(57)【要約】バニリン、バニリン酸、プロトカテク酸等を含む植物成分由来低分子混合物から、多段階の酵素反応を介して、単一の３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンを工業的に製造する方法を提供する。  バニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（ｖａｎＡＢ遺伝子）、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーセ遺伝子（ｌｉｇＶ遺伝子）及びプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｐｃａＨＧ遺伝子）を含む組換えプラスミド；当該プラスミドが導入されてなる形質転換体；バニリン、バニリン酸、プロトカテク酸又はこれらの２以上の混合物の存在下に、当該形質転換体を培養することを特徴とする、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（ｖａｎＡＢ遺伝子）、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーセ遺伝子（ｌｉｇＶ遺伝子）及びプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｐｃａＨＧ遺伝子）を含む、組換えプラスミド。
【請求項２】
前記ｖａｎＡＢ遺伝子が、配列番号７で示されるＤＮＡ分子である、請求項１記載の組換えプラスミド。
【請求項３】
前記ｌｉｇＶ遺伝子が、配列番号８で示されるＤＮＡ分子である、請求項１又は２記載の組換えプラスミド。
【請求項４】
前記ｐｃａＨ遺伝子が、配列番号１で示されるＤＮＡ分子であり、かつ前記ｐｃａＧ遺伝子が、配列番号３で示されるＤＮＡ分子である、請求項１〜３のいずれか１項記載の組換えプラスミド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の組換えプラスミドが導入されてなる形質転換体。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の組換えプラスミドが、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＰｐＹ１１００株に導入されてなる、請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
バニリン、バニリン酸、プロトカテク酸又はこれらの２以上の混合物の存在下に、請求項５又６記載の形質転換体を培養することを特徴とする、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物芳香族成分の低分子化処理混合物に含まれるバニリン、バニリン酸、プロトカテク酸又はそれらの混合物から、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンを発酵生産するための多段反応プロセスを構成する酵素をコードした遺伝子を含む組換えプラスミド、前記組換えプラスミドを導入した形質転換体、及びそれを用いる３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンの工業的製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物主要成分であるリグニンは、芳香族高分子化合物として植物細胞壁に普遍的に含まれているバイオマス資源であるが、リグニンを主成分とする植物由来の芳香族成分は、多様な化学構造を有する成分で構成されていることや複雑な高分子構造を持つために、有効な利用技術が開発されていない。これまで知られている利用技術としては、当該芳香族成分をアルカリ分解などの化学分解で生成する低分子芳香族分解物から、香料原料であるバニリンを分離製造する技術がある。しかし、現在のところ、化学分解で生成するバニリン以外の多量の低分子芳香族物質の有効な利用方法は知られていない。そのため製紙工程で大量に生成するリグニンは有効利用されることなく、重油の代替え品として燃焼されている。
一方、本発明者らは、リグニン等の植物芳香族成分が、加水分解や酸化分解、可溶媒分解などの化学的分解法、超臨界水や超臨界有機溶媒による物理化学的分解法などにより、バニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸等を含む低分子混合物に変換され、更に、これら５種類の化合物が、機能性プラスチック原料や化学製品の原料となり得る単一の中間物質２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換されることを見出している。
また、本発明者らは、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を発酵生産するための多段反応プロセスを構成する４種類の酵素（ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ディメチラーゼ、プロトカテク酸４，５−ジオキシゲナーゼ、４−カルボキシ−２−ヒドロキシムコン酸−６−セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子を保有する形質転換細胞を用いて、バニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸又はプロトカテク酸から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を製造する方法を報告している（例えば、特開２００５−２７８５４９号公報参照）。
