(57)【要約】  本発明の目的は、主として、新規なポリエチレングリコール誘導体、当該誘導体を含有する薬物担体、及び医薬を包含する当該薬物担体を含有する医薬組成物を提供することにある。  本発明は、下記一般式（Ｉ）で表されるポリエチレングリコール誘導体、当該誘導体と２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとを含有する薬物担体、及び当該薬物担体と医薬（好ましくは、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、オリゴ核酸）とを含有する医薬組成物に関するものである。【化５】2008096690.tif 000011  式（I）中、Ｒは炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。また、ｎは３０〜１５０の整数を表す。【選択図】なし
2008096690.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（I）で表されるポリエチレングリコール誘導体。
【化４】
2008096690.tif 000010
式（I）中、Ｒは炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。また、ｎは３０〜１５０の整数を表す。
【請求項２】
ポリエチレングリコール誘導体が、
（１）２−Ｏ−（メトキシポリエチレングリコールプロピル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、又は
（２）２−Ｏ−（メトキシポリエチレングリコールプロピル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジステアロイルグリセロールである、
請求項１に記載のポリエチレングリコール誘導体。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれかに記載のポリエチレングリコール誘導体と２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールとを必須の構成成分として含有する薬物担体。
【請求項４】
更にリン脂質を構成成分とする、請求項３に記載の薬物担体。
【請求項５】
更にコレステロールを構成成分とする、請求項３又は４のいずれかに記載の薬物担体。
【請求項６】
医薬を包含する、請求項３〜５のいずれかに記載の薬物担体を含有する医薬組成物。
【請求項７】
医薬が、一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、オリゴ核酸又は水溶性陰イオン化合物である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
オリゴ核酸が、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、アプタマー又は非コードＲＮＡである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
癌の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ウイルス性疾患の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１１】
炎症性疾患の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
代謝性疾患の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
神経疾患の治療及び／又は予防のための請求項６〜８のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なポリエチレングリコール誘導体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポリＩ・ポリＣ等の合成二本鎖ＲＮＡや、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用したｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等の核酸医薬が注目され、盛んに研究されている。かかる核酸医薬の中でｓｉＲＮＡのような核酸医薬は、単独で生体内に、例えば静脈から全身投与しても患部組織に移行され難いため、例えば、核酸医薬を適当な担体に包含して投与したり、患部組織に局所投与したりするなど、一定の工夫を施して投与する必要がある。【０００３】
核酸医薬を患部組織に移行させるための担体としては、リポフェクチン（登録商標）、リポフェクトアミン２０００（登録商標）、オリゴフェクトアミン（登録商標）等のカチオン性リポソームや、２−Ｏ−（２−ジエチルアミノエチル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール（以下、「化合物Ａ」という）とリン脂質とを必須構成成分として含有するカチオン性リポソーム（以下、「化合物Ａリポソーム」という）などを挙げることができる（例えば、特許文献１を参照）。そして、これらカチオン性リポソームは、例えば静脈から全身投与すると肝臓や脾臓に集積し易い傾向にあるため、そこに核酸医薬を包含し肝癌や肝炎の治療剤として応用することが期待されている。実際に、例えば、化合物ＡリポソームとポリＩ・ポリＣ等の合成二本鎖ＲＮＡとの複合体が肝癌や肝炎の治療に有効であることが報告されている（例えば、特許文献２、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２を参照）。【０００４】
【特許文献１】国際公開第９４／１９３１４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９９／２０２８３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９９／４８５３１号パンフレット
【非特許文献１】Ｋａｚｕｋｏ  Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９９、ｖｏｌ．５９、ｐ．４３２５−４３３３
【非特許文献２】Ｋａｚｕｋｏ  Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９９、ｖｏｌ．１１、ｐ．４９７−５０４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、主として、新規なポリエチレングリコール誘導体、かかるポリエチレングリコール誘導体と化合物Ａとを必須の構成成分として含有する薬物担体、及び医薬を包含する当該薬物担体を含有する医薬組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、例えば、下記１〜３に記載の発明を見出し、本発明を完成した。
１．次の一般式（I）で表されるポリエチレングリコール誘導体（以下、「本発明誘導体」という）。
【化１】
2008096690.tif 000003
式（I）中、Ｒは炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基、又は炭素数１０〜３０の飽和若しくは不飽和の脂肪酸残基を表す。また、ｎは３０〜１５０の整数を表す。
２．上記１のポリエチレングリコール誘導体と化合物Ａとを必須の構成成分として含有する薬物担体（以下、「本発明担体」という）。
３．医薬を包含する上記２の薬物担体を含有する医薬組成物（以下、「本発明組成物」という）。【０００７】
Ｒに係る炭素数１０〜３０の飽和の脂肪族炭化水素基としては、例えば、カプリル、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１０〜２０の飽和の脂肪族炭化水素基が好ましく、特にステアリルがより好ましい。また、炭素数１０〜３０の不飽和の脂肪族炭化水素基としては、例えば、オレイル、リノレイル、アラキドニルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１０〜２０の不飽和の脂肪族炭化水素基が好ましく、特にオレイルがより好ましい。【０００８】
