(57)【要約】  分離カラムは、平均細孔径が２．０μｍのカチオン交換性シリカモノリスディスク（ディスクＭ）と、平均細孔径が３．０μｍの疎水性シリカモノリスディスク（ディスクＯ）とからなるディスクを用いて作製した。具体的には、ディスクＭ，ＯをＨＰＬＣ装置の上流側から順にＭＭＭＯＯＯとなるように積層した分離カラムを作製し、この分離カラムを用いて安定型と不安定型のグリコヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を含む溶液の分離測定を行った。そうしたところ、安定型ＨｂＡ１ｃを良好な分解能で分離することができた。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性シリカを主成分とする多孔性シリカカラムであって、
第１の性質と第１の平均細孔径とを有する第１の多孔性シリカ部と、前記第１の性質とは異なる第２の性質と第１の平均細孔径とは異なる第２の平均細孔径とを有する第２の多孔性シリカ部とを含む、多孔性シリカカラム。
【請求項２】
前記第１の平均細孔径は、０．５μｍ以上５μｍ以下である、請求項１に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項３】
前記第２の平均細孔径は、１μｍ以上５μｍ以下である、請求項１又は２に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項４】
前記第１の平均細孔径は前記第２の平均細孔径よりも小さい、請求項１〜３のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項５】
多孔性シリカを主成分とする多孔性シリカカラムであって、
第１の性質を有する第１の多孔性シリカ部と、前記第１の性質とは異なる第２の性質を有する第２の多孔性シリカ部とを含み、前記第１の多孔性シリカ部及び前記第２の多孔性シリカ部の平均細孔径はそれぞれ１．５μｍ以上４．５μｍ以下である、多孔性シリカカラム。
【請求項６】
前記第１の性質はイオン交換性であり、前記第２の性質は疎水性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項７】
前記イオン交換性は陽イオン交換性である、請求項６に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項８】
前記第１の多孔性シリカ部は、スルホン酸塩により表面処理が施され、前記第２の多孔性シリカ部は、炭素数４以上２３以下のアルキル鎖を有するシラン化合物により表面処理が施されている、請求項６又は７に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項９】
前記スルホン酸塩はメタクリル酸３−スルホプロピルカリウムであり、前記シラン化合物はオクタデシルジメチルクロロシランである、請求項８に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項１０】
前記第１の多孔性シリカ部と前記第２の多孔性シリカ部とから構成され、前記第１の多孔性シリカ部がカラム全長に対して４０％以上６０％以下の長さのブロックで構成される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項１１】
前記第１の多孔性シリカ部と前記第２の多孔性シリカ部とが交互に配置されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項１２】
前記第１の多孔性シリカ部と該第１の多孔性シリカ部の長さに対して１．５倍以上２．５倍以下の長さを有する前記第２の多孔性シリカ部とから構成される繰り返し単位を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項１３】
