(57)【要約】  本発明は、これまでに知られる乳酸菌株よりも強い抗アレルギー作用を有し、かつ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生する、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株を提供すること、及び、この菌株の菌体を含有する飲料及び食品並びにこれらを有効成分として含有する抗アレルギー剤を提供することを目的としている。本発明は、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株であって、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、ＧＡＢＡを産生し、抗アレルギー作用を有する菌株を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株であって、
発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生し、
抗アレルギー作用を有する菌株。
【請求項２】
前記抗アレルギー作用は、インターフェロンγ及び／又はインターロイキン１２の産生促進作用である、請求項１記載の菌株。
【請求項３】
前記抗アレルギー作用は、ＩｇＥの産生抑制作用である、請求項１記載の菌株。
【請求項４】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のＳＢＣ８８０３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３２）である、請求項１〜３のいずれか一項記載の菌株。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載の菌株の菌体を含有する飲料。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項記載の菌株の菌体を含有する食品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項記載の菌株の菌体を有効成分として含有する抗アレルギー剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗アレルギー作用を有する菌株並びにその菌体を含有する飲料、食品及び抗アレルギー剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患の治療は、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤及びステロイド剤等を用いた薬物療法が一般的である。しかし最近では、薬物療法の限界と予防医学の観点から、腸管免疫に作用する乳酸菌が、アレルギー疾患の予防及び治療に効果があるとして注目されている（特許文献１〜３）。腸管免疫とは、経口的に取り込まれた病原微生物等を排除する免疫機構であり、過剰反応する腸管免疫を抑制できれば、アレルギー性疾患の予防及び治療に貢献できると考えられている。【０００３】
例えば、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のインファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）種、ブレーベ（ｂｒｅｖｅ）種、ロンガム（ｌｏｎｇｕｍ）種及びビフィダム（ｂｉｆｉｄｕｍ）種の菌株には、食物アレルギーの治療に効果を有するものがあり（特許文献１）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）及びラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）の菌株（特許文献２）並びにラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（特許文献３）の菌株には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎及びアトピー性皮膚炎等に効果を有するものがあると報告されている。【０００４】
さらに、アレルギー性疾患は、身体的ストレス及び精神的ストレスと相関があり、ストレスが多い人ほど症状が悪いことが知られている（非特許文献１）。このため、アレルギー性疾患の予防及び治療には、体内の免疫反応を抑制する作用に加えて、日常受けるストレスの解消を図ることが必要であると言われている。【０００５】
【特許文献１】特開平１０−３０９１７８号公報
【特許文献２】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献３】特開２００５−１３９１６０号公報
【非特許文献１】荻野  敏、「ストレスとアレルギー疾患−予備校生を対象に」、耳鼻展望、２００２年、４５巻、ｐ.２０４〜２１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤及びステロイド剤等の薬物療法は、血中で免疫反応に関与する分子に直接作用し、生体の恒常性維持に必要な免疫反応まで抑制するため、副作用が大きいという問題点がある。また、アレルギー疾患のような慢性疾患を予防するには、これまでに報告されている乳酸菌の活性では、実用上、効果が不十分であった。さらに、抗アレルギー作用を有し、かつ、抗ストレス作用を有するγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生する乳酸菌の菌株については、これまで報告がなかった。【０００７】
そこで本発明の目的は、これまでに知られる乳酸菌株よりも強い抗アレルギー作用を有し、かつ、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生する、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株を提供することにある。また本発明の目的は、このラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株の菌体を含有する飲料及び食品並びにこれらを有効成分として含有する抗アレルギー剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、ラクトバチラス・ブレビスの亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株であって、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生し、抗アレルギー作用を有する菌株を提供する。【０００９】
本発明者らは、ラクトバチラス・ブレビス種の乳酸菌のうち亜種ブレビスに属する菌株が、特に効果的に、マウス脾臓細胞からのＴｈ1型サイトカインの産生を誘導し、また、ＩｇＥの産生を抑制することを見出した。これらの作用は、ヒトのアレルギー性疾患の予防及び治療に効果的な作用であり、その活性は、これまでに報告のある乳酸菌の菌株と比較して顕著に強いものであった。乳酸菌は、古くから発酵食品に利用されている細菌であり、化学合成された抗アレルギー剤と比較して、人体に対する安全性がはるかに優れている。また、通常の乳酸菌は、発泡性アルコール飲料中で増殖不可能であるが、本発明の菌株は、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であるため、この性質を利用して本発明の菌株から抗アレルギー活性を有しない他の乳酸菌株を除くことができる。さらに、本発明の菌株は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するため、上記の抗アレルギー作用に加えて抗ストレス作用も有しており、身体的ストレス及び精神的ストレスと相関のあるアレルギー性疾患の予防及び治療に対して多面的で強い効果が期待できる。このような菌株としては、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスのＳＢＣ８８０３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３２）が特に好ましい。【００１０】
