(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ブロックＰＣＲまたは遺伝子合成法により遺伝子標的化用欠損カセットを製造する工程と、２）工程１）の欠損カセットを分裂酵母へ導入する工程と、３）標的遺伝子が欠損カセットの選択マーカー遺伝子によって置換された、遺伝子標的化分裂酵母菌株を同定する工程とを含む、遺伝子標的化へテロ接合分裂酵母菌株の製造方法であって、前記工程１）の欠損カセットが、選択マーカー遺伝子、前記選択マーカー遺伝子の左右にそれぞれ配置された一対の遺伝子特異的バーコード配列、および選択マーカー遺伝子の上流及び下流に位置するバーコード配列の左右にそれぞれ配置された一対の相同組換え部位を含み、該相同組換え部位が５’および３’側それぞれで１５０ｂｐ〜４５０ｂｐであることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記欠損カセットが、選択マーカー遺伝子の５’側に配置されたバーコード配列の増幅用共通プライマーのペアー、および選択マーカー遺伝子の３’側に配置されたバーコード配列の増幅用共通プライマーのペアーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記欠損カセットの相同組換え部位が、５’および３’側それぞれで２５０ｂｐ〜４５０ｂｐサイズであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的遺伝子がｅｒｇ１、ｒｐｓ９０１、ｒｐａ２、ｓｍｂ１、ｒｐｓ２４０２、ｒｐ１１８０１、ｃｃｔ１、ｒｐｐ１３７０２およびｐｍｍ１からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バーコード配列が、２０〜３０ｂｐのサイズであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記バーコード配列が、配列番号１８〜９９９３の塩基配列からなる群より選択され、２つのバーコード配列が選択マーカー遺伝子の上流及び下流にそれぞれ配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記選択マーカー遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、栄養要求性マーカー、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、ｕｒａ３、ｂｌｅおよびｓａｃＢからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の遺伝子標的化へテロ接合分裂酵母菌株の製造方法。
【請求項８】
欠損カセットが、図１に示した構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記選択マーカー遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子標的化へテロ接合分裂酵母菌株が、欠損カセットを該菌株の染色体に導入することにより改変され、該欠損カセットが、選択マーカー遺伝子、前記選択マーカー遺伝子の左右に配置された一対の遺伝子特異的バーコード配列、および選択マーカー遺伝子の上流及び下流に位置するバーコード配列の左右に配置された一対の相同組換え部位を含み、該バーコード配列が、配列番号１８〜９９９３の塩基配列からなる群より選択される、遺伝子標的化へテロ接合分裂酵母菌株ライブラリー。
【請求項１１】
１）請求項１０に記載の遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株ライブラリーを薬物で処理する工程と、２）前記薬物処理された分裂酵母菌株を培養する工程と、３）前記培養された菌株から染色体を抽出する工程と、４）前記抽出された染色体を用いて菌株の成長度合いを測定および比較することにより、相対的に成長が阻害されたヘテロ接合分裂酵母菌株を確認する工程とを含んでなることを特徴とする、薬物の作用点探索方法。
【請求項１２】
前記抽出された染色体をマイクロアレイ遺伝子チップまたはリアルタイムＰＣＲに適用することで、菌株の成長度合いを測定することを特徴とする、請求項１１に記載の薬物の作用点探索方法。
【請求項１３】
請求項１０の遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株ライブラリーを含む、薬物の作用点のスクリーニングキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子標的化された分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）のヘテロ接合菌株（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｓｔｒａｉｎｅｓ）を体系的に製造する方法に関する。さらに具体的には、本発明は、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に使用される欠損カセット（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を４段階連続的ＰＣＲ（４−ｒｏｕｎｄ  ｓｅｒｉａｌ  ＰＣＲ）、４段階ブロックＰＣＲ、または全遺伝子合成法を用いて効率よく製造し、これを用いて分裂酵母を形質転換して遺伝子標的化分裂酵母菌株を製造する方法に関する。
【０００２】
また本発明は、前記方法によって製造された遺伝子標的化分裂酵母ヘテロ接合菌株および遺伝子標的化分裂酵母ヘテロ接合菌株ライブラリーに関する。また、本発明は、前記ライブラリーを用いた薬物作用点の探索方法および前記ライブラリーを含む薬物スクリーニングキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
２００６年を基準とした場合の世界の医薬品市場規模は６４３０億ドルに、韓国における医薬品産業の総生産額は１１兆４，７２８億ウォンにそれぞれ達したが、２００７年における世界の医薬品市場規模は７３５０億〜７４５０億ドルに増加するものと予想される。新薬開発には平均１０〜１５年の期間と１〜６億ドル以上の費用がかかるが、成功確率は１万分の１に過ぎない。よって、未来型先端産業の一つである新薬開発のためには、生物情報学的（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）分析によって、できる限り数多くの作用点のうち、疾病の原因となるべき可能性の高い「医薬作用点」が予測されなければならないので、実際疾病に直接関与する特定の作用点を体系的に探索することが非常に重要である。
【０００４】
このように新薬探索技術は、新薬を開発するときに薬物作用点をより容易に把握することを可能にするので、新薬開発期間を画期的に短縮する。また、新薬探索技術は、薬物副作用として作用する薬物作用点も容易に把握することができる。よって、薬物作用点の探索に関する源泉技術の開発が至急要求される。
【０００５】
本発明の好適な様態として使用される菌株のシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ：Ｓ．ポンベ）は、分裂酵母であって、出芽酵母としてのサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と同様に子嚢菌類（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）に属するが、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と進化的にあまり密接に連関されてはいない。Ｓ．ポンベ  （Ｗｏｏｄ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ４５：８７１−８８０，  ２００２）は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｇｏｆｆｅａｕ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７４：５４６−５６７，  １９９６）以後、真核細胞の中でも遺伝子の塩基配列分析が完成された６番目の生物体である。分析結果によれば、Ｓ．ポンベは、今まで塩基配列が決定された真核細胞のうち、遺伝子の機能的反復性が少ない効率的な染色体構造を持っており、タンパク質を決定する遺伝子が４，８２４個と最も少ないが、４３％の遺伝子がイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）を含有しているものと報告された。また、Ｓ．ポンベには細胞周期調節、タンパク質分解（ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）、タンパク質リン酸化（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）、ＲＮＡスプライシング（ＲＮＡ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）などの真核細胞内で重要な関連遺伝子が非常によく保存されており、Ｓ．ポンベにおける３１％の遺伝子がＳ．セレヴィシエの遺伝子とは異なり、むしろヒトに近いものと報告された。よってＳ．ポンベ遺伝子の機能を研究してＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と比較することにより、ヒト遺伝子の機能を研究することが効率的な方法として考慮されている。
【０００６】
本発明において、薬物作用点探索のために酵母菌株を形質転換させる方法として使用された「遺伝子標的化（ジーンターゲティング）」は、個体内の特定の遺伝子を相同組換え法でノックアウトする、或いは導入する遺伝学的技術である。本技術を用いて特定の疾患に関連した特定の遺伝子を除去または挿入したマウスを製造し、ノックアウトされた遺伝子を有する生物の病理現象を介して、個体水準でノックアウトされた遺伝子本来の機能を研究することができる。
【０００７】
最初に遺伝子標的化マウスが誕生した１９８９年以来、遺伝子標的化は多様な技術として発展してきた。その結果、現在は発生成長時期のもの、あるいは成体であっても標的遺伝子を注入することができ、ある特定の時期にのみ発現される突然変異遺伝子の注入も可能になった。この方法を考案した功労として、Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｅｖａｎｓ、Ｏｌｉｖｅｒ  Ｓｍｉｔｈｉｅｓ、Ｍａｒｉｏ  Ｒ．Ｃａｐｅｃｃｈｉなどの３名は２００７年にノーベル医学賞を受賞した。
