(57)【要約】遺伝子導入方法及び宿主細胞の種類に関わらず、より効率的に目的遺伝子を宿主細胞に導入することができる手段を提供する。  本発明の遺伝子導入補助試薬は、式（Ｉ）で示される特定のアミノ酸配列を含むペプチド若しくはその変異体、その誘導体、又はこれらの塩を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、遺伝子導入補助試薬。
（ａ）下記式（Ｉ）：
2008044794.tif 000064
（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｃはシステインを表し、［Ｄ／Ｎ］はアスパラギン酸又はアスパラギンを表し、［Ｆ／Ｙ］はフェニルアラニン又はチロシンを表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）下記式（Ｉ）：
2008044794.tif 000065
（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｃはシステインを表し、［Ｄ／Ｎ］はアスパラギン酸又はアスパラギンを表し、［Ｆ／Ｙ］はフェニルアラニン又はチロシンを表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項１記載の試薬の存在下で宿主細胞に遺伝子を導入することを特徴とする、遺伝子導入方法。
【請求項６】
請求項１記載の試薬を含むことを特徴とする、遺伝子導入用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞への遺伝子導入効率を上昇させる遺伝子導入補助試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養細胞に目的遺伝子を導入して変化を観察する方法は、遺伝子の機能を解析する場合などに用いられる。このような遺伝子導入方法は、遺伝子導入動物（トランスジェニック動物）を作製するよりも簡単で安価であるため、広く普及している。
培養細胞への遺伝子導入方法としては、種々の方法が知られており、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、リポソーム法（リポプレックス法）、ポリプレックス法、ペプチド法、及びウイルスベクター法等が例示される。特に、リポソーム法やポリプレックス法などのように、導入遺伝子と宿主細胞との両方に親和性のある試薬を用いて、遺伝子を細胞に取り込ませる方法が、効率的かつ簡便でありよく使用されている（例えば、Ｇａｏ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．２，ｐ．７１０−７２２，１９９５；Ｊ  Ｒｅｊｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｌａｔｈｒｉｎ  ａｎｄ  ｃａｖｅｏｌａｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｌｉｐｏ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｐｌｅｘ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１２，ｐ．４６８−４７４，２００５を参照）。
しかしながら、従来の遺伝子導入方法では、宿主細胞の種類によって導入効率にばらつきを生じるものが多かった。また、前記試薬には細胞毒性を有するものがあり、そのような試薬を使用する場合は十分量添加することができず、効率的に遺伝子導入を行うことが困難であった。そのため、実験及び研究の進行が妨げられることも多くあった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、遺伝子導入方法及び宿主細胞の種類に関わらず、より効率的に目的遺伝子を宿主細胞に導入することができる手段を提供すること、並びに当該手段を用いた遺伝子導入方法、及び遺伝子導入用キットを提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、目的遺伝子を宿主細胞に導入する際に、特定のペプチドを補助試薬として用いれば、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、遺伝子導入補助試薬。
（ａ）下記式（Ｉ）：
2008044794.tif 000002
（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｃはシステインを表し、［Ｄ／Ｎ］はアスパラギン酸又はアスパラギンを表し、［Ｆ／Ｙ］はフェニルアラニン又はチロシンを表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）下記式（Ｉ）：
2008044794.tif 000003
（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｃはシステインを表し、［Ｄ／Ｎ］はアスパラギン酸又はアスパラギンを表し、［Ｆ／Ｙ］はフェニルアラニン又はチロシンを表す。）
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
（３）上記（２）のＤＮＡを含む組換えベクター。
（４）上記（３）の組換えベクターを含む形質転換体。
（５）上記（１）の試薬の存在下で宿主細胞に遺伝子を導入することを特徴とする、遺伝子導入方法。
（６）上記（１）の試薬を含むことを特徴とする、遺伝子導入用キット。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、血管内皮細胞（Ｐｒｏ  ５）に対するｊｅｔ−ＰＥＩを用いた遺伝子導入において、遺伝子導入効率の上昇活性をＤｅｌ−１タンパク質の有無で比較したグラフである。
図２は、血管内皮細胞（Ｐｒｏ  ５）に対するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いた遺伝子導入において、遺伝子導入効率の上昇活性をＤｅｌ−１タンパク質の有無で比較したグラフである。
図３は、腎上皮由来細胞（Ｃｏｓ  １）に対する遺伝子導入において、遺伝子導入効率の上昇活性をＤｅｌ−１タンパク質の有無で比較したグラフである。
