(57)【要約】  トロンビン溶液における、不安定なα−トロンビンの安定化方法、安定化されたα−トロンビンを含有する溶液及びこれを含む液状のフィブリノゲン測定用試薬を提供すること。  トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するα−トロンビン含量を少なくとも７０％以上とすることを特徴とするトロンビン含有溶液中のα−トロンビンの安定化方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するα−トロンビン含量を少なくとも７０％以上とすることを特徴とするトロンビン含有溶液中のα−トロンビンの安定化方法。
【請求項２】
トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するβ−及び／又はγ−トロンビン含量が３０％未満である請求項１記載の安定化方法。
【請求項３】
トロンビン含有溶液のｐＨが４〜９である請求項１又は２記載の安定化方法。
【請求項４】
全トロンビンに対してα−トロンビンを７０％以上含有することを特徴とするトロンビン含有溶液。
【請求項５】
トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するβ−及び／又はγ−トロンビンの含有比率が３０％未満である請求項４記載の溶液。
【請求項６】
ｐＨが４〜９である請求項４又は５記載の溶液。
【請求項７】
請求項４〜６の何れか１項記載のトロンビン含有溶液を含む液状のフィブリノゲン測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビン含有溶液中の不安定なα−トロンビンの安定化方法、α−トロンビンを安定化したトロンビン含有溶液、及びそれを含む液状フィブリノゲン測定用試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
フィブリノゲンは、血餅の主要タンパク質であるフィブリンの前駆物質であり、肝実質細胞で産生される。生体中のフィブリノゲンの約８０％は血漿中（健常成人で約２００〜４００ｍｇ／ｄＬ）に、残りは組織に分布している。フィブリノゲンは、ジスルフィドによって結合された３対のポリペプチド（Ａα、Ｂβ、及びγ）鎖を含む糖タンパク質であり、Ａα及びＢβ鎖がトロンビンにより分解されフィブリンとなることで血栓生成や止血血栓の主役を担っている。臨床的には炎症で増加し、高度な肝機能障害、ＤＩＣ等では減少する。【０００３】
フィブリノゲンの測定法としては、クラウス法（トロンビン添加法）、ＰＴ  ｄｅｒｉｖｅｄ法（凝固時間法）、ＴＩＡ（免疫比濁）法、ラテックス法等があり、一般的にはトロンビン添加法、すなわちクエン酸Ｎａ加血漿検体にトロンビンと塩化カルシウムを添加し、凝固する時間を測定し、既知濃度のフィブリノゲンを用いて作成した検量線から検体のフィブリノゲン濃度（ｍｇ／ｄＬ）を計算により求める方法が行われている。【０００４】
フィブリノゲン測定に用いられるトロンビンは、その前駆体であるプロトロンビンからペプチドが切り出されて凝固活性を有するα−トロンビンとなる。このα−トロンビンは低分子量の凝固活性を有さないβ−トロンビン、更にγ−トロンビンに自己分解を起こすことが知られており、長期間保存する場合は、通常、凍結乾燥されていた。【０００５】
そこで、トロンビンを溶液中で安定化する幾つかの試みも行われており、例えば、トロンビンに（１）高濃度グリセロール、ポリオール（スクロース、マンニトール、ソルビトール等）を添加する方法（特許文献１）、（２）糖、アミノ酸などを添加する方法（特許文献２）等が知られている。
しかし、これらは、液状のフィブリノゲン測定用試薬中のトロンビンの安定化方法としては効果が不十分であった。【０００６】
フィブリノゲン測定用試薬におけるトロンビンの安定化方法としては、トロンビン含有溶液にトロンビンの拮抗阻害剤を添加する方法（特許文献３）が知られている。
しかし、この方法は、トロンビンの活性を阻害することを機序とするものである。そのため、この方法を用いた場合、フィブリノゲン測定検査において重要な測定意義を持つフィブリノゲン低濃度検体では、凝固時間が極端に遅延し、場合によっては測定不能となる。このことは時間当たりの検体処理数の低下だけでなく、フィブリノゲン低濃度検体の測定不能による再検の増加につながるため、この方法は緊急検査には不向きなものであった。【０００７】
