(57)【要約】  本発明は、パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を免疫原として含有する、パラ百日咳菌由来百日咳予防用全菌体細菌ワクチン組成物および、その製造方法を提供することを課題とする。  本発明者らは、上記の課題を解決するために、まず、パラ百日咳菌を37℃、３日間の条件で培養した後、菌体濃度を 1010 cells/mLに調整し、ホルムアルデヒド溶液をホルマリンの最終濃度が 0.2%となるように添加して不活化した。この菌体を、菌体濃度換算で 1010 cells/mLとなるように滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて調整し、ワクチン組成物を得た。本発明のワクチン組成物をマウス（3.5週齢）に接種し、パラ百日咳菌懸濁液を感染させた結果、パラ百日咳菌に対する感染防御活性を有し、さらに通常の百日咳ワクチン接種量の1/30量でも感染防御活性を示すことが明らかとなった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を免疫原として含有する、パラ百日咳菌由来百日咳予防用全菌体細菌ワクチン組成物。
【請求項２】
抗原が、以下の（ａ）および（ｂ）の工程により得られる抗原である、請求項１に記載のワクチン組成物。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、１日から３日間培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程
【請求項３】
抗原が、以下の（ａ）および（ｂ）の工程により得られる抗原である、請求項１に記載のワクチン組成物。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、繊維状赤血球凝集素（FHA）量を指標に培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程
【請求項４】
パラ百日咳菌の不活化が、最終濃度0.1〜0.2%のホルムアルデヒドを含むホルマリン溶液によって行なわれることを特徴とする、請求項２または３に記載のワクチン組成物。
【請求項５】
パラ百日咳菌が抗生物質耐性変異株であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項６】
マウスにおける有効投与量が、ワクチン製剤の最終菌体濃度を1010 cells/mLとした場合に、0.100 mL/kg体重〜3mL/kg体重であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項７】
ヒトにおける単回接種の有効投与量が、ワクチン製剤の最終菌体濃度を1010 cells/mLとした場合に、0.02 mL〜0.5 mLであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項８】
１または複数回投与することを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のワクチン組成物。
【請求項９】
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、１日から３日間培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程
（ｃ）不活化した全菌体パラ百日咳菌と、医薬上許容される添加物を混合する工程
【請求項１０】
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、繊維状赤血球凝集素（FHA）量を指標に培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程
（ｃ）不活化した全菌体パラ百日咳菌と、医薬上許容される添加物を混合する工程
【請求項１１】
パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を対象に投与する工程を含む、パラ百日咳菌由来百日咳を予防する方法。
【請求項１２】
パラ百日咳の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を対象に投与する工程を含む、対象においてパラ百日咳菌に対する免疫を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を免疫原として含有する、パラ百日咳菌由来百日咳予防用全菌体細菌ワクチン組成物および、その製造方法に関する。また、本発明はパラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を対象に投与する工程を含む、パラ百日咳由来百日咳の予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
百日咳（ whooping cough, pertussis）は咳を主症状とする呼吸器感染症であり、百日咳菌（ Bordetella pertussis）またはパラ百日咳菌（ Bordetella parapertussis）の感染によって引き起こされる。病名どおり、患者は長期（ 2週〜数ヶ月）にわたる咳発作を呈する。百日咳菌による百日咳が多くの割合を占めていたことから、百日咳菌をターゲットとしたワクチン開発が進められ、現在は有効かつ安全な百日咳ワクチンが流通し、百日咳の患者数、死者数はともに大きく減少した。【０００３】
パラ百日咳菌と百日咳菌はBordetella属に属し、ともに人間を宿主とする好気性菌である。両菌が産生する病原因子（アデニレートシクラーゼ毒素、壊死毒素、気管細胞毒素、繊維状赤血球凝集素など）は非常に高い相同性を有し、その病原性発現機構はほぼ同一と考えられる。栄養要求性も類似しており、至適培養条件もほぼ同一である。両菌の相違点は百日咳毒素の産生（百日咳菌のみ産生）にみられ、これが百日咳菌の流行優位性に関わっている可能性がある。【０００４】
近年の調査によると、パラ百日咳菌の感染による百日咳は、その深刻度において百日咳菌によるものと大差がなく、また世界に広範に分布している。一方で、パラ百日咳菌と百日咳菌は非常に高い相似性にもかかわらず、現在の百日咳ワクチン（百日咳菌から製造される）はほとんどまたはまったく効果を有さないことが明らかとなった（非特許文献１−３）。また感染治癒による自然獲得免疫は交差反応を引き起こすが、現行ワクチンは両菌に対する交差防御を引き起こさないことが報告された（非特許文献３−５）。この結果は、現行ワクチンによる百日咳菌の制御がさらに進むことによって野外に分布している百日咳菌が減少すると、パラ百日咳菌の流行が助長されかねないことを強く暗示する。【０００５】
