(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鉄フタロシアニンスルホン酸と過酸化水素又は２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４とを含む化学発光試薬であって、前記鉄フタロシアニンスルホン酸と前記過酸化水素又は前記２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４とを反応させることにより化学発光を生じる化学発光試薬。
【請求項２】
鉄フタロシアニンスルホン酸と過酸化水素又は２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４とを反応させて、化学発光を生じさせる化学発光方法。
【請求項３】
試料液中に含まれる被検出物質の濃度を測定する方法であって、
前記試料液と、鉄フタロシアニンスルホン酸水溶液と、過酸化水素又は２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４とを混合する工程と、
前記混合溶液中に生じる発光の発光強度を測定する工程と、
前記測定した発光強度と、予め求めた検量線とから前記被検出物質の濃度を求める工程と
を含む測定方法。
【請求項４】
前記試料液のｐＨがｐＨ８〜１２に調整されている請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
前記被検出物質が、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−トリプトファン、およびＬ−チロシンからなる群より選択されるアミノ酸と、チアミン塩酸塩、リボフラミン、およびＬ−アスコルビン酸からなる群より選択されるビタミンと、グルコースと、過酸化水素と、銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、およびコバルトイオンからなる群より選択される金属イオンとからなる群のうちの少なくとも一つである請求項３または４に記載の測定方法。
【請求項６】
試料液中に含まれる被検出物質の濃度を測定するためのキットであって、前記キットは、鉄フタロシアニンスルホン酸と過酸化水素又は２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４とを含み、前記被検出物質の存在下で、前記試料と前記鉄フタロシアニンスルホン酸と前記過酸化水素又は前記２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４とを混合させることにより前記被検出物質の濃度に応じて化学発光を生じるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化学発光試薬および新規化学発光法ならびにそれを用いた被検出物質の測定方法およびそれに使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
溶液中の成分を検出するために用いられる化学発光法は高感度であり、かつ応答が速いという利点を有している。また、化学発光法は吸光光度法や蛍光光度法などと比較すると、励起光源が不要であるなど、装置の簡素化が可能であるといった利点も有している。しかしながら、現在化学発光分析法に使用可能な発光基質の絶対数は約１０種であり、また発光収率の高い化学発光反応系には限りがある。さらに、使用する有機溶媒や触媒の選択といった試薬の問題も有しており、これらにより分析対象成分には制限があり選択性が低いという問題を抱えている。そのため、化学発光法の適用範囲は制限され、実用面において普及が遅れており、新規、かつクリーンであり、さらに試薬の使用量が少ない化学発光系の出現が望まれている。
【０００３】
