(57)【要約】  動物の消化活動を補助し、飼料効率を高めるための安全かつ簡便な手段を提供する。具体的には、動物の腸内の病原菌やコクシジウムの増殖を抑えることにより感染症を予防・治療し、動物の体重増加を実現する手段を提供する。  アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）及びアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）から選ばれる少なくとも一種のアスペルギルス属菌、これらの菌が産生する酸性酵素を含む培養物、並びにバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）を一定量以上動物に投与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）及びアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）から選ばれる少なくとも一種のアスペルギルス属菌、これらの菌が産生する酸性酵素を含む培養物、並びにバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）を含む、動物用飼料添加剤であって、飼料添加剤１ｇ当たりの酸性酵素活性の総和が１２０Ｕ以上であり、バチルス・ズブチリスの濃度が２．５×１０7〜２×１０9ＣＦＵ／ｇである、動物用飼料添加剤。
【請求項２】
前記酸性酵素が、酸性アミラーゼを含み、飼料添加剤１ｇ当たりの酸性アミラーゼ活性が１Ｕ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項３】
前記アスペルギルス属菌が、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌に対する抗菌活性及び／又はコクシジウムに対する殺原虫活性を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項４】
前記アスペルギルス属菌が、アスペルギルス・ソーヤ及び／又はアスペルギルス・オリゼーである、請求項１〜３の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項５】
アスペルギルス・オリゼーが、ＩＫ−０５０７４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６２２）及び／又はこれの変異株であって、前記菌株と同じ酸性酵素産生能力を有する菌株であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項６】
前記培養物が、植物性栄養源を含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項７】
前記植物性栄養源が、玄米である、請求項６に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項８】
バチルス・ズブチリスが、ＤＢ９０１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３４１８）及び／又はこれの変異株であることを特徴とする請求項１〜７の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項９】
成長促進用であることを特徴とする、請求項１〜８の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項１０】
腸内感染症の予防・改善用であることを特徴とする、請求項１〜８の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか一項に記載の動物用飼料添加剤を０．０１〜１．０質量％含む飼料。
【請求項１２】
アスペルギルス属菌の増殖のための栄養源を含む固体培地で、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーから選ばれる少なくとも一種のアスペルギルス属菌を培養し、得られた培養物を、飼料１ｋｇ当たりの酸性酵素活性の総和が１２Ｕ以上となるように含有させる工程と、バチルス・ズブチリスを、濃度が２．５×１０6〜２．０×１０10ＣＦＵ／ｋｇとなるように含有させる工程とを含むことを特徴とする、飼料の製造方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の飼料を動物に摂取させることを特徴とする、動物の飼育方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酸性酵素を産生する能力を有するアスペルギルス属菌、及びバチルス属細菌を含有する動物用飼料添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
家畜やペット（以下、動物という。）などの飼料は、粉砕などの加工は行われるものの、一般的に加熱処理等は行われないため、消化吸収率が低くなり、飼料効率が悪いという問題がある。また、最近ではヒトの病気として知られる潰瘍性大腸炎やクローン病などの炎症性腸管障害が動物にも報告されており、下痢などの症状を引き起こすという問題がある。また、このような炎症性腸管障害は、飼料の吸収低下や健全肥育を妨げることも知られている。動物の腸内感染症を引き起こす病原菌としては、病原性大腸菌、サルモネラ属細菌、クロストリジウム属細菌、カンピロバクター属細菌などが知られている。このような病原菌は、異常増殖すると毒素（エンテロトキシン、サイトトキシン）を産生し、腸管粘膜に障害を起こし、軟便や激しい下痢等を引き起こすことが知られている。また、コクシジウムは、鶏、豚、牛などの腸管内に寄生する原虫であり、感染すると下痢、食欲不振などを引き起こす。このような炎症性腸管障害を予防・治療するために抗生物質を用いることが行われているが、薬剤耐性菌の出現などの問題がある。【０００３】
近年、腸内フローラのバランスを改善し、腸内の病原菌の増殖を抑制するために、プロバイオティクスを用いる技術が注目されている（特許文献１、特許文献２）。しかしながら、乳酸菌やビフィズス菌は、０．３％デオキシコール酸の濃度で死滅するものやｐＨ４以下で死滅するものが多く、大腸菌群と総称される細菌以外は、胆汁酸のうち微生物に対して強い抗菌性を持つデオキシコール酸の存在下で生存できない菌種が多い。そこで、動物の消化管内でも死滅せず、宿主に有利な効果をもたらす菌種が探し求められている。【０００４】
一方、動物用の飼料をその加工段階で酵素や酵素生産菌で処理して、ある程度分解しておくことにより動物の胃腸の負担を軽減する技術などが、消化器系の疾病の予防や改善に有用であることが報告されている（特許文献３）。また、麹菌を用いて魚粉を低水分で発酵させてプロテアーゼ、リパーゼ等を高濃度に含有する魚用の魚粉発酵飼料を得る方法が知られている（特許文献４）。しかしながら、このような技術においては、飼料中の水分含量を高め飼料の成分分解を行った後、乾燥して製品化するという煩雑な工程が必要であるという問題があった。さらに、成分分解のために水分の含量を高めた飼料は、腐敗菌やカビなどが発生しやすく、品質の維持が困難であるなどの問題もあった。
また、麹菌の胞子を動物に経口投与することにより動物の糞を改質する方法が報告されているが、動物の腸内で炎症等を引き起こす有毒な細菌の増殖を抑制したり、体重増加を促進したりするという用途については検討されておらず、麹菌に酸性酵素を産生させた形態で動物に投与することも知られていない（特許文献５）。
また、甲殻類の甲殻粉砕物に発酵栄養源を加えて混合し、これにアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼー、バチルス・ズブチリス、バチルス・リケニフォルミスから選ばれる１種又は２種以上を接種してキチン又はキトサンを分解させて発酵物を得て、動物に与えることが記載されている（特許文献６）。この方法による動物の成長促進効果は一部認められているが、動物腸内の病原菌の増殖を抑制し、腸内感染症を予防・治療することについては検討されておらず、そのような効果も認められていない。また、二種以上の微生物を混合して動物に投与することは、実際には検討されていない。【０００５】
また、バチルス・ズブチリスが、病原性大腸菌などの病原菌に対する抗菌活性を有していることが報告されており（特許文献７、８）、動物に経口投与することについて検討されている。また、バチルス・ズブチリスＤＢ９０１１はアフラトキシン分解性を有し、真菌の発育を阻害することが知られ、飼料に添加することが検討されている（特許文献９）。しかしながら、バチルス・ズブチリスを他の系統の微生物と組合せて動物に摂取させることについてはこれまで検討されていない。【０００６】
【特許文献１】特表２００５−５０７６７０号公報
【特許文献２】特表２００４−５２３２４１号公報
【特許文献３】特開２００４−１４１１４７号公報
【特許文献４】特表平６−３１９４６４号公報
【特許文献５】特開平１１−１７１６７４号公報
【特許文献６】特開２００２−２３８４６６号公報
【特許文献７】特開平１１−３３２５５５号公報
【特許文献８】特開平１１−２８５３７８号公報
【特許文献９】特許第３０４０２３４号公報
【非特許文献１】George A. Burdock, Madhusudan G. Soni, and Ioana G. Carabin (2001) Regulatory Toxicology and Pharmacology 33, 80-101
【非特許文献２】Harry E. Morton, Walter Kocholaty, Renate Junowicz-Kocholaty, and Albert Kelner (1945) J. Bacteriol 50, 579-584
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、動物の消化活動を補助し、飼料効率を高めるための安全かつ簡便な手段を提供することを課題とする。具体的には、動物の腸内の病原菌やコクシジウムの増殖を抑えることにより腸内感染症を予防・改善し、動物の体重増加を実現する手段を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーが酸性酵素、とりわけ酸性アミラーゼの産生能力に優れること、これらの菌が、腸内感染症を引き起こす病原菌に対する抗菌活性及びコクシジウムに対する殺原虫活性を有すること、及びこれらがプロバイオティクスとして機能することを見出した。また、これらの菌の酸性酵素産生能は、玄米を栄養源として培養した場合に極めて優れることを見出した。そして、これらの菌体と菌体により産生された酸性酵素を組み合わせて飼料と共に動物に摂取させることにより、消化を促進し、腸内感染症を予防・改善し、動物の体重増加に寄与することを見出した。また、バチルス・ズブチリスは、上記アスペルギルス属菌及び該菌が産生する酸性酵素と共存させても、その増殖が阻害されないことを見出した。そして、アスペルギルス属細菌及び該菌が産生する酸性酵素、並びにバチルス・ズブチリスを組み合わせて動物に摂取させることにより、さらに優れた成長促進効果、腸内感染症の予防・改善効果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）及びアスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）から選ばれる少なくとも一種のアスペルギルス属菌、これらの菌が産生する酸性酵素を含む培養物、並びにバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）を含む、動物用飼料添加剤であって、飼料添加剤１ｇ当たりの酸性酵素活性の総和が１２０Ｕ以上であり、バチルス・ズブチリスの濃度が２．５×１０7〜２×１０9ＣＦＵ／ｇである、動物用飼料添加剤。
（２）前記酸性酵素が、酸性アミラーゼを含み、飼料添加剤１ｇ当たりの酸性アミラーゼ活性が１Ｕ以上であることを特徴とする、（１）に記載の動物用飼料添加剤。
（３）前記アスペルギルス属菌が、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌に対する抗菌活性及び／又はコクシジウムに対する殺原虫活性を有することを特徴とする、（１）又は（２）に記載の動物用飼料添加剤。
（４）前記アスペルギルス属菌が、アスペルギルス・ソーヤ及び／又はアスペルギルス・オリゼーである、（１）〜（３）の何れか一に記載の動物用飼料添加剤。
（５）アスペルギルス・オリゼーが、ＩＫ−０５０７４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６２２）及び／又はこれの変異株であって、前記菌株と同じ酸性酵素産生能力を有する菌株であることを特徴とする（１）〜（４）の何れか一に記載の動物用飼料添加剤。
（６）前記培養物が、植物性栄養源を含む、（１）〜（５）の何れか一に記載の動物用飼料添加剤。
（７）前記植物性栄養源が、玄米である、（６）に記載の動物用飼料添加剤。
（８）バチルス・ズブチリスが、ＤＢ９０１１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−３４１８）及び／又はこれの変異株であることを特徴とする（１）〜（７）の何れか一に記載の動物用飼料添加剤。