現在のところ、ボルデテラ菌の変異株を免疫原とするワクチン（特許文献１）、パラ百日咳菌に発現される外膜タンパク質である、ペルタクチンに関するワクチンなどの研究はなされているが（特許文献２）、実際にパラ百日咳菌由来の百日咳に対する効果は明らかではなく、パラ百日咳菌感染による百日咳を有効に防御し得るワクチンの存在は知られていない。また、パラ百日咳菌に有効なワクチンの評価系を稼働するのは困難であり、いままで成功はしていない。【０００６】
さらに、全菌体ワクチンの新規開発は赤痢菌、淋菌、髄膜炎菌、マラリアなど多くの病原体に関して失敗に終わっているように、全菌体百日咳菌ワクチンの開発、製造において効力のあるワクチンを作成することは非常に困難である（非特許文献６）。
以上より、パラ百日咳菌の活性を効果的に制御しうるワクチンの開発が求められている。【０００７】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【特許文献１】登録2655583
【特許文献２】特表2003-533990
【非特許文献１】Liese, J.G. et al. Arch Dis Chid 88(8): 684-687, 2003
【非特許文献２】Mastrantonio, P. et al. Dev Biol Stand 89: 255-259, 1997
【非特許文献３】Watanabe, M. and Nagai, M. Expert Rev Anti-infect Ther 2(3): 447-454, 2004
【非特許文献４】Khelef, N. et al. Infect Immun 61(2): 486-490, 1993
【非特許文献５】Watanabe, M. and Nagai, M. Infect Immun 69(11): 6981-6986, 2001
【非特許文献６】Griffiths, E. In Pathogenesis and Immunity in Pertussis. P. 354-355. 1988
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を免疫原として含有する、パラ百日咳菌由来百日咳予防用全菌体細菌ワクチン組成物および、その製造方法を提供することにある。
また、本発明はパラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を対象に投与する工程を含む、パラ百日咳由来百日咳の予防方法を提供することを目的とする。【０００９】
パラ百日咳菌の生菌は毒性が高く、そのまま接種することはできないため、菌の産生する多種多様な毒素を不活性化（不活化）する必要がある。しかし不活化の条件決定は非常に難しく、一般的な不活化剤高濃度などの強い条件においては菌の毒性は完全に破壊するものの、ワクチンとしての効力も同時に失われる。一方、不活化剤低濃度などの弱い条件ではワクチンの効力は高くなる傾向があるが、菌の毒性が残存し、接種動物が死亡するなどワクチン自体が有害となるおそれがある。全菌体ワクチン、とくにパラ百日咳菌と類縁の百日咳菌から作られる全菌体型百日咳ワクチンにおいてはその毒性を不活性化するために約0.5%ホルムアルデヒドによる不活化が行われるが、この条件では有効なパラ百日咳ワクチンは調製できなかった。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意研究を行なった。百日咳菌は百日咳毒素と呼ばれる強力な毒素を有し、これがワクチンの副作用や毒性に関与している。しかしパラ百日咳菌は百日咳毒素を有さないことからパラ百日咳菌は菌体の毒性が低いと考えた。また、本発明者らはマウス実験系においてパラ百日咳菌が百日咳菌よりも早く生体内から排除されることを見出している（図６）。このためホルマリン濃度を下げてワクチンを調製しても毒性を示さず、有効なワクチンが作成できるのではないかと考えた。【００１１】
具体的にはまず、パラ百日咳菌を37℃、３日間の条件で培養した後、菌体濃度を 1010 cells/mLに調整し、ホルムアルデヒド溶液をホルムアルデヒドの最終濃度が 0.2%となるように添加して不活化した。この菌体を、菌体濃度換算で 1010 cells/mLとなるように滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて調整し、ワクチン組成物を得た。【００１２】
該ワクチン組成物を、マウス（3.5週齢）に、0.125 mL（1/4 人単回接種量, SHD,相当）ずつ皮下接種し、さらにその 14日後に追加接種（同量）を行った。追加免疫の 14日後に、パラ百日咳菌懸濁液（生菌濃度で約 108 CFU/mL, 50 μL/mouse）をペントバルビタール麻酔下で経鼻感染させた結果、本発明のワクチン組成物を接種したマウスでは、ワクチンを接種していない陰性対照群のマウスと比較して肺内生菌数の低下がみられ、感染防御活性が高いことが明らかとなった。さらに、ワクチン組成物の接種用量について検討を行なった結果、通常の百日咳ワクチン接種量の1/30でも、パラ百日咳菌の感染防御活性を示すことが明らかとなった。【００１３】
即ち、本発明者らは、パラ百日咳菌に対する感染防御活性を有する、パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を免疫原として含有する、パラ百日咳菌由来百日咳予防用全菌体細菌ワクチン組成物の製造に成功し、これにより本発明を完成するに至った。【００１４】
本発明は、より具体的には以下の〔１〕〜〔１２〕を提供するものである。
〔１〕  パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を免疫原として含有する、パラ百日咳菌由来百日咳予防用全菌体細菌ワクチン組成物。
〔２〕  抗原が、以下の（ａ）および（ｂ）の工程により得られる抗原である、〔１〕に記載のワクチン組成物。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、１日から３日間培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程
