(57)【要約】  ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが、骨髄由来間葉系幹細胞、歯髄細胞などの間葉系細胞に対して増殖を促進する作用を有することを見出した。ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを含有する炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジは骨髄または歯髄再生用生体材料として有用である。これにより、間葉系細胞の増殖促進能を有し、骨髄組織および歯髄組織の欠損を修復するための人工骨髄や人工歯髄として有用な骨格系生体材料を提供する。
2008026634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する間葉系細胞増殖促進剤。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載の間葉系細胞増殖促進剤を含むことを特徴とする骨格系生体材料。
【請求項３】
炭酸アパタイトおよびコラーゲンの複合体からなるスポンジ状体であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の骨格系生体材料。
【請求項４】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する間葉系細胞接着促進剤を含むことを特徴とする請求の範囲第２項または第３項に記載の骨格系生体材料。
【請求項５】
請求の範囲第２項〜第４項のいずれか１項に記載の骨格系生体材料を用いることを特徴とする骨髄組織または歯髄組織の再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系細胞増殖促進剤およびそれを含有する骨格系生体材料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年の高齢化社会において、骨、歯牙組織等の欠損・損傷を再建する技術の開発が望まれている。特に、再生医療の進歩による骨格系生体材料への関心が高まっている。欠損組織の修復に用いられる画期的な技術として、硬組織の構成要素である人工骨髄・歯髄の開発が望まれている。【０００３】
歯科の領域においては、特に、より長く自己の歯を維持して生活することが望まれているため、歯髄組織を保存する治療法の重要性が高まっている。歯髄は、歯の中心に位置する組織であり、細胞間質、血管、神経等により構成されている。歯が齲蝕に罹患し、歯髄の一部にまで感染が広がった場合、限局した感染部位のみを切断し、残存する歯髄を存続させる治療法（生活歯髄切断法）が、有用な治療法として注目されている。【０００４】
しかしながら、歯髄の切断面を適切に処置するのは技術的に困難であり、必ずしも切断後の歯髄の状態を良好に保つことは期待できないのが現状である。このため、より的確に、可能な限り侵襲を抑えた治療法を確立することが望まれている。そこで、感染部位の切断により欠損した歯髄部位をもとの状態に再生し、歯髄組織を保存することができれば、国民のＱＯＬの向上と医療費の削減に計り知れない貢献をもたらす可能性がある。【０００５】
骨組織の欠損を修復するための各種骨格系生体材料の研究は、炭酸アパタイト（ＣＯ３Ａｐ）の生分解性の観点から進められている。本発明者らは、化学組成および結晶化度の点において、生体硬組織に類似する炭酸アパタイトおよびコラーゲンから、作製した炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を生体材料として用いることを提案している（非特許文献１および非特許文献２を参照のこと）。この炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を、ラットの腹部内および頭蓋骨膜下に埋め込んだ場合、良好な生体適合性を示した。【０００６】
しかしながら、炭酸アパタイト・コラーゲン複合体のｉｎｎｅｒ ｂｕｌｋ（内部バルク）には、細胞が侵入できるスペースがない。そこで、スポンジ状炭酸アパタイト・コラーゲン複合体を用いた場合、スポンジ状体の孔が大きいとき、骨芽細胞の増殖、およびこの孔の内部への細胞の侵入が促進されることが分かった（非特許文献３を参照のこと）。【０００７】
欠損組織を再生し、生体材料が生着することによって、その機能を十分に発揮するためには、細胞へ酸素および栄養を供給することが不可欠である。すなわち、骨格系生体材料に複合機能を与える血管は、骨の維持および成長のためのライフラインとして不可欠である。【０００８】
上述したように、炭酸アパタイト・コラーゲン複合体は、適切な生体適合性を示し、また、この複合体のスポンジ状体は、細胞の浸潤に十分なスペースを有している。しかしながら、スポンジ状体の内部に細胞を浸潤させたとしても、酸素および栄養を供給する血管の非存在下において、細胞が生存することは不可能である。このため、生体材料内の血管新生が不可欠である。【０００９】
血管新生プロセスは、内皮細胞による血管基底膜の消化で開始される。その後、細胞は移動および増殖して管状構造を形成する。多数の研究者らが、各種の成長因子とサイトカイン（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インターロイキン８）から発せされる信号により、これらの細胞反応が厳重に調節されていることを報告している。【００１０】
細胞外基質蛋白質であるオステオポンチン（ＯＰＮ）は、大量のシアル酸を含むリン酸蛋白質であり、骨組織、腎臓、脳、皮膚等に広く分布している。ＯＰＮは骨代謝に関与し、炎症反応と血管新生を仲介する。最近、ＯＰＮ内に血管新生作用に関与するアミノ酸配列［Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＳＶＶＹＧＬＲ）］が発見された（特許文献１、非特許文献４および非特許文献５を参照のこと）。オステオポンチン分子内でＲＧＤ配列に隣接するＳＶＶＹＧＬＲはトロンビン切断によって暴露されていたため、このモチーフが病態において重要であると考えられる。我々は、血管成長因子としてのＳＶＶＹＧＬＲの配列を人工合成することに既に成功している（非特許文献６を参照のこと）。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ２００３／０３０９２５号パンフレット
【非特許文献１】Okazaki M, Ohmae H, Hino T. Insolubilization of apatite-collagen composites by UV irradiation. Biomaterials 1989; 10: 564-568.