（９）成長促進用であることを特徴とする、（１）〜（８）の何れか一に記載の動物用飼料添加剤。
（１０）腸内感染症の予防・改善用であることを特徴とする、（１）〜（８）の何れか一に記載の動物用飼料添加剤。
（１１）（１）〜（１０）の何れか一に記載の動物用飼料添加剤を０．０１〜１．０質量％含む飼料。
（１２）アスペルギルス属菌の増殖のための栄養源を含む固体培地で、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーから選ばれる少なくとも一種のアスペルギルス属菌を培養し、得られた培養物を、飼料１ｋｇ当たりの酸性酵素活性の総和が１２Ｕ以上となるように含有させる工程と、バチルス・ズブチリスを、濃度が２．５×１０6〜２．０×１０10ＣＦＵ／ｋｇとなるように含有させる工程とを含むことを特徴とする、飼料の製造方法。
（１３）（１１）に記載の飼料を動物に摂取させることを特徴とする、動物の飼育方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の動物用飼料添加剤は、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーから選ばれる少なくとも一種のアスペルギルス属菌、これらの菌が産生する酸性酵素を含む培養物、並びにバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）細菌を含むことを特徴とする。【００１０】
本発明の動物用飼料添加剤に含有するアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーは、当該技術分野において、麹菌の種の同定に一般的に用いられる方法により分類した場合に、それぞれ上記の種に分類される菌である。菌種の同定には、例えば、「H. Murakami, The Journal of General and Applied Microbiology, 17, p.281-309, (1971)」、「村上英也, 日本醸造協会誌, 第７４巻，第１２号， p.849-853, (1979)」、「Nikkuni, S., et al, The Journal of General and Applied Microbiology, 44, p.225-230, (1998)」なども参照することができる。【００１１】
アスペルギルス・ソーヤは、土壌、麹などに見出される糸状不完全菌類の一種で醤油、味噌の醸造に用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、以下に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは酸性アミラーゼを産生する能力を有しているものであって、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよく、このような菌として、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株（株式会社秋田今野商店）を好ましく用いることができる。【００１２】
アスペルギルス・タマリは、土壌、麹、食品などに見出される糸状不完全菌類の一種で醤油、味噌の醸造に用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、以下に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは、酸性アミラーゼを産生する能力を有しているものであって、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよく、このような菌として、アスペルギルス・タマリ ＡＯＫ ４３株（株式会社秋田今野商店）を好ましく用いることができる。【００１３】
アスペルギルス・フォエティダスは、土壌、麹、穀物かすなどに見出される糸状不完全菌類の一種で酒、味噌、醤油の醸造に用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、以下に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは、酸性アミラーゼを産生する能力を有しているものであって、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよく、このような菌として、アスペルギルス・フォエティダス ＡＯＫ Ｎ４５８６株（株式会社秋田今野商店）を好ましく用いることができる。【００１４】
アスペルギルス・ニガーは、土壌、麹、穀物かすなどに見出される糸状不完全菌類の一種で酒類の製造、食品加工、糖の製造や医薬の製造などさまざまな場面で用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、以下に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは、酸性アミラーゼを産生する能力を有しているものであって、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよく、このような菌として、アスペルギルス・ニガー ＡＯＫ Ｂ６５０株（株式会社秋田今野商店）を好ましく用いることができる。【００１５】
また、ＡＯＫ ２１０株、ＡＯＫ ４３株、ＡＯＫ Ｎ４５８６株又はＡＯＫ Ｂ６５０株の変異株を用いることもできる。変異株は、これらの菌株を自然変異させたり、化学的変異剤や紫外線等で変異処理して得られた菌株から、それぞれＡＯＫ ２１０株、ＡＯＫ ４３株、ＡＯＫ Ｎ４５８６株又はＡＯＫ Ｂ６５０株と同じ酸性酵素を産生する能力を有する菌株を選抜して得ることができる。また、酸性酵素を産生する能力に加え、上記菌株と同じ抗菌活性、殺原虫活性、胆汁酸耐性、耐酸性の少なくとも一つをさらに有する上記菌株の変異株を用いることも好ましい。また、さらに上記以外の菌学的性質もＡＯＫ ２１０株、ＡＯＫ ４３株、ＡＯＫ Ｎ４５８６株又はＡＯＫ Ｂ６５０株と同様である変異株を用いることも好ましい。【００１６】
アスペルギルス・オリゼーは、土壌、麹などに見出される糸状不完全菌類の一種で醤油、味噌の醸造に用いられる菌である。本発明の動物用飼料添加剤においては、下記に詳述する酸性酵素のうち少なくとも一種、好ましくは酸性アミラーゼを産生する能力を有していて、動物に摂食させる上で安全なものであれば、特に制限なく用いることができる。本発明の動物用飼料添加剤においては、市販されている菌株を用いてもよく、このような菌としてアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株を好ましく用いることができる。ＩＫ−０５０７４株は、各種発酵食品から分離された株で、平成１８年２月１５日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７９８として寄託され、平成１８年６月２０日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６２２が付与されている。【００１７】
ＩＫ−０５０７４株の菌学的性質は以下のとおりである。
（１）コロニーの性状（Ｃｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ寒天培地（２５℃で７日間培養））
大きさは直径５０〜６０ｍｍ、色は黄から緑、時間の経過により褐色がかった色に変化する。菌糸体は目立たず、裏面は無色である。
（２）形態
分生子柄：薄壁〜厚壁、滑面〜わずかに粗面であり、直径は２０μｍ以下、長さは２ｍｍ以下、頂のうは直径４０〜５０μｍ、８０μｍ以下の球形。
基底梗子：大きな分生子柄のほとんどにおいて存在し、長さは１２μｍ以下。
フィアライド：アンプル型、長さは８〜１２μｍ、短い頸部を有する。
分生子：直径５〜６μｍの球形、色は黄から緑、表面は滑面〜微細な粗面。【００１８】
以上より、ＩＫ−０５０７４株は、アスペルギルス・オリゼー（Aspergillus oryzae）に帰属すると推定された。【００１９】
また、本発明の動物用飼料添加剤においては、ＩＫ−０５０７４株の変異株を用いることもできる。ＩＫ−０５０７４株の変異株は、ＩＫ−０５０７４株を自然変異させたり、化学的変異剤や紫外線等で変異処理したりして得られた菌株からＩＫ−０５０７４株と同じ酸性酵素を産生する能力を有する菌株を選抜して得ることができる。また、酸性酵素を産生する能力に加え、ＩＫ−０５０７４株と同じ抗菌活性、殺原虫活性、胆汁酸耐性、耐酸性の少なくとも一つをさらに有するＩＫ−０５０７４株の変異株を用いることも好ましい。また、さらに上記以外の菌学的性質もＩＫ−０５０７４株と同様である変異株を用いることも好ましい。【００２０】
また、本発明の動物用飼料添加剤においては、例えば土壌、麹、食品、穀物かすなどから単離したアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼーのうち、酸性酵素を産生する能力を有している菌株を単離して用いてもよい。【００２１】
酸性酵素を産生する能力とは、菌体を培養して得られた培養物中に、酸性酵素活性を検出することができる程度に酸性酵素を産生することをいう。培養物の酸性酵素活性の測定は、常法に従って行うことができる。【００２２】
本発明の動物用飼料添加剤に含まれる酸性酵素は、上記菌が産生する消化酵素であることが好ましく、胃腸内の酸性条件下において失活せずに活性を有するものであれば特に制限されないが、中でも最適ｐＨを２．５〜５．５に有するものが好ましい。例えば、酸性のα−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、タカジアスターゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、リボヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、リパーゼなどを挙げることができ、本発明の動物用飼料添加剤は、これらのうち一種又は二種以上を含有する。この中でも特に、家畜の飼料成分のうち主な成分の一つであるデンプンを分解する酸性アミラーゼを含むことが好ましい。本発明の動物用飼料添加剤に含まれる酸性アミラーゼは、デンプンを加水分解する酸性酵素であれば特に制限されず、例えば、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼなどが挙げられる。この中でも最適ｐＨを３付近に有する耐酸性α−アミラーゼを好ましく挙げることができる。
本発明の動物用飼料添加剤は、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼーが産生する酸性酵素のうち少なくとも一種を含んでいればよいが、さらに他の菌種や他の生物種由来の酵素を含んでいてもよい。【００２３】
本発明の動物用飼料添加剤の酸性酵素活性は、以下の範囲となるようにすればよい。動物用飼料添加剤１ｇ当たりの酸性酵素活性の総和は、１２０Ｕ以上、好ましくは１７０Ｕ以上、さらに好ましくは２２０Ｕ以上、さらに好ましくは２７０Ｕ〜５４００Ｕである。酸性酵素活性の総和は、好ましくは酸性アミラーゼ活性、酸性プロテアーゼ活性及び酸性カルボキシペプチダーゼ活性の総和である。また、動物用飼料添加剤１ｇ当たりの酸性アミラーゼ活性は、好ましくは１Ｕ以上、さらに好ましくは５Ｕ以上、さらに好ましくは１０Ｕ以上、さらに好ましくは２０〜４００Ｕである。また、動物用飼料添加剤１ｇ当たりの酸性プロテアーゼ活性と酸性カルボキシペプチダーゼ活性の総和は、好ましくは１００Ｕ以上、さらに好ましくは１５０Ｕ以上、さらに好ましくは２００Ｕ以上、さらに好ましくは２５０〜５０００Ｕである。
酸性アミラーゼ、酸性プロテアーゼ及び酸性カルボキシペプチダーゼの活性は、国税庁所定分析法（改正第３回税庁訓令第１号）の固体こうじの分析法のグルコアミラーゼ活性測定法、α−アミラーゼ活性測定法、耐酸性α−アミラーゼ活性測定法、酸性プロテアーゼ活性測定法及び酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定法に準拠して測定すればよい。【００２４】
本発明の動物用飼料添加剤に含有するアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーから選ばれる少なくとも一種のアスペルギルス属菌、並びにこれらの菌が産生する酸性酵素を含む培養物の濃度は、飼料添加剤の酸性酵素活性が上記範囲になるように調節すればよい。通常、十分な量の玄米などの植物性栄養源を用いて２８℃で、７日間程度、上記菌を培養して得られた培養物を０．２５〜２０質量％、好ましくは０．５〜１０質量％、さらに好ましくは１〜５質量％の範囲で添加すればよい。【００２５】
また、本発明に用いる上記アスペルギルス属菌は、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌に対して抗菌活性を有していることが好ましい。
