(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テルペンシンターゼ変異体をインビボ性能の改善について検査する方法であって、
（ａ）宿主細胞の集団を、対照集団と試験集団とに分けるステップと、
（ｂ）ポリプレニル二リン酸を第一のテルペンに変換し得る対照テルペンシンターゼと、当該ポリプレニル二リン酸を第二のテルペンに変換し得る比較テルペンシンターゼと、を前記対照集団内で発現させるステップと、
（ｃ）前記対照テルペンシンターゼの変異体であり、且つ前記ポリプレニル二リン酸を第一のテルペンに変換することができる試験テルペンシンターゼと、前記試験集団および前記対照集団において同様のレベルで発現される前記比較テルペンシンターゼと、を前記試験集団内で発現させるステップと、
（ｄ）前記試験集団および前記対照集団において、前記第一のテルペンと前記第二のテルペンとの比を測定するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記対照集団における比と比較して、前記試験集団における前記第二のテルペンに対する前記第一のテルペンの比が増加することにより、前記試験集団が前記対照テルペンシンターゼと比較してインビボ性能が改善したテルペンシンターゼ変異体を含むとして同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対照テルペンシンターゼ、比較テルペンシンターゼ、および前記試験テルペンシンターゼが、セスキテルペンシンターゼであり、前記ポリプレニル二リン酸が、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記比較テルペンシンターゼが、トリコジエンシンターゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記対照および試験テルペンシンターゼが、ファルネセンシンターゼ活性を有するシンターゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記対照テルペンシンターゼ、比較テルペンシンターゼ、および前記試験テルペンシンターゼが、モノテルペンシンターゼであり、前記ポリプレニル二リン酸が、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記宿主細胞が、メバロン酸（ＭＥＶ）経路の１種以上の異種酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＥＶ経路の１種以上の異種酵素が、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＲＧ８）、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＲＧ１０）、メバロン酸キナーゼ（ＥＲＧ１２）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）シンターゼ（ＥＲＧ１３）、メバロナートピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＥＲＧ１９）、およびＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ（ＨＭＧ１）からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記試験テルペンシンターゼが、１〜１０のアミノ酸だけ前記対照テルペンシンターゼと異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第一のテルペンと前記第二のテルペンとの比が、少なくとも１．３である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記試験テルペンシンターゼが、前記対照テルペンシンターゼが前記対照集団において発現されるのと同様のレベルで、前記試験集団において発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記対照テルペンシンターゼのコード配列と前記試験テルペンシンターゼのコード配列とは同一であるが、前記対照テルペンシンターゼと前記試験テルペンシンターゼは異なるプロモータの調節的制御下にあり、前記対照集団と前記試験集団とで異なるレベルで発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞の集団が、酵母細胞の集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
宿主細胞の共通集団から分けられた２つの細胞亜集団を含むキットであって、ここで
（ａ）第一の亜集団が、対照テルペンシンターゼと比較テルペンシンターゼとを含み、
前記対照テルペンシンターゼが、ポリプレニル二リン酸を第一のテルペンに変換し、前記比較テルペンシンターゼが、当該ポリプレニル二リン酸を第二のテルペンに変換し；そして
（ｂ）第二の亜集団が、試験テルペンシンターゼと前記比較テルペンシンターゼとを含み、前記試験テルペンシンターゼが、前記ポリプレニル二リン酸を前記第一のテルペンに変換し、前記試験テルペンシンターゼが、前記対照テルペンシンターゼの変異体であり、
前記比較テルペンシンターゼが、前記第一の亜集団および前記第二の亜集団において同様のレベルで発現する、キット。
【請求項１５】
前記第一のテルペンと前記第二のテルペンとの比が、前記第一の亜集団における比と比較して前記第二の亜集団における方が大きい、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記宿主細胞の集団が、大腸菌細胞の集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
宿主細胞が、異種イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）イソメラーゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１８】
宿主細胞が、異種ＦＰＰシンターゼを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が異種ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）シンターゼを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対照テルペンシンターゼ、比較テルペンシンターゼ、および試験テルペンシンターゼがジテルペンシンターゼであり、
前記ポリプレニル二リン酸がゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対照テルペンシンターゼ、および試験テルペンシンターゼが、β−ファルネセンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、トリコジエンシンターゼ、パチュロールシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、バレンセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、およびノートカトンシンターゼからなる群よりそれぞれ選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記対照テルペンシンターゼ、および試験テルペンシンターゼが、セスタテルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、またはポリテルペンシンターゼよりそれぞれ選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第一のテルペンまたは前記第二のテルペンが、β−ファルネセン、α−ファルネセン、トリコジエン、パチュロール、アモルファジエン、バレンセン、ファルネソール、ネロリドール、およびノートカトンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記第一のテルペンまたは前記第二のテルペンがリモネンまたはミルセンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記対照テルペンシンターゼ、比較テルペンシンターゼ、および前記試験テルペンシンターゼが、セスキテルペンシンターゼであり、前記ポリプレニル二リン酸が、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）である、請求項１４に記載のキット。
【請求項２６】
前記対照および試験テルペンシンターゼが、ファルネセンシンターゼ活性を有するシンターゼである、請求項１４に記載のキット。
【請求項２７】
前記比較テルペンシンターゼが、トリコジエンシンターゼである、請求項１４に記載のキット。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、ＭＥＶ経路の１種以上の異種酵素を含む、請求項１４に記載のキット
。
【請求項２９】
前記ＭＥＶ経路の１種以上の異種酵素が、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＥＲＧ８）、アセチル−ＣｏＡチオラーゼ（ＥＲＧ１０）、メバロン酸キナーゼ（ＥＲＧ１２）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）シンターゼ（ＥＲＧ１３）、メバロナートピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＥＲＧ１９）、およびＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ（ＨＭＧ１）からなる群より選択される、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
宿主細胞が、異種ＦＰＰシンターゼを含む、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞を通してテルペンシンターゼ変異体を発生させる方法に関する。詳細には本開示は、インビボ性能が改善されていてテルペン製品の商業生産において有用となるテルペンシンターゼ変異体を発生させる方法を提供する。更に、優れたテルペンシンターゼ変異体、およびそのようなテルペンシンターゼ変異体を含む宿主細胞が、本開示に包含される。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
テルペンは、多くの生物体内で産生される炭化水素の大きな区分である。それは、イソプレン（Ｃ５Ｈ８）の単位を連結させることにより得られ、存在するイソプレン単位の数により分類される。ヘミテルペンは、単一のイソプレン単位からなる。イソプレンそのものが、唯一のヘミテルペンとみなされる。モノテルペンは、２つのイソプレン単位で生成され、分子式Ｃ１０Ｈ１６を有する。モノテルペンの例は、ゲラニオール、リモネンおよびテルピネオールである。セスキテルペンは、３つのイソプレン単位で構成され、分子式Ｃ１５Ｈ２４を有する。セスキテルペンの例は、ファルネセン、ファルネソールおよびパチュロールである。ジテルペンは、４つのイソプレン単位で生成され、分子式Ｃ２０Ｈ３２を有する。ジテルペンの例は、カフェストール、カーウェオール、センブレン、およびタキサジエンである。セスタテルペンは、５つのイソプレン単位で生成され、分子式Ｃ２５Ｈ４０を有する。セスタテルペンの例は、ゲラニルファルネソールである。トリテルペンは、６つのイソプレン単位からなり、分子式Ｃ３０Ｈ４８を有する。テトラテルペンは、８つのイソテルペン単位を含み、分子式Ｃ４０Ｈ６４を有する。生物学的に重要なテトラテルペンとしては、非環式リコペン、単環式γカロテン、ならびに二環式α−およびβ−カロテンが挙げられる。ポリテルペンは、多くのイソプレン単位の長鎖からなる。天然ゴムは、二重結合がシスであるポリイソプレンからなる。
【０００３】
テルペンが化学修飾されている場合（例えば、炭素骨格の酸化または転位による）、得られた化合物は一般に、テルペノイドと呼ばれ、イソプレノイドとしても公知である。イソプレノイドは、例えば電子伝達系ではキノンとして、蛋白質内輸送および蛋白質プレニル化を介した調節では膜の成分として、カロテノイド、クロロフィルをはじめとする光合成色素として、ホルモンおよびコファクターとして、ならびに様々なモノテルペン、セスキテルペン、およびジテルペンを有する植物防御化合物として、多くの重要な生物学的役割を担う。それらは、抗生物質、ホルモン、抗癌剤、殺虫剤、および化学薬品として産業的に有用である。
【０００４】
テルペンは、イソペンテニルピロリン酸（イソペンテニル二リン酸またはＩＰＰ）とその異性体であるジメチルアリルピロリン酸（ジメチルアリル二リン酸またはＤＭＡＰＰ）との縮合により生合成される。ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを生成させるための２つの経路、即ち、真核生物のメバロン酸（ＭＥＶ）経路、および原核生物の非メバロン酸またはデオキシキシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）経路が公知である。植物は、ＭＥＶ経路とＤＸＰ経路の両方を用いる。ＩＰＰとＤＭＡＰＰは、順次、プレニル二リン酸シンターゼ（例えば、それぞれＧＰＰシンターゼ、ＦＰＰシンターゼ、およびＧＧＰＰシンターゼ）の作用を介して、ポリプレニル二リン酸（例えば、ゲラニル二リン酸またはＧＰＰ、ファルネシル二リン酸またはＦＰＰ、およびゲラニルゲラニル二リン酸またはＧＧＰＰ）に縮合する。
【０００５】
ポリプレニル二リン酸中間体は、テルペンシンターゼによって、より複雑なイソプレノイド構造に変換される。テルペンシンターゼは、複数の生成物を形成する大きな遺伝子ファミリーに組織化される。テルペンシンターゼの例としては、ＦＰＰをセスキテルペンに変換するセスキテルペンシンターゼが挙げられる。セスキテルペンシンターゼの一例には、ＦＰＰをファルネセンに変換するファルネセンシンターゼがある。テルペンシンターゼの反応機構は、広範にわたって検討されており、十分に理解されている。総括すると、ＦＰＰなどの二リン酸基質をイソプレノイド生成物に変換するのに、３つのステップ：ａ）酵素基質複合体（ＥＳ）の形成、ｂ）酵素が結合した反応性カルボカチオン中間体の形成と、それに続く転位および生成物（ＥＰ）の形成、ならびにｃ）酵素生成物複合体からの生成物の遊離、が必要となる。テルペンシンターゼ触媒反応に関するインビトロ速度論的および前定常状態反応速度論的研究から、その反応の全体的律速段階が生成物の遊離であることが示された（Ｃａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３６（２７）：８３３２−９，  ａｎｄ  Ｍａｔｈｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６（２７）：８３４０−８）。テルペンシンターゼの代謝回転速度は低く、一般には０．５／秒未満と測定されている（Ｃａｎｅ，  Ｄ．  Ｃ．  （１９９０）  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  ９０：１０８９−１１０３）。
【０００６】
テルペンシンターゼは、代謝分岐点で働き、多くの場合プレニル二リン酸プールのための他の代謝酵素と拮抗するため、イソプレノイドへの代謝経路フラックスの調節において重要である。例えばＦＰＰは、スクアレン、ドリコール、およびコファクターであるヘムをはじめとする多くの細胞内分子の前駆体である。ファルネセンなどのセスキテルペンの産生が望ましい、遺伝子操作された微生物において、テルペンシンターゼは、そのようなテルペンを高収率で産生するためのカギを握る。しかしテルペンシンターゼは、緩やかな酵素であるため、多くの場合、代謝経路のボトルネックである。加えてそれらは、遺伝子操作された微生物宿主においてテルペンの効率的産生に必要となる速度論的能力を限定する基質阻害などの他の欠点を含み得る（Ｃｒｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１２８３３−１２８３８）。
【０００７】
よって、テルペンシンターゼの触媒効率を改善することで、これらの酵素がもはや全体的代謝経路フラックスをイソプレノイドに限定しなくなる潜在的に莫大な利益が存在する。製品の特異性を変えるため、および構造案内または適応進化に基づくような合理的アプローチを使用するためにテルペンシンターゼを遺伝子操作する試みが、過去に記載された（Ｇｒｅｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０３：９８２６−９８３１；  Ｏ’Ｍａｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ４：６１７−６２３；  Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４4０：１０７８−１０８２；  Ｙｏｓｈｉｋｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  １５：６０７−６１８）。しかしこれらの試験は、テルペンシンターゼの速度論的能力を改善しながら、同時に製品の特異性を維持することに及ばなかった。加えて、進化分子工学などの従来の蛋白質操作方策の適用は、第一には入手可能で効果的な高処理能力スクリーニング法がないため、テルペンシンターゼを用いなかった（上記のＹｏｓｈｉｋｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８））。こうして、テルペンシンターゼの触媒効率を改善する信頼性があり高処理能力の方法、およびそのような改善された触媒効率を有するテルペンシンターゼ変異体が、依然として求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
３．発明の概要
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞を通してテルペンシンターゼ変異体を発生させる方法に関する。詳細には本開示は、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体を発生させる方法を提供する。該方法は、これらの酵素のインビボ性能の継続的改善も可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、インビボ性能が改善されたセスキテルペンシンターゼ変異体のスクリーニング方法であって、
ａ）高レベルのＦＰＰを含まない親細胞よりも宿主細胞の生存能力を低減する高レベルのＦＰＰを含む対照セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞を遺伝子操作するステップと、
ｂ）対照セスキテルペンシンターゼ変異体である試験セスキテルペンシンターゼを、対照セスキテルペンシンターゼの代わりに細胞内で発現させるステップと、
ｃ）対照セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞に比較した、試験セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞の生存能力の上昇により、対照セスキテルペンシンターゼよりも改善されたインビボ性能を有するとして試験セスキテルペンシンターゼを同定するステップと、
を含む、スクリーニング方法を提供する。
【００１０】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、寒天プレート上に播種されて、インビボ性能が改善された試験テルペンシンターゼ変異体を含む宿主細胞が、コロニー成長により同定される。幾つかの実施形態において、該方法は、改善されたインビボ性能を有する試験セスキテルペンシンターゼを選択および／または単離する方法を更に含む。
【００１１】
幾つかの実施形態において、セスキテルペンシンターゼ変異体の回収物は、宿主細胞の回収物中で発現される。幾つかの実施形態において、セスキテルペンシンターゼ変異体の回収物は、２〜５個、５〜１０個、１０〜５０個、５０〜１００個、１００〜５００個、１００〜５００個、５００〜１，０００個、１，０００〜１０，０００個、１０，０００〜１００，０００個、１００，０００〜１，０００，０００個、およびそれを超えるセスキテルペンシンターゼ変異体を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態において、該スクリーニング方法は、反復方式で用いられ、反復法で同定された試験セスキテルペンシンターゼは、次の反復法の対照セスキテルペンシンターゼとして用いられ、反復法における宿主細胞は、非常に高レベルのＦＰＰを含むため、高レベルのＦＰＰを含まない親細胞よりも、過去の反復法で同定された試験セスキテルペンシンターゼの存在下では低い生存能力を有する。
【００１３】
別の態様において、高レベルのＦＰＰを含む宿主細胞の共通集団から得られた２つの細胞亜集団を含む組成物であって、
ａ）第一の亜集団が、対照セスキテルペンシンターゼを含み、第一の亜集団において、高レベルのＦＰＰが、高レベルのＦＰＰを含まない親細胞の生存能力よりも第一の亜集団の細胞の生存能力を低減させ、
ｂ）第二の亜集団が、対照セスキテルペンシンターゼの変異体である試験セスキテルペンシンターゼを含む、
組成物が、本明細書において提供される。
【００１４】
幾つかの実施形態において、第二の亜集団の細胞の生存能力は、第一の亜集団の細胞の生存能力よりも高い。
【００１５】
別の態様において、本発明は、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体を同定するための第二のスクリーニング方法であって、
ａ）対照テルペンシンターゼを発現し、１つの増殖速度を有する、宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）対照テルペンシンターゼの変異体である試験テルペンシンターゼを、対照テルペンシンターゼの代わりに細胞内で発現させるステップと、
ｄ）対照テルペンシンターゼを発現する宿主細胞の増殖速度に比較した、試験テルペンシンターゼを発現する宿主細胞増殖速度の低下により、対照テルペンシンターゼよりも改善されたインビボ性能を有する試験テルペンシンターゼを同定するステップと、
を含む、スクリーニング方法を提供する。
【００１６】
更に別の態様において、本発明は、テルペンシンターゼ変異体のインビボ性能を同定および／または順位付けするための拮抗方法であって、
ａ）宿主細胞の集団を、対照集団と試験集団とに分けるステップと、
ｂ）ポリプレニル二リン酸を第一のテルペンに変換し得る対照テルペンシンターゼと、ポリプレニル二リン酸を第二のテルペンに変換し得る比較テルペンシンターゼと、を対照集団内で発現させるステップと、
ｃ）試験集団および対照集団において同様のレベルで発現される該比較テルペンシンターゼと、対照テルペンシンターゼの変異体である試験テルペンシンターゼと、を試験集団内で発現させるステップと、
ｄ）試験集団および対照集団において、第一のテルペンと第二のテルペンの比を測定するステップと、
を含む、拮抗方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、該拮抗方法は、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、セステルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、およびポリテルペンシンターゼからなる群より選択されるテルペンシンターゼを同定および／または順位付けするために適用される。
【００１８】
幾つかの実施形態において、該拮抗方法は、対照テルペンシンターゼと比較して、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体が、より多くのフラックスをポリプレニル二リン酸基質からそのテルペン生成物に転ずることができ、このため該当するテルペン／比較テルペン（即ち、第一のテルペン／第二のテルペン）のより高い比が与えられる、という原理から突然変異体テルペンシンターゼのライブラリをスクリーニングするために用いられる。そのような実施形態において、対照テルペンシンターゼが対照集団内で発現されるのと同様に、試験テルペンシンターゼが試験集団内で同様のレベルで発現されることが、重要である。
【００１９】
別の実施形態において、該拮抗方法は、所望の強度のプロモータを同定するために用いられる。そのような実施形態において、対照テルペンシンターゼと試験テルペンシンターゼは、同一であり、対照集団と試験集団は、対照テルペンシンターゼの発現レベルが異なる。
【００２０】
別の態様において、宿主細胞の共通集団から得られた２つの細胞亜集団を含む組成物であって、ここで
ａ）第一の亜集団が、対照テルペンシンターゼと比較テルペンシンターゼとを含み、該対照テルペンシンターゼが、ポリプレニル二リン酸を第一のテルペンに変換し、該比較セスキテルペンシンターゼが、ポリプレニル二リン酸を第二のテルペンに変換し；
ｂ）第二の亜集団が、試験テルペンシンターゼと該比較テルペンシンターゼとを含み、該対照テルペンシンターゼが、ポリプレニル二リン酸を第一のテルペンに変換し、該試験テルペンシンターゼが、該対照テルペンシンターゼの変異体である、
組成物が、本明細書において提供される。
【００２１】
幾つかの実施形態において、第一のテルペンと第二のテルペンとの比は、第一の亜集団よりも第二の亜集団において大きい。
【００２２】
更に別の態様において、単離されたβ−ファルネセンシンターゼ変異体と、そのようなβ−ファルネセンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を含み、配列番号１１１に示されたアミノ酸配列を有するが、配列番号１１１の位置２、３、４、６、９、１１、１８、２０、２４、３５、３８、５０、６１、７２、８０、８９、１０５、１１５、１４４、１９６、２１１、２５１、２８０、２８８、３１９、３４８、３５７、３５９、３６９、３７１、３８５、３９８、４２３、４３３、４３４、４４２、４４４、４４６、４６０、４６７、４８８、４９５、５０５、５２６、５３１、５５６、５７２、および５７５からなる群より選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む単離された核酸と、が、本明細書において提供される。
【００２３】
更に別の態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１１１によりコードされたβ−ファルネセンシンターゼ変異体である異種β−ファルネセンシンターゼと、
（ｂ）ＭＥＶ経路またはＤＸＰ経路酵素と、
を含む、遺伝子修飾された宿主細胞であって、
ＭＥＶ経路またはＤＸＰ経路酵素および配列番号１１１によりコードされたβ−ファルネセンシンターゼを含む親細胞よりも、少なくとも１５％多いβ−ファルネセンを生成する、遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。
【００２４】
更に別の態様において、
（ａ）ｉ）配列番号１１１によりコードされたβ−ファルネセンシンターゼの変異体をコードする第一の異種ヌクレオチド配列と、
ii）ＭＥＶ経路またはＤＸＰ経路酵素をコードする第二の異種ヌクレオチド配列と、
を含む、複数の遺伝子修飾された宿主細胞を得るステップと、
（ｂ）β−ファルネセンを生成するのに適した条件下で、炭素供給源を含む培地中で前記遺伝子修飾された宿主細胞を培養するステップと、
（ｃ）該培地からβ−ファルネセンを回収するステップと、
を含む、β−ファルネセンを産生する方法が、本明細書において提供される。
【００２５】
４．図の簡単な説明
本開示は、好ましい実施形態を例示する添付の図と併せて読むことで、最良に理解される。しかし、本開示が図に開示された特定の実施形態に限定されないことは、理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】本発明の宿主細胞の生成に用いられる複数の染色体組み込み構築物のマップを示す。
【図１Ｂ】本発明の宿主細胞の生成に用いられる複数の染色体組み込み構築物のマップを示す。
【図１Ｃ】本発明の宿主細胞の生成に用いられる複数の染色体組み込み構築物のマップを示す。
【図１Ｄ】本発明の宿主細胞の生成に用いられる複数の染色体組み込み構築物のマップを示す。
【図１Ｅ】本発明の宿主細胞の生成に用いられる複数の染色体組み込み構築物のマップを示す。
【図１Ｆ】本発明の宿主細胞の生成に用いられる複数の染色体組み込み構築物のマップを示す。
【図１Ｇ】本発明の宿主細胞の生成に用いられる複数の染色体組み込み構築物のマップを示す。
【図１Ａ−Ｚ】本発明の宿主細胞の生成に用いられる複数の染色体組み込み構築物のマップを示す。
【図２】ＦＰＰ枯渇に基づく選択のために、活性および不活性セスキテルペンシンターゼを含む大腸菌宿主細胞を播種された複数の寒天プレートの像を示す。
【図３】ＦＰＰ毒性に基づく増殖選択のために、活性および不活性セスキテルペンシンターゼを含む大腸菌宿主細胞を播種された２つの寒天プレートの像を示す。
【図４】様々なファルネセンシンターゼコード配列を含む大腸菌宿主細胞のＧＣ分析により得られたファルネセン力価を示す。
【図５】ＦＰＰ毒性に基づく増殖選択のために、活性および不活性セスキテルペンシンターゼを含むサッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞を播種された寒天プレートの像を示す。
【図６】染色体に組込まれた、または染色体外に保持されたファルネセンシンターゼコード配列を含むサッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞のナイルレッド蛍光分析により得られたファルネセン力価を示す。
【図７】セスキテルペンシンターゼの拮抗により順位付けられたサッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞のＧＣ分析により得られたファルネセン力価を示す。
【図８】ファルネセンシンターゼコード配列のコピー数を増加させることを含む、サッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞のＧＣ分析により得られたファルネセン／トリコジエン力価比を示す。
【図９】セスキテルペンシンターゼライブラリの大腸菌宿主細胞の、ＧＣとナイルレッド蛍光分析との、得られたファルネセン力価の比較を示す。
【図１０】ナイルレッド蛍光分析によりスクリーニングされたＦＳ変異体のライブラリから同定された大腸菌宿主菌株のＧＣ分析により得られたファルネセン力価を示す。
【図１１Ａ】ＦＰＰ毒性に基づく増殖選択によりスクリーニングされたＦＳ変異体のライブラリから同定されたサッカロマイセス・セレビシエ宿主菌株の、ナイルレッド蛍光分析（Ａ）およびＧＣ分析（Ｂ）により得られたファルネセン力価を示す。
【図１１Ｂ】ＦＰＰ毒性に基づく増殖選択によりスクリーニングされたＦＳ変異体のライブラリから同定されたサッカロマイセス・セレビシエ宿主菌株の、ナイルレッド蛍光分析（Ａ）およびＧＣ分析（Ｂ）により得られたファルネセン力価を示す。
【図１２】ＦＰＰ毒性に基づく増殖選択によるＦＳ変異体のライブラリから同定されたサッカロマイセス・セレビシエ宿主菌株のナイルレッド蛍光分析により得られたファルネセン力価を示す。
【図１３Ａ】本発明の宿主細胞の生成において用いられた様々な発現プラスミドのマップを示す。
【図１３Ｂ】本発明の宿主細胞の生成において用いられた様々な発現プラスミドのマップを示す。
【図１４】ＦＳ変異体コード配列の単一染色体に組込まれたコピーを含むサッカロマイセス・セレビシエ宿主菌株のＧＣ分析により得られたファルネセン力価を示す。
【図１５】ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの産生のためのＭＥＶ経路の概略図を示す。
【図１６】ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの産生のためのＤＸＰ経路の概略図を示す。
【図１７】アモルファジエンシンターゼ変異体のためのコード配列を含むサッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞のＧＣ分析により得られたアモルファジエン／トリコジエン力価比を示す。
【図１８】リモネンシンターゼ変異体のためのコード配列を含むサッカロマイセス・セレビシエ宿主細胞のＧＣ分析により得られたリモネン／ミルセン力価比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
５．実施形態の詳細な説明
５．１  定義
