(57)【要約】  本発明は、イオントフォレーシスにより抗酸化成分を生体に投与するための製剤であって、抗酸化成分がリポソームに封入されてなることを特徴とするイオントフォレーシス用リポソーム製剤に関する。
2008087803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオントフォレーシスにより抗酸化成分を生体に投与するための製剤であって、抗酸化成分がリポソームに封入されてなることを特徴とする、イオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２】
前記抗酸化成分が抗酸化酵素である、請求項１に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項３】
前記抗酸化酵素が、ＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）である、請求項２に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項４】
前記抗酸化酵素が、グルタチオンペルオキシターゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）および／またはカタラーゼである、請求項２に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項５】
前記抗酸化成分として、ＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）、グルタチオンペルオキシターゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）およびカタラーゼのそれぞれが封入されたリポソームの組み合わせからなる、請求項１に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項６】
前記リポソームが、カチオン性脂質、ならびに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を構成成分として含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項７】
紫外線に起因する皮膚障害の予防ないし治療のための、請求項１に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項８】
毛孔を介して前記活性成分を生体に投与するための、請求項１に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項９】
前記カチオン性脂質が、Ｃ１〜Ｃ２２アシルオキシ基およびトリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基で置換されたＣ１〜Ｃ２０アルカンである、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１０】
前記カチオン脂質における前記Ｃ１〜Ｃ２２アシルオキシ基が２個であり、前記トリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基が１個である、請求項９に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１１】
前記カチオン性脂質が１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパンである、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１２】
前記両親媒性グリセロリン脂質がホスファチジルコリンである、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１３】
前記両親媒性グリセロリン脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１４】
前記飽和脂肪酸がＣ１２〜Ｃ２２の飽和脂肪酸である、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１５】
前記飽和脂肪酸が、パルミチン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１６】
前記不飽和脂肪酸が炭素−炭素不飽和二重結合を１〜６個含むものである、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１７】
前記不飽和脂肪酸がＣ１４〜Ｃ２２の不飽和脂肪酸である、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１８】
前記不飽和脂肪酸が、オレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項１９】
前記リポソームが構成成分としてステロール類をさらに含んでなる、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２０】
前記ステロール類が、コレステロール、Ｃ１２〜Ｃ３１脂肪酸コレステリルおよびＣ１２〜Ｃ３１脂肪酸ジヒドロコレステリルおよびポリオキシエチレンコレステリルエーテルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項１９に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２１】
前記ステロール類が、コレステロール、ラノリン脂肪酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、マカデミアナッツ脂肪酸コレステリルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項１９に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２２】
前記ステロール類がコレステロールである、請求項１９に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２３】
前記カチオン性脂質が１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパンであり、
前記両親媒性グリセロリン脂質が卵黄ホスファチジルコリンであり、
前記ステロール類がコレステロールである、請求項１９に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２４】
