(57)【要約】  核酸増幅反応後に、迅速、簡便、安価かつ高感度に核酸増幅を確認する方法を提供する。本発明に係るＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡ断片であって、ヘアピン構造中にバルジ構造を有し核酸増幅用プライマーの５’末端に結合して用いる。さらに、本発明に係る核酸増幅確認方法は、プライマーの５’末端に上記ＤＮＡ断片を備えたヘアピンプライマーを用いて、ＰＣＲなどの核酸増幅反応を行なった後、バルジ構造結合蛍光分子を用いて、上記ヘアピンプライマーの量を測定する。また、例えば、アレル特異的ＰＣＲに上記核酸増幅確認を適用することで、迅速、簡便、安価かつ高感度にＳＮＰを検出することができる。
2008026582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡ断片であって、
ヘアピン構造中にバルジ構造を有し、核酸増幅反応に用いるプライマーの５’末端に結合して用いることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項２】
上記バルジ構造が、複数存在することを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】
上記バルジ構造が、シトシンバルジ構造であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＤＮＡ断片。
【請求項４】
上記シトシンバルジ構造が、上記一本鎖ＤＮＡ断片中のチミン−シトシン−チミン配列におけるチミンと、アデニン−アデニン配列におけるアデニンとが、チミン−アデニン塩基対で分子内対合することにより形成されることを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列番号１〜５のいずれか１つに示される塩基配列からなることを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡ断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片の３’末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合していることを特徴とするヘアピンプライマー。
【請求項７】
上記核酸増幅反応は、ＰＣＲであることを特徴とする請求項６に記載のヘアピンプライマー。
【請求項８】
核酸増幅反応における核酸増幅を確認する方法であって、
請求項６に記載のヘアピンプライマーを少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、
バルジ構造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応前ヘアピンプライマー測定工程と、
核酸増幅反応を行なう工程と、
バルジ構造結合分子を用いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応後ヘアピンプライマー測定工程とを含むことを特徴とする核酸増幅確認方法。
【請求項９】
上記バルジ構造結合分子が、ナフチリジン環を有する化合物であることを特徴とする請求項８に記載の核酸増幅確認方法。
【請求項１０】
上記ナフチリジン環を有する化合物が、下記式（１）
【化１】
2008026582.tif 000018
（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基又は第３級アミン残基を示す。）
で示される２，７‐ジアミノナフチリジン誘導体であることを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅確認方法。
【請求項１１】
上記２，７‐ジアミノナフチリジン誘導体が、下記式（２）
【化２】
2008026582.tif 000019
で示される２，７‐ジアミノ−１，８−ナフチリジンであることを特徴とする請求項１０に記載の核酸増幅確認方法。
【請求項１２】
上記反応前ヘアピンプライマー測定工程は、上記核酸増幅反応液に上記バルジ構造結合分子を添加して行ない、さらに当該核酸増幅反応液をそのまま核酸増幅反応に供することを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅確認方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の核酸増幅確認方法を用いることを特徴とするＳＮＰ検出方法。
【請求項１４】
上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの３’末端の位置が、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されていることを特徴とする請求項１３に記載のＳＮＰ検出方法。
【請求項１５】
上記３’末端の位置が検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されているプライマーにヘアピンプライマーを用いることを特徴とする請求項１４に記載のＳＮＰ検出方法。
【請求項１６】
上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、
当該コンペティタープライマーの３’末端は、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されており、かつ、３’末端には、
上記ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、又は、
上記ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、を有することを特徴とする請求項１５に記載のＳＮＰ検出方法。
【請求項１７】
核酸増幅反応における核酸の増幅を確認するための試薬キットであって、少なくとも請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片を含むことを特徴とする試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅反応に用いるプライマーの５’末端に結合して用いるＤＮＡ断片、及びその利用に関するものである。さらに詳しくは、核酸の増幅を容易に確認するためにプライマーの５’末端に結合するＤＮＡ断片、それを利用したヘアピンプライマー、核酸増幅確認方法、ＳＮＰ検出方法及び当該ＤＮＡ断片を含む試薬キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）などの、特定の核酸を増幅する手法はバイオテクノロジーにおける様々な分野で応用されている（以下、本明細書において、ＰＣＲ等の、核酸を増幅する反応を「核酸増幅反応」と表記する。）。【０００３】
一般に、ＰＣＲなどの核酸増幅反応では、標的とする核酸が特異的に増幅されたか否かを確認する工程が必要である。（なお、本明細書において、ＰＣＲなどの核酸増幅手段による核酸の増幅を、単に「核酸増幅」と表記する。）
核酸増幅を確認する方法としては、例えば、ＰＣＲなどの核酸増幅反応に供した後の反応液を、ポリイミドなどのゲルを用いてゲル電気泳動に供した後、ＰＣＲ増幅により得られたＤＮＡ断片を染色することにより行なう方法がある。【０００４】
また、核酸増幅反応に供した後の反応液の濁度を測定することにより増幅を確認する方法、増幅対象の核酸に特異的に結合するプローブを備えたマイクロアレイを用いる方法、二本鎖ＤＮＡに結合する蛍光標識プローブや、目的とするＰＣＲ産物に特異的に結合する蛍光標識プローブを用いて、リアルタイムに増幅を確認するリアルタイムＰＣＲ等も、従来、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を行なう方法として用いられている。【０００５】
ＰＣＲ等の核酸増幅反応は、例えば、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；以下「ＳＮＰ」と表記する。）の解析にも用いられており、上述のような核酸増幅の確認方法が用いられている。【０００６】
特許文献１では、解析対象のＳＮＰ部位を含む染色体又はその断片に、野生型用プライマー及び１種又は２種の変異型用プライマーを、同時に又は別々にＤＮＡポリメラーゼと共に作用させ、プライマーに基づく伸長の有無を調べる解析方法が提案されており、増幅した核酸を確認する方法として、電気泳動が用いられている。【０００７】
また、特許文献２では、ＳＮＰ部位を含む基準配列用及び変異配列用の２種の特異的プライマーとユニバーサルプライマーとを用いて、目的配列部分を増幅するＳＮＰ解析方法が提案されており、特許文献１と同様に、得られた反応液を電気泳動に供することで、増幅産物の有無を確認している。【０００８】
特許文献３では、解析対象のゲノムＤＮＡと複数対のプライマーとを用いて、ＳＮＰ部位を含む核酸を増幅し、タイピングを行なう方法が提案されている。そして、得られた増幅産物に対して、標識化したプローブ等を用いてハイブリダイゼーションすることなどにより、上記タイピングが行われている。【０００９】
ＳＮＰ解析を迅速かつ簡便に行なうことができれば、例えば、患者のベッドサイド等で最適な治療法、投薬法などを診断するテーラーメード医療が可能となり、有力なＰＯＣ（Point Of Care）技術となるため、そのためにも、さらに迅速かつ簡便に核酸増幅反応後の核酸増幅を確認する方法が望まれている。
【特許文献１】国際公開第０１／０４２４９８号パンフレット（公開日：２００１年６月１４日）
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開２００３−５２３７２号公報（公開日：２００３年２月２５日）」
【特許文献３】日本国公開特許公報「特開２００２−３００８９４号公報（公開日：２００２年１０月１５日公開）」
【発明の開示】
【００１０】
〔発明が解決しようとする課題〕
上述したＰＣＲなどの核酸増幅反応において、核酸の増幅が得られたか否かの確認は、煩雑な作業や長時間を要し、高コストであるという問題を有している。
【００１１】
核酸増幅反応に供された後の反応液を電気泳動した後、増幅した核酸断片を染色するという方法は、電気泳動および染色に長時間を要する。また、電気泳動装置、電気泳動に用いるゲル、染色用試薬等が必要であるため、高コストである。
【００１２】
また、核酸増幅反応に供した後の反応液の濁度を測定することにより増幅を確認する方法は、極めて大量に核酸増幅産物を得る必要があるため、増幅条件の設定が煩雑であり、微量のサンプルに対して適用できないなどの課題がある。
【００１３】
ＤＮＡマイクロアレイを用いる方法は、マイクロアレイ上のプローブに蛍光標識等を施す必要があり、また高価なチップを作製する必要がある。
【００１４】
リアルタイムＰＣＲにおいても蛍光標識したプローブ等が必要であり、さらに、リアルタイムＰＣＲを実施するための装置や試薬も高価である。
【００１５】
例えば、上記特許文献１及び２に係る方法においても、電気泳動した後、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を染色することにより、ＰＣＲ増幅の確認を行なう必要がある。このため、上述したように長時間を要するという問題や高コストであるとの問題がある。また、特許文献３においては、プライマーの他に、別途、標的ゲノムにハイブリダイズさせるプローブが必要であり、さらに当該プローブを蛍光標識させるなどの化学修飾が必要であるなど、タイピングのための条件の検討が複雑である。
