(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる１またはそれ以上の精製されたポリペプチドを含む組成物；または配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる一またはそれ以上の精製されたポリペプチドを含む組成物であって、一またはそれ以上の精製されたポリペプチドが指示薬，シグナル配列，移送停止配列，貫膜ドメイン，蛋白質精製リガンドに連結されている該組成物；または配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる一またはそれ以上のポリペプチド、および天然には配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチドを含む組成物；またはそれらの組み合わせ。
【請求項２】
さらに担体を含む，請求項１記載の組成物。
【請求項３】
請求項１記載の１またはそれ以上の精製されたポリペプチドをコードする精製されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
繁殖性呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）またはＰＲＲＳＶポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出する方法であって，
（ａ）配列番号１，配列番号２，配列番号１８，配列番号１３からなる１またはそれ以上の精製されたポリペプチド；または配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる一またはそれ以上の精製されたポリペプチドであって、一またはそれ以上の精製されたポリペプチドが指示薬，シグナル配列，移送停止配列，貫膜ドメイン，蛋白質精製リガンドに連結されている該ポリペプチド；または配列番号１，配列番号２，配列番号１８，配列番号１３，またはそれらの組み合わせ，および天然には配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチドを含む融合蛋白質；または多量体型の配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる一またはそれ以上の精製されたポリペプチドを含む組成物；またはそれらの組み合わせを，ポリペプチド／抗体複合体が形成されうる条件下で，ＰＲＲＳＶに特異的な抗体を含むと疑われる試験サンプルと接触させ；
（ｂ）ポリペプチド／抗体複合体を検出する；
ことを含み，
ここで，ポリペプチド／抗体複合体が検出されることは，ＰＲＲＳＶに特異的な抗体が試験サンプル中に存在することを示し，ポリペプチド／抗体複合体が存在しないことは，ＰＲＳＳＶに特異的な抗体が試験サンプル中に存在しないことを示す，
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
さらに，（ｂ）の工程を実施する前に（ａ）の複合体を指示薬と接触させることを含む，請求項４記載の方法。
【請求項６】
抗体が抗体のフラグメントである，請求項４記載の方法。
【請求項７】
試験サンプル中の抗体の量を決定する，請求項４記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチドが基板に結合されている，請求項４記載の方法。
【請求項９】
試験サンプルが，哺乳動物から得た生物学的サンプルを含む，請求項４記載の方法。
【請求項１０】
該方法が，可逆流クロマトグラフィー結合アッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，ラジオイムノアッセイ，ヘマグルチネーションアッセイ，ウエスタンブロットアッセイ，蛍光偏光イムノアッセイ，および間接的免疫蛍光アッセイからなる群より選択されるアッセイを含む，請求項４記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物においてＰＲＲＳＶ感染を検出する方法であって，
（ａ）ＰＲＲＳＶに感染していると疑われる哺乳動物から生物学的サンプルを取得し；
（ｂ）配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３からなる１またはそれ以上の精製されたポリペプチド；または配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる一またはそれ以上の精製されたポリペプチドであって、一またはそれ以上の精製されたポリペプチドが指示薬，シグナル配列，移送停止配列，貫膜ドメイン，蛋白質精製リガンドに連結されている該ポリペプチド；または配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる一またはそれ以上のポリペプチドおよび天然には配列番号１，配列番号２，配列番号１３，または配列番号１８と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチド；または多量体型の配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる一またはそれ以上の精製されたポリペプチド；またはそれらの組み合わせを，ポリペプチド／抗体複合体が形成されうる条件下で，生物学的サンプルと接触させ；
（ｃ）ポリペプチド／抗体複合体を検出する；
ことを含み，ここで，ポリペプチド／抗体複合体が検出されることは，哺乳動物がＰＲＳＳＶに感染していることを示し，ポリペプチド／抗体複合体が存在しないことは，哺乳動物がＰＲＲＳＶに感染していないことを示すことを特徴とする方法。
【請求項１２】
さらに，（ｃ）の工程を実施する前に，（ｂ）のポリペプチド／抗体複合体を，測定可能なシグナルを生成する指示薬と接触させることを含む，請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７に特異的なＰＲＲＳＶ抗体を検出する診断アッセイにおいて偽陽性の発生率を低下させる方法であって，診断アッセイにおいて配列番号１，配列番号２，配列番号１３，または配列番号１８からなる１またはそれ以上の精製されたポリペプチド；または配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８のアミノ酸配列からなる一またはそれ以上の精製されたポリペプチドであって、一またはそれ以上の精製されたポリペプチドが指示薬，シグナル配列，移送停止配列，貫膜ドメイン，蛋白質精製リガンドに連結されている該ポリペプチド；または配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる一またはそれ以上のポリペプチドおよび天然には配列番号１，配列番号２，配列番号１３，または配列番号１８と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチド；または多量体型の配列番号１、配列番号２、配列番号１３または配列番号１８からなる一またはそれ以上の精製されたポリペプチド；またはそれらの組み合わせを抗体捕捉抗原として用いることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権
本出願は，米国特許出願６０／６５６，３４８（２００５年２月２５日出願）に基づく優先権を主張し，その全体を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は，ＰＲＲＳＶポリペプチドを用いてブタ繁殖性呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）抗体および抗体フラグメントを検出および定量するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ブタ繁殖性および呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は，ブタ繁殖性および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）の原因である異形ウイルス（ＲＮＡエンベロープウイルス）である。このウイルスは，成体ブタに主要な繁殖障害を引き起こして，流産を起こしうる。成長中のブタにおいては，症状として，死亡率の増加，食欲の低下，発熱，呼吸器系の障害，肺炎，二次細菌感染の増加，および萎縮性鼻炎が挙げられる。新生子豚においては，ウイルスは，呼吸窮迫症，成長不全，および二次細菌感染の増加を引き起こしうる。ウイルスは主としてブタからブタに伝播する。ウイルスはまた，感染した糞便，尿および乳を通して，初乳抗体をもたない子豚に伝播することができる。さらに，針，昆虫および空気を介した伝播の可能性もある。
【０００４】
当該技術分野においては，ＰＲＲＳＶを検出する方法が必要とされている。ＰＲＲＳ抗体検出キットは市販されており，例えば，ＨｅｒｄＣｈｅｋ（登録商標）ＰＲＲＳ抗体２ＸＲテストキット（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明の１つの態様は，配列番号１または配列番号１２から本質的になる精製されたポリペプチドを含む組成物を提供する。精製されたポリペプチドは，さらに，いずれかの末端に天然にはＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７と連続的に結合していない１またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。精製されたポリペプチドは多量体型であってもよい。この組成物はさらに担体を含むことができる。精製されたポリペプチドは，指示薬，アミノ酸スペーサー，アミノ酸リンカー，シグナル配列，移送停止配列，貫膜ドメイン，蛋白質，精製リガンド，またはそれらの組み合わせに連結させることができる。精製されたポリペプチドは，配列番号２または配列番号１３，および天然には配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチドから本質的になることができる。天然には配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチドは非ＰＲＲＳＶポリペプチドであってもよい。
【０００６】
本発明の別の態様は，配列番号１または配列番号１８から本質的になるポリペプチド，および天然には配列番号１または配列番号１８と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチドを含む，精製された融合ポリペプチドを提供する。天然には配列番号１または配列番号１８と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチドは，非ＰＲＲＳＶポリペプチドであってもよい。配列番号１または配列番号１８は多量体型であってもよい。精製された融合ポリペプチドは，指示薬，アミノ酸スペーサー，アミノ酸リンカー，シグナル配列，移送停止配列，貫膜ドメイン，蛋白質精製リガンドまたはそれらの組み合わせを含むことができる。精製されたポリペプチドは，配列番号２または配列番号１３から本質的になることができる。
【０００７】