上記の抗アレルギー作用は、インターフェロンγ及び／又はインターロイキン１２の産生促進作用であることが好ましい。【００１１】
インターフェロンγは、Ｔｈ１細胞が分泌するサイトカインであって、Ｂ細胞がＩｇＥを産生するのを阻害するほか、ウイルス、糸状菌及び結核菌等を攻撃するキラーＴ細胞やマクロファージ等の細胞性免疫能を増大させる作用を有する。また、インターロイキン１２は、マクロファージ等の抗原提示細胞が分泌するサイトカインであって、ＮＫ細胞を刺激してＴｈ１細胞を誘導する作用を有し、Ｔｈ１細胞によるインターフェロンγの産生をも誘導する。本発明の菌株は、インターフェロンγ及び／又はインターロイキン１２の産生促進し、ＩｇＥの産生を抑制できるため、Ｉ型アレルギー反応を抑制することが可能である。【００１２】
上記の抗アレルギー作用は、ＩｇＥの産生抑制作用であることが好ましい。【００１３】
ＩｇＥは、アレルギー性疾患を引き起こす原因物質である。すなわち、アレルゲンが侵入すると、これに反応してＩｇＥが産生され、ＩｇＥがマスト細胞や好塩基球に結合して感作が成立する。その後、同じアレルゲンが侵入すると、ＩｇＥはアレルゲンを認識し、マスト細胞や好塩基球からヒスタミン等の炎症性物質が遊離されることになる。このアレルギー反応は、気管支の収縮や蕁麻疹等のさまざまな症状を呈し、発症部位により、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、喘息等のアレルギー性疾患を引き起こすことになる。本発明の菌株は、ＩｇＥの産生を抑制できるため、アレルギー反応を抑制することが可能であり、これらのアレルギー性疾患の予防及び治療に利用できる。【００１４】
また、本発明は、上記菌株の菌体を含有する飲料及び食品を提供する。【００１５】
上記菌株の菌体は、抗アレルギー作用を有し、人体に対して安全であることから、健康食品素材として飲料及び食品に含有させて利用できる。さらに、上記菌株はγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するため、抗ストレス作用、血圧降下作用及び精神安定作用を併せ持ち、健康食品素材として利用価値が高い。【００１６】
また、本発明は、上記菌株の菌体を有効成分として含有する抗アレルギー剤を提供する。【００１７】
上記菌株の菌体は、インターロイキン１２及びインターフェロンγの産生促進作用、並びにＩｇＥの産生抑制作用を有するため、この菌体を有効成分として含有する抗アレルギー剤を製造すれば、化学合成された医薬品よりも安全性に優れた抗アレルギー剤として利用できる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、これまでに知られる乳酸菌株よりも強い抗アレルギー作用を有するラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株を提供できる。また、本発明の菌株は、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であるため、この性質を利用して本発明の菌株から抗アレルギー活性を有しない他の乳酸菌株を除くことができる。さらに、本発明の菌株は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するため、上記の抗アレルギー作用に加えて抗ストレス作用も有しており、身体的ストレス及び精神的ストレスと相関のあるアレルギー性疾患の予防及び治療に対して強い効果が期待できる。また本発明によれば、上記菌株の菌体を含有し、安全性に優れ、かつ、抗アレルギー作用を有する飲料、食品及び抗アレルギー剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株の菌体縣濁液の添加によりマウス脾臓細胞が産生したインターフェロンγの量を示したものである。
【図２】ＯＶＡと各菌株の菌体縣濁液の添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞が産生したインターフェロンγの量を示したものである。
【図３】ＯＶＡと各菌株の菌体縣濁液の添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞が産生したインターロイキン１２の量を示したものである。
【図４】ＯＶＡと各菌株の菌体縣濁液の添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞が産生したインターロイキン４の量を示したものである。
【図５】ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスの指標として、インターフェロンγ／インターロイキン４を算出し、グラフ化したものである。
【図６】ＯＶＡの添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に誘導される総ＩｇＥの産生に及ぼす各菌株の菌体縣濁液の効果を示したものである。
【図７】ＯＶＡの添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に誘導されるＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生に及ぼす各菌株の菌体縣濁液の効果を示したものである。
【図８】各菌株を腹腔内投与したＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌される総ＩｇＥの産生量を示したものである。
【図９】各菌株を腹腔内投与したＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌されるＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生量を示したものである。
【図１０】ＳＢＣ８８０３を含有している混餌飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚炎スコアの経時変化を示したものである。
【図１１】ＳＢＣ８８０３を含有している混餌飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスの耳介厚の経時変化を示したものである。
【図１２】ＳＢＣ８８０３を含有している混餌飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスの血清中ＩｇＥ抗体量の経時変化を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００２１】
本発明の菌株は、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株であって、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生し、抗アレルギー作用を有することを特徴としている。【００２２】
ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）には、４つの亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）が存在し、それぞれ、ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、グレブセンシス（ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ）、オタキエンシス（ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ）、コアギュランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）であるが、上記菌株は、亜種ブレビスに属する。亜種ブレビスに属する菌株は、１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列及び糖からの酸生成の違い等を指標に分離でき、亜種グレブセンシス、亜種オタキエンシス及び亜種コアギュランスに属さない菌株として分類できる。【００２３】
「抗アレルギー作用」とは、アレルギー反応を抑制する作用のことをいう。ここで、アレルギーとは、ある種の物質の摂取又は接触により生体内に抗体が作られ、同じ物質の再摂取又は再接触により過剰な抗原抗体反応が起きて病的症状が現れる状態をいう。また、アレルギー反応とは、生体の防御機構である免疫反応が、本来排除すべきでない自分自身の細胞や摂取した食品等を攻撃してしまう現象をいう。免疫反応には、抗原提示細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞が関与し、液性免疫として主にＩｇＧ及びＩｇＡが作られるが、アレルギー反応には、Ｔ細胞のうちのＴｈ２細胞が主に関与し、ＩｇＥが通常の免疫反応の１００〜１００００倍高い濃度で作られる。この大量のＩｇＥは、マスト細胞と結合し、マスト細胞にヒスタミン、ロイコトリエン等の炎症性物質の遊離を促すことになる。【００２４】
抗アレルギー作用としては、例えば、抗原提示細胞、Ｔ細胞又はマスト細胞に作用して、ＩｇＥの産生や上記の炎症性物質の遊離を抑制する作用や、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１側にシフトさせる作用が挙げられ、より具体的には、ＩｇＥの産生抑制作用、インターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生促進作用等が挙げられる。【００２５】
上記の菌株の抗アレルギー作用としては、ＩｇＥの産生抑制作用、インターフェロンγの産生促進作用及び／又はインターロイキン１２の産生促進作用が好ましく、これらの作用を２つ以上併せ持つことがより好ましい。【００２６】
「発泡性アルコール飲料」には、例えば、ビール、雑酒、発泡酒が含まれる。「発泡性アルコール飲料中で増殖可能」とは、発泡性アルコール飲料中で乳酸菌が死滅せず、かつ、細胞分裂して細胞数が増えることをいい、発泡性アルコール飲料のアルコール濃度が５％以上であることが好ましい。【００２７】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株は、自然界から容易に分離でき、１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を調べることにより同定できる。また、ＡＴＣＣ等の細胞バンクから購入できる。【００２８】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のうち、発泡性アルコール飲料中で増殖可能である菌株は、特開２００３−２５０５５７号公報に記載された方法に従って選抜できる。具体的には、ラクトバチルス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として所定のプライマーセット（特開２００３−２５０５５７号公報の配列表の配列番号１及び配列番号２に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット）でＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子断片を制限酵素で切断し、アクリルアミドゲル電気泳動後の制限酵素切断パターンを解析し、グループＩＩｂに属する菌株を選抜すればよい。制限酵素切断パターンは、大きく４つのグループに分類されるが、発泡性アルコール飲料中で増殖可能な菌株はグループＩＩｂに属することが判明している。【００２９】
上記の方法以外でも、ラクトバチルス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株を、発泡性アルコール飲料中に移植して培養し、増殖の可否を調べることによっても選抜できる。培養温度は、３０℃がより適しているが、１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜３７℃、特に３０℃前後であれば培養が可能である。【００３０】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のうち、γ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡ）を産生する菌株は、培養上清をアミノ酸分析装置等で分析し、ＧＡＢＡの含有量を調べることによって選抜できる。【００３１】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のうち、抗アレルギー作用を有する菌株は、例えば、i)マウス脾臓細胞に対するインターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生促進作用、ii)卵白アルブミン（以下、ＯＶＡ）免疫マウスの脾臓細胞で誘導されるＩｇＥの産生抑制作用、iii)ＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌されるＩｇＥの産生抑制作用、等を試験することによって選抜できる。【００３２】
i)では、マウスの脾臓から脾臓細胞を分離して培養し、そこに被検菌株の菌体を滅菌して調製した菌体縣濁液を加えて一定時間培養し、脾臓細胞から分泌されるインターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生量をＥＬＩＳＡ等で測定し、インターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生促進作用の有無を調べればよい。【００３３】
ii)では、追加免疫から２週間後のＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を分離して培養し、そこに被検菌株の菌体を滅菌して調製した菌体縣濁液とＯＶＡを加えて一定時間培養し、脾臓細胞から分泌されるＩｇＥの産生量をＥＬＩＳＡ等で測定し、ＩｇＥ産生抑制作用を調べればよい。【００３４】
iii)では、ＯＶＡマウスの腹腔内に被検菌株の菌体を滅菌して調製した菌体縣濁液を投与して一定時間飼育し、末梢血中に分泌されるＩｇＥの量をＥＬＩＳＡ等で測定し、菌体懸濁液を腹腔内投与していないＯＶＡマウスの末梢血に分泌されるＩｇＥの産生量と比較すればよい。【００３５】
尚、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、ＧＡＢＡを産生し、抗アレルギー作用を有する、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属するＳＢＣ８８０３（受託の日：２００６年６月２８日；受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３２）は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託されており、入手可能である。【００３６】
本発明の飲料、食品及び抗アレルギー剤は、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株であって、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、ＧＡＢＡを産生し、抗アレルギー作用を有する、上記の菌株を含有することを特徴としている。【００３７】