しかしながら、バニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸等からの発酵生産によって得られる、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸以外の中間体は多数知られているものの、それらの発酵生産法は報告されていない。
【発明の開示】
【０００３】
従って、本発明は、バニリン、バニリン酸、プロトカテク酸等を含む植物成分由来低分子混合物から、多段階の酵素反応を介して、植物成分由来成分の１つである３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンを工業的スケールで発酵生産する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、斯かる現状に鑑み鋭意検討した結果、ディメチラーゼ遺伝子（ｖａｎＡＢ遺伝子）及びベンズアルデヒドデヒドロゲナーセ遺伝子（ｌｉｇＶ遺伝子）に加えてプロトカテク酸環を開裂するプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子（ｐｃａＨＧ遺伝子）を含む組換えプラスミドを導入した形質転換体を、バニリン等の存在下で培養することにより、対応する３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸が生成することを見出し、更に、この３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を酸で処理することにより、３−カルボキシムコノラクトンが高収率かつ安価に製造できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下のものを提供する。
（１）バニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（ｖａｎＡＢ遺伝子）、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーセ遺伝子（ｌｉｇＶ遺伝子）及びプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｐｃａＨＧ遺伝子）を含む、組換えプラスミド。
（２）前記ｖａｎＡＢ遺伝子が、配列番号７で示されるＤＮＡ分子である、（１）記載の組換えプラスミド。
（３）前記ｌｉｇＶ遺伝子が、配列番号８で示されるＤＮＡ分子である、（１）又は（２）記載の組換えプラスミド。
（４）前記ｐｃａＨ遺伝子が、配列番号１で示されるＤＮＡ分子であり、かつ前記ｐｃａＧ遺伝子が、配列番号３で示されるＤＮＡ分子である、（１）〜（３）のいずれか１記載の組換えプラスミド。
（５）（１）〜（４）のいずれか１記載の組換えプラスミドが導入されてなる形質転換体。
（６）（１）〜（４）のいずれか１記載の組換えプラスミドが、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＰｐＹ１１００株に導入されてなる、（５）記載の形質転換体。
（７）バニリン、バニリン酸、プロトカテク酸又はこれらの２以上の混合物の存在下に、（５）又（６）記載の形質転換体を培養することを特徴とする、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、組換えプラスミドｐＵＬＶＨＧの作製方法を示す図である。
図２は、本発明の組換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧの作製方法を示す図である。
図３は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｐＹ１１００（ｐＫＴＶＤＨＧ）の培養による３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成過程のＯＤ増殖曲線（菌体量の増加）を示す。
図４は、バニリン、バニリン酸又はプロトカテク酸から、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸への変換反応の進行過程を示すＴＬＣである。図４において、（ａ）：バニリン、（ｂ）：バニリン酸、（ｃ）：プロトカテク酸、（ｄ）：３−カルボキシムコノラクトン、（ｅ）：バニリンからの変換（１２時間）、（ｆ）：バニリン酸からの変換（１２時間）、（ｇ）：プロトカテク酸からの変換（１２時間）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明によれば、バニリン、バニリン酸又はプロトカテク酸から、単一の３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンを高収率かつ安価に発酵生産することができる。
本発明の組換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧは、バニリン等から２−ピロン−４，６−ジカルボン酸を生産する多段階プロセスを触媒する酵素遺伝子（ｖａｎＡ、ｖａｎＢ、ｌｉｇＡ、ｌｉｇＢ及びｌｉｇＣ）を含む公知の組換えプラスミドｐＫＴＶＬＡＢＣ（特開２００５−２７８５４９号公報の図１５）のｌｉｇＡＢＣ遺伝子部位に、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｉｇＶ遺伝子）を、更にその下流にプロトカテク酸の環を開裂するプロトカテク酸３，４−ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子（ｐｃａＨＧ遺伝子）を組み込んだプラスミドである。
