(57)【要約】  本発明の主な目的は、新規有用な薬理作用を有する抗ウイルス剤を提供することにある。  本発明者らは、カチオン性リポソームやアテロコラーゲンのような、薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、二本鎖を形成しうるポリＩ及びポリＣといった２つの合成ＲＮＡを包含する複合体が、上記目的を解決することを見出し、本発明を完成した。【選択図】なし
2008114787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体、又は薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体に、ポリＡ若しくはポリＡアナログ及びポリＵ若しくはポリＵアナログを包含する複合体を含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項２】
薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体が、カチオン性リポソーム、アテロコラーゼン、及びナノ粒子からなる群から選択されるものである、請求項１記載の抗ウイルス剤。
【請求項３】
カチオン性リポソームが、次の一般式[Ｉ]で表される化合物及びリン脂質を必須構成成分として形成されるものである、請求項２記載の抗ウイルス剤。
【化４】
2008114787.tif 000006
式中、Ｒ１、Ｒ２は、異なって、ＯＹ、又は、−Ａ−(ＣＨ２)ｎ−Ｅを表す。ｎは０〜４の整数を表す。Ｅは、ピロリジノ、ピペリジノ、置換若しくは無置換のピペラジノ、モルホリノ、置換若しくは無置換のグアニジノ、又は
【化５】
2008114787.tif 000007
（Ｒ3、Ｒ4は、同一又は異なって、水素、炭素数１〜４の低級アルキル、炭素数１〜４のヒドロキシ低級アルキル、又はモノ若しくはジ低級アルキルアミノアルキル（炭素数２〜８）を表す。）を表す。
Ａは、下記の（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）又は（７）を表す。
【化６】
2008114787.tif 000008
Ｒ、Ｙは、同一又は異なって、炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。
【請求項４】
一般式[Ｉ]で表される化合物が、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル-１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、３−Ｏ−（４−ジメチルアミノブタノイル）-１，２−Ｏ−ジオレイルグリセロール、３−Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）カルバモイル-１，２−Ｏ−ジオレイルグリセロール、又は３−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル-１，２−Ｏ−ジオレイルグリセロールである、請求項３記載の抗ウイルス剤。
【請求項５】
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル-１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成されるカチオン性リポソームに、ポリＩ若しくはポリＩアナログ及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体、又は２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル-１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成されるカチオン性リポソームに、ポリＡ若しくはポリＡアナログ及びポリＵ若しくはポリＵアナログを包含する複合体を含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項６】
ポリＩ、ポリＩアナログ、ポリＣ、ポリＣアナログ、ポリＡ、ポリＡアナログ、ポリＵ、ポリＵアナログの各鎖長が、各々独立して１００〜６００塩基数の範囲内である、請求項１又は５に記載の抗ウイルス剤。
【請求項７】
２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル-１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成されるカチオン性リポソームに、鎖長が１００〜６００塩基数の範囲内にあるポリＩ及び鎖長が１００〜６００塩基数の範囲内にあるポリＣを包含する複合体を含有することを特徴とする抗ウイルス剤。
