(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
交配不全性の糸状菌を交配する方法であって、親株である交配不全性糸状菌と、該親株の交配型遺伝子領域を、該親株と異なるが同種の交配不全性株に由来する別の交配型遺伝子領域で入換えることによって作出された、染色体パターンが実質的に相同でありながら交配型が異なる株とを交配させることを含む、前記方法。
【請求項２】
糸状菌が、植物病原性糸状菌、麹菌、又はその他の子嚢菌である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
植物病原性糸状菌が、Fusarium
oxysporumである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
交配型遺伝子領域又は別の交配型遺伝子領域が、MAT1-1又はMAT1-2のいずれかである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
交配型遺伝子領域の入換えが相同組換えによって行なわれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
Fusarium
oxysporum tomino1-c株と、Fusarium oxysporum tomino1-c株のMAT1-2とFusarium oxysporum 880621a-1株のMAT1-1が入れ替わったFusarium oxysporum tomino1-c株(形質転換体R1とする)とを交配する方法。
【請求項７】
Fusarium
oxysporum tomino1-c株と形質転換体R1を培養した培地を、水寒天上に置き、トマトの茎を下端が水寒天に届くように入れ、25℃、明暗12時間周期で培養する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
親株である交配不全性糸状菌と、該親株の交配型遺伝子領域を、該親株と異なるが同種の交配不全性株に由来する別の交配型遺伝子領域で入換えることによって作出された、染色体パターンが実質的に相同でありながら交配型が異なる株とを交配させることにより、遺伝学的手法に基づき、遺伝子機能(植物病原性、宿主特異性も含む)を解析する方法。
【請求項９】
Fusarium
oxysporum tomino1-c株と、Fusarium oxysporum tomino1-c株のMAT1-2とFusarium oxysporum 880621a-1株のMAT1-1が入れ替わったFusarium oxysporum tomino1-c株とを交配させることにより、遺伝学的手法に基づき、遺伝子機能(植物病原性、宿主特異性も含む)を解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、交配不全性糸状菌を交配する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
菌類は、キチン質を主成分とする細胞壁を有する真核生物である。俗に、「かび」、「きのこ」、「酵母」と呼ばれる形態を有する世代を内包する。このうち、主に、菌糸や胞子（主に球形で発芽し、次世代を形成する能力を有する）からなるもので、酵母状でないものを一般に糸状菌と総称する。糸状菌には分類体系上の子嚢菌、担子菌、接合菌を含む。
【０００３】
糸状菌の生活環は無性世代と有性世代から構成される。菌糸、菌核、分生子、厚膜胞子、bud cell（酵母状細胞）などが核相nの無性世代であり、菌糸の伸長、菌核や分生子などの形成によって遺伝的に同一の後代（クローン）を生み出している（無性増殖）。多くの糸状菌では、無性増殖が繰り返され、生活環の大部分が無性世代によって占められている。
【０００４】
一方、環境条件が整うと、糸状菌は有性世代へとその生活環を切り替える場合がある。子嚢菌では子嚢、担子菌では担子器のような器官を、それぞれ子嚢果（子嚢殻など）、担子器果（いわゆる、きのこ）等の子実体上に形成し、そこで有性生殖を行い、後代を形成する。有性生殖では、核相nの２つの細胞が融合し、n+nの状態（異核共存体）になり、その後、核融合（2n）し、相同染色体が対合、さらに減数分裂によって核相nの後代をつくる。相同染色体の対合から減数分裂の過程での染色体シャフリングや乗換え等によって、遺伝子が組換わり、親と遺伝的に異なる後代が生じる可能性がある。その結果、後代は親と異なる性状をもつ可能性がある。子嚢菌では子嚢胞子が、担子菌では担子胞子（担胞子）がこの後代にあたる。この一連の現象を交配（mating）と呼ぶ。また、形成された子実体や次世代を含む一連の器官やそれを形成する生活間の部分は完全世代と呼ばれる。
【０００５】
糸状菌は基本的に雌雄同体であるが、有性生殖の際に相手を要求するものとしないものが存在する。相手を必要としない性質をホモタリック、相手を必要とする性質をヘテロタリックと呼ぶ。ホモタリックは自家和合性（self-compatible）、ヘテロタリックは自家不和合性（self-incompatible）と理解することが可能である（非特許文献１)。子嚢菌の基本的な有性生殖様式はヘテロタリックであり、ホモタリックな菌はヘテロタリックな菌から生じたと考えられている（後述する。）。
【０００６】
ヘテロタリックな糸状菌では、１種のうちに２つの交配型（MAT1-1とMAT1-2）の菌株が存在する。交配型はその2つに限定される。MAT1-1の菌株とMAT1-2の菌株が適した環境条件の下で出会うと、細胞融合が起こり（この場合、雌雄同体であるため、細胞融合するいずれかの細胞が雄、もう一方が雌として機能する）、有性生殖（上述）の一連の過程が進み、後代を形成する。MAT1-1の菌株同士、あるいはMAT1-2の菌株同士では交配は起きない。菌株の交配型を決定しているのは、交配型遺伝子領域（MAT1）に存在する１組の対立遺伝子（MAT1-1-1およびMAT1-2-1）であり、各菌株はこの対立遺伝子のどちらかを保持している。両遺伝子産物とも、DNA結合モチーフを有しており、交配の初期調節因子であることが示唆されている（非特許文献１および２)。
【０００７】
従って、ヘテロタリックな糸状菌の、異なる交配型の菌株を適当な環境条件で掛け合わせる（交雑、outcross）と、完全世代を形成する。この場合、適当な環境条件は種ごとに異なっている。例えば、Neurospora crassaでは、通常の培地上で対峙培養すれば良い、Cochliobolus
