(57)【要約】本発明は、植物におけるエンドリデュプリケーションを制御する遺伝子を解明し、当該遺伝子を作物の大型化に向けた育種に利用することを課題とする。  本発明によれば、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すシロイヌナズナ由来のエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子が導入され、植物細胞の核ＤＮＡ量が増加した形質転換植物、当該遺伝子を用いて植物体全体又はその一部を大型化する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの遺伝子。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１に示す塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１に示す塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子
【請求項２】
以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質
【請求項３】
以下の（ｄ）〜（ｆ）のタンパク質。
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質
【請求項４】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項１若しくは２に記載の遺伝子、又は請求項４に記載の組換えベクターが導入され、植物細胞の核ＤＮＡ量が増加した形質転換植物。
【請求項６】
植物が、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞である請求項５に記載の植物細胞の核ＤＮＡ量が増加した形質転換植物。
【請求項７】
請求項１若しくは２に記載の遺伝子、又は請求項４に記載の組換えベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを特徴とする、植物細胞の核ＤＮＡ量が増加した形質転換植物の作出方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の遺伝子を植物体内で過剰発現させることにより、植物体全体又はその一部を大型化する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物においてエンドリデュプリケーション促進活性を有する遺伝子、及び当該遺伝子を導入した形質転換植物などに関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドリデュプリケーションは、核の染色体ＤＮＡ複製が細胞分裂なしに起こる一種の細胞周期である。エンドリデュプリケーションが繰り返し起こると、核のＤＮＡ量（核相）が基本の２Ｃから倍増するので、４Ｃや８Ｃといった倍化した核ＤＮＡ量を持つ細胞が生まれる。細胞は核ＤＮＡ量の増加と比例して大きくなることが知られている。生物の大きさは、個体を構成する細胞の数と大きさで決まるので、エンドリデュプリケーションは生物の大きさを決める仕組みの１つになると考えられる。
エンドリデュプリケーションは、昆虫や哺乳類において幾つかの組織で観察されるが、植物器官の特有の特徴であり、植物の生長と他の生物の生長とを区別しうるものである。植物において、多くの器官は異なる倍数性レベルの細胞の混合物からなり、この特徴は胚軸伸長、子葉の展開、胚乳の発達において際立っている。倍数性細胞は、例えば、昆虫、哺乳類、植物などの種々の多細胞生物において共通して観察される（非特許文献１、２）。倍数性細胞は種々の発達中の組織において煩雑に見られ、分化と関係することから、倍数性は分化のマーカーであると考えられている（非特許文献３）。
幼植物体における下胚軸の伸長は、エンドリデュプリケーションによる細胞の大型化の典型である。シロイヌナズナ胚軸の細胞は、明所で生育させた芽生えでは８Ｃ（Ｃはハプロイド染色体のセットである）の核ＤＮＡを含んでおり、暗所で生育させた芽生えでは１６Ｃの核ＤＮＡを含んでいる（非特許文献４）。胚軸の倍数性レベルは植物ホルモンによって制御されることも知られている（非特許文献５）。ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ  ｔｒｉｐｌｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｌ（ｃｔｒ１）はエチレンシグナルが構成的に活性化され、外来性エチレンなしにトリプル応答性を引き起こすエチレンシグナル転移変異株であるが（Ｋｉｅｂｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｒｏｍａｎ，Ｇ．，Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｋ．Ａ．，ａｎｄ  Ｅｃｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．（１９９３）ＣＴＲ１，ａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，ｅｎｃｏｄｅｓ  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｆ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ．Ｃｅｌｌ  ７２，４２７−４４１．）、ｃｔｒ１は暗所で生育させた芽生えにおいて胚軸中の倍数性レベルが増加して３２Ｃを有する（非特許文献６）。これは、エチレンが胚軸細胞においてエンドリデュプリケーションを正に調節することを示す。
エンドリデュプリケーションはまた植物器官の発達にも関与している。トライコームは３２Ｃまでの核を含む単一の細胞からなる（非特許文献７）。エンドリデュプリケーションはまた胚乳において観察され、胚乳の発達に細胞周期関連遺伝子が関与しているという幾つかの報告がある（非特許文献８、９）。
以上から、エンドリデュプリケーションの制御は植物の生育と分化に重要な役割を果たしているといえる。
これまで、エンドリデュプリケーションを制御する因子として細胞周期関連因子が知られており、代表的にはサイクリンが挙げられる。例えば、Ｄ−型サイクリン遺伝子ＣＹＣＤ３；１はシロイヌナズナにおいて分裂組織や生育中の葉に特異的に発現するが、ＣＹＣＤ３；１を過剰発現させたトランスジェニック植物においては倍数性レベルが減少し、細胞サイズが小さくなることが報告されている（非特許文献１０）。これは、ＣＹＣＤ３；１が植物組織においてエンドリデュプリケーションを阻害することによって細胞増殖に関与することを示している。また、シロイヌナズナＡ−型サイクリン遺伝子ＣＹＣＡ２；１は、エンドリデュプリケーションがほとんど生じない孔辺細胞のような種々の細胞に発現することが報告されている（非特許文献１１，１２）。同じくＡ−型サイクリン遺伝子である、タバコＣＹＣＡ３；２をシロイヌナズナにおいて過剰発現させると、倍数性レベルが種々の組織で減少すること（非特許文献１３）、また、シロイヌナズナＣＹＣＡ２；３の機能欠失は成熟本葉において倍数性を増加させること（非特許文献１４）が報告される。従って、特にＡ−型サイクリンは植物においてエンドリデュプリケーション制御に重要な役割を有しているといえる。
このように、エンドリデュプリケーションに関する研究報告は幾つか存在するものの、植物におけるエンドリデュプリケーションのメカニズムについて解明されていない点が多く、このメカニズムを解明することが、植物の大きさを決める仕組みを理解することになり、さまざまな利用が可能となる。
【非特許文献１】Ｅｄｇａｒ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ  Ｏｒｒ−Ｗｅａｖｅｒ，Ｔ．Ｌ．（２００１）Ｅｎｄｏｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅｓ：ｍｏｒｅ  ｆｏｒ  ｌｅｓｓ．Ｃｅｌｌ  １０５，２９７−３０６．
【非特許文献２】Ｊｏｕｂｅｓ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｃ．（２０００）Ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３，７３５−７４５．
【非特許文献３】Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒ，Ｌ．，Ｂｅｅｃｋｍａｎ，Ｔ．，Ｂｅｅｍｓｔｅｒ，Ｇ．Ｔ．，Ｋｒｏｌｓ，Ｌ．，Ｔｅｒｒａｓ，Ｆ．，Ｌａｎｄｒｉｅｕ，Ｉ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｃｈｕｅｒｅｎ，Ｅ．，Ｍａｅｓ，Ｓ．，Ｎａｕｄｔｓ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｉｎｚ▲ｅ▼，Ｄ．（２００１）Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３，１６５３−１６６８．
【非特許文献４】Ｇｅｎｄｒｅａｕ，Ｅ．，Ｔｒａａｓ，Ｊ．，Ｄｅｓｎｏｓ，Ｔ．，Ｇｒａｎｄｊｅａｎ，Ｏ．，Ｃａｂｏｃｈｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｏｆｔｅ，Ｈ．（１９９７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１４，２９５−３０５．
【非特許文献５】Ｇｅｎｄｒｅａｕ，Ｅ．，Ｏｒｂｏｖｉｃ，Ｖ．，Ｈｏｆｔｅ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｔｒａａｓ，Ｊ．（１９９９）Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ．Ｐｌａｎｔａ  ２０９，５１３−５１６．
【非特許文献６】Ｇｅｎｄｒｅａｕ，Ｅ．，Ｔｒａａｓ，Ｊ．，Ｄｅｓｎｏｓ，Ｔ．，Ｇｒａｎｄｊｅａｎ，Ｏ．，Ｃａｂｏｃｈｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｏｆｔｅ，Ｈ．（１９９７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１４，２９５−３０５．
【非特許文献７】Ｍｅｌａｒａｇｎｏ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｈｒｏｔｒａ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｏｌｅｍａｎ，Ａ．Ｗ．（１９９３）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｅｎｄｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５，１６６１−１６６８
【非特許文献８】Ｓｕｎ，Ｙ．，Ｆｌａｎｎｉｇａｎ，Ｂ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｅｔｔｅｒ，Ｔ．Ｌ．（１９９９）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  Ｌ．）ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  Ｂ１−ｔｙｐｅ  ｃｙｃｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１，２４５−２５８．
【非特許文献９】Ｌａｒｋｉｎｓ，Ｂ．Ａ．，Ｄｉｌｋｅｓ，Ｂ．Ｐ．，Ｄａｎｔｅ，Ｒ．Ａ．，Ｃｏｅｌｈｏ，Ｃ．Ｍ．，Ｗｏｏ，Ｙ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｙ．（２００１）Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｏｗｓ  ａｎｄ  ｗｈｙｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．５２，１８３−１９２．
【非特許文献１０】Ｄｅｗｉｔｔｅ，Ｗ．，Ｒｉｏｕ−Ｋｈａｍｌｉｃｈｉ，Ｃ．，Ｓｃｏｆｉｅｌｄ，Ｓ．，Ｈｅａｌｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｊａｃｑｍａｒｄ，Ａ．，Ｋｉｌｂｙ，Ｎ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ａ．Ｈ．（２００３）Ａｌｔｅｒｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ，ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｄ−ｔｙｐｅ  ｃｙｃｌｉｎ  ＣＹＣＤ３．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５，７９−９２
【非特許文献１１】Ｍｅｌａｒａｇｎｏ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｈｒｏｔｒａ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｏｌｅｍａｎ，Ａ．Ｗ．（１９９３）Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｅｎｄｏｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｉｚｅ  ｉｎ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５，１６６１−１６６８．
【非特許文献１２】Ｂｕｒｓｓｅｎｓ，Ｓ．，ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  Ｅｎｇｌｅｒ，Ｊ．，Ｂｅｅｃｋｍａｎ，Ｔ．，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｃ．，Ｓｈａｕｌ，Ｏ．，Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｐ．，Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｉｎｚｅ，Ｄ．（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＣｙｃＡ２；１  ｇｅｎｅ．Ｐｌａｎｔａ  ２１１，６２３−６３１．