前記カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質とのモル比が、３：７〜７：３である、請求項６に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２５】
前記カチオン性脂質と、ステロール類とのモル比が、３：７〜７：３である、請求項１９に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２６】
前記両親媒性グリセロリン脂質と、ステロール類とのモル比が、３：７〜７：３である、請求項１９に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２７】
前記カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質およびステロール類の和とのモル比が、３：７〜７：３である、請求項１９に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２８】
前記カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質と、ステロール類とのモル比が、約２：２：１である、請求項１９に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項２９】
前記リポソームの平均粒径が４００ｎｍ以上である、請求項１に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項３０】
前記リポソームの平均粒径が４００〜１０００ｎｍである、請求項１に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項３１】
前記リポソームが電流値０．１〜０．６ｍＡ／ｃｍ２でイオントフォレーシスにより生体に投与される、請求項１に記載のイオントフォレーシス用リポソーム製剤。
【請求項３２】
請求項１に記載のリポソーム製剤を保持している、イオントフォレーシスにより抗酸化成分を生体に投与するための電極構造体。
【請求項３３】
請求項３２に記載の電極構造体を具備してなる、イオントフォレーシス装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、イオントフォレーシス（iontophoresis）によって抗酸化成分を経皮的に投与する技術に関し、特に、イオントフォレーシスによって抗酸化成分を安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達させることができ、紫外線に起因する皮膚障害の予防ないし治療に特に有用なイオントフォレーシス用リポソーム製剤に関するものである。
【０００２】
背景技術
近年、オゾン層の破壊等の要因による紫外線量の増大が人体にもたらす影響が問題とされている。特に、紫外線に起因する皮膚障害は深刻な問題である。
【０００３】
このような紫外線による皮膚障害は、皮膚の表面のみならず皮膚内部においても生じることが知られている。したがって、特にＵＶＡのように皮膚内部にまで浸透する紫外線による皮膚障害を防止ないし治療するためには、皮膚内部での活性酸素の産生を効果的に阻害するか、いったん産生された活性酸素をすみやかに除去する必要がある。
しかしながら、従来の通常の技術では、このような皮膚内部で発生する活性酸素を除去することは困難であった。
【０００４】
ところで、生体の所定部位の皮膚ないし粘膜（以下、単に「皮膚」という）の表面上に配置されたイオン性の薬物に対してこのイオン性薬物を駆動させる起電力を皮膚に与えて、薬物を皮膚を介して体内に導入（浸透）させる方法は、イオントフォレーシス（iontophoresis、イオントフォレーゼ、イオン導入法、イオン浸透療法）と呼ばれている（特開昭６３−３５２６６号等参照）。
【０００５】
例えば、正電荷をもつイオンは、イオントフォレーシス装置の電気系統のアノード（陽極）側において皮膚内に駆動（輸送）される。一方、負電荷をもつイオンは、イオントフォレーシス装置の電気系統のカソード（陰極）側において皮膚内に駆動（輸送）される。イオントフォレーシスによれば、肝臓の初回通過効果を回避でき、薬物等の投与の開始および中断も簡便に制御できる。そこで、近年、イオントフォレーシスは、局所作用のみならず、全身作用を目的とした投与方法として注目されている。
【０００６】
イオントフォレーシスにおいて、薬物は主に皮膚の角質層を介して生体に投与されるのが一般的である。しかしながら、角質層は脂溶性の高密度層であり、水溶性の高い物質やペプチド、核酸などの高分子を透過させることが困難な場合が少なくない。また、電荷を有しない物質はそのままではイオントフォレーシスを適用できないという問題がある。
【０００７】
種々の物理化学的性質を有する物質を経皮的に投与するため、イオントフォレーシスにおいて、荷電性のリポソームをキャリアーとして適用することが検討されている（Median VM et al., International Journal of Pharmaceutics, Dec. 8, 2005:306(1-2):1-14. Epub Nov. 2, 2005  Epub 2005 Nov 2. Review）。しかしながら、リポソームは粒子径が大きく、そのまま角質層を透過することは困難である。
【０００８】
一方、リポソームを効率的に経皮投与するため、皮膚表面から皮膚の深部にまで繋がる毛孔をターゲットとすることが知られている（例えば、Hoffman RT et al., Nat Med. 1995 Jul;1(7):705-706、Fleisher D et al, Life Sci. 1995;57(13):1293-1297を参照されたい）。
【０００９】
さらに、近年、イオントフォレーシスにおいても、毛孔を介してリポソームを投与することが検討されている。例えば、Protopapa EE らは、酵素を封入したリポソームを、イオントフォレーシスにより毛孔中の毛母幹細胞へ送達したことを報告している（Protopapa EE et al., J Eur Acad Dermatol Venereol. 1999 Jul;13(1):28-35）。
【００１０】
