(57)【要約】本発明により、エネルギー調節活性または循環機能調節活性を有する新規なペプチドが提供される。本発明のペプチドはエネルギー調節活性または循環機能調節活性を有し、摂食障害や循環系疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩：
（ａ）配列番号１〜９のいずれか、１１、１２または２６で表されるアミノ酸配列を含むペプチド（ただし、配列番号１３〜２１のアミノ酸配列からなるペプチドは除く）；
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか、１１、１２または２６で表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜９のいずれか、１１、１２または２６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）下記式（I）で表されるペプチド
[化１]
Ｒ１−Ａ−Ｒ２    （I）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ２はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ａは上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
【請求項２】
請求項１の（ａ）〜（ｃ）に記載のぺプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
【請求項４】
請求項３記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
【請求項５】
請求項４記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ペプチドを採取することを特徴とする該ペプチドの製造方法。
【請求項６】
配列番号１または２６のアミノ酸配列に存在するエピトープと結合する抗体。
【請求項７】
請求項６記載の抗体を用いて、請求項１に記載のペプチドを検出または定量する方法。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｆ）から選ばれる少なくとも１つのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含むエネルギー調節剤：
（ａ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、視床下部または下垂体の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、視床下部または下垂体の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；
（ｅ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；および
（ｆ）下記式（II）で表されるペプチド
[化２]
Ｒ３−Ｂ−Ｒ４    （II）
（式中、Ｒ３は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ４はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｂは上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
【請求項９】
以下の（ａ）〜（ｆ）から選ばれる少なくとも１つのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む循環調節剤：
（ａ）配列番号１〜１２のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１〜１２のいずれかのアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、腎臓、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜１２のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、腎臓、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；
（ｅ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；および
（ｆ）下記式（III）で表されるペプチド
[化３]
Ｒ５−Ｃ−Ｒ６    （III）
（式中、Ｒ５は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ６はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｃは上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
【請求項１０】
請求項８または９記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が抑制される場合の試験物質を該ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項８または９記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が促進される場合の試験物質を該ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項８または９記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を視床下部、下垂体、腎臓、心臓もしくは血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞、または該細胞の膜画分に接触させた場合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合の該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量と比較して、結合量が低下する場合の試験物質を該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定することを特徴とする、該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチド、該ペプチドをコードするDNA、該ペプチドの製造方法、該ペプチドを含む医薬、該ペプチドの活性を阻害または促進する物質、あるいは、該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
視床下部や下垂体は、ホルモンや神経伝達物質などの生理活性ペプチドを産生、受容する組織である。視床下部や下垂体で産生、受容される生理活性ペプチドにより、生体の恒常性の調節が行われている。
視床下部や下垂体で産生される生理活性ペプチドとしては、例えば甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）、成長ホルモン放出ホルモン（GRH）、ソマトスタチン（成長ホルモン抑制ホルモン）、プロラクチン抑制ホルモン（PIH）、プロラクチン放出ホルモン（PRH）、ニューロペプチドY（NPY）、オレキシン（OX）、メラニン凝集ホルモン（MCH）、アグーチ関連蛋白質（AGRP）、色素細胞刺激ホルモン（MSH）、コカインアンフェタミン調節転写産物（CART）などが知られている。【０００３】
視床下部や下垂体に発現が確認されている生理活性ペプチドの受容体としては、1型ニューロメジンU受容体（NMU1R）、2型ニューロメジンU受容体（NMU2R）、グレリン受容体、1型オレキシン受容体（OX1R）、2型オレキシン受容体（OX2R）、1型ニューロペプチドY受容体（NPY1R）、5型ニューロペプチドY受容体（NPY5R）、4型メラノコルチン受容体（MC4R）、1型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（CRHR-1）、2型コルチコトロピン放出ホルモン受容体（CRHR-2）などがある。【０００４】
このような生理活性ペプチド受容体とリガンドである生理活性ペプチドが相互作用することにより種々の細胞内シグナル伝達反応が引き起こされるが、とくに細胞内カルシウム濃度の上昇を介するシグナル伝達反応が著名な反応である。
視床下部や下垂体においては例えば1型ニューロメジンU受容体（NMU1R）、2型ニューロメジンU受容体（NMU2R）、グレリン受容体、1型オレキシン受容体（OX1R）、2型オレキシン受容体（OX2R）などは、リガンドである個々の生理活性ペプチドと結合すると、細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こす。この細胞内カルシウム濃度の上昇がセカンドメッセンジャーとなって、さらに生体の恒常性調節のための反応が引き起こされる。例えば１型ニューロメジンU受容体（NMU1R）、2型ニューロメジンU受容体（NMU2R）、グレリン受容体は摂食反応の調節を行い、また1型オレキシン受容体（OX1R）、2型オレキシン受容体（OX2R）は摂食反応や覚醒、動機付け反応の調節を行う。【０００５】
このように生理活性ペプチドによる視床下部や下垂体細胞内でのカルシウム濃度の上昇は、エネルギー調節などの反応を制御する作用をもたらしていることの指標となる。エネルギー調節には、摂食亢進、摂食抑制、飲水亢進、飲水抑制、睡眠誘起、覚醒亢進、代謝亢進、代謝抑制などの作用が含まれる。
心筋、骨格筋、平滑筋での筋収縮はアクチンフィラメントとミオシンフィラメントの相互作用により引き起こるが、その相互作用は細胞内のカルシウム濃度の上昇が引き金となっている。よって筋細胞内でのカルシウム濃度の上昇を引き起こす物質は筋収縮剤として利用される。とくに心筋や血管平滑筋など循環組織でカルシウム濃度の上昇をもたらす物質は、筋収縮亢進にともなう血圧上昇などを引き起こす。【０００６】
例えばエンドセリンやアンジオテンシンIIなどの生理活性ペプチドは、腎臓を含む循環組織に発現されている各受容体と相互作用することにより細胞内カルシウム濃度の上昇を引き起こし、血圧上昇などをもたらすことが知られている。
このように生理活性ペプチドによる循環組織細胞内でのカルシウム濃度の上昇は、循環調節作用を有することの指標となる。【０００７】
VGF遺伝子は、ラットPC12細胞の神経成長因子刺激により発現が増加する遺伝子として同定され（非特許文献１参照）、その後、ヒトVGF遺伝子が単離された（非特許文献２参照）。VGF遺伝子破壊マウスでは、摂食量は不変、体重減少、体脂肪減少、酸素消費増加、運動量増加が認められ、また生殖機能にも異常が見られた。特に、エネルギー代謝亢進が認められている（非特許文献３参照）。【０００８】
VGF遺伝子は中枢、末梢神経系、内分泌、神経内分泌細胞に発現し、発現や分布は、摂食行動や消化管の運動を制御するニューロペプチドY、ペプチドYY、グレリン（ghrelin）、コレシストキニン等の発現パターンと類似し、エネルギー代謝に関連する部分に存在する（非特許文献４参照）。【０００９】
VGF遺伝子がコードする蛋白質（以下、VGFとよぶ）は、ヒトで６１５アミノ酸、ラット/マウスで６１７アミノ酸である。VGFの１〜２２番目のアミノ酸はシグナルペプチドであり、またプロホルモンコンベルターゼによる切断やアミド化等のプロセッシングを受ける配列が存在する。VGFのプロセッシングについて、ラットを中心に調べられており、ラットの脳より、ラットVGF（５９８−６１７）（かっこ内の数字は、VGFのアミノ酸配列におけるペプチドの配列の位置を表す。以下のペプチドについても同様）、ラットVGF（５９９−６１７）、ラットVGF（６０１−６１７）、ラットVGF（６０２−６１７）、ラットVGF（５８７−６１７）、ラットVGF（５８８−６１７）、ラットVGF（５６７−６１７）、ラットVGF（５５６−６１７）、ラットVGF（４８９−６１７）、ラットVGF18（18 kDa：配列未確認）のVGFに由来するペプチドの存在が確認されている（非特許文献５参照）。またラットVGF（５５６−５７６）のペプチドの存在もラット脳抽出液中に確認されており、ラットの脳室内に投与することにより、高カロリーダイエット時において体重増加を抑制する活性が報告されている（非特許文献６参照）。ラットVGF（５５６−６１７）の部分ペプチドである、ラットVGF（５７７−６１７）、ラットVGF（５８８−６１７）、ラットVGF（５９９−６１７）は、オスのラットの視床下部室傍核（PVN）に直接投与することにより、勃起を引き起こす活性を示したが、ラットVGF（５５６−５７６）にはこの活性は確認されなかった（非特許文献７参照）。また、VGF（５８８−５９６）をVGF遺伝子破壊マウスに腹腔内投与したところ、10％〜15％程度の体重上昇があったことが報告されている（特許文献１参照）。【００１０】
ヒトVGFに由来するペプチドについては、ヒト脳脊髄液においてヒトVGF（２３−６２）、ヒトVGF（２３−５９）、ヒトVGF（２６−６２）（非特許文献８参照）、さらに、ヒトVGF（２３−５８）、ヒトVGF（２４−５９）、ヒトVGF（２４−６２）、ヒトVGF（２６−５７）、ヒトVGF（２６−５８）、ヒトVGF（２６−５９）、ヒトVGF（２６−６１）、ヒトVGF（２６−６４）、ヒトVGF（４９−６２）、ヒトVGF（９０−１１４）、ヒトVGF（３５０−３６７）、ヒトVGF（３５０−３７０）、ヒトVGF（３７３−４０４）、ヒトVGF（３７３−４１７）、ヒトVGF（４２０−４７１）、ヒトVGF（４２０−４７８）の存在が報告されている（特許文献２参照）。また、ウシの脳下垂体後葉から、ラットVGF（５８８−６１７）に相当し、ヒトVGFの５８６−６１５番目の配列と同一の配列のペプチドが単離されている（非特許文献９参照）。しかし、これらのヒトまたはウシのVGFに由来するペプチドの生理活性については、報告されていない。【００１１】
VGFまたはVGFに由来するペプチドを特異的に認識する抗体としては、ラットVGFのC末端に相当する５７３〜６１７番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたポリクローナル抗体（非特許文献１０参照）、ヒトVGFの５５６〜５６５番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたポリクローナル抗体（非特許文献４参照）、ラットVGFの４４３〜５８８番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原としたポリクローナル抗体（非特許文献１１参照）等が報告されている。【００１２】
【特許文献１】WO01/07477
【特許文献２】WO02/82075
【非特許文献１】サイエンス(Science)，（米国），1985年，第229巻，第4711号，p.393-395
【非特許文献２】ジェノミクス(Genomics)，（米国），1997年，第45巻、第2号，p.443-446
【非特許文献３】ニューロン(Neuron)，（米国），1999年，第23巻，第3号，p.537-548
【非特許文献４】セリュラー・アンド・モレキュラー・ニューロバイオロジー（Cellular and Molecular Neurobiology），（米国），2004年，第24巻，第4号，p.517-533
【非特許文献５】ジャーナル・オブ・ニューロケミストリー（Journal of Neurochemistry），（イギリス），2002年，第81巻，第3号，p.565-574
【非特許文献６】プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイティッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America），（米国），2006年，第103巻，第39号，p.14584-14589
【非特許文献７】ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス（European Journal of Neuroscience），（フランス），2004年，第20巻，第11号，p.3035-3040
【非特許文献８】ジャーナル・オブ・クロマトグラフィーＢ：バイオメディカル・サイエンシズ・アンド・アプリケーションズ（Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications）,（オランダ），2001年，第754巻，第2号，p.357-367
【非特許文献９】エンドクリノロジー（Endocrinology），（米国），1994年，第135巻，第6号，p.2742-2748
