(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＴＰ）に融合されたＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）−αを含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質が、配列番号３０で表されるアミノ酸配列を有し、分子量が１０ｋＤａ〜１００ｋＤａであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が更に結合されたことを特徴とする融合タンパク質。
【請求項２】
（ａ）請求項１に記載の融合タンパク質の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする肝疾患予防又は治療用の薬剤学的組成物。
【請求項３】
肝疾患が、肝臓癌又は肝炎である請求項２に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
血管に投与される請求項２に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＴＰ）に融合されたＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）−αを含むＩＦＮ−α融合タンパク質に関し、より詳細には、細胞膜結合能力が向上し、細胞内に導入された後には、核への移動が抑制され、優れた肝移動及び肝組織浸透特性を有するペプチドであるＣＴＰをヒトインターフェロン−アルファタンパク質のＮ−末端又はＣ−末端に融合して新しい特性を有するインターフェロンタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロンは肝炎治療剤として使用されてきており、インターフェロン−α製剤（Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ：Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，Ｒｏｆｅｒｏｎ−Ａ：Ｒｏｃｈｅ）及びインターフェロン−α製剤よりも投与回収を減らしたＰＥＧｙｌａｔｅｄ  ＩＦＮ  製剤（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ：Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，Ｐｅｇａｓｙｓ：Ｒｏｃｈｅ）等として販売されている。
【０００３】
インターフェロン−アルファ治療の初期副作用として、発熱、悪寒、全身無力感、食欲不振、吐き気及び筋肉痛があり、このような症状は、ほぼ全ての患者において投与用量に比例して現われるが、治療初期に最もひどく、一般的に治療を中断すればなくなる。また、Ｂ型慢性肝炎患者においてＰＥＧ−インターフェロン−アルファ治療中の副作用の頻度と重症度は、インターフェロン−アルファ治療と類似することが知られている（１）。
【０００４】
上記のように、インターフェロンの投与用量による副作用が知られるため、治療剤としてインターフェロンを使用するにあたり、その投与量の減少が要求されている。
【０００５】
本明細書全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、肝移動能力、肝滞留特性、及び肝組織浸透特性に優れ、より優秀な効能を有するインターフェロンを開発すべく努力した。その結果、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ＣＴＰ）をヒトインターフェロンに融合した融合タンパク質を製造することで上記融合タンパク質の優れた肝移動能力、肝組織浸透効果及び肝滞留特性を確認して、既存の治療剤が有していた副作用及び高コストの問題を解決することを確認し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、ＩＦＮ−α融合タンパク質を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記ＩＦＮ−α融合タンパク質をコードする核酸分子を提供することにある。
【０００９】
本発明のまた他の目的は、上記核酸分子を含むベクターを提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、上記ベクターを含む形質転換体を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、ＩＦＮ−α融合タンパク質の製造方法を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、ＩＦＮ−α融合タンパク質の精製方法を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、肝疾患予防又は治療用の薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、肝疾患予防又は治療方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、更に明確となる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一様態によれば、本発明は、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＴＰ）に融合されたＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）−αを含むＩＦＮ−α融合タンパク質を提供する。
【００１７】
本発明者らは、肝移動能力、肝滞留特性、及び肝組織浸透特性に優れ、より優秀な効能のインターフェロンを開発すべく努力した。その結果、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ＣＴＰ）をヒトインターフェロンに融合した融合タンパク質を製造することで、上記融合タンパク質の優れた肝移動能力、肝組織浸透効果及び肝滞留特性を確認した。
【００１８】
本明細書において「ＩＦＮ−α融合タンパク質」とは、ＣＴＰに融合されたＩＦＮ−αを含むタンパク質を意味する。
【００１９】
本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質に含まれるＣＴＰは、本発明者らによって、ＣＴＰの問題点を解決するために世界で最初に開発された伝達ペプチド（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ）であって、これを出願して特許登録され（大韓民国特許第０６０８５５８号公報、米国特許第７１０１８４４号公報、及び日本国特許第４１８８９０９号公報）、上記特許文献に開示されているＣＴＰに関する内容は、本発明の内容として挿入される。
【００２０】
本明細書において「細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ＣＴＰ）」とは、本発明者らによって最初に導入された用語であって、細胞膜透過能を保有しながらも細胞質に残留する特性、即ち核内への移動が抑制される特性を有するペプチドを意味する。
【００２１】
本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質に含まれるＣＴＰにおいて、ペプチドの長さは、当業界に受け容れられる一般的な長さに該当し、好ましくは９アミノ酸〜２０アミノ酸、より好ましくは９アミノ酸〜１５アミノ酸、最も好ましくは１１アミノ酸である。
