(57)【要約】  本発明者は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子が膵臓癌などの癌細胞で高発現していることを見出した。本発明者は、この分子に対するリガンドによる癌細胞に対する増殖抑制効果を測定したところ、当該リガンドが癌細胞増殖抑制効果を有することを見出した。また本発明者は、当該効果がＦＭ４分子を介したシグナルにより生じることを見出した。この知見より、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドが、膵臓癌をはじめとしたニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子が発現亢進する癌の治療や転移の予防に有効であることがわかった。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌治療剤。
【請求項２】
リガンドが配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の癌治療剤。
【請求項３】
癌が膵臓癌である請求項１又は２に記載の癌治療剤。
【請求項４】
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌転移抑制剤。
【請求項５】
リガンドが配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする請求項４に記載の癌転移抑制剤。
【請求項６】
癌が膵臓癌である請求項４又は５に記載の癌転移抑制剤。
【請求項７】
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む細胞増殖抑制剤。
【請求項８】
リガンドが配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする請求項７に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
細胞が膵臓癌細胞である請求項７又は８に記載の細胞増殖抑制剤。
【請求項１０】
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法：
（ａ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、
（ｃ）被検物質を接触させていない場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。
【請求項１１】
以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法：
（ａ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、
（ｃ）ニューロメジンUを接触させた場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。
【請求項１２】
細胞が組換え細胞であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
組換え細胞がＣＨＯ又はＰＡＮＣ１由来の細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞刺激活性が細胞内Ｃａ２＋濃度増加活性である、請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞刺激活性が細胞増殖抑制活性である、請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
細胞刺激活性が細胞のコロニー形成抑制活性である、請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
細胞刺激活性が細胞の細胞運動抑制活性である、請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１０から１７のいずれかに記載の方法より取得されたリガンド。
【請求項１９】
癌の診断方法であって、
標本の生物試料における配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルを検出する工程を含み、
正常組織と比較して、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルが上昇している場合に、癌と診断される方法。
【請求項２０】
検出が、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、それと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらの断片をプローブとして用いて行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドが配列番号：１３に記載の塩基配列を含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
癌が膵臓癌である請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法。
【請求項２４】
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌の転移を抑制する方法。
【請求項２５】
配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、細胞の増殖を抑制する方法。
【請求項２６】
癌治療剤の製造における、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。
【請求項２７】
癌転移抑制剤の製造における、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。
【請求項２８】
細胞増殖抑制剤の製造における、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の診断および治療方法、ならびに細胞増殖抑制剤および抗癌剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロメジンU（neuromedin U ; 以下本明細書中においては「NmU」と指称される。）は、1985年に豚の脊髄より平滑筋収縮活性を指標に単離された23アミノ酸よりなる生理活性ペプチドである（非特許文献１）。強力な子宮収縮作用を有することから、Uterus（子宮）のUをとってニューロメジンUと命名された。しかしながら、構造的に他の生理活性ペプチドとは相同性がなく、その生理作用は、発見から15年間もの間ほとんど解明されていなかった。【０００３】
2000年になり、NmUが、オーファンGPCRであったFM3とFM4の内因性のリガンドであることが複数のグループによって相次いで発表された。これを機に、NmUの生理作用が次第に明らかにされるようになった（非特許文献２〜７）。【０００４】
NmUは脳内、および消化管に発現する。特に脳内においては、視床下部弓状核や室傍核など限局した部位にNmU産生ニューロンが存在している。NmUのラット脳室内投与実験により、暗期と絶食後の摂餌量の減少（非特許文献３）、および、NmU-KOマウスにおける過食、運動量低下、代謝活動低下、不規則な摂餌行動に伴う肥満、高脂血症、脂肪肝が観察されている（非特許文献８）。一方、抗NmU IgG抗体の脳室内投与によって接餌量の優位な増加が観察されている（非特許文献２）。これらの知見から、NmUは摂食抑制とエネルギー消費の亢進をもたらす内因性生理活性ペプチドとして機能していると考えられている。【０００５】
NmUの受容体として、まずNmU1R（FM3/GRP66）がクローニングされ、ついでNmU2R（FM4）が二番目の受容体としてクローニングされた。FM3とFM4の間のアミノ酸配列の相同性は約50％であるが、生体内における両者の発現パターンは大きく異なる。FM3は、ヒト生体内においては小腸、胃、膵臓、心臓など末梢組織で広範な発現が観察されているが、脳での発現は観察されていない。対照的にFM4は、脳内の限局した部位でのみ発現が観察されており、末梢組織では精巣以外の組織では検出されていない（非特許文献９）。【０００６】
NmUは、FM3およびFM4を強制発現させたCHO、HEK-293、およびCOS-7細胞に対して、ナノモル単位の濃度で細胞内カルシウムイオン濃度の上昇を引き起こす。このことから、NmUは受容体を介して細胞内にシグナルを伝達しており、その結果として細胞に何らかの生理活性を誘導していると考えられる。【０００７】
FM3に関しては、ヒト急性骨髄性白血病細胞株（AML）細胞株であるK562細胞で、内在性にNmUとFM3が発現していることが報告されている。またK562を用いた実験により、NmUのFM3を介したオートクラインシグナルがK562細胞に細胞増殖を誘導することが明らかにされている（非特許文献１０）。【０００８】
一方、FM4に関しては、癌細胞などヒト由来細胞株での発現の報告がないため、FM4を介したNmUシグナルによって引き起こされる生理活性に関しては解析されていない。同様に、CHO細胞などを用いたFM4強制発現株によるシグナル解析もなされていない。このように、FM4を介したNmUの細胞に対する生理活性は全く明らかにされていない。【０００９】
なお、本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【非特許文献１】N. Minamino, K. Kangawa and H. Matsuo. Neuromedin U-8 and U-25: Novel uterus stimulating and hypertensive peptides identified in porcine spinal cord. Biochem. Biophys. Res. Commun. 130 （1985） 1078-1085.
【非特許文献２】M. Kojima, R. Harunoa, M. Nakazato, Y. Date, N. Murakami, R. Hanada, H. Matsuo and K. Kangawa. Purification and Identification of Neuromedin U as an Endogenous Ligand for an Orphan Receptor GPR66 （FM3） Biochem. Biophys. Res. Commun. 276, （2000） 435-438.
【非特許文献３】Howard AD, Wang RP, Pong SS, Mellin TN, Strack A, Guan XM, Zeng ZZ, Williams DL, Feighner SD, Nunes CN, et al. Identification of receptors for neuromedin U and its role in feeding. Nature 406 （2000） 70-74.
【非特許文献４】Szekeres PG, Muir AI, Spinage LD, Miller JE, Butler SI, Smith A, Rennie GI, Murdock PR, Fitzgerald LR, Wu HL, et al. Neuromedin U is a potent agonist at the orphan G protein-coupled receptor FM3. J Biol Chem 275 （2000） 20247-20250.
【非特許文献５】R. Fujii, M. Hosoya, S. Fukusumi, Y. Kawamata, Y. Habata, S. Hinuma, H. Onda, O. Nishimura and M. Fujino. Identification of neuromedin U as the cognate ligand of the orphan G protein-coupled receptor FM-3. J. Biol. Chem. 275 （2000） 21068-21074.
【非特許文献６】Hosoya M, Moriya T, Kawamata Y, Ohkubo S, Fujii R, Matsui H, Shintani Y, Fukusumi S, Habata Y, Hinuma S, et al. Identification and functional characterization of a novel subtype of neuromedin U receptor. J Biol Chem 275 （2000） 29528-29532.
【非特許文献７】Raddatz R, Wilson AE, Artymyshyn R, Bonini JA, Borowsky B, Boteju LW, Zhou SQ, Kouranova EV, Nagorny R, Guevarra MS, et al. Identification and characterization of two neuromedin U receptors differentially expressed in peripheral tissues and the central nervous system. J Biol Chem 275 （2000） 32452-32459.
【非特許文献８】Hanada R, Teranishi H, Pearson JT, Kurokawa M, Hosoda H, Fukushima N, Fukue Y, Serino R, Fujihara H, Ueta Y, Ikawa M, Okabe M, Murakami N, Shirai M, Yoshimatsu H, Kangawa K, Kojima M. Neuromedin U has a novel anorexigenic effect independent of the leptin signaling pathway. Nat Med. 10 （2004） 1067-73.