【非特許文献１０】エンドクリノロジー（Endocrinology），（米国），1999年，第140巻，第8号，p.3727-3735
【非特許文献１１】ザ・エンボ・ジャーナル（The EMBO Journal），（イギリス），1989年，第8巻，第8号，p.2217-2223
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、エネルギー調節活性または循環調節活性を有する新規なペプチドを提供すること、さらに該ペプチドをコードするDNA、該ペプチドの製造方法、該ペプチドを含む医薬、および該ペプチドの活性を阻害または促進する物質のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は以下の（１）〜（１２）に関する。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩：
（ａ）配列番号１〜９のいずれか、１１、１２または２６で表されるアミノ酸配列を含むペプチド（ただし、配列番号１３〜２１のアミノ酸配列からなるペプチドは除く）；
（ｂ）配列番号１〜９のいずれか、１１、１２または２６で表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜９のいずれか、１１、１２または２６で表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）下記式（I）で表されるペプチド
[化４]
Ｒ１−Ａ−Ｒ２    （I）
（式中、Ｒ１は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ２はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ａは上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
（２）（１）の（ａ）〜（ｃ）に記載のぺプチドをコードするＤＮＡ。
（３）（２）記載のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換えベクター。
（４）（３）記載の組換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（５）（４）記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にペプチドを生成蓄積させ、該培養物から該ペプチドを採取することを特徴とする該ペプチドの製造方法。
（６）配列番号１または２６のアミノ酸配列に存在するエピトープと結合する抗体。
（７）（６）記載の抗体を用いて、（１）に記載のペプチドを検出または定量する方法。
（８）以下の（ａ）〜（ｆ）から選ばれる少なくとも１つのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含むエネルギー調節剤：
（ａ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、視床下部または下垂体の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、視床下部または下垂体の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；
（ｅ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；および
（ｆ）下記式（II）で表されるペプチド
[化５]
Ｒ３−Ｂ−Ｒ４    （II）
（式中、Ｒ３は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ４はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｂは上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
（９）以下の（ａ）〜（ｆ）から選ばれる少なくとも１つのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む循環調節剤：
（ａ）配列番号１〜１２のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１〜１２のいずれかのアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、腎臓、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜１２のいずれかのアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、腎臓、心臓または血管の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；
（ｅ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；および
（ｆ）下記式（III）で表されるペプチド
[化６]
Ｒ５−Ｃ−Ｒ６    （III）
（式中、Ｒ５は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ６はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｃは上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。
（１０）（８）または（９）記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が抑制される場合の試験物質を該ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質のスクリーニング方法。
（１１）（８）または（９）記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞に接触させた場合の細胞応答を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞に接触させた場合の細胞応答と比較して、細胞応答が促進される場合の試験物質を該ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質として特定することを特徴とする、該ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質のスクリーニング方法。
（１２）（８）または（９）記載の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を視床下部、下垂体、腎臓、心臓もしくは血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞、または該細胞の膜画分に接触させた場合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量を測定し、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を試験物質の非存在下で該細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合の該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量と比較して、結合量が低下する場合の試験物質を該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定することを特徴とする、該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、エネルギー調節活性あるいは循環調節活性を有する新規ペプチド、該ペプチドをコードするDNA、該ペプチドと特異的に結合する抗体、該ペプチドの製造方法、該ペプチドを含む医薬、該ペプチドを利用する、該ペプチドの活性を促進または抑制する物質あるいは該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法が提供される。本発明のペプチドは、肥満症、拒食症などの摂食障害や摂水障害、代謝障害、睡眠障害などのエネルギー調節系の疾患、あるいは心筋梗塞、虚血性心疾患、脳梗塞等の循環器系疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、1μmol/Lのペプチド１（配列番号１）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド１を添加した。
【図２】図２は、5μmol/Lのペプチド１による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド１を添加した。
【図３】図３は、1μmol/Lのペプチド２（配列番号２）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド２を添加した。
【図４】図４は、1μmol/Lのペプチド２による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド２を添加した。
【図５】図５は、1μmol/Lのペプチド２による、アポエクオリン発現マウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド２を添加した。
【図６】図６は、1μmol/Lのペプチド３（配列番号３）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド３を添加した。
【図７】図７は、5μmol/Lのペプチド３による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド３を添加した。
【図８】図８は、1μmol/Lのペプチド３による、アポエクオリン発現マウスの腎臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド３を添加した。
【図９】図９は、1μmol/Lのペプチド４（配列番号４）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド４を添加した。
【図１０】図１０は、1μmol/Lのペプチド４による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド４を添加した。
【図１１】図１１は、5μmol/Lのペプチド５（配列番号５）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド５を添加した。
【図１２】図１２は、5μmol/Lのペプチド５による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド５を添加した。
【図１３】図１３は、5μmol/Lのペプチド５による、アポエクオリン発現マウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド５を添加した。
【図１４】図１４は、1μmol/Lのペプチド５による、アポエクオリン発現マウスの腎臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド５を添加した。
【図１５】図１５は、5μmol/Lのペプチド６（配列番号６）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド６を添加した。
【図１６】図１６は、5μmol/Lのペプチド６による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド６を添加した。
【図１７】図１７は、1μmol/Lのペプチド６による、アポエクオリン発現マウスの大動脈の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド６を添加した。
【図１８】図１８は、1μmol/Lのペプチド６による、アポエクオリン発現マウスの腎臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド６を添加した。
【図１９】図１９は、1μmol/Lのペプチド７（配列番号７）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド７を添加した。
【図２０】図２０は、1μmol/Lのペプチド７による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド７を添加した。
【図２１】図２１は、1μmol/Lのペプチド７による、アポエクオリン発現マウスの大動脈の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド７を添加した。
【図２２】図２２は、1μmol/Lのペプチド７による、アポエクオリン発現マウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド７を添加した。
【図２３】図２３は、1μmol/Lのペプチド８（配列番号８）による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド８を添加した。
【図２４】図２４は、5μmol/Lのペプチド８による、アポエクオリン発現マウスの心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド８を添加した。
【図２５】図２５は、5μmol/Lのペプチド９（配列番号２３）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド９を添加した。
【図２６】図２６は、5μmol/Lのペプチド９による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド９を添加した。
【図２７】図２７は、1μmol/Lのペプチド１０（配列番号２４）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド１０を添加した。
【図２８】図２８は、1μmol/Lのペプチド１０による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド１０を添加した。
【図２９】図２９は、5μmol/Lのペプチド１０による、アポエクオリン発現マウスの膵臓の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド１０を添加した。
【図３０】図３０は、1μmol/Lのペプチド１１（配列番号２５）による、アポエクオリン発現マウスの視床下部の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド１１を添加した。
【図３１】図３１は、5μmol/Lのペプチド１１による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド１１を添加した。
【図３２】図３２は、5μmol/Lのペプチド１２（配列番号２８）による、アポエクオリン発現マウスの下垂体の細胞の細胞内カルシウム濃度の上昇を示す。横軸は、培地添加後の時間（秒）、縦軸は毎秒の相対発光量（RLU）である。25秒でペプチド１２を添加した。
【図３３】図３３は、ペプチド１２（配列番号２８）の投与による、下垂体後葉神経終末からのバソプレッシンの放出を示す。３例の平均±標準誤差で示した。横軸は時間（分）で、縦軸は対照（basal）時を1としたペプチド１２投与終了時のシグナルの減少率を示す。
【図３４】図３４は、ペプチド１（配列番号１）の投与による、下垂体後葉神経終末からのバソプレッシンの放出を示す。３例の平均±標準誤差で示した。横軸は時間（分）で、縦軸は対照（basal）時を1としたペプチド１投与終了時のシグナルの減少率を示す。
【図３５】図３５は、ペプチド１１（配列番号２５）の投与による、下垂体後葉神経終末からのバソプレッシンの放出を示す。３例の平均±標準誤差で示した。横軸は時間（分）で、縦軸は対照（basal）時を1としたペプチド１１投与終了時のシグナルの減少率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
１．本発明のペプチド
本発明のペプチドとして、例えば、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドまたはその薬理学的に許容される塩があげられる。