【００２２】
本発明の好ましい実施例によれば、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質に含まれるＣＴＰは、配列表の第１３配列乃至第２６配列から構成された群より選択されるアミノ酸配列を含み、より好ましくは配列表の第１３配列乃至第１８配列、第２０配列乃至第２２配列、第２５配列及び第２６配列から構成された群より選択され、最も好ましくは第１３配列及び第２５配列から構成された群より選択される。
【００２３】
ＣＴＰは、細胞膜結合能力に優れ、細胞内に導入された後にも核への移動が抑制される特性を有し、生体内で他の伝達体（特に、ＰＴＤ又はポリアルギニン）に比べて細胞毒性が低く、且つ融合されたタンパク質を肝に移動させる独特の性質を有しており、肝をターゲットとする疾患治療のための効果的な薬物伝達ペプチドである。
【００２４】
本明細書において「インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）」とは、ウイルスの複製及び細胞増殖を抑制して免疫反応を調節する、同質性が大きく、種特異的なタンパク質群を意味する。
【００２５】
本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質に含まれるＩＦＮ−αは、組み換えＩＦＮ−α２ｂ、組み換えＩＦＮ−α２ａ、組み換えＩＦＮ−α２ｃ、天然アルファ−インターフェロンの精製された混合物であるＩＦＮ−α−ｎ１、コンセンサスアルファ−インターフェロン（米国特許第４，８９７，４７１号公報及び第４，６９５，６２３号公報参照）又は天然アルファ−インターフェロンの混合物であるＩＦＮ−α−ｎ３であり、より好ましくはＩＦＮ−α２ａ又はＩＦＮ−α２ｂ、最も好ましくはＩＦＮ−α２ｂである。ＩＦＮ−α２ｂの製造方法は、米国特許第４，５３０，９０１号公報に詳しく記載されている。
【００２６】
本発明の好ましい実施例によれば、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質に含まれるＩＦＮ−αは、配列表の第２８配列のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本発明の他の好ましい実施例によれば、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質は、上記ＣＴＰが上記ＩＦＮ−αのＮ−末端又はＣ−末端に融合され、より好ましくは、上記ＣＴＰが上記ＩＦＮ−αのＮ−末端に連結される。
【００２８】
本発明の好ましい実施例によれば、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質は、上記ＣＴＰが上記ＩＦＮ−αのＮ−末端に連結される場合には、配列表の第３０配列のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
本発明の他の好ましい実施例によれば、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質は、上記ＣＴＰが上記ＩＦＮ−αのＣ−末端に連結される場合には、配列表の第３２配列のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
本発明の他の更に好ましい実施例によれば、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が更に結合されてもよく、上記ＰＥＧを結合させるＰＥＧ化反応は、当業界の一般的な方法で行われることができる（Ｍ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｍ．Ｄ．Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ；５４：４５９  ４７６（２００２）；Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｍ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ；２２：４０５−４１７（２００１））。
【００３１】
本発明のより好ましい実施例によれば、本発明の融合タンパク質に結合されるＰＥＧの分子量は、好ましくは１０ｋＤａ〜１００ｋＤａであり、より好ましくは１０ｋＤａ〜６０ｋＤａであり、最も好ましくは１５ｋＤａ〜４０ｋＤａである。ＰＥＧの分子量が、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａである場合、腎クリアランス機序を減少させて血液内の維持時間を延長させることで、本発明の融合タンパク質の投与量を減少させる効果を有する。
【００３２】
本発明の他の様態によれば、本発明は、上述した本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００３３】
本明細書において「核酸分子」とは、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む（Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０））。
【００３４】
本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質に含まれるＩＦＮ−αのヌクレオチド配列は、配列表の第２７配列のヌクレオチド３０〜５３３を含む。本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質をエンコードする核酸分子は、最も好ましくは、配列表の第２９配列のヌクレオチド３０〜５６６又は配列表の第３１配列のヌクレオチド３１〜５６７を含む。ＣＴＰ−融合ＩＦＮ−αをコードする本発明の核酸分子は、上記のヌクレオチド配列に対して実質的な同一性を示すヌクレオチド配列も含むものと解釈される。上記の実質的な同一性とは、上記本発明のヌクレオチド配列と任意の他の配列とを最大限対応するようにアライメントし、当業界で通常利用されるアルゴリズムを用いてアライメントされた配列を分析した場合に、最小８０％の相同性、より好ましくは最小９０％の相同性、最も好ましくは最小９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
【００３５】
本発明の他の様態によれば、本発明は、ＣＴＰ−融合ＩＦＮ−αをコードする上述した本発明の核酸分子を含むＩＦＮ−α融合タンパク質発現用ベクターを提供する。
【００３６】
本発明のベクターシステムは、当業界に公知された多様な方法を通じて構築されることができ、これに関する具体的な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）に開示されており、この文献は、本明細書に参照として挿入される。
【００３７】
本発明のベクターは、典型的にクローニングのためのベクター又は発現のためのベクターとして構築されてもよい。また、本発明のベクターは、原核細胞又は真核細胞を宿主として構築されてもよい。本発明のヌクレオチド配列が原核細胞由来であり、培養の便宜性などを考慮して、原核細胞を宿主とすることが好ましい。
【００３８】