本明細書で用いられる以下の用語は、下に示された意義を有する。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「テルペンシンターゼ変異体」は、選択されたテルペンシンターゼよりも、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有するテルペンシンターゼを指す。例えば選択されたテルペンシンターゼの野生型配列よりも、テルペンシンターゼ変異体は、対応するアミノ酸配列への変化を引き起こし得る、または引き起こし得ないヌクレオチドの付加、欠失、および／または置換を含み得る。ヌクレオチドの変化がアミノ酸配列への変化をもたらさない幾つかの実施形態において、該変化は、それでもなお、例えばコドン最適化を通して、シンターゼ活性の改善を実行し得る。別の一実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、アミノ酸付加、欠失、および／または置換を含む。したがって本明細書で用いられる用語「セスキテルペンシンターゼ変異体」は、選択されたセスキテルペンシンターゼよりも、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸配列を有するセスキテルペンシンターゼを指す。例えば選択されたセスキテルペンシンターゼよりも、セスキテルペンシンターゼ変異体は、対応するアミノ酸配列への変化を引き起こし得る、または引き起こし得ないヌクレオチドの付加、欠失、および／または置換を含み得る。別の実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、アミノ酸付加、欠失、および／または置換を含む。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「遺伝子操作された宿主細胞」は、遺伝子操作技術（即ち、組換え技術）を用いて親細胞を遺伝子修飾することにより生成された宿主細胞を指す。遺伝子操作された宿主細胞は、親細胞のゲノムへのヌクレオチド配列の付加、欠失、および／または修飾を含み得る。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「異種」は、本質的には通常見出されないものを指す。用語「異種ヌクレオチド配列」は、所与の細胞において本質的には通常見出されないヌクレオチド配列を指す。そのため異種ヌクレオチド配列は、（ａ）宿主細胞にとって外来性であってもよい（即ち、該細胞にとって「外因性」である）；（ｂ）天然では宿主細胞内に見出される（即ち、「内因性」である）が、細胞内で非天然量で存在してもよい、または（ｃ）天然では宿主細胞内に見出されるが、天然の遺伝子座以外の位置に存在してもよい。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「天然由来」は、天然に見出されるものを指す。例えば天然の供給源から単離され得る生物体内に存在し、検査室内でヒトにより故意に修飾されていないテルペンシンターゼは、天然由来のテルペンシンターゼである。逆に、本明細書で用いられる用語「天然由来でない」は、天然には見出されず、ヒトの介入により生成されるものを指す。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「生合成された酵素」は、生合成経路内で機能して天然由来分子の生成を誘導する酵素を指す。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「インビボ性能」は、宿主細胞内で発現された場合の、ポリプレニル二リン酸基質をテルペンに変換するテルペンシンターゼの能力を指す。したがって用語「インビボ性能が改善された」は、宿主細胞内で発現された場合の、ポリプレニル二リン酸基質をテルペンに変換するテルペンシンターゼの能力の上昇を指す。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「親細胞」は、高レベルの細胞内ＦＰＰを含まない、または特別な異種ヌクレオチドを含まないこと以外では本明細書に開示された宿主細胞としての同一遺伝子的背景を有し、前記高レベルの細胞内ＦＰＰまたは前記異種ヌクレオチド配列を導入して本明細書に開示された宿主細胞を生成させる出発点として作用する細胞を指す。
【００３５】
５．概論
本開示は、遺伝子操作された宿主細胞を通してテルペンシンターゼ変異体を発生させる方法に関する。詳細には本開示は、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体を発生させる方法を提供する。該方法は、これらの酵素のインビボ性能の継続的改善も可能にする。
【００３６】
一態様において、本発明は、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体のスクリーニング方法を提供する。幾つかの実施形態において、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体は、遺伝子操作された宿主細胞の細胞死をレスキューする能力により同定される。遺伝子操作された宿主細胞は、高レベルの細胞内ＦＰＰを誘導する遺伝子修飾を含む。ＦＰＰは、細胞に対して高度に毒性があり、そのため細胞の生存能力を低減して（Ｗｉｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７３：６２７７−６２８３）、高レベルの細胞内ＦＰＰを含まない親細胞に匹敵する生存能力を実現するため、遺伝子操作された宿主細胞は、細胞内ＦＰＰレベルを低減するのに十分活性のあるセスキテルペンシンターゼを必要とする。
【００３７】
このため本明細書に提供されるスクリーニング方法は、
ａ）高レベルのＦＰＰを含まない親細胞よりも宿主細胞の生存能力を低減する高レベルのＦＰＰを含む対照セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞を遺伝子操作するステップと、
ｂ）対照セスキテルペンシンターゼの変異体である試験セスキテルペンシンターゼを、対照セスキテルペンシンターゼの代わりに細胞内で発現させるステップと、
ｃ）対照セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞に比較した、試験セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞の生存能力の上昇により、対照セスキテルペンシンターゼよりも改善されたインビボ性能を有するとして試験セスキテルペンシンターゼを同定するステップと、
を含む。
【００３８】
幾つかの実施形態において、該方法は、改善されたインビボ性能を有する試験セスキテルペンシンターゼを選択および／または単離する方法を更に含む。
【００３９】
それは、宿主細胞中の高レベルのＦＰＰが誘導性である場合に、最も簡便となる。誘導は、誘導剤または例えば温度などの特定の増殖条件に応答して起こり得る。宿主細胞内での高レベルのＦＦＰは、親細胞のＦＰＰレベルよりも高い、約１０％〜少なくとも約１，０００倍またはそれを超える範囲内であってもよい。
【００４０】
親細胞よりも対照セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞の生存能力の低減は、低い細胞増殖から致死までの範囲内となり得る。こうして幾つかの実施形態において、対照セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞は、親細胞よりも、液体培地中または寒天プレート上に少数の子孫細胞を産生する。別の実施形態において、対照セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞は、親細胞よりも、液体培地中または寒天プレート上に子孫細胞を全く産生しない。したがって対照セスキテルペンシンターゼの代わりに試験セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞の生存能力の上昇が、対照セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞により産生される子孫細胞数またはコロニーサイズよりも、液体培地中で子孫細胞がより多数であることにより、または寒天プレート上でコロニーサイズがより大きいことにより、明らかとなり得る。
【００４１】
宿主細胞内の高レベルのＦＰＰは、宿主細胞内のＦＰＰまたはその前駆体の産生に関与する酵素の発現および／または活性を改変することにより果たされ得る。幾つかのそのような実施形態において、ＭＥＶまたはＤＸＰ経路の酵素の発現および／または活性が改変される。幾つかのそのような実施形態において、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼおよび／またはメバロン酸キナーゼの発現および／または活性が改変される。あるいは宿主細胞内の高レベルのＦＰＰは、宿主細胞内のＦＰＰまたはその前駆体の利用に関与する酵素の発現および／または活性を改変することにより果たされ得る。幾つかのそのような実施形態において、スクアレンシンターゼの発現および／または活性が改変される。
【００４２】
対照セスキテルペンシンターゼは、天然由来のセスキテルペンシンターゼまたは天然由来でないセスキテルペンシンターゼであってもよい。試験セスキテルペンシンターゼは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または付加を含むことにより、対照セスキテルペンシンターゼと異なっていてもよい。加えて、またはあるいは、試験セスキテルペンシンターゼは、対照セスキテルペンシンターゼと同一のアミノ酸を含んでいてもよいが、これらのアミノ酸をコードするコドンは、試験セスキテルペンシンターゼと対照セスキテルペンシンターゼとで異なっていてもよい。幾つかのそのような実施形態において、該コドンは、宿主細胞内での使用のために最適化される。
【００４３】
幾つかの実施形態において、対照セスキテルペンシンターゼは、β−ファルネセンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、トリコジエンシンターゼ、パチュロールシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、バレンセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、およびノートカトンシンターゼからなる群より選択される。幾つかのそのような実施形態において、対照セスキテルペンシンターゼは、アルテミシア・アンヌアのβ−ファルネセンシンターゼである。幾つかのそのような実施形態において、対照セスキテルペンシンターゼは、配列番号１１１に示されたアミノ酸配列を有する。
【００４４】
試験セスキテルペンシンターゼの存在下での宿主細胞の生存能力を、対照セスキテルペンシンターゼの存在下での宿主細胞と比較することができるためには、宿主細胞内の対照セスキテルペンシンターゼと試験セスキテルペンシンターゼとを、確実に同様のレベルにする必要がある。これは、同じ調節要素の制御下で、２つの宿主細胞内のセスキテルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を配置することにより、完遂され得る。
【００４５】
改善されたセスキテルペンシンターゼを変異体よりもむしろ増殖を促進する突然変異を含む急速増殖の偽陽性宿主細胞が宿主細胞培養物を支配するような拮抗増殖の状況を予防するために、スクリーニング方法の一実施形態は、寒天プレートに基づく選択システムを含む。この実施形態において、宿主細胞は、寒天プレート上に播種され、インビボ性能が改善された試験セスキテルペンシンターゼ変異体を含む宿主細胞が、コロニー発育により同定される。
【００４６】
本明細書に開示されたスクリーニング方法の１つの重要な利点は、反復で同定された試験セスキテルペンシンターゼが次の反復の対照セスキテルペンシンターゼとして用いられるような反復方式で、セスキテルペンシンターゼが益々良好になるよう選択する継続的能力である。つまりこの方法は、特別なセスキテルペンシンテターゼが生合成経路において活性となり得るかのみを同定することを目的とし、対照、例えば親シンターゼを超えて改善された活性を有するシンターゼの同定を模索しないことで、当該技術分野で公知の他のアッセイと識別することができる。幾つかの実施形態において、宿主細胞内のＦＰＰレベルは、各反復の際にチェックされ、場合により、宿主細胞が新しい対照セスキテルペンシンターゼ（即ち、過去の反復の試験セスキテルペンシンターゼ）を発現すれば生存能力を低下させるレベルまで上昇される（例えば、酵素の発現レベルを上昇もしくは低下させることにより、酵素の付加もしくは低減により、遺伝子のコピー数の増加もしくは減少により、酵素の発現を制御するプロモータを置換することにより、または遺伝子突然変異により酵素を変化させることにより）。あるいは、または追加として、各反復では対照セスキテルペンシンターゼの発現を低減して（例えば、より弱いプロモータの発現を減少させることにより、もしくはより弱いプロモータを用いることにより、または対照セスキテルペンシンターゼの転写もしくはポリペプチドの安定性を低下させることにより）、活性の低い対照セスキテルペンシンターゼを提供することができる。その後、次の反復の際に、過去の反復の試験セスキテルペンシンターゼよりもインビボ性能が上昇した試験テルペンシンターゼが、同定され得る。
【００４７】
本明細書に開示されたスクリーニング方法の別の重要な利点は、その簡便性および高処理能力で履行する能力である。遺伝子操作された宿主細胞の細胞内ＦＰＰレベルを非毒性レベルまで低下させ得るセスキテルペンシンターゼ変異体は、単に細胞の生存能力に基づいて同定されて、高価で時間のかかる他のスクリーニング方法は事実上不要になる。つまり一実施形態において、該方法は、インビボ性能が改善されたセスキテルペンシンターゼ変異体に関して、セスキテルペンシンターゼ変異体の回収物（例えば、突然変異体セスキテルペンシンターゼのライブラリ）をスクリーニングするために用いられる。そのような実施形態において、１つの宿主細胞内で発現される試験セスキテルペンシンターゼは１つでなく、試験セスキテルペンシンターゼの回収物が、宿主細胞の回収物内で発現される。その後、宿主細胞を寒天プレート上で増殖することができ、インビボ性能が改善されたセスキテルペンシンターゼ変異体を発現する宿主細胞を、コロニー発育に基づいて同定することができる。幾つかの実施形態において、セスキテルペンシンターゼ変異体の回収物は、２〜５個、５〜１０個、１０〜５０個、５０〜１００個、１００〜５００個、１００〜５００個、５００〜１，０００個、１，０００〜１０，０００個、１０，０００〜１００，０００個、１００，０００〜１，０００，０００個、およびそれを超えるセスキテルペンシンターゼ変異体を含む。
【００４８】
本明細書に開示されたスクリーニング方法の別の重要な利点は、改善されたセスキテルペンシンターゼの選択が、インビトロよりもむしろインビボで行われることである。その結果、セスキテルペンシンターゼ変異体のインビボ性能を上昇させる複数の酵素特性の改善を、得ることができる。
【００４９】
別の態様において、本発明は、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体を同定するための第二のスクリーニング方法を提供する。この第二のスクリーニング方法において、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体は、ポリプレニル二リン酸（例えば、ＦＰＰ）の宿主細胞を枯渇させる能力により同定される。活性の高いテルペンシンターゼ変異体の存在下で、宿主細胞内のポリプレニル二リン酸基質の細胞内プールが消耗されて、細胞が細胞生存に必要な基本的細胞プロセスを保持することができなくなる。
【００５０】
こうして本明細書に提供された第二のスクリーニング方法は、
ａ）対照テルペンシンターゼを発現し、１つの増殖速度を有する、宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）対照テルペンシンターゼの変異体である試験テルペンシンターゼを、対照テルペンシンターゼの代わりに細胞内で発現させるステップと、
ｃ）対照テルペンシンターゼを発現する宿主細胞に比較した、試験テルペンシンターゼを発現する宿主細胞増殖速度の低下により、対照テルペンシンターゼよりも改善されたインビボ性能を有する試験テルペンシンターゼを同定するステップと、
を含む。
【００５１】
対照テルペンシンターゼは、モノテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セステルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、またはポリテルペンシンターゼであってもよい。幾つかの実施形態において、対照テルペンシンターゼは、セスキテルペンシンターゼである。幾つかのそのような実施形態において、対照テルペンシンターゼは、β−ファルネセンシンターゼである。幾つかのそのような実施形態において、対照テルペンシンターゼは、アルテミシア・アンヌアのβ−ファルネセンシンターゼである。幾つかのそのような実施形態において、対照テルペンシンターゼは、配列番号１１１に示されたアミノ酸配列を有する。
【００５２】
試験テルペンシンターゼの存在下、宿主細胞内で消耗されるようになるポリプレニル二リン酸基質は、ＦＰＰであってもよい。セスキテルペンシンターゼとは別に、複数の他の化合物が、宿主細胞の生存能力および増殖に肝要なＦＰＰから合成される。そのような化合物としては、限定するものではないが、スクアレン、ラノステロール、エルゴステロール、シクロアルテノール、コレステロール、ステロイドホルモン、およびビタミンＤが挙げられる。つまり幾つかの実施形態において、試験セスキテルペンシンターゼを発現する宿主細胞は、細胞膜内に少量のコレステロールまたはエルゴステロールを含み得る。細胞内のコレステロールまたはエルゴステロールの定量方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｃｒｏｃｋｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈａｚｅｌ  （２００５）  Ｊ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｚｏｏｌｏｇｙ，  ２７１（３）：  １９０−１９５；  Ａｒｔｈｉｎｇｔｏｎ−Ｓｋａｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３７（１０）：  ３３３２−３３３７；  Ｓｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７９）  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６９：  １２０２−１２０３）。幾つかの実施形態において、試験テルペンシンターゼの存在下で宿主細胞内で保持され得ない細胞の生存に必要となる基本的細胞プロセスは、細胞膜の産生および／または保持である。別の実施形態において、試験テルペンシンターゼの存在下、宿主細胞内で消耗されるようになるポリプレニル二リン酸基質は、ＧＰＰまたはＧＧＰＰである。
【００５３】
更に別の態様において、本発明は、テルペンシンターゼ変異体のインビボ性能を同定および／または順位付けするための拮抗方法を提供する。該拮抗方法は、公知テルペンシンターゼを、テルペンシンターゼ変異体を比較する比較酵素として用いる。比較テルペンシンターゼおよび各テルペンシンターゼ変異体の両方が、宿主細胞内で同時発現され、その後、同じポリプレニル二リン酸基質（例えば、ＧＰＰ、ＦＰＰ、またはＧＧＰＰ）に関して拮抗して、対応するテルペンを産生する。比較酵素の性能は、宿主細胞内では一定に保持されるため、比較テルペンシンターゼとテルペンシンターゼ変異体により産生されるテルペン生成物の力価の比の任意の変化が、テルペンシンターゼ変異体の活性の直接的結果である。結論として、そのような比を用いて、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体を同定することができ、および／またはポリプレニル二リン酸基質をテルペン産生に転換するインビボ速度論的能力についてテルペンシンターゼ変異体をランク付けもしくは定量的に比較することができる。
【００５４】
本明細書に提供された拮抗方法は、こうして
ａ）宿主細胞の集団を、対照集団と試験集団とに分けるステップと、
ｂ）ポリプレニル二リン酸を第一のテルペンに変換し得る対照テルペンシンターゼと、ポリプレニル二リン酸を第二のテルペンに変換し得る比較テルペンシンターゼと、を対照集団内で発現させるステップと、
ｃ）試験集団および対照集団において同様のレベルで発現される比較テルペンシンターゼと、対照テルペンシンターゼの変異体である試験テルペンシンターゼと、を試験集団内で発現させるステップと、
ｄ）試験集団および対照集団において、第一のテルペンと第二のテルペンとの比を測定するステップと、
を含む。
【００５５】
特に本明細書に開示された拮抗方法は、広範のテルペンシンターゼに適用することができる。つまり別個の実施形態において、該拮抗方法は、モノテルペンシンターゼ、ジテルペンシンターゼ、セスキテルペンシンターゼ、セステルペンシンターゼ、トリテルペンシンターゼ、テトラテルペンシンターゼ、およびポリテルペンシンターゼからなる群より選択されるテルペンシンターゼを同定および／または順位付けするために適用される。したがって別個の実施形態において、第一のテルペンおよび第二のテルペンは、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、セステルペン、トリテルペン、テトラテルペン、またはポリテルペンからなる群より選択される。幾つかのそのような実施形態において、第一のテルペンおよび第二のテルペンは、β−ファルネセン、α−ファルネセン、トリコジエン、パチュロール、アモルファジエン、バレンセン、ファルネソール、ネロリドール、リモネン、ミルセン、およびノートカトンからなる群より選択される。
【００５６】
対照テルペンシンターゼは、天然由来のテルペンシンターゼまたは天然由来でないシンターゼであってもよい。試験テルペンシンターゼは、対照テルペンシンターゼよりもアミノ酸置換、欠失、もしくは付加を含んでいてもよく、または対照テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列と、試験テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列の中に、異なるコドンによりコードされる同一アミノ酸を含んでいてもよい。幾つかの実施形態において、対照テルペンシンターゼは、セスキテルペンシンターゼである。幾つかのそのような実施形態において、セスキテルペンシンターゼは、β−ファルネセンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、トリコジエンシンターゼ、パチュロールシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、バレンセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、およびノートカトンシンターゼからなる群より選択される。幾つかのそのような実施形態において、対照セスキテルペンシンターゼは、アルテミシア・アンヌアのβ−ファルネセンシンターゼである。幾つかのそのような実施形態において、対照セスキテルペンシンターゼは、配列番号１１１に示されたアミノ酸配列を有する。
【００５７】
対照集団および試験集団の第一テルペン／第二のテルペンの比を比較することができるためには、類似発現レベルの比較テルペンシンターゼを確保することが必要となる。これは、同じ調節要素の制御下で２つの宿主細胞集団内の比較テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を配置することにより、完遂され得る。拮抗方法を用いてテルペンシンターゼ変異体を同定する実施形態において、２つの細胞集団内の対照セスキテルペンシンターゼおよび試験テルペンシンターゼの発現レベルも、類似していなければならない。拮抗方法を用いて、例えば所望の発現レベルを提供する調節要素（例えば、プロモータ）を同定する、別の実施形態において、試験テルペンシンターゼは、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列ではなく発現レベルが、対照テルペンシンターゼと異なる。そのような実施形態において、異なる調節要素が、対照テルペンシンターゼおよび試験テルペンシンターゼの発現に用いられる。
【００５８】
本明細書に開示された拮抗方法には、数多くの用途が存在する。幾つかの実施形態において、該方法は、対照テルペンシンターゼと比較して、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体が、より多くのフラックスをポリプレニル二リン酸基質からそのテルペン生成物に転ずることができ、このため該当するテルペン／比較テルペン（即ち、第一のテルペン／第二のテルペン）のより高い比が与えられる、という原理からインビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体を（例えば、突然変異体セスキテルペンシンターゼのライブラリから）スクリーニングするために用いられる。そのような実施形態において、対照テルペンシンターゼは対照集団において発現される時に、試験テルペンシンターゼが試験集団内で同様のレベルで発現されることが、重要である。
【００５９】
類似のアッセイを用いて、一連のプロモータの強度を順位付けすることができる（例えば、そのようなアッセイを利用して、本明細書に開示された第一のスクリーニング方法において対照セスキテルペンシンターゼを発現する際の使用に適したプロモータを同定した、実施例１６を参照されたい）。そのような実施形態において、対照テルペンシンターゼと試験テルペンシンターゼは、実際に同一であるが、それらは異なるプロモータの調節的制御下にあるため、対照集団と試験集団は、それらが含む試験テルペンシンターゼのタイプは異ならず、試験テルペンシンターゼの発現レベルが異なる。そのような実施形態において、試験集団および対照集団において第一のテルペンと第二のテルペンとの比を比較すると、試験テルペンシンターゼの活性についてではなく、試験テルペンシンターゼの発現を誘導するプロモータの強度についての情報を提供する。
【００６０】
加えてこのシステムを用いれば、様々な細胞を定義された比で組み合わせた混合物が、商業的に有用な生成物の所望の特性を有するように、様々な細胞により生成された２種以上のテルペン生成物の比を調整することができる。
【００６１】
本明細書に開示された拮抗方法の重要な利点は、それが酵素発現および活性において細胞間変動を排除すること、それがロバストであること、ならびにポリプレニル二リン酸基質への全体的代謝経路フラックスが宿主細胞内で限定的である場合でもそれを用い得ること、である。後者の事柄は、テルペン力価がポリプレニル二リン酸基質への全体的代謝経路フラックスにより規制される場合に、絶対テルペン力価測定に基づくアッセイが酵素活性の改善を遮る場合があるため、重要である。
【００６２】
本明細書に開示されたスクリーニング方法および／または拮抗方法を用いて開発された酵素は、限定するものではないが、蛍光スクリーニングおよび／またはガスクロマトグラフィーによるテルペンの直接的定量をはじめとする選択的スクリーニングという追加の手段を受ける可能性がある。より具体的にはこれには、ファルネセンなどのセスキテルペンの生成を測定する、ナイルレッドに基づく高処理能力の蛍光アッセイ、およびファルネセンなどのセスキテルペンの力価を測定する、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）に基づく直接的定量法がある。改善された酵素は、誘発突然変異などの遺伝子操作法により更に改善することもできる。その結果、最終的な酵素性能を向上させる複数の酵素特性の改善が、有効に完遂され、最も効果的な酵素変異体が、同定される。
【００６３】
本開示は、優れたファルネセンシンターゼ変異体、およびそのようなファルネセンシンターゼ変異体を含む宿主細胞にも属する。ファルネセンシンターゼ変異体は、本明細書に開示された方法を用いて開発され、２００％を超えるインビボ性能改善を示す。ファルネセンシンターゼ変異体は、改善された触媒効率を有し、即ちそれらは、より急速に反応を触媒することができる。そのためそれらは、高収率の製造が主たる重要事項となる、ファルネセンなどのセスキテルペン生成物の商業的製造にはより適切である。
【００６４】
つまり更に別の態様において、単離されたβ−ファルネセンシンターゼ変異体、およびそのようなβ−ファルネセンシンターゼ変異体をコードし、配列番号１１１に示されたアミノ酸配列を有するが、位置２、３、４、６、９、１１、１８、２０、２４、３５、３８、５０、６１、７２、８０、８９、１０５、１１５、１４４、１９６、２１１、２５１、２８０、２８８、３１９、３４８、３５７、３５９、３６９、３７１、３８５、３９８、４２３、４３３、４３４、４４２、４４４、４４６、４６０、４６７、４８８、４９５、５０５、５２６、５３１、５５６、５７２、および５７５からなる群より選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む、ヌクレオチド配列を含む単離された核酸が、本明細書において提供される。
【００６５】
更に別の態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１１１によりコードされたβ−ファルネセンシンターゼ変異体である異種β−ファルネセンシンターゼと、
（ｂ）ＭＥＶ経路またはＤＸＰ経路酵素と、
を含む、遺伝子修飾された宿主細胞であって、
ＭＥＶ経路またはＤＸＰ経路酵素および配列番号１１１によりコードされたβ−ファルネセンシンターゼを含む親細胞よりも、少なくとも１５％多くのβ−ファルネセンを生成する、遺伝子修飾された宿主細胞を提供する。
【００６６】
幾つかの実施形態において、異種β−ファルネセンシンターゼは、配列番号１１１の位置２、３、４、６、９、１１、１８、２０、２４、３５、３８、５０、６１、７２、８０、８９、１０５、１１５、１４４、１９６、２１１、２５１、２８０、２８８、３１９、３４８、３５７、３５９、３６９、３７１、３８５、３９８、４２３、４３３、４３４、４４２、４４４、４４６、４６０、４６７、４８８、４９５、５０５、５２６、５３１、５５６、５７２、および５７５からなる群より選択される位置に１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００６７】
幾つかの実施形態において、ＭＥＶ経路酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼである。幾つかの実施形態において、ＭＥＶ経路酵素は、メバロン酸キナーゼである。ＭＥＶ経路の追加の例示的酵素を、以下の５．４節に示す。
【００６８】
更に別の態様において、
（ａ）ｉ）配列番号１１１によりコードされたβ−ファルネセンシンターゼの変異体をコードする第一の異種ヌクレオチド配列と、
ii）ＭＥＶ経路またはＤＸＰ経路酵素をコードする第二の異種ヌクレオチド配列と、
を含む、複数の遺伝子修飾された宿主細胞を得るステップと、
（ｂ）β−ファルネセンを生成するのに適した条件下で、炭素供給源を含む培地中で前記遺伝子修飾された宿主細胞を培養するステップと、
（ｃ）該培地からβ−ファルネセンを回収するステップと、
を含む、β−ファルネセンを産生する方法が、本明細書において提供される。
【００６９】
幾つかの実施形態において、ＭＥＶ経路酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼである。幾つかの実施形態において、ＭＥＶ経路酵素は、メバロン酸キナーゼである。ＭＥＶ経路の追加の例示的酵素を、以下の５．４節に示す。
【００７０】
５．３  宿主細胞の選択
本発明の実践に有用な宿主細胞としては、古細菌細胞、原核細胞、または真核細胞が挙げられる。
【００７１】
適切な原核生物の宿主としては、限定するものではないが、様々なグラム陽性菌、グラム陰性菌、またはグラム不定菌のいずれかが挙げられる。例としては、限定するものではないが、アグロバクテリウム属、アリシクロバチルス属、アナバエナ属、アナシスチス属、アースロバクター属、アゾバクター属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、クロマチウム属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロバクター族、エルウイニア属、エシェリヒア属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、メソリゾビウム属、メチロバクテリウム属、ミクロバクテリウむ属、ホルミジウム属、シュードモナス属、ロドバクター属、ロドシュードモナス属、ロドスピリルム属、ロドコッカス属、サルモネラ属、セネデスムス属、セラチア属、シゲラ属、スタフィロコッカス属、ストレプトマイセス属、シネココッカス属、およびザイモモナス属に属する細胞が挙げられる。原核生物菌株の例としては、限定するものではないが、バチルス・サチリス、バチルス・アミロリクファシエンス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム、クロストリジウム・ベイジェリンキイ、エンテロバクター・サカザキイ、大腸菌、ラクトコッカス・ラクチス、メソリゾビウム・ロティ、シュードモナス・エルジノーサ、シュードモナス・メバロニイ、シュードモナス・プディカ、ロドバクター・カプスラタス、ロドバクター・スフェロイデス、ロドスピリルム・ルブラム、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・ティフィムリウム、シゲラ・ディセンテリエ、シゲラ・フレクスネリ、シゲラ・ソンネイ、およびスタフィロコッカス・アウレウスが挙げられる。
【００７２】
適切な古細菌宿主としては、限定するものではないが、アエロピルム属、アルカエグロブス属、ハロバクテリウム属、メタノコッカス属、メタノバクテリウム属、ピロコッカス属、スルフォロブス属、およびテルモプラズマ属に属する細胞が挙げられる。古細菌株の例としては、限定するものではないが、アーケオグロブス・フルギダス、ハロバクテリウム属の一種、メタノコッカス・ジャナスキイ、メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム、テルモプラズマ・アシドフィルム、テルモプラズマ・ボルカニウム、ピロコッカス・ホリコシイ、ピロコッカス・アビシイ、およびアエロピルム・ペルニックスが挙げられる。
【００７３】
適切な真核生物宿主としては、限定するものではないが、真菌細胞、緑藻細胞、昆虫細胞、および植物細胞が挙げられる。例としては、限定するものではないが、アスペルギルス属、カンジダ属、クリソスポリウム属、クリプトコッカス属、フザリウム属、クルイセロマイセス属、ネオティフォジウム属、ネウロスポラ属、ペニシリン属、ピチア属、サッカロマイセス属、トリコデルマ属、アスコマイコータ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）属、バシディオマイコータ（Ｂａｃｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）属、ドシデオマイセテス（Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ）属、およびキサントフィロマイセス属（正式にはファフィア属）に属する細胞が挙げられる。ピチア・パストリス、ピチア・フィンランディカ、ピチア・トレハロフィラ、ピチア・コクラメ、ピチア・メンブラナエファシエンス、ピチア・オプンチアエ、ピチア・サーモトレランス、ピチア・サリクタリア、ピチア・グエルキューム、ピチア・ピペリ、ピチア・スティプティス、ピチア・メタノリカ、ピチア属の一種、サッカロマイセス・セレビシアエ、サッカロマイセス属の一種、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ハンセヌラ・ポリモルファ、クルイベロマイセス属の一種、クルイベロマイセス・ラクチス、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス・ニドゥランス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリザエ、トリコデルマ・リーゼイ、クリソスポリウム・ラクノウェンス、フザリウム属の一種、フザリウム・グラミネウム、フザリウム・ベネナツム、ニューロスポラ・クラッサ、およびクラミドモナス・レインハルドティイが挙げられる。
【００７４】