（ａ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド。配列番号１のアミノ酸配列は、ヒトVGFの１７７−２０６番目のアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列は、ヒトVGFの１９５−２０６番目のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列は、ヒトVGFの４８５−４９５番目のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列は、ヒトVGFの５３３−５４３番目のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列は、ラットVGFの２１１−２３６番目のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列は、ラットVGFの３５３−３７２番目のアミノ酸配列、配列番号７のアミノ酸配列は、ヒトVGFの４００−４１７番目のアミノ酸配列、配列番号８のアミノ酸配列は、ラットVGFの４２３−４３０番目のアミノ酸配列、配列番号９のアミノ酸配列は、ヒトVGFの２０８−２３３番目のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列は、ヒトVGFの３５０−３７０番目のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列は、ヒトVGFの４２０−４２７番目のアミノ酸配列、配列番号１２のアミノ酸配列は、ラットVGFの５３５−５４６番目のアミノ酸配列、配列番号２３のアミノ酸配列は、ヒトVGFの５５４−５７７番目のアミノ酸配列、配列番号２４のアミノ酸配列は、ヒトVGFの４８５−５０３番目のアミノ酸配列、配列番号２５のアミノ酸配列は、ヒトVGFの５３３−５５２番目のアミノ酸配列、配列番号２６のアミノ酸配列は、ヒトVGFの１７７−２０６番目のアミノ酸配列、配列番号２７のアミノ酸配列は、ヒトVGFの５５４−５７７番目のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列は、ラットVGFの５５６−５８５番目のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列は、ラットVGFの５５６−５８５番目のアミノ酸配列に対応する、ヒトVGFの５５４−５８３番目のアミノ酸配列にそれぞれ相当するアミノ酸配列である。
（ａ）のペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１〜１２、または２３〜２９のアミノ酸配列を含んでいれば、アミノ酸数はいくつでもよいが、８０以下が好ましく、６０以下がさらに好ましく、４０以下が特に好ましい。【００１８】
（ｂ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド。ここで脳組織とは、大脳、中脳、小脳、間脳、延髄など、脳に包含される組織をいう。【００１９】
（ｃ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド。【００２０】
（ｄ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド。【００２１】
（ｅ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド。【００２２】
（ｆ）下記式（IV）で表されるペプチド
[化７]
Ｒ７−Ｄ−Ｒ８    （IV）
（式中、Ｒ７は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ８はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｄは上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチドのペプチド残基を表す）。【００２３】
配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ一もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１以上５以下の、好ましくは1以上４以下の、より好ましくは1以上３以下の、さらに好ましくは１以上２以下の、特に好ましくは１アミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加があることを意味し、置換、欠失もしくは付加が同時に生じてもよい。置換または付加されるアミノ酸としては、例えば、必須アミノ酸として知られる２０種類のL-アミノ酸、すなわちL-アラニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-アルギニン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-バリンおよびL-システインがあげられるが、これに限定されるものではなく、例えば、tert-ロイシン、ノルロイシン、ノルバリン、2-アミノブタン酸、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン、ホモセリン等の他のアミノ酸でもよく、またD-アミノ酸あるいはβ-アミノ酸でもよい。【００２４】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、O-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、tert-ロイシン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン
Ｆ群： セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン【００２５】
配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の相同性を有するアミノ酸配列とは、相同性解析プログラムBLAST 2 Sequences〔FEMS Microbiol Lett. 174, 247 (1999)〕を用いてデフォルトの条件（program: blastp、matrix: BLOSUM62、open gap: 11 penalties、extension gap: 1 penalty、gap x_dropoff: 50、expect: 10.0、word size: 3）で計算し、アラインメントをしたときに、相同性（対象の配列と配列番号１〜１２のうちの相同性解析を行った配列との間で同一のアミノ酸数／配列番号１〜１２、または２３〜２９のうちの相同性解析を行った配列の全体のアミノ酸数＋アラインメント時に挿入されたギャップの数）が90％以上、好ましくは92％以上、より好ましくは95％以上、更に好ましくは96％以上、特に好ましくは98％以上であるアミノ酸配列をいう。【００２６】
上記式（I）〜（IV）の各基の定義において、アルカノイルとしては、例えば直鎖または分枝状の炭素数１〜２０の、例えばホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、バレリル、イソバレリル、ピバロイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、ラウロイル、エイコサノイル等があげられる。【００２７】
アロイルおよびアリールオキシカルボニルのアリール部分としては、例えば炭素数６〜１５の、例えばフェニル、ナフチル等があげられる。
ヘテロアリールカルボニルおよびヘテロアリールオキシカルボニルのヘテロアリール部分としては、例えばフリル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ナフチリジニル等があげられる。【００２８】
アルコキシカルボニルおよびアルコキシのアルキル部分としては、例えば直鎖または分枝状の炭素数1〜20の、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、デシル、ドデシル、エイコシル等があげられる。
置換アルカノイル、置換アルコキシカルボニルおよび置換アルコキシにおける置換基としては、同一または異なって置換数1〜3の、例えばヒドロキシ、カルボキシ、炭素数3〜8の、例えばシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等の脂環式アルキル、置換もしくは非置換のフェニル、フルオレニル等があげられる。置換フェニルの置換基としては、同一または異なって置換数1〜3の、例えばアルキル、アルコキシ、ヒドロキシ、ニトロ、スルホ、シアノ、ハロゲン等があげられ、ハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素の各原子があげられる。
置換フェニルの置換基としてのアルキル、アルコキシのアルキル部分は、前記アルコキシカルボニルおよびアルコキシのアルキル部分と同義である。【００２９】
置換アロイル、置換アリールオキシカルボニル、置換ヘテロアリールカルボニルおよび置換ヘテロアリールオキシカルボニルにおける置換基は、同一または異なって置換数1〜3であり、上記の置換フェニルの置換基と同義である。
置換アミノにおける置換基としては、同一または異なって置換数1〜2の、例えば置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアリール等があげられる。アルキルは、前記アルコキシ等のアルキル部分と同義であり、置換アルキルの置換基は、前記置換アルコキシ等の置換基と同義である。アリールは、前記アロイルまたはアリールオキシカルボニルのアリール部分と同義であり、置換アリールの置換基は、前記アロイルまたはアリールオキシカルボニルの置換基と同義である。【００３０】
また、Cを構成するアミノ酸残基の側鎖の官能基が化学的に修飾または保護されたものであってもかまわない。そのように側鎖官能基が化学的に修飾または保護されたアミノ酸残基としては、例えば、側鎖カルボキシ基がベンジルエステルで保護されたアスパラギン酸残基もしくはグルタミン酸残基、側鎖チオール基がカルボキシメチル化されたシステイン残基等があげられる。【００３１】
薬理学的に許容される塩としては、例えば、酸付加塩、金属塩、有機塩基付加塩等があげられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられる。金属塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられる。有機塩基付加塩としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、アニリン等の一級アミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン等の二級アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、N,N-ジメチルアニリン、ピリジン等の三級アミン等とで形成される塩、アンモニウム塩等があげられる。【００３２】
２．本発明のペプチドの製造方法
（１）化学的合成による製造方法
本発明のペプチドは、例えば泉屋信夫、加藤哲夫ら，「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，（1985年）、相本三郎ら，「実験化学講座」，第4版，第22巻，「有機合成IV 酸・アミノ酸・ペプチド」，丸善，（1999年）、Int. J. Pept. Protein Res. 35, 161-214 (1990)、Fields, G. B., Solid-Phase Peptide Synthesis, Methods in Enzymology, vol. 289, Academic Press, (1997)、Pennington, M. W. and Dunn, B. M., Peptide Synthesis Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 35, Humana Press, (1994) 等に記載の通常のペプチド合成法により合成後、精製することによって得ることができる。具体的な合成法としては、例えば、アジド法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、ジクロロメタン法、活性エステル法、カルボイミダゾール法、酸化還元法等があげられる。また、その合成は、固相合成法および液相合成法のいずれをも適用することができる。すなわち、本発明のペプチドを構成するアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするペプチドを合成することができる。【００３３】
さらに、本発明のペプチドが、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖および／またはペプチドのアミノ末端および／またはペプチドのカルボキシ末端が化学修飾や保護がなされているものである場合には、ペプチド合成後に化学修飾する方法、化学修飾されたアミノ酸を用いてペプチド合成する方法、またはペプチド合成の最終脱保護の反応条件を適当に選ぶ方法等、ペプチド合成化学の分野において従来公知の方法〔泉屋信夫ら，「ペプチド合成の基礎と実験」，丸善，（1985年）、矢島治明監修，「続医薬品の開発」，第14巻，「ペプチド合成」，広川書店，（1991年）、日本生化学会編「生化学実験講座」，第1巻，「タンパク質の化学IV―化学修飾とペプチド合成」，東京化学同人、大野素徳ら，「生物化学実験法」，第12，13巻，「蛋白質の化学修飾（上）（下）」，学会出版センター，（1981年）〕によって製造することができる。【００３４】
また、本発明のぺプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、アドバンスト・ケムテック社（Advanced ChemTech, Inc.）製ペプチド合成機等の市販のペプチド合成機上で、適当に側鎖を保護したNα-Fmoc（9-フルオレニルメチルオキシカルボニル）-アミノ酸あるいはNα-Boc（t-ブチルオキシカルボニル）-アミノ酸等を用い、それぞれの合成プログラムに従って実施することができる。原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、アプライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems）、島津製作所、国産化学株式会社、EMDバイオサイエンシズ社（EMD Biosienses, Inc.）、渡辺化学株式会社、アドバンスト・ケムテック社、アナスペック社（AnaSpec, Inc.）またはペプチド研究所株式会社等から入手することができる。
本発明のペプチドの精製は、通常の精製法、例えば溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶等を組み合わせて行なうことができる。【００３５】
（２）遺伝子工学的手法による製造方法
本発明のペプチドが前述の２０種類の必須アミノ酸からなり、側鎖、N末端またはC末端の修飾を受けていない場合は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のペプチドをコードするDNAを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。【００３６】
本発明のペプチドをコードするDNAは、本発明のペプチドのアミノ酸配列から、コードする塩基配列を設計し、DNA合成機により合成することができる。また、本発明のペプチドが配列番号１〜１２のいずれかの配列を含むヒトVGFの部分ペプチドの場合は、ヒトの脳または膵臓の細胞のcDNAを鋳型としたPCRにより、単離することもできる。本発明のペプチドをコードするDNAを、本発明のペプチドの製造に用いる場合は、本発明のペプチドをコードする領域の末端は終止コドンになるようにする。【００３７】
以下に、本発明のペプチドがＮ末端がメチオニンである場合の製造方法を記載する。
上記で得られた本発明のペプチドをコードするDNAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製し、該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、例えば細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のペプチドをコードするDNAを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。【００３８】
