(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫寛容を誘導するペプチドの免疫寛容原性能力を調べるペプチド調査方法において、
抗原処理することなく、上記ペプチドがＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合できるかを判定し、Ｔ細胞に提示できるかを判定するステップを有し、
上記ペプチドがＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合できるかどうかの判定は、
（ｉ）定着された抗原提示細胞と、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子を含む脂質膜又は平面結合ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子とを有する提示組織非依存抗原系で上記ペプチドを処理し、
（ｉｉ）上記提示組織非依存抗原系内のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に対する上記ペプチドの結合性を分析して、行い、
上記提示組織非依存抗原系内のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合し、Ｔ細胞に提示できるペプチドは、生体内で免疫寛容を誘導できるペプチドとして識別されるペプチド調査方法。
【請求項２】
上記抗原処理することなく、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合して、Ｔ細胞に提示でき、生体内で免疫寛容を誘導できると識別されたペプチドを抽出するステップとを更に有する請求項１記載のペプチド調査方法。
【請求項３】
上記判定するステップでは、上記ペプチドが、抗原処理することなく、ＭＨＣクラスＩＩ分子のみに結合可能であるかどうかを判定することを特徴とする請求項１又は請求項２記載のペプチド調査方法。
【請求項４】
上記ペプチドは、Ｔ細胞エピトープを構成する複数のペプチドから選択されることを特徴とする請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のペプチド調査方法。
【請求項５】
複数のペプチドは、抗原提示細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子から溶出されることを特徴とする請求項４記載のペプチド調査方法。
【請求項６】
複数のペプチドのうちの各ペプチドは、免疫助成剤が被検者に投与されたとき、該被験者内にて抗原と結合される疾患を誘発可能であることを特徴とする請求項４又は５記載のペプチド調査方法。
【請求項７】
上記ペプチドは、切断されたペプチドの入れ子集合から選択されることを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド調査方法。
【請求項８】
請求項１記載のペプチド調査方法によって識別される免疫寛容原性ペプチドであって、ミエリン塩基性タンパク質ペプチド：３０−４４（ＰＲＨＲＤＴＧＩＬＤＳＩＧＲＦ）、８０−９４（ＴＱＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶ）、８３−９９（ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰ）、８１−９５（ＱＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴ）、８２−９６（ＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰ）、８３−９７（ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲ）、８４−９８（ＭＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴ）、１１０−１２４（ＳＬＳＲＦＳＷＧＡＥＧＱＲＰＧ）、１３０−１４４（ＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶ）、１３１−１４５（ＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶＤ）、１３２−１４６（ＳＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶＤＡ）、及び１３３−１４７（ＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶＤＡＱ）から選択されたものであり、多発性硬化症の治療及び／又は予防に用いられることを特徴する免疫寛容原性ペプチド。
【請求項９】
請求項８記載の免疫寛容原性ペプチドを含み、多発性硬化症用であることを特徴とする医薬品組成物。
【請求項１０】
請求項８記載の複数のミエリン塩基性タンパク質ペプチドを含むことを特徴とする請求項９記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
請求項８記載の上記ミエリン塩基性タンパク質ペプチドを２〜１２種類含むことを特徴とする請求項１０記載の医薬品組成物。
【請求項１２】
請求項８記載の上記ミエリン塩基性タンパク質ペプチドを４種類含むことを特徴とする請求項１１記載の医薬品組成物。
【請求項１３】
上記幾つかのペプチド又はそれぞれのペプチドは、同時にかつ別々にキットの形で準備され、別々に又は順次投与されることを特徴とする請求項９乃至１２のいずれか１項記載の医薬品組成物。
【請求項１４】
当該医薬品組成物は、鼻腔投与されることを特徴とする請求項９乃至１３のいずれか１項記載の医薬品組成物。
【請求項１５】
請求項８記載の免疫寛容原性ペプチドを用いて、多発性硬化症に対する医薬品組成物を製造する製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫寛容原性ペプチド（tolerogenic peptide）を選択する方法、この方法によって識別されるペプチド、及び疾患の治療及び／又は予防におけるこの方法を用いることに関する。また、本発明は、このような複数の免疫寛容原性ペプチドを含む医薬品組成物（pharmaceutical composition）に関する。
【０００２】
【従来の技術】
適応免疫反応（adaptive immune response）において、Ｔリンパ球（T lymphocytes）は、タンパク質抗原の内部エピトープを認識することができる。抗原提示細胞（Antigen presenting cells、以下、ＡＰＣという。）は、タンパク質抗原を取り込み（take up）、短いペプチドの断片に分解する。ペプチドは、細胞内の主要組織適合抗原複合体（major histocompatability complex、以下、ＭＨＣという）クラスＩ又はＩＩ分子に結合し、細胞表面に運ばれる。ペプチドは、ＭＨＣ分子と共に細胞表面に提示されると、Ｔ細胞（Ｔ細胞レセプタ（T cell receptor、以下、ＴＣＲという。））によって認識される。この場合、ペプチドは、Ｔ細胞エピトープ（T cell epitope）である。
【０００３】
Ｔ細胞エピトープは、外来か自己かに関わらずあらゆる抗原に対して、適応免疫反応における中心的な役割（central role）を果たす。過敏性症候群（アレルギー、自己免疫性疾患、移植拒絶反応を含む）におけるＴ細胞エピトープの中心的な役割は、実験的モデルを用いることにより証明されている。（Ｔ細胞エピトープの構造に基づく）合成ペプチドを、免疫増強剤（adjuvant）と共に注射することによって、炎症又はアレルギー疾患を誘発することができる。
【０００４】
これとは対照的に、ペプチドエピトープを可溶性の形で投与することによって、特定のペプチドエピトープに対する免疫寛容を誘導できることが示されている。可溶性ペプチド抗原の投与は、実験的な自己免疫脳脊髄炎（autoimmune encephalomyelitis（ＥＡＥ−多発性硬化症（multiple sclerosis（ＭＳ））のモデル、Metzler and Wraith (1993) Int. Immunol. 5: 1159-1165; Liu and Wraith (1995) Int. Immunol. 7: 1255-1263; Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol.28: 1251-1261）、並びに関節炎、糖尿病及びブドウ膜網膜炎（uveoretinitis）の実験的なモデル（上述のAnderton and Wraith (1998)）において疾患を抑制する有効な手段として、証明されている。また、これは、ＥＡＥにおける進行性疾患を治療する手段として、証明されている（上述のAnderton and Wraith (1998)）。
【０００５】