heterostrophusでは、最少培地上に滅菌したトウモロコシ葉を置き、その縁に両菌株を対峙させ、20℃前後、暗黒、過湿にならないように管理すれば良い、Gibberella fujikuroiではV8寒天培地上に片菌株の菌糸を生育させ、そこにもう片菌株の分生子懸濁液をかけ、しばらく放置した後に過剰な水相を除去、その後約25℃で培養すれば良い。
【０００８】
完全世代の形成に、交配型の異なる菌株とのoutcrossを必要としないホモタリックな糸状菌では、交配型遺伝子領域に2種類の交配型遺伝子が独立してあるいは融合して存在するか、MAT1-1-1およびMAT1-2-1に相当する遺伝子がゲノム上の離れた領域に存在することが見出されており、ヘテロタリックな菌から、ホモタリックな菌が進化上生じたことを示唆している（非特許文献３）。
【０００９】
以上のことは、糸状菌が交配を行い、完全世代を形成するのにいずれにせよ、MAT1-1-1およびMAT1-2-1遺伝子の両者あるいは両者の産物が必要であることを示している。
【００１０】
糸状菌の中には、これまで交配および完全世代の形成が観察されていない種が多く存在する。完全世代を形成しないことから、これらの糸状菌は、不完全菌と呼ばれる。過去に、これらの菌は、Deuteromycotina（不完全菌亜門）あるいはFungi imperfecti（不完全菌類）としてまとめられて来たが、近年は分子系統解析の進展によって、近縁の交配可能種との系統関係が明らかにされるようになっており、過去のDeuteromycotinaあるいは、Fungi imperfectiのような菌群は無意味なものとして理解されている（非特許文献４）。ここでは、交配が観察されていない糸状菌を「交配不全性糸状菌」と呼ぶこととする。交配不全性糸状菌は交配できないため、遺伝子機能の遺伝的解析（交配検定）や、交配による育種が不可能であった。交配が可能になれば、交配検定による遺伝子機能の解析が格段に進歩すること、麹菌等でより良好な形質の菌の育種が可能になり、科学的、産業的に意義深いものとなる。
【００１１】
交配不全性の糸状菌は多種に亘る。重要植物病原糸状菌として、Fusarium oxysporum、Verticillium dahliae、Alternaria alternata、Penicillium italicumなど、多くの交配不完全性種が報告されている（非特許文献５、不完全菌類の項目参照）。また、我が国の国菌とも言われる黄麹かびAspergillus oryzaeも交配不完全性種である。そのほか、抗生物質産生菌であるPenicillium spp.や、家庭内で問題となる黒かび類（Cladosporium
spp.やAlternaria spp.など）も多くは交配不完全性である。
【００１２】
従来は、交配不全性の糸状菌を交配する手立ては、種の起源地（多様性が豊かであると想定される）などから交配能を保持する株を探し出し、これと交配することのみであった。例として、イネいもち病菌（Magnaporthe oryzae、不完全世代Pyricularia oryzae）は長く交配不全性の菌として知られていたが、中国昆明由来のイネいもち病菌が実験室レベルで交配能を持つこと、その後、ベトナム北部、インド北西部からも交配能を持つイネいもち病菌が採集されたことが報告されている。さらにまた、従来より交配困難であった担子菌ブクリョウの交配を、アイソザイム分析による交配菌株の選択によって可能とした例もある（特許文献１）。
【００１３】
このような方法による交配不全性の糸状菌の交配は、交配不全性菌と同種の交配能を有する株が偶然にも見出された場合にのみ可能になり、しかも交配不全株を交配できるようにしたとは言えない。すなわち、日本や韓国などで実際に圃場で発生しているイネいもち病菌菌株は交配不全性なままである。
【００１４】
交配能を有することが知られているヘテロタリックな糸状菌（例えばNeurospora crassa）では、テスター菌株との交配試験によって、各菌株の交配型（MAT1-1かMAT1-2のどちらであるか）を検定することが容易である。その結果に基づいて、交配型の異なる菌株を適当な条件で掛け合わせ、交配させ、完全世代を形成することができる。
【００１５】
しかし、交配不全性の糸状菌では、以前は、そもそも菌株の交配型を検定することすら不可能であった。言い換えれば、交配不全性の糸状菌菌株に交配型があるのかどうかもわからなかった。
【００１６】
非特許文献６および関連する特許「交配型遺伝子上の特定部位を増幅させるためのプライマー；特許3718755」（特許文献２）は、PCR法に基づいて、交配不全性糸状菌の菌株の交配型の検定を可能にした。（もちろん、この方法は、交配能を持つ糸状菌にも適用可能である。）
【００１７】
この手法を利用して、交配不全性糸状菌であるFusarium oxysporum、Alternaria alternata、日本産のMagnaporthe
oryzaeの種内に交配型が異なる菌株が存在するかどうかを調査、両交配型の菌株が存在すること（非特許文献６、７、８、９）を示した。さらに、その検定結果に基づいて、異なる交配型の菌株間の掛け合わせ試験を行ったが、いずれも交配には至らなかった（非特許文献７、９）。
【００１８】
交配不全性菌が交配不全である原因として、以下の事項(1)、(2)及び(3)が推定された。(1)交配の初期調節因子である交配型遺伝子領域あるいは交配型遺伝子領域の遺伝子（交配型遺伝子）が存在しないか機能不全である、(2)その下流(以降の意味)で機能するシグナル伝達系の不全、(3)片方の交配型の菌株しか存在しない（交配パートナーの不在）。これらを検証した従来の研究例を概説する。
【００１９】
交配不全性の菌が交配能を有する近縁の菌と同等の交配型遺伝子領域を持つこと、その領域にコードされている交配型遺伝子が、交配能を有する近縁の菌とほぼ相同であることが、Bipolaris sacchari、Fusarium oxysporum、Alternaria alternata、日本産Magnaporthe grisea等を用いて示されている（非特許文献７、９、１０）。また、これらの交配型遺伝子が発現していることが示されている（非特許文献９、１０、１１）。
【００２０】
また、交配不全性の菌の交配型遺伝子が機能を持つことは、交配不全性の菌の交配型遺伝子を、ヘテロタリックな交配能を有する近縁の菌の交配型遺伝子領域を除去した交配不全性変異菌株をレシピエントとして導入した場合に、交配能が回復することで報告された。この様な手法を用いた研究例は、交配不全性のBipolaris sacchariおよびAlternaria alternataについての2つの報告（非特許文献７，１１）のみがあるが、いずれでも、交配不全性の菌の交配型遺伝子領域を導入した、レシピエントのゲノム領域は交配型遺伝子領域（MAT1）ではない。  
