(57)【要約】不安様行動を呈するkf-1遺伝子ノックアウト非ヒト動物を作製するためのベクターであって、Lox-pM-M-kf-1［in3b］-kf-1［ex4a］-LoxP (ここで、Mは選択マーカー遺伝子、pMはマーカー遺伝子発現のためのプロモーター、kf-1［in3b］は配列表の配列番号２に示される塩基配列、kf-1［ex4a］は配列表の配列番号３に示される塩基配列を表す。)を含むベクター、当該ベクターを用いて作製される不安様行動を呈するkf-1遺伝子ノックアウト非ヒト動物又はその子孫及びその利用方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
不安様行動を呈するkf-1遺伝子ノックアウト非ヒト動物を作製するためのベクターであって、
LoxP-pM-M-kf-1［in3b］-kf-1［ex4a］-LoxP 
(ここで、Mは選択マーカー遺伝子、
pMは前記選択マーカー遺伝子発現のためのプロモーター、
kf-1［in3b］は配列表の配列番号２に示される塩基配列、
kf-1［ex4a］は配列表の配列番号３に示される塩基配列を表す。)
を含むベクター。
【請求項２】
請求項１に記載のベクターを用いて作製されたkf-1遺伝子ノックアウト非ヒト動物又はその子孫。
【請求項３】
請求項２に記載の非ヒト動物又はその子孫の改良動物又はその子孫。
【請求項４】
うつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善作用を奏する化合物のスクリーニング方法であって、下記（１）〜（３）の工程を有する方法：
（１）請求項２又は３に記載の非ヒト動物又はその子孫に試験化合物を投与する工程、
（２）前記試験化合物の投与群と偽薬投与群における非ヒト動物の不安様行動を測定する工程、及び、
（３）前記（２）の結果を比較し、不安様行動を改善させる試験化合物を選定する工程。
【請求項５】
請求項４に記載のスクリーニング方法によって選定された化合物を有効成分とするうつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は不安様行動を呈するノックアウト非ヒト動物及びその利用方法に主に関する。  
【背景技術】
【０００２】
kf-1遺伝子はヒト健常脳で海馬と小脳に強く発現するが、大脳皮質にはほとんど発現しない。本発明者らはアルツハイマー病（AD）患者の大脳皮質で発現が亢進する二つの遺伝子を同定した。その一つが当時は未知の新規遺伝子であった。この遺伝子をkf-1と命名した（非特許文献１及び特許文献１等参照）。【０００３】
もう一つの遺伝子は、従来よりアルツハイマー病で大脳皮質に発現が亢進することが知られていたGFAP（Glial Fibrilary Acidic Protein）の遺伝子であった。【０００４】
本発明者は、kf-1遺伝子の機能を明らかにするために、Cre-Lox系を使った条件発現系によるノックアウトマウスの作製を試みた。【０００５】
その後、他のグループ（昭和大学精神医学科）は抗うつ薬である選択的セロトニン再吸収阻害剤（SSRI）投与によって大脳皮質に発現が亢進する遺伝子を同定し、それがkf-1遺伝子と同一であることを報告した（非特許文献２）。また、同グループにより電気パルス刺激による抗うつ治療でも同様の亢進があることが報告された（非特許文献３）。
【特許文献１】特開平９−２１５４９５号公報
【非特許文献１】Yasojima et al., 1997, BBRC, 231(2):481-487
【非特許文献２】Yamada, M., et al., 2002, BBRC, 78(1):150-157
【非特許文献３】Nishioka et al., 2003, J. Neural. Transm., 110(3):277-285
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、不安様行動の解明、或いは、不安様行動の予防、治療又は改善薬の開発に有用なノックアウト非ヒト動物、並びに、当該動物の利用方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、kf-1遺伝子と神経性疾患との関連性を調べるため、kf-1ノックアウトマウスの行動について鋭意解析を重ねた。【０００８】
具体的には、kf-1遺伝子内にloxPサイトをもつベクターを作製し、G418耐性ES細胞432クローンについてPCRスクリーニングを行った。そのうち、５つの相同組換えクローンを得て、これらのES細胞よりキメラマウスを作製し、Cre発現マウスとの交配により、kf-1ノックアウトマウスを作製した。そして神経系組織に対する影響を中心に解析を行った。【０００９】
その結果、不安様行動試験において、不安様行動の増強を見出し、更に検討を重ねて、本発明に至った。【００１０】
即ち、本発明は以下に関する。【００１１】
項１：不安様行動を呈するkf-1遺伝子ノックアウト非ヒト動物を作製するためのベクターであって、
LoxP-pM-M-kf-1［in3b］-kf-1［ex4a］-LoxP 
(ここで、Mは選択マーカー遺伝子、
pMは前記選択マーカー遺伝子発現のためのプロモーター、
kf-1［in3b］は配列表の配列番号２に示される塩基配列、
kf-1［ex4a］は配列表の配列番号３に示される塩基配列を表す。)
を含むベクター。【００１２】
好ましくは、pM-MがpKJ2由来のネオマイシン耐性遺伝子pgk-Neoである項１に記載のベクター。【００１３】