免疫寛容原性ペプチドを病気の予防又は治療に使用することは、大いに注目すべきことである。その理由は、特定の免疫寛容原性エピトープが、同じ組織内の異なる抗原に対するＴ細胞反応を抑制できることが示されていることである。この現象は、特定の免疫寛容原性ペプチド（上述のAnderton and Wraith (1998)）を用いることによって、所定の抗原内の１つ以上のエピトープ（好ましくは全てのエピトープ）に対し、及び所定の疾患の１つ以上の抗原に対して寛容を誘導できなければならない「非特異的抑制（bystander suppression）」手段として知られている。これは、特定の疾患内の全ての病原性抗原を識別する必要性を無くしている。
【０００６】
また、ペプチドは、比較的低コストであり、ペプチド類似物が、免疫学的性質を変えることによって生産することができるという事実があるので、治療における有利な選択肢である。このように、ペプチドは、ＭＨＣ（major histocompatability complex）又はＴＣＲ（T cell receptor）との相互作用を変えるために、変性することができる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
この手法において考えられる１つの問題点は、全てのペプチドが、寛容を誘導できるＴ細胞エピトープとして機構するのではないことが示されていることである。ミエリン塩基性タンパク質（myelin basic protein、以下、ＭＢＰという。）ペプチド８９−１０１は、免疫化の後の免疫優性抗原であり、また、Ｔ細胞反応の初回抗原刺激（priming）及びＥＡＥの誘導の両方観点から、非常に有効な免疫抗原（immunogen）である。しかしながら、このペプチドは、溶液で投与した場合、寛容を誘導する効果がないことが示されている（上述のAnderton and Wraith (1998)）。
【０００８】
寛容を誘導するＴ細胞の能力における観察された階層構造（hierarchy）についての幾つかの説明が提案されている（上述のAnderton and Wraith (1998)）。特に、ＭＨＣのペプチドの親和性（affinity）と免疫寛容原性（上述のLiu and Wraith (1995)）とに相関があることが提案されているが、観察結果には、一致しないものもある。例えば、ＭＢＰ［８９−１０１］は、免疫寛容原性ではないが、比較的高い親和性を有するＩ−ＡＳに結合する。このように、どのペプチドが寛容を誘導するかを直接予測できない。
【０００９】
一部のペプチドエピトープのみが寛容を誘導できることについて合理的な説明がある場合、過敏性疾患（hypersensitivity disorder）の予防及び治療に有効な免疫寛容原性ペプチドの選択が容易になる。
【００１０】
そこで、本発明に係るペプチド選択方法は、過敏性疾患等の免疫系疾患の予防及び治療に有効な免疫寛容原性ペプチドの選択を容易にすることを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、ペプチドのエピトープが抗原処理することなく未成熟のＡＰＣによって提示されるような適切なサイズであるか否かを示している。それが免疫寛容原性を誘発することができる。あるＴ細胞エピトープが免疫寛容原性であって、他は寛容を誘導できない点は、エピトープの中には、ＭＨＣ分子によって提示され得る以前に、更なる抗原処理が必要なものもあるという事実によって説明される。これらの抗原処理が必要なエピトープは、溶液状態にて投与されたとき、寛容を誘導できないにもかかわらず、エピトープは、免疫増強剤（adjuvant）とともに投与されると疾患を誘発することができる。
【００１２】
更なる抗原処理を必要としないエピトープは、免疫寛容を誘導することができ、これは本発明者によって「アピトープ（apitopes）（抗原処理非依存エピトープ（Antigen Processing Independent epiTOPES））」と称される。
【００１３】
この知見は、生体内におけるペプチドの寛容能力を検査する必要性を不要にする免疫寛容原性Ｔ細胞エピトープを規則に基づいて選択する方法を提供するものである。これは、特に、動物モデルが対応できない疾患を予防する又は治療するための方法の発展に有益である。生体内に用いられる前に、試験管内でヒトＴ細胞（ヒトＭＨＣ分子に結合する抗原を認識する。）を使って、ペプチドの寛容誘導能がテストされ、機構が提供されるため、動物モデルを持つ疾患があるが、その選択方法は、寛容性誘導構造を単純かつ安全に発展される。
【００１４】
第１の特徴は、本発明者は、更に抗原処理することなく、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合できるペプチドを選択するステップを含む免疫寛容原性ペプチドを選択する方法を提供する。好ましい例としては、ペプチドは、更に抗原処理することなく、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合できる。
【００１５】
所定の抗原に対してＴ細胞エピトープとして機能できるペプチドを分類する技術には、多くの方法が知られている。したがって、一般的に、この方法は、Ｔ細胞エピトープを構成する複数のペプチドの中から免疫寛容原性ペプチドを選択することに用いられる。
【００１６】
ペプチドが、更なる抗原処理することなく、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合できるか否かを調べるために、ペプチドのＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に対する結合能を提示組織非依存抗原系（antigen processing independent presentation system、以下、ＡＰＩＰＳという。）を用いて調べることができる。好ましくは、（ｉ）ＡＰＩＰＳでペプチドを処理する。（ｉｉ）ＡＰＩＰＳ内のＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に対するペプチドの結合性を分析する。
【００１７】
第２の特徴としては、本発明により、第１の特徴の方法によって選択されたペプチドを抽出することである。
【００１８】
ペプチドは、疾患の予防及び／又は治療に有用である。特に、ペプチドは、自己反応性Ｔ細胞によって媒介される疾患の予防及び／又は治療に有用である。例えば、アレルギー、自己免疫疾患及び移植による拒絶反応のような過敏症反応に対しては、特に本発明のペプチドを用いて治療／予防するとよい。
【００１９】
本発明者は、ミエリン塩基性タンパク質の多くのアピトープを既に識別した。これは、多発性硬化症における自己抗原でもある。特に好ましい例としては、本発明に係るペプチドは、多発性硬化症の予防及び／又は治療に有用である。
【００２０】
幾つかのペプチドは、同一抗原由来の他のエピトープ及び異なる抗原由来の他のエピトープに対して寛容を誘導できると知られている（非特異的抑制として知られている現象によって）。
【００２１】
しかしながら、本発明者は、全ての自己反応性Ｔ細胞を十分に抑制するためには、種々のアピトープを組み合わせて疾患の治療／予防のために患者に投与することが有効であろうことを予測した。
【００２２】
第３の特徴としては、本発明者は、発明の第２の特徴による複数のペプチドからなる医薬品組成物を提供するものである。ここで、各々のペプチドは、Ｔ細胞エピトープに基づいている。
【００２３】
第４の特徴としては、本発明者は、発明の第２の特徴に基づいて被験者にペプチドを投与するステップを含み、被験者の疾患を予防及び／又は治療する方法を提供する。
【００２４】
予防及び／又は治療のための一般的な方法は、以下のステップを含む。すなわち（ｉ）疾患の抗原を識別する。（ｉｉ）抗原のアピトープを識別する。（ｉｉｉ）被験者にアピトープを投与する。
【００２５】
【発明の実施の形態】
第１の特徴として、本発明は、免疫寛容原性ペプチド（tolerogenic peptide）を選択する方法に関する。
【００２６】
・寛容（Tolerance）
ここでは、用語「寛容原性（tolerogenic）」は「寛容（tolerance）を誘導できる能力」を意味するものとして用いる。
【００２７】
寛容は、抗原に反応できないことである。自己抗原に対する寛容は、免疫系（immune system）の本質的特徴であり、これが失われると、自己免疫疾患（autoimmune disease）が起こる。適応免疫系では、それ自身の組織内に含まれる自己抗原の自己免疫攻撃を避ける一方で、膨大な種類の病原菌に反応する能力を維持しなければならない。これは、胸腺（中枢性免疫寛容（Central tolerance））におけるアポトーシス細胞死（apoptotic cell death）に対して未成熟のＴリンパ球の感応性によって、大幅に制御される。しかしながら、胸腺において全ての自己抗原が検出されるわけではないので、自己反応胸腺リンパ球の死は、不完全のまま残る。そのため、末梢組織における成熟した自己反応Ｔリンパ球によって獲得できる免疫寛容（末梢性免疫寛容）の機構がある。中枢性及び末梢性免疫寛容の機構の検討がAnderton等によってなされている（1999, Immunological Reviews 169:123-137）。
【００２８】