上記菌株の菌体は、アレルギー性疾患の予防及び治療を目的として飲料及び食品に添加できる。上記飲料及び食品は、上記の菌株の菌体のみからなっていてもよく、当該分野で通常使用される添加物を含んでいてもよい。この添加物としては、例えば、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂、グルコース等の単糖類、スクロース、フルクトース及びマンニトール等の二糖類、デキストロース及びデンプン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール及びソルビトール等の糖アルコール類、ビタミンＣ等のビタミン類が挙げられ、これらの添加物は単独種又は複数種であってもよい。【００３８】
さらに、アレルギー性疾患の予防や症状の緩和の目的で、食品添加物として、特定保健用食品、特殊栄養食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品や病者用食品等の飲食物に配合することもできる。【００３９】
本発明の抗アレルギー剤は、上記の菌株の菌体を有効成分として含み、担体、賦形剤及び／又はその他の添加物を加えて製剤化すれば、安全性に優れた抗アレルギー剤として利用できる。薬学的に許容される添加物としては、例えば、グルコース等の単糖類、スクロース、フルクトース及びマンニトール等の二糖類、デキストロース及びデンプン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール及びソルビトール等の糖アルコール類、ビタミンＣ等のビタミン類、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、珪酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体、トラガカント、ゼラチン、シロップ、ヒドロキシ安息香酸メチル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、水、鉱油が挙げられ、これらの添加物は単独種又は複数種であってもよい。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４１】
１）実験に用いた各菌株について
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する１３菌株（ＳＢＣ８８０３及び菌株ａ〜ｌ）は、発明者が分離し、実験に用いるまで凍結乾燥菌体として４℃で保管した。また、ラクトバチラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）に属する菌株Ｘは市販のヨーグルトから分離し、実験に用いるまで凍結乾燥菌体として４℃で保管した。【００４２】
２）ビール中での増殖能力の判定
上記のラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する１３菌株及びラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘについて、ビール中での増殖能を選抜した。選抜方法は、特開２００３−２５０５５７号公報に記載された方法に従って行なった。すなわち、各乳酸菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として所定のプライマーセット（特開２００３−２５０５５７号公報の配列表の配列番号１及び配列番号２に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット）でＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子断片を制限酵素で切断し、アクリルアミドゲル電気泳動後の制限酵素切断パターンを解析することにより判定した。この方法では、制限酵素切断パターンは、大きく４つのグループに分類でき、ビール中で増殖可能である菌株は、グループＩＩｂに属することが判明している。【００４３】
その結果、調べたラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する１３菌株は全てビール中で増殖する菌株であると判定されたが、ラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘは、ビール中で増殖する菌株であるとは判定されなかった。尚、上記菌株を実際にビール中に植菌し増殖の可否を確認したが、上記方法の判定結果と同じであった。【００４４】
３）抗アレルギー作用の評価
i)菌体懸濁液の調製
上記の各菌株の抗アレルギー作用を評価するために、各菌株の菌体懸濁液を調製した。まず、各菌株を嫌気的条件下（Ｎ２：ＣＯ２：Ｈ２＝９０：５：５のガス組成）、ＭＲＳ液体培地（ディフコ社製、組成：１％プロテオースペプトン、１％牛肉エキス、０．５％酵母エキス、２％ブドウ糖、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．５％クエン酸アンモニウム、０．０１％硫酸マグネシウム、０．００５％硫酸マンガン、０．２％リン酸二カリウム）で３日間静置培養し、その培養液を１，５００回転で１０分間遠心分離して、各菌株の菌体を回収した。得られた菌体は、ＰＢＳで洗浄した後に凍結乾燥し、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁した。こうして得られた菌体懸濁液は、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）して以下の実験に使用した。【００４５】
ii)マウス脾臓細胞に対するラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のインターフェロンγ産生促進作用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
マウス脾臓細胞にラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する１３菌株の菌体縣濁液を加えて一定時間培養し、脾臓細胞から分泌されるインターフェロンγの量を調べることにより、各菌株のインターフェロンγ産生促進作用を評価した。【００４６】
（マウス脾臓細胞の調製）
まず、６週齢のＢＡＬＢ/ｃマウス（雌）から脾臓を無菌的に摘出し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に浸漬した。その後、脾臓をシャーレに移して乳棒ですり潰し、マウス脾臓細胞の縣濁液を、目開き７０μｍ、線径３９μｍのナイロンフィルターネット（日本理化学機器株式会社）に通した。このナイロンフィルターネットを通過したマウス脾臓細胞の縣濁液は、１，５００回転で１０分間遠心分離し、上清を捨てた後に赤血球溶血試薬（０．１６Ｍ塩化アンモニウム、トリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を沈殿したマウス脾臓細胞に加え、５分間、室温で静置した。その後、新しい１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加えてマウス脾臓細胞を洗浄し、１，５００回転で１０分間遠心分離し、上清を捨てた後に細胞数が５×１０６個／ｍＬになるように１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加えた。こうして得られたマウス脾臓細胞を、以下の実験に用いた。【００４７】
（インターフェロンγのＥＬＩＳＡによる測定）
