(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
【請求項２】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９５％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が９５％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
【請求項３】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列を含む核酸
【請求項４】
ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１〜３０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１〜１５個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
【請求項７】
ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、請求項５又は６に記載のタンパク質。
【請求項８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子とその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
不飽和結合を２箇所以上含有する脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ：polyunsaturated fatty acid）と総称され、アラキドン酸やジホモγリノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが知られている。この高度不飽和脂肪酸は、動物体内で合成できないものも含まれており、このような高度不飽和脂肪酸については、必須脂肪酸として食物から摂取する必要がある。高度不飽和脂肪酸は広く分布しており、例えば、アラキドン酸は動物の副腎腺や肝臓から抽出した脂質から分離される。しかしながら、動物臓器に含まれる高度不飽和脂肪酸は少量で、動物臓器から高度不飽和脂肪酸を抽出したり分離したりするだけでは、大量に供給するには十分ではなかった。そのため、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を獲得する方法が開発されてきた。中でもモルティエレラ（Mortierella）属微生物は、アラキドン酸等の高度不飽和脂肪酸含有脂質を生産する微生物として知られている。【０００３】
また、高度不飽和脂肪酸を植物で生産させる試みもなされている。高度不飽和脂肪酸は、トリアシルグリセロール（トリグリセリド、ＴＧともいう）などの貯蔵脂質を構成し、微生物の菌体内もしくは植物種子中に蓄積されることが知られている。【０００４】
貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールは、生体内で以下のとおり生成される。グリセロール−３−リン酸にグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素によりアシル基が転移されてリゾホスファチジン酸が生じ、リゾホスファチジン酸にリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素によりアシル基が転移されてホスファチジン酸が生じ、ホスファチジン酸がホスファチジン酸ホスファターゼにより脱リン酸化されてジアシルグリセロールが生じ、ジアシルグリセロールにジアシルグリセロールアシル基転移酵素によりアシル基が転移されてトリアシルグリセロールが生じる。【０００５】
上記系路の中で、ホスファチジン酸（phosphatidic acid、以下「ＰＡ」と記載する場合もある。また、１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロール−３−リン酸という場合もある。）は、トリアシルグリセロールの前駆体であるとともに、ジアシル型グリセロリン脂質の生合成前駆体である。酵母などではＰＡとシチジン５’−３リン酸（ＣＴＰ）からホスファチジン酸シチジルトランスフェラーゼ、によりＣＤＰジアシルグリセロール（ＣＤＰ−ＤＧ）が合成され、種々のリン脂質へと生合成される。【０００６】
上述したとおり、ＰＡを脱リン酸化してジアシルグリセロール（diacylglycerol、以下「ＤＧ」と記載する場合もある。）を生合成する反応は、ホスファチジン酸ホスファターゼ（E.C. 3.1.3.4、phosphatidic acid phosphatase、以下「ＰＡＰ」と記載する場合もある。）が触媒することが知られている。このＰＡＰは細菌から脊椎動物までのすべての生物で存在することが知られている。【０００７】
真菌類である酵母（Saccharomyces cerevisiae）では、２つのタイプのＰＡＰが知られている（非特許文献１、２、７）。一方はＭｇ２＋依存性のＰＡＰ（ＰＡＰ１）であり、他方はＭｇ２＋非依存性のＰＡＰ（ＰＡＰ２）である。ＰＡＰ１をコードする遺伝子としては、ＰＡＨ１遺伝子が知られているが（非特許文献３〜５）、ｐａｈ１Δ変異株はＰＡＰ１活性を有していることから、ほかにもＰＡＰ１活性を担う遺伝子があると考えられている。ｐａｈ１Δ変異株では、核膜やＥＲの膜が異常に拡張し、さらにリン脂質の生合成のキーとなる遺伝子の発現が異常に高まることが知られている（非特許文献６）。【０００８】
一方、ＰＡＰ２をコードする遺伝子としては、ＤＰＰ１遺伝子とＬＰＰ１遺伝子が知られており、これらが酵母におけるＰＡＰ２活性をほぼ担っている。これらの遺伝子がコードする酵素は基質特異性が広く、ジアシルグリセロールピロホスフェート（ＤＧＰＰ）、リゾホスファチジン酸、スフィンゴイドベースホスフェートやイソプレノイドホスフェートなどにも作用し、脱リン酸化することが知られている。【０００９】
脂質生産菌であるモルティエレラ  アルピナ（Mortierella alpina）では、Ｍｇ２＋依存性ＰＡＰ１ホモログとして、ＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２の２種類が知られている（特許文献１）。また、Ｍｇ２＋非依存性のＰＡＰ２ホモログであるＭａＰＡＰ１遺伝子が知られている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開公報第ＷＯ２０１１／０８１１３５号パンフレット
【特許文献２】国際公開公報第ＷＯ２００９／００８４６６号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Biochem. Biophys. Acta, 1348, 45-55, 1997
【非特許文献２】Trends Biochem Sci., 31(12), 694-699, 2006
【非特許文献３】EMBO J., 24, 1931-1941, 2005,
【非特許文献４】J. Biol. Chem., 281(14), 9210-9218, 2006
【非特許文献５】J. Biol. Chem., 281(45), 34537-34548, 2006
【非特許文献６】J. Biol. Chem., 282(51), 37026-37035, 2007
【非特許文献７】J. Biol. Chem., 284(5), 2593-2597, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
これまでにいくつかのＰＡＰ遺伝子が報告されているが、宿主細胞に導入して発現させた場合に、当該宿主が産生する脂肪酸組成物の脂肪酸組成を変化させ得ることについて検討された例は少ない。宿主細胞に導入する又は発現させることで、目的とする脂肪酸組成の油脂を製造させたり、目的とする脂肪酸の含有量を増加させたりできるような、新規な遺伝子を導入することが求められている。【００１３】
本発明の目的は、新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子、およびそれにコードされるタンパク質、ならびにそれら利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、脂質生産菌Mortierella alpinaのゲノムを解析し、この中から既知のＭｇ２＋非依存性のホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ２）遺伝子と相同性のある配列を抽出した。さらに、ＰＡＰをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を取得するため、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングあるいはＰＣＲにより全長ｃＤＮＡをクローニングした。その遺伝子を酵母等の高増殖能を有する宿主細胞に導入して、クローニングしたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質がホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有することを確認した。それにより、新規なホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）に関する遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、一態様において、本発明は以下の通りであってよい。【００１５】
（１）以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸【００１６】
（２）以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜１１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸【００１７】
（３）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸【００１８】
（４）ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、（１）又は（２）に記載の核酸。【００１９】
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質【００２０】
