(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の肺炎原因菌の検出に用いられるプライマーセットであって、
配列番号１の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号１３の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、
前記各プライマーの５´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とするプライマーセット。
【請求項２】
更に、配列番号５の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１４の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号１５の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、
前記各プライマーの５´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とする請求項１に記載のプライマーセット。
【請求項３】
前記プロモーター配列が、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列であることを特徴とする請求項１又は２に記載のプライマーセット。
【請求項４】
肺炎原因菌検出用キットであって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、核酸増幅用バッファーとを有することを特徴とする肺炎原因菌検出用キット。
【請求項５】
肺炎原因菌の検出方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いることを特徴とする肺炎原因菌の検出方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いた核酸増幅により、複数種類の肺炎原因菌を検出することを特徴とする請求項５に記載の肺炎原因菌の検出方法。
【請求項７】
核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、
（１）請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅を行う工程、
（２）工程（１）で得られた核酸増幅産物を鋳型とし、プロモーター配列と相同的な配列からなるユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅を行う工程、
（３）工程（２）で得られた核酸増幅産物を検出する工程、
を少なくとも含むことを特徴とする肺炎原因菌の検出方法。
【請求項８】
核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、
前記工程（３）の検出方法が、
前記工程（２）で得られた核酸増幅産物を一本鎖に変性する工程、
基板に固定された配列番号１〜１０の塩基配列からなるプライマーの群からなる１以上のフォワードプライマーと該一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせることにより二本鎖ＤＮＡを形成する工程、
及び該二本鎖ＤＮＡを標識試薬を用いて検出する工程、
を少なくとも有することを特徴とする請求項７に記載の肺炎原因菌の検出方法。
【請求項９】
マルチプレックスＰＣＲを用いることを特徴とする請求項６〜８のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。
【請求項１０】
前記ユニバーサルプライマーの濃度が、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットのプライマーの濃度の１０倍以上であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。
【請求項１１】
前記基板が平板状またはチューブ状であって、前記プライマーが前記基板表面に固定されていることを特徴とする請求項８〜１０のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。
【請求項１２】
前記基板が平板状で、かつ、複数の凹部を有し、前記プライマーが前記凹部に固定されていることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。
【請求項１３】
前記基板上に設けられた複数の前記凹部を、全て覆うことが可能な透明なカバーを用いて、反応溶液を表面張力によって前記凹部に導入することを特徴とする、請求項１２に記載の肺炎原因菌の検出方法。
【請求項１４】
前記標識試薬が蛍光色素であることを特徴とする請求項８〜１３のいずれか一項に記載の肺炎原因菌の検出方法。
【請求項１５】
前記蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することを特徴とする請求項１４に記載の肺炎原因菌の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数種類の肺炎原因菌を検出しうるプライマーセットと、肺炎原因菌の検出方法に関するものであり、より詳しくは、前記プライマーセットを用いて核酸増幅を行うことで、複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺炎は日本人の死因別死亡率で第４位、がん等の基礎疾患の合併症としてもしばしば起こり、罹患者数が非常に多い疾患として知られている。従来肺炎の原因となる微生物（原因菌）の探索試験として行われている培養検査は少なくとも数日の時間を要し、更に培養された原因菌について薬剤感受性試験を行うと１週間近くもかかることから、治療選択に十分寄与する検査方法にはなっていない。救急救命病室（ＩＣＵ）に入院が必要な重症の肺炎に関しては、迅速で正確な原因菌の決定が治療選択において極めて重要であり、適切な初期治療は肺炎患者の救命確率を確実に上昇させることが報告されている。しかし実際には、依然として培養法に代わる原因菌同定技術が確立されていないため、原因菌が不明の状態で治療を行わなければならないのが現状である。そのため、経験治療による抗生物質の使用がやむを得ず、耐性菌の出現にも繋がる虞がある。
【０００３】
肺炎の原因となる原因菌は、発生頻度の高い菌種が全体の５０％近くを占め、ウイルスまで含めた主な原因菌は２０−３０種類程度である。この中には通常の手法で培養できないものもあり、培養法による原因菌決定が困難である場合も多い。また、原因菌の種類によって最適な治療薬が異なるが、原因菌決定前に治療を開始するのも医療倫理上やむを得ない実情である。これらの問題を解決するために、複数種類の菌種の中から特定の菌を迅速かつ定量的に検出可能な手法の開発が待たれていた。
【０００４】
細菌の同定に関しては、従来から用いられてきた培養を介した同定法や染色による同定法、ＡＴＰなど細菌の代謝に係る物質を計測する方法に加え、核酸増幅やマイクロアレイ技術を用いた細菌同定法が開発されている。特に、ある細菌の遺伝子配列に特異的な塩基配列を有する核酸をプローブとして合成し、これを基板上に固定して検体から増幅された遺伝子とハイブリダイズさせる手法は、各菌種が持つ特異的な塩基配列を用いるため、正確な検出が可能であり、現在様々な形で応用が進められている（特許文献１−４、非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、従来の核酸増幅を用いた菌類の検出方法では、個々に肺炎原因菌を検出することは可能であるが、複数種類の肺炎原因菌を検出しようとすると複数回の核酸増幅を行う必要があり、時間とコストを要する。特に、生体検体は微量である場合が多いため、検体量が不足し十分に検出できない問題があった。複数種類の肺炎原因菌を同時に検出する方法としては、例えばマルチプレックスＰＣＲ法がある。マルチプレックスＰＣＲ法は、１回のＰＣＲで複数種類の標的核酸を増幅する方法であり、検体が微量であっても複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することが可能である。ただし、マルチプレックスＰＣＲ法では、１の反応溶液中に複数のプライマーが存在するため、プライマーダイマーの形成やミスアニーリング等が生じ非特異的な増幅が生じやすい。このため、このような非特異的な核酸の増幅を防止し、かつ一度のＰＣＲ条件で増幅可能である様にＴｍ値や塩基配列等を調整したプライマーからなるプライマーセットを用いる必要がある。しかしながら、主要な肺炎原因菌であるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、及びＣｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の標的核酸を１のＰＣＲで特異的に増幅できるプライマーセットは未だに開発されていなかった。
