(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４００−１と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８８９の下に寄託されたハイブリドーマ、４００−２と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８９０の下に寄託されたハイブリドーマ、４００−３と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８９１の下に寄託されたハイブリドーマ、及び４００−４と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８９２の下に寄託されたハイブリドーマ、から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む膵癌治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項１に記載の膵癌治療用医薬組成物。
【請求項３】
４００−１と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８８９の下に寄託されたハイブリドーマ、４００−２と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８９０の下に寄託されたハイブリドーマ、４００−３と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８９１の下に寄託されたハイブリドーマ、及び４００−４と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８９２の下に寄託されたハイブリドーマ、から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体の、膵癌治療剤を調製するための使用。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
４００−１と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８８９の下に寄託されたハイブリドーマ、４００−２と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８９０の下に寄託されたハイブリドーマ、４００−３と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８９１の下に寄託されたハイブリドーマ、及び４００−４と命名され、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５８９２の下に寄託されたハイブリドーマ、から選択されるハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体からなる膵癌治療剤。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項５に記載の膵癌治療剤。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
[0001]  この出願は、「Ｇａｓｔｒｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ」という名称の米国特許出願第１０／８１３３３６号と共に、２００４年３月２９日に同時出願された米国特許仮出願第６０／５５７７５９号に基づく権利を主張するものであり、各出願の明細書はそのまま、参照されることにより本明細書に組み込まれる。
【発明の分野】
【０００２】
[0002]  本発明は、ガストリンホルモンの特定の領域に対する抗体と、動物、特にヒトの生体内に存在するガストリンホルモンの種々の型と、に関する。本発明は更に、ガストリン介在性の疾患及び状態の検出及び診断、並びにモニタリングへのこれらのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の適用と、ガストリン介在性の疾患及び状態を予防及び治療するために、本発明のＭＡｂを使用する方法と、に関する。
【発明の背景】
【０００３】
[0003]  ガストリンホルモンは、１００年前に最初に同定され、１９６０年代に精製されたが、正常組織及び疾患組織の種々の組織に対する影響は、未だ不完全にしか解明されていない。ガストリンシステムに関する知見にこのようなギャップが存在する主な理由の１つは、ガストリンホルモンのいくつかの型を別々に検出し、定量化するのが困難であったことにある。
【０００４】
[0004]  ペプチドホルモンであるガストリンは、哺乳動物ではいくつかの型が存在し、それらは、ペプチド鎖中のアミノ酸残基の数に基づいて、「小さな」ガストリン及び「大きな」ガストリンの、２つの主要なサイズ別のクラスに分類される。「小さな」ガストリン型には、成熟したガストリン１７（Ｇ１７）、及びグリシン伸長を有するＧ１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）が含まれ、「大きな」ガストリンには、ガストリン３４（Ｇ３４）、及びグリシン伸長を有するＧ３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）が含まれる。Ｇ１７の成熟型は、胃酸分泌の主要なエフェクターであり、この役割では、Ｇ３４に比べて約６倍の効力があると推算されている。種々の型のガストリンは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、前駆体ペプチドであるプロガストリンから切断されることによって、或いは、場合により、切断型が修飾されることによって産生される。ヒトＧ３４は、Ｇ１７の全１７アミノ酸配列をそのＣ末端に有し、また、予想通り、Ｇ１７と免疫学的に交差反応する。
【０００５】
[0005]  成熟したＧ１７は、アミノ末端残基及びカルボキシ末端残基の両方で修飾されている。Ｎ末端のグルタミン酸は、環状化されて、ピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）を形成し、Ｃ末端フェニルアラニン残基の遊離カルボキシル基は、ペプチジルα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）という酵素によってアミド化されて、Ｃ末端Ｐｈｅ−ＮＨ２を形成する。成熟したＧ３４は、同様にＣ末端でアミド化されて、Ｃ末端Ｐｈｅ−ＮＨ２を形成する（Ｄｏｃｋｒａｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００１年）、６３：１１９−１３９を参照）。
【０００６】
[0006]  成熟したＧ１７は、ヒトで主要な、「小さな」ガストリン型であり、ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号１）というアミノ酸配列を有する。Ｇ１７−Ｇｌｙは、健常ヒト個体における、「小さな」ガストリンの少数構成成分として見出された、プロセシングが不完全な型のガストリンであり、ｐｅｇｐｗｌＥｅｅｅｅａｙｇｗｍｄｆｇ（配列番号２）というアミノ酸配列を有する。
【０００７】
[0007]  ガストリン３４は、ヒトで主要な、「大きな」ガストリン型であり、ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号３）というアミノ酸配列を有し、グリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）は、追加のＣ末端グリシン残基を有し、ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧというアミノ酸配列（配列番号４）を有する。
【０００８】
[0008]  ガストリンは、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）に反応して、胃の幽門腔Ｇ細胞によって分泌され、胃酸と、いくつかのペプチドホルモン、特に最も注目すべきものとしてはソマトスタチン、のパラクリン作用と、によって抑制される。ガストリンペプチドが、健常な個体の胃における酸分泌を刺激するように機能することは従来から認識されていたが、これらのペプチドが消化管（ＧＩ）系の種々の細胞の増殖、分化、及び成熟過程の制御も行うことは、最近になって初めて明らかになったことである。
【０００９】
[0009]  ＧＩ系における局所的活性に加えて、Ｇ１７、及びより低い程度でＧ１７−Ｇｌｙは、血流中に放出され、胃癌、結直腸癌、膵癌等の胃腸障害及び疾患に罹患している患者の血清中で増加することが判明している。これらのガストリン分子種が、肺小細胞癌（ＳＣＬＣ）及び肝転移腫瘍を含む、消化管に関連のない他の疾患にも関連していることが、更に最近になって判明した。例えば、「Ｇａｓｔｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｕｎｉｆｙｉｎｇ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ」、Ｓ．Ｎ．Ｊｏｓｈｉら、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９６年）、１４：３３４−３４４；並びに「Ｇａｓｔｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｍ．及びＷａｔｓｏｎ，Ｓ．Ａ．、Ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（２０００年）、１４（１０）：１２３１−１２４７を参照のこと。
【００１０】
[0010]  抗体は、医学、獣医学、及び他の分野で使用される多数のアッセイで主要な試薬となっている。そのような試験には、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ等、通常使用される多数のイムノアッセイが含まれる。
【００１１】
[0011]  モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、その固有の特性により、ポリクローナル抗血清、及びポリクローナル抗血清から精製された抗体と比較して、上記アッセイの多くに、多くの点で適している。その属性には、標的抗原への単一決定基（ｍｏｎｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）特異性（すなわち、単一エピトープへの特異性）、異なる抗体調製物間で不変な特異性、並びに経時的に不変な親和性及び化学組成が含まれる。更に、ＭＡｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法によって、無期限に、かつ無制限な量で産生することができる。これらの特性は、ポリクローナル抗体の特性とは明らかに異なる。ポリクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫法を必要とし、生物学的変動性と、免疫動物の寿命を限界とした限定的な抗体生産能力と、を不可避的に伴う。
【００１２】
[0012]  これらの利点がある一方で、個々のＭＡｂの間には相違が存在し、その相違は、異なるＭＡｂが同一のエピトープに特異的である場合にさえ存在する。例えば、単一抗原エピトープ領域を用いた免疫によって誘導されたＭＡｂ相互の間では、以下の特性のいずれか又はすべてに関して相違が生じる可能性がある。すなわち、１）エピトープの分子組成及び三次構造に関する細密な特異性、２）抗体イディオタイプ、３）抗体親和性、４）抗体アロタイプ、及び、５）抗体アイソタイプである。これらの特質の相違は、特定のイムノアッセイでのＭＡｂの挙動に影響を与えることがあり、それによって、同一の抗原領域に対して産生された異なるＭＡｂ単離株が、所与のアッセイで異なる挙動を示すことがある。従って、一部のＭＡｂは、特定のイムノアッセイにおける試薬として使用された場合、同一のエピトープに結合する他のものより優れているであろう。
【００１３】
[0013]  イムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）でも、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）でも、免疫拡散アッセイでも、或いは、ＥＬＩＳＰＯＴ、スロットブロット、ウェスタンブロット等の免疫検出アッセイでもよい。そのような方法に関する一般的な指針としては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）（１９８７年）「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。或いは、イムノアッセイは、組織試料中の、１つの型のガストリンホルモンを可視化する免疫組織化学（ＩＨＣ）染色又は免疫蛍光（ＩＦ）法であってもよい。例えば、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」（１９９１年）、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｐ．Ｐｒｉｃｅ及びＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ（編集）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【００１４】
