(57)【要約】  光学検出ユニットおよび温度制御ユニットを備える光学検出装置について、光学シグナルの検出および温度制御が正確に行われているか否か、それらの性能を簡易且つ高い信頼性で確認できる方法を提供する。被検体の光学シグナルを検出する光学検出ユニットと、被検体の温度を制御する温度制御ユニットを備える光学検出装置について、下記方法により光学シグナルの検出性能および温度制御性能を確認する。まず、光学シグナル強度とＴｍ値とが既知である核酸配列と相補鎖とを含む標準サンプルを準備し、前記温度制御ユニットにより前記標準サンプルの温度を上昇もしくは下降させ、且つ、前記検出ユニットにより前記標準サンプルの光学シグナル強度を測定する。他方、温度変化に伴う前記光学シグナル強度の変動から、前記標準サンプルの融解温度を決定する。測定した前記標準サンプルの光学シグナル強度と前記標準サンプルの既知の光学シグナル強度、および、決定した前記標準サンプルの融解温度と前記標準サンプルの既知の融解温度とを、それぞれ比較して、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度制御性能が正確か否かを確認する。
2008084672.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の光学シグナルを検出する検出ユニットと、前記試料の温度を制御する温度制御ユニットとを備える光学検出装置について、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度の制御性能を確認する方法であって、
下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含むことを特徴とする光学検出装置の性能確認方法。
（Ａ）光学シグナルの強度と融解温度とが既知である核酸配列およびその相補鎖を含む標準サンプルを準備する工程
（Ｂ）前記温度制御ユニットにより、前記標準サンプルの温度を上昇もしくは下降させ、且つ、前記検出ユニットにより、前記標準サンプルの光学シグナル強度を測定する工程
（Ｃ）温度変化に伴う前記光学シグナル強度の変動から、前記標準サンプルの融解温度を決定する工程
（Ｄ）前記（Ｂ）工程で測定した前記標準サンプルの光学シグナル強度と前記標準サンプルの既知の光学シグナル強度、および、前記（Ｃ）工程で決定した前記標準サンプルの融解温度と前記標準サンプルの既知の融解温度とを、それぞれ比較して、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度制御性能を確認する工程
【請求項２】
前記（Ｄ）工程において、
前記（Ｂ）工程で測定した前記標準サンプルの光学シグナル強度が、前記既知の光学シグナル強度を含む所定の範囲内であり、且つ、前記（Ｃ）工程で決定した前記標準サンプルの融解温度が、前記既知の融解温度を含む所定の範囲内である場合に、対象の光学検出装置の性能を正常と判断し、
前記（Ｂ）工程で測定した前記標準サンプルの光学シグナル強度が、前記既知の光学シグナル強度を含む所定の範囲外であり、または、前記（Ｃ）工程で決定した前記標準サンプルの融解温度が、前記既知の融解温度を含む所定の範囲外である場合に、対象の光学検出装置の性能を異常と判断する、請求の範囲１記載の性能確認方法。
【請求項３】
前記（Ｄ）工程において、
前記（Ｂ）工程で測定した前記標準サンプルの所望温度における単位時間当たりの光学シグナル強度変化量と、前記標準サンプルの前記所望温度における単位時間当たりの既知の光学シグナル強度変化量とを比較する、請求の範囲１記載の性能確認方法。
【請求項４】
前記光学シグナルの強度が、蛍光強度である、請求の範囲１記載の性能確認方法。
【請求項５】
前記（Ａ）工程において、前記核酸配列とその相補鎖とが、ハイブリッドした二本鎖核酸を形成している、請求の範囲１記載の性能確認方法。
【請求項６】
前記核酸配列が、蛍光物質で標識化された標識化プローブである、請求の範囲１記載の性能確認方法。
【請求項７】
前記標識化プローブが、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が消光するプローブである、請求の範囲６記載の性能確認方法。
【請求項８】
前記核酸配列において、その３’末端または５’末端が前記蛍光物質で標識化されている、請求の範囲６記載の性能確認方法。
【請求項９】
前記核酸配列において、前記蛍光物質で標識化された末端の塩基もしくは前記末端の塩基に隣接する塩基がシトシンである、請求の範囲８記載の性能確認方法。
【請求項１０】
前記標準サンプルが、さらにインターカレーターを含むサンプルである、請求の範囲１記載の性能確認方法。
【請求項１１】
試料の光学シグナルを検出する検出ユニットと、前記試料の温度を制御する温度制御ユニットとを備える光学検出装置の製造方法であって、
請求の範囲１記載の性能確認方法によって、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度の制御性能を確認する工程を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項１２】
請求の範囲１記載の光学検出装置の性能確認方法に使用する標準試薬であって、