【特許文献１】特開２００２−５１２６８８号公報
【特許文献２】特開２００６−０２５７９１号公報
【特許文献３】特開２００６−０６１１５５号公報
【特許文献４】特開２００６−３００２６８号公報
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎａ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３（２０）：１０６１４−９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、核酸増幅によって、肺炎原因菌であるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを同時に検出が可能となるプライマーセットを提供することを第一の目的とする。
また、本発明は、上記プライマーセットを用いて、複数種類の肺炎原因菌を一度に特異的に検出する検出方法を提供することを第二の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の請求項１に係るプライマーセットは、複数種類の肺炎原因菌の検出に用いられるプライマーセットであって、配列番号１の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号２の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号３の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号４の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号１３の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、前記各プライマーの５´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とする。
【０００８】
本発明の請求項２に係るプライマーセットは、請求項１において、更に、配列番号５の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号６の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号７の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号８の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号９の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるフォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号１４の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーと、配列番号１５の塩基配列の５´側にプロモーター配列が付加された塩基配列からなるリバースプライマーとを有し、前記各プライマーの５´側のプロモーター配列がいずれも同一のプロモーター配列であることを特徴とする。
【０００９】
本発明の請求項３に係るプライマーセットは、請求項１又は２において、前記プロモーター配列が、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列であることを特徴とする。
【００１０】
本発明の請求項４に係る肺炎原因菌検出用キットは、肺炎原因菌検出用キットであって、請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、核酸増幅用バッファーとを有することを特徴とする。
【００１１】
本発明の請求項５に係る肺炎原因菌の検出方法は、肺炎原因菌の検出方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセットを用いることを特徴とする。
【００１２】
本発明の請求項６に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項５において、請求項１〜３のいずれかに記載のプライマーセットを用いた核酸増幅により、複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出することを特徴とする。
【００１３】
本発明の請求項７に係る肺炎原因菌の検出方法は、核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、（１）請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットを用いて核酸増幅を行う工程、（２）工程（１）で得られた核酸増幅産物を鋳型とし、プロモーター配列と相同的な配列からなるユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅を行う工程、（３）工程（２）で得られた核酸増幅産物を検出する工程、を少なくとも含むことを特徴とする。
【００１４】
本発明の請求項８に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項７において、核酸増幅による肺炎原因菌の検出方法であって、前記工程（３）の検出方法が、前記工程（２）で得られた核酸増幅産物を一本鎖に変性する工程、基板に固定された配列番号１〜１０の塩基配列からなるプライマーの群からなる１以上のフォワードプライマーと該一本鎖ＤＮＡとをハイブリダイズさせることにより二本鎖ＤＮＡを形成する工程、及び該二本鎖ＤＮＡを標識試薬を用いて検出する工程、とを少なくとも有することを特徴とする。
【００１５】
本発明の請求項９に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項６乃至８において、マルチプレックスＰＣＲを用いることを特徴とする。
【００１６】
本発明の請求項１０に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項７乃至９において、前記ユニバーサルプライマーの濃度が、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプライマーセットのプライマーの濃度の１０倍以上であることを特徴とする。
【００１７】
本発明の請求項１１に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項８乃至１０において、前記基板が平板状またはチューブ状であって、前記プライマーが前記基板表面に固定されていることを特徴とする。
【００１８】
本発明の請求項１２に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項８乃至１１において、前記基板が平板状で、かつ、複数の凹部を有し、前記プライマーが前記凹部に固定されていることを特徴とする
【００１９】
本発明の請求項１３に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項１２において、前記基板上に設けられた複数の前記凹部を、全て覆うことが可能な透明なカバーを用いて、反応溶液を表面張力によって前記凹部に導入することを特徴とする。
【００２０】
本発明の請求項１４に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項８乃至１３において、前記標識試薬が蛍光色素であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の請求項１５に係る肺炎原因菌の検出方法は、請求項１４において、前記蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のプライマーセットによれば、複数種類の肺炎原因菌を特異的に検出することが可能となる。
また、本発明のプライマーセットを用いた肺炎原因菌の検出方法によれば、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することが可能である。
