(57)【要約】  本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄグルカンなど、ゲル化反応により測定される物質の濃度を、短時間で正確に測定できるようにすることを課題とする。ゲル化反応によって試料中の目的物質を測定する測定装置において、測定目的の物質を含む検体とゲル化を生じる試薬を含む溶液を収容する試料セル１３に対して、発光ダイオード１４の照明光を照射する。試料セル１３中の溶液は、攪拌棒２５により攪拌され微小かつ均一なゲル粒子を生成させ、照明光中を通過させる。試料セル１３中で生成するゲル粒子の透過光をダイオード２２で検出し、その透過光検出出力に基づき、コンピュータ２１により一定以下の透過光量が検出されるまでの遅延時間に基づき、前記溶液中の前記物質の濃度を測定する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル化反応によって試料中の目的物質を測定するゲル化反応測定装置において、
測定目的の物質を含む試料とゲル化を生じる試薬を含む溶液を収容する試料セルと、
前記試料セル中の溶液を攪拌する攪拌手段と、
前記試料セルに光を照射する照射手段と、
前記試料セル中で生成するゲル粒子の前記照射手段の照射光による透過光を受光する受光手段と、
前記受光手段により一定以下の透過光量が検出されるまでの遅延時間に基づき、前記溶液中の前記物質の濃度を測定する演算手段を設けたことを特徴とするゲル化測定装置。
【請求項２】
前記演算手段の記憶装置に、あらかじめ、各々異なる既知の濃度で前記測定目的の物質を含む試料溶液と試薬を前記試料セルに投入して、前記受光手段により一定以下の透過光量が検出されるまでの遅延時間をそれぞれ測定し、得られた遅延時間と前記濃度の関数関係データを格納したデータテーブルを用意し、
対象物質の濃度が未知である試料に対する測定において、前記演算手段は、前記受光手段により一定以下の透過光量が検出されるまでの遅延時間により前記データテーブルを参照することにより前記溶液中の前記物質の濃度を測定することを特徴とする請求項１に記載のゲル化測定装置。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のゲル化反応測定装置で用いられる前記試料セルにおいて、測定目的の物質のゲル化を生じる試薬、および試料投入後の試料および前記試薬の溶液を攪拌する攪拌手段をあらかじめ封入し、密閉部材により密閉された容器から構成されることを特徴とする試料セル。
【請求項４】
請求項３に記載の試料セルにおいて、測定目的の物質の含有レベルが所定以下の環境において、前記試薬および前記攪拌手段の封入が行なわれることを特徴とする試料セル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄグルカンなどの測定対象の試料中の濃度をゲル化現象過程を検出することにより測定するゲル化測定装置および試料セルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシン（細胞内毒素）とは、グラム陰性菌の細胞壁を構成するリポポリサッカライド（リン脂質と多糖類の高分子複合体）でリピドＡと呼ばれる脂質と多糖鎖が２−ケト−３−デオキシオクトン酸（ＫＤＯ）を介して結合したリポ多糖（ＬＰＳ）である。細菌の死などによって細胞壁が壊れてはじめて放出される。エンドトキシンは生体にさまざまな作用をおよぼす。発熱や致死的な敗血症やショックを引き起こす有害物質であり、更に、ＤＩＣ（播種性血管内凝固症侯群）の誘因の一つであると考えられている。また、医薬品（注射剤等）や医療用具（血管カテーテル等）は内毒素による汚染がないこと（パイロジェンフリー）が重要であり、細菌を用いて調製した医薬品（組み換えタンパク質、遺伝子治療に用いるＤＮＡなど）では内毒素を完全に除去することが不可欠となっている。      【０００３】
このエンドトキシンの除去確認、あるいは救急医学における計測手法には、多数の試料測定に対応できることはもちろん、救命治療という目的にかなった迅速性が求められている。【０００４】
１９６４年にＬｅｖｉｎとＢａｎｇが、カブトガニの血球抽出成分がエンドトキシンによって凝固（ゲル凝固）することを発見した。この現象を利用したエンドトキシン検出法はリムルステストと呼ばれ、さらにカブトガニの血球抽出成分であるリムルス試薬とエンドトキシンを含む検体溶液がゲル化することを応用している。【０００５】
