(57)【要約】  本発明に係る酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤は、下記一般式（１）2008050600.tif 000055〔式中、R1が水素原子、R2がC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基を示し；または、前記R1とR2とが互いに結合して、隣接する酸素原子とともにテトラヒドロフラニル環を形成してもよく；R3、R4は、互いに独立して、水素原子、ピリジル基またはハロゲン原子を置換基に有していてもよいC6-C10アリールC1-C3アルキル基を示す。〕で表される化合物またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分として含有する。
2008050600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）
2008050600.tif 000038
〔式中、R1は水素原子、R2はC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基を示し；または、前記R1とR2とが互いに結合して、隣接する酸素原子とともにテトラヒドロフラニル環を形成していてもよく；
R3およびR4は、互いに独立して、水素原子、ピリジル基またはハロゲン原子を置換基に有していてもよいC6-C10アリールC1-C3アルキル基を示す。〕で表される化合物またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分として含有する、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤。
【請求項２】
前記R2におけるC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基が、２，４，６−トリメチルフェニル基である、請求項１に記載の治療または予防剤。
【請求項３】
前記R3およびR4のいずれか一方が水素原子であり、他方がピリジル基または２，５−ジクロロフェニルメチル基である、請求項１または２に記載の治療または予防剤。
【請求項４】
式（１）で表される化合物が下記の化合物１Ａまたは１Ｂである、請求項１に記載の治療または予防剤；
2008050600.tif 000039
2008050600.tif 000040
【請求項５】
下記一般式（２）
2008050600.tif 000041
〔式中、R5、R6は、それぞれ独立して、ハロゲン原子を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基またはC1-C6アルキル基を置換基に有していてもよいピロリル基を示す。〕で表される化合物またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分として含有する、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤。
【請求項６】
前記R5、R6において、いずれか一方がハロゲン原子を置換基に有していてもよいフェニル基であり、他方がC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいピロリル基である、請求項５に記載の治療または予防剤。
【請求項７】
式（２）で表される化合物が下記の化合物２Ａまたは２Ｂである、請求項５に記載の治療または予防剤；
2008050600.tif 000042
2008050600.tif 000043
【請求項８】
下記一般式（３）
2008050600.tif 000044
〔式中、Xは酸素原子または硫黄原子を示し；
R7は、下記式で表されるいずれかの基を示す；
2008050600.tif 000045
2008050600.tif 000046
〕で表される化合物またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分として含有する、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤。
【請求項９】
式（３）で表される化合物が下記の化合物３Ａまたは３Ｂである、請求項８に記載の治療または予防剤；
2008050600.tif 000047
2008050600.tif 000048
【請求項１０】
下記のいずれかの化合物またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分として含有する、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤；
2008050600.tif 000049
2008050600.tif 000050
2008050600.tif 000051
2008050600.tif 000052
2008050600.tif 000053
2008050600.tif 000054
【請求項１１】
前記酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患が、神経変性疾患または虚血性心疾患である、請求項１〜１０のいずれかに記載の治療または予防剤。
【請求項１２】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳血管障害後の認知症または神経脱落を伴う認知症である、請求項１１に記載の治療または予防剤。
【請求項１３】
前記虚血性心疾患が、狭心症または心筋梗塞である、請求項１１に記載の治療または予防剤。
【請求項１４】
酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防が必要な患者に、有効量の請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容し得る塩を投与する段階を含む、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防方法。
【請求項１５】
酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤を製造するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容し得る塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳血管障害後の痴呆、その他の神経脱落を伴う痴呆症等、神経の細胞群の変性が関与する一群の疾患は、神経変性疾患と総称されている。神経変性疾患は、根本的治療法の確立していないものがほとんどであり、治療法の探索が求められている。【０００３】
神経変性疾患の治療のためのアプローチとして、神経細胞の変性を抑制する因子を投与することが考えられる。神経変性を抑制する因子を投与することにより、このような疾患の治療及び予防に対して有利な作用をもたらすことが期待される。しかしながら、そのような因子で実際に有効に治療薬として用いることができるものはほとんど見つかっていないのが現状である。【０００４】
神経細胞の変性を抑制する因子としては、例えば、ある種のドパミン受容体アゴニストがそのような作用を有する可能性があることが知られている。しかしながら、ドパミン拮抗と神経細胞の変性の抑制との因果関係は不明であり、また全てのドパミン受容体アゴニストにおいてそのような作用があるというわけではなかった。【０００５】
難治性下位運動神経変性疾患の一つである脊髄性筋萎縮症（Spinal Muscular Atrophy: SMA）の重篤度修飾因子として、 ヒト染色体５ｑ１３．１領域より神経細胞アポトーシス抑制蛋白質（Neuronal Apoptosis Inhibitory Protein (ＮＡＩＰ)）遺伝子が単離され（非特許文献１）、ＮＡＩＰの全アミノ酸配列とＮＡＩＰをコードするｃＤＮＡが単離されている（特許文献１）。そして、このＮＡＩＰ産生量を増加させる物質を探索する過程において、ある種のドパミン受容体アンタゴニストが、ＮＡＩＰ産生量を増加させ、さらにこれらが実際に神経の変性を抑制しうることが見出されている（特許文献２）。また、同様のドパミン受容体アンタゴニストが、酸化ストレスによって引き起こされるアポトーシスから神経細胞および非神経細胞を保護しうること、虚血により引き起こされる神経細胞死を抑制することが知られている（非特許文献２）。【０００６】
【特許文献１】特開平１１−１１６５９９号公報
【特許文献２】特開２００４−１２３５６２号公報
【非特許文献１】Roy M. et al. Cell (1995) 80, 167-178
【非特許文献２】Okada Y. et al. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism (2005) 25, 794-806
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防に有用な医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療薬として用いうる有効な物質を見出すべく鋭意研究した結果、特定構造を有する化合物が、酸化ストレス性の細胞死を顕著に抑制する活性を有し、神経変性疾患や虚血性心疾患などの酸化ストレス性の細胞死に由来する難治性疾患の治療薬として有効であることを見出し本発明を完成するに至った。すなわち本発明は下記を含む。【０００９】
〔１〕  下記一般式（１）
2008050600.tif 000003
〔式中、R1は水素原子、R2はC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基を示し；または、前記R1とR2とが互いに結合して、隣接する酸素原子とともにテトラヒドロフラニル環を形成していてもよく；
R3およびR4は、互いに独立して、水素原子、ピリジル基またはハロゲン原子を置換基に有していてもよいC6-C10アリールC1-C3アルキル基を示す。〕で表される化合物またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分として含有する、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤。
〔２〕  前記R2におけるC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基が、２，４，６−トリメチルフェニル基である、〔１〕に記載の治療または予防剤。
〔３〕  前記R3およびR4のいずれか一方が水素原子であり、他方がピリジル基または２，５−ジクロロフェニルメチル基である、〔１〕または〔２〕に記載の治療または予防剤。
〔４〕  式（１）で表される化合物が下記の化合物１Ａまたは１Ｂである、〔１〕に記載の治療または予防剤；
2008050600.tif 000004
2008050600.tif 000005
〔５〕  下記一般式（２）
2008050600.tif 000006
〔式中、R5、R6は、それぞれ独立して、ハロゲン原子を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基またはC1-C6アルキル基を置換基に有していてもよいピロリル基を示す。〕で表される化合物またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分として含有する、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤。
〔６〕  前記R5、R6において、いずれか一方がハロゲン原子を置換基に有していてもよいフェニル基であり、他方がC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいピロリル基である、〔５〕に記載の治療または予防剤。
〔７〕  式（２）で表される化合物が下記の化合物２Ａまたは２Ｂである、〔５〕に記載の治療または予防剤；
2008050600.tif 000007
2008050600.tif 000008
〔８〕  下記一般式（３）
2008050600.tif 000009
〔式中、Xは酸素原子または硫黄原子を示し；
R7は、下記式で表されるいずれかの基を示す；
2008050600.tif 000010
2008050600.tif 000011
