(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
８〜２５塩基長であるＲＮＡオリゴマーを含む免疫応答を誘発するための組成物であって、該ＲＮＡオリゴマーは、ＵＵＧの倍数体を含み、該倍数体の倍数は３〜８である、組成物。
【請求項２】
前記ＲＮＡオリゴマーは、５’−ＧＵＵＧＢ−３’ の倍数体を含む請求項１に記載の組成物であって、ＢはＵ、ＧまたはＣである、組成物。
【請求項３】
ＢがＵである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
８〜２５塩基長であるＲＮＡオリゴマーを含む免疫応答を誘発するための組成物であって、該ＲＮＡオリゴマーは、５’−ＧＵＵＧＢ−３’の倍数体を含み、ＢはＵ、ＧまたはＣであり、該倍数体は介在結合ヌクレオシドを介して結合し、該ヌクレオシドはＧおよびＵからなる群より選択され、該倍数体の倍数は３〜５である、組成物。
【請求項５】
ＢがＵである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記介在結合ヌクレオシドはＵである、請求項４または５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、全体として、免疫学および免疫賦活の分野に関する。より詳細には、本発明は、免疫賦活性リボ核酸、該免疫賦活性リボ核酸のホモログ、ならびに該免疫賦活性リボ核酸およびホモログの利用方法に関する。本発明の組成物および方法は、トル様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体７（ＴＬＲ−７）およびトル様受容体８（ＴＬＲ８）を介するシグナル伝達を誘起するのに有用であると考えられる。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫反応は、概念的には、先天性免疫と適応免疫に分類される。先天性免疫は、感染性細菌により発現される特定の種類の分子もしくは外来性高分子が同様に共有している病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識を含むと考えられている。また、ＰＡＭＰは、特定の免疫細胞のパターン認識受容体（ＰＲＲ）によって認識されると考えられている。
【０００３】
トル様受容体（ＴＬＲ）は、哺乳動物の先天性免疫において重要な役割を果たす高度に保存されたポリペプチドのファミリーである。現在、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１０と呼ばれる１０個のファミリー・メンバーが同定されている。種々のＴＬＲの細胞質ドメインは、トル−インターロイキン１（ＩＬ−１）受容体（ＴＩＲ）ドメインによって特徴付けられる。メドジトフ・Ｒほか（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９８年）モレキュラー・セル（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ）２：ｐ２５３−８参照。ＴＬＲによって細菌の侵入が認識されると、ショウジョウバエおよび哺乳動物において進化的に保存されているシグナル伝達系が賦活化される。ＴＩＲドメイン含有アダプタ蛋白質ＭｙＤ８８は、ＴＬＲと一体となってＩＬ−１受容体関与キナーゼ（ＩＲＡＫ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関与ファクター６（ＴＲＡＦ６）をＴＬＲに動員すると報告されている。このＭｙＤ８８依存性シグナル伝達経路は、免疫賦活の重要な段階であるＮＦ−ｋＢ転写因子およびｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２末端キナーゼ（Ｊｎｋ）マイトジェン賦活化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫｓ）の賦活化、ならびに炎症性サイトカインの産生をもたらすと考えられている。総説としては、アデレム・Ａほか（Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４０６：ｐ７８２−８７を参照されたい。
【０００４】
特定のＴＬＲリガンドがいくつか報告されているが、一部のＴＬＲのリガンドについてはまだ特定されていない。ＴＬＲ２のリガンドとしては、ペプチドグリカンおよびリポペプチドが挙げられる。ヨシムラ・Ａほか（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６３：ｐ１−５；ヨシムラ・Ａほか（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６３：ｐ１−５；アリプランティス・Ａ・Ｏほか（Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓ  ＡＯｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８５：ｐ７３６−９参照。ウイルス由来二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、およびｄｓＲＮＡの合成アナログであるポリＩ：Ｃは、ＴＬＲ３のリガンドであると報告されている。アレクソプロー・Ｌほか（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４１３：ｐ７３２−８参照。リポ多糖体（ＬＰＳ）はＴＬＲ４のリガンドである。ポルトラク・Ａほか（Ｐｏｌｔｏｒａｋ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９８年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８２：ｐ２０８５−８；ホシノ・Ｋほか（Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６２：ｐ３７４９−５２参照。細菌性フラジェリンはＴＬＲ５のリガンドである。ハヤシ・Ｆほか（Ｈａｙａｓｈｉ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４１０：ｐ１０９９−１１０３参照。ペプチドグリカンは、ＴＬＲ２のリガンドであるばかりでなく、ＴＬＲ６のリガンドでもある。オジンスキー・Ａほか（Ｏｚｉｎｓｋｙ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ９７：ｐ１３７６６−７１；タケウチ・Ｏほか（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）インターナショナル・イムノロジー（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１３：ｐ９３３−４０参照。細菌性ＤＮＡ（ＣｐＧ  ＤＮＡ）は、ＴＬＲ９リガンドであると報告されている。ヘンミ・Ｈほか（Ｈｅｍｍｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４０８：ｐ７４０−５；バウアー・Ｓほか（Ｂａｕｅｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ９８：ｐ９２３７−４２参照。上記に挙げたＴＬＲリガンドは全て、天然のリガンド、即ち、感染性細菌によって発現される分子として自然界に存在するＴＬＲリガンドを含む。
【０００５】
ＴＬＲ１、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ１０の天然リガンドは知られていないが、最近、一部の低分子量合成化合物イミダゾキノロン類のイミキモッド（Ｒ−８３７）およびレシキモッド（Ｒ−８４８）がＴＬＲ７のリガンドであると報告された。ヘンミ・Ｈほか（Ｈｅｍｍｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）（２００２年）ネイチャー・イムノロジー（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）３：ｐ１９６−２００参照。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（項目１）
少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡオリゴマー、ならびに必要に応じて、
陽イオン性脂質
を含む免疫賦活性組成物。
（項目２）
項目１に記載の組成物であって、前記単離ＲＮＡオリゴマーがＧ、Ｕ−リッチＲＮＡである組成物。
（項目３）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＲＵＲＧＹ−３’を含み、Ｒがプリンを表すものとし、Ｕがウラシルを表すものとし、Ｇがグアニンを表すものとし、およびＹがピリミジンを表すものとする組成物。
（項目４）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＡＧＵ−３’を含み、Ａがアデニンを表すものとする組成物。
（項目５）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＡＧＵＧＵ−３’を含む組成物。
（項目６）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＵＧＢ−３’を含み、ＢがＵ、ＧもしくはＣを表すものとし、Ｃがシトシンを表すものとする組成物。
（項目７）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＧＵＧ−３’を含む組成物。
（項目８）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を含む組成物。
（項目９）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む組成物。
（項目１０）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＣＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む組成物。
（項目１１）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が５’−ＣＵＣＧＧＣＡＣ−３’を含む組成物。
（項目１２）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが５〜１２ヌクレオチド長である組成物。
（項目１３）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列にＣｐＧジヌクレオチドがない組成物。
（項目１４）
項目１に記載の組成物であって、前記塩基配列が少なくとも５０パーセント自己相補性である組成物。
（項目１５）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが複数のオリゴマーである組成物。
（項目１６）
項目１５に記載の組成物であって、前記複数のオリゴマーが第１の塩基配列を有するオリゴマーおよび第２の塩基配列を有するオリゴマーを含み、該第１の塩基配列および該第２の塩基配列が少なくとも５０パーセント相補性であるものとする組成物。
（項目１７）
項目１５に記載の組成物であって、前記複数のオリゴマーが５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を含む塩基配列を有するオリゴマーおよび５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む塩基配列を有するオリゴマーを含む組成物。
（項目１８）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが非天然型主鎖結合を含む組成物。
（項目１９）
項目１８に記載の組成物であって、前記非天然型主鎖結合がホスホロチエート結合である組成物。
（項目２０）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが７−デアザグアノシン、８−アザグアノシン、５−メチルウラシルおよびシュードウラシルからなる群から選ばれる修飾塩基を含む組成物。
（項目２１）
項目１に記載の組成物であって、前記オリゴマーが修飾糖を含む組成物。
（項目２２）
項目１に記載の組成物であって、前記陽イオン性脂質がＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチル−サルフェート（ＤＯＴＡＰ）である組成物。
（項目２３）
項目１に記載の組成物であって、さらに抗原を含む組成物。
（項目２４）
項目２３に記載の組成物であって、前記抗原がアレルゲンである組成物。
（項目２５）
項目２３に記載の組成物であって、前記抗原が癌抗原である組成物。
（項目２６）
項目２３に記載の組成物であって、前記抗原が微生物抗原である組成物。
（項目２７）
項目１に記載の組成物であって、さらに医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
（項目２８）
有効量の項目１〜２７のうちの任意の１項に記載の組成物を免疫細胞と接触させて該免疫細胞の賦活化を誘起する工程
を含む免疫細胞を賦活化する方法。
（項目２９）
項目２８に記載の方法であって、前記免疫細胞の賦活化が該免疫細胞によるサイトカインもしくはケモカインの分泌を含む方法。
（項目３０）
項目２９に記載の方法であって、前記サイトカインがインターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン（ＩＦＮ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）からなる群から選ばれる方法。
（項目３１）
項目２９に記載の方法であって、前記ケモカインがインターフェロン−ガンマ誘導蛋白質１０（ＩＰ−１０）である方法。
（項目３２）
項目２８に記載の方法であって、前記免疫細胞の賦活化がＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路の賦活化を含む方法。
（項目３３）
項目３２に記載の方法であって、前記ＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路がトル様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）受容体（ＴＬＲ）と関連している方法。
（項目３４）
項目３３に記載の方法であって、前記ＴＬＲがＴＬＲ８である方法。
（項目３５）
項目３３に記載の方法であって、前記ＴＬＲがＴＬＲ７である方法。
（項目３６）
有効量の項目１〜２７のうちの任意の１項に記載の組成物を被験体に投与して該被験体の免疫反応を誘起する工程
を含む、被験体の免疫反応を誘起する方法。
（項目３７）
項目３６に記載の方法であって、前記被験体が癌に罹患しているか、罹患するリスクを有する方法。
（項目３８）
項目３６に記載の方法であって、前記被験体がウイルス、細菌、真菌および寄生生物からなる群から選ばれる外的病原因子による感染症に罹患しているか、罹患するリスクを有する方法。
（項目３９）
項目３６に記載の方法であって、前記被験体がウイルス感染症に罹患しているか、罹患するリスクを有する方法。
（項目４０）
抗原を被験体に投与する工程、および
有効量の項目１〜２２のうちの任意の１項もしくは項目２７に記載の組成物を該被験体に投与して該抗原に対する免疫反応を誘起すること
を含む、被験体の免疫反応を誘起する方法。
（項目４１）
項目４０に記載の方法であって、前記抗原がアレルゲンである方法。
（項目４２）
項目４０に記載の方法であって、前記抗原が癌抗原である方法。
（項目４３）
項目４０に記載の方法であって、前記抗原が微生物抗原である方法。
（項目４４）
被験体の樹状細胞を単離し、
項目１〜２２のうちの任意の１項もしくは項目２７に記載の組成物と該樹状細胞を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で接触させる工程、
抗原と該樹状細胞を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で接触させる工程、および
該接触させた樹状細胞を該被験体に投与する工程
を含む、被験体の免疫反応を誘起する方法。
（項目４５）
項目４４に記載の方法であって、前記抗原がアレルゲンである方法。
（項目４６）
項目４４に記載の方法であって、前記抗原が癌抗原である方法。
（項目４７）
項目４４に記載の方法であって、前記抗原が微生物抗原である方法。
（項目４８）
ＴＬＲ８シグナル伝達を誘起するのに有効な量の、トル様受容体８（ＴＬＲ８）のリガンド、および
別のＴＬＲによるシグナル伝達を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０からなる群から選ばれる該別のＴＬＲのリガンド
を含む組成物。
（項目４９）
項目４８に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ３である組成物。
（項目５０）
項目４８に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ７である組成物。
（項目５１）
項目４８に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ９である組成物。
（項目５２）
項目４８に記載の組成物であって、ＴＬＲ８の前記リガンドおよび前記別のＴＬＲのリガンドが結合されている組成物。
（項目５３）
項目４８に記載の組成物であって、さらに医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
（項目５４）
ＴＬＲ７シグナル伝達を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ７のリガンド、および
別のＴＬＲによるシグナル伝達を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０からなる群から選ばれる該別のＴＬＲのリガンド
を含む組成物。
（項目５５）
項目５４に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ３である組成物。
（項目５６）
項目５４に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ８である組成物。
（項目５７）
項目５４に記載の組成物であって、前記別のＴＬＲがＴＬＲ９である組成物。
（項目５８）
項目５４に記載の組成物であって、ＴＬＲ７の前記リガンドおよび前記別のＴＬＲのリガンドが結合されている組成物。
（項目５９）
項目５４に記載の組成物であって、さらに医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
（項目６０）
ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体であって、該結合体のＤＮＡが、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効なＣｐＧモチーフを含み、該結合体のＲＮＡが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８もしくはこれらの任意の組合せによるシグナル伝達を賦活化するのに有効なＲＮＡを含む結合体
を含む組成物。
（項目６１）
項目６０に記載の組成物であって、前記結合体がキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む組成物。
（項目６２）
項目６１に記載の組成物であって、前記キメラ主鎖が前記ＤＮＡと前記ＲＮＡとの間に切断部位を含む組成物。
（項目６３）
項目６０に記載の組成物であって、前記結合体が二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖を含む組成物。
（項目６４）
項目６０に記載の組成物であって、さらに医薬用として許容可能な担体を含む組成物。
（項目６５）
ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離ＲＮＡとＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目６６）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである方法。
（項目６７）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡがリボソームＲＮＡである方法。
（項目６８）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡが転移ＲＮＡである方法。
（項目６９）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである方法。
（項目７０）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡがウイルスＲＮＡである方法。
（項目７１）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡがＧ、Ｕ−リッチＲＮＡである方法。
（項目７２）
項目６５に記載の方法であって、前記ＲＮＡが本質的にＧおよびＵからなる方法。
（項目７３）
ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の、１Ｇ：５０Ｕ〜１０Ｇ：１Ｕの割合で本質的にＧおよびＵからなるヌクレオシドの混合物とＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目７４）
項目７３に記載の方法であって、前記ヌクレオシドがリボヌクレオシドである方法。
（項目７５）
項目７３に記載の方法であって、前記ヌクレオシドがリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの混合物を含む方法。
（項目７６）
項目７３に記載の方法であって、前記Ｇが８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、７−アリル−８−オキソグアノシン、グアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体、イノシンおよびネブラリンからなる群から選ばれるグアノシン誘導体である方法。
（項目７７）
リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物とＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目７８）
項目７７に記載の方法であって、前記混合物がグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体を含む方法。
（項目７９）
ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の、ＵＵＧＵＧＧ、ＵＧＧＵＵＧ、ＧＵＧＵＧＵおよびＧＧＧＵＵＵからなる群から選ばれる配列を含む単離Ｇ、Ｕ−リッチ・オリゴヌクレオチドとＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目８０）
項目７９に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドがオリゴリボヌクレオチドである方法。
（項目８１）
項目７９に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが７〜５０塩基長である方法。（項目８２）
項目７９に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが１２〜２４塩基長である方法。
（項目８３）
項目７９に記載の方法であって、前記オリゴヌクレオチドが配列５’−ＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧ−３’（配列番号１）を有する方法。
（項目８４）
ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の、少なくとも１つのＧ−Ｕ塩基対を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子とＴＬＲ８を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目８５）
ＴＬＲ８媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８リガンドとＴＬＲ８を接触させる工程、および
ＴＬＲ８以外のＴＬＲによって媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ８以外のＴＬＲのリガンドと、ＴＬＲ８以外のＴＬＲを接触させる工程
を含む、ＴＬＲ８媒介性免疫反応を補強する方法。
（項目８６）
免疫反応が低下している被験体に有効量のＴＬＲ８リガンドを投与してＴＬＲ８媒介性免疫反応を誘起する工程、および
該被験体に有効量の、ＴＬＲ８以外のＴＬＲのリガンドを投与して該ＴＬＲ８以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起する工程
を含む、被験体のＴＬＲ８媒介性免疫反応を補強する方法。
（項目８７）
項目８６に記載の方法であって、前記ＴＬＲ８以外のＴＬＲがＴＬＲ９である方法。
（項目８８）
項目８７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ９のリガンドがＣｐＧ核酸である方法。
（項目８９）
項目８８に記載の方法であって、前記ＣｐＧ核酸の主鎖が安定化されている方法。
（項目９０）
項目８７に記載の方法であって、前記ＴＬＲ８のリガンドおよび前記ＴＬＲ９のリガンドが１つの結合体である方法。
（項目９１）
項目９０に記載の方法であって、前記結合体が二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖を含む方法。
（項目９２）
項目９０に記載の方法であって、前記結合体がキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む方法。
（項目９３）
項目９２に記載の方法であって、前記キメラ主鎖が前記ＤＮＡと前記ＲＮＡとの間に切断部位を含む方法。
（項目９４）
ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離グアノシンリボヌクレオシドとＴＬＲ７を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目９５）
項目９４に記載の方法であって、前記グアノシンリボヌクレオシドが８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、７−アリル−８−オキソグアノシン、グアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体、イノシンおよびネブラリンからなる群から選ばれるグアノシンリボヌクレオシド誘導体である方法。
（項目９６）
項目９５に記載の方法であって、前記グアノシンリボヌクレオシド誘導体が８−オキソグアノシンである方法。
（項目９７）
項目９４に記載の方法であって、前記グアノシンヌクレオシドがリボヌクレオシドである方法。
（項目９８）
項目９７に記載の方法であって、前記グアノシンヌクレオシドがリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの混合物を含む方法。
（項目９９）
ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の、末端酸化もしくはハロゲン化グアノシンを含む単離核酸とＴＬＲ７を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目１００）
項目９９に記載の方法であって、前記酸化もしくはハロゲン化グアノシンが８−オキソグアノシンである方法。
（項目１０１）
ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離ＲＮＡとＴＬＲ７を接触させること
を含む、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目１０２）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである方法。
（項目１０３）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡがリボソームＲＮＡである方法。
（項目１０４）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡが転移ＲＮＡである方法。
（項目１０５）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡである方法。
（項目１０６）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡがウイルスＲＮＡである方法。
（項目１０７）
項目１０１に記載の方法であって、前記ＲＮＡがＧ−リッチＲＮＡである方法。
（項目１０８）
項目１０７に記載の方法であって、さらに前記ＲＮＡがＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の一部である方法。
（項目１０９）
項目１０７に記載の方法であって、前記ＲＮＡが本質的にグアノシンリボヌクレオシドからなる方法。
（項目１１０）
リボヌクレオシドバナシル錯体の混合物とＴＬＲ７を接触させる工程
を含む、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法。
（項目１１１）
項目１１０に記載の方法であって、前記混合物がグアノシンリボヌクレオシドバナシル錯体を含む方法。
（項目１１２）
ＴＬＲ７媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７リガンドとＴＬＲ７を接触させる工程、および
ＴＬＲ７以外のＴＬＲによって媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量の、ＴＬＲ７以外のＴＬＲのリガンドと、ＴＬＲ７以外のＴＬＲを接触させる工程
を含む、ＴＬＲ７媒介性免疫反応を補強する方法。
（項目１１３）
免疫反応が低下している被験体に有効量のＴＬＲ７リガンドを投与してＴＬＲ７媒介性免疫反応を誘起する工程、および
該被験体に有効量の、ＴＬＲ７以外のＴＬＲのリガンドを投与して該ＴＬＲ７以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起する工程
を含む、被験体のＴＬＲ７媒介性免疫反応を補強する方法。
（項目１１４）
項目１１３に記載の方法であって、前記ＴＬＲ７以外のＴＬＲがＴＬＲ９である方法。
（項目１１５）
項目１１４に記載の方法であって、前記ＴＬＲ９のリガンドがＣｐＧ核酸である方法。
（項目１１６）
項目１１５に記載の方法であって、前記ＣｐＧ核酸の主鎖が安定化されている方法。
（項目１１７）
項目１１４に記載の方法であって、前記ＴＬＲ７のリガンドおよび前記ＴＬＲ９のリガンドが１つの結合体である方法。
（項目１１８）
項目１１７に記載の方法であって、前記結合体が二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖を含む方法。
（項目１１９）
項目１１７に記載の方法であって、前記結合体がキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む方法。（項目１２０）
項目１１９に記載の方法であって、前記キメラ主鎖が前記ＤＮＡと前記ＲＮＡとの間に切断部位を含む方法。
（項目１２１）
対照ＲＮＡに反応するＴＬＲ８媒介性対照シグナルを測定する工程、
免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ８媒介性試験シグナルを測定する工程、および
該ＴＬＲ８媒介性試験シグナルを該ＴＬＲ８媒介性対照シグナルと比較する工程
を含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法。
（項目１２２）
対照のイミダゾキノリンに反応するＴＬＲ８媒介性対照シグナルを測定する工程、
免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ８媒介性試験シグナルを測定する工程、および
該ＴＬＲ８媒介性試験シグナルを該ＴＬＲ８媒介性対照シグナルと比較する工程
を含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法。
（項目１２３）
項目１２２に記載の方法であって、前記イミダゾキノリンがレシキモッド（Ｒ−８４８）である方法。
（項目１２４）
項目１２２に記載の方法であって、前記イミダゾキノリンがイミキモッド（Ｒ−８３７）である方法。
（項目１２５）
対照の７−アリル−８−オキソグアノシンに反応するＴＬＲ７媒介性対照シグナルを測定する工程、
免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ７媒介性試験シグナルを測定する工程、および
該ＴＬＲ７媒介性試験シグナルを該ＴＬＲ７媒介性対照シグナルと比較する工程
を含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法。
（項目１２６）
対照のイミダゾキノリンに反応するＴＬＲ７媒介性対照シグナルを測定する工程、
免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ７媒介性試験シグナルを測定する工程、および
該ＴＬＲ７媒介性試験シグナルを該ＴＬＲ７媒介性対照シグナルと比較する工程
を含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法。
（項目１２７）
項目１２６に記載の方法であって、前記イミダゾキノリンがレシキモッド（Ｒ−８４８）である方法。
（項目１２８）
項目１２６に記載の方法であって、前記イミダゾキノリンがイミキモッド（Ｒ−８３７）である方法。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の一部は、本発明者による特定の免疫賦活性ＲＮＡおよびＲＮＡ様（以下、単に「ＲＮＡ」という）分子の新規な発見に基づくものである。本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基配列であって、必要に応じて、その少なくとも１つのＧをＧの変異体もしくはホモログとし、および／またはその少なくとも１つのＵを独立にＵの変異体もしくはホモログとすることができる塩基配列を必要とすると、本発明者は考えている。意外なことに、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、一本鎖または少なくとも部分的に二本鎖とすることができる。しかも意外なことに、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、その免疫賦活効果を発揮するのにＣｐＧモチーフを必要としない。特定の理論もしくはメカニズムに捕らわれているということではなく、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が、ＭｙＤ８８依存性経路、恐らくＴＬＲを介してシグナルを伝達するというのは、本発明者の見解である。また、特定の理論もしくはメカニズムに捕らわれているということではなく、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７もしくはまだ確認されていない他のなんらかのＴＬＡを介してシグナルを伝達するということも、本発明者の見解である。
【０００８】
また、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子は、免疫を誘起することができる天然のＲＮＡ分子の１クラスを表すものとも、本発明者は考えている。特定の理論もしくはメカニズムに捕らわれているということではなく、これに相当する天然ＲＮＡ分子のクラスが、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）として存在するというのは、本発明者の見解である。このことに関連して、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が５〜４０ヌクレオチド長程度の小さなものであることに留意されたい。このような短いＲＮＡ分子は、癌抗原に対する免疫反応を誘起することを目的として樹状細胞を形質転換するのに有用と報告されている完全長のメッセンジャーＲＮＡの範囲から外れている。例えば、ボクツコウスキー・Ｄほか（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９６年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８４：ｐ４６５−７２；ミッチェル・Ｄ・Ａほか（Ｍｉｔｃｈｅｌ  Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）カレント・オピニョン・イン・モレキュラー・セラピューティクス（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）２：ｐ１７６−８１を参照されたい。
【０００９】
また、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が、ＲＮＡの安定化、ＲＮＡ分子の局所への集合
および／または細胞のエンドソームコンパートメントへのＲＮＡ分子の輸送に対して促進する特定の物質と有利に併用することができることも、本発明によって発見した。特に、この点において特定の脂質および／またはリポソームが有用であることを本発明により発見した。例えば、特定の陽イオン性脂質、例えば、特にＮ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）は、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子と併用すると、特に有利である。別の例として、このＲＮＡに、例えばこのＲＮＡの３’末端に、コレステリル部分を共有結合させると、陽イオン性脂質が存在しなくても、このＲＮＡの免疫賦活効果が増強される。
【００１０】
本発明は、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子に関連した組成物および方法を提供する。この組成物および方法は、とりわけ、イン・ビボ（生体内）、イン・ビトロ（試験管内）およびエクス・ビボ（生体外）での免疫細胞の賦活化、感染の治療、癌の治療、医薬組成物の調製、本発明の免疫賦活性ＲＮＡの標的受容体の特定、ならびに別の免疫賦活性化合物のスクリーニングおよび特徴付けに有用である。さらに、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子に関連した組成物および方法は、他の免疫賦活性の組成物、およびこのような他の免疫賦活性の組成物に関連した方法とも有利に併用することができる。
【００１１】
一態様として、本発明は、免疫賦活性組成物を提供する。本発明のこの態様による免疫賦活性組成物は、少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡオリゴマー、ならびに、必要に応じて陽イオン性脂質を含む。このＲＮＡオノゴマーは、天然由来のものでも非天然由来のものでもよい。一実施態様として、天然由来のＲＮＡオノゴマーは、原核生物ＲＮＡ由来のものとすることができ、別の実施態様として、真核生物ＲＮＡ由来のものとすることができる。さらに、天然由来のＲＮＡオノゴマーは、リボソームＲＮＡの一部を含むことができる。非天然由来のＲＮＡオノゴマーは、細胞外で、例えば、当業者に既知の化学的方法を用いて合成したＲＮＡ分子を含むことができる。一実施態様として、ＲＮＡオノゴマーは、天然由来ＲＮＡオノゴマーの誘導体を含むことができる。
【００１２】
一実施態様として、上記単離ＲＮＡオリゴマーは、以下に定義するようなＧ、Ｕ−リッチＲＮＡである。
【００１３】
一実施態様として、上記Ｇ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＲＵＲＧＹ−３’によって示されるような塩基配列を含み、Ｒがプリン、Ｕがウラシル、Ｇがグアニン、Ｙがピリミジンを表すものとする少なくとも５ヌクレオチド長の単離ＲＮＡ分子である。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＧＵＡＧＵ−３’によって示されるような塩基配列を含み、Ａがアデニンを表すものとする少なくとも５ヌクレオチド長の単離ＲＮＡ分子である。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＧＵＡＧＵＧＵ−３’によって示されるような塩基配列を含む単離ＲＮＡ分子である。
【００１４】
一実施態様として、上記Ｇ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＧＵＵＧＢ−３’によって示されるような塩基配列を含み、ＢがＵ、ＧまたはＣを表すものとする少なくとも５ヌクレオチド長の単離ＲＮＡ分子である。
【００１５】
一実施態様として、上記Ｇ、Ｕ含有免疫賦活性ＲＮＡは、５’−ＧＵＧＵＧ−３’によって示されるような塩基配列を含む少なくとも５ヌクレオチド長の単離ＲＮＡ分子である。
【００１６】
その他の実施態様として、この単離ＲＮＡ分子は、前述の配列のうちの任意のものの倍数単位、前述の配列のうちの任意のものの組合せ、または前述の配列のうちの任意のものの倍数単位を含む前述の配列のうちの任意のものの組合せを含有することができる。これらの倍数単位および組合せについては、直接結合させることができるが、間接的に、即ち、ヌクレオシドもしくは配列を介在させることによっても結合させることができる。一実施態様として、この結合に介在させるヌクレオシドはＧであり、一実施態様として、この結合介在性ヌクレオシドはＵである。
【００１７】
一実施態様として、上記塩基配列は５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を含む。一実施態様として、この塩基配列は５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’である。
【００１８】
別の実施態様として、この塩基配列は５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む。一実施態様として、この塩基配列は５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’である。
【００１９】
さらに別の実施態様として、この塩基配列は５’−ＣＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む。一実施態様として、この塩基配列は５’−ＣＵＡＧＧＣＡＣ−３’である。
【００２０】
またさらに別の実施態様として、この塩基配列は５’−ＣＵＣＧＧＣＡＣ−３’を含む。一実施態様として、この塩基配列は５’−ＣＵＣＧＧＣＡＣ−３’である。
【００２１】
一実施態様として、前記オリゴマーは５〜１２ヌクレオチド長である。一実施態様として、このオリゴマーは８〜１２ヌクレオチド長である。
【００２２】
また、本発明のこの態様によれば、一実施態様として、上記塩基配列はＣｐＧジヌクレオチドを欠く。従って、この実施態様では前記免疫賦活性ＲＮＡはＣｐＧ核酸ではない。
【００２３】
本発明のこの態様による一部の実施態様として、上記ＲＮＡオリゴマーの塩基配列は少なくとも部分的に自己相補的である。一実施態様として、この自己相補性の程度は少なくとも５０パーセントである。この自己相補性の程度は１００パーセントにまで及び、１００パーセントを含むことができる。従って、例えば、種々の実施態様として、この少なくとも部分的に自己相補性のＲＮＡオリゴマーの塩基配列は、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または１００パーセント自己相補的である。相補性塩基対としては、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）、アデニン−ウラシル（Ａ−Ｕ）、アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）、およびグアニン−ウラシル（Ｇ−Ｕ）が挙げられる。Ｇ−Ｕ「ゆらぎ」塩基対合は、リボソームＲＮＡおよびＲＮＡレトロウイルスでかなりよく見られるが、通常の、Ｇ−Ｃ、Ａ−ＴもしくはＡ−Ｕ間のワトソン−クリック塩基対合より幾分弱いものである。部分的自己相補性配列は、自己相補性配列の部分を１つ以上含むことができる。部分的自己相補性配列を必要とする実施態様では、前記ＲＮＡオリゴマーは、このオリゴマーの各末端に位置し、この各末端を含む自己相補性部分を包含することができる。
【００２４】
本発明のこの態様による一実施態様として、このオリゴマーは、複数のオリゴマー、即ち、少なくとも１つのグアニン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含む塩基対を有するそれぞれ６〜４０ヌクレオチド長の複数のＲＮＡオリゴマーである。この複数のオリゴマーは、少なくとも部分的に互いに相補性である配列を含むことができるが、これを必要とするものではない。一実施態様として、この複数のオリゴマーには、第１の塩基配列を有するオリゴマーおよび第２の塩基配列を有するオリゴマーが含まれ、この第１の塩基配列と第２の塩基配列とは少なくとも５０パーセントの相補性を有する。従って、例えば、種々の実施態様として、前記少なくとも部分的に相補性の塩基配列は、少なくとも５０パーセント、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、または１００パーセント相補的である。上述の場合のように、相補性塩基対としては、グアニン−シトシン（Ｇ−Ｃ）、アデニン−ウラシル（Ａ−Ｕ）、アデニン−チミン（Ａ−Ｔ）、およびグアニン−ウラシル（Ｇ−Ｕ）が挙げられる。部分的相補性配列は、相補性配列の部分を１つ以上含むことができる。部分的相補性配列を必要とする実施態様では、前記ＲＮＡオリゴマーは、このオリゴマーの少なくとも一端に位置し、この末端を含む相補性部分を含有することができる。
【００２５】
一実施態様として、このオリゴマーは、５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を含む配列を有するオリゴマーおよび５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を含む配列を有するオリゴマーをそれぞれ含有する複数のオリゴマーである。一実施態様として、このオリゴマーは、塩基配列５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’を有するオリゴマーおよび塩基配列５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’を有するオリゴマーを含む複数のオリゴマーである。
【００２６】
