(57)【要約】  トロンビンのアジュバントとしての利用方法及び該トロンビンをアジュバントとして含有してなるワクチンを提供する。抗原と共に非注射法により投与したときに、該抗原に対するIgG及びIgAの産生を高めることができるトロンビン及びこれをワクチンのアジュバントとして利用する方法、並びにトロンビンをアジュバントとして含有させることを特徴とする、局所免疫に有用なワクチン。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビンをワクチンのアジュバントとして使用する方法。
【請求項２】
トロンビンがIgG抗体及びIgA抗体を誘導することができる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
トロンビンが遺伝子組換え技術により得られた組換えトロンビンである、請求項１又は２の何れか一項記載の方法。
【請求項４】
トロンビンが動物由来である、請求項１ないし３の何れか一項記載の方法。
【請求項５】
トロンビンが霊長類由来である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
トロンビンがヒト由来である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ワクチンが局所免疫を行なうためのワクチンである、請求項１ないし６の何れか一項記載の方法。
【請求項８】
局所免疫が経皮又は経粘膜によるものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
経粘膜が、鼻腔、口腔、腸管、尿生殖管又は眼球周囲の何れかの粘膜によるものである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ワクチン抗原及びアジュバント活性を有するトロンビンを含有してなるワクチン。
【請求項１１】
IgG抗体及びIgA抗体を誘導することができる、請求項１０記載のワクチン。
【請求項１２】
トロンビンが遺伝子組換え技術により得られた組換えトロンビンである、請求項１０又は１１の何れか一項記載のワクチン。
【請求項１３】
トロンビンが動物由来である、請求項１０ないし１２の何れか一項記載のワクチン。
【請求項１４】
トロンビンが霊長類由来である、請求項１３記載のワクチン。
【請求項１５】
トロンビンがヒト由来である、請求項１４記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫応答誘導能を有するトロンビンに関し、詳しくはトロンビンをワクチンの免疫応答誘導剤（以下、「アジュバント」と称することもある）として使用する方法並びにワクチン抗原及び該トロンビンを含有してなるワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビンは止血血栓の形成や創傷治癒などの生命の維持進展に不可欠な作用を有するトリプシン様セリンプロテアーゼである。トロンビンにはメゾトロンビン、α−トロンビン、β−トロンビン、γ−トロンビンが存在するが生理的にはα−トロンビンが重要である。トロンビンの前駆体であるプロトロンビンはビタミンＫ依存的に肝細胞で生合成され、細胞膜リン脂質上でのFXa−FVa複合体によりプロトロンビンのArg320−ILe321結合が限定分解を受け、Glaドメインやクリングルドメインをもったメゾトロンビンが形成される。次いでArg271−Thr272結合が限定分解されα−トロンビンが生成され細胞膜から遊離し、多くの血漿タンパク質や種々の細胞膜のトロンビン受容体を限定分解して多様な生理活性を示す。α−トロンビンはＡ鎖とＢ鎖からなる２本鎖分子であるが、酵素活性に重要なＢ鎖がさらに自己消化されるとβ−トロンビン、γ−トロンビンとなりフィブリノーゲンや血小板の活性化能を失う。【０００３】
生成されたトロンビンはフィブリン血栓に結合して局所におけるより大きな血栓の形成に関わる。トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンに変換させる酵素であるとともに、FXIIIを活性化してフィブリンを架橋結合させる引き金でもある。さらに、それぞれFIXやFXaの補助因子であるFVIIIやFVを活性化して凝固を進行させる凝固促進機能をもつ。このように、トロンビンは止血作用においては重要な役割を果たすことから止血剤としては極めて有用なタンパク質である。【０００４】
一方、トロンビンは血管内皮細胞上のトロンボモジュリンと結合するとその基質特異性が変化して、プロテインCを活性化することにより抗凝固を促進するようになる。このトロンビンの酵素活性を利用して、抗凝固剤である活性化プロテインCをつくるためのプロセスエンザイムとしても利用されている有用なタンパク質である。さらに、トロンビンは単球に作用して組織因子の産生を促進し、血管内皮細胞に作用してプロスタサイクリンやプラスミノゲンアクチベータインヒビターを産生、分泌させ、さらに内皮細胞を収縮して細胞間隙を広げ、内皮の物質透過性を高めるとともに内皮下組織の平滑筋細胞や線維芽細胞の増殖を促すことが知られている。【０００５】
このように多彩な機能を有するトロンビンは、止血剤、プロセスエンザイム、研究用試薬としてこれまで広く利用されている。例えば、上部消化管出血に対しては血液由来のトロンビンが内視鏡的に出血患部に散布されたり、経口的に投与されたりして止血効果が認められている。さらに、組織の接着剤として使用されているフィブリン糊には、フィブリノーゲンやFXIII因子とともに血液由来のトロンビンが含まれている。【０００６】
