(57)【要約】  ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下に反応させることを特徴とするヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法におけるヘモグロビンの影響抑制方法、ならびに、胆汁酸誘導体を含有することを特徴とするヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定用試薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下に反応させることを特徴とするヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法。
【請求項２】
ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、更に、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の存在下に反応させる請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫測定法が、サンドイッチ法または競合法である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体との反応が、（１）該測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１の抗体および該測定対象成分に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体との反応、（２）該測定対象成分と、競合物質に標識が結合した標識化競合物質ならびに該測定対象成分および該競合物質に結合する抗体との反応、または、（３）該測定対象成分と、競合物質ならびに該測定対象成分および該競合物質に結合し、かつ標識が結合した標識化抗体との反応である請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体が、両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳと略記する）または３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳＯと略記する）である請求項５記載の方法。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド（以下、ＢＩＧＣＨＡＰと略記する）またはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド（以下、ｄｅｏｘｙ-ＢＩＧＣＨＡＰと略記する）である請求項６記載の方法。
【請求項９】
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである請求項２〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
試料が、全血である請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
測定対象成分が、ＭｘＡ蛋白質である請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
胆汁酸誘導体および、以下の（１）〜（３）からなる群より選ばれる要素を含有することを特徴とするヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定用試薬。
（１）該測定対象成分に結合する第１の抗体、および、該測定対象成分に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体；
（２）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、該測定対象成分および該競合物質に結合する抗体；または、
（３）競合物質、ならびに、該測定対象成分および該競合物質に結合し、かつ、標識が結合した標識化抗体。
【請求項１３】
更に、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含有する請求項１２記載の試薬。
【請求項１４】
胆汁酸誘導体が、両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である請求項１２または１３に記載の試薬。
【請求項１５】
胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である請求項１２または１３に記載の試薬。
【請求項１６】
両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、ＣＨＡＰＳまたはＣＨＡＰＳＯである請求項１４記載の試薬。
【請求項１７】
非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、ＢＩＧＣＨＡＰまたはｄｅｏｘｙ-ＢＩＧＣＨＡＰである請求項１５記載の試薬。
【請求項１８】
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである請求項１３〜１７のいずれかに記載の試薬。
【請求項１９】
ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下に反応させることを特徴とする、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法におけるヘモグロビンの影響抑制方法。
【請求項２０】
試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体が、両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である請求項１９記載の抑制方法。
【請求項２１】
試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である請求項１９記載の抑制方法。
【請求項２２】
両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、ＣＨＡＰＳまたはＣＨＡＰＳＯである請求項２０記載の抑制方法。
【請求項２３】
非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、ＢＩＧＣＨＡＰまたはｄｅｏｘｙ-ＢＩＧＣＨＡＰである請求項２１記載の抑制方法。
【請求項２４】
ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、更に、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の存在下に反応させる請求項１９〜２３のいずれかに記載の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法、免疫測定用試薬、および、免疫測定法におけるヘモグロビンの影響抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中の測定対象成分を免疫測定法により測定する場合、赤血球や白血球等の血球細胞の外に存在する測定対象成分については、全血から血球を除去した血清または血漿が試料として用いられる。しかし、血球を除去するためには遠心分離機等の専用の装置が必要であり、手間もかかるため、直接全血試料を測定する方法が提案されている（特許文献１参照）。全血を試料とする場合、溶血により試料に混入するヘモグロビン等の血球成分や血球の膜成分が、光学的な検出系に影響したり、免疫反応を阻害したり、測定対象物質を吸着することにより、測定に影響がでる問題がある。このような問題を回避するため、溶血をさせずに測定する全血を試料とする免疫測定方法が報告されている（特許文献２、３、４および５参照）。【０００３】
細胞内蛋白質等の血球成分を測定する場合には、血球を溶解する必要があるため、上記の溶血をさせずに測定する方法を用いることができない。この場合には、フローサイトメトリーにより、対象の血球を分離してから、分離した細胞を溶解させて目的の血球成分を測定する方法がとられてきたが、フローサイトメトリーのための専用の装置が必要であり、手間がかかる。【０００４】
一方、細胞内蛋白質の簡便な測定法の例として、界面活性剤で全血中の血球を溶解させたものを測定試料としたＭｘＡ蛋白質の免疫測定法が報告されている（非特許文献１、２）。
【特許文献１】特開平１０−４８２１４号公報
【特許文献２】特開平６−２６５５５４号公報
【特許文献３】国際公開第９６／０４５５８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０２／７３２０３号パンフレット
【特許文献５】特開２００４−４５３９５号公報
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・インターフェロン・リサーチ（Journal of Interferon Research），（米国），１９９２年，第１２巻，第２号，ｐ．６７−７４
【非特許文献２】ペディアトリック・リサーチ（Pediatric Research），（米国）、１９９７年，第４１巻，第５号，ｐ．６４７−６５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、ヘモグロビンの影響が抑制されたヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法および免疫測定用試薬、ならびに、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法におけるヘモグロビンの影響抑制方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、試料中の測定対象成分の免疫測定法において、該測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体との反応を、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下に行うことにより、正確に該測定対象成分を測定できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の［１］〜［２４］に関する。
［１］  ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下に反応させることを特徴とするヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法。
［２］  ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、更に、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の存在下に存在させる［１］記載の方法。