[0014]  Ｇ１７のＮ末端領域及びＣ末端領域に選択的なモノクローナル抗体については、文献に記載されている。例えば、Ａｚｕｍａら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｃａ  Ｊａｐｏｎｉｃａ（１９８６年）、２１（４）：３１９−３２４；Ｏｈｎｉｎｇら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（１９９４年）、１５（３）：４１７−４２３；Ｆｕｅｒｌｅら、Ｐａｎｃｒｅａｓ（１９９５年）、１０（３）：２８１−２８６；Ｋｏｖａｃｓら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（１９９６年）、１７（４）：５８３−５８７；Ｏｈｎｉｎｇら、Ａｍ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９６年）、２７１（３  Ｐｔ１）：Ｇ４７０−４７６；Ｓｉｐｐｏｎｅｎら（２００２年）、Ｓｃａｎｄ  Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３７（７）：７８５−７９１を参照。しかし、これらの抗体のいずれについても、単独でも、また、組合せても、正常状態及び疾患状態の生体液中のガストリンホルモンのいくつかの型のうち、複数のものを識別及び定量化できることが示されていない。
【００１５】
[0015]  抗ガストリンポリクロナール抗体がガストリン活性を抑制するのに有効であることが示され（「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｎ」、Ｊａｆｆｅら、Ｓｕｒｇｅｒｙ（１９６９年）、６５（４）：６３３−６３９）、非ヒト抗ガストリンポリクロナール抗体がゾリンジャー−エリソン症候群に罹患している患者の治療に適用されている。ゾリンジャー−エリソン症候群は、食餌による刺激なしに過剰のガストリンが産生される病的状態である。Ｈｕｇｈｅｓら、「Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｇａｓｔｒｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９７６年）、２１（３）：２０１−２０４を参照。しかし、これらのウサギ抗ガストリン抗体は、「よくても、この患者には短期効果」を有するのみであった（Ｈｕｇｈｅｓ、２０４ページ）。米国特許第５８８６１２８号明細書及び第５７８５９７０号明細書は、ガストリンホルモンに依存して成長し、又は刺激される潰瘍又は腫瘍を、ガストリンホルモンペプチド結合体で免疫することによって治療する方法を開示する。
【００１６】
[0016]  最近、血清中における、非アミド化型に対するアミド化型のガストリンホルモンの比率が、十二指腸潰瘍性疾患又は胃萎縮症を発症する、個体の危険プロフィールの指標を提供するものであることが示唆された。Ｔ．Ｃ．Ｗａｎｇによる、「Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ」という名称の米国特許出願公開第２００３／００４９６８９号明細書を参照のこと。別のグループは、ペプシノーゲンＩ／ＩＩ及びヘリコバクターピロリのマーカーのレベルと共に、絶食時のＧ１７に関する「カットオフ値」との比較によって、胃酸関連疾患の危険を評価するための基礎として、絶食時のＧ１７レベルを測定することを含む方法を用いた。２００４年３月１８日発行の国際公開第０４２３１４８号パンフレットを参照のこと。
【００１７】
[0017]  今まで、ガストリンホルモンのＧ１７型、Ｇ１７−Ｇｌｙ型、Ｇ３４型、及びＧ３４−Ｇｌｙ型の各々を、高感度で検出し、正確に識別することのできるＭＡｂは、利用可能でなかった。更に、本発明以前には、生体液試料中の上記型のガストリンホルモンの各々の量を正確に測定することはできなかった。臨床試験用のアッセイで本発明のＭＡｂを使用することによって、正常状態及び疾患状態におけるガストリンホルモンの生物学がより正確に示されることになる。本発明のＭＡｂの使用は、ガストリンに関連した疾患及び状態を予防及び治療するための、医薬用途のＭＡｂ組成物及び方法も提供する。
【発明の概要】
【００１８】
[0018]  本発明は、アミノ酸配列ｐＥＧＰＷＬＥ（Ｇ１７におけるアミノ酸１〜６に対応する。配列番号５）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）又はグリシン伸長Ｇ１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）のＮ末端に選択的に結合するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を提供する。また、アミノ酸配列ｐＥＧＰＷＬＥ（配列番号５）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）又はＧｌ７−ＧｌｙのＮ末端に選択的に結合するＭＡｂを産生するハイブリドーマを提供する。
【００１９】
[0019]  本発明はまた、アミノ酸配列ＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号６）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）又はガストリン３４（Ｇ３４）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂを提供する。また、アミノ酸配列ＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号６）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）又はガストリン３４（Ｇ３４）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂを産生するハイブリドーマを提供する。
【００２０】
[0020]  本発明はまた、アミノ酸配列ｐＥＬＧＰＱＧ（配列番号７）内のエピトープで、ヒトガストリン３４（Ｇ３４）のＮ末端に選択的に結合するＭＡｂを提供する。また、アミノ酸配列ｐＥＬＧＰＱＧ（配列番号７）内のエピトープで、ヒトガストリン３４（Ｇ３４）のＮ末端に選択的に結合するＭＡｂを産生するハイブリドーマを提供する。
【００２１】
[0021]  本発明は更に、アミノ酸配列ｙｇｗｍｄｆｇ（配列番号８）内のエピトープで、グリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）及びグリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂを提供する。また、アミノ酸配列ＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号８）内のエピトープで、グリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）及びグリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂを産生するハイブリドーマを提供する。
【００２２】
[0022]  本発明の抗体のうちの２つ以上の組合せを、Ｇ１７型、Ｇ１７−Ｇｌｙ型、Ｇ３４型、及びＧ３４−Ｇｌｙ型のガストリンホルモンの各々のＮ末端又はＣ末端に選択的に結合するＭＡｂパネルの形態で用いることもできる。
【００２３】
[0023]  （１）アミノ酸配列ｐＥＧＰＷＬＥ（Ｇ１７におけるアミノ酸１〜６に対応する。配列番号５）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）又はグリシン伸長Ｇ１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）のＮ末端に選択的に結合するＭＡｂ、（２）アミノ酸配列ＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号６）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）又はガストリン３４（Ｇ３４）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂ、（３）アミノ酸配列ｐＥＬＧＰＱＧ（配列番号７）内のエピトープで、ヒトガストリン３４（Ｇ３４）のＮ末端に選択的に結合するＭＡｂ、或いは、（４）アミノ酸配列ＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号８）内のエピトープで、グリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）及びグリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂ、の医薬組成物も、薬学的に許容される担体と組み合わせて提供される。
【００２４】
[0024]  患者におけるガストリン介在性の疾患又は状態は、患者から得た生体液の試料中のガストリンホルモン型のレベルを測定すること、及び、上記試料中のガストリンホルモン型のレベルを、健常個体グループから得た生体液の試料中の上記ガストリンホルモン型の正常レベルと比較すること、によって診断することができる。
【００２５】
[0025]  そのようなガストリン介在性の疾患又は状態は、（１）アミノ酸配列ｐＥＧＰＷＬＥ（Ｇ１７におけるアミノ酸１〜６に対応する。配列番号５）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）又はグリシン伸長Ｇ１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）のＮ末端に選択的に結合するＭＡｂ、（２）アミノ酸配列ＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号６）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）又はガストリン３４（Ｇ３４）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂ；（３）アミノ酸配列ｐＥＬＧＰＱＧ（配列番号７）内のエピトープで、ヒトガストリン３４（Ｇ３４）のＮ末端に選択的に結合するＭＡｂ、或いは（４）アミノ酸配列ＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号８）内のエピトープで、グリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）及びグリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂ、を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することによって、予防又は治療することができる。
【００２６】
[0026]  患者におけるガストリン介在性の疾患又は状態の経過をモニターする方法も提供する。この方法は、ガストリン介在性の疾患又は状態に罹患しているか、又はその危険がある患者から得た生体液の試料中のガストリンホルモン型のレベルを、第１の時点で測定するステップと、患者から得た生体液の１つ又は複数の試料中の上記ガストリンホルモン型のレベルを、異なる時点で測定するステップと、それによって、ガストリン介在性の疾患又は状態の経過をモニターするステップと、を含む。
【００２７】
[0027]  本発明は、ガストリンホルモン介在性の疾患又は状態に罹患している患者のガストリンホルモン遮断治療を評価する方法も提供する。この方法は、以下のステップａ）〜ｊ）を含む。
ａ）治療の前又は初期に、患者から生体液の第１の試料を得るステップ
ｂ）第１の試料中のガストリンホルモンのレベルを、イムノアッセイ法によって測定するステップ
ｃ）治療対象の疾患又は状態、及び第１の試料中のガストリンホルモンのレベルに基づいて診断を行うステップ
ｄ）ガストリンホルモンに結合して、ｉｎ  ｖｉｖｏでガストリンホルモンの標的受容体との結合を調節する第１の薬剤、又は第１の薬剤を生成する物質、を含む治療を患者に実施するステップ
ｅ）治療の効果が生じると考えられる適当な時間の後、患者から生体液の第２の試料を得るステップ
ｆ）第２の試料の第１のアリコート中の結合及び遊離ガストリンホルモンを含む全ガストリンホルモンのレベルをイムノアッセイによって測定するステップであって、
第２の試料の第１のアリコートを、（ｉ）第１の薬剤が結合したいかなるガストリンホルモンとも置換する第２の薬剤、及び（ｉｉ）第２の薬剤に結合しない固定化抗ガストリンホルモン抗体、と共にインキュベートし、
第２の薬剤を洗浄除去し、
ガストリンホルモンには結合するが、前記固定化抗体とは競合しない検出可能抗体を添加し、
ガストリンホルモンに結合した固定化抗体を含み、当該ガストリンホルモンが検出可能抗体と結合している免疫複合体を形成させるステップ
ｇ）免疫複合体中の検出可能抗体の量を検出し、それによって、第２の試料中の全ガストリンホルモンの量を測定するステップ
ｈ）第２の試料の第２のアリコートを用いて、ステップｆ）及びｇ）を反復することによって、遊離ガストリンホルモンのレベルを測定するステップであって、
ステップｆ）におけるインキュベーションを第２の薬剤なしで行うステップ
ｊ）第１の試料中の遊離ガストリンホルモンの測定量を、第２の試料中の遊離ガストリンホルモン及び全ガストリンホルモンの量と比較して、患者のガストリンホルモン遮断治療の有効性を判定するステップ
【００２８】
[0028]  本発明は更に、抗ガストリンホルモンＭＡｂと、適当な容器と、を含む、イムノアッセイを実施するためのキットを提供する。抗ガストリンＭＡｂは、ＭＡｂｓ４００−１、４００−２、４００−３、４００−４、４０１−２、４４５−１、４４５−２、及び４５８−１、からなる群から選択されることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【００２９】
[0032]  本明細書で使用する語句の定義を以下に示す。
【００３０】
[0033]  本明細書で互換性をもって使用される「ガストリンホルモン」又は「ガストリンホルモン型（ｇａｓｔｒｉｎ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｆｏｒｍ）」は、生物学的活性及び／又は免疫学的交差反応性を有するいかなるガストリンホルモンペプチドも意味する。ガストリンホルモンの主要な型としては、Ｃ末端でアミド化されているか、又は遊離Ｃ末端を有するガストリン１７（Ｇ１７）；グリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）；Ｃ末端アミド化型及び遊離Ｃ末端型の両方を含むガストリン３４（Ｇ３４）；グリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）；並びにプロガストリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