さらに、本発明のこの態様によれば、種々の実施態様として、このオリゴマーは、非天然型主鎖結合、修飾塩基、修飾糖、またはこれらの任意の組合せを含む。この非天然型主鎖結合は、安定化された結合、即ち、ホスホジエステル結合に比し、ＲＮＡ分解酵素もしくは核酸分解酵素による分解に対して比較的抵抗性の結合とすることができる。一実施態様として、この非天然型主鎖結合は、ホスホロチオエート結合である。このオリゴマーは、１つの非天然型主鎖結合、またはそれぞれその他とは独立に選ばれる複数の非天然型主鎖結合を含むことができる。上記修飾塩基は、本発明のこの態様による塩基配列の少なくとも１つのＧおよび少なくとも１つのＵを含む、Ｇ、Ｕ、ＡもしくはＣの修飾体とすることができる。一部の実施態様として、この修飾塩基は、７−デアザグアノシン、８−アザグアノシン、５−メチルウラシル、およびシュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）から選ぶことができる。このオリゴマーは、１つの修飾塩基、またはそれぞれその他とは独立に選ばれる複数の修飾塩基を含むことができる。上記修飾糖は、メチル化糖のアラビノースとすることができる。このオリゴマーは、１つの修飾糖、またはそれぞれその他とは独立に選ばれる複数の修飾糖を含むことができる。
【００２７】
一実施態様として、前記陽イオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）である。ＤＯＴＡＰは、ＲＮＡオリゴマーを細胞中へ輸送し、エンドソーム・コンパートメントへ特異的に出入りして、このコンパートメントでｐＨ依存性にこのＲＮＡオリゴマーを遊離させることができる。このＲＮＡは、一旦エンドソーム・コンパートメントに入れば、特定の細胞内トル様受容体分子（ＴＬＲ）と相互作用して、免疫反応の形成に関与するＴＬＲ媒介性シグナル変換経路を作動させることができる。エンドソーム・コンパートメントへの輸送などの同様な性質を有するその他の物質も、ＤＯＴＡＰの代わりに、あるいはこれに加えて用いることができる。
【００２８】
一実施態様として、前記免疫賦活性組成物は、さらに抗原を含む。一実施態様として、この抗原はアレルゲンである。一実施態様として、この抗原は癌抗原である。一実施態様として、この抗原は微生物抗原である。
【００２９】
また、本発明のこの態様によれば、別の実施態様として、本発明は医薬用組成物である。この医薬用組成物は、本発明の免疫賦活性組成物、および医薬用として許容可能な担体を含む。また、この医薬用組成物を調製する方法も提供する。この方法は、免疫賦活性組成物を医薬用として許容可能な担体と接触させて配置するものである。この医薬用組成物は、便宜のため、単位投与量として配合することができる。
【００３０】
別の態様として、本発明は、免疫細胞を賦活化する方法を提供する。この方法は、免疫細胞の賦活化を誘起するのに有効な量の上記本発明の免疫賦活性組成物を免疫細胞に接触させるものである。一実施態様として、免疫細胞の賦活化は、この免疫細胞によるサイトカインの分泌を伴うものである。一実施態様として、このサイトカインは、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン（ＩＦＮ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）からなる群から選ばれる。一実施態様として、免疫細胞の賦活化は、ケモカインの分泌を含む。一実施態様として、この分泌ケモカインは、インターフェロン・ガンマにより誘導される蛋白１０（ＩＰ−１０）である。一実施態様として、免疫細胞の賦活化は、免疫細胞による共起刺激／アクセサリー分子の発現を含む。一実施態様として、この共起刺激／アクセサリー分子は、細胞内粘着分子（ＩＣＡＭ、例えば、ＣＤ５４）、白血球機能関連抗原（ＬＦＡ、例えば、ＣＤ５８）、Ｂ７（ＣＤ８０、ＣＤ８６）、およびＣＤ４０からなる群から選ばれる。
【００３１】
また、本発明のこの態様によれば、一実施態様として、免疫細胞の賦活化は、ＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路を賦活化するものである。ＭｙＤ８８は、種々のトル様受容体（ＴＬＲ）分子のトル／インターロイキン−１受容体（ＴＩＲ）ドメインと相互作用し、シグナル変換経路に関与して最終的に核因子カッパＢ（ＮＦ−κＢ）の賦活化をもたらすアダプター分子であると考えられている。従って、一実施態様として、ＭｙＤ８８依存性シグナル変換経路はＴＬＲと関連づけられる。より詳細には、一実施態様として、このＴＬＲはＴＬＲ８である。別の実施態様として、このＴＬＲはＴＬＲ７である。
【００３２】
また、本発明のこの態様によれば、一実施態様として、免疫細胞はヒト免疫細胞である。一実施態様として、この免疫細胞は骨髄樹状細胞である。
【００３３】
本発明のこの態様の一実施態様として、前記接触はイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で行う。別の実施態様として、この接触は生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で行う。
【００３４】
別の態様として、本発明は、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体に対し、被験体の免疫反応を誘起するのに有効な量で、本発明の免疫賦活性組成物を投与するものである。本発明のこの態様による方法は、被験体に対し抗原を投与するものではないことに留意されたい。一実施態様として、この被験体はヒトである。一実施態様として、この被験体は癌に罹患しているか、罹患するリスクを有する者である。一実施態様として、この被験体は、ウイルス、細菌、および寄生生物からなる群から選ばれる外的病原因子（ａｇｅｎｔ）に感染しているか、感染するリスクのある者である。特定の実施態様として、この被験体は、ウイルスに感染しているか、感染するリスクのある者である。また、本発明のこの態様による方法は、有効な、もしくは所望の免疫反応を生じる能力が抑制されている被験体を治療するために用いることができることにも留意されたい。例えば、この被験体は、感染、癌、腎もしくは肝不全などの急性または慢性疾患、手術、および化学療法、放射線療法、特定の薬剤などの免疫抑制因子への暴露により免疫系が抑制されている者とすることができる。一実施態様として、この被験体は、アレルギーもしくは喘息に罹患しているか、罹患するリスクのある者とすることができる。このような被験体は、被験体のアレルギー反応もしくは喘息と関連があるアレルゲンに接触しているか、接触するリスクのある者とすることができる。
【００３５】
さらに別の態様として、本発明は、被験体の免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体に抗原を投与した後、この抗原に対する免疫反応を誘起するのに有効な量で、本発明の免疫賦活性組成物をこの被験体に投与するものである。この抗原の投与は、本発明の免疫賦活性組成物投与の前でも後でも、あるいは同時にでも行うことができることに留意されたい。さらに、この抗原および免疫賦活性組成物は、被験体に対し、２回以上投与することができる。
【００３６】
本発明のこの態様による一実施態様として、この抗原はアレルゲンである。本発明のこの態様による一実施態様として、この抗原は癌抗原である。一実施態様として、この癌抗原は、その被験体から単離された癌抗原とすることができる。前記微生物抗原は、ウイルス、細菌、真菌もしくは寄生生物の抗原とすることができる。
【００３７】
さらに、本発明は、さらに別の態様として、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体の樹状細胞を単離し、この樹状細胞を生体外で（ｅｘ  ｖｉｖｏ）本発明の免疫賦活性組成物と接触させた後、この樹状細胞を生体外で抗原と接触させ、こうして接触させた後の樹状細胞をこの被験体に投与するものである。
【００３８】
本発明のこの態様による一実施態様として、この抗原はアレルゲンである。本発明のこの態様による一実施態様として、この抗原は癌抗原である。一実施態様として、この癌抗原は、その被験体から単離された癌抗原とすることができる。別の実施態様として、この抗原は微生物抗原である。この微生物抗原は、ウイルス、細菌、真菌もしくは寄生生物の抗原とすることができる。
【００３９】
１つのＴＬＲを賦活化することにより生じる免疫反応は、別のＴＬＲを賦活化することによって修飾、増強もしくは増幅することができ、この免疫賦活効果の連係は相乗的なものとすることができる。例えば、ＴＬＲ９は、細菌性ＤＮＡ、より一般的には、ＣｐＧ  ＤＮＡに反応すると報告されている。ＴＬＲ９がその天然のリガンド（もしくは任意のＴＬＲ９リガンド）と接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ７をＴＬＲ７リガンドと選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ８をＴＬＲ８リガンドと選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても修飾、増強もしくは増幅することができる。同様に、ＴＬＲ７がＴＬＲ７リガンドと接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ８をＴＬＲ８リガンドと選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ９をＣｐＧ  ＤＮＡ（もしくは任意の適当なＴＬＲ９リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても修飾、増強もしくは増幅することができる。さらに別の例として、ＴＬＲ８がＴＬＲ８リガンドと接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ７をＴＬＲ７リガンドと選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ９をＣｐＧ  ＤＮＡ（もしくは任意の適当なＴＬＲ９リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても修飾、増強もしくは増幅することができる。
【００４０】
本発明の一部は、本発明者が、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対する天然のリガンドと考えられるものを新規に発見したことに基づいている。微生物由来の天然リガンドは一部のＴＬＲに関して報告されているが、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８に対する天然のリガンドは、これまで報告されていなかった。一部の合成低分子、イミダゾキノリン系化合物がＴＬＲ７のリガンドとして報告されているが、このような化合物は本発明の天然リガンドとは区別されるべきである。ヘンミ・Ｈほか（Ｈｅｍｍｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）（２００２年）  ネイチャー・イムノロジー（Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）３：ｐ１９６−２００参照。
【００４１】
ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の単離した天然リガンド類は、免疫反応を誘起、増強および補強することができる組成物として有用である。また、このＴＬＲ７およびＴＬＲ８の天然リガンド類は、免疫反応を誘起、増強および補強することができる新規な組成物を調製するのに有用である。さらに、このＴＬＲ７およびＴＬＲ８の天然リガンド類は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が媒介するシグナル伝達を選択的に誘起し、また、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８が媒介する免疫反応を選択的に誘起するのに有用である。さらに、このＴＬＲ７およびＴＬＲ８の天然リガンド類は、免疫賦活性化合物を特定および選択するためのスクリーニング法をデザインし、実施するのに有用である。
【００４２】
また、本発明の一部は、ヒト好中球がＴＬＲ８を強く発現するという本発明による新規発見に基づいている。この知見は、好中球が感染性病原体を結合し、それによって反応を誘発する最初の細胞となる場合が非常に多いので、重要である。賦活化された好中球は、ケモカインおよびサイトカインを分泌し、それによりこれらが樹状細胞を動員するのに貢献していると考えられる。この賦活化好中球のサイトに引き寄せられたＴＬＲ発現性樹状細胞は、そこで賦活化されることによって免疫反応を増幅する。
【００４３】
また、本発明の一部は、免疫系のさまざまな細胞におけるＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９などの種々のＴＬＲの識別的発現についての理解に基づいている。この識別は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９に関し、ヒトで特に重要である。これらのＴＬＲのうちの任意の１種を賦活化することにより生じる免疫反応は、別のＴＬＲを賦活化することによって増強もしくは増幅することができ、この免疫賦活化効果の連係は相乗的である。例えば、ＴＬＲ９は細菌性ＤＮＡ、より一般的には、ＣｐＧ  ＤＮＡに反応すると報告されている。ＴＬＲ９がその天然のリガンド（もしくは任意のＴＬＲ９リガンド）と接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ７をその天然リガンド（もしくは任意の適当なＴＬＲ７リガンド）と選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ８をその天然リガンド（もしくは任意の適当なＴＬＲ８リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても増強もしくは増幅させることができる。同様に、ＴＬＲ７がその天然リガンド（もしくは任意のＴＬＲ７リガンド）と接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ８をその天然リガンド（もしくは任意の適当なＴＬＲ８リガンド）と選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ９をＣｐＧ  ＤＮＡ（もしくは任意の適当なＴＬＲ９リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても増強もしくは増幅させることができる。さらに別の例として、ＴＬＲ８がその天然リガンド（もしくは任意のＴＬＲ８リガンド）と接触することにより生じる免疫反応は、ＴＬＲ７をその天然リガンド（もしくは任意の適当なＴＬＲ７リガンド）と選択的に接触させることによっても、またはＴＬＲ９をＣｐＧ  ＤＮＡ（もしくは任意の適当なＴＬＲ９リガンド）と選択的に接触させることによっても、あるいはこれらの両者によっても増強もしくは増幅させることができる。
【００４４】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８のリガンドを、ＴＬＲ８シグナル伝達を誘起するのに有効な量で含むと共に、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０からなる群から選ばれる別のＴＬＲのリガンドを、この別のリガンドによりシグナル伝達を誘起するのに有効な量で含む組成物を提供する。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ３である。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ７である。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ９である。一実施態様として、ＴＬＲ８のリガンドと別のＴＬＲのリガンドとは結合されている。さらに別の実施態様として、この組成物は、さらに医薬用として許容可能な担体を含む。
【００４５】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７のリガンドを、ＴＬＲ７シグナル伝達を誘起するのに有効な量で含むと共に、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９およびＴＬＲ１０からなる群から選ばれる別のＴＬＲのリガンドを、この別のリガンドによりシグナル伝達を誘起するのに有効な量で含む組成物を提供する。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ３である。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ８である。一実施態様として、別のＴＬＲはＴＬＲ９である。一実施態様として、ＴＬＲ７のリガンドと別のＴＬＲのリガンドとは結合されている。さらに別の実施態様として、この組成物は、さらに医薬用として許容可能な担体を含む。
【００４６】
別の態様として、本発明は、ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体を含む組成物であって、この結合体のＤＮＡが、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効な免疫賦活性モチーフを含み、かつこの結合体のＲＮＡが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８もしくはこれらの任意の組合せによるシグナル伝達を賦活化するのに有効なＲＮＡを含む組成物を提供する。一実施態様として、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効なこの免疫賦活性モチーフはＣｐＧモチーフである。別の実施態様として、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効なこの免疫賦活性モチーフはポリ−ｄＴである。さらに別の実施態様として、ＴＬＲ９シグナル伝達を賦活化するのに有効なこの免疫賦活性モチーフはポリ−ｄＧである。一実施態様として、上記結合体は、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む。一実施態様として、この結合体は、そのＤＮＡとＲＮＡとの間に切断部位を有する。一実施態様として、この結合体は、二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡのヘテロ二重鎖を含む。さらに別の実施態様として、上記組成物は、さらに医薬用として許容可能な担体を含む。
【００４７】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離ＲＮＡをＴＬＲ８と接触させるものである。一実施態様として、このＲＮＡは二本鎖ＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはリボソームＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡは転移ＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはウイルスＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはＧ、Ｕ−リッチＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡは本質的にＧおよびＵからなるものである。
【００４８】
さらに別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、１Ｇ：５０Ｕ〜１０Ｇ：１Ｕの割合で本質的にＧおよびＵからなるヌクレオシドの混合物を、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ８と接触させるものである。一実施態様として、このヌクレオシドはリボヌクレオシドである。一実施態様として、このヌクレオシドはリボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの混合物を含む。一実施態様として、このＧは、８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、７−アリル−８−オキソグアノシン、グアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体、イノシンおよびネブラリンからなる群から選ばれるグアノシン誘導体である。
【００４９】
さらに別の態様の本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物をＴＬＲ８と接触させるものである。一実施態様として、この混合物はグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体を含む。
【００５０】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、ＵＵＧＵＧＧ、ＵＧＧＵＵＧ、ＧＵＧＵＧＵおよびＧＧＧＵＵＵからなる群から選ばれる配列を含むＧ、Ｕ−リッチ単離オリゴヌクレオチドを、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ８と接触させるものである。一実施態様として、このオリゴヌクレオチドはオリゴリボヌクレオチドである。一実施態様として、このオリゴヌクレオチドは７〜５０塩基長である。一実施態様として、このオリゴヌクレオチドは１２〜２４塩基長である。一実施態様として、このオリゴヌクレオチドは５’−ＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧ−３’（配列番号１）の配列を有する。
【００５１】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、少なくとも１つのＧ−Ｕ塩基対を含む少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子を、ＴＬＲ８シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ８と接触させるものである。
【００５２】
さらに別の態様として、本発明は、ＴＬＲ８媒介性免疫反応を補強する方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ８媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８リガンドをＴＬＲ８と接触させた後、ＴＬＲ８以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８以外のＴＬＲのリガンドをＴＬＲ８以外のＴＬＲと接触させるものである。
【００５３】
別の態様として、本発明は、被験体のＴＬＲ８媒介性免疫反応を補強する方法を提供する。この態様による方法は、免疫反応が低下している被験体に対し、ＴＬＲ８媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８リガンドを投与した後、この被験体に、ＴＬＲ８以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ８以外のＴＬＲのリガンドを投与するものである。一実施態様として、このＴＬＲ８以外のＴＬＲは、ＴＬＲ９である。一実施態様として、ＴＬＲ９のリガンドはＣｐＧ核酸である。一実施態様として、このＣｐＧ核酸は安定化した主鎖を有する。一実施態様として、ＴＬＲ８のリガンドおよびＴＬＲ９のリガンドは１つの結合体である。一実施態様として、この結合体は二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡのヘテロ二重鎖を含む。一実施態様として、この結合体はキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む。一実施態様として、このキメラ主鎖はそのＤＮＡとＲＮＡとの間に切断部位を有する。
【００５４】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離グアノシンリボヌクレオシドをＴＬＲ７と接触させるものである。一実施態様として、このグアノシンリボヌクレオシドは、８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、７−アリル−８−オキソグアノシン、グアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体、イノシンおよびネブラリンからなる群から選ばれるグアノシンリボヌクレオシド誘導体である。一実施態様として、このグアノシンリボヌクレオシド誘導体は８−オキソグアノシンである。一実施態様として、このグアノシンヌクレオシドは、リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドとの混合物を含む。
【００５５】
別の態様として、本発明はさらに、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、末端酸化またはハロゲン化グアノシンを含む単離核酸を、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ７と接触させるものである。一実施態様として、この末端酸化またはハロゲン化グアノシンは８−オキソグアノシンである。
【００５６】
別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量の単離ＲＮＡをＴＬＲ７と接触させるものである。一実施態様として、このＲＮＡは二本鎖ＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはリボソームＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡは転移ＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはウイルスＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡはＧ−リッチＲＮＡである。一実施態様として、このＲＮＡは、ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二重鎖の一部である。一実施態様として、このＲＮＡは、本質的にグアノシンリボヌクレオシドからなる。
【００５７】
さらに別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、１Ｇ：５０Ｕ〜１０Ｇ：１Ｕの割合で本質的にＧおよびＵからなるヌクレオシドの混合物を、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化するのに有効な量を用いてＴＬＲ７と接触させるものである。
【００５８】
さらに別の態様の本発明は、ＴＬＲ７シグナル伝達を賦活化する方法を提供する。この態様による方法は、リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物をＴＬＲ７と接触させるものである。一実施態様として、この混合物はグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体を含む。
【００５９】
さらに別の態様として、本発明は、ＴＬＲ７媒介性免疫反応を補強する方法を提供する。この態様による方法は、ＴＬＲ７媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７リガンドをＴＬＲ７と接触させた後、ＴＬＲ７以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７以外のＴＬＲのリガンドをＴＬＲ７以外のＴＬＲと接触させるものである。
【００６０】
さらに別の態様として、本発明は、被験体のＴＬＲ７媒介性免疫反応を補強する方法を提供する。この方法は、免疫反応が低下している被験体に対し、ＴＬＲ７媒介性免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７リガンドを投与した後、この被験体に、ＴＬＲ７以外のＴＬＲにより媒介される免疫反応を誘起するのに有効な量のＴＬＲ７以外のＴＬＲのリガンドを投与するものである。一実施態様として、このＴＬＲ７以外のＴＬＲは、ＴＬＲ９である。一実施態様として、ＴＬＲ９のリガンドはＣｐＧ核酸である。一実施態様として、このＣｐＧ核酸は安定化した主鎖を有する。一実施態様として、ＴＬＲ７のリガンドおよびＴＬＲ９のリガンドは１つの結合体である。一実施態様として、この結合体は二本鎖ＤＮＡ：ＲＮＡのヘテロ二重鎖を含む。一実施態様として、この結合体はキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む。一実施態様として、このキメラ主鎖はそのＤＮＡとＲＮＡとの間に切断部位を有する。
【００６１】
別の態様として、本発明は、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この態様による方法は、対照ＲＮＡに反応するＴＬＲ８媒介性対照シグナルを測定し、免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ８媒介性試験シグナルを測定して、このＴＬＲ８媒介性試験シグナルをＴＬＲ８媒介性対照シグナルと比較するものである。
【００６２】
さらに別の態様として、本発明は、対照のイミダゾキノリンに反応するＴＬＲ８媒介性対照シグナルを測定し、免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ８媒介性試験シグナルを測定して、このＴＬＲ８媒介性試験シグナルをＴＬＲ８媒介性対照シグナルと比較することを含む、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００６３】
また、本発明のさらに別の態様によって、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、対照のイミダゾキノリンに反応するＴＬＲ７媒介性対照シグナルを測定し、免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ７媒介性試験シグナルを測定して、このＴＬＲ７媒介試験シグナルをＴＬＲ７媒介対照シグナルと比較するものである。
【００６４】
一部の実施態様として、このイミダゾキノリンはレシキモッド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８）である。
【００６５】
一部の実施態様として、このイミダゾキノリンはイミキモッド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８３７）である。
【００６６】
また、別の態様として、本発明は、免疫賦活性候補化合物をスクリーニングする方法を提供する。この態様による方法は、対照の７−アリル−８−オキソグアノシンに反応するＴＬＲ媒介性対照シグナルを測定し、免疫賦活性候補化合物に反応するＴＬＲ７媒介性試験シグナルを測定して、このＴＬＲ７媒介試験シグナルをＴＬＲ７媒介対照シグナルと比較するものである。
【００６７】
本発明の諸限定はそれぞれ、本発明の種々の実施態様を含むことができる。従って、任意の１つの構成要素もしくは構成要素の組合せを含む本発明の諸限定は、それぞれ本発明の各態様に含めることができると想定される。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、選択したＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチド単独またはＤＯＴＡＰ併用（それぞれ、「リポソーム非併用」および「リポソーム併用」）などによる特定の刺激に対するヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）によるＩＬ−１２  ｐ４０分泌について、特異的酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した結果を示したものである。塩基配列中の小文字「ｓ」はホスホロチオエート結合を示す。
【図２】図２は、選択したＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチド単独またはＤＯＴＡＰ併用（それぞれ、「リポソーム非併用」および「リポソーム併用」）などによる特定の刺激に対するヒトＰＢＭＣによるＴＮＦ−α分泌について、特異的ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す棒グラフである。
【図３】図３は、選択したＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＯＴＡＰ併用）の種々の濃度に対するヒトＰＢＭＣによるＩＬ−１２  ｐ４０分泌の用量依存性について、特異的ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す棒グラフである。
【図４】図４は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドＧＵＡＧＧＣＡＣに近縁の選択した種々のＲＮＡオリゴヌクレオチド（ＤＯＴＡＰ併用）に対するヒトＰＢＭＣによるＴＮＦ−α分泌の用量依存性について、特異的ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す棒グラフである。
【図５】図５は、種々の刺激に対するヒトＰＢＭＣのＩＬ−１２  ｐ４０分泌に対するＤＯＴＡＰの効果について、特異的ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す棒グラフである。
【図６−１】図６は、種々の試験および対照免疫賦活性化合物に対するさまざまなタイプのマウス・マクロファージ細胞によるＩＬ−１２  ｐ４０分泌について、特異的ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す４組の棒グラフである。パネルＡ：ＩＦＮ−γ存在下の野性型マクロファージ、パネルＢ：ＩＦＮ−γ存在下のＭｙＤ８８欠損マクロファージ、パネルＣ：Ｊ７７４マクロファージ細胞株、パネルＤ：ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞株。
【図６−２】図６は、種々の試験および対照免疫賦活性化合物に対するさまざまなタイプのマウス・マクロファージ細胞によるＩＬ−１２  ｐ４０分泌について、特異的ＥＬＩＳＡにより測定した結果を示す４組の棒グラフである。パネルＡ：ＩＦＮ−γ存在下の野性型マクロファージ、パネルＢ：ＩＦＮ−γ存在下のＭｙＤ８８欠損マクロファージ、パネルＣ：Ｊ７７４マクロファージ細胞株、パネルＤ：ＲＡＷ２６４．７マクロファージ細胞株。
【図７】図７は、ＤＯＴＡＰ添加および無添加の下、ＨＩＶ−１由来ＲＮＡ配列とインキュベートした時の、ヒトＰＢＭＣによる（Ａ）ＴＮＦ−αおよび（Ｂ）ＩＬ−１２  ｐ４０の分泌を示す１対のグラフである。丸印：５’−ＧＵＡＧＵＧＵＧＵＧ−３’（配列番号２）、三角印：５’−ＧＵＣＵＧＵＵＧＵＧＵＧ−３’（配列番号３）。白抜き印：ＤＯＴＡＰ無添加、黒印：ＤＯＴＡＰ添加。
【図８】図８は、ＴＬＲ間の見かけの関連性を示したグラフである。
【図９】図９は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９内の核酸結合ドメインを示す。
【図１０】図１０は、緊縮応答因子（ＳＲＦ）に対するヒトＰＢＭＣの反応性を示した棒グラフである。
【図１１】図１１は、リボヌクレオシド・バナジル錯体（ＲＶＣ）に対するヒトＰＢＭＣの反応性を示した棒グラフである。Ｘはレシキモッドを表す。
【図１２】図１２は、個々のリボヌクレオシドに対するヒトＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８の反応性を示す一連の３組の棒グラフである。
【図１３】図１３は、２種のリボヌクレオシドの混合物に対するＴＬＲ７およびＴＬＲ８の反応性を示す一連の３組の棒グラフである。
【図１４】図１４は、リボヌクレオシドＧおよびＵの混合物に対するヒトＰＢＭＣの反応を示した棒グラフである。
【図１５】図１５は、Ｇ、Ｕ−リッチＲＮＡ（ＤＮＡではない）オリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの反応を示した棒グラフである。
【図１６】図１６は、酸化ＲＮＡに対するヒトＰＢＭＣの反応を示した棒グラフである。
【図１７】図１７は、酸化グアノシンリボヌクレオシドに対するヒトＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８の反応を示す一連の３組の棒グラフである。Ｘはレシキモッドを表す。
【図１８】図１８は、修飾グアノシンリボヌクレオシドに対するヒトＴＬＲ７の反応を示す１対の棒グラフである。
【図１９】図１９は、ヒトＣＤ１２３＋樹状細胞（ＣＤ１２３＋ＤＣ）、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣおよび好中球におけるＴＬＲ１〜ＴＬＲ９の識別的発現を示す一連の配列ゲル画像である。
【図２０】図２０は、短い一本鎖Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーが、ヒトＴＬＲ７もしくはヒトＴＬＲ８で安定的に形質転換したＨＥＫ−２９３細胞においてＮＦ−κＢを誘導することができることを示す一連の３組のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
（発明の詳細な説明）
本発明の一部は、免疫賦活性化合物として有効ないくつかのＲＮＡおよびＲＮＡ関連分子についての本発明者による発見に関する。これらの免疫賦活性化合物の同定は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の天然リガンドを同定することを目的とした系統的な努力の結果、達成されたものである。こうした努力により、ごく最近、グアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）を含有する特定の配列を含むＧおよびＵを含有するＲＮＡならびにＲＮＡ様分子は、免疫賦活性であり、ＭｙＤ８８依存性経路を介して作用するように思われ、このことはＴＬＲの関与を示すものであることを発見した。注目に値すべきなのは、これらのＲＮＡ配列の一部が、ウイルスの複製に重要な５’非翻訳領域の高度に保存された構造的特徴として存在することである。また、この同定した免疫賦活性ＲＮＡの配列は、細菌および酵母由来のｔＲＮＡ、ならびに細菌そして恐らく真核生物に由来するｒＲＮＡを含む他のＲＮＡにも符合、もしくは殆ど符合している。重要なことは、本発明の免疫賦活性ＲＮＡが、部分的もしくは完全に二本鎖のＲＮＡの他に、一本鎖ＲＮＡも含み、その作用をＲＮＡ分解酵素によって消失させることができることである。このＲＮＡが少なくとも部分的に二本鎖である場合、一実施態様として、これはステムループ構造を含むことができる。以下にさらに詳細を説明するが、５ヌクレオチド長程度の短い一本鎖Ｇ、Ｕ−リッチＲＮＡが免疫細胞を賦活化して、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、タイプ１インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）、ＩＰ−１０などのいくつかのサイトカインおよびケモカインを大量に産生させることができることを本発明によって発見した。
【００７０】
本発明者は、ごく最近、意外なことに、特定のＧ、Ｕ含有ＲＮＡ分子およびそのアナログは免疫賦活性であるが、これに対応するＤＮＡはそうではないことを発見した。注目に値すべきなのは、本発明のＧ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドは、以前に樹状細胞ワクチンを調製するのに有用と報告されたメッセンジャーＲＮＡよりずっと小さいものとすることができることである。例えば、ボクツコウスキー・Ｄほか（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９６年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８４：ｐ４６５−７２；ミッチェル・Ｄ・Ａほか（Ｍｉｔｃｈｅｌ
Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）カレント・オピニョン・イン・モレキュラー・セラピューティクス（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）２：ｐ１７６−８１を参照されたい。本発明のＧ、Ｕ含有ＲＮＡ分子は、天然に存在するリボソームＲＮＡおよび／またはウイルスＲＮＡの代用になることができるが、そのサイズについては５〜４０ヌクレオチド長程度の小さなものとすることができる。さらに本明細書で説明するように、本発明のＧ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＧおよび少なくとも１つのＵを含む。驚くべきことに、本発明のＧ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドからＧまたはＵを除去すると、その免疫賦活化効果が実質的に消失する。これらの少なくとも１つのＧおよび少なくとも１つのＵは、互いに隣接したものとすることができ、あるいは、ヌクレオシドもしくは配列を介在させることにより離隔することもできる。また、注目に値すべきなのは、本発明のＧ、Ｕ含有ＲＮＡ分子がＣｐＧジヌクレオチドを必要としないことである。
【００７１】
一態様として、本発明は、免疫賦活性組成物を提供する。本発明のこの態様による免疫賦活性組成物は、少なくとも１つのグアノシン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含有する塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の単離ＲＮＡオリゴマーを含む。さらに以下でより詳細に説明するが、この少なくとも１つのグアノシン（Ｇ）および少なくとも１つのウラシル（Ｕ）を含有する塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長の免疫賦活性ＲＮＡオリゴマーは、このＲＮＡオリゴマーを分解に対して安定化し、リポソームなどの粒子中もしくは粒子上に濃縮し、および／または細胞のエンドソーム・コンパートメントへの送達の対象とすることができるように、有利に配合することができる。以下の実施例で説明する１つの配合例では、このＲＮＡオリゴマーは、エンドソーム・コンパートメントへこのＧ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドを輸送するのに役立つと考えられる陽イオン性脂質ＤＯＴＡＰと有利に併用することができる。従って、一態様として、本発明は、少なくとも１つのＧおよび少なくとも１つのＵを含有する塩基配列を有する５〜４０ヌクレオチド長のＲＮＡオリゴマーならびに、必要に応じて陽イオン性脂質を含む免疫賦活性組成物である。
【００７２】
本発明のこのＲＮＡオリゴマーは、天然もしくは非天然由来のものとすることができる。天然に存在する状態のＲＮＡは、一般に、特定のリボヌクレオシド単位の線状ポリマーであって、各リボヌクレオシド単位がプリンもしくはピリミジン塩基およびリボース糖で構成され、ヌクレオシド間がホスホジエステル結合によって連結されているものを意味する一種の核酸である。その際、「線状」とは、ＲＮＡの一次構造を表して言っている。一般に、ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であるが、部分的に二本鎖のものも含むことができる。
【００７３】
本明細書に用いている「ヌクレオシド」とは、置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））である交換可能な有機塩基に、単一の糖部分（例えば、リボースもしくはデオキシリボース）が結合したものを意味する。本明細書で述べたように、このヌクレオシドは天然のヌクレオシド、修飾したヌクレオシド、または合成（人工的）ヌクレオシドとすることができる。
【００７４】
「核酸」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義で用いられており、複数のヌクレオチド（即ち、リン酸基、および置換ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））または置換プリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））である交換可能な有機塩基に、糖（例えば、リボースもしくはデオキシリボース）が結合したものを含む分子）を意味する。本明細書に用いているこれらの用語は、オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドを意味する。また、これらの用語は、ポリヌクレオシド（即ち、ポリヌクレオチドからリン酸を除いたもの）および他の任意の有機塩基含有ポリマーを含むものとする。核酸分子は、既存の核酸供給源（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）からも得ることはできるが、好ましくは合成（例えば、核酸合成法により作製）したものである。
【００７５】
また、核酸およびオリゴヌクレオチドという用語は、塩基および／または糖部分などにおいて置換もしくは修飾した核酸またはオリゴヌクレオチドを含む。例えば、これらは、３’位および５’位においてそれぞれヒドロキシル基およびリン酸基以外の低分子量有機基に共有結合している主鎖糖を有する核酸を含む。このように修飾された核酸は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含むことができる。さらに、修飾核酸は、リボースの代わりにアラビノースなどの糖を含むことができる。従って、これらの核酸は、主鎖構成を異成分からなるものとすることができるため、（核酸塩基群を含むアミノ酸主鎖を有する）ペプチド核酸などの、互いに結合したポリマー単位の任意の可能な組合せを含むことができる。一部の実施態様として、これらの核酸は、主鎖構成が異成分からなるものである。また、核酸は、Ｃ−５プロピン修飾塩基などの置換されたプリンおよびピリミジンをも含む。ワーグナー・Ｒ・Ｗほか（Ｗａｇｎｅｒ  Ｒ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９６年）ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１４：ｐ８４０−４参照。プリンおよびピリミジンとしては、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに置換および非置換芳香族部分のその他の天然および非天然核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他のこのような修飾については、当業者によく知られている。
【００７６】
