(57)【要約】本発明は、ＣＤ３８の発現又は酵素活性の上昇を指標とした、オキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患の治療又は予防のための医薬のスクリーニング方法、及び、ＣＤ３８遺伝子領域に存在する変異を指標としたオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患素因の診断に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬の評価方法であって、被験物質投与によるＣＤ３８の発現又はその酵素活性の上昇に基づいて、当該被験物質の前記神経発達障害又は精神疾患に対する治療又は予防効果を評価することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＣＤ３８の発現又はその酵素活性の上昇を、ＣＤ３８の発現量、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ産生酵素活性、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ依存的細胞内カルシウム濃度、あるいは、ＣＤ３８依存的オキシトシン分泌活性に基づいて評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離された視床下部神経細胞又は下垂体神経終末を被験物質で処理し、前記被験物質が処理前に比較して前記細胞中のＣＤ３８の発現量、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ産生酵素活性、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ依存的細胞内カルシウム濃度、あるいは、ＣＤ３８依存的オキシトシン分泌活性を有意に増加させた場合、当該被験物質をオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬として有用と評価することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損しているトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いて評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法：
ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損しているトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、前記動物において血中オキシトシンレベルの増加及び／又は行動異常の回復が見られた場合、当該被験物質をオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬として有用と評価することを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
オキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患が、自閉症、アスペルガー症候群、多動性障害、および学習記憶障害から選ばれるいずれかである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損しているトランスジェニック非ヒト哺乳動物の、オキシトシン系の異常に伴う神経発達障害又は精神疾患のモデル動物としての使用。
【請求項８】
オキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患が、自閉症、アスペルガー症候群、多動性障害、および学習記憶障害から選ばれるいずれかである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
被験者から単離された試料中におけるＣＤ３８遺伝子領域上の変異を検出することにより、当該被験者のオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患の素因を検査する方法。
【請求項１０】
ＣＤ３８遺伝子領域上の変異が配列番号２に示されるＣＤ３８アミノ酸配列の１４０番目のアルギニンのトリプトファンへの置換を引き起こすものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ３８遺伝子領域上の変異が配列番号１に示されるＣＤ３８遺伝子の４６９３番目のシトシンのチミンへの置換である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
オキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患が、自閉症、アスペルガー症候群、多動性障害、および学習記憶障害から選ばれるいずれかである、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自閉症に代表されるオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患の診断と治療におけるＣＤ３８の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
自閉症は社会性や他者とのコミュニケーション能力の発達が遅滞する発達障害の一種である。日本における自閉症の発生率は１０００人に１〜２人の割合と言われているが、自閉症の範囲をどのように設定するかによってその値は異なってくる。日本自閉症協会の発表によれば、自閉症は全国で推定３６万人、知的障害や言語障害を伴わない高機能自閉症（アスペルガー障害）などを含めると１２０万人といわれている。
自閉症の発症については、愛情不足、脳障害、環境素因（水銀の蓄積）などさまざまな原因が提唱されてきたが、現在では遺伝的素因説が有力であり、多くの遺伝的因子が関与すると考えられている。ちなみに、遺伝病であるといわれる精神分裂病における一卵性双生児の双方発症率は５０％であるが、自閉症における一卵性双生児の双方発症率は９０％で、家族内集積も認められている。
例えば、自閉症の発症にＨＯＸＡ１という遺伝子が関係している可能性が高いことが報告されている（非特許文献１）。ＨＯＸＡ１は７番染色体上に存在する遺伝子で、転写因子をコードし、神経の分化や発達に重要なことがわかっているが、自閉症者ではこの遺伝子の繰り返し多型部位に変異が見られる確率が高い。そのほか、発達退行を有する自閉症に関連した遺伝子が第７番染色体と第２１番染色体上にあるとする報告もなされている（非特許文献２）。
最近下垂体ホルモンであるオキシトシンと精神疾患との関連が注目されている。オキシトシンは９つのアミノ酸からなるペプチドホルモンで、乳汁分泌促進や子宮収縮促進作用を有することで知られているが、中枢神経系や男性にもその受容体は存在する。例えば、ある種の自閉症者でオキシトシンの血中レベルが低いことや（非特許文献３）、オキシトシン受容体ノックアウトマウスにおいて、社会行動異常が見られることが報告されている（非特許文献４）。Ｆｅｈｒらは、学生１９４名にオキシトシンあるいはプラセボを鼻粘膜投与して「投資ゲーム」をさせると、オキシトシン投与群はプラセボ投与群より多くの投資を行い、最大投資を行う回数が増えるという結果を報告している（非特許文献５）。この結果は、オキシトシン投与が人への信頼感を高め、リスク負担の気持ちを増加させること、すなわち、オキシトシンが向社会性を促進することを示す。
一方、ＣＤ３８は４５ｋＤａの１回膜貫通型タンパク質で、細胞外ドメインに触媒活性（ＮＡＤ分解活性）を有するエクト型酵素である。ＣＤ３８は活性化したＴおよびＢ細胞、ＮＫ細胞、単球、形質細胞および胸腺髄質細胞で発現することが知られており、その発現は細胞の分化と活性化に依存していると考えられている。ＣＤ３８はＴおよびＢ細胞活性化の研究でマーカーとして広く用いられるほか、臨床的には血液腫瘍の診断、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、再生不良性貧血の診断に利用されている。ＣＤ３８の活性や性質については、特に免疫応答制御の分野において、その他さまざまな報告があるものの、前記した精神疾患やオキシトシン分泌との関連についてはこれまで報告された例はない。
【非特許文献１】Ｉｎｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｒａｔｏｌｏｇｙ．２０００  Ｄｅｃ；６２（６）：３９３−４０５
【非特許文献２】Ｍｏｌｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．２００５  Ａｕｇ；１０（８）：７４１−７４６
【非特許文献３】Ｍｏｄａｈｌ  ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．１９９８  Ｆｅｂ；４３（４）：２７０−２７７
【非特許文献４】Ｔａｋａｙａｎａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００５  Ｎｏｖ  １；１０２（４４）：ｐｐ１６０９６−１６１０１
【非特許文献５】Ｋｏｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００５  Ｊｕｎ  ２；４３５（７０４２）：ｐｐ６７３−６７６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
自閉症をはじめとする精神疾患は、環境素因と遺伝的素因が複雑に絡み合って発症する多因子疾患であり、その診断や治療は容易ではない。また、自閉症の中にも、原因や特徴が異なる複数のタイプが存在するが、各タイプを見分けて有効な治療を選択することは容易ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明者は、ＣＤ３８の機能を調べるためにＣＤ３８ノックアウト（−／−）マウスを作製し、野生型との表現上の違いを調べていたところ、このノックアウトマウスが自閉症者に特徴的な行動異常（多動）や、また血中オキシトシンレベルの顕著な低下を示すことに気がついた。そこで、オキシトシンの皮下注射やヒトＣＤ３８遺伝子の導入によって当該マウスにオキシトシンを補充したところ、前述の行動異常が回復することが確認された。さらに、発明者らはＣＤ３８欠損とオキシトシンレベル低下の関係を調べ、ＣＤ３８によるオキシトシン分泌の制御メカニズムを解明した。ＣＤ３８とオキシトシン分泌や自閉症等の精神疾患との関係については、これまで報告されたことがなく、この知見はこうした精神疾患の新たな治療や予防の可能性を示すものであった。
すなわち、本発明は、オキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬の評価方法であって、被験物質投与によるＣＤ３８の発現又はその酵素活性の上昇に基づいて、当該被験物質の前記神経発達障害又は精神疾患に対する治療又は予防効果を評価することを特徴とする方法を提供する。なお、オキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患としては、自閉症、アスペルガー症候群、多動性障害、および学習記憶障害等を挙げることができる。