Ｒに係る炭素数１０〜３０の飽和の脂肪酸残基としては、例えば、カプロイル、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、アラキドイル、ベヘノイル、リグノセロイル、セロトイル、モンタノイル、メリソイルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１０〜２０の飽和の脂肪酸残基が好ましく、特にステアロイルがより好ましい。また、炭素数１０〜３０の不飽和の脂肪酸残基としては、例えば、オレオイル、リノレオイル、アラキドノイル、ネルボノイルを挙げることができる。それらの中で、炭素数１０〜２０の不飽和の脂肪酸残基が好ましく、特にオレオイルがより好ましい。【０００９】
ｎは、３０〜１５０の範囲内の整数であるが、３０〜１００の範囲内の整数が好ましく、３０〜５０の範囲内の整数がより好ましい。【００１０】
好ましい本発明誘導体としては、例えば、
（１）２−Ｏ−（メトキシポリエチレングリコールプロピル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロール、又は
（２）２−Ｏ−（メトキシポリエチレングリコールプロピル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジステアロイルグリセロール
を挙げることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、実施例１で合成した本発明誘導体のマススペクトルを表す。
【００１２】
【図２】図２は、実施例２で合成した本発明誘導体のマススペクトルを表す。
【００１３】
【図３】図３は、比較例２、３で使用した化合物Ｂのマススペクトルを表す。
【００１４】
【図４】図４は、肝臓への移行性を表す。縦軸は組成物の分布率（％  ｏｆ  ｄｏｓｅ）を、横軸は本発明組成物を投与してからの時間（時間）を、それぞれ示す。
【００１５】
【図５】図５は、肝実質細胞及び肝非実質細胞への移行性を表す。縦軸は本発明組成物の移行量（μｇ／１０７ｃｅｌｌｓ）を示す。
【００１６】
【図６】図６は、肝臓でのＳｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ  １（ＳＯＤ１）  ｍＲＮＡ量の変化を表す。縦軸はＳＯＤ１  ｍＲＮＡ量をＰｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｃ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｂ（ＰＰＩＢ）  ｍＲＮＡ量で除した値（％  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を、横軸は本発明組成物を投与してからの時間（日）を、それぞれ示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
Ｉ．本発明誘導体の製造方法【００１８】
本発明誘導体（I）は、下記一般式（１）で表されるアルコールを適当な溶媒に溶解し、適当なアシル化剤で処理した後、下記一般式（２）で表されるアミン誘導体と反応させることにより製造することができる。使用し得る溶媒としては、反応に関与しなければ特に限定されないが、例えば、有機アミン類（例えば、ピリジン、ピコリン、コリジン）、ジメチルホルムアミド又はこれらの混合溶媒を挙げることができる。アシル化剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール、クロロ炭酸フェニルを挙げることができる。反応温度は０〜１００℃の範囲内が適当である。また、反応時間は、使用する原料の種類、反応温度によって異なるが、通常１〜３０時間の範囲内が適当である。【００１９】
【化２】
2008096690.tif 000004
（式中、Ｒ、ｎは前記と同義である。）【００２０】
アルコール（１）は、公知である二量体のジヒドロキシアセトン（３）を用い、例えば、下記工程で表される、文献記載の方法（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７０、ｖｏｌ．３５、ｐ．２０８２−２０８３）に従い製造することができる。縮合剤としては、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを挙げることができる。還元剤としては、例えば、水素化ほう素ナトリウムを挙げることができる。【００２１】
【化３】
2008096690.tif 000005
（式中、Ｒは前記と同義である。）【００２２】
II．本発明担体【００２３】
本発明担体は、本発明誘導体と化合物Ａとを必須の構成成分とするものである。具体的には、本発明担体は、リポソームや脂肪乳剤等の形態をとることができる。【００２４】
化合物Ａは、国際公開第９４／１９３１４号パンフレットに記載の方法により合成することができる。【００２５】
本発明担体における本発明誘導体と化合物Ａとの配合比率は、化合物Ａ１重量部に対して、本発明誘導体０．００５〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．０１〜５重量部の範囲内が好ましく、０．０５〜３重量部の範囲内がより好ましい。【００２６】
本発明担体には、必須の構成成分である本発明誘導体及び化合物Ａ以外にリン脂質を更に加えることができ、加える方が好ましい。かかるリン脂質としては、医薬上許容されるリン脂質であれば特に制限されないが、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、レシチン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルフォスファチジルグリセロールを挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。それらの中で、特に卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチンが好ましい。【００２７】
リン脂質を加える場合、本発明担体における本発明誘導体とリン脂質との配合比率は、リン脂質１重量部に対して、本発明誘導体０．００５〜１００重量部の範囲内が適当であり、０．０１〜５０重量部の範囲内が好ましく、０．０５〜１０重量部の範囲内がより好ましい。また、化合物Ａ１重量部に対して、本発明誘導体とリン脂質との和が、０．０１〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．０５〜５重量部の範囲内が好ましく、０．５〜３重量部の範囲内がより好ましい。【００２８】
本発明担体には、必須の構成成分である本発明誘導体及び化合物Ａ以外にコレステロールを添加することができる。コレステロールを加える場合、本発明担体における本発明誘導体とコレステロールとの配合比率は、コレステロール１重量部に対して、本発明誘導体０．００５〜１００重量部の範囲内が適当であり、０．０１〜５０重量部の範囲内が好ましく、０．０５〜１０重量部の範囲内がより好ましい。また、化合物Ａ１重量部に対して、本発明誘導体とコレステロールとの和が、０．０１〜１０重量部の範囲内が適当であり、０．０５〜５重量部の範囲内が好ましく、０．１〜３重量部の範囲内がより好ましい。【００２９】
本発明担体の分散液は、例えば、（１）本発明誘導体及び化合物Ａを混合するか、（２）本発明誘導体、化合物Ａ及びリン脂質を混合するか、又は（３）本発明誘導体、化合物Ａ及びコレステロールを混合し、常法により、水溶液中で分散させることにより調製することができる。分散には超音波分散装置、乳化分散装置等の装置を適宜用いることができる。【００３０】
III．本発明組成物【００３１】