【非特許文献１３】Ｙｕ，Ｙ．，Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，Ｓ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｄ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｎ，Ｗ．Ｈ．（２００３）．Ｔｈｅ  ｔｏｂａｃｃｏ  Ａ−ｔｙｐｅ  Ｃｙｃｌｉｎ，Ｎｉｃｔａ；ＣＹＣＡ３；２，ａｔ  ｔｈｅ  ｎｅｘｕｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １５，２７６３−２７７７．
【非特許文献１４】Ｉｍａｉ，Ｋ．Ｋ．，Ｏｈａｓｈｉ，Ｙ．，Ｔｓｕｇｅ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｍ．，Ｏｋａ，Ａ．，ａｎｄ  Ａｏｙａｍａ，Ｔ．（２００６）Ｔｈｅ  Ａ−Ｔｙｐｅ  Ｃｙｃｌｉｎ  ＣＹＣＡ２；３  Ｉｓ  ａ  Ｋｅｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｐｌｏｉｄｙ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８，３８２−３９６．
【発明の開示】
【０００３】
従って、本発明の課題は、植物におけるエンドリデュプリケーションを制御する遺伝子を解明し、当該遺伝子を作物の大型化に向けた育種に利用することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、シロイヌナズナアクチベーションタギングラインからフローサイトメトリーによって細胞核のＤＮＡ量が増加した変異株を探索し、そのような表現型が優性に表れる幾つかの変異株を得た。これら変異株では暗所および明所で生育した芽生えにおいてＤＮＡ量が増大していた。このため、これら変異株をｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ（ｉｌｐ）と名付けた。現在までに、原因遺伝子が確認できている変異株はｉｌｐ１−Ｄ、２−Ｄ、３−Ｄ、４−Ｄ、５−Ｄ、そして７−Ｄの６系統ある。これら変異株ではＤＮＡ含量の増大に伴う細胞の大型化も観察されている。解析の一例としてｉｌｐ１−１Ｄについて、以下に述べる。原因遺伝子（ＩＬＰ１遺伝子）をプラスミドレスキュー法にて単離し、その構造及び機能解析を行った結果、ＩＬＰ１遺伝子を過剰発現させると子葉が拡大し芽生えが長くなること、ＩＬＰ１遺伝子は哺乳類ＧＣ−結合因子（ＧＣＦ）のＣ末端領域に相同な新規な核タンパク質をコードすること、前記核タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで転写抑制因子として機能すること、ＩＬＰ１遺伝子はシロイヌナズナにおいてもマウスにおいてもサイクリンＡ２の発現を抑制することが確認できた。サイクリンＡ２は、ＤＮＡが複製された後に細胞分裂を促進する働きを有する。従って、ＩＬＰ１タンパク質がサイクリンＡ２遺伝子の発現を抑制し、その結果、エンドリデュプリケーションが促進されて核ＤＮＡ量が増加すると考えられた。本発明はかかる知見により完成されたものである。
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかの遺伝子。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１に示す塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子
（ｃ）配列番号１、３、５、７、９、又は１１に示す塩基配列に対して８０％以上の相同性を有する塩基配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子
（２）  以下の（ｄ）〜（ｆ）のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子。
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質
（３）  以下の（ｄ）〜（ｆ）のタンパク質。
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質
（ｆ）配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質
（４）  （１）又は（２）に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（５）  （１）若しくは（２）に記載の遺伝子、又は（４）に記載の組換えベクターが導入され、植物細胞の核ＤＮＡ量が増加した形質転換植物。
（６）  植物が、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞である、（５）に記載の植物細胞の核ＤＮＡ量が増加した形質転換植物。
（７）  （１）若しくは（２）に記載の遺伝子、又は（４）に記載の組換えベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを特徴とする、植物細胞の核ＤＮＡ量が増加した形質転換植物の作出方法。
（８）  （１）又は（２）に記載の遺伝子を植物体内で過剰発現させることにより、植物体全体又はその一部を大型化する方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１Ａは、野生株（Ｃｏｌ−０）とｃｔｒ１−１の各細胞倍数性の相対比を示す。約５０００の核を野生株（Ｃｏｌ−０）とｃｔｒ１−１の変異株においてカウントした。
図１Ｂは、野生株（Ｃｏｌ−０）、ｃｔｒ１−１、及び３：７の比のＣｏｌ−０とｃｔｒ１−１の混合物を暗所で生育した芽生えの８Ｃ／３２Ｃと１６Ｃ／３２Ｃの比率を示す。黒いバーは変異株スクリーニングに用いたカテゴリーを示す。各倍数性測定のために、少なくとも２０芽生えを用い、３回反復した。エラーバーは標準偏差を示す。
図２Ａは、７日齢の暗所で生育させた芽生えの胚軸細胞の倍数性レベルのヒストグラムを示す。左のパネル：野生株、右のパネル：ホモ接合体ｉｌｐ１−１Ｄ、Ｘ軸：核の倍数性、Ｙ軸：細胞数。約５０００の核を野生株及びｉｌｐ１−１Ｄにおいてカウントした。
図２Ｂは、暗所及び明所で生育させた野生株及びｉｌｐ１−１Ｄの細胞倍数性の相対比を示す。少なくとも２０芽生えを倍数性分析に用い、それを３回反復した。（Ｈｙｐ．Ｄ）：暗所で生育させた芽生えの胚軸細胞、（Ｈｙｐ．ＷＬ）：明所で生育させた芽生えの胚軸細胞、（Ｃｏｔ．ＷＬ）：明所で生育させた子葉細胞。約３０００−５０００の核を野生株及びｉｌｐ１−１Ｄにおいてカウントした。
図２Ｃは、野生株の胚軸の下側部分の核のＤＡＰＩ染色を示す。
図２Ｄは、ｉｌｐ１−１Ｄの胚軸の下側部分の核のＤＡＰＩ染色を示す。
図２Ｅは、７日齢の暗所で生育させた野生株（左側２つの芽生え）とｉｌｐ１−１Ｄ（右側２つの芽生え）の形態を示す。白い矢印は胚軸と根の結合部を示す。
図２Ｆは、７日齢の暗所で生育させた野生株及びｉｌｐ１−１Ｄの芽生えの胚軸及び根の長さを示す。
図２Ｇは、７日齢の暗所で生育させた野生株及びｉｌｐ１−１Ｄの芽生えの胚軸の直径を示す。
図２Ｈは、暗所で生育させた野生株の胚軸の横断面を示す。
図２Ｉは、暗所で生育させたｉｌｐ１−１Ｄの胚軸の横断面を示す。
図２Ｊは、７日齢の明所で生育させた野生株の子葉を示す。
図２Ｋは、７日齢の明所で生育させたｉｌｐ１−１Ｄの子葉を示す。
図２Ｌは、７日齢の明所で生育させた野生株、ｉｌｐ１−１Ｄの子葉面積を示す。
（図２Ｆ，Ｇ，Ｌでは少なくとも２０芽生えを測定した。図２Ｂ，Ｆ，Ｇ，Ｌのバーは標準偏差を示す。図２Ｃ、Ｄのバーは１０μｍ、図２Ｅ，Ｊ，Ｋのバーは５ｍｍ、図２Ｈ、Ｉのバーは１００μｍを示す。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ：図２Ｆ，Ｇ，Ｌの＊０．００１＞ｐ対野生株。）
図３Ａは、ｉｌｐ１−１ＤにおけるＴ−ＤＮＡ挿入部位を示す。バーを有する三角形はｉｌｐ１−１ＤにおけるアクチベーションタギングＴ−ＤＮＡ挿入部位を示す。バー上の黒ラインはＲＢ近くのＣａＭＶ  ３５Ｓエンハンサーの４つのコピーを示す。小さい白及びグレーの三角印はそれぞれｉｌｐ１−１（ＳＡＬＫ＿０３０６５０）とｉｌｐ１−２（ＳＡＬＫ＿１３５５６３）のＴ−ＤＮＡ挿入部位を示す。短い矢印は図３Ｂ、図６ＣにおけるリアルタイムＰＣＲのためのプライマー位置を示し、長い矢印は図４Ｂにおけるセミ定量ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマー位置を示す。
図３Ｂは、野生株（Ｃｏｌ−０）、ｉｌｐ１−１Ｄ、及びＩＬＰ１ｏｘにおけるＡＴ５ｇ０８５５０（ＩＬＰ１）の発現を示すリアルタイムＰＣＲ分析を示す。相対発現レベル：野生株に対するｉｌｐ１−１Ｄ及びＡＴ５ｇ０８５５０（ＩＬＰ１）過剰発現株（＃２）（ＩＬＰ１ｏｘ）におけるＩＬＰ１遺伝子の発現レベル。エラーバーは標準偏差を示す。
図３Ｃは、暗所で生育させた野生株（Ｃｏｌ−０）及びＩＬＰ１ｏｘ（＃２）の各細胞倍数性の相対比を示す。約５０００の核を野生株及びＩＬＰ１ｏｘにおいてカウントした。
図３Ｄは、ＩＬＰ１タンパク質のアミノ酸配列を示す。破線で囲ったボックスはモチーフ１を、実線で囲ったボックスはモチーフ２を示す。太文字は推定上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を示す。
図３Ｅは、ＩＬＰ１モチーフ１とそのホモログのアラインメントを示す。ＩＬＰ１モチーフ１を他のタンパク質：シロイヌナズナ（ＡＴ５ｇ０９２１０）、ヒト（ＡＡＫ６８７２１）、マウス（ＡＡＫ６８７２５）、及びヒトＧＣＦ１（ＡＡＡ３５５９８）の類似の領域と並べた。ＩＬＰ１モチーフ１とそのホモログのアミノ酸同一性と相同性はシロイヌナズナでは３８％と４２％、ヒトでは２７％と４８％、マウスでは２７％と４８％、ヒトＧＣＦ１では２８％と５２％であった。
図３Ｆは、ＩＬＰ１モチーフ２とそのホモログのアラインメントを示す。ＩＬＰ１モチーフ２を他のタンパク質：シロイヌナズナ（ＡＴ５ｇ０９２１０）、ヒト（ＡＡＫ６８７２１）、マウス（ＡＡＫ６８７２５）、ショウジョウバエ（ＡＡＦ５４０７４）、ヒトＧＣＦ１（ＡＡＡ３５５９８）、及び線虫（ＮＰ４９２３４１）の類似の領域と並べた。全てのアラインメントはｃｌｕｓｔａｌＷ  ａｎｄ  Ｍａｃ  Ｂｏｘｓｈａｄｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅｓを用いて実施した。ＩＬＰ１モチーフ２とそのホモログのアミノ酸同一性と相同性はシロイヌナズナでは７２％と７７％、ヒトでは２７％と４５％、マウスでは２７％と４４％、ショウジョウバエでは２８％と４８％、ヒトＧＣＦ１では２２％と４３％、及び線虫では２５％と４４％であった。
（図３Ｅ、Ｆにおいて、グレーの文字は少なくとも３メンバーにおける機能的に保存されたアミノ酸残基を示す。黒をバックにした白抜き文字はすべてのメンバーにおいて保存されたアミノ酸残基を示す。）
図３Ｇは、ＩＬＰ１：ＧＦＰの局在化を示す。左のパネルはＩＬＰ１：ＧＦＰの蛍光を示す。右のパネルはＤＡＰＩ−染色した核の画像である。三角矢印は核を示す。実験は３回繰り返した。
図３Ｈは、暗所で生育したＩＬＰ１過剰発現体（ＩＬＰ１ｏｘ）の主根の伸長。エラーバーは標準偏差を示す。
図３Ｉは、暗所で生育したＩＬＰ１過剰発現体（ＩＬＰ１ｏｘ）の胚軸径。エラーバーは標準偏差を示す。
図３Ｊは、明所で生育したＩＬＰ４過剰発現体（ＩＬＰ４ｏｘ）の子葉面積。エラーバーは標準偏差を示す。
図４Ａは、暗所で生育させた野生株、ｉｌｐ１−１、及びｉｌｐ１−２の形態学を示す。芽生えを５日間生長させた。左から右へ芽生えの各ペアはそれぞれ野生株、ｉｌｐ１−１，ｉｌｐ１−１とｉｌｐ１−２のヘテロ接合体、及びｉｌｐ１−２である。ｉｌｐ１−１の同質野生型同胞を野生株として用いた。同じ結果がｉｌｐ１−２の野生型同胞から得られた。白い三角矢印は胚軸と根の結合部を示す。
図４Ｂは、ＩＬＰ１の発現に対するセミ定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す。左の数はＰＣＲサイクル数を示す。ＡＣＴ２をコントロールとして用いた。
図４Ｃは、３，５，及び７日齢の暗所で生育させた野生株、ｉｌｐ１−１及びｉｌｐ１−２芽生えの胚軸の長さを示す。
図４Ｄは、７日齢の明所で生育させた芽生えを示す。芽生えのアラインメントは図４Ａと同じである。白い矢印は胚軸と根の結合部を示す。
図４Ｅは、７日齢の暗所又は明所で生育させたた野生株、ｉｌｐ１−１、及びｉｌｐ１−２の根の長さを示す（Ｄ：暗所，ＷＬ：白色光）。
図４Ｆは、３，５，及び７日齢の暗所で生育させた野生株、ｉｌｐ１−１、及びｉｌｐ１−２ホモ接合体の各細胞倍数性の相対比を示す。約３０００の核を野生株、ｉｌｐ１−１、及びｉｌｐ１−２でカウントした。
（図４Ａ，Ｄにおけるバーは５ｍｍを示す。図４Ｃ，ＥのＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ：＊０．００１＞ｐ対野生株。）
図５Ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏ転写アッセイに用いた構築物を示す。ＧＡＬ４−ＩＬＰ１Ｎ：ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ＤＢ）をＩＬＰ１のＮ末端領域（アミノ酸残基１−５６７）に融合させた構築物、ＧＡＬ４−ＩＬＰ１Ｃ：ＧＡＬ４ＤＢをＩＬＰ１のＣ末端領域（アミノ酸残基４７４−９０８）に融合させた構築物、ＧＡＬ４ＩＬＰ１Ｆｕｌｌ：ＧＡＬ４ＤＢを全長ＩＬＰ１に融合させた構築物。リポータープラスミドはＧＡＬ４結合部位と０．２ｋｂのＬＵＣリポーター遺伝子の上流にあるノパリン合成プロモーター（ＮＯＳ−ｐｒｏ）を含む。参照プラスミドは構成的ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって制御されたＧＵＳ発現による転写効率をモニターするように働く。
図５Ｂは、タバコ葉におけるｉｎ  ｖｉｖｏ転写アッセイを示す。ＬＵＣ／ＧＵＳ比：ＬＵＣ発現（リポーター）をＧＵＳ発現（参照）で標準化した。エラーバーは標準偏差を示す。実験は５回繰り返した。
図６Ａは、細胞周期関連遺伝子のセミ定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＣＹＣＤ３；１，ＨＩＳＨ４，ＣＹＣＡ２；１及びＣＹＣＢ１；２はそれぞれＧ１基−，Ｓ期−，Ｇ２基−及びＭ期−特異的マーカーである。ＡＣＴ２をコントロールとして用いた。左側の数字はＰＣＲのサイクルを示す。
図６Ｂは、ＣＹＣＡ２遺伝子ファミリーメンバーのリアルタイムＰＣＲ分析を示す。ＣＹＣＡ２ファミリー遺伝子の発現レベルをＡＣＴ２発現で標準化した。相対発現レベル：野生株に対する変異株とＩＬＰ１ｏｘ株それぞれにおけるＣＹＣＡ２遺伝子の発現レベル。ＲＮＡをｉｌｐ１−１ＤとＩＬＰ１ｏｘの７日齢の暗所で生育させた胚軸から単離し（上のパネル）、ｉｌｐ１−１とｉｌｐ１−２の３日齢の暗所で生育させた胚軸から単離した（下のパネル）。エラーバーは標準偏差を示す。実験は４回繰り返した。