天然ヌクレオシド塩基は、例えば、ヒポキサンチン；ジヒドロウラシル；シュードウラシル；２−チオウラシル；４−チオウラシル；５−アミノウラシル；５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル；５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル；５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル；５−（ヒドロキシメチル）ウラシル；５−クロロウラシル；５−フルオロウラシル；５−ブロモウラシル；５−ヒドロキシシトシン；５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン；５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン；５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン；５−クロロシトシン；５−フルオロシトシン；５−ブロモシトシンＮ２−ジメチルグアニン；２，４−ジアミノ−プリン；８−アザプリン（特に、８−アザグアニンなど）；７−デアザ−７−置換および／または７−デアザ−８−置換プリンなどの置換７−デアザプリン（特に、７−デアザグアニンなど）；または天然ヌクレオシド塩基のその他の修飾体から選ばれる修飾ヌクレオシド塩基によって置換することができる。以上に挙げたものは例示的なものであり、限定的なものと解釈されるべきではない。
【００７７】
特に、免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有オリゴリボヌクレオチドの前記少なくとも１つのグアニン塩基は、７−デアザグアニンなどの置換もしくは修飾グアニン；８−アザグアニン；７−デアザ−７−置換グアニン（７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニンなど）；７−デアザ−８−置換グアニン；ヒポキサンチン；２，６−ジアミノプリン；２−アミノプリン；プリン；８−ヒドロキシグアニンなどの８−置換グアニン；および６−チオグアニンとすることができる。以上に挙げたものは例示的なものであり、限定的なものと解釈されるべきではない。
【００７８】
また、特に、免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有オリゴリボヌクレオチドの前記少なくとも１つのウラシル塩基は、シュードウラシルおよび５−メチルウラシルなどの置換もしくは修飾ウラシルとすることができる。
【００７９】
本発明に用いるための本発明の核酸は、当該分野で既知のいくつかの方法のどれを用いてもデノボに合成することができる。例えば、β−シアノエチルホスホラミダイト法（ボーケイジ・Ｓ・Ｌほか（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）（１９８１年）テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）２２：ｐ１８５９）；Ｈ−ホスホン酸ヌクレオシド法（ガレッグほか（Ｇａｒｅｇｇｅｔ  ａｌ．）（１９８６年）テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）２７：ｐ４０５１−４；フローラーほか（Ｆｒｏｅｈｌｅｒｅｔ  ａｌ．）（１９８６年）ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）１４：ｐ５３９９−４０７；ガレッグほか（Ｇａｒｅｇｇｅｔ  ａｌ．）（１９８６年）テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）２７：ｐ４０５５−８；ガフニほか（Ｇａｆｆｎｅｙｅｔ  ａｌ．）（１９８８年）テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）２９：ｐ２６１９−２２）が挙げられる。これらの化学反応は、市販の種々の自動核酸合成機を用いて行うことができる。こうした核酸は、合成核酸と呼ばれている。一方、Ｔ−リッチおよび／またはＴＧジヌクレオチドは、プラスミドを用いて大規模に製造することができ（サンブルック・Ｔほか（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．）、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９８９年参照）、また、より小さな断片に分けるか、そのまま投与することができる。核酸は、制限酵素、エキソヌクレアーゼもしくはエンドヌクレアーゼを使用するなど、既知の技術を利用して既存の核酸配列（例えば、ゲノムＤＮＡもしくはｃＤＮＡ）から作製することができる。このような方法により作製した核酸は、単離（ｉｓｏｌａｔｅｄ）核酸と呼ばれている。一般に、単離核酸とは、通常自然界で関連がある成分から分離した核酸を意味する。単離核酸の例としては、細胞、核、ミトコンドリアもしくはクロマチンから分離したものが挙げることができる。「核酸」という用語は、合成および単離核酸の両方を意味することができる。
【００８０】
生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で使用するためのこれらの核酸は、必要に応じて、分解に対して比較的抵抗性とすることができる（例えば、安定化する）。一部の実施態様として、必要に応じて、これらの核酸の特定の部分のみを安定化することができる。「安定化核酸分子」とは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での（例えば、エキソ−もしくはエンド−ヌクレアーゼによる）分解に対して比較的抵抗性の核酸分子を意味するものとする。安定化は長さもしくは一次構造の関数とすることができる。数十〜数百ｋｂ長の核酸は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での分解に比較的抵抗性である。これらより短い核酸では、二次構造によりその作用を安定化および増強することができる。例えば、核酸の３’末端が上流領域に対する自己相補性を有するため、これが折り返し、一種のステムループ構造を形成する場合、核酸は安定となり、従って活性が増強する。
【００８１】
本発明のこの態様による一部の実施態様として、前記ＲＮＡオリゴマーの塩基配列は少なくとも部分的に自己相補性である。本明細書に用いている自己相補性配列とは、適当に配置すると、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｕおよび／またはゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）Ｇ−Ｕ対間で分子内、より一般的には分子間の塩基対合を形成することができる塩基配列のことを意味する。一実施態様として、自己相補性の程度は少なくとも５０パーセントである。例えば、少なくとも５０パーセント自己相補性である８−マーは、４個、５個、６個、７個もしくは８個のＧ−Ｃ、Ａ−Ｕおよび／またはゆらぎＧ−Ｕ塩基対を形成し得る配列を有することができる。このような塩基対は、この自己相補性ＲＮＡオリゴマーの両端に位置する塩基を含むことができるが、必ずしもこれらを必要とするものではない。核酸の安定化がこのＲＮＡオリゴマーにとって重要とすることができる場合、塩基対合またはその他の任意の適当な手段によって二本鎖核酸の一端もしくは両端を「固定（ｃｌａｍｐ）」することは有利とすることができる。自己相補性の程度は、オリゴマー間の配置構造に依拠することができるが、この配置構造は単一もしくは複数のヌクレオシド・オーバーハングを含んでもよいし、含まなくてもよい。他の実施態様として、自己相補性の程度は、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、もしくは１００パーセントである。上記にもかかわらず、二本鎖であることが本発明のＲＮＡオリゴマーの要件ではないことに留意されたい。
【００８２】
考慮すべき事して、同様な事柄が異なる塩基配列を有するＲＮＡオリゴマー間の分子間塩基対合にも当てはまる。従って、複数のＲＮＡオリゴマーが同時に用いられる場合、これらの複数のオリゴマーは、互いに少なくとも部分的に相補性の配列を含むことができるが、これを必要とするものではない。一実施態様として、これらの複数のオリゴマーは、第１の塩基配列を有するオリゴマーおよび第２の塩基配列を有するオリゴマーを含み、この第１の塩基配列と第２の塩基配列は少なくとも５０パーセント相補性である。例えば、少なくとも５０パーセント相補性の２つの８−マー間の場合のように、これらは、４個、５個、６個、７個もしくは８個のＧ−Ｃ、Ａ−Ｕおよび／またはゆらぎＧ−Ｕ塩基対を形成することができる。このような塩基対はこの相補性ＲＮＡオリゴマーの両端に位置する塩基を含むことができるが、必ずしも含む必要はない。この場合、相補性の程度は、オリゴマー間の配置構造に依拠することができるが、この配置構造は単一もしくは複数のヌクレオシド・オーバーハングを含んでもよいし、含まなくてもよい。他の実施態様として、自己相補性の程度は、少なくとも６０パーセント、少なくとも７０パーセント、少なくとも８０パーセント、少なくとも９０パーセント、もしくは１００パーセントである。
【００８３】
一方、核酸の安定化は、リン酸主鎖の修飾によって達成することができる。本発明の核酸の好ましい安定化では主鎖を修飾する。核酸の主鎖を修飾すると、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）投与した場合の核酸の活性が増強する。主鎖修飾の１つのタイプは、リン酸主鎖の修飾である。免疫賦活性核酸において、このオリゴヌクレオチドの５’末端に少なくとも２つのホスホロチオエート結合および３’末端に複数（好ましくは５つ）のホスホロチオエート結合を含ませると、ある状況の下では、活性が最大となり、細胞内エキソ−およびエンドヌクレアーゼによる分解からこの核酸が保護される。その他の修飾核酸としては、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート核酸の組合せ、アルキルホスホネートおよびアリールホスホネート核酸の組合せ、アルキルホスホロチオエートおよびアリールホスホロチオエート核酸の組合せ、メチルホスホネート核酸、メチルホスホロチオエート核酸、ホスホロジチオエート核酸、ｐ−エトキシ核酸、モルホリノ核酸、ならびにこれらの組合せが挙げられる。ホスホロチオエート結合を有する核酸では、活性が最大となり、細胞内エキソ−およびエンドヌクレアーゼならびにこれらの組合せによる分解からこの核酸が保護される。これらの各組合せおよびその免疫細胞に対する特定の作用については、付与された米国特許第６，２０７，６４６号および第６，２３９，１１６号においてＣｐＧ核酸の場合に関し、より詳細に開示されており、これらの特許の内容全体が引用により本明細書に組み込まれている。これらの修飾核酸では、ヌクレアーゼに対する抵抗性の向上、細胞への取り込みの増加、蛋白結合の増強および／または細胞内局在の変化により賦活化作用を増強させることができると考えられる。
【００８４】
ホスホロチオエートなどの修飾主鎖は、ホスホルアミデートもしくはＨ−ホスホネート・ケミストリーを利用する自動化技術を用いて合成することができる。アリール−およびアルキル−ホスホネートは、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に開示されている方法で合成することができ、また、アルキルホスホトリエステル（この荷電酸素部分が米国特許第５，０２３，２４３号およびヨーロッパ特許第０９２，５７４号に開示されている方法でアルキル化されている）は、市販の試薬を用いて自動化固相合成法により作製することができる。その他のＤＮＡ主鎖の修飾および置換方法についても報告がある。ウールマン・Ｅほか（Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９０年）ケミカル・レビューズ（Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．）９０：ｐ５４４；グッドチャイルド・Ｊ（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ．）（１９９０年）バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．）１：ｐ１６５参照。
【００８５】
その他の安定化核酸としては、アルキル−およびアリール−ホスフェート（この場合、ホスホネートの荷電酸素がアルキルもしくはアリール基によって置換されている）、ホスホジエステル、ならびに荷電酸素部分がアルキル化されているアルキルホスホトリエステルなどの非イオン性ＤＮＡアナログが挙げられる。また、一端もしくは両端にテトラエチレングリコールもしくはヘキサエチレングリコールなどのジオールを含む核酸も、ヌクレアーゼによる分解に対してかなり抵抗性であることが明らかにされている。
【００８６】
別の種類の主鎖修飾体としては、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシド（２’−ＯＭｅ）が挙げられる。このタイプの置換については、従来広く報告されており、特にその免疫賦活化特性に関してはザオほか（Ｚｈａｏｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）バイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔｅｒｓ）９：２４：ｐ３４５３−８に報告がある。ザオほか（Ｚｈａｏｅｔ  ａｌ．）は、核酸の２’ＯＭｅ修飾体を作製する方法を記載している。
【００８７】
本発明の免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、通常、約５〜約４０ヌクレオチド長である。従って、一部の別の実施態様として、このＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０ヌクレオチド長とすることができる。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０ヌクレオチド長とすることができる。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２ヌクレオチド長とすることができる。一実施態様として、このＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、８、９、１０、１１もしくは１２ヌクレオチド
長とすることができる。
【００８８】
例えば、次の塩基配列を有するＲＮＡオリゴマーが、本発明の組成物および本発明の実施に有用であることを発見した：５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’；５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’；５’−ＣＵＡＧＧＣＡＣ−３’；５’−ＣＵＣＧＧＣＡＣ−３’；および５’−ＧＵＧＵＵＵＡＣ−３’と５’−ＧＵＡＧＧＣＡＣ−３’との併用。
【００８９】
本発明のＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーの免疫賦活作用がＭｙＤ８８依存性であることを発見したので、本発明の免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーはその免疫賦活作用を発揮する際の１ステップとして少なくとも１種のＴＬＲと相互作用することができるというのが、本発明者の見解である。従って、本発明の免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、この少なくとも１種のＴＬＲに対する天然のリガンドの少なくとも一部に相当もしくは類似したものであるとすることができる。このような天然リガンドとしては、原核または真核生物のリボソームＲＮＡおよび特定のウイルスＲＮＡを挙げることができる。上記ＴＬＲは、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７もしくは何らかのまだ明らかにされていないＴＬＲとすることができる。ＴＬＲ１、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ１０の天然リガンドは、これまでのところ、報告されていない。
【００９０】
本発明の免疫賦活性ＲＮＡ分子が、通常、高度に保存された配列もしくは重要な構造的特徴に関連している天然のあらゆるタイプのＲＮＡの中に存在することを発見した。１例として、免疫賦活性ＲＮＡは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）と関連して存在することを見出した。
【００９１】
ＩＲＥＳは、キャップ非依存性にウイルスゲノムの翻訳開始を調節する、ウイルスＲＮＡおよび他のｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内の複雑な構造的特徴の中に含まれる最小のシス作用性ＲＮＡエレメントである。ヘレン・Ｃ・Ｕほか（Ｈｅｌｌｅｎ  Ｃ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）ジーンズ・アンド・ディベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．）１５：ｐ１５９３−１６１２参照。ウイルスＲＮＡ翻訳がｃａｐ非依存性に開始されることについては、ピコルナウイルスで最初に観察された。ジャクソン・Ｒ・Ｊほか（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９０年）トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシズ（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．）１５：ｐ４７７−８３；ジャクソン・Ｒ・Ｊほか（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９５年）アール・エヌ・エー（ＲＮＡ）１：ｐ９８５−１０００参照。
【００９２】
多くの真核細胞では、ｍＲＮＡの翻訳開始は、ｅＩＦ４Ｅ（キャップ結合蛋白質）、ｅＬＩＦ４ＡおよびｅＩＦ４Ｇからなるキャップ結合複合体の真核細胞翻訳開始因子（ｅＩＦ）４をｍＲＮＡの５’キャップ（ｃａｐｐｅｄ）末端に動員することで始まる。次いで、ｅＩＦ３を含有する４０Ｓリボソームサブユニットおよび三重開始複合体ｔＲＮＡ−ｅＩＦ２−ＧＴＰが、ｅＩＦ３とｅＩＦ４Ｇとの間の相互作用によりｍＲＮＡの５’末端へ動員される。次に、この４０Ｓサブユニットが、適当な開始コドンに出会うまでそのｍＲＮＡを５’から３’への方向に読み取って行き、その後すぐに、開始メチオニンｔＲＮＡのアンチコドンが嵌め込まれ、これに６０Ｓが加わって８０Ｓリボソームが形成され、翻訳が開始される。
【００９３】
従って、少なくともウイルスとの関連で見たＩＲＥＳの重要性は、ＩＲＥＳが、細胞内の通常のキャップ依存性翻訳に対して、ウイルスに選択的な利点を与えることができることにあると考えられている。
【００９４】
以下のウイルスはそのゲノム内にＩＲＥＳエレメントを有すると報告されている：全てのピコルナウイルス；ウシウイルス下痢症ウイルス；豚コレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）；コオロギ麻痺病ウイルス；脳心筋炎ウイルス；蹄疫ウイルス；フレンドマウス白血病ウイルスｇａｇ  ｍＲＮＡ；ＨＣＶ；ヒト免疫不全ウイルスｅｎｖ  ｍＲＮＡ；カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス；モロニーマウス白血病ウイルスｇａｇ  ｍＲＮＡ；チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ  ｓｔａｌｉ）腸ウイルス；ポオウイルス；ライノウイルス；ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｐａｄｉ）ウイルス；およびラウス肉腫ウイルス。ヘレン・Ｃ・Ｕほか（Ｈｅｌｌｅｎ  Ｃ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）ジーンズ・アンド・ディベロップメント（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．）１５：ｐ１５９３−１６１２参照。以上掲載したものは限定的なものではない。
【００９５】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のウイルス蛋白質は、５’および３’ＵＴＲによって隣接されている９．５ｋｂの一本鎖プラス・センス（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｎｓｅ）ＲＮＡから翻訳される。この高度に保存された５’ＵＴＲはｎｔ４０〜３７０に存在するＩＲＥＳを含む。レイノルズ・Ｊ・Ｅほか（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９６年）アール・エヌ・エー（ＲＮＡ）２：ｐ８６７−７８参照。このＨＣＶ５’ＵＴＲは、４つの主要構造ドメイン（Ｉ〜ＩＶ）を有し、このうちドメインＩＩおよびＩＩＩはサブドメインを有すると考えられている。サブドメインＩＩＩｄは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）突然変異に関する研究に基づき、ＨＣＶ  ＩＲＥＳ媒介性翻訳において重要と報告されている２７  ｎｔステム−ループ（ｎｔ２５３−２７９）を含む。キーフト・ジェイ・エスほか（Ｋｉｅｆｔ  Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９９年）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）２９２：ｐ５１３−２９；クリンク・Ｒほか（Ｋｌｉｎｃｋ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）アール・エヌ・エー（ＲＮＡ）６：ｐ１４２３−３１参照。ＩＩＩｄ２７−マーの配列は、５’−ＧＣＣＧＡＧＵＡＧＵＧＵＵＧＧＧＵＣＧＣＧＡＡＡＧＧＣ−３’（配列番号４）で示され、この場合、ＵＵＧＧＧＵは末端ループを形成している。このステム−ループ構造は、ゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）Ｕ・Ｇ、Ｕ・Ａ、Ｇ・ＡおよびＡ・Ａ塩基対を含む、他のＲＮＡに典型的ないくつかの非ワトソン−クリック塩基対を有すると報告されている。
【００９６】
別の例では、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ配列が、効率的なウイルスＲＮＡ詰め込み（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）に極めて重要なヒト免疫不全ウイルス・タイプ１（ＨＩＶ−１）のウイルスＲＮＡの５’末端近傍のＧ、Ｕ−リッチ配列内に存在することを発見した。ラッセル・Ｒ・Ｓほか（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）（２００２年）バイロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）３０３：ｐ１５２−６３参照。具体的には、Ｕ５内の２つの重要なＧ、Ｕ−リッチ配列、即ち、それぞれＢＨ１０株のｎｔ９９〜１０８および１１２〜１２３に相当する５’−ＧＵＡＧＵＧＵＧＵＧ−３’（配列番号２）および５’−ＧＵＣＵＧＵＵＧＵＧＵＧ−３’（配列番号３）が高度に免疫賦活性であることを本発明によって発見した（以下の実施例１１参照）。配列番号２がＧＵＡＧＵおよびＧＵＧＵＧを含み、配列番号３がＧＵＧＵＧを含むことが注目されよう。
【００９７】
さらに別の例では、本発明の免疫賦活性ＲＮＡ配列が、多数の種の細菌の５ＳリボソームＲＮＡループＥ内に存在することを見出した。
【００９８】
ＴＬＲ８およびＴＬＲ７は、ＴＬＲ９に高度な配列相同性を示す（図８）。ＴＬＲ９は、ＣｐＧ−ＤＮＡ受容体であり、免疫賦活性シグナルを変換する。ＴＬＲ内には２つのＤＮＡ結合モチーフが存在することが開示されており（米国特許出願第０９／９５４，９８７号）、これらは一部修飾されてＴＬＲ８およびＴＬＲ７にも存在する（図９）。しかしながら、このような類似性にもかかわらず、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８はＣｐＧ−ＤＮＡに結合しない。
【００９９】
グアノシン、特にウラシルと結合させたグアノシン、および一部のグアノシン含有核酸とその誘導体がＴＬＲ８の天然リガンドであることを本発明により発見した。また、ＲＮＡ、酸化ＲＮＡ、Ｇ、Ｕ−リッチ核酸、および少なくとも１つのＧ−Ｕ塩基対を有する少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子がＴＬＲ８リガンドであることも本発明により発見した。グアノシン、グアノシン誘導体およびＧ、Ｕ−リッチ核酸にかかわる一部の好ましい実施態様として、グアノシンはそのリボヌクレオシドである。ＧＵＵ、ＧＵＧ、ＧＧＵ、ＧＧＧ、ＵＧＧ、ＵＧＵ、ＵＵＧ、ＵＵＵ、これらの倍数体およびこれらの任意の組合せを含む核酸分子は、ＴＬＲ８リガンドであると考えられる。一部の実施態様として、このＴＬＲ８リガンドは、ヘキサマー配列（ＵＵＧＵＧＧ）ｎ、（ＵＧＧＵＵＧ）ｎ、（ＧＵＧＵＧＵ）ｎもしくは（ＧＧＧＵＵＵ）ｎを含み、ｎが１〜８の整数であるものとし、好ましくはｎが少なくとも３であるものとするＧ、Ｕ−リッチオリゴヌクレオチドである。さらに、リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物（即ち、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルリボヌクレオシドバナジル錯体の混合物）ならびにグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体単独がＴＬＲ８リガンドであることも、本発明により発見した。さらに、レシキモッドおよびイミキモッドを含む一部のイミダゾキノリン類がＴＬＲ８リガンドであることを本発明により発見した。
【０１００】
また、グアノシンおよび一部のグアノシン含有核酸とその誘導体がＴＬＲ７の天然リガンドであることも本発明により発見した。さらに、ＲＮＡ、酸化ＲＮＡ、Ｇ−リッチ核酸、およびＧ含量が高い少なくとも部分的に二本鎖の核酸分子がＴＬＲ８リガンドであることも本発明により発見した。グアノシン、グアノシン誘導体およびＧ−リッチ核酸にかかわる一部の好ましい実施態様として、グアノシンはそのリボヌクレオシドである。さらに、リボヌクレオシドバナジル錯体の混合物（即ち、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルリボヌクレオシドバナジル錯体の混合物）ならびにグアノシンリボヌクレオシドバナジル錯体単独がＴＬＲ７リガンドであることも、本発明により発見した。さらに、７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ））がＴＬＲ７リガンドであることを本発明により発見した。
【０１０１】
これらの種々のＴＬＲは、さまざまなリガンドを有することの他に、種々の組織およびさまざまなタイプの免疫細胞において識別的に発現されると考えられている。例えば、ヒトＴＬＲ７は、胎盤、肺、脾臓、リンパ節、扁桃腺、および形質球様前駆樹状細胞（ｐＤＣ）において発現されることが報告されている。チュアン・Ｔ−Ｈほか（Ｃｈｕａｎｇ  Ｔ−Ｈ  ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）ヨーロピアン・サイトカイン・ネットワーク（Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．）１１：ｐ３７２−８；カドワキ・Ｎほか（Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１９４：ｐ８６３−９参照。ヒトＴＬＲ８は、肺、末梢血白血球（ＰＢＬ）、胎盤、脾臓、リンパ節、および単球において発現されることが報告されている。カドワキ・Ｎほか（Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１９４：ｐ８６３−９；チュアン・Ｔ−Ｈほか（Ｃｈｕａｎｇ  Ｔ−Ｈｅｔ  ａｌ．）（２０００年）ヨーロピアン・サイトカイン・ネットワーク（Ｅｕｒ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．）１１：ｐ３７２−８参照。ヒトＴＬＲ９は、脾臓、リンパ節、骨髄、ＰＢＬ、ならびにｐＤＣ、Ｂ細胞およびＣＤ１２３＋ＤＣにおいて発現されると報告されている。カドワキ・エヌほか（Ｋａｄｏｗａｋｉ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１９４：ｐ８６３−９；バウアー・Ｓほか（Ｂａｕｅｒ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ９８：ｐ９２３７−４２；チュアン・Ｔ−Ｈほか（Ｃｈｕａｎｇ  Ｔ−Ｈｅｔ  ａｌ．）（２０００年）ヨーロピアン・サイトカイン・ネットワーク（Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．）１１：ｐ３７２−８参照。
【０１０２】
これまで、グアノシン誘導体は、Ｂ細胞およびＮＫ細胞のアクチベータとして説明されてきたが、これらの受容体および作用メカニズムについては知られていなかった。グッドマン・Ｍ・Ｇほか（Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９４年）ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティクス（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）２７４：ｐ１５５２−５７；ライツ・Ａ・Ｂほか（Ｒｅｉｔｚ  Ａ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９４年）ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）３７：ｐ３５６１−７８参照。このようなグアノシン誘導体としては、８−ブロモグアノシン、８−オキソグアノシン、８−メルカプトグアノシン、および７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
イミダゾキノリン類は、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）ならびに一部のインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−１２）を含む数種のサイトカインの発現を誘起すると考えられる合成低分子免疫反応修飾物質である。イミダゾキノリン類は、これらがＩｇＧ２ａレベルの増加を誘起することができることから部分的に明らかなように、Ｔｈ１免疫反応を賦活化することができる。また、イミダゾキノリン剤は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−３などのＴｈ２サイトカインの産生を抑制することができることも報告されている。イミダゾキノリン類によって誘導されるサイトカインの一部は、マクロファージおよび樹状細胞によって産生される。イミダゾキノリン類うちの一部の化学種は、ＮＫ細胞溶解作用を増強し、Ｂ細胞の増殖および分化を促進することにより抗体の産生および分泌を誘起すると報告されている。
【０１０４】
本明細書に用いているイミダゾキノリン剤としては、イミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、６，７−縮合シクロアルキルイミダゾピリジンアミンおよび１，２−架橋イミダゾキノリンアミンが挙げられる。これらの化合物は、米国特許第４６８９３３８号、第４９２９６２４号、第５２３８９４４号、第５２６６５７５号、第５２６８３７６号、第５３４６９０５号、第５３５２７８４号、第５３８９６４０号、第５３９５９３７号、第５４９４９１６号、第５４８２９３６号、第５５２５６１２号、第６０３９９６９号および第６１１０９２９号に開示されている。イミダゾキノリン剤の具体的な化学種としては、４−アミノ−α，α−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール（レシキモッドもしくはＲ−８４８もしくはＳ−２８４６３；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２８７６４号、国際特許第ＷＯ  ０２／２２１２５号）；および１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（イミキモッドもしくはＲ−８３７もしくはＳ−２６３０８）が挙げられる。現在、イミキモッドは、性器および肛門のいぼ等のいぼの局所治療に用いられており、また、基底細胞癌の局所治療においても試験されている。
【０１０５】
ヒトおよびマウスＴＬＲ３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は既知である。例えば、ジェンバンク登録（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号Ｕ８８８７９、ＮＭ＿００３２６５、ＮＭ＿１２６１６６、ＡＦ３５５１５２；およびＡＡＣ３４１３４、ＮＰ＿００３２５６、ＮＰ＿５６９０５４、ＡＡＫ２６１１７参照。ヒトＴＬＲ３は、９０４アミノ酸長であり、配列番号２１で示される配列を有することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は配列番号２１として示される。マウスＴＬＲ３は、９０５アミノ酸長であり、配列番号２２で示される配列を有することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は配列番号２３として示される。ＴＬＲ３ポリペプチドは、ロイシン−リッチ反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含有する細胞内ドメインを含んでいる。
【０１０６】
本明細書に用いている「ＴＬＲ３ポリペプチド」とは、上記配列の１つによる完全長のＴＬＲ３、相同分子種（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）、対立遺伝子多型、ＳＮＰ、保存的アミノ酸置換を有する変異体、ＴＬＲ３融合蛋白質、およびこれらの任意のものの機能性断片を含むポリペプチドのことを意味する。好ましい実施態様は、配列番号２０のヒトＴＬＲ３アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるヒトＴＬＲ３ポリペプチドを含む。また、好ましい実施態様は、配列番号２２のマウスＴＬＲ３アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるマウスＴＬＲ３ポリペプチドを含む。
【０１０７】
本明細書に用いている「ＴＬＲ３シグナル伝達」とは、本明細書でＴＬＲシグナル変換経路とも呼ぶＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路をＴＬＲ３ポリペプチドが賦活化することができることを意味する。ＴＬＲ３活性の変化については、κＢ−感受性のプロモータおよびエンハンサーの制御下に遺伝子を発現させるなど、本明細書に開示したようなアッセイ法を用いて測定することができる。このような天然の遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２  ｐ４０）ならびに共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードしている遺伝子が挙げられる。その他の遺伝子についても、このような調節性エレメントの制御下に置くことにより（下記参照）、ＴＬＲ３シグナル伝達のレベルを知るのに役立つ。配列番号２１もしくは配列番号２３に対して、好ましくは、配列番号２１のオープン・リーディング・フレームの５’または３’末端に大して別のヌクレオチド配列を加えることによって、検出可能な部分、即ちレポータ部分、例えば、ＦＬＡＧ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、および当業者に知られているその他のものを含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１０８】
【化１】
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【０１０９】
【化２】
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【０１１０】
【化３】
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ヒトおよびマウスＴＬＲ７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については既知である。例えば、ジェンバンク登録番号ＡＦ２４０４６７、ＡＦ２４５７０２、ＮＭ＿０１６５６２、ＡＦ３３４９４２、ＮＭ＿１３３２１１；およびＡＡＦ６０１８８、ＡＡＦ７８０３５、ＮＰ＿０５７６４６、ＡＡＬ７３１９１、ＡＡＬ７３１９２参照。ヒトＴＬＲ７は、１，０４９アミノ酸長であり、配列番号２４で示される配列を有することが報告されてい
る。これに対応するヌクレオチド配列は、配列番号２５として示される。マウスＴＬＲ７は、１，０５０アミノ酸長であり、配列番号２６で示される配列を有することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は、配列番号２７として示される。ＴＬＲ７ポリペプチドは、ロイシン−リッチ反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含有する細胞内ドメインを含んでいる。
【０１１１】
本明細書に用いている「ＴＬＲ７ポリペプチド」とは、上記配列の１つによる完全長のＴＬＲ７、相同分子種、対立遺伝子多型、ＳＮＰ、保存的アミノ酸置換を有する変異体、ＴＬＲ７融合蛋白質、およびこれらの任意のものの機能性断片を含むポリペプチドのことを意味する。好ましい実施態様は、配列番号２４のヒトＴＬＲ７アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるヒトＴＬＲ７ポリペプチドを含む。また、好ましい実施態様は、配列番号２６のマウスＴＬＲ７アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるマウスＴＬＲ７ポリペプチドを含む。
【０１１２】
本明細書に用いている「ＴＬＲ７シグナル伝達」とは、本明細書でＴＬＲシグナル変換経路とも呼ぶＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路をＴＬＲ７ポリペプチドが賦活化することができることを意味する。ＴＬＲ７活性の変化については、κＢ−感受性のプロモータおよびエンハンサーの制御下に遺伝子を発現させるなど、本明細書に開示したようなアッセイ法を用いて測定することができる。このような天然の遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２  ｐ４０）ならびに共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードしている遺伝子が挙げられる。その他の遺伝子についても、このような調節性エレメントの制御下に置くことにより（下記参照）、ＴＬＲ７シグナル伝達のレベルを知るのに役立つ。配列番号２５もしくは配列番号２７に対して、好ましくは、配列番号２５のオープン・リーディング・フレームの５’または３’末端に対して別のヌクレオチド配列を加えることによって、検出可能な部分、即ちレポータ部分、例えば、ＦＬＡＧ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、および当業者に知られているその他のものを含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１１３】
【化４】
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【０１１４】
【化５】
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【０１１５】
【化６】
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【０１１６】
【化７】
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ヒトおよびマウスＴＬＲ８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については既知である。例えば、ジェンバンク登録番号ＡＦ２４６９７１、ＡＦ２４５７０３、ＮＭ＿０１６６１０、ＸＭ＿０４５７０６、ＡＹ０３５８９０、ＮＭ＿１３３２１２；およびＡＡＦ６４０６１、ＡＡＦ７８０３６、ＮＰ＿０５７６９４、ＸＰ＿０４５７０６、ＡＡＫ６２６７７、ＮＰ＿５７３４７５参照。ヒトＴＬＲ８は、少なくとも２つのイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）、１つは配列番号２８の配列を有する１，０４１アミノ酸長のもの、他は配列番号３０の配列を有する１，０５９アミノ酸長のものとして存在することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号２９および配列番号３１として示される。これらの２つのイソ型のうち、短鎖のものの方がより重要と考えられている。マウスＴＬＲ８は、１，０３２アミノ酸長であり、配列番号３２で示される配列を有する。これに対応するヌクレオチド配列は、配列番号３３として示される。ＴＬＲ８ポリペプチドは、ロイシン−リッチ反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含有する細胞内ドメインを含んでいる。
【０１１７】
本明細書に用いている「ＴＬＲ８ポリペプチド」とは、上記配列の１つによる完全長のＴＬＲ８、相同分子種、対立遺伝子多型、ＳＮＰ、保存的アミノ酸置換を有する変異体、ＴＬＲ８融合蛋白質、およびこれらの任意のものの機能性断片を含むポリペプチドのことを意味する。好ましい実施態様は、配列番号２８のヒトＴＬＲ８アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるヒトＴＬＲ８ポリペプチドを含む。また、好ましい実施態様は、配列番号３２のマウスＴＬＲ８アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるマウスＴＬＲ８ポリペプチドを含む。
【０１１８】
本明細書に用いている「ＴＬＲ８シグナル伝達」とは、本明細書でＴＬＲシグナル変換経路とも呼ぶＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路をＴＬＲ８ポリペプチドが賦活化することができることを意味する。ＴＬＲ８活性の変化については、κＢ−感受性のプロモータおよびエンハンサーの制御下に遺伝子を発現させるなど、本明細書に開示したようなアッセイ法を用いて測定することができる。このような天然の遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２  ｐ４０）ならびに共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードしている遺伝子が挙げられる。その他の遺伝子についても、このような調節性エレメントの制御下に置くことにより（下記参照）、ＴＬＲ８シグナル伝達のレベルを知るのに役立つ。配列番号２９もしくは配列番号３３に対して、好ましくは、配列番号２９のオープン・リーディング・フレームの５’または３’末端に対して別のヌクレオチド配列を加えることによって、検出可能な部分、即ちレポータ部分、例えば、ＦＬＡＧ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、および当業者に知られているその他のものを含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１１９】
【化８】
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【０１２０】
【化９】
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【０１２１】
【化１０】
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【０１２２】
【化１１】
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【０１２３】
【化１２】
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ヒトおよびマウスＴＬＲ９のヌクレオチドおよびアミノ酸配列については既知である。例えば、ジェンバンク登録番号ＮＭ＿０１７４４２、ＡＦ２５９２６２、ＡＢ０４５１８０、ＡＦ２４５７０４、ＡＢ０４５１８１、ＡＦ３４８１４０、ＡＦ３１４２２４、ＮＭ＿０３１１７８、；およびＮＰ＿０５９１３８、ＡＡＦ７２１８９、ＢＡＢ１９２５９、ＡＡＦ７８０３７、ＢＡＢ１９２６０、ＡＡＫ２９６２５、ＡＡＫ２８４８８、ＮＰ＿１１２４５５参照。ヒトＴＬＲ９は、少なくとも２つのイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）、１つは配列番号３４の配列を有する１，０３２アミノ酸長のもの、他は配列番号３６の配列を有する１，０５５アミノ酸長のものとして存在することが報告されている。これに対応するヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号３５および配列番号３７として示される。これらの２つのイソ型のうち、短鎖のものの方がより重要と考えられている。マウスＴＬＲ９は、１，０３２アミノ酸長であり、配列番号３８で示される配列を有する。これに対応するヌクレオチド配列は、配列番号３９として示される。ＴＬＲ９ポリペプチドは、ロイシン−リッチ反復領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＩＲドメインを含有する細胞内ドメインを含んでいる。
【０１２４】
本明細書に用いている「ＴＬＲ９ポリペプチド」とは、上記配列の１つによる完全長のＴＬＲ９、相同分子種、対立遺伝子多型、ＳＮＰ、保存的アミノ酸置換を有する変異体、ＴＬＲ８融合蛋白質、およびこれらの任意のものの機能性断片を含むポリペプチドのことを意味する。好ましい実施態様は、配列番号３４のヒトＴＬＲ９アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるヒトＴＬＲ９ポリペプチドを含む。また、好ましい実施態様は、配列番号３８のマウスＴＬＲ９アミノ酸配列との配列同一性が少なくとも６５パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、さらに好ましくは少なくとも９０パーセント、最も好ましくは少なくとも９５パーセントであるマウスＴＬＲ９ポリペプチドを含む。
【０１２５】