【００１６】
核酸増幅反応を用いないＳＮＰ解析方法も提案されているが、もともと、ＳＮＰを解析する方法は、莫大な数のサンプル（被検体）のＳＮＰを網羅的に探索する技術の延長として開発が進められてきた。そのため、患者から採取した血液を、ＳＮＰ解析する設備がある検査センターなどの検査施設まで持ち帰ることが必要となる。これでは、長時間を要し、簡易かつ迅速にＳＮＰ解析をすることは不可能であり、ＰＯＣ技術としては全く不十分である。さらに、近年脅威となりつつあるウィルス感染の診断の場合、感染後いかに短時間で診断できるかが、治療による患者の回復に極めて重要となる。このような場合は、採血後すぐに診断することが必要となる。
【００１７】
以上のように、ＰＣＲなどの核酸増幅反応は、その増幅の確認に煩雑な作業や長時間を要する。そのため、迅速、簡便、安価にその増幅の確認を行なうことが可能な方法が望まれている。
【００１８】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、核酸増幅反応における増幅を、迅速、簡便、安価に確認する方法を実現し、ひいては迅速、簡便、安価なＳＮＰ解析方法を提供することにある。
【００１９】
〔課題を解決するための手段〕
発明者らは、上記課題の解決のため、鋭意検討を行なった。その結果、核酸増幅反応に用いるプライマーの５’末端に、ヘアピン構造を形成し、かつヘアピン構造中にバルジ構造を有するＤＮＡ断片を結合したヘアピンプライマーを用いて核酸増幅反応を行なえば、ヘアピンプライマーは相補鎖の伸長によりヘアピン構造が解消され、その結果バルジ構造が消失することを見出し、バルジ構造結合分子を用いて反応前後のバルジ構造の量を検出、比較することで核酸の増幅を容易に確認することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００２０】
即ち、本発明に係るＤＮＡ断片は、上記課題を解決するために、ヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡ断片であって、ヘアピン構造中にバルジ構造を有し、核酸増幅反応に用いるプライマーの５’末端に結合して用いることを特徴としている。
【００２１】
また、本発明に係るＤＮＡ断片では、上記バルジ構造が、複数存在することがより好ましい。
【００２２】
また、本発明に係るＤＮＡ断片では、上記バルジ構造が、シトシンバルジ構造であることがより好ましい。
【００２３】
また、本発明に係るＤＮＡ断片では、上記シトシンバルジ構造が、上記シトシンバルジ構造が、上記一本鎖ＤＮＡ断片中のチミン−シトシン−チミン配列におけるチミンと、アデニン−アデニン配列におけるアデニンとが、チミン−アデニン塩基対で分子内対合することにより形成されることがより好ましい。
【００２４】
また、本発明に係るＤＮＡ断片は、配列番号１〜５のいずれか１つに示される塩基配列からなることがより好ましい。
【００２５】
本発明に係るヘアピンプライマーは、上記課題を解決するために、上記の本発明に係るＤＮＡ断片の３’末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合していることを特徴としている。
【００２６】
また、上記核酸増幅反応は、ＰＣＲであることがより好ましい。
【００２７】
本発明に係る核酸増幅確認方法は、上記課題を解決するために、核酸増幅反応における核酸増幅を確認する方法であって、上記本発明に係るヘアピンプライマーを少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、バルジ構造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応前ヘアピンプライマー測定工程と、核酸増幅反応を行なう工程と、バルジ構造結合分子を用いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応後ヘアピンプライマー測定工程とを含むことを特徴としている。
【００２８】
また、本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記バルジ構造結合分子が、ナフチリジン環を有する化合物であることがより好ましい。
【００２９】
また、本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記ナフチリジン環を有する化合物が、下記式（１）
【００３０】
【化１】
2008026582.tif 000003
（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基又は第３級アミン残基を示す。）で示される２，７‐ジアミノナフチリジン誘導体であることがより好ましい。
【００３１】
また、本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記２，７‐ジアミノナフチリジン誘導体が、下記式（２）
【００３２】
【化２】
2008026582.tif 000004
で示される２，７−ジアミノ‐１，８‐ナフチリジンであることがより好ましい。
【００３３】
また、本発明に係る核酸増幅確認方法では、上記反応前ヘアピンプライマー測定工程は、上記核酸増幅反応液に上記バルジ構造結合分子を添加して行ない、さらに当該核酸増幅反応液をそのまま核酸増幅反応に供することがより好ましい。
【００３４】
本発明に係るＳＮＰ検出方法は、上記課題を解決するために、上記の本発明に係る核酸増幅確認方法を用いることを特徴としている。
【００３５】
また、本発明に係るＳＮＰ検出方法は、上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの３’末端の位置が、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されていることがより好ましい。
【００３６】
また、本発明に係るＳＮＰ検出方法は、上記３’末端の位置が検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されているプライマーにヘアピンプライマーを用いることが好ましい。
【００３７】
また、本発明に係るＳＮＰ検出方法は、上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、当該コンペティタープライマーの３’末端は、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されており、かつ、３’末端には、上記ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、又は、上記ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、を有することがより好ましい。
【００３８】
本発明に係る試薬キットは、上記課題を解決するために、核酸増幅反応における核酸の増幅を確認するための試薬キットであって、少なくとも本発明に係るＤＮＡ断片を含むことを特徴としている。
【００３９】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】本発明の一実施の形態の核酸増幅確認方法の原理を模式的に表した図である。
【図２】本発明の一実施の形態のＳＮＰ解析方法の原理を模式的に表した図である。
【図３】実施例において用いた本発明に係るヘアピンプライマーのプライマー名、塩基配列及びその構造を模式的に表す図である。
【図４】実施例において、ＰＣＲ前後における蛍光強度を比較した図である。
【図５】実施例において、シトシンバルジ構造を形成する配列によって、バルジ構造結合蛍光分子が発光する蛍光強度の相違を比較した結果を表す図である。
【図６】実施例において、ＰＣＲサイクルの回数と、バルジ構造結合蛍光分子による蛍光強度との関係を比較した結果を表す図である。
【図７】実施例において、リバースプライマーとして、M13RV、takei 5、takei 18及びtakei 18-4をそれぞれ用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
【図８】実施例において用いた本発明に係るヘアピンプライマーのプライマー名、塩基配列及びその構造を模式的に表す図である。
【図９】実施例において、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的ＰＣＲによる、ＰＣＲサイクル数と核酸の増幅効率との関係を比較した結果を示す図である。
【図１０】実施例において、リバースプライマーとして、takei18-4、takei18-4A、takei18-4G、takei18-4T、M13RVをそれぞれ用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
【図１１】実施例において、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的ＰＣＲに、さらにコンペティタープライマーを用いた場合の、ＰＣＲサイクル数と核酸の増幅効率との関係を比較した結果を示す図である。
【図１２】実施例において、リバースプライマー及びコンペティタープライマーとして、takei18-4及びM13RVA、takei18-4A及びM13RVを用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した結果を示す図である。
【符号の説明】
【００４１】
１    バルジ構造結合蛍光分子
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下のとおりである。しかし、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更して実施することができる。【００４３】
〔本発明に係るＤＮＡ断片〕
本発明に係るＤＮＡ断片は、ヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡ断片であって、ヘアピン構造中にバルジ構造を有するものであればよく、これを核酸増幅反応に用いるプライマーの５’末端に結合して用いればよい。【００４４】
本発明に係るＤＮＡ断片が有するヘアピン構造は、一本鎖のＤＮＡが分子内で対合して、ＤＮＡの弧状領域と二本鎖領域が形成されることによりなる。そして、本発明に係るＤＮＡ断片は、当該二本鎖領域中にバルジ構造を有する。【００４５】
本発明に係るＤＮＡ断片の有するヘアピン構造を構成する塩基の数は、ＤＮＡの弧状領域及び二本鎖領域を形成し、さらに当該二本鎖領域中にバルジ構造を有する限り、限定されるものではないが、２４〜３３であることが好ましく、さらに好ましくは２４〜２８である。２４以上であれば、ＤＮＡの弧状領域、二本鎖領域及びバルジ構造を好適に形成することができ、３３以下であれば、核酸増幅反応に影響を及ぼさない。【００４６】
また、上記弧状領域のＤＮＡを構成するＤＮＡの塩基配列は、弧状領域の形成が可能である限り、特に限定されるものではないが、構成する塩基の数は、３〜７が好ましく、さらに好ましくは４である。そして、４個の塩基により上記弧状領域が形成される場合、その配列は、ＴＴＴＴからなる配列であることが好ましい。ＴＴＴＴによる弧状領域を備えるヘアピン構造は、核酸増幅反応において良好に伸長されるからである。【００４７】