図６Ｃは、野生株（Ｃｏｌ−０）におけるＩＬＰ１のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。エラーバーは標準偏差を示す。数字は８日目に対するＩＬＰ１相対発現レベルを示す。実験は４回繰り返した。
図６Ｄは、ｉｌｐ１−１Ｄとｉｌｐ１−２の４つの生育ステージでの第一葉におけるＣＹＣＡ２遺伝子ファミリーのリアルタイムＰＣＲ分析を示す。ＣＹＣＡ２遺伝子ファミリーの発現レベルをＡＣＴ２発現レベルで標準化した。相対発現レベル：野生株に対する各変異系統におけるＣＹＣＡ２遺伝子の発現レベル。ＣＹＣＡ２；１発現は１２日後において野生株及びｉｌｐ１−１Ｄにおいて検出されなかった。
図６Ｅは、異なる生育段階における野生株、ｉｌｐ１−１Ｄ、及びｉｌｐ１−２の第一葉の倍数性分布パターンを示す。各倍数性のフラクションを野生株（丸）、ｉｌｐ１−１Ｄ（四角）、及びｉｌｐ１−２（黒三角）とした。ｉｌｐ１−１Ｄの同質の野生型同胞を野生株として用いた。同じ結果をｉｌｐ１−２の野生型同胞から得た。
図７Ａは、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｉｎ  ｖｉｖｏ転写アッセイに用いた構築物を示す。ｐｃＤＮＡ−ＥＣＦＰ−４０は増強シアンフルオレッセントタンパク質（ＥＣＦＰ）遺伝子を含んでおり、コントロールとして用い、ｐｃＤＮＡ−ＭｕｓＩＬＰ１−４０はマウスＩＬＰ１  ｃＤＮＡ（７３１  ａａ，ＡＡＫ６８７２５）を含んでいた。リポータープラスミドはＬＵＣ遺伝子に融合させたＣｃｎａ２プロモーター領域（転写開始部位の−１７０から＋１００ｂｐ）からなる。参照プラスミドはβ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）発現による転写効率をモニターする役割を果たす（ＣＭＶ  ｐｒｏ：ＣＭＶプロモーター，ＢＧＨ  ｐＡ：ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位）。
図７Ｂは、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるｉｎ  ｖｉｖｏ転写アッセイを示す。ＬＵＣ活性はβ−ガラクトシダーゼ活性にて標準化した（相対ＬＵＣ活性：ＥＣＦＰに対するマウスＩＬＰ１のＬＵＣ活性）。活性はトランスフェション２４時間及び４８時間後に測定した。エラーバーは標準偏差を示す。実験は４回繰り返した。
図８Ａは、ＣＹＣＡ２；１におけるＴ−ＤＮＡ挿入の遺伝子座を示す。三角印はｃｙｃａ２；１−１（ＳＡＬＫ＿１２１０７７）及びｃｙｃａ２；１−２（ＳＡＬＫ＿１３６７５０）のＴ−ＤＮＡの挿入部位を示す。
図８Ｂは、ＣＹＣＡ２；１のセミ定量的ＲＴ−ＰＣＲを示す。左側の数字はＰＣＲのサイクル数を示す。
図８Ｃは、暗所及び明所で生育させた野生株、ｃｙｃａ２；１−１、及びｃｙｃａ２；１−２ホモ接合体の細胞倍数性の相対比を示す。（Ｈｙｐ．Ｄ）：暗所で生育させた芽生えの胚軸細胞、（Ｈｙｐ．ＷＬ）：明所で生育させた芽生えの胚軸細胞、（Ｃｏｔ．ＷＬ）：暗所で生育させた芽生えの子葉細胞。ｃｙｃａ２；１−１の同質の野生型同胞を野生株として用いた。同じ結果がｃｙｃａ２；１−２の野生型同胞から得られた。約３０００の核を野生株、ｃｙｃａ２；１−１、及びｃｙｃａ２；１−２においてカウントした。エラーバーは、標準偏差を示す。
図９は、ｉｌｐ２−Ｄの表現型を示す。
Ａ．明所で生育したｉｌｐ２−Ｄの子葉におけるＤＮＡ量。上は野生型を、下はｉｌｐ２−Ｄを示す。
Ｂ．明所で生育したｉｌｐ２−Ｄの子葉の形態。上は野生型を、下はｉｌｐ２−Ｄを示す。ｉｌｐ２−Ｄは野生型より大きな子葉を有する。
Ｃ．明所で生育したｉｌｐ２−Ｄの子葉面積。エラーバーは標準偏差を示す。
Ｄ．暗所で生育したＩＬＰ２過剰発現体（ＩＬＰ２ｏｘ）の胚軸におけるＤＮＡ量。エラーバーは標準偏差を示す。
Ｅ．暗所で生育したＩＬＰ２過剰発現体（ＩＬＰ２ｏｘ）の胚軸径。エラーバーは標準偏差を示す。
Ｆ．暗所で生育したｉｌｐ２−Ｄの胚軸におけるＤＮＡ量。上は野生型を、下はｉｌｐ２−Ｄを示す。
Ｇ．暗所で生育したｉｌｐ２−Ｄの胚軸におけるＤＮＡ量。エラーバーは標準偏差を示す。
Ｈ．７日齢の暗所で生育した野生株、ｉｌｐ２−Ｄの芽生えの形態を示す。
Ｉ．暗所で生育したｉｌｐ２−Ｄの胚軸長と根長。エラーバーは標準偏差を示す。ｉｌｐ２−Ｄは野生型より根が伸長する。
Ｊ．暗所で生育したｉｌｐ２−Ｄの胚軸径。エラーバーは標準偏差を示す。ｉｌｐ２−Ｄは野生型より太い胚軸を持つ。
図１０は、ｉｌｐ３−Ｄの表現型を示す。
Ａ．暗所で生育したｉｌｐ３−Ｄの胚軸におけるＤＮＡ量。左は野生型を、右はｉｌｐ３−Ｄを示す。
Ｂ．明所で生育したｉｌｐ３−Ｄの子葉の形態。左は野生型を、右はｉｌｐ３−Ｄを示す。ｉｌｐ３−Ｄは野生型より大きな子葉を有する。
Ｃ．明所で生育したｉｌｐ３−Ｄの子葉面積。エラーバーは標準偏差を示す。
Ｄ．７日齢の暗所で生育した野生株、ｉｌｐ３−Ｄの芽生えの形態を示す。
Ｅ．暗所で生育したｉｌｐ３−Ｄの胚軸長と根長。エラーバーは標準偏差を示す。ｉｌｐ３−Ｄは野生型より根が伸長する。
Ｆ．暗所で生育したｉｌｐ３−Ｄの胚軸径。エラーバーは標準偏差を示す。ｉｌｐ３−Ｄは野生型より太い胚軸を持つ。
図１１は、ＩＬＰ４過剰発現体（ＩＬＰ４ｏｘ）の表現型を示す。
Ａ．暗所で生育したＩＬＰ４過剰発現体（ＩＬＰ４ｏｘ）の胚軸におけるＤＮＡ量。エラーバーは標準偏差を示す。
Ｂ．明所で生育したＩＬＰ４過剰発現体（ＩＬＰ４ｏｘ）の子葉面積。エラーバーは標準偏差を示す。
図１２は、ｉｌｐ５−Ｄの表現型を示す。
Ａ．暗所で生育したｉｌｐ５−Ｄの胚軸におけるＤＮＡ量。エラーバーは標準偏差を表す。
Ｂ．暗所で生育したｉｌｐ５−Ｄの胚軸の表面（電子顕微鏡像）。左は野生型を、右はｉｌｐ５−Ｄを示す。Ｉｌｐ５−Ｄは野生型より太い胚軸を持つ。
Ｃ．暗所で生育したＩＬＰ５過剰発現体（ＩＬＰ５ｏｘ）の胚軸におけるＤＮＡ量。
Ｄ．７日齢の暗所で生育した野生株、ＩＬＰ５過剰発現体（ＩＬＰ５ｏｘ）の芽生えの形態を示す。
Ｅ．暗所で生育したＩＬＰ５過剰発現体（ＩＬＰ５ｏｘ）の胚軸長と根長。エラーバーは標準偏差を示す。ＩＬＰ５ｏｘは野生型より根が伸長する。
Ｆ．暗所で生育したＩＬＰ５過剰発現体（ＩＬＰ５ｏｘ）の胚軸径。エラーバーは標準偏差を示す。ＩＬＰ５ｏｘは野生型より太い胚軸を持つ。
Ｇ．明所で生育したＩＬＰ５過剰発現体（ＩＬＰ５ｏｘ）の子葉の形態。左は野生型を、右はＩＬＰ５ｏｘを示す。ＩＬＰ５ｏｘは野生型より大きな子葉を有する。
Ｈ．明所で生育したＩＬＰ５過剰発現体（ＩＬＰ５ｏｘ）の子葉面積。エラーバーは標準偏差を示す。
図１３は、ｉｌｐ７−Ｄの表現型を示す。
Ａ．暗所で生育したｉｌｐ７−Ｄの胚軸におけるＤＮＡ量。エラーバーは標準偏差を表す。
Ｂ．ｉｌｐ７−Ｄの本葉におけるトライコームの分布。写真上は通常のトライコーム、下は分枝が１つ増加し大きくなったトライコーム。ｉｌｐ７−Ｄでは分枝が増えているもの（大型化したトライコーム）の数が野生型に比べて増加する。エラーバーは標準偏差を表す。
Ｃ．暗所で生育したＩＬＰ７過剰発現体（ＩＬＰ７ｏｘ）の胚軸におけるＤＮＡ量。エラーバーは標準偏差を示す。
Ｄ．７日齢の暗所で生育した野生株、ＩＬＰ７過剰発現体（ＩＬＰ７ｏｘ）の芽生えの形態を示す。
Ｅ．暗所で生育したＩＬＰ７過剰発現体（ＩＬＰ７ｏｘ）の胚軸長と根長。エラーバーは標準偏差を示す。ＩＬＰ７ｏｘは野生型より根が伸長する。
Ｆ．暗所で生育したＩＬＰ７過剰発現体（ＩＬＰ７ｏｘ）の胚軸径。エラーバーは標準偏差を示す。ＩＬＰ７ｏｘは野生型より太い胚軸を持つ。
Ｇ．明所で生育したＩＬＰ７過剰発現体（ＩＬＰ７ｏｘ）の子葉の形態。左は野生型を、右はＩＬＰ７ｏｘを示す。ＩＬＰ７ｏｘは野生型より大きな子葉を有する。
Ｈ．明所で生育したＩＬＰ７過剰発現体（ＩＬＰ７ｏｘ）の子葉面積。エラーバーは標準偏差を示す。
本願は、２００７年３月２８日に出願された日本国特許出願２００７−０８５５００号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
以下に、本発明について詳細に述べる。
１．エンドリデュプリケーション促進活性を有する遺伝子
本発明の遺伝子は、アクチベーションタギング法により植物遺伝子の転写を活性化した突然変異体を作成し、原因となっている遺伝子をクローニングすることにより取得できる。
具体的には、以下の手順で行うことができる。
（ｉ）  アクチベーションＴ−ＤＮＡタギング用ベクターを、アグロバクテリウムを介してシロイヌナズナのゲノムに無作為に挿入し、アクチベーションタグラインを作成する。
（ｉｉ）  タグラインより採取した種子からＴ２植物を生育させ、あらかじめ設定した表現形質（核ＤＮＡ量、胚軸の太さと長さ、子葉の大きさ、及びトライコームの分枝数と大きさなど）に関する検査項目に基づいて表現形質を記録し、同時にそのデジタルイメージも記録する。
（ｉｉｉ）  Ｔ２世代において野生型と明らかに表現形質の異なる変異株のゲノムからＴ−ＤＮＡを含んだＤＮＡ断片をプラスミドレスキュー法により回収し、その配列を決定する。
（ｉｖ）上記ＤＮＡ断片を野生型シロイヌナズナに導入して、変異体の表現形質が再現できるかどうかを調べる。
（ｖ）対応するｃＤＮＡをクローニングする。
なお、本明細書において、「Ｔ１世代」とは、形質転換を施した植物世代である「Ｔ０世代」の植物の種子から得られた植物世代を意味する。「Ｔ１世代」は、形質転換植物の最初の集合であり、その形質転換植物が持つ耐性遺伝子に対応する選択剤（例えば抗生物質や除草剤）を用いることによって選択することができる。また、「Ｔ２世代」とは、トランスジェニックであるとしてあらかじめ選択した「Ｔ１世代」植物の花を自家受粉して得られる植物世代を意味する。
アクチベーションＴ−ＤＮＡタギング用ベクターとしては、Ｗａｌｄｅｎら（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｓｉｅｎｃｅ，２５８，１３５０−１３５３，１９９２）の開発したｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴを用いることができる。本ベクターは、ＲＢに近接してＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター中のエンハンサー（−９０〜−４４０）を４つタンデムに持つバイナリーベクターである。このｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴを保有するアグロバクテリウムＧＶ３１０１（ｐＭＰ９０ＲＫ）にてシロイヌナズナを形質転換する。形質転換は、シロイヌナズナの地上部をアグロバクテリウム懸濁液に浸けて共存培養するｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法により行うことができる。
興味深い突然変異体が得られたら、転写活性化によって変異の原因となる遺伝子をクローニングする。クローニングの方法としては、プラスミドレスキュー法が好ましいが、Ｔａｉｌ−ＰＣＲ法やアダプターＰＣＲ法などを応用することが出来る。プラスミドレスキュー法の具体的な方法は、変異体のＤＮＡを精製し、種々の制限酵素で処理してサザンブロットよりバンドのサイズを確認し、挿入Ｔ−ＤＮＡを含めて約１０〜２０ｋｂの断片を与えるような制限酵素を探す。次に、ＤＮＡをその制限酵素で処理し、フェノール／クロロホルム処理し、エタノール沈殿した後、リガーゼにて自己ライゲーションを行う。これをコンピテントセル（大腸菌ＤＨ１０Ｂ）にエレクトロポレーションにて導入し、アンピシリンを含む培地にて耐性株を選択した後、通常の方法でプラスミドを選択する。得られたプラスミド中に含まれるゲノムＤＮＡ部分のＴ−ＤＮＡとの境界配列を決定し、Ｔ−ＤＮＡが挿入されたゲノム上の位置を決定する。その位置をもとにエンハンサー配列から６ｋｂ以内に翻訳開始点を持つ遺伝子をシロイヌナズナゲノムのデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｐｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｍｐｇ．ｄｅ）を用いて検索する。これらを候補遺伝子として、植物に導入した遺伝子又は組換えベクターに特異的プライマーを設計し、シロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを増幅し、クローニングする。これらのｃＤＮＡ断片をアグロバクテリウムを介して植物に導入し、変異体の表現型が再現されるかどうかを調べる。
ｃＤＮＡの塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製ＡＢＩ３７３シークエンサー、同社３１０  ＤＮＡシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。得られた塩基配列を、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエアエンジニアリング社）等のＤＮＡ解析ソフトによって解析し、得られたＤＮＡ鎖中にコードされているタンパク質コード部分を見出すことができる。
上記手法により、エンドリデュプリケーション促進活性を有する遺伝子として、ＡＴ５ｇ０８５５０（Ｚ０１０５２１）（括弧内はタグラインの名称）が単離同定され、ＩＬＰ−１と命名した。ＩＬＰ−１の塩基配列を配列番号１に、ＩＬＰ−１によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。また、上記手法により同じくエンドリデュプリケーション促進活性を有する遺伝子として、ＡＴ４ｇ２２８９０（Ｚ００９８０４）、ＡＴ５ｇ１４９６０（Ｚ０３６２２０）、ＡＴ５ｇ５６７９０（Ｚ０３２５２９）、ＡＴ４ｇ１５１４０（Ｚ０５２２８）、ＡＴ５ｇ５７４１０（Ｚ０５８０２９）が単離同定され、それぞれＩＬＰ−２，ＩＬＰ−３，ＩＬＰ−４，ＩＬＰ−５，ＩＬＰ−７と命名した。ＩＬＰ−２，ＩＬＰ−３，ＩＬＰ−４，ＩＬＰ−５，ＩＬＰ−７の塩基配列をそれぞれ配列番号３、５、７、９、１１に、またそれらによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４、６、８、１０、１２にそれぞれ示す。以下、これらのエンドリデュプリケーション促進活性を有する遺伝子群をＩＬＰ遺伝子と称する。
本発明に使用するＩＬＰ遺伝子は、エンドリデュプリケーション促進活性を有する限り、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
