(57)【要約】  新規なリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子の提供。  配列番号１、３，３６若しくは３７で示される塩基配列又はそのフラグメントを含む核酸。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸。
（ａ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｂ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列と同一性が６７％以上の塩基配列からなり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
【請求項２】
以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれかである塩基配列を含む、請求項１に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｂ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の塩基配列又はそのフラグメントを含む核酸。
（ａ）配列番号３６若しくは配列番号３７で示される塩基配列
（ｂ）配列番号２若しくは４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１若しくは３で示される塩基配列
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
【請求項５】
配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物であって、前記脂肪酸組成物におけるアラキドン酸含有率が、請求項６記載の組換えベクターで形質転換されていない宿主を培養して得られる培養物より高いことを特徴とする、前記脂肪酸組成物。
【請求項９】
請求項７に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、請求項８記載の脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、前記脂肪酸組成物の製造方法。
【請求項１０】
請求項８記載の脂肪酸組成物を含む、食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００７年５月２５日に出願された日本国特許出願２００７−１３９０４６及び２００７年１２月１４日に出願された日本国特許出願２００７−３２３９６５に基づく優先権を主張する。【０００２】
本発明は、新規なリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子に関する。
【背景技術】
【０００３】
脂肪酸は、リン脂質やトリアシルグリセロール等脂質を構成する重要な成分である。不飽和結合を２箇所以上含有する脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）と総称され、アラキドン酸やジホモγ-リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等が知られており、様々な生理活性が報告されている（非特許文献１）。【０００４】
このうち、アラキドン酸は、プロスタグランジンやロイコトリエンなどへの中間代謝物として注目され、機能性食品や医薬品の素材に適用する試みが数多くなされている。さらに、アラキドン酸は、母乳中に含まれており乳児の発育、特に、胎児の身長や脳の発育において重要であり、乳児の発育に必要な成分として、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）とともに栄養学的見地からも注目されている。【０００５】
この高度不飽和脂肪酸は様々な分野での利用が期待されているが、動物体内で合成できないものも含まれている。そこで、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を獲得する方法が開発されてきた。また、植物で高度不飽和脂肪酸を生産させる試みもなされている。こうした場合、高度不飽和脂肪酸は、例えばトリアシルグリセロール等の貯蔵脂質の構成成分として、微生物の菌体内若しくは植物種子中に蓄積されることが知られている。【０００６】
より詳細には、トリアシルグリセロールは、生体内で以下のとおり生成される。すなわち、グリセロール−３−リン酸がグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素によりアシル化されてリゾホスファチジン酸となり、このリゾホスファチジン酸がリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素によりアシル化されてホスファチジン酸となり、このホスファチジン酸がホスファチジン酸ホスファターゼにより脱リン酸化されてジアシルグリセロールとなり、このジアシルグリセロールがジアシルグリセロールアシル基転移酵素によりアシル化されてトリアシルグリセロールとなる。また、アシルＣｏＡ：コレステロールアシル基転移酵素やリゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素等が間接的にトリアシルグリセロールの生合成に関与することが知られている。【０００７】
上記のように、リゾホスファチジン酸（lysophosphatidic acid:以下、本明細書において「ＬＰＡ」と記載する場合もある。また、「１−アシルグリセロール−３−リン酸」と記載する場合もある）がアシル化されてホスファチジン酸（phosphatidic acid:以下、本明細書において「ＰＡ」、又は、「１,２−ジアシル−sn−グリセロール−３−リン酸」と記載する場合もある）を生成する反応には、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（以下、「LPAAT」と記載する場合もある）が介在することが知られている。【０００８】
このLPAATは、１−アシルグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ(E.C. 2.3.1.51)としても知られている。LPAAT遺伝子はこれまでにいくつかの生物で報告されている。Escherichia coli由来のLPAAT遺伝子としてplsC遺伝子がクローン化されている（非特許文献２）。これ以外に真菌では、Saccharomyces cerevisiae由来のSLC1遺伝子がクローン化されている（非特許文献３）。また、動物や植物からもクローン化されている（特許文献１）。【０００９】
脂質生産菌であるMortierella alpina（以下、「M. alpina」と記載する場合もある）のLPAATについては、ミクロソーム画分にリゾホスファチジン酸アシル基転移活性があることが報告されている（非特許文献４）。さらに、M. alpinaのLPAAT遺伝子としては、２種類のホモログが報告されている。（特許文献２及び特許文献３）。
【特許文献１】国際特許出願パンフレットＷＯ２００４／０７６６１７号
【特許文献２】米国特許公報第２００６/１７４３７６号
【特許文献３】米国特許公報第２００６/００９４０９０号
【非特許文献１】Lipids, 39, 1147 (2004)
【非特許文献２】Mol. Gen. Genet. , 232, 295-303, 1992
【非特許文献３】J.B.C., 268, 22156-22163, 1993
【非特許文献４】Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000
【非特許文献５】J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998
【非特許文献６】J. Bacteriology, 173, 2026-2034, 1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、これまでに報告されているLPAAT遺伝子は、宿主細胞に導入して発現させても、その基質特異性により、宿主が産生する脂肪酸組成物は限られていた。そこで、これまでとは異なる組成の脂肪酸組成物を産生しうる、新規な遺伝子を同定することが求められている。特に、利用価値の高い脂肪酸の含有量が高い脂肪酸組成物を生産しうるタンパク質の遺伝子を同定することが求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、宿主細胞で発現又は導入することで、目的とする脂肪酸組成の油脂を製造させたり、目的とする脂肪酸の含有量を増加させたりできるようなタンパク質及び核酸を提供することである。【００１２】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、脂質生産菌Mortierella alpinaのＥＳＴ解析を行い、そのなかから既知のLPAAT遺伝子と同一性の高い配列を抽出した。さらに、LPAATをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を取得するため、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングあるいはＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。それを酵母等の高増殖能を有する宿主細胞に導入して所望の脂肪酸組成物の産生を試みた発明者は、従来のLPAATが発現した宿主が産生する脂肪酸組成物と比較して、異なる脂肪酸組成物を生成させることができ、かつ、宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、当該遺伝子が導入されていない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高い、基質特異性が異なる新規なLPAATに関する遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。【００１３】
（１）  以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸。
（ａ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｂ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列と同一性が６７％以上の塩基配列からなり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（２）  以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれかである塩基配列を含む、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｂ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（３）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の塩基配列又はそのフラグメントを含む核酸。
（ａ）配列番号３６若しくは配列番号３７で示される塩基配列
（ｂ）配列番号２若しくは４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１若しくは３で示される塩基配列
（４）  以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸。
（ａ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（ｂ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（ｃ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列と同一性が６７％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（ｄ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（ｅ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（５）  以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれかである塩基配列を含む、（４）に記載の核酸。
（ａ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（ｂ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（ｃ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（６）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸。
（ａ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列を含むタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記塩基配列がコードするタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列と同一性が６７％以上の塩基配列からなり、かつ、前記塩基配列がコードするタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列を含むタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質
（ｅ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記タンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（７）以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれかである塩基配列を含む、（６）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列を含むタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｂ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、前記塩基配列がコードするタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、前記アミノ酸配列を含むタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（８）  以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（９）  以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（ｂ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（１０）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は４において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質
（１１）  配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。【００１４】
（１２）  （１）〜（７）のいずれか１項記載の核酸を含有する組換えベクター。【００１５】