【請求項８】
リン脂質がレシチンである、請求項３、５、又は７のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【請求項９】
ウイルスが、肝炎ウイルスである、請求項１〜８のいずれかに記載の抗ウイルス剤。
【請求項１０】
肝炎ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスである、請求項９記載の抗ウイルス剤
【請求項１１】
Ｃ型肝炎ウイルスのジェノタイプが、１ａ型又は１ｂ型である、請求項１０記載の抗ウイルス剤。
【請求項１２】
肝炎ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルスである、請求項９記載の抗ウイルス剤。
【請求項１３】
Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプが、Ｃ型である、請求項１２記載の抗ウイルス剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス剤に関するものである。【０００２】
ここで「Ｉ」とはイノシン酸を、「Ｃ」とはシチジル酸を、「Ａ」とはアデニル酸を、「Ｕ」とはウリジル酸を、それぞれ意味する。また、ポリＩアナログ、ポリＣアナログ、ポリＡアナログ、ポリＵアナログとは、当業者には周知であるが、各々、効果の増強や安定性の向上などを目的として、核酸を構成する、糖、核酸塩基又はリン酸バックボーンの全部又は一部を改変したものをいう。
【背景技術】
【０００３】
ポリＩ・ポリＣやポリＡ・ポリＵに代表される合成ＲＮＡは、生体内に投与すると、Ｉ型インターフェロン（以下「Ｉ型ＩＦＮ」という。）を誘導し、かかるＩ型ＩＦＮによりウイルスの増殖を抑制することが知られている。しかし、一般に合成ＲＮＡによるウイルス増殖抑制作用は十分でないことから、合成ＲＮＡを抗ウイルス剤として開発することは困難であると考えられる。また、合成ＲＮＡは毒性も懸念される。【０００４】
ところで、合成ＲＮＡ単独ではなく、合成ＲＮＡといわゆるカチオン性リポソームとで複合体を形成し、この複合体により肝炎を治療することが提案されている（例えば、特許文献１参照。）。かかる複合体は、マウスの肝臓に特異的に集積して、そこでＩ型ＩＦＮを誘導し、血中ＩＦＮは、長時間に渡って臨床上の有効性が十分に期待されるレベルとなることから、ウイルス性肝炎の治療効果が期待された。しかし、当該公報には、当該複合体のＩ型ＩＦＮ誘導を介した作用しか開示されていない。当時は、ウイルス性肝炎モデルの利用に限界があり、かかる複合体の抗肝炎ウイルス活性については未確認であった。例えば、肝炎ウイルスのひとつであるＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」という。）は、ヒトとチンパンジーの肝細胞にしか感染しない性質を持つため、かかる複合体がどの程度の抗ＨＣＶ活性を有しているのかを、ＨＣＶに感染した動物モデルで証明することは事実上不可能であった。しかし近年、ドイツとカナダのグループにより、ヒト正常肝細胞を肝臓に持つキメラマウスが開発された。このヒト肝臓キメラマウスはＨＣＶに感染する特性を有し、抗ＨＣＶ薬を開発するための現実的な動物評価系としての利用が可能となった。また、かかるキメラマウスは、Ｂ型肝炎ウイルス（以下「ＨＢＶ」という。）にも感染し得るため、抗ＨＢＶ薬の開発のための動物評価系としても利用することが可能である。
【特許文献１】国際公開第９９／４８５３１号パンフレット
【発明の開示】
【０００５】
本発明者らは、上記ＨＣＶ感染ヒト肝臓キメラマウスを用いて、かかる複合体と現在抗ＨＣＶ薬として最も多く使われているポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化インターフェロン（以下「ＰＥＧ化ＩＦＮ」という。）との抗ＨＣＶ活性を比較した。その結果、かかる複合体はＰＥＧ化ＩＦＮよりも強い抗ＨＣＶ活性を有していた。また、かかる複合体を投与しても、マウス肝臓と異なりヒト肝細胞ではＩＦＮ−βは殆ど誘導されなかった。このことは、かかる複合体が、Ｉ型ＩＦＮの誘導とは関係しない新たな抗ウイルスメカニズムを誘導していることを示すものである。
【０００６】
さらに、本発明者らは、上記ＨＢＶ感染ヒト肝臓キメラマウスを用いて、かかる複合体の抗ＨＢＶ活性を、現在抗ＨＢＶ薬として最も治療効果が高いとされているヌクレオシド系逆転写阻害剤エンテカビル（以下「ＥＴＶ」）またはＰＥＧ化ＩＦＮの抗ＨＢＶ活性と比較し、かかる複合体が、ＥＴＶおよびＰＥＧ化ＩＦＮよりも強い抗ＨＢＶ活性を有しているとの知見も得た。
