(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列を含んでなるタンパク質；（ii）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質；
（iii）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列からなる耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列の−１〜−４２番の配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の−１〜−４２番の配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列をＮ末端側に有する、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項４】
以下の（ｉ）及び（ii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号１に記載の塩基配列の１〜２４０３番の配列を含んでなるＤＮＡ。
【請求項５】
配列番号１に記載の塩基配列の１〜２４０３番の配列からなるＤＮＡ。
【請求項６】
請求項４又は５に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ。
【請求項７】
イントロン配列が、配列番号１に記載の塩基配列の３２２〜３７２番、５９９〜６５１番、１０６８〜１１１３番、又は、１２７９〜１３２６番の配列から選択される１以上の配列である、請求項６に記載のＤＮＡ。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ。
【請求項９】
シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列の１〜１２６番の配列である、請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項４〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
【請求項１１】
請求項４〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡ又は請求項１０に記載の発現ベクターで形質転換された宿主微生物。
【請求項１２】
宿主微生物が、糸状菌である、請求項１１に記載の宿主微生物。
【請求項１３】
糸状菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、又はアクレモニウム属に属する糸状菌から選択される糸状菌である、請求項１２に記載の宿主微生物。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の宿主微生物を培養し、培養物から耐熱性カタラーゼを採取することを特徴とする、耐熱性カタラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性カタラーゼに関するものであり、詳細には、ペニシリウム・ピノフィラム又はフミコーラ・グリゼア由来の耐熱性カタラーゼ、耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ及び耐熱性カタラーゼの製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カタラーゼは、過酸化水素を水と酸素に分解する反応を触媒する酵素である。過酸化水素水は消毒剤・殺菌剤として広く利用されている。過酸化水素水は、殺菌終了後、水で簡単に除去が可能であり、かつ時間経過とともにある程度自然分解されるため、食品などの殺菌剤として広く利用されている。しかし、残存する過酸化水素から発生する活性酸素が、細胞の老化やガンを引き起こす可能性を有するため、過酸化水素使用後は完全に分解・除去することが求められている。過酸化水素の分解には、新たな化学物質を添加することなく分解できるため、カタラーゼが非常に有効である。実際、カタラーゼは、綿の漂白処理後に残存する過酸化水素や、食品中の残存過酸化水素の分解・除去に用いられている。これまでに、カタラーゼとして、微生物由来のもの（特許文献１〜５）及び豚・牛の肝臓などの動物由来のカタラーゼなどが知られている。【０００３】
上記カタラーゼの中で、糸状菌であるアスペルギルス・ニガーが産生するカタラーゼや豚の肝臓由来のカタラーゼが工業用途に良く用いられてきた。しかし、これらのカタラーゼは耐熱性が低く、７０℃で３０分間処理すると１０％程度の活性が残存するのみであることが知られている（特許文献６）。一方、特に繊維加工や食品加工等の用途においては、高温での過酸化水素の分解が必要とされるため、従来品よりも耐熱性が高いカタラーゼが所望されている。これまでに耐熱性カタラーゼとして、アスペルギルス・テレウス（特許文献６）、アクレモニウム・アラバメンシス（特許文献６）、サーモアスカス・オーランチアカス（特許文献６）、シタリジウム・サーモフィラム（特許文献７）、フミコーラ・インソレンス（特許文献７）、及びサーモマイセス属（特許文献８）が産生するカタラーゼが報告されている。【０００４】
糸状菌は、タンパク質の分泌能が極めて高いことが知られており、酵素などの組換えタンパク質を生産するための宿主として適している。従って、耐熱性カタラーゼ遺伝子を糸状菌に導入し、組換えタンパク質として大量に発現させることができれば、野生株と比較して、耐熱性カタラーゼを著しく高い生産性により製造できることが期待される。これまでに、組換えタンパク質の生産用にアスペルギルス属（特許文献９）、ペニシリウム属（特許文献１０）、フミコーラ属（特許文献１１）、トリコデルマ属（特許文献１２）、アクレモニウム属（特許文献１３）に分類される糸状菌において組換えタンパク質の産生に成功したことが報告されている。【０００５】
これらの糸状菌を宿主として組換えタンパク質を発現させる場合、必ずしも宿主に導入した全ての外来遺伝子が発現される訳ではない。一般に、導入遺伝子のコドン使用の観点から、導入する外来遺伝子の由来は宿主にできる限り近縁であることが望ましいとされている。例えば、フミコーラ・インソレンスを宿主としてエンドグルカナーゼを組換えタンパク質として発現させる際に、フミコーラ・インソレンス由来であるＮＣＥ４、ＮＣＥ５遺伝子を導入した場合には顕著な量でのエンドグルカナーゼの発現が認められた（特許文献１４、１５）。これに対し、ＮＣＥ４、ＮＣＥ５とアミノ酸配列で高い同一性を有するリゾプス・オリゼー由来のＲＣＥＩ遺伝子を導入した場合には、エンドグルカナーゼの発現がほとんど認められなかった（特許文献１６）。また、アスペルギルス・アワモリを宿主としてグルコアミラーゼを組換えタンパク質として発現させる際に、アスペルギルス・ニガー由来のグルコアミラーゼ遺伝子を導入した場合には、グルコアミラーゼの発現は４．６ｇ／Ｌと高い生産性を示したのに対し、フミコーラ・グリゼア由来の遺伝子を導入した場合には０．６６ｇ／Ｌと低い生産性を示すに留まった（非特許文献１）。更には、アルファー−アミラーゼを組換えタンパク質として発現させる際に、アスペルギルス・オリゼを宿主としてアスペルギルス・オリゼ由来のアルファー−アミラーゼ遺伝子を導入した場合には、アルファー−アミラーゼの発現は１２ｇ／Ｌと高い生産性を示したのに対し、トリコデルマ・ビリデを宿主としてアスペルギルス・オリゼ由来のアルファー−アミラーゼ遺伝子を導入した場合には、アルファー−アミラーゼの発現は１ｇ／Ｌの生産性を示すに過ぎなかった（非特許文献１）。これらの結果は、著量の組換えタンパク質の発現を目指す場合においては、宿主と同種もしくは近縁の糸状菌に由来する遺伝子を導入するほうが望ましいことを示している。【０００６】
糸状菌を宿主とし、耐熱性カタラーゼを組換えタンパク質として大量に発現させることを目指す場合にも、上記の通り、導入される耐熱性カタラーゼ遺伝子の由来は宿主とする糸状菌と近縁であることが望ましいと考えられる。しかし、これまでに耐熱性カタラーゼ遺伝子の単離が報告されたのは、サーモアスカス・オーランチアカス由来のカタラーゼ遺伝子（特許文献１７）及びシタリジウム・サーモフィラム由来のカタラーゼ遺伝子（特許文献１８）のみである。タンパク質の生産宿主として開発されているアスペルギルス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、アクレモニウム属等の糸状菌から耐熱性カタラーゼ遺伝子が単離された例はこれまで報告されておらず、耐熱性カタラーゼを組換えタンパク質として生産性高く発現させることは、たいへん困難であった。【０００７】
【特許文献１】特開昭５５−１３５５８８号公報
【特許文献２】特開昭６０−０８３５７９号公報
【特許文献３】特開昭６３−００３７８８号公報
【特許文献４】特公昭４９−００４９５６号公報
【特許文献５】特開平２−０７６５７９号公報
【特許文献６】特開平５−１５３９７５号公報
【特許文献７】特表平６−５０６３４７号公報
【特許文献８】特開平１０−２５７８８３号公報
【特許文献９】国際公開第ＷＯ９７／０３４００４号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第ＷＯ２０００／０６８４０１号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第ＷＯ９８／００３６６７号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第ＷＯ９８／０１１２３９号パンフレット
【特許文献１３】特開２００１／０１７１８０号公報
【特許文献１４】国際公開第ＷＯ９８／００３６４０号パンフレット
【特許文献１５】国際公開第ＷＯ２００１／０９０３７５号パンフレット
【特許文献１６】国際公開第ＷＯ２０００／０２４８７９号パンフレット
【特許文献１７】特開２００４−２６１１３７号公報
【特許文献１８】米国特許第５６４６０２５号明細書
