(57)【要約】  本発明は、生理活性物質の固定化能力に優れ、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有する医療用粒子、及び、生体分子の捕捉能力に優れ、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有する分析用粒子を提供することを目的とする。  本発明は、核となる粒子の表面に重合性官能基、または、連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子、及び、生体分子の相互作用を分析するための粒子である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子。
【請求項２】
前記重合性成分が、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む請求の範囲第１項に記載の医療用粒子。
【請求項３】
生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーの官能基が、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、及びビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である請求の範囲第１項又は第２項に記載の医療用粒子。
【請求項４】
生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーが下記の一般式［１］で表される活性エステル基を有するモノマーである請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の医療用粒子。
【化１】
2008087909.tif 000012
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキレン基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項５】
前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである請求の範囲第４項に記載の医療用粒子。
【請求項６】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［２］で表されるモノマーを含む請求の範囲第２項〜第５項のいずれかに記載の医療用粒子。
【化２】
2008087909.tif 000013
（式中Ｒ２は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、異なっていてもよい。）
【請求項７】
前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート及び／又はエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートを含む請求の範囲第２項〜第６項のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項８】
前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート及び／又はエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である請求の範囲第７項に記載の医療用粒子。
【請求項９】
前記重合性官能基がメタクリル基、アクリル基、及びビニル基よりなる群から選ばれる１種以上である請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項１０】
前記連鎖移動基がメルカプト基である請求の範囲第１項〜第８項のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項１１】
前記核となる粒子が無機材料からなる請求の範囲第１項〜第１０項のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項１２】
前記無機材料が無機酸化物からなる請求の範囲第１１項に記載の医療用粒子。
【請求項１３】
前記無機酸化物が酸化ケイ素である請求の範囲第１２項に記載の医療用粒子。
【請求項１４】
前記核となる粒子の表面への重合性官能基、または連鎖移動基の導入が、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる粒子表面の官能基との共有結合の形成によってなされる請求の範囲第１項〜第１３項のいずれかに記載の医療用粒子。
【請求項１５】
前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤が重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランである請求の範囲第１４項に記載の医療用粒子。
【請求項１６】
請求の範囲第１項〜第１５項のいずれかに記載の医療用粒子の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性水溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランの酸性水溶液中で核となる粒子を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む医療用粒子の製造方法。
【請求項１７】
更に、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む請求の範囲第１６項に記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項１８】
前記重合反応がラジカル重合反応であることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の医療用粒子の製造方法。
【請求項１９】
生体分子の相互作用を分析するための粒子であって、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の前記生理活性物質を固定化する官能基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用粒子。
【請求項２０】
前記重合性成分がアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む請求の範囲第１９項に記載の分析用粒子。
【請求項２１】
前記生理活性物質を固定化する官能基がアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、及びビオチンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの官能基である請求の範囲第１９項又は第２０項に記載の分析用粒子。
【請求項２２】
前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインＡ，プロテインＧ、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、及び糖タンパクよりなる群から選ばれる少なくとも一つである請求の範囲第１９項〜第２１項のいずれかに記載の分析用粒子。
【請求項２３】
請求の範囲第１９項〜第２２項のいずれかに記載の分析用粒子の製造方法であって、高分子化合物を含む層を形成した粒子に生理活性物質をリン酸塩緩衝液に溶解した溶液を接触させる工程を含む分析用粒子の製造方法。
【請求項２４】
前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である請求の範囲第２３項に記載の分析用粒子の製造方法。
【請求項２５】
前記リン酸塩がリン酸２水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２カリウム、又はリン酸水素２ナトリウムである請求の範囲第２３項又は第２４項に記載の分析用粒子の製造方法。
【請求項２６】
請求の範囲第１９項〜第２２項のいずれかに記載の分析用粒子を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用粒子の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を固定化する機能を有する医療用粒子、生体分子の相互作用を分析するための分析用粒子、並びにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーでさまざまな粒子を被覆したポリマー被覆粒子は、工業分野で広く用いられてきただけでなく、近年においては基礎的な生物学や医療の分野においてその重要性が高まっている。例えばアフィニティークロマトグラフィーの担体への応用、医療における診断や薬物送達システム（ドラックデリバリーシステム、ＤＤＳ）、創薬用途などへの応用に対する関心が高まっている。創薬用途への応用例としては、例えば様々な粒子（担体）に固定されたリガンドと呼ばれる生理活性物質を介して特定のタンパク質などの生体分子を捕捉し、これを分離精製するものがある。【０００３】
粒子を担体として用いる際に求められる条件は、主には（１）穏和な条件下でリガンド、又はスペーサーを固定化できる官能基を有すること、またその固定化量が大きいこと、（２）担体自体がタンパク質などの生体物質一般に対して非特異的吸着をしないこと、（３）目的・用途に応じた機械的強度を有すること、である。しかし、これらの条件を満たす担体は未だ開発されていない。【０００４】