本明細書に用いている「ＴＬＲ９シグナル伝達」とは、本明細書でＴＬＲシグナル変換経路とも呼ぶＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路をＴＬＲ９ポリペプチドが賦活化することができることを意味する。特定の理論などによるという意味ではなく、このＴＬＲ／ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路は、骨髄分化マーカー（ＭｙＤ８８）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連因子６（ＴＲＡＦ６）という分子を介するシグナル伝達を伴い、ＩκＢキナーゼ複合体のキナーゼおよびｃ−ｊｕｎ  ＮＨ２−末端キナーゼ（例えば、Ｊｎｋ１／２）の賦活化をもたらすと考えている。ヘッカー・エイチほか（Ｈａｅｃｋｅｒ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．）（２０００年）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１９２：ｐ５９５−６００参照。ＴＬＲ９活性の変化については、κＢ−感受性のプロモータおよびエンハンサーの制御下に遺伝子を発現させるなど、本明細書に開示したようなアッセイ法を用いて測定することができる。このような天然の遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２  ｐ４０）ならびに共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードしている遺伝子が挙げられる。その他の遺伝子についても、このような調節性エレメントの制御下に置くことにより（下記参照）、ＴＬＲ９シグナル伝達のレベルを知るのに役立つ。配列番号３５もしくは配列番号３９に対して、好ましくは、配列番号３５のオープン・リーディング・フレームの５’または３’末端に対して別のヌクレオチド配列を加えることによって、検出可能な部分、即ちレポータ部分、例えば、ＦＬＡＧ、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、および当業者に知られているその他のものを含むキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１２６】
【化１３】
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【０１２７】
【化１４】
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【０１２８】
【化１５】
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【０１２９】
【化１６】
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【０１３０】
【化１７】
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リボヌクレオシドバナジル錯体（即ち、アデノシン、シトシン、グアノシン、およびウラシルリボヌクレオシドバナジル錯体の混合物）は、ＲＮＡ分解酵素阻害剤として当業者にはよく知られてる。バーガー・Ｓ・Ｌほか（Ｂｅｒｇｅｒ  Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）（１９７９年）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１８：ｐ５１４３；プスカシュ・Ｒ・Ｓほか（Ｐｕｓｋａｓ  Ｒ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）（１９８２年）バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２１：ｐ４６０２参照。リボヌクレオシドバナジル錯体は、シグマ−アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｉｎｃ．）などの供給元から市販されている。
【０１３１】
一実施態様として、本発明の免疫賦活性Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーは、ＣｐＧジヌクレオチドを含まず、ＣｐＧ免疫賦活性核酸ではない。一部の実施態様として、ＣｐＧ免疫賦活性核酸は、本発明の方法において用いている。
【０１３２】
ＣｐＧ免疫賦活性核酸はＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸であり、そのＣ残基はメチル化されていない。ＣｐＧ免疫賦活性核酸はＴｈ１型免疫反応を賦活化することが知られている。ＣｐＧ配列は、ヒトＤＮＡ中に存在するのは比較的まれであるが、細菌などの感染性微生物のＤＮＡ中にはよく見られる。ヒトの免疫系は、感染初期の危険徴候としてＣｐＧを認識し、他の免疫賦活剤でよく見られるような有害反応を生じることなく侵入病原体に対して直ちに強力な免疫反応を開始するよう進化したものと思われる。従って、この先天性免疫防御機構に依存するＣｐＧ含有核酸は、免疫療法のために独自で自然な経路を利用することができる。ＣｐＧ核酸の免疫調節に対する作用については、広く、米国特許第６，１９４，３８８Ｂ１号、第６，２０７，６４６Ｂ１号、第６，２３９，１１６Ｂ１号、第６，２１８，３７１号などの米国特許、および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０３６７８号、第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０４０８号、第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４７０３号、ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９８６３号などの公開特許出願に開示されている。これらの特許のそれぞれの内容全体は、引用により本明細書に組み込まれている。
【０１３３】
ＣｐＧ核酸は、少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸である。少なくとも１つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸は、シトシン−グアニンジヌクレオチド配列中に非メチル化シトシンを含む核酸分子（すなわち、「ＣｐＧ  ＤＮＡ」、もしくは５’シトシンの次にグアノシンが続き、これらがリン酸結合によって連結されているＤＮＡ）であり、免役系を賦活化する。このＣｐＧ核酸は、二本鎖もしくは一本鎖とすることができる。概して、二本鎖分子は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でより安定ではあるが、一本鎖分子の方が免疫活性は高い。従って、本発明の一部の態様として、この核酸は一本鎖であることが好ましいが、その他の態様としては、この核酸は二本鎖であることが好ましい。一部の実施態様として、この核酸は一本鎖であるが、（例えば、それ自体で折り返すことによって、または全体にわたって、もしくは長さに沿って選ばれたセグメントでそれ自体とハイブリッドを形成することによって）二次および三次構造を形成することができる。従って、このような核酸の一次構造は一本鎖とすることができるが、そのより高次の構造は二本鎖または三本鎖とすることができる。本明細書で用いているＣｐＧ核酸もしくはＣｐＧオリゴヌクレオチドという用語は、特に別の記載がない限り、免疫賦活性ＣｐＧ核酸のことを意味する。免疫賦活性核酸全体を非メチル化することができ、あるいは部分を非メチル化してもよいが、少なくとも５’ＣＧ３’のＣは非メチル化する必要がある。
【０１３４】
一態様として、本発明は、免疫細胞を賦活化する方法を提供する。この方法は、免疫細胞に対し、前述した本発明の免疫賦活性組成物を、この免疫細胞の賦活化を誘起する有効な量で接触させるものである。本明細書で用いている「免疫細胞」とは、免役系に属する細胞である。免疫細胞は、炎症および免疫反応の調節ならびに遂行に関与している。これらのものとしては、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞、樹状細胞、他の組織特異的抗原提示細胞（例えば、ランゲルハンス細胞）、マクロファージ、単球、顆粒球（好中球、好酸球、好塩基球）、および肥満細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。脾細胞、胸腺細胞および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は免疫細胞を含んでいる。免疫細胞は、当業者によく知られている方法を用いて、血液、脾臓、骨髄、リンパ節、胸腺その他の組織から単離することができる。また、免疫細胞は、一部の細胞株、およびイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）もしくは生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で維持されている一次培養細胞を含むことができる。
【０１３５】
一実施態様として、上記免疫細胞の賦活化はこの免疫細胞によるサイトカインの分泌を必要とする。一実施態様として、上記免疫細胞の賦活化はこの免疫細胞によるケモカインの分泌を必要とする。一実施態様として、上記免疫細胞の賦活化はこの免疫細胞による共起刺激／アクセサリー分子の発現を必要とする。一実施態様として、この共起刺激／アクセサリー分子は、細胞内粘着分子（ＩＣＡＭ、例えばＣＤ５４）、白血球機能関連抗原（ＬＦＡ、例えば、ＣＤ５８）、Ｂ７（ＣＤ８０、ＣＤ８６）およびＣＤ４０からなる群から選ばれる。
【０１３６】
「免疫細胞の賦活化」とは、免疫細胞が、休止もしくは静止状態から免疫細胞機能と関連した代謝活性および表現型の増強された状態へ移行することを意味するものとする。このような免疫細胞機能としては、例えば、免疫グロブリン、サイトカイン、ケモカインなどの可溶性産物の分泌；共起刺激／アクセサリー分子およびＭＨＣ抗原の細胞表面における発現；免疫細胞移動；標的細胞に対する食作用および細胞傷害作用；ならびに細胞成熟を挙げることができる。ある場合には、免疫の賦活化はＴｈ１免疫賦活化のことを意味することができ、他の場合には、免疫の賦活化はＴｈ２免疫賦活化のことを意味することができる。
【０１３７】
本明細書で用いている「Ｔｈ１免疫賦活化」とは、特定のサイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリンのサブクラスなどのＴｈ１様分泌産物を発現する免疫細胞を賦活化すること；および特定の免疫細胞を賦活化させることを意味する。Ｔｈ１様分泌産物としては、例えば、サイトカインのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦ−α、およびケモカインのＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）が挙げられる。マウスでは、Ｔｈ１免疫賦活化はＩｇＧ２ａの分泌を促進する。又、Ｔｈ１免疫賦活化は、ＮＫ細胞および樹状細胞、即ち、細胞性免疫に関与する細胞の賦活化を含むこともできる。Ｔｈ１免疫賦活化は、Ｔｈ２免疫賦活化を逆調節していると考えられる。
【０１３８】
本明細書で用いている「Ｔｈ２免疫賦活化」とは、特定のサイトカインおよび免疫グロブリンのサブクラスなどのＴｈ２様分泌産物を発現する免疫細胞を賦活化することを意味する。Ｔｈ２様分泌産物としては、例えば、サイトカインのＩＬ−４およびＩＬ−１０が挙げられる。マウスでは、Ｔｈ２免疫賦活化はＩｇＧ１およびＩｇＥの分泌を促進する。Ｔｈ２免疫賦活化は、Ｔｈ１免疫賦活化を逆調節していると考えられる。
【０１３９】
別の態様として、本発明は、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。この方法は、被験体に対し、被験体の免疫反応を誘起するのに有効な量で、本発明の組成物を投与するものである。従って、本発明の組成物は、免疫の賦活化を必要としている被験体の治療に用いることができる。免疫の賦活化を必要としている被験体としては、ＴＨ１様免疫の賦活化を必要としている被験体を挙げることができる。
【０１４０】
本発明の組成物および方法は、単独もしくは他剤との併用で用いることによりＴＨ１様免疫の賦活化を必要としている被験体を治療することができる。「ＴＨ１様免疫の賦活化を必要としている被験体」とは、疾病、疾患、もしくは免疫反応をＴｈ１に向けて偏らせることが有効な症状に罹患しているか、罹患するリスクのある被験体である。このような被験体は、Ｔｈ１媒介性の相互調節（ｃｒｏｓｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）もしくは抑制を受けやすいＴｈ２媒介性疾患に罹患しているか、罹患するリスクのある者とすることができる。このような疾患としては、例えば、特定器官に特異的な自己免疫疾患が挙げられる。あるいは、このような被験体は、Ｔｈ１欠損症状を有するか、これを発症するリスクのある者とすることができる。このような疾患としては、例えば、腫瘍、細胞内病原体による感染、およびＡＩＤＳが挙げられる。
【０１４１】
本明細書で用いている「Ｇ、Ｕ−リッチＲＮＡ」とは、塩基組成でグアニン（Ｇ）およびウラシル（Ｕ）が少なくとも６０パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセントである少なくとも５ヌクレオチド長のＲＮＡを意味するものとする。このような塩基組成については、このＲＮＡが１０塩基長以下であれば、その完全長について測定し、１１塩基長以上であれば、少なくとも１０個の連
続する塩基の一伸びについて測定する。
【０１４２】
本明細書で用いている「Ｇ−リッチＲＮＡ」とは、塩基組成でグアニン（Ｇ）が少なくとも７０パーセント、より好ましくは少なくとも８０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセントであるＲＮＡを意味するものとする。このような塩基組成については、このＲＮＡが１０塩基長以下であれば、その完全長について測定し、１１塩基長以上であれば、少なくとも１０個の連続する塩基の一伸びについて測定する。
【０１４３】
一部の実施態様として、本発明の組成物は、ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体を含む。ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体とは、少なくとも１つのリボヌクレオシドに結合した少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシドを含む分子もしくは結合体を意味するものとする。このデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシド成分は、塩基対の相互作用によって結合させることができる。あるいは、このデオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシド成分は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシドおよび少なくとも１つのリボヌクレオシドの糖部分間の共有結合によって結合させることができる。この糖部分間の共有結合は、直接的、または、例えば、リンカーを介する間接的なものとすることができる。塩基対相互作用としては、通常、非共有結合性のワトソン−クリック型塩基対相互作用が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明では、非共有結合性（例えば、ホーグスタイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）塩基対合）および共有結合性相互作用を含むその他の塩基対相互作用も企図している。また、通常、塩基対相互作用は２本のストランドを必要とする二本鎖形成を意味するが、本発明ではより高次の相互作用も企図している。
【０１４４】
上記の少なくとも１つのデオキシリボヌクレオシドおよび少なくとも１つのリボヌクレオシドの糖部分間の共有結合を伴うＤＮＡ：ＲＮＡ結合体は、本明細書では、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を有するものとする。キメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を有するこのＤＮＡ：ＲＮＡ結合体は、その塩基配列により規定される一次構造を有するが、さらに、これは二次以上の高次の構造を有することができる。二次以上の高次の構造には、少なくとも１つの分子内塩基対相互作用、例えば、ステム−ループ構造、または分子間塩基対相互作用が含まれよう。
【０１４５】
ヘテロ二重鎖塩基対合とは、ＤＮＡとＲＮＡ間の分子内もしくは分子間塩基対相互作用を意味するものとする。例えば、ヘテロ二重鎖塩基対合は、個々の相補性の一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ分子間で行わせることができる。あるいは、適当なＤＮＡ：ＲＮＡキメラ主鎖核酸分子では、同じ分子内の相補性ＤＮＡおよびＲＮＡ領域間でヘテロ二重鎖塩基対合を行わせることができる。
【０１４６】
一部の実施態様として、本発明の組成物は、ＤＮＡとＲＮＡ間に切断部位を有するキメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を含む。切断部位とは、任意の適当な手段により切断されやすいキメラ主鎖に沿った構造要素のことを意味する。この切断部位は、エンドヌクレアーゼにより比較的切断されやすいホスホジエステル結合とすることができる。この場合、ＤＮＡおよびＲＮＡがそれぞれ、安定化されたヌクレオチド間結合を含むことによって、そのキメラ主鎖がこの安定化ＤＮＡと安定化ＲＮＡとの間のホスホジエステル接合部でエンドヌクレアーゼによる切断を最も受けやすいようにすることができる。この切断部位は、特定のｐＨ条件下、例えば、低いｐＨよりも高いｐＨで、またはその逆で比較的より安定な条件下で切断されやすいようにデザインすることができる。このようなｐＨ感受性は、例えば、このキメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物をリポソームを用いて調製することにより得ることができる。上記切断部位は、ジスルフィド結合を含むことができる。このようなジスルフィド結合は、例えばエンドソーム内に存在する還元的な条件下よりも酸化的な条件下で比較的より安定なものとすることができる。また、この切断部位は、酵素、ｐＨ、酸化還元条件などにより切断されやすいリンカーを含むことができる。
【０１４７】
本発明の結合体では、結合体の成分について一定のモル比を選択することができる。ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体の場合、ＤＮＡとＲＮＡとの比を１：１とすることが有利もしくは好都合とすることができる。ヘテロ二重鎖ＤＮＡ：ＲＮＡである結合体では、ＤＮＡとＲＮＡとの比は１：１とするのが通例であろう。また、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ主鎖を有する結合体でも、ＤＮＡとＲＮＡとの比は、通例１：１とすることができる。他のＤＮＡ：ＲＮＡ比を有する結合体についても本発明は企図しており、例えば、１：２、１：３、１：４、２：１、３：１、４：１などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。この結合体は、１種以上の成分に対し、同じ成分単独の安定性と比較して、より安定なものとすることができる。また、結合体とすることにより、その成分を選択した比率で細胞内に送達することが容易になる。
【０１４８】
切断部位は、本発明において有用ないくつかの目的のどれにも役立てることができる。この切断部位を介して結合した成分は、対象の細胞に送達されるとすぐに遊離して、細胞内もしくは細胞近傍で、独立に、または最適に活性となることができる。一部の実施態様として、この切断部位は、その結合体成分の少なくとも１種についての薬動力学に重要なものとなることができる。例えば、この切断部位は、成分のうちの１種の持続放出を延長させるように、デザインし、選択することができる。
【０１４９】
本発明は、概して、免疫賦活性化合物を同定する効率的な方法、ならびにこれにより同定された化合物および物質を提供する。概して、このスクリーニング方法は、特定のＴＬＲを介するシグナル伝達を抑制または増強する化合物についてアッセイを行うものである。この方法では、ＴＬＲ、このＴＬＲに対する適当な対照リガンド、および免疫賦活性候補化合物を用いる。選択したＴＬＲを適当な対照化合物（ＴＬＲリガンド）と接触させ、ＴＬＲ媒介性対照シグナルを測定する。また、この選択したＴＬＲを免疫賦活性候補化合物と接触させ、ＴＬＲ媒介性対照シグナルを測定する。次に、こうして得られた試験シグナルと対照シグナルを比較する。その後、好ましい免疫賦活性候補化合物は、このアッセイの対照化合物として用いることができる。この方法は、候補化合物の、自動化されたハイスループット・スクリーニングに対応可能である。このようなハイスループット・スクリーニング法の例については、米国特許第６，１０３，４７９号、第６，０５１，３８０号、第６，０５１，３７３号、第５，９９８，１５２号、第５，８７６，９４６号、第５，７０８，１５８号、第５，４４３，７９１号、第５，４２９，９２１号、および第５，１４３，８５４号に開示されている。
【０１５０】
アッセイ混合物は、免疫賦活性候補化合物を含む。通常、複数のアッセイ混合物について種々の濃度を同時に用いアッセイすることにより、種々の濃度に対する異なる反応が得られる。通常、これらの濃度の１つを陰性対照、即ち、物質のゼロ濃度もしくはアッセイ検出限界未満の物質濃度とする。免疫賦活性候補化合物には、多くの化学物質のクラスが含まれが、通常は、有機化合物である。好ましくは、免疫賦活性候補化合物は、低分子、即ち、分子量が５０超、約２，５００未満の有機化合物である。高分子免疫賦活性候補化合物というのは、これらより分子量が大きく、例えば、約２，５００〜約１２，５００の範囲のオリゴヌクレオチドとすることができる。免疫賦活性候補化合物は、ポリペプチドとの構造上の相互作用に必要な官能化学基を含み、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくはこれらの官能化学基のうちの少なくとも２種、より好ましくはこれらの官能化学基のうちの少なくとも３種をふくむことができる。これらの免疫賦活性候補化合物は、上記で特定した官能基のうちの１種以上で置換した環状炭素もしくは複素環構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことができる。また、免疫賦活性候補化合物は、核酸、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジンなどの生体分子、これらの誘導体もしくは構造アナログ、または、これらの組合せなどとすることができる。免疫賦活性候補化合物が核酸の場合、この免疫賦活性候補化合物は、通常、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であるが、非天然結合もしくはサブユニットを有する修飾された核酸も企図している。
【０１５１】
免疫賦活性候補化合物は、天然、合成、もしくは半合成化合物のライブラリ、またはこれらの任意の組合せを含むさまざまな供給源から入手することができる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド、合成有機コンビナトリー・ライブラリ、ファージ提示系ランダムペプチド・ライブラリなどを含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムならびに制御（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成のための多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物からの抽出物の形の天然化合物のライブラリが利用可能であるか、容易に作製できる。さらに、天然および合成的に作製したライブラリならびに化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾することができる。さらに、既知の薬物に対して、アシル化、アルキル化、エステル化、アミディフィケーション（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの制御的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）もしくはランダム的化学修飾を行い、免疫賦活性候補化合物の構造アナログを作製することができる。
【０１５２】
従って、免疫賦活性候補化合物の供給源は、ＴＬＲ９と相互作用することが分かっているＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの既知のＴＬＲリガンドをベースとし、このリガンドの構造が、化学的部分をより多く、もしくは少なく含み、または異なる化学的部分を含むように、分子の１箇所以上の位置が変更されている分子のライブラリである。アナログ阻害剤のライブラリを作製する際にこれらの分子に加えられる構造の変更は、制御（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）もしくはランダム置換および／または付加、あるいはこれらの置換および／または付加の組合せとすることができる。コンビナトリー・ライブラリの作製に際し、当業者は、既存のＴＬＲ９リガンドを用いて、このようなライブラリを容易に作製することができる。
【０１５３】
また、種々の他の試薬をこの混合物に加えることができる。これらのものとしては、蛋白質−蛋白質および／または蛋白質−核酸結合の最適化を容易にするために用いることができる塩、緩衝剤、中性蛋白質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの試薬が挙げられる。また、このような試薬により、反応成分間の非特異的相互作用もしくはバックグラウンド相互作用を低減させることもできる。また、蛋白分解酵素阻害剤、核酸分解酵素阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を向上させるその他の試薬も使用することができる。
【０１５４】
成分の添加順序、インキュベーション温度、インキュベーション時間その他のアッセイ・パラメータは容易に決定することができる。こうした実験は、単にこれらのアッセイパラメータを最適化するものであり、このアッセイの根本的な構成に係わるものではない。インキュベーション温度は、通常４℃〜４０℃である。インキュベーション時間は、迅速ハイスループット・スクリーニングを容易にするため、できるだけ短くすることが好ましく、通常は１分〜１０時間である。
【０１５５】
インキュベーション後、ユーザーに利用可能な任意の便利な方法により、ＴＬＲシグナル伝達のレベルを検出する。セル・フリー結合型アッセイの場合、未結合成分から結合成分を分離する分離工程を用いることが多い。この分離工程は、種々の方法で遂行することができる。例えば、溶液中で分離を遂行することができ、あるいは、未結合成分を容易に分離することができる固体担体上に成分の少なくとも１つを固定すると都合がよい。この固体担体は、多種多様な材料で、マイクロタイター・プレート、マイクロビーズ、ディップ・スティック、樹脂粒子などの多種多様な形状に作製することができる。この担体は、シグナル対ノイズの最大化、主としてバックグラウンド結合の最少化をもたらすように、また、分離の容易さおよびコストを考慮して選択することが望ましい。
【０１５６】
分離は、例えば、リザーバからビーズもしくはディップスティックを除去し、マイクロタイター・プレートウェルのようなリザーバを空にするか希釈し、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラムもしくはフィルターを洗浄液もしくは溶媒ですすぐことによって行うことができる。この分離工程は、多数回のすすぎもしくは洗浄処理を含むことが望ましい。例えば、固体担体がマイクロタイター・プレートである場合、塩、緩衝剤、界面活性剤、非特異的蛋白質などのような、特異的結合に関与しないインキュベーション混合液の成分を含むのが通常である洗浄液を用いて、ウェルを数回洗浄することができる。固体担体が磁性ビーズである場合、このビーズは、洗浄液で１回以上洗浄した後、磁石を用いて分離することができる。
【０１５７】
検出は、細胞内もしくは細胞表面に存在する、または細胞により分泌された誘導ポリペプチドの測定など、細胞を利用するアッセイ用のどんな簡便な方法によっても行うことができる。細胞利用のアッセイに有用な検出法の例としては、蛍光細胞分離（ＦＡＣＳ）分析法、生体発光法（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などが挙げられる。無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）アッセイに有用な検出法としては、生体発光法、蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などが挙げられる。
【０１５８】
被験体とは、ヒト、または動物を意味するものとする。動物としては、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、齧歯動物、例えば、ラットおよびマウス、霊長類、例えば、サルおよび魚もしくはひれ魚（ｆｉｎ  ｆｉｓｈ）（例えば、サーモン）などの水産養殖類、ならびに甲殻類（例えば、エビおよびホタテ貝）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。治療もしくは予防方法に好適な被験体としては、脊椎動物種および無脊椎動物種が挙げられる。被験体は、家で飼うペット（例えば、イヌ、ネコ、魚など）、農業用家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ニワトリなど）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）、動物園の動物（例えば、ライオン、キリンなど）とすることができるが、これらに限定されるものではない。本明細書で説明する実施態様の多くは、ヒトの疾患に関するものであるが、本発明は、その他の非ヒト脊椎動物の治療にも有用である。
【０１５９】
本明細書に用いている「治療する」という用語は、本明細書に記載した諸疾患の１種に関して用いる場合、被験体がその疾患を発症する可能性を少なくする予防的治療、および確立された疾患の治療、例えば、その疾患もしくはそれによる症状を緩和もしくは根治させること、またはその疾患もしくは症状の悪化を防止することを意味する。
【０１６０】
疾患に罹患している被験体とは、その疾患の症状が客観的に測定可能である被験体のことを意味する。従って、例えば、癌に罹患している被験体とは、検出可能な癌細胞を有する被験体のことである。感染症に罹患している被験体とは、感染性生物に接触したことがあり、体内に検出可能なレベルでその生物を急性もしくは慢性的に有する被験体のことである。この感染症は、不顕性（潜伏性）もしくは活動性のものとすることができる。
【０１６１】
疾患に罹患するリスクのある被験体とは、その疾患を発症するリスクが通常より高い被験体と定義する。概して、この通常のリスクとは、その疾患に罹患していない正常者の集団、および、その疾患を発症する特定可能な（例えば、遺伝的もしくは環境的）素因を有していない正常者の集団のリスクのことである。従って、疾患に罹患するリスクのある被験体としては、その疾患を発症する遺伝的な素因を有する被験体、およびその疾患を引き起こすことが知られているか考えられている環境因子に接触しているか接触することになる被験体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的な環境因子としては、ウイルス、細菌、真菌および寄生生物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他の環境因子としては、例えば、タバコの煙、一部の有機化学物質、アスベストなどが挙げられる。
【０１６２】
核酸その他の治療剤の「有効量」という用語は、目的とする生物効果を達成するのに必要もしくは十分な量のことを意味する。概して、有効量とは、免疫系を賦活化させることにより、抗原特異的な免疫反応の形成が可能となるのに必要な量のことである。一部の実施態様として、この核酸その他の治療剤は、Ｔｈ１免疫反応もしくは一般的な免疫反応を賦活もしくは誘起するのに有効な量で投与する。Ｔｈ１免疫反応を賦活するのに有効な量とは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γなどのＴｈ１型サイトカインの１種以上の産生、および／またはＴｈ１型抗体の１種以上の産生を促進する量と定義することができる。
【０１６３】
さらに別の態様として、本発明は、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体に抗原を投与した後、この抗原に対する免疫反応を誘起するのに有効な量の本発明の免疫賦活性組成物をこの被験体に投与するものである。この抗原の投与は、本発明の免疫賦活性組成物投与の前、もしくは後、または同時に行うことができることに留意されたい。さらに、被験体への抗原および免疫賦活性組成物の投与は２度以上行うことができる。
【０１６４】
また、さらに別の態様として、本発明は、被験体において免疫反応を誘起する方法を提供する。本発明のこの態様による方法は、被験体の樹状細胞を単離し、この樹状細胞を生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で本発明の免疫賦活性組成物と接触させ、次いでこの樹状細胞を生体外で抗原と接触させ、接触させた樹状細胞をこの被験体に投与するものである。
【０１６５】
「抗原」という用語は、免疫反応を誘発することができる分子のことを意味する。概して、この抗原という用語は、宿主系が異物と認識するあらゆるタイプの分子を含む。抗原としては、微生物抗原、癌抗原およびアレルゲンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、抗原としては、細胞、細胞抽出物、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、多糖類、糖質複合体、多糖類その他の分子のペプチド性および非ペプチド性模倣体、低分子、脂質、糖脂質ならびに炭水化物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。蛋白質およびポリペプチドは、一般に炭水化物もしくは脂肪よりも抗原性が強いので、多くの抗原は事実上蛋白質もしくはポリペプチドである。
【０１６６】
この抗原は、核酸ベクターによりコードされている抗原とすることができるが、核酸ベクター内にコードされていなくてもよい。前者の場合、この核酸ベクターを被験体に投与すると、その抗原が生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で発現される。本明細書で用いている、核酸ベクター内にコードされていない抗原とは、核酸ではないあらゆるタイプの抗原を意味する。例えば、本発明の一部の態様として、この核酸ベクター内にコードされていない抗原は、ペプチドもしくはポリペプチドである。また、ペプチドもしくはポリペプチドの一次アミノ酸配列を軽微に修飾しても、対応する非修飾ポリペプチドに比し、ほぼ同等の抗原作用を有するポリペプチドを得ることができる。このような修飾は、部位特異的突然変異によるような意図的なものとすることができ、あるいは自然発生的なものとすることもできる。こうした修飾により産生されるポリペプチドは全て、抗原性が存続している限り、本明細書に含まれる。例えば、このペプチドもしくはポリペプチドは、ウイルス由来のものとすることができる。本発明に有用な抗原は、完全長の蛋白質もしくはポリペプチドの小ペプチド断片から完全長型までの範囲の任意の長さとすることができる。例えば、この抗原は、これが特異的免疫反応を賦活化するという条件で、アミノ酸残基数としての長さを５未満、８未満、１０未満、１５未満、２０未満、３０未満、５０７０未満、１００未満、またはそれ以上とすることができる。
【０１６７】
この抗原をコードする核酸は、真核細胞内で抗原核酸の発現を誘起する遺伝子発現配列へ動作可能なように結合させる。この遺伝子発現配列とは、プロモータ配列もしくはプロモータ−エンハンサ結合体などの任意の調節性ヌクレオチド配列のことであり、これにより、これに動作可能なように結合している抗原核酸の効率的な転写および翻訳が容易になる。この遺伝子発現配列は、例えば、構成性もしくは誘導性プロモータなどの哺乳動物もしくはウイルス・プロモータとすることができる。構成性哺乳動物プロモータとしては、ヒポキサンチン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシン・デアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモータ、β−アクチン・プロモータその他の構成性プロモータが挙げられるが、これらに限定されるものではない。真核細胞内で構成的に機能するウイルス・プロモータの例としては、例えば、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ）、シミアン・ウイルス（例えば、ＳＶ４０）、乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルスからのプロモータ、モロニー白血病ウイルスその他のレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）、および単純ヘルペス・ウイルスのチミジンキナーゼ・プロモータが挙げられる。その他の構成性プロモータについても当業者に知られている。また、本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモータとして誘導性プロモータがある。誘導性プロモータは、誘導剤の存在下に発現される。例えば、メタロチオネイン・プロモータは、特定の金属イオンの存在下に転写および翻訳を促進するよう誘導される。その他の誘導性プロモータについても当業者に知られている。
【０１６８】
概して、この遺伝子発現配列は、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などのような、それぞれ転写および翻訳の開始に関連している５’非転写および５’非翻訳配列を含むものとする。特に、この５’非転写配列は、動作可能なように結合した抗原核酸の転写を制御するためのプロモータ配列を有するプロモータを含むことになる。この遺伝子発現配列は、必要に応じて、エンハンサ配列もしくは所望の上流活性化配列を含む。
【０１６９】
上記抗原核酸は、遺伝子発現配列へ動作可能なように結合させる。本明細書に用いているような抗原核酸配列および遺伝子発現配列は、この抗原をコードする配列の発現もしくは転写および／または翻訳を遺伝子発現配列の影響もしくは制御下に置くような方法でこれらを共有結合させた場合、動作可能なように結合していると言う。５’遺伝子発現配列内にプロモータを導入することにより抗原配列が転写される場合、および、これら２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が、（１）フレームシフト突然変異を招かない、（２）抗原配列の転写を誘起するプロモータの能力を妨げない、または（３）対応するＲＮＡ転写物が蛋白質に翻訳される能力を妨げない場合、２つのＤＮＡ配列は動作可能なように結合していると言う。従って、遺伝子発現配列が抗原核酸配列の転写を行って生じた転写物が目的の蛋白質もしくはポリペプチドに翻訳されるようにすることができるならば、この遺伝子発現配列は抗原核酸配列に動作可能なように結合されるであろう。
【０１７０】
本発明の抗原核酸は、単独で、またはベクターと結合させて、免疫系へ送達することができる。ベクターは、最も広義には、この抗原核酸の免疫系の細胞への移入を容易にすることにより、この抗原が発現され、免疫細胞の表面に提示されることができるようにする任意の媒介物である。概して、このベクターは、上記核酸を、ベクターを用いなければ生じる恐れのある分解の程度に比し、さほど分解を生じずに免疫細胞へ輸送する。このベクターは、必要に応じて、この抗原核酸の免疫細胞における発現を増強する前述の遺伝子発現配列を含む。一般に、本発明に有用な上記ベクターとしては、抗原核酸配列の挿入もしくは組み込みにより操作したプラスミド、ファージミド、ウイルスその他のウイルス性もしくは細菌性供給源から得られる媒介物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ウイルス・ベクターは好ましいタイプのベクターであり、このようなものとしては、以下のウイルスからの核酸配列が挙げられるが、これらに限定されるものではない：モロニー・マウス白血病ウイルス、ハーベイ・マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、ラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ関連ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマ・ウイルス；エプスタインバル（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス；パピローマ・ウイルス；ヘルペス・ウイルス；ワクシニア・ウイルス；ポリオ・ウイルス；および；レトロウイルスなどのＲＮＡウイルス。命名されていないが当該分野で既知の他のベクターも容易に用いることができる。
【０１７１】
好ましいウイルス・ベクターは、非必須遺伝子が対象遺伝子で置換されている非細胞変性真核細胞ウイルス（ｎｏｎ−ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ）を用いるものである。非細胞変性ウイルスとしては、ライフサイクルがＤＮＡ中へのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写およびその後の宿主細胞ＤＮＡ中へのプロウイルスの組み込みを伴うレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスは、ヒトでの遺伝子治療試験用として認可されている。最も有用なものは、複製欠損性（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）（即ち、蛋白質の合成は誘導することができるが、感染性粒子を作ることができない）のレトロウイルスである。このような遺伝的に改変されたレトロウイルス・ベクターは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で遺伝子を高効率で導入するのに一般的に役立つものである。複製欠損性レトロウイルスを作製するための標準的なプロトコル（外来性遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドを満たしたパッケージング細胞を形質転換する工程、このパッケージング細胞株に組み換えレトロウイルスを産生させる工程、組織培養メジウムからウイルス粒子を回収する工程、および標的細胞にウイルス粒子を感染させる工程を含む）については、クリーグラー・Ｍ（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、  Ｍ．）ジーン・トランスファー・アンド・エクスプレッション（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｗ・Ｈ・フリーマン社（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．）、ニューヨーク（１９９０年）およびマレー・Ｅ・Ｊ（Ｍｕｒｒａｙ、Ｅ．Ｊ．）メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第７巻、フマーナ・プレス社（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｉｎｃ．）、クリフトン（Ｃｌｉｆｆｔｏｎ）、ニュージャージー（１９９１年）に示されている。
【０１７２】
一部の用途に好適なウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスのアデノ関連ウイルスである。このアデノ関連ウイルスは、複製欠損性となるように設計することができ、広範囲の細胞タイプおよび種に感染することができる。さらに、これは、熱および油性溶媒安定性；造血細胞を含む多種多様な系統の細胞における高導入頻度；および重感染抑制の欠如による多系列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｒｉｅｓ）の導入の可能性などの利点を有する。野性型アデノ関連ウイルスは、ヒト細胞ＤＮＡへの組み込み部位を幾分好むので、レトロウイルス感染に特有な、挿入遺伝子の発現に関する挿入突然変異およびばらつきの可能性を極力少なくすることができるとの報告がある。さらに、野性型アデノ関連ウイルスによる感染は、選択圧がない場合、組織培養で１００継代を超えて維持され、このことから、このアデノ関連ウイルス・ゲノムの組み込みは比較的安定な事象であることが示唆される。また、アデノ関連ウイルスは、染色体外でも機能することができる。レプリカーゼ蛋白質を欠損する組み換えアデノ関連ウイルスは、明らかに、この組み込み配列特異性を欠いている。
【０１７３】
その他のベクターとしては、プラスミドが挙げられる。プラスミド・ベクターについては、当該分野で広く報告されており、当業者には既知のものである。例えば、サンブルック・Ｔほか（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｔ．ｅｔ  ａｌ．）、「モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年参照を参照されたい。この数年の間に、プラスミド・ベクターは、宿主ゲノム内で複製してこのゲノムに組み込まれることができないため、生体内(ｉｎ  ｖｉｖ
ｏ)で細胞に遺伝子を送達するのに特に有利であることが見出された。また一方、宿主細
胞に適合したプロモータを有するこのプラスミドは、プラスミド内に動作可能なようにコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。よく用いられるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。その他のプラスミドについても当業者によく知られている。さらに、プラスミドは、特定のＤＮＡ断片を除去および付加することができるように、制限酵素および連結反応を利用してカスタム・デザインすることができる。
【０１７４】
最近、細菌を用いて遺伝子を含むプラスミドを免疫系に送達することができることが発見された。サルモネラなどの細菌の改変体は、プラスミドを用いて形質転換し、送達媒介物として利用することができる。この細菌性送達媒介物は、宿主被験体に対し、経口的に、またはその他の投与手段によって投与することができる。この細菌は、恐らく腸管障壁を通過することによって、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞、樹状細胞へこのプラスミドを送達する。この方法を用いることによって高レベルの免疫防御が達成されている。このような送達方法は、抗原、核酸および／または他の治療剤の全身的な送達を利用する本発明の諸態様に有用である。