上記病原菌は、通常腸内細菌科に属する。具体的には、病原性大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ属（Salmonella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、クロストリジウム属（Clostridium）に属する細菌や黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）などが挙げられる。病原性大腸菌としては、例えば、エンテロトキシンを産生する大腸菌（毒素原性大腸菌、enterotoxigenic E. coli(ETEC)）、浮腫病菌やＯ１５７などのベロ毒素を産生する腸管出血性大腸菌（Verotoxin-producing E. coli(VTEC)、enterohemorrhagic E. coli）などが挙げられる。サルモネラ属に属する細菌としては、S. pullorum、S. gallinarum、S. typhi、S. typhimurium、S. enteritidis、S. choleraesuis、S. derby、S. dublinなどが挙げられる。カンピロバクター属に属する細菌としては、C. jejuni、C. coli、C. fetusなどが挙げられる。クロストリジウム属に属する細菌としては、C. perfringens、C. botulinum、C. difficileなどが挙げられる。本発明の動物用飼料添加剤に含まれるアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼーは特にサルモネラ属細菌、中でもS. enteritidis及びクロストリジウム属細菌、中でもC. perfringens、浮腫病菌などの大腸菌、S. aureusに対して高い抗菌活性を有する。【００２６】
病原菌に対して抗菌活性を有するとは、病原菌と同一の培地に接種した場合に、病原菌の増殖を抑制する能力を有していることをいう。抗菌活性を有するアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼーは、例えば、土壌、麹などの分離源をSalmonella enteritidis（ＳＥ）、Clostridium perfringens（ＣＰ）、Escherichia coli（ＥＣ）、Staphylococcus aureus（ＳＡ）などの病原菌を接種した寒天培地に添加し、培養を行った後、阻止円を形成した菌体を分離することにより得ることができる。このようにして得た菌は、上述した病原菌の増殖を抑制する能力を有しているため、動物に投与することにより、動物の腸内感染症を予防・治療することができる。
また、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌の増殖が抑制されていることは、例えば動物の盲腸内容物や糞中の病原菌の菌体濃度（生菌数）を測定することなどにより確認することができる。【００２７】
また、本発明に用いる上記アスペルギルス属菌は、動物の腸内感染症を引き起こすコクシジウムに対して殺原虫活性を有していることが好ましい。
コクシジウムとは、胞子虫類（Sporozoasida亜綱）に属する原虫をいう。具体的にはEimeria属、Isospora属、Toxoplasma属、Cryptosporidium属などが挙げられる。Eimeria属に属する原虫としては、E. tenella、E. necatrix、E. acervulina、E. maxima、E. mitis、E. zuernii、E. bovisなどが挙げられる。Isospora属に属する原虫としては、I. suis、I. belli、I. hominisなどが挙げられる。Toxoplasma属に属する原虫としては、T. gondiiなどが挙げられる。Cryptosporidium属に属する原虫としては、C. parvumなどが挙げられる。本発明の動物用飼料添加剤は、特に、E. tenella、E. zuerniiによる感染症に対して好適に用いることができる。【００２８】
コクシジウムに対して殺原虫活性を有するとは、コクシジウムのオーシストと菌の培養物を共存させた場合に、オーシストの発芽・増殖を抑制し、好ましくはオーシストを減少させる能力を有していることをいう。具体的には、オーシストの細胞壁を変形、溶解し、オーシストを崩壊させる能力を有していることをいう。オーシストの崩壊や細胞壁の状態は、顕微鏡を用いて観察すればよい。
コクシジウムに対する殺原虫活性を有するアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼーは、例えば、以下の方法により得ることができる。土壌、麹などの分離源をE. tenellaやE. zuerniiのオーシストを懸濁させた滅菌水を入れたシャーレに加え、３７℃で培養を行い、１〜７日間観察を行う。オーシストの変形若しくは溶解が認められたシャーレから菌体を分離し、これを再度、E. tenella やE. zuerniiのオーシストを懸濁させた滅菌水を入れたシャーレに加え、３７℃で培養を行い、オーシストの変形若しくは溶解を確認する。このようにしてシャーレに含まれる菌を培養し、それぞれアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼーに属する菌を選ぶことにより、本発明に用いるアスペルギルス属菌を得ることができる。このようにして得た菌を動物に投与することにより、動物の腸内コクシジウム感染症を予防・治療することができる。【００２９】
また、コクシジウムの増殖が抑制されているかについては、例えば動物の盲腸内容物や糞中のコクシジウムのオーシストを顕微鏡下で観察することなどにより確認することができる。【００３０】
本発明の動物用飼料添加剤に含まれるアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼーは、胃酸や胆汁酸に対する耐性を有しているものが好ましい。これにより、動物の腸内でも菌体が有用な酸性酵素を産生し、酸性酵素による消化補助の機能が持続すると考えられる。また、これらのアスペルギルス属菌が上述したような病原菌に対する抗菌活性を有している場合には、動物の腸内感染症を引き起こす病原菌の増殖を抑制し、腸内フローラのバランス改善にも寄与する。胃酸や胆汁酸に対して耐性を有するとは、通常の消化器官内の条件において菌が死滅することなく、腸まで到達することをいう。通常、動物の胃内部は空腹時にはｐＨ２あるいはそれ以下に達することがあるが、食物を摂取した状態では、胃内部のｐＨは３．５〜６の範囲で空腹時よりも高い。従って、本発明の飼料添加剤に用いることができる耐酸性を有する菌株は、例えば、分離源をｐＨ３．５で２時間程度処理した場合に、生存する能力を有する菌株を選抜することで得ることができる。さらに、このようにして選抜した菌をデオキシコール酸濃度１０ｇ／ｌの存在下で２４時間程度処理して、生存する能力を有する菌株を選抜することにより、本発明の飼料添加剤に用いるのに適した胃酸や胆汁酸に対する耐性を有している菌株を得ることができる。また、菌が死滅せず腸まで到達していることは、例えば、動物の排泄物中の菌体の濃度を測定するなどにより確認することができる。【００３１】
本発明の動物用飼料添加剤は、上述した菌種のうち、一種の菌株を単独で含有することもできるし、二種以上の菌株を組み合わせて含有することもできる。この中でも、アスペルギルス・ソーヤ及びアスペルギルス・オリゼーの少なくとも一種を含有することが好ましい。【００３２】
本発明の動物用飼料添加剤に含有するアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーの菌体濃度は、飼料添加剤を動物に投与した際に、菌体が消化器官内で死滅しない範囲であればよく、通常は、上記酸性酵素活性を有する飼料添加剤を製造するのに適当な濃度の菌体を培地に接種して培養し、最終的に酸性酵素活性を上記値に調節すればよい。【００３３】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーは、通常の培養条件で培養することにより酸性酵素を産生する。例えば、培養温度は２５℃〜４０℃で行うことができるが、通常は２８〜３２℃で培養することが好ましい。また、培養方法は、往復動式振とう培養、ジャーファーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができるが、上記菌体が有する酸性酵素産生遺伝子の中には、固体培地においてのみ発現する遺伝子も存在するため、本発明においては固体培養法を用いることが好ましい。【００３４】
培養に用いる培地成分は、動物性又は植物性の何れを用いてもよいが、植物性の栄養源を含有することが好ましく、例えば、玄米、フスマ、米ぬか、大豆、大麦などを含有することが好ましい。この中でも、特に玄米を栄養源とすることが好ましい。これにより、酸性アミラーゼなどの酸性酵素の産生効率を高めることができる。
また、その他の炭素源としてグルコース、スクロース、糖蜜などの糖類、また窒素源としてアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や硝酸塩等を添加することもできる。【００３５】
上記のようにして得たアスペルギルス属菌の培養物は、乾燥しておくことが好ましい。また、保存性を高めるための任意成分をさらに添加するなどの加工をして、品質安定性を高めることも好ましい。
乾燥方法は、特に制限されるものではなく、例えば、通風乾燥、自然乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などにより行うことができるが、この中でも通風乾燥が好ましく用いられる。また、凍結乾燥を用いることもできるが、その際には、保護剤を添加してもよい。保護剤の種類は、特に制限されないが、スキムミルク、グルタミン酸ナトリウム及び糖類から一種又は二種以上を選択して用いるのが好ましい。また、糖類を用いる場合にその種類は特に制限されないが、グルコースやトレハロースを用いるのが好ましい。
さらに、乾燥後は、得られた乾燥物に、脱酸素剤、脱水剤を加えて、ガスバリアー性のアルミ袋に入れて密封し、室温から低温で貯蔵することが好ましい。これにより、菌体を長期間生きたままで保存することが可能となる。【００３６】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス・ズブチリスは、バージーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology）第９版（１９９４）において「バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）」に分類される細菌であれば、特に制限されない。このような菌として、例えばバチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株、ＮＢＲＣ３００９株、ＮＢＲＣ３０２５株、ＮＢＲＣ３１０８株、及びＮＢＲＣ３３３６株などを用いることができる。ＤＢ９０１１株は、通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現在は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に１９９１年５月２１日付で、ＦＥＲＭ ＢＰ−３４１８として寄託されている。なおＤＢ９０１１株は寄託時にはバチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）に分類されたが、その後バチルス・ズブチリスに帰属することが確認されている。また、ＮＢＲＣ３００９株、ＮＢＲＣ３０２５株、ＮＢＲＣ３１０８株、ＮＢＲＣ３３３６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）に登録されている株である。【００３７】
ＤＢ９０１１株の菌学的性質は以下の通りである。【００３８】
【表１】
2008023580.tif 000002
【００３９】
形態：
菌体幅０．７〜０．８μｍの桿菌である。楕円形の芽胞がやや中央に存在し、菌体を膨脹しない。運動性はあり、Ｒ型コロニーを形成する。嫌気性条件下において生育しない。【００４０】
各培地における生育状態：
（１）ＤＨＬ寒天培地：生育せず。
（２）マッコンキー寒天培地：発育せず。
（３）マンニット食塩培地：良好な発育。光沢あり。コロニーの表面にしわはなく、コロニーの色は黄色である。
（４）普通寒天培地：良好な発育。光沢なし。コロニーの表面にしわがあり、コロニーの色は白である。
（５）ハートインフージョン寒天培地：良好な発育。光沢なし。コロニーの表面にしわがあり、コロニーの色は白である。
（６）血液寒天培地（１０％緬羊血液加）
良好な発育。光沢なし。コロニーの表面にしわがあり、コロニーの色は白である。
（７）ＰＤＡ培地：良好な発育。光沢なし。コロニーの表面にしわがあり、コロニーの色は白である。【００４１】
生理学的性質：
グラム反応：    ＋
ゼラチン試験：
生育状態；      全面液化
ゼラチン液化；  ＋
リトマスミルク：
反応；          酸
状態；          凝固
硝酸塩還元：      ＋
脱窒反応：        −
ＭＲテスト：      −
インドールの生成：
硫化水素の生成：
クエン酸の利用（クリステンゼン）：＋
ウレアーゼ：      −
オキシダーゼ：    ＋
カタラーゼ：      ＋
生育の範囲：
ｐＨ；          ４〜９
温度；          ２５〜５０℃
ＯＦテスト：        発酵及びガス発生（ブドウ糖分解によるもの）【００４２】
糖類の利用性