本発明組成物に用い得る「医薬」としては、例えば、水溶性陰イオン性化合物、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗生物質を挙げることができる。具体的には、核酸化合物である一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡあるいはオリゴ核酸、酸性糖であるヘパラン硫酸やデキストラン硫酸等、サイトカイン類、サイクリックＡＭＰ、ＡＴＰやＩＰ３等のセカンドメッセンジャー類、ペニシリン類やセファロスポリン類、ビタミンＣやレチノール類等のビタミン類、その他酸性基をもった既知の医薬、インターフェロン（α、β、γ）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、レバミゾール、ペスタチン、レチノイックアシッド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、アデニンアラビノシド（Ａｒａ−Ａ）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、アジドチミジン（ＡＺＴ）等を挙げることができる。【００３２】
合成二本鎖ＲＮＡとしては、例えば、以下のものを挙げることができる。
１．ホモポリマー・ホモポリマー複合体
ポリイノシン酸・ポリシチジル酸、
ポリイノシン酸・ポリ（５−ブロモシチジル酸）、
ポリイノシン酸・ポリ（２−チオシチジル酸）、
ポリ（７−デアザイノシン酸）・ポリシチジル酸、
ポリ（７−デアザイノシン酸）・ポリ（５−ブロモシチジル酸）、
ポリ（２’−アジドイノシン酸）・ポリシチジル酸、
ポリイノシン酸・ポリ（シチジン−５’−チオリン酸）。
２．ホモポリマー・コポリマー複合体
ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、ウリジン酸）、
ポリイノシン酸・ポリ（シチジル酸、４−チオウリジン酸）。
３．合成核酸とポリカチオンとの複合体
ポリイノシン酸・ポリシチジル酸・ポリ−Ｌ−リジン。
４．その他
ポリイノシン酸・ポリ（１−ビニルシチジル酸）。【００３３】
オリゴ核酸としては、一分子内に１０〜２００、好ましくは１５〜１５０、より好ましくは１８〜１００の範囲内の核酸塩基を有する、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びそれらの化合物を挙げることができる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、非コードＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＤＮＡエンザイム、リボザイム、アプタマーを挙げることができる。【００３４】
上記オリゴ核酸は天然型に限定されるものではなく、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのヌクレオチドを構成している糖又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。かかる修飾としては、例えば、リボースの２’位の修飾、リボースのその他の部分の修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。リボースの２’位の修飾としては、例えば、リボースの２’位の水酸基をＨ、ＯＲ１、Ｒ１、Ｒ２ＯＲ１、ＳＨ、ＳＲ１、ＮＨ２、ＮＨＲ１、Ｎ（Ｒ１）２、Ｎ３、ＣＮ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉに置換する修飾を挙げることができる。ここで、Ｒ１はアルキル又はアリールを表す。また、Ｒ２はアルキレンを表す。【００３５】
Ｒ１のアルキルとしては、直鎖状であるか分枝鎖状であるか特に制限されず、例えば、炭素数１〜６のアルキルを挙げることができる。具体的には、例えば、メチル、エチル、ｎ―プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシルを挙げることができる。当該アルキルは置換されていてもよく、かかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロを挙げることができ、これらが１〜３個置換されていてもよい。かかるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。かかるアルキルとしては上記のアルキルと同様のものを挙げることができる。かかるアルコキシとしては、直鎖状であるか分枝鎖状であるか特に制限されず、例えば、炭素数１〜６のアルコキシを挙げることができる。具体的には、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、イソヘキシルオキシを挙げることができる。それらの中で、特に炭素数１〜３のアルコキシが好ましい。
Ｒ１のアリールとしては、例えば、炭素数６〜１０のアリールを挙げることができる。具体的には、例えば、フェニル、α―ナフチル、β―ナフチルを挙げることができる。それらの中で、特にフェニルが好ましい。【００３６】
Ｒ２のアルキレンとしては、直鎖状であるか分枝鎖状であるか特に制限されず、例えば、炭素数１〜６のアルキレンを挙げることができる。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、２−（エチル）トリメチレン、１−（メチル）テトラメチレンを挙げることができる。【００３７】
リボースのその他の部分の修飾としては、例えば、４’位をチオ体とする修飾を挙げることができる。リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチオエート体、ホスホロジチオエート体、アルキルホスホネート体、又はホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。【００３８】
本発明組成物中に含まれる本発明担体と医薬との重量比（本発明担体／医薬）は、医薬の種類、本発明担体における本発明誘導体と化合物Ａとの配合比率等によって異なるが、０．０１〜１０００の範囲内が適当であり、１０〜３００の範囲内が好ましく、１００〜２００の範囲内がより好ましい。更に、含有医薬がオリゴ核酸である場合には、０．０１〜１００の範囲内が適当であり、１〜５０の範囲内が好ましく、５〜３０の範囲内がより好ましい。【００３９】
本発明組成物には、上述した本発明担体と医薬以外に、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。かかる添加剤として、例えば、乳化補助剤（例えば、炭素数６〜２２の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グルコース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース）、ｐＨ調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン）を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明組成物中の当該添加剤の含有量は、９０重量％以下が適当であり、７０重量％以下が好ましく、５０重量％以下がより好ましい。【００４０】
本発明組成物は、本発明担体の分散液に医薬を加え、適当に攪拌することにより調製することができる。また、本発明担体の製造過程において、医薬を加えることによっても調製することができる。上述した添加剤は、分散前でも分散後でも適当な工程で添加することができる。【００４１】
本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。液剤の場合、本発明組成物中に含まれる本発明担体の濃度は、０．００１〜５０ｗ／ｖ％の範囲内が適当であり、０．０１〜２５ｗ／ｖ％の範囲内が好ましく、０．１〜１０ｗ／ｖ％の範囲内がより好ましい。【００４２】
