(57)【要約】  本発明は、微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離することによる乳酸の製造方法であって、該培養液をナノ濾過膜に通じて濾過する工程Ａおよび工程Ａで得られた乳酸含有溶液を１Ｐａ以上大気圧下の圧力下において２５℃以上２００℃以下で蒸留して乳酸を回収する工程Ｂを含む、乳酸の製造方法であり、本発明によって、発酵培養液中に溶解し又は難溶性固体として含まれる無機塩を簡単な操作により効果的に除去され、また、製造工程中の乳酸のラセミ化やオリゴマー化が抑制されるため、乳酸を高い収率で得るための製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離することによる乳酸の製造方法であって、該培養液をナノ濾過膜に通じて濾過する工程Ａおよび工程Ａで得られた乳酸含有溶液を１Ｐａ以上大気圧下の圧力下において２５℃以上２００℃以下で蒸留して乳酸を回収する工程Ｂを含む、乳酸の製造方法。
【請求項２】
前記工程Ａにおけるナノ濾過膜に通じる培養液のｐＨが２以上４．５以下である、請求項１に記載の乳酸の製造方法。
【請求項３】
前記培養液がカルシウム塩の存在下での微生物の発酵培養による培養液であって、該培養液中のカルシウム成分を難溶性硫酸塩として除去する工程Ｃの後に得られる乳酸を含む培養液を前記工程Ａに供する、請求項１または２に記載の乳酸の製造方法。
【請求項４】
前記ナノ濾過膜のクエン酸透過率に対する硫酸マグネシウム透過率の比が、操作圧力０．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水濃度１０００ｐｐｍにおいて、３以上である、請求項１から３のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項５】
前記ナノ濾過膜の硫酸マグネシウム透過率が、操作圧力０．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水濃度１０００ｐｐｍにおいて、１．５％以下である、請求項１から４のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項６】
前記ナノ濾過膜の膜素材がポリアミドを含む、請求項１から５のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項７】
前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式（１）で示される構成成分を含有することを特徴とする請求項６に記載の乳酸の製造方法。
【化１】
2009004922.tif 000011
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）
【請求項８】
前記工程Ａにおける培養液の濾過圧が０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下である、請求項１から７のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【請求項９】
前記工程Ａで得られる乳酸含有溶液を逆浸透膜で濾過して乳酸濃度を高める工程Ｄを含む、請求項１から８のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離することによる乳酸の製造方法に関する。詳しくは、微生物培養液中に残存している無機塩をナノ濾過膜によって除去して得られた乳酸含有溶液を蒸留することによる乳酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、食品用、医薬用などといった用途の他に、生分解性プラスチックのモノマー原料として工業的用途にまで広く適用され、需要が増加している。２−ヒドロキシプロピオン酸、即ち乳酸は、微生物による発酵により生産されることが知られており、微生物はグルコースに代表される炭水化物を含有する基質を乳酸に変換する。乳酸は、カルボニルα位の炭素に結合している水酸基の立体により、（Ｌ）−体および（Ｄ）−体の光学異性体に分類される。微生物発酵によれば、微生物を適宜選択することにより（Ｌ）−体または（Ｄ）−体の乳酸を選択的に、または（Ｌ）−体及び（Ｄ）−体の混合体（ラセミ体）の乳酸を生産することができる。【０００３】
一般に、微生物発酵による乳酸の生産は培養液中にアルカリ性物質を添加することで微生物発酵に最適なｐＨに保持されながら行われる。微生物発酵により生産された酸性物質である乳酸の多くは、アルカリ性物質が添加されることで、培養液中では乳酸塩として存在している。この場合、フリーの乳酸は、発酵終了後、培養液に酸性物質を添加することで得られる。具体的には、培養液中に添加するアルカリ性物質の例の１つとして水酸化カルシウムが用いられるが、この場合、微生物発酵により生産された乳酸は培養液中では乳酸カルシウムとして存在している。その後、培養終了後の培養液に酸性物質（例えば、硫酸）を添加することで、フリーの乳酸溶液を得ることができるが、カルシウム塩（例えば、硫酸カルシウム）が副生する。【０００４】
ここで生じたカルシウム塩を除去して乳酸を分離する方法として、硫酸カルシウムのようにカルシウム塩が難溶性で沈殿する場合は、定性濾紙等により濾別する方法が用いられている。しかしながら、この方法の場合、固体として沈殿しているカルシウム塩は除去されるが、溶液中に溶解している微量のカルシウム塩は除去されず、乳酸含有溶液中に残存してしまう。また微生物発酵により乳酸を生産する場合、目的とする乳酸以外に様々な無機塩が副生されるが、それらについて培養液中に溶解しているものは定性濾紙等では濾別できない。そのために、この乳酸を含む濾液を、例えばその後の精製工程において濃縮操作を行うと、フリーの乳酸含有溶液中に再びカルシウム塩やそれ以外の無機塩が析出（沈殿）するという問題がある。そして、無機イオンが十分に除去されていない状態のまま、蒸留等の操作により乳酸含有溶液を加熱すると、無機イオンの影響により、乳酸のラセミ化およびオリゴマー化が進行することが知られている。そのために、乳酸含有溶液中に残留する微量の無機イオン成分を効果的に除去する方法が求められている。【０００５】