【００２１】
交配型遺伝子産物は、既述したようにDNA結合部位を有し、これがゲノムDNAに結合することによって、交配に係わる、フェロモンやフェロモン受容体遺伝子の発現を調節するとされる。フェロモンは、異なる菌株のフェロモン受容体と結合し、その情報が、シグナル伝達系であるG-タンパク質、MAPキナーゼ、cAMP、STE12タンパク質などの調節因子を介して核内に伝えられ、細胞融合、核融合、子実体の形成、後代の形成などの一連の交配挙動が起こるとされている。
【００２２】
これまでに、交配不全性糸状菌のいくつかで、フェロモンやフェロモン受容体、G-タンパク質、MAPキナーゼ等の遺伝子が解析され、それらが、交配能を有する菌と同様に機能していることが示されている。
【００２３】
以上のことは、交配不全性の原因と考えられた上記(1)および(2)を否定し、交配不全性の菌が基本的に交配能を有する可能性を示しているかもしれない。
【００２４】
非特許文献８は、交配不全性のトマト萎凋病菌（F. oxysporum f. sp. lycopersici）菌株がF. oxysporumの系統樹中で３つの系統を形成すること、異なる系統に含まれる菌株では、菌糸融合群が異なること、各系統に含まれる萎凋病菌菌株は菌糸融合群が同一であるばかりか、交配型も１つに限られることを報告した。
【００２５】
非特許文献１２は、交配不全性の原因追及の一環としてFusarium oxysporumの交配型遺伝子領域（MAT1）の入換え株の作出を試みた。
【特許文献１】特開平07-227164号公報
【特許文献２】特許3718755号公報  「交配型遺伝子上の特定部位を増幅させるためのプライマー」
【非特許文献１】Debuchy R, Turgeon BG (2006) Mating-typestructure, evolution, and function in euascomycetes. In The Mycota I(Kues &Fisher eds.), Springer-Verlag, Berlin. pp. 293-323
【非特許文献２】Shiu PK, Glass NL (2000) Cell and nuclearrecognition mechanisms mediated by mating type in filamentous ascomycetes. CurrOpin Microbiol 3:183-188
【非特許文献３】Yun SH, Berbee ML, Yoder OC, Turgeon BG(1999) Evolution of the fungal self-fertile reproductive life style fromself-sterile ancestors. Proc Natl Acad Sci USA 96:5592-5597
【非特許文献４】宍戸和夫ら、キノコとカビの基礎科学とバイオ技術、アイピーシー、2002
【非特許文献５】米山勝美ら編、植物病原アトラス、ソフトサイエンス社、2006
【非特許文献６】Arie, T., Christiansen, S. K., Yoder, O. C.and Turgeon, B. G. (1997). Effecient cloning of ascomycete mating type genes byPCR amplification of the conserved MAT HMG box. Fungal Genet Biol 21: 118-130
【非特許文献７】Arie, T., Kaneko, I., Yoshida, T., Noguchi,M., Nomura, Y. and Yamaguchi, I. (2000). Mating type genes from asexualphytopathogenic ascomycetes, Fusarium oxysporum and Alternaria alternata. MolPlant-Microbe Interact 13 (12):1330-1339
【非特許文献８】M. Kawabe, Y. Kobayashi, G. Okada, I. Yamaguchi, T. Teraoka and T. Arie (2005). Three evolutionary lineages of tomato wilt pathogen,Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, based on sequences of IGS, MAT1, andpg1, are each composed of isolates of a single mating type and a single orclosely related vegetative compatibility group. J Gen Plant Pathol:71(4):263-272
【非特許文献９】Masaki Kanamori, Hana Kato, Nobuko Yasuda,Shinzo Koizumi, Tobin L. Peever, Takashi Kamakura, Tohru Teraoka, Tsutomu Arie(2007) Novel mating type-dependent transcripts at the mating type locus inMagnaporthe oryzae. Gene 403:6-17
【非特許文献１０】Sharon A., Yamaguchi K., Christiansen S.,Horwitz B.A., Yoder O.C., Turgeon B.G., 1996. An asexual fungus has thepotential for sexual development. Mol Gen Genet 250: 11-122
【非特許文献１１】Yun, Sung-Hwan, Arie, Tsutomu, Kaneko, Isao,Yoder, O. C., Turgeon, B. Gillian, 2000. Molecular Organization of Mating TypeLoci in Heterothallic, Homothallic, and Asexual Gibberella/Fusarium Species. FungalGenet Biol 31: 7-20