本発明のベクターが発現ベクターであり、原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させることができる強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーター等)、解読開始のためのリボソーム結合部位及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。宿主細胞として、Ｅ．ｃｏｌｉを用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター及びオペレータ部位（Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４（１９８４））及びファージλの左向プロモーター（ｐＬλプロモーター、Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ,Ｉ．ａｎｄ  Ｈａｇｅｎ，Ｄ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３９９−４４５（１９８０））を調節部位として用いてもよい。
【００３９】
なお、本発明に用いられるベクターは、当業界において頻繁に使用されるプラスミド（例えば、ｐＳＣ１０１、ＣｏｌＥ１、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＨＣ７９、ｐＵＣ１９、ｐＥＴ等）、ファージ（例えば、λｇｔ４．λＢ、λ−Ｃｈａｒｏｎ、λΔｚ１及びＭ１３等）又はウイルス（例えば、ＳＶ４０等）を操作して作製してもよい。
【００４０】
一方、本発明のベクターは、発現ベクターであり、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来されたプロモーター(例えば、メタロチオニンプロモーター等)又は哺乳動物ウイルスから由来されたプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター及びＨＳＶのｔｋプロモーター等）を用いることができ、一般的に、転写終結配列としてポリアデニル化配列を有する。
【００４１】
本発明のベクターは、それより発現される本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質の精製を容易にするために、必要に応じて他の配列と融合されてもよく、融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスファラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘ  Ｈｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｕｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）等を用いてもよいが、これらに制限されるものではない。
【００４２】
本発明の好ましい実施例によれば、本発明のベクターによって発現されたＩＦＮ−α融合タンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーにより精製される。
【００４３】
なお、本発明の発現ベクターは、選択標識として、当業界で通常用いられる抗生物質耐性遺伝子を含んでもよく、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン、テトラサイクリンに対する耐性遺伝子などが挙げられる。
【００４４】
本発明の他の様態によれば、本発明は、上述した本発明のベクターを含む形質転換体を提供する。
【００４５】
本発明のベクターを安定して連続的にクローニング及び発現させることができる宿主細胞は、当業界に公知のいずれの宿主細胞をも用いることができ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲ１、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ  １７７６、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、バチルスサブティリス、バチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、サルモネラチピムリウム、セラチア菌、多様なシュードモナス種等の腸内細菌、菌株などが挙げられる。
【００４６】
また、本発明のベクターを真核細胞に形質転換させる場合には、宿主細胞として、例えば、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞及びヒト細胞（例えば、ＣＨＯ細胞（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞等）などが用いられる。
【００４７】
本発明のベクターを宿主細胞内に運ぶ方法としては、宿主細胞が原核細胞の場合、ＣａＣｌ２法（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３））；ハナハン法（Ｃｏｈｅｎ,Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｃ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９：２１１０−２１１４（１９７３）及びＨａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６：５５７−５８０（１９８３））；電気穿孔法（Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：６１２７−６１４５（１９８８））等により実施される。更に、宿主細胞が真核細胞の場合、マイクロインジェクション法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．，Ｃｅｌｌ，２２：４７９（１９８０））；カルシウムフォスフェート沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３））；電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１：８４１（１９８２））；リポソーム媒介形質感染法（Ｗｏｎｇ，Ｔ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７（１９８０））；ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０（１９８５））；遺伝子衝撃法（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９５６８−９５７２（１９９０））等によりベクターを宿主細胞内に注入することができる。
【００４８】
宿主細胞内に注入されたベクターは、宿主細胞内で発現されることができ、このような場合、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質が多量に得られる。例えば、上記発現ベクターがｌａｃプロモーターを含む場合には、宿主細胞にＩＰＴＧを処理して遺伝子発現を誘導することができる。
【００４９】
以下、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質の製造方法又は精製方法は、上述した本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質を製造又は精製する方法であるため、両方間で共通する内容は、繰り返し記載による明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【００５０】
