(57)【要約】本発明は、これまで報告されてきている中皮腫診断キット等よりも高感度に、健常人との識別、アスベスト暴露経験者からの中皮腫患者の鑑別、肺がん等の他の疾患の患者との識別等を有効に行うことのできる中皮腫診断剤等を提供することを課題とする。本発明は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが血液のまま、あるいは血清に分離した状態で室温に３時間以上放置することにより生じるフラグメントのＮ端側フラグメントを認識する抗体を有効成分とする中皮腫診断剤に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する抗体。
【請求項２】
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを体液中、室温で放置することにより生じるフラグメントのＮ端側フラグメントを認識する抗体。
【請求項３】
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを血液中又は血清中、室温で放置することにより生じるフラグメントのＮ端側フラグメントを認識する抗体。
【請求項４】
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを血液中又は血清中、室温で３時間以上放置することにより生じるフラグメントのＮ端側フラグメントを認識する抗体。
【請求項５】
抗体の認識部位が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４〜２２９番目を含む抗体。
【請求項６】
抗体の認識部位が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３４〜１３９番目を含む抗体。
【請求項７】
抗体の認識部位が、配列番号１に記載のアミノ酸配列の６８〜１３９番目を含む抗体。
【請求項８】
更に、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する、請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載の抗体を備える、中皮腫診断剤。
【請求項１０】
請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載の抗体を備える、中皮腫診断キット。
【請求項１１】
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する第１の抗体を含有する第１の試薬と、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する抗体であって、前記第１の抗体と認識部位が異なる第２の抗体を含有する第２の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キット。
【請求項１２】
検体中の、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量を、請求項１０または１１に記載の中皮腫診断キットにより測定し、その量を指標とすることを特徴とする中皮腫診断方法。
【請求項１３】
検体が、血清、血漿、胸水または腹水である請求項１２に記載の中皮腫診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中皮腫の早期診断に用いることができる中皮腫診断剤、中皮腫診断キットおよび中皮腫診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アスベストに暴露された経験をもつヒトが高頻度で中皮腫を発病することは社会問題にまで発展している。中皮腫は悪性のものと良性のものが存在するが、悪性中皮腫患者の多くは、アスベストへの暴露歴を有し、アスベスト曝露から３０−３５年という長期潜伏期間を経て悪性中皮腫を発症している。このため、今後中皮腫患者が増加する可能性は否定できない。【０００３】
また、中皮腫は早期発見の難しい疾患であり、現在中皮腫はＭＲＩやＣＴ等を用いた方法により診断されているが、これらの方法では早期診断が難しく、中皮腫と診断された時点で既に病気が進行していることが多いことが問題となっている。それだけに本疾患の早期診断が切に望まれているが、現在のところ有効な早期診断マーカーが見つけられていない。【０００４】
現在まで中皮腫に関連するマーカーとしては、Ｅｒｃ、ＭＰＦおよびメソセリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）と呼ばれるタンパク質が発見されている。その経緯は次のようなものである。
まず、１９９４年、ヤマグチ（Yamaguchi）らにより、ヒト膵臓癌細胞ＨＰＣ−Ｙ５上清から、ＭＰＦ
(Megakaryocyte potentiating factor)と呼ばれるタンパク質が精製されたことが報告され（文献１）、さらに１９９５年、コジマ（Kojima）らにより、ヒト膵臓癌細胞ＨＰＣ−Ｙ５のｃＤＮＡからＭＰＦがクローニングされたことが報告された（文献２）。【０００５】
その後、チャン（Chang）らは、中皮細胞、卵巣癌および中皮腫の表面に発現する４０ｋＤａのエピトープに反応するモノクローナル抗体Ｋ１を作製し、該抗体を用いて、その抗原タンパク質をコードする遺伝子を探索したところ、６９ｋＤａのタンパク質をコードする１８８４ｂｐのオープンリーディングフレーム（open reading frame）を持つ遺伝子を単離した。そしてさらに、チャン（Chang）らは、当該６９ｋＤａタンパク質が前記４０ｋＤａタンパク質の前駆体であり、該６９ｋＤａタンパク質がホスファチジルイノシトール特異性ホスホリパーゼ（ＰＩ−ＰＬ）の作用により切断され、細胞表面に４０ＫＤａタンパク質が発現することを明らかにした。そしてチャン（Chang）らは、その６９ｋＤａタンパク質をメソセリンと名づけたが（文献３）、後に上述のＭＰＦとメソセリンは同一のタンパク質であることが明らかとなった。【０００６】
一方、ショラー（Scholler）らは卵巣癌細胞を免疫して作製したモノクローナル抗体ＯＶ５６９が認識するタンパク質を検索した結果、このものはメソセリンの膜結合領域と同じ配列を有する、分子量４２−４５ｋＤａのタンパク質であることを発見し、可溶性メソセリン（Soluble member of mesothelin）と呼んだ。このタンパク質は途中にフレームシフト変異を起しており、その結果、Ｃ末領域のＧＰＩアンカー部分が異なる配列になってしまうために可溶性になることが判明した。さらに、ＯＶ５６９と同じタンパク質を認識する別のモノクローナル抗体４Ｈ３を用いてサンドイッチＥＩＡ（Sandwich EIA）の測定系を構築し、卵巣癌患者の血清を測定した結果、健常人に比べて、上記タンパク質が高い値を示すことを見出した（文献４）。さらにロビンソン（Robinson）らはこの測定系を用いて中皮腫患者の測定を行い、健常人に比べて上記タンパク質が高い値を示すことを報告している（文献５）。【０００７】
本発明者である樋野らは、長年にわたる疾患モデル動物の研究を通じて、腎癌発症モデルＥｋｅｒラットの原因遺伝子を探索してきた。その結果、正常腎組織に比べてＥｋｅｒラット腎癌由来細胞株において高発現を示す遺伝子を発見し、その中の１つをＥｒｃと命名した。さらに、ラットＥｒｃのヒトホモログを探索した結果、ヒトにおいてはＭＰＦ  がラットＥｒｃに対して５６.１％の相同性を有することを明らかにした（文献６、７）。【０００８】
以上の経緯等から、（１）ヒトＥｒｃ、ＭＰＦおよびメソセリン（以下、これらを「Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ」という）は、全長６２２アミノ酸からなる糖タンパク質であり、２９０−２９５アミノ酸にＲＰＲＦＲＲ配列を有することから、フリン（Ｆｕｒｉｎ）様プロテアーゼでプロセッシングを受けて３１ｋＤａと４０ｋＤａフラグメントに開裂すること、（２）４０ｋＤａフラグメントのＣ末側領域はそのＣ末端にＧＰＩアンカー領域を含むことから細胞膜に結合した形で残り、Ｎ末側の３１ｋＤａフラグメントは可溶性タンパク質として分泌されること（以下、これを「３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ」という）、（３）また細胞膜上に結合した４０ｋＤａフラグメントのＣ末側もホスファチジルイノシトール−スペシフィックホスホリパーゼＣ（phosphatidiylinositol-specific phospholipase C：PI-PLC）処理によって細胞から放出されること等が考えられている。【０００９】
これらの異なるアプローチによって同定されたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎは、正常の中皮細胞および中皮腫に強く発現しているのみならず、中皮腫患者血液中にも存在することが報告されている。しかしながら、これらの知見では中皮腫においてどのようなタイプのＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが分泌されているのかは明らかにされていなかった。【００１０】
これまでに、本発明者らは上記の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが、中皮腫患者の血清中に高濃度で存在していることを示し、これにより中皮腫が診断できることを報告している（文献８）。しかし、この報告は患者検体中に目的タンパク質がどのような状態で存在しているかを可視化しているわけではなかった。また、この報告では３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端領域を認識する抗体を用いて測定していたため、完全に全長を保持した３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのみが測定され、Ｃ末端を何らかの作用で分解欠損してしまうような断片は測定することが不可能であった。【００１１】
また、本発明者らの報告の後にも、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを検出することにより中皮腫が診断できることが報告されているが（文献９）、この報告ではＥＬＩＳＡ系で測定されたＭＰＦの測定値が絶対値表記されていなかった。また、この報告では実際に中皮腫患者と健常人の血清を測定しているが、その結果はＭＰＦの絶対値表記ではなく、単なる吸光度が表記されているにすぎず、これでは、異なる試験ごとの値の比較をすることができない。これらの理由は標準物質と血液中のＭＰＦとの換算ができないためであると推測される。そして、その原因としては抗体の特異性、親和性が組み換え体と血液中の天然型との間で異なっていることが予想される。更に、この報告ではいくつか得られている抗体同士で認識エピトープの相違を調べているが、これはそれぞれのエピトープが異なるか否か調べているに過ぎず、実際に各抗体の認識エピトープの位置を明らかにしているものではない。このように、この先行技術では実用的な診断に用いることは適していないと判断されるものであった。【００１２】