好ましくは、上記LoxPカセットで挟まれた領域の外側に配列表の配列番号１で示される塩基配列及び／又は配列表の配列番号４に示される塩基配列を有する項１に記載のベクター。【００１４】
好ましくは、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなる項１に記載のベクター。【００１５】
好ましくは、不安様行動を呈するkf-1遺伝子ノックアウト非ヒト動物の作製又は調製におけるLoxP-pM-M-kf-1［in3b］-kf-1［ex4a］-LoxP 
(ここで、Mは選択マーカー遺伝子、
pMは前記選択マーカー遺伝子発現のためのプロモーター、
kf-1［in3b］は配列表の配列番号２に示される塩基配列、
kf-1［ex4a］は配列表の配列番号３に示される塩基配列を表す。)
を含むベクターの使用。【００１６】
項２：項１に記載のベクターを用いて作製されたkf-1遺伝子ノックアウト非ヒト動物（雌雄を含む）又はその子孫。
好ましくは、うつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善作用を奏する化合物のスクリーニング用kf-1遺伝子ノックアウト非ヒト動物（雌雄を含む）又はその子孫。【００１７】
項３：項２に記載の非ヒト動物又はその子孫の改良動物又はその子孫。
好ましくは、うつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症、特に不安様行動の予防、治療又は改善作用を奏する化合物のスクリーニング用のkf-1遺伝子ノックアウト非ヒト動物（雌雄を含む）又はその子孫の改良動物又はその子孫。【００１８】
項４：うつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善作用を奏する化合物のスクリーニング方法であって、下記（１）〜（３）の工程を有する方法：
（１）項２又は３に記載の非ヒト動物又はその子孫に試験化合物を投与する工程、
（２）前記試験化合物の投与前と投与後又は前記試験化合物投与群と偽薬投与群における非ヒト動物の不安様行動を観察又は測定する工程、及び、
（３）前記（２）の結果を比較し、不安様行動を改善させる試験化合物を選定する工程。【００１９】
特に、項４：不安様行動の予防、治療又は改善作用を奏する化合物のスクリーニング方法であって、下記（１）〜（３）の工程を有する方法：
（１）項２又は３に記載の非ヒト動物又はその子孫に試験化合物、または偽薬を投与する工程、
（２）前記試験化合物投与群と偽薬投与群における非ヒト動物の不安様行動を観察する工程、及び、
（３）前記（２）の結果を両者間で比較し、不安様行動を改善させる試験化合物を選定する工程。【００２０】
以上の工程に野生型マウスで同様の二群を加えることもできる。【００２１】
項５：項４に記載のスクリーニング方法によって初めて選定された化合物を有効成分とするうつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善用医薬組成物。【００２２】
特に、項５：項４に記載のスクリーニング方法によって選定された化合物を有効成分とする不安様行動の予防、治療又は改善用医薬組成物。【００２３】
以下、本発明について、更に詳細に説明する。【００２４】
１．ベクター
本発明のベクターは、不安様行動を呈するノックアウト非ヒト動物を作製するために好適なベクターであって、下記構造
LoxP-pM-M-kf-1［in3b］-kf-1［ex4a］-LoxP 
(ここで、Mは選択マーカー遺伝子、
pMは前記選択マーカー遺伝子発現のためのプロモーター、
kf-1［in3b］は配列表の配列番号２に示される塩基配列、
kf-1(ex4a)は配列表の配列番号３に示される塩基配列を表す。)
を含むベクターである。
ここで、kf-1［in3b］は、マウスkf-1遺伝子のイントロン３の一部である。
また、kf-1［ex4a］は、マウスkf-1遺伝子のエクソン４の大部分である。
また、LoxPはCre-LoxPシステムに用いられるLoxP配列を示す。【００２５】
マーカー遺伝子及びマーカー遺伝子発現のためのプロモーターは公知のものから適宜選定し得るが、好ましくは、pKJ2由来のネオマイシン（G418）耐性遺伝子pgk-Neoが用いられる。【００２６】
また、本発明のベクターは、上記、両端に挿入されたLoxPカセットに挟まれる領域の外側にkf-1のイントロン又はエクソン又はその一部を有することもできる。例えば、配列表の配列番号１で示される塩基配列及び／又は配列表の配列番号４に示される塩基配列を有することもできる。【００２７】
本発明の好ましいベクターの一例には、配列表の配列番号６に示される塩基配列からなるベクターが含まれる。【００２８】
また、本発明のベクターには、本発明の効果を奏する範囲内であれば、適当な遺伝子修飾を加えたり、適切なリンカーを結合することもできる。【００２９】
本発明のベクターは、公知の方法に従って適宜作製することができる。例えば、実施例１に記載の方法に従って作製することができる。【００３０】
本発明のベクターを用いてCre-LoxPシステムを利用することにより、不安様行動を呈するkf-1遺伝子ノックアウト動物を適切に作製することが可能になる。【００３１】
２．ノックアウト非ヒト動物又はその子孫
本発明において、「ノックアウト非ヒト動物 」とは、ヒト以外の動物である。種類は特に脊椎動物に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、ヒツジ及びヤギなどから選択されるいずれか一種が挙げられる。このうち、本発明では特にマウスが用いられる。又、子孫とは、当該ノックアウト非ヒト動物を親又は祖先として、交配等により常法に従って得られるものである。【００３２】