免疫寛容は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも一部によってアネルギを誘発することにより、その結果として生じ、又は特徴付けられる。Ｔ細胞を活性化するために、ペプチドは、Ｔ細胞に２つのシグナルを伝達できる「専門の」ＡＰＣに結合しなければならない。第１のシグナル（シグナル１）は、ＡＰＣの細胞表面のＭＨＣペプチド複合体によって伝達され、ＴＣＲを介してＴ細胞によって受け取られる。第２のシグナル（シグナル２）は、ＡＰＣの表面の共刺激分子（costimulatory molecules）、例えばＣＤ８０、ＣＤ８６によって伝達され、Ｔ細胞の表面のＣＤ２８によって受け取られる。Ｔ細胞が、シグナル２がない場合にシグナル１を受け取ったとき、Ｔ細胞は活性化されず、アネルギ性になると考えられる。アネルギ性Ｔ細胞は、連続的な抗原投与（antigenic challenge）に対して不応性であり、他の免疫反応を抑制できる能力がある。アネルギ性Ｔ細胞は、Ｔ細胞寛容をもたらす際に、関与すると考えられる。
【００２９】
理論に縛られることなく、本願発明の発明者は、ペプチドは、成熟した抗原提示細胞（antigen presenting cells）によって処理されるべきものであるので、ＭＨＣ分子と共に提示できるようになる前に、処理（processing）を必要とするペプチドは、寛容を誘導しないと予測している。成熟した抗原提示細胞（例えばマクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞）は、抗原処理の能力を有するが、また、シグナル１及びシグナル２をＴ細胞に伝達して、Ｔ細胞を活性化する。一方、アピトープ（Apitopes）は、未成熟のＡＰＣ上のクラスＩＩのＭＨＣに結合することができる。このように、アピトープは、同時刺激（costimulation）なしで、Ｔ細胞に提示され、結果として、Ｔ細胞アネルギ及び寛容を誘導する。
【００３０】
当然、アピトープも、成熟したＡＰＣの細胞表面でＭＨＣ分子に結合することができる。しかしながら、免疫系は、成熟したＡＰＣよりも大量の未成熟のＡＰＣを含んでいる（１０％未満の樹状細胞が活性化されていることが、Summers等によって示唆されている(2001) Am. J. Pathol. 159: 285-295）。したがって、アピトープに対するデフォルトの立場（default position）は、活性化というよりはむしろ、アネルギ／寛容である。
【００３１】
寛容がペプチドの吸引によって誘導されるとき、増殖に対する抗原特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞の能力は、低減される。また、ＩＬ−２並びにＩＦＮ−γの生成及びこれらの細胞によるＩＬ−４の生成は、抑制されるが、ＩＬ−１０の生成は増加する。ペプチドによって誘導された寛容の状態にあるハツカネズミ中のＩＬ−１０の無効化（neutralisation）は、疾患に対する感受性を完全に回復することが示されている。ＩＬ−１０を生成し、免疫制御（immune regulation）をもたらす（mediate）制御細胞の個体数（population of regulatory cells）は、寛容状態を維持することが示されている（Burkhart et al (1999) Int. Immunol. 11: 1625-1634）。
【００３２】
したがって、寛容の誘導は、
（ａ）生体内の標的エピトープであるペプチドに対して疾患となる感受性を低下させる
（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるアネルギの誘導（試験管内で抗原を連続投与することによって検出される）
（ｃ）以下、（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）によるＣＤ４＋Ｔ細胞の個体数の変更
（ｉ）培養の減数（reduction）
（ｉｉ）ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−４の生成のダウンレギュレーション
（ｉｉｉ）ＩＬ−１０の生成の増加
を含む種々の手法によって観察することができる。
抗原処理非依存エピトープ（Antigen Processing Independent Epitopes、以下、アピトープ（APITOPES）という。）
【００３３】
本発明の方法は、更なる抗原処理をすることなく、ＭＨＣクラスＩ又はＩＩタンパク質に結合することができるペプチドを選択するステップを有する。このようなペプチドを、本明細書では、「アピトープ（apitopes）」（抗原処理非依存エピトープ（Antigen Processing Independent epiTOPES）と称する。
【００３４】
所定の抗原から誘導されるペプチドの細胞表面提示は、ランダムではなく、頻繁に生じる少量のエピトープによって支配される傾向がある。特定のペプチドの優位性は、多くの因子、例えばＭＨＣ分子を結合する相対親和度（relative affinity）、ＡＰＣ内における生成時の空間的な位置及び耐崩壊性に依存する。抗原のエピトープ階層構造（epitope hierarchy）は、免疫反応の進行によって変化することができ、このエピトープ階層構造の変化は、自己寛容及び自己免疫に対して重要な影響を及ぼす。主要抗原決定基領域（Immunodominant determinant regions）は、優れた免疫寛容原である可能性がある。したがって、好ましい実施の形態において、本発明に係るアピトープは、優性エピトープ（dominant epitope）に基づいている。
【００３５】
しかしながら、免疫優性ペプチド（immunodominant peptides）に対する一次免疫反応の後、エピトープの「拡散（spreading）」が亜優性決定基（sub-dominant determinants）に起こる（Lehmann et al (1992) Nature 358: 155-157）。亜優性エピトープ（subdominant epitope）の提示は、自己免疫性のトリガとして重要である。本発明に係るアピトープは、亜優性エピトープに基づくことができる。
【００３６】
また、あらゆる所定の抗原に対して、潜在エピトープ（cryptic epitopes）が存在することができる。潜在エピトープは、ペプチドとして投与されたときには、Ｔ細胞反応を刺激することができるが、全ての抗原として投与されたときには、このような反応を起こすことはできない。抗原のＡＰＣのペプチド内への処理中に、潜在エピトープは、破壊（destroyed）される。本願の発明者は、ペプチド９２−９８がＭＢＰ（例２Ｃに示す。）に対して潜在エピトープであることを示している。興味深いことに、このペプチド領域内のアスパラギニルエンドペプチダーゼ（asparaginyl endopeptidase）の推定上の切断部位（putative cleavage site）があり、自然処理（natural processing）中には、この領域を含んだペプチドは、ＡＰＣによって生成されない。
【００３７】
潜在エピトープは、更なる抗原処理をすることなく、ＭＨＣ分子に結合できるという点で、試験管内でアピトープとして働き、潜在エピトープを認識するＴ細胞にアネルギを誘導する。しかしながら、このようなアピトープは、抗原の自然に処理されたエピトープ（naturally processed epitope）を認識するＴ細胞を寛容がある（tolerising）ようにしなければならないので、治療には役に立たない。
【００３８】
抗原のエピトープは、ＡＰＣによって提示されるとき、抗原全体に亘ってペプチドが部分的に一致するＴ細胞反応を測定することによって、識別することができる（下記参照）。このような研究により、通常、結果として、ペプチドの「入れ子集合（nested sets）」が得られ、特定のＴ細胞株／クローン（T cell line/clone）の最小のエピトープ（minimal epitope）は、切断されたペプチド（truncated peptides）の反応を測定することによって、評価することができる。
【００３９】
抗原の最小のエピトープがアピトープとして機能するとみなすことはできない。多分、最小のエピトープの側面に位置する（flanking）アミノ酸がＭＨＣに最適に結合することが必要である。アピトープは、異なるＴ細胞クローンの最小のエピトープ間の微妙な差異の可能性をカバーするように設計しなければならない。
【００４０】
全てのエピトープ用のアピトープを識別できないことは、強調すべきである。幾つかのエピトープがＭＨＣに結合することは、ある意味では、エンドソームにおけるＭＨＣの取込（MHC-loading）に依存し、したがって、処理（processing）を必要とするという明らかな証拠がある（Viner et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 2214-2218）。これは、各最小のエピトープが必然的にアピトープとして機能するとみなすことができないもう１つの理由である。
【００４１】
Ｔ細胞エピトープを含むペプチドの識別
所定の抗原内のＴ細胞エピトープを識別する技術的に知られた幾つかの方法がある。
【００４２】