ガス発生       酸生成
Ｌ−アラビノース        −            ＋
Ｄ−キシロース          −            ＋
Ｄ−グルコース          ＋            ＋
Ｄ−マンノース          −            ＋
Ｄ−フラクトース        −            ＋
Ｄ−ガラクトース        −            ＋
麦芽糖（マルトース）    −            ＋
ショ糖（シュークロース）−            ＋
乳糖（ラクトース）      −            ＋
トレハロース            −            ＋
Ｄ−ソルビット          −            ＋
Ｄ−マンニット          −            ＋
イノシット              −            ＋
グリセリン              −            ＋
デンプン                −            ＋【００４３】
エスクリンの分解：            ＋
マロン酸の利用：
アルギニンの分解：            ＋
リジンの脱炭酸反応：          ＋
尿素分解：                    ±
アフラトキシン分解：          ＋
オルニチンの脱炭酸反応：      −
コアグラーゼ：                −
溶血性：                      ＋
塩化ナトリウムの耐性：        １０％以下
シアン化カリウムの耐性：      発育可能
レシチナーゼ：                −【００４４】
また、本発明の動物用飼料添加剤には、バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株、ＮＢＲＣ３００９株、ＮＢＲＣ３０２５株、ＮＢＲＣ３１０８株、ＮＢＲＣ３３３６株を自然変異させたり、化学的変異剤や紫外線等で変異させたりして得た菌株から、各菌株と同様の菌学的性質を有している菌株を選抜して用いることもできる。バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株の変異株としては、上述した菌学的性質を有している菌株を選抜して用いることが好ましい。【００４５】
本発明の動物用飼料添加剤において、バチルス・ズブチリスの濃度は、２．５×１０7〜２×１０9ＣＦＵ／ｇ、好ましくは５×１０7〜１×１０9ＣＦＵ／ｇ、さらに好ましくは１×１０8〜５×１０8ＣＦＵ／ｇである。【００４６】
また、本発明の動物用飼料添加剤において、バチルス・ズブチリスの濃度は、１Ｕの酸性酵素活性の総和を示す動物用飼料添加剤当たり２．０×１０3〜５．０×１０6ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０4〜１．０×１０6ＣＦＵとなるようにしたり、１Ｕの酸性アミラーゼ活性を示す動物用飼料添加剤当たり１．０×１０5〜２．５×１０8ＣＦＵ、好ましくは５．０×１０5〜５．０×１０7ＣＦＵとなるようにしたり、１Ｕの酸性プロテアーゼ活性と酸性カルボキシペプチダーゼ活性の総和を示す動物用飼料添加剤当たり２．０×１０3〜５．０×１０6ＣＦＵ、好ましくは１．０×１０4〜１．０×１０6ＣＦＵとなるようにすることもできる。【００４７】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス・ズブチリスは、上記アスペルギルス属菌及び該菌が産生する酸性酵素の存在下で増殖する能力を有していることが好ましい。【００４８】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス・ズブチリスは、胆汁酸耐性であることが好ましい。
「胆汁酸耐性である」とは、高濃度の胆汁酸を含有する培地において、発芽・増殖する能力を有する胞子を形成することをいう。
胆汁酸とは、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類の胆汁中に広く見出される４環構造のステロイドをいい、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸及びウルソデオキシコール酸が含まれる。通常、動物の体内では、胆汁酸は、胆汁中でグリシンやタウリンとアミド結合した抱合型として存在し、ナトリウム塩となっている。本明細書において単に「胆汁酸」という場合は、上記胆汁酸及びこれらの塩並びにこれらの抱合体を含む。【００４９】
高濃度の胆汁酸を含有する培地とは、例えば、新鮮胆汁を１０倍に濃縮・乾固した胆汁末（Ｏｘｇａｌｌ、Ｄｉｆｃｏ製）を含む培地であって、胆汁末の濃度が、０．３質量％以上、好ましくは１質量％以上、さらに好ましくは３質量％以上であるものが挙げられる。また、「発芽・増殖する能力を有する」とは、上記のような高濃度の胆汁酸を含有する培地に胞子を接種し、胆汁酸濃度以外の条件をバチルス・ズブチリスの培養に好適な条件にした場合に、細菌が発芽し、増殖分裂を再開し、コロニーが形成されることをいう。【００５０】
胆汁酸耐性であるバチルス・ズブチリスは、例えば、以下のようにして得ることができる。バチルス・ズブチリスを含む分離源を胞子形成に適した条件で培養し、胞子を形成させる。得られた胞子を、上記高濃度の胆汁酸添加培地に接種し、培養を行った後、形成したコロニーを分離する。このコロニーの中から、バチルス・ズブチリスの菌学的性質を有するものを選抜する。【００５１】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス・ズブチリスは、さらに耐酸性であることが好ましい。このような細菌を用いることにより、胃内部においても細菌が死滅することなく、腸まで到達する。「耐酸性である」とは、細菌を動物に投与した場合に、胃内部の条件下（食物を摂取した状態で通常ｐＨ３．５〜６）でも死滅せず、腸に達した場合に増殖可能な程度の菌数を維持していることをいう。バチルス・ズブチリスの胞子は通常耐酸性であるため、胞子を用いる場合は、特に問題とならない。【００５２】
本発明の動物用飼料添加剤は、バチルス・ズブチリスの一種の菌株を単独で含有することもできるし、二種以上の菌株を組み合わせて含有することもできる。この中でも、特にＤＢ９０１１株を単独で、又は他の菌株と組み合わせて用いることが好ましい。【００５３】
本発明の飼料添加剤に用いるバチルス・ズブチリスを培養する方法は特に制限されず、細菌の性質に応じた適当な条件下で常法により行うことができる。例えば、培養温度は２０〜４０℃で行うことができるが、通常は３０〜３７℃で培養することが好ましい。また、培養方法は、静置培養、往復動式振とう培養、回転動式振とう培養、ジャーファーメンター培養などによる液体培養法や固体培養法を用いることができる。
培養に用いる培地成分も特に制限されず、炭素源としてグルコース、ガラクトース、ラクトース、アラビノース、マンノース、シュークロース、デンプン、デンプン加水分解物、糖蜜などの糖類、クエン酸などの有機酸類、グリセリンなどのアルコール類を、窒素源としてアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類を、また、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄などの無機塩類、ペプトン、大豆粉、脱脂大豆粕、肉エキス、酵母エキス等を用いることができる。【００５４】
本発明の動物用飼料添加剤に用いるバチルス・ズブチリスは、保存安定性、耐酸性の観点から、胞子の状態であることが好ましい。胞子の状態では、熱、乾燥に強いため、飼料添加剤を製造する際に十分に乾燥させることができ、保存安定性が向上する。細菌に胞子を形成させるためには、培養の周期において、培地の組成、培地のｐＨ、培養温度、培養湿度、培養する際の酸素濃度などの培養条件を、その胞子形成条件に適合させるように調整すればよい。このような方法として、例えば、Schaeffer, P., J. Millet, J.P. Aubert, 「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンス(Proceedings of the National Academy of Science)」米国，１９６５年，第５４巻，ｐ． ７０４−７１１に記載されている方法が挙げられる。【００５５】
また、上記の方法により得たバチルス・ズブチリスの培養物や胞子は、保存性の観点から乾燥粉末としておくことが好ましい。乾燥は、例えば水分含有量が２０質量％以下となるように行うことが好ましい。乾燥及び保存の方法は、アスペルギルス属菌の培養物の乾燥と同様である。【００５６】
本発明の動物用飼料添加剤は、上述したアスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーのうち少なくとも一種のアスペルギルス属菌及び該菌が産生する酸性酵素を含む培養物の全部又は一部と、バチルス・ズブチリスの菌体とを混合することによって得ることができる。【００５７】
また、本発明の動物飼料添加剤は、任意成分をさらに添加することができる。これらの任意成分は、飼料成分として安全が認められており、上記アスペルギルス属菌及びバチルス・ズブチリスを死滅させず、かつ酸性酵素を失活させないものであれば、特に制限なく用いることができる。例えば、β−グルカン、グルコマンナン、マンナンオリゴ糖、海藻などの免疫賦活剤、グルコン酸、γアミノ酪酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、パントテン酸、酪酸などの有機酸などが好ましく挙げられる。【００５８】
本発明の動物用飼料添加剤は、動物に摂取させることにより動物の体重増加を促進することから、成長促進用の動物用飼料添加剤とすることができる。この場合には、特に、飼料添加剤１ｇ当たりの酸性酵素活性の総和が２７０Ｕ以上、酸性アミラーゼ活性が２０Ｕ以上、酸性プロテアーゼ活性と酸性カルボキシペプチターゼ活性の総和が２５０Ｕ以上、バチルス・ズブチリスの濃度が、１×１０8ＣＦＵ／ｇ以上となるように調製することが好ましい。【００５９】
本発明の動物用飼料添加剤は、動物に摂取させることにより腸内感染症などを予防することから、腸内感染症の予防・改善用の動物用飼料添加剤とすることができる。この場合には、特に、飼料添加剤１ｇ当たりの酸性酵素活性の総和が５４０Ｕ以上、酸性アミラーゼ活性が４０Ｕ以上、酸性プロテアーゼ活性と酸性カルボキシペプチダーゼ活性の総和が５００Ｕ以上、バチルス・ズブチリスの濃度が、２．５×１０8ＣＦＵ／ｇ以上となるように調製することが好ましい。【００６０】
また、本発明の動物用飼料添加剤は、安全性の観点から麹酸の含有濃度が低いことが好ましい。通常は、麹酸の含有濃度が０．１ｍｇ／ｌ以下であることが好ましく、０．０１ｍｇ／ｌ以下であることがさらに好ましい。【００６１】
本発明の飼料は、本発明の動物用飼料添加剤を飼料全量に対して、乾燥状態で０．０１〜１．０質量％、好ましくは０．０２〜０．５質量％、さらに好ましくは０．０４〜０．２５質量％含有することを特徴とする。
また、本発明の飼料１ｋｇ当たりの酸性酵素活性の総和は、１２Ｕ以上、好ましくは１７Ｕ以上、さらに好ましくは２２Ｕ以上、さらに好ましくは２７〜５４０００Ｕである。また、バチルス・ズブチリスの濃度は２．５×１０6〜２．０×１０10ＣＦＵ／ｋｇ、好ましくは５．０×１０6〜１．０×１０10ＣＦＵ／ｋｇ、さらに好ましくは１．０×１０7〜５．０×１０9ＣＦＵ／ｋｇである。また、飼料１ｋｇ当たりの酸性アミラーゼ活性は、好ましくは０．１Ｕ以上、さらに好ましくは０．５Ｕ以上、さらに好ましくは１Ｕ以上、さらに好ましくは２〜４０００Ｕである。また、飼料１ｋｇ当たりの酸性プロテーゼ活性と酸性カルボキシペプチダーゼ活性の総和は、好ましくは１０Ｕ以上、さらに好ましくは１５Ｕ以上、さらに好ましくは２０Ｕ以上、さらに好ましくは２５〜５００００Ｕである。【００６２】
本発明の飼料は、本発明の動物用飼料添加剤を、通常用いられている飼料の成分に添加することにより製造することができる。飼料の種類や成分は、本発明の動物用飼料添加剤に含まれる菌体が死滅せず、かつ酸性酵素が失活しない限りにおいて特に制限されず、通常、家畜の飼料やペットフード、動物用サプリメントなど、動物の飼料として用いられているものに添加・混合すればよい。
また、本発明の飼料は、動物用飼料添加剤を、乾燥状態のまま飼料成分に添加し、混合してもよいが、混合を容易にするために液状又はゲル状の形態にして使用することもできる。この場合は、水、大豆油、菜種油、コーン油などの植物油、液体動物油、ポリビニルアルコールやポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物を液体担体として用いることができる。また、飼料中における菌体濃度の均一性を保つために、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、カゼインナトリウム、アラビアゴム、グアーガム、タマリンド種子多糖類などの水溶性多糖類を配合することも好ましい。また、雑菌の繁殖を防ぐために有機酸を配合することも好ましい。【００６３】