ここで、欠失、置換若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により欠失、置換、若しくは付加できる程度の数をいい、好ましくは、１個から数個である。例えば、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２のいずれかに示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。また、ここにいう「変異」は、主には公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異を意味するが、天然に存在する同様の変異であってもよい。
また、本発明の遺伝子には、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつエンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。上記８０％以上の相同性は、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性をいう。配列の同一性は、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
ここで、「エンドリデュプリケーション」とは、細胞分裂を伴わないでＤＮＡ複製する特殊な細胞周期をいい、「エンドリデュプリケーション促進活性」は、前記細胞周期を促進し、植物細胞の核ＤＮＡ量を増加させる活性をいう。
また、「エンドリデュプリケーション促進活性を有する」とは、上記の活性が、配列番号２、４、６、８、１０、又は１２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
本発明に係るＩＬＰ遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９、又は１１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、エンドリデュプリケーション促進活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含む遺伝子であってもよい。
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１、３、５、７、９、又は１１のいずれかに示す塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましく９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
当業者であれば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１０  Ｓｋｙｌｉｎｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ（１９８９））等を参照することにより、こうしたホモログ遺伝子を容易に取得することができる。また、上記の配列の相同性は、同様に、ＦＡＳＴＡ検索やＢＬＡＳＴ検索により決定することができる。
本発明に用いるＩＬＰ遺伝子は、それぞれの塩基配列の情報に基づいて設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。またＩＬＰ遺伝子は、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、当該ＩＬＰ遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいはＩＬＰ遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
上記アミノ酸の欠失、付加、及び置換は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異が導入される。
２．組換えベクター
植物形質転換に用いる本発明の組換えベクターは、上記ＩＬＰ遺伝子（以下、「目的遺伝子」ともいう）を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、例えば、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特にｐＢＩ系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことが可能である。一方、ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＧＶ３１０１、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５あるいはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ  ＬＢＡ１３３４等に、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質導入に用いる。
また、上記の方法以外にも、三者接合法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：８７１１（１９８４））によって、目的遺伝子を含む植物感染用アグロバクテリウムを調製することができる。すなわち、目的遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌、ヘルパープラスミド（例えば、ｐＲＫ２０１３等）を保有する大腸菌、及びアグロバクテリウムを混合培養し、リファンピシリン及びカナマイシンを含む培地上で培養することにより植物感染用の接合体アグロバクテリウムを得ることができる。
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
また、目的遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、目的遺伝子の上流、内部、あるいは下流に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、バイナリーベクター系を使用するための複製開始点（Ｔｉ又はＲｉプラスミド由来の複製開始点など）、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。
エンハンサーとしては、例えば、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域などが挙げられる。
ターミネーターとしては、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などが挙げられる。
また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
３．形質転換植物及びその作出方法
本発明の形質転換植物は、上記遺伝子又は組換えベクターを対象植物に導入することによって作出することができる。本発明において「遺伝子の導入」とは、例えば公知の遺伝子工学的手法により、目的遺伝子を上記宿主植物の細胞内に発現可能な形で導入することを意味する。ここで導入された遺伝子は、宿主植物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。
上記遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、例えば、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ法）がある。プロトプラストを用いる場合は、ＴｉプラスミドないしはＲｉプラスミドをもつアグロバクテリウム（それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）と共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。また種子あるいは植物体を用いるｉｎ  ｐｌａｎｔａ法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物（芽生え）、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。これらの植物形質転換法は、「島本功、岡田清孝  監修、新版  モデル植物の実験プロトコール遺伝学的手法からゲノム解析まで（２００１）、秀潤社」などの一般的な教科書の記載に従って行うことができる。
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＩＬＰ遺伝子特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。さらに、その植物細胞からタンパク質を抽出し、２次元電気泳動を行って分画し、ＩＬＰ遺伝子がコードするタンパク質のバンドを検出することにより、植物細胞に導入されたＩＬＰ遺伝子が発現されていること、すなわちその植物が形質転換されていることを確認してもよい。続いて、検出されたタンパク質についてエドマン分解等によりＮ末端領域のアミノ酸配列決定し、配列番号２、４、６、８、１０又は１２のＮ末端領域のアミノ配列と一致するかどうかを確認することにより、その植物細胞の形質転換をさらに実証することができる。
あるいは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等の遺伝子を目的遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、該ベクター導入したアグロバクテリムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することによっても確認できる。
本発明において形質転換に用いられる植物としては単子葉植物又は双子葉植物のいずれであってもよく、例えば、アブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ等）、イネ科（イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、等）、ナス科（トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ等）、マメ科（ダイズ、エンドウ、インゲン等）、ヒルガオ科（サツマイモ等）、トウダイグサ科（キャツサバ等）、バラ科（イチゴ等）等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂等の植物器官、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物培養細胞のいずれであってもよい。またｉｎ  ｐｌａｎｔａ法適用の場合、吸水種子や植物体全体を利用できる。
本発明において、形質転換植物とは、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、穀実、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、又は植物培養細胞（例えばカルス）のいずれをも意味するものである。
植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、以下のように行うことができる。
まず、形質転換の対象とする植物材料として植物組織又はプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞及び組織等）で貯蔵等を行ってもよい。
本発明の形質転換植物は、当該遺伝子を導入した植物体（形質転換された細胞やカルスから再生された植物体を含む）の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫の植物体、及びその子孫植物体の組織や器官等の一部（種子、プロトプラストなど）も包含するものとする。本発明の形質転換植物は、ＩＬＰ遺伝子を導入して形質転換した植物体から、種子、プロトプラストなどの繁殖材料を取得し、それを栽培又は培養することによって量産することができる。
上記のようにして得られる形質転換植物は、ＩＬＰ遺伝子の発現により植物細胞の核ＤＮＡ量が増加する。その結果、当該形質転換植物は、大型化の育種が実現できる。従って、本発明によれば、ＩＬＰ遺伝子やそのホモログ遺伝子を植物に導入し、植物体内で過剰発現させることにより植物体全体又はその一部を大型化する方法もまた提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものでない。
〔材料及び方法〕
後記各実施例において用いた材料及び方法は以下のとおりである。
（１）植物材料及び生育条件
全ての植物は抗生物質添加又は無添加の１０ｍｇ／ｍｌショ糖を含むＧＭプレート（ＧＭ，Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ，Ｄ．，Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｌｉｊｓｅｂｅｔｔｅｎｓ，Ｍ．（１９８８）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉｎａｎａ  ｒｏｏｔ  ｅｘｐｌａｎｔｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，５５３６−５５４０．）上で生育させた。植物は温度制御インキュベーション室内で白色光条件下（明所生育子葉に対して１５Ｗ／ｍ２又は明所生育胚軸に対して５Ｗ／ｍ２）又は完全な暗所にて２２℃で生育させた。ＳＡＬＫ  Ｔ−ＤＮＡ挿入変異株をＣｏｌ−０に２回戻し交配し、生理学的実験のために変異株を純化した。
（２）倍数性分析
核を抽出し、製造業者のプロトコルに従ってＣｙＳｔａｉｎ  ＵＶ  ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｐ（Ｐａｒｔｅｃ  ＧｍｂＨ，Ｍ▲ｕ▼ｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色した。フローサイトメトリー分析をＰｌｏｉｄｙ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｐａｒｔｅｃ  ＧｍｂＨ，Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって行った。
（３）ＩＬＰ１，２，３，４，５，７過剰発現トランスジェニック系統の作出
それぞれ遺伝子の全コード領域にまたがるｃＤＮＡをＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡライブラリー（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から、下記のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。
2008120410.tif 000002
2008120410.tif 000003