細胞密度が２．５×１０６個／ｍＬになるように９６ウェルプレートにマウス脾臓細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。マウス脾臓細胞を培養している各ウェルに、各菌株の菌体縣濁液（最終濃度：１０μｇ／ｍＬ）を添加し、７２時間経過後に培養上清中に分泌されたインターフェロンγの量をＥＬＩＳＡで定量した。ポジティブコントロールには、マウスの脾臓細胞に対してインターフェロンγ産生促進作用を有するリポポリサッカライド（以下、ＬＰＳ）（ＳＩＧＭＡ社、最終濃度：１０μｇ／ｍＬ）を、ネガティブコントロールには、ＰＢＳを使用した。【００４８】
インターフェロンγを定量するためのＥＬＩＳＡは、以下のようにして行なった。まず、１．２５μｇ／ｍＬに調製した一次抗体（Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ；ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ社）を９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ；ＮＵＮＣ社）の各ウェルに５０μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することにより固相した。その後、この９６ウェルプレートをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ社）でブロッキングした。引き続き、各培養上清又は予め濃度が明らかであるインターフェロンγの標品を、それぞれ５０μＬずつ各ウェルに添加して一次抗体である抗インターフェロンγ抗体と９０分間反応させ、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後に、０．５μｇ／ｍＬに調製した二次抗体（Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ社）を各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で９０分間反応させた。その後、各ウェルをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ社）を添加して反応させ、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄した後にＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質溶液（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  （ＴＭＢ）  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＳＩＧＭＡ社）を加えて反応させた。発色が十分進行した後に２Ｎ硫酸を各ウェルに５０μＬずつ加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。インターフェロンγの標品の吸光度から標準曲線を作成し、この標準曲線からマウス脾臓細胞が産生したインターフェロンγの量を定量した。【００４９】
図１は、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する１３菌株の菌体縣濁液の添加によりマウス脾臓細胞が産生したインターフェロンγの量を示したものである。その結果、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスのＳＢＣ８８０３は、マウス脾臓細胞に対してインターフェロンγの産生を誘導し、その産生量はＬＰＳ及び他のラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株（菌株ａ〜ｌ）によって誘導される量と比較して顕著に高いものであった。インターフェロンγ産生誘導作用を有したＳＢＣ８８０３（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３２；受託の日：２００６年６月２８日）は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託した。【００５０】
iii)ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に対するＳＢＣ８８０３のＴｈ１サイトカイン産生促進作用、Ｔｈ２サイトカイン産生抑制作用及びＩｇＥ産生抑制作用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
マウス脾臓細胞に対してインターフェロンγ産生促進作用を示したＳＢＣ８８０３について、ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に対するＴｈ１サイトカイン（インターフェロンγ及びインターロイキン１２）産生促進作用、Ｔｈ２サイトカイン（インターロイキン４）産生抑制作用及びＩｇＥ産生抑制作用を評価した。その際、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株ｂ及び菌株ｃ並びにラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘの作用についても同時に調べ、ＳＢＣ８８０３の作用と比較した。【００５１】
（ＯＶＡ免疫マウスの作成）
ＯＶＡ免疫マウスは、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）にＯＶＡを腹腔内投与し、人為的にアレルギーを惹起して作成した。具体的には、まず、１００μｇのＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、Ｅｇｇｗｈｉｔｅ、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び１０ｍｇの水酸化アルミニウムを１ｍＬのＰＢＳに溶解してＯＶＡ抗原溶液を調製し、その２００μＬをマウスの腹腔内に投与して初回免疫を行なった。その１週間後、上記と同じようにＯＶＡ抗原溶液を調製し、再度、その２００μＬをマウスの腹腔内に投与して追加免疫を行なった。追加免疫がされたマウスは、約１週間後にアレルギーが惹起され、このマウスをＯＶＡ免疫マウスとして以下の実験に用いた。【００５２】
（ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞の調製）
追加免疫から２週間後のＯＶＡ免疫マウスから脾臓を無菌的に摘出し、そこから上記と同じ手順で脾臓細胞を調製した。【００５３】
（インターフェロンγ、インターロイキン１２及びインターロイキン４のＥＬＩＳＡによる測定）
インターフェロンγ、インターロイキン１２及びインターロイキン４を測定するために、２．５×１０５個のＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を９６ウェルプレートに播種し（細胞密度は、２．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を培養している各ウェルにＯＶＡ（最終濃度：１００μｇ／ｍＬ）と各菌株の菌体縣濁液（最終濃度：１μｇ／ｍＬ）をそれぞれ添加し、７２時間経過後に培養上清中に分泌された各サイトカインの量をＥＬＩＳＡで定量した。その際、菌体縣濁液の代わりにＰＢＳを添加したコントロールを設けた。【００５４】