前記第１の多孔性シリカ部が送液方向の上流部に配置され前記第２の多孔性シリカ部が送液方向の下流部に配置されたユニットを有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項１４】
前記第１の多孔性シリカ部及び前記第２の多孔性シリカ部は、カラム内径に対してそれぞれ１．５倍以上５倍以下の長さである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項１５】
前記多孔性シリカカラムは、カラム長が２ｍｍ以上２０ｍｍ以下の範囲である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項１６】
ウシ血清アルブミンによるエージングが施されている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項１７】
グリコヘモグロビンを分析する際に用いる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラム。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラムを備える、液体クロマトグラフィ用装置。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラムを用いて検体試料から物質を分離する、分析方法。
【請求項２０】
前記検体試料は、全血、全血を希釈したもの、全血由来の赤血球又は全血由来の赤血球を希釈したものである、請求項１９に記載の分析方法。
【請求項２１】
前記物質はグリコヘモグロビンとヘモグロビンとである、請求項１９及び２０に記載の分析方法。
【請求項２２】
前記物質は、安定型グリコヘモグロビンと不安定型グリコヘモグロビンとヘモグロビンとである、請求項１９及び２０に記載の分析方法。
【請求項２３】
前記ヘモグロビンの溶出時間で溶離液の塩濃度が最高濃度になるよう連続的又は段階的に塩濃度を増加させることによって前記物質を分離する、請求項２１又は２２に記載の分析方法。
【請求項２４】
前記塩濃度を増加させる分析方法は段階的である、請求項２３に記載の分析方法。
【請求項２５】
前記塩濃度を増加させる分析方法は３段階で行う、請求項２４に記載の分析方法。
【請求項２６】
前記多孔性シリカカラムを用いて前記検体試料から前記物質を分離する前にウシ血清アルブミンを用いて前記多孔性シリカカラムのエージングを行う、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項２７】
前記多孔性シリカカラムの多孔性シリカ部のうちいずれか一方がエージングされている、請求項２６に記載の分析方法。
【請求項２８】
前記エージングされている多孔性シリカ部は疎水性を有する、請求項２７に記載の分析方法。
【請求項２９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の多孔性シリカカラムと、ヒト及び非ヒト動物から採取される被験試料とを用いて前記動物の糖尿病の発症リスク、前記糖尿病に罹患しているかどうか又は前記糖尿病の進行程度を診断する、糖尿病の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多孔性シリカカラム、これを用いた分析方法及び糖尿病の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、診療・看護現場で医療スタッフが実施する簡易・迅速検査などを意味するポイント・オブ・ケア検査（Point-of-Care Testing，POCT）の普及が進んでいる。POCTを採用した装置の一つとして、例えば、糖尿病の長期コントロールの指標であるグリコヘモグロビンを分析する装置が開発されている。この装置では、ラテックス免疫凝集法を用いることにより、システムの小型化を図るとともに患者から採取した血液中のグリコヘモグロビンを簡易な操作で分析することができる。また、血液を測定試料としてその中に含まれる特定成分をHPLC法を用いて測定する装置も知られている。例えば、特許文献１では、糖尿病の長期コントロールの指標となるグリコヘモグロビンを分析する装置が開示されている。