（１３）  （１２）記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。【００１６】
（１４）  （１３）に記載の形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物であって、前記脂肪酸組成物の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、（１２）の組換えベクターで形質転換されていない宿主を培養して得られる培養物の前記比率より高いことを特徴とする、前記脂肪酸組成物。
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
（１５）  （１３）に記載の形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物であって、前記脂肪酸組成物におけるアラキドン酸含有率が、（１２）記載の組換えベクターで形質転換されていない宿主を培養して得られる培養物より高いことを特徴とする、前記脂肪酸組成物。【００１７】
（１６）  （１３）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、（１４）又は（１５）記載の脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、前記脂肪酸組成物の製造方法。【００１８】
（１７）  （１４）又は（１５）記載の脂肪酸組成物を含む、食品。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のLPAATは、従来のLPAATとは基質特異性が異なり、従来のLPAATが発現した宿主が産生する脂肪酸組成物とは組成が異なる脂肪酸組成物を宿主中に産生させることができる。それにより、所望の特性や効果を有する脂質を提供できるため、食品、化粧料、医薬品、石鹸等に適用できるものとして有用である。【００２０】
本発明のLPAATが発現した宿主細胞内のアラキドン酸含有率は、本発明のLPAATが発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高く、当該細胞の培養物から得られる脂肪酸組成物は、栄養学的にもより高い効果が期待できるため、好ましい。【００２１】
また、本発明のLPAATは脂肪酸や貯蔵脂質の生産能の向上を図ることができるため、微生物や植物中での高度不飽和脂肪酸の生産性を向上させるものとして、好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の２つのホモログLPAAT3及びLPAAT4と、公知のホモログLPAAT1及びLPAAT2との関係を示す系統樹である。
【図２】図２は、本発明のLPAAT3のｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、LPAAT4のｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、LPAAT3とLPAAT4のＣＤＳ部分のＤＮＡ配列を比較した図である。
【図５】図５は、LPAAT3とLPAAT4の推定アミノ酸配列を比較した図である。
【図６】図６は、LPAAT3p及びLPAAT4pの推定アミノ酸配列を既知のアミノ酸配列と比較した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、リゾホスファチジン酸をアシル化して、ホスファチジン酸を生成させることを特徴とする、Mortierella属由来の新規なリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子に関する。【００２４】
本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（LPAAT）は、リゾホスファチジン酸をアシル化してホスファチジン酸を生成する反応を触媒する酵素である。アシル基供与体は、通常アシルＣｏＡであるが、これに限定されない。また、本発明に係るタンパク質が作用するアシル基転移反応のアシル基受容体はＬＰＡに限定されず、様々なリゾリン脂質がアシル基受容体になり得る。【００２５】
本発明に関するＬＰＡ（１−アシル−sn−グリセロール−３−リン酸ともいう）はグリセロリン脂質の１種である。ＬＰＡは、グリセロール−３−リン酸（sn−グリセロール−３−リン酸ともいう）の１位（α位）のヒドロキシル基のアシル化により生成する、脂肪酸を１つしかもたないリゾリン脂質である。ＬＰＡは、脂質生合成の中間体であるだけでなく、細胞増殖、血小板凝集効果、平滑筋収縮効果、がんの浸潤促進効果等非常に多岐にわたる生物学的、薬理的作用を有する脂質性の細胞内及び細胞間メディエーターである。【００２６】
本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素をコードする核酸
本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素（LPAAT）には、LPAAT3及びLPAAT4が含まれる。LPAAT3及びLPAAT4をコードする核酸のｃＤＮＡ、ＣＤＳ、ＯＲＦ及びアミノ酸配列の対応関係を以下の表１に整理して記載した。【００２７】
【表１】
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つまり、本発明のLPAAT3に関連する配列としては、LPAAT3のアミノ酸配列である配列番号２、LPAAT3のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号３６、そして、そのＣＤＳの領域を示す配列である配列番号８、及びそのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号１があげられる。このうち、配列番号８は配列番号１の第１５８〜１１４７番目の塩基配列に相当し、配列番号３６は配列番号１の第１５８〜１１４４番目の塩基配列、及び、配列番号８の第１〜９８７番目の塩基配列に相当する。【００２８】
同様に、LPAAT4に関連する配列としては、LPAAT4のアミノ酸配列である配列番号４、LPAAT4のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号３７、そして、そのＣＤＳの領域を示す配列である配列番号２３、及びそのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号３があげられる。ここで、配列番号２３は配列番号３の第５５〜９９６番目の塩基配列に相当し、配列番号３７は、配列番号３の第５５〜９９３番目の塩基配列、及び、配列番号２３の第１〜９３９番目の塩基配列に相当する。【００２９】
本発明の核酸とは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。【００３０】
本発明の核酸の好ましい態様としては、（ａ）配列番号３６若しくは配列番号３７で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２若しくは４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｃ）配列番号１若しくは３で示される塩基配列等があげられる。【００３１】
配列番号３６若しくは配列番号３７で示される塩基配列及び配列番号２若しくは４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、及び、配列番号１若しくは３で示される塩基配列は、表１に記載したとおりである。【００３２】
上記塩基配列を得るためには、LPAAT活性を有する生物のＥＳＴやゲノムＤＮＡの塩基配列データから、既知のLPAAT活性を有するタンパク質と同一性の高いタンパク質をコードする塩基配列を探索することもできる。LPAAT活性を有する生物としては、脂質生産菌が好ましく、脂質生産菌としてはM. alpinaがあげられるが、これに限定されない。【００３３】
ＥＳＴ解析を行う場合には、まず、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いてもよい。本発明に適するｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、例えば以下のような方法があげられる。すなわち、脂質生産菌であるM. alpinaの適当な株を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養する。この前培養に適する培養条件としては、例えば、培地組成としては、１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０があげられ、培養期間は３日間、培養温度は２８℃である条件があげられる。その後、前培養物を適当な条件にて本培養に供する。本培養に適する培地組成としては、例えば、１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０があげられる。本培養に適する培養条件としては、例えば、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃で８日間通気攪拌培養する条件があげられる。培養期間中に適当量のグルコースを添加してもよい。本培養中に適時培養物を採取し、そこから菌体を回収して、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製には、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法等の公知の方法を用いることができる。得られた全ＲＮＡから市販のキットを用いてpoly(A)＋ＲＮＡを精製することができる。さらに、市販のキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。その後、作製したｃＤＮＡライブラリーの任意のクローンの塩基配列を、ベクター上にインサート部分の塩基配列を決定できるように設計されたプライマーを用いて決定し、ＥＳＴを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)でｃＤＮＡライブラリーを作製した場合は、ディレクショナルクローニングを行うことができる。【００３４】
LPAAT3及びLPAAT4のＯＲＦ間の塩基配列の同一性は６６．６％である。一方、M. alpina由来のLPAATとして公知のLPAAT1とLPAAT2がある。この２つのホモログと本発明の２つのホモログとの関係を図１の系統樹に示す。本発明のLPAAT3と公知のLPAAT1及びLPAAT2とのＯＲＦの塩基配列の同一性は、各々３４．３％、４７．０％であり、LPAAT4と公知のLPAAT1及びLPAAT2とのＯＲＦの塩基配列の同一性は各々３４．６％、４７．３％である。図１から明らかなように、本発明のLPAAT3及び4は、進化的分類としては公知のLPAATからはかなり離れており、その機能も異なる。すなわち、以下に説明するように、本発明のLPAAT3及び4は、公知のLPAATが発現した宿主が産生する脂肪酸組成物とは異なる組成の脂肪酸組成物を宿主中に産生させることができ、かつ、本発明のLPAATが発現した宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、本発明のLPAATが発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いという、公知のLPAATとは全く異なる機能を有する。【００３５】
なお、本発明のLPAAT3をコードする塩基配列及びLPAAT4をコードする塩基配列をそれぞれBLASTX解析した結果、最もE-valueの低かったUstilago maydis 521由来の推定タンパク質（図１）（UM06426.1, GB accession No. EAK87199）をコードする塩基配列（GB accession No.XM_757480）との同一性はそれぞれ４９．２％、５１．３％である。【００３６】
同様に、LPAAT3とLPAAT4との間のアミノ酸配列の同一性は６９．１％であり、LPAAT3と公知のLPAAT1及びLPAAT2との同一性はそれぞれ１２．３％、１７．３％、LPAAT4と公知のLPAAT1及びLPAAT2との同一性はそれぞれ１２．５％、１５．５％である。なお、本発明のLPAAT3のアミノ酸配列及びLPAAT4のアミノ酸配列をそれぞれBLASTP解析した結果、最もE-valueの低かったUstilago maydis 521由来の推定タンパク質（図１）（UM06426.1, GB accession No. EAK87199）との同一性はそれぞれ３６．２％、３６．７％である。【００３７】
本発明はまた、上記配列番号３６及び３７で示される塩基配列（「本発明の塩基配列」と記載する場合もある）、並びに、配列番号２及び４で示されるアミノ酸配列（「本発明のアミノ酸配列」と記載する場合もある）からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸と同等の機能を有する核酸を含む。「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質が、LPAAT活性を有することを意味する。LPAAT活性は、公知の方法を用いて測定できるが、例えば、以下のような方法があげられる。すなわち、本発明のLPAATを発現させた酵母から、J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)に記載の方法等によりミクロソーム画分を調製する。そして、反応液である、０．４４ｍＭ ＬＰＡ、０．３６ｍＭアシル−ＣｏＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に上記ミクロソーム画分を添加し、２８℃で適当な時間反応させ、クロロホルム：メタノールを添加して反応を停止させた後、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄層クロマトグラフィー等により分画し、上記反応により生成したＰＡ量を定量することができる。その結果、生成したＰＡ量が多ければ、LPAATとしての活性が高いと判断できる。例えば、本方法によりLPAAT3やLPAAT4を発現させた株では、上記反応において、アシル−ＣｏＡとしてリノオレオイル−ＣｏＡを用いた場合、ＰＡ画分に取り込まれるリノール酸（１８：２）量が増加することが分かっている。そのため、LPAAT3およびLPAAT4は、LPAAT活性を有するといえる。【００３８】
また、このLPAAT活性に加えて、本発明の塩基配列がコードするタンパク質、又は、本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下の
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
のうちの少なくとも一つ以上が、上記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質（以下、「本発明のLPAATの脂肪酸組成を形成できる活性を有するタンパク質」という場合もある）である場合も含まれる。【００３９】
具体的には、上記本発明の塩基配列等を発現ベクターpYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）に挿入したものを、酵母Saccharomyces cerevisiae EH13-15株(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)を宿主として形質転換させ、得られた形質転換体を培養して回収した菌体を、以下の実施例７に記載の方法で脂肪酸解析をした場合の上記本発明のLPAATの脂肪酸組成が、具体的に、以下の