本発明に係るＤＮＡ断片の塩基配列は、以下のようにして設計すればよい。【００４８】
例えばＣＣＡＡＸＸＸＸＴＴＧＧ（Ｘは任意の塩基）のように、任意の塩基配列の両端に、互いに対合可能な塩基配列を設計する。そして、ＣＣＡＡ又はＴＴＧＧ中の任意の位置にバルジ塩基が含まれるように設計する。このように設計することにより、ＸＸＸＸが湾曲して弧状領域を形成し、ＣＣＡＡとＴＴＧＧとがハイブリダイズして二本鎖領域を形成し、当該バルジ塩基が含まれることでバルジ構造が形成される。【００４９】
つまり、弧状領域を形成するＤＮＡに対応する塩基配列の両端に、互いにハイブリダイズ可能な塩基配列を設計し、ハイブリダイズする領域の塩基配列にバルジ塩基が含まれるように設計する。このように設計した塩基配列に基づいてＤＮＡ断片を合成することで本願発明に係るＤＮＡ断片を得ることができる。なお、ＤＮＡ断片の合成は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよく、例えば化学合成により合成すればよい。【００５０】
なお、上の例では、本発明に係るＤＮＡ断片が、ＤＮＡの弧状領域と、バルジ構造を含む二本鎖領域とにより形成されるヘアピン構造のみからなる場合について説明した。この例のように、本発明に係るＤＮＡ断片はヘアピン構造のみからなることが最も好ましいが、ヘアピン構造の３’末端及び／又は５’末端に、さらなる核酸が連結していてもよい。当該さらなる核酸を含む場合は、その塩基の数は、３’末端、５’末端それぞれにおいて、１〜２０であることが好ましい。この範囲であれば、核酸増幅反応に影響を及ぼさない。【００５１】
本明細書において「バルジ構造」とは、ＤＮＡの二本鎖領域において、一方の鎖のＤＮＡに、余剰の塩基が存在するために生じるふくらみ（バルジ）をいう。例えば、ＴＣＴ部分とＡＡ部分とを有するＤＮＡ断片が折れ曲がってヘアピン構造を形成し、上記ＴＣＴ部分とＡＡ部分とが向かい合う位置となった場合、ＴＣＴ部分の二つのＴとＡＡ部分の二つのＡとがそれぞれ対合する。その結果、当該二つのＴの間に存在するＣは対合する塩基が無いため、当該Ｃの部分が膨らむこととなる。この膨らんだ構造がバルジ構造である。なお、この例のように余剰の塩基がＣ（シトシン）であることにより形成されるバルジ構造を、本明細書において「シトシンバルジ構造」と表記する。Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）についても同様に、「アデニンバルジ構造」等と表記する。また、本明細書において「バルジ塩基」とは、バルジ構造中の余剰の塩基をいう。【００５２】
（バルジ構造の数）
本発明に係るＤＮＡ断片が有するバルジ構造の数は、１つのみでもよいが、複数であることが好ましく、さらに好ましくは、２〜４個である。バルジ構造を複数備えることで、後述するバルジ構造結合分子が結合可能な部位が増えるため、高感度な上記ヘアピンプライマーの検出が可能となる。【００５３】
バルジ構造を複数備える場合、隣り合うバルジ塩基の間には、好ましくは３〜５、さらに好ましくは４の塩基が存在することが好ましい。バルジ構造が近接しすぎると、後述するバルジ構造結合分子がそれぞれのバルジ構造に良好に結合することが妨げられる。バルジ塩基間の間隔が広すぎると、ヘアピン構造が安定になり、ヘアピンの伸長が良好に行われない恐れがあり、また、本発明に係るＤＮＡ断片が大きくなり、合成コストが高くなる。【００５４】
（バルジ構造の種類及びそれを形成する配列）
本発明に係るＤＮＡ断片が備えるバルジ構造は、アデニンバルジ構造、シトシンバルジ構造、チミンバルジ構造、グアニンバルジ構造のいずれでもよい。【００５５】
チミンバルジ構造又はシトシンバルジ構造の場合、後述するナフチリジン環を有する化合物が結合すると、当該蛍光分子から発光される蛍光強度の吸収極大波長がシフトする。よって、核酸増幅反応の前後で、シフトした吸収極大波長における蛍光が弱くなれば、核酸増幅が得られたものと確認できる。【００５６】
また、アデニンバルジ構造、グアニンバルジ構造の場合、後述するナフチリジン環を有する化合物が結合すると消光し、結合していない状態で蛍光を発光する。よって、核酸増幅反応後の蛍光が、核酸増幅反応前より強くなれば核酸増幅を得ることができたものと確認できる。【００５７】
本発明に係るＤＮＡ断片が有するバルジ構造は、シトシンバルジ構造であることが好ましい。後述する２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは蛍光物質であり、シトシンバルジ構造に結合することで、蛍光の吸収極大波長がシフトし、シフトした波長において強い強度の蛍光を発光する。そのため、２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンを用いることで、特異的かつ高感度な核酸増幅の検出が可能となるからである。【００５８】
本発明に係るＤＮＡ断片が有するシトシンバルジ構造を形成するための塩基配列は、シトシンバルジ構造が形成される限り、限定されるものではないが、一本鎖ＤＮＡ断片中のＴＣＴ配列における二つのＴとＡＡ配列における二つのＡとが、Ｔ−Ａ塩基対で、当該ＤＮＡ断片の分子内で対合（分子内対合）し、ＴとＴとの間に位置するＣがバルジ塩基となることで、シトシンバルジ構造が形成されることが好ましい。ＤＮＡのＴＣＴ配列とＡＡ配列におけるＴ−Ａ塩基対の対合により形成されるシトシンバルジ構造を含むヘアピン構造は、安定であるためバルジ構造結合分子が良好に結合し、かつ、過度に安定ではないため、核酸増幅反応によるヘアピン構造の伸長が、良好に行なわれるからである。また、後述するナフチリジン環を有する化合物を用いた場合、得られる蛍光波長が、より長波長となるため、測定感度が向上するからである。【００５９】
（本発明に係るＤＮＡ断片の塩基配列の具体例）
以上に述べた本発明に係るＤＮＡ断片の塩基配列の具体例としては、配列番号１〜５に示す塩基配列を挙げることができる。これらの中では、ＤＮＡのＴＣＴ部分とＡＡ部分の対合によりシトシンバルジ構造が形成されていることから、配列番号１〜４に示す塩基配列が好ましく、さらに好ましくは、シトシンバルジ構造を複数形成する配列番号１〜３に示す塩基配列が好ましい。【００６０】
〔本発明に係るヘアピンプライマー〕
本明細書において「ヘアピンプライマー」とは、核酸増幅反応に用いるプライマーの５’末端に、本発明に係るＤＮＡ断片を結合させたものが意図される。【００６１】
本発明に係るヘアピンプライマーは、標的とする核酸を増幅可能なように、任意に設計した核酸増幅反応に用いるプライマーの５’末端に、本発明に係るＤＮＡ断片を結合させたものであればよい。【００６２】
即ち、従来公知の設計手法により、核酸増幅反応に用いるプライマーを設計して、当該プライマーの５’末端に、上述の本発明に係るＤＮＡ断片を結合すればよい。【００６３】
なお、核酸増幅反応に用いるプライマーに、本発明に係るＤＮＡ断片を結合する方法は、従来公知のＤＮＡリガーゼを用いればよい。また、本発明に係るＤＮＡ断片と、核酸増幅反応に用いるプライマーとが連なった塩基配列に基づき連続して化学合成しても本発明に係るヘアピンプライマーを得ることができる。【００６４】
本発明に係るヘアピンプライマーは、様々な核酸増幅反応に好適に用いることができる。上記核酸増幅反応としては、例えば、Ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ、逆転写ＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ、Ｔａｑ  Ｍａｎ  ＰＣＲ等のＰＣＲ、ＩＣＡＮ法、ＵＣＡＮ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。中でもＰＣＲに好適に用いることができる。ＰＣＲは核酸増幅反応の中でも簡便に行なうことができるため、ＰＣＲに本発明に係るヘアピンプライマーを用いることで、標的となる核酸の増幅から、増幅の確認までを迅速かつ簡便に行なうことができる。【００６５】
〔本発明に係る核酸増幅確認方法〕
本発明に係る核酸増幅確認方法は、本発明に係るヘアピンプライマーを、少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、バルジ構造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応前ヘアピンプライマー測定工程と、核酸増幅反応を行なう工程と、バルジ構造結合分子を用いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応後ヘアピンプライマー測定工程とを含めばよい。【００６６】
核酸増幅反応によって、本発明に係るヘアピンプライマーが備えるバルジ構造は伸長される。そのため、バルジ構造結合分子を用いれば、核酸増幅反応前後における、上記反応液中のバルジ構造の量、ひいてはヘアピンプライマーの量を比較することができる。即ち、ヘアピンプライマーの量が、当該増幅反応前に比べて当該増幅反応後で減少していれば、核酸の増幅が生じたことが確認でき、減少していなければ、核酸の増幅が生じなかったことが確認できる。【００６７】
以下に、本発明に係る核酸増幅確認方法の一実施形態を、図１に基づいて説明する。【００６８】
図１は、本実施の形態に係る核酸増幅確認方法の原理を模式的に表した図である。なお、図１では核酸増幅反応としてＰＣＲを用いた場合を示している。【００６９】
図１の（１）において、下側の線分は増幅対象の核酸を含むＤＮＡを示している。即ち、図１の（１）は、当該核酸を増幅可能なプライマーの５’末端に、シトシンバルジ構造を含むヘアピン構造を形成した本発明に係るＤＮＡ断片が結合した本発明に係るヘアピンプライマーと、解析対象の核酸とがアニールしている状態を示している。そして、伸長反応により破線方向に相補鎖が合成される。【００７０】
次いで、図１の（２）に示すように、図１の（１）で合成されたＤＮＡ鎖にリバースプライマーがアニールし、破線方向、つまり図１の（１）と逆方向にＤＮＡ鎖が合成される。【００７１】
図１の（１）、（２）のようにＰＣＲが進行した結果、図１の（３）に示すようにフォワード側のヘアピンプライマーが形成していたヘアピン構造が伸長され、ヘアピン構造中に含まれていたバルジ構造が消失する。【００７２】
図１の（４）は、図１の（１）のように、増幅対象の核酸にヘアピンプライマーがアニールした状態でバルジ構造結合蛍光分子１を反応液中に添加したときの状態を表している。すなわち、バルジ構造結合蛍光分子１はシトシンバルジ構造に結合し、シフトした吸収極大波長において蛍光を発する。なお、バルジ構造結合蛍光分子については後述するが、本実施の形態で用いられているバルジ構造結合蛍光分子１を端的に説明すれば、蛍光物質であってバルジ構造に結合することで発光する蛍光の吸収極大波長がシフトする物質である。【００７３】
図１の（５）は、ＰＣＲ終了後の反応液にバルジ構造結合蛍光分子１を添加したときの状態を表している。元のヘアピンプライマーはＰＣＲによりヘアピン構造が伸長し、バルジ構造が消失したため、バルジ構造結合蛍光分子１は増幅された核酸と結合できない。したがって、蛍光強度は非常に小さくなる。【００７４】
このようにＰＣＲの前後において、本発明に係るヘアピンプライマーの量を測定し、これが減少すれば、目的の核酸領域が増幅されたことが確認できる。【００７５】
なお、核酸増幅反応は、従来公知の方法、装置を用いて行なえばよく、反応条件は、用いる試料やプライマー等に応じて適宜設定すればよい。【００７６】