自然に処理されたエピトープは、抗原取込ＡＰＣ（antigen-loaded APC）から溶出されたペプチドの質量分光光度分析（mass spectrophotometric analysis）によって識別される。これらは、抗原を取り込む（take up）ように促進させたＡＰＣ、又は適切な遺伝子による変化によって、細胞内にタンパク質を生成することを強制されたＡＰＣである。通常は、ＡＰＣは、タンパク質によって溶液中で培養され、又はＡＰＣ細胞表面に対して適切にターゲットとされる。３７℃での培養の後、細胞は、表面活性剤（detergent）及び、例えばアフィニティークロマトグラフィ（affinity chromatography）により精製されたクラスＩＩタンパク質によって、溶解される。精製ＭＨＣを、適切な化学環境（suitable chemical medium、例えば酸性条件（acid conditions））によって処理することにより、ＭＨＣからペプチドが溶出される。このペプチドプールを分離し、同様に処理された制御ＡＰＣからのペプチドとプロフィールを比較する。細胞を提示する又は細胞から得られる（expressing/fed）タンパク質の特徴ピークを（例えば、質量分析法により）解析し、ペプチド断片を識別する。この手法により、通常、抗原処理によって特定の抗原から得られるペプチドの部位（通常、「入れ子集合（nested sets）」として確認される）についての情報が得られる。
【００４３】
エピトープを識別する他の方法は、試験管内の定量法によって、抗原の長さに重複及び亘っているペプチドの合成ライブラリを調べることである。例えば、ペプチド鎖内には１５のアミノ酸があり、５又は１０のアミノ酸が重複して使用されている。ペプチドは、抗原提示細胞とＴ細胞とを含む抗原提示系（antigen presentation system）にて、識別される。例えば、抗原提示系は、ラットの脾細胞（murine splenocyte）の調製物を使用し、ヒト細胞はＰＢＭＣ又は扁桃腺の調製物を使用する。若しくは、抗原提示系は、特定のＴ細胞株又はＴ細胞クローン、及び／又は特定の抗原提示細胞タイプを含む。
【００４４】
Ｔ細胞活性化は、Ｔ細胞培養（例えば、３Ｈ−チミジン取込）又はサイトカイン（cytokine）産生により測定される。ＴＨ１型ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ試験のような一般的な手法によって検出されるＩＦＮγの産生により測定される。
【００４５】
重複するペプチドを調べることは、大抵、エピトープが検出された抗原部位を示している。特定のＴ細胞に対する最小のエピトープは、切断されたペプチド（truncated peptides）への反応を測定することによって評価できる。例えば、重複ライブラリの中で１−１５の残基を含むタンパク質が得られれば、最小のエピトープの識別に用いることのできる両端が欠損している（例えば、１−１４、１−１３、１−１２、２−１５、３−１５、４−１５等）。
【００４６】
試験管内の試験により用いられた抗原の免疫優位残基の識別（特に、Ｔ細胞株を用いるもの）は、本発明によるペプチドの好反応性結果の非対称性を導くものと予測される。実例に示されたＭＢＰエピトープを識別する実験では、ＭＳ患者由来のＰＢＭＣの培養における動的反応性を分析し、健康な固体は重複ペプチドのライブラリに対して測定される。この試験は、健康な固体を形成するＴ細胞及びＭＳ患者のＴ細胞は精製されたタンパク質抗原に類似した種類に反応するが、ＭＢＰ配列に基づいたペプチドとは異なる方法で反応するとの知見に基づいている。ＭＳ患者由来のＴ細胞は、正常で健康な被験者と比較して、かなりの量が、ペプチド抗原に対してより急激に動的に反応する。これは、特定患者が特定時期に反応するエピトープの識別及びエピトープの検出を可能たらしめる。ここで示した実験では、この手法によって、基本的な手法を用いて識別されないエピトープ含有残基の数を明らかにしている。そしてまた、Ｔ細胞の認識は、ある時点に現れて、消失し、その後再度現れるという周期的パターンを示すことが明らかになった。
【００４７】
患者が特定時期に反応するエピトープを明らかにするため、本発明者が提案する運動反応性の測定は、非常に貴重な手段である。この情報は、関連性のあるエピトープ（１つでもあれば。）に対するアピトープを識別し、投与管理することによって、治療する上で、アピトープの投与方法を個々の患者に適応させることに役立つ。また、この情報によれば、疾患の進行に対する一般的なパターンが作成できるため、治療合成薬は、疾患の進行段階に適合すると考えられるエピトープにアピトープを含んで調製することができる。
【００４８】
提示組織非依存抗原系（Antigen Processing Independent Presentation Systems、以下、ＡＰＩＰＳという。）
一旦、エピトープが識別されると、次の段階は、このエピトープがアピトープとして作用するか否かを調べることである。
【００４９】
アピトープは、抗原処理を必要とすることなく、成熟のＴ細胞に提示されなくてはならない。アピトープは、Ｔ細胞エピトープを含む識別されたペプチドを持ち、処理のない系（processing free system）を用いて識別されてもよい。切断されたペプチド及びペプチド類似体は、提示組織非依存抗原系（ＡＰＩＰＳ）を使って活性化がテストされる。
【００５０】
ＡＰＩＰＳには、以下のものが含まれる。
ａ）固定ＡＰＣ（ＣＤ２８に対する抗体を持つもの又は持たないもの）。
ｂ）ＭＨＣ分子のクラスＩ又はＩＩを含む脂質膜（ＣＤ２８に対する抗体を持つもの又は持たないもの）。
ｃ）平面結合構造にある精製された本来の又は組換型のＭＨＣ（ＣＤ２８に対する抗体を持つもの又は持たないもの）。
【００５１】
例えば、切断されたペプチドへの反応を測定することによって、ポリペプチド内の最小のエピトープを調査する研究（Fairchild et al (1996) Int. Immunol. 8: 1035-1043）において、Ｔ細胞の反応を調べるために固定ＡＰＣを使用することは知られている。ＡＰＣは、例えば、ホルムアルデヒド（通常パラホルムアルデヒド）又はグルタルアルデヒドを用いて固定される。
【００５２】
脂質膜（平面膜又はリポソーム）としては、人工脂質を用いるか、又はＡＰＣ由来の原形質膜（plasma membrane）／ミクロソーム画分分画（microsomal fractions）を用いる。
【００５３】
使用に際して、ＡＰＩＰＳは、組織培養プレートの穴（wells）に適用されてもよい。ペプチド抗原は、選択されたＴ細胞株又はＴ細胞クローンの付加によって検出されるＡＰＩＰＳのＭＨＣ部にペプチドを付加されるとともに結合している。Ｔ細胞株又はＴ細胞クローンの活性化は、例えば、３Ｈ−チミジン取込又はサイトカイン分泌を介するような、既知の如何なる方法によって測定されてもよい。
【００５４】
ペプチド
ペプチドに関する発明の第２の様相
「ペプチド」という語は、典型的なＬ−アミノ酸や、隣接するアミノ酸のカルボキシル基とα−アミノ酸との間のペプチド結合によって典型的に互いに結合した一連の残基を表す通常の意味で使用されている。また、この語は、変性ペプチド及び合成ペプチド類似物を含む。
【００５５】
本発明に係るペプチドは、更なる抗原処理をすることなく、ＭＨＣのクラスＩ又はＩＩに結合できれば、如何なる長さであってもよい。
【００５６】
ＭＨＣのクラスＩ分子と結合するペプチドの分子長は、典型的には７〜１３個のアミノ酸からなり、より一般的なものは８〜１０個のアミノ酸からなる。
ペプチド結合は、全ＭＨＣクラスＩ分子のペプチド結合溝において、ペプチド主鎖の原子と不変部位との間の接触によって両端にて安定化されている。ペプチドのカルボキシ末端とアミノ末端との結合溝の両端には不変部位がある。ペプチド長の変動は、ペプチド骨格において起こる縺れ、またしばしば要求される柔軟性を持たせるプロリン又はグリシン残基にて起こる縺れによって決まる。
【００５７】
ＭＨＣのクラスＩＩ分子に結合するペプチドは、典型的には８〜２０個のアミノ酸長であり、より一般的なのは１０及び１７個のアミノ酸長であるが、これより長くもなり得る。これらのペプチドは、両端がオープンになったＭＨＣＩＩペプチド結合溝に沿って伸張された構造になっている（ＭＨＣクラスＩペプチド結合溝とは異なる。）。ペプチドは、主に、ペプチド結合溝に沿った保護残基に接した主鎖原子によって適切に保持されている。
【００５８】
本発明に係るペプチドは、化学的方法を用いて生成されてもよい（Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky , Springer-Verlag, Berlin.）。例えば、ペプチドは、固相法によって合成することができ（Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204）、樹脂から割削され、高性能液体クロマトグラフィによって精製できる（e. g., Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）。例えば、ＡＢＩ ４３ １ Ａペプチド合成装置（Perkin Elmer）を用いて製造業者から提供された指示にしたがって自動的に合成してもよい。
【００５９】
あるいは、ペプチドは、組換手段によって、又はより長いポリペプチドを分割することによって生成されるものであってもよい。例えば、ペプチドは、標的抗原からの分裂によって得られる。ペプチドの合成は、アミノ酸解析又は配列決定法により確立されている（例えばエドマン分解法）。
【００６０】