【非特許文献１】Yamaguchi N, Hattori K, Oh-eda M, Kojima T, Imai N, Ochi N. Anovelcytokine exhibiting megakaryocyte potentiating activity from a humanpancreatictumor cell line HPC-Y5., J Biol Chem.269:805-808, 1994.PMID: 8288629
【非特許文献２】Kojima, T.; Oh-eda, M.; Hattori, K.; Taniguchi, Y.; Tamura, M.;Ochi,N.; Yamaguchi, N. : Molecular cloning and expression of megakaryocyte potentiatingfactor cDNA., J. Biol. Chem. 270: 21984-21990, 1995. PubMed ID :7665620
【非特許文献３】Chang, K.; Pastan, I. : Molecular cloning of mesothelin, adifferentiationantigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovariancancers., Proc. Nat.Acad. Sci. 93: 136-140, 1996. PubMed ID : 8552591
【非特許文献４】Scholler, N.; Fu, N.; Yang, Y.; Ye, Z.; Goodman, G. E.; Hellstrom,K.E.; Hellstrom, I. : Soluble member(s) of the mesothelin/megakaryocytepotentiating factor family are detectable in sera from patients with ovariancarcinoma.,Proc. Nat. Acad. Sci. 96: 11531-11536, 1999.   PubMed ID : 10500211
【非特許文献５】Robinson BW, Creaney J, Lake R, Nowak A, Musk AW, de Klerk N,WinzellP, Hellstrom KE, Hellstrom I.Soluble mesothelin-related protein-A blood testfor mesothelioma.Lung Cancer. 49 Suppl 1:S109-111, 2005. PMID: 15950789
【非特許文献６】Hino O, Kobayashi E, Nishizawa M, Kubo Y, Kobayashi T, HirayamaY,Takai S, Kikuchi Y, Tsuchiya H, Orimoto K, et al.Renal carcinogenesis in the Ekerrat., J Cancer Res Clin Oncol. 121:602-605, 1995. PMID: 7559744
【非特許文献７】Yamashita Y, Yokoyama M, Kobayashi E, Takai S, Hino O  Mapping  and determination of the cDNA sequence of theErc genepreferentially expressed in renal cell carcinoma in the Tsc2 genemutant (Eker)rat model., Biochem Biophys Res Commun. 275(1):134-140, 2000. PMID: 10944454
【非特許文献８】Shiomi K, Miyamoto H, Segawa T, Hagiwara Y, Ota A, Maeda M,Takahashi K, Masuda K, Sakao Y, Hino O.  Novel ELISAsystem for detection of N-ERC/mesothelin in the sera of mesothelioma patients.Cancer Sci. 97:928-932, 2006. PMID: 16776777
【非特許文献９】Onda M, Nagata S, Ho M, Bera TK, Hassan R, Alexander RH, Pastan I. Megakaryocytepotentiation factor cleaved from mesothelin precursor is a useful tumor markerin the serum of patients with mesothelioma.Clin Cancer Res. 12:4225-4231, 2006. PMID: 16857795
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、本発明の目的は、これまで報告されてきている中皮腫診断キット等よりも高感度に、健常人との識別、アスベスト暴露経験者からの中皮腫患者の鑑別、肺がん等の他の疾患の患者との識別等を有効に行うことのできる中皮腫診断剤や中皮腫診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、中皮腫患者由来の体液を用いて詳細に検索した結果、体液中に３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎと共にその分解断片（フラグメント）も存在していることを発見した。そして、これまで、抗体作製において常識的に用いられる抗原部位である３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＮ末端およびＣ末端のアミノ酸を含むポリペプチドを抗原として得られる抗体を用いた測定系では３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのフラグメントは検出されなかったことを知った。【００１５】
そして、本発明者らはこの３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎと、フラグメントの両方を測定可能な測定系について鋭意研究したところ、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの適正な部位を認識する抗体を選択することにより、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎと共にそのフラグメントを高感度で測定でき、その結果、従来よりも中皮腫を精度良く診断可能なことを見出し、本発明を完成させた。【００１６】
すなわち、本発明は３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する抗体であり、より詳細には、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを体液中、室温で放置することにより生じるフラグメントのＮ端側フラグメントを認識する抗体である。また、本発明は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する抗体を有効成分とする中皮腫診断剤であり、より詳細には、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを体液中、室温で放置することにより生じるフラグメントのＮ端側フラグメントを認識する抗体を有効成分とする中皮腫診断剤である。【００１７】
更に、本発明は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する抗体を備える中皮腫診断キットであり、より詳細には、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する第１の抗体を含有する第１の試薬と、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する抗体であって、前記第１の抗体と認識部位が異なる第２の抗体を含有する第２の試薬とを組み合わせてなることを特徴とする中皮腫診断キットである。【００１８】
更に、本発明は検体中の、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量を、上記中皮腫診断キットにより測定し、その量を指標とすることを特徴とする中皮腫診断方法である。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の抗体は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのみならず、これから種々の要因により生成したフラグメントのうち、Ｎ端側のフラグメントも検出することができる。【００２０】
従って、本測定系を用いることにより、生体内に本来存在していた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの量を測定することが可能となり、従来用いられていた測定系と比較して精度のよい、中皮腫の診断及び進行状況の判断が可能となる。しかも、本測定系を用いることにより、検体の採取条件や保存条件等によらず、高い感度で測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】モノクローナル抗体７Ｅ７のウェスタンブロッティングによる特異性試験の結果を示す（ここでレーン１はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の溶解液、レーン２はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン３はベクターのみ導入したＣＯＳ−１細胞の培養上清、レーン４、５、６はそれぞれ、ＨeＬa細胞、ＭＫＮ−２８細胞、ＮＲＣ−１２細胞の培養上清をサンプルとした結果を表す）。
【図２】モノクローナル抗体１６Ｋ１６のウェスタンブロッティングによる特異性試験の結果を示す（ここでレーン１はヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ全長のｃＤＮＡを導入したＣＨＯ細胞の培養上清、レーン２は遺伝子を導入していないＣＨＯ細胞の培養上清、レーン３および４はそれぞれの細胞溶解液をサンプルとした結果）。
【図３】モノクローナル抗体７Ｅ７のウェスタンブロッティングによる認識部位確認試験の結果を示す（図中、×印は偽陰性を示す）。
【図４】モノクローナル抗体１６Ｋ１６のウェスタンブロッティングによる認識部位確認試験の結果を示す（図中、×印は偽陰性を示す）。
【図５】ポリクローナル抗体４のウェスタンブロッティングによる特異性試験の結果を示す（各レーンのサンプルは図１と同様のものである）
【図６】各種抗体を用いて中皮腫患者胸水中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量を測定した結果である（図中、I〜VIIIはＥＬＩＳＡキットに用いられた抗体の組み合わせを示す（Iは４と３４、IIは２１１と３４、IIIは７Ｅ７と３４、IVは２１１と４、Vは１６Ｋ１６と４、VIは７Ｅ７と４、VIIは３４と４、VIIIは７Ｅ７と１６Ｋ１６の組み合わせを示す））。