また、本発明に係る核酸増幅確認方法に適用可能な試料は、核酸を含むものであれば特に限定されることはない。例えば、血液、リンパ液、鼻水、喀痰、尿、糞便、腹水等の体液類、皮膚、粘膜、各種臓器、骨等の組織、鼻腔、気管支、皮膚、各種臓器、骨等を洗浄した後の洗浄液、植物、微生物を挙げることができる。【００７７】
上記試料に由来する核酸は特に限定されるものではなく、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。ＤＮＡとしてはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを挙げることができる。ＲＮＡとしては、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡなどを挙げることができる。ＲＮＡの場合には、逆転写反応によりＤＮＡを合成する工程を含むことが好ましい。【００７８】
（バルジ構造の検出）
反応前ヘアピンプライマー測定工程及び反応後ヘアピンプライマー測定工程は、バルジ構造結合分子を、本発明に係るヘアピンプライマーが有するバルジ構造に結合させて、バルジ構造を検出することにより行なう。【００７９】
本発明に係る核酸増幅確認方法に用いるバルジ構造結合分子は、バルジ構造に結合可能である限り限定されるものではないが、蛍光物質であって、バルジ構造と結合することで、蛍光を発光、発光する蛍光の波長がシフト、又は、蛍光が消光する等、蛍光の発光状態が変化する物質を用いることが好ましい。これらの蛍光を検出することで、容易にバルジ構造を検出できるからである。なお、蛍光物質ではないバルジ構造結合分子を用いてもよく、この場合、バルジ構造結合分子を別途蛍光物質等により標識化したり、バルジ構造結合分子をアフィニティクロマトグラフィーのカラムに充填したりして用いればよい。【００８０】
バルジ構造に結合して蛍光の発光状態が変化するバルジ構造結合分子としては、ナフチリジン環を有する化合物を挙げることができる。ナフチリジン環を有する化合物は、アデニンバルジ構造又はグアニンバルジ構造に結合すると、蛍光は消光する。また、ナフチリジン環を有する化合物は、シトシンバルジ構造又はチミンバルジ構造と結合すると、ナフチリジン環を有する化合物が発光する蛍光の吸収極大波長が、異なる波長にシフトする。この消光又はシフトした吸収極大波長における蛍光の検出により、簡便にバルジ構造を検出することができる。【００８１】
さらに、ナフチリジン環を有する化合物は、核酸増幅反応に用いるＤＮＡポリメラーゼ等の酵素を阻害しない。このため、ナフチリジン環を有する化合物を混合したまま核酸増幅反応に供することができる。よって、一つの反応容器に、核酸増幅反応液を調製し、これに予めナフチリジン環を有する化合物を混合することで、当該反応液の蛍光を測定し、当該反応液を、そのまま核酸増幅反応に供して、増幅反応終了後、同じ反応液の蛍光を測定することで、蛍光の変化を評価することができる。【００８２】
従って、バルジ構造結合分子として、ナフチリジン環を有する化合物を用いることで、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を、簡便に行なうことができる（以下、ナフチリジン環を有する化合物を「バルジ構造結合蛍光分子」と表記する）。【００８３】
本発明に係る核酸増幅確認方法に用いるバルジ構造結合蛍光分子としては、下記式（１）【００８４】
【化３】
2008026582.tif 000005
（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基又は第３級アミン残基を示す。）で示される２，７‐ジアミノナフチリジン誘導体を用いることが好ましい。上記第１級アミン残基としては、−ＮＨ２が挙げられる。また、上記第２級アミン残基としては、例えば、−ＮＨ（ＣＨ２）ＮＨ２基、−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２基、−ＮＨ（ＣＨ）２ＮＨ（ＣＨ３）基等が挙げられる。上記第３級アミン残基としては、例えば、−Ｎ（ＣＨ３）（ＣＨ２）２ＮＨ２基等が挙げられる。中でも、Ｒ１及びＲ２の内、少なくとも片方が第２級アミン残基であることが好ましく、Ｒ１及びＲ２の両方が第２級アミン残基であることがさらに好ましい。上記バルジ構造結合蛍光分子が第２級アミン残基を備えることで、上記バルジ構造との結合がより安定するからである。【００８５】
２，７‐ジアミノナフチリジン誘導体の中でも、下記式（２）【００８６】
【化４】
2008026582.tif 000006
で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンが特に好ましい。上記２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、シトシンバルジ構造に結合すると、発光する蛍光の吸収極大波長がシフトし、当該波長において強い強度の蛍光を発光するため、高感度かつ特異的に、シトシンバルジ構造、ひいては核酸増幅反応に用いた本発明に係るヘアピンプライマーを検出することが可能となるからである。【００８７】
２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、従来公知の方法により合成すればよく、例えば日本国公開特許公報「特開２００４−２６２８２７号公報」に記載の方法により合成すればよい。上記２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンは、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の条件下において、単独では吸収極大が３７６ｎｍで検出され、シトシンバルジ構造と結合することにより、３９６ｎｍにシフトする。【００８８】
なお、上記式（１）で示されるバルジ構造結合蛍光分子としては、下記式（３）【００８９】
【化５】
2008026582.tif 000007
（Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ独立して１〜６の自然数を示す）で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン誘導体であってもよく、下記式（４）【００９０】
【化６】
2008026582.tif 000008
（Ｒ５、Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子又はアミノ基であり、ｏ、ｐはそれぞれ独立して１〜６の自然数を示す）で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン誘導体であってもよい。【００９１】
なお、バルジ構造結合蛍光分子を用いて、本発明に係るヘアピンプライマーを検出するときのｐＨ条件は、好ましくはｐＨが５以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは６．５以上である。また、当該ｐＨの上限は、好ましくは９以下、より好ましくは８以下、さらに好ましくは７．５以下である。ｐＨが５以上、９以下であれば、ＤＮＡは安定であるため、バルジ構造結合蛍光分子は良好に本発明に係るヘアピンプライマー中のバルジ構造に結合する。これにより蛍光の検出を良好に行なうことができる。【００９２】
バルジ構造結合蛍光分子は、核酸増幅反応に供する反応液に、直接添加してもよく、例えば、さらにリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等を用いてもよい。【００９３】
バルジ構造結合蛍光分子の使用量は、核酸増幅反応の反応液に予め加えられるヘアピンプライマー１モルに対して、２０モル〜１００モルであることが好ましく、さらに好ましくは４０モル〜６０モルである。２０モル〜１００モルであれば、十分にヘアピンプライマー中のバルジ構造に結合し、さらにバックグラウンドシグナルによる測定誤差等も生じない。【００９４】
バルジ構造結合蛍光分子が、バルジ構造に結合したときに発光する蛍光の検出は、これを検出可能である限り限定されるものではないが、４００ｎｍ〜４８０ｎｍの波長が好ましく、さらに好ましくは４３０〜４６０ｎｍである。当該蛍光の蛍光強度は、４００ｎｍ〜４８０ｎｍの蛍光波長において、上記２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンがバルジ構造に結合していない場合に発光する蛍光と明確に区別することができるからである。【００９５】
以上に述べた蛍光強度の検出は、既存の蛍光プレートリーダーなど、公知の方法、装置により行なえばよい。【００９６】
〔ＳＮＰ検出方法〕
本発明に係るＳＮＰ検出方法は、本発明に係る核酸増幅確認方法を用いればよい。【００９７】
検出対象のＳＮＰ部位の塩基の種類に応じて、核酸増幅反応による核酸が増幅されるか否かの結果が異なるように増幅条件を設定した核酸増幅反応に、本発明に係る核酸増幅確認方法を用いることで、当該核酸におけるＳＮＰ部位の塩基の種類を、迅速、簡便、安価かつ高感度に検出できる。【００９８】
つまり、本発明に係るＳＮＰ検出方法で用いるプライマーは、ＳＮＰ検出対象の核酸の、ＳＮＰ部位の塩基に応じて、核酸が増幅されるか否かの結果が異なるように設計されれば、限定されるものではないが、上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの３’末端の位置が、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されていることが好ましい。【００９９】
プライマーの３’末端に位置する塩基と、核酸増幅反応に供する核酸とで、正常な塩基対を形成するか否かは、核酸増幅反応の進行に大きな影響を与える。よって、上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの３’末端の位置を、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計することで、ＳＮＰ部位の塩基の種類に応じて、核酸が増幅されるか否かの結果が異なる増幅条件を、容易に見出すことができる。【０１００】
本発明に係るＳＮＰ検出方法で用いる、３’末端が検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されたプライマーの、当該３’末端の塩基の種類は、ＳＮＰ検出の目的や、ＳＮＰ部位における検出対象の塩基に応じて、適宜選択すればよい。【０１０１】
例えば、ＳＮＰ部位の塩基が、特定の塩基か、他の塩基に変異しているかを検出する場合は、当該３’末端の塩基を当該特定の塩基に相補的な塩基とすればよい。これにより、核酸が増幅されれば、当該ＳＮＰ部位の塩基は当該特定の塩基であることが判定でき、核酸が増幅されなければ、当該ＳＮＰ部位の塩基が当該特定の塩基とは異なる塩基に変異していることが判定できる。【０１０２】
また、予め、ＳＮＰ部位の塩基の種類が予測可能な場合は、３’末端の塩基を当該予測される種類に相補的な塩基としたプライマーを、それぞれ用意して、それぞれのプライマーを用いた核酸増幅反応を行なえば、さらに検出結果の信頼性を向上させることができる。つまり、いずれかのプライマーを用いた核酸増幅反応では、核酸が増幅され、他のプライマーを用いた核酸増幅反応では核酸が増幅されないため、よって、さらに確実にＳＮＰ部位の塩基の種類を特定することができる。【０１０３】