また、本発明の飼料は、アスペルギルス属菌の増殖のための栄養源を含む固体培地で、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・タマリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ニガー及びアスペルギルス・オリゼーから選ばれる少なくとも一種のアスペルギルス属菌を培養し、得られた培養物、及びバチルス・ズブチリスを別々に飼料成分に混合し、飼料の酸性酵素活性及びバチルス・ズブチリスの濃度を上記範囲に調節することにより製造することもできる。【００６４】
本発明の飼料は、動物の成長促進のための飼料とすることができる。また、上述したアスペルギルス属菌がさらに動物の腸内感染症を引き起こす病原菌に対する抗菌活性及び／又はコクシジウムに対する殺原虫活性を有している場合には、病原菌及び／又はコクシジウムによる腸内感染症を予防・治療するための飼料とすることができる。【００６５】
本発明の飼料を摂取させる動物の種類は、特に制限されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類などが挙げられる。この中でも、特に家禽、家畜に対して好適に用いることができる。家禽としては、ニワトリ、アヒル、ウズラ、シチメンチョウなどに好適であり、家畜としては、豚、牛、羊、兎などに好適である。動物に摂取させる飼料の量は、動物の種類、体重、年齢、性別、使用目的、健康状態、飼料の成分などにより適宜調節することができる。【００６６】
飼料を摂取させる方法も、動物の種類に応じて、通常用いられる方法をとることができる。
【実施例】
【００６７】
＜１＞アスペルギルス属菌の培養
ポテトデキストロース寒天培地のｐＨを５に調整し、１２１℃で１５分間殺菌した。この寒天培地の温度が６０℃まで低下したところでデオキシコール酸ナトリウムを培地１Ｌ当たり１０ｇの濃度で添加し、株式会社秋田今野商店（日本国秋田県大仙市刈和野２４８）に保存されているアスペルギルス属菌を接種したところ、アスペルギルス・ソーヤ（Aspergillus sojae）、アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamarii）、アスペルギルス・フォエティダス（Aspergillus foetidus）及びアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が培地に良好に生育した。その中でも、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株、アスペルギルス・タマリ ＡＯＫ ４３株、アスペルギルス・フォエティダス ＡＯＫ Ｎ４５８６株、及びアスペルギルス・ニガー ＡＯＫ Ｂ６５０株が特に良好に生育した。【００６８】
上記と同様にデオキシコール酸ナトリウムを含有する培地に、各種発酵食品を分離源として多くのアスペルギルス属菌を接種し、培地に生育してきた菌株のうち、最も生育の良好な株を選抜した。この株を、アスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株とし、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託した。
ＩＫ−０５０７４株の菌学的性質は、上述したとおりである。【００６９】
玄米を固体培地として、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株、アスペルギルス・タマリ ＡＯＫ４３株、アスペルギルス・フォエティダス ＡＯＫ Ｎ４５８６株、アスペルギルス・ニガー ＡＯＫ Ｂ６５０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の培養を行った。すなわち、玄米１００ｇを一昼夜水に浸けて膨潤させた後、蓋に無菌フィルターの付いた直径１４センチ、深さ１０センチのポリカーボネート製容器に２センチの厚さに入れ、オートクレーブにて１２１℃で１５分間殺菌した。この容器に上記の各菌体を接種して２８℃で５日間培養し、種菌を製造した。
次いで、上記と同様に膨潤させた玄米を３０×４０×１０センチのステンレスバットに厚さ１．５センチに積層し、２０×２５センチのフィルターで覆った通気口を有する蓋をかけ、大型オートクレーブに入れて１２１℃で２５分間殺菌した。このバットを冷却した後、あらかじめ培養しておいた上記種菌を全量接種した。このバットを２８℃の孵卵器に入れ、７日間培養した。
培養後、３５℃で通風乾燥し、ジェットミルで粉砕し、それぞれの菌種について固体培養物を得た。【００７０】
それぞれの固体培養物１ｇ当たりの耐酸性α−アミラーゼ活性、及び酸性プロテアーゼ活性と酸性カルボキペプチダーゼ活性の総和を測定した。各培養物１ｇ当たりの上記酵素活性を表２に示す。
なお、上記酸性酵素の測定は、国税庁所定分析法（改正第３回税庁訓令第１号）の固体こうじの分析法の耐酸性α−アミラーゼ活性測定法、酸性プロテアーゼ活性測定法及び酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定法に準拠して行った。【００７１】
【表２】
2008023580.tif 000003
【００７２】
＜２＞アスペルギルス属菌の培養物の抗菌活性の測定
アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株と細菌を共培養することによってこれらのアスペルギルス属菌の細菌に対する抗菌活性を試験した。【００７３】
Salmonella  enteritidis（ＳＥ）については、標準寒天培地（日水製薬（株）製）にて３７℃、２４時間好気培養を行った。平板上に発育したコロニーをかきとり、滅菌生理食塩水に浮遊させた。１Ｌ容の三角フラスコにブレインハートインフュージョンブイヨン「日水」５００ｍｌを作製し、オートクレーブ殺菌後、ＳＥの最終濃度が約１．０×１０4〜１．０×１０5ＣＦＵ／ｍｌとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物を、おのおの５ｇずつ無菌的に投入し、試験例１及び２とし、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを３７℃の恒温器で、好気条件下で緩攪拌培養した。【００７４】
Clostridium  perfringens（ＣＰ）については、アネロパックケンキ（三菱ガス化学(株)製）を用い、卵黄加ＣＷ寒天培地（日水製薬（株）製）にて３７℃で２４時間嫌気培養を行った。平板上に発育したコロニーをかきとり滅菌生理食塩水に浮遊させた。１Ｌ容の三角フラスコにブレインハートインフュージョンブイヨン「日水」５００ｍｌを作製し、オートクレーブ殺菌後、ＣＰの最終濃度が約１．０×１０4〜１．０×１０5 ＣＦＵ／ｍｌとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物を、おのおの５ｇずつ無菌的に投入し、試験例３及び４とし、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを３７℃の恒温器で、アネロパックケンキを用いて嫌気条件下で緩攪拌培養した。【００７５】
試験開始後、０日、３日、７日目においてＳＥ及びＣＰの生菌数測定を実施した。ＳＥの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の０．１ｍｌをＸ−ＳＡＬ寒天培地「日水」に塗布し、３７℃、２４時間好気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。ＣＰの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の０．１ｍｌを卵黄加ＣＷ寒天培地（日水製薬（株）製）に塗布し、アネロパックケンキを用いて３７℃、２４時間嫌気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。
表３にＳＥの生菌数を、表４にＣＰの生菌数を示す。【００７６】
【表３】
2008023580.tif 000004
【００７７】
【表４】
2008023580.tif 000005
【００７８】
試験例１及び２に示すように、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の固体培養物は、ＳＥに対する抗菌活性を示した。なお、対照区においては試験７日目まで菌数の上昇が認められ、７日目に２．９×１０8ＣＦＵ／ｍｌを示した。
試験例３及び４に示すように、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株及びアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の固体培養物は、ＣＰに対する抗菌活性を示した。対照区においては試験７日目まで菌数の上昇が認められ、７日目に１．２×１０6ＣＦＵ／ｍｌを示した。【００７９】
Escherichia coli(ＥＣ)については、標準寒天培地（日水製薬（株）製）にて３７℃で２４時間好気培養した。平板上に発育したコロニーをかき取り、滅菌生理食塩水に浮遊させた。１Ｌ容の三角フラスコにブレインハートインフュージョンブイヨン「ニッスイ」（日水製薬（株）製）５００ｍｌを作製し、オートクレーブ殺菌後、ＥＣの最終濃度が約１．０×１０5〜１．０×１０6ＣＦＵ／ｍｌとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物を、おのおの５ｇずつ無菌的に投入し、試験例５及び６とし、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを３７℃の恒温器で、好気条件下で緩攪拌培養した。【００８０】
Staphylococcus aureus（ＳＡ）については、標準寒天培地（日水製薬（株）製）にて３７℃で２４時間好気培養した。平板上に発育したコロニーをかき取り、滅菌生理食塩水に浮遊させた。１Ｌ容の三角フラスコにブレインハートインフュージョンブイヨン「ニッスイ」（日水製薬（株）製）５００ｍｌを作製し、オートクレーブ殺菌後、ＳＡの最終濃度が約１．０×１０5〜１．０×１０6ＣＦＵ／ｍｌとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物を、おのおの５ｇずつ無菌的に投入し、試験例７及び８とし、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを３７℃の恒温器で、好気条件下で緩攪拌培養した。【００８１】
試験開始後、０日、３日、７日目においてＥＣ及びＳＡの生菌数測定を実施した。ＥＣの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の０．１ｍｌをクロモカルトコリフォームアガー「Ｍｅｒｃｋ」（Ｍｅｒｃｋ製）に塗布後、３７℃、２４時間好気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。ＳＡの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の０．１ｍｌを卵黄加マンニット食塩培地「栄研」（栄研器材（株）製）に塗布後、３７℃、４８時間好気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。
表５にＥＣの生菌数を、表６にＳＡの生菌数を示す。【００８２】
【表５】
2008023580.tif 000006
【００８３】
【表６】
2008023580.tif 000007
【００８４】
試験例５及び６に示すように、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の固体培養物は、ＥＣに対する抗菌活性を示した。なお、対照区においては試験３日目で最も高い菌数が認められ、３日目で４．３×１０8ＣＦＵ／ｍｌ、７日目に１．７×１０7ＣＦＵ／ｍｌを示した。
試験例７及び８に示すように、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の固体培養物は、ＳＡに対する抗菌活性を示した。なお、対照区においては試験３日目で最も高い菌数が認められ、３日目で４．２×１０8ＣＦＵ／ｍｌ、７日目に７．２×１０7ＣＦＵ／ｍｌを示した。【００８５】
Bacillus subtilis ＤＢ９０１１株、ＮＢＲＣ３００９株、ＮＢＲＣ３０２５株、ＮＢＲＣ３１０８株、及びＮＢＲＣ３３３６株については、標準寒天培地（日水製薬（株）製）にて３７℃で２４時間好気培養した。平板上に発育したコロニーをかき取り、滅菌生理食塩水に浮遊させた。１Ｌ容の三角フラスコにブレインハートインフュージョンブイヨン「ニッスイ」（日水製薬（株）製）５００ｍｌを作製し、オートクレーブ殺菌後、ＤＢ９０１１株、ＮＢＲＣ３００９株、ＮＢＲＣ３０２５株、ＮＢＲＣ３１０８株、及びＮＢＲＣ３３３６株の最終濃度が約１．０×１０4〜１．０×１０5ＣＦＵ／ｍｌとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物を、おのおの５ｇずつ無菌的に投入し、試験例９〜１８とし、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを３７℃の恒温器で、好気条件下で緩攪拌培養した。【００８６】