〕で表される化合物またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分として含有する、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤。
〔９〕  式（３）で表される化合物が下記の化合物３Ａまたは３Ｂである、〔８〕に記載の治療または予防剤；
2008050600.tif 000012
2008050600.tif 000013
〔１０〕  下記のいずれかの化合物またはその医薬的に許容し得る塩を有効成分として含有する、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤；
2008050600.tif 000014
2008050600.tif 000015
2008050600.tif 000016
2008050600.tif 000017
2008050600.tif 000018
2008050600.tif 000019
〔１１〕  前記酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患が、神経変性疾患または虚血性心疾患である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の治療または予防剤。
〔１２〕  前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳血管障害後の認知症または神経脱落を伴う認知症である、〔１１〕に記載の治療または予防剤。
〔１３〕  前記虚血性心疾患が、狭心症または心筋梗塞である、〔１１〕に記載の治療または予防剤。
〔１４〕  また、本発明は、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防が必要な患者に、有効量の〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容し得る塩を投与する段階を含む、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防方法にも関する。【００１０】
〔１５〕  さらに、本発明は、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防剤を製造するための、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の化合物またはその医薬的に許容し得る塩の使用に関する。【００１１】
〔発明の実施の形態〕
本明細書において、「C1-Cnアルキル基」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される一価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和炭素−炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素の部分集合を有する。アルキル基は直鎖状または分枝鎖状の構造を含む。「Ｃ１−Ｃｎアルキル基」とは、炭素原子数が１〜ｎを示し、「C1-C6アルキル基」とは、炭素原子数が１〜６を示す。【００１２】
具体的には例えば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、i−プロピル基、ｎ−ブチル基、sec−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、2，3−ジメチルプロピル基、ヘキシル基、２，３−ジメチルヘキシル基、１，１−ジメチルペンチル基、ヘプチル基、オクチル基などが挙げられる。【００１３】
本明細書において、「C6-Cnアリール基」とは、炭素数６〜ｎの芳香族性の炭化水素環式基を意味する。ｎは好ましくは１０である。具体的には例えば、フェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基などが挙げられる。好ましくはフェニル基である。【００１４】
本明細書において、「C6-Cnアリール基C1-Cnアルキル基」とは、前記定義「C1-Cnアルキル基」中の任意の水素原子を、前記定義「C6-Cnアリール基」で置換した基を意味する。【００１５】
本明細書において、「フェニルC1-Cnアルキル基」とは、前記定義「C1-Cnアルキル基」中の任意の水素原子を、前記定義「フェニル基」で置換した基を意味する。【００１６】
本明細書において、「ハロゲン原子」は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子を意味する。【００１７】
本明細書において、「酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾」とは、酸化ストレス性の細胞死が分子背景となっている難治性疾患であり、たとえば、神経変性疾患、虚血性心疾患、糖尿病などが挙げられる。
「分子背景」とは、「病因病態」という意味であり、病気の原因または病気がたどる経過を示す。【００１８】
本明細書において、「神経変性疾患」とは、中枢神経の中の特定の神経細胞群が徐々に死んでゆくことによって起こる神経疾患を意味する。神経変性疾患としては、たとえば、脳神経の変性疾患が挙げられる。このような脳神経変性疾患としては、たとえば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳血管障害後の痴呆、その他の神経脱落を伴う痴呆症等が含まれる。【００１９】
本明細書において、「虚血性心疾患」とは、心臓の筋肉への血液の供給が減ることや途絶えることによる虚血により引き起こされた疾患であり、狭心症、心筋梗塞などが挙げられる。【００２０】
「医薬的に許容される塩」とは、式（１）で表される化合物の生物学的有効性および性質を保持し、かつ適当な非毒性有機もしくは無機酸または有機もしくは無機塩基から形成される、通常の塩を意味する。
酸付加塩には塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸由来のもの、ならびにp-トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸由来のものが含まれる。
塩基付加塩には水酸化カリウム、ナトリウム、アンモニウム、および水酸化テトラメチルアンモニウムなどの水酸化四級アンモニウム由来のものが含まれる。【００２１】
