(57)【要約】  本発明は、ER-TR7を被験体へ投与することにより、線維化が抑制されるという新規の発見に基づいた、線維化疾患の治療方法および予防方法の提供である。
2008149980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ER-TR7もしくは同等の機能を持つ物質を有効性分として含む、線維化抑制剤。
【請求項２】
前記物質が、ER-TR7抗原を標的とする作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質が、ER-TR7抗原の分解促進作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記物質が、ER-TR7抗原の合成阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記物質が、ER-TR7抗原の活性中和作用を有する物質である、請求項1に記載の薬剤。
【請求項６】
前記物質が、ER-TR7抗原の修飾阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項７】
前記物質が、ER-TR7抗原の脱修飾化促進作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項８】
各器官においてER-TR7抗原の生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の薬剤。
【請求項９】
線維化疾患の治療用または予防用の、請求項１〜８のいずれかに記載の薬剤。
【請求項１０】
ER-TR7抗原を用いて抗体を作製する工程を含む、該抗体を有効成分として含む線維化抑制剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の薬剤を個体へ投与する工程を含む、線維化疾患の治療もしくは予防方法。
【請求項１２】
ER-TR7もしくは同等の機能を持つ物質の、線維化抑制剤の製造における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維化疾患の治療または予防のための薬剤、およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維化とは制御不能となった創傷の治癒反応である。障害を受けた組織は障害を受けた細胞を同じ細胞に置換することにより修復されるが、実質組織が結合組織に置換されることがある。このとき、線維芽細胞は活性化しマイオブラストへと分化し、細胞外マトリクスの合成、沈着、構築、リモデリングが起り、結果として線維化となる。慢性線維化疾患は様々な器官で発症しうる慢性炎症状態の終末像の総称であり、組織の過剰な線維化を伴う。例えば、肝臓における肝硬変症、腎臓における腎硬化症などがある。さらに、これらの線維症は臓器不全や癌へと進行する（非特許文献１）。【０００３】
大腸においては線維化が関与する疾患の一つとして、クローン病が知られている。クローン病は厚生労働省の特定疾患に指定されており、「原因不明で、主として若年者にみられ、線維化や潰瘍を伴う肉芽腫性炎症性病巣からなり、口腔から肛門までの消化管のどこでも起り得る。消化管以外（特に皮膚）にも病変が起ることがある。」と定義されている。病変部位の大多数は小腸や大腸、またはその両者に縦走潰瘍、敷石像やアフタなどの病変を有する。病型は縦走潰瘍、敷石型、または狭窄の存在部位によって小腸型、小腸大腸型、大腸型などに分類される。症状は腹痛や下痢、体重減少、発熱、肛門病変などがよくみられ、ときに虫垂炎に類似の症状、腸閉塞、腸窄孔、大出血で発症する。また、腹部症状を欠き、肛門病変や発熱で発症することもある。消化管外合併症としては貧血、低蛋白血症、強直性脊椎炎、口内アフタ、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、光彩炎、成長障害などがある。【０００４】
我が国においては1975年に旧厚生省の研究班が発足し、クローン病の診断基準が作製され、全国調査が行われた。患者数は調査開始以来年々増加し、医療受給者証交付件数でみると、1976年には128件であったものが2007年度には24,396件になっている。また、発症年齢は男性で２０〜２４歳、女性で１５〜１９歳が最も多くみられ、男女比では約２：１と男性に多くみられる。【０００５】
他の慢性線維化疾患においても肝硬変と進行する主要な原因の一つである肝炎ウイルスのキャリアは平成13年肝炎対策に関する有識者会議報告書によるとB型で120万〜140万人、C型で100万〜200万人と推定されている。また、腎線維化に伴う慢性腎不全のため、人工透析を受けている患者数は日本透析学会の2004年慢性透析患者に関する基礎集計によると約25万人に上り、導入患者も前年より3.2％増加の35,000人と年々増加している。【０００６】
現在のところ、線維化疾患についてはその原因や病態形成機序が明らかにされていないため、完治させる根本的な治療法はない。現時点での治療の目的は病気の活動性をコントロールして緩解状態を維持し、患者のQOLを高めることである。最終的な治療形態としては人工透析や臓器移植であるが、それらの治療法は患者のQOLを著しく低下させるばかりか、合併症や移植した臓器が再度線維化に陥る場合が多い。線維化疾患は、病理学的にはコラーゲンなどの細胞外マトリクスの過剰な蓄積を特徴とする。近年、線維芽細胞の過剰活性化がその過剰蓄積の大きな原因とみなされており、そのため線維芽細胞が治療標的としても注目されつつある。【０００７】
現在、線維化疾患の候補治療薬として、慢性炎症を抑制する副腎皮質ステロイド、コルヒチン、IL-10など、線維維芽細胞を活性化するTGF-β阻害剤、HGF（TGF-βの作用を抑制）、エンドセリン阻害剤、アンギオテンシン阻害剤など、コラーゲンを分解するMMP（matrix metalloproteinase；マトリックス  メタロプロテイナーゼ）などが期待されているが、いずれも治療法の確立には至っていない。【０００８】
ER-TR7は1984年にVan Vlietらによって作製されたマウス胸腺の非リンパ球に対するラットモノクローナル抗体の一つである（非特許文献２）。ER-TR7は細網線維芽細胞（reticular fibroblasts）を認識する抗体とされているが（非特許文献３）、様々な器官の結合組織マーカーとして数社より市販され汎用されている。しかし、その抗原についてはまだ同定されていない。最近、リンパ節の細網線維芽細胞（fibroblastic reticular cells）がリンパ球との接触により細胞外マトリクスとしてER-TR7抗原を分泌し、間質網目構造（reticular meshwork）を構築し免疫機能に寄与することが報告された（非特許文献４）。
【非特許文献１】Wynn TA., J. Clin. Invest., (2007) 117: 524-529
【非特許文献２】Van Vliet E. et al., Eur. J. Immunol., (1984) 14: 524-529
【非特許文献３】Van Vliet E. et al., J. Histochem. Cytochem., (1986) 34: 883-890
【非特許文献４】Katakai T. et al., J. Exp. Med., (2004) 200: 783-795
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、線維化疾患の治療又は予防に有用な、組織における線維化を抑制できる薬剤を提供することを１つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは線維化マーカーとして用いられるモノクローナル抗体であるER-TR7が線維化を促進する物質を中和し、線維化を抑制する効果を持つのではないかと考えた。本発明者らは、この考えに基づいて研究を進めた結果、ER-TR7が線維化を抑制できることを見いだし、本発明を完成させた。ER-TR7もしくは同等の機能を持つ物質は線維化抑制剤として、線維化の治療または予防に有効である。【００１１】
本発明は線維化を抑制する薬剤、および該薬剤を有効成分とする線維化疾患の治療剤に関し、より具体的には、
［1］ER-TR7もしくは同等の機能を持つ物質を有効性分として含む、線維化抑制剤、
［2］前記物質が、ER-TR7抗原を標的とする作用を有する物質である、［1］に記載の薬剤、
［3］前記物質が、ER-TR7抗原の分解促進作用を有する物質である、［1］に記載の薬剤、
［4］前記物質が、ER-TR7抗原の合成阻害作用を有する物質である、［1］に記載の薬剤、
［5］前記物質が、ER-TR7抗原の活性中和作用を有する物質である、［1］に記載の薬剤、
［6］前記物質が、ER-TR7抗原の修飾阻害作用を有する物質である、［1］に記載の薬剤、
［7］前記物質が、ER-TR7抗原の脱修飾化促進作用を有する物質である、［1］に記載の薬剤、
［8］各器官においてER-TR7抗原の生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、［1］〜［7］のいずれかに記載の薬剤、
［9］線維化疾患の治療用または予防用の、［1］〜［8］のいずれかに記載の薬剤（前記線維化疾患は特に制限されないが、例えば、肝硬変、腎硬化症、肺線維症、強皮症、心筋症、骨髄線維症、慢性腹膜炎をはじめとする臓器や皮膚などの生体組織に生じる線維化に起因する種々の疾患が挙げられる）、
［10］ER-TR7抗原を用いて抗体を作製する工程を含む、該抗体を有効成分として含む線維化抑制剤の製造方法、
［11］［1］〜［9］のいずれかに記載の薬剤を個体へ投与する工程を含む、線維化疾患の治療もしくは予防方法、
［12］ER-TR7もしくは同等の機能を持つ物質の、線維化抑制剤の製造における使用