【非特許文献１】塚越規弘著、組換えタンパク質生産法（学会出版センター）、ｐｐ．９４〜９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このような背景のもと、耐熱性カタラーゼを組換えタンパク質として大量に発現させることが求められており、本発明者らは、組換えタンパク質の生産宿主として開発されたアスペルギルス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、アクレモニウム属の糸状菌から耐熱性カタラーゼを探索し、それら耐熱性カタラーゼをコードする遺伝子を単離し、耐熱性カタラーゼを大量に発現させることを課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため、組換えタンパク質の生産宿主として開発された糸状菌であるアスペルギルス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、アクレモニウム属に分類される糸状菌を多数培養し、得られた培養液中のカタラーゼについてその熱安定性の評価を重ね、これらの糸状菌より耐熱性カタラーゼを得ることを試みた。その結果、ペニシリウム・ピノフィラム及びフミコーラ・グリゼアが耐熱性カタラーゼを産生することを見出した。【００１０】
次に本発明者らは、ペニシリウム・ピノフィラムの培養液より耐熱性カタラーゼを精製したところ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）上で約８０ｋＤａの位置に単一のバンドを示し、かつそのＮ末端アミノ酸配列がＤＤＳＮＡＳＳＥＴＥＡＦＬＳＥＦＹＬＮＤＮＤＡＹＬＴＴＤＶＧＧ（配列番号５）である耐熱性カタラーゼを得た。また、フミコーラ・グリゼアの培養液より耐熱性カタラーゼを精製したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約８０ｋＤａの位置に単一のバンドを示し、かつそのＮ末端アミノ酸配列がＱＤＴＴＳＧＱＳＰＬＡＡＹＥＶＤＤＳＴＧ（配列番号１０）である耐熱性カタラーゼを得た。【００１１】
更に、本発明者らは、ペニシリウム・ピノフィラム及びフミコーラ・グリゼアのゲノムＤＮＡから、これらの耐熱性カタラーゼをコードする遺伝子のクローニング、塩基配列の決定に成功し、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明は、
１）ペニシリウム属に属する微生物が産生する耐熱性カタラーゼ、
２）ペニシリウム属に属する微生物が、ペニシリウム・ピノフィラムである、１）に記載の耐熱性カタラーゼ、
３）分子量が約８０ｋＤａである、１）又は２）に記載の耐熱性カタラーゼ、
４）フミコーラ・グリゼアが産生する耐熱性カタラーゼ、
５）分子量が約８０ｋＤａである、４）に記載の耐熱性カタラーゼ、
６）以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列を含んでなるタンパク質；
（ii）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質；
（iii）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質、
７）配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列からなる耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質、
８）配列番号２に記載のアミノ酸配列の−１〜−４２番の配列、又は、配列番号２に記載のアミノ酸配列の−１〜−４２番の配列において１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列をＮ末端側に有する、６）又は７）に記載のタンパク質、
９）以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるタンパク質：
（ｉ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１〜６８４番の配列を含んでなるタンパク質；
（ii）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１〜６８４番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質；
（iii）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１〜６８４番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質。
１０）配列番号４に記載のアミノ酸配列の１〜６８４番の配列からなる耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質、
１１）配列番号４に記載のアミノ酸配列の−１〜−３２番の配列、又は、配列番号４に記載のアミノ酸配列の−１〜−３２番の配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列をＮ末端側に有する、９）又は１０）に記載のタンパク質、
１２）以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）６）〜８）のいずれか一に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号１に記載の塩基配列の１〜２４０３番の配列を含んでなるＤＮＡ；
（iii）配列番号１に記載の塩基配列の１〜２４０３番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
１３）配列番号１に記載の塩基配列の１〜２４０３番の配列からなるＤＮＡ、
１４）１２）又は１３）に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
１５）イントロン配列が、配列番号１に記載の塩基配列の３２２〜３７２番、５９９〜６５１番、１０６８〜１１１３番、又は、１２７９〜１３２６番の配列から選択される１以上の配列である、１４）に記載のＤＮＡ、
１６）１２）〜１５）のいずれか一に記載のＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
１７）シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号１に記載の塩基配列の１〜１２６番の配列である、１６）に記載のＤＮＡ、
１８）以下の（ｉ）、（ii）、及び（iii）から選択されるＤＮＡ：
（ｉ）９）〜１１）のいずれか一に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ii）配列番号３に記載の塩基配列の１〜２７４９番の配列を含んでなるＤＮＡ；
（iii）配列番号３に記載の塩基配列の１〜２７４９番の配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ耐熱性カタラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
１９）配列番号３に記載の塩基配列の１〜２７４９番の配列からなるＤＮＡ、
２０）１８）又は１９）に記載のＤＮＡから、イントロン配列を除去したＤＮＡ、
２１）イントロン配列が、配列番号３に記載の２８３〜４６３番、６６７〜７４７番、７７１〜８４６番、１００８〜１１６０番、１２１８〜１２７０番、又は１８４２〜１８９５番の配列から選択される１以上の配列である、２０）に記載のＤＮＡ、
２２）１８）〜２１）に記載されるＤＮＡから、シグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡ、
２３）シグナル配列をコードする塩基配列が、配列番号３に記載の１〜９６番の配列である、２２）に記載のＤＮＡ、
２４）１２）〜１７）のいずれか一に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター、
２５）１２）〜１７）のいずれか一に記載のＤＮＡ又は２４）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主微生物、
２６）宿主微生物が、糸状菌である、２５）に記載の宿主微生物、
２７）糸状菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、又はアクレモニウム属に属する糸状菌から選択される糸状菌である、２６）に記載の宿主微生物、
２８）２５）〜２７）のいずれか一に記載の宿主微生物を培養し、培養物から耐熱性カタラーゼを採取することを特徴とする、耐熱性カタラーゼの製造方法、
２９）１８）〜２３）のいずれか一に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター、
３０）１８）〜２３）のいずれか一に記載のＤＮＡ又は２９）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主微生物、
３１）宿主微生物が、糸状菌である、３０）に記載の宿主微生物、
３２）糸状菌が、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フミコーラ属、トリコデルマ属、又はアクレモニウム属に属する糸状菌から選択される糸状菌である、３１）に記載の宿主微生物、
３３）３０）〜３２）のいずれか一に記載の宿主微生物を培養し、培養物から耐熱性カタラーゼを採取することを特徴とする、耐熱性カタラーゼの製造方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、耐熱性カタラーゼを組換えタンパク質として効率良く生産するために必要なＤＮＡを得ることができ、また、耐熱性カタラーゼを効率良く発現する組換え微生物を得ることができる。更に、得られた組換え微生物を培養することにより、効率よく安価に耐熱性カタラーゼを生産することができる。本発明の耐熱性カタラーゼで過酸化水素を含んだ溶液を処理することにより、高温においても過酸化水素を効率的かつ安価に分解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】プラスミドｐＰＣＮの制限酵素地図である。