上記凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理することにより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約−４０〜−２０℃の条件で予備凍結を約２時間程度行い、約０〜１０℃で減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約１５〜２５℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはバイアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることができる。【００４３】
本発明組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり、特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の０．５〜２倍量、又は５００ｍＬ以下が適当である。【００４４】
本発明組成物は、例えば、癌、ウイルス性疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、神経疾患の治療に用いることができる。【００４５】
本発明組成物の投与形態は、医薬上許容される投与形態であれば特に制限されず、治療方法に応じて選択することができる。例えば、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、経肺投与、組織内投与、経皮投与、粘膜投与、直腸内投与、膀胱内投与、腹腔内投与、眼内投与、脳内投与、胸腔内投与を挙げることができる。それらの中で、特に静脈内投与、経皮投与、粘膜投与が好ましい。また、本発明組成物が取り得る剤型としては、特に制限されないが、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤を挙げることができる。【００４６】
本発明組成物の医薬としての用量は、医薬の種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与形態、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して医薬量として、１日当たり０．０１ｍｇ〜１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは０．１ｍｇ〜５ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。更に、本発明組成物に含有されている医薬がオリゴ核酸である場合には、成人に対してオリゴ核酸量として、１日当たり０．１ｍｇ〜１０ｇ／ヒトの範囲内が、好ましくは１ｍｇ〜５ｇ／ヒトの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また、１日１回から数回の投与又は１日から数日間の間隔で投与することができる。
【実施例】
【００４７】
以下に、製造例、実施例、比較例及び試験例を掲げて、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。【００４８】
製造例１  オリゴＲＮＡの合成
配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号５の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ及び配列番号６の塩基配列を有するオリゴＲＮＡの合成は、核酸自動合成機（Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９：アプライド・バイオシステムズ社製）を用いて、文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８４、ｖｏｌ．１２、ｐ．４５３９−４５５７）に記載のアミダイト法により合成した。
濃水酸化アンモニウム−エタノール（３／１）混合液を用いてＣＰＧより開裂させ、更に同溶液中で、５５℃で１８時間反応させることにより、塩基部分の保護基を脱保護した。その後、１Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドのテトラヒドロフラン溶液を用いて、室温で２０時間反応させることにより、２’位のシリル基を脱保護した。得られたオリゴＲＮＡを逆相クロマトグラフィーにて精製した。更に、８０％酢酸水溶液を用いて、室温で３０分間反応させることにより、５’位のジメトキシトリチル基を脱保護した後、イオン交換クロマトグラフィーにて再度精製した。得られた配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ、配列番号５の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ及び配列番号６の塩基配列を有するオリゴＲＮＡの各濃度は、それぞれ９．９９ｍｇ／ｍＬ、９．９９ｍｇ／ｍＬ、３．３７ｍｇ／ｍＬ、３．４５ｍｇ／ｍＬ、２．７４ｍｇ／ｍＬ及び３．２０ｍｇ／ｍＬであった。
なお、キャピラリー電気泳動により、得られたオリゴＲＮＡの９０％以上が２１塩基の鎖長を有していることを確認した。【００４９】
製造例２  トリチウムで標識されたオリゴＲＮＡの合成
トリチウムで標識された、配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡからなるオリゴ二本鎖ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｔ７  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて、トリチウムで標識された［２５’８−３Ｈ］アデノシン５’−３リン酸アンモニウム塩（アマシャムバイオサイエンス社製）を取り込ませることにより合成した。
その後、フェノール／クロロホルム混合溶液を用いてタンパク質を除去し、更にＧ−２５スピンカラム（ファルマシア社製）を用いて未反応モノマーの除去を行った。得られたオリゴ二本鎖ＲＮＡの濃度は１．６５ｍｇ／ｍＬであった。また、その比放射活性は、５．８×１０５ｄｐｍ／μｇであった。
なお、得られたオリゴＲＮＡは、１５％ポリアクリルアミド電気泳動により、その鎖長が２１塩基対付近であることを確認した。【００５０】
実施例１  ２−Ｏ−（メトキシポリエチレングリコールプロピル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールの合成
工程１  １，３−ジオレオイルグリセロールの合成
３．８ｇの二量体のジヒドロキシアセトン、２５ｇのオレイン酸、２０ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１２．９ｇの４−ジメチルアミノピリジンを１５０ｍＬのジクロロメタンに溶解し、室温で４時間攪拌し反応した。反応液に０．５Ｍリン酸二水素カリウム水溶液を加えて有機層を洗浄した。有機層を乾燥した後、減圧下で濃縮し、残渣に１Ｌのメタノールを加えて生じた粉末をろ取し、そのろ取した粉末を乾燥した。乾燥粉末を、１７０ｍＬのテトラヒドロフランと１７ｍＬの１０％酢酸水溶液との混合液に溶解し、その溶液に１．７ｇの水素化ほう素ナトリウムを０℃にて少しずつ加えた。その後、室温で２時間攪拌し反応した。反応液を飽和重曹水にあけ、酢酸エチルで抽出操作を行った。有機層を乾燥した後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１４．５ｇの目的物を得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ（ｍ/ｚ）＝６４３．３２０（［Ｍ+Ｎａ］+）
工程２  ２−Ｏ−（メトキシポリエチレングリコールプロピル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジオレオイルグリセロールの合成