以下、マウスを例に用いて説明する。【００３３】
２−１．ノックアウト非ヒト動物の作製
本発明のノックアウト非ヒト動物は、上記標的ベクターを用いて、Cre-LoxPシステムを利用することにより、作製することができる。すなわち、kf-1遺伝子又はその一部を二つのLoxP配列の間に連結して、上記ベクターを作製する。得られた標的ベクターをES細胞へ導入し、適当な薬剤、例えば、G418の存在下で培養することにより、耐性株を取得する。続いて、例えば、サザンブロット解析により、所望の相同組換えが起きているクローンを選択し、それを初期胚へ顕微注入し、キメラマウスを得る。得られたキメラマウスを野生型マウスと交配させることによりヘテロ接合体マウスを得る。更に、得られたヘテロ接合体マウス同士を交配することにより、ホモ接合体マウスが得られる。【００３４】
より具体的には、例えば、実施例１に記載の方法により作製することができる。【００３５】
２−２．特性
本発明のノックアウト非ヒト動物又はその子孫は、不安様行動を呈する。【００３６】
本明細書において、「不安様行動」とは、不安に関連する行動を意味する。【００３７】
また本発明において、「不安様行動を呈する」とは、不安様行動試験において、野生型又は正常マウスの場合（以下、対照群または対照群マウス）と比較して顕著な不安様行動の増強が観察されることを意味する。特に、基本的運動能や活動性、学習能力、強制水泳試験で定義される「うつ」モデル試験や社会的行動の試験では対照群との間で有意差を示さないが、不安様行動試験において有意な不安様行動を呈することを意味する。【００３８】
上記において、「うつ」モデル試験とは、例えば、強制水泳試験及び／又は尾懸垂試験である。また不安様行動試験とは、例えば、明暗選択試験、高架式十字迷路試験及び／又は驚愕反応試験（プレパルスインヒビションテスト）である。【００３９】
本発明のノックアウト非ヒト動物は、「うつ」モデル試験である強制水泳試験においては陰性、即ち、対照群と有意差のない結果が得られるのに対し、不安様行動試験である明暗選択試験及び／又は高架式十字迷路試験においては、顕著な不安様行動、即ち、対照群と比較して有意な不安様行動を呈する。また、本発明のノックアウト非ヒト動物は、感覚情報処理制御機能障害を試験するテストである驚愕反応試験（プレパルスインヒビションテスト）において、過度の感覚情報処理機能を発現する。統合失調症では、この機能に障害があるが、このノックアウトマウスは統合失調症のような障害を示さず、有意に野生型より高い驚愕反応抑制をしめす。これは感覚情報への感受性増強によって起こる不安様行動と相関していると思われる。【００４０】
このような特性は、うつ症状の一部や、アルツハイマー型痴呆症の前駆症状、或いは合併症などでも指摘されているが実体的な解明がなされていない精神症状、例えば、社会的引きこもり（Social withdrawal）などのモデルとしても利用できる可能性を示すものである。【００４１】
即ち、本発明のノックアウト非ヒト動物又はその子孫は、うつ症状を構成する諸症状、例えば、不安、性欲減退、引きこもり、社会的孤立、自殺念慮等の行動異常等を含む不安様行動の解明の研究用としてのモデル動物、又は不安様行動の予防、治療又は改善作用を奏する化合物のスクリーニング用実験動物などとして有用に利用できる。【００４２】
例えば、本発明のノックアウト非ヒト動物又はその子孫には、下記の特性を有するものが含まれる。
遺伝的分類：Targeted Mutation Congenic
系統の由来：マウスkf-1遺伝子のexon 4の前後二カ所にLoxPを配置したDNAを導入したマウスES細胞からマウス個体を作製し、Cre Tgマウス との交配によりkf-1 exon 4を欠失したマウス及びその子孫
微生物学的飼育環境：コンベンショナル
微生物学的性状：ICLAS （鏡検I・培養I・血清I）陰性、S. aureus 陽性
系統の詳細（特性・用途）：「ひきこもり」症状に類似した不安様行動を呈す。
飼育・交配：繁殖効率A
所見：行動の異常がある。明暗選択試験、高架式十字迷路試験で不安様行動、あるいは「ひきこもり」症状に類似した行動を呈す。一方、強制水泳試験及び／又は尾懸垂試験で定義される「うつ」症状を示さない。驚愕反応試験（プレパルスインヒビションテスト）で、統合失調症とは逆に、感覚情報処理能力が増強して野生型以上の強い驚愕反応抑制が起こる。【００４３】
また、本発明には、上記のように作製したノックアウト非ヒト動物又はその子孫の改良動物も含まれる。改良動物には、遺伝子操作や交配などにより改良された動物又はその子孫が含まれる。【００４４】
３．スクリーニング方法
本発明は、上記ノックアウト非ヒト動物を利用した、うつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善作用を奏する化合物のスクリーニング方法を提供する。【００４５】
即ち、本発明は、下記（１）〜（３）の工程を有する、うつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善作用を奏する化合物のスクリーニング方法を提供する：
（１）上記非ヒト動物又はその子孫に試験化合物を投与する工程、
（２）前記試験化合物の投与群と偽薬投与群における非ヒト動物の不安様行動を観察、測定する工程、及び、
（３）前記（２）の観察、測定結果を比較し、不安様行動を改善させる試験化合物を選定する工程。【００４６】