また、本発明で用いる化合物は、大気中に放置しておくことにより、水分を吸収し、吸着水が付いたり、水和物となったりする場合があり、そのような水和物も本発明の塩に包含される。【００２２】
さらに、本発明で用いる化合物は、他のある種の溶媒を吸収し、溶媒和物となる場合があるが、そのような溶媒和物も本発明の塩に包含される。【００２３】
以下、本発明に係る酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療又は予防に用いうる化合物について説明する。
本発明で用いる第１の態様の化合物は、下記一般式（１）で表される。（本明細書においては、式（１）で表される化合物を化合物１ということがある。また、化合物１を式（１）で表される化合物ということがある。他の式、化合物においても同様である。）【００２４】
2008050600.tif 000020
【００２５】
式中、前記R1は、水素原子であり、R2がC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基を示す。あるいは、R1とR2とは、互いに結合して、隣接する酸素原子とともにテトラヒドロフラニル環を形成してもよい。【００２６】
前記R2におけるC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基のC1-C3アルキル基としては、好ましくはメチル基である。アリール基としては好ましくはフェニル基である。R2におけるC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基としては、より好ましくは２，４，６−トリメチルフェニル基である。【００２７】
R3、R4は、互いに独立して、水素原子、ピリジル基またはハロゲン原子を置換基に有していてもよいC6-C10アリールC1-C3アルキル基を示す。【００２８】
好ましくは、前記R3およびR4のいずれか一方は水素原子であり、他方がピリジル基または２，５−ジクロロフェニルメチル基である。【００２９】
このような式（１）で表される化合物は、具体的には下記の化合物１Ａまたは１Ｂが挙げられる。
2008050600.tif 000021
2008050600.tif 000022
【００３０】
本発明の第２の態様の化合物は、下記一般式（２）で表される化合物である。
2008050600.tif 000023
【００３１】
式中、R5、R6は、それぞれ独立して、ハロゲン原子を置換基に有していてもよいC6-C10アリール基またはC1-C6アルキル基を置換基に有していてもよいピロリル基を示す。【００３２】
前記R5、R6において、好ましくは、いずれか一方がハロゲン原子を置換基に有していてもよいフェニル基であり、他方がC1-C3アルキル基を置換基に有していてもよいピロリル基である。【００３３】
このような式（２）で表される化合物としては、具体的には下記の化合物２Ａまたは２Ｂが挙げられる。
2008050600.tif 000024
2008050600.tif 000025
【００３４】
本発明の第３の態様の化合物は、下記一般式（３）で表される化合物である。
2008050600.tif 000026
【００３５】
式中、Xは酸素原子または硫黄原子を示す。R7は、下記式で表されるいずれかの基を示す。（式中、「（」は結合位置を示す。）
2008050600.tif 000027
2008050600.tif 000028
【００３６】
このような式（３）で表される化合物としては、具体的には下記の化合物３Ａまたは３Ｂが挙げられる。
2008050600.tif 000029
2008050600.tif 000030
【００３７】
さらに、本発明の他の態様の化合物は、下記化合物４Ａ〜９Ａが挙げられる。
2008050600.tif 000031
2008050600.tif 000032
2008050600.tif 000033
2008050600.tif 000034
2008050600.tif 000035
2008050600.tif 000036
【００３８】
上記化合物１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａは、たとえば市販品を使用できる。また、市販品を出発原料として有機合成反応で通常用いられる方法により官能基等を適宜変換することにより、式（１）、（２）、（３）で表される化合物を得ることができる。【００３９】
本発明で用いる式（１）、（２）、（３）、（４Ａ）〜（９Ａ）で表される化合物、その医薬的に許容し得る塩には、上記で挙げた化合物の全ての立体異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー（シス及びトランス幾何異性体を含む。））、前記異性体のラセミ体、及びその他の混合物が含まれる。【００４０】
また本発明で用いる式（１）、（２）、（３）、（４Ａ）〜（９Ａ）で表される化合物およびその医薬的に許容し得る塩には、いくつかの互変異性形態、例えばエノール及びイミン形態、ケト及びエナミン形態、並びにそれらの混合物で存在する場合がある。互変異性体は、溶液中で、互変異性セットの混合物として存在する。固体の形態では、通常、一方の互変異性体が優勢である。一方の互変異性体を記載することがあるが、本発明には、本発明の化合物の全ての互変異性体が含まれる。【００４１】
これらの異性体が存在する場合は、異性体間の物理化学的な性質の差を利用して常法により単離することができる。たとえば、ラセミ化合物が存在する場合一般的な光学分割法、たとえば、酒石酸等の光学活性酸とのジアステレオマー塩に誘導し光学分割する方法等により、立体的に純粋な異性体にすることができる。ジアステレオマーの混合物が存在する場合は分別結晶化、各種クロマトグラフィー（たとえば、薄層クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等）を用いることにより分離できる。【００４２】
本発明で用いる化合物がフリー体として得られる場合、前記化合物が形成していてもよい塩またはそれらの水和物もしくは溶媒和物の状態に、常法に従って変換することができる。
また、本発明で用いる化合物が、化合物の塩、水和物、または溶媒和物として得られる場合、化合物のフリー体に常法に従って変換することができる。【００４３】
