(57)【要約】  本発明は光学活性１，２-ジオール類の製法に使用される酵素、該酵素をコードする遺伝子およびそれらを利用した光学活性１，２-ジオール類の製法を提供する。具体的には不斉酸化酵素をコードする配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基を含む遺伝子および配列番号５のアミノ酸配列を有する不斉酸化酵素を提供する。また、本発明の不斉酸化酵素を１，２-ジオール類の両エナンチオマー混合物もしくは一方のエナンチオマーと接触させて、他方のエナンチオマーを得る、光学活性１，２−ジオール類の製法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子：
（ａ）配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基、
（ｂ）配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
【請求項２】
配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基からなる請求項１記載の遺伝子。
【請求項３】
以下の（ａ’）または（ｂ’）のいずれかのタンパク質：
（ａ’）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ’）配列番号５に記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列からなり、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する活性を有するタンパク質。
【請求項４】
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
請求項１または２に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項６】
請求項１または２の遺伝子もしくは請求項５のベクターを含む形質転換体。
【請求項７】
請求項１または２に記載の遺伝子を微生物に発現させることを含む、請求項３または４に記載のタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項３または４に記載のタンパク質を、１，２-プロパンジオールの両エナンチオマー混合物またはＳ体に接触させることを含む、Ｒ体１，２-プロパンジオールの製造方法。
【請求項９】
請求項３または４に記載のタンパク質を、３-クロロ-１，２-プロパンジオールまたは３-クロロ-２-メチル-１，２-プロパンジオールの両エナンチオマー混合物もしくはＲ体に接触させることを含む、Ｓ体３-クロロ-１，２-プロパンジオールまたはＳ体３-クロロ-２-メチル-１，２-プロパンジオールのエナンチオマーの製造方法。
【請求項１０】
請求項３または４記載のタンパク質を発現する微生物を用いる、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
微生物が、請求項６記載の形質転換体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
微生物が、シュードモナス  ニトロレデューセンスＤＳ−Ｓ−ＲＰ８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７７９３）を配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を相同組み換えノックアウトにより遺伝子改変したものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
配列番号３の塩基配列中第８８塩基〜第１８５７塩基からなる遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬、農薬、生理活性物質および強誘電性液晶などの光学活性化合物の合成において有用な中間体となりうるＲ体１，２-プロパンジオール、Ｓ体３-クロロ-１，２-プロパンジオールおよびＳ体３-クロロ-２-メチル-１，２-プロパンジオール等の光学活性１，２-ジオール類の製法に使用する微生物由来の酵素、該酵素をコードする遺伝子およびそれらを利用した光学活性１，２-ジオール類の製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性化合物の製法としては、対応する光学活性出発物質から目的物へ変換する化学的合成法のほか、対応するラセミ体を光学分割剤で処理して光学活性体に分割する方法が用いられる。また近年、微生物または酵素を用いて生体触媒反応により光学活性体を分離する方法が多く報告されている。【０００３】
本発明者等は先に１，２-プロパンジオールの両エナンチオマー混合物を作用させると不斉資化分割によりＲ体１，２-プロパンジオールを残存させる微生物シュードモナス  ニトロレデューセンス（Pseudomonas nitroreducens）ＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株を土壌より単離した（特許文献１）。【０００４】
また、３-ハロゲノ-２-メチル-１，２-プロパンジオールの両エナンチオマー混合物をＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株に作用させると、該微生物の酵素による不斉酸化反応により、Ｓ体３-ハロゲノ-２-メチル-１，２-プロパンジオールを残存させることができることも報告した（特許文献２）。【０００５】
さらに、３-ハロゲノ-１，２-プロパンジオールのラセミ体を不斉酸化させる微生物シュードモナス  ｓｐ．ＤＳ-ＳＩ-５株についても報告している（特許文献３）。特許文献３に開示する３-ハロゲノ-１，２-プロパンジオールのＲ体の資化能を有し、該Ｒ体を単一炭素源として生育しうるシュードモナス属に属する微生物として、特許文献３には示していないが出願人はシュードモナス  ニトロレデューセンスＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株を用いうることを確認している。【０００６】
しかしながら微生物の野生株を用いた光学分割の効率は工業的利用を考えると満足の行くものとは言えない。また、菌株の成長ステージによって光学分割の効率が変化し、安定した反応を行うことが困難であった。【０００７】
【特許文献１】特開２００２-２５３２９５
【特許文献２】特開２００６-１９７８０３