【非特許文献９】Paul J. Brighton, Philip G. Szekeres and Gary B. Willars. Neuromedin U and Its Receptors: Structure, Function, and Physiological Roles. Pharmacol Rev 56 （2004） 231-248
【非特許文献１０】Shetzline SE, Rallapalli R, Dowd KJ, Zou S, Nakata Y, Swider CR, Kalota A, Choi JK, Gewirtz AM. Neuromedin U: A Myb-regulated autocrine growth factor for human myeloid leukemias. Blood. 104 （2004） 1833-40.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドとその用途を提供することを課題とする。より詳細には、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドを用いた癌を治療する新規方法、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドを含む新規な細胞増殖抑制剤および抗癌剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者はニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子が膵臓癌などの癌細胞で高発現していることを見出した。さらに本発明者は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドによる膵臓癌などの癌細胞に対する増殖抑制効果を測定したところ、当該リガンドが癌細胞増殖抑制効果を有すること、及び、当該効果がＦＭ４分子を介したシグナルにより生じることを見出した。また本発明者は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドによる膵臓癌などの癌細胞に対するコロニー形成抑制効果を評価したところ、当該リガンドがコロニー形成抑制効果を有すること、及び、当該効果がＦＭ４分子を介して引き起こされていることを見出した。さらに本発明者は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドによる膵臓癌などの癌細胞に対する細胞運動抑制効果を評価したところ、当該リガンドが細胞の運動抑制効果を有すること、及び、当該効果がＦＭ４分子を介して引き起こされていることを見出した。以上の知見により、本発明者は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドが膵臓癌をはじめとしたニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子が発現亢進する癌の治療・転移の予防に有効であることを見出して、本発明を完成させた。【００１２】
即ち、本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。本発明はより具体的には、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドを有効成分として含有する細胞増殖抑制剤を提供する。更に本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドを有効成分として含有するコロニー形成抑制剤を提供する。本発明はまた、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドを有効成分として含有する細胞運動抑制剤を提供する。本発明はまた、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドを有効成分として含有する癌治療剤を提供する。更に本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドを有効成分として含有する癌転移抑制剤を提供する。【００１３】
本発明における上記薬剤において、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドは、好ましくは天然又は人工のリガンドであり、更に好ましくは天然のリガンドである。また、特に好ましい天然リガンドとしてはヒト由来のリガンドが挙げられ、更に好ましいリガンドとしてはニューロメジンＵ及びニューロメジンＵと実質的に同一のアゴニスト活性を有するペプチドが挙げられる。このようなペプチドの一例として、GenBank番号P48645（配列番号：１４）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド及び当該アミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一のペプチドを挙げることができる。また、当該抗癌剤の対象とする特に好適な癌種として膵臓癌を挙げることができる。【００１４】
別の態様においては、本発明は、癌診断マーカーとしてのニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子の使用を提供する。【００１５】
別の態様においては、本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子を発現する細胞とニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドとを接触させることによりニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子を発現する細胞の細胞増殖を抑制する方法を提供する。更に別の態様においては、本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子を発現する細胞とニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドとを接触させることによりニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子を発現する細胞のコロニー形成を抑制する方法を提供する。また別の態様においては、本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子を発現する細胞とニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドとを接触させることによりニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子を発現する細胞運動を抑制する方法を提供する。【００１６】
上記本発明の方法において、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドは、好ましくは天然又は人工のリガンドである。また、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子を発現する細胞は、好ましくは癌細胞であり、更に好ましくは膵臓癌細胞である。【００１７】
更に別の態様としては、本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を指標とした、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。すなわち本発明は、以下〔１〕〜〔２８〕を提供するものである。
〔１〕配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌治療剤、
〔２〕リガンドが配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする〔１〕に記載の癌治療剤、
〔３〕癌が膵臓癌である〔１〕又は〔２〕に記載の癌治療剤、
〔４〕配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む癌転移抑制剤、
〔５〕リガンドが配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする〔４〕に記載の癌転移抑制剤、
〔６〕癌が膵臓癌である〔４〕又は〔５〕に記載の癌転移抑制剤、
〔７〕配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを有効成分として含む細胞増殖抑制剤、
〔８〕リガンドが配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドであることを特徴とする〔７〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔９〕細胞が膵臓癌細胞である〔７〕又は〔８〕に記載の細胞増殖抑制剤、
〔１０〕以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法：
（ａ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、
（ｃ）被検物質を接触させていない場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程、
〔１１〕以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法：
（ａ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、
（ｃ）ニューロメジンUを接触させた場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程、
〔１２〕細胞が組換え細胞であることを特徴とする〔１０〕又は〔１１〕に記載の方法、
〔１３〕組換え細胞がＣＨＯ又はＰＡＮＣ１由来の細胞であることを特徴とする〔１２〕に記載の方法、
〔１４〕細胞刺激活性が細胞内Ｃａ２＋濃度増加活性である、〔１０〕から〔１３〕のいずれかに記載の方法、
〔１５〕細胞刺激活性が細胞増殖抑制活性である、〔１０〕から〔１３〕のいずれかに記載の方法、
〔１６〕細胞刺激活性が細胞のコロニー形成抑制活性である、〔１０〕から〔１３〕のいずれかに記載の方法、
〔１７〕細胞刺激活性が細胞の細胞運動抑制活性である、〔１０〕から〔１３〕のいずれかに記載の方法、
〔１８〕〔１０〕から〔１７〕のいずれかに記載の方法より取得されたリガンド、
〔１９〕癌の診断方法であって、
標本の生物試料における配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルを検出する工程を含み、
正常組織と比較して、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルが上昇している場合に、癌と診断される方法、
〔２０〕検出が、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、それと機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はそれらの断片をプローブとして用いて行われる、〔１９〕に記載の方法、
〔２１〕ポリヌクレオチドが配列番号：１３に記載の塩基配列を含むことを特徴とする〔２０〕に記載の方法、
〔２２〕癌が膵臓癌である〔１９〕から〔２１〕のいずれかに記載の方法、
〔２３〕配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌を治療する方法、
〔２４〕配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、癌の転移を抑制する方法、
〔２５〕配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドを対象に投与する工程を含む、細胞の増殖を抑制する方法、
〔２６〕癌治療剤の製造における、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用、
〔２７〕癌転移抑制剤の製造における、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用、
〔２８〕細胞増殖抑制剤の製造における、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドの使用。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１ａ】図１ａは、GeneChipによる解析結果を示すグラフである。図１ａは、ヒト組織におけるNmUの発現比較を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、GeneChipによる解析結果を示すグラフである。図１ｂは、ヒト由来の癌細胞株におけるNmUの発現比較を示す。
【図２】図２は、NmUとその受容体遺伝子NmU-RのRT-PCRによる発現解析の結果を示す写真である。図２（Ａ）は、膵臓癌細胞及び正常組織におけるNmU遺伝子、及びg3pdh（インターナルコントロール）遺伝子の発現比較を示す。図２（Ｂ）は、膵臓癌細胞及び正常組織における2種類のNmU-R（FM3，FM4）の発現比較を示す。
【図３】図３は、ＣＨＯ細胞、ＦＭ４発現ＣＨＯ細胞（FM4-CHO）のNmU刺激に対する反応性を細胞内Ca2+濃度変化により解析した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、NmUの細胞増殖への影響を示すグラフである。図４（Ａ）は、ＦＭ４発現ＣＨＯ細胞（FM4-CHO）におけるNmUの細胞増殖への影響を示す。図４（Ｂ）は、2種類の膵臓癌細胞（PANC-1，CAPAN-1）におけるNmUの細胞増殖への影響を示す。
【図５】図５は、ＦＭ４発現ＰＡＮＣ１細胞（FM4-PANC1）におけるＦＭ４遺伝子の発現をRT-PCRにより解析した結果を示す写真である。
【図６】図６は、NmU刺激によるＰＡＮＣ１細胞、ＦＭ４発現ＰＡＮＣ１細胞（FM4-PANC1）のNmUに対する反応性を細胞内Ca2+濃度変化により解析した結果を示すグラフである。
【図７】図７は、ＦＭ４発現ＰＡＮＣ１細胞（FM4-PANC1）のコロニー形成に対するNmUの抑制作用の解析結果を示す写真及びグラフである。図７（Ａ）は、コロニーを示す写真である。図７（Ｂ）は、NmU添加によるコロニー数の変化をグラフ化したものである。
【図８】図８は、ＦＭ４発現ＣＨＯ細胞（FM4-CHO）の形態の変化を示す写真である。
【図９】図９は、NmUの細胞運動に対する影響を示す写真である。図９（Ａ）は、NmU刺激によるＣＨＯ細胞の細胞運動に対する影響を示す写真である。図９（Ｂ）は、NmU刺激によるＦＭ４発現ＣＨＯ細胞（FM4-CHO）の細胞運動に対する影響を示す写真である。
【００１９】
〔発明の実施の形態〕
１．ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）及びこれをコードする遺伝子
天然のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）のアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列は、それぞれGenBank番号NP_064552（配列番号：１２）及びNM_020167（配列番号：１１）に開示されている。本発明においてニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）（以下、本発明のタンパク質と略記する場合がある）とは、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを意味する。配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドとしては、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドの断片が挙げられる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）の断片とは、天然のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質と実質的に同等の機能又は活性を有するポリペプチドを意味する。天然のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質と実質的に同等の機能又は活性としては、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。【００２０】
また、本発明におけるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）と機能的に同等なポリペプチドとして、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと同等の生物学的活性を有するポリペプチドも挙げることが出来る。すなわち、本発明におけるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）と機能的に同等なポリペプチドのより具体的な態様としては、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号：１１に記載の塩基配列を含む核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるタンパク質であって、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質を挙げることができる。【００２１】
あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）などを用いて、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）のアミノ酸に適宜変異を導入することにより、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）と機能的に同等な変異体を調製することができる。また、タンパク質中のアミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）のアミノ酸配列（配列番号：１２）において1もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。【００２２】
アミノ酸残基を改変する場合には、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、及び、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。これらの各グループ内のアミノ酸の置換を保存的置換と称す。あるアミノ酸配列に対する１又は複数個（好ましくは、１〜10個程度、より好ましくは1〜5個程度）のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1984)81:5662-6； Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Res.(1982)10:6487-500; Wang, A. et al., Science(1984)224:1431-3; Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1982)79:6409-13）。このような変異体は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、さらに好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、そして、最も好ましくは少なくとも95％のアミノ酸配列の同一性を有する。本明細書において配列の同一性は、配列同一性が最大となるように必要に応じ配列を整列化し、適宜ギャップ導入した後、元となったタンパク質のアミノ酸配列の残基と同一の残基の割合として定義される。アミノ酸配列の同一性は、上述の方法により決定することができる。なお、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、例えば後述のKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7）によって決定することができる。【００２３】