[0034]  本明細書において、試料中のガストリンホルモン型の「総量」は、遊離（非結合）ガストリンホルモン型の量と、複合体（結合）ガストリンホルモン型の量と、の合計を意味する。複合体ガストリンは、試料中の抗体が結合したものでも、他の結合部分が結合したものでもよい。
【００３２】
[0035]  本明細書において、「生体液」は、生物起源の物質を含有するいかなる液体も意味する。本発明で使用するのに好適な生体液は、動物、特に哺乳動物、好ましくはヒト個体の体液を含有するものである。体液は、いかなる体液でもよく、これには、血液、血漿、血清、リンパ、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び同様のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
[0036]  本明細書において、「保存剤」は、生体液の試料、又は生物学的成分を含む液体試料中のガストリンの時間依存的な分解を低減させる、いかなる薬剤、補充剤又は添加剤も意味する。本発明の実施に有用な保存剤は、当技術分野で周知の多数の保存剤のいずれでもよく、アジ化ナトリウム、ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤（例えば、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）、アプロチニン（トラジロール等））等の一般的な化学的保存剤、或いは、ヘパリン等の生物学的保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
[0037]（新規の抗ガストリンモノクローナル抗体）
[0038]  特定の用途に使用するのに最適なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の選択は、目的の用途における個々の候補ＭＡｂの性能を評価することによって行うのが好ましい。それ故、目的の用途における最適な機能性に関して候補ＭＡｂを試験することは、目的の使用に最適なＭＡｂを得るための選択過程の一部となる。この選択ステップは、標的抗原への結合、及びＭＡｂを産生するハイブリドーマの連続的クローニングを含む、ＭＡｂを得るために通常行う選択ステップに加えて実施するものであり、持続的な細胞増殖及び細胞分裂、並びに無限の期間にわたる一貫した無制限な抗体産生を含む、ハイブリドーマ細胞株の本質的特性の安定性を確実にするものである。
【００３５】
[0039]  本明細書において、ガストリンホルモンの特定の型に「選択的」という用語は、抗体が、ガストリンホルモンの特定の型に存在する特定の標的エピトープに特異的であり、他方、標的エピトープを含有する複数の型のガストリンホルモンの各々に結合することを意味する。例えば、成熟した（アミド化された）Ｇ１７のＣ末端は、成熟したＧ１７及びＧ３４で共通である。従って、成熟したＧ１７のＣ末端に存在する標的Ｃ末端エピトープに特異的なＭＡｂは、Ｇ１７（及びＧ３４）に選択的である。
【００３６】
[0040]  詳細には、本発明は、生物学的活性のあるガストリンホルモン型、すなわち、アミド化されたガストリン１７（Ｇ１７）、アミド化されたガストリン３４（Ｇ３４）、グリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、グリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）、及びプロガストリンのＮ末端及びＣ末端に選択的な、優れた特性を有するＭＡｂを同定する方法を開示する。これらのＭＡｂは、生体液中の特定の型のガストリンホルモンを測定することができるように設計された免疫酵素アッセイ（一般的には「ＥＬＩＳＡ」又は酵素結合免疫吸着アッセイと呼ばれている。）における使用に特に適している。本発明のＭＡｂは、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ、ラジオイムノアッセイ、抗体ベースのサンドイッチ捕捉アッセイ、ドットブロット、スロットブロット、ウェスタンブロットアッセイ等の免疫検出アッセイで、ガストリンホルモンを検出及び／又は定量化するのに適している。
【００３７】
[0041]  一態様では、本発明は、アミノ酸配列ｐＥＧＰＷＬＥ（配列番号５）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）のＮ末端に選択的に結合するＭＡｂを提供する。ガストリン１７のＮ末端（Ｇ１７）に選択的なこれらのＭＡｂの、ペプチドｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥ（配列番号１１）のＢＳＡ結合体への結合は、ヒトＧ１７、ウマＧ１７、又はヒトＧ１７−Ｇｌｙによって抑制される。
【００３８】
[0042]  別の態様では、本発明は、アミノ酸配列ＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号６）内のエピトープで、ガストリン１７（Ｇ１７）又はガストリン３４（Ｇ３４）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂを提供する。
【００３９】
[0043]  更に別の態様では、本発明は、アミノ酸配列ｐＥＬＧＰＱＧ（配列番号７）内のエピトープで、ヒトガストリン３４（ｈＧ３４）のＮ末端に選択的に結合するＭＡｂを提供する。
【００４０】
[0044]  更に別の態様では、本発明は、アミノ酸配列ｙｇｗｍｄｆｇ（配列番号８）内のエピトープで、グリシン伸長ガストリン１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）及びグリシン伸長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）のＣ末端に選択的に結合するＭＡｂを提供する。
【００４１】
[0045]  更に別の態様では、本発明は、プロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを提供する。このＭＡｂは、プロガストリンには結合するが、プロセシングされたガストリンホルモン型、すなわち、Ｇ１７、Ｇ３４、Ｇ１７−Ｇｌｙ、又はＧ３４−Ｇｌｙには結合しない。プロガストリンに選択的な本発明のＭＡｂには、ヒトプロガストリンのＣ末端に結合するＭＡｂが含まれる。上記ＭＡｂはプレプロガストリンに結合すると考えられる。プレプロガストリンは１０１アミノ酸のペプチド鎖からなり、これがプロセシングされて、プロガストリン及びガストリンが順次生成される。しかし、プレプロガストリンのプロセシングは急速であり、その合成が行われる小胞体（ＥＲ）で行われる。プロガストリンに結合する本発明のＭＡｂは、本明細書に記載のアッセイで、試料中のプロガストリンを検出及び定量化するのに有用である。
【００４２】
[0046]  本発明のＭＡｂは、会合定数（Ｋａ）約１０６〜約１０７ＬＭ−１、好ましくは約１０７〜約１０８ＬＭ−１、更に好ましくは約１０８〜約１０９ＬＭ−１、更に好ましくは約１０９〜約１０１０ＬＭ−１、更に好ましくは１０１０〜１０１１ＬＭ−１、最も好ましくは約１０１１〜１０１２ＬＭ−１の選択的結合を示すガストリン型に結合することが好ましい。
【００４３】
[0047]（抗ガストリンモノクローナル抗体パネル）
[0048]  本発明は、ガストリンホルモンのＧ１７型、Ｇ１７−Ｇｌｙ型、Ｇ３４型、及びＧ３４−Ｇｌｙ型のうちの１以上の明確な同定及び定量化を可能にする抗ガストリンホルモンＭＡｂパネルを初めて提供するものである。例えば、ガストリンホルモンのＧ３４型のＮ末端に選択的なＭＡｂ、及びＧ１７／Ｇ３４のＣ末端（Ｇ３４のＣ末端はＧ１７のＣ末端と同一である。）に選択的なＭＡｂ、を含むＭＡｂパネルは、当技術分野で通常行われる多数のイムノアッセイのいずれか１つによる、試料中のＧ３４の特異的同定及び定量化を可能にする。本発明のＭＡｂを使用可能な通常のイムノアッセイには、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡｓ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）、免疫拡散アッセイ、及び同様のものが含まれるが、これらに限定されない。そのような通常の診断アッセイの例については、例えば、Ｄｉｌｌｎｅｒらに交付された、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ１，５，６，８，１１，１６，１８，３１，３３  ａｎｄ  ５６  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ」という名称の米国特許第５９３２４１２号の明細書を参照されたい。
【００４４】
[0049]  本発明の１つ又は複数の追加的なＭＡｂでＭＡｂパネルを補充することによって、試料中における更に別のガストリンホルモン種を特異的に同定及び定量化する能力が得られる。例えば、Ｇ１７型のＮ末端に選択的なＭＡｂを上述の抗体パネルに追加することによって、以下に記載の本発明の方法による、試料中の遊離Ｇ１７ホルモン及び全（結合プラス遊離）Ｇ１７ホルモンの特異的同定及び定量化が更に可能となる。
【００４５】
[0050]  同様に、Ｇ３４のＮ末端に選択的なＭＡｂと、グリシン伸長Ｇ３４のＣ末端（これはグリシン伸長Ｇ１７のＣ末端と同一である。）に選択的なＭＡｂと、を含むＭＡｂパネルは、試料中のグリシン伸長Ｇ３４の特異的な同定及び定量化を可能にする。更に、Ｇ１７のＮ末端に選択的なＭＡｂをパネルに追加することによって、本明細書に記載の通り、試料中の遊離グリシン伸長Ｇ１７及び全（結合プラス遊離）グリシン伸長Ｇ１７の同定及び定量化が可能となる。
【００４６】
[0051]  他の型のガストリンホルモンの同定、定量化、及びモニタリング用のＭＡｂパネルとして有用な、本発明のＭＡｂから選択されたＭＡｂ対の他の組合せも、当業者には自明であろう。本発明は、そのような本発明のＭＡｂ対も、本発明のＭＡｂ対の組合せも、また、本発明のＭＡｂ対の集合も包含する。
【００４７】
[0052]  本発明のＭＡｂは、ガストリンホルモン介在性の疾患及び状態になる素因を評価するために、また、それらに罹患している患者のそのような疾患及び状態を検出及び診断するために、ガストリンホルモン型の量及び比率を正確に測定する手段を提供する。例えば、患者の血清又は他の生体液を大規模スクリーニングするための、Ｇ１７、Ｇ３４、Ｇ１７−Ｇｌｙ、及びＧ３４−Ｇｌｙガストリンホルモン型のいずれか１つ又はすべてに関するＥＬＩＳＡアッセイに、本発明の抗ガストリンＭＡｂを組み入れることができる。
【００４８】
[0053]  本発明のＭＡｂ、本発明のＭＡｂから選択されたＭＡｂ対の組合せ、及び本発明のＭＡｂパネルは、高スループット法に適用される際に特に有用である。そのような方法には、ガストリンホルモン抗原検出のためのマイクロチップ法及びマイクロアレイ法が含まれ、それによって、マイクロプレート、スライド、又は、バーチャルウェルを有するプレート等の他のアッセイ基質上で多数の試料を試験することができる（例えば、Ｇａｒｙａｎｔｅｓらに交付された米国特許第６５６５８１３号に記載のもの）。結合の検出は、利用可能である最先端の検出システムのうちのいずれによって行ってもよい。結合の検出は、例えば、抗原抗体結合等の特異的な生体分子反応によって生じる表面プラズモン抵抗の変化を用いて行うこともできる。酵素アッセイへのこの技術の適用に関しては、例えば、Ｔａｒｅｍｉらに交付された米国特許第５９８１１６７号の明細書を参照されたい。この方法は連続流動モードで適用することができ、また、同様に、表面に固定されたペプチド又はタンパク質（ガストリンホルモン等）への抗体結合を検出するのにも、或いはガストリン抗体複合体を検出するのにも適用できる。後者の複合体は、表面に固定された、当該ガストリンホルモン型（Ｇ１７、Ｇ３４、Ｇ１７−Ｇｌｙ、又はＧ３４−Ｇｌｙ）のエピトープに特異的な抗体への結合によって検出してもよく、その場合、エピトープは、複合体の抗体による立体障害を受けないものである。更に、この技術は、放射性標識を必要とせずに、高スループット適用性及び高感度を可能にするという利点を有する。
【００４９】
[0054]  本発明のＭＡｂは、例えば、生検物質から得たもの等、組織試料の免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ及び免疫蛍光（ＩＦ）アッセイにも有用である。そのような分析は、個々のガストリンホルモン型の異常なレベルを検出し、それによって、ガストリンホルモン介在性の疾患及び状態を診断するのに用いることができる。
【００５０】
[0055]  本発明のＭＡｂは、当技術分野で周知の、既に確立されている方法に従って、ヒト化することができる。例えば、Ｗａｌｄｍａｎらに交付された、「Ｌａｂｅｌｅｄ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ−１８  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ」という名称の米国特許第６６８９８６９号の明細書、及び、Ｃａｒｔｅｒらに交付された、「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称の米国特許第６６３９０５５号の明細書、を参照されたい。ヒト化抗体は、元のマウスＭａｂの結合親和性に更に適合するように再構成することができる。例えば、Ｏｎｏらに交付された、「Ｒｅ−ｓｈａｐｅｄ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ＨＭ１．２４  ａｎｔｉｂｏｄｙ」という名称の米国特許第６６９９９７４号を参照のこと。
【００５１】