本発明の他の様態によれば、本発明は次のステップを含むＩＦＮ−α融合タンパク質の製造方法を提供する：（ａ）プロモーターに作動的に連結された上述した本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターを製造するステップ；（ｂ）上記ステップ（ａ）の発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養するステップ；及び（ｃ）上記ステップ（ｂ）の形質転換体培養液からＩＦＮ−α融合タンパク質を得るステップ。
【００５１】
本明細書において「作動的に連結された」とは、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合部位のアレイ)と他の核酸配列との間の機能的な結合を意味し、これにより上記調節配列は、上記他の核酸配列の転写及び／又はトランスレーションを調節する。
【００５２】
本発明の他の様態によれば、本発明は次のステップを含むＩＦＮ−α融合タンパク質の精製方法を提供する：（ａ）プロモーターに作動的に連結された上述した本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された形質転換体を培養するステップ；（ｂ）上記ステップ（ａ）の形質転換体培養液からＩＦＮ−α融合タンパク質凝集体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を得るステップ；及び（ｃ）上記ステップ（ｂ）の凝集体をｐＨ１０〜ｐＨ１２の溶解化（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）緩衝液に溶解し、リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）緩衝液で４℃〜２５℃及びｐＨ８〜ｐＨ１０の条件で撹拌するステップ。
【００５３】
本発明の好ましい実施例によれば、上記ステップ（ｃ）の溶解化緩衝液は、ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ及び尿素を含み、上記リフォールディング緩衝液は、ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＥＤＴＡ、尿素、スクロース、並びに酸化及び還元グルタチオンから構成された群より選択される。
【００５４】
本発明の他の様態によれば、本発明は（ａ）上述した本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む肝疾患予防又は治療用の薬剤学的組成物を提供する。
【００５５】
本発明の他の様態によれば、本発明は（ａ）上述した本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与するステップを含む肝疾患予防又は治療方法を提供する。
【００５６】
本発明の他の様態によれば、本発明は肝疾患予防又は治療用の薬剤学的組成物を製造するための上述した本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質の用途を提供する。
【００５７】
本発明の好ましい実施例によれば、本発明の組成物は血管に投与され、より好ましくは血管に投与される組成物の有効成分はＰＥＧが結合された、ＣＴＰ融合ＩＦＮ−αの融合タンパク質である。
【００５８】
本発明の組成物によって予防又は治療される肝疾患は、肝臓癌、肝炎、肝硬変症及びその他肝疾患を含み、好ましくは肝臓癌及び肝炎を含み、より好ましくはＢ型又はＣ型肝炎である。
【００５９】
本発明の他の様態によれば、本発明は上述した本発明のＣＴＰと肝疾患治療用薬物が融合されたＣＴＰ−薬物融合タンパク質を提供する。
【００６０】
また、本発明は（ａ）ＣＴＰと肝疾患治療用の薬物とが融合されたＣＴＰ−薬物融合タンパク質の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む肝疾患予防又は治療用の薬剤学的組成物を提供する。
【００６１】
本発明の他の様態によれば、本発明は（ａ）ＣＴＰと肝疾患治療用の薬物とが融合されたＣＴＰ−薬物融合タンパク質の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む薬剤学的組成物を対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与するステップを含む肝疾患予防又は治療方法を提供する。
【００６２】
本発明の他の様態によれば、本発明は、肝疾患予防又は治療用の薬剤学的組成物を製造するためのＣＴＰと肝疾患治療用の薬物とが融合されたＣＴＰ−薬物融合タンパク質の用途を提供する。
【００６３】
本発明の好ましい実施例によれば、本発明に含まれる肝疾患治療用の薬物は、当業界に公知の多様な薬物を含み、好ましくは非経口投与される薬物、更に好ましくは血管に投与される薬物を含む。
【００６４】
上記肝疾患治療用の薬物とＣＴＰとの融合は、薬物の種類及び形態によって、本発明のＩＦＮ−α融合タンパク質の製造方法又は、当業界に公知のタンパク質融合技術を用いて行ってもよく、例えば、ペプチドリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）等を用いて行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本明細書において「薬剤学的有効量」とは、上述した本発明の融合タンパク質の効能又は活性を達成するのに十分な量を意味する。
【００６６】
本発明の薬剤学的組成物は、必要に応じて薬剤学的に許容される通常の無毒性担体、補助剤及び賦形剤を含有する用量単位製剤であって、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、直腸内又は局所的に投与することができ、好ましくは非経口的に投与することができる。また、局所投与は、経皮的パッチ剤のような経皮投与又はイオン泳動装置を用いることを含んでもよい。
【００６７】
本明細書において「非経口的投与」とは、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入技術を含む。薬物製剤は、例えば、文献（Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５）に開示されている。薬物製剤に関する内容は、文献（Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．及びＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０）より確認することができる。
【００６８】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤の際に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油等を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、上記成分の他に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤等を更に含んでもよい。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５）に詳しく記載されている。
【００６９】