それ故、低濃度のフィブリノゲン検体においても測定不能とならず、測定時間の極端な遅延が少なく、また、低濃度検体の測定値への影響が少ない液状のフィブリノゲン測定用試薬に適用可能なα−トロンビン含有溶液中のα−トロンビンの安定化方法の開発が望まれていた。
【特許文献１】特開昭６２−１０６０２８
【特許文献２】特開昭６４−０４０４３３
【特許文献３】特開２００４−１９１３６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、トロンビン含有溶液における、不安定なα−トロンビンの安定化方法、α−トロンビンを安定化したトロンビン含有溶液及びこれを含む液状のフィブリノゲン測定用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、従来、β−トロンビンやγ−トロンビンは、単なるα−トロンビンの自己分解産物としか考えられていなかったが、α−トロンビンがα−トロンビンに作用する自己分解よりも、β−及びγ−トロンビンがα−トロンビンに作用する分解活性がより強いことを見出した。そして、全トロンビンに対するβ−及び／又はγ−トロンビンの含量を一定範囲に低く抑えることにより、全く意外にも従来は自己分解を起こすために不安定と考えられていたα−トロンビンの溶液中での安定化が可能であることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち本発明は、トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するα−トロンビン含量を少なくとも７０％以上とすることを特徴とするトロンビン含有溶液中のα−トロンビンの安定化方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、トロンビン含有溶液中のα−トロンビンの残存率の低下や活性の低下を抑制し、トロンビン含有溶液の保存安定性や品質を向上することができる。さらに、緊急検査に適した液状のフィブリノゲン測定用試薬の保存安定性や品質を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】精製トロンビンの１０−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。図の左は精製α−トロンビン、図の右は精製β−及びγ−トロンビンの混合物の像である。尚、Ａはα−トロンビンに相当するもの、Ｂはβ−及びγ−トロンビンに相当するものである。
【図２】３７℃加速試験後のα−トロンビン含量残存率。０週目の凝固時間を１００％とした。
【図３】３７℃加速試験後のトロンビン活性。０週目の凝固時間を１００％とした。
【図４】３７℃加速試験後の試料１の凝固時間の遅延。０週目の凝固時間を１００％とした。
【図５】３７℃加速試験後の試料２の凝固時間の遅延。０週目の凝固時間を１００％とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明におけるトロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するα−トロンビン含量は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。そして、トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対する、α−トロンビン含量は７０％以上且つβ−及び／又はγ−トロンビン含量は３０％未満が更に好ましく、α−トロンビン含量は８０％以上且つβ−及び／又はγ−トロンビン含量は２０％未満がより更に好ましく、α−トロンビン含量は９０％以上且つβ−及び／又はγ−トロンビン含量は１０％未満が特に好ましい。【００１４】
本発明は、後記実施例に示すとおり、全トロンビンに対するβ−及びγ−トロンビン含量が高まるにつれてβ−及びγ−トロンビンが溶液中のα−トロンビンの残存率の低下や活性を低下させるため、全トロンビンに対するα−トロンビン含量を高め、一方で全トロンビンに対するβ−及びγ−トロンビン含量を抑えることで、溶液中のα−トロンビンの保存安定性、品質を高めることができる。【００１５】
本発明におけるトロンビンとは、α−トロンビンを含むものをいい、全トロンビンとはα−トロンビン、β−トロンビン及びγ−トロンビンの全てをいう。【００１６】
本発明における全トロンビンに対するα−トロンビン含量は、トロンビンを定量的に測定することができる公知の方法にて、α−トロンビン、β−トロンビン及びγ−トロンビンの各測定値を求め、下記式（１）により求めることができる。【００１７】
