(57)【要約】  本発明は、半導体微粒子からなるコアと該コアを被覆するコア組成とは異なる組成からなるシェル層とで構成される半導体蛍光微粒子において、該コアに励起光照射時間または照射量に対する蛍光強度のブリンキング（明滅現象）の平均蛍光滅時間が、シェル層を有するコア／シェル粒子のブリンキングの平均蛍光滅時間の１００倍以上であり、コア／シェル粒子のブリンキング頻度がコア粒子のみのブリンキング頻度の１／１０以下であることを特徴とする半導体蛍光微粒子及び生体物質蛍光標識剤並びに標識方法に関する。  本発明の半導体蛍光微粒子はブリンキングが改善され、検出精度の高い標識剤および標識方法を提供できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
半導体微粒子からなるコアと該コアを被覆するコア組成とは異なる組成からなるシェル層とで構成される半導体蛍光微粒子において、該コアに励起光照射時間または照射量に対する蛍光強度のブリンキング（明滅現象）の平均蛍光滅時間が、シェル層を有するコア／シェル粒子のブリンキングの平均蛍光滅時間の１００倍以上であり、コア／シェル粒子のブリンキング頻度がコア粒子のみのブリンキング頻度の１／１０以下であることを特徴とする半導体蛍光微粒子。
【請求項２】
前記コア／シェル粒子のコアが、１ｎｍ〜１０ｎｍの平均粒径を有し、インジウム（Ｉｎ）とリン（Ｐ）を含む半導体微粒子であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の半導体蛍光微粒子。
【請求項３】
請求の範囲第１項または請求の範囲第２項に記載の半導体蛍光微粒子の表面に、生体物質に結合する修飾基と該半導体蛍光微粒子の表面に結合する修飾基とをもつ表面修飾化合物の少なくとも１つを有することを特徴とする生体物質蛍光標識剤。
【請求項４】
追跡もしくは標的物質を有する生細胞に、請求の範囲第３項に記載の生体物質蛍光標識剤を添加することにより該標的物質と反応させる工程と、該標的物質に対して所定の波長の励起光を照射し、該励起光に応じて上記半導体蛍光微粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、追跡・標的物質の生学分析もしくは蛍光イメージングを行う工程とを有することを特徴とするバイオアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はブリンキング頻度が大きく抑えられた光物理的に安定な半導体微粒子に関する。本発明はさらに、細胞の動態解析を行う生物学や免疫解析分野において有用な生体物質蛍光標識剤とそれを用いたバイオアッセイ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、粒径により蛍光波長を制御可能である半導体ナノ粒子の研究が盛んに行われている。【０００３】
半導体ナノ粒子は蛍光波長の制御性、高耐光性、表面修飾の自由度の高さを有することから生体内外の蛍光マーカとして応用され、研究されている。【０００４】
特に最近、バルクの生体認識で定性的なアッセイから、より分子レベルで動態を解析することにより生体分子の反応機構を掴み病気の原因、薬の作用を解明しようとする１分子イメージングの研究が盛んであり、蛍光標識剤１分子に対し標識される生体物質（細胞内の核、小胞体、ゴルジ体、蛋白、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ）１分子が結合し、所定の励起光を照射することによる発光を検知することで、これまで得られなかった生体情報（ＤＮＡ転写ｍＲＮＡ・蛋白形成に至る動態や細胞アポトーシス動態ｅｔｃ）が得られている。【０００５】
この場合、１分子対１分子であるがために、１検体当りの検知する発光量が乏しく、精度の向上が望まれていた。しかも、生体分子を追跡するといった動態解析の場合に、従来の半導体ナノ粒子（ＣｄＳｅタイプ）に見られるブリンキング（明滅現象）により生体物質を見失ったり、軌跡の途切れが多く、その間隔も長いので本来の目的である動態解析が困難となり、実験不可もしくは再三繰り返さざるを得ない問題があった（例えば、非特許文献１参照。）。【０００６】
更に、従来生体標識に使われてきた有機色素、蛍光タンパクにおいては、退色の課題と発光強度が充分で無いことから、ことさらイメージングの精度が低いことが指摘されていた。
【非特許文献１】Ｊ．ｐｈｙｓ．ｃｈｅｍ．Ｂ２００５，１０９，１４３５０−１４３５５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題を鑑みてなされたものであり、本発明の目的は、ブリンキングを改善する半導体蛍光微粒子並びに生体標的物質のより検出精度の高い標識を実現する標識剤並びに標識方法を提供するものである。特に１分子イメージングの研究分野において高感度測定法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の上記目的は、下記構成により達成された。【０００９】
１．半導体微粒子からなるコアと該コアを被覆するコア組成とは異なる組成からなるシェル層とで構成される半導体蛍光微粒子において、該コアに励起光照射時間または照射量に対する蛍光強度のブリンキング（明滅現象）の平均蛍光滅時間が、シェル層を有するコア／シェル粒子のブリンキングの平均蛍光滅時間の１００倍以上であり、コア／シェル粒子のブリンキング頻度がコア粒子のみのブリンキング頻度の１／１０以下であることを特徴とする半導体蛍光微粒子。【００１０】
２．前記コア／シェル粒子のコアが、１ｎｍ〜１０ｎｍの平均粒径を有し、インジウム（Ｉｎ）とリン（Ｐ）を含む半導体微粒子であることを特徴とする前記１に記載の半導体蛍光微粒子。【００１１】
