(57)【要約】  デルマタン硫酸又はその薬理学的に許容されうる塩、好ましくは重量平均分子量が１万〜５万であるデルマタン流酸又はその薬理学的に許容されうる塩を、ほ乳類タイプのヒアルロニダーゼ阻害剤の有効成分として利用することにより、新規なヒアルロニダーゼ阻害剤が得られる。このヒアルロニダーゼ阻害剤を用いることにより、医薬品や化粧品に用いられるヒアルロン酸がヒアルロニダーゼにより分解されて所望の効果が発揮されない問題を解決できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
デルマタン硫酸又はその薬理学的に許容されうる塩を有効成分として含むヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項２】
デルマタン硫酸の重量平均分子量が１万〜５万であることを特徴とする請求項１記載のヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項３】
ほ乳類タイプヒアルロニダーゼ（EC3.2.1.35）に対して阻害作用を示すことを特徴とする請求項１又は２記載のヒアルロニダーゼ阻害剤。
【請求項４】
デルマタン硫酸のヒアルロニダーゼ阻害剤としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬品及び化粧品への適用がなされているヒアルロン酸を分解する作用を有する特定のヒアルロニダーゼに対する阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は医薬品や化粧品として極めて有用であるが、容易に分解するため、ヒアルロニダーゼ阻害剤が求められていた。かかるヒアルロン酸とともに使用するヒアルロニダーゼ阻害剤としては、安定性などの理由からヒアルロン酸と同じ糖類を阻害剤として使用することが好ましいと考えられる。【０００３】
特許文献１には、貝類肉から抽出された酸性多糖類がヒアルロニダーゼ阻害剤として有用である旨が記載されているが、デルマタン硫酸は含まれていなかった旨が記載されている。【０００４】
特許文献２には、コンドロイチン硫酸のヒアルロニダーゼ阻害剤としての用途が開示されているが、特にコンドロイチン硫酸ＡとＣがかかる作用を有している旨を示唆する記載がある。一方、デルマタン硫酸がヒアルロニダーゼ阻害効果を示すことは開示されておらず、また示唆もされていない。【０００５】
特許文献３には、様々な硫酸化多糖が微生物由来のヒアルロニダーゼ阻害剤として使用できる旨が記載されているが、デルマタン硫酸単体でヒアルロニダーゼ阻害剤として使用できることは開示されておらず、また動物由来のヒアルロニダーゼ阻害剤としての使用は何ら開示も示唆もされていない。【０００６】
【特許文献１】特開平６−２１９９５４号公報
【特許文献２】特開平７−８２１３１号公報
【特許文献３】特開２０００−１７８１９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
かかる様々なヒアルロニダーゼ阻害剤が検討されているにもかかわらず、ヒアルロニダーゼ阻害剤として実用化されている多糖は、現在は存在していない。特にほ乳類由来のヒアルロニダーゼに対する阻害作用を示す阻害剤は存在せず、かかる新規な阻害剤が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の発明者らは、上記課題の解決のために鋭意検討を行った結果、意外なことにヒアルロン酸と同じグリコサミノグリカンの一種であるデルマタン硫酸に優れたヒアルロニダーゼ阻害効果があることを見いだし、本発明に想到した。本発明の要旨は下記の通りである。【０００９】
１．  デルマタン硫酸を有効成分として含むヒアルロニダーゼ阻害剤。
２．  デルマタン硫酸の重量平均分子量が１万〜５万であることを特徴とする１記載のヒアルロニダーゼ阻害剤。
３．  ほ乳類タイプヒアルロニダーゼ（EC3.2.1.35）に対して阻害作用を示すことを特徴とする１又は２記載のヒアルロニダーゼ阻害剤。
４．  デルマタン硫酸のヒアルロニダーゼ阻害剤としての使用。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、新規なヒアルロニダーゼ阻害剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】デルマタン硫酸の濃度によるヒアルロニダーゼ阻害作用への阻害作用を確認するためのキャピラリー電気泳動チャートを示す図である。横軸は検出時間を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、発明を実施するための最良の形態により、本発明を詳説する。【００１３】
１．本発明阻害剤
本発明阻害剤は、デルマタン硫酸を有効成分として含むことを特徴とする。【００１４】
