(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコール酸、その誘導体または前駆体の発酵生産方法であって、炭素源を含んでなる適切な培養培地中で大腸菌株を培養し、培養培地からグリコール酸を回収することを含んでなり、
大腸菌株が、次の遺伝子：
−  リンゴ酸シンターゼをコードするａｃｅＢ
−  第二のリンゴ酸シンターゼをコードするｇｌｃＢ、および
−  グリオキシル酸カルボリガーゼをコードするｇｃｌ
の発現を減衰させることにより、グリオキシレートのグリコレート以外の産物への変換を減衰させるように改変され、かつ
大腸菌株が、グリオキシレートのグリコレートへの変換を触媒するＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸還元酵素をコードするｙｃｄＷ遺伝子を発現し、その発現が増加されている、方法。
【請求項２】
大腸菌株が、２-ケト-３-デオキシグルコン酸６-リン酸アルドラーゼをコードするｅｄａ遺伝子の発現を減衰させるようにさらに改変された、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
大腸菌株が、実質的にグリコレートを代謝することができないように改変された、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
グリコレート代謝に関わる次の遺伝子、
−  グリコール酸酸化酵素をコードするｇｌｃＤＥＦ、
−  グリコルアルデヒド脱水素酵素をコードするａｌｄＡ、
から選択される少なくともひとつの遺伝子の発現が減衰された、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
大腸菌株が、グリオキシル酸経路の流れを増加させるように形質転換された、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
イソクエン酸脱水素酵素の活性が減衰された、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
次のうち少なくとも一つの遺伝子の発現が減衰された、請求項５に記載の方法：
−  ホスホトランスアセチラーゼをコードするｐｔａ
−  酢酸キナーゼをコードするａｃｋ、
−  ピルビン酸酸化酵素をコードするｐｏｘＢ。
【請求項８】
ａｃｅＡの活性を増加させることによりグリオキシル酸経路の流れが増加された、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ｉｃｌＲまたはｆａｄＲの発現を減衰させることによりａｃｅＡの発現が増加された、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ａｃｅＡ遺伝子の上流に人工プロモーターを導入することによりａｃｅＡの発現が増加された、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＡＤＰＨの供給が増加された、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
次の遺伝子、
−  グルコース-６-リン酸イソメーラーゼをコードするｐｇｉ
−  可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈＡ
−  ホスホグルコン酸脱水酵素をコードするｅｄｄ
から選択される少なくともひとつの遺伝子の発現が減衰された、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
炭素源が、グルコース、スクロース、単糖類もしくはオリゴ糖類、またはデンプンの少なくとも１つである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
下記工程を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載されたグリコレートの発酵調製方法：
ａ）グリコレート生産する大腸菌株の発酵工程
ｂ）細菌または培地中におけるグリコレートの濃縮工程、および
ｃ）最終産物中に、場合によっては一部または全量（０〜１００％）残存している発酵培養液および／またはバイオマスからのグリコール酸の単離工程。
【請求項１５】
グリコレートが、少なくともグリコレートの二量体に重合する工程を通して単離される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
グリコレートが、グリコレートの二量体、オリゴマーおよび／またはポリマーからの脱重合によって回収される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項で定義された大腸菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好気的に生育する微生物による発酵性炭素源のグリコール酸への生物変換のプロセスを含む。
【背景技術】
【０００２】
グリコール酸（ＨＯＣＨ２ＣＯＯＨ）は、カルボン酸のα−ヒドロキシ酸ファミリーの一番目のメンバーである。グリコール酸は、極めて小さい分子に、アルコールとやや強酸の官能基を有し二重機能性をもつ。これは、典型的な酸およびアルコール化学に加えて独特の化学的性質をもたらす。
【０００３】
グリコール酸はヒドロキシ基とカルボン酸基を共に用い、多価金属と五員環錯体（キレート）を形成する。この金属イオン錯化能は強固な水垢の溶解および腐敗の防止、特に優れたすすぎ性が重要な要素である酸洗浄の用途において有用である。グリコール酸は有機アルコールおよび酸と反応し、エステルを生成する。低分子量アルキルグリコール酸エステルは、独特の溶媒の性質を有し、ｎ−プロパノールおよびイソプロパノール、エチレンジアミン、フェノール、メタクレゾール、酢酸２−エトキシエチル、および乳酸エチルおよび乳酸メチルの代替品として使用され得る。高分子量アルキルエステルは、パーソナルケア製品の成分に使用され得る。グリコール酸はそれ自身と反応して、二量体グリコリド、頭−尾ポリエステルオリゴマーおよび長鎖ポリマーを形成し得る。乳酸のような他のα−ヒドロキシ酸と、共重合体が作られ得る。ポリエステルポリマーは、水性の環境で制御可能な速度で、徐々に加水分解する。この性質は、溶解性縫合のような生物医学応用および、ｐＨを下げる為に酸の制御された放出が必要とされる用途において有用である。現在、年間一万五千トンを超えるグリコール酸が、米国で消費されている。
【０００４】
図１に示されているグリコール酸の生物学的生産は、中間体としてグリオキシレート（glyoxylate）の形成を必要とし、グリオキシレートは、遺伝子ｙｃｄＷ（Nunez et al, (2001) Biochemistry, 354, 707-715）にコードされるＮＡＤＰＨ依存性酸化還元酵素によって、グリコレート（glycolate）に還元される。グリオキシレートはグリオキシル酸回路の中間体である（Tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypass, reviewed in Neidhardt, F. C. (Ed. in Chief), R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanik, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (eds). 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology）。この回路において、ａｃｅＡ遺伝子にコードされるイソクエン酸リアーゼによって触媒される反応で、イソシトレート（isocitrate）は、スクシネート（succinate）とグリオキシレートに分割される。スクシネートはクエン酸回路に直接入っていき、オキサロアセテート（oxaloacetate）に変換される。グリオキシレートは、ａｃｅＢおよびｇｃｌＢにコードされる２つのリンゴ酸シンターゼイソ酵素によって触媒される反応で、アセテート（acetate）由来のアセチルＣｏＡの分子を組み込むことによってマレート（malate）に変換される。炭素がグリオキシル酸短絡回路（glyoxylate shunt）に入ることにより、転写レベルおよび転写後レベルが制御される。転写制御はＩｃｌＲリプレッサーによってａｃｅＢＡＫオペロン上に作用する。ＡｃｅＢＡＫはリンゴ酸シンターゼ、イソクエン酸リアーゼ、およびイソクエン酸キナーゼ／ホスファターゼをそれぞれコードする。ｉｃｌＲ遺伝子は負に自己制御され、ＦａｄＲタンパク質によって活性化される。ｉｃｄ遺伝子にコードされているイソクエン酸脱水素酵素（isocitrate dehydrogenase）の活性は、転写後に制御されている。イソクエン酸脱水素酵素およびイソクエン酸リアーゼは、共通の基質であるイソシトレートについて競合している。イソシトレートに対するＫｍ値はイソクエン酸リアーゼ反応に対して著しく高いので、グリオキシル酸回路へ入るか否かは、部分的にイソクエン酸脱水素酵素の制御に依存する。イソクエン酸脱水素酵素活性はＡｃｅＫによって触媒されるそのリン酸化または脱リン酸化によって調節される。リン酸化はＩｃｄの活性を減じ、脱リン酸化はＩｃｄ酵素を再活性化する。ＡｃｅＫがキナーゼとして働くかホスファターゼとして働くかは、いくつかの代謝産物の存在に依る。イソシトレートおよび３−ホスホグリセレートの除去はキナーゼ活性を刺激し、ピルベート（pyruvate）およびＡＭＰの存在はキナーゼ機能を阻害する、つまりホスファターゼ活性に好ましい（Ｎｅｉｄｈａｒｄも参照）。グリオキシレートは、ｇｃｌにコードされるグリオキシル酸カルボリガーゼによってタルトロン酸セミアルデヒドに、ｅｄａでコードされる２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼによって２−ケト−４−ヒドロキシグルタレートに変換される。一方で、グリコレートは、ａｌｄＡによってコードされるＮＡＤ＋依存性グリコアルデヒド脱水素酵素によってグリコアルデヒドに還元されるか、またはｇｌｃＤＥＦによってコードされるＮＡＤ＋依存性グリコール酸酸化酵素によってグリオキシレートに酸化され得る。