【非特許文献１２】今井峻介、寺岡  徹、有江  力 2007. 「Fusarium oxysporumの交配型遺伝子領域（MAT1）の入換え株の作出」平成19年度日本植物病理学会関東部会講演要旨集 8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
上述したことは、交配不全であるFusarium oxysporumでは、交配し得る近縁の集団内にパートナーが不在になってしまっており、これが交配不全の原因である可能性を示唆した。すなわち、原因として推測された上記背景技術の項の上記(3)の可能性を示唆したものである。
【００２７】
そのため、交配不全性糸状菌を交配する新規な方法の開発が望まれている。
【００２８】
本発明は、交配不全性糸状菌を交配する新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
上記課題を解決し、本発明の目的を達成するため、本発明者らは、今回、交親株である交配不全性糸状菌と、該親株の交配型遺伝子領域を、該親株と異なるが同種の交配型不全性株に由来する別の交配型遺伝子領域で入換えることによって染色体パターンが実質的に相同でありながら交配型が異なる入換え株とを交配させることを含む方法によって、交配不全性糸状菌を交配可能にする方法を見出した。
【００３０】
ここで、限定されるわけではないが、糸状菌が、植物病原性糸状菌又は麹菌であることが好ましい。また、限定されるわけではないが、植物病原性糸状菌がFusarium oxysporumであることが好ましい。また、限定されるわけではないが、入換えが相同組換えによって行なわれることが好ましい。
本発明は、Fusarium
oxysporum tomino1-c株と、Fusarium oxysporum tomino1-c株のMAT1-2とFusarium oxysporum 880621a-1株のMAT1-1が入れ替わったFusarium oxysporum tomino1-c株 (形質転換体R1とする)とを交配する方法である。
本発明は、親株である交配不全性糸状菌と、該親株の交配型遺伝子領域を、該親株と異なるが同種の交配不全性株に由来する別の交配型遺伝子領域で入換えることによって作出された、染色体パターンが実質的に相同でありながら交配型が異なる株とを交配させることにより、遺伝学的手法に基づき、遺伝子機能(植物病原性、宿主特異性も含む)を解析する方法である。
本発明は、Fusarium
oxysporum tomino1-c株と、Fusarium oxysporum tomino1-c株のMAT1-2とFusarium oxysporum 880621a-1株のMAT1-1が入れ替わったFusarium oxysporum tomino1-c株とを交配させることにより、遺伝学的手法に基づき、遺伝子機能(植物病原性、宿主特異性も含む)を解析する方法である。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の交配不全性糸状菌を交配する方法は、産業上重要又は有用な糸状菌の遺伝子機能の解析や、良好な形質の菌の生成、すなわち育種、を可能にする利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】この図は、Fusarium oxysporumのCHEF分離による染色体パターンを示す。図中、Aは、NBRC6531株、Bは、880621a-1株、Cは、MAFF103038株、Dは、MAFF103036株、Eは、tomino 1-c株、Fは、F-1-1株をそれぞれ表わす。アガロースゲル電気泳動条件は次のとおりである。ゲル：0.8% Certified Megabase Agarose (Bio-rad)；泳動バッファー：0.5×TBE；温度：10℃；電圧：2．0 V／cm；泳動時間：120時間；初期スイッチング時間：10分：最終スイッチング時間：30分。
【図２】この図は、Gibberella fujikuroiのCHEF分離による染色体パターンを示す。アガロースゲル電気泳動条件は次のとおりである。ゲル：0.8% Certified Megabase Agarose (Bio-rad)；泳動バッファー：0.5×TBE；温度：10℃；電圧：2．0 V／cm；泳動時間：120時間；初期スイッチング時間：10分：最終スイッチング時間：30分。
【図３】この図は、TAIL-PCRで用いたプライマーの位置と880621a-1とtomino1-cのMAT1領域の構造を示す。白抜きのボックスは、塩基配列が95%以上相同な領域を示す。
【図４】この図は、TAIL(thermal asymmetric interlaced)-PCR及びLA(long accurate)-PCRの反応条件及び手順を示す。なお、TAIL-PCRの試薬はすべて、New England Biolabs社製であり、一方、LA−PCRの試薬はすべてTakara社製である。
【図５】この図は、MAT1領域入換えベクターの構築（図5A）と形質転換体の交配型検定結果（図5B）を示す。
【図６】この図は、形質転換体の染色体パターンを示す。アガロースゲル電気泳動条件は次のとおりである。ゲル：0.8%Certified Megabase Agarose (Bio-rad)；泳動バッファー：0.5×TBE；温度：10℃；電圧：2．0 V／cm；泳動時間：120時間；初期スイッチング時間：10分：最終スイッチング時間：30分。
【図７】この図は、トマト茎上に形成された子嚢殻（図7A及び7B）、子嚢(図7C)及び子嚢胞子(図7D)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、糸状菌を交配する方法にかかる発明を実施するための最良の形態について説明する。
【００３４】
本発明は、交配不全性の糸状菌を交配する方法であって、親株である交配不全性糸状菌と、該親株の交配型遺伝子領域を、該親株と異なるが同種の交配不全性株に由来する別の交配型遺伝子領域で入換えることによって作出された、染色体パターンが実質的に相同でありながら交配型が異なる入換え株とを交配させることを含む方法を提供する。
【００３５】