【特許文献１】特開２００１−７４７２１号公報
【発明の開示】
【０００３】
しかしながら、患者から採取した血液中のグリコヘモグロビンを分析するにあたり、ラテックス免疫凝集法を用いた場合には、システムの小型化が可能なものの、グリコヘモグロビンの分析に一般に用いられているHPLC法に比べて精度が低いという問題があった。一方、HPLC法をPOCTに適用しようとすると、精度は高くなるものの既存のカラムを用いた場合には背圧が高くなる傾向にあるためにシステムが大型で高価になってしまい、POCTには不向きであるという問題があった。これらのことから、糖尿病の検査としてPOCT測定系を確立するにあたり、ある程度の分離性能を維持しつつ簡易に且つ迅速に分析することが可能な新規なカラムの開発が望まれていた。
【０００４】
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであり、ある程度の分離性能を維持しつつ簡易に且つ迅速に分析することができる新規な多孔性シリカカラムを提供することを目的の一つとする。また、そのような多孔性シリカカラムを用いた分析方法及び糖尿病の診断方法を提供することを目的の一つとする。
【０００５】
本発明は、上述の目的を達成するために以下の手段を採った。
【０００６】
すなわち、本発明の多孔性シリカカラムは、
多孔性シリカを主成分とする多孔性シリカカラムであって、
第１の性質と第１の平均細孔径とを有する第１の多孔性シリカ部と、前記第１の性質とは異なる第２の性質と第１の平均細孔径とは異なる第２の平均細孔径とを有する第２の多孔性シリカ部とを含む、ものである。
【０００７】
この多孔性シリカカラムは、性質及び平均細孔径が互いに異なる第１の多孔性シリカ部と第２の多孔性シリカ部とを含むという従来にない構成を有する。その結果、本発明の多孔性シリカカラムを用いて試料の分析を行った際に、ある程度の分離性能を維持しつつ簡易に且つ迅速に試料を分析することができる。
【０００８】
ここで、「性質」とは、例えば、分子サイズやイオン交換性、疎水性、分子内極性などが挙げられる。このうち、好ましくは第１の性質はイオン交換性であり第２の性質は疎水性であり、より好ましくはイオン交換性は陽イオン交換性である。こうすれば、例えば、試料として血液を用いた場合に、血液中のグリコヘモグロビンとヘモグロビンとを分析することができる。
【０００９】
陽イオン交換性を有する第１の多孔性シリカ部は、スルホン酸塩により表面処理が施され、疎水性を有する第２の多孔性シリカ部は、炭素数４以上２３以下のアルキル鎖を有するシラン化合物により表面処理が施されているのが好ましい。ここで、スルホン酸塩としては、例えば、４−ビニルフェニルスルホン酸やメタクリル酸３−スルホプロピルカリウムなどが挙げられ、このうちメタクリル酸３−スルホプロピルカリウムが好ましい。また、シラン化合物としては、例えば、オクチルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシラン、オクチルジメチルクロロシラン、オクタデシルジメチルクロロシランなどが挙げられ、このうちオクタデシルジメチルクロロシランが好ましい。
【００１０】
第１の平均細孔径は、０．５μｍ未満では圧力損失が高くなり５μｍより大きいとカラムの分離性能が十分でないことから０．５μｍ以上５μｍ以下の範囲が好ましく、より好ましくは１．０μｍ以上２．３μｍ以下である。また、第２の平均細孔径は、１μｍ未満では圧力損失が高く５μｍより大きいとカラムの分離性能が十分でないことから１μｍ以上５μｍ以下の範囲が好ましく、より好ましくは２．０μｍ以上４．２μｍ以下である。
【００１１】