インターフェロンγのＥＬＩＳＡによる定量は、上記と同様の手順で行なった。インターロイキン１２の定量については、一次抗体に１μｇ／ｍＬのＰｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社)を用い、二次抗体に１μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、インターフェロンγの定量と同様の手順でＥＬＩＳＡを行なった。インターロイキン４の定量については、一次抗体に１μｇ／ｍＬのＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ.）を用い、二次抗体に１μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いて、インターフェロンγの定量と同様の手順でＥＬＩＳＡを行なった。【００５５】
図２は、ＯＶＡと各菌株の菌体縣濁液の添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞が産生したインターフェロンγの量を、図３はインターロイキン１２の量を、図４はインターロイキン４の量を示したものである。図５は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの指標として、インターフェロンγ／インターロイキン４を算出し、グラフ化したものである。その結果、ＯＶＡとＰＢＳを添加したコントロールでは、Ｔｈ１型サイトカインであるインターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生はほとんど認められず、Ｔｈ２型サイトカインであるインターロイキン４の産生が顕著に誘導された。このことより、ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ２側にシフトし、アレルギー反応が亢進していることが示唆された。【００５６】
一方、ＯＶＡとＳＢＣ８８０３の菌体縣濁液を添加した処理区及びＯＶＡと菌株ｂ又は菌株ｃの菌体縣濁液を添加した処理区では、Ｔｈ１型サイトカインであるインターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生が、コントロール及びラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘに比べて促進され、Ｔｈ２型サイトカインであるインターロイキン４の産生が顕著に抑制されていた。また、ＳＢＣ８８０３の作用は、菌株ｂ又は菌株ｃの作用よりも顕著なものであり、ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを大きくＴｈ１側にシフトさせるものであった。この結果より、ＳＢＣ８８０３は強い抗アレルギー作用を有することが示唆された。【００５７】
（総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥのＥＬＩＳＡによる測定）
総ＩｇＥを測定するために、９６ウェルプレートに２．５×１０５個のＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を播種し（細胞密度は、２．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を培養している各ウェルにＯＶＡ（最終濃度：１００μｇ／ｍＬ）及び各菌株の菌体縣濁液（最終濃度：１μｇ／ｍＬ）をそれぞれ添加し、１４日経過後に培養上清中に分泌された総ＩｇＥの量をＥＬＩＳＡで定量した。コントロールには、菌体縣濁液の代わりにＰＢＳを添加し、同様にＥＬＩＳＡで定量した。【００５８】
一方、ＯＶＡ特異的ＩｇＥを測定するために、４８ウェルプレートに２．５×１０６個の脾臓細胞を播種し（細胞密度は、２．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。脾臓細胞にＯＶＡ（最終濃度：１００μｇ／ｍＬ）及び各菌株の菌体縣濁液（最終濃度：１μｇ／ｍＬ）を添加して３日間培養し、新しい培地で脾臓細胞を３回洗浄してＯＶＡを除去し、洗浄後の脾臓細胞に、再度、各菌株の菌体縣濁液を１μｇ／ｍＬとなるように加えて１１日間培養し、培養上清中に分泌されたＩｇＥをＯＶＡ特異的ＩｇＥとしてＥＬＩＳＡで定量した。コントロールには、菌体縣濁液の代わりにＰＢＳを添加し、同様にＥＬＩＳＡで定量した。【００５９】
総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥを定量するためのＥＬＩＳＡは、以下のようにして行なった。まず、１０μｇ／ｍＬに調製した抗マウスＩｇＥ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ＫＩＴ；ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ；ＮＵＮＣ社）の各ウェルに５０μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することにより固相した。その後、この９６ウェルプレートをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ社）でブロッキングした。引き続き、各培養上清又は予め濃度が明らかであるＩｇＥの標品を各ウェルに添加して抗マウスＩｇＥ抗体と９０分間反応させ、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後に、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）で作製したビオチン化ＯＶＡを各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で９０分間反応させた。その後、各ウェルをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ社）を添加して反応させ、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄した後にＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質溶液（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  （ＴＭＢ）  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＳＩＧＭＡ社）を加えて反応させた。発色が十分進行した後に２Ｎ硫酸を各ウェルに５０μＬずつ加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＩｇＥの標品の吸光度から標準曲線を作成し、この標準曲線からＯＶＡマウスの脾臓細胞が産生したＩｇＥの量を定量した。尚、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量については、ＯＶＡ特異的ＩｇＥの標品がないためコントロール（陰性対照）の吸光度に対する相対値で表した。【００６０】
図６は、ＯＶＡの添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に誘導される総ＩｇＥの産生に及ぼす各菌株の菌体縣濁液の効果を示したものである。図７は、ＯＶＡの添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に誘導されるＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生に及ぼす各菌株の菌体縣濁液の効果を示したものである。【００６１】
その結果、ＳＢＣ８８０３の菌体縣濁液の添加により、ＯＶＡで誘導される総ＩｇＥ量及びＯＶＡ特異的ＩｇＥ量は、それぞれ約７５％及び約９５％抑制された。【００６２】
一方、菌株ｂ及び菌株ｃ並びにラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘは、ＯＶＡで誘導される総ＩｇＥ量及びＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生を抑制するものの、ＳＢＣ８８０３と比較して弱い作用であった。【００６３】