このような、本発明で用いる式（１）、（２）、（３）、（４Ａ）〜（９Ａ）で表される化合物およびその医薬的に許容し得る塩は、酸化ストレス性細胞死を抑制する活性を有する。このため式（１）、（２）、（３）、（４Ａ）〜（９Ａ）で表される化合物およびその医薬的に許容し得る塩は、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の予防または治療剤として用いられる。【００４４】
酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患としては、たとえば、神経変性疾患、虚血性心疾患、糖尿病などが挙げられる。
前記神経変性疾患としては、たとえば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症候群（ＳＭＡ）、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳血管障害後の痴呆、その他の神経脱落を伴う痴呆症等が含まれる。
前記虚血性心疾患としては、狭心症、心筋梗塞などが挙げられる。【００４５】
また、本発明は、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の予防または治療法であって、それを必要とする患者に治療上有効量の式（１）、（２）、（３）、（４Ａ）〜（９Ａ）で表される化合物またはその医薬的に許容し得る塩を投与する段階を含む酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療又は予防方法にも関する。【００４６】
さらに、本発明は、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の予防または治療剤の製造のための、式（１）、（２）、（３）、（４Ａ）〜（９Ａ）で表される化合物またはその医薬的に許容し得る塩の使用にも関する。【００４７】
本発明の医薬組成物を、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の予防または治療剤として使用する場合、その投与方法は、経口的、直腸的、非経口的（静脈内的、筋肉内的、皮下的）、槽内的、膣内的、腹腔内的、膀胱内的、局所的（点滴、散剤、軟膏、ゲルまたはクリーム）投与および吸入（口腔内または鼻スプレー）などが挙げられる。その投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、水性および非水性の経口用溶液および懸濁液、および個々の投与量に小分けするのに適応した容器に充填した非経口用溶液が挙げられる。また投与形態は、皮下移植のような調節された放出処方物を包含する種々の投与方法に適応させることもできる。【００４８】
上記の製剤は、賦形剤、滑沢剤（コーティング剤）、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤などの添加剤を用いて周知の方法で製造される。【００４９】
例えば、賦形剤としては、デンプン、バレイショデンプン、トウモロコシデンプン等のデンプン、乳糖、結晶セルロース、リン酸水素カルシウム等を挙げることができる。【００５０】
コーティング剤としては、例えば、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、セラック、タルク、カルナウバロウ、パラフィン等を挙げることができる。【００５１】
結合剤としては、例えばポリビニルピロリドン、マクロゴール及び前記賦形剤と同様の化合物を挙げることができる。【００５２】
崩壊剤としては、例えば前記賦形剤と同様の化合物及びクロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドンのような化学修飾されたデンプン・セルロース類を挙げることができる。【００５３】
安定剤としては、例えばメチルパラベン、プロピルパラベンのようなパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコールのようなアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾールのようなフェエノール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。【００５４】
矯味矯臭剤としては、例えば通常使用される、甘味料、酸味料、香料等を挙げることができる。【００５５】
また、液剤を製造するための溶媒としては、エタノール、フェノール、クロロクレゾール、精製水、蒸留水等を使用することができる。【００５６】
界面活性剤又は乳化剤としては、例えば、ポリソルベート８０、ステアリン酸ポリオキシル４０、ラウロマクロゴール等を挙げることができる。【００５７】
本発明の医薬組成物を、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の予防または治療剤として使用する場合、本発明の化合物又はその医薬的に許容される塩の使用量は、症状、年齢、体重、相対的健康状態、他の投薬の存在、投与方法等により異なる。例えば、患者（温血動物、特に人間）に対して、一般に有効な量は、有効成分として、経口剤の場合、一日につき体重１ｋｇ当たり好ましくは０．１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは体重１ｋｇ当たり１〜３００ｍｇであり、一日当たりの使用量は、普通の体重の成人患者に対しては、好ましくは１０〜８００ｍｇの範囲にある。非経口剤の場合、一日につき体重１ｋｇ当たり好ましくは０．１〜１０００ｍｇ、さらに好ましくは体重１ｋｇ当たり１０〜８００ｍｇである。これを１日１回又は数回に分けて、症状に応じて投与することが望ましい。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、細胞生存試験による、化合物１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂの細胞死抑制活性の結果を示す図である。図１中、Ａは化合物１Ａ、Ｂは化合物１Ｂ、Ｃは化合物２Ａ、Ｄは化合物２Ｂ、Ｅは化合物３Ａ、Ｆは化合物３Ｂの結果を示す。
