(57)【要約】  励起光波長／蛍光波長が生体組織透過性に優れた近赤外領域にあって測定対象物質をレシオ法で測定可能な蛍光プローブであって、蛍光団A−S−蛍光団B（蛍光団A及び蛍光団Bは600 nm〜950 nmの波長の励起光を照射した場合に蛍光を発する蛍光団であって、蛍光団Aは測定対象物質との特異的な反応の前後で蛍光特性が変化する性質を有し、Sは蛍光団Aと蛍光団Bとを連結するスペーサーを示す）で表され、測定対象物質との特異的な反応の前後で蛍光団Aと蛍光団Bとの間の蛍光共鳴エネルギー効率の実質的な変化を生じる化合物を含む蛍光プローブであって、蛍光団Aが下記の式（AI）で表される蛍光プローブ。2008108074.tif 000014
2008108074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式(I)：
蛍光団A−S−蛍光団B    (I)
（ただし、蛍光団A及び蛍光団Bはそれぞれ600 nm〜950 nmの波長の励起光を照射した場合に蛍光を発する蛍光団であって、蛍光団Aは測定対象物質との特異的な反応の前後で蛍光特性が変化する性質を有し、Sは蛍光団Aと蛍光団Bとを連結するスペーサーを示す）で表され、測定対象物質との特異的な反応の前後で蛍光団Aと蛍光団Bとの間の蛍光共鳴エネルギー効率の実質的な変化を生じる化合物を含む蛍光プローブであって、蛍光団Aが下記の式（AI）：
【化１】
2008108074.tif 000011
［式中、R1及びR2はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基を示し；R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子を示すか、又は測定対象物質を検出するための置換基を示すが、R3及びR4が同時に水素原子であることはなく、R3及びR4が互いに結合して測定対象物質を検出するための環構造を形成してもよく；Y1及びY2はそれぞれ独立に-O-、-S-、-Se-、-CH=CH-、-C(R5)(R6)-、又は-N(R7)-（式中、R5、R6、及びR7はそれぞれ独立に水素原子、又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）を示し；n及びn'はそれぞれ独立に0、1、又は2を示し；Z1及びZ2はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいベンゾ縮合環又は置換基を有していてもよいナフト縮合環を形成するために必要な非金属原子群を示し；L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7はそれぞれ独立に置換又は無置換のメチン基を示すが、n又はn'が2である場合には重複するL1及びL2又は重複するL6とL7は同一でも異なっていてもよく、；M-は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示し、ただしR3及びR4の組み合わせは、測定対象物質の検出の前後で、式(AI)で表される蛍光団Aの極大励起波長が変化する組合せである］で表される蛍光プローブ。
【請求項２】
一般式(I)中の蛍光団Aが下記の式(AII)：
【化２】
2008108074.tif 000012
［式中、R11及びR12はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基を示し；R13及びR14はそれぞれ独立に水素原子を示すか、又は測定対象物質を検出するための置換基を示すが、R13及びR14が同時に水素原子であることはなく、R13及びR14が互いに結合して測定対象物質を検出するための環構造を形成してもよく；Y11及びY12はそれぞれ独立に-O-、-S-、-Se-、-CH=CH-、-C(R15)( R16)-、又は-N(R17)-（式中、R15、R16、及びR17はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）を示し；Z11及びZ12はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいベンゾ縮合環又は置換基を有していてもよいナフト縮合環を形成するために必要な非金属原子群を表し；M'-は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示し；ただしR13及びR14の組み合わせは、測定対象物質の検出の前後で式(AII)で表される蛍光団Aの極大励起波長が変化する組合せである］で表される請求項１に記載の蛍光プローブ。
【請求項３】
蛍光団Bがテトラメチルインドジカルボシアニン誘導体である請求項１又は２に記載の蛍光プローブ。
【請求項４】
測定対象物質がプロトン、金属イオン、活性酸素種、又は酵素反応基質若しくは酵素反応生成物である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項５】
pH測定用に用いる蛍光プローブであって、蛍光団Aが上記式(AI)（ただし、R1及びR2がそれぞれ独立にメチル基又は4-スルホブチル基であり；R3及びR4のいずれか一方が水素原子であり、もう一方が置換基を有していてもよいC1-18アルキル基であり；Y1及びY2が-C(CH3)2-であり；n及びn'がともに1であり；Z1及び Z2がともに無置換ベンゾ縮合環であり；L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7が無置換のメチン基であり；M−は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示す）で表される請求項１ないし３のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項６】
pH測定に用いる蛍光プローブであって、蛍光団Aが上記式(AI)（ただしR1及び
R2がそれぞれ独立にメチル基又は4-スルホブチル基であり；R3及びR4がそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は-(CH2)m-N(R21)(R22)であり、R3及びR4の少なくとも一方が-(CH2)m-N(R21)(R22)(R21及びR22はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-6アルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基を示すか、又はR21又はR22がそれぞれR3又はR4と結合して置換基を有していてもよいC1-3アルキレン基を示し、mは1又は2を示す)であり； Y1及びY2が-C(CH3)2-であり；n及びn'がともに1であり、Z1及びZ2が無置換ベンゾ縮合環であり、L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7が無置換のメチン基であり；M−は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示す）で表される請求項１ないし３のいずれか１項に記載の蛍光プローブ。
【請求項７】
pH測定のための蛍光プローブとしては、下記の化合物を含む請求項１に記載の蛍光プローブ。
【化３】
2008108074.tif 000013
【請求項８】
