(57)【要約】    【課題】  本発明は、血清、血漿等の生体試料中の高密度リポ蛋白中コレステロール（ＨＤＬ）の測定方法およびその試薬に関する。    【解決手段】  酵素反応による高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法において、第一反応で、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼおよびこれらの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を含む緩衝液中で、試料中の低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で、第一反応における上記両酵素の高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質をさらに含む緩衝液中で、高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法であって、
第一反応で、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む緩衝液中で、試料中の低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、以下の（ａ）〜（ｄ）を含む緩衝液中で、高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する、
高密度リポ蛋白中のコレステロール測定方法。
（ａ）コレステロールエステラーゼ
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質
（ｄ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
【請求項２】
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体および／または配糖体である請求項１項記載の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項３】
コール酸誘導体が３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドまたはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドより選択される１種または複数である請求項２項記載の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項４】
配糖体がｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−α，β−Ｄ−マルトシド（別名：ドデシルマルトース）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−グルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドより選択される１種または複数である請求項２項記載の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項５】
第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、界面活性剤、第四級アンモニウム塩、ベタイン化合物より選択される１種または複数である請求項１項記載の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項６】
第一反応中に２価金属イオンを含有する請求項１項記載の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項７】
第二反応中に、第一反応のコレステロールエステラーゼとは異なる、高密度リポ蛋白中コレステロールに親和性の高いコレステロールエステラーゼを含有する請求項１項記載の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項８】
第一反応および第二反応のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない請求項１項記載の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項９】
第一反応および第二反応のいずれにおいても、アルブミンを含有しない請求項１項記載の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかに記載の、試料中の高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法に用いるための試薬であって、
第一試薬に、以下の（ａ）〜（ｃ）および緩衝液を含み、かつ、
第一試薬と第二試薬とを合わせた組成物に、以下の（ａ）〜（ｄ）を含むように構成されている、高密度リポ蛋白中のコレステロール測定試薬。
（ａ）コレステロールエステラーゼ
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質
（ｄ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清、血漿等の生体試料中の高密度リポ蛋白中コレステロール（ＨＤＬ）の測定方法およびその試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中の脂質の主な成分は、コレステロール、中性脂肪、リン脂質等である。これら血清脂質はアポ蛋白と結合してリポ蛋白を形成し、血液中を循環している。このリポ蛋白は密度の差によりＨＤＬ、低密度リポ蛋白（ＬＤＬ）、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）等に分類される。これらリポ蛋白のうち、ＨＤＬは組織に沈着した過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、抗動脈硬化作用があることから、冠動脈硬化症をはじめとする各種動脈硬化症の危険予防因子である。このことから、ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の含有量を知ることは、これら疾患の診断、治療、および予防において重要である。【０００３】
従来、ＨＤＬ−Ｃの測定法としては、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法等が知られている。これら従来法のうち、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法は、沈殿・遠心分離処理、超遠心分離処理、電気泳動処理により、ＨＤＬとＨＤＬ以外のリポ蛋白とを分離する前処理工程が必要であるため、操作が煩雑であり、多数の検体を処理できない等の問題があり、日常的にはほとんど用いられていない。【０００４】
また、これまで臨床検査の領域で一般に用いられてきた方法は、検体に沈殿剤を加えてＨＤＬ以外のリポ蛋白質を凝集させ、これを遠心分離によって取り除き、分離されたＨＤＬのみを含む上清中のコレステロールを測定する方法である。この方法は、超遠心法や電気泳動法に比較して簡便であるが、沈殿剤を加えて分離する操作を含むことから、尚、簡便性に問題を残す。【０００５】
一方、近年、ＨＤＬ中のコレステロールを酵素的に分別定量する方法が主流となってきている。例えば、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を抗体とポリアニオンで予め凝集させておき、ＨＤＬ中のコレステロールのみを酵素的に反応させた後に、酵素を失活させると同時に凝集体を再溶解して吸光度を測定するという方法（特許文献１）がある。しかしながら、この方法は少なくとも３回の試薬を添加する操作が必要なため、限定された分析装置にしか適用できず、汎用性の点で問題があった。この問題を解決するために、種々の測定法が報告されてきている。
【特許文献１】特開平６−２４２１１０号公報
【０００６】
ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させてＨＤＬ−Ｃを測定する方法としては、例えばデキストラン硫酸等のＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させる試薬、２価の金属塩、および、化学的に修飾された酵素を用いる測定法（特許文献２）、ポリアニオン等のＨＤＬ以外のリポ蛋白と複合体を形成する試薬と、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物等のリポ蛋白を溶解しない界面活性剤とを用いる測定法（特許文献３）、デキストラン硫酸等のポリアニオン、２価の金属塩、特定の非イオン性界面活性剤および試料由来のアルブミンとは別異のアルブミンとを用いる測定法（特許文献４）、血清または血漿を、リポ蛋自分画剤（デキストラン硫酸等のポリアニオンとマグネシウムイオン等の２価陽イオンとの組み合わせ）を含む溶液で処理し、得られた混合液を固体および液体の分離処理することなく、アニオン性界面活性剤（アルキルスルホン酸または胆汁酸もしくはその誘導体）の存在下に、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼと反応させ、生成した過酸化水素を測定することを特徴とする血清または血漿中のＨＤＬ−Ｃを測定する方法（特許文献５）、生体試料に、ポリアニオン等のＨＤＬ以外のリポ蛋白質と複合体を形成する物質と、リポ蛋白質を溶解しない特定の界面活性剤とを添加した後、酵素的にＨＤＬ−Ｃを測定する方法（特許文献６）等が知られている。しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させるＨＤＬ−Ｃ測定法においては、反応で生成する凝集物による濁りに起因する不正確性、反応セルのアルカリ洗浄の際に、反応液中の金属塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による自動分析装置への過度の負荷等の問題がある。
【特許文献２】特開平８−１３１１９７号公報
【特許文献３】特開平８−２０１３９３号公報
【特許文献４】特開平９−２８５２９８号公報
【特許文献５】特開平８−１１６９９６号公報
【特許文献６】特開平８−２０１３９３号公報
【０００７】
これに対し、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させずに直接ＨＤＬ−Ｃを測定する方法としては、例えば、生体試料と、膵臓由来のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼとを、胆汁酸もしくはその塩およびアルブミン存在下に反応させ、当該酵素反応により消費または生成する化合物を測定することによる生体試料中のＨＤＬ−Ｃの測定方法（特許文献７）、ＨＤＬ画分に対して反応選択性をもつＨＬＢ値が１６以上の非イオン性界面活性剤の存在下に、検体と、ＨＤＬ画分に優先的に作用するリポプロテインリパーゼおよび／またはコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼとを反応させて、検体中のＨＤＬ−Ｃを測定する方法（特許文献８）等が知られている。また、検体とコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを、非イオン性界面活性剤、ポリアニオンおよびアルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素を測定するＨＤＬ−Ｃの測定法（特許文献９）、検体とコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを、胆汁酸誘導体、アルブミンを含有する水性媒体中で反応させ、生成した過酸化水素を測定するＨＤＬ−Ｃの測定法（特許文献１０）が知られている。
【特許文献７】国際公開第９７／４０３７６号
【特許文献８】国際公開第００／５２４８０号
【特許文献９】国際公開第０４／３５８１６号
【特許文献１０】国際公開第０４／３５８１７号
【０００８】
しかしながら、これらのＨＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させず直接ＨＤＬ−Ｃを測定する方法においては、例えばアルブミン、ポリアニオンを用い、ＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールに対し酵素が作用しないようにし、ＨＤＬ−Ｃにのみ酵素を作用させ測定するが、アルブミン、ポリアニオンでは、ＶＬＤＬ、ＣＭを多く含む乳び検体において、ＶＬＤＬ、ＣＭが高濃度であるため、これらに対する酵素反応の阻害が不十分となり測定値が高値化する。また、自動分析機による２ポイントアッセイ（検体ブランク補正）においては、第一反応における検体の濁りに起因する吸光度が第二反応で濁りの原因であるＶＬＤＬ、ＣＭにコレステロールエステラーゼなどが一部作用してしまい、検体に起因する濁りが減少することにより、見かけ上吸光度が減少し測定値が低値化する場合がある。このように、酵素の非特異反応、さらには光学的な影響により測定値の不正確性が問題となる場合がある。【０００９】
また、Ｍ蛋白血症や骨髄腫等の患者由来の検体では、水不溶性の蛋白に起因する濁りが正確な測定に影響を与えることが大きな問題となっている。この光学的な影響を回避するために、反応液中の塩類を高濃度とし、水不溶性蛋白に起因する濁りを解消させる方法が一般的に知られている。しかしながら、ＨＤＬ−Ｃの測定においては、高濃度の塩類を存在させることによりＨＤＬ−Ｃに対する特異性が低下し、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭに対する非特異反応が増大することから、高濃度の塩類の存在下でもＨＤＬ−Ｃを正確に測定する方法が望まれている。【００１０】
これに対し、ＨＤＬ以外のリポ蛋白を予め測定系外に導き消去し、その後、残存するＨＤＬ−Ｃを測定する方法が提案されている。例えば、アシルポリオキシエチレンソルビタンエステルによりＨＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを優先的に過酸化水素へ変換し、生成した過酸化水素を消去した後、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの添加により、ＨＤＬ−Ｃを酵素的に測定する方法（特許文献１１）が知られている。また、第一反応においてｐＨ５〜８を維持する緩衝液中、及び２価の金属イオンの存在下において、被検試料にコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼを作用させ、生じた過酸化水素を除去することにより、被検試料中の高密度リポ蛋白以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、次いで、第二反応において前記第１工程の産物に、高密度リポ蛋白に特異的に作用する、ＨＬＢが１３〜１４の界面活性剤を加え、高密度リポ蛋白中のコレステロールをコレステロールエステラーゼ及びコレステロールオキシダーゼの作用により生じた過酸化水素を定量する方法（特許文献１２）、が知られている。
【特許文献１１】特開平９−２９９号公報
【特許文献１２】特開平１０−９５６００号公報
【００１１】
これらの方法においては、第一反応においてＨＤＬ以外のリポ蛋白を消去するが、第一反応時間内に完全に消去しきれず、第二反応において一部ＬＤＬ−Ｃが存在することから、これらに対するコレステロールエステラーゼなどの酵素反応を阻害しＨＤＬ−Ｃのみに特異的に作用させる界面活性剤を用いる。しかしながら、このような界面活性剤はＬＤＬ−Ｃに対する酵素反応を阻害するものの、ＨＤＬ−Ｃに対する反応も一部阻害してしまうことから、反応終点測定ができず希釈直線性がシグモイドとなり、定量性を損なう。また、この方法においてもＶＬＤＬ、ＣＭを多く含む乳び検体の測定においては、ＶＬＤＬ、ＣＭが高濃度であるため第一反応での消去が不十分となり、自動分析機による２ポイントアッセイ（検体ブランク補正）においては、第一反応における検体の濁りに起因する吸光度が第二反応で濁りの原因であるＶＬＤＬ、ＣＭに界面活性剤またはコレステロールエステラーゼなどが一部作用してしまい、検体に起因する濁りが減少することにより、見かけ上吸光度が減少し測定値が低値化する場合がある。このようなことから、高濃度のＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの存在下でもＨＤＬ−Ｃを正確に測定する方法が望まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
このことから、本発明が解決しようとする課題は、遠心分離、電気泳動等の前処理の必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能であり、反応液の塩濃度の影響なく、高濃度のＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの存在下でも特異性、精密性よくＨＤＬ−Ｃを測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、試料中の高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、
