｋｂ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ｓｋ−）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩサイトに導入することにより、プラスミドｐＢ−Ｇｎを構築した。ｐＢｌｕｅＳＸＸＲＥＧＵＳ−ｌａｓｔよりＧＵＳ遺伝子とｎｏｓターミネーターの遺伝子カセットをＸｂａＩとＫｐｎＩで抜き出し、同サイトにｐＢ−ＧｎからＸｂａＩとＫｐｎＩ消化で切り出したＳＧＦＰとｎｏｓターミネーターの遺伝子カセット（１．０ｋｂ）を挿入、ｐＢ−Ｘ６Ｇｎを構築。ｐＳＫＡＶＡｔのＳａｌＩサイトに、ｐＢ−Ｘ６ＧｎをＸｈｏＩ消化して切り出した６ｘＸＲＥプロモーターとｓＧＦＰ、ｎｏｓターミネーターの遺伝子カセット（１．２ｋｂ）を導入、ｐＳＰＢ１４５８を構築した。
ｐＳＰＢ１４５８をアグロバクテリウムツメファシエンスＡｇｌ０株に導入し、リーフディスクを用いるアグロバクテリウム法でトレニア（品種サマーウェーブブルー：ＳＷＢ（サントリーフラワーズ株式会社））リーフディスクに形質転換を行った。トレニアの形質転換は公知の方法（Ｍｏｌ．Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ６，２３９−２４６（２０００））によった。ＳＷＢの花色は青であるが、本実験の目的には使用するトレニア品種はＳＷＢに限定されるものではない。独立した形質転換トレニア系統ＴＡＧを４０系統取得した。
（３）  トレニアへの感染例  その２
花卉植物としてトレニアを用いて、外来遺伝子としてフラボノイドの合成に係る遺伝子を導入した。
ＷＯ２００５−０５９１４１に開示されている方法に準じ、トレニア品種サマーウェーブブルーを宿主植物として、上記同様のアグロバクテリウムを用いる方法により、オーロン合成に関わる遺伝子の発現カセットと、アントシアニン合成系遺伝子の発現をＲＮＡｉにより抑制するためのカセットを有するコンストラクト（ｐＳＦＬ３０７またはｐＳＦＬ３０８）を導入した。得られたトレニアでは、花色が青から黄色に変化した。
（４）タバコ、バーベナ、ニーレンベルギアへの感染例
花卉植物としてタバコ、バーベナまたはニーレンベルギアを用いて、外来遺伝子として転写因子遺伝子を導入した。
リン酸飢餓条件下で発現するシロイヌナズナのＰＨＲ１遺伝子（Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５：２１２２−２１３３（２００１））をＴＯＰＯ−ＴＡＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（インビトロジェン株式会社）を用い、解説書に従いｐＣＲ２．１ベクターにサブクローニングした。プライマーＰＨＲｆ（５’−ＡＴＧＧＡＧＧＣＴＣＧＴＣＣＡＧＴＴＣＡＴ−３’）とＰＨＲｒ（５’−ＴＣＡＡＴＴＡＴＣＧＡＴＴＴＴＧＧＧＡＣＧＣ−３’）を用いたＰＣＲ反応で増幅した産物をサブクローニングし、ｐＳＰＢ１８９２とした。３５Ｓプロモーターのエンハンサー配列とマノピンシンターゼプロモーターを連結した（Ｍａｃ）プロモーターとマノピンシンターゼ（ｍａｓ）ターミネーターを有するバイナリーベクターｐＳＰＢ２３１１をＳｍａＩで切断し、ｐＳＰＢ２３１１Ａを得た。ｐＳＰＢ１８９２をＥｃｏＲＩで切断し平滑化した断片をｐＳＰＢ２３１１Ａに挿入しｐＳＰＢ２３１４を得た。
引き続いて、公知の方法（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５，８１，１９９４）に基づいてｐＳＰＢ１８９８を用いてアグロバクテリウム（菌株：Ａｇｌ０）を形質転換し、このｐＳＰＢ１８９８を有する形質転換体アグロバクテリウムを用いて、タバコ、バーベナ、ニーレンベルギアの形質転換を実施した。タバコ、バーベナ、ニーレンベルギアの形質転換はそれぞれ公知の方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７，１２２９，１９８５；Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２１，４５９，２００３；Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３，１９，２００６）に基づき行った。得られた植物体の遺伝子導入については、各植物体の葉よりＤＮＡを抽出し、ＰＨＲ１遺伝子をテンプレートとしたＰＣＲにより確認した。タバコで１１個体、バーベナで１６個体、ニーレンベルギアで１個体のＰＨＲ１形質転換植物を取得した。
（５）インパチェンス、ベゴニアへの感染例
花卉植物としてインパチェンスまたはベゴニアを用いて、外来遺伝子として転写因子遺伝子を導入した。
インパチェンス（Ｉｍｐａｔｉｅｎｓ  ｗａｌｌｅｒｉａｎａ）の形質転換は基本的にＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２１，５１１に従い、品種グリッターレッド（サカタのタネ）とテンポピンク（タキイ種苗）を用いておこなった。ビトロ苗から切り出した茎頂、節、葉柄、葉片を前培養液体培地（１ｍｇ／Ｌ  ＴＤＺ  添加ＭＳ培地）で５日間前培養後、前培養固形培地（０．０５ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ，６ｍｇ／Ｌ  Ｚｅａｔｉｎ，０．３％ゲランガム添加ＭＳ培地）に４８時間静置した。その後、ｐＳＰＢ２３１４を導入したアグロバクテリウム（菌株Ａｇｌ０）を感染させ、選択培地上（０．０５ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ，６ｍｇ／Ｌ  Ｚｅａｔｉｎ，１００ｍｇ／Ｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，５００ｍｇ／Ｌ  Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００ｍｇ／Ｌ  Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ，０．３％ゲランガム添加ＭＳ培地）で４−８週間培養しシュートを得た（表９）。葉片は容易に褐変してしまいシュートは得られなかった。茎頂および節では１つの外植片より多くのシュートが得られたが、偽陽性も多数含まれると考えられた。葉柄からのシュートは出現に時間がかかり、数も少ないが、最も確からしい。