【図２】プラスミドｐＨＣＮの制限酵素地図である。
【図３】プラスミドｐＰＴＰＣＮの制限酵素地図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本明細書において、「耐熱性カタラーゼ」とは、特許文献６の実施例４に開示された方法で耐熱性を測定し、７０℃で３０分間保存後の活性残存率が５０％以上であるカタラーゼを意味する。【００１６】
ペニシリウム・ピノフィラム及びフミコーラ・グリゼアが培養液中に産生する耐熱性カタラーゼは、例えば特許文献６に示されている方法により得ることができる。カタラーゼ活性の測定は、過酸化水素を含んだ溶液にカタラーゼを添加し、一定時間後に減少した過酸化水素を定量することにより評価され、例えば特許文献６に開示されている方法により測定できる。また、耐熱性カタラーゼは、特許文献６に記載の方法に従って、適当な濃度に希釈した培養上清を７０℃で３０分間熱処理し、熱処理前後のカタラーゼ活性を測定することで評価できる。本明細書において、上記の定義に従い、本熱処理において５０％以上の活性が残存するカタラーゼを耐熱性カタラーゼとする。【００１７】
上記の方法により得られたペニシリウム・ピノフィラム及びフミコーラ・グリゼアの培養液上清につき、その上清中のカタラーゼの熱安定性を測定した。その結果、７０℃で３０分間の熱処理によりペニシリウム・ピノフィラムの産生するカタラーゼは５０％、フミコーラ・グリゼアの産生するカタラーゼは５７％のカタラーゼ活性が残存しており、ペニシリウム・ピノフィラム及びフミコーラ・グリゼアは耐熱性カタラーゼを産生していた。【００１８】
耐熱性カタラーゼの精製は、上記の方法で得られた耐熱性カタラーゼを含んだ培養上清から、タンパク質精製の定法に従って実施できる。この際、用いられるタンパク質精製法は、一般的に知られている様々な方法が適用できるが、例えば、疎水クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィを組み合わせることにより実施できる。また、精製された耐熱性カタラーゼの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定することができる。【００１９】
上記の方法により、ペニシリウム・ピノフィラム及びフミコーラ・グリゼアの産生する耐熱性カタラーゼを精製し、分子量を決定したところ、ペニシリウム・ピノフィラム及びフミコーラ・グリゼアから、それぞれ約８０ｋＤａの分子量を持つ耐熱性カタラーゼが得られた。【００２０】
本明細書において、「アミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の方法により、又は天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。アミノ酸の改変の個数は、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜３０個、更に好ましくは１〜１０個、更により好ましくは１〜５個、最も好ましくは１〜２個である。【００２１】
本発明のタンパク質の改変アミノ酸配列の例は、好ましくは、そのアミノ酸が、１又は複数個（好ましくは、１ないし数個あるいは１、２、３、又は４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であることができる。
本明細書において、「保存的置換」とは、１もしくは複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。【００２２】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーション後のメンブレンの洗浄操作を、高温下低塩濃度溶液中で行うことを意味し、例えば、０．５×ＳＳＣ濃度（１×ＳＳＣ：１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸３ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）、６０℃、１５分間の洗浄条件、好ましくは０．５×ＳＳＣ濃度、０．１％ＳＤＳ溶液中で６０℃、１５分間の洗浄条件を意味する。【００２３】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。【００２４】
本明細書において、塩基配列又はアミノ酸配列についての「同一性」とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基又はアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えば、ＦＡＳＴＡ等においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いることにより、容易に算出することができる。【００２５】
配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。【００２６】
配列番号４に記載のアミノ酸配列の１〜６８４番の配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。【００２７】
本発明において、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列をコードする種々の塩基配列を選択することができる。【００２８】
本発明において、配列番号４に記載のアミノ酸配列の１〜６８４番の配列が与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定まり、配列番号４に記載のアミノ酸配列の１〜６８４番の配列をコードする種々の塩基配列を選択することができる。【００２９】
従って、配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡとは、配列番号１に記載の塩基配列の１〜２４０３番の配列で表される塩基配列の一部又は全部に加え、同一のアミノ酸をコードする塩基配列であって縮重関係にあるコドンを塩基配列として有する配列をも意味するものとする。本発明においては更に、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。【００３０】
また、配列番号４に記載のアミノ酸配列の１〜６８４番の配列を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡとは、配列番号３に記載の塩基配列の１〜２７４９番の配列で表される塩基配列の一部又は全部に加え、同一のアミノ酸をコードする塩基配列であって縮重関係にあるコドンを塩基配列として有する配列をも意味するものとする。本発明においては更に、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。【００３１】
配列番号２に記載のアミノ酸配列の１〜６９２番の配列を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡの好ましい例としては、配列番号１に記載の塩基配列の１〜２４０３番の配列で表される塩基配列を含んでなるＤＮＡが挙げられる。【００３２】
配列番号４に記載のアミノ酸配列の１〜６８４番の配列を含んでなるタンパク質をコードするＤＮＡの好ましい例としては、配列番号３に記載の塩基配列の１〜２７４９番の配列で表される塩基配列を含んでなるＤＮＡが挙げられる。【００３３】
ペニシリウム・ピノフィラム及びフミコーラ・グリゼアが産生する耐熱性カタラーゼをコードする遺伝子の単離は、ペニシリウム・ピノフィラム及びフミコーラ・グリゼアよりゲノムファージライブラリーを作製し、耐熱性カタラーゼ遺伝子を含んだ陽性ファージクローンを得ることにより実施することができる。ゲノムファージライブラリーより陽性ファージクローンをスクリーニングするためのプローブとして、耐熱性カタラーゼ遺伝子断片を用いることができる。プローブとする耐熱性カタラーゼ遺伝子断片はそれぞれのゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによる増幅できる。ＰＣＲのためのプライマーセットは、既知の糸状菌由来カタラーゼ遺伝子の保存配列を基に設計できる。この様にして得られた陽性クローンから耐熱性カタラーゼ遺伝子を大腸菌ベクターにサブクローニングしたのち、得られるベクターの塩基配列を解析することにより、耐熱性カタラーゼ遺伝子の塩基配列を決定できる。また、該塩基配列より推定されるアミノ酸配列と既知のカタラーゼのアミノ酸配列との比較、及びイントロンの保存配列を基に、該塩基配列中のイントロン配列が推定できる。また該遺伝子の翻訳開始コドンから、精製された耐熱性カタラーゼのＮ末アミノ酸配列をコードする配列の直前までが、シグナル配列をコードする配列として推定できる。【００３４】
上記の方法により、ペニシリウム・ピノフィラムのゲノムＤＮＡより単離された全長の耐熱性カタラーゼ遺伝子ＰＣＮは、配列表の配列番号１に記載された２４０３ｂｐの塩基からなっており、また本遺伝子は配列番号１に記載の３２２〜３７２番、５９９〜６５１番、１０６８〜１１１３番、及び１２７９〜１３２６番の塩基配列で示される４つのイントロンからなっていると推定された。該遺伝子配列より推定される耐熱性カタラーゼのアミノ酸配列は配列番号２に示される通りであった。また、該アミノ酸配列の１〜３１番の配列は、ペニシリウム・ピノフィラムより精製した耐熱性カタラーゼのＮ末アミノ酸配列と完全に一致したため、配列番号２の−１〜−４２番のアミノ酸配列をシグナル配列であると推定し、該アミノ酸配列がコードされる配列番号１の１〜１２６番の塩基配列をシグナル配列がコードされる塩基配列と推定した。【００３５】