を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、線維化の発現、促進にER-TR7抗原の関与が関係していることが明らかになった。また、ER-TR7抗原を中和することによって線維症の発症が抑制されることが示せた。この発見を応用することにより、これまでにない新しいコンセプトの線維症抑制剤が提供できることになる。線維症はさまざまな器官で生じ、重篤な疾患に繋がることから医療上また産業上も重要な意義を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】マウス肝硬変モデルにおけるER-TR7の治療効果を示す写真である。4型コラーゲンの免疫染色像（1）、およびマッソン染色像（2）。
【図２】マウス肝硬変モデルにおけるER-TR7投与による線維化マーカー遺伝子の発現抑制を示す図である。α-SMA（1）、TNFα（2）、1型collagen（3）の発現量の変化をqPCRにより測定した結果を示す。
【図３】マウス潰瘍性大腸炎モデルにおけるER-TR7の治療効果を示す図である。対照群および潰瘍性大腸炎モデル（未治療）群、潰瘍性大腸炎モデル（ER-TR7治療）群における腸の長さの測定結果を示す。
【図４】マウス潰瘍性大腸炎モデルにおけるER-TR7投与による線維化マーカー遺伝子の発現抑制を示す図である。α-SMA（1）、TNFα（2）、1型collagen（3）の発現量の変化をqPCRにより測定した結果を示す。
【図５】LPS（lipopolysaccharide）の有無によるヒト正常肺線維芽細胞のER-TR7抗原の発現を示す写真である。ヒト正常肺線維芽細胞のER-TR7による染色像を示す。
【図６】ヒト正常肺線維芽細胞抽出物の電気泳動像を示す写真である。クマシーブリリアントブルーによる染色とウェスタンブロッティングの像を示す。
【図７】線維化モデルマウスの病変部位へのER-TR7陽性細胞の集積を示す写真である。肺気腫モデルマウスの肺組織における結果を示す。茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
【図８】線維化モデルマウスの病変部位へのER-TR7陽性細胞の集積を示す写真である。２型糖尿病モデルマウスの膵臓組織における結果を示す。茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
【図９】線維化モデルマウスの病変部位へのER-TR7陽性細胞の集積を示す写真である。パーキンソン病モデルマウスの脳組織における結果を示す。抗体結合を観察した。
【図１０】線維化モデルマウスの病変部位へのER-TR7陽性細胞の集積を示す写真である。心筋症モデルマウスの心臓組織における結果を示す。茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
【図１１】線維化モデルマウスの病変部位へのER-TR7陽性細胞の集積を示す写真である。潰瘍性大腸炎モデルマウスの大腸組織における結果を示す。茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
【図１２】線維化モデルマウスの病変部位へのER-TR7陽性細胞の集積を示す写真である。腎線維化モデルマウスの腎臓組織における結果を示す。茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
【図１３】線維化モデルマウスの病変部位へのER-TR7陽性細胞の集積を示す写真である。肝硬変モデルマウスの肝臓組織における結果を示す。茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
慢性線維化疾患は様々な器官で発症しうる慢性炎症状態の終末像の総称であり、組織の過剰な線維化を伴う。この疾患の進行に伴い、臓器不全やがん化などの重篤な病態になる。本発明者らは線維化のマーカーであるER-TR7に着目した。潰瘍性大腸炎モデルマウスを作出し、ER-TR7投与の効果を詳細に解析したところ、野生型の大腸粘膜に比して炎症の活性低下、萎縮の抑制など、炎症状態の改善がみられた。すなわち、ER-TR7の投与により、炎症さらには線維化に深く関与しているER-TR7抗原がER-TR7によって中和され、線維化の改善に繋がることを見いだした。【００１５】
本発明はER-TR7もしくはER-TR7抗原を標的とした抗体、化合物を有効成分として含む、線維化抑制剤に関する。【００１６】
本発明の「線維化抑制剤」は組織の線維化を効果的に抑制することができる。本発明において「線維化を抑制する」とは、線維化が生じた組織における線維化病変を現象もしくは消失させるか、またはそれ以上の線維化の進行を遅延もしくは阻止する（線維化病変の増大を抑制する）ことを意味する。【００１７】
例えば、肝組織における線維化の程度は、当業者に公知の様々な方法によって評価することができる。最も基本的な方法としては、肝生検における線維化所見、例えば、肝生検サンプルの特殊染色（アニリンブルー、トリクローム、または銀染色など）によって強調された線維化組織の像を、組織学的に評価すればよい。線維化の具体的な評価は、例えば、Dai K, et al. World J Gastroenterol. 31: 4822-4826, 2005、Hillebrandt S, et al. Nature Genetics 37: 835-843, 2005にしたがって、免疫組織学的染色に基づき各試料の肝線維化レベルを線維化度数で表すことによっておこなうことができる。また、ヒアルロン酸、I型、III型、およびIV型等のコラーゲン、線維芽細胞、マクロファージ等の肝線維化マーカーを用いて、より簡便に肝組織における肝線維化の程度を評価してもよい。簡便だが肝線維化の程度を鋭敏に反映する血小板数の計測に基づく検査も都合よく利用することができる。腹部超音波検査などの肝画像診断によっても肝線維化の程度を大まかに予測することが可能である。さらに、近年エコセンス社（EcoSence、フランス）によって開発されたトランジエント・エラストグラフィー技術に基づく非侵襲的肝線維化測定法のための測定機器（Fibro Scan502など）を用いて、肝線維化の程度を評価することもできる。本発明の線維化抑制剤による肝線維化の抑制レベルは、これらの方法によって得られる肝線維化の程度の評価に基づいて決定すればよい。【００１８】
本発明の線維化抑制剤による線維化抑制効果は、特に、皮膚や臓器等の生体組織におけるIII型コラーゲンの伸長抑制、I型コラーゲンの沈着抑制、線維芽細胞の集積抑制およびマクロファージの集積抑制のうち少なくとも一つを伴うことが好ましく、これら全てを伴うことがより好ましい。本発明の線維化抑制剤による線維化抑制レベルは、これらの抑制効果のうち一つ以上を指標として決定してもよい。【００１９】
本発明の「ER-TR7」はVan Vlietらによって作製されたマウス胸腺非リンパ球を標的としたラットモノクローナル抗体の一つである。ER-TR7はマウスおよびヒトの様々な器官の結合組織を認識する抗体として、数社により市販されている。本発明における「ER-TR7」は市販のER-TR7に限定されず、ER-TR7と同じエピトープを認識する抗体、ER-TR7抗原の他の部位をエピトープとして認識する抗体も含まれる。その由来する生物種はヒトであることが好ましいが、特に制限されず、ヒト以外の生物におけるER-TR7抗原と同等なタンパク質（ホモログ、オルソログ等）を認識するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体も本発明における「ER-TR7」に含まれる。また、遺伝子工学の技術を用いて作成された組み換え抗体も本発明における「ER-TR7」に含まれる。本発明におけるER-TR7と「同等の機能を有する物質」とは、ER-TR7と同じ抗原を標的とする抗体があげられるが、これに限らず、ER-TR7抗原と結合し活性を生成および蓄積を阻害、または中和する活性を有する化合物も含まれる。【００２０】
本発明におけるER-TR7抗原の「生成および蓄積を阻害、または中和」とは、例えば、「合成阻害」、「分解促進」、「修飾阻害」、「脱修飾化」、ER-TR7抗原活性の「無効化」などがあげられるが、これに限らず、ER-TR7抗原の存在量、機能または活性が比較対象よりも低下または消失させることをいう。本発明においてER-TR7抗原の「生成および蓄積を阻害、または中和」とは、特に制限されないが、好ましくはER-TR7抗原の「分解促進作用を有する物質」、「合成阻害作用を有する物質」、「修飾阻害作用を有する物質」、「脱修飾化促進作用を有する物質」または「中和活性を有する物質」である。【００２１】
「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」がある。また、タンパク質の「分解抑制」も含まれる。「ER-TR7抗原タンパク質の発現」とはER-TR7抗原タンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、または、これらの転写・翻訳によりER-TR7抗原タンパク質が生成されることを意味する。また、「ER-TR7抗原の機能」とは、例えば、該タンパク質が他の細胞中の構成要素との結合等をあげることができる。上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価（測定）することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。【００２２】
さらにまた、ER-TR7抗原の「分解促進」は、ER-TR7抗原を切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素の発現の上昇であってもよい。また、「分解促進」はER-TR7抗原の発現の抑制を促す物質の投与により生じるものであってもよい。【００２３】