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１〜１１０個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質【００２１】
（７）ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、（５）又は（６）に記載のタンパク質。【００２２】
（８）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。【００２３】
（９）（１）〜（４）のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。【００２４】
（１０）（９）に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、新規なＰＡＰ遺伝子、及びそれにコードされるタンパク質、ならびにそれらの利用法を提供する。本発明のＰＡＰは、ＰＡＰを導入していない宿主が産生する脂肪酸組成物と比較して、組成が異なる脂肪酸組成物を宿主中に産生可能であることが期待される。それにより、所望の特性や効果を有する脂質を提供できるため、食品、化粧料、医薬品、石鹸等に適用できるものとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１−１】図１−１は、ＭａＰＡＰ２．２のゲノム配列およびＣＤＳの塩基配列を示す。
【図１−２】図１−２は、図１−１の続きである。
【図２】図２は、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列と、オオキツネタケ由来の推定タンパク質および酵母由来のＳｃＤＰＰ１（YDR284C：アクセッション番号  AAS56070））のアミノ酸配列のアラインメントである。
【図３】図３は、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列と、Mortierella alpina由来のＭｇ２＋非依存性ＰＡＰ（ＰＡＰ２）として既知のＭａＰＡＰ１（WO2009/008466）のアミノ酸配列のアラインメントである。二重下線は、Ｍｇ２＋非依存性のホスファチジン酸ホスファターゼ２型（ＰＡＰ２）ファミリー酵素の３つの保存領域（Ｎ末端側より順に、ドメイン１、ドメイン２、及びドメイン３）を示す。＊は、ＰＡＰ活性に必至なアミノ酸を示す。
【図４】図４は、ＭａＰＡＰ２．２の１８：２−ＰＡを１８：２−ＤＧに変換する活性に関し、Ｍｇ２＋依存性について検討した結果を示すグラフである（ｎ＝１）。Ａは、Ｍｇ２＋を添加した場合の結果を示す。Ｂは、ＥＤＴＡを添加した場合（Ｍｇ２＋不含）の結果を示す。縦軸は、ＤＧ画分中に見出された１８：２の、粗酵素液のタンパク質あたりの量（μｇ／ｍｇ・タンパク質）を示す。
【図５】図５は、Ｍｇ２＋不含の反応液における、ＭａＰＡＰ２．２（Ａ）及びＭａＰＡＰ１（Ｂ）の１８：２−ＰＡを１８：２−ＤＧに変換する活性について検討した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。縦軸は、ＤＧ画分中に見出された１８：２の、粗酵素液のタンパク質あたりの量（μｇ／ｍｇ・タンパク質）を示す。
【図６】図６Ａは、ＭａＰＡＰ２．２を含む反応液およびコントロールにおいて、基質であるホスファチジン酸を添加しない場合の１８：１−ＤＧの量を検討した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。図６Ｂは、ＭａＰＡＰ２．２を含む反応液およびコントロールにおいて、基質として１８：１−ＰＡを添加した場合の、反応後の１８：１−ＤＧの量を検討した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。縦軸はいずれも、ＤＧ画分中に見出された１８：１の、粗酵素液のタンパク質あたりの量（μｇ／ｍｇ・タンパク質）を示す。
【図７】図７は、ＭａＰＡＰ２．２を含む反応液およびコントロールにおいて、基質として１７：０−ＰＡを添加した場合の、反応後の１７：０−ＤＧの量を検討した結果を示すグラフである（ｎ＝３）。縦軸はいずれも、ＤＧ画分中に見出された１７：０の、粗酵素液のタンパク質あたりの量（μｇ／ｍｇ・タンパク質）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、ホスファチジン酸を脱リン酸化して、ジアシルグリセロールを生成させることを特徴とする、Mortierella属由来の新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子、それにコードされるタンパク質、およびそれらの利用法に関する。
【００２８】
ホスファチジン酸ホスファターゼは、ホスファチジン酸を脱リン酸化して、ジアシルグリセロールを生成する反応を触媒する酵素である。本発明のＰＡＰの基質は、通常、ホスファチジン酸であるが、これに限定されない。
【００２９】
ホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸
本発明のホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）には、ＭａＰＡＰ２．２及びその変異体が含まれる。ＭａＰＡＰ２．２をコードする核酸のｃＤＮＡ、ＣＤＳ、ＯＲＦ及びアミノ酸配列の対応関係を以下の表１に整理して記載した。
【００３０】
【表１】
0005576986.tif 000002
【００３１】
つまり、ＭａＰＡＰ２．２に関連する配列としては、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列である配列番号２、ＭａＰＡＰ２．２のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号１、そして、そのＣＤＳの領域を示す配列である配列番号３、及びそのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号５があげられる。このうち、配列番号１は配列番号５の第７５〜１１６３番目の塩基配列に相当し、配列番号３は配列番号５の第７５〜１１６６番目の塩基配列に相当する。また、ＭａＰＡＰ２．２をコードするゲノム塩基配列として、配列番号４があげられる。配列番号４のゲノム配列は、エキソン３個とイントロン２個からなっており、エキソン領域は配列番号４の第１〜２０７番目、第４４５〜５８２番目、第８８９〜１６３２番目である。
【００３２】
本明細書において核酸とは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。
【００３３】
本発明の核酸の好ましい態様としては、（ａ）配列番号１で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｃ）配列番号５で示される塩基配列、等を含む核酸があげられる。
【００３４】
上記塩基配列を得るためには、ＰＡＰ活性を有する生物のＥＳＴやゲノムＤＮＡの塩基配列データから、既知のＰＡＰ活性を有するタンパク質と相同性のあるタンパク質をコードする塩基配列を探索することもできる。ＰＡＰ活性を有する生物としては、脂質生産菌が好ましく、脂質生産菌としてはM. alpinaがあげられるが、これに限定されない。
【００３５】
ＥＳＴ解析を行う場合には、まず、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いてもよい。本発明に適するｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、例えば以下のような方法があげられる。すなわち、脂質生産菌であるM. alpinaの適当な株を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養する。この前培養に適する培養条件としては、例えば、培地組成としては、１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０があげられ、培養期間は３〜４日間、培養温度は２８℃である条件があげられる。その後、前培養物を適当な条件にて本培養に供する。本培養に適する培地組成としては、例えば、１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％  Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％  ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０があげられる。本培養に適する培養条件としては、例えば、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃で８日間通気攪拌培養する条件があげられる。培養期間中に適当量のグルコースを添加してもよい。本培養中に適時培養物を採取し、そこから菌体を回収して、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製には、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法等の公知の方法を用いることができる。得られた全ＲＮＡから市販のキットを用いてpoly（Ａ）＋ＲＮＡを精製することができる。さらに、市販のキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。その後、作製したｃＤＮＡライブラリーの任意のクローンの塩基配列を、ベクター上にインサート部分の塩基配列を決定できるように設計されたプライマーを用いて決定し、ＥＳＴを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE)でｃＤＮＡライブラリーを作製した場合は、ディレクショナルクローニングを行うことができる。
【００３６】
ゲノムＤＮＡを解析する場合は、ＰＡＰ活性を有する生物の細胞を培養し、当該細胞からゲノムＤＮＡを調製する。得られたゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、決定した塩基配列をアッセンブリする。最終的に得られたスーパーコンティグの配列から、既知のＰＡＰ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をコードする配列を探索する。このようなアミノ酸配列をコードするものとしてヒットしたスーパーコンティグの配列からプライマーを作製し、上述したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込み、クローン化する。クローン化されたプラスミドを鋳型として、上述のプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりプローブを作製する。作製したプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。