第一反応でＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに作用する、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ、これらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、さらに、第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を含む緩衝液中で、高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定することで、ＨＤＬ−Ｃを簡便に、特異性、精密性良く分別測定できることを見出した。また、本測定法ではポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく、自動分析機への適用性が優れていることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）
試料中の特定のリポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法であって、
第一反応で、以下の（ａ）〜（ｃ）を含む緩衝液中で、試料中の低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、以下の（ａ）〜（ｄ）を含む緩衝液中で、高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する、
高密度リポ蛋白中のコレステロール測定方法。
（ａ）コレステロールエステラーゼ
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質
（ｄ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
（２）
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体および／または配糖体である（１）記載の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（３）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドまたはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドより選択される１種または複数である（２）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（４）コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．００１〜０．２％である（２）または（３）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（５）配糖体がｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−α，β−Ｄ−マルトシド（別名：ドデシルマルトース）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−グルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドより選択される１種または複数である（２）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（６）配糖体の第一反応中の濃度が、０．００１〜０．２％である（２）または（５）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（７）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、界面活性剤、第四級アンモニウム塩、ベタイン化合物より選択される１種または複数である（１）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（８）界面活性剤が、ＨＬＢが１４以上であるポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、またはコール酸類、アルキルスルホン酸類である（７）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（９）第四級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、である（７）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１０）ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体、である（７）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１１）第一反応中に２価金属イオンを含有する（１）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１２）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（１１）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１３）第二反応中に、第一反応のコレステロールエステラーゼとは異なる、高密度リポ蛋白中コレステロールに親和性の高いコレステロールエステラーゼを含有する（１）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１４）第一反応および第二反応のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない（１）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１５）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（１４）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１６）第一反応および第二反応のいずれにおいても、アルブミンを含有しない（１）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１７）
（１）ないし（１６）のいずれかに記載の、試料中の高密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法に用いるための試薬であって、
第一試薬に、以下の（ａ）〜（ｃ）および緩衝液を含み、かつ、
第一試薬と第二試薬とを合わせた組成物に、以下の（ａ）〜（ｄ）を含むように構成されている、高密度リポ蛋白中のコレステロール測定試薬。
（ａ）コレステロールエステラーゼ
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質
（ｄ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
（１８）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼおよびこれらの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体および／または配糖体である（１７）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１９）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドまたはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドより選択される１種または複数である（１８）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２０）コール酸誘導体の第一試薬中の濃度が、０．００１〜０．２％である（１８）または（１９）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２１）配糖体がｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−α，β−Ｄ−マルトシド（ドデシルマルトース）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−グルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドより選択される１種または複数である（１８）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（６）配糖体の第一試薬中の濃度が、０．