なお、第１の多孔性シリカ部が陽イオン交換性を有し第２の多孔性シリカ部が疎水性を有する場合、第１の平均細孔径が１．０μｍ以上２．３μｍ以下（添付資料中の図１の細孔分布Ｂ４参照）であり、第２の平均細孔径が２．０μｍ以上４．２μｍ以下（添付資料中の図２の細孔分布Ｂ３参照）であるのが好ましい。
【００１２】
また、第１の平均細孔径は、第２の平均細孔径より大きくても小さくてもよいし、ほぼ同じであってもよいが、第２の平均細孔径よりも小さいのが好ましい。
【００１３】
また、第１の平均細孔径及び第２の平均細孔径は、カラムの分離性能を良好にするとともに圧力損失を低減させる観点から、それぞれ１．５μｍ以上４．５μｍ以下とすることもできる。この場合、第１の平均細孔径と第２の平均細孔径とをほぼ同じにすることもできる。これにより、本発明の多孔性シリカカラムを用いて試料の分析を行った際に、ある程度の分離性能を維持しつつ簡易に且つ迅速に試料を分析することができる。
【００１４】
本発明の多孔性シリカカラムは、第１の多孔性シリカ部及び第２の多孔性シリカ部以外の他の構成を含んでいてもよいし、第１の多孔性シリカ部と第２の多孔性シリカ部とから構成されていてもよいが、第１の多孔性シリカ部と第２の多孔性シリカ部とから構成されているのが好ましい。多孔性シリカカラムが第１の多孔性シリカ部と第２の多孔性シリカ部とから構成されている場合、第１の多孔性シリカ部がカラム全長に対して４０％以上６０％以下の長さのブロックで構成されていてもよい。この場合、第１の多孔性シリカ部と第２の多孔性シリカ部とがそれぞれカラム全長に対して５０％の長さのブロックで構成されているのが好ましい。このとき、第１の多孔性シリカ部が送液方向の上流部に配置され第２の多孔性シリカ部が送液方向の下流部に配置されているのが好ましい。また、各ブロックは、１つのかたまりとして構成されるものでもよいし、厚みの薄い複数のディスクなどを積層することによって構成されるものでもよい。
【００１５】
本発明の多孔性シリカカラムは、ＰＯＣＴ等に適用する観点からすると、カラム長が２ｍｍ以上２０ｍｍ以下であるのが好ましく、より好ましくは６ｍｍ以上１６ｍｍ以下である。
【００１６】
また、第１の多孔性シリカ部と第２の多孔性シリカ部とが交互に配置されていてもよい。例えば、ほぼ同じ長さの第１の多孔性シリカ部と第２の多孔性シリカ部とが交互に配置されているものや、第１の多孔性シリカ部と該第１の多孔性シリカ部の長さに対して１．５倍以上２．５倍以下（好ましくは２倍）の長さを有する第２の多孔性シリカ部とから構成される繰り返し単位を有するものなどが挙げられる。このとき、第１の多孔性シリカ部が送液方向の上流部に配置され第２の多孔性シリカ部が送液方向の下流部に配置されたユニットを有するのが好ましい。
【００１７】
第１の多孔性シリカ部又は第２の多孔性シリカ部の長さは、カラム内径に対して１．５倍より短いと分離性能が低下し５倍より長いとPOCT等に適用しにくいことから、カラム内径に対してそれぞれ１．５倍以上５倍以下の長さであるのが好ましく、１．８倍以上４倍以下であるのがより好ましい。ここでいう、カラム内径に対する長さとは、第１の多孔性シリカ部又は第２の多孔性シリカ部が１つのカラム中に複数存在するときには、それぞれの多孔性シリカ部の長さの和を意味する。
【００１８】
本発明の多孔性シリカカラムは、ウシ血清アルブミンによるエージングが施されていてもよい。こうすれば、例えば、血液成分を分析する場合に、分析したい成分がカラムに吸着されるのを防ぐことができる。また、ウシ血清アルブミンであればグリコヘモグロビンやヘモグロビンとは吸光度が異なるため、精製後の試料中にウシ血清アルブミンが混入したとしても、血液中のグリコヘモグロビンやヘモグロビンを分析する際にさほど支障がない。
【００１９】
本発明の他の１つの形態によれば、本発明の多孔性シリカカラムを備える液体クロマトグラフィ用装置が提供される。この液体クロマトグラフィ用装置は、本発明の多孔性シリカカラムを備えるため、上述の多孔性シリカカラムが備える効果、すなわち、試料の分析を行った際にある程度の分離性能を維持しつつ簡易に且つ迅速に試料を分析することができるという効果を奏する。