全トロンビンに対するα−トロンビン含量（％）＝（α−トロンビン測定値／全トロンビン測定値の総和）×１００・・・式（１）【００１８】
また、同様にして、全トロンビンに対するβ−及び／又はγ−トロンビン含量を下記式（２）により求めることができる。【００１９】
全トロンビンに対するβ−及び／又はγ−トロンビン含量（％）＝（β−及び／又はγ−トロンビン測定値／全トロンビン測定値の総和）×１００・・・式（２）【００２０】
トロンビンを定量的に測定する方法としては、例えば、活性測定法やデンシトメトリーによる蛋白定量等が挙げられ、いずれの測定方法であってもよい。また、適宜測定前に公知の方法にてα−トロンビン及びその分解物を分離・精製してもよい。【００２１】
より具体的には、合成基質Ｓ−２２３８（第一化学薬品製）を用いた活性測定法（合成基質法）によってα−トロンビン含量を求める場合、公知のイオン交換樹脂にてα−、β−及びγ−トロンビンを分画後、各画分のＳ−２２３８に対する分解活性をそれぞれ測定し、全トロンビン活性に対するα−トロンビン活性の活性比率（％）として求めることができる。
また、デンシトメトリーを用いた場合、公知のタンパク質分析用の電気泳動にてα−、β−及びγ−トロンビン画分に分け、デンシトメトリーによりそれぞれのタンパク質含量を求めた後、全トロンビンのタンパク質含量に対するα−トロンビンのタンパク質含量の比率（％）として求めることができる。【００２２】
本発明に用いるトロンビンは、ヒト等の動物由来、遺伝子工学的手法で調製されたもの、又は市販の医薬品のいずれであってもよい。【００２３】
本発明に用いるトロンビンの調製法としては、公知のタンパク質の分離・精製法、例えば、濾過、洗浄、乾燥、再結晶、各種カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、液々分配等が挙げられる。より具体的には、陽イオン交換樹脂等のイオン交換樹脂、ベンザミジン樹脂等のアフィニティー樹脂、限界濾過膜やゲルろ過等が挙げられる。
そして、これらを適宜組み合わせて全トロンビンに対するα−トロンビン含量が高まるよう調整する。【００２４】
本発明のトロンビン含有溶液は、トロンビンを水及び／又は有機溶媒に懸濁又は溶解させた水溶液、有機溶媒溶液又は水・有機溶媒の混合溶液であり、好ましくは水溶液又は水・有機溶媒混合溶液である。当該有機溶媒としては、α−トロンビンの分解や活性阻害等、フィブリノゲン測定への影響を有するものでなければ特に限定されず、例えば、ジメチルスルホキシド、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリピレングリコール等が挙げられる。これらを１種類もしくは２種類以上を組み合わせて用いることもできる。【００２５】
本発明のトロンビン含有溶液のｐＨは、特に調整しなくともよいが、α−トロンビンの分解や活性阻害を抑制するため好ましくは４〜９であり、より好ましくは５．５〜７であり、更に好ましくは６〜６．５である。【００２６】
当該ｐＨを４〜９に調整するには、ｐＨ４〜９の範囲に緩衝能をもつ緩衝剤を適宜選択して使用することができ、例えば、クエン酸、リン酸、酢酸、イミダゾール、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳＯ、ＡＤＡ、ＭＥＳ等から１種類もしくは２種類以上を適宜組み合わせることができる。
また、当該ｐＨを５．５〜７に調整する場合や、６〜６．５に調整する場合には、例えばクエン酸、リン酸、イミダゾール、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳＯ、ＡＤＡ、ＭＥＳ等から１種類もしくは２種類以上を適宜組み合わせることができる。
これらの緩衝剤の添加量は、緩衝能を有する量であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の緩衝剤の濃度が５〜１０００ｍＭ、特に２０〜３００ｍＭであるのが好ましい。【００２７】
また、本発明のトロンビン含有溶液におけるα−トロンビンの活性量は、上記全トロンビンに対するα−トロンビン含量に応じて目的とする活性値に調整されていればよく、特に限定されない。例えば、フィブリノゲン測定用試薬に適用する場合にはα−トロンビンの活性が、公知の合成基質法にて２０〜１０００単位／ｍＬ、更に５０〜５００単位／ｍＬ、特に１００〜３００単位／ｍＬであるのが好ましい。【００２８】
本発明のトロンビン含有溶液は、以下のような公知の化合物をフィブリノゲン測定に影響のない範囲で適宜配合し、公知の製造方法にて製造することができる。【００２９】