００１〜０．２％である（１８）または（２１）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２２）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、界面活性剤、第四級アンモニウム塩、ベタイン化合物より選択される１種または複数である（１７）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２３）界面活性剤が、ＨＬＢが１４以上であるポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、またはコール酸類、アルキルスルホン酸類である（２２）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２４）第四級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、である（２２）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２５）ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体、である（２２）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２６）第一試薬中に２価金属イオンを含有する（１７）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２７）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（２６）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２８）第二試薬中に、第一反応のコレステロールエステラーゼとは異なる、高密度リポ蛋白中コレステロールに親和性の高いコレステロールエステラーゼを含有する（１７）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２９）第一試薬および第二試薬のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない（１７）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（３０）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（２９）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（３１）第一試薬および第二試薬のいずれにおいても、アルブミンを含有しない（１７）の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、遠心分離、電気泳動等の前処理の必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能であり、反応液の塩濃度の影響なく、高濃度のＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭの存在下でも特異性、精密性よくＨＤＬ−Ｃを測定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明で用いるコレステロールオキシダーゼ（コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明においては、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＨＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
コレステロールオキシダーゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましい下限は、第一試薬中で通常０．５Ｕ／ｍＬ、好ましくは１Ｕ／ｍＬであり、好ましい上限は、通常１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。【００１６】
また、第二反応時に、第一試薬と同起源または異なる起源のコレステロールオキシダーゼ、または、これらのアミノ酸配列を改変したコレステロールオキシダーゼ、または、化学修飾したコレステロールオキシダーゼを添加してもよい。酵素の使用量は特に限定されるものではないが、好ましくは第二反応中で０〜５Ｕ／ｍＬで用いられる。【００１７】
本発明に用いるコレステロールエステラーゼ（コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、スエヒロタケ属、キャンディダ属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明の第一反応においては、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＨＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。このようなコレステロールエステラーゼとしてスエヒロタケ属を起源とするものが挙げられる。
コレステロールエステラーゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましい下限は、第一試薬中で通常０．１Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．５Ｕ／ｍＬであり、好ましい上限は、通常１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。【００１８】
また、第二反応時に、第一試薬と同起源または異なる起源のコレステロールエステラーゼ、または、これらのアミノ酸配列を改変したコレステロールエステラーゼ、または、化学修飾したコレステロールエステラーゼを添加してもよい。
本発明の第二反応においては、ＨＤＬ−Ｃ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。このようなコレステロールエステラーゼとしてシュードモナス属のものが挙げられるが、更には、これら酵素のＨＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
第二反応において添加されるコレステロールエステラーゼは、第一反応に含まれるコレステロールエステラーゼが、第一反応において試料中の低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去するためには十分に機能するが、第二反応においては高密度リポ蛋白中のコレステロールを測定するために十分に機能しないような場合（例えば、「第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質」によって、阻害等の影響を受ける場合）にも、用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
コレステロールエステラーゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましい下限は、第二反応中で通常０．１Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．５Ｕ／ｍＬであり、好ましい上限は、通常１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。【００１９】
なお、本発明で用いるコレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼは、いずれも「第一反応でＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに実用上十分に作用する酵素」を意味する。すなわち、「第一反応でＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールのいずれかに対して十分に作用しない」酵素は本願発明の方法および試薬に使用することはできない。
「実用上十分」とは、血清試料中に標準的に含まれるとされる濃度の、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭそれぞれのコレステロールに作用し、これを消去するに十分であることをいう。【００２０】