以上述べてきたように、トロンビンはその多彩な生理作用から幅広く利用されているが、近年、in vitroにおいてヒト単球に作用してTh1型免疫応答を誘導するサイトカインであるインターロイキン12（IL-12）の産生を抑え、Th2型免疫応答にシフトさせる作用を有することが明らかとなった（例えば、非特許文献１参照）。このことはトロンビンが炎症反応と免疫反応の橋渡しをしている可能性を示唆するものである。しかしながら、in vitroで認められるTh2型免疫応答へのシフトがin vivoでの異物に対する抗体産生能を惹起するか、言い換えれば免疫応答を誘導する作用を有するかについて、これまでのところ明らかではない。【０００７】
現在、異物に対する抗体産生能を増強する作用から、アジュバントが抗原性の弱い不活化ワクチンの弱点を補うために利用されている。その中でも、ヒトに対しての使用が許可されているものは、水酸化アルミニウムゲルのみであり、非経口的に投与されると血中でのワクチン抗原に対する抗体（IgG）を十分に上昇させることができる。しかし、多くの病原体が侵入門戸とする、外界と接する面積の最も大きな粘膜表面（鼻腔、口腔、腸管、尿生殖管、眼球周囲など）においては十分な免疫応答誘導能は認められていない。【０００８】
粘膜表面での病原体の排除において大きな役割を担うものはIgAと呼ばれる抗体であり、侵入してきた病原体を結合して、それらが粘膜を通して生体内へ侵入するのを阻止する働きを持っている。したがって、病原体からの感染をより効果的に防ぐには、従来のワクチン接種で期待される血中のIgG抗体の上昇だけでなく、粘膜表面でのIgA抗体を誘導することが重要である。この観点から、これまで細菌由来の毒素成分等を含む様々な物質が調べられ、動物の系では両抗体を誘導できるものが知られている（例えば、非特許文献２参照）。しかし、経粘膜投与において、十分な免疫応答誘導能を持ちながら、臨床面で利用されうる物質はこれまで知られていない。【０００９】
【非特許文献１】Naldini A. et al., British J. Pharmacol., 140, 980-986, 2003
【非特許文献２】Holmgen J. et al., Immunology Letters, 97, 181-188, 2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
以上述べたように、トロンビンはヒト単球に作用してサイトカインを誘導する作用は知られているが、in vivoにおいて同時に投与した抗原に対する免疫応答を誘導する作用はこれまで明らかにされていない。したがって、本発明の目的はこの点に着目し、既に医薬品として経口投与が認められているトロンビンの経粘膜投与での免疫応答誘導能を明らかにし、該投与経路でのワクチン接種に利用できるアジュバントを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らはトロンビンのin vitroでの作用に着目して検討を行った結果、驚くべきことに、トロンビンを卵白アルブミンとともに経粘膜的に投与すると、当該卵白アルブミンに対する血中IgG抗体を上昇させるアジュバント活性があることを見出した。さらに、粘膜表面の抗原特異的IgA抗体も誘導することをも見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
したがって、本発明は、以下に示すトロンビンをアジュバントとして使用する方法並びにワクチン抗原及びアジュバント活性を有する該トロンビンを含有してなるワクチンを提供するものである。
１．トロンビンをワクチンのアジュバントとして使用する方法。
２．トロンビンがIgG抗体及びIgA抗体を誘導することができる、上記１の方法。
３．トロンビンが遺伝子組換え技術により得られた組換えトロンビンである、上記１又は２の何れかの方法。
４．トロンビンが動物由来である、上記１ないし３の何れかの方法。
５．トロンビンが霊長類由来である、上記４の方法。
６．トロンビンがヒト由来である、上記５の方法。
７．ワクチンが局所免疫を行なうためのワクチンである、上記１ないし６の何れかの方法。
８．局所免疫が経皮又は経粘膜によるものである、上記７の方法。
９．経粘膜が、鼻腔、口腔、腸管、尿生殖管又は眼球周囲の何れかの粘膜によるものである、上記８の方法。
１０．ワクチン抗原及びアジュバント活性を有するトロンビンを含有してなるワクチン。
１１．IgG抗体及びIgA抗体を誘導することができる、上記１０のワクチン。
１２．トロンビンが遺伝子組換え技術により得られた組換えトロンビンである、上記１０又は１１の何れかのワクチン。
１３．トロンビンが動物由来である、上記１０ないし１２の何れかのワクチン。
１４．トロンビンが霊長類由来である、上記１３のワクチン。
１５．トロンビンがヒト由来である、上記１４のワクチン。
【発明の効果】
【００１３】
本発明に従えば、トロンビンをアジュバントとして使用する方法及びこれをアジュバントとして含有するワクチンが提供される。本発明に従ってトロンビンを経粘膜免疫的に抗原とともに投与することにより、血中の該抗原に対する特異的IgG抗体を早期に、かつ多量に、また粘膜表面に該抗原に対する特異的IgA抗体を多量に誘導することができる。したがって、本発明により、トロンビンは主に経粘膜的に投与するワクチン抗原のアジュバントとして有用であることがわかった。【００１４】