【０１７５】
本発明の一部の態様として、前記核酸は、疾患特異的な薬剤(ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔ)などの治療剤と併用して投与することができる。本明細書に用いている薬剤(ｍｅｄｉｃａ
ｍｅｎｔ)とは、疾患の治療もしくは予防に主として用いられている療法もしくは薬物で
ある。
【０１７６】
一態様として、核酸と疾患特異的薬剤とを併用することにより、高用量で通常遭遇する程多くの副作用を生じることなく、高用量の疾患特異的薬剤を投与することが可能になる。別の態様として、核酸と疾患特異的薬剤とを併用することにより、両化合物を治療量以下の低用量で投与して、併用しなければそのような低用量で達成されると思われる効果よりも高い効果を得ることが可能になる。一例として、免疫賦活性核酸と薬剤とを併用投与することにより、この薬剤の投与量が、単独では有効でないと考えられる用量（即ち、治療量以下の用量）であっても、有効な反応を得ることが可能である。別の例では、この併用投与により、核酸の投与量が、単独では有効でないと考えられる用量であっても、反応を得ることができる。
【０１７７】
また、上記核酸および／または他の治療剤は、決まった予定表に基づいて、あるいは相互の時間的な関連を異にして投与することもできる。こうした種々の併用には、免疫反応を調節し、疾患を予防もしくは治療する従来の方法に対して、特に、正常組織への非特異的毒性が少ないなど、多くの利点がある。
【０１７８】
癌は、細胞のコントロール不良の増殖（即ち、分裂）を伴う疾患である。癌細胞のコントロール不良の増殖の一因となる既知のメカニズムの一部としては、成長因子非依存性、ゲノム変異の検出不能、および不適切な細胞シグナル伝達が挙げられる。癌細胞が正常な増殖制御を無視することができることにより、増殖速度は増大することができる。癌の原因についてはまだ明確に立証されていないが、癌の一因となるか、その素因を被験体にもたらす因子がいくつか報告されている。このような因子としては、特定のゲノム変異（例えば、乳癌でのＢＲＣＡ遺伝子変異、大腸癌でのＡＰＣ）、発癌性が疑われる物質もしくは発癌性物質（例えば、アスベスト、紫外線）への接触、または乳癌などの特定の癌に対する家族性素因が挙げられる。
【０１７９】
対象とする癌は、悪性もしくは非悪性の癌とすることができる。癌または腫瘍としては、胆管癌；脳腫瘍；子宮頚癌；絨毛癌；大腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内腫瘍；リンパ腫；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞癌）；黒色腫；神経芽細胞腫；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；肉腫；皮膚癌；睾丸癌；甲状腺癌；および腎癌、ならびにそのたの癌および肉腫が挙げられる。一部の実施態様として、この癌は、ヘアリー細胞白血病、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞性白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、へん平上皮細胞癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱細胞癌、もしくは大腸癌である。
【０１８０】
「癌に罹患している被験体」とは、検出可能な癌細胞を有する被験体のことである。
【０１８１】
「癌を発症するリスクのある被験体」とは、癌を発症する確率が通常より高い被験体のことである。この被験体としては、例えば、癌発症の可能性の増大と関連付けられることが明らかにされている遺伝的異常を有する被験体、癌に罹患する家族性素因を有する被験体、タバコ、アスベストもしくは他の化学的毒素などの癌の原因となる物質（即ち、発癌性物質）に接触した被験体、および以前に癌の治療を受け、寛解していると思われる被験体が挙げられる。
【０１８２】
本明細書に用いている「癌抗原」とは、ペプチドもしくは蛋白質のような化合物であって、腫瘍もしくは癌細胞表面と関係があり、ＭＨＣ分子との関連で抗原提示細胞の表面に発現されると、免疫反応を誘発することができる化合物のことである。癌細胞からの癌抗原の調製は、例えば、コーエン・Ｐ・Ａほか（Ｃｏｈｅｎ  Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９４年）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５４：ｐ１０５５−８に記載されている方法で癌細胞の粗抽出物を調製し、もしくはこの抗原を部分精製し、または組み換え技術を用い、あるいは既知の抗原をデノボ合成することによって行うことができる。癌抗原としては、組み換え技術により発現させた抗原、腫瘍もしくは癌の免疫原性部分、または腫瘍もしくは癌全体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような抗原は、組み換え技術により、または当該分野で既知の任意の他の手段によって単離もしくは調製することができる。
【０１８３】
「癌抗原」および「腫瘍抗原」という用語は、同義に用いられており、癌細胞によって識別的に発現されるので癌細胞を標的にするのに利用することができる抗原のことを意味する。癌抗原は、腫瘍特異的と思われる免疫反応を潜在的に賦活化することができる抗原である。これらの抗原の一部は、必ずしも発現されないが、正常細胞によってもコードされている。このような抗原は、正常細胞では通常埋もれている（ｓｉｌｅｎｔ）（即ち、発現されない）もの、分化の特定の段階でのみ発現されるもの、および胚性もしくは胎児性抗原のように一時的に発現されるものとして特徴付けられる。別の癌抗原は、腫瘍遺伝子（例えば、活性化ラス（ｒａｓ）腫瘍遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、変異型ｐ５３）、内部欠損もしくは染色体転座から生じた融合蛋白質などの突然変異した細胞遺伝子によりコードされている。さらに別の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス上に含まれるようなウイルス遺伝子によってコードされていることがある。腫瘍抗原の例としては、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／メラン−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジル・ペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシン・デアミナーゼ結合蛋白質（ＡＤＡｂｐ）、サイクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）-Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ
）とその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍ１１、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）とその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、ＭＡＧＥファミリーの腫瘍抗原（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、ＧＡＧＥファミリーの腫瘍抗原（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ラス（ｒａｓ）、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫様ポリポーシス蛋白質（ＡＰＣ）、ホドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ヒト・パピローマ・ウイルス蛋白質などのウイルス蛋白質、スマッド（Ｓｎａｄ）ファミリーの腫瘍抗原、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲン・ホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。
【０１８４】
癌もしくは腫瘍およびこのような腫瘍と関連のある腫瘍抗原としては（以下に限定されるものではないが）、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６；ａｍ１１；サイクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、グリオーマ（Ｅ−カドヘリン；α−カテニン；β−カテニン；γ−カテニン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱癌（ｐ２１ラス）、胆管癌（ｐ２１ラス）、乳癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頚癌（ｐ５３；ｐ２１ラス）、結腸癌（ｐ２１ラス；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛癌（ＣＥＡ）、上皮細胞癌（サイクロフィリンｂ）、胃癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖蛋白質）、肝細胞癌（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、肺癌（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ球様細胞由来白血病（サイクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ１５蛋白質、ｇｐ７５、腫瘍胎児抗原、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー；ｐ２１ラス）、非小細胞肺癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、上咽頭癌（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、卵巣癌（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺癌（前立腺特異抗原（ＰＳＡ）およびその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２およびＰＳＡ−３；ＰＳＭＡ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膵臓癌（ｐ２１ラス；ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖蛋白質）、腎癌（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頚部および食道のへん平上皮癌（ヒト・パピローマ・ウイルス蛋白質などのウイルス蛋白質）、睾丸癌（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）、ならびに黒色腫（メラン−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ｃｄｃ２７；ＭＡＧＥ−３；ｐ２１ラス；ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７）が挙げられる。
【０１８５】
ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの一方または両方に結合する腫瘍抗原の例については、以下の文献を参照されたい：クーリー（Ｃｏｕｌｉｅ）、ステム・セルズ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ）１３：ｐ３９３−４０３、１９９５年；トラベルサーリほか（Ｔｒａｖｅｒｓａｌｉｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１７６：ｐ１４５３−１４５７、１９９２年；ショーほか（Ｃｈａｕｘｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６３：ｐ２９２８−２９３６、１９９９年；フジエほか（Ｆｕｊｉｅｅｔ  ａｌ．）インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）８０：ｐ１６９−１７２、１９９９年；タンザレラほか（Ｔａｎｚａｒｅｌｌａｅｔ  ａｌ．）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５９：ｐ２６６８−２６７４、１９９９年；ファン・デル・ブルッケンほか（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎｅｔ  ａｌ．）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２４：ｐ２１３４−２１４０、１９９４年；ショーほか（Ｃｈａｕｘｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８９：ｐ７６７−７７８、１９９９年；カワシマほか（Ｋａｗａｓｈｉｍａｅｔ  ａｌ．）ヒューマン・イムノロジー（Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）５９：ｐ１−１４、１９９８年；タハラほか（Ｔａｈａｒａｅｔ  ａｌ．）クリニカル・キャンサー・リサーチ（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５：ｐ２２３６−２２４１、１９９９年；ガウグラーほか（Ｇａｕｇｌｅｒｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１７９：ｐ９２１−９３０、１９９４年；ファン・デル・ブルッケンほか（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎｅｔ  ａｌ．）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２４：ｐ３０３８−３０４３、１９９４年；タナカほか（Ｔａｎａｋａｅｔ  ａｌ．）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５７：ｐ４４６５−４４６８、１９９７年；オイソほか（Ｏｉｓｏｅｔ  ａｌ．）インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）８１：ｐ３８７−３９４、１９９９年；ハーマンほか（Ｈｅｒｍａｎｅｔ  ａｌ．）イムノジェネティックス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）４３：ｐ３７７−３８３、１９９６年；マニッチほか（Ｍａｎｉｃｉｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８９：ｐ８７１−８７６、１９９９年；ダフォールほか（Ｄｕｆｆｏｕｒｅｔ  ａｌ．）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２９：ｐ３３２９−３３３７、１９９９年；ゾーンほか（Ｚｏｒｎｅｔ  ａｌ．）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２９：ｐ６０２−６０７、１９９９年；ファングほか（Ｈｕａｎｇｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６２：ｐ６８４９−６８５４、１９９９年；ベールほか（Ｂｏｅｌｅｔ  ａｌ．）イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）２：ｐ１６７−１７５、１９９５年；ファン・デン・アインデほか（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８２：ｐ６８９−６９８、１９９５年；ド・バッカーほか（Ｄｅ  Ｂａｃｋｅｒｅｔ  ａｌ．）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５９：ｐ３１５７−３１６５、１９９９年；イェーガーほか（Ｊａｅｇｅｒｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８７：ｐ２６５−２７０、１９９８年；ワンほか（Ｗａｎｇｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６１：ｐ３５９６−３６０６、１９９８年；アーンヌーゼほか（Ａａｒｎｏｕｄｓｅｅｔ  ａｌ．）インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）８２：ｐ４４２−４４８、１９９９年；ギューほか（Ｇｕｉｌｌｏｕｘｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８３：ｐ１１７３−１１８３、１９９６年；ルペッティほか（Ｌｕｐｅｔｔｉｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８８：ｐ１００５−１０１６、１９９８年；ヴェルフェルほか（Ｗｏｅｌｆｅｌｅｔ  ａｌ．）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２４：ｐ７５９−７６４、１９９４年；スキッパーほか（Ｓｋｉｐｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８３：ｐ５２７−５３４、１９９６年；カンほか（Ｋａｎｇｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５５：ｐ１３４３−１３４８、１９９５年；モレルほか（Ｍｏｒｅｌｅｔ  ａｌ．）インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）８３：ｐ７５５−７５９、１９９９年；ブリチャードほか（Ｂｒｉｃｈａｒｄｅｔ  ａｌ．）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２６：ｐ２２４−２３０、１９９６年；キトルセンほか（Ｋｉｔｔｌｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６０：ｐ２０９９−２１０６、１９９８年；カワカミほか（Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６１：ｐ６９８５−６９９２、１９９８年；トパリアンほか（Ｔｏｐａｌｉａｎｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８３：ｐ１９６５−１９７１、１９９６年；コバヤシほか（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５８：ｐ２９６−３０１、１９９８年；カワカミほか（Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５４：ｐ３９６１−３９６８、１９９５年；ツァイほか（Ｔｓａｉｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５８：ｐ１７９６−１８０２、１９９７年；コックスほか（Ｃｏｘｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２６４：ｐ７１６−７１９、１９９４年；カワカミほか（Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ９１：ｐ６４５８−６４６２、１９９４年；スキッパーほか（Ｓｋｉｐｐｅｒｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５７：ｐ５０２７−５０３３、１９９６年；ロビンスほか（Ｒｏｂｂｉｎｓｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１５９：ｐ３０３−３０８、１９９７年；カステリほか（Ｃａｓｔｅｌｌｉｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６２：ｐ１７３９−１７４８、１９９９年；カワカミほか（Ｋａｗａｋａｍｉｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８０：ｐ３４７−３５２、１９９４年；カステリほか（Ｃａｓｔｅｌｌｉｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８１：ｐ３６３−３６８、１９９５年；シュナイダーほか（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｅｔ  ａｌ．）インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）７５：ｐ４５１−４５８、１９９８年；ワンほか（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８３：ｐ１１３１−１１４０、１９９６年；ワンほか（Ｗａｎｇｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８４：ｐ２２０７−２２１６、１９９６年；パークハーストほか（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５８：ｐ４８９５−４９０１、１９９８年；ツングほか（Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．）８７：ｐ９８２−９９０、１９９５年；コッレアーレほか（Ｃｏｒｒｅａｌｅｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティテュート（Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．）８９：ｐ２９３−３００、１９９７年；クーリーほか（Ｃｏｕｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ９２：ｐ７９７６−７９８０、１９９５年；ヴェルフェルほか（Ｗｏｅｌｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２６９：ｐ１２８１−１２８４、１９９５年；ロビンスほか（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８３：ｐ１１８５−１１９２、１９９６年；ブレンドルほか（Ｂｒａｅｎｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８３：ｐ２５０１−２５０８、１９９６年；テン・ボッシュほか（ｔｅｎ  Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）８８：ｐ３５２２−３５２７、１９９６年；マンドルザ��トほか（Ｍａｎｄｒｕｚｚａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８６：ｐ７８５−７９３、１９９７年；ゲグエンほか（Ｇｕｅｇｕｅｎｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６０：ｐ６１８８−６１９４、１９９８年；イェルツェンほか（Ｇｊｅｒｔｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）インターナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ）７２：ｐ７８４−７９０、１９９７年；ゴーダンほか（Ｇａｕｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６２：ｐ１７３０−１７３８、１９９９年；キアーリほか（Ｃｈｉａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５９：ｐ５７８５−５７９２、１９９９年；ホーガンほか（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５８：ｐ５１４４−５１５０、１９９８年；ピーパーほか（Ｐｉｅｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８９：ｐ７５７−７６５、１９９９年；ワンほか（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８４：ｐ１３５１−１３５４、１９９９年；フィスクほか（Ｆｉｓｋ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．）１８１：ｐ２１０９−２１１７、１９９５年；ブロサートほか（Ｂｒｏｓｓａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）５８：ｐ７３２−７３６、１９９８年；レプケほか（Ｒｏｅｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ．）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ）ＵＳＡ９３：ｐ１４７０４−１４７０７、１９９６年；イケダほか（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．）イミュニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）６：ｐ１９９−２０８、１９９７年；ロンシンほか（Ｒｏｎｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）１６３：ｐ４８３−４９０、１９９９年；ヴォンダーハイデほか（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．）イミュニティ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）１０：ｐ６７３−６７９、１９９９年。これらの
抗原ならびに他のものは、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６０１において開示される。
【０１８６】
本発明の組成物および方法は、癌の治療に単独、または他の薬剤および方法との併用で用いることができる。現在、癌は、外科手術、放射線療法および化学療法を含む種々の様式を用いて治療されている。治療様式の選択は、癌の種類、部位および播種度によって決まることになる。例えば、外科手術および放射線療法は、固形で境界の明瞭な腫瘍塊の場合にはより適切であるが、白血病、リンパ腫などの非固形腫瘍癌の場合には役立つことは少ない。外科手術および放射線療法の利点の１つは、治療による強い影響をある程度コントロールすることができ、これにより体内の正常組織への毒性に歯止めをかけることができることである。しかしながら、外科手術および放射線療の後では、残存または放射線抵抗性癌細胞に対する用心のため、化学療法が行われる。また、化学療法は、白血病およびリンパ腫のような播種性の癌ならびに転移に対しては、最も適切な治療法である。
【０１８７】
化学療法とは、癌細胞を攻撃するのに化学的および／または生物学的薬剤を用いる治療法のことを意味する。局所的な外科手術もしくは放射線療法と異なり、化学療法は一般に全身性に投与されるので、正常組織への毒性が大きな関心事である。多くの化学療法は癌細胞の増殖特性に基づいて癌細胞を標的にするので、正常な増殖性を有する消化管および骨髄も化学療法の作用による影響を受けやすい。化学療法の主な副作用の１つは、正常な造血前駆細胞の死滅による骨髄抑制（貧血、好中球減少、血小板減少など）である。
【０１８８】
多くの化学療法剤が癌の治療用として開発されてきた。しかしながら、全ての腫瘍が化学療法に反応する訳ではなく、その他の腫瘍は、最初は化学療法剤に反応を示すが、次第に抵抗性を生じることがある。そのため、有効な抗癌剤の探索では、非特異的な毒性が少なくさらに有効な薬剤を見出す努力が強化されている。
【０１８９】
制癌剤はさまざまな様式で作用する。一部の制癌剤は、腫瘍細胞に特有の生理的メカニズムを標的にすることにより作用する。その例としては、癌において突然変異している特定の遺伝子およびその遺伝子産物（即ち、主として蛋白質）を標的にすることが挙げられる。このような遺伝子としては、腫瘍遺伝子（例えば、ラス、Ｈｅｒ２、ｂｃｌ−２）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＥＧＦ、ｐ５３、Ｒｂ）、および細胞周期ターゲット（例えば、ＣＤＫ４、ｐ２１、テロメラーゼ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。あるいは、制癌剤は、癌細胞内で変質しているシグナル変換経路および分子レベルのメカニズムを標的にすることもできる。細胞表面に発現されるエピトープを介して癌細胞を標的にするには、モノクロナール抗体を用いる。この後者のタイプの制癌剤は、本明細書では概して、免疫療法と呼ぶ。
【０１９０】
その他の制癌剤は癌細胞以外の細胞を標的にする。例えば、免疫系を賦活化して腫瘍細胞を攻撃する薬剤もある（即ち、癌ワクチン）。さらに、血管形成阻害薬と呼ばれる別の薬剤は、固形腫瘍への血液供給面を攻撃することにより作用する。最も悪性の癌は転移することができる（即ち、一次腫瘍部位から離れて別の部位に浸潤することにより二次腫瘍を形成する）ので、このような転移を妨げる薬剤も癌の治療に有用である。血管形成メディエータとしては、塩基性ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、アンジオポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、ＴＮＦ−α、ＴＮＰ−４７０、トロンボスポジン−１、血小板因子４、ＣＡＩ、蛋白質のインテグリン・ファミリーの一部が挙げられる。このタイプの薬剤の１種は、癌細胞が一次腫瘍部位を離れて別の組織内に滲出するために利用する酵素を阻害するメタロプロテイナーゼ阻害剤である。
【０１９１】
一部の癌細胞は抗原性を有するので、免疫系による標的にすることができる。一態様として、核酸と制癌剤、特に癌免疫療法剤として分類されるものとの併用投与は、癌抗原に対する特異的な免疫反応を賦活するのに有用である。
【０１９２】
免疫監視機構の理論というのは、免疫系の第一の機能が、腫瘍が形成される前に新生細胞を検知し排除することにあるというものである。この理論の基本的な原理は、癌細胞の抗原性が正常細胞と異なることにより、免疫不適合の同種移植片に対して拒絶をもたらすのと同様な免疫反応が誘発されるということである。研究の結果、腫瘍細胞は、定性的にも定量的にも抗原の発現が異なっていることが確認されている。例えば、「腫瘍特異抗原」というのは、腫瘍細胞と特異的な関連性を有するが、正常細胞とはそうではない抗原である。腫瘍特異抗原の例としては、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスが誘発する腫瘍のウイルス抗原がある。「腫瘍関連」抗原は、腫瘍細胞および正常細胞の両方に存在するが、腫瘍細胞では異なる量もしくは異なる形態で存在する。このような抗原の例は、腫瘍胎児抗原（例えば、癌胎児性抗原）、分化抗原（例えば、ＴおよびＴｎ抗原）、ならびに腫瘍遺伝子産物（例えば、ＨＥＲ／ｎｅｕ）である。
【０１９３】
イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）および生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で標的腫瘍を殺傷することができる種々のタイプの細胞が同定されている：ナチュラル・キラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ）および活性化マクロファージ。ＮＫ細胞は、前もって特異抗原に感作していなくても腫瘍細胞を殺傷することができ、この作用には標的細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされたクラスＩ抗原の存在は必要とされない。ＮＫ細胞は、発生期の腫瘍の抑制および転移性増殖の抑制に関与していると考えられている。ＮＫ細胞とは対照的に、ＣＴＬは、これが腫瘍抗原に感作した後にのみ、および、ＭＨＣクラスＩをも発現する腫瘍細胞上に標的抗原が発現されている場合に、腫瘍細胞を殺傷することができる。ＣＴＬは、移植腫瘍およびＤＮＡウイルス誘発腫瘍の拒絶の際の効果細胞であると考えられている。ＬＡＫ細胞は、ＮＫおよびＣＴＬ集団とは異なるヌル・リンパ球のサブセットである。活性化マクロファージは、一旦賦活化されると、抗原依存性でもＭＨＣ拘束性でもない仕方で腫瘍細胞を殺傷することができる。活性化マクロファージは、貫通して、これが浸潤する腫瘍の増殖速度を低下させる。イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイでは、抗体依存性、細胞媒介性細胞傷害反応および抗体プラス補体による細胞溶解のような他の免疫メカニズムが明らかにされている。しかしながら、こうした免疫エフェクター・メカニズムは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのＮＫ、ＣＴＬ、ＬＡＫおよびマクロファージの機能よりも生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での重要性は少ないと考えられている（総説としては、ピーセンズ・Ｗ・Ｆほか（Ｐｉｅｓｓｅｎｓ  Ｗ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．）「腫瘍免疫学（Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、サイエンティフィック・アメリカン・メディシン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、第２巻、サイエンティフィック・アメリカン・ブックス（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ）、Ｎ．Ｙ．、ｐ１−３、１９９６年を参照）。
【０１９４】
免疫療法の目標は、確立された腫瘍に対する患者の免疫反応を増強することにある。免疫療法の一方法として、アジュバントの使用がある。カルメット・ゲラン菌などの微生物由来のアジュバント物質は、動物において免疫反応を高め、腫瘍に対する抵抗性を向上させる。
【０１９５】
免疫療法剤は、癌抗原を特異的に結合または認識する抗体もしくは抗体断片に由来する薬剤である。抗体を利用した免疫療法は、癌細胞の表面に結合して作用することにより、内在性免疫系を賦活化して癌細胞を攻撃することができる。抗体を利用した療法が作用する別の方法は、癌細胞に対して特異的に毒性物質をターゲッティングするための送達システムを用いるものである。通常、抗体は、（トウゴマの実などからの）リシン、カリーチアマイシン、メイタンシノイドなどの毒素、ヨード−１３１、イットリウム−９０などの放射性同位体、（本明細書に記載したような）化学療法剤、または生物反応修飾物質に結合させる。この方法では、これらの毒性物質を癌の部位に集中させることができ、正常細胞に対する非特異的な毒性をできるだけ少なくすることができる。癌抗原に特異的な抗体を使用することのほかに、内皮細胞に結合する抗体などの血管に結合する抗体も本発明に有用である。これは、固形腫瘍の生残が、概して新規に形成される血管に依存するので、多くの腫瘍が新規の血管の成長を強化、促進することができるからである。このため、多くの制癌剤について採られる戦略は、腫瘍を養っている血管および／またはこの血管を支持する結合組織（または、ストロマ）を攻撃することである。
【０１９６】
癌ワクチンは、癌細胞に対する内因性の免疫反応を賦活化するための薬剤である。現在作製されているワクチンのほとんどは、液性免疫系を賦活化する（即ち、抗体依存性免疫反応）。その他の現在開発中のワクチンは、腫瘍細胞を殺傷することができる細胞傷害性Ｔリンパ球を含む細胞性免疫系を賦活化することに焦点を当てている。概して、癌ワクチンは、抗原提示細胞（例えば、マクロファージおよび樹状細胞）および／またはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などの他の細胞への癌抗原の提示を強化する。
【０１９７】
癌ワクチンは、後述のように、いくつかの形態のうちの１つをとることができるが、それらの目的は、癌抗原および／または癌関連抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）へ送達することにより、ＡＰＣによるこのような抗原の内因性プロセッシングおよびＭＨＣクラスＩ分子との関連での細胞表面への抗原の最終的な提示を促進することにある。癌ワクチンの１つの形態は、被験体から取り出し、生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で処理した後、完全体の細胞の形でこの被験体に再導入する癌細胞の製剤である全細胞ワクチンである。また、腫瘍細胞のライセートを癌ワクチンとして用いて免疫反応を誘起することもできる。別の形態の癌ワクチンは、癌特異的もしくは癌関連低分子蛋白質を用いてＴ細胞を賦活化するペプチドワクチンである。癌関連蛋白質は、癌細胞によってのみ発現されるのではない蛋白質である（即ち、他の正常細胞もなおこの抗原を発現することができる）。しかしながら、一般に、癌関連抗原の発現は、特定のタイプの癌の場合、常に上方制御される。その他の癌ワクチンとしては、ガングリオシド・ワクチン、熱ショック蛋白質ワクチン、ウイルスおよび細菌ワクチン、ならびに核酸ワクチンが挙げられる。
【０１９８】
さらに別の形態のワクチンは、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で癌抗原もしくは癌関連抗原に接触させた完全体の樹状細胞を含む樹状細胞ワクチンである。また、樹状細胞のライセートもしくは膜フラクションも癌ワクチンとして用いることができる。樹状細胞ワクチンは、ＡＰＣを直接賦活化することができる。樹状細胞は本来の（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）ＡＰＣである。樹状細胞は、抗原を提示し、その局所環境においてＬＰＳのような微生物性分子を検知するパターン認識受容体を発現することによって、先天性免疫系と獲得免疫系との橋渡しをしている。樹状細胞は、これが接触する可溶性特異抗原を効率的に取り込み、プロセッシングし、提示する。抗原を取り込み、提示するこのプロセスにより、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）および共起刺激分子の発現の迅速な上方制御、サイトカインの産生、ならびにこれらがＴ細胞の賦活化に関与する部位と考えられているリンパ器官への移動が起こる。
【０１９９】
本明細書に用いている化学療法剤とは、免疫療法剤もしくは癌ワクチンのカテゴリーに入らない他の全ての形態の制癌剤を含むものである。本明細書に用いている化学療法剤は、化学的および生物学的薬剤の両者を含む。これらの薬剤は、癌細胞が生存の継続のために依存している細胞機能を阻害するように作用する。化学療法剤というカテゴリーには、アルキル化／アルカロイド剤、代謝拮抗剤、ホルモンもしくはホルモン・アナログ、および多種多様な抗癌剤が含まれる。これらの薬剤のうち、全てではないにしても殆どは、癌細胞に対して直接毒性を示し、免疫の賦活を必要としない。
【０２００】
本明細書に用いている「感染症」もしくは同様な意味合いの「感染」とは、感染性生物が宿主を表在性、局所性もしくは全身性に侵襲することにより生じる疾患のことを意味する。感染性生物としては、細菌、ウイルス、真菌、および寄生生物が挙げられる。従って、「感染症」には、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症および寄生生物による感染症が含まれる。
【０２０１】
感染症に罹患している被験体とは、感染性生物に接触したことがあり、体内に急性的もしくは慢性的に検出可能なレベルのこの生物を有する被験体である。一般に、感染性生物への接触は、被験体の体表面、例えば、皮膚もしくは粘膜に対して起こり、および／または感染性生物が被験体の体表面に侵入することを意味する。
【０２０２】
感染症を発症するリスクのある被験体とは、感染を引き起こす病原体に接触するリスクが通常より高い被験体である。例えば、リスクのある被験体は、特定の種類の病原菌が見出されている地域へ旅行することを計画している被験体であり、もしくは生活様式もしくは医療処置を通じて、感染性生物を含んでいる恐れのある体液、もしくは直接その生物に接触している被験体であり、または感染性生物が確認された地域に住んでいる被験体である。また、感染症を発症するリスクのある被験体には、医療機関が特定の感染性生物に対するワクチン接種を勧告している一般住民も含まれる。
【０２０３】
感染症を発症するリスクのある被験体には、微生物、例えば、インフルエンザに接触する一般的なリスクを有するが本発明による治療中にその病気が活動的でない被験体、および被験体を特定の微生物に接触させる医療上もしくは環境的な因子のため、感染症を発症する固有のリスクを有すると考えられる被験体が含まれる。
【０２０４】
細菌は、二分裂によって無性的に増殖する単細胞生物である。これは、その形態、染色反応、栄養および代謝要求量、抗原構造、化学的組成、および遺伝的相同性に基づいて分類、命名されている。細菌は、その形態によって、球状（球菌）、真っ直ぐな桿状（桿菌）、および湾曲もしくは螺旋形桿状（ビブリオ属菌、カンピロバクター、らせん菌）の３群に分類することができる。また、より一般的には、細菌はその染色反応によってグラム陽性およびグラム陰性の２クラスの微生物に特徴付けられる。グラムとは、微生物学実験室で通常行われている染色の方法のことを意味する。グラム陽性微生物は、染色処置後も染色剤を保持し、濃い紫色に見える。グラム陰性微生物は、その染色剤を保持しないが、対比染色剤を吸収するのでピンク色に見える。
【０２０５】
感染性細菌としては、グラム陰性およびグラム陽性細菌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。グラム陽性菌としては、バスツレラ属、ブドウ球菌属およびストレプトコッカス属が挙げられるが、これらに限定されるものではない。グラム陰性菌としては、大腸菌、シュードモナス属、およびサルモネラ属が挙げられるが、これらに限定されるものではない。感染性細菌の具体例としては、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・ブルグドルフェリー、レジオネラ・ニューモフィリア、マイコバクテリア属（例えば、エム・ツベルクローシス、エム・アビウム、エム・イントラセルラール、エム・カンサシ、エム・ゴルドナエ）、黄色ブドウ球菌、淋菌、髄膜炎菌、リステリア・モノサイトゲネス、化膿連鎖球菌、（連鎖球菌Ａ群）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（連鎖球菌Ｂ群）、ストレプトコッカス（ビリダンス群）、大便連鎖球菌、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌、病原性カンピロバクター属、腸球菌属、インフルエンザ菌、炭疽菌、ジフテリア菌、コリネバクテリウム属、ブタ丹毒菌、ウェルシュ菌、破傷風菌、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌、パスツレラ・ムルトシダ、バクテロイデス属、フソバクテリウム・ナクレタム、ストレプトバシラス・モニリフォルミス、梅毒トレポネーマ、トレポネーマ・ペルテヌエ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属、リケッチア属、およびアクチノマイセス・イスラエリが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０６】
ウイルスは、一般に核酸コアおよび蛋白質被膜を有する微小病原体であるが、独立して生きている生物ではない。また、ウイルスは蛋白質を欠く感染性核酸の形をとることもできる。ウイルは、内部で複製することができる生細胞がないと、生存することができない。ウイルスは、エンドサイトーシスまたはＤＮＡ（ファージ）の直接注入によって特定の生細胞に入り、増殖し、疾患を誘発する。次いで、増殖したウイルスは放出され、別の細胞に感染する。ウイルスにはＤＮＡ含有ウイルスもあり、ＲＮＡ含有ウイルスもある。また、一部の態様として、本発明は、例えば、ウシ海綿状脳症（即ち、狂牛病、ＢＳＥ）もしくは動物のスクレピー感染、またはヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病などの、疾患進行にプリオンが関与している疾患を治療するものである。
【０２０７】
ウイルスとしては、エンテロ・ウイルス（例えば、ポリオ・ウイルス、コクサッキー・ウイルス、エコー・ウイルスなどのピコルナ・ウイルス科のウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない）、ロタウイルス、アデノウイルス、肝炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヒトに見出されたウイルスの具体例としては、レトロウイルス科（例えば、ポリオ・ウイルス、肝炎Ａ型ウイルス；エンテロ・ウイルス、ヒトコクサッキー・ウイルス、ライノ・ウイルス、エコー・ウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎誘発株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビ・ウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナ・ウイルス科（例えば、コロナ・ウイルス）；ラブド・ウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロ・ウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザ・ウイルス、ムンプス・ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器性シンシチアル・ウイルス）；オルトミクソ・ウイルス科（例えば、インフルエンザ・ウイルス）；ブニアウイルス科（例えば、ハンターンウイルス、ブニアウイルス、フレボ・ウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、ロタ・ウイルス）；ビルナ・ウイルス科；ヘパドナ・ウイルス科（肝炎Ｂ型ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマ・ウイルス、ポリオーマ・ウイルス）；アデノウイルス科（アデノウイルスの殆ど）；ヘルペス・ウイルス科（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水疱瘡ウイルス、サイトメガロ・ウイルス（ＣＭＶ））；ポックスウイルス科（天然痘ウイルス、ワクシニア・ウイルス、ポックスウイルス）；イリドウイルス科（例えば、アフリカ豚コレラウイルス、）；および未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病因ウイルス、（肝炎Ｂ型ウイルスの不完全（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）サテライトと考えられる）デルタ肝炎のウイルス、非Ａ非Ｂ型肝炎のウイルス（クラス１＝内部的に伝染；クラス２＝非経口的に伝染（即ち、Ｃ型肝炎）；ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２０８】