測定対象物質の蛍光測定方法であって、下記の工程：(a)一般式(I)で表される化合物と測定対象物質とを接触させる工程、及び(b)上記工程(a)の接触後に上記一般式(I)で表される化合物の蛍光強度を測定して測定対象物質との接触に起因するFRET効率の変化を検出する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛍光プローブに関する。より具体的には近赤外領域の励起光／蛍光が使用可能な蛍光共鳴エネルギー移動を利用した蛍光プローブに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生命化学研究において生体現象をイメージングするための蛍光プローブの開発が盛んに行われており、pH、各種金属イオン、及び活性酸素種などに対する種々の蛍光プローブが提案されている。例えば、pHを測定するための蛍光プローブとしてBCECF（2',7'-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein）及びその誘導体、CFDA（carboxyfluorescein diacetate）及びその誘導体、SNARF-1（seminaphthorhodafluor）及びその誘導体[いずれもモレキュラープローブス社のカタログ（Handbook of  Fluorescent Probes and Research Chemicals, Tenth edition）の第20章（pHインディケーター）]などが提案されている。また、亜鉛イオンを測定するための蛍光プローブとしてTSQ (Reyes, J.G., et al., Biol. Res., 27, 49, 1994)、Zinquin ethyl ester (Tsuda, M., et al., Neurosci., 17, 6678, 1997)、Dansylaminoethylcyclen (Koike, T., et al., J. Am. Chem. Soc., 118,  12686, 1996)、Newport Green [モレキュラープローブス社のカタログ（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Tenth edition）の第19章（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、及び他の金属イオン）]、さらに本発明者らによって、フルオレセインを蛍光母核とする亜鉛イオンプローブ（特開2000-239272号公報、国際公開WO01/062775号、及び特開2004-315501号公報）及びベンゾフランを蛍光母核とする亜鉛イオンプローブ（国際公開WO02/102795号）などが提案されている。【０００３】
これらの蛍光プローブは、目的とする測定対象と反応したときのみ、蛍光特性に変化が生じることが望ましいが、それ以外の要因によって影響を受けることも多い。特に細胞や生体組織に蛍光プローブを適用するときには、細胞によって導入する蛍光プローブ濃度にばらつきを生じたり、細胞膜の厚さによって測定部位での励起光強度に差が生じたり、膜などの疎水性の高い部分に蛍光プローブが局在してしまう可能性があるなど、測定に影響を与える要因が多いという問題がある。【０００４】
これらの要因による測定誤差を減少させ、正確な定量的解析を行なえる方法としてレシオ（ratio）測定法が開発され使用されている（Kawanishi Y., et al,  Angew. Chem. Int. Ed.,39(19), 3438, 2000）。この方法は、蛍光スペクトル又は励起スペクトルにおいて異なる二波長での蛍光強度を測定してその比を検出する工程を含んでおり、蛍光プローブ自体の濃度や励起光強度による影響を無視できるとともに、1つの波長で観測を行なった場合に生じる蛍光プローブ自身の局在や濃度変化、あるいは退色などによる測定誤差をなくすことができる。このようなレシオ測定を可能とするためには、測定対象との反応の前後で励起光波長あるいは蛍光波長が変化する蛍光プローブが必要となる。例えばpH蛍光プローブSNARF-1は、pHがアルカリ性に偏るとデプロトネーションにより蛍光波長のピークが長波長側にシフトする性質を有しており、500 nm付近で励起した場合、580 nm付近の蛍光強度はpHの上昇に伴って減少するのに対して、640 nm付近の蛍光強度はpHの上昇に伴って増加する。従って、この化合物を含む溶液に励起光を照射して、そのときの適当な二波長の蛍光強度を測定してその比を求めることにより、プローブ濃度、光源強度、細胞の大きさなどに関係なくpHを正確に測定できる。また、国際公開WO02/102795号に記載の亜鉛イオン蛍光プローブは分子内電荷移動を原理とする蛍光プローブで、亜鉛イオンを捕捉していない場合の励起波長は354 nm、蛍光波長は532 nmであるが、亜鉛イオンの濃度に依存して励起スペクトルのピークが20 nm程度ブルーシフトすることから、励起波長として例えば335 nm及び354 nmを用い、それぞれの励起波長における蛍光強度を測定してその比を求めることにより、プローブ濃度、光源強度、細胞の大きさなどに関係なく亜鉛イオン濃度を正確に測定できる。しかしながら、これらは可視光領域以下の波長の励起光波長／蛍光波長を使用するレシオ型蛍光プローブであり、このような励起光は生体組織の透過性が低いという問題がある。さらに測定の際に細胞系自身が有する自家蛍光による影響を受け易いという問題は解決できていない。【０００５】
一方、シアニン色素はさまざまな分野で広く利用されており、生理機能を研究する蛍光イメージング領域においても生体分子の蛍光ラベルとして使用されている。これらシアニン色素のうち、トリカルボシアニン系色素は、生体分子による吸収が比較的少ない650 nm〜950 nm付近の近赤外領域に極大吸収波長及び極大蛍光波長を持つ蛍光色素で、生体組織の深部まで透過できる波長の光を使用できる利点を有する。また、近赤外領域は生体成分からの自家蛍光も少ないことから、トリカルボシアニン系色素の特性はin vivoイメージングにとって好適である。【０００６】
最近、生体分子を直接蛍光ラベルするためのシアニン系色素に加え、生体分子と特異的に反応することで蛍光強度が変化するトリカルボシアニン色素が開発された。例えば、カルシウムイオンに対する近赤外蛍光プローブ（Ozmen, B., et al., Tetrahedron Lett., 41, pp.9185-9188, 2000）、一酸化窒素（NO）に対する近赤外蛍光プローブ（国際公開WO2005/080331号）が挙げられる。これらの蛍光プローブは生体分子との特異的な反応の前後で励起/蛍光波長が変化することなく、蛍光強度のみが変化するプローブである。また、pHプローブとして国際公開WO00/075237号に記載の化合物やCypHer（GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社）がある。これらは、シアニン骨格のポリメチン鎖に接合する窒素含有複素芳香環の窒素原子がプロトン化して発蛍光する原理でpHの低下に伴って中性領域以下で蛍光強度が上昇する。さらに、本発明者らは近年、亜鉛イオンに対する近赤外蛍光プローブ（特願2005-057265）及びpH測定に用いる近赤外蛍光プローブ（特願2007-035768）を開発した。これらはpH、亜鉛イオン濃度変化に応じて励起波長が移動するレシオ蛍光プローブであり、生体透過性に優れる650 nm〜800 nmに極大吸収波長を持ち、亜鉛イオン濃度又はpH変化に応じて励起スペクトルのピークに顕著な波長シフトを生じるため、650 nm〜800 nmの適当な二波長の励起光を照射して、それぞれの励起波長における蛍光強度を測定してその比を求めることにより極めて正確に生体組織深部の亜鉛イオン濃度及びpH変化が測定できる。【０００７】