前記方法において、ＣＤ３８の発現又はその酵素活性の上昇は、たとえば、ＣＤ３８の発現量のほか、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ産生酵素活性、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ依存的細胞内カルシウム濃度、あるいは、ＣＤ３８依存的オキシトシン分泌活性に基づいて評価することができる。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの評価方法としては、たとえば、単離された視床下部神経細胞又は下垂体神経終末を被験物質で処理し、前記被験物質が処理前に比較して前記細胞中のＣＤ３８の発現量、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ産生酵素活性、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ依存的細胞内カルシウム濃度、あるいは、ＣＤ３８依存的オキシトシン分泌活性を有意に増加させた場合、当該被験物質をオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬として有用と評価することができる。
ｉｎ  ｖｉｖｏでの評価方法としては、たとえば、ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損しているトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いる方法を挙げることができる。具体的には、ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損しているトランスジェニック非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、前記動物において血中オキシトシンレベルの増加及び／又は行動異常の回復が見られた場合、当該被験物質をオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬として有用と評価することができる。
本発明はまた、ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損しているトランスジェニック非ヒト哺乳動物の、オキシトシン系の異常に伴う神経発達障害又は精神疾患のモデル動物としての使用も提供する。
本発明はまた、被験者から単離された試料中におけるＣＤ３８遺伝子領域上の変異を検出することにより、当該被験者のオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患の素因を検査する方法を提供する。
前記ＣＤ３８遺伝子領域上の変異としては、配列番号２に示されるＣＤ３８アミノ酸配列の１４０番目のアルギニンのトリプトファンへの置換を引き起こす変異、たとえば、配列番号１に示されるＣＤ３８遺伝子の４６９３番目のシトシンのチミンへの置換が挙げられる。
【発明の効果】
【０００５】
本発明によれば、従来診断や治療が困難であった、自閉症等のオキシトシン系の異常に関連した精神疾患の素因の診断（特にタイプ別診断）や治療が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
図１は、野生型（Ｎ＝１１）及びＣＤ３８−／−マウス（Ｎ＝８）の自発運動を示す（ａ：経時変化  ｂ：マウス１匹あたりの平均値（６０分間））。
図２は、野生型及びＣＤ３８−／−マウスにおける母性行動を示す（ａ，ｂ：実験方法の概要  ｃ：野生型マウス  ｄ：ＣＤ３８−／−マウス  ｅ：各仔マウスを取り戻すまでの時間  ｆ：腹の下に子ネズミを抱くために座り込む時間、＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。
図３は、野生型及びＣＤ３８−／−マウスにおける社会認識記憶を示す（ａ：実験方法の概要  ｂ：嗅覚調査時間  ｃ：オキシトシン（ＯＴ）、バソプレッシン（ＡＶＰ）、生理食塩水（ＮａＣｌ：ｃｏｎｔｒｏｌ）投与後の嗅覚調査時間  ｄ：ＣＤ３８遺伝子又はＧＦＰ導入後の嗅覚調査時間  ｅ：初回に対する４回目の嗅覚調査時間（％））。
図４は、野生型及びＣＤ３８−／−マウスの嗅覚機能（イソ吉草酸を入れた飲料水と添加されていない普通の水がある場合、イソ吉草酸をさけて普通の水を飲む割合（嗜好比）を示す。
図５は、野生型及びＣＤ３８−／−マウスの受動的回避テスト結果を示す。
図６は、野生型及びＣＤ３８−／−マウスの組織学・生化学的検査結果を示す。図中、ａ：血中オキシトシン（ＯＴ）及びバソプレッシン（ＡＶＰ）濃度、ｂ：組織内オキシトシン（ＯＴ）及びバソプレッシン（ＡＶＰ）濃度、ｃ：野生型マウス脳下垂体切片電顕写真、ｄ：ＣＤ３８−／−脳下垂体切片電顕写真。
図７は、ウイルス処理ＣＤ３８−／−マウスのＣＤ３８発現を示す（ａ，ｂ：ＣＤ３８遺伝子導入後の視床下部におけるＣＤ３８及びオキシトシン（ＯＴ）もしくはバソプレッシン（ＡＶＰ）の免疫染色、ｃ：ＣＤ３８遺伝子又はＧＦＰ導入後の下垂体後葉のウエスタンブロット分析）。
図８は、野生型及びＣＤ３８−／−マウスにおけるＣＤ３８発現と酵素活性を示す。
図９は、野生型及びＣＤ３８−／−マウスにおけるＣＤ３８とＡＶＰの免疫化学分析を示す。ＣＤ３８はヤギ抗マウスＣＤ３８ポリクローナル抗体で赤に、ＡＶＰはウサギ抗ＡＶＰ抗体で緑に染色される。
図１０は、野生型及びＣＤ３８−／−マウスにおいて、オキシトシンあるいはバソプレッシン分泌、または細胞内カルシウム濃度変化に対する各種アンタゴニストの影響をみた結果を示す。
図１１は、野生型（グラフ左）及びＣＤ３８−／−マウス（グラフ右）における、高濃度カリウム脱分極とドパミン分泌の関係を示す。
図１２は、野生型及びＣＤ３８−／−マウスにおける社会認識記憶を示す。ａ：ＣＤ３８ノックアウトマウスにＣＤ３８遺伝子（＋Ｌｅｎｔｉ−ＣＤ３８：ＷＴ）、変異型ＣＤ３８遺伝子（＋Ｌｅｎｔｉ−ＣＤ３８：Ｒ１４０Ｗ）、又はＧＦＰ導入後（＋Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ）の嗅覚調査時間  ｂ：初回に対する４回目の嗅覚調査時間（％）；ＣＤ３８遺伝子（ＷＴ，グラフ右から２番目）、変異型ＣＤ３８遺伝子（Ｒ１４０Ｗ，グラフ一番右）、ＧＦＰ導入後（＋ＧＦＰ，グラフ右から３番目）
図１３は、ＣＤ３８遺伝子上の多型を示す。
図１４は、第３エクソン領域４６９３番目の多型を有する自閉症者３例の家族の多型調査結果を示す。黒塗りは多型を有するもの、網掛けは多型を有しないものを示す。
図１５は、自閉症者２９例について、第３エクソン領域４６９３番目の多型を有する者（Ｒ１４０Ｗ）と有しない者（Ｃｏｎ）の、血中オキシトシン（ＯＴ）レベルと血中バソプレッシン（ＡＶＰ）レベルを示す。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００６−３０８９２０号及び特願２００６−３３９０５４号の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
１．オキシトシンと精神疾患
オキシトシンは、下垂体後葉から分泌される９個のアミノ酸からなるペプチドホルモンである。オキシトシンは、その作用として乳汁分泌促進や子宮収縮促進作用がよく知られているが、ほかにも脂質代謝におけるインスリン様作用が報告されている。最近では、自閉症をはじめとする精神疾患とオキシトシンあるいはオキシトシン受容体との関連が報告され、オキシトシンの精神病患者への応用が期待されている。特に、オキシトシンは向社会性や他人への信頼感を促進する作用を有することから、社会恐怖症や社会生活・集団行動の不得手な人、社会行動・集団生活に問題を持つ自閉症、アスペルガー症候群、多動性障害、および学習記憶障害などの症状に対して有用であると考えられている。なお、本発明において、「オキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患」とは、オキシトシンの欠損、発現量低下、分泌量低下、活性低下、又は局在、あるいはオキシトシン受容体の欠損、発現量低下、機能低下、又は局在等により、オキシトシン分泌不全と同様の状態を生じ、それに伴って引き起こされる可能性がある神経発達障害又は精神疾患であって、たとえば、自閉症、アスペルガー症候群、多動性障害、および学習記憶障害などを含む。
２．ＣＤ３８とオキシトシン分泌
ＣＤ３８は４５ｋＤａの１回膜貫通型タンパク質で、細胞外ドメインに触媒活性（ＮＡＤ分解活性）を有するエクト型酵素である。ＣＤ３８抗原は、主として初期分化と活性化の過程において、大部分の造血系細胞に発現する。ＣＤ３８は、骨髄あるいは胸腺のＢ、Ｔ前駆細胞に発現し、休止期の細胞ではダウンレギュレートされているが、細胞の活性化に伴って再発現し、最終的に分化したＢ細胞（形質細胞）で、非常に高い発現が認められる。そのため、ＣＤ３８はＴおよびＢ細胞活性化の研究でマーカーとして広く用いられるほか、血液腫瘍の診断、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、再生不良性貧血の診断に利用されている。
発明者らは、ＣＤ３８ノックアウト（−／−）マウスにおいて自閉症に類似した行動異常が見られ、この行動異常がＣＤ３８機能の欠損に伴うオキシトシン分泌の低下によるものであることを初めて見出し、実証した。
さらに発明者らは、ＣＤ３８ノックアウト（−／−）マウスを利用したｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験結果から、ＣＤ３８によるオキシトシン分泌制御のプロセスを解明した。このプロセスの概要を下記に示す。
2008059991.tif 000002
視床下部や下垂体神経細胞からのオキシトシン分泌は、サイクリックＡＤＰリボース（ｃｙｃｌｉｃ  ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ：ｃＡＤＰＲ）あるいはニコチン酸アデニンジヌクオチドリン酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｔｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  Ｄｉｎｕｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＮＡＡＤＰ）をセカンドメッセンジャーとするリアノジン受容体を介した細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇により制御されていると考えられる。上記経路のうち、ＣＤ３８はＮＡＤやＮＡＤＰからのｃＡＤＰＲやＮＡＡＤＰ産生に作用して、ｃＡＤＰＲ又はＮＡＡＤＰレベルを高めることでオキシトシン分泌を促す。
３．ＣＤ３８を利用したオキシトシン異常を伴う精神疾患を治療又は予防するための医薬のスクリーニング
