(57)【要約】本発明は、従来のＰＴＤよりも効率良く機能性分子を細胞内のみならず、核内にまで運搬することができる、アミノ酸配列Ｒ  ＩおよびＦ  ＩおよびＲ  Ｉ  Ｇ  Ｃを含んでなり、アミノ酸残基数が２５以下であるペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列Ｒ  ＩおよびＦ  ＩおよびＲ  Ｉ  Ｇ  Ｃを含んでなり、アミノ酸残基数が２５以下であるペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列Ｒ  ＩおよびＦ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃを含む請求の範囲第１項に記載のペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列Ｒ  Ｉ  Ｆ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃである請求の範囲第２項に記載のペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列Ｒ  ＩとＦ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃの間にＸａ  Ｑ  Ｑ  Ｘｂ  Ｘｃが挿入されたアミノ酸配列Ｒ  Ｉ  Ｘａ  Ｑ  Ｑ  Ｘｂ  Ｘｃ  Ｆ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃを含んでなり（ここで、Ｘａ、ＸｂおよびＸｃは同一もしくは相異なり、各々標準アミノ酸を示す）、アミノ酸残基数が２０以下である請求の範囲第２項に記載のペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列Ｒ  Ｉ  Ｌ  Ｑ  Ｑ  Ｌ  Ｌ  Ｆ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃである請求の範囲第４項に記載のペプチド。
【請求項６】
生理活性物質を細胞内または細胞核内に運搬するためのベクターとして使用する請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のペプチド
【請求項７】
請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のペプチドと機能性分子とが直接またはリンカー分子を介して間接的に連結してなる複合体。
【請求項８】
機能性分子が核酸類、アミノ酸類、脂質、糖類およびその他の高分子化合物より選ばれる生理活性物質である請求の範囲第７項に記載の複合体。
【請求項９】
機能性分子が磁性ナノ粒子またはリポソームである請求の範囲第７項に記載の複合体。
【請求項１０】
請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のペプチドをベクターとして使用することを特徴とする生理活性物質の細胞内および核内運搬方法。
【請求項１１】
請求の範囲第９項に記載の磁性ナノ粒子複合体で処理された細胞に高周波磁場照射することを特徴とする細胞処理方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のペプチドのアミノ酸配列を一部に有するタンパク質またはポリペプチドを組み換え遺伝子を用いて作製する方法。
【請求項１３】
請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載のペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡ塩基配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内および核内への移行性を有するペプチドならびに該ペプチドと機能性分子との複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞膜を通過して細胞内へ移行する能力を有するペプチド（ＰＴＤ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ）がいくつか同定され、タンパク質をはじめ、核酸、高分子化合物などの機能性分子を細胞内に運搬するキャリアとして幅広い分野へ応用する試みがなされている。
これまでに同定されたＰＴＤとしては、ＨＩＶのＴａｔ由来ペプチド（Ｅ．Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７２（２５），１６０１０，（１９９７）参照）、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（Ｄ．Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（３０），１８１８８，（１９９６）参照）、単純ヘルペスウイルス・タイプ１の外皮タンパク質ＶＰ２２（Ｇ．Ｅｌｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８８，２２３，（１９９７）参照）などが挙げられる。
中でも、ｔａｔペプチドは最も良く知られたＰＴＤであり、例えば、米国特許第５６５２１１号明細書には、β−ガラクトシダーゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼを、ｔａｔペプチドを用いて細胞内輸送したことが開示されている。また、Ｍ．Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１３，８４０，（２００２）には、ｔａｔペプチドと超常磁性酸化鉄ナノ粒子との複合体を用いたＭＲＩによる細胞内イメージングについて報告されている。
さらに、Ｙ．Ｍｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２９（８），１５７０，（２００６）には、ｔａｔペプチドの機能向上を目的とした研究の過程で、ｔａｔペプチドよりも約３倍の細胞内移行能を示す「ＹＭ−３」が発見されたことも報告されている。
一方、本発明者らは、先に、ＨＩＶ−１のアクセサリー遺伝子の１つであるＶｐｒ由来のタンパク質より、強い移行機能を有するアミノ酸配列：Ｄ  Ｔ  Ｗ  Ａ  Ｇ  Ｖ  Ｅ  Ａ  Ｉ  Ｉ  Ｒ  Ｉ  Ｌ  Ｑ  Ｑ  Ｌ  Ｌ  Ｆ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃ  Ｒ  Ｈで示される２７アミノ酸残基のペプチドＣ４５Ｄ１８を同定し、Ｃ４５Ｄ１８およびその酵素タンパク質複合体は、細胞質内だけでなく、核内にまで移行することができるペプチドであること、ｔａｔペプチドよりその移行機能が優れていることなどを報告した（Ｔ．Ｔａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，３２０，１８，（２００４）参照）。しかし、この文献には、移行機能の発現に必要なアミノ酸配列については何ら言及されていない。
このように、いくつかのＰＴＤが同定・改良され、ＤＤＳキャリアをはじめとした幅広い分野で利用することが試みられているが、その細胞内移行能力が未だ十分でないなどの理由で、産業上実用化されるに至っていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、機能性分子を、従来のＰＴＤよりも効率良く、細胞内のみならず、核内にまで運搬することができるペプチドを提供することである。
