(57)【要約】【課題】  ウイルス（特に、HCMV）特異的CTLによる細胞治療の実用化を実現するため、簡便性と安全性を兼ね備え、しかも低コストで実施可能なウイルス特異的CTLの閉鎖系培養システムの提供すること。【解決手段】  ウイルス特異的CTLエピトープペプチドと末梢血単核球とを混合培養した後、このエピトープペプチドと培地中で再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離し、OKT3（抗CD3モノクローナル抗体）の刺激で末梢血単核球から増殖させたT細胞と前記エピトープペプチドとを培地中で接触させた後に、このT細胞と前記ウイルス特異的CTLとを共培養することによって、ウイルス特異的CTLが増殖する。【選択図】        ２
2008023786.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HTLV-1、インフルエンザ、アデノウィルス、エイズウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス、及びヒトサイトメガロウイルスからなる群から選択される一つのウイルス特異的CTLを誘導する方法であって、末梢血単核球とウイルス特異的CTLエピトープペプチドを混合培養することを特徴とするウイルス特異的CTLの誘導方法。
【請求項２】
前記混合培養において、エピトープペプチドの培地中での終濃度が0.01μg/mL-10μg/mLであることを特徴とする請求項１に記載のウイルス特異的CTLの誘導方法。
【請求項３】
前記混合培養に用いる培地として、5％ - 10％自己血漿を含むRPMI1640を用い、エピトープペプチドを添加後、2日後に終濃度が10 IU/mLとなるようにIL-2を加え、その後IL-2濃度を2-3日ごとに2倍づつ上げながら12日間-19日間培養することを特徴とする請求項１または２に記載のウイルス特異的CTLの誘導方法。
【請求項４】
ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の誘導方法、またはその他の方法で誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドと培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
【請求項５】
ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の誘導方法、またはその他の方法で誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドを提示した抗原提示細胞と培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
【請求項６】
ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、請求項１〜３のいずれかに記載の誘導方法、またはその他の方法で誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドと複合体を形成するMHC分子と培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
【請求項７】
前記再刺激に用いるエピトープペプチドの培地中での終濃度が0.1ng/mL-1000ng/mLであることを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの単離方法。
【請求項８】
前記再刺激は、5％-10％自己血漿と10 IU/mL〜50 IU/mLのIL-2または10ng/mL IL-15のいずれかとを含むRPMI1640培地中で8時間〜15時間に渡って行うことを特徴とする請求項４〜７のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの単離方法。
【請求項９】
CD137抗原を標的とする際に、磁気標識した抗CD137抗体を用いることを特徴とする請求項４〜８のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの単離方法。
【請求項１０】
CD137抗原を標的とする際に、抗CD137抗体を感作した固相を用いることを特徴とする請求項４〜８のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの単離方法。
【請求項１１】
ウイルス特異的CTLの増殖方法であって、抗CD3モノクローナル抗体であるOKT3を用いて末梢血単核球から増殖させたT細胞と、請求項１〜３のいずれかにおいて誘導の際に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドとを培地中で接触させた後に、このT細胞と、請求項４〜１０のいずれかに記載の単離方法で単離したウイルス特異的CTLまたは請求項１〜３のいずれかに記載の誘導方法で誘導したウイルス特異的CTLとを共培養することを特徴とするウイルス特異的CTLの増殖方法。
【請求項１２】
請求項１１においてOKT3を用いて末梢血単核球から増殖させたT細胞を、ウイルス特異的CTLエピトープペプチドと培地中で接触させる際に、下記条件を用いることを特徴とする増殖方法。
（ａ）培地中に加えるエピトープペプチドの終濃度； 0.0001μg/mL〜10μg/mL
（ｂ）接触時間；30分間〜60分間
（ｃ）培養温度；18℃〜25℃
（ｄ）培地；血清、血漿など蛋白成分を含まないRPMI1640。
【請求項１３】
請求項１１において、以下の共培養条件を特徴とする増殖方法。
（ｅ）ウイルス特異的CTL：OKT3を用いて増殖させたT細胞の混合比；10:1〜1:3
（ｆ）培地組成  共培養開始後1日目-3日目まで；RPMI1640（5％〜10％自己血漿、10 IU/mL〜50 IU/mL IL-2）またはRPMI1640(5％〜10％自己血漿、10ng/mL IL-15)、共培養開始後3日目以降；ALyS505N（100 IU/mL〜1000 IU/mL IL-2、0.1％〜1％自己血漿）またはALyS505N（10ng/mL IL-15、0.1％〜1％自己血漿）。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれかに記載の誘導方法によりウイルス特異的CTLを誘導する工程を含むウイルス特異的CTLの製造方法。
【請求項１５】