本発明のさらに別の態様は，本発明の精製されたポリペプチドおよび精製された融合ポリペプチドをコードする，精製されたポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本発明のさらに別の態様は，繁殖性呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）またはＰＲＲＳＶポリペプチドに特異的に結合する抗体を検出する方法を提供する。この方法は，配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３またはそれらの組み合わせから本質的になる精製されたポリペプチドを，ポリペプチド／抗体複合体が形成されうる条件下で，ＰＲＲＳＶに特異的な抗体を含むと疑われる試験サンプルと接触させ，ポリペプチド／抗体複合体を検出することを含む。ポリペプチド／抗体複合体が検出されることは，ＰＲＲＳＶに特異的な抗体が試験サンプル中に存在することを示し，ポリペプチド／抗体複合体が存在しないことは，ＰＲＳＳＶに特異的な抗体が試験サンプル中に存在しないことを示す。この方法はさらに，ポリペプチド／抗体複合体を検出する前にこれを指示薬と接触させることを含むことができる。抗体は抗体のフラグメントであってもよい。試験サンプル中の抗体の量を決定することができる。ポリペプチドは基板に結合させることができる。ポリペプチドは多量体型であってもよい。ポリペプチドは，配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３またはそれらの組み合わせ，および天然には配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチドを含む融合蛋白質であることができる。天然には配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチドは，非ＰＲＲＳＶポリペプチドであってもよい。試験サンプルは，哺乳動物から得られる生物学的サンプルを含むことができる。この方法は，可逆流クロマトグラフィー結合アッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ，ラジオイムノアッセイ，ヘマグルチネーションアッセイ，ウエスタンブロットアッセイ，蛍光偏光イムノアッセイ，および間接的免疫蛍光アッセイからなる群より選択されるアッセイを含むことができる。
【０００９】
本発明のさらに別の態様は，哺乳動物においてＰＲＲＳＶ感染を検出する方法を提供する。この方法は，ＰＲＲＳＶに感染していると疑われる哺乳動物から生物学的サンプルを取得し；配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３またはそれらの組み合わせから本質的になる精製されたポリペプチドを，ポリペプチド／抗体複合体が形成されうる条件下で生物学的サンプルと接触させ；そして，ポリペプチド／抗体複合体を検出することを含む。ポリペプチド／抗体複合体が検出されることは，哺乳動物がＰＲＳＳＶに感染していることを示し，ポリペプチド／抗体複合体が存在しないことは哺乳動物がＰＲＲＳＶに感染していないことを示す。この方法はさらに，検出の前に，ポリペプチド／抗体複合体を測定可能なシグナルを生成する指示薬と接触させることを含む。ポリペプチドは，配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３またはそれらの組み合わせ，および天然には配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３と連続的に結合していない１またはそれ以上のポリペプチドから本質的になる融合蛋白質であってもよい。
【００１０】
本発明の別の態様は，ＰＲＲＳＶポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体を提供し，ここで，前記ポリペプチドは，配列番号１，配列番号２，配列番号１８，または配列番号１３である。抗体は，モノクローナル抗体，ポリクローナル抗体または抗体フラグメントであることができる。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は，サンプル中のＰＲＲＳＶポリペプチドまたはＰＲＲＳＶを検出する方法を提供する。この方法は，ＰＲＲＳＶポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する１またはそれ以上の抗体を，ポリペプチド／抗体複合体が形成されうる条件下でサンプルと接触させ，ここで前記ポリペプチドは，配列番号１，配列番号２，または配列番号１８，または配列番号１３を含み；そして，ポリペプチド／抗体複合体を検出することを含む。ポリペプチド／抗体複合体が検出されることは，ＰＲＳＳＶまたはＰＲＳＳＶポリペプチドがサンプル中に存在することを示し，ポリペプチド／抗体複合体が存在しないことは，ＰＲＳＳＶまたはＰＲＲＳＶポリペプチドがサンプル中に存在しないことを示す。１またはそれ以上の抗体は，モノクローナル抗体，ポリクローナル抗体，または抗体フラグメントである。サンプルは，血清，全血，痰，乳，肉汁，肺洗浄液，肺組織，へんとう腺組織，またはリンパ節組織であることができる。
【００１２】
本発明の別の態様は，ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７に特異的なＰＲＲＳＶ抗体を検出する診断アッセイにおいて，偽陽性の発生率を低下させる方法を提供する。この方法は，診断アッセイにおいて，約１９−約２８個のＮ末端アミノ酸の欠失を含むＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７ポリペプチドを抗体捕捉抗原として用いることを含む。ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７ポリペプチドは，配列番号１または配列番号１８であることができる。ポリペプチドはさらに，いずれかの末端に天然にはＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７と連続的に結合していない１またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。
【００１３】
すなわち，本発明は，ポリペプチドを用いて，感度および特異度をもってＰＲＲＳＶ抗体および抗体フラグメントを検出するために用いることができる方法および組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
ＰＲＲＳＶポリペプチド
ポリペプチドは，アミド結合により共有結合的に連結された３つまたはそれ以上のアミノ酸のポリマーである。ポリペプチドは，翻訳後修飾を受けてもよい。精製されたポリペプチドは，細胞性物質，他のタイプのポリペプチド，化学的前駆体，ポリペプチドの合成に用いた化学物質，またはこれらの組み合わせを実質的に含まないポリペプチド調製物である。細胞性物質，培地，化学的前駆体，ポリペプチドの合成に用いた化学物質を実質的に含まないポリペプチド調製物は，約３０％，２０％，１０％，５％，１％またはそれ以下の他のポリペプチド，培地，化学的前駆体，および／または合成に用いた他の化学物質を有する。すなわち，精製されたポリペプチドは，約７０％，８０％，９０％，９５％，９９％またはそれ以上の純度である。
【００１５】
本発明の精製されたポリペプチドは，全長ポリペプチドであってもポリペプチドのフラグメントであってもよい。
【００１６】
３つのＵＳＯＲＦ７株，すなわち，ＰＲＲＳＶ：ＶＲ−２３３２（太字）（米国特許５，９９８，６０１）（配列番号８）；ＩＳＵ−１２（下線）（配列番号９）；およびＵＳ−Ａ（斜体）（配列番号１０）の配列の比較を表１に示す。
【００１７】
【表１】
0005580967.tif 000002
【００１８】
３つの株の相対的同一性を表２に示す。
【００１９】
【表２】
0005580967.tif 000003
【００２０】
コンセンサス配列は配列番号１１に示される。
MPNNXGKQXX EKKGDGQPVN QLCQMLGKII AXQNQSRGKG 40
PGKKNKKKNP EKPHFPLATE DDVRHHFTPS ERQLCLSSIQ 80
TAFNQGAGTC TLSDSGRISY TVEFSLPTHH TVRLIRVTAX PSA 123
【００２１】
５位のＸはＮまたはＴであることができる。別の態様においては，５位のＸは任意のアミノ酸であることができる。９位のＸはＱまたはＴであることができる。別の態様においては，９位のＸは任意のアミノ酸であることができる。１０位のＸはＥまたはＫであることができる。別の態様においては，１０位のＸは任意のアミノ酸であることができる。１１位のＸはＥ，ＲまたはＫであることができる。別の態様においては，１１位のＸは任意のアミノ酸であることができる。３２位のＸはＱまたはＨであることができる。別の態様においては，３２位のＸは任意のアミノ酸であることができる。１２０位のＸはＳまたはＰであることができる。別の態様においては，１２０位のＸは任意のアミノ酸であることができる。
【００２２】
本発明の１つの態様においては，ポリペプチドは，Ｕ．Ｓ．血清型のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７の一部を含む。
LCQXLGKIIAXQNQSRGKGPGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCTLSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAXPSA (配列番号1)
【００２３】
１１位のＸは任意のアミノ酸であることができる。別の態様においては，１１位のＸはＱまたはＨであることができる。９９位のＸは任意のアミノ酸であることができる。別の態様においては，９９位のＸはＰまたはＳであることができる。４位のＸは任意のアミノ酸であることができる。
【００２４】
本発明の別の態様においては，ポリペプチドは，Ｕ．Ｓ．血清型のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７の一部およびヒスチジンタグを含む。
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTGSLCQXLGKIIAXQNQSRGKGPGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCTLSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAXPSA (配列番号2)
【００２５】
４２位のＸは任意のアミノ酸である。ある態様においては，４２位のＸはＭまたはＩであることができる。４９位のＸは任意のアミノ酸である。ある態様においては，４９位のＸはＱまたはＨである。１３７位のＸは任意のアミノ酸である。ある態様においては，１３７位のＸはＰまたはＳである。
【００２６】
別の態様は，Ｎ末端トランケート型ＰＲＲＳＶ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ＯＲＦ７ポリペプチドを提供する。
CQLLGAXIKSQRQQPRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGEVSFQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAS  (配列番号12)
７位のＸは任意のアミノ酸である。ある態様においては，７位のＸはＭまたはＩであることができる。別の態様は，
CQLLGAXIKSQRQQPRGGQAKKKKPEKPHFP LAAEDDIRHHLTQTERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGEVSFQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAS  (配列番号18)
である。７位のＸは任意のアミノ酸であることができる。好ましい態様においては，７位のＸはＭまたはＩである。
【００２７】
別の態様は，Ｈｉｓ−タグ付きＮ−トランケート型ＰＲＲＳＶＬｅｌｙｓｔａｄ  ＯＲＦ７ポリペプチドを提供する：
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTGSCQLLGAXIKSQRQQPRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGEVSFQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAS (配列番号13)
４５位のＸは任意のアミノ酸である。ある態様においては，４５位のＸはＭまたはＩであることができる。
【００２８】
本発明の１つの態様においては，配列番号１，配列番号２，配列番号１２，および／または配列番号１３は，全長ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７を含むポリペプチドより溶解性が高い。さらに，本発明のポリペプチドは，ＰＲＲＳＶに特異的な抗体に特異的に結合する。したがって，本発明のポリペプチドの基本的かつ新規な特徴は，全長ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７より可溶性が高いこと，ＰＲＲＳＶ検出アッセイにおいて全長ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７より特異性が高いこと，および抗ＰＲＲＳＶ抗体に特異的に結合することである。
【００２９】
本発明の１つの態様は，全長より短いＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７ポリペプチドを提供する。特に，ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７ポリペプチドは，Ｎ末端トランケーションを有する。すなわち，ポリペプチドは，約１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，または４３アミノ酸がＮ末端から除かれている。本発明の好ましい態様においては，ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７ポリペプチドは，約１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，または３２アミノ酸がＮ末端から除かれている。別の態様においては，ＰＲＲＳＶＯＲＰ７ポリペプチドは，約１６−約３１アミノ酸がＮ末端から除かれており；約１７−約３０アミノ酸がＮ末端から除かれており；約１８−約２９アミノ酸がＮ末端から除かれており；約１９−約２８アミノ酸がＮ末端から除かれており；約２０−約２７アミノ酸がＮ末端から除かれており；または約２１−約２６アミノ酸がＮ末端から除かれている。ＵＳ  ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７のほぼ２５位に，およびＬｅｌｙｓｔａｄ  ＰＲＲＳＶのほぼ３３位にＭ残基が存在する場合には，これを別のアミノ酸と置き換えることができる。例えば，配列番号１および配列番号１８を参照。
【００３０】
本発明のポリペプチドのフラグメントは，本発明のポリペプチドの約５，１０，１５，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。変種ポリペプチドは，配列番号１，配列番号２，配列番号１２，または配列番号１３に示されるポリペプチド配列と少なくとも約８０，または約９０，９６，９８，または９９％同一であり，これもまた本発明のポリペプチドである。変種ポリペプチドは，１またはそれ以上の保存的アミノ酸変種または他の軽敏な改変を有し，かつ生物学的活性を維持している，すなわち，生物学的に機能的な同等物である。生物学的に活性な同等物は，対応する野生型ポリペプチドと比較したときに実質的に同等の機能を有する。パーセント配列同一性は，当該技術分野において認識されている意味を有し，２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の同一性を測定する多くの方法が存在する。例えば，Ｌｅｓｋ，Ｅｄ．，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８８）；Ｓｍｉｔｈ，Ｅｄ．，Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９３）；Ｇｒｉｆｆｉｎ＆Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｅｄｓ．，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ，（１９９４）；ｖｏｎＨｅｉｎｊｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８７）；およびＧｒｉｂｓｋｏｖ＆Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｅｄｓ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，ＭＳｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９９１）を参照。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをアライメントする方法は，ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）），およびＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．，２：４８２−４８９（１９８１））の局所ホモロジーアルゴリズムを使用するＢｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）等のコンピュータプログラムにおいて体系化されている。例えば，ＦＡＳＴＡアルゴリズムを利用するコンピュータプログラムであるＡＬＩＧＮを用いて，ギャップオープンペナルティー−１２，ギャップイクステンションペナルティー−２でアフィンギャップサーチを行うことができる。
【００３１】
配列アライメントプログラムのいずれかを用いて，特定の配列が参照配列と例えば約９５％同一であるか否かを判定する場合，参照ポリヌクレオチドの全長にわたって同一性のパーセンテージを計算し，参照ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの総数の５％までの同一性のギャップが許容されるように，パラメータを設定する。
【００３２】
変種は一般に，本発明のポリペプチド配列の１つを改変し，改変されたポリペプチドの特性を評価してこれが生物学的同等物であるか否かを判定することにより，同定することができる。変種は，免疫組織学的アッセイ，酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ），ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），免疫酵素アッセイまたはウエスタンブロットアッセイなどのアッセイにおいて，本発明のポリペプチドと実質的に同じ反応をする場合，例えば，元のポリペプチドの活性の９０−１１０％を有する場合，生物学的同等物である。１つの態様においては，アッセイは競合アッセイであり，ここで，生物学的に同等のポリペプチドは，対応する反応性抗原または抗体に対する本発明のポリペプチドの結合を約８０，９５，９９，または１００％低下させることができる。対応する野生型ポリペプチドに特異的に結合する抗体は，変種ポリペプチドにも特異的に結合する。本発明の変種ポリペプチドは，約１，２，３，４，５，または６個の保存アミノ酸置換を含むことができる。
【００３３】
保存的置換とは，アミノ酸が，ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造およびハイドロパシーの性質が実質的に変化しないと予測するように，類似する特性を有する別のアミノ酸で置換されているものである。一般に，以下のアミノ酸のグループが保存的置換を表す：（１）ａｌａ，ｐｒｏ，ｇｌｙ，ｇｌｕ，ａｓｐ，ｇｉｎ，ａｓｎ，ｓｅｒ，ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ，ｓｅｒ，ｔｙｒ，ｔｈｒ；（３）ｖａｌ，ｉｌｅ，ｌｅｕ，ｍｅｔ，ａｌａ，ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ，ａｒｇ，ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ，ｔｙｒ，ｔｉｐ，ｈｉｓ。
【００３４】
本発明のポリペプチドはさらに，翻訳と同時にまたは翻訳後に蛋白質の輸送を指示するシグナル（またはリーダー）配列を含むことができる。ポリペプチドはまた，ポリペプチドの合成，精製または同定を容易にするための（例えばｐｏｌｙ−Ｈｉｓ），またはポリペプチドの固体支持体への結合を促進するための，リンカーまたは他の配列を含むことができる。例えば，ポリペプチドは，イムノグロブリンＦｃ領域またはウシ血清アルブミンにコンジュゲート化することができる。
【００３５】
ポリペプチドは，ポリペプチドが天然には通常は結合していないアミノ酸配列に，共有結合的にまたは非共有結合的に連結させることができる。さらに，ポリペプチドは，アミノ酸以外の化合物または分子に，共有結合的にまたは非共有結合的に連結させることができる。例えば，ポリペプチドは，指示薬，アミノ酸スペーサー，アミノ酸リンカー，シグナル配列，移送停止配列，貫膜ドメイン，蛋白質精製リガンド，またはそれらの組み合わせに連結させることができる。アミノ酸スペーサーは，天然には通常は本発明のポリペプチドと連続的に結合していないアミノ酸の配列である。アミノ酸スペーサーは，約１，５，１０，２０，１００，１，０００またはそれ以上のアミノ酸を含むことができる。
【００３６】