３．前記１または２に記載の半導体蛍光微粒子の表面に、生体物質に結合する修飾基と該半導体蛍光微粒子の表面に結合する修飾基とをもつ表面修飾化合物の少なくとも１つを有することを特徴とする生体物質蛍光標識剤。【００１２】
４．追跡もしくは標的物質を有する生細胞に、前記３に記載の生体物質蛍光標識剤を添加することにより標的物質と反応させる工程と、該標的物質に対して所定の波長の励起光を照射し、当該励起光に応じて上記半導体蛍光微粒子から発生する所定の波長の蛍光を検出することにより、追跡・標的物質の生学分析もしくは蛍光イメージングを行う工程とを有することを特徴とするバイオアッセイ法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、平均粒径が１〜１０ｎｍで、ＩｎＰからなるコア半導体微粒子にシェル層を設け、そのブリンキング現象を滅時間と頻度を大きく抑制した半導体蛍光微粒子を得ることができた。また、本発明の半導体微粒子を具備する生体物質蛍光標識剤は、生体物質の検出精度を大きく向上するものを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＩｎＰ（平均粒径４．２ｎｍ）とＩｎＰ／ＺｎＳ（コア平均粒径４．２ｎｍ）の粒子の発光間欠（ブリンキング）現象を示す図である。
【図２】バイオアッセイ装置の概略構成を示す図である。
【図３】ウェル中、サンプルＤＮＡ（Ｓ）を基板上に固定後、ウェル中に標識プローブＤＮＡ（Ｐｒ）が添加された状態を示す図である。
【図４】標識プローブＤＮＡ（Ｐｒ）とサンプルＤＮＡ（Ｓ）とが相互反応（ハイブリダイゼーション）した状態を示す図である。
【符号の説明】
【００１５】
１  バイオアッセイ基板
７  ウェル
２１  バイオアッセイ装置
２２  ディスク装填部
２３  滴下部
２４  励起光検出部
２５  制御／サーボ部
３３  貯留部
３４  滴下ヘッド
４０  光学ヘッド
４４  励起光源
Ｄ  量子ドット
Ｆ  蛍光
Ｐ  励起光
Ｐｒ  標準プローブＤＮＡ
Ｓ  サンプルＤＮＡ
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明に係るブリンキングとは、励起光を照射した時の照射時間もしくは照射量に対して蛍光強度（発光強度ともいう）が突然ゼロ（ＯＦＦ）となる時間が数ｍｓｅｃ〜１００ｍｓｅｃ近く続き、再び元の発光強度を得る現象の繰り返しである。【００１７】
本発明に係る、蛍光強度が殆どゼロとなる滅時間とは励起光照射時間であれば、例えば、５分間励起光を照射した時の発光強度のＯＦＦ時間がｍｓｅｃ以上となるものの平均時間で表したものである。【００１８】
例えば、滅時間が３回繰り返されたとして各々１０ｍｓｅｃ、５０ｍｓｅｃ、１００ｍｓｅｃだった場合は５３ｍｓｅｃが平均滅時間となる。一方、励起光照射量であればｍＪ／ｃｍ２で表した単位で例えば１０００ｍＪ／ｃｍ２での平均滅時間となる。【００１９】
コア粒子は、コア／シェル粒子にくらべ１００倍以上の滅時間を要する特徴を示す。また、ブリンキング頻度は励起後の時間順に発光と滅の繰り返しの回数を表し、コアに対してコア／シェル粒子は１／１０以下となる特徴を有する。【００２０】
本願の請求の範囲第１項に記載のコア粒子、コア／シェル粒子の、各々のブリンキング滅時間とブリンキング頻度に係る発明要件を実現する手段として、コアが結晶性を高め、内部欠陥が少ない状態の粒子であり、且つ、シェルはコアの結晶格子に近い組成を選択し、コアの表面欠陥を大きく安定化（電子トラップ、ホールトラップ準位をつくらない）するようにシェル形成時に温度制御を工夫し、濃度、合成時間、ｐＨを適正にコントロールすることが好ましい。【００２１】
特に、本発明に係る、インジウム（Ｉｎ）とリン（Ｐ）を含む半導体微粒子（単に、ＩｎＰという場合もある）は、従来の半導体ナノ粒子に比較して上記手段を検討した時にコアとコア／シェル粒子のブリンキングの差が著しく、本発明の半導体蛍光微粒子を得ることができた。【００２２】
本発明の応用範囲は固定細胞を用いた免疫染色、細胞観察やレセプター・リガンド（低分子、薬物）相互作用のリアルタイムトラッキング、１分子蛍光イメージングなどが挙げられる。【００２３】
本発明の半導体蛍光微粒子はコアとその表面を覆うシェル（殻）からなる。コアはインジウム（Ｉｎ）とリン（Ｐ）を含む半導体材料から構成され、必要があればＧａなどのドープ材料を微量含んでもよい。【００２４】
シェルに適切な材料としては、コアより高いバンドギャップエネルギーを有する半導性材料が挙げられる。コアより高いバンドギャップエネルギーを有することに加えて、シェルに適切な材料は、コアに対して、良好な伝導性および原子価バンドオフセットを有するべきである。【００２５】
従って、伝導性バンドは、コアの伝導性バンドよりも望ましくは高く、そして原子価バンドは、コアの原子価バンドよりも望ましくは低い。可視で（例えば、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＧａＰ、ＧａＡｓ）または、近赤外で（例えば、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ）エネルギーを放出するコアに対して、紫外線領域でバンドギャップエネルギーを有する材料が使用され得る。【００２６】
例示的な材料としては、ＺｎＳ、ＧａＮおよびマグネシウムカルコゲニド（例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅおよびＭｇＴｅ）が挙げられる。【００２７】