上記工程１で得られた３．４ｇの１，３−ジオレオイルグリセロールを３０ｍＬのピリジンに溶解し、その溶液に１．７ｇのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを加え、室温で終夜攪拌し反応した。反応液を減圧下で濃縮した後、残渣をジクロロメタンに溶解し、その溶液に５％リン酸二水素ナトリウム水溶液を加えて有機層を洗浄した。有機層を乾燥した後、減圧下で濃縮した。９２０ｍｇの残渣を１０ｍＬのピリジンに溶解し、その溶液に３．３９ｇのα−アミノプロピル−ω−メトキシポリオキシエチレン［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＭＥＰＡ−２０Ｈ：日本油脂社製。以下同じ。］を加え、４０℃で終夜攪拌し反応した。反応液を減圧下で濃縮した後、トルエンで３回共沸した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、２．９ｇの標記本発明誘導体を得た。
エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルにより分子量を測定した結果、図１に示すように、得られた本発明誘導体の分子量は、２，２００〜３，５００の範囲内で分布していた【００５１】
実施例２  ２−Ｏ−（メトキシポリエチレングリコールプロピル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジステアロイルグリセロールの合成
工程１  １，３−ジステアロイルグリセロールの合成
３．０ｇの二量体のジヒドロキシアセトン、２２．７ｇのステアリン酸、１６．８ｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１０．８ｇの４−ジメチルアミノピリジンを１００ｍＬのジクロロメタンに溶解し、室温で終夜攪拌し反応した。反応液に０．５Ｌのメタノールを加えて生じた粉末をろ取し、そのろ取した粉末をメタノールで洗浄した。洗浄後の粉末を乾燥した後、６ｇの乾燥粉末を、４００ｍＬのテトラヒドロフランと２０ｍＬの１０％酢酸水溶液との混合液に懸濁し、その懸濁液に１．１ｇの水素化ほう素ナトリウムを０℃にて少しずつ加えた。その後、室温で６時間攪拌し反応した。反応液を飽和重曹水にあけ、酢酸エチルで抽出操作を行った。有機層を乾燥した後、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、３．５ｇの目的物を得た。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ（ｍ/ｚ）＝６４７．５４７（［Ｍ+Ｎａ］+）
工程２  ２−Ｏ−（メトキシポリエチレングリコールプロピル）カルバモイル−１，３−Ｏ−ジステアロイルグリセロールの合成
上記工程１で得られた０．４ｇの１，３−ジステアロイルグリセロールを１０ｍＬのピリジンに溶解し、その溶液に１５６ｍｇのＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾールを加え、室温で終夜攪拌し反応した。反応液を減圧下で濃縮した後、残渣をジクロロメタンに溶解し、その溶液に５％リン酸二水素ナトリウム水溶液を加えて有機層を洗浄した。有機層を乾燥した後、減圧下で濃縮した。４５０ｍｇの残渣を、１０ｍＬのピリジンと４ｍＬのジクロロメタンとの混合液に溶解し、１．６４ｇのα−アミノプロピル−ω−メトキシポリオキシエチレンを加え、４０℃で終夜攪拌し反応した。反応液を減圧下で濃縮した後、トルエンで３回共沸した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１．２ｇの標記本発明誘導体を得た。
エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルにより分子量を測定した結果、図２に示すように、得られた本発明誘導体の分子量は、２，２００〜３，５００の範囲内で分布していた。【００５２】
実施例３  本発明担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、実施例１で合成した８ｍｇの本発明誘導体及び９２ｍｇの卵黄レシチン（キューピー社製。以下同じ。）をバイアル中で２ｍＬのクロロホルムに溶解し、これに窒素ガスを吹きつけてクロロホルムを除去し、バイアルの壁面に薄膜を形成させた。これを更に減圧下で一晩放置した後、１，０００ｍｇのマルトース（大塚製薬社製。以下同じ。）、４．０ｍＬの注射用水（大塚製薬社製。以下同じ。）及び８１μＬの１Ｎ塩酸を加えてボルテックスミキサーで薄膜を分散させた。４℃で３時間放置した後、マイクロプローブを用いて、１０分間超音波処理を行い、３２ｍｇ／ｍＬの本発明担体の分散液を調製した。その後、注射用水を用いて５．０ｍＬにメスアップした。【００５３】
実施例４  本発明担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、実施例１で合成した３２ｍｇの本発明誘導体及び６８ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例３と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００５４】
実施例５  本発明担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、実施例１で合成した８０ｍｇの本発明誘導体及び２０ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例３と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００５５】
実施例６  本発明組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
製造例１で合成した配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ溶液０．５０ｍＬ、製造例１で合成した配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ溶液０．５０ｍＬ、及び４．００ｍＬの注射用水を混和して、核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量に、実施例４で調製した本発明担体の分散液５ｍＬを添加し、５分間の超音波処理を行った。５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った後、０．２２μｍのフィルターを用いてろ過を行うことにより、１．０ｍｇ／ｍＬの本発明組成物を調製した。
（３）薬物担体の平均粒子径の測定
本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、注射用水を用いて、上記（２）で作成した本発明組成物を０．０２ｍｇ／ｍＬに希釈して測定した。具体的には、粒子径測定装置［Ｎｉｃｏｍｐ  Ｃ３８０（登録商標）：Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．社製。以下同じ。］を用い、屈折率を０．９９３に、粘度を１．３３３、測定時間を５分間に設定して、３回測定を行った。その結果、本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、９７．６ｎｍであった。【００５６】
実施例７  本発明組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
実施例６の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び実施例５で調製した本発明担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの本発明組成物を調製した。
なお、本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、４７．１ｎｍであった。【００５７】
実施例８  本発明担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、実施例２で合成した８０ｍｇの本発明誘導体及び２０ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例３と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００５８】