特別な実施形態において、宿主細胞は、大腸菌細胞である。別の特別な実施形態において、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ細胞である。幾つかの実施形態において、宿主細胞は、パン酵母、ＣＢＳ  ７９５９、ＣＢＳ  ７９６０、ＣＢＳ  ７９６１、ＣＢＳ  ７９６２、ＣＢＳ  ７９６３、ＣＢＳ  ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、およびＡＬ−１からなる群より選択されるサッカロマイセス・セレビシエ細胞である。幾つかの実施形態において、宿主細胞は、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１、およびＳＡ−１からなる群より選択されるサッカロマイセス・セレビシエ細胞である。特別な実施形態において、宿主細胞は、菌株ＰＥ−２のサッカロマイセス・セレビシエである。別の特別な実施形態において、宿主細胞は、菌株ＣＡＴ−１のサッカロマイセス・セレビシエである。別の特別な実施形態において、宿主細胞は、菌株ＢＧ−1のサッカロマイセス・セレビシエである。
【００７５】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、産業発酵、例えばバイオエタノール発酵に適した細胞である。特別な実施形態において、宿主細胞は、産業発酵環境の認識されたストレス条件である、高い溶媒濃度、高温、膨張した基質の使用、栄養不足、浸透圧ストレス、酸性、亜硫酸および細菌混入、またはそれらの組み合わせの下で生存するように調整される。
【００７６】
５．４  細胞内ＦＰＰレベルが上昇した宿主細胞
幾つかの実施形態において、親細胞と比較して宿主細胞は、宿主細胞の生存能力を低下させる、高レベルの細胞内ＦＰＰを含む。
【００７７】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、単位細胞培養容量あたりに、親細胞の細胞内ＦＰＰレベルよりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％高い、または少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、またはそれを超える高さの細胞内ＦＰＰレベルを含む。
【００７８】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、単位乾燥細胞重量あたりに、親細胞の細胞内ＦＰＰレベルよりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％高い、または少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、またはそれを超える高さの細胞内ＦＰＰレベルを含む。
【００７９】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、単位時間の単位細胞培養容量あたりに、親細胞の細胞内ＦＰＰレベルよりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％高い、または少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、またはそれを超える高さの細胞内ＦＰＰレベルを含む。
【００８０】
幾つかの実施形態において、宿主細胞は、単位時間の単位乾燥細胞重量あたりに、親細胞の細胞内ＦＰＰレベルよりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％高い、または少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、またはそれを超える高さの細胞内ＦＰＰレベルを含む。
【００８１】
ほとんどの実施形態において、宿主細胞の細胞内ＦＰＰレベルの上昇は、誘導化合物により誘導可能である。そのような宿主細胞は、誘導化合物の非存在下で容易に操作することができる。その後、誘導化合物が添加されて、宿主細胞内のＦＰＰレベル上昇を誘導する。別の実施形態において、宿主細胞の細胞内ＦＰＰレベルの上昇は、例えば増殖温度などの培養条件を変化させることにより誘導可能である。細胞内ＦＰＰレベルの誘導可能な上昇により、宿主細胞の低生存能力の表現型に分子オン・オフスイッチが提供される。
【００８２】
細胞内ＦＰＰレベルの上昇は、宿主細胞の目的とする遺伝子操作により実行することができる。複数の酵素が、ＦＰＰおよびその前駆体の産生または利用において機能することが公知であり、これらの酵素のいずれも、宿主細胞内のＦＰＰレベルを変化させるように操作することができる。
【００８３】
幾つかの実施形態において、宿主細胞の細胞内アセチル−ＣｏＡの産生増加により、宿主細胞内のＦＰＰ産生が増加される。
【００８４】
幾つかの実施形態において、宿主細胞のＩＰＰおよび／またはＤＭＡＰＰの産生増加により、宿主細胞内のＦＰＰ産生が増加される。幾つかのそのような実施形態において、ＭＥＶ経路の１種以上の酵素の活性を上昇させることにより、宿主細胞内のＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの産生が増加される。ＭＥＶ経路の概略図を、図１５に記載する。一般に該経路は、６つのステップを含む。
【００８５】
第一のステップにおいて、アセチルコエンザイムＡの２つの分子が、酵素的に組み合わせられてアセトアセチル−ＣｏＡを形成する。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えばアセチル−ＣｏＡチオラーゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、以下のＧｅｎＢａｎｋアクセション番号およびその配列が得られる生物体が挙げられる：ＮＣ＿０００９１３  領域：２３２４１３１．．２３２５３１５；大腸菌)、（Ｄ４９３６２；パラコッカス・デニトリフィカンス)、および（Ｌ２０４２８；サッカロマイセス・セレビシエ)。
【００８６】
ＭＥＶ経路の第二のステップにおいて、アセトアセチル−ＣｏＡが、アセチル−ＣｏＡの別の分子と酵素的に縮合して、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成する。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えばＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＮＣ＿００１１４５．相補配列１９０６１．．２０５３６；サッカロマイセス・セレビシエ)、（Ｘ９６６１７；サッカロマイセス・セレビシエ）、（Ｘ８３８８２；アラビドプシス・タリアナ）、（ＡＢ０３７９０７；キタサトスポラ・グリセオラ)、（ＢＴ００７３０２；ホモ・サピエンス）、および（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座ＳＡＶ２５４６、遺伝子ＩＤ  １１２２５７１；スタフィロコッカス・アウレウス）が挙げられる。
【００８７】
第三のステップにおいて、ＨＭＧ−ＣｏＡが、酵素的にメバロナートに変換される。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えばＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＮＭ＿２０６５４８；ドロソフィラ・メラノガスター）、（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座ＳＡＶ２５４５、遺伝子ＩＤ１１２２５７０；スタフィロコッカス・アウレウス）、（ＮＭ＿２０４４８５；ガッルス・ガッルス）、（ＡＢ０１５６２７；ストレプトマイセス属の一種 ＫＯ  ３９８８）、（ＡＦ５４２５４３；ニコチアナ・アテヌアタ）、（ＡＢ０３７９０７；キタサトスポラ・グリセオラ）、（ＡＸ１２８２１３、トランケート型ＨＭＧＲをコードする配列を提供する；サッカロマイセス・セレビシエ）、および（ＮＣ＿００１１４５：相補配列（１１５７３４．．１１８８９８：サッカロマイセス・セレビシエ）が挙げられる。
【００８８】
第四のステップにおいて、メバロナートが、酵素的にリン酸化されて、メバロナート５−リン酸を形成する。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えばメバロン酸キナーゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（Ｌ７７６８８；アラビドプシス・タリアナ）、および（Ｘ５５８７５；サッカロマイセス・セレビシエ）が挙げられる。
【００８９】
第五のステップにおいて、第二のリン酸基が、メバロナート５−リン酸に酵素的に付加されて、メバロナート５−ピロリン酸を形成する。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えばホスホメバロン酸キナーゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＡＦ４２９３８５；ヘベア・ブラシリエンシス)、（ＮＭ＿００６５５６；ホモ・サピエンス）、および（ＮＣ＿００１１４５．相補配列７１２３１５．．７１３６７０；サッカロマイセス・セレビシエ）が挙げられる。
【００９０】
第六のステップにおいて、メバロナート５−ピロリン酸が、ＩＰＰに酵素的に変換される。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えばメバロナートピロリン酸デカルボキシラーゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（Ｘ９７５５７；サッカロマイセス・セレビシエ）、（ＡＦ２９００９５；エンテロコッカス・フェシウム）、および（Ｕ４９２６０；ホモ・サピエンス）が挙げられる。
【００９１】
他のそのような実施形態において、ＤＸＰ経路の１種以上の酵素の活性を上昇させることにより、宿主細胞中のＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの産生が増加される。ＤＸＰ経路の概略図を、図１６に記載する。一般にＤＸＰ経路は、７つのステップを含む。
【００９２】
第一のステップにおいて、ピルバートが、Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸と縮合されて、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸を生成する。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えば１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＡＦ０３５４４０；大腸菌）、（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座ＰＰ０５２７；シュードモナス・プチダＫＴ２４４０）、（ＣＰ００００２６、遺伝子座ＳＰＡ２３０１；サルモネラ・エンテリカ・パラティフィ、ＡＴＣＣ  ９１５０参照）、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座ＲＳＰ＿０２５４；ロドバクター・スファロイデス２．４．１)、（ＮＣ＿００５２９６、遺伝子座ＲＰＡ０９５２；ロドシュードモナス・パルストリスＣＧＡ００９)、（ＮＣ＿００４５５６、遺伝子座ＰＤ１２９３；キシレラ・ファスチディオサ・テメクラ１)、および(ＮＣ＿００３０７６、遺伝子座ＡＴ５Ｇ１１３８０；アラビドプシス・タリアナ)が挙げられる。
【００９３】
第二のステップにおいて、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸が、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸に変換される。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えば１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＡＢ０１３３００；大腸菌）、（ＡＦ１４８８５２；アラビドプシス・タリアナ)、（ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座ＰＰ１５９７；シュードモナス・プチダＫＴ２４４０)、(ＡＬ９３９１２４、遺伝子座ＳＣＯ５６９４；ストレプトマイセス・コエリコラーＡ３（２）)、(ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座ＲＳＰ＿２７０９; ロドバクター・スファロイデス２．４．１)、および(ＮＣ＿００７４９２、遺伝子座Ｐｆｌ＿１１０７；シュードモナス・フルオレセンスＰｆＯ−１)が挙げられる。
【００９４】
第三のステップにおいて、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−４−リン酸が、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールに変換される。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えば４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＡＦ２３０７３６；大腸菌)、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座ＲＳＰ＿２８３５；ロドバクター・スファロイデス２．４．１)、（ＮＣ＿００３０７１、遺伝子座ＡＴ２Ｇ０２５００；アラビドプシス・タリアナ）、および(ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座ＰＰ１６１４；シュードモナス・プチダＫＴ２４４０)が挙げられる。
【００９５】
第四のステップにおいて、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールが、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸に変換される。このステップを触媒することが知られる酵素は、例えば４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＡＦ２１６３００；大腸菌)および（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座ＲＳＰ＿１７７９；ロドバクター・スファロイデス２．４．１)が挙げられる。
【００９６】
第五のステップにおいて、４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２−リン酸が、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸に変換される。このステップを触媒することで公知の酵素は、例えば２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＡＦ２３０７３８；大腸菌)、（ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座ＲＳＰ＿６０７１；ロドバクター・スファロイデス２．４．１)、および(ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座ＰＰ１６１８；シュードモナス・プチダＫＴ２４４０)が挙げられる。
【００９７】
第六のステップにおいて、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール２，４−シクロ二リン酸が、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸に変換される。このステップを触媒することで公知の酵素は、例えば１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＡＹ０３３５１５；大腸菌)、(ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座ＰＰ０８５３；シュードモナス・プチダＫＴ２４４０)、および(ＮＣ＿００７４９３、遺伝子座ＲＳＰ＿２９８２；ロドバクター・スファロイデス２．４．１)が挙げられる。
【００９８】
第七のステップにおいて、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸が、ＩＰＰまたはその異性体ＤＭＡＰＰに変換される。このステップを触媒することで公知の酵素は、例えばイソペンチル／ジメチルアリル二リン酸シンターゼである。ヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＡＹ０６２２１２；大腸菌)および(ＮＣ＿００２９４７、遺伝子座ＰＰ０６０６；シュードモナス・プチダＫＴ２４４０）が挙げられる。
【００９９】
幾つかの実施形態において、ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの異性体化を増加させることにより、宿主細胞におけるＦＰＰの産生が増加する。幾つかのそのような実施形態において、ＩＰＰイソメラーゼの活性を上昇させることにより、ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの異性体化が増加する。ＩＰＰイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．．３０３１６３５；大腸菌)、および(ＡＦ０８２３２６;ヘマトコッカス・プルビアリス)が挙げられる。
【０１００】
幾つかの実施形態において、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰのＦＰＰへの縮合を増加させることにより、宿主細胞におけるＦＰＰの産生が増加する。幾つかのそのような実施形態において、ＦＰＰシンターゼの活性を上昇させることにより、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰの、またはＩＰＰおよびゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）の、ＦＰＰへの縮合が増加する。ＦＰＰシンターゼをコードするヌクレオチド配列の例示としては、限定するものではないが、（ＡＴＵ８０６０５；アラビドプシス・タリアナ)、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；アラビドプシス・タリアナ）、（ＡＡＵ３６３７６；アルテミシア・アンヌア)、（ＡＦ４６１０５０；ボス・タウルス）、（Ｄ００６９４；大腸菌Ｋ−１２）、（ＡＥ００９９５１、遺伝子座ＡＡＬ９５５２３；フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタムＡＴＣＣ  ２５５８６)、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；ジベレラ・フジクロイ)、（ＣＰ０００００９、遺伝子座ＡＡＷ６００３４；グルコノバクター オキシダンス６２１Ｈ)、(ＡＦ０１９８９２；ヘリアンサス・アンヌス)、（ＨＵＭＦＡＰＳ；ホモ・サピエンス)、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；クルイベロマイセス・ラクチス)、（ＬＡＵ１５７７７；ルピヌス・アルブス)、（ＬＡＵ２０７７１；ルピヌス・アルブス）、（ＡＦ３０９５０８；ムス・ムスクルス)、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；ネウロスポラ・クラッサ)、（ＰＡＦＰＳ１；パルテニウム・アルゲンタタム)、（ＰＡＦＰＳ２；パルテニウム・アルゲンタタム)、（ＲＡＴＦＡＰＳ；ラッツス・ノルベギクス)、（ＹＳＣＦＰＰ；サッカロマイセス・セレビシエ)、（Ｄ８９１０４；シゾサッカロマイセス・ポンベ)、（ＣＰ０００００３、遺伝子座ＡＡＴ８７３８６；ストレプトコッカス・ピオゲネス)、（ＣＰ００００１７、遺伝子座；ストレプトコッカス・ピオゲネス)、（ＮＣ＿００８０２２、遺伝子座ＹＰ＿５９８８５６；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０２７０)、（ＮＣ＿００８０２３、遺伝子座ＹＰ＿６００８４５；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、遺伝子座ＹＰ＿６０２８３２；ストレプトコッカス・ピオゲネスＭＧＡＳ１０７５０）、（ＭＺＥＦＰＳ；ゼアマイス)、（ＡＥ０００６５７、遺伝子座ＡＡＣ０６９１３；アクイフェックス・エオリクスＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；アラビドプシス・タリアナ)、（Ｄ８４４３２、遺伝子座ＢＡＡ１２５７５；バチルス・サチリス)、（Ｕ１２６７８、遺伝子座ＡＡＣ２８８９４；ブラディリゾビウム・ジャポニカムＵＳＤＡ  １１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス)、（ＮＣ＿００２９４０、遺伝子座ＮＰ＿８７３７５４；ヘモフィルス・ジュクレイ３５０００ＨＰ）、（Ｌ４２０２３、遺伝子座ＡＡＣ２３０８７；ヘモフィリスインフルエンザＲｄ  ＫＷ２０)、（Ｊ０５２６２；ホモ・サピエンス)、（ＹＰ＿３９５２９４；ラクトバチルス・サケイ亜種サケイ２３Ｋ)、（ＮＣ＿００５８２３、遺伝子座ＹＰ＿０００２７３；レプトスピラ・インテロガンス・セロバール・コペンハーゲニ・ｓｔｒ・フィオクルズＬ１−１３０)、（ＡＢ００３１８７；ミクロコッカス・ルテウス)、（ＮＣ＿００２９４６、遺伝子座ＹＰ＿２０８７６８；ナイセリア・ゴノレアＦＡ  １０９０）、（Ｕ０００９０、遺伝子座ＡＡＢ９１７５２；リゾビウム属の一種ＮＧＲ２３４)、（Ｊ０５０９１；サッカロマイセス・セレビシエ)、（ＣＰ００００３１、遺伝子座ＡＡＶ９３５６８；シリシバクターポメロイＤＳＳ−３)、（ＡＥ００８４８１、遺伝子座ＡＡＫ９９８９０；ストレプトコッカス・ニューモニエＲ６）、および（ＮＣ＿００４５５６、遺伝子座ＮＰ  ７７９７０６；キシレラ・ファスチディオサ  テメクラ１)が挙げられる。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、産生ステップから得られた中間体をＦＰＰの形成に転ずる阻害反応により、宿主細胞におけるＦＰＰの産生が増加される。そのような反応としては、限定するものではないが、脂肪酸生合成、アラニン生合成、アスパラギン酸の超経路（ｓｕｐｅｒｐａｔｈｗａｙ）、糖新生、ヘム生合成、グルタミン酸生合成、およびホスホトランスアセチラーゼの作用を介したアセチル−ＣｏＡからアセタートへの変換を導くＴＣＡ回路の副反応が挙げられる。
【０１０２】
幾つかの実施形態において、高レベルの細胞内ＦＰＰを含む宿主細胞は、宿主細胞内でのＦＰＰ消費を減少させることにより得られる。幾つかのそのような実施形態において、ＦＰＰをスクアレンに変換し得るファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼまたはスクアレンシンターゼの活性を低下させることにより、宿主細胞におけるＦＰＰの消費は減少する。別のそのような実施形態において、宿主細胞におけるセスキテルペンシンターゼの活性を低下させることにより、宿主細胞におけるＦＰＰの消費は減少する。
【０１０３】
高レベルの細胞内ＦＰＰを含む宿主細胞は、遺伝子操作技術（即ち、組換え技術）、古典的微生物学的技術、またはそれらの技術の組み合わせを利用して親細胞を遺伝子修飾することにより生成することができる。宿主細胞は、高レベルの細胞内ＦＰＰにより特定の増殖条件下で非生存可能である天然由来の遺伝子変異体であってもよい。
【０１０４】
低い細胞生存能力を有するような高レベルの細胞内ＦＰＰを含む宿主細胞は、固形培地上の宿主細胞の増殖を、高レベルの細胞内ＦＰＰを含まない親細胞の増殖と比較することにより同定することができる。高レベルの細胞内ＦＰＰを含む宿主細胞は、親細胞と比較して、固形寒天培地上により少ない、またはより小さいコロニーを生成する。最初、宿主細胞が高レベルの細胞内ＦＰＰを含まず、親細胞と同じ生存能力を有する条件（「寛容的増殖条件」）下で宿主細胞を増殖し、その後、宿主細胞をレプリカプレートして、宿主が高レベルの細胞内ＦＰＰを含む条件（「制限的増殖条件」）下でそれを増殖させて、制限的増殖条件下のみでは低い生存能力を有するが寛容的増殖条件下では低い生存能力を有さない宿主細胞を同定することにより、特定の増殖条件下のみで高レベルの細胞内ＦＰＰを含む宿主細胞を同定することができる。そのような制限的増殖条件は、限定するものではないが、培地中の特異的栄養素の存在、培地中の特異的レベルの特異的栄養素の存在、培地中の誘導化合物の存在、培地中の抑制化合物の存在、および特異的増殖温度を含むことができる。
【０１０５】
５．５  テルペンシンターゼ
本明細書に提供された方法は、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体を発生させることを目的としている。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、天然由来テルペンシンターゼの変異体である。別の実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、天然由来でないテルペンシンターゼの変異体である。
【０１０７】
幾つかのそのような実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、および／または付加により、天然由来テルペンシンターゼまたは天然由来でないテルペンシンターゼと異なっている。幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える追加のアミノ酸を含むことにより、天然由来テルペンシンターゼまたは天然由来でないテルペンシンターゼと異なっている。幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える追加のアミノ酸置換を含むことにより、天然由来テルペンシンターゼまたは天然由来でないテルペンシンターゼと異なっている。幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超えるアミノ酸を欠くことにより、天然由来テルペンシンターゼまたは天然由来でないテルペンシンターゼと異なっている。
【０１０８】
幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、天然由来テルペンシンターゼまたは天然由来でないテルペンシンターゼのアミノ酸配列に対し、約５０％〜約５５％、約５５％〜約６０％、約６０％〜約６５％、約６５％〜約７０％、約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％、約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、または約９５％〜約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１０９】
幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、コンセンサスアミノ酸配列を含む。コンセンサスアミノ酸配列は、３つ以上のアミノ酸配列を整列させて、その配列の少なくとも２つにより共有されるアミノ酸を同定することにより得られる。幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、２つ以上の天然由来テルペンシンターゼから得られたコンセンサス配列を含む。
【０１１０】
幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、ハイブリッドテルペンシンターゼである。ハイブリッドテルペンシンターゼは、２つ以上の異なるテルペンシンターゼの隣接するアミノ酸伸長を含む。ハイブリッドテルペンシンターゼは、限定するものではないがエクソンシャフリング、ドメインスワッピングなどをはじめとする任意の公知方法を用いて生成させることができる（例えば、Ｎｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１０６９−１０７３；  Ｆｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（１５）：７７６１−７７６６）。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、天然由来テルペンシンターゼをコードする核酸にハイブリダイズする。別の実施形態において、テルペンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、適度なハイブリダイゼーション条件下で、天然由来テルペンシンターゼをコードする核酸にハイブリダイズする。更に別の実施形態において、テルペンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、天然由来テルペンシンターゼをコードする核酸にハイブリダイズする。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞のコドン優先性（ｃｏｄｏｎ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を反映する天然由来テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列から変化する（即ち、特別な宿主細胞における発現のためにコドン最適化される）。特別な宿主細胞に好ましいコドンの使用は、一般にヌクレオチド配列の翻訳の確率、つまり発現を増加させる。特定の生物体が特定のコドンを使用して特定のアミノ酸をコードする時間の割合を要約したコドン使用頻度を、多くの生物体に関して入手することができ、適切なヌクレオチド配列を設計する際の参照として用いることができる。幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、サッカロマイセス・セレビシエのコドン優先性を反映して変化される（例えば、Ｂｅｎｎｅｔｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ  （１９８２）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５７（６）：  ３０２６−３０３1参照）。幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列は、大腸菌のコドン優先性を反映するように変化する（例えば、Ｇｏｕｙ  ａｎｄ  Ｇａｕｔｉｅｒ  （１９８２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０（２２）：７０５５−７０７４；  Ｅｙｒｅ−Ｗａｌｋｅｒ  （１９９６）  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（６）：８６４−８７２；  Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８（１）：２９２参照）。
【０１１３】
テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、様々な公知の組換え技術および合成手順のいずれかを用いて得ることができる。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡから調製することができるが、それらの全てが、細胞から直接抽出することができ、または限定するものではないがＰＣＲおよびｒｔ−ＰＣＲをはじめとする様々な増幅プロセスにより組換え生成することができる。
【０１１４】
テルペンシンターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、様々な公知方法のいずれかを用いて得ることができる。例えば核酸は、化学的突然変異誘発因子もしくは放射線で処理された細胞から、またはＤＮＡ修復において欠損を有する細胞から単離することができる。適切な化学的突然変異誘発因子としては、限定するものではないが、エチルメタンスルホナート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルホナート（ＭＭＳ）、Ｎ−ニトロソ尿素（ＥＮＵ）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ’−ニトロソグアニジン、４−ニトロキノリンＮ−オキシド、ジエチルスルファート、ベンゾピレン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、トリエチルメラミン、アクリルアミドモノマー、ナイトロジェンマスタード、ビンクリスチン、ジエポキシアルカン（例えば、ジエポキシブタン）、ＩＣＲ−１７０、ホルムアルデヒド、プロカルバジン塩酸、エチレンオキシド、ジメチルニトロサミン、７，１２−ジメチルベンゾ［ａ］アントラセン、クロラムブシル、ヘキサメチルホスホラミド、ビスルファン、およびアクリジン染料が挙げられる（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．  Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９８９）  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，  Ｍａｓｓ．，  ｏｒ  Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３６，  ２２７  （１９９２）参照）。適切な放射線暴露しては、限定するものではないが、紫外線照射（場合により、例えばトリメチルプソラレンなどの化学剤への暴露と組み合わせて）、γ線照射、Ｘ線、および高速中性子衝撃が挙げられる。細胞におけるＤＮＡ修復の際に欠損を導入する適切な方法としては、限定するものではないが、細胞のゲノムにおける突然変異を高頻度で発生させる（突然変異約１回／１００遺伝子〜突然変異約１回／１０，０００遺伝子程度）突然変異体のＤＮＡ修復酵素の発現が挙げられる。ＤＮＡ修復酵素をコードする遺伝子の例としては、限定するものではないが、Ｍｕｔ  Ｈ、Ｍｕｔ  Ｓ、Ｍｕｔ  Ｌ、およびＭｕｔ  Ｕ、ならびに他の種におけるそれらの相同体（例えば、ＭＳＨ  １〜６、ＰＭＳ  １〜２、ＭＬＨ  １、ＧＴＢＰ、およびＥＲＣＣ−１）が挙げられる。テルペンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を得る他の方法としては、無細胞インビトロ系で操作（例えば、核酸の増幅のためのエラープローンＰＣＲの使用）、細胞のゲノムにおける可動性ＤＮＡ要素（例えば、転位因子）の無作為もしくは標的挿入、またはインビトロＤＮＡシャフリング（例えば、エクソンシャフリング、ドメインスワッピングなど；例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （現行版）；およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｄ．  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａ��ｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００１）参照）が挙げられる。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、β−ファルネセンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、トリコジエンシンターゼ、パチュロールシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、バレンセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、およびノートカトンシンターゼからなる群より選択されるセスキテルペンシンターゼの変異体である。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、テルペンシンターゼ変異体は、β−ファルネセンシンターゼ変異体である。幾つかのそのような実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、アルテミシア・アンヌアのβ−ファルネセンシンターゼから誘導される。アルテミシア・アンヌアのβ−ファルネセンシンターゼの配列は、過去に記載されている（Ｐｉｃａｕｄ，  ｅｔ  ａｌ，  （２００５）  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６６  （９）：９６１−９６７）。アルテミシア・アンヌアのβ−ファルネセンシンターゼのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＹ８３５３９８として寄託され、本明細書において配列番号１１２として示される。アルテミシア・アンヌアのβ−ファルネセンシンターゼのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＸ３９３８７として寄託され、本明細書において配列番号１１１として示される。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置２にセリンからアスパラギン酸塩へのアミノ酸置換（Ｓ２Ｄ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３にトレオニンからアスパラギンへのアミノ酸置換（Ｔ３Ｎ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４にロイシンからセリンへのアミノ酸置換（Ｌ４Ｓ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置６にイソロイシンからトレオニンへのアミノ酸置換（Ｉ６Ｔ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置９にバリンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換（Ｖ９Ｄ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置１１にフェニルアラニンからセリンへのアミノ酸置換（Ｆ１１Ｓ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置２０にバリンからグルタミン酸へのアミノ酸置換（Ｖ２０Ｅ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置２４にバリンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換（Ｖ２４Ｄ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３５にメチオニンからトレオニンへのアミノ酸置換（Ｍ３５Ｔ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３８にアスパラギンからセリンへのアミノ酸置換（Ｎ３８Ｓ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置５０にアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換（Ｄ５０Ｎ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置６１にロイシンからグルタミンへのアミノ酸置換（Ｌ６１Ｑ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置７２にグルタミン酸からリシンへのアミノ酸置換（Ｆ７２Ｋ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置７２にグルタミン酸からバリンへのアミノ酸置換（Ｅ７２Ｖ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置８０にアスパラギンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換（Ｎ８０Ｄ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置８９にイソロイシンからバリンへのアミノ酸置換（Ｉ８９Ｖ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置１０５にグルタミン酸からアスパラギン酸へのアミノ酸置換（Ｅ１０５Ｄ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置１１５にイソロイシンからメチオニンへのアミノ酸置換（Ｉ１１５Ｍ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置１１５にイソロイシンからバリンへのアミノ酸置換（Ｉ１１５Ｖ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置１４４にフェニルアラニンからチロシンへのアミノ酸置換（Ｆ１４４Ｙ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置１９６にトレオニンからセリンへのアミノ酸置換（Ｔ１９６Ｓ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置２１１にセリンからトレオニンへのアミノ酸置換（Ｓ２１１Ｔ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置２５１にロイシンからメチオニンへのアミノ酸置換（Ｌ２５１Ｍ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置２８０にロイシンからグルタミンへのアミノ酸置換（Ｌ２８０Ｑ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置２８８にチロシンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換（Ｙ２８８Ｆ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３１９にトレオニンからセリンへのアミノ酸置換（Ｔ３１９Ｓ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３５７にグルタミン酸からバリンへのアミノ酸置換（Ｅ３５７Ｖ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３５９にグルタミン酸からトレオニンへのアミノ酸置換（Ｅ３５９Ｔ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３６９にバリンからロイシンへのアミノ酸置換（Ｖ３６９Ｌ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。��つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３７１にロイシンからメチオニンへのアミノ酸置換（Ｌ３７１Ｍ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３８５にトレオニンからアラニンへのアミノ酸置換（Ｔ３８５Ａ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３９８にイソロイシンからバリンへのアミノ酸置換（Ｉ３９８Ｖ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４２３にバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換（Ｖ４２３Ｉ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４３３にメチオニンからイソロイシンへのアミノ酸置換（Ｍ４３３Ｉ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４３４にイソロイシンからトレオニンへのアミノ酸置換（Ｉ４３４Ｔ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４４２にグリシンからアラニンへのアミノ酸置換（Ｇ４４２Ａ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４４２にグリシンからアスパラギン酸へのアミノ酸置換（Ｇ４４２Ｄ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４４４にイソロイシンからロイシンのアミノ酸置換（Ｉ４４４Ｌ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４４６にトレオニンからアスパラギンへのアミノ酸置換（Ｔ４４６Ｎ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４６０にイソロイシンからバリンへのアミノ酸置換（Ｉ４６０Ｖ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４６７にバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換（Ｖ４６７Ｉ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４８８にセリンからフェニルアラニンへのアミノ酸置換（Ｓ４８８Ｆ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置４９５にグルタミン酸からグリシンへのアミノ酸置換（Ｅ４９５Ｇ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は��配列番号１１１で示されるが、位置５０５にグルタミン酸からバリンへのアミノ酸置換（Ｅ５０５Ｖ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置５２６にトレオニンからセリンへのアミノ酸置換（Ｔ５２６Ｓ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置５３１にプロリンからセリンへのアミノ酸置換（Ｐ５３１Ｓ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置５５６にアラニンからバリンへのアミノ酸置換（Ａ５５６Ｖ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置５７２にメチオニンからリシンへのアミノ酸置換（Ｍ５７２Ｋ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置５７５に終止コドンからリシンへのアミノ酸置換（終止５７５Ｋ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置３４８にアルギニンからリシンへのアミノ酸置換（Ｒ３４８Ｋ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。幾つかの実施形態において、β−ファルネセンシンターゼ変異体は、配列番号１１１で示されるが、位置１８にロイシンからイソロイシンへのアミノ酸置換（Ｌ１８Ｉ突然変異）を含むアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
５．６  宿主細胞の遺伝子操作
本明細書に提供された方法は、高レベルの細胞内ＦＰＰを含むように、またはテルペンシンターゼもしくはテルペンシンターゼ変異体を発現するように遺伝子操作された宿主細胞を得ることを含む。そのような遺伝子操作された宿主細胞は、細胞内ＦＰＰレベルを上昇させるのに、またはテルペンシンターゼもしくはテルペンシンターゼ変異体を発現するのに望ましい効果を提供する手法で、ヌクレオチドの挿入、欠失、または修飾を含んでいてもよい。そのような遺伝子修飾は、特異的酵素のコピー数または活性の減少または増加または改変を引き起こし得る。
【０１１９】
例えば、宿主細胞中の酵素のコピー数は、酵素をコードする遺伝子の転写を改変することにより変化させてもよい。これは、例えば酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を改変することにより（例えば、ヌクレオチド配列を含む高もしくは低コピー数の発現ベクターを用いることにより、または宿主細胞のゲノムにヌクレオチド配列の追加的コピー数を導入することにより、または宿主細胞のゲノムのヌクレオチド配列を欠失もしくは破壊することにより）、オペロンのポリシストロン性ｍＲＮＡ上のコード配列の順序を変更することにより、そのものの制御要素によりオペロンを個々の遺伝子に分解することにより、またはヌクレオチド配列が操作可能に連結されたプロモータもしくはオペレータの強度を上昇させることにより、実現することができる。あるいは、または追加として、酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳レベルを改変することにより、宿主細胞内の酵素のコピー数を変化させてもよい。これは、例えばｍＲＮＡの安定性を改変することにより、リボソーム結合部位の配列を改変することにより、リボソーム結合部位と酵素コード配列の開始コドンとの距離もしくは配列を改変することにより、酵素コード領域の開始コドンの５’側の「上流」に位置する、もしくは５’側に隣接したシストロン間領域全体を改変することにより、ヘアピンおよび専用の配列を用いてｍＲＮＡ転写産物の３’末端を安定化させることにより、酵素のコドン使用を改変することにより、酵素の生合成において使用されるレアコドンｔＲＮＡの発現を変化させることにより、ならびに／または、例えばコード配列の突然変異を介して、酵素の安定性を上昇させることにより、実現することができる。
【０１２０】
宿主細胞における酵素の活性は、限定するものではないが、宿主細胞における溶解度上昇もしくは低下を示す、改変された形態の酵素を発現すること、酵素活性を阻害するドメインを欠く、変化させた形態の酵素を発現すること、基質へのより高いもしくは低いＫｃａｔまたはより低いもしくは高いＫｍを有する改変された形態の酵素を発現すること、あるいは経路の別の分子によるフィードバックまたはフィードフォワード調節により、より大きなまたは小さな影響を受ける変化させた形態の酵素を発現すること、をはじめとする複数の方法で変化させることができる。
【０１２１】
本明細書に提供された方法は、そのようなテルペンシンターゼまたはテルペンシンターゼ変異体を天然で発現しない宿主細胞におけるテルペンシンターゼまたはテルペンシンターゼ変異体を発現させるステップを更に含む。宿主細胞におけるテルペンシンターゼまたはテルペンシンターゼ変異体の発現は、宿主細胞における発現が可能な調節要素の制御下で、テルペンシンターゼまたはテルペンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を宿主細胞内に導入することにより完遂することができる。幾つかの実施形態において、核酸は、染色体外プラスミドである。別の実施形態において、核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み入れ得る染色体組み入れベクター（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）である。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、２つ以上の宿主細胞におけるテルペンシンターゼまたはテルペンシンターゼ変異体の発現レベルが類似していることが、肝要である。これは、同様の調節要素の制御下でテルペンシンターゼまたはテルペンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を用いることにより、完遂することができる。そのような核酸は、染色体外発現ベクターとして、またはテルペンシンターゼもしくはテルペンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列および調節要素を、宿主の染色体に組み入れるために、用いることができる。テルペンシンターゼまたはテルペンシンターゼ変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に、２つ以上の宿主細胞内の同じ位置を標的化させて、同じ内在性調製要素の制御下でヌクレオチド配列を配置させることにより、同等の発現レベルを完遂することができる。類似の調節要素の使用に加えて、同等の発現レベルは、２つ以上の宿主細胞内のヌクレオチド配列の類似コピー数にも依存し得る。コピー数は、染色体外発現ベクターにおいて類似もしくは同一の複製起点を使用することにより、またはヌクレオチド配列を２つ以上の宿主細胞の染色体内に組み入れるために類似のタイプおよび数の染色体組み入れ構築物を使用することにより、制御することができる。核酸の複数の追加的特色が、コードされたテルペンシンターゼまたはテルペンシンターゼ変異体の発現レベルに影響を及ぼすことができ（例えば、蛋白質またはｍＲＮＡの安定性、リボソーム結合部位の配列、リボソーム結合部位と開始コドンとの距離、上流および下流の配列の性質、ヘアピンおよび他の専門の配列、ならびにコドンの使用）、提供された方法に必要とされるならば、これらの全てを改変して類似の発現レベルを確保することができる。
【０１２３】
限定するわけではないが、当業者に公知の任意方法により、核酸を微生物に導入することができる（例えば、Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：１２９２−３；  Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３３７６−３３８５；  Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ，  ｅｄｓ，  １９９０，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ．  １８５，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  ，  ＣＡ；  Ｋｒｉｅｇｅｒ，  １９９０，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ；  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ，  １９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −−  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ ａｌ．  ，  ｅｄｓ．  ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  ＮＹ参照）。例示的技術としては、限定するものではないが、スフェロプラスト化、電気穿孔、ＰＥＧ１０００を介した形質転換、および酢酸リチウムまたは塩化リチウムを介した形質転換が挙げられる。
【０１２４】
幾つかの実施形態において、宿主細胞を遺伝子修飾するのに用いられる核酸は、形質転換された宿主細胞を選択するのに有用な、および宿主細胞に選択的圧力を施して外来ＤＮＡを保持するのに有用な１つ以上の選択マーカを含む。
【０１２５】
幾つかの実施形態において、選択マーカは、抗生物質耐性マーカである。抗生物質耐性マーカの例示としては、限定するものではないが、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲおよびＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物が挙げられる。大腸菌からのＢＬＡ遺伝子産物は、β−タクタム抗生物質（例えば、狭域セファロスポリン、セファロマイシン、およびカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、およびセフォペラゾン）、ならびにテモシリンを除く全ての抗グラム陰性菌ペニシリンに耐性を付与し；Ｓ．ノウルセイからのＮＡＴ１遺伝子産物は、ノウルセオトリシンに耐性を付与し；Ｓ．ビリドクロモゲネスＴｕ９４からのＰＡＴ遺伝子産物は、ビアラフォスに耐性を付与し；サッカロマイセス・セレビシエからのＡＵＲ１−Ｃ遺伝子産物は、オーレオバシジンＡ（ＡｂＡ）に耐性を付与し；ＰＤＲ４遺伝子産物は、セルレニンに耐性を付与し；ＳＭＲ１遺伝子産物は、スルホメツロンメチルに耐性を付与し；Ｔｎ９トランスポリンからのＣＡＴ遺伝子産物は、クロラムフェニコールに耐性を付与し；マウスｄｈｆｒ遺伝子産物は、メトトレキサートに耐性を付与し；クレブシエラ・ニューモニエのＨＰＨ遺伝子産物は、ハイグロマイシンＢに耐性を付与し；大腸菌のＤＳＤＡ遺伝子産物は、Ｄ−セリンを唯一の窒素供給源として用いて細胞をプレート上で増殖させることができ；Ｔｎ９０３トランスポリンのＫＡＮＲ遺伝子産物は、Ｇ４１８に耐性を付与し、ストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌスからのＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物は、ゼオシン（ブレオマイシ）に耐性を付与する。幾つかの実施形態において、抗生物質体性マーカは、本明細書に開示された遺伝子修飾された宿主細胞が単離された後に欠失される。
【０１２６】
幾つかの実施形態において、選択マーカは、遺伝子修飾された微生物において栄養要求性（例えば、栄養要求性（ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈｙ））をレスキューする。そのような実施形態において、親微生物は、アミノ酸またはヌクレオチド生合成経路において機能し、非機能的であれば、１種以上の栄養素を補充しなければ親化合物が培地中で増殖し得なくなる、１種以上の遺伝子産物における機能的破壊を含む。そのような遺伝子産物としては、限定するものではないが、酵母におけるＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、およびＵＲＡ３遺伝子産物が挙げられる。その後、栄養要求性表現型は、破壊された遺伝子産物の機能的コピーをコードする発現ベクターまたは染色体組み入れ構築物で親細胞を形質転換することによりレスキューすることができ、生成された遺伝子修飾宿主細胞は、親細胞の栄養要求性表現型の喪失に基づいて選択することができる。ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２遺伝子の選択マーカとしての使用は、正の選択および負の選択の両者が可能であるため、著しい利点を有する。正の選択は、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２突然変異の栄養要求性相補性により実施されるが、負の選択は、原栄養菌株の増殖を妨害するが、それぞれＵＲＡ３、ＴＲＰ１、およびＬＹＳ２突然変異体の増殖を可能にする特異的阻害剤、即ち、それぞれ５−フルオロオロチン酸（ＦＯＡ）、５−フルオロアントラニル酸、およびα−アミノアジピン酸（ａＡＡ）に基づく。
【０１２７】
別の実施形態において、選択マーカは、公知選択法により同定され得る他の非致命的欠損または表現型をレスキューする。
【０１２８】
５．７  宿主細胞の増殖
本発明は、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼ変異体を発生させる方法、およびテルペンを産生する方法を提供する。該方法は一般に、炭素供給源を含む適切な培地中、適切な条件下で宿主細胞を増殖させることを含む。
【０１２９】
微生物を増殖させるための適切な条件および適切な培地は、当該技術分野で周知である。幾つかの実施形態において、適切な培地は、１種以上の追加的薬剤、例えば誘導化合物（例えば、遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列が、誘導性プロモータの制御下にある場合）、抑制化合物（例えば、遺伝子産物をコードする１つ以上のヌクレオチド配列が、抑制性プロモータの制御下にある場合）、または選択剤（例えば、遺伝子修飾を含む微生物を選択するための抗生物質）を補充されている。
【０１３０】
幾つかの実施形態において、炭素供給源は、単糖類（単糖）、二糖類、多糖類、非発酵性炭素供給源、またはそれらの１種以上の組み合わせである。適切な単糖類の非限定的例としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、リボース、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切な二糖類の非限定的例としては、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切な多糖類の非限定的例としては、デンプン、グリコーゲン、セルロース、キチン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。適切な非発酵性炭素供給源の非限定的例としては、アセタートおよびグリセロールが挙げられる。
【０１３１】
一態様において、本発明は、試験テルペンシンターゼを含む宿主細胞の増殖速度に基づき、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼを同定する方法を提供する。宿主細胞の増殖速度は、例えば、宿主細胞を液体培地中で所定の期間増殖させ、その後、培養物の全てまたは一部を寒天プレート上に播種し、最後に寒天プレート上に生じたコロニーの数を計数することにより決定することができる。あるいは宿主細胞の増殖速度は、所定の期間の後、培養物のバイオマスを測定することにより決定される。バイオマスは、例えばＵＶ分光法により、液体培地の比重を決定することにより、またはヘキソサミンおよびおエルゴステロールなどのバイオマス指数の分子を定量することにより、測定することができる（Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｂｉｏｌ．  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｏｉｌｓ  １３：  ２２９−２３４；  Ｎｅｗｅｌｌ  （１９９２）  ｐ．  ５２１−５６１．  Ｉｎ  Ｇ．  Ｃ．  Ｃａｒｒｏｌｌ  ａｎｄ  Ｄ．  Ｔ．  Ｗｉｃｋｌｏｗ  （ｅｄ．），  Ｔｈｅ  ｆｕｎｇａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ：  ｉｔｓ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【０１３２】
５．８  テルペンの産生
本発明は、テルペンを産生する方法を提供する。
【０１３３】
幾つかの実施形態において、テルペンは、発酵培地１リットルあたり約１０グラムを超える量で産生される。幾つかのそのような実施形態において、テルペンは、細胞培養物１リットルあたり、約１０〜約５０グラム、約１５グラムを超える、約２０グラムを超える、約２５グラムを超える、または約３０グラムを超える量で産生される。
【０１３４】
幾つかの実施形態において、テルペンは、乾燥細胞重量１グラムあたり約５０ミリグラムを超える量で産生される。幾つかのそのような実施形態において、テルペンは、乾燥細胞重量１グラムあたり、約５０〜約１５００ミリグラム、約１００ミリグラムを超える、約１５０ミリグラムを超える、約２００ミリグラムを超える、約２５０ミリグラムを超える、約５００ミリグラムを超える、約７５０ミリグラムを超える、または約１０００ミリグラムを超える量で産生される。
【０１３５】
幾つかの実施形態において、テルペンは、単位細胞培養容量あたりに、第一の異種ヌクレオチド配列を含まない宿主細胞により産生されるテルペン量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％高い、または少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、またはそれを超える量で産生される。
【０１３６】
幾つかの実施形態において、テルペンは、単位乾燥細胞重量あたりに、第一の異種ヌクレオチド配列を含まない宿主細胞により産生されるテルペン量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％高い、または少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、またはそれを超える量で産生される。
【０１３７】
幾つかの実施形態において、テルペンは、単位時間の単位細胞培養容量あたりに、第一の異種ヌクレオチド配列を含まない宿主細胞により産生されるテルペン量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％高い、または少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、またはそれを超える量で産生される。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、テルペンは、単位時間の単位乾燥細胞重量あたりに、第一の異種ヌクレオチド配列を含まない宿主細胞により産生されるテルペン量よりも少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％高い、または少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、または少なくとも約１０００倍、またはそれを超える量で産生される。
【０１３９】
５．９  テルペンの抽出および定量
本発明の遺伝子修飾された宿主細胞により産生されたテルペンは、当該技術分野で公知の任意の適切な分離および精製法を用いて、発酵から単離されてもよい。
【０１４０】
幾つかの実施形態において、テルペンを含む有機相は、遠心分離により発酵から分離される。別の実施形態において、テルペンを含む有機相は、自然に発酵から分離される。更に別の実施形態において、テルペンを含む有機相は、発酵反応に無乳化剤および／または核化剤を添加することにより、発酵から分離される。無乳化剤の例示としては、凝集剤および凝固剤が挙げられる。核化剤の例示としては、テルペンそのものの液滴および有機溶媒、例えばドデカン、ミリスチン酸イソプロピル、およびオレイン酸メチルが挙げられる。
【０１４１】
幾つかの実施形態において、テルペンは、有機相中に存在し得る他の産物から分離される。幾つかの実施形態において、分離は、吸着、蒸留、気液抽出（逆抽出）、液液抽出（溶媒抽出）、限外ろ過、および標準のクロマトグラフィー技術を用いて実現される。
【０１４２】
幾つかの実施形態において、テルペンは、純粋であり、例えば少なくとも約４０％純粋、少なくとも約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、少なくとも約９８％純粋、または９８％を超えて純粋である（テルペンに関連する「純粋」は、他のテルペンまたは混入物を含まないテルペンを指す）。
【０１４３】
テルペン産生は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）、核磁気共鳴法（ＮＭＲ）、ラマン分光法、光吸収（ＵＶ／ＶＩＳ）、赤外分光法（ＩＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、イオンクロマトグラフィー−質量分析法、薄層クロマトグラフィー、パルスアンペアメトリック検出法、およびＵＶ−ＶＩＳ分光法をはじめとし、当該技術分野で知られる周知方法を用いて即座に定量することができる。
【０１４４】
宿主細胞により産生されたテルペンは、限定するものではないが、クロマトグラフィー、抽出、溶媒抽出、膜分離、電気透析法、逆浸透法、蒸留、化学的誘導体化、および結晶化をはじめとする様々な方法のいずれかを用いて回収することができる。
【０１４５】
テルペンの定量または単離を改善する追加の処理ステップとしては、限定するものではないが、宿主細胞の破壊が挙げられる。適切な方法としては、限定するものではないが、ボルテックス処理、音波処理、およびガラスビーズの使用が挙げられる。他の処理ステップは、不適当な細胞片を上清から除去するための遠心分離を含むことができる。
【実施例】
【０１４６】
以下の具体的実施例は、本開示を例示するためのものであり、特許請求の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０１４７】
実施例１
この実施例は、テルペンシンターゼ変異体の生成および特徴付けに有用となるＤＮＡ構築物を生成する方法を説明する。
【０１４８】