【０００７】
本発明の主な目的は、新規有用な薬理作用を有する抗ウイルス剤を提供することにある。
【０００８】
本発明者らは、例えば、カチオン性リポソームやアテロコラーゲンのような、薬物を細胞内に移送するのに有用な薬物担体（以下、単に「薬物担体」という。）に、二本鎖を形成しうるポリＩ及びポリＣといった２つの合成ＲＮＡを包含する複合体が、上記目的を解決することを見出し、本発明を完成した。
【０００９】
本発明として、例えば、薬物担体に、ポリＩ若しくはポリＩアナログ及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体、又は薬物担体に、ポリＡ若しくはポリＡアナログ及びポリＵ若しくはポリＵアナログを包含する複合体（以下、これらをまとめて「本複合体」という。）を含有することを特徴とする抗ウイルス剤（以下「本発明抗ウイルス剤」という。）を挙げることができる。
【００１０】
以下、本発明を詳述する。
【００１１】
本発明に係る「薬物担体」としては、医薬上許容され、合成ＲＮＡを包含することができ、包含された合成ＲＮＡを細胞内に移送することができるものであれば、特に限定されない。かかる薬物担体として、例えば、カチオン性リポソーム、アテロコラーゲン、ナノ粒子を挙げることができる。
【００１２】
具体的には、当該カチオン性リポソームとして、例えば、オリゴフェクトアミン（登録商標）、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクトアミン（登録商標）、リポフェクトアミン２０００（登録商標）、リポフェクトエース（登録商標）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（登録商標）、ＧｅｎｅＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）、ＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）、ＴｒａｎｓＩＴ  ＴＫＯ（登録商標）や、国際公開第９４／１９３１４号公報パンフレットに開示されている薬物担体、即ち、次の一般式[Ｉ]で表される化合物［例えば、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル-１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール（以下「化合物Ｘ」という。）、３−Ｏ−（４−ジメチルアミノブタノイル）-１，２−Ｏ−ジオレイルグリセロール、３−Ｏ−（２−ジメチルアミノエチル）カルバモイル-１，２−Ｏ−ジオレイルグリセロール、３−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル-１，２−Ｏ−ジオレイルグリセロール］及びリン脂質を必須構成成分として形成される薬物担体（以下「本グリセロール担体」という。）を挙げることができる。
【００１３】
【化１】
2008114787.tif 000003
【００１４】
［式中、Ｒ１、Ｒ２は、異なって、ＯＹ、又は、−Ａ−(ＣＨ２)ｎ−Ｅを表す。ｎは０〜４の整数を表す。Ｅは、ピロリジノ、ピペリジノ、置換若しくは無置換のピペラジノ、モルホリノ、置換若しくは無置換のグアニジノ、又は
【００１５】
【化２】
2008114787.tif 000004
【００１６】
（Ｒ3、Ｒ4は、同一又は異なって、水素、炭素数１〜４の低級アルキル、炭素数１〜４のヒドロキシ低級アルキル、又はモノ若しくはジ低級アルキルアミノアルキル（炭素数２〜８）を表す。）を表す。
Ａは、下記の（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）又は（７）を表す。
【００１７】
【化３】
2008114787.tif 000005
【００１８】
Ｒ、Ｙは、同一又は異なって、炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。］
本発明において好ましいカチオン性リポソームとしては、化合物Ｘ及びリン脂質を必須構成成分として形成される薬物担体（以下「本グリセロール担体Ｘ」という。）を挙げることができる。
【００１９】
ポリＩアナログ、ポリＣアナログ、ポリＡアナログ、ポリＵアナログは、もとの核酸（例えばポリＩアナログならポリＩ）の機能を損なわなければ特に限定されないが、具体例としては、ポリ（７−デアザイノシン酸）、ポリ（２’−アジドイノシン酸）、ポリ（シチジン−５’−チオリン酸）、ポリ（１−ビニルシチジル酸）、ポリ（シチジル酸、ウリジル酸）コポリマー、ポリ（シチジル酸、４−チオウリジル酸）コポリマー、ポリ（アデニル酸、ウリジル酸）コポリマーを挙げることができる。