【０００５】
本発明によって解決すべき課題は、グルコースおよび他の糖類のような安価な炭素基質からのグリコール酸の生物学的生産である。生化学的工程の数および代謝経路の複雑さは、グリコール酸生産の工業的に実用可能なプロセスにとって、代謝的に組み換られた全細胞触媒の使用を必要とする。
【発明の開示】
【０００６】
出願人は、記載された問題を解決し、本発明は、発酵性炭素源をグリコール酸に直接的に生物転換する方法を提供する。グルコースがモデル基質として用いられ、組み換え大腸菌がモデル宿主として用いられる。この発明の一つの局面において、リンゴ酸シンターゼ（ａｃｅＢおよびｇｌｃＢ）、グリオキシル酸カルボリガーゼ（ｇｃｌ）および２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）をコードする遺伝子を不活性化することによって、グリオキシレートをグリコレート以外の化合物に代謝不可能な組み換え大腸菌が構築される。他の局面では、ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸還元酵素活性が、ｙｃｄＷまたはｙｉａＥなどをコードする内在性の遺伝子を用いて、毒性のあるグリオキシレートをグルコレートに還元するのに用いられる。本発明の更なる局面では、グリコレートを代謝する酵素、グリコール酸酸化酵素（ｇｌｃＤＥＦ）およびグリコルアルデヒド脱水素酵素（ａｌｄＡ）をコードする遺伝子が欠失される。更に、グリオキシル酸回路の流れは、ｉ）ｉｃｌＲ遺伝子を不活性化することまたは直接ａｃｅＡの発現を増加させることによりａｃｅＡのレベルを増加させること、ｉｉ）イソクエン酸脱水素酵素（ｉｃｄ）をコードしている遺伝子の発現レベルを減少させるまたは不活性化すること、およびｉｉｉ）ピルビン酸酸化酵素（ｐｏｘＢ）および酢酸経路（ａｃｋ、ｐｔａ）をコードする遺伝子を不活性化すること、によって増加される。該発明の最後の局面では、グリコレート生産のより良い収率が、グルコース-６-リン酸イソメーラーゼ（ｐｇｉ）、６-ホスホグルコン酸脱水酵素（ｅｄｄ）、および可溶性トランスヒドロゲナーゼ（ｕｄｈＡ）をコードする遺伝子を不活性化することによってＮＡＤＰＨの供給（availability）を増加することによって得られる。本発明は、一般的に、アセチルＣｏＡに容易に変換されるいかなる炭素基質も包含し適応され得る。
【０００７】
従って、本発明の目的は、グリコール酸の生産に有用な組み換え生物を提供することであって、（ａ）少なくとも、リンゴ酸シンターゼ（malate synthases）、グリオキシル酸カルボリガーゼ（glyoxylate carboligases）および２-ケト-３-デオキシグルコン酸６-リン酸アルドラーゼ（2-keto-3-deoxygluconate 6-phosphate aldolase）をコードする遺伝子のすべての不活性化、（ｂ）ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸還元酵素（NADPH dependent glyoxylate reductase）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも一つの遺伝子、および（ｃ）少なくとも、ＮＡＤ＋依存のグリコレートのグリオキシレートへの酸化をコードする遺伝子の不活性化、を含んでなる。場合によっては、組み換え生物は、ｉ）（ａ）グリオキシル酸経路のリプレッサーをコードする遺伝子、（ｂ）グルコース-６-リン酸イソメーラーゼ（glucose-6-phosphate isomerase）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（ｃ）可溶性トランスヒドロゲナーゼ（soluble transhydrogenase）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（ｄ）６−ホスホグルコン酸脱水酵素（6-phosphogluconate dehydratase）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（ｅ）ホスホトランスアセチラーゼ（phospho-transacetylase）および酢酸キナーゼ（acetate kinase）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子、（ｆ）ピルビン酸酸化酵素（pyruvate oxidase）活性をコードする遺伝子、（ｇ）グリコルアルデヒド脱水素酵素（glycoaldehyde dehydrogenase）活性をコードする遺伝子からなる群から選ばれる内在性遺伝子における変異の不活性化、ｉｉ）イソクエン酸リアーゼ（isocitrate lyase）をコードする遺伝子の増加したレベル、およびｉｉｉ）イソクエン酸脱水素酵素（isocitrate dehydrogenase）活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の減少したレベルもしくは不活性化、を含み得る。
【０００８】
他の態様において、本発明は、組み換え生物からグリコール酸を生産するためのプロセスを提供し、該プロセスは、本発明の組み換え生物と、単糖類、オリゴ糖類、多糖類および単一炭素基質からなる群から選ばれた少なくともひとつの炭素源とを接触させる工程を含み、それによって、グリコレートが生産され；場合によっては、（ｂ）少なくともグリコール酸の二量体に重合する工程を通して（ａ）において生産されたグリコール酸を回収する工程、および（ｃ）グリコール酸の二量体、オリゴマーおよび／またはポリマーから脱重合によるグリコール酸の回収、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
この明細書に組み込まれその一部となっている付属の図は、本発明を例示し、説明と共に、本出願の原理を説明する。
【００１０】
【図１】図１は、炭水化物からのグリコール酸生産系の進行における、解糖、 ＴＣＡ回路およびグリオキシル酸経路の遺伝子組み換えを示す。
【図２】図２は、ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷベクターの構築を示した図である。
【本発明の詳細の説明】
【００１１】
ここで使用されているように、次の語は、本請求項および明細書の解釈に用いられる。
【００１２】
「突然変異株」という語は野生型でない株を意味する。
【００１３】
「微生物」という語は、細菌のような原核生物および酵母のような真核生物を含むすべての種類の単細胞生物を意味する。細菌としては、特に、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ストレプトマイセス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）およびコリネバクテリア科（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）が挙げられる。腸内細菌科は、特に、エシュリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属およびパントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００１４】
「形質転換」または「トランスフェクション（transfection）」という語は、外来の核酸を組み込んだ後、細胞中における新規の遺伝子の取得を意味する。「形質転換体」という語は形質転換の産物を意味する。「遺伝学的に改変された」という語は、形質転換または突然変異によって遺伝因子を変える操作を意味する。
【００１５】
「減衰（attenuation）」という語は、遺伝子の減少した発現または遺伝子産物であるタンパク質の減少した活性を意味する。当業者は、これら結果を得るための数多くの手段を知っており、例えば、
−  遺伝子への変異の導入、該遺伝子の発現レベルまたはコードされたタンパク質の活性レベルを減少させること、
−  その遺伝子の本来のプロモーターの低い強度のプロモータへの置換、その結果の低い発現、
−  対応するメッセンジャーＲＮＡまたはタンパク質を不安定化する要素の使用
−  発現しないことが必要であれば、遺伝子の欠失、
である。
【００１６】
「発現」という語は、遺伝子からその遺伝子の産物であるタンパク質への転写および翻訳を意味する。
【００１７】
「プラスミド」または「ベクター」という語は、細胞の中心的代謝の一部でない遺伝子を多くの場合有し、通常、環状の二重鎖ＤＮＡ分子の形である染色体外要素を意味する。
【００１８】