光学シグナルの強度と融解温度とが既知である核酸配列およびその相補鎖を含むことを特徴とする標準試薬。
【請求項１３】
前記核酸配列とその相補鎖とが、ハイブリッドした二本鎖核酸を形成している、請求の範囲１２記載の標準試薬。
【請求項１４】
前記核酸配列が、蛍光物質で標識化された標識化プローブである、請求の範囲１２記載の標準試薬。
【請求項１５】
前記標識化プローブが、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が消光するプローブである、請求の範囲１４記載の標準試薬。
【請求項１６】
前記核酸配列において、その３’末端または５’末端が前記蛍光物質で標識化されている、請求の範囲１４記載の標準試薬。
【請求項１７】
前記核酸配列において、前記蛍光物質で標識化された末端の塩基もしくは前記末端の塩基に隣接する塩基がシトシンである、請求の範囲１６記載の標準試薬。
【請求項１８】
さらにインターカレーターを含む、請求の範囲１２記載の標準試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学検出装置について、試料の光学シグナルの検出ならびに前記試料の温度制御を正常に行うことができているか、それらの性能を確認する方法、ならびにそれに用いる標準試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の多型や点突然変異等の新たな検出方法として、核酸の融解温度（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を解析する方法が実用化されている。この解析方法は、例えば、前記核酸の融解曲線の解析により行われることから融解曲線解析、または、Ｔｍ解析とも呼ばれている。【０００３】
Ｔｍ値は、一般的に、以下のように定義されている。二本鎖核酸を含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖核酸における両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖核酸に解離（核酸の融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖核酸が解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖核酸のみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍ（℃）とは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。【０００４】
核酸のこのような特性を利用すれば、例えば、以下のようにして標的部位における多型や変異等の検出が可能である。すなわち、まず、変異型の標的部位を含む標的核酸配列に相補的な変異型検出用プローブを用いて、分析対象の一本鎖核酸と前記プローブとの二本鎖核酸を形成させ、形成された二本鎖核酸に加熱処理を施し、温度上昇に伴う前記二本鎖核酸の解離（融解）を示すシグナルを測定する。そして、測定したシグナル値の挙動からＴｍ値を決定し、決定したＴｍ値から、標的部位における変異の有無を判断する方法である（非特許文献１、特許文献１参照）。Ｔｍ値は、二本鎖核酸の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。そこで、変異型の標的部位を含む標的核酸配列とそれに１００％相補的な変異型検出用プローブとの二本鎖核酸、および、前記標的部位が野生型である核酸配列と前記変異型検出用プローブとの二本鎖核酸のそれぞれについて、予め評価基準となるＴｍ値を求めておく。前述のように相同性が高い程Ｔｍ値は高くなるため、前者、すなわち標的部位が変異型である場合のＴｍ値（以下、「Ｔｍｍ値」ともいう）は、相対的に高く、後者、すなわち標的部位が野生型である場合のＴｍ値（以下、「Ｔｍｗ値」）は、相対的に低くなる。そして、分析対象の一本鎖核酸と前記変異型検出用プローブとから形成される二本鎖核酸について、前述のようにしてシグナルの測定を行い、例えば、作成した融解曲線からシグナル変動のピークを検出する。このピークを示す温度、すなわち、Ｔｍ値が、予め求めたＴｍｍ値と同程度であれば、一本鎖核酸と前記プローブとは１００％マッチしているため、すなわち、分析対象の核酸は、前記標的部位における多型が変異型であると判断できる。他方、前記ピークを示すＴｍ値が、予め求めたＴｍｍ値よりも低く、ＴｍＷ値と同程度であれば、一本鎖核酸と前記プローブとは一塩基ミスマッチしているため、分析対象の核酸は、前記標的部位における多型が野生型であると判断できる。また、多型がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるかについても、判断することができる。すなわち、一対の対立遺伝子の分析の際、融解曲線において、Ｔｍｍ値付近とＴｍｗ値付近の両方にピークが存在する場合、ヘテロ接合性と判断でき、他方、Ｔｍｍ値付近にのみピークが存在する場合は、変異型のホモ接合性であり、Ｔｍｗ値付近にのみピークが存在する場合は、野生型のホモ接合性であると判断することができる。【０００５】