本発明の目的は、また、それによって、機能性分子の細胞内および核内移行量を産業利用上有効な量まで引き上げることである。
本発明者らは、Ｃ４５Ｄ１８の核内移行機能を利用する研究の過程で、陰性対象のつもりでアミノ酸配列：Ｒ  Ｉ  Ｌ  Ｑ  Ｑ  Ｌ  Ｌ  Ｆ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃ  Ｒ  Ｈ  Ｓ  Ｒ  Ｉで示される２０アミノ酸残基のペプチドを合成し、その移行性を調べたところ、全く意外にも、Ｃ４５Ｄ１８よりも格段に優れた移行性を示すことが発見した。この発見を契機に、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、今回、Ｃ４５Ｄ１８のアミノ酸配列の一部が、従来のＰＴＤよりも細胞内移行能力および核内移行能力ともに格段に優れており、しかもＣ４５Ｄ１８よりも細胞毒性が低いペプチドを同定し、本発明を完成するに至った。
かくして、本発明は、アミノ酸配列Ｒ  ＩおよびＦ  ＩおよびＲ  Ｉ  Ｇ  Ｃを含んでなり、アミノ酸残基数が２５以下であるペプチドを提供するものである。
本発明のペプチドによれば、単独では細胞内および核内移行が困難なタンパク質、遺伝子、糖、その他の高分子化合物などの運搬において、従来のＰＴＤを使用した時よりも、数倍ないし数十倍高い細胞内および核内移行性を付与することが可能である。そのため、本発明のペプチドを利用することにより、これまで移行機能の低さから実用化が困難であった分野においても実用化が期待される。
また、本発明のペプチドは、母ペプチドであるＣ４５Ｄ１８に比較して細胞毒性が低いため、医療用途に適用する際にも、安全性の観点から有利である。
さらに、本発明のペプチドは、アミノ酸残基数が少ないので、産業上利用する場合に、細胞毒性の低減に加え、コスト削減にも有利である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、各種ペプチド−ＣＭＤＭ複合体のＨｅＬａ細胞内および核内移行能試験結果を示すグラフである。
図２は、ＬＲ１７−ＣＭＤＭ複合体の粒子直径の違いによるＨｅＬａ細胞内および核内移行能を比較した試験結果を示すグラフである。
図３は、各種ペプチド−ＣＭＤＭ複合体の神経細胞内および核内移行能試験結果を示すグラフである。
図４は、各種ペプチド−ＣＭＤＭ複合体の末梢血単核球細胞移行能試験結果を示すグラフである。
図５は、ＬＲ１５ＤＬ−Ｑｄｏｔ複合体のＨｅＬａ細胞内および核内移行能試験結果を示すグラフである。
図６は、ＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰ複合体のＨＥＫ２９３Ｔ細胞内移行試験結果を示すＦＡＣＳ解析図である。
図７は、（Ｈｉｓ）６−ＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰキメラタンパク質のＨＥＫ２９３Ｔ細胞内移行試験結果を示すＦＡＣＳ解析図である。
図８は、ＬＲ２０とＣ４５Ｄ１８及びＶｐｒの細胞毒性を試験し比較した細胞の顕微鏡写真である。
図９は、ＬＲ２０−ＣＭＤＭ複合体を細胞に取り込ませ、高周波磁場照射した後に、細胞の生存率を調べた結果を示す細胞染色後のシャーレを撮影した写真である。
以下、本発明のペプチドについてさらに詳細に説明する。
発明の詳細な記述
以下、本発明のペプチド（以下、本ペプチドと略記することもある）およびその製造法、本ペプチドと組み合わせ得る機能性分子の例示、本ペプチドと機能性分子との複合体の合成法、該複合体の細胞内および核内移行能などの性質の評価、対象となる細胞などについて順次説明する。
なお、以下の説明において、アミノ酸配列は、簡単のために、下記表１に示すペプチド番号で表示することがある。
【表１】
2008108505.tif 000002
2008108505.tif 000003
（ａ）本発明のペプチドおよびその製造法
本発明のペプチド
本発明のペプチドは、細胞内および核内移行機能を発揮する最小必要部分として、アミノ酸配列Ｒ  ＩおよびＦ  ＩおよびＲ  Ｉ  Ｇ  Ｃを含むアミノ酸残基数が２５以下のペプチドであり、該ペプチド分子中における上記アミノ酸配列の順序としては、Ｎ末端から順にＲ  Ｉ、Ｆ  Ｉ、次いでＲ  Ｉ  Ｇ  Ｃであることが好ましい。上記アミノ酸配列はあくまで移行機能を発揮するために必要な最小の配列であり、上記アミノ酸配列の前、後または間にさらに別のアミノ酸配列を付加することにより、さらに高い移行能をもたせることも可能である。
しかして、本発明によれば、好適態様として、アミノ酸配列Ｆ  ＩとＲ  Ｉ  Ｇ  Ｃの間にＨ  Ｆを挿入したアミノ酸配列Ｒ  ＩとＦ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃを含んでなり、アミノ酸残基数が２５以下であるペプチドが提供される。そのようなペプチドとして、具体的には、ペプチド番号４（Ｒ  Ｉ  Ｆ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃ）で示されるペプチドが挙げられ、これは高い移行性を示す。また、例えば、上記配列中、Ｒ  ＩとＦ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃの間にさらにＸａ  Ｑ  Ｑ  Ｘｂ  Ｘｃが挿入されたアミノ酸配列Ｒ  Ｉ  Ｘａ  Ｑ  Ｑ  Ｘｂ  Ｘｃ  Ｆ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃで示されるペプチド（ここで、Ｘａ、ＸｂおよびＸｃは同一もしくは相異なり、各々標準アミノ酸を示す、なお、「標準アミノ酸」とは哺乳動物内で機能するタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸を意味する）、特にペプチド番号３（Ｒ  Ｉ  Ｌ  Ｑ  Ｑ  Ｌ  Ｌ  Ｆ  Ｉ  Ｈ  Ｆ  Ｒ  Ｉ  Ｇ  Ｃ）で示されるペプチドはさらに一層高い移行能を示す。
このような最小必要配列に特定アミノ酸を付加したペプチドは、従来のＰＴＤであるｔａｔペプチドやＰｅｎｅｔｒａｔｉｎの約十倍ないし数十倍高い移行量を示す。
製造法
本発明のペプチドは、それ自体既知のペプチド合成法により製造することができる。ペプチド合成法としては、例えば、固相合成法（Ｍａｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５，２１４９−２１５４，１９６３）が挙げられ、本ペプチドは、現在、この原理を用いて自動化されかつ汎用されているペプチド合成機を使用して、比較的短時間かつ簡便に製造することができる。
また、本ペプチドは、例えば、文献（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３５０，３６７−３８２，１９８７）などに示されるような遺伝子工学によるそれ自体既知の手法を利用して製造することもできる。
（ｂ）機能性分子及び機能性粒子の例示
本発明のペプチドは、前述したとおり、優れた細胞内および核内移行能を有しているので、それをベクターとして使用し、例えば、本ペプチドと機能性分子または機能性粒子とが結合した複合体を製造し、それを細胞内もしくは核内に移行させ、そこで該分子または粒子がもつ機能を発現させることに応用することができる。本ペプチドと組み合わせることができる分子や粒子としては非常に広い範囲から選ぶことができる。