最近、アセトニトリル／水混合溶媒中において植物の葉の中に含まれるポルフィリン類縁体のクロロフィルの化学発光が見出され、報告されている（特許文献１）。この化学発光現象は、クロリン骨格を有する発光性のマグネシウム錯体であるクロロフィルが発光基質として作用していると考えられている。また、アセトリニトリル／水混合溶媒中において金属ポルフィリン錯体である鉄−クロロフィリン錯体の化学発光が報告されている（非特許文献１）。鉄−クロロフィリン錯体は非発光性であるが、過酸化水素との酸化反応によりポルフィリン骨格が開裂し、常磁性金属である鉄イオンが放出されることにより、ポルフィリンの分解物が発光を発する。さらに、鉄−クロロフィリン錯体と過酸化水素の反応によりジオキセタンが生成し、それが開裂する際、発光を有する分解物にエネルギーを供与し発光する。すなわち、鉄−クロロフィリン錯体は発光基質としてだけではなくエネルギー供与体、エネルギー受容体、さらに触媒として機能し化学発光反応が起きていると考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０００―７４８４１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】T. Nagoshi, O. Ohno, T. Kotake, S. Igarashi, Luminescence,20, 401-404(2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
新規な化学発光反応系を提供し、それを用いた試料中に含まれる被検出物質の濃度を高感度に測定できる濃度測定法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、鉄フタロシアニン錯体と酸化剤とを含む化学発光試薬であって、前記鉄フタロシアニン錯体と前記酸化剤とを反応させることにより化学発光が生じることを特徴とする。また、本発明の化学発光試薬は、前記鉄フタロシアニン錯体が、鉄フタロシアニンスルホン酸であることを特徴とする。また、本発明の化学発光試薬は、前記酸化剤が、過酸化水素であることを特徴とする。
【０００８】
また、本発明の別の態様によれば、化学発光を生じる化学発光方法であって、前記方法は、鉄フタロシアニン錯体と酸化剤とを反応させることを特徴とする。また、本発明の化学発光法によれば、前記鉄フタロシアニン錯体が、鉄フタロシアニンスルホン酸であることを特徴とする。また、本発明の化学発光法によれば、前記酸化剤が過酸化水素であることを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の別の態様によれば、試料液中に含まれる被検出物質の濃度を測定する方法であって、前記測定方法は、前記試料液と、鉄フタロシアニン錯体水溶液と、酸化剤とを混合する工程と、前記混合溶液中に生じる発光の発光強度を測定する工程と、前記測定した発光強度と、予め求めた検量線とから前記被検出物質の濃度を求める工程とを含むことを特徴とする。また、本発明の測定方法は、前記鉄フタロシアニン錯体が、鉄フタロシアニンスルホン酸であることを特徴とする。また、本発明の測定方法は、前記酸化剤が過酸化水素であることを特徴とする。また、本発明の測定方法は、前記試料液のｐＨがｐＨ８〜１２に調整されていることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の測定方法は、前記被検出物質が、還元性の物質であることが好ましく、例えば、Ｌ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−トリプトファン、およびＬ−チロシンからなる群より選択されるアミノ酸と、チアミン塩酸塩、リボフラミン、およびＬ−アスコルビン酸からなる群より選択されるビタミンと、グルコースといった糖と、過酸化水素とが挙げられる。また、前記被検出物質は、例えば、銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、およびコバルトイオンからなる群より選択される金属イオンであることが好ましい。
【００１１】