この解析においては、前記プローブとして、例えば、蛍光物質で標識化したプローブを使用し、前記蛍光物質の蛍光をシグナルとして測定する手法が広く採用されている。このようなＴｍ解析を利用した検出方法には、通常、試料の光学シグナルを検出する検出ユニットと前記試料の温度を制御する温度制御ユニットとを備える光学検出装置が使用されており、様々な商品が販売されている。【０００６】
前述のように、Ｔｍ解析においては、温度変化に伴う光学シグナルの変動を測定することによってＴｍ値を決定するため、前記光学検出装置内において、前記試料の温度が正確にコントロールされているか、また、前記試料の光学シグナルが正常に検出されているかという、これら２点が極めて重要となる。このため、前記光学検出装置については、解析結果の信頼性を維持するために、光学シグナルの検出性能と温度制御性能の２つを確認することが必須である。そこで、光学シグナルの検出については、例えば、既知の蛍光物質を既知濃度で含む溶液を準備し、前記溶液について、前記蛍光色素のシグナル強度（蛍光強度）を所定の温度条件下で測定し、光学シグナルが正常に測定できているか否かを確認している。他方、試料の温度制御に関しては、試料を前記光学検出装置の所定部位（以下、「試料配置部」ともいう）に配置し、実際に、前記試料の温度を測定することによって、前記装置の温度制御ユニットにより前記試料が正確に温度制御されているか否かを確認している。【０００７】
しかしながら、このような従来の方法では、１つの光学検出装置に対して、光学シグナルの検出性能と温度制御性能の２つを別々に確認することが必要であり、時間や労力がかかる。また、光学シグナルの検出性能に関しては、前述のように、所定温度条件下での確認測定によって、例えば、理論値と同等である信頼性の高い測定値が得られた場合でも、実際に測定時における温度が正確であることの証明にはならない。すなわち、試料配置部もしくはそこに配置された試料が、実際に所定の設定温度になっていることの証明にはならない。このため、蛍光強度の測定値が「所望の設定温度」において信頼性の高い値を示しているということもできず、結果的には、別途、温度制御性能の確認が必須となる。他方、前記光学検出装置に配置した試料の温度測定は、通常、外部から温度測定器を導入して行われる。しかしながら、前記試料配置部のいずれの場所で測定を行うかによって、温度が異なるおそれがある。また、試料の配置部は微小であることから、外部から温度測定器を導入すること自体によって、実際の温度に影響がでるおそれがある。このような理由から、前記光学検出装置に配置した試料の実際の温度を正確に測定することが困難であるため、結果的に、前記温度制御ユニットにより前記試料の温度制御が正確に行われているか否かが判断し難い。
【非特許文献１】Clinical  Chemistry  46：5  631-635（2000）
【特許文献１】特開２００５−５８１０７号公報
【発明の開示】
【０００８】
そこで、本発明は、光学検出ユニットおよび温度制御ユニットを備える光学検出装置について、光学シグナルの検出および温度制御が正確に行われているか否か、それらの性能を簡易且つ高い信頼性で確認できる方法の提供を目的とする。
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明の光学検出装置の性能確認方法は、試料の光学シグナルを検出する検出ユニットと、前記試料の温度を制御する温度制御ユニットとを備える光学検出装置について、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度の制御性能を確認する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）光学シグナルの強度と融解温度とが既知である核酸配列およびその相補鎖を含む標準サンプルを準備する工程
（Ｂ）前記温度制御ユニットにより、前記標準サンプルの温度を上昇もしくは下降させ、且つ、前記検出ユニットにより、前記標準サンプルの光学シグナルの強度を測定する工程
（Ｃ）温度変化に伴う前記光学シグナル強度の変動から、前記標準サンプルの融解温度を決定する工程
（Ｄ）前記（Ｂ）工程で測定した前記標準サンプルの光学シグナル強度と前記標準サンプルの既知の光学シグナル強度、および、前記（Ｃ）工程で決定した前記標準サンプルの融解温度と前記標準サンプルの既知の融解温度とを、それぞれ比較して、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度の制御性能を確認する工程
【００１０】
本発明の製造方法は、試料の光学シグナルを検出する検出ユニットと、前記試料の温度を制御する温度制御ユニットとを備える光学検出装置の製造方法であって、本発明の性能確認方法によって、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度の制御性能を確認する工程を含むことを特徴とする。
【００１１】
本発明の標準試薬は、本発明の光学検出装置の性能確認方法に使用する標準試薬であって、  光学シグナルの強度と融解温度とが既知である核酸配列およびその相補鎖を含むことを特徴とする。
【００１２】