本明細書において示したペニシリウム・ピノフィラム由来のカタラーゼ遺伝子ＰＣＮの塩基配列に基づいて、所望の遺伝子を増幅させるためのプライマーを作製し、ペニシリウム・ピノフィラムのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することにより発現ベクターを作製することができ、所望の遺伝子を単離することができる。更に、本発明のペニシリウム・ピノフィラム由来のＤＮＡは、プラスミドｐＰＣＮに含まれていることから、これらをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして利用することが可能である。また、これらプラスミドから適当な制限酵素にて所望のＤＮＡ断片を調製することができる。【００３６】
本発明によれば、平成２０年（２００８年）２月７日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国内寄託（国内受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５０４）され、平成２０年（２００８年）１２月１１日から国際寄託（国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７４）に移管されている、ｐＰＣＮで形質転換された大腸菌（Escherichia coli）株が提供される。【００３７】
上記の方法によりフミコーラ・グリセアのゲノムＤＮＡより単離された全長の耐熱性カタラーゼ遺伝子ＨＣＮは配列表の配列番号３に示された２７４９ｂｐの塩基からなっており、また本遺伝子は、配列番号３の２８３〜４６３番、６６７〜７４７番、７７１〜８４６番、１００８〜１１６０番、１２１８〜１２７０番、１８４２〜１８９５番の塩基配列で示される６つのイントロンからなっていると推定された。該遺伝子配列より推定される耐熱性カタラーゼのアミノ酸配列は配列番号４に示される通りであった。また、該アミノ酸配列の１〜２０番の配列は、フミコーラ・グリセアより精製した耐熱性カタラーゼのＮ末アミノ酸配列と完全に一致したため、配列番号４の−１〜−３２番のアミノ酸配列をシグナル配列であると推定し、該アミノ酸配列がコードされる配列番号３の１〜９６番の塩基配列をシグナル配列がコードされる塩基配列と推定した。【００３８】
本明細書において示したフミコーラ・グリセア由来のカタラーゼ遺伝子ＨＣＮの塩基配列に基づいて、所望の遺伝子を増幅させるためのプライマーを作製し、フミコーラ・グリセアのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを実施し、増幅したＤＮＡ断片を適当なベクターと連結することにより発現ベクターを作製することができ、所望の遺伝子を単離することができる。更に、本発明のフミコーラ・グリセア由来のＤＮＡは、プラスミドｐＨＣＮに含まれていることから、これらをＰＣＲの鋳型ＤＮＡとして利用することが可能である。また、これらプラスミドから適当な制限酵素にて所望のＤＮＡ断片を調製することができる。【００３９】
また、本発明によれば、平成２０（２００８）年２月７日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に国内寄託（国内受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１５０３）され、平成２０年（２００８年）１２月１１日から国際寄託（国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１０７３）に移管されている、ｐＨＣＮで形質転換された大腸菌（Escherichia coli）が提供される。【００４０】
上記のようにして単離した耐熱性カタラーゼ遺伝子は、これらを宿主に導入して発現させることにより耐熱性カタラーゼを製造できる。宿主に導入されるＤＮＡは、全長の耐熱性カタラーゼ遺伝子、該ＤＮＡからイントロン配列の一部又は全部を除去したＤＮＡ、又はシグナル配列をコードする塩基配列を除去したＤＮＡのいずれでも構わない。【００４１】
本発明によれば、前記の本発明によるＤＮＡを、宿主微生物内で複製可能で、かつそのＤＮＡがコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。更に本発明によれば、この発現ベクターによって形質転換された微生物が提供される。【００４２】
この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば大腸菌、放線菌、酵母、カビなどを用いた系、及びそれらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。本発明に好適な宿主微生物としては、糸状菌、好ましくはトリコデルマ属、アスペルギルス属、ペニシリウム属（更に好ましくはペニシリウム・ピノフィラム）、フミコーラ属（更に好ましくはフミコーラ・グリセア）、アクレモニウム属糸状菌などが挙げられ、発現ベクターとしては、特許文献９〜１３に記載の発現ベクターなどを使用することができる。【００４３】
本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。【００４４】
本発明の発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望のタンパク質を発現させるために、前記の本発明によるＤＮＡの他に、その発現を制御するＤＮＡや微生物を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいてもよい。【００４５】
こうして得られた形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から上記した本発明のタンパク質を単離して得ることができる。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物に応じて適宜に設定すればよい。また、培養液からの目的とするタンパク質の回収、精製も常法に従って行なうことができる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明の理解を深めるために実施例に沿って説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４７】
実施例１：ペニシリウム・ピノフィラム培養液中のカタラーゼ活性（耐熱性）の測定
ポテトデキストロース寒天培地で生育させたペニシリウム・ピノフィラムを、シュークロース５０ｇ／Ｌ、麦芽エキス２０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌより成る培地３０ｍＬを入れた２００ｍＬの三角フラスコに植菌し、２６℃で５日間振とう培養した後、得られた培養液から遠心分離により菌体を除き、培養上清液を得た。得られた培養上清液中のカタラーゼについて、そのカタラーゼ活性（耐熱性）を特許文献６の実施例４に開示された方法で測定した結果、７０℃で３０分間保存後の活性残存率は５０％であった。以上の結果から、ペニシリウム・ピノフィラムは耐熱性のカタラーゼを産生していると判断した。【００４８】
実施例２：ペニシリウム・ピノフィラム培養液中の耐熱性カタラーゼの単離精製
実施例１に記載の方法で得られたペニシリウム・ピノフィラムの培養上清液に最終濃度１ｍｏｌ／Ｌになるように硫酸アンモニウムを溶解させた後、本溶液をあらかじめ５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムで平衡化させた疎水カラムPhenyl Sepharose HP 26/10（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）に通液させることにより吸着させた。次に、本疎水カラムに吸着されたタンパク質を５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムから５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）への直線勾配溶出法により溶出させ、分画した。分画した溶出液のカタラーゼ活性を実施例１に記載の方法により測定し、活性を示した画分を回収した。回収した活性画分に最終濃度１ｍｏｌ／Ｌになるように硫酸アンモニアを添加し、上記と同様の方法で疎水カラムにより再クロマトグラフィを実施した。得られた活性画分を限外ろ過することにより濃縮脱塩した後、最終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を添加した。続いて本溶液を、あらかじめ５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した陰イオン交換カラムＭｏｎｏＱ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）に通液し、タンパク質を吸着させた。吸着させたタンパク質を５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）から５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌへの直線勾配溶出法により溶出させ分画した。分画した溶出液のカタラーゼ活性（耐熱性）を実施例１に記載の方法により測定し、活性を示した画分を回収した。回収した活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析したところ、約８０ｋＤａの単一なバンドを示したので、本バンドに由来するタンパク質が耐熱性カタラーゼであると判断した。本耐熱性カタラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜にブロットし、Ｎ末端のアミノ酸配列を解析したところ、次の配列が得られた。
ＤＤＳＮＡＳＳＥＴＥＡＦＬＳＥＦＹＬＮＤＮＤＡＹＬＴＴＤＶＧＧ（配列番号５）【００４９】
実施例３：ペニシリウム・ピノフィラムからの耐熱性カタラーゼ遺伝子ＰＣＮのクローニング
３−１）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