また、Han Iらは、光線力学治療用薬剤である５−アミノレブリン酸を封入したリポソームを、イオントフォレーシスにより毛孔上部の毛孔脂腺等に送達したことを報告している（Han I et al., Arch Dermatol Res. 2005 Nov;295(5):210-217. Epub 2005 Nov 11）。さらに、Han Iらは、毛孔関連腫瘍用の治療剤であるアドリアマイシンを封入したリポソームを、イオントフォレーシスにより毛孔へ投与したことを報告している（Han I et al., Exp Dermatol. 2004 Feb;13(2):86-92）。
【００１１】
毛孔をターゲットとした従前のイオントフォレーシスでは、皮膚表面疾患等を治療対象とし、皮膚組織の表層部に薬物を送達させることを主目的としている。しかしながら、イオントフォレーシスにおいて全身作用を目的として薬物等を投与する場合、毛孔深部に存在する皮下血管を介して全身循環系へ薬物を送達することが望まれる。
【００１２】
さらに上述したような皮膚の内部まで浸透する紫外線に起因する皮膚障害を治療ないし予防するためには、皮膚内部における活性酸素の産生を阻害したり、生じた活性酸素を迅速に除去するために、抗酸化成分を確実に毛孔周辺内組織に送達することが求められる。したがって、毛孔をターゲットとしたイオントフォレーシスにおいて、安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺内組織にまで抗酸化成分を送達することは重要な課題である。
【発明の概要】
【００１３】
したがって、本発明は、イオントフォレーシスにおいて、抗酸化成分を安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達することを可能とするイオントフォレーシス用製剤を提供することを目的とするものである。
【００１４】
本発明者らは、リポソームに抗酸化成分を封入してイオントフォレーシスに適用することにより、抗酸化成分を安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達することができるとの知見を得た。
【００１５】
すなわち、本発明に係るイオントフォレーシス用リポソーム製剤は、イオントフォレーシスにより抗酸化成分を生体に投与するための製剤であって、抗酸化成分がリポソームに封入されてなることを特徴とするものである。
【００１６】
本発明の好ましい態様において、前記抗酸化成分が抗酸化酵素であり、より具体的には、抗酸化酵素が、ＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）である。
【００１７】
さらに、別の態様においては、上記抗酸化酵素が、グルタチオンペルオキシターゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）および／またはカタラーゼであることができ、さらに、抗酸化成分として、ＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）、グルタチオンペルオキシターゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）およびカタラーゼのそれぞれが封入されたリポソームの組み合わせからなることができる。
【００１８】
本発明の好ましい態様においては、前記リポソームが、カチオン性脂質、ならびに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を構成成分として含んでなる。
【００１９】
また、本発明は、紫外線に起因する皮膚障害の予防ないし治療のための上記イオントフォレーシス用リポソーム製剤を包含し、さらに、イオントフォレーシスにより抗酸化成分を生体に投与するための電極構造体ならびにこの電極構造体を具備してなるイオントフォレーシス装置も包含するものである。
【００２０】
本発明は、安定で毛孔内移動可能なリポソームに抗酸化成分が封入された製剤からなるので、イオントフォレーシスによって皮膚内部に当該リポソーム製剤を送達させることができ、これにより皮内で生じる活性酸素を消去することが可能となり、紫外線照射等に起因する皮膚障害を予防、低減ならびに治療にすこぶる有用である。また、従来困難であると考えられていた皮膚内部での活性酸素の発生に起因する傷害を防止することによって皮膚炎症を含む皮膚障害の予防のみならず、これらの傷害に起因するシミやしわの発生を抑制することができる点でもすぐれた効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明によるリポソーム製剤を投与する際のin vivo皮膚透過試験に用いたイオントフォレーシス装置の概要を示す図である。
【図２】SOD封入リポソーム非投与ラット（A:UV照射）およびSOD封入リポソーム投与ラット（B:SODリポソーム＋UV照射）のUV照射後の皮膚の生物の形態を示す写真である。
【図３】SOD封入リポソーム非投与ラット皮膚（UV）およびSOD封入リポソーム投与ラット皮膚（SOD）のUV照射後における過酸化脂質（マロンジアルデヒド：MDA）の定量結果を示すグラフである。
【図４】SOD封入リポソーム非投与ラット（UV）およびSOD封入リポソーム投与ラット（SOD）のUV照射後の皮膚切片を各種過酸化傷害マーカー抗体によって免疫染色した顕微鏡写真である。
【発明の具体的説明】
【００２２】
本明細書において、特に断らない限り、基または基の一部における「Ｃ」とは基または基の一部における「炭素の総数」を意味する。したがって、例えば、「Ｃ１〜Ｃ６の飽和脂肪酸」とは、「総炭素数が１〜６個の飽和脂肪酸」を意味し、「Ｃ１２〜３１脂肪酸コレステリル」とは、「総炭素数が１２〜３１個の脂肪酸」を有する脂肪酸コレステリルを意味する。
【００２３】
また、基または基の一部としての「アルキル」、「アルケニル」または「アルキニル」という語は、直鎖状、分枝鎖状、または環状のアルキル、アルケニルまたはアルキニルを意味し、好ましくは直鎖状または分枝鎖状であり、より好ましくは直鎖状である。
【００２４】
また、「脂肪酸コレステリル」または「脂肪酸ジヒドロコレステリル」において、脂肪酸は飽和または不飽和であってよい。さらに、上記脂肪酸は、直鎖状、分枝鎖状、または環状の脂肪酸であってよい。そして、「脂肪酸コレステリル」における脂肪酸は、好ましくは直鎖状であり、「脂肪酸ジヒドロコレステリル」における脂肪酸は、好ましくは直鎖状である。
【００２５】
また、特に断らない限り、「アリール」とは、フェニルまたはナフチルを意味し、「ヘテロアリール」という語は、特に断らない限り、１−３個の窒素、酸素若しくは硫黄原子を含む５−６員ヘテロアリール（５−６員環芳香族複素環基）を意味する。
【００２６】
また、「前面」とは、リポソームの投与に際して電極構造体内を流れる電流の経路上における生体皮膚に近い側を意味する。
【００２７】
イオントフォレーシス用リポソーム