上記機能性分子としては、例えば、核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、アミノ酸類（タンパク質、ペプチドなど）、脂質、糖類、その他の高分子化合物などの生理活性物質；蛍光物質などの機能性化合物などが挙げられ、また、機能性粒子としては、例えば、磁性粒子、蛍光粒子、リポソームなどが挙げられ、これらはそれぞれ単独でまたは２種もしくはそれ以上を組み合わせて使用することができる。特に、ナノサイズの粒子が好ましい。以下、便宜上、機能性分子および機能性粒子をまとめて機能性分子と呼ぶことがある。
次に、代表的な機能性分子および機能性粒子についてさらに具体的に説明するが、これらに限定されるものではない。
核酸類（ＤＮＡ、ＲＮＡ等）
本発明のペプチドとの結合に用い得る核酸類としては、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの一般的な核酸全般を制限なく使用することができるが、例えば、本ペプチドをその１つの用途である形質転換用ベクターとして使用する場合には、細胞内で機能を発現できるような形態のものが好適に用いられる。例えば、ＤＮＡとしては、導入された細胞内でＤＮＡが転写され、産生される生理活性物質が所期の機能を発現するようなものが適している。
そのような核酸類としては、例えば、サイトカイン系遺伝子（例えば、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ系など）、癌抗原ペプチド遺伝子（例えば、ｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１など）、ＬＤＬ受容体遺伝子などが挙げられる。その他、糖尿病、動脈硬化症、アルツハイマー病などの治療用遺伝子も挙げられる。
アミノ酸類（タンパク質、ポリペプチド）
本発明のペプチドとの結合に用い得るアミノ酸類としては、例えば、抗体や酵素などの、標的細胞内に運搬されることにより細胞内で何らかの生理活性を発現するものが好ましい。
そのようなアミノ酸類としては、例えば、抗原として使用可能なタンパク質が、細胞障害性Ｔ細胞を誘導することから全般的に使用可能であり、また、細胞サイクル調節タンパク質（例えば、サイクリン、サイクリン依存キナーゼなど）、抗体（例えば、ＨＥＲ２抗体）、酵素（例えば、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）、不死化タンパク質（例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原、テロメラーゼなど）、抗アポトーシスタンパク質（例えば、突然変異体ｐ５３、ＢｃｌｘＬなど）なども使用することができる。
このようなアミノ酸類と本発明のペプチドとの結合方法については、後述する「（ｃ）本発明のペプチドと機能性分子との結合方法」の項にて詳しく説明するが、この他にもバクテリアなどを利用して本発明のペプチドのアミノ酸配列が予め組み込まれたアミノ酸類を生物的に合成することもできる。また、その結合位置はＮ末側、Ｃ末側のいずれであってもよい。
本発明のペプチドのアミノ酸配列が予め組み込まれたアミノ酸類を得る方法としては、例えば、一般に発現ベクターとして利用されているプラスミドに、運搬させたいアミノ酸類と本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入した後、大腸菌などに発現させて得る方法が挙げられる。この方法によれば、目的のアミノ酸類を得る際に細胞内への運搬能も同時に付与することができるため、実用化の際にコスト面で有利であり、このようして得られる本発明のペプチド導入アミノ酸類及びこの方法も、本発明に包含される。
磁性粒子
本発明のペプチドとの結合に用い得る磁性粒子は、その形態、物性等から一般に多種多用なものが存在するが、本ペプチドに対して好適に使用される形態は、生体適合性に優れ且つナノメートルオーダー（ナノサイズ）の範囲内の全体直径を有する、いわゆる磁性ナノ粒子が好ましいが、これに限定されるものではない。
そのような磁性ナノ粒子としては、例えば、特公昭５９−１３５２１号公報、日本国特許第２９３９３３６号公報、米国特許第４４５２７７３号明細書などに記載の粒子が挙げられ、これらは一般にＭＲＩ造影剤や細胞磁気分離用として実用化されている。
中でも、日本国特許第２７２６５２０号公報に記載されているカルボキシアルキル多糖−磁性金属酸化物、特にカルボキシメチルデキストランマグネタイト（以下、ＣＭＤＭと略記する）が、粒子表面上に別分子との結合に利用できる官能基を有しており、好都合に利用することができる。その具体的な合成法は同特許公報の引用を以って詳細な記述に代える。
上記磁性ナノ粒子は、用途にもよるが、一般に１〜５００ｎｍ、好ましくは１〜２００ｎｍ、さらに好ましくは１〜１５０ｎｍの範囲内の全体直径を有することができ、用途に応じて適宜選択することができる。なお、本明細書において、全体粒子径は、レーザー光散乱測定装置により測定した時の値である。
また、磁性ナノ粒子の磁性については、その指標として、例えばＴ２緩和能力を挙げることができる。この数値は、ＭＲＩにおける検出感度や温熱療法における発熱性などの観点から、可能な限り高いことが望ましく、一般に１〜１０００（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、好ましくは２０〜１０００（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、さらに好ましくは５０〜１０００（ｍＭ・ｓｅｃ）−１の範囲内が好適である。なお、本明細書において、Ｔ２緩和能力は０．４７ＴにおいてパルスＮＭＲ装置で測定した時の値である。
リポソーム
本発明のペプチドとの結合に用い得るリポソームとしては、それ自体既知のリポソーム全般を使用することができ、例えば、本ペプチドの用途の１つである薬物ＤＤＳとして使用する場合、薬物内包のために適度な全体直径を有していることが好ましく、特に、細胞内へのデリバリーが完了した後に、必要に応じてリポソーム膜を破砕することができるように設計されたものが好ましいが、これらに限定されるものはない。かかるリポソームとしては、例えば、特開２００６−３０６７８４号公報に記載の温度感受性リポソームなどが挙げられる。その合成法や好ましい物性については、同公開公報の引用を以って詳細な記述に代える。
蛍光粒子
本発明のペプチドとの結合に用い得る蛍光粒子としては、その蛍光波長や形態は特に限定されないが、サイズ的な面において、当然ながら細胞の大きさを超えないもの、好ましくはナノメートルオーダー以下のものであり、特に生態適合性が良好なものが好ましい。そのような粒子として、例えば量子ドットが挙げられる。中でも米国カンタムドット社が開発した「Ｑｄｏｔ（登録商標）」が最もよく知られており、それを一例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。
（ｃ）本発明のペプチドと機能性分子との結合方法（複合体の製造法）
