(57)【要約】  アレルギー診断において簡便な操作で鮮明な皮膚判定を短時間で行うことができる安価なアレルギー診断用マイクロニードルデバイスを提供する。マイクロニードルデバイス（１）は、マイクロニードル基板（２）と、基板上に設けられ皮膚を穿孔可能な長さが５０μｍ〜５００μｍで密度が１ｃｍ２当たり１００ないし１００００本のマイクロニードル（３）と、マイクロニードル上に設けられ少なくとも１種類のアレルギー抗原を保持するアレルギー抗原保持手段（４）とを備える。マイクロニードル（３）は非金属製の合成または天然の樹脂素材を用いて作製することができる。
2008096732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、上記基板上に設けられ皮膚を穿孔可能な長さが５０μｍ〜５００μｍで密度が１ｃｍ２当たり１００ないし１００００本のマイクロニードルと、上記マイクロニードル上に配置され少なくとも１種類のアレルギー抗原を保持するアレルギー抗原保持手段とを備えたことを特徴とするアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【請求項２】
上記マイクロニードルが非金属製の合成または天然の樹脂素材を用いて作製されることを特徴とする請求項１記載のアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【請求項３】
上記非金属製の合成または天然の樹脂素材が、生分解性ポリマーであるポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ乳酸−ｃｏ−ポリグリコリド、カプロノラクトン、ポリウレタン若しくはポリ無水物、または多糖類であるヒアルロン酸、プルラン、デキストラン、デキストリン若しくはコンドロイチン硫酸、または非分解性ポリマーであるポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレンビニルアセテート、ポリテトラフルオロエチレン若しくはポリオキシメチレンであることを特徴とする請求項２記載のアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【請求項４】
上記アレルギー抗原がペプチドまたはタンパクであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載のアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【請求項５】
上記アレルギー抗原保持手段が上記アレルギー抗原を上記マイクロニードル表面にコーティング担体を用いてコーティングされたものであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【請求項６】
上記コーティング担体が水酸基を有する水溶性高分子を含有することを特徴とする請求項５記載のアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【請求項７】
上記コーティング担体が、ポリエチレンオキサイド、ポリヒドロキシメチルセルロース、ポリヒドロキシプロピルセルロース、ポリヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリメチルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、およびポリビニルアルコールの群から選ばれる水酸基を有する水溶性高分子を含有することを特徴とする請求項６記載のアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【請求項８】
上記コーティング担体が、多糖類を含有することを特徴とする請求項６記載のアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【請求項９】
上記多糖類が、プルラン、カルメロースナトリウム、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、およびアラビアゴムの群から選ばれる水溶性高分子を含有することを特徴とする請求項８記載のアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【請求項１０】