「炭素基質（carbon substrate）」または「炭素源」は、微生物によって代謝され得る任意の炭素源を意味する。その基質はすくなくともひとつの炭素原子を含む。出願人は、特に再生可能で、安価な、発酵性の炭素源を指している。例えば、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、単一炭素基質およびグリセロールのようなポリオールが挙げられる。単一炭素基質は、メタノールのように炭素原子をひとつのみ含む炭素分子として定義される。一般式（ＣＨ２Ｏ）ｎの単糖類は、オース類（oses）または「単純糖質」とも呼ばれる。単糖類は、サッカロース、フルクトース、グルコース、ガラクトースおよびマンノースを含む。二つ以上の単糖類を含む他の炭素源は、二糖類、三糖類、オリゴ糖類および多糖類と呼ばれる。二糖類は、サッカロース（スクロース）、ラクトースおよびマルトースを含む。デンプンおよびヘミセルロースは、多糖類であり、「複合糖質」としても知られている。故に「炭素源」という語は上記のいかなる物質およびそれらの混合物も意味する。
【００１９】
「ＡＴＣＣ」という語は、American Type Culture Collection, 12301 ParklawnDrive, Rockville, Md. 20852, U.S.Aを表す。
【００２０】
「グリオキシレート(glyoxylate)」と「グリオキシル酸(glyoxylic acid)」は互換的に用いられる。
【００２１】
「グリコレート(glycolate)」と「グリコール酸(glycolic acid)」は互換的に用いられる。
【００２２】
本発明の説明において、酵素は、その特異的な活性によって同定される。すなわち、この定義は、他の生物、より具体的には他の微生物でも存在する、定義された特異的活性を有するすべてのポリペプチドを包含する。多くの場合、類似の活性を有する酵素は、ＰＦＡＭまたはＣＯＧで定義されるある種のファミリーへの分類によって同定される。
【００２３】
ＰＦＡＭ（アライメントおよび隠れマルコフモデルのタンパク質ファミリーデータベース、http ://www. Sanger.ac.uk/Software/Pfam/）は、タンパク質配列アライメントの膨大なコレクションである。各々のＰＦＡＭによって、多数から成るアライメントを視覚化したり、タンパク質ドメインを見たり、生物での分布を評価したり、他のデータベースへのアクセスを獲得したり、既知のタンパク質の構造を視覚化することが可能になる。
【００２４】
ＣＯＧｓ（タンパク質の相同分子種グループのクラスター、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）は、配列が完全に解読された４３のゲノムのタンパク質配列を比較することによって得られ、３０の主要な系統学的系列を表している。各々のＣＯＧは、少なくとも三つの系統から定義され、前に保存されているドメインの同定を可能にする。
【００２５】
相同配列およびその相同性パーセント割合を同定する手段は当業者に周知であり、特に、BLASTプログラムを包含する。該プログラムは、そのウェブサイトで示された初期パラメータを用いて、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/から利用することができる。得られた配列は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）またはＭＵＬＴＡＬＩＮ（http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl）といったプログラムを使い、それらウェブサイトで示された初期パラメータを用いて、利用される（例えば、配列される）。
【００２６】
既知の遺伝子に対してＧｅｎＢａｎｋで示された参照資料を使って、当業者は、他の生物、細菌株、酵母、菌類、哺乳類、植物等で相当する遺伝子を決定することができる。この所定の作業は、他の微生物由来の遺伝子との配列アライメントを実行することによって決定され得る共通配列を用い、他の生物中の対応遺伝子をクローンするための縮重プローブを設計することで、有利に行われる。分子生物学のこれら所定の方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの論文（1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York）に記載されている。
【００２７】
本発明は、微生物を炭素源を含んでなる適切な培養培地中で培養し、培地からグリコール酸を回収することによって、グリコール酸、その誘導体または前駆体の発酵的生産の方法を提供する。
【００２８】
本発明の更なる態様は、微生物を、グリコレートの重要な前駆体であるグリオキシレートを消化する酵素をコードする遺伝子、リンゴ酸シンターゼをコードするａｃｅＢおよびｇｃｌＢ、グリオキシル酸カルボリガーゼをコードするｇｃｌ、および２−ケト−３−デオキシグルコン酸６−リン酸アルドラーゼをコードするｅｄａの減衰によって、グリコレートを生産することを除いて、低いグリオキシレート変換能を有するように改変する方法を提供する。
【００２９】
本発明のもう一つの態様において、微生物はグリオキシレートのグリコレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする少なくともひとつの遺伝子含む。
【００３０】
特に、ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸還元酵素をコードする遺伝子は、好気的条件下で、毒性のあるグリオキシレート中間体を毒性の低い最終産物のグリコレートに変換する為に存在する。該遺伝子は、外来性でも内在性でもよく、染色体上、あるいは染色体外で発現することができる。ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸還元酵素をコードする遺伝子は、大腸菌  ＭＧ１６５５のゲノムからｙｃｄＷまたはｙｉａＥに共通して取り出され得る。好ましい態様では、前記遺伝子の少なくともひとつの発現は増加する。必要に応じて、高レベルのＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸還元酵素活性は、当業者に知られている組み換えの方法によって導入され得るゲノム上のひとつまたは数コピーを用いることによって、染色体上に位置する遺伝子から取得することができる。染色体外の遺伝子に関して、その複製起点およびすなわち細胞内コピー数の点で異なる違ったタイプのプラスミドが使用され得る。それらは、極めて低い（tight）複製の低コピー数プラスミド（ｐＳＣ１０１、ＲＫ２）、低コピー数プラスミド（ｐＡＣＹＣ、ｐＲＳＦ１０１０）または高コピー数プラスミド（ｐＳＫ  ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ）に対応して、１〜５コピー、約２０コピー、最高５００コピーとして存在する。ｙｃｄＷまたはｙｉａＥ遺伝子は、誘導因子分子によって誘発される必要があるまたはその必要がないといった異なる強度を有するプロモーターを用いて発現される。例えば、プロモーターＰｔｒｃ、 Ｐｔａｃ、  Ｐｌａｃ、ラムダプロモータｃＩまたは当業者に知られている他のプロモーターが挙げられる。遺伝子の発現は、対応するメッセンジャーＲＮＡ（Carrier and Keasling (1998) Biotechnol. Prog. 15, 58-64）またはタンパク質（例、ＧＳＴタグ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を安定化する要素によってもまた引き上げられ得る。
【００３１】
本発明の更なる態様において、微生物は、実質的にグリコレートを代謝することができないように改変される。この結果は、グリコレートを消費する酵素をコードする遺伝子（グリコール酸酸化酵素をコードするｇｌｃＤＥＦ、およびグリコアルデヒド脱水素酵素をコードするａｌｄＡ）の少なくともひとつを減衰させることによって達成される。遺伝子の減衰は、低い強度のプロモーター、または対応するｍＲＮＡもしくはタンパク質を不安定化する要素で本来のプロモーターを置換することによって達成される。もし必要であれば、遺伝子の完全な減衰は、対応するＤＮＡ配列の欠失によっても達成される。
【００３２】
他の態様において、本発明の方法で用いられる微生物は、グリオキシル酸回路の流れを増加するように形質転換される。
【００３３】
グリオキシル酸経路の流れは様々な手段によって増加され、特に、
i) イソクエン酸脱水素酵素（Ｉｃｄ）の活性を減少させること、
ii)遺伝子の減衰によって、次の酵素の少なくともひとつの活性を減少させること
−ｐｔａ遺伝子にコードされるホスホトランスアセチラーゼ
−ａｃｋ遺伝子にコードされる酢酸キナーゼ
−ｐｏｘＢ遺伝子にコードされるピルビン酸酸化酵素
iii) ａｃｅＡ遺伝子にコードされるイソクエン酸リアーゼの活性を増加させること、
によって増加され得る。
【００３４】
イソクエン酸脱水素酵素のレベルを減少させることは、イソクエン酸脱水素酵素をコードするｉｃｄ遺伝子の発現を促進する人工的なプロモーターを導入すること、またはそのタンパク質の酵素活性を低下させるｉｃｄ遺伝子に変異を導入することによって達成し得る。
【００３５】
タンパク質Ｉｃｄの活性は、リン酸化によって低下するので、その活性は、野生型ＡｃｅＫ酵素と比較して増加したキナーゼ活性または減少したホスファターゼ活性を有する変異ａｃｅＫ遺伝子を導入することによって制御され得る。
【００３６】
イソクエン酸リアーゼの活性を増加することは、グリオキシル酸経路のリプレッサーをコードするｉｃｌＲまたはｆａｄＲ遺伝子のレベルを減衰させることによって、あるいは、例えば、遺伝子発現を促進させる人工的なプロモーターを導入したり、コードされたタンパク質の活性を増加させる変異をａｃｅＡに導入したりして、ａｃｅＡ遺伝子の発現を刺激することによって達成される。
【００３７】