上述したように、本発明による製剤は、リポソームに封入された抗酸化成分を含んでなる。
本発明の好ましい態様においては、抗酸化成分が封入されるべきリポソームが、カチオン性脂質、ならびに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を構成成分として含んでなる。このような一定の構成成分を含有するリポソームが、抗酸化成分を安定に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達するのに有利であることは意外な事実である。
【００２８】
そして、本発明におけるリポソームの構成成分であるカチオン脂質は、好ましくはＣ１〜Ｃ２０アシルオキシ基およびトリＣ１〜Ｃ４アルキルアンモニウム基で置換されたＣ１〜Ｃ２０アルカンである。
【００２９】
さらに、上記Ｃ１〜Ｃ２０アルカンは、好ましくはＣ１〜Ｃ５アルカンであり、より好ましくはＣ１〜Ｃ３アルカンである。
【００３０】
また、上記Ｃ１〜Ｃ２０アルカンにおいて、置換基としてのＣ１〜Ｃ２０アシルオキシ基は、１〜４個であり、より好ましくは２個である。また、上記Ｃ１〜Ｃ２２アシルオキシ基は、好ましくはＣ１〜Ｃ２０アシルオキシ基であり、より好ましくはＣ１〜Ｃ１８アシルオキシ基である。
【００３１】
また、上記Ｃ１〜Ｃ２２アシルオキシ基としては、具体的には、アルキルカルボニルオキシ基、アケニルカルボニルオキシ基、アルキニルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基またはヘテロアリールカルボニルオキシ基等が挙げられるが、好ましくはアルキルカルボニルオキシ基、アケニルカルボニルオキシ基、アルキニルカルボニルオキシ基であり、より好ましくはアケニルカルボニルオキシ基である。
【００３２】
また、上記Ｃ１〜Ｃ２０アルカンにおいて、置換基としてのトリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基は、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１個である。また、上記トリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基は、好ましくはトリＣ１〜Ｃ４アルキルアンモニウム基である。また、上記トリアルキルアンモニウム基の対イオンとしては、特に限定されないが、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオン、亜硫酸イオンおよび亜硝酸イオン等が挙げられ、好ましくは塩素イオン、臭素イオンおよびヨウ素イオンである。
【００３３】
より具体的には、カチオン脂質としては、好ましくは、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane：ＤＯＴＡＰ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（dioctadecyldimethylammonium chloride：ＤＯＤＡＣ）、N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル-N,N,N,-トリメチルアンモニウム（N-（2,3-dioleyloxy）propyl-N,N,N-trimethylammonium：ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（didodecylammonium bromide：ＤＤＡＢ）、1,2-ジミリストイルオキシプロピル1-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium：ＤＭＲＩＥ）、2,3-ジオレオイルオキシ-N-[2(Ｓペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミウムトリフルオロアセテイト（2,3-dioleyloxy-N-[2（sperminecarboxamido）ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate：ＤＯＳＰＡ）であり、より好ましくはＤＯＴＡＰである。
【００３４】
また、本発明における両親媒性グリセロリン脂質は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含むことを一つの特徴とする。両親媒性グリセロリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトール等が挙げられ、好ましくはホスファチジルコリンであり、より好ましくは卵黄ホスファチジルコリンである。
【００３５】
また、両親媒性グリセロリン脂質の構成脂肪酸のうち、飽和脂肪酸としては、好ましくはＣ１２〜Ｃ２２の飽和脂肪酸であり、より好ましくはＣ１４〜Ｃ１８の飽和脂肪酸である。具体的には、飽和脂肪酸は、好ましくはパルミチン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、より好ましくはパルミチン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸またはステアリン酸である。
【００３６】
また、両親媒性グリセロリン脂質の構成脂肪酸のうち、不飽和脂肪酸としては、好ましくはＣ１４〜Ｃ２２の不飽和脂肪酸であり、より好ましくはＣ１４〜Ｃ２０の不飽和脂肪酸である。さらに、上記不飽和脂肪酸は、好ましくは炭素−炭素二重結合を１〜６個、より好ましくは１〜４個含むものである。
【００３７】
具体的には、不飽和脂肪酸は、好ましくはオレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、より好ましくはオレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸およびアラキドン酸である。
【００３８】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、両親媒性グリセロリン脂質において、飽和脂肪酸が、パルミチン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸およびステアリン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、不飽和脂肪酸が、オレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸およびアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものである。
