(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターから受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０５を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体、またはアミノ酸配列が配列番号：１で示されるものであるエピトープに特異的に結合する該抗体のフラグメント。
【請求項２】
キメラ化またはヒト化されている、請求項１記載の抗体、またはアミノ酸配列が配列番号：１で示されるものであるエピトープに特異的に結合する該抗体のフラグメント。
【請求項３】
請求項１または２記載の抗体またはフラグメントを含む、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害するための組成物。
【請求項４】
請求項１または２記載の抗体またはフラグメントを含む、がん治療用医薬組成物。
【請求項５】
がんを治療するための医薬の製造における請求項１または２記載の抗体またはフラグメントの使用。
【請求項６】
請求項１または２記載の抗体またはフラグメントを、対象から得た試料と接触させ、試料中の腫瘍細胞と結合させることを特徴とする、試料中の腫瘍細胞のイメージング方法または腫瘍細胞の検出方法。
【請求項７】
請求項１または２記載の抗体またはフラグメントを含む、腫瘍細胞イメージング剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞運動およびがん細胞浸潤抑制剤に関する。さらに詳細には、ＭＭＰ１により誘導される細胞運動活性および細胞浸潤活性を抑制するＰＡＲ１抗体、ならびに該ＰＡＲ１抗体を含有する医薬組成物などに関する。なお、本願は、日本国特許出願第２００８−８３５８８号に対して優先権を主張するものであり、参照により該日本国特許出願の内容を本願に一体化させる。
【背景技術】
【０００２】
細胞の運動能および浸潤能が異常に高まった結果生じる疾病の典型はがんである。がんの最たる脅威の１つとして転移が挙げられる。転移性がん細胞は細胞運動によって原発巣から血管を介して移動し、血管内に浸潤した後、血流に乗り他の組織へ転移する。ＰＡＲ１（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １：プロテアーゼ活性化受容体１）は、がん細胞の運動能および浸潤能を活性化する７回膜貫通型受容体で、多種のがん（乳がん、肺がん、膵臓がんおよび前立腺がんなど）の転移に関与するものである。特に乳がんでは、転移能を有するがん培養細胞株のほとんどでＰＡＲ１が発現しており、がん特有のプロテアーゼ（ＭＭＰ１：Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  １：マトリックスメタロプロテアーゼ１）によって、ＰＡＲ１のＮ末の細胞外領域（Ｒ４１とＳ４２の間）が切断されるとＰＡＲ１が活性化することが知られている。ＰＡＲ１活性化の刺激は、ＰＡＲ１の細胞内領域にカップルしているＧタンパク質を活性化する。その結果、細胞内Ｃａ２＋濃度が局所的に高まり、このＣａ２＋シグナルにより細胞運動能および細胞浸潤能が増強されると考えられている（非特許文献１参照）。【０００３】
ＰＡＲ１はもともと血小板を活性化させるために必要なトロンビン依存性の受容体（トロンビン受容体）として発見された。トロンビンは、ＭＭＰ１と同じＰＡＲ１の部位を認識して切断する。また、血小板におけるトロンビン受容体の活性化もがん細胞の場合と同様に、Ｃａ２＋シグナルを活性化する。現在、ＰＡＲ１のＮ末細胞ドメインに対するモノクローナル抗体がいくつか販売されており、これらの抗体は血小板の活性化を阻害するものである。しかしながら、これらの抗体とがん細胞の運動性および浸潤性との関係に関する報告はなく、ましてやがん細胞の運動性および浸潤性をＰＡＲ１抗体で阻害する、あるいはＰＡＲ１抗体をがん治療に使用するという報告はない。【０００４】
また、ＰＡＲ１のＧタンパク質結合部位に相当するペプチドを合成し、このペプチドに膜透過性を持たせたペプデュシン（Ｐｅｐｄｕｃｉｎ）という物質が作製されている（非特許文献２参照）。ＣｏｖｉｃらはペプデュシンをＧタンパク質の拮抗剤として利用することでＰＡＲ１の活性を阻害することに成功している（ペプデュシンの阻害効果は３−４μＭ）。これに対し、抗体を抗がん剤として応用する方法は、標的分子活性の阻害効果だけでなく、免疫系細胞による抗体依存性細胞障害活性の効果が期待できる。さらに抗体は、遺伝子工学により高親和性抗体を作製する技術が確立されており、また生体への安全性も保証されているなど抗体を抗がん剤として応用するメリットは非常に大きい。そのため、ＰＡＲ１抗体を抗がん剤として応用すれば、ペプデュシンより効果的な抗がん剤となりうる可能性を秘めていると考えられる。【０００５】
ＰＡＲ１の５２番目のＴｙｒから５６番目のＴｒｐをエピトープとする抗体がファージディスプレイ法で作製され、該抗体は、トロンビンがＰＡＲ１を切断する活性を阻害する。該抗体がＰＡＲ１の切断活性を阻害すること（ＰＡＲ１への結合）に関して、特に５６番目のＴｒｐがエピトープとして含まれることが重要であるとされている（特許文献１参照）。現在、がん細胞の運動性や浸潤性をＰＡＲ１抗体で阻害する報告や、阻害効果に有効なＰＡＲ１抗体のエピトープとして他のペプチド配列が見出されたとの報告はない。
【特許文献１】特開２００２−１０７８４号公報
【非特許文献１】Ｂｏｉｒｅ  Ａ，Ｃｏｖｉｃ  Ｌ，Ａｇａｒｗａｌ  Ａ，Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｓ，Ｓｈｅｒｉｆｉ  Ｓ，Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  Ａ．ＰＡＲ１  ｉｓ  ａ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  １２０：３０３−３１３（２００５）
【非特許文献２】Ｃｏｖｉｃ  Ｌ，Ｍｉｓｒａ  Ｍ，Ｂａｄａｒ  Ｊ，Ｓｉｎｇｈ  Ｃ，Ｋｕｌｉｏｐｕｌｏｓ  Ａ．Ｐｅｐｄｕｃｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：１１６１−１１６５（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞運動性および浸潤性に関する機能を効果的に阻害する薬剤を提供すること、詳細には、細胞のＰＡＲ１の活性を抑制して細胞運動性および浸潤性に関する機能を効果的に阻害する薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＰＡＲ１のＭＭＰ１による切断部位（Ａｒｇ４１とＳｅｒ４２の間）を含む領域に特異的に結合する抗体を見出した。さらにこの抗体が、ＭＭＰ１により誘導される細胞運動活性および細胞浸潤活性を阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は：
（１）ＰＡＲ１（プロテアーゼ活性化受容体１）に特異的に結合してＭＭＰ１（マトリックスメタロプロテアーゼ１）による切断を阻害し、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害する抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント；
（２）ＰＡＲ１（プロテアーゼ活性化受容体１）のＭＭＰ１（マトリックスメタロプロテアーゼ１）による切断部位（Ａｒｇ４１とＳｅｒ４２の間）を含む領域をエピトープとして特異的に結合し、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害する（１）記載の抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント；
（３）該エピトープのアミノ酸配列が配列番号：１で示されるものである（２）記載の抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント；