特に、リガンドの固定化量は担体の性能を左右する大きな要因であり、できるだけ大きな固定化量が要求される。リガンドの固定化量が大きくなれば、それに伴い捕捉するタンパク質の総量が増加するからである。特に、目的とするタンパク質がリガンドに捕捉されるタンパク質の中でもマイナーな成分である場合、固定化量が少ないとそれを発見できなくなる恐れもあるため、なおさらリガンド固定化量の大きな粒子が求められている。【０００５】
一方、捕捉したいタンパク質以外の成分の非特異的吸着を抑制することも極めて重要である。従来の担体のうち、無機系のシリカゲル粒子は物理的強度の強い担体で、多孔質であることから分離には良いとされているが、非特異的吸着の度合が高いという欠点があるため実際に使用されている例は極めて少ない。また、合成高分子系では、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物などでなる粒子が開発されているが、これらの高分子も生体関連物質の非特異的吸着が起こり易いという欠点がある。【０００６】
上記のように、粒子を医療用担体又は分析用担体として用いる場合には、非特異的吸着も問題になることが多い。そのため、それを回避するために様々な手法が検討されている。例えば、表面に目的の生理活性物質をつけたあと、残りの粒子表面をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の害の少ないタンパクを先に吸着させておくブロッキングの手法などがあるが、効果は十分ではない。また、表面がエポキシ基からなる粒子に特定のタンパク質と特異的に結合するＤＮＡを結合させ、タンパク質の精製用途に用いる例もある（例えば特許文献１）。この方法では、タンパク質の非特異吸着性が少ないという理由から、粒子表面へのエポキシ基導入にグリシジルメタクリレートなどを用いている。しかし、エポキシ基にＤＮＡ等生理活性物質を直接結合させる方法は、アルカリ条件下や高温条件下で反応させる必要があるなど相当厳しい反応条件を必要とする。このため、固定化させる生理活性物質がアルカリや高温で不安定な場合、固定化プロセスで生理活性物質が変質してしまう恐れがあるので不適当である。【０００７】
その他、粒子の非特異吸着低減方法としては、非特異吸着の少ないポリマー粒子を乳化重合法などで合成する例がある。例えば、特許文献２には、生理活性物質と反応可能な反応基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、ポリオキシアルキレン側鎖を有するエチレン系不飽和重合性モノマー及び疎水性を付与するエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーを乳化重合法、又は懸濁重合法にて共重合し、粒子を得る方法が記載されている。しかし、このような方法では、得られる粒子径の制御が困難である。一般に、乳化重合法では、比較的均一な粒径を有する粒子が得られるものの、粒子径がサブミクロン程度のものしかできない。一方、懸濁重合法で得られる粒子は、粒子径分布が広く、例えばカラム用充填剤として用いるためには粒子を分級する必要があるが、特別な装置のない場合にはポリマー粒子を高度に分級することが難しい。しかも、得られる粒子のサイズが数十ミクロンから数百ミクロンであり、それよりも小さい径の粒子を合成することが難しい。さらに、重合で得られる粒子は、高分子であるがために担体としての強度に自ずと限界がある。粒子強度が求められる用途に使用する場合には、高分子中のエチレン系不飽和重合性ビニル芳香族モノマーの比率を上げるなど強度を上げるための処方を余儀なくされ、そのことは逆に非特異的吸着に不利であった。【０００８】
【特許文献１】特許第２７５３７６２号公報
【特許文献２】特許第３２１５４５５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
粒子強度を確保しつつ、非特異吸着を低減させるためには、物理的強度の強いシリカゲル粒子などを非特異吸着の少ないポリマーで被覆する方法が有効であると考えられた。特に、洗浄工程におけるポリマーの溶解を回避するため、ポリマーと粒子表面との間に共有結合を形成させる方法が効果的であると考えられた。しかしながら、比較的大きく平らな基板上に塗布する場合と異なり、ポリマー中の官能基と粒子表面の官能基を反応させる従来の方法では、ポリマーの立体障害により、官能基同士の衝突頻度が少ないために反応率が悪く、粒子表面にポリマーを均一に被覆することは困難であった。そのため、粒子表面に化学的・物理的に安定して被覆されるポリマーの量が不充分となり、目的とする生理活性物質の固定化能力が不十分であった。【００１０】
本発明の第一の課題は、目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有する医療用粒子を提供すること、さらには前記特性に加えてタンパク質等に対して非特異的吸着がより少なく、ＳＮ比の高い医療用粒子を提供することである。
本発明の第二の課題は、目的とする生体分子の捕捉能力に優れ、洗浄工程における溶解や劣化の少ない化学的・物理的安定性を有する分析用粒子を提供すること、さらには前記特性に加えてタンパク質等に対して非特異的吸着がより少なく、ＳＮ比の高い分析用粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、
（１）核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子、
（２）前記重合性成分が、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む（１）に記載の医療用粒子、
（３）生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーの官能基が、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、及びビオチンから選ばれる少なくとも一つの官能基である（１）又は（２）に記載の医療用粒子、
（４）生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーが下記の一般式［１］で表される活性エステル基を有するモノマーである（１）〜（３）のいずれかに記載の医療用粒子、【００１２】
【化１】
2008087909.tif 000002
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキレン基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）
（５）前記活性エステル基がｐ−ニトロフェニルエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである（４）に記載の医療用粒子、
（６）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが下記の一般式［２］で表されるモノマーを含む（２）〜（５）のいずれかに記載の医療用粒子、【００１３】
【化２】
2008087909.tif 000003
（式中Ｒ２は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、異なっていてもよい。）
（７）前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート及び／又はエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートを含む（２）〜（６）項のいずれかに記載の医療用粒子、
（８）前記メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート及び／又はエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートのエチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００である（７）に記載の医療用粒子、
（９）前記重合性官能基がメタクリル基、アクリル基、及びビニル基よりなる群から選ばれる１種以上である（１）〜（８）のいずれかに記載の医療用粒子、
（１０）前記連鎖移動基がメルカプト基である（１）〜（８）のいずれかに記載の医療用粒子、
（１１）前記核となる粒子が無機材料からなる（１）〜（１０）のいずれかに記載の医療用粒子、
（１２）前記無機材料が無機酸化物からなる（１１）に記載の医療用粒子、
（１３）前記無機酸化物が酸化ケイ素である（１２）に記載の医療用粒子、
（１４）前記核となる粒子の表面への重合性官能基、または連鎖移動基の導入が、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる粒子表面の官能基との共有結合の形成によってなされる（１）〜（１３）のいずれかに記載の医療用粒子、
（１５）前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤が重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランである（１４）に記載の医療用粒子、【００１４】
（１６）（１）〜（１５）のいずれかに記載の医療用粒子の製造方法であって、重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランを酸性水溶液中で加水分解する工程、次いで前記重合性官能基、または連鎖移動基を有するアルコキシシランの酸性水溶液中で核となる粒子を撹拌下、加熱する工程、及び乾燥後、更に加熱する工程、を含む医療用粒子の製造方法、