【図７】７Ｅ７−１６Ｋ１６キットを用いて作成された代表的な検量線を示す。
【図８】７Ｅ７−１６Ｋ１６キットを用いて測定された培養細胞の培養上清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示す。
【図９】７Ｅ７−４キットを用いて作成された代表的な検量線を示す。
【図１０】７Ｅ７−４キットを用いて測定した培養細胞の培養上清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示す。
【図１１】７Ｅ７−４キットを用いて測定した健常人血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示す。
【図１２】７Ｅ７−１６Ｋ１６キットを用いて血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を測定した結果である（図中、Ａは採血し室温１時間放置後、室温に１６時間放置後遠心分離し血清分離後凍結したものを測定した結果を示し、Ｂは採血し室温１時間放置後遠心分離し血清分離した後、室温に１６時間放置後凍結したものを測定した結果を示す）。
【図１３】７Ｅ７−４キットを用いて血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を測定した結果である（図中、Ａは採血し室温１時間放置後、室温に１６時間放置後遠心分離し血清分離後凍結したものを測定した結果を示し、Ｂは採血し室温１時間放置後遠心分離し血清分離した後、室温に１６時間放置後凍結したものを測定した結果を示す）。
【図１４】中皮腫患者胸水を用いたモノクローナル抗体７Ｅ７およびポリクローナル抗体３４、２１１、４によるウェスタンブロッティングの結果を示す（図中、レーン１は未処理の中皮腫患者胸水、レーン２はＣ末抗体カラム吸着画分、レーン３はＮ末、Ｃ末抗体カラム非吸着画分、レーン４は７Ｅ７抗体カラム非吸着画分、レーン５は７Ｅ７抗体カラム吸着画分をサンプルとした結果を示し、矢印は３１ｋＤａを示す）。
【図１５】ＥＬＩＳＡ測定系（７Ｅ７−１６Ｋ１６キット）を用いて、中皮腫患者、健常者、アスベスト関連疾患患者／アスベスト暴露経験者（胸膜プラーク患者、暴露経験者、石綿症患者、良性アスベスト胸膜炎患者）、肺癌患者、その他の鑑別疾患患者の血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を測定した結果を示す図である。図中、横軸の、「ＭＭ」は中皮腫患者を、「ＰＰ」は胸膜プラーク患者を、「Ｅｘ」はアスベスト暴露経験者を、「Ａｓ」は石綿症患者を、「ＢＡＰ」は良性アスベスト胸膜炎患者を、「ＬＣ」は肺癌患者を、「Ｏｔｈｅｒｓ」はその他の識別疾患患者を、「Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」は健常人を表す。また、図中、縦軸は、検出されたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの量［ｎｇ／ｍＬ］を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書において、「３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチド（以下、「Ｎフラグメント」という）」とは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドであれば特に限定されない。配列番号１において、１番目のメチオニンから３３番目のプロリンまではシグナル配列であり、Ｎフラグメントとしては、シグナル配列のアミノ酸を除いたペプチドが好ましい。Ｎフラグメントにおいて欠失しているＣ末端のアミノ酸の数としては、１個以上であれば特に限定されず、例えば、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上等が挙げられる。Ｎフラグメントにおいて欠失しているＣ末端のアミノ酸の数として、特に上限はないが、例えば、１５５個、１５０個、１００個、９０個、８０個、７０個、６５個、６０個等を挙げることができる。また、Ｎフラグメントとしては、例えば、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを体液中、室温で放置することにより生じるフラグメントのＮ端側フラグメントを挙げることができる。使用される体液としては、例えば、血液、血清、血漿、胸水、尿または腹水を挙げることができるが、これに限定されるものではなく、好ましくは、血液又は血清である。また、放置する時間は、特に限定されないが、好ましくは１時間以上、より好ましくは、２時間以上、最も好ましくは、３時間以上である。本明細書における、Ｎフラグメントとしては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列（この配列はAccession No.AAV87530に記載のヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのアミノ酸配列の１〜２９５番目に該当する）を有する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを、血液中又は血清中、室温で３時間以上放置することにより生じたフラグメントのうちの、Ｎ端側のフラグメントであり、長さの異なる複数のものを含む。また、本明細書におけるＮフラグメントは、好ましくは、通常の抗体作製で使用されるＣ末端のアミノ酸を含むポリペプチドを抗原として常法により作製される抗体では認識されないものである。本明細書における、Ｎフラグメントとして、より好ましくは、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが分解して生じる断片であって、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのアミノ酸配列（配列番号１）のうち３４〜２２９番目（好ましくは３４〜１３９番目、特に好ましくは６８〜１３９番目）のアミノ酸配列を有するフラグメントである。【００２３】
本明細書において、「中皮腫」とは、中皮細胞に由来する悪性腫瘍のことであり、より詳細には例えば、上皮型中皮腫、肉腫型中皮腫、二相性中皮腫等を挙げることができる。【００２４】
本発明の抗体は、Ｎフラグメントを認識する抗体であれば、特に限定されない。Ｎフラグメントとして複数のフラグメントが存在し得るが、本発明の抗体は、中皮腫の診断剤として利用し得る限り、全てのフラグメントを認識する必要は無く、その一部のフラグメントを認識するものであっても良い。本発明の抗体として、好ましくは、２種類以上のＮフラグメントを認識する抗体である。本発明の抗体としては、例えば、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを血液中又は血清中、室温で３時間以上放置することにより生じるフラグメントのＮ端側フラグメントを認識する抗体を挙げることができる。本発明の抗体として、より好ましくは、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、及び、Ｎフラグメントの両方を認識する抗体である。このような抗体としては、例えば、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントに保存されているアミノ酸配列を認識する抗体を挙げることができる。このような認識部位としては、例えば、以下の（ａ）〜（ｄ）のアミノ酸配列（配列番号２〜５）が挙げられ、これらの中でも、（ａ）〜（ｃ）が好ましく、（ｂ）または（ｃ）がより好ましい。
（ａ）ＳＲＴＬＡＧＥＴＧＱＥＡＡＰＬＤＧＶ
（配列番号１のアミノ酸配列の３４〜５１番目：配列番号２）
（ｂ）ＧＦＰＣＡＥ
（配列番号１のアミノ酸配列の６８〜７３番目：配列番号３）
（ｃ）ＰＱＡＣＴＨ
（配列番号１のアミノ酸配列の１３４〜１３９番目：配列番号４）
（ｄ）ＣＰＧＰＬＤＱＤＱＱＥＡＡＲＡＡＬＱＧ
（配列番号１のアミノ酸配列の２１１〜２２９番目：配列番号５）【００２５】
本発明の抗体は、起源について特に制約はなく、ヒト由来のものでなくても良い。また、本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、認識部位を明らかにすることができるためモノクローナル抗体が好ましい。【００２６】
本発明の抗体は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの全部または一部を抗原とし、これを当業者に周知の方法、例えば「続生化学実験講座、免疫生化学研究法」（日本生化学会編）等に記載の方法、に従って得られた抗体を、Ｎフラグメントに保存されているアミノ酸配列の一部と一致するポリペプチド等を利用したスクリーニングで選択により調製することができる。【００２７】
本発明の抗体の製造において、抗原として使用される３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの全部または一部は、配列番号１のアミノ酸配列の１〜２９５番目、好ましくは３５〜２９５番目の全部あるいは一部と一致するポリペプチドを合成機で合成したもの、あるいは前記アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（配列番号６）の全部あるいは一部を常法によりベクターに組み込み、このベクターを用いて大腸菌等の宿主微生物もしくは培養細胞を形質転換し、形質転換した大腸菌等の宿主微生物・培養細胞を培養して産生させて得られるリコンビナントタンパク質やポリペプチドを、アフィニティーカラムやニッケルカラム等で精製したもの等が挙げられる。また、前記アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの全部あるいは一部に一致するポリヌクレオチドはラットＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ
ｃＤＮＡ等のほ乳類由来のＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ ｃＤＮＡをプローブとしてヒト腫瘍細胞株等のｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることによっても得られる。【００２８】
具体的に、本発明の抗体を調製する手順を示せば次の通りである。すなわち、ポリクローナル抗体として本発明の抗体を調製するには、まず、ヒト３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのｃＤＮＡ配列（配列番号６）をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲ法により作製する。次いで、これをｐＧＥＸ等のベクターに組み込み、このベクターを大腸菌等の宿主微生物に導入し、ＬＢ培地等で培養してポリペプチドのリコンビナントタンパク質を産生させる。次いで、得られたリコンビナントタンパク質を抗原とし、これをリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、更にこれらとフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバントあるいはミョウバン等の補助剤と結合した後、これを免疫原として哺乳動物などを免疫する。【００２９】