【特許文献３】特開２００１-１４９０９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記問題点の解決を課題とするものであり、光学活性１，２-ジオール類の製法に使用する微生物由来の酵素、該酵素をコードする遺伝子およびそれらを利用した光学活性１，２-ジオール類の製法を提供することを目的とする。【０００９】
本発明はまた、該遺伝子を含むベクター、形質転換体、および該酵素を用いる光学活性体の製造方法を提供することも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｒ体１，２-プロパンジオール、Ｓ体３-クロロ-１，２-プロパンジオールおよびＳ体３-クロロ-２-メチル-１，２-プロパンジオール等の光学活性１，２-ジオール類を安価に製造する方法を見出すべく、種々研究を重ねた結果、Pseudomonas nitroreducens ＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株から上記の不斉資化分割および不斉酸化反応を担う酵素を特定し、該酵素遺伝子を単離し、その塩基配列ならびにアミノ酸の一次構造を決定することに成功し、本発明を完成するに至った。【００１１】
これにより、組換えＤＮＡの手法を用いて微生物に該酵素を大量に生産させることが可能になり、立体識別性も向上し、微生物の触媒能力を従来と比較して飛躍的に増大することができる。【００１２】
即ち本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子を提供する：
（ａ）配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基、
（ｂ）配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。【００１３】
本発明にはまた、下記いずれかの配列からなる遺伝子を包含する：
（ｃ）配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基において、１または数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列であって、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、および、
（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列。【００１４】
また、本発明は、以下の（ａ’）または（ｂ’）のいずれかのタンパク質を提供する：
（ａ’）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ’）配列番号５のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列からなり、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質。【００１５】
本発明はまた、
（ｃ’）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質も包含する。【００１６】
本発明によれば、本発明の遺伝子を含むベクターおよび該ベクターを含む形質転換体が提供される。【００１７】
さらに本発明は、本発明のタンパク質を基質である１，２-プロパンジオールのＳ体もしくは両エナンチオマー混合物へ作用させることを含む、Ｒ体１，２-プロパンジオールの製造方法に関する。
本発明はまた、本発明のタンパク質を基質である３-クロロ-１，２-プロパンジオールまたは３-クロロ-２-メチル-１，２-プロパンジオールのＲ体もしくは両エナンチオマー混合物へ作用させることを含む、Ｓ体３-クロロ-１，２-プロパンジオールまたはＳ体３-クロロ-２-メチル-１，２-プロパンジオールの製造方法に関する。【００１８】
本発明のタンパク質を基質へ作用させる際、本発明のタンパク質を発現する微生物を、基質へ作用させてもよい。本発明のタンパク質を発現する微生物としては、本発明の遺伝子にて形質転換した微生物が例示される。【００１９】
また、本発明のタンパク質を本来発現している微生物、例えばシュードモナス  ニトロレデューセンスＤＳ−Ｓ−ＲＰ８より本発明のタンパク質の働きに競合する働きを有するタンパク質、即ち同じ基質に作用するが、本発明のタンパク質と比して立体選択性が反対、あるいは低い酵素、例えば配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子を相同組み換えノックアウトにより遺伝子改変したものであってもよい。本発明はまた、この配列番号６に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、配列番号３の塩基配列中第８８塩基〜第１８５７塩基からなる遺伝子を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明で提供される酵素を用いることによって、１，２-ジオール類の光学活性体を効率よく、安定的にかつ安価に製造することが可能となる。
本発明の完成までに、シュードモナス  ニトロレデューセンスＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株は少なくとも５種類の酸化酵素を発現していることが判明した。かかる５種類の酵素は酸化能が相違し、また基質に対する立体選択性もそれぞれに相違する。従って、野生株を用いて上記１，２-ジオール類の一方の一方のエナンチオマーを得ようとしても効率が悪く、また使用する培地組成や野生株の成長のステージによって各酸化酵素の発現の程度が変化する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本明細書および特許請求の範囲において不斉資化分割あるいは不斉酸化反応とは、両エナンチオマー混合物のうち一方の光学活性体を立体選択的に酸化分解する反応をいう。かかる働きにより、もう一方の光学活性体が残存され、光学活性体の分割が達成される。【００２２】
本明細書および特許請求の範囲において、「Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有する」とは、該タンパク質が１，２-プロパンジオールのＳ体エナンチオマーを基質とした場合の酸化分解活性が、Ｒ体エナンチオマーを基質とした場合の酸化分解活性の２倍以上、好適には５倍以上、より好適には８倍以上であることを意味する。【００２３】
本発明によれば、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの塩基配列からなる遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基、