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のペプチドをコードするDNAを含有してなる組換えベクターは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のDNA、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００３９】
発現ベクターとしては、例えば、pSE420（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-30（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-110600）、pKYP200〔Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)（ストラタジーン社）、pTrs30〔形質転換大腸菌株（FERM BP-5407）より調製〕、pTrs32〔形質転換大腸菌株（FERM BP-5408）より調製〕、pGHA2〔形質転換大腸菌株（FERM BP-400）より調製〕、pGKA2〔形質転換大腸菌株（FERM P-6798）より調製〕、pTerm2（特開平3-22979）、pGEX-2T（GEヘルスケア社製）、pET（ノバジェン社製）、pKK223-2（GEヘルスケア社製）、pMAL-c2X（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）等をあげることができる。【００４０】
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ptrp）、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター、T7プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またPtrpを２つ直列させたプロモーター（Ptrp×２）、tacプロモーター、lacT7プロモーター、let Iプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００４１】
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば6〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換えベクターにおいては、本発明のDNAの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。【００４２】
宿主細胞としては、エシェリヒア（Escherichia）属、セラチア（Serratia）属、バチルス（Bacillus）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属等に属する微生物、例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia coli XL2-Blue、Escherichia coli DH1、Escherichia coli MC1000、Escherichia coliKY3276、Escherichia coli W1485、Escherichia coliJM109、Escherichia coli HB101、Escherichia coli No.49、Escherichia coli W3110、Escherichia coli TB1、Serratia ficaria、Serratia fonticola、Serratia liquefaciens、Serratia marcescens、Bacillus subtilis、Bacillus amyloliquefacines、Brevibacterium ammoniagenes、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066、Brevibacterium flavum ATCC14067、Brevibacterium lactofermentum ATCC13869、Corynebacterium glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas putida 、Pseudomonas sp. D-0110等をあげることができる。【００４３】
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、またはGene, 17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。【００４４】
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、YEP13（ATCC37115）、YEp24（ATCC37051）、YCp50（ATCC37419）、pHS19、pHS15等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーター、gal 1プロモーター、gal 10プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、MFα1プロモーター、CUP 1プロモーター等をあげることができる。【００４５】
宿主細胞としては、サッカロミセス（Saccharomyces）属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、クルイベロミセス（Kluyveromyces）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、シュワニオミセス（Schwanniomyces）属、ピキア（Pichia）属、カンディダ（Candida）属等に属する微生物、例えば、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyceslactis、Trichosporon pullulans、Schwanniomyces alluvius、Candida utilis等をあげることができる。【００４６】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods Enzymol., 194, 182 (1990)〕、スフェロプラスト法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リチウム法〔J. Bacteriology, 153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげることができる。【００４７】
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、pcDNA3.1(+)（インビチロジェン社製）、pAGE107〔特開平3-22979、Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、pAS3-3（特開平2-227075）、pCDM8〔Nature, 329, 840 (1987)〕、pREP4（Invitrogen社製）、pAGE103〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（CMV）のIE（immediate early）遺伝子のプロモーター、SV40の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、SRαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトCMVのIE遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００４８】
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Namalwa）細胞、サルの細胞であるCOS細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるCHO細胞、HBT5637（特開昭63-299）等をあげることができる。【００４９】
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Cytotechnology, 3, 133 (1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕、Virology, 52, 456 (1973)等をあげることができる。【００５０】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)、Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、ペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよび欠損型バキュロウイルスゲノムを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ペプチドを発現させることができる。【００５１】
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、pVL1392、pVL1393（ベクトン・ディッキンソン社製）、pBlueBac4.5（インビトロジェン社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヤガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。【００５２】
昆虫細胞としては、例えば、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるSf9、Sf21〔Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるHigh 5（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕等をあげることができる。【００５３】
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Tiプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター、イネアクチン1プロモーター等をあげることができる。【００５４】
宿主細胞としては、例えばタバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にDNAを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Agrobacterium）（特開昭59-140885、特開昭60-70080、WO94/00977）、エレクトロポレーション法（特開昭60-251887）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第2606856、特許第2517813）等をあげることができる。【００５５】
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のペプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。【００５６】
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００５７】
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、例えばグルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。【００５８】
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことが好ましい。培養温度は15〜40℃が好ましく、培養時間は、通常16時間〜7日間が好ましい。培養中のpHは3.0〜9.0に保持することが好ましい。pHの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行うことができる。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００５９】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加するのが好ましい。例えば、lacプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド等を、trpプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００６０】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、例えばRPMI1640培地〔The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)〕、Eagleのミニマル・エッセンシャル培地（MEM）〔Science, 122, 501 (1952)〕、ダルベッコ改変イーグル培地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等があげられる。
培養は、通常、5％CO２存在下で行うのが好ましく、pHは6〜8、温度は30〜40℃が好ましく、1〜7日間行うのが好ましい。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
また、特開平2-227075に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【００６１】
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているTNM-FH培地（ベクトン・ディッキンソン社製）、Sf-900 II SFM培地（インビチトロジェン社製）、ExCell400、ExCell405（いずれもJRHバイオサイエンシズ社製）、グレース（Grace）の昆虫培地〔Nature, 195, 788 (1962)〕等を用いることができる。
培養は、通常、pHは6〜7、温度は25〜30℃が好ましく、1〜5日間行うのが好ましい。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００６２】
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ培地、ホワイト(White)培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常、pHは5〜9、温度は20〜40℃が好ましく、3〜60日間行うのが好ましい。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００６３】
上記のとおり、本発明のペプチドをコードするDNAを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ペプチドを採取することにより、該ペプチドを製造することができる。【００６４】
本発明のペプチドは、宿主細胞内での分解を避けるため、任意のポリペプチド（以下、ポリペプチドXとよぶ）と本発明のペプチドとの融合蛋白質を製造した後、本発明のペプチドを融合蛋白質から単離して製造してもよい。融合蛋白質を発現する発現ベクターは、上記の本発明のペプチドをコードするDNAを作製する際に、その5'末端に特定のプロテアーゼの認識配列またはメチオニンをコードするDNAを付加して作製し、ポリペプチドXの発現ベクターの、ポリペプチドXをコードするDNAとフレームを合わせて連結して作製することができる。ただし、メチオニンをコードするDNAを付加するのは、本発明のペプチドがメチオニンを含んでいない場合に限る。ポリペプチドXとしては任意のポリペプチドを用いることができるが、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、マルトース結合蛋白質、DsbA、DsbC、プロテインA等があげられる。特定のプロテアーゼの認識配列としては、ファクターXa認識配列（Ile-Glu-Gly-Arg）、エンテロキナーゼ認識配列（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）等があげられる。ポリペプチドXの発現ベクターは、上記の本発明のペプチドの発現ベクターに準じて、本発明のペプチドをコードするDNAの代わりにポリペプチドXをコードするDNAを挿入して作製できる。また、市販の融合蛋白質発現用ベクター、例えば、グルタチオンS-トランスフェラーゼとの融合蛋白質発現用ベクターpGEX-3（GEヘルスケア社製）、マルトース結合蛋白質との融合蛋白質発現ベクターpMAL-c2X、pMAL-p2E（ニュー・イングランド・バイオラブズ社製）、DsbAとの融合蛋白質発現ベクターpET-39b(+)（EMDバイオサイエンシズ社製）等を利用してもよい。ポリペプチドXに特定のプロテアーゼの認識配列を介して本発明のペプチドが融合している場合は、認識配列に対応するプロテアーゼ処理により、本発明のペプチドを融合蛋白質から切断することができる。ポリペプチドXのC末端にメチオニンを介して本発明のペプチドが融合している場合は、特開平1-102096に記載の方法に準じて、臭化シアン処理することにより、本発明のペプチドを融合蛋白質から切断することができる。プロテアーゼまたは臭化シアンで処理した後、ゲルろ過、逆相HPLC、アフィニティークロマトグラフィー等を組み合わせることにより、本発明のペプチドを単離精製することができる。【００６５】