〔３〕  抗原が、以下の（ａ）および（ｂ）の工程により得られる抗原である、〔１〕に記載のワクチン組成物。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、繊維状赤血球凝集素（FHA）量を指標に培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程
〔４〕  パラ百日咳菌の不活化が、最終濃度0.1〜0.2%のホルムアルデヒドを含むホルマリン溶液によって行なわれることを特徴とする、〔２〕または〔３〕に記載のワクチン組成物。
〔５〕  パラ百日咳菌が抗生物質耐性変異株であることを特徴とする、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のワクチン組成物。
〔６〕  マウスにおける有効投与量が、ワクチン製剤の最終菌体濃度を1010 cells/mLとした場合に、0.100 mL/kg体重〜3mL/kg体重であることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のワクチン組成物。
〔７〕  ヒトにおける単回接種の有効投与量が、ワクチン製剤の最終菌体濃度を1010 cells/mLとした場合に、0.02 mL〜0.5 mLであることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載のワクチン組成物。
〔８〕  １または複数回投与することを特徴とする〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のワクチン組成物。
〔９〕  以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、１日から３日間培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程
（ｃ）不活化した全菌体パラ百日咳菌と、医薬上許容される添加物を混合する工程
〔１０〕  以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、ワクチン組成物の製造方法。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、繊維状赤血球凝集素（FHA）量を指標に培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程
（ｃ）不活化した全菌体パラ百日咳菌と、医薬上許容される添加物を混合する工程
〔１１〕  パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を対象に投与する工程を含む、パラ百日咳菌由来百日咳を予防する方法。
〔１２〕  パラ百日咳の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を対象に投与する工程を含む、対象においてパラ百日咳菌に対する免疫を誘導する方法。【００１５】
〔発明の実施の形態〕
本発明は、パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を免疫原として含有する、パラ百日咳菌由来百日咳予防用全菌体細菌ワクチン組成物に関する。
本発明のパラ百日咳菌ワクチン製剤は、細菌抗原を培養および採取した後、後述で説明する製法に従い、抗原を不活化することで製造が行われる。【００１６】
本発明において、培養に使用する菌株としては、パラ百日咳菌の野外株や臨床分離株などから純化して使用することができ、または、これらの菌種の人工変異株を使用することも可能である。菌種としてはBordetella parapertussisが好ましく、本菌種の中で野外分離株である23054株がより好ましい。【００１７】
本発明で用いる菌株は、さらに抗生物質耐性変異株であってもよい。抗生物質耐性変異株を用いることにより、培養において培地に抗生物質を添加することで他の雑菌混入を阻止することができる。抗生物質としては、当業者に周知の抗生物質であれば特に制限はないが、好ましくはナリジクス酸またはストレプトマイシン、より好ましくはストレプトマイシンを挙げることができる。【００１８】
本発明で使用できる菌株の具体例としては、野外分離株である23054株をストレプトマイシン含有培地に慣化した変異株が挙げられる。この変異誘導および選択は本発明者らが北里研究所にて行った。この変異体は野外分離株でありその病原性を保持していること、そしてストレプトマイシン耐性変異のため数日間におよぶ長期培養においても雑菌の混入を回避できることから、本発明に用いる菌株として好ましい。【００１９】
Bordetella parapertussis 23054株のストレプトマイシン耐性変異株BPP23054SMRは本願出願人によって、下記のとおり寄託されている。
(a) 寄託機関の名称・あて名
名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構・特許微生物寄託センター（NPMD）
あて名：日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8（郵便番号292-0818）
(b) 原寄託日：２００７年５月８日
(c) 受託番号：NITE  BP-356【００２０】
本発明のワクチン組成物において、抗原は以下の（ａ）および（ｂ）の工程により得ることができる。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、１日から３日間培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程【００２１】
また、本発明のワクチン組成物において、抗原は以下の（ａ）および（ｂ）の工程により得ることができる。
（ａ）パラ百日咳菌を37℃において、繊維状赤血球凝集素（FHA）量を指標に培養し、最終菌体濃度が1010 cells/mLとなるパラ百日咳菌培養調整物を製造する工程
（ｂ）パラ百日咳菌培養調整物に不活化剤を添加して、全菌体パラ百日咳菌を不活化する工程【００２２】
本発明のワクチン製剤の製造方法において、パラ百日咳菌を培養し、パラ百日咳菌培養調製物を製造する工程について説明する。【００２３】