本発明阻害剤に用いるデルマタン硫酸の由来は特に限定されず、鳥類や哺乳類等の肉冠（例えば鶏冠等）、皮膚、臍帯、内臓等の生物由来原料から分離、精製されたデルマタン硫酸を用いることができるが、ブタ皮又は鶏冠由来のものが好ましい。【００１５】
デルマタン硫酸の分離・精製は、破砕、抽出、酵素分解（例えばプロテアーゼによる分解）、有機溶媒（例えばアルコール）による沈殿、塩析、塩溶、あるいは各種クロマトグラフィー等またはこれらの組み合わせ等、グリコサミノグリカンの分離、精製に通常用いられる方法より行うことができる。【００１６】
本発明阻害剤に用いる重量平均分子量がデルマタン硫酸は、その薬学的に許容される塩であってもよい。このデルマタン硫酸の薬学的に許容される塩としては、例えば、アルカリ金属塩（ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属塩もしくはアンモニウム塩等の無機塩基との塩、または有機アミン塩（ジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、トリエチルアミン塩、トリエタノールアミン塩等）もしくはアミノ酸塩（アルギニン塩やリジン塩等）等の有機塩基との塩を用いることができる。なかでもナトリウム塩が好ましい。【００１７】
本発明阻害剤に用いられるデルマタン硫酸の重量平均分子量は、特に限定はされないが、１万〜５万の範囲に包含されることが好ましく、３万〜４万程度が特に好ましい。【００１８】
なお、本発明阻害剤で用いることができるデルマタン硫酸は、下記の特性を有することが特に好ましい。なお、かかる好ましい特性を有するデルマタン硫酸を以下ＤＳ１と略記する。【００１９】
(A) コンドロイチナーゼＡＢＣで消化したとき、高速液体クロマトグラフィーで分析される不飽和二糖における２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−(４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸)−６−スルホ−Ｄ−ガラクトース（ΔＤｉ−６Ｓ）の割合が約４〜２５％、好ましくは約７〜１６％である。【００２０】
(B) コンドロイチナーゼＢを作用させたとき、約３重量％〜約１７重量％、好ましくは約５重量％〜１５重量％が消化されない。【００２１】
(C) 多角度光散乱法によって測定した分子量の範囲が、１万ダルトン〜２０万ダルトンである。
なお、このデルマタン硫酸は、さらに下記の特性を有することが好ましい。【００２２】
(D) 多角度光散乱法によって測定した分子量分布が、分子量４万ダルトン以下の画分が７９〜９９％、４万〜１０万ダルトンの画分が１〜２０％、１０万ダルトン以上の画分が１％以下である画分組成として検出される。【００２３】
(E) 多角度光散乱法によって測定した重量平均分子量が、約２．８万〜約４．３万ダルトン、好ましくは約３．２万〜約３．８万ダルトンである。【００２４】
(F)ゲル濾過高速液体クロマトグラフィー（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）法によって測定した重量平均分子量が約３．０万〜４．６万ダルトン、好ましくは約３．５万〜約４．１万ダルトンである。【００２５】
(G) ＧＰＣ−ＨＰＬＣ法によって測定した分子量分布が、分子量２万ダルトン以下の画分が５〜３０％、２万〜８万ダルトンの画分が７０〜９５％、８万ダルトン以上の画分が０％である画分組成として検出される。【００２６】
(H) コンドロイチナーゼＡＢＣで消化したときの不飽和二糖の組成が以下の通りである。
・２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−(４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸)−６−スルホ−Ｄ−ガラクトース（ΔＤｉ−６Ｓ）の含量が、約４％〜約２５％、好ましくは約７％〜約１６％である。
・２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−ガラクトース（ΔＤｉ−０Ｓ）の含量が、約４％〜約１０％、好ましくは約４．５％〜約１０％である。
・２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース（ΔＤｉ−４Ｓ）の含量が、約６３％〜約８５％、好ましくは約６８％〜約８４％である。
・ ２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース（ΔＤｉ−ｄｉＳD ）の含量が、約０．５％〜約２．２％、好ましくは約０．８％〜約１．７％である。
・２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース（ΔＤｉ−ｄｉＳB ）の含量が、約２％〜約８％、好ましくは約３％〜約７％である。
・２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキシ−４−エノピラノシルウロン酸）−４,６−ビス−Ｏ−スルホ−Ｄ−ガラクトース（ΔＤｉ−ｄｉＳE ）の含量が、約０％〜約２％である。【００２７】