i)  オレイン酸含有量が52％以上；
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率が7.25以上；
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率が9.94以上；及び
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の含有量の比率が10.72以上という数値である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸である。さらに好ましくは、本発明の塩基配列等は、LPAAT活性及び上記本発明のLPAATの脂肪酸組成を形成できる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。なお、これらの脂肪酸組成については、上記実施例７に記載の方法とは異なる形質転換体の培養条件を用いて培養した場合には、その組成に多少の変化を生じる場合がある。上記培養条件とは、例えば、温度や培養時間があげられる。【００４０】
さらに、上記「同等の機能を有する」には、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質がLPAAT活性及び本発明のLPAATの脂肪酸組成を形成できる活性に加えて、本発明の塩基配列がコードするタンパク質、又は、本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いような活性を有するタンパク質（「本発明の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性を有するタンパク質」といういう場合もある）である場合も含まれる。【００４１】
アラキドン酸については、「本発明の脂肪酸組成物」の項で説明する。そのような核酸は、具体的には、上記同様、本発明の塩基配列等を発現ベクターpYE22mに挿入したものを、酵母Saccharomyces cerevisiae YPH499株にΔ１２脂肪酸不飽和化酵素、Δ６脂肪酸不飽和化酵素、Δ６脂肪酸鎖長延長酵素およびΔ５脂肪酸鎖長延長酵素を導入し発現させたアラキドン酸を生産する酵母、ARA3-1株を宿主として形質転換させ、得られた形質転換体を培養して回収した菌体を、以下の実施例７に記載の方法で脂肪酸解析をした場合、細胞内のアラキドン酸含有率が、上記タンパク質を発現していない宿主よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。さらに好ましくは、本発明の塩基配列等は、LPAAT活性及び本発明の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。【００４２】
このような本発明の核酸と同等の機能を有する核酸としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸があげられる。なお、以下にあげる塩基配列の記載において、「本発明の上記活性」とは、上記の「LPAAT活性及び/又は上記本発明のLPAATの脂肪酸組成を形成できる活性及び/又は本発明の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性」を意味する。【００４３】
（ａ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。【００４４】
具体的には、
(i) 配列番号２又は４に示すアミノ酸配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２又は４に示すアミノ酸配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２又は４に示すアミノ酸配列において1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。【００４５】
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。【００４６】
保存的置換は、一般的には、生物学的系合成や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。【００４７】
以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸及び２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン及びグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸及び２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン及び４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン及びホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン及びチロシン
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。【００４８】
また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。【００４９】
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. Golub及びD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。【００５０】
Ｄ−アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。【００５１】
なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。【００５２】
同様に、一般的には、特に言及しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向とする。【００５３】
当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したタンパク質の適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のタンパク質の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができるタンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている分子の残基及び領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。特に、本発明では、図６中に二重下線で示したように、本発明の２つのLPAATのアミノ酸配列中に、保存モチーフである「ＨＸＸＸＸＤ（ＨＸ４Ｄ）」（保存されているアミノ酸残基を＊印で示す）が存在する。本モチーフは、グリセロリン脂質アシル基転移酵素（Glycerolipid acyltransferase）に必須のモチーフであり（J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998）、本発明のLPAATにとっても重要なモチーフである。従って、本発明の変異体は上記保存モチーフが保存され、かつ、本発明の上記活性が損なわれない限り、いかなる変異体であってもよい。なお、上記保存モチーフ中で、Ｘはいかなるアミノ酸残基であってもよいことを示している。【００５４】
当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造−機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。【００５５】
上記したように、配列番号２又は４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。【００５６】
なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。【００５７】
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、LPAAT活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。【００５８】
また、本発明の核酸に含まれる塩基配列には、配列番号２又は４において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。【００５９】
本発明のタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の部位は、LPAAT活性、又は本発明のLPAATの脂肪酸組成を形成できる活性、又は本発明の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性が保持される限り制限はない。【００６０】
本発明のLPAAT活性、又は本発明のLPAATの脂肪酸組成を形成できる活性、又は本発明の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性は、公知の方法を用いて測定することが可能である。例えば、以下の文献：J.B.C., 265, 17215-17221, 1990を参照することができる。【００６１】
例えば、本発明の「LPAAT活性」は以下の通り測定してもよい。本発明のLPAATを発現させた酵母から、J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)に記載の方法等によりミクロソーム画分を調製する。そして、反応液である、０．４４ｍＭ ＬＰＡ、０．３６ｍＭアシル−ＣｏＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に上記ミクロソーム画分を添加し、２８℃で適当な時間反応させ、クロロホルム：メタノールを添加して反応を停止させた後、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄層クロマトグラフィー等により分画し、生成したＰＡ量を定量することができる。【００６２】
また、本発明の「LPAATの脂肪酸組成を形成できる活性」は、例えば以下のように測定してもよい。本発明の脂肪酸組成物の製造方法により得られた凍結乾燥した菌体に、適当な比率で調整したクロロホルム：メタノールを添加して攪拌した後、適当な時間、加熱処理をする。さらに遠心分離により菌体を分離して、溶媒を回収することを数回繰り返す。その後、適当な方法を用いて脂質を乾固させてから、クロロホルム等の溶媒を添加して脂質を溶解する。この試料を適当量分取して、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで分析を行う。また、本発明の「細胞内アラキドン酸含有率を高める活性」も上記方法にてアラキドン酸の含有量を分析することにより測定できる。【００６３】
（ｂ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。配列番号３６又は配列番号３７及びLPAAT活性については上記のとおりである。【００６４】
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。【００６５】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。【００６６】
ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。【００６７】
具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４２℃〜５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ〜３×ＳＳＣ、４５℃〜５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４０℃〜６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％〜０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。【００６８】
高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５５℃〜６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣ、６０℃〜６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５０℃〜６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０〜６５℃があげられる。【００６９】
特に本発明に用いられるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。【００７０】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。【００７１】
本発明に含まれる塩基配列としては、好ましくは、配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、LPAAT活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。【００７２】
（ｃ）配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列と同一性が６７％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号３６又は３７に示される核酸配列に対して少なくとも６７％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。【００７３】
好ましくは、配列番号３６又は３７に示される核酸配列に対して少なくとも７０％、さらに好ましくは７５％、さらに一層好ましくは８０％（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％）の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。上記したように、LPAAT3（配列番号３６）及びLPAAT4（配列番号３７）の同一性は６６．６％である。本発明の核酸は、配列番号３６又は３７に示される核酸配列に対して少なくとも６７％以上であり、両者に類似するものを含む。【００７４】
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるBLASTNプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン2.2.7、又はWU-BLAST2.0アルゴリズム等があげられる。WU-BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。【００７５】
（ｄ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。本発明の核酸がコードするタンパク質は、本発明の上記活性を有するタンパク質と同等の機能を有する限り、LPAAT3又はLPAAT4のアミノ酸配列と同一性のあるタンパク質でもよい。【００７６】