（１７）更に、重合性官能基、または連鎖移動基を導入した核となる粒子と重合性モノマーを溶媒中で混合することにより重合反応を進行させる工程、及び乾燥する工程を含む（１６）に記載の医療用粒子の製造方法、
（１８）前記重合反応がラジカル重合反応である（１７）に記載の医療用粒子の製造方法、【００１５】
（１９）生体分子の相互作用を分析するための粒子であって、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の前記生理活性物質を固定化する官能基を介して生理活性物質を固定化したことを特徴とする分析用粒子、
（２０）前記重合性成分がアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む（１９）に記載の分析用粒子、
（２１）前記生理活性物質を固定化する官能基がアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、及びビオチンよりなる群から選ばれる少なくとも一つの官能基である（１９）又は（２０）に記載の分析用粒子、
（２２）前記生理活性物質が核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインＡ，プロテインＧ、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、及び糖タンパクよりなる群から選ばれる少なくとも一つである（１９）〜（２１）のいずれかに記載の分析用粒子、【００１６】
（２３）（１９）〜（２２）のいずれかに記載の分析用粒子の製造方法であって、高分子化合物を含む層を形成した粒子に生理活性物質をリン酸塩緩衝液水溶液に溶解した溶液を接触させる工程を含む分析用粒子の製造方法、
（２４）前記リン酸塩緩衝液のリン酸塩濃度が０．１Ｍ以上５Ｍ以下である（２３）に記載の分析用粒子の製造方法、
（２５）前記リン酸塩がリン酸２水素カリウム、リン酸２水素ナトリウム、リン酸水素２カリウム、又はリン酸水素２ナトリウムである（２３）又は（２４）に記載の分析用粒子の製造方法、
（２６）（１９）〜（２２）のいずれかに記載の分析用粒子を、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、及び組織破砕液から選ばれる少なくとも一つの溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することを特徴とする分析用粒子の使用方法、
である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、目的とする生理活性物質の固定化能力に優れ、洗浄工程において表面の高分子化合物を含む層の溶解や劣化の少ない、化学的・物理的安定性を有する医療用粒子を提供することができる。また、高分子化合物の成分にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーからなる成分を加えることにより、タンパク質等の非特異的吸着がより少ない医療用粒子を提供することができる。
更に、本発明によれば、目的とする生体分子の捕捉能力に優れ、洗浄工程において表面の高分子化合物を含む層の溶解や劣化の少ない、化学的・物理的安定性を有する分析用粒子を提供することができる。また、高分子化合物の成分にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーからなる成分を加えることにより、タンパク質等の非特異的吸着がより少ない分析用粒子を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の医療用粒子は、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成した医療用粒子である。
また、本発明の分析用粒子は、生体分子の相互作用を分析するための粒子であって、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の生理活性物質を固定化する官能基を介して生理活性物質を固定化した分析用粒子である。【００１９】
本発明の粒子は、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、核となる粒子表面に高分子化合物を含む層を形成している。核となる粒子表面に形成される高分子化合物は、生理活性物質を固定化する官能基を有するため、特定の生理活性物質を固定化する性質をしている。さらに、本発明の粒子は、核となる粒子表面と共有結合を形成した重合性官能基、または連鎖移動基に高分子化合物を形成させるため、核となる粒子表面に高密度で該高分子化合物をグラフトさせることが可能である。このようにして得られたグラフト化粒子は、洗浄工程により該高分子化合物が流出してしまうことがない。更に、ポリマー中の官能基と粒子表面の官能基を反応させる従来の方法よりも、粒子表面に均一に高分子化合物を被覆することが可能になる。【００２０】
前記重合性成分には、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーが含まれるが、更に、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含むことが好ましい。アルキレングリコール残基は、タンパク質等の非特異的吸着を抑制する性質を有する。生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーが、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを兼ねていても良いし、生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーとは別にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが重合性成分に含まれていても良い。【００２１】
本発明に用いる生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーの官能基としては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチン、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、ストレプトアビジン、金属キレートなどがある。これらの中でも生理活性物質に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、また生理活性物質と結合定数が高い点ではビオチンが好ましい。なかでもモノマーの保存安定性の点から活性エステル基が最も好ましい。【００２２】
本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーとしては、特に構造を限定しないが、下記の一般式［１］で表される（メタ）アクリル基と活性エステル基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキレン基を介して結合した化合物であることが好ましい。下記の一般式［１］で表される化合物がアルキレングリコール残基の連鎖を有する場合、それ自体がタンパク質の非特異的吸着を抑制する性質を有している。このため、（メタ）アクリル基と活性エステル基がアルキレングリコール残基の連鎖を介して結合したモノマーは、生理活性物質を固定化する性質とタンパク質の非特異的吸着を抑制する性質とを併せ持つ。従ってこのようなモノマーの重合体は、たとえ単独の重合体であったとしても、粒子表面に層を形成する高分子化合物として好適に用いることができる。なお、本発明において（メタ）アクリルはアクリル及び／又はメタクリルを示し、（メタ）アクリレートは、アクリレート及び／又はメタクリレートを示す。【００２３】
【化３】
2008087909.tif 000004
（式中Ｒ1は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキレン基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、異なっていてもよい。）【００２４】
式［１］で、アルキレングリコール残基又はアルキレン基Ｘの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。なおここで、アルキレングリコール残基とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側末端又は両末端の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る、アルキレンオキシ基（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲはアルキレン基）をいう。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はエチレンオキシ基（−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）である。
Ｘの繰り返し数ｐは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜９０の整数であり、最も好ましくは２〜８０の整数である。各種ｐの混合物が用いられる場合には、重合体としては、ｐは平均値として特定される。繰り返し数ｐが２以上の場合は、繰り返されるＸは同一であっても、異なっていてもよい。【００２５】