乳酸含有溶液から微量の無機イオン成分を除去する方法としては、イオン交換樹脂により用いる方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、イオン交換樹脂のイオン交換性能を保持するためには、定期的にイオン交換樹脂を再生する必要がある。また、イオン交換樹脂の再生には大量の塩化ナトリウム水溶液を用いて行われるが、再生に伴い、大量の廃液が排出され、廃液処理に多額のコストがかかるという問題点がある。さらに、繰り返しイオン交換樹脂の再生を行うとイオン交換樹脂の再生率が低下する上に、イオン交換性能が低下し、無機塩の除去率が低下するという問題点があった
また、電気透析装置を用いたバイポーラ膜によって、乳酸含有溶液から微量のカルシウム成分等の無機イオン成分を除去する方法も知られている（例えば、特許文献２参照）。しかしながら、この方法で用いるバイポーラ膜は高価な上に、カルシウム塩等の無機塩の除去効率が決して高くないという問題点があった。【０００６】
その他、分離膜を用いた有機酸の分離・回収方法が知られており、逆浸透膜によるピルビン酸溶液からパラピルビン酸を分離する方法が開示されている（特許文献３参照）が、その際の無機塩の除去率については開示されていない。また、特許文献３はピルビン酸の分離・回収方法に関するが、ピルビン酸は光学活性体ではないため、乳酸含有溶液から乳酸を分離・回収する際の問題点であるラセミ化やオリゴマー化については解決されていなかった。【０００７】
さらに、ナノ濾過膜を用いて、乳酸含有溶液から無機塩を除去する方法が開示されている（例えば、特許文献４〜６参照）が、微生物の発酵培養液をナノ濾過膜に通じて得られた乳酸含有溶液を蒸留によって乳酸を回収する工程や、蒸留が乳酸の収率に及ぼす影響については開示されておらず、乳酸を蒸留によって高い収率で回収するという課題は解決されていなかった。
【特許文献１】特表２００１−５０６２７４号公報
【特許文献２】特開２００５−２７００２５号公報
【特許文献３】特開平６−３０６０１１号公報
【特許文献４】ＵＳ５５０３７５０
【特許文献５】ＵＳ５６８１７２８
【特許文献６】ＵＳ２００４／００３３５７３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述したような課題、すなわち、微生物発酵により乳酸を生産する場合において、培養液中の乳酸を、ラセミ化やオリゴマー化を抑制しながら効率よく分離・回収する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、乳酸を含む微生物発酵培養液をナノ濾過膜を用いて濾過して得られた乳酸含有溶液を蒸留することで、乳酸のラセミ化を抑制しながら効率よく乳酸を分離・回収することができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は、次の（１）〜（９）から構成される。【００１１】
（１）微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離することによる乳酸の製造方法であって、該培養液をナノ濾過膜に通じて濾過する工程Ａおよび工程Ａで得られた乳酸含有溶液を１Ｐａ以上大気圧下の圧力下において２５℃以上２００℃以下で蒸留して乳酸を回収する工程Ｂを含む、乳酸の製造方法。【００１２】
（２）前記工程Ａにおけるナノ濾過膜に通じる培養液のｐＨが２以上４．５以下である、（１）に記載の乳酸の製造方法。【００１３】
（３）前記培養液がカルシウム塩の存在下での微生物の発酵培養による培養液であって、該培養液中のカルシウム成分を難溶性硫酸塩として除去する工程Ｃの後に得られる乳酸を含む培養液を前記工程Ａに供する、（１）または（２）に記載の乳酸の製造方法。【００１４】
（４）前記ナノ濾過膜のクエン酸透過率に対する硫酸マグネシウム透過率の比が、操作圧力０．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水濃度１０００ｐｐｍにおいて、３以上である、（１）から（３）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。【００１５】
（５）前記ナノ濾過膜の硫酸マグネシウム透過率が、操作圧力０．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水濃度１０００ｐｐｍにおいて、１．５％以下である、（１）から（４）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。【００１６】
（６）前記ナノ濾過膜の膜素材がポリアミドを含む、（１）から（５）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。【００１７】
（７）前記ポリアミドが架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、化学式（１）で示される構成成分を含有することを特徴とする（６）に記載の乳酸の製造方法。【００１８】
【化１】
2009004922.tif 000002
【００１９】
（式中、Ｒは−Ｈまたは−ＣＨ３、ｎは０から３までの整数を表す。）。【００２０】
（８）前記工程Ａにおける培養液の濾過圧が０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下である、（１）から（７）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。【００２１】
（９）前記工程Ａで得られる乳酸含有溶液を逆浸透膜で濾過して乳酸濃度を高める工程Ｄを含む、（１）から（８）のいずれかに記載の乳酸の製造方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によって、発酵培養液中に溶解し又は難溶性固体として含まれる無機塩を簡単な操作により効果的に除去され、また、製造工程中の乳酸のラセミ化やオリゴマー化が抑制されるため、乳酸を高純度・高収率で製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明で用いたナノ濾過膜分離装置の一つの実施の形態を示す概要図である。