【図２】図２は、細胞生存試験による、化合物４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａの細胞死抑制活性の結果を示す図である。図２中、Ｇは化合物４Ａ、Ｈは化合物５Ａ、Ｉは化合物６Ａ、Ｊは化合物７Ａ、Ｋは化合物８Ａ、Ｌは化合物９Ａの結果を示す。
【図３】図３は、ALS(SOD1 H46R)マウスモデルにおける化合物1Aの薬効を示す図である。対照群１および投与群１（化合物1A、1mg/kg/day経口投与）の発症日に関するKaplan-Meier曲線の結果を示す。
【図４】図４は、ALS(SOD1 H46R)マウスモデルにおける化合物1Aの薬効を示す図である。対照群１および投与群２（化合物1A、10mg/kg/day経口投与）の発症日に関するKaplan-Meier曲線の結果を示す。
【図５】図５は、ドパミン作動性のヒト神経芽細胞腫株化細胞SH-SY5Y細胞における6-hydroxydopamine (6-OHDA)によって誘起される神経細胞死に対する化合物1Aの細胞死抑制効果の検討実験の概略を示す図である。
【図６】図６は、分化誘導５日後のSH-SY5Y細胞における6-OHDA障害（細胞死）に対する化合物1Aの細胞死抑制効果を示す図である。
【実施例】
【００５９】
以下実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は実施例に何ら限定されるものではない。【００６０】
〔実施例１〕
本実施例では、酸化ストレスにより誘起される細胞死に対して、候補低分子化合物の細胞死抑制活性を細胞生存率試験により検討した。【００６１】
〔試薬、機器類〕
細胞： HeLa cells
培地： DMEM (SIGMA) (10% FBS, 4mM Glutamine, 100μg/ml streptomycin, 100U/ml penicillin Gを含む)
試薬類： Menadione (SIGMA)、Dimethyl sulfoxide (DMSO) (SIGMA)、AlamarBlue (Biosource)【００６２】
化合物：下記の１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａ
【表１】
2008050600.tif 000037
化合物１Ａ:
N-(4-(2-pyridyl)(1,3-thiazol-2-yl))-2-(2,4,6-trimethylphenoxy) acetamide (ENAMINE, T5252123)
化合物１Ｂ：
N-{5-[(2,5-dichlorophenyl)methyl](1,3-thiazol-2-yl)}oxolan-2-ylcarboxamide (ENAMINE, T0502-9890)
化合物２Ａ：
3-(2,5-dimethylpyrrolyl)-5-[(2-fluorophenyl)methylene]-2-thioxo-1,3-thiazolidin-4 -one (Princeton, OSSK_536230)
化合物２Ｂ：
3-(3-chlorophenyl)-5-[(1-methylpyrrol-2-yl)methylene]-2-thioxo-1,3-thiazolidin-4 -one (Princeton, OSSK_553398)
化合物３Ａ：
2-(5,6-dimethylthiopheno[3,2-e]pyrimidin-4-ylthio)-N-(3-fluorophenyl)acetamide (AsinexGold, BAS 03270531)
化合物３Ｂ：
methyl 3-(5,6-dimethylthiopheno[3,2-e]pyrimidin-4-yloxy)benzoate (LifeChemicals, F1174-1680) 
化合物４Ａ：
5-chloro-2-(6-piperidylpyrazin-2-yl)benzimidazole (RareChemicals, BG FA 0496)
化合物５Ａ：
Acetic acid 2-(chloro-phenyl)-6,7-dihydro-5H-[1,2,4]triazolo [5,1-b][1,3]thiazin-6-yl ester (RareChemicals, BG FA 1249)
化合物６Ａ：
(2,5-dichloro(3-thienyl))-N-(2,4-difluorophenyl)carboxamide (Maybridge, CD 09464)
化合物７Ａ： cyclopropyl-N-ethyl-N-[4-(4-fluorophenyl)(1,3-thiazol-2-yl)]carboxamide (AsinexPlatinum, ASN 04457879)
化合物８Ａ：
(E)-2-(2-fluorobenzylthio)-6,7-dihydro-[1,3,4]thiadiazolo[3,2-a][1,3]diazepin-8(5H) -one (LifeChemicals, F0597-0028) 
化合物９Ａ：
[(2,5-dichlorophenyl)sulfonyl][(8-methyl(4-hydroimidazo[1,2-a]pyridin-2-yl)) methyl] amine (LifeChemicals, F1837-0136) 【００６３】
各化合物はDMSOを用いて溶解あるいは希釈後に使用した。【００６４】
測定機器：CYTOFLUOR（登録商標）Multi-Well Plate Reader Series 4000 (PerSpective Biosystems)【００６５】
〔実験方法〕
１：細胞
本試験において用いるHeLa細胞は10% FBS, 4mM Glutamine, 100μg/ml streptomycin, 100U/ml penicillin Gを含むDMEM培地(SIGMA)中にて培養を行った。【００６６】
２：細胞生存率試験
HeLa細胞（1.0x106 cells/75cm2フラスコ(Iwaki、3123-075)）を前記培地中にて5% CO2存在下37℃で一晩培養後、最終濃度が40μMとなるように前項化合物溶液を添加し、さらに24時間培養した。尚、本実験ではDMSOのみを加えたものをコントロール実験とした。DMSO及び化合物処理したHeLa細胞を前記培地にて洗浄し、回収後に細胞数を計測し、1.5x104 cells/wellとなるように96ウェルプレート (FALCON、35-3072)に細胞懸濁液を添加した。【００６７】