本発明のペプチドと機能性分子との結合は、直接に行ってもよく或いはリンカー分子を介して間接的に行ってもよい。さらに、機能性分子によっては本発明のペプチドと単に混合するだけで結合することもある。一般に、その結合は、それ自体既知の方法で行うことができ、具体的には、例えば、機能性分子としての生体分子の末端または内部に存在する官能基を利用して、化学的な結合方法で、直接的にまたは直接結合が困難な場合にはリンカー分子を介して間接的に行うことができる。その際の化学的な結合様式としては、例えば、アミド結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、Ｓ−Ｓ結合などの共有結合のほかに、イオン結合、静電的結合、分子間力結合、水素結合などの非共有結合が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、前記リンカー分子としては、両端に反応性基を有し、２分子を連結させうる構造の分子であれば、特に限定されるものではない。該反応性基としては、例えば、マレイミド基、Ｎ−コハク酸イミドエステル基、エポキシ基、アビジン基などが挙げられるが、これに限定されるものではない。
また、本ペプチドとリポソームや磁性粒子との結合は、直接的に行ってもよいが、直接結合に利用できる反応性基を粒子表面上に有しているものは比較的少ないことから、通常は何らかのリンカー分子を介して間接的に行われる。前記磁性ナノ粒子と本ペプチドとの結合については、磁性ナノ粒子としてＣＭＤＭを用い、その表面カルボキシル基を利用してリンカーを導入し、さらにそのリンカーの末端にペプチドを結合させる方法が最適である。
以上述べたように、本ペプチドと機能性分子の組み合わせは幅広く、それらの結合方法は一義的には決められないが、それらの活性と構造相関を考慮し、当業者であれば、それ自体既知の結合方法の中から、本ペプチドと機能性分子のそれぞれの組み合わせに合った結合方法を実験的に容易に決めることができる。
（ｄ）該複合体の性質（細胞内・核内移行能を含む）
本発明のペプチドと機能性分子との複合体が有すべき性質は、細胞内および核内移行を行う上で支障をきたさない限り、特に制限されない。ここで、移行に支障をきたす可能性のある性質としては、例えば、サイズ的なことが挙げられ、より具体的には、該複合体の全体直径が挙げられる。本発明のペプチドの細胞内および核内移行のメカニズムは、マクロピノサイトーシスによると考えられ、全体直径が小さい分には問題ないが、大きすぎる場合には、細胞膜や核膜を通過できなくなるおそれがある。そのため、上記複合体は、通常５〜５００ｎｍ、特に５〜２００ｎｍ、さらに特に５〜１５０ｎｍの範囲内の全体直径を有することが好ましい。
上記の如くして製造される本発明において好適な本ペプチド−磁性ナノ粒子複合体は、以下に述べる如き性質を有することができる。
上記複合体は、製造条件にもよるが、一般に用いた磁性ナノ粒子のそれとおおむね同じであることが好ましく、用途にもよるが、通常５〜５００ｎｍ、好ましくは５〜２００ｎｍ、さらに好ましくは５〜１５０ｎｍの範囲内の全体直径を有することができる。
Ｔ２緩和能力は、前述したとおり可能な限り高いことが好ましく、通常１〜１０００（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、好ましくは２０〜１０００（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、さらに好ましくは５０〜１０００（ｍＭ・ｓｅｃ）−１の範囲内にあることができる。
以上に述べた本ペプチド−機能性分子複合体における本ペプチドの含有量は、複合体の用途や機能性分子の大きさなどにより変化させることができるが、本ペプチドの機能を十分に発揮させることができ且つ可能な限り少ないことが好ましく、機能性分子１個あたり、通常１〜３０個、好ましくは１〜２５個、さらに好ましくは１〜２０個の範囲内であることができる。
細胞内および核内移行量
上記ペプチド−磁性ナノ粒子複合体の細胞内および核内移行量は、該複合体を培養細胞上に添加し、一定時間放置後に細胞質および核を分けて回収し、ＮＭＲによりＴ２緩和時間を測定することにより、取り込まれた磁性ナノ粒子の含量を測定することができ、それにより、本発明のペプチドと従来のＰＴＤとの移行能力を比較することができる。
対象とする細胞
本発明のペプチド−機能性分子複合体を移行させることができる対象細胞としては、細胞壁を持たない細胞であれば、特に制限はなく、分裂・非分裂いずれのタイプのものであってもよく、用途によって任意に選択することができる。例えば、遺伝子導入試薬として基礎研究用途に使用する場合には、バクテリアから昆虫、哺乳類までの各種正常細胞、腫瘍細胞または不死化細胞が広範に挙げられ、また、ヒト疾病の治療に応用する場合には、哺乳類の各種正常細胞、腫瘍細胞または不死化細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳなど）、好ましくはヒトの各種正常細胞、腫瘍細胞または不死化細胞（例えば、ＨｅＬａ、Ｈｕｈ−７、２９３、ＭＣＦ−７、神経系細胞、血球系浮遊細胞など）が挙げられる。
複合体の応用
本発明のペプチドを導入した機能性分子複合体は、細胞内、更には核内への移行性が格段に向上するため、こうした移行性に基づき、ベクターとして使用し、生理活性物質を細胞内および核内運搬するのに利用することができ、機能性分子の性質に応じて種々の用途に応用することができる。例えば、機能性分子として遺伝子を用いれば遺伝子導入に応用することができ、また、細胞毒性分子を用いればＤＤＳとして応用することができるが、本発明のペプチドは、様々な機能性分子の細胞内・核内ベクターとしての機能を利用した応用化形態であれば、これらにとどまることなく広く使用することができる。
その際、本発明のペプチドを別の細胞内移行性分子と組み合わせて使用することも可能である。例えば、本発明のペプチドを遺伝子導入ベクターとして機能する陽性荷電高分子に結合することにより、非分裂細胞内への遺伝子導入が可能となる。また、本発明のペプチドを遺伝子発現用のウイルス粒子表面上に結合させることにより、ウイルス粒子を直接核内に運搬し、外来遺伝子を発現させることが可能となる。
一方、本発明のペプチドを高周波磁場照射により誘導加温が可能な上記磁性ナノ粒子に結合させて磁性ナノ粒子複合体とすることにより、細胞質だけでなく核内においても磁性粒子複合体が発熱し、温熱療法への応用が可能となる。また、上記磁性ナノ粒子複合体は、加温と同時に振動することから、核内でＤＮＡや核膜機能を損傷するメカニカルな細胞障害性をも付与することが可能となる。かくして、本発明によれば、磁性ナノ粒子複合体で処理された細胞に高周波磁場照射することを特徴とする細胞処理方法が提供される。
【実施例】
【０００５】
以下、本発明を実施例、比較例および試験例によりさらに具体的に説明する。
なお、実施例および比較例では、日本国特許第２７２６５２０号公報に記載の方法に従って合成した次の１）および２）に示す性質をもつＣＭＤＭ及び大粒子ＣＭＤＭを用いた。
１）ＣＭＤＭの性質
鉄濃度：４４．２ｍｇ／ｍｌ（鉄収率８３％）、磁性酸化鉄の粒子径：５．１ｎｍ、全体の粒子径：４０ｎｍ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．７、Ｔ１緩和能力：３２（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、Ｔ２緩和能力：１２１（ｍＭ・ｓｅｃ）−１。
２）大粒子ＣＭＤＭの性質
鉄濃度：２０．４ｍｇ／ｍｌ、全体の粒子径：７５ｎｍ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．６、Ｔ１緩和能力：３８（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、Ｔ２緩和能力：３１２（ｍＭ・ｓｅｃ）−１。