【図２】本発明で用いたナノ濾過膜分離装置のナノ濾過膜が装着されたセル断面図の一つの実施の形態を示す概要図である。
【符号の説明】
【００２４】
１  原水槽
２  ナノ濾過膜または逆浸透膜が装着されたセル
３  高圧ポンプ
４  膜透過液の流れ
５  膜濃縮液の流れ
６  高圧ポンプにより送液された培養液の流れ
７  ナノ濾過膜
８  支持板
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明をより詳細に説明する。【００２６】
本発明の乳酸の製造方法は、微生物の発酵培養により培養液中に生産された乳酸を分離することによる乳酸の製造方法であって、発酵培養液をナノ濾過膜に通じて濾過して、発酵培養液中の無機塩を除去して乳酸溶液を得る工程Ａ、及び工程Ａで得られた乳酸含有溶液を、１Ｐａ以上大気圧下の圧力下において、２５℃以上２００℃以下で蒸留して乳酸を回収する工程Ｂを含むものである。【００２７】
工程Ａで用いるナノ濾過膜とは、ナノフィルター（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。【００２８】
また、「ナノ濾過膜に通じて濾過する」とは、微生物の発酵培養により生産された乳酸を含む培養液を、ナノ濾過膜に通じて濾過し、溶解または固体として析出している無機塩を除去または阻止または濾別し、乳酸溶液を濾液として透過させることを意味する。ここで、無機塩には、培養液中に含まれる無機塩のいずれの形態のものも含まれ、また培養液中において溶解しているもの、培養液中に析出し若しくは沈殿して含まれているもののいずれも含まれる。【００２９】
工程Ａにおけるナノ濾過膜に供する培養液のｐＨは、２．０以上４．５以下であることが好ましい。ナノ濾過膜は、溶液中にイオン化している物質の方が、イオン化していない物質に比べて除去または阻止しやすいことが知られていることから、培養液のｐＨを４．５以下とすることで、乳酸が培養液中で解離して乳酸イオンとして存在している割合を少なくし、乳酸が透過しやすくなる。また、ｐＨが２．０未満である場合、ナノ濾過膜の損傷に影響するおそれがある。さらに、乳酸のｐＫａが３．８６であることから、ｐＨを３．８６以下とする場合、乳酸イオンと水素イオンに解離していない乳酸の方が培養溶液中に多く含まれるため、効率的に乳酸をナノ濾過膜に透過することができることから、より好ましい。なお、培養液のｐＨ調整は微生物発酵時であっても、微生物発酵後であってもよい。【００３０】
工程Ａにおけるナノ濾過膜に供する培養液としては、培養液中にアルカリ性物質を添加することで微生物発酵に最適なｐＨに保持して得られた培養液が好ましく使用される。添加するアルカリ性物質としては特に限定されないが、塩基性のカルシウム塩を添加することが好ましい。塩基性のカルシウム塩を培養液に添加することで、工程Ａの前段において培養液中のカルシウム成分を難溶性の硫酸塩として除去する工程Ｃを導入することができる。具体的には、例えば培養液中に硫酸を添加して、培養液中のカルシウム成分を、難溶性硫酸塩である硫酸カルシウムとして沈殿、濾別する工程Ｃを行い、その濾液（乳酸を含む分離液）を工程Ａのナノ濾過膜に通じることで、より効果的にカルシウム成分を除去または阻止することができる。塩基性のカルシウム塩としては、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化カルシウム、酢酸カルシウムなどが挙げられるが、好ましくは水酸化カルシウムである。培養液中のカルシウム成分を難溶性硫酸塩として沈殿、濾別する場合、培養液に添加する硫酸の当量がカルシウムの当量を超えると（硫酸当量＞カルシウム当量）、過剰分の硫酸がナノ濾過膜を一部透過し、その後、透過液を濃縮、蒸留などの加熱条件下に晒すと、透過した硫酸が乳酸のオリゴマー化を促進する触媒として働き、蒸留収率が低減されるおそれがある。このことから、培養液中のカルシウム成分を難溶性硫酸塩として沈殿、濾別する場合、培養液中のカルシウム成分の当量以下で硫酸を添加することが好ましく、ｐＨで添加当量を調整する場合は、ｐＨ２．０以上であれば、カルシウム成分の当量以下となることから好ましい。【００３１】
本発明で使用されるナノ濾過膜の、溶解または固体として析出している無機塩の除去、阻止または濾別の程度を評価する方法としては、無機イオン除去率（阻止率）を算出することで評価する方法が挙げられるが、この方法に限定されるものではない。無機塩阻止率（除去率）は、イオンクロマトグラフィーに代表される分析により、原水（培養液）中に含まれる無機塩濃度（原水無機塩濃度）および透過液（乳酸溶液）中に含まれる無機塩の濃度（透過液無機塩濃度）を測定することで、式１によって算出することができる。【００３２】
無機塩除去率（％）＝（１−（透過液無機塩濃度／原水無機塩濃度））×１００・・・（式１）。【００３３】
工程Ａで用いるナノ濾過膜の膜分離性能としては特に限定はないが、ナノ濾過膜のクエン酸透過率に対する硫酸マグネシウム透過率の比が、操作圧力０．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水濃度１０００ｐｐｍにおいて、３以上であるあるものが好ましく用いられる。上記条件におけるナノ濾過膜のクエン酸透過率に対する硫酸マグネシウム透過率の比が３以上であれば、培養液中に含まれる無機塩を除去して、効率的に乳酸を透過させることができることから好ましい。ここで、硫酸マグネシウム透過率は、イオンクロマトグラフィーに代表される分析により、原水中に含まれる硫酸マグネシウム濃度（原水硫酸マグネシウム濃度）および透過液中に含まれる硫酸マグネシウム濃度（透過液硫酸マグネシウム濃度）を測定し、式２によって算出することができる。同様にクエン酸透過率についても、高速液体クロマトグラフィーに代表される分析により、原水中に含まれるクエン酸濃度（原水クエン酸濃度）および透過液中に含まれるクエン酸濃度（透過液クエン酸濃度）を測定し、式２の硫酸マグネシウム濃度をクエン酸濃度に置き換えることで算出することができる。【００３４】
硫酸マグネシウム透過率（％）＝（透過液硫酸マグネシウム濃度）／（原水硫酸マグネシウム濃度）×１００・・・（式２）。【００３５】