一方、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡ（以下、本発明のＤＮＡと略記する場合がある）としては、前述したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡ及びそれと機能的に同等なＤＮＡが挙げられる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡの具体的な態様としては、配列番号：１１に記載のＤＮＡが挙げられる。また、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡとしては、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）の断片をコードする塩基配列を含有するものであって、適当な細胞中で発現させた際にニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）と実質的に同質の機能又は活性（例、リガンド結合活性、シグナル伝達作用など）を有するものが挙げられる。このようなＤＮＡのより具体的な態様としては、配列番号：１１に記載のＤＮＡの断片が挙げられる。【００２４】
また本発明におけるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡとして、配列番号：１１に記載の塩基配列を含むＤＮＡと同等の生物学的活性を有するポリヌクレオチドを挙げることも出来る。すなわち、本発明におけるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡと機能的に同等なＤＮＡのより具体的な態様として、配列番号：１１に記載の塩基配列において１若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、および／または付加した塩基配列からなるＤＮＡ、または、配列番号：１１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。【００２５】
本発明のＤＮＡは、上記の要件を備えれば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。適当な細胞中で発現する際に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。【００２６】
本発明のタンパク質及びＤＮＡは、例えば、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）の発現系を用いた受容体結合アッセイを行う際に有用である。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）の発現系を用いた受容体結合アッセイ系を用いることによって、ヒトや哺乳動物に特異的なニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドをスクリーニングすることができる。当該スクリーニングによって得られたリガンドは、各種疾病の予防・治療剤などとして使用することができる。【００２７】
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡ及びそれと機能的に同等なＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列の部分塩基配列を含有する合成ＤＮＡプライマー、及び、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を発現する細胞・組織よりｍＲＮＡを含むＲＮＡ画分を調製したものを鋳型として用いて、直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と指称する。）によって増幅することができる。【００２８】
具体的には、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡ及びそれと機能的に同等なＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１１に記載の塩基配列を含むＤＮＡなどが用いられる。また、当該塩基配列の一又はそれ以上の何れかの塩基に付加、欠失又は置換がされたＤＮＡであっても、適当な細胞中で発現させた際にニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）と実質的に同質の機能又は活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するものであれば好適に使用することができる。又、当該合成ＤＮＡプライマーとしては配列番号：７、８、９及び１０のいずれかに記載の塩基配列を含むＤＮＡを好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。即ち、適当な細胞中で発現させた際にニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）と実質的に同質の機能又は活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡを増幅することができれば、何れの配列であっても好適に使用できる。特定配列を有する合成ＤＮＡプライマーは、半自動化された機械（例えば、PE Applied Biosytems社製Models 392/394など）を用いて固相合成法により作成することができる。【００２９】
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を完全にコードするＤＮＡを当該ＰＣＲ法によって増幅する際には、鋳型としてニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を発現する細胞から取得した複数種のｍＲＮＡを含むＲＮＡライブラリーを好適に使用することができる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を発現する細胞としては特に限定されないが黒質、延髄、橋網様体、脊髄、視床、海馬、視床下部、大脳皮質、精巣の組織から由来する細胞の他、本発明に係る癌細胞株、好ましくは膵臓癌細胞株であるCapan-1、Capan-2、CFPAC1、HPAF II、AsPC、MPANC96、又はsu.86.86等を好適に用いることができる。ＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299, (1979))、AGPC法 (Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. 162, 156-159, (1987))等により全ＲＮＡを調製することができる。このように調製した全ＲＮＡからmRNA Purification Kit (Pharmacia社) 等を使用してｍＲＮＡを精製することができる。また、QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia社)を用いることにより、上記記載のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を発現する細胞からｍＲＮＡを直接調製することもできる。【００３０】
上記に記載したＲＮＡライブラリーの他には当該ＲＮＡライブラリーから作成されたｃＤＮＡライブラリーも好適に用いることができる。得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡライブラリーを合成する。ｃＤＮＡライブラリーの合成は、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社）等を用いて行うことができる。また、5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製)およびPolymerase chain reaction（以下、ＰＣＲ法と指称する）を用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. (1988) 85, 8998-9002, (1988); Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, (1989)) に従い、ｃＤＮＡライブラリーの合成および増幅を行うことができる。そのようなｃＤＮＡライブラリーは市販のｃＤＮＡライブラリーから入手することもできる。【００３１】
また好適なベクターに組み込んで作成したｃＤＮＡライブラリーの中から、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするｃＤＮＡを含有するｃＤＮＡのクローンをハイブリダイゼーションによって選別することができる。当該ハイブリダイゼーションの際には、例えば配列番号：５又は６に記載のオリゴヌクレオチドの他、配列番号：１１に記載されるポリヌクレオチド配列、またはこれと相補的な塩基配列中の連続する少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、より好ましくは少なくとも５０塩基の配列を有し、多くとも２０００塩基、好ましくは多くとも１０００塩基、より好ましくは多くとも５００塩基の配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することが出来る。若しくは配列番号：１１に記載されるポリヌクレオチド配列、またはこれと相補的な塩基配列が好適に用いられる。これらＤＮＡの合成方法は上記記載の方法が好適に使用できる。当該ｃＤＮＡライブラリーの作成方法、当該プローブの標識方法、ハイブリダイゼーションの反応条件、その他当該ハイブリダイゼーションの際に用いる方法は、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載された方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。【００３２】
ハイブリダイゼーションの用語は、ＤＮＡまたはこれに対応するＲＮＡが、溶液中でまたは固体支持体上で、別のＤＮＡまたはＲＮＡ分子と水素結合相互作用により結合することを意味する。このような相互作用の強さは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性によって、種々のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができる。ストリンジェンシーは、塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節することができる。そのようなストリンジェンシーの調節方法は当該技術分野においてよく知られており、上記モレキュラー・クローニングに記載されている。【００３３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、５０％ホルムアミドの存在下で、７００ｍＭのＮａＣｌ中４２℃、またはこれと同等の条件をいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃にて終夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄である。【００３４】
２．癌の診断方法及び診断用組成物
本発明によれば、上記記載に基づき取得されたニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子をコードするＤＮＡを用いて、膵臓癌を始めとする癌細胞を診断することが可能となる。即ち本発明は、被検患者からバイオプシー等により採取された組織片、血液、細胞その他の被検試料を使用して、係る被検試料中の癌細胞の存在を診断する方法を提供する。また本発明は、癌細胞の存在を検出するための組成物、すなわち、癌の診断用組成物を提供する。具体的には、本発明の診断用組成物は、配列番号：１１に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡ）を増幅することができる１組のプライマーを含んでいてもよい。さらに本発明は、配列番号：１１に記載の塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡ）を増幅することができるプライマーを提供する。このようなプライマーとしては、配列番号：１５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このようなプライマーを用いて、上記記載の方法により被検試料から抽出されたＲＮＡ若しくは当該ＲＮＡより調製されたｃＤＮＡをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより、目的とする配列を増幅することが出来る。そして、被検試料中のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）の転写産物の存在または量的変化を検出することができる。このようなＰＣＲ手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、"PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications", Academic Press, Michael , et al., eds. 1990に記載されている。【００３５】
被検試料中のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）の転写産物の存在量またはその変化量をより定量的に測定する方法としては、例えば定量的ＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられる。定量的ＲＴ−ＰＣＲ法は、ＰＣＲの反応に使用する機器であるサーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した機器を用いてＰＣＲでの増幅産物の生成の過程をリアルタイムで検出し、解析する方法である。内部標準（internal standard）を用いた定量的ＰＣＲを行うには、同じ増幅効率のものについて指数関数的な増幅が起こっているところで増幅産物の量を比較することが必要であるが、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法では増幅産物の生成の過程を連続して見ることができるため、より正確な定量が可能である。このような定量的ＰＣＲのキット、測定機器からなるシステムは市販されており（例えばBio-Rad社の"i Cycler iQ Real-Time PCR System"等）、当該システムやキットに付属のマニュアルに従って使用することができる。内部標準としてはg3pdh（グリセルアルデヒド脱水素酵素）やACT（アクチン）をコードするＤＮＡを好適に使用できる。【００３６】
プライマーとして好適に用いるためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：１１に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の、連続する少なくとも１２塩基以上、好ましくは１２−５０塩基、より好ましくは１２−２０塩基の配列を有する。より好ましくは、配列番号：５又は６に記載のオリゴヌクレオチドを挙げることができる。【００３７】
また、細胞内に発現しているＤＮＡおよび／またはＲＮＡを可視的に検出する手法である生体内ハイブリダイゼーション（in situ hybridization）法も好適に使用することができる。組織切片や細胞標本などに、標識したプローブを反応させることによって、組織中の限局された領域で発現しているニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子の発現を当該組織切片や細胞標本上で可視化することが可能となる。【００３８】
生体内ハイブリダイゼーション法に使用するプローブとして好適に用いるためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号：１１に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の、連続する少なくとも１５塩基、好ましくは少なくとも３０塩基、より好ましくは少なくとも５０塩基の配列を有し、かつ、多くとも１０００塩基、好ましくは多くとも５００塩基、より好ましくは多くとも３００塩基の配列を有する。当該プローブは、放射性リンで標識する手法であるhot法によって標識することができる。【００３９】
また、予めニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子をコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅させ、その後に生体内ハイブリダイゼーション法で検出する、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法も好適に使用することができる。ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法で使用するニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子配列に特異的なプライマーとしては、上記記載のオリゴヌクレオチド、即ち配列番号：１１に記載の塩基配列またはこれと相補的な塩基配列中の、連続する少なくとも１２塩基以上、好ましくは１２−５０塩基、より好ましくは１２−２０塩基の配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。具体的には、配列番号：５又は６に記載のオリゴヌクレオチドを挙げることができる。ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ法の手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、"Cell and Molecular Biology, In-Situ PCR Techniques", Wiley, Omar Bagasra & John Hansen, eds. 1997に記載されている。本発明の診断方法の対象となる癌は特に限定されず、肺癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌などの如何なる癌でもよい。好ましい癌の例としては、膵臓癌を挙げることができる。【００４０】
３．ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を発現する組換え細胞