本発明の性能確認方法によれば、評価対象である光学検出装置を用いて、前記標準サンプルを使用したＴｍ解析を行うことで、前記検出ユニットの性能と前記温度制御ユニットの性能の両方を確認することできる。具体的には、前記標準サンプルの測定結果と、前記標準サンプルの既知条件（シグナル強度やＴｍ値）とを比較し、例えば、ほぼ同じ結果であれば、前記検出ユニットおよび前記温度制御ユニットの性能が正常であると判断し、異なる結果であれば前記性能が異常であると判断することができる。本発明は、核酸とその相補鎖とから二本鎖が形成（ハイブリッド形成）され、加熱処理によって、前記二本鎖が解離（一本鎖核酸への解離）し、且つ、それらの配列に基づいて固有のＴｍ値（℃）を有するという性質を利用した技術である。そして、二本鎖の形成、二本鎖の解離（一本鎖への解離）およびＴｍ値の信頼性は、当業者において十分認識されている。したがって、本発明の光学検出装置の性能確認方法によれば、Ｔｍ解析を利用することで、光学検出装置における検出性能と温度制御性能とを高い信頼性で評価できることは明らかである。なお、二本鎖の形成、二本鎖の解離およびＴｍ値に関しては、前述のように公知であるが、従来は、あくまでも目的の遺伝子の配列、変異または多型等を解析するためにこれらの性質が利用されているにすぎない。これらの性質を利用して、光学検出装置の検出性能および温度制御性能を確認するという技術的思想は、本発明者らがはじめて見出し確立したものである。本発明の方法は、本発明の標準試薬を標準サンプルとして使用することによって、容易に行うことができる。また、本発明の性能確認方法によれば、従来のように、外部から内部に、別途温度測定器等を導入する必要がないため、前述のような温度測定器の導入による問題も生じない。また、本発明の性能確認方法は、光学検出装置の製造における性能検査工程に適用することもできる。このように、本発明の性能確認方法によれば、簡易且つ簡便に、光学検出装置における光学シグナルの検出性能および温度制御性能の二つを同じ方法で確認できるため、極めて有効な技術といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、本発明の実施例１におけるＴｍ解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
＜性能確認方法＞
本発明の光学検出装置の性能確認方法は、試料の光学シグナルを検出する検出ユニットと、前記試料の温度を制御する温度制御ユニットとを備える光学検出装置について、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度の制御性能を確認する方法であって、下記（Ａ）〜（Ｄ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）光学シグナルの強度と融解温度とが既知である核酸配列およびその相補鎖を含む標準サンプルを準備する工程
（Ｂ）前記温度制御ユニットにより、前記標準サンプルの温度を上昇もしくは下降させ、且つ、前記検出ユニットにより、前記標準サンプルの光学シグナルの強度を測定する工程
（Ｃ）温度変化に伴う前記光学シグナル強度の変動から、前記標準サンプルの融解温度を決定する工程
（Ｄ）前記（Ｂ）工程で測定した前記標準サンプルの光学シグナル強度と前記標準サンプルの既知の光学シグナル強度、および、前記（Ｃ）工程で決定した前記標準サンプルの融解温度と前記標準サンプルの既知の融解温度とを、それぞれ比較して、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度の制御性能を確認する工程【００１５】
前記標準サンプルに含まれる核酸配列とその相補鎖との組み合わせは、何ら制限されず、温度の変動によって、ハイブリッドの形成（二本鎖核酸の形成）とハイブリッドの解離（一本鎖核酸への解離）とが行われるものであればよい。本発明においては、温度制御が正確か否か、さらに、光学シグナルの検出が正確であるか否かを判断するため、前記核酸配列と前記相補鎖とがハイブリッドした二本鎖核酸のＴｍ値が必要である。Ｔｍ値は、例えば、配列情報、ＧＣ含量、塩濃度等に基づいて、従来公知の方法によって理論値を算出することができる。前記公知の方法としては、例えば、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）や、ＭｅｌｔＣａｌｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｄｅ／）等のソフトウエアを用いる方法があげられる。本発明においては、このＴｍ値の理論値を、例えば、「既知のＴｍ値」とすることができる。また、Ｔｍ値は、例えば、反応液中の塩濃度の他に、前記核酸配列およびその相補鎖の濃度、コンジュゲート基(例えば、ビオチンや蛍光色素等)の存在等により影響を受ける可能性がある。そこで、例えば、標準サンプルを含む反応液を用いて、予め、検出性能および温度制御性能が正常である光学検出装置によりＴｍ値を測定しておき、これを既知のＴｍ値とすることが好ましい。この他にも、例えば、すでにＴｍ値が既知である核酸配列とその相補鎖とを組み合わせて使用してもよい。【００１６】
本発明において、前記核酸配列とその相補鎖は、温度変化によって、ハイブリッド形成と解離とが行われるものであればよい。このため、前記相補鎖は、例えば、前記核酸配列と完全に（１００％）相補的な配列であってもよいし、部分的に異なる配列であってもよい。また、前記相補鎖は、例えば、前記核酸配列に相補的な配列のみからなる鎖でもよいし、前記核酸配列に相補的な配列を含む鎖でもよく、前記核酸配列の部分配列に相補的な配列のみからなる鎖でもよい。【００１７】