また、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）による蛍光変化も二波長のレシオ型となるためFRET型蛍光プローブでもレシオ測定が可能であり、プローブ濃度、光源強度、細胞の大きさなどに関係なく測定対象を定量的に測定可能である。しかしながら、従来知られているFRETを利用した蛍光プローブ（例えば特開2000-316598号公報に記載の蛍光プローブなど）のほとんどは可視光領域の蛍光を利用するものであり、近赤外領域の励起光波長／蛍光波長を利用した蛍光プローブとしては、国際公開WO00/075237号にpH変化に伴う蛍光のon/offを利用したFRET型pHプローブの記載がある他にはほとんど知られていない。また、この国際公開WO00/075237号に記載されたプローブはpHプローブとしてのみ利用できるものであり、その他の金属イオンや酵素基質などの測定対象物質のプローブとしては応用できないという問題がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、励起光波長／蛍光波長が生体組織透過性に優れた近赤外領域にあって測定対象物質をレシオ法で測定可能な蛍光プローブを提供することである。特に、上記の特徴を有する化合物を含むpH蛍光プローブ及びpH蛍光プローブを用いたpHの測定方法、並びに亜鉛イオン蛍光プローブ及び該亜鉛イオン蛍光プローブを用いた亜鉛イオン測定法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、近赤外領域に励起波長／蛍光波長を有し、試料中の測定対象物質に特異的に反応して励起光波長が大きく変化する特異的蛍光性化合物（後述する蛍光団A）と、それ自身が近赤外領域に蛍光を有し、該特異的蛍光性化合物に対してFRET関係にある供与体又は受容体として機能する化合物（後述する蛍光団B）とを連結した蛍光プローブを使用することにより、該蛍光プローブと測定対象物質との反応を該蛍光プローブのFRET効率の変化として蛍光を利用して測定できることを見出した。また、本発明者らは、この方法を用いることによって、生体組織透過性に優れた近赤外領域の励起波長／蛍光波長を用いて試料中の測定対象物質をレシオ法によって測定することができ、生体組織の環境の違いや生体組織中の内在性物質に由来する自家蛍光などの影響を受けずに極めて正確に生体組織深部の測定対象物質を測定できることを見出した。本発明はこれらの知見を基に完成されたものである。【００１０】
すなわち、本発明により、下記の一般式(I)：
蛍光団A−S−蛍光団B    (I)
（ただし、蛍光団A及び蛍光団Bはそれぞれ600 nm〜950 nmの波長の励起光を照射した場合に蛍光を発する蛍光団であって、蛍光団Aは測定対象物質との特異的な反応の前後で蛍光特性が変化する性質を有し、Sは蛍光団Aと蛍光団Bとを連結するスペーサーを示す）で表され、測定対象物質との特異的な反応の前後で蛍光団Aと蛍光団Bとの間の蛍光共鳴エネルギー移動効率の実質的な変化を生じる化合物を含む蛍光プローブであって、蛍光団Aが下記の式（AI）：
【化１】
2008108074.tif 000003
［式中、R1及びR2はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基を示し；R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子を示すか、又は測定対象物質を検出するための置換基を示すが、R3及びR4が同時に水素原子であることはなく、R3及びR4が互いに結合して測定対象物質を検出するための環構造を形成してもよく；Y1及びY2はそれぞれ独立に-O-、-S-、-Se-、-CH=CH-、-C(R5)(R6)-、又は-N(R7)-（式中、R5、R6、及びR7はそれぞれ独立に水素原子、又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）を示し；n及びn'はそれぞれ独立に0、1、又は2を示し；Z1及びZ2はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいベンゾ縮合環又は置換基を有していてもよいナフト縮合環を形成するために必要な非金属原子群を示し；L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7はそれぞれ独立に置換又は無置換のメチン基を示すが、n又はn'が2である場合には重複するL1及びL2又は重複するL6とL7は同一でも異なっていてもよく、；M-は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示し、ただしR3及びR4の組み合わせは、測定対象物質の検出の前後で、式(AI)で表される蛍光団Aの極大励起波長が変化する組合せである］で表される蛍光プローブが提供される。【００１１】
上記発明の好ましい態様によれば、上記一般式(I)中の蛍光団Aが下記の式(AII)：
【化２】
2008108074.tif 000004
［式中、R11及びR12はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基を示し；R13及びR14はそれぞれ独立に水素原子を示すか、又は測定対象物質を検出するための置換基を示すが、R13及びR14が同時に水素原子であることはなく、R13及びR14が互いに結合して測定対象物質を検出するための環構造を形成してもよく；Y11及びY12はそれぞれ独立に-O-、-S-、-Se-、-CH=CH-、-C(R15) (R16)-、又は-N(R17)-（式中、R15、R16、及びR17はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す）を示し；Z11及びZ12はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいベンゾ縮合環又は置換基を有していてもよいナフト縮合環を形成するために必要な非金属原子群を表し；M'-は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示し；ただしR13及びR14の組み合わせは、測定対象物質の検出の前後で式(AII)で表される蛍光団Aの極大励起波長が変化する組合せである］で表される蛍光プローブが提供される。【００１２】
上記の発明のさらに好ましい態様によれば、測定対象物質がプロトン、金属イオン、活性酸素種、又は酵素反応基質若しくは酵素反応生成物である上記の蛍光プローブ；蛍光団Bがテトラメチルインドジカルボシアニン誘導体であり、かつ蛍光団Aが上記式（AII）で表される上記の蛍光プローブ；金属イオンがアルカリ金属イオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、又は亜鉛イオンである上記の蛍光プローブ；活性酸素種が一酸化窒素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、過酸化水素、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン、及びスーパーオキシドからなる群から選ばれる上記の蛍光プローブ；及び酵素が還元酵素、酸化酵素、及び加水分解酵素からなる群から選ばれる上記の蛍光プローブが提供される。【００１３】