本発明は更に、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を発現する組換え細胞を提供する。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡは、その５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）の発現ベクターは、例えば、（イ）ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡを含むＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）当該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。【００４１】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えば、pBR322、pBR325、pUC19等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、pUB110、pC194、pE194Ts等）、酵母由来プラスミド（例えばpSH19等）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRC/RSV、pcDNAI/Neo、pcDNA3.1、pRC/CMV2、pRc/RSV（Invitrogen社）などが用いられる。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、SRαプロモーター、SV40プロモーター、HIV-LTRプロモーター、CMVプロモーター、HSV-TKプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーターなど、宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。【００４２】
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン（以下、SV40oriと指称する場合がある。）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、dhfrと指称する場合がある。）遺伝子（メソトレキセート（MTX）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Amprと指称する場合がある。）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Neorと指称する場合がある。G418耐性）等が挙げられる。特に、CHO(dhfr-)細胞を用いてdhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、PhoAシグナル配列、OmpAシグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼシグナル配列、サブチリシンシグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、MFαシグナル配列、SUC2シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列などがそれぞれ利用できる。このようにして構築されたニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。【００４３】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、植物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 60, 160, 1996）、HB101（J.Mol.Biol.41, 459, 1969）、C600（Genetics, 39, 4401, 1954）などが用いられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis）、MI114（Gene, 24, 255, 1983）などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22、AH22R-、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913、NCYC2036、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などが用いられる。昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM 細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。当該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、イン・ヴィボ（In Vivo）,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。動物細胞としては、例えば、サル細胞COS-7、Vero、チャイニーズハムスター細胞CHO（J.Exp.Med. 108, 945, (1995)。以下、CHO細胞と指称する。）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 77, 4216-4220, (1980)。以下、CHO (dfhfr-)細胞と指称する。）、マウスＬ細胞、マウスAtT-20、マウスミエローマ細胞、ラットGH3、ヒトFL細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Valle, et al., Nature, 291, 338-340, (1981)）などの両生類細胞が用いられる。植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞をカルス培養すればよい。【００４４】
プラスミドベクターの導入は、ウイルスベクターによる感染の他、原核細胞の内、例えばエシェリヒア属菌の場合は塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法、例えば、バチルス属菌の場合はコンピテント細胞を用いた接触法やエレクトロポレーション法、真核細胞の内、サッカロマイセス・セレビシエ等の場合はＰＥＧ法やエレクトロポレーション法、動物細胞の場合はリン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。【００４５】
４．ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンド
本発明はまた、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドに関する。本発明においてリガンドとは、受容体に対して特異的に結合し、当該受容体を発現する細胞に情報を伝達する能力を有する物質を指称する。狭義の意では体内に本来備わっており細胞において発現する受容体に結合することによって、当該受容体を通じて細胞に情報を伝達する物質である内在性リガンドを示す。しかし本発明のリガンドは、前記の当該受容体を発現する細胞の宿主において内在する天然型の内在性リガンドに限定されるものではない。本発明のリガンドには、本発明の受容体に対してアゴニスティックに作用するリガンドや天然又は人工の化合物またはそれらの塩が含まれる。本発明における塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルフォン酸、ベンゼンスルフォン酸）との塩などが挙げられるがこれらに限定されない。天然に存在するが当該宿主以外の宿主により生産される物質であっても、当該受容体に結合又は接触したときに当該受容体を発現する細胞に情報を伝達する能力を有する物質であれば、また、人工の化合物であっても、当該受容体に結合及び接触したときに当該受容体を発現する細胞に情報を伝達する能力を有する物質であれば、本発明においてリガンドとして使用することができる。【００４６】
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドの例としては、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と同一、または、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と実質的に同一のタンパク質と結合する能力を有するペプチド若しくは低分子化合物、並びにそれらの塩が挙げられる。当該ペプチドの例として具体的には、ニューロメジンＵ及びニューロメジンＵと実質的に同一のアゴニスト活性を有するペプチドを挙げることができる。更に具体的にはニューロメジンＵは、SwissProt番号Ｐ４８６４５（配列番号：１４）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド及びSwissProt番号Ｐ４８６４５（配列番号：１４）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドを挙げることができる。【００４７】
配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドとしては、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列を含有するペプチドが用いられる。上述のように、あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666 、Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500 、Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433 、Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413）。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドペプチドとしては、好ましくはヒトまたはヒト以外の哺乳動物由来のペプチド、さらに好ましくはヒト由来のペプチドが挙げられる。【００４８】
配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドとしては、例えば、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％以上、少なくとも約７５％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、更に好ましくは約９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドが挙げられる。【００４９】
アミノ酸配列の同一性は、比較すべき２つの配列において、同一である残基の数を残基の総数で除し、１００を乗ずることにより表される。標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム、例えば、Gapped BLASTまたはPSI-BLAST(Altschul, et. Al. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, 1997)、BLAST (Altschul et. al., J.Mol.Biol. 215, 403-410, 1990)、及び、スミス−ウォーターマン（Smith-Waterman）(Smith, et.al., J.Mol.Biol., 147, 195-197, 1981)が利用可能である。【００５０】
本発明の配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドが挙げられる。実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用等が挙げられるが、これらに限定されない。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用等の活性が同等（例、約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性以外の活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は、異なっていてもよい。リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができ、例えば、後述の決定方法やスクリーニング方法に従って行うことが出来る。
本発明の配列番号：１４に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドが、生体内での発現した後に切断等の修飾を受けた結果生成されるポリペプチドなどが挙げられる。【００５１】
本明細書におけるポリペプチドおよびタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従い、左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをはじめとするニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドペプチドは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート(−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ2）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキル基などのＣ7-14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などが用いられる。【００５２】
本発明に係るニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドペプチドが、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも、本発明のリガンドペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。さらに、本発明に係るニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドペプチドには、上記したペプチドにおいて、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6アシル基など）で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ2-6アルカノイル基などのＣ1-6 アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチド・糖タンパク質などの複合ペプチドなども含まれる。【００５３】
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドペプチドの具体例としては、例えば、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むヒト由来のポリペプチドなどがあげられるが、当該アミノ酸配列と物質として同一でないポリペプチドであっても、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドとしての機能又は活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するものであれば、本発明において好適に使用することができる。当該リガンドは化学合成法によっても作成することもでき、天然物から抽出することもでき、又は組換えタンパク質としても調製することもできる。【００５４】
組換えタンパク質として調製する場合は、上記１．〜３．に記載の方法を用いて調製することができる。その際に使用されるポリヌクレオチドの具体例としては、配列番号：１４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、配列番号：１３に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このようなポリヌクレオチドの一例としては、配列番号：１５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。配列番号：１５に記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドは、未成熟型のポリペプチドとして配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、組換え細胞内において産生された後、分泌、プロセッシングを受ける。その結果、配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドが産生される。【００５５】
配列番号：１５に記載されるポリヌクレオチドは上記１．に記載の方法にて作成することができる。ＲＴ−ＰＣＲ法又はＰＣＲ法にて作成する場合には、当該合成ＤＮＡプライマーとして、配列番号：１７、１８、１９及び２０のいずれかに記載の塩基配列を含むポリヌクレオチドを好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。即ち、適当な細胞中で発現させた際に配列番号：１４又は１６と実質的に同質の機能又は活性（例、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用など）を有するニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）をコードするＤＮＡを増幅することができる限り、どのような配列を有するポリヌクレオチドであっても、好適に使用できる。特定配列を有する合成ＤＮＡプライマーは、半自動化された機械（例えば、PE Applied Biosytems社製Models 392/394など。）を用いて、固相合成法により作成することができる。【００５６】
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を完全にコードするＤＮＡを当該ＰＣＲ法によって増幅する際には、鋳型として配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現する細胞から取得した複数種のｍＲＮＡを含むＲＮＡライブラリーを好適に使用することができる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を発現する細胞としては特に限定されないが、例えば黒質、延髄、橋網様体、脊髄、視床、海馬、視床下部、大脳皮質、精巣の組織から由来する細胞の他、本発明に係る癌細胞株、好ましくは膵臓癌細胞株であるCapan-1、Capan-2、CFPAC1、HPAF II、AsPC、MPANC96、又はsu.86.86等を好適に用いることができる。【００５７】
５．ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドのスクリーニング
本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に被検物質を接触させ、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）が関与する細胞内のシグナル伝達活性を測定することを特徴とする、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。また本発明は、本発明のリガンドのスクリーニング方法によって得られたリガンドを提供する。本発明のスクリーニング方法は細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤、癌転移抑制剤などのスクリーニングに有用である。【００５８】
本発明のスクリーニング方法の第一の態様としては、以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドのスクリーニング方法が挙げられる。
（ａ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに被検物質を接触させる工程、
（ｂ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドと被検物質の結合を検出する工程、及び
