(57)【要約】本発明は、Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニストを提供する。当該アンタゴニストとしては、例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｕｐｔａｋｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＳＳＲＩ）が挙げられ、具体的には、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ及びＣｉｔａｌｏｐｒａｍ等が挙げられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニスト。
【請求項２】
選択的セロトニン再取り込み阻害剤である、請求項１記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
前記阻害剤がＰａｒｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ及びＣｉｔａｌｏｐｒａｍからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項２記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニストを含む、神経因性疼痛治療用医薬組成物。
【請求項５】
Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニストが選択的セロトニン再取り込み阻害剤である、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記阻害剤がＰａｒｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ及びＣｉｔａｌｏｐｒａｍからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
神経因性疼痛が、アロディニア、糖尿病性神経痛、がん性疼痛、術後又は外傷後の遷延痛、痛覚過敏、帯状疱疹後神経痛、絞扼性神経障害、交感神経依存性疼痛及び求心路遮断痛からなる群から選択される少なくとも１つである請求項４〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐ２Ｘ４受容体アンタゴニストに関する。詳しくは、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｕｐｔａｋｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＳＳＲＩ）である、Ｐ２Ｘ４受容体アンタゴニストに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラット脊髄Ｌ５神経結紮によって脊髄ミクログリア活性化・Ｐ２Ｘ４受容体発現増加が生じ、非選択的Ｐ２Ｘ４受容体拮抗薬によって痛覚過敏が著明に抑制されたことが報告された（Ｔｓｕｄａ，Ｍ．，Ｓｈｉｇｅｍｏｔｏ−Ｍｏｇａｍｉ，Ｙ．，Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｓ．，Ｍｉｚｏｋｏｓｈｉ，Ａ．，Ｋｏｈｓａｋａ，Ｓ．，Ｓａｌｔｅｒ，Ｍ．Ｗ．＆  Ｉｎｏｕｅ，Ｋ，“Ｐ２Ｘ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ｇａｔｅ  ｔａｃｔｉｌｅ  ａｌｌｏｄｙｎｉａ  ａｆｔｅｒ  ｎｅｒｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ．”，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４２４，ｐ．７７８−７８３（２００３））。この報告によりヒト神経因性疼痛に対するＰ２Ｘ４受容体拮抗薬の治療薬としての可能性が示唆された。しかしながら、現在のところ、Ｐ２Ｘ４受容体に対する選択的かつ強力なアンタゴニストは存在しない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明者は、以上のことからＰ２Ｘ４受容体拮抗作用を評価すること、及びＰ２Ｘ４受容体に対し強力な拮抗作用を持つ神経因性疼痛治療薬を探索することを目的とし、鋭意検討を行った。その結果、本発明者は、Ｐ２Ｘ４受容体に対する選択的かつ強力なアンタゴニストを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニスト。
当該アンタゴニストとしては、例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｕｐｔａｋｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＳＳＲＩ）が挙げられ、具体的には、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ及びＣｉｔａｌｏｐｒａｍ等が挙げられる。
（２）Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニストを含む、神経因性疼痛治療用医薬組成物。
当該組成物において、Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニストとしては、例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）が挙げられ、具体的には、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ及びＣｉｔａｌｏｐｒａｍ等が挙げられる。
当該組成物において、神経因性疼痛としては、例えば、アロディニア、糖尿病性神経痛、がん性疼痛、術後又は外傷後の遷延痛、痛覚過敏、帯状疱疹後神経痛、絞扼性神経障害、交感神経依存性疼痛  及び求心路遮断痛等が挙げられる。