【００２０】
本発明の分析方法は、本発明の多孔性シリカカラムを用いて検体試料から物質を分離するものである。この分析方法では、本発明の多孔性シリカカラムを用いて検体試料の分析を行うため、上述の多孔性シリカカラムが備える効果、すなわち、検体試料の分析を行った際にある程度の分離性能を維持しつつ簡易に且つ迅速に試料を分析することができるという効果を奏する。
【００２１】
ここで、検体試料としては、特に限定されないが、例えば、全血、全血を希釈したもの、全血由来の赤血球又は全血由来の赤血球を希釈したものであってもよい。この場合、血液成分の分析にあたり、患者等から採取した血液の前処理を行う必要がなく、より簡便な操作で血液の分析を行うことができる。
【００２２】
検体試料から分離する物質としては、特に限定されないが、例えば、グリコヘモグロビンとヘモグロビンとであってもよいし、安定型グリコヘモグロビンと不安定型グリコヘモグロビンとヘモグロビンとであってもよい。このうち、糖尿病の診断をより的確に行うことを考慮すれば、安定型グリコヘモグロビンと不安定型グリコヘモグロビンとヘモグロビンとが分離されるのが好ましい。
【００２３】
本発明の分析方法において、検体試料から物質を分離する際には、塩化ナトリウムなどの中性塩の濃度勾配を利用して行うことができる。また、検体試料から安定型グリコヘモグロビンと不安定型グリコヘモグロビンとヘモグロビンとを分離する場合には、ヘモグロビンの溶出時間で溶離液の塩濃度が最高濃度になるよう連続的又は段階的に塩濃度を増加させることによって検体試料から物質を分離することにより、これらの３つの物質を精度よく分析することができる。このとき、精度よく分離するには、塩濃度は段階的に変化させるのが好ましく、３段階で変化させるのがより好ましい。
【００２４】
本発明の分析方法では、本発明の多孔性シリカカラムを用いて検体試料から物質を分離する前にウシ血清アルブミンを用いて前記多孔性シリカカラムのエージングを行うとしてもよい。こうすれば、例えば、血液成分を分析する場合に、分析したい成分がカラムに吸着されるのを防ぐことができる。また、ウシ血清アルブミンであればグリコヘモグロビンやヘモグロビンとは吸光度が異なるため、精製後の試料中にウシ血清アルブミンが混入したとしても、血液中のグリコヘモグロビンやヘモグロビンを分析する際にさほど支障がない。
【００２５】
また、多孔性シリカカラムの多孔性シリカ部のうちいずれか一方がエージングされているとしてもよい。このとき、エージングされている多孔性シリカ部は疎水性を有するのが好ましい。
【００２６】
ところで、グリコヘモグロビンＨｂＡ１ｃは、血液中の糖が赤血球に入った後にヘモグロビンＨｂＡと結合して生成する。ヘモグロビンＨｂＡを含む赤血球は骨髄で作られ、血液中を約１２０日間循環する。そして循環している間に、赤血球中のヘモグロビンＨｂＡは血液中の糖類やそれらの代謝産物と結合し、グリコヘモグロビンＨｂＡ１ｃとなる。グリコヘモグロビンＨｂＡ１ｃには、安定型と不安定型とがある。ヘモグロビンＨｂＡにグルコースが結合すると不安定型ＨｂＡ１ｃ（Ｌａｂｉｌｅ  ＨｂＡ１ｃ）となり、この状態ではヘモグロビンＨｂＡとグルコースとの結合が外れることがあるが、この状態で日数が経過するとグルコースとの結合が安定した状態、すなわち安定型ＨｂＡ１ｃ（Ｓｔａｂｌｅ  ＨｂＡ１ｃ）となる。安定型ＨｂＡ１ｃは赤血球の寿命まで蓄積し、その蓄積の程度は赤血球が血液中に存在する期間の平均血糖値を反映する。このため、安定型ＨｂＡ１ｃを不安定型ＨｂＡ１ｃやヘモグロビンＨｂＡと分離して定量することが望まれている。本発明の分析方法はこのような要望を満たすものである。
【００２７】