近赤外で放出するコアに対して、可視でバンドギャップエネルギーを有する材料（例えば、ＣｄＳまたはＣｄＳｅ）もまた使用され得る。コーティングされた半導体蛍光微粒子の調製は、例えば、Ｄａｂｂｏｕｓｉら（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１０１：９４６３、Ｈｉｎｅｓら（１９９６）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００：４６８−４７１、Ｐｅｎｇら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：７０１９−７０２９、およびＫｕｎｏら（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０６：９８６９において見出され得る。【００２８】
本発明に係る表面修飾化合物は少なくとも１つの修飾基と少なくとも１つの半導体蛍光微粒子に結合する基を有する。後者は疎水性の半導体蛍光微粒子に吸着できる基であり、他方は生体に親和性があり生体分子に結合する修飾基をもつ。互いの表面修飾化合物は互いをつなぐ各種のリンカーを使用してもよい。【００２９】
半導体蛍光微粒子に結合する基としてはメルカプト基などが挙げられ、結合する粒子の組成：コア組成もしくはシェル組成によって選択される。生体物質に親和的に結合する官能基としてはカルボキシ基、アミノ基、フォスフォン酸基（ホスホノ基ともいう）、スルホン酸基などが挙げられる。生体物質とは細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、蛋白質、抗体、抗原、小胞体、核、ゴルジ体などを指す。【００３０】
又、半導体蛍光微粒子に結合させる方法としては、表面修飾化合物を適するｐＨに調整することによりメルカプト基を粒子に結合させることができる。それぞれ他端にはアルデヒド基、アミノ基、カルボキシ基が導入され、生体のアミノ基、カルボキシ基とペプチド結合することができる。また、オリゴヌクレオチドにアミノ基、アルデヒド基、カルボキシ基を導入しても同様に結合させることができる。【００３１】
（本発明の半導体蛍光微粒子結合体および結合組成物）
本発明は、本発明の表面修飾半導体蛍光微粒子の結合体および標的分析物に結合したこれらの結合体を含む組成物にさらに関する。【００３２】
すなわち、本発明の表面修飾半導体蛍光微粒子は、結合対の第１のメンバーとして働く親和性分子に結合し得る。一般的に、必ずではないが、これは、親和性分子への結合手段を提供するのは半導体蛍光微粒子表面上の両親媒性分散剤でもある。【００３３】
上記のような、両親媒性分散剤の親水性領域内に存在するイオン化可能基は、親和性分子への結合手段を提供し得、そして／または分散剤分子内に存在または導入される他の官能基が、親和性分子への結合手段を提供し得る。【００３４】
この結合は一般的に共有結合であり、そして適切な結合は上記のセクションIIIで議論される。親和性分子に分子および分子セグメントを結合する適切な方法が、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９６）に記載される。【００３５】
親和性分子によるこのような半導体蛍光微粒子「結合体」は、生物学的化合物および化学的化合物の存在および／または量、生物系、生物学的プロセスにおける相互作用、生物学的プロセスの変更あるいは生物学的化合物の構造における変化を検出するために使用され得る。【００３６】
すなわち、半導体蛍光微粒子に結合した場合、親和性分子は、結合対の第２のメンバーとして働く生物学的標的と相互作用し、生物学的プロセスまたは応答を検出するか、あるいは生物学的分子またはプロセスを変化させ得る。【００３７】
好ましくは、親和性分子および生物学的標的の相互作用は、特異的結合を伴い、そして共有結合、非共有結合、疎水性、親水性、ファンデルワールスまたは磁性の相互作用を伴い得る。好ましくは、親和性分子は生物学的標的と物理的に相互作用する。【００３８】
半導体蛍光微粒子に結合する親和性分子は、天然に存在し得るかまたは化学的に合成され得、そして所望の物理学的、化学的または生物学的特性を有することが選択され得る。このような特性としては以下が挙げられるが、これらに制限されない：タンパク質、核酸、シグナル伝達分子、原核生物細胞または真核生物細胞、ウイルス、細胞内オルガネラおよび他の任意の生物学的化合物との共有結合および非共有結合。このような分子の他の特性としては、以下が挙げられるが、これらに制限されない：生物学的プロセス（例えば、細胞周期、血液凝固、細胞死、転写、翻訳、シグナル伝達、ＤＮＡ損傷またはＤＮＡ切断、ラジカル生成、ラジカル除去など）に影響を与える能力、および生物学的化合物の構造（例えば、架橋、タンパク質分解切断、ラジカル損傷など）を変化させる能力。【００３９】
好ましい実施形態において、半導体蛍光微粒子結合体は、調整可能な波長で光を放射する半導性ナノ粒子を含み、そして核酸に結合される。結合は、直接的または間接的であり得る。核酸は、任意のリボ核酸、デオキシリボ核酸、ジデオキシリボ核酸または任意の誘導体およびその組み合わせであり得る。【００４０】
核酸はまた、任意の長さのオリゴヌクレオチドであり得る。このオリゴヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、三本鎖またはより高位の立体配置（例えば、ホリデー結合、環状一本鎖ＤＮＡ、環状二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ立方体（Ｓｅｅｍａｎ（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２７：２２５２４８を参照のこと））であり得る。【００４１】