実施例１：ＬＲ２０（ペプチド番号１）の合成
固相合成法の原理によるペプチド自動合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｐｉｏｎｅｅｒ型）を用い、標題のペプチドＬＲ２０のアミノ酸２０残基配列のプログラミングを行い且つペプチドＬＲ２０の製造に必要なペプチド合成用アミノ酸試薬をセットし、自動合成を行った。合成が終了した後、ＴＦＡを用いて担体用樹脂からペプチドを切り離し、樹脂を除去後、エーテルを加えて遠心し（３０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）、析出したペプチドを凍結乾燥することによりペプチドを得た。得られたペプチドについて、マススペクトル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＲＰ型）により分子量を測定し、また、ＨＰＬＣ（関東化学社製、Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  ＲＰ−１８ＧＰカラム、検出波長２２０ｎｍ、溶出液０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ）によるピーク面積から純度を測定し、得られたペプチドがＬＲ２０ペプチドであることを確認した。
マススペクトル分析結果：測定分子量２５０６．７（理論分子量２５０７．３）、ＨＰＬＣ分析結果：リテンションタイム２２．８２５ｍｉｎ（９３．６％）。
実施例２：ＬＲ２０−ＣＭＤＭの合成
（１）  全体直径４０ｎｍのＣＭＤＭ  ８ｍｌ（鉄濃度２０ｍｇ／ｍｌ）に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（以下ＥＤＣ）６２３ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（以下ＮＨＳ）１８７ｍｇおよびＮ−エチルアミノマレイミド・トリフルオロ酢酸塩２２ｍｇの０．２Ｍ−ホウ酸ナトリウムバッファー溶液８ｍｌを順次添加し、室温にて反応を行う。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、不要な試薬類を除去し、リンカー結合ＣＭＤＭ水溶液２８ｍｌを得た。
（２）  上記（１）で得たリンカー結合ＣＭＤＭの水溶液１０ｍｌに、ＬＲ２０（ペプチド番号１）９．８ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、未結合のペプチドを回収し、定量する。上清を水で希釈した後、システイン１．０ｍｇを添加し、室温にて反応させる。２０時間後、限外濾過（分画分子量５０，０００ダルトン）を行い、上清を０．１Ｍ−ホウ酸ナトリウムバッファーで８ｍｌに希釈し、ＬＲ２０−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号１）。
鉄濃度：７．６ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．６０、全体粒子径：４９ｎｍ（ＰＨ９）、Ｔ１緩和能力：２８（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、Ｔ２緩和能力：１１５（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．０個。
実施例３：ＬＲ１７（ペプチド番号２）の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＬＲ１７の配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、ＬＲ１７ペプチドを得た。
マス分析結果：測定分子量２１５０．２５（理論分子量２１５０．６７０）、ＨＰＬＣ分析結果：リテンションタイム１９．０００ｍｉｎ（１００．０％）。
実施例４：ＬＲ１７−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＬＲ１７（ペプチド番号２）８．４ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、ＬＲ１７−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号２）。
鉄濃度：６．７ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５８、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１１．４個。
実施例５：ＬＲ１５（ペプチド番号３）の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＬＲ１５の配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、ＬＲ１５ペプチドを得た。
マス分析結果：測定分子量１８５７．４７（理論分子量１８５７．３４０）、ＨＰＬＣ分析結果：リテンションタイム１９．６００ｍｉｎ（１００．０％）。
実施例６：ＬＲ１５−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＬＲ１５（ペプチド番号３）７．２ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、ＬＲ１５−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号３）。
鉄濃度：７．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．６０、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．０個。
実施例７：ＬＲ１５ＤＬ（ペプチド番号４）の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＬＲ１５ＤＬの配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、ＬＲ１５ＤＬペプチドを得た。
マス分析結果：測定分子量１２６１．９７（理論分子量１２６１．５７５）、ＨＰＬＣ分析結果：リテンションタイム１６．９９２ｍｉｎ（９７．７％）。
実施例８：ＬＲ１５ＤＬ−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＬＲ１５ＤＬ（ペプチド番号４）２．５ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、ＬＲ１５ＤＬ−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号４）。
鉄濃度：７．６ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５５、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．１個。
実施例９：ＬＲ８ＤＨＦ（ペプチド番号５）の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＬＲ８ＤＨＦの配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、ＬＲ８ＤＨＦペプチドを得た。