（３）上記（２）記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、神経因性疼痛の治療方法。
（４）神経因性疼痛の治療用の上記（１）記載のアンタゴニスト。
（５）神経因性疼痛を治療するための医薬の製造のための上記（１）記載のアンタゴニストの使用。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＡＴＰ刺激に対する細胞内Ｃａレベルの変化を示す図である。
図２は、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ（１０μＭ）処置によるＡＴＰ誘発カルシウム応答抑制作用を示す図である。
図３は、各種ＳＳＲＩ（図中ではＤｒｕｇ）（１０μＭ）処置によるＡＴＰ誘発カルシウム応答抑制作用を示す図である。
図４は、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ処置によるＡＴＰ誘発カルシウム応答抑制作用の濃度依存性を示す図である。
図５は、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ処置によるＡＴＰ誘発カルシウム応答抑制作用の濃度依存性を示す図である。
図６は、実験スケジュールを示す図である。
図７は、神経損傷後７日目のラットにＰａｒｏｘｅｔｉｎｅを髄腔内投与した場合のアロディニア抑制作用を経時的に観察した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる米国仮出願６０／８３８，７５９号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
本発明者は、Ｐ２Ｘ４受容体に関する種々の研究を行うことにより、すでに、当該受容体が神経因性疼痛のキーファクターであることを明らかにしている。今回、本発明者は、ＳＳＲＩ系抗うつ薬がＰ２Ｘ４受容体と拮抗作用を持つことを見出し、神経因性疼痛の治療薬の候補化合物になり得ることを示した。
詳しくは、まず本発明者は、ＡＴＰ受容体としてＰ２Ｘ４受容体だけを発現している細胞株を用い、ＡＴＰ刺激による細胞内Ｃａイオン濃度上昇を指標にして、ＳＳＲＩ系抗うつ薬の拮抗作用を評価した。その結果、例えばＰａｒｏｘｅｔｉｎｅ及びＦｌｕｏｘｅｔｉｎｅ等のＳＳＲＩ系抗うつ薬が、Ｐ２Ｘ４受容体に対して選択的かつ強力な拮抗作用を有すること、及び当該作用が高い用量依存性を示すことを見出した。
さらに本発明者は、神経損傷モデル動物にＳＳＲＩ系抗うつ薬を髄腔内投与することにより、対照群（非投与群）と比較して投与群に有意な抗アロディニア作用（アロディニア抑制作用）が認められるかどうかを評価した。その結果、投与群では対照群に比べて有意な抗アロディニア作用が認められること、及び当該作用が高い用量依存性を示すことを見出した。
糖尿病及び感染症などで神経が傷ついて発生する慢性的な痛み、並びに癌の進行により発生する痛み（これらを神経因性疼痛という）に対しては、モルヒネなどの一般的な鎮痛薬はほとんど効かないことが知られている。これに対し、本発明者らは、すでに、脊髄内ミクログリア細胞のＡＴＰ受容体の一種であるＰ２Ｘ４受容体が、神経因性疼痛シグナルの伝達に関わっていることを明らかにしている。
このＰ２Ｘ４受容体は、細胞膜に存在するイオンチャネルである。Ｐ２Ｘ４受容体は、ＡＴＰ分子によってチャネルが開く。そして、この開いたイオンチャネルを介してナトリウムイオン及びカルシウムイオンが細胞内に大量に流入することにより、結果として疼痛を増幅させることになると考えられている。
ところで、抗うつ薬は、神経因性疼痛患者の症状を緩和させることが知られており、臨床では鎮痛補助薬として汎用されている。しかし、その作用メカニズムは未だ明らかにはされていない。抗うつ薬にＰ２Ｘ４受容体拮抗作用が確認されれば、抗うつ薬のアロディニア抑制作用メカニズムの解明につながるとともに、Ｐ２Ｘ４受容体をターゲットとした治療法が臨床へ迅速に導入されることが期待される。抗うつ剤の中でも、特に、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ  ｒｅｕｐｔａｋｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ；ＳＳＲＩ）は、三環系及び四環系抗うつ薬が有するような副作用がほとんど認められず、さらに心循環系や呼吸器系への作用も少ないため安全性に優れている。よって、ＳＳＲＩのＰ２Ｘ４受容体拮抗作用が確認されれば、より一層有用なものとなる。
以上のことから、本発明者は、抗うつ薬の中でもＳＳＲＩに着目し、このＳＳＲＩのＰ２Ｘ４受容体拮抗作用について、各種評価を行うことにより、本発明を見出すに至った。
２．Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニスト
本明細書中、「Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニスト」は、Ｐ２Ｘ４受容体に対する拮抗作用を有する物質を意味する。Ｐ２Ｘ４受容体に対する拮抗作用は、公知の手法、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ  ＫＪ，Ｍｉｃｈｅｌ  ＡＤ，Ｃｈｅｓｓｅｌｌ  ＩＰ，Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ＰＰ．Ｃｉｂａｃｒｏｎｂｌｕｅ  ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｒａｔ  Ｐ２Ｘ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．１９９８  Ｄｅｃ；３７（１２）：１５７９−８６．に記載の方法によって確認することができる。