本発明の態様は、ＮＡＤＰＨ依存グリオキシル酸還元酵素へのＮＡＤＰＨの供給を増加することによって、より優れたグリコレート生産の収率を提供する。この微生物の性質の改変は、次の遺伝子、グルコース-６-リン酸イソメーラーゼをコードするｐｇｉ、可溶性トランスヒドロゲナーゼをコードするｕｄｈＡおよび６-ホスホグルコン酸脱水酵素をコードするｅｄｄ、から選択される遺伝子の少なくともひとつを減衰することを通して獲得され得る。そのような遺伝子改変があれば、すべてのグルコース６−ホスファターゼはペントースリン酸経路を通して解糖に入らなければならなくなり、グルコース６−ホスファターゼが代謝される毎にふたつのＮＡＤＰＨが生産される。
【００３８】
本発明の他の態様において、組み換え生物からグリコール酸を発酵生産する為のプロセスを提供し、（ａ）本発明の組み換え生物とグルコース、スクロース、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、デンプンまたはその誘導体、グリセロールおよび単一炭素基質からなる群から選ばれた少なくともひとつの炭素源とを接触させる工程を含んでなり、それによって、グリコール酸が生産される。場合によっては、該プロセスは、細菌内または培地中でグリコレートを濃縮する工程および最終生産物中に場合によっては一部もしくは全量（０ないし１００％）残存している発酵培養液および／もしくはバイオマスからグリコール酸を単離する工程を含んでなる。場合によっては、該プロセスは、少なくともグリコール酸の二量体に重合する工程を通して工程（ａ）で生産されたグリコール酸を回収する工程および（ｂ）グリコール酸の二量体、オリゴマー、および／またはポリマーから脱重合によるグリコール酸の回収を含んでなる。
【００３９】
当業者であれば、本発明による微生物に用いられる培養条件を定義することができる。特に、細菌は２０°Ｃと５５°Ｃの間、好ましくは２５°Ｃと４０°Ｃの間の温度で、より具体的にＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは約３０°Ｃで、大腸菌は約３７°Ｃで発酵される。
【００４０】
発酵は、一般的に、少なくとも一つの単一炭素源および必要に応じて代謝物の生産に必要な補基質を含み、使用される細菌に調製された既知の所定の組成の無機培養培地中で、発酵槽において行われる。
【００４１】
本発明は、また、前述の微生物に関する。好ましくは、該微生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからなる群から選ばれる。
【００４２】
実施例１
グリコレートに還元することを除いて、グリオキシレートを代謝することができない株の構築：ＭＧ１６５５ ΔａｃｅＢ Δｇｃｌ ΔｇｌｃＢ
ａｃｅＢ遺伝子を欠失させるために、Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ＆  Ｗａｎｎｅｒ（２０００）に記載の相同的組み換え方法を用いる。この方法によって、関連する遺伝子のほとんどを欠失させる一方、クロラムフェニコールまたはカナマイシン耐性カセットの挿入が可能となる。この目的の為、次のオリゴヌクレオチドを用いる：
ＤａｃｅＢＦ  （配列番号１）
ggcaacaacaaccgatgaactggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttactgccgaagcggtagCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子ａｃｅＢ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）の配列（４２１３０６８〜４２１３１４７）に相同な領域（小文字）
−クロラムフェニコール耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
ＤａｃｅＢＲ  （配列番号２）
ggcggtagcctggcagggtcaggaaatcaattaactcatcggaagtggtgatctgttccatcaagcgtgcggcatcgtcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子ａｃｅＢ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）の配列（４２１４６４７〜４２１４５６９）に相同な領域（小文字）
−クロラムフェニコール耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
オリゴヌクレオチドＤａｃｅＢＦおよびＤａｃｅＢＲを、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたＰＣＲ産物を電気穿孔法により、ＭＧ１６５５株  （ｐＫＤ４６）に導入する。該菌株では発現したＲｅｄリコンビナーゼ酵素が相同性組み換えを可能にする。その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドａｃｅＢＦおよびａｃｅＢＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持した株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ：：Ｃｍと呼ぶ。
ａｃｅＢＦ  （配列番号３）  ： cgttaagcgattcagcaccttacc（４２１２８０７〜４２１２８３０の配列に相同）
ａｃｅＢＲ  （配列番号４）  ： ccagtttctgaatagcttcc（４２１５３２７〜４２１５３０８の配列に相同）
【００４３】
次に、ｇｃｌ遺伝子をＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ：：Ｃｍ株においてトランスダクション（transduction）によって欠失する。はじめに、ＭＧ１６５５  Δｇｃｌ：：Ｋｍ株を、次のオリゴヌクレオチドを用いて前記と同じ方法を使って構築する：
ＤｇｃｌＦ  （配列番号５）
ggcaaaaatgagagccgttgacgcggcaatgtatgtgctggagaaagaaggtatcactaccgccttcggtgttccgggagcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子ｇｃｌ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）の領域の配列（５３３１４２〜５３３２２４）に相同な領域（小文字）
−カナマイシン耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
ＤｇｉｐＲ  （配列番号６）
gcgttacgttttaacggtacggatccatccagcgtaaaccggcttccgtggtggtttggggtttatattcacacccaacccCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子ｇｃｌ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）の領域の配列（５３５７２０〜５３５６４０）に相同な領域（小文字）
−カナマイシン耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
オリゴヌクレオチドＤｇｃｌＦおよびＤｇｉｐＲをプラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたＰＣＲ産物を電気穿孔法により、ＭＧ１６５５株  （ｐＫＤ４６）に導入する。その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドｇｃｌＦおよびｇｉｐＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  Δｇｃｌ：：Ｋｍと呼ぶ。
ｇｃｌＦ  （配列番号７）  ： ggatatgcccaccttgctgaagg（５３２７９５〜５３２８１７の配列に相同）
ｇｉｐＲ  （配列番号８）  ： cgcttagtttcaatcggggaaatgg（５３６１１４〜５３６０９０の配列に相同）
【００４４】
Δｇｃｌ：：Ｋｍ欠失を転移する為に、ファージＰ１トランスダクションの方法を用いる。次のプロトコールは２段階で実施され、ＭＧ１６５５  Δｇｃｌ：：Ｋｍのファージ溶解物の調製と、それに続くＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ：：Ｃｍ株へのトランスダクションである。株の構築は上記の通りである。
ファージ溶解物Ｐ１の調製：
−  Ｋｍ５０μｇ／ｍｌ、０．２％グルコース、５ｍＭ塩化カルシウム入りの１０ｍｌのＬＢ培地中で一晩培養のＭＧ１６５５Δｇｃｌ：：Ｋｍ株の１００μｌを接種
−  ３７°Ｃで３０分間振盪しながら培養
−  １００μｌのＭＧ１６５５株で調製されたファージ溶解物Ｐ１の添加（約１．１０９ファージ／ｍｌ）
−  すべての細胞が溶解するまで３７°Ｃで３時間振盪
−  ２００μｌのクロロホルムの添加およびボルテックス
−  細胞残屑を除くために１０分間４５００ｇで遠心
−  上清を滅菌した試験管に移し、２００μｌのクロロホルムを添加
−  溶解物を４°Ｃで保存
トランスダクション
−  ＬＢ培地中で一晩培養のＭＧ１６５５ΔａｃｅＢ：：Ｃｍ株の５ｍｌを１０分間１５００ｇで遠心
−  細胞沈殿物を２．５ｍｌの１０ｍＭの硫化マグネシウム、５ｍＭの塩化カルシウムに懸濁
−  対照試験管：１００μｌの細胞、１００μｌのＭＧ１６５５Δｇｃｌ：：Ｋｍ株のファージＰ１
−  テスト試験管：１００μｌの細胞および１００μｌのＭＧ１６５５Δｇｃｌ：：Ｋｍ株のファージＰ１
−  ３０°Ｃで３０分間振盪せずに培養
−  各試験管に１００μｌの１Ｍのクエン酸ナトリウムの添加およびボルテックス