また、トロンビンは既に医薬品として経口投与されていることから、経粘膜的にも安全に投与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、卵白アルブミン単独又はトロンビンと卵白アルブミンとの混合液をマウスに免疫したときの血中における抗卵白アルブミンIgG抗体価の経時的変化を示すグラフである。
【００１６】
【図２】図２は、卵白アルブミン単独又はトロンビンと卵白アルブミンとの混合液をマウスに免疫したときの鼻腔洗浄液中における抗卵白アルブミンIgA抗体価を示すグラフである。
【００１７】
【図３】図３は、卵白アルブミン単独又はトロンビンと卵白アルブミンとの混合液をマウスに免疫したときの腸管洗浄液中における抗卵白アルブミンIgA抗体価を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明は、免疫応答誘導能を有するトロンビン及びこれをアジュバントとして含有するワクチンによって特徴付けられる。該トロンビンは、低温エタノール分画やクロマトグラフィー操作等により、霊長類又は他の動物の血液から調製することができる。或いは、以下に示すような遺伝子組換え技術を利用して調製することもできる。遺伝子組換え技術を利用する場合は、トロンビンをコードする遺伝子は、霊長類又は他の動物の何れから取得した遺伝子であっても良い。本願実施例では、ヒトプロトロンビン遺伝子から出発して組換えヒトトロンビンを取得した（調製例１；詳細は、WO2007/040162を参照）。トロンビンの由来としては、霊長類等の哺乳類又は他の動物由来、好ましくはヒト由来のトロンビンを使用できるが、免疫する動物（或いはヒト）に応じて適宜選択することができる。【００１９】
例えば、ヒトプロトロンビン遺伝子は、ヒト肝臓から抽出された全RNA,ｍRNA又はゲノムDNAを出発材料として、Sambrookらが述べている一般的な遺伝子組換え技術（Molecular Cloning, A Laboratory Manual Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989）に従って調製することができる。今日では、種々のキットが市販されているのでこれを使用すれば良い。例えば、RNAの抽出には、TRIzol試薬（インビトロジェン社）、ISOGEN（ニッポンジーン社）、StrataPrep Total RNA Purification Kit（東洋紡）などの試薬、mRNAの精製には、mRNA Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス社）、Poly(A) Quick mRNA Isolation Kit（東洋紡）、mRNA Separator Kit（クロンテック社）などのキット、cDNAへの変換には、T-Primed First Strand Kit（アマシャムファルマシア社製）、SuperScript plasmid system for cDNA synthesis and plasmid cloning（インビトロジェン社）、cDNA Synthesis Kit（宝酒造）、SMART PCR cDNA Synthesis & Library Construction Kits（クロンテック社）、Directionary cDNA Library Construction systems（ノバジェン社）、GeneAmp PCR Gold（アプライドバイオシステムズ社）などが使用される。【００２０】
こうして得られたヒトプロトロンビン遺伝子は適当な発現ベクターに挿入され、該発現ベクターで宿主、例えば、動物細胞の形質転換が行なわれる。発現ベクターには特段の制約はないが、外来遺伝子に適当なプロモーター等の発現調節領域、終止コドン、ポリA付加シグナル配列、Kozak配列、分泌シグナルなどが付加される。当該発現ベクターに含まれるプロモーターは、宿主として動物細胞を用いる場合、SV40初期、SV40後期、サイトメガロウイルスプロモーター、ニワトリβアクチンなどが利用できるが、最終的に使用する宿主において外来遺伝子が発現するものであれば如何なるものでも良い。動物細胞を宿主として用いる場合、好ましくは、ニワトリβ−アクチンプロモーター系発現プラスミドpCAGG（特開平3-168087）が使用される。選択や遺伝子増幅のマーカー遺伝子として、neo遺伝子やジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子、ピューロマイシン耐性酵素遺伝子、グルタミン合成酵素（GS）遺伝子など一般に知られる選択や遺伝子増幅用のマーカー遺伝子が利用できる。【００２１】
本発明で用いる宿主としては、各種哺乳類由来の培養細胞を広く利用することができ、好適にはチャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）、ヒト由来293細胞又はトリ由来細胞等が例示される。動物細胞への遺伝子導入方法にも特段の制約はなく、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、リポフェクチン系のリポソームを用いる方法、プロトプラストポリエチレングリコール融合法、エレクトロポレーション法などが利用でき、使用する宿主細胞により適当な方法を選択すればよい（Molecular Cloning (3rd Ed.), Vol 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)）。培養に用いる培地として、その形状から寒天培地、液体培地、その種類からYMM-01、DMEM、RPMI、αMEMなどが使用されるが、細胞や培養目的、或は培養段階に応じて適宜選択すれば良い。それぞれの培地のプロトコールに従って、血清、アミノ酸、ビタミン、糖、抗生物質、pH調整用緩衝液などを添加したものが使用される。培地のpHは6〜8、培養温度は30℃〜39℃の範囲が設定される。培地の量、添加物及び培養時間は、培養スケールに合わせて適宜調節される。【００２２】