本発明において用いられるＰ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニストは、特に限定されず、抗うつ剤である選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）を含む。本発明で好ましく用いられるＳＳＲＩとしては、例えば、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ及びＣｉｔａｌｏｐｒａｍ並びにそれらの薬学的に許容し得る塩等が挙げられる。この中で、特に好ましいＳＳＲＩは、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ、Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅであり、単独で使用してもよく、複数種類を適宜組み合わせて使用してもよい。これら抗うつ剤としてのＳＳＲＩは公知であり、メルクインデックス（Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ，１３ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１））、教科書・ＮＥＷ薬理学等に記載されている。
上記ＳＳＲＩは、当業者に周知の方法で合成することができるが、市販品を使用してもよい。ここで、ＳＳＲＩの周知の合成方法としては、例えば、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅについては、Ｊ．Ｂｕｕｓ  Ｌａｓｓｅｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｖｏｌ．４７，ｐ．３５１（１９７８）；Ｅ．Ｈａｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ．，ｖｏｌ．１１８，ｐ．１０７（１９８５）等、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅについては、Ｄ．Ｔ．Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．１５，ｐ．４７１（１９７４）；Ｊ．Ｆ．Ｎａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２８，ｐ．２１００（１９８２）等、Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅについては、Ｖ．Ｃｌａａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｖｏｌ．６０，ｐ．５０５（１９７７）；Ｇ．Ｊ．ＤｅＪｏｎｇ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，ｖｏｌ．１８３，ｐ．２０３（１９８０）等、Ｃｉｔａｌｏｐｒａｍについては、Ａ．Ｊ．Ｂｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｉｍ．Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．１２，ｐ．２８９（１９７７）；Ａ．Ｖ．Ｃｈｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｖｏｌ．４１，ｐ．１５３（１９７７）等を参照することができる。また、ＳＳＲＩの市販品としては、例えば、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅについては、パキシル（グラクソ・スミスクライン社製）等、Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅについては、プロザック（イーライ・リリー社製）等、Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅについては、デプロメール（明治製菓社製）及びルボックス（アステラス（旧藤沢製薬）社製）等、Ｃｉｔａｌｏｐｒａｍについては、セレクサ（ルンドベック社製）等などが挙げられる。
３．神経因性疼痛治療用医薬組成物
本発明は、Ｐ２Ｘ４受容体アンタゴニストを有効成分として含有する神経因性疼痛治療のための医薬組成物、及び当該医薬組成物を神経因性疼痛患者に投与することを特徴とする神経因性疼痛の治療方法を提供する。
また本発明は、神経因性疼痛の治療用のＰ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニスト、及び、神経因性疼痛を治療するための医薬の製造のためのＰ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニストの使用も提供することができる。
ＳＳＲＩ系抗うつ薬などの種々の抗うつ薬は、神経因性疼痛患者の症状を緩和させ得る疼痛補助薬として用いられることが知られているが、そのメカニズムは明らかにされていない。驚くべきことに、本発明者は、ＳＳＲＩ系抗うつ薬が、Ｐ２Ｘ４受容体アンタゴニストとして作用して、神経因性疼痛に対し優れた治療効果があることを初めて見出したものである。
本明細書において「治療」とは、一般的には、ヒト及びヒト以外の哺乳動物の症状を改善させることを意味する。「改善」は、例えば、本発明の医薬組成物を投与しない場合と比較して、疼痛の程度が軽減する場合及び悪化しない場合を指し、予防という意味をも包含する。さらに「医薬組成物」とは、本発明において有用な活性成分（ＳＳＲＩ系抗うつ薬）と、医薬の調製において用いられる担体等の添加物とを含有する組成物を意味する。
なお、本明細書中、「Ｐ２Ｘ４受容体アンタゴニストを有効成分として含有する」という用語は、Ｐ２Ｘ４受容体アンタゴニストとして機能し得る公知の化合物及びこの化合物の医薬的に許容し得る形態（例えば、その塩、エステル、アミド、水和又は溶媒和形態、ラセミ混合物、光学的に純粋な形態等）での使用を全て包含する意味で用いられる。