（４）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターから受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０５を付与されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、（３）記載の抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント；
（５）キメラ化またはヒト化されている、（１）〜（４）のいずれかに記載の抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント；
（６）モノクローナル抗体である（１）〜（５）いずれかに記載の抗体；
（７）ポリクローナル抗体である（１）〜（３）または（５）のいずれかに記載の抗体；
（８）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを含む、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害するための組成物；
（９）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを含む、がん治療用医薬組成物；
（１０）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを含む、医薬組成物の有効量を治療を必要とする対象に投与することを含むがんの治療方法；
（１１）がんを治療するための医薬の製造における（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体またはフラグメントの使用；
（１２）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを、対象から得た試料と接触させ、試料中の腫瘍細胞と結合させることを特徴とする、試料中の腫瘍細胞のイメージング方法または腫瘍の検出方法；
（１３）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体またはフラグメントを含む、腫瘍細胞イメージング剤；
（１４）（１）〜（７）のいずれかに記載の抗体または抗体フラグメントを対象に投与して、体内の腫瘍組織と本発明の抗体または抗体フラグメントとの結合を調べることを特徴とする、腫瘍の診断方法；
（１５）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド；
（１６）配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびキャリア蛋白からなる抗原性ペプチド；
（１７）（１５）記載のペプチドまたは（１６）記載の抗原性ペプチドを用いることを特徴とする、ＰＡＲ１に特異的に結合してＭＭＰ１による切断を阻害する抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメントの作製方法；
（１８）（１５）記載のペプチドまたは（１６）記載の抗原性ペプチドを用いることを特徴とする、ＰＡＲ１に特異的に結合してＭＭＰ１による切断を阻害する抗体、または該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメントの精製方法；
（１９）（１５）記載のペプチドまたは（１６）記載の抗原性ペプチドを含む、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害するための組成物
を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のＰＡＲ１に特異的に結合してＭＭＰ１による切断を阻害し、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害する抗体（以下、本明細書において「ＰＡＲ１抗体」という）は、がん細胞の運動能および浸潤能を効果的に阻害することができるので、優れた抗がん剤を得ることができる。また、本発明のＰＡＲ１抗体を用いて腫瘍の検出やイメージングを行うこともできる。さらに本発明の抗原性ペプチドを用いて、有効なＰＡＲ１抗体を取得し、あるいは精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】実施例２のＰＡＲ１の部分アミノ酸配列（配列番号：３）および合成ペプチド（１）〜（１８）のアミノ酸配列（配列番号：４〜２１）ならびに各配列に対するＮ２−１１抗体の結合を示すグラフである。なお、ペプチド溶液の濃度は、４μｇ／ｍｌである。
【図２】実施例３のＰＡＲ１の部分アミノ酸配列（配列番号：２４）および実施例３の合成ペプチドＰＡＲ１−Ｎ３−（１）〜（２７）のアミノ酸配列（配列番号：２５〜５１）ならびに各配列に対するＮ３−１抗体の結合を示すグラフである。上グラフは、４μｇ／ｍｌのペプチド溶液であり、下グラフは、４００μｇ／ｍｌのペプチド溶液である。
【図３】３μＭまたは１０μＭのマウスＩｇＧ（コントロール）の浸潤細胞数を１００％とした場合の（ａ）〜（ｃ）の各条件における浸潤細胞数の割合を示すものである。なお、（ａ）は３μＭ  Ｎ２−１１抗体（ｎ＝３０）処理、（ｂ）は１０μＭ  Ｎ２−１１抗体（ｎ＝８０）処理、および（ｃ）は１０μＭ  Ｎ３−１抗体（ｎ＝４０）処理を示す。マトリゲルチャンバーには１．５ｘ１０５細胞／ウェルをアプライした。１０μＭのマウスＩｇＧでは約２．４ｘ１０３細胞が浸潤能を示す。エラーバーは標準誤差を示す。
【図４】実施例５の（Ａ）〜（Ｄ）により得られた細胞（各々、カラム１〜４）およびカラム１〜４のデータの定量的解析結果を示すものである。エラーバーは標準誤差を示す。ただし、（カラム１）ｎ＝１６、（カラム２）ｎ＝１１、（カラム３）ｎ＝１１、（カラム４）ｎ＝１０。
【図５】表１の（ａ）〜（ｄ）の条件における２〜１３時間の間の１時間当たりの平均運動速度を示すものである。エラーバーは標準誤差を示す。
【図６】表２の（ｂ）の条件の浸潤細胞数を１００％とした場合の表２の（ａ）、（ｃ）および（ｄ）の各条件における浸潤細胞数の割合を示すものである。マトリゲルチャンバーには１．５ｘ１０５細胞／ウェルをアプライした。（ｂ）の条件では約２．２ｘ１０３細胞が浸潤能を示す。エラーバーは標準誤差を示す。
【図７】Ｎ２−１１抗体−ＱＤを用いた生体腫瘍組織のイメージング像を示す図である。（Ｂ）は（Ａ）の２個の腫瘍細胞の像を示すものである（細胞の輪郭を白で示した）。細胞中央の黒く抜けた部分は核を示す。
【図８】表３の（ａ）の条件の浸潤細胞数を１００％とした場合の表３の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各条件における浸潤細胞数の割合を示すものである。マトリゲルチャンバーには１．５ｘ１０５細胞／ウェルをアプライした。（ａ）の条件では約１．５ｘ１０３細胞が浸潤能を示す。エラーバーは標準誤差を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、１の態様において、ＰＡＲ１抗体、および該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメントを提供する。本発明のＰＡＲ１抗体は、具体的には、ＭＭＰ１による切断部位を含むＰＡＲ１の特定の領域に特異的に結合し、その結果、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害するものであってもよい。あるいは本発明のＰＡＲ１抗体は、ＰＡＲ１に特異的に結合し、立体障害を生じさせることによりＭＭＰ１による切断部位へのＭＭＰ１のアクセスを阻害するものであってもよい。本発明のＰＡＲ１抗体は、このようにしてＭＭＰ１によるＰＡＲ１の切断を阻害することにより、がん細胞の運動活性および浸潤活性を抑制するものである。それゆえ、本発明のＰＡＲ１抗体はがん治療に有用である。なお、本発明のＰＡＲ１抗体はモノクローナル抗体であってもよく、あるいはポリクローナル抗体であってもよい。【００１１】