【非特許文献２】Okazaki M, Ohmae H, Takahashi J, Kimura H, Sakuda M. Insolubilized properties of UV-irradiated CO3apatite-collagen composites. Biomaterials 1990; 11: 568-572.
【非特許文献３】Itoh M, Shimazu A, Hirata I, Yoshida Y, Shintani, H, Okazaki M. Characterization of CO3Ap-collagen sponges using x-ray high-resolution microtomography. Biomaterials 2004; 25: 2577-2583.
【非特許文献４】Yokosaki Y, Matsuura N, Sasaki T, Murakami I, Schneider H, Higashiyama S, Saitoh Y, Yamakido M, Taooka Y, Sheppard D. The integrin a9b1 bind to a novel recognition sequence (SVVYGLR) in the thrombin-cleaved amino-terminal fragment of osteopontin. J Biol Chem 1999; 274: 36328-36334.
【非特許文献５】Hamada Y, Nokihara K, Okazaki M, Fujitani W, Matsumoto T, Matsuo M, Umakoshi Y, Takahashi J, Matsuura N. Angiogenic activity of osteopontin- derived peptide SVVYGLR. Biochem Biophys Res Commun 2003; 310: 153-157.
【非特許文献６】Hamada Y, Yuki K, Okazaki M, Fujitani W, Matsumoto T, Kobayashi Hashida M, Harutsugu K, Nokihara K, Daito M, Matsuura N, Takahashi J. Osetpontin-derived peptide SVVYGLR induces angiogenesis in vivo. Dent Mater J 2004; 23: 650-655.
【発明の開示】
【００１１】
上述のように、欠損組織を修復するために生体材料がその機能を十分発揮するためには、欠損組織を再生し、生体材料が生着するだけではなく、再生組織における血管新生が重要である。しかし、骨髄組織や歯髄組織の再生を促進するための生体材料として応用するためには、さらに、組織間質を構成する間葉系細胞の増殖を促進できることが望ましい。
【００１２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、間葉系細胞の増殖促進能を有する骨格系生体材料を提供することにある。
【００１３】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討した結果、血管新生作用に関与することが知られているＳＶＶＹＧＬＲペプチドが、骨髄由来間葉系幹細胞、歯髄細胞などの間葉系細胞に対して増殖を促進する作用を有することを新たに見出し、当該ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを含有する炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを欠損した骨髄に移植すると、スポンジ領域における血管の形成およびスポンジ内部への間葉系細胞の侵入が認められ、骨髄再生用生体材料として有用であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
すなわち、本発明に係る間葉系細胞増殖促進剤は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有効成分とするペプチドであることを特徴としている。
【００１５】
本発明に係る骨格系生体材料は、上記本発明に係る血管新生誘導および間葉系細胞増殖促進剤を含むことを特徴としている。当該骨格系生体材料は、炭酸アパタイトおよびコラーゲンの複合体からなるスポンジ状体であることが好ましい。また、当該骨格系生体材料は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有する間葉系細胞接着促進剤を含むことが好ましい。
【００１６】
本発明に係る骨髄組織または歯髄組織の再生方法は、上記本発明に係る骨格系生体材料を用いることを特徴としている。
【００１７】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＳＶＶＹＧＬＲペプチドがヒト骨髄由来間葉系幹細胞の増殖に及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。
【図２】ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが歯髄細胞の増殖に及ぼす影響を検討した結果を示すグラフである。
【図３】図中（ａ）はＳＶＶＹＧＬＲペプチドを培地に添加していない場合の間葉系細胞ペレットの位相差顕微鏡画像であり、図中（ｂ）はＳＶＶＹＧＬＲペプチドを培地に添加した場合の間葉系細胞ペレットの位相差顕微鏡画像である。
【図４】位相差顕微鏡で撮影したペレットの面積を画像解析ソフトを用いて測定した数値（μｍ２）を示すグラフである。
【図５】合成炭酸アパタイトのＸ線回折パターンを示すチャートである。
【図６】図中（ａ）は炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジの走査電子顕微鏡画像であり、図中（ｂ）は炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジのＸ線マイクロコンピューター断層撮影で描出した３Ｄ画像である。
【図７】ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを含む炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを移植した移植片の組織像であり、図中（ａ）は低倍率で観察した組織像、図中（ｂ）は図中（ａ）のＸ部分の強拡大像、図中（ｃ）は図中（ａ）のＹ部分の強拡大像である。