ＭｅｖＴ６６オペロンをベクターｐＡＭ３６に挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ３６−ＭｅｖＴ６６を生成させた。ベクターｐＡＭ３６は、ｐＡＣＹＣ１８４ベクター（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＸＯ６４０３）からｔｅｔ耐性遺伝子を除去して、それにＡｓｃＩ−ＳｆｉＩ−ＡｓｉＳＩ−ＸｈｏＩ−ＰａｃＩ−ＦｓＩｌ−ＰｍｅＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチドカセットを付加することにより、生成させた。ＭｅｖＴ６６オペロンに、ユビキタス前駆体アセチル−ＣｏＡを（Ｒ）−メバロン酸に一緒に形質転換するＭｅｖ経路酵素のセット、即ちアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、およびＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼをコードしていた。ＭｅｖＴ６６オペロンは、合成により生成させ、大腸菌における発現のためにコドン最適化されたエシェルヒア・コリのａｔｏＢ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿０００９１３  領域：２３２４１３１．．２３２５３１５；アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼをコードする）と、大腸菌における発現のためにコドン最適化されたサッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１３遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｘ９６６１７，領域：２２０．．１６９５；ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードする）と、大腸菌における発現のためにコドン最適化されたサッカロマイセス・セレビシエのＨＧＭ１遺伝子のトランケート型コード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ２２００２，領域：１７７７．．３２８５；トランケート型ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼをコードする）と、を含んだ。合成により生成させたＭｅｖＴ６６オペロンを、標準のｐＵＣまたはｐＡＣＹＣ起源ベクター（ｏｒｉｇｉｎ  ｖｅｃｔｏｒ）などのクローニングベクターにクローニングし、それからフランキングＳｆｉＩおよびＡｓｉＳＩ制限部位により再度ＰＣＲ増幅させて、ＳｆｉＩおよびＡｓｉＳＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて増幅されたＤＮＡフラグメントを消化し、ＭｅｖＴ６６オペロンを含むおよそ４．２ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製して、精製されたＤＮＡフラグメントをｐＡＭ３６ベクターのＳｆｉＩおよびＡｓｉＳＩ制限部位に挿入して、発現プラスミドｐＡＭ３６−ＭｅｖＴ６６を得た。
【０１４９】
ＭｅｖＢオペロンをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−１ベクターに挿入することにより、発現プラスミドｐＭｅｖＢ−Ｃｍを生成させた。ＭｅｖＢオペロンは、（Ｒ）−メバロン酸をＩＰＰに一緒に変換する酵素のセット、即ちメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、およびメバロン酸ピロリン酸カルボキシラーゼをコードする。ＥＲＧ１２遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｘ５５８７５，領域：５８０．．１９１１; メバロン酸キナーゼをコードする）、ＥＲＧ８遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｚ４９９３９，領域：３３６３．．４７１８；ホスホメバロン酸キナーゼをコードする）、およびＭＶＤ１遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｘ９７５５７，領域：５４４．．１７３４;メバロン酸ピロリン酸カルボキシラーゼをコードする）を、サッカロマイセス・セレビシエのゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。適切なプライマー配列を選択することにより、ＰＣＲ増幅の間にＥＲＧ１２およびＥＲＧ８コード配列の終止コドンをＴＡＡからＴＡＧに変化させて、リボソーム結合部位を導入した。配列重複伸長（ＳＯＥ；Ｈｏ，  ｅｔ  ａｌ，  １９８９）により、ＰＣＲ産物を一緒にＭｅｖＢオペロンにスプライシングした。３’Ａオーバーハングの付加の後、ＭｅｖＢオペロンをＴＡクローニングベクターｐＣＲ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）にライゲートした。ＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてクローニング構築物を消化することによりＭｅｖＢオペロンを再度切除し、ＭｅｖＢオペロンを含むおよそ４．２ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製し、精製されたＤＮＡフラグメントをベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−１のＰｓｔＩ制限部位にライゲートして（Ｋｏｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １６６（１）：  １７５−１７６  （１９９５））、発現プラスミドｐＭｅｖＢ−Ｃｍを得た。
【０１５０】
ＭＢＩオペロンをｐＢＢＲ１ＭＣＳ−３ベクターに挿入することにより、発現プラスミドｐＭＢＩを生成させた。ＭＢＩオペロンは、ＭｅｖＢオペロンと同じ酵素に加え、ＩＰＰからＤＭＡＰＰへの変換を触媒するイソペンテニルピロホスファターゼイソメラーゼもコードする。ＭＢＩオペロンは、５’末端にＸｍａＩ制限部位を含むプライマーを用いて、大腸菌のゲノムＤＮＡからｉｄｉ遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ１１９７１５）をＰＣＲ増幅することにより生成させた。ＸｍａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてＰＣＲ産物を消化し、ｉｄｉコード配列を含む０．５ｋｂ  ＤＮＡフラグメントをゲル精製して、精製されたＤＮＡフラグメントを発現プラスミドｐＭｅｖＢ−ＣｍのＸｍａＩ制限部位に挿入して、ｉｄｉをＭｅｖＢオペロンの３’末端に配置させた。その後、ＭＢＩオペロンをベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ−３のＳａｌＩおよびＳａｃＩ制限部位にサブクローニングして（Ｋｏｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １６６（１）：  １７５−１７６  （１９９５））、発現プラスミドｐＭＢＩを得た。
【０１５１】
ｉｓｐＡ遺伝子を発現プラスミドｐＭＢＩに挿入することにより、発現プラスミドｐＭＢＩＳを生成させた。ｉｓｐＡ遺伝子は、ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰのＦＰＰへの縮合を触媒するファルネシルピロリン酸シンターゼをコードする。ｉｓｐＡ遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｄ００６９４，領域：４８４．．１３８３）を、ＳａｃII制限部位を含むフォワードプライマーおよびＳａｃＩ制限部位を含むリバースプライマーを用いて、大腸菌のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。ＳａｃIIおよびＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、増幅されたＰＣＲ産物を消化し、ｉｓｐＡコード配列を含む０．９ｋｂ  ＤＮＡフラグメントをゲル精製して、精製されたＤＮＡフラグメントをｐＭＢＩのＳａｃIIおよびＳａｃＩ制限部位にライゲートして、ｉｄｉのｉｓｐＡコード配列の３’およびＭｅｖＢオペロンを配置させて、発現プラスミドｐＭＢＩＳを得た。
【０１５２】
ＭｅｖＴ６６オペロンをｐＡＭ２９ベクターに挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ２５を生成させた。ｐ１５Ａ複製起点およびカナマイシン耐性付与遺伝子をｐＺＳ２４−ＭＣＳ１ベクター（Ｌｕｔｚ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ  （１９９７）  Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：１２０３−１２１０）からオリゴヌクレオチド生成ｌａｃＵＶ５プロモータを用いて組み立てることにより、ｐＡＭ２９ベクターを生成させた。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼを用いて、ＭｅｖＴ６６オペロンを含むＤＮＡ合成構築物（先のｐＡＭ３６−ＭｅｖＴ６６に関する記載を参照）を消化し、ＭｅｖＴ６６オペロンを含むおよそ４．２ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製して、精製されたＤＮＡフラグメントをｐＡＭ２９のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII制限部位にライゲートして、発現プラスミドｐＡＭ２５を得た。
【０１５３】
発現プラスミドｐＡＭ２５内で、サッカロマイセス・セレビシエＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼのトランケート型をコードするＨＭＧ１遺伝子のトランケート型コード配列を、スタフィロコッカス・アウレウスＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼをコードするｍｖａＡ遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＢＡ００００１７，領域：２６８８９２５．．２６８７６４８）と交換することにより、発現プラスミドｐＡＭ４１を生成させた。ｍｖａＡ遺伝子のコード配列を、ＳｐｅＩ制限部位を含むプライマーを用いて、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（ＡＴＣＣ７００６９）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させ、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてＰＣＲ産物を消化し、ｍｖａＡコード配列を含むおよそ１．３ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製した。ＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼを用いて発現プラスミドｐＡＭ２５を消化し、末端のオーバーハングをＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化し、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて直線状ベクターバックボーンを部分的に消化し、トランケート型ＨＭＧ１コード配列を欠くおよそ４．８ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製した。精製されたＤＮＡフラグメントをライゲートして、発現プラスミドｐＡＭ４１を得た。
【０１５４】
ＭＢＩＳオペロンを発現プラスミドｐＡＭ３６−ＭｅｖＴ６６に挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ４３を生成させた。５’ＸｈｏＩ制限部位およびＰａｃＩ制限部位を含むプライマーを用いて、ＭＢＩＳオペロンをｐＭＢＩＳからＰＣＲ増幅させて、ＸｈｏＩおよびＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて増幅されたＰＣＲ産物を消化して、ＭＢＩＳオペロンを含むおよそ５．４ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製して、ゲル精製されたＤＮＡフラグメントを発現プラスミドｐＡＭ３６−ＭｅｖＴ６６のＸｈｏｌ  ＰａｃＩ制限部位にライゲートして、発現プラスミドｐＡＭ４３を得た。
【０１５５】
ｌａｃＵＶ５プロモータを、発現プラスミドｐＡＭ４３のＭＢＩＳおよびＭｅｖＴ６６オペロンの前に挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ４５を生成させた。ｌａｃＵＶ５プロモータをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメントを、オリゴヌクレオチドから合成し、ｐＡＭ４３のＡｓｃＩ  ＳｆｉＩおよびＡｓｉＳＩ  ＸｈｏＩ制限部位に挿入して、発現プラスミドｐＡＭ４５を得た。
【０１５６】
発現プラスミドｐＡＭ４１において、サッカロマイセス・セレビシエＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするＥＲＧ１３遺伝子のコード配列を、スタフィロコッカス・アウレウスＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードするｍｖａＳ遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＢＡ００００１７，領域：２６８９１８０．．２６９０３４６）と交換することにより、発現プラスミドｐＡＭ５２を生成させた。ｍｖａＳ遺伝子のコード配列を、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス（ＡＴＣＣ  ７００６９）ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させて、増幅されたＤＮＡフラグメントをＰＣＲプライマーとして用いて、Ｇｅｉｓｅｒ他（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：８８−９２  （２００１））の方法によりｐＡＭ４１内のＨＭＧ１遺伝子のコード配列を交換することにより、発現プラスミドｐＡＭ５２を得た。
【０１５７】
発現プラスミドｐＡＭ４５内で、ＭｅｖＴ６６オペロンを発現プラスミドｐＡＭ５２の（ａｔｏＢ（ｏｐｔ）：ｍｖａＳ：ｍｖａＡ）オペロンと交換することにより、発現プラスミドｐＡＭ９７を生成させた。ＡｓｉＳＩおよびＳｆｉＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、発現プラスミドｐＡＭ４５を消化して、ＭｅｖＴ６６オペロンを欠くおよそ８．３ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製した。ＳｆｉＩおよびＡｓｉＳＩ制限部位を含むプライマーを用いて、ｐＡＭ５２の（ａｔｏＢ（ｏｐｔ）：ｍｖａＳ：ｍｖａＡ）オペロンをＰＣＲ増幅させて、ＳｆｉＩおよびＡｓｉＳＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてＰＣＲ産物を消化し、（ａｔｏＢ（ｏｐｔ）：ｍｖａＳ：ｍｖａＡ）オペロンを含むおよそ３．８ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製した。精製されたＤＮＡフラグメントをライゲートして、発現プラスミドｐＡＭ９７を得た。
【０１５８】
発現プラスミドｐＡＭ９７内で、サッカロマイセス・セレビシエのメバロン酸キナーゼをコードするＥＲＧ１２遺伝子のコード配列を、スタフィロコッカス・アウレウスのメバロン酸キナーゼをコードするｍｖａＫ１遺伝子のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＧ０２４２４）と交換することにより、発現プラスミドｐＡＭ７６５を生成させた。スタフィロコッカス・アウレウスのメバロン酸キナーゼは、ＦＰＰによるフィードバック阻害に対して感受性が低く（Ｖｏｙｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １８６：６１−６７）、そのため発現プラスミドｐＡＭ７６５は、発現プラスミドｐＡＭ９７よりも宿主細胞内で多くのＦＰＰ産生を起こすことができる。ｍｖａＫ１遺伝子のコード配列を発現プラスミドからＰＣＲ増幅させ、およそ０．９ｋｂのＰＣＲ産物をゲル精製した。ＰＭＫ−ＰＭＤ−ｉｄｉ−ｉｓｐＡオペロンを、ｐＡＭ９７からＰＣＲ増幅させ、およそ４．１ｋｂのＰＣＲ産物をゲル精製した。精製されたＰＣＲ産物を一緒にスティッチングし、スティッチングされた産物をゲル精製した。ＸｈｏＩおよびＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、精製されたスティッチング産物およびｐＡＭ９７を消化し、消化されたＤＮＡフラグメントをゲル精製し、精製されたＤＮＡフラグメントをライゲートして、発現プラスミドｐＡＭ７６５（配列番号１）を得た。
【０１５９】
ベクターｐＡＭ４７１のＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ２０＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲインサートをベクターｐＡＭ４６６に挿入することにより、プラスミドｐＡＭ４８９を生成させた。サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ２０遺伝子のコード配列（ＥＲＧ２０ヌクレオチド位置１から１２０８まで；ＡＴＧ開始コドンのＡは、ヌクレオチド１である）（ＥＧＲ２０）と、サッカロマイセス・セレビシエの分岐したＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモータを含むゲノム遺伝子座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８まで）（ＰＧＡＬ）と、サッカロマイセス・セレビシエのＨＭＧ１遺伝子のトランケート型コード配列（ＨＭＧ１ヌクレオチド位置１５８６から３３２３まで）（ｔＨＭＧＲ）とを含むＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ２０＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲを、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に挿入することにより、ベクターｐＡＭ４７１を生成させた。ヌクレオチド位置−８５６から位置５４８まで伸長するサッカロマイセス・セレビシエの野生型ＴＲＰ１遺伝子座のセグメントを含み、塩基−２２６から−２２５までの非ネイティブ内部ＸｍａＩ制限部位を持つ、ＤＮＡフラグメントＴＲＰ１−８５６  ｔｏ  ＋５４８を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｑ  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）に挿入することにより、ベクターｐＡＭ４６６を生成させた。表１にまとめるように、ＰＣＲ増幅によりＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ２０＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲおよびＴＲＰ１−８５６  ｔｏ  ＋５４８を生成させた。ｐＡＭ４８９の構築については、ＸｍａＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）を用いてｐＡＭ４７１  ４００ｎｇおよびｐＡＭ４６６  １００ｎｇを完全に消化し、ＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ２０＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲインサートおよび直線化ｐＡＭ４６６ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製して、精製されたインサートの４モル当量を精製された直線化ベクター１モル当量とライゲートして、ｐＡＭ４８０を得た。図１Ｒに、ｐＡＭ４８９のＴＲＰ１＿ＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ２０＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲ＿ＴＲＰインサートのマップおよび配列番号２のヌクレオチド配列を示す。
【表１】
0005580488.tif 000002
【０１６０】
ベクターｐＡＭ４７２のＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ１３＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲインサートをベクターｐＡＭ４６７に挿入することにより、プラスミドｐＡＭ４９１を生成させた。サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１３遺伝子のコード配列（ＥＲＧ１３ヌクレオチド位置１から１６２６まで）（ＥＧＲ１３）と、サッカロマイセス・セレビシエの分岐したＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモータを含むゲノム遺伝子座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８まで）（ＰＧＡＬ）と、サッカロマイセス・セレビシエのＨＭＧ１遺伝子のトランケート型ＯＲＦ（ＨＭＧ１ヌクレオチド位置１５８６から３３２３まで）（ｔＨＭＧＲ）とを含むＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ１３＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲを、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターに挿入することにより、ベクターｐＡＭ４７２を生成させた。ヌクレオチド位置−７２３から位置−２２４まで伸長するサッカロマイセス・セレビシエの野生型ＵＲＡ３遺伝子座のセグメントを含み、塩基−２２４から−２２３までの非ネイティブ内部ＸｍａＩ制限部位を持つ、ＤＮＡフラグメントＵＲＡ３−７２３  ｔｏ  ７０１を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することにより、ベクターｐＡＭ４６７を生成させた。表２にまとめるように、ＰＣＲ増幅によりＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ１３＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲおよびＵＲＡ３−７２３  ｔｏ  ７０１を生成させた。ｐＡＭ４９１の構築については、ＸｍａＩ制限酵素を用いてｐＡＭ４７２  ４００ｎｇおよびｐＡＭ４６７  １００ｎｇを完全に消化し、ＥＲＧ１３−ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートおよび直線化ｐＡＭ４６７ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製して、精製されたインサートの４モル当量を精製された直線化ベクター１モル当量とライゲートして、ｐＡＭ４９１を得た。図１Ｓに、ｐＡＭ４９１のＵＲＡ３＿ＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ１３＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲ＿ＵＲＡ３インサートのマップおよび配列番号１３のヌクレオチド配列を示す。
【表２】
0005580488.tif 000003
【０１６１】
ベクターｐＡＭ４７３のＰＧＡＬ１０−ＩＤＩ１＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲインサートをベクターｐＡＭ４６８に挿入することにより、プラスミドｐＡＭ４９３を生成させた。サッカロマイセス・セレビシエのＩＤＩ１遺伝子のコード配列（ＩＤＩ１ヌクレオチド位置１から１０１７まで）（ＩＤＩ１）と、サッカロマイセス・セレビシエの分岐したＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモータを含むゲノム遺伝子座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８まで）（ＰＧＡＬ）と、サッカロマイセス・セレビシエのＨＭＧ１遺伝子のトランケート型ＯＲＦ（ＨＭＧ１ヌクレオチド位置１５８６から３３２３まで）（ｔＨＭＧＲ）とを含むＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＩＤＩ１＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲを、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターに挿入することにより、ベクターｐＡＭ４７３を生成させた。ヌクレオチド位置−２２５から位置６５３まで伸長するサッカロマイセス・セレビシエの野生型ＡＤＥ１遺伝子座のセグメントを含み、塩基−２２６から−２２５までの非ネイティブ内部ＸｍａＩ制限部位を持つ、ＤＮＡフラグメントＡＤＥ１−８２５  ｔｏ  ６５３を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することにより、ベクターｐＡＭ４６８を生成させた。表３にまとめるように、ＰＣＲ増幅によりＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＩＤＩ１＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲおよびＡＤＥ１−８２５  ｔｏ  ６５３を生成させた。ｐＡＭ４９３の構築については、ＸｍａＩ制限酵素を用いてｐＡＭ４７３  ４００ｎｇおよびｐＡＭ４６８  １００ｎｇを完全に消化し、ＰＧＡＬ−ＩＤＩ１＿ＰＧＡＬ−ｔＨＭＧＲインサートおよび直線化ｐＡＭ４６７ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製して、精製されたインサートの４モル当量を精製された直線化ベクター１モル当量とライゲートして、ｐＡＭ４９３を得た。図１Ｔに、ｐＡＭ４９３のＡＤＥ１＿ＰＧＡＬ１０−ＩＤＩ１＿ＰＧＡＬ１−ｔＨＭＧＲ＿ＡＤＥ１インサートのマップおよび配列番号２４のヌクレオチド配列を示す。
【表３】
0005580488.tif 000004
【０１６２】
ベクターｐＡＭ４７４のＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ１０＿ＰＧＡＬ１−ＥＲＧ１２インサートをベクターｐＡＭ４６９に挿入することにより、プラスミドｐＡＭ４９５を生成させた。サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１０遺伝子のコード配列（ＥＲＧ１０ヌクレオチド位置１から１３４７まで）（ＥＲＧ１０）と、サッカロマイセス・セレビシエの分岐したＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモータを含むゲノム遺伝子座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８まで）（ＰＧＡＬ）と、サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１２遺伝子のコード配列（ＥＲＧ１２ヌクレオチド位置１から１４８２まで）（ＥＲＧ１２）とを含むＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ１０＿ＰＧＡＬ１−ＥＲＧ１２を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターに挿入することにより、ベクターｐＡＭ４７４を生成させた。ヌクレオチド位置−３２から位置−１０００まで伸長し、ヌクレオチド位置５０４から位置１１０３まで伸長する、サッカロマイセス・セレビシエのＨＩＳ遺伝子座の２つのセグメントと、ＨＩＳＭＸマーカと、ＨＩＳ５０４  ｔｏ  −１１０３配列からＨＩＳＭＸマーカまでの非ネイティブＸｍａＩ制限部位と、を含むＤＮＡフラグメントＨＩＳ３−３２  ｔｏ  １０００＿ＨＩＳＭＸ＿ＨＩＳ３５０４  ｔｏ  −１１０３を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することにより、ベクターｐＡＭ４６９を生成させた。表４にまとめるように、ＰＣＲ増幅によりＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ１０＿ＰＧＡＬ１−ＥＲＧ１２およびＨＩＳ３−３２  ｔｏ  １０００＿ＨＩＳＭＸ＿ＨＩＳ３−５０４  ｔｏ  １１０３を生成させた。ｐＡＭ４９５の構築については、ＸｍａＩ制限酵素を用いてｐＡＭ４７４  ４００ｎｇおよびｐＡＭ４６９  １００ｎｇを完全に消化し、ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１０＿ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１２インサートおよび直線化ｐＡＭ４６９ベクターに対応するＤＮＡフラグメントをゲル精製して、精製されたインサートの４モル当量を精製された直線化ベクター１モル当量とライゲートして、ｐＡＭ４９５を得た。図１Ｄに、ｐＡＭ４９５のＨＩＳ３＿ＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ１０＿ＰＧＡＬ１−ＥＲＧ１２＿ＨＩＳ３インサートのマップおよび配列番号３４のヌクレオチド配列を示す。
【表４】
0005580488.tif 000005
【０１６３】
ベクターｐＡＭ４７５のＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ８＿ＰＧＡＬ１−ＥＲＧ１９インサートをベクターｐＡＭ４７０に挿入することにより、プラスミドｐＡＭ４９７を生成させた。サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ８遺伝子のコード配列（ＥＲＧ８ヌクレオチド位置１から１５１２まで）（ＥＲＧ８）と、サッカロマイセス・セレビシエの分岐したＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモータを含むゲノム遺伝子座（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６８まで）（ＰＧＡＬ）と、サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１９遺伝子のコード配列（ＥＲＧ１９ヌクレオチド位置１から１３４１まで）（ＥＲＧ１９）とを含むＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ８＿ＰＧＡＬ１−ＥＲＧ１９を、ＴＯＰＯ  Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＩＩクローニングベクターに挿入することにより、ベクターｐＡＭ４７５を生成させた。ヌクレオチド位置−１００から位置−４５０まで伸長し、ヌクレオチド位置１０９６から位置１７７０まで伸長する、サッカロマイセス・セレビシエのＬＥＵ２遺伝子座の２つのセグメントと、ＨＩＳＭＸマーカと、ＬＥＵ２１０９６  ｔｏ  １７７０配列からＨＩＳＭＸマーカまでの非ネイティブＸｍａＩ制限部位と、を含むＤＮＡフラグメントＬＥＵ２−１００  ｔｏ  ４５０＿ＨＩＳＭＸ＿ＬＥＵ２１０９６  ｔｏ  １７７０を、ＴＯＰＯ  ＴＡ  ｐＣＲ２．１クローニングベクターに挿入することにより、ベクターｐＡＭ４７０を生成させた。表５にまとめるように、ＰＣＲ増幅によりＤＮＡフラグメントＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ８＿ＰＧＡＬ１−ＥＲＧ１９およびＬＥＵ２−１００  ｔｏ  ４５０＿ＨＩＳＭＸ＿ＬＥＵ２−１０９６  ｔｏ  １７７０を生成させた。ｐＡＭ４９７の構築については、ＸｍａＩ制限酵素を用いてｐＡＭ４７５  ４００ｎｇおよびｐＡＭ４７０  １００ｎｇを完全に消化し、ＥＲＧ８＿ＰＧＡＬ−ＥＲＧ１９インサートおよび直線化ｐＡＭ４７０ベクターに対応するＤＮＡフラグメントを精製して、精製されたインサートの４モル当量を精製された直線化ベクター１モル当量とライゲートして、ｐＡＭ４９７を得た。図１Ｖに、ｐＡＭ４９７のＬＥＵ２＿ＰＧＡＬ１０−ＥＲＧ８＿ＰＧＡＬ１−ＥＲＧ１９＿ＬＥＵ２インサートのマップおよび配列番号４７のヌクレオチド配列を示す。
【表５】
0005580488.tif 000006
【０１６４】
ベクターＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ４０：１８３−１９０  （１９８５））から、２つのＮｃｏＩ制限部位を除去することにより、ベクターｐＡＭ４１９を生成させた。Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）を用い、製造業者の推奨するプロトコルに従って、最初に、ベクターｐＴｒｃ９９Ａのマルチクローニング部位のＮｃｏＩ制限部位をＮｄｅＩ制限部位に変換した。その後、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔを用いて、ベクターＴｒｃ９９Ａの位置２６９９のマルチクローニング部位の外側の第二のＮｄｅＩ制限部位も除去して、ベクターｐＡＭ１４１９（配列番号６０）を得た。
【０１６５】