また、本発明の別の態様によれば、試料液中に含まれる被検出物質の濃度を測定するためのキットであって、前記キットは、鉄フタロシアニン錯体と酸化剤とを含み、前記被検出物質の存在下で、前記試料と前記鉄フタロシアニン錯体と前記酸化剤とを混合させることにより前記被検出物質の濃度に応じて化学発光を生じることを特徴とする。また、本発明のキットは、前記鉄フタロシアニン錯体が、鉄フタロシアニンスルホン酸であることを特徴とする。また、本発明のキットは、前記酸化剤が、過酸化水素であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
鉄フタロシアニン錯体と酸化剤とから、新規の化学発光反応系を提供することができる。さらに、この化学発光反応系を用いることで被検出物質を高感度に測定できる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明に係る鉄フタロシアニン錯体と酸化剤との化学発光反応の一実施の形態を示すフローチャートであり、試薬の混合からそれにより生じる発光を測定するまでの工程を示す。
【図２】本発明の化学発光反応を利用した試料液中に含まれる被検出物質の濃度測定法における一実施の形態を示すフローチャートである。
【図３】本発明の一実施の形態である鉄フタロシアニンスルホン酸（Ｆｅ−ＰＴＳ）と過酸化水素との化学発光反応におけるｐＨの影響を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施の形態であるＦｅ−ＰＴＳと過酸化水素との化学発光反応における酸化剤濃度の影響を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施の形態であるＦｅ−ＰＴＳと過酸化水素との化学発光反応におけるＦｅ−ＰＴＳ濃度の影響を示すグラフである。
【図６】本発明の一実施の形態であるＦｅ−ＰＴＳと過酸化水素との化学発光反応における温度の影響を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施の形態であるＬ−チロシン共存下のＦｅ−ＰＴＳと過酸化水素との化学発光反応においてｐＨの濃度の影響を示すグラフである。
【図８】本発明の一実施の形態であるＬ−チロシン共存下のＦｅ−ＰＴＳと過酸化水素との化学発光反応において酸化剤濃度の影響を示すグラフである。
【図９】本発明の一実施の形態であるＬ−チロシン共存下のＦｅ−ＰＴＳと過酸化水素との化学発光反応においてＦｅ−ＰＴＳの影響を示すグラフである。
【図１０】本発明に係るＦｅ−ＰＴＳと酸化剤との反応により生じる化学発光強度と反応系に共存するＬ−チロシン濃度との関係を示すグラフ（検量線）である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、鋭意検討の結果、鉄フタロシアニン錯体と酸化剤とを反応させることにより発光が生じる新規な化学発光反応系を見出した。さらに、この化学発光反応系を利用することで、試料液に含まれる特定の被検出物質の濃度を測定することができることを見出した。
【００１５】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１６】
図１は、本発明者らにより新たに見出された鉄フタロシアニン錯体と酸化剤とが反応して発光が生じる化学発光反応と、その発光強度を測定するまでの一実施の形態のフローチャートを示す。図１に示すように、本発明の化学発光反応は、化学発光用セル１と、化学発光用セル１内で化学発光を生じさせるために混合される蒸留水２とｐＨ緩衝溶液３と酸化剤４と鉄フタロシアニン錯体５とを順に添加する工程から構成されている。
【００１７】
化学発光用セル１は、蒸留水２と、ｐＨ緩衝液３と、酸化剤４と、鉄フタロシアニン錯体５とを混合し、混合液中に生じた発光の強度をそのまま化学発光測定装置にセットすることで測定できるようなものであれば、従来から使用されているものを使用することができる。特に限定はされないが、例えば石英セルやポリスチレン製セル等が挙げられる。蒸留水２は、混合液を一定体積とするために使用される。
【００１８】
本発明に使用されるｐＨ緩衝液３としては、反応系混合液のｐＨを一定に保つことができるものであれば、特に限定されず、例えばＢｏｒａｘ緩衝液や、水酸化ナトリウム−酢酸系緩衝液等を使用することができる。ｐＨ緩衝液３により維持するｐＨとしては、ｐＨ８〜１２が好ましく、ｐＨ９〜１１がより好ましく、約ｐＨ１０が最も好ましい。