とりわけ好ましい本発明の組成物および方法の使用は、以下のような核酸の検出および／または定量である：（ａ）ウイルス核酸；（ｂ）細菌核酸；および（ｃ）目的の多くのヒトの配列（例えば、単鎖ヌクレオチド多型）。本発明の範囲を制限することなしに、半導体蛍光微粒子結合体は、個々のヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチドまたは任意の誘導体およびその組み合わせに結合するナノ結晶を含み得、そしてＤＮＡ重合反応（例えば、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡへのＲＮＡの逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））において使用される。【００４２】
ヌクレオチドとしてはまた、一リン酸塩、二リン酸塩および三リン酸塩ならびに環状誘導体（例えば、環状アデニン一リン酸（ｃＡＭＰ））が挙げられる。【００４３】
核酸に結合した半導体蛍光微粒子の他の使用は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が含まれる。この好ましい実施形態において、半導体蛍光微粒子はインビボで特異的な配列にハイブリダイズするように設計されたオリゴヌクレオチドに結合される。【００４４】
ハイブリダイゼーションに関して、半導体蛍光微粒子タグは、細胞において所望のＤＮＡ配列の位置を可視化するために使用される。例えば、そのＤＮＡ配列が部分的または完全に既知である遺伝子の細胞内局在は、ＦＩＳＨを用いて決定され得る。【００４５】
その配列が部分的または完全に既知である任意のＤＮＡまたはＲＮＡは、ＦＩＳＨを用いて視覚的に標識され得る。例えば、本発明の範囲を制限することなしに、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡテロメア、他の高反復ＤＮＡ配列および他のコードされていないＤＮＡ配列がＦＩＳＨにより標的化され得る。【００４６】
半導体蛍光微粒子結合体はまた、生物学的化合物（例えば、酵素、酵素基質、酵素インヒビター、細胞内オルガネラ、脂質、リン脂質、脂肪酸、ステロール、細胞膜、シグナル伝達に関する分子、レセプターおよびイオンチャネル）の検出のための分子または試薬と結合して、本明細書中で提供されるような表面修飾半導体蛍光微粒子を含む。【００４７】
結合体はまた、細胞形態および流体の流れ；細胞生存能力、増殖および機能；エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス（Ｂｅｔｚら（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６（３）：３６５−７１）；および反応性酸素種（例えば、スーパーオキシド、一酸化窒素、ヒドロキシラジカル、酸素ラジカル）を検出するために使用され得る。さらに、結合体は、生物系の疎水性領域または親水性領域を検出するために使用され得る。【００４８】
半導体蛍光微粒子の結合体はまた、他の多くの生物学的および非生物学的な用途における有用性を見い出し、ここで、発光マーカ、特に蛍光マーカが代表的に使用される。【００４９】
例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ．第６版１９９６；Ｗｅｂｓｉｔｅ，ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ．）を参照のこと。【００５０】
本発明の半導体蛍光微粒子の結合体が有用である領域の例としては、以下が挙げられるが、これらに制限されない：蛍光免疫細胞化学、蛍光顕微鏡法、ＤＮＡ配列分析、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、フローサイトメトリー（蛍光活性化セルソーター；ＦＡＣＳ）および生物系についての診断アッセイ。上記の領域における半導体蛍光微粒子の有用性に関するさらなる議論については、Ｂａｗｅｎｄｉらに対する国際公開第００／１７６４２号パンフレットを参照のこと。
【実施例】
【００５１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。【００５２】
《半導体蛍光微粒子１の作製：ＩｎＰコア粒子のみ：比較例》
アルゴンガスで置換したグローブＢＯＸ内で無水ＩｎＣｌ3を０．８ｇ、Ｐ（Ｓｉ−（ＣＨ）3）3を０．７５ｇ、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）：トリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）＝０．１：１で５．０ｇを室温で混合したＡ１液を調整する。【００５３】
一方、三角フラスコ内にＴＯＰＯ：ＴＯＰ＝０．１：１で５ｇを入れアルゴンガスで置換・雰囲気下、攪拌しながら２９０℃に昇温する。上記Ａ１液を１秒以下のスピードで三角フラスコ内へ注入する。温度を２７０℃に保ち２４時間保持する。【００５４】
さらにマイクロ波（２．５ＧＨＺ）を１時間照射した後にアルゴンガス雰囲気下で降温し、室温になった時に脱水メタノールを適量添加すると、溶液中で淡くて白い煙状のふわふわした粒子が発生する。遠心分離を行い生成した粒子を沈降させて捕集し、半導体蛍光微粒子１を得た。【００５５】
得られた半導体蛍光微粒子１の粒径分布を動的光散乱法（マルバーン社製：ゼータサイザー）を用いて測定すると平均粒径４．２ｎｍで粒径分布が標準偏差で１０％であった。【００５６】
《半導体蛍光微粒子２（コア・シェル層を有する）の作製：本発明》