前記核酸配列および前記相補鎖としては、例えば、ポリヌクレオチドがあげられる。それぞれの長さは、特に制限されないが、例えば、１０〜１００ｍｅｒ程度が好ましい。【００１８】
本発明に使用する時点において、前記標準サンプルにおける前記核酸配列と相補鎖とは、ハイブリットを形成した状態（二本鎖核酸）でもよいし、前記両者が解離した状態でもよい。【００１９】
前記核酸配列と相補鎖との組み合わせの具体例としては、光学シグナルの検出感度を向上できることから、例えば、光学シグナルを発する標識化物質で標識化されたプローブ（以下、「標識化プローブ」ともいう）とその相補鎖との組み合わせが好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者のようなプローブであれば、相補鎖とハイブリッド（二本鎖）を形成している際にはシグナルを示さず、加熱によりハイブリッドが解離して標識化プローブが遊離するとシグナルを示す。また、後者のプローブであれば、相補鎖とハイブリッド（二本鎖）を形成することによってシグナルを示し、加熱によりハイブリッドが解離して標識化プローブが遊離するとシグナルが減少（消失）する。このような標識化プローブと相補鎖とを含む標準サンプルを使用する場合、前記（Ｂ）工程において、例えば、標識化物質の種類に応じた条件で、光学シグナルを測定すればよい。前記（Ｂ）工程における光学シグナルの測定方法は、例えば、標識化物質の種類に応じて適宜決定でき、特に制限されないが、吸光度（吸収強度）測定や蛍光強度測定等があげられる。前記標識化プローブを使用し、その標識化物質のシグナルを測定することによっても、前述の二本鎖核酸（未標識）の融解状態を示す２６０ｎｍでの吸光度と同様に、融解の進行ならびにＴｍ値の決定を行える。なお、本発明は、光学検出装置の性能を確認する方法であるため、前記標識化プローブを使用する際には、例えば、前記光学検出装置での測定が想定される標識化物質（測定予定の標識化物質）を使用して、光学シグナルの検出性能を確認することが特に好ましい。【００２０】
前記標識化物質としては、前述のように特に制限されないが、広く利用されていることから、蛍光物質が好ましく、例えば、蛍光色素（蛍光団）があげられる。具体例としては、例えば、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）するプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ  ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）を利用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記標識化プローブは、プローブ（ポリヌクレオチド）の３’末端もしくは５’末端が蛍光色素で標識化されていることが好ましい。また、標識化される前記末端の塩基またはそれに隣接する塩基が、シトシン（Ｃ）であることが好ましい。前記隣接する塩基は、例えば、前記末端の塩基から１〜３番目の塩基であることが好ましい。この場合、前記標識化プローブがハイブリダイズする相補鎖の配列において、前記標識化プローブの末端塩基Ｃまたは隣接する塩基Ｃと対をなす塩基がＧとなるように、前記標識化プローブと相補鎖との塩基配列を設計することが好ましい。このようなプローブは、一般的にグアニン消光プローブと呼ばれ、いわゆるＱＰｒｏｂｅ（登録商標）として知られている。このようなグアニン消光プローブが相補鎖にハイブリダイズすると、蛍光色素で標識化された標識化プローブの末端のＣが、前記相補鎖のＧに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）という現象を示す。このような標識化プローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。【００２１】
前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられる。市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（商標、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）、ＴＡＲＭＡ(モレキュラー・プローブ社製)等があげられる。【００２２】
また、前記核酸配列と相補鎖との組み合わせとしては、例えば、標識化されていない核酸配列とそれに相補的な核酸配列の組み合わせであってもよい。前述のように二本鎖核酸は、温度変化によって、波長２６０ｎｍにおける吸光度が変化する。したがって、このように標識化していない核酸配列と相補鎖とを使用する場合には、前記（Ｂ）工程において、例えば、光学シグナルとして２００〜３５０ｎｍ（好ましくは２６０ｎｍ）の吸光度を測定することが好ましい。なお、このような核酸配列と相補鎖の長さも、特に制限されず、前述と同様である。【００２３】