【図８】ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを含まない炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを移植した移植片の組織像であり、図中（ａ）は低倍率で観察した組織像、図中（ｂ）は図中（ａ）のＺ部分の強拡大像である。
【図９】ＳＶＶＹＧＬＲペプチドでコーティングしたプレート上に接着したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の細胞数を測定した数値を示すグラフである。
【図１０】ＳＶＶＹＧＬＲペプチドでコーティングしたプレート上に接着したヒト歯肉線維芽細胞の細胞数を測定した数値を示すグラフである。
【図１１】ＳＶＶＹＧＬＲペプチドでコーティングしたプレート上に接着したヒト歯根膜細胞の細胞数を測定した数値を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
〔間葉系細胞増殖促進剤〕
本発明に係る間葉系細胞増殖促進剤は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、すなわちＳｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＳＶＶＹＧＬＲ）の７アミノ酸からなるペプチド（以下、「ＳＶＶＹＧＬＲペプチド」と記す）を有効成分とするものであればよい。ＳＶＶＹＧＬＲペプチドは、オステオポンチン中に存在する血管新生作用を有するペプチドとして公知であるが、本発明者らは、後段の実施例に示すように当該ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが間葉系細胞の増殖を促進する作用を有することを確認し、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドは間葉系細胞増殖促進剤の有効成分となることが見出された。【００２０】
なお、本発明に係る間葉系細胞増殖促進剤は、間葉系細胞の増殖促進作用を有する限り、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたペプチドを有効成分とするものであってもよい。【００２１】
ここで「１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ペプチド作製法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数（好ましくは３個、より好ましくは２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されることを意味する。このような変異ペプチドは、公知の変異ペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するペプチドを単離精製したものであってもよい。【００２２】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るペプチド活性を変化させない。【００２３】
また、本発明に係る間葉系細胞増殖促進剤の有効成分となるペプチドは、間葉系細胞の増殖促進作用を有する限り、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドに付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドは特に限定されないが、例えば、ポリアルギニンタグ（Ａｒｇ−ｔａｇ）やポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）やＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。【００２４】
ペプチドが間葉系細胞の増殖促進作用を有するか否かは、ペプチドを添加した培養液を用いて培養した間葉系細胞の増殖曲線を、ペプチドを添加していない培養液を用いて培養した間葉系細胞の増殖曲線と比較することにより確認できる。【００２５】
また、ペプチドは、市販のペプチド合成機を用いる常法により、容易に合成することができる。具体的には、例えば、Ｆｍｏｃ化学による高効率固相法により合成することができる。また、常法により、遺伝子工学的に製造することも可能である。得られたペプチドをＨＰＬＣ、ＬＣＭＳなどに供し、質量理論値、単一ピークの存在などにより目的のペプチドであることを確認できる。【００２６】
間葉系細胞は、骨髄あるいは歯髄といった結合組織を構成する細胞で、硬組織系細胞に分化できる間葉系幹細胞も含まれる。【００２７】
上記ＳＶＶＹＧＬＲペプチドは、単独で、または生理緩衝液などの適切な溶媒に溶解した注射液等の形態で、血管新生誘導および間葉系細胞の増殖が望まれる組織に局所投与することができる。手術や外傷により生じた創傷等の近傍に本発明の間葉系細胞増殖促進剤を、注射や塗布、噴霧等の方法により局所投与することにより、間葉系細胞の増殖が促進され、創傷の治癒が促進される。ここで、注射または塗布若しくは噴霧等に用いるペプチド溶液中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常、０．００１〜１０μｇ／ｍＬ程度である。また、投与量は、傷などの大きさや深さにより適宜選択できるが、傷全体がペプチド溶液で被覆される程度がよい。また、傷が治癒するまで、１日〜数日毎に１回〜数回投与することができる。また、注射液には、他の消毒剤や消炎鎮痛剤など、通常、傷の治療薬に含まれる種々の成分を含んでいてもよい。【００２８】
また、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドをキャリアに結合し、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが結合されたキャリアを生体に埋め込むことにより間葉系細胞の増殖を促進することもできる。これはキャリアに固定化しているために必要な部位に選択的に作用させることができ、新たなＤＤＳ（ドラッグデリバリーシステム）としての可能性に富んでいる。生体材料移植部に本発明の間葉系細胞増殖促進剤を、塗布、噴霧等の方法により局所投与することにより、間葉系細胞の増殖が促進され、術後の治癒が促進される。ここで、キャリアとしては、特に限定されるものではなく、代用骨や代用歯、人工臓器等に用いられる樹脂や、タンパク質等の生体高分子を挙げることができる。樹脂に上記ペプチドを結合することにより、当該樹脂を生体に埋め込んだ際に、樹脂と接する周辺組織中での間葉系細胞の増殖が促進される。また、より好ましい態様として、タンパク質をキャリアとして用いるができる。【００２９】