本発明において、パラ百日咳菌を菌種として培養する場合、該菌体をBordet-Gengou培地上に塗り、37℃、３日間培養する。生じた集落から溶血環のみられるものをさらに炭末寒天培地に塗り、37℃、１日間培養する。その後増菌のため、さらに炭末寒天培地に継代し、37℃、３日間（１〜３日間）の培養を行なう。なお、パラ百日咳菌は培養を継続すると、溶菌により増殖が減少することから、溶菌が起こる前に菌体を回収することが望ましい。【００２４】
また、免疫原として使用するパラ百日咳菌菌体は病原性を有していることが好ましい。病原性を有するパラ百日咳菌は、例えば病原因子である繊維状赤血球凝集素（FHA）の量を指標に回収することができる。FHAが存在するか否かは、当業者に周知の方法で、培養液における赤血球凝集反応を調べることにより確認することができる。【００２５】
本発明のワクチン製造に使用する培地は菌体の増殖に適した組成ならば、上記した培地に限られず、何れの組成でも使用可能である。培地には炭素源、窒素源、リン酸源、微量金属などを含ませることができる。好ましい培地の組成としては、実施例に記載の培地を挙げることができる。また、上記培地は市販製品を使用することもできる。市販されている培地としてパラ百日咳菌の培養に使用可能なものを例示すれば、Bordet-Gengou agar base およびCharcoal ager (ともにBeckton, Dickinson, and Company, U.S.A.)などがより好ましいが、これらに限定されない。【００２６】
さらに、培地には、イオン交換樹脂、シクロデキストリン等の百日咳菌およびパラ百日咳菌の増殖阻害物質を吸着除去する添加物を加えることもできる。【００２７】
本発明における菌体の培養において、培養容器はガラス容器、ステンレス容器、プラスティック容器、市販の発酵槽などを使用できる。【００２８】
本発明の細胞培養における、培養温度は通常35〜37℃であるが、特に好ましくは37℃である。【００２９】
本発明のパラ百日咳菌培養における、ｐＨ範囲は通常7〜7.5であるが、特にこのpHに限定されるものではなく、菌体が死滅しない酸性またはアルカリ性条件下においても培養を行うことができる。【００３０】
パラ百日咳菌を増菌する際には、必要に応じてパラ百日咳菌の菌数を測定し、培養の進行度を確認する。菌数の測定は、短期間培養後、波長650 nmにおける吸光度または濁度で測定することで可能である。最近は定量PCRを用いたDNAコピー数として測定することも可能である。パラ百日咳菌の培養、集菌、洗浄、純化操作は厳密な封じ込めが可能な環境下で実施しなければならない。通常は国立感染症研究所の定める生物学的安全性レベル２（BSL2）の環境が必要である。【００３１】
パラ百日咳菌培養調製物を製造する工程において、上記の方法で培養生成した後、全菌体抗原を洗浄、純化、濃縮する。以下に洗浄、純化、濃縮の方法について説明する。【００３２】
培養終了後、菌体を食塩添加リン酸緩衝液、などにより、洗浄、純化を行う。純化には洗浄法、遠心法、撹拌法、濃縮法、カラム法などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
洗浄、純化、濃縮の時期としては、不活化の前が好ましいが、不活化の後でも実施できる。不活化の前後両方に実施しても良い。【００３３】
本発明のワクチン製造方法において、パラ百日咳菌培養調製物等に不活化剤を添加して、パラ百日咳菌培養調製物等を不活化する工程について以下で説明する。【００３４】
抗原の不活化は種々の方法が使用可能であるが、一般に最適の不活化方法は抗原が全菌体であるかタンパク質であるかにより異なる。不活化は種々の化学品処理と物理化学的処理の方法で実施できる。その一例を示せば、以下のものを含むがこれらに限定されない。【００３５】
不活化を目的として菌体を処理するのに用いる化学処理物質として以下の物質があげられる。使用可能な濃度を合わせて示すがこれらに限定されるものではない。
ホルムアルデヒド(0.04-4 % )、フェノール(0.1-5 v/v %)、クロロホルム(10-60 v/v %)、アセトン(10-80 v/v %)、ＳＨ試薬 (1-100 mM)、過酸化水素 (0.1-5 %)、過酢酸(0.5-10 w/v %)、二酸化炭素 (5-90 v/v %)、オゾン(0.1-10 v/v %)、界面活性剤（0.01 -5 w/v %）。【００３６】
また、不活化のための物理化学的処理法には下記の手段を使用できる。以下に使用可能な条件の一例を合わせて示すが、これらに限定されるものではない。
加温処理（温度：30-70 ℃；加温時間：10-120 分）、γ線照射(線源：コバルト60；5-50 kGy (キログレー))、レーザー光照射(光源：各種レーザー照射装置；波長500-700 mn；光量：0.01-1 J(ジュール)/cm2),電子線照射(電子レンジ)、超音波照射、などがあげられる。【００３７】
処理条件は固定的ではなく、菌体量、温度、緩衝液のpH、処理時間、などを変化させて、好適な条件を設定することが出来る。通常、無菌条件下で操作する。【００３８】
これらの不活化方法を単独で使用してもよいし、複数の方法を組み合わせて使用しても良い。不活化の際にアミノ酸、アミン類を共存させることで不活化後の品質の安定性が改善される場合があり、必要に応じてこれらの物質を添加することも可能である。また、ホルマリン不活化に加えて、有機溶媒処理、加温処理、γ線照射処理を施すことにより、溶菌が起こりにくい品質の安定した不活化全菌体を得ることができる。【００３９】
百日咳菌は低濃度ホルムアルデヒドで不活化処理を行っても、菌体の毒性が残存することから、これまで高濃度による不活化処理が通常行われてきた。百日咳菌は高濃度ホルムアルデヒドで不活化処理を行った場合でもワクチンとしての有効性を示すが、パラ百日咳菌は高濃度ホルムアルデヒドで不活化処理を行うとワクチンとしての効果を失うことから、これまでパラ百日咳菌のホルムアルデヒドによる不活化処理は困難であるとされてきた。【００４０】
本発明者らは、パラ百日咳菌は百日咳毒素を有さず、百日咳菌と比較すると比較的毒性が低いこと（図６）に着目し、適格な条件下の低濃度ホルムアルデヒド処理を行うことで、毒性が低く、かつワクチンとしての有効性を示すワクチン組成物の生成に初めて成功した。表１に、ホルムアルデヒド濃度を変えて作成したワクチンの有効性と毒性を示す。【００４１】
【表１】
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ワクチンの効力は、気道感染実験系（噴霧感染実験系または経鼻感染実験系）において、ワクチン未接種群および接種群間に有意差（P<0.05）が検出された場合＋とした。