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、例えば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。【００２６】
このような活性エステル基としては、−ＣＯＯＲ”で表されるＲ”に上記酸性度が高い電子吸引性基を有するものが挙げられる。例えば上記Ｒ”がｐ−ニトロフェニルである、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基；上記Ｒ”がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、上記Ｒ”がフタル酸イミドである、フタル酸イミド活性エステル基；上記Ｒ”が５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドである、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でも保存安定性と反応性の高さとのバランスの点からｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。【００２７】
生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーとしては、例えばｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートやスクシンイミドオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）（メタ）アクリレートを挙げることができるが、中でも、下記式で表されるｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）メタクリレートが好ましい。なお、エチレングリコールの繰り返し数ｐ及び／又はｐの平均値は２〜２０が好ましい。【００２８】
【化４】
2008087909.tif 000005
【００２９】
本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーの重合体中での割合は特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、１〜９９．７ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜７０ｍｏｌ％である。【００３０】
本発明に使用する重合性成分には、生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーとは別に、更にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが重合性成分に含まれていることが好ましい。生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーがアルキレングリコール残基を有する場合には、アルキレングリコール残基は通常、生理活性物質を固定化する官能基の位置を調整する機能も有する。そのため、重合性成分中に生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーとは別にアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含んで共重合体を形成する方が、タンパク質の非特異的吸着を抑制する性質と生理活性物質を固定化する性質のバランスを向上させる点から好ましい。
生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーとは異なるアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの構造は特に限定しないが、一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。【００３１】
【化５】
2008087909.tif 000006
（式中Ｒ２は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ３は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＹは、同一であっても、異なっていてもよい。）【００３２】
式［２］中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。各種ｑの混合物である場合には、重合体全体としては、ｑは平均値として特定される。【００３３】
アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。中でも、エチレングリコール残基の平均繰り返し数が３〜１００であるメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートが、合成時の操作性（ハンドリング）の良さの点から好ましく用いられる。【００３４】
生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーとは異なるアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを使用する場合の、当該アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーの重合体中での割合は特に制限されるものではないが、重合体における全モノマーの繰り返し単位の総数に対して、０〜９５ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは３０〜９５ｍｏｌ％、最も好ましくは５０〜９０ｍｏｌ％である。【００３５】
本発明において、核となる粒子表面に導入する重合性官能基としては、ビニル基、アリル基、メタクリル基、エポキシ基、スチレン基等が挙げられるが、重合性に優れている点でメタクリル基が好ましい。【００３６】
本発明において、核となる粒子表面に導入する連鎖移動基としては、メルカプト基、アミノ基等が挙げられるが、反応性に優れている点でメルカプト基が好ましい。【００３７】
粒子表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入する方法としては、特に限定されないが、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる粒子表面の官能基との共有結合を形成させる方法が好ましい。【００３８】
重合性官能基を有するシランカップリング剤としては、例えば、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジエチルメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジエチルエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）エチルジメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）エチルジエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリエトキシシラン等のアルコキシシランが挙げられるが、反応性が良好で被覆される高分子化合物量が多くなる点からメタクリル基を有するトリアルコキシシランが好ましく、中でも反応性、及び入手性の点から（３−メタクリロキシプロピル）トリメトキシシランや（３−メタクリロキシプロピル）トリエトキシシランが好ましい。これらのシランカップリング剤は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。【００３９】
連鎖移動基を有するシランカップリング剤としては、例えば（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン、（メルカプトメチル）トリメトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジメトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルメトキシシラン、（メルカプトメチル）トリエトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジエトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルエトキシシラン等のアルコキシシランが挙げられるが、入手性から（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシランや（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシランが好ましい。これらのメルカプトシラン化合物は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。【００４０】