請求項４〜１０のいずれかに記載の単離方法によりウイルス特異的CTLを単離する工程を含むウイルス特異的CTLの製造方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の増殖方法によりウイルス特異的CTLを増殖する工程を含むウイルス特異的CTLの製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜３のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの誘導方法、請求項４〜１０のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの単離方法、請求項１１〜１４のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの増殖方法をそれぞれ組み合わせることを特徴とするウイルス特異的CTLの製造方法。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの製造方法によって製造されたウイルス特異的CTL。
【請求項１９】
請求項１４〜１７のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの製造方法によって製造されたウイルス特異的CTLを含むウイルス感染症の治療剤及び／または予防剤。
【請求項２０】
請求項１９に記載のウイルス感染症の治療剤及び／または予防剤を用いることを特徴とするウイルス感染症の治療方法及び／または予防方法。
【請求項２１】
CTLの免疫応答能の検査方法であって、培地中で、(a)CTLエピトープペプチド、このCTLエピトープペプチドを提示した抗原提示細胞、または前記CTLエピトープペプチドと複合体を形成するMHC分子からなる群から選択される少なくとも一つの成分と、(b)被験者から採取したリンパ球、培養中のCTL、とを接触させながら共培養した後、前記リンパ球またはCTL上に新たに発現するCD137分子を検出することにより免疫応答能を判断することを特徴とする検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルス、特にヒトサイトメガロウイルス（human cytomegalovirus; 以下「HCMV」という）に対して特異的な細胞傷害性T細胞（cytotoxic T lymphocyte; 以下「CTL」という）を調製する方法、およびこの方法により調製されたHCMV特異的CTLを用いたHCMV感染症の治療方法及び／又は予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
HCMVは、大部分の健常な成人において潜伏感染が認められる。通常の免疫能を有する者については、HCMVの感染症状が出ることは希である。しかし、免疫抑制状態にある者（例えば、がん患者、造血幹細胞移植といった移植手術を受けた患者、エイズ患者など）においては、HCMVの感染症状が現れ、致死的な間質性肺炎のほか、網膜炎、肝炎などを引き起すことがある。
造血幹細胞移植は、白血病などの造血器腫瘍への適用にとどまらず、一部の固形腫瘍や代謝疾患にもその適用が広がっている。移植される幹細胞の起源は、HLA適合ドナーのみならず、骨髄バンク・臍帯血バンクやHLA不適合ドナーといった代替ドナーからの幹細胞を使用した症例数も増加している。これら代替ドナーからの移植のときには、移植患者に対して強力な免疫抑制治療を施すので、日和見感染症のリスクが高くなる。特に、HCMVの再活性化は移植患者のほぼ全例にみられるので、HCMV感染症の制御は移植手術後の大きな問題点のひとつである。ガンシクロビルは優れた抗ウイルス剤であり、HCMV感染症にも汎用されているが、頻回投与による副作用が度々問題となる。このため、HCMVを安全にかつ有効に制御する新しい方法が強く望まれている。【０００３】
HCMV感染細胞の活動を制御している主な免疫担当細胞は、HCMV感染細胞を特異的に認識するCD8＋CTL、すなわちHCMV特異的CTLである。HCMV特異的CTLは、HCMV感染細胞を発見すると、それを破壊する能力を持っているので、その機能を有効に活性化すれば、HCMV関連疾患の新しい予防法と治療法の開発につながる可能性が高い。従って、抗ウィルス剤に代わる新たな治療法として、HCMV特異的CTLによる細胞療法が注目されている。欧米においては、この細胞療法は既に応用研究が行われており、臨床試験において期待された効果が得られている（非特許文献1）。【０００４】
【非特許文献１】ELIZABETH A. WALTER et al., N Eng J Med, 1995; 333: 1038-1044
【非特許文献２】N Watanabe et al., Cytotherapy, 2004; 6(5): 514-522
【非特許文献３】Mark Cobbold et al., J Exp Med., 2005; 202(3): 379-386
【非特許文献４】Marek Cebecauer et al., J Immunol., 2005; 174(11): 6809-6819
【非特許文献５】Foster AE, Gottlieb DJ, Marangolo M, Bartlett A, Li YC, Barton GW,Romagnoli JA, Bradstock KF. Rapid, large-scale generation of highly pure cytomegalovirus-specific cytotoxic T cells for adoptive immunotherapy., J Hematother Stem Cell Res. 2003 Feb;12(1):93-105.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これまで報告されているHCMV特異的CTLの調製方法は、以下に掲げた問題があるため、事業として応用されるまでには至っていない。
（１）HCMV特異的CTLを誘導させるために、抗原提示細胞の調製を必要とする。抗原提示細胞としては、樹状細胞が使われることが多いが、樹状細胞の調製は煩雑で費用が嵩む。
（２）誘導したHCMV特異的CTLをさらに増殖させる場合に、樹状細胞が使われる（非特許文献５）。このため、上記（１）と同様の問題が生じる。また、増殖において使用する樹状細胞を調製するため、再度ドナーから採血する必要がある。更に、増殖時には誘導時に比べて、多数の樹状細胞が必要となることからドナーにかかる負担が大きい。【０００６】
（３）誘導したHCMV特異的CTLをさらに増殖させる別の手段として、OKT3やレクチンによる非特異的な刺激を用いることがある。しかし、この方法では、相対的にHCMV特異的CTL以外のT細胞が増殖しやすいため効率性に欠ける。