また、硫酸マグネシウム透過率が、操作圧力０．５ＭＰａ、原水温度２５℃、原水濃度１０００ｐｐｍにおいて、１．５％以下であるものが好ましく用いられる。上記条件におけるナノ濾過膜の硫酸マグネシウム透過率が１．５％を上回る場合、ナノ濾過膜を透過した乳酸溶液を濃縮すると無機塩が析出するおそれがあり、さらに、蒸留操作を行うと、透過した無機塩の影響で乳酸のラセミ化及びオリゴマー化が発生しやすく、また、蒸留収率が低下する虞がある。より好ましくはナノ濾過膜の硫酸マグネシウム透過率が１．０％以下のものが用いられる。【００３６】
その他、塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の除去率が４５％以上のナノ濾過膜が好ましく用いられる。また、ナノ濾過膜の透過性能としては、０．３ＭＰａの濾過圧において、膜単位面積当たりの塩化ナトリウム（５００ｍｇ／Ｌ）の透過流量（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）が０．５以上０．８以下のナノ濾過膜が好ましく用いられる。膜単位面積当たりの透過流量（膜透過流束）の評価方法としては、透過液量および透過液量を採水した時間および膜面積を測定することで、式３によって算出することができる。【００３７】
膜透過流束（ｍ３／ｍ２／ｄａｙ）＝透過液量／膜面積／採水時間・・・（式３）。【００３８】
本発明で使用されるナノ濾過膜の素材には、酢酸セルロース系ポリマー、ポリアミド、ポリエステル、ポリイミド、ビニルポリマーなどの高分子素材を使用することができるが、前記１種類の素材で構成される膜に限定されず、複数の膜素材を含む膜であってもよい。またその膜構造は、膜の少なくとも片面に緻密層を持ち、緻密層から膜内部あるいはもう片方の面に向けて徐々に大きな孔径の微細孔を有する非対称膜や、非対称膜の緻密層の上に別の素材で形成された非常に薄い機能層を有する複合膜のどちらでもよい。複合膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載の、ポリスルホンを膜素材とする支持膜にポリアミドの機能層からなるナノフィルターを構成させた複合膜を用いることができる。【００３９】
これらの中でも高耐圧性と高透水性、高溶質除去性能を兼ね備え、優れたポテンシャルを有する、ポリアミドを機能層とした複合膜が好ましい。操作圧力に対する耐久性と、高い透水性、阻止性能を維持できるためには、ポリアミドを機能層とし、それを多孔質膜や不織布からなる支持体で保持する構造のものが適している。また、ポリアミド半透膜としては、多官能アミンと多官能酸ハロゲン化物との重縮合反応により得られる架橋ポリアミドの機能層を支持体に有してなる複合半透膜が適している。【００４０】
ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜において、ポリアミドを構成する単量体の好ましいカルボン酸成分としては、例えば、トリメシン酸、ベンゾフェノンテトラカルボン酸、トリメリット酸、ピロメット酸、イソフタル酸、テレフタル酸、ナフタレンジカルボン酸、ジフェニルカルボン酸、ピリジンカルボン酸などの芳香族カルボン酸が挙げられるが、製膜溶媒に対する溶解性を考慮すると、トリメシン酸、イソフタル酸、テレフタル酸、およびこれらの混合物がより好ましい。【００４１】
前記ポリアミドを構成する単量体の好ましいアミン成分としては、ｍ−フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミン、ベンジジン、メチレンビスジアニリン、４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、ジアニシジン、３，３’，４−トリアミノビフェニルエーテル、３，３’，４，４’−テトラアミノビフェニルエーテル、３，３’−ジオキシベンジジン、１，８−ナフタレンジアミン、ｍ（ｐ）−モノメチルフェニレンジアミン、３，３’−モノメチルアミノ−４，４’−ジアミノビフェニルエーテル、４，Ｎ，Ｎ’−（４−アミノベンゾイル）−ｐ（ｍ）−フェニレンジアミン−２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾイミダゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾオキサゾール）、２，２’−ビス（４−アミノフェニルベンゾチアゾール）等の芳香環を有する一級ジアミン、ピペラジン、ピペリジンまたはこれらの誘導体等の二級ジアミンが挙げられ、中でもピペラジンまたはピペリジンを単量体として含む架橋ポリアミドを機能層とするナノ濾過膜は耐圧性、耐久性の他に、耐熱性、耐薬品性を有していることから好ましく用いられる。より好ましくは前記架橋ピペラジンポリアミドまたは架橋ピペリジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドであり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドである。また、前記化学式（１）中、ｎ＝３のものが好ましく用いられる。架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とするナノ濾過膜としては、例えば、特開昭６２−２０１６０６号公報に記載のものが挙げられ、具体例として、架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ、前記化学式（１）中、ｎ＝３のものを構成成分として含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製の架橋ピペラジンポリアミド系半透膜のＵＴＣ６０が挙げられる。【００４２】