【００１９】
本発明で使用する酸化剤４としては、鉄フタロシアニン錯体を酸化させることにより発光性物質を生じさせることができるものであればよく、例えば、酸化剤４としては過酸化水素や２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４、過ヨウ素酸ナトリウム等を挙げることができるが、好ましくは過酸化水素を使用することができる。過酸化水素を使用するときの濃度は、混合液における最終的な濃度が２．５×１０−３Ｍ〜１．０×１０−２Ｍの範囲であることが好ましく、５．０×１０−３Ｍ〜７．５×１０−３Ｍの範囲であることがより好ましく、約６．４×１０−３Ｍが最も好ましい。
【００２０】
本発明に使用できる鉄フタロシアニン錯体５としては、特に鉄フタロシアニンスルホン酸が好ましい。鉄フタロシアニンスルホン酸は、鉄フタロシアニンスルホン酸のナトリウム塩、カリウム塩，アンモニウム塩等の塩を蒸留水に溶解させて作製したものを使用することができる。鉄フタロシアニンスルホン酸を使用する際の濃度としては、混合液における最終的な濃度が０．１×１０−５Ｍ〜１．０×１０−５Ｍの範囲であることが好ましく、１．５×１０−５Ｍ〜３．０×１０−５Ｍの範囲であることがより好ましく、約２．０×１０−５Ｍが最も好ましい。
【００２１】
以上の構成によれば、化学発光用セル１内でｐＨ緩衝液３によりｐＨ調整した蒸留水２に、酸化剤４を添加する。酸化剤４添加後の化学発光用セル１を化学発光測定装置のセルホルダーにセットし、鉄フタロシアニン錯体５を添加する。これにより、鉄フタロシアニン錯体５と酸化剤４との反応により混合液中に化学発光が生じるため、この化学発光の強度を化学発光測定装置により測定する。このとき、混合液の温度は、１５℃〜４０℃の範囲が好ましく、２０℃〜４０℃の範囲がより好ましい。
【００２２】
図２は、本発明に係る試料液中の被検出物質を測定するための鉄フタロシアニン錯体と酸化剤との化学発光反応を用いた発光強度測定の流れを示すフローチャートである。図２に示すように、本発明の発光強度測定は、化学発光用セル１を用意し、化学発光用セル１に蒸留水２と、ｐＨ緩衝液３と、試料液６と、鉄フタロシアニン錯体５とを添加し、軽く混合した後、酸化剤４をさらに加えることで、混合液中で発光を生じさせ、その発光強度を化学発光測定装置により測定する。
【００２３】
試料液６は、濃度測定したい物質を含んでおり、本発明の濃度測定方法によって測定可能な物質としては、鉄フタロシアニン錯体と酸化剤との反応により生じる発光強度に対して増加または減少の影響を有するものであればよい。具体的な被検出物質としては、以下に限定されないが、例えばＬ−システイン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−トリプトファン、およびＬ−チロシン等のアミノ酸、チアミン塩酸塩、リボフラミン、およびＬ−アスコルビン酸等のビタミン、ならびにグルコース等の還元性物質や過酸化水素を挙げることができる。さらに、銅イオン、ニッケルイオン、亜鉛イオン、マンガンイオン、およびコバルトイオン等の金属イオンも挙げられる。
【００２４】
図２の構成によれば、化学発光用セル１内でｐＨ緩衝液３によりｐＨ調整された蒸留水２に、試料液６を添加し、さらに鉄フタロシアニン錯体５を添加する。混合液を軽く振り混ぜた後、化学発光測定装置のセルホルダーに化学発光用セル１をセットし、酸化剤４を添加する。これにより、混合液中で化学発光が生じるため、この化学発光の強度を化学発光測定装置により測定する。このとき、試料中の被検出物質の濃度により影響を受けた発光強度（増加または減少）を測定することができる。すなわち、あらかじめ試料中に含まれる被検出物質の濃度と、発光強度との関係を示すグラフ（検量線）を作成することで、測定した発光強度より被検出物質の濃度を導き出すことができる。
【実施例１】
【００２５】
本発明に係る鉄フタロシアニン錯体と酸化剤との化学発光反応において使用する酸化剤、温度、ｐＨ等の条件を検討するため、以下のような実験操作に基づいて発光強度を測定した。なお、特に断りのない限り、操作に使用した試薬は市販特級品を用いた。