【００２０】
ポリＩ、ポリＩアナログ、ポリＣ、ポリＣアナログ、ポリＡ、ポリＡアナログ、ポリＵ、及びポリＵアナログの各鎖長は、特に限定されないが、各々独立して、５０〜２，０００塩基数の範囲内にあるものが適当であり、１００〜６００塩基数の範囲内にあるものが好ましく、２００〜５００塩基数の範囲内にあるものがより好ましい。５０塩基数未満でも、また２，０００塩基数より長くても本発明の効果を奏しうるが、５０塩基数未満では有効性に問題が生じるおそれがあり、２，０００塩基数より長いと毒性が生じるおそれがある。
【００２１】
なお、ポリＩやポリＣ等の合成ＲＮＡは、通常様々な鎖長からなる一定の分布をもって存在するので、前記各鎖長は最大分布の塩基数を意味する。
【００２２】
本グリセロール担体中のリン脂質としては、医薬上許容されるリン脂質であれば特に限定されないが、具体例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も挙げることができる。好ましいリン脂質としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、卵黄ホスファチドを挙げることができる。これらの１種又は２種以上のリン脂質を用いることができる。なお、本グリセロール担体Ｘについても上記と同様のリン脂質を挙げることができる。本グリセロール担体Ｘにおける好ましいリン脂質についても同様に、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、卵黄ホスファチドを挙げることができる。同様にこれらの１種又は２種以上のリン脂質を用いることができる。
【００２３】
好ましい本発明としては、従って、リン脂質がレシチンである本グリセロール担体Ｘに、各合成ＲＮＡの鎖長が１００〜６００塩基数の範囲内にある、ポリＩ若しくはポリＩアナログ及びポリＣ若しくはポリＣアナログを包含する複合体、又はリン脂質がレシチンである本グリセロール担体Ｘに、各合成ＲＮＡの鎖長が１００〜６００塩基数の範囲内にある、ポリＡ若しくはポリＡアナログ及びポリＵ若しくはポリＵアナログを包含する複合体を含有することを特徴とする本発明抗ウイルス剤を挙げることができる。特に好ましい本発明としては、リン脂質がレシチンである本グリセロール担体Ｘに、各合成ＲＮＡの鎖長が２００〜５００塩基数の範囲内にある、ポリＩ及びポリＣを包含する複合体を含有することを特徴とする本発明抗ウイルス剤を挙げることができる。
【００２４】
本複合体中における薬物担体とポリＩ、ポリＣ等の合成ＲＮＡとの構成比率は、用いる薬物担体や合成ＲＮＡの種類や鎖長、ウイルスの種類や増殖程度等によって異なるが、薬物担体１０重量部に対して、合成ＲＮＡ０．０５〜１０重量部が適当であり、０．１〜４重量部が好ましく、０．３〜２重量部がより好ましい。
【００２５】
本グリセロール担体Ｘ中における化合物Ｘとリン脂質との構成比率は、合成ＲＮＡの種類や鎖長、使用量、またリン脂質の種類等によって異なるが、化合物Ｘ１重量部に対して、リン脂質０．１〜１０重量部が適当であり、０．５〜５重量部が好ましく、１〜２重量部がより好ましい。
【００２６】
本発明抗ウイルス剤は、例えば、液剤（注射剤、点滴剤等）やその凍結乾燥製剤の形態をとることができる。
【００２７】
本発明抗ウイルス剤は、医薬上許容される任意の添加剤、例えば、乳化補助剤、安定化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤を適当量含有していてもよい。具体的には、炭素数６〜２２の脂肪酸（例、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸）やその医薬上許容される塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩）、アルブミン、デキストラン等の乳化補助剤、コレステロール、ホスファチジン酸等の安定化剤、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等の等張化剤、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン等のｐＨ調整剤などを挙げることができる。
【００２８】