得られたＩＬＰ１、２のｃＤＮＡをＫｐｎＩ及びＳａｌＩもしくはＳａｃＩで消化し、ｐＰＺＰＹ１２２（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｙ．，Ｄｅｎｇ，Ｘ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｉ，Ｍ．（２００１）ＣＩＰ４，ａ  ｎｅｗ  ＣＯＰ１  ｔａｒｇｅｔ，ｉｓ  ａ  ｎｕｃｌｅｕｓ−ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｐｈｏｔｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １３，３９９−４１１．）の誘導体であるｙｙ４５ベクター（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｙ．ら、同上）にクローニングした。
ＩＬＰ３、４、５、７は上記のプライマーセットを用いてＰＣＲ法によりｃＤＮＡを増幅した。増幅したＰＣＲ断片をｐＤＯＮＲ２０７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）ベクターへＧＡＴＥＷＡＹ法のＢＰ反応によりクローニングした。それぞれのｃＤＮＡが組み込まれたｐＤＯＮＲ２０７ベクターから、ＧＡＴＥＷＡＹ法のＬＲ反応によりｐＢＩ系のｐＢＩＤＡＶＬ−ＧＷＲ１バイナリーベクター（Ｎａｋａｚａｗａ  Ｍ，Ｉｃｈｉｋａｗａ  Ｔ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ａ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｈ，Ｔｓｕｈａｒａ  Ｙ，Ｋａｗａｓｈｉｍａ  Ｍ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｋ，Ｍｕｔｏ  Ｓ，Ｍａｔｓｕｉ  Ｍ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔａｇｇｉｎｇ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｄｉｓｓｅｃｔ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２００３  ３４：７４１−７５０．）へクローニングした。
作製したバイナリーベクターをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＧＶ３１０１株）にエレクトロポレーションによってトランスフェクトし、ｙｙ４５ベクターの場合、形質転換体を７０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地上で選択した。ｐＢＩＤＡＶＬ−ＧＷＲ１を導入したアグロバクテリウムは２５μｇ／ｍｌのカナマイシン培地で選抜した。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＷＴ（Ｃｏｌ−０）をｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ法によって形質転換した（Ｃｌｏｕｇｈ，Ｓ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｂｅｎｔ，Ａ．Ｆ．（１９９８）Ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ：ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６，７３５−７４３．）。ｙｙ４５を形質転換した芽生えは、５０μｇ／ｌカナマイシンと１００μｇ／ｌセファロタキシムを含むＧＭ上で、ｐＢＩＤＡＶＬ−ＧＷＲ１では５０μｇ／ｌハイグロマイシンと１００μｇ／ｌセファロタキシム選抜した。
（４）細胞内タンパク質局在
ＩＬＰ１：ＧＦＰのために、ＧＦＰを下記のプライマー（ＧＦＰｎ−ＦとＧＦＰｎ−Ｒ）を用いてｙｙ２１７から増幅した。
2008120410.tif 000004
ＧＦＰ断片をＸｂａＩ及びＳａｃＩで消化し、ｙｙ４５にクローニングした（ｙｙ４５ＧＦＰｎ）。ＩＬＰ１  ｃＤＮＡをＩＬＰ１−ＦとＩＬＰ−Ｒ２−ＳＡＬ（５’−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＣＴＧＣＣＴＣＣＴＴＡＡＧＡＴＴＧ−３’：配列番号２７）プライマーを用いてＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙから増幅し、ｙｙ４５ＧＦＰｎのＫｐｎＩ及びＳａｌＩ部位にクローニングしてＩＬＰ１：ＧＦＰを作製した。タマネギ表皮細胞を剥がし、ＧＭプレートに置いた。ＩＬＰ１：ＧＦＰ構築物を製造業者のプロトコルに従い金粒子（１μｍ直径）に搭載した。粒子をＢｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてタマネギ表皮細胞に送達させた。衝撃パラメータは、ｒａｐｔｕｒｅ  ｄｉｓｃ  ｂｕｒｓｔｉｎｇ  ｐｒｅｓｓｕｒｅを６００ｐｓｉ、標的組織までの距離を９ｃｍとした。ＧＦＰ蛍光を衝撃１８時間及び３６時間後、ＢＸ６０  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）によって観察した。
（５）セミ定量ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＰＣＲ分析
（５−１）セミ定量ＲＴ−ＰＣＲ
セミ定量逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）分析は既報（Ｋｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ，Ｔ．，Ｍａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｉ，Ｍ．（２００１）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｇｈｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ｖｉａ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ６，６０７−６１７．）に記載の通り行った。種子を、ショ糖を含むＧＭプレート上に撒き、プレートを５日間処理し、２２℃にて白色光下で３日間インキュベートした。芽生えを収穫し、全ＲＮＡを既報（Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ，Ｔ．，Ｎａｇａｔａ，Ｎ．，Ｓｈｉｍａｄａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｉ，Ｍ．（１９９９）Ａｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ，ＣＤＣ２ｂ，ｐｌａｙｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｅｄｌｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｄａｒｋｎｅｓｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１，１８８３−１８９６．）に記載の通り単離した。
細胞周期関連遺伝子の発現解析（図６Ａ）を行う際、各遺伝子の増幅用プライマーセットとしては既報のものを用いた。ＣＹＣＡ２；１，ＣＹＣＢ１；２，及びＣＹＣＤ３；１  ｃＤＮＡ増幅のために用いたプライマーセットはＲｉｃｈａｒｄ，Ｃ．，Ｇｒａｎｉｅｒ，Ｃ．，Ｉｎｚ▲ｅ▼，Ｄ．，ａｎｄ  Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒ，Ｌ．（２００１）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．５２，１６２５−１６３３．に記載されている。ＨＩＳＨ４  ｃＤＮＡ増幅に用いるプライマーセットはＭａｒｉｃｏｎｔｉ，Ｌ．，Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｂ．，Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｒ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｒ．，Ｂｅｒｇｏｕｎｉｏｕｘ，Ｃ．，Ｃｅｌｌａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｌｂａｎｉ，Ｄ．（２００２）Ｔｈｅ  Ｅ２Ｆ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ／Ｅ２Ｆ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，９９１１−９９１９．に記載されている、ＡＣＴ２  ｃＤＮＡ増幅に用いるプライマーはＨｉｍａｎｅｎ，Ｋ．，Ｂｏｕｃｈｅｒｏｎ，Ｅ．，Ｖａｎｎｅｓｔｅ，Ｓ．，ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  Ｅｎｇｌｅｒ，Ｊ．，Ｉｎｚｅ，Ｄ．，ａｎｄ  Ｂｅｅｃｋｍａｎ，Ｔ．（２００２）Ａｕｘｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅａｒｌｙ  ｌａｔｅｒａｌ  ｒｏｏｔ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４，２３３９−２３５１．に記載されている。
ＣＹＣＡ２；１のＴ−ＤＮＡ挿入変異系統（ｃｙｃａ２；１−１，ｃｙｃａ２；１−１）におけるＣＹＣＡ２；１の発現解析（図８Ｂ）には以下のプライマーセットを用いた。また、ｉｌｐ１−１Ｄ及びＩＬＰ１ｏｘにおけるＩＬＰ１の発現解析（図４Ｂ）には、前記配列番号１３及び１４に示すプライマーセットを用いた。
2008120410.tif 000005
（５−２）リアルタイムＰＣＲ分析
リアルタイムＰＣＲはＭｘ３０００Ｐ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，ＣＡ）のプロトコルに従って実施した。全ＲＮＡを上述したようにＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて芽生えから単離し、これを鋳型として、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて製造業者の指示に従って第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲにはＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｒｅａｌｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を用い、Ｍｘ３０００Ｐ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，ＣＡ）によって分析した。ＩＬＰ１遺伝子（図３Ｂ，図６Ｃ）とＣＹＣＡ２遺伝子ファミリー（図６Ｂ，図６Ｄ）の発現レベルを調査するために、以下のプライマーセットを用いた。
2008120410.tif 000006
2008120410.tif 000007
（６）光学顕微鏡法
植物材料を２０ｍＭカコジル酸ナトリウムを含む緩衝液中４％パラホルムアルデヒドで４℃にて２４時間固定化し、エタノールシリーズで脱水し、それからＴｅｃｈｎｏｖｉｔ７１００樹脂（Ｋｕｌｚｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｗｅｈｒｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に包埋した。切片（２．５μｍ厚さ）を超ミクロトーム上においてグラスナイフでカットし、カバースリップ上に置き、乾燥させた。それらを０．１Ｍリン酸緩衝液生理食塩水（ｐＨ７．０）中で１％トルイジンブルーにて３０秒間染色し、その後、蒸留水にて１０秒間洗浄した。試料はＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）にて観察した。
（７）ｉｎ  ｖｉｖｏ転写アッセイ
ＮＯＳプロモーターの−１５０から＋５領域を、プライマー：５’−ＧＧＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＣＧ  ＧＧＴ  ＴＴＣ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＡ  ＡＴＧ−３’（配列番号４４）及び５’−ＣＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＡＴＴ  ＧＧＡ  ＴＡＣ  ＣＧＡ  ＧＧ−３’（配列番号４５）を用いてｐＭＡ５６０（Ｍａ，Ｊ．，Ｐｒｚｉｂｉｌｌａ，Ｅ．，Ｈｕ，Ｊ．，Ｂｏｇｏｒａｄ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８８）Ｙｅａｓｔ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ３３４，６３１−６３３．）からＰＣＲによって増幅した。増幅断片をＢａｍＨＩ及びＸｂａＩで増幅し、ｙｙ７６のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ部位にクローニングし（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｇ，Ｘ．Ｗ．（１９９８）Ａ  ｎｅｗ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  ＧＡＬ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，２１７−２２０．）、得られたクローン内のＸｂａＩ部位とＧＵＳとの間に存在する第２のＢａｍＨＩ部位を残した。このクローン、ｙｙ７８をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＢＩＬ２２１（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｍ．，Ｔｓｕｎｏｄａ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｏｂｏｋａｔａ，Ｊ．（２００２）Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅｓ  ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  ｌａｃｋ  ＴＡＴＡ−ｂｏｘｅｓ：ａ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ  Ｉ  ｇｅｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ  ｌｉｇｈｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  ｉｎｉｔｉａｔｏｒ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２９，１−１０．）のＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしてｙｙ９７を得た。ｙｙ９７プラスミドは本アッセイのためにＧＭ２１６３（Ｄａｍ−／Ｄｃｍ−）株から調製した。エフェクタープラスミドを作製するために、種々の長さのＩＬＰ１  ｃＤＮＡをＧＡＬ−ＩＬＰ１  Ｆｕｌｌに対してはＩＬＰ１−ＦとＩＬＰ１−Ｒプライマー、ＧＡＬ４−ＩＬＰ１Ｎに対してはＩＬＰ１−ＦとＩＬＰ１−Ｎｏ  ２−Ｒ（５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＧＴＧＣＴ−３’：配列番号４６）プライマー、及びＧＡＬ４−ＩＬＰ１Ｃに対してはＩＬＰ１−Ｎｏ  ５−Ｆ（５’−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＴ−３’：配列番号４７）とＩＬＰ１−Ｒプライマーを用いて増幅した。得られたｃＤＮＡをＫｐｎＩとＳａｌＩで消化し、ｙｙ６４（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｇ，Ｘ．Ｗ．（１９９８）Ａ  ｎｅｗ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  ＧＡＬ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，２１７−２２０．）のＫｐｎＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングした。タバコ葉（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ  ＳＲ１）に対し、遺伝子銃法を上記のようにして実施した。ルシフェラーゼ活性をＬｕｍａｔ  ＬＢ９５０７  ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＭＡ）で測定した。
（８）細胞培養及びトランスフェクション
マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）で培養した。トランスフェクションのために、約２．０ｘ１０５のＮＩＨ３Ｔ３細胞を１２−ウェルタイタープレートの各ウェルに撒いた。ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）で２日間培養後、トランスフェクションをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いて実施した。トランスフェクション２４時間及び４８時間後、ルシフェラーゼ活性をＴＤ−２０／２０ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を用い、製造業者のプロトコルに従って測定した。マウスＩＬＰ１遺伝子を下記のプライマーセットを用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞から調製した全ＲＮＡから増幅し、それをシーケンスによって確認した。ＰＣＲ断片はＧＡＴＥ−ＷＡＹ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を用いてｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０にクローニングした。
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［結果］
【実施例１】
【０００６】
エンドリデュプリケーション変異株の分類
暗所で生育させたシロイヌナズナ芽生えを用い、胚軸細胞の倍数性レベルを測定した。スクリーニング条件を定めるために、陽性コントロールとしてエチレンシグナル伝達変異株ｃｔｒ１−１（Ｇｅｎｄｒｅａｕ，Ｅ．，Ｔｒａａｓ，Ｊ．，Ｄｅｓｎｏｓ，Ｔ．，Ｇｒａｎｄｊｅａｎ，Ｏ．，Ｃａｂｏｃｈｅ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｈｏｆｔｅ，Ｈ．（１９９７）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１４，２９５−３０５．）を用いた。暗所で生育させたｃｔｒ１−１では３２Ｃピークが顕著に増加した。２Ｃ，４Ｃ，８Ｃ及び１６Ｃを含む他の倍数性ピークもまた野生株（Ｃｏｌ−０）と同様にｃｔｒ１−１では異なる比率であったが現れた（図１Ａ）（Ｇｅｎｄｒｅａｕ，Ｅ．ら，（１９９７）、同上）Ｏｒｂｏｖｉｃ，Ｖ．，Ｈ▲ｏ▼ｆｔｅ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｔｒａａｓ，Ｊ．（１９９９）Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ．Ｐｌａｎｔａ  ２０９，５１３−５１６．）。生育プレートにショ糖を有するスクリーニング条件下では、暗所で生育させた胚軸において３２Ｃの細胞を観察できた。
ｃｔｒ１−１と野生株の８Ｃ／３２Ｃと１６Ｃ／３２Ｃの相対比を算出した。また、ヘテロ接合性で表現型が表れる優性変異の遺伝を再現するため、３：１の代わりに７：３の割合でｃｔｒ１−１芽生えと野生型を混合し、これについても上記の相対比を算出した。８Ｃ／３２Ｃに対しては１．０未満、１６Ｃ／３２Ｃに対しては２．０未満というスクリーニング基準を設定し（図１Ｂ）、これらの数値を優性倍数体変異株の単離のために用いた。
各Ｔ２アクチベーションタグラインに対して約２０芽生えを用いた。本スクリーニングでは、劣性変異株はＴ２種子の４分の１しか出現せず、この頻度では倍数性レベルに何らかの相違があっても野生型のパターンにおいて隠れてしまうだろうから、劣性変異株を単離することは困難である。機能獲得（ｇａｉｎ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）又は優性変異については、変異同胞は集団の４分の３に出現し、フローサイトメトリーによってモニターすることができる。また、暗所で生育させた芽生えは収穫が容易で条件が再現可能であるので、本アッセイに用いた。
４５００の独立したアクチベーションタギングライン（Ｎａｋａｚａｗａ，Ｍ．，Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．，Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｍｕｔｏ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｉ，Ｍ．（２００３）Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔａｇｇｉｎｇ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｄｉｓｓｅｃｔ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３４，７４１−７５０．；Ｉｃｈｉｋａｗａ，Ｔ．，Ｎａｋａｚａｗａ，Ｍ．，Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｍ．，Ｍｕｔｏ，Ｓ．，Ｇｏｈｄａ，Ｋ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．，Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ａ．，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ，Ｔ．，Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｔｓｕｈａｒａ，Ｙ．，Ｉｉｚｕｍｉ，Ｈ．，Ｇｏｔｏ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｉ，Ｍ．（２００３）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  １１７２  Ｔ−ＤＮＡ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｔａｇｇｉｎｇ  ｌｉｎｅｓ  ｔｈａｔ  ｓｈｏｗｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  Ｔ１  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３６，４２１−４２９．；ｈｔｔｐ：／／ｒａｒｇｅ．ｇｓｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｔａｇ／ｔｏｐ．ｐｈｐ）から１７の優性変異株を単離した。
これらの変異株は倍数性細胞の数が増加しており、ｃｔｒ１−１変異株と同様に暗所で生育させた芽生えの胚軸において高い３２Ｃ倍数性ピークを示した。これらの１７個の変異株は胚軸の長さ、根の長さ、及び光への依存性によって２つのグループに分類された。それらをグループ１及びグループ２と名付けた（表１）。
【表１】
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グループ１に属する１２個の変異株は野生株に比べて暗所及び明所で生育させた芽生えにおいて増加した倍数性レベル示した。それらは野生株より長い根を有していたが胚軸の長さはほとんど同じであった。グループ２では、５個の変異株が暗所でのみ増加した倍数性を有しており、明所では野生株とほとんど同じ倍数性レベルであった。このことはグループ２の表現型が光依存性であることを示した。それらはまた暗所で生育させた芽生えより長い胚軸を有していた。
【実施例２】
【０００７】
優性変異株ｉｌｐ１−１Ｄの特徴づけ
グループ１に属する変異株のうちのひとつ、ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｌｏｉｄｙ１−１Ｄ（ｉｌｐ１−１Ｄ）と称する優性変異株Ｚ０１０５２１の特徴付けを行った。暗所で生育させた芽生えの胚軸は、前記アッセイでは３２Ｃの倍数性レベルを有していた（図２Ａ）。ホモ接合性のｉｌｐ１−１Ｄもまた、３２Ｃレベルの細胞を有していたが、暗所では野生株（Ｔ−ＤＮＡ挿入のない同種同胞）と比較して３２Ｃピークが大きかった（図２Ａ）。この結果は各倍数性レベルについて全細胞数を比べたときより明白であった（図２Ｂ）。暗所で生育させた胚軸では、３２Ｃ細胞の割合が野生株に比べてｉｌｐ１−１Ｄにおいて顕著に増加した。ｉｌｐ１−１Ｄでは、８Ｃ／３２Ｃと１６Ｃ／３２Ｃの数値がそれぞれ０．４４と１．３であり、設定した前記のスクリーニング基準にあてはまった。この結果は、エンドリデュプリケーションの程度が本変異株において増加したことを示した。
暗所で生育させた胚軸を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色することによって核体積の増加を測定した。ｉｌｐ１−１Ｄ芽生えは野生株に比べてはるかに拡大した核を有していた（図２Ｃ及び図２Ｄ）。明所では、野生株胚軸は本アッセイにおいて最大１６Ｃの細胞を含んでおり、その１６Ｃ細胞の割合はｉｌｐ１−１Ｄにおいて増加した（図２Ｂ）。明所で生育させたｉｌｐ１−１Ｄの子葉は胚軸細胞と同様、１６Ｃ細胞の数が増加していた（図２Ｂ）。
【実施例３】
【０００８】
ｉｌｐ１−１Ｄ表現型の解析
明所及び暗所においてｉｌｐ１−１Ｄ表現型を野生株と比較した。暗所で生長させたとき、ｉｌｐ１−１Ｄホモ接合体系統は野生株と比べて胚軸長さに違いはなかった（図２Ｅ及び図２Ｆ）。伸長の代わりに、ｉｌｐ１−１Ｄ胚軸は野生株より太く、これは細胞が横軸にそってその体積を増加させたことを示す（図２Ｇ）。横軸切片を作製することによって胚軸内の細胞を調べた。ｌｐ１−１Ｄの皮質細胞と内胚葉細胞は直径が増加し、その結果、野生株に比べて太い胚軸となっていることがわかった（図２Ｈ及び図２Ｉ）。皮層と内皮に含まれる細胞の数にはほとんど相違はなかった。これらの結果はｉｌｐ１−１Ｄにおける倍数性の上昇が胚軸細胞の直径を増加させ、その結果、細胞体積の増加をもたらしたことを示した。
これらの胚軸表現型に加えて、主根の長さの増加も観察された（図２Ｅ及び図２Ｆ）。
明所で生育させた芽生えにおいて、ｉｌｐ１−１Ｄ接合性変異株は野生株と比較して大きな子葉を有していた（図２Ｊ〜図２Ｌ）。子葉の長軸及び短軸にそって細胞の数を調べたところ、ｉｌｐ１−１Ｄと野生株とでは細胞数の違いはまったくなく、このことは変異株の大きな子葉サイズは細胞数の増加ではなく、個々の細胞サイズの増加に起因することを示した。成体ｉｌｐ１−１Ｄ植物は野生株とほとんど同じ高さであった。
【実施例４】
【０００９】
ＩＬＰ１遺伝子の構造解析
（１）候補遺伝子の選択
アクチベーションＴ−ＤＮＡは選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を含む。ｉｌｐ１−１Ｄヘテロ接合性植物のＴ２子孫を調べたところ、その子孫の約７０％がハイグロマイシン耐性を示すことがわかった。これは、そのゲノム内にただ一つのＴ−ＤＮＡが存在することを示す。全てのハイグロマイシン耐性植物はＴ３世代において増加した倍数性レベルを示した。これらの結果はアクチベーションタグ化Ｔ−ＤＮＡが増加した倍数性表現型の原因となっていることを強く示唆する。Ｔ−ＤＮＡフランキング配列をプラスミドレスキューによって単離した。配列決定後、そのＴ−ＤＮＡをＡＴ５ｇ０８５６０のコード領域に挿入した（図３Ａ）。Ｔ−ＤＮＡの推定上の開始コドンとライトボーダー（ＲＢ）間の距離はＡＴ５ｇ０８５５０で約１ｋｂ、ＡＴ５ｇ０８５６０で約７．４ｋｂであった（図３Ａ）。リアルタイムＰＣＲによってｉｌｐ１−１Ｄのヘテロ接合体と野生株におけるＡＴ５ｇ０８５５０の発現を調べたところ、ｉｌｐ１−１Ｄでは野生株の１３倍高かった（図３Ｂ）。ＡＴ５ｇ０８５６０における挿入が増加した倍数性を引き起こしたかどうかを決定するために、ＳＡＬＫ  Ｔ−ＤＮＡコレクション（ＳＡＬＫ＿０９５４９５）（Ａｌｏｎｓｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｅｐａｎｏｖａ，Ａ．Ｎ．，Ｌｅｉｓｓｅ，Ｔ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｓｈｉｎｎ，Ｐ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｊ．，Ｂａｒａｊａｓ，Ｐ．，Ｃｈｅｕｋ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，６５３−６５７．）からＴ−ＤＮＡ挿入系統を調べた。Ｔ−ＤＮＡはＡＴ５ｇ０８５６０のエクソン１に挿入されていた（データは示さず）。この系統は倍数性の変化はなかった（データは示さず）。これらの結果から、ＡＴ５ｇ０８５５０がｉｌｐ１−１Ｄのアクチベーション表現型の原因となる遺伝子候補であると判断した。