さらに、本発明の他の１つの形態によれば、本発明の多孔性シリカカラムと、ヒト及び非ヒト動物から採取される被験試料とを用いて前記動物の糖尿病の発症リスク、前記糖尿病に罹患しているかどうか又は前記糖尿病の進行程度を診断する糖尿病の診断方法が提供される。この診断方法では、本発明の多孔性シリカカラムを用いてヒト及び非ヒト動物から採取される被験試料（例えば全血など）を分析するため、上述の多孔性シリカカラムが備える効果、すなわち、試料の分析を行った際にある程度の分離性能を維持しつつ簡易に且つ迅速に試料を分析することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】カラムディスク（Ｂ４）の細孔分布を表すグラフ。
【図２】カラムディスク（Ｂ３）の細孔分布を表すグラフ。
【図３】ＨＰＬＣ装置の概略構成図。
【図４】分離カラム（ＭＭＭＯＯＯ，Ｍ：Ｂ４，Ｏ：Ｂ３）のクロマトグラム。
【図５】分離カラム（ＭＯＯＭＯＯＭＯＯ，Ｍ：Ｂ４，Ｏ：Ｂ３）のクロマトグラム。
【図６】分離カラム（ＭＭＭＭＯＯＯＯ，Ｍ：Ｂ４，Ｏ：Ｂ３）のクロマトグラム。
【図７】分離カラム（ＭＯＭＯＭＯＭＯ，Ｍ：Ｂ４，Ｏ：Ｂ３）のクロマトグラム。
【図８】分離カラム（ＭＭＯＯＭＭＯＯ，Ｍ：Ｂ４，Ｏ：Ｂ３）のクロマトグラム。
【図９】分離カラム（ＭＭＭＭＯＯＯＯ，Ｍ：Ｂ３，Ｏ：Ｂ３）のクロマトグラム。
【図１０】分離カラム（ＭＯＭＯＭＯＭＯ，Ｍ：Ｂ３，Ｏ：Ｂ３）のクロマトグラム。
【図１１】平均細孔径の異なるディスクＭ，ＯをＭＯＭＯＭＯＭＯという順序で積層した分離カラムのクロマトグラム。
【図１２】カラムディスク（Ｂ２）の細孔分布を表すグラフ。
【図１３】細孔分布Ｂ２〜Ｂ４のカラムディスクのＳＥＭ写真。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明を実施するための最良の形態を実施例を用いて以下に説明する。
【実施例】
【００３０】
［実施例１］分離カラムの作製
分離カラム（多孔性シリカカラムの一実施例）としては、多孔性シリカ連続体担体の表面に重合反応による化学修飾を施してなるポリマー結合型カラム（例えば多孔性シリカ連続体担体の表面をゾル−ゲル転移させた後、焼成してメソポアを減少させてなるカラム）を使用可能である。実施例１では、分離カラムは、平均細孔径が２．０μｍ（図１参照、この細孔分布をＢ４という）のカチオン交換性シリカモノリスディスク（以下「ディスクＭ」という）と、平均細孔径が３．０μｍ（図２参照、この細孔分布をＢ３という）の疎水性シリカモノリスディスク（以下「ディスクＯ」という）とからなるディスクを用いて作製した。それぞれのディスクの平均細孔径は、分析装置として島津オートポア  ９５２０形を用い、試料約０．１ｇを大片用標準セルに採取して、初期圧約２ｋＰａの条件で、水銀圧入法を用いて測定した。また、それぞれのディスクの厚さは２ｍｍ、ディスクの内径は３．２ｍｍとした。ディスクＭは、次のようにして作製した。すなわち、シリカモノリスディスクの表面にスペーサである３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（ＭＯＰ）を導入することで表面処理を行った後、過酸化ベンゾイルを開始剤にしてメタクリル酸−３−スルホプロピルカリウム（ＭＡＳＫ）をディスク表面に存在するシラノール基の１０当量分加え、２４時間メタノール還流下で反応させた後、水、メタノールで洗浄し、修飾してディスクＭを得た。一方、ディスクＯは、次のようにして作製した。すなわち、シリカモノリスディスクから水を除去し、オクタデシルジメチルクロロシラン（ＯＤＳ）、ピリジンをディスク表面に存在するシラノール基の５当量分加え、２４時間トルエン還流下で反応させることで表面処理を行った後、トルエン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エタノールで洗浄し、減圧乾燥してＯＤＳ化した。ＯＤＳ化したシリカモノディスクにヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ）を１７時間トルエン還流下で反応させ、トルエン、ＴＨＦ、エタノールで洗浄し、修飾してディスクＯを得た。このようにして作製したディスクＭ，Ｏを「ＭＭＭＯＯＯ（Ｍ：ディスクＭ、Ｏ：ディスクＯ）」の順で積層し、熱収縮チューブに充填した後、約２２０度で収縮させて分離カラムとした。ここでは、熱収縮チューブとしてフッ素樹脂チューブ（四フッ化エチレン樹脂チューブ）を使用した。【００３１】