ベクターｐＡＭ１４１９にＦＳ＿Ｓ２Ｄ−Ｅｃコード配列を挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ１４２１（図１３Ａ）を生成させた。ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてベクターｐＡＭ１４１９を消化し、およそ４．１５ｋｂの直線化ベクターバックボーンをゲル精製して、精製されたＤＮＡフラグメントをＣａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｓｅ  （ＣＩＰ）で消化して、５’リン酸基を除去した。位置２にセリンからアスパラギン酸塩へのアミノ酸置換（Ｓ２Ｄ）を含み、大腸菌における発現のためにフランキングＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ制限部位でコドン最適化されたアルテミシア・アンヌアのｂ−ファルネセンシンターゼ遺伝子(ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＹ８３５３９８；  Ｐｉｃａｕｄ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００５)を、他の発現プラスミドからＰＣＲ増幅され、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、その後、ゲル精製した。精製された直線化ベクターおよび消化したＰＣＲ産物を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼでライゲートして、発現プラスミドｐＡＭ１４２１を得た。
【０１６６】
ｐＲＳ４２５−Ｇａｌ１ベクター（Ｍｕｍｂｅｒｇ  ｅｔ．  ａｌ．  （１９９４）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．  ２２（２５）：  ５７６７−５７６８）内に、サッカロマイセス・セレビシエ（ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列：配列番号６８）における発現のためにコドン最適化されたアルテミシア・アンヌアのβ−ファルネセンシンターゼ遺伝子のコード配列（ ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＹ８３５３９８）を挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ３５３を生成させた。ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を合成により生成させて、５’ＢａｍＨＩおよび３’ＸｈｏＩ制限部位によりフランキングすると、標準ｐＵＣまたはｐＡＣＹＣ起源ベクターなどのクローニングベクターの適合性のある制限部位にクローニングすることができた。ＢａｍＨＩ  ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて構築物を消化することによりＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を再度切除して、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を含むおよそ１．７ｋｂのＤＮＡフラグメントをゲル精製して、精製されたＤＮＡフラグメントをｐＲＳ４２５−Ｇａｌ１ベクターのＢａｍＨＩ  ＸｈｏＩ制限部位にライゲートして、発現プラスミドｐＡＭ３５３を得た。
【０１６７】
ベクターｐＡＭ１７８（配列番号６９）内にＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ４０４（図１３Ｂ）を生成させた。ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてベクターｐＡＭ１７８を消化して、およそ７．３ｋｂのベクターバックボーンをゲル精製した。フランキングＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ制限部位を有するＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列をｐＡＭ３５３からＰＣＲ増幅させて、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてＰＣＲ産物を消化して、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を含むおよそ１．７ｋｂ  ＤＮＡフラグメントをゲル精製した。２つのゲル精製されたＤＮＡフラグメントをライゲートして、発現プラスミドｐＡＭ４０４を得た。
【０１６８】
表６および図１３Ｂに示された発現プラスミドを、発現プラスミドｐＡＭ４０４において、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を、示されたコード配列と交換することにより生成させた。ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてベクターｐＡＭ４０４を消化して、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を欠くおよそ７．３ｋｂの直線化ベクターバックボーンをゲル精製した。直線化ｐＡＭ４０４ベクターバックボーンの末端配列と重複したプライマーを用いて、ＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃコード配列を別の発現プラスミドからＰＣＲ増幅させた。ＩＳ＿Ｐｎ＿ＳｃおよびＴＤＳ＿Ｐｎ＿Ｓｃコード配列を、他の発現ベクターからの制限エンドヌクレアーゼ消化により抽出した。ＤＮＡフラグメントをゲル精製した。菌株Ｙ５３９を形質転換して、唯一の炭素供給源として２％グルコースを含むＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＳＭ）の、ロイシンを含まないもの（ＣＳＭ−Ｌ）で宿主細胞形質転換物を選択することにより、相同組換えを介して、ＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃコード配列を精製された直線化ベクターに挿入した。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、ＩＳ＿Ｐｎ＿ＳｃおよびＴＤＳ＿Ｐｎ＿Ｓｃコード配列を、精製された直線化ベクターにライゲートした。
【表６】
0005580488.tif 000007
【０１６９】
発現プラスミドｐＡＭ４０４にＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ１８１２（配列番号７２；図１３Ｃ）を生成させた。ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて発現プラスミドｐＡＭ４０４を消化して、およそ９．０ｋｂ直線化プラスミドをゲル精製した。直線化ｐＡＭ４０４の末端配列と重複したプライマーを用いて、ＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を発現プラスミドｐＡＭ１７９５からＰＣＲ増幅させて、ＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を含む１．２ｋｂ  ＰＣＲ産物をゲル精製した。菌株Ｙ５３９を両方の精製されたＤＮＡフラグメントで形質転換して、唯一の炭素供給源として２％グルコースを含むＣＳＭ−Ｌで宿主細胞形質転換物を選択することにより、相同組換えを介して、２つのゲル精製されたＤＮＡフラグメントをライゲートした。
【０１７０】
発現プラスミドｐＡＭ１８１２において、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を、示されたコード配列と交換することにより、表７および図１３Ｃに示された発現プラスミドを生成させた。ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて発現プラスミドｐＡＭ１８１２を消化して、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を欠くおよそ７．２ｋｂの直線化ベクターバックボーンをゲル精製した。コード配列を、他の発現ベクターからのＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼ消化により抽出し、コード配列を含むＤＮＡフラグメントをゲル精製した。最後に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、精製されたＤＮＡフラグメントをライゲートして、発現プラスミドを得た。
【表７】
0005580488.tif 000008
【０１７１】
発現プラスミドｐＡＭ１７９５にＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ１８１３（図１３Ｄ）を生成させた。ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて発現プラスミドｐＡＭ１７９５を消化して、およそ８．４ｋｂ直線化プラスミドをゲル精製した。直線化ｐＡＭ４０４の末端配列と重複したプライマーを用いて、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列をＰＣＲ増幅させて、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を含むＰＣＲ産物をゲル精製した。それを菌株Ｙ５３９内に形質転換して、唯一の炭素供給源として２％グルコースを含むＣＳＭ−Ｌで宿主細胞形質転換物を選択することにより、相同組換えを介して、精製されたＰＣＲ産物をライゲートした。ＴＤＳおよびＦＳのプロモータが入れ替えられていることを除き、ｐＡＭ１８１２およびｐＡＭ１８１３が同一であることに留意されたい。異なる強度のプロモータを用いれば、ファルネセン／トリコジエン比の変動が可能である。
【０１７２】
ベクターｐＲＳ４１５にＩＳ＿Ｐｎ＿Ｓｓコード配列を挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ１６５３を生成させた。ＮｏｔＩ制限ドヌクレアーゼを用いて発現プラスミドｐＡＭ１５４９を消化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端を生成させ、ＮｏｔＩ制限ドヌクレアーゼを用いて再度消化し、ＩＳ＿Ｐｎ＿Ｓｃコード配列およびＰＧＡＬ配列を含む２．８ｋｂＤＮＡフラグメントをゲル精製した。ＮｏｔＩおよびＡｌｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてベクターｐＲＳ４１５を消化して、６．０ｋｂの直線化されたベクターバックボーンをライゲートし、発現プラスミドｐＡＭ１６５３を得た。
【０１７３】
発現プラスミドｐＡＭ１６５３のマルチクローニング部位から特定の制限部位を排除することにより、発現プラスミドｐＡＭ１７３４を生成させた。ＸｂａＩおよびＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼを用いて発現プラスミドｐＡＭ１６５３を消化し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメントで処理して平滑末端を生成させ、最後に、自己ライゲートさせて、発現プラスミドｐＡＭ１７３４を得た。
【０１７４】
発現プラスミドｐＡＭ１７３４内にＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃコード配列を挿入することにより、発現プラスミドｐＡＭ１７６４（配列番号７４）を生成させた。ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて発現プラスミドｐＡＭ１７３４を消化し、およそ６．９ｋｂの直線化プラスミドをゲル精製した。直線化ｐＡＭ１７３４の末端配列と重複したプライマーを用いて、ＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃコード配列を発現プラスミドｐＡＭ１４２１からＰＣＲ増幅させて、ＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃコード配列を含む１．７ｋｂ  ＰＣＲ産物をゲル精製した。菌株Ｙ５３９を両方の精製されたＤＮＡフラグメントで形質転換して、唯一の炭素供給源として２％グルコースを含むＣＳＭ−Ｌで宿主細胞形質転換物を選択することにより、相同組換えを介して、２つのゲル精製されたＤＮＡフラグメントをライゲートした。
【０１７５】
発現プラスミド１４１９からｌａｃＩ遺伝子を欠失させることにより、発現プラスミドｐＡＭ１６６８を生成させた。ＥｃｏＲＶおよびＳａｐＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて発現プラスミドｐＡＭ１４１９を消化して、Ｅｎｄ−Ｉｔ  ＤＮＡ  Ｅｎｄ−Ｒｅｐａｉｒ  Ｋｉｔ  （Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を用いて、製造業者の推奨するプロトコルに従い、消化したプラスミドを修復して、末端修復されたベクターを自己ライゲートし、ベクターｐＡＭ１６６８を得た。
【０１７６】
発現プラスミドｐＡＭ１６６８に示されたコード配列を挿入ることにより、表８および図１３Ｅに示された発現プラスミドを生成させた。ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて発現プラスミドｐＡＭ１６６８を消化して、およそ２．９ｋｂの直線化ベクターバックボーンをゲル精製した。直線化ｐＡＭ１６６８の末端配列と重複したプライマーを用いてそのコード配列をＰＣＲ増幅させて、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いてＰＣＲ産物を消化し、コード配列を含む消化したＰＣＲ産物をゲル精製した。精製された直線化ベクターおよび消化したＰＣＲ産物を最後にライゲートして、発現プラスミドを得た。
【表８】
0005580488.tif 000009
【０１７７】
構築物Ａを、表９に記載されたとおりＰＣＲ増幅により生成させた。その構築物は、サッカロマイセス・セレビシエのＮＤＴ８０遺伝子の上流領域（ＮＤＴ８０ヌクレオチド位置−１７５から−９５２まで）、サッカロマイセス・セレビシエのＬＥＵ２マーカ（ＬＥＵ２ヌクレオチド位置−６６１から＋１５４１まで）、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１遺伝子のプロモータ（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６７まで）、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列、サッカロマイセス・セレビシエのＣＹＣ１遺伝子のターミネータ（ＣＹＣ１ヌクレオチド位置＋３３１から＋５２１まで）、およびサッカロマイセス・セレビシエのＮＤＴ８０遺伝子の下流位置（ＮＤＴ８０ヌクレオチド位置＋１６８５から＋２４７１まで）を含む。図１Ｗに、構築物Ａのマップおよび配列番号８６のヌクレオチド配列を示す。
【表９】
0005580488.tif 000010
【０１７８】
構築物Ｂ（図IX）を、ＰＣＲ増幅により生成させた。その構築物は、サッカロマイセス・セレビシエのＮＤＴ８０遺伝子の上流領域（ＮＤＴ８０ヌクレオチド位置−１７５から−９５２まで）、サッカロマイセス・セレビシエのＬＥＵ２マーカ（ＬＥＵ２ヌクレオチド位置−６６１から＋１５４１まで）、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１遺伝子のプロモータ（ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−６６７まで）、ＨＩＳＧマーカ、サッカロマイセス・セレビシエのＣＹＣ１遺伝子のターミネータ（ＣＹＣ１ヌクレオチド位置＋３３１から＋５２１まで）、およびサッカロマイセス・セレビシエのＮＤＴ８０遺伝子の下流位置（ＮＤＴ８０ヌクレオチド位置＋１６８５から＋２４７１まで）を含む。
【０１７９】
構築物Ｄを、表１０に記載されたとおりＰＣＲ増幅により生成させた。その構築物は、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１遺伝子のプロモータによりフランクされたコード配列（ＰＧＡＬ１；ＧＡＬ１ヌクレオチド位置−１から−４５まで）、サッカロマイセス・セレビシエのＰＧＫ１遺伝子のターミネータ（ＴＰＧＫ１：ＰＧＫ１ヌクレオチド位置＋１１５９から＋１５４７まで）、およびサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１０遺伝子のプロモータによりフランクされたＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列（ＰＧＡＬ１０；ＧＡＬ１０ヌクレオチド位置−１から−２０２まで）およびサッカロマイセス・セレビシエのＡＤＨ１遺伝子のターミネータ（ＴＡＤＨ１：ＡＤＨ１ヌクレオチド位置−１から−１６６まで）を含む。図１Ｚに、構築物Ｄのマップおよび配列番号１１６のヌクレオチド配列を示す。
【表１０】
0005580488.tif 000011
【０１８０】
ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）ＢｓｔＺ１７Ｉ制限酵素（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ，  Ｈａｍｐｔｏｎ，  ＮＨ）を用いて消化したベクターｐＡＭ５５２（配列番号１５６）１００ｎｇ、および構築物Ｄ  ３００ｎｇで、指数増殖期のＹ３１９８細胞を形質転換することにより、発現プラスミドｐＡＭ２１９１を作製した。宿主細胞形質転換物を、唯一の炭素供給源として２％グルコースを含むＣＳＭ−Ｌ寒天プレートに播種して、個々のコロニーが約１ｍｍ径になるまで３０℃で３日間インキュベートした。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標）  Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  II（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｏｒａｎｇｅ，  ＣＡ）を用いて、これらのコロニーからＤＮＡを採取して、採取されたＤＮＡを化学的に拮抗するＸＬ１Ｂｌｕｅ大腸菌（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．  ，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）内に形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、カルベニシリンを補充したＬｙｓｏｇｅｎｙブロス寒天培地に播種して、個々のコロニーが目視できるようになるまで３７℃で２４時間インキュベートした。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いて、これらのコロニーからプラスミドＤＮＡを採取し、プラスミドＤＮＡを配列決定して、発現プラスミドｐＡＭ２１９１が正しく作製されていることを確認した。
【０１８１】
実施例２
この実施形態は、テルペンシンターゼ変異体の生成および特徴付けに有用となる酵母菌株を生成する方法を説明する。
【０１８２】
酵母菌株Ｙ００２およびＹ００３（それぞれＣＥＮ．ＰＫ２バックグランドＭＡＴ  Ａ  またはＭＡＴ  α；ｕｒａ３−５２；ｔｒｐ１−２８９；ｌｅｕ２−３，１１２；ｈｉｓ３Δ１；ＭＡＬ２−８Ｃ；ＳＵＣ２；ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６：７０６−７１４）を、サッカロマイセス・セレビシエのＭＥＴ３遺伝子のプロモータと交換することにより、菌株Ｙ９３（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ９４（ＭＡＴ  α）を生成させた。この目的のために、クルイベロマイセス・ラクチスのＴｅｆ１遺伝子のプロモータおよびターミネータによりフランクされたカナマイシン耐性マーカ（ＫａｎＭＸ）と、ＥＲＧ９コード配列と、ＥＲＧ９プロモータのトランケート型セグメント（ｔｒｕｎｅ．  ＰＥＲＧ９）と、ＥＲＧ９の上流および下流配列によりフランクされたＭＥＴ３プロモータ（ＰＭＥＴ３）と、を含む組み込み構築物ｉ８（配列番号８７）で、指数増殖期のＹ００２およびＹ００３細胞を形質転換した（図１Ａ）。宿主細胞の形質転換物を０．５μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を含む培地上で選択し、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ９３およびＹ９４を得た。
【０１８３】
それぞれ菌株Ｙ９３およびＹ９４におけるＡＤＥ１遺伝子のコード配列を、カンジダ・グラブラタのＬＥＵ２遺伝子のコード配列（ＣｇＬＥＵ２）と交換することにより、菌株Ｙ１７６（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ１７７（ＭＡＴ  α）を生成させた。この目的のために、プライマー６１−６７−ＣＰＫ０６６−Ｇ（配列番号８８）および ６１−６７−ＣＰＫ０６７−Ｇ（配列番号８９）を用いて、３．５ｋｂ  ＣｇＬＥＵ２ゲノム遺伝子座をカンジダ・グラブラタゲノムＤＮＡ（ＡＴＣＣ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）からＰＣＲ増幅させて、ＰＣＲ産物を指数増殖期のＹ９３およびＹ９４細胞に形質転換した。宿主細胞の形質転換物をＣＳＭ−Ｌ上で選択し、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ１７６およびＹ１７７を得た。
【０１８４】
それぞれサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のガラクトース誘導性プロモータの調節制御下で、サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１３、ＥＲＧ１０、およびＥＲＧ１２遺伝子のコード配列、ならびにサッカロマイセス・セレビシエのＨＭＧ１遺伝子のトランケート型コード配列の追加のコピーを、菌株Ｙ１７６に導入することにより、菌株Ｙ１８８を生成させた。この目的のために、指数増殖期のＹ１７６細胞を、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ）で消化した発現プラスミドｐＡＭ４９１およびｐＡＭ４９５  ２μｇで形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、ウラシルおよびヒスチジンを欠くＣＳＭ（ＣＳＭ−Ｕ−Ｈ）上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ１８８を得た。
【０１８５】
それぞれサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のガラクトース誘導性プロモータの調節制御下で、サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ２０、ＥＲＧ８、およびＥＲＧ１９遺伝子のコード配列、ならびにサッカロマイセス・セレビシエのＨＭＧ１遺伝子のトランケート型コード配列の追加のコピーを、菌株Ｙ１７７に導入することにより、菌株Ｙ１８９を生成させた。この目的のために、指数増殖期のＹ１８８細胞を、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した発現プラスミドｐＡＭ４８９およびｐＡＭ４９７  ２μｇで形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、トリプトファンおよびヒスチジンを欠くＣＳＭ（ＣＳＭ−Ｔ−Ｈ）上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ１８９を得た。
【０１８６】
それぞれサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のガラクトース誘導性プロモータの調節制御下で、菌株Ｙ１８８とＹ１８９を交配させて、サッカロマイセス・セレビシエのＩＤＩ１遺伝子のコード配列、およびサッカロマイセス・セレビシエのＨＭＧ１遺伝子のトランケート型コード配列の追加のコピーを導入することにより、菌株Ｙ２３８を生成させた。この目的のために、菌株Ｙ１８８およびＹ１８９のおよそ１×１０７細胞を、ＹＰＤ培地プレート上で、室温で６時間混合して、二倍体細胞をＣＳＭ−Ｈ−Ｕ−Ｔ上で選択し、指数増殖期の二倍体を、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した発現プラスミドｐＡＭ４９３  ２μｇで形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、アデニンを欠くＣＳＭ（ＣＳＭ−Ａ）上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ２３８を得た。
【０１８７】
菌株Ｙ２３８を胞子形成させることにより、菌株Ｙ２１０（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ２１１（ＭＡＴ  α）を生成させた。二倍体細胞を２％酢酸カリウムおよび０．０２％ラフィノース液体培地中で胞子形成させて、Ｓｉｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＭＳＭ３００  ｓｅｒｉｅｓ  ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  （Ｓｉｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ，  ＬＴＤ．  Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，  ＵＫ）を用いて単離した。胞子をＣＳＭ−Ａ−Ｈ−Ｕ−Ｔ上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ２１０（ＭＡＴ  Ａ）およびＹ２１１（ＭＡＴ  α）を得た。
【０１８８】
指数増殖期のＹ２１１細胞をベクターｐＡＭ１７８で形質転換することにより、菌株Ｙ２２１を生成させた。宿主細胞の形質転換物を、ＣＳＭ−Ｌ上で選択した。
【０１８９】
菌株Ｙ２２１のＧＡＬ８０遺伝子のコード配列を欠失させることにより、菌株Ｙ２９０を生成させた。この目的のために、ＧＡＬ８０の上流および下流配列によりフランクされたクルイベロマイセス・ラクチスのＴｅｆ１遺伝子のプロモータおよびターミネータによりフランクされたハイグロマイシンＢ耐性マーカ（ｈｐｈ）を含む組み込み構築物ｉ３２（配列番号９０）で、指数増殖期のＹ２２１細胞を形質転換した（図１Ｂ）。宿主細胞の形質転換物を、ハイグロマイシンＢを含む培地上で選択し、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ２９０を得た。
【０１９０】
ロイシンが高濃度の培地中で継体培養して菌株Ｙ２９０からｐＡＭ１７８を除去し、ＣＳＭ−Ｌ上で増殖できないことを個々のコロニーで検査することにより、菌株３１８を生成させて、菌株Ｙ３１８を得た。
【０１９１】
β−ファルネセンシンターゼをコードする非相同性ヌクレオチド配列を、菌株Ｙ３１８に導入することにより、菌株Ｙ４０９を生成させた。この目的のために、指数増殖期のＹ３１８を発現プラスミドｐＡＭ４０４で形質転換させた。宿主細胞の形質転換物をＣＳＭ−Ｌ上で選択して、菌株Ｙ４０９を得た。
【０１９２】
菌株Ｙ４０９のＧＡＬプロモータを構成的活性にすることにより、菌株Ｙ４１９を生成させた。修飾されたＥＲＧ９プロモータの上流および下流配列、ならびにコード配列によりフランクされた、ネイティブプロモータおよびＧＡＬ４ターミネータ（ＴＧＡＬ４）（図１Ｃ）の「オペレーティブ・コンスティチューティブ（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）」バージョン（ＰＧＡＬ４ｏｃ；  Ｇｒｉｇｇｓ  ＆  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  （１９９１）  ＰＮＡＳ  ８８（１９）：８５９７−８６０１）の調節制御下で、クルイベロマイセス・ラクチスのＴｅｆ１遺伝子のプロモータおよびターミネータによりフランクされたストレプトマイセス・ノウルセイのノウルセオトリシン耐性マーカ（ＮａｔＲ）と、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ４遺伝子のコード配列と、を含む組み込み構築物ｉ３３（配列番号９１）で、指数増殖期のＹ４０９を形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、ノウルセオトリシンを含む培地上で選択し、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ４１９を得た。
【０１９３】
サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１遺伝子のプロモータの制御下で、菌株Ｙ４１９の修飾されたＧＡＬ８０遺伝子座に、サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１２遺伝子のコード領域の追加のコピーを導入することにより、菌株Ｙ６７７を生成させた。この目的のために、クルイベロマイセス・ラクチスのＴｅｆ１遺伝子のプロモータおよびターミネータによりフランクされたストレプトマイセス・ノウルセイのカナマイシン耐性マーカ（ＫａｎＲ）と、ＧＡＬ１プロモータ（ＰＧＡＬ１）およびＥＲＧ１２ターミネータ（ＴＥＲＧ１２）によりフランクされたサッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１２遺伝子のコード配列およびターミネータ配列と、を含む組み込み構築物ｉ３７（配列番号９２）で、指数増殖期のＹ６７７細胞を形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、カナマイシンを含む培地上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ６７７を得た。
【０１９４】
菌株Ｙ１５５１を、化学的突然変異により菌株Ｙ６７７から生成させた。突然変異した菌株を、β−ファルネセンの産生増加によりスクリーニングして、菌株Ｙ１５５１を得た。
【０１９５】
菌株Ｙ１７７８を、化学的突然変異により菌株Ｙ１５５１から生成させた。突然変異した菌株を、β−ファルネセンの産生増加によりスクリーニングして、菌株Ｙ１７７８を得た。
【０１９６】
菌株Ｙ１７７８のＨＸＴ３コード配列を、一方がサッカロマイセス・セレビシエ由来であり、他方がＣ．ブチリクス由来である、アセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼコード配列の２コピーと、Ｂ．ジュンセアのＨＭＧＳ遺伝子のコード配列の１コピーと交換することにより、菌株Ｙ１８１６を生成させた。クルイベロマイセス・ラクチスのＴｅｆ１遺伝子のプロモータおよびターミネータによりフランクされたハイグロマイシンＢ耐性マーカ（ｈｙｇ）と、トランケート型ＴＤＨ３プロモータ（ｔＰＴＤＨ３）およびＡＨＰ１ターミネータ（ＴＡＨＰ１）によりフランクされたサッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１０遺伝子のコード配列と、ＹＰＤ１プロモータ（ＰＹＰＤ１）およびＣＣＷ１２ターミネータ（ＴＣＣＷ１２）によりフランクされたＣ．ブチリクス（チオラーゼ）のアセトアセチル−ＣｏＡチオラーゼ遺伝子のコード配列と、ＴＵＢ２プロモータ（ＰＴＵＢ２）により進められ、サッカロマイセス・セレビシエのＨＸＴ３遺伝子の上流および下流配列によりフランクされたＢ．ジュンセアのＨＭＧＳ遺伝子のコード配列（ＨＭＧＳ）と、を含む組み込み構築物ｉ３０１（配列番号９３）で、指数増殖期のＹ１７７８細胞を形質転換した（図１Ｅ）。宿主細胞の形質転換物を、ハイグロマイシンＢを含む培地上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ１８１６を得た。
【０１９７】
菌株Ｙ２０５５を、化学的突然変異により菌株Ｙ１７７８から生成させた。突然変異した菌株を、β−ファルネセンの産生増加によりスクリーニングして、菌株Ｙ２０５５を得た。
【０１９８】
菌株Ｙ２２９５を、化学的突然変異により菌株Ｙ２０５５から生成させた。突然変異した菌株を、β−ファルネセンの産生増加によりスクリーニングして、菌株Ｙ２２９５を得た。
【０１９９】
菌株Ｙ２２９５の交配型をＭＡＴ  ＡからＭＡＴ  αに入れ替えることにより、菌株Ｙ３１１１を生成させた。この目的のために、ＭＡＴ  α交配遺伝子座と、ハイグロマイシンＢ耐性マーカ（ｈｙｇＡ）とを含む組み込み構築物ｉ４７６（配列番号９４）で、指数増殖期のＹ２２９５細胞を形質転換した（図１Ｆ）。宿主細胞の形質転換物を、ハイグロマイシンＢを含む培地上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ３１１１を得た。
【０２００】
菌株Ｙ２１６８を、化学的突然変異により菌株Ｙ１８１６から生成させた。突然変異した菌株を、β−ファルネセンの産生増加によりスクリーニングして、菌株Ｙ２１６８を得た。
【０２０１】
菌株Ｙ２４４６を、化学的突然変異により菌株Ｙ２１６８から生成させた。突然変異した菌株を、β−ファルネセンの産生増加によりスクリーニングして、菌株Ｙ２４４６を得た。
【０２０２】
菌株Ｙ２４４６のネイティブＵＲＡ３遺伝子座に、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ８０遺伝子のコード配列、プロモータ、およびターミネータを挿入することにより、菌株Ｙ３１１８を生成させた。この目的のために、ＵＲＡ３配列を重複することにより（本来のＵＲＡ３配列の相同組換えおよび回復によりＧＡＬ８０遺伝子のループアウトの切除が可能になる）フランクされたサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ８０遺伝子のプロモータ、ターミネータ、およびコード配列を含む組み込み構築物ｉ４７７（配列番号９５）で、指数増殖期のＹ２４４６細胞を形質転換した（図１Ｇ）。宿主細胞の形質転換物を、５−ＦＯＡを含む培地上で選択して、菌株３１１８を得た。
【０２０３】
発現プラスミドｐＡＭ４０４を除去することにより、菌株Ｙ３１１８から菌株Ｙ３１２５を生成させた。この目的のために、菌株Ｙ３１１８を最初に、４０ｍｇ／Ｌウラシルを含むＹＰＤ＋０．５％ロイシン培地（ＹＰＤ＋Ｌ＋Ｕ）３ｍＬ中でインキュベートした。細胞を、２４時間ごとに最大５日間、新鮮なＹＰＤ＋Ｌ＋Ｕで１００倍に希釈して発現プラスミドｐＡＭ４０４を除去し、その後、ＹＰＤ上に播種して、３０℃で最大５日間インキュベートした。小さなコロニーをＹＰＤおよびＣＳＭ−Ｌの両方でレプリカプレートして、ＹＰＤで発育することができたがＣＳＭ−Ｌで発育できなかったコロニーを同定して、菌株Ｙ３１２５を得た。