本発明で用いる、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質としては、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性への影響が実質的になく、ＨＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させるものであれば特に限定はない。
このような物質として例えばコール酸誘導体、または配糖体がある。コール酸誘導体としては、特に限定されないが、好ましくは３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、１２−オキソリトコール酸、１２−オキソケノデオキシコール酸、７−オキソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、デヒドロコール酸等およびこれらの塩が挙げられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。なかでも少ない添加量でＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させ得ることから、更に好ましくはＮ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドおよびその塩が良い。また、これらのコール酸誘導体より選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。
これらの使用量としては特に限定されるものではないが、コール酸誘導体の総量として第一試薬中で通常０．００１〜５％の範囲で用いられ得るが、好ましくは限界ミセル濃度（ｃ．ｍ．ｃ）付近かそれ以下で使用するのがよい。これは、これらコール酸誘導体の本来ある界面活性剤としての作用が反って本発明の期待するコレステロールエステラーゼおよび／またはコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応阻害効果を弱めることに起因する。したがって、限界ミセル濃度を超える濃度または大きく下回る濃度で使用するとＨＤＬ−Ｃに対する反応阻害効果は軽減または消失してしまう。
限界ミセル濃度の測定は電気伝導度、浸透圧、氷点降下、蒸気圧、粘度、密度、可溶化能、洗浄力、光散乱、色素の変化などの物理性質の急変点を測定することで測定が可能である。例えば、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸の限界ミセル濃度は、０．５０％（ｗ／ｖ）であり、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸は０．５１％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドは０．２６％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドは０．１２％（ｗ／ｖ）であることが知られている。したがって、これらの好ましい使用量としては０．０１〜０．６％である。また、その他のコール酸誘導体についても同じく限界ミセル濃度を知ることで使用量の最適化が可能である。【００２１】
配糖体としては、特に限定されないが、好ましくはｎ−ドデシル−α−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−α，β−Ｄ−マルトシド（ドデシルマルトース）、ｎ−ヘプチル−β−Ｄ−チオグルコシド、ジギトニン、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、２−エチル−ヘキシルグルコシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−グルカミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミドであり、少ない添加量でＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させ得ることから、更に好ましくは、ドデシルマルトース、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ジギトニンが良い。また、これらの配糖体より選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。また、前述のコール酸誘導体とこれらより選択される１種または複数を組合わせて用いてもよい。これらの使用量としては特に限定されるものではないが、配糖体の総量として第一試薬中で通常０．００１〜５％の範囲で用いられ得る。【００２２】
本発明において「阻害」とは、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させることを意味する。【００２３】
本発明で用いる２価金属イオンとしては、ＨＤＬ−Ｃ以外のリポ蛋白中コレステロールに対する反応性を向上させることを目的として、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンが用いられるが、好ましくは、マグネシウムイオン、カルシウムイオンが好適である。また、これらの２価金属イオンは選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。また、少なくとも第一試薬に添加されていればよい。これらの使用量は特に限定されるものではないが、自動分析機への適用性を考慮し、第一試薬中で通常０．０００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．００５〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。【００２４】
本発明のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質とは、第一試薬中におけるＨＤＬ−Ｃに対する阻害を、当該物質を含む第二試薬の添加により軽減または消失が可能なものであれば特に限定されないが、このような物質として、界面活性剤、第四級アンモニウム塩、ベタイン化合物が挙げられ、これらは単独または複数が組み合わせて用いられる。また、第一試薬中におけるＨＤＬ−Ｃに対する阻害は、前述のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質を限界ミセル濃度を大きく超える濃度または大きく下回る濃度で使用することによりＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質となりうる。
言い換えれば、例えば後述の実施例における組成５のように、第二試薬に「第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質」を含有させなくても、試薬組成や第一試薬と第二試薬の液比を、第二反応において「コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質」の濃度が限界ミセル濃度を下回るよう設定することにより、本願発明を実施することができる。
また、例えば後述の実施例における組成６のように、第二試薬にも「コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの高密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質」を含有させ、試薬組成や第一試薬と第二試薬の液比を、その濃度が限界ミセル濃度を上回るよう設定することにより、本願発明を実施することができる。【００２５】
界面活性剤としては、好ましくはポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル、またはコール酸類、アルキルスルホン酸類が挙げられるが、非イオン界面活性剤についてはＨＬＢが１４以上で用いることが好ましい。これら界面活性剤より選択される１種または複数の界面活性剤を混合することによりＨＬＢを上記の範囲内に調整することもでき、このような複数の界面活性剤の混合物を用いることもできる。なお、界面活性剤のＨＬＢの算出方法は周知であり、例えば「新界面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版編に記載されている。