（ｃ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドと結合する被検物質を選択する工程。【００５９】
第一の態様では、まず、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに被検物質を接触させる。本発明の方法における「被検物質」としては、特に制限はなく、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、原核細胞抽出物、真核単細胞抽出物もしくは動物細胞抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。また上記被検物質は必要に応じて適宜標識して用いることができる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識等が挙げられるがこれらに限定されない。【００６０】
本発明において「接触」は、以下のようにして行う。例えば、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドが精製された状態であれば、精製標品に被検物質を添加することにより行うことができる。また、細胞膜に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検物質を添加することにより行うことができる。被検物質がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドが発現している細胞へ導入する、または該ベクターを配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドが発現している細胞の培養液に添加することで行うことも可能である。また、例えば、酵母または動物細胞等を用いた 2ハイブリッド法を利用することも可能である。【００６１】
第一の態様では、次いで、上記配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドと被検物質の結合を検出する。タンパク質間の結合を検出または測定する手段は、例えばタンパク質に付した標識を利用することにより行うことができる。標識の種類は、例えば、蛍光標識、放射標識等が挙げられる。また、酵素ツーハイブリット法や、BIACOREを用いた測定方法等、公知の方法によって測定することもできる。本方法においては、ついで、上記生合成酵素と結合した被検物質を選択する。選択された被検物質の中には、癌を治療するための薬剤等の候補物質が含まれる。また、選択された被検物質を、以下のスクリーニングの被検物質として用いてもよい。【００６２】
また本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。
（ａ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、及び
（ｃ）被検物質を接触させていない場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。
本発明のスクリーニング方法は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に被検物質を接触させた場合における、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）の当該被検物質に対する応答反応、例えば、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質の生理学的若しくは生化学的変化を検出すること、又は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）を発現する細胞に対して被検物質を接触させた場合に当該細胞に対する刺激活性等を測定することにより好適に実施される。【００６３】
本発明のスクリーニング方法は、具体的には、被検物質を細胞膜上に発現したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に接触させ、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定する工程を含む、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法である。細胞膜上に発現したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質は、例えば、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって取得することが出来る。また細胞刺激活性としては、例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+ 遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下などを促進する活性または抑制する活性、細胞増殖抑制活性、コロニー形成アッセイ、細胞運動抑制活性などが挙げられるがこれらに限定されない。
また本発明のスクリーニング方法は、具体的には、被検物質をニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換細胞の抽出物に接触させ、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定する工程を含む、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法である。細胞刺激活性としては、例えば上記の活性が挙げられる。【００６４】
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性の測定には、例えばニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を発現した細胞又は該細胞の抽出物を用いることが出来る。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を発現した細胞としては、前述の組換え型ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞株などが望ましい。形質転換体であるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞は、安定発現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。また、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を発現した細胞の抽出物には、該タンパク質を含む膜画分が含まれる。被検物質としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、これらの化合物の塩、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられるがこれらに制限されない。【００６５】
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性の測定方法に使用されるアッセイ系として、例えば下記（１）〜（９）のアッセイ系が挙げられる。
（１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると、細胞内のＧタンパクが活性化されて、ＧＴＰが結合する。この現象は、受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、ＧＴＰは加水分解されてＧＤＰへと変化する。この際に反応液中にＧＴＰγＳを添加しておくと、ＧＴＰγＳはＧＴＰと同様にＧタンパクに結合するものの、加水分解はされずにＧタンパクを含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したＧＴＰγＳを用いて細胞膜に残存した放射活性を測定することによって、受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。この反応を利用して、本発明の被検物質及びリガンドの、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞に対する刺激活性を測定することができる。この方法は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む細胞を用いるものではなく、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む膜画分を用いるアッセイ法ではあり、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を指標にして細胞刺激活性を測定するものである。本測定法において、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を示す物質は、アゴニストである。（１）に係るアッセイ系において、被検物質を添加しニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性に変化が生じることを観察することによって、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。
当該活性測定法の一例について、より具体的に以下に述べる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 1μM GDP, 0.1％ BSA pH 7.4）で希釈する。希釈率は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質の発現量により異なる。これをFalcon2053に0.2mlずつ分注し、本発明のリガンドあるいは被検物質を加え、さらに終濃度200 pMとなるように[35 S]GTPγSを加える。25℃で1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（50 mM Tris, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 0.1％ BSA, 0.05％ CHAPS pH 7.41, 5ml）を加えて、ガラス繊維ろ紙ＧＦ／Ｆでろ過する。６５℃、３０分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した[35 S]GTPγSの放射活性を測定する。本発明のリガンドを加えた対照の放射活性を１００％、本発明のリガンドを加えなかった対照の放射活性を０％とし、被検物質を加えた場合に測定される放射活性の値に基づいて被検物質によるＧＴＰγＳ結合促進活性に対する被検物質の影響を算出する。【００６６】
（２）ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質の発現細胞は、本発明のリガンドにより刺激されると、細胞内ｃＡＭＰ量が減少する。この反応を利用して、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質の発現細胞における、本発明のリガンドによるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を発現させた種々の動物細胞のｃＡＭＰ産生量は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗ｃＡＭＰ抗体と125Ｉ標識ｃＡＭＰ（ともに市販品）を使用することによって、ＲＩＡで測定することが出来る。あるいは、抗ｃＡＭＰ抗体と標識ｃＡＭＰとを組み合わせた他のＥＩＡ系で測定することもできる。また、抗ｃＡＭＰ抗体をプロテインＡあるいは抗ｃＡＭＰ抗体産生に用いた動物のＩｇＧなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと125Ｉ標識ｃＡＭＰとを使用するＳＰＡ法による定量も可能である（アマシャムファルマシアバイオテク製のキットを使用する）。ｃＡＭＰ産生抑制のアッセイにおいて、フォルスコリンまたはcalcitoninなど細胞内ｃＡＭＰ量を増加させるようなリガンドなどによって細胞内ｃＡＭＰ量を上昇させた後に、本発明のリガンド又は被検物質を添加することによって、本発明のリガンド又は被検物質の単独投与による細胞内ｃＡＭＰ量の産生量に対する抑制の変化を測定することが出来る。この測定を通して、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。
測定方法を、より具体的に以下に記載する。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４細胞；後述の実施例２−２）を２４穴プレートに5x104cell/wellで播種し、４８時間培養する。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーに1 nMの本発明のリガンドあるいは被検物質を添加したものを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。１００μlの２０％過塩素酸を加えて反応を停止させ、次に氷上で１時間置くことにより、細胞内ｃＡＭＰを抽出する。抽出液中のｃＡＭＰ量は、ｃＡＭＰ ＥＩＡキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリン刺激によって産生されたｃＡＭＰ量を１００％とし、1 nMの本発明のリガンドの添加によって抑制されたｃＡＭＰ量を０％として、被検物質SによるｃＡＭＰ産生抑制活性を算出する。ｃＡＭＰ産生促進活性を測定するには、フォルスコリンを添加せずに本発明のタンパク質発現ＣＨＯ細胞に被検物質を添加して産生されたｃＡＭＰを上記の方法で定量する。【００６７】
（３）ＣＲＥ（cAMP response element）を含むＤＮＡを、ピッカジーン・ベイシックベクターまたはピッカジーン・エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、ｃＡＭＰ上昇を伴う刺激は、ＣＲＥを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のｃＡＭＰ量の変動を検出することができる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞にＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞を利用して、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性の測定を行なうことができる。
具体的な測定法を以下に記す。ＣＲＥ−レポーター遺伝子を導入したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞を２４穴プレートに5x103 cell/wellで播種し、４８時間培養する。細胞を0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄する（以下、0.2mM ３−イソブチル−メチルキサンチンと0.05％BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を、反応用バッファーと呼ぶ）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて３０分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、1nMの本発明のペプチドあるいは1 nMの本発明のペプチドおよび試験化合物と2μMフォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーを細胞に加え、３７℃で２４分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定することが出来るが、これらに限定されない。本発明のリガンド又は被検物質とニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性は、ルシフェラーゼによる発光量の抑制を指標に測定することができる。即ち、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量に対する本発明のリガンド又は被検物質による抑制効果を指標として、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に、例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、又はβ−ガラクトシダーゼ等を用いることができるが、これらに限定されない。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は、以下のように市販の測定キットを用いて、容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって測定することが出来るが、これらに限定されない。クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kitによって測定することが出来るが、これらに限定されない。またβ−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができるが、これらに限定されない。【００６８】
（４）ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞は、本発明のリガンドによる刺激の結果、アラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。あらかじめ、放射活性を有するアラキドン酸を細胞に取り込ませておくことによって、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を、細胞外に放出された放射活性を指標に測定することができる。即ち、本発明のリガンド又は被検物質を添加することによって、アラキドン酸代謝物放出活性に対する影響を調べることにより、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性の測定法について、以下に具体的に述べる。本発明のタンパク質発現ＣＨＯ細胞を２４穴プレートに5 x 104 cell/wellで播種し、２４時間培養後、[3 H]アラキドン酸を0.25μCi/wellとなるよう添加する。[3 H]アラキドン酸添加16時間後、細胞を0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄し、各wellに0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)に溶解した終濃度10 nMの本発明のペプチドあるいは10 nMの本発明のリガンド又は被検物質を含むバッファー500 μlを添加する。以降、0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)を反応用バッファーと呼ぶ。３７℃で６０分間インキュベートした後に、反応液400 μlをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した[3 H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーによる培地中の[3 H]アラキドン酸代謝物の量を０％とし、10 nMの本発明のリガンドを添加したときの培地中の[3 H]アラキドン酸代謝物の量を１００％として、被検物質を添加したときの培地中の[3 H]アラキドン酸代謝物の量を測定することにより、被検物質によるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。【００６９】