【０００８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）は、ＤＮＡを複製・増幅させる分子生物学的技術（米国登録特許第４，６８３，１９５号、米国登録特許第４，６８３，２０２号、米国登録特許第４，８００，１５９号、ヨーロッパ登録特許第０２００３６２号、同第０２０１１８４号および同第０２２９７０１、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １５５，１９８７，ｐｐ．３３５−３５０，Ｍｕｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ７；２８７−２９５（１９８８））であって、微量のＤＮＡ溶液によって所望する特定のＤＮＡ断片のみを選択的に増幅させることができる。変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）の３工程を３０〜４０サイクル経て増幅されるが、このようなＰＣＲの種類としては、多重ＰＣＲ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ−ＰＣＲ）、ネスト型ＰＣＲ（Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ）、定量ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、タッチダウンＰＣＲ（Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ  ＰＣＲ）などが挙げられる。
【０００９】
ＰＣＲの一種であるリアルタイムＰＣＲは、一般なＰＣＲで必要なプライマーの他に特異的プローブをさらに添加し、増幅過程中に発色される蛍光色素の量をリアルタイムで測定して定量する方法である。リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲ反応の後に増幅産物を電気泳動で確認する必要がないため、簡便且つ迅速に結果を得ることができるうえ、コンタミネーションのリスクが低いため、既存のＰＣＲで検出していた遺伝子検査をリアルタイムＰＣＲで検出しようとする試みも盛んに行われている。
【００１０】
形質転換とは、外部ＤＮＡを受け入れた結果、一つの生物体の形質が変わることであって、一般には、導入するＤＮＡは選択マーカーで標識し、形質転換が成功した細菌を区別する。選択マーカーの代表的なものとしては、アンピシリン、テトラサイクリンおよびカナマイシンなどを挙げることができ、形質転換を経た後、該当細菌を抗生剤含有培地で培養すると、形質転換が成功した細菌のみを収得することができる。本発明では、ジーンターゲティングを介した形質転換によって分裂酵母の特定の遺伝子をノックアウトさせる一方で、該当する相同組換え部位に抗生剤に耐性の遺伝子が導入される。
【００１１】
また、本発明で使用される「遺伝子合成法」は、１９９０年代初めにＰＣＲ反応を介したオリゴ接合技術の開発以後から現在まで約２００余編の論文が発表された公知の技術である（Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２９２：７５６−６２，Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ．３２：１７６−８０，Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＡＲ．１０：４４６７−８２，Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．９：２９８−３００，Ｃｉｃｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２１：６００７−１３，Ｐｒｏｄｒｏｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．５：８２７−２９，Ｓｔｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１６４−４９−５３，Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．２８８：８５−９４，Ｖｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．１００：１５４４０−４５）。原理は、２０ｂ〜６０ｂｐの長さのオリゴを互いに重畳させた後、接合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を介して所望の少量の２本鎖ＤＮＡ断片を得た後、これをテンプレートとしてＰＣＲ法によって最終遺伝子を増幅することである。１回の遺伝子合成で成功した遺伝子の長さは通常１０００ｂｐ未満であり、これよりさらに長い遺伝子を合成するためには、成功した１０００ｂｐ未満のＤＮＡ断片をＰＣＲで接合する方法を使用する。２００３年、米国のＣｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒ博士は、このような方法によってファイＸ１７４バクテリオファージ遺伝子の全体（５，３８６ｂｐ）を合成したことがある。
【００１２】
本発明の「薬物作用点の探索方法」に関連して、現在まで薬物作用点を把握することが可能な道具として最も多用されてきた既存の方法は、インビトロ法である。薬物をレジンに付着させた親和性カラムに細胞とタンパク質との混合物を通過させた後、付着するタンパク質を精製して質量分析器（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で分析する方法である（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：１１２７−１１５２）。
他の方法は、薬物をレジンに付着させた親和性カラムにファージの表皮タンパク質形態で発現されたヒトタンパク質−ファージライブラリーを通過させることにより、薬物に結合したファージを選別し、これを分析し、薬物に結合するタンパク質を推定することである（Ｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．６：７０７−７１６）。
【００１３】
最近では、前述した２つの方法とは完全に異なる概念のインビボ探索法も試みられている（Ｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．１１６：１２１−３７）。この方法は、ヒトタンパク質を探索する前述の２つの方法に比べて酵母のタンパク質を探索するという欠点はあるが、迅速（１００個の薬物／１週）かつ簡便であり、成功率が高いという利点を持っている。２００４年、Ｍｅｒｃｋ社のＳｈｏｅｍａｋｅｒとＬｕｍ博士のチームは、体系的な遺伝子標的化出芽酵母ライブラリーを用い、既存の８０余個の薬物を対象として薬物作用点を探索し、作用点探索の成功率を既存の２５％から７０％に増大させた。この方法の原理は薬物誘導型ハプロ不全（ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）である。大部分の遺伝子は１つの遺伝子のみでも正常的に成長し子孫を作ることができるが、ある遺伝子は１つのみでは正常的に成長することができないことがある。このような現象をハプロ不全という。出芽酵母の場合、６０００余個の遺伝子の約３％、すなわち１８０個の遺伝子が、十分な栄養状態で培養しても野生型に比べてよく成長できないハプロ不全を示すものと報告された（Ｄｅｕｔｓｃｈｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．  １６９：１９１５−２５）。
【００１４】
酵母のヘテロ接合突然変異菌株を用いて薬物作用点を探索する薬物誘導型ハプロ不全の原理は、このようなハプロ不全現象に基づいている。例えば、ある薬物「ａ」の作用タンパク質が「Ａ」であると仮定するとき、薬物「ａ」の処理濃度を、２つの野生性遺伝子で発現されるタンパク質「Ａ」を５０％抑制する濃度「ＩＣ５０」に合わせると、遺伝子標的化ヘテロ接合菌株におけるタンパク質「Ａ」は１００％抑制される（ノックダウン）状況になる。この際、薬物処理していない菌株との細胞成長を比較すると、成長速度が相対的に遅くなっている。本発明では、このようなハプロ不全の原理を用いて薬物作用点を探索する方法を提供する。
【００１５】
本発明の遺伝子標的化菌株の製造成功率は、菌株ごとに異なる相同組換えの効率によって決定されるので、菌株の特性に依存する。ところが、同一の菌株における相同組換えの効率は染色体相同部位の長さに比例する。よって、遺伝子標的化菌株を効率的に製造するためには、遺伝子の染色体相同部位に該当するＤＮＡ断片の長さを長くしなければならない。しかし、出芽酵母の場合には次のような試みがあったが（表１）、分裂酵母の場合にはこれまで高い成功率で実施された事例がなかった（Ｐａｌａｎｉｙａｎｄｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３：２７９９−２８００；Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１５９：１１３−１７；Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：１０８０−８１）。
【００１６】
【表１】
0005608637.tif 000002
【００１７】
遺伝子標的化出芽酵母菌株の製造の際に、使用した相同組換え部位を長くする既存の方法は、遺伝子特異的なオリゴリンカーを媒介としたＰＣＲ法（ｇｅｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ）である。Ｇｉａｅｖｅｒ博士などは、前記の方法を用いて出芽酵母全体の遺伝子６，０００個の欠損カセットを製造したが、この際、相同組換え用５’側と３’側のＤＮＡ断片の長さは４０〜６０ｂｐであった（Ｇｉａｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５０−５６；Ｗａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ．１０：１７９３−１８０８）。出芽酵母の場合には、欠損カセットの両側末端の染色体相同部位の長さが４５〜６０ｂｐであれば、通常約８１％の菌株製造成功率を示した（表１）。但し、分裂酵母の場合には相同性の長さを４０ｂｐまで伸ばしても成功率が１〜３％に止まるという問題点があった。分裂酵母におけるこのような低成功率は、相同組換えの効率が出芽酵母より低いので、菌株の製造が難しいという点を示唆している。本発明は、分裂酵母において高効率の相同組換えを介して菌株を製造する方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