前記標準サンプルは、この他に、例えば、インターカレーターを含んでいてもよい。特に、前述のような標識化プローブを使用しない場合は、未標識の核酸配列と相補鎖に加えて、前記インターカレーターを含むことが好ましい。前記インターカレーターとしては、例えば、インターカレーター性蛍光物質が好ましく、これは、一般に、二本鎖核酸にインターカレーションすることによって蛍光特性が変化する色素として知られている。このような蛍光色素は、二本鎖核酸にインターカレーションすることで、蛍光特性が変化するものであれば特に制限はない。中でも、インターカレーションにより蛍光強度が増加するものが好ましく、例えば、エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエローやそれらの誘導体等があげられる。このように前記インターカレーターを含む標準サンプルの場合には、前記（Ｂ）工程において、前記標準サンプルに励起光を照射して、前記インターカレーターより発生する蛍光の強度を測定すればよい。【００２４】
本発明においては、例えば、２種類以上の異なる標準サンプルを用いて、２回以上の性能確認を行ってもよい。前述のように、核酸配列と相補鎖とから形成されるハイブリッドは、固有のＴｍ値を有している。したがって、異なるＴｍ値を示す標準サンプルを複数使用すれば、それらの各サンプルについて、正確な温度制御ならびに光学シグナルの検出が行われているかを評価できる。このようにすれば、さらに多くの温度範囲について性能の確認を行うことができるため、結果的に、光学検出装置による解析の信頼性をより一層向上することが可能となる。【００２５】
また、同様に、前記標識化プローブにおける標識化物質の種類のみを変えた２種類以上の異なる標準サンプルを用いて性能確認を行ってもよい。例えば、光学検出を用いた実際の測定において、検出波長が異なる２種類以上の蛍光物質を使用する場合、一つの光学検出装置において、２つ以上の異なる波長で蛍光強度を検出することとなる。このような場合、蛍光物質が異なる２種類以上の標準サンプルを使用して、蛍光検出装置の性能確認を行っておけば、例えば、複数の波長についても、高い信頼性で測定を行うことが可能になる。具体例として、例えば、前述のＱ−プローブを用いた解析法や、ハイブリダイゼーション法等において、複数波長での解析を行う前に、本発明の性能確認方法を実行すれば、非常に信頼性の高い解析が可能になるといえる。【００２６】
本発明において、光学シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、前記核酸配列の標識化の有無や、インターカレーションの有無に応じて、蛍光強度や吸光度等があげられる。【００２７】
本発明の性能確認方法を採用できる光学検出装置は、試料の光学シグナルを検出するための光学検出ユニットならびに温度制御ユニットを備える装置であればよく、例えば、前記各ユニットの構造、大きさ、配置部位、その他の構成等は何ら制限されない。具体例としては、例えば、例えば、Ｔｍ解析装置、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクション）装置、リアルタイムＰＣＲ装置等、従来公知の光学検出装置への適用が例示できる。【００２８】
本発明の性能確認方法について、蛍光色素で標識化された標識化プローブとその相補鎖とを含む標準サンプルを使用する一例をあげて説明する。なお、本発明は、この例には何ら制限されない。【００２９】
（Ａ）工程：標準サンプルの準備
まず、前述のような標識化プローブとその相補鎖とを含む標準サンプルを準備する。前記Ｔｍ解析には、一般的に、液体試料を使用することから、前記標準サンプルは、前記標識化プローブと相補鎖とを含む液体であることが好ましい。前記標準サンプルの溶媒は、何ら制限されないが、例えば、水、グリシン、クエン酸、酢酸、リン酸、トリス等の各種緩衝液があげられ、ｐＨは、例えば、５〜９の範囲が好ましい。また、これらの他に、例えば、塩、アルコール、界面活性剤等を含んでもよい。【００３０】
前記標準サンプルにおける標識化プローブと相補鎖とのハイブリッドのＴｍ値（既知Ｔｍ値）は、前述のような方法により、予め決定することができる。【００３１】
前記標準サンプルにおける既知の光学シグナル強度は、例えば、以下のように設定することができる。例えば、予め、光学検出ユニットの検出性能ならびに温度制御性能が正常である光学検出装置を用いて、後述する性能確認の際と同じ条件で、前記標準サンプルの光学シグナル強度を測定しておく。そして、これを既知の光学シグナル強度とする。具体例として、蛍光色素で標識化されたプローブを使用する場合は、例えば、標準サンプルの組成、蛍光色素の種類、標準サンプル中の標識化プローブおよび相補鎖の濃度、標識化プローブおよび相補鎖の配列、励起光の光源の種類（例えば、波長、光量等）、検出側の種類（例えば、波長、検出感度等）、検出温度等を特定して蛍光シグナル強度を測定する。この測定値を、既知の蛍光シグナル強度とすることができる。そして、既知の蛍光シグナル強度の決定と同じ測定条件で、同じ標準サンプルを用いて、性能を確認する対象の被検装置により、前記標準サンプルの蛍光シグナル強度を測定する。この測定値と前記既知の蛍光シグナル強度とを比較して、同程度の値か否かを判断すれば、検出性能を確認できる。このように、同じ標準サンプルを使用して、同じ条件で確認の測定を行えば、例えば、定期的に性能を確認する際、光学検出ユニットの性能を継続的に高い信頼性で確認することも可能である。【００３２】