本発明の薬剤学的組成物の好適な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食事、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって多様に処方されることができる。本発明の薬剤学的組成物の投与量は、大人基準で、好ましくは、０．００１μｇ／ｋｇ（体重）〜１００μｇ／ｋｇ（体重）である。
【００７０】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することで、単位用量形態で製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させて製造されることができる。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤を更に含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、大腸菌のコドン使用頻度が考慮されたヒトインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）のＰＣＲ合成遺伝子（ｓＩＦＮ）を示す図である。
【図２】図２は、ＩＦＮ−αのＮ−末端にＣＴＰが融合されたＩＦＮ−αのＰＣＲ合成遺伝子（ＣＴＰ−ｓＩＦＮ）及びアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３は、ＩＦＮ−αのＣ−末端にＣＴＰが融合されたＩＦＮ−αのＰＣＲ合成遺伝子（ｓＩＦＮ−ＣＴＰ）及びアミノ酸配列を示す図である。
【図４】図４は、ｓＩＦＮｎ、ＣＴＰ−ｓＩＦＮ及びｓＩＦＮ−ＣＴＰのＰＣＲ結果を示すゲル写真である。レーン１は、ＣＴＰ−ｓＩＦＮを、レーン２は、ｓＩＦＮ−ＣＴＰを、レーン３は、ｓＩＦＮを示す。
【図５ａ】図５ａは、ｐＩＦＮ、ｐＮＩＦＮ及びｐＣＩＦＮの発現ベクターを製造する過程を示す図である。
【図５ｂ】図５ｂは、ｓＩＦＮ、ＣＴＰ−ｓＩＦＮ及びｓＩＦＮ−ＣＴＰタンパク質をエンコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含むｐＥＴ−２１ｂの遺伝子地図である。
【図６】図６は、ＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮタンパク質を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング分析結果を示す写真である。（−）は、誘導しない場合を示し、（＋）は、ＩＰＴＧ誘導を示す。
【図７】図７は、ＩＦＮ、ＣＴＰ−ＩＦＮ及びＩＦＮ−ＣＴＰタンパク質を確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示す写真である。（−）は、誘導しない場合を示し、（＋）は、ＩＰＴＧ誘導を示す。
【図８】図８は、ＩＦＮ及びＣＴＰ−ＩＦＮタンパク質のＨｅＬａ細胞膜結合の有無を共焦点走査顕微鏡を用いて観察した写真である。
【図９】図９は、ＣＴＰ−融合ＩＦＮタンパク質がＨｅＬａ又はＨｅｐＧ２細胞内で核膜を通過せずに細胞質にのみ留まっていることを示す、共焦点走査顕微鏡を用いて観察した写真を示す。
【図１０】図１０は、ＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮタンパク質のランダムＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）反応結果を示すゲル写真である。
【図１１】図１１は、ＰＥＧ−ＩＦＮ及びＰＥＧ−ＣＴＰ融合ＩＦＮタンパク質をマウスの静脈に投与した後、インビボイメージングステムであるＩＶＩＳ−２００を用いて体内分布を示す写真である。
【図１２】図１２は、ＰＥＧ−ＩＦＮ、ＰＥＧ−Ｎ末端ＣＴＰ融合ＩＦＮ及びＰＥＧ−Ｃ末端ＣＴＰ融合ＩＦＮタンパク質をマウスに投与した後、投与タンパク質の肝組織内の相対濃度測定結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、ＰＥＧ−ＩＦＮ及びＰＥＧ−ＣＴＰ融合ＩＦＮタンパク質のマウスの肝組織凍結断片（Ｃｒｙｏ  ｓｅｃｔｉｏｎ）の蛍光顕微鏡観察結果を示す写真である。
【図１４】図１４は、ＰＥＧ−ＩＦＮ、ＰＥＧ−Ｎ末端ＣＴＰ融合ＩＦＮ及びＰＥＧ−Ｃ末端ＣＴＰ融合ＩＦＮタンパク質をマウスに投与した後、時間経過による肝における投与タンパク質の相対濃度測定結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＩＦＮ、ＰＥＧ−ＩＦＮ、Ｎ−末端ＣＴＰ融合ＩＦＮ及びＰＥＧ−Ｎ末端ＣＴＰ融合ＩＦＮタンパク質の抗ウイルス活性測定結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に沿って本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【実施例】
【００７３】
（実施例１：大腸菌での高発現のためのヒトインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）遺伝子の鋳型合成）
ヒト由来のインターフェロン−アルファ（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α，ＩＦＮ−α）遺伝子は大腸菌でよく発現されない相当数のコドンを含んでおり、変形せずに使用する場合ＩＦＮタンパク質の発現率が非常に低いものと知られている。特に、ＡＧＧ／ＡＧＡ、ＣＵＡ、ＡＵＡ、ＣＣＡ又はＣＣＣのようなコドンクラスターは大腸菌で発現されるタンパク質の量と質をいずれも低下させるものと報告されている（２、３）。
【００７４】
これらの中で最も深刻な影響を与えるものとして、ＡＧＧコドンクラスターが挙げられるが、その理由は使用できるｔＲＮＡのプール（ｐｏｏｌ）が制限されており、且つ、該クラスターはシャイン−ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と類似して、リボソームと競争的に結合するからであると理解されている（４、５）。
【００７５】
このような低発現の問題を解決するために、大腸菌のコドン使用頻度を考慮してレアコドン（ｒａｒｅ  ｃｏｄｏｎ）を除外させた、ヒトＩＦＮ−α遺伝子の全体配列を化学的に合成しようとした。まず、大腸菌のコドン使用頻度に最適化されたヒトＩＦＮ−α２ｂの遺伝子を得るために、１８個のヌクレオシドが互いに重複するように下記表１のような 6個のオリゴマーを合成した。：
【００７６】
【表１】
0005576928.tif 000002
【００７７】
（実施例２：ＩＦＮ又はＣＴＰ−融合ＩＦＮ遺伝子のＰＣＲ合成）
ＩＦＮ、これのＮ−末端又はＣ−末端にＣＴＰペプチドが融合されたＩＦＮのＤＮＡを得るために、下記表２のプライマーを用いて上記表１のヒトＩＦＮ遺伝子のオリゴマーを鋳型としてＳＯＥｉｎｇ  ＰＣＲを実施した（６）。：
【００７８】
【表２】
0005576928.tif 000003
【００７９】
（実施例２−１：ＩＦＮタンパク質の高発現のための変形ＩＦＮ−α遺伝子（ｓＩＦＮ）の合成）
ヒト由来の遺伝子を変形せずに大腸菌で発現する場合、発現量が非常に少ない問題点があった。これを解決するために、大腸菌のコドン使用頻度が考慮された合成遺伝子を得るために２段階の反応を実施した。まず、上記表１の６個のオリゴマーを同量ずつ交ぜてｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミクスチャーを添加した後、６０℃で３０分間反応させてコドン使用頻度によって合成された、ヒトＩＦＮ−α遺伝子の鋳型を作製した。この鋳型にＣＦＮ−４及びＣＦＮ−３プライマーでＰＣＲを実施して、図１のようなヒトＩＦＮ−αの遺伝子を得た（配列表の第２７配列）。このようにして得られた約０．５５ｋｂのＰＣＲ結果物を図４のレーン３に示す。