当該トロンビン含有溶液には、フィブリノゲン測定に影響のない範囲でα−トロンビンの安定化や保存安定性向上等のために用いる公知の化合物を適宜配合してもよく、例えば、カルシウムイオン、有機酸、界面活性剤、タンパク質等を挙げることができる。【００３０】
前記カルシウムイオンの具体例としては、水溶性のカルシウム化合物が好ましく、例えば塩化カルシウム、乳酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グルクロン酸カルシウム、酒石酸カルシウム等が挙げられる。これらのカルシウム化合物は１種類もしくは２種以上を組み合わせて使用することもできる。該カルシウム化合物のα−トロンビンに対する安定化有効量は、安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中のカルシウムの濃度は、好ましくは５ｍＭ〜１００ｍＭであり、より好ましくは１０ｍＭ〜５０ｍＭである。【００３１】
前記有機酸の具体例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルコン酸、乳酸、グルクロン酸、グリコール酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルタル酸、アミノ酢酸、アミノカプロン酸等が挙げられ、遊離酸又はその塩のどちらを用いても良い。また、これらの有機酸は１種類もしくは２種以上を組み合わせて使用することができる。
当該有機酸の添加量はα−トロンビン含有溶液の安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の当該有機酸の濃度は、好ましくは１０ｍＭ〜５００ｍＭであり、より好ましくは５０ｍＭ〜２００ｍＭである。【００３２】
前記界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、及び非イオン性界面活性剤のいずれでもよく、その具体例としては、次のものが挙げられる。
陰イオン性界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、ドデシル−Ｎ−サルコシン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。
陽イオン性界面活性剤としては、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルアンモニウムブロミド、ドデシルピリジニウムクロリド等が挙げられる。
両イオン性界面活性剤としては、例えば３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、パルミトイルリゾレシチン、ドデシル−Ｎ−ベタイン、ドデシル−β−アラニン等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤としては、例えばオクチルグルコシド、ペプチルチオグルコシド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ポリオキシエチレンドデシルエーテル、ポリオキシエチレンへプタメチルヘキシルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘシリーズ）、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトールエステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）シリーズ）等が挙げられる。
これらの界面活性剤のうち、非イオン性界面活性剤が特に好ましく用いられる。また、これらの界面活性剤は１種類もしくは２種類以上を組み合わせて用いることもできる。
当該界面活性剤の添加量は、α−トロンビン含有溶液の安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばα−トロンビン含有溶液中の当該界面活性剤の濃度は、好ましくは０．００１〜１ｗ／ｖ％であり、より好ましくは０．００５〜０．１ｗ／ｖ％である。【００３３】
前記タンパク質の具体例としては、アルブミン、ゼラチン、グロブリン等を挙げることができるが、これらのタンパク質は１種類もしくは２種類以上を組み合わせて用いることもできる。