以下に、本発明に係るＳＮＰ検出方法の一実施形態を、図２に基づいて説明する。【０１０４】
図２は、本実施の形態に係るＳＮＰ検出方法の原理を模式的に表した図である。なお、図２では核酸増幅反応としてＰＣＲを用いた場合を示している。【０１０５】
図２の（１）において、Ａ（アデニン）が含まれている直線は、Ａ（アデニン）の位置にＳＮＰを有する解析対象の核酸を示している。即ち、図２の（１）は、３’末端に当該Ａ（アデニン）に相補的な塩基であるＴ（チミン）を備えるプライマーの５’末端に、シトシンバルジ構造を含むヘアピン構造を形成した本発明に係るＤＮＡ断片が結合した本発明に係るヘアピンプライマーと、解析対象の核酸とがアニールしている状態を示している。そして、伸長反応により破線方向に相補鎖が合成される。【０１０６】
次いで、図２の（２）に示すように、図２の（１）で合成されたＤＮＡ鎖にリバースプライマーがアニールし、破線方向、つまり図２の（１）と逆方向にＤＮＡ鎖が合成される。なお、ここで用いるリバースプライマーは、ＳＮＰの位置より下流側に設計されていればよい。【０１０７】
図２の（１）、図２の（２）のようにＰＣＲが進行した結果、図２の（３）に示すようにフォワード側のヘアピンプライマーが形成していたヘアピン構造が伸長され、ヘアピン構造中に含まれていたバルジ構造が消失する。【０１０８】
図２の（４）は、図２の（１）のように、解析対象の核酸にヘアピンプライマーがアニールした状態でバルジ構造結合蛍光分子１を反応液中に添加したときの状態を表している。すなわち、バルジ構造結合蛍光分子１はシトシンバルジ構造に結合し、シフトした吸収極大波長において蛍光を発する。【０１０９】
図２の（５）は、ＰＣＲ終了後の反応液にバルジ構造結合蛍光分子１を添加したときの状態を表している。元のヘアピンプライマーはＰＣＲによりヘアピン構造が伸長し、バルジ構造が消失したため、バルジ構造結合蛍光分子１は増幅された核酸と結合できない。したがって、蛍光強度は非常に小さくなる。【０１１０】
これにより、解析対象の核酸が有するＳＮＰの位置の塩基は、Ａ（アデニン）であることが判定できる。【０１１１】
図２の（６）は、３’末端にＧ（グアニン）を備え、５’末端にシトシンバルジ構造を含むヘアピン構造を形成した本発明に係るＤＮＡ断片を結合させた本発明に係るヘアピンプライマーを、フォワードプライマーとして用いたＰＣＲに、（１）と同じ核酸を解析対象として供した状態を表している。当該Ｇ（グアニン）は、解析対象の核酸がＳＮＰを有しており、当該ＳＮＰの位置にある塩基がＣ（シトシン）である場合に、ＰＣＲが進行するように設計されたものである。【０１１２】
しかし、図２の（６）の場合、ＰＣＲに供した核酸のＳＮＰの位置にある塩基はＣ（シトシン）ではなくＡ（アデニン）である。そのため、ＰＣＲは進行せず、当該ＰＣＲ後の反応液中には、シトシンバルジ構造を備えた未反応のヘアピンプライマーが多量に残存することとなる。【０１１３】
図２の（７）は、図２の（６）に示したＰＣＲが行なわれた後の状態を表している。上述の通り、図２の（６）においてＰＣＲは進行していないため、本発明に係るヘアピンプライマーは、未反応のまま残存している。このため、反応液中のバルジ構造結合蛍光分子１は、当該ヘアピンプライマー中のシトシンバルジ構造に結合し、シフトした吸収極大波長において蛍光を発光する。従って、図２の（６）に示したＰＣＲの前後において、バルジ構造結合蛍光分子１が当該波長において発光する蛍光強度は、ほとんど変化しない。つまり図２の（７）では、図２の（５）の場合と比較して、当該波長における蛍光強度が大きい。【０１１４】
これにより、解析対象の核酸が有するＳＮＰの位置の塩基は、Ｃ（シトシン）ではないことが判定できる。【０１１５】
このように、例えば、アレル特異的ＰＣＲのように、標的とする核酸がＳＮＰ等の変異を有するか否かにより、核酸が増幅されるか否かの結果が異なるように増幅条件を設定した核酸増幅反応に、本発明に係るヘアピンプライマーを用いることで、当該核酸における変異の有無を、迅速、簡便、安価かつ高感度に検出できる。【０１１６】
（コンペティタープライマー）
本発明に係るＳＮＰ検出方法では、上述した３’末端の位置が検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されているプライマーにヘアピンプライマーを用いればよい。さらに、上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、
当該コンペティタープライマーの３’末端は、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されており、かつ、３’末端には、上記ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、又は、上記ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、を有することが好ましい。【０１１７】
これにより、例えば、野生型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合、変異型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基を３’末端に備えたコンペティタープライマーが、優先して変異型核酸にアニールする。よって、当該ヘアピンプライマーが、変異型核酸にアニールすることを防ぐことができる。つまり、野生型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーが変異型核酸の増幅に用いられ、ヘアピン構造が消失することを防ぐので、変異型核酸の増幅を、野生型核酸の増幅と誤認することを防ぐことができる。従って、ＳＮＰ検出の検出結果の信頼性が向上する。【０１１８】
また、例えば、変異型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合、野生型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基を３’末端に備えたコンペティタープライマーが、優先して野生型核酸にアニールする。よって、上述の野生型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合と同様に、野生型核酸の増幅を、変異型核酸の増幅と誤認することを防ぐことができる。従って、ＳＮＰ検出の検出結果の信頼性が向上する。【０１１９】
なお、本明細書において「コンペティタープライマー」とは、核酸増幅反応に用いるプライマーが、非増幅確認対象核酸にアニールする可能性があるとき、非増幅確認対象核酸に対して、当該プライマーより優先的にアニールするプライマーをいう。【０１２０】
また、本明細書において「野生型核酸」とは、検出対象のＳＮＰの位置に、高い頻度で現れる塩基を有する核酸をいい、「変異型核酸」とは、検出対象のＳＮＰの位置に、低い頻度で現れる塩基を有する核酸をいう。【０１２１】
本発明に係るＳＮＰ検出方法に用いるコンペティタープライマーの塩基配列の設計は、３’末端の塩基を、野生型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合は、変異型核酸のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基とし、変異型核酸の増幅を目的としたヘアピンプライマーを用いる場合は、野生型核酸のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基とすればよい。【０１２２】
例えば、上述の図２の（６）に示したヘアピンプライマーであって、Ａに相補的な塩基であるＴを３’末端に備えた以外は、当該ヘアピンプライマーのヘアピン構造を除いた部分と同一の塩基配列からなるように設計したプライマーは、図２の（６）に示すＰＣＲにおいてコンペティタープライマーとして用いることができる。そして、当該コンペティタープライマーは、当該ヘアピンプライマーより優先して、図２の（６）に示したＰＣＲに供した核酸にアニールする。よって、図２の（６）に示したヘアピンプライマーの一部が、図２の（６）において、検出対象ではない塩基であるＡを有する核酸にアニールして、ＰＣＲが進行することを防ぎ、当該ＳＮＰ部位の塩基がＣであるという誤認を防ぐことができる。【０１２３】
なお、リアルタイムＰＣＲでは、増幅を目的としない核酸が増幅されても蛍光が検出されるため、これをＳＮＰ検出に用いても、結果の信頼性に欠ける。そのため、信頼性を向上させるために、別途、ＳＮＰ部位の塩基の種類に応じて特異的にハイブリダイズする蛍光標識プローブなどを用いる必要があり、作業も煩雑となる。【０１２４】
しかし、コンペティタープライマーを用いた本発明に係るＳＮＰ検出方法によれば、ＳＮＰ部位の塩基が、検出対象ではない塩基に変異した核酸の増幅に、ヘアピンプライマーが用いられることを防ぐことができる。よって、確認される核酸増幅の結果の信頼性が向上し、リアルタイムＰＣＲよりも信頼性の高いＳＮＰ検出を、簡便に行なうことができる。【０１２５】
なお、コンペティタープライマーを用いれば、ＳＮＰ検出のみに限らず、ＰＣＲ等の核酸増幅反応において、本発明に係るヘアピンプライマーが、増幅確認対象ではない核酸に、アニールすることを防ぐことができる。つまり、増幅確認対象ではない核酸の増幅を、目的の核酸増幅が得られたものと誤認することを防ぐことができる。【０１２６】
この場合、コンペティタープライマーの塩基配列は、増幅確認対象ではない核酸に対して、本発明に係るヘアピンプライマーがアニールする恐れのある領域を含む領域に、アニールするように設計し、かつ、当該コンペティタープライマーが、当該増幅確認対象ではない核酸にアニールする領域における、当該増幅確認対象ではない核酸に対する相同性が、当該ヘアピンプライマーより高くなるように、設計すればよい。なお、当該ヘアピンプライマーがアニールする恐れのある領域の塩基配列は、既知であることが必要である。【０１２７】
これにより、増幅確認対象ではない核酸の増幅に、本発明に係るヘアピンプライマーが用いられることを防ぐことができる。つまり、誤った核酸増幅反応に起因する、上述したバルジ構造結合蛍光分子の蛍光強度の低下を防ぐことができ、増幅確認の特異性が向上する。【０１２８】
〔本発明に係る試薬キット〕
本発明に係る試薬キットは、少なくとも本発明に係るＤＮＡ断片を含めばよい。さらに、本発明に係るＤＮＡ断片をキットの使用者が任意に設計した核酸増幅用プライマーの５’末端に結合するためのＤＮＡリガーゼ等の試薬を含んでもよい。【０１２９】
さらに、本発明に係る試薬キットには、既知のＳＮＰ情報に基づき、特定のＳＮＰを検出可能な、本発明に係るヘアピンプライマーを含んでいてもよいし、上述したバルジ構造結合分子又はバルジ構造結合蛍光分子を含んでもよい。また、上述したコンペティタープライマーを含んでもよい。【０１３０】
また、キットの構成としては上記挙げたものに限定されるものではなく、他の試薬や器具を含んでもよい。例えば、ＰＣＲ関連試薬・器具（ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ用バッファー、ＰＣＲ用チューブ等）、増幅核酸精製用試薬・器具を含んでもよいし、ＤＮＡ断片を安定的に保持するための試薬や緩衝液、バルジ構造結合分子又はバルジ構造結合蛍光分子を安定的に保持するための試薬や緩衝液を含んでもよい。【０１３１】