【００３７】
ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列を、GenBankに登録されているアミノ酸配列に対してBLASTpプログラムで相同性検索を行った。このアミノ酸配列は、オオキツネタケの推定タンパク質（配列番号１０、アクセッション番号：XP 001878243）と最も高いスコアでヒットし、同一性は３６．７％である。また、Mortierella alpina由来の公知のＰＡＰ２（Ｍｇ２＋非依存性のＰＡＰ）であるＭａＰＡＰ１のアミノ酸配列と、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列の間の同一性は２０．５％である。
【００３８】
本発明はまた、上記配列番号１で示される塩基配列、または、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、を含む核酸と同等の機能を有する核酸を含む。「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質がホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）活性を有することを意味する。本明細書において、ＰＡＰ活性とは、ホスファチジン酸を脱リン酸化して、ジアシルグリセロールを生成する反応を触媒する活性である。また、ＰＡＰ活性は、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いものであってもよいが、これに限定されない。また、ＰＡＰ活性は、Ｍｇ２＋非依存性であってもよいが、これに限定されない。
【００３９】
配列番号１で示される塩基配列、または、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、を含む核酸の変異体であって当該核酸と同等の機能を有する核酸としては、以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸があげられる。
【００４０】
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
【００４１】
具体的には、
(i) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜110個、1〜100個、1〜75個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜110個、1〜100個、1〜75個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２に示すアミノ酸配列において１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜110個、1〜100個、1〜75個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列、
からなるタンパク質であって、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
【００４２】
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
【００４３】
保存的置換は、一般的には、生物学的合成系や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
【００４４】
以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸及び２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン及びグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸及び２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン及び４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン及びホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン及びチロシン
【００４５】
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。
【００４６】
また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。
【００４７】
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. Golub及びD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
【００４８】
Ｄ−アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。
【００４９】
なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
【００５０】
同様に、一般的には、特に言及しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向とする。
【００５１】
当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したタンパク質の適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のタンパク質の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができるタンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている分子の残基及び領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
【００５２】
特に、図３において二重下線で示したように、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列（配列番号２）中の第１１５〜１２３残基、第１７２〜１７５残基、及び第２２９〜２３３残基に、Ｍｇ２＋非依存性のホスファチジン酸ホスファターゼ２型（ＰＡＰ２）ファミリー酵素の３つの保存領域が存在する。また、ＰＡＰ２ファミリー酵素の３つの保存領域中、ドメイン１のアルギニン、ドメイン２及び３のヒスチジンは、活性に必須なアミノ酸として知られており、ＭａＰＡＰ２．２においても当該アミノ酸が、それぞれ配列番号２の第１２２残基のアルギニン、第１７５残基のヒスチジン及び第２２９残基のヒスチジンとして保存されている。上記保存領域は、ＰＡＰ２ファミリー酵素に必須の領域であり、本発明のＰＡＰにとっても重要な領域である。従って、本発明の変異体は、上記保存領域が保存されている限り、いかなる変異体であってもよい。
【００５３】
当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造−機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
【００５４】
上記したように、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
【００５５】
なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
【００５６】
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１〜３０個、１〜２０個、又は１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
【００５７】
本発明の核酸がコードするタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異または修飾の部位は、ＰＡＰ活性が保持される限り制限はない。
【００５８】
ＰＡＰ活性は、公知の方法を用いて測定することが可能である。例えば、以下の文献：J. Biol. Chem., 273, 14331-14338(1998)を参照することができる。
【００５９】
例えば、ＰＡＰ活性は以下の通り測定してもよい。本発明のＰＡＰを発現させた形質転換細胞を破砕し、その細胞破砕液を遠心分離して上清を回収し、粗酵素液とする。粗酵素液をさらに本発明のＰＡＰについて精製してもよい。そして、本発明のＰＡＰを含む粗酵素液又は精製した本発明のＰＡＰを、１００μｇ／ｍＬ  ホスファチジン酸、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む反応液に添加し、２５〜２８℃で適当な時間反応させる。クロロホルム：メタノールを添加して反応を停止させた後、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄層クロマトグラフィー等により分画し、生成したジアシルグリセロール量を定量することができる。
【００６０】
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
【００６１】
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
【００６２】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
【００６３】
ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。
【００６４】
具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４２℃〜５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ〜３×ＳＳＣ、４５℃〜５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４０℃〜６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％〜０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。