マウス致死率は、ワクチン接種による各実験群あたりのマウス死亡数を記載した。【００４２】
本発明で使用される好ましい不活化の条件としては、以下の弱条件が挙げられる。まず、パラ百日咳菌生菌懸濁液に最終濃度0.2％となるようにホルムアルデヒドを加え1〜5日間、好ましくは３日間、４℃に静置して不活化する。その後、5,000 rpmで10分間遠心し、上清を除去後、等量の生理食塩添加リン酸緩衝液（0.01 M, pH 7.2）に懸濁し、不活化パラ百日咳菌懸濁液とする。不活化完了の確認は不活化処理後に、試料の一部を取り、培養すると菌が生育しないことにより確認することができる。不活化処理の後、リン酸緩衝液などで洗浄することにより、不活化に使用した化学薬品を除去する。その後、約1-1 x 1010 cells/mL程度になるように菌数を調整する。本発明においては約1 x 1010 cells/mLの菌体濃度が好ましい。【００４３】
前述のパラ百日咳菌懸濁液または抗原蛋白液を一定量（例えば、0.5 mL, 1.0 mL, 10 mL）ずつバイアル、もしくはシリンジに分注して、ワクチンが製造される。【００４４】
パラ百日咳ワクチンの一般的組成を以下に例示するが、ワクチン製剤組成としては以下に限定されるものではない。
抗原：不活化全菌体パラ百日咳菌  菌体濃度1 x 1010 cells/mL
緩衝液:食塩添加0.01Mリン酸緩衝液 
ｐＨ：7.0
浸透圧: 1
容量：0.6 mL
保存剤： ソルビトール２％、ラクトース５％【００４５】
本発明のワクチン製剤には、医薬上許容しうる添加剤を添加してもよい。ここで医薬上許容される添加剤とは、それ自体は抗原（または免疫原性）とは異なる物質であって、ワクチン投与において抗原とともに投与可能な医薬上許容される材料を意味する。例えば、アジュバント、保存剤、安定剤等のワクチン添加物が例示できるが、これらに限定されるものではない。アジュバントとしてはヒト用ワクチンに認可されたアジュバントとして、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＦ５９などを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。【００４６】
安定剤としては、0.2%程度のゲラチンやデキストラン、0.1-1.0%のグルタミン酸ナトリウム、あるいは約5%の乳糖や約2%のソルビトールなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。保存剤としては、0.01%程度のチメロサール、0.1%程度のベータプロピオノラクトンや、0.5%程度のフェノキシエタノールなどを使用することが出来るが、これらに限定されるものではない。【００４７】
注射剤を調製する場合、必要により、pH 調製剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤等を添加し、常法により、皮下、筋肉内、静脈内注射剤とする。注射剤は、溶液を容器に収納後、凍結乾燥等によって、固形 製剤として、用時調製の製剤としてもよい。また、一投与量を容器に収納してもよく、また、投与量を同一の容器に収納してもよい。【００４８】
本発明の細菌ワクチンの接種法としては、公知の種々の方法が使用できる。接種法としては皮下注射、筋肉内注射、経鼻接種、経口接種、経皮接種等が好ましく、筋肉注射がより好ましいがこれらに限定されるものではない。経鼻接種には鼻腔内スプレー、粉末スプレー、滴下、塗布などが含まれる。これらの接種法のうち経口接種や経鼻接種がより好ましく、その理由は、気道や消化管の粘膜が感染初期の重要な部位であるためである。適切な免疫増強活性の強いアジュバントを含むワクチンの接種により、局所粘膜における免疫機構を誘発し、できるだけ感染初期に防御効果を発揮させることが可能になる。【００４９】
どの接種方法が適切かはワクチン抗原の種類、剤型、抗体発現時期、抗体持続期間、接種対象者の年齢、等を考慮して決定される。また、接種を行う対象としてはヒト以外に、愛玩動物、家畜、野外動物、鳥類もあげることができる。接種方法は専門家による臨床試験を通じて最終決定され、これらの方法は同業者にとって公知である。一回接種用製品でも複数回接種用製品でも良い。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。【００５０】
本発明のワクチン組成物をマウスに投与する場合には、ワクチン製剤の最終菌体濃度を1010 cells/mLとした場合には、0.100 mL/kg体重〜3mL/kg体重の投与量で投与することができる。【００５１】
一方、一般的にヒトに適用される全菌体ワクチンの場合0.1から0.5 mLの皮下注射または筋肉内注射で投与することができるが、本発明においては、同様の製法で調整した百日咳菌を抗原とするワクチン製剤と比較して、1/3〜1/30量で投与することが可能である。
例えば、本発明のワクチンをヒトに接種する場合、具体的には上記した組成のワクチン製剤（最終菌体濃度1010 cells/mL）を0.02〜0.5 mLで投与することが可能である。【００５２】
なお、本発明のワクチンの投与回数は、１回であってもよいし複数回であってもよいが、好ましくは２〜４回、最も好ましくは４回である。【００５３】
ワクチン開発にとってワクチン有効性の判定を行うことは重要である。これらの試験はワクチン従事者には公知であるが、方法の一例を以下に記載する。防御抗原もしくは発症防止抗原を含む可能性のある抗原材料を不活化した後、実験動物を免疫する。次に免疫した動物をパラ百日咳菌で攻撃し、実験動物の生死、もしくは感染パラ百日咳菌数の減少などにより、試験材料の有効性を判定する。パラ百日咳菌は人間に感染、病気を発症させるが、マウスに対しても実験的感染を成立させることが知られている。実験動物においては生死の判定、または肺におけるパラ百日咳菌感染の程度を計測する方が適している。【００５４】
本発明のパラ百日咳菌またはその調製物、または全菌体細菌ワクチン組成物は、接種される対象においてパラ百日咳菌感染に対する免疫を誘導することができる。