所望の場合には，ポリペプチドは融合蛋白質であってもよく，これはまた，他のアミノ酸配列，例えば，アミノ酸リンカー，アミノ酸スペーサー，シグナル配列，ＴＭＲ移送停止配列，貫膜ドメイン，ならびに蛋白質精製に有用なリガンド，例えば，グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ，ヒスチジンタグ，およびブドウ球菌プロテインＡ，またはこれらの組み合わせを含むことができる。融合蛋白質中には２以上の本発明のポリペプチドが存在していてもよい。本発明の融合蛋白質中には，本発明のポリペプチドのフラグメントが存在していてもよい。本発明の融合蛋白質は，配列番号１，配列番号２，配列番号１２，配列番号１３の１またはそれ以上，これらのフラグメント，またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【００３７】
本発明のポリペプチドは，多量体型であってもよい。すなわち，ポリペプチドは，配列番号１，配列番号２，配列番号１２，および／または配列番号１３の１またはそれ以上のコピーを含むことができる。多量体ポリペプチドは，多抗原ペプチド（ＭＡＰ）であってもよい。例えば，Ｔａｒｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９６：１７−３２（１９９６）を参照。
【００３８】
本発明のポリペプチドは，ＰＲＲＳＶに対して反応性の抗体により認識される抗原を含んでいてもよい。抗原は，１またはそれ以上のエピトープ（すなわち，抗原決定基）を含むことができる。エピトープは，直鎖状エピトープ，連続的エピトープまたはコンフォメーションエピトープであってもよい。本発明のポリペプチド中のエピトープは，いくつかの方法により同定することができる。例えば，米国特許４，５５４，１０１；Ｊａｍｅｓｏｎ＆Ｗｏｌｆ，ＣＡＢＩＯＳ４：１８１−１８６（１９８８）を参照。例えば，本発明のポリペプチドを単離し，スクリーニングすることができる。一緒になってポリペプチド配列全体にわたる一連の短ペプチドは，蛋白質分解により調製することができる。例えば，２０ｍｅｒのポリペプチドフラグメントから出発して，各フラグメントをＥＬＩＳＡにおいて認識されるエピトープの存在について試験することができる。例えば，ＥＬＩＳＡアッセイにおいては，ＰＲＲＳＶポリペプチド，例えば２０ｍｅｒのポリペプチドフラグメントを，固体支持体，例えばプラスチックのマルチウエルプレートのウエルに結合させる。抗体の集団を標識し，固体支持体に加えて，非特異的吸着が妨げられている条件下で未標識抗原に結合するようにし，未結合抗体および他の蛋白質を洗い流す。抗体の結合は，例えば，無色の基質が有色の反応生成物に変換される反応により検出する。次に，同定された２０ｍｅｒから始めて，順番に小さくなる重複するフラグメントを試験して，目的とするエピトープをマッピングすることができる。
【００３９】
本発明のポリペプチドは，組換え的に製造することができる。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに導入し，当該技術分野においてよく知られる手法を用いてこれを適当な発現用宿主細胞系で発現させることができる。種々の細菌，酵母，植物，哺乳動物および昆虫発現系が当該技術分野において利用可能であり，そのような発現系のいずれをも用いることができる。任意に，ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは，無細胞翻訳系において翻訳することができる。ポリペプチドはまた，化学的に合成してもよく，ＰＲＲＳＶ培養物から取得してもよい。
【００４０】
ＰＲＲＳＶポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは，細菌ゲノム全体より少ないものを含むことができ，一本鎖核酸であっても二本鎖核酸であってもよい。ポリヌクレオチドは，ＲＮＡ，ＤＮＡ，ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ，化学的に合成されたＲＮＡまたはＤＮＡ，またはこれらの組み合わせであることができる。ポリヌクレオチドは，他の成分，例えば，蛋白質，脂質および他のポリヌクレオチドを含まないように精製することができる。例えば，ポリヌクレオチドは，５０％，７５％，９０％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，１００％精製されていてもよい。本発明のポリヌクレオチドは，上述のポリペプチドをコードする。本発明の１つの態様においては，ポリヌクレオチドは，配列番号１，配列番号２，配列番号１２，配列番号１３に示されるポリペプチド，またはこれらの組み合わせをコードすることができる。本発明のポリヌクレオチドは，他のヌクレオチド配列，例えば，リンカー，スペーサー，シグナル配列，ＴＭＲ移送停止配列，貫膜ドメイン，または蛋白質精製において有用なリガンド，例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ，ヒスチジンタグ，およびブドウ球菌プロテインＡをコードする配列を含むことができる。
【００４１】
本発明のポリヌクレオチドは，単離することができる。単離されたポリヌクレオチドは，天然にこれに付随する５’および３’フランキングゲノム配列の一方または両方と隣接して連続していない，天然に生ずるポリヌクレオチドである。単離されたポリヌクレオチドは，例えば，任意の長さの組換えＤＮＡ分子でありうるが，ただし天然に生ずるゲノム中の組換えＤＮＡ分子に直接隣接する天然の核酸配列が除去されているかまたは存在しない。単離されたポリヌクレオチドはまた，天然に生じない核酸分子を含んでいてもよい。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリ等の中で数百から数百万種の他の核酸分子の中に存在する核酸分子，またはゲノムＤＮＡの制限酵素消化物を含むゲル切片は，単離されたポリヌクレオチドであるとはいえない。
【００４２】
本発明のポリヌクレオチドはまた，免疫原性ポリペプチドをコードするフラグメントを含むことができる。本発明のポリヌクレオチドは，全長ポリペプチド，ポリペプチドフラグメント，および変種または融合ポリペプチドをコードすることができる。
【００４３】
本発明のポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列，ならびに本発明のポリヌクレオチド配列と少なくとも約８０，または約９０，９６，９８，または９９％同一である相同的ヌクレオチド配列，およびこれらの相補体もまた，本発明のポリヌクレオチドである。パーセント配列同一性は，"ポリペプチド"の節で記載したようにして計算することができる。縮重ヌクレオチド配列は，本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするが，遺伝コードの縮重のため野生型ポリヌクレオチド配列とは核酸配列が異なるポリヌクレオチドである。生物学的に機能的なＰＲＲＳＶポリペプチドをコードするＰＲＲＳＶポリヌクレオチドの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子，種相同体，および変種もまたＰＲＲＳＶポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは，例えば，生物学的サンプル，例えば，唾液，血液，乳，肉汁，血清，肺洗浄液，痰，肺，へんとう腺，リンパ節または他の組織サンプル，尿，糞便，脳脊髄液，羊水，または傷浸出液中に存在する核酸配列から単離することができる。ポリヌクレオチドは，例えば自動化合成機を用いて実験室で合成することもできる。ＰＣＲ等の増幅方法を用いて，ポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかからポリヌクレオチドを増幅することができる。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチドは，天然に生ずるポリペプチドをコードする配列を含んでいてもよく，天然には生じない変更された配列をコードしてもよい。所望の場合には，ポリヌクレオチドを，発現制御要素，例えば，複製起源，プロモーター，エンハンサー，または宿主細胞中で本発明のポリヌクレオチドの発現を推進する他の制御要素を含む発現ベクター中にクローニングすることができる。発現ベクターは，例えば，プラスミド，例えばｐＢＲ３２２，ｐＵＣ，またはＣｏｌ  Ｅ１，またはアデノウイルスベクター，例えばアデノウイルス２型ベクターまたは５型ベクターであることができる。任意に，他のベクターを用いることができ，これには，限定されないが，シンビスウイルス，サルウイルス４０，アルファウイルスベクター，ポックスウイルスベクター，およびサイトメガロウイルスおよびレトロウイルスベクター，例えば，ネズミ肉腫ウイルス，マウス乳癌ウイルス，モロニーネズミ白血病ウイルス，およびラウス肉腫ウイルス，ミニ染色体，例えばＭＣおよびＭＣ１，バクテリオファージ，ファージミド，酵母人工染色体，細菌人工染色体，ウイルス粒子，ウイルス様粒子，コスミド（ファージラムダのｃｏｓ部位が挿入されているプラスミド）およびレプリコン（細胞内でそれ自身の制御下に複製しうる遺伝的要素）が含まれる。
【００４５】
発現制御配列に動作可能なように連結されたポリヌクレオチドを製造し，これを宿主細胞中で発現させる方法は，当該技術分野においてよく知られている。例えば，米国特許４，３６６，２４６を参照。本発明のポリヌクレオチドは，ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳を指示する１またはそれ以上の発現制御要素に隣接してまたはその近くに位置するとき，動作可能なように連結されている。
【００４６】
本発明のポリヌクレオチドは，例えば，プローブまたはプライマーとして用いることができ，例えば，ＰＣＲプライマーとして用いて，サンプル，例えば生物学的サンプル中のＰＲＲＳＶポリヌクレオチドの存在を検出することができる。そのようなプローブおよびプライマーはＰＲＲＳＶポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズすることができるため，所定のサンプル中の相補的配列の存在を検出するために用いることができる。本発明のポリヌクレオチドプローブおよびプライマーは，生物学的サンプル等のサンプル，例えば，唾液，血液，血清，乳，肉汁，肺洗浄液，痰，肺，へんとう腺，リンパ節または他の組織サンプル，尿，糞便，脳脊髄液，羊水，または創傷浸出液中に存在する相補的配列にハイブリダイズすることができる。サンプルからのポリヌクレオチドは，例えば，ゲル電気泳動または他のサイズ分離手法に供するか，またはサイズ分離することなく固定化することができる。ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーは標識することができる。適当な標識，およびプローブおよびプライマーを標識する方法は，当該技術分野において知られており，例えば，ニックトランスレーションまたはキナーゼにより取り込まれる放射性標識，ビオチン標識，蛍光標識，化学発光標識，生物発光標識，金属キレーター標識および酵素標識が挙げられる。サンプルからのポリヌクレオチドを，適当なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で，プローブまたはプライマーと接触させる。
【００４７】