また、非常に効率の良い増殖法としてREM法が知られている。REM法は大量の末梢血単核球と、EBV-LCLを必要とすることから、事業化において現実的な方法ではない。
（４）誘導、増殖したHCMV特異的CTLの純度を高めるための方法として、MHC-tetramerを使ったHCMV特異的CTL単離法が一般化している（非特許文献３）。MHC-tetramerは、大腸菌由来の蛋白質を用いて作られるので、安全面での問題があることに加え、CTLの生存率が低下するという問題点がある（非特許文献４）。
また、純度を高めるための究極の手段として、HCMV特異的CTLのクローニングを行うことも報告されている。しかし、現在のところ、作業の効率、費用面から、この方法を事業化することは現実的ではない。【０００７】
（５）これまで行われているHCMV特異的CTL培養法は、抗原提示細胞を調製するなど、複雑なステップを経るので開放系培養に頼らざるを得ない。開放系での培養は、外部からの細菌、ウイルスなどの混入を防ぐため、細胞加工施設内で行う必要があり、莫大な設備費、管理費を要する。
（６）日本人に多いHLA-A24に拘束性のHCMV特異的CTLについては、臨床応用に向けた体外での調製方法に関する報告はなされていない。HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLが末梢血中に含まれる数は、欧米人に多いHLA-A2拘束性HCMV特異的CTLのそれに比べると百分の一程度である。これは、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの体外での誘導、増殖が困難であることの理由のひとつと考えられる。従って、日本においては、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを体外で調製する方法を工夫する必要がある。
本発明は上記問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ウイルス（特に、HCMV）特異的CTLによる細胞治療の実用化を実現するため、簡便性と安全性を兼ね備え、しかも低コストで実施可能なウイルス特異的CTLの閉鎖系培養システムの提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一般にCTLの調製工程（製造工程）は、CTL誘導工程、CTL単離工程、及びCTL増殖工程の３工程から構成される。本発明者らは、これら３工程において、適切な条件を求めることにより、簡便かつ安価にHCMV特異的CTLを調製する方法を発明した。
すなわち、本発明に係るHCMV特異的CTLの調製方法は、以下の通りである。
下記（１）〜（３）は、CTLの誘導工程に関するものである。
（１）HTLV-1、インフルエンザ、アデノウィルス、エイズウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス、及びヒトサイトメガロウイルス（HCMV）からなる群から選択される一つのウイルス（特に、HCMV）特異的CTLを誘導する方法であって、末梢血単核球とウイルス特異的CTLエピトープペプチドを混合培養することを特徴とする誘導方法。
（２）前記混合培養において、エピトープペプチドの培地中での終濃度が0.01μg/mL-10μg/mLであることを特徴とする上記（１）に記載の誘導方法。このとき、ウイルスがHCMVである場合には、HLA-A2拘束性エピトープであるNLVPMVATV（配列番号１）では0.05μg/mL-2μg/mL、HLA-A24拘束性エピトープであるQYDPVAALF（配列番号２）では0.2μg/mL-5μg/mLであることが好ましい。【０００９】
（３）前記混合培養に用いる培地として、5％-10％自己血漿を含むRPMI1640を用い、エピトープペプチドを添加後、2日後に終濃度が10 IU/mLとなるようにIL-2を加え、その後IL-2濃度を2-3日ごとに2倍づつ上げながら12日間-19日間培養することを特徴とする上記（１）または（２）に記載の誘導方法。
下記（４）〜（１０）は、CTLの単離工程に関するものである。
（４）ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の誘導方法、またはその他の方法で誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドと培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とする単離方法。
（５）ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の誘導方法、またはその他の方法で誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドを提示した抗原提示細胞と培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
（６）ウイルス特異的CTLを単離する方法であって、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の誘導方法、またはその他の方法で誘導されたウイルス特異的CTLを、誘導に用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドと複合体を形成するMHC分子と培地中で接触させることにより再刺激後、新たに発現するCD137抗原を標的として、ウイルス特異的CTLを単離することを特徴とするウイルス特異的CTLの単離方法。
（７）前記再刺激に用いるエピトープペプチドの培地中での終濃度が0.1ng/mL-1000ng/mLであることを特徴とする上記（４）〜（６）に記載の単離方法。このとき、ウイルスがHCMVである場合には、1ng/mL-10ng/mLであることが好ましい。【００１０】
（８）前記再刺激は、5％-10％自己血漿と10 IU/mL〜50 IU/mLのIL-2または10ng/mL IL-15のいずれかとを含むRPMI1640培地中で8時間〜15時間に渡って行うことを特徴とする上記（４）〜（７）に記載の単離方法。
（９）CD137抗原を標的とする際に、磁気標識した抗CD137抗体を用いることを特徴とする上記（４）〜（８）のいずれかに記載の単離方法。
（１０）CD137抗原を標的とする際に、抗CD137抗体を感作した固相を用いることを特徴とする上記（４）〜（８）のいずれかに記載の単離方法。