（実験操作：鉄フタロシアニン錯体と酸化剤との反応による化学発光強度測定）
化学発光用ガラスセルに蒸留水（株式会社島津製作所製ＳＷＡC−５００の蒸留水製造装置により作製、以下同じ）３４０μｌをマイクロシリンジにより注入し、ｐＨ緩衝溶液（和光純薬工業株式会社製四ホウ酸ナトリウム（Ｂｏｒａｘ）を蒸留水に溶解させ、０．１ｍｏｌＬ−１に希釈したものを使用、以下同じ）を１００μｌ加え、ｐＨを調整した後（株式会社堀場製作所ｐＨメーターＦ−２２を使用、以下同じ）、０．０８ｍｏｌＬ−１過酸化水素水溶液（和光純薬製工業株式会社製３０％過酸化水素を蒸留水により希釈したものを使用、以下同じ）を４０μｌ加え混合した。そして、化学発光装置のセルホルダーにセルをセットし、Ｆｅ−ＰＴＳ水溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ社製鉄フタロシアニンスルホン酸ナトリウムを蒸留水に希釈して作製した）を２０μｌマイクロシリンジにより注入した。その後、注入直後に現れる化学発光シグナルを化学発光測定装置（株式会社日音医理科機器製作所製ＬＵＭＩＣＯＵＮＴＥＲ  ＮＵ−６００）により測定した。
【００２６】
（金属フタロシアニン錯体の化学発光）
水溶液中における他の金属フタロシアニン錯体（銅、鉄、ニッケル、コバルト、マグネシウム、鉛、白金、亜鉛）および遊離のフタロシアニンの化学発光現象について検討するため、Ｆｅ−ＰＴＳ水溶液のかわりに上記の金属フタロシアニン錯体および遊離のフタロシアニン錯体を添加した（銅フタロシアニン錯体はＡｌｄｒｉｃｈ社製銅フタロシアニンスルホン酸ナトリウムを蒸留水に希釈して作製；ニッケルフタロシアニン錯体はＡｌｄｒｉｃｈ社製ニッケルフタロシアニンスルホン酸ナトリウムを蒸留水に希釈して作製；その他の合成フタロシアニンはスルホン化したフタロシアニンと金属塩をＤＭＳＯ中において１５０℃、１時間の条件で合成し、再結晶したものを使用）。それぞれの化学発光強度を表１に示す。Ｆｅ−ＰＴＳの化学発光強度（ＩＣＬ）が１２７０で最大となり、遊離のフタロシアニンスルホン酸とその他の金属フタロシアニンスルホン酸ではほとんど化学発光現象が観測されなかった。
【００２７】
【表１】
0005431079.tif 000002
【００２８】
（酸化剤の検討）
Ｆｅ−ＰＴＳと酸化剤との化学発光反応における酸化剤の種類について検討を行った。酸化剤としてＨ２Ｏ２、および２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４を用いて、ｐＨ２．３、ｐＨ７．０、またはｐＨ１０．０における場合のＦｅ−ＰＴＳの化学発光強度について検討した。その結果を、表２および表３に示す。過酸化水素では、ｐＨ１０．０において最大の化学発光強度が得られた。これは、代表的な化学発光であるルミノール化学発光の挙動と同様である。また、２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４では、酸性〜アルカリ性条件下において微弱ではあるが、ほぼ同様な発光強度が得られた。
【００２９】
【表２】
0005431079.tif 000003
【表３】
0005431079.tif 000004
【００３０】
鉄フタロシアニン錯体としてＦｅ−ＰＴＳを用い、酸化剤として過酸化水素を用いたときの化学発光反応における各条件（ｐＨ、過酸化水素濃度、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度、温度）の最適化を行った。
（ｐＨの影響）
Ｆｅ−ＰＴＳと過酸化水素との化学発光反応系に及ぼすｐＨの影響を検討した。Ｆｅ−ＰＴＳ濃度２．０×１０−５Ｍ、過酸化水素濃度６．４×１０−３Ｍの条件で行った。その結果を図３に示す。ｐＨ変化に伴う最大化学発光強度はｐＨ１０．０において観測された。これは他の化学発光系（ルミノール化学発光、鉄−クロロフィリン錯体化学発光など）とほぼ同様の値となった。ｐＨ１０．０前後における化学発光強度のピークは、過酸化水素からスーパーオキシドラジカルの生成される最適なｐＨが１０前後であるためではないかと考えられる。