試験化合物の投与方法は特に限定されず、常法に従って行うことができる。【００４７】
不安様行動の測定及び比較に用いる手段も特に限定されず、公知の方法に従い、不安様行動試験により行うことができる。【００４８】
不安様行動試験としては、例えば、明暗選択試験、高架式十字迷路試験及び／又は驚愕反応試験などが挙げられる。【００４９】
明暗選択試験においては、相互に行き来できる隣り合わせの明暗箱の暗箱の方にマウスを最初に置き、一定時間における（１）明箱と暗箱の内にそれぞれ滞在していた時間、（２）明箱と暗箱の間を行き来した回数（３）最初に明箱に入るまでの所要時間（潜時）、（４）移動距離などを測定する。【００５０】
明箱の滞在時間が短い、行き来した回数が少ない、最初に明箱に入るまでの潜時が長いなどのとき、不安様行動が増強していると考えられる。 【００５１】
また、高架式十字迷路試験においては、十字型に交差した高架迷路（一方の軸は壁のあるクローズド・アーム、他方の軸は壁がないオープン・アーム）を設け、迷路の交差中心点のプラットフォームにマウスを置き、（１）一定時間における、オープン・アームとクローズド・アームにそれぞれ滞在していた時間、（２）オープン・アームとクローズド・アームにそれぞれ入った回数、（３）移動距離などを測定する。【００５２】
オープン・アームへの滞在時間が長ければ、不安様行動が減少しており、短ければ不安様行動が増強していると考えられる。【００５３】
また、驚愕反応試験においては、驚愕反応を検知する荷重変化計測装置を内蔵した試験箱にマウスを入れ、装置に慣れさせた後、さらに背景音を聞かせて新しい環境に順応させる。突然、強音刺激のみを与えたとき、或いは、事前に先行弱音刺激を与えた後に強音刺激を与えたときの驚愕反応の大きさを荷重の増加で表し、それぞれをA、Bとしたとき、驚愕反応の減少率（Prepulse Inhibition）C%をC=100（1-B/A）より得る。【００５４】
事前に先行弱音刺激を受けることによって、強音刺激に際しての荷重が減少、すなわちC値が増加した時に驚愕反応が抑制されたと判断する。統合失調症では、その抑制が対照群よりも有意に低くなることが知られており、感覚情報処理機能が障害されていると考えられている。しかし、その逆に抑制が対照群よりも有意に高い場合は感覚情報処理機能が増強した状態にあり、それは不安様行動が増強した状態を反映していると考えられる。  【００５５】
このような行動試験において、試験化合物投与後のノックアウト非ヒト動物において、偽薬投与群と比較して不安様行動の改善又は抑制が観察された場合には、当該試験化合物をうつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善作用を奏する化合物又はその候補化合物として選定することができる。【００５６】
うつ病に伴う不安症以外の他の精神疾患としては統合失調症、認知症、引きこもり症状などに伴う不安症状があげられるが、それらだけにとどまるものではない。【００５７】
４．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、上記スクリーニング方法によって選定される化合物を有効成分として含むことができる。【００５８】
特に、本発明は、上記スクリーニング方法によって初めて、選定される化合物を有効成分として含む、うつ病または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善用医薬組成物を提供し得る。【００５９】
本発明の医薬組成物には、本発明の効果を奏する範囲内で、適当な薬学的担体や、一般に医薬組成物に配合される各種添加剤、また他の薬効成分等を配合することができる。【００６０】
本発明の医薬組成物の製造方法は特に限定されず、公知の方法に従って、適宜製造することができる。【００６１】
本発明の医薬組成物は、上記スクリーニング方法によって初めて、選定される「うつ」病（以下、強制水泳試験／尾懸垂試験によって定義されるマウスの「うつ」症状を示す場合は、「うつ」と「」内に表記し、臨床的に診断されるヒトのうつ病と区別する）または他の精神疾患の一部としての不安様行動、あるいは不安症の予防、治療又は改善作用を奏する化合物を含むものである。【００６２】
具体的には、うつ病の一症状としての不安症、あるいは不安様行動、例えば、不安、性欲減退、引きこもり、社会的孤立、自殺念慮等のうつ病一般の衝動とそれに伴う行動異常等の予防、治療又は改善用医薬組成物として有効に利用することができる。
【発明の効果】
【００６３】
現在、ヒトの「ひきこもり」症状については、性差が大きい（約80％を男性が占める）、「ひきこもり」症状を呈する患者の親族には同様の既往歴がある例が多いなどが明らかになりつつあり、生物学的要因が疑われている。【００６４】
その改善に有益な薬剤の開発には「ひきこもり」症状様の不安行動を呈する簡易動物（たとえばマウス）の利用が必要であるが、そのような動物の報告は未だ皆無である。【００６５】
本発明で開発されたkf-1欠失マウスが示す行動は、強制水泳試験や尾懸垂試験で定義されるマウスの「うつ」的症状を示す事なく、高架式十字迷路試験と明暗選択試験で定義される不安様行動を特異的に発現するという点において、「ひきこもり」症状と近似した症状を示す。【００６６】
そして、このようなひきこもり様行動の特性は、うつ症状の一部、アルツハイマー型痴呆症の前駆症状などと指摘されているが、実体的な解明がなされていない種々の精神神経症の合併症、例えば、不安、性欲減退、社会的孤立、自殺念慮等の行動異常等との関連も考えられる。【００６７】