[0056]  本発明のＭＡｂは、ガストリンホルモン介在性の疾患及び状態の予防及び治療に有用である。本発明の抗ガストリンＭＡｂは、特定のガストリンホルモン型に対する受動免疫用の医薬組成物として製剤化することができる。例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎらに交付された、「Ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ／ＩＸａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」という名称の米国特許第６３９１２９９号（本明細書では、以下、‘２９９号特許と呼ぶ。）の明細書を参照されたい。本発明のＭＡｂの機能性断片（例えば、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、及び対象のガストリンホルモン型への結合能力を保持する任意の断片。断片については‘２９９号特許を参照。）も、医薬組成物に組み入れて、治療に適用することができる。有用な医薬組成物については、‘２９９特許を参照のこと。本発明の医薬組成物を投与するのに好適な経路には、皮下、筋肉内、静脈内経路等、非経口投与経路が含まれる。別法では、上記医薬組成物を鼻腔内経路で送達することができる。ガストリンホルモン介在性の疾患又は状態になる可能性が高いと予想される患者における、そのような疾患又は状態の予防又は治療、或いは既にそのような疾患又は状態に罹患している患者の治療、に有効な量で投与した場合に、上記医薬組成物は特に有用である。
【００５２】
[0057]  本発明の完全な抗ガストリンＭＡｂ又はその機能性断片、特にヒト化抗ガストリンＭＡｂを含有する医薬組成物の、ガストリン介在性の疾患又は状態を治療するのに有効な量は、その疾患又は状態の進行の開始を阻止するか、又はその速度を低減させる量と定義されるが、より好ましくは、その疾患又は状態を安定化させる量であり、更に好ましくは、その疾患又は状態の退行を引き起こす量であり、最も好ましくは、その疾患又は状態の完全な治癒をもたらす量である。
【００５３】
[0058]  更に、本発明のＭＡｂは、ガストリンホルモン介在性の疾患及び状態の進行をモニターするためのイムノアッセイに適用することができ、その際、特定のガストリンホルモン型、或いは、遊離ガストリン型若しくは結合ガストリン型、又は全ガストリン型、のレベル又は量は、ガストリンホルモン介在性の疾患又は状態の治療の成否、又は進行に関する指標を提供する。
【００５４】
[0059]  更に、本発明のＭＡｂは、ガストリンホルモン介在性の疾患又は状態に罹患している患者のガストリンホルモン遮断治療を評価する方法において有用である。この方法は、
ａ）治療の前又は初期に、患者から生体液の第１の試料を得るステップと、
ｂ）第１の試料中のガストリンホルモンのレベルを、イムノアッセイ法によって測定するステップと、
ｃ）治療対象の疾患又は状態、及び第１の試料中のガストリンホルモンのレベルに基づいて診断を行うステップと、
ｄ）ガストリンホルモンに結合して、ｉｎ  ｖｉｖｏでガストリンホルモンの標的受容体との結合を調節する第１の薬剤、又は第１の薬剤を生成する物質、を含む治療を患者に実施するステップと、
ｅ）治療の効果が生じると考えられる適当な時間の後、患者から生体液の第２の試料を得るステップと、
ｆ）第２の試料の第１のアリコート中の結合及び遊離ガストリンホルモンを含む全ガストリンホルモンのレベルをイムノアッセイによって測定するステップであって、
第２の試料の第１のアリコートを、（ｉ）第１の薬剤が結合したいかなるガストリンホルモンとも置換する第２の薬剤、及び（ｉｉ）第２の薬剤に結合しない固定化抗ガストリンホルモン抗体、と共にインキュベートし、
第２の薬剤を洗浄除去し、
ガストリンホルモンには結合するが、前記固定化抗体とは競合しない検出可能抗体を添加し、
ガストリンホルモンに結合した固定化抗体を含み、当該ガストリンホルモンが検出可能抗体と結合している免疫複合体を形成させるステップと、
ｇ）免疫複合体中の検出可能抗体の量を検出し、それによって、第２の試料中の全ガストリンホルモンの量を測定するステップと、
ｈ）第２の試料の第２のアリコートを用いて、ステップｆ）及びｇ）を反復することによって、遊離ガストリンホルモンのレベルを測定するステップであって、
ステップｆ）におけるインキュベーションを第２の薬剤なしで行うステップと、
ｊ）第１の試料中の遊離ガストリンホルモンの測定量を、第２の試料中の遊離ガストリンホルモン及び全ガストリンホルモンの量と比較して、患者のガストリンホルモン遮断治療の有効性を判定するステップと、
を含む。
【００５５】
[0060]  患者におけるガストリンホルモン遮断治療を評価するのに適用される上述の方法は、臨床診療で特に有益である。臨床診療では、ある治療処方計画を進めるか、或いは別のものを進めるかを決定する時期が、患者の予後にとって極めて重要となることがある。本発明の方法は、これらの極めて重要な決定の根拠となる情報を提供する。この方法は、治療の前又は初期段階（例えば、米国特許第５６２２７０２号明細書に記載のような、ガストリンホルモンペプチド結合ワクチンで免疫した直後）のガストリンホルモンの測定を備え、また、治療の効果が生じ始めていると予測される期間の後の、全ガストリンホルモン及び／又は遊離ガストリンホルモンの１つ又は複数の測定を備える。
【００５６】
[0061]  ガストリンホルモン遮断治療は能動免疫であってもよく、その場合、ガストリンに対する抗体を産生させる免疫原を、上述の通りに患者に投与する。別法では、ガストリンホルモン遮断物質を受動的に患者に投与してもよい。ガストリンホルモン遮断物質は、いかなるガストリンホルモン遮断物質でもよく、特に限定されるものではないが、例えば、抗ガストリンホルモン抗体、特にヒト化されたモノクローナル抗ガストリンホルモン抗体が挙げられる。或いは、ガストリンホルモン遮断物質は、ガストリンホルモン受容体又はガストリンホルモン受容体模倣体であってもよい。ガストリンホルモン受容体模倣体は、例えば、可溶性のガストリンホルモン受容体、又は可溶性のガストリンホルモン受容体断片であるが、それ以外に、ガストリンホルモンに結合する機能を有する任意の他の分子等、ガストリンホルモンへのガストリンホルモン受容体の結合を模倣するいかなる分子でもよい。
【００５７】
[0062]  本発明は、ガストリンホルモンを含有すると推測される試料をスクリーニングするための組成物、方法、及びキットも提供する。そのようなスクリーニングは、そのようなポリペプチドを含有又は産生していると推測される患者試料又は実験室試料について行うことができる。キットは、本発明の抗体を含有することができる。このキットは、試料と本発明の抗体との相互作用を検出する試薬を含有してもよい。提供される試薬は、放射標識、蛍光標識、又は酵素的に標識されたものであってもよい。このキットは、本発明の抗体と結合又は相互作用することが可能な既知の放射標識された物質を含有してもよい。
【００５８】
[0063]  キットの試薬は、液体溶液として提供することも、固体の支持体に結合させた状態で提供することも、乾燥粉末として提供することもできる。試薬を液体溶液で提供する場合、液体溶液は、水溶液であることが好ましい。提供する試薬を固体の支持体に結合させる場合、固体支持体は、クロマトグラフィー媒体、複数のウェルを有する試験プレート、又は顕微鏡用スライドであることが好ましい。提供する試薬が乾燥粉末である場合、粉末は、適当な溶剤を添加することによって再構成することができるが、再構成された形で提供されてもよい。
【００５９】
[0064]  本発明のキットは、容器に入れた状態で提供するが、容器には、通常、抗体、抗原、又は検出試薬を入れたバイアル、好ましくはそれらが適切に分注されたバイアルが含まれる。本発明のキットは、通常、市販のために、抗体容器、抗原容器、及び試薬容器を収容する手段も含むことになろう。そのような容器は、所望のバイアルを保持するプラスチック容器、１つ又は複数の必要な化学物質（例えば、クロマトグラフィー用の物質、溶媒、溶離液）、並びに検出反応用の試験管、界面活性剤、抗体及び化学物質、を含むものでもよい。
【００６０】
[0065]  更に別の実施形態では、本発明は、免疫検出法及びそれに関連したキットに関する。ガストリンホルモン又はそのペプチド断片が、それとの反応性を有する抗体を検出するのに利用可能なこと、或いは、ガストリンホルモン又はガストリンホルモン介在性のエピトープ含有ペプチドを検出するのに、本発明に従って調製された抗体が利用可能なことが提唱されている。通常、これらの方法は、先ず、そのようなホルモン、ペプチド又は抗体を含有することが推測される試料を得るステップと、免疫複合体を形成させるのに有効な条件下で、上記試料を、本発明による抗体又はペプチドと接触させるステップと、その後、免疫複合体の存在を検出するステップと、を含むであろう。
【００６１】
[0066]  一般に、免疫複合体形成の検出は、当技術分野で完全に周知のものであり、多数の方法の適用を通じて実現できる。例えば、本発明では、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット（例えば、ドットブロット、スロットブロット、ウェスタンブロット等）、間接免疫蛍光法、及び同様のものの適用が企図されている。通常、免疫複合体形成は、放射性標識、酵素タグ（例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、又は同様のもの）等の標識の使用によって検出されるであろう。当技術分野で周知の方法に従って、２次結合リガンド（例えば、２次抗体、ビオチン／アビジンリガンド結合物質）を使用することによって、追加的な利点が生じる可能性がある。
【実施例】
【００６２】
[0067]（実施例１：ヒトＧ１７のＣ末端に対するモノクローナル抗体の産生）
[0068]  ＣＳＳＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号１０）と、リンカースペーサである（−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−）配列と、それに続く、ヒトＧ１７及びＧ３４のＣ末端エピトープを含有するアミノ酸配列（−ＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２、配列番号６）と、を含有するペプチドは、標準的な固相ペプチド合成法によって合成されたものを購入した。
【００６３】
[0069]  このペプチドを免疫原に組み込み、Ｇ１７／Ｇ３４のＣ末端に対する抗体を、以下の通りにして誘導した。最初に、このペプチドを、ジフテリアトキソイド（「ＤＴ」）に、共有結合によって連結させ、ペプチド−担体結合を産生させた。各ＤＴ担体上に置換されたペプチド単位の数を測定し、最後に、この結合体を免疫原として処方した。使用した方法は、米国特許第５６２２７０２号明細書に記載の通りであった。
【００６４】
[0070]  簡潔には、担体へのペプチドの化学結合は、ヘテロ二官能性架橋物質であるε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ε−ＭＣＳ）を用いて行った。この結合体を、０．１Ｍナトリウムリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．３（ＰＢＳ）に対する透析によって精製し、ローリー法のアッセイによってタンパク質濃度を測定した。ＤＴ上でのペプチドの置換レベルは、結合体のアミノ酸分析によってモル量で測定した。その後、溶解させた結合体は、結合体溶液をＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３（ＳＥＰＰＩＣ社製、仏国）オイルと３０／７０の比率（結合体／アジュバントのｗｔ／ｗｔ比）で混合することによって、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３をアジュバントとした免疫原として処方した。混合は、適当な容積の各々の液体を注射器に引き込み、次に、連結ハブを通して、第２の注射器との間で溶液を前後に迅速に通過させることによって行った。
【００６５】
[0071]  マウスの免疫は、最初に、容積０．１ｍＬ中の０．１ｍｇのペプチドＤＴ結合体免疫原／Ｍｏｘｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３をｉ．ｐ．注射して行った。最初の注射の３週間後に、同一の用量で第２の注射を投与した。
【００６６】
[0072]  Ｇ１７／Ｇ３４のＣ末端に選択的なＭＡｂを産生するハイブリドーマを作製するために、当業者に周知の標準的な方法によって、免疫化されたマウスから得た脾細胞を、標準的なマウス骨髄腫融合パートナー細胞株に融合させた。これらの方法は、多数の総説及び実験ハンドブックに記載されている。例えば、Ｋａｐｒｏｗｓｋｉらに交付された米国特許第４１９６２６５号明細書「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」；「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（「Ｃｈａｐｔｅｒ  １７：Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ」Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳ．Ｓｈｉｉｇｉ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．社、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９８０年）；Ｈａｒｌｏｗｅ及びＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、１９８８年；Ｚｏｌａ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．社、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ、１９８７年を参照されたい。免疫化されたマウスの追加免疫を、それらの脾細胞を細胞融合用に採集する４日前に、上述したペプチド−ＤＴ結合体０．１ｍｇのＰＢＳ溶液をｉ．ｐ．注射することによって行った。ハイブリッド細胞の初期選択は、Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉの文献に記載の通り、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン補充培地を用いて行った。この融合体をＦ４５８と名付けた。