従って、本発明において用いられる有効成分としての化合物はフリー体であっても、医薬的に許容される塩であってもよい。このような「塩」は、塩酸、硝酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸との酸付加塩、あるいは脂肪族のモノカルボン酸、ジカルボン酸、ヒドロキシアルカン酸、ヒドロキシアルカン二酸、アミノ酸など、また芳香族の酸、脂肪族、芳香族のスルホン酸などの無毒な有機酸から誘導される塩がある。このような酸付加塩の例としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、安息香酸塩、フタル酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、グリコール酸塩、トリフルオロ酢酸塩などがあげられる。
本発明の医薬組成物は、神経因性疼痛の治療に有効である。そのような神経因性疼痛の例としては、例えば、アロディニア、糖尿病性神経痛、がん性疼痛、術後や外傷後の遷延痛、痛覚過敏、帯状疱疹後神経痛、三叉神経痛、多発性硬化症による疼痛、脊髄障害による対麻痺性疼痛、無知覚性疼痛、幻肢痛における神経因性疼痛、絞扼性神経障害、交感神経依存性疼痛及び求心路遮断痛などが含まれる。本発明の医薬組成物は、特に、アロディニアの治療に有効である。
本発明の医薬組成物の投与形態は、特に制限は無く、経口的又は非経口的に、ヒト及びヒト以外の動物に投与することができる。本発明の医薬組成物において、有効成分であるＰ２Ｘ４受容体アンタゴニストは単独で配合されてもよいが、これに製薬学的に許容しうる担体又は製剤用添加物を配合して製剤の形態で提供することもできる。一般には、１又は２以上の製剤用添加物を用いて医薬組成物を製造して投与することが好ましく、投与経路に応じた適当な剤型とされる。この場合、本発明の有効成分であるＰ２Ｘ４受容体アンタゴニストは、例えば、製剤中、０．１〜９９．９重量％を含有することができる。
製薬学的に許容しうる担体又は添加剤としては、例えば、賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤等を用いることができる。賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムなどが挙げられ、崩壊剤としては、例えば、デンプン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン末、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリンなどが挙げられ、結合剤としては、例えば、ジメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、滑沢剤としては、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などが挙げられる。他の担体又は添加剤についても、当業者は適宜選択することができる。
経口投与に適する製剤としては、例えば、散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、液剤又はシロップ剤等が挙げられる。
経口投与の場合、例えば錠剤を形成するには、結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムなどの種々の賦形剤を、崩壊剤（デンプン、アルギン酸ナトリウム等）及び顆粒形成結合剤（ポリビニルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム等）と共に使用することができる。また、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤も錠剤形成に使用することができる。
経口投与用として液剤又はシロップにする場合、活性成分を各種の甘味料又は香味料、着色料又は染料と併用する他、必要であれば、乳化剤及び／又は懸濁化剤も併用し、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等、及びそれらを組み合わせた希釈剤と共に使用することができる。
非経口投与に適する製剤としては、例えば、静注、筋注などの注射剤、皮下投与剤、坐剤、直腸投与剤、経皮投与剤、脊髄内投与剤等が挙げられる。
非経口投与の場合、本発明の有効成分をゴマ油又は落花生油のいずれかに溶解するか、あるいはプロピレングリコール水溶液に溶解した溶液を使用することができる。水溶液は、必要に応じて適宜緩衝し、液体希釈剤を等張にする必要がある。このような水溶液は静脈内注射に適し、油性溶液は関節内注射、筋肉注射及び皮下注射に適する。また、注射剤は、凍結乾燥法などによって無菌の固体組成物とし、使用前に無菌の注射用蒸留水又は他の溶媒に溶解して使用する用時調製の形態として製造することができる。これらすべての溶液を無菌状態で製造するには、当業者に周知の標準的な製薬技術で容易に達成することができる。
さらに、本発明の有効成分は皮膚など局所的に投与することも可能である。この場合は標準的な医薬慣行によりクリーム、ゼリー、ペースト、軟膏の形で局所投与するのが望ましい。
本発明の医薬組成物の投与量は、特に限定されず、疼痛の種類、患者の年齢や症状、投与経路、治療の目的、併用薬剤の有無等の種々の条件に応じて適切な投与量を選択することが可能である。例えば、有効成分であるＳＳＲＩと適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される本発明の医薬組成物の有効量は、１回につき０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｂｏｄｙ、１〜５０μｇ／ｂｏｄｙ、１〜２０μｇ／ｂｏｄｙ、又は１〜１０μｇ／ｂｏｄｙの範囲から選択することができ、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