特に該プライマーセットを用いて核酸増幅を行うことで、簡便に複数種類の肺炎原因菌を検出することが可能となる。また、一度の核酸増幅により複数種類の肺炎原因菌を検出することができるため、検体の量が少ない場合においても有効であり、かつ多検体を迅速に検出することが可能である。
更に、上記プライマーセットの５´側にプロモーター配列を有しているキメラプライマーと、該プロモーター配列と相同な塩基配列を有するユニバーサルプライマーとを用いて核酸増幅を行うことで、各プライマー間での増幅効率がユニバーサルプライマーを用いることで統一され、複数種類の肺炎原因菌を簡便にかつ迅速に定量的に検出することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の第一実施形態は、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することができるプライマーセットである。
【００２４】
以下、プライマーセットを構成するフォワードプライマーについて説明する。
配列番号１の塩基配列を有するプライマーは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１６ｓｒＲＮＡをコードする遺伝子領域の転写開始部位を１位としたとき（以下同様）、２０２位〜２２３位の塩基配列に相同的な塩基配列を有する。
配列番号２の塩基配列を有するプライマーは、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の１６５位〜１８７位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号３の塩基配列を有するプライマーは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の１２２５位〜１２４５位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号４の塩基配列を有するプライマーは、Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の９９４位〜１０１７位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号５の塩基配列を有するプライマーは、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の４３６位〜４５９位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号６の塩基配列を有するプライマーは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の５２位〜７１位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号７の塩基配列を有するプライマーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の１６４位〜１８５位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号８の塩基配列を有するプライマーは、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ（Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）の１６ｓｒＲＮＡ遺伝子の４５３位〜４７３位の塩基に相同的な塩基配列を有する。
配列番号９の塩基配列を有するプライマーは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のｓｐａＡ遺伝子をコードする遺伝子領域の転写開始部位を１位としたとき、１１６０位〜１１８３位の塩基配列に相同的な塩基配列を有する。
配列番号１０の塩基配列を有するプライマーは、Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）のｍｅｃＡ遺伝子をコードする遺伝子領域の転写開始部位を１位としたとき、２７０位〜２９２位の塩基配列に相同的な塩基配列を有する。
このように、上記の各フォワードプライマーは、それぞれの菌種に特異的な１６ｓｒＲＮＡ遺伝子、ｓｐａＡ遺伝子又はｍｅｃＡ遺伝子の塩基配列に相同的な塩基配列を有している。
【００２５】
次に、プライマーセットを構成するリバースプライマーについて説明する。
配列番号１２の塩基配列を有するリバースプライマーは、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓに対応するものであり、前記６菌種の肺炎原因菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の共通配列で、５０２位〜５１９位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
配列番号１３の塩基配列を有するプライマーは、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対応するものであり、前記２菌種の肺炎原因菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の共通配列で、１３７８位〜１３９２位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
配列番号１４の塩基配列を有するリバースプライマーは、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子に対応するものであり、４０２位〜４１９位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
配列番号１５の塩基配列を有するリバースプライマーは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ遺伝子に対応するものであり、１３６３位〜１３８３位の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
【００２６】
配列番号１の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の２０２位〜５１９位の領域が増幅され、３１８塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号２の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１６５位〜５１９位の領域が増幅され、３５５塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号３の塩基配列を有するプライマーと配列番号１３の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１２２５位〜１３９２位の領域が増幅され、１６８塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号４の塩基配列を有するプライマーと配列番号１３の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の９９４位〜１３９２位の領域が増幅され、３９９塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号５の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の４３６位〜５１９位の領域が増幅され、８４塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号６の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の５２位〜５１９位の領域が増幅され、４６８塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号７の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１６４位〜５１９位の領域が増幅され、３５６塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号８の塩基配列を有するプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の４５３位〜５１９位の領域が増幅され、６７塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号９の塩基配列を有するプライマーと配列番号１５の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ遺伝子の１１６０位〜１３８３位の領域が増幅され、２２４塩基対の増幅産物が得られる。