ヒトプロトロンビン産生細胞は、抗トロンビン抗体を用いた特異反応を利用した検出方法、例えば、ドットブロット、ウェスタンブロット、ELISAなどの方法により、クローン化された薬剤耐性細胞の培養液中のヒトプロトロンビンを検出することにより取得することができる。こうして得られたヒトプロトロンビン産生細胞は、無血清培地に順応化させた後、工業生産レベルの大量培養が行なわれる。大量培養の方法としては、フェドバッチ培養、バッチ培養などが一般に用いられるが、何れの方法で行なっても良い。【００２３】
斯かるプロトロンビン産生細胞からヒトプロトロンビンを精製する際には、一般的に、タンパク質化学において使用される精製方法、例えば、塩析法、限外ろ過法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換クロマト法、ゲルろ過クロマト法、アフィニティークロマト法、疎水クロマト法、ハイドロキシアパタイトクロマト法などの方法が用いられる。実際には、細胞由来の多種類の夾雑物が混在するため、上記方法の組み合わせにより行われることもある。【００２４】
ヒトプロトロンビンのヒトトロンビンへの変換には、組換えエカリンを用いるのが好ましい。組換えエカリンは、特許公報（WO2003/004641）に記載の方法に従って調製することができる。簡単には、Nishidaらの方法に従って、蛇毒エカリンcDNAを調製し（S. Nishida et. Al., Biochemistry, 34, 1771-1778, 1995）、これを本発明で使用したニワトリβ-アクチンプロモーター系発現プラスミドpCAGGに組み込む。得られた発現ベクターを動物細胞、例えば、CHO細胞に導入し、組換えエカリン産生細胞を得る。組換えエカリンは、陽イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過を行うことにより精製することができる。こうして精製された組換えエカリンを、精製ヒトプロトロンビン液に添加し、変換反応が十分に行なわれる時間反応させる。反応温度は、35〜38℃、好ましくは、37℃、反応時間は、1-4時間、好ましくは、2時間である。エカリン処理により変換されたヒトトロンビンは、ベンズアミジンカラム及び陽イオン交換カラムを用いたクロマトグラフィーにより精製される。こうして精製された組換えエカリンをヒトプロトロンビンに作用させ、ヒトトロンビンへの変換が行なわれる。反応条件は、通常の酵素反応と同じ条件が使用される。例えば、ヒトプロトロンビン1000μg/mLに終濃度2-8Unit/mLのエカリンを添加し、36-38℃で1-4時間反応させることによりヒトプロトロンビンのヒトトロンビンへの変換は完了する。【００２５】
ヒトトロンビンは、エカリン処理液を上記のタンパク質精製方法に供することにより精製される。好ましくは、ベンズアミジンカラムと陽イオン交換クロマトグラフィーの組合せによる精製方法が用いられる。緩衝液は、陰イオン交換と同様に、中性領域を中心として緩衝能力を保持するものであれば使用可能である。pH範囲としては7-9，好ましくは8、緩衝液の濃度は0.1M以下、好ましくは0.01Mである。ヒトトロンビンをカラムに吸着させるときは、これに0.3-0.7Mの塩を含有させる。好ましくは、0.5M NaClが使用される。ヒトトロンビンは、同緩衝液で洗浄した後、吸着及び洗浄に使用された緩衝液に0.1Mのベンズアミジン塩酸塩を添加した緩衝液により溶出される。【００２６】
ヒトトロンビンを高度に精製するために、更に陽イオン交換クロマトグラフィーに供される。陽イオン交換体として、スルホプロピル基型、カルボキシメチル基型などが挙げられるが、適宜選択して使用すれば良い。本願実施例では、SPトヨパール550C（東ソー）が使用される。吸着、洗浄、溶出の条件は、一般に陽イオン交換クロマトグラフィーに使用される範囲のものが使用される。例えば、pHは、6-8、好ましくは6-7、緩衝液の濃度は、5-200 mM、好ましくは、10mMである。より具体的には、10mMクエン酸緩衝液に0.2M NaClが添加されたものが使用される。ヒトトロンビンを溶出するときは、塩濃度を上げることにより行なわれる。好ましくは、0.6M NaClが使用される。斯かる方法により、高純度のヒトトロンビンを取得できる。【００２７】
こうして得られたヒトトロンビンについて、クロッティング活性、合成基質（S-22338）切断活性等の酵素化学的性質、及び糖鎖分析が行なわれる。クロッティング活性値は、フィブリノーゲンがクロッティングする時間を標準品の検量線と比較して求められる相対値を表したもので、斯かる標準品として、日本薬局方標準品及びWHO国際標準品（NIBSC社）のトロンビンが用いられる。また、S-2338切断活性は、トロンビンとその特異的な基質との反応を利用したもので、合成基質S-2238をトロンビンが切断することで遊離してくるｐ−ニトロアニリン量をOD405/650の吸光度変化で測定することにより行なわれる。【００２８】