試験開始後、０日、３日、７日目においてＤＢ９０１１株、ＮＢＲＣ３００９株、ＮＢＲＣ３０２５株、ＮＢＲＣ３１０８株、およびＮＢＲＣ３３３６株の生菌数及び胞子数測定を実施した。上記株の生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の０．１ｍｌを標準寒天培地（日水製薬（株）製）に塗布後、３７℃、４８時間好気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。上記株の胞子数測定方法は以下の通りである。まず、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で１０倍に希釈し、７０℃で３０分加熱処理を行った。冷却後、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の０．１ｍｌを標準寒天培地（日水製薬（株）製）に塗布後、３７℃、４８時間好気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。
ＤＢ９０１１株の生菌数を表７、胞子数を表８に示す。【００８７】
【表７】
2008023580.tif 000008
【００８８】
【表８】
2008023580.tif 000009
【００８９】
ＮＢＲＣ３００９株の生菌数を表９、胞子数を表１０に示す。【００９０】
【表９】
2008023580.tif 000010
【００９１】
【表１０】
2008023580.tif 000011
【００９２】
ＮＢＲＣ３０２５株の生菌数を表１１、胞子数を表１２に示す。【００９３】
【表１１】
2008023580.tif 000012
【００９４】
【表１２】
2008023580.tif 000013
【００９５】
ＮＢＲＣ３１０８株の生菌数を表１３、胞子数を表１４に示す。【００９６】
【表１３】
2008023580.tif 000014
【００９７】
【表１４】
2008023580.tif 000015
【００９８】
ＮＢＲＣ３３３６株の生菌数を表１５、胞子数を表１６に示す。【００９９】
【表１５】
2008023580.tif 000016
【０１００】
【表１６】
2008023580.tif 000017
【０１０１】
試験例９〜１８に示すように、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の固体培養物は、Bacillus subtilis ＤＢ９０１１株、ＮＢＲＣ３００９株、ＮＢＲＣ３０２５株、ＮＢＲＣ３１０８株、ＮＢＲＣ３３３６株に対する抗菌活性を示さなかった。【０１０２】
Lactobacillus acidophilus (ＬＡ)については、アネロパックケンキ（三菱ガス化学(株)製）を用い、ＢＣＰ加プレートカウントアガー「ニッスイ」（日水製薬（株）製）にて３７℃で７２時間嫌気培養した。平板上に発育したコロニーをかき取り、滅菌生理食塩水に浮遊させた。１Ｌ容の三角フラスコにＧＡＭブイヨン（日水製薬（株）製）５００ｍｌを作製し、オートクレーブ殺菌後、ＬＡの最終濃度が約１．０×１０3〜１．０×１０4ＣＦＵ／ｍｌとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株及びアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物を、おのおの５ｇずつ無菌的に投入し、試験例１９及び２０とし、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを３７℃の恒温器で、アネロパックケンキを用いて嫌気条件下で緩攪拌培養した。【０１０３】
Bifidobacterium breve（ＢＢ）については、アネロパックケンキ（三菱ガス化学(株)製）を用い、ＢＬ寒天培地（日水製薬（株）製）にて３７℃、４８時間嫌気培養を行った。平板上に発育したコロニーをかきとり滅菌生理食塩水に浮遊させた。１Ｌ容の三角フラスコにＧＡＭブイヨン（日水製薬（株）製）５００ｍｌを作製し、オートクレーブ殺菌後ＢＢの最終濃度が約１．０×１０4〜１．０×１０5 ＣＦＵ／ｍｌとなるよう無菌的に投入した。三角フラスコに、アスペルギルス・ソーヤＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物を、おのおの５ｇずつ無菌的に投入し、試験例２１及び２２とし、麹菌培養物を加えない三角フラスコを対照区とした。おのおのの三角フラスコを３７℃の恒温器で、アネロパックケンキを用いて嫌気条件下で緩攪拌培養した。【０１０４】
試験開始後、０日、３日、７日目においてＬＡ及びＢＢの生菌数測定を実施した。ＬＡの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の０．１ｍｌをＢＣＰ加プレートカウントアガー「ニッスイ」（日水製薬（株）製）に塗布後、アネロパックケンキ（三菱ガス化学(株)製）を用い、３７℃、７２時間嫌気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。ＢＢの生菌数測定方法は、採取した培養液を、滅菌生理食塩水で１０倍段階希釈後、それぞれの希釈段階液の０．１ｍｌをＢＬ寒天培地（日水製薬（株）製）に塗布後、アネロパックケンキ（三菱ガス化学(株)製）を用い、３７℃、４８時間嫌気培養を行い、発育した特徴的なコロニーを計数した。
表１７にＬＡの生菌数を、表１８にＢＢの生菌数を示す。【０１０５】
【表１７】
2008023580.tif 000018
【０１０６】
【表１８】
2008023580.tif 000019
【０１０７】
試験例１９及び２０に示すように、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株及びアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の固体培養物は、ＬＡに対する抗菌活性を示さなかった。
試験例２１及び２２に示すように、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の固体培養物は、ＢＢに対する抗菌活性を示さなかった。【０１０８】
以上の結果より、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株及びアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株は、病原性細菌であるEscherichia coli、Salmonella enteritidis、Staphylococcus aureus、Clostridium perfringensには抗菌活性を示したのに対し、プロバイオティクスとして有望なBacillus subtilisや好ましい腸内細菌であるLactobacillus acidophilus及びBifidobacterium breveには抗菌活性を示さなかった。そこで、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株及び／又はアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株とB. subtilisとを組み合わせることにより、B. subtilisの能力を失わせること無く発揮させることが出来るとともに、腸内細菌として有用なL. acidophilus及びB. breveに悪影響を与えない、新しい動物用飼料添加剤が開発できると考えられた。【０１０９】
＜３＞アスペルギルス属菌の培養物の殺原虫活性の測定
（１）Eimeria tenella防除試験
Eimeria tenellaに自然感染した鶏の糞を集め、オーシストを実体顕微鏡下で分離し、生理食塩水で洗浄した。直径９ｃｍのシャーレに生理食塩水５ｍｌを加え、洗浄したオーシストを約４０００個／ｍｌとなるように投入した。ＡＯＫ ２１０株、ＡＯＫ ４３株、ＡＯＫ Ｎ４５８６株、ＡＯＫ Ｂ６５０株及びＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物を、シャーレ当たり５０ｍｇずつ投入し、おのおの試験例２３〜２７とした。また、麹菌培養物を加えないシャーレを対照区とした。おのおののシャーレを３７℃において振とう（１５０ｒｐｍ）した。７日後に、実体顕微鏡下で、オーシストの個数の測定、細胞壁の変形や溶解の状態の観察を行い、オーシストの減少率及び溶解変性率を算出した。
結果を表１９に示す。【０１１０】
【表１９】
2008023580.tif 000020
【０１１１】
試験例２３〜２７に示すように、ＡＯＫ ２１０株、ＡＯＫ ４３株、ＡＯＫ Ｎ４５８６株、ＡＯＫ Ｂ６５０株及びＩＫ−０５０７４株の固体培養物は、E. tenellaのオーシスト数を減少させたり、オーシスト溶解変性活性を示すことが分かった。特にＡＯＫ ２１０株及びＩＫ−０５０７４株でE. tenellaのオーシストを処理することにより、極めて高いオーシストの減少率及び溶解変性率が得られた。【０１１２】
（２）Eimeria zuernii防除試験
Eimeria zuerniiに自然感染した牛下痢便を集め、オーシストを実体顕微鏡下で分離し、生理食塩水で洗浄した。直径９ｃｍのシャーレに生理食塩水５ｍｌを加え、洗浄したオーシストを約２０００個／ｍｌとなるように投入した。ＡＯＫ ２１０株、ＡＯＫ ４３株、ＡＯＫ Ｎ４５８６株、ＡＯＫ Ｂ６５０株及びＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物を、シャーレ当たり５０ｍｇずつ投入し、おのおの試験例２８〜３２とした。麹菌培養物を加えないシャーレを対照区とした。おのおののシャーレを３７℃において振とう（１５０ｒｐｍ）した。７日後に、実体顕微鏡下で、オーシストの個数の測定、細胞壁の変形や溶解の状態の観察を行い、オーシストの減少率及び溶解変性率を算出した。
結果を表２０に示す。【０１１３】
【表２０】
2008023580.tif 000021
【０１１４】
試験例２８〜３２に示すように、ＡＯＫ ２１０株、ＡＯＫ ４３株、ＡＯＫ Ｎ４５８６株、ＡＯＫ Ｂ６５０株及びＩＫ−０５０７４株の固体培養物は、E. zuerniiのオーシスト数を減少させ、さらに高いオーシスト溶解変性活性を示した。特に、ＡＯＫ ２１０株及びＩＫ−０５０７４株でE. zuerniiのオーシストを処理することにより、極めて高いオーシストの減少率及び溶解変性率が得られた。
以上より、上記アスペルギルス属菌は、コクシジウムの防除にも有効であると推測される。【０１１５】
＜４＞バチルス・ズブチリスの培養
下記に示す組成の胞子形成培地を用いてBacillus subtilis ＤＢ９０１１株、Bacillus subtilis ＮＢＲＣ３００９株、Bacillus subtilis ＮＢＲＣ３０２５株、Bacillus subtilis ＮＢＲＣ３１０８株、Bacillus subtilis ＮＢＲＣ３３３６株をそれぞれ３７℃で７２時間液体培養した。得られた培養液を遠心分離し、菌体を集めた。得られた菌体を凍結乾燥した後に粉砕し、胞子粉末を得た。ＤＢ９０１１株、ＮＢＲＣ３００９株、ＮＢＲＣ３０２５株、ＮＢＲＣ３１０８株、及びＮＢＲＣ３３３６株の胞子密度は、おのおの１．０１×１０11ＣＦＵ/ｇ、１．２１×１０11ＣＦＵ/ｇ、１．１５×１０11ＣＦＵ/ｇ、１．０６×１０11ＣＦＵ/ｇ、１．０９×１０11ＣＦＵ/ｇであった。胞子密度は、得られた胞子粉末を適当な濃度まで滅菌水で希釈し、７０℃で３０分加熱することにより栄養細胞のみを死滅させてから普通寒天培地に接種し、形成されたコロニー数を計数する事により測定した。
なお、バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株は、１９９１年５月２１日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−３４１８として寄託されている。また、ＮＢＲＣ３００９株、ＮＢＲＣ３０２５株、ＮＢＲＣ３１０８株、及びＮＢＲＣ３３３６株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構の生物遺伝資源部門(ＮＢＲＣ)にそれぞれ登録されている株である。【０１１６】
胞子形成培地成分1)
Difco nutrient broth      ８．０      ｇ
KCl                       １．０      ｇ
MgSO4・7H2O              ０．２５    ｇ
MnCl2・4H2O              ０．００２  ｇ
pHを7.0に調整し、全量    １，０００ｍｌ
オートクレーブ滅菌後、滅菌済みCaCl2溶液及びFeSO4溶液を、
それぞれ5×10-4M及び 1×10-6Mになるように添加
１）Schaeffer, P., J. Millet, J. P. Aubert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,54, 704-711 (1965)【０１１７】
＜５＞飼養試験−１
（１）飼料添加剤の製造