また、上記（１）〜（３）の誘導方法、および（４）〜（１０）の単離方法については、ウイルス特異的CTLとは、ウイルス特異的CD8＋CTLに加えて、ウイルス特異的CD4＋T細胞も含まれる。
下記（１１）〜（１３）は、CTLの増殖工程に関するものである。
（１１）ウイルス特異的CTLの増殖方法であって、OKT3（抗CD3モノクローナル抗体）を用いて末梢血単核球から増殖させたT細胞と、上記（１）〜（３）のいずれかにおいて誘導の際用いたエピトープペプチドと同じエピトープペプチドとを培地中で接触させた後に、このT細胞と、上記（４）〜（１０）のいずれかに記載の単離方法で単離したウイルス特異的CTLまたは（１）〜（３）のいずれかに記載の誘導方法で誘導したウイルス特異的CTLとを共培養することを特徴とするウイルス特異的CTLの増殖方法。【００１１】
（１２）上記（１１）においてOKT3を用いて末梢血単核球から増殖させたT細胞を、ウイルス特異的CTLエピトープペプチドと培地中で接触させる際に、下記条件を用いることを特徴とする増殖方法。
（ａ）培地中に加えるエピトープペプチドの終濃度； 0.0001μg/mL〜10μg/mL
（ｂ）接触時間；30分間〜60分間
（ｃ）培養温度；18℃〜25℃
（ｄ）培地；血清、血漿など蛋白成分を含まないRPMI1640。
（１３）上記（１１）において、以下の共培養条件を特徴とする増殖方法。
（ｅ）ウイルス特異的CTL：OKT3を用いて増殖させたT細胞の混合比；10:1〜1:3
（ｆ）培地組成  共培養開始後1日目-3日目まで；RPMI1640（5％〜10％自己血漿、10 IU/mL〜50 IU/mL IL-2）またはRPMI1640(5％〜10％自己血漿、10ng/mL IL-15)、共培養開始後1日目−3日目以降；ALyS505N（100 IU/mL〜1000 IU/mL IL-2、0.1％〜1％自己血漿）またはALyS505N（10ng/mL IL-15、0.1％〜1％自己血漿）。【００１２】
（１４）上記（１）〜（３）のいずれかに記載の誘導方法によりウイルス特異的CTLを誘導する工程を含むウイルス特異的CTLの製造方法。
（１５）上記（４）〜（１０）のいずれかに記載の単離方法によりウイルス特異的CTLを単離する工程を含むウイルス特異的CTLの製造方法。
（１６）上記（１１）〜（１３）のいずれかに記載の増殖方法によりウイルス特異的CTLを増殖する工程を含むウイルス特異的CTLの製造方法。
（１７）上記（１）〜（３）のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの誘導方法、上記（４）〜（１０）のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの単離方法、上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの増殖方法をそれぞれ組み合わせることを特徴とするウイルス特異的CTLの製造方法。
（１８）上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの製造方法によって製造されたウイルス特異的CTL。【００１３】
（１９）上記（１４）〜（１７）のいずれかに記載のウイルス特異的CTLの製造方法によって製造されたウイルス特異的CTLを含むウイルス感染症の治療剤及び／または予防剤。
（２０）上記（１９）に記載のウイルス感染症の治療剤及び／または予防剤を用いることを特徴とするウイルス感染症の治療方法及び／または予防方法。
（２１）CTLの免疫応答能の検査方法であって、培地中で、(a)CTLエピトープペプチド、このCTLエピトープペプチドを提示した抗原提示細胞、または前記CTLエピトープペプチドと複合体を形成するMHC分子からなる群から選択される少なくとも一つの成分と、(b)被験者から採取したリンパ球または培養中のCTLとを接触させながら共培養した後、前記リンパ球またはCTL上に新たに発現するCD137分子を検出することにより免疫応答能を判断することを特徴とする検査方法。
なお、上記については、ウイルスのエピトープペプチドに対して応用できる製造方法等を説明したが、本発明に関する技術は、その他のペプチド（例えば、腫瘍抗原）についても応用できる。
【発明の効果】
【００１４】
CTL誘導工程、CTL単離工程、及びCTL増殖工程の各工程からなるCTLの調製工程（製造工程）は、いずれも煩雑で高コストであるため、CTLを用いた細胞治療の実用化において障害となってきた。本発明のウイルス（特に、HCMV）特異的CTLの調製方法は、簡便で安価なHCMV特異的CTLの調製を可能とした。例えば、CTLの誘導工程は従来、樹状細胞などの抗原提示細胞とリンパ球を共培養することにより行われてきた。樹状細胞などの抗原提示細胞の調製は煩雑で、その調製には多大な労力と経費が必要であった。これに対し、本発明による誘導工程は、抗原提示細胞の調製が不要であるため、迅速かつ簡便にウイルス特異的CTLの誘導を行える。【００１５】
また、CTL増殖工程においても、従来の方法では樹状細胞を必要とするため、前記と同様の問題点があった。本発明によるウイルス特異的CTLの増殖工程は、抗原提示細胞としてOKT3で増殖させたT細胞に代替することによって簡便で安価なウイルス特異的CTLの増殖を可能とした。さらに、CTL単離工程においてはMHC-tetramerを用いることが一般的となっているが、MHC-tetramerは大腸菌由来の蛋白質であることから安全面での問題があることに加え、CTL単離後の生存率の低下が指摘されている。また、CD107抗原やインターフェロンガンマ（IFNg）を標的として、CTLを単離する方法が知られている（Leukemia (2005) 19, 707-709）。しかしながら、この方法では、CTLを単離したときの収率が悪いという欠点が知られている。本発明においては、CD137抗原を標的とした単離方法を樹立することにより、このような問題点を克服した。すなわち、CD137抗原を標的とすれば、生存率を低下させることなく安全にウイルス特異的CTLの単離が可能となる。【００１６】
HCMVは免疫抑制状態にある患者、例えば造血幹細胞移植後の患者においては、ほぼ100％の確率で再活性化し、致死的な感染症を引き起こす。従って、その制御は患者の予後を左右する重要な問題である。従来HCMVの制御にはガンシクロビル等の抗ウィルス薬が使用されているが、頻回投与による副作用の問題があり、より安全で効果的な、予防薬、治療薬の開発が望まれていた。HCMV特異的CTLは、HCMV感染細胞を特異的に認識し、かつ極めて強力な細胞傷害活性を有している。