本発明抗ウイルス剤は、薬物担体ないしその原料化合物と合成ＲＮＡとを、常法により混合、攪拌、分散等を行うことにより製造することができる。薬物担体がカチオン性リポソームである本発明抗ウイルス剤の場合には、例えば、リポソームの一般的な製法と同様な方法により製造することができる。具体的には、カチオン性リポソーム又はその原料化合物（例えば、化合物Ｘとリン脂質）と、例えば二本鎖ポリＩ・ポリＣないしは一本鎖ポリＩと一本鎖ポリＣとを水溶液中で適当な分散機により分散処理することにより製造することができる。水溶液としては、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液等を挙げることができる。適当な分散機としては、例えば、ホモミキサー、ホモジナイザー、超音波分散器、超音波ホモジナイザー、高圧乳化分散機、マイクロフルイダイザー（商品名）、ナノマイザー（商品名）、アルティマイザー（商品名）、デビー（商品名）、マントン−ガウリン型高圧ホモジナイザーを挙げることができる。また、当該分散処理は、粗分散を経るなど数段階に分けて製造することもできる。
【００２９】
薬物担体は、市販のものをその指示に従って用いることができ、また適当に加工して用いることもできる。
【００３０】
カチオン性リポソームの原料化合物から本発明抗ウイルス剤を製造する場合には、当該原料化合物に、例えば二本鎖ポリＩ・ポリＣないしは一本鎖ポリＩと一本鎖ポリＣとを加え、一緒に分散処理することができる他、当該原料化合物をまず分散処理してカチオン性リポソームを形成し、続いて例えば二本鎖ポリＩ・ポリＣないしは一本鎖ポリＩと一本鎖ポリＣとを加え再度分散処理して本発明抗ウイルス剤を製造することもできる。
【００３１】
医薬上許容される任意の添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。
【００３２】
本発明抗ウイルス剤の凍結乾燥製剤は、常法により製造することができる。例えば、液状の本発明抗ウイルス剤を滅菌し、所定量をバイアル瓶に分注する。次いで、約−４０℃〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０℃〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、更に約１５℃〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥する。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明抗ウイルス剤の凍結乾燥製剤を得ることができる。
【００３３】
本発明抗ウイルス剤の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。
本発明抗ウイルス剤は、例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型等の肝炎ウイルスや、ＲＳウイルスなどへの使用が考えられる。本発明抗ウイルス剤は、後述する試験例から明らかな通り、ＰＥＧ化ＩＦＮよりも強く、ジェノタイプ２型（2a,  2b）のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のみならず、ジェノタイプ１型（1a,  1b）にも有効である。本発明抗ウイルス剤は、ＩＦＮでは治療効果が乏しい肝炎ウイルス（ＩＦＮ耐性肝炎ウイルス）を含めて多種のジェノタイプＨＣＶに対しても有用である。これらのことから、本発明抗ウイルス剤によれば、ＨＣＶｓｉＲＮＡにおけるいわゆるカクテル療法のような手法は不要であることが期待される。
本発明抗ウイルス剤は、ヒトを含む動物に対して有効である。
【００３４】
本発明抗ウイルス剤の投与方法としては、例えば、静脈内投与、皮下投与、肝動脈内投与、局所投与（例、経粘膜投与、経鼻投与、吸入投与）を挙げることができる。
【００３５】
本発明抗ウイルス剤の投与量は、用いる薬物担体や合成ＲＮＡの種類や組成、鎖長、ウイルスの種類や進行状況、患者の年齢、動物種差、投与経路、投与方法等によって異なるが、ポリＩ、ポリＣ等の合成ＲＮＡの投与量として、１回当たり通常１μｇ〜５０ｍｇ／ヒトが適当であり、１０μｇ〜１０ｍｇ／ヒトが好ましい。本発明抗ウイルス剤は、１日１〜３回を、連日、隔日、１週毎、２週毎等に１ショット投与や点滴投与等することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、血清中のＨＣＶ（1a型）ゲノム数を表す。横軸の数値はマウス個体Ｎｏを表し、縦軸はゲノム数（コピー数／ｍＬ）を表す。
【図２】図２は、血清中のＨＣＶ（1a型）ゲノム数を表す。横軸の数値はマウス個体Ｎｏを表し、縦軸はゲノム数（コピー数／ｍＬ）を表す。
【図３】図３は、血清中のＨＣＶ（1b型）ゲノム数を表す。横軸の数値はマウス個体Ｎｏを表し、縦軸はゲノム数（コピー数／ｍＬ）を表す。
【図４】図４は、血清中のＨＣＶ（1b型）ゲノム数を表す。横軸の数値はマウス個体Ｎｏを表し、縦軸はゲノム数（コピー数／ｍＬ）を表す。