上記コーティングが上記マイクロニードル表面に固着した状態にあることを特徴とする請求項５乃至９のいずれかに記載のアレルギー診断用マイクロニードルデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は簡便、迅速、明瞭な皮膚アレルギー診断を行うためのアレルギー診断用マイクロニードルデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫は本来病気等にかからないようにするための仕組みであるが、免疫反応が体に対して具合の悪い反応を引き起こしてしまう場合があり、これをアレルギーと呼び、反応を引き起こす元をアレルギー抗原（抗原）と呼ぶ。【０００３】
接触性アレルギー検査は、一般的にはパッチテストと呼ばれるものがある。斯かる接触性アレルギー検査には、シート表面に抗原が載置され且つ被験者の皮膚に貼付可能になされた接触アレルギー検査用シートが使用されている。そして、被験者の皮膚にシートを貼付し、一定の接触時間経過後に皮膚から剥離し、皮膚の色の変化により、アレルギーの有無や程度を肉眼で判定するのが一般的である。【０００４】
ここで言うパッチテストとは、皮膚の表皮を傷つける、傷つけないに関係なく、出血および痛みを伴わず簡便に行える診断方法を言う。【０００５】
ところで皮膚は、最外層の角質層、表皮、真皮、および皮下結合組織からなる。通常、死細胞層および脂質二重層からなる角質層は、多くの物質に対して強力なバリア機能を示す。表皮層には、ランゲルハンス細胞と呼ばれる抗原提示細胞が存在し免疫機能を担っている。ランゲルハンス細胞は、皮膚内に侵入したタンパク質抗原を補足し、内部で分解し、ＭＨＣ分子上にペプチド断片を表出する。ＭＨＣ−ペプチド複合体は、輸入リンパ管から所属リンパ節の皮質下層へと移動し、Ｔ細胞と指状突起細胞とを介して接触する。ランゲルハンス細胞が、このように移動することによって、抗原が皮膚からリンパ節内に存在するＴＨ細胞へと伝えられる。ランゲルハンス細胞は、抗原をＴＨ細胞へ提示するために必要なＭＨＣクラスＩＩ分子を有している。【０００６】
このように皮膚の角質層による強力なバリア機能のためパッチテストの接触時間は、十分な時間を採るとの観点から、通常４８時間とされている。また、従来の接触アレルギー検査は、皮膚の色の変化の判定が肉眼によって行われているため、判定に熟練を要すると共にアレルギーの程度の判定においては精度上問題があった。【０００７】
また、抗原が蛋白などの高分子量物質であることが多いため、吸収性に難があり最近では抗原の透過を高める手段として特許文献１および特許文献２にあるようなイオントフォレーシスおよびエレクトロポレーション装置による外用投与形態の検討も行われている。しかし、これらを直接アレルギーパッチテストに用いることはこれまでになく、接触アレルギー検査に使われた例もない。つまり、利便性、簡易性、迅速性および皮膚刺激性の理由から接触アレルギー検査にイオントフォレーシスやエレクトロポレーション装置を用いることは、これまで敬遠されがちであった。【０００８】
さらに、最近ではマイクロニードルおよびそれに付随したコーティング技術も様々に進んできている。特許文献３では、皮膚を通してワクチンを接種するためのデバイスとして皮膚穿刺部材がコーティングを保持するマイクロニードルを備えたインターフェイスが開示されている。しかし、ここにおいても接触アレルギー検査に使われた例はない。【０００９】
ところで、先ほど述べた皮膚の角質層による強力なバリア機能によるパッチテストによる長時間の接触さらに皮膚の色の変化の不鮮明さの問題を解決するために、直接抗原を皮下に注射針あるいは針による投与も考えられるが、アレルギー診断の性質上様々な抗体を診断する必要があり被験者の負担を考えると問題があることは明らかである。【００１０】
その他、抗生物質等の薬剤アレルギーや糖尿病、感染性疾患（結核、肝炎、ＨＩＶ等）の診断についても皮膚反応試験による診断が考案されており、プリックテストまたは皮内投与試験による皮膚反応試験において有用性が確認されている。プリックテストとは、皮内針を皮膚に対して水平方向に持ち、出血しない程度に皮膚に穿刺する方法であり、即時型の薬剤アレルギーを診断する方法である。本方法は、皮内投与試験よりも安全ではあるが、手技が煩雑であり時間がかかるとともに、医療従事者の熟練を必要とするとともに、針を皮膚に穿刺する程度によっては出血を伴うリスクがあり、感染性の疾患に感染している恐れのある患者に対しては特に注意を要する。また、皮内反応試験においては、皮内に直接注射するために、投与技術を必要とするだけでなく、痛み、出血、過剰反応を引き起こすことが問題となったため、実際に抗生物質の皮内反応テストは廃止された経緯がある。【００１１】
例えば、特許文献４では、粘着テープ片の一部の粘着面にアレルギー物質を塗布または付着しある限度まで皮膚に突刺しができる一本または多数本の突起状のランセット刃針が保持されたテスト片が開示されているが、これはランセットの長さが０．７６２ｍｍ〜１．５２４ｍｍ範囲であり、明らかに免疫機能を担っている抗原提示細胞が多く存在する表皮を通り越した真皮への投与であり、プリックテスト同様、痛みの発生による被験者の負担や効率的なアレルギー診断という意味で多くの問題を残していた。