【００３１】
（過酸化水素濃度の影響）
Ｆｅ−ＰＴＳと過酸化水素との測定方法に使用する化学発光反応系における過酸化水素濃度の影響を検討した。Ｆｅ−ＰＴＳ濃度２．０×１０−５Ｍ、ｐＨ１０．０の条件でおこなった。その結果を図４に示す。添加する過酸化水素濃度の変化に伴う最大化学発光強度は過酸化水素濃度６．４×１０−３Ｍにおいて観測された。極大値以上の濃度では発光強度の減少がみられた。これは一般の化学発光系と同様の挙動であった。
【００３２】
（Ｆｅ−ＰＴＳ濃度の影響）
Ｆｅ−ＰＴＳと過酸化水素との化学発光反応系に及ぼすＦｅ−ＰＴＳ濃度の影響を検討した。過酸化水素濃度６．４×１０−３Ｍ、ｐＨ１０．０の条件で行った。その結果を図５に示す。添加するＦｅ−ＰＴＳの濃度の増加に伴い化学発光強度も増加した。また、Ｆｅ−ＰＴＳの濃度に伴う化学発光強度の増加率低下は、Ｆｅ−ＰＴＳの濃度が過剰となり、過酸化水素から生成されるスーパーオキシドラジカルにより酸化分解される割合が低下してしまうためであると考えられる。よって、本実施例においては、Ｆｅ−ＰＴＳの濃度は２．０×１０−５Ｍとすることとした。
【００３３】
（温度変化）
Ｆｅ−ＰＴＳと過酸化水素との化学発光反応系に及ぼす温度変化の影響を検討した。Ｆｅ−ＰＴＳ濃度２．０×１０−５Ｍ、過酸化水素濃度６．４×１０−３Ｍ、ｐＨ１０．０の条件下で温度を１５℃〜４０℃の間で変化させた。その結果を図６に示す。図６に示すように２０℃〜４０℃の間において化学発光強度の変化はほとんど見られなかった。
【００３４】
（共存物質の影響）
Ｆｅ−ＰＴＳの化学発光反応系における共存物質の影響について検討した。
アミノ酸の化学発光強度に与える影響を表４に示す。アミノ酸のうち、Ｌ−システイン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンにおいて消光現象がみられた。その他のアミノ酸については特に影響を及ぼさなかった。Ｌ−システインは還元性の物質であり、酸化反応に影響を及ぼしていると推測される。Ｌ−ヒスチジンはヘモグロビンのタンパク中に含まれ、ヘム鉄と結合している。本化学発光系においても、Ｆｅ−ＰＴＳの軸配位部位に配位し、触媒活性の低下が起こり、発光強度の現象がみられたと考えられる。Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンは一重項酸素の消去剤として用いられることから（H. Goto, A. Masuda, M. Yamada, BUNSEKI KAGAKU, 46, 711-717 (1997)）、活性酸素種に影響を与えているものと考えられる。
【００３５】
【表４】
0005431079.tif 000005
【００３６】
ビタミンの化学発光強度に与える影響を表５に示す。結果として、特にＬ−アスコルビン酸において大きな消光現象がみられた。Ｌ−アスコルビン酸は強い還元剤であり、過酸化水素の還元により酸化力の低下などが生じ、消光現象が起きたと考えられる。
【００３７】
【表５】
0005431079.tif 000006
【００３８】
糖の化学発光強度に与える影響を表６に示す。その結果、グルコースにおいて消光現象が見られた。グルコースは還元糖であり、Ｌ−アスコルビン酸と同様に活性酸素種の消去などにより発光強度が減少したと考えられる。
【００３９】
【表６】
0005431079.tif 000007
【００４０】
金属イオンの化学発光強度に与える影響を表７に示す。その結果、Ｃｕ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、およびＣｏ２＋において発光強度の増加が観測された。金属イオンは化学発光において触媒として用いられていることから（S. Nakano, K. Sakamoto, A. Takenobu, T. Kawashima, Talanta, 58, 1263-1270 (2002)）、本発明の化学発光系においても触媒として作用していると考えられる。
【００４１】
【表７】
0005431079.tif 000008
【００４２】