【００６５】
高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５５℃〜６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣ、６０℃〜６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５０℃〜６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０〜６５℃があげられる。
【００６６】
特に本発明に用いられるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。
【００６７】
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。
【００６８】
本発明に含まれる塩基配列としては、好ましくは、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
【００６９】
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１に示される塩基配列に対して少なくとも７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
【００７０】
好ましくは、配列番号１に示される塩基配列に対して少なくとも７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
【００７１】
２つの塩基配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるBLASTNプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン2.2.7、又はWU-BLAST2.0アルゴリズム等があげられる。WU-BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。
【００７２】
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む。
【００７３】
本発明の核酸がコードするタンパク質は、ＰＡＰ活性を有する限り、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列と同一性のあるタンパク質でもよい。具体的には、本発明の核酸がコードするタンパク質のアミノ酸配列として、配列番号２で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％（例えば、９５％、さらには、９８％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。
【００７４】
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列である。さらに好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
【００７５】
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、BLAST、FASTA（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びClustalW等があげられる。特に、BLASTプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（BLASTマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DINASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI(Infomax)等のプログラムを用いて決定することもできる。
【００７６】
複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ−スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
【００７７】
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
【００７８】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びハイブリダイズの条件は上記のとおりである。
【００７９】
（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
配列番号４からなる塩基配列は、ＭａＰＡＰ２．２をコードするゲノムＤＮＡ配列である。
【００８０】
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む。
【００８１】
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ゲノムライブラリー等から得ることができる。ハイブリダイズの条件は、上記の通りである。
【００８２】
（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４からなる塩基配列に対して少なくとも７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。好ましくは、配列番号４に示される塩基配列に対して少なくとも７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは、９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列があげられる。２つの塩基配列の同一性％は、上述したように決定することができる。
【００８３】
配列番号４のゲノムＤＮＡ配列は、エキソン３個とイントロン２個からなっており、エキソン領域は配列番号４の第１〜２０７番目、第４４５〜５８２番目、第８８９〜１６３２番目である。
【００８４】
別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４に示されるゲノムＤＮＡ配列において、イントロン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して１００％同一であり、そして、エキソン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列があげられる。
【００８５】
また別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４に示されるゲノムＤＮＡ配列において、エキソン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して１００％同一であり、そして、イントロン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、スプライシングによりイントロン領域が脱離可能であり、それによりエキソン領域が連結してＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、があげられる。
【００８６】
さらに別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４に示されるゲノムＤＮＡ配列において、イントロン領域の塩基配列が配列番号４に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、そして、エキソン領域の塩基配列が配列番号５又は配列番号１０に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、スプライシングによりイントロン領域が脱離可能であり、それにより連結したエキソン領域がＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする、塩基配列があげられる。
【００８７】
２つの塩基配列の同一性％は、上述した方法により決定することができる。
【００８８】
また、本発明の核酸には、配列番号１からなる塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸も含まれる。具体的には、
(i) 配列番号１に示す塩基配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜330個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が欠失した塩基配列、
(ii) 配列番号１に示す塩基配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜330個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号１に示す塩基配列において１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜330個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の他の塩基が付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせた塩基配列、
であって、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。
【００８９】
本発明の核酸の別の態様としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列のフラグメントを含む核酸も含まれる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列
（ｄ）配列番号５で示される塩基配列
【００９０】
（ａ）配列番号１で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｄ）配列番号５で示される塩基配列については、表１に記載したとおりである。また、配列番号４で示される塩基配列についても上述の通りである。上記配列のフラグメントとは、上記塩基配列に含まれるＯＲＦ、ＣＤＳ、生物学的活性を有する領域、以下に記載するようなプライマーとして用いた領域、プローブとなりうる領域が含まれ、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。