好ましい実施の形態において、ペプチドは、標的抗原から提供される。標的抗原は、疾患が生じている間、ＡＰＣによって処理される分子（例えば、タンパク質又は糖タンパク質）及びＴ細胞によって認識される分子である。当然のことながら、標的抗原は、標的疾患に依存する。好ましくは、ペプチドは、ＡＰＣによる抗原の自然の処理によって生じた抗原の断片から誘導される。
【００６１】
実際には、ペプチドには様々な他の特性もある。例えば、ペプチドは、生体における許容濃度で可溶でなくてはならない。好ましくは、ペプチドは、最高でも０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶でなくてはならない。より好ましくは、ペプチドは、最高でも１ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶でなくてはならない。また、最も好ましくは、ペプチドは、最高でも５ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶でなくてはならない。
【００６２】
鼻腔投与における服用量の最大値は、最新の方法では、鼻腔当たり約２００ｐｌである。仮にペプチドが１ｍｇ／ｍｌの濃度で可溶であれば、各鼻腔に２服することで８００μｇが患者に投与される。一回の服用が５ｍｇを超えることは、例外的である。
【００６３】
また、ペプチドが治療に有効であるためには、体内で十分に安定していることも重要である。本発明者は、体内で投与後３０分経過して、試験ペプチドの全量が５０％に低下し、投与後４時間経過して、ペプチド量が約３０％に低下することが判った。しかしながら、５日経過後にも依然として検出可能な程度含まれる（約５％）ことが判った。体内におけるペプチドの半減期は、少なくとも１０分程度は必要であり、好ましくは３０分、より好ましくは４時間、更に好ましくは２４時間である。
【００６４】
本発明者は、ペプチドを鼻腔内へ投与すると、流出するリンパ節中のペプチドの量が投与後約４時間経過後に最大値となるが、５日経過後もペプチドが依然として検出できる（最大約５％程度のレベルで）ことを見出した。ペプチドは、流出するリンパ節に長期間に亘って治療効果を発揮できる治療活性濃度で十分に安定していることが好ましい。
【００６５】
また、ペプチドは、体内で良好な生物学的利用能を示さなくてはならない。ペプチドは、体内で、障害なく細胞表面でＭＨＣ分子に結合できる構造を保持しなくてはならない。
【００６６】
標的疾患
一具体例において、本発明を第２の知見からみたペプチドは、疾患の予防及び／又は治療に有用である。
【００６７】
ＭＨＣクラスＩＩに対するアピトープは、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応が介在する疾患に対して特に有用であると思われる。例えば、異常な又は過剰なＣＤ４＋Ｔ細胞反応によって引き起こされる又は継続される疾患に対して有用である。
【００６８】
このようなペプチドは、特に過敏性疾患の治療に有用である。過敏性反応には、以下のものを含む。
（ｉ）無害な体外異物に対する異常反応により生じるアレルギー
（ｉｉ）自己組織抗原に対する反応から生じる自己免疫疾患
（ｉｉｉ）移植に対する反応から生じる移植片拒絶反応
【００６９】
アレルギーの例としては、枯草熱（hay fever）、外因性喘息（extrinsic asthma）、昆虫刺症及び毒針アレルギー（insect bite and sting allergies）、食品及び薬物アレルギー（food and drug allergies）、アレルギー性鼻炎（allergic rhinitis）、気管支喘息慢性気管支炎（bronchial asthma chronic bronchitis）、アナフィラキシー症候群（anaphylactic syndrome）、蕁麻疹（urticaria）、血管神経性浮腫（angioedema）、アトピー性皮膚炎（atopic dermatitis）、アレルギー性接触皮膚炎（allergic contact dermatitis）、結節性紅斑（erythema nodosum）、多形性紅斑（erythema multiforme）、スティーブンズ−ジョンソン症候群（Stevens-Johnson Syndrome）、鼻腔性結膜炎（rhinoconjunctivitis）、結膜炎（conjunctivitis）、皮膚壊死（cutaneous necrotizing）、細静脈炎（venulitis）、炎症性肺疾患（inflammatory lung disease）、水疱瘡性皮膚疾患（bullous skin diseases）等がある。ただし、この例に限定されない。
【００７０】
自己免疫疾患の例としては、慢性関節リウマチ（rheumatoid arthritis（ＲＡ））、重症筋無力症（myasthenia gravis（ＭＧ））、多発性硬化症（multiple sclerosis（ＭＳ））、全身性エリテマトーデス（systemic lupus erythematosus（ＳＬＥ））、慢性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis（橋本病）(Hashimoto's thyroiditis)）、バセドウ病（Graves'disease）、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）、自己免疫ブドウ膜網膜炎（autoimmune uveoretinitis）、多発性筋炎及び糖尿病の特定種（polymyositis and certain types of diabetes）、全身性脈管炎（systemic vasculitis）、多発性筋炎及び皮膚筋炎（polymyositis-dermatomyositis）、全身性硬化症（systemic sclerosis（強皮症）（scleroderma））、シェーグレン症候群（Sjogren's Syndrome）、強直性脊椎炎及びそれに関連した脊椎関節症（ankylosing spondylitis and related spondyloarthropathies）、リウマチ熱（rheumatic fever）、過敏症肺臓炎（hypersensitivity pneumonitis）、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症（allergic bronchopulmonary aspergillosis）、無機ダスト塵肺症（inorganic dust pneumoconioses）、サルコイドーシス（sarcoidosis）、自己免疫溶血性貧血（autoimmune hemolytic anemia）、免疫性血小板障害（immunological platelet disorders）、クリオフィブリノーゲン血症のような寒冷症（cryopathies such as cryofibrinogenemia）、自己免疫多線性内分泌障害（autoimmune polyendocrinopathies）等がある。ただし、この例に限定されない。
【００７１】
臨床医学では、腎臓、肝臓、心臓肺、皮膚、角膜、骨髄を含む種々の組織は、一般的に移植される。現在では、角膜及び一部の骨髄を除く全ての移植片は、通常長期に亘って免疫抑制する必要がある。
【００７２】
本発明をこの知見からみた一具体例では、ペプチドは、糖尿病の予防及び／又は治療に有用である。この例では、ペプチドは、標的抗原ＩＡ２から誘導される。
【００７３】
本発明の他の具体例として、ペプチドは、多発性硬化症（ＭＳ）の予防及び／又は治療に有用である。多発性硬化症（ＭＳ）は、ＣＮＳ白質に散在的に広まった多発性脱髄性障害によって特徴付けされる慢性の炎症性疾患であって、あらゆる部位及び時点にて発症する（McFarlin and McFarland, 1982 New England J. Medicine 307: 1183-1188 and 1246-1251）。ＭＳは、自己反応性Ｔ細胞によって引き起こされると考えられる。
【００７４】
本具体例では、ペプチドは、自己抗原の１つ、特にミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）又はプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）から得られる。ＰＬＰは高い疎水性を有し、ＰＬＰから誘導されるペプチドは互い凝集する傾向にあるので、ＭＢＰが、ＰＬＰよりも適している可能性がある。動物において、ＭＢＰは、免疫原性であり、ＭＢＰ特性Ｔリンパ球は、脳炎誘発性活性を持っている（Segal et al., 1994 J. Neuroimmunol. 51: 7-19;Voskuhl et al., 1993 J. Neuroimmunol 42: 187-192; Zamvil et al., 1985 Nature 317: 355-8）。
【００７５】
好ましい例としては、ペプチドは、ＭＢＰの免疫優性残基、すなわち１−２４、３０−５４、７５−９９、９０−１１４、１０５−１２９、１２０−１４４、１３５−１５９、１５０−１７０の中の１つから得られる。
【００７６】
特に好ましくは、ペプチドは、本発明者によってアピトープとして作用することが確認されたＭＢＰペプチド、すなわち、３０−４４、８０−９４、８３−９９、８１−９５、８２−９６、８３−９７、８４−９８、１１０−１２４、１３０−１４４、１３１−１４５、１３２−１４６、１３３−１４７の１つから選択される。