（５）ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞は、本発明のリガンドにより刺激されることによって、細胞内のＣａ2+ イオン濃度が上昇する。これを利用することによって、本発明のリガンド又は被検物質のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性に対する影響を調べることができる。
具体的には、後述の実施例２−３に準じた方法で調べることができる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞を、2 x 104 cells/wellになるように96 well plate（蛍光測定用黒色プレート）に撒き一晩培養する。培地を除去した後、50 μl/wellでFluo 4 AM sol’n [2% FCS, 3μM Fluo 4 AM (Molecular PROBES社) を含むassay buffer (2 mM HEPES, 1.5 mM probenecid in HBSS)] を添加する。遮光して37℃、30分インキュベートした後、細胞をassay bufferで3回洗浄する。そして、2.5μM濃度でNmU（フナコシ社）を含有するassay bufferを添加し、490 nm励起光での細胞内Ca2+依存蛍光トレースを、蛍光測定解析プレートリーダー（Fusion; PerkinElmer社）でモニターする。本発明のリガンド又は被検物質の添加による蛍光強度の上昇を観察することによって、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。別の態様では、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞に、細胞内Ｃａ2+イオンの上昇によって発光するタンパク質の遺伝子（例、aequorinなど）を共発現させておき、細胞内Ｃａ2+イオン濃度の上昇によって、当該タンパク質の遺伝子（例、aequorinなど）がＣａ2+結合型となり発光することを利用する。本発明のリガンド又は被検物質の添加の有無によって変化する発光強度の相違を測定することにより、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することが出来る。【００７０】
（６）細胞内Ｃａ2+イオンの上昇によって発光するタンパク質の遺伝子（例、aequorinなど）の他、細胞内Ｃａ2+イオンの上昇に応答する転写エレメント（例：ＴＲＥ（TPA response element））の下流にレポーター遺伝子を挿入したDNAを共発現する方法も、好適に使用することができる。即ち、ＴＲＥ（TPA response element）を含むＤＮＡを、ピッカジーン・ベイシックベクターまたはピッカジーン・エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））のルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、これをＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターとする。ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクションした細胞において、細胞内Ｃａ2+イオン濃度上昇を伴う刺激は、ＴＲＥを介したルシフェラーゼ遺伝子発現とそれに引き続くルシフェラーゼタンパク質の産生を誘導する。つまり、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウムイオン量の変動を検出することができる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞にＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクターをトランスフェクトした細胞に、本発明のリガンド又は被検物質を投与し、発光量の増加を観察することにより、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性の測定を行なうことができる。
具体的な測定方法を以下に記す。ＴＲＥ−レポーター遺伝子を導入したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞を、２４穴プレートに5 x 103cell/wellで播種し、４８時間培養する。細胞を0.05％ BSAと20mM HEPESを含むハンクスバッファー(pH7.4)で洗浄した後、10 nMの本発明のリガンドあるいは被検物質を添加し、３７℃で６０分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定することが出来るが、これらに限定されない。本発明のリガンドの投与により、細胞内Ｃａ2+ イオン濃度が上昇し、発光量が増加することを利用する。発明のリガンドの非添加反応バッファーを用いたときの発光量を０％とし、10 nMの本発明のリガンドを添加したときの発光量を１００％として、被検物質を添加したときの発光量を測定することにより、本発明のリガンド又は被検物質によるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ以外に例えばアルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼあるいはβ−ガラクトシダーゼを用いることもできる。これらのレポーター遺伝子の遺伝子産物の酵素活性は、以下のように市販の測定キットを用いて容易に測定することができる。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530によって測定することが出来るが、これに限定されない。クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kitによって測定することが出来るが、これに限定されない。β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEによって測定することができるが、これに限定されない。【００７１】
（７）本発明によれば、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞の増殖抑制効果を指標に、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞の増殖抑制の評価としては、通常の細胞増殖活性測定法を好適に用いることができる。即ち、(a) 血球計算板上で細胞数の計測を行う方法、(b) ＤＮＡ複製の前駆体であるチミジンを放射標識したものである[3H]-チミジンを培養細胞に添加する。一定時間経過後、培地中の遊離[3H]-チミジンを洗浄除去した後に、細胞内に取り込まれた放射量を、液体シンチレーションカウンターを用いて測定する方法、(c) 細胞のミトコンドリア内のコハク酸脱水素酵素により、テトラゾリウム塩化合物が特定の波長の発色を呈する化合物に変換される現象を利用する方法（当該発色の強度を分光光度計によって測定する方法）、などを好適に使用することができる。(a)の変法として使用される色素排除法は、細胞数計測の際にトリパンブルーなどの生細胞によって細胞外へ排出される性質を有する化合物を添加することによって、単なる細胞数のみを測定するのではなく、生細胞又は死細胞の別を検出することが可能となる方法である。(c)のテトラゾリウム塩の具体例としては、本願実施例２−４で使用されるＷＳＴ−８（特許番号第2757348号）の他、ＷＳＴ−１（Biochem., 179, 1-7 (1989)）、ＭＴＴ（J. Immunol. Methods 65, 55-63, (1983)）、ＭＴＳ（Cancer Commun. 3, 207-212, (1991)）、ＸＴＴ（Cancer Res. 48, 4827-4833, (1988)）などの化合物が好適に使用できる。
具体的には、以下のような方法を用いて、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞の増殖抑制効果を指標に、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。本発明のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞を９６穴プレートに播いて、４８時間後の細胞に、ＷＳＴ−８を主成分として含有する呈色試薬（Cell Count Reagent SF, ナカライテスク社）を加え、プレートリーダーにて呈色強度を測定する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーを添加したときの発色値を０％とし、本発明のリガンドを添加したときの発色値を１００％として被検物質を添加したときの発色値を測定することにより、被検物質によるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。【００７２】
（８）更に本発明によれば、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞のコロニー形成抑制効果を指標に、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。細胞の悪性形質転換はジェネティックやエピジェネティックの変化により誘導され、成長抑制因子のシグナルに関係なく独自で成長する細胞集団を産生し、細胞外の成長因子をほとんど必要とせずに成長する。具体的には、癌細胞などの形質転換細胞は、正常細胞と異なり、接着せずに増殖する（足場非依存性増殖）ことが可能となる。即ち、基質に付着して増殖する正常細胞は、軟寒天中では足場が無いために増殖できないのに対して、癌細胞などの形質転換細胞は足場非依存性増殖（Anchorage independent growth）が可能であることから、軟寒天中でコロニー形成能を有する。即ち、被検ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞の軟寒天中におけるコロニー形成活性を指標に、当該細胞の形質転換の程度及び転移能などを評価することができる。更に、当該測定に使用する軟寒天中のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンド又は被検物質の有無に基づくコロニー形成能を測定することにより、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性として評価することができる。
具体的には、以下のような方法を用いて、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞のコロニー形成能を指標に、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。即ち、1.5 ml/well ずつbase agar（0.5% agar, 1 x MEM, 10% FCS）を添加した6 well plateに、PANC1細胞、あるいは、FM4-PANC1細胞をtop agar（0.35% agar, 1 x MEM, 10% FCS）中に本発明のリガンド又は被検物質の存在下、又は非存在下で0.5 x 104 cells/wellになるように1.5 ml/wellで各wellに添加する。１ヶ月間培養後、soft agar中におけるコロニー形成細胞数を顕微鏡下で測定する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーを添加したときのコロニー数を１００％とし、本発明のリガンドを添加したときのコロニー数を０％として、被検物質を添加したときのコロニー数を測定することにより、被検物質によるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。【００７３】
（９）また、本発明によれば、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞の細胞運動抑制効果を指標に、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。正常細胞の場合、増殖により細胞同士が接触したときに運動阻止（contact inhibition）が起こり、細胞が密に増殖すると互いに平行に並ぶ。これに対して、ジェネティックやエピジェネティックの変化により誘導される悪性形質転換細胞においては、細胞同士の接触による運動阻止が起こらず（loss of contact inhibition）、お互いに重なり合った不規則な配列を示す増殖像を示す。こうした細胞運動の接触阻止現象を評価することによって、被検細胞の形質転換の程度及び転移能などを評価することができる。即ち、被検ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞の細胞運動活性を指標に、当該細胞の形質転換の程度及び転移能などを評価することができる。更に、リガンド又は被検物質の有無に基づく細胞運動活性を検出することにより、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を評価することができる。
具体的には、以下のようなwound healing assayなどの方法を用いて、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞の細胞運動活性を指標に、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定することができる。即ち、シャーレ中でコンフルエントにさせたニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞をピペットチップの先で傷つけ、細胞間に一定の隙間を作る。細胞をPBSで２回洗浄後、本発明のリガンド又は被検物質の存在下又は非存在下で培養を行う。同様にニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を発現しない細胞を対照として同じ条件下で培養を行う。２４時間後に、細胞間の隙間へと移動した細胞の存在を顕微鏡で観察し、その数を計測する。本発明のリガンドの非添加反応バッファーを添加したときの細胞数を０％とし、本発明のリガンドを添加したときの細胞数を１００％として、被検物質を添加したときのコロニー数を測定することにより、被検物質によるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を算出することができる。【００７４】
６．ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対するリガンドの拮抗試験スクリーニング
また本発明は、以下の（ａ）から（ｃ）の工程を含む、配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドに対するリガンドのスクリーニング方法を提供する。
（ａ）配列番号：１２に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はそれと機能的に同等なポリペプチドを発現する細胞又は該細胞抽出物に、被検物質を接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞又は該細胞抽出物に対する被検物質の細胞刺激活性を測定する工程、及び
（ｃ）ニューロメジンUを接触させた場合と比較して、上記細胞刺激活性を変化させた被検物質を選択する工程。
本発明に係るスクリーニングの別の好ましい態様としては、（i）ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に本発明のリガンドを接触させた場合と（ii）上記したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に本発明のリガンドおよび被検物質を接触させた場合における、例えば当該ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）に対する本発明のリガンドの結合量などを測定して比較することにより、拮抗試験スクリーニング法としても好適に実施される。係るスクリーニング法により見出された化合物は、上記細胞刺激活性を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法と同様の方法に基づいて、更に当該刺激活性を評価することができる。【００７５】
上記の拮抗試験スクリーニング法の一態様としては、以下の工程を含む、本発明のリガンドとニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
（１）標識した本発明のリガンドを、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に接触させる工程、
（２）標識した本発明のリガンドおよび被検物質を、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に接触させる工程、および
（３）上記（１）および（２）のそれぞれにおいて、標識した本発明のリガンドの本発明のタンパク質に対する結合量を測定し、上記（１）および（２）における結合量を比較する工程。
本発明の拮抗試験スクリーニング法の一態様としては、以下の工程を含む、本発明のリガンドとニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
（１）標識した本発明のリガンドを、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含有する細胞または当該細胞の膜画分に接触させる工程、
（２）標識した本発明のリガンドおよび被検物質を、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含有する細胞または当該細胞の膜画分に接触させる工程、および
（３）上記（１）および（２）のそれぞれにおいて、標識した本発明のリガンドの当該細胞または当該膜画分に対する結合量を測定し、上記（１）および（２）における結合量を比較する工程。
本発明の拮抗試験スクリーニング法の一態様としては、以下の工程を含む、本発明のリガンドとニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法が挙げられる。
（１）標識した本発明のリガンドを、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に接触させる工程、
（２）標識した本発明のリガンドおよび被検物質を、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に接触させる工程、および