上記＜１＞で得たアスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株の粉砕固体培養物、アスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物、ＤＢ９０１１株及びＮＢＲＣ３００９株の胞子をそれぞれ乳糖で希釈して異なる濃度の飼料添加剤を作製した（製造例１〜４）。また、ＡＯＫ ２１０株又はＩＫ−０５０７４株の培養物と、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の胞子をそれぞれ組み合わせて乳糖で希釈して異なる濃度の飼料添加剤を作製した（製造例５〜８）。それぞれの飼料添加剤における固体培養物及びバチルス・ズブチリスの添加量を表２１に示す。【０１１８】
【表２１】
2008023580.tif 000022
【０１１９】
（２）鶏ヒナ飼養試験
鶏ヒナの飼料（ＳＤブロイラー前後期用、日本配合飼料(株)製、抗菌性物質無添加飼料）全質量に対して、製造例１〜８の飼料添加剤を０．１質量％となるように混合した。ブロイラー種鶏(銘柄：チャンキー)由来の種卵より孵化した鶏ヒナ１２羽を一群として、各群に上記飼料を３５日間与え、成長試験を行った。不断給餌、自由給水で飼育した。また、乳糖のみを０．１質量％混合した飼料を対照区とし、同様に成長試験を行った。３５日後の各群の鶏ヒナの体重を測定し、それぞれの群の平均値を算出した。
結果を表２２に示す。【０１２０】
【表２２】
2008023580.tif 000023
【０１２１】
アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株又はアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の培養物を１５質量％以上含む製造例１（Ｅ〜Ｇ）及び製造例２（Ｅ〜Ｇ）の飼料添加剤を与えたヒナは、対照区のヒナに比べて顕著な体重増加が認められた。バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の胞子を１．５×１０9ＣＦＵ／ｇ以上含む製造例３（Ｅ〜Ｇ）、製造例４（Ｅ〜Ｇ）の飼料添加剤を与えたヒナは、対照区のヒナに比べて顕著な体重増加が認められた。
一方、ＡＯＫ ２１０株又はＩＫ−０５０７４株の培養物１．０質量％以上と、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株１．０×１０8ＣＦＵ／ｇ以上をそれぞれ組み合わせた製造例５（Ｂ〜Ｇ）、製造例６（Ｂ〜Ｇ）、製造例７（Ｂ〜Ｇ）及び製造例８（Ｂ〜Ｇ）を動物に摂取させた場合に、顕著な体重増加の効果が認められた。これにより、アスペルギルス属菌の培養物とバチルス・ズブチリスを組み合わせる事により、おのおのの有効成分を単独で使用する場合より低い濃度で鶏ヒナの体重増加を促進できる事が分かった。【０１２２】
（３）子豚飼養試験
子豚の飼料全質量（ＳＤ子豚人工乳前後期用標準飼料、日本配合飼料(株)製、抗菌性物質無添加飼料）に対して、製造例１〜８の飼料添加剤を０．１質量％となるように混合した。３週齢の子豚（銘柄：大ヨークシャー）８頭を一群として、各群に上記飼料を３５日間不断給餌、自由給水で与え、成長試験を行った。また、乳糖のみを０．１質量％混合した飼料を対照区とし、同様に成長試験を行った。３５日後の各群の子豚の体重を測定し、それぞれの群の平均値を算出した。
結果を表２３に示す。【０１２３】
【表２３】
2008023580.tif 000024
【０１２４】
アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ ２１０株又はアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の培養物を１５質量％以上含む製造例１（Ｅ〜Ｇ）及び製造例２（Ｅ〜Ｇ）の飼料添加剤を与えた子豚は、対照区の子豚に比べて顕著な体重増加が認められた。バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株を１．５×１０8ＣＦＵ／ｇ以上含む製造例３（Ｅ〜Ｇ）及びＮＢＲＣ３００９株の胞子を１．５×１０8ＣＦＵ／ｇ以上含む製造例４（Ｅ〜Ｇ）の飼料添加剤を与えた子豚は、対照区の子豚に比べて顕著な体重増加が認められた。
一方、ＡＯＫ ２１０株又はＩＫ−０５０７４株の培養物１．０質量％以上とＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の胞子１．０×１０8ＣＦＵ／ｇ以上を組み合わせた製造例５（Ｂ〜Ｇ）、製造例６（Ｂ〜Ｇ）、製造例７（Ｂ〜Ｇ）及び製造例８（Ｂ〜Ｇ）を動物に摂取させた場合に、顕著な体重増加の効果が認められた。これにより、アスペルギルス属菌の培養物とバチルス・ズブチリスを組み合わせる事により、おのおのの有効成分を単独で使用する場合より低い濃度で子豚の体重増加を促進できる事が分かった。【０１２５】
＜６＞飼養試験−２
（１）飼料添加剤の製造
上記＜１＞で得たＡＯＫ ２１０株又はＩＫ−０５０７４株の培養物と、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の胞子を組み合わせて乳糖で希釈して、各成分を異なる比率で含有する飼料添加剤を作製した（製造例９〜１２）。それぞれの飼料添加剤における固体培養物、バチルス・ズブチリスの添加量を表２４に示す。【０１２６】
【表２４】
2008023580.tif 000025
【０１２７】
（２）鶏ヒナ飼養試験
鶏ヒナの飼料全質量（ＳＤブロイラー前後期用、日本配合飼料(株)製、抗菌性物質無添加飼料）に対して、製造例９〜１２の飼料添加剤を０．１質量％となるように混合した。ブロイラー種鶏(銘柄：チャンキー)由来の種卵より孵化した鶏ヒナ１２羽を一群として、各群に上記飼料を３５日間与え、成長試験を行った。不断給餌、自由給水で飼育した。また、乳糖のみを０．１質量％混合した飼料を対照区とし、同様に成長試験を行った。３５日後の各群の鶏ヒナの体重を測定し、それぞれの群の平均値を算出した。
結果を表２５に示す。【０１２８】
【表２５】
2008023580.tif 000026
【０１２９】
アスペルギルス・ソーヤＡＯＫ ２１０株又はアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物と、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の比率は、４質量％：１×１０8ＣＦＵ／ｇ〜１質量％：４×１０8ＣＦＵ／ｇの範囲が最適であった（製造例９（Ｂ〜Ｆ）、製造例１０（Ｂ〜Ｆ）、製造例１１（Ｂ〜Ｆ）、製造例１２（Ｂ〜Ｆ））。これより、１Ｕの耐酸性α−アミラーゼ活性を示す飼料添加剤当たりのバチルス・ズブチリスの濃度は、０．５×１０6〜２．０×１０7ＣＦＵ／ｇの範囲が最適であることが分かった。また、１Ｕの酸性プロテアーゼ及び酸性カルボキシペプチダーゼの総和を示す飼料添加剤当たりのバチルス・ズブチリスの濃度は、４．５×１０4〜８．５×１０5ＣＦＵ／ｇの範囲が最適であることが分かった。【０１３０】
（２）子豚飼養試験
子豚の飼料全質量（ＳＤ子豚人工乳前後期用標準飼料、日本配合飼料(株)製、抗菌性物質無添加飼料）に対して、製造例９〜１２の飼料添加剤を０．１質量％となるように混合した。３週齢の子豚（銘柄：大ヨークシャー）８頭を一群として、各群に上記飼料を３５日間不断給餌、自由給水で与え、成長試験を行った。乳糖のみを０．１質量％混合した飼料を対照区とし、同様に成長試験を行った。３５日後の各群の子豚の体重を測定し、それぞれの群の平均値を算出した。
結果を表２６に示す。【０１３１】
【表２６】
2008023580.tif 000027
【０１３２】
アスペルギルス・ソーヤＡＯＫ ２１０株又はアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物と、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の比率は、４質量％：１×１０8ＣＦＵ／ｇ〜１質量％：４．０×１０8ＣＦＵ／ｇの範囲が最適であった（製造例９（Ｂ〜Ｆ）、製造例１０（Ｂ〜Ｆ）、製造例１１（Ｂ〜Ｆ）、製造例１２（Ｂ〜Ｆ））。【０１３３】
＜７＞鶏ヒナに対する病原菌攻撃試験
（１）Salmonella enteritidis攻撃試験
鶏ヒナの飼料全質量（ＳＤブロイラー前期用、日本配合飼料(株)製、抗菌性物質無添加飼料）に対して、製造例１〜８の飼料添加剤を０．１質量％となるように混合した。ブロイラー種鶏(銘柄：チャンキー)由来の種卵より孵化した鶏ヒナ１２羽を一群として、上記飼料を不断給餌、自由給水で１４日間与えた。乳糖のみを０．１質量％混合した飼料を対照区とし、同様に試験を行った。７日齢で１羽当たり、２．３×１０7ＣＦＵのSalmonella enteritidis(ＳＥ)を経口投与した。１４日齢で盲腸内容物と、総排泄腔を綿棒で拭うことにより糞を採取した。
盲腸内容物のＳＥ生菌数を以下の方法により測定し、感染指数及び防御指数を算出した。
盲腸内容物１ｇを滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて１０倍に希釈し、充分混合して試料原液とした。ついで、試料原液を滅菌生理食塩水を用いて１０倍で段階希釈し、段階希釈液とした。試料原液及び段階希釈液をそれぞれＳＳ寒天平板培地「ニッスイ」（日水製薬(株)製）及びブリリアントグリーン寒天平板培地(Difco Laboratories製)に０．１ｍｌずつ塗沫し、３７℃で２４時間培養し、各平板培地に生育した典型的なＳＥのコロニー数を測定した。さらに、コロニーより釣菌してリジン脱炭酸試験用、ＳＩＭ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬(株)製）及びＴＳＩ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬(株)製）に接種して３７℃で２４時間培養して性状の確認を行った。【０１３４】
この中からＳＥと認められたコロニー数に希釈液の希釈倍率を乗じて盲腸内容物１ｇ当たりのＳＥ生菌数を算出した。この結果を元に、以下のようにして感染指数及び防御指数を算出した。感染指数とは、病原菌の感染率の高さを示す値であり、防御指数とは、対照区の飼料を投与した場合と比較した場合のそれぞれの飼料が病原菌の感染を防御する能力を示す値である。【０１３５】
感染指数：各個体の盲腸内容物中のＳＥ生菌数の対数の平均値（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｇの平均値）
防御指数：対照区の感染指数／各試験区の感染指数【０１３６】
総排泄腔より採取した糞に関しては、以下の方法により個体別に定性培養を行うことによりＳＥの性状を確認した。すなわち、綿棒に付着した糞を１０ｍｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、試料原液とした後、これをＳＳ寒天平板培地及びブリリアントグリーン寒天平板培地に０．１ｍｌずつ塗沫し、３７℃で２４時間培養し、各平板培地に生育した典型的なＳＥのコロニー形成の有無を判定した。さらに、コロニーより釣菌してＬＩＭ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬(株)製）、ＳＩＭ寒天培地及びＴＳＩ寒天培地に接種して３７℃で２４時間培養して性状の確認を行った。
感染指数を表２７に、防御指数を表２８に、総排泄腔採取糞のＳＥの検出個体数を表２９に示す。【０１３７】
【表２７】
2008023580.tif 000028
【０１３８】
【表２８】
2008023580.tif 000029
【０１３９】
【表２９】
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【０１４０】
アスペルギルス・ソーヤＡＯＫ ２１０株又はアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物は単独では２０質量％以上飼料添加剤に添加した場合に、盲腸内容物のＳＥの菌体濃度が低くなり、低いＳＥの感染指数を示した（製造例１（Ｆ、Ｇ）、製造例２（Ｆ、Ｇ））。バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株は単独では２．０×１０9ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加した場合に、盲腸内容物のＳＥの菌体濃度が低くなり、低いＳＥの感染指数を示した（製造例３（Ｆ、Ｇ）、製造例４（Ｆ、Ｇ））。これに対し、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株又はアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株と、バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の組み合わせでは、ＡＯＫ２１０株又はＩＫ−０５０７４株の培養物を２．５質量％以上、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株を２．５×１０8ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加した場合に、ＡＯＫ ２１０株又はＩＫ−０５０７４株を単独で２０質量％以上飼料添加剤に添加した時やＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株を単独で２．０×１０9ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加した時と同程度のＳＥの防除効果が得られた（製造例５（Ｃ〜Ｇ）、製造例６（Ｃ〜Ｇ）、製造例７（Ｃ〜Ｇ）、製造例８（Ｃ〜Ｇ））。さらに、ＡＯＫ２１０株又はＩＫ−０５０７４株を２０質量％以上、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株を２．０×１０9ＣＦＵ／ｇ以上組み合わせた飼料添加剤を与えた場合に、完全にＳＥを防除することができた（製造例５（Ｇ）、製造例６（Ｇ）、製造例７（Ｇ）、製造例８（Ｇ））。これより、アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼーと、バチルス・ズブチリスを組み合わせて鶏ヒナに与える事により、おのおのの有効成分を単独で使用する場合より、それぞれ低い濃度でＳＥ感染症を予防する効果が有る事が分かる。【０１４１】