［３］  免疫測定法が、サンドイッチ法または競合法である［１］または［２］に記載の方法。
［４］  測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体との反応が、（１）該測定対象成分と、該測定対象成分に結合する第１の抗体および該測定対象成分に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体との反応、（２）該測定対象成分と、競合物質に標識が結合した標識化競合物質ならびに該測定対象成分および該競合物質に結合する抗体との反応、または、（３）該測定対象成分と、競合物質ならびに該測定対象成分および該競合物質に結合し、かつ標識が結合した標識化抗体との反応である［１］または［２］に記載の方法。
［５］  試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体が、両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である請求項［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［７］  両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳと略記する）または３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート（以下、ＣＨＡＰＳＯと略記する）である［５］記載の方法。
［８］  非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド（以下、ＢＩＧＣＨＡＰと略記する）またはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド（以下、ｄｅｏｘｙ-ＢＩＧＣＨＡＰと略記する）である［６］記載の方法。
［９］  ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである［２］〜［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］  試料が、全血である［１］〜［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］  測定対象成分が、ＭｘＡ蛋白質である１］〜［１０］のいずれかに記載の方法。
［１２］  胆汁酸誘導体および、以下の（１）〜（３）からなる群より選ばれる要素を含有することを特徴とするヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定用試薬。
（１）該測定対象成分に結合する第１の抗体、および、該測定対象成分に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体；
（２）競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、該測定対象成分および該競合物質に結合する抗体；または、
（３）競合物質、ならびに、該測定対象成分および該競合物質に結合し、かつ、標識が結合した標識化抗体。
［１３］  更に、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含有する［１２］記載の試薬。
［１４］  胆汁酸誘導体が、両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である［１２］または［１３］に記載の試薬。
［１５］  胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である［１２］または［１３］に記載の試薬。
［１６］  両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、ＣＨＡＰＳまたはＣＨＡＰＳＯである［１４］記載の試薬。
［１７］  非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、ＢＩＧＣＨＡＰまたはｄｅｏｘｙ-ＢＩＧＣＨＡＰである［１５］記載の試薬。
［１８］  ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルである［１３］〜［１７］のいずれかに記載の試薬。
［１９］  ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下に反応させることを特徴とする、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法におけるヘモグロビンの影響抑制方法。
［２０］  試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体が、両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である［１９］記載の抑制方法。
［２１］  試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体が、非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体である［１９］記載の抑制方法。
［２２］  両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、ＣＨＡＰＳまたはＣＨＡＰＳＯである［２０］記載の抑制方法。
［２３］  非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が、ＢＩＧＣＨＡＰまたはｄｅｏｘｙ-ＢＩＧＣＨＡＰである［２１］記載の抑制方法。
［２４］  ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体とを、更に、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の存在下に反応させる［１９］〜［２３］のいずれかに記載の抑制方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の正確な測定を可能とする免疫測定法および免疫測定用試薬、ならびに、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法におけるヘモグロビンの影響抑制方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（１）ヘモグロビンを含有する試料
本発明の免疫測定方法において使用されるヘモグロビンを含有する試料としては、例えば、全血、全血から調製した赤血球を含む血球画分、溶血が疑われる血漿または血清、赤血球、任意の試料にヘモグロビンを添加した試料等、ヘモグロビンを含有する試料またはヘモグロビンの含有が疑われる試料があげられる。全血としては、被検者より採取した血液そのものでもよいが、採取した血液を処理したものでもよく、処理した血液が好ましい。当該処理としては、例えば抗凝固処理、溶血処理等があげられ、これらの処理を組み合わせてもよい。【０００９】
測定対象成分が血球の細胞内成分である場合は、全血として、溶血処理した血液が好ましく、抗凝固処理と溶血処理の両処理を行った血液が特に好ましい。抗凝固処理としては、例えば採取した血液にＥＤＴＡ、ヘパリン等を添加する処理等があげられる。溶血処理としては、例えば界面活性剤またはサポニン類溶液の添加、低張液との混合、凍結融解、超音波処理等があげられる。
（２）測定対象成分
本発明における測定対象成分は、ヘモグロビンを含有する可能性の有る試料中の成分で有れば特に制限は無いが、例えば、核酸、蛋白質、脂質、ビタミン、多糖類等が挙げられる。核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、サイクリックＡＭＰ等が挙げられる。また、蛋白質としては酵素、ホルモン、各種ペプチド等が挙げられる。【００１０】
本発明において好適な測定対象成分は、細胞内に含まれる物質、インターフェロン等の各種サイトカインによって細胞内に誘発される蛋白質が挙げられる。
具体的な測定対象成分としては、Ｉ型インターフェロンによって細胞質内に誘導されるＭｘＡ蛋白質（Mol. Cell. Biol., 9, 5062-5072, 1989; J. Virol. 64, 1171-1181, 1990）等があげられる。
（３）胆汁酸誘導体
本発明における胆汁酸誘導体は、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体である。試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体としては、本発明の免疫測定法およびヘモグロビンの影響抑制方法を可能とする胆汁酸誘導体であれば特に制限はないが、両性界面活性剤機能または非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体が好ましい。【００１１】
両性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体としては、例えば３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホネート｛３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、以下、ＣＨＡＰＳと略記する｝、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホネート｛３−［（３−Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、以下、ＣＨＡＰＳＯと略記する｝等が挙げられる。【００１２】
非イオン性界面活性剤機能を有する胆汁酸誘導体としては、例えばＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コールアミド［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｃｈｏｌａｍｉｄｅ、以下ＢＩＧＣＨＡＰと略記する］、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコールアミド［Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ（３−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｍｉｄｅ、以下、ｄｅｏｘｙ-ＢＩＧＣＨＡＰと略記する］等が挙げられる。【００１３】