具体的には、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列と７０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％、さらに好ましくは８５％以上、より一層好ましくは、９０％（例えば、９５％、さらには、９８％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。上記したように、LPAAT3（配列番号２）とLPAAT4（配列番号４）の間のアミノ酸配列の同一性は６９．１％である。本発明の核酸がコードするタンパク質は、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも６９％以上であり、両者に類似するものを含む。【００７７】
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。さらに好ましくは、配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。【００７８】
２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性パーセントを決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、BLAST、FASTA（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びClustalW等があげられる。特に、BLASTプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（BLASTマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DINASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI(Infomax)等のプログラムを用いて決定することもできる。【００７９】
複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ−スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。【００８０】
（ｅ）配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。【００８１】
配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びハイブリダイズの条件は上記のとおりである。本発明の核酸に含まれる塩基配列としては、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。【００８２】
また、本発明の核酸には、配列番号３６又は配列番号３７からなる塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸も含まれる。具体的には、
(i) 配列番号３６又は３７に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））の塩基が欠失した塩基配列、
(ii) 配列番号３６又は３７に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号３６又は３７に示す塩基配列において1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））の他の塩基が付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせた塩基配列であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。【００８３】
本発明の核酸の好ましい態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の塩基配列またはそのフラグメントを含む核酸も含まれる。
（ａ）配列番号３６若しくは配列番号３７で示される塩基配列
（ｂ）配列番号２若しくは４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１若しくは３で示される塩基配列
（ａ）配列番号３６若しくは配列番号３７で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２若しくは４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｃ）配列番号１若しくは３で示される塩基配列については、表１に記載したとおりである。上記配列のフラグメントとは、上記塩基配列に含まれるＯＲＦ、ＣＤＳ、生物学的活性を有する領域、以下に記載するようなプライマーとして用いた領域、プローブとなりうる領域が含まれ、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。【００８４】
本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素タンパク質
本発明のタンパク質は、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び前記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質については、上記のとおりである。「同等の機能を有するタンパク質」とは、上記『本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおり、「本発明の上記活性」を有するタンパク質を意味する。【００８５】
本発明において、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質があげられる。【００８６】
（ａ）配列番号２又は４において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
上記のうち、配列番号２又は４において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号２又は配列番号４からなるアミノ酸配列と同一性が６９％以上のアミノ酸配列については、上記、『本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおりである。また、上記「本発明の上記活性を有するタンパク質」は、配列番号３６若しくは配列番号３７の塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質の変異体、又は、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加等の多くの種類の修飾により変異したタンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾されている修飾タンパク質、他のタンパク質との融合タンパク質であって、かつ、LPAAT活性を有するタンパク質であるか、及び／又は、本発明のLPAATの脂肪酸組成を形成できる活性を有するタンパク質であるか、及び又は本発明の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性を有するタンパク質も含まれる。【００８７】
また、本発明のタンパク質は、人工的に作製したものであってもよく、その場合は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。【００８８】
LPAATの核酸のクローニング
本発明のLPAATの核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。【００８９】
例えば、pBlue-Script TM SK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp(TM: Gibco-BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等の市販のプラスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号１又は３等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができるが、例えば、配列番号１に対しては、
上流側用プライマーとしてI-1:5’-GGATGTCATCAATGTCATCAATAGAG-3’（配列番号９）を、
下流側プライマーとして、I-2: 5’-CTAACCCCCTCTTCCTCCACCAC-3’（配列番号１０）を、
配列番号３に対しては、
上流側用プライマーとしてB-1：5’-CCTCGCAAAATGTATCGTGG-3’（配列番号１５）を、
下流側プライマーとして、B-2：5’-GATGGGAAGTTGAGCTTGAATG-3’（配列番号１６）等を、
各々用いることができる。そして、M. alpina 菌体から調製したｃＤＮＡに、上記プライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))』等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
サイクル数：１０回以上
得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。【００９０】
クローニングした核酸の塩基配列は、塩基配列シーケンサーを用いて決定することができる。【００９１】
LPAAT発現用ベクター構築及び形質転換体の作製
本発明はまた、本発明のLPAAT3及び4をコードする核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。【００９２】
このような組換えベクター及び形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、本発明のLPAATをコードする核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、EcoRI、KpnI、BamHI及びSalI等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後の塩基配列断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。この塩基配列断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、LPAAT発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。【００９３】
このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。真菌として、脂質生産菌であるM. alpina等の糸状菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母等があげられる。また細菌として、大腸菌（Escherichia coli）やバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。【００９４】
脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol.XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Mortierella isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物等があげられる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。【００９５】
真菌類を宿主として用いる場合は、本発明の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。宿主としてM. alpinaを使用する場合、発現ベクターとして、例えば、pD4、pDuraSC、pDura5等があげられる。プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるプロモーターを用いてもよく、例えば、histonH4.1遺伝子プロモーター、GAPDH（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーター、TEF（Translation elongation factor）遺伝子プロモーターといったM. alpinaに由来するプロモーターが用いられる。【００９６】
M. alpina等の糸状菌への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。【００９７】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、pYE22m等があげられる。また、pYES（Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等の市販の酵母発現用ベクターを、用いてもよい。また本発明に適する宿主としては、Saccharomyces cerevisiae EH13-15株（trp1, MATα）等があげられるがこれらに限定されない。プロモーターとしては、例えば、GAPDHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター等の酵母等に由来するプロモーターが用いられる。【００９８】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数又は複数）の被包、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。【００９９】
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX、pUC18等があげられる。プロモーターとしては、例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。【０１００】
本発明の脂肪酸組成物の製造方法
本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸組成物を製造する方法である。具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。【０１０１】
LPAATを発現させた生物の培養に用いる培地は、適当なｐＨ及び浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、酵母を形質転換してLPAATを発現させた場合は、SC-Trp培地、YPD培地、YPD5培地等を用いることができるが、これらに限定されない。具体的な培地の組成としてSC-Trp培地を例示する：１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）。【０１０２】
培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよいが、大量培養をする場合には、培養効率がよい２段階培養等が好ましい。【０１０３】
以下に、本発明の脂肪酸組成物の具体的な製造方法として、宿主として酵母を用いて２段階培養を行った場合を例示して説明する。すなわち、前培養として、上記で得られたコロニーを、例えば上記のSC-Trp培地等に植菌して、３０℃で２日間振盪培養を行う。その後、本培養として、YPD5（２％酵母エキス、１％ポリペプトン、５％グルコース）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振盪培養を行う方法である。【０１０４】
本発明の脂肪酸組成物