−  １ｍｌのＬＢの添加
−  ３７°Ｃで１時間振盪しながら培養
−  試験管を３分間７０００ｒｐｍで遠心した後、５０μｇ／ｍｌのＫｍ入りＬＢをディシュに薄く広げる
−  ３７°Ｃで一晩培養
株の検証
次に、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、遺伝子の欠失Δｇｃｌ：：Ｋｍを、前述のｇｃｌＦおよびｇｉｐＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ：：Ｃｍ  Δｇｃｌ：：Ｋｍと呼ぶ。
【００４５】
次に、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットを取り除くことができる。その後、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼをもつプラスミドｐＣＰ２０を、電気穿孔法により組み換え部位に導入する。一連の４２°Ｃ培養の後、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットの消失を、前述と同様のオリゴヌクレオチド（ａｃｅＢＦ／ａｃｅＢＲおよびｇｃｌＦ／ｇｉｐＲ）を用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌと呼ぶ。
【００４６】
トランスダクションによってＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ株においてｇｌｃＢ遺伝子が欠失される。
はじめに、ＭＧ１６５５  ΔｇｌｃＢ：：Ｋｍを、次のオリゴヌクレオチドを用いて前述と同様の方法を使用して構築する：
ＤｇｌｃＢＲ  （配列番号９）
cccagagccgtttacgcattgacgccaattttaaacgttttgtggatgaagaagttttaccgggaacagggctggacgcCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子ｇｌｃＢ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）の領域の配列（３１２１８０５〜３１２１７２７）に相同な領域（小文字）
−カナマイシン耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
ＤｇｌｃＢＦ  （配列番号１０）
cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccgaggaagattaaatcgctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子ｇｌｃＢ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列）の領域の配列（３１１９６６７〜３１１９７４５）に相同な領域（小文字）
−カナマイシン耐性カセット（参照配列はDatsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645）の増幅の為の領域（大文字）
オリゴヌクレオチドＤｇｌｃＢＦおよびＤｇｌｃＢＲを、プラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたＰＣＲ産物を、電気穿孔法により、ＭＧ１６５５株（ｐＫＤ４６）に導入する。その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドｇｌｃＢＦおよびｇｌｃＢＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔｇｌｃＢ：：Ｋｍと呼ぶ。
ｇｌｃＢＲ  （配列番号１１）  ： gccagcaaatggcgagtgc（３１２２２２５〜３１２２２０７の配列に相同）
ｇｌｃＢＦ  （配列番号１２）  ： cgcagagtatcgttaagatgtcc（３１１９４７５〜３１１９４９７の配列に相同）
【００４７】
ΔｇｌｃＢ：：Ｋｍ欠失を転移する為に、ファージＰ１トランスダクションの方法を用いる。株ＭＧ１６５５  ΔｇｌｃＢ：：Ｋｍのファージ溶解物の調製を、株ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌへのトランスダクションの為に用いる。
その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、遺伝子の欠失ΔｇｌｃＢ：：Ｋｍを前述のオリゴヌクレオチドｇｌｃＢＦおよびｇｌｃＢＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＢ：：Ｋｍと呼ぶ。
【００４８】
次に、カナマイシン耐性カセットを除き得くことができる。その後、カナマイシン耐性カセットのＦＲＴサイトに作用するＦＬＰリコンビナーゼをもつプラスミドｐＣＰ２０を電気穿孔法により組み換えサイトに導入する。一連の４２°Ｃでの培養の後、カナマイシン耐性カセットの消失を前述と同様のオリゴヌクレオチド（ｇｌｃＢＦおよびｇｌｃＢＲ）を用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＢと呼ぶ。
【００４９】
実施例２
ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸還元酵素の増加したレベルを有する株の構築：ＭＧ１６５５ ΔａｃｅＢ Δｇｃｌ ΔｇｌｃＢ  （ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷ）
ＮＡＤＰＨ依存性グリオキシル酸還元酵素のレベルを引き上げる為にｙｃｄＷ遺伝子をプラスミドｐＣＬ１９２０(Lerner & Inouye, 1990, NAR 18, 15 p 4631)からプロモーターＰｔｒｃを用いて発現する。低コピーベクターからの発現の為、プラスミドｐＭＥ１０１は次のように構築される。オリゴヌクレオチドＰＭＥ１０１ＦおよびＰＭＥ１０１Ｒを用いてプラスミドｐＣＬ１９２０をＰＣＲ増幅し、ｌａｃＩ遺伝子およびＰｔｒｃプロモーターをもつベクターＰＴＲＣ９９ＡからのＢｓｔ１７Ｉ-ＸｍｎＩ断片を増幅したベクターに挿入する。
ＰＭＥ１０１Ｆ  （配列番号１３）  ： Ccgacagtaagacgggtaagcctg
ＰＭＥ１０１Ｒ  （配列番号１４）  ： Agcttagtaaagccctcgctag
ｙｃｄＷ遺伝子を次のオリゴヌクレオチドを用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅する。
ＢｓｐＨＩ  ｙｃｄＷ  （配列番号１５）：
agctagctctcatgagaataaatttcgcacaacgcttttcggg
ＳｍａＩ  ｙｃｄＷ  （配列番号１６）：
gcatgcatcccgggtctctcctgtattcaattcccgcc
ＰＣＲ断片をＢｓｐＨＩおよびＳｍａＩで切断し、ＮｃｏＩおよびＳｍａＩ制限酵素で切断したベクターｐＭＥ１０１にクローンし、その結果、ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷプラスミドを生じる。
次いで、ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷプラスミドを、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＢに導入する。
【００５０】
実施例３
減少したグリコレート消費を有する株の構築：ＭＧ１６５５ ΔａｃｅＢ Δｇｃｌ ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ ΔａｌｄＡ  （ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷ）
トランスダクションによってＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ株においてｇｌｃＤＥＦＧＢ遺伝子が欠失される。
はじめに、ＭＧ１６５５  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ：：Ｋｍ株を、次のオリゴヌクレオチドを用いて前述と同様の方法を使用して構築する：
ＤｇｌｃＤＲ（配列番号１７）
gcgtcttgatggcgctttacccgatgtcgaccgcacatcggtactgatggcactgcgtgagcatgtccctggacttgagatccCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子ｇｌｃＤ(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の配列（３１２６０１６〜３１２５９３４）に相同な領域（小文字）
−クロラムフェニコール耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
ＤｇｌｃＢＦ（配列番号１８）
cgcgtaaacgccaggcgtgtaataacggttcggtatagccgtttggctgtttcacgccgaggaagattaaatcgctggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子ｇｌｃＢ(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の領域の配列（３１１９６６７〜３１１９７４５）に相同な領域（小文字）
−クロラムフェニコール耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