技術的課題
報告によれば、分裂酵母の遺伝子標的化菌株の製造が、既存の出芽酵母の製造に比べて技術的に難しいというのは公知の事実である（Ｄｅｃｏｔｔｉｇｎｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１３：３９９−４０６）。本発明では、「４段階ブロックＰＣＲ」或いは「遺伝子合成法」を用いて欠損カセットの両末端に２０−ｍｅｒの遺伝子特異的バーコードと２５０〜３５０ｂｐの染色体相同部位を挿入することにより、効率的な遺伝子標的化菌株の製造方法の開発を目的とした。これを用いると、遺伝子チップを用いてハイスループット・スクリーニングで薬物作用点を探索することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって本発明の目的は、選択マーカー遺伝子とマイクロアレイ用バーコード塩基配列および相同組換え部位を含む遺伝子標的化欠損カセットを用いて、遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株の製造方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の他の目的は、前記製造方法によって製造された遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、前記製造方法によって製造された遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株ライブラリーを提供することにある。
【００２２】
本発明の他の目的は、前記遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株ライブラリーを用いた、薬物作用点の探索方法を提供することにある。
【００２３】
本発明の目的の目的は、前記遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株ライブラリーを含む、新規薬物スクリーニングキットを提供することにある。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によって、世界で最初に、体系的に分裂酵母遺伝子標的化菌株の製造法を完成することができた。分裂酵母の菌株製造の成功率は出芽酵母のそれより相対的に低いにもかかわらず、遺伝子標的化菌株の製造成功率を、酵母における成功水準である９５％から９９％に増加させた。出芽酵母の場合、約６０００種の遺伝子のうちヘテロ接合遺伝子標的化菌株は９５％の約５７００種のみが製造可能であった（「遺伝子標的プロジェクト」のホームページを参照、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｙｅａｓｔ＿ｄｅｌｅｔｉｏｎ＿ｐｒｏｊｅｃｔ／ｎｏｔ＿ｍａｄｅ．ｈｔｍｌ）。
【００２５】
ところが、本発明では、全遺伝子の１％に該当するｗｔｆ系列１８個、Ｔｆ２系列１１個、不確実（ｄｕｂｉｏｕｓ）遺伝子系列２６個など、合計５５個の遺伝子群が、系列内の遺伝子相互間におけるＤＮＡ相同性が９９．２％〜９９．８％であって、理論上、遺伝子標的化菌株の製造が不可能であることを除いては、２００７年６月２０日を基準として、英国Ｓａｎｇｅｒ研究所の分裂酵母遺伝子データベース「Ｓ  Ｐｏｍｂｅ  ＧｅｎｅＤＢ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｄｂ．ｏｒｇ／ｇｅｎｅｄｂ／ｐｏｍｂｅ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）で遺伝子として規定した５０００（４９８９〜５０１４と推定される）個の９９％、すなわち計４，９４５種の遺伝子標的化ヘテロ接合菌株の製造に成功した。このように本発明のヘテロ接合菌株ライブラリーは、薬物の作用点を遺伝子水準で体系的に探索するのに用いられるため、新規薬物の発掘に非常に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ジーンターゲティングの際に一般に使用される欠損カセットの構造を示す概略図である。
【図２】図２は、欠損カセットのＫａｎｒ−バーコードモジュールの製造方法を示す図である。
【図３】図３は、４段階連続的ＰＣＲ法を用いた欠損カセットの製造方法を示す図である。
【図４】図４は、４段階ブロックＰＣＲ法を用いた欠損カセットの製造方法を示す図である。
【図５】図５は、遺伝子合成法を用いた欠損カセット製造の設計方法の模式図である。
【図６】図６は、製造された菌株をコロニーＰＣＲ法で確認する方法の代表的な結果を示す図である。
【図７】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図８】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図９】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１０】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１１】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１２】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１３】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１４】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１５】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１６】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１７】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１８】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図１９】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２０】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２１】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２２】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２３】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２４】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２５】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２６】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２７】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２８】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図２９】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３０】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３１】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３２】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３３】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３４】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３５】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３６】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３７】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３８】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図３９】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４０】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４１】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４２】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４３】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４４】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４５】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４６】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４７】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４８】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図４９】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図５０】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図５１】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図５２】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図５３】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図５４】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図５５】図７〜図５５は、遺伝子標的化菌株製造用欠損カセット内に挿入される遺伝子特異的バーコードの塩基配列を示す図である。