ここで、キャリアとして用いるタンパク質は、生体適合性を有するいずれのタンパク質であってもよく、とりわけ、生体組織との接合を良好にするために、細胞接着性タンパク質であることが好ましい。細胞接着性タンパク質の好ましい例として、コラーゲン（ゼラチン）、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびラミニン、並びにこれらの部分加水分解物を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。なお、これらのタンパク質は、アレルゲンを除去した精製タンパク質であることが、アレルギー反応の防止の観点から好ましい。【００３０】
キャリアに結合されるペプチドの量は、特に限定されず、適宜選択することができるが、通常、キャリアとペプチドの重量比率（キャリア：ペプチド）が１００：１〜１：１程度であり、好ましくは２０：１〜５：１程度である。【００３１】
キャリアとペプチドとの結合は、共有結合によることが好ましい。結合は、例えばペプチドのＮ末端のアミノ基と、キャリア中の任意のアミノ基をグルタルアルデヒド等の結合架橋剤を用いて結合することにより容易に行うことができる。また、人工臓器等の樹脂に結合する場合には、この樹脂中に、アミノ基等の、ペプチドとの結合に用いることができる基を含むモノマーを共重合させておき、当該アミノ基等とペプチドのＮ末端のアミノ基を結合することができる。また、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドの一端または両端に、任意のアミノ酸配列を有する他のペプチドを結合したものを採用し、この任意のペプチドをキャリアとの結合に供することも好ましい。【００３２】
ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを結合したキャリアは、塗布または噴霧する他にそのままで生体内に埋め込むことができる。キャリアとして、細胞接着性タンパク質を採用した場合には、ＳＶＶＹＧＬＲペプチド結合キャリアは、縫合糸、各種整形手術材料、傷口の癒着促進剤等として単独または他の薬効成分とともに用いることができる。【００３３】
〔間葉系細胞接着促進剤〕
本発明に係る間葉系細胞接着促進剤は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、すなわちＳｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＳＶＶＹＧＬＲ）の７アミノ酸からなるペプチド（以下、「ＳＶＶＹＧＬＲペプチド」と記す）を有効成分とするものであればよい。本発明者らは、後段の実施例に示すように当該ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが間葉系細胞の接着を促進する作用を有することを確認し、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドは間葉系細胞接着促進剤の有効成分となることが見出された。【００３４】
なお、本発明に係る間葉系細胞接着促進剤は、間葉系細胞の接着促進作用を有する限り、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドにおいて１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたペプチドを有効成分とするものであってもよい。また、本発明に係る間葉系細胞接着促進剤の有効成分となるペプチドは、間葉系細胞の接着促進作用を有する限り、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドに付加的なペプチドを含むものであってもよい。付加的なペプチドは特に限定されないが、例えば、ポリアルギニンタグ（Ａｒｇ−ｔａｇ）やポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）やＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ペプチドが挙げられる。なお、本明細書中に記載の方法に従えば、当業者は、作成したペプチドが間葉系細胞の接着促進作用を有するか否かを容易に確認できる。また、ペプチドは、上述したいずれかの方法によって合成することができる。【００３５】
上記ＳＶＶＹＧＬＲペプチドは、単独で、または生理緩衝液などの適切な溶媒に溶解した注射液等の形態で、間葉系細胞の接着が望まれる組織に局所投与することができる。手術や外傷により生じた創傷等の近傍に本発明の間葉系細胞接着促進剤を、注射や塗布、噴霧等の方法により局所投与することにより、間葉系細胞の接着が促進され、創傷の治癒が促進される。ここで、注射または塗布若しくは噴霧等に用いるペプチド溶液中のペプチド濃度は、上記の〔間葉系細胞増殖促進剤〕の項で説明したものと同様である。【００３６】
また、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドをキャリアに結合し、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが結合されたキャリアを生体に埋め込むことにより間葉系細胞の接着を促進することもできる。生体材料移植部に本発明の間葉系細胞接着促進剤を、塗布、噴霧等の方法により局所投与することにより、間葉系細胞の接着が促進され、術後の治癒が促進される。ここで、キャリアとして好ましい物質、キャリアに結合されるペプチドの量、キャリアの使用例については、上記の〔間葉系細胞増殖促進剤〕の項で説明したものと同様である。【００３７】
〔骨格系生体材料〕
本発明に係る骨格系生体材料は、上記本発明に係る間葉系細胞増殖促進剤を含むものであればよい。したがって、公知の骨格系生体材料に適切な方法でＳＶＶＹＧＬＲペプチドを結合させたものが、本発明に係る骨格系生体材料として好適である。なかでも、炭酸アパタイトおよびコラーゲンの複合体からなるスポンジ状体の骨格系生体材料にＳＶＶＹＧＬＲペプチドを結合させたものが特に好ましい。【００３８】
また、本発明に係る骨格系生体材料は、上記本発明に係る間葉系細胞接着促進剤をさらに含んでいてもよい。この場合、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが間葉系細胞増殖促進剤の有効成分と間葉系細胞接着促進剤の有効成分とを兼ねている。したがって、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを結合させた骨格系生体材料が、間葉系細胞増殖作用および間葉系細胞接着促進作用を有する。【００３９】