【特許文献１】特許第２５０６５４３号公報
【特許文献２】特表２００２−５３５１００号公報
【特許文献３】特表２００４−５２８９００号公報
【特許文献４】特開昭５８−１３１９１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
上述のようにこれまでのパッチテストは通常４８時間かかっていて、スキンプリックテストや皮内投与試験においても簡便で安全な診断方法と呼べるものではなく、さらに皮膚の色の変化が不鮮明なものが多かった。さらにマイクロニードルの材質はこれまで特許文献３で開示されているように金属を用いることが多かったが、アレルギー診断においては金属自身が抗原として作用する場合も多く正確な診断ができない問題があった。また、チタン等のアレルギー抗原として作用しにくい金属素材を使用することも考えられるが、素材が高価であるため診断として用いるには現実的でなくより安価なマイクロニードルが求められていた。さらに、特許文献４に示されるランセットは長さが０．７６２ｍｍ〜１．５２４ｍｍとマイクロニードルに比べて長く、効率的な判定ができないのに加えて、痛みの発生、出血という問題があった。
本発明の目的は、アレルギー診断において簡便な操作で鮮明な皮膚判定を短時間で行うことができる安価なアレルギー診断用マイクロニードルデバイスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
免疫を獲得させたラットを用いてアレルギー抗原の経皮からの投与方法を検討した結果、マイクロニードルを用い、かつ、マイクロニードルにコーティングを行うことで最も高いアレルギー反応を示した。さらに、マイクロニードルの材質として非金属製の合成または天然樹脂素材を用いることにより迅速かつ正確な診断が可能であることを見出し、本発明を完成した。【００１４】
すなわち上記目的は、基板と、上記基板上に設けられ皮膚を穿孔可能な長さが５０μｍ〜５００μｍで密度が１ｃｍ２当たり１００ないし１００００本のマイクロニードルと、上記マイクロニードル上に配置され少なくとも１種類のアレルギー抗原を保持するアレルギー抗原保持手段とを備えたアレルギー診断用マイクロニードルデバイスにより達成される。
ここで、上記マイクロニードルは非金属製の合成または天然の樹脂素材を用いて作製することができる。
上記非金属製の合成または天然の樹脂素材は、生分解性ポリマーであるポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ乳酸−ｃｏ−ポリグリコリド、カプロノラクトン、ポリウレタン若しくはポリ無水物、または多糖類であるヒアルロン酸、プルラン、デキストラン、デキストリン若しくはコンドロイチン硫酸、または非分解性ポリマーであるポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレンビニルアセテート、ポリテトラフルオロエチレン若しくはポリオキシメチレンとすることができる。
上記アレルギー抗原はペプチドまたはタンパクとすることができる。
上記アレルギー抗原保持手段は上記アレルギー抗原を上記マイクロニードル表面にコーティング担体を用いてコーティングされたものとすることができる。
上記アレルギー抗原は上記マイクロニードル表面の先端部分にのみコーティングすることができる。
上記コーティング担体は水酸基を有する水溶性高分子を含有することができる。
上記コーティング担体は、ポリエチレンオキサイド、ポリヒドロキシメチルセルロース、ポリヒドロキシプロピルセルロース、ポリヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリメチルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、およびポリビニルアルコールの群から選ばれる水酸基を有する水溶性高分子を含有することができる。
上記コーティング担体は多糖類を含有することができる。上記多糖類は、プルラン、カルメロースナトリウム、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、およびアラビアゴムの群から選ばれる水溶性高分子を含有することができる。
上記コーティングは上記マイクロニードル表面に固着した状態にすることができる。
【発明の効果】
【００１５】