上記で得られた半導体蛍光微粒子１（ＩｎＰコア粒子）をピリジン中に分散させ１００℃に保温した。別途、Ｚｎ（Ｃ２Ｈ５）２と（（ＣＨ３）３Ｓｉ）２Ｓ、Ｐ（Ｃ４Ｈ９）３をアルゴンガス雰囲気下、超音波をかけながらｐＨを制御しながらゆっくり混合した。【００５７】
これをピリジン分散液に滴下して添加した。添加後、温度を適正に制御し、ｐＨを一定に保ちゆっくり３０分攪拌した。これの遠心分離を行い沈降した粒子を捕集し、半導体蛍光微粒子２（コア・シェル粒子）を得た。【００５８】
得られた粒子の元素分析を行ってみたところＩｎＰとＺｎＳが確認され、ＸＰＳ（Ｘ線光電子分光法）によりＺｎＳがＩｎＰコア粒子の表面に被覆していることがわかった。【００５９】
シェル層の被覆の状態はＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）から１００粒子抽出し、コア粒子のみのＴＥＭ写真と比較することによって被覆厚み、被覆の欠けを求め平均被覆率と平均シェル層の厚みを求めた。上記粒子は被覆率１００％であり、平均膜厚は２．５ｎｍであった。【００６０】
《半導体蛍光微粒子３（ＩｎＰコア粒子のみ）の作製：比較例》
上記の半導体微粒子１（ＩｎＰコア粒子のみ）の作製において、ＩｎＣｌ3およびＰ（Ｓｉ−（ＣＨ）3）3を高濃度にし、反応時間を１．５倍に変更すること以外は同様にして粒子形成を行った結果、平均粒径２０ｎｍ、標準偏差１５％の粒子を得た。【００６１】
《半導体蛍光微粒子４（コア・シェル層有り）の作製：比較例》
上記の半導体蛍光微粒子２（コア・シェル層を有する）の作製において、シェルの形成の攪拌時間を１時間に変更する以外は同様にしてコア・シェル粒子を得た。シェルの被覆率は１００％であり、平均厚みは２．５ｎｍであった。【００６２】
《半導体蛍光微粒子５（コア・シェル層（層形成不良））の作製：比較例》
以下のようにしてコア粒子、次いで、コア粒子上にシェル層を形成した。【００６３】
（コア粒子の形成）
アルゴンガスで置換したグローブＢＯＸ内で無水ＩｎＣｌ3を０．８ｇ、Ｐ（Ｓｉ−（ＣＨ）3）3を０．７５ｇ、トリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）：トリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）＝０．１：１で５．０ｇを室温で混合したＡ２液を調整する。【００６４】
一方、三角フラスコ内にＴＯＰＯ：ＴＯＰ＝０．１：１で５ｇを入れアルゴンガスで置換・雰囲気下、攪拌しながら２７０℃に昇温する。上記Ａ２液を１秒以下のスピードで三角フラスコ内へ注入する。温度を２５０℃に保ち２４時間保持する。【００６５】
室温になった時に脱水メタノールを適量添加すると、溶液中で淡くて白い煙状のふわふわした粒子が発生する。遠心分離を行い生成した粒子を沈降させて捕集し、コア粒子を得た。【００６６】
得られたコア粒子の粒径分布を動的光散乱法（マルバーン社製：ゼータサイザー）を用いて測定すると中心粒径４．２ｎｍで粒径分布が標準偏差で２０％であった。【００６７】
（シェル層の形成）
上記で得られたコア粒子をピリジン中に分散させ１００℃に保温した。別途、Ｚｎ（Ｃ2Ｈ5）2と（（ＣＨ3）3Ｓｉ）2Ｓ、Ｐ（Ｃ4Ｈ9）3を本発明より２／３の濃度でアルゴンガス雰囲気下、ゆっくり混合した。【００６８】
これをピリジン分散液に滴下して添加した。添加後、温度はなりゆきにまかせ、２０分攪拌した。これの遠心分離を行い沈降した粒子を捕集し、半導体蛍光微粒子５（コア・シェル粒子）を得た。【００６９】
得られた半導体蛍光微粒子５の元素分析を行ってみたところＩｎＰとＺｎＳが確認されたが、ＸＰＳ分析によりＺｎＳがＩｎＰの表面上に部分的に被覆してのみであり、シェル層の形成は不完全であった。【００７０】
また、コア粒子に対するシェル層の被覆状態はＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）から１００粒子抽出し、コアのみのＴＥＭ写真と比較することによって被覆厚み、被覆の欠けを求め平均被覆率と平均シェル厚みを求めた。【００７１】
半導体蛍光微粒子５のコアに対するシェル層の被覆率４０％であり、厚みも０．２ｎｍ〜３ｎｍとばらつきが高かった。【００７２】
得られた半導体蛍光微粒子１〜５の各々について、ブリンキング現象（滅平均時間、ブリンキング頻度）の測定を行った。【００７３】
《滅平均時間、ブリンキング頻度の測定》
粒子の分光測定は、自作した共焦点顕微鏡システムで行った。走査ステージ上の試料は、直線偏光の半導体レーザ（５３２ｎｍ）もしくは４３０ｎｍ光を油浸対物レンズ（ＮＡ１．２）を通してフォーカスしたスポットで励起される。【００７４】
ここで発光信号は、発光イメージを測定する際にはＳｉアバランシェ・フォトダイオードを用い検出し、発光スペクトルを測定する時には焦点距離３２ｃｍの分光器と液体窒素冷却のＣＣＤカメラ、もしくは、ＩｎＧａＡｓダイオードアレーを用いて測定した。【００７５】
具体的には、半導体蛍光微粒子１（ＩｎＰ（コア平均粒径４．２ｎｍ））、半導体蛍光微粒子２（ＩｎＰ（コア平均粒径４．２ｎｍ、シェル層の平均膜厚２．５ｎｍ）で）の各々の粒子について、励起光を当てながら１ｍｓｅｃの分解能で蛍光強度を追跡し、５分間照射したときの様子を、図１に示した。【００７６】
尚、半導体蛍光微粒子３〜５についても同様に滅平均時間、ブリンキング頻度の測定を行った。【００７７】
図１は、半導体蛍光微粒子１（ＩｎＰ（コア平均粒径４．２ｎｍ）と半導体蛍光微粒子２（ＩｎＰ（コア平均粒径４．２ｎｍ）、ＺｎＳ（シェル層平均膜厚２．５ｎｍ）の粒子の発光間欠（ブリンキング）現象を示す図である。【００７８】
図１に示すように蛍光強度が、高い蛍光強度（蛍光発光強度ともいう）を示す状態と低い蛍光強度の状態の間をスイッチングしている。【００７９】