配列番号１０の塩基配列を有するプライマーと配列番号１４の塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子の２７０位〜４１９位の領域が増幅され、１５１塩基対の増幅産物が得られる。
【００２７】
図１は、上記プライマーの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子内の増幅領域を模式的に示した図である。図中、欄外の直線は１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の１位から１５００位までを模式的に示している。図中、矢印は、各プライマーを表しており、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に対応する部位に配置している。矢印の矢尻は５´側を示している。また、太い直線はフォワードプライマーとリバースプライマーとで増幅される領域を示している。Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ遺伝子、及びＭＲＳＡのｍｅｃＡ遺伝子の増幅領域は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子内には設定されていないので、図中には記されていない。
図中「Ｉｎｔ．ｃｏｎｔ」は内部コントロールを意味する。
【００２８】
内部コントロールとして、人の常在菌ではないＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ（Ａ．ａｃｅｔｉ）を用いることが好ましい。核酸増幅に用いるプライマーとしては、配列番号１１の塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列を有するリバースプライマーとを用いる。
配列番号１１の塩基配列を有するフォワードプライマーは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５３位〜３７４位の塩基配列に相同的な配列を有する。配列番号１１の塩基配列を有するフォワードプライマーと配列番号１２の塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、Ａ．ａｃｅｔｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３５３位〜５１９位の領域が増幅され、１６７塩基対の増幅産物が得られる。
【００２９】
本発明におけるプライマーの合成は、当該技術分野で公知の手法を用いて行うことができる。
【００３０】
配列番号１〜１５の塩基配列を有する各プライマーは、Ｔｍ値がほぼ一致しているため、同一のＰＣＲ条件で核酸増幅をすることができる。又、これら全てのプライマーは特異性に優れているために、１の反応溶液中に添加した状態でＰＣＲを行った場合には、プライマーダイマーの形成やミスアニーリング等による非特異的な核酸増幅はほとんど生じない。このため、本発明のプライマーセットを用いることにより複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することが可能である。特に、配列番号１〜１５の各塩基配列を有する各プライマーを有するプライマーセットを用いることにより、主要な肺炎原因菌である１０菌種全てを同時に特異的に検出することが可能である。
【００３１】
また、本発明のプライマーセットの各プライマーは、各遺伝子の塩基配列に対する特異性を喪失しない限り、付加的な塩基配列を有していてもよく、標識されていてもよい。該標識は、通常核酸の標識に用いることができる物質であれば特に限定されるものではなく、蛍光物質やビオチン等の低分子化合物等が挙げられる。又、該付加的な塩基配列として、制限酵素認識配列や各種プロモーター配列等がある。  
【００３２】
特に、本発明のプライマーセットは、第一実施形態のプライマーセットの５´側にプロモーター配列を付加したキメラプライマーからなるプライマーセットとすることが好ましい。
該プロモーター配列に関しては、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡ−３´）、Ｔ３ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＴＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧ−３´）、ＳＰ６ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列（５´−ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ−３´）など適宜選択して用いることができ、このうちＴ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列が好ましい。
配列番号１６〜３０の各塩基配列を有するそれぞれのプライマーは、配列番号１〜１５の各塩基配列を有するそれぞれのプライマーの５´側に、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列を付加したものである。
【００３３】
配列番号１６〜３０の各塩基配列を有するそれぞれのキメラプライマーからなるプライマーセットは、第一実施形態のプライマーセットの５´側にそれぞれ同一のプロモーター配列が付加されたものであるので、第一実施形態のプライマーセットと同様に、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出することが可能である。
【００３４】
検出方法に関しては、特に限定されるものはなく、例えば、核酸増幅による検出や、プライマーセットをプローブとして用いたハイブリダイゼーション等により、肺炎原因菌を検出することができる。核酸増幅による検出方法は、例えば、核酸増幅産物の塩基配列を電気泳動やシーケンサー等により決定する方法が挙げられ、ハイブリダイゼーションによる検出方法は、例えばスポットハイブリダイゼーションやコロニーハイブリダイゼーション、Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、核酸サンドウィッチハイブリダイゼーション等が挙げられる。
微量な検体量で検出が行えることや、短時間で検出できることから、核酸増幅により肺炎原因菌を検出することが好ましい。
【００３５】
核酸増幅に関しては、ポリメラーゼを用いた塩基の伸長反応を行うものであれば特に限定されるものではなく、公知の方法を用いて行うことができる。例えば通常のＰＣＲに加えて、マルチプレックスＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられるが、複数種類の肺炎原因菌を同時に検出することを考慮すると、マルチプレックスＰＣＲが好ましい。
また、用いるポリメラーゼは、増幅塩基数や増幅塩基配列、反応温度等、考慮して適宜選択可能であるが、非特異的増幅を抑制することからも、ホットスタート用ポリメラーゼを用いることが好ましい。
核酸増幅用バッファーとしては、用いるポリメラーゼを考慮して、公知のものを適宜調整して用いることができる。
核酸増幅用ヌクレオチドに関しては、標識試薬等で標識されたものを用いることもできる。
【００３６】
核酸試料としては特に限定されるものではなく、生体試料や、生体試料から得られた培養物、及びこれらの試料から主に核酸を抽出した試料であってもよい。また、株化した細胞、ＰＣＲにより合成した試料等を用いることもできる。これら核酸の抽出方法としては、特に限定されるものではなく、例えばエタノール沈殿法等で行うことができる。その他、市販のキット等を用いてもよい。
【００３７】
本発明のプライマーセットは、複数種類のプライマーを同時に用いることができることから、マルチプレックスＰＣＲに用いることで複数種類の肺炎原因菌を一度に検出することが可能である。
【００３８】
更に、公知の定量的ＰＣＲを用いることで複数種類の肺炎原因菌を一度に、定量的に検出することが可能である。
【００３９】
特に、第一実施形態のプライマーセットの５´側にプロモーター配列を付加したキメラプライマーからなるプライマーセットと、該プロモーター配列と相同な塩基配列を有するユニバーサルプライマーとを用いて核酸増幅を行うことで、定量的かつ精度よく検出することが可能である。