また、シアル酸の測定には、標準物質として、N-Acetylneuraminic acidとN-Glycolylneuraminic acidが用いられ、これらのイオン交換クロマトグラフィーカラムからの溶出時間と被検物質の溶出時間とを比較することにより行なわれる。すなわち、標準物質の各濃度におけるピーク面積からそれぞれの回帰式を作成し、これに被検物質の測定値を外挿し、シアル酸濃度が求められる。【００２９】
こうして得られたヒトトロンビンのアジュバントとしての有用性は、該ヒトトロンビンと適当な抗原の混合液を種々の動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、イヌ、サルなどに免疫し、得られる血清中のIgG量あるいは粘膜表面におけるIgA産生量を調べることにより示すことができる。抗原としては、特に制限はなく、種々の細菌、ウイルスの感染症に対するワクチン抗原が使用できる。ワクチン抗原は、ペプチド、タンパク質、菌体、ウイルス粒子など、何れの形態であっても良い。本願実施例では、入手、分析が容易な卵白アルブミンを用いた。投与方法については、非注射法により投与されるのであれば特に制限はなく、例えば、経皮、経口、点鼻、点眼など通常使用される接種ルートにより投与される。局所免疫の効果を調べる場合は、タンパク質分解酵素の影響を抑えるための処置を必要としない経皮、点鼻及び点眼による接種ルートが好ましいが、カプセルへの封入等の処置を行なうことで経口投与も利用可能である。ヒトトロンビン及び抗原を混合するときの溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液（PBS）が用いられるが、ヒト又は動物に毒性を示さないものであれば特に制限されない。【００３０】
具体的には、免疫は、C57BL/6マウス（SLC社）を用い、マウス1匹当たり、5μgの卵白アルブミンに対して0-40μgのヒトトロンビンをPBSに混合した混液を、週一回（計5回）、鼻腔に滴下することにより行われる。初回免疫の4日前及び2回目免疫以降5回目の免疫までは、免疫の日から4-5日目に尾静脈から採血し、血清を回収する。【００３１】
一方、粘膜表面の洗浄液は、殺処分したマウスについて切開した気管よりカテーテルを入れ、喉から鼻腔へつながる鼻腔口に挿入し、PMSF（シグマ社）含有PBSで洗浄し、その洗浄液を採取する。また、腸管洗浄液は以下の方法により採取する。まず、腸管を傷つけないようにして胃の幽門部下から盲腸の直前部までの小腸を剥離し、あらかじめSoybean Trypsin inhibitor（GIBCO BRL社）含有EDTA（DOJINDO社）液を入れたdishに採取する。これをピペッティング後遠心分離し、その上清にPMSFを混合後遠心分離する。上清にProtease inhibitor Cocktail set III、NaN3（片山化学工業社）を添加し、混合後15分間静置し、これに牛胎児血清（ハイクローン社）を添加、混合して腸管洗浄液として使用する。【００３２】
血清及び粘膜洗浄液中の特異抗体は、ELISA法により測定される。卵白アルブミンを固定した96-well plate（Nunc社、Maxisorp）をBlock Ace（大日本住友製薬社）、スキムミルク等でブロッキング後、希釈した血清を添加し反応させる。洗浄後、HRP標識抗マウスIgGヤギ抗体（American Qualax社、A131PS）を反応させ、洗浄後、発色基質液TMB+（Dako社）を添加して遮光下、室温で反応させる。1N硫酸で発色を停止し、450nmの吸光度（OD450値）を測定する。腸管及び鼻腔洗浄液中のIgAを測定するときには、HRP標識抗マウスIgAヤギ抗体（フナコシ社、A90-103P）を用いて同様に行なう。標準液の検量線から抗卵白アルブミン抗体価が算出される。【００３３】
その結果、ヒトトロンビンは、卵白アルブミンと一緒に投与したときに、血中の抗卵白アルブミンIgG抗体及び経粘膜表面の抗卵白アルブミンIgA抗体の産生を高める効果を有することが明らかとなった。それ故、ヒトトロンビンは、種々のワクチンのアジュバントとして利用することができる。特に、粘膜表面における局所免疫に対するアジュバント効果を期待するときに有用である。【００３４】
このようにヒトトロンビンは、アジュバント活性を有するものであり、適当なワクチン抗原と共に動物又はヒトに投与される。ワクチンの製剤化においては、該ヒトトロンビンの量は、ワクチン抗原の性状、投与量、免疫する動物（或いはヒト）、免疫スケジュールなど種々の条件に基づいて設定される。トロンビン量は、0.1〜10mg/mLの濃度範囲で必要な抗原と共に投与することが効果的である。好ましくは、0.5〜4mg/mLのトロンビンを用いるのが効果的である。【００３５】
また、ヒトトロンビンを含むワクチンの製剤化には、安定剤、保護剤などの添加剤を加えても良い。斯かる添加剤として、ポリソルベート80、アミノ酸及びラクトースやスクロース等の糖等の安定剤、ホルマリン、チメロサール、２−フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンゼトニウム及び塩化ベンザルコニウム等の保存剤が挙げられる。また、賦形剤としての効果を有するラクトース、スクロース等の糖を添加した場合、凍結乾燥製剤として製剤化することも可能である。更に、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミネラルオイル及びノンミネラルオイル等の免疫賦活剤と併用して用いることもできる。【００３６】