本明細書で使用される「交配不全性糸状菌」は、交配が観察されていない糸状菌を指す。ここで糸状菌は、菌類のうち菌糸や胞子からなるものを指し、子嚢菌、担子菌、接合菌なども包含する。交配不全性糸状菌は交配できないため、遺伝子機能の遺伝的解析（交配検定）や、交配による育種が不可能であるため、本発明の方法により交配が可能になれば、交配検定による遺伝子機能の解析が格段に進歩すること、また、麹菌等でより良好な形質の菌の育種が可能になり、科学的、産業的に意義深いものとなる。
【００３６】
本発明における交配不全性糸状菌は、以下のものに限定されないが、例えば重要な植物病原性糸状菌、例えばFusarium
oxysporum、Verticillium dahliae、Alternaria
alternata、Penicillium italicumなど（米山勝美、2006（非特許文献５）、「不完全菌類」の項目参照）、麹菌、例えば黄麹かび(Aspergillus
oryzae)やAspergillus spp.、或いは、その他の子嚢菌、例えばAcremonium spp.、Alternaria spp.、Ambrosiella spp.、Arthrobotrys spp.、Aureobasidium spp.、Beauveria spp.、Blastomyces spp.、Botriosporium spp.、Botrytis spp.、Chalara spp.、Cercospora spp.、Cephalosporium spp.、Chrysomnia spp.、Chrysosporium spp.、Cladosporium spp.、Chlorodoim spp.、Coccidioides spp.、Cryptococcus spp.、Curvularia spp.、Cylindrocarpon spp.、Cylindrocladium spp.、Drechslera spp.、Epicoccum spp.、Fusarium spp.、Geotrichum spp.、Gliocladium spp.、Graphium spp.、Helicomyces spp.、Helicosporium spp.、Heliscus spp.、Helmithosporium spp.、Hyalodendron spp.、Hystoplasma spp.、Isaria spp.、Lemonniera spp.、Metarhizium spp.、Microsporium spp.、Monilia spp.、Monocillium spp.、Nigrospora spp.、Nodulisporium spp.、Oidiodendron spp.、Paecilomyces spp.、Penicillium spp.、Phialomyces spp.、Phialophora spp.、Pyricularia spp.、Raffaelea spp.、Ramularia spp.、Rhinocladiella spp.、Sporpthrix spp.、Staphylotricum spp.、Stilbella spp.、Thermomyces spp.、Trichiphyton spp.、Trichoderma spp.、Trichothecium spp.、Tripospermum spp.、Varicosporium spp.、Verticillium spp.、 Ascochyta spp.、Endothiella spp.、Leucocytospora spp.、Melasmia spp.、Pestalotia spp.、Pestalotiopsis spp.、Phoma spp.、Phomopsis spp.、Septoria spp.、Rhizoctonia spp.、Sclerotium spp.などのうち完全世代の報告がないものを例示することができる。
【００３７】
本明細書で使用される「交配型遺伝子」とは、菌株の交配型を決定する遺伝子である。一般にヘテロタリックな糸状菌では1種のうちに２つの交配型(例えばMAT1-1とMAT1-2)の菌株が存在し、これらの菌株が適した環境条件で出会うと細胞融合が起こり、有性生殖の一連の過程が進み、後代を形成する。交配型の呼称は各菌種によって異なる場合があるが、交配型遺伝子領域の構造からはMAT1-1およびMAT1-2と整理することが標準とされており（Turgeon, B. G. and Yoder, O. C. (2000). Proposed nom enclature for
mating type genes of filam entous ascom ycetes. Fungal genet. Biol. 31:1-5.）、本明細書では交配型としてそのような標準的呼称を採用している（従って、他の表記もすべて内包することになる）。
【００３８】
本発明では、交配不全性糸状菌の親株と、該親株と異なるが同種の交配不全性株に由来する別の交配型遺伝子領域で入換えることによって染色体パターンが実質的に相同となった入換え株とを交配させる。ここで、親株の交配型遺伝子と、入換え株の交配型遺伝子は、菌株間での細胞融合を起こしうる、交配型を決定する２つの遺伝子である。上記例示のような、MAT1-1とMAT1-2などが、交配型決定遺伝子の対である。
【００３９】
MAT1-1及びMAT1-2などの交配型遺伝子を含む領域の配列情報としては、各種の交配不全性糸状菌についてGenBank（米国NCBI）などのジーンバンクに登録された配列、あるいは刊行物に記載された配列などを利用することができる。例えば、Fusarium oxysporumのMAT1領域及びその隣接領域(flanking regions)を含むゲノム領域の配列情報は、GenBank 
AB011379, AB011378などとして登録されている。また、黄麹かび(Aspergillus
oryzae)の交配型遺伝子領域を含むゲノム配列に関する配列情報は、Galagan et al.,
(2005) Nature Vol 438:22-29に登録されている。
【００４０】
本発明は、同種の糸状菌間、特に株間での交配型遺伝子領域の入換え（例えば、組換え又は置換）を利用する。後述の実施例では、Fusarium oxysporumのうち、880621a-1株とtomino1-c株との間で、880621a-1株のMAT1-1領域(約4.5kb)及びその両隣接領域（それぞれ、約2.5〜3.0kb）を含むゲノム領域によって、tomino1-c株のMAT1-2領域及び（880621a-1株のMAT1-1領域(約4.5kb)の両隣接領域の各々と）95％以上（好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上）の相同性を有するその両隣接領域（約2.5〜3.0kb）を含むゲノム領域を、相同組換え法によって組み換える（図３、図５参照）。相同組換えを実施するために、目的の糸状菌において、交配型遺伝子領域及びその両隣接領域からなる挿入しようとするゲノム領域（全長約7〜10kb）を、プライマーを用いるPCR