したがって、本発明のパラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物、菌体可溶化物、またはこれらを免疫原として含有する全菌体細菌ワクチン組成物は、パラ百日咳菌由来の百日咳の予防に使用することができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】パラ百日咳菌における培養時間と、菌体濃度および繊維状赤血球凝集素の有無の関係を示す図である。パラ百日咳菌をカザミノ酸添加スタイナーショルト液体培地に1 billion/mLとなるように懸濁し、その10 mLを75 cm2培養フラスコにいれ、37℃で静置培養した。培養24、48、72、96、および120時間後の培養液を回収し、菌濃度および赤血球凝集活性（FHA活性、病原因子産生指標として使用）を測定した。パラ百日咳菌は72時間後まで増殖し、その後溶菌によるとみられる菌濃度の減少がみられた。培養液を100倍希釈した試料におけるFHA活性は24-72時間後に検出され、その後消失した。以上の結果から、ワクチン材料として最適な培養時間は72時間と考えられた。
【図２】マウス経鼻感染実験系を使用して、各ワクチンのパラ百日咳菌に対する効果を測定した結果を示す図である。感染防御効力を有するワクチンは、ワクチン未接種群（黒丸, None）に比べ肺内のパラ百日咳菌生菌数が抑制される。現行の百日咳ワクチン（黒四角）および百日咳菌全菌体ワクチン（黒三角）は、ワクチン未接種群と有意な差はみられない。一方、パラ百日咳菌ワクチン（白丸, vMW1）は統計学的に有意に肺内生菌数を低下させており、ワクチンとしての効力が示された。＊：陰性対照群（None）に対し有意差あり（p<0.05）。
【図３】マウスにおけるパラ百日咳菌ワクチンの用量反応性を示す図である。マウス経鼻感染実験系における通常接種量（0.125 mL）を1とし、その1/3（0.3 dose）、1/10 (0.1 dose)、および 1/30 (0.03 dose)を接種した群において、感染後５日目の肺内生菌数を示した。図中では0.3、0.1、および0.03 doseのデータのみ示す。ワクチン未接種群における肺内生菌数は約107 CFU（7.03±0.02（Log CFU/lung））であったのに対し、図で示したすべての接種用量においてワクチンとしての効果が検出された。また、図下にマウスにおけるデータと人間においてそれに対応する接種量（相関性から予測）を示した。このワクチンは人間に接種する場合においては0.02〜0.5 mLの接種で効果を示すことが予測された。
【図４】パラ百日咳ワクチンに含まれるタンパク質をSDS-PAGE法で分析した結果を示す写真である。SDS-PAGEはBio-Rad社製のReadyGelJを使用し、染色は同社のBiosafe Coomassie液を使用した。マウスにおける１回接種量（1010 cells/mL, 0.125 mL）およびその約30倍量（マウス体重１kgあたり換算）をロードし、分析したところ、図のようなパターンを得た。分子量約70 kDaを示すペルタクチンは、どちらのレーンにも検出されなかった。
【図５】ペルタクチンに対する免疫応答反応が起こっているか確認する目的でWestern blotting解析を行った結果を示す写真である。百日咳菌から精製したペルタクチン（パラ百日咳菌と共通抗原性を有する）3μgをSDS-PAGEし、展開後のゲルからニトロセルロース膜上に転写した。一時抗体としてパラ百日咳ワクチンを接種され、ワクチンの効果が誘導されたマウスの血清（1000倍希釈）を使用した。二次抗体としては5000倍希釈されたアルカリフォスファターゼ標識された抗マウスIgG（Jackson ImmunoResearch laboratory, U.S.A.）を使用し、一般的な方法に従ってNBT/BCIPにてペルタクチンに結合したマウス抗体の検出を試みた。ペルタクチン抗体が存在すれば約70 kDaの位置に黒いバンドが検出される（レーン２、コントロール）が、結果ではそのような抗体は検出されなかった（レーン４）。この結果から、パラ百日咳ワクチンはペルタクチン抗体をほとんど誘導しないことが明らかとなった。
【図６】ワクチン未接種マウスに百日咳菌（黒丸）またはパラ百日咳菌（白四角）を経鼻感染させ、その後の肺内生菌数の消長を調べた結果を示す図である。その結果百日咳菌に比べ、パラ百日咳菌のほうがやや速やかにクリアされていくことが明らかとなった。このことから、百日咳菌に比べパラ百日咳菌のほうが病原性が低いと推察された。
【実施例】
【００５６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
本発明で用いた培地の組成
<Bordet-Gengou 培地>
塩化ナトリウム                          5.5 g
寒天                                    20 g
1%グリセロール含有ジャガイモ浸出液      1 L
121℃, 15分滅菌後、羊脱繊維素血液を150 mL加える。薬剤耐性を有する菌株使用時には適切な抗菌剤を加える。上記の場合はストレプトマイシン200μg/mL。【００５７】
<炭末寒天培地>
牛心臓抽出物                            12 g
ペプトン                                10 g
塩化ナトリウム                          5 g
可溶性デンプン                          10 g
酵母抽出液                              3.5 g
活性炭末                                4 g
寒天                                    18 g
超純水                                  1 L
121℃, 15分滅菌後、羊脱繊維素血液を100 mL加える。薬剤耐性を有する菌株使用時には適切な抗菌剤を加える。上記の場合はストレプトマイシン200μg/mLである。【００５８】
<カザミノ酸添加スタイナーショルト液体培地>
グルタミン酸ナトリウム                  10.72 g
プロリン                                0.24 g
塩化ナトリウム                          2.0 g
リン酸二水素カリウム                    0.5 g
塩化カリウム                            0.2 g
トリス塩酸塩                            3.175 g