真菌は、真核生物であり、このうちの極一部が脊椎動物に感染を引き起こす。真菌は、真核生物であるので、原核性の細菌とは、サイズ、構造構成、ライフ・サイクルおよび増殖メカニズムが大きく異なっている。一般に、真菌は、形態学的特徴、増殖の様式および培養特性に基づいて分類されている。真菌は、真菌抗原の吸入による呼吸器アレルギー、毒キノコにより産生されるタマゴテングタケ毒素およびファロトキシンならびに
アスペルギルス属菌により産生されるアフラトキシンなどの有毒物質の摂取による真菌性中毒などの種々のタイプの疾患を被験体に引き起こすが、全ての真菌が感染症を誘発する訳ではない。
【０２０９】
感染性真菌は、全身性もしくは表在性の感染症を誘発することができる。一次全身感染は、正常な健常被験体で起こることがあるが、日和見感染は、免疫障害を有する被験体において最も高頻度に認められる。一次全身感染を誘発する最も代表的な真菌性病原体としては、ブラストミセス属菌、コクシジオイデス属菌、およびフトプラズマ（Ｈｔｏｐｌａｓｍａ）属菌が挙げられる。免疫障害もしくは免疫抑制のある被験体に日和見感染を誘発する代表的な真菌としては、カンジダ・アルビカンス、クリプトコックス・ネオフォルマンスおよび種々のアスペルギルス属菌が挙げられるが、これらに限定されるものではない。全身性真菌感染症は、臓器の侵襲性感染症である。通常、この菌は、肺、消化管、または静脈カテーテルを介して体内に入る。一次病原性真菌または日和見性真菌により、３つのタイプの感染が誘発され得る。
【０２１０】
表在性真菌感染は、内部組織を侵襲することなく体表面で真菌が増殖するものである。典型的な表在性真菌感染症としては、皮膚、毛髪または爪に関わる皮膚真菌感染症が挙げられる。
【０２１１】
真菌感染に伴う疾患としては、アスペルギルス症、ブラストミセス症、カンジダ症、クロモブラストミコーシス症、コクシジオイデス症、クリプトコッカス症、真菌眼感染症、真菌毛髪、爪および皮膚感染症、ヒストプラスマ症、ロボ真菌症、足真菌症、耳真菌症、パラコクシジオイデス症、ペニシリウム・マルネッフェイ症、黒色菌糸症、リノスポリジオーシス症、スポロトリクム症、および接合菌症が挙げられる。
【０２１２】
寄生生物は、生残するために他の生物に依存しているので、そのライフ・サイクルを継続するには別の生物に侵入、もしくは感染する必要がある生物である。感染された生物、即ち、宿主は、この寄生生物に栄養および生息場所を与える。最も広義には、寄生生物という用語は、あらゆる感染体（即ち、細菌、ウイルス、真菌、原生動物および蠕虫）を含むことができるが、一般的に言えば、この用語は、もっぱら、原生動物、蠕虫および外寄生節足動物（例えば、マダニ（ｔｉｃｋ）、ダニ（ｍｉｔｅ）など）を意味するものとして用いられる。原生動物は、細胞内、および細胞外、特に血液、腸管もしくは組織の細胞外基質で複製することができる単細胞生物である。蠕虫は、ほとんど常に細胞外に生息する（旋毛虫属は例外）多細胞生物である。通常、蠕虫は、複製するためには、一次宿主から出て二次宿主内に伝染する必要がある。前述のようなクラスとは対照的に、外寄生節足動物は、宿主体の外表面と寄生関係を形成する。
【０２１３】
寄生生物としては、細胞内寄生生物および偏性細胞内寄生生物が挙げられる。寄生生物の例としては、熱帯熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、二日熱マラリア原虫、ネズミバベシア、バベシア原虫、クルーズトリパノソーマ、トキソプラズマ・ゴンディ、旋毛虫、森林型熱帯リーシュマニア、ドノバン・リーシュマニア、ブラジル・リーシュマニア、皮膚リーシュマニア、ガンビアトリパノソーマ、ローデシアトリパノソーマ、およびマンソン住血吸虫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２１４】
その他の医療上関連のある微生物については、文献に広範囲にわたって記載されており、例えば、本明細書に引用により全内容が組み込まれているシー・ジー・エー・トーマス（Ｃ．Ｇ．Ａ．  Ｔｈｏｍａｓ）、メディカル・マイクロバイオロジー（Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ベイリエール・チンダル（Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ）、英国、１９８３年を参照されたい。上記に挙げた例は例示的なものであり、限定的なものではない。
【０２１５】
本発明の組成物および方法は、単独で、あるいは感染の治療に有用な他の薬剤および方法との併用で用いることができる。感染用薬剤としては、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗寄生生物剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「抗感染剤」、「抗生剤」、「抗菌剤」、「抗ウイルス剤」、「抗真菌剤」、「抗寄生生物剤」および「殺寄生生物剤」などの語句は、当業者に定着した意味を有し、標準的な医学の教科書で定義されている。簡単に言えば、抗菌剤は、細菌を殺傷もしくは阻害し、抗生物質および同様な作用を有する他の合成もしくは天然化合物を含む。抗ウイルスは、天然の供給源から単離するか、合成することができ、ウイルスを殺傷もしくは阻害するのに有用である。抗真菌剤は、表在性真菌感染症ならびに日和見および一次性全身真菌感染症を治療するのに用いられる。抗寄生生物剤は、寄生生物を殺傷もしくは阻害する。抗生物質の多くは、微生物などの細胞により二次代謝体として産生される低分子量分子である。一般に、抗生物質は、微生物に固有で、宿主細胞には存在しない１種以上の機能もしくは構造を妨害する。
【０２１６】
抗感染療法の問題点の１つは、抗感染剤を投与された宿主に副作用が生じることである。例えば、多くの抗感染剤は、広いスペクトルの微生物を殺傷もしくは阻害することができるが、特定のタイプの種に特異的ではない。３種類の抗感染剤を投与すると、感染性微生物のみならず、宿主に生息する常在の微生物叢も殺傷される。微生物叢が失われると、合併症が生じ、宿主が他の病原菌による感染に罹りやすくなる。何故なら、微生物叢は感染性病原菌と対抗し、これに対するバリアとして機能しているからである。その他の副作用は、非微生物細胞もしくは宿主の組織に対するこれらの化学物質の特異的もしくは非特異的作用のために生じることがある。
【０２１７】
抗感染剤の広範囲に及ぶ使用による別の問題点は、微生物の抗生物質耐性株が形成されることである。既に、バンコマイシン耐性腸球菌、ペニシリン耐性肺炎球菌、多剤耐性黄色ブドウ球菌、および多剤耐性結核菌株が形成され、大きな臨床的問題となりつつある。抗感染剤が広範に使用されると、恐らく、細菌の多数の抗生物質耐性株が生じることになろう。このため、こうした微生物を撲滅するための新しい抗感染戦略が必要になる。
【０２１８】
広範囲の細菌を殺傷もしくは阻害するのに有効な抗菌抗生物質は、広域抗生物質と呼ばれている。その他のタイプの抗菌抗生物質の大部分は、グラム陽性もしくはグラム陰性のクラスの細菌に対して有効である。こうしたタイプの抗生物質は、狭域抗生物質と呼ばれている。単一種の細菌もしくは疾患に有効で、その他のタイプの細菌には有効でない他の抗生物質は、限定域（ｌｉｍｉｔｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ）抗生物質と呼ばれている。
【０２１９】
抗菌剤は、その主な作用様式に基づいて分類される場合がある。概して、抗菌剤は、細胞壁合成阻害剤、細胞膜阻害剤、蛋白質合成阻害剤、核酸合成阻害剤もしくは機能性阻害剤、および拮抗阻害剤である。細胞壁合成阻害剤は、細胞壁合成の過程、通常細菌ペプチドグリカンの合成のある段階を阻害する。細胞壁合成阻害剤としては、β−ラクタム系抗生物質、天然ペニシリン、半合成ペニシリン、アンピシリン、クラブラン酸、セファロスポリン、およびバシトラシンが挙げられる。
【０２２０】
β−ラクタムは、ペプチドグリカン合成の最後の段階を阻害する４員β−ラクタム環を有する抗生物質である。β−ラクタム系抗生物質は合成物もしくは天然由来のものとすることができる。青カビにより産生されるβ−ラクタム系抗生物質は、ペニシリンＧまたはペニシリンＶなどの天然ペニシリンである。これらはペニシリウム・クリソゲヌムの発酵によって製造される。これらの天然ペニシリンは、活性域が狭く、一般に連鎖球菌、淋菌およびブドウ球菌に対して有効である。グラム陽性菌に対しても有効な他のタイプの天然ペニシリンとしては、ペニシリンＦ、Ｘ、ＫおよびＯが挙げられる。
【０２２１】
一般に、半合成ペニシリンは、カビによって産生される分子６−アミノペニシラン酸の修飾体である。６−アミノペニシラン酸に側鎖を付加して修飾することにより、活性スペクトルが天然ペニシリンより広く、あるいは種々の他の有利な性質を有するペニシリンが得られる。一部のタイプの半合成ペニシリンは、グラム陽性およびグラム陰性菌に対して広いスペクトルを有するが、ペニシリナーゼによって不活化される。このような半合成ペニシリンとしては、アンピシリン、カルベニシリン、オキサシリン、アズロシリン、メズロシリン、およびピペラシリンが挙げられる。別のタイプの半合成ペニシリンは、グラム陽性菌に対してより狭い活性を有するが、ペニシリナーゼにより不活化されないような性質を発現させている。このようなものとしては、例えば、メチシリン、ジクロキサシリン、およびナフシリンが挙げられる。広域半合成ペニシリンの一部は、クラブラン酸およびスルバクタムのようなβ−ラクタマーゼ阻害剤と併用して用いることができる。β−ラクタマーゼ阻害剤は、抗微生物作用を有しないが、ペニシリナーゼを阻害する作用があるので、この半合成ペニシリンを分解から保護することができる。
【０２２２】
天然および半合成ペニシリンと関連性のある重大な副作用の１つは、ペニシリン・アレルギーである。ペニシリン・アレルギーは極めて重篤であり、短時間のうちに死をもたらすことがある。ペニシリンにアレルギーの被験体では、このβ−ラクタム分子が血清蛋白質に結合してＩｇＥ媒介性炎症反応を誘発する。この炎症反応はアナフィラキシー、場合によっては死をもたらす。
【０２２３】
別のタイプのβ−ラクタム系抗生物質は、セファロスポリンである。これは、細菌β−ラクタマーゼによる分解を受けやすいので、必ずしも単独で有効ではない。しかしながら、セファロスポリンはペニシリナーゼに対して抵抗性である。これは種々のグラム陽性およびグラム陰性菌に対して有効である。セファロスポリンとしては、セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セファマンドール、セファクロール、セファゾリン、セフロキシン、セフォキシチン、セフォタキシム、セフスロジン、セフェタメト、セフィキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジン、およびモキサラクタムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２２４】
バシトラシンは、ムロペプチド・サブユニットもしくはペプチドグリカンに対し、このサブユニットを膜の外側に送達する分子からの遊離を阻害することにより、細胞壁合成を阻害する別のクラスの抗生物質である。バシトラシンはグラム陽性菌に対して有効であるが、その強い毒性のために、一般にその使用は局所投与に限定されている。
【０２２５】
カルバペネムは、細胞壁合成を阻害することができる別の広域β−ラクタム系抗生物質である。カルバペネムの例としては、イミペネムが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、モノバクタムも広域β−ラクタム系抗生物質であり、これにはユーズトレオナム（ｅｕｚｔｒｅｏｎａｍ）が挙げられる。また、ストレプトミセスによって産生される抗生物質バンコマイシンも細胞壁合成を阻害することで、グラム陽性菌に対して有効である。
【０２２６】
別のクラスの抗細菌剤に、細胞膜阻害剤の抗細菌剤がある。これらの化合物は、細菌の膜に対し、構造を破壊するか、機能を阻害する。細胞膜阻害剤である抗細菌剤の１つの問題点は、細菌および真核細胞の膜中のリン脂質が類似しているために、この抗細菌剤が、細菌のみならず真核細胞においても作用を生じる得ることである。従って、このような化合物は、全身性に投与することができるのに十分特異的であることはまれであり、また、局所投与に高用量を用いることもできない。
【０２２７】
臨床的に有用な細胞膜阻害剤の１つは、ポリミキシンである。ポリミキシンは、膜のリン脂質に結合することによって膜の機能を妨げる。ポリミキシンは、主にグラム陽性菌に対して有効であり、一般に、低毒性抗生物質に耐性の重症シュードモナス菌感染症もしくはシュードモナス菌感染症に用いられる。この化合物の全身性投与に伴う重篤な副作用としては、腎臓その他の臓器に対する障害が挙げられる。
【０２２８】
その他の細胞膜阻害剤としては、全身性真菌感染症およびカンジダ・イースト感染症の治療に主に用いられる抗真菌剤であるアンホテリシンＢおよびナイスタチンが挙げられる。イミダゾールは、細胞膜阻害剤である別のクラスの抗生物質である。イミダゾールは、抗細菌剤および抗真菌剤として使用され、例えば、イースト感染症、皮膚糸状菌感染症および全身性真菌感染症の治療に用いられる。イミダゾールとしては、クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾールおよびフルコナゾールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２２９】
抗細菌剤の多くは、蛋白質合成阻害剤である。これらの化合物は、細菌が構造蛋白質および酵素を合成するのを阻止することにより、細菌の細胞増殖もしくは機能を阻害し、または細胞死をもたらす。一般に、これらの化合物は、転写もしくは翻訳の過程を阻害する。転写をブロックする抗細菌剤としては、リファンピシンおよびエタンブトールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。酵素ＲＮＡポリメラーゼを阻害するリファンピシンは、広い作用スペクトルを有し、グラム陽性およびグラム陰性菌ならびにヒト型結核菌に対して有効である。エタンブトールは、ヒト型結核菌に対して有効である。
【０２３０】
翻訳をブロックする抗細菌剤は、細菌のリボソームを阻害してｍＲＮＡが蛋白質に翻訳されるのを阻止する。一般に、このクラスの化合物としては、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、マクロライド類（例えば、エリスロマイシン）およびアミノグリコシド類（例えば、ストレプトマイシン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２３１】
アミノグリコシド類は、バクテリウム属ストレプトミセスによって産生されるクラスの抗生物質であり、例えば、ストレプトマイシン、カナマイシン、トブラマイシン、アミカシン、およびゲンタマイシンが挙げられる。アミノグリコシド類は、グラム陽性およびグラム陰性菌により生じる多種多様な細菌感染症に対して用いられてきた。ストレプトマイシンは、もっぱら結核の治療の主要薬剤として用いられてきた。ゲンタマイシンは、シュードモナス感染など、グラム陽性およびグラム陰性細菌の多くの菌株に対して、特にトブラマイシンとの併用で用いられている。カナマイシンは、ペニシリン耐性ブドウ球菌を含む多くのグラム陽性細菌に対して用いられている。臨床的な使用を制限してきたアミノグリコシド類の１つの副作用は、有効性を得るのに不可欠な用量で長期使用すると、腎機能障害、および聴覚神経障害による難聴が認められたことである。
【０２３２】
別のタイプの翻訳阻害型抗細菌剤は、テトラサイクリン類である。テトラサイクリン類は、広域スペクトルタイプの抗生物質であり、種々のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対して有効である。テトラサイクリン類の例としては、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、およびクロロテトラサイクリンが挙げられる。これらは、多くのタイプの細菌感染の治療に重要であるが、特にライム病の治療において重要である。テト
ラサイクリン類は、毒性が低く直接的な副作用もこくわずかであるため、医学界で過剰使用および誤使用されてきて、問題となっている。例えば、その過剰使用によって耐性が広範囲に発現している。
【０２３３】
マクロライド類のような抗細菌剤は、５０Ｓリボソーム・サブユニットに可逆性に結合してペプチジル転移酵素による蛋白質の伸長を阻害し、もしくは細菌リボソームからのアンチャージｔＲＮＡの遊離を妨げ、またはこれらの両方を行う。これらの化合物としては、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、クラリスロマイシン、オレアンドマイシン、およびアジスロマイシンが挙げられる。エリスロマイシンは、多くのグラム陽性菌、ナイセリア、レジオネラおよびヘモフィルスに対して有効であるが、腸内細菌科の菌類には有効ではない。蛋白質合成中のペプチド結合の形成をブロックするリンコマイシンおよびクリンダマイシンは、グラム陽性菌に対して用いられている。
【０２３４】
別のタイプの翻訳阻害剤にクロラムフェニコールがある。クロラムフェニコールは、７０Ｓリボソームに結合して細菌酵素ペプチジル転移酵素を阻害することにより、蛋白質合成中のポリペプチドの成長を阻止する。クロラムフェニコールに関連した１つの重篤な副作用は、再生不良性貧血である。クロラムフェニコールによる再生不良性貧血は、少ない割合（１／５０．０００）の患者で、細菌感染を治療するのに有効な用量で生じる。クロラムフェニコールは、かつては非常よく処方された抗生物質であったが、貧血による死亡が認められたため、現在では滅多に用いられない。それでもなお、これは、有効であるため、生死に関わる状況（例えば腸チフス）では用いられている。
【０２３５】
一部の抗細菌剤は、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡに結合してこれらのメッセージを読み取ることができないようにすることによって、核酸の合成もしくは機能を阻害する。これらのものとしては、合成化学物質であるキノリン類およびコトリモキサゾール、ならびに天然もしくは半合成の化学物質であるリファマイシン類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。キノリン類は、細菌がその環状ＤＮＡを作るのに必要とする酵素であるＤＮＡギラーゼを阻害することによって、細菌のＤＮＡ複製をブロックする。これらは、広域スペクトルであり、例としては、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、ナリジクス酸およびテマフロキサシンが挙げられる。ナリジクス酸は、ＤＮＡの複製に不可欠なＤＮＡギラーゼ酵素（トポイソメラーゼ）に結合し、超コイルをほぐして改造することによりＤＮＡギラーゼ作用を阻害する。ナリジクス酸の主な用途は、下部尿路感染症（ＵＴＩ）の治療にあるが、これは、ナリジクス酸が、ＵＴＩの共通の原因菌である大腸菌、エンテロバクター・アエロゲネス、肺炎桿菌およびプロテウス属などのいくつかのタイプのグラム陰性菌に対して有効であるからである。コトリモキサゾールは、スルファメトキサゾールとトリメトプリムとの合剤であり、ＤＮＡヌクレオチドを作るのに必要な葉酸の細菌による合成をブロックする。リファンピシンは、（ヒト型結核菌および髄膜炎菌による髄膜炎を含む）グラム陽性菌、ならびに一部のグラム陰性菌に対して有効であるリファマイシンの誘導体である。リファンピシンは、ポリメラーゼのベータ・サブユニットに結合し、ポリメラーゼを活性化するのに必要な最初のヌクレオチドの付加をブロックすることにより、ｍＲＮＡの合成をブロックする。
【０２３６】
抗細菌剤の別のクラスに細菌酵素の競合的阻害剤として作用する化合物がある。この競合的阻害剤は、ほぼ全てが、細菌成長因子と構造的に類似しているものであり、結合に対して競合するが、細胞の代謝機能は果たさない。このような化合物としては、スルホンアミド類、およびこれより抗菌作用がさらに強く、かつ広域である、スルファニルアミドの化学的修飾体が挙げられる。スルホンアミド類（例えば、ガントリシンおよびトリメトプリム）は、肺炎連鎖球菌、ベータ溶連菌および大腸菌感染の治療に有用であり、大腸菌による無併発性ＵＴＩの治療および髄膜炎菌性髄膜炎の治療に用いられてきた。
【０２３７】
抗ウイルス剤は、ウイルスによる細胞の感染もしくは細胞内のウイルスの複製を阻止する化合物である。抗ウイルス剤は抗細菌剤よりもずっと少ない。何故なら、ウイルス複製の過程が宿主細胞内のＤＮＡ複製と極めて密接な関係があるため、非特異的な抗ウイルス剤は宿主に対して毒性を示す場合が多いからである。ウイルス感染の過程には、抗ウイルス剤によってブロックもしくは阻害することができるいくつかの段階がある。これらの段階としては、ウイルスの宿主細胞への付着（免疫グロブリンもしくは結合ペプチド）、ウイルスの脱殻（例えば、アマンタジン）、ウイルスｍＲＮＡの合成もしくは翻訳（例えば、インターフェロン）、ウイルスＲＮＡもしくはＤＮＡの複製（例えば、ヌクレオシド・アナログ）、新しいウイルス蛋白質の成熟（例えば、プロテアーゼ阻害剤）、ならびにウイルスの出芽および放出が挙げられる。
【０２３８】
抗ウイルス剤の別のカテゴリーにヌクレオシド・アナログがある。ヌクレオシド・アナログは、ヌクレオシドに類似しているが、不完全、もしくは正常でないデオキシリボースまたはリボース基を有する合成化合物である。ヌクレオシド・アナログは、細胞内に入るとすぐに、リン酸化されて三リン酸型となり、正常なヌクレオチドと競合してウイルスＤＮＡもしくはＲＮＡ内へ組み込まれる。この三リン酸型ヌクレオシド・アナログが成長中の核酸鎖にくみこまれるとすぐに、ウイルス・ポリメラーゼとの不可逆的な結合が生じることによって鎖の成長が終結する。ヌクレオシド・アナログとしては、（単純疱疹ウイルスおよび水疱瘡ウイルス感染の治療に用いられる）アシクロビル、（サイトメガロ・ウイルス感染の治療に用いられる）ガンシクロビル、イドクスウリジン、呼吸器合胞体ウイルスの治療に用いられる）リバビリン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシチジン、およびジドブジン（アジドチミジン）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２３９】
別のクラスの抗ウイルス剤としては、インターフェロンなどのサイトカインが挙げられる。インターフェロンは、ウイルス感染細胞、および免疫細胞によって分泌されるサイトカインである。インターフェロンは、感染細胞に隣接する細胞の特定の受容体に結合してこの細胞をウイルス感染から保護する細胞内変化をもたらすことにより作用する。また、αおよびβ−インターフェロンは、感染細胞表面においてクラスＩおよびクラスＩＩＭＨＣ分子の発現を誘導し、宿主細胞に認識させるための抗原提示を増強する。αおよびβ−インターフェロンは、組み換え型として入手可能であり、慢性Ｂ型およびＣ型肝炎感染の治療に用いられてきた。インターフェロンには、抗ウイルス療法として有効な用量で、発熱、倦怠感、体重減少などの重篤な副作用がある。
【０２４０】
ウイルス感染の予防には免疫グロブリン療法が用いられている。ウイルス感染に対する免疫グロブリン療法は細菌感染の場合と異なっており、それは、免疫グロブリン療法が、抗原特異性によるのではなく、細胞外ビリオンに結合して、ウイルス感染を受けやすい細胞にビリオンが付着、侵入するのを阻止することにより作用するからである。この療法は、その抗体が宿主内に存在している期間はウイルス感染の予防に有効である。概して、免疫療法には、標準（ｎｏｒｍａｌ）免疫グロブリン療法および高免疫（ｈｙｐｅｒ−ｉｍｍｕｎｅ）グロブリン療法の２つのタイプがある。標準免疫グロブリン療法は、正常な血液提供者の血清から調製し、プールした抗体を利用するものである。このプールした調製品は、Ａ型肝炎、パルボウイルス、（特に、新生児の）エンテロウイルスなどの広範囲のヒト・ウイルスに対する力価の低い抗体を含有する。高免疫グロブリン療法は、特定のウイルスに対する高力価の抗体を有する者の血清から調製した抗体を利用するものである。従って、この抗体は、特定のウイルスに対して用いられる。高免疫グロブリンの例としては、免疫的に無防備な子供および新生児の水痘の予防に有用な）帯状疱疹免疫グロブリン、（狂犬病動物に咬まれた被験体の暴露後予防に有用な）ヒト・狂犬病免疫グロブリン、（特にＢ型肝炎ウイルスに暴露された被験体におけるＢ型肝炎の予防に有用な）Ｂ型肝炎免疫グロブリン、および（呼吸器合胞体ウイルス感染の治療に有用な）ＲＳＶ免疫グロブリンが挙げられる。
【０２４１】
感染性真菌症の治療および予防には抗真菌剤が有用である。抗真菌剤は、その作用メカニズムによって分類されることがある。一部の抗真菌剤は、グルコース合成酵素を阻害することにより細胞壁阻害剤として作用する。これらのものとしては、バシウンギン（ｂａｓｉｕｎｇｉｎ）／ＥＣＢが挙げられるが、これに限定されるものではない。その他、膜の完全性を損なわせることによって作用する抗真菌剤がある。このようなものとしては、クロトリマゾール、セルタコンゾール（ｓｅｒｔａｃｏｎｚｏｌｅ）、フルコナゾール、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ボリコナゾール（ｖｏｒｉｃｏｎａｚｏｌｅ）などのイミダゾール類、ＦＫ４６３、アンホテリシンＢ、ＢＡＹ３８−９５０２、ＭＫ９９１、プラディマイシン、ＵＫ２９２、ブテナフィン、およびテルビナフィンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他、キチンの破壊（例えば、キチナーゼ）もしくは免疫抑制（５０１クリーム）によって作用する抗真菌剤がある。
【０２４２】
殺寄生生物剤は、寄生生物を直接的に殺傷する薬剤である。このような化合物は、当該分野では既知であり、一般に市販されている。ヒトへの投与に有用な殺寄生生物剤の例としては、アルベンダゾール、アンホテリシンＢ、ベンズニダゾール、ビチオノール、塩酸クロロキン、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、ジロキサニドフロエート、エフロルニチン、フラゾリダオン（ｆｕｒａｚｏｌｉｄａｏｎｅ）、糖質コルチコイド類、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、メグルミンアンチモニエート、メラルソプロール、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス（ｎｉｆｕｒｔｉｍｏｘ）、オキサムニキン、パロモマイシン、ペンタミジンイセチオネート、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、ピランテルパモエート、ピリメタンミン（ｐｙｒｉｍｅｔｈａｎｍｉｎｅ）−スルホンアミド類、ピリメタンミン−スルファドキシン、塩酸キナクリン、硫酸キニン、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコネート・ナトリウム（グルコン酸アンチモンナトリウム）、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびトリパルサミドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２４３】
また、本発明の組成物および方法は、アレルギーおよび喘息の治療に用いることもできる。
【０２４４】
「アレルギー」とは、ある物質（アレルゲン）に対する獲得過敏性のことを意味する。アレルギー症状としては、湿疹、アレルギー性鼻炎、枯草熱、アレルギー性結膜炎、気管支喘息、蕁麻疹および食物アレルギー、アトピー性皮膚炎などのその他のアトピー症状；アナフィラキシー；薬物アレルギー；ならびに血管性水腫が挙げられるが、これらに限定されるものではない。アレルギー疾患としては、鼻炎（枯草熱）、喘息、蕁麻疹およびアトピー性皮膚炎が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２４５】
アレルギーは、アレルゲンに対する特定クラスの免疫グロブリン、ＩｇＥからの抗体産生を伴う疾患である。また、通常の空気アレルゲンに対してＩｇＥ媒介性の反応が発現することは、喘息を発症しやすい体質を示すファクターでもある。アレルゲンが、（血液中を循環している）好塩基球もしくは（固形組織全体に散在している）肥満細胞の表面のＩｇＥ  Ｆｃ受容体（ＦｃεＲ）に結合している特定のＩｇＥに接触すると、その細胞が賦活化されてヒスタミン、セロトニン、脂質メディエータなどのメディエータが産生され、放出される。
【０２４６】
アレルギー症に罹患している被験体とは、アレルゲンに反応して、アレネギー反応が現在起こっている、または以前に起こったことがある被験体のことである。
【０２４７】
アレルギー症もしくは喘息を発症するリスクのある被験体とは、過去においてアレルギー症もしくは喘息に罹患していると診断されたことがあるが、現在は活動性の症状が現れていない被験体、および遺伝的もしくは環境的要因のためにアレルギー症もしくは喘息を発症する恐れがあると考えられる被験体のことである。また、アレルギー症もしくは喘息を発症するリスクのある被験体には、アレルゲンに接触するリスクのある被験体、または喘息を発症するリスクのある、即ち、喘息発作を起こしたことがあるか、喘息発作を起こしやすい素質を有する被験体を含めることができる。例えば、リスクのある被験体は、特定のタイプのアレルゲンもしくは喘息誘発因子が見出されている地域への旅行を計画している被験体とすることができ、あるいはアレルゲンが確認されている地域に住んでいる被験体の全てとさえすることができる。その被験体が特定の抗原にアレルギー反応を発症する者であり、その被験体がこの抗原に（例えば、花粉の季節であるため）接触する可能性がある場合、その被験体はこの抗原に接触するリスクがある。
【０２４８】
アレルギー反応を引き起こす分子は、総称してアレルゲンという。本明細書で用いている「アレルゲン」とは、ＩｇＥの産生を特徴とする免疫反応を誘発することができる分子のことである。アレルゲンは、素因のある被験体に対してアレルギーもしくは喘息反応を誘発することができる物質である。従って、本発明との関連では、アレルゲンという用語は、ＩｇＥ抗体が媒介するアレルギー反応を誘発することができる特定のタイプの抗原のことを意味する。本発明の方法および組成物は、広範な種類のこのようなアレルゲン、およびアレルゲンとして作用するアレルゲンの断片もしくはハプテンにも適用される。アレルゲンのリストは膨大なものであり、花粉、昆虫毒、動物のふけ、ダスト、真菌胞子、および薬剤（例えば、ペニシリン）を含むことができる。
【０２４９】
アレルゲンには多くの種類がある。アレルギー反応は、組織を感作するＩｇＥタイプの免疫グロブリンが外来性アレルゲンと反応したときに生じる。このＩｇＥ抗体が肥満細胞および／または好塩基球に結合した後、これらの特殊化した細胞は、抗体分子の末端間を架橋しているアレルゲンにより賦活化されると、アレルギー反応の化学メディエータ（血管作用性アミン）を放出する。ヒトのアレルギー反応のメディエータとして最もよくしられているものの中には、ヒスタミン、血小板活性化因子、アラキドン酸代謝体、およびセロトニンがある。ヒスタミンその他の血管作用性アミンは、通常、肥満細胞および好塩基球に貯蔵されている。肥満細胞は動物組織全体に散在しており、好塩基球は血管系内を循環している。これらの細胞内のヒスタミンは、ＩｇＥ結合を伴う特殊化した一連の事象が生じてその放出を誘発しない限り、作られ、貯蔵される。
【０２５０】
アレルギー反応の症状は、ＩｇＥが抗原と反応する体内部位によって異なる。反応が気道上皮に沿って生じる場合、症状は、くしゃみ、咳、および喘息反応となる。この相互作用が、食物アレルギーの場合のように、消化管で生じると、腹痛および下痢がよく起こる。ハチ刺された後で見られるような全身性の反応は、重篤であり、多くの場合、生命にかかわる可能性がある。
【０２５１】
タイプＩＶアレルギー反応とも呼ばれる遅延型過敏症は、アレルギー性被験体に抗原が侵入してから炎症もしくは免疫反応が出現するまで少なくとも１２時間の遅延期間があることを特徴とするアレルギー反応である。アレルギー状態の者のＴリンパ球（感作Ｔリンパ球）は、抗原と反応することにより、このＴリンパ球が、炎症メディエータとして作用するリンホカイン（マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、マクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、マイトジェン因子（ＭＦ）、皮膚反応性因子（ＳＲＦ）、化学走化性因子、新血管形成促進因子など）を放出する引き金となり、次いで、このリンパ球の生物活性が、局所に出現しているリンパ球その他の炎症性免疫細胞の直接および間接作用と相まって、タイプＩＶアレルギー反応をもたらす。遅延型アレルギー反応としては、ツベルクリン型反応、同種移植片拒絶反応、細胞依存型防衛反応、接触皮膚炎過敏反応などが挙げられ、これらに対しては、ステロイド剤が最も強力に抑制することが知られている。従って、ステロイド剤は、遅延型アレルギー反応によりもたらされる疾患に対して有効である。しかしながら、現在使用されている濃度のステロイド剤を長期間用いると、ステロイド依存性と呼ばれる重篤な副作用が生じる。本発明の方法は、投与すべき用量を低下させ、回数を少なくすることによってこうした問題の一部を解決するものである。
【０２５２】
即時型過敏症（即ち、アナフィラキシー反応）は、極めて急速に、即ち、患者が原因アレルゲンに接触して数秒もしくは数分以内に生じる形のアレルギー反応であり、これはＢ細胞が産生するＩｇＥ抗体によって媒介される。非アレルギー性の患者では、ＩｇＥ抗体は臨床的に重要ではないが、アレルギー性疾患を患っている患者では、ＩｇＥ抗体は、皮膚、リンパ器官、および眼、鼻、口腔の膜、ならびに気道、腸管に豊富に存在する肥満細胞を感作することにより、即時型過敏反応を媒介する。
【０２５３】
肥満細胞の表面にはＩｇＥの受容体があり、アレルギーを患っている患者のＩｇＥ抗体はこの受容体に結合するようになる。上記で簡単に説明してように、この結合ＩｇＥが後に適当なアレルゲンによって接触されると、肥満細胞は、脱顆粒を起こし、ヒスタミンなどの生理活性メディエータと呼ばれる種々の物質を周囲の組織に放出する。即時型過敏症に典型的な臨床症状、即ち、気道もしくは腸管の平滑筋収縮、微小血管の拡張とその水、血漿蛋白質透過性の増大、濃凋な粘液の分泌、ならびに皮膚における発赤、腫脹、およびそう痒もしくは疼痛を生じる神経終末の刺激の原因となるのは、こうした物質の生理活性である。
【０２５４】
本明細書で用いている「喘息」とは、気道の炎症、狭窄および吸入剤に対する気道反応性の増大を特徴とする呼吸器系の疾患のことを意味する。喘息は、常にではないが、しばしば、アトピー性もしくはアレルギー性の症状と関連づけられる。喘息の症状としては、繰り返し起こる喘鳴、息切れおよび胸苦しさ、ならびに気道閉塞による咳嗽が挙げられる。喘息に伴う気道炎症は、気道上皮の剥脱、基底膜直下のコラーゲン沈着、浮腫、肥満細胞活性化、好中球、イノシネオフィル（ｉｎｏｓｉｎｅｏｐｈｉｌ）およびリンパ球を含む炎症細胞の浸潤などのいくつかの生理的変化を観察することによって検知することができる。喘息患者では、気道炎症のため、気道過敏症、気道狭窄、呼吸器症状、および疾患慢性化が起こることが多い。気道狭窄症状としては、気管支閉塞をもたらすことが多い特徴としての急性気管支収縮、気道浮腫、粘液栓形成、および気道リモデリングが挙げられる。喘息の一部の症例では、基底膜下線維形成が生じ、肺機能の持続性異常をもたらすことがある。
【０２５５】
過去数年間にわたる研究では、喘息は、炎症細胞、メディエータ、ならびに気道に常在している他の細胞および組織の間の複雑な相互作用によって生じるらしいことが明らかにされた。肥満細胞、イノシネオフィル、上皮細胞、マクロファージおよび活性化Ｔ細胞は全て、喘息に伴う炎症過程において重要な役割を果たしている。ジュカノビッチ・Ｒほか（Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９０年）アメリカン・レビュー・オブ・レスピラトリー・ディジージズ（Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．）１４２：ｐ４３４−４５７参照。これらの細胞は、その局所組織に直接的にもしくは間接的に作用することができる予め形成され、または新たに合成されたメディエータを分泌することによって気道機能に影響を及ぼすと考えられている。また、Ｔリンパ球の亜集団（Ｔｈ２）は、選択的なサイトカインを遊離することによって気道のアレルギー性炎症を調節し、疾患の慢性化を定着させることに重要な役割を果たしているものと理解されている。ロビンソン・Ｄ・Ｓほか（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９２年）ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ）３２６：ｐ２９８−３０４参照。
【０２５６】
喘息は、発育の種々の段階で生じ、症状の程度によって急性、亜急性または慢性と分類することができる複雑な疾患である。急性炎症反応は、気道内への細胞の初期の動員と関連付けられる。亜急性炎症反応は、細胞の動員、および炎症のより持続性のパターンをもたらす常在細胞の賦活化を伴う。慢性炎症反応は、気道に永久的な異常をもたらす恐れのあるより持続的なレベルの細胞傷害および進行中の修復過程を特徴としている。
【０２５７】
「喘息に罹患している被験体」とは、気道の炎症、狭窄および吸入剤に対する気道反応性の増大を特徴とする呼吸器系の疾患を有する被験体のことである。喘息は、常にではないが、しばしば、アトピー性もしくはアレルギー性の症状と関連づけられる。本明細書で用いている「誘発因子」とは、喘息を誘発する成分もしくは環境条件のことを意味する。誘発因子としては、アレルゲン、寒い気温、運動、ウイルス感染、ＳＯ２が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２５８】
本発明の組成物および方法は、単独で、または喘息の治療に有用な他の薬剤および方法との併用で用いることができる。本明細書で用いている「喘息／アレルギー用薬剤」とは、喘息もしくはアレルギー反応の症状を軽減し、発症を予防し、またはこれらの疾患を抑制する物質の組成物のことである。喘息およびアレルギー治療用の種々のタイプの薬剤については、「ガイドライン・フォア・ザ・ダイアグノーシス・アンド・マネージメント・オブ・アズーマ（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ
Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｓｔｈｍａ）」、エキスパート・パネル・レポート２（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２）、ＮＩＨ発行（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）第９７／４０５１号、１９９７年７月１９日に説明されており、これらの全内容は、引用により本明細書に組み込まれている。このＮＩＨの発行書に記載されているこれらの薬剤については、その要約を以下に示した。多くの実施態様の喘息／アレルギー用薬剤は、喘息およびアレルギーの両方に対し、ある程度有用である。
【０２５９】
一般に、喘息治療用の薬剤は、急速緩和剤および長期治療剤の２つのカテゴリーに分類されている。喘息患者は、持続性喘息の緩解を得、これを維持するために、長期治療剤を毎日摂取する。長期治療剤としては、副腎皮質ステロイド、クロモリン・ナトリウム、ネドクロミルなどの抗炎症剤；持続性β２−アゴニスト、メチルキサンチンなどの長時間作用型の気管支拡張剤；およびロイコトリエン調節剤が挙げられる。急速緩和剤としては、短時間作用型β２−アゴニスト、抗コリン剤および全身投与用副腎皮質ステロイドが挙げられる。これらの薬剤のそれぞれには、多くの副作用が伴い、単独投与でも併用投与でも喘息を予防または完全に治療できる薬剤はない。
【０２６０】
喘息用薬剤としては、ＰＤＥ−４阻害剤、気管支拡張剤／β２−アゴニスト、Ｋ＋チャネル開口剤、ＶＬＡ−４アンタゴニスト、ニューロキン・アンタゴニスト、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）合成阻害剤、キサンチン、アラキドン酸アンタゴニスト、５リポキシゲナーゼ阻害剤、ＴＸＡ２受容体アンタゴニスト、ＴＸＡ２アンタゴニスト、５−リポックス（５−ｌｉｐｏｘ）活性化蛋白質阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２６１】
気管支拡張剤／β２−アゴニストは、気管支拡張または平滑筋弛緩を生じる化合物のクラスである。気管支拡張剤／β２−アゴニストとしては、サルメテロール、サルブタモール、アルブテロール、テルブタリン、Ｄ２５２２／フォルモテロール、フェノテロール、ビトルテロール、ピルブテロール、メチルキサンチンおよびオルシプレナリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。持続性β２−アゴニストおよび気管支拡張剤は、抗炎症療法に加えて症状の長期予防のために用いられる化合物である。持続性β２−アゴニストとしては、サルメテロールおよびアルブテロールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。通常、これらの化合物は、副腎皮質ステロイドと併用して用いられ、概して、抗炎症剤と併用しないで用いられることはない。これらは、頻脈、骨格筋振戦、低カリウム血症、および過量投与でのＱＴｃ間隔の延長などの副作用と関連付けられている。
【０２６２】
テオフィリンなどのメチルキサンチン類は、症状の長期的緩和および予防に用いられてきた。これらの化合物は、ホスホジエステラーゼを阻害し、また恐らくアデノシンに拮抗することによって気管支拡張を生じる。これらの化合物では、特に用量依存性の急性毒性が問題である。このため、血清濃度を日常的に監視して、代謝クリアランスの個人差から生じる毒性、および治療域の狭さについて明らかにする必要がある。副作用としては、頻脈、頻脈性不整脈、吐き気および嘔吐、中枢神経刺激、頭痛、発作、吐血、過血糖ならびに低カリウム血症が挙げられる。短時間作用型β２−アゴニストとしては、アルブテロール、ビトルテロール、ピルブテロール、およびテルブタリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。短時間作用型β２−アゴニストの投与に伴う有害作用の一部としては、頻脈、骨格筋振戦、低カリウム血症、乳酸の上昇、頭痛および過血糖が挙げられる。
【０２６３】
アレルギー症を治療もしくは予防する従来の方法は、抗ヒスタミン剤または脱感作療法を必要とした。アレルギー反応の化学メディエータの作用をブロックする抗ヒスタミン剤その他の薬剤は、アレルギー症状の強さを調節するのに有効であるが、アレルギー反応を予防できず、その結果生じたアレルギー反応に対して効果を示さない。脱感作療法は、アレルゲンに対するＩｇＧ型反応を誘起するために、少量のアレルゲンを、通常皮下注射により投与して実施する。ＩｇＧ抗体が存在すると、ＩｇＥ抗体の誘導によるメディエータ産生を阻止するのに役立つ。重篤な反応が生じるのを回避するため、最初は極めて低用量のアレルゲンを被験体に投与し、その後、用量を徐々に増加させる。このタイプの療法は、被験体が、実に、アレルギー反応を誘発する化合物を投与され、重篤なアレルギー反応を生じる可能性があるので、危険なものである。
【０２６４】
アレルギー用薬剤としては、抗ヒスタミン剤、ステロイド、およびプロスタグランジン誘導剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗ヒスタミン剤とは、肥満細胞もしくは好塩基球により放出されるヒスタミンに拮抗する化合物である。これらの化合物は、当該分野でよく知られており、アレルギーの治療によく用いられている。抗ヒスタミン剤としては、アステミゾール、アゼラスチン、ベタタスチン、ブクリジン、セチリジン、セチリジン、セチリジン・アナログ、Ｃ５６０、デスロラタジン、エバスチン、エピナスチン、フェキソフェナジン、ＨＳＲ６０９、レボカバスチン、ロラチジン、ミゾラスチン、ノルアステミゾール、テルフェナジン、およびトラニラストが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２６５】
プロスタグランジン誘導剤とは、プロスタグランジン活性を誘導する化合物である。プロスタグランジンは、平滑筋弛緩を調節する機能を有する。プロスタグランジン誘導剤としては、Ｓ−５７５１が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０２６６】
また、喘息／アレルギー用薬剤として、ステロイドおよび免疫調節剤も挙げることができる。ステロイドとしては、ベクロメサゾン、フルチカゾン、トリアムシノロン、ブデソニド、副腎皮質ステロイド類およびブデソニドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２６７】
副腎皮質ステロイド類としては、ベクロメサゾン・ジプロピオネート、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン・プロピオネート、およびトリアムシノロン・アセトニドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。デキサメサゾンは、抗炎症作用を有する副腎皮質ステロイドであるが、吸収が良好なため有効用量で長期的に抑制性の副作用を示すので、吸入形態での喘息／アレルギーの治療に恒常的に用いられることはない。しかしながら、デキサメサゾンは、本発明によって喘息／アレルギーの治療に用いることができる。何故なら、本発明の核酸と併用して低用量で用いることにより副作用を軽減することができるからである。副腎皮質ステロイドと関連付けられる副作用の一部としては、咳、発声困難、口内がこう瘡（カンジダ症）、および高用量での副腎機能抑制、骨粗鬆症、成長抑制、薄皮化（ｓｋｉｎ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ）、あざができやすいことなどの全身作用が挙げられる。バーンズ（Ｂａｒｎｓ）、ピーターソン(Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）（１９９３年）アメリカン・レビュー・オブ・レスピラトリー・ディジージズ（Ａｍ．  Ｒｅｖ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｄｉｓ．）１４８：ｐＳ１−Ｓ２６；カマダ・Ａ・Ｋほか（Ｋａｍａｄａ  Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９６年）アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピラトリー・アンド・クリティカル・ケア・メディシン（Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．）１５３：ｐ１７３９−４８参照。
【０２６８】