６時間の培養後、最終濃度が0μM、30μM、40μM、50μM、60μMとなるように酸化ストレス剤であるMenadioneを添加し、5% CO2存在下37℃、4時間の酸化ストレス処理を行った。Menadioneの代わりに1% TritonX-100を含む前記培地で処理したものをブランクとした。前記培地にて洗浄後、10% AlamarBlueを含む前記培地に置換し、5% CO2存在下37℃培養条件下で15〜20時間以内にCYTOFLUOR（登録商標）Multi-Well Plate Reader Series 4000 (PerSpective Biosystems)を用いて励起波長（530nm）及び発光波長（580nm）を測定することで、生細胞数を判定した。【００６８】
酸化ストレス剤であるMenadioneに対する前項化合物の細胞死抑制効果の結果を図１および図２に示す。グラフの横軸はMenadione濃度、縦軸は細胞生存率を示す。各条件下での縦軸の数値は、コントロール実験におけるMenadione未処理（0μM）条件下での細胞の生存率を１００％とした時の相対値として示してある。【００６９】
〔結果〕
酸化ストレス誘導型細胞死に対する候補化合物の抑制効果の解析
酸化ストレスにより誘導される細胞死に対して、前記化合物１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａを用いて細胞死抑制効果に関する解析を行った。図１、図２で示されるように、Menadione処理したコントロール実験の生存率（黒色の棒グラフ）との比較から、化合物１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａで前処理した細胞は、Menadione処理後でも有意な生存率（白色の棒グラフ）を示した。この結果は、化合物１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、４Ａ、５Ａ、６Ａ、７Ａ、８Ａ、９Ａが酸化ストレスにより誘導される細胞死に対して抑制効果を有することを示す。【００７０】
酸化ストレスは神経変性疾患や虚血性心疾患と深く関係していることがこれまでに示唆されており（Mariani E. et al. Journal of Chromatography B (2005), 827, 65-75）、酸化ストレスにより誘導される細胞死に対して抑制効果を有する化合物は、神経変性疾患、虚血性心疾患の治療あるいは予防に有効である。【００７１】
〔実施例２〕ALS(SOD1 H46R)マウスモデルにおける化合物1Aの薬効評価
筋萎縮性側索硬化症（ALS）は上位と下位の運動神経の変性脱落を特徴とする進行性の難治性運動神経変性疾患である。ALSの発症と進行の分子背景として、酸化ストレスや活性酸素種による運動神経の変性・細胞死を裏付ける知見が数多く蓄積している。本実施例では、ALS治療薬開発を目的として、12種類の候補低分子化合物（1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 5A, 6A, 7A, 8A, 9A）のうち、酸化ストレス・フリーラジカル誘導剤menadione処理により誘起される細胞死に対して最も高い細胞死抑制活性を示した化合物1Aを用いて、当該化合物のALS(SOD1 H46R)マウスモデルでの薬効を検討した。【００７２】
〔試薬〕
化合物1A：N-(4-(2-pyridyl)(1,3-thiazol-2-yl))-2-(2,4,6-trimethylphenoxy)acetamide (ENAMINE、T5252123)
〔動物〕
筋萎縮性側索硬化症（ALS）のCu/Zn-SOD1 geneトランスジェニックマウス：ALS(SOD1 H46R)マウス（Aoki M. et al., Saishin Igaku (2002), Vol.57(7), 1622-1627）【００７３】
〔実験方法〕
化合物1Aを0.5％Carboxymethyl cellulose-Na（丸石製薬(株）、日本)溶液に懸濁し、2mg/mLの投与溶液を調製した。1mg/kg及び10mg/kg投与量はALS(SOD1 H46R)マウス個体の体重を基に算出し、各マウス個体あたりに投与する液量は5mL/kgとなるように0.5％Carboxymethyl cellulose-Na溶液にて調製した。ALS(SOD1 H46R)マウスの12週齢（生後84日）より投与を開始し、投与回数は1日1回、胃ゾンデを使用しての経口投与により、死亡時まで毎日投与を行なった。1mg/kg投与量の化合物1Aを経口投与したALS(SOD1 H46R)マウス個体群を投与群１、10mg/kg投与量の化合物1Aを経口投与したALS(SOD1 H46R)マウス個体群を投与群２、そして、0.5％Carboxymethyl cellulose-Na溶液のみを経口投与したALS(SOD1 H46R)マウス個体群を対照群１とした。各投与群の神経症状の発症の評価はバランスビームテスト(Tariq M. et al., Brain Res. Bull. (2005), 67, 161-168）（円筒状バーを使用、バーの長は45cm、直径は0.9cm、床面からバーまでの高さは13cm)により行い、マウスをバー上で歩かせた時にマウスの後肢が激しくすべりだした時点を神経症状の発症と定義した。解析にはKaplan-Meier法(SPSS 15.0J software)を用い、log-rank testによりP<0.05の場合は統計的な有意差があるとした。【００７４】
〔結果〕
ALS(SOD1 H46R)マウスを用いて化合物1Aのin vivoでの薬効を検証した。0.5％Carboxymethyl cellulose-Na溶液のみを経口投与した対照群１(n=5)の発症日はおよそ127.8±2.2日であった。一方、化合物1Aを経口投与した投与群1(n=5)及び投与群２(n=5)の発症日は、それぞれ131.0±5.7日及び134.8±4.9日であった。対照群１と投与群１の発症日に関してのKaplan-Meier曲線の結果を図３に、対照群１と投与群２の発症日に関してのKaplan-Meier曲線の結果を図４に示した。これらの結果は、対照群１と比較して化合物1Aを投与した投与群1においては４日程度、投与群２においては７日程度の神経症状の発症遅延が認められたことを示している。対照群１と投与群１の間には統計的な有意差が認められ（P<0.05）、対照群１と投与群２の間にも統計的な有意差が認められた（P<0.05）。つまり、これらの結果は化合物1Aが筋萎縮性側索硬化症（ALS）に対する治療薬となりえることを示している。【００７５】