ナノ濾過膜は一般にスパイラル型の膜エレメントとして使用されるが、本発明で用いるナノ濾過膜も、スパイラル型の膜エレメントとして好ましく使用される。好ましいナノ濾過膜エレメントの具体例としては、例えば、酢酸セルロース系のナノろ過膜であるＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ社製ナノ濾過膜のＧＥｓｅｐａ、ポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０が挙げられ、より好ましくはポリアミドを機能層とするアルファラバル社製ナノ濾過膜のＮＦ９９またはＮＦ９９ＨＦ、架橋ピペラジンポリアミドを機能層とするフィルムテック社製ナノ濾過膜のＮＦ−４５、ＮＦ−９０、ＮＦ−２００またはＮＦ−４００、あるいは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０であり、さらに好ましくは架橋ピペラジンポリアミドを主成分とし、かつ前記化学式（１）で示される構成成分を含有するポリアミドを機能層とする、東レ株式会社製のＵＴＣ６０を含む同社製ナノ濾過膜モジュールＳＵ−２１０、ＳＵ−２２０、ＳＵ−６００またはＳＵ−６１０である。【００４３】
工程Ａにおける微生物発酵培養液のナノ濾過膜による濾過は、圧力をかけてもよく、その濾過圧は、０．１ＭＰａ以上８ＭＰａ以下の範囲で好ましく用いられる。濾過圧が０．１ＭＰａより低ければ膜透過速度が低下し、８ＭＰａより高ければ膜の損傷に影響を与えるおそれがある。また、濾過圧が０．５ＭＰａ以上７ＭＰａ以下で用いれば、膜透過流束が高いことから、乳酸溶液を効率的に透過させることができ、膜の損傷に影響を与える可能性が少ないことからより好ましく、１ＭＰａ以上６ＭＰａ以下で用いることが特に好ましい。【００４４】
工程Ａのナノ濾過膜に通じて濾過する微生物発酵培養液中の乳酸の濃度は、特に限定されないが、高濃度であれば、透過液中に含まれる乳酸の濃度も高いため、濃縮する時間を短縮することができることからコスト削減に好適である。【００４５】
工程Ａにおける培養液中に含まれる無機塩の濃度は特に限定はなく、飽和溶解度以上であってもよい。すなわち、無機塩が飽和溶解度以下であれば培養溶液中に溶解しており、飽和溶解度以上であれば、一部析出しているが、本発明の乳酸の製造方法は、培養液中において溶解しているもの、培養液中に析出し若しくは沈殿して含まれているもののいずれも除去または阻止することが可能であるので、無機塩の濃度に拘束されずに乳酸を濾過することができる。【００４６】
上記の方法によって培養液から乳酸を分離する際の、乳酸のナノ濾過膜透過性の評価方法としては、乳酸透過率を算出して評価することができる。乳酸透過率は、高速液体クロマトグラフィーに代表される分析により、原水（培養液）中に含まれる乳酸濃度（原水乳酸濃度）および透過液（乳酸含有溶液）中に含まれる乳酸濃度（透過液乳酸濃度）を測定することで、式４によって算出することができる。【００４７】
乳酸透過率（％）＝（透過液乳酸濃度／原水乳酸濃度）×１００・・・（式４）。【００４８】
本発明の乳酸の製造方法は、工程Ａの培養液をナノ濾過膜で濾過して得られる乳酸含有溶液を、さらに蒸留する工程Ｂに供することで、高純度の乳酸を得ることを特徴としている。蒸留工程は、１Ｐａ以上大気圧（常圧、約１０１ｋＰａ）以下の減圧下で行われる。１０Ｐａ以上３０ｋＰａ以下の減圧下で行えば、蒸留温度を低減できることからより好ましい。減圧下で行う場合の蒸留温度は、２０℃以上２００℃以下で行われるが、１８０℃以上で蒸留を行った場合、不純物の影響により、乳酸がラセミ化するおそれがあるため、５０℃以上１８０℃以下、より好ましくは６０℃以上１５０℃以下であれば、好適に乳酸の蒸留を行うことができる。【００４９】
前記工程Ｂに供する前に、ナノ濾過膜を透過した乳酸含有溶液を、一旦エバポレーターに代表される濃縮装置を用いて乳酸含有溶液を濃縮してもよく、また、工程Ａで得られる乳酸含有溶液を、さらに、逆浸透膜で濾過して乳酸濃度を高める工程Ｄに供してもよいが、濃縮のためのエネルギー削減という観点から、逆浸透膜で濾過して乳酸濃度を高める工程Ｄが好ましく採用できる。ここでいう逆浸透膜とは、被処理水の浸透圧以上の圧力差を駆動力にイオンや低分子量分子を除去する濾過膜であり、例えば酢酸セルロースなどのセルロース系や、多官能アミン化合物と多官能酸ハロゲン化物とを重縮合させて微多孔性支持膜上にポリアミド分離機能層を設けた膜などが採用できる。逆浸透膜表面の汚れすなわちファウリングを抑制するために、酸ハライド基と反応する反応性基を少なくとも１個有する化合物の水溶液をポリアミド分離機能層の表面に被覆して、分離機能層表面に残存する酸ハロゲン基と該反応性基との間で共有結合を形成させた主に下水処理用の低ファウリング逆浸透膜なども好ましく採用できる。本発明の工程Ｂで２価のカルシウムイオンを大部分除去できているため、逆浸透膜面でのスケールの生成もなく安定した膜濃縮が行える。【００５０】
次に、本発明の乳酸の製造方法に供される微生物の発酵培養による乳酸生産について説明する。【００５１】
微生物の発酵培養による乳酸生産に使用する発酵原料としては、培養する微生物の生育を促し、目的とする発酵生産物である乳酸を良好に生産させうるものであればよく、炭素源、窒素源、無機塩類、及び必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が良い。炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトース、ラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、グリセリンなども使用される。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等を適宜添加することができる。本発明に使用する微生物が生育のために特定の栄養素（例えば、アミノ酸など）を必要とする場合には、その栄養物をそれ自体もしくはそれを含有する天然物として添加する。また、消泡剤も必要に応じて使用してもよい。本発明において、培養液とは、発酵原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言う。培養液に追加する発酵原料の組成は、目的とする乳酸の生産性が高くなるように、培養開始時の発酵原料組成から適宜変更しても良い。【００５２】
本発明では、微生物の培養は、ｐＨ４−８、温度２０−４０℃の範囲であることが好ましい。また、微生物の培養において、酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。【００５３】