図４は、各タンパク質の遺伝子導入効率の上昇活性を比較したグラフである。
図５は、野生型マウス（ＷＴ）及びトランスジェニックマウス（ＴＧ）における血清中のアルカリフォスファターゼ活性を示したグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００６−２７６３２２号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．遺伝子導入補助試薬
本発明の遺伝子導入補助試薬（以下、本発明の補助試薬という。）は、先に述べた通り、下記（ａ）のペプチドを含むものである。
（ａ）下記式（Ｉ）：
2008044794.tif 000004
で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
上記（ａ）のペプチド中、式（Ｉ）のアミノ酸配列は、アミノ酸の１文字表記を用いて示したものであり、例えば、Ｃはシステイン（Ｃｙｓ）、Ｄはアスパラギン酸（Ａｓｐ）、Ｎはアスパラギン（Ａｓｎ）、Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）、Ｙはチロシン（Ｔｙｒ）を意味する。ただし、［Ｄ／Ｎ］はアスパラギン酸又はアスパラギンを表し、［Ｆ／Ｙ］はフェニルアラニン又はチロシンを表す。また、Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、任意のアミノ酸残基は、通常、２０種類のアミノ酸残基、すなわちＡ（Ａｌａ），Ｒ（Ａｒｇ），Ｄ（Ａｓｐ），Ｎ（Ａｓｎ），Ｃ（Ｃｙｓ），Ｑ（Ｇｌｎ），Ｅ（Ｇｌｕ），Ｇ（Ｇｌｙ），Ｈ（Ｈｉｓ），Ｉ（Ｉｌｅ），Ｌ（Ｌｅｕ），Ｋ（Ｌｙｓ），Ｍ（Ｍｅｔ），Ｆ（Ｐｈｅ），Ｐ（Ｐｒｏ），Ｓ（Ｓｅｒ），Ｔ（Ｔｈｒ），Ｗ（Ｔｒｐ），Ｙ（Ｔｙｒ），Ｖ（Ｖａｌ）から選択することができる。本明細書では、他のアミノ酸配列を示す場合も、式（Ｉ）と同様に１文字表記で表すことがある。
前記式（Ｉ）のアミノ酸配列は、以下の配列番号２〜５に示されるアミノ酸配列を含むものであり、なかでも配列番号２に示されるアミノ酸配列が好ましい。
2008044794.tif 000005
また、前記式（Ｉ）のアミノ酸配列としては、具体的には、以下の配列番号６〜７に示されるアミノ酸配列が好ましく挙げられ、なかでも配列番号６に示されるアミノ酸配列がより好ましい。
2008044794.tif 000006
本発明において、「ペプチド」とは、少なくとも２個以上のアミノ酸がペプチド結合によって結合して構成されたものを意味し、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが含まれる。さらに、ポリペプチドが一定の立体構造を形成したものはタンパク質と呼ばれるが、本発明においては、このようなタンパク質も上記「ペプチド」に含まれるものとする。従って、本発明の補助試薬に含まれるペプチドは、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質のいずれをも意味し得るものである。
また本発明の補助試薬は、先に述べた通り、下記（ｂ）のペプチドを含むものであってもよい。
（ｂ）前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
ここで、上記「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、例えば、１個〜５個程度、好ましくは１個〜２個程度のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられ、限定はされない。ただし本発明においては、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列における第１番目、第３番目、第８番目、第１０番目及び第１２番目のアミノ酸残基（順に、Ｃ、［Ｄ／Ｎ］、［Ｆ／Ｙ］、Ｃ及びＣ）が欠失、置換又は付加されていないもの、並びに／又は、前記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列における第２番目、第４〜７番目、第９番目及び第１１番目のアミノ酸残基（いずれもＸ）が欠失又は付加されていないものが好ましい。上記欠失、置換、付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えば、ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社製）、及びＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、上記欠失、置換又は付加の変異が導入されたペプチドであるかどうかは、各種アミノ酸配列決定法、並びにＸ線及びＮＭＲ等による構造解析法などを用いて確認することができる。
本発明において、遺伝子導入効率の上昇活性とは、宿主細胞のエンドサイトーシス及びファゴサイトーシスの亢進を意味し、当該活性は、例えば、導入遺伝子として、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、及びＧＦＰ又はその変異体（ＥＧＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ等）などのレポーター遺伝子を用いたレポーターアッセイにより測定することができる。
本発明の補助試薬に含まれる前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドは、前記式（Ｉ）のアミノ酸配列を含むペプチド、又は前記欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチドである限り、その構成アミノ酸の残基数は限定されず、好ましくは１２残基以上であり、例えば１２〜１００残基であってもよいし、１２〜５０残基であってもよいし、１２〜３０残基であってもよい。
前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドは、天然物由来のペプチドであってもよいし、人工的に化学合成して得られたものであってもよく、限定はされないが、天然物由来のペプチドである場合は、細胞毒性等の悪影響がない場合が多いため好ましい。