胆汁酸誘導体は、測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体との反応におけるヘモグロビンの影響を抑制する作用を示し、特にＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＢＩＧＣＨＡＰおよびｄｅｏｘｙ-ＢＩＧＣＨＡＰが好適に使用される。
胆汁酸誘導体の濃度としては、臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）の１倍〜５０倍の範囲の濃度で用いるとよく、特にｃｍｃ濃度の１倍〜１０倍が好ましい。本発明においては、胆汁酸誘導体を単独（１種類）で用いることもできるが、２種以上組み合わせて用いることもできる。
（４）ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤
ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤は、本発明の免疫測定法において、測定感度を向上させる作用があり、免疫反応に共存させるのが好ましい。【００１４】
本発明におけるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル等があげられ、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが好ましい。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル等があげられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルの具体例（市販品）としては、例えばノニデットＰ−４０（ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル）等があげられる。【００１５】
本発明においては、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を単独（１種類）で用いることもできるが、２種以上組み合わせて用いることもできる。本発明の免疫測定法においては、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の濃度は０．０１〜２．０％が好ましく、０．０５〜１．８％がより好ましく、０．１〜１．４％が特に好ましい。
（５）抗体および標識化抗体
本発明の測定方法において使用される抗体としては、測定対象成分に特異的に結合する抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明に用いる抗体としては、抗体断片を包含する。具体的には、抗体をパパイン処理により得られるＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）２、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体断片が挙げられる。抗体断片としては、Ｆ（ａｂ’）２が特に好ましい。【００１６】
本発明において使用する抗体は、測定対象成分またはその一部分を抗原として用いて通常の方法により取得することができるが、市販品としても入手可能である。
測定対象成分がＭｘＡ蛋白質である場合、ＭｘＡ蛋白質に特異的に結合する抗体としては、例えば、国際公開公報ＷＯ９６／０５２３０に記載された、ハイブリドーマ細胞株ＫＭ１１２２、ＫＭ１１２３、ＫＭ１１２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７２９）、ＫＭ１１２５、ＫＭ１１２６、ＫＭ１１２７、ＫＭ１１２８、ＫＭ１１２９、ＫＭ１１３０、ＫＭ１１３１、ＫＭ１１３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７３０）、ＫＭ１１３３、ＫＭ１１３４、ＫＭ１１３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７３１）がそれぞれ産生する抗ヒトＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１２２、ＫＭ１１２３、ＫＭ１１２４、ＫＭ１１２５、ＫＭ１１２６、ＫＭ１１２７、ＫＭ１１２８、ＫＭ１１２９、ＫＭ１１３０、ＫＭ１１３１、ＫＭ１１３２、ＫＭ１１３３、ＫＭ１１３４、ＫＭ１１３５等があげられる。【００１７】
本発明における標識化抗体は、本発明の測定対象成分の免疫測定に使用され得るものであり、本発明に用いられる抗体と後述の標識物質とを用いて、後述の方法により作製されるものである。
（６）競合物質および標識化競合物質
本発明において「競合物質」とは、本発明の免疫測定法において用いる「測定対象成分に結合する抗体」に結合できる物質であって、かつその結合が、該測定対象成分と競合的であるような物質を意味し、測定対象成分そのものも含まれる。「競合物質」は、試料中の測定対象成分を競合法により測定する際に使用されるものである。したがって、競合法において用いる測定対象成分に結合する抗体は、測定対象成分、競合物質および標識化競合物質に結合する抗体であり、該測定対象成分と結合して免疫複合体を生成するとともに、競合物質とも結合して免疫複合体を生成する。【００１８】
競合物質としては、測定対象成分に結合する抗体が認識するエピトープの構造と同じ構造を有している物質が好ましく、さらに測定対象成分に結合する抗体に対する結合の強さが、該抗体に対する該測定対象成分の結合の強さと同程度であるものが好ましい。測定対象成分そのものが競合物質として好ましい。
本発明における標識化競合物質は、本発明の測定対象成分の免疫測定に使用され得るものであり、上記の競合物質と後述の標識物質とを用いて、後述の方法により作製されるものである。
（７）免疫測定法
本発明の免疫測定法は、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と該測定対象成分に結合する抗体との反応を、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下に行うことを特徴とするヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法である。【００１９】
ヘモグロビンを含有する試料と、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体との混合比は１：１〜１：１０００が好ましく、ヘモグロビンを含有する試料が全血である場合には、１：２〜１：４９の混合比が良く、１：４〜１：９が特に好ましい。試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体を、ヘモグロビンを含有する試料に添加する場合、添加の際の温度としては、約２℃〜４０℃が好ましく、添加後２４時間以内に測定することが好ましい。【００２０】
免疫測定法としては、抗原抗体反応に基づく方法であれば特に制限がなく、操作方法、標識物質の有無、標識物質の種類、担体、Ｂ／Ｆ分離の有無は限定されない。
抗原抗体反応の反応としては、競合反応法および非競合反応法のいずれでもよい。
検出方法としては、抗原抗体反応の結果を凝集等により直接検出する非標識法、標識物質を使用して検出する標識法のいずれでもよいが、測定感度の点で特に標識法が好ましい。【００２１】
本発明の免疫測定法としては、Ｂ／Ｆ分離を行う必要のあるヘテロジニアス法、およびＢ／Ｆ分離を行う必要のないホモジニアス法のいずれも使用できる。
反応相としては、全反応が液相で行われる液相法と免疫反応の相手を固相化して反応を行う固相法のいずれの方法を用いてもよい。
具体的な測定方法としては、「バイオ検査薬開発マニュアル」シーエムシー、石川栄治ら共編「酵素免疫測定法」第３版  医学書院、文献  日本臨床  ｖｏｌ．５３  Ｎｏ．９等に記載されている方法が挙げられる。【００２２】
本発明の測定法の具体例として、以下の測定方法１〜４の方法が挙げられるが、本発明は、これらの方法に限定されるものではない。測定方法１は非競合反応法であるサンドイッチ法、測定方法２および３は試料中の測定対象成分と競合物質を競合させる競合法、測定方法４は、免疫複合体と免疫複合体に含まれない標識化抗体または標識化競合物質との分離（Ｂ／Ｆ分離）を行わないホモジニアス法である。
測定方法１
以下の（ａ）〜（ｅ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分と、該測定対象成分に特異的に結合する第１の抗体とを、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下、または、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体とポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の存在下に反応させて、第１の抗体と該測定対象成分とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下、または、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体とポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の存在下に、（ａ）工程で生成した免疫複合体と、該測定対象成分に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、第１の抗体、該測定対象成分および標識化抗体からなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｃ）（ｂ）工程で生成した免疫複合体と該免疫複合体に含まれない標識化抗体とを分離する工程；
（ｄ）（ｂ）工程で生成した免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｅ）（ｄ）工程で測定した該免疫複合体中の標識の量から、該試料中の該測定対象成分の濃度を決定する工程。【００２３】
第１の抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。工程（ａ）と工程（ｂ）は順次行っても、同時に行ってもよい。第１の抗体と結合した該測定対象成分に第２の抗体が結合することができれば、第１の抗体が認識する該測定対象成分の部位と、第２の抗体が認識する該測定対象成分の部位とは同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。また、後述のように、（ｅ）工程において、既知濃度の測定対象成分を用いて予め作成した該測定対象成分濃度と測定値（標識由来の情報量）との関係を表す検量線を用いることにより、該試料中の測定対象成分の濃度を決定することができる。
測定方法２