そのため、本発明のkf-1欠失マウスは、種々の精神神経症、例えば、不安、性欲減退、社会的孤立、自殺念慮等のうつ的な行動異常、「ひきこもり」症状における実体的解明、またそれらの症状の予防、治療又は改善用の医薬のスクリーニング又は開発に有益な手段となりうる可能性がある。  
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例のkf-1ノックアウトマウスの作製で使用された遺伝子ターゲッティング法を説明する図である。図中、上から順に、正常の染色体にあるkf-1遺伝子（野生型アリル（Wild type allele））領域、kf-1ノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクター、相同組換えを起こし、loxPサイトおよびネオマイシン（G418）耐性遺伝子が挿入されたkf-1遺伝子（相同組換え体）、Cre発現トランスジェニックマウスとの交配により組換えを起こし、kf-1遺伝子翻訳領域の大部分を欠失した変異アレル（Cre組換え体）の構造をそれぞれ模式的に示す。
【図２】野生型マウス、相同組換えマウス、Cre組換えマウスkf-1 (-/-)のゲノムDNAを単離し、サザンブロッティングにより解析した結果を示す図面である。上の図は、上から、正常のkf-1遺伝子、ターゲッティングベクターとの相同組換え体、Cre発現トランスジェニックマウスとの交配によりkf-1遺伝子のエクソン4を欠失した変異アレルの構造と、制限酵素BspHIによる切断点、プローブを示す。下の図は、野生型、ターゲッティングベクターとの相同組換えホモ接合体、Cre発現トランスジェニックマウスとの交配により片方のkf-1アリル遺伝子のエクソン4が欠失したヘテロ接合体、kf-1遺伝子の両方のアリルが欠失したホモ接合体(kf-1 (-/-))由来のゲノムDNAを制限酵素BspHIで消化し、マウスkf-1のエクソン4配列をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションにより解析を行った結果を示す。レーン4のkf-1 (-/-)では、エクソン4が完全に欠失していることを示している。
【図３】実施例１で作製したkf-1 (-/-)マウスの明暗選択試験の結果を示す図面である。野生型マウス(Controls)と、kf-1欠失マウス(Mutants)を暗箱から入れ、A: 明室、暗室内での移動距離、B: 明室での滞在時間、C: 明室と暗室との移動回数、D: 暗室から明室に最初に移動するまでの時間を測定した結果を示す。分散分析による有意差検定では、欠失マウスは野生型に比べ、明室滞在時間が顕著に短く（B）、また、そのときの活動性も顕著に低下していた（A）、暗室での活動性は野生型との有意差はなかった。また、明室に最初に入室するまでの時間も欠失マウスと野生型マウスでは差がない。以上より、欠失マウスにおいては、活動性一般については野生型との差はなく、また新規探究性にも差がないにも関わらず、明室での活動性が顕著に減少することが示された。また、明室に最初に侵入するまでの時間に有意差がないことから、単なる光恐怖症でないことは明らかである。
【図４】実施例１で作製したkf-1 (-/-)マウスの高架式十字迷路試験の結果を示す図面である。野生型マウス(Controls)と、kf-1欠失マウス(Mutants)を、最初に高架式十字路（センタープラットホーム）の交点中央に置き、その後10分間の行動を記録した。図は順にA: センタープラットホームへの進入回数、B: オープンアームへの進入頻度、C: 総移動距離、D: オープンアームでの滞在時間の割合を示している。マウスは本来高所恐怖症であり、オープンアームを避けるが、その傾向には野生型と欠失マウスに有意差はなかった（B, D）。しかし、オープンアームとクローズドアームの交点である十字路中央への進入頻度（A）と総移動距離（C）には顕著な有意な差があり、欠失マウスがいずれかのアーム上に滞在して留まる傾向が強い事がわかった。
【図５】実施例１で作製したkf-1 (-/-)マウスの強制水泳試験の結果を示す図面である。野生型マウス(Controls)と、kf-1欠失マウス(Mutants)を水槽に入れ、10分間の行動を記録し、１分ごとの、無動時間の割合(A), 移動距離(B) をグラフで表した(Day1)。 同様の実験を24時間後にも行い、Day2として示した。強制水泳では、野生型と、kf-1 (-/-)間で有意差はみられず、マウスでの「うつ」症状とされる生への意欲欠如が見られない。
【図６】実施例１で作製したkf-1 (-/-)マウスのオープンフィールド試験の結果を示す図面である。野生型マウス(Controls)と、kf-1欠失マウス(Mutants)のオープンフィールド上での行動を120分間記録し、5分ごとの移動距離(A), 立ち上がり回数(B), 中央部滞在時間(C), 常同行動(D)を示した図である。野生型とkf-1 (-/-)マウス間では行動パターンに有意の差はみられなかった。欠失マウスに活動量の低下が見られないことが明らかである。
【図７】実施例１で作製したkf-1 (-/-)マウスの驚愕反応試験（Prepulse Inhibition test）の結果を示す図面である。（A）野生型マウス(Controls)と、kf-1欠失マウス(Mutants)の強音刺激（110 dBまたは120 dB）に対する驚愕反応を、静時体重に対する驚愕時の荷重増加の比で表している。ノックアウトマウスでは、野生型マウスに比べて有意に、驚愕反応が弱い。これは不安様行動が増強していることに対応している。（B）先行弱音刺激を受けたあとの強音刺激の驚愕反応を単独で強音刺激を受けた場合の驚愕反応に対する減少率で表している。kf-1 (-/-)マウスは野生型に比べて、先行刺激に対する学習効果が強く現れており、驚愕反応抑制の強さが不安様行動の増強と対応していることがわかる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