天然物由来のペプチドとしては、天然に存在するオリゴペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、又はこれらを断片化した状態のもの等が挙げられる。天然物由来のペプチドは、天然物から公知の回収法及び精製法により直接得てもよいし、又は、公知の遺伝子組換え技術により、当該ペプチドをコードする遺伝子を各種発現ベクター等に組込んで細胞に導入し、発現させた後、公知の回収法及び精製法により得てもよい。あるいは、市販のキット、例えば、試薬キットＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（東洋紡社製）、ＴＮＴＴＭ  Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）、合成装置のＰＧ−ＭａｔｅＴＭ（東洋紡社製）及びＲＴＳ（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）等を用いた無細胞タンパク質合成系により当該ペプチドを産生し、公知の回収法及び精製法により得てもよく、限定はされない。
また、化学合成ペプチドは、公知のペプチド合成方法を用いて得ることができる。合成方法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、カルボイミダゾール法及び酸化還元法等が挙げられる。また、その合成は、固相合成法及び液相合成法のいずれをも適用することができる。市販のペプチド合成装置を使用してもよい。合成反応後は、クロマトグラフィー等の公知の精製法を組み合わせてペプチドを精製することができる。
ここで、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドであって天然物由来のペプチドに該当するものとして、（ｉ）内皮細胞遺伝子座−１（Ｄｅｌ−１；ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｌｏｃｕｓ−１）タンパク質及びその部分断片、並びに（ｉｉ）血液凝固因子  第ＩＸ因子を、以下に例示説明する。
Ｄｅｌ−１タンパク質は、上皮増殖因子（ＥＧＦ；ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）類似ドメイン及びジスコイジンＩ類似ドメインを有する細胞外基質タンパク質であり、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。このＤｅｌ−１タンパク質のＥＧＦ類似ドメインとしてはＥＧＦ１、ＥＧＦ２及びＥＧＦ３があり、ジスコイジンＩ類似ドメインとしてはＤｉｓｃｏｉｄｉｎ１及びＤｉｓｃｏｉｄｉｎ２があることが知られている。本発明者は、上記各種ドメインのうちＥＧＦ３に着目し、さらにＥＧＦ３を構成するアミノ酸配列（配列番号１２）中の特定の１２アミノ酸残基からなる領域：Ｃ−Ｔ−Ｄ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｎ−Ｙ−Ｓ−Ｃ−Ｅ−Ｃ（配列番号８）に着目した。そして、この特定領域を含むペプチドが、遺伝子導入効率の上昇活性を有することを見出した。すなわち、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドであって天然物由来のペプチドに該当するものとしては、例えば、Ｄｅｌ−１タンパク質全長、並びにＥＧＦ３からなる部分断片、及びＥＧＦ３を一部に含む各種部分断片を挙げることができる（表１参照）。なお、Ｄｅｌ−１タンパク質及びその部分断片に関する詳細については、ＷＯ  ２００５／０００１０９３に記載の内容を全て参酌することができ、表１に示したアミノ酸配列を有する部分断片以外の部分断片についても本発明の例示として含むことができる。例えば、下記表１中の「Ｄｅｌ−１全長」のうちシグナルペプチド部分を除いたアミノ酸配列を有する部分断片も、本発明の例示として含まれる。なお、上記の「Ｄｅｌ−１全長のうちシグナルペプチド部分を除いたアミノ酸配列」とは、配列番号９で示される塩基配列のうちの第６９４番目〜第２０６１番目の塩基からなる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列、すなわち配列番号１０で示されるアミノ酸配列のうち第２６番目〜第４８０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列である。
【表１】
2008044794.tif 000007
また、血液凝固因子  第ＩＸ因子は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、Ｎ末端から順に、Ｇｌａドメイン、ＥＧＦドメイン及びプロテアーゼドメインを有する一本鎖糖タンパク質である。ここで、第ＩＸ因子のＥＧＦドメインは、配列番号２８に示されるアミノ酸配列のうちの第９０番目〜第１２３番目のアミノ酸からなる配列（配列番号３０）で構成される。本発明者は、第ＩＸ因子のＥＧＦドメインを構成するアミノ酸配列中には、前述したＤｅｌ−１タンパク質のＥＧＦ３（ＥＧＦ類似ドメイン）と同様に、特定の１２アミノ酸残基からなる領域：Ｃ−Ｋ−Ｄ−Ｄ−Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｅ−Ｃ−Ｗ−Ｃ（配列番号３１）が含まれていることに着目し、この領域を含むペプチドが、遺伝子導入効率を高めることができることを見出した。すなわち、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドであって天然物由来のペプチドに該当するものとしては、例えば、第ＩＸ因子全長のほか、配列番号３１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片又は当該断片を一部に含む各種部分断片、及びＥＧＦドメインからなる部分断片又は当該ＥＧＦドメインを一部に含む各種部分断片を挙げることができる。なお、第ＩＸ因子全長をコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号２７に示されるものであり、第ＩＸ因子のＥＧＦドメインをコードするＤＮＡの塩基配列は、配列番号２９に示されるものである。