【００４０】
ユニバーサルプライマーには、Ｔ７ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列、Ｔ３ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列、ＳＰ６ＲＮＡ合成酵素のプロモーター配列等、キメラプライマーで用いたプロモーター配列と相同な配列をもつプライマーを用いる。
【００４１】
具体的には、以下のように行う。
まず、核酸試料、キメラプライマーから成るプライマーセット、ユニバーサルプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ用バッファー、デオキシヌクレオチドをそれぞれ適宜調整した混合溶液を作製し、ＰＣＲを行う。
【００４２】
核酸増幅の反応初期においては、プライマーセットの各キメラプライマーが鋳型である核酸試料と反応し、キメラプライマーに付加されたプロモーター配列を両端に有する核酸増幅産物が得られる。
次いで、上記で得られた核酸増幅産物を鋳型とし、核酸増幅産物中のプロモーター配列とユニバーサルプライマーとを介して核酸増幅産物が得られる。
得られた核酸増幅産物を解析することで、定量的な検出を行うことができる。
【００４３】
ユニバーサルプライマーとキメラプライマーとを用いて核酸増幅することにより得られた核酸増幅産物は、プロモーター配列を有する。このプロモーター配列を有する核酸増幅産物は、ユニバーサルプライマーを介して増幅されるようにもなる。従来は、核酸増幅に用いるプライマーによって核酸増幅の効率が異なっていたが、同一のユニバーサルプライマーを用いて核酸を増幅することで、プライマー間での増幅効率を同一にすることができるため、核酸増幅による定量的な解析が可能となる。
【００４４】
また、プライマーの濃度比は、ユニバーサルプライマーの濃度を、キメラプライマーの濃度よりも多くすることが必要であり、ユニバーサルプライマー：キメラプライマーの濃度比が、１０：１から５０：１であることが好ましく、より好ましくは２０：１から４０：１、更に好ましくは４０：１である。ユニバーサルプライマーの濃度を高くすることで、該プライマーの反応性が増し、定量性が向上する。
【００４５】
従来のリアルタイムＰＣＲでは、鋳型やプライマー毎に定量に適したサイクル数を予め調べておく必要があるが、本発明の構成をとることにより、核酸増幅がプラトーに達した時点の核酸増幅産物は、もともと核酸試料に含有されていた鋳型の量に依存する。そのため、通常のＰＣＲにおいて行われるサイクル数であれば、特にサイクル数を考慮することなくＰＣＲを行い、定量することが可能である。これは、プライマー間の増幅効率が統一されるためと推察される。
【００４６】
このように、キメラプライマーとユニバーサルプライマーを用いて核酸増幅することにより、１の試料中に含まれる多数の肺炎原因菌を、リアルタイムＰＣＲをすることなく、簡便にかつ定量的に検出することが可能となる。また、複数種類の肺炎原因菌を同時に定量できることから、簡便にかつ迅速に肺炎原因菌の定量的に検出することができる。更に、新たな病原菌を検出する場合においても、キメラプライマーを追加するだけで定量的に検出することが可能である。
【００４７】
上記の核酸増幅により得られた二本鎖ＤＮＡの検出方法としては、特に限定されるものではなく、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、核酸増幅産物をハイブリダイゼーションさせて検出する方法や、核酸増幅産物を標識試薬によって検出する方法等が挙げられる。
特に、基板上にて検出する方法が好ましい。基板上にて検出することで、複数の核酸増幅産物を簡便に定量できるためである。また、サイズの差異が小さい核酸増幅産物も識別して定量することができるためである。
【００４８】
基板上における検出方法として、例えば以下の定量的な検出方法がある。
該方法は、核酸増幅により得られた二本鎖ＤＮＡを一本鎖に変性し、この一本鎖ＤＮＡと、基板上に固定した該核酸増幅産物に相補的な配列を有するプライマーとを介して二本鎖ＤＮＡを形成すると同時に、該二本鎖ＤＮＡを標識し、検出する方法である。該核酸増幅産物に相補的な配列を有するプライマーとして、特に本発明のプライマーセットを構成するフォワードプライマーを用いることが好ましい。特異性に優れるためである。以下、該核酸増幅産物に相補的な配列を有するプライマーとして、本発明のプライマーセットを構成するフォワードプライマーを用いた方法について説明する。
まず、フォワードプライマーを基板上に固定する。
【００４９】
このような基板としては、熱可塑性樹脂を用いたプラスチック材料が好適である。  このような熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることが好ましい。このような熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂、等を用いることができる。このうち、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に優れた飽和感情ポリオレフィンを使用することが好ましい。
【００５０】
また、基板の形状としては特に限定されるものではなく、板状の他に、例えば、フィルム状やシート状、チューブ状等が挙げられる。例えば、９６穴等のマルチプレートが挙げられる。
また、基板の表面を微細加工により小さなマイクロプレート用構造にすることが好ましい。この場合、多数の凹部を形成し、この凹部にて固相プライマーを結合させることが好ましい。凹部に関しては、深さ１５０〜２５０μｍ、底部直径０．５〜１．５ｍｍのウェルとすることが好ましい。凹部を形成することで、効率よくフォワードプライマーとハイブリダイズすることが可能となる。
【００５１】
基板へのフォワードプライマーの固定方法としては、公知のものであれば限定されるものではなく、例えば、プライマーを溶解または分散した液体を点着する方法が挙げられる。このプライマーを溶解または分散した液体としては、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができ、ＴＥバッファー（ｐＨ８．０）などが挙げられる。
【００５２】
特に、基板の表面にリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が基板表面に存在するような場合には、この高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。
【００５３】
このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該基板の表面に固定化される。
【００５４】
また、固定するフォワードプライマーの５´側には、基板と結合するためのリンカー部を有していることが好ましい。リンカー部は、基板に固定されるために用いられるのであれば、特に限定されるものではないが、例えば、基板表面上に活性エステル基がある場合、このエステル基反応性を高めるため、５´側にアミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基を導入されたフォワードプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に基板の表面上に固定化することができる。
【００５５】
フォワードプライマーの点着後、基板表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液等で洗浄し、洗浄後はプライマーを固定化した以外の基板表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行うことが好ましい。
【００５６】
このようなアルカリ化合物としては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウム等が挙げられる。
【００５７】
また、一級アミノ基を有する化合物としては、例えばグリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレン等が挙げられる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
【００５８】
洗浄後は、７５〜８５℃の温度で1時間加熱することが好ましい。加熱処理の後、１２０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶを照射し、ＤＮＡを更に固定化することがより好ましい。
【００５９】