用途に応じて，種々のハイブリダイゼーション条件を用いて，プローブまたはプライマーの標的配列に対する種々の程度の選択性を達成することができる。高い選択性を必要とする用途のためには，比較的高いストリンジェンシーの条件，例えば，低い塩濃度および／または高温の条件，例えば，約０．０２Ｍ−約０．１５Ｍの塩濃度および約５０℃−約７０℃の温度により与えられる条件を用いることができる。より低い選択性を必要とする用途のためには，より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件，例えば，約０．１４Ｍ−約０．９Ｍの塩の塩濃度条件，および約２０℃−約５５℃の範囲の温度を用いることができる。プローブまたはプライマーおよび試験サンプルからの相補的ポリヌクレオチドを含む，ハイブリダイズした複合体が存在することは，サンプル中にＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶポリヌクレオチド配列が存在することを示す。
【００４８】
抗体
本発明の抗体は，本発明のＰＲＲＳＶポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的かつ安定に結合する抗体分子である。本発明の抗体は，ポリクローナル抗体，モノクローナル抗体，一本鎖抗体（ｓｃＦｖ），または抗体のフラグメントであることができる。抗体のフラグメントは，無傷の抗体の抗原結合部位または可変領域を含む，無傷の抗体の一部であり，この部分は無傷の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメインを含まない。抗体フラグメントの例としては，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆａｂ’−ＳＨ，Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。
【００４９】
本発明の抗体は，任意のクラスの抗体であることができ，例えば，ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤおよびＩｇＥであることができる。抗体またはそのフラグメントは，本発明のポリペプチドのエピトープに結合する。抗体は，適当な実験動物中でインビボで，または組換えＤＮＡ手法を用いてインビトロで生成することができる。抗体を製造し特性決定する手段は当該技術分野においてよく知られている。例えば，Ｄｅａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０：２３−３７（１９９８）；Ｄｅａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：３６１−７９（１９９４）；Ｂａｉｌｅｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：３８１−８８（１９９４）；Ｇｕｌｌｉｃｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：３８９−９９（１９９４）；Ｄｒｅｎｃｋｈａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３７：７−５６（１９９３）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２３９−６５（１９９２）；Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２５−６８（１９９２）を参照。例えば，ポリクローナル抗体は，本発明のポリペプチドを動物，例えばヒトまたは他の霊長類，マウス，ラット，ウサギ，モルモット，ヤギ，ブタ，イヌ，ウシ，ヒツジ，ロバ，またはウマに投与することにより生成することができる。免疫した動物から血清を回収し，硫酸アンモニウムによる沈殿の後，クロマトグラフィー，例えばアフィニティークロマトグラフィーにより，血漿から抗体を精製する。ポリクローナル抗体を製造し加工する手法は当該技術分野において知られている。
【００５０】
"特異的に結合する"または"・・・に特異的"とは，ポリペプチド等の第１の抗原が他の非特異的分子に対するより高い親和性をもって本発明の抗体を認識してこれに結合することを意味する。非特異的分子は，第１の抗原と共通するエピトープを共有しない抗原である。例えば，抗体が非特異的抗原に対するより効率的に結合するある抗原（例えばポリペプチド）に対して生成された抗体は，抗原に特異的に結合すると記述することができる。好ましい態様においては，抗体またはその抗原結合部分は，これがＫａ＝１０７ｌ／ｍｏｌまたはそれ以上の結合親和性をもって，配列番号１，２，１２または１３（または本発明の他の配列）からなるポリペプチドに特異的に結合する。特異的結合は，例えば，酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ），ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），またはウエスタンブロットアッセイを用いて，当該技術分野においてよく知られる方法論を用いて試験することができる。
【００５１】
さらに，本発明のポリペプチド上に存在するエピトープに対するモノクローナル抗体を容易に作成することができる。例えば，本発明のポリペプチドで免疫感作したマウス等の哺乳動物からの正常Ｂ細胞を，例えば，ＨＡＴ感受性マウスミエローマ細胞と融合させて，ハイブリドーマを作成することができる。ＰＲＲＳＶ特異的抗体を産生するハイブリドーマは，ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡを用いて同定し，半固体寒天法または限界希釈法でクローニングすることにより単離することができる。別のラウンドのスクリーニングにより，ＰＲＲＳＶ特異的抗体を産生するクローンを単離する。モノクローナル抗体は，標準的な手法を用いて，例えば，本発明のポリペプチドをマイクロタイタープレートに結合させ，モノクローナル抗体の結合をＥＬＩＳＡアッセイにより測定することにより，特異性についてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体を製造し加工する手法は当該技術分野において知られている。例えば，Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）を参照。特定のアイソタイプのモノクローナル抗体は，最初の融合物から選択することにより直接調製してもよく，または異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマからｓｉｂ選択手法を用いて二次的に調製して，クラススイッチ変種を単離してもよい。Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ．ＵＳＡ．８２：８６５３，１９８５；Ｓｐｒｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｍｅｔｈ．７４：３０７，１９８４を参照。本発明のモノクローナル抗体はまた，組換えモノクローナル抗体であってもよい。例えば，米国特許４，４７４，８９３；米国特許４，８１６，５６７を参照。本発明の抗体はまた，化学的に構築してもよい。例えば，米国特許４，６７６，９８０を参照。
【００５２】
本発明の抗体は，キメラ（例えば，米国特許５，４８２，８５６を参照）でもよく，ヒト化（例えば，Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３（１９９２）を参照）でもよく，またはヒト抗体でもよい。ヒト抗体は，例えば，直接免疫感作，ファージディスプレイ，トランスジェニックマウス，またはトリメラ（Ｔｒｉｍｅｒａ）方法論により作成することができる（例えば，Ｒｅｉｓｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：２４２−２４６（１９９８）を参照）。
【００５３】
ＰＲＲＳＶ抗原（例えばＰＲＲＳＶポリペプチド）に特異的に結合する抗体は，ＰＲＲＳＶに感染した動物，例えばブタからのサンプル，例えば，唾液，血液，血清，乳，肉汁，肺洗浄液，痰，肺，へんとう腺，リンパ節または他の組織サンプル，尿，糞便，脳脊髄液，羊水，または創傷侵出液のサンプルにおけるＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶ抗原の存在を検出するのに特に有用である。ＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶ抗原のためのイムノアッセイは，１つの抗体を用いてもいくつかの抗体を用いてもよい。ＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶ抗原のためのイムノアッセイでは，例えば，ＰＲＲＳＶエピトープに向けられたモノクローナル抗体，１つのＰＲＲＳＶポリペプチドの複数のエピトープに向けられたモノクローナル抗体の組み合わせ，異なるＰＲＲＳＶポリペプチドの複数のエピトープに向けられたモノクローナル抗体，同じＰＲＲＳＶ抗原に向けられたポリクローナル抗体，異なるＰＲＲＳＶ抗原に向けられたポリクローナル抗体，またはモノクローナルとポリクローナル抗体との組み合わせを用いることができる。イムノアッセイのプロトコルは，競合，直接反応，または標識された抗体等を用いるサンドイッチタイプのアッセイに基づくことができる。本発明の抗体は，当該技術分野において知られる任意の種類の標識，例えば，蛍光，化学発光，放射性，酵素，金属コロイド，放射性同位体および生物発光標識で標識することができる。
【００５４】
本発明の抗体またはそのフラグメントは，支持体に結合させて，ＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶ抗原の存在を検出するために用いることができる。支持体としては，例えば，ガラス，ポリスチレン，ポリプロピレン，ポリエチレン，デキストラン，ナイロン，アミラーゼ，天然のおよび修飾されたセルロース，ポリアクリルアミド，アガロースおよび磁性物質が挙げられる。
【００５５】
本発明の抗体はさらに，免疫アフィニティーカラムを用いてＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶ抗原を単離するために用いることができる。抗体を，抗体がその免疫選択活性を保持するように，例えば，吸着または共有結合により固体支持体に固定することができる。任意に，抗体の抗原結合部位がアクセス可能なまま保持されるように，スペーサー基を含めることができる。次に，固定化された抗体を用いて，生物学的サンプル等のサンプル，例えば，唾液，血液，血清，乳，肉汁，肺洗浄液，痰，肺，へんとう腺，リンパ節または他の組織サンプル，尿，糞便，脳脊髄液，羊水，または傷侵出物からのＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶ抗原を結合させる。結合したＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶ抗原は，ｐＨの変化などによりカラムマトリクスから回収する。
【００５６】