【０２０４】
表１１に示した菌株は、指数増殖期のＹ３１２５細胞を、示されたコード配列を含む示された発現ベクターで形質転換して、宿主細胞の形質転換物をＣＳＭ−Ｌ上で選択することにより、生成させた。
【表１１】
0005580488.tif 000012
【０２０５】
菌株Ｙ２１１を発現プラスミドｐＡＭ４２６で形質転換することにより、菌株Ｙ２２７を生成させた。宿主細胞の形質転換物を、ＣＳＭ−Ｌ上で選択した。
【０２０６】
菌株Ｙ２２７から発現プラスミドｐＡＭ４２６を除去することにより、菌株Ｙ３１９８を生成させた。この目的のために、Ｙ２７７をＹＰＤ＋Ｌ中で４日間増殖させた。２４時間ごとに、新鮮なＹＰＤ＋Ｌ中に培養物をＯＤ６００が０．５になるように接種した。４日後に、細胞を系列希釈して、ＹＰＤ固形寒天に播種し、プレートを３０℃で４日間インキュベートした。小さなコロニーをＹＰＤおよびＣＳＭ−Ｌの両方でレプリカプレートして、ＹＰＤで発育することができたがＣＳＭ−Ｌで発育できなかったコロニーを同定して、菌株Ｙ３１９８を得た。
【０２０７】
菌株Ｙ３１１１とＹ３１１８を交配させることにより、菌株Ｙ３２１５を生成させた。およそ１×１０７細胞のＹ３１１１およびＹ３１１８を、ＹＰＤ培地プレート上で室温で６時間混合することで交配が可能になり、その後、ＹＰＤ寒天プレート上に播種して、単一コロニーを単離した。ｈｐｈＡで標識されたＭＡＴ  α遺伝子座と野生型ＭＡＴ  Ａ遺伝子座の両方の存在下で、コロニーＰＣＲでスクリーニングすることにより、二倍体を同定した。
【０２０８】
菌株３２１５を胞子形成させて、ＧＡＬ８０コード配列をループアウトさせることにより、菌株Ｙ３０００を生成させた。２％酢酸カリウムおよび０．０２％ラフィノース液体培地中で、二倍体細胞を胞子形成させた。不揃いの胞子を単離して、ＹＰＤ寒天に播種し、３日間発育させ、その後、ＣＳＭ−Ｕにレプリカプレートして、ＧＡＬ８０を欠く（即ち、機能的ＵＲＡ３遺伝子を有する）細胞のみを増殖させた。その後、胞子をβ−ファルネセン産生について検査して、最良の産生体を同定し、診断ＰＣＲにより組み込み構築物ｉ３０１の存在を確認して、菌株Ｙ３０００を得た。
【０２０９】
菌株Ｙ３０００からＵＲＡ３マーカを除去することにより、菌株Ｙ３２８４を生成させた。この目的のために、サッカロマイセス・セレビシエのＵＲＡ３遺伝子の上流および下流配列によりフランクされた、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子のガラクトース誘導性プロモータの制御下で、サルモネラのｈｉｓＤコード配列と、サッカロマイセス・セレビシエのＥＲＧ１３遺伝子のコード配列およびＨＭＧ１遺伝子のトランケート型コード配列と、を含む組み込み構築物ｉ９４（配列番号９６）で、指数増殖期のＹ３０００を形質転換した（図１Ｈ）。宿主細胞を、５−ＦＯＡを含む培地上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ３２８４を得た。
【０２１０】
菌株Ｙ３２８４のＮＤＴ８０コード配列を、サッカロマイセス・セレビシエのアセチル−ＣｏＡシンテターゼ遺伝子のコード配列およびＺ．モビリスのＰＤＣ遺伝子のコード配列の追加のコピーと交換することにより、菌株Ｙ３３８５を生成させた。この目的のために、ＵＲＡ３マーカと、ＨＸＴ３プロモータ（ＰＨＸＴ３）およびＰＧＫ１ターミネータ（ＴＰＧＫ１）によりフランクされたサッカロマイセス・セレビシエのＡＣＳ２遺伝子のコード配列（ＡＣＳ２）と、ＧＡＬ７プロモータ（ＰＧＡＬ７）およびＴＦＨ３ターミネータ（ＴＴＤＨ３）によりフランクされ、上流および下流ＮＤＴ８０配列によりフランクされたＺ．モビリスのＰＤＣ遺伝子のコード配列（ｚｍＰＤＣ）と、を含む組み込み構築物ｉ４６７（配列番号９７）で、指数増殖期のＹ３３８５細胞を形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、ＣＳＭ−Ｕ上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ３３８５を得た。
【０２１１】
菌株Ｙ３５４７を、化学的突然変異により菌株Ｙ３３８５から生成させた。突然変異した菌株を、β−ファルネセンの産生増加によりスクリーニングして、菌株Ｙ３５４７を得た。
【０２１２】
菌株Ｙ３６３９を、化学的突然変異により菌株Ｙ３５４７から生成させた。突然変異した菌株を、β−ファルネセンの産生増加によりスクリーニングして、菌株Ｙ３６３９を得た。
【０２１３】
菌株Ｙ３６３９のＮＤＴ８０遺伝子座のＵＲＡ３マーカを、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ８０遺伝子のコード配列、プロモータ、およびターミネータの組み込み物で破壊することにより、菌株Ｙ３９０２を生成させた。この例において、ＧＡＬ８０ｓ−２と称する突然変異対立遺伝子を用いた（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  （１９８４）  １２（２４）：９２８７−９２９８）。ＵＲＡ３配列を重複することにより（本来のＵＲＡ３配列の相同組換えおよび回復によりＧＡＬ８０遺伝子のループアウトの切除が可能になる）フランクされたサッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ８０遺伝子のプロモータ、ターミネータ、およびコード配列と、ＨＸＴ３プロモータ（ＰＨＸＴ３）およびＰＧＫ１ターミネータ（ＴＰＧＫ１）によりフランクされたサッカロマイセス・セレビシエのＡＣＳ２遺伝子のコード配列（ＡＣＳ２）と、ＧＡＬ７プロモータ（ＰＧＡＬ７）およびＴＦＨ３ターミネータ（ＴＴＤＨ３）によりフランクされ、上流および下流ＮＤＴ８０配列によりフランクされたＺ．モビリスのＰＤＣ遺伝子のコード配列（ｚｍＰＤＣ）と、を含む組み込み構築物ｉ６０１（配列番号９８）で、指数増殖期のＹ３６３９細胞を形質転換した（図１Ｊ）。宿主細胞の形質転換物を、５−ＦＯＡを含む培地上で選択して、菌株３９０２を得た。
【０２１４】
ロイシンが高濃度の培地中で継体培養して発現プラスミドｐＡＭ４０４を除去し、ロイシンを欠く培地上での増殖できないことを個々のコロニーで検査することにより、菌株Ｙ４０２７を菌株Ｙ３９０２から生成させた。
【０２１５】
菌株Ｙ４０２７のＡＤＨ５コード配列を、ＦＳ＿Ｄ＿３．５コード配列およびＦＳ＿Ｃ＿７コード配列と交換することにより、菌株Ｙ４９０９を生成させた（表１７参照）。この目的のために、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモータ（ＰＧＡＬ１またはＰＧＡＬ１０）によりフランクされたＬＥＵ２コード配列（ＬＥＵ２）およびファルネセンシンターゼ変異体コード配列と、上流および下流ＡＤＨ５配列によりフランクされたそれぞれＣＹＣ１またはＡＤＨ１ターミネータ（ＴＣＹＣ１またはＴＡＤＨ１）と、を含む組み込み構築物ｉ２１２５（配列番号９９）で、指数増殖期のＹ４９０９を形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、ＣＳＭ−Ｌ上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ４９０９を得た。
【０２１６】
菌株Ｙ４９０９からサッカロマイセス・セレビシエのコード配列、プロモータ、およびターミネータを除去することにより、菌株Ｙ４９５９を生成させた。この目的のために、Ｙ４９０９細胞をＣＳＭ−Ｕ上に播種し、自然なＧＡＬ８０「ループアウト」組換え事象について選択して、菌株Ｙ４９５９を得た。
【０２１７】
菌株Ｙ４９５９のＣＡＮ１遺伝子座にＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を挿入することにより、菌株Ｙ５４４４を生成させた。この目的のために、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１プロモータ（ＰＧＡＬ１）によりフランクされたＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列と、サッカロマイセス・セレビシエのＣＹＣ１ターミネータ（ＴＣＹＣ１）と、を含む組み込み構築物ｉ２６０８（配列番号１００）で、指数増殖期のＹ４９５９細胞を形質転換した（図１Ｌ）。宿主細胞の形質転換物を、カナバリンを含むＹＮＢ培地上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ５４４４を得た。
【０２１８】
菌株Ｙ４０２７のＡＤＨ５遺伝子座に、ＦＳ＿Ａ＿５．３コード配列、ＦＳ＿Ｂ＿５．３コード配列、ＦＳ＿Ｃ＿７コード配列およびＦＳ＿Ｄ＿３．５コード配列を挿入することにより、菌株Ｙ４９１０を生成させた（表１７参照）。この目的のために、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモータ（ＰＧＡＬ１またはＰＧＡＬ１０）によりフランクされたＬＥＵ２コード配列（ＬＥＵ２）およびファルネセンシンターゼ変異体コード配列と、上流および下流ＡＤＨ５配列によりフランクされたＡＤＨ１またはＣＹＣ１ターミネータ（ＴＡＤＨ１またはＴＣＹＣ１）と、を含み、組み込み構築物ｉ２１２７（配列番号１０１）の２つのオーバーラッピングセグメントでの同時形質転換と、それによる２つのオーバーラッピングプラスミドインサート間の刺激相同組換えにより生成された組み込み構築物ｉ２１２７で、指数増殖期のＹ４９０９を形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、ＣＳＭ−Ｌ上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ４９１０を得た。
【０２１９】
菌株Ｙ４９１０から、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ８０遺伝子のコード配列、プロモータ、およびターミネータを除去することにより、菌株Ｙ４９６０を生成させた。この目的のために、Ｙ４９０９細胞をＣＳＭ−Ｕ上に播種し、自然なＧＡＬ８０「ループアウト」組換え事象について選択して、菌株Ｙ４９６０を得た。
【０２２０】
菌株Ｙ４９６０のＣＡＮ１遺伝子座にＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を挿入することにより、菌株Ｙ５４４５を生成させた。この目的のために、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１プロモータ（ＰＧＡＬ１）と、サッカロマイセス・セレビシエのＣＹＣ１ターミネータ（ＴＣＹＣ１）と、によりフランクされたＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を含む組み込み構築物ｉ２６０８（配列番号１００）で、指数増殖期のＹ４９５９細胞を形質転換した（図１Ｌ）。宿主細胞の形質転換物を、カナバリンを含むＹＮＢ培地上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ５４４５を得た。
【０２２１】
菌株Ｙ４９６０からＵＲＡ３マーカを除去することにより、菌株Ｙ５０６４を生成させた。この目的のために、ＨＸＴ３プロモータ（ＰＨＸＴ３）およびＰＧＫ１ターミネータ（ＴＰＧＫ１）によりフランクされたサッカロマイセス・セレビシエのＡＣＳ２遺伝子（ＡＣＳ２）と、ＧＡＬ７プロモータ（ＰＧＡＬ７）およびＴＤＨ３ターミネータ（ＴＴＤＨ３）によりフランクされ、上流および下流のＮＤＴ８０配列によりフランクされたＺ．モビリスのＰＤＣ遺伝子のコード配列（ｚｍＰＤＣ）と、を含む組み込み構築物ｉ５６９（配列番号１０２）で、指数増殖期のＹ４９６０細胞を形質転換した（図１Ｎ）。宿主細胞の形質転換物を、５−ＦＯＡを含む培地上で選択して、菌株Ｙ５０６４を得た。
【０２２２】
菌株Ｙ５０６４のＢＩＯ４遺伝子座に、ＦＳ＿Ａ＿５．３コード配列およびＦＳ＿Ｂ＿５．３コード配列を挿入することにより、菌株Ｙ５０６５を生成させた（表１７参照）。この目的のために、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモータ（ＰＧＡＬ１またはＰＧＡＬ１０）によりフランクされたＵＲＡ３コード配列（ＵＲＡ３）およびファルネセンシンターゼ変異体コード配列と、上流および下流ＢＩＯ４配列によりフランクされたＡＤＨ１またはＣＹＣ１ターミネータ（ＴＡＤＨ１またはＴＣＹＣ１）と、を含む組み込み構築物ｉ２１２４で、指数増殖期のＹ５０６４を形質転換した（図１０）。宿主細胞の形質転換物を、ＣＳＭ−Ｕ上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ５０６５を得た。
【０２２３】
菌株Ｙ５０６４のＢＩＯ４遺伝子座に、ＦＳ＿Ａ＿５．３コード配列、ＦＳ＿Ｂ＿５．３コード配列、ＦＳ＿Ｃ＿７コード配列およびＦＳ＿Ｄ＿３．５コード配列を挿入することにより、菌株Ｙ５０６６を生成させた（表１７参照）。この目的のために、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０プロモータ（ＰＧＡＬ１またはＰＧＡＬ１０）によりフランクされたＬＥＵ２コード配列（ＬＥＵ２）およびファルネセンシンターゼ変異体コード配列と、上流および下流ＡＤＨ５配列によりフランクされたＡＤＨ１またはＣＹＣ１ターミネータ（ＴＡＤＨ１またはＴＣＹＣ１）と、を含み、組み込み構築物ｉ２１２７（配列番号１０１）の２つのオーバーラッピングセグメントでの同時形質転換と、それによる２つのオーバーラッピングプラスミドインサート間の刺激相同組換えにより生成された組み込み構築物ｉ２１２７で、指数増殖期のＹ５０６４を形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、ＣＳＭ−Ｌ上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ５０６６を得た。
【０２２４】
菌株Ｙ５０６５のＣＡＮ１遺伝子座にＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を挿入することにより、菌株Ｙ５４４６を生成させた。この目的のために、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１プロモータ（ＰＧＡＬ１）と、サッカロマイセス・セレビシエのＣＹＣ１ターミネータ（ＴＣＹＣ１）と、によりフランクされたＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を含む組み込み構築物ｉ２６０８（配列番号１００）で、指数増殖期のＹ４９５９細胞を形質転換した（図１Ｌ）。宿主細胞の形質転換物を、カナバリンを含み、アルギニンを欠くＹＮＢ培地上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ５４４６を得た。
【０２２５】
菌株Ｙ５０６６のＣＡＮ１遺伝子座にＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を挿入することにより、菌株Ｙ５４４７を生成させた。この目的のために、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１プロモータ（ＰＧＡＬ１）と、サッカロマイセス・セレビシエのＣＹＣ１ターミネータ（ＴＣＹＣ１）と、によりフランクされたＴＤＳ＿Ｆｓ＿Ｓｃコード配列を含む組み込み構築物ｉ２６０８（配列番号１００）で、指数増殖期のＹ４９５９細胞を形質転換した（図１Ｌ）。宿主細胞の形質転換物を、カナバリンを含み、アルギニンを欠くＹＮＢ培地上で選択して、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認し、菌株Ｙ５４４７を得た。
【０２２６】
菌株２２１に、アモルファデインシンターゼ（ＡＤＳ）、チトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＡＭＯ、ＣＹＰ７１ＡＶ１）、およびＮＡＤＰ−チトクロムＰ４５０オキシドリダクターゼ（ＣＰＲ）をコードする発現プラスミドを導入することにより、菌株Ｙ２２４を生成させた。この目的のために、アルテミシア・アンヌアのＡＤＳ遺伝子のコード配列（ＡＤＳ）と、アルテミシア・アンヌアのＡＭＯ遺伝子のコード配列と、アルテミシア・アンヌアのＣＰＲ遺伝子のコード配列と（全てが、サッカロマイセス・セレビシエ内での発現のためにコドン最適化されており、サッカロマイセス・セレビシエのＧＡＬ１またはＧＡＬ１０のプロモータの制御下にある）、を含む発現プラスミドｐＡＭ３２２で、指数増殖期のＹ２１１細胞を形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、ＣＳＭ−Ｌ上で選択し、菌株Ｙ２２４を得た。
【０２２７】
菌株Ｙ２２４のＧＡＬ１およびＧＡＬ１０遺伝子の分岐したプロモータとＧＡＬ１コード配列とを、ハイグロマイシンＢ耐性マーカ（ｈｐｈＡ）と交換することにより、菌株Ｙ２８４を生成させた。この目的のために、組み込み構築物ｉ６５（配列番号１０４；図１Ｐ）形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、ハイグロマイシンＢへの耐性に基づいて選択し、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ２８４を得た。
【０２２８】
サッカロマイセス・セレビシエのＣＴＲ３遺伝子のプロモータの調節制御下に菌株Ｙ２８４のＥＲＧ遺伝子を置くことにより、菌株Ｙ３０１を生成させた。上流によりフランクされたＤ−セリンデアミナーゼのコード配列（ｄｓｄＡ）およびＣＴＲ３プロモータ（ＰＣＴＲ３）と、ＥＲＧ９遺伝子のコード配列と、を含む、組み込み構築物ｉ１０（配列番号１０５）で、指数増殖期のＹ２８４細胞を形質転換した（図１Ｑ）。宿主細胞の形質転換物を、Ｄ−セリンデアミナーゼで増殖する能力に基づいて選択し、選択されたクローンを診断ＰＣＲにより確認して、菌株Ｙ３０１を得た。
【０２２９】
発現プラスミドｐＡＭ３２２を除去することにより、菌株Ｙ５３９を生成させた。この目的のために、菌株Ｙ３０１を、０．５％（ｗ／ｖ）ロイシンを含有する高濃度の酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）中で４日間増殖させた。２４時間ごとに、０．５％（ｗ／ｖ）ロイシンを含有する新鮮なＹＰＤ中に培養物をＯＤ６００が０．５になるように接種した。４日後に、細胞を系列希釈して、ＹＰＤ固形寒天に播種して、プレートを３０℃で４日間インキュベートした。２つの異なるコロニーサイズが観察された。小さなコロニー（ｐＡＭ３２２の減損を示す）を、ロイシンを欠く最少培地でレプリカプレートした。ＹＰＤ固形寒天で増殖することができたがロイシンを欠く培地で増殖できなかったクローンを、菌株Ｙ５３９として選択した。
【０２３０】
実施例３
この実施例は、大腸菌におけるＦＰＰ枯渇に基づく選択を利用して、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼについてスクリーニングすることの実行可能性を実証する。
【０２３１】
ＤＨ５α化学的または電気的拮抗大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を、発現プラスミドｐＡＭ１６６８（陰性対照）、ｐＡＭ１６７０、ｐＡＭ２０９６、ｐＡＭ２０９７、ｐＡＭ２０９８、ｐＡＭ２１０１、およびｐＡＭ２１０４からなる群より選択される発現プラスミド５ｎｇで形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、カルベニシリンを含む寒天プレートに播種し、プレートを３０℃で２〜３日間インキュベートした。
【０２３２】
図２に示されるように、発現プラスミドｐＡＭ２０９７またはｐＡＭ２０９６で形質転換された細胞は、空ベクター（ｐＡＭ１６６８）で形質転換された細胞と類似サイズのコロニーを産生した。しかし、発現プラスミドｐＡＭ１６７０、ｐＡＭ２０９８で形質転換された細胞、および発現プラスミドｐＡＭ２１０４またはｐＡＭ２１０１で形質転換された細胞（データは示さず）は、対照により産生されたものよりも小さなコロニーを産生した。より小さなコロニーサイズは、活性セスキテルペンシンターゼの発現により介された、宿主細胞におけるＦＰＰからファルネセンへの変換によりＦＰＰの枯渇が誘発されたことが原因の可能性がある。これらのセスキテルペンシンターゼのインビボ活性は、振とうフラスコにおいて７２時間目の宿主細胞のＧＣ分析により確認し（図４）、ＦＰＰ枯渇に基づく大腸菌での選択を利用して、セスキテルペンシンターゼをインビボ酵素活性についてスクリーニングし得ることが示された。
【０２３３】
実施例４
この実施例は、大腸菌におけるＦＰＰ毒性に基づく選択を利用して、インビボ性能が改善されたセスキテルペンシンターゼについてスクリーニングすることの実行可能性を実証する。
【０２３４】
ＤＨ５α化学的または電気的拮抗大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を、発現プラスミドｐＡＭ７６５（宿主細胞内でＰＦＦの産生を全体として増加させるＭＥＶ経路酵素をコードする）５ｎｇと、発現プラスミドｐＡＭ１６６８（陰性対照）、ｐＡＭ１６７０、ｐＡＭ２０９６、ｐＡＭ２０９７、ｐＡＭ２０９８、ｐＡＭ２１０１、およびｐＡＭ２１０４からなる群より選択される発現プラスミド  ５ｎｇと、で同時形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、クロラムフェニコールおよびカルベニシリンを含む寒天プレートに播種し、プレートを３０℃で２〜５日間インキュベートした。
【０２３５】
図３および表１２に示されるように、空ベクター（ｐＡＭ１６６８）で形質転換された細胞は、コロニーを産生せず、それは宿主細胞内の毒性ＦＰＰの蓄積により誘発された細胞死が原因である可能性がある（Ｗｉｔｈｅｒｓ  ａｔ  ａｌ．  （２００７）  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ７３：６２７７−６２８３）。同様に、発現プラスミドｐＡＭ２１５８またはｐＡＭ２１１７で形質転換された細胞は、コロニーを形成せず、それはこれらのプラスミドのファルネセンシンターゼコード配列が大腸菌宿主細胞における効率的発現のためにコドン最適化されなかった、という事実を原因とする可能性がある。発現プラスミドｐＡＭ２０９６で形質転換された細胞も、コロニーを形成せず、シトラス・ユノスのファルネセンシンターゼが大腸菌宿主細胞において十分な活性を有さないことが示唆される。他の細胞は全て、１〜３日以内の培養でコロニーを産生し、それはおそらく発現プラスミドｐＡＭ１６７０、ｐＡＭ２１５７、ｐＡＭ２０９８、ｐＡＭ２１０４、ｐＡＭ２０９７、およびｐＡＭ２１０１によりコードされた活性セスキテルペンシンターゼによる、ＦＰＰから低毒性のセスキテルペンへの変換が原因であろう。これらのセスキテルペンシンターゼのうちの複数のインビボ活性を、振とうフラスコにおいて７２時間目の宿主細胞のＧＣ分析により確認し（図４）、ＦＰＰ毒性に基づく大腸菌での選択を利用して、セスキテルペンシンターゼをインビボ酵素活性についてスクリーニングし得ることが示された。
【表１２】
0005580488.tif 000013
【０２３６】
実施例５
この実施例は、酵母におけるＦＰＰ毒性に基づく選択を利用して、インビボ性能が改善されたセスキテルペンシンターゼについてスクリーニングすることの実行可能性を実証する。
【０２３７】
菌株Ｙ３１９８を、それぞれ構築物Ａまたは構築物Ｂ  ５００ｎｇで形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、５ｍＬのＹＰＤ培地中、２５０ｒｐｍで浸透しながら６時間インキュベートし、５ｍＬの脱イオン水で２回洗浄した。唯一の炭素供給源として２％ガラクトースを含むＣＳＭ−Ｌ寒天プレートに、各洗浄済み培養物の半量を播種した（ガラクトースでの増殖が、菌株Ｙ３１９８に遺伝子操作されたＭＥＶ経路酵素のコード配列の発現を誘導して、細胞内のＦＰＰを増加させることに留意されたい）。唯一の炭素供給源として２％ガラクトースを含むＣＳＭ−Ｌ寒天プレートに、各洗浄済み培養物の残り半量を播種した。個々のコロニーがおよそ１ｍｍ径になるまで、プレートを３０℃で３日間インキュベートした。
【０２３８】
図５に示すように、構築物Ａで形質転換された細胞のみが、唯一の炭素供給源としてガラクトースを含むＣＳＭ−Ｌ培地で増殖が可能であり、酵母におけるＦＰＰ毒性に基づく選択を利用して、セスキテルペンシンターゼをインビボ酵素活性についてスクリーニングされることが実証された。
【０２３９】
実施例６
この実施例は、ナイルレッド蛍光分析を利用して、インビボ性能が改善されたセスキテルペンシンターゼについてスクリーニングすることの実行可能性を実証する。
【０２４０】
相対的ファルネセン力価を決定するために、構築物Ａで形質転換された菌株Ｙ３１９８の４８のコロニーと、発現プラスミドｐＡＭ４０４で形質転換された菌株Ｙ３１９８の４８のコロニーとを、ウェルあたり２％ガラクトース含有バードシード培地（ＢＳＭ）３６０μＬを含有する９６ウェルプレートの別個のウェルに選び取った（予備培養）。９９９ｒｐｍの撹拌の下、３０℃で２日間インキュベートした後、各ウェルの１６μＬを、２％ガラクトース含有の新鮮なＢＳＭ  ３６０μＬを含有する新しい９６ウェルプレートのウェルに接種した（産生培養）。９９９ｒｐｍでの撹拌下、３０℃で更に２日間インキュベートした後、ナイルレッド蛍光分析によるファルネセン力価決定のために、試料を採取した。
【０２４１】
ナイルレッド蛍光分析では、各培養物９８μＬを９６ウェル黒色ポリスチレン平底アッセイプレートに移し替えて、ＤＭＳＯ中に１００μｇ／ｍＬで溶解されたナイルレッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）  ２μＬを、各ウェルに添加した。直ちに、蛍光レベルを、５００ｎｍでの励起および５５０ｎｍでの発光により測定した。
【０２４２】
図６に示されるように、構築物Ａで形質転換された菌株Ｙ３１９８中のＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列の単一染色体に組込まれたコピーは、高コピーの発現プラスミドｐＡＭ４０４で形質転換された菌株Ｙ３１９８で得られたものの３９％のナイルレッド蛍光シグナルを生成させた。２つの菌株の間にあるファルネセン力価におよそ３倍の差は、ＧＣ分析により確認され（データは示さず）、この系でのナイルレッド蛍光レベルに十分な差（Δ）が存在し、インビボ性能が改善されたテルペンシンターゼについて適切なスクリーニングであることが実証された。
【０２４３】
実施例７
この実施例は、酵母におけるセスキテルペンシンターゼの拮抗を利用して、インビボ酵素活性レベルによるセスキテルペンシンターゼを順位付けることの実行可能性を実証する。
【０２４４】
酵母菌株Ｙ３３５３およびＹ３３５４それぞれについて、それぞれ発現プラスミドｐＡＭ１８１２またはｐＡＭ１８１３を有する菌株Ｙ３１２５の元となる形質転換の単一コロニー８個を、ウェルあたり２％スクロース含有バードシード培地（ＢＳＭ）３６０μＬを含有する９６ウェルプレートの別個のウェルでインキュベートした（予備培養）。９９９ｒｐｍの撹拌の下、３０℃で２日間インキュベートした後、各ウェルの１６μＬを、４％スクロース含有の新鮮なＢＳＭ  ３６０μＬを含有する新しい９６ウェルプレートのウェルに接種した（産生培養）。９９９ｒｐｍでの撹拌下、３０℃で更に２日間インキュベートした後、試料を採取して、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によりテルペン産生について分析した。各菌株について、単一コロニーをＣＳＭ−Ｌ−Ｍ−Ｕ寒天プレート上で再度ストリークして、各再ストリークから得られた８個の単一コロニーを、記載のように発育させて、ＧＣ分析によりテルペン産生について分析した。
【０２４５】
ＧＣ分析については、試料をメタノール／ヘプタン（１：１ｖ／ｖ）で抽出して、混合物を遠心分離し、細胞材料を除去した。メタノール／ヘプタン抽出物の一部をヘプタンで希釈し、その後、パルススプリット注入を利用してメチルシリコーン固定相に注入した。ファルネセンおよびトリコジエンを、ＧＣおよび水素炎イオン化検出法（ＦＩＤ）を利用して、沸点により分離した。トランス−β−カリオフィレンを滞留時間マーカとして使用して、特定のＧＣオーブンプリファイルの間の有効な注入および溶出をモニタリングした。ファルネセンおよびトリコジエンの力価を使用して、ファルネセン／トリコジエン比を計算した。
【０２４６】
表１３に示されるように、独立した元の形質転換物の間のテルペン力価は、ウェルごとにかなり変動したため、変動係数（ＣＶ）が最大２９％になった。ＣＶは、８個の反復測定では低下した。観察されたＣＶから、ウェル間およびクローン間の変動により、セスキテルペンシンを産生するセスキテルペンシンターゼの活性に関して、セスキテルペンの力価から直接結論を引き出すことができないことが示される。しかし、同じく表１３に示されるように、ファルネセン／トリコジエン比が、むしろ試料全体で一定しており、５．７％以下のＣＶを生じた。つまり比較セスキテルペンシンターゼと同じプラスミドから試験セスキテルペンシンターゼを同時発現することにより、ウェル間およびクローン間の変動が大きく減少するため、試験セスキテルペンシンターゼ（例えば、ファルネセンシンターゼ）のインビボ触媒効率を、比較セスキテルペンシンターゼ（例えば、ＴＤＳ）のそれに対して指標とすることができる。
【表１３】
0005580488.tif 000014
【０２４７】
酵母におけるセスキテルペンシンターゼ活性の順位付けツールとしてセスキテルペンシンターゼの拮抗を更に検証するために、酵母菌株Ｙ３３５３、Ｙ３３９４、およびＹ３３９５を、記載のように評価した。表１４に示されるように、絶対ファルネセン滴滴濃度は、同じく有意な変動を示したが、ファルネセン／トリコジエン比では低いＣＶが観察された。観察された比から判断すると、検査されたファルネセンシンターゼは、以下のとおり順位付けすることができる：ＦＳ＿Ａｄ＿Ｓｃコード配列（Ｙ３３９５）＞ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列（Ｙ３３５３）から発現されたアルテミシア・アンヌアのファルネセンシンターゼ＞ＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃコード配列（Ｙ３３９４）から発現されたＳ２Ｄ突然変異アルテミシア・アンヌアのファルネセンシンターゼ。この順位付けは、ＦＳ＿Ａｓ＿Ｓｃ、ＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃ、またはＦＳ＿Ａｄ＿Ｓｃコード配列（図７）の単一コピーを持つ菌株を使用したＧＣ分析により確認し、こうして酵素におけるインビボ酵素活性レベルによりセスキテルペンシンターゼを順位付けする手段としてセスキテルペンシンターゼの拮抗の利用を検証した。
【表１４】
0005580488.tif 000015
【０２４８】
酵母におけるセスキテルペンシンターゼ活性についての順位付けツールとしてセスキテルペンシンターゼの拮抗を更に検証するために、酵母菌株Ｙ５４４４、Ｙ５４４５、Ｙ５４４６、およびＹ５４４７を、以下の例外を含みながら記載のように評価した：各菌株について、８個のコロニーの代わりに４個のコロニーを分析し、培養物を３０℃ではなく３４℃でインキュベートし、予備培養は２日ではなく３日継続し、産生培養物は予備培養物の１０倍希釈物であった。表１５および図８に示されるように、組み入れられたファルネセンシンターゼコード配列の数と、ファルネセンとトリコジエンとの比の間に、直線関係が観察され、酵母におけるインビボ酵素活性レベルによりセスキテルペンシンターゼを順位付ける手段としてのセスキテルペンシンターゼの拮抗の有用性が確認された。
【表１５】
0005580488.tif 000016
【０２４９】
実施例８
この実施例は、セスキテルペンシンターゼ変異体のライブラリを作成する方法を説明する。
【０２５０】
複数のファルネセンシンターゼ変異体ライブラリを、ＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃコード配列を鋳型として用いて作成した。各ライブラリについて、ｐＡＭ１６７０  ２５０から５００ｎｇを、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を用い、製造業者が示唆したプロトコルに従い、プライマーＬＸ−２６８−１３９−Ｓ２Ｄ−Ｆ  （配列番号１０６）およびＬＸ−２６８−１３９−Ｓ２Ｄ−Ｒ  （配列番号１０７）を用い、２５回の増幅サイクルで、エラープローンＰＣＲに供した。ＰＣＲ産物をゲル精製して、ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）ＮｄｅＩ  ａｎｄ  ＢａｍＨＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  （Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）で逐次消化した。ベクターｐＡＭ１６６８を消化して、同じ２つの制限エンドヌクレアーゼを用いて完全に消化して、直線化ベクターＤＮＡフラグメントをウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して、５’リン酸基を除去すれば、再環状化が可能になった。精製されたＰＣＲ産物および直線化ｐＡＭ１６８８ベクターを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて３：１のインサート対ベクター比でライゲートして、ライゲーション反応混合物  ２μＬを、製造業者が示唆するプロトコルに従って、ＸＬ１−ブルー電気的拮抗大腸菌細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）に形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、カルベニシリンを含む複数のＬＢ寒天プレート（１００ｍｍ径）上で選択した。ランダム突然変異ライブラリの性能を評価するために、４８個または９６個の単一コロニーを、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いて各培養物から単離して、プラスミドＤＮＡをＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）ＮｄｅＩ  ａｎｄ  ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて消化して、プラスミドのおよそ９５％がインサートを含むことを決定した。同じくプラスミドを配列決定して突然変異の頻度を決定し、ＦＳコード配列ごとのヌクレオチド変動の推定平均が２〜６であることが見出された。残りのコロニーを寒天プレートから洗い流して、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いて単離した。