本発明はまた、本発明のLPAAT3又は4が発現している細胞における１又はそれ以上の脂肪酸の集合体である脂肪酸組成物を提供する。好ましくは、本発明のLPAAT3又は4が発現している形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物である。脂肪酸は、遊離脂肪酸でもよいし、トリグリセリド、リン脂質等でもよい。特に、本発明の脂肪酸組成物は、その脂肪酸組成において、以下の
i)  オレイン酸含有量
ii)  パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率
iii)  パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに
iv)  パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率のうちの少なくとも一つ以上が、本発明の組換えベクターで形質転換されていない宿主を培養して得られる培養物の前記比率より高いこと、又は、本発明の脂肪酸組成物におけるアラキドン酸含有率が、前記組換えベクターで形質転換されていない宿主を培養して得られる培養物より高いことを特徴とする。ここで、「本発明の組換えベクターで形質転換されていない宿主」とは、例えば、本明細書中の「本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素をコードする核酸」の項目で記載した核酸が組み込まれていないベクター（空ベクター）で形質転換された宿主である。なお、上記脂肪酸組成物については、上記「本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素をコードする核酸」の項目でも説明したように培養条件を変化させた場合には、その脂肪酸組成が多少変化する場合もある。【０１０５】
本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸としては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐状のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリスチン酸（テトラデカン酸）(14:0)、ミリストレイン酸（テトラデセン酸）（14：1）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）(16:0)、パルミトレイン酸（9−ヘキサデセン酸）(16:1)、ステアリン酸（オクタデカン酸）(18:0)、オレイン酸（cis−9−オクタデセン酸）(18:1(9))、バクセン酸（11−オクタデセン酸）(18:1(11))、リノール酸（cis, cis−9,12 オクタデカジエン酸）(18:2(9,12))、α−リノレン酸（9,12,15−オクタデカントリエン酸）(18:3(9,12,15))、γ−リノレン酸（6,9,12−オクタデカントリエン酸）(18:3(6,9,12))、ステアリドン酸(6,9,12,15-オクタデカンテトラエン酸)(18:4(6,9,12,15))、アラキジン酸（イコサン酸）(20:0)、（8,11−イコサジエン酸）(20:2(8,11))、ミード酸（5,8,11−イコサトリエン酸）(20:3(5,8,11))、ジホモγ-リノレン酸（8,11,14-イコサトリエン酸）(20:3(8,11,14))、アラキドン酸（5,8,11,14−イコサテトラエン酸）(20:4(5,8,11,14))、エイコサテトラエン酸（5,11,14,17-イコサテトラエン酸）（20:4(5,11,14,17)、エイコサペンタエン酸（5,8,11,14,17-イコサペンタエン酸）（20:5(5,8,11,14,17)）、ベヘン酸（ドコサン酸）(22:0)、（7,10,13,16-ドコサテトラエン酸）(22:4(7,10,13,16))、（4,7,13,16,19-ドコサペンタエン酸）(22:5(4,7,13,16,19))、（4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸）(22:5(4,7,10,13,16))、（4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸）(22:6(4,7,10,13,16,19))、リノグリセリン酸（テトラドコサン酸）(24:0)、ネルボン酸（cis−15−テトラドコサン酸）(24:１)、セロチン酸（ヘキサドコサン酸）(26:0)等があげられるが、これらに限定されない。なお、上記物質名はIUPAC生化学命名法で定義された慣用名であり、組織名及び、炭素数と二重結合の位置を示す数値を、カッコ内に記載した。【０１０６】
本発明の脂肪酸組成物の特徴の一つとして、アラキドン酸含有率が高いことがあげられる。アラキドン酸は、化学式Ｃ２０Ｈ３２Ｏ２で示される、分子量３０４．４７の物質で、４つの二重結合を含む２０個の炭素鎖からなるカルボン酸（〔２０：４（ｎ−６）〕）で、（ｎ−６）系に分類される。アラキドン酸は、動物の細胞膜中の重要なリン脂質（特にホスファチジルエタノールアミン・ホスファチジルコリン・ホスファチジルイノシトール）として存在し、脳に多く含まれる。またアラキドン酸は、アラキドン酸カスケードにより生成するプロスタグランジン・トロンボキサン・ロイコトリエンなど一連のエイコサノイドの出発物質であり、細胞間のシグナル伝達におけるセカンドメッセンジャーとしても重要である。一方、アラキドン酸は、動物ではリノール酸を原料として体内で合成される。しかし、動物の種あるいは年齢等によっては、この機能が十分でないため必要な量を生産することかできないか、あるいは全く生産する機能がないため、食物からアラキドン酸を摂取しなければならず、アラキドン酸は必須脂肪酸であるといえる。【０１０７】
本発明の脂肪酸組成物中のアラキドン酸含有率は、例えば、以下のように測定することができる。すなわち、本発明のLPAAT3又は4のプラスミドを、例えば、実施例９に記載の方法によりpDuraSCやpDura5MCS等のベクターに挿入し、M. alpina株で形質転換して得られた形質転換体を発現させて、実施例９に記載した培養方法等に従って得られた培養菌体を用いて菌体内の脂肪酸含有率や培地あたりのアラキドン酸の含有量等を測定する方法である。アラキドン酸の含有量等の分析方法としては、例えば、得られた培養菌体の脂肪酸を塩酸メタノール法により脂肪酸メチルエステルに誘導したあと、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで行う方法があげられる。これによれば、本発明のLPAAT3又は4をM. alpinaで形質転換させた場合は、菌体内の脂肪酸含有率も培地あたりのアラキドン酸生産量も高いことが示されている。このように、アラキドン酸含有率が高い本発明の脂肪酸組成物は、アラキドン酸を効率よく摂取できるため、好ましい。【０１０８】
本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸のうち、１またそれ以上の脂肪酸の組み合わせであれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪酸からなる組成物でもよい。【０１０９】
このような本発明の脂肪酸組成物が得られたこと、つまり、本発明のLPAAT3又は4が発現したことの確認は、公知の一般的な方法を用いて行うことができる。例えば、酵母でLPAATを発現させた場合は、脂肪酸組成の変化として確認することができる。すなわち、上記本発明の脂肪酸組成物の製造方法により得られた凍結乾燥した菌体に、適当な比率で調整したクロロホルム：メタノールを添加して攪拌した後、適当な時間、加熱処理をする。さらに遠心分離により菌体を分離して、溶媒を回収することを数回繰り返す。その後、適当な方法を用いて脂質を乾固させてから、クロロホルム等の溶媒を添加して脂質を溶解する。この試料を適当量分取して、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで分析を行う。【０１１０】
その結果、上記の脂肪酸組成を有する脂肪酸組成物及び/又はアラキドン酸含有率が高い脂肪酸組成物が得られた場合は、本発明の脂肪酸組成物が得られたと判断することができる。なお、本発明のLPAATは、公知のLPAAT脂肪酸組成物の脂肪酸組成とは脂肪酸組成が異なることから、本発明のLPAATは公知のLPAATと基質特異性が異なることが示される。【０１１１】
本発明の脂肪酸組成物を含む食品等
また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業原料（化粧料、医薬（例えば、皮膚外用薬）、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。化粧料（組成物）又は医薬（組成物）の剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をあげることができるが、これらに限定されない。また、食品の形態としては、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。【０１１２】
さらに、本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等があげられるが、これらに限定されない。本明細書においては、食品とは、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称をいう。【０１１３】
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等が含まれる。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。【０１１４】
これらの食品としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）；中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品；天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品；バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品；おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげることができる。しかしながら、本発明の食品は、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品；清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられる。【０１１５】
本発明のLPAATをコードする核酸又はLPAATタンパク質を用いた菌株の評価・選択方法
本発明はまた、本発明のLPAATをコードする核酸又はLPAATタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価や選択を行う方法を提供する。具体的には以下のとおりである。【０１１６】
（１）評価方法
本発明の一態様として、本発明のLPAATをコードする核酸又はLPAATタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価を行う方法があげられる。本発明の上記評価方法としては、まず、本発明の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検菌株である脂質産生菌株の本発明の上記活性について評価する方法があげられる。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、国際特許出願パンフレットＷＯ０１／０４０５１４号、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。【０１１７】
まず、被検菌株のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、いかなる公知の方法をも用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)参照）。【０１１８】
本発明の塩基配列、好ましくは、配列番号３６又は３７に基づいてプライマー又はプローブを設計する。上記プライマー又はプローブは本発明の塩基配列のいずれの部分をも用いることができ、またその設計は公知の手法を用いて行うことができる。プライマーとして用いるポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０塩基以上であり、１５〜２５塩基であることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００塩基が適当である。【０１１９】
上記で作製したプライマー又はプローブを用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明の塩基配列と特異的な配列が存在するか否かを調べる。本発明の塩基配列と特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、本発明の塩基配列に特異的配列の一部または全部を含むポリヌクレオチドまたは上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部または全部を含むポリヌクレオチド、又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、例えば、ＰＣＲ法等によって被検菌株の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定することができる。【０１２０】
本発明の方法に適するＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
サイクル数：１０回以上
などの条件である。得られた反応生成物である増幅産物を、アガロースゲルなどを用いた電気泳動法等により分離して、増幅産物の分子量を測定することができる。これにより、増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか否かを確認することにより、被検菌株の本発明の上記活性を予測又は評価することができる。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方法等で解析することによって、さらに本発明の上記活性をより正確に予測又は評価することができる。なお、本発明の上記活性の評価方法は、上記のとおりである。【０１２１】
また、本発明の上記評価方法としては、被検菌株を培養し、配列番号３６又は３７等の本発明の塩基配列がコードするLPAATの発現量を測定することによって、被検菌株の本発明の上記活性を評価することもできる。なお、LPAATの発現量は、被検菌株を適当な条件で培養し、LPAATのｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することにより測定できる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、ウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。また、上記活性の評価方法として、本発明のLPAATが産生する脂肪酸組成物の組成及び/又はアラキドン酸含有率を測定する方法をあげることもできる。脂肪酸組成物の組成及び/又はアラキドン酸含有率の測定方法は上記のとおりである。【０１２２】
（２）選択方法