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分、標識化競合物質を、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下、または、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体とポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の存在下に、該測定対象成分および該標識化競合物質に結合する抗体と反応させて、該抗体と該標識化競合物質とからなる免疫複合体、および、該抗体と該測定対象成分とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）該抗体と該標識化競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の標識化競合物質から分離する工程；
（ｃ）（ａ）工程で生成した該抗体と該標識化競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｄ）（ｃ）工程で測定した該免疫複合体中の標識の量から、該試料中の該測定対象成分の濃度を決定する工程。【００２４】
該抗体は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。また、後述のように、（ｄ）工程において、既知濃度の測定対象成分を用いて予め作成した該測定対象成分濃度と測定値（標識由来の情報量）との関係を表す検量線を用いることにより、該試料中の測定対象成分の濃度を決定することができる。
測定方法３
以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を順次行う測定方法。
（ａ）ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分、競合物質を、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下、または、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体とポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の存在下に、該測定対象成分および該競合物質に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体と反応させて、該標識化抗体と該競合物質とからなる免疫複合体、および、該標識化抗体と該測定対象成分とからなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）該標識化抗体と該競合物質とからなる免疫複合体を、未反応の標識化抗体、および、該標識化抗体と該測定対象成分とからなる免疫複合体から分離する工程；
（ｃ）該標識化抗体と該競合物質とからなる免疫複合体中の標識の量を測定する工程；および、
（ｄ）（ｃ）工程で測定した該免疫複合体中の標識の量から、該試料中の該測定対象成分の濃度を決定する工程。【００２５】
該競合物質は、不溶性担体に固定化されていることが好ましい。なお、該競合物質が該測定対象成分と同じ構造である場合には、（ａ）の工程において不溶性担体に固定化された競合物質を用いる。また、後述のように、（ｄ）工程において、既知濃度の測定対象成分を用いて予め作成した該測定対象成分濃度と測定値（標識由来の情報量）との関係を表す検量線を用いることにより、該試料中の測定対象成分の濃度を決定することができる。【００２６】
測定方法４
以下の（ａ）〜（ｃ）の工程を有する測定方法。
（ａ）ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分を、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体の存在下、または、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体とポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤の存在下に、該測定対象成分に特異的に結合する第１の抗体を標識物質１で標識した標識化抗体１、および、該測定対象成分に特異的に結合する第２の抗体を標識物質１とは異なる標識物質２で標識した標識化抗体２と反応させ、標識化抗体１、測定対象成分および標識化抗体２からなる免疫複合体を生成させる工程；
（ｂ）（ａ）工程で生成した該免疫複合体における標識物質１と標識物質２の相互作用の変化量を測定する工程；および
（ｃ）（ｂ）工程で測定した相互作用の変化量から試料中の該測定対象成分の量を決定する工程。【００２７】
第２の抗体は、第１の抗体と結合した測定対象成分に結合することができれば、第１の抗体が認識する該測定対象成分の部位と、第２の抗体が認識する該測定対象成分の部位は同じであっても異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。また、後述のように、（ｃ）工程において、既知濃度の測定対象成分を用いて予め作成した該測定対象成分濃度と測定値（標識由来の情報量）との関係を表す検量線を用いることにより、該試料中の測定対象成分の濃度を決定することができる。【００２８】
上記の通り、測定方法１〜３は、Ｂ／Ｆ分離を伴うヘテロジニアス法である。測定方法１の工程（ｃ）、測定方法２および３の工程（ｂ）がＢ／Ｆ分離の工程である。このＢ／Ｆ分離は、抗体または競合物質が不溶性担体に固定化されている場合には、反応溶液を除去した後、不溶性担体を洗浄することにより容易に行うことができる。すなわち、抗原抗体反応後に反応溶液を除去し、不溶性担体を洗浄液により洗浄することにより、不溶性担体上に生成した免疫複合体と未反応の標識体（標識化抗体、標識化競合物質）とを分離することができる。【００２９】
洗浄液としては、リン酸緩衝化生理食塩水（０．１５  ｍｏｌ／Ｌ  塩化ナトリウムを含有する１０  ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液、ｐＨ  ７．２、以下、ＰＢＳと記す）、界面活性剤を含有するＰＢＳ、後述の水性媒体等をあげることができる。当該界面活性剤としては、例えばツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０等の非イオン性界面活性剤等があげられる。
また、測定方法１において、第１の抗体が不溶性担体に固定化されている場合には、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、未反応の反応物を除去するため、不溶性担体を洗浄する工程を挿入することもできる。この場合、工程（ｂ）は、（ａ）工程で生成した免疫複合体と、該測定対象成分に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体とを反応させ、第１の抗体、該測定対象成分および標識化抗体からなる免疫複合体を生成させる工程となる。【００３０】
測定方法２において、測定対象成分に結合する抗体が不溶性担体に固定化されていない場合は、（ｃ）工程で標識化競合物質に結合せず、該抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体を該免疫複合体に作用し、該免疫複合体を不溶性担体に結合させた後、反応溶液を除去し、さらに不溶性担体を洗浄することにより、該免疫複合体と、該免疫複合体に含まれない標識化競合物質とを分離することができる。また、標識化競合物質に結合せず、該抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体の存在下で、（ａ）工程の免疫複合体を生成させる反応を行い、免疫複合体の生成と免疫複合体の不溶性担体への固定化を同時に行った後、反応溶液を除去し、さらに不溶性担体を洗浄することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質を分離することができる。標識化競合物質に結合せず、該抗体に結合する結合性物質としては、例えば、該抗体の定常領域と結合する抗体等があげられる。また測定対象成分が蛋白質でない場合は、（ｃ）工程で、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール等の蛋白質沈殿剤を添加して、免疫複合体のみを沈殿させた後、遠心分離することにより、免疫複合体と、免疫複合体に含まれない標識化競合物質を分離することができる。【００３１】
測定方法１の方法において、第１の抗体が不溶性担体に固定化されていない場合は、Ｂ／Ｆ分離の工程において、標識化抗体に結合せず、第１の抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体を添加するか、あるいは免疫複合体を生成させる工程を、標識化抗体に結合せず、第１の抗体に結合する結合性物質を固定化した不溶性担体の存在下で行い、それぞれ反応溶液を除去した後、不溶性担体を洗浄することにより、免疫複合体中の標識化抗体と免疫複合体に含まれない標識化抗体とを分離することができる。標識化抗体に結合せず、第１の抗体に結合する結合性物質としては、例えば、第１の抗体の作製に用いた動物種と標識化抗体に用いられる抗体（第２の抗体）の作製に用いた動物種とが異なる場合には、第１の抗体の作製に用いた動物種の免疫グロブリンに対する抗体等があげられ、第１の抗体が定常領域を有する抗体で、標識化抗体がＦａｂやＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等の定常領域を有しない抗体断片である場合であれば、第１の抗体の定常領域に特異的に結合する抗体等があげられる。
（８）不溶性担体
抗体または競合物質を固定化するための不溶性担体としては、抗体または競合物質を安定に保持できるものであればいかなるものも包含される。不溶性担体の好ましい素材としてはポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ゼラチン、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、酢酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート等の高分子素材、ガラス、セラミックス、磁性粒子や金属等があげられる。不溶性担体の好ましい形状としてはチューブ、ビーズ、プレート、ラテックス等の微粒子、スティック等があげられる。例えば、１枚に９６ウェルを有するポリスチレン製のマイクロタイタープレート等が好ましい。
（９）抗体または競合物質の不溶性担体への固定化