これまで通常４８時間かかっていたアレルギーパッチテストが、本発明の診断用マイクロニードルデバイスを用いることで、短時間例えば２０分程度で、しかも簡便な操作でより鮮明な皮膚判定が可能となったばかりでなく、痛みが少なく、出血を実質的に回避できるより安価なアレルギー診断用マイクロニードルデバイスを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係るアレルギー診断用マイクロニードルデバイスの一例を示す図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ｂ断面図である。
【図２】エバンスブルーの漏出量評価結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
図１は本発明に係るアレルギー診断用マイクロニードルデバイスの一例を示す図であり、（ａ）は斜視図、（ｂ）は（ａ）のＡ−Ｂ断面図である。図１（ａ）に示すように、本発明に係るマイクロニードルデバイス１は、マイクロニードル基板２と、マイクロニードル基板２上に皮膚を穿孔可能な二次元状に配置された複数のマイクロニードル３とを有する。マイクロニードル３上には少なくとも１種類のアレルギー抗原を保持するアレルギー抗原保持手段としてコーティング担体を用いてコーティング４が施される。コーティング４は、好適にはマイクロニードル３の表面に固着した状態とされる。このコーティング４は、図示はしないがマイクロニードル３が設けられるマイクロニードル基板２上に設けてもよい。マイクロニードル３は、好適には非金属製の合成または天然の樹脂素材を用いて作製される。また、マイクロニードル３の形状は本例では円錐状であるが、本発明はこれに限定されず、四角錐等の多角錐でもよく、また別の形状でもよい。
マイクロニードルデバイスは、皮膚又は粘膜に穿刺される針部（マイクロニードル）とこの針部を支持する基板からなり、針状構造体は基板に複数配列されている。本発明では、マイクロニードルの針状構造体は微小構造のものを扱うため、マイクロニードルの長さ（高さｈ）は、好ましくは５０μｍ〜５００μｍである。ここで、マイクロニードルの長さを５０μｍ以上とするのはアレルギー抗原の経皮からの投与を確実とするためであり、５００μｍ以下とするのはマイクロニードルの神経との接触を回避し、痛みの可能性を確実に減少させることができると同時に出血の可能性を確実に回避するためである。また、その長さが５００μｍ以下であると、皮内に入る抗原の量を効率良く投与することができる。【００１８】
ここで、マイクロニードルとは、凸状構造物であって広い意味での針形状又は針形状を含む構造物を意味し、円錐状構造の場合、通常その下底における直径は５０〜２００μｍ程度である。
また、単純な針形状のものに限定されるものではなく先の尖っていない形状もあるため、ここでいうマイクロニードルは先鋭な先端を有するものに限定されるものではない。【００１９】
マイクロニードル基板はマイクロニードルを支持するための土台であり、その形態は限定されるものではなく、例えば貫通した穴を備えた基板であってもよく、これにより基板の背面からの抗原の投与が可能となる。マイクロニードルあるいは基板の材質としては、シリコン、二酸化ケイ素、セラミック、金属（ステンレス、チタン、ニッケル、モリブテン、クロム、コバルト等）及び合成または天然の樹脂素材等が挙げられるが、マイクロニードルの抗原性および材質の単価を考慮すると、ポリ乳酸、ポリグリコリド、ポリ乳酸−ｃｏ−ポリグリコリド、プルラン、カプロノラクトン、ポリウレタン、ポリ無水物等の生分解性ポリマーや、非分解性ポリマーであるポリカーボネート、ポリメタクリル酸、エチレンビニルアセテート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリオキシメチレン等の合成または天然の樹脂素材が特に好ましい。また、多糖類であるヒアルロン酸、プルラン、デキストラン、デキストリン若しくはコンドロイチン硫酸等も好適である。【００２０】
マイクロニードルの密度は、典型的には、針の横列は１ミリメートル（ｍｍ）当たり約１ないし１０の密度が提供される様に横列間が空けられている。一般に、横列は横列内の針の空間に対し実質等しい距離だけ離れており、１ｃｍ２当たり１００ないし１００００本の針密度を有する。１００本以上の針密度があると、皮内に入る抗原の量を効率良く投与することができ、１００００本を超える針密度では、マイクロニードルに皮膚穿孔可能な強度を付与することが難しくなる。【００２１】
マイクロニードルの製法としては、シリコン基板を用いたウエットエッチング加工又はドライエッチング加工、金属又は樹脂を用いた精密機械加工（放電加工、レーザー加工、ダイシング加工、ホットエンボス加工、射出成型加工等）、機械切削加工等が挙げられる。これらの加工法により、針部と支持部は、一体に成型される。針部を中空にする方法としては、針部を作製後、レーザー加工等で２次加工する方法が挙げられる。【００２２】