【００３９】
本発明のより好ましい態様によれば、リポソームは、構成成分としてステロール類をさらに含んでなる。本発明におけるステロール類は、好ましくはコレステロール、Ｃ１２〜Ｃ３１脂肪酸コレステリルおよびＣ１２〜Ｃ３１脂肪酸ジヒドロコレステリル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのものであり、より好ましくは、コレステロール、ラノリン脂肪酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、マカデミアナッツ脂肪酸コレステリルおよびジヒドロコレステロールポリエチレングリコールエーテル（具体的にはジヒドロコレス−３０等が挙げられる）からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、さらに好ましくはコレステロールである。
【００４０】
構成成分の組み合わせ
本発明におけるリポソームは、上述のように、カチオン性脂質、ステロール類、ならびに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を、いずれも構成成分として含んでなることが好ましい。
【００４１】
そして、本発明のより好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、２個のＣ１〜Ｃ２２アシルオキシ基および１個のトリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基により置換されたＣ１〜Ｃ２０アルカン；ステロール類；Ｃ１２〜Ｃ２２の飽和脂肪酸、およびＣ１４〜Ｃ２２の不飽和脂肪酸であって、炭素−炭素不飽和二重結合を１〜６個のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００４２】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン；コレステロール、Ｃ１２〜Ｃ３１脂肪酸コレステリルおよびＣ１２〜Ｃ３１脂肪酸ジヒドロコレステリルおよびポリオキシエチレンコレステリルエーテルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのステロール類；Ｃ１２〜Ｃ２２の飽和脂肪酸、およびＣ１４〜Ｃ２２の不飽和脂肪酸であって、炭素−炭素不飽和二重結合を１〜６個のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００４３】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン；コレステロール、ラノリン脂肪酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、マカデミアナッツ脂肪酸コレステリルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのステロール類；Ｃ１２〜Ｃ２２の飽和脂肪酸、およびＣ１４〜Ｃ２２の不飽和脂肪酸であって、炭素−炭素不飽和二重結合を１〜６個のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００４４】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン；ステロール類；パルミチン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸からなる群から選択される少なくとも一つの飽和脂肪酸、およびオレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される少なくとも一つの不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００４５】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン；コレステロール、Ｃ１２〜Ｃ３１脂肪酸コレステリルおよびＣ１２〜Ｃ３１脂肪酸ジヒドロコレステリルおよびポリオキシエチレンコレステリルエーテルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのステロール類；パルミチン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸からなる群から選択される少なくとも一つの飽和脂肪酸、およびオレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される少なくとも一つの不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００４６】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン；コレステロール、ラノリン脂肪酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、マカデミアナッツ脂肪酸コレステリルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのステロール類；パルミチン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸からなる群から選択される少なくとも一つの飽和脂肪酸、およびオレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される少なくとも一つの不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００４７】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、上記両親媒性グリセロリン脂質がホスファチジルコリンである。
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン、コレステロール、卵黄ホスファチジルコリンを含んでなる。
【００４８】