なお、シリカモノリスディスクは、以下のようにして作製した。すなわち、分子量１００００のポリエチレングリコール４．２ｇに０．０１Ｎ酢酸水溶液５０ｍＬを加え攪拌し溶解させた。完全に溶解した後に氷冷し、テトラメトキシシラン２４ｍＬを加え攪拌を継続した。角型容器に溶液を移しテフロンリング（テフロンは登録商標、以下同じ）を入れ、密封して４０℃恒温槽（水浴）に１日間放置した。得られたシリカバルクをエタノール／水＝１／１（ｖ／ｖ）の水溶液に浸漬し１日放置した。このバルクを０．５Ｍ尿素水溶液に浸漬させ、テフロン製の分解ビンを用いて加熱処理した後、４０℃オーブンに移し２日間放置し、続いて６０℃オーブンに移し１日間放置し、電気炉を用いて焼成して多孔性のシリカモノリスディスクを調製した。【００３２】
［実施例２］圧力損失の測定−その１
実施例１で作製した分離カラムを用いて、それぞれの圧力損失で１０回ずつ測定を行い、１０回のうち何回漏洩したかを漏洩頻度とした。圧力損失はデジタル圧力センサーＡＰ−Ｖ８０（ＫＥＹＥＮＣＥ製）を用い、カラムの前後の圧力損失を０〜１００ｋｇｆ／ｃｍ2に設定して測定した。その結果を表１に示す。表１に示すように、圧力損失が４ｋｇｆ／ｃｍ2以下のものでは漏洩が生じなかった。一般的にＰＯＣＴで用いられるカラムは５ｋｇｆ／ｃｍ2で使用されるため、この分離カラムはＰＯＣＴで使用するに十分な性能を有しているといえる。【００３３】
【表１】
2008023534.tif 000003
【００３４】
［実施例３］圧力損失の測定−その２
ディスクＭ，Ｏを上流側から順にＭＯＭＯＭＯＭＯとなるように積層した分離カラム（全長１６ｍｍ）を用いて流速１００μＬ／ｍｉｎで実施例２に準じて圧力損失を測定した。使用したディスクＭ，Ｏの細孔分布と圧力損失の値を表２に示す。表２から明らかなように、圧力損失の点からみると、ディスクＭが細孔分布Ｂ３でディスクＯが細孔分布Ｂ３の組合せか、ディスクＭが細孔分布Ｂ４でディスクＯが細孔分布Ｂ３の組合せが好ましい。【００３５】
【表２】
2008023534.tif 000004
【００３６】
［実施例４］グリコヘモグロビンの分離測定−その１【００３７】
グリコヘモグロビンの分離測定では、図３に示すように、ＨＰＬＣ装置１０（資生堂製、ＮＡＮＯＳＰＡＣＥ）を用いた。ＨＰＬＣ装置１０は、溶離液Ａ，Ｂ中のガスを抜くデガッサ１２（ＮＡＮＯＳＰＡＣＥＳＩ−２  ３０１０）と、デガッサ１２を通過した溶離液Ａ，Ｂをミキシングカラムに送出するポンプＡ，Ｂ（ＮＡＮＯＳＰＡＣＥＳＩ−２  ３１０１）と、ミキシングカラムで混合された混液にサンプルを注入するマニュアルインジェクタ１４（ＮＡＮＯＳＰＡＣＥＳＩ−２  ３００６）と、分離カラムを設定温度に保つカラムオーブン１６（ＮＡＮＯＳＰＡＣＥＳＩ−２  ３０１４）と、分離カラムを通過したあとの分離液に光源からの光を照射して通過した光の強度を測定するＵＶ−ＶＩＳ検出器１８（ＮＡＮＯＳＰＡＣＥＳＩ−２  ３００２）と、ＵＶ−ＶＩＳ検出器１８から出力された検出信号を入力してデータ処理を実行する図示しないデータ処理装置（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ  Ｓ−ＭｉｃｒｏＣｈｒｏｍ）とを備えたものである。このＨＰＬＣ装置１０に、実施例１で作製した分離カラムを接続し、溶離液Ａ（２０ｍＭ  ＭＥＳ，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．０１ｗｔ％アジ化ナトリウム（ｐＨ５．２））と溶離液Ｂ（２０ｍＭ  ＭＥＳ，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．