トリス                                  0.587 g
塩化マグネシウム６水和物                0.1 g
1M塩化カルシウム液                      0.135 mL
カザミノ酸                              2.5 g
5%デンプン液                           10 mL
以上を超純水に1 Lとなるように混和し、121℃15分間滅菌する。放熱後、濾過滅菌した以下の溶液を加える。
L-シスチン                              0.04 g
硫酸第二鉄７水和物                      0.01 g
アスコルビン酸                          0.02 g
還元型グルタチオン                      0.1 g
少量の塩酸と超純水で10 mLとなるように溶解する。【００５９】
〔試験例１〕百日咳ワクチンの調整
現行ワクチン対照として現行の無細胞百日咳ワクチン（acelluler pertussis vaccine, aP）および全菌体百日咳ワクチン（whole-cell pertussis vaccine, wP）を使用した。
無細胞ワクチンとしては市販の沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン（ DTaP,社団法人北里研究所）を使用した。
全菌体百日咳ワクチンは次のように調製した。すなわち凍結保存しておいた百日咳菌東浜株I相菌を Bordet-Gengou培地上に塗り、37℃、4日間培養した。生じた集落から溶血環のみられるものを数個選び炭末寒天培地に塗り、37℃，１日間培養した。その後増菌のため、さらに炭末寒天培地に菌を塗まつし、37℃で 4日間培養した。培養終了後、培地表面上の菌体を掻き取り、滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。菌体濃度を 1010 cells/mLに調整した後、ホルムアルデヒド溶液をホルムアルデヒドの最終濃度が 0.2%となるように添加した。それを穏やかに攪拌した後、 4℃で 3日間静置した。静置後、遠心（ 5,000 rpm, 4℃, 10分間）し上清を除き、遠心沈さを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。再度同条件で遠心し、遠心沈さを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した後、菌体濃度換算で 1010 cells/mLとなるように滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて調整し、これを全菌体百日咳ワクチンとした。【００６０】
〔試験例２〕百日咳菌およびパラ百日咳菌の病原性の比較
マウス（6週齢）に、百日咳菌またはパラ百日咳菌の懸濁液（生菌濃度で約 108 CFU/mL, 50 μL/mouse）をペントバルビタール麻酔下（20倍希釈ネンブタール注射液を0.5 mL腹腔内接種）で経鼻感染させた。 0（約 2時間後）、2〜20日後にペントバルビタールによってマウスを無痛で死亡させ、無菌的に肺を摘出し、10 mLの滅菌緩衝生理食塩水中でホモジナイズした。ホモジネートを段階希釈し、Bordet-Gengou培地に塗まつして培養（37℃、4〜5日間）した後、生じた集落数を計数することで肺内の各菌生菌数を算定した。百日咳菌感染マウスにおいては、感染5日後まで肺内生菌数は増加し、その後緩やかに減少した（図６）。一方パラ百日咳菌感染マウスにおいては感染後の菌数の増加はほとんどみられず、その減少も百日咳菌感染マウスよりも速やかであった（図６）。この結果から、パラ百日咳菌の病原性は百日咳と比較すると低いと考えられた。【００６１】
〔実施例１〕  パラ百日咳菌ワクチン
パラ百日咳菌ワクチンとなる菌体の培養法の検討
パラ百日咳菌をカザミノ酸添加スタイナーショルト液体培地に1 billion cells/mLとなるように懸濁し、その10 mLを75cm2 培養フラスコに入れ、37℃で静置培養した。本条件では培地液深および静置条件が固形プレート培養に近く、固形プレート培養では測定しがたい菌体増殖を定量化できる。またカザミノ酸添加スタイナーショルト液体培地は炭末培地同様、パラ百日咳菌の増殖に十分な栄養を含んでいる。一方で、ワクチンとするためには、その菌体が病原性を保有する状態でなくてはならない。このことを確認するために、病原因子の一つである繊維状赤血球凝集素の存在を、100倍希釈培養液における赤血球凝集反応を指標として各時点で測定した。【００６２】
得られた結果を図１に示す。パラ百日咳菌は培養３−４日目まで増殖し、その後溶菌を起こした。また、繊維状赤血球凝集素は１−３日目まで検出され、その後消失した。菌体溶菌によってエンドトキシンをはじめとする各種毒素が放出される可能性があること、また４日目以降は病原性保持の指標が消失することから、ワクチン材料としての使用に耐える菌体は培養１−３日のもの、最適なのは３日目のものを使用すべきと考えられた。【００６３】
以上の検討結果より、パラ百日咳菌の菌体および産生成分を含むパラ百日咳菌ワクチンは次のように調製した。凍結保存しておいたパラ百日咳菌をBordet-Gengou培地上に塗り、37℃、３日間培養した。生じた集落から溶血環のみられるものを数個選び炭末寒天培地に塗り、 37℃、１日間培養した。【００６４】
その後増菌のため、さらに炭末寒天培地に継代し、 37℃、３日間培養した。培養終了後、培地表面上の菌体を掻き取り、滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。
滅菌リン酸緩衝生理食塩水は以下のとおり調整した。
塩化ナトリウム                          8 g
塩化カリウム                            0.2 g
リン酸水素二ナトリウム                  1.44 g
リン酸二水素カリウム                    0.24 g
超純水                                  1 L
121℃, 15分滅菌後使用する。【００６５】