実施例９  本発明担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、実施例１で合成した３２ｍｇの本発明誘導体及び６８ｍｇのコレステロール（和光純薬社製。以下同じ。）を用い、実施例３と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００５９】
実施例１０  本発明担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、実施例１で合成した８０ｍｇの本発明誘導体及び２０ｍｇのコレステロールを用い、実施例３と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００６０】
実施例１１  本発明担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、実施例２で合成した３２ｍｇの本発明誘導体及び６８ｍｇのコレステロールを用い、実施例３と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００６１】
実施例１２  本発明担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、実施例２で合成した８０ｍｇの本発明誘導体及び２０ｍｇのコレステロールを用い、実施例３と同様に本発明担体の分散液を調製した。【００６２】
実施例１３  本発明組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
製造例１で合成した配列番号１の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ溶液０．５０ｍＬ、製造例１で合成した配列番号２の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ溶液０．５０ｍＬ、及び４．００ｍＬの注射用水を混和して、核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び実施例８で調製した本発明担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの本発明組成物を調製した。
なお、本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、４１．６ｎｍであった。【００６３】
実施例１４  本発明組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
実施例１３の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び実施例９で調製した本発明担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの本発明組成物を調製した。
なお、本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、１３１．４ｎｍであった。【００６４】
実施例１５  本発明組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
実施例１３の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び実施例１０で調製した本発明担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの本発明組成物を調製した。
なお、本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、４６．３ｎｍであった。【００６５】
実施例１６  本発明組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
実施例１３の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び実施例１１で調製した本発明担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの本発明組成物を調製した。
なお、本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、１４０．４ｎｍであった。【００６６】
実施例１７  本発明組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
実施例１３の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び実施例１２で調製した本発明担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの本発明組成物を調製した。
なお、本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、４８．３ｎｍであった。【００６７】
実施例１８  本発明組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
製造例２で合成したトリチウムで標識されたオリゴ二本鎖ＲＮＡ溶液３６μＬ、製造例１で合成した配列番号３の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ溶液１．５０ｍＬ、製造例１で合成した配列番号４の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ溶液１．４３ｍＬ、及び２．０７ｍＬの注射用水を混和して、核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び実施例９で調製した本発明担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの本発明組成物を調製した。
なお、本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、１２０．５ｎｍであった。【００６８】
実施例１９  本発明組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
製造例１で合成した配列番号５の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ溶液１．８８ｍＬ、製造例１で合成した配列番号６の塩基配列を有するオリゴＲＮＡ溶液１．５２ｍＬ、及び１．６１ｍＬの注射用水を混和して、核酸溶液を調製した。
（２）本発明組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び実施例９で調製した本発明担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの本発明組成物を調製した。
なお、本発明組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、１６５．０ｎｍであった。【００６９】
比較例１  比較対照用担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ及び１００ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例３と同様に比較対照用担体の分散液を調製した。【００７０】
比較例２  比較対照用担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、３２ｍｇの平均分子量が２，８９８であるＮ−（メトキシ  ポリエチレングリコールカルボニル）ジステアロイル  ホスファチジルエタノールアミン［ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）  ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ：日本油脂社製］（以下、「化合物Ｂ」という。）及び６８ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例３と同様に比較対照用担体の分散液を調製した。