これは、発光間欠（ブリンキング）現象とよばれる。５分間のトータルの頻度と滅平均時間は表１に結果を示した。【００８０】
得られた半導体蛍光微粒子１〜５は、各々数ｎｍの半導体のナノ粒子であり、これらは、量子ドットと呼ばれる。【００８１】
《半導体蛍光微粒子１、２を用いての生体物質蛍光標識剤の調製》
以上のように製造された、半導体蛍光微粒子１（量子ドット１：ＩｎＰコア量子ドット）、半導体蛍光微粒子２（量子ドット２：ＩｎＰ／ＺｎＳコア／シェル量子ドット）の双方に生体サンプルＤＮＡを酵素処理して切断することによって得たオリゴレヌクレオチド（２０塩基鎖）を以下の如く導入した。【００８２】
《生体結合修飾基の導入》
表面修飾化合物ＨＳ−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨを溶剤を純水に置換してバッファ塩を添加した量子ドットの分散水溶液中に添加し、ｐＨを調整し加温攪拌することによって上記合成した粒子にメルカプト基を介して結合させた。【００８３】
これに末端にアミノ基を導入した標的にハイフ゛リダイゼーションする配列をもつオリゴヌクレオチドを１００ｎＭとなるように加えて１時間放置することで、量子ドットとオリゴヌクレオチドとを表面修飾剤を介して結合させる。【００８４】
量子ドット１（コア量子ドット）、量子ドット２（コア／シェル量子ドット）の双方ともに同じ量のオリゴヌクレオチド面積になるように条件により調整した。【００８５】
このように調整した標的配列に対応するオリゴヌクレオチドを有したプローブを下記バイオアッセイ装置に添加し、サンプル液より標的ＤＮＡを検出する。【００８６】
尚、半導体蛍光微粒子３（量子ドット３）〜半導体微粒子５（量子ドット５）についても、上記と同様にして、生体物質蛍光標識剤の調製を行った。【００８７】
《バイオアッセイ装置》
次に、バイオアッセイ基板を用いてＤＮＡ解析を行うバイオアッセイ装置について、図２を参照して説明する。【００８８】
バイオアッセイ装置２１は、図２に示すように、バイオアッセイ基板１を保持して回転させるディスク装填部２２と、ハイブリダイゼーションのための各種溶液を貯留するとともにバイオアッセイ基板１のウェル７にその溶液を滴下する滴下部２３と、バイオアッセイ基板１のウェル７から励起光を検出するための励起光検出部２４と、上記の各部の管理及び制御を行う制御／サーボ部２５とを備えている。【００８９】
ディスク装填部２２は、バイオアッセイ基板１の中心孔内に挿入して当該バイオアッセイ基板１を保持するチャッキング機構３１と、チャッキング機構３１を駆動することによりバイオアッセイ基板１を回転させるスピンドルモータ３２とを有している。ディスク装填部２２は、上面側が上方向となるようにバイオアッセイ基板１を水平に保持した状態で、当該バイオアッセイ基板１を回転駆動する。【００９０】
滴下部２３は、試料溶液を貯留する貯留部３３と、貯留部３３内の試料溶液をバイオアッセイ基板１に滴下する滴下ヘッド３４とを有している。滴下ヘッド３４は、水平に装填されたバイオアッセイ基板１の上面の上方に配置されている。【００９１】
さらに、滴下ヘッド３４は、図３記載のバイオアッセイ基板１のアドレスピット９から読み出される位置情報及び回転同期情報に基づいてバイオアッセイ基板１との相対位置を半径方向に制御し、上述のＩｎＰ又はＩｎＰ／ＺｎＳの量子ドットを結合させたプローブオリゴヌクレオチドと、サンプルＤＮＡを含有する試料溶液を所定のウェル７に正確に追従して滴下する構成とされている。【００９２】
励起光検出部２４は、光学ヘッド４０を有している。光学ヘッド４０は、水平に装填されたバイオアッセイ基板１の下方側、すなわち、下面側に配置されている。光学ヘッド４０は、例えば、図示しないスレッド機構等により、バイオアッセイ基板１の半径方向に移動自在とされている。【００９３】
光学ヘッド４０は、対物レンズ４１と、対物レンズ４１を移動可能に支持する２軸アクチュエータ４２と、導光ミラー４３とを有している。対物レンズ４１は、その中心軸がバイオアッセイ基板１の表面に対して略垂直となるように２軸アクチュエータ４２に支持されている。【００９４】
したがって、対物レンズ４１は、バイオアッセイ基板１の下方側から入射された光束を当該バイオアッセイ基板１に対して集光することができる。２軸アクチュエータ４２は、バイオアッセイ基板１の表面に対して垂直な方向、及び、バイオアッセイ基板１の半径方向の２方向に対物レンズ４１を移動可能に支持している。【００９５】
２軸アクチュエータ４２を駆動することにより、対物レンズ４１により集光された光の焦点を、バイオアッセイ基板１の表面に対して垂直な方向及び半径方向に移動させることができる。したがって、この光学ヘッド４０では、光ディスクシステムにおけるジャストフォーカス制御並びに位置決め制御と同様の制御を行うことができる。【００９６】
導光ミラー４３は、光路Ｘ上に対して４５°の角度で配置されている。光路Ｘは、励起光Ｐ、蛍光Ｆ、制御光Ｖ及び反射光Ｒが、光学ヘッド４０に対して入射及び出射する光路である。導光ミラー４３には、励起光Ｐ及び制御光Ｖが光路Ｘ上から入射される。導光ミラー４３は、励起光Ｐ及び制御光Ｖを反射して９０°屈折させて、対物レンズ４１に入射する。対物レンズ４１に入射された励起光Ｐ及び制御光Ｖは、当該対物レンズ４１により集光されてバイオアッセイ基板１に照射される。【００９７】
また、導光ミラー４３には、蛍光Ｆ及び制御光Ｖの反射光Ｒが、バイオアッセイ基板１から対物レンズ４１を介して入射される。導光ミラー４３は、蛍光Ｆ及び反射光Ｒを反射して９０°屈折させて、光路Ｘ上に出射する。なお、光学ヘッド４０をスレッド移動させる駆動信号及び２軸アクチュエータ４２を駆動する駆動信号は、制御／サーボ部２５から与えられる。【００９８】