【００９１】
また、本発明の核酸には以下の核酸も含まれる。
（１）  以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
【００９２】
（２）  以下の(ａ)〜（ｇ）のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｆ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｇ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸
【００９３】
ホスファチジン酸ホスファターゼタンパク質
本発明のタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びその変異体であって前記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質については、上記のとおりである。「同等の機能を有するタンパク質」とは、上記『ホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸』の項で説明したとおり、ＰＡＰ活性を有するタンパク質を意味する。
【００９４】
本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質があげられる。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質
【００９５】
上記のうち、配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列については、上記、『ホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸』の項で説明したとおりである。また、上記「ＰＡＰ活性を有するタンパク質」は、配列番号１の塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質の変異体、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加等の多くの種類の修飾により変異したタンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾されている修飾タンパク質、他のタンパク質との融合タンパク質であって、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質も含まれる。
【００９６】
また、本発明のタンパク質は、人工的に作製したものであってもよく、その場合は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
【００９７】
また、本発明のタンパク質には、以下のタンパク質も含まれる。
（１）（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）  以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１〜１１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
【００９８】
核酸のクローニング
ＰＡＰの核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
【００９９】
例えば、pBlue-Script TMSK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp(TM: Gibco-BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等の市販のプラスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号５等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができるが、例えば、
上流側用プライマーとして、プライマーPAP2.2-1f：５’−TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT−３’（配列番号６）、
下流側用プライマーとして、プライマーPAP2.2-4r：５’−GACAATGCCGAGGATCGAGCC−３’（配列番号７）、
等を、各々用いることができる。そして、M. alpina 菌体から調製したｃＤＮＡに、上記プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃
サイクル数：１０回以上
【０１００】
得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。
【０１０１】
クローニングした核酸の塩基配列は、塩基配列シーケンサーを用いて決定することができる。
【０１０２】
ＰＡＰ発現用ベクター構築及び形質転換体の作製
本発明はまた、ＰＡＰをコードする核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
【０１０３】
このような組換えベクター及び形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、ＭａＰＡＰ２．２またはその変異体をコードする核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、EcoRI、KpnI、BamHI及びSalI等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。このＤＮＡ断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、ＰＡＰ発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。
【０１０４】
このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。真菌として、脂質生産菌であるM. alpina等の糸状菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母等があげられる。また細菌として、大腸菌（Escherichia coli）やバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。
【０１０５】
脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol.XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Mortierella isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物等があげられる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。
【０１０６】
真菌類を宿主として用いる場合は、本発明の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。宿主としてM. alpinaを使用する場合、発現ベクターとして、例えば、pD4、pDuraSC、pDura5等があげられる。プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるプロモーターを用いてもよく、例えば、histonH4.1遺伝子プロモーター、GAPDH（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーター、TEF（Translation elongation factor）遺伝子プロモーターといったM. alpinaに由来するプロモーターが用いられる。
【０１０７】
M. alpina等の糸状菌への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
【０１０８】
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、pYE22m等があげられる。また、pYES（Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等の市販の酵母発現用ベクターを、用いてもよい。また本発明に適する宿主としては、Saccharomyces cerevisiae EH13-15株（trp1, MATα）等があげられるがこれらに限定されない。プロモーターとしては、例えば、GAPDHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター等の酵母等に由来するプロモーターが用いられる。
【０１０９】
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数又は複数）の被包、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。
【０１１０】
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX、pUC18等があげられる。プロモーターとしては、例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
【０１１１】
脂肪酸組成物の製造方法
本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸組成物を製造する方法である。脂肪酸組成物は、１又はそれ以上の脂肪酸の組み合わせを含む組成物である。ここで、脂肪酸は遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリドやリン脂質等の脂肪酸を含む脂質として存在していてもよい。本発明の脂肪酸組成物は、具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
【０１１２】
ＰＡＰを発現させた生物の培養に用いる培地は、適当なｐＨ及び浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、酵母を形質転換してＰＡＰを発現させた場合は、SC-Trp培地、YPD培地、YPD5培地等を用いることができるが、これらに限定されない。具体的な培地の組成としてSC-Trp培地を例示する：１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ。
【０１１３】