オリゴヌクレオチドＤｇｌｃＤＲおよびＤｇｌｃＢＦをプラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたＰＣＲ産物を、電気穿孔法により、ＭＧ１６５５株（ｐＫＤ４６）に導入する。該菌株では発現したＲｅｄリコンビナーゼ酵素によって相同性組み換えが可能となる。その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドｇｌｃＤＲおよびｇｌｃＢＦを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ：：Ｋｍと呼ぶ。
ｇｌｃＤＲ  （配列番号１９）  ：  ccaagacaaggtcacagagc（３１２６１８３〜３１２６１６４の配列に相同）
ｇｌｃＢＦ  （配列番号２０）  ：  cgcagagtatcgttaagatgtcc（３１１９４７５〜３１１９４９７の配列に相同）
【００５１】
欠失ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ：：Ｋｍを転移する為に、ファージＰ１トランスダクションの方法を用いる。株ＭＧ１６５５  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ：：Ｋｍのファージ溶解物の調製を株ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌへのトランスダクションの為に用いる。
その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、遺伝子の欠失ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ：：Ｋｍは前述のオリゴヌクレオチドｇｌｃＢＦおよびｇｌｃＤＲを用いてＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ：：Ｋｍと呼ぶ。
【００５２】
次に、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ：：Ｋｍ株においてトランスダクションによってａｌｄＡ遺伝子を欠失する。ＭＧ１６５５  ΔａｌｄＡ：：Ｃｍ株を、次のオリゴヌクレオチドを用いて前述と同様の方法を使用して構築する：
ＡｌｄＡ  Ｄ  ｒ  （配列番号２１）
ttaagactgtaaataaaccacctgggtctgcagatattcatgcaagccatgtttaccatctgcgccgccaataccggatttCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子ａｌｄＡ(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の配列（１４８７６１５〜１４８７６９５）に相同な領域（小文字）
−カナマイシン耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
ＡｌｄＡ  Ｄ  ｆ  （配列番号２２）
atgtcagtacccgttcaacatcctatgtatatcgatggacagtttgttacctggcgtggagacgcatggattgatgtggtaGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子ａｌｄＡ(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の配列（１４８６２５６〜１４８６３３６）に相同な領域（小文字）
−カナマイシン耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
オリゴヌクレオチドａｌｄＡＦおよびａｌｄＡＲを、プラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅するのに用いる。次いで、得られたＰＣＲ産物を電気穿孔法により、ＭＧ１６５５株（ｐＫＤ４６）に導入する。該菌株では発現したＲｅｄリコンビナーゼ酵素によって相同性組み換えが可能となる。次いで、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドＹｄｃＦＣｆおよびｇａｐＣＣＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株は、ＭＧ１６５５  ΔａｌｄＡ：：Ｃｍと呼ぶ。
ＹｄｃＦＣｆ  （配列番号２３）  ：  tgcagcggcgcacgatggcgacgttccgccg（１４８５７２２〜１４８５７５２の配列に相同）
ｇａｐＣＣＲ  （配列番号２４）  ：  cacgatgacgaccattcatgcctatactggc （１４８８１９５〜１４８８２２５の配列に相同）
【００５３】
欠失ΔａｌｄＡ：：Ｃｍを転移する為に、ファージＰ１トランスダクションの方法を用いる。株ＭＧ１６５５  ΔａｌｄＡ：：Ｃｍのファージ溶解物の調製を株ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ：：Ｋｍへのトランスダクションの為に用いる。
その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、遺伝子の欠失ΔａｌｄＡ：：Ｃｍを前述のオリゴヌクレオチドＹｄｃＦｃｆおよびｇａｐＣＣＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ：：Ｋｍ  ΔａｌｄＡ：：Ｃｍと呼ぶ。
【００５４】
次いで、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットを取り除くことができる。その後、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴサイトに作用するＦＬＰリコンビナーゼをもつプラスミドｐＣＰ２０を電気穿孔法により組み換えサイトに導入する。一連の４２°Ｃ培養の後、カナマイシンおよびクロラムフェニコール耐性カセットの消失を、先に使用したのと同様のオリゴヌクレオチド（ｇｌｃＢＦ／ｇｌｃＤＲおよびＹｄｃＦＣｆ／ｇａｐＣＣＲ）を用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡと呼ぶ。
その後、ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷプラスミドを、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ株に導入する。
【００５５】
実施例４
グリオキシル酸経路の流れが増加した株の構築：ＭＧ１６５５ ΔａｃｅＢ Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ ΔａｌｄＡ ΔｉｃｌＲ  （ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷ）
次のオリゴヌクレチドを用いて、前述と同じ方法を用いて、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡにおいてｉｃｌＲ遺伝子の欠失を導入する：
ＤｉｃｌＦ（配列番号２５）
CgcacccattcccgcgaaacgcggcagaaaacccgccgttgccaccgcaccagcgactggacaggttcagtctttaacgcgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子ｉｃｌＲ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列）の配列（４２２１２０２〜４２２１１２０）に相同な領域（小文字）
−カナマイシン耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
ＤｉｃｌＲ（配列番号２６）
gcgcattccaccgtacgccagcgtcacttccttcgccgctttaatcaccatcgcgccaaactcggtcacgcggtcatcggCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子ｉｃｌＲ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/上参照配列）の配列（４２２０３８６〜４２２０４６５）に相同な領域（小文字）
−カナマイシン耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
オリゴヌクレチドＤｉｃｌＦおよびＤｉｃｌＲをプラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたＰＣＲ産物を、電気穿孔法によってＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  （ｐＫＤ４６）株に導入する。その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットを下に定義されたオリゴヌクレオチドｉｃｌＦおよびｉｃｌＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ：：Ｋｍと呼ぶ。
ｉｃｌＦ  （配列番号２７）  ：  cctttgaggtcgcatggccagtcggc (４２２１５５８〜４２２１５３３の配列に相同)
ｉｃｌＲ  （配列番号２８）：gctttttaatagaggcgtcgccagctccttgcc (４２１９９１７〜４２１９９４９の配列に相同)。
【００５６】