（ｂ）配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（ｃ）配列番号１の第１１２塩基〜第２１８４塩基において、１または数個の塩基が欠失、付加または置換されている塩基配列であって、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、
（ｄ）配列番号５のアミノ酸配列をコードする塩基配列、
（ｅ）配列番号のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列であって、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列、および、
（ｆ）配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列。【００２４】
また、本発明によって下記：
（ａ’）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ’）配列番号５のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列からなり、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質、および
（ｃ’）配列番号５または６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化する不斉酸化活性を有するタンパク質
からなる群から選択される不斉酸化酵素であるタンパク質が提供される。【００２５】
本発明はさらに、配列番号３の塩基配列中第８８塩基〜第１８５７塩基からなる遺伝子が提供される。【００２６】
本明細書および特許請求の範囲において、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されている」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていることを意味する。また、「１または数個の塩基が欠失、付加または置換されている」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が欠失、置換または付加されていることを意味する。【００２７】
本明細書および特許請求の範囲において、「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、0.2xSSC、0.1%SDS、65℃程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは(ａ)の塩基配列からなるDNAと７０%以上の高い相同性を有することが望ましく、さらに８０%以上の相同性を有することが好ましい。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989.）等に記載されている方法に準じて行うことができる。【００２８】
本明細書および特許請求の範囲において、「相同性」とは、２つのポリペプチドあるいはポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列または塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。相同性の数値（％）は両方のアミノ酸または塩基配列に存在する同一のアミノ酸または塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸または塩基の総数で割り、得られた数値に100をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび相同性を得るためのアルゴリズムとしては当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、例えばBLASTP、FASTAなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。塩基配列の相同性は、BLASTN、FASTAなどのソフトウェアを用いて決定される。【００２９】
「配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列番号５のアミノ酸配列との相同性は７５％以上であれば特に制限はなく、例えば、７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上であることを意味する。【００３０】
本発明の配列番号１に示す不斉酸化酵素遺伝子は、シュードモナス属に属する微生物シュードモナス  ニトロレデューセンスＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株の染色体ＤＮＡから単離されたものである。本株は本出願人により郵便番号３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１３年６月２９日に国際寄託されている。国際番号はＦＥＲＭ  ＢＰ-７７９３である。【００３１】
本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されない。本発明の遺伝子は、所望の酵素を産生することが予測される微生物の染色体からのクローニングにより、あるいはＤＮＡ合成機を用いた合成によって得ることができ、その形態は一本鎖、二本鎖のいずれでも良い。【００３２】
クローニングによって本発明の遺伝子を得る場合の染色体供与微生物としては、ＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株ならびに該株と同様の性質を有する株であるシュードモナスＳｐ．ＤＳ-ＳＩ-５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ-７０８０）アルカリゲネスｓｐ。ＤＳ-Ｓ-７Ｇ株（ＦＥＲＭ  ＢＰ-３０９８）などが例示されるがこれらに限定されない。【００３３】
その遺伝子供与体からの本発明の不斉酸化酵素遺伝子をもつＤＮＡ断片の取得は、配列番号１の不斉酸化酵素遺伝子塩基配列の一部をプローブとして、遺伝子供与体の染色体ＤＮＡから常法により作製したＤＮＡライブラリーよりハイブリダイゼーション法を用いて目的の遺伝子のＤＮＡ断片を得ることができる。【００３４】
取得した不斉酸化酵素遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定法としては、例えばジデオキシシークエンス法が挙げられる。この方法には、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する方法や核酸分解酵素により欠失させる方法などの、遺伝子工学分野で慣用される様々な手法が含まれる。これらの方法により、配列番号１で示される目的のＤＮＡ塩基配列中に全アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が確認できる。【００３５】