「分解促進作用を有する物質」の好ましい態様としては、以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原タンパク質と結合する抗体
（b）ER-TR7抗原タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するER-TR7抗原タンパク質変異体
（c）ER-TR7抗原タンパク質と結合する低分子化合物【００２４】
また、「分解促進作用を有する物質」としては以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物（核酸）をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（b）ER-TR7抗原タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（c）ER-TR7抗原タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する物質【００２５】
ER-TR7抗原の「合成阻害」とはER-TR7抗原の合成に関わる酵素の活性阻害があげられるが、必ずしもこれに限らず、ER-TR7抗原が合成される過程のいずれかを阻害することを指す。【００２６】
「合成阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物（核酸）をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原タンパク質合成酵素と結合する抗体
（b）ER-TR7抗原タンパク質合成酵素に対してドミナントネガティブの性質を有するER-TR7抗原タンパク質合成酵素変異体
（c）ER-TR7抗原タンパク質合成酵素と結合する低分子化合物【００２７】
また、「合成阻害作用を有する物質」としては以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物（核酸）をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原タンパク質合成酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（b）ER-TR7抗原タンパク質合成酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（c）ER-TR7抗原タンパク質合成酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する物質【００２８】
ER-TR7抗原の「修飾」とはER-TR7への翻訳後修飾をさし、例えば、糖鎖や脂質の付加、リン酸基やメチル基などの官能基の付加などがあげられる。【００２９】
「修飾阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物（核酸）をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原タンパク質修飾酵素と結合する抗体
（b）ER-TR7抗原タンパク質修飾酵素に対してドミナントネガティブの性質を有するER-TR7抗原タンパク質修飾酵素変異体
（c）ER-TR7抗原タンパク質修飾酵素と結合する低分子化合物【００３０】
また、「修飾阻害作用を有する物質」としては以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原タンパク質修飾酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（b）ER-TR7抗原タンパク質修飾酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（c）ER-TR7抗原タンパク質修飾酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する物質【００３１】
ER-TR7抗原の「脱修飾化」とはER-TR7抗原の活性に必要な翻訳後修飾を加水分解等により除去する反応をさす。【００３２】
「脱修飾化促進作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原タンパク質脱修飾化酵素抑制タンパク質と結合する抗体
（b）ER-TR7抗原タンパク質脱修飾化酵素抑制タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するER-TR7抗原タンパク質脱修飾化酵素抑制タンパク質変異体
（c）ER-TR7抗原タンパク質脱修飾化酵素抑制タンパク質と結合する低分子化合物【００３３】
また、「脱修飾化促進作用を有する物質」としては以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物（核酸）をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原タンパク質脱修飾化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（b）ER-TR7抗原タンパク質脱修飾化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（c）ER-TR7抗原タンパク質脱修飾化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する物質【００３４】
ER-TR7抗原の「中和」とはER-TR7抗原の活性化部位に化合物が結合することによりER-TR7抗原の活性を抑制することを指し、例えば、ER-TR7抗原の活性化部位に結合するER-TR7抗原活性化抑制タンパク質などがあげられる。【００３５】
「中和活性を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原と結合する抗体
（b）ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するER-TR7抗原活性化抑制タンパク質変異体
（c）ER-TR7抗原と結合する低分子化合物【００３６】
また、「脱修飾化促進作用を有する物質」としては以下の（a）〜（c）からなる群より選択される化合物（核酸）をあげることができる。
（a）ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（b）ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（c）ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する物質【００３７】
上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調整することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然の上述タンパク質、あるいはGST等のエピトープタグとの融合タンパク質として微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインAカラム、プロテインGカラム、DEAEイオン交換カラム、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調整する。また、モノクローナル抗体であれば、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質やその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫し、同マウスの脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインAカラム、プロテインGカラム、DEAEイオン交換カラム、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調整することが可能である。【００３８】
本発明の抗体は本発明の上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質に結合するものであれば特に制限はなく、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の他にヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物であってもよい。【００３９】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質はその由来となる動物種については制限されないが、哺乳動物、例えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。【００４０】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基末端断片やカルボシキル基末端断片があげられる。本発明における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味する。【００４１】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得るほか、ヒトリンパ球、例えば、EBウイルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。【００４２】
本発明の上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質に対する抗体は、該タンパク質と結合することにより、該タンパク質の発現もしくは機能を阻害する効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。【００４３】