また、本発明におけるリポソームにおいて、カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質とのモル比は、イオントフォレーシスにおけるリポソームの安定性および送達効率を勘案すれば、好ましくは３：７〜７：３であり、より好ましくは４：６〜６：４である。また、リポソームがステロール類を含む場合、カチオン性脂質と、ステロール類とのモル比は、好ましくは３：７〜７：３であり、より好ましくは４：６〜６：４である。また、本発明におけるリポソームにおいて、両親媒性グリセロリン脂質と、ステロール類とのモル比は、好ましくは３：７〜７：３であり、より好ましくは４：６〜６：４である。また、本発明におけるリポソームにおいて、カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質およびステロール類の和とのモル比は、好ましくは３：７〜７：３であり、より好ましくは４：６〜６：４である。また、本発明の一つの態様によれば、カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質と、ステロール類とのモル比は、約２：２：１である。
【００４９】
また、本発明におけるリポソームの平均粒径は、好ましくは約４００ｎｍ以上であり、より好ましくは４００〜１０００ｎｍである。リポソームの平均粒径は、例えば、動的光散乱法、静的光散乱法、電子顕微鏡観察法および原子間力顕微鏡観察法等の方法によって確認することができる。
【００５０】
抗酸化成分
本発明において、封入される抗酸化成分は、リポソームに封入可能な限り、特に限定されるものではないが、好ましくは、抗酸化成分が活性酸素消去酵素等の抗酸化酵素である。
【００５１】
より具体的には、好ましい抗酸化酵素は、活性酸素消去酵素であるＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）であり、さらに、グルタチオンペルオキシターゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）およびカタラーゼも用いられ得る。
【００５２】
さらに、本発明においては、リポソーム製剤が、抗酸化成分として、ＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ）、グルタチオンペルオキシターゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）およびカタラーゼのそれぞれが封入されたリポソームの組み合わせからなるものであってもよい。
【００５３】
さらに、本発明においては、抗酸化成分としては、上記の他にも、たとえば、脂溶性抗酸化化合物である、α−トコフェロール（ビタミンＥ）、β−カロテン、アスタキサンチン、リコピン、カプサイシンなどを、また水溶性抗酸化化合物であるアスコルビン酸（ビタミンＣ）、クルクミンなどのポリフェノール、システインなどを用いることができる。
【００５４】
製造方法
本発明におけるリポソームおよびこれを含む組成物の製造方法としては、例えば、以下の方法を用いることができる。まず、カチオン性脂質、両親媒性グリセロリン脂質および所望によりステロール類を、ＣＨＣｌ３等の有機溶媒中に所望の比率で混合し、懸濁液を得る。この懸濁液を減圧留去した後、有機溶媒の添加および減圧留去を繰り返し、脂質フィルムを得る。次に、脂質フィルムに、１０〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ(2-[4-(2-hydroxyethy)-1piperazinyl] ethanesulfonic acid)等のバッファーおよび所望の量の抗酸化成分を添加する。得られた混合液を室温で１０分間放置して水和させ、ソニケーションを行う。ソニケーションの条件としては、例えば、８５Ｗ、室温、１分間程度が挙げられるが、これに限定されない。さらに混合液をメンブランフィルターやエクストリューダー等により処理して粒径を調節し、本発明におけるリポソームを得る。さらに、得られたリポソームを薬理学的に許容可能な担体等とともに、さらに適宜混合し、本発明によるリポソーム製剤を得ることができる。
【００５５】
本発明に用いられる薬理学的に許容可能な担体としては、イオントフォレーシスによるリポソームの投与を妨げない限り特に限定されないが、例えば、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤および着色剤等の添加剤等が挙げられる。さらに、本発明によるリポソーム製剤は、イオントフォレーシスによるリポソームの投与を妨げない限り、所望により適当な剤型とすることができる。しかしながら、イオントフォレーシスによる効率的なリポソームの投与を勘案すれば、ＨＥＰＥＳバッファーや後述する電解液とともに溶液または懸濁液とすることが好ましい。
【００５６】
リポソーム製剤の適用
本発明によるリポソームは、毛孔の深部や皮内組織への安定かつ効率的な抗酸化成分の送達を可能とすることから、局所的皮膚障害の予防・治療や皮内への抗酸化成分の適用、さらには全身作用を必要とする活性酸素の消去を含む治療等に有利に利用することができる。
【００５７】
また、本発明のさらに別の態様によれば、イオントフォレーシスにより抗酸化成分を生体に投与する方法であって、本発明による組成物を生体の皮膚表面に配置し、上記皮膚に通電することを少なくとも含んでなる方法が提供される。上記方法において、製剤のリポソームに封入された抗酸化成分は、毛孔を介して生体に投与される。
【００５８】
本発明によるリポソーム製剤を皮膚表面に配置する方法としては、例えば、リポソーム製剤をそのまま皮膚に塗布してもよく、イオントフォレーシス装置の電極構造体に製剤を保持させ、この電極構造体を皮膚表面に配置してもよい。抗酸化成分を封入した本発明におけるリポソームは、そのまま通電してイオントフォレーシスに用いてもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００５９】
通電においては、本発明におけるリポソームはカチオン性であるため、電気系統の陽極側において陽電流を印加することが好ましい。通電の際、その電流値は、好ましくは０．１〜０．６ｍＡ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．３〜０．５ｍＡ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは約０．４５Ａ／ｃｍ２である。また、通電時間は、好ましくは０．５〜１．５時間であり、より好ましくは０．７５〜１．２５時間であり、さらに好ましくは約１時間である。
【００６０】
また、上記生体としては、好ましくは哺乳類であり、より好ましくはラット、ヒトモルモット、ウサギ、マウスおよびブタであり、さらに好ましくはヒトである。
【００６１】
イオントフォレーシス用の電極構造体および装置
本発明によるリポソーム製剤は、上述の通り、イオントフォレーシス用の電極構造体に保持させて用いることができる。