【００６７】
[0073]  Ｇ１７のＣ末端に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを単離するための最初の選択ステップは、標的ペプチドに対する抗体産生と、ハイブリッド細胞株の安定性とに関する細胞の選択を含むものであった。抗体を産生する細胞の選択は、Ｇ１７／３４のＣ末端に対する抗体のための単一クローンを含有する組織培養ウェルから得られた細胞培地をスクリーニングすることによって実施した。スクリーニングは、リシン−１６でシステインを介して、免疫担体であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に連結された、アミド化された合成ペプチド（Ｇ３４のアミノ酸１６〜３４−ＮＨ２）を含む結合体を標的抗原として用いたＥＬＩＳＡによって実施した。適当なＥＬＩＳＡ法は当業者に知られており、そのうちのいくつかの例は、下記に詳細に説明する。安定した細胞株は、ＥＬＩＳＡ試験で、ｈＧ３４（１６〜３４）ＮＨ２−ＢＳＡ結合体に結合する抗体を産生した各ハイブリッドを２回クローニングすることによって取得した。これらの方法によって、Ｇ１７及びＧ３４に共通のＣ末端に対するＭＡｂを産生する１５株のハイブリッド細胞株を取得した。
【００６８】
[0074]（実施例２：全（結合プラス遊離）Ｇ１７の免疫酵素アッセイで優れた性能を示すモノクローナル抗体の選択）
[0075]  抗ガストリン抗体を含有する可能性のある、ヒト血漿等の生体液試料中のＧ１７の総量を測定する方法が開発されており、２００４年３月２９日出願の米国特許出願第１０／８１３３３６号明細書に記載されている。簡潔には、この方法は、生体液試験試料中に存在して、同様に試験試料中に存在する可能性のあるＧ１７Ｎ末端エピトープ特異的抗体に、Ｎ末端エピトープを介して結合している可能性のあるいかなるガストリンホルモンとも置換するように、ヒトＧ１７のアミノ酸１〜８を含有するペプチド（ヒトＧ１７（１〜８）置換ペプチド）の過剰量を、この生体液試験試料中に添加するステップを含む。一定の時間インキュベーションした後で、置換用のペプチドを含有する試料混合物を、Ｇ１７のＣ末端に対して産生された捕獲抗体でコーティングされた９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに添加する。インキュベーションの後で、プレートを洗浄して、置換用のペプチドを除去し、それに続いて、Ｇ１７のＮ末端エピトープに結合する酵素結合抗体を添加することによって、結合しているＧ１７を検出及び定量化する。結合しなかった酵素結合抗体を除去するのに、別の一連の洗浄ステップが必要であり、抗体に連結された酵素の作用によって検出可能な産物を産生する発色基質又は他の基質を添加することによって、検出可能なシグナルを発生させる。例えば、酵素が西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である場合には、基質はテトラメチルベンジジンスルホナート（ＴＭＢＳ）である。アルカリホスファターゼが、検出に使用された酵素である場合には、有色化合物ｐ−ニトロフェノールを産生する発色基質として、ｐ−ニトロフェノールリン酸を使用することができる。発色の程度は、吸光度単位（ＡＵ、ｐ−ニトロフェノールの場合は４０５ｎｍ、また、ＴＮＢＳの場合には４５０ｎｍで測定する）で測定し、これは、試験試料中に存在するＧ１７の量を示し、実際の濃度は、試験試料の吸光度を測定して、既知の濃度のＧ１７を用いて作成された検量線と対照させることによって決定する。
【００６９】
[0076]  ヒト患者からの血漿試料を用いて、このアッセイで予備試験を行った。この血漿試料に所定の濃度のＧ１７を添加し、Ｇ１７のＣ末端エピトープに対するポリクローナルウサギ抗体を、試験プレートのウェルにコーティングされた捕獲抗体として用いてイムノアッセイを行った。これらのアッセイから得られた結果及びデータは、一貫性が乏しく、許容されるレベルの感度を与えなかった。従って、試験プレートをコーティングするのに、Ｃ末端に選択的なＭＡｂを使用し、このアッセイにおける捕獲抗体として試験した。
【００７０】
[0077]  融合体４５８から得たＣ末端Ｇ１７選択的なＭＡｂの各々を全Ｇ１７アッセイで試験するために、Ｇ１７のＣ末端に対する１５株の個々のＭＡｂを、最初にプロテインＧ親和性クロマトグラフィーで精製した。これは、市販キット（ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ、１ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、製造業者の指示に従って使用することによって行った。その後、各ＭＡｂの濃度を、波長２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）から決定した。濃度を得るために、Ａ２８０を濃度係数１．４ｍＬ／ｍｇで割った。濃度が０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲になるように調整した。その後、Ｇ１７のＣ末端へのＭＡｂの結合を質的に確認するために、各溶液をＥＬＩＳＡで再試験した（無希釈）。
【００７１】
[0078]  次に、１５株のＭａｂ、１株の陰性対照ＭＡｂ、及び精製されたＭａｂの３種類の混合物を、上述の通りヒトＧ１７（１〜８）置換ペプチドを用いて、全Ｇ１７の免疫酵素アッセイでの性能を求めるために試験した。各ＭＡｂを、アッセイコーティング緩衝液（１バイアルのＣｏｎｖｏｌ  ｐＨ８．０濃縮緩衝溶液（ＢＤＨ社、製品番号１８０５２  １Ｕ）を２．５Ｌの水に添加し、アジ化ナトリウム（２．５ｇ）を添加して溶解させる）で最終濃度１０μｇ／ｍＬに希釈し、その後、全Ｇ１７を測定する方法で上述した通り、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートのウェルをコーティングするのに用いた（ウェルあたり０．１ｍＬを添加した）。
【００７２】
[0079]  終夜、室温でインキュベートして、存在するＧ１７を内因性の血清プロテアーゼで完全に消化させることによって天然のＧ１７が枯渇している血清試料に、既知濃度のＧ１７のアリコートを添加した。Ｇ１７の既知濃度の標準溶液を調製するために、この「Ｇ１７添加」された血清の希釈液を調製した。標準溶液中のＧ１７濃度は、０、４．１、６４、及び８００ｐＭであった。その後、Ｇ１７のＮ末端を含むヒトＧ１７（１〜８）置換ペプチドを添加して、これらの試料をアッセイでの試験試料として取り扱った。その後、Ｇ１７のＣ末端に選択的な個々のＭＡｂの調製物でコーティングされたプレートウェルに、各Ｇ１７溶液を添加し、上述した操作法に従って全Ｇ１７アッセイを行った。
【００７３】
[0080]  これらのアッセイの結果を表１に示す。結果は、試験プレートのウェルに捕捉ＭＡｂとしてコーティングされた１５株のモノクローナル抗体の各々を用いたアッセイにおける、各濃度のＧ１７によって得られたＡ２８０吸光度度単位で示されている。
【００７４】
【表１】
0005576592.tif 000002
【００７５】
[0082]  アッセイにおける各ＭＡｂの性能を試験した結果に基づいて、最適なＭＡｂを選択した。単離されたＭＡｂを比較するのに使用された規準には、以下のものが含まれていた。すなわち、
１）  ０．０ｐＭのＧ１７が添加された際の吸光度の値が低いこと（ベースライン値、好ましくは≦０．１ＡＵ）、
２）  ４．１ｐＭのＧ１７を添加した際の吸光度がベースラインの倍あること、
３）  アッセイの主要な動作範囲である、４．１ｐＭのＧ１７と、６４ｐＭのＧ１７との間で、ＡＵの増大（勾配）が最も急であること、そして
４）  Ｇ１７濃度８００ｐＭでＡＵの値が最も高いことである。
【００７６】
[0083]  これらの規準に基づいて、最も性能の良かったＭＡｂは、Ｆ４５８−３−８Ｇ  １Ｈ  ３Ｃであった。この抗体の名称をＭＡｂ４５８−１に改め、Ｇ１７のＣ末端に選択的に結合する最適なＭＡｂとして、これ以降のアッセイで使用した。これらの規準及び同様のアッセイは、下記に例示する、ガストリンホルモン型Ｇ１７、Ｇ３４、Ｇ１７−Ｇｌｙ、及びＧ３４−Ｇｌｙの末端のエピトープに対して産生されたＭＡｂの選択にも適用した。
【００７７】
[0084]  結合しているホルモンと置換する、適切なアミノ酸配列の置換ペプチドの使用を、他のガストリンホルモンペプチド型のアッセイに組み入れることによって、試料中の遊離ホルモンの量と、全ホルモン（結合ホルモン＋遊離ホルモン）の量との両方の測定を行うことができる。置換ペプチドの使用は、当該ペプチドが結合する領域のアミノ酸配列が利用可能ないかなるペプチドホルモンの総量のアッセイにも適用することができる。
【００７８】
[0085]（実施例３：ヒトＧ３４のＮ末端に対するモノクローナル抗体の単離及び特性決定）
[0086]  Ｇ３４のアミノ末端に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを、Ｇ１７及びＧ３４のＣ末端に対するＭＡｂの産生に関する実施例１に記載の通りに作製した。但し、Ｇ３４のＮ末端に存在するエピトープに対して、ドナーマウスの脾細胞を免疫化するのに使用したペプチド、及び、Ｇ３４のＮ末端エピトープに特異的なＭａｂを選択するのに使用したペプチドの組成は異なるものであった。Ｇ３４のＮ末端エピトープに対する抗体反応を誘導するため、ｐＥＬＧＰＱＧＲＰＰＰＰＣ（配列番号１２）というペプチドをＤＴに結合して、免疫原を形成させた。Ｇ３４のＮ末端エピトープに対するＭａｂを同定するためのＥＬＩＳＡで使用する標的抗原を形成させるために、このペプチドをＢＳＡに同様に連結させた。この融合体にＦ４０１という番号を付けた。
【００７９】
[0087]  Ｆ４０１は、ＭＡｂ４０１−２を産生した。Ｇ３４への特異性は、抑制ＥＬＩＳＡによって立証した。この抑制ＥＬＩＳＡで、Ｇ３４Ｎ末端のペプチド性免疫摸倣体（ｉｍｍｕｎｏｍｉｍｉｃ）（配列番号１２）へのＭＡｂ４０１−２の結合が、表２に示す通り、Ｇ３４ペプチドのみによって抑制されることが示された。
【００８０】
【表２】
0005576592.tif 000003
【００８１】
[0089]  Ｇ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、及びウマＧ１７を含む他の型のガストリン、並びにＣＣＫ８（非硫酸化）及び陰性対照であるＧｎＲＨは、４０１−２  Ｍａｂの結合を抑制しなかった（表２に示した通り）。
【００８２】
[0090]（実施例４：Ｇ１７のＮ末端に対するモノクローナル抗体の単離及び特性決定）
[0091]  Ｇ１７のアミノ末端に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを、Ｇ１７及びＧ３４のＣ末端に対するＭＡｂの産生に関する実施例１に記載の通りに作製した。但し、Ｇ１７のＮ末端に存在するエピトープに対して、ドナーマウスの脾細胞を免疫化するのに使用したペプチド、及び、Ｇ１７のＮ末端エピトープに特異的なＭａｂを選択するのに使用したペプチドの組成は異なるものであった。Ｇ１７のＮ末端エピトープに対する抗体反応を誘導するため、ｐＥＧＰＷＬＥＲＰＰＰＰＣ（配列番号５）というペプチドをＤＴに結合して、免疫原を形成させた。Ｇ１７のＮ末端エピトープに対するＭａｂを同定するためのＥＬＩＳＡで使用する標的抗原を形成させるために、このペプチドをＢＳＡに同様に連結させた。加えて、ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＡＡＰＰＣ（配列番号１６）というペプチドをＢＳＡに連結させて、Ｇ１７のＮ末端エピトープに関するＥＬＩＳＡ標的抗原を作製した。この融合体にＦ４００という番号を付けた。Ｆ４００は、Ｇ１７のＮ末端エピトープに対する４株のＭＡｂを産生した。これらは、ＭＡｂ番号を４００−１から−４まで通して付けた。
【００８３】
[0092]  ＭＡｂは、標準的な方法によって、マウスの腹水液として産生した。試験での使用には、Ｆ４００  ＭＡｂの各々の腹水液を等容積で混合して、前記抗体のプールを形成させた。このプールの抗Ｇ１７  ＭＡｂ力価を、ＥＬＩＳＡによって測定した。それらを表３に示す。
【００８４】
[0093]  ４株のＦ４００  ＭＡｂの各々の親和性を、抑制ラジオイムノアッセイのスキャッチャード解析によって測定した。この抑制ラジオイムノアッセイでは、当業者に知られている標準的なラジオイムノアッセイ法を用い、放射性ヨウ素化されたＧ１７への各ＭＡｂの結合を、標識されていないＧ１７で、その濃度を上昇させながら抑制した。ＭＡｂ４００−１〜−４の各々の親和性（Ｋａ）を表４に示す。Ｇ１７のＮ末端エピトープへの特異性は、抑制ＥＬＩＳＡによって立証した。この抑制ＥＬＩＳＡでは、Ｇ１７（配列番号１１）のＮ末端のペプチド性免疫摸倣体への、ＭＡｂ４００−１から−４までの結合が、Ｇ１７、Ｇ１７−Ｇｌｙ、及びウマＧ１７ペプチドによってのみに抑制され、一方、Ｇ３４、並びにＣＣＫ８（非硫酸化）及び陰性対照であるＧｎＲＨは、４００−１から−４までのＭＡｂの結合を抑制しないことが示された（表５に示す通り）。
【００８５】
[0094]（抗Ｇ１７  ＭＡｂの特性決定）
【表３】
0005576592.tif 000004
【００８６】
【表４】
0005576592.tif 000005
【００８７】
【表５】
0005576592.tif 000006
【００８８】
[0098]（実施例５：グリシン伸長Ｇ１７／Ｇ３４のＣ末端に対するモノクローナル抗体の単離及び特性決定）
[0099]  Ｇ１７−Ｇｌｙのカルボキシ末端エピトープに対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを、Ｇ１７及びＧ３４のＣ末端に対するＭＡｂの産生に関する実施例１に記載の通りに作製した。但し、Ｇ１７−Ｇｌｙのカルボキシ末端エピトープに対して、ドナーマウスの脾細胞を免疫化するのに使用したペプチド、及び、Ｇ１７−Ｇｌｙのカルボキシ末端エピトープに特異的なＭＡｂを選択するのに使用したペプチドの組成は異なるものであった。Ｇ１７−Ｇｌｙのカルボキシ末端エピトープに対する抗体反応を誘導するため、ＣＰＰＰＰＳＳＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号１４）というペプチドをＤＴに結合して、免疫原を形成させた。