抗体または競合物質の不溶性担体への固定化方法としては、物理学的結合を利用した方法と化学的結合を利用した方法またはこれらの併用等、公知の方法が用いられる。物理学的結合としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等があげられる。化学的結合としては、例えば共有結合、配位結合等があげられる。例えば、ポリスチレン製免疫測定用マイクロタイタープレートを不溶性担体として使用する場合には、プレート内のウェルに抗体または競合物質の溶液を添加して、１時間から１日間、４℃〜３０℃でインキュベートすることにより、物理吸着させ固定化する方法をあげることができる。【００３２】
抗体または競合物質は、直接、不溶性担体に固定化してもよいし、間接的に不溶性担体に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばアビジンを固定化した不溶性担体に、ビオチン化した抗体または競合物質を添加し、ビオチンとアビジンとの特異的結合を介して、抗体または競合物質を不溶性担体に固定化する方法があげられる。また、不溶性担体に、抗体に特異的に結合する抗体または競合物質に特異的に結合する抗体を固定化し、この抗体を介して抗体または競合物質を不溶性担体に固定化してもよい。あるいは、抗体または競合物質は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に固定化してもよい。【００３３】
リンカーとしては、例えば、抗体または測定対象成分の官能基と不溶性担体の側鎖の官能基の両者と共有結合できる分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、抗体または測定対象成分が有する官能基と反応することができる第１の反応活性基と、不溶性担体の側鎖の官能基と反応することができる第２の反応活性基を同時に持つ分子であり、第１の反応活性基と第２の反応活性基が異なる基であることが好ましい。抗体または競合物質の官能基および不溶性担体がその表面に保持している官能基としては例えば、カルボキシ基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、Ｎ−ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等があげられる。リンカーにおける活性な反応性基としては、例えば、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基があげられる。
（１０）抗体または測定対象成分の標識
抗体または測定対象成分を標識する標識物質としては酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド、金属コロイド粒子、着色ラテックス粒子等があげられる。【００３４】
酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等があげられる。
蛍光物質としては、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレッセイン  イソチオシアナート）、ＲＩＴＣ（ローダミンＢ−イソチオシアナート）等があげられる。その他の蛍光物質として、例えばｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ（Science, 281, 2016-2018, 1998）、フィコエリスリン等のフィコビリ蛋白質、ＧＦＰ（Green fluorescent Protein）、ＲＦＰ（Red fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue fluorescent Protein）等の蛍光を発する蛋白質があげられる。【００３５】
発光物質としては、例えば、アクリジニウムおよびその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等があげられる。またルテニウム錯体化合物としては、電子供与体と共に電気化学的に発光する、Clin. Chem. 37, 9, 1534-1539, 1991に示されたものが好ましい。
放射性同位元素としては、例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等があげられる。【００３６】
タグ配列を含むポリペプチドとしては、ＦＬＡＧペプチド（ＦＬＡＧタグ、Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys）、ポリヒスチジン（Ｈｉｓタグ、His His His His His His）、ｍｙｃエピトープペプチド（ｍｙｃタグ、Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu）、ヘマグルチニンエピトープペプチド（ＨＡタグ、Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala）等があげられる。【００３７】
抗体または測定対象成分の標識化は、抗体または測定対象成分と標識物質それぞれが有する官能基の間で、リンカーを介してまたは介さず共有結合を生じる反応によって行うことができる。官能基としては、カルボキシル基やアミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、ヒドロキシサクシニルエステル基、マレイミド基、イソチオシアナート基等があげられる。この官能基同士の間で縮合反応を行わせることが可能である。【００３８】
リンカーを介さない結合方法としては例えば、ＥＤＣ等のカルボジイミド化合物を用いる方法等があげられる。この場合、ＮＨＳまたはその誘導体等の活性エステルを使用することも可能である。イソチオシアナート基とアミノ基の間の縮合反応は、他の試薬を必要とせず、中性〜弱アルカリ性の条件で混合するだけで進行するため、好ましい。
リンカーとしては、例えば、標識物質と抗体とをそれぞれの官能基を介して結合させうる分子であればどのようなものでもよい。好ましい態様は、例えば、抗体のアミノ酸残基と反応することができる第１の官能基と、標識物質の側鎖の官能基と反応することができる第２の官能基とを同一分子内に有する分子であり、第１の官能基と第２の官能基とが異なる基であることが好ましい。リンカーの官能基としては、例えば前述の官能基があげられる。【００３９】
放射性同位元素を化学的に結合させる方法としては、例えば文献（Antibody Immunoconj. Radiopharm., 3, 60, 1990）記載の方法があげられる。
標識物質が酵素、アビジン、蛍光を発する蛋白質、フィコビリ蛋白質、タグ配列を含むポリペプチド等のポリペプチドである場合には、公知の遺伝子組換え技術（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）にしたがって、標識物質と抗体の融合蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを作製し、発現ベクターを適当な宿主に導入して、宿主を培養することにより製造することができる。融合蛋白質をコードするＤＮＡは、抗体および標識物質をそれぞれコードするＤＮＡをＰＣＲ等でクローニングし、それぞれのＤＮＡをリガーゼ反応で連結することにより得ることができる。【００４０】
前述の（６）の測定方法４に記載のホモジニアス法に用いられる標識物質１と２としては、１つの測定対象成分に結合して近接することにより相互作用を起こす標識物質があげられる。このような標識物質として、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ:fluorescence resonance energy transfer）を起こす蛍光物質があげられる。ＦＲＥＴとは、第１の蛍光物質が励起光を受光することによって生じた蛍光エネルギーが、近接する第２の蛍光物質の蛍光エネルギーとして利用される現象であり、２種類の蛍光物質が１〜１０ｎｍまで近接することにより起こる。ＦＲＥＴを起こす蛍光物質の組み合わせとしては、一方の蛍光波長のスペクトルと、他方の励起波長のスペクトルとに重なりがある組合せがあげられる。蛍光物質としては、蛍光蛋白質、低分子有機蛍光色素、無機化合物等があげられる。ＦＲＥＴを起こす蛍光蛋白質の組み合わせとしては、例えばＣＦＰ［緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の黄色変異体］とＹＦＰ［緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のシアン色変異体］との組み合わせ等があげられる。低分子有機蛍光色素の組み合わせとしては、例えばＣｙ３とＣｙ５の組み合わせがあげられる。無機化合物としては例えばｑｕａｎｔｕｍ  ｄｏｔ（Science, 281,2016-2018, 1998）があげられる。【００４１】
また、ホモジニアス法での該標識物質の組み合わせとして、バイオルミネッセンス共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ：bioluminescence resonance energy transfer）を起こす、化学発光を生じる酵素と蛍光物質との組み合わせもあげることができる。ＢＲＥＴを起こす酵素と蛍光物質との組み合わせとしては、酵素が基質を分解して生じる発光波長のスペクトルと、蛍光物質の励起波長のスペクトルとに重なりがある組合せがあげられる。例えば酵素としてウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）、基質として例えばディープブルーＣ［Deep Blue C、パッカードバイオサイエンス（Packard BioScience）社製］、蛍光物質としてＧＦＰを用いる組合せ等があげられる。この場合、Ｒｌｕｃによる基質の分解によって３９５ｎｍの波長の光が生じ、ＲｌｕｃにＧＦＰが近接することにより、ＧＦＰがこの光のエネルギーを受けて発する５１０ｎｍの波長の蛍光を検出することができる。【００４２】
また、ホモジニアス法での該標識物質の組み合わせとして、標識物質１と標識物質２が近接して、ある配向性をもって結合したときに酵素活性を生じる物質の組み合わせがあげられる。例えば、標識物質の組み合わせとしては、標識物質１としてβ−ガラクトシダーゼのΔαサブユニット、標識物質２としてβ−ガラクトシダーゼのΔωサブユニットを用いる組合せ、標識物質１としてＲｌｕｃのＮ末端側ドメイン、標識物質２としてＲｌｕｃのＣ末端側ドメインを用いる組合せ等があげられる。
（１１）抗原抗体反応
抗原抗体反応は水性媒体中で行われることが好ましい。反応温度としては、例えば０〜５０℃があげられ、４℃〜４０℃が好ましい。反応時間としては、５分間〜２０時間が好ましい。
（１２）標識量の測定
免疫複合体の標識の量の測定方法は、標識物質に応じて適切なものを選ぶことができる。すなわち、標識物質が発色物質すなわちある波長の光を吸収する物質の場合、或いは凝集等により生じる濁度（吸光度）変化量の場合、分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が蛍光物質の場合には、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が発光物質の場合には、発光光度計や発光マルチウェルプレートリーダー等を用いることができる。標識物質が放射性同位元素である場合、放射性同位元素の量は、放射活性をシンチレーションカウンター、γ−ウェルカウンター等により測定することができる。【００４３】