【図５】図５は、ヒト肝キメラマウス肝臓中のＩＦＮｍＲＮＡ量を表す。横軸の数値はマウス個体Ｎｏを表し、縦軸はヒト又はマウスのＩＦＮ−β量（コピー数／全ＲＮＡのμｇ）を表す。
【図６】図６は、血清中のＩＦＮ−β量を表す。横軸の数値はマウス個体Ｎｏを表し、縦軸は血中濃度（ｐｇ／ｍＬ）を表す。
【図７】図７は、血清中のＨＢＶゲノム数の変化を表す。横軸は投与開始後の日数を表す。縦軸は投与開始１日前（ｄａｙ−１）の血清中ＨＢＶゲノム数を１００％とした時のＨＢＶゲノム数（％）を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、製造例及び試験例を掲げて、本発明を更に詳しく説明する。
【実施例】
【００３８】
製造例１
化合物Ｘ１２４ｇ、精製卵黄レシチン２００ｇ、及びマルトース２ｋｇを容器にとり、これに注射用水１０．２Ｌを加え攪拌混合し、ホモジナイザーで粗乳化した後、高圧乳化分散機（マイクロフルイダイザー（登録商標））で微細乳化した。これに約３００塩基数のポリＩと約３００塩基数のポリＣとを溶解した注射用水（全量８Ｌ）を徐々に添加し、再度前記高圧乳化分散機で分散し、この分散液を０．２μｍのメンブランフィルターでろ過滅菌して本発明抗ウイルス剤を得た。次いで、かかる本発明抗ウイルス剤をバイアル瓶に５ｍＬずつ充填した後、常法に従って凍結乾燥し、凍結乾燥した本発明抗ウイルス剤を得た。
試験例１  ＨＣＶ感染ヒト肝キメラマウスにおけるウイルス増殖抑制作用
（１）方法
ＨＣＶモデルとして、常法によりジェノタイプ１ａ型ＨＣＶを感染させたヒト肝キメラマウス（フェニックスバイオ社製、以下同じ。）を用いた（Takuya  Umehara,  Masayuki  Sudoh,  Fumihiko  Yasui,  Chiho  Matsuda,  Yukiko  Hayashi,  and  Michinori  Kohara.  Serine  palmitoyltransferase  inhibitor  suppresses  HCV  replication  in  a  mouse  model.  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  346,  67-73  (2006)）。試験液（投与液）としては、製造例１に係る凍結乾燥した本発明抗ウイルス剤に４．６ｍＬの注射用水を加え再構築し、これに５％ブドウ糖液を加えて適宜希釈したものを用いた。【００３９】
ポリＩ・ポリＣとしての投与量が１０μｇ／ｋｇ、３０μｇ／ｋｇ、又は１００μｇ／ｋｇとなるよう試験液を上記キメラマウスの尾静脈から投与した。投与は、投与開始日（day  0）から投与開始後７日目(day  7)まで１日１回の頻度で、８日間連続投与した。対照薬として３０μｇ／ｋｇのＰＥＧ化ＩＦＮ（ペガシス（登録商標）、中外製薬社製、以下同じ。）を投与開始日(day  0)、投与開始後３日目(day  3)、７日目(day  7)、１０日目(day  10)に間欠皮下投与した。なお、ＰＥＧ化ＩＦＮのヒト臨床投与量は週１回３μｇ／ｋｇである。【００４０】
本発明抗ウイルス剤のウイルス増殖抑制活性の評価は、常法により得た血清から全ＲＮＡをアシッド・グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法（acid  guanidinium-phenol-chloroform  method）により抽出し、血清中のＨＣＶゲノムコピー数をリアルタイムＰＣＲ法により測定することによって行った。【００４１】
採血は、本発明抗ウイルス剤投与群については、投与開始３日前（day  -3）、投与開始後１日目（day  1）、４日目（day  4）、８日目（day  8）に行った。ＰＥＧ化ＩＦＮ投与群とコントロール群については、投与開始１日前（day  -1）、投与開始後１日目（day  1）、８日目（day  8）、１４日目（day  14）に行った。
（２）結果
結果を図１及び図２に示す。【００４２】
当該図中、個体Ｎｏ．１−５はＰＥＧ化ＩＦＮ投与群の結果を、個体Ｎｏ．６−１０はコントロール(０．９％食塩水)群の結果を、個体Ｎｏ．１１−１５は１０μｇ／ｋｇの本発明抗ウイルス剤投与群の結果を、個体Ｎｏ．１６−１９は３０μｇ／ｋｇの本発明抗ウイルス剤投与群の結果を、個体Ｎｏ．２０−２３は１００μｇ／ｋｇの本発明抗ウイルス剤投与群の結果を、それぞれ表す。【００４３】
図１及び図２から明らかなように、本発明抗ウイルス剤は、血清中ＨＣＶゲノム数を用量依存的に強く抑制した。ＰＥＧ化ＩＦＮ投与群では、ＨＣＶ量は投与前の１／１０〜１／１００にまで抑制したのに対し、本発明抗ウイルス剤投与群では１０μｇ／ｋｇで１／１０〜１／１００にまで、３０μｇ／ｋｇで１／２０〜１／２００にまで、１００μｇ／ｋｇで１／１００〜１／１，０００にまで、それぞれ抑制した。【００４４】