以上の結果より、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属するＳＢＣ８８０３は、インターフェロンγ及インターロイキン１２の産生促進作用並びにＩｇＥ産生抑制作用を有し、これまでに知られる乳酸菌の菌株と比較して強い抗アレルギー作用を発揮することが判明した。【００６４】
iv)ＯＶＡ免疫マウスに対するＳＢＣ８８０３のＩｇＥ産生抑制作用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で強い抗アレルギー作用を有することが判明したＳＢＣ８８０３について、ＯＶＡ免疫マウスに対するＩｇＥ産生抑制作用をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。その際、ラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘの作用についても同時に調べ、ＳＢＣ８８０３の作用と比較した。【００６５】
ＯＶＡ免疫マウスは、上記のようにＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、Ｅｇｇｗｈｉｔｅ、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で初期免疫及び追加免疫をすることによって作成し、体重を指標に１群１０匹となるように３群に分け、ＳＢＣ８８０３若しくは菌株Ｘの菌体縣濁液、又はＰＢＳ（コントロール）を、初回免疫の1週間前から追加免疫の1週間後まで２日に１回、２００μＬずつ腹腔内投与した。尚、各菌体縣濁液は、上記のように凍結乾燥した菌体を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで懸濁し、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）することにより調製した。【００６６】
追加免疫の1週間後、マウスの尾静脈から血液を採取し、そこから分離した血清中の総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥの量をＥＬＩＳＡで測定した。血清中の総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥのＬＩＳＡによる測定は、上記と同じ方法で行なった。【００６７】
図８は、各菌株を腹腔内投与したＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌される総ＩｇＥの産生量を示したものである。図９は、同様に各菌株を腹腔内投与したＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌されるＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生量を示したものである。グラフ中の＊＊は、コントロールに対してｐ＜０．０１で統計的有意であることを示している。【００６８】
その結果、ＳＢＣ８８０３の菌体縣濁液の添加により、ＯＶＡマウスの末梢血に分泌される総ＩｇＥ量は約８５％抑制され、ＯＶＡ特異的ＩｇＥは約６０％抑制された。この作用は、ＰＢＳを投与したコントロールと比べて統計的に有意なものであった。【００６９】
一方、ラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘは、ＯＶＡマウスの末梢血に分泌される総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生を抑制するものの、ＳＢＣ８８０３と比較して弱い作用であり、コントロールと比べて統計的に有意なものではなかった。【００７０】
以上の結果より、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属するＳＢＣ８８０３は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもＩｇＥ産生抑制作用を有しており、これまでに知られる乳酸菌の菌株と比較して強い抗アレルギー作用を発揮することが判明した。【００７１】
v)アトピー様皮膚炎に対するＳＢＣ８８０３の作用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ＮＣ／Ｎｇａマウスは、２，４，６−トリニトロクロロベンゼン（塩化ピクリル）の塗布によってアトピー様皮膚炎を発症する病態モデルマウスであり、ＮＣ／Ｎｇａマウスにおける血清中ＩｇＥ抗体値の上昇は、アトピー様皮膚炎の発症と関連することが報告されている。そこで、ＳＢＣ８８０３を０．０５％又は０．５％含有している混餌飼料をＮＣ／Ｎｇａマウスに摂取させながら塩化ピクリルの塗布を行い、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー様皮膚炎の発症に及ぼすＳＢＣ８８０３の経口投与の効果を調べた。【００７２】
（ＮＣ／Ｎｇａマウスへのアトピー様皮膚炎の惹起）
体重を指標に１群１０匹となるように、８週齢のＮＣ／Ｎｇａマウス（雄）を３群に分け、各マウスの剃毛した腹部及びフットパットに、１５０μLの５％塩化ピクリル溶液（エタノール：アセトン＝４：１の溶液に溶解）を塗布して一次感作を行った。その４日後からは１週間に1回ずつ（合計９回）、オリーブオイルに溶解した１５μＬの１％塩化ピクリル溶液を両耳介に塗布することによって二次感作を行い、ＮＣ／Ｎｇａマウスにアトピー様皮膚炎を発症させた。【００７３】
（ＳＢＣ８８０３の経口投与）
各群のＮＣ／Ｎｇａマウスには、それぞれＳＢＣ８８０３を含有していないコントロール飼料、ＳＢＣ８８０３を０．０５％含有している混餌飼料、又はＳＢＣ８８０３を０．５％含有している混餌飼料を、一次感作の２週間前から試験終了日まで自由に摂取させた。【００７４】
一次感作後は、各群のＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚炎スコア、マウス耳介厚、及び血清中ＩｇＥ抗体量を経時的に測定し、平均値を求めて各群間で比較した。皮膚炎スコアは、Ｍａｔｓｕｄａらの方法(Ｍａｔｓｕｄａら、Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７年、９巻、ｐ．４６１〜４６６) に従って測定した。具体的には、発赤及び出血、浮腫、脱毛及び皮膚欠損、並びに発疹の各項目についてその程度を調べ、無症状の場合は０点、軽度の場合は１点、中程度の場合は２点、高度の場合は３点としてスコアリングを行った。耳介厚は、ダイアルシックネスゲージ（株式会社ミツトヨ）を用いて測定した。血清中ＩｇＥ抗体量は、上述したサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。【００７５】
図１０は、ＳＢＣ８８０３を含有している混餌飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスの皮膚炎スコアの経時変化を示したものである。グラフ中の＊は、コントロール飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスに対してｐ＜０．０５で統計的有意であることを示し、＊＊は、コントロール飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスに対してｐ＜０．０１で統計的有意であることを示している。【００７６】
その結果、ＳＢＣ８８０３を０．０５％含有している混餌飼料又はＳＢＣ８８０３を０．５％含有している混餌飼料を摂取したＮＣ／Ｎｇａマウスにおいては、皮膚炎スコアの上昇が顕著に抑制され、この作用は、コントロール飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスに対して統計的に有意なものであった。【００７７】