上記の何れの構成であっても、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を行なうために好ましい薬剤等が含まれている。そのため、本発明に係る試薬キットを用いることで、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を容易かつ迅速に実施することができ、本発明を臨床検査産業や医薬品産業等の産業レベルで利用することが可能となる。【０１３２】
また、本発明に係る試薬キットの提供形態は、本発明に係るＤＮＡ断片、バルジ構造結合蛍光分子、その他の試薬全てを、適切な容量及び／又は形態で含有した一つの容器として提供してもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、本発明に係る試薬キットには、核酸増幅反応における核酸増幅の確認を行なうための手順等を記載した説明書を含んでもよい。【０１３３】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。【０１３４】
〔本発明のコストの優位性〕
本発明によれば、上述のＳＮＰ解析等を、従来の方法に比べて低コストで行なうことができる。【０１３５】
この点について、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたＰＣＲによってＳＮＰを解析する方法と、従来、ＳＮＰ解析に用いられてきたＩｎｖａｄｅｒ法とを比較して説明する。なお、以下に述べるＩｎｖａｄｅｒ法については、M.Olivier, The Invader assay for SNP genotyping, 2005, Mutation Research, 573, 103-110を参考としている。【０１３６】
まず、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたＰＣＲと、従来のＩｎｖａｄｅｒ法とに用いられる主な試薬について表１に示す。【０１３７】
【表１】
2008026582.tif 000009
また、表２に、表１に示した試薬等に関するコストを定性的に比較した結果を示す。なお、表２において、バツ印はコストが極めて高いことを示し、三角印はコストが高いことを示し、丸印はコストが低いことを示し、二重丸印はコストが極めて低いことを示す。【０１３８】
【表２】
2008026582.tif 000010
表１及び表２に示すように、オリゴマーの数は、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたＰＣＲの方が、従来のＩｎｖａｄｅｒ法に比べて少ないので、この点でコストが低くなる。【０１３９】
つまり、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたＰＣＲでは、オリゴマーは２又は３種類でよい。例えば、本発明に係るヘアピンプライマーをフォワードプライマーとして用い、さらに、別途作製したリバースプライマーを用いればＰＣＲは可能であるのでオリゴマーは２種類でよい。なお、図２に説明したように、核酸増幅が起こる場合と起こらない場合とで比較検討する場合は、本発明に係るヘアピンプライマーの３’末端の塩基を他の塩基に変えたものを用いるが、リバースプライマーの配列を変える必要はないので、３種類のオリゴマー、即ち、３’末端の塩基がそれぞれ異なる２種類の本発明に係るヘアピンプライマーと、１つのプライマーとを用いればよい。【０１４０】
一方、従来のＩｎｖａｄｅｒ法では、インベーダーオリゴ（Ｉｎｖａｄｅｒ Ｏｌｉｇｏ）、プライマリープローブ（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｐｒｏｂｅ）、フレットカセット（ＦＲＥＴ Ｃａｓｓｅｔｔｅ）の少なくとも３種類のオリゴマーが必要となる。また、核酸増幅が起こる場合と起こらない場合とで比較検討する場合、プライマリープローブ、レットカセットがさらに１種類ずつ必要となるので、合計５種類のオリゴマーが必要になる。【０１４１】
つまり、必要なオリゴマーが少ない点で、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたＰＣＲは、従来法に比べて有利である。【０１４２】
また、表１及び表２に示すように、オリゴマーの化学修飾は、本発明に係るヘアピンプライマーでは不要であるが、従来のＩｎｖａｄｅｒ法では必須である。よって、この点で、本発明に係るヘアピンプライマーを用いるＰＣＲは、従来のＩｎｖａｄｅｒ法に比べてコストが極めて低くなる。【０１４３】
具体的には、従来のＩｎｖａｄｅｒ法では、フレットカセットを蛍光色素及び消光剤で２ヶ所化学修飾する必要がある。この化学修飾は極めて高価である。【０１４４】
なお、表１及び２に示すように、オリゴマー以外の試薬として、本発明に係るヘアピンプライマーを用いれば、ＤＮＡポリメラーゼ及びバルジ構造結合蛍光分子が必要となるが、従来のＩｎｖａｄｅｒ法では酵素としてフラップエンドヌクレアーゼ（Ｆｌａｐ Ｅｎｄｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いればよい。しかし、ＤＮＡポリメラーゼのコストは、フラップエンドヌクレアーゼのコストと同程度であり、また、バルジ構造結合蛍光分子は極めて安価に得ることができる。そのため、オリゴマー以外の試薬については、本発明に係るヘアピンプライマーでは、従来のＩｎｖａｄｅｒ法に比べて若干高くなるにとどまる。【０１４５】
例えば、後述の実施例で用いた２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン等の多くのバルジ構造結合蛍光分子は、２，６−ジアミノピリジン及びＤＬ−リンゴ酸を原料に製造することができる。いずれも、東京化成工業株式会社から購入可能であり、価格はそれぞれ２５ｇで５９００円、５００ｇで２２００円と安価である。しかも大量に購入する場合は、この１０分の１の価格で購入できる。当該原料以外にも、１，３−ジアミノプロパン及びオキシ塩化リンを用いる場合もあるが、前者は５００ｍｌで５４００円と安価あり、後者は工業原料として極めて安価に入手可能である。しかも、一回のＰＣＲに必要なバルジ構造結合蛍光分子は、５０μｍｏｌ／Ｌ程度でもよく、使用するオリゴマーと比較すると、そのコストは全体のコストに比べて極めて小さく、無視できる程度である。【０１４６】
以上を総合的に評価すると、本発明によれば、上述のＳＮＰ解析等を、従来の方法に比べて極めて低コストで行なえるといえる。
【実施例】
【０１４７】
本発明に係るＤＮＡ断片、及びバルジ構造結合蛍光分子を用いてＰＣＲを行なった実施例について説明する。【０１４８】
以下の実施例では、図３に示すヘアピンプライマーを用いた。図３は、以下の実施例に用いた各ヘアピンプライマーのプライマー名、塩基配列及びその構造を模式的に表した図である。プライマー名takei5、takei18、takei18-4、takei2、takei2-2は、それぞれ、配列番号６〜１０に示される塩基配列からなるＤＮＡにより形成されるヘアピンプライマーである。具体的には、配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡの５’末端に、それぞれ、配列番号１〜５に示される塩基配列からなるＤＮＡを結合させたものである。【０１４９】
なお、図３中「Ａ＿Ａ」は、ＡＡ、つまりＡが二つ連続した配列であり、対向するＴＣＴに対して、当該２つのＡとＴとがそれぞれ対合しているが、当該Ｃに対合する塩基が無いため、当該ＡとＡとの間を「＿」で表している。「Ｔ＿Ｔ」についても同様に、当該２つのＴが対向するＡとそれぞれ対合しており、２つのＡの間に位置するＣに対合する塩基が無いため、当該ＴとＴとの間を「＿」で表している。つまり、図３に示したヘアピンプライマーは、全てシトシンバルジ構造が形成されている。【０１５０】
〔実施例１〕
本実施例では、サンプルＤＮＡとして公知のプラスミドであるｐＵＣ１８（GenBank Accession Number L09136）を、以下に示す条件におけるＰＣＲの鋳型に用いた。【０１５１】
本実施例におけるＰＣＲには、リバースプライマーとしてtakei5を用い、フォワードプライマーとして配列番号１２に示される塩基配列からなるＤＮＡ（以下、当該プライマーを「M13M3」と表記する。）を用いた。【０１５２】
ＰＣＲ反応液は、全量を５０μｌとして、上記ｐＵＣ１８を５ｎｇ、上記フォワードプライマー０．５μＭ、上記リバースプライマー０．５μＭ、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ２５μl混合し、残部はＨ２Ｏとした。さらに、バルジ構造結合蛍光分子として、上記式（２）で表される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジン（以下、「ＤＡＮＰ」と表記する）２０μＭを上記ＰＣＲ反応液に添加した。【０１５３】
ＰＣＲの温度条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を４０サイクル繰り返し、その後４℃で保持した。【０１５４】
蛍光強度の検出は、蛍光プレートリーダー（ベルトールドテクノロジー社製  Ｍｉｔｈｒａｓ ＬＢ９４０）を用いて、励起波長４００ｎｍ、蛍光検出波長４５０ｎｍで行った。【０１５５】
次に、ＰＣＲ前における上記ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定した後、当該ＰＣＲ反応液をそのままＰＣＲに供し、ＰＣＲ終了後の反応液の蛍光強度を測定した。【０１５６】
ＰＣＲ前後における蛍光強度を比較した結果を図４及び表３に示す。【０１５７】
【表３】
2008026582.tif 000011
図４は、ＰＣＲ前後における蛍光強度を比較した図である。【０１５８】
表３及び図４に示すように、ＰＣＲ後の反応液の蛍光強度は、ＰＣＲ前に比べて約４０％に減少していた。これは、ＰＣＲが進行し、核酸の増幅が行われたことを示している。【０１５９】
〔実施例２〕
本実施例では、takei2、takei2-2を用いて、シトシンバルジ構造を形成する塩基配列による、バルジ構造結合蛍光分子が発光する蛍光強度の相違について検討した。【０１６０】
本実施例に用いた反応液は、全量を４００μlとして、ＤＡＮＰ５０μＭ、リン酸０．０１Ｍ、ＮａＣｌ０．１Ｍ、takei2又はtakei2-2を５μＭ混合し、残部はＨ２Ｏとした。【０１６１】
蛍光強度の測定は、蛍光測定機（株式会社島津製作所製  ＲＦ−５３００ＰＣ）を用いて、蛍光検出波長を３５０ｎｍ〜６００ｎｍまで変化させた。その結果を図５に示す。【０１６２】
図５において、縦軸は蛍光強度、横軸は蛍光検出波長を示している。また、実線はtakei2を用いた結果であり、破線は、takei2-2を用いた結果である。図５に示すように、takei2を用いた場合、即ち、シトシンバルジ構造が、ＡＡとＴＣＴとの結合により形成される場合の方が、長波長側の蛍光波長を示した。これは、takei2を用いた場合に、バルジ構造に結合していないＤＡＮＰが発光する蛍光強度から、バルジ構造に結合したＤＡＮＰが発光する蛍光強度へのシフトが、より大きかったことを示す。つまり、この結果は、シトシンバルジ構造を、ＡＡとＴＣＴとの結合により形成することで、高感度な測定、すなわち高感度なＰＣＲ増幅の確認が可能であることを示している。【０１６３】
〔実施例３〕
本実施例では、ＰＣＲサイクル数と、バルジ構造結合蛍光分子による蛍光強度との関係を検討した。【０１６４】