（２）Clostridium perfringens攻撃試験
上記で作製した飼料添加剤を用いて、上記と同様にして鶏ヒナを飼育した。７日齢で１羽当たり、５．０×１０7ＣＦＵのClostridium perfringens (ＣＰ)を経口投与した。１４日齢で盲腸内容物と、総排泄腔を綿棒で拭うことにより糞を採取した。【０１４２】
盲腸内容物のＣＰ生菌数を以下の方法により測定し、感染指数及び防御指数を算出した。
盲腸内容物１ｇを滅菌リン酸緩衝生理食塩水を加えて１０倍に希釈し、充分混合して試料原液とした。ついで、試料原液を滅菌生理食塩水を用いて１０倍で段階希釈し、段階希釈液とした。試料原液及び段階希釈液をそれぞれクロストリジア測定用培地（日水製薬(株)製）に０．１ｍｌずつ塗沫し、アネロパックケンキを用いて３５℃で２４時間嫌気培養し、各平板培地に生育した黒色集落数を測定した。さらに、コロニーより釣菌して卵黄加ＣＷ寒天培地（日水製薬(株)製）に接種して、３５℃で２４〜４８時間好気及び嫌気培養して性状の確認を行った。
この中からＣＰと認められたコロニー数に希釈液の希釈倍率を乗じて盲腸内容物１ｇ当たりのＣＰ生菌数を算出した。この結果を元に、上記と同様にして感染指数及び防御指数を算出した。
総排泄腔より採取した糞に関しては、以下の方法により個体別に定性培養を行うことによりＣＰの性状を確認した。すなわち、綿棒に付着した糞を１０ｍｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水に懸濁し、試料原液とした後、これをクロストリジア測定用培地（日水製薬(株)製）に０．１ｍｌずつ塗沫し、アネロパックケンキを用いて３５℃で２４時間嫌気培養し、各平板培地に生育した黒色集落形成の有無を判定した。さらに、コロニーより釣菌して卵黄加ＣＷ寒天培地（日水製薬(株)製）に接種して、３５℃で２４〜４８時間好気及び嫌気培養して性状の確認を行った。
感染指数を表３０に、防御指数を表３１に総排泄腔採取糞のＣＰの検出個体数を表３２に示す。【０１４３】
【表３０】
2008023580.tif 000031
【０１４４】
【表３１】
2008023580.tif 000032
【０１４５】
【表３２】
2008023580.tif 000033
【０１４６】
アスペルギルス・ソーヤＡＯＫ ２１０株又はアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物は単独では２０質量％以上飼料添加剤に添加した場合に、盲腸内容物のＣＰの菌体濃度が低くなり、低いＣＰの感染指数を示した（製造例１（Ｆ、Ｇ）、製造例２（Ｆ、Ｇ））。バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株は単独では２．０×１０9ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加した場合に、盲腸内容物のＣＰの菌体濃度が低くなり、低いＣＰの感染指数を示した（製造例３（Ｆ、Ｇ）、製造例４（Ｆ、Ｇ））。これに対し、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株又アスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株と、バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の組み合わせでは、ＡＯＫ２１０株又はＩＫ−０５０７４株を２．５質量％以上、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株を２．５×１０8ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加した場合に、ＡＯＫ ２１０株又はＩＫ−０５０７４株を単独で２０質量％以上飼料添加剤に添加した時、又はＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株を単独で２．０×１０9ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加した時と同程度のＣＰの防除効果が得られた（製造例５（Ｃ〜Ｇ）、製造例６（Ｃ〜Ｇ）、製造例７（Ｃ〜Ｇ）、製造例８（Ｃ〜Ｇ））。さらに、ＡＯＫ２１０株又ＩＫ−０５０７４株を２０質量％以上、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株を２．０×１０9ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加した場合に、ＣＰを完全に防除することができた（製造例５（Ｇ）、製造例６（Ｆ、Ｇ）製造例７（Ｇ）、製造例８（Ｇ））。これより、アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株又はアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株と、バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株を組み合わせる事により、おのおのの有効成分を単独で使用する場合より低い濃度でＣＰ感染症を予防する効果が有る事が分かる。【０１４７】
＜８＞子豚に対する浮腫病菌攻撃試験
子豚の飼料全質量（ＳＤ子豚人工乳前期用標準飼料、日本配合飼料(株)製、抗菌性物質無添加飼料）に対して、上記で製造した製造例１〜８の飼料添加剤を０．１質量％となるように混合した。３週齢の子豚（銘柄：大ヨークシャー）８頭を一群として、各群に上記飼料を不断給餌、自由給水で１４日間与えた。乳糖のみを０．１質量％混合した飼料を対照区とし、同様に試験を行った。豚浮腫病菌Escherichia coli（ＥＣ）をトリプティックソイブロス（Difco Laboratories製）で３７℃で４時間培養した。４℃で遠心分離（３，０００ｒｐｍ、１５分）し、ペレットを腸溶性カプセルに入れた。４週齢で１頭当たり、４．５×１０8ＣＦＵのＥＣを腸溶性カプセルを用いて１日１回、３日間連続強制経口投与した。浮腫病菌の代わりに生理食塩水を腸溶性カプセルに入れ、同様に強制経口投与し無接種例とし、同様に試験を行なった。５週齢まで飼育した後、体重測定を行い、それぞれの群の増体重の平均値を算出した。また、強制経口投与開始から試験終了日まで、糞便性状及び目周囲浮腫の臨床観察を毎日行い、個体ごとに試験期間中の糞便性状スコア及び目周囲浮腫スコアの合計を算出し、それぞれの群のスコアの平均値を算出した。
試験期間中の増体重を表３３に、糞便性状スコアを表３４に目周囲浮腫スコアを表３５に示した。【０１４８】
【表３３】
2008023580.tif 000034
【０１４９】
【表３４】
2008023580.tif 000035
【０１５０】
【表３５】
2008023580.tif 000036
【０１５１】
アスペルギルス・ソーヤＡＯＫ ２１０株又はアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物は、単独では１５質量％以上飼料添加剤に添加する事により、増体重が無接種例と同程度の値を示した（製造例１（Ｅ〜Ｇ）、製造例２（Ｅ〜Ｇ））。バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株は単独では１５×１０8ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加する事により、増体重が無接種例と同程度の値を示した（製造例３（Ｅ〜Ｇ）、製造例４（Ｅ〜Ｇ））。糞便性状スコア、目周囲浮腫スコアに関しても同様の傾向を示した。これに対し、アスペルギルス・ソーヤＡＯＫ ２１０株又はアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株と、バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の組み合わせでは、ＡＯＫ２１０株又はＩＫ−０５０７４株を２．５質量％以上、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株を２．５×１０8ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加する事により、増体重が無接種例と同程度の値を示した（製造例５（Ｃ〜Ｇ）、製造例６（Ｃ〜Ｇ）、製造例７（Ｃ〜Ｇ）、製造例８（Ｃ〜Ｇ））。糞便性状スコア、目周囲浮腫スコアに関しても同様の傾向を示した。これにより、アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼーと、バチルス・ズブチリスを組み合わせる事により、おのおのの有効成分を単独で使用する場合より低い濃度で浮腫病菌感染を予防する効果が有る事が分かる。【０１５２】
＜９＞子牛に対するSalmonella Typhimurium攻撃試験
生後１週齢の雄子牛（ホルスタイン種）を４頭を一群として、市販の哺乳期子牛用代用乳（プロミルク、日本配合飼料(株)）を朝夕２回、各２Ｌずつ７週齢まで給与した。自由給水とし、乾草と市販の人工乳（スーパーほいくモーレット、全農）は不断給餌とした。上記で製造した製造例１〜８の飼料添加剤を１日１頭当たり２５gを代用乳に混ぜて投与した。乳糖２５ｇのみを代用乳に混ぜて対照区とし、同様に試験を行った。２週齢で1頭当たり１０％ＮａＨＣＯ3 ５０ｍｌに浮遊させた５．０×１０6ＣＦＵのSalmonella Typhimurium (ＳＴ)を全頭に経口投与した。７週齢まで飼育し、体重測定を行い、それぞれの群の増体重の平均値を算出した。また、強制経口投与開始から試験終了日まで、糞便性状の観察を毎日行い、個体ごとに試験期間中の糞便性状スコアの合計を算出し、それぞれの群のスコアの平均値を算出した。
試験期間中の増体重を表３６に、糞便性状スコアを表３７に示す。【０１５３】
【表３６】
2008023580.tif 000037
【０１５４】
【表３７】
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【０１５５】
アスペルギルス・ソーヤ ＡＯＫ２１０株又はアスペルギルス・オリゼー ＩＫ−０５０７４株の粉砕固体培養物は単独では２０質量％以上飼料添加剤に添加する事により、増体重が無接種例と同程度の値を示した（製造例１（Ｆ、Ｇ）、製造例２（Ｆ、Ｇ））。バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株は単独では２．０×１０9ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加する事により、増体重が無接種例と同程度の値を示した（製造例３（Ｆ、Ｇ）、製造例４（Ｆ、Ｇ））。糞便性状スコアに関しても同様の傾向を示した。これに対し、アスペルギルス・ソーヤＡＯＫ ２１０株又はアスペルギルス・オリゼーＩＫ−０５０７４株と、バチルス・ズブチリス ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株の組み合わせでは、ＡＯＫ２１０株又はＩＫ−０５０７４株を２．５質量％以上、ＤＢ９０１１株又はＮＢＲＣ３００９株を２．５×１０8ＣＦＵ／ｇ以上飼料添加剤に添加する事により、増体重が無接種例と同程度の値を示した（製造例５（Ｃ〜Ｇ）、製造例６（Ｃ〜Ｇ）、製造例７（Ｃ〜Ｇ）、製造例８（Ｃ〜Ｇ））。糞便性状スコアに関しても同様の傾向を示した。これにより、アスペルギルス・ソーヤ又はアスペルギルス・オリゼーと、バチルス・ズブチリスを組み合わせる事により、おのおのの有効成分を単独で使用する場合より低い濃度でＳＴ感染症を予防する効果が有る事が分かる。
【産業上の利用の可能性】
【０１５６】
本発明のアスペルギルス属菌及び該菌が産生する酸性酵素を含む培養物、並びにバチルス・ズブチリスを含む動物用飼料添加剤を飼料に混合し、動物に摂取させることにより、栄養吸収が促進され、飼料効率が上がる。具体的には、アスペルギルス属菌が産生する酸性酵素が、腸内の病原菌などに対して抗菌活性を示し、バチルス・ズブチリスが免疫を賦活し、結果として動物の腸内感染症を予防・改善し、動物の体重増加に寄与する。本発明の飼料は、鶏、豚、牛などの家畜の飼育に好適に用いることができる。
【国際調査報告】
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