(Polymerase Chain Reaction)にて増幅し、この増幅産物をプラスミドなどのベクターに組み入れたのち、制限酵素で切断して一本鎖にし、これを用いて、親株のゲノムの相同領域との組換えを行う。このとき、親株からプロトプラスト（又はスフェロプラスト）を作製し、このなかにプラスミド由来の相同組換え用DNAを導入する。このような方法は、一般的な手法で実施しうる。プロトプラスト（又はスフェロプラスト）は、培養糸状菌を細胞壁溶解酵素（例えばセルラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、キチナーゼ、リゾチームなど））で処理することによって該菌の細胞壁を部分的に又は全体的に溶解して得ることができる。プロトプラスト（又はスフェロプラスト）内への外来DNA（ここでは、プラスミド）の導入のために、ポリエチレングリコール(PEG)法、エレクトロポレーション法などを使用できる。PEG法で使用可能なPEGの分子量は、一般に約4,000〜約10,000の範囲である。また、エレクトロポレーションは、細胞懸濁液に電気パルスをかけて微小な孔をあけ、これにより外来DNAを細胞内に導入する手法である。プラスミドは、糸状菌の形質転換用であればいずれも使用可能であり、例えばpCSN43（Staben, C. et al., (1989) Fungal Genet. Newsl. 36:79-81）などを含む。プラスミドは、プロモーター、エンハンサー、選択マーカー（例えば、薬剤耐性マーカー（例えばG418、オリゴマイシン、ブラシチシジンSなど）、栄養要求性マーカー（例えばpryG、argB、tryCなど）、チミジンキナーゼ(tk)遺伝子など）、マルチクローニングサイトなどを含むことができる。
【００４１】
本発明では、交配を成功させるためには、親株の染色体パターンと、交配パートナーの入換え株の染色体パターンとが実質的に相同である必要がある。ここで、染色体パターンは、後述の実施例に記載のようにCHEF電気泳動によって確認することができる（図６参照）。ここで、実質的とは、完全一致でないが視覚的に一致していることの意味である。また、染色体パターンとは、CHEF電気泳動によって識別できる当該菌株が有する染色体の数や大きさのEFHEH意味である。核型とも同義である。
【００４２】
上記のようにして作出した形質転換株（入換え株）と親株との交配は、寒天培地などの固体培地に必要な栄養分を補充した培地にて両菌株を一緒に培養し、必要であれば感染対象を接触させて培養を行い、交配により親株類と異なる形質の株を選抜する。形質の違いは、例えば、子嚢殻様構造の形成、内部の子嚢および子嚢胞子の形成や子嚢殻からの子嚢胞子の放出によって判定することができる。
【００４３】
染色体パターンが相同で交配型遺伝子が異なる株は、必ずしも全く同一の株の交配型遺伝子入れ換え株に限定されない。染色体パターンが相同（同一でなく、類似する場合も含む）であっても、相同染色体が対合することが可能であればよい。
【００４４】
なお、本発明は上述の発明を実施するための最良の形態に限らず本発明の要旨を逸脱することなくその他種々の構成を採り得ることはもちろんである。
【実施例】
【００４５】
つぎに、本発明にかかる実施例について具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではないことはもちろんである。
【００４６】
交配不全性菌であるFusarium oxysporum 菌株における遺伝的なバックグラウンドを調査するために、CHEF (Clamped Homogeneous Electric Fields) 電気泳動を行い、染色体のパターンを核型解析によって調査した。使用した菌株は、トマト萎凋病菌F. oxysporum f. sp. lycopersici MAT1-1の株を4株(NBRC6531, 880621a-1, MAFF103038, MAFF103036)、MAT1-2の株を2株(tomino1-c,
F-1-1)である。各株のプロトプラストを調製（プロトプラストの調製法は後述する。）、1.0 x 108
protoplasts/ml以上になるようにSTE (1 M Sorbitol, 25 mM
Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 7.5) に再懸濁した。等量のSTEに1.4 % InCert agarose (低融点アガロース、FMC) を融解、プロトプラスト溶液と混合し、プロトプラストを包埋した。できたプラグを3 mm程度の薄さにスライスし、SE buffer (1 M Sorbitol, 50
mM EDTA, pH 8.0)中で55℃、36時間インキュベートした。プラグを取り出し、2 mg/mlのProteinaseKを含むNDS (100 mM Tris, 500 mM EDTA, 1 % N-laurylsarcosyl) 中で更に55℃で36時間インキュベートして、細胞を破壊し、染色体を露出させた。50 mM EDTAにプラグを浸して10分間震盪した後、EDTAを捨てた。この作業を3回繰り返し、完成したプラグをCHEF Mapper (Bio-rad) に供試した。電気泳動の条件は図１に示す。各株で染色体パターンが異なるのが分かる（図１）。特に、交配する可能性があるMAT1-1株とMAT1-2株間で染色体パターンが類似するものがない。
【００４７】
F. oxysporumに近縁で交配能を持つGibberella
fujikuroiには交配群 (mating population) と呼ばれるグループが存在し、同一交配群内の異なる交配型の菌株間でのみ交配がおこる。G. fujikuroi菌株の染色体を上述と同様にCHEFによって分離すると、一つの交配群の中では、異交配型の菌株間でも類似したパターンを示した（図2）。
【００４８】
しかるに、F. oxysporum菌株がたとえ交配する潜在能力を持っていたとしても、菌株ごとに異なる染色体パターンを持つため、異交配型菌株が交配を開始した場合でも、染色体の対合から減数分裂の過程が不全になる可能性、さらには、これがF. oxysporumの交配不全性の原因であることが示唆された。この原因は、これまでF.