重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を用いて、重合性官能基、または連鎖移動基と核となる粒子表面の官能基との共有結合を形成させる方法は特に制限されるものではないが、例えば、ｐＨ２〜４の酸性水溶液に重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を０．０１〜１．０ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、撹拌混合して加水分解した後、核となる粒子を投入して１０〜１００℃で５〜１８０分間撹拌し、次いで吸引ろ過により粒子を回収して乾燥させ、更に２０〜１００℃に加熱して粒子を乾燥させることによって行う。核となる粒子と重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤の使用割合は特に制限されるものではないが、通常核となる粒子１ｇに対し、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤０．１〜１０ｍｍｏｌの割合で用いられる。酸性水溶液は特に限定されるものではないが、酢酸水溶液、塩酸水溶液等が用いられる。なかでも、取り扱いが比較的容易な酢酸水溶液が好ましい。【００４１】
核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入した後に、該粒子と重合性モノマーを混合し、次いで重合反応を進行させる。この方法は特に限定されるものではないが、例えば重合性モノマー、及び重合開始剤を溶解した溶媒中に核となる粒子を投入し、撹拌下、０〜８０℃で１〜３０時間加熱することにより行われる。その後、核となる粒子は減圧下ろ過され、洗浄後乾燥される。【００４２】
核となる粒子と重合性モノマー、及び重合開始剤の使用割合は特に制限されるものではないが、通常核となる粒子１ｇに対し、重合性モノマー０．１〜１０ｍｍｏｌ、重合開始剤０．０１〜１０ｍｍｏｌの割合で用いられる。【００４３】
溶媒としてはそれぞれの重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、N，N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。【００４４】
重合開始剤としては特に限定されないが、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。【００４５】
本発明において、粒子表面に形成される高分子化合物の化学構造は、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーからなる（共）重合体であれば、当該重合体が共重合体の場合の結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。【００４６】
本発明に使用する核となる粒子の素材は、特に限定されるものではなく、有機物、無機物を問わず用いることができる。有機物の担体としては、アフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる、多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチルなどからなる粒子などが使用できる。一方、無機物としては、無機酸化物が粒子自体の強度が高く、好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。また、粒子の大きさは何ら制限を受けるものではなく、目的・用途に合わせて適宜選択できる。このことは核となる粒子の大きさを選択すれば、いかなる大きさの粒子でも作製できることを意味している。この点は粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で粒子を作製する方法に比較して、大きな利点となっている。実際に粒子として用いる場合には、用途によっても異なるが、粒径が数ｎｍから１００μｍ程度のものが好ましい。【００４７】
以上のように高分子化合物を含む層を表面に形成した本発明の粒子は、生理活性物質の固定化能力に優れた粒子である。また、粒子表面の高分子化合物を含む層の成分にアルキレングリコール残基を含む成分を加えることにより、目的とするタンパク質以外の成分による非特異的吸着を抑制する性質を増すことができる。しかも、核となる粒子表面と共有結合を形成した重合性官能基、または連鎖移動基に重合反応を進行させて高分子化合物を形成させるため、核となる粒子表面に高密度で該高分子化合物をグラフトさせることが可能である。このようにして得られたグラフト化粒子は、非特異的吸着が極めて低く、また洗浄工程により該高分子化合物が流出してしまうことがない。また、本発明の粒子は、末端に官能基を有する高分子化合物を核となる粒子にコーティング後反応することにより形成された粒子に比べて、粒子表面に化学的・物理的に安定して被覆される高分子化合物の量が多くなり、目的とする生理活性物質の固定化能力が高くなる。【００４８】
本発明の粒子表面に化学的・物理的に安定して被覆された高分子化合物の量は、例えばＸ線光電子分光法（ＥＳＣＡ：electron spectroscopy for chemical analysis）や、元素分析により測定可能である。
例えば、核となる粒子が二酸化ケイ素である場合、ＥＳＣＡによる測定により、粒子表面の高分子化合物に由来する炭素元素と二酸化ケイ素粒子に由来するケイ素元素のピーク強度比（Ｃ／Ｓｉ）から、二酸化ケイ素粒子表面に存在する高分子化合物の量を比較定量することができる。核となる粒子が二酸化ケイ素である場合、本発明の粒子は、粒子表面の高分子化合物に由来する炭素元素と二酸化ケイ素粒子に由来するケイ素元素のピーク強度比（Ｃ／Ｓｉ）が１．０以上であることを達成可能である。前記ピーク強度比（Ｃ／Ｓｉ）の上限は特に限定されないが、前記（Ｃ／Ｓｉ）が５．０以下を目安とすることができる。ここでＥＳＣＡによる測定は、Ｘ線光電子分光装置（例えば、アルバックファイ社製、ＥＳＣＡ５４００ＭＣ）を用いて、例えば、分析表面：１．０×３．５ｍｍ、Ｘ線源：ＭｇＫα線、出射角：４５ｄｅｇという条件で測定できる。
また、例えば、核となる粒子が無機材料である場合、元素分析により、本発明の粒子中の高分子化合物量を、粒子中の炭素元素含有量として定量することができる。核となる粒子が無機材料である場合、本発明の粒子は、粒子中の炭素元素含有量が１０〜４０重量％であることを達成可能である。ここで元素分析は、元素分析装置（例えば、パーキンエルマー２４００II型元素分析装置）を用いて行うことができる。【００４９】
以上のことから、本発明の粒子に生理活性物質を結合させた場合、その生理活性物質が捕捉する物質（タンパク質など）を効率よく回収できる。また、該粒子に生理活性物質を固定化する官能基を介して生理活性物質を固定化した粒子は、分析用粒子として好適に用いられる。【００５０】
高分子化合物を含む層を表面に形成した粒子に生理活性物質の固定化して本発明の分析用粒子を製造する方法としては、高分子化合物を含む層を形成した粒子に生理活性物質をリン酸塩緩衝液に溶解した溶液を接触させる工程を含むことが好ましい。【００５１】
リン酸塩緩衝液は、水溶液であって、各種リン酸塩が０．１Ｍ以上５．０Ｍ以下で溶解していることが好ましい。より好ましくは０．６Ｍ以上２．４Ｍ以下、もっとも好ましくは０．８Ｍ以上１．４Ｍ以下である。濃度が下限値未満では生理活性物質が十分に固定化できずシグナルが検出されないという問題が発生する恐れがあり、濃度が上限値を超えると生理活性物質が変性を起こし生理活性物質が特異的な反応を起こさず機能しないという問題が発生する恐れがある。【００５２】
本発明に使用するリン酸塩は、特に限定されるものではないが、リン酸アルミニウム、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムリン酸ナトリウム、リン酸インジウム、リン酸サマリウム、リン酸水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素カルシウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素アンモニウム、リン酸水素バリウム、リン酸二アンモニウム、リン酸二カリウムリン酸二水素２−アミノエチル、リン酸二水素アンモニウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素マンガン、リン酸二水素リチウム、リン酸二バリウム、リン酸ヒドロキシアンモニウム、リン酸尿素、リン酸リチウム、リン酸ジフェニル、リン酸トリエチル、リン酸トリオクチル、リン酸トリフェニル、リン酸トリブチル、リン酸トリメチル、リン酸ホウ素、リン酸マグネシウム、などが挙げられる。特に好ましくはリン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウムである。【００５３】
前記リン酸塩緩衝液に、生理活性物質を溶解した溶液を、高分子化合物を含む層を形成した粒子に接触させることにより、容易に生理活性物質を固定化できる。
生理活性物質を溶解した溶液を粒子に接触させる方法はさまざまであるが、たとえば容器に粒子を取り分けた後、溶液を分注し、攪拌する方法や、粒子をカラム状に充填し、溶液を送液することにより接触させる方法などがある。【００５４】
本発明の分析用粒子に固定化される生理活性物質としては、捕捉回収する物質により異なり特に限定されることは無いが、核酸、アプタマー、タンパク質、抗体、抗原、プロテインＡ、プロテインＧ、リガンド、ペプチド、グルタチオン、低分子化合物、ビオチン、糖鎖、レクチン、糖タンパク、ヘパリン、ゼラチン、ベンズアミジン、リジン、金属キレート等であることが好ましい。【００５５】
本発明の分析用粒子の使用方法の一つとして、標的生体分子の溶解液、血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、組織破砕液等の溶液に接触させることにより標的生体物質を回収することが挙げられる。