文献〔J. Biol. Chem.，264, 17619 (1989); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8227 (1989); Genes Develop., 4, 1288（1990）; 特開平5-336963; WO94/23021）の記載に準じて、上記の本発明のペプチドをコードするDNAを作製する際に、その5'末端に分泌蛋白質のシグナルペプチドをコードするDNAを付加して作製し、該DNAを用いて、上記と同様にして組換えベクターを作製し、宿主細胞に導入することにより、本発明のペプチドを培地中に分泌させて製造することができる。【００６６】
本発明のペプチドのN末端がメチオニンでない場合は、上記の融合蛋白質を製造した後に単離する方法または培地中に分泌させる方法で製造することができる。例えば、配列番号９のアミノ酸配列からなる本発明のペプチドは、以下のようにして製造できる。まず、配列番号２２の塩基配列からなるDNAおよび配列番号２２と相補的な塩基配列からなるDNAをDNA合成機で化学合成した後、両者をアニーリングして２本鎖DNAを調製する。該２本鎖DNAとXmnIで切断したpMAL-c2Xを連結させて、pMAL-c2XのXmnIサイトに該２本鎖DNAを挿入したプラスミドを作製する。得られたプラスミドは、マルトース結合蛋白質のC末端に、ファクターXa認識配列（Ile-Glu-Gly-Arg）および配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドが融合した融合蛋白質をコードする。得られたプラスミドでEscherichia coliを形質転換する。得られた形質転換体を培地中に培養して、形質転換体の細胞内に融合蛋白質を発現させる。培養後の菌体を遠心分離により単離した後、菌体を破砕して、融合蛋白質を含む溶液を得る。得られた溶液から、マルトースを固定化したカラムによるアフィニティークロマトグラフィーにより、融合蛋白質を単離した後、ファクターXaで融合蛋白質を処理し、配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを融合蛋白質から切り離す。ゲルろ過あるいは逆相HPLC等で配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを単離、精製することができる。【００６７】
本発明の形質転換体により製造されたペプチドを単離精製するためには、通常の蛋白質の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明のペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（DEAE）-セファロース、DIAION HPA-75（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF（Pharmacia社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００６８】
また、該ペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてペプチドの不溶体を回収する。回収したペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ペプチドの精製標品を得ることができる。【００６９】
本発明のペプチドが細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ペプチドを回収することができる。すなわち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００７０】
３．本発明のペプチドと特異的に結合する抗体
本発明の抗体は、配列番号１のアミノ酸配列中に存在するエピトープと結合する抗体であり、配列番号１および２のペプチドに特異的に結合することができる。本発明の抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。また、本発明の抗体には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体から調製されるFab、Fab’、F(ab')２等の抗体断片も含まれる。また、モノクローナル抗体には、非ヒト動物で作製したモノクローナル抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域からなるヒト型キメラ抗体、非ヒト動物で作製したモノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）をヒト抗体のフレームワーク領域に挿入した可変領域と、ヒト抗体の定常領域からなるヒト型CDR移植抗体も含まれる。【００７１】
（１）ポリクローナル抗体の作製
配列番号１の一部を有するアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として、非ヒト動物の皮内、静脈内、腹腔内または筋肉内等に投与することにより、配列番号１のアミノ酸配列中に存在するエピトープと結合するポリクローナル抗体を作製することができる。このポリクローナル抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合することができる。この場合、抗原とするペプチドをキーホール・リンペット・ヘモシアニン、ウシチログロブリン、オボアルブミン等のキャリア蛋白に共有結合させたものを、アジュバントと共に投与するのが望ましい。抗原とするペプチドのキャリア蛋白への共有結合は、マレイミド、カルボジイミド、グルタルアルデヒド等の架橋剤を用いた反応により行うことができる。マレイミドの反応を行う場合は、抗原とするペプチドのアミノ酸配列のN末端またはC末端にシステイン残基を付加したペプチドを上記２に記載の方法で作製し、システインを介して共有結合させる。アジュバントとしては、例えばフロイントの完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等があげられる。抗原を投与する非ヒト動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができ、投与量は動物１匹に１回当たり、抗原とするペプチドを50〜200μg含有する量が好ましい。【００７２】
該抗原の投与は、例えば１回目の投与の後1〜3週間おきに、血清の抗体価が十分に上昇するまで3〜10回行うのが好ましい。血清の抗体価は、各投与後3〜7日目に採血して血清を調製し、酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセイ法等により測定できる。酵素免疫測定法は、文献〔酵素免疫測定法、医学書院 (1976); Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)〕に基づき、（ｉ）抗原としたペプチドを抗原に用いたものとは別のキャリア蛋白質と共有結合させたものを適当なプレートに固定化し、（ii）ブロッキングを行って洗浄し、（iii）免疫した動物から調製した血清を反応させた後、洗浄し、(iv)免疫に用いた動物のIgGに対する酵素標識した抗体と反応させて洗浄し、（ｖ）標識酵素により発色または発光する基質を用いた反応を行い、発色量または発光量を測定して抗体価の指標とする、という手順で行うことができる。
その血清が抗原としたペプチドに対して十分な抗体価を示した非ヒト動物より、血液を採取して血清を調製する。この血清、すなわち抗血清をポリクローナル抗体として使用することもできるし、該抗血清からポリクローナル抗体を精製することもできる。【００７３】
抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法としては、例えば遠心分離、40〜50％飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿〔Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988)〕、またはDEAE-セファロースカラム、陰イオン交換カラム、プロテインAまたはG-カラムあるいはゲル濾過カラム等を用いるクロマトグラフィー等を、単独または組み合わせて処理する方法があげられる。【００７４】
（２）モノクローナル抗体の作製
以下に示す方法より、配列番号１のアミノ酸配列中に存在するエピトープと結合するモノクローナル抗体を作製することができる。このモノクローナル抗体は、本発明のペプチドに特異的に結合することができる。【００７５】
（ａ）抗体産生細胞の調製
マウスまたはラットを抗原を投与する動物として用い、（１）のポリクローナル抗体の作製と同様の抗原の投与を行い、その血清が抗原としたペプチドに対して十分な抗体価を示したマウスまたはラットを、抗体産生細胞の供給源とすることができる。抗体産生細胞としては、脾細胞を用いることができる。抗体産生細胞は、十分な抗体価を示したマウスまたはラットから、例えば以下のようにして調製することができる。【００７６】
該抗体価を示したマウスまたはラットに抗原を最終投与した後3〜7日目に、脾臓を摘出する。脾臓をMEM中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離した後、上清を捨て、沈殿の脾細胞を回収する。得られた脾細胞をトリス-塩化アンモニウム緩衝液（pH 7.65）で1〜2分間処理し赤血球を除去した後、MEMで3回洗浄したものを抗体産生細胞として用いることができる。【００７７】
（ｂ）骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスまたはラットの骨髄腫細胞から樹立した株化細胞を用いることができる。株化骨髄腫細胞としては、例えば、8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1〔Curr. Topics. Microbiol. Immunol., 81, 1 (1978); Europ. J. Immunol., 6, 511 (1976)〕、SP2/0-Ag14〔Nature, 276, 269 (1978)〕、P3-X63-Ag8653〔J. Immunol., 123, 1548 (1979)〕、P3-X63-Ag8〔Nature, 256, 495 (1975)〕等があげられる。これらの細胞株は、8-アザグアニン培地〔RPMI-1640培地にグルタミン（1.5 mmol/L）、2-メルカプトエタノール（5×10−５mol/L）、ジェンタマイシン（10μg/mL）およびウシ胎児血清（10％）を加えた培地（以下、正常培地という）に、さらに8-アザグアニン（15μg/mL）を加えた培地〕で継代するのが好ましく、また細胞融合の3〜4日前には正常培地で培養するのが好ましい。融合には該細胞を2×10７個以上用いるのが好ましい。【００７８】
（ｃ）ハイブリドーマの作製
（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞を、例えば、以下のようにしてポリエチレングリコールを用いて細胞融合させるにより、ハイブリドーマを作製できる。（ａ）で取得した抗体産生細胞と（ｂ）で取得した骨髄腫細胞を、MEMまたはPBS（リン酸二ナトリウム1.83 g、リン酸一カリウム0.21 g、食塩7.65 g、蒸留水1リットル、pH 7.2）でよく洗浄し、細胞数が、抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝5〜10：1になるよう混合し、1,200 rpmで5分間遠心分離した後、上清を捨てる。得られた沈殿画分の細胞群をよくほぐし、該細胞群に、攪拌しながら、37℃で、10８抗体産生細胞あたり、ポリエチレングリコール-1000  2 g、MEM  2 mLおよびジメチルスルホキシド0.7 mLを混合した溶液を0.2〜1 mL添加し、さらに1〜2分間ごとにMEM  1〜2 mLを数回添加する。添加後、MEMを加えて全量が50 mLになるように調製する。該調製液を900 rpmで5分間遠心分離後、上清を捨てる。【００７９】
細胞融合後の細胞は、例えば、以下のように培養し、抗体の生産量の高いハイブリドーマを選択することができる。得られた沈殿画分の細胞を、ゆるやかにほぐした後、メスピペットによる吸込み、吹出しでゆるやかにHAT培地〔正常培地にヒポキサンチン（10−４mol/L）、チミジン（1.5×10−５mol/L）およびアミノプテリン（4×10−７mol/L）を加えた培地〕100 mL中に懸濁する。該懸濁液を96穴培養用プレートに100μL/穴ずつ分注し、5％CO２インキュベーター中、37℃で7〜14日間培養するのが好ましい。培養後、培養上清の一部を採取し、血清の代わりに該培養上清を用いて（１）で上述した抗体価の測定を行い、抗体価の高い培養上清に対応するハイブリドーマを、抗体の生産量の高いハイブリドーマとして選択することができる。【００８０】
該ハイブリドーマは、クローニングを行い、得られた各ハイブリドーマのクローンから、抗体を高生産するものを選択することにより、安定して抗体を高生産するハイブリドーマ細胞を得ることができる。クローニングは、例えば、限界希釈法等により行うことができ、2回繰り返す〔1回目は、HT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）、2回目は、正常培地を使用する〕のが好ましい。クローニングにより得られた各クローンの培養上清を用いて、上述の抗体価の測定を行い、強い抗体価の認められた培養上清に対応するハイブリドーマのクローンを、安定して抗体を高生産するハイブリドーマ細胞として選択することができる。【００８１】
（ｄ）モノクローナル抗体の調製
本発明のモノクローナル抗体は、例えば、以下のように（ｃ）で選択されたハイブリドーマをヌードマウス内で腹水癌として増殖させた後、腹水から調製することができる。2，6，10，14-テトラメチルペンタデカン（プリスタン）0.5 mLを腹腔内投与し、2週間飼育した8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、（ｃ）で取得した本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞5〜20×10６細胞／匹を腹腔内に注射するのが好ましい。10〜21日後に、ハイブリドーマが腹水癌化したマウスから腹水を採取し、3,000 rpmで5分間遠心分離して固形分を除去する。得られた腹水の上清より、ポリクローナル抗体で用いた方法と同様の方法でモノクローナル抗体を精製、取得することができる。
抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットを用いて行うことができる。ペプチド量は、ローリー法あるいは280 nmでの吸光度より算出することができる。【００８２】
（３）本発明の抗体を用いた本発明のペプチドの測定方法
本発明の抗体を用いて、本発明のペプチドを免疫学的に検出または定量することができる。免疫学的な検出または定量方法としては、競合法、サンドイッチ法、免疫組織化学、ウェスタンブロット、凝集法（単クローン抗体実験マニュアル、講談社サイエンティフィック、1987；続生化学実験講座5、免疫生化学研究法、東京化学同人、1986）等があげられる。【００８３】