また、ER-TR7抗原タンパク質を用いて該抗原と結合する抗体を作製する工程を含む、該抗体を有効成分として含む線維化抑制剤の製造方法もまた、本発明に含まれる。【００４４】
さらに本発明は、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質の機能を阻害し得る物質として、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。該低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造あるいは取得可能な化合物である。【００４５】
さらに、本発明の上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有する変異体（ドミナントネガティブタンパク質）をあげることができる。「ER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有する該タンパク質変異体」とは発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失あるいは低下させる機能を有するタンパク質を指す。【００４６】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA（peptide nucleic acid）やモルフォリノアンチセンスオリゴ（Morpholino antisense oligo）等の化学合成核酸アナログも本発明の核酸に含まれる。PNAは核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したものであり、モルフォリノアンチセンスオリゴはモルフォリノ骨格に置換したもので、核酸と類似の３次元構造を有する。【００４７】
特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点とのハイブリッド形成よるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害（平島および井上、新生化学実験講座2  核酸IV遺伝子の複製と発現、日本生化学会編、東京化学同人、1993、319-347）、アンチセンスRNAについてはmRNAとのハイブリッド形成による二本鎖RNA形成よりRNAi効果による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は転写、スプライシング、翻訳などの様々過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する。【００４８】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、ER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質のいずれかをコードする遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、ER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの5’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、ER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして構築された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に導入することができる。アンチセンス核酸の配列は形質転換される動物（細胞）が有する内在性のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列が好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて、標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば100塩基以上、または、500塩基以上であってもよい。【００４９】
上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用しておこなうことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムにはグループIイントロン型やRnasePに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、1990、35、2191）。【００５０】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3’側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi M, et al., FEBSLett, 1988, 239, 285、小泉誠および大塚栄子、蛋白質核酸酵素、1990、35、2191、Koizumi M, et al., Nucl Acids Res. 1989, 17, 7059）。【００５１】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えば、タバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見いだされる（Buzayan JM., Nature, 1986, 323, 349）。ヘアピン型リボザイムからも標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikushi Y. & Sasaki N., Nucl. Acids Res., 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112）。このように、リボザイムを用いて上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することによって、該遺伝子の発現を阻害することができる。【００５２】
内在性遺伝子の発現抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）によってもおこなうことができる。【００５３】
近年のゲノムプロジェクトの完了によって、ヒトゲノムの全塩基配列が解読され、数多くの疾患関連遺伝子が盛んに同定されている現在、特定の遺伝子を標的とした治療法、創薬開発が盛んに実施されている。中でも、特異的転写後抑制効果を発揮するsmall interfering RNA（siRNA）の遺伝子治療への応用が注目されている。RNAiは二本鎖のRNA（dsRNA）が細胞内に取り込まれると、このdsRNAと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑制されるという、現在注目されている手法である。哺乳類細胞においては、dsRNAを導入することでRNAiを誘導することが可能で、RNAiはノックアウトマウスと比較して効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。【００５４】
RNAiは二本鎖RNAと相補的な塩基配列を持ったmRNAが分解される現象である。RNAiはこの現象を利用して人工的に21〜23merの二本鎖RNA（siRNA）を導入することにより任意の遺伝子の発現を抑制する方法である。1998年にFireらが線虫を用いて二本鎖RNAが配列特異的に遺伝子のサイレンシングを引き起こすことを発見して以来（Fire A. et al., Nature, 1998, 391, 806-811）、21〜23merにプロセッシングされた二本鎖RNAがmRNAを切断する機構（Zamore PD. et al., Cell, 2000, 101, 25-33）やRISC（RNA-induced silencing complex）の存在（Hammond SM. et al., Science, 2001, 293, 1146-1150）、Dicerのクローニング（Bernstein E. et al., Nature, 409, 363-366）を経て、2001年にElbashirらによって哺乳類細胞でもsiRNAによる配列特異的な発現抑制が可能であることが証明され（Elbashir SM. et al., Nature, 2001 411, 494-498）、遺伝子治療応用への期待が高まっている。【００５５】
RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは標的遺伝子のmRNAと相同配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該遺伝子転写産物を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、dsRNAを細胞に導入すると、そのRNAと相同配列を持つ遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組み替えによる遺伝子破壊方法（ノックアウト）に変わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。【００５６】
siRNAの設計にあたっては、標的としては上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域をすべて標的候補とすることが可能である。【００５７】