本発明によれば、安全で効果的なウイルス特異的CTLによるウイルス予防薬、治療薬、及び、これを簡便で安価に調製する技術を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
次に、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は、下記の実施形態によって限定されるものではなく、その要旨を変更することなく、様々に改変して実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
以下、本発明の実施形態については、ウイルスの代表としてHCMVを例にとって説明するが、その他のウイルス（HTLV-1、インフルエンザ、アデノウィルス、エイズウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルス）についても同様に実施することができる。CTLの製造について、（１）HCMV特異的CTLの誘導工程、（２）HCMV特異的CTLの単離工程、および（３）HCMV特異的CTLの増殖工程の三つに分けて説明する。【００１８】
まずHCMV特異的CTLの誘導工程について説明する。
本実施形態におけるHCMV特異的CTLの誘導方法（以下、「本実施形態の誘導方法」という。）では、末梢血単核球とHCMV特異的CTLエピトープペプチドを血漿を含む培地中で接触させながら培養する。「CTLエピトープペプチド」とは、隣接するアミノ酸残基のα-アミノ基とカルボキシル基間のペプチド結合により相互に結合した線状のアミノ酸の分子鎖であって、ヒト白血球抗原(human leucocyte antigen、以下「HLA」という。)クラスＩ分子と複合体を形成し、HCMV特異的CTL上に発現するT細胞レセプターと結合性を有するペプチドを意味する。T細胞に対する抗原提示は、抗原提示細胞上に発現するMHCとペプチドとの複合体（以下、「MHC-ペプチド複合体」という）がT細胞受容体（TCR）に認識され、かつ抗原提示細胞上のB7-1、B7-2等の補助分子がT細胞側の補助分子であるCD28等と結合することによってなされる。本実施形態の誘導方法においては、末梢血単核球に含まれる単球、B細胞、微量に含まれる樹状細胞等の膜表面上に発現するHLAクラスＩ分子とCTLエピトープペプチドが複合体を形成し、抗原提示細胞として機能するものと考えられる。【００１９】
従って、本実施形態における誘導方法においては、従来必要とされた樹状細胞などの抗原提示細胞を調製する必要がなく、誘導工程を大幅に縮小することができるので、簡便、迅速、かつ安価にHCMV特異的CTLを誘導することが可能となる。抗原提示の際に起こるMHC-ペプチド複合体とＴＣＲとの結合は、適度な結合力によって起こることが、抗原提示能を高めるために重要である（結合力が強すぎても抗原提示能が高まるとは言えない）。このため、加えるCTLエピトープペプチドの濃度は、抗原提示の効果を左右する。HLA-A2拘束性のHCMVエピトープペプチド（NLVPMVATV:配列番号１）においては、終濃度が0.05μg/mL-2μg/mLであることが望ましい。また、HLA-A24拘束性のHCMVエピトープペプチド（QYDPVAALF:配列番号２）においては、終濃度が0.2μg/mL-5μg/mLであることが望ましい。【００２０】
HLAは、人種間、個人間によって異なっている。HLAが異なると、同じ抗原であってもエピトープペプチドが異なる（これをエピトープペプチドのHLA拘束性という）。日本人の約80％が保有し、かつ世界的に最も頻度の高いHLA-A24型、およびHLA-A2型に拘束性のHCMVエピトープペプチドの誘導工程における至適濃度が明らかとなった。
次に、本実施形態における誘導方法において、培養条件の詳細を説明する。基礎培地としては、5％〜10％自己血漿を含むRPMI1640, AIM-Vまたはダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's modified eagle medium)が望ましく、末梢血単核球と該CTLエピトープペプチドを混合2日後に終濃度が10 IU/mLになるようにIL-2を加え、その後、2-3日おきにIL-2の濃度を2倍づつ高めながら前記培地を用いると尚効果的である。培養中の炭酸ガス濃度、温度及び培養日数はそれぞれ5％、37℃、14-21日間が好ましい。また、細胞濃度としては、10６〜2x10６個/mLが好ましい。さらに細胞同士を密着させながら培養することが効率的な抗原提示にとって重要であり、そのためには、底がU字状となった培養容器中で培養することが好ましい。【００２１】
次に、HCMV特異的CTLの単離工程について説明する。本発明におけるHCMV特異的CTLの単離方法（以下、「本実施形態における単離方法」という。）は、本実施形態における誘導方法により誘導したHCMV特異的CTLとHCMV特異的CTLエピトープペプチドを血漿を含む培地中で接触させながら培養することによりHCMV特異的CTL上に新たに発現するCD137分子を標的として単離することを特徴とする。
CD137分子(4-1BB, ILAともいう)はKwon BSらにより同定された分子で、CTLの分化、増殖に関連し、TCRを介した刺激によりCTL上に選択的に発現することが知られている。従ってHCMV特異的CTLを含むT細胞集団にエピトープペプチドを加えることにより、培地中に含まれるT細胞上には、HLAクラスI分子とエピトープペプチドから成る複合体が発現する。この複合体とHCMV特異的CTL上のTCRが接触し、HCMV特異的CTL上に選択的にCD137分子が発現する。このHCMV特異的CTLは、例えばCD137抗体をコートした磁性微粒子のように、CD137分子を認識する物質と反応させた後、適当な分離装置（例えば、磁気分離装置）を用いて、HCMV特異的CTLを単離することができる。【００２２】
なお、CD137抗体をコートした磁性微粒子の代わりに、CD137抗体をコートした培養プレートを用い、パンニング法により単離することもできる。抗CD137抗体としてはモノクローナル抗体であってもポリクロナル抗体であっても良い。培地中に添加するエピトープペプチドの終濃度としては1 ng/mL - 10 ng/mLが効果的である。HCMV特異的CTLは、エピトープペプチドを培地中に加えた後に最もCD137抗原の発現が高まる15時間〜24時間後に単離することが望ましい。なお、単離工程において、CD137抗体とHCMV特異的CTLが接触する際、CD137分子から刺激が細胞内に伝達されるので、HCMV特異的CTLの増殖を高める効果も期待される。【００２３】