また、別の好ましい態様により、pH測定に用いる上記の蛍光プローブ；pH測定に用いる上記の蛍光プローブであって、蛍光団Aが上記式(AI)（ただし、R1及びR2がそれぞれ独立にメチル基又は4-スルホブチル基であり；R3及びR4のいずれか一方が水素原子であり、もう一方が置換基を有していてもよいC1-18アルキル基であり；Y1及びY2が-C(CH3)2-であり；n及びn'がともに1であり；Z1及びZ2がともに無置換ベンゾ縮合環であり；L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7が無置換のメチン基であり；M−は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示す）で表される蛍光プローブ；及び蛍光団Aが上記式(AI)（ただしR1及びR2がそれぞれ独立にメチル基又は4-スルホブチル基であり；R3及びR4がそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は-(CH2)m-N(R21)(R22)であり、R3及びR4の少なくとも一方が-(CH2)m-N(R21)(R22)(R21及びR22はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-6アルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基を示すか、又はR21又はR22がそれぞれR3又はR4と結合して置換基を有していてもよいC1-3アルキレン基を示し、mは1又は2を示す)であり； Y1及びY2が-C(CH3)2-であり；n及びn'がともに1であり、Z1及びZ2が無置換ベンゾ縮合環であり、L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7が無置換のメチン基であり；M−は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示す）で表される蛍光プローブが提供される。【００１４】
pHの測定のための蛍光プローブとしては、下記の化合物を含む蛍光プローブが特に好ましい。
【化３】
2008108074.tif 000005
【００１５】
さらに別の観点からは、本発明により、上記一般式(I)で表される化合物を含む亜鉛イオンの測定のための蛍光プローブであって、蛍光団Aが上記式(AI)[式中、R1及びR2がそれぞれ独立にメチル基又は4-スルホブチル基であり；R3及びR4がそれぞれ独立に水素原子であるか、又は下記の式(D)：
【化４】
2008108074.tif 000006
（式中、W1、W 2、W 3、及びW 4はそれぞれ独立に水素原子、2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、又は2-メチル-6-ピリジルエチル基を示すが、W1、W 2、W 3、及びW 4からなる群から選ばれる基のうち少なくとも１つは2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基を示し；p及びｑはそれぞれ独立に0又は1を示す）で表される基であり（ただし、R3及びR4がともに水素原子であることはなく）；Y1及びY2が-C(CH3)2-であり；n及びn'がともに1であり；Z1及びZ2が無置換ベンゾ縮合環であり；L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7が無置換のメチン基であり；M−は電荷の中和に必要な個数の対イオンを示す）で表される蛍光プローブが提供される。【００１６】
別の観点からは、本発明により、上記一般式(I)で表される化合物、好ましくは上記一般式(I)で表される化合物を測定対象物質の測定のための蛍光プローブ、好ましくはpH蛍光プローブ又は亜鉛イオン蛍光プローブとして用いる方法；上記一般式(I)で表される化合物の上記蛍光プローブの製造のための使用；測定対象物質の蛍光測定方法であって、下記の工程：(a)上記一般式(I)で表される化合物と測定対象物質とを接触させる工程、及び(b)上記工程(a)の接触後に上記一般式(I)で表される化合物の蛍光強度を測定して測定対象物質との接触に起因するFRET効率の変化を検出する工程を含む方法が提供される。【００１７】
さらに別の観点からは、上記の式(I)で表される化合物を含む蛍光プローブの製造方法であって、上記式(AI)で表される試料中の測定対象物質に特異的に反応して蛍光特性が変化する蛍光団Aと、蛍光団Aとの間で蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能な供与体又は受容体となる蛍光団Bとをスペーサーで連結して上記式(I)で表される化合物を製造する工程を含む方法も本発明により提供される。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、生体組織透過性に優れた近赤外領域の励起波長／蛍光波長を使用して、試料中の測定対象物質をレシオ法によって測定できる蛍光プローブが提供される。本発明の蛍光プローブに含まれる上記一般式(I)で表される化合物は、蛍光団Aが測定対象物質に特異的に反応して極大励起波長が大きく変化する性質を有しているが、これは蛍光団Aである上記式(AI)、好ましくは（AII）のシアニン蛍光団におけるメチン鎖と結合している窒素原子の電子供与能が変化していることに起因している。すなわち、測定対象物質との特異的反応によって該窒素原子のシアニン蛍光団への電子供与能が変化する基を種々選択して、測定対象物質との反応前後で蛍光測定を行って、上記一般式(I)中の蛍光団Aと蛍光団Bとの間での蛍光共鳴エネルギー移動効率変化を検出することにより、生体内の深部組織中の種々の測定対象物質を測定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】さまざまなpH下における化合物5の吸収スペクトル及び蛍光スペクトルの変化を測定した結果を示した図である。図中、(A)は吸収スペクトル、(B)は蛍光スペクトル（励起波長640 nm）、(C)は660 nmと750 nmの蛍光強度比（励起波長640 nm）を示す。すべてのサンプルは、100 mMリン酸緩衝液とアセトニトリルの1:1混合溶媒中（但し、補助溶媒として0.1％以下のDMSOを含有する）で測定した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明により提供される上記一般式（Ｉ）で表される蛍光プローブは、測定対象物質との特異的な反応の前後で蛍光団Aと蛍光団Bとの間のFRET効率に実質的な変化を生じる蛍光プローブであって、被検対象物質との接触に起因するFRET効率の変化を検出して測定対象物質を測定するための蛍光プローブとして用いられる。測定対象物質の種類は特に限定されず、水素イオン、水酸イオン、酵素反応基質若しくは酵素反応生成物、金属イオン（例えば、ナトリウムイオンやリチウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなど）、非金属イオン（炭酸イオンなど）、活性酸素種（例えば、一酸化窒素、ヒドロキシラジカル、一重項酸素、過酸化水素、パーオキシナイトライト、次亜塩素酸イオン及びスーパーオキシドなど）などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。酵素反応に関与する酵素としては、例えば、β-ラクタマーゼ、チトクロームP450酸化酵素、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、ラクターゼ、アルカリホスファターゼなどの還元酵素、酸化酵素、加水分解酵素などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。【００２１】
本明細書において「FRET」とは、一つの化合物の分子内で二つの蛍光団が距離的に近い位置（約100Å以内）に存在する場合において、その二つの蛍光団のうちの片方（供与体）の蛍光スペクトルと、もう片方（受容体）の励起スペクトルが重なりを持つ場合、供与体の励起波長の光を照射すると、本来観察されるはずの供与体の蛍光が減衰して、代わりに受容体の蛍光が観察される現象をいう。【００２２】