本実施例において、リバースプライマーにはtakei5及びtakei18をそれぞれ用いた。また、フォワードプライマーにはM13M3を用いた。【０１６５】
ＰＣＲ反応液は、全量を３００μｌとして、上記ｐＵＣ１８を３０ｎｇ、上記フォワードプライマー０．５μＭ、上記リバースプライマー０．５μＭ、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １５０μl混合し、残部はＨ２Ｏとした。さらに、バルジ構造結合蛍光分子として上記ＤＡＮＰ２０μＭを添加した。【０１６６】
ＰＣＲは、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間で行なった。ＰＣＲに供する前に、上記ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定し、次に当該ＰＣＲ反応液をそのままＰＣＲに供し、その後、５サイクル毎に、当該ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定した。ＰＣＲは、４０サイクルまで行った。【０１６７】
なお、蛍光強度の検出は、実施例１と同様に行なった。【０１６８】
各サイクルにおける蛍光強度の測定結果を図６に示す。【０１６９】
図６において、縦軸は相対蛍光強度、横軸はＰＣＲのサイクル数を示す。ここで上記相対蛍光強度とは、０回目、即ちＰＣＲ前における反応液の蛍光強度の値を１としたときの、各サイクル数における蛍光強度の値である。また、丸印のシンボルはtakei5を用いたＰＣＲの結果を表し、四角印のシンボルはtakei18を用いたＰＣＲの結果を表す。【０１７０】
図６から、ＰＣＲサイクル数が増加すると、相対蛍光強度が低下することが分かる。これは、ＰＣＲにより、takei5及びtakei18が備えるヘアピン構造が伸長され、シトシンバルジ構造が無くなったためである。即ち、蛍光強度の減少を検出することによりＰＣＲ増幅の確認が可能であることを示している。また、takei5又はtakei18を用いた場合は、ＰＣＲを２５サイクル以上行なうことで、好適に核酸の増幅を確認することが可能であることを示している。【０１７１】
〔実施例４〕
本実施例では、本発明に係るヘアピンプライマーと、ヘアピン構造を備えないプライマーとを、それぞれ用いたＰＣＲの結果を比較した。【０１７２】
本実施例において、リバースプライマーには、takei5、takei18及びtakei18-4を、それぞれ用いた。また、ヘアピン構造を備えないリバースプライマーとして、配列番号１１に示される塩基配列からなるＤＮＡ（以下、当該プライマーを「M13RV」と表記する。）を用いた。【０１７３】
フォワードプライマーは、上述したいずれのリバースプライマーに対しても、全てM13M3を用いた。【０１７４】
なお、本実施例におけるＰＣＲ反応液の組成を表４に示す。【０１７５】
【表４】
2008026582.tif 000012
なお、表４に示す組成に、さらにＨ２Ｏを加えて、全量を２００μｌとした。また、表４におけるＴａｑ ｍｉｘとは、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。また、さらに、バルジ構造結合蛍光分子として、実施例１と同様に上記ＤＡＮＰ２０μＭを添加した。【０１７６】
ＰＣＲの温度条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３５サイクル繰り返し、その後４℃で保持した。【０１７７】
蛍光強度の検出は、実施例１と同様に行った。【０１７８】
ＰＣＲ前に上記ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定し、当該ＰＣＲ反応液をそのままＰＣＲに供して、ＰＣＲ終了後、当該ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定した。ＰＣＲ前後における上記反応液の蛍光強度の測定結果を表５に示す。【０１７９】
【表５】
2008026582.tif 000013
ここで、表５において「ratio」とは、上述したＰＣＲ前の蛍光強度をＦＩ（０）、ＰＣＲ後の蛍光強度をＦＩ（３５）としたとき、ＦＩ（３５）／ＦＩ（０）の値である。なお、M13RVを用いたＰＣＲでは、蛍光強度が微増しているが、これは、ＰＣＲにより生成する二本鎖ＤＮＡに由来するものである。【０１８０】
次に、リバースプライマーとして、上記M13RV、takei5、takei18及びtakei18-4をそれぞれ用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図７に示す。【０１８１】
図７に示されるバンドは、左から順に、M13RV、takei5、takei18、takei18-4をそれぞれリバースプライマーとして用いたＰＣＲにより得られたＤＮＡ増幅断片によるバンドを示す。【０１８２】
図７に示されるように、リバースプライマーにM13RVを用いたときより、takei5、takei18、takei18-4を用いた方が、ヘアピン構造を形成する塩基配列に相当する長さの分だけ、ＰＣＲ産物が長い。【０１８３】
〔実施例５〕
本実施例では、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的ＰＣＲによる、ＰＣＲサイクル数と核酸の増幅効率との関係について検討した。【０１８４】
本実施例において、リバースプライマーには、本発明に係るヘアピンプライマーとしてtakei18-4、takei18-4の３’末端の塩基をＡに置換したプライマー（takei18-4A）、takei18-4の３’末端の塩基をＧに置換したプライマー（takei18-4G）、takei18-4の３’末端の塩基をＴに置換したプライマー（takei18-4T）を用い、また、比較のためM13RVを用いた。なお、図８は、takei18-4、takei18-4A、takei18-4G、takei18-4Tの塩基配列及びその構造を模式的に示した図である。【０１８５】
フォワードプライマーは、上述したいずれのリバースプライマーに対しても、全てM13M3を用いた。【０１８６】
なお、本実施例におけるＰＣＲ反応液の組成を表６に示す。【０１８７】
【表６】
2008026582.tif 000014
表６におけるＴａｑ ｍｉｘとは、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。【０１８８】
ＰＣＲは、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間で行なった。ＰＣＲに供する前に、上記ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定し、次に当該ＰＣＲ反応液をそのままＰＣＲに供し、その後、５サイクル毎に、当該ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定した。ＰＣＲは、４０サイクルまで行なった。【０１８９】
蛍光強度の検出は、実施例１と同様に行った。【０１９０】
takei18-4、takei18-4A、takei18-4G、takei18-4Tをリバースプライマーとして用いたＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を表７及び図９に示す。【０１９１】
【表７】
2008026582.tif 000015
図９において、縦軸は相対蛍光強度、横軸はＰＣＲのサイクル数を示し、丸印のシンボルはtakei18-4、四角印のシンボルはtakei18-4A、三角印のシンボルはtakei18-4G、×印のシンボルはtakei18-4Tを、それぞれ用いたＰＣＲの結果を表す。【０１９２】
表７及び図９に示すように、takei18-4を用いた場合、他のリバースプライマーを用いた場合に比べて、少ないＰＣＲサイクル数で、蛍光強度が低下することが分かる。takei18-4A、takei18-4G、takei18-4Tを用いた場合においても、ＰＣＲサイクル数が増えると蛍光強度が低下することが確認された。これは、増幅対象の核酸と非相補的な塩基を有するプライマーであっても、一旦、当該プライマーの一部が鋳型ＤＮＡにアニールして、ＤＮＡポリメラーゼがこれを認識して、ＰＣＲが進行しＤＮＡが合成されると、当該ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲが進行することとなるという、従来から指摘されているアレル特異的ＰＣＲの欠点によるものである。【０１９３】
しかし、本実施例では、takei18-4を用いたＰＣＲを２０サイクル行なった結果、相対蛍光強度が0.75まで減少したことに比べ、他のリバースプライマーを用いた場合では、相対蛍光強度が約１のままであった。これは、takei18-4及びtakei18-4の３’末端の塩基を別の塩基に置換したプライマーを用いたアレル特異的ＰＣＲでは、ＰＣＲを２０サイクル行なうことで、ＰＣＲに供する核酸の、当該３’末端に位置する塩基が変異しているか否かを判定できることを示している。【０１９４】
次に、takei18-4、takei18-4A、takei18-4G、takei18-4T、M13RVをリバースプライマーとして用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は実施例４と同様に行なった。【０１９５】
図１０にポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。図１０において、各レーンの上に記載の数値は、各リバースプライマーを用いたＰＣＲにおけるＰＣＲサイクル数を示し、「product」と付した位置にあるバンドは、当該ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物に由来するバンドであり、「primer」と付した位置にあるバンドは、ＰＣＲに用いられずに残存したプライマーに由来するバンドである。【０１９６】
図１０に示すように、takei18-4を用いた場合、他のリバースプライマーを用いた場合に比べて、少ないＰＣＲサイクル数で、核酸増幅が得られたことが示された。また、リバースプライマーにM13RVを用いたときより、takei18-4、takei18-4A、takei18-4G、takei18-4Tを用いた方が、ヘアピン構造を形成する塩基配列に相当する長さの分だけ、ＰＣＲ産物が長いことが確認できた。【０１９７】
〔実施例６〕
本実施例では、本発明に係るヘアピンプライマーを用いたアレル特異的ＰＣＲに、さらにコンペティタープライマーを用いた場合の、ＰＣＲサイクル数と核酸の増幅効率との関係について検討した。【０１９８】
本実施例において、リバースプライマーには、本発明に係るヘアピンプライマーとしてtakei18-4、takei18-4Aを用いた。【０１９９】
フォワードプライマーとして、上述したいずれのリバースプライマーに対しても、全てM13M3を用いた。【０２００】
コンペティタープライマーとして、takei18-4Aをリバースプライマーとして用いたＰＣＲにはM13RVを用い、takei18-4をリバースプライマーとして用いたＰＣＲには、M13RVの３’末端の塩基をＡに置換したプライマー（以下、「M13RVA」と表記する）を用いた。なお、当該ＰＣＲの鋳型ＤＮＡであるｐＵＣ１８において、リバースプライマーの３’末端に相当する位置の塩基はＧである。【０２０１】
本実施例におけるＰＣＲ反応液の組成を表８及び表９に示す。【０２０２】