分析用粒子に固定化した生理活性物質が捕捉した物質である標的生体物質を回収する方法は、特に限定するものではなく、分析用粒子を検体溶液中に浸し、捕捉物質と生理活性物質の反応を行い、粒子上に捕捉物質を固定化し、ついで捕捉物質が固定化した粒子を塩濃度やpHを調整した溶液、または界面活性剤を含む溶液、交換反応を行うための化学種を含む溶液等に浸し、捕捉物質を遊離させる方法などが挙げられる。回収した物質を定量する方法としては、特に限定するものではなく、捕捉された物質に由来する特定波長の吸収や蛍光などを分光光度法で定量する方法や、SDS-PAGEなどが挙げられる。【００５６】
本発明の分析用粒子をカラムの充填剤として用いて生体試料から目的分子を精製するカラムとすることができる。カラムとしては特に限定するものではなく、アフィニティクロマト用、逆相クロマト用、疎水性相互作用クロマト用などに用いることができる。本発明は特にアフィニティークロマト用のカラム充填剤として適しており、該粒子をオープンカラムやフラッシュカラム、スピンカラムなどの充填剤として用いることができる。
かくして、本発明の分析用粒子は捕捉物質を精製回収する担体として好適に用いることができる。【００５７】
本発明の分析用粒子は、捕捉物質を回収するだけでなく、抗体と抗原との特異性を検出する免疫分析にも好適に用いることができる。免疫分析は特に限定するものではなく、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、蛍光検出、化学発光検出、放射性同位元素法、凝集法、免疫沈降法、イムノクロマト法など抗体と抗原の特異的な反応を利用した分析方法であるがいずれにも好適に用いることができる。
また、本発明の分析用粒子をマイクロ流路への充填剤としても用いることができ、微量検体からの物質回収、免疫分析、イムノクロマト法など各用途に用いることができる。
【実施例】
【００５８】
実施例Ｉシリーズ：医療用粒子の製造と評価
（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成）      
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂株式会社製Ｂｌｅｎｍｅｒ  ＰＥ−２００）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業株式会社製）及びクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を撹拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下ＭＥＯＮＰと記載）粗体を得た。さらに、得られた粗体をシリカゲルカラムにて精製を行った。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が４．５単位含まれていることを確認した。【００５９】
《実施例Ｉ−１》
メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（信越化学工業株式会社製ＬＳ３３８０）７．４５ｇをｐH３．０の酢酸水溶液３９．３ｇに添加し、室温で１時間攪拌した。そこにシリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）５ｇを投入し８５℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、得られたシリカビーズをエタノールで分散させて、室温で１時間振とうし、遠心分離により上澄みを除去する操作を２回繰り返し、さらに、エタノールで分散させてボルテックスミキサーで攪拌し、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回繰り返した後、乾燥させた。
数平均分子量Ｍｎ＝約４７５のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ４７５と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ＭＥＯＮＰを脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ４７５、ＭＥＯＮＰの順に８０：２０である。そこにＡＩＢＮを０．００４ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルトリメトキシシランで処理したシリカビーズ１ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で２２時間反応させた。次いで、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、エタノールで分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回繰り返した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた。【００６０】
《実施例Ｉ−２》
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン（ＧＥＬＥＳＴ社製）１３．０ｇをｐH３．０の酢酸水溶液１００ｇとエタノール１００mlを混合した溶液に添加し、室温で１時間攪拌した。そこにシリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）１０ｇを投入し７０℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後の洗浄、乾燥操作、及びＰＥＧＭＡ４７５、ＭＥＯＮＰとの重合反応、重合反応後の洗浄、乾燥操作は実施例１と同様の方法で行った。【００６１】
（非特異的吸着量評価）
実施例Ｉ−１、及び実施例Ｉ−２で得られたシリカビーズ約３７ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。得られたシリカビーズ１０ｍｇに５μｇ／ｍＬの西洋わさびペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと記載）標識化抗体溶液（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ社製Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎｓ／ＨＲＰをＰＢＳで２６０倍に希釈）２７０μＬを投入し、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、０．０５％の濃度で非イオン性界面活性剤（ＳＩＧＭＡ社製、ＴｒｉｔｏｎＸ１００（T9284-100ML））を含むＰＢＳを投入し、よく分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を１５回繰り返した後、フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、商標：Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにＨＲＰの基質である３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（以下ＴＭＢＺと記載）溶液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用）を加え室温で１５分間攪拌することによりＴＭＢＺとシリカビーズ表面に非特異的に吸着したＨＲＰ標識化抗体とを反応をさせた後、反応停止液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用）を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における４５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度には主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたＨＲＰ標識化抗体の量が反映される。【００６２】
（タンパク質の特異的捕捉評価）