以下、図面を参照しながら本発明の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
１．kf-1ノックアウトマウスの作製
[1.1]
ターゲッティングベクター作製のため、配列表の配列番号７に示すマウスkf-1のcDNAをプローブとして、マウスのゲノムDNAライブラリーをプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、kf-1遺伝子を含む複数のゲノムDNAを単離した。マウスkf-1遺伝子は、４つのエクソンに別れ、約20kbの領域に存在していた。得られたクローンをもとに、イントロン３のAseIサイトから、StuIサイトまでの1.9kb（イントロン3a）を上流側アームとし、以下、LoxP配列、pKJ2由来のネオマイシン耐性遺伝子、kf-１遺伝子のイントロン3のStuIサイトからエクソン4まで（イントロン3b）及びエクソン4のはじめからBgl IIサイトまでの2.6kb（エクソン4a）、LoxP配列を連結し、さらにエクソン４のBglIIサイトからpolyA付加サイトまで（エクソン4b）、さらにその下流約10kbを下流側アームとして連結した。相同組換えのネガティブ選択のマーカーとして上流にジフテリア毒素遺伝子(DT-A)を挿入し、ターゲッティングベクターを作製した（図１）。【００７１】
なお、このターゲッティングベクターのバックボーンにはpHSG396(Gene, 1987;61:63-74.に記載)を用いた。【００７２】
作製したターゲッティングベクターの全配列を、配列表の配列番号６に示す。
ターゲッティングベクターにおける各領域を説明すると下記のようになる：
領域        由来
1-1206    pHSG396
1218-2772 pMC1_DTpA(ジフテリア毒素（diphteria toxin）
2780-4695 mouse kf-1 gene intron 3a 
4759-4942 pBS246 (LoxP カセット)
4997-6329 pKJ2 (pgk-Neo) 
6376-6956 mouse kf-1 gene intron 3b
6957-8943 mouse kf-1 gene exon 4a 
8959-9037 pBS246 (LoxP casette)
9044-9074 mouse kf-1 gene exon 4b
9075-19222 mouse genome downstream
19223-19252 Linker
19562-20248 pHSG396。【００７３】
なお、上記領域のうち、
mouse kf-1 gene intron 3aは配列表の配列番号１、
mouse kf-1 gene intron 3bは配列表の配列番号２、
mouse kf-1 gene exon 4aは配列表の配列番号３、
mouse kf-1 gene exon 4bは配列表の配列番号４、
mouse genome downstreamは配列表の配列番号５
に配列を示した。【００７４】
[1.2]
上記ターゲッティングベクターを直鎖化後、129SVJ ES細胞にエレクトロポレーションによって導入した。抗生物質G418耐性クローンをピックアップした。得られた432クローンについて、下記二種類のプライマーを使ってPCRスクリーニングを行い、483bpの増幅産物を示す５つの相同組換え体を得た。
mgKF_U17436 ：5’-AACTTGAAGTCGCTGTCTTTTGG（配列番号８）、
Neo-F712 ：5’- GAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTG（配列番号９）。【００７５】
[1.3]
相同組み換えが起こった上記ES細胞のクローンを、公知の方法（Genes Dev. (1994) 8, 707-719）に従ってマウス初期胚に顕微注入することにより、キメラマウスを得た。さらにこのキメラマウスを野生型C57BL/6マウスと交配し、得られたヘテロ接合体雄マウスとCre発現トランスジェニックマウス雌を交配することにより、kf-1遺伝子のエクソン4を欠失したヘテロ接合体マウスを得た。ヘテロ接合体マウスの雌雄を交配することにより変異アレルをホモで有するkf-1ノックアウトマウス（以下、「kf-1（-/-）マウス」）を得ることができた。【００７６】
それぞれのマウスのゲノムDNAを単離し、制限酵素BspHIで消化後、kf-1遺伝子エクソン４をプローブとしてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、野生型C57BL/6では、約5.86 kbのバンドが、相同組換えホモ接合体では約4.76 kbの断片が観察された。Cre組換えヘテロ接合体では、5.86 kbのDNA断片の濃度が野生型の約半分に減少し、Cre組換えホモ接合体 kf-1(-/-)では、kf-1エクソン4を完全に欠失していることが確認された。(図２)。  【００７７】
更に、下記プライマー
20039FW: TCTTGGTTAAATAATGTATGCTCT（配列番号１０）