その後、カナマイシン耐性カセットを取り除くことができる。次いで、カナマイシン耐性カセットのＦＲＴ部位に作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０は、電気穿孔法によって組み換え部位に導入される。一連の４２℃培養の後、カナマイシン耐性カセットの消失を、前に使用されたオリゴヌクレオチド（ｉｃｌＦおよびｉｃｌＲ）を用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲと呼ぶ。
その後、ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷプラスミドをＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲに導入する。
【００５７】
実施例５
ＮＡＤＰＨの供給が増加した株の構築：ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｉｃｌＲ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  Δｅｄｄ-ｅｄａ  （ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷ）
ｅｄｄ-ｅｄａ遺伝子はＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＢ  ΔｇｌｃＤＥＦ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ株においてトランスダクションによって欠失される。
最初に、ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ-ｅｄａ：：Ｃｍ株を、次のオリゴヌクレチドを用いて、前記と同様の方法を用いて構築する：
ＤｅｄｄＦ  （配列番号２９）
CgcgcgagactcgctctgcttatctcgcccggatagaacaagcgaaaacttcgaccgttcatcgttcgcagttggcatgcggTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−遺伝子ｅｄｄ-ｅｄａ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列）の領域の配列（１９３２５８２〜１９３２５００）に相同な領域（小文字）
−クロラムフェニコール耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
ＤｅｄａＲ  （配列番号３０）
gcttagcgccttctacagcttcacgcgccagcttagtaatgcggtcgtaatcgcccgcttccagcgcatctgccggaaccCATATGAATATCCTCCTTAG
−遺伝子ｅｄｄ-ｅｄａ（ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列）の領域の配列（１９３０１４４〜１９３０２２３）に相同な領域（小文字）
−クロラムフェニコール耐性カセット（Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列）の増幅の為の領域（大文字）
オリゴヌクレチドＤｅｄｄＦおよびＤｅｄａＲをプラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたＰＣＲ産物を電気穿孔法によってＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）株に導入する。その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を下に定義されたオリゴヌクレオチドｅｄｄＦおよびｅｄａＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ-ｅｄａ：：Ｃｍと呼ぶ。
ｅｄｄＦ  （配列番号３１）  ：  Gggtagactccattactgaggcgtgggcg (１９３２９９６〜１９３２９６８の配列に相同). 
ｅｄａＲ  （配列番号３２）  ：  ccacatgataccgggatggtgacg (１９２９７５４〜１９２９７７７の配列に相同).
【００５８】
欠失Δｅｄｄ-ｅｄａ：：Ｃｍを転移する為に、前述のＰ１ファージトランスダクションの方法を用いる。ＭＧ１６５５  Δｅｄｄ-ｅｄａ：：Ｃｍ株のファージ溶解物の調製をＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ株へのトランスダクションの為に用いる。
その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、Δｅｄｄ-ｅｄａ：：Ｃｍ遺伝子の欠失を、オリゴヌクレオチドｅｄｄＦおよびｅｄａＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＢ  ΔｇｌｃＤＥＦ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ-ｅｄａ：：Ｃｍと呼ぶ。
【００５９】
次に、クロラムフェニコール耐性カセットを取り除くことができる。その後、クロラムフェニコール耐性カセットのＦＲＴサイトに作用するＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０を、エレクトロポレーションによって組み換えサイトに導入する。一連の４２℃培養の後、クロラムフェニコール耐性カセットの消失を、前記と同じオリゴヌクレオチド（ｅｄｄＦおよびｅｄａＲ）を用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ-ｅｄａと呼ぶ。
次に、ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷプラスミドを、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ-ｅｄａに導入する。
【００６０】
実施例６
ＮＡＤＰＨの供給が増加した株の構築：ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｉｃｌＲ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  Δｐｇｉ：：Ｃｍ  Δｅｄｄ-ｅｄａ  （ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷ）
次のオリゴヌクレチドを用い、前述と同様の方法を使って、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＢ  ΔｇｌｃＤＥＦ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ-ｅｄａにおいて、ｐｇｉ遺伝子の欠失を導入する：
ＤｐｇｉＦ  （配列番号３３）
ccaacgcagaccgctgcctggcaggcactacagaaacacttcgatgaaatgaaagacgttacgatcgccgatctttttgcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG 
−ｐｇｉ遺伝子(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur.fr/Colibri/に参照配列)の配列（４２３１３５２〜４２３１４３２）に相同な領域（小文字）
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域（大文字）
ＤｐｇｉＲ  （配列番号３４）
gcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgagctatcgtggctgctgatttctttatcatctttcagctctgCATATG AATATCCTCCTTAG
−ｐｇｉ遺伝子(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の配列（４２３２９８０〜４２３２９０１）に相同な領域（小文字）
−クロラムフェニコール耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域（大文字）
オリゴヌクレチドＤｐｇｉＦおよびＤｐｇｉＲをプラスミドｐＫＤ３からクロラムフェニコール耐性カセットを増幅する為に用いる。次いで、得られたＰＣＲ産物を電気穿孔法によってＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＢ  ΔｇｌｃＤＥＦ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ-ｅｄａ  （ｐＫＤ４６）株に導入する。その後、クロラムフェニコール耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を、下に定義されたオリゴヌクレオチドｐｇｉＦおよびｐｇｉＲを用いたＰＣＲ分析によって検証する。保持された株は、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＢ  ΔｇｌｃＤＥＦ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ-ｅｄａ  Δｐｇｉ：：Ｃｍと呼ぶ。
ｐｇｉＦ  （配列番号３５）  ： gcggggcggttgtcaacgatggggtcatgc (４２３１１３８〜４２３１１６７の配列に相同)
ｐｇｉＲ  （配列番号３６）  ： cggtatgatttccgttaaattacagacaag (４２３３２２０〜４２３３１９１の配列に相同).