なお、上記各種不飽和二糖の名称及び略称は、Yoshida, K. et al., Analytical Biochemistry, 177, 327-332(1989)の記載に従った。【００２８】
このようなＤＳ１の中で最も好ましいＤＳ１の特性は下記表１の通りである。【００２９】
【表１】
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【００３０】
このＤＳ１は、例えば以下の方法により製造することができる。【００３１】
鶏冠１重量に対して水約２〜３倍量を加えてミンチした後に煮沸し、冷却後プロテアーゼ（プロナーゼ、科研製薬(株)）を添加して一晩加水分解する。加水分解液に、塩化ベンザルコニウム溶液を加えた後、珪藻土で濾過し、濾過上清を捨て、残った珪藻土を得る。この珪藻土を塩化ナトリウム溶液に懸濁し、エタノールを加え、生じた沈殿を静置し、得られた沈殿を乾燥させて粉体を得る。【００３２】
この粉体を水に溶解して１０％溶液となるように調整し、ShivelyとConrad法により亜硝酸処理を行ってヘパリン／ヘパラン硫酸を除去する。すなわち、上記粉体を溶解した溶液を、０．１％亜硝酸水溶液に混和し、室温で放置した後、沈殿を濾過して除く。濾過液のｐＨを１０．５に調整し、塩化ナトリウムを終濃度１％になるように加え、さらにエタノールを終濃度４８％になるように撹拌しながら加える。得られた沈殿物に活性炭を加えて吸引濾過し、濾過液をイオン交換樹脂Diaion SA-12A（三菱化学(株)）に通して脱塩し、濾過液にエタノールを加え、ＤＳ１が得られる。【００３３】
得られたＤＳ１を、１０万ダルトンの分子排除限界を有する膜（アミコン社製）による分子限外濾過に付し、０．２Ｍ程度の塩化ナトリウム溶液で洗浄することが好ましい。【００３４】
なお、このＤＳ１の前記特性は、以下の方法で確認することができる。【００３５】
(a)ＧＰＣ−ＨＰＬＣ法による平均分子量の測定
ＤＳ１の平均分子量は、Araiらの方法(Biochem. Biophys. Acta, 1117, 60-70, 1992)に準拠して測定でき、分子量が既知のコンドロイチン硫酸（分子量３９１００、１８０００、８０５０）及びヒアルロン酸ナトリウム（分子量１０４０００）を標準品として高速液体クロマトグラフィーを用いたゲル濾過（ＧＰＣ−ＨＰＬＣ）での溶出時間により決定できる。カラムはTSK gel G4000PWXL 、G3000PWXL 及びG2500PWXL （各φ７．８×３００ｍｍ、東ソー(株)）を連結したものを用いることができる。溶媒は、0.2 mol/L 塩化ナトリウム溶液を用い、流速は0.6ml/分とし、検出器は示差屈折率検出器（RI-8000、東ソー(株)）を用いることができる。【００３６】
(b)多角度光散乱法による分子量の測定
検出器に示差屈折率検出器（Shodex RI-71、昭和電工(株)）及び多角度光散乱検出器（DAWN, Wyatt Technology CORPORATION）を使用し、ASTRAソフトウェア(WyattTechnology CORPORATION）のジムプロットモジュールを用いて解析を行う。【００３７】
カラムはＳＢ−８０６ＨＱ（φ８×３００ｍｍ、昭和電工(株)）、溶媒は0.1mol/L 硝酸ナトリウム溶液を用いて、流速は1.0mL/分とする。【００３８】
(c)コンドロイチナーゼＢ消化パターンの分析
ＤＳ１溶液100μLに、緩衝液Ａ（0.001mol/L 酢酸カルシウム、0.02mol/L Tris-HCl、pH7.5）10μLに0.03UのコンドロイチナーゼＢ（生化学工業(株)）を溶解したものを加え、３７℃で２時間消化する。沸騰湯浴中で１分加熱して反応を止め、消化物100μg相当10μLを、40℃でＧＰＣ−ＨＰＬＣを用いて分析する。カラムはTSK gel G4000PWXL 、G3000PWXL 及びG2500PWXL （各φ７．８×３００ｍｍ、東ソー(株)）を連結したものを用いる。溶媒は0.2mol/L塩化ナトリウム溶液を用い、流速は0.6 mL/分とし、検出器は示差屈折率検出器（RI-8020、東ソー(株)）及び紫外可視検出器（UV-8020、A230nm、東ソー(株)）を使用できる。【００３９】
(d)コンドロイチナーゼＡＢＣによる消化
１％ＤＳ１溶液50μLに、緩衝液Ｂ（0.01 mol/L 酢酸ナトリウム、0.05 mol/LTris-HCl、pH7.5）10μLに0.5UのコンドロイチナーゼＡＢＣを溶解したものを加え、３７℃で２時間消化する。沸騰湯浴中で１分間加熱して反応を止め、遠心して不溶物を除去する。【００４０】
この分解物に対し、緩衝液Ｂ 10μLに0.5UのコンドロイチナーゼＡＢＣを溶解したものを加え、３７℃で６時間消化する。沸騰湯浴中で１分加熱して反応を止め、遠心して不溶物を除去する。【００４１】
(e)コンドロ−６−スルファターゼによる消化