炭酸アパタイトおよびコラーゲンの複合体からなるスポンジ状体の骨格系生体材料は、例えば以下のようにして作製することができる。【００４０】
用いる炭酸アパタイトとしては、一般式；Ｃａ１０−Ｘ（ＰＯ４）６−Ｙ（ＣＯ３）Ｙ（ＯＨ）２−Ｚ、ただし、０≦Ｘ≦３〜５、０≦Ｙ≦２〜４、０≦Ｚ≦１〜２で表されるものであり、その合成方法と炭酸アパタイトについては、各種論文（例えば非特許文献２）に報告されている。例えば、本発明者らは、後段の実施例３に記載の方法で炭酸アパタイトを合成している。【００４１】
コラーゲンとしては、特に制限はなく、市販されているいずれのコラーゲンでも用いることができる。ただし、市販のコラーゲンのなかには純度が低く、アレルゲンが含まれており、品質の再現性も劣るものがあるので、このようなコラーゲンは臨床適用には好ましくない。動物由来のコラーゲンを部分加水分解し、アレルゲンを除去したゼラチンが臨床用途のために市販されているので、このような精製されたコラーゲンまたはその部分加水分解物を用いることが好ましい。【００４２】
スポンジ状体は、コラーゲンを酸性水溶液（例えば、塩酸水溶液、リン酸水溶液）に溶解し、コラーゲン溶液および炭酸アパタイトを混合し、凍結乾燥することにより作製できる。なお、コラーゲン溶液は炭酸アパタイトを混合する前または後に中和処理（例えば、ＮａＯＨ水溶液を添加）を行い、好ましくは当該溶液のｐＨを７〜９の範囲内にする。また、コラーゲン溶液と炭酸アパタイトの混合割合は、通常、コラーゲン溶液１ｇに対して炭酸アパタイト０．００１〜０．０１ｇ、好ましくは０．００３〜０．０１ｇである。【００４３】
炭酸アパタイトを混合したコラーゲン溶液にさらに有機溶媒を添加してもよい。添加する有機溶媒は混合物の粘度を低下させ得るものであれば特に制限はないが、アルコール系有機溶媒が好ましく、中でもエタノールが好ましい。なお、炭酸アパタイトを混合する前のコラーゲン溶液に有機溶媒を添加してもよい。有機溶媒の添加量は、通常、コラーゲン溶液１ｇに対して０．０１〜０．５ｇ、好ましくは０．１〜０．３ｇである。また、有機溶媒の添加量は、添加後の混合物の粘度が１００〜５０００ｍＰａ・ｓの範囲内になる量であることが好ましい。【００４４】
凍結乾燥は、コラーゲン／炭酸アパタイト混合物を適当な容器等に入れ、市販の凍結乾燥機を用いて行うことができる。【００４５】
炭酸アパタイトおよびコラーゲンの複合体からなるスポンジ状体（以下、「炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジ」と記す。）にＳＶＶＹＧＬＲペプチドを含有させる方法としては、上述の方法により得られた炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジをＳＶＶＹＧＬＲペプチド溶液に浸漬して、スポンジ表面にＳＶＶＹＧＬＲペプチドを付着させる方法を挙げることができる。この場合、ＳＶＶＹＧＬＲペプチド溶液の濃度としては、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌが好ましい。【００４６】
また、上記の〔間葉系細胞増殖促進剤〕の項で説明したように、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを予めキャリアタンパク質としてのコラーゲンに結合させておき、ＳＶＶＹＧＬＲペプチド含有コラーゲンを用いて上述のように炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを作製する方法を挙げることができる。【００４７】
以上のようにして作製された本発明に係る骨格系生体材料は骨髄疾患や外傷により損傷した骨髄の再生、および生活歯髄切断法後の歯髄再生に好適に用いることができる。つまり、修復しようとする骨髄損傷部位、または、切断した歯髄部位に、本発明に係る骨格系生体材料を移植することにより、骨髄または歯髄を再生し修復することが可能となる。【００４８】
〔骨髄組織または歯髄組織の再生方法〕
本発明に係る骨髄組織または歯髄組織の再生方法は、上記本発明に係る骨格系生体材料を用いるものであればよい。本方法においては、ＳＶＶＹＧＬＲペプチド含有炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを再生・修復したい骨髄損傷部位や歯髄切断部位に適用すればよい。【００４９】
なお、発明を実施するための最良の形態の項においてなした具体的な実施態様および以下の実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、当業者は、本発明の精神および添付の特許請求の範囲内で変更して実施することができる。【００５０】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００５１】
〔実施例１：ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが間葉系細胞の増殖能に及ぼす影響〕
ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが骨髄および歯髄の組織間質に存在する間葉系細胞の増殖能に及ぼす影響をｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系で検討した。【００５２】
骨髄組織間質の間葉系細胞には、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社）を購入して用いた。また、歯髄組織の主体を成す間葉系細胞である「歯髄細胞」を、Ｎａｋａｍｕｒａ Ｈらの方法（Ｊ Ｄｅｎｔ Ｒｅｓ． ８４： ５１５−５２０： ２００５）に従い、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（８週齢雄）の下顎切歯より分離培養し、実験に用いた。【００５３】
これらの細胞を９６穴培養プレート中に５，０００個／ｗｅｌｌで播種し、ＳＶＶＹＧＬＲペプチド存在下（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）における細胞数をＷＳＴ−１ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（同仁化学）を用いて測定した。培地は１日おきに交換した。【００５４】