また本発明では、抗原をマイクロニードルに精製水および／または高分子コーティング担体あるいは、精製水および／または低分子コーティング担体を用いてコーティングすることが可能であり、これにより、吸収性の悪い高分子化合物においてもより高い透過性を確保できる。すなわち、高分子コーティング担体としてポリエチレンオキサイド、ポリヒドロキシメチルセルロース、ポリヒドロキシプロピルセルロース、ポリヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリメチルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、低分子コーティング担体としては塩化ナトリウムなどの塩類やグルコースなどの糖類から選ばれるコーティング剤をマイクロニードルに全面あるいは一部にコーティングしたのち乾燥する。適用時には、このコーティング付きマイクロニードルで皮膚の角質層を穿孔し、これによりコーティングからの抗原が穿孔された孔を通って経皮吸収される。この場合、皮膚からの体液でコーティングを溶解することも可能であるが、皮膚の適用部またはコーティング自体に別途コーティング溶解用の液体を付与するようにしてもよい。【００２３】
コーティング担体としては高分子コーティング担体が好ましく、そのうち水酸基を有する水溶性高分子であるポリエチレンオキサイド、ポリヒドロキシメチルセルロース、ポリヒドロキシプロピルセルロース、ポリヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリメチルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、プルラン、カルメロースナトリウム、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、アラビアゴム等がより好ましい。特にポリビニルアルコールがもっとも好ましい。ポリビニルアルコールのけん化度は、７８〜１００ｍｏｌ％であり、特にけん化度の比較的低いグレードが好ましく、部分あるいは中間けん化物グレード、例えばＰＶＡ−２２０（株式会社クラレ製）の場合そのけん化度は、９４ｍｏｌ％程度である。また、ポリビニルアルコールの平均重合度は、２００〜５０００であり、好ましくは溶解性の比較的高い傾向にある５００〜２０００が最も効果的である。
また、比較的分子量の大きなアレルギー抗原との相溶性（均一に交わる性質）を考慮した場合には、多糖類の担体が好ましく、ポリヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリメチルセルロース、デキストラン、ポリエチレングリコール、プルラン、カルメロースナトリウム、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デキストラン、アラビアゴム等が好ましく、更にヒドロキシプロピルセルロース、プルラン、アラビアゴムがより好ましい。特に、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−ＳＳＬ（分子量：１５，０００〜３０，０００）、ＨＰＣ−ＳＬ（分子量：３０，０００〜５０，０００）、ＨＰＣ−Ｌ（分子量：５５，０００〜７０，０００）、ＨＰＣ−Ｍ（分子量：１１０，０００〜１５０，０００）、ＨＰＣ−Ｈ（分子量：２５０，０００〜４００，０００））、プルラン、ヒアルロン酸が最も好ましい。【００２４】
コーティング剤中のコーティング担体の含量は、１〜７０重量％であり、好ましくは１〜４０重量％であり、特に好ましくは３〜２５重量％である。また、このコーティング担体は、液だれすることのないようある程度の粘性が必要である場合があり、粘度として１００〜１０００００ｃｐｓ程度必要である。より好ましい粘度は、５００〜５００００ｃｐｓであり、更に粘度が５０００〜３００００ｃｐｓであると最も好ましい。【００２５】
また、マイクロニードルへのコーティングの厚さは、５０μｍ未満、および最も好ましくは２５μｍ未満すなわち１〜１０μｍである。一般に、コーティングの厚さは、乾燥後にマイクロニードルの表面にわたって測定される平均の厚さである。コーティングの厚さは、一般に、コーティング担体の複数の被膜を適応することにより増大させることができ、被膜を連続する被覆の間に乾燥させることで形成できる。コーティングは既知の方法を使用してマイクロニードルに塗布し、乾燥させることで固着化させる。また、マイクロニードルの針状構造体の中空路内面、マイクロニードルの基板の下面に塗布することも可能であるが、効率を考えた場合にはマイクロニードルが実際に皮膚に入るニードル部分特にニードルの先端部分にのみコーティングが施されていれば十分である。【００２６】