微生物の培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物濃度を高くした後に、連続培養（引き抜き）を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。適当な時期から原料培養液の供給及び培養物の引き抜きを行うことが可能である。原料培養液供給と培養物の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、原料培養液の供給と培養物の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。原料培養液には上記に示したような菌体増殖に必要な栄養素を添加し、菌体増殖が連続的に行われるようにすればよい。培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、培養液の環境が微生物または培養細胞の増殖にとって不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましく、一例として、乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することで良好な生産効率が得られる。【００５４】
発酵生産能力のあるフレッシュな菌体を増殖させつつ行う連続培養操作は、通常、単一の発酵槽で行うのが、培養管理上好ましい。しかしながら、菌体を増殖しつつ生産物を生成する連続培養法であれば、発酵槽の数は問わない。発酵槽の容量が小さい等の理由から、複数の発酵槽を用いることもあり得る。この場合、複数の発酵槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても発酵生産物の高生産性は得られる。【００５５】
本発明で使用される微生物については特に制限はないが、例えば、発酵工業においてよく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌などが挙げられる。動物細胞、昆虫細胞等の培養細胞も、本発明で使用される微生物に含まれる。使用する微生物は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５７】
参考例１  乳酸生産能力を持つ酵母株の作製
乳酸生産能力を持つ酵母株を下記のように造成した。具体的には、ヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することでＬ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成した。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造株式会社製）、あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡株式会社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。【００５８】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen社製）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen社製）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを続くＰＣＲの増幅鋳型とした。【００５９】
上記操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ＬＤＨ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（宝酒造株式会社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素ＨｉｎｃＩＩで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造株式会社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することによりヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子（アクセッションナンバー；ＡＹ００９１０８、配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ＬＤＨ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られた各ＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにしてヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ＬＤＨ５を得た。【００６０】
ヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ＬＤＨ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．３ｋｂのヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を１．５％アガロースゲル電気泳動により分離、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片、１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子及びＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調製した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。【００６１】
得られた形質転換細胞がヒト由来Ｌ−ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のように行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることで確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＹＥＡＳＴ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ２０００  ＥＤＩＴＩＯＮ、ＣＳＨＬ  ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することで確認した。【００６２】