標識が酵素である場合、標識量は、酵素活性を測定することにより定量することができる。例えば酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識量を測定することができる。
酵素がペルオキシダーゼである場合には、例えば吸光度法、蛍光法等によりペルオキシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および酸化発色型色原体の組み合わせとを反応させ、反応液の吸光度を分光光度計やマルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等があげられる。【００４４】
ロイコ型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、テトラメチルベンジジン、ｏ−フェニレンジアミン、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン  ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等があげられる。【００４５】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素およびペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類（トリンダー試薬）との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等があげられる。カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等があげられる。アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等があげられる。フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等があげられる。【００４６】
蛍光法によりペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および蛍光物質の組み合わせとを反応させ、蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で生成した蛍光の強度を測定する方法等があげられる。当該蛍光物質としては、例えば４−ヒドロキシフェニル酢酸、３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等があげられる。【００４７】
発光法によるペルオキシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばペルオキシダーゼとその基質である過酸化水素および発光物質の組み合わせとを反応させ、発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で生成した発光の強度を測定する方法等があげられる。当該発光物質としては、例えばルミノール化合物、ルシゲニン化合物等があげられる。
酵素がアルカリホスファターゼである場合には、例えば発光法等によりアルカリホスファターゼ活性を測定することができる。発光法によりアルカリホスファターゼ活性を測定する方法としては、例えばアルカリホスファターゼとその基質とを反応させ、生成した発光の発光強度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。アルカリホスファターゼの基質としては、例えば３−（２'−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３'−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン・二ナトリウム塩（ＡＭＰＰＤ）、２−クロロ−５−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］カン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＤＰ−ＳｔａｒＴＭ）、３−｛４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２'−（５'−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル｝フェニルホスフェート・二ナトリウム塩（ＣＳＰＤＴＭ）、［１０−メチル−９（１０Ｈ）−アクリジニルイデン］フェノキシメチルリン酸・二ナトリウム塩（ＬｕｍｉｇｅｎＴＭ  ＡＰＳ−５）等があげられる。【００４８】
酵素がβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである場合には、例えば吸光度法（比色法）、発光法または蛍光法等によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定することができる。吸光度法（比色法）によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばｏ−ニトロフェル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等があげられる。発光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えばガラクトン−プラス［Galacton-Plus、アプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）社製］またはその類似化合物等があげられる。蛍光法によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼとその基質とを反応させ、反応液の蛍光度を蛍光光度計や蛍光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。β−Ｄ−ガラクトシダーゼの基質としては、例えば４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等があげられる。【００４９】
酵素がルシフェラーゼである場合には、例えば発光法等によりルシフェラーゼ活性を測定することができる。発光法によりルシフェラーゼ活性を測定する方法としては、例えばルシフェラーゼとその基質とを反応させ、反応液の発光度を発光強度計や発光マルチウェルプレートリーダー等で測定する方法等があげられる。ルシフェラーゼの基質としては、例えばルシフェリン、セレンテラジン等があげられる。【００５０】
標識物質が蛍光物質、発光物質、放射性同位元素および酵素以外の場合は、当該標識物質に特異的に結合する物質を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素、酵素等で標識した標識体と、免疫複合体中の標識化抗体または標識化競合物質を構成している当該標識物質とを結合させ、当該標識物質に特異的に結合する物質を標識している蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行うことができる。標識物質に特異的に結合する物質としては、標識物質を特異的に結合する抗体、また標識物質がビオチンの場合は、アビジンやストレプトアビジン等があげられる。また、標識物質に特異的に結合する物質（標識物質に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジン等）を用いて、免疫複合体中の標識物質と結合させた後、標識物質に特異的に結合する物質に結合する抗体、例えば、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体またはアビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体を蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素で標識したものを結合させ、これらの抗体を標識している蛍光物質、発光物質、放射性同位元素または酵素を用いて、上記の記載と同様にして検出を行うこともできる。【００５１】
これらの検出に用いる抗体、アビジンまたはストレプトアビジンや標識物質に特異的に結合する抗体、抗体の定常領域に特異的に結合する抗体、アビジンまたはストレプトアビジンに特異的に結合する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、あるいはＦａｂ、ペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）２、ペプシン処理−還元処理により得られるＦａｂ’等のＦｃ部分を除去した抗体フラグメントでもよい。
（１３）測定対象成分の定量
測定対象成分の定量においては、標準物質、すなわち既知の濃度の該測定対象成分の溶液を用いて該測定対象成分の濃度と測定値（標識由来の情報量）との関係を表す検量線を作成する必要がある。検量線を作成した後、試料を用いて測定を行い、得られた測定値と予め作成された検量線とから、該試料中の該測定対象成分の濃度を決定することができる。
（１４）水性媒体およびその他の共存物
本発明の免疫測定法において使用される水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等があげられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に限定されないが、ｐＨ１〜１１の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等があげられる。【００５２】