本明細書において、ある官能基について「置換基を有していてもよい」と言う場合には、置換基の種類、個数、及び置換位置は特に限定されないが、例えば、アルキル基、アルコキシ基、アリール基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、若しくはヨウ素原子のいずれでもよい）、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基若しくはそのエステル、又はスルホ基若しくはそのエステルなどを置換基として有していてもよい。本明細書においてアリール基という場合には、単環性若しくは多環性のアリール基、又は単環性若しくは多環性のヘテロアリール基のいずれであってもよいが、好ましくは単環性若しくは多環性のアリール基、より好ましくはフェニル基を用いることができる。【００２３】
式(AI)において、R1及びR2はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基を示す。アルキル基としては、直鎖状、分岐鎖状、環状、又はそれらの組合せからなるアルキル基を用いることができ、例えば、C1-15アルキル基が好ましく、C1-10アルキル基がより好ましく、C1-6アルキル基がさらに好ましい。例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、ｎ-ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、n-ペンチル基、イソペンチル基、2-メチルブチル基、1-メチルブチル基、ネオペンチル基、1,2-ジメチルプロピル基、1-エチルプロピル基、ｎ-ヘキシル基、4-メチルペンチル基、3-メチルペンチル基、2-メチルペンチル基、1-メチルペンチル基、3,3-ジメチルブチル基、2,2-ジメチルブチル基、1,1-ジメチルブチル基、1,2-ジメチルブチル基、1,3-ジメチルブチル基、2,3-ジメチルブチル基、2-エチルブチル基、1-エチルブチル基、1-エチル-1-メチルプロピル基、n-ヘプチル基、n-オクチル基、n-ノニル基、n-デシル基、n-ウンデシル基、n-ドデシル基、n-トリデシル基、n-テトラデシル基、n-ペンタデシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロプロピルメチル基、1-シクロプロピルエチル基、2-シクロプロピルエチル基、3-シクロプロピルプロピル基、4-シクロプロピルブチル基、5-シクロプロピルペンチル基、6-シクロプロピルヘキシル基、シクロブチルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロブチルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルプロピル基、シクロヘキシルブチル基、シクロヘプチルメチル基、シクロオクチルメチル基、又は6-シクロオクチルヘキシル基等を挙げることができるが、これらに限定されることはない。R1及びR2が示すアルキル基としては直鎖状のアルキル基が好ましい。【００２４】
R1及びR2が示すC1-18アルキル基上に存在可能な置換基としては、例えば、アルコキシ基、アリール基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、若しくはヨウ素原子のいずれでもよい）、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基若しくはそのエステル、スルホ基若しくはそのエステル、又はホスホ基若しくはそのエステルなどを挙げることができる。これらのうち、カルボキシ基又はスルホ基などが好ましく、本発明の化合物の水溶性を著しく増す効果が得られる。例えば、置換基を有するアルキル基の具体的な例としては、ヒドロキシメチル基、1-ヒドロキシエチル基、2-ヒロドキシルエチル基、2-ヒドロキシプロピル基、3-ヒドロキシプロピル基、4-ヒドロキシブチル基、カルボキシメチル基、スルホメチル基、2-スルホエチル基、3-スルホプロピル基、又は4-スルホブチル基等が挙げられる。R1及びR2の両者が無置換のC1-18アルキル基であってもよく、あるいはそれらのいずれか片方のC1-18アルキル基が置換基を有していてもよい。R1及びR2は直鎖状のC1-6アルキル基又はスルホン酸基で置換されているC1-6アルキル基であることが好ましく、特にメチル基であることが好ましい。式(AII)におけるR11及びR12についても上記の式(AI)におけるR1及びR2と同様である。【００２５】
式(AI)において、R3及びR4はそれぞれ独立に水素原子を示すか、または上記に説明した測定対象物質の検出のための置換基を示すが、R3及びR4が同時に水素原子であることはなく、R3及びR4が互いに結合して測定対象物質を検出するための環構造を形成してもよい。本明細書において「測定対象物質の検出」という用語には、測定対象物質との化学的反応による官能基変換のほか、イオンなどを捕捉することによる検出も包含される。本明細書において「捕捉」という用語は、R3及び／又はR4が実質的に化学変化を起こさずに金属イオンなどをキレート化などにより捕捉する場合のほか、測定対象物質との化学反応によりR3及び／又はR4の化学構造が変化する場合を含めて、最も広義に解釈しなければならず、いかなる意味においても限定的に解釈してはならない。【００２６】
測定対象物質の捕捉のための置換基は種々提案されており、測定対象物質の種類に応じて当業者は適宜選択可能である。例えば、国際公開WO01/062755号、特開2004-315501号公報などを参照することができる。また、モレキュラープローブス社のカタログ（Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Tenth edition）の第19章（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、及び他の金属イオン）、第20章（pHインディケーター）、及び第21章（ナトリウムイオン、カリウムイオン、塩素イオン、及び他の無機イオン）に記載された測定対象物質の捕捉のための置換基を用いることもできる。もっとも、測定対象物質の捕捉のための置換基は上記刊行物に記載されたものに限定されることはない。酵素反応基質又は酵素反応生成物の検出のための置換基としては、例えば、糖加水分解酵素活性を測定する場合には、R3又はR4としてその酵素の基質となる糖化合物の残基を用いることができる。糖化合物が有するヒドロキシ基やアミノ基などの官能基は必要に応じて適宜の保護基で保護されていてもよい。このような保護基を有する化合物もすべて本発明の範囲に包含される。【００２７】
例えば、pHの測定のための蛍光プローブでは、R3及びR4のいずれか一方が水素原子であり、もう一方が置換基を有していてもよいC1-18アルキル基、好ましくは置換基を有していてもよいC1-6アルキル基であってもよい。アルキル基としては直鎖アルキル基が好ましく、置換基を有していてもよいC1-18アルキル基上に存在可能な置換基としては、例えば、アルコキシ基、アリール基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、若しくはヨウ素原子のいずれでもよい）、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基若しくはそのエステル、スルホ基若しくはそのエステル、又はホスホ基若しくはそのエステルなどを挙げることができるが、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基がカルボキシ置換C1-6アルキル基であることが好ましく、5-カルボキシペンチル基であることが特に好ましい。【００２８】