全身投与用副腎皮質ステロイド類としては、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンおよびプレドニゾンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。副腎皮質ステロイド類は、グルコース代謝の可逆性異常、食欲増進、体液貯留、体重増加、気分の変容、高血圧、胃潰瘍、および無菌性骨壊死と関連づけられる。これらの化合物は、コントロール不十分な持続性喘息の炎症反応を短期間（３〜１０日間）予防するのに有用である。また、これらは、重篤で持続性の喘息において症状を長期間予防する作用を有することにより、炎症を抑制し、コントロールして事実上消失させる。長期使用に伴う一部の副作用としては、副腎系の抑制、成長抑制、薄皮化、高血圧、糖尿病、クッシング症候群、白内障、筋力低下、およびまれに免疫機能障害が挙げられる。これらのタイプの化合物は、最小有効用量で用いることが推奨されている（「ガイドライン・フォア・ザ・ダイアグノーシス・アンド・マネージメント・オブ・アズーマ（Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｓｔｈｍａ）」、エキスパート・パネル・レポート（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  Ｒｅｐｏｒｔ）、ＮＩＨ発行（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）第９７／４０５１号、１９９７年７月）。
【０２６９】
免疫調節剤としては、抗炎症剤、ロイコトリエン・アンタゴニスト、ＩＬ−４突然変異蛋白質、可溶性ＩＬ−４受容体、（寛容化（ｔｏｌｅｒｉｚｉｎｇ）ペプチドワクチンなどの）免疫抑制剤、抗−ＩＬ−４抗体、ＩＬ−４アンタゴニスト、抗ＩＬ−５抗体、可溶性ＩＬ−１３受容体−Ｆｃ融合蛋白質、抗ＩＬ−９抗体、ＣＣＲ３アンタゴニスト、ＣＣＲ５アンタゴニスト、ＶＬＡ−４阻害剤、およびＩｇＥのダウンレギュレータ（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｏｒ）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２７０】
ロイコトリエン調節剤は、軽症持続性喘息の症状を長期間コントロールし、予防するのに用いられることが多い。ロイコトリエン調節剤は、ロイコトリエン受容体アンタゴニストとして作用し、ＬＴＤ−４およびＬＴＥ−４受容体に対して選択的に競合する。これらの化合物としては、ザフィルルーカスト錠およびジレウトン錠が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ジレウトン錠は、５−リポキシゲナーゼ阻害剤として作用する。これらの薬剤は、肝酵素の上昇ならびに一部症例の可逆性肝炎および高ビリルビン血症と関連づけられている。ロイコトリエンは、喘息患者の気道において気道平滑筋を収縮させ、血管透過性、粘液分泌を増加させ、炎症細胞を賦活化する、肥満細胞、イノシネオフィル（ｉｎｏｓｉｎｅｏｐｈｉｌ）、および好塩基球から放出される生化学的メディエータである。
【０２７１】
その他の調節剤としては、免疫調節性を有することが明らかにされている神経ペプチドが挙げられる。機能的研究によって、例えば、サブスタンスＰは、特異的な受容体媒介性メカニズムによりリンパ球機能に影響を及ぼし得ることが明らかにされている。また、サブスタンスＰは、粘膜肥満細胞によるアラキドン酸由来メディエータの産生を促進することにより、相異なる即時過敏症反応を調節することも明らかにされている。マックギリーズ・Ｊほか（ＭｃＧｉｌｌｉｅｓ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．）（１９８７年）フェデレーション・プロシーディング（Ｆｅｄ．  Ｐｒｏｃ．）４６：ｐ１９６−９（１９８７年）参照。サブスタンスＰは１９３１年に初めて確認された神経ペプチドである。フォン・オイラー（Ｖｏｎ  Ｅｕｌｅｒ）、ガッダム（Ｇａｄｄｕｍ）ジャーナル・オブ・フィジオロジー（Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．）（ロンドン）７２：ｐ７４−８７（１９３１年）参照。そのアミノ酸配列は１９７１年、チャンほか（Ｃｈａｎｇｅｔ  ａｌ．）によって報告された。チャン・Ｍ・Ｍほか（Ｃｈａｎｇ  Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）（１９７１年）ネイチャー・ニュー・バイオロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ．）２３２：ｐ８６−８７参照。サブスタンスＰの断片の免疫調節活性については、ジーミオン・Ｉ・Ｚほか（Ｓｉｅｍｉｏｎ  Ｉ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９０年）モレキュラー・イムノロジー（Ｍｏｌｅｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２７：ｐ８８７−８９０（１９９０年）の研究がある。
【０２７２】
別のクラスの化合物にＩｇＥのダウンレギュレータがある。この化合物としては、ＩｇＥ受容体に結合することにより抗原特異的ＩｇＥの結合を妨げることができるペプチドその他の分子が挙げられる。別のタイプのＩｇＥダウンレギュレータに、ヒトＩｇＥ分子のＩｇＥ受容体結合部位に対するモノクロナール抗体がある。従って、ＩｇＥのダウンレギュレータの１つのタイプは、抗ＩｇＥ抗体もしくは抗体断片である。抗ＩｇＥ抗体は、ジェネンテク社（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が開発中である。当業者は、同じ機能を有する結合ペプチドの機能的に活性な抗体断片を作製することができよう。その他のタイプのＩｇＥダウンレギュレータに、細胞表面のＦｃ受容体へのＩｇＥ抗体の結合をブロックし、ＩｇＥが既に結合している結合部位からＩｇＥを置換することができるポリペプチドがある。
【０２７３】
ＩｇＥダウンレギュレータの１つの問題点は、これらの多くの分子が、生体内に生じたＩｇＥ分子とその受容体との間の極めて強い相互作用に相当する受容体への結合強度を有しないことである。このような強度を有する分子は、受容体に不可逆的に結合する傾向があるが、こうした物質は、共有結合して体内の他の構造類似の分子をブロックすることができるので比較的毒性が強い。これに関連して興味深いのは、ＩｇＥ受容体のα鎖が、例えば、数種のＩｇＧ受容体が含まれるより大きな遺伝子ファミリーに属することである。こうした受容体は、例えば、細菌感染に対して、身体を防御するのに絶対的に不可欠なものである。さらに、共有結合のために活性化された分子は、比較的不安定である場合が多く、従って、肥満細胞および好塩基球の表面で連続的に再生するＩｇＥのプールを完全にブロックすることができるためには、恐らく投与回数を１日数回とし、その上、比較的高濃度で投与する必要がある。
【０２７４】
クロモリン・ナトリウムおよびネドクロミルは、運動により生じる主として喘息の症状、またはアレルゲンにより生じるアレルギー症状を阻止する長期治療剤として用いられている。これらの化合物は、塩素チャネルの機能を阻害することにより、アレルゲンに対する初期および遅発型反応をブロックすると考えられている。また、これらは、肥満細胞の膜を安定化し、イノシネオフィルおよび上皮細胞からのメディエータの活性化および放出を阻害する。最大の効果を得るためには、概して、４〜６週間の投与が必要である。
【０２７５】
抗コリン剤は、一般に、急性気管支攣縮を緩解するために用いられる。このような化合物は、ムスカリン様コリン作動性受容体を競合的に阻害することにより作用すると考えられている。抗コリン剤としては、臭化イプラトロピウムが挙げられるが、これに限定されるものではない。こうした化合物は、コリン作動性に媒介された気管支攣縮のみを消失させ、抗原に対する反応は緩解させない。副作用としては、口渇、気道分泌、一部症例の喘鳴悪化、および眼に噴霧された場合の視力障害が挙げられる。
【０２７６】
標準的な喘息／アレルギー用薬剤のほかに、喘息／アレルギーを治療する他の方法が、単独または従来の薬剤との併用で用いられている。アレルギーを緩解する、多くの場合不可能ではあるが好ましい方法は、アレルゲンもしくは誘発因子を回避することである。現在用いられている別のアレルギー疾患治療方法は、用量を漸増させてアレルゲンを注射することによりアレルゲンへの寛容性を誘導し、その後のアレルギー反応を阻止するものである。
【０２７７】
アレルゲン注射療法（アレルゲン免疫療法）は、アレルギー性鼻炎の重症度を緩和することが知られている。この治療法は、異なる種類の抗体である「遮断抗体」と呼ばれる防御抗体の産生を伴うものであると、理論づけられている。クック・Ｒ・Ａほか（Ｃｏｏｋｅ  Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．）（１９３５年）「ヒト・アレルギーの一タイプにおいて感作が共存する免疫の血清学的証拠（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｅｘｉｓｔｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ
Ｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ）」エクスペリメンタル・メディシン（Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．）６２：ｐ７３３参照。アレルギーを治療する別の試みには、アレルゲンを化学的に修飾して、患者の免疫反応をもたらすことができることに変わりはないが、アレルギー反応の誘発性をかなり改善できるようにするものがある。しかしながら、こうした方法は、有効性が認められるまで数年を要するし、アナフィラキシー・ショックのような副作用のリスクを連想させるものである。
【０２７８】
本発明の組成物および方法を用いて免疫反応を調節することができる。免疫反応を調節することができることにより、免疫系の調節を介して作用させることができる特定の疾患を予防および／または治療することが可能になる。
【０２７９】
疾患発症後の治療については、その疾患を軽減し、寛解させ、または完全に治癒させるか、疾患の悪化を予防する目的で着手してきた。疾患発症前の被験体の処置（即ち、予防的処置）については、疾患を発症するリスクを低減させる目的で着手してきた。本明細書で用いている「予防する」という用語は、疾患を発症するリスクを有する患者の予防的処置（この被験体が疾患を発症する確率を低下させること）、および既に発症してしまっている疾患の更なる進行の防止のことを意味する。
【０２８０】
被験体の治療には、化合物の活性、投与方式、免疫の目的（即ち、予防か治療か）、疾患の性質および重症度、被験体の年齢および体重に応じて、種々の用量が必要となることがある。所定の用量の投与は、単一用量単位あるいはいくつかに小分けした用量単位の形で単回投与することにより行うことができる。数週間もしくは数ヶ月の特定の間隔をおいた用量の投与は、抗原特異的な免疫反応を増強するのに有用である。
【０２８１】
本明細書に示した教示内容と合わせて、前記の種々の有効化合物の中から選び、効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、有害副作用の重症度および好ましい投与様式を検討することによって、さほど毒性を生じない上に、特定の患者に投与して完全に有効であるような効果的な予防もしくは治療計画を策定することができる。特定の用途に対する有効量は、治療されている疾患もしくは症状、投与されている特定の治療剤（即ち、免疫賦活性核酸の場合、核酸のタイプ、即ち、ＣｐＧ核酸、非メチル化ＣｐＧモチーフの数もしくは核酸内の位置、このオリゴヌクレオチドに対する主鎖修飾の程度など）、被験体のサイズ、または疾患もしくは症状の重症度によって異なり得る。当業者は、過度の実験を必要とすることなく、特定の核酸および／または他の治療剤の有効量を実験的に求めることができる。
【０２８２】
本明細書に開示した化合物の被験体毎の用量は、一般的に約０．１μｇ〜１０，０００ｍｇ、より一般的には約１μｇ／日〜８，０００ｍｇ、最も一般的には約１０μｇ〜１００μｇである。被験体の体重に換算すると、一般的な投与量は、約０．１μｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、より一般的には約１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も一般的には約１〜５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０２８３】
核酸および／または他の化合物を含有する医薬用組成物は、薬剤を投与するのに適した経路により投与することができる。種々の投与経路が利用可能である。勿論、選択する特定の方式は、選択する特定の薬剤、治療している特定の症状、および治療効果を得るのに必要とする投与量によって決まることになる。一般的に言えば、本発明の方法は、医療上許容可能な投与方式、即ち、容認できない有害作用を生じることなく効果的なレベルの免疫反応をもたらす方式であれば、どんな方式を用いても実施することができる。本明細書では好ましい投与方式を説明している。治療用には、有効量の核酸および／または他の治療剤を、薬剤を目的とする表面に送達する任意の方式、例えば、粘膜投与、全身性投与によって被験体に投与することができる。
【０２８４】
本発明の医薬用組成物の投与は、当業者に既知の任意の手段によって遂行することができる。投与経路としては、経口、非経口、静脈内、筋肉内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、皮下、眼内、膣内および直腸内が挙げられるが、これらに限定されるものではない。喘息もしくはアレルギーの治療もしくは予防の場合、こうした化合物は、吸入、摂取、または全身性経路によって投与することが好ましい。全身性経路は、経口および非経口を含む。一部の実施態様では、主として喘息患者で炎症部位である肺に直接送達させるため、薬剤を吸入させることが好ましい。吸入投与にはいくつかのタイプの器具が恒常的に用いられる。これらのタイプの器具としては、計量式吸入器（ＭＤＩ）、吸息作動式（ｂｒｅａｔｈ−ａｃｔｕａｔｅｄ）ＭＤＩ、ドライパウダー吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩと併用のスペーサ／保持チャンバ、およびネブライザーが挙げられる。
【０２８５】
本発明の治療剤は、ベクターを活用して、特定の組織、細胞型、もしくは免疫系に送達することができる。「ベクター」とは、最も広義には、前記組成物の標的細胞への移入を容易にすることができる任意の媒介物のことである。概して、このベクターは、前記免疫賦活性核酸、抗体、抗原および／または疾患特異的薬剤を、ベクターを用いなければ生じる恐れのある分解に比し、さほど分解を生じずに標的細胞へ輸送する。
【０２８６】
一般に、本発明に有用なベクターは、２つのクラス、即ち、生物学的ベクターおよび化学的／物理的ベクターに分類される。生物学的ベクターおよび化学的／物理的ベクターは、本発明の治療剤の送達および／または取込みに有用である。
【０２８７】
生物学的ベクターの多くは、核酸の送達に用いられ、このベクターは、免疫賦活性核酸である、またはこれを含む治療剤の送達に最も適切であると思われる。
【０２８８】
本明細書に記載した生物学的ベクターのほかに、化学的／物理的ベクターを用いて免疫賦活性核酸、抗体、抗原、および疾患特異的薬剤を含む治療剤を送達することができる。本明細書に用いている「化学的／物理的ベクター」とは、上記核酸および／または他の薬剤を送達することができる、細菌学的もしくはウイルス供給源由来のもの以外の天然もしくは合成分子のことを意味する。
【０２８９】
本発明の好ましい化学的／物理的ベクターはコロイド分散系である。コロイド分散系としては、水中油エマルジョン、ミセル、混合性ミセル、およびリポソームを含む脂質系が挙げられる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）もしくはイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で送達ベクターとして有用な人工的膜容器（ｖｅｓｓｅｌ）である。サイズが０．２〜４．０μｍの大型単層膜小胞（ＬＵＶ）は、大きな高分子を内包することができることが示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡおよび完全体ビリオンは、この水性内部に内包して生物学的に活性な形で細胞に送達することができる。フラレーほか（Ｆｒａｌｅｙｅｔ  ａｌ．）（１９８１年）トレンズ・イン・バイオケミカル・サイエンシーズ（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．）６：ｐ７７参照。
【０２９０】
リポソームは、モノクロナール抗体、糖、糖脂質もしくは蛋白質のような特異的なリガンドにリポソームを結合させることによって、特定の組織を標的とすることができる。リポソームが免疫細胞を標的とするのに有用とすることができるリガンドとしては、免疫細胞の特定の受容体と相互作用する分子の完全体もしくは断片、および免疫細胞の細胞表面マーカーと相互作用する抗体などの分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。このようなリガンドは、当業者に既知の結合アッセイによって容易に特定することができる。さらに別の実施態様として、このリポソームは、前記の免疫療法用抗体の１種にこれを結合させることにより、癌を標的にすることができる。さらに、このベクターを核を標的とするペプチドに結合させて、宿主細胞の核にこのベクターを誘導することができる。
【０２９１】
形質転換用の脂質調製品はキアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ）から、例えば、ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ(登録商標)(特別なＤＮＡ濃縮エンハンサーを有する非リポソーム脂質)およびＳＵＵＰＥＲＦＥＣＴ(登録商標)(新規な活性型デンドリマー技術)として、市販されている。
【０２９２】
リポソームは、ギブコＢＲＬ社（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）から、例えば、Ｎ−［１−（２，３ジオレイロキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム・クロリド（ＤＯＴＭＡ）およびジメチルジオクタデシルアンモニウム・ブロミド（ＤＤＡＢ）のような陽イオン性脂質の形をとるＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）およびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（登録商標）として市販されている。リポソームの作製方法は、当該分野では既知であり、多くの刊行物に記載されている。また、リポソームについてはグレゴリアディス・Ｇ（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ．）（１９８５年）トレンズ・イン・バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）３：ｐ２３５−２４１に総説がある。
【０２９３】
一実施態様として、この媒介物は、哺乳動物受容個体への移植もしくは投与に好適な生体適合性の微粒子もしくは移植物である。本方法に基づいて有用である例示的なバイオエローディブル（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）移植物については、「高分子遺伝子送達システム（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ）」と題するＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７号（公開番号：第ＷＯ９５／２４９２９号）に開示されている。ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ／０３３０７号には、適当なプロモータにより制御された外来性遺伝子を内包させるための生体適合性、好ましくは生分解性高分子マトリクスについて記載されている。この高分子マトリクスを用いると、被験体の体内でこの治療剤を持続性に放出させることができる。
【０２９４】
好ましくは、この高分子マトリクスは、（核酸および／または他の治療剤が固体高分子マトリクス全体に分散する）小球体などの微粒子、または（核酸および／または他の治療剤が高分子シェルのコアに貯蔵される）マイクロカプセルの形をとるものである。治療剤を含ませるための高分子マトリクスの別の形態としては、薄膜、被膜、ゲル、移植物およびステントが挙げられる。高分子マトリクス・デバイスのサイズおよび組成は、マトリクスを導入する組織において良好な放出動態が得られるように、選択する。さらに、高分子マトリクスのサイズは、用いることになる送達方法、通常は組織内への注入または鼻腔もしくは肺部位内へのエアロゾルによる懸濁液の投与に合わせて、選択する。エアロゾルによる経路を用いる場合、高分子マトリクスおよび核酸および／または他の治療剤は、界面活性物質の媒介物に含ませることが好ましい。高分子マトリクスの組成は、良好な崩壊速度を有し、また、生体接着性の材料の形をとることにより、傷害を受けている鼻腔および／または肺表面にこのマトリクスを投与する場合の移入効果を高めるように、選択することができる。また、このマトリクスの組成は、崩壊するのではなく、長期間にわたって拡散により放出するように、選択することができる。一部の好ましい実施態様として、核酸は移植物を介して投与するが、他の治療剤は急性に投与する。経口もしくは粘膜からの送達などの送達に好適な生体適合性小球体については、チッカリンほか（Ｃｈｉｃｋｅｒｉｎｇｅｔ  ａｌ．）（１９９６年）バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ｂｉｏｅｎｇ．）５２：ｐ９６−１０１、およびマティオヴィッツ・Ｅほか（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．）（１９９７年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３８６：ｐ４１０−４１４、ならびにＰＣＴ特許出願第ＷＯ９７／０３７０２号に開示されている。
【０２９５】
非生分解性および生分解性マトリクスは、共に、被験体に核酸および／または他の治療剤を送達するのに用いることができる。生分解性マトリクスの方が好ましい。このような高分子は、天然もしくは合成高分子とすることができる。この高分子は、一般に数時間から１年以上のオーダーの、目的とする放出期間に基づいて選択する。通常、数時間から３〜１２ヶ月の範囲の期間にわたる放出が、特に核酸剤に対しては最も望ましい。この高分子は、必要に応じて、水中でのその重量の約９０％まで吸収することができるヒドロゲルの形をとり、さらに、必要に応じて多価イオンもしくは他の高分子と架橋させる。
【０２９６】
特に興味深い生体接着性高分子としては、本明細書にその教示内容が組み込まれているエイチ・エス・ソーニィ（Ｈ．Ｓ．  Ｓａｗｈｎｅｙ）、シー・ピー・パタック（Ｃ．Ｐ．  Ｐａｔｈａｋ）、ジェイ・エー・ヒューベル（Ｊ．Ａ．  Ｈｕｂｅｌｌ）、マクロモレキュルズ（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、（１９９３年）２６：ｐ５８１−５８７に記載のあるバイオエローディブル（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）・ヒドロゲル類が挙げられる。これらのものとしては、ポリヒアルロン酸、カゼイン、ゼラチン、グルチン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギネート、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）が挙げられる。
【０２９７】
治療剤が核酸である場合、凝縮剤を使用することも望ましい。また、凝縮剤は、単独で、または生物学的もしくは化学的／物理的ベクターと併用して用いることもできる。本明細書で用いている「凝縮剤」とは、核酸の陰性電荷を中和し、核酸を細粒状に凝縮させることができるヒストンなどの物質のことを意味する。核酸が凝縮されると、標的細胞による核酸の取り込みが容易になる。この凝縮剤は、単独で用いることができる、即ち、細胞により効率的に取り込まれる形で核酸を送達することができるが、より好ましくは前述のベクターの１種以上と併用して用いることができる。
【０２９８】
核酸の取り込みを容易にするために用いることができる他の成分の例としては、リン酸カルシウムその他の細胞内輸送の化学メディエータ、微量注入用成分、（例えば、標的細胞の染色体内の予め選んだ部位に核酸を組み込むための）電気穿孔および相同的遺伝子組み換え用成分が挙げられる。
【０２９９】
前記化合物は、単独で（例えば、生理食塩水もしくは緩衝液に溶かして）、または当該分野で既知の任意の送達ベクターを用いて投与することができる。例えば、以下の送達ベクターが報告されている：渦巻型（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）（グールド−フォーガライトほか（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、１９９６年）；エマルソーム（Ｅｍｕｌｓｏｍｅ）（バンコットほか（Ｖａｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、ローエルほか（Ｌｏｗｅｌｌｅｔ  ａｌ．）、１９９７年）；ＩＳＣＯＭ（モワットほか（Ｍｏｗａｔｅｔ  ａｌ．）、１９９３年、カールソンほか（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年、フーほか（Ｈｕｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、モレインほか（Ｍｏｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年）；リポソーム（チルダーズほか（Ｃｈｉｌｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年、ミハウェックほか（Ｍｉｃｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年、１９９２年、デ・ハーン（ｄｅ  Ｈａａｎ）、１９９５年ａ、１９９５年ｂ）；生細菌ベクター（例えば、サルモネラ、大腸菌、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｍａｔｔｅ−ｇｕｅｒｉｎ）、赤痢菌、乳酸菌）（ホーンほか（Ｈｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、プーウェルズほか（Ｐｏｕｗｅｌｓｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、チャットフィールドほか（Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年、ストーバーほか（Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９１年、ニュージェントほか（Ｎｕｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年）；生ウイルス・ベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純疱疹）（ガリチャンほか（Ｇａｌｌｉｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年、１９９５年、モスほか（Ｍｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、ニュージェントほか（Ｎｕｇｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、フレクスナーほか（Ｆｌｅｘｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、モローほか（Ｍｏｒｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年）；小球体（グプタほか（Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、ジョーンズほか（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９６年、マロイほか（Ｍａｌｏｙ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、ムーアほか（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年、オヘイガンほか（Ｏ'Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９４年、エルドリッジほか（Ｅｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９８９年）；核酸ワクチン（フィナンほか（Ｆｙｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９３年、ククリンほか（Ｋｕｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年、ササキほか（Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、オカダほか（Ｏｋａｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年、イシイほか（Ｉｓｈｉｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９７年）；ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）（ハマジマほか（Ｈａｍａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、ジャバル−ギルほか（Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年）；ポリマーリング（ワイアットほか（Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年）；プロテオソーム（バンコットほか（Ｖａｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、ローエルほか（Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、１９９６年、１９９７年）；フッ化ナトリウム（ハシ���か（Ｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年）；遺伝子導入植物（タケットほか（Ｔａｃｋｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、メイソンほか（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年、ハクほか（Ｈａｑ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年）；ビロゾーム（グラックほか（Ｇｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９２年、メンギアーディほか（Ｍｅｎｇｉａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９５年、クライツほか（Ｃｒｙｚ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年）；およびウイルス様粒子（ジャンほか（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９９年、リーブルほか（Ｌｅｉｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．）、１９９８年）。
【０３００】
本発明の製剤は、医薬用として許容可能な溶液として投与され、この溶液は通常、医薬用として許容可能な濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性の担体、佐剤、および必要に応じて、その他の治療成分を含むことができる。
【０３０１】
医薬用として許容可能な担体という用語は、ヒトその他の脊椎動物への投与に適した１種以上の適合性固体もしくは液体増量剤、希釈剤または封入剤のことを意味する。担体という用語は、有効成分に、その適用を容易にするように混合する天然または合成の有機もしくは無機成分を意味する。また、医薬用組成物の諸成分は、目的の薬剤効果を大きく損なう相互作用が起こらないように、本発明の化合物と、および諸成分間で混合することもできる。
【０３０２】
経口投与の場合、化合物（即ち、核酸、抗原、抗体、および他の治療剤）は、当該分野で既知の医薬用として許容可能な担体とこの活性化合物を混合することにより容易に製剤化することができる。このような担体を用いることにより、本発明の化合物を、治療すべき被験体の経口摂取用に錠剤、丸剤、糖剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤（ｓｌｕｒｒｉｅｓ）、懸濁剤などとして製剤化することができる。経口用の医薬製剤は、固形賦形剤として得られ、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、必要なら適当な佐剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して錠剤もしくは糖錠コアを得ることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトールなどの糖；トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、じゃがいも澱粉、ゼラチン、トラガカント・ゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤のような増量剤である。必要ならば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、もしくはアルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムなどこれらの塩のような崩壊剤を加えることができる。経口製剤は、生理食塩水または製剤中の酸性状態を中和する緩衝液に溶かして作製することもでき、あるいは担体を用いないで投与することができる。
【０３０３】
糖錠コアには適当な被膜を設ける。このためには、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポール・ゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適当な有機溶媒または溶媒混液を任意に含むことができる濃縮糖溶液を用いることができる。錠剤もしくは糖錠被膜には、識別のため、または活性化合物用量の種々の組合せを特徴付けるために、色素または顔料を加えることができる。
【０３０４】
経口で使用できる医薬製剤としては、ゼラチンでできたプッシュフィット・カプセル剤、ならびにゼラチン、およびグリセロールもしくはソルビトールなどの可塑剤でできた軟質密閉カプセル剤が挙げられる。プッシュフィット・カプセル剤では、ラクトースなどの増量剤、澱粉などの結合剤および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、ならびに必要に応じて、安定剤を含む混合物に有効成分を添加することができる。軟カプセル剤では、有効成分は、脂肪油、流動パラフィン、液状ポリエチレングリコールなどの適当な液中に溶解または懸濁することができる。また、経口投与用に作製された小球体を用いることもできる。このような小球体は、当該分野でよく定義されている。経口投与用の製剤では、この投与法に適した投薬量を用いる必要がある。
【０３０５】
口腔内投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤化した錠剤もしくはトローチ剤の形をとることができる。
【０３０６】
吸入投与の場合、本発明により使用する組成物は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素その他の適当なガスのような好適な高圧ガスを用いて加圧容器もしくはネブライザーからエアロゾルを噴霧する形で、適宜送達させることができる。加圧エアロゾルの場合、計測量を送達するためのバルブを設けることによって、投与量単位を決めることができる。吸入器もしくは注入器用のゼラチンなどのカプセルもしくはカートリッジは、化合物の混合粉体、および乳糖、澱粉などの適当な粉末基剤を内包させて、製剤化することができる。
【０３０７】
化合物は、これを全身性に送達することを目的とする場合、注入、例えば、急速静注もしくは持続点滴による非経口的投与用に製剤化することができる。注入用の製剤は、単位投与形態、例えば、保存剤を添加したアンプルもしくは多数回使用容器（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ  ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）として供給することができる。こうした組成物は、油性もしくは水性媒体の懸濁液、溶液もしくは乳液などの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤のような製剤用剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含むことができる。
【０３０８】
非経口投与用の医薬製剤としては、水溶性活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性懸濁注射液として調製することができる。好適な親油性溶媒もしくは媒体としては、ゴマ油などの脂肪油、もしくはオレイン酸エチル、トリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。水性懸濁注射液は、カルボキシメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの、懸濁液の粘度を増加させる物質を含むことができる。また、必要に応じて、この懸濁液は、適当な安定剤、または化合物の溶解度を増大させて高濃度溶液の調製を可能にする物質を含むことができる。
【０３０９】
一方、活性化合物は、適当な媒体、例えば発熱物質不含滅菌水を用いて構成後使用する粉末状とすることができる。
【０３１０】
また、活性化合物は、例えばカカオ脂その他のグリセリドのような通常の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸などの直腸または膣内投与用の組成物として製剤化することができる。
【０３１１】
また、これまでに述べた製剤のほかに、持続性製剤として化合物を製剤化することもできる。このような作用持続型製剤は、適当な高分子もしくは疎水性物質を用いて（例えば、許容可能な油のエマルジョンとして）、またはやや溶けにくい誘導体、例えばやや溶けにくい塩として、製剤化することができる。
【０３１２】
また、前記医薬組成物は、適当な固体もしくはゲル相担体または賦形剤を含むことができる。こうした担体または賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３１３】
好適な液状もしくは固形医薬製剤の形態には、例えば、吸入用水溶液もしくは生理食塩水溶液、マイクロカプセル封入、渦巻型化（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅｄ）、顕微鏡的金微粒子への被覆、リポソームへの封入、噴霧、エアロゾル、皮膚内移植ペレット、または皮膚切創用鋭利物面での乾燥がある。また、医薬用組成物としては、顆粒剤、散剤、錠剤、コーチング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、滴剤、もしくは活性化合物の持続製剤が挙げられ、これらの製剤では、通例、崩壊剤、結合剤、コーチング剤、膨潤剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、甘味剤可溶化剤などの賦形剤および添加剤および／または佐剤を前述のようにして用いられる。こうした医薬用組成物は、種々の薬物送達システム用として好適である。薬物送達の方法についての簡単な総説については、引用により本明細書に組み込まれているランガー・Ｒ（Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ．）（１９９０年）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４９：ｐ１５２７−１５３３を参照されたい。
【０３１４】
核酸および、必要に応じて加える他の治療剤および／または抗原は、これら自体で（混ぜものなしで）、または医薬用として許容可能な塩として投与することができる。医薬品として用いる場合は、この塩は医薬用として許容可能なものである必要があるが、非医薬用として許容可能な塩もその医薬用として許容可能な塩を調製するために適宜用いることができる。このような塩としては、以下の酸から調製されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、カルボン酸基のナトリウム、カリウムもしくはカルシウム塩のようなアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の塩として調製することもできる。
【０３１５】
好適な緩衝剤としては、酢酸と塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸と塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸と塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；およびリン酸と塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５＆ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０３１６】
こうした組成物は、単位投与形態で適宜提供することができ、調剤分野で既知の任意の方法により調製することができる。全ての方法は、１種以上の副成分を構成する担体と化合物を会合させる工程を含む。一般に、このような組成物は、液状担体、微粉化した担体、もしくはこれらの両方に化合物を均一かつ密に会合させ、次いで必要なら、この生成物を成形することにより、調製することができる。液体の投与量単位は、アンプルもしくはバイアルである。固体の投与量単位は、錠、カプセルおよび坐剤である。
【０３１７】
他の送達システムとしては、持続放出性（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ）、遅延放出性（ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）もしくは徐放性（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）送達システムを挙げることができる。このようなシステムによれば、化合物の投与を繰り返し行う必要がなくなり、被験体および医師にとっての利便性を高めることができる。多くのタイプの放出送達システムが利用可能であり、当業者には既知である。こうしたものとしては、ポリ（ラクチド−グリコリド）、コポリオキサレート、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリヒドロキシ酪酸、およびポリ無水物などのポリマー系シンテムが挙げられる。薬物を内包する上記ポリマーのマイクロカプセルについては、例えば、米国特許第５，０７５，１０９号に開示されている。また、送達システムとしては、非ポリマー系システム、即ち、コレステロール、コレステロールエステル、脂肪酸などのステロールもしくはモノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどの中性脂肪酸を含む脂質；ヒドロゲル放出システム；シラスチック・システム；ペプチド系システム；ワックス・コーティング；通常の結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠；部分融合移植物（ｐａｒｔｉａｌｌｙ  ｆｕｓｅｄ  ｉｍｐｌａｎｔ）なども挙げられる。具体例としては、（ａ）米国特許第４，４５２，７７５号、第４，６７５，１８９号および第５，７３６，１５２号に開示されているようなマトリクスに本発明の薬剤を内包させたエローショナル（ｅｒｏｓｉｏｎａｌ）システム、ならびに（ｂ）米国特許第３，８５４，４８０号、５，１３３，９７４号および第５，４０７，６８６号に開示されているようなポリマーから活性成分が制御した速度で透過する拡散システムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、ポンプ利用ハードウェア（ｐｕｍｐ−ｂａｓｅｄ  ｈａｒｄｗａｒｅ）送達システム類も用いることができ、これらの一部は移植に適している。
【０３１８】
また、本発明は、免疫賦活性化合物を特定し、特定した化合物および薬剤を最大限に利用する効率的な方法を提供する。概して、このスクリーニング方法は、特定のＴＬＲを介してシグナル伝達を阻害または増強する化合物をアッセイするものである。この方法では、ＴＬＲ、ＴＬＲに対する適当な対照リガンド、および免疫賦活性候補化合物を使用する。選択したＴＬＲを適当な対照化合物（ＴＬＲリガンド）と接触させ、ＴＬＲ媒介性対照シグナルを測定する。また、選択したＴＬＲを免疫賦活性候補化合物と接触させ、ＴＬＲ媒介性試験シグナルを測定する。次いで、得られた試験シグナルと対照シグナルとを比較する。好適な免疫賦活性候補化合物は、その後、このアッセイの対照化合物として用いることができる。候補化合物の自動化ハイスループット・スクリーニングに適合することができる。このようなハイスループット・スクリーニング法の例については、米国特許第６，１０３，４７９号、第６，０５１，３８０号、第６，０５１，３７３号、第５，９９８，１５２号、第５，８７６，９４６号、第５，７０８，１５８号、第５，４４３，７９１号、第５，４２９，９２１号、および第５，１４３，８５４号に開示されている。
【０３１９】
本明細書に用いている「ＴＬＲシグナル伝達」とは、ＴＬＲポリペプチドが、本明細書でＴＬＲシグナル変換経路とも呼ぶトル（Ｔｏｌｌ）／ＩＬ−１Ｒ（ＴＩＲ）シグナル伝達経路を賦活化することができることを意味する。ＴＬＲ活性の変化については、κＢ−感受性プロモータおよびエンハンサーの制御下の遺伝子発現を測定できるようにデザインされたアッセイ法によって測定することができる。このような遺伝子は、天然の遺伝子とすることができ、あるいは細胞内に人工的に導入した遺伝子とすることができる。天然のレポータ遺伝子としては、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、インターロイキン１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ−１２  ｐ４０）、ならびに共起刺激分子ＣＤ８０およびＣＤ８６をコードしている遺伝子が挙げられる。その他の遺伝子についても、このような調節性エレメントの制御下に置くことにより、ＴＬＲシグナル伝達のレベルを知るのに役立つ。