【図５６】図５６は、遺伝子チップを用いて薬物誘導ハプロ不全原理に基づいて生体薬物作用点を探索する方法の模式図である。
【図５７】図５７は、遺伝子チップを用いた薬物作用点の探索のために遺伝子標的化菌株ライブラリー混合液を製造する方法の模式図である。
【図５８】図５８は、アフィメトリクス社で注文して製作した遺伝子チップの蛍光写真を示す図である。
【図５９】図５９は、薬物作用点の探索の際に使用された抗真菌剤テルビナフィン薬物のＩＣ５０測定結果を示す図である。
【図６０】図６０は、遺伝子チップの結果から出たテルビナフィンの薬物作用点を固体培地で再び確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明では、４段階連続的ＰＣＲ、４段階ブロックＰＣＲまたは遺伝子合成法によって欠損カセットを製造した後、この欠損カセットを用いて、形質転換された遺伝子標的化菌株を作り、当該菌株を用いたライブラリーを製作する一方で、これを用いて薬物作用点を探索する方法を提供する。
【００２８】
具体的に、一つの様態として、本発明は、（１）選択マーカー遺伝子、（２）前記選択マーカー遺伝子の左右に配置された１対のマイクロアレイ用バーコード塩基配列、および（３）前記バーコード塩基配列の左右に配置された相同組換え部位の１対を含むジーンターゲティング用欠損カセットを用いた遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株の製造方法であって、前記欠損カセットの相同組換え部位がそれぞれ１５０ｂｐ以上であることを特徴とする方法に関する。以下、各構成要素をより詳細に説明する。
【００２９】
選択マーカー
選択マーカーの遺伝子は、形質転換が成功した酵母を区別するために使用される。このような選択マーカーとしては、栄養要求性マーカー、ネオマイシン抵抗性遺伝子（ｎｅｏＲ）、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎＲ）、ヒグロマイシン（ｈｙｇ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、テトラサイクリン（ｔｅｔＲ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）、ｕｒａ３、ｂｌｅおよびｓａｃＢを含み、好ましくは、カナマイシン耐性遺伝子を応用したｋａｎＭＸである。選択マーカーを含む欠損カセットは、相同性を有する染色体ＤＮＡ部位に遺伝子交換を介して組み込まれ得る。
【００３０】
分裂酵母において標的遺伝子の欠損のためのマーカーとして現在使用されるものには、アミノ酸または核酸の合成に要求される栄養要求性マーカーとしてのｕｒａ４、ｌｅｕ１、ｈｉｓ３などがある。ところが、このようなマーカーを用いるためには、一つまたはそれ以上の栄養要求性突然変異を有する菌株を必ず使用しなければならない。また、ＤＮＡ導入による栄養要求性突然変異の遺伝子変換（ｇｅｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）が起こる恐れがあり、栄養要求性突然変異それ自体が他の突然変異と共に、浸透圧感受性または窒素欠乏による細胞分化（ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、胞子形成（ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ）、仮性菌糸（ｐｓｅｕｄｏｈｙｐｈａｅ）などの予測し難い表現型を示すこともあり、また、多くの栄養要求性突然変異は一般的な培地で成長阻害を示すことがある。
【００３１】
このような栄養要求性マーカーの限界を克服するために、Ｐｈｉｌｉｐｓｅｎの研究チームは、優性薬（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｄｒｕｇ）耐性マーカーとしてのｋａｎＭＸモジュールを開発した。これは酵母の遺伝子を欠損させるサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の欠損プロジェクトにも使用された。ｋａｎＭＸモジュールは、抗生剤としてのＧ４１８に抵抗性を示して選択マーカーとして使用できるように製造された。Ｇ４１８のマーカーは、ＰＣＲ−ＤＮＡ断片の使用時にも遺伝子欠損の確率が高いため、栄養要求性マーカーに比べて利点がある。現在、ヒグロマイシンＢ（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）、ノーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）、ビアラホス／ホスフィノスリシン（ｂｉａｌａｐｈｏｓ／ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）の優性薬耐性マーカーが開発されている。
【００３２】
したがって、好適な様態として本発明で使用される選択マーカー８１０ｂｐのＫａｎＭＸ４は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のトランスポゾン（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ）Ｔｎ９０３遺伝子から起源したもので、アミノ−グリコシドリン酸基を伝達する活性（ａｍｉｎｏ−ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を持つため、カナマイシンまたは誘導体Ｇ４１８の活性を抑制すると報告されている（Ｌａｎｇ−Ｈｉｎｒｉｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１８：５１１−６，Ｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：２１７−２６）。抗生マーカーの一つであるｋａｎＭＸモジュールは、大腸菌トランスポゾンＴｎ９０３のｋａｎｒとして知られているオープン・リーディング・フレーム（以下、「ＯＲＦ」という）を真菌アッシビヤゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のＴＥＦ遺伝子の転写および翻訳調節部位に接合させたものであって、抗生剤Ｇ４１８に耐性を示し、選択マーカーとして使用できるように製造された。
【００３３】
遺伝子欠損の場合、ＰＣＲ産物を使用すれば、或いは組換えが起こるべき標的遺伝子の相同部位が少なければ、間違った挿入の頻度が高く現れる。Ｇ４１８マーカーは優性耐性（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を示す異種選択マーカー（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍａｒｋｅｒ）であって、ＰＣＲ−ＤＮＡ断片を使用する際にも遺伝子欠損の確率が高いという利点がある。
【００３４】
マイクロアレイ用バーコード塩基配列
６，０００余種の遺伝子標的化出芽酵母菌株ライブラリーの成長速度を効率よく測定するために、遺伝子チップの技法によって成長を測定する現実的且つ体系的な戦略が必要であるが、このために、欠損カセット内にマイクロアレイ用バーコード塩基配列を導入した（図３）。バーコード塩基配列を用いると、薬物処理後に６０００菌株の染色体を混合抽出し、しかる後に、これをテンプレートとしてバーコード部位のみをＰＣＲで標識し、増幅、遺伝子チップ分析を介して、薬物により細胞成長が減少する菌株を容易に検出することができる。バーコード塩基配列は、各菌株に特異的に指定されなければならないので、互いに異なるバーコード塩基配列の数は少なくとも菌株の染色体数の２倍以上でなければならず（各染色体の両側末端にそれぞれ１つずつ、一つの染色体当たり２つのバーコード塩基配列が必要）、これを満足する限り、その長さには制限がない。
【００３５】
好適な様態として、上記目的のために、２０−ｍｅｒのオリゴからなる遺伝子特異的バーコードが、欠損カセットのＫａｎＭＸ４前後にそれぞれ１つずつ、計２つが配置されるが、ＤＮＡ塩基の種類がＧ、Ａ、Ｔ、Ｃの４種なので、理論的に可能なバーコードの種類は計４２０になる。本発明の具体的な実施例では、図７〜図５５に示したバーコード塩基配列を使用した。
【００３６】
相同組換え部位
菌株製造の成功率は、菌株ごとに異なる相同組換えの効率によって決定されるので、菌株の特性に依存する。ところが、同一の菌株における相同組換え効率は多くの場合染色体相同部位の長さに左右される（Ｍｉｃｈａｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１５８：１１３−１７；Ｐａｌａｎｉｙａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３：２７９９−２８００）。したがって、遺伝子標的化菌株を効率よく製造するためには、遺伝子の染色体相同部位に該当するＤＮＡ断片の長さを最適化しなければならない。
【００３７】
本発明の一つの様態として、このような相同組換え部位は、５’および３’側それぞれで１５０ｂｐ以上であることを特徴とする。本発明の好適な様態として、相同組換え部位が５’および３’側それぞれで１５０ｂｐ〜４５０ｂｐサイズであることを特徴とする欠損カセットを提供する。本発明のさらに好適な様態として、このような相同組換え部位が５’および３’側それぞれで２５０ｂｐ〜４５０ｂｐサイズであることを特徴とする欠損カセットを提供する。