マス分析結果：測定分子量９７７．２６（理論分子量９７７．２７）、ＨＰＬＣ分析結果：リテンションタイム１８．９５０ｍｉｎ（９８．５％）。
実施例１０：ＬＲ８ＤＨＦ−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＬＲ８ＤＨＦ（ペプチド番号５）３．８ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、ＬＲ８ＤＨＦ−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号５）。
鉄濃度：７．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５２、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．１個。
比較例１：ＬＲ１１（ペプチド番号６）ＧＧＣ付加品の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＬＲ１１＋ＧＧＣの配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、ＬＲ１１ペプチド（ＧＧＣ付加品）を得た。
マス分析結果：測定分子量１６４５．０５（理論分子量１６４５．０５）、ＨＰＬＣ分析結果：リテンションタイム１９．３０８ｍｉｎ（９４．１％）。
比較例２：ＬＲ１１−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＬＲ１１（ペプチド番号６）のＣ末端にＧＧＣを付加したもの６．４ｍｇとし、かつ添加する際にＤＭＳＯに溶解させておくこと以外は実施例２と同様に処理し、ＬＲ１１−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号６）。
鉄濃度：７．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．６１、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．４個。
比較例３：ＬＲ８ＤＨＦＲＩ（ペプチド番号７）の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＬＲ８ＤＨＦＲＩの配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、ＬＲ８ＤＨＦＲＩペプチドを得た。
マス分析結果：測定分子量７０８．９８（理論分子量７０７．９１）、ＨＰＬＣ分析結果：リテンションタイム１６．８８ｍｉｎ（９６．１％）。
比較例４：ＬＲ８ＤＨＦＲＩ−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＬＲ８ＤＨＦＲＩ（ペプチド番号７）４．５ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、ＬＲ８ＤＨＦＲＩ−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号７）。
鉄濃度：７．１ｍｇ／ｍｌ、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．３個。
比較例５：ＬＲ８ＤＲＩＨＦ（ペプチド番号８）の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＬＲ８ＤＲＩＨＦの配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、ＬＲ８ＤＲＩＨＦペプチドを得た。
マス分析結果：測定分子量７０８．４０（理論分子量７０７．９１）、ＨＰＬＣ測定純度：１００．０％
比較例６：ＬＲ８ＤＲＩＨＦ−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＬＲ８ＤＲＩＨＦ（ペプチド番号８）４．５ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、ＬＲ８ＤＲＩＨＦ−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号８）。
鉄濃度：６．６ｍｇ／ｍｌ、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．７個。
比較例７：Ｃ４５Ｄ１８（ペプチド番号９）の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＣ４５Ｄ１８の配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、Ｃ４５Ｄ１８ペプチドを得た。
マス分析結果：測定分子量３２０７．１
比較例８：Ｃ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＣ４５Ｄ１８（ペプチド番号９）１２．５ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、Ｃ４５Ｄ１８−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号９）。
鉄濃度：７．４ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５８、全体粒子径：４６ｎｍ（ＰＨ９）、Ｔ１緩和能力：２９（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、Ｔ２緩和能力：１１７（ｍＭ・ｓｅｃ）−１、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．３個。
比較例９：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ（ペプチド番号１０）ＧＧＣ付加品の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ＋ＧＧＣの配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎペプチド（ＧＧＣ付加品）を得た。
マス分析結果：測定分子量２４６４．３８（理論分子量２４６４．０３）、ＨＰＬＣ分析結果：リテンションタイム１９．２８ｍｉｎ（９９．５％）。
比較例１０：Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＰｅｎｅｔｒａｔｉｎ（ペプチド番号１０）のＣ末端にＧＧＣを付加したもの９．５ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号１０）。
鉄濃度：７．７ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．６０、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：９．８個。
比較例１１：ｔａｔ（ペプチド番号１１）ＧＧＣ付加品の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをｔａｔ＋ＧＧＣの配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、ｔａｔペプチド（ＧＧＣ付加品）を得た。