（Ｂ）工程：光学シグナル強度の測定
つぎに、準備した前記標準サンプルを、性能を確認する対象の被検装置（光学検出装置）における所定の試料配置部（試料配置ユニット）に供給する。【００３３】
続いて、光学検出装置の作動方法に従って、前記装置内部に配置した標準サンプルの温度を上昇または下降させる。開始温度や最終温度は、特に制限されず、例えば、使用する標準サンプルの既知Ｔｍ値に応じて決定できる。既知Ｔｍ値よりも低い温度から開始する場合、通常、前記核酸配列と相補鎖とはハイブリッドを形成している。このため、例えば、前記標準サンプルの温度を、経時的に既知Ｔｍ値よりも高い温度にまで向上させ、ハイブリッドを解離させることが好ましい。一方、Ｔｍ値よりも高い温度から開始する場合、通常、前記核酸配列と相補鎖配列とは解離している。このため、例えば、前記標準サンプルの温度を、経時的に既知Ｔｍ値よりも低い温度にまで下降させ、ハイブリッドを形成させることが好ましい。【００３４】
また、前記標準サンプルの温度調整と並行して、温度変化に伴う前記標準サンプルの蛍光強度を、光学検出装置の作動方法に従って測定する。蛍光強度の測定は、例えば、連続的でも断続的でもよいが、本発明は、性能の確認であることから、連続的に測定することが好ましい。【００３５】
（Ｃ）工程：Ｔｍ値の決定
前記（Ｂ）工程で測定した、温度変化に伴う前記蛍光強度の変動から、前記標準サンプルの融解温度を決定する。具体的には、例えば、測定した蛍光強度の変動結果から、それに基づくＴｍ値（Ｔｍ１）を決定する。【００３６】
前記Ｔｍ値（Ｔｍ１）は、例えば、単位時間当たりの光学シグナル強度変化量から決定することができる。具体的には、例えば、まず、前記（Ｂ）工程で測定した前記標準サンプルの光学シグナル強度から、各温度における単位時間当たりの光学シグナル強度変化量を求める。この変化量は、例えば、式「−ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」または「蛍光強度変化量／ｄｔ」により算出できる。そして、前記光学シグナル強度変化量の絶対値が最も大きな値を示す点（温度）を、前記標準サンプルのＴｍ値（Ｔｍ１）として決定できる。なお、これには制限されない。【００３７】
（Ｄ）工程：性能確認
そして、決定したＴｍ値の結果および測定した前記標準サンプルの蛍光強度と、前記標準サンプルの既知Ｔｍ値（Ｔｍ０）および既知蛍光強度（Ｆ０）とを比較する。具体的には、例えば、測定した蛍光強度の変動結果から、前述のように、それに基づくＴｍ値（Ｔｍ１）、ならびに、前記温度（Ｔｍ１）における蛍光強度（Ｆ１）を求め、これらを既知の値（Ｔｍ０、Ｆ０）と比較する。その結果、Ｔｍ０≒Ｔｍ１、Ｆ０≒Ｆ１であれば、光学検出装置における光学検出ユニットの検出性能ならびに温度制御ユニットの温度制御性能は、正常であると判断できる。他方、Ｔｍ≠Ｔｍ１、Ｆ０≠Ｆ１であれば、光学検出装置における光学検出ユニットの検出性能ならびに温度制御ユニットの温度制御性能は、異常であると判断できる。なお、本発明においては、測定結果のＴｍ１やＦ１と、既知の値Ｔｍ０、Ｆ０とが、どの程度近似している場合に正常と判断し、どの程度異なる場合に異常と判断するかという点については、何ら制限されない。本発明は、Ｔｍ解析によって、性能を確認できることを見出した点が特徴であり、例えば、性能に関して正常か異常かの判断基準（評価の線引き）は、光学検出装置の確認を行う者が、所望の基準に設定できる。【００３８】
本発明において、前記標準サンプルの既知シグナル強度とは、例えば、所望温度における単位時間当たりの光学シグナル強度変化量であってもよい。この場合、前記（Ｄ）工程において、前記（Ｂ）工程で測定した前記標準サンプルの光学シグナル強度から、所望温度における単位時間当たりの光学シグナル強度変化量を求め、これと、前記標準サンプルの前記所望温度における単位時間当たりの既知の光学シグナル強度変化量とを比較すればよい。具体例としては、例えば、測定した蛍光強度から所望温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量を、式「−ｄ蛍光強度変化量／ｄｔ」または「蛍光強度変化量／ｄｔ」により求めることができる。【００３９】
＜製造方法＞
本発明の製造方法は、試料の光学シグナルを検出する検出ユニットと、前記試料の温度を制御する温度制御ユニットとを備える光学検出装置の製造方法であって、本発明の性能確認方法によって、前記検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度の制御性能を確認する工程を含むことを特徴とする。【００４０】
本発明は、製造工程の一環として、本発明の性能確認方法により製造にかかる光学検出装置の性能を確認することが特徴であって、その他の構成や条件は、何ら制限されない。【００４１】
＜標準試薬＞
本発明の標準試薬は、試料の光学シグナルを検出する光学検出ユニットと前記試料の温度を制御する温度制御ユニットとを備える光学検出装置について、前記光学検出ユニットによる光学シグナルの検出性能および前記温度制御ユニットによる温度の制御性能を確認するために使用する標準試薬であって、光学シグナルの強度とＴｍ値とが既知である核酸配列とその相補鎖とを含むことを特徴とする。【００４２】