調製例１：ヒトトロンビンの調製
ニワトリβ-アクチンプロモーターの下流にヒトプロトロンビン遺伝子を結合した発現プラスミドを、リン酸カルシウム法変法（C. Chen et al., Mol. Cell. Biol., 7, p.2745-2752, 1987）により、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞に導入した。抗ヒトトロンビン抗体を用いたELISA法により、プロトロンビン産生CHO細胞をスクリーニングした。得られたプロトロンビン産生細胞を無血清培地に順応化させた後、ファーメンターで大量培養しヒトトロンビンの精製を行なった。【００３７】
プロトロンビン産生CHO細胞の培養上清3200mlに、2倍量の20mMリン酸バッファー（pH7.4）を加え0.22μmフィルター濾過したものを試料とした。この試料を0.1MのNaClを含む10mMリン酸バッファー（pH7.4）で平衡化したＱセファロースファーストフロー（アマシャム）80mlカラムに6.6ml/minの流速でアプライした。1600mlの上記バッファーでカラムを洗浄後、0.35MのNaClを含む10mMリン酸バッファー（pH7.4）450mlで6.6ml/minの流速で溶出を行った。【００３８】
陰イオン交換クロマトグラフィー溶出液360mlに、精製組換えエカリンを最終濃度4U/mlになるように添加し、37℃で2時間反応させ、プロトロンビンのトロンビンへの変換を行なった。この反応液を、0.5N NaClを含む10mM Tris-HCl（pH8.0）バッファーで平衡化したベンズアミジンファーストフロー（アマシャム）40mlカラムに対して、2.5ml/minでアプライした。800mlの上記バッファーでカラムを洗浄後、100mMベンズアミジン塩酸塩を含む10mM Tris-HCl+0.5M NaCl（pH8.0）バッファー360mlで溶出を行った。【００３９】
次いで、ベンズアミジンカラム溶出液160mlに、2.5倍量の10mMクエン酸バッファー（pH7.0）を加えたものを試料とし、0.2M NaClを含む10mMクエン酸バッファー（pH7.0）で平衡化したSPトヨパール550C（東ソー）40mlカラムに対して、6.6ml/minでアプライした。800mlの上記バッファーでカラムを洗浄後、0.6N NaClを含む10mMクエン酸バッファー（pH7.0）120mlで溶出を行い、高純度の組換えヒトトロンビンを得た。調製した組換えヒトトロンビンのタンパク質濃度は、BSAをスタンダードとしたLowry法により、4.57mg/mLであった。
【実施例１】
【００４０】
卵白アルブミンの免疫
（１）卵白アルブミン溶液の調製
市販の卵白アルブミン（シグマ社、GradeIV、A2512-250MG）を10mLのPBS（GIBCO BRL社）に溶解し、その200μLをPBSにて2.5倍希釈（10mg/mL）して30μLずつ0.5ｍLチューブに分注し、使用時まで-20℃以下で保存した。【００４１】
（２）投与マウス
雄のC57BL/6（7週齢、SPF）をSLC社より購入し、SPF環境下で10日間飼育した。【００４２】
（３）免疫群構成
表１に示すように、22匹のマウスを4群に分け、卵白アルブミン単独免疫群（グループ1）及び卵白アルブミンと組換えトロンビン免疫群（グループ2、3、4）とした。【００４３】
【表１】
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【００４４】
（４）免疫物の調製
グループ1；先に調製した卵白アルブミン溶液4μLをPBSで希釈して80μLとした。
グループ2；上記卵白アルブミン溶液4μLに組換えトロンビン（4.57mg/mL）8.8μLを加え、PBSで希釈して80μLとした。
グループ3；上記卵白アルブミン溶液4μLに組換えトロンビン（4.57mg/mL）35μLを加え、PBSで希釈して80μLとした。
グループ4；上記卵白アルブミン溶液4μLに組換えトロンビン（4.57mg/mL）70μLを加え、PBSで希釈して80μLとした。【００４５】
（５）免疫方法及びスケジュール
エーテル麻酔下、上記（４）にて調製した各免疫物をマウス1匹あたり10μLずつピペットマンP-20（ギルソン社）を用いて鼻腔より投与した。マウスへの免疫は1週間隔で6回の免疫を行った。【００４６】
（６）採血及び鼻腔、腸管洗浄液の採取
初回免疫の4日前及び2回目の免疫以降5回目の免疫までは免疫の日から4〜5日目に尾静脈より約150μLの採血を行った。また、6回目の最終免疫から6日目にすべてのマウスをペントバルビタールナトリウム（共立製薬、ソムノペンチル）麻酔下、腹部大静脈より採血して殺処分した。採取した血液はマイクロティナ（BECTON DICKINSON社）に移し、室温にて十分に凝固させた後、5,000回転、10分間遠心分離した。分離した血清は各々0.5mLチューブ2本に分注し、測定まで-80℃にて保存した。【００４７】
採血後、切開した気管よりカテーテルを入れ、喉から鼻腔へつながる鼻腔口に挿入し、0.5mLの1mM PMSF（シグマ社）含有PBSで洗浄した。その洗浄液を1.5mLチューブに採取し、5μLのProtease inhibitor Cocktail set III（Calbiochem社、539134）を加え、鼻腔洗浄液として測定まで-80℃にて保存した。【００４８】