本明細書において「該抗体と同様の性質を保持する該抗体のフラグメント」とは、エピトープのアミノ酸配列が本発明のＰＡＲ１抗体のエピトープのアミノ酸配列と同じまたは類似のものであり、かつ、本発明のＰＡＲ１抗体と同じまたは同様のがん細胞運動阻害活性および浸潤阻害活性を有するフラグメントをいう。本発明のＰＡＲ１抗体の「フラグメント」とは、本発明のＰＡＲ１抗体の一部分をいい、例えばＦａｂフラグメントなどを包含する。なお、特に明記しない限り、本明細書において「ＰＡＲ１抗体」という場合には、上述のフラグメントも包含するものとする。【００１２】
なお、本明細書において「エピトープ」とは、本発明のペプチドおよび抗原性ペプチドを構成する、あるいはこれらに含まれるアミノ酸配列であって、本発明の抗体または抗体フラグメントによって認識され結合されるアミノ酸配列をいう。詳細には、本発明に用いられるエピトープは、ＭＭＰ１による切断部位（Ａｒｇ４１とＳｅｒ４２の間）を含む、少なくとも数個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸配列であるが、これらに限定されるものではない。通常は、「エピトープ」は、約５個ないし約１０００個のアミノ酸からなる。本発明の「エピトープ」はその変異体も包含する。例えば、上記アミノ酸配列を有する「エピトープ」において１個ないし数個のアミノ酸が欠失、付加、および置換されたアミノ酸配列を有するものであってもよく、構成アミノ酸が修飾されたものであってもよい。ただし、かかる変異または修飾「エピトープ」は、本来の「エピトープ」の性質、すなわち、本発明の抗体または抗体フラグメントによって認識され結合される性質を保持しているものである。【００１３】
ＰＡＲ１の特定の領域とは、ＭＭＰ１によるＰＡＲ１の切断部位（Ａｒｇ４１とＳｅｒ４２の間）を含む領域である。好ましい特定の領域は、上記切断部位をまたぐ約１０個のアミノ酸配列であり、最も好ましいのはＰＡＲ１の３５番目から４５番目のアミノ酸配列ＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ（配列番号：１）である。本発明の好ましい抗体、または抗体フラグメントは、配列番号：１からなるアミノ酸配列を抗原認識部位（エピトープ）とするものである。【００１４】
なお、本明細書ではアミノ酸の表記は当該分野で公知の１文字法および３文字法を用いる。アミノ酸の右下の数字はＰＡＲ１のアミノ酸配列のＮ末端から数えたアミノ酸位置を示し、例えばＡｒｇ４１またはＲ４１はＰＡＲ１のアミノ酸配列のＮ末端から４１番目のアルギニンを表す。【００１５】
本発明のＰＡＲ１抗体であって、配列番号：１からなるアミノ酸配列をエピトープとするもののなかで、がん細胞の運動活性および浸潤活性を強く阻害する好ましい抗体は、ブタペスト条約の下、平成２０年（２００８年）３月１８日より、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０５の受託番号で寄託してある、ハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である（以下、本明細書において「Ｎ２−１１抗体」という）。【００１６】
実施例にて説明するように、本発明の抗体または抗体フラグメントの特徴は、アミノ酸配列ＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ（配列番号：１）を認識して特異的に結合することである。かかるアミノ酸配列は、本発明において新しく見出されたものである。上記アミノ酸配列を認識する利点は、本発明の抗体または抗体フラグメントがＭＭＰ−１によるＰＡＲ１の切断部位をまたぐ形のアミノ酸配列を認識することにより、効率よくＭＭＰ−１による分解を阻害するものであるが、認識部位の候補となる多くのペプチドの中から配列番号：１を選び出した点において本発明の意義は大きい。【００１７】
本発明のＰＡＲ１抗体は、例えば、以下のように調製することができる。動物、好ましくはヒトのＰＡＲ１のＭＭＰ１による切断部位（Ｒ４１とＳ４２の間）を含む少なくとも数個、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸配列を標的ペプチドとして用いる。好ましい標的ペプチドは配列番号：１に示されるアミノ酸配列からなる。標的ペプチドは、公知の方法にて、例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などのキャリアタンパク質に結合されてもよい。これを抗原としてマウスなどの動物を免疫し、ハイブリドーマを得ることができる。得られたハイブリドーマを培養し、培養上清を用いてがん細胞の運動活性および浸潤活性を、例えばマトリゲルアッセイなどの公知方法により検定し、強力な活性を有するハイブリドーマを選択し、それが産生する抗体を、例えばアフィニティー精製などの常法にて精製・単離することができる。得られた抗体について抗体特異性および抗体効果の解析を行うことができる。本発明のＰＡＲ１抗体は、上記方法と当該分野で公知のペプチドの化学合成法を組み合わせることによっても得ることができる。本発明のＰＡＲ１抗体の作製方法は上記方法に限定されないことはいうまでもない。【００１８】
さらに、常法により本発明のＰＡＲ１抗体をキメラ化およびヒト化することもできる。また本発明の抗体は一本鎖抗体であってもよい。本発明のＰＡＲ１抗体という場合、これらのキメラ抗体、ヒト化抗体、１本鎖抗体を包含する。【００１９】
また上述のごとく、本発明のＰＡＲ１抗体はポリクローナル抗体であってもよい。本発明のポリクローナルＰＡＲ１抗体は、当業者に公知の手法により得ることができる。その一例を実施例９に示す。【００２０】
上記アミノ酸配列とは異なるＰＡＲ１の領域を認識する抗体、例えば特開２００２−１０７８４号公報に記載された抗体や、それと同様の認識部位を有するＮ３−１抗体があるが、実施例にて説明するように、Ｎ３−１抗体には、がん細胞に対する浸潤抑制活性、運動抑制活性がない。これに対し、本発明の抗体、特に配列番号：１のアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体（好ましくは、Ｎ２−１１抗体）または抗体フラグメント（好ましくは、Ｎ２−１１抗体のフラグメント）は、がん細胞に対する浸潤抑制活性、運動抑制活性が高い。したがって、本発明の抗体または抗体フラグメントは、がん治療用として優れた効果を発揮する。【００２１】
それゆえ、本発明は、もう１つの態様において、ＰＡＲ１抗体、好ましくはＮ２−１１抗体を含む、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害するための組成物を提供する。本発明の組成物はインビトロにおいても、インビボにおいても効果的に作用することができる。特に、キメラ化またはヒト化された本発明のＰＡＲ１抗体を含む組成物は、ヒトのがん細胞の運動活性および浸潤活性を効果的に阻害することができる。【００２２】
本発明は、さらにもう１つの態様において、ＰＡＲ１抗体、好ましくはＮ２−１１抗体を含む、がん治療用医薬組成物を提供する。ヒトに用いる場合には、本発明の医薬組成物中のＰＡＲ１抗体はキメラ化されていることが好ましく、ヒト化されていることがさらに好ましい。本発明の医薬組成物は、任意の剤形に調製することができる。剤形は、対象のがんの部位、がんの種類、大きさ、ＰＡＲ１抗体の特性、対象の身体状況、健康状態などに応じて適宜選択することができ、例えば、注射剤、輸液剤などの液剤、経皮パッチ、軟膏、クリーム、粉末などの半固形〜固形剤などにすることができる。本発明の医薬組成物は、任意の投与経路にて対象に投与することができる。投与経路は、対象のがんの部位、がんの種類、大きさ、ＰＡＲ１抗体の特性、対象の身体状況、健康状態などに応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の医薬組成物を皮内注射、皮下注射、筋肉注射、静脈注射などの注射により、輸液により、あるいは経皮パッチ、軟膏、クリームなどによる局所適用により、対象に投与することができる。本発明の医薬組成物によるＰＡＲ１抗体の投与量は、１回あたり通常５μｇ／ｋｇ〜１２５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは５０μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇであり、１日１回〜数回投与することができる。投与は毎日、数日ごと、１週間〜数週間ごと、１ヶ月〜数ヶ月ごとにすることができる。本発明の医薬組成物中のＰＡＲ１抗体は１種類であってもよく、２種類以上であってもよい。好ましくは、本発明の医薬組成物はＮ２−１１抗体またはそのフラグメントを含む。また本発明の医薬組成物はＰＡＲ１抗体以外の他の有効成分、例えば公知の抗がん剤やその他の薬剤を含んでいてもよい。【００２３】