【表８】
2008026582.tif 000016
【０２０３】
【表９】
2008026582.tif 000017
表８が、コンペティタープライマーを用いずにＰＣＲを行なったときのＰＣＲ反応液の組成を示し、表９が、コンペティタープライマーを用いてＰＣＲを行なったときのＰＣＲ反応液の組成を示す。表９に示すように、リバースプライマーとコンペティタープライマーとのモル比は、１：５となるようにした。【０２０４】
なお、表８及び表９におけるＴａｑ ｍｉｘとは、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）に付属のＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅである。【０２０５】
ＰＣＲは、まず９５℃で１分間加温した後、９５℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間のサイクルを繰り返した。ＰＣＲに供する前に、上記ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定し、次に当該ＰＣＲ反応液をそのままＰＣＲに供し、その後、５サイクル毎に、当該ＰＣＲ反応液の蛍光強度を測定した。ＰＣＲは、４０サイクルまで行なった。【０２０６】
蛍光強度の検出は、実施例１と同様に行った。【０２０７】
当該ＰＣＲにおける蛍光強度の測定結果を図１１に示す。【０２０８】
図１１において、縦軸は相対蛍光強度、横軸はＰＣＲのサイクル数を示し、四角印のシンボルはtakei18-4及びM13RVA、×印のシンボルはtakei18-4A及びM13RV、三角印のシンボルはtakei18-4、丸印のシンボルはtakei18-4Aを、それぞれ用いたＰＣＲの結果を表す。【０２０９】
図１１に示すように、takei18-4のみを用いた場合と、takei18-4及びM13RVAを用いた場合とでは、蛍光強度の減少に変化は確認されなった。これは、M13RVAは、takei18-4によるＰＣＲの進行を阻害しなかったことが示している。また、takei18-4Aのみを用いた場合に比べ、takei18-4A及びM13RVを用いた場合の方が、蛍光強度の減少が遅くなった。つまり、蛍光強度を、同程度減少させるのに必要なＰＣＲサイクル数が増えた。これは、M13RVが、takei18-4Aより優先的にＰＣＲに用いられ、takei18-4AによるＰＣＲの進行を防いだことを示す。【０２１０】
次に、takei18-4及びM13RVA、takei18-4A及びM13RVを用いたＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動は実施例４と同様に行なった。【０２１１】
図１２にポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。図１２において、各ポリアクリルアミドゲルの上に、用いたリバースプライマー及びコンペティタープライマー並びにそのモル比を示している。また、各ポリアクリルアミドゲルにおいて、最も左のレーンはＤＮＡラダー（ladder）を示し、各レーンの下に記載の数値はＰＣＲサイクル数を示す。【０２１２】
図１２に示すように、Takei18-4及びM13RVAを用いたＰＣＲでは、takei18-4による核酸増幅が得られたが、M13RVAによる核酸増幅は得られなかったことが示された。一方、takei18-4A及びM13RVを用いたＰＣＲでは、M13RVによる核酸増幅は、少ないＰＣＲサイクル数でも得られたが、takei18-4Aによる核酸増幅は、ＰＣＲサイクル数が増えてから得られたことが示された。この結果もM13RVが、takei18-4Aより優先的にＰＣＲに用いられたことを示している。【０２１３】
本発明に係るＤＮＡ断片は、以上のように、ヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡ断片であって、ヘアピン構造中にバルジ構造を有し、核酸増幅用プライマーの５’末端に結合して用いる。【０２１４】
本発明に係るＤＮＡ断片を結合させた核酸増幅用プライマーを、核酸増幅反応に供し標的の核酸が増幅されれば、当該ＤＮＡ断片が有するヘアピン構造が伸長されて解消し、その結果バルジ構造が消失する。【０２１５】
そのため、公知のバルジ構造結合分子等を用いてバルジ構造を検出することで、核酸増幅反応前後における、本発明に係るＤＮＡ断片を結合した核酸増幅用プライマーの量を比較することができ、核酸の増幅の確認を行なうことができる。従って、電気泳動や増幅されたＰＣＲ産物の染色による方法に比べて短時間で核酸の増幅を確認でき、また、電気泳動装置や得られたＰＣＲ産物の染色用試薬などが不要となる。【０２１６】
即ち、本発明を用いれば、核酸増幅反応における核酸の増幅を、迅速、簡便、安価かつ高感度に確認することができるという効果を奏する。【０２１７】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２１８】
本発明に係る核酸増幅確認方法は、遺伝子解析や遺伝子をモニタリングすることにより行われるバイオアッセイなど、ＰＣＲを用いるあらゆる産業で利用可能である。また、本発明に係るＳＮＰ解析方法は、テーラーメード医療における臨床検査産業や医薬品産業等などに利用可能である。
【図１】
2008026582.tif 000020
【図２】
2008026582.tif 000021
【図３】
2008026582.tif 000022
【図４】
2008026582.tif 000023
【図５】
2008026582.tif 000024
【図６】
2008026582.tif 000025
【図８】
2008026582.tif 000026
【図９】
2008026582.tif 000027
【図１１】
2008026582.tif 000028
【図７】
2008026582.tif 000029
【図１０】
2008026582.tif 000030
【図１２】
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【配列表】
2008026582000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月13日(2008.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘアピン構造を形成する一本鎖ＤＮＡ断片であって、
ヘアピン構造中にバルジ構造を有し、核酸増幅反応に用いるプライマーの５’末端に結合して用いるものであり、
上記バルジ構造が複数存在し、
上記バルジ構造がシトシンバルジ構造であることを特徴とするＤＮＡ断片。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
上記シトシンバルジ構造が、上記一本鎖ＤＮＡ断片中のチミン−シトシン−チミン配列におけるチミンと、アデニン−アデニン配列におけるアデニンとが、チミン−アデニン塩基対で分子内対合することにより形成されることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片。
【請求項５】
配列番号１〜５のいずれか１つに示される塩基配列からなることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片。
【請求項６】
請求項１、４及び５のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片の３’末端に、核酸増幅反応に用いるプライマーを結合していることを特徴とするヘアピンプライマー。
【請求項７】
上記核酸増幅反応は、ＰＣＲであることを特徴とする請求項６に記載のヘアピンプライマー。
【請求項８】
核酸増幅反応における核酸増幅を確認する方法であって、
請求項６に記載のヘアピンプライマーを少なくとも一方のプライマーとするプライマーセットを含む核酸増幅反応液を調製する工程と、
バルジ構造結合分子を用いて、上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応前ヘアピンプライマー測定工程と、
核酸増幅反応を行なう工程と、
バルジ構造結合分子を用いて、核酸増幅反応終了後の上記核酸増幅反応液中のヘアピンプライマーの量を測定する反応後ヘアピンプライマー測定工程とを含むことを特徴とする核酸増幅確認方法。
【請求項９】
上記バルジ構造結合分子が、ナフチリジン環を有する化合物であることを特徴とする請求項８に記載の核酸増幅確認方法。
【請求項１０】
上記ナフチリジン環を有する化合物が、下記式（１）
【化１】
2008026582.tif 000032
（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立して、第１級アミン残基、第２級アミン残基又は第３級アミン残基を示す。）
で示される２，７−ジアミノナフチリジン誘導体であることを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅確認方法。
【請求項１１】
上記２，７−ジアミノナフチリジン誘導体が、下記式（２）
【化２】
2008026582.tif 000033
で示される２，７−ジアミノ−１，８−ナフチリジンであることを特徴とする請求項１０に記載の核酸増幅確認方法。
【請求項１２】
上記反応前ヘアピンプライマー測定工程は、上記核酸増幅反応液に上記バルジ構造結合分子を添加して行ない、さらに当該核酸増幅反応液をそのまま核酸増幅反応に供することを特徴とする請求項９に記載の核酸増幅確認方法。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれか１項に記載の核酸増幅確認方法を用いることを特徴とするＳＮＰ検出方法。
【請求項１４】
上記プライマーセットに含まれるプライマーの内、いずれか一方のプライマーの３’末端の位置が、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されていることを特徴とする請求項１３に記載のＳＮＰ検出方法。
【請求項１５】
上記３’末端の位置が検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されているプライマーにヘアピンプライマーを用いることを特徴とする請求項１４に記載のＳＮＰ検出方法。
【請求項１６】
上記核酸増幅反応液には、コンペティタープライマーを含み、
当該コンペティタープライマーの３’末端は、検出対象のＳＮＰの位置になるように設計されており、かつ、３’末端には、
上記ヘアピンプライマーにより、野生型核酸の増幅を目的とする場合は、変異型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、又は、
上記ヘアピンプライマーにより、変異型核酸の増幅を目的とする場合は、野生型核酸における、当該検出対象のＳＮＰの位置の塩基に相補的な塩基、を有することを特徴とする請求項１５に記載のＳＮＰ検出方法。
【請求項１７】
核酸増幅反応における核酸の増幅を確認するための試薬キットであって、少なくとも請求項１、４及び５のいずれか１項に記載のＤＮＡ断片を含むことを特徴とする試薬キット。
【国際調査報告】
2008026582.tif 000034
2008026582.tif 000035
2008026582.tif 000036
2008026582.tif 000037