ここで、Ｓ体１，２-プロパンジオールを立体選択的に酸化分解する不斉酸化酵素活性を有する限り、配列番号５に示したアミノ酸配列について１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。例えば、ＤＮＡがコードするアミノ酸配列についてアミノ酸のいくつかの欠失、挿入、置換等を生じるようにＤＮＡを改変することは、合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的変異導入法などの周知の方法で適宜行うことができる。また、配列番号１に示したＤＮＡまたは該ＤＮＡを適宜改変したＤＮＡを鋳型にして、Ｍｎ2+イオンの存在下（通常０．５〜１０ｍＭの濃度）、または特定のヌクレオチドの濃度を低くしてＰＣＲ法を行うことによってランダムに変異が導入されたＤＮＡを得ることができる。このようにして得られたＤＮＡのうち、不斉酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするものが、本願発明に含まれることは言うまでもない。【００３６】
本発明の酵素の精製方法は、特に限定されないが、通常のタンパク質の精製方法を適当に組み合わせることにより精製することができる。例えば、菌体を超音波により破砕後、硫酸アンモニウムによる塩析を行ない、沈殿の溶解物を疎水クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーを組み合わせることにより、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下ＳＤＳ-ＰＡＧＥと略す）で単一になるまで精製することができる。【００３７】
さらに本発明は本発明の遺伝子の塩基配列を含むベクターを提供する。【００３８】
本発明の遺伝子を、該酵素の発現を可能とするプロモーターなどの機能領域および宿主での複製オリジンを有するベクターに組み込めば、得られたベクターを用いて本発明の遺伝子を宿主細胞に導入し形質転換体を得ることができる。このようなベクターのうち好ましいのは、宿主細胞中で自律複製可能であり、さらに組換え細胞のみを選別できるような適当な選択マーカーが付与されたものが例示される。かかるベクターとしては市販のものが数多く提供されており、特に限定されず宿主の種類に応じて適当なものを選択すればよい。例えば、宿主をシュードモナス属細菌とする場合、特開２００１−２０４４７３に記載のプラスミドベクター、ｐＴＭ３３が特に好適に用いられる。【００３９】
更に本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡにより形質転換され、本発明の不斉酸化酵素活性を有する酵素の産生能を有する微生物を提供する。【００４０】
用いられる宿主細胞としては、組換えベクターでもって形質転換され、かつ本遺伝子を発現させることができるようなものであれば特に制限なく使用することができる。このような宿主細胞としては、本発明の目的に沿って本遺伝子の発現を達成し得る限り、グラム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞であろうと植物由来細胞であろうと使用できる。【００４１】
具体的に本発明で使用することのできる宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia coli）、エンテロバクター属、サッカロミセス属、キサントモナス属、アセトバクター属、シュードモナス属、グルコノバクター属、アゾトバクター属、リゾビウム属、クレブシエラ属、サルモネラ属及びセラチア属から選ばれる微生物が挙げられる。特にシュードモナス属微生物が好適に用いられる。【００４２】
形質転換体は、適当な栄養培地中で培養を行なうことにより大量に得ることができる。培養に用いられる培地は微生物の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地であれば何でも良い。例えば炭素源としてグルコース，フラクトース等の炭水化物、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、プロピレングリコール等のアルコール類、酢酸，クエン酸，リンゴ酸，マレイン酸，フマル酸，グルコン酸とその塩類などの有機酸、またはそれらの混合物を用いることができる。窒素源として硫酸アンモニウム，硝酸アンモニウム，リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物および尿素，ペプトン，カゼイン，酵母エキス，肉エキス，コーンスチープリカー等の有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無機塩としてリン酸塩，マグネシウム塩，カリウム塩，マンガン塩，鉄塩，亜鉛塩，銅塩など、更に必要に応じてビタミン類を加えてもよい。また、高酵素活性を持った形質転換菌体を得るための酵素誘導添加物として、上記培地およびペプトン培地、ブイヨン培地等の栄養培地に使用する菌株に応じて、効果的に目的のＤＮＡを発現させるためにアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に添加してもよいし、イソプロピルβ-Ｄ（-）-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等のプロモーターの活性化誘導剤を用いることもできる。培養は用いる形質転換体により適した条件で培養するとよく、例えば好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜６０℃の任意の範囲に制御して１〜５日間培養を行えばよい。【００４３】
こうして製造される不斉酸化酵素を大量に産生する形質転換体は、安価な培地中で大量に調製することができ、光学活性１，２-ジオール類の製造等に利用することができる。  【００４４】
得られた不斉酸化酵素産生形質転換体の細胞から該酵素の抽出は次の方法で行うことができる。１）フレンチプレスや超音波破砕による機械的（物理的）方法、２）リゾチームなどの酵素処理方法、３）自己溶解法、４）浸透圧を利用した抽出法などの方法によって形質転換体を破壊して行うことができる。【００４５】