当該タンパク質の添加量は、α−トロンビン含有溶液の安定性を向上させる量であれば良く、特に限定されないが、例えばα−トロンビン含有溶液中の当該タンパク質の濃度は、好ましくは０．０５〜１０ｗ／ｖ％であり、より好ましくは０．１〜５ｗ／ｖ％である。【００３４】
さらに、本発明のα−トロンビン含有溶液には、上記以外に測定再現性を向上させるためフィブリノゲン測定に影響のない範囲で高分子多糖類及び／又は合成高分子類を配合してもよい。【００３５】
当該高分子多糖類の具体例としては、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストラン２００，０００、デキストラン５００，０００、フィコール等が挙げられる。これらの高分子多糖類は１種類もしくは２種類以上を組み合わせて用いることができる。
当該高分子多糖類の添加量は、再現性を向上させる量であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の高分子多糖類の濃度は、好ましくは０．１〜１０ｗ／ｖ％であり、より好ましくは０．３〜３ｗ／ｖ％である。【００３６】
当該合成高分子類の具体例としては、ポリビニルアルコール５００、ポリビニルアルコール１５００、ポリビニルアルコール２０００、ポリエチレングリコール１５００、ポリエチレングリコール２０００、ポリエチレングリコール４０００、ポリエチレングリコール６０００、ポリエチレングリコール８０００、ポリエチレングリコール２００００及びポリビニルピロリドン等が挙げられる。これらの合成高分子類は１種類もしくは２種類以上を組み合わせて用いることができる。
当該合成高分子類の添加量は、再現性を向上させる量であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中の合成高分子類の濃度は０．１〜１０ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．３〜３ｗ／ｖ％である。【００３７】
また、本発明のトロンビン含有溶液には、フィブリノゲン測定に影響のない範囲で適当な防腐剤を添加してもよい。当該防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、プロクリン（登録商標）３００、シプロフロキサシン、プロピオン酸もしくは安息香酸ナトリウム等が挙げられ、これらの中から１種類もしくは２種類以上を組み合わせて用いることができる。また、必要に応じて塩化ナトリウム等の塩や、アミノ酸、糖等の一般的な安定化剤等を含ませることもある。
当該防腐剤の添加量は、所定の範囲内であれば特に限定されないが、例えばトロンビン含有溶液中のプロクリン（登録商標）３００の濃度は０．００１〜１ｗ／ｖ％であり、好ましくは０．０１〜０．１ｗ／ｖ％である。尚、上記に記載の濃度は、市販のプロクリン（登録商標）３００を１００ｗ／ｖ％とした場合の濃度を記載している。【００３８】
本発明の液状フィブリノゲン測定用試薬は、上記α−トロンビン含有溶液を含み、更にフィブリノゲン測定に影響のない範囲でフィブリノゲンを測定するため通常用いる化合物を適宜配合してもよい。【００３９】
当該液状のフィブリノゲン測定用試薬は、凝固能検査試薬、特にフィブリノゲンの定量用試薬に使用することができる。具体的には、フィブリノゲン標準液を検体希釈用緩衝液で所定の濃度に希釈後、希釈フィブリノゲン標準液と液状のフィブリノゲン測定用試薬を添加し、３７℃にて凝固時間を測定する。本フィブリノゲン濃度と凝固時間の測定値を基に検量線を作成し、被検検体の凝固時間の測定値を本検量線から換算して、被検検体中のフィブリノゲン濃度を求めることができる。
また、本発明のトロンビン含有溶液を含む液状フィブリノゲン測定用試薬は、トロンビン活性阻害物質の活性、例えば、アンチトロンビン活性、ヒルジン活性、化学合成阻害剤の活性を測定することができる。【００４０】
また、本発明の液状のフィブリノゲン測定用試薬は、測定用試薬キットとしてもよく、斯かる場合には検体及び標準液を希釈するための検体希釈用緩衝液を含んでもよい。
検体希釈用緩衝液としては、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳなどのグッド緩衝液、バルビタール緩衝液を挙げることができる。当該検体希釈用緩衝液は、上記トロンビン含有溶液に加えた際に、上記トロンビン含有溶液のｐＨや濃度の範囲と成るように使用すればよい。
【実施例】
【００４１】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００４２】
（製造例１）α−トロンビン及びβ・γ−トロンビンの分離・精製