本発明の標準試薬は、本発明の性能確認方法における標準サンプルとして使用できる。前記核酸配列とその相補鎖は、前述と同様であり、また、前記標準試薬の組成や使用方法等は、前記標準サンプルと同様である。【００４３】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記の実施例により制限されない。
【実施例１】
【００４４】
まず、標準サンプル（標準試薬）として、下記標識化プローブおよび前記標識化プローブに相補的な相補鎖ＤＮＡを含む下記組成の反応液を調製した。下記標識化プローブの５’末端の（ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ）は、蛍光色素であり、３’末端の（Ｐ）は、リン酸化を示す。【００４５】
【表１】
2008084672.tif 000003
【００４６】
（標準サンプル）
標識化プローブ５’−(BODIPY  FL)−caccccctgaatccaggtaagg−P−３’（配列番号１）
相補鎖ＤＮＡ  ５’−ttggccttacctggattcagggggtgcttacaatcctgat−３’（配列番号２）【００４７】
予め、前記反応液の既知Ｔｍ値ならびに既知蛍光強度を、以下のようにして決定した。性能評価の対象である後述する蛍光検出装置と同じ型であって、予め、光学検出ユニットの検出性能ならびに温度の制御性能が正常であることが確認された光学検出装置（商品名Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ、Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を準備した。そして、この光学検出装置を用いて、後述する性能確認の際と同じ条件で、所定の温度範囲（４５〜９５℃）における蛍光値（蛍光強度）を測定した。また、この蛍光値から蛍光強度の変化量を示す微分値「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を求めた。この結果、前記反応液のＴｍ値は、７０．６℃であり、８０℃における蛍光値は、１０７２であった。これらを、それぞれ既知Ｔｍ値および既知蛍光強度とした。なお、本発明においては、いずれの温度における蛍光値を既知蛍光強度としてもよい。例として、下記表２に複数の温度における蛍光値（既知蛍光強度）を示す。【００４８】
そして、性能評価の対象である蛍光検出装置、すなわち、光学シグナルの検出性能ならびに温度制御性能が不明である蛍光検出装置（商品名Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ、Ｃｅｐｈｅｉｄ社製）を準備し、前記反応液についてＴｍ解析を行った。測定波長は、４５０〜４９５ｎｍ（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）、５０５〜５３７ｎｍ（Ｅｍｉｓｓｉｏｎ）とした。この結果を、図１に示す。同図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を示すＴｍ解析のグラフであり、縦軸の微分値とは「−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ」を示す。また、複数の温度における蛍光値（測定蛍光強度）を下記表２に示す。【００４９】
【表２】
2008084672.tif 000004
【００５０】
同図に示すように、蛍光強度の微分値がピークを示す温度は７０．６℃であり、前記既知Ｔｍ値７０．９℃と同程度であった。また、８０℃における蛍光値は９８４であり、既知蛍光値１０７２とほぼ同程度であった。以上の結果から、蛍光強度の検出および温度制御のいずれの性能も問題がないことがわかった。このように、本実施例の方法によれば、一回のＴｍ解析の結果から、蛍光強度の検出および温度制御のいずれの性能についても確認することが可能である
【産業上の利用可能性】
【００５１】
以上のように、本発明の方法によれば、性能の評価対象である光学検出装置により、標準サンプルを用いてＴｍ解析を行うことで、前記光学検出ユニットの性能と温度制御ユニットの性能の両方について確認することが可能となる。具体的には、標準サンプルの測定結果と、前記標準サンプルの既知条件（強度やＴｍ値）とを比較することによって、例えば、ほぼ同じ結果であれば光学検出装置の性能は正確であり、異なる結果であれば、前記性能は不正確であると判断することができる。また、本発明の方法によれば、温度測定のため、従来のように外部から温度測定器等を導入する必要もない。このように、本発明の性能確認方法によれば、簡易且つ簡便に、光学検出装置における光学シグナルの検出性能および温度制御性能の二つを同じ方法で確認できるため、極めて有効な技術といえる。
【図１】
2008084672.tif 000005
【配列表】
2008084672000001.app
【国際調査報告】
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2008084672.tif 000008
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