本発明は、別の態様において、本発明のＰＡＲ１抗体またはフラグメントを含む、医薬組成物の有効量を治療を必要とする対象に投与することを含む、がんの治療方法を提供する。さらに本発明は、がんを治療するための医薬の製造における本発明のＰＡＲ１抗体またはフラグメントの使用も提供する。上記方法および使用に好ましいＰＡＲ抗体はＮ２−１１抗体である。対象は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。【００２４】
腫瘍細胞は、ＰＡＲ１蛋白を発現している。したがって、本発明は、さらなる態様において、これに結合する本発明の抗体または抗体フラグメントを、対象から得た試料と接触させ、試料中の腫瘍細胞と結合させることを特徴とする、試料中の腫瘍細胞のイメージング方法または腫瘍の検出方法を提供する。さらに本発明は、本発明の抗体または抗体フラグメントを含む、腫瘍細胞イメージング剤も提供する。【００２５】
さらに本発明は、本発明の抗体または抗体フラグメントを対象に投与して、体内の腫瘍組織と本発明の抗体または抗体フラグメントとの結合を調べることを特徴とする、腫瘍の診断方法も提供する。【００２６】
これらの方法およびイメージング剤において、本発明の抗体または抗体フラグメントには、検出可能な標識やタグを付すことが好ましい。検出可能な標識やタグとしては、蛍光物質、発光物質、セイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素、ビオチンまたはアビジンなどの特異的結合物質、あるいはＰＥＴやＳＰＥＣＴなどに用いる陽電子放出核種などが例示されるが、これらに限定されない。また、これらの方法およびイメージング剤において、好ましい抗体はＮ２−１１抗体であり、好ましい抗体フラグメントはＮ２−１１抗体のフラグメントである。【００２７】
本発明は、さらなる態様において、配列番号：１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドおよびキャリア蛋白からなる抗原性ペプチドを提供する。上述のごとく、かかる抗原性ペプチドを用いて本発明の抗体または抗体フラグメントを取得または製造することができる。【００２８】
本明細書において「キャリア蛋白」とは、分子量の小さいペプチドに結合する、より大きなタンパク質であって、抗原として認識されないものをいう。キャリア蛋白の例として、限定するものではないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などが挙げられる。キャリア蛋白は、ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、あるいはペプチド中の適当なアミノ酸に、公知の方法にて結合させることができる。【００２９】
本発明は、さらなる態様において、上記エピトープペプチドまたは抗原性ペプチドと本発明の抗体または抗体フラグメントとの特異的結合を利用して、本発明の抗体または抗体フラグメント作製する方法、ならびに精製する方法を提供する。好ましくは、かかる方法により得られ、あるいは精製される抗体または抗体フラグメントは、ＰＡＲ１に特異的に結合してＭＭＰ１による切断を阻害する抗体または抗体フラグメントである。上記エピトープペプチドまたは抗原性ペプチドを不溶性担体に結合させておいて、本発明の抗体または抗体フラグメントを含む試料を該担体と接触させて特異的結合を生じさせ、適当な溶離条件を適用することにより、本発明の抗体または抗体フラグメントを精製することができる。【００３０】
上記エピトープペプチドまたは抗原性ペプチド、好ましくは配列番号：１に示すアミノ酸配列からなるペプチドを、癌の治療を必要とするあるいは癌の予防を必要とする対象に投与して、本発明の抗体または抗体フラグメントを対象において生成させることにより、対象のがん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害して、癌を治療または予防することができる。したがって、本発明は、さらなる態様において、上記エピトープペプチドまたは抗原性ペプチドを含む、がん細胞の運動活性および浸潤活性を阻害するための組成物も提供する。【００３１】
本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明するが、これらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３２】
実施例１：ＰＡＲ１抗体の作製
（Ａ）ＰＡＲ１の切断部位（Ｒ４１とＳ４２の間）をまたぐような配列（Ｎ３５ＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ４５）（配列番号：１）、および（Ｂ）ＰＡＲ１の切断部位（Ｒ４１とＳ４２の間）よりも内側に位置する配列（４５ＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫＫＮＥＳ６４）（配列番号：２２）を標的として選択し、（Ａ）配列のＮ末および（Ｂ）配列のＣ末にＣを付加したＣ−Ｎ３５ＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ４５（配列番号：２）ペプチドおよびＬ４５ＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫＫＮＥＳ６４−Ｃ（配列番号：２３）ペプチドを合成した。ＣのＳＨ基を用いて合成ペプチドをＫＬＨと架橋し、これを抗原としてマウスを免疫し、１１種のハイブリドーマを得た。これらのハイブリドーマを、それぞれＰＡＲ１  Ｎ２−１〜ＰＡＲ１  Ｎ２−１１およびＰＡＲ１  Ｎ３−１〜ＰＡＲ１  Ｎ３−１１と命名し、そのうち、ハイブリドーマの培養上清を用いたマトリゲルアッセイから効果が最も強力であったＰＡＲ１  Ｎ２−１１および配列番号：２３に非常に強い結合活性を示したＰＡＲ１  Ｎ３−１を選択し、抗体特異性および抗体効果の解析を行った。ＰＡＲ１  Ｎ２−１１により産生される抗体をＮ２−１１、ＰＡＲ１  Ｎ３−１により産生される抗体をＮ３−１と命名した。このうち、Ｎ２−１１抗体を産生するハイブリドーマは、ＰＡＲ１  Ｎ２−１１と命名し、ブタペスト条約の下、平成２０年（２００８年）３月１８日より、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６の、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１１１０５の受託番号で寄託してある。Ｎ２−１１抗体およびＮ３−１抗体のクラス決定を行った結果、ＩｇＧ１のクラスに属することが判明した。
【実施例２】
【００３３】
実施例２：Ｎ２−１１抗体の抗原認識部位の決定
本発明のＮ２−１１抗体の抗原認識部位を以下のように決定した。ＰＡＲ１の部分アミノ酸配列Ａ２６ＲＲＰＥＳＫＡＴＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰ５４（配列番号：３）に基づき１２個のアミノ酸のペプチドを１８種類作製し（以下、本明細書においてペプチド（１）〜（１８）という）、ＥＬＩＳＡ法によるエピトープマッピングを行った。ペプチド（１）〜（１８）のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