これら界面活性剤を具体的に挙げると、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としては、エマルゲンＡ９０（ＨＬＢ：１４．５）等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１４）、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１５）等が挙げられる。本発明で用いるポリオキシエチレン直鎖アルキルエーテルとしては、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル類としてエマルゲン１２０（ＨＬＢ１５．３）、エマルゲン１２３Ｐ（ＨＬＢ１６．９）、エマルゲン１４７（ＨＬＢ１６．３）、エマルゲン１３０Ｋ（ＨＬＢ１８．１）、ノニオンＫ−２１５（ＨＬＢ１５．２）、ノニオンＫ−２２０（ＨＬＢ１６．２）、ノニオンＫ−２３０（ＨＬＢ１７．３）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ（ＨＬＢ１４．５）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−２１（ＨＬＢ１９）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−２５（ＨＬＢ１９．５）、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２２０（ＨＬＢ１４．２）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−１５ＴＸ（ＨＬＢ１５．５）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２０ＴＸ（ＨＬＢ１７）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２３（ＨＬＢ１８）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２５ＴＸ（ＨＬＢ１８．５）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−３０ＴＸ（ＨＬＢ１９．５）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−４０ＴＸ（ＨＬＢ２０）、ノニオンＰ−２１３（ＨＬＢ１４．１）、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＳ−２０（ＨＬＢ１８）、ノニオンＳ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ノニオンＳ−２２０（ＨＬＢ１５．３）、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４３０（ＨＬＢ１６．２）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−２（ＨＬＢ７．５）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−１０ＴＸ（ＨＬＢ１４．０）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−２０（ＨＬＢ１７．０）、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−５０（ＨＬＢ１８．０）、ノニオンＥ−２１５（ＨＬＢ１４．２）、ノニオンＥ−２３０（ＨＬＢ１６．６）、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−２０（ＨＬＢ１６．５）ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−３０（ＨＬＢ１８）等が挙げられる。アルキルスルホン酸類としては、１−ペンタスルホン酸、１−ヘキサスルホン酸、１−ヘプタスルホン酸、１−オクタスルホン酸等およびこれらの塩が挙げられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。これらの使用量は、自動分析機への適用性および第一試薬におけるＨＤＬ−Ｃに対する阻害を軽減または消失するための必要量を設定する。第ニ試薬中で通常０．００５〜２％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０５〜０．５％（ｗ／ｖ）である。【００２６】
第四級アンモニウム塩としては特に限定されないが、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、塩化モノアルキルトリメチルアンモニウム、塩化モノアルキルベンジルジメチルアンモニウム、ジアルキルエチルメチルアンモニウムエトサルフェート、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、ポリアルキレンオキシ化アルキルメチルアンモニウムクロライド、塩化アルキルジアンモニウムなどが挙げられる。これらの使用量は、第ニ試薬中で通常０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．２〜３％（ｗ／ｖ）である。【００２７】
ベタイン化合物としては特に限定されないが、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体等が挙げられる。これらの使用量は、第ニ試薬中で通常０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．２〜３％（ｗ／ｖ）である。【００２８】
本発明で用いる色原体としては特に限定されないが、水素供与体、ロイコ体、テトラゾリウム塩などが挙げられる。【００２９】
水素供与体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。また、これら水素供与体はカップラーと組合わせてして用いることができる。カプラーとしては４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。【００３０】
また、ロイコ体としては、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。【００３１】
また、テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。【００３２】
色原体の使用量としては、溶解度を考慮して反応終濃度として０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。【００３３】
また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。第一試薬における該緩衝液のｐＨはＨＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させる目的で５〜８の範囲で調整される。さらには５．５〜７．５が好ましい。また、第二試薬は、第二試薬との混合したときのｐＨを考慮し、ＨＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させる目的で７〜９が好ましい。これらの使用量は、通常０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０２〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。【００３４】
本発明において、アスコルビン酸オキシダーゼ、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。また、特異性を補完する特定のリポ蛋白に親和性を有する物質を添加してよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、メチルイソチアゾリノン、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。本発明では試薬中塩類の濃度の影響をほとんど受けることがない。酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。また、特異性を補完する特定のリポ蛋白に親和性を有する物質として、ポリアニオン、アルブミン、抗体、抗生物質、レクチンなどが挙げられるが、本発明によるとこれらを添加しなくとも特異性を確保することができる。ポリアニオンとしては例えば、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミドがあるが、自動分析機の洗浄機構の反応で生成する凝集物による濁りに起因する不正確性、反応セルのアルカリ洗浄の際に、反応液中の金属塩との反応で生成する金属水酸化物の析出による自動分析装置への過度の負荷等の問題があるので、含有しないことが好ましい。また、アルブミンはＬＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃのブロッキング効果がありＨＤＬ−Ｃ測定で用いられることがあるが、特異性にロット間差があり、測定値変動の要因になりうることから、含有しないことが好ましい。【００３５】