【００７７】
ＭＨＣクラスＩに対するアピトープは、例えば、免疫寛容原性型にて、抗ウイルス性ＣＤ８＋反応を変化させるために用いられる。
【００７８】
医薬品組成物
本発明者は、寛容を効果的に誘導するために、「非特異的抑制（bystander suppression）」にも関わらず、多くの異なるＴ細胞クローンを標的にすることが必要であると予測した。したがって、疾患を防止又は治療するために、複数のペプチドが患者に投与される。
【００７９】
第３の特徴では、本発明は、複数のアピトープを含む医薬品組成物に関する。
【００８０】
医薬品組成物は、例えば、２〜５０個のアピトープからなることが好ましい。より好ましくは、２〜１５個のアピトープからなる。アピトープは、同一又は異なる標的抗原から誘導されるのがよい。アピトープは、更なる抗原処理をすることなく、全てがＭＨＣクラスＩに結合できること、又は全てがＭＨＣクラスＩＩに結合できることが好ましい。好ましい例では、医薬品組成物中の全アピトープは、更なる抗原処理をすることなく、ＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ分子に結合できる。
【００８１】
医薬品組成物は、キットの形で投与することができ、キットにおいては、幾つかのアピトープ又は各アピトープは、同時に独立して投与され、あるいは別々に、すなわち順番に投与される。
【００８２】
若しくは、医薬品組成物（又はそのあらゆる部位）は、多回服用にて投与されるべきものであるが、各服用分は、別々にパックされていてもよい。
【００８３】
医薬品組成物は、治療上又は予防上効果的なアピトープ量からなっていてもよく、また、少なくとも１つのアピトープは、選択的に、希釈液又は賦形剤等の製薬上許容できる担体に含まれている。
【００８４】
また、本発明に係る医薬品組成物において、少なくとも１つのアピトープは、最適な結合剤（ｓ）、滑沢剤（ｓ）、懸濁剤（ｓ）、コーティング剤（ｓ）、又は可溶化剤（ｓ）と混合されてもよい。
【００８５】
投与
ペプチドは、補助剤がない場合、可溶状態で投与されなくてはならない。
【００８６】
ペプチドは、粘膜経由で投与されることが好ましい。
【００８７】
研究は、ペプチドが可溶状態にて与えられれば、腹膜内に（i.p.）、静脈内に（i.v.）、鼻腔内に（i.n.）、又は経口にてＴ細胞寛容を誘導できる（上述のAnderton and Wraith (1998)、上述のLiu and Wraith (1995)、Metzler and Wraith (1999) Immunology 97: 257-263）ということを示している。
ペプチドは、鼻腔内に投与されることが好ましい。
【００８８】
ハツカネズミによる研究では、寛容を誘導するために要求されるペプチドの継続投与が、レセプタ中のＴ細胞の前駆体頻度に依存することが示されている（上述のBurkhart et al (1999)）。また、多くの研究にて、ペプチドの反復投与が寛容を誘導することが証明されてきている（上述のBurkhart et al (1999)）。ペプチドの服用回数と適切な服用とは、個体に依存するものであるが、好ましい具体例では、多回服用にて投与されている。
【００８９】
仮に、多数のペプチドが同時に投与されるのであるなら、ペプチドは、単一又は多回服用にて投与するために適切な「混合薬」の形態が適している。また、ペプチドは、多回服用にて与えられることが好ましいが、各服用間の相対的なペプチド濃度を変更してもよい。
【００９０】
好ましい例として、濃度を段階的に上昇させて患者に多回服用させる「服用量の段階的増加（dose escalation）」プロトコルが挙げられる。このような用例としては、例えば、蜂毒針アレルギーに対する免疫療法用途としてホスホリパーゼＡ２ペプチドが使用される（Muller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101: 747-754 and Akdis et al (1998) J. Clin. Invest. 102: 98-106）。
【００９１】
【実施例】
以下の例は、本発明の実例を説明するのに役立つが、これらに限定されるものではない。本発明は、特にこれらの例にて説明される詳細な実施例に関連付けられる。
【００９２】
例１−ＭＢＰにおけるＴ細胞エピトープの識別
物質及び方法
【００９３】
抗原
ヒトＭＢＰは、Deibler等によって示された方法によって脳白質から抽出し（Deibler et al., 1972 Preparative Biochemistry 2: 139）、この純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価する。ＭＢＰ及びヒト型結核菌精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）（英国サリー州の英国中央獣学研究所（UK Central Veterinary Laboratory））は、予め決定された最適濃度での増殖定量法に使用される。すなわち、各抗原に対する最適濃度は５０ｐｇ／ｍｌである。ＭＢＰ分子全体に亘るペプチドに重複した１５ｍｅｒのパネル（panel）は、Ａｂｉｍｅｄ  ＡＭＳ４２２多重ペプチド合成装置（Abimed, Langenfeld, Germany）で標準的なF-moc化学を用いて合成される。各ペプチドは、５ａａ及び重複する１０ａａによって置換される。発明者らは、３３個のペプチドを、３つのグループのプールに生成し、各プールは、５０μｇ／ｍｌの最適濃度にて検査される。各ペプチドは、試験管内で１６．６μｇ／ｍｌの濃度に調製される。
【００９４】
患者及び被験対象
この研究の被験者は、臨床的に明白若しくは研究室的にも明白にＭＳであると認められ（Poser et al., 1983）、２９歳〜５１歳の年齢幅がある１２人の患者からなる。１２人のうち８人は、インターフェロン−βの試験中であるが、ほかのＭＳ患者は、研究開始以前の少なくとも３ヶ月間は、コルチコステロイド治療を行っていない。また、対象群は、２５歳〜５５歳の年齢幅のある１３人の健康な個人を含んでおり、血液サンプルを得る以前の少なくとも３ヶ月間は免疫抑制療法を受けていない。
【００９５】
組織培養基
２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（英国ドーセット州プールのSigma社製）を含むＲＰＭＩ−１６４０基、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン硫酸エステル（１００ｍｇ／ｍｌ）、４ｍＭのＬ−グルタミン（以上は全て、スコットランド、ペイズリーのLife Technologies社製）を組織培養基として用いる。血清を除いた培養基は、リンパ系細胞及びＴＣＬを洗浄するために使用する。培養組織の調節及び評価分析のために、培養基は、１０％を熱不活性化された自己由来の血漿にて補う。
【００９６】
培養組織の調製及びＴ細胞の増殖性評価
クエン酸塩添加血（５０〜１００ｍｌ）は、書面による情報開示に基づいて同意を得た後、静脈穿刺により各被験者から収集した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（英国ドーセット州プールのSigma社製）による密度遠心分離にて血液から分離され、２４穴組織培養プレート（米国ニューヨークのNunc International社製、Costar社製、Corning社製）にＰＰＤ、ＭＢＰ又はＭＢＰのペプチドを含む１×１０６cell／ｍｌを１．５体積ｍｌ用いて培養される。プレートは、湿度５％、ＣＯ２濃度９５％、３７℃の温度調節装置内で培養される。５日乃至１４日の間に各培養組織から１００μｌの部分標本を一対ずつ回収し、９６穴丸底マイクロタイタープレートの底部周辺に移し、０．４μＣｉにて［３Ｈ］−チミジン（英国アマシャムのAmersham International社製）を律動的に送り込む。１８時間経過後、細胞は、マッハ１１１ハーベスタ９６（Mach 111 harvester 96、米国ニュージャージ州オレンジのTomtec社製）を用いたガラス繊維マット（フィンランド、トゥルクのLKB-Wallac社製）から回収される。３Ｈ−チミジン取込は、マクロベータ液体シンチレーションカウンタ（LKB-Wallac）を用いて検出される。抗原を含む試験床は、δｃｐｍ＞１０００、刺激指数（ＳＩ）＞３、であれば陽性とされる。ここで、ＳＩは、（培養組織に含まれるＣＰＭ抗原）／（抗原を除く培養組織ＣＰＭ）である。
【００９７】
Ｔ細胞株及びＴ細胞クローンの生成