次に、HCMV特異的CTLの増殖工程について説明する。本実施形態におけるHCMV特異的CTLの増殖方法（以下、「本実施形態における増殖方法」という。）は、OKT3(CD3モノクローナル抗体)を用いて増殖させたT細胞にエピトープペプチドを接触させることにより、このT細胞上にHLAクラスI分子とエピトープペプチドから成る複合体を形成させ、これと本実施形態における単離方法により調製したHCMV特異的CTL上に発現するTCRを接触させることにより、HCMV特異的CTLを増殖させることを特徴とする。末梢血単核球をOKT3で刺激することにより増殖させたT細胞（以下、「OKT3-T細胞」という。）上には副刺激分子であるCD80及び、CD86分子が高発現するので、抗原提示細胞として用いることができる。従来、CTL増殖工程において抗原提示細胞として樹状細胞が用いられることが一般的であり、その調製には高価で、煩雑な操作が必要であった。また、CTL増殖工程においては、大量の樹状細胞が必要で（非特許文献５）、新たにドナーから採血しなければならず、ドナーにかける負担が大きかった。本実施形態による増殖方法においては、CTL誘導の際に採血した血液の一部を使って、OKT3で刺激し、増殖させて得られるT細胞を抗原提示細胞とするため、従来法に比べて、簡便かつ低コストでHCMV特異的CTLを増殖させることができる。抗原提示細胞として用いるOKT3-T細胞上のCD80、CD86の発現量は多いほど良い。PBMCをOKT3で刺激後、CD80、CD86の発現量が最も高くなる2週間〜1ヶ月間培養したT細胞を用いることが望ましい。【００２４】
次に、OKT3-T細胞（OKT3を用いて増殖させたT細胞；抗原提示細胞）とエピトープペプチドを培地中で接触させる際の条件について以下に記す。培地中に加えるエピトープペプチドの終濃度は、0.1μg/mL〜10μg/mLが好ましい。培地としては、血清、血漿などの蛋白成分を含まないRPMI1640, AIM-V, またはダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's modified eagle medium)が好ましい。接触時間は30分間〜60分間、接触温度は18℃〜25℃が好ましい。この条件でOKT3-T細胞とエピトープペプチドを接触させた後は、遊離のエピトープペプチドを除去するため、RPMI1640などで複数回（例えば、3回程度）に渡って洗浄することが好ましい。このようにして調製された抗原提示細胞とHCMV特異的CTL（例えば、本実施形態における単離方法により単離したもの）を共培養することにより、HCMV特異的CTLを増殖させる。HCMV特異的CTLと抗原提示細胞の混合比は、10:1〜1:3の間で任意に選択できる。【００２５】
なお、抗原提示細胞がHCMV特異的CTLに対して過剰に混合された場合には、HCMV特異的CTLに対してActivation Induced Cell Death (AICD)による細胞死が誘導されるので注意を要する。AICDを防止するために、カスパーゼ阻害剤であるZ-VAD-FMKを終濃度が20μM〜40μM となるように加えることができる。HCMV特異的CTLと抗原提示細胞との共培養に用いられる培地としては、5％-10％自己血漿、10 IU/mL - 50 IU/mL のIL-2を含むRPMI1640、AIM-V、またはダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco's modified eagle medium)を用いることが好ましい。共培養開始後、18時間〜36時間後に、培地を1％自己血漿を含むALyS505N-1000に入れ替え、その後、同培地を2〜3日に一度、全体の半分を入れ替えることが好ましい。
上記の工程を経ることにより、HCMV特異的CTLを誘導、単離、及び増殖することができる。次に、実施例を説明することにより、本発明を更に詳細に説明する。
【実施例】
【００２６】
以下に実施例を参照しつつ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。また、本発明の技術的範囲は均等の範囲にまで及ぶものである。
なお、本実施例においては、HCMV特異的CTLとは、HCMV特異的CD8＋CTLを意味している。
〔実施例１〕HCMV特異的CTLの誘導工程
HLA-A24分子保持者、またはHLA-A2保持者由来の末梢血より分離した末梢血単核球(PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell)を5％自己血漿、2-メルカプトエタノール、L-グルタミン、抗生物質としてペニシリンとストレプトマイシンを含むHEPES緩衝RPMI1640培地(以下、「CTL誘導用培地」という)1ｍL中に細胞数が2x10６個となるように縣濁させ、ポリプロピレン製14mLの丸底チューブ（Becton Dickinson社製）に１mL分注した。4μg/mLのHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLエピトープペプチドQYD(配列番号２：以下、「QYDペプチド」という)、若しくは2μg/mLのHLA-A2拘束性HCMV特異的CTLエピトープペプチドNLV(配列番号１：以下、「NLVペプチド」という）を含むCTL誘導用培地1 mLを添加後、2日間、5％CO２インキュベータ内において、37℃で培養した。その後、IL-2を10 IU/mLとなるように添加した後、3日おきに、培地1ｍLを、50 IU/mL のIL-2を含むCTL誘導用培地と入れ替えながら12日間、5％ CO２インキュベータ内において、37℃で培養した。こうして、HCMV特異的CTLを誘導し、HCMV特異的CTLラインとした。【００２７】
〔実施例２〕HCMV特異的CTLの誘導効率の検討
実施例１の方法によるHCMV特異的CTLの誘導効率を誘導前後のHCMV特異的CTLの数を比較することにより検討した。HCMV特異的CTLの数は培養中に含まれる総細胞数とHCMV特異的MHC-tetramerにより測定したHCMV特異的CTL陽性率を乗ずることにより算出した。HCMV特異的CTL陽性率のHCMV特異的MHC-tetramerによる測定は、以下のように行った。
測定に用いる細胞を、0.1％BSAを含むPBS(以下、「細胞洗浄緩衝液」という)で洗浄後、細胞濃度が2x10６個/mLとなるように細胞洗浄緩衝液に縣濁させ、その100μLにフィコエリトリン（Phycoerythrin；以下「PE」という）を標識したHCMV特異的MHC-tetramer 10 μLとPC5標識したCD8モノクローナル抗体10μLを同時に混合させた後、4℃で30分間反応させた。PBSで2回洗浄後、細胞を500μLの細胞洗浄緩衝液に縣濁させ、フローサイトメーターを用いて測定した。【００２８】