ベゴニア（Ｂｅｇｏｎｉａ  Ｓｅｍｐｅｒｆｌｏｒｅｎｓ）の形質転換は品種アンバサダーホワイトとアンバサダースカーレット（サカタのタネ）を用いておこなった。ビトロ苗から葉片と葉柄を切り出し、ｐＳＰＢ２３１４を導入したアグロバクテリウム（菌株Ａｇｌ０）を感染させ、共存培養培地（０．５ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ，０．１ｍｇ／Ｌ  ＴＤＺ，０．５％  ＰＶＰ，２ｍｇ／Ｌ  ＡｇＮＯ３，２００μＭ  Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ，０．３％ゲランガム添加ＭＳ培地）上で暗黒下３日間培養した。その後、前選択培地（１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ，１ｍｇ／Ｌ  Ｚｅａｔｉｎ，０．１ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ，５００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ，５０μＭ  Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ，０．２５％ゲランガム添加ＭＳ培地）で３−５日間、選択培地１（２ｍｇ／Ｌ  ＴＤＺ，０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ，１００ｍｇ／Ｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，５００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ，０．４％寒天添加ＭＳ培地）で２週間、選択培地２（０．２ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ，０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ，１００ｍｇ／Ｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，５００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ，０．４％寒天添加ＭＳ培地）で２週間、選択培地３（１００ｍｇ／Ｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，５００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ，０．４％寒天添加ＭＳ培地）で３週間連続して培養した。その間に形成されたシュートは直径５ｍｍ以上に成長したところで、周りの組織を削り取り、選択培地４（１５０ｍｇ／Ｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，５００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ，０．４％寒天添加ＭＳ培地）に移し、さらに２−３週間培養後、発根培地（１００ｍｇ／Ｌ  Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，５００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ，０．４％寒天添加ＭＳ培地）に移し発根シュートを得た（表１０）。
【表９】
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【表１０】
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以上のように、バラやカーネーション以外の花卉植物、例えばペチュニア、トレニア、タバコ、バーベナ、ニーレン、インパチエンス、ベゴニアなどにもアグロバクテリウムを用いて外来遺伝子を導入することが出来ることがわかった。導入する外来遺伝子としては、ここで挙げている具体的な遺伝子に限らず、導入後にＬ１細胞で機能する遺伝子であれば、いずれの遺伝子であっても同様の方法にてこれら花卉植物に導入することができると考えられる。本発明の技術はアグロバクテリウムを用いて外来遺伝子を導入することができる花卉植物に適応可能であることから、これらの植物についても、本発明の花卉植物、すなわち、導入遺伝子が形質転換体植物の一部の細胞にのみ存在し、他の細胞には存在しない花卉植物を作出することが可能である。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によって開示された方法によって作出される形質転換体植物は生殖細胞等を含むＬ２細胞層には導入遺伝子を有さず、Ｌ１層の細胞にのみ導入遺伝子を有するキメラ植物である。このような形質転換体は生殖細胞に導入遺伝子を有さないため、権限なき第三者により、当該遺伝子組換え植物が自由に交配親として利用される可能性を阻止することができる。
また、遺伝子組換え植物に関しては、自然界への導入遺伝子の拡散が懸念されるところ、このような生殖細胞に導入遺伝子を持たない遺伝子組換え植物を作出することで、導入遺伝子拡散の可能性が完全に否定されることとなる。よって、遺伝子組換え植物を産業上利用しようとする者にとっては遺伝子組換え植物の商業利用のための承認申請（日本国内においては、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律（カルタヘナ法）」に基づく生物多様性影響評価など）に係る負担を軽減することとなる。
［配列表］
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【図３】
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【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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