siRNAを細胞に導入するには二本のRNAをアニールして導入する方法などを採用することができる。また、上記二本鎖RNAは一方の端が閉じたヘアピン構造を有するRNA（shRNA）でもよい。shRNAとはショートヘアピンRNA（short hairpin RNA）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためステムループ構造を有するRNA分子である。このように分子内で二本鎖RNAを形成得る分子もまた本発明のsiRNAに含まれる。【００５８】
本発明の好ましい態様としては、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子をRNAi効果によって抑制し得るRNA（siRNA）であって、例えば1もしくは少数の塩基の欠失あるいは付加された構造の二本鎖RNAであっても、該遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明のsiRNAに含まれる。【００５９】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分が多いが、DICERと呼ばれる酵素（RNaseIII核酸分解酵素ファミリーの一つ）が二本鎖RNAと結合し、二本鎖RNAがsiRNAとよばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。すなわち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞内においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。【００６０】
例えば、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解し、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物にはRNAi効果を有する二本鎖RNAが含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待される領域を特に選択しなくともよい。すなわち、RNAi効果を有する本発明の上述の遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。【００６１】
本発明におけるsiRNAは、必ずしも標的配列に対する一組の二本鎖RNAである必要ではなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の二本鎖RNAの混合物であってもよい。また、本発明のsiRNAには、所謂「カクテルsiRNA」が含まれる。【００６２】
また、本発明におけるsiRNAは必ずしもすべてのヌクレオチドがリボヌクレオチドでなくともよい。すなわち、本発明において、siRNAを構成する1もしくは複数のリボヌクレオチドは対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、チミン（ウラシル）、グアニン、シトシン）であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことをいう。また、前記の「複数」とは特に限定されないが、好ましくは2〜5個程度の少数を指す。【００６３】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNAは、該二本鎖RNAの一方をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAがそれぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。また、標的配列を適当なプロモーターの下流に適当な配列を挟んだ回文構造で導入したDNAでもよい。この場合、前述のshRNAが得られる。【００６４】
また、本発明の発現阻害物質には、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子発現調節領域と結合する転写因子に結合することにより、上述のER-TR7抗原タンパク質、合成酵素、修飾酵素、脱修飾化酵素抑制タンパク質、ER-TR7抗原活性化抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物が含まれる。【００６５】
本発明は、本発明の「線維化抑制剤」を被験体に投与することによる、被験体の皮膚や臓器等の生体組織における線維化を抑制する方法にも関する。【００６６】
さらに本発明の「線維化抑制剤」は、皮膚や臓器等の生体組織の線維化を効果的に抑制できることから、線維化疾患（組織の過剰な線維化に伴う疾患）の治療および予防のために有利に使用することができる。本発明における線維化疾患の例は限定されるものではない。本発明にかかわる「線維化疾患」の具体例としては、特に限定されないが、皮膚をはじめとする外皮および上皮組織における弾性線維症、強皮症、慢性腹膜炎、後腹膜腔線維化症など、結合組織などの支持組織、筋肉における多発性筋炎、皮膚筋炎、結節性多発動脈炎、軟組織線維症、慢性関節リウマチ、手掌線維腫、腱炎、腱鞘炎、アキレス腱炎、足菌腫など、骨髄、心臓などの血液組織、脈管系における骨髄線維症、脾機能亢進症、脈管炎、徐脈性不整脈、動脈硬化、閉塞性血栓性血管炎、結節性線維症、狭心症、拡張型うっ血性心筋症、心不全、拘束型心筋症、びまん性非閉塞性心筋症、閉塞性心筋症、肺性心、僧帽弁狭窄、大動脈弁狭窄、慢性心膜炎、心内膜線維症、心内膜心筋線維症など、肝臓などの消化器系では慢性膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アルコール性肝炎、慢性B型肝炎、慢性C型肝炎、ウィルソン病、肝硬変、ウイルス性肝炎、ゴーシェ病、糖原病、α抗トリプシン欠損、ヘモクロマトーシス、チロシン血症、果糖血症、ガラクトース血症、ゼルウェガー症候群、先天性肝線維症、門脈圧亢進症、肝肉芽腫症、バッド-キアリ症候群、原発性硬化性胆管炎、脂肪肝、非アルコール性肝炎、肝線維症、先天性肝線維症、アルコール性肝硬変、ウイルス性肝硬変、寄生虫性肝硬変、中毒性肝硬変、栄養障害性肝硬変、うっ血性肝硬変、肝硬化症、シャルコー肝硬変、トッド肝硬変、続発性胆汁性肝硬変、単葉性肝硬変、慢性非化膿性破壊性胆炎から移行した肝硬変、閉塞性肝硬変、胆細管性肝硬変、胆汁性肝硬変、萎縮性肝硬変、壊死後性肝硬変、肝炎後肝硬変、結節性肝硬変、混合型肝硬変、小結節性肝硬変、代償性肝硬変、非代償性肝硬変、大結節性肝硬変、中隔性肝硬変、突発性肝硬変、門脈周囲性肝硬変、門脈性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変など、肺などの呼吸系におけるコクシジオイデス症、ブラストミセス症、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、グッドパスチャー症候群、成人呼吸促迫症候群における肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、無気肺、肺炎、珪肺症、石綿肺症、過敏性肺炎、特発性肺線維症、リンパ球性間質性肺炎、ランゲルハンス細胞肉芽腫症、嚢胞性線維症、膿胞性線維症、肺線維症、特発性肺線維症、線維化性肺胞隔炎、間質性線維症、びまん性肺線維症、慢性間質性肺炎、気管支拡張症、細気管支炎線維症、気管支周囲線維症、胸膜線維症など、腎臓などの泌尿器、生殖器系における男性性腺機能低下症、筋強直性ジストロフィー、ペイロニー病などによる線維症、慢性尿細管間質性腎炎、常染色体劣性嚢胞腎、骨髄腫腎、水腎症、急速進行性糸球体腎炎、腎毒性疾患、黄色肉芽腫性腎盂腎炎、鎌状赤血球腎症、腎性尿崩症、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、慢性糸球体腎炎、IgA腎症、腎硬化症、巣状糸球体硬化症、膜性腎炎、膜増殖性糸球体腎炎、慢性腎盂腎炎、腎アミロイドーシス、多発性嚢胞腎、後腹膜線維症、ループス腎炎など膠原病に伴う腎病変、糖尿病性腎症、慢性前立腺炎、住血吸虫症による���胱炎、乳腺線維症、乳腺線維腺腫など、脊椎などの神経系における先天性斜頸、強直性脊椎炎、神経線維腫や脊髄損傷後の神経機能欠損等の脊髄疾患、パーキンソン病やアルツハイマー病等の脳神経疾患、眼球における後部水晶体線維化症、増殖性網膜症など、また、全身に病変の生じるサルコイドーシス、全身性エリテマトーデスによる線維症や全身性強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎などがあげられるが、本発明における「線維化疾患」はこれらに限定されるものではなく、皮膚や臓器など各生体組織における線維化によって生じる疾患を含む。【００６７】
本発明の「線維化抑制剤」は「線維化治療薬」、「線維化改善剤」または「抗線維化剤」等と表現することも可能である。また、本発明において「抑制剤」は「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。【００６８】
なお、本発明における「治療」には、線維化の発生を予め抑制し得る予防的な効果、改善効果等も含まれる。また、線維化発現組織に対して、必ずしも完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であっても良い。【００６９】
本発明では、本発明の「線維化抑制剤」を被験体に投与することにより、被験体の生体組織の線維化を効果的に抑制することができる。「線維化抑制剤」の投与経路としては、限定されるものではないが、非経口経路が好ましい。非経口経路の好適な例としては、静脈内、動脈内、腹腔内、および皮下経路等があげられる。本発明の「線維化抑制剤」は全身投与してもよいし、局所投与（例えば肝臓の線維化組織に直接投与）してもよい。投与量は、被験体の体重や年齢、投与方法などに依存するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。【００７０】