また、pH測定のために用いる蛍光プローブでは、R3及びR4がそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-18アルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、又は-(CH2)m-N(R21)(R22)であり、R3及びR4の少なくとも一方が-(CH2)m-N( R21)(R22)(R21及びR22はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいC1-6アルキル基又は置換基を有していてもよいアリール基を示すか、又はR21又はR22がそれぞれR3又はR4と結合してエチレン基を示し、mは1又は2を示す)であることが好ましい。R3及びR4が示す置換基を有していてもよいC1-18アルキル基としては、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基が好ましく、特にメチル基であることが好ましい。置換基を有していてもよいC1-18アルキル基上に存在可能な置換基としては、例えば、アルコキシ基、アリール基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、若しくはヨウ素原子のいずれでもよい）、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基若しくはそのエステル、又はスルホ基若しくはそのエステルなどが挙げられる。R21及びR22が示す置換基を有していてもよいC1-18アルキル基としては、置換基を有していてもよいC1-6アルキル基が好ましく、特にメチル基、エチル基、又はベンジル基が好ましい。R21又はR22がそれぞれR3又はR4と結合してC1-3アルキレン基を形成することも好ましく、さらに該アルキレン基はアルコキシ基、アリール基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、若しくはヨウ素原子のいずれでもよい）、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基若しくはそのエステル、又はスルホ基若しくはそのエステルのような置換基を有していてもよく、特にエチレン基であることが好ましい。mは2であることが好ましい。式(AII)におけるR13及びR14についても上記の式(AI)におけるR3及びR4と同様である。【００２９】
これらのうち、蛍光団AがAIで表される基であり、
(1)R3がメチル基であり、かつR4が-(CH2)m-N(R21)(R22)で表される基であって、
R21及びR22がメチル基であり、mが2である場合；
(2)R3がメチル基であり、かつR4が-(CH2)m-N(R21)(R22)で表される基であって、
R21及びR22がエチル基であり、mが2である場合；
(3)R3が-(CH2)m-N(R21)(R22)で表される基であって、mが2であり、R21がベンジル基であり、R4がR22と結合したエチレン基である場合；
(4)R3が-(CH2)m-N(R21)(R22)で表される基であって、mが2であり、R21がメチル基であり、R4がR22と結合したエチレン基である場合；及び
(5)R3が-(CH2)m-N(R21)(R22)で表される基であって、mが2であり、R21がフェニル基であり、R4がR22と結合したエチレン基である場合
が好ましい。【００３０】
さらに、例えば、亜鉛イオン測定のための蛍光プローブとしては、R3及びR4がそれぞれ独立に水素原子を示すか、上記式（D）（式中、W1、W2、W3、及びW4はそれぞれ独立に水素原子、2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、又は2-メチル-6-ピリジルエチル基を示すが、W1、W2、W3、及びW4からなる群から選ばれる基のうち少なくとも１つは2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基、及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基を示し；p及びｑはそれぞれ独立に0又は1を示す）で表される基であることが好ましい。ただし、R3及びR4がともに水素原子であることはない。この場合、ｐが0であり、ｑが1であり、かつW4が水素原子であり、W1及びW2のうちの少なくとも１つが2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基であることが好ましく、W1及びW2が共に2-ピリジルメチル基であることが特に好ましい。さらに、pが0であり、qが0であり、W1及びW2のうちの少なくとも１つが2-ピリジルメチル基、2-ピリジルエチル基、2-メチル-6-ピリジルメチル基及び2-メチル-6-ピリジルエチル基からなる群から選ばれる基であることも好ましい。【００３１】
式(AI)において、R1ないしR4はそれぞれ独立に細胞膜内に埋没可能な基であってもよい。この場合、一般式(I)で表される本発明の化合物を膜局在型の蛍光プローブとして使用して、細胞膜近傍のpH変化のみを測定できる。細胞膜内に埋没可能な基としては、直鎖または分岐C7-18アルキル基及びリン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルコリン類、ホスファチジルセリン類、ホスファチジルイノシトール類、ホスファチジルグリセロール類、カルジオリピン類、スフィンゴミエリン類、セラミドホスホリルエタノールアミン類、セラミドホスホリルグリセロール類、セラミドホスホリルグリセロールホスファート類、1,2-ジミリストイル-1,2-デオキシホスファチジルコリン類、プラスマロゲン類、又はホスファチジン酸類が挙げられるが、これらのリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されず、炭素数12〜20個程度の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を1個又は2個有するリン脂質を用いることができる）が一般式(I)のR1ないしR4の置換基を有していてもよいC1-18アルキル基の置換基を介して結合した基などが好ましい。【００３２】
Y1及びY2はそれぞれ独立に-O-、-S-、-Se-、-CH=CH-、-C(R5)(R6)-、又は-N(R7)-を示し、R5、R6、及びR7はそれぞれ独立に水素原子又は置換基を有していてもよいC1-6アルキル基を示す。Y1及びY2は-C(R5)(R6)-であることが好ましく、R5及びR6はメチル基が好ましい。式(AII)におけるY11及びY12についても上記の式(AI)におけるY1及びY2と同様である。【００３３】
式(AI)においてZ1及びZ2はそれぞれ置換基を有していてもよいベンゾ縮合環又は置換基を有していてもよいナフト縮合環を形成するために必要な非金属原子群を示し、より具体的には、例えばZ1及びZ2はそれぞれ以下のベンゾ縮合環又は以下のナフト縮合環を形成する。該ベンゾ縮合環又はナフト縮合環はさらにアルコキシ基、アリール基、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、若しくはヨウ素原子のいずれでもよい）、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基若しくはそのエステル、又はスルホ基若しくはそのエステルなどの置換基を有していてもよい。式（AII）におけるZ11及びZ12についても上記の式(AI)におけるZ1及びZ2と同様である。【００３４】
【化５】
2008108074.tif 000007
【００３５】