ＭＢＰ特異性Ｔ細胞株（ＴＣＬ）は、８人のＭＳ患者及び２人の健康な被験者から生成する。各被験者からのＰＢＭＣは、上述のように分離され、６穴プレートにおいて、ＭＢＰ（５０μｇ／ｍｌ）の存在の下で、１×１０６cell／ｍｌに培養される。各被験者からのＰＢＭＣの一部は、完全に凍結され引き続き行われる再刺激（restimulation）のために保管される。７日後、細胞は、２％のＩＬ−２（英国バーミンガムのLymphocult-HT ; Biotest社）の新鮮な培地に移され、培養の１２日目において、全細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源として、抗原、ＩＬ−２及び放射線処理された自己由来のＰＭＢＣ（２５００Ｒｅｄ）によって、Ｔ細胞：ＡＰＣ＝１：５の割合にて再刺激（restimulate）される。細胞は、ＩＬ−２において、３、４日毎に増殖し、上述したように、１４日目に抗原、ＩＬ−２及びＰＭＢＣによって再刺激される。最初の再刺激（restimulation）のときに、ＭＢＰに対する細胞の特異的な増殖を調べる。すなわち、このＭＢＰにおいて、２×１０４個のＴ細胞及び１×１０５個の放射線処理された自己由来のＰＢＭＣは、９６穴丸底プレートで約３倍に培養される。細胞は、２日間培養され、培養の最後の１８時間をかけて、［３Ｈ］−チミジン（英国アマシャムのAmersham International社製）を０．４μＣｉにて律動的に送り込む。この後、細胞は、上述したように回収される。ＴＣＬは、δｃｐｍ＞１０００、及びＳＩ＞３でＭＢＰ特異性に対して陽性とされる。
【００９８】
続く、再刺激（restimulation）と培養の３つのサイクルにて、ＴＣＬは、ＡＰＣとして自己由来の放射線照射処理されたこのＰＢＭＣにおいて、ＰＨＡ（英国ドーセット州プールのSigma社製）を用いて分枝される。Ｔ細胞は、０．１cell／well、０．３cell／well、及び１cell／wellの限界希釈条件の下で、１×１０４の放射線処理されたＰＢＭＣ、５μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ、及び２％ＩＬ−２とともに寺崎プレート（Nunc International社製、Costar社製）を用いて培養される。１０〜１２日後、成熟陽性の穴は、１×１０５放射線照射処理ＰＭＢＣ、５μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ、ＩＬ−２を用いて９６穴丸底プレートに増やされる。３日後に、穴には、ＩＬ−２を含む新鮮な媒体が供給され、７日目に、クローンが４８穴プレート上で、５×１０５の放射線照射処理ＰＭＢＣ、ＰＨＡ及びＩＬ−２を用いて培養され、ここで、クローンは、ＭＢＰに対する特異的な反応のための増殖反応測定法で試験される。ＭＢＰ特異性的クローンは、１週間後、ＰＨＡ又はダイナベッヅ（Dynabeads、英国Dynal社製）と、ＩＬ−２とともに１×１０６放射線照射処理ＰＭＢＣを用いて２４穴プレートで培養される。クローンは、２４穴プレート内にて、基本的には上述した７〜１０日間の再刺激／培養サイクルが継続して行われる。ＭＢＰペプチドのパネルを認識するためのＴ細胞クローン（ＴＣＣ）の機能は、上述した増殖反応測定法によって確認される。
【００９９】
結果
ＭＳ患者と健康な個体との間のＭＢＰペプチド評価
本発明者は、ヒトＭＢＰの全長に亘る１５ｍｅｒの合成ペプチドに重複するパネルに対する反応性について調べられる健康体及びＭＳ患者由来のＰＢＭＣに対して動的反応性試験を行う。各培養組織から得たＰＢＭＣの増殖反応は、２週間の間の５時点にて調べられ、ＭＢＰ及びペプチドに対する反応の動的プロファイルは、ＰＰＤに対する反応と比較され、後者は、２次反応／記憶抗原を示している。インターフェロン−βを使用している患者と使用してない患者との間には、ＰＢＭＣのＭＢＰ及び／又はペプチドに対する反応において、大きな差異は見受けられない（データは示さない。）。ＭＳ患者と健康な被験者におけるＭＢＰへの反応の最大値は、ＰＰＤに対する反応以上に遅い。以下に、非リコール抗原に対する反応の動的指標を示す。図１は、ＭＳ患者及び健康体におけるＰＰＤ及びＭＢＰの動的評価の典型例を示している。
【０１００】
図２に示すように、ＭＳ患者に最も一般的に認められる２つのペプチドが９０−１１４と７５−９９（１２人の患者のうち６人に認められる。）であり、残基３０−５４、１３５−１５９、１５０−１７０（１２人の患者のうち５人に認められる。）、１−２４、１０５−１２９（１２人の患者のうち４人に認められる。）と続いている。３人の患者は、ａａ１５−３９と１２０−１４４に反応している。また、２人の患者には、４５−６９が認められる。また、残基６０−８４に反応したＭＳ患者はいない。
【０１０１】
図１０によれば、ここで全患者は、ＨＬＡ−ＤＲ２陽性であり、ＭＳ患者に最も一般的に認められる２つのペプチドは、９０−１１４と７５−９９であり（１１人の患者のうち６人に認められる。）、次いで残基１２０−１４４、１３５−１５９、１５０−１７０（１１人の患者のうち５人に認められる。）であり、次いで１−２４、１５−３９、３０−５４、１０５−１２９（１１人の患者のうち４人に認められる。）となっている。３人の患者は、ａａ４５−６９に反応し、ここでもまた残基６０−８４に反応したＭＳ患者はいなかった。
【０１０２】
対照的に、健康な被験者は、僅か２人の被験者が２以上のペプチド（図３におけるＣとＪ）に反応している点で極僅かなペプチドに重要性が認められる。ａａ６０−８４が認められたのは、被験者Ｃ及びＪの僅か２人であって、この患者群では残基は確認されない。興味深いことに、３人の被験者は何れも、ＤＲＢ１＊０７０１対立因子（対立遺伝子）を示している。４５−６９及び１０５−１２９は、どの健康な被験者にも認められないが、７５−９９及び１５０−１７０は、４人の健康体に認められ、１３５−１５９は、３人の健康体に認められ、１−２４、３０−５４、６０−８４及び１２０―１４４は、２人の健康体に認められ、１５−３９及び９０−１１４は、１人の健康体に認められている。全体として、１３人の健康体のうち８人は、重複したペプチドの何れにも反応していないが、１２人のＭＳ患者のうち１人（ＭＳ１９）は、一貫してＭＢＰペプチドが確認されていない。特に、この患者は、ＭＢＰタンパク質に対しても反応していないことに特徴がある。
【０１０３】
図１１には、健康な被験者のＭＢＰペプチドに対する反応が示されている。この研究では、唯一１人の被験者が２つ以上のペプチドに反応している（Ｎ１１）。また、Ｎ１１は、この患者群によって確認されていない残基であるａａ６０−８４に反応した唯一の被験者である。１５−３９、４５−６９、及び１０５−１２９は、何れの健康な被験者にも確認されていないが、１２０−１４４及び１３５−１５９は、２人の健康な被験者に認められている。また、１−２４、３０−５４、６０−８４、７５−９９、９０−１４４、及び１５０−１７０は、１人の被験者に認められる。全体として、１２人の健康な被験者のうち９人は、何れの重複するペプチドにも反応していない。
【０１０４】
全体として、ＭＢＰ及び／又はペプチドへの反応が最大値を達した日は、健康な被験者と患者との間で大きな相違はなく、両グループにおける動的反応性は、これらの初期の抗原反応に類似していた。加えて、ＭＢＰ及びペプチドに対する反応の度合いは、患者と健康な被験者とでは相違なかった。
【０１０５】
ＭＢＰペプチド認識性の時間変化
ＭＳ患者は、ＭＢＰペプチドの幅広のスペクトルに反応することが確認されているが、本発明者は、同一の被験者におけるＰＢＭＣ認識性がほぼ４〜１２ヶ月間に集中され安定しているか否かを調べようとした。図２、図１０及び図３には、ＭＳ患者と健康な被験者の何れも同一のペプチド認識パターンを呈示しないことが示されている。
【０１０６】
図４には、２つの異なる時点で複数のペプチドに反応したＭＳ患者（ＭＳ４９）の例を示しているが、２番目の時点における認識結果は、４ヶ月後に測定したものであるが、著しく異なっている。これは、２番目の動的試験において、ＰＢＭＣのａａ１５−３９、３０−５４、及び１５０−１７０に対する反応が残存したものであるが、７５−９９及び１０５−１２９に対する反応が継続し、９０−１１４及び１３５−１５９の部位にシフトしたものである。
【０１０７】
図５に示す（ＭＳ６０）は、幅広のエピトープ反応が４ヶ月間以上に亘って反応が集中して継続した患者の例である。２巡目に検査された健康な個体では、何れのペプチドに対する反応もみられなかった（図３）。
【０１０８】
全体として、この結果は、ＭＳ患者が認識のセットパターンを呈示していないことを示している。各患者において、ＰＢＭＣは、患者ＭＳ４９の例が示すように、幾つかのペプチドに対するＰＢＭＣの反応は、残存し、退行し、ＭＢＰの新しい部位にシフトしている。
【０１０９】
ペプチド認識の周期性
１２ヶ月間に亘って３若しくはそれ以上の異なる時点にて、ペプチドに対するＰＢＭＣの反応を解析すると、ある患者では、エピトープ反応が変動するというよりむしろ新たなペプチド部位に不可逆的にシフトしていることを表しているということが明らかになっている。例えば、図２及び１０に示されるように、患者ＭＳ６０は、ａａ１２０−１４４及び１３５−１５９の認識が周期的なパターンを示しているが、これは、残基１２０−１４４及び１３５−１５９が最初の検査時点にてほとんど認識され、これらの２部位に対する反応が２番目の検査時点によって退行し、４ヶ月後に測定された３番目の検査時点で再び現れたものである。患者ＭＳ４１の動的プロファイルは、ａａ１３５−１５９の認識が幾つかの時点で変動していることを近似的に示している（図２及び１０参照）。
【０１１０】
健康な被験者のグループ（図３）では、ある被験者（Ｍ）は、部位７５−９９及び１３５−１５９に対する反応が変動していることを示しており、被験者（Ｆ）は、３つの時点のうち２時点の解析にて７５−９９が認められ、被験者（Ｄ）は、残基１５−３９に対して周期的な反応を示している。
【０１１１】