ペニシリウム・ピノフィラムの菌体より、堀内らの方法［H.Horiuchi et. al., J. Bacteriol., 170, 272-278, (1988)］に従ってゲノムＤＮＡを単離・精製した。単離したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩにより部分消化した。これをファージベクター・ＥＭＢＬ３クローニングキット（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩアームに、ライゲーションキットＶｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結させた。これをエタノール沈澱後、ＴＥ緩衝液に溶解した。連結混合物の全量をMaxPlaxλ packerging kit（エピセンターテクノロジー社製）を用い、ファージ粒子を形成させ、大腸菌XL1-blue MRA (P2)株に感染させた。この方法により１．１×１０４個のファージから成るゲノムＤＮＡライブラリーが得られた。【００５０】
３−２）プローブの作製
既知のカタラーゼの保存領域の配列を基に以下のプライマーを作製した。
ＰカタラーゼＦ：ＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＣＣＮＧＡＲＴＧＧＲＡ（配列番号６）
ＰカタラーゼＲ：ＣＣＴＧＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＧＣＲＡＡＲＷＡＲＴＴ（配列番号７）【００５１】
ＰカタラーゼＦ及びＰカタラーゼＲをプライマーとして使用し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。ＰＣＲは、９４℃で３０秒、アニールを３０秒、７２℃で１分間を４０サイクル実施するプログラムで実施したが、アニール温度は最初の２０サイクルで６３℃から５３℃へ段階的に低下させ、その後の２０サイクルにおいては５３℃に固定した。増幅された２５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドＴＯＰＯ−Ｐカタラーゼを得た。【００５２】
プラスミドＴＯＰＯ−Ｐカタラーゼにクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。その結果得られた塩基配列をホモロジー検索した結果、アスペルギルス・クラバタス由来のカタラーゼと７１％の同一性を示したため、本ＤＮＡ断片をカタラーゼ遺伝子の一部であると判断した。本ＤＮＡ断片をプラスミドＴＯＰＯ−Ｐカタラーゼを鋳型として上記と同様の方法でＰＣＲに増幅し、得られたＰＣＲ産物はＥＣＬダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて標識しプローブとした。【００５３】
３−３）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
実施例３−１において作製したファージプラークを、ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン（アマシャム社製）に転写し、アルカリ変性後、５倍濃度ＳＳＣ（ＳＳＣ：１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸３ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させてＤＮＡを固定した。ハイブリダイゼーションは、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識プローブを添加し、４時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った。プローブの洗浄は６ｍｏｌ／Ｌ尿素、０．４％ＳＤＳ添加０．５倍濃度ＳＳＣで２回、２倍濃度ＳＳＣで２回行った。【００５４】
プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、検出溶液に１分間浸したあと、同社製ハイパーフィルムＥＣＬに感光させ、１個の陽性クローンを得た。陽性クローンからのＤＮＡ調製は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（J．Sambrook，E．F．Fritsch and T．Maniatis，"Molecular Cloning"，Cold Spring
Harbor Laboratory Press.1989）に従い、宿主大腸菌としてＬＥ３９２を用いて行った。まず、ＬＥ３９２をＬＢ−ＭＭ培地（１％ペプトン、０．５％イーストエキス、０．５％塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウム、０．２％マルトース）で一晩培養した。これにシングルプラーク由来のファージ溶液を感染させ、ＬＢ−ＭＭ培地で一晩培養した。これに、塩化ナトリウムを１ｍｏｌ／Ｌに、そしてクロロホルムを０．８％になるよう加え、大腸菌の溶菌を促進させた。遠心分離により、菌体残渣をのぞき、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱（１０％ＰＥＧ６０００）からファージ粒子を回収した。ファージ粒子はＳＤＳ存在下、プロティナーゼＫで消化し、これをフェノール処理、エタノール沈澱化によりファージＤＮＡを回収した。
以上のように調製したＤＮＡはＥＣＬダイレクトシステムを用い、サザンブロット解析を行った。実施例３−２のＰＣＲ増幅断片をプローブにハイブリダイゼーションを行った結果、約７ｋｂのＰｓｔＩ断片が染色体ＤＮＡと共通のハイブリダイゼーションパターンを示した。【００５５】
このＰｓｔＩ断片をｐＵＣ１１８にクローン化し、プラスミドｐＵＣ−ＰＣＮを得た。得られたプラスミドの塩基配列を実施例３−２に記載の方法により解析した。更にペニシリウム・ピノフィラム由来のカタラーゼ遺伝子ＰＣＮをサブクローニングするために、ｐＵＣ−ＰＣＮを鋳型にして、以下のプライマーセット（ＰＣＮＦ及びＰＣＮＲ）によりＰＣＲを実施し、ＰＣＮ遺伝子を増幅した。
ＰＣＮＦ：ＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＴＡＴＡＣＴＣＣＣＴＣ（配列番号８）
ＰＣＮＲ：ＣＴＡＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＧＡＡＴＣＧ（配列番号９）
増幅されたＤＮＡをＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、pCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドｐＰＣＮを得た。得られたプラスミドｐＰＣＮにより大腸菌（Escherichia coli）ＴＯＰ１０株（インビトロジェン社）を形質転換することによりEscherichia coli ＴＯＰ１０株／ｐＰＣＮを得た。【００５６】
３−４）耐熱性カタラーゼのアミノ酸配列の推定
上記の方法によりペニシリウム・ピノフィラムのゲノムＤＮＡより単離された全長の耐熱性カタラーゼ遺伝子ＰＣＮは配列番号１に示された２４０３ｂｐの塩基からなっていた。本塩基配列より推定されるアミノ酸配列と既知のカタラーゼのアミノ酸配列との比較及びイントロンの保存配列を基に、本遺伝子は配列番号１の３２２〜３７２番、５９９〜６５１番、１０６８〜１１１３番、１２７９〜１３２６番に示される４つのイントロンが含まれていると推定された。本塩基配列より推定される耐熱性カタラーゼのアミノ酸配列は配列番号２に示される通りであった。また、配列番号２のアミノ酸配列の１番〜３１番の配列は、実施例２に示したペニシリウム・ピノフィラムより精製した耐熱性カタラーゼのＮ末アミノ酸配列と完全に一致したため、配列番号２のアミノ酸配列の−１〜−４２番の配列をシグナル配列であると推定し、本アミノ酸配列がコードされる配列番号１の１〜１２６番の塩基配列をシグナル配列がコードされる塩基配列と推定した。【００５７】
実施例４：フミコーラ・グリセア培養液中のカタラーゼ活性（耐熱性）の測定
フミコーラ・グリセアの培養上清液を、実施例１と同様の方法で調製した。得られた培養上清液中のカタラーゼについて、そのカタラーゼ活性（耐熱性）を実施例１の方法で測定した結果、７０℃で３０分間保存後の活性残存率は、５７％であった。以上の結果から、フミコーラ・グリセアは耐熱性カタラーゼを産生していると判断した。【００５８】
実施例５：フミコーラ・グリセア培養液中の耐熱性カタラーゼの単離精製
実施例４に記載の方法で得られたフミコーラ・グリセアの培養上清液に最終濃度１ｍｏｌ／Ｌになるように硫酸アンモニウムを溶解させた後、本溶液をあらかじめ５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐH７．０）中１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムで平衡化させた疎水カラムPhenyl