本発明の補助試薬は、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドとともに又はそれに代えて、当該ペプチドの誘導体を含むことができる。誘導体とは、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドに由来して調製され得るものをすべて含む意味であり、例えば、構成アミノ酸の一部が非天然のアミノ酸に置換されたものや、構成アミノ酸（主にその側鎖）の一部に化学修飾が施されたもの等が挙げられる。
本発明の補助試薬は、前記（ａ）或いは（ｂ）のペプチド、及び／又は当該ペプチドの誘導体とともに又はそれに代えて、当該ペプチド及び／又は当該誘導体の塩を含むことができる。当該塩としては、生理学的に許容される酸付加塩又は塩基性塩が好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸などの無機酸との塩、あるいは酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。塩基性塩としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化マグネシウムなどの無機塩基との塩、あるいはカフェイン、ピペリジン、トリメチルアミン、ピリジンなどの有機塩基との塩が挙げられる。
塩は、塩酸などの適切な酸、又は水酸化ナトリウムなどの適切な塩基を用いて調製することができる。例えば、水中、又はメタノール、エタノール若しくはジオキサンなどの不活性な水混和性有機溶媒を含む液体中で、標準的なプロトコルを用いて処理することにより調製することができる。
本発明の補助試薬は、上述した（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩からなるものであってもよいし、当該ペプチド、その誘導体又はこれらの塩と他の成分とを含むものであってもよく、限定はされない。他の成分としては、例えば、ＰＢＳ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、並びにアジ化ナトリウム及びグリセロール等の添加剤などが挙げられる。他の成分を含む場合、その含有割合は、上記ペプチド、その誘導体又はこれらの塩による遺伝子導入効率の上昇活性が著しく妨げられない範囲で、適宜設定することができる。
２．ＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを構成するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含むものである。したがって、本発明のＤＮＡは、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする塩基配列からなるＤＮＡのみからなるものであってもよいし、あるいは、当該ＤＮＡを一部に含み、その他に遺伝子発現に必要な公知の塩基配列（転写プロモーター、ＳＤ配列、Ｋｏｚａｋ配列、ターミネーター等）を含むものであってもよく、限定はされない。なお、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする塩基配列では、コドンの種類は限定されず、例えば、転写後、ヒト等の哺乳類において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよいし、大腸菌や酵母等の微生物や、植物等において一般的に使用されているコドンを用いたものであってもよく、適宜選択又は設計することができる。
また本発明においては、前記（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードする塩基配列を含むＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって遺伝子導入効率の上昇活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含むことができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、塩（ナトリウム）濃度が１５０〜９００ｍＭであり、温度が５５〜７５℃、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が１５０〜２００ｍＭであり、温度が６０〜７０℃での条件をいう。
３．組換えベクター、形質転換体
（１）ＤＮＡを含む組換えベクター
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルス等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。またウイルスとしてはアデノウイルスやレトロウイルスなどが挙げられる。
本発明のベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
（２）形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入して得ることができる。宿主としては、本発明のＤＮＡを発現し得るものであれば限定されず、例えば、当該分野において周知の細菌、酵母、動物細胞等を用いることができる。またマウスなどの実験動物を用いることもできる。
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含めることができる。細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などが挙げられる。プロモーターとしては、例えばｌａｃプロモーターなどが用いられる。細菌へのベクター導入法としては、例えばカルシウムイオン法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター等が挙げられる。酵母へのベクター導入法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、ＣＨＯ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞などが用いられる。プロモーターとしては、ＳＶ４０プロモーター等が挙げられる。動物細胞へのベクター導入法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等が挙げられる。