１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング
単離された細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングの場合、前記ＣＤ３８の発現量又は酵素活性は、ＣＤ３８遺伝子の発現量、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ産生酵素活性、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ依存的細胞内カルシウム濃度、あるいは、ＣＤ３８依存的オキシトシン分泌活性を指標として評価することができる。なお、本発明において「ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ依存的細胞内カルシウム濃度」とは、５０ｍＭカリウムイオンを含む液で単離神経終末を刺激した時、増加する細胞内ＣａがｃＡＤＰＲやＮＡＡＤＰ阻害剤により抑制される量を意味し、「ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ依存的オキシトシン分泌活性」とは、細胞外から与えたｃＡＤＰＲやＮＡＡＤＰにより神経終末等から分泌されるオキシトシン量を意味する。
用いる細胞としては、視床下部神経細胞又は下垂体神経終末が好ましい。例えば、この視床下部神経細胞又は下垂体神経終末を被験物質で処理し、前記細胞中のｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰレベルを被験物質処理前後で測定し比較する。ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰレベルが処理前に比較して有意（例えば、ｐ＜０．０５）に増加した場合、当該被験物質はオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬として有用であると評価することができる。同様に、ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ依存的細胞内カルシウム濃度が処理前に比較して有意（例えば、ｐ＜０．０５）に増加した場合、当該被験物質はオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬として有用であると評価することができる。あるいはまた、培養中のｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰ依存的オキシトシンの濃度すなわち分泌活性が処理前に比較して有意（例えば、ｐ＜０．０５）に増加した場合、当該被験物質はオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬として有用であると評価することができる。
また、次項で説明するＣＤ３８欠損非ヒト哺乳動物（マウス）から単離した視床下部神経細胞又は下垂体神経終末を用いて同様の評価を行なうこともでき、この場合、その応答の大きさ（鋭敏さ）を指標として評価することも可能である。
ｃＡＤＰＲ及び／又はＮＡＡＤＰレベルは、当該タンパクあるいはその一部に特異的な抗体を用いた免疫学的測定法、アフィニティークロマトグラフィー、二次元電気泳動により測定することができる。免疫学的測定法の具体例としては、例えば、ウェスタンブロット、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）、蛍光・酵素免疫測定法（ＦＥＩＡ）、蛍光偏光免疫測定法（ＦＰＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ）、結合タンパクサンドイッチ測定法（ＳＢＰＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などが挙げられる。これらの免疫学的測定法の詳細については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら編，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版（２００１）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ．Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、などの分子生物学及び生化学における通常の参考書を参照することもできる。なお、「レベル」は当該蛋白質の量に限定されず、これを間接的に示す力価（抗体価等）も含む。
検出に用いられる抗体は、公知の方法にしたがって調製できるし、市販のものを用いてもよい。例えば、抗原を用いて動物を免疫し、該動物生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐ．３６５−３６７，１９８０，Ｐｒｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）にしたがって、特異的抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、これよりモノクローナル抗体を得ることもできる。
前記抗体作製用の抗原は、抗原蛋白質又はその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド（エピトープ部分のポリペプチド）、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体（例えば、Ｎ末端付加するキーホールリンペットヘモシアニン）が付加された誘導体を挙げることができる。抗原ポリペプチドは、遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
抗体は、それを直接標識するか、又は該抗体を一次抗体とし、該一次抗体を特異的に認識する（抗体を作製した動物由来の抗体を認識する）標識二次抗体と協同で検出に用いられる。前記標識の種類として好ましいものは、酵素（アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼ）又はビオチン（ただし二次抗体のビオチンにさらに酵素標識ストレプトアビジンを結合させる操作が加わる）であるが、これらに限定されない。標識二次抗体（又は標識ストレプトアビジン）としては、予め標識された抗体（又はストレプトアビジン）が、各種市販されている。なお、ＲＩＡの場合は１２５Ｉ等の放射性同位元素で標識された抗体を用い、測定は液体シンチレーションカウンター等を用いて行う。これら標識された酵素の活性を検出することにより、抗原の発現量が測定される。アルカリホスファターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼで標識する場合、これら酵素の触媒により発色する基質や発光する基質が市販されている。
発色する基質を用いた場合、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法を利用すれば、目視で検出できる。ＥＬＩＳＡ法では、市販のマイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの吸光度（測定波長は基質により異なる）を測定し、定量することが好ましい。また上述の抗体作製に使用した抗原の希釈系列を調製し、これを標準抗原試料として他の試料と同時に検出操作を行い、標準抗原濃度と測定値をプロットした標準曲線を作成することにより、他の試料中の抗原濃度を定量することも可能である。一方、発光する基質を使用した場合は、ウエスタンブロット法やドット／スロットブロット法においては、Ｘ線フィルム又はイメージングプレートを用いたオートラジオグラフィーや、インスタントカメラを用いた写真撮影により検出することができる。また、デンシトメトリーやモレキュラー・イメージャーＦｘシステム（バイオラッド社製）等を利用した定量も可能である。さらに、ＥＬＩＳＡ法で発光基質を用いる場合は、発光マイクロプレートリーダー（例えば、バイオラッド社製等）を用いて酵素活性を測定する。
２）ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング（ＣＤ３８欠損非ヒト哺乳動物の利用）
後述するＣＤ３８欠損非ヒト哺乳動物（ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損しているトランスジェニック非ヒト哺乳動物）を用いたｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングも可能である。この場合、ＣＤ３８欠損非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、前記動物において血中オキシトシンレベルの増加及び／又は行動異常の回復が見られた場合、当該被験物質をオキシトシン系の異常を伴う精神疾患を治療又は予防するための医薬として有用であると評価することができる。なお、ＣＤ３８欠損非ヒト哺乳動物の作製方法については、次項で詳述する。
なお、オキシトシンレベルは、オキシトシン又はその一部に特異的抗体を用いた免疫学的測定法、アフィニティークロマトグラフィー、二次元電気泳動により測定することができる。その詳細は、前述のとおりである。
４．ＣＤ３８欠損非ヒト哺乳動物
４．１  定義
本発明で用いられるＣＤ３８欠損非ヒト哺乳動物は、「ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損しているトランスジェニック非ヒト哺乳動物」である。
「ＣＤ３８遺伝子」の塩基配列は、マウス、ラット、ヒト等の哺乳動物において公知であり、その配列はＧｅｎＢａｎｋ等の公共データベースを通じて容易に入手することができる（例えば、マウス：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＢ０１６８６８、ヒト：ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ８４２８４等）。また、公共データベースにその配列が登録されていない動物の場合は、常法により、既知のＣＤ３８遺伝子との相同性からそのＣＤ３８遺伝子をクローニングし、配列を決定することができる。すなわち、当該動物のゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、遺伝的に最も近い種に由来する既知のＣＤ３８遺伝子、またはその一部をプローブとして該ライブラリーをスクリーニングし、目的とするＣＤ３８遺伝子を同定し、配列を決定すればよい。
「ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損している」とは、染色体上のＣＤ３８遺伝子が両アレルで破壊され、その機能が正常に発現されないことを意味する。すなわち、ＣＤ３８遺伝子産物が全く発現されない場合だけでなく、当該遺伝子産物が発現されてもＣＤ３８として正常な機能を有しなければ、「ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損している」ことになる。こうしたＣＤ３８遺伝子の破壊は、ＣＤ３８遺伝子上、またはその転写調節領域やプロモーター領域を含む発現制御領域上の部分配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入等の改変によって生じさせることができる。なお、前記欠失、置換、または挿入を行う部位や、欠失、置換、または挿入される配列は、ＣＤ３８遺伝子の正常な機能が欠損しうる限り、特に限定されない。しかしながら、ＣＤ３８遺伝子のコーディング領域の大部分（例えば、５０％以上、好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上）を欠失させるような変異は、確実にＣＤ３８遺伝子の機能を損なわせることができる。このＣＤ３８遺伝子の機能を欠損させる手法については次項で詳細に説明する。
「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の哺乳動物であれば特に限定されないが、マウス、ラット、ウサギ等の齧歯動物が好ましく、特にＥＳ細胞が確立し、遺伝子組換えが容易に実施できるマウスが最も好ましい。
４．２  ＣＤ３８欠損動物の作製方法
本発明で用いられるＣＤ３８欠損動物は、ジーンターゲッティング、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステム、体細胞クローン等の技術を利用することにより作製することができる。
（１）ジーンターゲッティング
ジーンターゲッティングは、相同組換えを利用して染色体上の特定遺伝子に変異を導入する手法である（Ｃａｐｅｃｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１２８８−１２９２，１９８９，Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．＆Ｃｐｅｃｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．Ｃｅｌｌ，４４，４１９−４２８，１９８６）。
１）ターゲティングベクターの構築
まず、ＣＤ３８遺伝子を欠損させるためのターゲッティングベクターを構築する。ターゲッティングベクターの構築に先立って、使用する動物のゲノムＤＮＡライブラリーを調製する。このゲノムＤＮＡライブラリーは、多型等による組換え頻度の低下が起こらないよう、使用する動物のＥＳ細胞、または当該細胞が由来する系統のゲノムＤＮＡから作製したライブラリーを用いる必要がある。そのようなライブラリーとしては市販のもの（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製  １２９Ｓｖ／Ｊゲノムライブラリー等）を用いてもよい。ゲノムライブラリーは、標的とするＣＤ３８ｃＤＮＡまたはその部分配列をプローブとしてスクリーニングを行い、ＣＤ３８ゲノムＤＮＡをクローニングする。
クローニングされたゲノムＤＮＡはシークエンシング、サザンブロッティング、制限酵素消化等を行うことにより、各エクソンの位置を明示した制限酵素地図を作成し、変異導入部位等を決定する。また、ターゲッティングベクターに使用する相同領域の外側には相同組換え体をスクリーニングするためのプローブ（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｂｅ）を設定する。
本発明において、染色体上に導入する変異（欠失、置換、または挿入）はＣＤ３８遺伝子の正常な機能が損なわれる限り特に限定されない。例えば、欠失または置換される配列は、ＣＤ３８遺伝子のイントロン領域であってもエクソン領域であっても、あるいはＣＤ３８遺伝子の発現制御領域であってもよい。特に、ＣＤ３８遺伝子のコーディング領域の大部分（例えば、５０％以上、好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上）を欠失させるような変異であれば、確実にＣＤ３８遺伝子の機能を欠損させることができる。また、挿入される他の配列も特に限定されず、例えば、以下のような各マーカー遺伝子配列であってもよい。
ターゲッティングベクターは、変異導入部位の３’および５’側の相同領域とともに、組み換え体を選択するための適当な選択マーカーを含む。該マーカーとしては、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子（ｐＧＫｎｅｏ、ｐＭＣ１ｎｅｏ等）、βラクタマーゼ遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子等のポジティブセレクションマーカー、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴ−Ａ）等のネガティブセレクションマーカー等が挙げられるが、これらに限定されない。また、ベクターは相同領域の外側に、ベクターを直鎖化するための適当な制限酵素切断部位を含む。
こうしたターゲッティングベクターの構築は、市販のプラスミドベクター（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）等）を利用して好適に行うことができる。
２）ＥＳ細胞へのターゲッティングベクターの導入
次に、構築されたターゲティングベクターを胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の全能性を有する細胞に導入する。ＥＳ細胞は、マウス、ハムスター、ブタ等では細胞株が樹立されており、特にマウスでは、１２９系マウス由来のＫ１４株、Ｅ１４株、Ｄ３株、ＡＢ−１株、Ｊ１株や、Ｒ１株、ＴＴ２株等、複数の細胞株が入手可能である。また、マウスではＥＳ細胞に代えて胚性ガン腫細胞（ＥＣ細胞）を利用することもできる。
ＥＳ細胞は、ターゲッティングベクターの導入に先立って、適当な培地で培養しておく。例えば、マウスＥＳ細胞であれば、マウス繊維芽細胞等をフィーダー細胞として、これにＥＳ細胞用の液体培地（例えば、ＧＩＢＣＯ製）を加えて共培養する。
ＥＳ細胞へのターゲッティングベクターの導入は、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム法等、公知の遺伝子導入法により実施することができる。ターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞は、ベクター中に挿入されたマーカーにより容易に選択することができる。例えば、ネオマイシン耐性遺伝子をマーカーとして導入した細胞であれば、Ｇ４１８を加えたＥＳ細胞用培地で培養することにより、一次セレクションを行うことができる。
ターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞では、相同組換えによって、染色体上のＣＤ３８遺伝子の一部が該ベクターで置換され、内因性のＣＤ３８遺伝子が破壊される。所望の相同組換えがなされたか否かは、サザンブロティングやＰＣＲ法等を利用したジェノタイプ解析によって判定できる。サザンブロッティングによるジェノタイプ解析は、変異導入部位の外側に設定したプローブ（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｐｒｏｂｅ）を用いて行うことができる。ＰＣＲ法によるジェノタイプ解析は、それぞれ野性型と変異型ＣＤ３８遺伝子の特異的増幅産物を検出することにより実施できる。こうしてターゲッティングベクターが適切に導入されたＥＳ細胞は、さらに次の段階に備えて培養しておく。
３）キメラ動物の作製
ターゲッティングベクターが導入されたＥＳ細胞（組換えＥＳ細胞）は、ＥＳ細胞が由来する系統とは外見上明らかな相違を有する別な系統由来の初期胚に導入し、キメラ動物として発生させる。例えば、マウスであれば、Ａｌｂｉｎｏ色の毛色を有する１２９系由来のＥＳ細胞に対しては、黒色の毛色を有し、マーカーとして利用できる各種遺伝子座が１２９系マウスとは異なっているＣ５７ＢＬ／６マウス等の初期胚を用いることが望ましい。これにより、キメラマウスはその毛色によって、キメラ率を判断することができる。
ＥＳ細胞の初期胚への導入は、マイクロインジェクション法（Ｈｏｇａｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．”Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ”Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８）や、アグリゲーション法（Ａｎｄｒａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，８４２４−８４２８，１９９３，Ｓｔｅｐｈｅｎ，Ａ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，４５８２−４５８５，１９９３）等により行うことができる。
マイクロインジェクション法は、ＥＳ細胞を胚盤胞（ブラストシスト）に直接注入する方法である。すなわち、動物より採取した胚盤胞（ブラストシスト）に、マイクロマニピュレーター等を用いて組換えＥＳ細胞を顕微鏡下で直接注入してキメラ胚を作製する。このキメラ胚を、仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植し、発生させれば、所望のキメラ動物を得ることができる。
一方、アグリゲーション法では、透明帯を除去した２個の８細胞期の胚の間に、ＥＳ細胞の塊を挟み込むように挿入して培養し、凝集させてキメラ胚を得る。このキメラ胚を、仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植し、発生させれば、キメラ動物を得ることができる。
４）ＣＤ３８欠損動物系統の作製
仮親から得られたキメラ動物は、さらに同系の野性型動物と交配する。得られる動物の約半分は、ＣＤ３８遺伝子欠失染色体をヘテロで有するはずである。各個体のジェノタイプは、毛色等の外見上の特徴で一時判定できるほか、前述したサザンブロッティングやＰＣＲ法を利用したジェノタイプ解析によって決定することができる。こうして、ヘテロ型のＣＤ３８欠損動物が同定されたら、このヘテロ型のＣＤ３８欠損動物同士を交配して、ＣＤ３８遺伝子の欠損をホモで有する動物を得ることができる。
本発明のＣＤ３８欠損動物には、上記ＣＤ３８遺伝子の欠損をヘテロで有する動物と、ホモで有する動物の両方を含むものとする。さらに、上記のようにして作製されたＣＤ３８欠損動物の子孫も、染色体上のＣＤ３８遺伝子の機能が欠損している限り、本発明のＣＤ３８欠損動物に含まれる。
（２）  Ｃｒｅ−ｌｏｘＰシステムの利用
ジーンターゲッティングにバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ−ｌｏｘＰシステムを利用して、部位特異的、時期特異的に標的遺伝子を欠損させる方法（Ｋｕｈｎ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９，１４２７−１４２９，１９９５）もある。ｌｏｘＰ（ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  Ｘ−ｉｎｇ−ｏｖｅｒ）配列は３４塩基対からなるＤＮＡ配列でＣｒｅ（Ｃａｕｓｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）組換え酵素の認識配列である。遺伝子上の２つのｌｏｘＰ配列はＣｒｅ蛋白の存在下で特異的組換えを起こす。すなわち、欠損させたい標的遺伝子をｌｏｘＰで挟んだものに置換し、さらにＣｒｅ発現ベクターを組み込めば、部位特異的・時期特異的なＣｒｅ蛋白の産生により、ｌｏｘＰで挟まれた標的遺伝子を欠失させることができる。
例えば、前項１）に準じて欠損させるＣＤ３８遺伝子領域の５’側にｌｏｘＰ遺伝子を３’側にｌｏｘＰ遺伝子で挟んだマーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）を組み込んだターゲッティングベクターを作製し、ＥＳ細胞に導入する。ＥＳ細胞はマーカーによる選択の後、サザンブロッティングあるいはＰＣＲ法によるジェノタイプ解析を行って相同組換えを確認する。この相同組換えＥＳ細胞に、さらにＣｒｅ蛋白を特異的プロモーターに連結したＣｒｅ発現ベクターを導入する。得られたＥＳ細胞から、ｌｏｘＰ組換えによってマーカー遺伝子のみが欠失し、ＣＤ３８遺伝子領域は欠失していないＥＳ細胞クローンを同定する。このＥＳ細胞を前項３）および４）に準じて動物に導入し、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え動物を得る。
あるいは、ＣＤ３８遺伝子両端にｌｏｘＰ遺伝子を組み込んだターゲッティングベクターを導入したｌｏｘＰ導入組換え動物と、Ｃｒｅ発現ベクターを導入したＣｒｅ発現組換え動物を別個に作製し、両者を交配することによって、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換え動物を作製してもよい。
こうして得られたＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換え動物は、Ｃｒｅ蛋白の発現に応じて、部位特異的、時期特異的にＣＤ３８遺伝子を欠損しうる。したがって、特定時期、特定部位におけるＣＤ３８遺伝子の機能解析に極めて有用である。
（３）  体細胞クローン
ＥＳ細胞が利用できない動物の場合、体細胞クローン（Ｉ．Ｗｉｌｍｕｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３８５，８１０−８１３，１９９７、Ａ．Ｅ．Ｓｃｈｎｉｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２７８，２１３０−２１３３，１９９７）を利用してＣＤ３８欠損動物を作製することも可能である。体細胞クローンとは、体細胞から取り出した核を、脱核した未受精卵に移植してクローン胚を作製し、このクローン胚を仮親の子宮に移植して発生させたクローンである。この体細胞クローンに遺伝子導入技術を組み合わせれば、所望の組換え動物クローンを得ることができる。すなわち、予めＣＤ３８遺伝子を欠損させる組換え操作を行った体細胞から核を取り出し、これを脱核した未受精卵に移植して、クローン胚を作製する。このクローン胚を仮親（偽妊娠動物）の子宮に移植して、体細胞クローン動物を得れば、この動物はＣＤ３８遺伝子の欠損を有することになる。
４．３  ＣＤ３８欠損非ヒト哺乳動物の利用方法
前記したように、ＣＤ３８の機能が染色体の両アレルで欠損しているトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、血中オキシトシンレベルが野生型に比較して顕著に低く、自閉症等のオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患にみられる行動異常を呈する。それゆえ、ＣＤ３８欠損非ヒト哺乳動物は、これら神経発達障害又は精神疾患のモデル動物として、その病態研究や治療薬の開発（スクリーニング系）に有用である。
５．  ＣＤ３８遺伝子の変異に基づくオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患の診断
本発明者らは、自閉症者の染色体を検査し、高頻度でＣＤ３８遺伝子第３エクソン領域にＣからＴへの１塩基多型（配列番号１の塩基番号４６９３番のシトシンのチミンへの置換）が見られることを見出した。この変異は配列番号２に示されるＣＤ３８アミノ酸配列の１４０番目のアルギニンのトリプトファンへの置換を伴う新規多型であり、この変異がオキシトシン分泌不全を介した社会性の低下につながる可能性が高い。よって、このＣＤ３８遺伝子領域に変異を検出することにより、オキシトシン系の異常を伴う自閉症、アスペルガー症候群、多動性障害、あるいは学習記憶障害等の遺伝的素因を検査することができる。変異の解析は、生体試料から常法により抽出・精製したゲノムＤＮＡ若しくはｍＲＮＡ又はそこから得たｃＤＮＡを用い、ＳＮＰや配列変異を検出するために当業者が利用可能な公知の任意の方法を使用して行うことができる（Ｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８６：２７６６−２７７０等を参照されたい）。これらの解析に使用できる具体的な手法としては、例えば、ＣＡＰＳ（Ｃｌｅａｖｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）法、ＰＣＲダイレクトシークエンス法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，２４６−２４９（１９９１）〕、ＡＰ−ＰＣＲ（Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  Ｐｒｉｍｅｄ−ＰＣＲ）法〔Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，７２１３−７２１８（１９９０）〕、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型）法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１６，２９６−２９７（１９９４），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１，５１０−５１４（１９９６）〕、ＡＳＯ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ハイブリダイゼーション法〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１８９，１５３−１５７（１９９０）〕、ＡＲＭＳ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｉｎｇ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）法〔Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１９，３５６１−３５６７（１９９１），Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２０，４８３１−４８３７（１９９２）〕、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｇｅｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＤＧＧＥ）法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｓ，２７，１０１６−１０１８（１９９９）〕、ＲＮａｓｅＡ切断法〔ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，８７−９４（１９９５）〕、化学切断法〔Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１，２１６−２１８（１９９６）〕、ＤＯＬ（Ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ）法〔Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，８，５４９−５５６（１９９８）〕ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ／Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）法〔Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，７，３７８−３８８（１９９７），Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５，５４５−５４８（１９９７）〕、ＴＤＩ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｙｅ−ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）法〔Ｐｒｏｃ���Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１０７５６−１０７６１（１９９７）〕、パドロック・プローブ（Ｐａｄｌｏｃｋ  Ｐｒｏｂｅ）法〔Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，３，ｐ２２５−２３２（１９９８）、遺伝子医学，４，ｐ５０−５１（２０００）〕、モレキュラー・ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）法〔Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，ｐ４９−５３（１９９８）、遺伝子医学、４，ｐ４６−４８（２０００）〕、ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法〔Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．，１４，１４３−１４９（１９９９），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３４，２９３３−２９３６（１９９６）〕、インベーダー法〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，５１０９，７７８−７８３（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３０，２１３８７−２１３９４（１９９９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，２９２−２９６（１９９９）〕、ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション法（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｌｌｅｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＤＡＳＨ）法〔Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１，ｐ８７−８８，（１９９９）、遺伝子医学，４，ｐ４７−４８（２０００）〕、ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｋａｒａ．ｃｏ．ｊｐ）参照〕、及びＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイを用いる方法〔Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，（１９８９），Ｄｒｍａｎａｅ，Ｒ．，Ｌａｂａｔ，Ｉ．，Ｂｒｕｋｎｅｒ，Ｉ．ａｎｄ  Ｃｒｋｖｅｎｊａｋｏｖ，Ｒ．，ｐ１１４−１２８、Ｂｉｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．１７  Ｎｏ．４，「ＤＮＡチップ技術」ｐ５−１１（２０００）〕等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。検出に先立って、ＣＤ３８遺伝子第３エクソン領域はＰＣＲあるいはＲＴ−ＰＣＲにより適宜増幅する。被験者の試料から、配列番号１に示されるＣＤ３８遺伝子の塩基番号４６９３番のシトシンのチミンへの置換が見出された場合、当該被験者はオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患（たとえば、自閉症、アスペルガー症候群、多動性障害、あるいは学習記憶障害）の遺伝的素因を有していると評価することができる。
６．  キット
抗ｃＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ＮＡＡＤＰ抗体は、本発明のオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患を治療又は予防するための医薬の評価用キットとして利用可能である。
抗ｃＡＤＰＲ抗体及び／又は抗ＮＡＡＤＰ抗体は、前記した方法により作製することができる。抗体は適当な標識によりラベル（例えば、酵素標識、放射性標識、蛍光標識等）されていてもよいし、ビオチン等により適当に修飾されていてもよいし、適当な支持体に固相化されていてもよいし、あるいは固相化可能なように別個に支持体がキットが含まれていてもよい。そのような支持体としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリブチレン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド等の蛋白を付着可能な合成樹脂、ガラス、ニトロセルロース、セルロース、及びアガロース製の支持体、あるいはゲル型支持体を使用することができる。支持体の形態は特に限定されないが、極小球あるいはビーズ（例えば“ラテックス”ビーズ）などの微粒子、微量遠心チューブなどのチューブ（内壁）、マイクロタイタープレート（ウェル）等の形態で提供される。
本発明はまた、ＣＤ３８遺伝子の変異に基づくオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患の診断用キットも提供する。前記キットは、配列番号１に示されるＣＤ３８遺伝子の塩基番号４６９３番目のシトシンのチミンへの置換を検出可能なプローブ、当該領域近傍を増幅するためのプライマー等を含む。
本発明のキットは上記した構成要素のほか、必要に応じて、ラベル体の検出のための試薬、反応用緩衝液、酵素、基質等、本発明の実施に必要な他の要素を含んでいてもよい。
【実施例】
【０００８】
以下、実施例により本発明についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものではない。
実施例１：
１．ＣＤ３８−／−マウス（ＣＤ３８遺伝子のホモ欠損マウス）の作製
東北大学Ｋａｔｏらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１８６９−１８７２（１９９９））に従い、ＣＤ３８遺伝子のホモ欠損マウス（ＣＤ３８−／−マウス）を以下のようにして作製したものを、ＣＤ３８サイクリックＡＤＰリボース情報伝達系の研究について過去多大な実績のある東北大学より供与を受けて実験に用いた。
（１）ターゲッティングベクターの作製
ＧｅｎＢａｎｋ登録のマウスＡＢ０１６８６８の第１エクソンを含むＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ切断の１５キロ塩基長をＴＴ２胎児幹細胞からクローニングした。これをｌｏｘｐｔｏＢａｍＨＩ切断面と連結し、さらにＰＫＧ−１プロモーター、ネオマイシン抵抗遺伝子、さらにジフテリア毒素Ａ断片を連結させてｐＣＤ３８−ｌｏｘＰ−ＤＴＡを作製した。
（２）マウスＥＳ細胞へのターゲッティングベクターの導入
ＴＴ２幹細胞にＮｏｔＩサイトで切断したｐＣＤ３８−ｌｏｘＰ−ＤＴＡを導入した。ネオマイシン耐性株細胞を選択し、ＣＤ３８ｍＲＮＡ  ＣＤ３８たんぱく質の発現パターンより、欠損細胞を選抜した。
（３）ＣＤ３８−／−マウスの樹立
ＣＤ３８欠損幹細胞をＩＣＲマウスの８分裂胎細胞に挿入し、キメラマウスを確立した。キメラマウス（オス）と（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  ｘ  ＤＢＡ）Ｆ１（メス）を掛け合わせたマウスから得られた受精卵母細胞の雄性前核にＣｒｅを含むプラスミドを導入した。この受精卵母細胞から得られた新生仔Ｆ１にはＣＤ３８のエクソンＩを欠失しているマウスが存在した。このＣＤ３８のエクソンＩ欠失マウスをＩＣＲマウスにバッククロスして得たヘテロマウス同士を交接して得たＣＤ３８−／−マウスと野生型マウスを実験に用いた。
２．ＣＤ３８−／−マウスにおける行動異常
（１）自発運動
試験方法
既報（Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２，１６０６６−１６０７１（２００５））に従い、マウスは１匹ずつ透明のアクリル製ケージ（２５ｘ３０ｘ１８ｃｍ）にいれ、動きを赤外線センサー（ＮＳ−ＡＳ０１；Ｎｅｕｒｏｓｃｅｉｅｎｃｅ  Ｉｄｅａ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）により５分毎に６０分間測定した。
結果
ＣＤ３８−／−マウス（野生型（Ｎ＝１１）、ＣＤ３８−／−（Ｎ＝８））は、同腹の野生型に比較して、有意に自発運度性が高いが（図１）、不安や恐れといった精神活動の異常は全く、あるいはほとんど認められなかった。
（２）分娩後雌マウスにおける母性行動
試験方法
図２のａ−ｂに示すように、分娩後の雌マウス（野生型（Ｎ＝６）、ＣＤ３８−／−（Ｎ＝１０））から生後６−１４日目の仔マウスを１０分間引き離した後、親マウスをケージの角に戻し、他の３つの角に仔マウスを置き、親マウスの行動を観察した。また、各仔マウスを取り戻すために要した時間と、３匹の仔マウスの上に屈んで懐い抱く時間を測定した。
結果
野生型は極めて短い時間にすべての仔マウスを集め、取り戻した仔マウスの上に屈み長い間あたため授乳を行なった（図２ｃ，ｅ，ｆ）。これに対し、ＣＤ３８−／−マウスは仔マウスを集めるのに長い時間を要し、仔マウスの上に屈んでいる時間は野生型に比べて短く、明らかな母性行動の異常が認められた（図２ｄ，ｅ，ｆ）。このように、ＣＤ３８−／−マウスではその育児活動（母性行動）に明らかな異常が見られた。
３．雄マウスにおける社会認識記憶
試験方法
一般に、雄マウスを同じ雌マウスと繰り返し、あるいは長時間会わせると、相手を確認するための嗅覚調査行動（ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）が減退する。そこで、図３に示すように、７−９週齢の雄マウス（各群Ｎ＝１０）を同じ雌マウスと１分間会わせ、１０分置いてまた会わせることを４回繰り返し、次いで、新しい雌マウスに１分間会わせ、その行動をビデオに撮影し、嗅覚調査行動を行なう時間を測定した。なお、各マウスは試験開始前７−１０日前にケージで飼育し、ｈｏｍｅ−ｃａｇｅ  ｔｅｒｒｉｔｏｒｙを確立させるようにした。
結果
野生型マウスでは同じ雌マウスと繰り返し（４回）会わせると、嗅覚調査行動（時間）の減退が見られたが、新しい雌マウスと会わせると、最初のマウスに最初にあわせたときと同程度の嗅覚調査行動を行なった（図３ｂ）。しかし、若いＣＤ３８−／−雄マウスの場合は、同じ雌マウスと繰り返し（４回）会わせても、嗅覚調査行動の減退は見られず、新しい雌マウスと会わせても同様の嗅覚調査行動を示した（図３ｂ）
４．嗅覚機能試験
試験方法
前項の嗅覚調査行動の減退が、嗅覚機能の異常に伴うものであるかどうかを確認するため、何も添加しない水と飲料水にイソ吉草酸を入れた水を用意し、その両方を飼育ケージにいれ、マウスが２−４日間に飲む両方の水の量を測定し比較した。その消費量から嗜好比（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｒａｔｅ）を求めた。
結果
ＣＤ３８−／−マウスと野生型の間に有意な嗜好比の違いはみられなかった（図４）。この結果から、ＣＤ３８−／−マウスにおける社会認識記憶（Ｓｏｃｉａｌ  ｍｅｍｏｒｙ）の異常は嗅覚異常によるものではないことが確認された。
５．受動的回避テスト
試験方法
臭覚調査行動の異常が全般的認識障害であるかどうかを調べるために、学習・記憶や罰を受けた後の行動抑制を調べる受動的回避テストを行なった。テスト区画は、暗箱と明箱で構成され、暗箱に入ると、床から弱い電気ショックを与えるようになっている。まず明箱にマウスを入れ、それから暗箱への扉を開くと、マウスは暗い場所を好むため暗箱に入り電気ショックを受ける。これを４回繰り返しトレーニングし覚えさせた。翌日、同様にマウスを明箱に入れ、暗箱への扉を開くことを繰り返す。記憶があればマウスは暗箱に入るのをためらい、入るまでの時間が遅くなる。マウスが暗箱に３００秒間入らなかった場合は、正常とみなした。
結果
ＣＤ３８−／−マウスと野生型の間には受動的回避テストにおける相違は認められなかった（図５）。つまり、ＣＤ３８−／−マウスでは全般的認識障害はなく、社会認識記憶だけが低下していることが確認された。
６．ＣＤ３８−／−マウスの組織学的・生化学的検査
試験方法
イムノアッセイ：血液及び組織は試験前日に単離し、検査はキット製造元のプロトコール（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のプロトコールにしたがって実施した。電子顕微鏡解析：マウスはＮｅｍｂｕｔａｌで麻酔し、ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ（２％グルタルアルデヒド、２％ＴＥＡ、０．１Ｍリン酸バッファー）で固定した。組織は２％ＯｓＯ４溶液で固定し、日本電子製電子顕微鏡を用いて観察した。
結果