また、励起光検出部２４は、励起光Ｐを出射する励起光源４４と、励起光源４４から出射された励起光Ｐを平行光束とするコリメータレンズ４５と、コリメータレンズ４５により平行光束とされた励起光Ｐを光路Ｘ上で屈折させて導光ミラー４３に照射する第１のダイクロックミラー４６とを有している。【００９９】
励起光源４４は、蛍光標識剤を励起可能な波長のレーザ光源を有する発光手段である。励起光源４４から出射される励起光Ｐは、ここでは波長が４０５ｎｍのレーザ光である。【０１００】
なお、励起光Ｐの波長は、蛍光標識剤を励起できる波長であればどのような波長であってもよい。コリメータレンズ４５は、励起光源４４から出射された励起光Ｐを平行光束にする。第１のダイクロックミラー４６は、波長選択性を有する反射鏡であり、励起光Ｐの波長の光のみを反射して、蛍光Ｆ及び制御光Ｖ（その反射光Ｒ）の波長の光を透過する。第１のダイクロックミラー４６は、光路Ｘ上に４５°の角度を持って挿入されており、コリメータレンズ４５から出射された励起光Ｐを反射して９０°屈折させ、導光ミラー４３に励起光Ｐを照射している。【０１０１】
また、励起光検出部２４は、蛍光Ｆを検出するアバランジェフォトダイオード４７と、蛍光Ｆを集光する集光レンズ４８と、光学ヘッド４０から光路Ｘ上に出射された蛍光Ｆを屈折させてアバランジェフォトダイオード４７に照射する第２のダイクロックミラー４９とを有している。【０１０２】
アバランジェフォトダイオード４７は、非常に感度の高い光検出器であり、微弱な光量の蛍光Ｆを検出することが可能である。なお、アバランジェフォトダイオード４７により検出する蛍光Ｆの波長は、ここでは４７０ｎｍ程度である。【０１０３】
また、この蛍光Ｆの波長は、蛍光標識剤の種類により異なるものである。集光レンズ４８は、アバランジェフォトダイオード４７上に蛍光Ｆを集光するためのレンズである。第２のダイクロックミラー４９は、光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー４３側から見て第１のダイクロックミラー４６の後段に配置されている。【０１０４】
したがって、第２のダイクロックミラー４９には、蛍光Ｆ、制御光Ｖ及び反射光Ｒが入射し、励起光Ｐは入射しない。第２のダイクロックミラー４９は、波長選択性を有する反射鏡であり、蛍光Ｆの波長の光のみを反射して、制御光（反射光Ｒ）の波長の光を透過する。【０１０５】
第２のダイクロックミラー４９は、光学ヘッド４０の導光ミラー４３から出射された蛍光Ｆを反射して９０°屈折させ、集光レンズ４８を介してアバランジェフォトダイオード４７に蛍光Ｆを照射する。【０１０６】
アバランジェフォトダイオード４７では、このように検出した蛍光Ｆの光量に応じた電気信号を発生し、その電気信号を制御／サーボ部２５に供給する。【０１０７】
また、励起光検出部２４は、制御光Ｖを出射する制御光源５０と、制御光源５０から出射された制御光Ｖを平行光束とするコリメータレンズ５１と、制御光Ｖの反射光Ｒを検出するフォトディテクト回路５２と、非点収差を生じさせてフォトディテクト回路５２に対して反射光Ｒを集光するシリンドリカルレンズ５３と、制御光Ｖと反射光Ｒとを分離する光セパレータ５４とを有している。【０１０８】
制御光源５０は、例えば７８０ｎｍの波長のレーザ光を出射するレーザ光源を有する発光手段である。なお、制御光Ｖの波長は、アドレスピット９が検出できる波長に設定されている。さらに、制御光Ｖの波長は、励起光Ｐ及び蛍光Ｆの波長と異なった波長に設定されている。このような波長であれば、制御光Ｖの波長は、７８０ｎｍに限らずどのような波長であってもよい。コリメータレンズ５１は、制御光源７０から出射された制御光Ｖを平行光束にする。平行光束とされた制御光Ｖは光セパレータ５４に入射される。【０１０９】
フォトディテクト回路５２は、反射光Ｒを検出するディテクタと、検出した反射光Ｒからフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号、及び、アドレスピット９の再生信号を生成する信号生成回路とを有している。反射光Ｒは、制御光Ｖがバイオアッセイ基板１で反射して生成された光であるので、その波長は、制御光Ｖと同一の７８０ｎｍである。【０１１０】
なお、フォーカスエラー信号は、対物レンズ４１により集光された光の合焦位置とバイオアッセイ基板１の基板層３との位置ずれ量を示すエラー信号である。フォーカスエラー信号が０となったときに、対物レンズ４１とバイオアッセイ基板１との間の距離が最適となる。位置決めエラー信号は、所定のウェル７の位置と焦点位置とのディスク半径方向に対する位置ずれ量を示す信号である。【０１１１】
位置決めエラー信号が０となったときに、制御光Ｖのディスク半径方向に対する照射位置が所定のウェル７に一致したこととなる。アドレスピット９の再生信号は、バイオアッセイ基板１に記録されているアドレスピット９に記述されている情報内容を示す信号である。この情報内容を読み出すことにより、現在、制御光Ｖを照射しているウェル７を特定することができる。【０１１２】
フォトディテクト回路５２は、反射光Ｒに基づき生成されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット９の再生信号を制御／サーボ部２５に供給する。【０１１３】
シリンドリカルレンズ５３は、フォトディテクト回路５２上に反射光Ｒを集光するとともに非点収差を生じさせるためのレンズである。このように非点収差を生じさせることによりフォトディテクト回路５２によりフォーカスエラー信号を生成させることができる。【０１１４】