なお、本実験では、個体Ｎｏ．２のＰＥＧ化ＩＦＮ投与群、個体Ｎｏ．１１の１０μｇ／ｋｇ投与の本発明抗ウイルス剤投与群、及び個体Ｎｏ．２１の１００μｇ／ｋｇ投与の本発明抗ウイルス剤投与群のように、反応しない個体も見られた。
試験例２  ＨＣＶ感染ヒト肝キメラマウスにおけるウイルス増殖抑制作用
（１）方法
ＨＣＶモデルとして、常法によりジェノタイプ１ｂ型ＨＣＶを感染させたヒト肝キメラマウスを用いた(Takuya  Umehara,  Masayuki  Sudoh,  Fumihiko  Yasui,  Chiho  Matsuda,  Yukiko  Hayashi,  and  Michinori  Kohara.  Serine  palmitoyltransferase  inhibitor  suppresses  HCV  replication  in  a  mouse  model.  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  346,  67-73  (2006))。試験液（投与液）としては、製造例１に係る凍結乾燥した本発明抗ウイルス剤に４．６ｍＬの注射用水を加え再構築し、これに５％ブドウ糖液を加えて適宜希釈したものを用いた。【００４５】
ポリＩ・ポリＣとしての投与量が１００μｇ／ｋｇとなるよう試験液を上記キメラマウスの尾静脈から投与した。投与は、投与開始日(day  0)から投与開始後７日目(day  7)まで連続８日間、１日１回又は１日３回の頻度で行った。対照薬として３０μｇ／ｋｇＰＥＧ化ＩＦＮを投与開始日(day  0)、投与開始後３日目(day  3)、７日目(day  7)、１０日目(day  10)に間欠皮下投与した。なおＰＥＧ化ＩＦＮのヒト臨床投与量は３μｇ／ｋｇを週１回である。【００４６】
本発明抗ウイルス剤のウイルス増殖抑制活性の評価は、常法により得た血清から全ＲＮＡをアシッド・グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法（acid  guanidinium-phenol-chloroform  method）により抽出し、血清中のＨＣＶゲノムコピー数をリアルタイムＰＣＲ法により測定することによって行った。【００４７】
採血は、本発明抗ウイルス剤投与群については、投与開始２日前（day  -2）、投与開始後１日目（day  1）、４日目（day  4）、８日目（day  8）に行った。ＰＥＧ化ＩＦＮ投与群とコントロール群については、投与開始１日前（day  -1）、投与開始後１日目（day  1）、４日目（day  4）、８日目（day  8）、１１日目（day  11）、１４日目（day  14）に行った。
（２）結果
結果を図３及び図４に示す。【００４８】
当該図中、個体Ｎｏ．１−３はＰＥＧ化ＩＦＮ投与群の結果を、個体Ｎｏ．４−８は１００μｇ／ｋｇ（１日１回）の本発明抗ウイルス剤投与群の結果を、個体Ｎｏ．９−１３は１００μｇ／ｋｇ（１日３回）の本発明抗ウイルス剤投与群の結果を、それぞれ表す。【００４９】
図３及び図４から明らかなように、本発明抗ウイルス剤は１日１回、１日３回のいずれの投与群においても、血清中ＨＣＶゲノム数を非常に強く抑制した。その効果は、現在最も治療効果が高いとされているＨＣＶ抑制剤であるＰＥＧ化ＩＦＮよりも強かった。血清中ＨＣＶゲノム数は、ＰＥＧ化ＩＦＮ投与で１／１００程度にまでしか抑制されなかったのに対し、１００μｇ／ｋｇ／回の本発明抗ウイルス剤投与群では１／１，０００−１／１０，０００にまで抑制された。【００５０】
また、ＰＥＧ化ＩＦＮは、投与を停止すると血清中ＨＣＶゲノム数が速やかに増加したが、本発明抗ウイルス剤は、投与終了７日後も約半数の個体で、血清中ＨＣＶゲノム数の強力な抑制効果が持続した。
試験例３  本発明抗ウイルス剤による肝臓中のヒト及びマウスのＩＦＮｍＲＮＡ誘導作用
（１）方法
製造例１に係る凍結乾燥した本発明抗ウイルス剤に４．６ｍＬの注射用水を加え再構築し、これに５％ブドウ糖液を加えて５０倍に希釈したものを試験液（投与液、２０μｇ／ｍＬ）として用いた。かかる試験液の１回の投与量は、ヒト肝キメラマウスの体重２０ｇ当たり１００μＬ（ポリＩ・ポリＣとしての投与量は、１００μｇ／ｋｇ）であり、これを眼窩静脈叢より静脈内投与した。【００５１】
肝臓の採取と採血は、マウス２例（個体Ｎｏ．３，４）について１回投与して２時間後、マウス２例（個体Ｎｏ．５，６）について１日１回４日間投与して２４時間後、マウス３例（個体Ｎｏ．７−９）について１日１回５日間投与して２時間後に各々行った。別にマウス２例（個体Ｎｏ．１，２）について無処置のコントロールとして肝臓と血清とを採取した。肝臓の採取は、肝臓２葉から５ｍｍ幅で切り出すことによって行った。【００５２】