本発明はさらに、本発明にて提供される酵素を用いて光学活性１，２-ジオール類を得る製造方法を提供する。本発明の方法は、１，２-ジオール類のエナンチオマー混合物あるいは一方のエナンチオマーに本発明の不斉酸化活性を有するタンパク質を接触させ、一方のエナンチオマーのみ選択的に酸化分解させ、他方のエナンチオマーを得る方法である。【００４６】
本発明の方法は具体的には例えば、１，２-プロパンジオールのエナンチオマー混合物もしくはＳ体へ本発明の不斉酸化活性を有するタンパク質と接触させ、Ｓ体１，２-プロパンジオールを選択的に酸化分解させ、Ｒ体１，２-プロパンジオールを残存させることによってＲ体１，２-プロパンジオールを得る方法、および３-クロロ-１，２-プロパンジオールまたは３-クロロ-２-メチル-１，２-プロパンジオールのＲ体もしくは両エナンチオマー混合物へ本発明の不斉酸化活性を有するタンパク質と接触させ、該化合物のＲ体エナンチオマーを選択的に酸化分解させ、Ｓ体３-クロロ-１，２-プロパンジオールまたは３-クロロ-２-メチル-１，２-プロパンジオールを残存させる、Ｓ体３-クロロ-１，２-プロパンジオールまたは３-クロロ-２-メチル-１，２-プロパンジオールの製造方法である。【００４７】
本発明の方法において、出発物質となる１，２-プロパンジオール類の両エナンチオマー混合物もしくは目的とは反対の立体選択性を有する化合物は従来から知られる化学合成法などによって調製すればよい。【００４８】
「本発明の不斉酸化活性を有するタンパク質と接触させ」とは、本発明にて提供される不斉酸化酵素そのものを基質と接触させても、本発明にて提供される遺伝子またはベクターにて形質転換され、本発明の不斉酸化酵素を発現する細胞と基質を接触させてもよい。後者の場合、細胞としては細胞培養液中に懸濁された細胞、細胞培養液の遠心分離により得た細胞およびその細胞処理物（細胞破砕物または細胞抽出液）あるいは、それらを常法により固定化したものを基質と接触させてもよい。【００４９】
あるいは、「本発明の不斉酸化活性を有するタンパク質と接触させ」とは、本来本発明の不斉酸化活性を有するタンパク質を発現している微生物から、本発明のタンパク質の不斉酸化活性と競合するタンパク質の発現をノックアウトして遺伝子改変したものであってもよい。本発明の不斉酸化活性を有するタンパク質を発現している微生物としては、シュードモナス  ニトロレデューセンスＤＳ−Ｓ−ＲＰ８が、本発明の不斉酸化活性と競合するタンパク質としては、配列番号６に記載のタンパク質が例示される。標的とするタンパク質をノックアウトする方法としては、公知のものを採用すればよく、例えば配列番号６に記載のタンパク質をコードする遺伝子を相同組み合えによりノックアウトする方法が例示される。【００５０】
基質と酵素または酵素を含む細胞との接触は、緩衝液に混合した微生物菌体混合液に基質を添加する方法などがある。反応温度は１５〜５０℃が好ましく、反応ｐＨは６〜９で行なうのが好ましい。基質は初期に一括添加してもよいし、分割添加してもよい。反応は通常、攪拌あるいは振とうしながら行い、反応時間は基質濃度、微生物菌体または酵素量により異なるが、１〜１２０時間で終了するのがよい。好ましくはガスクロマトグラフィーなどの分析により、目的の光学活性体の濃度および光学純度を測定し終点を決定するのがよい。
【実施例】
【００５１】
以下実施例をもって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例中の％は特に記載のない限り（ｗ／ｖ）で表す。【００５２】
〔実施例１〕  不斉酸化酵素の特定
グリセリン１０ｇ/l、酵母エキス１０ｇ/l、ペプトン１０ｇ/ｌを含む栄養培地１００ｍｌ（ｐＨ７．２）を入れた５００ｍｌ容バッフル付き三角フラスコに、あらかじめ同栄養培地プレートで生育させたシュードモナスニトロレデューセンスＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株の菌体を１白金耳分植菌し、３０℃で２４hr培養を行ない種培養液を得た。次いで、５L容のジャーファーメンターに上記栄養培地２．５Ｌを調製、および下記表１に示す１，２-プロパンジオールを単一炭素源とする最少培地２．５Ｌを調製し、３０℃で２４hr培養を行なった。各培養液を遠心分離し、菌体を調製した。
【００５３】
【表１】
2008146888.tif 000002
【００５４】
得られた湿菌体を、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーに懸濁後、−２０℃に冷却したアセトン中に攪拌しながら徐々に滴下した。生じた沈殿をろ過にて回収し、再度冷却したアセトン中に加えた。沈殿をろ過にて回収し、減圧下にてアセトンを除去し、沈殿を乾燥させ、乾燥菌体を得た。乾燥菌体を５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  （ｐＨ７．５）バッファーに加え、よく攪拌した後、遠心分離により不溶性分を取り除き、無細胞抽出液を得た。【００５５】
得られた無細胞抽出液を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅｒｌによる陰イオン交換クロマトグラフィーに供した。【００５６】
［酵素活性の確認］
各画分の酵素活性を、Tetrahedron Asymmetry Vol.5, pp.239-246, 1994の方法にて確認した。具体的には５０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーに０．２５ｍＭフェナジンメソサルフェート（ＰＭＳ）、０．２５ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）および０．２％（ｖ／ｖ）Ｓ体プロパンジオールを加えた反応液を調製し、この反応液２．７ｍｌに酵素液３００μｌを加え、３０℃で１０分間反応させＤＣＩＰの還元による６００ｎｍの吸光度の減少を利用した比色定量により行なった。【００５７】
該酵素の活性画分を回収した。この画分を分画分子量１０，０００の限外ろ過膜で濃縮後、ＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅｒｌによる陽イオン交換クロマトブラフィーに供し、上記と同様にして該酵素の活性画分を回収し分画分子量１０，０００の限外ろ過膜で濃縮して酵素液を得た。【００５８】
［活性染色］
得られた酵素液を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ）に供し、泳動後に活性染色を行った。反応液として、５０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファーに０．５ｍＭフェナジンメソサルフェート（ＰＭＳ）、０．５ｍＭテトラニトロテトラゾリウムブルー、および基質であるＳ体１，２−プロパンジオール０．２％（ｖ／ｖ）を添加した溶液を調製し、電気泳動後のゲルを２０分間浸して活性染色を行なった（Tetrahedron Asymmetry Vol.5,pp.239-246, 1994）。【００５９】