【０３２０】
このアッセイ混合物は、免疫賦活性候補化合物を含む。通常、種々の物質濃度と並行に、複数のアッセイ混合物をアッセイすることにより、種々の濃度に対する異なる反応が得られる。通常、これらの濃度の１つを陰性対照、即ち、物質のゼロ濃度もしくはアッセイ検出限界未満の物質濃度とする。免疫賦活性候補化合物には、多くの化学物質のクラスが含まれ得るが、通常は、有機化合物である。一実施態様として、免疫賦活性候補化合物は、低分子ＲＮＡもしくは低分子有機化合物、即ち、分子量が５０超２５００未満ダルトンの有機化合物である。高分子免疫賦活性候補化合物は、これらより分子量が大きく、例えば、約２，５００〜約１２，５００の範囲のオリゴヌクレオチドとすることができる。また、免疫賦活性候補化合物は、核酸、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジンなどの生体分子、これらの誘導体もしくは構造アナログ、または、これらの組合せなどとすることができる。免疫賦活性候補化合物が核酸の場合、この免疫賦活性候補化合物は、通常、ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であるが、非天然結合もしくはサブユニットを有する修飾された核酸も企図している。
【０３２１】
免疫賦活性候補化合物は、天然、合成、もしくは半合成化合物のライブラリ、またはこれらの任意の組合せを含むさまざまな供給源から入手することができる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチド、合成有機コンビナトリー・ライブラリ、ファージ提示系ランダムペプチド・ライブラリなどを含む、さまざまな有機化合物および生体分子のランダムならびに制御（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成のための多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物からの抽出物の形の天然化合物のライブラリが利用可能であるか、容易に作製できる。さらに、天然および合成的に作製したライブラリならびに化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾することができる。さらに、既知の薬物に対して、アシル化、アルキル化、エステル化、アミディフィケーション（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの制御的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）もしくはランダム的化学修飾を行い、免疫賦活性候補化合物の構造アナログを作製することができる。
【０３２２】
また、種々の他の試薬をこの混合物に加えることができる。これらのものとしては、塩、緩衝剤、中性蛋白質（例えば、アルブミン）、界面活性剤などの試薬が挙げられ、これらを用いることによって蛋白質−蛋白質および／または蛋白質−核酸結合の最適化を容易にすることができる。また、このような試薬により、反応成分間の非特異的もしくは背景相互作用を低減させることもできる。また、蛋白分解酵素阻害剤、核酸分解酵素阻害剤、抗菌剤などのようなアッセイの効率を向上させるその他の試薬も使用することができる。
【０３２３】
成分の添加順序、インキュベーション温度、インキュベーション時間その他のアッセイ・パラメータは容易に決定することができる。このような実験は、単にこれらのアッセイパラメータを最適化するものであり、このアッセイの根本的な構成に係わるものではない。インキュベーション温度は、一般的に４℃〜４０℃、より一般的には３７℃である。インキュベーション時間は、迅速ハイスループット・スクリーニングを容易にするため、できるだけ短くすることが好ましく、通常は１分〜１０時間である。
【０３２４】
インキュベーション後、ユーザーに利用可能な任意の便利な方法により、ＴＬＲシグナル伝達のレベルを検出する。セル・フリー結合型アッセイの場合、未結合成分から結合成分を分離する分離工程を用いることが多い。この分離工程は、種々の方法で遂行することができる。例えば、溶液中で分離を遂行することができ、あるいは、未結合成分を容易に分離することができる固体担体上に成分の少なくとも１つを固定すると都合がよい。この固体担体は、さまざまな材料で、マイクロタイター・プレート、マイクロビーズ、ディップ・スティック、樹脂粒子などのさまざまな形状に作製することができる。この担体は、シグナル対ノイズの最大化、主として背景結合の最少化をもたらすように、また、分離の容易さおよびコストを考慮して選択することが望ましい。
【０３２５】
分離は、例えば、リザーバからビーズもしくはディップスティックを除去し、マイクロタイター・プレートウェルのようなリザーバを空にするか希釈し、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラムもしくはフィルターを洗浄液もしくは溶媒ですすぐことによって行うことができる。この分離工程は、多数回のすすぎもしくは洗浄処理を含むことが望ましい。例えば、固体担体がマイクロタイター・プレートである場合、塩、緩衝剤、界面活性剤、非特異的蛋白質などのような、特異的結合に関与しないインキュベーション混合液の成分を含むのが通常である洗浄液を用いて、ウェルを数回洗浄することができる。固体担体が磁性ビーズである場合、このビーズは、洗浄液で１回以上洗浄した後、磁石を用いて分離することができる。
【０３２６】
検出は、細胞内もしくは細胞表面の、または細胞により分泌された誘導ポリペプチドの測定などの細胞を利用するアッセイ用のどんな簡便な方法によっても行うことができる。細胞利用のアッセイに有用な検出法の例としては、蛍光細胞分離（ＦＡＣＳ）分析法、生体発光法（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）、蛍光法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）などが挙げられる。無細胞（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）アッセイに有用な検出法としては、生体発光法、蛍光法、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲなどが挙げられる。
【実施例】
【０３２７】
（実施例１．Ｇ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの反応性）
健常ドナーからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離して３×１０５個／ウェルで平板培養し、これを種々の試験および対照免疫賦活性薬剤によりイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で１６時間賦活した後、サイトカインＩＬ−１２ｐ４０およびＴＮＦ−αの分泌について、ＢＤ−ファーミンゲン社（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のマッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）抗体ペアを用い、このメーカーのプロトコルに従って酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により解析した。また、メジウム単独およびＤＯＴＡＰ（１０μｇ／２００μｌ培養ウェル；「リポソーム」）単独を含む特定の陰性対照も含めた。用いた対照免疫賦活性薬剤としては、イミダゾキノロンＲ−８４８（２μｇ／ｍｌ）、リポポリサッカライド（ＬＰＳ；１μｇ／ｍｌ）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ（５μ／ｍｌ）、ポリＩＣ（５０μ／ｍｌ）およびＣｐＧ  ＤＮＡ（５０μ／ｍｌ）が含まれた。これらは、それぞれＴＬＲ７、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、およびＴＬＲ９のリガンドであると報告されている。用いた試験免疫賦活性薬剤としては、それぞれ５０μｇ／ｍｌでＤＯＴＡＰの使用有および無（それぞれ、「リポソーム」使用計１０μｇ、「リポソーム」無）の以下のＲＮＡ分子が含まれた：ＧＵＧＵＵＵＡＣ単独；ＧＵＡＧＧＣＡＣ単独；ＧＵＧＵＵＵＡＣとＧＵＡＧＧＣＡＣとの併用；ＧＵＡＧＧＡ；ＧＡＡＧＧＣＡＣ；ＣＵＡＧＧＣＡＣ；ＣＵＣＧＧＣＡＣ；およびＣＣＣＣＣＣＣＣ。これらのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、それぞれ、末端から二番目と３’末端ヌクレオシドとの間にホスホロチオエート結合を有した。
【０３２８】
図１は、上記の試験および対照薬剤に対するヒトＰＢＭＣの反応性について、ＩＬ−１２  ｐ４０の分泌量（ｐｇ／ｍｌ）の測定により得られた結果を示したものである。図１から分かるように、ＰＢＭＣはＲ−８４８、ＬＰＳ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、およびポリＩＣに反応したが、ＤＯＴＡＰ単独には反応しなかった。注目に値すべきなのは、ヒトＰＢＭＣが、Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチドＧＵＧＵＵＵＡＣ単独；ＧＵＡＧＧＣＡＣ単独；ＧＵＧＵＵＵＡＣとＧＵＡＧＧＣＡＣとの併用；ＣＵＡＧＧＣＡＣ；およびＣＵＣＧＧＣＡＣのそれぞれとＤＯＴＡＰとの併用に反応して、大量のＩＬ−１２  ｐ４０（１０〜２０ｎｇ／ｍｌ）を分泌したことである。さらに注目に値すべきなのは、ヒトＰＢＭＣが、Ｇ、Ｕを含有しないＲＮＡオリゴヌクレオチドＧＡＡＧＧＣＡＣおよびＣＣＣＣＣＣＣＣに反応して有意な量のＩＬ−１２  ｐ４０を分泌しなかったことである。概して、上記Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチド分子の免疫賦活性作用は、ＤＯＴＡＰに内包させることによって大きく増強するように思われた。この実験では、Ｇ、Ｕ含有６−ｍｅｒＲＮＡ  ＧＵＡＧＧＡは、ＤＯＴＡＰの有無にかかわらず、有るか無しかの程度の免疫賦活性作用しか発現しないように思われた。
【０３２９】
図２は、上記の試験および対照薬剤に対するヒトＰＢＭＣの反応性について、ＴＮＦ−αの分泌量の測定により得られた結果を示したものである。図１に示したのと同様なパターンの結果が観察された。即ち、ヒトＰＢＭＣは、Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチドＧＵＧＵＵＵＡＣ単独；ＧＵＡＧＧＣＡＣ単独；ＧＵＧＵＵＵＡＣとＧＵＡＧＧＣＡＣとの併用；ＣＵＡＧＧＣＡＣ；およびＣＵＣＧＧＣＡＣのそれぞれとＤＯＴＡＰとの併用に反応して、大量のＴＮＦ−α（４０〜１００ｎｇ／ｍｌ）を分泌した。また、図１の結果と同様に、ヒトＰＢＭＣは、Ｇ、Ｕを含有しないＲＮＡオリゴヌクレオチドＧＡＡＧＧＣＡＣおよびＣＣＣＣＣＣＣＣ、またはＧ、Ｕ含有６−ｍｅｒＲＮＡ  ＧＵＡＧＧＡに反応して有意な量のＴＮＦ−αを分泌しなかった。上記Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチド分子の免疫賦活性作用は、ＤＯＴＡＰに内包させることによって大きく増強するように思われた。
【０３３０】
Ｇ−Ｕゆらぎ塩基対を点による結合で示し、Ｇ−ＣおよびＡ−Ｕ塩基対を線による結合で示した下記の図の部分的自己相補性塩基対合が可能であることは、この実施例から明瞭に理解されよう。
【０３３１】
【化１８】
0005608024.tif 000019
（実施例２．  Ｇ、Ｕ含有オリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの用量−反応性挙動）
種々の濃度のＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、上記実施例の実験を繰り返し、本発明のＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチドに対するヒトＰＢＭＣの用量−反応性挙動を評価した。１０μｇのＤＯＴＡＰに総量１０、３もしくは１μｇのＲＮＡを加え、次いでこれを２００μｌ培養ウェルに添加した。１６時間後、実施例１の場合と同様にして、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αのＥＬＩＳＡを実施した。
【０３３２】
図３は、種々のＲＮＡに対するヒトＰＢＭＣの用量−反応性について、ＩＬ−１２  ｐ４０の分泌量（ｎｇ／ｍｌ）の測定により得られた結果を示したものである。図３から分かるように、ヒトＰＢＭＣは、漸増量のＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーＧＵＧＵＵＵＡＣ；ＧＵＡＧＧＣＡＣ；ＣＵＡＧＧＣＡＣ；およびＣＵＣＧＧＣＡＣのそれぞれとＤＯＴＡＰとの併用に反応して、漸増量のＩＬ−１２  ｐ４０を分泌した。また、逆に、図３は、ヒトＰＢＭＣが、試験したどの量のＧ、Ｕ不含ＲＮＡオリゴマーＧＡＡＧＧＣＡＣまたはＣＣＣＣＣＣＣＣに対してもＩＬ−１２  ｐ４０分泌反応を生じなかったことを示すものである。
【０３３３】
ＴＮＦ−αの分泌量によっても、対応する、種々のＲＮＡに対するヒトＰＢＭＣの用量−反応性を評価した。図３に示したのと同様なパターンの結果が観察された。即ち、ヒトＰＢＭＣは、漸増量のＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチドＧＵＧＵＵＵＡＣ；ＧＵＡＧＧＣＡＣ；ＣＵＡＧＧＣＡＣ；およびＣＵＣＧＧＣＡＣのそれぞれとＤＯＴＡＰとの併用に反応して、漸増量のＴＮＦ−αを分泌した。また、図３の結果と同様に、ヒトＰＢＭＣは、試験したどの量のＧ、Ｕ不含ＲＮＡオリゴヌクレオチドＧＡＡＧＧＣＡＣおよびＣＣＣＣＣＣＣＣに対しても有意な量のＴＮＦ−αを分泌しないように思われた。
【０３３４】
（実施例３．ＲＮＡオリゴマーの塩基配列感受性）
ＲＮＡオリゴヌクレオチドＧＵＡＧＧＣＡＣに対して点変異を行い、選択した位置でＡもしくはＣに置換した。得られた種々のオリゴヌクレオチドとしては、以下のものが挙げられる：ＧＵＡＧＧＣＡＣ；ＧＵＡＧＧＡ；ＧＡＡＧＧＣＡＣ；ＡＵＡＡＡＣＡＣ；ＡＵＡＧＡＣＡＣ；ＡＵＡＡＧＣＡＣ；ＧＵＡＡＡＣＡＣ；ＣＵＡＧＧＶＡＣ；ＣＵＣＧＧＣＡＣ；およびＧＵＧＵＵＵＡＣ。健常ドナーから単離して３×１０５個／ウェルで平板培養したヒトＰＢＭＣを用い、上記オリゴヌクレオチドの力価を判定した。１０μｇのＤＯＴＡＰに総量１０μｇのＲＮＡを加え、次いでこれを２００μｌ培養ウェルに添加した。ヒトＴＮＦ−αは、ＢＤ−ファーミンゲン社（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のマッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）抗体ペアを用い、このメーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡにより測定した。結果は、図４に示した。
【０３３５】
（実施例４．ヒトＰＢＭＣの種々の賦活に対する反応に及ぼすＤＯＴＡＰの影響）
さらに、以上の実施例で認められたＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーの免疫賦活化作用におけるＤＯＴＡＰの役割を特徴付けるために、ヒトＰＢＭＣを健常ドナーから単離して３×１０５個／ウェルで平板培養した後、ＤＯＴＡＰを併用しまたは併用しない（それぞれ、「リポソーム併用」または「リポソーム非併用」）で、既知のＴＬＲリガンドの存在下にこれを賦活化した。調べた既知のＴＬＲリガンドは、菌糸から調製した全ＲＮＡ（菌糸）、酵母から調製した全ＲＮＡ（酵母）、骨髄球細胞株ＨＬ−６０から調製した全ＲＮＡ（ＨＬ−６０）、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で転写した大腸菌Ｓｐ６のリボソームＲＮＡ、イン・ビトロで転写した大腸菌Ｔ７のリボソームＲＮＡ、ＬＰＳ、ポリＩＣ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、およびＲ−８４８であった。陰性対照としてはメジウム単独およびＤＯＴＡＰ単独を用いた。また、前記実施例からの、この場合も１０μｇ／ｍｌの、ＤＯＴＡＰを併用しないＲＮＡのパネルも含めた。
【０３３６】
トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））を用いてヒト骨髄球細胞株ＨＬ−６０から全ＲＮＡを単離した。単離の前に、この細胞株にアポトーシスを誘発する過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）５００μＭを用いて細胞を４時間処理した（ＨＬ６０  ５００）。未処理細胞は対照とした（ＨＬ６０  ０）。
【０３３７】
（１０％ウシ胎仔血清を用いた４時間のインキュベーションによって誘導した）酵母または菌糸からカンジダ・アルビカンスＲＮＡを単離した。１００ｍｌ培養液からの細胞沈殿物を洗浄し、１０ｍｌのトリス／ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭ、１ｍＭ）中に再懸濁した。ＲＮＡの単離は、オースベル・Ｆ・Ｍほか（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．）編、カレント・プロトコル・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ）、ニューヨークに記載の方法によ
り、熱酸性フェノールを用いた抽出によって行った。
【０３３８】
ゲノム大腸菌ＤＮＡからのプライマー５’−ＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＧＣＴＣＡＧＡＴＴＧＡＡＣＧ−３’（配列番号５）および５’−ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＧＣＡＧＧＴＴＣＣ−３’（配列番号６）を用いて、大腸菌１６Ｓ  ＲＮＡのゲノム断片を増幅させ、これをｐＧＥＭ  Ｔイージーベクター（ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ）中にクローニングした。イン・ビトロ転写は、Ｔ７もしくはＳｐ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて行った。転写されたＲＮＡは、さらにクロロホルム／フェノール抽出により精製し、沈殿させ、１０μｇを使用した。
【０３３９】
１６時間インキュベーションした後、前記と同様にしてＥＬＩＳＡを実施し、ＩＬ−１２  ｐ４０およびＴＮＦ−αの分泌を評価した。図５に代表的な結果を示した。
【０３４０】
図５は、ＤＯＴＡＰ併用および非併用下にインキュベーションした後のヒトＰＢＭＣにより分泌されたＩＬ−１２  ｐ４０の量について、ＤＯＴＡＰの影響を示したものである。この図から分かるように、以下のものによる賦活は、ＤＯＴＡＰの存在下では非存在下の場合よりも強い免疫賦活作用を示すように思われた：菌糸、酵母、大腸菌Ｓｐ６および大腸菌Ｔ７。次のものによる賦活は、ＤＯＴＡＰの存在下では非存在下の場合よりも弱い免疫賦活作用を示すように思われた：ＬＰＳおよびポリＩＣ。以下のものによる賦活は、ＤＯＴＡＰの存在もしくは非存在下でほぼ同等の免疫賦活作用を示すように思われた：ＨＬ６０、Ｐａｍ３ＣｙｓおよびＲ−８４８。
【０３４１】
（実施例５．Ｇ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーの免疫賦活作用は種およびＭｙＤ８８依存性である。）
以下のマウス細胞を単離し、種々のＲＮＡおよび他の既知のＴＬＲリガンドとインキュベーションして種、細胞型およびシグナル伝達経路特異性を評価した：ＩＦＮ−γ存在下の野性型マクロファージ；ＩＦＮ−γ存在下のＭｙＤ８８欠損マクロファージ；Ｊ７７４（マウス・マクロファージ細胞株）；およびＲＡＷ２６４．７（マウス・マクロファージ細胞株、例えば、ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−７１）。野性型もしくはＭｙＤ８８欠損Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのマウス骨マクロファージを、骨髄細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと５日間培養することにより調製した。細胞は、２５，０００個／ウェルを接種し、２０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−γで１６時間処理した。マウス・マクロファージ細胞株ＲＡＷおよびＪ７７４は１０，０００個／ウェルを接種した。
【０３４２】
以下の試験および対照薬剤について検討した：Ｒ−８４８（２μｇ／ｍｌ）、ＯＤＮ１６６８（ＣｐＧ  ＤＮＡ；５’ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’；配列番号７）；ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）；ポリＩＣ（５０μｇ／ｍｌ）；Ｐａｍ３Ｃｙｓ（５μｇ／ｍｌ）；イオノマイシン／ＴＰＡ；次の、それぞれＤＯＴＡＰ（１０μｇ／２００μｌ培養ウェル）併用（「＋リポ」）および非併用のＲＮＡ分子：ＧＵＧＵＵＵＡＣ単独（ＲＮＡ１）；ＧＵＡＧＧＣＡＣ単独（ＲＮＡ２）；ＧＵＧＵＵＵＡＣとＧＵＡＧＧＣＡＣとの併用（ＲＮＡ１／２）；ＵＣＣＧＣＡＡＵＧＧＡＣＧＡＡＡＧＵＣＵＧＡＣＧＧＡ（ＲＮＡ６；配列番号８）；ＧＡＧＡＵＧＧＧＵＧＣＧＡＧＡＧＣＧＵＣＡＧＵＡＵＵ（ＲＮＡ９；配列番号９）；およびＲＮＡ１、ＲＮＡ２およびＲＮＡ１／２に対応する次のＤＮＡ分子：ＧＴＧＴＴＴＡＣ単独（ＤＮＡ１）；ＧＴＡＧＧＣＡＣ単独（ＤＮＡ２）；およびＧＴＧＴＴＴＡＣとＧＴＡＧＧＣＡＣとの併用（ＤＮＡ１／２）。これらのＲＮＡオリゴヌクレオチドは、それぞれ、末端から二番目と３’末端ヌクレオシドとの間にホスホロチオエート結合を有した。ＲＮＡ６は、リステリア・モノサイトゲネスから得られるリボソームＲＮＡステム・ループに相当する。ＲＮＡ９は、ヒト免疫不全ウイルス（ＲＮＡレトロウイルスのＨＩＶ）から得られるステム・ループに相当する。これらの細胞を１２時間培養し、上清を採取した。マウスＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−６、およびＴＮＦ−αは、ＢＤ−ファーミンゲン社（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のマッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）抗体ペアを用い、このメーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡにより測定した。
【０３４３】
図６のパネルＡから明らかなように、ＩＦＮ−γ存在下の野性型マウス・マクロファージは、Ｒ−８４８；ＯＤＮ１６６８（ＣｐＧ  ＤＮＡ）；ＬＰＳ；ポリＩＣ；Ｐａｍ３Ｃｙｓ；およびＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴマーＧＵＧＵＵＵＡＣとＧＵＡＧＧＣＡＣとの併用（ＤＯＴＡＰ使用）に反応して、有意な量のＩＬ−１２ｐ４０を分泌する。これに対して、図６のパネルＢから明らかなように、ＩＦＮ−γ存在下のＭｙＤ８８欠損マクロファージは、検討した試験および対照薬剤のいずれに対してもＩＬ−１２ｐ４０分泌反応を全くといってよいくらい示さず、従って、これらの化合物に対する免疫賦活反応のＭｙＤ８８依存性が立証された。このような結果は、特に本発明のＧ、Ｕ含有ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むこれらの化合物の全てに対する免疫賦活反応にＴＬＲが関与していることと一致している。図６のパネルＣおよびＤから明らかなように、Ｊ７７４およびＲＡＷ２６４．７マウス・マクロファージ細胞株の反応パターンは、パネルＡに示した、ＩＦＮ−γ存在下の野性型マウス・マクロファージの場合に比し、やや減弱するものの、ほぼ同様であった。並行してＩＬ−６およびＴＮＦ−αを測定したＥＬＩＳＡでもほぼ同様な結果であった。
【０３４４】
ＭｙＤ８８野性型細胞を含む別の研究では、バフィロマイシンを添加すると、このＲＮＡオリゴマーの免疫賦活作用が大きく、または完全に阻害されることが観察された。この観察結果は、上記ＭｙＤ８８依存性と共に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９のうちの少なくとも１種が関与していることと一致している。
【０３４５】
（実施例６．陽イオン性脂質に代わるコレステリルエステルの使用）
ＲＮＡオリゴマー＋陽イオン性脂質の代わりにコレステリルエステルで修飾したＲＮＡを用いることができるかどうかを検討するために、３’コレステリルエステルで修飾したＲＮＡオリゴマーＧＵＧＵＧＵＧＵ（Ｒ１０５８）および修飾していない同ＲＮＡオリゴマー（Ｒ１００６）を調製した。ヒトＰＢＭＣの一夜培養液に、ＤＯＴＡＰ併用および非併用のこれら２種のＲＮＡオリゴマーをさまざまな濃度で加えた。その後、培養上清を採取し、ＢＤ−ファーミンゲン社（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のマッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）抗体ペアを用い、このメーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡによりヒトＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＩＦＮ−αを測定した。表１にはＤＯＴＡＰを含む実験の代表的な結果を示した。
【０３４６】
【表１】
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これらの結果から分かるように、コレステリルエステルで修飾したＲ１０５８は、ＤＯＴＡＰ併用および非併用の両方において、同一の塩基配列を有するがコレステロールを有しないＲ１００６よりも効力が優れている。
【０３４７】
（実施例７．オリゴマーの長さの影響）
ヒトＰＢＭＣの一夜培養液に、ＤＯＴＡＰ併用および非併用のＲＮＡオリゴマーＧＵＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＧＵ、ＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵ、ＧＵＧおよびＧＵをさまざまな濃度で加えた。その後、培養上清を採取し、ＢＤ−ファーミンゲン社（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のマッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）抗体ペアを用い、このメーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡによりヒトＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＩＦＮ−αを測定した。表２にはＤＯＴＡＰを含む実験の代表的な結果を示した。
【０３４８】
【表２】
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（実施例８．ヌクレオシド間結合の安定化の影響）
表２に示したように、特異的なホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合を有するＧＵＧＵＧＵＧＵ  ＲＮＡオリゴマーを合成した。表中、「＊」はホスホロチオエートを表し、「＿」はホスホジエステルを表す。ヒトＰＢＭＣの一夜培養液に、ＤＯＴＡＰ併用および非併用のＲＮＡオリゴマーをさまざまな濃度で加えた。その後、培養上清を採取し、ＢＤ−ファーミンゲン社（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のマッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）抗体ペアを用い、このメーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡによりヒトＴＮＦ−α、ＩＬ−１２ｐ４０、およびＩＦＮ−αを測定した。表３にはＤＯＴＡＰを含む実験の代表的な結果を示した。
【０３４９】
【表３】
0005608024.tif 000022
同様にして、ステム−ループ構造を形成することができ、５’−ＣＡＣＡＣＡＣＵＧＣＵＵＡＡＧＣＧＣＵＵＧＣＣＵＧＣＵＵＡＡＧＵＡＧＵＧＵＧＵＧ−３’（Ｒ１０４１；配列番号１０）で示される塩基配列を有する全ホスホジエステル４０−マーを合成し、ヒトＰＢＭＣを含む一夜培養液で試験した。このＲＮＡオリゴマーは、ＩＦＮ−α誘導能が極めて高く、ＥＣ５０値は０．１μＭ未満、最大濃度は５，０００ｐｇ／ｍｌであった。
【０３５０】
（実施例９．ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体）
それぞれＲＮＡ配列ＧＵＧＵＧＵＧＵおよびポリ−ｄＴもしくはポリ−ｄＧ配列を含む一連のＤＮＡ：ＲＮＡ結合体を調製した。これらのオリゴマーは下記の通りであり、この場合も「＊」はホスホロチオエートを表し、「＿」はホスホジエステルを表す。
【０３５１】
【化１９】
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ＤＯＴＡＰ併用および非併用の添加ＤＮＡ：ＲＮＡ結合体の存在下にヒトＰＢＭＣを一夜培養した。その後、培養上清を採取し、ＢＤ−ファーミンゲン社（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のマッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）抗体ペアを用い、このメーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡによりヒトＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＰ１０およびＩＦＮ−αを測定した。表４にはＤＯＴＡＰを含む実験の代表的な結果を示した。
【０３５２】
【表４】
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（実施例１０．転移ＲＮＡ）
麦芽、ウシ、酵母および大腸菌供給源から得られ、ＤＯＴＡＰ含有および非含有培養メジウムに添加された種々の濃度（１，３および１０μｇ／ｍｌ）のｔＲＮＡの存在下に、ヒトＰＢＭＣを一夜培養した。その後、培養上清を採取し、ＢＤ−ファーミンゲン社（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のマッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）抗体ペアを用い、このメーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡによりヒトＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２ｐ４０を測定した。ＤＯＴＡＰが存在する場合、酵母および大腸菌のｔＲＮＡ、および、程度はより低いがウシｔＲＮＡもＴＮＦ−αおよびＩＬ−１２ｐ４０を誘導した。さらに、３および１０μｇ／ｍｌの大腸菌は、ＤＯＴＡＰが存在しなくても両サイトカインを少量誘導した。
【０３５３】
（実施例１１．ＨＩＶ  ＲＮＡ）
２つの重要なＧ、Ｕ−リッチ配列、即ち、ＨＩＶ−１株ＢＨ１０のｎｔ  ９９〜１０８および１１２〜１２３に相当する５’−ＧＵＡＧＵＧＵＧＵＧ−３’（配列番号２）および５’−ＧＵＣＵＧＵＵＧＵＧＵＧ−３’（配列番号３）のいずれかと、それぞれＤＯＴＡＰの存在および非存在下に、ヒトＰＢＭＣを一夜培養した。その後、培養上清を採取し、ＢＤ−ファーミンゲン社（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のマッチド（ｍａｔｃｈｅｄ）抗体ペアを用い、このメーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡによりヒトＩＬ−１２ｐ４０およびＴＮＦ−αを測定した。表７には代表的な結果を示した。この図から明らかなように、これらのＲＮＡ分子は共に、ＤＯＴＡＰの存在下、マイクロモル濃度で５０〜１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦおよび５０〜２００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２  Ｐ４０を誘導した。
【０３５４】
（実施例１２．緊縮応答因子（Ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｆａｃｔｏｒ）に対するヒトＰＢＭＣの反応性）
細菌を饑餓させると、これらは、緊縮応答と呼ばれるプログラム化された応答を開始する。これは、核酸アラーモンおよびリボソーム・ロス（ｌｏｓｓ）の産生を伴う。速い速度で増殖している細菌は、その乾燥重量の５０％もの多くを占める７０，０００〜８０，０００個のリボソームを含有する。増殖が遅くなるにつれて、不要なリボソームは加水分解される。初期の静止相で急速に増殖している細胞は大量のオリゴヌクレオチドを含有しており、これらは、細胞を中性のｐＨ環境に置くと、メジウム中に放出されると想定されている。
【０３５５】
図１０は、緊縮応答因子（ＳＲＦ）に対するヒトＰＢＭＣの反応性を示すものである。ＳＲＦは、富栄養培地で後期対数相まで急速に増殖を続けている細菌（この場合、リステリア・モノサイトゲネス）によって産生される。細菌は、沈殿させた後、等容量のＰＢＳ中で２４時間再懸濁した。この混液を遠心することにより、この細菌を除去する。上清は、０．２μｍフィルターを通すことによって滅菌する。滅菌した溶液は、１０ｋＤａのカットオフを有する分子フィルターを通した。このフラクションは、Ｃ１８カラムで分離し、得られた溶出物質を試験に用いた。ＳＲＦは、５μｇ／ｍｌの濃度でヒトＰＢＭＣからＴＮＦを誘導した。ＳＲＦは３種のＲＮＡ分解酵素の中のどれで処理しても、その活性は消失した。ＲＮＡ分解酵素処理したＳＲＦはほぼバックグラウンドの免疫賦活性を有していたので、その活性は、ＲＮＡ以外の物質によるものではなかった。即ち、このことから、活性はＲＮＡによるものであると示唆された。
【０３５６】
（実施例１３．リボヌクレオシド・バナジル錯体に対するヒトＰＢＭＣの反応性）
ＳＲＦの研究中、驚いたことに、ＲＮＡ分解酵素阻害剤リボヌクレオシド・バナジル錯体（ＲＶＣ）がヒトＰＢＭＣを賦活化してＴＮＦ（図１１）およびＩＬ−６を産生させることが明らかになった。
【０３５７】
図１１は、リボヌクレオシド・バナジル錯体（ＲＶＣ）に対するヒトＰＢＭＣの反応性を示したものである。ＲＮＡ分解酵素阻害剤の試験中、意外なことに、ＲＶＣがヒトＰＢＭＣに対して賦活性であることを発見した。２ｍＭのＲＶＣが大量のＴＮＦの放出を誘起した。また、Ｘで表した抗ウイルス性イミダゾキノリン、レシキモッド（Ｒ−８４８）についても、０．１μｇ／ｍｌを用いて試験した。
【０３５８】
（実施例１４．リボヌクレオシドに対するヒトＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８の反応性）
実施例１３の知見は、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８を用いて遺伝的に再構成した２９３細胞にも適用することができたが、形質転換しなかった２９３細胞には適用できなかった（図１２）。個々のリボヌクレオシド・バナジル錯体について解析中に、意外にも、リボヌクレオシドＡ、Ｕ、ＣおよびＧの混合物もしくは単一リボヌクレオシドＧは、バナデートの非存在下で、ＰＢＭＣを賦活化してＴＮＦおよびＴＬＲ７もしくはＴＬＲ８を産生させ、ＮＦ−κＢを活性化するのに有効であることが明らかになった（図１２）。
【０３５９】
図１２は、リボヌクレオシドに対するヒトＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８の反応性を示したものである。ＲＮＡもしくはＲＶＣに対するヒトＰＢＭＣの反応がＴＬＲ７もしくはＴＬＲ８によって媒介されること、またさらに、この反応がリボヌクレオシドのみによって起こさせることができることが明らかとなった。ヒト２９３細胞は、擬似的に形質転換するか、ヒトＴＬＲ７もしくはヒトＴＬＲ８を用いて形質転換し、リボヌクレオシドに対する反応性を観察した。ヒトＴＬＲ７（ｈＴＬＲ７）およびヒトＴＬＲ８（ｈＴＬＲ８）の読み取り枠は、次のプライマー対：ＴＬＲ７に対して５’−ＣＡＣＣＴＣＴＣＡＴＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１５）および５７−ＧＣＴＡＧＡＣＣＧＴＴＴＣＣＴＴＧＡＡＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号１６）；ならびにＴＬＲ８に対して５’−ＣＴＧＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＡＣＧＧＡＡＴＧ−３’（配列番号１７）および５’−ＧＣＧＣＧＡＡＡＴＣＡＴＧＡＣＴＴＡＡＣＧＴＣＡＧ−３’（配列番号１８）を用いて、ＰＢＭＣのｃＤＮＡライブラリからＰＣＲにより増幅させた。プライマー選択のための配列情報は、ジェンバンク登録（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号ＡＦ２４０４６７およびＡＦ２４５７０３から入手した。完全長のＴＬＲ断片は全て、ｐＧＥＭ−Ｔイージー・ベクター（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）中にクローニングし、ＮｏｔＩで切り取り、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）、ドイツ）中にクローニングした後、配列決定を行った。ｈＴＬＲ７およびｈＴＬＲ８のコーディング領域の配列は、それぞれ、上記登録番号ＡＦ２４０４６７（配列番号２５）およびＡＦ２４５７０３（配列番号２９）に相当する。
【０３６０】
一時的なＮＦ−κＢ活性化について観察するために、２５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補った４００μｌのＲＰＭＩメジウム中で、担体として１μｇのＴＬＲ発現プラスミド、２０ｎｇのＮＦ−κＢルシフェラーゼレポータ−プラスミドおよび１４μｇのｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドを用い、２００ボルト、９６０μＦで３×１０６個の２９３ＨＥＫ細胞（ＡＴＴＣ、ＶＡ、ＵＳＡ）を電気穿孔した。細胞は、ウェル当たり１０５個を接種し、一夜培養後、Ｒ−８４８（図１２ではＸで表示；ＧＬシンセシス社（ＧＬＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．）、ウースター（Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ）、ＭＡ、米国で市販用に合成されたもの）、ＲＶＣもしくはリボヌクレオシドを用い、さらに７時間賦活化した。賦活化した細胞は、レポータ・リシスバッファー（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）を用いて溶解し、このライセートのルシフェラーゼ活性をベルトール（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）照度計（ヴィルバード（Ｗｉｌｂａｄ）、ドイツ）により測定した。
【０３６１】
図１２に示したように、ＴＬＲ形質移入体はＲ−８４８、ＲＶＣ、リボヌクレオシド（０．５ｍＭのＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕ）混合物、およびリボヌクレオシド・グアノシンに対して反応した。さらに、ＴＬＲ８も同様な反応パターンを示した。
【０３６２】
（実施例１６．２種のリボヌクレオシドの混合物に対するＴＬＲ７およびＴＬＲ８の反応性）
図１３は、２種のリボヌクレオシドの混合物に対するＴＬＲ７およびＴＬＲ８の反応性を示したものである。図１１の場合と同様に実験を行った結果、ＴＬＲ８はリボヌクレオシドＧおよびＵの併用に対して最大の反応を示すが、ＴＬＲ７はＧ単独に対して最大の反応を示すことが明らかになった。これらのデータから、適正な組成のリボヌクレオシドはＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドとなることが示された。ＴＰＡの非特異的な賦活は、対照となるに過ぎない。
【０３６３】
（実施例１７．ヒトＰＢＭＣはリボヌクレオシドＧおよびＵの混合物に対して反応する。）
図１４は、リボヌクレオシドＧおよびＵの混合物に対するヒトＰＢＭＣの反応を示したものである。リボヌクレオシドＧおよびＵは相乗的に作用してヒトＰＢＭＣからＴＮＦを誘導することが明瞭に理解できよう。この実施例では、Ｇ：Ｕの比率は１：１０が最適であった。
【０３６４】
（実施例１８．ヒトＰＢＭＣはＧ、Ｕ−リッチ・オリゴヌクレオチドに反応する。）
図１５は、ヒトＰＢＭＣがＲＮＡ  Ｇ、Ｕ−リッチ・オリゴヌクレオチドに対してどの程度反応するかを示したものである。ＲＮＡおよびＤＮＡオリゴヌクレオチド５’−ＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧ−３’（配列番号１および１９）は共に、ヒトＰＢＭＣに対し、３０ｍＭを用いて試験し、ＴＮＦを測定した。ヒトＰＢＭＣはＧ、Ｕ−リッチＲＮＡオリゴヌクレオチドに反応したが、Ｇ、Ｕ−リッチＤＮＡオリゴヌクレオチドには反応しなかった。
【０３６５】
（実施例１９．ヒトＰＢＭＣは酸化ＲＮＡに反応する。）
図１６は、酸化ＲＮＡに対するヒトＰＢＭＣの反応を示したものである。大腸菌からリボソーム１６Ｓ  ＲＮＡを単離し、これに化学的に酸化処理をおこなった。この処理は、（修飾Ａ）０．２ｍＭアスコルビン酸＋０．２ｍＭ  ＣｕＣｌ２、３７℃３０分もしくは（修飾Ｂ）  ０．２ｍＭアスコルビン酸＋０．０２ｍＭ  ＣｕＣｌ２、３７℃３０分とした。この処理によりグアノシンの８位が酸化され、また、この修飾グアノシンの３’に鎖切断が生じる。リボソームＲＮＡは、ヒトＰＢＭＣによるＴＮＦ産生を誘起することが示された。また、リボソームＲＮＡを酸化すると、反応が大きく増強されることは明白であった。
【０３６６】
（実施例２０．ヒトＴＬＲ７は酸化グアノシンリボヌクレオシドに対して反応する。）
図１７は、酸化グアノシンリボヌクレオシドに対するヒトＴＬＲ７およびＴＬＲ８の反応を示したものである。実施例１４の場合と同様にして擬似的に形質転換した細胞、またはヒトＴＬＲ７もしくはヒトＴＬＲ８を用い形質転換した細胞について、１ｍＭの７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン）に対する反応性を試験した。ヒトＴＬＲ７が７−アリル−８−オキソグアノシンに対して反応性であることは明白に示すことができる。従って、ＴＬＲ７のリガンドは酸化核酸であると思われる。
【０３６７】
（実施例２１．ヒトＴＬＲ７はその他の修飾グアノシンリボヌクレオシドに対して反応する。）
図１８は、その他の修飾グアノシンリボヌクレオシドに対するヒトＴＬＲ７の反応を示したものである。実施例１４の場合と同様にしてヒトＴＬＲ７で形質転換した細胞について、７−アリル−８−オキソグアノシン（ロキソリビン）に対する用量依存性反応の有無を試験した。さらに、他の修飾グアノシンについても試験した。ヒトＴＬＲ７が７−アリル−８−オキソグアノシンに対して用量依存性に反応したことは明白に示すことができる。前述のように、ヒトＴＬＲ７はグアノシンに対して反応性であったが、図１８は、ヒトＴＬＲ７がグアノシンのデオキシ型および８−ブロモ−グアノシンに対して軽度に反応したことも示すものである。
【０３６８】
（実施例２２．ヒトＴＬＲの分布）
図１９は、ヒトのＴＬＲ１〜ＴＬＲ９の分布を示したものである。種々の精製ヒト免疫細胞について、ＴＬＲ１〜９の発現をＰＣＲによりスクリーニングした。その結果、ヒト・リンパ系ＣＤ１２３＋樹状細胞（ＤＣ）はＴＬＲ９およびＴＬＲ７に関して強い陽性を示したが、ＴＬＲ８に関してはより弱い陽性を示した。しかしながら、骨髄ＣＤ１１ｃ＋ＤＣでは逆のことが認められた。このことは、これら２種のＤＣが免疫系において全く異なる機能を有しているので、極めて重要なことである。また、注目に値すべきなのは、図１９から明らかなように、ヒト好中球が、ヒトＴＬＲ８に関しては強い陽性を示したが、ＴＬＲ９では極めて弱く、ＴＬＲ７では陰性であったことである。このことも、好中球が感染性病原菌を結合する最初の細胞となる場合が非常に多く、従って反応を引き起こすと考えられているので、極めて重要なことである。
【０３６９】
（実施例２３．）
ＨＥＫ−２９３細胞は、ヒトＴＬＲ７もしくはヒトＴＬＲ８で安定的に形質転換することができた。さらに、この細胞は、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ・レポータ構築体（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）でも安定的に形質転換することができた。これらの細胞は、種々の量のＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて力価を判定した後、１６時間培養した。ルシフェラーゼ活性は、標準的な方法により測定し、擬似的に賦活した形質移入体に対して標準化した。擬似的に賦活した形質移入体の測定ルシフェラーゼ活性は、１倍ＮＦ−κＢ誘導の値に設定した。図２０に結果を示した。図では、ＲＮＡオリゴヌクレオチドでの賦活により誘導される古いＮＦ−κＢが試験リボヌクレオチドの濃度に対してプロットされている。ＧＵＧＵＧＵＧＵによる賦活化はヒトＴＬＲ８に対して示した。また、ＧＵＡＧＵＣＡＣによる賦活化はヒトＴＬＲ７およびヒトＴＬＲ８に対して示した。
【０３７０】
（均等）
上記明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本発明は、本発明は、示された実施例によって範囲が限定されるべきではない。何故なら、これらの実施例は本発明の一態様についてただ一つ例示するものであり、その他の機能的に均等な実施態様は本発明の範囲内にあるからである。本明細書で提示され、説明されたものに加えて、本発明を種々に修正できることは、当業者に明瞭に理解されるであろうし、そのような修正は、添付の特許請求の範囲に包含される。また、本発明の利益および目的は、必ずしも本発明の各実施態様によって包含されるものではない。
【０３７１】
本出願書において列記した文献、特許および公開特許公報は全て、全文引用により本明細書に組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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