本発明の「線維化抑制剤」を投与すべき被験体としては、ヒト、家畜、愛玩動物、実験動物を含む哺乳動物が好ましい。特に線維化疾患、例えば肝硬変や肺線維症などの罹患している哺乳動物（患者）が本発明にかかわる被験体として好ましい。【００７１】
本発明の薬剤は製薬上許容される担体、賦形剤、および／または希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。本発明における担体、賦形剤、および／または希釈剤の例としては水、生理食塩水、リン酸緩衝バッファー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシルビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどがあげられるがこれらに限定されない。本発明の医薬組成物には保存剤等の添加物をさらに含んでもよい。本発明の医薬組成物はさらに他の薬理成分を含有していてもよい。【００７２】
本発明の医薬組成物は経口製剤または非経口製剤としても提供してもよいが、非経口製剤として提供することがより好ましい。非経口製剤としては、液剤、懸濁剤等の液体製剤が好ましく、特に注射剤や点滴剤が好ましい。【００７３】
さらに本発明は、本発明の薬剤を個体（例えば、線維化疾患の患者等）に投与する工程を含む、線維化疾患の治療方法もしくは予防方法を提供する。【００７４】
また、上述したER-TR7もしくは同等の機能を持つ物質について、本発明の薬剤（線維化抑制剤、線維化疾患の治療もしくは予防剤等）の製造のための使用に関する。【００７５】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願はその全体を参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  マウス肝硬変モデルにおけるER-TR7の治療効果：臨床像【００７７】
C57BL/6Jマウス（メス、5〜6週令、日本クレア社製）に、四塩化炭素（10μl；Sigma-Aldrich社製）を90μlのミネラルオイル（Sigma-Aldrich社製）に混合し、週2回ずつ4週間にわたり（7回）、腹腔内に注射し、肝線維症を惹起した。さらに四塩化炭素を週2回ずつ2週間にわたって追加投与し（総計11回）、肝硬変を誘導した。この四塩化炭素誘導肝線維症モデルは再現性に優れており、肝硬変モデルの実験系としても広く使用されている（Sakaida I., et al., Hepatology, 40: 1304-1311, 2004）。肝硬変が誘導されたマウスにER-TR7（10μl/200μl PBS）を週2回ずつ2週間にわたり投与し（4回）、これをER-TR7治療群とした。また、同様にPBSのみを投与したものを未治療群、四塩化炭素を投与せず、肝硬変を惹起しなかったものを対照群とした。それぞれの群を屠殺し、肝臓を採取した。【００７８】
採取した肝臓の第2葉の一部を凍結用包埋剤OCTコンパウンド（Miles社製）に包埋し、液体窒素で凍結ブロックを作製した。その凍結ブロックからクライオスタット（Microm社製）を用いて厚さ6μmの切片を作製した。【００７９】
得られた切片をアセトン（和光純薬社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗IV型コラーゲン抗体（ウサギ血清、1:2000希釈、LSL社製）を添加し、室温で1時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ抗体（MP biomedicals社製；1:200希釈）を用いて二次抗体反応をおこなった後、DAB基質（ニチレイ社製）を添加した（図１(1)）。【００８０】
また、得られた切片をbouin' solution（Sigma-Aldrich社製）で固定した後、Weigert's Iron Hematoxyline Set（Sigma-Aldrich社製）を用いて、取扱説明書に従い、核を染色した。水洗後、Trichrome Masson（Sigma-Aldrich社製）を用いて、取扱説明書に従い染色をおこなった（図１(2)）。光学顕微鏡（LEICA社製）下で試料を観察した。【００８１】
得られた肝組織の染色像の例を図１に示す。それぞれの染色においてER-TR7治療群の像では未治療群に比べて線維化の状態が緩和され、対照群に近い像が得られた。すなわち、ER-TR7による治療の結果、線維化の症状が緩和されたことが示された。
〔実施例２〕  マウス肝硬変モデルにおけるER-TR7の治療効果：線維化マーカー遺伝子の発現量の測定【００８２】
C57BL/6Jマウス（メス、5〜6週令、日本クレア社製）に、四塩化炭素（10μl；Sigma-Aldrich社製）を90μlのミネラルオイル（Sigma-Aldrich社製）に混合し、週2回ずつ4週間にわたり（7回）、腹腔内に注射し、肝線維症を惹起した。さらに四塩化炭素を週2回ずつ2週間にわたって追加投与し（総計11回）、肝硬変を誘導した。この四塩化炭素誘導肝線維症モデルは再現性に優れており、肝硬変モデルの実験系としても広く使用されている（Sakaida I., et al., Hepatology, 40: 1304-1311, 2004）。肝硬変が誘導されたマウスにER-TR7（10μl/200μl PBS）を週2回ずつ2週間にわたり投与し（4回）、これをER-TR7治療群とした。また、同様にPBSのみを投与したものを未治療群、四塩化炭素を投与せず、肝硬変を惹起しなかったものを対照群とした。それぞれの群を屠殺し、肝臓を採取した。【００８３】
採取した肝臓の一部を1.5 mlチューブにとりわけ、液体窒素で凍結した。組織50 mgに対し、RNA-Bee（TEL-TEST社製）1 mlを加えてホモジナイズした懸濁液にクロロホルム200μl（Sigma-Aldrich社製）を加え穏やかに混合後、約5分氷冷し、12,000 rpm、4℃、15分間遠心分離機（Centrifuge 5417R、eppendolf社製）を用い遠心分離をおこなった。遠心分離後の上澄み液500μlを別の1.5 mlチューブに移し、上澄み液と同等量のイソプロパノール500μl（Sigma-Aldrich社製）を加え、混合後1μlのグリコーゲン（Invitrogen社製）を加え、15分間氷冷した。氷冷15分後、12,000 rpm、4℃、15分間遠心し、その後、75%エタノール1000μl（Sigma-Aldrich社製）で3回洗浄して得られたRNA沈殿物を30分〜1時間、自然乾燥させた後、大塚蒸留水（大塚製薬製）に溶解させ、さらに大塚蒸留水にて100倍希釈し、UVプレート（コーニングコースター社製）上でプレートリーダー（POWER Wave XS、BIO-TEK社製）により抽出したサンプル中のRNA濃度を算出した。得られたRNAサンプルを500 ng/20μlの濃度に調整し、68℃、3分間、BLOCK INCUBATOR（ASTEC社製）にて加温し、10分間氷冷した。氷冷後、予め調整していたRT PreMix液（組成：25 mg MgCl2 18.64μl（Invitrogen社製）、5×Buffer 20μl（Invitrogen社製）、0.1 M DTT 6.6μl（Invitrogen社製）、10 mM dNTP mix 10μl（Invitrogen社製）、Rnase Inhibitor 2μl（Invitrogen社製）、MMLV Reverse Transcriptase 1.2μl（Invitrogen社製）、Random primer 2μl（Invitrogen社製）、滅菌蒸留水（大塚蒸留水；大塚製薬社製））を80μl加え、BLOCK INCUBATORにて42℃、1時間、99℃、5分間、加熱した後、氷冷しcDNA 100μlを作成した。【００８４】
得られたcDNAを用いて、以下の組成でPCR反応を行った。SYBR Premix EX taq 12.5μl (TAKARA社製)、滅菌蒸留水11.3μl（大塚蒸留水）、プライマー0.1μl (50 pmol/μl; 表１)、cDNA1μlを混合させ、Real-time PCR Dice (TAKARA社製)により95℃ 5秒、60℃ 30秒で40サイクル反応させた。反応終了後、36B4遺伝子とGAPDH遺伝子の発現量を内部標準として各線維化マーカー遺伝子の発現量の測定をおこなった。【００８５】
[表１]
NM_007393
Mus musculus actin, beta, cytoplasmic (Actb), mRNA (β-actin)
F: CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC（配列番号：１）
R: ATGGAGCCACCGATCCACA（配列番号：２）
NM_008084
Mus musculus glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, mRNA (GAPDH)
F: AAATGGTGAAGGTCGGTGTG（配列番号：３）
R: TGAAGGGGTCGTTGATGG（配列番号：４）
NM_007475
Mus musculus acidic ribosomal phosphoprotein P0 (Arbp), mRNA (36B4)
F: TTCCAGGCTTTGGGCATCA （配列番号：５）
R: ATGTTCAGCATGTTCAGCAGTGTG（配列番号：６）
NM_013693
Mus musculus tumor necrosis factor (Tnf), mRNA (TNF-α)
F: CAGGAGGGAGAACAGAAACTCCA（配列番号：７）
R: CCTGGTTGGCTGCTTGCTT（配列番号：８）
NM_007743
Mus musculus procollagen, type I, alpha 2 (Col1a2), mRNA (Type 1 collagen)