【０２５１】
同じく、複数のファルネセンシンターゼ変異体ライブラリを、ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を鋳型として用いて作成した。構築物Ｃは、ＦＳ＿Ａａ＿ＳｃＰＣＲ産物が、最終的な組立ての前に、Ｍｕｔａｚｙｍｅ  ＩＩ（登録商標）Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）およびプライマーＡＭ−２８８−９０−ＣＰＫ１６１８  （配列番号８３）およびＡＭ−２８８−９０−ＣＰＫ１６１９  （配列番号８４）を用い、製造業者が示唆するプロトコルに従って、エラープローンＰＣＲにより突然変異したこと以外は、構築物Ａと本質的に同一であった。菌株Ｙ３１９８を構築物Ｃ  ５００ｎｇで形質転換して、宿主細胞の形質転換物を、５ｍＬのＹＰＤ培地中で２５０ｒｐｍで振とうしながら、６時間回復させた後、それらを２％ガラクトースを含むＣＳＭ−Ｌ上に播種した。
【０２５２】
実施例９
この実施例は、大腸菌におけるＦＰＰ毒性に基づく増殖選択によりセスキテルペンシンターゼ変異体のライブラリをスクリーニングする方法を説明する。
【０２５３】
ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ５α−Ｅ大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を、発現プラスミドｐＡＭ７６５（ＭＥＶ経路酵素をコードする）５ｎｇおよび実施例８のＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃに基づくファルネセンシンターゼ変異体ライブラリプラスミド  ５ｎｇでトランスフェクトした。４０を超える同時形質転換実験を実施して、約２×１０５宿主細胞の形質転換物を生成させた。宿主細胞の形質転換物を、カルベニシリンおよびクロロフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（１００ｍｍ径）上に播種して、３０℃で２日間インキュベートした後、およそ４００この大きなコロニーおよび類似の数の小さなコロニーを寒天プレート上で目視することができた。ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ５α−Ｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を発現プラスミドｐＡＭ７６５  ５ｎｇのみで形質転換して、カルベニシリンおよびクロロフェニコールを含むＬＢ寒天プレート（１００ｍｍ径）上に播種した場合には、コロニーは全く観察されなかった。これらのコロニー全てが親ファルネセンシンターゼ以上の活性を有するファルネセンシンターゼ変異体を含むと仮定すると、的中率はおよそ１％であると推定された。
【０２５４】
実施例１０
この実施例は、ナイルレッド蛍光分析を利用して、セスキテルペンシンターゼ変異体のライブラリをスクリーニングする方法を説明する。
【０２５５】
実施例９のＦＰＰの毒性に基づく増殖選択スクリーニングにおいて得られた大きなコロニーを、ウェルあたり５μＬの脱イオン水を含む９６ウェルプレートに個別に選び取った。精製した溶解物を、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ 化学的拮抗大腸菌細胞（ＡＧＩＬＥＮＴ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＩＮＣ．，  ＳＡＮＴＡ  ＣＬＡＲＡ，  ＣＡ）内に形質転換し、宿主細胞の形質転換物を、カルベニシリンを含むＬＢ寒天プレート上に播種した。クロラムフェニコールが選択培地から省かれているため、発現プラスミドｐＡＭ７６５が、細胞から失われていることに、留意されたい。個々のコロニーを選び取って、カルベニシリンを含むＬＢ培地中で発育させ、ＱＩＡｐｒｅｐ  ９６  Ｔｕｒｂｏ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｖａｌｅｎｃｉａ，  ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを単離した。大きなコロニーが選択プレートから単離された後、小さなコロニーをプレートから洗い流して、プラスミドを類似の方式で混合物から単離した。
【０２５６】
ＸＬ１−Ｂｌｕｅ化学的拮抗大腸菌細胞  （Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を、発現プラスミドｐＡＭ９７（ＭＥＶ経路酵素をコードする）５ｎｇおよび単離されたプラスミド（大きなコロニーから得られる）またはプラスミド混合物（小さなコロニーから得られる）５ｎｇでトランスフェクトした。宿主細胞の形質転換物を、カルベニシリンおよびクロロフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上に播種して、３７℃で２４時間インキュベートした。個々のコロニーを、カルベニシリンおよびクロラムフェニコールを含むＭ９−へペス培地を含有する９６ウェルプレートに接種して、培養物を３０℃で２４時間インキュベートした（予備培養）。その後、各培養物５０μＬを用いて、第二の培養物を初期ＯＤ０．０５となるよう接種した。ＭＥＶ経路酵素およびファルネセンシンターゼの発現を誘導するために、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、各培養物に最終濃度１ｍＭとなるよう添加した。培養物を少なくとも２０時間インキュベートした後（産生培養）、ファルネセン力価をナイルレッド蛍光分析で決定した。ｐＡＭ９７またはｐＡＭ１４１９で同時形質転換された大腸菌菌株を、陰性対照として用いて、ｐＡＭ９７またはｐＡＭ１４２１で同時形質転換された大腸菌菌株を、陽性対照として用いた。ナイルレッド蛍光分析を検証するために、ファルネセンの力価をＧＣ分析によっても決定した。
【０２５７】
図９に示すように、測定されたナイルレッド蛍光シグナルは、ＧＣ分析により決定されたファルネセン力価と直接相関しており、ナイルレッド蛍光分析がファルネセン力価を測定する手段として更に検証された。
【０２５８】
ナイルレッド蛍光分析およびＧＣ分析により決定された、最大ファルネセン力価を与えた大きなコロニーから得られたプラスミドで形質転換された細胞から得られた最良の７０の菌株を、新しい９６ウェルプレートにレプリカプレートして、産生レベルを記載のように再測定した。図１０に示すように、これらの菌株のおよそ５０は、親ＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃコード配列を含む対照菌株よりも高いファルネセン力価を生じ、最良のファルネセンシンターゼ変異体は、親ファルネセンシンターゼよりも６５％多くのファルネセンを生成させた。
【０２５９】
およそ４００の大きなコロニーから抽出されたプラスミドを等モル量で混和して、プライマーＬＸ−２６８−１３０−３−Ｓ２Ｄ−Ｆ（配列番号１１０）およびＬＸ−２６８−１３０−４−Ｓ２Ｄ−Ｒ（配列番号１０９）を用いてＦＳコード配列をＰＣＲ増幅させ、ＰＣＲ産物をゲル精製した。ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）Ｂｓｔ１１０１制限エンドヌクレアーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いてベクターｐＡＭ１７３４を直線化して、直線化されたベクターをＺｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（商標）  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，  Ｏｒａｎｇｅ，  ＣＡ）を用いて洗浄した。精製したベクターおよびＰＣＲ産物を、１：３（ベクター：インサート）の比で混合して、相同組換えを介してライゲーションのために菌株Ｙ５３９または菌株Ｙ３１９８内へ形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、２％グルコース（Ｙ５３９宿主）または２％ガラクトース（Ｙ３１９８宿主）を唯一の炭素供給源として含むＣＳＭ−Ｌ寒天プレートに播種した。およそ２，５００の個々のコロニーを選び出して、記載のようにナイルレッド蛍光分析により決定した（Ｙ５３９宿主では２％グルコースを、そしてＹ３１９８宿主では２％ガラクトースを含むＢＳＭを用いる）。標準の誘導の３倍にあたる親対照（Ｙ５３９中のｐＡＭ１７６４（ＣＥＮ．ＡＲＳプラスミドのＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃ））で得られた蛍光シグナルよりも大きな蛍光シグナルを生成したクローンを、ＣＳＭ−Ｌ寒天プレートに再度播種して単一コロニーを得て、各リストレークの４つのコロニーを、ナイルレッド蛍光分析およびＧＣ分析により再検査した。図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、ファルネセンシンターゼ変異体で形質転換された細胞の多くは、親対照菌株よりも高い力価のファルネセンスを生成し、発現プラスミドｐＡＭ１７６５（高コピー数のプラスミドのＦＳ＿Ａａ＿Ｅｃ）で形質転換された菌株Ｙ５３９よりも高い力価を生成する細胞は少なかった。
【０２６０】
実施例１１
この実施例は、酵母におけるＦＰＰ毒性に基づく増殖選択により、セスキテルペンシンターゼ変異体をスクリーニングする方法を説明する。
【０２６１】
実施例８の構築物Ｃでトランスフェクトされた菌株Ｙ３１９８の洗浄された形質転換物を、唯一の炭素供給源として２％ガラクトースを含むＣＳＭ−Ｌ寒天プレートに播種した。プレートを３０℃で５日間インキュベートして、コロニーを選び出し、発育させて、記載のようにナイルレッド蛍光分析およびＧＣ分析によりファルネセン力価について分析した。図１２に示されるように、唯一の炭素供給源としてガラクトースで増殖されたクローンのおよそ１５％が、親対照（構築物Ａでトランスフェクトされた菌株Ｙ３１９８）で得られた平均力価よりも少なくとも１５％高いファルネセン力価を有した。親対照よりも少なくとも１５％高いファルネセン力価を有したクローンを、個々のコロニーごとに、２％グルコースを含むＣＳＭ−Ｌ寒天プレートに再ストレークした。各クローンごとに、個々のコロニー８個を選び出して、記載のようにＧＣ分析により再検査した。ＧＣアッセイにより対照よりも１５％を超えて高い平均ファルネセン力価を維持するクローンは、セスキテル拮抗アッセイ用にプロモートした。
【０２６２】
実施例１２
この実施例は、セスキテルペンシンターゼの拮抗により、セスキテルペンシンターゼ変異体をスクリーニングする方法を説明する。
【０２６３】
Ｚｙｍｏｐｒｅｐ（商標） Ｙｅａｓｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ  （Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．，  Ｏｒａｎｇｅ，  ＣＡ）を用いて、実施例１０の、最も多くファルネセンを産生した酵母菌株から、プラスミドを単離した。プラスミドをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、ファルネセンシンターゼ変異体コード配列をゲル精製して、２つの制限エンドヌクレアーゼで消化した発現ベクターｐＡＭ１８１２でライゲートし、こうしてｐＡＭ１８１２のＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列を、ＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿ＥｃまたはＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列と交換した。
【０２６４】
あるいは、そして加えて、ファルネセンシンターゼ変異体コード配列を、プライマーＡＭ−２８８−９０−ＣＰＫ１６１８（配列番号８３）およびＡＭ−２８８−９０−ＣＰＫ１６１９（配列番号８４）を用いて、実施例１１の、最も多くファルネセンを産生した酵母菌株の単離されたプラスミドまたは細胞溶解物からＰＣＲ増幅させて、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｃ．，  Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，  ＧＡ）を用い、製造業者が示唆するプロトコルに従って、ＰＣＲ産物をゲル精製して、発現プラスミドｐＡＭ１９４８でライゲートして、菌株Ｙ３１２５を精製された両方のＤＮＡフラグメントで形質転換することにより相同組換えによりＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＢａｍＨＩ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）で消化し、こうしてｐＡＭ１９４８のＩＳ＿Ｐｎ＿Ｓｃコード配列を変異体のＦＳ＿Ｓ２Ｄ＿Ｅｃコード配列と交換した。
【０２６５】
宿主細胞の形質転換物を、唯一の炭素供給源として２％グルコースを含むＣＳＭ−Ｌ寒天プレートに播種し、その後、３０℃で少なくとも７２時間、ＣＳＭ−Ｌ−Ｕ寒天プレートにレプリカプレートして、宿主細胞の形質転換物中のＧＡＬ８０コード配列をループアウトした。各クローンごとに、８個のコロニーを選び出し、成長させて、記載のようにＧＣ分析によりテルペンの力価を決定した。親ファルネセンシンターゼ（ｐＡＭ１８１２で形質転換された菌株Ｙ３１２５）で得られたファルネセン／トリコジエン比よりも高い比を生成したファルネセンシンターゼ変異体を、ＣＳＭ−Ｌ寒天プレートに再ストリークした。各再ストリークごとに、個々のコロニー８個を、記載のように９６ウェルプレート産生実験において再検査した。ファルネセンシンターゼ変異体を含む１１個の酵母菌株全てが、改善されたファルネセンシンターゼ／トリコジエン比を示し、これらのファルネセンシンターゼ変異体が酵母における改善されたインビボ酵素活性を有することが示唆された。
【０２６６】
実施例１３
この実施例は、改善された酵素活性を有するセスキテルペンシンターゼ変異体の特徴付けを説明する。
【０２６７】
可能性のある原因の突然変異を同定するために、実施例１２で同定され、本質的に記載のように生成およびスクリーニングされたファルネセンシンターゼ変異体の別のライブラリにおける改善されたファルネセンシンターゼ変異体を、Ｅｌｉｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍｅｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．（Ｈａｙｗａｒｄ，  ＣＡ）により配列決定した。同定された突然変異体を、表１６に列挙する。要約すると、推定で合計３００，０００個のクローンをスクリーニングして、大腸菌および／または酵母におけるＦＰＰ毒性に基づく増殖選択、ナイルレッド蛍光および／またはＧＣ分析、ならびに酵母におけるセスキテルペンシンターゼの拮抗により評価して、酵素活性が改善された５１のファルネセンシンターゼ変異体を同定した。複数のファルネセンシンターゼ変異体を、１回を超える回数（回数は表１６の変異体名の次のカッコ内に示す）同定し、特定のヌクレオチドおよびアミノ酸変化が、複数のファルネセンシンターゼ変異体において見出され、突然変異と酵素活性上昇との因果関係が示唆された。幾つかのファルネセンシンターゼ変異体において、サイレント突然変異のみが明らかにされず、これらの突然変異がコードされたＦＳの発現を改善する可能性が示唆された。
【表１６】
0005580488.tif 000017
【表１７】
0005580488.tif 000018
【０２６８】
実施例１４
この実施例は、酵母におけるセスキテルペンシンターゼの拮抗を利用して、突然変異を組み合わせ、改善されたファルネセンシンターゼ変異体をスクリーニングする方法を説明する。
【０２６９】
実施例１３において同定された様々なアミノ酸変化を、配列重複伸長（ＳＯＥ；  Ｈｏ，  ｅｔ  ａｌ，  １９８９）により組み合わせて、その組み合わせを、記載のようにセスキテルペンシンターゼの拮抗によりスクリーニングして、酵素活性が上昇したＦＳを同定した。表１７に示されるように、複数のファルネセンシンターゼ変異体は、野生型Ａ．アンヌアＦＳよりも実質的に改善されたファルネセン／トリコジエン比を示した。これらのファルネセンシンターゼ変異体の複数の活性上昇が、ファルネセンシンターゼ変異体コード配列の単一染色体組み込みコピーを含む酵母菌株のＧＣ分析により更に確認された（図１４）。
【表１８】
0005580488.tif 000019
【０２７０】
実施例１５
この実施例は、野生型ファルネセンシンターゼおよびファルネセンシンターゼ変異体蛋白質を発現および精製する方法を説明する。
【０２７１】
ベクターｐＡＭ１４９０（配列番号１１７）のＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩ部位にクローニングされたＦＳ＿Ａａ＿Ｅｃ、ＦＳ＿Ｂ＿５．３＿Ｅｃ（大腸菌における発現についてコドン最適化されたＦＳ＿Ｂ＿５．３）、またはＦＳ＿Ｃ＿８コード配列を含む発現プラスミドで、大腸菌・ロゼッタ（ＤＥ３）細胞を形質転換した。０．４ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することにより宿主細胞の形質転換物の１Ｌの培養物中のＦＳ発現を誘導し、各培養物を２０℃で２０時間インキュベートした。細胞溶解物を、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）をプレパックしたＨｉｓ  ＧｒａｖｉＴｒａｐカラムにロードした。カラムを、１０ｍＬ（１０倍カラム容積）の結合緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  イミダゾール、５％グリセロール、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄して、５０（分画１）、１００（分画２）、または２５０ｍＭ（分画３）のイミダゾールを含む４ｍｌ溶出緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて、段階的に溶出した。全ての分画を結合緩衝液で透析し、分画２を、透析カセット中でプロテアーゼ消化緩衝液（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）に対して更に透析した。Ｈｉｓ６標識を除去するために、１２０ＵのＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  （ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を、各透析カセットに直接添加して、透析液を一晩継続させた後、貯蔵緩衝液（２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）に対して透析して、透析カセットから取り出した。ＧＳＴ標識プロテアーゼを除去するために、貯蔵緩衝液で予備洗浄したＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を、プロテアーゼ消化試料に添加し、ビーズ混合物を穏やかに混合しながら１時間インキュベートした。最後に、混合物をＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｃｏｌｕｍｎ  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ, ＣＡ）に通すことにより、ＦＳ蛋白質を回収して、精製されたＦＳ蛋白質を−８０℃に貯蔵した。
【０２７２】
単離されたファルネセンシンターゼ変異体を、反応速度特性に関してアッセイした。表１８に示されるように、ファルネセンシンターゼ変異体のインビボ活性上昇が、単離されたファルネセンシンターゼ変異体のｋｃａｔ増加を表した。
【表１９】
0005580488.tif 000020
【０２７３】
実施例１６
この実施例は、セスキテルペンシンターゼの拮抗を利用して適切なプロモータを選択し、ファルネセンシンターゼの発現を、酵母におけるＦＰＰ毒性に基づく増殖選択を可能にするレベルに調整することを説明する。
【０２７４】
様々なプロモータを、表１９に記載のようにＰＣＲ増幅させた。
【表２０】
0005580488.tif 000021
【０２７５】
ｐＡＭ２１９１中の１９１ＧＡＬ１プロモータを交換するために、発現プラスミドをＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）  ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて消化して、この直線化プラスミド１００ｎｇを、プロモータのＰＣＲ産物それぞれ３０ｎｇで指数増殖期のＹ３１９８細胞に同時形質転換した。宿主細胞の形質転換物を、唯一の炭素供給源として２％グルコースを含むＣＳＭ−Ｌに播種して、個々のコロニーがおよそ１ｍｍになるまで３０℃で３日間インキュベートした後、記載のようにＧＣ分析によりファルネセンおよびトリコジエン力価を決定した（表２０）。ＦＳ＿Ａａ＿Ｓｃコード配列に連結されたＧＡＬ１プロモータと類似のファルネセン／トリコジエン比を与えるプロモータを選択して、記載のように、Ｙ２２７におけるＦＰＰ毒性に基づく増殖選択により更にスクリーニングした。ＦＳ＿Ａ＿５．３コード配列を親鋳型として用いた場合、検査されたプロモータのうちＰＥＴ９遺伝子のプロモータが、改善されたＦＳのＦＰＰ毒性に基づく選択での使用に適することが示された。
【表２１】
0005580488.tif 000022
【０２７６】
実施例１７
この実施例は、セスキテルペンシンターゼの拮抗を介して同定されたファルネセンシンターゼの有益な突然変異を関連のセスキテルペンシンターゼに移植する方法を説明する。
【０２７７】
飽和突然変異誘発を利用して、実施例１３で同定されたＦＳの様々なアミノ酸変化が、ＦＳ活性の改善のための原因であることを確認し、これらの突然変異の複数を、関連のセスキテルペンシンターゼである、アルテミシア・アンヌアのアモルファジエンシンターゼ（ＡＤＳ）に移植して、活性の類似の改善が実現され得るかどうかを決定した。移植用に選択されたＦＳのアミノ酸位置は、Ｍｅｔ３５、Ｔｙｒ２８８、Ｔｈｒ３１９、Ｖａｌ３６９、Ｉｌｅ４３４、Ｔｈｒ４４６、Ｉ４６０およびＶ４６７であった。多重整列に基づけば、ＡＤＳにおける整列された対応するアミノ酸は、Ａｌａ１３、Ｃｙｓ２６０、Ａｌａ２９１、Ｍｅｔ３４１、Ｔｈｒ４０６、Ｔｈｒ４１８、Ｐｈｅ４３２およびＧｌｙ４３９である。これらの位置のそれぞれを、１９の他の残基での置換により突然変異させて、核突然変異体をアモルファジエン：トリコジエン拮抗アッセイで検査した。
【０２７８】
別個のＰＣＲ反応を用いることによりＡＤＳ突然変異体を構築して、ＡＤＳ遺伝子内の特異的コドンで重複する２つのＤＮＡフラグメントを増幅させた。各オリゴヌクレオチド対を、標的領域に特異的にアニーリングするヌクレオチドにより両側がフランクされたオリゴヌクレオチドの中央のミスマッチした変性ヌクレオチド配列を用いて合成した（例えば、ＫがＧ塩基とＴ塩基との混合を表し、ＮがＡ塩基、Ｔ塩基、Ｇ塩基およびＣ塩基の混合を表す、ＮＮＫ）。
【表２２】
0005580488.tif 000023
【表２３】
0005580488.tif 000024
【０２７９】
ＡＤＳ−ＴＤＳ拮抗ベクターを調製するために、ｐＡＭ１９４８プラスミドをＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩで消化して、ＩＳ＿Ｐｎ＿Ｓｃコード配列を切除して、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎゲル精製キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）を用いてゲル精製した。残基Ａｌａ１３の突然変異誘発で、ＡＤＳ−Ａ１３−ＦおよびＡＤＳ−ＳＭ−３’を用いてオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を直接増幅させたことを除き、表２２に列挙されたＰＣＲフラグメントと表２１に列挙された適当なＡＤＳ−ＳＭ−５’オリゴおよびＡＤＳ−ＳＭ−３’オリゴと、を等モル量で混合することにより、各飽和突然変異体を含むＡＤＳのｏｒｆ増幅を実施した。増幅されたＰＣＲ産物を直線化ｐＡＭ１９４８ないでギャップ修復して、Ｙ３１２５を形質転換した。各部位の飽和突然変異体では、突然変異体のＡＤＳ／ＴＤＳ比をＡＤＳ  ＷＴと比較することにより、倍率改善が得られた。
【０２８０】
図１７に示されるように、バリン（Ａ２９１Ｖ；配列番号１７４）、システイン（Ａ２９１Ｃ；  配列番号１７５）またはイソロイシン（Ａ２９１Ｉ；  配列番号１７６）のいずれかによるＡｌａ２９１の置換は、ＡＤＳ親物質（ＷＴ）よりも３０％を超えるＡＤＳ／ＴＤＳ比を改善させた。
【０２８１】
ＡＤＳ  Ａ２９１Ｖ、Ａ２９１ＣおよびＡ２９１Ｉの活性改善を確認するために、アモルファジエン力価を、核突然変異体用の発現プラスミドで形質転換された細胞内で決定した。それぞれＡ２９１Ｖ、Ａ２９１ＣおよびＡ２９１Ｉを含むＡＤＳ−ＴＤＳプラスミドを、ＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩを用いて消化して、ゲル抽出した。ＣＥＮ．ＡＲＳプラスミドおよび２μ  Ｌｅｕ２プラスミドを、同じ制限酵素を用いて直線化して、ゲル精製した。ＡＤＳ突然変異体を含む消化されたフラグメントを、１６℃でＴ４リガーゼを用い、直線化ＣＥＮ．ＡＲＳまたは２μ  Ｌｅｕ２プラスミドにライゲートした。反応物２μｌをＨｌ１−ブルー細胞に形質転換して、ＬＢプレートに播種した。ＣＥＮ．ＡＲＳまたは２μ  Ｌｅｕ２プラスミドのいずれかの中に各ＡＤＳ突然変異体を含むコロニーを、配列検証した。
【表２４】
0005580488.tif 000025
【０２８２】
産生については、各プラズマを矯正された（ｃｕｒｅｄ）Ｙ２２７に形質転換して、ＣＳＭ−Ｌプレートに播種した。核突然変異体ごとに８個のコロニーを選び出し、４％ガラクトース含有バードシード培地３６０μＬを含有する９６ウェルプレートで成長させた。３４℃で２日間インキュベートした後、各ウェルの１６μｌを、産生用の４％ガラスとースを有する新鮮なバードシード培地を含有する新しい９６ウェルプレートに接種した。３０℃で２日間インキュベートした後、産生試料をナイルレッドおよびＧＣ分析用に採取した。
【０２８３】
図１８に示されるように、プラスミドＡＤＳ  Ａ２９１Ｖ、Ａ２９１ＣおよびＡ２９１Ｉそれぞれは、２μプラスミドまたはＣＥＮ．ＡＲＳのいずれかで発現された場合、親ＡＤＳよりもアモルファジエン産生の増加を示した。最良の突然変異体ＡｌａＡ２９１Ｖａｌが、親よりも最大５８％改善されたアモルファジエン力価を示した。
【０２８４】
これらの結果から、テルペンシンターゼの拮抗アッセイを用いた１つのテルペンシンターゼにおいて同定された有益な突然変異体を、関連のテルペンシンターゼに有効に移植して、改善されたシンターゼ活性を実行することができた。
【０２８５】
実施例１８
この実施例は、酵母においてセスキテルペンシンターゼの拮抗を利用して、インビボ酵素活性レベルにより、パチュロールシンターゼを順位付けることの実行可能性を実証する。
【０２８６】
発現プラスミドｐＡＭ２５９６、ｐＡＭ２７０２、およびｐＡＭ２５９７を酵母菌株Ｙ９１２０（ＭＥＶ経路を含む）に形質転換することにより、それぞれ酵母菌株Ｙ９２５９、Ｙ１１１３６、Ｙ９２６０を作製し、コロニーＰＣＲにより正しいプラスミドを含むことを確認した。各プラスミドは、ＧＡＬ１プロモータ上に異なるＰＳアイソフォームを、そして分岐したＧＡＬ１プロモータ上にトリコジエンシンターゼ（ＴＤＳ）の同一バージョンを含有した。確認されたコロニーは、単一コロニー用に再ストリークされ、それから８個のコロニーを、ウェルあたり２％スクロース含有バードシード培地（ＢＳＭ）３６０μＬを含有する９６ウェルプレートの別個のウェルでインキュベートした（予備培養）。９９９ｒｐｍの撹拌の下、３０℃で２日間インキュベートした後、各ウェルの６．４μＬを、４％ガラクトースと３．３３％鉱物油およびＢｒｉｊ−５６エマルジョンとを含む新鮮なＢＳＭ  １５０μＬを含有する新しい９６ウェルプレートのウェルに接種した（産生培養）。９９９ｒｐｍでの撹拌下、３０℃で更に４日間インキュベートした後、試料を採取して、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）分析によりテルペン産生について分析した。
【０２８７】
ＧＣ分析については、試料をメタノール／ブトキシエタノール／ヘプタン（１００μＬ：５０μＬ：４００μＬ  ｖ／ｖ）で抽出して、細胞材料を重力により沈降させた。ヘプタン抽出物の一部をヘプタンで希釈し、その後、パルススプリット注入を利用してメチルシリコーン固定相に注入した。パチュロールアルコールおよびトリコジエンを、ＧＣおよび水素炎イオン化検出法（ＦＩＤ）を利用して、沸点により分離した。ヘキサデカンを滞留時間マーカとして使用して、特定のＧＣオーブンプリファイルの間の有効な注入および溶出をモニタリングした。ファルネセンおよびトリコジエンの力価を使用して、ファルネセン／トリコジエン比を計算した（パチュリ油は、パチュリアルコールの力価のおよそ３倍である）。
【０２８８】
表２４に示すように、パチュリ油／トリコジエン比は、試料全体でかなり一定しており、５．４７％以下のＣＶを生じた。こうしてＴＤＳと同じプラスミドからのＰＳを同時発現することにより、検査されたパチュロールシンターゼは、以下のとおり順位付けすることができた（最大活性から最小活性まで）：ＰＳアイソフォーム＿３コード配列（Ｙ９２６０）＞ＰＳ＿アイソフォーム＿２コード配列（Ｙ１１１３６）＞ＰＳ＿アイソフォーム＿２コード配列（Ｙ９２５９）。
【表２５】
0005580488.tif 000026
【０２８９】
実施例１９
この実施例は、モノテルペンシンターゼの拮抗を利用して、インビボ酵素活性によりモノテルペンシンターゼを順位付けすることの実行可能性を実証する。
【０２９０】
モノテルペンリモネンのシンターゼの産生性を決定するために、ｐＧａ１１０プロモータにより誘導される、本明細書で比較テルペンシンターゼとして用いられるオシマム・バシリクムのミルセンシンターゼのコード配列と、同じプラスミド上のｐＧＡＬ１（ｐＡＭ２６４５）により誘導される照合リモネンシンターゼ（ＬＳ）のコード配列と、を含む拮抗ベクターを調製した。コロニーＰＣＲにより、それぞれ異なるＬＳトランケーション変異体またはアイソフォームをコードする拮抗プラスミド８個が、それぞれ酵母菌株Ｙ８２７０（ＭＥＶ経路を含む）に形質転換され、形質転換された菌株が、正しいプラスミドを含むことを確認した。各菌株の単一コロニー８個を、炭素供給源として２％グルコースを含むバードシード培地３６０μＬと共に９６ウェルマイクロタイタープレートでインキュベートした。９９８ＲＰＭでの振とう下、３０℃で３日間成長させた後、各培養物６μＬを、ウェルあたり４％ガラクトースを含むバードシード培地７５μＬおよびミリスチン酸イソプロピル７５μＬを含有する新しい９６ウェルプレートのウェルに接種した。産生プレートをＶｅｌｏｃｉｔｙ  １１ヒートシーラー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で密封して、９９８ＲＰＭでの振とう下、３０℃で成長させた後、−２０℃で２時間、急速冷凍した。その後、０．００１％ヘキサデカン内部標準を含む酢酸エチル３００μｌを急速に添加し、ヒートシーリングし、室温で２時間振とうした後、生成物をアッセイした。ミルセンおよびリモネンの絶対濃度の標準曲線を利用して、ガスクロマトグラム／水素炎イオン化検出法（ＧＣ−ＦＩＤ）を実施した。詳細には酢酸エチル抽出物２μＬを、メチルシリコーン固定相カラムに、スプリット比１：５０で注入した。注入の精密度および滞留時間の調整のために、ヘキサデカンを内部標準として用いて、この注入を分析した。オーブン温度を、２．５分間にわたり２５℃から２５０℃まで勾配を加え、その時点でオーブンを次の飼料のために急速に冷却した。ミルセンおよびリモネンの力価を利用して、拮抗比を計算した。
【０２９１】
図１８に示されるように、テルペンシンターゼの拮抗アッセイを用いて、異なるリモネンシンターゼトランケーション変異体およびアイソフォームの相対的性能を順位付けすることができる。
【０２９２】
本開示の範囲および周知を逸脱することなく、本開示の様々な改良および変更が当業者に明白となろう。本開示を特定の好ましい実施形態と関連づけて記載したが、特許請求の範囲がそのような特定の実施形態に不当に限定すべきでないことを、理解しなければならない。事実、当業者に理解される、本開示を実施するための記載された様式の様々な改良が、特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図１Ａ】
0005580488.tif 000027
【図１Ｂ】
0005580488.tif 000028
【図１Ｃ】
0005580488.tif 000029
【図１Ｄ】
0005580488.tif 000030
【図１Ｅ】
0005580488.tif 000031
【図１Ｆ】
0005580488.tif 000032
【図１Ｇ】
0005580488.tif 000033
【図２】
0005580488.tif 000034
【図３】
0005580488.tif 000035
【図４】
0005580488.tif 000036
【図５】
0005580488.tif 000037
【図６】
0005580488.tif 000038
【図７】
0005580488.tif 000039
【図８】
0005580488.tif 000040
【図９】
0005580488.tif 000041
【図１０】
0005580488.tif 000042
【図１１Ａ】
0005580488.tif 000043
【図１１Ｂ】
0005580488.tif 000044
【図１２】
0005580488.tif 000045
【図１３Ａ】
0005580488.tif 000046
【図１３Ｂ】
0005580488.tif 000047
【図１４】
0005580488.tif 000048
【図１５】
0005580488.tif 000049
【図１６】
0005580488.tif 000050
【図１７】
0005580488.tif 000051
【図１８】
0005580488.tif 000052
【配列表】
0005580488000001.app