なお、エレクトロスプレーイオン化法を用いたマススペクトルにより分子量を測定した結果、図３に示すように、使用した化合物Ｂの分子量は、２，１００〜３，８００の範囲内で分布していた。【００７１】
比較例３  比較対照用担体の分散液の調製
６０ｍｇの化合物Ａ、８０ｍｇの化合物Ｂ及び２０ｍｇの卵黄レシチンを用い、実施例３と同様に比較対照用担体の分散液を調製した。【００７２】
比較例４  比較対照用担体の分散液の調製
リポフェクチン（登録商標）（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いて、供給会社が指定する調製方法により、比較対照用担体の分散液を調製した。【００７３】
比較例５  比較対照用担体の分散液の調製
オリゴフェクトアミン（登録商標）（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）を用いて、供給会社が指定する調製方法により、比較対照用担体の分散液を調製した。【００７４】
比較例６  比較対照用組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
実施例６の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例１で調製した比較対照用担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用組成物を調製した。
なお、比較対照用組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、１３８．６ｎｍであった。【００７５】
比較例７  比較対照用組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
実施例６の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例２で調製した比較対照用担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用組成物を調製した。
なお、比較対照用組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、１０６．９ｎｍであった。【００７６】
比較例８  比較対照用組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
実施例６の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例３で調製した比較対照用担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用組成物を調製した。
なお、比較対照用組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、９３．０ｎｍであった。【００７７】
比較例９  比較対照用組成物の調製
（１）核酸溶液の調製
実施例１３の（１）と同様にして核酸溶液を調製した。
（２）比較対照用組成物の調製
上記（１）で調製した核酸溶液全量及び比較例１で調製した比較対照用担体の分散液５ｍＬを用い、実施例６の（２）と同様に１．０ｍｇ／ｍＬの比較対照用組成物を調製した。
なお、比較対照用組成物中の薬物担体の平均粒子径は、実施例６の（３）と同様の方法により測定したところ、１５１．０ｎｍであった。【００７８】
試験例１  本発明担体の溶血性の評価
（１）実験方法
雄性ラット（Ｓｌｃ：ＳＤ、７週齢、日本エスエルシー社製）より採取した血液を３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上層を除き、赤血球懸濁液を得た。得られた赤血球懸濁液に対し２倍量の注射用生理食塩水（大塚製薬工場社製。以下同じ。）を加え、混和した後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。この操作を更に２回繰り返した。得られた赤血球懸濁液は、注射用生理食塩水を用いて１×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように希釈した。
実施例５、８又は比較例１、３、４、５で調製した担体の分散液を、０．３μｇ／μＬ〜３０ｍｇ／μＬの範囲内で所望の濃度になるように、１０％マルトースで希釈した。２８５μＬの希釈した担体の分散液を３７℃で１０分間予備加温した後、１５μＬの赤血球懸濁液を加え混和し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応液を３，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を回収した。４０５ｎｍにおける上清の吸光度を測定した。
溶血度は、担体を加えなかった場合の吸光度を溶血度０％とし、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００を加えた場合の吸光度を溶血度１００％として算出した。また、算出した溶血度より、５０％溶血濃度を算出した。
（２）実験結果
表１に示すように、実施例５及び８に係る本発明担体の５０％溶血濃度は、比較例１、３、４及び５に係る比較対照用担体の５０％溶血濃度と比較して高かった。【００７９】
【表１】
2008096690.tif 000006
【００８０】
試験例２  本発明担体の細胞毒性の評価
（１）実験方法
ヒトさい帯静脈内皮細胞（三光純薬社製）を３，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように９６ウェルプレートに播種し、一晩培養した。実施例５又は比較例１、３、４、５で調製した担体の分散液を、３μｇ／μＬ〜１０ｍｇ／μＬの範囲内で所望の濃度になるように、１０％マルトースで希釈した。希釈した担体の分散液を培地の１／１０容量添加した。７２時間培養後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＷＳＴ−８：同仁化学社製）を用いて、生存細胞数を測定し、その値より５０％細胞増殖阻害濃度を算出した。なお、ヒトさい帯静脈内皮細胞の培養には、Ｍ１９９培地（ニッスイ社製）を用いた。
（２）実験結果
表２に示すように、実施例５に係る本発明担体の５０％細胞増殖阻害濃度は、比較例１、３、４及び５に係る比較対照用担体の５０％細胞増殖阻害濃度と比較して高かった。【００８１】
【表２】
2008096690.tif 000007
【００８２】
試験例３  本発明組成物のサイトカイン誘導能の評価
（１）実験方法
実施例６、７又は比較例６、７、８で調製した組成物を、雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）の尾静脈内に、１０ｍＬ／ｋｇの投与量で投与した。投与から２時間後に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、血清を得た。１群あたり、３匹のマウスを用いた。なお、無処理のマウスを陰性対照とした。
血清中のＩＦＮ−α濃度はＭｏｕｓｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ａｌｐｈａ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（ＰＢＬ社製）を用いて測定した。
（２）実験結果
表３に示すように、実施例６、７に係る本発明組成物の投与により誘導されたＩＦＮ−α量は、比較例６、７、８に係る比較対照用組成物の投与により誘導されたＩＦＮ−α量と比較して低かった。また、実施例１に係る本発明誘導体の濃度に依存して、誘導されたＩＦＮ−α量は低かった。【００８３】
【表３】
2008096690.tif 000008
【００８４】
試験例４  本発明組成物のサイトカイン誘導能の評価
（１）実験方法