ゲル凝固する検体溶液の希釈倍率からエンドトキシン濃度を測定するゲル化法やゲル化反応に伴う濁度変化よりエンドトキシン濃度を測定する比濁法が知られている（下記特許文献１）。また、凝固過程における凝固前駆物質（コアギュロゲン）の代わりに発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−  Ｂｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアリニド）を加えることにより、その加水分解でｐ−ニトロアニリンが遊離され、その黄色発色の比色によりエンドトキシン濃度を測定する発色合成基質法なども知られている。また、リムルス試薬と検体との混合溶液を円形パイプで構成される測定回路に循環させ、レーザ光散乱を用いてゲル化による０．５ｍｍ以下の散乱粒子の数を計測する装置が知られている（下記特許文献２）。【０００６】
なお、同様のゲル化反応を利用した測定技術は、エンドトキシンのみならずβ−Ｄグルカン（β−Ｄ  ｇｌｕｃａｎ）などの測定にも利用される。【０００７】
β−Ｄグルカン（β−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ）は真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄグルカンを測定することにより、カンジダやスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲で真菌感染症のスクリーニングなどに有効である。【０００８】
β−Ｄグルカンの測定においても、カブトガニの血球抽出成分がβ−Ｄグルカンによって凝固（ゲル凝固）することが利用されており、上記同様にゲル化法や比濁法、発色合成基質法によって測定されている。【０００９】
エンドトキシンやβ−Ｄグルカンの測定手法には共通点があり、たとえば、ほぼ同様の測定ハードウェアを用い、カブトガニの血球抽出成分中からＦａｃｔｏｒ  Ｇ成分を除くことにより、エンドトキシンに選択的なゲル化反応や発色反応が測定でき、また、試料中のエンドトキシンを前処理により不活化することにより、β−Ｄグルカンに選択的なゲル化反応や発色反応が測定できる。
【特許文献１】特開２００４−９３５３６号公報
【特許文献２】特開２００３−３２２６５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従来の各リムルステスト手法のうち、ゲル化法は、リムルス試薬液に試料を加え一定温度で静置して流動性の低いゲルが生成するまでの時間を測定する方法である。また、比濁法は同様にリムルス試薬液に試料を加え一定温度で静置し、ゲル化反応に伴う濁度変化を透過光量の変化としてとらえ、透過光量が反応開始からある一定の割合だけ変化するまでの時間をゲル化時間として測定する方法である。【００１１】
そして、上記いずれの従来の方法とも、ゲル化反応それ自体を検出しようとするもので、従来では、リムルス試薬と検体を混合後、ゲル化反応を促進するような工夫については一切、考慮されていない。このため、試薬／検体溶液中にゲルが生成するのに約９０分という長時間を要する、という問題がある。【００１２】
また、反応溶液のゲル化時間は、測定対象の物質の濃度に比例するが、ゲル化法および比濁法共に感度の点から正確なゲル化開始時間が検出できないため、ゲル化終了までの時間から反応量を算出して、ゲル化時間の目安を得ており、従って、ゲル化法および比濁法は共に救急を要する場合や多数の検体を測定するのに適した方法とはいえない。【００１３】
また、発色合成基質法はゲル化法および比濁法にくらべ測定時間は３０分と短時間であるが、偽陽性反応が生じる場合があり、また、測定準備が煩雑である、という問題がある。【００１４】
本発明の課題は、上記問題を解決し、エンドトキシンやβ−Ｄグルカンなど、ゲル化反応により測定される物質の濃度を、短時間で正確に測定できるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
以上の課題を解決するために、本発明によれば、ゲル化反応によって試料中の目的物質を測定するゲル化反応測定装置において、測定目的の物質を含む試料とゲル化を生じる試薬を含む溶液を収容する試料セルと、前記試料セル中の溶液を攪拌する攪拌手段と、前記試料セルに光を照射する照射手段と、前記試料セル中で生成するゲル粒子の前記照射手段の照射光による透過光を受光する受光手段と、前記受光手段により一定以下の透過光量が検出されるまでの遅延時間に基づき、前記溶液中の前記物質の濃度を測定する演算手段を設けた構成を採用した。【００１６】
また、前記ゲル化反応測定装置で用いられる前記試料セルにおいては、測定目的の物質のゲル化を生じる試薬、および試料投入後の試料および前記試薬の溶液を攪拌する攪拌手段をあらかじめ封入し、密閉部材により密閉された容器からなる構成を採用した。
【発明の効果】
【００１７】