Sepharose HP 26/10（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）に通液させることにより吸着させた。次に、本疎水カラムに吸着されたタンパク質を５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中１ｍｏｌ／Ｌ硫酸アンモニウムから５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）への直線勾配溶出法により溶出させ分画した。分画した溶出液のカタラーゼ活性（耐熱性）を実施例１に記載の方法により測定し、活性を示した画分を回収した。回収した活性画分に最終濃度１ｍｏｌ／Ｌになるように硫酸アンモニアを添加し、上記と同様の方法で疎水カラムにより再クロマトグラフィを実施した。得られた活性画分を限外ろ過することにより濃縮脱塩した後、最終濃度５０ｍｍｏｌ／Ｌとなるように酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を添加した。続いて本溶液を、あらかじめ５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で平衡化した陽イオン交換カラムＭｏｎｏＳ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）に通液した。非吸着画分にカタラーゼ活性が検出されたため、非吸着画分を活性画分として回収した。回収した活性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析したところ、約８０ｋＤａの単一なバンドを示したので、本バンドに由来するタンパク質が耐熱性カタラーゼであると判断した。本耐熱性カタラーゼをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した後、ＰＶＤＦ膜にブロットし、Ｎ末端のアミノ酸配列を解析したところ、次の配列が得られた。
ＱＤＴＴＳＧＱＳＰＬＡＡＹＥＶＤＤＳＴＧ（配列番号１０）【００５９】
実施例６：フミコーラ・グリセアからの耐熱性カタラーゼ遺伝子ＨＣＮのクローニング
６−１）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
実施例３−１に記載の方法で、フミコーラ・グリセアのゲノムＤＮＡライブラリーを調製した。【００６０】
６−２）プローブの作製
糸状菌及び酵母由来カタラーゼの保存領域の配列を基に以下のプライマーを作製した。
ＨカタラーゼＦ：ＧＴＮＣＧＮＴＴＹＴＣＮＡＣＴＧＴ（配列番号１１）
ＨカタラーゼＲ：ＡＡＲＡＡＮＡＣＮＧＧＮＴＴＲＴＴＧＴＴ（配列番号１２）
［配列番号１２中、下線で示す記号「Ｎ」（１２番）はデオキシイノシンを意味する］
ＨカタラーゼＦ及びＨカタラーゼＲをプライマーとして使用し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、Ｅｘ  Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて実施した。ＰＣＲは、９８℃で１０秒、アニールを５５℃で３０秒、伸長反応を７２℃で１５秒間の３０サイクル実施するプログラムで実施した。増幅された３００ｂｐのＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、添付のプロトコールに従ってpCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドＴＯＰＯ−Ｈカタラーゼを得た。【００６１】
プラスミドＴＯＰＯ−Ｈカタラーゼにクローニングされた挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた塩基配列をホモロジー検索した結果、スクレロティニア・スクレロティオラム由来のカタラーゼと９７％と高い同一性を示したため、本ＤＮＡ断片をカタラーゼ遺伝子の一部であると判断した。本ＤＮＡ断片をプラスミドＴＯＰＯ−Ｈカタラーゼを鋳型として上記と同様の方法でＰＣＲに増幅し、得られたＰＣＲ産物はＥＣＬダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて標識しプローブとした。【００６２】
６−３）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
実施例３−３に記載の方法で、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした結果、１個の陽性クローンを得た。得られた陽性クローンについてサザンブロット解析を行った結果、約７ｋｂのＸｈｏＩ断片と約４ｋｂのＢａｍＨＩ断片が染色体ＤＮＡと共通のハイブリダイゼーションパターンを示した。これらＸｈｏＩ断片とＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１１８にクローン化し、それぞれプラスミドｐＵＣ−ＨＣＮ−ＸｈｏＩとｐＵＣ−ＨＣＮ−ＢａｍＨ１を得た。これらのプラスミドの塩基配列を解析した結果、ＸｈｏＩ断片には配列番号３の塩基配列の６１６番から３’末端までの配列が、ＢａｍＨＩ断片には５’末端から配列番号３の塩基配列の１６７５番の配列が確認され、耐熱性カタラーゼ遺伝子断片が含まれていた。これらの塩基配列を結合させることにより全長の耐熱性カタラーゼ遺伝子の塩基配列を確定させた。フミコーラ・グリセア由来のカタラーゼ遺伝子ＨＣＮをサブクローニングするために、フミコーラ・グリセアのゲノムＤＮＡを鋳型にして、以下のプライマーセット（ＨＣＮＦ及びＨＣＮＲ）によりＰＣＲを実施し、ＨＣＮ遺伝子を増幅した。
ＨＣＮＦ：ＡＴＧＡＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＧＡＡＴＣＴＣ（配列番号１３）
ＨＣＮＲ：ＴＣＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧ（配列番号１４）
増幅されたＤＮＡをＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、pCR2.1-TOPOプラスミドベクターに挿入し、プラスミドｐＨＣＮを得た。得られたプラスミドｐＨＣＮにより大腸菌（Escherichia coli）ＴＯＰ１０株（インビトロジェン社）を形質転換することによりEscherichia coli ＴＯＰ１０株／ｐＨＣＮを得た。【００６３】
６−４）耐熱性カタラーゼのアミノ酸配列の推定
上記の方法によりフミコーラ・グリセアのゲノムＤＮＡより単離された全長の耐熱性カタラーゼ遺伝子ＨＣＮは配列番号３に示された２７４９ｂｐの塩基からなっていた。本塩基配列より推定されるアミノ酸配列と既知のカタラーゼのアミノ酸配列との比較及びイントロンの保存配列を基に、本遺伝子は配列番号３の塩基配列の２８３〜４６３番、６６７〜７４７番、７７１〜８４６番、１００８〜１１６０番、１２１８〜１２７０番、１８４２〜１８９５番に示される６つのイントロンが含まれていると推定された。本塩基配列より推定される耐熱性カタラーゼのアミノ酸配列は配列番号４に示される通りであった。また、配列番号４のアミノ酸配列の１〜２０番の配列は、実施例５に示したフミコーラ・グリセアより精製した耐熱性カタラーゼのＮ末アミノ酸配列と完全に一致したため、配列番号４のアミノ酸配列の−１〜−３２番のアミノ酸配列をシグナル配列であると推定し、本アミノ酸配列がコードされる配列番号３の塩基配列の１〜９６番の配列をシグナル配列がコードされる塩基配列と推定した。【００６４】
実施例７：組換えＰＣＮ発現ベクターの調製
アスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラス（Aspergillus niger var. macrosporus）を宿主とした組換えＰＣＮの発現は、アスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスにおいて著量発現されているプロクターゼＢ遺伝子のプロモーターとターミネーターとの間に、ＰＣＮ遺伝子を挿入した発現ベクターを用いて実施した。本発現ベクターは、以下の手順により調製した。【００６５】
７−１）ゲノムＤＮＡライブラリーの作製
アスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスの菌体より、堀内らの方法［H.Horiuchi et. al., J. Bacteriol., 170, 272-278, (1988)］に従ってゲノムＤＮＡを単離・精製した。単離したゲノムＤＮＡをＳａｕ３ＡＩにより部分消化した。これをファージベクターλＥＭＢＬ３クローニングキット（ストラタジーン社製）のＢａｍＨＩアームに、ライゲーションキットＶｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結させた。これをエタノール沈澱後、ＴＥ緩衝液に溶解した。連結混合物の全量をMaxPlaxλ packerging kit（エピセンターテクノロジー社製）を用い、ファージ粒子を形成させ、大腸菌XL1-blue MRA(P2)株に感染させた。この方法により１．２５×１０５個のファージから成るゲノムＤＮＡライブラリーが得られた。【００６６】
７−２）プローブの作製
アスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスのゲノムＤＮＡライブラリーについて、プロクターゼＢ遺伝子の翻訳領域をプローブとしたサザンブロッティングを実施することにより、プロクターゼＢ遺伝子のプロモーター及びターミネーター領域を含んだクローンを単離した。プロクターゼＢ遺伝子の翻訳領域はアスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスのゲノムＤＮＡを鋳型にし、特開平５−６８５７０号公報に記載されたプロクターゼＢ遺伝子の翻訳領域の５’末端及び３’末端配列を基に設計したプライマー（ｐｒｏｃｔａｓｅＢ−ＮとｐｒｏｃｔａｓｅＢ−Ｃ）を用いて、ＰＣＲにより増幅した。
ｐｒｏｃｔａｓｅＢ−Ｎ：ＡＴＧＧＴＣＧＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＡＡＣＣ（配列番号１５）
ｐｒｏｃｔａｓｅＢ−Ｃ：ＣＴＡＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＧＣＧＡＡＴＣＣ（配列番号１６）【００６７】