また、基板上にゲルを展開させ、このゲルに固相プライマーを結合させることもできる。この場合、固相プライマーを三次元で固定できるので、より効率よく反応を進めることができる。このようなゲルとしては、例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル等が挙げられる。
【００６０】
基板に設けた各凹部にそれぞれの肺炎原因菌に特異的なフォワードプライマーを固定することで、核酸増幅により合成された二本鎖ＤＮＡが基板上で混在することなく、一度に定量することが可能となる。
【００６１】
次に、核酸増幅により得られた核酸増幅産物を一本鎖に変性し、前記フォワードプライマーを固定した基板上に導入する。
核酸の一本鎖への変性方法としては、公知の方法で行うことができ、例えば、熱変性により行うことが好ましい。この場合、９５℃で１〜１０分処理することが好ましい。
【００６２】
基板に反応溶液を導入するには、基板上に設けられた複数の凹部全てを覆うことが可能な透明なカバーを基板に被せて、表面張力によって反応溶液を凹部内に導入することが好ましい。これにより、反応溶液を分注する手間が省けるばかりでなく、コンタミネーションの抑制や、反応溶液の総量を軽減することができ、低コスト化が図られる。
【００６３】
次いで、一本鎖に変性した核酸と基板に固定されたプライマーとをハイブリダイズさせ、デオキシヌクレオチドとポリメラーゼにより基板上に二本鎖ＤＮＡを形成させると同時に標識試薬を取り込ませ、検出を行う。
上記ハイブリダイゼーションから二本鎖ＤＮＡ形成までの反応は７０℃のワンステップで行うことが可能であり、３０分反応させれば十分である。
ここで、検出のために新たにデオキシヌクレオチドやポリメラーゼ等を加えても良いが、核酸増幅を行った反応溶液をそのまま熱変性を加えて基板上に導入することで、核酸増幅に用いたヌクレオチドやＤＮＡポリメラーゼを、基板上に二本鎖ＤＮＡを形成する際にも用いることができるため、低コスト化が図れる。
【００６４】
標識試薬に関しては、二本鎖ＤＮＡを標識する公知のものを用いることができ、例えば、二本鎖ＤＮＡ間に取り込まれるインターカレーターであるＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ等が挙げられる。ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎを反応溶液中に加えることで、基板上で二本鎖ＤＮＡが形成されるときに該ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎが取り込まれ、簡便に標識することが可能である。
また、デオキシヌクレオチドを予め標識しておくことも可能であり、必要に応じ適宜選択すればよい。デオキシヌクレオチドの標識に関しては特に限定されるものではなく、例えば、ＦＩＴＣ、やローダミン、Ｃｙ３やＣｙ５などのサイアニン、ビオチンやジゴキシゲニン、ＲＩ等が挙げられる。これら標識されたデオキシヌクレオチドは、基板上における二本鎖ＤＮＡの形成に用いられるため、形成された二本鎖ＤＮＡを簡便に標識することができる。
このような標識試薬は、核酸増幅産物を一本鎖に変性させる前に、反応溶液中に加えても良く、核酸増幅産物を一本鎖に変性させた後に、反応溶液中に加えても良い。
この二本鎖ＤＮＡ間に取り込まれた標識試薬の蛍光等を測定することで、核酸を定量することができる。この標識試薬の測定に関しては、公知の方法を用いて行うことができ、標識試薬を考慮して適宜調節して行えばよい。例えばマイクロアレイ・スキャナーを用いて、標識試薬がＣＹ３であった場合、５４３ｎｍの励起光で、５７６ｎｍの蛍光を経時的に観察することが好ましい。
【００６５】
また、リアルタイムＰＣＲ等により、検出に用いた蛍光色素の蛍光量を、経時的に測定することも可能である。このようにして得た測定値を積算することにより、得られたＰＣＲ産物を定量することができる。
【００６６】
本発明のプライマーセットと、ＤＮＡポリメラーゼと、ヌクレオチドと、核酸増幅用バッファーとを予め調整して混合したものをキットとすることができる。キットとすることで、試薬の調整等の手間が省け、簡便に行うことができる。また各種溶液を混合する際のコンタミなどを抑制することもできる。
キットに含まれるプライマーセットとしては、本発明の第一実施形態であるプライマーセットでも良いし、プロモーター配列を付加したキメラプライマーからなるプライマーセットでも良い。
また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、核酸の増幅塩基数やＴｍ値、塩基配列等を適宜考慮して選択し、用いることができる。
ヌクレオチドに関しては、標識試薬で標識されたデオキシヌクレオチド等を用いることもできる。
核酸増幅用バッファーとしては、用いるＤＮＡポリメラーゼを考慮して、公知のものを適宜調整して用いることができる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
マイクロアレイ基板上での肺炎原因菌の検出
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＡ．ａｃｅｔｉを検出するため、各菌種に対するフォワードプライマー（配列番号１，４，８，１１）をマイクロアレイ基板上に固定し、ＰＣＲにより増幅して得た核酸増幅産物を基板上で検出した。
まず始めに、各フォワードプライマーを固定したマイクロアレイ基板を作製した。
長さ７６ｍｍ、幅２６ｍｍのプラスチック製基板の上に、深さ２００μｍ、底部直径１ｍｍのウェル６０個を備えたマイクロアレイ基板を作製した。この基板の表面に活性エステルを有するポリマーをコートし、フォワードプライマーの５´末端に導入したアミノ基との結合機能を付与した。
その後、各フォワードプライマーをそれぞれ１μＭに調整し、固定用のスポッティング溶液（住友ベークライト社製）に溶解させ、この１μｌを各ウェルに滴下した。滴下後、基板を８０℃で１時間保温し、各フォワードプライマーを基板に固定した。
ポジティブコントロールとしてはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓ及びＡ．ａｃｅｔｉの増幅部位に共通な配列である、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の３４１位〜３５９位の領域の塩基配列を有するプローブを基板に固定し、ネガティブコントロールとしては、２０塩基対からなるポリＴ配列を基板に固定した。
Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＡ．ａｃｅｔｉのゲノム１ｎｇをそれぞれＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、それぞれに、０．１ｍＭデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、４ユニットのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、０．１５μＭに調整した各フォワードプライマー（配列番号１〜１１）の混合液、及び０．１５μＭに調整した各リバースプライマー（配列番号１２〜１５）の混合液、を混合させ反応溶液を作製した。本実施例１で用いたプライマーの配列を、表１に示す。
【００６８】
【表１】
0005403573.tif 000002
【００６９】
次に、上記反応溶液に対し、９５℃を３０秒、６０℃を９０秒、７２℃を３０秒で４５サイクル反応させてＰＣＲを行った。ＰＣＲ終了後、９５℃で５分反応させた後、各フォワードプライマーを結合させた基板に透明なカバーを被せて、ＰＣＲ反応溶液を凹部に導入した。その後、基板を７０℃の恒温槽に設置し、温度を７０℃に保ち、基板に固定した固相プライマー伸長反応を３０分間行った後、ビオチン標識ｄＵＴＰをストレプトアビジン・アルカリフォスファラーゼを介してＢＩＰＣ／ＮＢＴ発色させ観察した。
この結果を図２に示す。
（ａ）は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムを鋳型としてＰＣＲを行い、この反応溶液を基板に展開してＭＰＥＸを行った結果である。基板には表記されている菌種に対する各フォワードプライマーが固定されている。図中、ウェルの色が濃くなっているものが、陽性であったもので、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅとポジティブコントロールのウェルで、核酸が検出された。