【００８０】
（実施例２−２：Ｎ−末端ＣＴＰ−融合ＩＦＮ−α遺伝子（ＣＴＰ−ｓＩＦＮ）の合成）
ＩＦＮ−αのＮ−末端にＣＴＰペプチドを付着するために３段階の反応を実施した。まず、上記表１の６個のオリゴマーを同量ずつ交ぜてｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＮＴＰミクスチャーを添加した後、６０℃で３０分間反応させてコドン使用頻度によって合成されたヒトＩＦＮ−α遺伝子の鋳型を作製した。この鋳型にＣＦＮ−１及びＣＦＮ−３プライマーで１次ＰＣＲを実施した後、更にこれを鋳型としてＣＦＮ−２及びＣＦＮ−３プライマーで２次ＰＣＲを実施して、図２のようなアミノ酸配列を有するＮ−末端にＣＴＰが融合されたヒトＩＦＮ−αの遺伝子を得た（配列表の第２９配列）。このようにして得られた約０．５８ｋｂのＰＣＲ結果物を図４のレーン１に示す。
【００８１】
（実施例２−３：Ｃ−末端ＣＴＰ−融合ＩＦＮ−α遺伝子（ｓＩＦＮ−ＣＴＰ）の合成）
上記実施例２−２のＮ−末端ＣＴＰ融合ＩＦＮと同一の方法でヒトＩＦＮ−α遺伝子の鋳型を作製し、これにＣＦＮ−４及びＣＦＮ−５プライマーで１次ＰＣＲを実施した後、
ＣＦＮ−４及びＣＦＮ−６プライマーで２次ＰＣＲを実施して、図３のようなアミノ酸配列を有するＣ−末端にＣＴＰが融合されたヒトＩＦＮ−αの遺伝子を合成した（配列表の第３１配列）。このようにして得られた約０．５８ｋｂのＰＣＲ結果物を図４のレーン２に示す。
【００８２】
（実施例３：ＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮの大腸菌発現ベクターの製造）
ＰＣＲを通じて確保された３種類（ｓＩＦＮ、ＣＴＰ−ｓＩＦＮ、及びｓＩＦＮ−ＣＴＰ）の遺伝子を大腸菌で発現するために、図５ａのような過程を経て大腸菌発現ベクターであるｐＥＴ−２１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にそれぞれクローニングを実施して、ｐＩＦＮ、ｐＮＩＦＮ、及びｐＣＩＦＮの３個の発現ベクターを製造した。まず、それぞれのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングして塩基配列を分析し、所望のアミノ酸配列が変形されずに合成された３種類の組み換えｐＧＥＭ−Ｔベクター（ｓＩＦＮ／ｐＧＥＭ−Ｔ、ＣＴＰ−ｓＩＦＮ／ｐＧＥＭ−Ｔ及びｓＩＦＮ−ＣＴＰ／ｐＧＥＭ−Ｔ）を得た。このような組み換えｐＧＥＭ−ＴベクターからＰＣＲ時にプライマーに含ませておいた制限酵素セットを用いてインサート（ｉｎｓｅｒｔ）を得て、これらをｐＥＴ−２１ｂベクターに導入して最終３種類の発現ベクター（ｐＩＦＮ、ｐＮＩＦＮ、及びｐＣＩＦＮ）を完成した（図５ｂ）。
【００８３】
（実施例４：大腸菌におけるＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮの発現及び確認）
ｐＥＴ−２１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いてそれぞれ構成された発現ベクターを発現用大腸菌であるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換させ、３種類の生産菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＩＦＮ、ｐＮＩＦＮ、及びｐＣＩＦＮ）を作製し、これらをＬＢ培地で６００ｎｍ波長の吸光度が０．４になるまで培養した。次に、０．４ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）のＩＰＴＧを添加してさらに４時間培養してＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングを通じて正常なＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮが生成されることを確認した（図６）。
【００８４】
（実施例５：ＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮの製造）
上記ＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮを大量確保するために、５Ｌ醗酵槽を用いた大量培養及び精製を実施した。
【００８５】
（実施例５−１：５Ｌ醗酵槽を用いた大量培養）
生産菌株Ｅ.ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＩＦＮ、ｐＮＩＦＮ、及びｐＣＩＦＮでインターフェロン（ｐＩＦＮ）又はＣＴＰ−融合インターフェロン（ｐＮＩＦＮ又はｐＣＩＦＮ）を大量確保するために、５Ｌ醗酵槽（ＢｉｏＳｔａｔ（登録商標）Ｂ，Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．)を用いて大量培養を実施した。まず、２ｘＹＴ培地（トリプトン１６ｇ、酵母抽出物１０ｇ及びＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ）６０ｍＬにアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）を５０μｇ／ｍＬとなるように添加した後、それぞれの菌株を植菌して３７℃で１６時間培養した。この培養液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）が添加された３ＬのＴＢ醗酵槽培地（酵母抽出物２４g、トリプトン１２ｇ、グリセロール０．４質量％、ＫＨ２ＰＯ４  ２．３１ｇ又はＫ２ＨＰＯ４  １２．５４ｇ／Ｌ）に全部植菌して３７℃で培養し、６００ｎｍで吸光度を測定して約３になったときに、最終濃度０．４ｍＭ（ｍｍｏｌ／Ｌ）のＩＰＴＧを添加してタンパク質の発現を誘導した。次に、更に６時間培養して細胞を回収して発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した（図７）。
【００８６】
（実施例５−２：凝集体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）の分離及びリフォールディング （ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ））
上記大量発現した培養液から細胞を回収して、ＴＥ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した後、ホモジナイザー（ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  Ｃ−３，Ａｖｅｓｔｉｎ）を用いて細胞を破砕し遠心分離して不溶性の凝集体分画を回収した。これを１質量％のトリトン−Ｘ１００で２回、また蒸溜水で２回洗浄して細菌破砕物が除去された凝集体を分離した。構造的に活性を有するＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮを得るために、分離した凝集体を種類別に最適化された溶解化（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）緩衝液にそれぞれ溶かし、これを更にそれぞれのリフォールディング緩衝液で撹拌してリフォールディングを実施した。各ＩＦＮの凝集体の溶解化（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）及びリフォールディングに用いた緩衝液及び条件を下記表３に示す。：