F: ACCCGATGGCAACAATGGA（配列番号：９）
R: ACCAGCAGGGCCTTGTTCAC（配列番号：１０）
NM_007392
Mus musculus actin, alpha 2, smooth muscle, aorta (Acta2), mRNA (α-SMA)
F: GAGCATCCGACACTGCTGACA（配列番号：１１）
R: AGCACAGCCTGAATAGCCACATAC（配列番号：１２）【００８６】
その結果、対照群に比べてER-TR7治療群では検定したすべての遺伝子において発現量の低下が見られた。このことにより、ER-TR7を投与することにより線維化が抑制されていると考えられる（図２）。【００８７】
〔実施例３〕  マウス潰瘍性大腸炎モデルにおけるER-TR7の治療効果：肉眼像
C57BL/6Jマウス（メス、7週令、日本クレア社製）にデキストラン硫酸ナトリウム（DSS: 和光社製）を3％含有する高塩素水を7日間自由飲水させることにより潰瘍性大腸炎モデルを作製した。また、3％DSS水を給水すると同時に、マウスにはER-TR7（0.4 mg/ml、BMA Biomedicals社製）10μlを生理食塩水（大塚製薬社製）190μlに混合したもの、または生理食塩水のみ200μlを腹腔内に注射した。この処置をおこなったマウス群をER-TR7群、対照群と名付け、3％DSS水を飲水させながら8日間飼育した後、各群の個々のマウスを屠殺し、その大腸を採取し長さを測定した。【００８８】
その結果、ER-TR7投与群と対照群を比較すると、ER-TR7群は対照群に比べ有意に腸の長さが保たれていた。（p＜0.05、t検定）。このことによりER-TR7により大腸の線維化変化による萎縮が抑制されていると考えられる（図３）。【００８９】
〔実施例４〕  マウス潰瘍性大腸炎モデルにおけるER-TR7の治療効果：線維化マーカー遺伝子の発現量の測定
C57BL/6Jマウス（メス、7週令、日本クレア社製）にデキストラン硫酸ナトリウム（DSS: 和光社製）を3％含有する高塩素水を7日間自由飲水させることにより潰瘍性大腸炎モデルを作製した。また、3％DSS水を給水すると同時に、マウスにはER-TR7（0.4 mg/ml、BMA Biomedicals社製）10μlを生理食塩水（大塚製薬社製）190μlに混合したもの、または生理食塩水のみ200μlを腹腔内に注射した。この処置をおこなったマウス群をER-TR7群、対照群と名付け、3％DSS水を飲水させながら8日間飼育した後、各群の個々のマウスを屠殺し、その大腸を採取し長さを測定した。【００９０】
採取した大腸の長さを測定した後、一部を1.5 mlチューブにとりわけ、液体窒素で凍結した。組織50 mgに対し、RNA-Bee（TEL-TEST社製）1 mlを加えてホモジナイズした懸濁液にクロロホルム200μl（Sigma-Aldrich社製）を加え穏やかに混合後、約5分氷冷し、12,000 rpm、4℃、15分間遠心分離機（Centrifuge 5417R、eppendolf社製）を用い遠心分離をおこなった。遠心分離後の上澄み液500μlを別の1.5 mlチューブに移し、上澄み液と同等量のイソプロパノール500μl（Sigma-Aldrich社製）を加え、混合後1μlのグリコーゲン（Invitrogen社製）を加え、15分間氷冷した。氷冷15分後、12,000 rpm、4℃、15分間遠心し、その後、75%エタノール1000μl（Sigma-Aldrich社製）で3回洗浄して得られたRNA沈殿物を30分〜1時間、自然乾燥させた後、大塚蒸留水（大塚製薬社製）に溶解させ、さらに大塚蒸留水にて100倍希釈し、UVプレート（コーニングコースター社製）上でプレートリーダー（POWER Wave XS、BIO-TEK社製）により抽出したサンプル中のRNA濃度を算出した。得られたRNAサンプルを500 ng/20μlの濃度に調整し、68℃、3分間、BLOCK INCUBATOR（ASTEC社製）にて加温し、10分間氷冷した。氷冷後、予め調整していたRT PreMix液（組成：25 mg MgCl2 18.64μl（Invitrogen社製）、5×Buffer 20μl（Invitrogen社製）、0.1M DTT 6.6μl（Invitrogen社製）、10 mM dNTP mix 10μl（Invitrogen社製）、Rnase Inhibitor 2μl（Invitrogen社製）、MMLV Reverse Transcriptase 1.2μl（Invitrogen社製）、Random primer 2μl（Invitrogen社製）、滅菌蒸留水（大塚蒸留水；大塚製薬社製））を80μl加え、BLOCK INCUBATORにて42℃、1時間、99℃、5分間、加熱した後、氷冷しcDNA 100μlを作成した。【００９１】
得られたcDNAを用いて、以下の組成でPCR反応を行った。SYBR Premix EX taq 12.5μl (TAKARA社製)、滅菌蒸留水11.3μl（大塚蒸留水）、プライマー0.1μl (50 pmol/μl; 表１)、cDNA 1μlを混合させ、Real-time PCR Dice (TAKARA社製)により95℃ 5秒、60℃ 30秒で40サイクル反応させた。反応終了後、β-actin遺伝子の発現量を内部標準として各線維化マーカー遺伝子の発現量の測定をおこなった。【００９２】
その結果、対照群に比べてER-TR7治療群では検定したすべての遺伝子において発現量の低下が見られた。このことにより、ER-TR7を投与することにより線維化が抑制されていると考えられる（図４）。【００９３】
〔実施例５〕  ヒト正常肺線維芽細胞でのER-TR7による細胞免疫染色
ヒト正常肺線維芽細胞（1×104個；CELL APPLICATION社製）を滅菌したギャップカバーガラス（24×25 mm；松波硝子工業社製）を入れた6穴プレート（コーニングコースター社製）中で10μg/ml lipopolysaccharide（Escherichia Coli 055:B5; Sigma-Aldrich社製）を含む10%牛胎児血清（CELL APPLICATION社製）含有HLF Growth Medium（CELL APPLICATION社製）で1日培養した後、PBSで3回洗浄した後、氷冷メタノール（WAKO社製）を加え、4℃で15分間放置した。PBSで3回洗浄した後、ブロックエース（雪印乳業社製）溶液を加え室温2時間放置した。その後、ER-TR7（0.4 mg/ml）をブロックエース溶液に1:500になるように混合し、室温で2時間放置した。PBST（0.05% Tween20）で10分間3回洗浄した後、Alexa Fluor(R) 488 Goat Anti-rat IgG（Molecular Probe社製）を1:2000、TO-PRO3（Molecular Probe社製）を1:5000でPBST中に混合し、この溶液を加え暗所で室温2時間放置した。PBSTで10分間3回洗浄した後、Fluorescent Mounting Medium（DAKO Cytomation社製）で封入し、蛍光顕微鏡（Leica TCS SPE；Leica社製）で観察した。
その結果、ヒト正常肺線維芽細胞ではER-TR7抗原の発現が確認された（図５）。【００９４】
〔実施例６〕  ヒト正常肺線維芽細胞抽出物よりER-TR7抗原の同定
ヒト正常肺線維芽細胞をT150フラスコ（コーニングコースター社製）中で10%牛胎児血清含有HLF Growth Mediumで80%コンフレント（約5×107個）まで培養し、PBSで3回洗浄した後、10μg/ml lipopolysaccharide（Escherichia Coli 055:B5）を含む10%牛胎児血清含有HLF Growth Mediumを加え、3日間培養した。PBSで3回洗浄した後、M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent（PIERCE社製）500μlを加え、細胞抽出物を得た。得られた細胞抽出物8μlと2×Sample Buffer（組成：62.5 mM Tris-HCl（Invitorgen社製）pH6.8、25% glycerol（WAKO社製）、2% SDS（ナカライテスク社製）、350 mM DTT（Sigma Aldrich社製）、0.01% Bromophenol Blue（Sigma-Aldrich社製））8μlを混合し、BLOCK INCUBATOR（ASTEC社製）にて99℃、5分間加熱した。加熱後、全量をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（泳動槽：AE-6530M ラピタス・ミニスラブ電気泳動槽；アトー社製、濃縮ゲル：125 mM Tris-HCl（Invitrogen社製）pH6.8、0.01% SDS（ナカライテスク社製）、3.75%アクリルアミド溶液（29：1=acrylamide（Invitrogen社製）: bisacrylamide（Invitrogen社製））、分離ゲル：375 mM Tris-HCl pH8.8、0.01% SDS、7.5%アクリルアミド溶液、泳動バッファー：25 mM Tris-HCl、192 mM Glycine（WAKO社製）、0.1% SDS、pH 8.3）に100 V、40分間、パワーパックBasic（BIORAD社製）を用いてかけた。泳動終了後、Immobilon-Pメンブレン（MILLIPORE社製）へミニトランスブロットセル（BIORAD社製）を用いて100 V、40分かけて転写した。転写後、メンブレンをブロックエース溶液中で室温1時間放置した後、ER-TR7（0.4 mg/ml）をブロックエース溶液に1:500になるように混合し、この溶液中で室温2時間放置した。TBST（50 mM Tris、150 mM NaCl、0.01% Tween20）で5分間3回洗浄した後、HRP GOAT anti-rat whole A（GE Healthcare Bioscience社製）をTBST中に1:2000になるように混合した液中で室温1時間放置した。その後、TBSTで5分間3回洗浄し、Donkey Anti-Goat IgG (H+L)（Jackson ImmunoReseach Laboratories社製）をTBST中に1:2000になるように混合した液中で室温1時間放置した。TBSTで5分間3回洗浄した後、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate（PIRCE社製）にメンブレンを浸した後、FluorChem（AlphaInnotech社製）でシグナルを検出した。【００９５】