０１ｗｔ％アジ化ナトリウム，４００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））とをＡ：Ｂ＝８２：１８で混合した混合液を通液した後、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン水溶液をディスクＯ１枚あたり２μｌ／回を連続１０回注入し、以下の表３に示す条件で一度送液することで、エージング処理（分離カラムの前処理）を行った。その後、表３に示す条件で以下の３種類のサンプル液を注入し、安定型グリコヘモグロビンの分離測定を行った。【００３８】
【表３】
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【００３９】
すなわち、（１）ＨｂＡ１ｃ測定用実試料標準物質（レベル２：ＨｂＡ１ｃが５．３８％（ｗ／ｗ），ＪＤＳ  ＨｂＡ１ｃ  Ｌｏｔ．２（有限責任中間法人  ＨＥＣＴＥＦスタンダードレファレンスセンター製））を超純水にて１０１倍希釈したサンプル液、（２）Ｄ−（＋）グルコース（シグマアルドリッチジャパン製、特級）を超純水で１０ｍｇ／ｍＬとなるように調製したグルコース溶液にて前出のＨｂＡ１ｃ測定用実試料標準物質を１０１倍に希釈して３７℃で２時間インキュベートしたサンプル液、（３）前出のＤ−（＋）グルコースを超純水で１００ｍｇ／ｍＬとなるように調製したグルコース溶液にて前出のＨｂＡ１ｃ測定用実試料標準物質を１０１倍に希釈して３７℃で２時間インキュベートしたサンプル液を、それぞれマイクロシリンジで２μＬ注入することにより安定型グリコヘモグロビンの分離測定を行った。その結果を図４に示す。図４から明らかなように、いずれのサンプル液についても、安定型ＨｂＡ１ｃをＨｂＡ（ヘモグロビン）や不安定型ＨｂＡ１ｃと分離して検出することができた。このため、実施例１で作製した分離カラムは、安定型ＨｂＡ１ｃを検出するために十分な性能を有しているといえる。【００４０】
また、上述した方法で作製したディスクＭ及びディスクＯを以下の表４に示した組み合わせで積層し、同様の実験を行ったところ、図５〜１０のクロマトグラムに示すように、これらの組み合わせでも安定型ＨｂＡ１ｃを分離して検出することができた。このため、以下の表４に示した組み合わせのディスクを用いても、安定型ＨｂＡ１ｃを検出するに十分な性能を有しているといえる。【００４１】
【表４】
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【００４２】
［実施例４］グリコヘモグロビンの分離測定−その２
実施例１に準じて、平均細孔径の異なるディスクＭ，Ｏを用いてＭＯＭＯＭＯＭＯという順序で積層した分離カラムを作製し、ＨｂＡ１ｃ測定用実試料標準物質（レベル５：ＨｂＡ１ｃが１２．６３％（ｗ／ｗ），ＪＤＳ  ＨｂＡ１ｃ  Ｌｏｔ．２（有限責任中間法人  ＨＥＣＴＥＦスタンダードレファレンスセンター製））を超純水にて１０１倍希釈したサンプル液を用いて、安定型ＨｂＡ１ｃの分離測定を実施例３に準じて行った。その結果を図１１に示す。図１１から明らかなように、分離カラムに使用するディスクＭ，Ｏの細孔分布はＢ２（図１２参照）よりもＢ４（図１参照）やＢ３（図２参照）が好ましい。細孔分布がＢ２〜Ｂ４のＳＥＭ写真を図１３に示す。【００４３】
本出願は、２００６年８月２３日に出願された米国仮出願第６０／８３９，４５６号を優先権主張の基礎としており、その内容の全てが引用により本明細書に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、例えば血液中の安定型ＨｂＡ１ｃの定量や糖尿病などの診断に利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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