マス分析結果：測定分子量１８３４．３
比較例１２：ｔａｔペプチド−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをｔａｔペプチド（ペプチド番号１１）のＣ末端にＧＧＣを付加したもの７．０ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、ｔａｔペプチド−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号１１）。
鉄濃度：７．３ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５７、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．１個。
比較例１３：ＹＭ−３（ペプチド番号１２）ＧＧＣ付加品の合成
実施例１において、配列のプログラミングおよび必要なアミノ酸試薬のセットをＹＭ−３＋ＧＧＣの配列に合わせる以外は、実施例１と同様にして合成および分析を行い、ＹＭ−３ペプチド（ＧＧＣ付加品）を得た。
マス分析結果：測定分子量１７７７．７８（理論分子量１７７７．１０）、ＨＰＬＣ分析結果：リテンションタイム１８．３６ｍｉｎ（９９．１％）。
比較例１４：ＹＭ−３−ＣＭＤＭの合成
実施例２において、添加するペプチドをＹＭ−３（ペプチド番号１２）のＣ末端にＧＧＣを付加したもの７．０ｍｇとする以外は実施例２と同様に処理し、ＹＭ−３−ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号１２）。
鉄濃度：７．３ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．５９、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１０．６個。
実施例１１：ＬＲ１７−大粒子ＣＭＤＭの合成
実施例４において、用いるＣＭＤＭを全体直径７５ｎｍのものとする以外は、実施例４と同様に処理し、ＬＲ１７−大粒子ＣＭＤＭ水性ゾルを得た（複合体番号１３）。
鉄濃度：７．５ｍｇ／ｍｌ、ＣＭＤ／鉄重量比：０．３４、磁性ナノ粒子１個あたりのペプチド結合数：１６．２個。
実施例１２：ＬＲ１５ＤＬ−Ｑｄｏｔの合成
ＱｄｏｔＩＴＫ７０５ＴＭ２０μｌにｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ  ７μｇを加え、２５℃で３０分反応させた。その後、サイズ排除クロマトグラフィー（セファデックスＧ５０、溶出液：０．０１Ｍ−ＰＢＳ）に供し、不要な試薬を除去した。最後にＬＲ１５ＤＬを２μｇ加え、２５℃で反応することによりＬＲ１５ＤＬ−Ｑｄｏｔ水性ゾルを得た（複合体番号１４）。
実施例１３：ＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰの合成
ＬＲ１５ＤＬ（ペプチド番号４）とＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を、モル比１：１、３：１、１０：１で混合し、４℃で１時間インキュベートし、結合量の異なる３種類のＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰを得た（複合体番号１５）。
実施例１４：Ｈｉｓタグ−ＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰキメラタンパク質の調製
ヒスチジン６個をタグとして発現する発現プラスミドＤＮＡとしてｐＥＴ１５ｂプラスミドを用いた。まず、このベクターにＥＧＦＰをコードするＤＮＡ配列を挿入した。次いで、このＤＮＡ中のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩサイトに、ＬＲ１５ＤＬをコードするＤＮＡ（ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＴＧＣ）を挿入した組換え体を作製した。それぞれの発現プラスミドＤＮＡを組み換え蛋白質発現用大腸菌であるＢＬ２１（ノバジェン社製）に導入し、発現させた。得られた粗タンパク質は、Ｈｉｓタグと特異的にキレート結合するニッケルで表面処理したアフィニティーカラム（インビトロジェン社製、型番Ｒ９０１−１５）にて精製することにより、（Ｈｉｓ）６−ＥＧＦＰ単独と（Ｈｉｓ）６−ＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰキメラタンパク質を得た（複合体番号１６）。
試験例１（磁性粒子のＨｅＬａ細胞内および核内移行能）
実施例１〜１１および比較例１〜１５にて合成した各複合体について、ＨｅＬａ細胞内および核内移行試験を実施した。その実験方法は以下のとおりである。
サイミジンにより細胞周期を止めたＨｅＬａ細胞２×１０６個に対し、実施例１〜１１および比較例１〜１５により得られた各種のペプチド−磁性ナノ粒子複合体（Ｆｅ濃度：０．７ｍｇ／ｍｌに培養液で調整）を３ｍｌ添加した。１８時間後、ＰＢＳで細胞を洗浄・回収し、遠心沈降（２０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）によりペレット化した。これに７００ｍｌのＰＢＳを加えて再懸濁後、ダウンスホモジナイザーにて細胞を破砕・遠心沈降（２０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）した。この時、上清は細胞質画分であり、ペレットは核画分である（ペレットには０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ溶液を加え、超音波破砕する）。このようにして得られたそれぞれの画分のＴ２緩和時間をＮＭＲにて測定した。並行して同画分のタンパク質濃度をＢＳＡプロテインアッセイ法にて測定しておく。
Ｔ２緩和時間と磁性体濃度の間には一定の関係式が成立するので、試験前後で試料のＴ２緩和能力は変化しないと仮定し、磁性体濃度を算出することができる。求めた濃度はさらにタンパク質濃度にて補正した。結果を図１及び図２に示す。
図１の結果から明らかなとおり、本発明により得られたペプチドからなる複合体番号１〜５は、既存のペプチドからなる複合体番号９〜１２よりも、数倍〜数十倍高い移行機能を示した。
本発明のペプチドからなる複合体の中でも、複合体番号１〜３は、この順に機能が向上したことから、Ｃ末端側のアミノ酸配列Ｒ  Ｈ  Ｓ  Ｒ  Ｉは細胞内および核内移行には不要の部分であり、この部分を欠いたペプチド番号３のペプチドが最も優れた細胞内および核内移行機能を有することが示された。また、複合体番号４の結果から、アミノ酸配列Ｌ  Ｑ  Ｑ  Ｌ  Ｌを除去しても細胞内への移行はやや減じたものの、核内への移行は十分に保持していることが示された。さらに、複合体番号５〜８の結果からは、ペプチド番号５で示されるアミノ酸配列Ｒ  ＩおよびＦ  ＩおよびＲ  Ｉ  Ｇ  Ｃが、細胞内および核内移行機能に必要な最小配列であることが示唆された。
図２の結果から、移行させるＣＭＤＭの粒子直径を増大させても、細胞内への移行量は変わらず、導入ペプチド量に左右されることが示唆された。
試験例２（磁性粒子の神経細胞内および核内移行能）
対象細胞として、マウス胎児の大脳皮質より調整した神経細胞を用いること以外は試験例１と同様の方法にて、複合体番号１、２、１２の神経細胞内および核内移行試験を実施した。結果を図３に示す。