その結果、約70 kDaのシグナルを得た。この結果、このタンパク質がER-TR7の抗原であり、線維化の進行に深く関っていることが示唆された（図６）。【００９６】
〔実施例７〕  各種組織におけるER-TR7陽性細胞の存在の確認
（１）肺気腫モデルマウス肺組織におけるER-TR7陽性細胞の集積
C57BL/6Jマウス（メス、5〜6週令、日本クレア社製）に、ブタ膵臓由来エステラーゼ（PPE、4単位、Calbiochem-Novabiochem社製）を気管内投与する。投与後、３週間飼育し、肺組織を採取した。対照群は同様のマウスでPPE未投与のものを用いた。
採取された肺組織サンプルを、凍結用包埋剤OCTコンパウンド（Miles社製）に包埋し、クライオスタット（カールツァイス社製）により薄切した。得られた切片をアセトン（和光純薬社製）で１０分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてER-TR7抗体（ラットモノクローナル抗体、1μg/ml、BMA社製）を添加し、室温で１時間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識坑ラットIgG（１：２００希釈）を用いて二次抗体反応をおこなった後、DAB基質（ニチレイバイオサイエンス社製）を添加し、発色させた。その後、リリー・マイヤーヘマトキシリン（武藤化学社製）により核染色をおこない、光学顕微鏡（ライカ社製）下でサンプルを観察し、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
上記結果から、線維化肺組織においてER-TR7陽性細胞の存在が確認された。即ち、線維化肺組織は本発明の薬剤の治療対象となり得ることが確認された。
（２）２型糖尿病モデルマウス膵臓組織におけるER-TR7陽性細胞の集積
妊娠１４日目のC57BL/6JcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させ、出生後２日令のメスにStreptozotocin 10mg/ml（SIGMA社製）を20μl/head皮下注射し、４週令までCE-2（日本クレア社製）の飼料、滅菌水を与え飼育し、４週令よりHigh Fat Diet食（日本クレア社製）、滅菌水を与え、２週間飼育し、膵臓組織を採取した。
ER-TR7抗体による免疫染色は上述と同様の方法でおこなった。その結果、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
上記結果から、線維化膵臓組織においてER-TR7陽性細胞の存在が確認された。即ち、線維化膵臓組織は本発明の薬剤の治療対象となり得ることが確認された。
（３）パーキンソン病モデルマウスにおける脳内でのER-TR7陽性細胞の集積
妊娠１４日目C57BL/6JcLマウス（日本クレア社製）を飼育、出産させ、８週令メスに３日連続でドーパミンニューロンのみを選択的に破壊するMPTP（Sigma Aldrich Japan社製）を30mg/kgで体内に投与したものを飼育した。最初の投与１週間後に脳を摘出し、サンプルとした。
採取された脳組織サンプルを、凍結用包埋剤OCTコンパウンド（Miles社製）に包埋し、クライオスタット（カールツァイス社製）により薄切した。得られた切片を４％PFAリン酸緩衝液（ナカライテスク社製）で１０分間固定後、脱イオン水で洗浄し、一次抗体としてER-TR7（１：１００希釈、BMA社製）を添加し、４℃で一晩反応させた。次に二次抗体であるAlexa488標識抗ラットIgGヤギ抗体（I：２００希釈、Invitrogen社製）を添加し、室温で３０分反応させた。その結果、可視化された抗体結合を観察した。
上記結果から、線維化脳組織においてER-TR7陽性細胞の存在が確認された。即ち、線維化脳組織は本発明の薬剤の治療対象となり得ることが確認された。
（４）心筋症モデルマウス心臓組織におけるER-TR7陽性細胞の集積
C57BL/6Jマウス（オス、８週令、日本クレア社製）にDOX（15 mg/kg、協和発酵社製）を腹腔内投与した。投与後１週間飼育し、心臓組織を採取した。
ER-TR7による免疫染色は上述と同様の方法でおこなった。その結果、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
上記結果から、線維化心臓組織においてER-TR7陽性細胞の存在が確認された。即ち、線維化心臓組織は本発明の薬剤の治療対象となり得ることが確認された。
（５）潰瘍性大腸炎モデルマウスの大腸組織におけるER-TR7陽性細胞の集積
C57BL/6Jマウス（メス、６週令、日本クレア社製）にデキストラン硫酸ナトリウム（DSS、和光純薬社製）を３％含有する高塩素水を８日間自由飲水させることにより大腸炎モデルマウスを作製し、大腸を採取した。
ER-TR7抗体による免疫染色は上述と同様の方法でおこなった。その結果、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
上記結果から、線維化大腸組織においてER-TR7陽性細胞の存在が確認された。即ち、線維化大腸組織は本発明の薬剤の治療対象となり得ることが確認された。
（６）腎線維化モデルマウスの腎組織におけるER-TR7陽性細胞の集積
C57BL/6JcLマウス（♀、8週齢、日本クレア社製）に片側尿管結紮術（UUO）を行い、腎線維化モデルを作成した。この腎線維症モデルマウスは再現性に優れており、マウスの腎線維症の実験系で広く用いられている（American journal of pathology 2003 163;4 1261-1273）。マウスをケタラール/キシラジン麻酔下で開腹し、尿管を露出させ、右尿管を4-0号手術用糸で2カ所結紮し、1-0号手術用糸にて腹膜、皮膚を縫合した。８日後、腎組織を採取した。
ER-TR7抗体による免疫染色は上述と同様の方法でおこなった。その結果、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
上記結果から、線維化腎組織においてER-TR7陽性細胞の存在が確認された。即ち、線維化腎組織は本発明の薬剤の治療対象となり得ることが確認された。
（７）肝硬変モデルマウスの肝臓におけるER-TR7陽性細胞の集積
C57BL/6Jマウス（メス、5〜6週令、日本クレア社製）に、四塩化炭素（10μl；Sigma-Aldrich社製）を90μlのミネラルオイル（Sigma-Aldrich社製）に混合し、週2回ずつ4週間にわたり（7回）、腹腔内に注射し、肝線維症を惹起した。さらに四塩化炭素を週2回ずつ2週間にわたって追加投与し（総計11回）、肝硬変を誘導した。その後、２週間飼育し、肝臓を採取した。
ER-TR7抗体による免疫染色は上述と同様の方法でおこなった。その結果、茶色のシグナルで可視化された抗体結合を観察した。
上記結果から、線維化肝組織においてER-TR7陽性細胞の存在が確認された。即ち、線維化肝組織は本発明の薬剤の治療対象となり得ることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明に係る、ER-TR7を有効成分として含有する線維化抑制剤は生体組織の線維化を抑制することにより、組織の過剰な線維化を伴う疾患の治療または予防に効果を有する。本発明に係る線維化抑制剤は、繊維化した組織において、線維化マーカー遺伝子であるα-SMA、TNFα、I型collagenの発現が抑制されることから、組織の線維化を抑制する上で非常に有用である。本発明の線維化抑制剤を投与することによる線維化疾患の治療または予防方法は、薬剤療法によって線維化病変を有効に改善できることから、患者のQOLの向上に役立つ優れた療法となりうる。【００９８】
さらに、医療上での利用にとどまらず、愛玩動物の慢性線維化疾患の治療や予防、家畜動物への投与による疾患予防など、各動物種のER-TR7抗原ホモログに対する抗体の作製によって、ペット産業、畜産産業への利用も期待できる。
【図１】
2008149980.tif 000003
【図２】
2008149980.tif 000004
【図３】
2008149980.tif 000005
【図４】
2008149980.tif 000006
【図５】
2008149980.tif 000007
【図６】
2008149980.tif 000008
【図７】
2008149980.tif 000009
【図８】
2008149980.tif 000010
【図９】
2008149980.tif 000011
【図１０】
2008149980.tif 000012
【図１１】
2008149980.tif 000013
【図１２】
2008149980.tif 000014
【図１３】
2008149980.tif 000015
【配列表】
2008149980000001.app
【国際調査報告】
2008149980.tif 000016
2008149980.tif 000017
2008149980.tif 000018
2008149980.tif 000019
2008149980.tif 000020
2008149980.tif 000021