ペプチド（１）ＡＲＲＰＥＳＫＡＴＮＡＴ（配列番号：４）
ペプチド（２）ＲＲＰＥＳＫＡＴＮＡＴＬ（配列番号：５）
ペプチド（３）ＲＰＥＳＫＡＴＮＡＴＬＤ（配列番号：６）
ペプチド（４）ＰＥＳＫＡＴＮＡＴＬＤＰ（配列番号：７）
ペプチド（５）ＥＳＫＡＴＮＡＴＬＤＰＲ（配列番号：８）
ペプチド（６）ＳＫＡＴＮＡＴＬＤＰＲＳ（配列番号：９）
ペプチド（７）ＫＡＴＮＡＴＬＤＰＲＳＦ（配列番号：１０）
ペプチド（８）ＡＴＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬ（配列番号：１１）
ペプチド（９）ＴＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ（配列番号：１２）
ペプチド（１０）ＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲ（配列番号：１３）
ペプチド（１１）ＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮ（配列番号：１４）
ペプチド（１２）ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰ（配列番号：１５）
ペプチド（１３）ＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮ（配列番号：１６）
ペプチド（１４）ＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤ（配列番号：１７）
ペプチド（１５）ＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫ（配列番号：１８）
ペプチド（１６）ＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹ（配列番号：１９）
ペプチド（１７）ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ（配列番号：２０）
ペプチド（１８）ＦＬＬＲＮＰＮＤＬＹＥＰ（配列番号：２１）【００３４】
ＥＬＩＳＡ用の９６ウェルに１ウェル当たり４μｇ／ｍｌの溶液を７５μｌ添加し、４℃で１２時間静置し、ペプチド（１）〜（１８）を貼り付けた。室温で１時間１２５μｌのＰＢＳ含有１％ＢＳＡにてブロッキングした後、室温で１時間、一次抗体にハイブリドーマ培養上清の原液１００μｌを、次いで、二次抗体に５０００倍希釈のＨＲＰ結合抗マウス抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ社）１００μｌを用いて、ＯＰＤを基質としたＨＲＰによる発色を行った。発色結果は、プレートリーダーにて４９２ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．４９２ｎｍ）を検出し、Ｎ２−１１抗体のペプチド（１）〜（１８）に対する反応性を検討した。コントロールには、ハイブリドーマの培養に使用した培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭ１６４０（ＧＩＢＣＯ社））１００μｌを用いた。コントロール実験でのＯ．Ｄ．４９２ｎｍ値（約０．０５）をＮ２−１１抗体の発色値から引いた値を解析した。その結果、Ｎ２−１１抗体の抗原認識部位がＰＡＲ１の３５番目から４５番目のアミノ酸配列ＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ（配列番号：１）であることが判明した（図１参照）。【００３５】
しかしながら、ペプチド（９）および（１０）は同一のＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ配列を含むにもかかわらず、Ｎ２−１１抗体はペプチド（９）には反応を示したが、ペプチド（１０）には反応を示さなかった（Ｏ．Ｄ．４９２値  ペプチド（９）：約０．１２、ペプチド（１０）：約０、図１参照）。これは、抗原ペプチドとしてＣＮ３５ＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ４５配列を用いているので、ＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬのＮ末の露出したアミノ基がＮ２−１１抗体と反応を示さなかったためであると考えられる。【００３６】
培養上清中のハイブリドーマ由来の抗体濃度は０．１−１０μｇ／ｍｌが一般的であるが、ハイブリドーマの培養上清中には、培地中の血清（ＦＢＳ）由来のウシＩｇＧが１０％ＦＢＳ中に２ｍｇ／ｍｌ含まれていた。そのため、ＳＣＩＤマウスの腹水を用いた方法で抗体の精製を行った。「ＳＣＩＤマウス」とは、免疫不全マウスのことであり、機能的なＴ細胞およびＢ細胞を欠失しているため体内にＩｇＧがほとんど存在していないマウスをいう。したがって、ＳＣＩＤマウスの腹水から抗体の精製を行うことにより、高純度のＮ２−１１抗体を精製することができる。本発明の抗体を以下のように精製した。８−１０週齢のＳＣＩＤマウスの腹腔内にプリスタン（ＳＩＧＭＡ社）を５００μｌ注入し炎症を起こさせ、腹腔内をハイブリドーマの増殖に適した環境にした。プリスタンを注入して２週間後に、１０７個のＮ２−１１抗体産生ハイブリドーマをマウス腹腔内に注入した。細胞注入後、１−３週間の間に腹水を採取し、遠心分離（２００００Ｘｇ）した上清を腹水溶液として冷凍保存した。該腹水溶液から、プロテインＧセファロースＦＦ（ＧＥヘルスケア社）を用いて抗体の精製を行った。精製された抗体を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、腹水溶液中に含まれるトランスフェリンおよびアルブミンがＮ２−１１抗体中に混入していないことを確認した。抗体の収量は腹水溶液１ｍｌ当たり約２００μｇであった。
【実施例３】
【００３７】
実施例３：Ｎ３−１抗体の抗原認識部位の決定
本発明のＮ３−１抗体の抗原認識部位を以下のように決定した。ＰＡＲ１の部分アミノ酸配列Ａ３６ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＷＥＤＥＥＫＮＥＳＧＬＴＥＹＲＬＶＳ７３（配列番号：２４）に基づき１２個のアミノ酸のペプチドを２７種類作製し（以下、本明細書においてＰＡＲ１−Ｎ３−（１）〜（２７）という）、ＥＬＩＳＡ法によるエピトープマッピングを行った。ＰＡＲ１−Ｎ３−（１）〜（２７）のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１）ＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮ（配列番号：２５）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（２）ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰ（配列番号：２６）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（３）ＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮ（配列番号：２７）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（４）ＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤ（配列番号：２８）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（５）ＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫ（配列番号：２９）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（６）ＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹ（配列番号：３０）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（７）ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ（配列番号：３１）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（８）ＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰ（配列番号：３２）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（９）ＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ（配列番号：３３）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１０）ＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷ（配列番号：３４）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１１）ＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号：３５）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１２）ＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ（配列番号：３６）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１３）ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ（配列番号：３７）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１４）ＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥ（配列番号：３８）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１５）ＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ（配列番号：３９）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１６）ＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫＮ（配列番号：４０）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１７）ＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫＮＥ（配列番号：４１）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１８）ＥＰＦＷＥＤＥＥＫＮＥＳ（配列番号：４２）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（１９）ＰＦＷＥＤＥＥＫＮＥＳＧ（配列番号：４３）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（２０）ＦＷＥＤＥＥＫＮＥＳＧＬ（配列番号：４４）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（２１）ＷＥＤＥＥＫＮＥＳＧＬＴ（配列番号：４５）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（２２）ＥＤＥＥＫＮＥＳＧＬＴＥ（配列番号：４６）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（２３）ＤＥＥＫＮＥＳＧＬＴＥＹ（配列番号：４７）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（２４）ＥＥＫＮＥＳＧＬＴＥＹＲ（配列番号：４８）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（２５）ＥＫＮＥＳＧＬＴＥＹＲＬ（配列番号：４９）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（２６）ＫＮＥＳＧＬＴＥＹＲＬＶ（配列番号：５０）
ＰＡＲ１−Ｎ３−（２７）ＮＥＳＧＬＴＥＹＲＬＶＳ（配列番号：５１）【００３８】
１ウェル当たり４μｇ／ｍｌおよび４００μｇ／ｍｌの２種類の溶液を用いることを除き、実施例２と同様の方法を用いて、Ｎ３−１抗体のＰＡＲ１−Ｎ３−（１）〜（２７）に対する反応性を検討した。４μｇ／ｍｌのペプチド溶液ではＳ／Ｎ比が多少悪かったため、Ｓ／Ｎ比を上げるために４００μｇ／ｍｌのペプチド溶液を用いた。その結果、Ｎ３−１抗体の抗原認識部位がＰＡＲ１の４６番目から５７番目のアミノ酸配列ＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥ（配列番号：３５）であることが判明した（図２参照）。なお、ＯＤ値はＯＰＤを基質とした反応時間によって変化するものであるため、抗原に対する結合の相対性は示すが、抗体の実質的な結合力を示す指標ではない。【００３９】
実施例２と同様の方法を用いて、Ｎ３−１抗体を精製した。精製された抗体を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、腹水溶液中に含まれるトランスフェリンおよびアルブミンがＮ３−１抗体中に混入していないことを確認した。抗体の収量は腹水溶液１ｍｌ当たり約４００μｇであった。
【実施例４】
【００４０】
実施例４：Ｎ２−１１抗体およびＮ３−１抗体の比較
Ｎ２−１１抗体およびＮ３−１抗体が、トロンビンに依存する細胞浸潤活性をどの程度阻害できるのかを調べるために、マトリゲルアッセイを用いて、抗体の浸潤阻害効果を試験した。第１に、アッセイを用いる細胞を調製するため、低浸潤性乳がん培養細胞ＫＰＬ−４（ＰＡＲ１低発現株）にＰＡＲ１−ＧＦＰを安定発現させた細胞株（以下、本明細書においてＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４という）を作製した。１．５ｘ１０５細胞のＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞をトリプシン処理により浮遊させ、ＰＢＳで洗浄した。３および１０μＭのＮ２−１１抗体または１０μＭのＮ３−１抗体またはコントロール抗体である３および１０μＭのマウスＩｇＧを添加し、３７℃で９０分間保温した。次いで、セルカルチャーインサート(ＢＤ  バイオサイエンス社)に細胞を蒔き、３７℃で４５時間培養した。インサートを浸す誘引物質溶液には、１０％ＦＢＳ含有２．５Ｕ／ｍｌトロンビン(ＷＡＫＯ社)溶液を用い、４５時間後にメンブレンフィルターの底面に移動してきた浸潤細胞をＨＥ染色し、浸潤細胞数をカウントした。浸潤細胞数のカウントは、フィルター内のランダムな地点を０．６６ｍｍＸ０．６６ｍｍの大きさでスキャンし、その平均細胞数を算出した。次いで、マウスＩｇＧで処理した場合の浸潤細胞数を１００％としたときのＮ２−１１抗体およびＮ３−１抗体処理時の浸潤細胞数の割合を図３に示す。なお、１０μＭのマウスＩｇＧで処理した場合の浸潤細胞数は、約２．４ｘ１０３細胞であった。図３において、（ａ）は３μＭ  Ｎ２−１１抗体（ｎ＝３０）処理時、（ｂ）は１０μＭ  Ｎ２−１１抗体（ｎ＝８０）処理時、および（ｃ）は１０μＭ  Ｎ３−１抗体（ｎ＝４０）処理時の細胞数の割合を示す。【００４１】
結果
１０μＭの抗体濃度において、Ｎ２−１１抗体は４０％の阻害効果を有することが判明したが、Ｎ３−１抗体にはこのような活性はみられなかった（図３（ｂ）および（ｃ）参照）。このため、ＰＡＲ１の５２番目のＴｙｒから５６番目のＴｒｐを含む配列をエピトープとする抗体は、細胞浸潤能を阻害しないことが分かる。【００４２】