【００８９】
[0100]  ＣＧＧＳＫＫＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号１５）というペプチドをＢＳＡに連結させ、Ｇ１７−Ｇｌｙのカルボキシ末端エピトープに対するＭａｂを同定するためのＥＬＩＳＡで使用する標的抗原を形成させた。Ｇ１７−Ｇｌｙには結合するが、Ｇ１７又はＧ３４には結合しないＭＡｂを選択するために、この融合体には、Ｇ１７−Ｇｌｙ（配列番号２）ではＭＡｂが抑制されるが、Ｇ１７（配列番号１）では抑制されないことを実証する追加の選択ステップを用いた。この融合体にＦ４４５という番号を付けた。
【００９０】
[0101]  Ｆ４４５は、グリシン伸長Ｇ１７に特異的な２株のＭＡｂを産生した。これらには、ＭＡｂ番号４４５−１及び４４５−２を付けた。これらのＭＡｂを作製するのは特に困難であった。発明者らがそれに成功するまでに、約１４回の融合を行う必要があった。通常、本明細書に記載の他のガストリンホルモン等、ペプチドホルモンに対するＭＡｂを得るのには、１回の融合で十分である。
【００９１】
[0102]  Ｇ１７−Ｇｌｙへの特異性は、抑制ＥＬＩＳＡによって立証した。この抑制ＥＬＩＳＡでは、Ｇ１７−Ｇｌｙ  Ｃ末端エピトープ標的ペプチド（配列番号１４）ＢＳＡ結合体へのＭＡｂ  ４４５−１及び４４５−２の結合を、Ｇ１７−Ｇｌｙペプチド（配列番号２）及びＣＰＰＰＰＳＳＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号１４）という免疫原ペプチドのみが抑制し、一方、Ｇ１７、Ｇ３４、及びウマＧ１７を含む他の型のガストリン、並びにＣＣＫ８（非硫酸化）及び陰性対照であるＧｎＲＨは、４４５−１及び４４５−２  ＭＡｂの結合を抑制しなかったことが示された（表６に示す通り）。
【００９２】
【表６】
0005576592.tif 000007
【００９３】
[0105]（実施例６：Ｇ３４のＣ末端に対するモノクローナル抗体の単離及び特性決定）
[0106]  ヒトＧ３４及びＧ１７は同一のＣ末端エピトープを有する。実施例１に記載の融合体番号Ｆ４５８で産生されたＭＡｂは、Ｇ３４及びＧ１７両方のＣ末端エピトープに結合するＭＡｂを産生した。この融合体で産生されたＭＡｂに、４５８−１から−５までの通し番号を付けた。
【００９４】
[0107]  Ｇ１７とＧ３４とによって共有されているＣ末端エピトープへの、ＭＡｂ４５８−１から−５までの特異性は、抑制ＥＬＩＳＡによって立証した。この抑制ＥＬＩＳＡでは、Ｇ１７／３４  Ｃ末端エピトープ標的ペプチド（配列番号１１）ＢＳＡ結合体への、ＭＡｂ４５８−１から−５の結合を、Ｇ１７ペプチド（配列番号１）、Ｇ３４ペプチド（配列番号３）、及びＣＣＫ８ペプチド（配列番号１３）（これもＣ末端エピトープを提示する）のみが抑制し、一方、Ｇ１７−Ｇｌｙ及びＧ１７（１〜９）Ｎ末端を含む他の型のガストリン、並びに陰性対照であるＧｎＲＨは、４５８−１から−５までのＭＡｂの結合を抑制しなかったことが示された（表７に示す通り）。
【００９５】
【表７】
0005576592.tif 000008
【００９６】
[0109]（実施例７：膵癌、胃癌、及び大腸癌の細胞に対するＦ４００  ＭＡｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍細胞有効性の実証）
[0110]  実施例４の図３に示した、Ｇ１７のＮ末端に対するＭＡｂのプールを、ヒト膵癌、胃癌、及び大腸癌から得られた腫瘍細胞株の増殖抑制能について試験した。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究では、各臓器源から２株の細胞株を試験した。試験された６株の個々の腫瘍細胞株は、それ自身のＧ１７ホルモンを産生することが知られていた。これは、オートクリン効果をもたらす可能性があり、Ｇ１７に対する中和ＭＡｂが、それを抑制するかもしれない。
【００９７】
[0111]  細胞に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験用のＦ４００  ＭＡｂ混合物を調製するために、セファロース（Ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｎｋ、Ｐｉｅｒｃｅ社）に、Ｓｕｌｆｏ−Ｌｉｎｋキットと共に提供された方法によって連結された、Ｇ１７（配列番号１２）のＮ末端エピトープを提示するペプチドに対するクロマトグラフィーによって、抗体の親和性精製を行った。これらのＭＡｂをＰＢＳに対して透析し、それらの濃度を、Ａ２８０測定によって決定した。
【００９８】
[0112]  細胞は、標準条件（３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーター）下で培養した。培地は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化されたウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ社）を含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ社）からなるものであった。
【００９９】
[0113]  実験用の細胞を採取するために、準集密的な単層培養中の細胞を、０．０２５％のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｓｉｇｍａ社）を用いて採取した。細胞を培地で洗浄し、１ｘ１０５生存細胞／ｍＬの密度で培地に再懸濁し、９６ウェル培養プレート中に、０．１ｍＬ／ウェルでプレーティングした。終夜のインキュベーションの後、吸引によって培地を除去し、Ｆ４００  ＭＡｂの混合物又は正常なマウス免疫グロブリン（ＮＭＩｇ）のいずれか５００μｇ／ｍＬを含有する新たな培地で置換した。その後、更に４８時間、細胞をインキュベートし、それに続いて、哺乳類細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養における細胞増殖を評価するのに一般的に使用されているテトラゾリウムベースのＭＴＴアッセイによって細胞増殖を評価した。各試験グループ（ｎ＝５）について、ＭＴＴアッセイで得られた各ウェルの吸光度を平均した。その後、ＮＭＩｇの存在下における増殖と比較して、Ｆ４００  ＭＡｂが細胞増殖を抑制したパーセントを計算した。
【０１００】
[0114]  これらの試験の結果を表８に示す。表８は、抗Ｇ１７  ＭＡｂ混合物が、試験された各腫瘍細胞株の増殖を抑制したことを示す。抑制は、膵臓腫瘍細胞株の１９．５％から、胃細胞株の５２．０％にまで及んだ。
【０１０１】
[0115]  従って、３種類の一般的な消化管の悪性腫瘍に由来する腫瘍に対して、本発明のＭＡｂがｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗増殖性治療活性を有することが示された。
【０１０２】
【表８】
0005576592.tif 000009
【０１０３】
[0117]（実施例８：胃癌細胞に対するＦ４００  Ｍａｂのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍有効性の実証）
[0118]  Ｇ１７のＮ末端に対するＭＡｂのプールは、ＭＡｂ４００−１〜−４の各々を含有する腹水液の等容積混合物を含有するものであるが、ＭＧＬＶＡ１という、ヒト胃癌から得られた腫瘍細胞株の増殖を抑制するそれらの能力を試験した。ＭＧＬＶＡ１細胞はそれら自身のＧ１７ホルモンを産生することが知られており、これは、オートクリン効果をもたらす可能性があり、Ｇ１７に対する中和ＭＡｂが、それを抑制するかもしれない。
【０１０４】
[0119]  ｉｎ  ｖｉｖｏ試験用のＦ４００  ＭＡｂ腹水液混合物を調製するために、それらの腹水液を５６℃で３０分間加熱することによって、腹水液中の補体を枯渇させた。Ｓｉｇｍａ社から購入した、陰性対照の腹水液も同様に処理した。
【０１０５】
[0120]  ＭＧＬＶＡ１胃腫瘍細胞は、メスのヌードマウスで皮下腫瘍として増殖させた。腫瘍を試験マウスに移植するためには、腫瘍保持マウスから外科的に腫瘍を切除し、約１ｍｍ３の小片に切断した。その後、これらの断片を、研究で使用されるヌードマウスの側腹部に皮下移植し、腫瘍を生着させる。腫瘍部位を観察し、腫瘍成長をノギスで測定した。腫瘍の生着が観測されたときに、マウスを、試験ＭＡｂ（Ｆ４００混合物）で処置されるグループ、又は陰性対照の腹水で処置されるグループに無作為に振り分けた。この研究ではマウス１２匹／グループであった。
【０１０６】
[0121]  第１週には、０．２ｍＬの腹水液（Ｆ４００混合物又は陰性対照）を、週に２回、マウスの腹腔内に注入した。第１週の後には、注射容積を週２回０．１ｍＬにまで減少させた。週に３回、腫瘍の測定を行った。この研究は２７日間継続した。研究の最後に、マウスを屠殺し、腫瘍を切除して、重量を測定した。
【０１０７】
[0122]  Ｆ４００試験ＭＡｂ混合物で処置されたマウスのＭＧＬＶＡ１胃癌腫瘍の平均重量は０．７５ｇであった。一方、ＭＧＬＶＡ１胃癌腫瘍を保有し、陰性対照の腹水液で処置されたマウスの腫瘍の平均重量は１．５ｇであった。従って、Ｆ４００試験混合物の抗Ｇ１７  ＭＡｂは、胃癌細胞に対して強力な増殖阻害作用を示し、腫瘍の重量を５０％減少させた。
【０１０８】
[0123]（実施例９：Ｇ１７及びＧ３４のＣ末端に対する抗体の力価を測定するためのＥＬＩＳＡ）
[0124]  この解析法の目的は、試験血清中の抗ｈＧ１７抗体の力価をＥＬＩＳＡによって測定することである。簡潔には、本発明の抗ｈＧ１７抗体ＥＬＩＳＡは、ｈＧ１７（１〜９）−ＡＡＰＰＣ−ＢＳＡ結合体（配列番号１６のリンカーを介してしてＢＳＡに連結されたヒトガストリンホルモンペプチドのアミノ酸１〜９）によって提示されたｈＧ１７エピトープに対する抗体（Ａｂ、ポリクローナル又はモノクローナルのいずれか）の特異的な結合に基づいている。
【０１０９】
[0125]  最初のステップで、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに結合体を結合させた。遊離している結合体は、９６ウェルプレート洗浄機を用いた洗浄ステップで除去した。その後、試験（又は対照）抗血清を添加した。試験血清中に存在する抗ｈＧ１７  Ａｂは、抗原表面に存在するｈＧ１７ペプチドエピトープの存在によって結合体に結合した。その後、検出される抗ｈＧ１７抗体に種特異的な抗ＩｇＧアルカリホスファターゼ試薬の添加によって、抗体を検出した。例えば、ウサギ抗ｈＧＨ１７抗体は、Ａｂ検出試薬としてヤギ抗ウサギＩｇＧアルカリホスファターゼ結合体（「ＧＡＲ−ＡＰ」）を用いて検出する。ＧＡＲ−ＡＰは、ウサギ抗ｈＧ１７  Ａｂに結合する。続いて、抗Ｉｇ−ＡＰ結合体のＡＰ部分が、基質から有色産物（ｐ−ニトロフェノール）への変換を触媒する。発色は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーでの４０５ｎｍの吸光度として測定した。
【０１１０】
[0126]  試験試料と同じ動物種から得た、プールされた抗ｈＧ１７血清を含有する標準血清又は、指定された参照力価を有する抗ｈＧＩ７  ＭＡｂを含有する腹水液を陽性対照として用いた。試験試料と同じ動物種から得た血清、例えば、正常な血清、免疫前の血清等を陰性対照として用いた。
【０１１１】
[0127]  直線領域における発色の程度は、標的抗原に結合した抗ｈＧ１７  Ａｂの量に正比例していた。標準曲線を作成するために、陽性標準（抗ｈＧ１７）血清の連続希釈に対する吸光度のプロットを用いた。その後、陽性標準物質の参照力価（例えば、ウサギ抗ｈＧ１７陽性標準物質の１：２０００００希釈）と同じ吸光度を生じる希釈率から試験試料の抗ｈＧ１７  Ａｂ力価を決定した。
【０１１２】
[0128]  試薬溶液：  この解析法で調製するように特定された試薬及び溶液の量は、便宜のためのみのものである。実際の量は、必要に応じて調節できる。
【０１１３】
１．  ０．０２％のＮａＮ３を含有する炭酸緩衝液（「炭酸緩衝液」）：１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３と、２．９３ｇのＮａＨＣＯ３を約７５０ｍｌの蒸留水中にマグネチックスターラで溶解させることによって作製する。４ｍｌの５％ＮａＮ３溶液を添加して、撹拌する。水を加えて１．０リットルに調整する。ｐＨを測定する。ｐＨは、９．６±０．２とすべきである（必要に応じて、１．０ＭのＮａＯＨ又は１．０ＭのＨＣｌでｐＨを調整する）。必要になるまで冷蔵庫で保存する。
【０１１４】
２．  ０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０及び０．０２％のＮａＮ３を含有するＦＴＡ（ＰＢＳ）（「ＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎ」）：９．２３ｇのＦＴＡを約７５０ｍｌの精製水中に溶解させる。０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０と４ｍｌの５％ＮａＮ３を添加する。水を加えて１．０００リットルに調整する。
【０１１５】
３．  １％ＢＳＡを含有するＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎ（「ＢＳＡ／ＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎ」）：１０ｇのＢＳＡを１０００ｍｌのＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎに溶解させる。
【０１１６】
４．  基質緩衝液：５０ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２０を４４８ｍｌの精製水に溶解させる。５０ｍｌのＤＥＡと、２ｍｌの５％のＮａＮ３と、を添加する。濃塩酸でｐＨを９．８に調整する。光から保護して室温で保存する。
【０１１７】
５．  ＰＢＳ、ｐＨ７．２：固体のＦＴＡ（ＦＴＡ赤血球凝集緩衝液（「ＦＴＡ」）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から調製することができる。