【００６２】
したがって、本発明の好ましい態様によれば、本発明によるリポソーム製剤を保持している、イオントフォレーシスにより抗酸化成分を生体に投与するための電極構造体が提供される。
【００６３】
たとえば、本発明において好ましい態様として使用されるリポソームはカチオン性であり、電極構造体はイオントフォレーシス装置の電気系統の陽極側に接続される。したがって、本発明による電極構造体は、陽電極と、本発明によるリポソーム製剤に保持されている抗酸化成分保持部とを少なくとも含んでなる。このような電極構造体においては、上記抗酸化成分保持部を陽電極の前面に直接配置してもよく、イオントフォレーシスによるリポソームの投与を妨げない限り、陽電極と抗酸化成分保持部との間にイオン交換膜等の他の部材を配置してもよい。このような他の部材を用いる電極構造体としては、例えば、陽電極と、陽電極の前面に配置された電解液を保持する電解液保持部と、該電解液保持部の前面に配置されたアニオン交換膜と、本発明による製剤を保持するための抗酸化成分保持部とを少なくとも含むものが挙げられる。さらに、上記抗酸化成分保持部の前面には、所望によりカチオン交換膜をさらに配置してもよい。
【００６４】
さらに、本発明の別の態様によれば、上記電極構造体を具備してなる、イオントフォレーシス装置が提供される。該イオントフォレーシス装置は、電源装置と、電源装置に接続された、本発明による製剤を保持している電極構造体と、該電極構造体の対電極としての電極構造体とを少なくとも具備してなる。対電極としての電極構造体の構成は、イオントフォレーシスによるリポソームの投与を妨げない限り特に限定されないが、例えば、陰電極と、陰電極の前面に配置された電解液を保持する電解液保持部と、該電解液保持部の前面に配置されたイオン交換膜とから構成することができる。上記イオン交換膜は、アニオン交換膜またはカチオン交換膜であってよいが、好ましくはアニオン交換膜である。
【００６５】
上述のような、本発明による電極構造体およびイオントフォレーシス装置の具体例としては、後述する図１および本出願人による国際公開ＷＯ０３／０３７４２５Ａ１に記載されているもの等が挙げられる。
【００６６】
本発明によるイオントフォレーシス装置において、リポソームは、通電時には電場（電界）により陽電極の反対側へ泳動して、電極構造体から効率的に放出される。したがって、本発明の別の態様によれば、イオントフォレーシス装置の作動方法であって、本発明による電極構造体および該対電極としての電極構造体を生体の皮膚表面に配置し、イオントフォレーシス装置を通電し、本発明による電極構造体からリポソームを放出させる方法が提供される。
【００６７】
上記イオントフォレーシス装置において、抗酸化成分保持部または電解液保持部は、本発明による組成物または電解液で満たされた、アクリル製等のセル（電極室）として構成してもよく、本発明による組成物または電解液を含浸保持する特性を有する薄膜体で構成してもよい。この薄膜体は、抗酸化成分保持部および電解液保持部において同種の材料が使用可能である。
【００６８】
また、電解液としては、適用する抗酸化成分の特性条件に応じて適宜所望のものが使用できるが、電極反応により生体の皮膚に障害を与えるものは回避すべきである。本発明において好適な電解液においては、生体の代謝回路において存在する有機酸やその塩は無害性という観点から好ましい。例えば、乳酸、フマル酸等が好ましく、具体的には、１Ｍの乳酸と１Ｍのフマル酸ナトリウムの１：１比率の水溶液が特に好ましい。
【００６９】
また、抗酸化成分保持部を構成する薄膜体としては、組成物や電解液を含浸し保持する能力が充分であり、所定の電場条件のもとで含浸保持したイオン化されたリポソームを皮膚側へ移行させる能力（イオン伝達性、イオン導電性）が充分であることが重要である。良好な含浸保持特性と良好なイオン伝達性の双方を具備する材料としては、アクリル系樹脂のヒドロゲル体（アクリルヒドロゲル膜）、セグメント化ポリウレタン系ゲル膜、あるいはゲル状固体電解質形成用のイオン導電性多孔質シート（例えば、特開昭１１−２７３４５２に開示された、アクリロニトリルが５０モル％以上、好ましくは７０〜９８モル％以上であり、空隙率が２０〜８０％であるアクリルニトリル共重合体をベースにした多孔質重合体）等を挙げることができる。また、上記のような抗酸化成分保持部を含浸させる場合、その含浸率（乾燥時の重量をＤ、含浸後の重量をＷとして場合の１００×（Ｗ−Ｄ）／Ｄ［％］）は、好ましくは３０〜４０％である。
【００７０】
本発明による組成物または電解液を抗酸化成分保持部または電解液保持部において含浸させる条件は、電解液およびイオン性薬剤の含浸量、含浸速度等に応じて適宜決定される。このような含浸条件としては、例えば、４０℃にて３０分とすることができる。
【００７１】
また、電極構造体の電極としては、例えば、炭素、白金のような導電性材料からなる不活性電極が好ましく用いられ得る。
【００７２】
また、電極構造体に使用されるイオン交換膜としては、カチオン交換膜とアニオン交換膜を併用することが好ましい。カチオン交換膜としては、好ましくは、（株）トクヤマ製ネオセプタ（ＮＥＯＳＥＰＴＡ，ＣＭ―１、ＣＭ―２、ＣＭＸ、ＣＭＳ、ＣＭＢ、ＣＬＥ０４−２）等が挙げられる。また、アニオン交換膜としては、好ましくは、（株）トクヤマ製ネオセプタ（ＮＥＯＳＥＰＴＡ，ＡＭ―１、ＡＭ―３、ＡＭＸ、ＡＨＡ、ＡＣＨ、ＡＣＳ、ＡＬＥ０４−２、ＡＩＰ−２１）等が挙げられる。また、他の好ましい例としては、多孔質フィルムの空隙部の一部または全部に、陽イオン交換機能を有するイオン交換樹脂が充填されたカチオン交換膜、または陰イオン交換機能を有するイオン交換樹脂が充填されたアニオン交換樹膜が挙げられる。
【００７３】
上述したような各構成材料等の詳細については、本出願人による国際公開ＷＯ０３／０３７４２５Ａ１に記載されており、本発明はこの文献に記載された内容を含めるものとする。
【実施例】
【００７４】
実施例
リポソーム製剤の調製
まず、下記の方法により、イオントフォレーシス可能な安定脂質膜組成のリポソーム（カチオン性脂質ＤＯＴＡＰを含む）に、活性酸素消去酵素であるＳＯＤ（スーパーオキシドディスムターゼ（superoxide dismutase））を封入し、イオントフォレーシス用リポソーム製剤を調製した。【００７５】