培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよいが、大量培養をする場合には、培養効率がよい２段階培養等が好ましい。
【０１１４】
宿主として酵母を用いて２段階培養を行う場合、本発明の脂肪酸組成物の製造方法は以下のように行うことができる。前培養として、形質転換体のコロニーを、上記のSC-Trp培地等に植菌して、３０℃で２日間振盪培養を行う。その後、本培養として、YPD5（２％酵母エキス、１％ポリペプトン、５％グルコース）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振盪培養を行う。
【０１１５】
脂肪酸組成物
本発明はまた、ＭａＰＡＰ２．２又はその変異体が発現している細胞における１又はそれ以上の脂肪酸の集合体である脂肪酸組成物を提供する。好ましくは、ＭａＰＡＰ２．２又はその変異体が発現している形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物である。脂肪酸は、遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリド、リン脂質等の脂肪酸を含む脂質の形で存在していてもよい。
【０１１６】
本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸としては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐状のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリスチン酸（テトラデカン酸）(14:0)、ミリストレイン酸（テトラデセン酸）（14:1）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）(16:0)、パルミトレイン酸（9−ヘキサデセン酸）(16:1)、マルガリン酸（ヘプタデカン酸）（17:0)、ステアリン酸（オクタデカン酸）(18:0)、オレイン酸（cis−9−オクタデセン酸）(18:1(9))、バクセン酸（11−オクタデセン酸）(18:1(11))、リノール酸（cis, cis−9,12 オクタデカジエン酸）(18:2(9,12))、α−リノレン酸（9,12,15−オクタデカトリエン酸）(18:3(9,12,15))、γ−リノレン酸（6,9,12−オクタデカトリエン酸）(18:3(6,9,12))、ステアリドン酸(6,9,12,15-オクタデカテトラエン酸)(18:4(6,9,12,15))、アラキジン酸（イコサン酸）(20:0)、（8,11−イコサジエン酸）(20:2(8,11))、ミード酸（5,8,11−イコサトリエン酸）(20:3(5,8,11))、ジホモγ-リノレン酸（8,11,14-イコサトリエン酸）(20:3(8,11,14))、アラキドン酸（5,8,11,14−イコサテトラエン酸）(20:4(5,8,11,14))、エイコサテトラエン酸（8,11,14,17-イコサテトラエン酸）（20:4(8,11,14,17)、エイコサペンタエン酸（5,8,11,14,17-イコサペンタエン酸）（20:5(5,8,11,14,17)）、ベヘン酸（ドコサン酸）(22:0)、（7,10,13,16-ドコサテトラエン酸）(22:4(7,10,13,16))、（7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸）(22:5(7,10,13,16,19))、（4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸）(22:5(4,7,10,13,16))、（4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸）(22:6(4,7,10,13,16,19))、リグノセリン酸（テトラドコサン酸）(24:0)、ネルボン酸（cis−15−テトラコセン酸）(24:1)、セロチン酸（ヘキサドコサン酸）(26:0)、等があげられるが、これらに限定されない。なお、上記物質名はIUPAC生化学命名法で定義された慣用名であり、組織名及び、炭素数と二重結合の位置を示す数値を、カッコ内に記載した。
【０１１７】
本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸のうち、１またそれ以上の脂肪酸の組み合わせであれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪酸からなる組成物でもよい。
【０１１８】
脂肪酸組成物を含む食品等
また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業原料（化粧料、医薬（例えば、皮膚外用薬）、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。化粧料（組成物）又は医薬（組成物）の剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をあげることができるが、これらに限定されない。また、食品の形態としては、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。
【０１１９】
さらに、食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等があげられるが、これらに限定されない。本明細書においては、食品とは、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称をいう。
【０１２０】
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等が含まれる。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
【０１２１】
これらの食品としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）；中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品；天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品；バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品；おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげることができる。しかしながら、本発明の食品は、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品；清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられる。
【０１２２】
ＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いた菌株の評価・選択方法
本発明はまた、本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価や選択を行う方法を提供する。具体的には以下のとおりである。
【０１２３】
（１）評価方法
本発明の一態様として、本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価を行う方法があげられる。上記評価方法としては、まず、本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検菌株である脂質産生菌株のＰＡＰ活性について評価する方法があげられる。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、国際特許出願パンフレットWO01/040514号、特開平8-205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
【０１２４】
まず、被検菌株のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、いかなる公知の方法をも用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)参照）。
【０１２５】
本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列、好ましくは、配列番号１に基づいてプライマー又はプローブを設計する。上記プライマー又はプローブは本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列のいずれの部分をも用いることができ、またその設計は公知の手法を用いて行うことができる。プライマーとして用いるポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０塩基以上であり、１５〜２５塩基であることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００塩基が適当である。
【０１２６】
上記で作製したプライマー又はプローブを用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列と特異的に対応する配列が存在するか否かを調べる。特異的に対応する配列の検出は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、本発明のＰＡＰをコードする核酸の塩基配列の一部を含むポリヌクレオチド、又は上記塩基配列の一部に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流若しくは下流の配列の一部を含むポリヌクレオチド、又は上記配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、例えば、ＰＣＲ法等によって被検菌株の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定することができる。
【０１２７】
本発明の方法に適するＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
サイクル数：１０回以上