式(AI)においてn、n'の和が2であることが好ましく、n及びn'が共に1であることが特に好ましい。式(AI)で表される蛍光団は、吸収波長が400 nm〜1300 nm、好ましくは650 nm〜950nm、より好ましくは650 nm〜800 nmの領域で最大になることが好ましい。当業者は、本発明の上記一般式(I)で表される化合物の式(AI)で表される蛍光団において、n又はn'が増大するにつれて励起波長及び蛍光波長が増大し、同様にn又はn'が減少する場合には励起波長及び蛍光波長が減少することを理解するであろう。【００３６】
L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7は置換又は無置換のメチン基を表し、これらは同一でも異なっていてもよい。また、nが2の場合には、重複するL1及びL2は同一でも異なっていてもよく、n'が2の場合には重複するL6とL7は同一でも異なっていてもよい。L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7で表されるメチン基の置換基どうしが結合して連続する3つのメチン基を含む環を形成してもよく、この環はさらに他のメチン基を含む環と縮合環を形成していてもよい。L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7により構成される部分構造として、特に以下に示す構造が好ましい。【００３７】
【化６】
2008108074.tif 000008
【００３８】
蛍光団Bは、式(AI)で表される蛍光団Aとの間で蛍光共鳴エネルギー移動を惹起させることが可能な供与体又は受容体となる蛍光団であれば特に限定されず、任意の蛍光団を選択することができる。例えば、式(AＩ)中、n及びn'の和が2である場合には、蛍光団Aは約650 nm〜800 nmに極大励起波長を有することから、蛍光団Bとして、この励起光領域に蛍光波長を持つ蛍光団、例えば、テトラメチルインドジカルボシアニン誘導体を含むシアニン蛍光団又はローダミン誘導体などを適宜選択すればよい。この場合には、蛍光団B（蛍光団Bが供与体の場合）に励起光を照射して蛍光団A及び蛍光団Bのそれぞれに由来する蛍光を測定することにより蛍光団AへのFRET効率変化を検出することができる。【００３９】
Sで表されるスペーサーの長さは、蛍光団Aと蛍光団Bとの間でFRETが起こる範囲内で適宜選択することができる。スペーサーとしては一般式(I)において式(AI)で表される蛍光団AのR1ないしR4が示す置換基を有していてもよいアルキル基を利用してもよく、また、R1ないしR4が示す置換基を有していてもよいアルキル基の置換基を利用してアルキル鎖、ポリエチレングリコール鎖、又はポリアミノ酸などを導入してもよい。また、スペーサー中にシクロヘキサンのような構造的にリジッドな基が含まれることが好ましい。この場合には、一般式(I)で表される化合物の自由度が低下し、供与体と受容体の蛍光団が会合しにくく、無蛍光性の会合体形成を防ぐ効果が得られる場合がある。【００４０】
M-は電荷の中和に必要な個数の対イオンを表す。対イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、若しくはマグネシウムイオンなどの金属イオン、4級アンモニウム、ヨウ素イオンなどのハロゲンイオン、又はグリシンなどのアミノ酸のイオンを挙げることができる。例えば一般式(I)において式(AI)で表される蛍光団AのR1及びR2が示すC1-18アルキル基にカルボキシ基、スルホ基などが存在する場合、あるいはR3、R4、R5、R6、R7、Z1、及びZ2のうちのいずれか1個所以上にカルボキシ基、スルホ基、又はホスホ基などを含む場合は、M-として2個以上の対イオンが必要になる場合がある。また、一般式(I)において式(AI)で表される蛍光団AのR1及びR2が示す一方のC1-18アルキル基に1個のカルボキシ基又はスルホ基などが存在する場合には、R1が結合する4級窒素原子上の陽電荷とカルボキシ基又はスルホ基のアニオンとが分子内ツビッターイオンを形成するので、電荷の中和に必要な対イオンが不必要になる場合もある。【００４１】
上記一般式(I)で表される本発明の化合物は1個又は2個以上の不斉炭素を有している場合がある。従って、1個又は2個以上の不斉炭素に基づく光学的に純粋な形態の任意の光学異性体、光学異性体の任意の混合物、ラセミ体、純粋な形態のジアステレオ異性体、ジアステレオ異性体の混合物などはいずれも本発明の範囲に包含される。また、本発明の化合物は水和物や溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質も本発明の範囲に包含されることはいうまでもない。【００４２】
上記一般式(I)において蛍光団Aが式(AI)（式中、R1及びR2がメチル基及び4-スルホブチル基を示し、Y1及びY2が-C(CH3)2-を示し、n及びn'がともに1を示し、Z1、Z2が無置換ベンゾ縮合環を示し、L1、L2、L3、L4、L5、L6、及びL7が無置換のメチン基を示す）で表される蛍光団であり、蛍光団Bがテトラメチルインドジカルボシアニン誘導体あることが好ましい。pHの測定のための蛍光プローブとしては、一般式(I)で表される化合物として特に下記の化合物を好ましい化合物として挙げることができるが、この特定の化合物に限定されることはない。
【化７】
2008108074.tif 000009
【００４３】
上記一般式(I)で表される化合物は、例えば、以下のスキームに示した方法により製造することができる。また、本明細書の実施例には、上記一般式(I)に包含される代表的化合物の製造方法を具体的に示した。下記スキームと実施例の具体的説明を参照することにより、上記一般式(I)で表される化合物を容易に製造できることが当業者には理解されよう。
【化８】
2008108074.tif 000010
【００４４】
上記一般式(I)で表される化合物は、生体組織透過性に優れた600 nm〜950 nm付近の近赤外領域の励起光で強い蛍光を発する性質を有しており、式(AI)で表される蛍光団Aが、(a)L1などのメチン鎖に結合した置換基において測定対象物質と反応して電子供与能が変化し；(b)シアニン蛍光団に直接直結する窒素原子の電子供与能の変化に応じて励起スペクトルのピークに顕著な波長シフトを生じる性質を有しており；かつ(c)励起スペクトルのピークの波長シフトに伴って蛍光団Bとの間のFRET効率が実質的に変化する性質を有している。例えば、化合物5の場合、トリカルボシアニン蛍光団がpH感受性のFRET受容体、ジカルボシアニン蛍光団がFRET供与体であって、トリカルボシアニン蛍光団のメチン鎖に結合した窒素原子がプロトネーションすると電子供与能の低下に伴って励起スペクトルのピークが660 nm付近から長波長シフトする性質を有する。この性質により、ジカルボシアニン蛍光団（640 nmの励起光を当てると660 nm付近を蛍光波長ピークとする蛍光を発する）の励起波長の光を照射すると、(1)プロトネーションしていない場合には、ジカルボシアニン蛍光団からトリカルボシアニン蛍光団へのFRETが効率よく起こって、トリカルボシアニン蛍光団からの蛍光（波長750 nm付近）が強く観察され、(2)プロトネーションしている場合には、ジカルボシアニン蛍光団からトリカルボシアニン蛍光団へのFRETが効率よく起こらず、ジカルボシアニン蛍光団からの蛍光（波長660 nm付近）が強く観察される。すなわち、化合物5を被検試料中に溶解して、640 nmの光で励起して、そのときの660 nmと750 nmの蛍光強度比を測定することにより、pHをレシオ法によって検出することが可能となる。化合物5は特に生細胞や生組織中、特に深部組織中のpHを生理条件下で測定するためのpH蛍光プローブとして有用である。【００４５】