マイクロニードルをコーティングするのに使用される液体組成物は、生体適合性の担体、送達されるべき有益な作用物質、および場合によってはいずれかのコーティング補助物質を揮発性液体と混合することにより調製する。揮発性液体は、水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エタノール、イソプロピルアルコールおよびそれらの混合物であることができる。これらの中で水が最も好ましい。液体のコーティング溶液もしくは懸濁液は、典型的には、０．１〜６５重量％の有益な生理活性物質濃度を有することができ、好ましくは１〜３０重量％、更に好ましくは、３〜２０重量％である。コーティングは、固着化された状態が特に好ましい。「固着化された状態」というのは、コーティング担体が対象物にほぼ一様に付着している状態をいう。しかし、コーティング直後には、風乾、真空乾燥、凍結乾燥またはそれらの組合せの既知の乾燥方法で、コーティング担体が乾燥状態で固着しているが、経皮投与後は、取り巻く雰囲気と平衡にある水分含量あるいは有機溶媒等を保持することもあるため、乾燥状態で固着しているとは限らない。【００２７】
他の既知の製剤補助物質は、それらがコーティングの必要な溶解性および粘度の特徴ならびに乾燥されたコーティングの物理的完全性に有害な影響を及ぼさない限りは、コーティングに添加してもよい。【００２８】
アレルギー抗原としては、金属や化学物質に対するアレルギー検査の場合は、該当する金属や化学物質が使用され、アトピー性皮膚炎の抗原を明らかにするアレルギー検査の場合は、ハウスダスト、ダニ、真菌類、細菌類、食物などの構成成分が使用できる。さらに花粉症においても、スギ、ヒノキ、ブタクサ、ヨモギ、シラカンバ、イネ類など各種の花粉などが使用される。また、ツベルクリン反応の抗原も使用することができる。
また、食物アレルギーであれば、その発症・増悪に関与しているといわれる卵類、牛乳、乳製品、肉類、米穀、豆類、魚類、果実類などの種々の食物の構成成分が使用できる。【００２９】
これら構成成分は、一般的手法により抽出された粗生成物として、あるいは、精製した単一成分としても使用できるほか、遺伝子工学を利用して微生物並びに動物細胞に遺伝子を組み込むことにより、大量に産生させたものも使用できる。さらにこれら抗原の分解物や任意のフラグメントペプチド、あるいは、一部のアミノ酸を変異させたものも使用可能である。また、これらの抗原は、単独で使用することもできるが、２つ以上の組み合わせにより、より幅広い効果を期待した使用方法も可能である。
【実施例】
【００３０】
（実験例１）
雄性１２Ｗのヘアレスラットに蛋白リゾチーム／完全フロイントアジュバント（１：１）腹腔内投与（４００μｇ／ラット）し、１２日間経過させることで蛋白リゾチームに対する免疫（ＩｇＥ）を獲得させたアナフィラキシーモデルラットを作成した。
次に、ウレタン麻酔下で３％エバンスブルー（ＥＢ）溶液（１００μＬ／体重１００ｇあたり）を頸静脈投与し、腹部左右に蛋白リゾチームを下記に示す比較例２〜４および実施例１、２の方法で投与した。比較例１では蛋白リゾチームは投与しない。
また、エバンスブルーによる着色の評価は、次のように行った。すなわち投与部位皮膚を剥ぎ取り内径１２ｍｍ（φ１２）の皮ポンチで打ち抜くことで皮膚切片を摘出し、１Ｎの水酸化カリウム１ｍＬで皮膚切片を溶かし３７℃で一昼夜静置した。溶解した皮膚切片を０．６Ｎリン酸溶液を２．５ｍＬ、アセトン６．５ｍＬ添加後、遠心分離（１１００＊ｇ、２０分）し、上清２００μＬを採取してプレートリーダー（分光光度計）で測定した。このエバンスブルーの漏出量評価結果を図２に示す。【００３１】
（比較例１）
実験例１の操作のうち蛋白リゾチームを投与することなく食塩水２０μＬを滴下したものを比較例１とした。【００３２】
（比較例２）
実験例１の操作のうち蛋白リゾチームを投与するにあたって、何もコーティングしていないマイクロニードル（ポリ乳酸製、長さ２５０μｍ、密度８４１本／ｃｍ２）を５秒間穿刺してその後、５％蛋白リゾチーム溶液（４００μＬ）を含浸した不織布製剤（面積１ｃｍ２）を１０分間貼付した。【００３３】
（比較例３）
実験例１の操作のうち蛋白リゾチームを皮内投与するにあたって、何もコーティングしていないマイクロニードル（ポリ乳酸製、長さ２５０μｍ、密度８４１本／ｃｍ２）上に５％蛋白リゾチーム溶液２０μＬを滴下し、マイクロニードルデバイスを押圧後１０分間貼付した。【００３４】
（比較例４）
実験例１の操作のうち蛋白リゾチーム０．５％を２５μＬ皮内投与したものを比較例４とした。【００３５】