なお、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドはＰＳＳＭ−８ペプチド合成装置（島津製作所製）を用いて、Ｆｍｏｃ法による固相合成（固相担体：ＰＥＧ−ＰＳ）で合成した。ペプチド鎖合成後、樹脂に結合したペプチドを切り離すために側鎖保護を除いた。得られたペプチドはＨＰＬＣ（島津製作所製）により、純粋なＳＶＶＹＧＬＲペプチドであることを確認した。【００５５】
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の結果を図１に示した。図１において、各群はｎ＝６であり、平均値±ＳＤを表している。図１から明らかなように、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＳＶＶＹＧＬＲペプチド存在下で培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞の細胞数は、非存在下（０ｎｇ／ｍｌ）で培養した対照群と比較して４日目以降に有意に増加した（Ｐ＜０．０１）。【００５６】
歯髄細胞の結果を図２に示した。図２において、各群はｎ＝６であり、平均値±ＳＤを表している。図２から明らかなように、１０〜１００ｎｇ／ｍｌのＳＶＶＹＧＬＲペプチド存在下で培養した歯髄細胞の細胞数は、非存在下（０ｎｇ／ｍｌ）で培養した対照群と比較して１０日目以降に有意に増加した（Ｐ＜０．０１）。【００５７】
これらの結果から、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドはヒト骨髄由来間葉系幹細胞および歯髄細胞の増殖を濃度依存的に促進することが明らかとなった。【００５８】
〔実施例２：ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが間葉系細胞の立体的増殖に及ぼす影響〕
骨髄の間質に存在する間葉系細胞が長期間をかけて立体的に増殖凝集する際にＳＶＶＹＧＬＲペプチドが及ぼす影響をペレット培養実験により検討した。【００５９】
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（８週齢雄）の大腿骨骨髄より間葉系細胞を分離培養し、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｓらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２８８：４１３−４１９：２００１）に従って５０，０００個の細胞からペレット培養を行った。培養には、α−ＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ：ナカライテスク）にｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（１００ｎＭ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ（５０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＩＴＳ＋ ｐｒｅｍｉｘ（１００倍希釈，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β１（１０ｎｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＥＣ）を添加した培地を用いた。この培地に１００ｎｇ／ｍｌのＳＶＶＹＧＬＲペプチドを添加して２６日間培養した。培地は１日おきに交換した。【００６０】
ペレットを回収し、１０％リン酸緩衝ホルマリン溶液で４℃、３時間、固定した。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した後、ペレットを培養プレートのＰＢＳ中に浸漬し、位相差顕微鏡下で撮影した。撮影したペレットの面積を画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ ｖｅｒ．１．３３ｕ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ)を用いて測定した。【００６１】
結果を図３および図４に示した。図３（ａ）はＳＶＶＹＧＬＲペプチドを培地に添加していない場合のペレットの位相差顕微鏡画像であり、図３（ｂ）はＳＶＶＹＧＬＲペプチドを培地に添加した場合のペレットの位相差顕微鏡画像である。両者を比較すると、明らかに（ｂ）のほうが大きいことがわかる。図４は位相差顕微鏡で撮影したペレットの面積を上記画像解析ソフトを用いて測定した数値（μｍ２）を示すグラフである。両群のそれぞれ３個のペレットを測定し、その平均値±ＳＤを示している。図４から明らかなように、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを培地に添加した場合のペレットの大きさは、対照群の約１．５倍の大きさであった。【００６２】
これらのペレットの切片を作製しトルイジンブルー染色にて観察した結果、トルイジンブルーに特異的な染色像は見られず、細胞数自体の増加が観察された。したがって、このペレットの大きさの増加は、細胞がペレット内に産生した細胞外基質（酸性ムコ多糖）量が原因ではなく、細胞自身の増殖亢進に起因していることが確認された。以上の結果からＳＶＶＹＧＬＲペプチドは、ペレット状態で長期間培養した間葉系細胞の増殖を促進する可能性が示唆された。【００６３】
〔実施例３：ＳＶＶＹＧＬＲペプチド含有炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジの作製〕
炭酸アパタイト合成は、温度６０±１℃、ｐＨ７．４±０．２で行った。１．３ｍｏｌ／Ｌ酢酸バッファー１Ｌに、１００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｃａ（ＣＨ３ＣＯＯ）２Ｈ２Ｏ溶液０．５Ｌと、６０ｍｍｏｌ／Ｌ （ＮＨ４）２ＣＯ３を含む６０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４溶液０．５Ｌとを、攪拌しながら添加した。３時間攪拌を続けた後、２５℃で２４時間静置した。炭酸アパタイトは、ろ過によって分離し、蒸留水で洗浄後、６０℃で乾燥することにより得た。【００６４】
得られた合成炭酸アパタイトのＸ線回折を、Ｘ線回折装置（ＤＸ１、島津製作所製）を用いて行った。図５に合成炭酸アパタイトのＸ線回折パターンを示した。高度に結晶化したパターンを持つヒドロキシアパタイトと比較すると、合成炭酸アパタイトは低結晶化アパタイトパターンを有し、ヒトの骨のパターンと類似していることがわかる。【００６５】