17436FW: AACTTGAAGTCGCTGTCTTTTGG（配列番号１１）
20292RV: CCCCTATAAAATTCTTTCCTATCC（配列番号１２）
を用いて、PCRを行った結果、野生型（WT）では 277 bp、ノックアウトマウス（Hicky）では560 bpに増幅産物が検出された。【００７８】
kf-1（-/-）マウスは外見上野生型マウスとの違いは観察されず、繁殖率に関しても差はみられなかった。【００７９】
[1.4]
kf-1（-/-）マウスについて、C57BL/6Nとの戻し交配を8回繰り返した後、得られたkf-1（+/-）マウスの雌雄同士を交配させ、同腹から生まれた雄のkf-1(+/+)、kf-1(-/-)マウスをそれぞれ20匹ずつ準備し、４週齡時に  kf-1(+/+)を２匹、kf-1(-/-)を２匹ずつ１ケージに移し、10週齡から以下に示す行動学実験を行った。【００８０】
２．kf-1(-/-)マウスの行動学実験  
有意差検定は分散分析法により行い、p<0.05を有意差有と判定した。【００８１】
[2.1]明暗選択試験  
明暗箱による不安症状の確認法(Psychopharmacology, 94, 392-396, 1988) により、kf-1(-/-)マウスが不安を喚起しているかを確認した。実験装置は２個のボックスを設置し、１個のボックスは暗室とし、もう１個のボックスは明室とした。明室はランプで明るく照明を行い、暗室と明室はトンネルで接続した。動物を暗室から入れ、ボックスのふたに設置したビデオカメラでマウスの動きを10分間記録し、各ボックスでの移動距離(Distance Traveled)、明室に滞在した時間(Stay Time in Light)、暗室および明室の移動回数（transitions）、暗室から明室に最初に移動するまでの時間（Latency to Light）を解析した。【００８２】
結果は図3に示す。【００８３】
その結果、暗室での総移動距離、暗室から明室に入るまでの時間（Latency to Light）は両群で差はなかった。しかし、明室での移動距離、明室での滞在時間、暗室および明室の移動回数については、kf-1(-/-)マウスではコントロールマウスと比較して有意に減少していた。すなわち、kf-1(-/-)マウスはコントロールマウスと比較して不安を惹起していた。【００８４】
[2.2]高架式十字迷路試験
高架式十字迷路による不安様行動の確認法(Miyakawa T,  et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003;100:8987-8992.)により、kf-1(-/-)マウスが不安を喚起しているかを確認した。【００８５】
十字迷路装置は２本のオープン・アームと、それと同サイズで壁のあるクローズド・アームを高架にした。前記アームをセントラル・スクエアに連結し、それによって迷路装置を十字に形成した。各マウスをセンター・プラットフォームに置いて、実験を開始した。記録した10分間の行動はセンター・プラットフォームへの進入回数(Number of entries)、オープン・アームへの進入頻度(Entries into Open Arms %)、総移動距離(Distance Traveled)及びオープン・アームでの滞在時間の割合(Times on Open Arms)であった。【００８６】
結果を図４に示す。【００８７】
その結果、kf-1(-/-)マウスは対照群マウスよりも、十字型迷路装置のセンター・プラットフォームへの進入回数が少なく、総移動距離も有意に減少していた。オープン・アームへの進入頻度や、オープン・アームでの滞在時間については、対照群と比べて減少傾向がみられたが、有意の差は示されなかった。【００８８】
[2.3] 強制水泳試験  
マウスの「うつ」症状とされる生への意欲喪失確認のために強制水泳法 (Arch. int. Pharmacodyn. 229, 327-336, 1977) により、kf-1(-/-)マウスの「うつ」症状について判定を行った。実験装置は４個のプラスチック製の円柱水槽に水を入れ、マウスを円柱水槽の中央に入れ、10分間の行動を記録した。解析は1分ごとの無動時間と移動距離を測定して行った。翌日も同様の実験を行った。【００８９】
結果を図５に示す。【００９０】
その結果、kf-1(-/-)マウスは、野生型マウスと比較して、無動時間においても移動距離においてもすべて有意差はみられなかった。【００９１】
[2.4]オープンフィールド試験
オープンフィールド法により、kf-1(-/-)マウスの探索行動、活動量、情動行動について試験を行った。動物を白いアクリル製ケージに入れ、120分間の移動距離(Total distance), 立ち上がり回数(Vertical Activity), 中央部滞在時間(Center time)、常同行動(Stereotypic Counts)を測定し、5分間ごとの変化をグラフに示した。【００９２】
結果は図６に示す。【００９３】
その結果、すべての項目においてkf-1(-/-)マウスと対照群に有意差はなかった。【００９４】
[2.5] 驚愕反応試験（プレパルスインヒビションテスト）
驚愕反応試験により、kf-1(-/-)マウスが、統合失調症患者に見られる感覚制御機能障害の有無を観察した。単独で強い驚愕音刺激が与えられると、正常な感覚情報処理が行われて驚愕反応が起こるが、事前に弱い先行音刺激があれば抑制される。kf-1(-/-)マウスは110dB、120dBの強い音刺激を与えると、正常なマウスよりもやや弱い驚愕反応を示すが、事前に小さな先行音刺激（74dB、78dB）を与えておくと、対照群に比べて強い驚愕反応抑制（prepulse inhibition）が見られた。【００９５】