実施例Ｉ−１、及び実施例Ｉ−２で得られたシリカビーズ約３７ｍｇを５０μｇ／ｍＬのアビジン溶液（ＰＩＥＲＣＥ製、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎＴＭＢｉｏｔｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  ＰｒｏｔｅｉｎをｐＨ８．５のリン酸水素二カリウム緩衝液で希釈）と混合し３７℃で４時間処理した後、遠心分離により上澄みを除去し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い、さらに０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。得られたシリカビーズ１０ｍｇにアビジンと特異的に結合する５μｇ／ｍＬのビオチン標識化ＨＲＰ溶液（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ＰｅｒｏｘｉｄａｓｅをＰＢＳで２００倍に希釈）２７０μＬ、または５μｇ／ｍＬのＨＲＰ標識化抗体溶液２７０μＬを投入し、室温で３０分間攪拌した後、遠心分離により上澄みを除去した。次いで、０．０５％の濃度で非イオン性界面活性剤（ＳＩＧＭＡ社製、ＴｒｉｔｏｎＸ１００（T9284-100ML））を含むＰＢＳを投入し、よく分散させた後、遠心分離により上澄みを除去する操作を１５回繰り返し、フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製、商標：Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣ）を用いてシリカビーズを回収した。回収したシリカビーズにＴＭＢＺ溶液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ用発色キットより調製し使用）を加え室温で１５分間攪拌することによりＴＭＢＺとシリカビーズ表面に特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰ、又は非特異的に吸着したＨＲＰ標識化抗体とを反応をさせた後、反応停止液（住友ベークライト株式会社製ペルオキシダーゼ発色キットより使用）を加え反応を停止させた。その後、フィルターユニットによりシリカビーズと反応液を分離し、反応液における４５０ｎｍの吸光度を測定した。この吸光度には上記操作においてビオチン標識化ＨＲＰ溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに特異的に捕捉されたビオチン標識化ＨＲＰの量が反映され、ＨＲＰ標識化抗体溶液を投入した場合には、主としてシリカビーズに非特異的に吸着されたＨＲＰ標識化抗体の量が反映される。【００６３】
（粒子の表面分析）
実施例Ｉ−１、及び実施例Ｉ−２で得られたシリカビーズを用いて、ＥＳＣＡによる表面分析を行った。シリカビーズ表面の高分子化合物に由来する炭素元素とシリカビーズに由来するケイ素元素のピーク強度比（Ｃ／Ｓｉ）から、シリカビーズ表面に存在する高分子化合物の量を比較定量することができる。【００６４】
《比較例Ｉ−１》
シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）をそのまま用い、前記と同様、非特異的吸着量評価、及びタンパク質の特異的捕捉評価を行った。【００６５】
《比較例Ｉ−２》
数平均分子量Ｍｎ＝約１１００のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ１１００と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、ＭＥＯＮＰを脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．３ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ１１００、ＭＥＯＮＰの順に７０：３０である。そこにさらに（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン（以下ＭＰＤＥＳと記載、アヅマックス社製）およびＡＩＢＮをそれぞれ０．００３ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を収集した。得られた高分子化合物の０．３ｗｔ％シクロヘキサノン溶液にシリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）を投入し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した。吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた後、１５０℃で２時間加熱処理を施した。
得られたシリカビーズを用い、前記と同様、表面分析、非特異吸着量評価、及びタンパク質の特異的捕捉評価を行った。【００６６】
表１には実施例Ｉ−１、実施例Ｉ−２、比較例Ｉ−１及び比較例Ｉ−２の非特異吸着量評価における４５０ｎｍの吸光度を示した。表より明らかなように、本発明の粒子は比較例Ｉ−１のシリカビーズ及び比較例Ｉ−２の粒子に比較して非特異吸着量は著しくに低下しており、タンパク質の非特異的吸着が抑制されていることがわかる。【００６７】
【表１】
2008087909.tif 000007
【００６８】
表２には実施例Ｉ−１、実施例Ｉ−２、比較例Ｉ−１及び比較例Ｉ−２のタンパク質の特異的捕捉評価における４５０ｎｍの吸光度を示した。表より明らかなように、本発明の粒子は非特異的吸着を抑制しつつも、標的とするタンパク質のみを特異的に捕捉することが可能である。【００６９】
【表２】
2008087909.tif 000008
【００７０】
表３には実施例Ｉ−１、実施例Ｉ−２、及び比較例Ｉ−２のＥＳＣＡによる表面分析の結果を示した。本発明の粒子は比較例Ｉ−２のシリカビーズと比較して、高いＣ／Ｓｉ値を示しており、本発明の粒子が、予め重合した高分子化合物をシリカビーズにコーティングした粒子よりも、多くの高分子化合物で被覆されていることがわかる。【００７１】
【表３】
2008087909.tif 000009
【００７２】
実施例シリーズＩＩ：分析用粒子の製造と評価
《実施例ＩＩ−１》
０．５Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａが１２μｇ／ｍｌになるように調製された溶液を作製した。この溶液５００μリットルに、上記実施例Ｉ−１で得られたシリカビーズ約１０ｍｇを入れ、３７℃で４時間攪拌し、１次抗体を固定化した。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。次いで０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させて、分析用粒子を得た。【００７３】
《実施例ＩＩ−２》
１．２Mのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液を用いた以外は実施例ＩＩ−１と同様に操作した。【００７４】
《実施例ＩＩ−３》
２．４Mのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液を用いた以外は実施例ＩＩ−１と同様に操作した。【００７５】
《比較例ＩＩ−１》
シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）をそのまま用いた。【００７６】
《比較例ＩＩ−２》
上記実施例Ｉ−１で得られたシリカビーズ約３７ｍｇを０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。【００７７】
《比較例ＩＩ−３》
上記比較例Ｉ−２で得られたシリカビーズを用いた以外は実施例ＩＩ−１と同様に操作した。【００７８】
評価１
（抗原抗体反応１）
ＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇ溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウスＩｇＧ２ａを添加し２０ｎｍｏｌ／リットルとした溶液を作製した。この溶液をＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇ溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）で１倍、２倍、３倍、４倍希釈溶液となるように希釈した。これらの希釈溶液および抗原であるマウスＩｇＧ２ａを含まない１０％ＦＢＳ溶液各1ｍｌを室温にて２時間、実施例ＩＩ−１〜ＩＩ−３、比較例ＩＩ−１〜ＩＩ−３で得られた分析用粒子１ｍｇと接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後、遠心分離により上澄みを除去した後、０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行った。【００７９】
（抗原抗体反応２）
二次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ２ａをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇ溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液１ｍｌと各ビーズ１ｍｇとを室温にて２時間、抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行った。【００８０】
（発色）
最後にＨＲＰ発色試薬である、ＴＭＢＺ発色キット（住友ベークライト株式会社製）を用いて発色反応を行った。発色剤１００容量に対し基質液を１容量の割合で加え発色液とした。発色液を１００μｌに各ビーズ１ｍｇを投入し、１５分間暗所で静置させた後、停止液を１００μｌ投入し発色反応を停止した。発色した溶液の４５０ｎｍの吸光度をＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーを用いて測定した。【００８１】
シグナル強度の結果を表４に示す。【００８２】
実施例ＩＩ−１〜ＩＩ−３では、ある一定濃度を用いて抗体を固定化することにより、抗原量に応じたシグナル値が確認された。比較例ＩＩ−１では、表面処理を施さないため、抗原の非特異吸着が抑えられていなかった。比較例ＩＩ−２では、1次抗体を固定化しなかったためシグナルが得られなかった。比較例ＩＩ−３では、予め重合した高分子化合物がシリカビーズへ十分に被覆できなかったため、抗原の非特異吸着が抑えられなかった。【００８３】
【表４】
2008087909.tif 000010
【００８４】
評価２
（抗原抗体反応１）
ＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇ溶解したバッファ）で１０％に希釈したヒト血清溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウスＩｇＧ２ａを添加し２０ｎｍｏｌ／リットルとした溶液を作製した。この溶液をＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇ溶解したバッファ）で１０％に希釈したヒト血清で４倍希釈溶液となるように希釈した。この希釈溶液1ｍｌを室温にて２時間、実施例ＩＩ−１〜ＩＩ−３、比較例ＩＩ−１〜ＩＩ−３で得られた分析用粒子と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後、遠心分離により上澄みを除去した後、０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行った。【００８５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
得られたビーズをグリシン―塩酸溶液（ｐＨ２．５）、３０μｌに分散させ、遠心分離により上澄液を回収した。得られた上澄液とlaemmli buffer（０．２５ＭＴｒｉｓｐＨ６．８、６％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、４０％グリセリン、０．０４％ブロモフェノールブルー水溶液）を1対1の割合で混合し、９０℃で５分加熱した。冷却後各溶液を２００Ｖで４５分間電気泳動を行った。電気泳動を行ったゲルを銀染色（和光純薬製、銀染色ＭＳキット、２９９−５８９０１）することにより得られたバンドを解析した。【００８６】
実施例ＩＩ−１〜ＩＩ−３では分子量６９ｋＤａ付近にラットアルブミン由来のバンドが確認できた。比較例ＩＩ−１は表面処理が施されていないため、ヒト血清由来のバンドが多く認められた。比較例ＩＩ−２はバンドが確認できなかった。比較例ＩＩ−３は、予め重合した高分子化合物がシリカビーズへ十分に被覆できなかったため、ヒト血清由来のバンドが多く認められた。【００８７】
《実施例ＩＩ−４》
０．５Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に５’末端にアミノ基を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＴＧＣＧＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ（配列番号１）（シグマジェノシス社製）を１μｇ／μｌの濃度になるように調製された溶液を作製した。この溶液５００μリットルに上記実施例Ｉ−１で得られたシリカビーズ約１０ｍｇを入れ、３７℃で４時間攪拌し、DNAを固定化した。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。次いで０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。【００８８】
《実施例ＩＩ−５》
１．２Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液を用いた以外は実施例ＩＩ−４と同様に操作した。【００８９】
《実施例ＩＩ−６》
４．５Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中を用いた以外は実施例ＩＩ−４と同様に操作した。【００９０】
《比較例ＩＩ−４》
上記比較例Ｉ−２で得られたシリカビーズを用いた以外は実施例ＩＩ−４と同様に操作した。【００９１】
評価３
ＤＮＡ溶液２；  ５’末端にビオチン標識を有した鎖長２４ｂｐのオリゴＤＮＡ（ＣＡＴＣＧＴＣＣＡＣＣＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＣＴＡ（配列番号２）（シグマジェノシス社製）を０．００２μｇ／μｌの濃度になるように３×ＳＳＣ（ここで、ＳＳＣとは、SIGMA社製、SSC Buffer 20x Concentrate（S6639−1L）を２０倍希釈したものをいい、組成は、クエン酸ナトリウム0.015mol／l、及び塩化ナトリウム0.15mol／lである。３×ＳＳＣとは、ＳＳＣを３倍に濃縮したものをいう。）、０．２％ＳＤＳの溶液に溶解した。
次に、この溶液と実施例ＩＩ−４〜ＩＩ−６、比較例ＩＩ−１、ＩＩ−２及びＩＩ−４で得られた分析用粒子１ｍｇを接触させ、６５℃で３時間攪拌することで、固定化されたオリゴＤＮＡとビオチン標識オリゴＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行なった。その後、遠心分離により上澄を除去した後、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で分散させ、遠心分離により上澄を除去する操作を５回行った。ついで各ビーズを０．１μｇ／ｍｌのストレプトアビジン溶液に分散させ、３０分間室温で攪拌した。遠心分離により上澄みを除去した後、０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行った。【００９２】
（発色）
最後にＨＲＰ発色試薬である、ＴＭＢＺ発色キット（住友ベークライト株式会社製）を用いて発色反応を行った。発色剤１００容量に対し基質液を１容量の割合で加え発色液とした。発色液を１００μｌに各ビーズ１ｍｇを投入し、１５分間暗所で静置させた後、停止液を１００μｌ投入し発色反応を停止した。発色した溶液の４５０ｎｍの吸光度をＴＥＣＡＮ社製プレートリーダーを用いて測定した。シグナル強度の結果を表５に示す。【００９３】
【表５】
2008087909.tif 000011
【００９４】
実施例は比較例と比較して高いシグナル量を示した。【００９５】
《実施例ＩＩ−７》
０．５Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に鎖長１８ｍｅｒのペプチド（ＣＥＲＩＫＩＫＡＬＩＰＫＮＡＧＶＳＤ）（株式会社免疫生物研究所社製）を１０μｇ／μｌの濃度になるように調製された溶液を作製した。この溶液５００μリットルに上記実施例Ｉ−１で得られたシリカビーズ約１０ｍｇを入れ、３７℃で４時間攪拌し、ペプチドを固定化した。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。次いで０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、ＭＥＯＮＰの不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。【００９６】
《実施例ＩＩ−８》
１．２Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中を用いた以外は実施例ＩＩ−７と同様に操作した。【００９７】
《実施例ＩＩ−９》
４．５Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中を用いた以外は実施例ＩＩ−７と同様に操作した。【００９８】
《比較例ＩＩ−５》
上記比較例Ｉ−２で得られたシリカビーズを用いた以外は実施例ＩＩ−７と同様に操作した。【００９９】
評価４
鎖長１８ｍｅｒのペプチド（ＣＥＲＩＫＩＫＡＬＩＰＫＮＡＧＶＳＤ）をウサギに免疫し、このペプチドに対する抗体を作製した。得られた抗血清を用いて評価を行った。【０１００】
ＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇ溶解したバッファ）で１０％に希釈したウサギ抗血清溶液を作製した。この溶液中１ｍｌ中で、室温にて２時間、実施例ＩＩ−７〜ＩＩ−９、比較例ＩＩ−１、ＩＩ−２及びＩＩ−５で得られた分析用粒子と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後、遠心分離により上澄みを除去した後、０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行った。【０１０１】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
得られたビーズをグリシン−塩酸溶液（ｐＨ２．５）、３０μｌに分散させ、遠心分離により上澄液を回収した。得られた上澄液とlaemmli buffer（０．２５ＭＴｒｉｓｐＨ６．８、６％ＳＤＳ、４０％グリセリン、０．０４％ブロモフェノールブルー水溶液）を1対1の割合で混合し、９０℃で５分加熱した。冷却後各溶液を２００Ｖで４５分間電気泳動を行った。電気泳動を行ったゲルを銀染色（和光純薬製、銀染色MSキット、２９９−５８９０１）することにより得られたバンドを解析した。【０１０２】
実施例ＩＩ−７〜ＩＩ−９では分子量５０ｋＤａ付近に抗体のＨ鎖に由来するバンドが確認できた。また分子量２５ｋＤａ付近に抗体のＬ鎖に由来するバンドが確認できた。比較例ＩＩ−１では抗体のＨ鎖、Ｌ鎖由来のバンド以外にウサギ血清に由来するバンドが多く確認された。比較例ＩＩ−２はバンドが確認できなかった。比較例ＩＩ−５では、予め重合した高分子化合物がシリカビーズへ十分に被覆できなかったため、ウサギ血清に由来するバンドが多く確認された。
【配列表】
2008087909000001.app
【国際調査報告】
2008087909.tif 000014
2008087909.tif 000015
2008087909.tif 000016
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