免疫される動物としては当該分野で常用されたもの、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ等のいずれをも使用することができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は１回または適当な間隔で、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回行うことができる。【００３０】
最後に、常法に従い、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清を分離し、この血清中から、抗原に用いたリコンビナントタンパク質を固相化したカラムによるアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって抗原特異精製を行うことによってポリクローナル抗体である本発明の抗体を得ることができる。【００３１】
また、モノクローナル抗体として本発明の抗体を調製するには、モノクローナル抗体調製の常法、例えば「抗ペプチド抗体実験プロトコール」、大海忍、辻村邦夫、稲垣昌樹著、秀潤社、１９９４年、「単クローン抗体実験マニュアル」富山朔二・安東民衛／編、講談社、１９８７年等に記載の方法に従って、上記リコンビナントタンパク質で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取する。このように採取された抗体を更に、抗原に用いたリコンビナントタンパク質や上述したアミノ酸配列を持つ合成ペプチドなどを固相化した９６穴マイクロタイタープレートを用いたＥＩＡ法によってスクリーニングすることによりモノクローナル抗体である本発明の抗体を得ることができる。【００３２】
より具体的に、本発明診断剤に有効成分として含有される本発明の抗体として特に好ましい次のアミノ酸配列（ｂ）または（ｃ）を認識するモノクローナル抗体は、上述したハイブリドーマの培養物から採取された抗体を、更に、以下のアミノ酸配列（ａ）または（ｂ）を抗原として固相化したマイクロタイタープレートを用いたＥＩＡ法でスクリーニングすることによって得ることができる。
（ｂ）ＧＦＰＣＡＥ
（配列番号１のアミノ酸配列の６８〜７３番目：配列番号３）
（ｃ）ＰＱＡＣＴＨ
（配列番号１のアミノ酸配列の１３４〜１３９番目：配列番号４）【００３３】
かくして得られる本発明の抗体は、必要により標識ないし固相化して、本発明の本発明診断剤に適した形にすることができる。このうち標識は、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、「ＨＲＰ」という）、アルカリホスファターゼ等の酵素、フルオレセインイソシアネート、ローダミン等の蛍光物質、３２Ｐ、１２５Ｉ等の放射性物質、化学発光物質などの標識物質を結合することにより行われる。また、固相化は、適切な固相に本発明の抗体を結合させることにより行われる。固相としては、免疫化学的測定法において慣用される固相のいずれをも使用することができ、例えば、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレート、アミノ基結合型のマイクロタイタープレート等のプレートや、各種のピーズ類が挙げられる。本発明の抗体を固相化させるには、例えば、抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。【００３４】
また、本発明の中皮腫診断キット（以下、「本発明キット」という）は、必要により標識ないし固相化した本発明の抗体を使用し、他に、希釈用緩衝液、標準物質、基質用緩衝液、停止液、洗浄液等を組み合わせて常法に従って作製すればよい。本発明の中皮腫診断キットは、好ましくは、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する２種類の抗体を備え、より好ましくは、認識部位がそれぞれ異なる、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する２種類の抗体を備える。具体的に、本発明の抗体を２種使用して本発明キットを作製する場合には、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する第１の抗体を含有する第１の試薬（例えば、固相化抗体）と、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する抗体であって、前記第１の抗体と認識部位が異なる第２の抗体を含有する第２の試薬（例えば、標識抗体）とを組み合わせて使用することができる。【００３５】
この本発明キットに用いられる第１の抗体および第２の抗体の組み合わせは、特に限定されないが、例えば、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの全アミノ酸配列（配列番号１）のうち３４〜２２９番目、好ましくは３４〜１３９番目、特に好ましくは６８〜１３９番目のアミノ酸配列に認識部位が含まれる抗体の組み合わせを挙げることができる。第１の抗体および第２の抗体の具体的な例としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つに記載のアミノ酸配列（配列番号２〜５）を認識する抗体の組み合わせが挙げられ、これらの組み合わせの中でも（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列を認識する抗体と（ｃ）または（ｄ）に記載のアミノ酸配列を認識する抗体の組み合わせが好ましく、（ａ）または（ｂ）に記載のアミノ酸配列を認識する抗体と（ｃ）に記載のアミノ酸配列を認識する抗体の組み合わせがより好ましく、（ｂ）と（ｃ）の組み合わせが特に好ましい。
（ａ）ＳＲＴＬＡＧＥＴＧＱＥＡＡＰＬＤＧＶ
（配列番号１のアミノ酸配列の３４〜５１番目：配列番号２）
（ｂ）ＧＦＰＣＡＥ
（配列番号１のアミノ酸配列の６８〜７３番目：配列番号３）
（ｃ）ＰＱＡＣＴＨ
（配列番号１のアミノ酸配列の１３４〜１３９番目：配列番号４）
（ｄ）ＣＰＧＰＬＤＱＤＱＱＥＡＡＲＡＡＬＱＧ
（配列番号１のアミノ酸配列の２１１〜２２９番目：配列番号５）【００３６】
上記のように作製された本発明診断剤および本発明キットは、これに含まれる本発明の抗体により、中皮腫患者の各種体液中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎだけでなく種々の要因により生成したフラグメントも測定できる。【００３７】
本発明診断剤および本発明キットを用いた具体的な、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎと、そのフラグメントの両方の存在や量の測定方法としては、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ法（E. Engvall et al., (1980): Methods in Enzymol., 70, 419-439）、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、凝集法、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）、イムノクロマト法等の、一般の免疫化学的測定法において使用されている種々の方法（「ハイブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆Ｄプランニング発行、第３０頁−第５３頁、昭和５７年３月５日）が挙げられる。【００３８】
これらの測定方法は種々の観点から適宜選択することができるが、感度、簡便性等の点からはＥＬＩＳＡ法が好ましい。より具体的な、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎと、そのフラグメントの測定について、ＥＬＩＳＡ法の一つであるサンドイッチ法を例にとってその手順を説明すれば次の通りである。【００３９】
まず、工程（Ａ）として、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する第一の抗体（以下、「第一抗体」という）を担体に固相化する。次いで、工程（Ｂ）として、抗体が固相化されていない担体表面を第一抗体と無関係な、例えばタンパク質により、ブロッキングする。更に、工程（Ｃ）として、これに各種濃度の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及び／またはＮフラグメントを含む検体を加え、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及び／またはＮフラグメントと、第一抗体との複合体を生成さる。その後、工程（Ｄ）として、固相化した第一抗体と認識部位の異なる標識した３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端のアミノ酸が欠失したペプチドを認識する第二の抗体（以下、「第二抗体」という）を加え、これを前記複合体と結合させる。最後に工程（Ｅ）として、前記複合体の標識量を測定することにより、予め作成した検量線から検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの総量を決定することができる。【００４０】
具体的に工程（Ａ）において、第一抗体を固相化するために用いられる担体としては、特別な制限はなく、免疫化学的測定法において常用されるものをいずれも使用することができる。具体的には、ポリスチレン製の９６穴マイクロタイタープレートあるいは、アミノ基結合型のマイクロタイタープレートが挙げられる。また、第一抗体を固相化させるには、例えば、前記抗体を含む緩衝液を担体上に加え、インキュベーションすればよい。緩衝液としては公知のものが使用でき、例えば１０ｍＭのＰＢＳを挙げることができる。緩衝液中の上記抗体の濃度は広い範囲から選択できるが、通常０.０１〜１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは０.１〜２０μｇ／ｍｌである。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープレートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で２０〜１５０μｌ／ウェル程度が望ましい。更に、インキュベーションの条件にも特に制限はないが、通常４℃程度で一晩のインキュベーションが適している。【００４１】