５０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ  ７．０で溶解した５万単位のトロンビン溶液をＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（２．５ｘ１１ｃｍ、ファルマシア）に吸着させ、同緩衝液で洗浄後、０．４Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液を用いた０〜０．４Ｍ  ＮａＣｌ（各３００ｍＬ）のリニアグラジエントにて溶出した。トロンビン活性を合成基質法で測定し、低いイオン強度で溶出されるβ−及びγ−トロンビン混合物（以下、β・γ−トロンビンとする。）画分と高いイオン強度で溶出されるα−トロンビン画分を回収した。
さらに、各画分のトロンビン溶液をＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（２．１ｘ６ｃｍ、ファルマシア）に吸着させ、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液で洗浄後、０．１Ｍ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む同緩衝液を用いた０−０．１Ｍ  Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ（各１００ｍＬ）のリニアグラジエントにて溶出し、精製α−トロンビン（約３万単位）と精製β・γ−トロンビン（約１万単位）を得た。なお、回収した各精製トロンビン溶液は、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４で透析した後、後記する検討に使用した。また、合成基質法によるトロンビン活性測定は、試薬１（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  クエン酸３Ｎａ、０．０５％ＢＳＡ，ｐＨ７．４）で５００倍希釈した各トロンビン含有溶液２００μＬと試薬２（Ｓ−２２８３：１ｍｇ／ｍＬ）２００μＬを加え、３７℃で１０分間反応させた後、１ｍＬの２％クエン酸を添加し、４０５ｎｍの波長で測定した。さらに、合成基質法測定値からトロンビン活性への換算は、トロンビン標準品（日本薬局方）を基に行ない、精製α−トロンビンは１２３８単位／ｍＬ、精製β・γ−トロンビンは６７７単位／ｍＬであった。【００４３】
（製造例２）各トロンビンの純度検定（デンシトメトリー）
精製α−トロンビン、並びに精製β・γ−トロンビンをＬａｅｍｍｌｉ法に従い非還元下の１０−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて分離した。ＣＢＢによる蛋白染色後、充分に脱色した後、デンシトメーター（コダックＩＳ４４０ＣＦ）にて各バンドの染色度合い（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を測定した。
その結果、表１、図１に示すように精製α−トロンビンの純度は約９５％であり（約５％はβ−及びγ−トロンビンを含む）、精製β・γ−トロンビンの純度は約８０％であった（約２０％はα−トロンビンを含む）。尚、Ａはα−トロンビンに相当するもの、Ｂはβ−及びγ−トロンビンに相当するものである。【００４４】
【表１】
2008075455.tif 000002
【００４５】
（実施例１）条件１〜５のトロンビン含有溶液の調製
条件１〜５のトロンビン含有溶液は、１００単位／ｍＬ  α−トロンビン、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．０５％  プロクリン（登録商標）３００、β・γ−トロンビンを下記に記載の活性比率で含有する５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液からなるｐＨ６．３の溶液であり、精製α−トロンビン及び精製β・γ−トロンビンを用いて調製した。【００４６】
条件１：全トロンビン活性に対するβ・γ−トロンビンの活性比率：  ５％
条件２：全トロンビン活性に対するβ・γ−トロンビンの活性比率：１０％
条件３：全トロンビン活性に対するβ・γ−トロンビンの活性比率：１５％
条件４：全トロンビン活性に対するβ・γ−トロンビンの活性比率：２０％
条件５：全トロンビン活性に対するβ・γ−トロンビンの活性比率：５０％【００４７】
（実施例２）α−トロンビン含量の安定性