【００３８】
【表２】
0005608637.tif 000003
【００３９】
遺伝子標的化用欠損カセットの製造
本発明の欠損カセットは、欠損カセットを菌株内に形質転換して導入することにより、欠損カセット内のマーカー遺伝子と染色体上の標的遺伝子との置換が起こり、標的遺伝子がターゲティングされる結果を引き起こすので、酵母の各遺伝子約５０００個を標的させるのに必須的な構成要素である。このような遺伝子標的化用欠損カセットの製造は、遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株を製造するための必須条件である。好適な様態として、欠損カセットの構造は、選択マーカーが中央に位置し、その左右両側にマイクロアレイ用遺伝子特異的バーコード部位が位置し、さらにバーコードの両側に相同組換えに必要な、適正な長さの染色体相同部位が位置する（図１）。
【００４０】
本発明の好適な様態として、Ｔｎ９０３のカナマイシン耐性遺伝子を酵母において発現させるために、ｋａｎＭＸ４モジュールの構造は、別の酵母の一種であるアッシビヤゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のＴＥＦプロモータである３８１ｂｐを当該遺伝子の開始コドンＡＴＧの前に配置させ、アッシビヤゴシッピー（Ａｓｈｂｙａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）のＴＥＦターミネータである２４２ｂｐを当該遺伝子の終止コドンの後ろに配置させた形態となっている。
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または分裂酵母自体のプロモータまたはターミネータを使用すると、染色体内の相同性部位が重複して存在し、間違った相同組換えが発生するおそれがあるので、異種酵母のプロモータを用いることが好ましい。前述した過程を経ると、ＫａｎＭＸ４モジュールの長さは１，４３３ｂｐになる。欠損カセットをヘテロ接合菌株内に形質転換して導入すると、相同性遺伝子の組換えによって染色体上で欠損カセット内のマーカー遺伝子と染色体上の標的遺伝子との置換が起こる。この際、マーカー遺伝子は染色体に挿入され、標的遺伝子がターゲティングされて欠損する。
【００４１】
本発明の具体的な実施例として、カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）をテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として、２０ｂｐのバーコードを含有した約７０ｂｐ長さの５’および３’バーコードプライマー対を用いて１次ＰＣＲを行い、ＫａｎＲ−バーコードモジュールを製造した後（図２）、さらにＫａｎＲ−バーコードモジュールをテンプレートとして、染色体相同部位の４０〜６０ｂｐとＫａｎＲ−バーコードモジュールの両末端部位の２０ｂｐとを含む６０〜８０ｂｐのプライマー対を用いて２次ＰＣＲを行ったところ、本発明の構成要素である欠損カセットが製造された。
【００４２】
欠損カセット製造のための４段階連続的ＰＣＲ、４段階ブロックＰＣＲおよび遺伝子合成法
本発明を実施するための遺伝子標的化用欠損カセットの製造方法は、（１）４段階連続的ＰＣＲ、（２）４段階ブロックＰＣＲ、および（３）遺伝子合成法を含み、その好適な様態は次のとおりである。
【００４３】
（１）「４段階連続的ＰＣＲ」は、４回のＰＣＲを経る過程をいう。上述したバーコード配列を含有した約７０ｂｐの長さの５’および３’バーコードプライマー対を用いて１次ＰＣＲを行うことにより、バーコードモジュールを製造し、製造されたバーコードモジュールをテンプレートとして５０ｍｅｒのプライマー対で２回、４０ｍｅｒのプライマー対で１回、合計３回の連続ＰＣＲをさらに行うことにより、菌株特異的なバーコードと染色体相同組換えのための８０ｂｐを提供する方法である。
【００４４】
（２）「４段階ブロックＰＣＲ」は、染色体相同組換え用５’と３’の３５０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片をＰＣＲで別途製造した後、前記精製されたＫａｎｒ−バーコードモジュールと混合してブロックＰＣＲを行い、欠損カセットを製造する方法である。
【００４５】
（３）「遺伝子合成法」は、ＰＣＲ法とは全く異なる新しい方法であり、次の利点を持つ。
第一に、既存のＰＣＲ法に必要な４回のＰＣＲ反応と４回のＤＮＡ断片の精製過程とを、１回のリン酸化反応および重合接合反応と２回のＰＣＲ反応とに減らすことによって精製過程を除去することができる。これにより本発明において、遺伝子合成法は４段階ブロックＰＣＲ法の８０％より高い、９０％以上の菌株製造の成功率を示した（表２）。
第二に、９６ウェル形式の一連の作業が可能であるから、作業の効率性が向上する。既存のＰＣＲ法では１人が週当たり１０個の菌株を製造することしかできないが、これに対し、本発明の遺伝子合成法では１人が週当たり１００個以上の菌株を製造することができるので、少なくとも１０倍の効率性を示した。
第三に、既存のＰＣＲ法では４回のＰＣＲを必要とするが、これに対し本発明の遺伝子合成法では２回のＰＣＲのみを必要とするので、ＰＣＲによる点突然変異（ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）率を少なくとも２倍以上低下させることができる。本発明において、それぞれの方法で製造された菌株２０個をランダムに選択して標的遺伝子部位である約２．１−ｋｂの全体をＰＣＲで増幅した後、ＤＮＡ塩基配列の解析を行って点突然変異率を調べた結果、既存の０．５個／１ｋｂより２倍以上減少した０．２個／１ｋｂの突然変異が発見された。
【００４６】
図１は、本発明で遺伝子合成によって製造した欠損カセットの詳細な構造図である。前記方法（１）および（２）の共通点は、ＰＣＲ法に基づいて欠損カセットを製造するという点であり、方法（３）が方法（１）および（２）と異なる点は、重合酵素連鎖反応ではなく、合成オリゴをライゲートして欠損カセットを製造するという点である。
特に、方法（３）は、既存のＰＣＲ法では製造することが難しかった２００余個のヘテロ接合遺伝子標的化菌株の製造に成功することができた。そしてこの方法は、分裂酵母全遺伝子全体、４，９８８余種のうち９７％以上でターゲティングすることを可能にした。
【００４７】
本発明は、前述の方法で製造された欠損カセットを用いてヘテロ接合分裂酵母菌株を製造し、該当菌株を用いたライブラリーおよび注文制作された遺伝子チップを用いてハイスループットのインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）薬物作用点探索システムを提供する。
本発明の好適な実施例として、抗真菌剤テルビナフィンを用いて本システムが良く作動することを検証した。
【００４８】
ヘテロ接合分裂酵母
分裂酵母の種類にはシゾサッカロミセス・オクトスポラス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などがあり、分裂酵母のいずれをも本発明の菌株にすることが可能である。形質転換の段階を経て製造された突然変異菌株は、遺伝子欠損カセット内に存在する標的遺伝子特異的塩基配列が細胞内の相同組換えによって分裂酵母の染色体上に存在する標的遺伝子の塩基配列と置換されたものであって、標的遺伝子が染色体上で欠損するようにした遺伝子欠損ヘテロ接合突然変異菌株である。
【００４９】
一つの好適な様態として、分裂酵母はシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）であってもよいが、必ずこれに限定されるのではなく、他の分裂酵母を使用してもよい。本発明の好適な様態として実施される対象菌株「分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）」は、アフリカで昔から作られてきたビールから抽出された酵母であって、酒、パンなどの食品に用いられるうえ、真核生物のモデル生物としても優れた微生物である。特に分裂酵母は、均等分裂によって増殖する細胞周期の研究に有用であり、高等真核生物型のように約４３％の遺伝子にイントロン（ｉｎｔｒｏｎ）が存在しているため、より高等真核生物に近い特徴を持つと言える。また分裂酵母は、最近約５０００個のＯＲＦ（ｏｐｅｎ  Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｆｒａｍｅ）を有するコンパクトなゲノム構造を有することが解明され、遺伝子解析研究に非常に適した材料となっており、ひいては薬剤探索系における応用も期待することができるため、新薬開発を含んだ生物科学分野に広く貢献することができるものと認識されている。
【００５０】
別の様態として、本発明は、選択マーカー遺伝子、マイクロアレイ用バーコード塩基配列および相同組換え部位を含む遺伝子標的化用欠損カセットを用いて製造された、遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株に関する。
【００５１】
別の様態として本発明は、前記製造方法によって製造された、遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株のライブラリーに関する。
【００５２】
別の様態として、本発明は、製造されたヘテロ接合分裂酵母のライブラリーに薬物を処理し、薬物処理された分裂酵母菌株のライブラリーを培養して、培養されたライブラリーから染色体を抽出し、抽出された染色体を用いてマイクロアレイ遺伝子チップに適用し、或いはリアルタイムＰＣＲを行うことにより、薬物作用点を探索する方法に関する。
【００５３】
本発明は、薬物作用点を把握することが可能な道具としてヘテロ接合分裂酵母のライブラリーを提供するが、「薬物作用点」を把握することは既存の薬物の薬効増大および副作用の少ない薬物の開発に必須である。薬物作用点の探索方法は、次の工程を含んでなる。
１）ヘテロ接合分裂酵母菌株のライブラリーを薬物で処理する工程、
２）前記薬物処理された分裂酵母菌株ライブラリーを培養する工程、
３）前記培養されたライブラリーから染色体を抽出する工程、および
４）前記抽出された染色体をマイクロアレイ遺伝子チップに適用して菌株の成長度合いを測定し、並びに比較することにより、相対的に成長が阻害されたヘテロ接合分裂酵母菌株を確認する工程。
【００５４】