一方、腸管洗浄液は以下に示す方法で採取、前処理して調製した。まず、腸管を傷つけないようにして胃の幽門部下から盲腸の直前部までの小腸を剥離した。あらかじめ1mLの0.2mg/mL Soybean Trypsin inhibitor（GIBCO BRL社）含有50mM EDTA（DOJINDO社）を入れた直径10cmのdishに剥離した腸管の洗浄液（2mLのPBSで洗浄）を腸内容物とともに採取した。これをピペッティング後15mLチューブに移し、0.2mg/mL Soybean Trypsin inhibitor含有50mM EDTAで3mLにメスアップして4℃にて2,500回転、10分間遠心分離した。その上清2mLを新しい15mLチューブに移し、100mM PMSFを1/100量添加して混合後、4℃にて14,190回転、20分間遠心分離した。分離した上清1mLを1.5mLチューブに入れ、10μLのProtease inhibitor Cocktail set III、10μLの1％ NaN3（片山化学工業社）を添加し、混合後15分間静置した。これに50μLの牛胎児血清（ハイクローン社）を添加、混合して腸管洗浄液として測定まで-80℃にて保存した。
【実施例２】
【００４９】
血中抗体価測定
（１）標準血清の調製
上記各グループ間の抗卵白アルブミン抗体上昇を比較するために、抗卵白アルブミン抗体の標準血清を以下に示す方法で調製した。5匹のマウス（C57BL/6、雄）に卵白アルブミン（100μg/head）を3日間連続経鼻投与し、これを1クールとして1週間隔で4クール投与した。最終クールの投与から1週後に1回経鼻投与して追加免疫し、その5日後に採血して得られた血清をプールし、標準血清とした。【００５０】
（２）抗卵白アルブミンIgG抗体の測定
免疫に使用した卵白アルブミンを0.1M Carbonate buffer, pH9.6で10μg/mLに希釈し、96-well plate（Nunc社、Maxisorp）に100μL/well加え、4℃で一夜静置して固相化した。翌日、各wellを350μLのPBSで5回洗浄し、PBSで4倍希釈したBlock Ace（大日本住友製薬社、以降、BAと略す）を350μL/wellずつ添加して、室温で2時間静置した。【００５１】
2時間後、4倍希釈BAを十分に除き、0.05%Tween20含有PBS（PBST）で10倍希釈したBA（検体希釈液）で検体を希釈して100μL/wellにて添加した（各検体ともduplicate）。37℃、2時間の反応の後、添加した各希釈血清を捨て、350μL/wellのPBSTで5回洗浄した。洗浄後、well内の洗浄液を十分に除き、検体希釈液を用いて2000倍希釈したHRP標識抗マウスIgGヤギ抗体（American Qualax社、A131PS）を100μL/wellにて添加し、37℃、1時間反応した。反応後、標識抗体希釈液を捨て、350μL/wellのPBSTで4回、同量の蒸留水で2回洗浄し、発色基質液TMB+（Dako社）を100μL/well添加して遮光下、室温で30分間反応した。その後、1N硫酸を100μL/well添加して発色を停止し、450nmの吸光度（OD450値）を測定した。【００５２】
（３）標準血清の抗体価算出
28匹の未免疫マウス（C57BL/6）血清を検体希釈液にて50倍希釈し、各希釈検体をduplicateにてそれらのOD450値を測定した。測定したOD450値の平均値にその標準偏差値の2倍を加えた値をカットオフ値と設定した。次に、標準血清を200倍から204,800倍まで2倍段階希釈してそのOD450値を測定し、カットオフ値を超える最大希釈倍率を標準血清の抗体価とした。なお、本試験系では102,400倍希釈までカットオフ値を超えたことから、標準血清の抗体価は102,400単位とした。【００５３】
（４）抗卵白アルブミン抗体価
実施例１に示す方法で卵白アルブミンを免疫した各群のマウス血清の抗体価は以下のようにして算出した。まず、標準血清を検体希釈液にて0.5、1、2、4、8、16、32単位となるように希釈し、抗体価測定時のスタンダードを調製した。次に各免疫群のマウス血清を調製したスタンダードの範囲に入るように検体希釈液にて希釈した。以上のように調製した被検試料を（２）に示す系にて測定し、得られたスタンダードの単位とOD450値の標準直線より各被検マウス血清の抗卵白アルブミン抗体価を算出した。【００５４】
算出した各免疫群の平均抗体価の経時的な変化を図１に示した。図１に示すように、卵白アルブミン単独免疫群（グループ1）に比較して、抗卵白アルブミン抗体はトロンビンの投与量に応じて、早期に出現し、かつ高い抗体価となることが確認できた。特に1匹当たり1回の免疫に20μgと40μgのトロンビンを同時投与した群（グループ3及び4）では、抗体の出現時期及び抗体価はほぼ同じであったことから、同時投与するトロンビン量は20μgで十分であると考えられた。
【実施例３】
【００５５】
鼻腔洗浄液中のIgA抗体価測定
（１）特異的IgA抗体の測定
免疫に使用した卵白アルブミンを0.1M Carbonate buffer, pH9.6で10μg/mLに希釈し、96-well plate（Nunc社、Maxisorp）に100μL/well加え、4℃で一夜静置して固相化した。翌日、各wellを350μLのPBSで5回洗浄し、PBSで4倍希釈したBAを350μL/wellずつ添加して、室温で1時間静置した。【００５６】