光セパレータ５４は、偏向ビームスプリッタからなる光分離面５４ａと１／４波長板５４ｂとにより構成されている。光セパレータ５４では、１／４波長板５４ｂの逆側から入射された光を光分離面５４ａが透過し、その透過光の反射光が１／４波長板５４ｂ側から入射された場合には光分離面５４ａが反射する機能を有している。光セパレータ５４は、光分離面５４ａが光路Ｘ上に４５°の角度を挿入されているとともに、導光ミラー４３側から見て第２のダイクロックミラー４９の後段に配置されている。【０１１５】
したがって、光セパレータ５４では、コリメータレンズ５１から出射された制御光Ｖを透過して光学ヘッド４０内の導光ミラー４３に対してその制御光Ｖを入射させているとともに、光学ヘッド４０の導光ミラー４３から出射された反射光Ｒを反射することにより９０°屈折され、シリンドリカルレンズ５３を介してフォトディテクト回路５２に反射光Ｒを照射する。【０１１６】
制御／サーボ部２５は、励起光検出部２４により検出されたフォーカスエラー信号、位置決めエラー信号及びアドレスピット９の再生信号に基づき、各種のサーボ制御を行う。【０１１７】
すなわち、制御／サーボ部２５は、フォーカスエラー信号に基づき光学ヘッド４０内の２軸アクチュエータ４２を駆動して対物レンズ４１とバイオアッセイ基板１との間の距離を制御し、フォーカスエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部２５は、位置決めエラー信号に基づき光学ヘッド４０内の２軸アクチュエータ４２を駆動して対物レンズ４１をバイオアッセイ基板１の半径方向に移動制御し、位置決めエラー信号が０となるようにサーボ制御を行う。また、制御／サーボ部２５は、アドレスピット９の再生信号に基づき光学ヘッド４０を所定の半径位置に移動し、目的のウェル位置に対物レンズ４１を移動させる。【０１１８】
以上のような構成のバイオアッセイ装置では、バイオアッセイを行う場合には、次のような動作を行う。【０１１９】
ＩｎＰ又はＩｎＰ／ＺｎＳ量子ドットをプローブオリゴヌクレオチドに結合させて標識する場合、バイオアッセイ装置は、バイオアッセイ基板１を回転させながら、図３に示すようにウェル上にサンプルＤＮＡ（Ｓ）が含有した溶液を滴下し基板上に固定化後、図４に示すように標識プローブＤＮＡ（Ｐｒ）とサンプルＤＮＡ（Ｓ）とを相互反応（ハイブリダイゼーション）させる。【０１２０】
その後、洗浄後、バイオアッセイ装置は、バイオアッセイ基板を回転させ、励起光Ｐを当該バイオアッセイ基板の下面１ｂ側から入射させてウェル７内の蛍光標識剤に照射し、その励起光Ｐに応じてその蛍光標識剤から発生した蛍光Ｆをバイオアッセイ基板の下方から検出する。【０１２１】
ここで、バイオアッセイ装置２１では、励起光Ｐと制御光Ｖとを同一の対物レンズ４１を介してバイオアッセイ基板に照射している。そのため、バイオアッセイ装置では、制御光Ｖを用いたフォーカス制御、位置決め制御並びにアドレス制御を行うことによって、励起光Ｐの照射位置、すなわち、蛍光Ｆの発光位置を特定することが可能となり、その蛍光の発光位置からサンプルＤＮＡと結合したプローブＤＮＡを特定することができる。【０１２２】
（ＤＮＡ解析方法について）
ウエルにサンプルＤＮＡの滴下後、バイオアッセイ基板１を恒温層等に移し、ウェル７内を数十度に加熱し、加熱した状態のまま１ＭＶ／ｍ、１ＭＨｚ程度の交流電界を印加する。このような処理をすると、サンプルＤＮＡとプローブオリゴヌクレオチドとが垂直方向に伸張して立体障害の少ない状態となるとともに、サンプルＤＮＡがバイオアッセイ基板に対して垂直方向に移動する。この結果、互いの塩基配列が対応したサンプルＤＮＡとプローブＤＮＡとが同一のウェル７内にある場合には、それらがハイブリダイゼーション反応を起こす。【０１２３】
続いて、バイオアッセイ基板の表面を純水等で洗浄し、ハイブリダイゼーション反応を起こしていないウェル内のＳｉ量子ドットで標識されたプローブオリゴヌクレオチドを除去する。この結果、ハイブリダイゼーション反応を起こしたウェル内にのみ、ＩｎＰ又はＩｎＰ／ＺｎＳ量子ドットが残存することとなる。【０１２４】
続いて、バイオアッセイ装置により、制御光Ｆを用いてフォーカスサーボ制御及び位置決めサーボ制御並びにアドレス制御を行いながらバイオアッセイ基板を回転させ、励起光Ｐを所定のウェルに照射する。この励起光Ｐの照射とともに、アドレス情報を検出しながら蛍光Ｆが発生しているか否かを検出する。【０１２５】
このときのＩｎＰコア粒子を使用したオリゴヌクレオチドプローブとＩｎＰ／ＺｎＳコア／シェル粒子を用いたプローブについての平均蛍光強度と検出精度を標的ＤＮＡを検出できた割り合いで表１に示した。【０１２６】
表１からわかるように本発明に従ったコア／シェル量子ドットを使用することによって平均蛍光強度が増大し、何より検出精度が大きく向上することがわかる。【０１２７】
《検出精度》
ウエル上の蛍光検出において同じ標的ＤＮＡを含むサンプルを１００ウエル分で測定した時に目的の信号が明確に検出（８０％以上の信号強度を示す）できたときの割合で検出精度を示した。【０１２８】
検出良好    ：明確な検出頻度９５％以上
検出やや不良：明確検出頻度６０％で信号のとぎれやや有り
検出不良    ：明確検出頻度３０％以下で信号とぎれ頻繁【０１２９】
【表１】
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【０１３０】
本発明の半導体蛍光微粒子は優れた検出精度を示すことが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2008029730.tif 000008
2008029730.tif 000009
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