前記探索方法で処理される薬物としては、いずれの薬物でも適用可能である。上述したように本発明の好適な実施例では、遺伝子ｅｒｇ１をターゲットとする抗真菌剤としてのテルビナフィン（ｔｅｒｂｉｎａｆｉｎｅ）を用いて、薬物作用点探索システムがよく作動するかを検証した。
【００５５】
培養された分裂酵母菌株から染色体を抽出する過程は当業界における公知のいずれの方法でも可能であり、本発明の好適な実施例では、Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔａｌｏｇ＃Ｄ６００５）を用いて染色体ＤＮＡを収得した。
【００５６】
本発明内の「遺伝子チップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）」とは、生物の遺伝情報がどのように発現されているかを検出する装置であって、約１ｃｍ３の固体表面に数百〜数万種類のＤＮＡ配列を配置することにより製造される。表面に公知の遺伝情報データベースを有するＤＮＡを配置した遺伝子チップを、予め蛍光物質などで標識しておいた目的のＤＮＡが入っている溶液で濡らした後、洗浄すると、目的のＤＮＡに結合する該当ＤＮＡが蛍光で標識されて該当遺伝子の発現を確認することができる。このような遺伝子チップは遺伝子基礎研究に用いられるだけでなく遺伝関連疾患を迅速に検出することができるうえ、個人に応じる最適薬剤の選択などにまで広く応用できる、新しい次元の分析システムである。
【００５７】
本発明で使用される遺伝子チップは、菌株特異的に挿入されたバーコード配列を認識することが可能な遺伝子チップであればいずれでも可能である。一つの好適な様態として、本発明では２０ｂｐの長さのバーコードを挿入し、これを認知するためのシステムであって、米国のアフィメトリクス社で注文者一連番号がＫＲＩＢＢＳＰ１−ａ５２０４２９である適切な遺伝子チップを注文して製作した。
【００５８】
本発明の別の様態としては、遺伝子チップを使用する方法の代わりに定量分析および定性分析が可能な当業界で通常使用されるリアルタイムＰＣＲを行い、作用点を探索することもできる。検出方法によって大きくインターキレート法と蛍光標識プローブを用いる方法に分けられるが、以下、プローブを用いた検出方法について述べる。
【００５９】
本発明の好適な様態として、蛍光標識プローブを用いたリアルタイムＰＣＲを行う方法にはＴａｑＭａｎプローブ法とサイクリングプローブ法があるが、前者はＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）活性を利用する方法であり、後者はＤＮＡとＲＮＡからなるキメラプローブとＲＮａｓｅＨを用いて、蛍光物質とクエンチャーがＰＣＲの途中でＲＮａｓｅＨによって切断されて蛍光を示すように考案された方法である。以下、ＴａｑＭａｎプローブ法によって薬物の作用点を探索する方法について述べる。
【００６０】
本発明の好適な様態として、リアルタイムＰＣＲでは共通プライマーの他に特異的プローブをさらに添加して反応を行うが、この際ＴａｑＭａｎプローブを添加して行う。ＴａｑＭａｎプローブは、５’末端が蛍光物質で、３’末端はクエンチャー物質でそれぞれ修飾されたオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎＴＭプローブ）である。このプローブは、アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）段階でテンプレートＤＮＡに特異的に結合するが、プローブ上ではクエンチャーによって蛍光発色が抑制される。ところが伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）段階では、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが有する５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によってテンプレートに結合したプローブが分解されながら蛍光色素が遊離され、クエンチャーによって抑制が解除されて初めて蛍光を示す。この蛍光を感知して発現量を測定する。プローブのオリゴヌクレオチド配列を本発明のバーコード配列で製作し、各プローブそれぞれに対してリアルタイムＰＣＲを行うと、該当バーコードのリアルタイム発現量に対するデータを得ることができ、発現量が著しく増加または減少した部位を薬物作用点として判断することができる。
【００６１】
別の様態として本発明は、前記ヘテロ接合分裂酵母菌株ライブラリーを含む新規薬物スクリーニングキットに関する。
【００６２】
本発明のスクリーニングキットは、前述した本発明の薬物作用点の探索法および新規薬物スクリーニングに活用できる。具体的に、
１）ヘテロ接合分裂酵母菌株のライブラリーを含むスクリーニングキットに、スクリーニングしようとする新規薬物候補物質を含む培養培地を入れ、菌株を培養する工程、および
２）前記培養した分裂酵母菌株の成長度合いを測定および比較し、相対的に成長が阻害されたヘテロ接合分裂酵母菌株を確認する工程
によって、薬物作用点の探索および新規薬物のスクリーニングに活用することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容を限定するものではない。
【００６４】
実施例１：４段階連続的ＰＣＲおよび４段階ブロックＰＣＲ法による欠損カセットの製造
ＰＣＲ法による欠損カセット製造方法は、４段階連続的ＰＣＲ法と４段階ブロックＰＣＲ法に区分され、共通にＫａｎｒ−バーコードモジュールをまず製造しなければならない。ＫａｎＭＸ４の塩基配列は公知の事実なので省略する。Ｋａｎｒ−バーコードモジュールを製造するために、ＫａｎＭＸ４をテンプレートとし、遺伝子特異的バーコードを含む７０ｍｅｒの５’および３’バーコードプライマー対を用いて１次ＰＣＲを行った（図２）。製造されたＫａｎｒ−バーコードモジュールは、ＤＮＡ蛍光染色化合物としてのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）が添加されたアガロースゲルにおける電気泳動の後に、紫外線（ＵＶ）の下でＤＮＡ断片を切って精製し、後続の実験に使用した。
【００６５】
４段階連続的ＰＣＲ法による欠損カセットの製造原理は、既存の出芽酵母と分裂酵母遺伝子標的化菌株を製造するために使用した方法と類似しているが、欠損カセットの両末端にある８０ｂｐの長さの染色体相同組換え部位を作る方法において相異する（Ｇｉａｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５０−５６）。出芽酵母の場合にはＧｉａｅｖｅｒ博士などがＫａｎｒ−バーコードモジュールをテンプレートとして１回の追加ＰＣＲで通常４５ｂｐの染色体相同部位を提供し、全体で６，０００個の遺伝子の９０％以上をターゲティングするのに成功した。しかし分裂酵母の場合には、４５ｂｐ染色体相同部位の長さでは相同組換えが効率的に起こらないという問題があった。
【００６６】
したがって、本発明では、遺伝子標的化出芽酵母菌株の製造に使用した方法を応用し、前記精製されたＫａｎｒ−バーコードモジュールをテンプレートとして５０ｍｅｒのプライマー対で２回、４０ｍｅｒのプライマー対で１回、すなわち合計３回の連続的ＰＣＲを行い、菌株特異的なバーコードと染色体相同組換えのための８０ｂｐを提供した（図３）。
【００６７】
５０％以上の菌株製造の成功率を示す前記４段階連続的ＰＣＲ法は、分裂酵母全遺伝子４，９８８種の１／４程度にのみ成功したが、残り３／４の遺伝子に対しては成功しなかった。したがって染色体相同部位の長さを伸ばす改善策として、４段階ブロックＰＣＲ法を導入した（図４）。４段階ブロックＰＣＲ法は、染色体相同組換え用５’と３’の３５０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片とをＰＣＲで別途に製造した後、前記精製されたＫａｎｒ−バーコードモジュールと混ぜてブロックＰＣＲを行うことにより欠損カセットを製造する方法である。この方法を経ると、３つのＫａｎｒ−バーコードモジュールおよび相同組換え用５’と３’の３５０〜５００ｂｐのＤＮＡ断片が一つのＤＮＡ断片となって互いに連結される。この方法はによれば、相同組換えに使用される欠損カセットの両側末端の染色体相同部位の長さが既存の４段階連続的ＰＣＲ法の８０ｂｐから３５０〜５００ｂｐにまで増加するので、遺伝子標的化菌株の製造効率が５０％から９０％に画期的に増大するという利点を持っている。
【００６８】
実施例２：遺伝子合成法による欠損カセットの製造
前述したＰＣＲによる方法でも、遺伝子標的化菌株の製造に失敗する場合が全遺伝子の約４％に達する。その理由は、遺伝子のプロモータ部位とターミネータ部位がＰＣＲを行うことが不可能な程度にアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）の比率が高く、既存のＰＣＲ法ではプライマー結合部位が存在できない場合が発生するためである。したがって、このような問題点を解決するために、新しい概念の方法である遺伝子合成法を導入した。遺伝子合成法を用いて欠損カセットを製造し、遺伝子標的化菌株を製造した事例は本発明が始めてである。
【００６９】
まず、遺伝子合成用欠損カセットを
１）５’染色体相同部位および５’バーコード部位、
２）カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）部位、
３）３’バーコード部位および３’染色体相同部位
の３つの断片(fragment)に分けて設計し、３つの断片を合わせて１つの欠損カセットに製造するために、互いに重畳する部分には各断片の連結に必要な塩基配列を有する連結オリゴを配置した（図５）。この際、菌株製造の際に菌株製造の効率を決定する最も重要な因子である染色体相同部位の長さは、２５０ｂｐに設定した。
【００７０】
５’染色体相同部位はタンパク質コーディング開始コドンＡＴＧを基準として遺伝子のプロモータ方向に２５０ｂｐ、３’染色体相同部位はタンパク質コーティング終止コドンＴＧＡ、ＴＡＧ或いはＴＡＡを基準としてポリＡ方向に２５０ｂｐを染色体から持ってきて使用した。２５０ｂｐの長さの５’と３’染色体相同部位の塩基配列は各遺伝子毎に相違し、通常の遺伝子情報に対する知識さえあれば誰でも容易に塩基配列を推定することができるので、省略する。
【００７１】