血中オキシトシン濃度を測定したところ、ＣＤ３８−／−マウスでは野生型に比較して有意に低い値を示した（図６ａ）が、視床下部や脳下垂体では野生型に比較して増加していた（図６ｂ）。同じ下垂体ホルモンであるバソプレッシンの血中濃度や組織濃度は、ＣＤ３８−／−マウスと野生型でほとんど差異が認められなかった（図６ａ）。脳下垂体を電子顕微鏡で分析したところ、野生型では神経終末にオキシトシン分泌小胞（ｄｅｎｓｅ  ｃｏｒｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）が少なく（図６ｃ）、一方ＣＤ３８−／−マウスでは神経終末にｄｅｎｓｅ  ｃｏｒｅ  ｖｅｓｉｃｌｅが多量に蓄積されていることが確認された（図６ｄ）。このことから、ＣＤ３８−／−マウスにおける血中オキシトシン濃度の低下は、オキシトシンの合成や小胞内取込みではなく、分泌異常によるものであることが示唆された（図６ｄ）。
７．オキシトシン投与あるいはＣＤ３８導入による行動異常の回復
血中オキシトシン濃度の低下が行動異常の原因であるなら、オキシトシンの補充によりＣＤ３８−／−マウスの行動異常は回復するはずである。そこで、ＣＤ３８−／−マウスにオキシトシンを皮下投与、あるいはレンチウイルスベクターを用いてＣＤ３８遺伝子を導入することで、母性行動と社会認識記憶の異常が回復するか否かを観察した。
（１）オキシトシン皮下投与
試験方法
既報にしたがい（Ｂｏｃｃｉａ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅａｒｎ．Ｍｅｍｏｒｙ  ６９，１３６−１４６（１９９８））、０．０５Ｍ酢酸に溶解したオキシトシン（ＯＴ）あるいはバソプレッシン（ＡＶＰ）を、生理食塩水で０．０１μＭに調整したものを、前述の分娩後のＣＤ３８−／−雌マウス（Ｎ＝６−８）及び若い雄マウス（各群Ｎ＝１０）に１−１０ｎｇ／ｋｇ体重ｍｌで１回皮下投与した。
結果
オキシトシン投与により、分娩後のＣＤ３８−／−雌マウスでは野生型と同様の母性行動の回復がみられ（図２ｅ及びｆ）、また若い雄マウスでは社会認識記憶の回復が見られた（図３ｃ）。これに対し、バソプレッシンの投与では何らの変化も見られなかった（図３ｃ）。一方、野生型ではオキシトシン及びバソプレッシンの投与による変化は見られなかった。
（２）ＣＤ３８遺伝子導入
試験方法
既報（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００６  Ａｐｒ  １２；１０８２（１）：１１−２２）にしたがい、ＭＳＣＶプロモーター制御下にヒトＣＤ３８遺伝子（Ｔａｋａｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２６０５２−２６０５４（１９９３））あるいはＧＦＰを連結したＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉ−ｈＣＤ３８，ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ：このウイルスベクターは視床下部・脳下垂体選択的に発現する）を用意し、１：１で混合し、３６００００ｎｇ  ｏｆ  ｐ２４／ｍｌとなるようにウイルス懸濁液を調製した。このウイルス懸濁液を６−８週齢の雄マウスの第３脳室に投与し、投与２週間後のマウスを前述の社会認識記憶の試験に用いた。
結果
２週間後、ｌｅｎｔｉ−ｈＣＤ３８を導入したマウスでは、視床下部及び下垂体でヒトＣＤ３８の発現と免疫反応が見られたが、ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰを導入されたマウスではヒトＣＤ３８特異的な免疫反応は見られなかった（図７）。ｌｅｎｔｉ−ｈＣＤ３８導入マウスではオキシトシンの低い血中レベルと高い組織レベルは逆転したが、ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ導入マウスでは変化は見られなかった（図６ａ，ｂ）。バソプレッシンの血中レベル（図６ａ）及び組織レベルに変化は見られなかった。
ｌｅｎｔｉ−ｈＣＤ３８を導入されたＣＤ３８−／−雄マウスでは、社会認識記憶の回復が見られた。すなわち、同じ雌と会わせる回数が増えるにつれ嗅覚調査行動は減退し、新たな雌マウスに会わせると嗅覚調査行動は回復した（図３ｄ）。このｌｅｎｔｉ−ｈＣＤ３８発現による回復は、オキシトシン皮下投与に匹敵するものであった（図３ｅ）。
８．ＣＤ３８発現と酵素活性試験方法
１）ＡＤＰ−リボシルサイクラーゼ活性
ＡＤＰ−リボシルサイクラーゼ活性は、既報（Ｈｉｇａｓｈｉｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３３３４８−３３３５４（１９９９））にしたがって測定した。すなわち、Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  Ｇｕａｎｉｎｅ  Ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（ＮＧＤ）を酵素基質に用い、産生されてくるサイクリックＧＤＰ−リボース（ｃＧＤＰＲ）量を蛍光分光計で測定した。３４９ｎｍの励起波長及び４９９ｎｍの測定波長を用いた。
２）ｃＡＤＰＲレベル
ｃＡＤＰＲレベルは、４℃０．６Ｍ過塩素酸を用いて組織からヌクレオチドを抽出し、既報（Ｇｒａｅｆｆ，Ｒ．＆Ｌｅｅ，Ｈ．Ｃ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３６１，３７９−３８４（２００２））にしたがって酵素リサイク
リング法にて測定した。
３）視床下部細胞及び脳下垂体神経終末の単離
視床下部ニューロンの細胞体と神経終末は既報（ＯｕＹａｎｇ，Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１０２４，２０３−２１１（２００４））にしたがって単離し、Ｌｏｃｋｅ溶液で洗浄後、ショ糖２７０；ＨＥＰＥＳ−Ｔｒｉｓ，１０；Ｋ−ＥＧＴＡ，０．０１を含む溶液（ｉｎ  ｍＭ，ｐＨ７．２５）中でホモジナイズしてペトリ皿に移し５−８分静置した。
結果
ＣＤ３８発現量の低下につれて、ＣＤ３８−／−マウスから単離した脳組織ではＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ活性の顕著な低下がみられた。視床下部室周囲領域の免疫組織化学的分析と他の検査によりこの表現的変化を確認した（図８）。
野生型マウスでは、ＣＤ３８の免疫反応はオキシトシン発現神経及び／又はバソプレッシン発現神経上あるいはその外側に点状ドットとして観察されたが、ＣＤ３８−／−マウスでは、バックグラウンドレベルにすぎなかった（図８ａ、図９）。野生型マウスでは、ＣＤ３８  ｍＲＮＡレベルは視床下部領域で非常に高いが、下垂体後葉では低かった（図８ｂ）。この結果はＮＧＤ＋からのｃＧＤＰＲ産生量によって測定したＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ活性の結果とよく一致していた（図８ｃ）。
視床下部と神経性下垂体のいずれにおいても、ＣＤ３８−／−マウスは極めて低いＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ活性を示したが（図８ｅ）、これはｃＡＤＰＲ量の減少に一致した（図８ｄ）。
ＣＤ３８−／−マウスにおけるＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ活性の低下は、ヒトＣＤ３８遺伝子導入によって部分的に回復した（図８ｅ）。
９．オキシトシン分泌とＣａ２＋濃度（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
試験方法
オキシトシン分泌：
単離した細胞と神経終末を６時間静置した後、実験を開始した。４５分間還流しコントロール濃度測定用に最後の５分ごとに３回還流液を集め、次いで７０ｍｍｏｌ  ＫＣｌを含むロック液で５分間還流した。得られた還流液中のオキシトシン濃度をオキシトシン測定キットを用いて測定し、脱分極刺激によって分泌されたオキシトシン濃度とした。
細胞内カルシウム：
細胞をオレゴングリーンとともに１時間インキュベーションして細胞内に取り込ませた。次いで、４８５ｎｍの励起波長を用い、５３８ｎｍフィルターで当該細胞の蛍光光度を測定した。測定には、蛍光顕微分光光度計とアルガス５０ＣＣＤカメラによる集光装置を用いた。
結果
野生型マウスでは、高濃度カリウムによる脱分極は、単離した視床下部神経からのオキシトシン分泌を２倍以上増加させ（図１０ａ）、脳下垂体神経終末からの分泌を８倍増加させた（図１０ｂ）。一方、ＣＤ３８−／−マウスでは、いずれの組織においても（特に下垂体神経において顕著に）、オキシトシン分泌は減少したが（図１０ａ，ｂ）、バソプレッシン分泌はどの領域でも認められなかった（図１０ｃ）。
野生型マウスにおける下垂体神経終末からのオキシトシン分泌は、２００μＭリアノジン（リアノジンはこの量でリアノジン受容体の完全アンタゴニストとして作用する）、１００μＭ  ８−ｂｒｏｍｏ−ｃＡＤＰＲ（ｃＡＤＰＲのリアノジン受容体結合部位のアンタゴニスト）、及び２μＭ  ｂａｆｉｌｏｍｙｃｉｎ（ＮＡＡＤＰアンタゴニスト）処理によってＣＤ３８−／−マウスと同レベルに減少した。（図１０ｂ）。
さらに、Ｃａ２＋で初回刺激したいずれのマウスにおいても、下垂体神経終末からのオキシトシン分泌は、細胞外から投与したｃＡＤＰＲ（１０μＭ）及びＮＡＡＤＰ（１００ｎＭ）により促進された。特に、ＣＤ３８−／−マウスでは、ｃＡＤＰＲはオキシトシン分泌を２．５倍も増加させた（図１０ｄ）。このことは、これらのＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ代謝物がオキシトシン分泌に不可欠であることを示し、それゆえ、ＣＤ３８−／−マウスにおけるオキシトシン分泌不足と血中オキシトシンレベルの低下は、ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ活性に関連することを示すとともに、バソプレッシン分泌が影響を受けていないことから、神経分泌における一般的欠陥を反映したものではないことを示唆する。線状体における脱分極誘導性ドパミン分泌もまたＣＤ３８−／−マウスでは影響を受けないことは、この仮説をさらに支持するものだった（図１１）。
視床下部細胞におけるオキシトシン分泌は、活動電位の反復発生に関連した電圧依存性カルシウムチャンネルからの細胞外カルシウムの流入による、細胞内カルシウム濃度の増加が引き金となる。体細胞及び樹状細胞ではｔｈａｐｓｉｇｅｒｇｉｎ感受性ＩＰ３を介したＣａ２＋濃度の増加、及び視床下部神経終末におけるリアノジン受容体からのわずかなＣａ２＋放出（Ｃａ２＋  ｓｙｎｔｉｌｌａｓ）がみられるという報告がある（Ｌｕｄｗｉｇ，Ｍ．  ＆  Ｌｅｎｇ，Ｇ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７，１２６−１３６（２００６）ほか）。単離された神経終末における一過性のＣａ２＋濃度の増加を、Ｃａ２＋−感受性色素Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎを用いて調べたところ、５０ｍＭ  ＫＣｌ存在下でのインキュベーションにより、野生型マウスでは細胞内Ｃａ２＋濃度が２２０％まで増加したが、ＣＤ３８−／−マウスでは１６０％までしか増加しなかった（図１０ｅ）。興味深いことに、野生型マウスで顕著であった細胞内Ｃａ２＋濃度の増加は、リアノジンあるいは８−ｂｒｏｍｏ−ｃＡＤＰＲの存在下で顕著に阻害された（図１０ｆ）。