ヒト新鮮血を採取し、凝固を防ぐため血液１０ｍＬあたり１ｍＬのヘパリンナトリウム注 (味の素社製) を混合した。等量のＰｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（以下、「ＰＢＳ」という）を加え、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ (ＧＥ  ヘルスケア  バイオサイエンス社製)３ｍＬあたり１０ｍＬの血液を、界面を乱さないよう穏やかに重層した。４００×ｇ、室温で３０分間遠心し、末梢血単核球を得た。得られた末梢血単核球をＰＢＳで２度洗浄した。その後、末梢血単核球を１０％牛胎児血清（ＪＲＨ バイオサイエンス社製）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（ナカライテスク社製）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ニッスイ社製）に浮遊させ、細胞数を測定し、２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。
調製した細胞懸濁液を４８穴プレートに３００μＬ (６×１０５ｃｅｌｌｓ)／ｗｅｌｌ で播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３時間培養した後、実施例７、１３、１４、１５、１６、１７又は比較例９で調製した組成物を所望の濃度（３０ｎＭ又は１００ｎＭ）になるように培地中に添加した。組成物を添加してから２４時間培養した後、培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡを行った。ＩＦＮ−αの測定はヒトインターフェロン−ａｌｐｈａ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ (バイオソース社製) を用いて添付のプロトコールに従い行った。
（２）実験結果
表４に示すように、実施例７、１３、１４、１５、１６及び１７に係る本発明組成物を処理することにより誘導されたＩＦＮ−α量は、比較例９に係る比較対照用組成物を処理することにより誘導されたＩＦＮ−α量と比較して低かった。【００８５】
【表４】
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【００８６】
試験例５  本発明組成物の肝臓への移行性の評価
（１）実験方法
実施例１８で調製した本発明組成物を、本発明組成物中の核酸の濃度が０．２５ｍｇ／ｍＬになるように希釈し、以下の実験で用いた。
１群あたり３又は４匹の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）を用い、本発明組成物の投与から３０分後に採血する群、２時間後に採血する群、８時間後に採血する群、２４時間後に採血する群の４群に分けて実験を行った。各群のマウスの尾静脈内に、本発明組成物を１０ｍＬ／ｋｇの投与量で投与した。投与から３０分後、２時間後、８時間後及び２４時間後に、マウスをエトレン麻酔下で腹部大動脈より全血を採取し、致死させた。その後、肝臓を摘出し、その湿重量を秤量した。
摘出した肝臓は、バイアル中で１ｍＬの組織溶解剤（ソルバブル：パーキンエルマー社製。以下同じ。）を加え、４０℃で二晩振とうさせることにより溶解させた。溶解させた試料に１０ｍＬのシンチグラフィレーター（Ｈｉｏｎｉｃ−Ｆｌｕｏｒ：パーキンエルマー社製。以下同じ。）を加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、放射活性を測定した。その結果より、肝臓への本発明組成物の分布率（％  ｏｆ  ｄｏｓｅ）を算出した。
（２）実験結果
図４に示すように、実施例１８に係る本発明組成物中の本発明担体の肝臓への分布率は、投与後、２時間の値が最も高く、全投与量の約４０％が肝臓に移行していた。【００８７】
試験例６  本発明組成物の肝実質細胞への移行性の評価
（１）実験方法
肝細胞の分離は、文献（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、２００１、ｖｏｌ．７０、ｐ．２９５−３０７）に記載の方法に従い行った。
実施例１８で調製した本発明組成物を、４匹の雄性マウス（Ｓｌｃ；ｄｄＹ、８週齢、日本エスエルシー社製）の尾静脈内に、１０ｍＬ／ｋｇの投与量で投与した。
投与から２時間後、ペントバルビタール麻酔下で開腹した。門脈から、前灌流用緩衝液による灌流を行い、血液が灌流液へと置換されたことを確認した後、灌流液をコラーゲナーゼ溶液に交換した。灌流速度は約２ｍＬ／分の流速でゆっくりと行い、酵素が作用し肝小葉が崩れるまで、約１５分間行った。消化された肝臓をシャーレに移し、ハサミで細断した後、ＨＡＮＫＳ溶液を加え駒込ピペットを用いて細胞を懸濁した。これをガーゼで濾過し、細胞懸濁液を得た。この細胞懸濁液を、５０×ｇで１．５分間遠心し、上層を回収した。残った沈殿をＨＡＮＫＳ溶液で懸濁後、４８μｍのナイロンメッシュに通し、５０×ｇで１．５分間遠心した。その後、ＨＡＮＫＳ溶液で懸濁し、５０×ｇで１．５分間遠心した。この操作を更に２回行い、肝実質細胞を得た。先に回収した上層を、６００×ｇで５分間遠心し、沈殿をＨＡＮＫＳ溶液で懸濁した。この操作を再度行い、肝非実質細胞を得た。それぞれの細胞数を血球計算盤を用いて測定した。
各細胞の懸濁液２．０ｍＬに少量の組織溶解剤を加え、４０℃で一晩振とうさせることにより溶解させた。溶解させた試料に１８ｍＬのシンチグラフィレーターを加え混和した後、液体シンチレーションカウンターを用いて、放射活性を測定した。その結果より、１０７ｃｅｌｌｓ当りの肝実質細胞又は肝非実質細胞への本発明組成物の移行量（μｇ／１０７ｃｅｌｌｓ）を算出した。
（２）実験結果
図５に示すように、実施例１８に係る本発明組成物中の本発明担体の肝実質細胞への移行量は、肝非実質細胞への移行量よりも約８倍高かった。【００８８】
試験例７  本発明組成物の肝臓への移行性の評価
（１）本発明組成物の肝臓への移行性を、本発明組成物中のオリゴＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制効果を指標として評価した。なお、本実験で用いた実施例１９で調製した本発明組成物に含まれる、配列番号５の塩基配列を有するオリゴＲＮＡと配列番号６の塩基配列を有するオリゴＲＮＡとからなる核酸は、ＳＯＤ１の発現を抑制する核酸として、文献（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２００４、ｖｏｌ．３１４、ｐ．２８３−２９１）に記載されているものである。
（２）実験方法
１群あたり４匹の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、６週齢、日本クレア社製）を用い、本発明組成物を２日間投与する群、３日間投与する群、４日間投与する群の３群に分けて実験を行った。各群のマウスの尾静脈内に、実施例１９で調製した本発明組成物を、１０ｍＬ／ｋｇの投与量で、１日１回投与した。各群の投与終了から２４時間後に肝臓を摘出し、当該臓器をＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ社製）中で凍結保存した。その後、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）を用いて、全ＲＮＡを抽出し、当該ＲＮＡ中のＳＯＤ１  ｍＲＮＡ量をＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ２．０（Ｐａｎｏｍｉｃｓ社製）を用いて定量した。
得られたＳＯＤ１  ｍＲＮＡ量をマウスの肝臓のＰＰＩＢ  ｍＲＮＡ量で補正を行った。また、本発明組成物の代わりに、１０％マルトースを４日間投与したマウスの肝臓における、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ量を１００％として評価した。
（３）実験結果
図６に示すように、実施例１９に係る本発明組成物は、肝臓のＳＯＤ１  ｍＲＮＡの発現を抑制した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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