次に、ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷプラスミドを、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｅｄｄ-ｅｄａ  Δｐｇｉ：：Ｃｍに導入する。
【００６１】
実施例７
ＮＡＤＰＨ供給が増加した株の構築：ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｉｃｌＲ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  Δｐｇｉ  Δｅｄｄ-ｅｄａ：：Ｃｍ  ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍ  （ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷ）
次のオリゴヌクレチドを用い、前述と同様の方法を使って、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｐｇｉ：：Ｃｍ  Δｅｄｄ-ｅｄａにおいてｕｄｈＡ遺伝子の欠失を導入する：
ＤｕｄｈＡＦ  （配列番号３７）
CCCAGAATCTCTTTTGTTTCCCGATGGAACAAAATTTTCAGCGTGCCCACGTTCATGCCGACGATTTGTGCGCGTGCCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG
−ｕｄｈＡ遺伝子(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の配列（４１５７５８８〜４１５７６６７）に相同な領域（太字）、
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域（下線文字） 
ＤｕｄｈＡＲ  （配列番号３８）
GGTGCGCGCGTCGCAGTTATCGAGCGTTATCAAAATGTTGGCGGCGGTTGCACCCACTGGGGCACCATCCCGTCGAAAGCCATATGAATATCCTCCTTAG
−ｕｄｈＡ遺伝子(ウェブサイトhttp ://genolist.pasteur. fr/Co libri/に参照配列)の配列（４１５８７２９〜４１５８６５０）に相同な領域（太字）、
−カナマイシン耐性カセット(Datsenko, K.A. & Wanner, B.L., 2000, PNAS, 97: 6640-6645に参照配列)の増幅の為の領域（下線文字）。
オリゴヌクレチドＤｕｄｈＡＦおよびＤｕｄｈＡＲをプラスミドｐＫＤ４からカナマイシン耐性カセットを増幅するのに用いた。次いで、得られたＰＣＲ産物を、電気穿孔法によってＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｐｇｉ：：Ｃｍ  Δｅｄｄ-ｅｄａ  （ｐＫＤ４６）株に導入した。その後、カナマイシン耐性形質転換体を選択し、耐性カセットの挿入を下に定義されたオリゴヌクレオチドｕｄｈＡＦおよびｕｄｈＡＲを用いて、ＰＣＲ分析によって検証する。保持された株を、ＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｐｇｉ：：Ｃｍ  Δｅｄｄ-ｅｄａ  ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍと呼ぶ。
ｕｄｈＡＦ  （配列番号３９）  ：  GATGCTGGAAGATGGTCACT (４１５７０８８〜４１５７１０８の配列に相同)
ｕｄｈＡＲ  （配列番号４０）  ：  gtgaatgaacggtaacgc (４１５９０７０〜４１５９０５２の配列に相同)。
次に、ｐＭＥ１０１-ｙｃｄＷプラスミドをＭＧ１６５５  ΔａｃｅＢ  Δｇｃｌ  ΔｇｌｃＤＥＦＧＢ  ΔａｌｄＡ  ΔｉｃｌＲ  Δｐｇｉ：：Ｃｍ  Δｅｄｄ-ｅｄａ  ΔｕｄｈＡ：：Ｋｍに導入する。
【００６２】
実施例８
三角フラスコにおけるグリコール酸生産株の発酵
初めに、株の性能を、４０ｇ／ｌのＭＯＰＳおよび１０ｇ／ｌのグルコースを補完し、ｐＨを６．８に調節した改良Ｍ９培地（Anderson, 1946, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32:120-128）を用いて、２５０ｍｌのバッフル付三角フラスコ培養で評価した。必要に応じて、スペクチノマイシンを、５０ｍｇ／ｌの濃度で加え、発現ベクターが存在する場合、その誘導の為に１００μｍのＩＰＴＧも又加えた。一晩の前培養を、約０．３のＯＤ６００  ｎｍで５０ｍｌ培養の接種の為に用いた。培養液は培養培地中においてグルコースが枯渇するまで、３０°Ｃ、４００ｒｐｍで振盪器で振盪する。培養の最後に、グルコースとグリコール酸を、分離のためにＢｉｏｒａｄ  ＨＰＸ  ９７Ｈカラムを、検出のために屈折計を用いて、ＨＰＬＣで分析した。
【００６３】
異なる株の性能比較を下表に示す（各値はｎ回の繰り返し実験の平均値）。実施例１に記載の株はいかなるグリコール酸生産も示さなかった。
【００６４】
【表１】
0005431149.tif 000002
【００６５】
実施例６および実施例７に記載の株が、２ｇ／ｌより高い滴定濃度（titer）、０．２ｇ／ｇより高い収率を有し、グリコール酸の最良生産株である。
【００６６】
実施例９
流加培養発酵槽におけるグリコール酸生産株の発酵
実施例６および実施例７に記載の株を、流加培養（fed batch）プロトコルを用いて、６００ｍｌ発酵槽における生産条件下で評価した。
【００６７】
試験管で第一の前培養を２．５ｇ／ｌのグルコースを補完したＬＢ培地で３０℃で行った。それに続いて、第二の前培養を４０ｇ／ｌのＭＯＰＳおよび１０ｇ／ｌのグルコースを補完した合成培地（フラスコ培養に用いたものと同様の培地）５０ｍｌを満たした５００ｍｌ三角フラスコにおいて、３０°Ｃで行った。第二の前培養を発酵槽の接種に用いた。
【００６８】
４０ｇ／ｌのグルコース、５０ｍｇ／ｌのスペクチノマイシン、１００μｍのＩＰＴＧを補完した２００ｍｌ合成培地を満たした発酵槽に初期吸光度約２で接種した。培養は攪拌しながら３０°Ｃで行い、通気は溶解酸素３０％を超える飽和率を維持するように調節した。ｐＨは塩基を添加することによって６．８に調節した。培養はグルコースが枯渇するまでバッチモードで行った。その時点で、硫化マグネシウム、オリゴ成分、スペクチノマイシンおよびＩＰＴＧを補完した５００ｇ／ｌのグルコース溶液を、培地中のグルコースの濃度が４０ｇ／ｌに戻るように加えた。グルコースが枯渇する毎に更なる添加を施した。
通常、発酵槽において、実施例７記載の株は、実施例６記載の株より良い生産能力を示した（グルコースからの収率０．２２ｇ／ｇ対０．１５ｇ／ｇ）。
【００６９】
実施例７記載の株を用いたグリコール酸生産のための発酵の典型的な時系列を下表に示す。
【００７０】
【表２】
0005431149.tif 000003
【００７１】
最終適定濃度は３１ｇ／ｌのグリコール酸で、グルコースに対する収率０．２２ｇ／ｇであった。
【図１】
0005431149.tif 000004
【図２】
0005431149.tif 000005