（３）上記（１）および（２）のそれぞれにおいて、標識した本発明のリガンドのニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対する結合量を測定し、上記（１）および（２）における結合量を比較する工程。【００７６】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下に記載する。まず、本発明のスクリーニング方法に用いるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質としては、上記のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含有するものであれば何れのものであってもよい。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、組換え体を用いて大量発現させたニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質などが適している。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を製造するには、前述の方法などが用いられる。本発明のスクリーニング方法において、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含有する細胞あるいは当該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含有する細胞を用いる場合、当該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法は公知の方法に従って行うことができる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含有する細胞としては、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を発現した宿主細胞が挙げられる。当該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などがあげられる。膜画分としては、細胞を破砕した後、公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（５００ｒｐｍ〜３０００ｒｐｍ）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（１５０００ｒｐｍ〜３００００ｒｐｍ）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。当該膜画分中には、発現した本発明のタンパク質と細胞由来のリン脂質や膜タンパク質などの膜成分が多く含まれる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含有する細胞や膜画分中のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質の量は、１細胞当たり１０3 〜１０8 分子であるのが好ましく、１０5 〜１０7 分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定することが可能である。【００７７】
本発明のリガンドとニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする前記の拮抗試験スクリーニングを実施するためには、適当なニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質画分と、標識した本発明のリガンドが用いられる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む画分としては、天然型のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識した本発明のリガンドとしては、例えば〔3 Ｈ〕、〔125 Ｉ〕、〔14 Ｃ〕、〔35 Ｓ〕などで標識された本発明のリガンドなどを利用することができる。特に、ボルトン−ハンター試薬を用いて公知の方法で調製した本発明のリガンドの標識体を利用することもできる。具体的には、本発明のリガンドとニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、まずニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することにより受容体標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなど、リガンドと受容体との結合を阻害しない任意のバッファーを使用することが出来る。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明のタンパク質や本発明のペプチドの分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１ｍｌ〜１０ｍｌの当該受容体溶液に、一定量（５０００ｃｐｍ〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のリガンドを添加し、同時に１０-4 〜１０-1μＭの被検物質を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃から５０℃、望ましくは４℃から３７℃で２０分から２４時間、望ましくは３０分から３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ0）から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる被検物質を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。また、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質と本発明のリガンドとの結合を測定する方法として、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を用いることもできる。この方法では、本発明のリガンドを装置に添付のプロトコールに従ったアミノカップリング法によってセンサーチップに固定し、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含有する細胞、ニューロ��ジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体から精製したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質またはニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む膜画分、または精製したニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質またはニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を含む膜画分および被検物質を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を毎分２−２０μｌの流量で通過させる。センサーチップ上の本発明のリガンドとニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質とが結合することによって生じる表面プラズモン共鳴の変化を、共存する被検物質が変化させることを観察することによって、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質と本発明のリガンドとの結合を変化させる化合物のスクリーニングを行なうことができる。この方法は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質をセンサーチップに固定し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび被検物質を含むリン酸バッファーまたはトリスバッファーなどの緩衝液をセンサーチップ上を通過させる方法を用いても、同様に測定することができる。被検物質としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられるがこれらに限定されない。【００７８】
上記拮抗試験スクリーニング法により選択された本発明のリガンドについてそのニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を介した細胞刺激活性を測定するには、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を発現した細胞が好適に用いられる。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を発現した細胞としては、前述の組換え型ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞株などが望ましい。形質転換体であるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞は、安定発現株でも一過性発現株でも構わない。また、動物細胞の種類は上記と同様のものが用いられる。被検物質としては、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられるがこれらに限定されない。【００７９】
７．ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）が関与する膵臓癌を始めとする癌の治療および/または予防剤
別の観点においては、本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する医薬組成物を提供する。又本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する薬剤を提供する。本発明の薬剤としては、細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤、癌転移抑制剤などが挙げられる。本発明の薬剤は、癌を罹患している対象、羅患した癌を手術により切除した対象または罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。対象としては、例えば哺乳動物（例えばヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、サル等）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明において「抑制」とは、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドによって、当該受容体の生物学的活性が減少することを意味する。本発明においては、その減少の程度は制限されるものではなく、生物学的活性の一部でも減少すれば、本発明における「抑制」の意味に含まれる。【００８０】
本発明において、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する細胞増殖抑制剤は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含む細胞増殖を抑制する方法、または、細胞増殖抑制剤の製造におけるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。更に本発明において、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有するコロニー形成抑制剤は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含むコロニー形成を抑制する方法、または、コロニー形成抑制剤の製造におけるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。また本発明において、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する細胞運動抑制剤は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含む細胞運動を抑制する方法、または、細胞運動抑制剤の製造におけるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。【００８１】
本発明において、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する癌治療剤は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含む癌を予防または治療する方法、または、癌治療剤の製造におけるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。更に本発明において、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する癌転移抑制剤は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを対象に投与する工程を含む癌の転移を予防または治療する方法、または、癌転移抑制剤の製造におけるニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドの使用と表現することもできる。本発明において「転移」とは、細胞が本来コロニーを形成していた原発部位から離れて異なる別の部位に移動して別のコロニーを形成することをいい、生体内及び生体外で観察される現象を指称する。本発明の癌治療剤または癌転移抑制剤が対象とする癌は特に限定されず、肺癌、大腸癌、膵臓癌、胃癌などの如何なる癌でもよい。好ましい癌の例としては、膵臓癌を挙げることができる。【００８２】
本発明において、「ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを有効成分として含有する」とは、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを主要な活性成分として含むという意味であり、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４)タンパク質に対するリガンドの含有率を制限するものではない。【００８３】
本発明の医薬組成物（例えば、細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤及び癌転移抑制剤。以下同様。）に含有されるリガンドはニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質と結合し細胞刺激活性を有する限り特に制限はなく、本明細書中に記載されたリガンドが例示できる。【００８４】
本発明のリガンドは、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等として経口的に、または水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る溶媒との無菌性溶液、もしくは懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明のリガンドを生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。錠剤、カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸等のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤等が用いられる。【００８５】
調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油等のような天然産出植物油等を溶解または懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等）等が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノール等）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０等）等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等と併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール等）、酸化防止剤等と配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。【００８６】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えばヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。本発明のリガンドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、一般的に成人（６０ｋｇとして）においては、一日につき本発明のリガンドを約１ｍｇ〜１０００ｍｇ、好ましくは約５〜５００ｍｇ、より好ましくは約１０〜２００ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、本発明のリガンドの１回投与量は例えば齢数、症状などの相違、投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、本発明のリガンドを注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき当該ペプチドを約１〜１０００ｍｇ程度、好ましくは約５〜２００ｍｇ程度、より好ましくは約１０〜１００ｍｇ程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。【００８７】
上記記載の通り、本発明の医薬組成物の投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによって実施できるが、特に好ましくは非経口投与による投与方法である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。【００８８】
また本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞とニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドとを接触させる工程を含む、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞の増殖を抑制する方法を提供する。
また本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞とニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドとを接触させる工程を含む、コロニー形成を抑制する方法を提供する。
また本発明は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞とニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドとを接触させる工程を含む、細胞の転移を抑制する方法を提供する。
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドは、本発明のニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドとして上述したとおりである。ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドが結合する細胞は、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質が発現している細胞であれば特に限定されないが、好ましくは癌細胞であり、より好ましくは膵臓癌細胞である。【００８９】
本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞の培養液にニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを添加することにより行われる。この場合において、添加されるリガンドの担体としては、溶液又は凍結乾燥等により得られる固体等の担体が適宜使用できる。水溶液として添加される場合にあっては純粋にリガンドのみを含有する水溶液であってもよいし、例えば軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等などにより例示される界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。添加する濃度は特に限定されないが、培養液中の最終濃度として、好ましくは1 pg/mlから1 g/mlの範囲であり、より好ましくは1 ng/mlから1 mg/mlであり、更に好ましくは1 μg/mlから1 mg/mlが好適に使用されうる。【００９０】