図３の結果から、本発明のペプチドは、神経細胞内および核内に対しても、既存のペプチドより数倍高い移行能を示した。
試験例３（磁性粒子の末梢血単核球細胞内移行能）
ヒト末梢血単核球細胞２×１０６個に対し、複合体番号２および１２（Ｆｅ濃度：０．７ｍｇ／ｍｌに培養液で調整）を添加した。ヒト末梢血単核球細胞は被験者の血液からＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（ＡＸＩＳ−ＳＨＩＥＬＤ社）を用いて調製した。１８時間後に細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄した後に１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ  ０．６ｍｌに懸濁し、超音波破砕した。得られたサンプルのＴ２緩和時間をＮＭＲにて測定し、磁性体濃度を算出した。結果を図４に示す。
図４の結果から、本発明のペプチドは、末梢血単核球細胞に対しても、既存のペプチドより高い移行能を示した。
試験例４（量子ドットのＨｅＬａ細胞内および核内移行能）
実施例１２で合成したＬＲ１５ＤＬ−Ｑｄｏｔ（複合体番号１４）について、細胞内および核内移行試験を以下の方法で実施した。
サイミジンにより細胞周期を止めたＨｅＬａ細胞４×１０５個に対し、実施例１２で得られたＬＲ１５ＤＬ−Ｑｄｏｔ複合体（複合体番号１４）を終濃度６ｎＭとなるように添加した。１６時間後、ＰＢＳで細胞を３回洗浄し、スクレーパーで細胞を剥がし回収した。ＰＢＳで細胞を１回洗浄し、ダウンスホモジナイザーにて細胞を破砕・遠心沈降（２０００ｒｐｍ×５ｍｉｎ）した。この時、上清は細胞質画分であり、ペレットは核画分である（ペレットには０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳ溶液を加え、超音波破砕する）。このようにして得られたそれぞれの画分の蛍光輝度を測定した。得られた画分の蛍光輝度を励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍの条件で測定した。結果を図５に示す。
図５の結果から、移行させる物質としてＱｄｏｔ（登録商標）を選択しても、同様に細胞内・核内移行することが確認できた。
試験例５（タンパク質の細胞内移行能１）
実施例１３にて合成したＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰ（複合体番号１５）について、細胞内移行試験を以下の方法で実施した。
実施例１３により得られたＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰ（複合体番号１５）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対し１０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加し、３℃  ４時間インキュベートした。細胞をトリプシンで処理し、ＥＧＦＰの取り込みにより蛍光を発する細胞量をＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）解析にて測定した。結果を図６に示す。
図６の結果から、本発明のペプチドは、タンパク質を細胞内移行する能力を持つことが確認できた。また、その移行能力は本ペプチドの結合量に依存することが示された。
試験例６（タンパク質の細胞内移行能２）
実施例１４にて合成した（Ｈｉｓ）６−ＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰキメラタンパク質（複合体番号１６）について、細胞内移行試験を以下の方法で実施した。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、実施例１４により得られた（Ｈｉｓ）６−ＬＲ１５ＤＬ−ＥＧＦＰ（複合体番号１６）を１７．５μｇ／ｍｌの濃度になるように添加し３７℃  ４時間インキュベートした後、細胞をリンスして余分な複合体を除去した。翌日、細胞をトリプシンを用いて剥がし、ＥＧＦＰの取り込みにより蛍光を発する細胞量をＦＡＣＳ解析にて測定した。結果を図７に示す。
図７の結果から、本発明のペプチドのアミノ酸配列が組み込まれたキメラタンパク質が、細胞内移行能力を持つことが確認できた。
試験例７（細胞毒性試験）
本発明のペプチドの、細胞内ＤＮＡに対する損傷を以下の方法で試験した。
（１日目）  ディッシュ上に５×１０４個のＨｅＬａ細胞を播種し、１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地（２ｍｌ）で培養した。
（２日目）  リコンビナントＶｐｒ（Ｖｐｒ由来タンパク質）、Ｃ４５Ｄ１８（ペプチド番号９）、ＬＲ２０（ペプチド番号１）を添加し、２日間インキュベートした。
（４日目）  以降、次の順で処理した：ディッシュをＰＢＳで洗浄→４％パラホルムアルデヒドで固定→氷上で２０分インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄→１％トライトンＸ１００／２ＭＨＣｌ溶液を２００ｕｌ添加後、室温で３０分インキュベート→１％ＢＳＡ２００ｕｌでブロッキング、室温１時間→ａｎｔｉ−γＨ２ＡＸ溶液を添加し、切断されたＤＮＡ二重鎖を染色（３７℃３０分）→ｃｙ３−ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅｌｇＧ溶液を添加し、室温３０分→ＤＡＰＩ／ＰＢＳＴで核を染色（３分）→スライドグラス上にて検鏡した。
結果を図８に示す。図８において、染色された部分は切断されたＤＮＡを示す。
図８の結果から、本発明のペプチド群における代表的な１つであるＬＲ２０は、ＤＮＡへの損傷度合いが低減していることがわかる。左上：バッファーコントロール、右上：リコンビナントＶｐｒ、左下：Ｃ４５Ｄ１８、右下：ＬＲ２０。
また、ＬＲ１５ＤＬについても同様の試験を実施し、ＤＮＡの損傷が見られないことを確認した。
試験例８（本ペプチド−磁性ナノ粒子複合体を取り込ませた細胞の高周波磁場処理）
実施例１で得られたＬＲ２０−ＣＭＤＭ（複合体番号１）と、原料ＣＭＤＭ及びＬＲ２０ペプチド単体を、ＨｅＬａ細胞に、Ｆｅとして８００ｕｇ／ｍｌ添加し、１２時間インキュベートした後の細胞に、周波数３５０ｋＨｚおよび磁場強度２１ｍＴの高周波磁場を１時間照射した。その３日後の細胞増殖の様子を図９に示す。染色された部分は生存細胞を示す。
図９の結果から、ＬＲ２０−ＣＭＤＭ複合体は、磁場照射により細胞に損傷を与える傾向があることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
本ペプチドは、遺伝子改変を目的とした核酸類に結合することにより、形質転換ベクターとして利用することができる。
本ペプチドは、また、薬物または薬物包接化合物と結合することにより、目的細胞へのＤＯＳとして利用することができる。
本ペプチドは、さらに、ＭＲＩ撮影および磁場照射による発熱が可能な磁性粒子に結合することにより、分子イメージング、細胞磁気標識、または癌細胞を殺すための高周波磁場処理に利用することができる。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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