このように鉄フタロシアニン錯体と酸化剤との混合により生じる化学発光の発光強度に影響を与える共存物質（すなわち、被検出物質）については、予め被検出物質の濃度と被検出物質により影響を受ける発光強度との検量線を作成することで、被検出物質濃度に依存して影響を受けた発光強度よりその濃度を導き出すことが可能である。
【００４３】
次に、鉄フタロシアニン錯体と酸化剤との化学発光反応系におけるチロシンの影響をさらに検討した。なお、実験操作は以下のようにしておこなった。
（実験操作）
化学発光用セルに蒸留水１００μｌをマイクロシリンジにより注入し、ｐＨ緩衝液１００μｌを加えてｐＨを調整した後、Ｌ−チロシンを含む水溶液２００μｌとＦｅ−ＰＴＳ水溶液５０μｌを加え混合した。化学発光装置のセルホルダーにセルをセットし、過酸化水素水溶液５０μｌをマイクロシリンジにより注入し、化学発光シグナルを化学発光測定装置（マイクロテック・ニチオン社製ＧＥＮＥＬＩＧＨＴ  ＧＬ−２００Ｓ）で測定した。
【００４４】
（ｐＨ条件の検討）
ｐＨを変化させたときの化学発光強度の影響を検討した。過酸化水素濃度６．４×１０−３Ｍ、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度２．０×１０−５Ｍ、Ｌ−チロシン濃度２．０×１０−７Ｍの条件でおこなった。その結果を図７に示す。ｐＨ変化に伴う最大化学発光強度はｐＨ１０において観測された。ｐＨ１０前後における化学発光強度のピークは、過酸化水素からスーパーオキシドラジカルの生成される最適なｐＨが１０前後であるためではないかと考えられる。この結果より、Ｌ−チロシンの濃度２．０×１０−７Ｍにおける発光強度の差が大きいことから、ｐＨ１０を最適ｐＨとした。
【００４５】
（過酸化水素濃度の検討）
反応系における過酸化水素濃度の影響を検討した。ｐＨ１０、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度２．０×１０−５Ｍ、Ｌ−チロシン濃度２．０×１０−７Ｍの条件でおこなった。その結果を図８に示す。過酸化水素濃度の変化に伴う最大化学発光強度は過酸化水素濃度６．４×１０−３Ｍにおいて観測され、極大値以上の濃度では発光強度の減少が見られた。これは一般の化学発光系と同様の挙動であった。しかし、Ｌ−チロシンの濃度２．０×１０−７Ｍにおける発光強度の差が大きい３．２×１０−３Ｍを最適濃度とした。
【００４６】
（Ｆｅ−ＰＴＳ濃度の検討）
Ｆｅ−ＰＴＳ濃度の影響を検討した。ｐＨ１０、過酸化水素濃度６．４×１０−３Ｍ、Ｌ−チロシン濃度２．０×１０−７Ｍの条件でおこなった。その結果を図９に示す。Ｆｅ−ＰＴＳの濃度の増加に伴い化学発光強度は増加した。Ｌ−チロシンの濃度２．０×１０−７Ｍにおける発光強度の差が大きいことから、４．０×１０−５Ｍを最適濃度とした。
【００４７】
（Ｌ−チロシンの検量線の作成）
ｐＨ１０、過酸化水素濃度３．２×１０−３Ｍ、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度４．０×１０−５Ｍの条件下でＬ−チロシンの濃度を変化させ、Ｌ−チロシンの検量線を作成した。ＧＥＮＥＬＩＧＨＴ  ＧＬ−２００ＳによるＬ−チロシン（Ｔｙｒ）の検量線を図１０に示す。その結果、２．０×１０−８Ｍ〜２．０×１０−５Ｍにおいて良好な直線が得られた。検量線の相関係数は０．９８４２であった。また、Ｌ−チロシンの濃度２．０×１０−７Ｍにおいて、５回測定での変動係数は０．６８％であり、検出限界（３σ）は１．８１×１０−８Ｍ（３．２７ｐｐｍ）であった。
【符号の説明】
【００４８】
１  化学発光用セル
２  蒸留水
３  ｐＨ緩衝溶液
４  酸化剤
５  鉄フタロシアニン錯体
６  試料液
【図１】
0005431079.tif 000009
【図２】
0005431079.tif 000010
【図３】
0005431079.tif 000011
【図４】
0005431079.tif 000012
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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