本発明において、第一反応におけるＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを優先的に消去する方法としては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素を、例えばカタラーゼ、またはペルオキシダーゼと前述の色原体、またはペルオキシダーゼと前述のカプラーを用いて消去することができるが、特に限定されない。【００３６】
本発明の一実施態様として、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、ペルオキシダーゼ、カプラー、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＨＤＬ−Ｃ測定試薬がある。【００３７】
また、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、ペルオキシダーゼ、カプラー、コレステロールエステラーゼ、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＨＤＬ−Ｃ測定試薬がある。【００３８】
また、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、ペルオキシダーゼ、カプラー、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＨＤＬ−Ｃ測定試薬がある。【００３９】
また、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、ペルオキシダーゼ、カプラー、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＨＤＬ−Ｃ測定試薬がある。【００４０】
また、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、カプラー、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＨＤＬ−Ｃ測定試薬がある。【００４１】
また、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、カプラー、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＨＤＬ−Ｃ測定試薬がある。【００４２】
また、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、カプラー、コレステロールエステラーゼ、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＨＤＬ−Ｃ測定試薬がある。【００４３】
また、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、カプラー、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールエステラーゼ、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＨＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質等を構成するＨＤＬ−Ｃ測定試薬がある。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
下記組成１〜２０のＨＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し下記測定条件で、試料としてヒト血清より精製したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭを測定し、各測定値より各々のリポ蛋白中のコレステロール濃度を１００％ととして相対％を求めた。また、比較例として下記組成２１、２２のＨＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の検討を行なった。尚、精製リポ蛋白画分の調製はＨａｔｃｈ  ａｎｄ  Ｌｅｅｓの方法の、３種の密度液を用い超遠心分離にて分離・分取した。【００４５】
（試薬の調製）
下記組成１〜２２のＨＤＬ−Ｃ測定試薬をそれぞれ調製した。
組成１
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲンＡ９０（花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００４６】
組成２
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲンＡ９０（花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００４７】
組成３
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲンＡ９０（花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００４８】
組成４
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲンＡ９０（花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００４９】
組成５
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５０】
組成６
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５１】
組成７
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化コリン  ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５２】
組成８
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
塩化コリン  ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５３】
組成９
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ベタイン一水和物  ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５４】
組成１０
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
ベタイン一水和物  ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５５】
組成１１
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５６】
組成１２
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５７】
組成１３
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
塩化コリン  ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５８】
組成１４
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
ベタイン一水和物  ３ｇ／Ｌ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００５９】
組成１５
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００６０】
組成１６
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド（同仁化学社製）  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００６１】
組成１７
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
タウロコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）  ０．４％  
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００６２】
組成１８