また本発明において「接触」は、別の態様では、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や、内在的にニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質を発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。投与方法は経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の薬剤（細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、細胞運動抑制剤、癌治療剤および癌転移抑制剤）が全身または局部的に投与され得る。また、被験動物の齢数、症状により適宜投与方法を選択することができる。水溶液として投与される場合にあっては純粋にリガンドのみを含有する水溶液であってもよいし、例えば上記記載の界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等を含む溶液であってもよい。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、対象あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明のリガンド投与量はこれらの投与量に制限されるものではない。【００９１】
ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドの接触によってニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞に引き起こされた細胞増殖抑制活性を、試験管内において評価又は測定する方法としては、例えば、上記２（７）に記載の方法が好適に使用される。また、生体内で細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法としては、例えばニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被検リガンドを含む担体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより、細胞増殖抑制活性と規定することができる。試験管内での評価と同様に、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドを含まない担体を投与し、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンド投与群における腫瘍の大きさが、対照であるリガンド非投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さいか否かによって、細胞増殖抑制活性を判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与されたリガンドによる細胞増殖抑制活性の評価・測定に当たって被検動物中のＴリンパ球の関与を除くことができる。【００９２】
更に、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドの接触によって、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞に引き起こされたコロニー形成抑制活性を試験管内において評価又は測定する方法としては、例えば、上記２（８）に記載の方法が好適に使用される。また、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質に対するリガンドの接触によってニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）タンパク質発現細胞に引き起こされた細胞運動抑制活性を試験管内において評価又は測定する方法としては、例えば、上記２（９）に記載の方法が好適に使用される。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００９３】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に記載された態様に限定されるものではない。【００９４】
1. NmU-R2 （FM4）の膵臓癌における発現
1-1. Gene chip を用いたヒトNmU遺伝子発現解析
肺癌や膵癌といった癌組織で特異的に発現亢進する遺伝子を探索するため、GeneChip U133A（アフィメトリクス社製）を用いて、正常組織、癌組織及び癌細胞株の網羅的遺伝子発現解析を実施した。
はじめに、表１及び表２に示す正常組織、癌組織及び癌細胞株からISOGEN（ニッポンジーン社製）を用いて常法により全RNAを調製した。そしてそれらの全RNAを各10 μgずつ用い、GeneChip U-133A（アフィメトリクス社製）に供しExpression Analysis Technical Manual（アフィメトリクス社製）に準じて遺伝子発現解析を行った。全遺伝子の発現スコアの平均値を100とし、癌組織あるいは癌細胞において発現が亢進する遺伝子の探索を行った。
【表１】
2008029601.tif 000002
【表２】
2008029601.tif 000003
【００９５】
その結果、ヒトNmU遺伝子（プローブID： 206023_at HG-U133A）が、調査した正常組織においては顕著な発現が認められず、肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、ならびに膵癌組織で発現亢進していた。また、NmU遺伝子が100以上のスコアを示す癌細胞株は、脳腫瘍（U251）、食道癌（TE2）、胃癌細胞株（AGS、KATOIII、MKN45、2M）、大腸癌細胞株（DLD1、hCT116、LOVO、SW480）、膵癌細胞株（Capan1、KLM1、PK59）、肺癌細胞株（Lu130、H1395、H1648、H2347）及び子宮頸癌（Hela）であった（図１（Ａ）及び（Ｂ））。
以上より、ヒトNmU遺伝子（プローブID： 206023_at HG-U133A）は正常組織で発現量が非常に低いのに対し、肺癌、大腸癌、膵癌、胃癌及び腎癌と広範な癌種で発現亢進していることが明らかとなった。【００９６】
1-2. RT-PCRによるNmU, およびその受容体遺伝子の発現解析
GeneChip 解析によりNmUの発現が複数の膵臓癌患者で発現上昇していることを見出した。そこで、実際の膵臓癌における遺伝子発現を詳細に解析することを目的として、NmUおよびその受容体であるFM3およびFM4の膵臓癌での発現について、RT-PCRにより解析を行った。
具体的な手法は以下に記すとおりである。まず12種類の膵臓癌細胞株（BxPC-3, CFPAC-1, PANC-1, HPAC, MIApaca, Capan-1, Capan-2, HPAF II, AsPc, HS766T, Mpanc96, Su.86.86 ; いずれもAmerican Type Culture Collection （ATCC）より購入）を、ATCCの指南書記載の培養条件下で培養した。各細胞をTrizol （Invitrogen） で溶解し、細胞よりtotal RNAを調整した。このRNAより添付のマニュアルに従って cDNA を合成し （SuperScript II ファーストストランドシステム；invitogen）、得られた膵臓癌細胞株由来cDNAと、ヒト各種正常臓器cDNA （human Marathon-Ready cDNA; Clontech） を鋳型にして、EX Taq polymerase（タカラ）によりRT-PCRを行った。各遺伝子の増幅条件と使用したプライマーセットを以下に示す。
NmU （94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒：30サイクル）
NmU-1 : CTCAGGCATCCAACGCACTG（配列番号：１）
NmU-2 : CTGACCTTCTTCCATTCCGTG（配列番号：２）
FM3 （94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒：34サイクル）
NmUR1-1 : GCTATTTCCGCACGCTACTGT（配列番号：３）
NmUR1-2 : GCCCAATGAGCAGGTAGAGC（配列番号：４）
FM4 （94℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒：34サイクル）
NmUR2-1 : GGGCTGCTACTTCAAGACGG（配列番号：５）
NmUR2-2 : CCCTTCATCTGCCTCAAGAGA（配列番号：６）【００９７】
RT-PCR解析の結果、NmUの発現は12株中10株で認められた（図２（Ａ））。受容体の１つであるFM4の発現は、正常抹消組織ではまったく発現が認められない一方で、膵臓癌細胞株においては12株中7株という高い頻度で発現が確認された。もう一方の受容体であるFM3は、肝臓、膵臓、脾臓、精巣、小腸などの末梢組織で発現が観察されたものの、膵臓癌細胞株での発現はまったく見出されなかった（図２（Ｂ））。
このようにFM4遺伝子が膵臓癌で亢進されているという知見は新規であり、FM4が膵臓癌に対する分子標的治療薬の標的分子として有用であることが強く示唆された。【００９８】
2. NmU-R2 （FM4）を介するNmUの増殖抑制効果
2-1. FM4発現ベクターの構築
FM4発現ベクターを構築するため、まずFM4遺伝子のクローニングを以下のとおり行った。膵臓癌細胞株（Capan-1）由来cDNAを鋳型にしてPyrobest Taq polymerase（タカラ）以下の条件でRT-PCRを行い、全長FM4遺伝子をクローニングした。
FM4-UP ：ATGTCAGGGATGGAAAAACTTC（配列番号：７）
FM4-LOW ：TCAGGTTTTGTTAAAGTGGAAGC（配列番号：８）
（94℃  30秒、59℃  30秒、72℃  60秒：32サイクル）【００９９】
次に、得られたPCR産物を鋳型にして、以下の条件で再度PCRを行い、5’端、3’端にそれぞれEcoRI、NotI切断配列が付加された全長FM4 cDNA断片を得た。
FM4-ECO ：AAAGAATTCCACCATGTCAGGGATGGAAAAACTTCAGAA（配列番号：９）
FM4-NOT ：TTTGCGGCCGCTCAGGTTTTGTTAAAGTGGAAGCTTT（配列番号：１０）
（94℃  30秒、68℃  30秒、72℃  60秒：、20サイクル）
これをEcoRI、NotIで切断し、同じくEcoRI、NotIで切断した動物細胞用発現ベクター（pMCN）に挿入し、FM4発現ベクター（pMCN-FM4）を構築した。【０１００】
2-2. FM4発現CHO細胞株の樹立
pvuIで切断することにより直鎖化したFM4発現ベクター（pMCN-FM4）15 μgを、1.5 kV, 25 μFDでCHO細胞にエレクトロポレーション（Gene Pulser ; BioRad）により導入した。細胞を500 μg/ml のG418を含む培地で培養し、G418耐性細胞をピックアップした。これら細胞にNmUを添加し、細胞内Ca2+濃度の上昇を指標にNmUに反応する細胞株を選抜した。【０１０１】
2-3. 細胞内カルシウム濃度の測定
細胞をトリプシンではがし、2 x 104 cells/wellになるように96 well plate（蛍光測定用黒色プレート）に撒き一晩培養後、細胞内カルシウム測定に使用した。細胞内カルシウム濃度測定は以下のとおり行った。【０１０２】
培地を除いた後、50 μl/wellでFluo 4 AM sol’n [2% FCS, 3μM Fluo 4 AM（Molecular PROBES）in assay buffer（2mM HEPES, 1.5mM probenecid in HBSS）]を添加した。遮光して37℃、30分インキュベートした後、細胞をassay bufferで3回洗浄した。そして、2.5 μM のNmU（フナコシ）を含有するassay bufferを添加し、490nm励起での細胞内Ca2+依存蛍光トレースを蛍光測定解析プレートリーダー（Fusion; PerkinElmer社）でモニターした。
樹立したFM4-CHO細胞株は、NmUで刺激することにより、速やかに細胞内Ca2+濃度が上昇した（図３）。このことから、得られた細胞は、FM4を介してNmUシグナルが細胞内に伝わっていることが確認された。【０１０３】
2-4. NmUの増殖抑制効果の解析
NmU刺激で細胞内Ca2+濃度が上昇することを指標にスクリーニングしたFM4発現CHO細胞株（FM4-CHO）を用いて、FM4を介したNmU signalingについて解析を行った。
FM4-CHO細胞を、2 x 103 cells/wellで96 well plateに撒種した。翌日、各wellにNmUを各濃度(0.096〜60 μM）で添加し培養を行い、４８時間後にWST-8 assay（Cell counting kit-8，同仁化学）により生細胞数の数を解析した。その結果、NmUは低濃度で、FM4-CHOに対して増殖を抑制した（図４Ａ）。【０１０４】
次に、FM4を高発現している膵臓癌細胞株に対しても、NmUが増殖抑制効果を示すか検証を行った。RT-PCR解析でFM4遺伝子の発現が高いCapan-1、および、FM4遺伝子の発現が検出されないPANC-1を選び、これらの細胞を96 well plateに撒いた。翌日、各wellにNmUを0.096〜60 μMで添加し、72時間後に細胞数を測定した。その結果、PANC-1の増殖に対してNmUは全く作用しなかったのに対し、FM4遺伝子の発現が高いCapan-1においてNmUの増殖抑制効果が認められた（図４Ｂ）。【０１０５】
3. NmU-R2 （FM4）を介するNmUのコロニー形成抑制効果
3-1. FM4発現CHO細胞株の樹立
膵臓癌細胞株PANC-1のFM4強制発現細胞株の樹立を以下のとおり行った。pvuIで切断し直鎖化したFM4発現ベクター（pMCN-FM4）15μgを1.5 kV, 25 μFDでCHO細胞にエレクトロポレーション（Gene Pulser ; BioRad）により導入した。細胞を400 μg/ml のG418を含む培地で培養し、G418耐性細胞７クローンをピックアップした。これらの細胞より total RNAを精製し、cDNAを合成した。得られたcDNAを鋳型にしてFM4の発現をRT-PCRにより解析した（図５）。クローン＃６がFM4遺伝子を最も発現していたので、この株をFM4発現PANC-1（FM4-PANC1）として以下の実験に用いた。【０１０６】
3-2. FM4発現PANC1細胞に対するNmUのコロニー形成抑制効果
得られたFM4発現PANC1細胞（FM4-PANC1）がNmUシグナルを細胞内に伝達することを確認するため、NmU添加により細胞内Ca2+濃度の上昇が認められるかを解析した。その結果、FM4-PANC1においてNmU（1μΜ）の添加によって細胞内Ca2+濃度の上昇が確認された（図６）。このことから樹立したFM4-PANC1細胞はNmU刺激によりFM4を介して細胞内にシグナルが伝達されていることが確認された。
この細胞のコロニー形成能に対するNmUの作用を解析するためsoft agar colony formation assayを実施した。Soft agar colony formation assayは以下のとおり行った。
1.5 ml/well ずつbase agar（0.5% agar, 1 x MEM, 10% FCS）を添加した6 well plateに、PANC1細胞、あるいは、FM4-PANC1細胞をtop agar（0.35% agar, 1 x MEM, 10% FCS）中にNmU（1μΜ）存在下、あるいは非存在下で0.5 x 104 cells/wellになるように1.5 ml/wellで各wellに添加した。１ヶ月間培養後、soft agar中におけるコロニー形成細胞数を顕微鏡下で測定した。【０１０７】
その結果、FM4を発現してない親株のコロニー形成能に対しては、NmUはまったく影響を及ぼさなかったが、FM4-PANC1においては、NmUによるコロニー形成抑制作用が確認された（図７）。
以上の結果より、NmUはFM4を介して軟寒天培養におけるコロニー形成を抑制することが示された。【０１０８】
4. NmU-R2 （FM4）を介するNmUの細胞運動抑制効果
4-1. FM4-CHO細胞の細胞形態変化
FM4を強制発現させたFM4-CHO細胞の細胞形態を顕微鏡で観察した。その結果、親株であるCHO細胞に比べて、FM4-CHO細胞では細胞突起の増加と細胞の肥大といった特徴に見られる細胞の形態変化が観察された（図８）。
そして、これらの特徴を有するFM4-CHO細胞を、さらにNmUで刺激することによって、約12時間程度で細胞突起の消失など著しい細胞の形態変化が観察された（図８）。このことから、NmUが細胞の接着と細胞運動を調節するシグナル伝達に関与していることが推測された。【０１０９】
4-2. NmUによる細胞運動能の抑制効果
次にwound healing assayにより細胞運動能に対するNmUの作用について解析を行った。シャーレ中でコンフルエントにさせた親株CHO、およびFM4-CHO細胞をピペットチップの先で傷つけ細胞間に一定の隙間を作った。細胞をPBSで２回洗浄後、無血清培養液にNmU（5μM）添加/非添加で培養を行った。２４時間後に、細胞間の隙間へと移動した細胞を顕微鏡で観察・写真撮影した。【０１１０】
その結果、NmUは親株CHO細胞の細胞移動にまったく影響を与えなかったのに対し、FM4-CHO細胞は、NmU刺激により細胞移動が完全に阻害された（図９）。このことから、NmUはFM4を介して細胞運動を抑制する作用を有することが強く示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
本発明に係るニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドは、ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子を発現する膵臓癌などの各種の癌細胞の細胞増殖抑制剤、コロニー形成抑制剤、又は細胞運動抑制剤として使用することができる。更に、本発明に係るニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子に対するリガンドは、膵臓癌などの癌に対する癌治療剤として使用することができる。更に膵臓癌などの癌の術後予防薬として使用することができる。【０１１２】
また、本発明に係るニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子は、膵臓癌などの癌の診断マーカーとして使用することができる。即ち、当該ニューロメジンＵ受容体２（ＦＭ４）分子を検出することのできるプローブを化学物質又はラジオアイソトープなどにより標識し使用することにより、生体外又は生体内において膵臓癌の存在を検出することができる。
【図１ａ】
2008029601.tif 000004
【図１ｂ】
2008029601.tif 000005
【図２】
2008029601.tif 000006
【図３】
2008029601.tif 000007
【図４】
2008029601.tif 000008
【図５】
2008029601.tif 000009
【図６】
2008029601.tif 000010
【図７】
2008029601.tif 000011
【図８】
2008029601.tif 000012
【図９】
2008029601.tif 000013
【配列表】
2008029601000001.app
【国際調査報告】
2008029601.tif 000014
2008029601.tif 000015
2008029601.tif 000016
2008029601.tif 000017
2008029601.tif 000018
2008029601.tif 000019
2008029601.tif 000020
2008029601.tif 000021