本発明の他の態様として、本発明のLPAATをコードする核酸又はLPAATタンパク質を用いて、脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養し、配列番号３６又は３７等の本発明の塩基配列がコードするLPAATの発現量を測定して、目的とする発現量の菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。また、基準となる菌株を設定し、この基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量を比較して、所望の菌株を選択することもできる。具体的には、例えば、基準菌株および被検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。所望の活性には、上記のように、LPAATの発現量及び/又はLPAATが産生する脂肪酸組成物の組成及び/又はアラキドン酸含有率を測定する方法があげられる。【０１２３】
また、本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養して、本発明の上記活性が高いか若しくは低い菌株を選択することにより、所望の活性を有する被検菌株を選択することもできる。所望の活性には、上記のように、LPAATの発現量及び/又はLPAATが産生する脂肪酸組成物の組成及び/又はアラキドン酸含有率を測定する方法があげられる。【０１２４】
被検菌株または基準菌株としては、例えば、上記の本発明のベクターを導入した菌株、上記本発明の核酸の発現が抑制された菌株、突然変異処理が施された菌株、自然変異した菌株などを用いることができるがこれらに限定されない。なお、本発明のLPAAT活性及びLPAATの脂肪酸組成物を形成できる活性及び本発明の細胞内アラキドン酸含有率を高める活性は、例えば本明細書中の「本発明のリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素をコードする核酸」、「本発明の脂肪酸組成物」の項目で記載した方法によって測定することが可能である。突然変異処理としては、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法などがあげられる（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会出版センターなど参照）が、これらに限定されない。【０１２５】
なお、本発明の基準菌株、被検菌株として用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又は酵母等があげられるが、これらに限定されない。具体的には、基準菌株、被検菌株は、異なる属や種に属するいかなる菌株を組み合わせて用いてもよく、被検菌株は１又はそれ以上の菌株を同時に用いてもよい。【０１２６】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１２７】
（１）ＥＳＴ解析
M. alpina 1S-4株を１００ｍｌの培地（１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、３日間２８℃で前培養した。１０Ｌ培養槽（Able Co．，東京）に５Ｌの培地（１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）を入れ、前培養物を全量植菌し、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃の条件で８日間通気攪拌培養した。培養１、２、及び３日目に各々２％、２％、及び１．５％相当のグルコースを添加した。培養１、２、３、６、及び８日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアジニン／ＣｓＣｌ法でtotal ＲＮＡを調製した。Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit（タカラバイオ）を用いて、total ＲＮＡからpoly（Ａ）＋ＲＮＡの精製を行った。各ステージのｃＤＮＡライブラリーを、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)を用いて作製し、ｃＤＮＡの５’側からのワンパスシーケンス解析（８０００クローン×５ステージ）を行った。得られた配列をクラスタリングした。その結果、約５０００の配列を得た。【０１２８】
（２）LPAAT遺伝子ホモログの探索
ＥＳＴ解析で得られた塩基配列をGENEBANKに登録されているアミノ酸配列に対して相同性検索プログラムであるBLASTXで検索し、LPAAT遺伝子のホモログを抽出した。その結果、４つのLPAATのホモログの配列（配列番号１、５、６及び７）を見出した。【０１２９】
上記検索で各々の配列が最も高い同一性を示したタンパク質は次のとおりである。
配列番号５はNeurospora crassa由来の1−アシル−sn−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ様の推定タンパク質（GB accession No.EAA28956）と；
配列番号６はセイヨウナタネ（Brassica napus）由来の1−アシル−sn−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ様の推定タンパク質（GB accession No.T07936）と；
配列番号１はEmericella nidulans由来の1−アシル−sn−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ様タンパク質AtaAp（GB accession No.AAD37345）と；
配列番号７はS. cerevisiae由来の1−アシル−sn−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼタンパク質であるSlc1p（GB accession No.CAA98614）と；
それぞれ最も同一性が高かった。【０１３０】
国際特許出願パンフレットＷＯ２００４／０８７９０２号と米国特許出願ＵＳ２００６／００９４０９０号公報の明細書中に記載されているM. alpinaのLPAATホモログの配列と上記で得られた配列を比較すると、配列番号５はLPAAT1ホモログの部分配列、配列番号６はLPAAT2ホモログの部分配列であった。
そこで、配列番号５にかかる遺伝子をLPAAT1遺伝子、配列番号６にかかる遺伝子をLPAAT2遺伝子、配列番号１にかかる遺伝子をLPAAT3遺伝子、配列番号７にかかる遺伝子をLPAAT4遺伝子とした。【０１３１】
上記の配列について、由来するライブラリーとそのＥＳＴは表２のとおりである。なお、表２には何日目の培養で得られたｃＤＮＡライブラリー由来のクローンであるかを示している。【０１３２】
【表２】
2008146745.tif 000003
【実施例２】
【０１３３】
（１）LPAATホモログのクローニング
配列番号１には990bpからなるＣＤＳ（配列番号８）が含まれており、LPAAT3遺伝子の全長をコードしている配列であると考えられた。この遺伝子によってコードされるタンパク質（LPAAT3p）の推定アミノ酸配列を配列番号２に示した。このＯＲＦ配列を含むＤＮＡをＰＣＲで増幅するために以下のプライマーを作製した。
プライマーI-1:GGATGTCATCAATGTCATCAATAGAG  （配列番号９）
プライマーI-2:CTAACCCCCTCTTCCTCCACCAC     （配列番号１０）
３日目ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、プライマーI-1とI-2により、ExTaq（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃ ２分のあと、９４℃ １分、５４℃ １分、７２℃ ２分を１サイクルとして３０サイクルで行った。
増幅された断片をTOPO-TA cloning Kit（INVITROGEN CORPORATION）を用いてＴＡ−クローニングを行った。いくつかのクローンの塩基配列を確認し、この遺伝子の正しい塩基配列を含むと考えられるクローンをpCR-LPAAT3とした。【０１３４】
配列番号５、６及び７には、LPAATホモログをコードすると考えられるＣＤＳが存在しなかったため、これらの遺伝子の全長をコードするｃＤＮＡをクローン化するために各々の配列に基づき、以下のとおりプライマーを作製した。
配列番号５に基づき設計したプライマー：
プライマー955-1：GGACGTGTCAAGGAAAAGGA  （配列番号１１）
プライマー955-2：TCCTTCAGATGAGCCTCCTG  （配列番号１２）
配列番号６に基づき設計したプライマー：
プライマーA-1：ggcgtccttctccacgtacttc  （配列番号１３）
プライマーA-2：gtgaaatacattccattctacg  （配列番号１４）
配列番号７に基づき設計したプライマー：
プライマーB-1：CCTCGCAAAATGTATCGTGG    （配列番号１５）
プライマーB-2：GATGGGAAGTTGAGCTTGAATG  （配列番号１６）
これらのプライマーを用いて、各々配列番号５、６及び７を構成するＥＳＴを含むｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ExTaq（タカラバイオ）を用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片をTOPO-TA cloning Kit（INVITROGEN CORPORATION）を用いてＴＡ−クローニングを行い、各々のインサート部分の塩基配列を決定した。【０１３５】
その結果、配列番号５の第２０番目から５１８番目、配列番号６の第１１６番目から第６１６番目、配列番号７の第１５９番目から第６８７番目の塩基配列を含むＤＮＡ断片が各々クローン化されたことを確認し、これらのプラスミドを各々pCR-955-P、pCR-A-P及びpCR-B-Pとした。次に、これらのプラスミドを各々鋳型として、上記プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。反応には、ExTaq（タカラバイオ）を用いたが、添付のｄＮＴＰミックスの代わりにＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて、増幅されるＤＮＡをジゴキシゲニン（DIG）ラベルし、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングに用いるプローブを作製した。このプローブを用いて、ＥＳＴ解析でそれぞれの配列を構成するＥＳＴを得たｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。【０１３６】
ハイブリダイゼーションの条件は、次のとおりである。
バッファー：５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド；
温度：４２℃（一晩）；
洗浄条件：０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中（６５℃）で、２０分間×３回；
検出は、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、in vivo エキシジョンにより、プラスミドを切り出し、各プラスミドＤＮＡを得た。【０１３７】
配列番号５を含むｃＤＮＡをスクリーニングして得られたクローンのインサートの塩基配列を配列番号１７に示す。配列番号１７には、第36番目から第1289番目までの1254bpからなるＣＤＳが含まれており、LPAAT1ホモログの全長をコードしている配列が得られたと考えられた。この遺伝子によってコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号１８に示した。配列番号１７を含むプラスミドをpB-LPAAT1とした。【０１３８】
配列番号６を含むｃＤＮＡをスクリーニングして得られた、インサートの長さが最も長いクローンのインサートの塩基配列を配列番号１９に示す。配列番号１９には、第２６番目から第９４９番目までの９２４ｂｐからなるＣＤＳが含まれており、LPAAT2ホモログの全長をコードしている配列が得られたと考えられた。この遺伝子によってコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号２０に示した。配列番号１９を含むプラスミドをpB-LPAAT2とした。【０１３９】
配列番号７を含むｃＤＮＡをスクリーニングして得られたクローンのうち、インサート長のもっとも長いクローンの塩基配列を決定したところ、配列番号１の第１０３番目から第１１４８番目の塩基配列が含まれていた。これは先に得られた配列番号７と共通の配列を含んでいたため、これらをアセンブリすると配列番号３に示す配列が得られた。配列番号３には配列番号２３に示す９４２ｂｐからなるＣＤＳが存在し、LPAATホモログの全長をコードしている配列が得られたと考えられた。この遺伝子によってコードされるタンパク質（LPAAT4p）の推定アミノ酸配列を配列番号４に示した。この領域を含むＤＮＡをＰＣＲにより増幅するために以下のプライマーを作製した。
B-3: CAYGYCCATAGGCTCTTCTAATCC  （配列番号２１）
B-4: GTTTTACTCTTTCAGTGTCCTCC   （配列番号２２）
3日目の菌体より調製したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーB-1とB-2により、ExTaq（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。増幅された断片をpCR2.1-TOPOにＴＡ−クローニングして塩基配列を確認し、この遺伝子の正しい塩基配列を含むとクローンをpCR-LPAAT4とした。【０１４０】
（２）配列解析
上記のようにして得られたM. alpina由来のLPAATホモログのｃＤＮＡ配列をGENEBANKに登録されているアミノ酸配列に対してBLASTXを用いて相同性解析を行った。その結果、各配列に対して最もE-valueの低かった、すなわち同一性の高かったアミノ酸配列は以下のとおりであった。各配列のＯＲＦと、もっとも同一性の高かった配列に係る塩基配列の同一性、及びアミノ酸配列の同一性をclustalWにて求め、以下に合わせて記載した。【０１４１】
配列番号１７は、Aspergillus nidulans由来の1−アシル−sn−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ様の推定タンパク質（GB accession No.EAA60126）の相当する部分のみを比較した場合、塩基配列で５１％、アミノ酸配列で３２．１％であった。【０１４２】
配列番号１９は、Magnaporthe grisea由来の1−アシル−sn−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ様の推定タンパク質（GB accession No.EAA48685）の相当する部分のみを比較した場合、塩基配列で５３％、アミノ酸配列で３１％であった。【０１４３】
配列番号１及び３は、Ustilago maydis由来の1−アシル−sn−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ様の推定タンパク質（GB accession No.EAK87199）の相当する部分のみを比較した場合、配列番号１の塩基配列で４９％、アミノ酸配列で３７％；配列番号３の塩基配列で５１％、アミノ酸配列で３６％であった。【０１４４】
また、配列番号１７と配列番号１９については、各々M. alpina由来の既知のLPAATホモログであるLPAAT1遺伝子（WO2004/087902）とLPAAT2遺伝子（US2006/0094090）及びそれらのコードする推定アミノ酸配列で比較した。上記文献に開示されている配列とM. alpina 1S-4株から取得した配列を各々の相当する領域で比較すると、LPAAT1は塩基配列で８９％、アミノ酸配列で９１％の同一性、LPAAT2は塩基配列で９２％、アミノ酸配列で９８％の同一性であることが確認された。【０１４５】