１０．結論
以上の結果から、ＣＤ３８機能の欠損マウスは自閉症によく似た行動異常（母性行動及び社会認識記憶の異常）を示し、この行動異常はオキシトシンの分泌不全によるものであることが確認された。さらに、ＣＤ３８は、ｃＡＤＰＲ及びＮＡＡＤＰ−リアノジン受容体系を介した細胞内Ｃａ２＋濃度の増加を介してオキシトシン分泌を特異的に阻害するものと考えられた。この事実は、ＣＤ３８の発現量低下、活性低下、あるいは局在を正常化させる化合物、あるいはＣＤ３８によって制御されるオキシトシン分泌系のセカンドメッセンジャーであるｃＡＤＰＲ及びＮＡＡＤＰ量を増加させる化合物や細胞内カルシウム濃度上昇を生じる化合物や、直接オキシトシンの分泌増加をもたらす化合物などをスクリーニングすることで、自閉症をはじめとするオキシトシン系の異常を伴う神経発達障害又は精神疾患の治療薬を開発できることを示す。
実施例２：
（１）対象
対象は、２００６年に金沢大学病院を来院した自閉症者１１例及び健常者４９例であり、本研究に登録されることを同意し、インフォームドコンセントを提出した者である。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ及び配列決定
各自閉症者及び健常者の末梢血から赤血球成分を除き、沈殿した白血球を分離した。この白血球より、常法にしたがい、ＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡ試料はＴＲＩｚｏｌ試薬を加えて希釈し、ＲＴ−ＰＣＲ用試料とした。
ＲＴ−ＰＣＲはＱｕｉａｇｅｎ社製ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて行った。すなわち、得られた各被験者のＲＮＡ試料を鋳型として、以下のプライマーを用いてＣＤ３８の各エクソン領域を増幅した。
【表１】
2008059991.tif 000003
ＰＣＲ条件は、９４℃５分の変性条件に続いて、変性（９４℃×０．５分）、アニーリング（５０℃×１分）、伸展（７２℃×２５分）の３０サイクルとそれに続く最終伸展７２℃×１０分の条件でＰＣＲを行なった。
得られたＰＣＲ産物はアガロースゲル上で電気泳動した。その結果、いずれのエクソン領域についても、予測される産物と同じサイズの産物が１１例の自閉症者由来の試料で確認された。
この増幅産物を常法にしたがってクローニングし、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０キャピラリー  シークエンサーを用いて配列決定をした。その結果、１１例中１例の患者で第３エクソン領域４６９３番目のシトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に置換していることが確認された（下記参照）。この多型は配列番号２に示されるＣＤ３８アミノ酸配列の１４０番目のアルギニンのトリプトファンへの置換を伴う新規エクソン多型であった。一方、健常者では、上記置換は４９例中１例も見られなかった。
2008059991.tif 000004
実施例３：
１．変異型ＣＤ３８遺伝子導入
試験方法
既報（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００６  Ａｐｒ  １２；１０８２（１）：１１−２２）にしたがい、ＭＳＣＶプロモーター制御下にヒトＣＤ３８遺伝子（Ｔａｋａｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２６０５２−２６０５４（１９９３））、変異型ヒトＣＤ３８遺伝子（Ｙａｇｕｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．１９９８  Ｓｅｐ；４１（９）：１０２４−１０２８）、あるいはＧＦＰを連結したＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスベクター（ｌｅｎｔｉ−ｈＣＤ３８，ｌｅｎｔｉ−Ｒ１４０Ｗ−ｈＣＤ３８，ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ：このウイルスベクターは視床下部・脳下垂体選択的に発現するように導入されている）を用意した。試験に用いた変異型ヒトＣＤ３８遺伝子は、配列番号２に示されるＣＤ３８アミノ酸配列の１４０番目のアルギニンがトリプトファンへ置換されている。このウイルス懸濁液を６−８週齢の雄マウスの第３脳室に投与し、投与２週間後のマウスを前述の社会認識記憶の試験に用いた。
結果
ｌｅｎｔｉ−ｈＣＤ３８を導入されたＣＤ３８−／−雄マウスでは、社会認識記憶の回復が見られた。すなわち、同じ雌と会わせる回数が増えるにつれ嗅覚調査行動は減少し、新たな雌マウスに会わせると嗅覚調査行動は回復した（図１２ａ）。このｌｅｎｔｉ−ｈＣＤ３８発現による回復は、オキシトシンを皮下投与されたＣＤ３８−／−マウス、野生型マウスに匹敵するものであった（図１２ｂ）。さらに、社会認識記憶の回復におけるＣＤ３８酵素活性の重要性を調べるため、変異型ヒトＣＤ３８を用いて試験を行った。この変異型ＣＤ３８は、ヒト糖尿病において認められ、ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ活性が正常のおよそ３分の１であることが知られている。変異型ＣＤ３８は、ｌｅｎｔｉ−Ｒ１４０Ｗ−ｈＣＤ３８の導入により視床下部に発現した。変異型ＣＤ３８の発現は、ＣＤ３８−／−マウスの社会認識記憶を回復させなかった（図１２ａ，ｂ）。したがって、社会認識記憶の回復には、ＣＤ３８分子そのものでなくＣＤ３８の持つ酵素活性が、重要な役割を果たし、この変異が社会認識記憶等の行動異常の一因となる可能性が示唆された。
実施例４：
（１）対象
自閉症２９名（うち、３名について家族調査実施）、健常者２０１名、ＭＲ（精神発達遅滞）５０名で、本研究に登録されることを同意し、インフォームドコンセントを提出した者である。
（２）ＲＴ−ＰＣＲ−ＲＦＬＰ及び配列決定
実施例２に従い、各被験者の末梢血白血球からＲＮＡを抽出し、ＣＤ３８の各エクソン領域を増幅した。増幅した各ＤＮＡ断片は、ダイレクトシーケンシングにより配列決定し、変異の解析を行った。
さらに、自閉症者のうち３例については、その家族のうち同意が得られたものについて臨床解析と多型解析を行った。
（３）血中オキシトシン及びバソプレッシンレベル
さらに、自閉症者２９例と上記３例の家族について、血中オキシトシンレベルとバソプレッシンレベルの解析を行った。
結果
上記の結果、エクソン領域に、実施例２に記載した第３エクソン領域４６９３番目の多型を含む５つの多型：３１９３Ｃ＞Ｇ（Ｒ４７Ｃ）ｉｎ  ｅｘｏｎ  １：４０９２Ｃ＞Ｔ（Ｔ１１６Ｔ）ｉｎ  ｅｘｏｎ  ２；４６９３Ｃ＞Ｔ（Ｒ１４０Ｗ）ｉｎ  ｅｘｏｎ  ３；５３４６Ａ＞Ｃ（Ｉ１６８Ｉ）ｉｎ  ｅｘｏｎ  ４；６９００Ｃ＞Ｔ（Ｓ２６４Ｌ）ｉｎ  ｅｘｏｎ  ７を同定した（図１３）。
第３エクソン領域４６９３番目の多型（Ｒ１４０Ｗ）は、自閉症者２９例中３例（１０．３％）に、２０１例の健常者ではわずか３例（１．５％）、ＭＲ５０例では全くみられなかった。
第３エクソン領域４６９３番目の多型を有する自閉症者３例の家族調査では、同意を得られた１３名中６名（４６％）に同じ多型（いずれもヘテロ）が見出された。またこの多型を有する家族のうち５例は自閉症あるいは自閉症の可能性が高いことが確認された（図１４）。
自閉症者２９例について、第３エクソン領域４６９３番目の多型を有する者と有しない者では、血中オキシトシンレベルには有意な相違がみられたが、血中バソプレッシンレベルに相違は見られなかった（図１５）。
以上より、第３エクソン領域４６９３番目の多型（Ｒ１４０Ｗ）は遺伝的に優性で、この多型を有する者では有しない者に比較して血清オキシトシンレベルが有意に低く、これが自閉症と何らかの関連を有する可能性が高いことが示唆された。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明は、オキシトシン異常を伴う神経発達障害又は精神疾患、例えば、自閉症、アスペルガー症候群、多動性障害、および学習記憶障害の早期診断や治療に有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００１０】
配列番号１：ヒトＣＤ３８  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＯ．Ｄ８４２８４）  ｎはａ，ｃ，ｇ又はｔ
変異の説明：（Ｃ）から（Ｔ）への一塩基置換
配列番号２：ヒトＣＤ３８アミノ酸配列
配列番号３：ヒトＣＤ３８エクソン３（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓの４６３９−４７７４位）
変異の説明：（Ｃ）から（Ｔ）への一塩基置換
配列番号４：ヒトＣＤ３８エクソン３を含む増幅配列
配列番号５：プライマー
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
［配列表］
2008059991.tif 000005
2008059991.tif 000006
2008059991.tif 000007
2008059991.tif 000008
2008059991.tif 000009
2008059991.tif 000010
2008059991.tif 000011
2008059991.tif 000012
2008059991.tif 000013
2008059991.tif 000014
2008059991.tif 000015
2008059991.tif 000016
2008059991.tif 000017
2008059991.tif 000018
2008059991.tif 000019
2008059991.tif 000020
【図４】
2008059991.tif 000021
【図５】
2008059991.tif 000022
【図１１】
2008059991.tif 000023
【図１３】
2008059991.tif 000024
【図１】
2008059991.tif 000025
【図２】
2008059991.tif 000026
【図３】
2008059991.tif 000027
【図６】
2008059991.tif 000028
【図７】
2008059991.tif 000029
【図８】
2008059991.tif 000030
【図９】
2008059991.tif 000031
【図１０】
2008059991.tif 000032
【図１２】
2008059991.tif 000033
【図１４】
2008059991.tif 000034
【図１５】
2008059991.tif 000035
【国際調査報告】
2008059991.tif 000036
2008059991.tif 000037
2008059991.tif 000038
2008059991.tif 000039
2008059991.tif 000040