オリゴは相互間のギャップなしで重畳するように設計し、オリゴのみの重畳で、切れ目（ｎｉｃｋ）を有する２本鎖の欠損カセットＤＮＡ断片を製造した。この際、全オリゴのＴｍ値はＳａｎｔａＬｕｃｉａの計算式を用いて６０±３℃で均一に設計し（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  ＰＮＡＳ．  ９５：１４６０−５）、欠損カセットの両末端部位は相対的に長さの短い１２〜１６ｂｐのオリゴが配置されるように設計し、欠損カセットの両末端を平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）に作った。次に、重畳した全てのオリゴ間の切れ目をリガーゼで処理して接合（ライゲーション）させ、２本鎖からなる欠損カセットＤＮＡ断片を製造した。
【００７２】
実施例３：欠損カセットの形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および遺伝子標的化菌株の確認
前記実施例１と実施例２の過程を経て製造された欠損カセットを、２倍体分裂酵母ＳＰ２８６菌株（ａｄｅ６−Ｍ２１０／ａｄｅ６−Ｍ２１６、ｕｒａ４−Ｄ１８／ｕｒａ４−Ｄ１８、ｌｅｕ１−３２／ｌｅｕｌ−３２）細胞内に導入するために、公知の酢酸リチウム方法を用いて形質転換した（Ｍｏｒｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １９４：７９５−８２３）。形質転換された菌株はＧ４１８抗生剤（２００ｍｇ／Ｌ）を含むＹＥＳ寒天固体培地に塗抹した後、コロニーが生成されるまで３０℃で３〜４日間培養した。形質転換されたコロニーにおいて所望の遺伝子がターゲティングされたかを確認するためにコロニーＰＣＲを行った。固体培地で成長した形質転換コロニーの縁部から少量の細胞を採取して３次蒸留水に懸濁した後、この中から一部を取り、菌株確認用オリゴプライマー対を用いてＰＣＲで確認した。図６に示すように、欠損カセットが挿入された染色体の５’側の部位ではＣＰ５とＣＰＮ１若しくはＣＰＮ１０のオリゴプライマー対を用いて５’コロニーＰＣＲを行い、一方３’側の部位ではＣＰ３とＣＰＣ１若しくはＣＰＣ３のオリゴプライマー対を用いて３’コロニーＰＣＲを行って確認した。ＣＰ５とＣＰ３は染色体相同部位の１００〜２００ｂｐの外側染色体部位に、ＣＰＮ１とＣＰＣ１はＫａｎＭＸ４遺伝子側の２００ｂｐ内側に、ＣＰＮ１０とＣＰＣ３はＫａｎＭＸ４遺伝子側の３００ｂｐ内側にそれぞれ位置する。したがって、コロニーＰＣＲされたＤＮＡ断片の大きさは、３００〜４００ｂｐに染色体相同部位の長さ８０〜４５０ｂｐを加えたものと同様であり、通常５００〜１０００ｂｐ程度である。コロニーＰＣＲの反応条件は、本発明者の先行特許である韓国登録特許第１０−０４７５６４５号に明示されているので省略する。
【００７３】
ＣＰ５とＣＰ３のオリゴ塩基配列は全ての遺伝子特異的に相違するが、通常の遺伝子の知識があれば容易に分かるので省略する。カナマイシン耐性遺伝子内に存在するＣＰＮ１、ＣＰＮ１０、ＣＰＣ１、ＣＰＣ３のオリゴ部位の塩基配列および配列番号は下記表３に示した。
【００７４】
【表３】
0005608637.tif 000004
【００７５】
実施例４：遺伝子特異的バーコードの塩基配列の決定およびバーコードのＰＣＲ増幅
遺伝子特異的バーコードは、下記実施例５のマイクロアレイ遺伝子チップを用いた菌株を体系的に確認するために必ず必要である。このために、前述したように遺伝子標的化用欠損カセットの製造の際に５’側と３’側に各１つずつ合計２つの遺伝子固有の２０ｂｐのバーコードを挿入した（図１）。分裂酵母の遺伝子情報データベースを有する英国のＳａｎｇｅｒ研究所は分裂酵母に存在する遺伝子の個数を４，９８８個と開示した。したがって図７〜図５５に示すように、合計４，９８８個の遺伝子に対して１つの遺伝子に２つずつ合計９，９７６個のバーコードを与えた。配定されたそれぞれのバーコード名は、遺伝子の体系的名称に＿ＵＰ或いは＿ＤＮの拡張子を与える形式で命名した。例えば、配列番号１８のＳＰＡＣ１００２．０９ｃ遺伝子の５’側の上位タグ（ｕｐ−ｔａｇ）バーコードはＳＰＡＣ１００２．０９ｃ＿ＵＰで表記し、配列番号１９の３’側の下位タグ（ｄｏｗｎ−ｔａｇ）バーコードはＳＰＡＣ１００２．０９ｃ＿ＤＮで表記した（図７）。バーコードの塩基配列は、分裂酵母の染色体上には存在しない人為のＤＮＡ配列であって、Ｔｍ値が６０±１℃値を持つようにコンピュータアルゴリズムを用いて決定した。
【００７６】
実施例５：遺伝子標的化２倍体分裂酵母菌株のライブラリーを用いた、薬物作用点の探索法
薬物誘導ハプロ不全の原理を用いて薬物作用点の探索を行うために、出芽酵母を用いた薬物作用点の探索に用いられたＧｉａｅｖｅｒ博士の方法を変形させて使用した（図５６）（Ｇｉａｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５０−５６．，Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １１：２９５８−２９７４．，Ｐｉｅｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６０１−３）。遺伝子チップを用いた薬物作用点の分析は、
１）菌株ライブラリーの混合（ｐｏｏｌｉｎｇ）、
２）冷凍混合菌株液の活性化と薬物処理およびサンプリング、
３）染色体抽出およびＰＣＲによるバーコード標識子の増幅、
４）アフィメトリクス社への遺伝子チップの注文製作、
５）ハイブリダイゼーション、
６）発色と洗浄反応および発色の測定、および
７）結果分析
の７段階の工程が必要であり、以下ではこれをさらに詳細に区分して説明する。
【００７７】
１）菌株ライブラリーの混合
製造された菌株全体を同一の量で混ぜた菌株混合物を作る方法は、下記図５７に示した。４，８８４種の遺伝子標的ヘテロ接合菌株ライブラリーを一度に取り扱う作業は容易ではないので、先ず９６個の菌株を一つの小単位に括って作業を行った後、さらに小単位を一つに括る方法を採用した。具体的には、９６個の菌株を２００ｍｇ／ｍＬ濃度のＧ４１８抗生剤が添加されたＹＥＳ固体培地で３０℃で３日間培養した後、さらに平板プレートに９６ウェルの形態でさらに３０℃で３日間培養した。培養された菌株を５１枚の平板プレートの培地から掻き集めて２倍濃度の５．５ｍＬのＹＥＳに懸濁した後、最終濃度が３０％となるようにグリセロールを添加し、１ｍＬずつ小分して−８０℃で冷凍して保管した。薬物作用点の探索１回付き少なくとも一つの菌株当たり細胞の個数が１０，０００個以上となるように、合計５×１０７個の酵母を使用した。
【００７８】
２）冷凍した混合菌株液の活性化、薬物処理および試料採取(sampling)
菌株混合液に薬物を処理する前に、−８０℃に冷凍保管された菌株混合液の活性化先行作業が必要であった。ＹＥＳ液体培地に菌株混合液をＯ．Ｄ６００＝０．２で初期接種して２５℃で最終Ｏ．Ｄ６００＝２．０となるように培養した。活性化された菌株をＯ．Ｄ６００＝０．２で希釈し、適正濃度の薬物で処理して、３継代培養（通常、分裂酵母における１継代の培養時間は４時間である）ごとに、合計２０〜３０継代まで試料を採取した。菌株が栄養分に影響を受けず常に一定の速度で成長すれば、薬物による細胞成長阻害の度合いを測定することが容易なので、試料を採取した後にはさらにＯ．Ｄ６００＝０．２で新しい薬物が含まれた培地に希釈した。また、対照群としては、薬物のない培地で培養した菌株を採取した。採取したそれぞれの試料は遠心分離して菌株のみを濃縮した後、−８０℃に保管し、全ての試料採取が終わった後、一括的に染色体ＤＮＡを抽出して遺伝子チップの分析に使用した。
【００７９】
薬物の処理濃度を決定するために、まず５０％の細胞成長阻害薬物濃度（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ５０、ＩＣ５０）を測定した。野生型菌株ＳＰ２８６をＹＥＳ液体培地でＯ．Ｄ６００＝２．０まで培養させた後、薬物を５〜１０倍で連続希釈してＯ．Ｄ６００＝０．１となるように接種し、３０℃で２４時間培養した。各濃度で最終Ｏ．Ｄ６００値を測定して、Ｘ軸はＬｏｇ［薬物濃度］、Ｙ軸は最終Ｏ．Ｄ６００値にしてグラフを描いた後、プリズム（Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）プログラムを用いてＩＣ５０を自動算出した。薬物の処理濃度はＩＣ５０値近くの適切な値を実験的経験値によって決定した。
【００８０】
３）染色体の抽出およびＰＣＲによるバーコード標識子の増幅
Ｆｕｎｇａｌ／Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｃａｔａｌｏｇ＃Ｄ６００５）を用いて、前記で採取された試料２００ｍｇで通常２〜４μｇの染色体ＤＮＡを抽出した。抽出した染色体ＤＮＡは、２０〜５０倍希釈した後、２００倍希釈したＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ染料（Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ(R)  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．ｃａｔ＃Ｐ１１４９５）と１：１で混ぜた後、ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＮＤ−１０００、ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｉｎｃ．）で定量して各２００ｎｇを標識ＰＣＲに使用した。
【００８１】
遺伝子チップのプローブとして使用するために、抽出された染色体上に存在するバーコード部位のみを、ビオチンで標識されたプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。前記目的のために、まず２ｂｐのバーコードの両側にバーコードを増幅させるための共通プライマーＤＮＡ配列を決定した。共通プライマーの塩基配列は、分裂酵母の染色体との非特異的結合がなければならないことが重要なので、アルゴリズムと一連の実験によって決定した。決定された共通プライマーの塩基配列と配列番号は下記表４に示した。ＰＣＲでバーコードを増幅するときには、標識のためにカナマイシン遺伝子側に近いオリゴプライマーにビオチンを付着させて使用し、５’と３’のバーコード部位のＰＣＲ産物の長さはそれぞれ７０ｂｐと７３ｂｐである。ＰＣＲ増幅のための溶液の混合およびＰＣＲ条件は下記表５のとおりである。ＰＣＲ増幅済みの試料は、５μｌずつを３％アガロースゲルで電気泳動してＰＣＲ産物の長さおよび量を確認した後、ハイブリダイゼーションの前まで４℃の冷蔵庫に保管した。各ハイブリダイゼーションには約３０μＬのＰＣＲ産物を使用した。