上記構成によれば、測定目的の物質を含む試料とゲル化を生じる試薬を含む溶液を攪拌することにより、エンドトキシンやβ−Ｄグルカンなどの測定目的の物質のゲル化反応を促進し、これによりゲル化による粒子（ゲル粒子）が早期に出現し、ゲル化反応により測定される物質の濃度を、従来の比濁法に比して著しく短時間で正確に測定することができる。【００１８】
また、試料セルを、測定目的の物質のゲル化を生じる試薬、および試料投入後の試料および前記試薬の溶液を攪拌する攪拌手段をあらかじめ封入し、密閉部材により密閉された容器から構成することにより、運搬あるいは取り扱い中に測定目的の物質が試料中に混入することにより測定誤差を生じる可能性を低減し、上記の高感度な測定を保証することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明を採用した測定装置の構成を示した説明図である。
【図２Ａ】図１の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
【図２Ｂ】図１の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
【図２Ｃ】図１の測定装置によるエンドトキシンの測定例を示した説明図である。
【図３】図１の測定装置の試料セルの構成を示した説明図である。
【符号の説明】
【００２０】
１２  集光レンズ
１３  試料セル
１４  発光ダイオード（ＬＥＤ）
１５  マグネチックスターラー
１６  試料溶液
１７  受光レンズ
２０  ＡＤ変換器
２１  コンピュータ
２２  フォトダイオード
２３  ディスプレイ
２５  スターラーバー（攪拌棒）
１３１  容器
１３２  密閉部材
１３３  リムルス試薬
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための最良の形態の一例として、エンドトキシンの濃度をリムルス試薬を用いたゲル化反応を検出することにより測定する測定装置に関する実施例を示す。
【実施例１】
【００２２】
図１に本発明を採用した計測装置の構成を示す。図１において、発光ダイオード１４から照射される光は集光レンズによってコリメートされ、試料セル１３内のリムルス試薬液に試料（検体）を加え、混合した試料溶液１６に照射される。【００２３】
試料セル１３は、たとえばガラスなどの材質から構成される。図１では試料セル１３を開放した状態で図示しているが、試料セル１３の異なる構造については後で詳述する。【００２４】
試料セル１３内の試料溶液１６は、ゲル粒子を生成させるため、不図示の保温ないし加熱手段によって、３７℃の一定温度に保たれる。【００２５】
そして、本実施例では、試料溶液１６中で生じるゲル化反応を促進するため、スターラーバー（攪拌棒）２５とマグネチックスターラー１５により１０００ｒｐｍ程度の適当な回転数で回転攪拌する。【００２６】
試料溶液中のゲル粒子を透過した光は、受光レンズ１７を介して透過光強度測定のためのフォトダイオード２２によって測定される。【００２７】
フォトダイオード２２から得られる測定結果は電気信号として出力され、不図示の増幅器により電流電圧変換、増幅の後、ＡＤ変換器２０によりＡＤ変換され、演算手段としてのコンピュータ２１に入力される。【００２８】
デジタル信号に変換された透過光測定信号は、たとえばパーソナルコンピュータのハードウェアなどを用いて構成したコンピュータ２１により信号処理される。【００２９】
コンピュータ２１には、キーボード、マウスなどの操作装置、測定結果表示用のディスプレイ２３、あるいはさらにプリンタなどの出力装置、他の装置と測定結果あるいは測定に関する情報を入出力するネットワークインターフェースなどが含まれる（ディスプレイ２３以外は不図示）。【００３０】
また、スターラーバー２５の回転数管理、および前述の試料セル１３ないしその内部の試料溶液１６の温度管理は、コンピュータ２１により行なうことができる。このためには、コンピュータ２１にスターラーバー２５の回転数、試料セル１３ないしその内部の試料溶液１６の温度などを検出する不図示のエンコーダセンサ、プローブなどを接続しておく。そして、コンピュータ２１でフィードバック制御を行うことによりスターラーバー２５の回転数、試料セル１３ないしその内部の試料溶液１６の温度を所望に制御することができる。【００３１】
上記構成における測定では、測定目的の物質を含む検体とゲル化を生じる試薬を含む溶液を試料セルに入れ、測定を開始した後、一定以下の透過光量が計測されるまでの時間ＴＬ（遅延時間）と、このＴＬと試料液中の測定対象物質（下記の例ではエンドトキシン）の量（濃度）との相関より、測定対象物質の濃度をコンピュータ２１により演算し、ディスプレイ２３で表示する。【００３２】
一定以下の透過光量が計測されるまでの遅延時間ＴＬと、測定対象物質の濃度の相関データ（あるいは関数関係データ）は、下記の測定例に示すようにあらかじめ測定しておき、遅延時間ＴＬと測定対象物質の濃度を関連づけたテーブルデータとしてコンピュータ２１の記憶装置（ＨＤＤやＲＯＭなど）に格納しておく。【００３３】