活性染色の結果、栄養培地で培養した菌体の酵素液は５種類のバンド、最少培地で培養した菌体の酵素液は２種類のバンドが確認できた。栄養培地での５種類のバンドのうちの２種類は、最少培地での２種類のバンドと同じ位置に存在した。この２種類のバンド(ＰｎＥ１、ＰｎＥ２)をゲルから切り出し、切り取ったゲルを５０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）バッファー中でホモジネートし、一晩4℃で攪拌し、該酵素を抽出した。【００６０】
得られた不斉酸化酵素は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで解析した結果、それぞれほぼ単一バンドとなり、その分子量は、７８ｋＤａ（ＰｎＥ１）および６９ｋＤａ（ＰｎＥ２）であった。【００６１】
［酵素活性の確認１］
得られた両酵素の(S)-1,2-プロパンジオール及び(R)-1,2-プロパンジオールに対する活性を(1)に示した方法で調べた。その結果、両酵素とも(S)-1,2-プロパンジオールを優先的に分解することが確認された。【００６２】
【表２】
2008146888.tif 000003
(S)-1,2-プロパンジオールに対する活性を100とした。【００６３】
［酵素活性の確認２］
ＰｎＥ１について各基質に対する反応性を確認した。反応性は上記活性染色法に基づいて行った。染色度合いの強い程、該基質に対する酸化分解活性が強い。結果を表２に示す。【００６４】
【表３】
2008146888.tif 000004
【００６５】
〔実施例２〕不斉酸化酵素のＮ末端アミノ酸配列の解析
実施例１で得られた２種類の不斉酸化酵素溶液をＳＤＳ-ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜にブロッティングし、プロテインシークエンサーにてＮ末端アミノ酸配列の解析を行った結果、配列番号７および８に記載のアミノ酸配列が得られた。【００６６】
〔実施例３〕不斉酸化酵素遺伝子のクローニング
（１）シュードモナス  ニトロレデューセンスＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株からの染色体ＤＮＡの調製
ＤＳ-Ｓ-ＲＰ８株をグリセリン１０ｇ／ｌ、酵母エキス１０ｇ／ｌ、ペプトン１０ｇ／ｌを含む液体培地５ｍｌ中で２０時間培養し、遠心分離により菌体を回収した。【００６７】
菌体を４９０μｌのＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に懸濁し、１０％ＳＤＳを３０μｌ、２０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＫを５０μｌ添加し、５０℃で１時間反応させた。その後、等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）による抽出を行ったあと、０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を添加し、０．６倍量の２−プロパノールを静かに重層した。その結果界面に生じたＤＮＡをガラス棒で糸状に巻きつけ回収した。得られたＤＮＡを再度ＴＥに溶解させ、染色体ＤＮＡ溶液を調製した。【００６８】
（２）プローブの作製
実施例２で決定したＰｎＥ１およびＰｎＥ２それぞれのＮ末端アミノ酸配列を元に、アミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列についてコドン縮重を考慮してＰＣＲプライマーを合成した（配列番号９、１０）。また、実施例２で決定したＰｎＥ１およびＰｎＥ２それぞれのアミノ酸配列をもとに相同性の検索を行った結果、ＰＱＱを補酵素とする各種アルコール脱水素酵素との相同性がみられた。その保存領域を検索し、その保存領域の内部アミノ酸配列を元に、アミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列についてコドン縮重を考慮してＰＣＲプライマー（配列番号１１、１２）を合成した。なお縮重プライマーは配列表に記載の配列においてｈがａ、ｃまたはｔ、ｎがａ、ｃ、ｇまたはｔ、ｒがａまたはｇ、ｙがｃまたはｔを示すものそれぞれの組合せの混合プライマーである。【００６９】
上記Ｎ末端および内部アミノ酸配列より合成したＰＣＲプライマーを組み合わせ（配列番号７と９および８と１０）、（１）で抽出した染色体５０ｎｇを鋳型にして、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造株式会社製）を用いてＰＣＲ（熱変性９６℃、３０秒、アニーリング５４℃、１分、伸長反応７２℃、１分）を４０サイクル行ない、４℃まで冷却後アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認し、ＤＮＡ断片を常法によりアガロースゲルより回収した。次いで、そのＤＮＡ断片をｐＵＣ１１８（宝酒造株式会社製）にサブクローニングし、塩基配列をＤＮＡシークエンサーで決定した。その結果、決定したＤＮＡ塩基配列中に、あらかじめ決定した部分アミノ酸配列（配列番号７および８）をコードする領域を確認できたので、得られた増幅ＤＮＡを常法に従って３２Ｐでラベルし、プローブＤＮＡとした。【００７０】
（３）ＰｎＥ１遺伝子制限酵素地図の作成
抽出したDS-S-RP8株の染色体ＤＮＡを種々の制限酵素で切断し、１％アガロースゲルを用いて電気泳動後、ニトロセルロースメンブレンに転写させた。風乾後、（２）で作製したプローブを用いて、６５℃で２０時間ハイブリダイゼーション反応を行った。【００７１】
ハイブリダイゼーションを行なったメンブレンは、(i)２×ＳＳＣ、６５℃、１５分、(ii)１×ＳＳＣ、６５℃、３０分で洗浄し、Ｘ線フィルムと増感紙をあて、オートラジオグラムをとった。この結果、種々のシグナルを比較することにより、不斉酸化酵素遺伝子領域近辺の制限酵素地図を作製した。【００７２】
（４）ゲノムライブラリーからのＰｎＥ１遺伝子のクローニング
（３）で作製した制限酵素地図から目的とする不斉酸化酵素遺伝子の全長が含まれることを考慮して、プラスミドpBluescriptII KS（東洋紡績株式会社製）のNotＩ-KpnＩ部位に約６２００塩基対のDS-S-RP8株の染色体ＤＮＡに由来する多種類のＤＮＡ断片を挿入したゲノムライブラリーを作製した。これを大腸菌JM１０９株に導入して得られた形質転換体１６０個体をニトロセルロースメンブレンにレプリカした後、０．５N ＮａＯＨにメンブレンを浸して溶菌し、１M トリス-HCl（ｐＨ７．５）にメンブレンを浸して中和した。風乾後、（２）で作製したプローブを用いて、６５℃で２０時間ハイブリダイゼーション反応を行なった。【００７３】