【００８２】
【表４】
0005608637.tif 000005
【００８３】
【表５】
0005608637.tif 000006
【００８４】
４）アフィメトリクス社への遺伝子チップ注文製作
それぞれの菌株に特異的に挿入された２０ｂｐ長さのバーコードを認知するためのシステムとして、米国アフィメトリクス社で注文者一連番号ＫＲＩＢＢＳＰ１−ａ５２０４２９の適切な種類の遺伝子チップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）を注文して製作した（図５８）。製作されたＤＮＡチップは、横０．８ｃｍ×縦０．８ｃｍに１００，０００個のプローブが植えられており、プローブの大きさは横１１μｍ×縦１１μｍであった。１００，０００個のプローブの構成は次のとおりである：１）５’および３’のバーコード（各１０，０００）との完全一致（ｐｅｒｆｅｃｔ  ｍａｔｃｈ、ＰＭ）およびバーコードの中間における不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ、ＭＭ）塩基が配定された合計２０，０００個のプローブの３回反復（合計６０，０００）、２）非特異的結合によって誘導されたプローブの間違った信号（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ）を最小化するための対照群としての１０，０００個のプローブ、３）余裕分バーコード用の２０，０００個のプローブ、４）アフィメトリクス社のチップの製作、テキストオリゴの確認および区画に必要な１０，０００個の基本的プローブ。
【００８５】
５）ハイブリダイゼーション
前記過程４）で製造されたアフィメトリクス社の遺伝子チップと、過程３）で得られたバーコードのＰＣＲ増幅プローブとのハイブリダイゼーションは、下記のように行った。
まず下記表６に示すように、ハイブリダイズ溶液を１．５ｍＬのチューブで混合した。ハイブリダイゼーションでは、ビオチンで標識されたバーコードプローブ以外にも、テキスト（ｔｅｘｔ）オリゴとブロッキングオリゴとを混合した。ビオチンで標識されたテキストオリゴは、ハイブリダイゼーション済みの遺伝子チップの分析の際に光学的認知システムの標準を提供する役割を果たす。また、８種のオリゴが混合されたブロッキングオリゴ混合液は、ＰＣＲで増幅されたバーコード内の共通プライマーおよびプライマーとバーコードとの間に存在するギャップ部位を隠して正方向（ｓｅｎｓｅ）の２０ｂｐのバーコードのみが一本鎖で露出されるようにすることにより、遺伝子チップの逆方向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）プローブオリゴとの特異的なハイブリダイゼーションができるように助ける役割を果たす。それぞれ８種のオリゴは、３００ｐＭの原液で作って混合するが、５Ｕ−Ｂｌｏｃｋ、Ｋ５Ｕ−Ｂｌｏｃｋ、５Ｕ−Ｂｌｏｃｋ（ｒｅｖ  ｃｏｍｐ）、Ｋ５Ｕ−Ｂｌｏｃｋ（ｒｅｖ  ｃｏｍｐ）はそれぞれ最終３７．５ｐｍｏｌｅ／μＬとなるように、３Ｕ−Ｂｌｏｃｋ、Ｋ３Ｕ−Ｂｌｏｃｋ、３Ｕ−Ｂｌｏｃｋ（ｒｅｖ  ｃｏｍｐ）、Ｋ３Ｕ−Ｂｌｏｃｋ（ｒｅｖ  ｃｏｍｐ）はそれぞれ最終１２．５ｐｍｏｌｅ／μＬとなるように作成する。混合されたハイブリダイゼーション液を９８℃で５分間沸かした後、直ちに氷水に浸して順方向の２０ｂｐのバーコード配列が一本鎖で露出されるように誘導した。５分間、１４０μＬの混成緩衝溶液で前処理された遺伝子チップに、ビオチンで標識されたバーコードプローブが含まれたハイブリダイゼーション溶液１４０μＬを注入した後、４２℃で１６時間ハイブリダイゼーションを行った。
【００８６】
【表６】
0005608637.tif 000007
【００８７】
６）発色と洗浄反応および発色の測定
ハイブリダイゼーション済みのチップは、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）が結合したストレプトアビジンタンパク質を用いて発色反応（染色）を行った。ストレプトアビジンは、ビオチンに強く結合して蛍光発色することにより、遺伝子チップのプローブと特異的に結合したビオチン標識バーコードの量を定量的に測定可能とする。
【００８８】
発色反応溶液（６００μＬ＝２０倍ＳＳＰＥ  １８０．５７μＬ＋５０倍デンハルト溶液  １１．９４μＬ＋１０％  Ｔｗｅｅｎ２０  ０．５９７μＬ＋フィコエリトリン−ストレプトアビジン  １．０１９μＬ＋蒸留水４０５．８７４μＬ）をアフィメトリクス社の自動洗浄および発色機器Ｆｌｕｄｉｃｓ  Ｐ４５０に取り付けて機器の推薦使用方法によって遺伝子チップの自動洗浄および発色反応を下記表７に示すように行った。この際、洗浄液Ａ溶液の組成は１Ｌを基準として２０倍ＳＳＰＥ  ３００ｍＬ、１０％  Ｔｗｅｅｎ  １ｍＬ、蒸留水６９９ｍＬであり、洗浄液Ｂ）溶液の組成は１Ｌを基準として２０倍ＳＳＰＥ  １５０ｍＬ、１０％  Ｔｗｅｅｎ１ｍＬ、蒸留水８４９ｍＬであった。自動洗浄と発色反応の終わった遺伝子チップの蛍光値は、アフィメトリクス社の自動蛍光測定機器であるＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００Ｇ７を用いて測定した。
【００８９】
【表７】
0005608637.tif 000008
【００９０】
７）結果分析
ＰＣＲで増幅された正方向の遺伝子特異的標識バーコードが遺伝子チップに植えられた逆方向のオリゴと結合する度合いは、定量的蛍光値の強さで表示される。この際、測定された蛍光値は、コンピュータにセルの拡張子名を持つファイルに格納される。遺伝子チップにおいて強い信号を示す遺伝子は細胞成長が増加したことを意味し、弱い信号を示す遺伝子は細胞成長が減少したことを意味する。前記データを抽出し、ＡＮＯＶＡ法を用いて細胞成長が阻害されるヘテロ接合遺伝子標的化菌株を、公知の統計学的な方法としてのＡＮＣＯＶＡモデルを用いて分析した。
【００９１】
ＡＮＣＯＶＡモデルによれば、薬物による細胞成長の抑制度合いは減少した継代数で表現され、この値は次の公式で得る。
【００９２】
単位時間（１２時間）当たりの薬物によって減少した継代数＝薬物処理の際に単位時間（１２時間）当たりの変化した継代数−薬物がないときに単位時間（１２時間）当たりの変化した継代数
この際、継代数は次の公式で求める。
継代数＝Ｌｏｇ２（次の時点におけるＸの蛍光値）−Ｌｏｇ２（任意の時点における遺伝子Ｘの蛍光値）
【００９３】
実施例６：遺伝子チップを用いた抗真菌剤テルビナフィン(terbinafine)の薬物作用点の探索および検証
遺伝子チップを用いたテルビナフィンの薬物作用点探索のために、最も先に前述した方法でＩＣ５０-値を測定して薬物処理濃度を決定した。０．１ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ濃度のテルビナフィンで処理して薬物の相対的細胞成長阻害の度合いを求めた後、プリズムプログラムでＩＣ５０＝４０ｎＭの結果を得た（図１１）。 
【００９４】
４０ｎＭの濃度で混合菌株にテルボナフィンを処理し、下記表８に示すように、３継代（約１２時間）ごとに３０〜３５継代まで試料を採取し、対照群１３種および薬物処理群１２種の試料を用いて遺伝子チップの分析を行った。
【００９５】
【表８】
0005608637.tif 000009
【００９６】
テルビナフィンで処理して、時間による菌株の細胞成長をＡＮＣＯＶＡ法で分析し、上位１０位内の薬物作用遺伝子の候補群を下記表９にまとめた。既存のテルビナフィン作用点として知られているｅｒｇ１遺伝子が薬物ターゲットの１位として探索された。遺伝子ｅｒｇ１は、スクアレンモノオキシダーゼ（ｓｑｕａｌｅｎｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）であって、菌の細胞膜構成成分としてのエルゴステロール（ｅｒｇｏｓｔｅｒｏｌ）を生合成する過程の重要な遺伝子である。既存の出芽酵母を用いたテルビナフィンの薬物作用点探索においても、ｅｒｇ１遺伝子は１位として探索される。前述の試料は本発明で製造された分裂酵母遺伝子標的化菌株ライブラリーを用いた薬物作用点探索システムもよく作動していることを示す。
【００９７】
遺伝子チップで探索された薬物作用点は、実験未熟およびチップ解析の誤りによって発生する、間違った結果（ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を含む場合があるので、上位１０個の薬物作用点において遺伝子チップの分析で探索された上位１０種の作用点の中から非特異的なリボソーム関連遺伝子群は除いて、テルビナフィンが含有されたＹＥＳ固体培地で培養して再び検証する工程を行った。図６０に示すように、ｅｒｇ１とｐｍｍ１遺伝子はチップの結果と一致しており、ｓｍｂ１遺伝子はチップの結果と一致していない。赤いボックスで表示されたｅｒｇ１とｐｍｍ１遺伝子がテルビナフィンの特異的ターゲットであることを検証した。
これは本発明が既存に予想された作用タンパク質を正確に探索するうえ、新規の作用点も探索することができることを示している。
【００９８】
【表９】
0005608637.tif 000010
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明の「４段階ブロックＰＣＲ」或いは「遺伝子合成法」を用いて欠損カセットの両末端に２０ｍｅｒの遺伝子特異的バーコードと２５０〜３５０ｂｐの染色体相同部位を挿入することにより、効率的に遺伝子標的化菌株を製造することができ、前記菌株を用いたヘテロ接合菌株ライブラリーは、薬物の作用点を遺伝子水準で体系的に探索するのに利用できるため、新規薬物の発掘に非常に有用である。
【０１００】
以上、本発明の好適な実施例について本発明を説明の目的で開示したが、当業者であれば、添付した請求の範囲に開示された本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変形、追加または置換を加え得ることを理解するであろう。
【図７】
0005608637.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【配列表】
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