また、工程（Ｂ）のブロッキングは、工程（Ａ）で第一抗体を固相化した担体において、後に添加する検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及び／またはＮフラグメントが抗原抗体反応とは無関係に吸着される部分が存在する場合があるので、それを防ぐ目的で行う。ブロッキング剤としては、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液や、ブロックエース（Ｂｌｏｃｋ−Ａｃｅ：大日本製薬製（コードＮｏ.ＵＫ−２５Ｂ））等の市販のブロッキング剤を使用することができる。具体的なブロッキングは、限定されるわけではないが、例えば抗原を固相化した部分に、ブロックエースを適量加え、約４℃で、一晩のインキュベーションをした後、緩衝液で洗浄することにより行われる。【００４２】
更に、工程（Ｃ）において、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及び／またはＮフラグメントを含む検体を固相化した第一抗体と接触させ、この固相化した第一抗体で検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントを捕捉し、複合体を生成させる。この複合体を生成させるための条件は限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間〜１晩の反応を行えばよい。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７.２）および０.０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０の組成のものが好ましい。【００４３】
また更に、工程（Ｄ）において、固相化した第一抗体と、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ又はＮフラグメントとの複合体に、固相化した第一抗体と認識部位の異なる標識した第二抗体を加え、固相化した第一抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ又はＮフラグメント−標識した第二抗体からなる複合体を生成させる。この反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、未反応のタンパク質等を除去させることが好ましい。この反応に用いる緩衝液としては、前記したものが使用される。この工程（Ｄ）において使用される標識した第二抗体の量は、固相化した第一抗体に対して約５,０００〜１０,０００倍、好ましくは最終吸光度が１.５〜２.０となるように希釈された量である。希釈には緩衝液を用いることができ、反応条件は特に限定されるわけではないが、４℃〜３７℃程度で約１時間行い、反応後、緩衝液で洗浄することが好ましい。以上の反応により、固相化した第一抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ又はＮフラグメント−標識した第二抗体からなる複合体を生成することができる。【００４４】
最後に工程（Ｅ）において、固相化した第一抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ又はＮフラグメント−標識した第二抗体の複合体に、標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を測定する。前記反応で標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と３,３',５,５'−テトラメチルベンジン（以下「ＴＭＢ」という）を含む発色基質溶液を使用することができる。また、吸光度は、固相化した第一抗体−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎまたはＮフラグメント−標識した第二抗体からなる複合体に、発色基質溶液を加え約２５℃で約３０分間反応させた後、１〜２Ｎの硫酸を加えて酵素反応を停止させ、４５０ｎｍの波長で測定すればよい。一方、標識物質として、アルカリホスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２Ｎの水酸化ナトリウムを加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。【００４５】
なお、既知の濃度の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを上記サンドイッチ法等に用い、予め作成しておいた検量線を用いれば、検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量を算出できる。【００４６】
上記した測定方法等により、検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量、すなわち、生体内に本来存在していた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量を算出することができ、これにより健常者から中皮腫患者を診断すること、中皮腫患者の外科的手術の成否を見分けること、中皮腫の再発を予見できること等ができる。中皮腫の診断等に用いることのできる検体は、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及び／またはＮフラグメントが存在する検体であれば特に制限はなく、例えば全血、血清、血漿、尿、リンパ液、胸水、腹水等の体液が挙げられる。これらの検体の中でも、血清、血漿、胸水または腹水を用いることが好ましい。【００４７】
具体的に中皮腫の診断は、検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量を指標として、その量が健常者の平均値より有意に高いと判断される場合に中皮腫と診断することができる。検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量を健常者の平均値より有意に高いと判断する指標の例としては、例えば、健常人血清群で得られた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量の平均値＋２ｘ標準偏差の値、好ましくは健常人血清群で得られた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量の平均値＋５ｘ標準偏差の値を統計学的なカットオフ値として用いることが挙げられるが、これに限定されるものではない。なお、上記した中皮腫の診断には、検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量を指標とするかわりに、検体における３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの濃度を指標としてもよい。【００４８】
また、中皮腫の外科的手術の成否や再発の予見は、中皮腫患者の検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量が、中皮腫細胞の存在の有無によって変化するということに基づいて行うことができる。すなわち、中皮腫の外科的手術前後に検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量を測定し、その量を手術前後で比較して手術後の量が手術前の量よりも有意に低下していれば、その外科的手術によって中皮腫細胞が除去されたことを確認することができる。また、中皮腫の外科的手術後も検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量をモニタリングしておけば、その量が増えた時に、中皮腫細胞が存在すること、すなわち、再発したことを予見することが可能になる。【００４９】
本発明診断剤および本発明キットを用いた検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ及びＮフラグメントの量の測定によって、上述したように、健常者から中皮腫患者を診断すること、中皮腫患者の外科的手術の成否を見分けること、中皮腫の再発の予見できること等だけでなく、アスベスト暴露経験者からの中皮腫患者の鑑別、肺がん等の他の疾患の患者との識別にも利用出来うる。すなわち、アスベスト暴露経験者における胸膜肥厚、良性胸膜炎、肺繊維症、肺ガンなどの発症率は健常者に比べて高いといわれている。しかし、それらの疾患では３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの測定値は中皮腫患者と比べて有意に低く、中皮腫患者と識別出来る。このことは、治療方法の最適化に非常に有用である。すなわち、中皮腫患者と例えば肺がん患者を識別できればその治療方針は全く異なってくる。効果のない抗がん剤を無用に投与して患者に苦痛を与えることを避けることができ、近年注目されているオーダーメイド医療に向けた取り組みが可能になる。
【実施例】
【００５０】
以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約を受けるものではない。【００５１】
実 施 例  １
モノクローナル抗体の作製（１）：
（１）免疫用抗原の作製
全長のヒトＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ
ｃＤＮＡ（Accession No. AY743922）を鋳型として、配列番号１で表される３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのアミノ酸配列の３５番から２９５番目までの領域に対応するヌクレオチド（配列番号６の塩基配列の１０３〜８８５番目）を、以下に示したプライマーＮｏ.５’−３およびＮｏ.３’−３を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により増幅させた。次に上記で得られたオリゴヌクレオチドにＧＳＴ（Glutathione S-transferase）タグをコードする配列を、またＣ末側領域にヒスチジン（Histidine）タグをコードする配列を付加して、これらＧＳＴ−３１ｋＤａ分泌型ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓ領域を、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Amershambiosciences社製）に挿入し、発現ベクターとし、これを大腸菌に組み込んで融合タンパク質として発現させた。
プライマーＮｏ.５’−３（配列番号７）：
５’−ＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡ−３’
プライマーＮｏ.３’−３（配列番号８）：
５’−ＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＡ−３’【００５２】