また、動物又は植物に対する遺伝子導入には、ウイルスベクター法やリポフェクション法などが用いられる。さらに、生殖細胞やＥＳ細胞に対して遺伝子を導入し、遺伝子組み換え動物を作製することも可能である。
４．遺伝子導入方法
本発明の遺伝子導入方法は、先に述べた通り、本発明の補助試薬の存在下で宿主細胞に遺伝子を導入することを特徴とする方法である。
本発明の方法は、具体的には、リポソーム法（リポプレックス法）、ポリプレックス法、ペプチド法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、及びウイルスベクター法などの公知の各種遺伝子導入方法を用いた宿主細胞内への遺伝子導入反応において、少なくとも遺伝子導入時に本発明の補助試薬を同一反応系内に存在させることを特徴とする方法である。よって、本発明の補助試薬を上述のように存在させる限りにおいては、本発明の補助試薬を、各種遺伝子導入試薬及び／又は導入する目的遺伝子と共に反応系内に加えるようにしてもよいし、別々に加えてもよく、限定はされない。
本発明の方法は、上記のように本発明の補助試薬を用いる以外はどのような工程を含むものであってもよく、限定はされないが、通常は、公知の各種遺伝子導入方法のプロトコルに従った工程を含むことが好ましい。
本発明の補助試薬を用いた本発明の方法は、各種遺伝子導入方法を通常のプロトコルで行った場合に比べて、宿主細胞への遺伝子導入効率を効果的に高めることができる。また、本発明の方法は、使用する宿主細胞の種類に関わらず、遺伝子導入効率を高めることができる。
５．遺伝子導入用キット
本発明の遺伝子導入用キットは、先に述べた通り、構成成分として本発明の補助試薬を含むことを特徴とするものである。
本発明のキットは、公知の各種遺伝子導入方法により種々の宿主細胞に遺伝子を導入する場合に、導入効率をより一層高めることができるため、実験及び研究等の分野において極めて有用性が高いものである。
本発明のキットは、本発明の補助試薬以外に他の構成成分を含んでいてもよい。他の構成成分としては、限定はされないが、例えば、ＰＢＳ及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、アジ化ナトリウム及びグリセロール等の添加剤、実験マニュアル、並びに遺伝子導入試薬等を含むことができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
＜ポリプレックス法を用いた遺伝子導入法における導入効率の上昇＞
カチオン性の水溶性ポリマーである直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）をベースにした遺伝子導入試薬であるｊｅｔ−ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）を用いて、Ｐｒｏ５細胞（血管内皮細胞）にｌａｃＺ遺伝子を導入する実験を行った。
まず、ｐＡＰｔａｇ−４ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社製）を用いて、アルカリフォスファターゼとＤｅｌ−１（シングルペプチド部分は除く）との融合タンパクをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを、以下の通り構築した。なお、ここで使用するｐＡＰｔａｇ−４ベクターは、目的タンパク質をコードするＤＮＡを所定の位置に挿入することにより、目的タンパク質のＮ末端にシグナルペプチドとアルカリフォスファターゼを融合させたタンパク質を一過的に発現させることができるベクターである。
受精後９〜１２日のマウス胎児よりＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を用いてＲＮＡを抽出し、このＲＮＡを鋳型として、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｐｔ  ＩＩ（インビトロジェン社製）を用いて、常法により逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを作製した。
このｃＤＮＡを鋳型として、配列番号１０で示される全長Ｄｅｌ−１のアミノ酸配列のうちシグナルペプチド部分を除いたアミノ酸配列をコードする塩基配列、すなわち、配列番号９で示される塩基配列のうちの第６９４番目〜第２０６１番目の塩基からなる塩基配列を、ＰＣＲにより増幅した。増幅産物がｐＡＰｔａｇ−４ベクターに挿入できるように、Ｆ及びＲプライマーとして、５’末端に制限酵素認識配列を導入したものを合成した。
Ｆプライマー：
2008044794.tif 000008
Ｒプライマー：
2008044794.tif 000009
上記ＰＣＲは、下記の反応液組成および反応条件で行った。
《反応液組成》
2008044794.tif 000010
《反応条件》
「９４℃で３０秒（熱変性・解離）→６２℃で３０秒（アニーリング）→７２℃で９０秒（合成・伸長）」を１サイクルとするサイクル条件で、計３５サイクル。
ＰＣＲ後の増幅断片とｐＡＰｔａｇ−４ベクターとを、ともにＢｇｌ  ＩＩ及びＸｈｏ  Ｉで処理した後、公知の遺伝子組換え技術により、増幅断片をｐＡＰｔａｇ−４ベクターに挿入し、目的の融合タンパクを発現し得る発現ベクターを構築した。
次いで、当該発現ベクターを、常法によりＣｏｓ１細胞に導入してコンディションメディウムを作製した。陰性対照（Ｄｅｌ１（−））には、ｐＡＰｔａｇ−４ベクターのみを使用した。次に、ｊｅｔ−ＰＥＩに添付された説明書の内容に従い、Ｐｒｏ５細胞とｌａｃＺ遺伝子のｃＤＮＡとを用意した。ｌａｃＺ遺伝子導入時の培養液中に、アルカリフォスファターゼとＤｅｌ−１との融合タンパクを添加し（Ｄｅｌ−１（＋））、陰性対照には、上記添加した融合タンパクと同等のアルカリフォスファターゼ活性を有する量のアルカリフォスファターゼを添加した。ｌａｃＺ遺伝子導入から７２時間後にＰｒｏ５細胞を採取して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
以上の結果を、図１のグラフに示した。
Ｄｅｌ−１の融合タンパクの添加により遺伝子導入効率を約６．５倍高めることができた。
【実施例２】
【０００７】
＜リポソーム法を用いた遺伝子導入法における導入効率の上昇＞