（２）候補遺伝子ＡＴ５ｇ０８５５０の同定
これを確かめるため、ＲＴ−ＰＣＲによって単離したＡＴ５ｇ０８５５０  ｃＤＮＡをカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ（ＣａＭＶ  ３５Ｓ）プロモーターの制御下で過剰発現するトランスジェニック植物を作出した。１５系統のうち８系統はｉｌｐ１−１Ｄ表現型を繰り返すＴ２世代において顕著に増加した倍数性を示した。ＡＴ５ｇ０８５５０はこれらの系統（ＩＬＰ１ｏｘ（＃２））で高発現した（図３Ｂ）。ホモ接合体系統の暗所で生育させた芽生えの倍数性を調べたところ、３２Ｃピークの相対比は増加し、６４Ｃ細胞が観察された（図３Ｃ）。倍数性表現型を示さなかったトランスジェニック系統（＃１及び＃３）は野生株とほとんど同じＩＬＰ１発現レベルを有していた。ＡＴ５ｇ０８５５０過剰発現体はまた大きな子葉、太い胚軸、及び主根の伸長のようなｉｌｐ１−１Ｄの他の表現型を再現した（図３Ｈ−Ｊ）。しかしながら、野生株と比較して成体植物の高さと種サイズにおいてほとんど違いはなかった。これらの結果から、ＡＴ５ｇ０８５５０がｉｌｐ１−１Ｄ変異に対応する遺伝子であることが強く示唆された。ＡＴ５ｇ０８５５０をＩＬＰ１と命名した。
ＩＬＰ１遺伝子は９０８アミノ酸残基からなるタンパク質をコードする。保存モチーフを同定するためにＢＬＡＳＴＰプログラムを用いてタンパク質データベース内でＩＬＰ１ホモログをサーチした。このサーチによればＩＬＰ１はヒト及び他の種のＧＣ−結合因子（ＧＣＦ）のＣ末端領域に対して類似性を有していることがわかった（図３Ｄから図３Ｆ）。ＧＣＦタンパク質は上皮細胞増殖因子（ＥＧＦＲ）、β−アクチン、及びカルシウム依存性プロテアーゼ遺伝子のプロモーター領域におけるＧＣ−リッチ配列に結合する転写抑制因子として最初に単離されている（Ｋａｇｅｙａｍａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ５９，８１５−８２５．）。しかしながら、最初に報告されたＧＣＦｃＤＮＡクローンはキメラ遺伝子であって、そのタンパク質のＮ末端はＧＣリッチ領域に結合し、そのＣ末端は機能未知なもうひとつのｃＤＮＡに由来していた（Ｒｅｅｄ，Ａ．Ｌ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｙ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｃ．（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ＧＣ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２１５９４−２１６０２．；Ｔａｋｉｍｏｔｏ，Ｍ．，Ｍａｏ，Ｐ．，Ｗｅｉ，Ｇ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｍｉｕｒａ，Ｔ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｋｕｚｕｍａｋｉ，Ｎ．（１９９９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＣＦ  ｇｅｎｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ａｎｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４４７，１２５−１３１．）。
混乱を避けるために、このＤＮＡ結合性ドメインを真性ＧＣＦと呼び、そしてそのＣ末端領域をコードする遺伝子をＣＴＩＬＰ１（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬＰ１）と呼ぶこととする。ＩＬＰ１はＣＴＩＬＰ１と相同性を示す。ＣＴＩＬＰ１はマウス、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）においてパラロガスな遺伝子を有する（図３Ｅ及び図３Ｆ）。また、ＩＬＰ１はシロイヌナズナゲノム（ＡＴ５ｇ０９２１０）においてパラロガスな遺伝子を有する（図３Ｅ及び図３Ｆ）。ＩＬＰ１と他のＣＴＩＬＰ１タンパク質において２つの保存されたモチーフが見出された。モチーフ１はＩＬＰ１の残基３７１−４６５に存在し（図３Ｄ及び図３Ｅ）、モチーフ２は残基５７１−８５２に存在する（図３Ｄ及び図３Ｆ）。これらの２つのモチーフは、いろいろな種のＣＴＩＬＰ１においてよく保存されている。モチーフ２は特によく保存されているが、モチーフ１はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のタンパク質に見出されなかった。また、ＣＴＩＬＰ１タンパク質のＮ末端領域においては顕著な相同性は見出されなかった。３Ｄ−ＰＳＳＭ（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｌ．Ａ．，ＭａｃＣａｌｌｕｍ，Ｒ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，Ｍ．Ｊ．Ｅ．（２０００）Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｒａｍ  ３Ｄ−ＰＳＳＭ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９９，４９９−５２０．）を用いたが、これら２つのモチーフのいかなる予測される特徴も得ることができなかった。
一方、ＰＳＯＲＴプログラム（Ｎａｋａｉ，Ｋ．，ａｎｄ  Ｈｏｒｔｏｎ，Ｐ．（１９９９）ＰＳＯＲＴ：ａ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４，３４−３６．）を用いたところ、上記の２つの保存領域に推定上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）が見出された。この配列はＩＬＰ１の残基５２２−５３９に位置し、アルギニン残基に富んでおり、典型的な２分裂ＮＬＳである（図３Ｄ）。この推定上のＮＬＳモチーフの存在はＩＬＰ１が核タンパク質であることを示唆する。この予測を確認するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＮ末端との融合タンパク質（ＩＬＰ１：ＧＦＰ）としてＣａＭＶ  ３５Ｓ  ロモーターの制御下で発現させた。遺伝子銃法を用いてタマネギ表皮細胞における局在化を調べた。ＩＬＰ１：ＧＦＰ融合タンパク質は核において検出され、ＩＬＰ１が核タンパク質であることがわかった（図３Ｇ）。
【実施例５】
【００１０】
ＩＬＰ１遺伝子のＴ−ＤＮＡ挿入変異株の表現型
ＳＡＬＫ  Ｔ−ＤＮＡ挿入系統（Ａｌｏｎｓｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｅｐａｎｏｖａ，Ａ．Ｎ．，Ｌｅｉｓｓｅ，Ｔ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｓｈｉｎｎ，Ｐ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｊ．，Ｂａｒａｊａｓ，Ｐ．，Ｃｈｅｕｋ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，６５３−６５７．）から２つのＴ−ＤＮＡ挿入変異株を単離した。両方の変異株ともＩＬＰ１の第５イントロン中の異なる位置にＴ−ＤＮＡ挿入を有している（図３Ａ中の小さい三角印）。これらの両変異株におけるＩＬＰ１遺伝子の発現を調べたところ、その領域に特異的なプライマーセット（図３Ａ中の矢印）はＰＣＲ産物を確かに増幅したけれども（データは示さず）、全長を増幅するプライマーセット（ＩＬＰ１−ＦおよびＩＬＰ１−Ｒ）を用いた場合には何も検出されなかった（図４Ｂ）。このことは、これらの変異株が、ヌル変異を有するというよりむしろ全長転写物を欠くことを示す。これらのホモ接合体変異株をｉｌｐ１−１（ＳＡＬＫ＿０３０６５０）及びｉｌｐ１−２（ＳＡＬＫ＿１３５５６３）とそれぞれ命名した。ｉｌｐ１−１もｉｌｐ１−２も暗所でそれらの野生株に比べて短い胚軸と根を有していた（図４Ａ、図４Ｃ、及び図４Ｅ）。光照射下では、それらの両方ともが野生株よりも短い胚軸と小さい子葉を呈し、根の伸長の阻害があった（図４Ｄ及び図４Ｅ）。第５イントロンのスプライシングアクセプターに近いＴ−ＤＮＡ挿入を有しているｉｌｐ１−１は、ｉｌｐ１−２よりもより重度な形態学的表現型を示した。これらの系統の相補性を調べるために、ｉｌｐ１−１とｉｌｐ１−２を互いに交配した。Ｆ１植物もまた明所及び暗所の両方において野生株に比べて短い胚軸と根を示した（図４Ａ及び図４Ｄ）。この結果は、これらの系統はアレルであって、ＩＬＰ１の欠失が短い胚軸表現型を引き起こすことを示した。倍数性とＩＬＰ１機能との関係を解明するために、暗所でヘテロ接合性ｉｌｐ１−１及びｉｌｐ１−２の倍数性レベルを調べた。ｉｌｐ１−１とｉｌｐ１−２の両方とも、３日齢の芽生えの胚軸細胞において３２Ｃ細胞数が減少した（図４Ｆ）。胚軸の長さとｉｌｐ１−１とｉｌｐ１−２における倍数性との関係を調べるために、これらの変異株を芽生えの生育を異なる段階において分析した。ｉｌｐ１−１及びｉｌｐ１−２は暗所ですべての生育段階で野生株に比べて短い胚軸を有していた（図４Ｃ）。しかしながら、胚軸細胞の倍数性レベルの減少は吸水７日後に野生株のそれよりも回復した。これは倍数性の減少が短い胚軸長さの結果ではないことを示す。
【実施例６】
【００１１】
転写抑制因子としてのＩＬＰ１の機能
最初に同定されたキメラＧＣＦは転写抑制因子として機能することが報告されている（Ｋａｇｅｙａｍａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ５９，８１５−８２５．）。このタンパク質（ＧＣＦ）のＮ末端部分はＧＣＦ２と相同性があり、ＤＮＡ結合活性を有している（Ｒｅｅｄ，Ａ．Ｌ．，Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．，Ｋａｕｆｍａｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，Ｙ．，Ｍｕｒｐｈｙ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｃ．（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ＧＣ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２１５９４−２１６０２．）。ＩＬＰ１はＣＴＩＬＰ１類と相同性を有するが、それらは哺乳類細胞において詳細に調べられていない。ＩＬＰ１の機能を理解するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ転写アッセイ（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｙ．，ａｎｄ  Ｄｅｎｇ，Ｘ．Ｗ．（１９９８）Ａ  ｎｅｗ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｅｔ  ｆｏｒ  ＧＡＬ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，２１７−２２０．）を実施した。ＩＬＰ１  ｃＤＮＡをＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端領域に融合させた（ＧＡＬ４−ＩＬＰ１Ｆｕｌｌ）。このキメラプラスミドを、プロモーター領域内にＧＡＬ４結合配列を含むルシフェラーゼ（ＬＵＣ）リポータープラスミドとともにタバコ葉細胞にＢｉｏｌｉｓｔｉｃ  Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ（遺伝子銃）法によって導入した（図５Ａ）。レポータープラスミドはそれが脱メチル化されていることを確かめるために、ＤＮＡメチラーゼを欠いた大腸菌株から調製した。ＧＡＬ４−ＩＬＰ１Ｆｕｌｌを用いたとき、リポーター活性が減少した（図５Ｂ）。ＩＬＰ１は２つの保存されたモチーフを有する。これらのモチーフの一つを核局在化シグナル（ＮＬＳ）とともに含むＩＬＰ１タンパク質の部分を発現させた。ＧＡＬ４−ＩＬＰ１ＮはＩＬＰ１のＮ末領域（残基１−５６７）を有するＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインを含むキメラである（図５Ａ）。このキメラはモチーフ１とＮＬＳを含み、ＧＡＬ４−ＩＬＰ１Ｆｕｌｌタンパク質ほど強い抑制は示さなかった（図５Ｂ）。しかしながら、モチーフ２を含むＩＬＰ１のＣ末端領域（残基４７４−９０８）を用いたとき、はるかに強いＬＵＣリポーター活性の抑制が観察された（図５Ａ及び図５Ｂ）。これらの結果はＩＬＰ１がｉｎ  ｖｉｖｏで転写抑制因子として機能し、モチーフ２がその抑制活性を担っていることを示す。
【実施例７】
【００１２】
ＩＬＰ１によるサイクリンＡ２発現調節
エンドリデュプリケーションは一種の細胞周期であり、通常の有糸分裂細胞周期からこの周期にスイッチするために異なる細胞周期関連遺伝子が関与しているかもしれない。そこで有糸分裂細胞周期の特定の段階で発現する幾つかの細胞周期関連遺伝子を調べた。Ｇ１期−特異的遺伝子としてＣｙｃｌｉｎＤ３；１（ＣＹＣＤ３；１）（Ｒｉｏｕ−Ｋｈａｍｌｉｃｈｉ，Ｃ．，Ｍｅｎｇｅｓ，Ｍ．，Ｈｅａｌｙ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ａ．Ｈ．（２０００）Ｓｕｇａｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｄ−ｔｙｐｅ  ｃｙｃｌｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０，４５１３−４５２１．）、Ｓ期−特異的遺伝子としてＨｉｓｔｏｎＨ４（ＨＩＳＨ４）（Ｍａｒｉｃｏｎｔｉ，Ｌ．，Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ，Ｂ．，Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｒ．，Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｒ．，Ｂｅｒｇｏｕｎｉｏｕｘ，Ｃ．，Ｃｅｌｌａ，Ｒ．，ａｎｄ  Ａｌｂａｎｉ，Ｄ．（２００２）Ｔｈｅ  Ｅ２Ｆ  ｆａｍｉｌｙ    ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ／Ｅ２Ｆ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，９９１１−９９１９．）、Ｓ／Ｇ２期−特異的遺伝子としてＣｙｃｌｉｎＡ２；１（ＣＹＣＡ２；１）、Ｇ２／Ｍ期−特異的遺伝子としてＣｙｃｌｉｎＢ１；２（ＣＹＣＢ１；２）（Ｓｈａｕｌ，Ｏ．，Ｍｉｒｏｎｏｖ，Ｖ．，Ｂｕｒｓｓｅｎｓ，Ｓ．，Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｉｎｚｅ，Ｄ．（１９９６）Ｔｗｏ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃｙｃｌｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ＢＹ−２  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．９３，４８６８−４８７２．）を用いた。  これらの遺伝子の発現をセミ定量的ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。増加した倍数性を示すＩＬＰ１過剰−発現系統（ＩＬＰ１ｏｘ，ｌｉｎｅ  ＃２，図３Ｂ）を用い、暗所で生育させた芽生えにおけるこれらの細胞周期関連遺伝子の発現を調べた。