カラム：Shim-Pack SPR-H（株式会社島津製作所製）、移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、検出方法：電気伝導度、温度：４５℃。【００６３】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。【００６４】
カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー株式会社製）、移動相 ：１ｍＭ 硫酸銅水溶液、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、検出方法 ：ＵＶ２５４ｎｍ、温度 ：３０℃。【００６５】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は式４で計算した。ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。【００６６】
光学純度（%）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）‥‥‥（式４）。【００６７】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことを確認した。得られた形質転換細胞を酵母ＳＷ−１株として、続く実施例に用いた。【００６８】
参考例２  バッチ発酵によるＬ−乳酸の製造
微生物を用いた発酵形態として最も典型的なバッチ発酵を行い、その乳酸生産性を評価した。表１に示す乳酸発酵培地を用い、バッチ発酵試験を行った。該培地は高圧蒸気滅菌（１２１℃、１５分）して用いた。微生物として参考例１で造成した酵母ＳＷ−１株を用い、生産物である乳酸の濃度の評価には、参考例１に示したＨＰＬＣを用いて評価し、グルコース濃度の測定にはグルコーステストワコーＣ（和光純薬工業株式会社製）を用いた。参考例２の運転条件を以下に示す。【００６９】
反応槽容量（乳酸発酵培地量）：２（Ｌ）、  温度調整：３０（℃）、反応槽通気量：０．２（Ｌ／ｍｉｎ）、反応槽攪拌速度：４００（ｒｐｍ）、ｐＨ調整：１Ｎ  水酸化カルシウムによりｐＨ５に調整。【００７０】
まず、ＳＷ−１株を試験管で５ｍｌの乳酸発酵培地で一晩振とう培養した（前々培養）。前々培養液を新鮮な乳酸発酵培地１００ｍｌに植菌し５００ｍｌ容坂口フラスコで２４時間振とう培養した（前培養）。温度調整、ｐＨ調整を行い、発酵培養を行った。この時の菌体増殖量は、６００ｎｍでの吸光度で１５であった。回分発酵の結果を表２に示す。【００７１】
【表１】
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【００７２】
【表２】
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【００７３】
参考例３  ナノ濾過膜の硫酸マグネシウム透過性評価
超純水１０Ｌに硫酸マグネシウム（和光純薬工業株式会社製）１０ｇ添加して２５℃１時間攪拌し、１０００ｐｐｍ硫酸マグネシウム水溶液を調整した。次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水層１に上記で調整した硫酸マグネシウム水溶液１０Ｌを注入した。図２の符号７に示される９０φナノ濾過膜として、架橋ピペラジンポリアミド半透膜“ＵＴＣ６０”（ナノ濾過膜１；東レ製）、架橋ピペラジンポリアミド半透膜“ＮＦ−４００”（ナノ濾過膜２；フィルムテック製）、ポリアミド半透膜“ＮＦ９９”（ナノ濾過膜３；アルファラバル製）、酢酸セルロース半透膜“ＧＥｓｅｐａ”（ナノ濾過膜４；ＧＥ  Ｏｓｍｏｎｉｃｓ製）をそれぞれステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにセットし、原水温度を２５℃、高圧ポンプ３の圧力を０．５ＭＰａに調整し、透過液４を回収した。原水槽１、透過液４に含まれる、硫酸マグネシウムの濃度をイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）により以下の条件で分析し、硫酸マグネシウムの透過率を計算した。【００７４】
陰イオン；カラム（ＡＳ４Ａ−ＳＣ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（１．８ｍＭ炭酸ナトリウム／１．７ｍＭ炭酸水素ナトリウム）、温度（３５℃）。【００７５】
陽イオン；カラム（ＣＳ１２Ａ（ＤＩＯＮＥＸ製））、溶離液（２０ｍＭメタンスルホン酸）、温度（３５℃）。【００７６】
結果を表３に示す。【００７７】
【表３】
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【００７８】
参考例４  ナノ濾過膜のクエン酸透過性評価
超純水１０Ｌにクエン酸（和光純薬工業株式会社製）１０ｇ添加して２５℃１時間攪拌し、１０００ｐｐｍクエン酸水溶液を調整した。次いで、参考例３と同じ条件でナノ濾過膜１〜４の透過液を回収した。原水槽１、透過液４に含まれる、クエン酸濃度を、高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により以下の条件で分析し、クエン酸の透過率およびクエン酸透過率／硫酸マグネシウム透過率を計算した。【００７９】
カラム：Shim-Pack SPR-H（株式会社島津製作所製）、移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）、検出方法：電気伝導度、温度：４５℃。【００８０】
結果を表４に示す。【００８１】
【表４】
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【００８２】
参考例５〜２５
（ナノ濾過膜で濾過する培養液の準備）