カチオン性脂質をベースにした遺伝子導入試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（インビトロジェン社製）を用いて、Ｐｒｏ５細胞（血管内皮細胞）にｌａｃＺ遺伝子を導入する実験を行った。
まず、実施例１と同様に、ｐＡＰｔａｇ−４ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社製）を用いて、アルカリフォスファターゼとＤｅｌ−１（シングルペプチド部分は除く）との融合タンパクをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築し、これをＣｏｓ  １細胞に導入してコンディションメディウムを作製した。陰性対照にはｐＡＰｔａｇ−４ベクターのみを使用した。次に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００に添付された説明書の内容に従い、Ｐｒｏ５細胞とｌａｃＺ遺伝子のｃＤＮＡとを用意した。ｌａｃＺ遺伝子導入時の培養液中に、アルカリフォスファターゼとＤｅｌ−１との融合タンパクを添加し（Ｄｅｌ−１（＋））、陰性対照（Ｄｅｌ−１（−））には、上記添加した融合タンパクと同等のアルカリフォスファターゼ活性を有する量のアルカリフォスファターゼを添加した。ｌａｃＺ遺伝子導入から７２時間後にＰｒｏ５細胞を採取して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
以上の結果を、図２のグラフに示した。
Ｄｅｌ−１の融合タンパクの添加により遺伝子導入効率を約１５倍高めることができた。
【実施例３】
【０００８】
＜腎上皮由来細胞（Ｃｏｓ  １）に対する遺伝子導入効率の上昇＞
ｊｅｔ−ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）を用いて、Ｃｏｓ  １細胞にｌａｃＺ遺伝子を導入する実験を行った。
まず、実施例１と同様に、ｐＡＰｔａｇ−４ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社製）を用いて、アルカリフォスファターゼとＤｅｌ−１（シングルペプチド部分は除く）との融合タンパクをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを構築し、これをＣｏｓ  １細胞に導入してコンディションメディウムを作製した。陰性対照（Ｄｅｌ−１（−））にはｐＡＰｔａｇ−４ベクターのみを使用した。次に、ｊｅｔ−ＰＥＩに添付された説明書の内容に従い、Ｃｏｓ  １細胞とｌａｃＺ遺伝子のｃＤＮＡとを用意した。ｌａｃＺ遺伝子導入時の培養液中に、アルカリフォスファターゼとＤｅｌ−１との融合タンパクを添加し（Ｄｅｌ−１（＋））、陰性対照には、上記添加した融合タンパクと同等のアルカリフォスファターゼ活性を有する量のアルカリフォスファターゼを添加した。ｌａｃＺ遺伝子導入から７２時間後にＰｒｏ５細胞を採取して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
以上の結果を、図３のグラフに示した。
Ｄｅｌ−１の融合タンパクの添加による遺伝子導入効率の上昇効果は、宿主細胞としてＰｒｏ  ５細胞を用いた場合（実施例１）は約６．５倍であったのに対し、Ｃｏｓ  １細胞を用いた本実施例の場合は約２．５倍であり、見かけの効果は小さいが、宿主細胞としてＣｏｓ  １細胞を使用する系は、もともと高い遺伝子導入効率が得られる系である。そのため、Ｃｏｓ  １細胞を使用する系において導入効率をさらに約２．５倍高めることができたことは、極めて優れた効果であるといえる。
【実施例４】
【０００９】
＜遺伝子導入効率の上昇活性を有するタンパク質の検討＞
Ｄｅｌ−１内のどのようなアミノ酸配列に遺伝子導入効率の上昇活性が有するか、及びＤｅｌ−１以外のタンパク質内のアミノ酸配列に同活性を有するものがあるか、検討した。
具体的には、下記（ｉ）〜（ｉｖ）の４種類の各タンパクについて、遺伝子導入効率の上昇活性を比較する実験を行った。
（ｉ）Ｄｅｌ−１（シングルペプチド部分は除く）
（ｉｉ）Ｄｅｌ−１のＥＧＦ３ドメイン（ＥＧＦ  ３ｒｄ  ｏｆ  Ｄｅｌ−１；配列番号１１）
（ｉｉｉ）Ｄｅｌ−１のＥＧＦ３ドメインの第１３６番目のアミノ酸であるアスパラギン酸をグルタミン酸に置換したタンパク（ＥＧＦ  ３ｒｄ  ｏｆ  Ｄｅｌ−１（Ｄ１３６Ｅ））
（ｉｖ）血液凝固因子  第ＩＸ因子のＥＧＦドメイン（Ｆ−ＩＸ）
まず、実施例１と同様に、ｐＡＰｔａｇ−４ベクター（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社製）を用いて、アルカリフォスファターゼと上記各タンパクとの融合タンパクをコードするＤＮＡを含む発現ベクターをそれぞれ構築した。
なお、上記各タンパクのうち（ｉｉ）ＥＧＦ  ３ｒｄ  ｏｆ  Ｄｅｌ−１及び（ｉｖ）Ｆ−ＩＸをコードするＤＮＡについては、それぞれ下記のプライマーを用いた以外は、実施例１と同様のＰＣＲを行うことにより得たものを使用した。
（ｉｉ）ＥＧＦ  ３ｒｄ  ｏｆ  Ｄｅｌ−１をコードするＤＮＡを得るためのプライマー
Ｆプライマー：
2008044794.tif 000011
Ｒプライマー：
2008044794.tif 000012
（ｉｖ）Ｆ−ＩＸをコードするＤＮＡを得るためのプライマー
Ｆプライマー：
2008044794.tif 000013
Ｒプライマー：
2008044794.tif 000014
また、（ｉｉｉ）ＥＧＦ  ３ｒｄ  ｏｆ  Ｄｅｌ−１（Ｄ１３６Ｅ）をコードするＤＮＡについては、上記ＰＣＲにより得られた（ｉｉ）ＥＧＦ  ３ｒｄ  ｏｆ  Ｄｅｌ−１をコードするＤＮＡを基にして、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により変異を導入して得られたものを使用した。
次に、上述のようにして構築した各発現ベクターを、それぞれＣｏｓ  １細胞に導入してコンディションメディウムを作製した。陰性対照（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）にはｐＡＰｔａｇ−４ベクターのみを使用した。ｌａｃＺ遺伝子導入時の培養液中に、アルカリフォスファターゼと上記各タンパクとの融合タンパクを添加し、陰性対照には、上記添加した融合タンパクと同等のアルカリフォスファターゼ活性を有する量のアルカリフォスファターゼを添加した。ｌａｃＺ遺伝子導入から７２時間後にＰｒｏ５細胞を採取して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