この大腸菌を５ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地で３７℃一晩振盪培養した。これをさらに１,０００ｍＬのＬＢ培地に加え、３７℃で４時間振盪培養し、５００mＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）を１ｍＬ加え３時間振盪培養した。このようにして得た培養液を４℃で６,０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈殿をリン酸緩衝塩化ナトリウム液（PBS）で２回洗浄した。その後、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のトリトン（Triton）Ｘ−１００を加えた２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）２０ｍｌを加え、この液に対し３０秒間の超音波処理を４回行って菌体を破壊し、目的のタンパク質を抽出した後、４℃で１０,０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、上清を得た。この上清からグルタチオン−セファロースビーズ（Glutathion-sepharose beads：Amershambiosciences社製）を用いてＧＳＴ−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓタンパク質を精製した後、プレシジョンプロテアーゼ（PreScission Protease：Amershambiosciences社製）処理によりＧＳＴ部分を切断、除去した３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓを得た。【００５３】
（２）モノクローナル抗体の作製
免疫用抗原として、上記（１）において得られたタンパク質を用い、１週間、または２週間おきに５０μｌ（５０μｇ）を投与し、マウスを免疫した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（J. Immunol. 146:3721-3728）に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化された３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎに反応する細胞を選択することにより行った。【００５４】
上記のようにして選択した細胞を無血清培地のＧＩＴ培地（和光純薬）で細胞の８０％が死滅するまで抗体を産生させた。次いでこの培地から遠心（１,０００ｒｐｍ、１５ｍｉｎ）により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウムを５０％飽和状態にして４℃で一晩静置し、沈殿を遠心（１,０００ｒｐｍ、３０ｍｉｎ）により回収した。更にこの沈殿を２倍に希釈したバインディングバッファー（binding buffer:Protein AMAPS II kit製）に溶解させた後、プロテインＡカラム（Pharmacia-Amersham製）にＩｇＧを吸着させた。その後、ＰＢＳ透析を一晩行って抗体を精製し、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識する抗体を複数得た。そしてこれらの抗体のうちの二つを７Ｅ７および１６Ｋ１６と名付けた。【００５５】
（３）ウェスタンブロッティングによるモノクローナル抗体７Ｅ７および１６Ｋ１６の特
異性の確認
上記（２）で得られたモノクローナル抗体７Ｅ７および１６Ｋ１６が３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識することを、ＣＯＳ−１細胞あるいはＣＨＯ細胞に強制発現させたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎタンパク質等のサンプルを用いたウェスタンブロッティングにより確認した。それぞれのサンプルにはウェスタンブロッティングを行う前に、２−メルカプトエタノール（２Ｍｅ）を加えて還元状態とした。ウェスタンブロッティングは常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い行った。【００５６】
ウェスタンブロッティングの結果を図１および図２に示した。この図１および図２によるとモノクローナル抗体７Ｅ７および１６Ｋ１６の何れもが、Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを強制発現させたサンプルについて、７１ｋＤａ全長型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎおよび３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの発現部位にバンドを有することが確認され、これらの抗体がＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎに対し反応性を有することが確認された。【００５７】
実 施 例  ２
モノクローナル抗体７Ｅ７および１６Ｋ１６の抗原認識部位の探索：
３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端領域を６アミノ酸づつ欠損する一連の融合タンパク質を作製し、それとモノクローナル抗体７Ｅ７および１６Ｋ１６を反応させ、抗原認識部位の探索をした。【００５８】
まず、実施例１で作製したＧＳＴ−３１ｋＤａ分泌型ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓ領域を鋳型にしてアンチセンスプライマーを６アミノ酸ずつずらしたものを作製し、ＰＣＲ反応で増幅させた。次に、これをｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Amershambio sciences社製）に挿入し、発現ベクターとし、更にこれを大腸菌に組み込んだ。この大腸菌を５ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地で３７℃一晩振盪培養した。これをさらに１,０００ｍＬのＬＢ培地に加え、３７℃で４時間振盪培養し、５００mＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）を１ｍＬ加え３時間振盪培養した。このようにして得た培養液を４℃で６,０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、沈殿をリン酸緩衝塩化ナトリウム液（PBS）で２回洗浄した。その後、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えた２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.４）２０ｍｌを加え、この液に対し３０秒間の超音波処理を４回行って菌体を破壊し、目的のタンパク質を抽出した後、４℃で１０,０００ｒｐｍ、３０分間遠心分離し、上清を得た。この上清からグルタチオン−セファロースビーズ（Glutathion-sepharose beads：Amershambiosciences社製）を用いて、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが６アミノ酸ずつ欠損したＧＳＴ−３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓ欠損タンパク質を精製した。【００５９】
次に、これらの欠損タンパク質に対してモノクローナル抗体７Ｅ７および１６Ｋ１６によるウェスタンブロッティングおよびドットブロッティングを常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い行い、その認識部位を決定した。ウエスタンブロットおよびドットブロットの結果を図３および図４に示した。図３および図４中の１〜６およびＡ〜Ｈに対応するタンパク質のアミノ酸配列を表１に示した。表中の数字は３１ｋＤａ分泌型ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＮ末端からＣ末端方向へ連続したアミノ酸の数を示す。この図よりモノクローナル抗体７Ｅ７抗体は１３４番目から１３９番目の領域、モノクローナル抗体１６Ｋ１６はＮ末端から６８番目から７３番目までの領域を認識することが判明した。【００６０】
【表１】
2008068906.tif 000002
【００６１】
実 施 例  ３
ポリクローナル抗体の作製（１）：
（１）免疫用抗原の作製
ヒト３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの内部配列に相当する下記のアミノ酸配列（ｄ）を有するペプチドは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品を伊藤ハム株式会社より購入した。このペプチドをポリクローナル抗体作製のための抗原とした。
（ｄ）ＣＰＧＰＬＤＱＤＱＱＥＡＡＲＡＡＬＱＧ
（配列番号１のアミノ酸配列の２１１〜２２９番目：配列番号５）【００６２】
（２）ポリクローナル抗体の作製
（１）で作製したペプチド１００μｇとフロイント完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、これをウサギに免疫した。免疫１週間後に、抗原１００μｇとフロイント不完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、ウサギに追加免疫し、以後同様の操作を各週の間隔で３回行った。その後、免疫原に対する力価上昇を、抗原ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認した後、全採血を行い１,５００ｒｐｍで１５分間の遠心により抗血清を分離し、抗原ペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いて抗原特異精製を行い、ポリクローナル抗体を得た。そしてこの抗体を２１１抗体と名づけた。【００６３】
実 施 例  ４
ポリクローナル抗体の作製（２）：
（１）免疫用抗原の作製
ヒト３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの内部配列に相当する下記のアミノ酸配列（ａ）のＣ末側に更にシスティン（Ｃ）を付けたアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品を伊藤ハム株式会社より購入した。このペプチドをポリクローナル抗体作製のための抗原とした。
（ａ）ＳＲＴＬＡＧＥＴＧＱＥＡＡＰＬＤＧＶＣ
（配列番号１のアミノ酸配列の３４〜５１番目：配列番号２）【００６４】
（２）ポリクローナル抗体の作製
（１）で作製したペプチド１００μｇとフロイント完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、これをウサギに免疫した。免疫１週間後に、抗原１００μｇとフロイント不完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、ウサギに追加免疫し、以後同様の操作を各週の間隔で３回行った。その後、免疫原に対する力価上昇を、抗原ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認した後、全採血を行い１,５００ｒｐｍで１５分間の遠心により抗血清を分離し、抗原ペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いて抗原特異精製を行い、ポリクローナル抗体を得た。そしてこの抗体を３４抗体と名づけた。【００６５】