oxysporumが交配をせずに、無性的な増殖を繰り返してきた結果であると推測された。
【００４９】
以上のことは、F. oxysporumでは、各菌株の染色体パターンが異なるため、交配可能なパートナーの不在が起きている可能性を示し、交配不全性の原因として上述で推測した(3)を強く支持するものである。
【００５０】
そこで、F.oxysporumにおいて、染色体パターンが相同でありながら、交配型が異なる菌株を人工的に作出し、それを用いて交配試験を試みた。図3に示すように、MAT1領域の両側は、MAT1-1株およびMAT1-2株とも相同であるため、二回相同組換え法に基づいて、MAT1領域をそっくり入れ換えることを意図した。その結果、上述した従来作出されたMAT1領域挿入株とは異なる新たなタイプの挿入株が生じる。なお、二回相同組換えによる遺伝子領域の入換え自体は普遍的な技術である。
【００５１】
二回相同組換えによる遺伝子領域の入換えを行うには、当該遺伝子領域の両側の隣接領域約0.5〜5 kbの塩基配列情報が必要になる。そこで、すでに決定されていたF. oxysporumのMAT1領域および隣接領域の塩基配列（Arie et al. 2000;
GenBank  AB011379, AB011378）のさらに周辺領域の塩基配列を決定した。そのために、F. oxysporum 880621a-1株 (交配型MAT1-1) ゲノムDNAを鋳型に用いてTAIL-PCR（非特許文献７(Arie et al. 2000)）を行った。
【００５２】
GenBank AB011379で登録されている塩基配列を基に設計した特異プライマーと7つの非特異プライマー(表1)を用いて図4に示した条件で数回のTAIL-PCRを行い、MAT1領域の上流約2.8 kb、下流約2.6
kbの隣接領域の塩基配列を決定した(図3)。これらの塩基配列はF. oxysporum tomino 1-c株 (交配型MAT1-2)の同領域と95%以上の高い相同性を示した(図3)。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
プライマーXとY (表1)を用いて図4に示した条件でF.
oxysporum 880621a-1株ゲノムDNAを鋳型にLA-PCRを行い、得られた約10 kbのMAT1領域（MAT1-1-1遺伝子を含む）を含むDNA断片をTOPO XL Gel purification kit
(Invitrogen) を用いて精製し、pCR-XL-TOPO (Invitrogen) ベクターに導入、MAT1領域入換えベクターpMAT1-1とした (図5A) 。
【００５５】
PSA (potato sucrose agar) 培地上で生育させたtomino 1-cの菌糸を培地ごと切り出し、50 mlのPSB (potato sucrose broth) 液体培地に入れ、5日間、120 rpmで震盪培養した。二重滅菌ガーゼで濾過して菌糸を除き、3000 rpmで10分間遠心し、胞子をチューブの底に沈め上清を捨てた。滅菌RO水を加えて沈殿している胞子をよく洗い、再び3000 rpmで10分間遠心し、上清を捨て、適当な量の滅菌RO水を加え胞子懸濁液とした。1.0 x 107個の胞子を100 mlのPSBに加え、室温で静置した。約36時間後、発芽した胞子をブフナー漏斗と濾紙を用いて回収し、50 mlの滅菌RO水に懸濁、3000 rpmで10分間遠心して上清を捨てた。再び滅菌RO水を加えて同様の作業を行った後、回収した発芽胞子を10 mlの1.2 M MgSO4に再懸濁し、そこへ等容量の酵素液 (2%
Lysing Enzymes, 2% ドリセラーゼ(セルラーゼ・プロテアーゼ・ペクチナーゼ複合酵素;協和発酵工業製)、0.0005%キチナーゼを加えて、70 rpmで3時間インキュベートした。滅菌ティッシュペーパーで菌糸を取り除き、等容のSTC (1 M Sorbitol, 10 mmM Tris-HCl, 10 mM CaCl2・2 H2O) を加えて、3000 rpmで20分間遠心し、沈殿したプロトプラストを回収して120 μlのSTCに再懸濁し、プロトプラスト溶液を調製した。このとき、濃度が1.0 x 108 protoplasts/ml以上になるように調整した。
【００５６】
pMAT1-1と、ハイグロマイシンB耐性遺伝子を持つpCSN43はそれぞれQIAfilter Plasmid Midi kit (QIAGEN)
で抽出し、それぞれ20μgずつを制限酵素Not Iで一本鎖化した。両プラスミド液は65℃で20分間以上加熱し制限酵素を失活させた後、既述のプロトプラスト溶液に全量を加え、20分間氷上に静置した。この液に60 % PEG (ポリエチレングリコール) 4000溶液を200μl、200μl、800μlの順に混ぜながら段階的に加えていき、20分間氷上で静置し、細胞内に両プラスミドをとりこませた。6 mlのSTCを加えPEGを希釈し、40℃程度に冷ましたRM培地に混ぜ込み、シャーレに分注した。約24時間後に100μg/ml のハイグロマイシンB（非形質転換体F. oxysporumが感受性の抗生物質）を含む1.0 %水寒天を重層し、上層に生えてきた菌株を形質転換体とし、以降の実験に用いた。この形質転換は、２つのプラスミドを同時に使用して行っている。高い効率で２つのプラスミドが同時にゲノムに取り込まれることが知られており、この方法をcotransformationという。本実施例では、２つのうちの１つに、糸状菌をハイグロマイシン耐性にするpCSN43を使用しているため、形質転換体をハイグロマイシンB添加培地で選抜できる。