一方、配列番号１〜４は、既知の塩基配列及びアミノ酸配列と比較しても同一性の著しく高いものはなく、M. alpina由来の新規のLPAAT遺伝子であることと考えられた。各々のｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を図２及び図３に示す。LPAAT3とLPAAT4のＯＲＦ部分のＤＮＡ配列を比較すると同一性は６７％（図４）であり、これらの遺伝子によってコードされるタンパク質LPAAT3pとLPAAT4pの推定アミノ酸配列を比較すると同一性は６９％（図５）であった。【０１４６】
LPAAT3p及びLPAAT4pの推定アミノ酸配列を既知のアミノ酸配列と比較した（図６）。図の下線で示したようにLPAAT3p及びLPAAT4pも、これらのLPAATタンパク質あるいはそのホモログと同様に、グリセロ脂質アシル基転移酵素（Glycerolipid acyltransferase）の保存配列ＨＸ４Ｄ（J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998）が保存されていた。【０１４７】
ここで、図６のアミノ酸のうち、gi_46101966で示されるアミノ酸配列（配列番号４０）はUstilago maydis 521（GB accession No.EAK87199）由来であり、gi_5002178で示されるアミノ酸配列（配列番号４１）はEmericella nidulans由来（GB accession No. AAD37345）であり、gi_6320151で示されるアミノ酸配列（配列番号４２）は、Saccharomyces cerevisiae由来（GB accession No. NP_010231）であり、gi_19115517で示されるアミノ酸配列（配列番号４３）はSchizosaccharomyces pombe 972h-由来（GB accession No. NP_594605）であり、gi_17564032で示されるアミノ酸配列（配列番号４４）はCaenorhabditis elegans由来（GB accession No. NP_505578）である。
【実施例３】
【０１４８】
LPAAT活性の測定
（１）Δslc1:URA3株の育種
酵母のLPAAT活性を担う遺伝子として知られるSLC1のＣＤＳを取得するために以下のプライマーを作製した。
プライマーSLC1-1  ggtgaagggggaattcttc      （配列番号４５）
プライマーSLC1-2  atgtcgacgtggcttaatgcatc  （配列番号４６）
Saccharomyces cerevisiae S288C株のゲノムＤＮＡを取得するため、YPD培地10ｍｌに植菌し、30℃で１日振とう培養した。培養液１．５ｍｌより、Genとるくん（酵母用）（タカラバイオ）を用いて、ＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、プライマーSLC1-1とSLC1-2を用いてＰＣＲ反応により、SLC1のＣＤＳを増幅した。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素EcoRIとSalIで消化し、ベクターpUC18のEcoRI-SalIサイトに挿入したあと、塩基配列を確認し、プラスミドpUC-SLC1を得た。続いて、プラスミドpUC-SLC1を制限酵素SalIで消化した後、末端を平滑化し、セルフライゲーションすることにより、プラスミドpUC-SLC1-2を得た。【０１４９】
SLC1遺伝子の欠失株を以下のとおり作製した。プラスミドｐURA34（特開２００１−１２０２７６号公報）を制限酵素HindIIIで消化し、末端を平滑化して得られた約１．２ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドpUC-SLC1-2を制限酵素EcoRVとHincIIで消化して得られた約３．１ｋｂのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドpUCΔslc1：URA3を構築した。Saccharomyces cerevisiae YPH499株（STRATAGENE）を、プラスミドpUCΔslc1：URA3を制限酵素EcoRIとHindIIIで消化したＤＮＡ断片で形質転換した。形質転換株は、SC-Ura（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）に生育できるものとして選抜した。得られた形質転換株のうち、任意の１株をΔslc1：URA3-1株とした。【０１５０】
（２）Δslc1:URA3株へのLPAAT遺伝子の導入
ScSLC1発現用ベクターを構築するために、pUC-SLC1を制限酵素EcoRIとSalIで消化して得られた０．９ｋｂのＤＮＡ断片を、ベクターpYE22ｍのEcoRI-SalIサイトに挿入し、プラスミドpYE-ScSLC1を構築した。【０１５１】
Δslc1:URA3-1株を、プラスミドpYE22ｍ、pYELPAAT3、pYELPAAT4、pYESLC1でそれぞれ形質転換した。形質転換株は、SC-Trp,Ura（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）に生育できるものとして選抜した。【０１５２】
それぞれのプラスミドから得られた形質転換株の任意の株を、C-3株、LPAAT2-3株、LPAAT3-3株、SLC1-3株とした。【０１５３】
（３)ミクロソーム画分の調製
C-3株、LPAAT3-3株、LPAAT4-3株、SLC1-3株を、それぞれSC-Trp,Ura液体培地１０ｍｌ、30℃で１日間、振盪培養した。この培養液のうち、１ｍｌをSC-Trp,Ura液体培地100ｍｌに植菌し、２８℃で１日間培養した。菌体を遠心分離により集め、1/2量の滅菌水で洗浄したあと、５ｍｌのバッファーＢ（０．６Ｍソルビトール、５ｍＭ2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Acid（ＭＥＳ）、１ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１ｍＭフェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ｐＨ６．０）に懸濁した。フレンチプレスを用いて１６ｋＰａで菌体を破砕し、２００００×ｇ、１時間、４℃にて遠心分離して得られた上清を、さらに１０００００×ｇ、1時間、４℃にて遠心分離し、得られた沈殿物をバッファーＢに溶解し、ミクロソーム画分を調整した。各サンプルに含まれるタンパク質濃度はプロテイン アッセイ ＣＢＢ溶液（ナカライテスク）を用いて定量した。【０１５４】
（４）LPAAT活性の測定
LPAAT活性は、以下のとおり測定した。反応液は、１００μｇ 1-オレオイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-リン酸（ＬＰＡ−１８：１）、５０μｇリノオレオイル コエンザイムＡ（１８：２−ＣｏＡ）、０．５ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、０．５ｍｇ牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーｐＨ７．５、１００μｌミクロソーム画分、全量を５００μｌとした。２８℃で１０分間反応させ、クロロホルム：メタノール１：２を１８７５μｌ添加して反応を停止した。内部標準として、1,2-ジヘプタデカノイル-sn-グリセロ-リン酸を２０μｇ添加した。Ｂｌｉｇｈ＆Ｄｙｅｒらの方法に従って脂質を抽出し、全量を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分画した。ＴＬＣには、シリカゲル６０プレート（メルク）を用い、展開溶媒はクロロホルム：メタノール：酢酸：水＝１７０：２５：２５：４とした。ＰＡ画分を掻きとり、１ｍｌのジクロロメタンと２ｍｌの１０％塩酸メタノールを加え、脂肪酸を塩酸メタノール法によりをメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行い、この画分に含まれるリノール酸量を定量した。上記反応によってＰＡ画分中のリノール酸の酵素液のタンパク質あたりの値を表に示した。【０１５５】
【表３】
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このように、LPAAT3、LPAAT4、SLC1を発現させた株では、上記反応においてＰＡ画分に取り込まれるリノール酸（１８：２）量が増加しており、LPAAT3およびLPAAT4は、LPAAT活性を有することが示された。
【実施例４】
【０１５６】
酵母発現ベクターの構築
LPAAT1、LPAAT2、LPAAT3及びLPAAT4を酵母で発現させるために、以下のとおり酵母発現用ベクターを構築した。【０１５７】
LPAAT1を酵母で発現させるために、以下のとおり、酵母発現ベクターを構築した。すなわち、プラスミドpB-LPAAT1を鋳型として、以下のプライマーLPAAT1-6F（配列番号３８）とLPAAT1-R1（配列番号３９）を用いてExTaq(タカラバイオ)により、ＰＣＲ反応を行った。
LPAAT１-6F: TCTGAGATGGATGAATCCACCACCACCAC     （配列番号３８）
LPAAT１-R1: GTCGACTCAACCAGACGATACTTGCTGCAGAG  （配列番号３９）
得られたＤＮＡ断片について、TOPO-TA cloning Kit（INVITROGEN）を用いて、ＴＡ−クローニングを行い、インサート部分の塩基配列を確認し、正しい塩基配列を持つプラスミドをpCR-LPAAT1とした。このプラスミドを制限酵素EcoRIとSalIで消化して得られた約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を、酵母発現用ベクターpYE22mのEcoRI-SalI部位に挿入し、プラスミドpYE-MALPAAT1を構築した。【０１５８】
LPAAT2を酵母で発現させるために、以下のとおり、酵母発現ベクターを構築した。すなわち、プラスミドpB-LPAAT2を制限酵素KpnIで消化した後、アルカリホスファターゼ処理することにより末端を平滑化し、続いて制限酵素BamHIで消化して得られるＤＮＡ断片を、制限酵素SalIで消化した後末端を平滑化し続いて制限酵素BamHIで消化した酵母用発現ベクターpYE22mに挿入し、プラスミドpYE-MALPAAT2とした。【０１５９】
LPAAT3及び4を酵母で発現させるために、以下のとおり、酵母発現ベクターを構築した。すなわち、プラスミドpCR-LPAAT3又はプラスミドpCR-LPAAT4を制限酵素EcoRIで消化し、インサート部分を切り出し、酵母用発現ベクターpYE22mのEcoRI部位に連結した。挿入したＤＮＡ断片の向きを確認し、pYE22mのGAPDHプロモーターからＯＲＦが転写される向きに挿入されたものを各々pYE-MALPAAT3及びpYE-MALPAAT4とした。
【実施例５】
【０１６０】
酵母の形質転換
プラスミドpYE22m、pYE-MALPAAT1、pYE-MALPAAT2、pYE-MALPAAT3又はpYE-MALPAAT4を用いて酢酸リチウム法により、酵母Saccharomyces cerevisiae EH13-15株（trp1, MATα）(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)に形質転換した。形質転換株は、SC-Trp（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。
【実施例６】
【０１６１】
酵母の培養
各々のベクターでの形質転換株のうち任意の２株ずつ（c-1株、c-2株、LPAAT1-1株、LPAAT1-2株、LPAAT2-1株、LPAAT2-2株、LPAAT3-1株、LPAAT3-2株及びLPAAT4-1株、LPAAT4-2株）を選択して、以下の条件で培養した。【０１６２】
すなわち、前培養として、SC-Trp培地１０ｍｌに酵母をプレートから１白金耳植菌し、３０℃で２日間振盪培養を行った。本培養は、YPD5（酵母エキス２％、ポリペプトン１％、グルコース５％）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振盪培養を行った。
【実施例７】
【０１６３】
酵母の脂肪酸分析
酵母の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。１０ｍｌの滅菌水で洗浄し、遠心分離により再び菌体を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥菌体にクロロホルム：メタノール（２：１）を４ｍｌ添加し、激しく攪拌した後、７０℃で１時間処理した。遠心分離により菌体を分離し、溶媒を回収した。残った菌体に再度クロロホルム：メタノール（２：１）を４ｍｌ添加し、同様に溶媒を回収した。スピードバックで脂質を乾固したのち、２ｍｌのクロロホルムを添加して脂質を溶解した。この試料のうち、２００μｌを分取して、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。
その結果を表４に示す。【０１６４】
【表４】
2008146745.tif 000005
M. alpina由来の４つのLPAATホモログを導入した酵母と、コントロールの酵母の脂肪酸組成を比較した。LPAAT2を導入した酵母の脂肪酸組成はコントロール株と比べて若干オレイン酸の割合が増えるものの、ほとんど差はなかった。また、LPAAT1を導入した酵母の脂肪酸組成は、パルミチン酸の割合がコントロール株に比して上昇する一方、パルミトレイン酸含量の割合は減少した。よって、パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率はコントロール株に比して低くなった。ステアリン酸及びオレイン酸の割合はコントロール株と同程度であった。【０１６５】
一方、LPAAT3又はLPAAT4を導入した酵母ではオレイン酸の割合がコントロール株に比べて１割以上上昇した。一方、パルミトレイン酸、パルミチン酸の割合はいずれも減少していた。パルミチン酸に対するパルミトレイン酸の比は、コントロール株に比べて高くなっていた。【０１６６】
以上の結果から、M. alpina由来の４つのLPAATホモログは、その基質のアシル基の特異性が異なるためにこれらの遺伝子を導入した酵母では各々のホモログで脂肪酸組成が異なっていることが示された。また、上記ホモログを適時使い分けることにより、目的とする脂肪酸組成の生物を育種することができることが示された。
【実施例８】
【０１６７】
アラキドン酸生産酵母での発現解析
（１）アラキドン酸生産酵母の育種
アラキドン酸生産酵母（Saccharomyces cerevisiae）を育種するために、以下のプラスミドを構築した。【０１６８】
まず、M. alpina 1S-4株から調製したｃＤＮＡを鋳型として、Δ12-fとΔ12-r、Δ6-fとΔ6-r、GLELO-fとGLELO-r又はΔ5-fとΔ5-rといった、プライマーの組み合わせでExTaqを用いてＰＣＲを行い、M. alpina 1S-4株のΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、GLELO脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子及びΔ5脂肪酸不飽和化遺伝子を増幅した。
Δ12-f：TCTAGAatggcacctcccaacactattg（配列番号２４）