（ｂ）は、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓのゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったもので、Ｍ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓとポジティブコントロールのウェルで、核酸が検出された。
（ｃ）は、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムを鋳型としてＰＣＲを行ったもので、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのフォワードプライマーが固定されたウェルで、核酸が検出された。ポジティブコントロールに関しては、今回用いたポジティブコントロール用のプライマーにはＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの増幅領域が含まれていないため、検出されなかった。
（ｄ）は、対照実験であり、ＰＣＲの鋳型としてＡ．ａｃｅｔｉが用いられている。核酸はポジティブコントロールのみ、検出された。
以上より、基板上で本発明のプライマーセットを用いて、肺炎原因菌の特異的な検出が可能であることが観察された。
【００７０】
（実施例２）
マルチプレックスＰＣＲを利用した肺炎原因菌２菌種の検出
試料中の肺炎原因菌の核酸を同定するため、表１に記載の各肺炎原因菌に特異的なフォワードプライマー（配列番号１〜１１）とリバースプライマー（配列番号１２〜１５）とを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。その後、フォワードプライマーを固定した基板にＰＣＲ産物を展開し、基板に固定した固相プライマー伸長反応を行うと同時に、蛍光試薬により二本鎖ＤＮＡを標識した。その後、蛍光強度を測定することで、肺炎原因菌由来の核酸を検出できるかどうかを検討した。
基板には、各フォワードプライマーを０．５μＭに調整し、図３（ａ）に示すように、基板の各ウェルに、各菌種に特異的なフォワードプライマーを実施例１と同様な方法により固定した。なお、図３（ａ）中、ｍｅｃＡ２、Ｓ．ｓｐＡ２、Ｐ．ａｅｒ２、Ｋ．ｐｎｅ２、Ｌｅｇｉｏ２、Ｍ．ｐｎｅ２に関しては、各フォワードプライマーを１μＭに調整して基板に固定した。
次に、終濃度が１ｎＭとなるようにＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅの核酸、１ｍＭデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、０．1５μＭに調整した各フォワードキメラプライマー、同様に調整した各リバースプライマー、４ユニットのＴａｑポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ社製）、添付のバッファー、を混合し、９５℃で５分間加熱した後、実施例１と同様な方法によりＰＣＲを行い、ＰＣＲ終了後、９５℃で５分反応させた後、各フォワードプライマーを結合させた基板に透明なカバーを被せて、ＰＣＲ反応溶液を凹部に導入した。その後、基板を７０℃の恒温槽に設置し、温度を７０℃に保ち、ＭＰＥＸ反応を３０分間行った後、５４３ｎｍの励起光で５７６ｎｍの蛍光を観察し，ＣＹ３の蛍光を観察した。
この結果を図３（ｂ）に示す。
図３（ｂ）は、反応終了後の基板をマイクロアレイ・スキャナーで取り込んだ画像である。この図より、試料中に含まれるＳ．ａｕｒｅｕｓ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅに対して特異的なフォワードプライマーを配したウェル及びポジティブコントロールを配したウェルにおいて、ＣＹ３の蛍光が観察された。
図３（ｂ）で観察された蛍光強度を、ネガティブコントロールの蛍光強度に対する相対比で表したグラフが、図３（ｃ）である。図３（ｂ）と同様に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅで蛍光強度の増加が観察された。また、固相プライマーの濃度を２倍で固定すると蛍光強度が増加することが観察された。
以上より、複数種類の肺炎原因菌に対する特異的なプライマーが固定された基板において、本発明のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことで、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。
【００７１】
（実施例３）
マルチプレックスＰＣＲを利用した肺炎原因菌２菌種の検出
肺炎原因菌由来の核酸を実施例２のＳ．ａｕｒｅｕｓからＭＲＳＡに変えて行った。実施方法は、実施例２と同様である。
図４（ｂ）は、反応終了後の基板をマイクロアレイ・スキャナーで測定した結果である。この結果より、試料中に含まれるＭＲＳＡ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅに対して特異的なフォワードプライマーを配したウェルにおいて、ＣＹ３の蛍光が観察された。
図４（ｂ）で観察された蛍光強度を、ネガティブコントロールの蛍光強度に対する相対比で表したグラフが、図４（ｃ）である。図４（ｂ）と同様に、ｍｅｃＡ及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅで蛍光強度の増加が観察された。また、基板に固定したフォワードプライマーの濃度を２倍で固定すると蛍光強度が増加することが観察された。
以上より、複数種類の肺炎原因菌に対する特異的なプライマーが固定された基板において、本発明のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行うことで、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。
【００７２】
（実施例４）
マルチプレックスＰＣＲを利用した肺炎原因菌５菌種の検出
試料中の肺炎原因菌５菌種を検出するために、各肺炎原因菌に特異的なフォワードキメラプライマー（配列番号１６〜２０）とリバースキメラプライマー（配列番号２７〜３０）とを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動にて分離し、各菌種の検出を行った。増幅部位は図１に示す通りである。また、本実施例４で用いたプライマー配列を表２に示す。
【００７３】
【表２】
0005403573.tif 000003
【００７４】
等量の肺炎原因菌１０菌種のゲノムを混合した混合溶液を作製し、それぞれの肺炎原因菌のゲノムコピー数が１０６となるように、限界希釈した溶液を調整した。次に、この溶液それぞれに、０．０１ｍＭのデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、４ユニットのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、に対する０．０２５μＭの各フォワードキメラプライマー、０．０２５μＭに調整した各リバースキメラプライマー、1μＭのユニバーサルプライマー、及び１０００ｐｇのＣＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ、を混合させマルチプレックスＰＣＲを行った。
ＰＣＲの反応条件は、実施例１と同様である。
ＰＣＲ終了後、１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動して各ＰＣＲ産物を分離し、蛍光を観察した。
この結果を、図５及に示す。
図５は、電気泳動後に蛍光強度を測定しグラフにしたもので、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＰＣＲ産物の塩基数はそれぞれ順に１４６塩基対（図中＜１＞）、２２２塩基対（図中＜２＞）、３８８塩基対（図中＜３＞）、４１６塩基対（図中＜４＞）、４７４塩基対（図中＜５＞）、となっている。なお、上述した塩基数は、電気泳動した際の実測値を示している。
図５より、本発明のキメラプライマーセットを用いることで、マルチプレックスＰＣＲにより、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。
【００７５】
（実施例５）
マルチプレックスＰＣＲを利用した肺炎原因菌他の５菌種の検出
実施例４で用いたフォワードキメラプライマーをＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するフォワードキメラプライマー（配列番号２１〜２５）に変更し、また、リバースキメラプライマーを、配列番号２７，２９，３０の各塩基配列を有するそれぞれのプライマーに変更して、実施例４と同様な方法によって肺炎原因菌由来の核酸の検出を行った。この結果を、図６に示す。