ハイブリダイゼーションを行なったメンブレンは、(i)２×ＳＳＣ、６５℃、１５分、(ii)１×ＳＳＣ、６５℃、３０分、(iii)０．５×ＳＳＣ、６５℃、１時間で洗浄し、Ｘ線フィルムと増感紙をあて、オートラジオグラムをとった。この結果、陽性シグナルを与える１個の形質転換体を得た。【００７４】
（５）ＰｎＥ１遺伝子塩基配列の決定
上記陽性株から常法によりプラスミドを抽出し、ＰｎＥ１遺伝子を得た。次いで、実施例３の（２）で決定したプローブの塩基配列を元に、プライマーウォーキング法により不斉酸化酵素遺伝子の塩基配列をジデオキシ法により決定した。決定した塩基配列を配列番号１に、またその塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、配列番号１に示す塩基配列のうち第１〜第１１１塩基はシグナルペプチドをコードするものである。配列番号５にＰｎＥ１の成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す。【００７５】
（６）ＰｎＥ２遺伝子のクローニングと塩基配列の決定
プラスミドpUC１９のEcoRＩ-KpnＩ部位に約６８００塩基対のDS-S-RP8株の染色体ＤＮＡに由来する多種類のＤＮＡ断片を挿入したゲノムライブラリーを作製し、使用した以外は、（３）-（５）の同じ手法を用いて、ＰｎＥ２の遺伝子クローニングおよび塩基配列の決定を行なった。決定した塩基配列を配列番号３に、またその塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号３に示す塩基配列のうち、第１から第８７塩基はシグナルペプチドをコードするものである。配列番号６にＰｎＥ２の成熟タンパク質のアミノ酸配列を示す。【００７６】
〔実施例４〕  ＰｎＥ１発現プラスミドの作製
（１）ＰｎＥ１遺伝子のサブクローニング
配列番号１の塩基配列より配列番号１３及び１４に示すＰＣＲプライマーを設計し、実施例３の（５）で得られたプラスミド１ｎｇを鋳型にしてＰＣＲ（熱変性９４℃、１５秒、アニーリング６０℃、３０秒、伸長反応６８℃、３分）を３０サイクル行なった。４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認し、ＤＮＡ断片を常法によりアガロースゲルより回収した。次いで、そのＤＮＡ断片をＰＣＲ産物クローニングキットであるTArget Clone（東洋紡績製）にて、キットのプロトコール通りにｐＴＡ２ベクター（２．９６Ｋｂｐ）へのクローニングを実施し、ライゲーション混液にてEscherichia coli DH5αコンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換した。【００７７】
３０℃、１８時間培養して得られた複数のコロニーを、再度アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む４ｍＬのＬＢ培地にて３０℃、１８時間培養し、培養液よりプラスミド抽出キット（MagExtractor-Plasmid：東洋紡績製）にてキットのプロトコール通りに個々のコロニーのプラスミドを抽出した。得られたプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで３７℃、２時間切断反応し、アガロースゲル電気泳動により目的のＰＣＲ産物がクローニングされたものを選択した。更に、ＤＮＡシーケンシングにより、ＰｎＥ１遺伝子がＢａｍＨＩからＸｈｏＩの方向にクローニングされているプラスミドを選択し、ｐＴＡ−ＰｎＥ１（５．２３Ｋｂｐ）とした。【００７８】
（２）  ＰｎＥ１発現プラスミドの構築
特開２００１−２０４４７３に記載のシュードモナス（Pseudomonas）用プラスミドｐＴＭ３３（１５．８Ｋｂｐ）をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで３７℃、２時間切断反応し、アガロースゲル電気泳動後、１３．７Ｋｂｐの断片を回収した。この断片を、ゲル中ＤＮＡ抽出キット（MagExtractor-PCR&Gel Clean-up，東洋紡績製）にてキットのプロトコール通りに抽出し、５０μＬ水溶液として回収した。
一方、実施例４の（１）で調製したｐＴＡ−ＰｎＥ１、をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで３７℃、２時間切断反応し、アガロースゲル電気泳動後、２．２７Ｋｂｐの断片を回収した。これらの断片を、MagExtractor-PCR&Gel Clean-upにて抽出し、５０μＬ水溶液として回収した。
回収したプラスミドｐＴＭ３３由来１３．７Ｋｂｐ断片とＰｎＥ１遺伝子を含む２．２７Ｋｂｐ断片を等モル量ずつ混合し、ライゲーションキット（Ligation high：東洋紡績製）にてキットのプロトコール通りに１６℃、１時間のライゲーション反応を行った。その後、ライゲーション混液１０μＬを用いてEscherichia coli DH5αコンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換した。３０℃、１８時間培養して得られた複数のコロニーを、再度アンピシリンを１００μｇ／ｍｌ含む４ｍＬのＬＢ培地にて３０℃、１８時間培養し、培養液よりMagExtractor-Plasmidにてコロニーのプラスミドを抽出した。得られたプラスミドをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで３７℃、２時間切断反応し、アガロースゲル電気泳動により目的のＰＣＲ産物がクローニングされたものを選択した。更に、ＤＮＡシーケンシングにより、ＰｎＥ１遺伝子を確認し、ｐＴＭ−ＰｎＥ１Ｓ（１６．０Ｋｂｐ）とした。【００７９】
〔実施例５〕  ＰｎＥ２発現プラスミドの作製
（１）ＰｎＥ２遺伝子のサブクローニング
配列番号３の配列より配列番号１５及び１６に示すＰＣＲプライマーを設計し、実施例３の（６）で得られたプラスミド１ｎｇを鋳型にした以外は、実施例４記載の方法と同じ方法にてＰｎＥ２遺伝子のサブクローニングを行い、ＰｎＥ２遺伝子がＢａｍＨＩからＸｈｏＩの方向にクローニングされているプラスミドを選択し、ｐＴＡ−ＰｎＥ２（４．９０Ｋｂｐ）とした。【００８０】
（２）  ＰｎＥ２発現プラスミドの構築