ＰＣＲは、ＬＡ  ＰＣＲＴＭ  ＫＩＴ  Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ社製）を用いて行った。反応条件は、９４℃で１分間保温の後、（９４℃、３０秒間）・（５２℃、３０秒間）・（７２℃、９０秒間）のサイクルを３０サイクル行い、最後に７２℃、７分間処理し、反応を終了した。その結果、約１．２ｋｂのＤＮＡが増幅された。増幅された１．２ｋｂのＤＮＡ断片を、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社製）により、キットに添付されていたプロトコールに従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドベクターに挿入し、プラスミドＴＯＰＯ−ＰｒｏＢを得た。プラスミドＴＯＰＯ−ＰｒｏＢにクローニングされた挿入ＤＮＡ断片のシークエンスは、BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社製）とＡＢＩ  ＰＲＩＳＭジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、添付されていたプロトコールに従って行った。その結果得られた塩基配列は特開平５−６８５７０号公報記載のプロクターゼＢ遺伝子の配列と一致したため、本ＤＮＡ断片をプロクターゼＢ遺伝子の翻訳領域であると判断した。本ＤＮＡ断片をＥＣＬダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて標識し、プローブとした。【００６８】
７−３）プラークハイブリダイゼーションによるプロクターゼ遺伝子のプロモーター領域及びターミネーター領域を含んだクローンのスクリーニング
実施例７−１において作製したファージプラークを、ハイボンドＮ＋ナイロントランスファーメンブラン（アマシャム社製）に転写し、アルカリ変性後、５倍濃度ＳＳＣ（ＳＳＣ：１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸３ナトリウム、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム）で洗浄し、乾燥させてＤＮＡを固定した。ハイブリダイゼーションは、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、実施例に７−２に記載の方法で調製したプローブを添加し、２０時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った。プローブの洗浄は６ｍｏｌ／Ｌ尿素、０．４％ＳＤＳ添加０．５倍濃度ＳＳＣで２回、２倍濃度ＳＳＣで２回行った。プローブの洗浄を行ったナイロン膜は、検出溶液に１分間浸したあと、同社製ハイパーフィルムＥＣＬに感光させ、８個の陽性クローンを得た。【００６９】
陽性クローンからのＤＮＡ調製は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（J．Sambrook，E．F．Fritsch and T．Maniatis，"Molecular Cloning"，Cold Spring
Harbor Laboratory Press.1989）に従い、宿主大腸菌としてＬＥ３９２を用いて行った。まず、ＬＥ３９２を、ＬＢ−ＭＭ培地（１％ペプトン、０．５％イーストエキス、０．５％塩化ナトリウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウム、０．２％マルトース）で一晩培養した。これにシングルプラーク由来のファージ溶液を感染させ、ＬＢ−ＭＭ培地で一晩培養した。これに、塩化ナトリウムを１ｍｏｌ／Ｌに、そしてクロロホルムを０．８％になるように加え、大腸菌の溶菌を促進させた。遠心分離により、菌体残渣をのぞき、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱（１０％ＰＥＧ６０００）からファージ粒子を回収した。ファージ粒子はＳＤＳ存在下、プロティナーゼＫで消化し、これをフェノール処理、エタノール沈澱化によりファージＤＮＡを回収した。【００７０】
以上のように調製したＤＮＡはＥＣＬダイレクトシステムを用い、サザンブロット解析を行った。実施例７−２に記載の方法で調製したプローブにハイブリダイゼーションを行った結果、約５．５ｋｂのＸｈｏＩからＥｃｏＲＩ断片が染色体ＤＮＡと共通のハイブリダイゼーションパターンを示したため、本断片がプロクターゼＢ遺伝子を含んだ断片であると判断し、サブクローニングを実施することとした。ファージＤＮＡより切り出したＸｈｏＩからＥｃｏＲＩ断片をｐＵＣ１１９のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ部位に挿入し、プラスミドｐＰＲＯＢ／１１９Ｅ．Ｘを得た。得られたプラスミドの塩基配列を解析し、プロクターゼＢ遺伝子のプロモーター、ターミネーター領域の塩基配列を決定した。【００７１】
７−４）遺伝子発現用組換えベクターｐＰＴＢ−ＥＸの構築
実施例７−３に記載した方法で調製したプラスミドｐＰＲＯＢ／１１９Ｅ．Ｘから、プロクターゼＢ遺伝子の翻訳領域を削除し、本遺伝子のプロモーターの３’末端とターミネーター領域の５’側末端とが、ＸｂａＩ認識配列で結合したベクターを発現ベクターｐＰＴＢ−ＥＸとした。ｐＰＴＢ−ＥＸは、ｐＰＲＯＢ／１１９Ｅ．Ｘを鋳型として、プロクターゼＢ遺伝子のプロモーターの３’側末端としたプライマー（ｐｒｏｃｔａｓｅＢＮｘｂａ）、ターミネーターの５’側末端をプライマー（ｐｒｏｃｔａｓｅＢＣｘｂａ）としたインバースＰＣＲにより調製した。
ｐｒｏｃｔａｓｅＢＮｘｂａ：ＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＴ（配列番号１７）
ｐｒｏｃｔａｓｅＢＣｘｂａ：ＧＧＴＣＴＡＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡ（配列番号１８）
尚、両プライマー５’側末端にはＸｂａＩ認識配列を付加した。ＰＣＲは、Primestar MAX DNA POLYMERASE（タカラバイオ社製）を用いて、（９８℃、１０秒間）・（５５℃、５秒間）・（７２℃、６０秒間）の反応を３０サイクル行った。その結果、約７ｋｂのＤＮＡが増幅された。ＰＣＲ反応液はQIAQUICK PCR PURIFICATION KIT（キアゲン社製）を用いてＤＮＡの精製を行い、５０μＬのＴＥバッファーに溶出し、得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩで制限処理した後、ライゲーションキットＶｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて再連結し、発現ベクターｐＰＴＢ−ＥＸとした。得られたプラスミドの塩基配列を解析し、インバースＰＣＲによる変異が入っていないことを確認した。【００７２】
７−５）組換えＰＣＮ発現用ベクターｐＰＴＰＣＮの構築
実施例３に記載の方法で単離したＰＣＮ遺伝子を、発現ベクターｐＰＴＢ−ＥＸのＸｂａＩサイトに挿入し、組換えＰＣＮ発現用ベクターｐＰＴＰＣＮを構築した。ＰＣＮ遺伝子翻訳領域の５’側末端及び３’側末端にＸｂａＩ認識配列を付加するために、ｐＰＣＮを鋳型として、ＰＣＮ遺伝子の翻訳領域の５’側末端及び３’側末端にＸｂａＩ認識配列を付加したプライマーＰＣＮ−ＸｂａＩＰｔＮとＰＣＮ−ＸｂａＩＰｔＣを用いてＰＣＲを行った。
ＰＣＮ−ＸｂａＩＰｔＮ：ＧＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＡＡＡＡＴＧＣＧＡＧＧＡＴＴＡＴＡＣＴＣＣＣＴ（配列番号１９）
ＰＣＮ−ＸｂａＩＰｔＣ：ＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＧＡＡＴＣＧＧ（配列番号２０）
ＰＣＲは、Primestar MAX DNA POLYMERASE（タカラバイオ社製）、（９８℃、１０秒間）・（５５℃、５秒間）・（７２℃、６０秒間）の反応を３０サイクルで行った。その結果、約２．３ｋｂのＤＮＡが増幅された。ＰＣＲ反応液はQIAQUICK PCR PURIFICATION KIT（キアゲン社製）を用いてＤＮＡの精製を行い５０μＬのＴＥバッファーに溶出し、得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩで制限処理した後、同じくＸｂａＩで消化した後に脱リン酸化処理したｐＰＴＢ−ＥＸとライゲーションキットＶｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結し、プラスミドｐＰＴＰＣＮを得た（配列番号２１、図３）。本プラスミドに挿入されたＰＣＮのＤＮＡ配列を解析し、ＰＣＲにより変異が導入されていないことを確認した。【００７３】
実施例８：ＰＣＮ発現ベクターｐＰＴＰＣＮによるアスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスの形質転換、及び組換えＰＣＮの発現【００７４】
ＰＣＮ発現ベクターｐＰＴＰＣＮによるアスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスの形質転換は、本株のｎｉａＤ欠損株を、ｎｉａＤ遺伝子を選択マーカー遺伝子として形質転換することにより実施した。【００７５】
８−１）ｎｉａＤ欠損株Ｎｉａ２株の単離
アスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスの胞子をサペック培地−Ｎ（０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５％ＫＣｌ、０．００１％ＦｅＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、３％シュークロース、１．５％Purified Agar、ｐＨ５．５〜６．０）に０．１８８％グルタミン酸ナトリウム及び３％ＫＣｌＯ３を添加した培地に塗布した。３０℃にて５〜７日間培養した後に得られたコロニーを、サペック培地のＮ源をＮＯ３、ＮＨ４もしくはグルタミン酸とする培地にそれぞれレプリカし３０℃、５〜７日間培養した。レプリカしたコロニーのうち、ＮＨ４及びグルタミン酸をＮ源とする培地では生育するが、ＮＯ３をＮ源とする培地では生育しない株をｎｉａＤ欠損株Ｎｉａ２株として単離した。【００７６】
８−２）選択マーカー遺伝子ｎｉａＤ遺伝子の単離
アンクルら［Uncle,S.E., Cambell,E.I., Punt,P.J., Hawker,K.L., Contreras,R.,