【０１１８】
[0129]  ＥＬＩＳＡの手順：  抗原でのコーティング：炭酸緩衝液中に１μｇ／ｍｌ  ｈＧ１７（１〜９）−ＡＡＰＰＣ−ＢＳＡ結合体の溶液（配列番号１６のリンカーを介してＢＳＡに連結されたヒトガストリンホルモンペプチドのアミノ酸１〜９）を調製する。各プレートのコーティングには、最小限５．２ｍｌの抗原溶液が必要である。炭酸緩衝液で、１ｍｇ／ｍｌ結合体保存溶液の１：１０００希釈を行うことによって、抗原溶液を調製する。プレートは、例えば、Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ（登録商標）イムノアッセイプレート、硬質スチレン（例えば、Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）２丸底９６ウェルプレート、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、ＶＡ；平底９６ウェルプレート、ポリスチレン：例えば、Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ、Ｎｕｎｃ社、ＶＷＲ社販売）等、ＥＬＩＳＡアッセイに適したいかなるプレートでもよい。５０μｌ／ウェルの抗原溶液を添加することによって、Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）２丸底プレートを抗原でコーティングする。水分の消失を防止するために、プレートを湿室（例えば、水分を含んだペーパータオルの入っている密閉容器）に保存し、冷蔵庫（２°〜８℃）で終夜インキュベートする。
【０１１９】
[0130]  血清希釈液の調製：  陽性標準及び陰性対照、並びに試験血清の１／１００．５系列希釈シリーズを、表９に示す通りに調製した。血清は、平底９６ウェルプレート内のＢＳＡ／ＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎ溶液中に希釈した（１２チャンネルのマルチピペッターによって、最大１２点の血清の同時希釈が可能となる）。
【０１２０】
【表９】
0005576592.tif 000010
【０１２１】
[0132]  各血清の希釈液を、最小作業容積を２００μｌとするのに十分な容積調製した。血清力価に応じて、各血清の１／１００希釈（低力価血清用）又は１／１０００希釈（高力価血清用）に始まる希釈液を行Ａに作製し、その後、系列希釈を各列の下側へ行Ｈまで進め（表９を参照）、合計８つの各試料の希釈液を産生させる。陰性対照の連続希釈は、１／１００から始めて調製した。陽性標準血清及び事前採血／陰性対照血清の連続希釈試料は、各プレートで２つ組みで行った。
【０１２２】
[0133]  プレートの洗浄：  プレート洗浄機（例えば、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ；又はＤｙｎａＷａｓｈｅｒ  ＩＩ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ社，ＶＡ）又は同等のもの）を用いて、コーティングされたプレートを、各々４回、ＦＴＡ／トゥイーンで洗浄し、その後、残留溶液を除去するために、ペーパータオルの上にプレートを「勢いよく押し付けた」。
【０１２３】
[0134]  抗体結合：  下記の表１０に示す通りに、試料プレート連続希釈を行った後、５０μｌ／ウェルの希釈された血清を、抗原でコーティングされた丸底プレートにおける対応するウェルに移した。プレートを湿室内、室温で１時間インキュベートした。
【０１２４】
【表１０】
0005576592.tif 000011
【０１２５】
[0136]  抗体検出試薬：  抗Ｉｇ−アルカリホスファターゼ結合体の適当な希釈液をＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎで調製した。アッセイではプレートあたり最小限５．２ｍｌが必要であった。プレートは上述の通りに洗浄した。５０μｌ／ウェルのＧＡＲ−ＡＰ溶液（抗Ｉｇ−アルカリホスファターゼ結合体、例えば、ウサギ抗ｈＧ１７抗体を試験するには、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−アルカリホスファターゼ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｉｎｃ．社、Ｄａｖｉｓ，ＣＡ））を、丸底プレートのすべてのウェルに添加し、湿室内、室温で、１時間インキュベートした。
【０１２６】
[0137]  ウサギ以外の種から得られた血清中の抗ｈＧ１７抗体を検出するには、試験用血清を産生した種に特異的な抗Ｉｇ−ＡＰ結合体を用いなければならない（例えばヒト抗ｈＧ１７抗体は、試薬の各ロットに関して確立した希釈で使用される抗ヒトＩｇＧ−ＡＰ試薬で検出されるであろう）。陽性標準及び陰性対照血清は、試験血清と同じ種から得るべきである。
【０１２７】
[0138]  基質溶液：  ｐ−ＮＰＰ錠剤（ｐ−ニトロフェニルリン酸、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｓｉｇｍａ  １０４（「ｐ−ＮＰＰ」）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）として販売）を冷凍庫から取り出して、室温に暖まるまでおいた。使用する直前に、１錠のｐ−ＮＰＰ錠剤を、５ｍｌのＤＥＡ基質緩衝液（室温）に添加することによって、１ｍｇ／ｍｌのｐ−ＮＰＰ溶液を調製した。１枚のアッセイプレートには、基質溶液の各５ｍｌ分量で十分であった。基質溶液は、使用するまで暗所に保存した。
【０１２８】
[0139]  基質の添加：  プレートは上述の通りに洗浄した。列１に始まるすべてのウェルに、５０μｌ／ウェルのｐ−ＮＰＰ溶液を、８（又は１２）チャンネルマルチピペッターを用いて同時に、行Ａから始めて添加した。
【０１２９】
[0140]  反応のモニタリング：  参照力価に最も近い陽性標準物質希釈液の吸光度が、ＥＬＩＳＡプレートリーダーの最大線形測定値の１０〜３０％に達したときに、基質溶液の発色は停止させた。参照力価に対応する希釈液が、リーダーの読み取り範囲の１０〜３０％に達したとき（通常１０〜３０分間の発色時間の後）を判定するために、陽性標準物質の吸光度をモニターするのに、ＭＲＸ自動プレートリーダー；若しくはＭＲ５８０  ＭｉｃｒｏＥＬＩＳＡ自動リーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、ＶＡ）；又はこれらの等価物等のＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いた。ＥＬＩＳＡリーダーは、ｐ−ニトロフェノール用にＡ４０５ｎｍで測定するように設定した。
【０１３０】
[0141]  反応の停止：  陽性標準物質における上述の通りに選択された希釈液の吸光度が、リーダーの線形範囲の１０〜３０％に達したときに、８（又は１２）チャンネルのピペッターで、５０μｌの１．０Ｍ  ＮａＯＨを各ウェルに添加することによって、反応を停止させた。ＮａＯＨ溶液は、基質溶液を添加したのと同じ順序、かつ同じタイミングでウェルに添加した。試薬は、台上でプレートを慎重に振盪することによって、穏やかに混合した。
【０１３１】
[0142]  吸光度の測定：  プレート全体をＥＬＩＳＡリーダーで測定した。
【０１３２】
[0143]  データの分析：  各血清の力価は、次の通りに決定した。陰性対照血清で得られた吸光度を、陽性標準物質及び試験血清における、対応する希釈液の吸光度から引いた。（陽性標準物質及び陰性対照の各希釈液の平均を用いた。）陽性標準物質を含む各血清について、片対数グラフ目盛における、横座標（対数目盛）の（１／希釈）に対して、吸光度を縦座標（線形目盛）にプロットした。希釈の逆数をプロットすることによって、力価をＸ軸上で直接的に読み取ることができた。時として、吸光度が、特定の血清の結合曲線から明確に離れている（異常値）ことがあったが、そのような値はその曲線から排除した。各血清の力価は、陽性標準物質の参照力価（例えば、ウサギ抗ｈＧ１７陽性標準物質の１：２０００００希釈）によって生じるものと同じ吸光度を生じる希釈の逆数として決定される。データ分析の例を図１に示す。
【０１３３】
[0144]（実施例１０：抑制ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の測定）
[0145]  ペプチド阻害ＥＬＩＳＡにも、上記の実施例と同じ方法が行われたが、以下に記載の点が相違していた。
【０１３４】
[0146]  抑制物質の調製：  通常、適当な標的ホルモンペプチド、この場合はｈＧ１７を、１μｍｏｌ／ｍｌ（１０００μＭ）の作業用保存液として調製する。抑制連続希釈は、１：２から１：１０までの希釈率で作業用保存液から調製し、プレートのレイアウトに応じて合計８つから１２の希釈液を産生する。
【０１３５】
[0147]  試料希釈の調製：  ５０％最大結合における抗体試料の希釈率を確定するために、抑制分析の前に、試料の力価測定シリーズを行う。次に、等容積のペプチド性抑制物質と、そして、抑制分析の対照として緩衝液と混合させるために、５０％結合濃度の２Ｘに試料を調製した。試料混合物を湿室内で約３０分間インキュベートし、その後、コーティングされ、かつ洗浄されたＥＬＩＳＡプレートに添加し、湿室内で、約１時間インキュベートした。
【０１３６】
[0148]  パーセント結合は、抑制物質存在下の試料から得られた吸光度を、抑制物質非存在下で試料対照から得られた吸光度で割って、この値に１００を掛けることによって、吸光度の測定値（バックグランドの値が引かれている）から決定した。最後に、パーセント抑制は、１００％から結合パーセントを引くことによって決定した。
【０１３７】
[0149]  試験試料は、血清、細胞培養上清中のＭＡｂ、腹水液、又はアフィニティー精製抗体（Ａｂ）であってもよい。Ｇ１７のアミノ末端以外の標的抗原に対するＡｂには、適切な標的ホルモン抗原及び抑制物質が使用される。陰性対照として、関連性のないペプチドが含まれているべきである。
【０１３８】
[0150]（ＥＬＩＳＡ：データ分析）
[0151]  上述のＥＬＩＳＡで得られたデータの例を図１に示す。各希釈における正味の吸光度を得るために、平均の陽性標準物質及び試験血清の値から、平均の陰性対照血清の吸光度を引いた。正味の吸光度の値を力価に対してプロットした（この例では、典型的な値を明らかにするために、陰性対照もプロットした）。
【０１３９】
[0152]（ガストリン１７の安定性）
[0153]  室温（約２２℃）におけるガストリンの安定性を、上述の全ガストリンアッセイによって評価した。これは、１５、１００、及び６００ｐＭを既知のＧ１７濃度とするように試料を調製した直後と、室温で机上に２時間置いた後とに全Ｇ１７を測定することによって行った。結果を下記の表１１に示す。それらは、各試料のＧ１７濃度が実質的に減少していることを実証するものである。
【０１４０】
【表１１】
0005576592.tif 000012
【０１４１】
[0155]（実施例１１：ＨＧ１７に対する抗血清の抑制ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）−抗ヒトガストリン１７（ｈＧ１７）抗血清の抗原結合能（ＡＢＣ）を測定するための血清力価測定及び抗原抑制ＲＩＡ）
[0156]  希釈緩衝液：
１．リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）＋０．０２％アジ化ナトリウム（ＮａＮ３）。可溶性固形物の市販製剤である「ＦＴＡ赤血球凝集緩衝液」を蒸留水で溶解させて、ＰＢＳを産生することができる（９．２３ｇ／ｌによってｐＨ７．２±０．１の溶液が得られる）。
２．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．０２％ＮａＮ３を含有するＦＴＡ。
３．補充用子ウシ血清（ＳＣＳ；ＧＩＢＣＯ社）、５０ｍｌ以下の分量で凍結保存。
４．ＰＥＧ、ＭＷ８０００、２５％溶液に調製（１リットルあたり２５０ｇ、ゆっくりと溶解させる）。４℃で保存する。
５．ヒトガストリン１７（１５−Ｌｅｕ）（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｌｕｓ社、＃０７−０２７−００２）；単回使用分量には、ＦＴＡ／１％ＢＳＡ／アジ化物中に５〜１０μｇ／ｍｌ。−７０℃で保存。
６．ヒトガストリン１７−１２５Ｉ（ＮＥＮ社）。
【０１４２】
[0157]（方法）
[0158]  抑制ＲＩＡで試験する各抗血清の容積を確立するために、最初に、試験血清を量の異なる１組のｈＧ１７−１２５Ｉに対して力価測定を行った。その後、血清を抑制ＲＩＡによって試験し、スキャッチャード解析によって抗原結合能（ＡＢＣ）を計算した。
【０１４３】
[0159]  力価測定ＲＩＡプロトコル：
１．  陽性対照抗血清及びすべての試験抗血清について、アッセイされる各抗血清希釈液用に２つ組みのチューブを用意した。好ましくは、アッセイチューブにおける最終希釈が１：４０〜１：４０００００となるように、血清の５回の１０倍希釈を行った。これは、１チューブあたり、１０μｌから０．００１μｌの範囲の抗血清が添加されたのと同等である。
２．  ３００μｌの希釈緩衝液を２本のチューブに分注した。これらは試薬ブランクとして機能した。残りのチューブすべてに２００μｌの希釈緩衝液を添加した。
３．  希釈された抗血清１００μｌを２つ組みの血清チューブの各々に移した（各希釈につき２Ｘ１００μｌが必要である）。連続希釈には、移動の際の減失を考慮しても、３０μｌの抗血清から始めることで十分であった（１：１０希釈液３００μｌを産生する）。
４．  非特異的な結合に関する対照として、少なくとも１希釈（１：４０、試験血清の最も低い希釈）の陰性血清を含有させた。
５．  ＲＩＡ緩衝液で約１００００ｃｐｍ／０．１ｍｌに希釈された１２５Ｉ標識された抗原（Ａｇ）。下記の希釈手順を参照のこと。
６．  すべてのチューブに標識されたガストリン１００μｌを添加した。添加された総カウント数を確認するために、標識されたｈＧ１７  １００μｌを１０本のシンチレーションバイアル又はγ線計数器チューブに添加した。