本明細書中のレシオ法についてはMason  W. T.の著書(Mason  W. T.  in Fluorescent and Luminescent  Probes for  Biological Activity,  Second Edition, Edited  by  Mason W.  T.,  Academic  Press)などに詳細に記載されており、本明細書の実施例にも本発明の化合物を用いた測定方法の具体例を示した。なお、本明細書において用いられる「測定」という用語については、定量及び定性を含めて最も広義に解釈すべきものである。また、本明細書において用いられる「検出」の用語は、例えば測定値を用いて結果を算出する概念、例えばFRET効率の変化を算出する概念も含む。【００４６】
本発明の蛍光プローブの使用方法は特に限定されず、従来公知の蛍光プローブと同様に用いることが可能である。通常は、生理食塩水や緩衝液などの水性媒体、又はエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどの水混合性の有機溶媒と水性媒体との混合物などに上記一般式(I)で表される化合物及びその塩からなる群から選ばれる物質を溶解し、細胞や組織を含む適切な緩衝液中にこの溶液を添加して、(1)適宜選択された生体組織の透過性に優れた600 nm〜950 nm付近の近赤外領域の異なる二波長により励起して、それぞれの蛍光強度を測定する二波長励起一波長蛍光測定型のレシオ測定を行うか、(2)生体組織の透過性に優れた600 nm〜950 nm付近の一波長で励起して、適宜選択された異なる二波長の蛍光強度を測定する一波長励起二波長蛍光型のレシオ測定を行えばよい。なお、本発明のpH蛍光プローブを適切な添加物と組み合わせて組成物の形態で用いてもよい。例えば、緩衝剤、溶解補助剤などの添加物と組み合わせることができる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。（以下の実施例中、化合物番号は上記スキーム中の化合物番号に対応させてある。）
例1：化合物5の合成
(A)化合物1の合成
2,3,3-トリメチル-3H-インドール（7.2 g、45 mmol）と3-ヨードプロピオン酸（13 g、63 mmol）をo-ジクロロベンゼンに溶解した。アルゴン雰囲気下、110 ℃で15時間加熱攪拌した。濾取して得られた沈殿物をジエチルエーテルおよびアセトンで洗浄し、化合物1（11 g）を得た。【００４８】
(B)化合物2の合成
マロンアルデヒドジアニリド一塩酸塩（0.68 g、2.6 mmol）およびジイソプロピルエチルアミン（0.69 g、5.3 mmol）をジクロロメタン（6 mL）に懸濁した。これに無水酢酸（0.36 g、3.5 mmol）とジクロロメタン（6 mL）の混合溶液を氷冷下攪拌しながら滴下し、さらに氷冷下で1時間攪拌した（黄色の反応液）。別に、化合物1と酢酸ナトリウム（0.85 g、10 mmol）をアセトニトリル（25 mL）と水（1 mL）の混合溶液に溶解して加熱還流し、ここへ先の黄色の反応液を滴下した。1時間加熱還流を継続した後、室温まで放冷した。沈殿物を濾取し、アセトニトリル、5%塩酸水溶液、ジエチルエーテルで洗浄し、化合物2（0.68 g）を得た。【００４９】
(C)化合物3の合成
IR-786（Sigma、0.50 g、0.86mmol）と、6-アミノ-n-カプロン酸（0.46 g、3.5 mmol）をジメチルホルムアミド（DMF、 30 mL）に溶解し、アルゴン雰囲気下80 ℃で3時間加熱した。室温まで放冷後、減圧下溶媒を留去した。残渣をNHシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物3（0.42 g）を得た。【００５０】
(D)化合物4の合成
trans-1,4-シクロヘキサンジアミン（0.19 g、1.7 mmol）をDMF（20 mL）に溶解した。ここへ化合物3（0.42 g、0.61 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（HOBT・H2O、0.19 g、1.3 mmol）、O-（ベンゾトリアゾール-1-イル）-N,N,N'-N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロりん酸塩（HBTU、0.47 g、1.2 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（85 mg、0.66 mmol）のDMF（40 mL）溶液を、室温で攪拌しながら滴下した。アルゴン雰囲気下、室温で3時間攪拌した後、減圧下溶媒を留去した。NHシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物4（0.35 g）を得た。【００５１】
(E)化合物5の合成
化合物4（0.15 g、0.21 mmol）をDMF（20 mL）に溶解した。この溶液を、化合物2（0.25 g、0.40 mmol）、HOBT・H2O（94 mg、0.61 mmol）、HBTU（0.24g、0.62 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（85 mg、0.66 mmol）のDMF(20 mL)溶液に室温で攪拌しながら滴下した。アルゴン雰囲気下、室温で3時間攪拌した後、減圧下溶媒を留去した。NHシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物5（35 mg）を得た。
1H-NMR(300MHz,  CD3OD): δ 0.98-1.94(m,  40 H),  2.03(t,  2 H, J = 8.0 Hz),  2.41-2.52 (m, 8 H),  3.32(s, 6 H),  3.40(br, 2 H),  3.63(t, 2 H, J =6.8Hz), 4.25(br,  4 H),  5.65(d, 2 H, J = 13.0 Hz),  6.15,  (d, 1 H, J = 13.3Hz),  6.33(d, 1 H, J = 13.3Hz),  6.51(t, 1 H, J = 13.3 Hz),  6.94-7.36(m, 16 H),  7.63(d, 2H, J= 13.0 Hz),  8.11(tt, 2 H, J =  13.2Hz, 13.2 Hz)
HRMS (ESI+)  Calcd for [M-H]+, 1154.7211,  Found,  1154.7243【００５２】
例2：化合物5のpH変化に伴うスペクトル変化
100 mmol/Lりん酸緩衝溶液（pH 1.2、2.1、3.3、3.9、5.0、6.0、6.8）とアセトニトリルの1：1混合溶液（補助溶媒として0.1％以下のDMSOを含有する）中で、化合物5の吸収スペクトルおよび蛍光スペクトル（励起波長640 nm）を測定した。吸収スペクトルを図1(A)に、蛍光スペクトルを図1(B)に示す。pHの上昇に応じて650 nm付近の吸光度が増加しており、吸収スペクトルが変化していることがわかる。また蛍光スペクトルもpHの上昇に応じて660 nm付近で減少し、750 nm付近で上昇していることがわかる。従って、化合物5を用いた一波長励起二波長蛍光測定によるレシオ法を用いてpH変化を正確に測定することができる。図1(C)には660 nmと750 nmの蛍光強度比を示す。660 nmと750 nmの蛍光強度はpH4から6にかけて直線的に変化するため、この範囲のpHを化合物5を用いて測定することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明により提供される蛍光プローブを用いることにより、生体組織透過性に優れた近赤外領域の励起波長／蛍光波長を使用して試料中の測定対象物質をレシオ法によって測定することができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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