グッド緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝剤、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）緩衝剤、２−［Ｎ−（２−アセトアミド）アミノ］エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）緩衝剤、２−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］エタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝剤、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝剤、２−｛Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸（ＴＥＳ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−スルホエチル）ピペラジン（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤、３−［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）緩衝剤、２−ヒドロキシ−３−｛［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）緩衝剤、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−３−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）ピペラジン（ＨＥＰＰＳＯ）緩衝剤、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−Ｎ’−（３−スルホプロピル）ピペラジン（ＥＰＰＳ）緩衝剤、トリシン［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン］緩衝剤、ビシン［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン］緩衝剤、３−［Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝剤、２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝剤、３−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝剤等があげられる。【００５３】
緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましく、０．０１〜０．１ｍｏｌ／Ｌが特に好ましい。
本発明の免疫測定法においては、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を共存させることができる。【００５４】
金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等があげられる。
塩類としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム等があげられる。
糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等があげられる。
防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質（ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等）、バイオエース、プロクリン300、プロキセル（Proxel）ＧＸＬ等があげられる。【００５５】
蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カゼイン、ブロックエース（大日本製薬社製）等があげられる。
蛋白質安定化剤としては、例えばペルオキシダーゼ安定化緩衝液［Peroxidase Stabilizing Buffer、ダコサイトメーション（DakoCytomation）社製］等があげられる。
（１５）免疫測定用試薬
本発明の免疫測定用試薬は、本発明の免疫測定法に使用され得るものであり、上記（３）に記載した胆汁酸誘導体、要すれば、さらにポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含有する。具体的には、本発明の免疫測定用試薬としては、例えば（３）に記載した胆汁酸誘導体、要すれば、さらにポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤を含有すると共に、以下の(i)〜(iii)からなる群より選ばれる要素を含有することを特徴とする試薬が挙げられる。
(i)該測定対象成分に結合する第１の抗体、および、該測定対象成分に結合する第２の抗体に標識が結合した標識化抗体；
(ii)競合物質に標識が結合した標識化競合物質、ならびに、該測定対象成分および該競合物質に結合する抗体；または、
(iii)競合物質、ならびに、該測定対象成分および該競合物質に結合し、かつ、標識が結合した標識化抗体。【００５６】
本発明の免疫測定用試薬の形状は、本発明の免疫測定法を可能とする形状であれば特に制限はない。試薬の形状としては、例えば液状や凍結乾燥状態等の形状が挙げられる。凍結乾燥状態の試薬を使用する場合には、測定前に前述の水性媒体等で溶解して測定に供する。
本発明の免疫測定用試薬において使用される胆汁酸誘導体、測定対象成分に結合する抗体、競合物質、測定対象成分に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体、標識化競合物質としては、例えば、それぞれ、前述の胆汁酸誘導体、測定対象成分に結合する抗体、競合物質、測定対象成分に結合する抗体に標識が結合した標識化抗体、標識化競合物質をあげることができる。また、本発明の免疫測定用試薬は、必要に応じて、前述の水性媒体、金属イオン、塩類、糖類、界面活性剤、防腐剤、蛋白質、蛋白質安定化剤等を含有することができる。【００５７】
また、本発明の免疫測定用試薬は、キットの形態で保存、流通されてもよい。キットとしては、２試薬系、３試薬系等の形態が挙げられるが、キットを構成する各試薬中の構成要素は、当業者が適宜選択することができる。例えば、胆汁酸誘導体を水性媒体に溶解して調製した溶液を試料希釈液としてキット中の１つの構成試薬とすることができる。
（１６）試料中のヘモグロビンの影響抑制方法
本発明は、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法における、ヘモグロビンの影響を抑制する方法を提供する。ヘモグロビンの影響は、試料中の測定対象成分を免疫測定法により測定する際、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体を存在させることにより抑制される。試料中の測定対象成分の測定において、試料由来の胆汁酸誘導体とは別異の胆汁酸誘導体を存在させることにより、試料に含まれるヘモグロビンの影響が抑制されるため、測定対象成分の正確な測定が可能となる。【００５８】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例１】
【００５９】
［１］抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体の調製
プリスタン処理した８週令ヌード雌マウス（Balb／c）に、モノクローナル抗体ＫＭ１１２４を生産するハイブリドーマ株ＫＭ１１２４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７２９）およびモノクローナル抗体ＫＭ１１３５を生産するハイブリドーマ株ＫＭ１１３５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７３１）をそれぞれ５〜２０×１０６細胞／匹ずつ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマ株が腹水癌化し、腹水のたまったマウスから腹水を採取した。採取した腹水を３０００ｒｐｍで５分間、遠心分離して固形分を除去し、上清を回収した。この上清から、カプリル酸沈殿法（Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）によりモノクローナル抗体を精製し、それぞれモノクローナル抗体ＫＭ１１２４およびモノクローナル抗体ＫＭ１１３５を取得した。【００６０】
なお、ＫＭ１１２４は、ヒトＭｘＡ蛋白質のアミノ末端から２２０〜２９７残基中に存在するエピトープ、ＫＭ１１３５はヒトＭｘＡ蛋白質のアミノ末端から１０〜２２０残基中に存在するエピトープとそれぞれ結合するマウスモノクローナル抗体である。
［２］リコンビナントＭｘＡ蛋白質の調製
ヒトＭｘＡ蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ベクターｐＥＴ−１４ｂ［ノバジェン（Novagen）、ＥＭＤバイオサイエンシズ（EMD Biosciences）社製］のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ間に挿入して作製したヒトＭｘＡ蛋白質発現ベクターｐＥＴ１４ｂ−ＭｘＡ（Nucleic Acids Res, 32, 643-652, 2004）でＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株を形質転換した。この形質転換体は、Ｎ末端にＨｉｓタグが付加したＭｘＡ蛋白質を発現する。【００６１】
得られた形質転換体を、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍＬに植菌し、６００ｎｍの吸光度（ＯＤ６００）が０．５になるまで３７℃で振とう培養した。この培養液をアンピシリンを含むＬＢ培地２５０ｍＬに植菌し、６００ｎｍでの吸光度が０．３〜０．５になるまで３７℃で振とう培養した。ここに、イソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を終濃度０．４ｍｍｏｌ／Ｌになるように添加し、さらに３７℃で２時間振とう培養して培養を終了した。培養液を４℃で３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離して菌体を回収した。菌体はＭｘＡ蛋白質の調製まで−８０℃で保存した。【００６２】
ＭｘＡ蛋白質は菌体内に不溶体（inclusion body）の状態で存在していたので、菌体を氷上で融解させ、氷冷した結合緩衝液（５ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）２０ｍＬを添加し、懸濁させた。菌体懸濁液に３０秒ずつ５回の超音波処理をして菌体を破砕した後、４℃で４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行った。上清を除き、沈殿に氷冷した結合緩衝液２０ｍＬを添加して懸濁させ、再び同様に超音波処理と遠心分離を行った。上清を除き、沈殿に６ｍｏｌ／Ｌ尿素を含む結合緩衝液２０ｍＬを添加し、懸濁させた。同様に超音波処理を行った後、氷上で３０分間静置して不溶体を溶解させ、４℃で１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離を行った。上清を回収して０．４５ｎｍミリポアフィルターでろ過した。【００６３】