図１には、測定結果の一例を示した。縦軸はCD８蛍光強度、横軸はHCMV特異的MHC-tetramerの蛍光強度を対数尺で示し、個々の打点は各細胞の蛍光強度を表す。4分割した左上の領域の打点は、CD8とMHC-tetramerが同時に陽性細胞、すなわち、HCMV特異的CTLを表す。誘導後の細胞中に、10.28％のHCMV特異的CTLが含まれていた。後に示す表１には、誘導前後における、総細胞数、HCMV特異的CTLの割合及び数を示し、さらに誘導効率を誘導前のHCMV特異的CTL数に対する、誘導後のHCMV特異的CTL数の比として表現した。【００２９】
〔実施例３〕HCMV特異的CTLの単離、及び濃縮
１．CD137モノクローナル抗体を感作した培養プレートによる単離
（１）CD137モノクローナル抗体感作培養プレートの作製
PBSで10 μg/mLに希釈したCD137モノクローナル抗体（クローン4B4）を6ウェルプレートに1 ｍL分注し、4℃で18時間、静置反応させた。抗体溶液をアスピレーターで除去後、5％ヒトアルブミンを含むPBSを2 mL分注し、37℃で1時間インキューベートし、抗体が感作された培養プレート表面をブロッキングした。PBSで3回プレート表面を洗浄した後、CD137モノクローナル抗体感作培養プレートとして用いた。【００３０】
（２）HCMV特異的CTLエピトープペプチドによるHCMV特異的CTLラインの再刺激とCD137分子の発現解析
実施例１で誘導したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLライン培養中にQYDペプチドを終濃度10 ng/mLで加え、18時間培養した。細胞の一部を採取し、HCMV特異的CTL上に選択にCD137が発現していることを確認するため、PC5標識CD137モノクローナル抗体とPE標識HCMV特異的MHC-tetramerを用いて二重染色を行い、フローサイトメーターにより解析した。図２に示すように、HCMV特異的CTL(MHC-tetramer 陽性細胞として示された細胞集団)上にCD137分子の選択的発現を認めた。【００３１】
（３）HCMV特異的CTLの単離、及び培養
QYDペプチドにより再刺激したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLラインを、CD137モノクローナル抗体を感作した培養プレートに移し、1時間、5％ CO２インキュベータ内において、37℃で反応させ、CD137分子を発現したHCMV特異的CTLをCD137モノクローナル抗体を介して、培養プレート表面に接着させた。培養プレートを軽く揺らした後、ピペットを用いて、培養プレート表面に接着していない細胞を除去した。その後、0.5％ヒトアルブミンを含むHEPES緩衝RPMI培地で洗浄をゆっくりと1ｍL加え、軽く揺らした後、再度、ピペットを用いて、培養プレート表面に接着していない細胞を除去した。さらにこの操作を2回繰り返した後、50 IU/mL のIL-2 を含むCTL誘導用培地を1 mL加え、5％ CO２インキュベータ内において、37℃で24時間培養した。さらにALyS505N-1000培地を1 mL 添加し、5％ CO２インキュベータ内において、37℃で6日間培養した。【００３２】
（４）単離、及び培養したHCMV特異的CTLの純度と回収率の解析
単離、及び培養したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを、10６/mL の細胞濃度で細胞洗浄緩衝液に浮遊させ、その100μLにPEを標識したHCMV特異的MHC-tetramer 10μLとFITC標識したCD8モノクローナル抗体10μLを同時に混合させた後、4℃で30分間反応させた。PBSで2回洗浄後、細胞を500μLの細胞洗浄緩衝液に縣濁させ、フローサイトメーターを用いて測定した。
図２に示すように、単離前10.28％であったHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの純度が、単離直後では56.03％に、また、培養一週間後97.14％に上昇した。また、単離直後において48.7％のHCMV特異的CTLが回収され、その後１週間の培養で、2.9倍に増殖した（表１）。【００３３】
【表１】
2008023786.tif 000003
【００３４】
２.細胞自動分離装置を用いた単離
（１）CD137モノクローナル抗体を用いた単離
上記１（２）の方法に従い、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLラインをQYDペプチドにより再刺激した後、細胞洗浄緩衝液100μLに懸濁した後、100μg/mL CD137モノクローナル抗体(クローン4B4)を10μL加え、攪拌の後、室温で15分間反応させた。細胞洗浄緩衝液で2回洗浄し、細胞を0.5％ヒトアルブミン、2 mM EDTAを含むPBS（以下、「細胞分離緩衝液」という）80μLに細胞を懸濁させた後、抗マウスIgG結合マイクロ磁性ビーズ(ミルテニ社製)を20μL加え、攪拌後、4℃で15分間反応させた。細胞分離緩衝液で２回洗浄後、500μLの細胞分離緩衝液に懸濁させた後、細胞自動分離装置(AutoMACS:ミルテニ社製)を用いて、CD137陽性細胞、すなわちHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを分離した。【００３５】
（２）MHC-tetramerを用いた単離
HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLラインを細胞洗浄緩衝液100μLに懸濁した後、HCMV特異的HLA-A24-tetramer（(株)ベックマンコールター社製）を10μL加え、攪拌の後、室温で15分間反応させた。細胞洗浄緩衝液で2回洗浄し、細胞を0.5％ヒトアルブミン、2 mM EDTAを含むPBS（以下細胞分離緩衝液という）80μLに細胞を懸濁させた後、抗PE抗体結合マイクロ磁性ビーズ(ミルテニ社製)を20μL加え、攪拌後、4℃で15分間反応させた。細胞分離緩衝液で2回洗浄後、500μLの細胞分離緩衝液に懸濁させた後、細胞自動分離装置(AutoMACS:ミルテニ社製)を用いて、HCMV特異的HLA-A24-tetramer陽性細胞、すなわちHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを分離した。