したがって、細胞浸潤阻害効果を有する抗体医薬品を作製するためには、Ｎ３−１抗体よりＮ２−１１抗体が有効であると考えられるため、以後、Ｎ２−１１抗体の効果について検討を行った。
【実施例５】
【００４３】
実施例５：抗体の特性の検討
Ｎ２−１１抗体が細胞表面のＰＡＲ１を特異的に認識できるかを評価するため、ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４を作製し、次いで、ＫＰＬ−４およびＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４に対するＮ２−１１抗体の特性について以下の（Ａ）〜（Ｄ）により検討した：
（Ａ）ＫＰＬ−４細胞をトリプシン処理により浮遊させ、ＦＢＳ不含Ｌ−１５溶液（ＧＩＢＣＯ社）で洗浄した。２μＭ  マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社）含有Ｌ−１５培地を添加し、３７℃で１５分間保温し、ブロッキングを行い、さらに４０ｎＭのＮ２−１１抗体−ＱＤプローブを添加し、３７℃で３０分間保温した。次いで、Ｎ２−１１抗体−ＱＤプローブをＬ−１５培地で洗浄し、０．５％ＦＢＳ含有Ｌ−１５培地を添加し、ガラスボトムディシュに細胞を蒔き、細胞の観察および解析を行った。なお、Ｎ２−１１抗体−ＱＤプローブは、Ｎ２−１１抗体と高輝度の蛍光性ナノ粒子（ＱＤ７０５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社））を結合させたプローブである。
（Ｂ）ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４をトリプシン処理により浮遊させ、ＦＢＳ不含Ｌ−１５溶液（ＧＩＢＣＯ社）で洗浄した。２μＭ  マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社）含有Ｌ−１５培地を添加し、３７℃で１５分間保温し、ブロッキングを行い、さらに４０ｎＭのＮ２−１１抗体−ＱＤプローブを添加し、３７℃で３０分間保温した。次いで、Ｎ２−１１抗体−ＱＤプローブをＬ−１５培地で洗浄し、０．５％ＦＢＳ含有Ｌ−１５培地を添加し、ガラスボトムディシュに細胞を蒔き、細胞の観察および解析を行った。
（Ｃ）ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４をトリプシン処理により浮遊させ、ＦＢＳ不含Ｌ−１５溶液（ＧＩＢＣＯ社）で洗浄した。５０ｎＭ  ＭＭＰ１（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、３７℃で６０分間保温した。２μＭ  マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社）含有Ｌ−１５培地を添加し、３７℃で１５分間保温し、ブロッキングを行い、さらに４０ｎＭのＮ２−１１抗体−ＱＤプローブを添加し、３７℃で３０分間保温した。次いで、Ｎ２−１１抗体−ＱＤプローブをＬ−１５培地で洗浄し、０．５％ＦＢＳ含有Ｌ−１５培地を添加し、ガラスボトムディシュに細胞を蒔き、細胞の観察および解析を行った。
（Ｄ）ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４をトリプシン処理により浮遊させ、ＦＢＳ不含Ｌ−１５溶液（ＧＩＢＣＯ社）で洗浄した。２μＭ  マウスＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社）含有Ｌ−１５を添加し、３７℃で１５分間保温し、ブロッキングを行い、さらに４０ｎＭのＮ２−１１抗体−ＱＤプローブを添加し、３７℃で３０分間保温した。次いで、Ｎ２−１１抗体−ＱＤプローブをＬ−１５培地で洗浄し、５０ｎＭ  ＭＭＰ１を添加し、３７℃で６０分間保温した。さらに、Ｌ−１５培地で洗浄し、０．５％ＦＢＳ含有Ｌ−１５培地を添加し、ガラスボトムディシュに細胞を蒔き、細胞の観察および解析を行った。【００４４】
さらに、Ｎ２−１１抗体−ＱＤプローブを用いて抗体の結合性の定量的解析を行った。蛍光性ナノ粒子は粒子数と蛍光強度が比例関係にある。露光時間１００ｍｓでの蛍光画像をＳＯＬＩＳソフト（Ａｎｄｏｒ社）のコントラスト範囲１１５０−１６００でＴＩＦＦフォーマット画像に変換した。次いで、ＩｍａｇｅＪソフトで細胞１個の全グレー値（１−２５６階調の濃淡値）からバックグラウンドのグレー値を差し引き、Ｎ２−１１抗体−ＱＤ蛍光に由来する１細胞当たりの全グレー値を算出した。【００４５】
結果
上記（Ａ）〜（Ｄ）により得られた細胞およびそのデータに基づく定量的解析結果を図４に示す。なお、（Ａ）〜（Ｄ）の結果は図中のカラム１〜４にそれぞれ対応している。細胞を観察した結果、ＫＰＬ−４細胞ではＰＡＲ１の発現量が少ないことから、Ｎ２−１１抗体−ＱＤが僅かしか反応していなかったこと（カラム１）、ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４ではＮ２−１１抗体−ＱＤによる標識により、「細胞膜上のＰＡＲ１」および「細胞内に取り込まれたＰＡＲ１」がドット状に強く標識されていたこと（カラム２）、ＭＭＰ１で細胞膜上のＰＡＲ１が切断されているため、Ｎ２−１１抗体がＰＡＲ１を認識できず、Ｎ２−１１抗体−ＱＤで標識されなかったこと（カラム３）、ならびにＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４をＮ２−１１抗体−ＱＤで標識した後にＭＭＰ１で処理した場合には、Ｎ２−１１抗体がカラム２と同程度細胞に結合していたこと（カラム４）が示された。また、定量的解析の右パネルにより、ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４に結合するＮ２−１１抗体の量はＫＰＬ−４に結合する量の約６倍であること、ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４を５０ｎＭ  ＭＭＰ１で処理した場合には、Ｎ２−１１抗体の結合量はＫＰＬ−４と同レベルになること、ならびにＮ２−１１抗体で標識後にＭＭＰ１処理した場合には、Ｎ２−１１抗体がＭＭＰ１未処理の場合とほぼ同程度結合していることが示された。【００４６】
したがって、Ｎ２−１１抗体は細胞膜上のＰＡＲ１の未切断部位配列を認識し特異的に結合し、ＭＭＰ１によるＰＡＲ１の切断を阻害することを示している。
【実施例６】
【００４７】
実施例６：抗体の細胞運動能への効果の検討
ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞は、ＭＭＰ１処理によりＰＡＲ１が活性化し、細胞浸潤能が促進される。そこで、ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４の細胞運動の経時的コマ撮り撮影（Ｔｉｍｅ−ｌａｐｓ）観察およびその運動軌跡解析を行い、Ｎ２−１１抗体がＭＭＰ１依存的な細胞運動能を阻害するかを検討した。７ｘ１０４細胞のＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞をトリプシン処理により浮遊させ、ＰＢＳで洗浄した。１０μＭのＮ２−１１抗体またはコントロール抗体であるマウスＩｇＧを添加し、３７℃で６０分間保温した。次いで、２．５ｎＭ  ＭＭＰ１を含む１０％ＦＢＳ含有Ｌ−１５培地を添加し、ガラスボトムデッシュに細胞を蒔いた。細胞運動の経時的コマ撮り撮影画像を２分ごとに取得し、細胞運動の軌跡を追跡した。経時的コマ撮り撮影観察開始後、２−１３時間の間の１時間当たりの平均運動速度を算出した。細胞運動の軌跡では、核の重心位置を指標とし、データに偏りが出ないように追跡可能な全ての細胞を解析した。また、コントロール実験として、ＫＰＬ−４細胞およびＭＭＰ１未処理のＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞についても同様に解析を行った。【００４８】
結果