得られた溶液にＮｉ−ＮＴＡ  Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄレジン（ノバジェン、ＥＭＤバイオサイエンシズ社製）０．５ｍＬを添加し、４℃で２時間回転させながら混和させ、Ｈｉｓタグを介してレジンにＭｘＡ蛋白質を結合させた。４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、レジンを回収した。レジンに氷冷した６ｍｏｌ／Ｌ尿素を含む結合緩衝液１０ｍＬを添加した後、４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、レジンを回収した。この洗浄操作を再度繰り返した後、さらにレジンに氷冷した洗浄緩衝液（６ｍｏｌ／Ｌ尿素、６０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）１０ｍＬを添加し、４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、レジンを回収した。【００６４】
レジンに氷冷した溶出緩衝液（６ｍｏｌ／Ｌ尿素、１ｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９）１０ｍＬを添加し、４℃で２時間回転させながら混和させ、レジンからＭｘＡ蛋白質を溶出させ、次いで４℃で３０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清をＭｘＡ蛋白質溶液として回収した。
［３］抗ＭｘＡ蛋白質抗体固相化プレートの調製
［１］で調製した抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１３５を５μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、９６ウェルマイクロタイタープレート［ナルジェンヌンクインターナショナル（Nalge Nunc International）社製］に１００μＬ／ウェルの量で分注した。３日間放置後、上清を吸引除去し、２５％ブロックエース（大日本製薬社製）、ＰＢＳ３００μＬを分注し室温で一晩静置しブロッキングした。ブロッキング液を除去した後、ＰＢＳで洗浄した。真空乾燥機で３日間乾燥したものを、抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体固相化プレートとして使用した。
［４］ペルオキシダーゼ標識抗ＭｘＡ蛋白質抗体の調製
［１］で調製した抗ＭｘＡ蛋白質モノクローナル抗体ＫＭ１１２４を以下のようにしてマレイミド法でペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略す）と結合させ、ＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白質抗体を作製した。【００６５】
まず、抗ＭｘＡ蛋白質抗体ＫＭ１１２４  ２ｍｇを含む溶液の溶媒を０．１ｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）に置換し、０．０８６ｍｇの２−イミノチオラン塩酸塩［ピアース（Pierce）社製］を添加し、攪拌後、３０℃で３０分間反応させた。０．１ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックス（Sephadex）Ｇ２５（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラム（直径１．５ｃｍ×３０ｃｍ）を用いて、反応溶液中の未反応の２−イミノチオランを除去し、スルフヒドリル化したＫＭ１１２４を回収した。【００６６】
一方、抗ＭｘＡ蛋白質抗体ＫＭ１１２４に対しモル比で５倍量にあたるＰＯＤ（東洋紡績社製、ペルオキシダーゼＩ−Ｃ）２．５ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２５０μＬに溶解させた。この溶液を３０℃で５分間加温した後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ナカライテスク社製）に溶解させた０．７２ｍｇのＮ−（６−マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（ＥＭＣＳ、同仁化学研究所社製）を加えて攪拌し、３０℃で３０分間反応させた。０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ２５カラム（直径１．５ｃｍ×３０ｃｍ）を用いて、反応後の溶液のゲルろ過を行い、未反応のＥＭＣＳを除去し、マレイミド化したＰＯＤを回収した。【００６７】
上記で得られたスルフヒドリル化した抗ＭｘＡ蛋白質抗体ＫＭ１１２４の溶液とマレイミド化したＰＯＤの溶液を混合し、３０℃で１時間反応させた。得られた標識化抗体は、ＰＯＤ標識希釈液（液状組成）緩衝液｛５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｂｉｓ-Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、０．１％ＢＳＡ［インタージェン（InterGen）社製］｝にて８００倍に希釈し使用した。
［５］試料希釈液の調製
以下の組成からなる試料希釈液をそれぞれ調製した。【００６８】
ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）          ０．１ｍｏｌ／Ｌ
界面活性剤                        （第１表に記載の種類と濃度）
ＮａＣｌ                          １．５ｍｏｌ／Ｌ
ＢＳＡ                            ０．１％
アジ化ナトリウム                  ０．１％
［６］サンドイッチＥＬＩＳＡによるＭｘＡ蛋白質測定系の構築
前記［２］で調製したＭｘＡ蛋白質溶液を前記［５］で調製した試料希釈液で希釈し、ＭｘＡ蛋白質の０（緩衝液のみ）、３．２、６．３、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍＬの各濃度の溶液を調製し、測定試料とした。【００６９】
前記［３］で作製した抗ＭｘＡ蛋白質抗体固定化プレートに１００μＬの測定試料を添加し、室温で１時間インキュベートし、抗体に測定試料中のＭｘＡ蛋白質を結合させた。測定試料を除去した後、洗浄液［０．０５％ツイーン２０（関東化学社製）を含むＰＢＳ］を４００μＬ添加して除去する洗浄操作を５回行った。次いで、［４］で作製したＰＯＤ標識抗ＭｘＡ蛋白質抗体溶液を１００μＬ添加して室温で３０分間反応させた。標識化抗体を除去し、洗浄液を４００μＬ添加して除去する洗浄操作を５回行った。暗所で、０．０５％テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を含むＰＯＤの発色基質ＴＭＢｌｕｅ［セロロジカル（Serological）社製］を１００μＬ添加し、室温で１０分間反応させた。０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬ添加して室温で１０分間インキュベーションして反応を停止させた。波長４５０ｎｍの吸光度をプレートリーダーで測定した。その結果、測定試料中のＭｘＡ蛋白質の濃度の上昇にしたがって、吸光度の上昇が見られ、ＭｘＡ蛋白質の測定ができることが示された。【００７０】
なお、実際に血液中のＭｘＡ蛋白質を測定する場合には、このようにして得られた標準曲線を用いて血液中のＭｘＡ蛋白質を換算することによって行う。
［７］血液を用いたＭｘＡ蛋白質の添加回収試験
ウィルス感染が認められＭｘＡ陽性を示す患者２例と、健常者３例からＥＤＴＡ・２Ｎａ採血管を用いて採取した血液を用いた。【００７１】
この血液を[５]の試料希釈液で１０倍希釈した試料を、[６]記載の方法で各試料中のＭｘＡ蛋白質濃度を測定し、ＭｘＡ蛋白質無添加試料中のＭｘＡ蛋白質濃度（以下、Ａと略記する）とした。
次にこの試料溶液９容に対し、前記［２］で調製した５００ｎｇ／ｍＬのＭｘＡ蛋白質溶液を１容添加した試料を、[６]記載の方法で各試料中のＭｘＡ蛋白質濃度を測定し、ＭｘＡ蛋白質添加試料中のＭｘＡ蛋白質濃度（以下、Ｂと略記する）として、次式によりＭｘＡ蛋白質回収率（％）を計算した。【００７２】
【数１】
2008053973.tif 000002
【００７３】
ＭｘＡ蛋白質回収率（％）は、ヘモグロビンによる影響が完全に抑制されたときに理論的に１００％となり、ヘモグロビンの影響が出るに従い、低い値となる。
比較例１
実施例１の[５]の組成より界面活性剤を除いたものを試料希釈液として用いる以外は実施例１と同様の方法により、添加回収試験を行った。
比較例２
実施例１の[５]の組成中、界面活性剤を０．２％ノニデットＰ４０とすること以外は実施例１と同様の方法により、添加回収試験を行った。【００７４】
【表１】
2008053973.tif 000003
【００７５】
第１表に示すように、胆汁酸誘導体を添加して測定することによりＭｘＡ蛋白質回収率の値は上昇し、ヘモグロビンの影響を抑制していることが判る。
【実施例２】
【００７６】
４．９％ＣＨＡＰＳを含む前記［５］に記載の試料希釈液組成にノニデットＰ−４０を添加することによる感度の検討を行った。前記［５］記載の試料希釈液にノニデットＰ−４０を０、０．２％、１％、１．４％添加し、前記［２］で調製したＭｘＡ蛋白質０（緩衝液のみ）、３．２、６．３、１２．５、２５、５０、１００、２００ｎｇ／ｍＬの各濃度の溶液を調製し、実施例１の［６］記載の方法で吸光度（Ａｂｓ）を測定した。結果を第２表に示す。【００７７】
【表２】
2008053973.tif 000004
【００７８】
第２表に示すとおり、ノニデットＰ−４０の添加量に依存した吸光度の上昇が認められ測定感度が上昇することがわかる。
【実施例３】
【００７９】
ウィルス感染が認められＭｘＡ蛋白質陽性を示す患者２例と、健常者３例からＥＤＴＡ・２Ｎａ採血管を用いて採血した血液を試料として用いた。
試料希釈液として、４．９％ＣＨＡＰＳを含む試料希釈液および４．９％ＣＨＡＰＳおよび１．４％ノニデットＰ−４０を含む試料希釈液を用いる以外実施例１と同様にしてＭｘＡ蛋白質回収率を求めた。結果を第３表に示す。【００８０】
【表３】
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【００８１】
第３表に示すように、添加回収率はノニデットＰ−４０を添加しても低下しないことがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明により、臨床診断に有用な、ヘモグロビンの影響が抑制された、ヘモグロビンを含有する試料中の測定対象成分の免疫測定法等が提供される。
【国際調査報告】
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