０．５ｗｔ％コラーゲン溶液（牛皮膚由来コラーゲン、（株）高研製）は、予め抗原性を最小化するために酵素処理を施したものを用いた。０．０５Ｎ ＮａＯＨで中和した後、直ちに７０％（ｗ／ｗ）炭酸アパタイト（乾燥重量）と混和した。ゲルを９６穴プレートに分注し、−８０℃で２時間凍結した後、凍結乾燥機（Ｅｙｅｌａ製）で２４時間乾燥した。不溶性にするため、紫外線ランプ（１０Ｗ、２５３．７ｎｍ）を１０ｃｍの距離から４時間照射した。６ｍｍ×１０ｍｍの円筒状の炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジが得られた。【００６６】
走査電子顕微鏡（Ｓ−４１００システム、日立製）で観察した画像を図６（ａ）に示した。また、Ｘ線マイクロコンピューター断層撮影（Ｘ−ｒａｙ ｍｉｃｒｏ−ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）で描出した３Ｄ画像を図６（ｂ）に示した。なお、Ｘ線マイクロコンピューター断層撮影には、ＳｋｙＳｃａｎ製のｍｉｃｒｏ ＣＴ １０７２を用いた。【００６７】
図６（ａ）および（ｂ）より、約５０〜３００μｍのサイズの孔がスポンジの奥深くまで連続していた。凝固した炭酸アパタイト結晶は、炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジのｆｉｂｒｏｕｓ ｒｉｂｂｏｎｓ ｏｆ ｃｏｌｌａｇｅｎ（コラーゲン線維帯）と共に観察された。【００６８】
炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを１００ｎｇ／ｍｌのＳＶＶＹＧＬＲペプチド溶液に浸漬することにより、ＳＶＶＹＧＬＲペプチド含有炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを作製した。【００６９】
別途、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドをコラーゲンに架橋させた後、ＳＶＶＹＧＬＲペプチド含有コラーゲンと炭酸アパタイトとを上述のとおり混和し凍結乾燥してＳＶＶＹＧＬＲペプチド含有炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを作製した。【００７０】
具体的には、ＳＶＶＹＧＬＲペプチド含有コラーゲンを以下のようにして作製した。すなわち、２架橋剤のＧＭＢＳを、コラーゲンに対して１０等量の割合でＰＢＳ中、４℃にて２時間反応させた後、ゲルろ過カラムで未反応のＧＭＢＳを除去した。続いて、コラーゲンに対して等量のＳＶＶＹＧＬＲペプチドを、室温で５時間反応させた。酢酸塩の形で使用するため、脱塩カラムにて酢酸塩に置換した。得られたＳＶＶＹＧＬＲペプチド含有コラーゲンでは、ＳＶＶＹＧＬＲペプチド：コラーゲンの重量比は、約１：４であった。【００７１】
〔実施例４：ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを含む炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジの移植〕
４週齢のＳＰＦ／ＶＡＦ Ｃｒｌ；ＣＤ（ＳＤ）系雄性ラット（日本チャールス・リバー）を用いた。ラットにペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）麻酔下、ＵＶ照射したＳＶＶＹＧＬＲペプチド含有炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを脛骨の骨髄中に外科的に埋め込んだ。具体的には、ドリルを用いて、脛骨に骨髄が露出しないように３×７ｍｍの穴を開け、骨ノミで骨髄を露出させた。骨髄単層を捨て、移植片を配置するスペースを作った。なお、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを含有しない炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを移植したラットを対照群とした。【００７２】
移植後１週間目にラットを安楽死させ、移植片を周囲の組織とともに摘出した。切片は直ちにアセトン−ドライアイス中でＯＴＣコンパウンド（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ製）を用いて包埋した。【００７３】
第ＶＩＩＩ因子（フォンビルブラント因子）に対するポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ製）を一次抗体として用いた。厚さ６μｍ凍結切片を１０％リン酸緩衝ホルマリンで１０分間固定した後、１：４００に希釈した一次抗体を切片上に載せて４℃で１４時間反応させた。０．１％のｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液でリンスし、ビオチン化抗ウサギ免疫グロブリン（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）で、室温にて３０分間処理した。リンスした後、アルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ製）を反応させた。アルカリホスファターゼ活性は、ｎｅｗ ｆｕｃｈｓｉｎ中で視覚化した。ヘマトキシリンで核を対比染色した。また、別途凍結切片をヘマトキシリン−エオジン染色した。【００７４】
図７（ａ）、（ｂ）、（ｃ）にＳＶＶＹＧＬＲペプチドを含む炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを移植した移植片の組織像を示した。図７（ａ）のＸ部分の拡大像が（ｂ）であり、図７（ａ）のＹ部分の拡大像が（ｃ）である。なお、Ｘ部分は骨髄との境界に近い炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジ領域、Ｙ部分は骨梁部分である。【００７５】
図７（ｂ）では、矢印で示した第ＶＩＩＩ因子染色部位に代表されるように、第ＶＩＩＩ因子陽性の血管内皮細胞により形成された多数の血管像が鮮明に観察された。さらに、血管内皮細胞は炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジ内部方向への侵入が認められた。また、多数の間葉系細胞が炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジ内部で観察された。図７（ｃ）では、骨梁に第ＶＩＩＩ因子陽性の血管内皮細胞により構成されたハヴァース管が認められた。【００７６】