１．方法
ラットＰ２Ｘ４受容体を強制発現させた１３２１Ｎ１ヒト星状細胞腫細胞にＦｕｒａ−２ＡＭ  ５μＭを加え、室温で４５分間静置してＬｏａｄｉｎｇを行い、洗浄後１５分間静置した。細胞外液（ＮａＣｌ：１５０ｍＭ，ＫＣｌ：５ｍＭ，ＣａＣｌ２：１．８ｍＭ，ＭｇＣｌ２：１．２ｍＭ，ＨＥＰＥＳ：２５ｍＭ，Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ：１０ｍＭ）を灌流し、ＡＴＰ  ３０μＭ刺激によるカルシウム流入をＦｕｒａ−２蛍光によるカルシウムイメージング法で解析した。ＡＴＰ  ３０μＭを２０秒間処置して１ｓｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ（Ｓ１）を得た後、洗浄を行い、引き続きＳＳＲＩである薬物（Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ，Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ，Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ，Ｃｉｔａｌｏｐｒａｍ）を１０分間処置した。薬物の存在下ＡＴＰ  ３０μＭを２０秒間処置して２ｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ（Ｓ２）を測定し、さらに１０分間洗浄後、３ｒｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ（Ｓ３）を得てカルシウム応答が回復することを確認した。
＜実験スケジュール＞
実験は、図６に記載の通りに行った。
２．結果
ＡＴＰ  ３０μＭ，２０秒間処置によって一過性の細胞内Ｃａ流入反応が観察された。細胞内Ｃａ上昇レベルを、ｒａｔｉｏ値の変化（Δｒａｔｉｏ）を指標として比較すると、ＡＴＰ刺激２回目（Ｓ２）では８５％以上、ＡＴＰ刺激３回目（Ｓ３）では８５％以上という高い値を示したことから（図１）、少なくとも３回の３０μＭ  ＡＴＰ刺激に対する反応再現性が確認された。なお、Δｒａｔｉｏは、ＡＴＰ刺激前約１５秒間のｒａｔｉｏ値（３４０／３８０）の平均値（Ｂａｓｅ  ｒａｔｉｏ）とピーク値（Ｍａｘ  ｒａｔｉｏ）との差を意味する。
ＳＳＲＩ（Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ，Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ，Ｆｌｕｖｏｘａｍｉｎｅ，Ｃｉｔａｌｏｐｒａｍ）１０μＭ処置によってＡＴＰ誘発カルシウム応答抑制作用が見られ、特にＰａｒｏｘｅｔｉｎｅのブロック作用が強力であることが分かった（図２，図３）。
そこで、ＰａｒｏｘｅｔｉｎｅのＡＴＰ誘発カルシウム応答抑制作用についてより詳細な検討を行った（図４，図５）。その結果、用量依存性（１μＭ以上の濃度で抑制作用あり）が認められ、また、ＡＴＰ  ３０μＭ刺激に対するＩＣ５０は約３μＭであった。
ＳＳＲＩを処置することで濃度依存的にＡＴＰ誘発ラットＰ２Ｘ４受容体介在カルシウム応答反応を抑制したことから、ＳＳＲＩがラットＰ２Ｘ４受容体に対する拮抗作用を有している可能性が示された。洗浄後カルシウム応答が部分的に回復することから可逆的な拮抗作用であると考えられた。また、今回検討を行ったＳＳＲＩの中では、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅが比較的強力なカルシウム応答抑制作用を有していた。
【実施例２】
【０００７】
１．実験方法
神経損傷後７日目のラットにおいて、薬物投与前の痛み行動を測定した。ラット髄腔内に留置したカテーテル内部に、薬物を１０μｌ注入した後、さらに１０μｌのＰＢＳ（−）を注入した。薬物注入後２時間は１５分毎、それ以降の４時間は３０分毎に痛み行動を測定した。Ｐａｒｏｘｅｔｉｎは１００％  ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ）に溶解させ、ＤＭＳＯの最終濃度が５％になるように、ＰＢＳ（−）に希釈して用事調製した。
２．実験結果
神経因性疼痛病態モデルとして本実験に用いたＬ５脊髄神経損傷モデルでは、機械刺激性アロディニアが強く発症することが知られている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。以前の報告（Ｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）と同様に、逃避閾値の低下は、神経損傷後１日目から観察され、７日目から１４日目でピークを迎えた。
神経損傷後７日目のラットにＰａｒｏｘｅｔｉｎｅを髄腔内投与したところ、対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）群と比較し、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ  １ｎｍｏｌ投与群、Ｐａｒｏｘｅｔｉｎｅ  ３ｎｍｏｌ投与群及びＰａｒｏｘｅｔｉｎｅ  １０ｎｍｏｌ投与群において有意なアロディニア抑制作用が観察された（図７）。最も強力な作用を示したのはＰａｒｏｘｅｔｉｎｅ  ３ｎｍｏｌ投与群であり、投与後９０分から２７０分にかけて顕著な抗アロディニア作用が観察された。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明により、Ｐ２Ｘ４受容体に対するアンタゴニストが提供される。アンタゴニストの活性は強力かつ選択的であることから、本発明のアンタゴニストは、神経因性疼痛治療用医薬組成物として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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