競合法は、本発明の抗体に、試料溶液および一定量の競合物質（測定対象の本発明のペプチドを酵素、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質等で標識したもの）を反応させて、試料溶液中の本発明のペプチドおよび競合物質を競合的に抗体と結合させた後、抗体と結合した競合物質の量を標識を利用して測定し、その結合量から本発明のペプチドを定量する方法である。例えば抗体をプレートやビーズ等の固相に固定化し、本発明のペプチドおよび競合物質を競合的に抗体と結合させた後、固相を洗浄し、固相上の抗体への競合物質の結合量を測定する方法、本発明のペプチドおよび競合物質を競合的に抗体と結合させた後、γ-グロブリンおよびポリエチレングリコールにより免疫複合体を沈殿させて抗体と結合していない競合物質と分離し、抗体と結合した競合物質の量を測定する方法等があげられる。例えば、5〜10点の濃度を決めた本発明のペプチドの溶液を調製し、この溶液を試料溶液とした場合の競合物質の抗体への結合量を測定して、ペプチドの濃度と競合物質の結合量をプロットした検量線を作成し、本発明のペプチドを定量する試料溶液についての、競合物質の結合量を検量線にあてはめることにより、試料溶液の本発明のペプチドを定量することができる。【００８４】
サンドイッチ法は本発明のペプチドと特異的に結合する２種類の抗体を使用する方法であり、例えば、片方の抗体をプレートやビーズ等の固相に固定化したものに試料溶液を反応させ、試料中の本発明のペプチドを固相上の抗体と結合させた後、酵素、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質等で標識したもう一方の抗体を反応させて、固相上の抗体と結合した本発明のペプチドにさらに該標識抗体を結合させ、該標識抗体の結合量を標識物質を利用して測定し、その結合量から本発明のペプチドを定量する方法があげられる。例えば、5〜10点の濃度を決めた本発明のペプチドの溶液を調製し、この溶液を試料溶液とした場合の、標識抗体への結合量を測定して、ペプチドの濃度と標識の結合量をプロットした検量線を作成し、本発明のペプチドを定量する試料溶液についての、標識抗体の結合量を検量線にあてはめることにより、試料溶液の本発明のペプチドを定量することができる。【００８５】
酵素免疫測定法は、上記の競合法、サンドイッチ法において、競合物質あるいは抗体をアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素で標識し、該標識酵素により発色または発光する試薬を反応させ、その発色または発光量から競合物質または標識抗体の結合量を測定する定量方法である。また、ラジオイムノアッセイは、上記の競合法、サンドイッチ法において、競合物質あるいは抗体を放射性同位元素で標識し、その放射活性から競合物質または標識抗体の結合量を測定する定量方法である。【００８６】
免疫組織化学は、組織や細胞を凍結またはパラフィンに包埋して作製した切片に対し、酵素、ビオチン、放射性同位元素、蛍光物質、金コロイド等で標識した本発明の抗体を反応させた後、本発明の抗体を標識物質を利用して検出し、組織または細胞における本発明のペプチドを検出する方法である。【００８７】
ウェスタンブロットは、試料に含まれる蛋白質およびペプチドをSDS-ポリアクリルアミドゲルで分離した後、ゲルからポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜、ニトロセルロース膜等に蛋白質およびペプチドをブロットし、酵素、ビオチン、放射性同位元素等で標識した本発明の抗体を反応させた後、標識物質を利用して本発明の抗体を検出し、膜上の本発明のペプチドを検出する方法である。【００８８】
凝集法は、本発明の抗体を固定化したラテックス等の粒子と、試料溶液とを反応させて、試料中の本発明のペプチドに粒子上の抗体が結合することにより生ずる粒子の凝集を、吸光度の測定により検出または定量する方法である。【００８９】
４．VGF関連ペプチドを含有する医薬製剤
本発明において、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかのペプチドを「VGF関連ペプチド」とよぶ。１．に記載した本発明のペプチドは、VGF関連ペプチドに含まれる。
（ａ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド；
（ｂ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｃ）配列番号１〜１２、または２３〜２９のいずれかのアミノ酸配列と90％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチド；
（ｄ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１以上５以下のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；
（ｅ）配列番号１、２５、２８、２９のいずれかで表されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するペプチド；
（ｆ）下記式（V）で表されるペプチド
[化８]
Ｒ９−Ｅ−Ｒ１０    （V）
（式中、Ｒ９は水素原子、置換もしくは非置換のアルカノイル、置換もしくは非置換のアロイル、置換もしくは非置換のヘテロアリールカルボニル、置換もしくは非置換のアルコキシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールオキシカルボニル、または置換もしくは非置換のヘテロアリールオキシカルボニルを表し、Ｒ１０はヒドロキシ、置換もしくは非置換のアルコキシ、または置換もしくは非置換のアミノを表し、Ｅは上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのペプチド残基を表す）。【００９０】
上記の「VGF関連ペプチド」における、アミノ酸の置換、欠失および付加、ならびにアミノ酸配列の相同性の定義は、１．の本発明のペプチドにおけるアミノ酸の置換、欠失および付加ならびにアミノ酸配列の相同性の定義と同じものである。また、式（V）における各基の定義は、１．の式（I）〜（IV）における各基の定義と同じものである。【００９１】
VGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は、腎臓、血管または心臓の細胞の細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するので、血圧や血流量を調節する循環調節活性を有する。したがって、VGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は循環調節剤、昇圧剤、あるいは心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療薬の有効成分として用いることができる。【００９２】
VGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は、視床下部または下垂体、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有するので、摂食量や摂水量、エネルギー代謝を調節するエネルギー調節活性を有する。したがって、VGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は摂食調節剤、摂水調節剤、代謝調節剤、あるいは肥満、拒食症または不眠症等のエネルギー調節系の疾患の治療薬の有効成分として用いることができる。【００９３】
VGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は、下垂体後葉からのバソプレッシン分泌促進活性を有するので、血圧や血流量、体液量を調節する循環調節活性を有する。またバソプレッシンは腎臓における水や電解質の再吸収やグリコーゲン分解などにも関与するので、VGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は、摂食量や摂水量、エネルギー代謝を調節するエネルギー調節活性を有する。したがって、VGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩は循環調節剤、昇圧剤、あるいは心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療薬の有効成分として用いることができる他、摂食調節剤、摂水調節剤、電解質代謝調節剤、エネルギー代謝調節剤、あるいは肥満、拒食症または不眠症等のエネルギー調節系の疾患の治療薬の有効成分として用いることができる。
VGF関連ペプチドの薬理学的に許容される塩としては、１．の本発明のペプチドの薬理学的に許容される塩としてあげた塩があげられる。【００９４】
VGF関連ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含有する医薬製剤は、活性成分として該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。【００９５】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口または、例えば脳室内や静脈内等の非経口をあげることができる。
投与形態としては、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、注射剤等がある。
経口投与に適当な、例えばシロップ剤のような液体調製物は、水、蔗糖、ソルビット、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を使用して製造できる。また、錠剤、散剤および顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニット等の賦形剤、澱粉、アルギン酸ソーダ等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。【００９６】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。
また、これら非経口剤においても、経口剤で例示した希釈剤、防腐剤、フレーバー類、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結合剤、界面活性剤、可塑剤等から選択される１種もしくはそれ以上の補助成分を添加することもできる。【００９７】
本発明のペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常経口の場合、成人一人当り0.01 mg〜1 g、好ましくは0.05〜50 mgを一日一回ないし数回投与する。静脈内投与等の非経口投与の場合、成人一人当り0.001〜100 mg、好ましくは0.01〜10 mgを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。【００９８】
５．VGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩のエネルギー調節活性または循環調節活性の測定
VGF関連ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩がエネルギー調節活性または循環調節活性を有していることは、以下の測定法により細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有していることで確認できる。【００９９】
（ａ）細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性の測定
（ｉ）アポエクオリン発現トランスジェニックマウスの利用
アポエクオリン遺伝子の発現ベクターを受精卵に導入して作製した、全身にアポエクオリンを発現するトランスジェニックマウス（WO02/010371）から、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管、あるいは脳の一部の組織を採取する。得られた視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管、あるいは脳組織を細断し、セレンテラジンを含む培地に懸濁して培養し、細胞内にセレンテラジンを取り込ませてエクオリン（アポエクオリンとセレンテラジンの複合体）を形成させる。エクオリンは、細胞内カルシウムイオンと結合して発光するので、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含む培地を添加する前と添加後の細胞の毎秒の相対発光量をルミノメーターで経時的に測定し、細胞内カルシウムイオン濃度の指標とする。ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の添加により、相対発光量が増加する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有することが確認できる。【０１００】
（ii）カルシウム結合性蛍光試薬の利用
動物個体から採取した視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管、あるいは脳組織を細断したもの、あるいは視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管、あるいは脳組織内の細胞に由来する細胞株を、カルシウムイオンの有無で、励起波長、蛍光波長あるいは蛍光強度が変化するようなFura-2、Indo-1、Fluo-3等のカルシウムイオン結合性の蛍光試薬を含む緩衝液に懸濁して培養し、細胞内に取り込ませる。Fura-2はカルシウムイオンと結合することにより、蛍光励起波長のピークが380 nmから340 nmにシフトするので、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含む緩衝液を添加する前と添加後に、380 nmの波長で励起した時の蛍光強度に対する340 nmの波長で励起した時の蛍光強度の比を蛍光測定装置で測定し、細胞内カルシウムイオン濃度の指標とする。ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の添加により、蛍光強度の比が増加する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有することが確認できる。Indo-1はカルシウムイオンと結合することにより、蛍光波長が480 nmから400 nmにシフトするので、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含む緩衝液を添加する前と添加後に、480 nmの波長の蛍光強度に対する400 nmの波長の蛍光強度の比を蛍光測定装置で測定し、細胞内カルシウムイオン濃度の指標とする。ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の添加により、蛍光強度の比が増加する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有することが確認できる。Fluo-3はカルシウムイオンと結合することにより、520 nmの波長における蛍光強度が大きく増加するので、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を含む緩衝液を添加する前と添加後に、520 nmの波長の蛍光強度の比を蛍光測定装置で測定し、細胞内カルシウムイオン濃度の指標とする。ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の添加により、蛍光強度の比が増加する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有することが確認できる。【０１０１】
（ｂ）エネルギー調節を制御する活性
麻酔下にあるラット等の動物の側脳室にカテーテルを挿入し、カテーテルを通して生理食塩水に溶解したペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を側脳室に一過性に、あるいは適当な期間で複数回投与し、投与後の自由行動下での体重、飲水量、摂食量、運動量、覚醒時間、体脂肪量、体温などを測定する。あるいは麻酔下にあるラット等の動物の外頸静脈等にカテーテルを挿入し、カテーテルを通して外頸静脈等から生理食塩水に溶解したペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を一過性に、あるいは適当な期間で複数回投与し、投与後の自由行動下での体重、飲水量、摂食量、運動量、覚醒時間、体脂肪量、体温などを測定する。当該ペプチドの非投与群と比較してこれらの測定項目が変動する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩がエネルギー調節を制御する活性を有することが確認できる。【０１０２】