移植された炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジは、術後１週間では吸収や分解されず、多孔体として存在していることが確認された。【００７７】
図８（ａ）、（ｂ）に、対照のＳＶＶＹＧＬＲペプチドを含まない炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジを移植した移植片の組織像を示した。図８（ａ）のＺ部分の拡大像が（ｂ）であり、Ｚ部分は骨髄との境界に近い炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジ領域である。【００７８】
図８では、第ＶＩＩＩ因子陽性の細胞はほとんど観察されず、（ｂ）の移植片と骨髄との境界領域にのみ血管は確認された。また、間葉系細胞は移植片多孔体内部でほとんど確認できなかった。【００７９】
〔実施例５：ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが間葉系細胞の接着能に及ぼす影響〕
ＳＶＶＹＧＬＲペプチドが間葉系細胞の接着能に及ぼす影響を検討した。間葉系細胞には、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（研究用ヒト間葉系幹細胞：ＲＩＫＥＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫより提供）、ヒト歯肉線維芽細胞（定法に従ってヒト歯肉より分離培養）およびヒト歯根膜細胞（正常ヒト歯根膜線維芽細胞：三光純薬より購入）を用いた。【００８０】
これらの細胞を培養する９６穴浮遊細胞用マイクロプレート（旭テクノグラス社製）に、合成ＳＶＶＹＧＬＲペプチドを０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で添加し、３７℃で２時間静置した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ：Ｓｉｇｍａ社製）で２回洗浄することによって、コーティングプレートを作製した。なお、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドは、上記〔実施例１〕に示す方法によって合成した。【００８１】
Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ：ナカライテスク）に懸濁したヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト歯肉線維芽細胞およびヒト歯根膜細胞を、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドでコーティングしたコーティングプレートに、それぞれ１ウェルあたり２０，０００個添加した。細胞を添加したコーティングプレートを３７℃のＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで２回洗浄し、非付着細胞を取り除いた。【００８２】
コーティングプレート上に付着した細胞を０．１％クリスタルバイオレット（Ｗａｋｏ社製）で１０分間染色した後、ＰＢＳで３回洗浄した。各ウェルに２０％ＴｒｉｔｏｎＸ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加し、４８時間後に吸光度計（ＢｉｏＲａｄモデル６８０）を用いて波長５５０ｎｍの吸光度を測定した（参照波長６３０ｎｍ）。【００８３】
コーティングプレートに接着した細胞数を細胞毎に評価した結果を図９〜１１に示した。図９〜１１において、各群はｎ＝８であり、平均値±ＳＤを表している。図９はヒト骨髄由来間葉系細胞の結果を示しており、図９から明らかなように、０．０１〜１００μｇ／ｍｌのＳＶＶＹＧＬＲペプチドでコーティングされたプレート上に接着したヒト骨髄由来間葉系細胞の細胞数は、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドでコーティングされていない（０μｇ／ｍｌ）プレート上に接着した対照群と比較して濃度依存的に有意に増加した（Ｐ＜０．０１）。【００８４】
また、図１０および１１は、それぞれヒト歯肉線維芽細胞およびヒト歯根膜細胞の結果を示しており、図１０および１１から明らかなように、０．０１〜１００μｇ／ｍｌのＳＶＶＹＧＬＲペプチドでコーティングされたプレート上に接着したヒト歯肉線維芽細胞およびヒト歯根膜細胞の細胞数は、それぞれＳＶＶＹＧＬＲペプチドでコーティングされていない（０μｇ／ｍｌ）プレート上に接着した対照群と比較して濃度依存的に有意に増加した（Ｐ＜０．０１）。【００８５】
これらの結果から、ＳＶＶＹＧＬＲペプチドはヒト骨髄由来間葉系幹細胞、ヒト歯肉線維芽細胞およびヒト歯根膜細胞の接着を濃度依存的に促進することが明らかとなった。また、上述した炭酸アパタイト・コラーゲンスポンジのような生体材料にＳＶＶＹＧＬＲペプチドをコーティングし、これを生体内に移植することによって、生体内において間葉系細胞の接着を促進し得ることが示唆される。【００８６】
本発明の血管新生誘導および間葉系細胞増殖促進剤は、間葉系組織の修復に有効に利用できる。特に、骨格系生体材料に含有させることにより、骨髄疾患や生活歯髄切断法後の歯髄再生に用いられる非常に有用なツールを提供できる。【００８７】
また、本発明の間葉系細胞増殖促進剤の有効成分は７個のアミノ酸から構成されるペプチドであるので、分子量の大きいタンパク質と比較して抗原性の観点から副作用が起こり難く安全であり、代謝が容易であるという利点を有している。さらに、タンパク質は組換えタンパク質や抽出タンパク質として製造する必要があるため、感染症や予期し得ない副作用の発生などの問題を孕んでいるが、ペプチドは高効率な合成方法が確立されており、製造コストおよび安全性の点からも好ましい。【００８８】
本発明により、国民のＱＯＬの向上と医療費の削減を実現できるという効果を奏する。【００８９】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明は、人工骨髄、人工歯髄として非常に有用であり、医薬品産業や医療機器産業に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月6日(2008.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含有し、骨髄組織または歯髄組織の損傷部位または欠損部位に投与するための骨髄組織または歯髄組織の再生促進剤。
【国際調査報告】
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