参 考 例  １
ポリクローナル抗体の作製：
（１）免疫用抗原の作製
ヒト３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの内部配列に相当する下記のアミノ酸配列（ｅ）のＣ末側に更にシスティン（Ｃ）を付けたアミノ酸配列を有するペプチドは、ＨＰＬＣクロマトグラフィー精製した状態の品をオウスペップ（Auspep Corporation）社より購入した。このペプチドをポリクローナル抗体作製のための抗原とした。
（ｅ）ＲＱＰＥＲＴＩＬＲＰＲＦＲＲ
（配列番号１のアミノ酸配列の２８２〜２９５番目：配列番号９）【００６６】
（２）ポリクローナル抗体の作製
（１）で作製したペプチド１００μｇとフロイント完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、これをウサギに免疫した。免疫１週間後に、抗原１００μｇとフロイント不完全アジュバントを等量混合してエマルジョンを作製し、ウサギに追加免疫し、以後同様の操作を各週の間隔で３回行った。その後、免疫原に対する力価上昇を、抗原ペプチドを固相化したＥＬＩＳＡ法で確認した後、全採血を行い１,５００ｒｐｍで１５分間の遠心により抗血清を分離し、抗原ペプチドを結合させたアフィニティーカラムを用いて抗原特異精製を行い、ポリクローナル抗体を得た。そしてこの抗体を４抗体と名づけた。【００６７】
（３）ウェスタンブロッティングによるポリクローナル抗体４の特異性の確認
次に、（２）で得られたポリクローナル抗体４が３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを認識することを確認するために、ポリクローナル抗体４を用いてＣＯＳ−１細胞に強制発現させたＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎタンパク質等について、前述のように常法に従いウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングの結果を図５に示した。サンプルは実施例１（３）で用いたものと同じである。この図によるとこの抗体４がＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを強制発現させたサンプルに対して反応性を有することが確認された。【００６８】
実
施 例  ５
中皮腫患者胸水中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量の
測定：
実施例１、３、４および参考例１で作製したモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を組み合わせて実施例６および参考例２で述べる方法を用いてＥＬＩＳＡ系を構築し、それを用いて中皮腫患者胸水中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を測定した。その結果を図６に示した。【００６９】
この図より、モノクローナル抗体７Ｅ７と１６Ｋ１６の組み合わせ、モノクローナル抗体７Ｅ７とポリクローナル抗体３４の組み合わせ、モノクローナル抗体２１１とポリクローナル抗体３４の組み合わせの順に、胸水中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度が高く測定された。また、この結果より４抗体を用いた系では濃度が低く、Ｃ末端まで保持する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ分子種は胸水中では少ないことがわかった。一方、３４抗体を用いた系では７Ｅ７抗体＞２１１抗体の順に濃度が低下し、Ｎ末端を保持する３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ分子種はＣ末端側から７Ｅ７抗体が認識する部位まで分解欠損されてしまうことも判明した。【００７０】
実 施 例  ６
ＥＬＩＳＡ測定系（７Ｅ７−１６Ｋ１６キット）の作製：
（１）標準物質の作製
抗体作製時に用いた抗原タンパク質（３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｈｉｓ）を基準にして、ＣＯＳ−１細胞で発現させた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を測定し、ＥＬＩＳＡ測定系の標準物質とした。【００７１】
（２）モノクローナル抗体１６Ｋ１６とＨＲＰとの結合物の作製
実施例１で得られたモノクローナル抗体１６Ｋ１６とＨＲＰとの結合物は以下のように作製した。必要量のＨＲＰを蒸留水に溶かし、ＮａＩＯ４で酸化させた後、ｐＨ４.４の１ｍＭ酢酸緩衝液に一晩透析した。また、モノクローナル抗体１６Ｋ１６の１−１０ｍｇもｐＨ９.５の０.１Ｍ炭酸緩衝液に一晩透析した。これらの透析した１６Ｋ１６抗体とＨＲＰを抗体１ｍｇに対してＨＲＰが０.４ｍｇになるように混合し、室温で２時間反応させた。次いで、これにＮａＢＨ４を加え氷中で２時間反応させた後ＰＢＳに一晩透析した。更に、この反応物をゲル濾過し、モノクローナル抗体１６Ｋ１６とＨＲＰとの結合物を作製した。【００７２】
（３）ＥＬＩＳＡ測定系の作製
サンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築は以下のようにして行った。まず、１０μｇ／ｍｌの７Ｅ７抗体を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。次いで、これを４℃で一晩反応させた後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。また、上記（２）で作成したモノクローナル抗体１６Ｋ１６とＨＲＰとの結合物を標識抗体とした。【００７３】
適当に希釈した標準物質および検体を各ウェルに添加し３７℃で１時間反応（１次反応）、洗浄後、ＨＲＰ（horseradish peroxidase）標識したモノクローナル抗体１６Ｋ１６を加え４℃、３０分間反応（２次反応）、洗浄後、テトラメチルベンジジン（Tetra Methyl Benzidine (TMB)）を含む基質液を加え室温３０分間放置、反応停止液（１ＮのＨ２ＳＯ４）を加え反応停止後、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定し、標準物質から作成した検量線を用いて検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を算出した。【００７４】
図７に代表的な検量線の作成例を示した。また、図８に本測定系を用いて測定した各種培養細胞の培養上清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示した。その結果、ＨｅＬａ細胞では大量に３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを産生していることがわかった。【００７５】
参 考 例  ２
ＥＬＩＳＡ測定系（７Ｅ７−４キット）の作製：
（１）ポリクローナル抗体４とＨＲＰとの結合物の作製
参考例１で得られたポリクローナル抗体４とＨＲＰとの結合物を実施例６の（２）と同様にして作製した。【００７６】
（２）ＥＬＩＳＡ測定系の作製
実施例１で得られたモノクローナル抗体７Ｅ７と参考例１で得られたポリクローナル抗体４を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法の構築は以下のようにして行った。まず、１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体７Ｅ７を１００μｌずつ９６ｗｅｌｌのＥＬＩＳＡ用プレートに加えた。次いで、これを４℃で一晩反応させた後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ＮａＮ３溶液にてブロッキングを行い、サンドイッチＥＬＩＳＡ用プレートとした。また、上記（１）で作製したポリクローナル抗体４とＨＲＰとの結合物を標識抗体とした。【００７７】
適当に希釈した標準物質および検体を各ウェルに添加し３７℃で１時間反応（１次反応）、洗浄後、ＨＲＰ（horseradish
peroxidase）標識した４抗体を加え４℃、３０分間反応（２次反応）、洗浄後、テトラメチルベンジジン（Tetra Methyl Benzidine (TMB)）を含む基質液を加え室温３０分間放置、反応停止液（１ＮのＨ２ＳＯ４）を加え反応停止後、波長４５０ｎｍでの吸光度を測定し、標準物質から作成した検量線を用いて検体中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を算出した。【００７８】
図９に代表的な検量線の作成例を示した。また、図１０に本測定系を用いて測定した各種培養細胞の培養上清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示した。更に、図１１に健常人血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を示した。健常人血清中の健常人血清の平均値は７.６６ｎｇ／ｍｌ、ヘパリン添加血漿１０.６０ｎｇ／ｍｌ、ＥＤＴＡ添加血漿１１.７７ｎｇ／ｍｌであった。【００７９】
実 施 例  ７
各種患者血清の測定：
実施例６で作製したＥＬＩＳＡ測定系（７Ｅ７−１６Ｋ１６キット）を用いて、中皮腫患者２７例、胸膜肥厚患者２８例、良性胸膜炎およびびまん性胸膜肥厚患者６例、アスベスト暴露経験有りおよび肺繊維症１１例、およびその他の鑑別疾患（肺がんを含む）８例の血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を次のようにして測定した。また、比較として参考例２で作製したＥＬＩＳＡ測定系（７Ｅ７−４キット）を用いて同様の測定を行った。【００８０】
血清サンプルは採取後すぐにＰＢＳで８倍に希釈し、そして実施例３に記載の方法に従って測定を行った。そして希釈サンプルの吸光度から３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を求め、更に、その濃度から原液濃度（８倍）へ換算した。この測定結果を表２に示した。【００８１】
【表２】
2008068906.tif 000003
【００８２】
この結果、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度は、中皮腫患者においては１.０６〜５５.５９ｎｇ／ｍＬの範囲を示し、平均値は１５.２１ｎｇ／ｍＬ、胸膜肥厚患者においては０.７４〜７．４５ｎｇ／ｍＬの範囲を示し、平均値は３．４７ｎｇ／ｍＬ、良性胸膜炎およびびまん性胸膜肥厚患者においては１.１８〜４.００ｎｇ／ｍＬの範囲を示し、平均値は２.５８ｎｇ／ｍＬ、アスベスト暴露経験有りおよび肺繊維症においては１.９７〜５.２７ｎｇ／ｍＬの範囲を示し、平均値は３.４５ｎｇ／ｍＬ、およびその他の鑑別疾患（肺がんを含む）においては１.３１〜９.７６ｎｇ／ｍＬの範囲を示し、平均値は４.０４ｎｇ／ｍＬであった。このように中皮腫患者血清中では、ほかの疾患患者に比べて３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度が高値であることが判った。【００８３】