【００５７】
得られた2株の形質転換体のゲノムDNAを抽出し、A+B、C+Dのプライマー (表1、図５) の組合せでPCRを行い、交配型を調査した。その結果、tomino1-cのMAT1-2と880621a-1のMAT1-1が入れ替わった株tomino1-c (ΔMAT1-2; MAT1-1) [以降R1とする] と入換えが起こらずMAT1-1が異所に挿入された株tomino1-c (MAT1-2; MAT1-1) [以降E1とする] が得られたことが確認された (図5B)
。
【００５８】
これらの形質転換体の染色体を上述と同様にCHEF電気泳動で分離し、染色体パターンを調査した。その結果、形質転換体（R1およびE1）の染色体パターンが親株（tomino
1-c）と相同になっていることが分かった (図6) 。
【００５９】
この結果、F.oxysporumにおいて、染色体パターンがtomino
1-c (MAT1-2)と相同でありながら、交配型が異なる（MAT1-1）菌株（R1）を人工的に作出できたことになる。本実施例の特徴は、単に交配型の異なる株を得たのではなく、染色体パターンを相同にした上で交配型が異なる株を作出した点にある。
【００６０】
上述までに作出した形質転換体（R1、MAT1-1）とその親株tomino 1-c（MAT1-2）の掛け合わせ試験を行った。試験管の底に3 cmほどの水寒天を入れ、オートクレーブ滅菌を行った。PSA、MMAのいずれかの平板培地上で両菌株を5日間ほど培養し、生育が良好な菌そうの先端部を培地ごと、約1 cm四方に切り出し、先述の試験管内の水寒天上に置いた。次に、一ヶ月以上滅菌土で育苗したトマト (品種: ポンデローザ) の茎の気根を取り除き、約5 cmの長さに切断したものを、70 %エタノール中で5分間振とうしながら洗浄した。さらに有効塩素濃度1 %に調整した次亜塩素酸ナトリウム水溶液中で5分間上下に振とうし、殺菌した。次亜塩素酸ナトリウム水溶液を捨て、滅菌RO水で洗浄した。この洗浄作業を3回繰り返した。得られた表面殺菌済みのトマトの茎を、茎の下端が試験管内の水寒天に届くように垂直に入れて、試験管にシリコ栓をし、25℃、明暗12時間周期に設定したインキュベータ内で培養した。
【００６１】
培養14日後、tomino1-c×R1の組合せで菌を入れた試験管内で、有性世代に特異的な器官である子嚢殻が形成されているのを確認した。更に顕微鏡下で観察を行ったところ、子嚢殻内部に子嚢、及び、子嚢の内部に8個の子嚢胞子が確認された。従って、上述の条件下で交配が行われたことが示された (図7) 。
【００６２】
糸状菌は、交配の為に種ごとに異なる環境条件を要求する。本実施例では、上述がF. oxysporumの交配好適条件であることを見出したことも初の報告であり、意義深い。
【００６３】
以上のように、遺伝的なバックグラウンドが極めて近く、交配型が異なる菌株を作出し、交配好適条件で掛け合わせることによって、交配不全性菌糸状菌の交配が可能になった。また、この結果は、F. oxysporumが交配に係わる機能を完全に維持していることの初の証明である。
【００６４】
両交配型遺伝子を保持するE1株は、上述の条件でE1の菌そうのみを植えたところ、上述と同様な完全世代を形成した。ここで使用したE1株は、背景技術で既述したホモタリック株と同様に、両交配型遺伝子を保持しているため、リーズナブルである。
【００６５】
なお、配列表において、880621a-1 MAT1-1 locusは、MAT1-1領域を含む塩基配列であり、MAT1-1領域は2897-7501 bpである。tomino1-c MAT1-2 leftは880621a-1の1219-2754 bpに相当する部分の配列であり、tomino1-c MAT1-2 rightは880621a-1の7556-10302 bpに相当する部分の配列である。
【００６６】
以上のことから、本実施例によれば以下のような効果が得られる。
今後Fusarium oxysporumの完全世代の命名が可能となる。
Fusarium oxysporumにおいて、遺伝学的手法に基づき、交配によって遺伝子機能(植物病原性、宿主特異性なども含む)の解析などが可能になる。
他の交配不全性の植物病原性糸状菌種でも同様な方法で発病因子の解析に遺伝的手法が利用できるようになる。
【００６７】
植物病原性でない交配不全性の糸状菌（例えばAspergillus oryzae）にも同様な手法が適用可能であり、完全世代を形成させること、交配試験による遺伝子機能などの遺伝解析が可能になる。
産業上有用な交配不全性菌（Aspergillus oryzae、Penicillium spp.）で、交配による形質の改善、すなわち、育種が可能になる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
産業上有用な交配不全性菌（例えばAspergillus oryzae、Penicillium spp.）で、交配による形質の改善、すなわち、育種が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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