以上の結果を、図４のグラフに示した。
Ｄｅｌ−１のＥＧＦ３のみでも、Ｄｅｌ−１と同等な効果を示したため、活性中心はＥＧＦ３にあると考えられた。他種のタンパクに関する既報より、ＥＧＦ３のアミノ酸配列から、第１３６番目のアスパラギン酸がβハイドロキシレーションを受けることが予測された。そこで、ＥＧＦ３内のアスパラギン酸をグルタミン酸に置換したところ遺伝子導入効率の上昇活性は大幅に抑制された。このことから、ＥＧＦ３内のアスパラギン酸が重要なアミノ酸であることがわかった。さらに、自然界においてＤｅｌ−１のＥＧＦ３と同様な構造を有するタンパクである第９凝固因子のＥＧＦドメインについては、Ｄｅｌ−１のＥＧＦ３と同様に、高い遺伝子導入効率上昇活性を示した。従って、Ｄｅｌ−１のＥＧＦ３のみならず、これと同様なアミノ酸配列を含むファミリータンパクは、遺伝子導入効率の上昇活性を有することが示された。
【実施例５】
【００１０】
＜ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＤｅｌ−１の遺伝子導入促進作用＞
本発明のペプチドが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遺伝子導入促進作用を有することを確認した。
（１）方法
常法により、Ｄｅｌ−１全長のｃＤＮＡ（すなわち、配列番号９に示される塩基配列からなるＤＮＡ）を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製した（Ｈｉｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ  Ａ，ｖｏｌ．２８７Ａ，ｐ．１１６５−１１７５を参照）。なお、当該トランスジェニックマウスの細胞内において産生されるＤｅｌ−１タンパク質は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質（シグナルペプチドを含むもの）であり、当該細胞内から細胞外へ分泌されたＤｅｌ−１タンパク質は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列のうち第２６番目〜第４８０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有するタンパク質（シグナルペプチドを含まないもの）である。ＴｒａｎｓＩＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｒｕｓ社製）を用いて、上記トランスジェニックマウスの尾静脈よりヒト熱安定性アルカリフォスファターゼ遺伝子を注入した。２４時間後に採血し、血清を分離した。分離後、採取した血清に対し６５℃で３０分間の加熱処理を施すことにより、内因性のアルカリフォスファターゼを不活化した。加熱処理後の血清２０μｌを用いて、外因性のアルカリフォスファターゼ（ヒト熱安定性アルカリフォスファターゼ）の活性を測定した。当該活性の測定は、２０μｌの血清と２００μｌの１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅとを混和して、３０分から１時間、室温で反応させた後、マイクロメーター（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を知ることにより行われた。
一方、対照群としては、上記トランスジェニックマウスと同腹の野生型マウスを採用した。この野生型マウスに対しても、上記トランスジェニックマウスと同様に、ヒト熱安定性アルカリフォスファターゼ遺伝子を注入し、その後、採血等及び加熱処理を施して、外因性のアルカリフォスファターゼ活性を測定した。
アルカリフォスファターゼ活性の測定値は、平均値±ＳＥＭ（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｅｒｒｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅａｎ）で示すこととし、アルカリフォスファターゼ遺伝子の注入を施していない対照群から得られた測定値を１として、上記トランスジェニックマウスにおける測定値を算出した。その結果を、図５に示した。
（２）結果
まず、図５のグラフ左側（ｃｏｎｔｒｏｌ）に示したように、マウスにヒト熱安定性アルカリフォスファターゼ遺伝子を注入しなかった場合は、野生型マウス（ＷＴ）とトランスジェニックマウス（ＴＧ）との間で、内因性のアルカリフォスファターゼ活性には差がないことが確認された。
次に、図５のグラフ右側（ＡＰ−ｔａｇ４）に示したように、マウスにヒト熱安定性アルカリフォスファターゼ遺伝子を注入し、前述したように採血等及び加熱処理を施して、外因性のアルカリフォスファターゼ活性を測定した場合は、トランスジェニックマウス（ＴＧ）は野生型マウス（ＷＴ）と比較して約２倍のアルカリフォスファターゼ活性を示した。このことから、本発明のペプチド（Ｄｅｌ−１全長）は、ＴｒａｎｓＩＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍの遺伝子導入効率を向上させることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００１１】
本発明の補助試薬を用いることにより、各種遺伝子導入方法における遺伝子導入効率を大きく上昇させることができる。本発明の補助試薬は、どのような遺伝子導入方法を行うか、あるいは、どのような種類の宿主細胞や導入試薬を用いるかに関わらず、遺伝子導入効率を高めることができ、極めて実用性に優れたものである。そのため、市販の遺伝子導入試薬では低い導入効率しか得られなかった細胞においても目的遺伝子の導入効率を飛躍的に高めることができ、実験及び研究等の大幅な効率化を図ることができる。
【配列表フリーテキスト】
【００１２】
配列番号１：ペプチド
配列番号１：存在位置：３のＸａａはアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）を表し、存在位置：８のＸａａはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）又はチロシン（Ｔｙｒ）を表し、存在位置：２，４，５，６，７，９，１１のＸａａは任意のアミノ酸残基を表す。