また、カットオフ（Cut Off）値を７Ｅ７−１６Ｋ１６キットでは６.０ｎｇ／ｍｌと設定した場合および７Ｅ７−４キットでは３.０ｎｇ／ｍｌと設定した場合、表中に示したような陽性率となった。なお、７Ｅ７−４キットでは中皮腫患者で陽性率が低下し、胸膜肥厚、暴露／肺繊維症例で高くなってしまった。その他鑑別疾患ではどちらのキットとも同じ陽性率であった。全体で見ると７Ｅ７−１６Ｋ１６キットの方が高感度、高特異性で中皮腫患者を診断することが可能であると判明した。【００８４】
実 施 例  ８
健常人血清および血漿の測定：
実施例６で作製したＥＬＩＳＡ測定系（７Ｅ７−１６Ｋ１６キット）を用いて、健常人５２例の血清、およびＥＤＴＡ血漿中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を次のようにして測定した。【００８５】
血清サンプルは採取後すぐにＰＢＳで８倍に希釈し、そして実施例３に記載の方法に従って測定を行った。そして希釈サンプルの吸光度から３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を求め、更に、その濃度から原液濃度（８倍）へ換算した。この測定結果を表３に示した。【００８６】
【表３】
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【００８７】
この結果、健常人においては３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度は、血清中では１.０３〜８.１９ｎｇ／ｍＬの範囲を示し、平均値は３.３６ｎｇ／ｍＬ、血漿中では１.４４〜８.２９ｎｇ／ｍＬの範囲を示し、平均値は３.６０ｎｇ／ｍＬであった。【００８８】
実 施 例  ９
血清および血漿中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの安
定性の確認：
実施例６で作製したＥＬＩＳＡ測定系（７Ｅ７−１６Ｋ１６キット）を用いて、健常人５例（ａ〜ｅ）の血清またはＥＤＴＡ血漿中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの安定性を次のようにして測定した。【００８９】
血液サンプルは採血後、真空採血管に分取後、室温で１時間放置、１５００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し血清を分離し直ちに−２０℃に凍結保存した。この検体をコントロールとした。これ以外に、採血し室温１時間放置後、室温に１６時間放置後遠心分離し血清分離後凍結したもの（試験区Ａ）、および採血し室温１時間放置後遠心分離し血清分離した後、室温に１６時間放置後凍結したもの（試験区Ｂ）を用意した。これらの検体は融解後、ＰＢＳで８倍に希釈し、上記実施例に記載の方法に従って測定を行った。そして希釈サンプルの吸光度から３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を求め、更に、その濃度から原液濃度（８倍）へ換算した。７Ｅ７−１６Ｋ１６キットの測定結果を図１２に示した。また、比較として参考例２で作製した測定系（７Ｅ７−４キット）を用いて同様の測定を行った。その結果を図１３に示した。【００９０】
この結果、７Ｅ７−１６Ｋ１６キットは、採血後室温に１６時間放置した場合でも、採血分離後室温に１６時間放置した場合においても、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度は大きな変化を示さず、本実験条件下では安定であり、正確な測定を行うのに適した測定系であることが判明した。なお、健常人５例の内、検体ｂに関しては試験区Ｂで１６時間放置後のデータが得られなかったため除去した。【００９１】
一方、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端領域を認識する抗体を検出側に用いた７Ｅ７−４キットによる同様な実験においては、血清の場合、採血後分離までの間室温に３時間放置した場合、コントロールに比べて測定値が５−３０％低下した。また、血清分離後凍結するまでの間室温に放置した場合、３時間で５−３０％低下した。このことから、血液のまま、あるいは血清に分離した状態で室温に３時間以上放置することにより３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが断片化しうることが示された。【００９２】
実 施 例  １０
中皮腫患者胸水中の各種分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ断片の存在
の検出：
実施例９において、３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎは血清中において分解されて断片化しうることを示した。すなわち、採血後および血清分離後の放置時間（３時間以上）の間に３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端領域が分解され、欠損してしまったために、その領域を認識する抗体を利用している測定キットでは測定されなくなってしまう。その結果、目的のタンパク質（３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）はあたかも存在していないかのような測定結果が出てしまうことになる。しかし、血液中には分解される前の分子が存在しているはずであり、そのような検査では間違った結果を与えてしまうことになる。よって、適正な認識部位を持つ抗体を用いることは非常に重要なことである。そこで、そのことを確認するために、血液のままあるいは血清に分離した状態で室温に３時間以上放置した状態と同等の状態になると考えられる採取後室温で放置されていた中皮腫患者胸水を用いて実施例および参考例で作製したモノクローナル抗体７Ｅ７およびポリクローナル抗体３４、２１１、４によるウェスタンブロッティングを以下の方法で行った。【００９３】
まず、モノクローナル抗体７Ｅ７およびポリクローナル抗体３４、４をそれぞれホルミルセルロファイン（生化学工業株式会社）
と混合し、還元剤を用いて結合させたものをカラムに充填した。次にこのカラムと強酸性溶液、高塩濃度溶液等を利用して中皮腫患者胸水の分画を行った。具体的には、中皮腫患者胸水を、ポリクローナル抗体４を結合させたカラムに通し、吸着したもの（Ｃ末抗体カラム吸着画分）と吸着しなかったものに分けた。その後前記カラムに吸着しなかったものをポリクローナル抗体３４を結合させたカラムに通し、吸着したものと吸着しなかったもの（Ｎ末、Ｃ末抗体カラム非吸着画分）に分けた。更に前記カラムに吸着したものをモノクローナル抗体７Ｅ７を結合させたカラムに通し、吸着したもの（７Ｅ７抗体カラム吸着画分）と吸着しなかったもの（７Ｅ７抗体カラム非吸着画分）に分けた。この各画分をサンプルとして、モノクローナル抗体７Ｅ７およびポリクローナル抗体３４、２１１、４によるウェスタンブロッティングを行った。その結果を図１４に示した。【００９４】
その結果、採取後室温で放置されていた中皮腫患者胸水に３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎのＣ末端領域が欠損した断片（Ｎ端側フラグメント）が複数存在することが判明した。このことから血液のままあるいは血清に分離した状態で室温に３時間以上放置した状態でもＮ端側フラグメントが複数存在することも示された。【００９５】
このように用いる抗体の認識部位の違いにより、検出できなくなる断片も存在したことから、生体内に本来存在していた３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを高効率で検出するためには、このような検索を行い、適正な抗体を選択することが重要であり、その結果、高感度で目的タンパク質を検出する測定系を構築することが可能になることが判明した。このような測定系で、高感度で検出することが可能になれば、より微量な存在を検出できるようになり、ひいては早期の検出、診断が可能になる。【００９６】
実 施 例  １１
外科的手術施行後のモニタリング：
悪性の中皮腫であると診断され外科的手術を施行した患者について、術前術後に採血を行い、血清を分離し、実施例６で作製したＥＬＩＳＡ測定系（７Ｅ７−１６Ｋ１６キット）および、参考例２で作製したＥＬＩＳＡ測定系（７Ｅ７−４キット）を用いて３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度を測定した。【００９７】
その結果、７Ｅ７−１６Ｋ１６キットによる測定では術前に３５.８７ｎｇ／ｍｌであったものが術後は３.２１ｎｇ／ｍｌまで低下していた。７Ｅ７−４キットによる測定では２５.６４ｎｇ／ｍｌであったものが術後は１.４７ｎｇ／ｍｌまで低下していた。このことは、術前術後の血清中３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ量を測定することによって、手術によって中皮腫細胞が除去されたことを確認できることを示している。また、逆に、この結果は血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎが、中皮腫細胞の存在に起因することを示唆しているので、術後も３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ濃度をモニタリングすることにより再発を予見しうる。【００９８】
実 施 例  １２
各種患者血清の測定：
実施例７と同様にして、中皮腫患者３９例、健常者１０２名、アスベスト関連疾患患者／アスベスト暴露経験者２０１例（胸膜プラーク患者９８例、暴露経験者８３例、石綿症患者６例、良性アスベスト胸膜炎患者１４例）、肺癌患者４５例、その他の鑑別疾患患者８例の血清中の３１ｋＤａ分泌型Ｅｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎの濃度を測定した。【００９９】
結果を図１５に示した。図に示すとおり、本発明の抗体を用いてＥｒｃ／ＭＰＦ／ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎを測定した結果、中皮腫以外の肺疾患患者、アスベスト暴露経験者又は健常人と比較して、中皮腫患者において測定値が高かった。従って、本発明の抗体は、効率的な中皮腫の診断に用いることができることが示された。【０１００】
本出願は、２００６年１２月８日に日本国において出願された特願２００６−３３１４０９を優先権の基礎としており、当該出願に記載された内容は本明細書に援用される。また、本願において引用した特許、特許出願及び文献に記載された内容は、本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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