採取した肝臓から全ＲＮＡをアシッド・グアニジニウム−フェノール−クロロホルム法（acid  guanidinium-phenol-chloroform  method）により抽出し、逆転写反応に続くリアルタイムＰＣＲ法により肝臓中のヒト及びマウスのＩＦＮ  ｍＲＮＡのコピー数を測定した。また、常法により得た血清中のヒト及びマウスのＩＦＮ−β量をＥＬＩＳＡ法により定量した。
（２）結果
結果を図５及び図６に示す。【００５３】
図５及び図６から明らかな通り、ヒトＩＦＮ−βは、マウスＩＦＮ−βと比較して１／１００程度しか誘導されていない。このようにヒトＩＦＮ−βはあまり誘導されていないにも拘わらず、試験例１及び２が示す通り、本発明抗ウイルス剤はＨＣＶを肝細胞から排除することができる。
試験例４ ＨＢＶ感染ヒト肝キメラマウスにおけるウイルス増殖抑制作用
（１）方法
ＨＢＶモデルとして、常法によりＨＢＶを感染させたヒト肝キメラマウスを用いた（Masaya  Sugiyama,  Yasuhito  Tanaka,  Takanobu  Kato,  Etsuro  Orito,  Kiyoaki  Ito,  Subrat  K.  Acharya,  Robert  G.  Gish,  Anna  Kramvis,  Takashi  Shimada,  Namiki  Izumi,  Masahiko  Kaito,  Yuzo  Miyakawa,  and  Masashi  Mizokami.  Influence  of  Hepatitis  B  Virus  Genotypes  on  the  Intraand  Extracellular  Expression  of  Viral  DNA  and  Antigens.  HEPATOLOGY,  44(4),  915-924  (2006)）。【００５４】
試験液（投与液）としては、製造例１に係る凍結乾燥した本発明抗ウイルス剤に４．６ｍＬの注射用水を加え再構築し、これに５％ブドウ糖液を加えて２０μｇ／ｍＬに希釈したものを用いた。【００５５】
ポリＩ・ポリＣとしての投与量が１００μｇ／ｋｇとなるよう試験液を上記キメラマウスの眼窩静脈叢から投与した。投与は、投与開始日（ｄａｙ  ０）から投与開始後１３日目（ｄａｙ  １３）まで１日1回の頻度で１４日間連続して行った。対照薬として３０μｇ／ｋｇＰＥＧ化ＩＦＮを投与開始日（ｄａｙ  ０）、投与開始後３日目（ｄａｙ  ３）、７日目（ｄａｙ  ７）、１０日目（ｄａｙ  １０）に１日１回の頻度で間欠皮下投与した。さらに、別の対照薬として１７μｇ／ｋｇまたは１７０μｇ／ｋｇエンテカビル（ＥＴＶ）（バラクルード（登録商標）、ブリストルマイヤーズ社製、以下同じ。）を投与開始日（ｄａｙ  ０）から投与開始後１３日目（ｄａｙ  １３）まで１日1回の頻度で１４日間連続して経口投与した。【００５６】
採血は、投与開始１日前（ｄａｙ  −１）、投与開始後１日目（ｄａｙ  １）、３日目（ｄａｙ  ３）、７日目（ｄａｙ  ７）、１０日目（ｄａｙ  １０）、１４日目（ｄａｙ  １４）に眼窩静脈叢より行った。【００５７】
血清中ＨＢＶゲノム数の定量は、常法により得た血清１μＬからスマイテスト（登録商標）ＥＸ−Ｒ＆Ｄ（医学生物学研究所製）を用いてＤＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲ法により血清中のＨＢＶゲノム数を測定することにより行った。
（２）結果
結果を図７に示す。【００５８】
図７から明らかなように、血清中ＨＢＶゲノム数は、臨床用量の２０倍のＰＥＧ−ＩＦＮ（３０μｇ／ｋｇ、週２回）投与で、投与開始後１４日目（ｄａｙ  １４）において投与開始前の１／２３に抑制され、また、臨床用量（１７μｇ／ｋｇ、連日）又はその１０倍（１７０μｇ／ｋｇ、連日）のＥＴＶ投与で、投与開始後１４日目（ｄａｙ  １４）において投与開始前の１／２５又は１／３２０に抑制された。一方、本発明抗ウイルス剤（１００μｇ／ｋｇ、連日）は、投与開始後１４日目（ｄａｙ  １４）において血清中ＨＢＶゲノム数を投与開始前の１／２７０にまで抑制した。【００５９】
本発明抗ウイルス剤は、臨床用量の２０倍のＰＥＧ化ＩＦＮ及び臨床用量のＥＴＶよりも強力に血清中ＨＢＶゲノム数を抑制した。本発明抗ウイルス剤の抗ＨＢＶ活性は臨床用量の１０倍のＥＴＶに匹敵するものであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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