配列番号２：ペプチド
配列番号２：存在位置：２，４，５，６，７，９，１１のＸａａは任意のアミノ酸残基を表す。
配列番号３：ペプチド
配列番号３：存在位置：２，４，５，６，７，９，１１のＸａａは任意のアミノ酸残基を表す。
配列番号４：ペプチド
配列番号４：存在位置：２，４，５，６，７，９，１１のＸａａは任意のアミノ酸残基を表す。
配列番号５：ペプチド
配列番号５：存在位置：２，４，５，６，７，９，１１のＸａａは任意のアミノ酸残基を表す。
配列番号６：ペプチド
配列番号６：存在位置：３のＸａａはアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）を表し、存在位置：８のＸａａはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）又はチロシン（Ｔｙｒ）を表し、存在位置：２，４，５，６，７，９，１１のＸａａは任意のアミノ酸残基を表す。
配列番号７：ペプチド
配列番号７：存在位置：３のＸａａはアスパラギン酸（Ａｓｐ）又はアスパラギン（Ａｓｎ）を表し、存在位置：８のＸａａはフェニルアラニン（Ｐｈｅ）又はチロシン（Ｔｙｒ）を表し、存在位置：２，４，５，６，７，９，１１のＸａａは任意のアミノ酸残基を表す。
配列番号３２：合成ＤＮＡ
配列番号３３：合成ＤＮＡ
配列番号３４：合成ＤＮＡ
配列番号３５：合成ＤＮＡ
配列番号３６：合成ＤＮＡ
配列番号３７：合成ＤＮＡ
［配列表］
2008044794.tif 000015
2008044794.tif 000016
2008044794.tif 000017
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2008044794.tif 000019
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2008044794.tif 000058
2008044794.tif 000059
2008044794.tif 000060
2008044794.tif 000061
2008044794.tif 000062
2008044794.tif 000063
【図１】
2008044794.tif 000066
【図２】
2008044794.tif 000067
【図３】
2008044794.tif 000068
【図４】
2008044794.tif 000069
【図５】
2008044794.tif 000070
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月11日(2008.8.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、遺伝子導入補助試薬。
（ａ）下記式（Ｉ）：
Ｃ−Ｘ−［Ｄ／Ｎ］−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−［Ｆ／Ｙ］−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｃ      （Ｉ）
（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｃはシステインを表し、［Ｄ／Ｎ］はアスパラギン酸又はアスパラギンを表し、［Ｆ／Ｙ］はフェニルアラニン又はチロシンを表す。）で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）下記式（Ｉ）：
Ｃ−Ｘ−［Ｄ／Ｎ］−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−［Ｆ／Ｙ］−Ｘ−Ｃ−Ｘ−Ｃ      （Ｉ）
（Ｘは任意のアミノ酸残基を表し、Ｃはシステインを表し、［Ｄ／Ｎ］はアスパラギン酸又はアスパラギンを表し、［Ｆ／Ｙ］はフェニルアラニン又はチロシンを表す。）で示されるアミノ酸配列を含むペプチド。
（ｂ）上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項５】
請求項１記載の試薬の存在下で宿主細胞に遺伝子を導入することを特徴とする、遺伝子導入方法。
【請求項６】
請求項１記載の試薬を含むことを特徴とする、遺伝子導入用キット。
【請求項７】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、遺伝子導入補助試薬。
（ａ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、遺伝子導入補助試薬。
（ａ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチド、その誘導体又はこれらの塩を含むことを特徴とする、遺伝子導入補助試薬。
（ａ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の試薬の存在下で宿主細胞に遺伝子を導入することを特徴とする、遺伝子導入方法。
【請求項１１】
請求項７〜９のいずれか１項に記載の試薬を含むことを特徴とする、遺伝子導入用キット。
【請求項１２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
【請求項１３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号３０で示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）上記（ａ）のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主細胞への遺伝子導入効率の上昇活性を有するペプチド。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項１５】
請求項１４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【国際調査報告】
2008044794.tif 000071
2008044794.tif 000072
2008044794.tif 000073
2008044794.tif 000074