Δ12-r：AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC（配列番号２５）
Δ6-f：TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag（配列番号２６）
Δ6-r：AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG（配列番号２７）
GLELO-f：TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc（配列番号２８）
GLELO-r：GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC（配列番号２９）
Δ5-f：TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc（配列番号３０）
Δ5-r：AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC（配列番号３１）
これらをTOPO-TA-cloning Kitによりクローン化した。塩基配列を確認し、配列番号３２〜３５の塩基配列を含むクローンをそれぞれプラスミドpCR-MAΔ12DS（配列番号３２の塩基配列を含む）、pCR-MAΔ6DS（配列番号３３の塩基配列を含む）、pCR-MAGLELO（配列番号３４の塩基配列を含む）、pCR- MAΔ5DS（配列番号３５の塩基配列を含む）とした。【０１６９】
一方、プラスミドｐURA34（特開２００１−１２０２７６号公報）を制限酵素HindIIIで消化して得られた約1.2ｋｂのＤＮＡ断片を、ベクターpUC18を制限酵素EcoRIとSphIで消化したあと末端を平滑化し、セルフライゲーションして得られたベクターのHindIIIサイトに挿入し、ベクターのEcoRIサイト側がURA3の５’側であるクローンをpUC-URA3とした。また、YEｐ13を制限酵素SalIとXhoIで消化して得られた約２．２ｋｂのＤＮＡ断片をベクターpUC18のSalIサイトに挿入し、ベクターのEcoRI側がLUE2の５’側であるクローンをpUC-LEU2とした。【０１７０】
次に、プラスミドpCR-MAΔ12DSを制限酵素HindIIIで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素XbaIで消化して得られた約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ベクターpESC-URA（STRATAGENE）を制限酵素SacIで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素SpeIで消化した約６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドpESC-U-Δ12を得た。プラスミドpCR-MAΔ6DSを制限酵素XbaIで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化して得られた約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドpESC-U-Δ12を制限酵素SalIで消化した後末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化した約８ｋｂｐのＤＮＡ断片と連結し、プラスミドpESC-U-Δ12:Δ6を得た。これを制限酵素PvuIIで部分消化して得られた約４．２ｋｂの断片をpUC-URA3のSmaIサイトに挿入し、プラスミドpUC-URA-Δ12:Δ6を得た。【０１７１】
また、プラスミドpCR-MAGLELOを制限酵素XbaIとSacIで消化して得られた約０．９５ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ベクターpESC-LEU（STRATAGENE）を制限酵素XbaIとSacIで消化して得られた約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片と連結し、プラスミドpESC-L-GLELOを得た。プラスミドpCR- MAΔ5DSを制限酵素XbaIで消化した後末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化して得られた約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片とプラスミドpESC-L-GLELOを制限酵素ApaIで消化した後末端を平滑化したものを制限酵素HindIIIで消化して得られた約８．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結して、プラスミドpESC-L-GLELO:Δ5を得た。これを制限酵素PvuIIで消化して得られた約３．２ｋｂ断片をpUC-LEU2のSmaIサイトに挿入し、プラスミドpUC-LEU-GLELO:Δ5を得た。Saccharomyces cerevisiae YPH499株（STRATAGENE）をプラスミドpUC-URA-Δ12:Δ6とプラスミドpUC-LEU-GLELO:Δ5でco-transformationした。形質転換株は、SC-Leu,Ura（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。こうして得られた株のうち、任意の一株をARA3-1株とした。【０１７２】
（２）アラキドン酸生産酵母の形質転換株の取得と解析
ARA3-1株をプラスミドpYE22m、pYE-MALPAAT3、pYE-MALPAAT4でそれぞれ形質転換した。形質転換株は、SC-Trp,Leu,Ura（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。こうして得られた任意の株をそれぞれ、ARA-C、ARA-LPAAT3、ARA-LPAAT4とした。【０１７３】
これらの株を上記SC-Trp,Leu,Ura液体培地１０ｍｌで３０℃、１日間培養し、そのうち１ｍｌをSG-Trp,Leu,Ura（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、ガラクトース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇを混合したもの）１．３ｇ）液体培地１０ｍｌで３０℃、２日間培養し、菌体の脂肪酸分析を行った。菌体の脂肪酸組成を表５に、菌体内の脂肪酸含有率を表６に、菌体のアラキドン酸含有率を表７に各々示した。【０１７４】
【表５】
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【０１７５】
【表６】
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【０１７６】
【表７】
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ARA-LPAAT4株では、飽和脂肪酸であるパルミチン酸とステアリン酸の比率が低下し、リノール酸やアラキドン酸の比率が増加していた。一方、ARA-LPAAT3は、脂肪酸組成はコントロール株と変わらないが、菌体内脂肪酸含有率が増加していた。つまり、LPAAT3が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率もLPAAT4が発現している宿主細胞内のアラキドン酸含有率も、コントロールの細胞内のアラキドン酸含有率よりも高いことが示された。【０１７７】
また、これらのプラスミド導入株各４株を上記SC-Trp,Leu,Ura液体培地１０ｍｌで３０℃、１日間培養し、そのうち１ｍｌをSG-Trp,Leu,Ura液体培地１０ｍｌに植菌して１５℃、７日間培養し、菌体の脂肪酸分析を行った。菌体の脂肪酸組成を表８に、菌体内の脂肪酸含有率を表９に、菌体内のアラキドン酸含有率を表１０に各々示した。【０１７８】
【表８】
2008146745.tif 000009
【０１７９】
【表９】
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【０１８０】
【表１０】
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アラキドン酸生産酵母で、M. alpina由来のLPAAT3を発現させた場合、コントロールと比較して、リノール酸、γ−リノレン酸、ＤＧＬＡ、アラキドン酸といったＰＵＦＡの比率が高くなった。また、菌体内の脂肪酸含有率が高くなった。一方、M. alpina由来のLPAAT4を発現させた場合には、リノール酸、γ−リノレン酸の比率が高くなり、アラキドン酸の比率も高まった。
【実施例９】
【０１８１】
（１）M. alpina発現用ベクターの構築
M. alpina発現用ベクターとして、GAPDHプロモーターから目的遺伝子を発現させるpDuraSCとヒストンプロモーターから目的遺伝子を発現させるpDuraMCSを用いた。
LPAAT3およびLPAAT4をM. alpinaで発現させるために、以下のとおりベクターを構築した。プラスミドpCR-LPAAT3又はプラスミドpCR-LPAAT4を制限酵素EcoRIで消化し、インサート部分を切り出し、ベクターpDuraSCまたはベクターpDura5MCSのマルチクローニングサイトのEcoRIサイトに挿入した。挿入されたＤＮＡの向きを確認し、それぞれのベクターのプロモーターからＯＲＦが転写される向きに挿入されたものを各々プラスミドpDuraSC-LPAAT3、プラスミドpDuraSC-LPAAT4、プラスミドpDura5MCS-LPAAT3、プラスミドpDura5MCS-LPAAT4とした。【０１８２】
（２）M. alpina形質転換株の取得
これらのプラスミドで、M. alpinaより特許文献（ＷＯ２００５/０１９４３７「脂質生産菌の育種方法」）に記載された方法にしたがって誘導したウラシル要求性株Δｕｒａ−３を宿主としてパーティクルデリバリー法で形質転換を行った。形質転換株の選択には、ＳＣ寒天培地（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate（Difco）０．５％、硫酸アンモニウム０．１７％、グルコース２％、アデニン０．００２％、チロシン０．００３％、メチオニン０．０００１％、アルギニン０．０００２％、ヒスチジン０．０００２％、リジン０．０００４％、トリプトファン０．０００４％、スレオニン０．０００５％、イソロイシン０．０００６％、ロイシン０．０００６％、フェニルアラニン０．０００６％、寒天２％）を用いた。【０１８３】
（３）形質転換M. alpinaの評価
得られた形質転換株を、ＧＹ培地（グルコース２％、酵母エキス１％）４ｍｌに植菌し、２８℃で３日間もしくは４日間振とう培養を行った。菌体をろ過により回収し、RNeasy plant kit（QIAGEN）を用いてＲＮＡを抽出した。スーパースクリプトファーストストランドシステム for RT-PCR（インビトロジェン）によりｃＤＮＡを合成した。導入したコンストラクトからの各遺伝子の発現と、トータルの各遺伝子の発現を確認するため、以下のプライマーの組み合わせでＲＴ−ＰＣＲを行った。
○プラスミドpDuraSC-LPAAT3導入株
導入コンストラクトからの発現に用いたプライマー
プライマーMaGAPDHpfw：CACACCACACATTCAACATC（配列番号４７）
プライマーLAT3-2R：GAATCGTAGATATGGTTGTATCCAGCGCT（配列番号４８）
トータルのLPAAT3の発現に用いたプライマー
プライマーLAT3-1F：CTGGCGGTCATCCTTGTTTTCTACCTG（配列番号４９）
とプライマーLAT3-2R（配列番号４８）
○プラスミドpDuraSC-LPAAT4導入株
導入コンストラクトからの発現に用いたプライマー
プライマーMaGAPDHpfw（配列番号４７）
プライマーLAT4-2R：GAATCATAGATGTGTGAGTATCCTTGCGA（配列番号５０）
トータルのLPAAT4の発現に用いたプライマー
プライマーLAT4-1F：TTCTAATCCTGTCCTACTGGCAGCG（配列番号５１）
プライマーLAT4-2R（配列番号５０）
○プラスミドpDura5MCS-LPAAT3導入株
導入コンストラクトからの発現に用いたプライマー
プライマーPD4P：CGCATCCCGCAAACACACAC（配列番号５２）
プライマーLAT3-2R（配列番号４８）
トータルのLPAAT3の発現に用いたプライマー
プライマーLAT3-1F（配列番号４９）とプライマーLAT3-2R（配列番号４８）
○プラスミドpDura5MCS-LPAAT4導入株
導入コンストラクトからの発現に用いたプライマー
プライマーPD4P（配列番号５２）とプライマーLAT4-2R（配列番号５０）
トータルのLPAAT4の発現に用いたプライマー
プライマーLAT4-1F（配列番号５１）とプライマーLAT4-2R（配列番号５０）
上記ＲＴ−ＰＣＲの結果より、各遺伝子の導入コンストラクトからの発現およびトータルの発現の高かったものとして、プラスミドpDuraSC-LPAAT3導入株からGp-LPAAT3-3株、Gp-LPAAT3-29株を、プラスミドpDuraSC-LPAAT4導入株からGp-LPAAT4-26株とGp-LPAAT4-68株を、プラスミドpDura5MCS-LPAAT3導入株からHp-LPAAT3-34株を、プラスミドpDura5MCS-LPAAT4導入株からHp-LPAAT4-26株とHp-LPAAT4-31株をそれぞれ選抜した。【０１８４】
これらの株を、ＧＹ培地４ｍｌ、２８℃、１２５ｒｐｍで、３日間または４日間培養振とう培養した（各ｎ＝３）。培養終了後、菌体をろ過により回収し、凍結乾燥した。乾燥菌体の一部（約１０〜２０ｍｇ程度）をとり、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。菌体内の脂肪酸含有率と、培地あたりのアラキドン酸生産量を以下の表にまとめた。【０１８５】
【表１１】
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【０１８６】
【表１２】
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【０１８７】
【表１３】
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【０１８８】
【表１４】
2008146745.tif 000015
これらの結果より、試験した全ての形質転換M. alpina株は、菌体内の脂肪酸含有率も培地あたりのアラキドン酸生産量もコントロールよりも高いことが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０１８９】
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２２：プライマー
配列番号２４：プライマー
配列番号２５：プライマー
配列番号２６：プライマー
配列番号２７：プライマー
配列番号２８：プライマー
配列番号２９：プライマー
配列番号３０：プライマー
配列番号３１：プライマー
配列番号３８：プライマー
配列番号３９：プライマー
配列番号４５：プライマー
配列番号４６：プライマー
配列番号４７：プライマー
配列番号４８：プライマー
配列番号４９：プライマー
配列番号５０：プライマー
配列番号５１：プライマー
配列番号５２：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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