本発明の抗体はまた，免疫局在性の研究に用いて，種々の細胞事象の間または生理学的条件下における本発明のポリペプチドの存在および分布を分析することができる。抗体はまた，受動免疫に関与する分子を同定するために，および非蛋白質抗原の生合成に関与する分子を同定するために用いることができる。そのような分子の同定は，ワクチン開発において有用でありうる。本発明の抗体，例えばモノクローナル抗体およびシングルチェイン抗体は，ＰＲＲＳＶにより引き起こされる疾患の改善の経過をモニターするために用いることができる。動物からの試験サンプル中のＰＲＲＳＶ抗体対ＰＲＲＳＶ抗原の増加または減少を測定することにより，疾患を改善することを目的とする特定の治療計画が有効であるか否かを判定することができる。抗体は，例えば，直接結合アッセイ，例えばＲＩＡ，ＥＬＩＳＡ，またはウエスタンブロットアッセイを用いて，検出および／または定量することができる。
【００５７】
検出の方法
本発明の方法は，試験サンプル，例えば，生物学的サンプル，環境サンプル，または実験室サンプル中の，ＰＲＲＳＶに特異的な抗体または抗体フラグメントを検出するために用いることができる。生物学的サンプルとしては，例えば，動物，例えば，ウマ，ネコ，イヌ，ブタ，またはヒトからの，唾液，血液，血清，乳，肉汁，肺洗浄液，痰，肺，へんとう腺，リンパ節または他の組織サンプル，尿，糞便，脳脊髄液，羊水，または創傷侵出液が挙げられる。試験サンプルは，未処理でもよく，本発明のポリペプチドと混合する前に沈殿，分画，分離，希釈，濃縮，または精製してもよい。
【００５８】
この方法は，本発明のポリペプチドを，ポリペプチド／抗体複合体が形成されうる条件下で試験サンプルと接触させることを含む。すなわち，本発明のポリペプチドは，サンプル中に存在するＰＲＲＳＶ特異的抗体に対して特異的に結合する。この態様においては，本発明のポリペプチドは，抗体捕捉試薬として作用する。当業者は，抗体／ポリペプチド複合体の結合を検出するために用いられるアッセイおよび条件に精通している。ポリペプチドとサンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体との間の複合体の形成を検出する。
【００５９】
本発明の抗体は，ＰＲＲＳＶに感染していると疑われるヒトまたは動物から試験サンプルを取得することにより，ＰＲＲＳＶ感染の診断方法において用いることができる。試験サンプルを，抗体−抗原複合体（すなわち免疫複合体）が形成されうる条件下で，本発明の抗体と接触させる。当該技術分野において知られる方法論により，抗体−抗原複合体の量を測定する。対照サンプルにおいて形成されるよりレベルが高いことは，ＰＲＲＳＶ感染を示す。あるいは，本発明のポリペプチドを試験サンプルと接触させることができる。陽性の体液サンプル中のＰＲＲＳＶ抗体は，適当な条件下で抗原−抗体複合体を形成するであろう。抗体−抗原複合体の量は，当該技術分野において知られる方法により測定することができる。
【００６０】
本発明の１つの態様においては，抗体に結合されている酵素等の指示薬が検出可能な反応を触媒したときに，ポリペプチド／抗体複合体が検出される。任意に，シグナル生成化合物を含む指示薬を，ポリペプチド／抗体／指示薬複合体が形成されることを可能とする条件下で，ポリペプチド／抗体複合体に適用してもよい。ポリペプチド／抗体／指示薬複合体を検出する。任意に，ポリペプチドまたは抗体をポリペプチド／抗体複合体の形成前に指示薬で標識してもよい。この方法は，任意に，陽性または陰性対照を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明のアッセイには，限定されないが，競合，直接反応またはサンドイッチタイプのアッセイに基づくアッセイが含まれ，例えば，限定されないが，酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ），ウエスタンブロット，ＩＦＡ，ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），ヘマグルチニン化（ＨＡ），および蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）が挙げられる。本発明の１つのアッセイは，可逆流クロマトグラフィー結合アッセイ，例えば，ＳＮＡＰ（登録商標）アッセイを含む。米国特許５，７２６，０１０を参照。
【００６２】
アッセイは，固相または基板を用いることができ，あるいは免疫沈殿法または固相を用いない任意の他の方法により行うことができる。固相または基板を用いる場合には，本発明のポリペプチドを，固体支持体または基板，例えば，マイクロタイターウエル，磁性ビーズ，非磁性ビーズ，カラム，マトリクス，膜，合成または天然の繊維から構成される繊維マット（例えば，ガラスまたはセルロース系の材料または熱可塑性ポリマー，例えばポリエチレン，ポリプロピレンまたはポリエステル），粒子状材料から構成される焼結構造（例えば，ガラスまたは種々の熱可塑性ポリマー），またはニトロセルロース，ナイロン，ポリスルホン等（一般に天然に合成される）から構成される成形された膜フィルムに，直接または間接的に結合させる。１つの態様においては，基板はポリエチレンの焼結した微細粒子であり，これは一般に多孔性ポリエチレンとして知られており，例えば，Ｃｈｒｏｍｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ）の１０−１５ミクロンの多孔性ポリエチレンフィルムがある。これらの基板材料のいずれも，適当な形状で，例えば，フィルム，シートまたはプレートで用いることができ，あるいは，適当な不活性担体，例えば，紙，ガラス，プラスチックフィルム，または線維にコーティングするか，結合させるか，ラミネートすることができる。ペプチドを固相上に固定化する適当な方法としては，イオン性，疎水性，共有結合性相互作用等がある。
【００６３】
１つのタイプのアッセイフォーマットにおいては，１またはそれ以上のポリペプチドを固相または基板上にコーティングすることができる。抗ＰＲＲＳＶ抗体またはそのフラグメントを含むと疑われる試験サンプルを，ＰＲＲＳＶに特異的な抗体または抗体フラグメントにコンジュゲート化したシグナル生成化合物を含む指示薬とともに，試験サンプルの抗体と固相のポリペプチドとの間に，またはＰＲＲＳＶに特異的な抗体にコンジュゲート化した指示薬化合物と固相のポリペプチドとの間に，抗原／抗体複合体が形成されるのに十分な条件下で，一定時間インキュベートする。抗ＰＲＲＳＶ抗体にコンジュゲート化した指示薬の固相への結合の減少を定量的に測定することができる。シグナルの測定可能な減少を，確認されている陰性のＰＲＲＳＶ試験サンプルから生成するシグナルと比較することにより，試験サンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在が示される。このタイプのアッセイにより，試験サンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体の量を定量することができる。
【００６４】
別のタイプのアッセイフォーマットにおいては，本発明の１またはそれ以上のポリペプチドを支持体または基板上にコーティングする。本発明のポリペプチドを指示薬とコンジュゲート化して試験サンプルに加える。この混合物を支持体または基板に適用する。試験サンプル中にＰＲＲＳＶ抗体が存在すれば，これらは指示薬とコンジュゲート化したポリペプチドに，および基板に固定化したポリペプチドに結合する。次に，ポリペプチド／抗体／指示薬複合体を検出することができる。このタイプのアッセイにより，試験サンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体の量を定量することができる。
【００６５】
別のタイプのアッセイフォーマットにおいては，本発明の１またはそれ以上のポリペプチドを支持体または基板上にコーティングする。試験サンプルを支持体または基板に適用してインキュベートする。固体支持体を洗浄溶液で洗浄することにより，サンプルからの未結合成分を洗い流す。ＰＲＲＳＶ抗体が試験サンプル中に存在すれば，これらは固相上にコーティングしたポリペプチドに結合する。このポリペプチド／抗体複合体は，指示薬にコンジュゲート化した種特異的二次抗体を用いて検出することができる。次に，ポリペプチド／抗体／抗種抗体指示薬複合体を検出することができる。このタイプのアッセイにより，試験サンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体の量を定量することができる。
【００６６】
ポリペプチド／抗体複合体またはポリペプチド／抗体／指示薬複合体の形成は，放射性，発色，蛍光，サイズ分離，または沈殿法により検出することができる。任意に，ポリペプチド／抗体複合体の検出は，シグナル生成化合物を含む指示薬と結合させた二次抗体を用いて行う。ポリペプチド／抗体複合体と会合した，シグナル生成化合物（標識）を含む指示薬は，上述の方法を用いて検出することができ，これには，例えば，発色剤，触媒，例えば酵素，蛍光化合物，例えばフルオレセインおよびローダミン，化学発光化合物，例えばジオキセタン，アクリジニウム，フェナントリジニウム，ルテニウム，およびルミノール，放射性元素，直接可視標識，ならびに補因子，阻害剤，磁気粒子等が含まれる。酵素の例としては，アルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。特定の標識の選択は重要ではないが，それ自身でまたは１またはそれ以上の追加の物質とともにシグナルを生成することが可能なものである。
【００６７】
複合体の形成は，試験サンプルにおける抗ＰＲＲＳＶ抗体の存在を示す。したがって，本発明の方法は，患者におけるＰＲＲＳＶ感染の診断に用いることができる。本発明の方法はまた，試験サンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体の量または数量を示すことができる。酵素等の多くの指示薬を用いると，存在する抗体の量は生成するシグナルと比例する。試験サンプルの種類によって，これを適当なバッファー試薬で希釈してもよく，濃縮してもよく，または操作せずに固相と接触させてもよい。例えば，存在する抗体の存在および／または量を決定するためには，通常は，予め希釈した血清または血漿サンプル，または濃縮した標本，例えば尿を試験することが好ましい。
【００６８】
本発明はさらに，サンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体または抗体フラグメントまたはＰＲＲＳＶポリペプチドを検出するためのアッセイキット（例えば製品）を含む。キットは，本発明の１またはそれ以上のポリペプチド，およびポリペプチドとサンプル中の抗ＰＲＲＳＶ抗体または抗体フラグメントとの結合を判定する手段を含むことができる。キットまたは製品はまた，本発明の１またはそれ以上の抗体または抗体フラグメント，および抗体または抗体フラグメントとサンプル中のＰＲＲＳＶまたはＰＲＲＳＶポリペプチドとの結合を判定するための手段を含むことができる。キットは，本発明の１またはそれ以上のポリペプチドまたは抗体を含むデバイス，および１またはそれ以上のポリペプチドまたは抗体を，例えば哺乳動物におけるＰＲＲＳＶ感染の同定に用いるための指針を含むことができる。キットはまた，キットの１またはそれ以上のポリペプチドまたは抗体がＰＲＲＳＶ感染の同定に用いることができるものであることを示すラベルを含む包装材料を含むことができる。そのような試験キットには，当該技術分野において知られる他の成分，例えば，バッファ，対照等を含めることができる。本発明のポリペプチド，抗体，アッセイ，およびキットは，例えば，患者におけるＰＲＲＳＶ感染の個々の症例の診断に，ならびにＰＲＲＳＶ発生の疫学的研究に有用である。本発明のポリペプチドおよびアッセイは，他のポリペプチドまたはアッセイと組み合わせて，ＰＲＲＳＶの存在を他の生物の存在とともに検出することができる。