そして、コンピュータ２１により、実測された遅延時間ＴＬから、このテーブルデータを参照することにより、測定対象物質の濃度を求めることができる。下記の他の相関データに関しても、コンピュータ２１にテーブルデータとして用意しておくことができる。【００３４】
たとえば、下記の測定例（図２Ａおよび図２Ｃ）で得られた結果は、遅延時間ＴＬと、測定対象物質（下記の例ではエンドトキシン）の濃度との相関データとしてテーブルデータ形式でコンピュータ２１の記憶装置に格納しておくことができる。【００３５】
また、ゲル化反応で生成するゲル粒子の生成速度Ｖ（Ｖ＝ｄＸｔ／ｄｔ）の最大値Ｖｍａｘと、このＶｍａｘと試料液中の測定対象物質の量（濃度）との相関より目的の物質の濃度をコンピュータにより演算し、ディスプレイ２３で表示することができる。【００３６】
また、ゲル化反応で生成するゲル粒子の最大生成量Ｘｍａｘと、試料液中の測定対象物質の量（濃度）との相関より目的の物質の濃度をコンピュータ２１により演算し、ディスプレイ２３で表示することもできる。【００３７】
以下、本発明を採用した測定装置によるエンドトキシンの測定例を示す。【００３８】
ここでは、あらかじめエンドトキシンを０．１ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌの既知の各濃度でそれぞれ含む試料を用いて、本発明のスターラーバー２５による攪拌をともなう透過光量測定と、従来の試料を静置したまま行なう透過光量測定（比濁法に相当）の比較対照を行なう（図２Ａおよび図２Ｂ）。【００３９】
さらに、各透過光量測定（図２Ａおよび図２Ｂ）から、実際の検体の測定に使用できる上記の遅延時間ＴＬと測定対象物質の濃度を関連づけたテーブルデータとして使用可能な、一定以下の透過光量が計測されるまでの遅延時間ＴＬと、測定対象物質の濃度の相関（あるいは関数関係）を示す（図２Ｃ）。【００４０】
まず、図２Ａに、図１の装置で、エンドトキシンを０．１ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌの各濃度（グラフ中に併記した単位なしの数値）でそれぞれ含む試料について測定した透過光量変化の測定結果を示す。【００４１】
この測定においては、図１の装置の試料セルに、上記各濃度のエンドトキシンを含む試料とリムルス試薬を投入し、スターラーバー２５で攪拌を開始するとともに、その間、フォトダイオード２２、ＡＤ変換器２０、コンピュータ２１により透過光量測定を行っている。【００４２】
測定期間中、コンピュータ２１により、ゲル化反応に伴う透過光強度の時間系列的変化をディスプレイに表示させる。この時の測定フォーマットは、たとえば図２Ａと同様な線図（グラフ）形式とすることができる。【００４３】
また、コンピュータ２１により、一定以下の透過光量が計測されるまでの時間ＴＬ、ゲル粒子の生成速度の最大値Ｖｍａｘ、およびゲル化反応で生成するゲル粒子の最大生成量Ｘｍａｘを演算し、ディスプレイ２３に表示する。【００４４】
さらに、比較対照のため、図２Ｂに、スターラーバー２５による攪拌を行なわず、図２Ａの場合と同じエンドトキシンを０．１ｐｇ／ｍｌ、１ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌの各濃度（グラフ中に併記した単位なしの数値）でそれぞれ含む試料について測定した透過光量変化の測定結果を示す。【００４５】
この測定においては、図１の装置の試料セルに、上記各濃度のエンドトキシンを含む試料とリムルス試薬を投入し、スターラーバー２５で攪拌を行わず、その間、フォトダイオード２２、ＡＤ変換器２０、コンピュータ２１により透過光量測定を行っている。【００４６】
すなわち、この図２Ｂの測定は、攪拌を行わずに透過光量を測定する、従来の比濁法に実質的に相当する。【００４７】
図２Ａと図２Ｂを比較して明かなように、スターラーバー２５で攪拌を行いつつ測定を行う場合（図２Ａ）の方が、スターラーバー２５で攪拌を行わずに測定を行う場合（図２Ｂ）よりも透過光量が１００％を割るまでの遅延時間が短かいことがわかる。【００４８】
さらに、図２Ｃに、図２Ａおよび図２Ｂの各測定において測定されたエンドトキシン濃度（ｐｇ／ｍｌ）と一定以下の透過光量が計測されるまでの遅延時間ＴＬの結果を示す。【００４９】
ここでは、透過光量（透過率）が１００％を切るまでの時間を、遅延時間ＴＬとして採用している。また、白丸でプロットしたグラフが本発明の攪拌を行った場合（図２Ａ）、黒丸でプロットしたグラフが従来の攪拌を行わなかった場合（図２Ｂ）の遅延時間ＴＬである。【００５０】