７．  チューブの内容物を振盪又はボルテックスによって混合し、パラフィルムで覆った。
８．  チューブを終夜、約１８時間、４℃でインキュベートした。これは最小のインキュベーション時間であって、力価測定ＲＩＡには更に長いインキュベーションを用いることもできるが、通常、その必要はない。
９．  １００μｌのＳＣＳをすべてのチューブに添加し、チューブを震動させた。
１０．  ５００μｌの２５％ＰＥＧ（４℃又はＲＴ）をすべてのチューブに添加して、ボルテックスによって混合した。
１１．  ２０００Ｘｇ、４〜１２℃で３０分間、チューブを遠心した。
１２．  すべてのチューブから上清を吸引して、廃棄した。
１３．  γ線計数器でアッセイチューブ内の沈殿を計測するか、下記に記載の通り、シンチレーション計測用に調製を行った。
【０１４４】
[0160]（計算）
[0161]  ２つ組み試料の毎分カウント数（ｃｐｍ）を平均した。非特異的なバックグランド結合の減算は行わなかった。添加された血清の容積に対する、％ｈＧ１７−１２５Ｉ結合として、データをプロットした。試料あたりに添加された総ｃｐｍの３５％に結合した各血清の量を抑制ＲＩＡ用に選択した。
【０１４５】
[0162]（抑制ＲＩＡ）
１．  各抑制シリーズに、力価測定ＲＩＡで決定された１通りの希釈の抗血清を用いた。用意する２つ組みチューブの数は、無抑制の対照を含む、試験される抑制物質の希釈の数によって決定される。通常は、抗血清１つあたり、抑制物質の希釈８通り（１６チューブ）と、２本の無抑制チューブと、を用いた。
２．  ゼロ計数ブランクとして、２本のチューブに希釈緩衝液３００μｌを分注した（自然バックグラウンド計数を確定するため）。
３．  陰性対照血清を受容するもの（非特異的な結合のバックグランドを得るため）として、６本のチューブに緩衝液２００μｌを分注し、これらのうち２本はアッセイの終わりに試験した。各抗血清あたり２本のチューブに緩衝液２００μｌを分注した（結合した総カウント数計測用）。これらのチューブには、いかなるｈＧ１７抑制物質も添加されなかった。
４．  残りすべてチューブに希釈緩衝液１００μｌを添加した。
５．  適当な最終濃度（下記参照）が得られるように希釈された無標識のｈＧ１７（抑制物質）１００μｌを、試験抗血清及び対照抗血清の各々の２つ組みチューブに分注した。これらのシリーズによって、各抗血清に関するｈＧ１７抑制曲線が確立された。ｈＧ１７抑制物質は、５１２０ｐｇ／０．１ｍｌに始まる、ＦＴＡ／アジ化物中での１：１連続希釈によって調製した。
８．  チューブの内容物を混合した。
９．  ＲＩＡ緩衝液中の１２５Ｉ標識された抗原を約１００００ｃｐｍ／０．１ｍｌに希釈した。
１０．  添加された合計カウント数を確定するために、アッセイ全体にわたって配置されている１２本以上のチューブを含むすべてのチューブにｈＧ１７−１２５Ｉ  １００μｌを添加した。
１１．  最後に、適切に希釈された抗ｈＧ１７対照血清、陰性対照血清、又は試験血清１００μｌを、適切なチューブセットの各チューブに添加した。
１２．  チューブの内容物を混合し、カバーした（例えばパラフィルムを用いて）。
【０１４６】
【表１２】
0005576592.tif 000013
【０１４７】
１３．  チューブを約４２時間（２日間）４℃でインキュベートした。
１４．  すべてのチューブにＳＣＳ  １００μｌを添加して混合した。
１５．  すべてのチューブに２５％ＰＥＧ  ５００μｌを添加して混合した。
１６．  チューブを２０００Ｘｇ、４℃で３０分間、遠心した。
１７．  すべてのチューブから上清を吸引して廃棄した。
１８．  γ線計数器でアッセイチューブ内の沈殿を計測するか、シンチレーション計測用に調製を行った。シンチレーション計測用に、すべてのアッセイチューブにｄＨ２Ｏ  ２５０μｌを添加した。水を９０〜１００℃に加熱することによって、ペレットの溶解が加速される。ペレットの溶解には、２〜３時間を必要とした。その後、シンチレーションバイアルの各々に３ｍｌのシンチレーション液を添加した。溶解したペレットのすべてを、１本のチューブから１本のシンチレーションバイアルに移し、計測用にラック内に配置した。
【０１４８】
[0164]（計算）
１．  ２つ組み試料のｃｐｍを平均し、非特異的なバックグランド結合（陰性血清対照の平均によって決定とする）を引いた。
２．  無抑制の抗ＨＧ１７抗体に結合した総カウント数が予測された範囲内にあったことを確認するために、総カウント数を加算し、ベースラインバックグランド対照を用いた。
３．  抑制物質の各々の量に関して、添加された総カウント数と、結合したカウント数と、を用いて、抗血清のＡＢＣ及び親和定数を、スキャッチャード解析（結合した抗原に対する結合／遊離のプロット）によって決定した。個々の抗血清に関して、最良の線形回帰線を与えた点を選択し、残りを除去した。これは、プロットを見て、回帰係数に注意することによって行った。一般的には、プロットにおける値の低い部分は用いなかった。ＡＢＣ及び親和定数は、この目的のために設定したスプレッドを用いて自動的に計算した。
【０１４９】
[0165]（ＨＧ１７−１２５Ｉの希釈）
[0166]  ｈＧ１７−１２５ＩはＮＥＮ社から購入した。この放射標識されたホルモン（１５μＣｉ）には、出荷時に、２２００μＣｉ／ｍｍｏｌｅの比活性があった。添付されていた商品説明書に従い、崩壊日数に基づいて、凍結乾燥物をｄＨ２Ｏで５０μＣｉ／ｍｌに希釈した。溶解の後、５０μｌ分量を作製し、鉛の容器に入れて−７０℃で保存した。
【０１５０】
[0167]（１００００ＣＰＭへの希釈）
[0168]  約１００００ｃｐｍの標識化合物を各アッセイチューブ（０．１ｍｌ）に入れた（通常１００００〜１０４００ｃｐｍ／チューブ）。必要とする希釈ｈＧ１７−１２５Ｉの容積を決定する際には、総カウント数測定と、移動及び泡立ちによる減失を考慮して、３〜４ｍｌの余分を与えた。
【０１５１】
[0169]  注意：このアッセイで検査される試験試料は、血清でも、細胞培養上清中のＭＡｂでも、腹水液でも、アフィニティー精製Ａｂでもよい。Ｇ１７のアミノ末端以外の標的抗原に対する抗体には、適当な１２５Ｉ標識標的ホルモン抗原及び抑制物質を使用する。関連のないペプチドも含めて、陰性対照として試験するべきである。
【０１５２】
[0170]（実施例１２：ウサギα−ＧＲＥ１１抗体を用いたパラフィン包埋組織上のＣＣＫ２受容体の検出）
[0171]  ３回の別々のキシレン槽（各槽につき５〜６回上下させる）での浸漬によって、組織切片のパラフィン除去を行った。その後、１００％工業用加メチルエタノール（ＩＭＳ）中でのインキュベーション（各槽につき５〜６回上下させる）によって、それを再水和させた。スライドを蒸留水中で５分間すすいだ。スライドを１５％酢酸中で２０分間インキュベートすることによって、内因性のアルカリホスファターゼ活性を遮断した。その後、スライドを蒸留水中で５分間すすいだ。スライドを、相互に２スペース離れるようにプラスチックスライドラック中に配置し、ｐＨ６のクエン酸緩衝液（１Ｌあたり２．１ｇクエン酸一水和物、１２．５ｍＬ  ２Ｍ  ＮａＯＨ）の中に入れ、最高出力の電子レンジ（６００Ｗ）で１０分間加熱した。その際、全過程の時間、スライドを覆うのに十分な量の緩衝液が確実に存在するように注意した。その後、スライドを直ちに、冷たい蒸留水の水流中に移し、スライドが乾燥してしまわないように注意しながら３〜４分間おいた。
【０１５３】
[0172]  疎水性のペンを用いて切片に印を付け、湿室に入れ、ｐＨ７．６のトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）（０．６６ｇトリス−（ヒドロキシメチル）メチルアミン、８．７５ｇ  ＮａＣｌ、約４．１５ｍＬ  ＨＣＬ）中に、室温（「ＲＴ」）で５分間、浸漬させた。スライドを、ＴＢＳ中の１０％正常ヤギ血清と共にＲＴで２０分間、インキュベートすることによって、２次抗体（「Ａｂ」）の非特異的結合を遮断した。スライドから液体を除き、各スライドに、一次抗体（２００μｌ／スライド）を添加し、湿室中、ＲＴに１時間置いた。スライドの洗浄は、最初にＴＢＳ（洗浄ビン（ｓｑｕｉｒｔ  ｂｏｔｔｌｅ）中；組織切片に直接水流を向けないように注意する）で穏やかにすすぎ、次に、５分間、緩衝液中に浸漬させることによって行った。
【０１５４】
[0173]  アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ２次抗体（又は、試験抗体の産生源を標的とした適当な抗体）を、２００μｌ／スライドのＴＢＳ中、１／５０希釈でスライドに添加した。次に、スライドをＲＴで１時間インキュベートし、その後、ＴＢＳ中で５分間洗浄した。
【０１５５】
[0174]  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ社／Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ、Ｓｉｇｍａ社）を、使用の直前に調製し、各切片に添加して、最長の時間を２０分（Ｖｅｃｔｏｒ）又は３０分（Ｓｉｇｍａ社）としてインキュベートした。スライドをＴＢＳ、次いで蒸留水ですすぎ、その後、マイヤーヘマトキシリン（時間は変動的）で対比染色を行った。染色の後に、スライドを蒸留水中に移した。
【０１５６】
[0175]  その後、過剰の対比染色を除去するために、スライドを１％酸アルコール（１リットルあたり１０ｍＬ濃塩酸、７００ｍＬ  ＩＭＳ、２９０ｍＬ蒸留水）中に浸漬した。但し、Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ基質（Ｓｉｇｍａ社）を用いた場合には、代わりに蒸留水中に移した。スライドを０．５％テトラホウ酸ナトリウム溶液（水で希釈したもの）中で何度か上下させた。この時点で、核が、紫色ではなく、青いかどうかを確認するために、切片の１つを顕微鏡下で検査するのが賢明である。その後、染色されたスライドを蒸留水に移し、それに続いて、ＩＭＳに、そして最後にキシレンに移し、その後、ＤＰＸ（キシレン包埋剤）で包埋した。
【０１５７】
[0176]  試験及び対照血清／精製抗体の適切な希釈率は、連続希釈を用いて確定した。ＧＩ切片は、アルカリホスファターゼ試薬システムを用いて染色するのが最良である。ＡＢＣは、更に特異的であるが、高感度であることによる多くの非特異的染色をもたらす。腸管アルカリホスファターゼは、レバミソール（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｓ社）で遮断することができ、切片を発色させるときには、これを基質溶液に添加する。Ｖｅｃｔｏｒ  ｒｅｄ基質は、Ｓｉｇｍａ社の基質製品より問題が少ない。しかし、調製された基質溶液に、レバミソールを１滴、添加する必要がある。
【０１５８】
[0177]  この免疫組織化学法に使用される一次抗体（Ａｂ）は、血清でも、ＭＡｂでも、細胞培養上清中のＡｂでも、腹水液でも、親和性精製されたＡｂでもよい。
【０１５９】
[0178]  本明細書で上述した手順は、他のペプチド、特に、他のガストリンホルモン型を含む他のホルモンペプチドの免疫検出アッセイ及び免疫酵素アッセイ用に最適なＭＡｂの単離に適用可能なことを、当業者ならば直ちに認識するであろう。本発明では、本明細書に記載の非限定な実施例によって教示及び例示される全範囲のＭＡｂが企図されている。本明細書で引用したすべての特許及び出版物はそのまま、参照されることにより本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
[0179]（ハイブリドーマ細胞株の寄託）
[0180]  本発明の特定のＭＡｂを産生する下記のハイブリドーマを、２００４年３月２５日にＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に寄託した。
１．  ＭＡｂ  ４００−１を産生するハイブリドーマ４００−１には、アクセッション番号ＰＴＡ−５８８９が指定された。
２．  ＭＡｂ  ４００−２を産生するハイブリドーマ４００−２には、アクセッション番号ＰＴＡ−５８９０が指定された。
３．  ＭＡｂ  ４００−３を産生するハイブリドーマ４００−３には、アクセッション番号ＰＴＡ−５８９１が指定された。
４．  ＭＡｂ  ４００−４を産生するハイブリドーマ４００−４には、アクセッション番号ＰＴＡ−５８９２が指定された。
５．  ＭＡｂ  ４０１−２を産生するハイブリドーマ４０１−２には、アクセッション番号ＰＴＡ−５８９３が指定された。
６．  ＭＡｂ  ４４５−１を産生するハイブリドーマ４４５−１には、アクセッション番号ＰＴＡ−５８９４が指定された。
７．  ＭＡｂ  ４４５−２を産生するハイブリドーマ４４５−２には、アクセッション番号ＰＴＡ−５８９５が指定された。
８．  ＭＡｂ  ４５８−１を産生するハイブリドーマ４５８−１には、アクセッション番号ＰＴＡ−５８９６が指定された。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】ｈＧ１７−ＢＳＡでコーティングされたプレートを用いたＥＬＩＳＡを示す図である。血清の力価に対する４０５ｎｍの吸光度（Ａ４０５）を示すプロットである。正方形は試験試料を表し、菱形は事前採血試料を表し、三角形は参照標準を表す。陽性標準物質における２ｘ１０５の力価（１）で得られた吸光度（２）を決定する。試験試料曲線が、この吸光度と交差する点が試験試料の力価（３）を示す。この実施例では、試験試料が２．８ｘ１０４の力価を有する。
【図２】全ガストリン１７の代表的な検量線を示す図である。テトラメチルベンジジンスルホナート（ＴＭＢＳ）色素原を用いた酵素的発色の後の４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）に対して、ガストリン濃度をピコモルでプロットしたものである。
【図３】遊離ガストリン１７の代表的な検量線を示す図である。テトラメチルベンジジンスルホナート（ＴＭＢＳ）色素原を用いた酵素的発色の後の４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）に対して、ガストリン濃度をピコモルでプロットしたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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