本発明の組換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧは、シュードモナス属細菌をはじめとした広い宿主域を有し、当該組換えプラスミドが導入された形質転換体において、ｌｉｇＶ遺伝子、ｖａｎＡＢ遺伝子及ｐｃａＨＧ遺伝子を同調的に発現して、植物成分もしくは石油成分由来又は化学的に合成されたバニリン、バニリン酸、プロトカテク酸又はこれらの混合物から３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンを生産することができる。
すなわち、ｐｃａＨＧ遺伝子の存在により、プロトカテク酸は、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸に変換されることなく、プロトカテク酸の環が開き、３−カルボキシムコノラクトンの前駆体である、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を与える。
組換えプラスミドｐＫＴＶＬＡＢＣの作製方法については特開２００５−２７８５４９号公報に詳細に記載されている。プラスミドｐＫＴＶＬＡＢＣに組み込まれるｖａｎＡＢ遺伝子は、同文献に記載の、ｉ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｐＹ１０１株由来のバニリン酸ディメチラーゼ遺伝子（同文献の配列番号１）、又はｉｉ）バニリン酸ディメチラーゼ酵素をコードするＤＮＡ分子（同文献の配列番号２及び／又は３）である。これらのｖａｎＡＢ遺伝子の内で、好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｐＹ１０１株由来のバニリン酸ディメチラーゼ遺伝子であり、本明細書において配列番号７とする。
本発明で使用するｌｉｇＶ遺伝子は、特開２００５−２７８５４９号公報に記載の、ｉ）Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＳＹＫ−６株由来の、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（同文献の配列番号２１）、ｉｉ）ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードするＤＮＡ分子（同文献の配列番号２２）、ｉｉｉ）同文献の配列番号２１に記載のＤＮＡ分子又はその相補配列からなるＤＮＡ分子と緊縮条件下でハイブリダイズし、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又はｉｖ）同文献の配列番号２２に記載のアミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ分子、から選ばれるＤＮＡ分子でよい。これらのｌｉｇＶ遺伝子の内で、好ましくは、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ  ＳＹＫ−６株由来の、ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子であり、本明細書において配列番号８とする。ｌｉｇＶ遺伝子の微生物からの分離、断片化手段は特に制限されず、同文献に記載の方法に従って行うことができる。
本発明で使用するｐｃａＨＧ遺伝子は、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８９  Ｎｏｖ；１７１（１１）：５９１５−２１やＰｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株の全ゲノムデータ（ＮＣＢＩ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＮＣ＿００２９４７）等を参照し取得することができる。
ｐｃａＨＧ遺伝子の具体的な取得手段は特に制限されないが、例えばＫＴ２４４０株からゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素等により切断し、ＤＮＡ断片とし、一方、制限酵素等を用いて、ファージ、プラスミド等のベクターＤＮＡから、ゲノムＤＮＡ断片が挿入可能な制限酵素末端を作製する。このゲノムＤＮＡ断片とベクターＤＮＡとを公知のＤＮＡリガーゼを用いて組換えベクターを作製する。この組換えベクターを好適な宿主細胞に導入し、目的の組換えベクターを保持する形質転換体を選択し、当該形質転換体より目的の組換えベクターを分離することにより取得できる。
ゲノムの抽出は常法により行うことができる。例えば、微生物の培養菌体を集菌し、例えばプロテアーゼＫにて菌体を溶菌した後、フェノール抽出による除タンパク質処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコールによるゲノムＤＮＡの沈殿、遠心分離などの方法を適宜組み合わせて行うことが好ましい。
プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とするｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＫＴ２３０ＭＣ、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等を好ましく使用できる。制限酵素による切断後に、適宜、切断末端を脱リン酸化してもよい。公知のＤＮＡリガーゼとしては、例えばＴ４ＤＮＡリガーゼが挙げられる。
Ｐｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株から取得したＰｃａＨ遺伝子の読み取り枠のヌクレオチド配列を配列番号１に、そのアミノ酸配列を配列番号２に、ＰｃａＧ遺伝子の読み取り枠のヌクレオチド配列を配列番号３に、そのアミノ酸配列を配列番号４に各々示す。
本発明の組換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧは、例えば以下のようにして作製することができる。
（１）先ず、特開２００５−２７８５４９号に記載の配列番号２１で示されるｌｉｇＶ遺伝子を、公知のリガーゼを用いて、好適なプラスミド、例えばＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＬａｃＺプロモーターの下流に存在するＬａｃＺのαフラグメントをコードする遺伝子内に存在するマルチクローニングサイトの内、制限酵素ＸｂａＩによって切断される部位に連結することにより、組換えプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−／ｌｉｇＶを作製する。
（２）次に、ｐｃａＨＧ遺伝子を、好適なプラスミドのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素ＸｂａＩによる切断部位に連結することにより、組換えプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−／ｐｃａＨＧを作製する。
（３）次いで、組み換えプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−／ｐｃａＨＧを制限酵素ＰｖｕＩＩ及びＢａｍＨＩによって切断した後に末端処理によって得られる、ＬａｃＺプロモーター領域を含むプラスミドのＤＮＡ断片と、組み換えプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−／ｌｉｇＶを制限酵素ＦｂａＩによって切断した後に末端処理によって得られるＤＮＡ断片とを、公知のリガーゼにより結合させることにより、組み換えプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−／ｐｃａＨＧ−ＬｉｇＶを作製する。さらに、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−／ｐｃａＨＧ−ＬｉｇＶをＸｂａＩで切断することによって得られるＤＮＡ断片と、公知の組み換えプラスミドｐＫＴＶＬＡＢＣを制限酵素ＸｂａＩによって切断した後に末端処理によって得られるＤＮＡ断片とを、公知のリガーゼにより結合させることにより、組み換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧを作製することができる。
３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンの高生産のための宿主として使用できる微生物は、本発明の組換えプラスミドを複製し、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトン生産に関与する酵素遺伝子を発現できるものであれば特に制限されないが、植物成分由来、化学合成又は石油成分由来のバニリン、バニリン酸、プロトカテク酸を透過し、そのいずれかから２−ピロン−４，６−ジカルボン酸への分解代謝酵素機能、及び３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンに対する分解酵素機能を消失せしめた微生物を宿主とした形質転換体を用いる必要がある。このような微生物としては、例えばシュードモナス属細菌が挙げられ、特にシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）ＰｐＹ１１００株が好ましい。
このような組換えプラスミドを用いて宿主生物を形質転換するには、プロトプラスト法、コンピテントセル法、エレクトロポレーション法等の公知の方法を用いればよい。
形質転換体の選択は、用いたプラスミドの選択マーカー、例えば形質転換体のＤＮＡ組換えにより獲得する薬剤耐性を指標にすることができる。これらの形質転換体の中から目的の組換えプラスミドを含有する形質転換体の選択は、例えば遺伝子の部分的なＤＮＡ断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により行うのが好ましい。このプローブの標識としては、例えば放射性同位元素、ジゴキシゲニン、酵素等を用いることができる。
得られた形質転換体は、炭素源、窒素源、金属塩、ミネラル、ビタミン等を含む培地を用いて適当な条件下で培養すればよい。培地のｐＨは、形質転換体が生育し得る範囲のｐＨであればよく、ｐＨ６．０〜８．０程度に調整するのが好適である。培養条件は、１５〜４０℃、好ましくは２８〜３７℃で２〜７日間振盪又は通気攪拌培養すればよい。
上記培養により得られた３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−３−ムコン酸を含む培養液を酸処理することより、３−カルボキシムコノラクトンに収率良く変換することができる。酸としてはｐＨ１〜２程度の塩酸が好ましい。