菌体濃度を 1010 cells/mLに調整した後、ホルムアルデヒド溶液をホルマリンの最終濃度が 0.2%となるように添加した。穏やかに攪拌した後、 4℃で 3日間静置した。静置後、遠心（5,000 rpm, 4℃, 10分間）し上清を除いた後、遠心沈さを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した。再度遠心し遠心沈さを滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した後、菌体濃度換算で 1010 cells/mLとなるように調整し、これをパラ百日咳菌ワクチンとした。【００６６】
〔実施例２〕  ワクチンの感染防御活性（効力）の検出
ワクチンの人における効果と強い相関性を有するマウス経鼻感染法を使用し、各ワクチンの感染防御活性（効力）を判定した（Guiso, N. et al., Vaccine 17:2366-2376, 1999.）。すなわち、マウス（3.5週齢）に、各種ワクチンを 0.125 mL（1/4 人単回接種量, SHD,相当）ずつ皮下接種し、さらにその 14日後に追加接種（同量）を行った。追加免疫の 14日後に、パラ百日咳菌懸濁液（生菌濃度で約 108 CFU/mL, 50 μL/mouse）をペントバルビタール麻酔下（20倍希釈ネンブタール注射液を0.5 mL腹腔内接種）で経鼻感染させた。 0（約 2時間後）、2、5、および 8日後にペントバルビタールによってマウスを無痛で死亡させ、無菌的に肺を摘出し、10 mLの滅菌緩衝生理食塩水中でホモジナイズした。ホモジネートを段階希釈し、Bordet-Gengou培地に塗まつして培養（37℃、4〜5日間）した後、生じた集落数を計数することで肺内のパラ百日咳菌生菌数を算定した。ワクチンによって感染防御が誘導された（すなわちワクチンの効果がみられた）場合、誘導された感染防御免疫によって経鼻感染したパラ百日咳菌がクリアされるため、ワクチンを接種していない陰性対照群にくらべて肺内生菌数の低下がみられる。【００６７】
各ワクチンのパラ百日咳菌に対する感染防御効果
ワクチンを接種しない陰性対照群（ None）では、パラ百日咳菌の肺内生菌数は感染後 5日目まで緩やかに増加し、8日目で減少するパターンを示した（図２）。現行の沈降精製百日せきジフテリア破傷風混合ワクチン接種群（DTaP）および全菌体百日咳ワクチン接種群（wP）の各データポイントにおける肺内生菌数は陰性対照群の値と有意差がなく、パラ百日咳菌の感染に対し無効であった（図２）。一方、パラ百日咳菌ワクチン（vMW1）では感染後 2-8日の各ポイントにおいてそのパラ百日咳菌の肺内生菌数は陰性対照群に比べ有意に低く、パラ百日咳菌に対するワクチンとしての効果を有することが示された（図２）。【００６８】
以上より、現行の百日咳ワクチンに関し、パラ百日咳菌感染に対するワクチンとしての効果がないことが証明された。このことはすでに野外試験で確認されており、本実験で使用したマウス実験系が人におけるワクチンの効果と強く相関することを裏付けるものである。
本発明者らが発明したパラ百日咳菌ワクチンは、パラ百日咳菌に対するワクチンとしての効果を有していた。パラ百日咳菌ワクチンは、培地上で生育したパラ百日咳菌を掻き取って懸濁し、不活化剤（今回はホルマリン）を使用して処理して製造したものである。掻き取ったパラ百日咳菌は菌体構成成分のほかに分泌された因子を含み、それらのいくつかが防御抗原として働いていると考えられる。【００６９】
〔実施例３〕  パラ百日咳菌ワクチンの用量反応
パラ百日咳菌ワクチンを 1/3、1/10、および 1/30希釈したものをマウスに接種し、用量反応性を調べた。結果は経鼻感染 2日後の肺内生菌数で表した（図３）。その結果、用量反応性が確認された。パラ百日咳ワクチンは 1/30用量においてもなお感染防御効果を発揮した。この結果から、マウス実験系において有効性を示す接種量は約0.1 mL/kg体重（マウス一匹当たり0.003 mL）であった。
本発明において使用したマウス実験系では、ワクチンの効果を確認するのに0.125 mL (1/4 SHD)を接種するのが標準であり、この用量で有効性が確認された場合、ヒトにおける0.5 mL接種における有効性と相関する。このため本ワクチンもヒトに対する使用においては0.015-0.5 mLの接種で有効性を示す可能性が考えられる。
以上より、本発明のパラ百日咳菌ワクチンは、ワクチンとしての効果が高く期待できると考えられた。【００７０】
〔実施例４〕  本発明のワクチンにおけるペルタクチンの抗原性についての検討
本発明のパラ百日咳ワクチンにおけるペルタクチン含有量をSDS-PAGEで解析したところ、ペルタクチンは検出されなかった（図４）。この検出系の感度から計算して、動物体重1kgあたりに換算したワクチン量に含まれるペルタクチン含有量は約0.01 μg以下と考えられた。これは一般的にペルタクチンタンパク質を抗原として（特願2003-533990）免疫応答を誘導するのに必要なタンパク質量（1 μg/kg）よりも遙かに低い。またWestern blotting法によってこのワクチンを接種されたマウスにペルタクチンに対する免疫反応を調べたところ、免疫されたマウスにおいてペルタクチンに対する免疫応答は検出されなかった（図５）。したがって本発明のパラ百日咳菌ワクチンの効果においてペルタクチンと、それによる免疫反応はほとんど関わっていないと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によって、パラ百日咳菌の全菌体、全菌体の破砕物または菌体可溶化物を免疫原として含有する、パラ百日咳菌由来百日咳予防用全菌体細菌ワクチン組成物が提供された。【００７２】
現在広く使用されている百日咳ワクチンは、パラ百日咳菌の感染による百日咳にほとんどまたはまったく効果を有さない。本発明のワクチン組成物は、症状においては百日咳菌によるものと大差がないパラ百日咳菌由来の百日咳の予防に有用である。本発明のパラ百日咳ワクチンは、通常の百日咳ワクチンの1/30用量においてもなお感染防御効果を発揮することから、ワクチンとしての効果が高く、また少量で安全に使用できるワクチンである。【００７３】
また、ワクチン製造の過程において、通常の全菌体ワクチンより弱い条件で不活化を行なうことから、ワクチンの生産時に使用する不活化剤の量が少量でよく、不活化処理も簡便である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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