実施例５の（１）で得たプラスミドｐＴＡ−ＰｎＥ２（４．９０Ｋｂｐ）を使用した以外は、実施例４の（２）記載の方法と同じ方法にてＰｎＥ２発現プラスミドの構築を行った。ｐＴＭ３３由来１３．７Ｋｂｐ断片とＰｎＥ２遺伝子を含む１．９４Ｋｂｐ断片を等モル量ずつ混合し、ライゲーション反応を実施後、ライゲーション混液１０μＬを用いてEscherichia coli DH5αコンピテントセルを形質転換した。コロニーのプラスミドを抽出し、得られたプラスミドをＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで３７℃、２時間切断反応し、アガロースゲル電気泳動により目的のＰＣＲ産物がクローニングされたものを選択した。更に、ＤＮＡシーケンシングにより、ＰｎＥ２遺伝子を確認し、ｐＴＭ−ＰｎＥ２Ｓ（１５．７Ｋｂｐ）とした。【００８１】
〔実施例６〕組換えシュードモナス菌の作製
（１）コンピテントセルの調製
シュードモナス（Pseudomonas sp. TE3493 :茨城県つくば市東１丁目１番３号  通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現  郵便番号３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所特許性物寄託センター）に平成３年６月１０日に国際寄託、国際寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−４１６９）菌株の培養液１０ｍｌより菌体を遠心分離（１２，０００ｒｐｍ，５分間）し、８ｍｌのバッファー（５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０），３００ｍＭシュークロース）で懸濁後、遠心分離で菌体を回収した。この操作を再度繰り返し、菌体を洗浄後、０．４ｍｌのバッファーに懸濁することによりエレクトロポレーション用コンピテントセルを調製した。【００８２】
（２）シュードモナスの形質転換
エレクトロポレーション用セルに、（１）で調製したコンピテントセルと実施例４あるいは５で作製したプラスミドＤＮＡ（ｐＴＭ−ＰｎＥ１ＳあるいはｐＴＭ−ＰｎＥ２Ｓ）０．５μｇを混合し、エレクトロポレーション装置（ジーンパルサー：Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）にセットして、２５μＦ、２００Ωのパルスを与えた。その後、混合液に５ｍｌのＬＢ培地を追加し、３０℃、１時間振とう培養後、ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地にプレーティングし、３０℃、１８時間培養して、目的の形質転換体ＴＥ３４９３／ｐＴＭ−ＰｎＥ１Ｓ及びＴＥ３４９３／ｐＴＭ−ＰｎＥ２Ｓを得た。【００８３】
〔実施例７〕組換えシュードモナス菌におけるＰｎＥ１遺伝子及びＰｎＥ２遺伝子の発現
（１）培養液の調製
ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、グリセリン１０ｇ／Ｌからなる組成の培地１００ｍｌ（ｐＨ７．０）を、５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌した。次いで、ストレプトマイシンを１００μｇ／ｍＬとなるように添加し、あらかじめ同栄養培地プレートで生育させた実施例６で得た組換えシュードモナス株を１白金耳分植菌し、３０℃で２４時間培養を行った。得られた培養液にラセミ体３−クロロ−２−メチル−１，２−プロパンジオールを１．０％（ｖ／ｖ）とＣａＣＯ３を１．５％とを加え、３０℃、１２０ｒｐｍで４８時間反応させた。反応液中に残存する３−クロロ−２−メチル−１，２−プロパンジオールをガスクロマトグラフィー（ＧＬサイエンス社製のカラム担体：ＰＥＧ２０Ｍ，６０−８０メッシュ（０．３１−０．４２ｍｍ）で分析した。反応終了後、反応液を取り出し、遠心操作により菌体を除去し、上清液を得た。この上清液をエバポレーターで濃縮し、エーテルにより抽出した。続いて無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下でエーテルを除去し、３−クロロ−２−メチル−１，２−プロパンジオールのシロップを得た。【００８４】
本物質の光学純度の測定は、得られた３−クロロ−２−メチル−１，２−プロパンジオールの光学異性体を水酸化ナトリウム水溶液を用いたアルカリ処理により相当する２−メチルグリシドールの光学異性体に変換後、アステック社製のキャピラリーカラムＡ−ＰＨ［（０．２５ｍｍ（ＩＤ）ｘ３０ｍ（Length））を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。【００８５】
【表４】
2008146888.tif 000005
ＰｎＥ１遺伝子およびＰｎＥ２遺伝子で組換えることにより、各エナンチオマーの相対反応速度比であるエナンチオマー過剰度（ｅ．ｅ）が向上した。しかしながら、ＰｎＥ２組換体で得られる光学純度はＰｎＥ１組換体にて得られる値と比して低く、またＰｎＥ１とＰｎＥ２は同じ基質に作用することからＰｎＥ１とＰｎＥ２の両方を含む系より、ＰｎＥ１のみを含む系の方がより高い立体選択性をもって１，２-プロパンジオール類の光学分割を可能とすると解される。【００８６】
（比較例）
ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス１０ｇ／Ｌ、グリセリン１０ｇ／Ｌからなる組成の培地１００ｍｌ（ｐＨ７．０）を、５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに入れ、１２１℃で１５分間、加圧蒸気滅菌した。次いで、あらかじめ同栄養培地プレートで生育させたＰｎＥ１及びＰｎＥ２遺伝子供与株であるシュードモナスニトロレデューセンス（Pseudomonas nitroreducens） ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株を１白金耳分植菌し、３０℃で２４時間培養を行った。得られた培養液にラセミ体３−クロロ−２−メチル−１，２−プロパンジオールを１．０％（ｖ／ｖ）とＣａＣＯ３を１．５％とを加え、３０℃、１２０ｒｐｍで４８時間反応させ、実施例７と同様にして、残存率及び光学純度を測定した。その結果、ＤＳ−Ｓ−ＲＰ８株よりも遺伝子組換え体ＴＥ３４９３／ｐＴＭ−ＰｎＥ１Ｓの方が光学純度＞９９％ｅ．ｅ．  での残存率すなわち収率が高かった。【００８７】
【表５】
2008146888.tif 000006
【配列表】
2008146888000001.app
【国際調査報告】
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