図２Ｃに明かなように、従来技術の試料溶液を攪拌しない比濁法では、エンドトキシンの測定に長時間を要することが明らかである。【００５１】
たとえば、０．１ｐｇ／ｍｌ濃度のエンドトキシンを測定する場合、比濁度法の遅延時間は約１００分であるが、本発明の測定装置で測定される遅延時間は３５分と、ほぼ本測定装置により攪拌を行いながら、エンドトキシン測定を行うことにより、この濃度レベルの検体であれば１時間の測定時間の短縮が可能となることがわかる。【００５２】
また、図２Ｃにプロットされた曲線、特に、本発明の攪拌を行いつつ測定（図２Ａ）した白丸でプロットした曲線上の各データ（遅延時間ＴＬ：対照物質濃度）は、遅延時間ＴＬと測定対象物質の濃度を関連づけたテーブルデータとしてコンピュータ２１の記憶装置に格納しておくことができる。【００５３】
このようなデータ（遅延時間ＴＬ：対照物質濃度）をデータテーブルに用意しておけば、対照物質の濃度が未知である検体に対して、測定を行い、一定以下の透過光量が計測されるまでの遅延時間ＴＬを求め、この遅延時間ＴＬで当該データテーブルを参照することにより、その検体の対象物質の濃度を測定することができる。【００５４】
以上に示したように、図１の構成、すなわち、測定目的の物質を含む試料溶液を攪拌しつつ透過光量を測定する構成によれば、エンドトキシンやβ−Ｄグルカンなどのゲル化反応を促進し、これによりゲル化による粒子（ゲル粒子）が早期に出現し、ゲル化反応により測定される物質の濃度を、従来の比濁法に比して著しく短時間で正確に測定することができる。【００５５】
なお、上記実施例では、試料セル１３にリムルス試薬と試料をそれぞれ投入する旨説明した。【００５６】
しかしながら、より正確にエンドトキシンを測定するためには、試料セル廻りの構造を工夫してエンドトキシン・フリーの度合を高めておく必要があると考えられる。【００５７】
すなわち、エンドトキシンは通常環境中においても多く存在しており、試薬製造工程中、あるいは測定操作中に幾許かのエンドトキシンが試料セル内に混入する可能性は決して否めない。【００５８】
したがって、たとえば、試料セル１３の一端がリムルス試薬と試料をそれぞれ投入できるように開放されている、あるいは開閉可能となっているような従来技術で想定されていたエンドトキシン・フリーのレベルでは、本発明の測定装置がエンドトキシンを含まない検体でも混入したエンドトキシンの影響でエンドトキシン陽性を検出する可能性がある。【００５９】
そこで、図３に示すように、試料セル１３を、樹脂やガラスなどから成る容器１３１中にスターラーバー（攪拌棒）２５と、必要量のリムルス試薬１３３を封入し、上部を密閉部材１３２で密閉した構成が考えられる。【００６０】
密閉部材１３２の様式は任意であるが、もちろん運搬中や取り扱いの過程でエンドトキシンが混入しないような仕様の部材を用いる。【００６１】
試料セル１３内への測定試料（検体）の導入は、たとえば密閉部材１３２を注射針などで穿孔して注入するなどの方式が考えられる。あるいは測定試料（検体）の導入を容易にするため、試料セル１３内が大気圧に対して一定の負圧レベルを保つように密閉部材１３２の密閉仕様を決定しておいてもよい。【００６２】
もちろん、図３のような試料セル１３は、一定のエンドトキシン・フリー・レベルを達成した製造環境で組立てられるのはいうまでもない。【００６３】
図３に示すように構成した試料セル１３は、図１に示した測定装置の付属品や製品ファミリーの一部を構成するたとえば測定キットのような製品としてユーザに供給することができ、その場合、所定のエンドトキシン・フリー・レベルを満たした測定環境を容易に形成することができ、精度の高い測定結果を安定して達成することができる。【００６４】
なお、図３では、１検体（試料）ぶんのみの試料セルの構成を示したが、同様の構成を多数、一体化し、多数の検体（試料）を同時に測定できるような製品を構成することも容易である。その場合、図１に示した測定装置側の構成も複数の各試料セルに対応した数、必要になるのはいうまでもない。【００６５】
また、以上の実施例では、測定対象の物質をエンドトキシンと考えたが、同じ測定ハードウェアを、同様ないし類似のリムルス試薬を用いたβ−Ｄグルカンの測定など、ゲル化現象過程を検出する同様の測定処理に応用できることはいうまでもない。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明は、リムルス試薬を用いたエンドトキシンやβ−Ｄグルカンなどの測定対象の試料中の濃度をゲル化現象過程を検出することにより測定する種々の測定装置において実施することができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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