〔実施例３〕ドパミン作動性のヒト神経芽細胞腫株化細胞SH-SY5Y細胞における6-hydroxydopamine (6-OHDA)によって誘起される神経細胞死に対する化合物1Aの細胞死抑制効果の検討
パーキンソン病(PD)は、中脳黒質緻密層のドパミン産生細胞の選択的変性・脱落に伴い神経終末部の線条体でドパミン不足を来たし、運動障害が緩徐に進行する神経変性疾患である。PDの病因として、老化、フリーラジカルによる酸化ストレス、一酸化窒素(NO)、興奮性アミノ酸のグルタミン酸、内因性・外因性神経毒などによって、黒質ドパミン神経細胞死が起きると考えられている。In vitro及びin vivoのPD実験モデル作成に多用される神経毒6-hydroxydopamine (6-OHDA)は、ドパミン作動性神経細胞での代謝中間産物として反応性の高いpara-キノンと過酸化水素を産生し、細胞機能障害を引き起こし、細胞が死に至る(Bove J. et al. NeuroRx (2005) 2, 484-494)。これで見られる細胞死はPDで認められるドパミン神経細胞死のモデルとして広く使われている。そこで本実施例では、PD治療薬を開発することを目的として、ドパミン作動性のヒト神経芽細胞腫株化細胞SH-SY5Yを用いて6-OHDA障害に対する化合物1Aの細胞死抑制活性を細胞生存率試験により検討した。【００７６】
〔試薬〕
化合物1A：N-(4-(2-pyridyl)(1,3-thiazol-2-yl))-2-(2,4,6-trimethylphenoxy)acetamide (ENAMINE、T5252123)、化合物はDMSOを用いて溶解あるいは希釈後に使用した。【００７７】
〔実験方法〕
(1) 細胞
本試験に用いたドパミン作動性ヒト神経芽細胞腫株化細胞SH-SY5Y (American Type Culture CollectionよりCRL2266株として入手)は、10% FBS、4mM glutamine、100μg/ml streptomycin、100U/ml penicillin Gを含むDMEM培地(Sigma)中で5% CO2存在下37℃で培養した。
(2) 細胞生存率試験
SH-SY5Y細胞を96 wellマイクロプレート (BD Falcon、PRIMARIA、Catalog# 353872)に1.0x104 cells/wellの細胞密度で播種し、24時間培養後、10μM all-trans-retinoic acid (Wako)を含む前記培地中で5日間培養することで分化を誘導した。分化誘導したSH-SY5Y細胞に最終濃度が0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μMとなるように化合物1Aを添加し、さらに24時間培養した。尚、本実施例では化合物1Aの代わりにdimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma)のみを加えたものをコントロール実験とした。最終濃度が0μM、60μM、80μM、120μM、160μMとなるように6-OHDA (Sigma、H4381)を添加し、5% CO2存在下37℃、4時間の処理を行った。6-OHDAの代わりに0.1% TritonX-100を含む前記培地で処理したものをブランク（6-OHDA無処理群）とした。処理後、10% AlamarBlue (Biosource)を含む前記培地に置換し、5% CO2存在下37℃で14時間培養後、CYTOFLUOR(登録商標) Multi-Well Plate Reader Series 4000 (PerSpective Biosystems)を用いて励起波長（530nm）及び発光波長（580nm）を測定することで、生細胞数を判定した。図５に本実施例の実験方法の概略を示す。また、6-OHDAに対する化合物1Aの細胞死抑制効果の結果を図６に示す。グラフの横軸は6-OHDA濃度(μM)、縦軸は細胞生存率(%)を示す。縦軸の数値は6-OHDA未処理（0μM）条件下での細胞の生存率を100%とした時の相対値として示してある。【００７８】
〔結果〕
6-OHDAにより誘導される細胞死に対して、化合物1Aを用いて細胞死抑制効果に関する解析を行った。図６で示したように6-OHDA処理したコントロール実験の生存率（黒色の棒グラフ）との比較から、化合物1Aで前処理した細胞は、6-OHDA処理後でも優位な生存率を示し、その細胞死抑制効果は化合物1A濃度依存的であった。この結果は、化合物1Aが6-OHDAにより誘導されるドパミン作動性神経細胞の細胞死に対して抑制効果を有することを示す。つまり、これらの結果は化合物1Aがパーキンソン病に対する治療薬となりえることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明によれば、酸化ストレス性細胞死を分子背景とする難治性疾患の治療または予防に有用な医薬組成物が提供される。
【図１】
2008050600.tif 000056
【図２】
2008050600.tif 000057
【図３】
2008050600.tif 000058
【図４】
2008050600.tif 000059
【図５】
2008050600.tif 000060
【図６】
2008050600.tif 000061
【国際調査報告】
2008050600.tif 000062
2008050600.tif 000063
2008050600.tif 000064
2008050600.tif 000065
2008050600.tif 000066
2008050600.tif 000067
2008050600.tif 000068
2008050600.tif 000069
2008050600.tif 000070
2008050600.tif 000071
2008050600.tif 000072