図６は、電気泳動後に蛍光強度を測定しグラフにしたもので、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ＰＣＲ産物の塩基数は、それぞれ順に１２９塩基対（図中＜６＞）、２０８塩基対（図中＜７＞）、２８１塩基対（図中＜８＞）、４０９塩基対（図中＜９＞）、５４７塩基対（図中＜１０＞）、となっている。なお、上述した塩基数は、電気泳動した際の実測値を示している。
図６より、本発明のプライマーセットを用いることで、マルチプレックスＰＣＲにより、複数種類の肺炎原因菌を同時に特異的に検出できることが観察された。
【００７６】
（実施例６）
マルチプレックスＰＣＲを利用した複数種類の肺炎原因菌の定量的な検出
複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出するために、表２に記載のＭ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、及びＣ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するキメラプライマーに特異的なフォワードキメラプライマー（配列番号１６〜２６）、リバースキメラプライマー（配列番号２７〜３０）、及びユニバーサルプライマー（配列番号３１）を用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を電気泳動にて分離し、その後、蛍光強度を測定することで、複数種類の肺炎原因菌を定量的に検出できるかどうかを検討した。増幅部位は図１に示す通りである。
各肺炎原因菌１０菌種のゲノムをそれぞれ終濃度１０１、１０２、１０３、１０４、１０５１０6コピーとなるように混合して調整し、それぞれに１ｍＭデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、４ユニットのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、上記０．０２５μＭの各フォワードキメラプライマーとリバースキメラプライマー、1μＭのユニバーサルプライマー、１０００ｐｇのＣＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ、を混合した。
その後、実施例４と同様にＰＣＲを行い、電気泳動した後、蛍光を観察した。
この結果を図７に示す。
図７は、Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、ＭＲＳＡのｍｅｃＡ、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに対するキメラプライマーとユニバーサルプライマーとを用いてＰＣＲを行った結果であり、それぞれ順に、ＰＣＲ産物の塩基数は１２９塩基対（図中＜１＞）、１４６塩基対（図中＜２＞）、２０８塩基対（図中＜３＞）、２２２塩基対（図中＜４＞）、２８１塩基対（図中＜５＞）、３８８塩基対（図中＜６＞）、４０９塩基対（図中＜７＞）、４１６塩基対（図中＜８＞）、４７４塩基対（図中＜９＞）、５４７塩基対（図中＜１０＞）となっている。なお、上述した塩基数は、電気泳動した際の実測値を示している。
図７において、鋳型となる核酸のコピー数の増加に伴い、蛍光強度（ＦＵ）の増加が観察された。
【００７７】
（実施例７）
マルチプレックスＰＣＲを利用した複数種類の肺炎原因菌の定量的な検出
図８〜図１１はリアルタイムＰＣＲによって蛍光強度を経時的に観察したものである。Ｍ．ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｓｐａＡ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのゲノムをそれぞれ終濃度１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０6コピーとなるように混合して調整し、また、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに関しては、ゲノムをそれぞれ終濃度１０１、１０２、１０３、１０４、１０５コピーとなるように混合して調整し、ＭＲＳＡに関しては、ゲノムをそれぞれ終濃度１０６１０７１０８となるように混合して調整し、ゲノム溶液を作製した。それぞれのゲノム溶液に、１ｍＭデオキシリボヌクレオチド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、４ユニットのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（タカラ社製）、表２に記載の０．０２５μＭの各フォワードキメラプライマーとリバースキメラプライマー、1μＭのユニバーサルプライマー、１０００ｐｇのＣＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ、を混合した。その後、リアルタイムＰＣＲを行い、蛍光を観察した。ＰＣＲの反応条件は、実施例１と同様である。
この結果を図８〜図１１に示す。図８〜図１１より、サイクル数が増加していったとき、鋳型の量に依存した蛍光強度の増加が観察された。
よって、本発明のキメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いることで、マルチプレックスＰＣＲにより、複数種類の肺炎原因菌を同時に定量的に検出できることが観察された。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明を用いることにより、複数種類の肺炎原因菌を一度に検出することができる。また、定量的な検出が可能であるので、微量でも肺炎を起こす原因菌の検出や、感染量により病症が異なる原因菌の検出に有効である。
本発明のプライマーセットを用いた肺炎原因菌の検出システムは、クラミジアやリッケッチアなど培養困難な病原微生物、薬剤耐性菌など院内感染原因菌に対して適切な治療法選択のための臨床診断用簡易検査試薬として利用可能である。更に、本発明では基板に合成樹脂を用いており、取り扱いが簡便で検出用機器に合わせた加工が可能な汎用性の高いシステムを提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】核酸増幅による１６ＳｒＲＮＡ遺伝子内の増幅範囲を示した模式図である。
【図２】基板上で、肺炎原因菌の検出を行った図である。
【図３】マルチプレックスＰＣＲによって肺炎原因菌２菌種の検出を基板で測定した図である。
【図４】マルチプレックスＰＣＲによって他の肺炎原因菌２菌種の検出を基板で測定した図である。
【図５】マルチプレックスＰＣＲによる肺炎原因菌５菌種を検出した図である。
【図６】マルチプレックスＰＣＲによる肺炎原因菌他の５菌種を検出した図である。
【図７】マルチプレックスＰＣＲによる肺炎原因菌１０菌種を検出した図である。
【図８】キメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲにより、肺炎原因菌であるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、及びＭＲＳＡを検出した図である。
【図９】キメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲにより、肺炎原因菌であるＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、及びＬｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．を定量的に検出した図である。
【図１０】キメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲにより、肺炎原因菌であるＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａｅ、及びＭ．ｃａｔａｒｒａｈａｌｉｓを定量的に検出した図である。
【図１１】キメラプライマー及びユニバーサルプライマーを用いたマルチプレックスＰＣＲにより、肺炎原因菌であるＳ．ａｕｒｅｕｓを定量的に検出した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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