（実施例１）
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ２２０：株式会社クラレ）の１５％溶液に蛋白リゾチーム濃度が５％になるように溶解させ、メタルマスクを用いて３回連続してマイクロニードル（ポリ乳酸製、長さ２５０μｍ、密度８４１／ｃｍ２）にコーティングを行い、乾燥させた。次にこのマイクロニードルデバイスを押圧後１０分間貼付した。【００３６】
（実施例２）
実施例１のうち蛋白リゾチーム濃度が１０％になるように溶解したものを実施例２とした。
エバンスブルーの漏出量評価結果を示す図２のグラフにおいて、比較例１の値を横線で示している。図２のグラフから分かるように、比較例に比べて実施例１及び２においてエバンスブルーの着色が明らかに高い。これにより、マイクロニードルへのコーティングによる蛋白リゾチーム（抗原）の投与がより効果的なアレルギー反応を惹起していることが判明した。【００３７】
（実施例３）各種ポリマーのＢＳＡ，ＯＶＡとの相溶性確認試験
操作手法
各種ポリマーとＢＳＡ，ＯＶＡとを、下記の表１、表２の条件にしたがって、それぞれ混合水溶液を調製し、凝集物の発生の有無や遠心脱泡後（遠心条件は表に記載）の相分離発生の有無を確認することで、相溶性について評価した（均一な液性：○印、不均一な液性：×印）。表１、表２において、○印は相溶性を有するものであり、×印は相溶性を有しないものである。なお、以下の記載において％表記は重量％である。コーティング含量の測定は、上述の図２に示す方法でコーティングを行った後、１ｍＬ精製水で抽出し、ＢＳＡまたはＯＶＡ含量（付着量）を測定した。また、「不可」の記載は、ポリマーの針への付着性が認められなかったことを示す。【００３８】
【表１】
2008096732.tif 000003
【００３９】
【表２】
2008096732.tif 000004
【００４０】
表１，２に、ＯＶＡまたはＢＳＡと各水溶性ポリマーとの相溶性に関する結果とマイクロニードルへコーティングした際の、ＢＳＡまたはＯＶＡ含量を示す。生理活性物質と水溶性ポリマーの配合比を最適化することで高い相溶性を示したのはプルラン、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、ポリアクリル酸Ｎａであり、特にプルランは、高濃度のＯＶＡに対しても高い相溶性を示した。さらに、これらの溶液を用いて図２の方法でマイクロニードルへのコーティングを行った結果、プルランが最も高い値を示し、続いてヒドロキシプロピルセルロース（ＳＬ）、メチルセルロース、ヒアルロン酸の順であった。ヒドロキシプロピルセルロースに関しては、グレードによってコーティング量に違いが認められ、ＨＰＣ−ＳＬ＞ＨＰＣ−Ｌ＞ＨＰＣ−Ｈの順で低下する傾向を示した。この原因としては、ヒドロキシプロピルセルロースは低分子量になるにつれてポリマーの粘弾性（粘稠性）が上昇する傾向を示したため、マイクロニードルへの付着性が上昇したと考えられる。他、メチルセルロースはＯＶＡでは良好な相溶性を示したが、ＢＳＡでは良好な条件は確認されなかった。ヒアルロン酸については、ＯＶＡ，ＢＳＡいずれにおいても良好な相溶性を示したが、粘稠性に乏しく十分なコーティング量は得られなかった。ポリアクリル酸Ｎａについては、良好な相溶性を示したが、針への付着性が全く認められず、コーティング担体として不適であった。以上の結果から、高分子生理活性物質と相溶性を有するコーティング担体を用いることで、実質的に均一な高分子生理活性物質を含むコーティングを実現できる。【００４１】
なお、各種ポリマーは以下のものを使用した。メチルセルロース（ＳＭ−２５、ＳＭ−４００、ＳＭ−８０００）は信越化学工業製を、ポリアクリル酸（ＮＰ−６００、ＮＰ−８００）は昭和電工製を、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（９０ＳＨ−３００００、６５ＳＨ−１５００、ＴＣ−５）は信越化学工業製を、ポリビニルピロリドン（Ｋ２９／３２、Ｋ９０）は日本触媒社製をそれぞれ使用した。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
以上のように本発明によれば、短時間で、しかも簡便な操作でより鮮明な皮膚判定が可能となるばかりでなく、さらにより安価なアレルギー診断用マイクロニードルを提供できるようになるため、医薬産業およびその関連産業の発展に寄与するところ大である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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