【００６９】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において，"・・・を含む"，"・・・から本質的になる"および"・・・からなる"との用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いられる用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではない。そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の等価物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【００７０】
さらに，発明の特徴および観点がマーカッシュグループまたは他の代替グループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループの個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
【００７１】
以下の記述は例示の目的のみのために提供され，上で広く説明した本発明の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書の開示において引用されるすべての参考文献は，本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】
【００７２】
実施例１
ＰＥＸＵＳｏｒｆ７は，先に記載されるようにして（ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８４，３：１４２９−１４３４），発現させ精製した。組換え全長Ｕ．Ｓ．ＯＲＦ７，Ｎ末端欠失誘導体Ｕ．Ｓ．ＯＲＦ７およびカルボキシ末端欠失誘導体Ｕ．Ｓ．ＯＲＦ７蛋白質は，Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｐＥＴ発現系を用いて，製造元により記載される方法により発現させた（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１９）。以下に示される蛋白質をコードする核酸を，製造元により記載される方法を用いてｐＥＴ２００発現系中にクローニングした。組換え蛋白質は，アミノ末端にベクターにコードされるヒスチジンタグを付けて発現させ，迅速なアフィニティー精製を可能とした。蛋白質は，製造元により記載される方法を用いて（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ），Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ｓｔａｒ）株で発現させ，精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いてＥ．ｃｏｌｉの粗溶解物を分離し，分離した蛋白質をニトロセルロースにブロッティングし，ニトロセルロースブロットを当業者に知られる標準的な手法を用いてブロッキングした。例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ"（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）を参照。ブタ抗体の存在は，ヤギ抗ブタＩｇＧＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，１９３９０）を用いて，当業者に知られる標準的な手法を用いて検出した。ＰＲＳＳＶ（Ｕ．Ｓ．血清型）オープンリーディングフレーム７（ＯＲＦ７）の配列は，１２３アミノ酸の長さであり，以下に示される：
ブタ繁殖性呼吸器症候群ウイルス，Ｕ．Ｓ．血清型
MPNNNGKQQKKKKGDGQPVNQLCQMLGKIIAQQNQSRGKGPGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCTLSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAPPSA  (配列番号３) 
【００７３】
ＰＥＸＵＳｏｒｆ７のアミノ酸配列は配列番号４に示される。ＰＲＲＳ  ＯＲＦ７，Ｕ．Ｓ．血清型からのアミノ酸は太字下線で示される。ＯＲＦ７の１２３アミノ酸のすべてが存在する。
MEQRITLKEAWDRSGAWLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPRALADSLMQLARQVSRLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAEACDVGFREVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDGDPMPNNNGKQQKKKKGDGQPVNQLCQMLGKIIAQQNQSRGKGPGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCTLSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAPPSA  （配列番号４）
【００７４】
Ｕ．Ｓ．血清型ＯＲＦ７のアミノ酸２−１２３が存在し，これは配列番号５中で太字下線で示される。この組換え蛋白質は，ＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴ２００発現ベクターを用いて発現させた。蛋白質のアミノ末端に３７アミノ酸融合タグが付加されている。
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTGSLPNNNGKQQKKKKGDGQPVNQLCQMLGKIIAQQNQSRGKGPGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCTLSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAPPSA  （配列番号５）
【００７５】
ＯＲＦ７アミノ末端から２１アミノ酸を欠失させた。アミノ酸２２−１２３が存在し，Ｕ．Ｓ．血清型ＯＲＦ７アミノ酸は配列番号６中で太字下線で示される。組換え蛋白質は，ＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴ２００発現ベクターを用いて発現させた。アミノ酸番号２５（全長ＰＲＲＳ蛋白質の）−メチオニン（Ｍ）−をイソロイシン（Ｉ）−に変換して，異常な翻訳開始部位を除いた。この蛋白質は，蛋白質のアミノ末端に付加させた同じ３７アミノ酸融合タグを有する。
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTGSLCQILGKIIAQQNQSRGKGPGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCTLSDSGRISYTVEFSLPTHHTVRLIRVTAPPSA（配列番号６）
【００７６】
Ｕ．Ｓ．ＯＲＦ７のカルボキシ末端から３０アミノ酸を除去した。Ｕ．Ｓ．ＯＲＦ７のアミノ酸２−９３が存在し，これは配列番号７中で太字下線で示される。組換え蛋白質はＮｏｖａｇｅｎのｐＥＴ２００発現ベクターを用いて発現させた。この蛋白質は，蛋白質のアミノ末端に付加した同じ３７アミノ酸融合タグを有する。この蛋白質はカルボキシ末端に付加された，ベクターによりコードされＰＲＲＳウイルス由来ではない追加の３０アミノ酸タグを有する。
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTGSLPNNNGKQQKKKKGDGQPVNQLCQMLGKIIAQQNQSRGKGPGKKNKKKNPEKPHFPLATEDDVRHHFTPSERQLCLSSIQTAFNQGAGTCTLSLESLEKGELNDPAANKARKEAELAAATAEQ  （配列番号７）
【００７７】
実施例２
ウエスタンブロットにおける反応性
このデータは，ウエスタンブロットにおいて，Ｕ．Ｓ．ＯＲＦ７（配列番号７）のＣ末端欠失誘導体は陽性ブタ血清と反応しないが，全長Ｕ．Ｓ．ＯＲＦ７およびＵ．Ｓ．ＯＲＦ７（配列番号６）のＮ末端（すなわちアミノ末端）欠失誘導体は両方とも陽性ブタ血清と反応することを示す。
【表３】
0005580967.tif 000004
【００７８】
実施例３
ＥＬＩＳＡにおける反応性
組換え蛋白質は，Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｐＥＴ発現系を用いて，製造元により記載された方法（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１９）を用いて発現させた。上述の蛋白質をコードする遺伝子を，製造元により記載される方法を用いてｐＥＴ２００発現系にクローニングした。組換え蛋白質は，アミノ末端にベクターにコードされるヒスチジンタグを付けて発現させ，迅速なアフィニティー精製を可能とした。蛋白質は，製造元（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により記載された方法を用いて，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ｓｔａｒ）株で発現させ精製した。
【００７９】
Ｉｍｍｕｌｏｎ  １プレートを，炭酸バッファｐＨ９．５中１ｕｇ／ｍｌの精製組換え蛋白質で，４℃で一晩コーティングした。プレートを"軽くたたいて"空にし，パッティングして乾燥した。プレートをＰＢＳ中２．５％ＢＳＡを用いて一晩ブロッキングした。プレートを"軽くたたき"，パッティングして乾燥し，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．５）中２．５％ショ糖で重層した。軽くたたいてパッティングして乾燥した後，プレートを４時間真空乾燥し，乾燥剤とともに保存した。
【００８０】
サンプルは，これらのＥＬＩＳＡプレートで，"Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ"（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ  ＭＥ，カタログ番号０６−０４４０４−００）からの市販の試薬および方法を用いて調べた。この結果は，Ｕ．Ｓ．ＯＲＦ７蛋白質（配列番号６）のＮ末端欠失誘導体は，ＥＬＩＳＡアッセイにおいて，全長蛋白質（配列番号５）と同様に反応することを示す。
【００８１】
実施例４