【００８７】
【表３】
0005576928.tif 000004
【００８８】
（実施例５−３：クロマトグラフィーによる高純度精製）
上記方法によってリフォールディングを実施した後、構造的に正常リフォールディングされたＩＦＮ又はＣＴＰ−融合ＩＦＮを高純度で精製するために、陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを行った。分離しようとするタンパク質の等電点がＩＦＮの場合に約６．０、ＣＴＰ−融合ＩＦＮの場合に約９．２と予想されるので、それぞれこれより低いｐＨでＣＭ−セファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）陽イオン交換基（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に結合させた後、下記表４に示すｐＨ及びＮａＣｌ濃度勾配で溶出してそれぞれの分画を得て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じてタンパク質溶出分画を決定した。確保された溶出分画からタンパク質マルチマーを除去し、緩衝液を入れ替えるために分子量５，０００ダルトンのセントリコン（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）で濃縮した後、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施して高純度のタンパク質を最終確保した。
【００８９】
【表４】
0005576928.tif 000005
【００９０】
（実施例６：ＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮの活性測定）
上記実施例５を通じて精製されたＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮを用いて次のように生物学的活性を測定した。:
【００９１】
（実施例６−１：細胞膜結合及び細胞質残留特性の観察）
精製されたＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮをＦＩＴＣ又はローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）蛍光物質で標識し、２日培養したＨｅＬａ（韓国細胞株銀行)又はＨｅｐＧ２細胞（韓国細胞株銀行）に最終濃度が５ｎＭ（ｎｍｏｌ／Ｌ）〜１０ｎＭ（ｎｍｏｌ／Ｌ）となるように処理した後、その分布を共焦点走査顕微鏡（ＬＳＭ  ５  Ｅｘｃｉｔｅｒ，Ｃａｒｌ−Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察した。
【００９２】
図８から確認できるように、ＣＴＰ−融合ＩＦＮがＩＦＮよりも格段に強い細胞膜の結合を示し、また、図９から見られるように、細胞膜を透過して細胞内に移動したＣＴＰ−融合ＩＦＮの場合、核膜を通過せずに細胞質にだけ留まっていることが確認できた。この結果から、ＣＴＰ−融合ＩＦＮの場合、共に付着されたタンパク質により発生し得る核内染色体の損傷危険が減少されることが証明された。
【００９３】
（実施例６−２：肝移動及び肝組織浸透活性の測定）
（１）ＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮのＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）
マウスの場合、タンパク質の分子量が３０ｋＤａ以下と小さければ、腎クリアランス（ｒｅｎａｌ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）機序により速やかに膀胱に排出され、タンパク質の血液内維持時間が短くなり肝移動特性を観察しにくい問題が発生し得る。したがって、このような問題点を克服して血液内維持時間を延長させて肝移動特性の観察を容易にするために、約２０ｋＤａ前後のＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮにＰＥＧ化を実施して分子量を最小４０ｋＤａ以上に増加させようとした。
【００９４】
このために分子量２０ｋＤａのＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）ＮＨＳエステル（ＪＥＮＫＥＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮをランダムでＰＥＧ化し（図１０）、これを陽イオン交換クロマトグラフィー及びゲル濾過クロマトグラフィーを実施してモノ−ＰＥＧ化されたＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮを最終分離した。
【００９５】
（２）インビボイメージングシステムを用いた肝移動及び肝組織浸透の観察
ＰＥＧ化を通じて分子量を４０ｋＤａ以上に増加させたＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮを、Ｃｙ５．５蛍光物質で標識し、マウスの静脈に２ｎｍｏｌ投与した後、約４５分間経過後、投与タンパク質の体内分布をＩＶＩＳ−２００（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を通じて、確認した。
【００９６】
図１１から分かるように、ＰＥＧ−ＩＦＮは、４５分経過後、膀胱に排出されるのに対し、ＰＥＧ−ＣＴＰ融合ＩＦＮは、大部分が肝に留まっていることが確認できた。図１２から確認できるように、肝を摘出して蛍光強度測定を通じた投与タンパク質の肝組織内の相対濃度を比較した結果、ＰＥＧ−ＩＦＮに対してＰＥＧ−Ｎ末端ＣＴＰ−融合ＩＦＮが約３．２倍、そしてＰＥＧ−Ｃ末端ＣＴＰ−融合インターフェロンが約２．６倍高いことが分かった。
【００９７】
図１３は、摘出した肝を凍結した後、薄い切片（Ｃｒｙｏ  ｓｅｃｔｉｏｎ）として、蛍光顕微鏡を通じてＣｙ５．５で標識されたＰＥＧ−ＩＦＮ及びＰＥＧ−ＣＴＰ融合ＩＦＮの組織内の分布を観察したものであって、ＰＥＧ−ＩＦＮとは違って、ＰＥＧ−ＣＴＰ融合ＩＦＮが肝の一部表面にだけ留まらず、肝組織の内部にまで強く侵透していることが分かる。
【００９８】
これは、既存に販売されているＰＥＧ−ＩＦＮに比べて、ＰＥＧ−ＣＴＰ融合ＩＦＮを用いて肝炎治療剤を開発する場合、既存のインターフェロン治療剤に比べて少量でも、より持続的な肝治療効果を奏することを意味する。
【００９９】
（３）時間経過による肝における濃度変化の測定
マウス静脈にＰＥＧ化されたＩＦＮ及びＣＴＰ−融合インターフェロンを蛍光標識して投与した後、時間経過による肝での蛍光強度を測定することで投与タンパク質の相対濃度を決定した。
【０１００】
その結果、図１４から見られるように、ＣＴＰ−融合ＩＦＮの最大濃度時点は投与後３０分〜６０分であり、以後ＩＦＮに比べて遅い速度で膀胱に排出された。ＩＦＮが投与後約２時間で全部排出されるのに対し、ＣＴＰ−融合インターフェロンは最小６時間から最大２４時間まで一定量以上維持される優れた肝滞留特性を示した。
【０１０１】
これは、ＩＦＮにＣＴＰを融合して肝炎治療剤を開発する場合、既存のインターフェロン治療剤に比べて少量でもより持続的な治療効果を奏することを意味する。
【０１０２】
（実施例６−３：抗ウイルス活性の測定）