1時間後、4倍希釈BAを十分に除き、0.05%Tween20含有PBS（PBST）で10倍希釈したBA（検体希釈液）で各個体の鼻腔洗浄液を5倍希釈して100μL/wellにて添加した（各検体ともduplicate）。37℃、1時間の反応後、添加した各希釈鼻腔洗浄液を捨て、350μL/wellのPBSTで5回洗浄した。洗浄後、well内の洗浄液を十分に除き、検体希釈液を用いて5,000倍希釈したHRP標識抗マウスIgAヤギ抗体（フナコシ社、A90-103P）を100μL/wellにて添加し、37℃、1時間反応した。反応後、標識抗体希釈液を捨て、350μL/wellのPBSTで4回、同量の蒸留水で2回洗浄し、発色基質液TMB+（Dako社）を100μL/well添加して遮光下、室温で5分間反応した。その後、1N硫酸を100μL/well添加して発色を停止し、450nmの吸光度（OD450値）を測定した。【００５７】
（２）全IgA抗体の測定
鼻腔洗浄液中の全IgA抗体は、フナコシ社のMOUSE IgA ELISA QUANTITATION KIT（E90-103）を使用し、添付のプロトコールに従って測定した。測定時、鼻腔洗浄液は20倍希釈した。【００５８】
（３）鼻腔洗浄液中の抗卵白アルブミンIgA抗体価の算出
洗浄液の採取時のバラツキを標準化して卵白アルブミン特異的IgA抗体価を比較するために、（１）で得られた各検体のOD450値と（２）で得られた測定値（mg/mLに換算）から全IgA抗体に対する抗卵白アルブミンIgA抗体価を次式（I）により算出した。
（I）  抗卵白アルブミン抗体価＝（特異的IgA抗体OD450値×5）÷全IgA抗体測定値（mg/ｍL）【００５９】
算出した各グループの抗卵白アルブミンIgA抗体価とその標準誤差を図２に示した。卵白アルブミン単独免疫群（グループ1）に比較して、グループ2（トロンビン5μgの同時免疫群）では顕著ではないが、グループ2及び3（それぞれトロンビン20及び40μgの同時免疫群）では特異的なIgA抗体価が上昇していることが確認できた。
【実施例４】
【００６０】
腸管洗浄液のIgA抗体価測定
（１）特異的IgA抗体の測定
実施例３に示した鼻腔洗浄液中の特異的IgA抗体の測定法と同様に行った。ただし、測定時、腸管洗浄液は検体希釈液にて20倍希釈した。【００６１】
（２）全IgA抗体の測定
実施例３と同様に、フナコシ社のMOUSE IgA ELISA QUANTITATION KIT（E90-103）を使用した。ただし、測定時、腸管洗浄液は2,000倍希釈した。【００６２】
（３）腸管洗浄液中の抗卵白アルブミンIgA抗体価の算出
鼻腔洗浄液同様、洗浄液の採取時のバラツキを標準化して卵白アルブミン特異的IgA抗体価を比較するために、（１）にて得られた各検体のOD450値と（２）で得られた測定値（mg/mLに換算）から全IgA抗体に対する抗卵白アルブミンIgA抗体価を次式（II）により算出した。
（II）  抗卵白アルブミン抗体価＝（特異的IgA抗体OD450値×20）÷全IgA抗体測定値（mg/mL）【００６３】
算出した各グループの抗卵白アルブミンIgA抗体価とその標準誤差を図３に示した。鼻腔洗浄液同様、卵白アルブミン免疫群（グループ1）に比較して、同時投与したトロンビンの量に応じて特異的なIgA抗体価が上昇（グループ1に対してグループ2及び3）した。なお、トロンビンの20及び40μgでは特異的IgA抗体価の上昇は同程度であった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明に従って、トロンビンを主として経粘膜的にワクチン抗原を投与するときのアジュバントとして利用することができる。
【図１】
2008044465.tif 000003
【図２】
2008044465.tif 000004
【図３】
2008044465.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月5日(2008.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
（削除）
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
（削除）
【請求項１３】
（削除）
【請求項１４】
（削除）
【請求項１５】
（削除）
【請求項１６】
トロンビンを有効成分として含有するアジュバント。
【請求項１７】
ＩｇＧ抗体及びＩｇＡ抗体を誘導することができる、請求項１６記載のアジュバント。
【請求項１８】
トロンビンが動物由来である、請求項１６または１７に記載のアジュバント。
【請求項１９】
動物が霊長類である、請求項１８記載のアジュバント。
【請求項２０】
霊長類がヒトである、請求項１９記載のアジュバント。
【請求項２１】
トロンビンが遺伝子組み換え技術により得られた組換えトロンビンである、請求項１６又は１７記載のアジュバント。
【請求項２２】
トロンビンの遺伝子が動物由来である、請求項２１記載のアジュバント。
【請求項２３】
動物が霊長類である、請求項２２記載のアジュバント。
【請求項２４】
霊長類がヒトである、請求項２３記載のアジュバント。
【請求項２５】
局所免疫を誘導することができる、請求項１６ないし２４の何れか一項記載のアジュバント。
【請求項２６】
局所免疫が経皮又は経粘膜によるものである、請求項２５記載のアジュバント。
【請求項２７】
経粘膜が鼻腔、口腔、腸管、尿生殖管又は眼球周囲の何れかの粘膜である、請求項２６記載のアジュバント。
【請求項２８】
ワクチン抗原及び請求項１６ないし２７の何れか一項記載のアジュバントを含有してなるワクチン。
【国際調査報告】
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