本発明の製造法によって得られる３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸及び／又は３−カルボキシムコノラクトンは、プラスチック材料、化学製品材料等として、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸とは異なった機能又は更なる高機能を発現することができ、有用なプラスチック材料の製造が期待できる。
【実施例】
【０００６】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
［実施例１］  組み換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧの作製
（１）組換えプラスミドｐＫＴＶＬＡＢＣの作製
特開２００５−２７８５４９号公報に記載の方法に従って、組換えプラスミドｐＫＴＶＬＡＢＣを作製した。
（２）組換えプラスミドｐＵＬＶの作製
特開２００５−２７８５４９号公報に記載の方法に従って、組換えプラスミドｐＵＬＶを作製した。
（３）組換えプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−／ｐｃａＨＧの作製
ＰＣＲプライマーとして、ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｐｒｉｍｅｒ：５′−ＧＧＴＧＴＣＡＧＧＣＡＡＡＧＧＴＧＴＴＡＡＧＡＣ−３′（配列番号５）及びｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ：５′−ＡＧＴＧＧＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＣＧＧＣ−３′（配列番号６）を用い、ＫＴ２４４０株ゲノムからｐｃａＨＧ増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−のＸｂａＩによって切断したＤＮＡ断片に、Ｌａｃとインフレームになるよう連結し作製した。
（４）組換えプラスミドｐＵＬＶＨＧの作製
組み換えプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ−／ｐｃａＨＧを制限酵素Ｐｖｕ  ＩＩ及びＢａｍＨＩによって切断した後に末端処理によって得られる、ＬａｃＺプロモーター領域を含むプラスミドのＤＮＡ断片と、組み換えプラスミドｐＵＬＶを制限酵素ＢａｍＨＩによって切断した後に末端処理によって得られるＤＮＡ断片とを、公知のリガーゼにより結合させることにより、組み換えプラスミドｐＵＬＶＨＧを作製した。
（５）組換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧの作製
ｐＵＬＶＨＧをＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断し末端処理をすることによって得られるＤＮＡ断片と、公知の組み換えプラスミドｐＫＴＶＬＡＢＣを制限酵素ＸｂａＩによって切断した後に末端処理によって得られるＤＮＡ断片とを、公知のリガーゼにより結合させることにより、組み換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧを作製した。
［実施例２］  バニリンからの３−カルボキシムコノラクトンの製造
（１）バニリンから３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸への変換
（１−１）実施例１で作製した組み換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧを大腸菌ＨＢ１０１株に形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地（１００ｍｌ）で、３７℃で１８時間振とう培養し、増殖した培養細胞から組み換えプラスミドｐＫＴＶＤＨＧを抽出した。
（１−２）植物成分由来、化学合成もしくは石油由来のバニリン、シリンガアルデヒド、バニリン酸、シリンガ酸、プロトカテク酸、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のいずれかから２−ピロン−４，６−ジカルボン酸への分解代謝酵素機能及び３−カルボキシムコノラクトン、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸に対する分解酵素機能を消失せしめた微生物であるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｐＹ１１００を、ＬＢ液体培地５００ｍｌで、２８℃２３時間培養し、氷中で３０分間冷却した。４℃で１００００ｒｐｍで１０分間遠心集菌し、５００ｍｌの０℃蒸留水で温和に洗浄後再び遠心集菌した。続いて２５０ｍｌの０℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。更に１２５ｍｌの０℃蒸留水で温和に洗浄後、遠心集菌した。集菌した微生物細胞を、１０％グリセロールを含む蒸留水に懸濁、０℃にて保持した。
（１−３）プラスミドｐＫＴＶＤＨＧ  ＤＮＡ約０．０５μｇを含む蒸留水４μｌを０．２ｃｍのキュベットに入れ、（１−２）の１０％グリセロールを含む蒸留水に懸濁した細胞液４０μｌを加え、２５μＦ、２５００Ｖ、１２ｍｓｅｃの条件下でエレクトロポレーションにかけた。