上記(c)の消化物100μg相当に対し、緩衝液Ｃ（0.02mol/L Tris-AcOH、pH7.0）50μLに0.25Uのコンドロ−６−スルファターゼを溶解したものを加え、37℃で２４時間消化し、不溶物を除去する。【００４２】
(f)二糖組成分析
上記(d)あるいは(e)の消化物を、それぞれＨＰＬＣを用いて各々分析する。カラムは
Lichorosorb  NH24φ×250ｍｍ（メルク社製）を用いることができる。流速は1.0 mL/分で６０分間に0.8mol/Lリン酸水素ナトリウムを２％から１００％までの直線濃度勾配で流す。不飽和コンドロ−二糖キット（生化学工業(株)）の溶出位置を基準として、この間に溶出する各種不飽和二糖を２３２ｎｍで同定し、不飽和二糖と同定されたピーク面積の総和を１００％として計算して二糖組成比を求めることができる。【００４３】
(g)極限粘度の測定
ＤＳ１の極限粘度の測定は、第１３改正日本薬局方に準拠して行うことができる。測定装置には自動粘度測定装置（ＶＭＣ−０５２、離合社(株)）を用いることができる。溶媒は0.2mol/L 塩化ナトリウム溶液を用い、ウベローデ型粘度管の流下時間の測定にも同じ溶液を用いることができる。粘度の測定は３０±０．１℃で行い、流下時間の1/100秒を四捨五入し、差が３回連続して０．１秒以内である測定値を極限粘度算出に用いる。【００４４】
極限粘度は還元粘度（＝（ｔS ／ｔ0 −１）／Ｃ、ｔS ：溶液の流下時間、ｔ0 ：溶媒の流下時間、Ｃ：試料濃度(重量％)）を縦軸に濃度を横軸にプロットして得られた直線を濃度０に補外したときの切片から求めることができる。【００４５】
本発明阻害剤が阻害効果を示すヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する作用を有している酵素であれば特に限定はされないが、特にほ乳類型と呼ばれるエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが好ましい。かかる好ましい酵素は、酵素分類でEC3.2.1.35に属する酵素である。【００４６】
本発明阻害剤が使用される濃度は、ヒアルロン酸の濃度と比して0.3%以上が好ましく、0.5%以上がより好ましく、1%以上が更に好ましく、2.5%以上であることが最も好ましい。かかる濃度でデルマタン硫酸をヒアルロン酸と混合することにより、ほ乳類由来のヒアルロニダーゼによる分解に耐性を有するヒアルロン酸組成物を得ることも可能である。
【実施例１】
【００４７】
微生物由来のヒアルロン酸にデルマタン硫酸を添加し、ヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼによる消化作用を検討した。【００４８】
下記表２に記載した量で放線菌由来のヒアルロン酸（紀文フードケミファ株式会社製：重量平均分子量100万）及びブタ皮由来のデルマタン硫酸（生化学工業株式会社性：重量平均分子量2.0万）含む水溶液100μgをサンプルチューブへ分注し、100mmol/Lの酢酸緩衝液（pH5.2）を10μl添加した後、ヒツジ精巣由来ヒアルロニダーゼ（ロッシュ株式会社製）10μgを添加して37℃で8時間反応させた。【００４９】
【表２】
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【００５０】
反応混合液を沸騰水浴上で5分間インキュベートして酵素反応を停止した後、遠心分離（15，000×g）を10分間行い、上清を常法によりキャピラリー電気泳動により分析した。キャピラリー電気泳動の条件は表３の通りである。【００５１】
【表３】
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【００５２】
結果を図１に示す。デルマタン硫酸を1.25％含む試料６でヒアルロン酸の分解が若干観察され、低分子化したヒアルロン酸がショルダーピークとして観察された。デルマタン硫酸を0.313%含む試料４ではオリゴ糖のピークが観察されはじめ、デルマタン硫酸を0.078%含む試料２及び0.039%しか含まない試料１では阻害効果はほとんど観察されなかった。デルマタン硫酸の濃度が2.5%の試料７ではほ乳類由来ヒアルロニダーゼの酵素反応を完全に阻害することが分かった。【００５３】
一方、デルマタン硫酸と構造的に近いことが知られているコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来：生化学工業株式会社製）を用いて同様の実験を行ったところ、ヒアルロニダーゼ阻害作用は観察されなかった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、化粧品や医薬品に使用されるヒアルロニダーゼに対する新たな阻害剤として利用可能である。
【図１】
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【国際調査報告】
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