図１１は、ＳＢＣ８８０３を含有している混餌飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスの耳介厚の経時変化を示したものである。グラフ中の＊＊は、コントロール飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスに対してｐ＜０．０１で統計的有意であることを示している。【００７８】
その結果、ＳＢＣ８８０３を０．５％含有している混餌飼料を摂取したＮＣ／Ｎｇａマウスの耳介厚の増加は顕著に抑制され、この作用は、コントロール飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスに対して統計的に有意なものであった。【００７９】
図１２は、ＳＢＣ８８０３を含有している混餌飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスの血清中ＩｇＥ抗体量の経時変化を示したものである。グラフ中の＊は、コントロール飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスに対してｐ＜０．０５で統計的有意であることを示し、＊＊は、コントロール飼料を摂取させたＮＣ／Ｎｇａマウスに対してｐ＜０．０１で統計的有意であることを示している。【００８０】
その結果、ＳＢＣ８８０３を０．０５％又は０．５％含有している混餌飼料を摂取したＮＣ／Ｎｇａマウスの血清中ＩｇＥ抗体量の上昇は顕著に抑制され、この作用は、コントロール飼料を摂取させたマウスに対して統計的に有意なものであった。【００８１】
以上の結果より、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属するＳＢＣ８８０３は、アトピー様皮膚炎の発症を抑制する作用を有し、強い抗アレルギー作用を発揮することが判明した。【００８２】
４）γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の産生能の測定
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属するＳＢＣ８８０３のγ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡ）の産生能について試験した。まず、ＳＢＣ８８０３を、１００ｍＬの液体培地（３％麦芽エキス（ＤＩＦＣＯ社）、２％酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社）、０．２％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）に植菌し、４日間静置培養した。その後、ＳＢＣ８８０３の培養液を１，５００回転で１０分間遠心分離して培養上清を回収し、その培養上清に含まれるＧＡＢＡの量をＨＰＬＣで定量した。使用したＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
・ＨＰＬＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００
・使用カラム：ＺＯＲＢＡＸ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＡＡＡ（４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ）（島津ジーエルシー社）
・カラムオーブン：４０℃
・流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
・蛍光検出器：Ｅｘ．３４０ｎｍ、Ｅｍ．４５０ｎｍ
・ＨＰＬＣ試薬：１０ｍｇ／ｍＬ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＯＰＡ試薬（０．４Ｍ  ホウ酸バッファー、ｐＨ１０．２）（島津ジーエルシー社）
・溶離液：Ａ液：４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．８）
Ｂ液：４５体積％アセトニトリル、４５体積％ＭｅＯＨ、１０％Ｈ２Ｏ
・  タイムテーブル（グラジェント）：表１を参照【００８３】
【表１】
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【００８４】
その結果、ＳＢＣ８８０３は、培養上清中にＧＡＢＡを１０２．５  μｍｏｌ／Ｌ産生した。【００８５】
以上の結果より、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属するＳＢＣ８８０３は、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、強い抗アレルギー作用を有し、さらに抗ストレス作用を有するＧＡＢＡを産生する菌株であることが判明した。【００８６】
５）ＳＢＣ８８０３を用いて製造した果汁乳酸発酵液の官能検査
抗アレルギー作用を有するＳＢＣ８８０３を用いて果汁乳酸発酵液を製造し、得られた果汁乳酸発酵液の香りと風味について官能検査を行なった。【００８７】
表２は、乳酸発酵に使用した果汁について、果実の種類、糖度及びｐＨを示したものである。【００８８】
【表２】
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【００８９】
各果汁は、それぞれグレープフルーツ濃縮果汁、りんご濃縮果汁、白ぶどう濃縮果汁及びレモン濃縮果汁を滅菌水で希釈して所定の糖度になるように調製し、ｐＨはＮａＯＨを添加して調整した。乳酸発酵は、各果汁１００ｍＬに対し１×１０９細胞のＳＢＣ８８０３を植菌し、１日１回の撹拌を行い、３０℃で７２時間、攪拌時以外は静置条件下で行なった。発酵終了後、各乳酸発酵液の濁度を分光光度計（タイテック社）で測定し、乳酸量をＦ−ｋｉｔ  Ｄ−／Ｌ−乳酸（Ｊ．Ｋ．インターナショナル社）で測定した。各乳酸発酵液の濁度は、ＳＢＣ８８０３の増殖の指標とし、乳酸量は乳酸発酵の程度の指標とした。【００９０】
表３は、各乳酸発酵液の濁度、乳酸量及び官能検査の結果を示したものである。【００９１】
【表３】
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【００９２】
その結果、試験に用いた全ての果汁でＳＢＣ８８０３の乳酸発酵は進み、ヨーグルト風味はなく、ベース果汁の風味を保持した果汁乳酸発酵液を製造するに至った。特に、りんご果汁を用いた発酵では、穏やかな香りと爽やかな酸味が加味され、乳酸発酵飲料として好ましい性質を備えるものであった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の菌株は、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であるため、この性質を利用して本発明の菌株から抗アレルギー活性を有しない他の乳酸菌株を除くことができる。さらに、本発明の菌株は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するため、上記の抗アレルギー作用に加えて抗ストレス作用も有しており、身体的ストレス及び精神的ストレスと相関のあるアレルギー性疾患の予防及び治療に対して強い効果が期待できる。また本発明によれば、上記菌株の菌体を含有し、安全性に優れ、かつ、抗アレルギー作用を有する飲料、食品及び抗アレルギー剤を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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