などの条件である。得られた反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等により分離して、増幅産物の分子量を測定することができる。これにより、増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか否かを確認することにより、被検菌株のＰＡＰ活性を予測又は評価することができる。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方法等で解析することによって、さらにＰＡＰ活性をより正確に予測又は評価することができる。なお、ＰＡＰ活性の評価方法は、上記のとおりである。
【０１２８】
また、本発明の評価方法は、被検菌株を培養し、配列番号１等の本発明の塩基配列がコードするＰＡＰの発現量を測定することによって、被検菌株のＰＡＰ活性を評価するものであってもよい。なお、ＰＡＰの発現量は、被検菌株を適当な条件で培養し、ＰＡＰのｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することにより測定できる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、ウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
【０１２９】
（２）選択方法
本発明の他の態様として、本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いて、脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１等の本発明の塩基配列がコードするＰＡＰの発現量を測定して、目的とする発現量の菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。また、基準となる菌株を設定し、この基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量を比較して、所望の菌株を選択することもできる。具体的には、例えば、基準菌株及び被検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。所望の活性には、上記のように、ＰＡＰの発現量及びＰＡＰが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
【０１３０】
また、本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養して、本発明の上記活性が高いか若しくは低い菌株を選択することにより、所望の活性を有する被検菌株を選択することもできる。所望の活性には、上記のように、ＰＡＰの発現量及びＰＡＰが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
【０１３１】
被検菌株又は基準菌株としては、例えば、上記の本発明のベクターを導入した菌株、上記本発明の核酸の発現が抑制された菌株、突然変異処理が施された菌株、自然変異した菌株などを用いることができるがこれらに限定されない。なお、ＰＡＰ活性は、例えば本明細書中の「ホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸」の項目で記載した方法によって測定することが可能である。突然変異処理としては、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法などがあげられる（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39  酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会出版センターなど参照）が、これらに限定されない。
【０１３２】
なお、本発明の基準菌株、被検菌株として用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又は酵母等があげられるが、これらに限定されない。具体的には、基準菌株、被検菌株は、異なる属や種に属するいかなる菌株を組み合わせて用いてもよく、被検菌株は１又はそれ以上の菌株を同時に用いてもよい。
【０１３３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３４】
実施例１：  Mortierella alpinaのゲノム解析
M. alpina 1S-4株を１００ｍｌのＧＹ２：１培地（２％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy (QIAGEN) を用いてゲノムＤＮＡを調製した。【０１３５】
上記ゲノムＤＮＡの塩基配列を、Roche 454 GS FLX Standard を用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を２ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を３ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、３００個のスーパーコンティグが得られた。【０１３６】
実施例２：  ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライブラリーの作製
M. alpina 1S-4株を１００ｍｌの培地（１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、３日間２８℃で前培養した。１０Ｌ培養槽（Able Co.、東京）に５Ｌの培地（１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）を入れ、前培養物を全量植菌し、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃の条件で８日間通気攪拌培養した。培養１、２、及び３日目に各々２％、２％、及び１．５％相当のグルコースを添加した。培養１、２、３、６、及び８日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法でトータルＲＮＡを調製した。Oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit（Takara Bio Inc.）を用いて、トータルＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの精製を行った。各ステージのｃＤＮＡライブラリーを、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit （STRATAGENE）を用いて作製した。【０１３７】
実施例３：  酵母由来ＤＰＰ１ホモログの探索
酵母のＳｃＤＰＰ１（YDR284C：アクセッション番号  AAS56070）とＳｃＬＰＰ１（YDR503C：アクセッション番号  AAT93210）のホモログをゲノムデータベースより検討した。その結果、２つのスーパーコンティグがヒットした。１つは、ＭａＰＡＰ１に係るゲノム配列を含むスーパーコンティグであり、他方は、配列番号４を含むスーパーコンティグであった。配列番号４に係る遺伝子をＭａＰＡＰ２.２と命名した。  【０１３８】
実施例４：  ＭａＰＡＰ２．２のクローニング及び配列解析
（１）クローニング
MaＰＡＰ２．２のｃＤＮＡをクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
プライマーPAP2.2-1f：TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT（配列番号６）
プライマーPAP2.2-4r：GACAATGCCGAGGATCGAGCC（配列番号７）【０１３９】
上記のとおり作製したライブラリーを鋳型とし、プライマーPAP2.2-1FとプライマーPAP2.2-4Rの組み合わせでExTaq(タカラバイオ)を用いて、９４℃  ２分、（９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  １分）３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。得られた約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、TOPO-TAクローニングキット（Invitrogen）を使ってクローン化し、インサート部分の塩基配列を決定した。配列番号３の５３４〜９０４番目の塩基配列を有するプラスミドをpCR-MaPAP2.2-Pとした。【０１４０】
次に、このプラスミドpCR-MaPAP2.2-Pを鋳型として、上記プライマーを用いてPCRによりプローブを作製した。反応には、ExTaq（タカラバイオ）を用いたが、添付のｄＮＴＰミックスの代わりにＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて、増幅されるＤＮＡをジゴキシゲニン（DIG）ラベルしたプローブを作製し、MaPAP2.2プローブとした。これらのプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。【０１４１】
ハイブリダイゼーションの条件は、次のとおりである。
バッファー：５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド；
温度：４２℃（一晩）；
洗浄条件：０．２ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中（６５℃）で、２０分間×３回。【０１４２】
検出は、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、in vivo エキシジョンにより、プラスミドを切り出し、プラスミドＤＮＡを得た。最もインサート長の長いものは、配列番号５の塩基配列を含んでおり、プラスミドpB-MaPAP2.2と名づけた。【０１４３】
開始コドンや終止コドンの存在、他のPAP2ホモログとの比較から、配列番号５の７５番目〜１１６６番目（配列番号３と同じ）が、ＭａＰＡＰ２．２のＣＤＳであると考えられた。【０１４４】
（２）配列解析
ＭａＰＡＰ２．２遺伝子の塩基配列及びこれのコードする推定アミノ酸配列について、BLAST及びclustalWによる解析で、既知の核酸の塩基配列及びアミノ酸配列に対する相同性検索を行った。BLASTXによるGENBANKに登録されているアミノ酸配列に対する相同性検索でヒットしたものの中で、もっともE-Valueの低かった配列は、オオキツネタケ（Laccaria bicolor）由来の推定タンパク質（アクセッション番号：XP 001878243）で、アミノ酸配列の同一性は３６．７％であった。ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列と、オオキツネタケ由来の推定タンパク質および酵母由来のＳｃＤＰＰ１（YDR284C：アクセッション番号  AAS56070））のアミノ酸配列のアラインメントを図２に示した。【０１４５】