（ｃ）血圧を上昇させる活性
麻酔下にあるラット等の動物の外頸静脈と内頸動脈にカテーテルを挿入し、内頸動脈のカテーテルを圧モニターに接続して動脈圧を連続的に測定する。外頸静脈から生理食塩水に溶解したペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を投与し、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の投与前と投与後の動脈圧を比較して、ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の投与により、動脈圧が上昇する場合に、該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩が血圧を上昇させる活性を有することが確認できる。【０１０３】
（ｄ）バソプレッシンの分泌を促進する活性
バソプレッシン（arginine vasopressin : AVP）遺伝子に改変緑色蛍光タンパク（enhanced green fluorescent protein : eGFP）遺伝子を挿入した融合遺伝子を用いて作製したトランスジェニック（Tg）ラットは視床下部−下垂体系におけるAVPニューロンおよびその軸索に特異的にeGFPが発現している（Uetaら、Endocrinology, 146, 406-413, 2005）。このAVP-eGFP Tgラットから摘出した下垂体を用い、バソプレッシンの分泌を促進する活性を測定することができる。
AVP-eGFP Tgラットの下垂体を摘出し、灌流液（140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1.2 mM KH２PO４, 1.2 mM MgCl２, 2 mM CaCl２, pHは7.37、浸透圧は295〜300 mOsmlになるよう調節した）で満たされた灌流装置のチャンバーに設置する。励起光照射装置（１６１C,  Spectra Physics社製）からのレーザー光（488 nm）を光ファイバー（GIF625-100,  Thorlabs社製）を通して下垂体後葉に照射し、下垂体後葉の神経終末で励起されたeGFP蛍光はもう一本の光ファイバーを通して光電管（R6249HA,  浜松ホトニクス社）で集光する。これを電気信号に変換した後、アンプ（C7246,  浜松ホトニクス社製）で増幅することにより、eGFPの蛍光の変化を観察することができる。該変化量が下垂体に存在するAVP-eGFPの変化量の指標となり、VGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩が有する、バソプレッシンの分泌を促進する活性を測定することができる。
具体的には10分間の記録時間を設定し、初めの5分は灌流液のみを投与してこれを対照（basal）とし、残りの5分は灌流液にVGF関連ペプチドおよびその薬理学的に許容される塩を最終濃度が10−６ Mとなるように混合したものを投与し、eGFP蛍光の変化を観察することにより、下垂体から分泌されるバソプレッシンの量を測定することができる。【０１０４】
６．VGF関連ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害または促進する物質のスクリーニング方法
VGF関連ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質は、（ｉ）視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞に、該VGF関連ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を接触させた場合の細胞応答を測定し、（ii）同じ細胞に試験物質の非存在下で、該VGF関連ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を接触させた場合の細胞応答と比較し、（iii）試験物質の存在下で細胞応答が抑制される場合にその試験物質を該VGF関連ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質として特定すること、によりスクリーニングできる。【０１０５】
また同様に、（ｉ）視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞に、該VGF関連ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を接触させた場合の細胞応答を測定し、（ii）同じ細胞に試験物質の非存在下で、該VGF関連ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を接触させた場合の細胞応答と比較し、（iii）試験物質の存在下で細胞応答が促進される場合にその試験物質を該VGF関連ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質として特定すること、により該VGF関連ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質をスクリーニングできる。【０１０６】
細胞応答としては、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞に該VGF関連ペプチドを接触させたときに起こる、測定可能な細胞応答であれば、いかなる細胞応答でもかまわないが、例えば、細胞内カルシウムイオン濃度の上昇があげられる。
上記のスクリーニング方法で用いる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞は、VGF関連ペプチドと接触させたときに細胞応答を示す細胞であれば、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管、あるいは脳組織内の細胞に由来する細胞株でもよいし、動物から採取した視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管、あるいは脳組織を細断したものでもよい。アポエクオリン遺伝子を導入して作製した全身にアポエクオリンを発現するトランスジェニックマウス（WO02/010371）の視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管、あるいは脳組織を採取し、細断して得られる細胞は、セレンテラジンの存在下で発光量をルミノメーターで測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度を簡便に測定できるので、好ましい。【０１０７】
上記のスクリーニング方法で得られるVGF関連ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を促進する物質は、VGF関連ペプチドと同様に、エネルギー調節活性または循環調節活性を有するので、摂食調節剤、摂水調節剤、代謝調節剤、循環調節剤、昇圧剤、あるいは摂食障害、摂水障害、代謝障害、睡眠障害などのエネルギー調節系の疾患や心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療薬に用いることができる。また、VGF関連ペプチドによる視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を阻害する物質は、VGF関連ペプチドが有する、例えば血圧を上昇させる活性を阻害するので、降圧剤として用いることができる。【０１０８】
７．VGF関連ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法
VGF関連ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストは、（ｉ）視床下部、下垂体、腎臓、心臓もしくは血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞または該細胞の膜画分に、該VGF関連ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩および試験物質を接触させた場合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量を測定し、（ii）同じ細胞または膜画分に試験物質の非存在下で、該VGF関連ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を接触させた場合の該細胞または該細胞の膜画分に対する該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量と比較し、（iii）試験物質の存在下で該ペプチドまたはその薬理学的に許容される塩の結合量が低下する場合にその試験物質を該VGF関連ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして特定すること、によりスクリーニングできる。【０１０９】
視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管の細胞、あるいは脳組織内の細胞は、上記５．に記載の細胞を用いることができる。該細胞または該細胞の細胞膜画分は、適当な緩衝液に懸濁する。緩衝液は、VGF関連ペプチドと該細胞または該細胞の細胞膜画分との結合を阻害しない緩衝液であればいずれでもよく、例えばpH 4〜10（望ましくはpH 6〜8）のリン酸緩衝液やTris-HCl緩衝液等が用いられる。また、非特異的結合を低減させる目的で、CHAPS、Tween-80、ジギトニン、デオキシコール酸等の界面活性剤やウシ血清アルブミンやゼラチン等の各種蛋白質を緩衝液に加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明のポリペプチドやリガンドの分解を抑える目的でPMSF、ロイペプチン、E-64、ペプスタチン等のプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。【０１１０】
10μL〜10 mLの該細胞または該細胞の細胞膜画分の懸濁液に、１２５I、３H等の放射性同位元素で標識した一定の放射能量を有するVGF関連ペプチドを共存させて結合実験を行う。反応は0〜50℃、好ましくは4〜37℃で、20分〜24時間、好ましくは30分〜3時間行なう。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同緩衝液で洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性をγ-カウンターまたは液体シンチレーションカウンターで計測する。この時の結合量を全結合量（Ａ）とする。大過剰の非標識の同化合物を加えた条件で同様の反応を行い、その時の結合量を非特異的結合量（Ｂ）とする。試験物質を加えた条件で同様の反応を行い、その時の結合量をＣとする。試験物質の結合阻害率は下記の式で求めることができる。【０１１１】
阻害率（％）＝［１−｛（Ｃ−Ｂ）／（Ａ−Ｂ）｝］×１００【０１１２】
上記のスクリーニング方法で得られるVGF関連ペプチドの受容体に対するアゴニストは、VGF関連ペプチドと同様に、エネルギー調節活性または循環調節活性を有するので、摂食調節剤、摂水調節剤、代謝調節剤、循環調節剤、昇圧剤あるいは摂食障害、摂水障害、代謝障害、睡眠障害などのエネルギー調節系の疾患や心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療薬に用いることができる。また、VGF関連ペプチドの受容体に対するアンタゴニストは、VGF関連ペプチドが有する、例えば血圧を上昇させる活性を阻害するので、降圧剤として用いることができる。【０１１３】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１１４】
以下に、本発明の実施例を示す。ただし本発明はこれら実施例によって制限されるものではない。
〔実施例１〕
VGFに由来するペプチドの単離と構造決定
コンフルエントになるまで増殖させたヒト膵臓由来細胞株（10８個）を、フェノールレッドおよび血清を含まないRPMI培地中で6時間培養後に培地を回収した。培地を回収し遠心した後の上清に1 mol/Lの塩酸を1/50容量加えた後に、セップ−パック（Sep-Pak）C18カートリッジ〔ウォーターズ（Waters）社製〕を用いて試料を抽出した。カートリッジは0.1％トリフルオロ酢酸（以下、TFAと略する）で洗浄し、60％アセトニトリル-0.1％ TFAで試料を溶出させた。溶出液を凍結乾燥の後に60％アセトニトリル-0.1％ TFAに溶解させ、同液で平衡化したゲル濾過HPLCカラム〔TSKgel  G2000SWXL、21.5 mm×30 cm（東ソー株式会社製）〕を用いたHPLC〔HPLCポンプ  L-2100（日立製）〕により、流速1.5 ml／分で分離し、ペプチド画分を回収した。凍結乾燥した同試料を1 mol/L酢酸に溶解の後、1 mol/Lトリス（pH 11）で中和させ、還元反応液（1 mmol/L EDTA、25 mmol/Lジチオスレイトール、0.5 mol/Lトリス、pH 8.5）中で37℃1時間加温した。引き続きヨードアセトアミドを終濃度50 mmol/Lになるように加え、遮光して室温で15分間反応させた。氷酢酸で反応を停止させ、セップ−パックC18カートリッジを用いて脱塩した。脱塩後、凍結乾燥した試料を0.1％ TFAに溶解し、逆相HPLCカラム〔バイダック（Vydac）Protein & Peptide C18、1 mm×15 mm（グレース・バイダック（Grace Vydac）社製）〕を用いたHPLC〔HPLCポンプL-6000（日立製）〕により、流速50μL/分で分離し、30秒ごとに分取した。各画分は減圧乾燥の後、50％メタノール−2％酢酸に溶解させ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法とエレクトロスプレーイオン化（ESI）法の2種類の質量分析法で分析した。MALDI法では、ターゲットプレートに上記試料を塗布後に、50％アセトニトリル−0.1％TFAに溶解させた2.5 mg/mL  α-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸溶液を0.5μL添加した。プレートは、タンデム飛行時間型（TOF）質量分析計〔4700プロテオミクス・アナライザー、アプライド・バイオシステムズ社製〕で質量分析し、検出されるペプチドを逐次同定した。ESI法による質量分析は、四重極飛行時間型質量分析計〔Q-Tof2、マイクロマス（Micromass）社製〕を用いて実施した。獲得したタンデムマススペクトルは、解析ソフトウエア  マスコットMS/MSイオン・サーチ〔Mascot MS/MS Ion Search、マトリックス・サイエンス（Matrix Science）社製〕を用い、NCBIおよびSwiss-Protのアミノ酸配列データベースを基に同定した。その結果、ヒトVGFの一部のアミノ酸配列を有する、配列番号１〜４、７および９〜１１で示される８種類のペプチドを見出した。配列番号１で示されるペプチドはN末端がピログルタミル化されていた。なお、配列番号５、６、８、および１２で示される４種類のペプチドは、それぞれ配列番号９、１０、１１、４で示されるヒト由来ペプチドのラットにおけるカウンターパートである。【０１１５】
〔実施例２〕
VGFに由来するペプチドの調製
実施例１で見出されたペプチドをそれぞれ、シグマ−ジェノシス（Sigma-Genosys）社に依頼して化学合成した。
合成後のペプチドの構造をMALDI-TOF質量分析計オートフレックス〔Autoflex、ブルカー（Brucker）社製〕を用いたMALDI法による質量分析で確認した。マトリックスは、50％アセトニトリル−0.1％ TFAで調製したα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（シグマーアルドリッチ社製）飽和溶液を用いた。また、MALDI-TOF質量分析計ボイジャーDEプロ（Voyager DE Pro、アプライド・バイオシステムズ社）を用いたMALDI法による質量分析で確認した。マトリックスは、50％アセトニトリル−0.1％ TFAで調製したα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸（シグマーアルドリッチ社製）飽和溶液を2倍希釈した溶液を用いた。さらに、アミノ酸分析〔Anal. Biochem., 222, 19 (1994)〕によっても、ペプチドの構造の確認を行った。加水分解はピコタグ用ワークステーション（ウォーターズ社製）を使用し、塩酸蒸気中110℃で22時間行い、加水分解物のアミノ酸組成はアミノ酸分析機L-8500（日立製）を用いて行った。【０１１６】