野生株（Ｃｏｌ−０）とＩＬＰ１過剰発現系統（ＩＬＰｏｘ）間でＣＹＣＤ３；１，ＨＩＳＨ４及びＣＹＣＢ１；２の発現における違いはなかった（図６Ａ）。しかしながら、ＣＹＣＡ２；１の発現は野生株と比較してＩＬＰ１過剰発現系統において顕著に減少した（図６Ａ）。ＣＹＣＡ２；１は遺伝子ファミリーの一部であり、シロイヌナズナゲノムには４つのＣＹＣＡ２メンバーが存在する（Ｖａｎｄｅｐｏｅｌｅ，Ｋ．，Ｒａｅｓ，Ｊ．，Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒ，Ｌ．，Ｒｏｕｚｅ，Ｐ．，Ｒｏｍｂａｕｔｓ，Ｓ．，ａｎｄ  Ｉｎｚｅ，Ｄ．（２００２）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｒｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４，９０３−９１６．）。リアルタイムＰＣＲを用いてより正確にＩＬＰ１ｏｘとｉｌｐ１−１ＤにおけるＣＹＣＡ２遺伝子の発現を調べた。すべてのＣＹＣＡ２メンバーの発現が減少し（図６Ｂ、上のパネル）、特に、ＩＬＰ１ｏｘ系統におけるＣＹＣＡ２；１の発現は野生株の約４０％まで減少した。ＩＬＰ１挿入変異株におけるＣＹＣＡ２遺伝子の発現調査では、ｉｌｐ１−１とｉｌｐ１−２の両方において、ほぼ全てのＣＹＣＡ２遺伝子ファミリーの発現が増加した（図６Ｂ、下のパネル）。
葉生育中のＩＬＰ１発現を調査した。発現は第１葉の生育に従って徐々に減少し、吸水２０日後、第１葉が増殖期（Ｖｌｉｅｇｈｅ，Ｋ．，Ｂｏｕｄｏｌｆ，Ｖ．，Ｂｅｅｍｓｔｅｒ，Ｇ．Ｔ．，Ｍａｅｓ，Ｓ．，Ｍａｇｙａｒ．Ｚ．，Ａｔａｎａｓｓｏｖａ，Ａ．，ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ  Ｅｎｇｌｅｒ，Ｊ．，Ｄｅ  Ｇｒｏｏｄｔ，Ｒ．，Ｉｎｚ▲ｅ▼，Ｄ．，ａｎｄ  Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒ，Ｌ．（２００５）Ｔｈｅ  ＤＰ−Ｅ２Ｆ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅ  ＤＥＬ１  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｃｙｃｌｅｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１５，５９−６３．）に入ったとき、それは８日目のレベルの１０分の１になった（図６Ｃ）。また、葉生育中のＣＹＣＡ２遺伝子ファミリーの発現を野生株と比較して調査した（図６Ｄ）。すべてのＣＹＣＡ２遺伝子ファミリーは８日目に高い発現量を有していたが、ＩＬＰ１と同様に徐々に減少した（データ示さず）（Ｉｍａｉ，Ｋ．Ｋ．，Ｏｈａｓｈｉ，Ｙ．，Ｔｓｕｇｅ，Ｔ．，Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｉ，Ｍ．，Ｏｋａ，Ａ．，ａｎｄ  Ａｏｙａｍａ，Ｔ．（２００６）Ｔｈｅ  Ａ−Ｔｙｐｅ  Ｃｙｃｌｉｎ  ＣＹＣＡ２；３  Ｉｓ  ａ  Ｋｅｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｐｌｏｉｄｙ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｅｎｄｏｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １８，３８２−３９６）。ｉｌｐ１−１Ｄでは、すべてのＣＹＣＡ２遺伝子ファミリーの発現は野生株に比べて減少した（図６Ｄ、上のパネル）。しかしながら、ｉｌｐ１−２では、すべてのＣＹＣＡ２遺伝子ファミリーの発現が野生株に比べて増加し、比較的高い発現が１２日目においてＣＹＣＡ２；３とＣＹＣＡ２；４において観察された（図６Ｄ、下のパネル）。１２日後のＣＹＣＡ２；１発現は、野生株、ｉｌｐ１−１Ｄ、及びｉｌｐ１−２において検出できなかった。
一方、８日までの分裂中の葉における倍数性レベルの観察によれば、野生株とｉｌｐ１−１Ｄ、では何ら明確な違いはなかったにも関わらず、ｉｌｐ１−２と比較した場合、２Ｃフラクションの減少と８Ｃ及び１６Ｃフラクションの増加を示した。１０日後、ｉｌｐ１−１Ｄは、野生株に比べて徐々に８Ｃ及び１６Ｃフラクションが増加した（図６Ｅ）。２２日目、１６Ｃ細胞のフラクションが野生株では７％であるのに対し、ｉｌｐ１−１Ｄでは１８％まで増加した（図６Ｅ）。８日目、ｉｌｐ１−２では２Ｃフラクションが６０％以上で、８Ｃ及び１６Ｃフラクションは検出されなかった。しかしながら、１０日後、８Ｃ及び１６Ｃフラクションは、ｉｌｐ１−１Ｄと同様にｉｌｐ１−２において増加した（図６Ｅ）。
【実施例８】
【００１３】
マウスＩＬＰ１による哺乳類細胞におけるサイクリンＡ２遺伝子発現の調節
サイクリンＡ２発現の減少が哺乳類細胞においてもまた観察されるかどうかを理解するために、コトランスフェクションアッセイをＮＩＨ３Ｔ３細胞を用いて行った。マウスＩＬＰ１ホモログ（ＡＡＫ６８７２５）ｃＤＮＡ（図３Ｅ及び図３Ｆ）をＲＴ−ＰＣＲによって単離し、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む発現ベクターにクローン化した（図７Ａ）。このｃＤＮＡをマウスサイクリンＡ２（Ｃｃｎａ２）プロモーター−ＬＵＣリポーターとともにリポフェクション法にてコトランスフェクトした。転写開始部位の−１７７から＋１００までを含むＣｃｎａ２プロモーター（Ｈｕｅｔ，Ｘ．，Ｒｅｃｈ，Ｊ．，Ｐｌｅｔ，Ａ．，Ｖｉｅ，Ａ．，ａｎｄ  Ｂｌａｎｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｍ．（１９９６）Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ｕｎｄｅｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６，３７８９−３７９８．）を用いた。この領域は、マウス及びヒトサイクリンＡ２プロモーター間で保存性を示す。本アッセイのための内部標準として、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子を用いた。図７Ｂに示すように、マウスＩＬＰ１遺伝子でトランスフェクトされた細胞においてトランスフェクション後２４時間及び４８時間の両方でリポーター活性の減少が認められた。
【実施例９】
【００１４】
ＣＹＣＡ２遺伝子のＴ−ＤＮＡ挿入変異株の表現型
ＣＹＣＡ２ファミリーのうち、ＣＹＣＡ２；１は熱心に研究されており、この遺伝子発現はＳ／Ｇ２期に特異的であると報告されている（Ｓｈａｕｌ，Ｏ．，Ｍｉｒｏｎｏｖ，Ｖ．，Ｂｕｒｓｓｅｎｓ，Ｓ．，Ｖａｎ  Ｍｏｎｔａｇｕ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｉｎｚｅ，Ｄ．（１９９６）Ｔｗｏ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｃｙｃｌｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ  ＢＹ−２  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．９３，４８６８−４８７２．）。ＣＹＣＡ２；１発現の減少がエンドリデュプリケーションに関連するかどうかを試験するために、ＳＡＬＫ  Ｔ−ＤＮＡコレクション（Ａｌｏｎｓｏ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｔｅｐａｎｏｖａ，Ａ．Ｎ．，Ｌｅｉｓｓｅ，Ｔ．Ｊ．，Ｋｉｍ，Ｃ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｈ．，Ｓｈｉｎｎ，Ｐ．，Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｊ．，Ｂａｒａｊａｓ，Ｐ．，Ｃｈｅｕｋ，Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，６５３−６５７．）から得たＣＹＣＡ２；１  Ｔ−ＤＮＡ挿入変異株の倍数性レベルを調べた。２つの独立したＴ−ＤＮＡ挿入系統について調べた。挿入系統１（ｃｙｃａ２；１−１）では、Ｔ−ＤＮＡは第１エクソン（ＳＡＬＫ＿１２１０７７）にあり、挿入系統２（ｃｙｃａ２；１−２）では、それは第４イントロン（ＳＡＬＫ＿１３６７５０）にあった（図８Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析ではこれらの２系統がヌルであることを示唆した（図８Ｂ）。ｃｙｃａ２；１−１及びｃｙｃａ２；１−２ホモ接合体系統の両方が成体段階で野生株とほとんど形態学的相違は示さなかった。暗所で生育させた芽生えの形態もまた野生株と同じであった。これらのＴ−ＤＮＡ挿入系統において倍数性レベルを観察したとき、両方とも暗所で生育させた胚軸において野生株と比較して３２Ｃ細胞の割合が増加していた（図８Ｃ）。明所で生育させた芽生えの胚軸においては、１６Ｃ細胞のレベルの増加が観察された（図８Ｃ）。また、明所で成育させた子葉細胞における倍数性レベルを調べた。子葉のサイズは野生株と比べて変化しなかったが、１６Ｃフラクションがｃｙｃａ２；１−１とｃｙｃａ２；１−２の両方で増加した（図８Ｃ）。これらのデータは、ＣＹＣＡ２；１発現の欠失が倍数性増加を誘導することを示す。
【実施例１０】
【００１５】
他の変異株の特徴づけ
残りの５変異株であるｉｌｐ２−Ｄ、３−Ｄ、４−Ｄ、５−Ｄ、および７−Ｄでもグループ１の特徴が現れ、暗所でも明所でもＤＮＡ含量の増大が観察された。ｉｌｐ４−Ｄを除くこれら変異株では、子葉面積の増加や、シロイヌナズナの表面に現れる三つの分枝を持つ毛であるトライコームの大型化と分枝数増加、根の伸長、そして胚軸径が太くなるなどの細胞の大型化を示す表現型が現れた（図９、１０、１２、１３）。さらに、ＩＬＰ２、ＩＬＰ５、ＩＬＰ７を過剰発現させた形質転換体では、胚軸におけるＤＮＡ含量が増大しており、前記変異株と同様の表現型を示した（図９、１２、１３）。ＩＬＰ４を過剰発現させた形質転換体（ＩＬＰ４ｏｘ）では、ｉｌｐ４−ＤよりＩＬＰ４の発現が強まっていた。この形質転換体では、子葉面積が増大していた（図１１）。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００１６】
本発明によれば、植物細胞のエンドリデュプリケーションを促進し、核ＤＮＡ量を増加させる活性を有する遺伝子が見出された。植物体の大きさは、植物体を構成する細胞の数と大きさで決まり、植物細胞は核ＤＮＡ量が多いほど大きくなる。従って、本遺伝子を利用することにより、植物体全体又はその一部を大型化させた植物育種が可能となる。たとえば、トマトの実ではエンドリデュプリケーションが生じることが知られているので、本遺伝子を使って大きなトマトを作出するような品種改良への利用が期待される。また、イネやトウモロコシなど穀物の胚乳細胞でもＤＮＡ含量が増大することで、発達することから、胚乳の大型化への応用も考えられる。さらに、ＩＬＰ遺伝子を利用してエンドリデュプリケーションを促進すれば、物質生産に関わる遺伝子も倍化できるので、植物が生産する様々な有用物質（例えば、アントシアニンやフラボノイド等）の生産量を向上させることも可能である。
エンドリデュプリケーションが促進した変異株では、紫外線などに強くなることが知られている（Ｈａｓｅ  Ｙ，Ｔｒｕｎｇ  ＫＨ，Ｍａｔｓｕｎａｇａ  Ｔ，Ｔａｎａｋａ  Ａ（２００６）Ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｕｖｉ４  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏ−ｒｅｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｂ  ｌｉｇｈｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．４６：３１７−３２６．）。これは、１細胞当たりの遺伝子数が増えることにより、ＤＮＡ損傷の被害を相補できるためである。二次的な効果として、本遺伝子を利用することにより、紫外線などＤＮＡ障害を引き起こすストレスに強い作物の育種も期待できる。
［配列表］
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｄ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｆ−２】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４Ａ】
2008120410.tif 000088
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2008120410.tif 000099
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図９Ｊ】
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【図１０Ａ】
2008120410.tif 000112
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【国際調査報告】
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