図３に細胞自動分離装置を用いた単離の結果を示した。CD137モノクローナル抗体を用いた単離においては、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの回収率74.1％、純度80.82％であった。一方、MHC-tetramer を用いた単離においては回収率34.0％、純度80.15％であった。純度については両者の間で差はみられなかったが、回収率の点ではCD137モノクローナル抗体を用いた方法が MHC-tetramer を用いた方法に比べて優れていた。【００３６】
〔実施例４〕HCMV特異的CTLの増殖
１．OKT3-T細胞の調製
HCMV特異的CTLの誘導の際に分離したPBMCの一部(2X10６個)を1μg/mLの濃度でOKT3を含むCTL誘導用培地10ｍLに懸濁させ、5％ CO２インキュベータ内で2日間、37℃で培養した。ALyS505N-1000培地を10 mL添加後、5％ CO２インキュベータ内で12日間、37℃で培養し、OKT3-T細胞を得た。【００３７】
２．OKT3-T細胞を用いたHCMV抗原提示細胞の調製
上記１で調製したOKT3-T細胞10７個を細胞洗浄緩衝液で2回洗浄の後、1 μg/mL HCMV特異的CTLエピトープペプチドを含む1 ｍL HEPES緩衝RPMI1640培地に懸濁させ、25℃で30分間反応させた。細胞洗浄緩衝液で2回洗浄し、HCMV抗原提示細胞とした。
３．HCMV抗原提示細胞との共培養によるHCMV特異的CTLの増殖
〔実施例３〕１に示した方法で単離したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTL 4x10６個を4 mL の50IU/ｍL IL-2を含むCTL誘導用培地に懸濁させ、上記２で調製したHCMV抗原提示細胞2x10６個を添加した後、5％ CO２インキュベータ内で24時間、37℃で培養した。ALyS505N-1000培地を4 ｍL加えた後、さらに8日間培養した。培養後、一部を採取し、総細胞数を血球計算版にて測定し、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの割合を実施例２と同様に、フローサイトメーターにより計測した。また、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの数は総細胞数とフローサイトメーターを用いて計測した割合を掛けることにより求めた。
図４には、増殖前後のフローサトメトリー像を示した。HCMV特異的CTLの割合は、増殖前98.5％、増殖後97.68％とほとんど変わらなかった。一方、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTL数は、4x10６個から、4.1x10７個とほぼ１０倍に増殖した。【００３８】
このように本実施形態によれば、簡便かつ安価に、HCMV特異的CTLの調製を行うことができた。HCMV特異的CTL誘導工程では、抗原提示細胞の調製が不要であるため、迅速かつ簡便にHCMV特異的CTLの誘導を行えた。また、HCMV特異的CTL増殖工程では、抗原提示細胞としてOKT3で増殖させたT細胞に代替することによって、簡便で安価なHCMV特異的CTLの増殖が可能であった。さらに、HCMV特異的CTL単離工程においては、CD137抗原を標的とした単離方法を樹立することにより、生存率を低下させることなく安全にHCMV特異的CTLの単離が可能となった。
HCMV特異的CTLをヒトCMV患者に投与することにより、症状の改善が認められることが複数の論文によって示されている（例えば、非特許文献１、非特許文献３、BLOOD 2002;99:3916-3922）。HCMV特異的CTLは、HCMV感染細胞を特異的に認識し、かつ極めて強力な細胞傷害活性を有しているので、これを用いることにより、安全で効果的なHCMV特異的CTLによるHCMV予防薬、治療薬、及びこれを簡便で安価に調製する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】HCMV特異的CTLの誘導例を示すためのサイトフローメーターによる解析結果を示す図である。実施例１に従い、HLA-A24陽性健常人由来末梢血単核球からHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを誘導した後、実施例２に従って、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLの陽性率を測定した。陽性率10.28％と算定された。
【図２】CD137モノクロナル抗体感作培養プレートによるHCMV特異的CTL単離例を示すためのサイトフローメーターによる解析結果を示す図である。実施例１で誘導したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLラインから[実施例３]１．に示した方法に従い、HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを単離した後、７日間培養した。単離前では10.28％であったHLA-A24拘束性HCMV特異的CTL陽性率が単離後、56.03％、さらに７日間培養後においては97.14％に上昇した。単離後の回収率は48.7％、7日間増殖後の増殖率は2.9倍であった。
【図３】細胞自動分離装置を用いた単離の結果を示すためのフローサイトメーターによる解析結果を示す図である。実施例１の方法で誘導したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLラインから[実施例３]２．に示した方法に従い、 HLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを単離した。純度についてはCD137を用いた方法とMHC-tetramer を用いた方法の間で差はみられなかったが、回収率の点ではCD137を用いた方法がMHC-tetramer を用いた方法に比べて優れていた。
【図４】HCMV特異的CTLの増殖の結果を示すためのフローサイトメーターによる解析結果を示す図である。［実施例３］１．の方法で単離したHLA-A24拘束性HCMV特異的CTLを［実施例４］に従い増殖させた。Tetramer/CD8陽性率は8日間増殖後において増殖前とほぼ同様であった。HCMV特異的CTL細胞数は、ほぼ10倍に増殖した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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