以下のＬｅｌｙｓｔａｄ  ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７ポリペプチドは当該技術分野においてよく知られる手法を用いて製造した。Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ＯＲＦ７蛋白質からの配列を太字下線で示す。他のアミノ酸は，これらの組換え蛋白質に付加された融合パートナー／タグである。
【００８２】
ｐＥＸ４ベクターにより発現されるｂｅｔａｇａｌ−ＯＲＦ７  Ｌｅｌｙｓｔａｄの配列
MEQRITLKEAWDRSGAWLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPRALADSLMQLARQVSRLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAEACDVGFREVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDGDPKGFEFELGTLAGKNQSQKKKKSTAPMGNGQPVNQLCQLLGAMIKSQRQQPRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGKVSFQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGARDPLE  (配列番号14)
【００８３】
ｐＥＴ２００ベクターから発現されるＨｉｓ−ｏｒｆ７  Ｌｅｌｙｓｔａｄの配列
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTGLAGKNQSQKKKKSTAPMGNGQPVNQLCQLLGAMIKSQRQQPRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGKVSFQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAS(配列番号15)
【００８４】
ｐＥＴ２００ベクターから発現されるＨｉｓ−Ｎ末端トランケート型ＯＲＦ７  Ｌｅｌｙｓｔａｄの配列。このＮ末端欠失ペプチドは，アミノ末端から２６アミノ酸が除去されている。
MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDHPFTGSCQLLGAIIKSQRQQPRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGEVSFQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAS (配列番号16)
【００８５】
ｐＥＴ２００ベクターから発現されるＨｉｓカルボキシトランケート型ＯＲＦ７  Ｌｅｌｙｓｔａｄの配列。このＣ末端欠失ペプチドは，カルボキシ末端から３４アミノ酸が除去されている。
MGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDDDDKDHPFTGLAGKNQSQKKKKSTAPMGNGQPVNQLCQLLGAMIKSQRQQPRGGQAKKKKPEKPHFPLAAEDDIRHHLTQTERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLS (配列番号17)
【００８６】
ウエスタンブロットを用いてこれらのポリペプチドの反応性を調べた。結果を表４に示す。
【００８７】
【表４】
0005580967.tif 000005
【００８８】
このデータは，ウエスタンブロットでは，Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ＯＲＦ７のＣ末端欠失誘導体は陽性ブタ血清と反応しないが，Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ＯＲＦ７の全長Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ＯＲＦ７およびＮ末端欠失誘導体は両方とも陽性ブタ血清と反応することを示す。
【００８９】
実施例５
ＥＬＩＳＡにおける反応性
組換え蛋白質は，Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｐＥＴ発現系を用いて，製造元（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｄ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ  ５３７１９）により記載された方法を用いて発現させた。上述のポリペプチドをコードする核酸を，製造元により記載される方法を用いてｐＥＴ２００発現系にクローニングした。組換えポリペプチドは，アミノ末端にベクターにコードされるヒスチジンタグを付けて発現させ，迅速なアフィニティー精製を可能とした。蛋白質は，製造元（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により記載された方法を用いて，Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ｓｔａｒ）株で発現させ精製した。Ｉｍｍｕｌｏｎ  １プレートを，炭酸バッファｐＨ９．５中１ｕｇ／ｍｌの精製組換え蛋白質で，４℃で一晩コーティングした。プレートを"軽くたたいて"空にし，パッティングして乾燥した。プレートをＰＢＳ中２．５％ＢＳＡを用いて一晩ブロッキングした。プレートを"軽くたたき"，パッティングして乾燥し，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファ（ｐＨ７．５）中２．５％ショ糖で重層した。軽くたたいてパッティングして乾燥した後，プレートを４時間真空乾燥し，乾燥剤とともに保存した。サンプルをこれらのＥＬＩＳＡプレートで，市販の試薬および方法"Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｓｔ  Ｋｉｔ"（ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ  ＭＥ，カタログ番号０６−０４４０４−００）を用いて試験した。このデータは，Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ＯＲＦ７蛋白質のＮ末端欠失誘導体がＥＬＩＳＡアッセイにおいて全長蛋白質と同等に反応性であることを示す。
【００９０】
実施例６
トランケート型Ｕ．Ｓ．ｏｒｆ７抗原を用いる抗体検出の特異度の改良
組換え蛋白質発現により生成したＵＳＯｒｆ７（配列番号６）のＮ末端トランケート型ポリペプチドを，ＥＬＩＳＡフォーマットで免疫反応性について試験して，全長ＵＳＯｒｆ７（配列番号５）と比較した。配列番号５および６の組換え蛋白質は，先に記載したようにして発現させ精製した（実施例３）。Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）Ｉプレートを，先に記載したようにして（実施例３）ポリペプチドでコーティングした。プレートコーティングおよび二次抗体希釈は，陽性対照ブタ血清を用いて，ＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ（登録商標）２ＸＲ  ＥＬＩＳＡアッセイとほぼ同等の特異的シグナルが得られるよう最適化した。選択されたブタ血清に対する反応性をＥＬＩＳＡにより評価した（表７を参照）。
【００９１】
スクリーニングした血清サンプルは，他の方法論，例えばＩＦＡおよびＰＣＲによってＰＲＲＳＶについて陰性であると示されているが，ＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ（登録商標）２ＸＲ  ＥＬＩＳＡでは反応性を示した。これは，２ＸＲプレートにおける非特異的シグナルの存在を示唆する。これらの特性を有する血清サンプルはＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ（登録商標）２ＸＲ  ＥＬＩＳＡでは偽陽性であり，ＰＲＲＳ診断の分野の当業者には一般に"シングルトン"と称される。ＵＳＯｒｆ７からＮ末端２６アミノ酸を欠失させると，全長ＵＳＯｒｆ７と比較して低下した反応性および改良された特異度を示す（それぞれ，７９％特異度対６９％特異度）免疫反応性抗原が得られる。陽性および陰性対照標準物質を用いたＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ（登録商標）２ＸＲの最適化に基づいて，０．２００より低いＯＤ６５０値を，サンプルが陰性であると考えられるカットオフ値として決定した。Ｕ．Ｓ．ｏｒｆ７抗原のアミノ末端部分のトランケーションにより，ブタ血清からの非特異的シグナルが有意に低下した。
【００９２】
【表５】
0005580967.tif 000006
【００９３】
実施例７
トランケート型Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｏｒｆ７抗原を用いる抗体検出の特異度の改良
ＰＲＲＳウイルスのＬｅｌｙｓｔａｄ株からの全長Ｏｒｆ７（配列番号１５），ならびにＮ末端トランケート型（配列番号１６）をＥ．ｃｏｌｉで発現させ，単離して，先に記載したように（実施例５），選択されたブタ血清に対してＥＬＩＳＡ分析を行った。プレートコーティングおよび二次抗体（コンジュゲート）希釈は，陽性対照血清を用いて，ＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ（登録商標）２ＸＲ  ＥＬＩＳＡアッセイとほぼ同等の特異的シグナルが得られるよう最適化した。スクリーニングした血清サンプルは，他の方法論，例えばＩＦＡおよびＰＣＲによりＰＲＲＳＶについて陰性であると示されているが，ＩＤＥＸＸ  ＨｅｒｄＣｈｅｃｋ（登録商標）２ＸＲ  ＥＬＩＳＡでは反応性を示した。
【００９４】
Ｎ末端トランケート型Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｏｒｆ７蛋白質は，全長Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｏｒｆ７蛋白質と比較したときに，低下した免疫反応性および改良された特異度を示した（それぞれ，６２％特異度対４２％特異度）。陽性および陰性対照標準を用いるＩＤＥＸＸＨｅｒｄＣｈｅｃｋ２ＸＲの最適化に基づいて，０．２００以下のＯＤ６５０値を，サンプルが陰性であると考えられるカットオフ値として決定した。Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｏｒｆ７抗原のＮ末端部分のトランケーションにより，ブタ血清からの非特異的シグナルが有意に低下した。
【００９５】
【表６】
0005580967.tif 000007
【００９６】
表７  全長およびトランケート型のｏｒｆ７ポリペプチドを用いるＥＬＩＳＡにおける"シングルトン"血清サンプルの反応性
全長（ＦＬ）およびＮ末端トランケート型（Ｔｒｎ）ポリペプチドについてのＯＤ６５０の値が示される。０．２より高いＯＤは陽性である（太字）。
【００９７】
【表７】
0005580967.tif 000008
【００９８】
【表８】
0005580967.tif 000009
【配列表】
0005580967000001.xml