精製されたＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮの抗ウイルス活性はＭＤＢＫ（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ）細胞（韓国細胞株銀行）にＶＳＶ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（韓国細胞株銀行）を感染させたときに発生する細胞病変効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を、これらタンパク質がどの程度緩和させることができるかを確認することで測定した。
【０１０３】
まず、ＭＤＢＫ細胞をＤＭＥＭ培地で７．５×１０４細胞／ｍＬになるように希釈した後、９６ウェルプレートの各ウェルごとに２００μＬずつ分注して３７℃、５％ＣＯ２培養基で約１８時間培養し、これに２倍ずつ連続希釈されたＩＦＮ及びＣＴＰ−融合ＩＦＮを処理してインターフェロン反応を誘導した。４時間〜２０時間反応を誘導後、全てのウェルに５×１０４ＰＦＵのＶＳＶを感染させ約２４時間追加培養して細胞病変効果を誘発した。培養が終わった細胞をホルムアルデヒドで固定してクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ  ｖｉｏｌｅｔ）染色した後、乾燥させ、８０質量％メタノールを添加して染色薬を溶かし出して５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１０４】
（１）精製インターフェロンの抗ウイルス活性
既知のインターフェロン標準品との相対比較を通じて、精製インターフェロンの抗ウイルス活性を決定した。インターフェロンを２０時間処理して反応を誘導した後、抗ウイルス活性を測定した結果、下記表５からわかるように、精製されたインターフェロンの活性は標準品対比９７.７％で標準品と同等であり、非活性は約２．５４×１０８ＩＵ／ｍｇで国際基準（１．４×１０８ＩＵ／ｍｇ以上）を満たした。以後の活性測定では、標準品と同等な活性を有するものと判明された精製インターフェロンを新しい標準品とした。
【０１０５】
【表５】
0005576928.tif 000006
【０１０６】
（２）ＣＴＰ−融合ＩＦＮ、ＰＥＧ−ＩＦＮ、及びＰＥＧ−ＣＴＰ融合ＩＦＮの抗ウイルス活性
Ｎ−末端ＣＴＰ−融合ＩＦＮ、ＰＥＧ−ＩＦＮ、及びＰＥＧ−Ｎ末端ＣＴＰ融合ＩＦＮの抗ウイルス活性は、４時間インターフェロン反応を誘導した後、測定した（図１０）。
【０１０７】
図１５に示すように、抗ウイルス活性はＮ−末端ＣＴＰ−融合ＩＦＮがＩＦＮよりも高く、ＰＥＧ−Ｎ末端ＣＴＰ融合ＩＦＮがＰＥＧ−ＩＦＮより高かった。これらの非活性及び相対活性は下記表６及び表７に示す。これより、ＩＦＮに比べてＣＴＰ−融合ＩＦＮの方が高い抗ウイルス効果を奏することが確認され、また、ＰＥＧ−ＩＦＮに比べてＰＥＧ−ＣＴＰ融合ＩＦＮの方が高い抗ウイルス活性を示すことが確認された。
【０１０８】
【表６】
0005576928.tif 000007
【０１０９】
【表７】
0005576928.tif 000008
【０１１０】
以上で詳細に説明したように、本発明は、細胞質残留性細胞膜透過ペプチド（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＴＰ）に融合されたＩＦＮ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）−αを含むＩＦＮ−α融合タンパク質を提供する。本発明は、細胞膜結合及び肝移動特性を有するペプチドであるＣＴＰをヒトＩＦＮ−αに遺伝的に融合して細胞膜結合能力及び抗ウイルス活性が向上し、核への移動が抑制され、肝移動及び滞留、肝組織浸透に優れた効果を有する融合タンパクである。これにより、各種のウイルス性感染等を含む肝疾患の予防又は治療に効果的なタンパク質医薬品の開発が可能となる。
【０１１１】
以上のように本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとってこのような具体的な記述は単に好ましい実施例に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されるのではない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれの等価物によって定義されると言えよう。
【０１１２】
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１．Ｋｗａｎ  Ｓｉｋ  Ｌｅｅ，Ｄｏｎｇ  Ｊｏｏｎ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ，Ｔｈｅ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．；１３：４４７−４８８（２００７）．
２．Ｍ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｌｉｌｌｅｙ，Ｓ．Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｃａｎ  ａｆｆｅｃｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．；１２：６６６３−６６７１（１９８４）．
３．Ｉ．Ｇ．Ｉｖａｎｏｖ，Ｒ．Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖａ，Ｂ．Ｄｒａｇｕｌｅｖ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍｌｙ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ＡＧＧ  ｔｒｉｐｌｅｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＡＴ−ｍＲＮＡ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．；３０７：１７３−１７６（１９９２）．
４．Ｉ．Ｇ．Ｉｖａｎｏｖ，Ｎ．Ｍａｒｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；２１：９８３−９８５（１９８９）．
５．Ｒ．Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖａ，Ｍ．Ｅｗｅｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  １  ｇｅｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔａｎｄｅｍｓ  ｏｆ  ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ＡＧＧ  ｐｌａｙ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．；２７：４６９−４７３（１９９５）．
６．Ｒ．Ｍ．Ｈｏｒｔｏｎ，Ｚ．Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：ｔａｉｌｏｒ−ｍａｄｅ  ｇｅｎｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．；８：５２８−５３５（１９９０）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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