解析は以下のように行った。驚愕反応を検知する荷重変化計測装置を内蔵した試験箱にマウスを入れ、10分間装置に慣れさせた後、さらに５分間背景音を聞かせて新しい環境に順応させた。110dB、120dBの強音刺激のみを与えたとき、事前に74dB、78dBの先行弱音刺激を与えたときの強音刺激に対する驚愕反応の大きさを荷重の増加で表し、それぞれをA、Bとしたとき、驚愕反応の減少率（Prepulse Inhibition）C%をC=100（1-B/A）で得る。【００９６】
その結果、kf-1(-/-)マウスは対照群マウスよりも単独に強音刺激を受けたときの驚愕反応が有意に弱く、さらに、事前に先行弱音刺激を受けることによる、強音刺激に対する驚愕反応への抑制が対照群よりも有意に増加する。これは情報学習能力が高いとも解釈できるので、統合失調症とは逆反応であり、感覚制御機能がより感受性を増強しているためと解釈できる。これが高架式十字迷路試験や明暗選択試験で見られたkf-1(-/-)マウスの不安様行動の増強と相関しているということは、うつ病と統合失調症が同一機能の異常であり、それぞれが機能障害と機能獲得という逆方向に発現している可能性を示唆している。従って、不安様行動の増強を、高架式十字迷路試験や明暗選択試験による不安様行動の観察以外に、驚愕反応試験で驚愕反応抑制を観察して検知できる可能性があり、この試験はより簡便なスクリーニングの方法を提供できる。【００９７】
[2.6]結果解析
kf-1欠失マウスは、体重、筋力試験などで野生型マウスと有意の差はなく、またオープンフィールド試験でも、両者に活動量の有意差はない。強制水泳試験からは、欠失マウスには、マウスにおける「うつ」症状とされる特徴は見られなかった。【００９８】
にもかかわらず、明暗選択試験、高架式十字迷路試験においては、野生型マウスとの顕著な有意差が確認された。また高架式十字迷路試験から高所恐怖症的心理において野生型マウスと有意差はないものの、新規探求性が顕著に低下していることが観察された。また明暗選択試験から、暗室滞在を好み、暗室での活動性は低下していないことがわかった。驚愕反応試験からは、kf-1欠失マウスでは、感覚情報機能が増強しており、不安様行動の増強との相関があると判定された。【００９９】
kf-1欠失マウスのこれらの行動パターンは、このマウスが、「社会的ひきこもり」のモデルになる可能性を示唆した。【０１００】
3.寄託生物
上記で得られたマウスは、理化学研究所バイオリソースセンターにReg_No.01916として寄託されている（寄託日：平成18年10月12日、寄託機関住所：日本国茨城県つくば市高野台3丁目1番地の1）。【０１０１】
寄託した当該マウスの詳細を下記に示す。
Reg_No.01916、系統名 ：pKF1KO4.3.1、通称・系統別名：Hicky mouse
(1)遺伝的分類：Targeted Mutation Congenic
(2)系統の由来と世代数：マウスkf-1遺伝子のexon 4の前後にLoxP配列を導入したES細胞からマウス個体を作製。Cre Tg との交配によりkf-1 exon 4を欠失。継代数18 generations
(3)微生物学的飼育環境：コンベンショナル
(4)微生物学的性状：ICLAS （鏡検I・培養I・血清I）陰性、S. aureus 陽性
系統の詳細（特性・用途）：「ひきこもり」様不安行動を呈す。抗不安薬、抗うつ薬開発のためのモデル動物
(5)飼育・交配：繁殖効率A
(6)系統の開発経緯：C57BL/6Nとの交配、８世代
(7)所見：行動の異常がある。明暗選択試験、高架式十字迷路試験で典型的な「ひきこもり」様症状、不安様行動を呈す。強制水泳試験、尾懸垂試験ではマウスの「うつ」症状を示さず正常。
(8)導入ベクター名：pKF1KO-4.3
(9)導入遺伝子：Lox-pgk-Neo-kf-1［ex4］-LoxP
より正確にはLoxP-pgk-Neo-kf-1［in3b］-kf-1［ex4a］-LoxP
但しCre Tg との交配により単一のLoxP配列をのぞいて、二つのLoxP配列に挟まれた部分は除去されている。
(10)作出方法：ES細胞
(11)(10)のES細胞名：129SVJ
(12)遺伝子の検出方法：PCR
(13)(12)の検出方法の詳細（プライマー配列）：
20039FW: TCTTGGTTAAATAATGTATGCTCT
17436FW: AACTTGAAGTCGCTGTCTTTTGG
20292RV: CCCCTATAAAATTCTTTCCTATCC
WT 277 bp、Hicky: 560 bp
【図１】
2008059949.tif 000002
【図２】
2008059949.tif 000003
【図３】
2008059949.tif 000004
【図４】
2008059949.tif 000005
【図５】
2008059949.tif 000006
【図６】
2008059949.tif 000007
【図７】
2008059949.tif 000008
【配列表】
2008059949000001.app
【国際調査報告】
2008059949.tif 000009
2008059949.tif 000010
2008059949.tif 000011
2008059949.tif 000012
2008059949.tif 000013
2008059949.tif 000014
2008059949.tif 000015