Hawkins,A.R., Van Den Hondel,C.A. and Kinghorn,J.R., "The Aspergillus niger niaD gene
encoding nitrate reductase:upstream nucreltide and amino acid sequence
comparisons", Gene 111(2), 149-155(1992)］により報告されたアスペルギルス・ニガーのｎｉａＤ遺伝子の翻訳領域の５’末端及び３’末端を基に設計したプライマーＮｉａ−Ｎ及びＮｉａ−Ｃを用いたＰＣＲにより、アスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスのｎｉａＤ遺伝子の翻訳領域を増幅した。
Ｎｉａ−Ｎ：ＡＴＧＧＣＧＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＧＴＧ（配列番号２２）
Ｎｉａ−Ｃ：ＴＴＡＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＧＧＴＣＣＧＡ（配列番号２３）
ＰＣＲはアスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスのゲノムＤＮＡを鋳型にして、LA PCRTM KIT Ver2.1（タカラバイオ社製）を用いて、９４℃１分の後、（９４℃、３０秒間）・（５５℃、３０秒間）・（７２℃、３分間）のサイクルを３０サイクル行い最後に７２℃、７分間処理することにより、実施した。その結果、約３ｋｂのＤＮＡが増幅された。増幅された３ｋｂのＤＮＡ断片を、ＥＣＬダイレクトシステム（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いて標識し、プローブとした。【００７７】
続いて、前記の方法で調製したｎｉａＤ遺伝子の翻訳領域をプローブとして、実施例７−１に記載の方法で調製したアスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスのゲノムＤＮＡライブラリーよりｎｉａＤ遺伝子のプロモーター領域、ターミネーター領域を含んだクローンを単離した。実施７と同様の方法により、ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、１個の陽性クローンを得た。得られたファージクローンを実施例７と同様の方法でサザンブロット解析を行った。その結果、約６．５ｋｂのＸｂａＩ消化断片が染色体ＤＮＡと共通のハイブリダイゼーションパターンを示したので、このＸｂａＩ断片をｐＵＣ１１８のＸｂａＩ認識配列部位にクローニングし、プラスミドｐＰＴｎｉａ１１８を得た。得られたプラスミドの塩基配列を解析し、ｎｉａＤ遺伝子のプロモーター及びターミネーター領域を含む６４１６ｂｐの塩基配列（配列番号２４）を決定した。【００７８】
８−３）ＰＣＮ遺伝子のアスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスＮｉａ２株への導入
アスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスＮｉａ２株をＳ培地（３．０％グルコース、０．１％ポリペプトン、１％イーストエキス、０．１４％硫酸アンモニウム、０．２％リン酸カリウム、０．０３％硫酸マグネシウム、ｐＨ６．８）で３０℃、２４時間培養し、遠心分離（３５００ｒｐｍ、１０分）によって菌体を回収した。得られた菌体を０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（１０ｍｇ／ｍＬ  βグルクロニダーゼ、３ｍｇ／ｍＬキチナーゼ、３ｍｇ／ｍＬザイモラーゼ、０．５ｍｏｌ／Ｌシュークロース）に懸濁した。３０℃、６０分間振とうし、菌糸をプロトプラスト化させた。脱脂綿によりこの懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣバッファー（１７．１％シュークロース、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２）で洗浄した。以上のようにして調製したプロトプラストを１００μＬのＳＵＴＣバッファーで再懸濁した後、ｐＰＴＰＣＮ７．５μＬ（１μｇ／μＬ）とｐＰＴｎｉａ１１８  ２．５μＬ（１μｇ／μＬ）とを添加し、氷上で５分間静置した。次に４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２）を添加し、氷上に２０分静置した後、ＳＵＴＣバッファーを１０ｍＬ添加し２５００ｒｐｍ、１０分間遠心した。遠心分離したプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣバッファーに懸濁した後、４０００ｒｐｍ、５分間遠心して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣバッファーに懸濁した。
以上の処理をしたプロトプラストをサペック再生培地（０．０８５％ＮａＮＯ３、０．１％Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５％ＫＣｌ、０．００１％ＦｅＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、１７．１％シュークロース、１．５％Purified Agar、ｐＨ５．５〜６．０）上に軟寒天とともに重層し、３０℃、５〜７日間培養し形成したコロニーを形質転換体とした。【００７９】
８−４）アスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラス  Ｎｉａ２株形質転換体におけるＰＣＮの発現と酵素活性の測定
得られた形質転換体をＰ培地（１．０％でんぷん、６．０％脱脂大豆粕、１．０％コーンスティープリカー、０．３％硫酸アンモニウム、１％炭酸カルシウム）にて２８℃、６日間培養した。培養後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したところ、組換えＰＣＮに由来する分子量約８０ｋＤａのバンドが観測された株（Ｎｏ．１６株）を得た。Ｎｏ．１６株の培養上清と、Ｎｉａ２株を同様に培養し得られた培養上清について、実施例１に記載の方法でカタラーゼ活性を測定した。その結果、表１に記載のとおりＮｏ．１６は親株の７７倍以上の活性を示し、組換えＰＣＮが発現したことが確認された。【００８０】
【表１】
0005608372.tif 000002
【００８１】
なお、カタラーゼ活性は１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を分解する酵素量を１単位とした。更に、実施例１に記載の方法で得られたペニシリウム・ピノフィラムの培養上清のカタラーゼ活性を測定したところ、その活性は３８５Ｕ／ｍＬであった。この結果から、ＰＣＮをアスペルギルス・ニガー  バラエティ  マクロスポーラスを宿主として、発現させることにより、その生産性が顕著に向上することが示された。【００８２】
８−５）Ｎ末端アミノ酸配列の解析
実施例８−４で得られた形質転換体Ｎｏ．１６株の培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ミリポア社製ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰＳＱ）に転写した。このＰＶＤＦ膜をクマシーブリリアントブルーで染色し、約８０ｋＤａのタンパク質がブロットされた部分を切り取り、Ｍｏｄｅｌ４９２アミノ酸シーケンサーに供し、アミノ末端側１１残基のアミノ酸配列を解読した。その配列は以下に示されるとおりであった。
ＤＤＳＮＡＳＳＥＴＥＡ（配列番号５の１〜１１番）
このアミノ酸配列はペニシリウム・ピノフィラム由来ＰＣＮのＮ末端アミノ酸配列と同一であったことから、約８０ｋＤａのタンパク質が組換えＰＣＮであることが確認された。【００８３】
８−６）組換えＰＣＮの熱安定性の検討
実施例１に記載のとおり、ペニシリウム・ピノフィラムの産生する天然のＰＣＮの熱安定性は、５０％であった。実施例１に記載の方法で、実施例８−４に記載の方法で得た組換えＰＣＮの熱安定性を評価した結果、その安定性は７１．３％であった。以上の結果から、組換えＰＣＮの熱安定性は、天然のＰＣＮのそれと比較して顕著に向上することが明らかとなった。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
配列表の配列番号６−９、１１−２０、２２−２３の各塩基配列は、人工的に合成したプライマー配列であり、それぞれ、プライマーP catalase F（配列番号６）、P catalase R（配列番号７）、PCNF（配列番号８）、PCNR（配列番号９）、H catalase F（配列番号１１）、H catalase R（配列番号１２）、HCNF（配列番号１３）、HCNR（配列番号１４）、proctaseB-N（配列番号１５）、proctaseB-C（配列番号１６）、proctaseBNxba（配列番号１７）、proctaseBCxba（配列番号１８）、PCN-XbaIPtN（配列番号１９）、PCN-XbaIPtC（配列番号２０）、Nia-N（配列番号２２）、Nia-C（配列番号２３）である。
配列番号２１の塩基配列は、プラスミドｐＰＴＰＣＮである。
配列番号６の記号「Ｎ」（１８番）、配列番号１１の記号「Ｎ」（３、６、１２番）、配列番号１２の記号「Ｎ」（６、９番）は、それぞれ、任意の塩基を表し、配列番号１２の記号「Ｎ」（１２番）は、デオキシイノシンを表す。
【図１】
0005608372.tif 000003
【図２】
0005608372.tif 000004
【図３】
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【配列表】
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