参考例１、２で乳酸発酵した培養液（２Ｌ）をｐＨが１．９（参考例５）２．０（参考例６〜９）、２．２（参考例１０〜１３）、２．６（参考例１４〜２０）、４．０（参考例２１〜２４）になるまで濃硫酸（和光純薬工業株式会社製）を滴下後、1時間２５℃で撹拌し、培養液中の乳酸カルシウムを乳酸と硫酸カルシウムに変換した。次いで、沈殿した硫酸カルシウムを定性濾紙Ｎｏ2（アドバンテック株式会社製）を用いて吸引濾過により、沈殿物を濾別し、濾液２Ｌを回収した。また、濃硫酸を添加しなかったｐＨ５の培養液（２Ｌ）についても分離実験を行った（参考例２５）。【００８３】
（ナノ濾過膜による分離実験）
次いで、図１に示す、膜濾過装置の原水槽１に上記実施例で得られた濾液２Ｌを注入した。図２の符号７の９０φナノ濾過膜として、前記ナノ濾過膜１〜４をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ１ＭＰａ、３ＭＰａ、４ＭＰａ、５ＭＰａに調整し、それぞれの圧力における透過液４を回収した。原水槽１、透過液４に含まれる、硫酸イオン、カルシウムイオンの濃度を、参考例３と同様の条件でイオンクロマトグラフィー（ＤＩＯＮＥＸ製）、乳酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。結果を表５に示す。【００８４】
【表５】
2009004922.tif 000007
【００８５】
表５に示すように、すべてのｐＨ、濾過圧力において、硫酸カルシウムが高効率で除去されたことがわかった。また、上記参考例５〜２５において、ナノ濾過膜を新しい膜に取り換えることなく、上記の濾加圧において、硫酸カルシウムが高効率で除去された。【００８６】
実施例１〜４
（エバポレーターを用いた乳酸含有溶液の濃縮および濃縮液の蒸留）
参考例７、参考例１１、参考例１５、参考例２２の透過液各１Ｌをロータリーエバポレーター（東京理化器械株式会社製）を用いて、減圧下（５０ｈＰａ）で水を蒸発させて濃縮した。この時、硫酸カルシウムの析出は見られなかった。【００８７】
次いで、１３３Ｐａ、１３０℃で減圧蒸留を行った。蒸留した乳酸のラセミ化を確認するために、蒸留の前後で光学純度を高速液体クロマトグラフィーにより測定を行ったところ、光学純度の低下は見られなかった。表６に結果を示す。【００８８】
【表６】
2009004922.tif 000008
【００８９】
実施例５〜１３
（逆浸透膜を用いた乳酸含有溶液の濃縮）
参考例５（ナノ濾過膜１、ｐＨ１．９）の透過液、参考例７（ナノ濾過膜１、ｐＨ２．０）の透過液、参考例１１（ナノ濾過膜１、ｐＨ２．２）の透過液、参考例１５（ナノ濾過膜１、ｐＨ２．６）の透過液、参考例１８（ナノ濾過膜２、ｐＨ２．６）の透過液、参考例１９（ナノ濾過膜３、ｐＨ２．６）の透過液、参考例２０（ナノ濾過膜４、ｐＨ２．６）の透過液、参考例２２（ナノ濾過膜１、ｐＨ４．０）の透過液、参考例２５（ナノ濾過膜１、ｐＨ５．０）の透過液各１．９Ｌを、図１に示す膜濾過装置の原水槽１に注入した。図２の符号７の９０φ逆浸透膜として、ポリアミド製逆浸透膜（ＵＴＣ−７０、東レ株式会社製）をステンレス（ＳＵＳ３１６製）製のセルにそれぞれセットし、高圧ポンプ３の圧力をそれぞれ３ＭＰａに調整し、逆浸透膜濃縮液５を回収した。膜濃縮液に含まれる乳酸濃度を、参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィー（株式会社島津製作所製）により分析した。結果を表７に示す。【００９０】
（乳酸含有溶液の蒸留）
前記逆浸透膜濃縮液各０．４Ｌをロータリーエバポレーター（東京理化器械株式会社製）を用いて、減圧下（５０ｈＰａ）で水を蒸発させて濃縮した。この時、硫酸カルシウムの析出は見られなかった。次いで、１３３Ｐａ、１３０℃で減圧蒸留を行った。蒸留した乳酸のラセミ化を確認するために、蒸留の前後で光学純度を高速液体クロマトグラフィーにより測定を行ったところ、光学純度の低下は見られなかった。表７に結果を示す。【００９１】
【表７】
2009004922.tif 000009
【００９２】
比較例１
（定性濾紙による濾過実験）
実施例１〜４と同様に、参考例１、２で乳酸発酵した培養液（２L）をｐHが２．０になるまで濃硫酸（和光純薬工業株式会社製）を滴下後、1時間２５℃で攪拌した。沈殿した硫酸カルシウムを定性濾紙Ｎｏ２（アドバンテック製）を用いて吸引濾過により濾別した。濾液中に含まれる、硫酸カルシウムの濃度をイオンクロマトグラフィーにより分析を行ったところ、カルシウムイオン濃度は５４９ｍｇ／Ｌであった。このことから、硫酸カルシウムが十分に除去されていないことがわかった。【００９３】
比較例２
（乳酸の蒸留）
比較例１で得られた濾液１L（乳酸濃度：２４ｇ／L）をロータリーエバポレーター（東京理化製）を用いて、減圧下（５０ｈＰａ）で水を蒸発させて濃縮したところ、上記定性濾紙により除去されなかった硫酸カルシウムが析出した。次いで、１３３Ｐａ、１３０℃で減圧蒸留を行った。蒸留した乳酸のラセミ化を確認するために、蒸留の前後で乳酸の光学純度を参考例１と同様の条件で高速液体クロマトグラフィーにより測定を行ったところ、光学純度の低下が見られた。また、蒸留残渣には、一部オリゴマー化した乳酸が確認された。表８に結果を示す。【００９４】
【表８】
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【００９５】
以上の実施例及び比較例の結果から、ナノ濾過膜により、培養液中の硫酸カルシウムを高効率で除去できることが明らかとなった。すなわち、本発明によって、微生物培養液中の乳酸溶液中のカルシウム成分をナノ濾過膜によって高効率で除去することができ、濃縮してもカルシウム成分が析出せず、さらに、蒸留工程にかけてもラセミ化、オリゴマー化が進行しないことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明の乳酸の製造方法により得られる乳酸は、食品、医薬品のほか、生分解性プラスチックであるポリ乳酸のモノマー原料として好適に用いられる。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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