〔実施例３〕
VGFに由来するペプチドの細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性測定
全身にアポエクオリンを発現しているアポエクオリン遺伝子のトランスジェニックマウス（以下、アポエクオリン発現マウスとよぶ）の各臓器を利用して、実施例２で合成したペプチド１〜８が、細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するかどうかを調べた。アポエクオリン発現マウスの細胞は、アポエクオリンが発光基質セレンテラジンの存在下でカルシウムイオンと結合し発光するため、細胞内カルシウムイオン濃度をモニターできる。なお、特許文献（WO02/010371）には、アポエクオリン発現マウスの作製法、該マウス由来の生体試料を使用した生理活性物質の評価方法および、以下に示すような生理活性ペプチドを該マウスの臓器を使用して評価した実験結果が開示されている。すなわち、アポエクオリン発現マウスより得られた各臓器に、アンジオテンシンIIを終濃度1μmol/Lで添加したところ、血管、子宮、副腎において強い発光が観察され、またブラジキニンを終濃度10μmol/Lで添加したところ、血管、子宮、副腎において強い発光が観察されたとの記載があり、アポエクオリン発現マウスは新規なペプチドの生理活性評価に使用可能である。【０１１７】
アポエクオリン発現マウスは特許文献（WO02/010371）の参考例４で開示されている方法に従い作製した。アポエクオリン発現マウスを屠殺後、胸腺、視床下部、脾臓、骨、大動脈、心臓、腎臓、副腎、膵臓、下垂体、子宮、延髄、脊髄の各臓器を摘出し、それぞれの臓器を約1〜2 mm３の立方体に細断した。次に、5 mLチューブ（Rohren-Tubes；ザルスタット（Sarstedt）社製、No.55.476）中で、RPMI1640培地に溶解した10μmol/Lセレンテラジン〔モレキュラー・プローブズ（Molecular Probes社）製〕溶液50μLに、調製した各種臓器試料を3個づつ加え37℃で3時間培養した。3時間後、RPMI1640培地を添加し、25秒後にRPMI1640培地に溶解したペプチド１〜５それぞれを終濃度1μmol/Lおよび5μmol/Lになるように添加し、ルミノメーター〔オートルーマット（AutoLumat）LB953、ベルトルード（Berthold）社製〕を用いて、RPMI1640培地の添加直後から1秒ごとに相対発光量を測定した。【０１１８】
その結果、配列番号１で示されるペプチドは胸腺、視床下部（図１）、下垂体（図２）、延髄で、配列番号２で示されるペプチドは、視床下部（図３）、下垂体（図４）、心臓（図５）、延髄で、配列番号３で示されるペプチドは胸腺、視床下部（図６）、下垂体（図７）、腎臓（図８）、延髄で、配列番号４で示されるペプチドは視床下部（図９）、下垂体（図１０）、膵臓で、配列番号５で示されるペプチドは視床下部（図１１）、下垂体（図１２）、心臓（図１３）、腎臓（図１４）、脾臓、子宮、延髄、脊髄で、配列番号６で示されるペプチドは胸腺、視床下部（図１５）、下垂体（図１６）、大動脈（図１７）、腎臓（図１８）、脾臓、心臓、子宮、延髄で、配列番号７で示されるペプチドは視床下部（図１９）、下垂体（図２０）、大動脈（図２１）、心臓（図２２）、脾臓で、配列番号８で示されるペプチドは胸腺、下垂体（図２３）、心臓（図２４）、脾臓、延髄、脊髄で、配列番号２３で示されるペプチドは視床下部（図２５）、下垂体（図２６）で、配列番号２４で示されるペプチドは視床下部（図２７）、下垂体（図２８）、膵臓（図２９）で、配列番号２５で示されるペプチドは視床下部（図３０）、下垂体（図３１）で、配列番号２８で示されるペプチドは下垂体（図３２）で、それぞれ発光が観察された。以上からこれらのペプチドは、エネルギー調節系や循環器系に関与する臓器である、視床下部、下垂体、腎臓、心臓または血管などの細胞において細胞内のカルシウムイオンの濃度を上昇させる活性を有していることがわかった。【０１１９】
〔実施例４〕
抗体の作製
（１）動物の免疫と抗血清の調製
ヒトVGFの一部である、配列番号１のC末端部分に相当する、ESPGPERVWからなるペプチドをキャリア蛋白質と結合させるため、該ペプチドのN末端にシステイン残基を付加したペプチドを実施例２と同様に化学合成した。該ペプチド6.0 mgを、システイン残基を介して、マレイミドで活性化したキーホール・リンペット・ヘモシアニン〔Imject Activated mcKLH; ピアース（Pierce）社製〕10 mgと共有結合させた。共有結合の反応はピアース社のマニュアルに従って行った。得られたペプチドとKLHとのコンジュゲートを生理食塩水で透析したものを抗原とした。抗原は分注し、使用時まで-35℃で保存した。得られた抗原の生理食塩溶液0.5 mLを当容のフロイントの完全アジュバントと混合して安定なエマルジョンを作成し、２週間毎に７回雄のウサギ（New Zealand white rabbit）に皮内投与して、免疫した。投与後に抗体価を測定し、抗体価の上昇が見られたウサギから血清を調製し、抗血清とした。【０１２０】
（２）抗体価の測定
抗体価の測定は、以下に示すようなラジオイムノアッセイ（RIA）により行った。すなわち、ポリスチレンチューブ内で、RIA緩衝液〔25 mmol/L  EDTA、80 mmol/L塩化ナトリウム、0.05％アジ化ナトリウム、0.5％N-エチルマレイミド処理BSA、0.5％トリトンX-100を含む50 mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）〕で段階的に希釈した抗血清100μLに、一定量の［１２５I］標識したペプチド（約20000 cpm、500〜550 Bq、ペプチド量として約9 fmol）を含むRIA緩衝液100μLを添加し、4℃で40時間インキュベートし、抗血清中の抗体と標識したペプチドを結合させた。対照として、非特異結合を測定するため、抗血清の代わりに、抗血清を含まないRIA緩衝液を用いた反応も行った。インキュベート後、1％ウシγ-グロブリン（シグマ-アルドリッチ社製）溶液〔80 mmol/L塩化ナトリウム、0.05％アジ化ナトリウムを含む50 mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）〕100μLを添加して混合し、さらに23％ポリエチレングリコール#6000（ナカライテスク社製）溶液〔80 mmol/L塩化ナトリウム、0.05％アジ化ナトリウムを含む50 mmol/Lリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）〕500μLを添加して混合し、氷上で10分以上静置した後、3000 rpmで15分間遠心分離して、免疫複合体を沈殿させた。抗体と結合していない［１２５I］標識したペプチドが含まれる上清を吸引して除き、γ-カウンターで沈殿の放射活性Ａ（cpm）を測定した。非特異結合の反応チューブについても同様にして放射活性Ｎ（非特異結合量；cpm）を測定し、沈殿の放射活性の値Ａから非特異結合量Ｎの値を差し引いた値を抗血清の特異的結合量とした。反応に用いた［１２５I］標識したペプチド１を含むRIA緩衝液100μLの放射活性Ｔ（cpm）をγ-カウンターで測定し、添加した抗原ペプチドの放射活性に対する特異的結合量の割合Ｘ（％）を以下の式で求めた。抗血清の希釈率とＸとをプロットし、Ｘが30％になる希釈率の逆数を抗体価の指標とした。【０１２１】
Ｘ（％）＝｛（Ａ−Ｎ）／Ｔ｝×１００【０１２２】
抗原ペプチドの［１２５I］標識はラクトペルオキシダーゼ法により、抗原ペプチドのN末側にチロシン残基を付加したペプチドを合成し、これを標識した。すなわち、該ペプチド10μgを0.4 mol/L酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.6）25μLに溶解させ、200 ngのラクトペルオキシダーゼを含む0.1 mol/L酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.6）溶液10μL、3.7 MBq／μL  Na１２５I  5μL（18.5 MBq）、0.002％過酸化水素5μLを添加して撹拌し、30℃で10分間反応させた。さらに0.002％過酸化水素5μLを添加して撹拌し、30℃で10分間反応させた。水500μLを添加し、アセトニトリル勾配10−60％／0.1％TFAの溶媒系を用いたC18系の逆相HPLCにより、標識ペプチドを分取した。ペプチド溶液は60％アセトニトリル−0.1％TFAで希釈し、N-エチルマレイミド処理BSAを最終0.5％となるように添加後、分注して-85℃で保存した。【０１２３】
（３）抗血清の結合特異性
得られた抗血清のうち、上記の抗体価が3×10５を示した抗血清、すなわち上記のRIAにおいて、9×10５倍に希釈しても、添加した抗原ペプチドの30％が結合を示した抗血清を用いて、RIAによりVGFに由来する６種類のペプチドに対する結合特異性を調べた。すなわち、RIA緩衝液で9×10５倍に希釈した抗血清100μLに、一定量の［１２５I］標識したペプチド１（約20000 cpm、500〜550 Bq、ペプチド量として約9 fmol）を含むRIA緩衝液100μL、段階的に希釈した各VGF由来ペプチドを含むRIA緩衝液100μLを添加し、4℃で40時間インキュベートし、抗血清中の抗体に標識ペプチド１とVGF由来ペプチドを競合的に結合させた。対照として、非特異結合を測定するため、抗血清を添加せず、代わりにRIA緩衝液を用いた反応、最大結合量を測定するため、VGF由来ペプチド溶液を添加せず、代わりにRIA緩衝液を用いた反応も行った。非特異結合の反応は４連、その他の反応は２連で行い、それぞれの反応物に対し、上記の抗体価の測定と同様にして免疫複合体を沈殿させ、その放射活性（cpm）を測定した。非特異結合の反応の放射活性の平均を非特異結合量Ｎ、各VGF由来ペプチドの添加反応の放射活性の値をＹ、最大結合の反応の放射活性の値をＺとしたとき、最大結合量Ｂ０に対するペプチド添加時の抗血清の特異的結合量Ｂの割合Ｂ／Ｂ０（％）を以下の式により求めた。【０１２４】
Ｂ／Ｂ０（％）＝｛（Ｙ−Ｎ）／（Ｚ−Ｎ）｝×１００【０１２５】
抗血清が添加したペプチドにも結合する場合は、添加したペプチドが、量の増加と共に、抗血清の抗原ペプチドへの結合を競合的に阻害するので、ペプチド添加時の抗血清の特異的結合量が減少する。したがって、Ｂ／Ｂ０が50％になる、つまり最大結合量を50％阻害するペプチドの量を、そのペプチドに対する抗血清の結合の強さの指標とした。50％阻害するペプチドの量が低いほど、結合の強さが強いことになる。【０１２６】
その結果、ヒトVGFの一部である、配列番号１のC末端部分に相当する、ESPGPERVWのアミノ酸配列からなるペプチドのN末側にチロシン残基を付加したペプチドは量依存的に抗血清の結合を阻害し、該ペプチドの50％阻害の量は9.0 fmolであった。なお、VGF以外のペプチドとして、アンジオテンシンII、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、Leu-エンケファリン、ニューロメジンU-8、バソプレッシン、Met-エンケファリン-Arg-Gly-Leu、アドレノメジュリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニン、ペプチドHI、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、PAMP-20、カルシトニン受容体刺激ペプチド、ニューロテンシン、セクレチン、神経ペプチドY、β色素胞刺激ホルモン、メラニン凝集ホルモン、ソマトスタチン、グルカゴンに対する結合を、上記と同様にして1、10、100 pmolの各量のペプチドで調べたが、どのペプチドも1、10および100 pmolいずれも阻害を示さず、ヒトVGF由来のペプチドに特異的に結合する抗体であることが確認された。【０１２７】
〔実施例５〕
ラット下垂体後葉におけるAVP-eGFP蛍光の連続測定
バソプレッシン（arginine vasopressin : AVP）遺伝子に改変緑色蛍光タンパク（enhanced green fluorescent protein : eGFP）遺伝子を挿入した融合遺伝子を用いて作製したトランスジェニック（Tg）ラットは視床下部−下垂体系におけるAVPニューロンおよびその軸索に特異的にeGFPが発現している（Uetaら、Endocrinology, 146, 406-413, 2005）。本実験にはAVP-eGFP Tgラットから急性に摘出した下垂体を用いた。
Tgラットの性別は雌雄両方、体重は250〜350 gのものを用いた。実験に用いるまで、本学動物センター（温度24±1℃、湿度54±5％）にて、12時間明暗周期（明期7:00-19:00）、食餌および飲水はともに自由摂取とした。【０１２８】
頚椎脱臼したAVP-eGFP Tgラットの下垂体をすばやく摘出し、灌流液（140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1.2 mM KH２PO４, 1.2 mM MgCl２, 2 mM CaCl２, pHは7.37、浸透圧は295〜300 mOsmlになるよう調節した）で満たされた灌流装置のチャンバーに設置した。励起光照射装置（１６１C,  Spectra Physics社製）からのレーザー光（488 nm）を光ファイバー（GIF625-100,  Thorlabs社製）を通して下垂体後葉に照射した。下垂体後葉の神経終末で励起されたeGFP蛍光はもう一本の光ファイバーを通して光電管（R6249HA,  浜松ホトニクス社）で集光し、電気信号に変換した後、アンプ（C7246,  浜松ホトニクス社製）で増幅した。光電管の前には励起光を遮断するフィルタを設置し、励起光自身が感知されるのを防いだ。増幅された信号はアナログ/デジタル変換器（MacLab/4,  Castle Hill社製）を介し記録ソフト（chart v3.4,  Castle Hill社製）でコンピューターに保存した。【０１２９】
記録時間は10分間で、初めの5分は灌流液のみを投与し、対照（basal）とした。残りの5分は灌流液にペプチド１２（配列番号２８）、ペプチド１(配列番号１)、ペプチド１１（配列番号２５）を最終濃度が10−６Mとなるように混合したものを投与し、eGFP蛍光の変化を観察した。なおペプチド試薬は上記の灌流液にBSAを0.05％加えたものに溶かし、最終濃度10 nmolになるよう調節した。実験中の灌流液の温度は37±0.5℃に保持した。得られたデータとして対照（basal）時を1としたペプチド投与終了時のシグナルの減少率を示した。その結果を図３３〜図３５に示す。図３３〜図３５に示した通り、ペプチド投与によりeGFPの蛍光が減少し、下垂体後葉の神経終末に貯蔵されているAVP-eGFPが開口放出されていた。
【産業上の利用可能性】
【０１３０】
本発明により、エネルギー調節活性または循環調節活性を有する新規なペプチド、および該ペプチドと特異的に結合する抗体が提供される。また該ペプチドを利用する、該ペプチドの活性を促進または抑制する物質あるいは該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法が提供される。該ペプチド、または本発明で提供されるスクリーニング方法によって得られる該ペプチドの活性を促進または抑制する物質、あるいは該ペプチドの受容体に対するアゴニストまたはアンタゴニストはエネルギー調節活性または循環調節活性を有するので、摂食調節剤、摂水調節剤、代謝改善剤、循環調節剤、昇圧剤として有用であり、また摂食障害、摂水障害、代謝障害、睡眠障害などのエネルギー調節系の疾患、あるいは心筋梗塞、虚血性心疾患または脳梗塞等の循環系の疾患の治療に用いることができる。【０１３１】
「配列表フリーテキスト」
配列番号１−発明者：山崎基生；高橋憲行；南野直人；
発明者：佐々木一樹；高尾敏文；里見佳典；
発明者：上田陽一
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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