条件１〜５のトロンビン含有溶液を３７℃で０，１，２週間保存したときのα−トロンビン含量の残存率を測定した。なお、α−トロンビンの含量の測定は製造例２の純度検定にて行った。【００４８】
その結果、表２及び図２に示したように、３７℃加速試験後のα−トロンビンの含量残存率は、β・γ−トロンビンの活性比率が増加するに従い低下した。β・γ−トロンビンの活性比率が５０％（条件５）のトロンビン含有溶液では３７℃・２週間保存でα−トロンビン含量残存率が５０％であったのに対し、条件４のβ・γ−トロンビンの活性比率が２０％のトロンビン含有溶液は、３７℃・２週間保存でα−トロンビン含量残存率が８１％と良好な結果が得られ、共存するβ・γ−トロンビンが少ない方が（すなわち、α−トロンビンの活性比率が大きい方が）、α−トロンビンの残存率が高かった。【００４９】
【表２】
2008075455.tif 000003
【００５０】
ここで、図２より、全トロンビンに対するβ・γ−トロンビンの活性比率とα−トロンビンの含量残存率が逆比例することから、β・γ−トロンビンの活性比率が３０％（すなわち、全トロンビン活性に対するα−トロンビンの活性比率７０％）では、３７℃・２週間保存後のα−トロンビン含量の残存率が７０％以上と予想される。また、この結果より、トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対するα−トロンビン含量は、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上であることが判る。そして、トロンビン含有溶液中の全トロンビンに対する、α−トロンビン含量は７０％以上且つβ−及び／又はγ−トロンビン含量は３０％未満が更に好ましく、α−トロンビン含量は８０％以上且つβ−及び／又はγ−トロンビン含量は２０％未満がより更に好ましく、α−トロンビン含量は９０％以上且つβ−及び／又はγ−トロンビン含量は１０％未満が特に好ましいことが判る。【００５１】
（実施例３）トロンビン活性の安定性
実施例１と同様に条件１〜５の各トロンビン含有溶液を調製し、３７℃で０，１，２週間保存したときの合成基質法での測定値よりトロンビン活性の残存率を求めた。
合成基質法による活性測定は、前記の製造例１に記載の方法を用いた。【００５２】
その結果、表３及び図３に示したように、条件５のβ・γ−トロンビンの活性比率が５０％の含有溶液では、３７℃で２週間保存後のトロンビン活性残存率は２０％以下であったのに対し、条件４のβ・γ−トロンビンの活性比率が２０％のトロンビン含有溶液では３７℃で２週間保存後のトロンビン活性残存率は約６０％と良好であり、初期のβ・γ−トロンビンの活性比率が小さいほど（すなわち、α−トロンビンの活性比率が大きいほど）、３７℃で２週間保存後のトロンビン活性残存率は増大した。【００５３】
【表３】
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【００５４】
（実施例４）各α−トロンビン含有溶液の凝固活性の安定性
実施例２で調製した条件１〜５のα−トロンビン含有溶液について、３７℃で０，１，２週間保存したトロンビン含有溶液を用い、ヒト血漿（試料１及び試料２）について凝固時間の測定を行った。本実験は、検体希釈液（ＴＣ緩衝液、シスメックス）で１０倍に希釈した血漿１００μＬに各トロンビン含有溶液を５０μＬ添加し、コアグレックス８００（シスメックス）にて凝固時間を測定した。
試料１に関する結果を表４及び図４に示し、試料２に関する結果を表５及び図５に示し、図４及び５については０週目の凝固時間を１００％とした場合の相対％で示した。【００５５】
【表４】
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【００５６】
【表５】
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【００５７】
図４及び図５より、β・γ−トロンビンの活性比率が５０％（条件５）のトロンビン含有溶液では、３７℃で２週間保存後の凝固時間の初期凝固時間に対する相対％は１２０％を超えていたのに対し、β・γ−トロンビンの活性比率が２０％以下（条件１−４）の含有溶液では、１１０％未満であった。以上より、本発明のトロンビン含有溶液は溶液中で安定であり、液状のフィブリノゲン測定用試薬として有用なことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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