また、Mortierella alpina由来のＭｇ２＋非依存性ＰＡＰ（ＰＡＰ２）として既知のＭａＰＡＰ１（WO2009/008466）と、ＭａＰＡＰ２．２のアミノ酸配列の同一性は２０．５％であった。ＭａＰＡＰ２．２とＭａＰＡＰ１のアミノ酸配列のアラインメントを図３に示した。ＰＡＰ２ファミリー酵素には３つの保存領域があり、活性に必須のアミノ酸も知られている。図３に示したとおり、ＭａＰＡＰ２．２においてもこれらの保存領域は保存されており（図３中、二重下線で示した領域）、活性に必須であるドメイン１のアルギニン残基、ドメイン２とドメイン３のヒスチジン残基（図３中、＊で示した残基）が保存されていた。【０１４６】
実施例５：  ＭａＰＡＰ２．２の機能解析
（１）酵母発現ベクターの構築
MaPAP2.2を酵母で発現させるために、以下のとおり酵母発現用ベクターを構築した。まず、プライマーEco-PAP2-2-FとKpn-PAP2-2-Rを作成し、pB-MaPAP2.2を鋳型として、ExTaq（タカラバイオ）にてＰＣＲ反応を行った。
Eco-PAP2-2-F：GAATTCATGTTCTCGTCCATGCGCTTCAAG（配列番号８）
Kpn-PAP2-2-R：TGGTACCTCATGGTCCCAAGTATACATCGTTCC（配列番号９）【０１４７】
得られた１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片をTOPO-TA cloning Kit（インビトロジェン）を用いてＴＡクローニングし、塩基配列を確認し、ＭａＰＡＰ２．２のＣＤＳの正しい塩基配列（配列番号３）を持つプラスミドをpCR-MaPAP2.2とした。pCR-MaPAP2.2を制限酵素EcoRIとKpnIで消化して得られた約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片と、酵母発現用ベクターpYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩで消化して得られた約８．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ligation high（TOYOBO）で連結し、プラスミドpYE-MaPAP2.2を構築した。【０１４８】
（２）形質転換酵母の取得
プラスミドpYE22m、pYE-MaPAP2.2、pYE-MaPAP1（WO2009/008466）をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、酵母S. cerevisiae EH13-15株（trp1，MATα）（Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989）を形質転換した。形質転換株は、SC-Trp（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids（DIFCO）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。【０１４９】
（３）酵母の培養
それぞれのベクターでの形質転換株を、以下の条件で培養した。すなわち、前培養として、SD-Trp  １０ｍｌに酵母を植菌し、３０℃で１日、振とう培養を行った。本培養として、前培養液１ｍｌをSD-Trp  １００ｍｌに添加し、３０℃で１日、振とう培養した。【０１５０】
（４）粗酵素液の調製
遠心分離にて集菌後、水洗し、−８０℃にて一時保存した。菌体に５ｍｌのバッファーＡ（５０ｍＭ  Tris-HCl（ｐＨ７．５）、０．３Ｍスクロース、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を添加し、よく懸濁した。その後、フレンチプレスにて１６ｋＰａで３回処理することにより、菌体を破砕した。菌体破砕液を１，５００×ｇ、４℃にて１０分間、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。【０１５１】
（５）ＰＡＰ活性測定
方法
ＰＡＰ活性は、以下の通り測定した。反応液として、５０ｍＭ  Tris-HCl（ｐＨ７．５）、５０μｇ  リノール酸（１８：２）−ＰＡまたはオレイン酸（１８：１）−ＰＡまたはマルガリン酸（１７：０）−ＰＡ（基質となるホスファチジン酸）、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２または０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｌ粗酵素液、を含む全量５００μｌの反応液を調製し、２８℃で３０分間反応させた。クロロホルム：メタノール（１：２）を添加して反応を停止させた。コントロールとして、粗酵素液のかわりにＭａＰＡＰ２．２遺伝子を含まないプラスミドpYE22mで形質転換した酵母（コントロール株）の菌体破砕液の上清を添加した反応液を用いた。Bligh & Dyer法により脂質を抽出し、遠心濃縮機で乾固させた。クロロホルムに溶解し、ＴＬＣ（シリカゲル６０プレート、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝７０：３０：１）により脂質を分画した。プリムリン溶液を噴霧後、ＵＶ照射下で脂質を可視化し、リン脂質画分とジグリセリド（ＤＧ）画分を掻きとり、含まれる全脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにて分析した。【０１５２】
上記の反応において、基質として添加したホスファチジン酸（ＰＡ）から変換されたジグリセリド（ＤＧ）の量を測定することにより、ＰＡＰ活性を測定することができる。【０１５３】
結果
結果を図４〜７に示した。【０１５４】
図４に示すとおり、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液を添加した反応液においては、コントロールと比較して１８：２−ＤＧの量が増加した。このことは、ＭａＰＡＰ２．２の存在により、１８：２−ＰＡから１８：２−ＤＧへの変換が高められた、すなわちＭａＰＡＰ２．２のはＰＡＰ活性を有することが示された。また、図４に記載の結果から、Ｍｇ２＋の有無にかかわらず、コントロールとＭａＰＡＰ２．２の高発現株（図４において、MaPAP2-2と表記した）の１８：２−ＰＡから１８：２−ＤＧへの変換の程度は同等、すなわち、ＭａＰＡＰ２．２はＭｇ２＋の有無にかかわらず同等のＰＡＰ活性を示すことが明らかとなった。このことは、ＭａＰＡＰ２．２のＰＡＰ活性はＭｇ２＋に依存しないことを示すものである。【０１５５】
図５は、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液、又はＭａＰＡＰ１の粗酵素液を添加したＭｇ２＋不含の反応液における１８：２−ＤＧの量を検討した結果を示すものである。ＭａＰＡＰ２．２を用いた場合には、１８：２−ＰＡから１８：２−ＤＧへの変換が有意に高められたのに対し、ＭａＰＡＰ１を用いた場合はコントロールと同程度の１８：２−ＤＧしか認められなかった。このことは、ＭａＰＡＰ２．２とＭａＰＡＰ１とでは異なる基質特異性を有することを示している。【０１５６】
図６は、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液を含む反応液およびコントロールにおいて、基質として１８：１−ＰＡを添加した場合、ならびに添加しない場合の、反応後の１８：１−ＤＧの量を検討した結果を示すものである。１８：１−ＰＡは酵母において元々存在するホスファチジン酸であるので、１８：１−ＰＡを添加しない条件で粗酵素液中の１８：１−ＰＡの量（バックグラウンド）を測定し、ＭａＰＡＰ２．２発現株とコントロール株の間で差がないことを確認した（図６Ａ）。その上で、１８：１−ＰＡを添加した場合の反応後の１８：１−ＤＧの量を測定したところ、コントロールの粗酵素液を用いた場合に比べて、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液を用いた場合に、より多くの１８：１−ＰＡが生成することが確認された（図６Ｂ）。この結果は、ＭａＰＡＰ２．２が、１８：１−ＰＡを基質とした場合にもＰＡＰ活性を有することを示している。【０１５７】
図７は、ＭａＰＡＰ２．２の粗酵素液を含む反応液およびコントロールにおいて、基質として１７：０−ＰＡを添加した場合の、反応後の１７：０−ＤＧの量を検討した結果を示すものである。図７に示す結果は、この結果は、ＭａＰＡＰ２．２が、１７：０−ＰＡを基質とした場合にもＰＡＰ活性を有することを示している。【０１５８】
また、図５ないし図７の結果の比較から、１８：２−ＰＡを１８：２−ＤＧに変換する活性と、１８：１−ＰＡを１８：１−ＤＧに変換する活性は同程度と考えられた。一方、１７：０−ＰＡを１７：０−ＤＧに変換する活性は、１８：２−ＰＡを１８：２−ＤＧに変換する活性や１８：１−ＰＡを１８：１−ＤＧに変換する活性の１／５程度と見積もられた。このことは、ＭａＰＡＰ２．２のホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数１７のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも、炭素数１８のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いものであることを示している。
【配列表フリーテキスト】
【０１５９】
配列番号６：プライマーPAP2.2-1f
配列番号７：プライマーPAP2.2-4r
配列番号８：プライマーEco-PAP2-2-F
配列番号９：プライマーKpn-PAP2-2-R
【図４】
0005576986.tif 000003
【図５】
0005576986.tif 000004
【図６】
0005576986.tif 000005
【図７】
0005576986.tif 000006
【図１−１】
0005576986.tif 000007
【図１−２】
0005576986.tif 000008
【図２】
0005576986.tif 000009
【図３】
0005576986.tif 000010
【配列表】
0005576986000001.app