１０ｍＭ ＤＯＴＡＰ（ＡＶＡＮＴＩ社)のＣＨＣｌ３溶液 ２５０μＬ、１０ｍＭ コレステロール(以下、「Ｃｈｏｌ」という；ＡＶＡＮＴＩ社)のＣＨＣｌ３溶液 １２５μＬ、１０ｍＭ 卵黄ホスファチジルコリン（日本油脂社）のＣＨＣｌ３溶液 ２５０μＬを混合した。得られた混合液に、５００μＬのＣＨＣｌ３を添加し、懸濁液（モル比；ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：卵黄ホスファチジルコリン＝２：１：２）を得た。この懸濁液をエバポレーターにより減圧留去した後、４００μＬのＣＨＣｌ３を添加して再度減圧留去し、脂質フィルムを得た。この脂質フィルムに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー1mLならびにＳＯＤ（SIGMA社製）5mg(4470units/mg相当)/ml in 10mMリン酸バッファー（pH 7.4）溶液を0.5 mLを添加した。得られた混合液を室温で１０分間放置して水和した後、ソニケーション（アイワ医科工業(株)社製AU-25C超音波洗浄装置、８５Ｗ、室温、１分間）を行った。さらに混合液をポアサイズ４００ｎｍおよび１００ｎｍのＰＣメンブラン（製品名：Nuclepre Track-Etch Membrane、Whatman社製）を用い、エクストリューダー（製品名：Mini-Extruder、Avanti Polar Lipids, Inc.社製）により処理してリポソーム懸濁液を得た。得られたリポソーム懸濁液（リポソーム製剤）の平均粒径は、約260〜400 nmの範囲であった。【００７６】
経皮投与試験
下記の要領で、毛を刈ったラットの背中に、イオントフォレーシス装置を用いて、上記で得られたリポソーム製剤のイオントフォレーシスによる経皮投与を実施した。【００７７】
まず、ＳＤラット（オス、９週齢、日本クレア製）に麻酔（ネンブタール（５０ｍｇ／ｍｌ）１ｍＬ／体重ｋｇ）を投与し、背中の毛を剃った。次に、図１に示される通り、露出した皮膚５上に、電源装置２と、作用電極構造体３と非作用電極構造体４とから構成されるイオントフォレーシス装置１を配置した。ここで、露出した皮膚５と、作用電極構造体３との接触面には上記リポソーム懸濁液１００μLを予め塗布した。また、上記イオントフォレーシス装置１において、作用電極構造体３は、陽電極３１と、陽電極３１の前面に配置された電解液（生理食塩水）１ｍＬを保持する電解液保持部３２と、アニオン交換膜３３と、アニオン交換膜３３の前面に配置された、リポソーム懸濁液２００μLを保持する抗酸化成分保持部３４とから構成した。一方、非作用電極構造体４は、陰電極４１と、陰電極４１の前面に配置された電解液１ｍＬを保持する電解液保持部４２と、カチオン交換膜４３と、カチオン交換膜４３の前面に配置された生理食塩水８００μLを保持する電解液保持部４４と、電解液保持部４４の前面に配置されたアニオン交換膜４５とから構成した。また、上記アニオン交換膜３３，４５（ALE04-2、(株)トクヤマ製）およびカチオン交換膜４３（CLE04-2、(株)トクヤマ製）は予め生理食塩水中に保管していたものを使用した。【００７８】
次に、図１に示されるイオントフォレーシス装置１により、1.14mA（0.45mA/cm2）、1時間の条件で通電することによってリポソーム製剤を投与した。【００７９】
リポソーム製剤の投与１時間後に紫外線を受けて活性酸素を産生する色素（8-methoxypsoralen）を塗布した後、ＵＶＡ（365nm）ランプを用いて、４時間紫外線を照射した（34.5J/cm2）。【００８０】
４４時間後に皮膚を回収し、皮膚中の過酸化脂質量（マロンジアルデヒドＭＤＡ量）をＴＢＡ法によって定量するとともに、酸化傷害を検出する抗体（抗ＭＤＡ抗体（脂質酸化）、抗ヘキサノイルリジン抗体（タンパク質酸化）、抗８−ＯＨ−デオキシグアノシン（ＤＮＡ酸化））を用いて、免疫染色によって酸化傷害を評価した。【００８１】
その結果、紫外線照射したラットの皮膚は炎症が起こっており、皮膚表面にシミが認められた。しかし、ＳＯＤ封入リポソーム製剤を投与したラットの皮膚は、紫外線照射前と同じであった（図２（Ａ）および（Ｂ）参照）。図２（Ａ）はＳＯＤ封入リポソーム製剤の投与を行わずに紫外線を照射した場合であり、皮膚に炎症が認められる。一方、図２（Ｂ）はＳＯＤ封入リポソーム製剤の投与後に紫外線照射を行った場合の例であり、皮膚は紫外線照射前と同様の状態を維持していた。【００８２】
さらに、紫外線照射したラットの皮膚に対して免疫染色を行ったところ、酸化傷害に対する抗体によって有意に染色がされたが、ＳＯＤ封入リポソーム製剤を投与したラットにおいては、酸化傷害の存在は認められなかった。また、ＭＤＡ量を比較すると、ＳＯＤ封入リポソーム製剤を投与したラットにおいては、リポソーム製剤非投与ラットよりも低い値を示すことが明らかになった。ちなみに、ＳＯＤ封入リポソーム製剤を皮膚の表面に塗布しただけでは、これらの保護効果は認められなかった。【００８３】
図３および図４はこれらの結果を示すものである。図３に示すグラフは、SOD封入リポソーム非投与ラット皮膚（UV）およびSOD封入リポソーム投与ラット皮膚（SOD）のUV照射後における過酸化脂質（マロンジアルデヒド：MDA）量を定量した結果である。ここで、過酸化脂質量は、皮膚１ｇ当たりのモル量(nmol/g wet weight)として示した。【００８４】
一方、図４（Ａ）〜（Ｆ）は、SOD封入リポソーム非投与ラット（UV）およびSOD封入リポソーム投与ラット（SOD）のUV照射後の皮膚切片を各種過酸化傷害マーカー抗体によって免疫染色したものを、共焦点レーザー顕微鏡によって蛍光観察した写真である。すなわち、図４（Ａ）は、SOD封入リポソーム非投与ラット（UV）皮膚を抗ヘキサノイルリジン（HEL）で免疫染色したもの、図４（Ｂ）は、SOD封入リポソーム非投与ラット（UV）皮膚を抗マロンジアルデヒド（MDA）で免疫染色したもの、図４（Ｃ）は、SOD封入リポソーム非投与ラット（UV）皮膚を抗８−ＯＨ−デオキシグアノシン（8-OHdG）で免疫染色したもの、図４（Ｄ）は、SOD封入リポソーム投与ラット（UV）皮膚を抗ヘキサノイルリジン（HEL）で免疫染色したもの、図４（Ｅ）は、SOD封入リポソーム投与ラット（UV）皮膚を抗マロンジアルデヒド（MDA）で免疫染色したもの、図４（Ｆ）は、SOD封入リポソーム投与ラット（UV）皮膚を抗８−ＯＨ−デオキシグアノシン（8-OHdG）で免疫染色したもの、である。【００８５】
これらの結果から、本発明によるリポソームが毛孔から皮内へとその構造を保持したまま拡散していることが確認され、さらに、ＳＯＤ封入リポソーム製剤をイオントフォレーシスによって皮膚内部に投与することによって紫外線による皮膚内部での皮膚障害を効果的に防止ないし抑制できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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