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
ドデシルマルトース（同仁化学社製）  ０．０１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００６３】
組成１９
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（同仁化学社製）  ０．０１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００６４】
組成２０
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
ジギトニン（同仁化学社製）  ０．０１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲン１２０（花王社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００６５】
組成２１
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
トリトンＸ−１００  ０．１％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００６６】
組成２２
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００６７】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．４μＬに第一試薬  １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍ主波長、８００ｎｍ副波長で吸光度を測定した。ＨＤＬ−Ｃ濃度未知試料のＨＤＬ−Ｃ濃度の算出は、精製水および６０ｍｇ／ｄＬ  ＨＤＬ−Ｃ標準血清の測定吸光度より算出して求めた。【００６８】
【表１】
2008087895.tif 000002
【００６９】
結果    表１に示す。実施例の組成１〜２０はいずれもＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異反応は１０．０％未満であり、良好な特異性が確認された。一方、比較例の組成２１はＨＤＬ−Ｃの回収率が不良であり、組成２２はＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異が大きい。【００７０】
（実施例２）
実施例１に示す組成１〜２０のＨＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例１に示す測定条件で、試料として血清２０検体を測定した。また、比較例として下記組成２１、２２のＨＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の測定を行なった。各試薬における測定値は、第一化学社製  分画剤試液により分画した試料を東洋紡社製  コレスカラー・リキッドで測定して算出したＨＤＬ−Ｃ値を対照として相対％を求めた。【００７１】
【表２】
2008087895.tif 000003
【００７２】
【表３】
2008087895.tif 000004
【００７３】
結果    表２に測定値を示し、表３に対照の測定値に対する相対％の最大、最小、平均を示し、また、測定値の相関係数、傾き、Y切片を示す。各組成の相対％は、実施例の組成１で８４．１〜１１６．７％、組成２で８１．８〜１２１．４％、組成３で７９．５〜１２０．８％、組成４で７９．５〜１２０．８％、組成５で８４．１〜１１６．７％、組成６で８５．７〜１１４．３％、組成７で８４．１〜１１６．７％、組成８で８６．４〜１１６．７％、組成９で８６．４〜１１２．５％、組成１０で８６．４〜１１３．２％、組成１１で９０．９〜１０８．３％、組成１２で８８．６〜１０８．３％、組成１３で９２．９〜１０８．３％、組成１４で９０．９〜１０８．３％、組成１５で９２．９〜１０６．９％、組成１６で９１．４〜１０９．１％、組成１７で９１．４〜１０８．３％、組成１８で９４．３〜１１２．５％、組成１９で９４．３〜１０９．１％、組成２０で９４．３〜１１０．３％、と良好であった。また、組成１〜２０の相関係数は０．９５以上で傾き、Ｙ切片が良好であった。一方、比較例では、組成２１で１００．０〜１９６．４％、組成２２で６１．４〜１７８．６％であり、Ｙ切片が大きく、特異性に問題があった。【００７４】
（実施例３）
実施例１に示す組成１２、１５、２０のＨＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例１に示す測定条件で、試料として血清９容に対し干渉チェックＡプラス・乳び（シスメックス社製）を３００００ホルマジン濁度に調製した試料を１容添加したもの、および乳びに変えてブランク用試料を添加したものを各々測定し、乳び３０００ホルマジン濁度の測定値をブランク用試料の測定値に対する相対％として求め、乳びの影響を算出した。また、比較例として、実施例１で示す組成２２および以下の組成２３、２４のＨＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例と同様の測定を行なった。【００７５】
組成２３
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  ５ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．１％
牛血清アルブミン（シグマ）  ２．５ｇ／Ｌ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ８．２
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．３％
化学修飾コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１３）  １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００７６】
組成２４
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ６．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３０１）  ２Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ  １００ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲンＢ６６（花王社製、ポリオキシエチレン誘導体、ＨＬＢ１３．２）  ０．３％
アジ化ナトリウム  ０．１％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．４ｇ／Ｌ【００７７】
【表４】
2008087895.tif 000005
【００７８】
結果    表４に相対％を示す。各組成の相対％は、実施例の組成１２で９８．３％、組成１５で９８．２％、組成２０で１００．０％と良好であった。一方、比較例では、組成２２で８４．１％、組成２３で８８．７、組成２４で８２．８と乳びの影響がみられた。比較例においては第一反応、第二反応を通じて徐々に吸光度の低下がみられ、特に組成２４では第二試薬添加後、顕著な吸光度の低下みられた。この要因として、乳びに多く存在するＶＬＤＬ、ＣＭの一部が、界面活性剤またはコレステロールエステラーゼにより非特異的に可溶化し濁度（吸光度）の低下をまねき、負の誤差が生じたものと考察する。【００７９】
なお、実施例１における組成１〜２２、および、実施例３における組成２３および２４の主要構成を表５および表６にまとめた。【００８０】
【表５】
2008087895.tif 000006
【００８１】
【表６】
2008087895.tif 000007
【産業上の利用可能性】
【００８２】
本発明の高密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法は、血中の高密度リポ蛋白中コレステロールを、反応液の塩濃度の影響なく、高濃度の低密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールの存在下でも、簡便に、特異性、精密性良く分別測定でき、ポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく自動分析機への適用性が優れていることから、特に動脈硬化症等の臨床検査の分野においてより的確で迅速な診断を行なうことができる。
【国際調査報告】
2008087895.tif 000008
2008087895.tif 000009
2008087895.tif 000010