Ｎ２−１１抗体の算出された平均運動速度を図５に示し、その算出値を表１に示す。
【表１】
0005483023.tif 000002
表１より、ＫＰＬ−４が最も運動速度が遅く、１０μＭ  マウスＩｇＧで処理したＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞では、ＭＭＰ１非存在下でも運動速度の上昇が認められた。さらに、マウスＩｇＧで処理をしたＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞を２．５ｎＭ  ＭＭＰ１存在下の条件にすると、ＭＭＰ１非存在下に比べ、運動速度の大きな上昇が認められ、１０μＭ  Ｎ２−１１抗体で処理をすると、ＭＭＰ１存在下における運動速度の上昇の抑制が認められた。マウスＩｇＧで処理したＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞のＭＭＰ１による運動速度の上昇度（７．０μｍ／ｈ）を１００％とする場合における、Ｎ２−１１抗体存在下でのＭＭＰ１による運動速度の上昇度（３．８μｍ／ｈ）は５４％であった。【００４９】
したがって、ＰＡＲ１発現細胞はＭＭＰ１処理することにより運動速度が促進されるが、Ｎ２−１１抗体で処理することによりＭＭＰ１によるＰＡＲ１切断効果が阻害され、運動能の活性化が約５０％阻害されることを示している。
【実施例７】
【００５０】
実施例７：抗体の細胞浸潤能への効果の検討
ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞は、ＭＭＰ１処理によりＰＡＲ１が活性化し、細胞浸潤能が促進される。そこで、Ｎ２−１１抗体存在下でＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４のマトリゲルアッセイを行い、Ｎ２−１１抗体がＭＭＰ１依存的な細胞浸潤能を阻害するかを検討した。１．５ｘ１０５細胞のＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞をトリプシン処理により浮遊させ、ＰＢＳで洗浄した。３および１０μＭのＮ２−１１抗体またはコントロール抗体であるマウスＩｇＧを添加し、３７℃で９０分間保温した。次いで、セルカルチャーインサートに細胞を蒔き、３７℃で４５時間培養した。インサートを浸す誘引物質溶液には、１０％ＦＢＳ含有２．５ｎＭ  ＭＭＰ１溶液を用い、４５時間後にメンブレンフィルターの底面に移動してきた浸潤細胞をＨＥ染色し、浸潤細胞数をカウントした。浸潤細胞数のカウントは、フィルター内のランダムな地点を０．６６ｍｍＸ０．６６ｍｍの大きさでスキャンし、その平均細胞数を算出した。次いで、マウスＩｇＧで処理した場合の浸潤細胞数を１００％としたときのＮ２−１１抗体処理時の浸潤細胞数の割合を求めた。【００５１】
結果
条件（ｂ）の平均浸潤細胞数を１００％とした場合におけるＮ２−１１抗体処理時の浸潤細胞数の割合を図６に示し、その算出値を以下の表２に示す。
【表２】
0005483023.tif 000003
【００５２】
したがって、ＰＡＲ１発現細胞はＭＭＰ１処理することにより浸潤能が促進されるが、Ｎ２−１１抗体で処理することによりＭＭＰ１によるＰＡＲ１切断効果が用量依存的に阻害され、浸潤能の活性化が約６０％阻害されることを示している。【００５３】
上記実施例５〜７の結果より、Ｎ２−１１抗体はＰＡＲ１の切断部位を認識し特異的に結合し、ＭＭＰ１によるＰＡＲ１の切断活性を阻害することで、ＰＡＲ１発現細胞のＭＭＰ１依存的な細胞運動活性および細胞浸潤活性を阻害することを示している。すなわち、Ｎ２−１１抗体ががん治療において有効な抗体医薬品となりうることを示している。
【実施例８】
【００５４】
実施例８：抗体の腫瘍細胞に対する特異性の検討
実施例５と同様のＮ２−１１抗体−ＱＤをプローブに用いて、独自のインビボイメージング法により腫瘍組織の生体染色を行い、上記により調製された抗体が腫瘍組織のＰＡＲ１に対し特異的であるかを検討した。ＳＣＩＤマウスに１ｘ１０６細胞のＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞を皮下注入した。次いで、４週間飼育しＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４細胞由来の腫瘍を作製した。腫瘍を露出させて観察用の小窓を作製した後、Ｎ２−１１抗体−ＱＤプローブを血中濃度１０ｎＭで尾静脈より注入した。次いで、独自のイメージング装置を用いて、生きたマウスの腫瘍組織を観察した。【００５５】
結果
Ｎ２−１１抗体−ＱＤが腫瘍細胞に特異的に反応している像を図７に示す。図７より、マウス生体内において、Ｎ２−１１抗体が腫瘍細胞に対し特異的であることが示された。したがって、濃度や結合能（結合定数）を高めることにより、Ｎ２−１１抗体が生きた腫瘍細胞のＰＡＲ１活性を阻害する可能性を示唆している。
【実施例９】
【００５６】
実施例９：ポリクローナルＰＡＲ１抗体の調製と腫瘍細胞に対する活性の検討
ＰＡＲ１の切断部位（Ｒ４１とＳ４２の間）をまたぐような配列（Ｎ３５ＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ４５）（配列番号：１）を標的として選択し、この配列のＮ末にＣを付加したＣＮ３５ＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬ４５（配列番号：２）ペプチドを合成した。ＣのＳＨ基を利用して合成ペプチドをＫＬＨと架橋し、これを抗原としてウサギを免役し、ＰＡＲ１に対する抗血清を調製した。次いで、抗血清のアフィニティー精製を行うため、抗原に用いたペプチドとＳｕｌｆｏＬｉｎｋカップリングゲル（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いてカラムを作製した。カラムに抗血清をアプライした後、カラム体積の５倍以上のＰＢＳ（ｐＨ７．２）でカラムの洗浄を行った。その後、３Ｍ  ＭｇＣｌ２でＰＡＲ１ポリクローナル抗体の溶出を行った。溶出後はＰＢＳにて透析を行い、精製ＰＡＲ１抗体とした（１０ｍｌの抗血清から約０．４ｍｇの精製抗体を得た）。ポリクローナル抗体の細胞浸潤活性を、モノクローナル抗体のアッセイと同様の方法でマトリゲルを用いて検討した。コントロールとして３００ｎＭのウサギＩｇＧを用いた。【００５７】
結果
条件（ａ）の平均浸潤細胞数を１００％とした場合におけるＰＡＲ１ポリクローナル抗体処理時の浸潤細胞数割合を図８に示し、その算出値を以下の表３に示す。
【表３】
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表３より、条件（ａ）の浸潤細胞数を１００％とすると、３００ｎＭのポリクローナルＰＡＲ１抗体が、ＰＡＲ１発現ＫＰＬ−４の細胞浸潤能を約５５％阻害することを示す。【００５８】
したがって、３００ｎＭのポリクローナルＰＡＲ１抗体は、１０μＭのモノクローナルＰＡＲ１抗体（阻害効果：約６０％）と同レベルのがん細胞の浸潤能抑制効果を有することを示している。すなわち、遺伝子工学的手法により、モノクローナルＰＡＲ１抗体の遺伝子に改良を加えることで、１０−１００倍阻害効果を強化できることを示唆しており、本発明の抗体が有効な抗がん剤として使用できることを示している。【００５９】
さらに、これらの実験結果から、本発明の抗体は有効な抗がん剤として使用できるのみならず、腫瘍の検出にも使用できることも明らかである。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明によれば、ＰＡＲ１抗体が、ＰＡＲ１発現細胞においてＭＭＰ１依存的な細胞運動能および細胞浸潤能を阻害すること、およびマウス生体内において腫瘍細胞に特異的に反応を示すことから、がん治療において有効な抗体医薬品となりうることを示唆している。また、本発明の抗体は腫瘍の検出等に使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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