（１−４）上記（１−３）で得られた細胞全量を１０ｍｌのＬＢ液体培地に接種し、２８℃で６時間培養した。培養後遠心によって菌体を集め２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ平板に展開し２８℃で４８時間培養し、プラスミドｐＫＴＶＤＨＧを保持するカナマイシン耐性を示す形質転換株を得た。本菌をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｐＹ１１００（ｐＫＴＶＤＨＧ）株と名付けた。
（１−５）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｐＹ１１００（ｐＫＴＶＤＨＧ）株を、２００ｍｌのＬＢ液体培地（２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む）に接種し、２８℃で１６時間培養し前培養菌体懸濁液とした。５ＬのＬＢ液体培地及び消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍ  Ａ）３ｍｌを１０Ｌ容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いて調製し、そこに培養したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ  ＰｐＹ１１００（ｐＫＴＶＤＨＧ）株の前培養菌体懸濁液２００ｍｌを混合し、２８℃、５００ｒｐｍ／分の通気攪拌下、ＯＤ６６０  １３〜１４まで培養した（１０時間〜１２時間）。
（１−６）１０Ｌ容量のジャーファーメンター（発酵槽）を用いた培養で、ＯＤ６６０が１３〜１４に達した時点で、発酵槽から５００ｍｌの培養液を三角フラスコに抜き取り、氷上で保存した。
（１−７）ＯＤ６６０が１３〜１４に達した発酵槽の培養液に、基質であるバニリン５０ｇを含む０．１ＮのＮａＯＨ溶液（ｐＨ８．５に調整）５００ｍｌを、ペリスタポンプを用いて５〜７時間かけて添加した。反応の進行に伴う３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成により、培養液のｐＨが低下するのを防ぐため、ｐＨセンサーに連結したペリスタポンプで０．１ＮのＮａＯＨ溶液を添加して、培養液のｐＨを維持した。図３に、３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸の生成過程のＯＤ増殖曲線（菌体量の増加）（−黒三角−）を示す。図３中、−黒四角−は、酸素濃度（８１ｐｐｍ／分で送気）を、−黒菱形−は、塩酸と水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ６．５に調整したことを示す。
添加したバニリンがＴＬＣ分析で殆ど消失が確認される１６時間後、
（１−６）で調製した氷冷菌体懸濁５００ｍｌを発酵槽の培養液に加えて１２時間培養を続けた。反応の進行は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって確認した。図４の（ｅ）には、塩酸で処理後、酢酸エチルで抽出した溶液をスポットしたＴＬＣを示す。
（２）３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸から３−カルボキシムコノラクトンへの変換
反応終了後、発酵槽の培地をプラスチック容器（バケツ）に移した。培養液から遠心分離（６０００ｒｐｍ、２０℃）により菌体成分を沈殿除去し、得られた上清に塩酸を加えることによりｐＨ１．０以下に低下させ、低温で保存することにより３−カルボキシ−ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を３−カルボキシムコノラクトンに変換した。３−カルボキシムコノラクトンへの完全変換は、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ及びＧＣ−ＭＳにより確認した。３−カルボキシムコノラクトンへの完全変換を確認後、有機溶媒を用いて３−カルボキシムコノラクトンを抽出した。培養液２００ｍｌから抽出乾固した３−カルボキシムコノラクトンは約１．９ｇに達し、培養液全量５．７Ｌで換算すると、添加した基質比８８．５％程度の収率で回収された。得られた３−カルボキシムコノラクトンを活性炭処理等により更に純度を上げ、その構造をＮＭＲスペクトルによって確認した。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯｄ６）δ（ｐｐｍ）：２．６７，３．１０，５．５５，６．８１，１２．５−１３．０
１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯｄ６）δ（ｐｐｍ）：３６．５，７８．５，１２５．９，１５７．９，１６２．１，１７０．４，１７０．８
ＭＳ  ｍ／ｚ：４０２（Ｍ＋）（３−カルボキシムコノラクトンのＴＭＳ（トリメチルシリル）体として）
［実施例３］  バニリン酸からの３−カルボキシムコノラクトンの製造
基質としてバニリン酸を使用する以外は実施例２と同様にして、３−カルボキシムコノラクトンを、添加した基質比８８．５％程度の収率で回収した。
［実施例４］  プロトカテク酸からの３−カルボキシムコノラクトンの製造
基質としてプロトカテク酸を使用する以外は実施例２と同様にして、３−カルボキシムコノラクトンを、添加した基質比８８．５％程度の収率で回収した。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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