ＭＢＰに対する反応の最適なマッピング
ＴＣＣは、８人のＭＳ患者及び２人の健康な被験者から生成され、動的反応性試験にて識別されたペプチド基の最適な特異性を明確にするのに用いられる。各ＴＣＣの特異性は、１５ｍｅｒのペプチドのパネルに対する増殖反応性によって調べられる。クローンＳＤ：Ａ７は、１−２４にて確認され、この部位内にてこのＴＣＣは、ａａ５−１９に対する反応を示した。部位３０−５４は、４つのクローン（ＭＳ４９：Ｄ３、ＭＳ４９：Ｃ８、ＭＳ４９：Ａ８、ＭＳ４９：Ｂ６）及び部位３０−４４内のエピトープによって認識される。ＭＳ患者由来のクローン（ＭＳ３９：Ｄ７）は、ペプチド６０−７４を認識し、興味深いことに、ある健康な被験者は、我々の動的反応性試験において、この部位６０−８４に対して反応している。５つのクローン（ＭＳ４３：Ａ７、ＭＳ４１：Ｂ６、ＭＳ４１：Ａ２、ＭＳ４１：Ｃ６、Ｎ５：８）は、部位７５−９９に含まれるａａ８３−９９を認識する。ある患者は、１０５−１２９内に含まれるａａ１１０−１２４（ＭＳ６０：Ａ２、ＭＳ６０：Ｂ３）、に対して特異的なＴＣＣを生成し、同一患者由来の他のＴＣＣは、１２０−１４４部位内の１３０−１４４（ＭＳ６０：Ｅ１）に対して特異的である。５人の被験者は、部位１３５−１５９内の認識エピトープであるＭＳ６０：Ｆ７、ＭＳ６０：Ｄ１、ＭＳ５９：Ｆ１及びＮ５：１９がａａ１４０−１５４を認識し、ＭＳ５７：Ａ１が１４０−１４９に対して特異的であるというクローンを生成し、ＭＳ１７：Ａ３は、１３０−１４４のシーケンスに対して反応する。このクローンのパネルは、ＭＢＰの１３５−１５９内に少なくとも２つのＴ細胞エピトープが存在することを明確にしている。最後に部位１５０−１７０は、ａａ１５６−１６９に対して特異的な２つのクローンによって認識される。全ＴＣＣの特異性は、図６に要約されている。
【０１１２】
例２−ＭＢＰ中のアピトープの識別
物質と方法
【０１１３】
ＡＰＩＰＳを用いた抗原提示試験
ペプチドのＴ細胞クローンに対する提示は、培養によって測定する。ＡＰＣは、０．５％パラホルムアルデヒドで定着され、９６穴組織培養プレートの穴毎に１×１０５cell／wellに培養される。Ｔ細胞クローンは、種々の濃度のペプチドの存在の下で、１穴当たり２×１０４cell／wellに培養される。３７℃にて４８時間温置した後、１６〜２０時間に亘って［３Ｈ］−チミジン取込を行い、増殖を測定する。結果は、活性なＡＰＣによって示されるエピトープに反応するためのＴ細胞の能力と比較される。
【０１１４】
ＤＲ２：ＭＢＰ８２−１００の遺伝子導入マウスから分離されたＴ細胞に対するペプチドの提示は、上述したＡＰＣが１穴当たり５×１０５cell／wellに培養され、Ｔ細胞が１穴当たり１×１０５cell／wellに培養され、３Ｈ−チミジンの添加に先立って７２時間の温置が行われることを除いては、基本的には上述したように行われる。
【０１１５】
結果
この実験において、先の例にてエピトープとして識別されたペプチドは、ＡＰＩＰＳを用いてその適応性が検査される。結果を図７ｂに示す。これまで検査された５つのエピトープのうち、４つのエピトープがアピトープであり（３０−４４、８０−９４、１１０−１２４、及び１３０−１４４）、１つはアピトープではないがエピトープとして作用することが明らかになった（１５６−１７０）。
【０１１６】
例２Ａ−ＭＢＰペプチド３０−４４、１１０−１２４、１３０−１４４、及び１５６−１７０に関する調査
種々のＭＢＰペプチドがアピトープであるか否かを調査するために、定着されたＡＰＣによってＴ細胞に示される適応性を調査した。活性化された、すなわち予め刺激されたＭｇａｒ（ＨＬＡ−ＤＲ２＋ｖｅ）細胞は、血清中のペプチド又は血清単独で３．５時間予め刺激される。過剰なペプチドを細胞から取り除き、適切なＴ細胞クローンを添加する。Ｔ細胞増殖反応は、［３Ｈ］−チミジンを加えて測定する。
【０１１７】
図８及び図９に示されるように、ペプチド３０−４４（図８Ａ）、１１０−１２４（図８Ｂ）、及び１３０−１４４（図９Ａ）は、更なる抗原処理をすることなく、定着されたＡＰＣによって用意できる。したがって、これらのペプチドは、アピトープとして定義される。一方、ペプチド１５６−１７０は、Ｔ細胞に対して提示するために、更なる抗原処理を必要とする（図９Ｂ）。定着されたＡＰＣは、このエピトープをＴ細胞に提示することができない。それゆえ、１５６−１７０は、アピトープではない。
【０１１８】
例２Ｂ−ＭＢＰの部位７７−１００及び１２５−１４８内のアピトープの識別
所定の全エピトープに対して、１又は１以上のアピトープが存在し、これらは、更なる抗原処理をすることなく、ＡＰＣに対して提示される。ＭＢＰの２部位内のアピトープの提示は、活性の細胞、又はＭＢＰ部位７７−１００（図１２）及び１２５−１４８（図１３）から得た血清中又は単独の血清中にて、重複するペプチドで培養されたパラホルムアルデヒド固定されたＭｇａｒ（ＨＬＡ−ＤＲ２＋ｖｅ）細胞を培養することによって調べられる。Ｔ細胞を付加し、７２時間後（図１２）又は４８時間後（図１３）にＴ細胞増殖反応を３Ｈ−チミジン取込によって調べた。ＭＢＰ７７−１００に関して、Ｔ細胞は、ＤＲ２：ＭＢＰ８２−１００遺伝子導入マウスから分離されるのに対して、ＭＢＰ１３０−１４４については、Ｔ細胞クローンＭＳ１７：Ａ３が用いられる。
【０１１９】
ＭＢＰ部位７７−１００に対して、以下のペプチドがアピトープとして定義される。
ＭＢＰ  ８３−９９  ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰ
ＭＢＰ  ８０−９４  ＴＱＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶ
ＭＢＰ  ８１−９５  ＱＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴ
ＭＢＰ  ８２−９６  ＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰ
ＭＢＰ  ８３−９７  ＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲ
ＭＢＰ  ８４−９８  ＭＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴ
【０１２０】
ＤＲ２  ＭＢＰ  ８２−１００遺伝子導入マウス由来のＴ細胞によって認識される最小のＭＢＰシーケンスは、部位８５−９４である。
【０１２１】
ＭＢＰ部位１２５−１４８に対して関して、以下のペプチドがアピトープとして定義される。
ＭＢＰ  １３０−１４４  ＲＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶ
ＭＢＰ  １３１−１４５  ＡＳＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶＤ
ＭＢＰ  １３２−１４６  ＳＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶＤＡ
ＭＢＰ  １３３−１４７  ＤＹＫＳＡＨＫＧＦＫＧＶＤＡＱ
【０１２２】
Ｔ細胞クローンＭＳ１７：Ａ３によって認識される最小のＭＢＰシーケンスは、部位１３３−１４４である。
【０１２３】
例２Ｃ−ＭＢＰ部位８９−１０１の調査
本発明者は、予め、他のミエリンＴ細胞エピトープと比べ、溶液状態にて、ペプチド８９−１０１を投与しても全ミエリン又は８９−１０１ペプチド自体の何れかを導入してもマウス試験免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を予防できない（Anderton and Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251）ということを示している。
【０１２４】
３つのＴ細胞エピトープを備えるＭＢＰ８９−１０１
ＭＢＰの部位８１−１１１に対するＴ細胞反応を調べるために、試験管内で、８１−１１１を有するマウス由来のリンパ節細胞を８１−１１１で刺激する。これらの細胞は、８１−１１１部位をカバーする２残基を持った１０ｍｅｒのペプチドのパネルにて試験される（すなわち、８１−９０、８３−９２、８５−９４、８７−９６、８９−９８、９１−１００、９３−１０２、９５−１０４、９７−１０６、９９−１０８、及び１０１−１１１）。８９−１０１をカバーするペプチドに対する反応パターンは、エピトープとは異なる少なくとも２つ（及び約３つ）の提示を示す５つの隣接するペプチド（８７−９６から９５−１０４までのＮ末端）を刺激することを示している。
【０１２５】
更にこの部位を調べるために、元の８１−１１１反応Ｔ細胞株から３つの副系を生成し、シフトして８４−１０６部位をカバーしている１つの残基を持つ重複する１０ｍｅｒのペプチドのパネルで再試験した。結果は、８９−１０１シーケンスの中に、重複しない８９−９４、９２−９８、及び９５−１０１の３つの異なる部位が存在することが明らかになった（図１４参照）。
【０１２６】
ＭＢＰペプチド９２−９８は、潜在エピトープである。
３つのエピトープ特異性Ｔ細胞株（ＴＣＬ）は、全組換型ＭＢＰ及びペプチド８９−１０１に対する反応性をテストしたとき、興味深い相違点を示す。３つのＴＣＬの全ては、ペプチド（８９−１０１）に対して反応するが、８９−９４及び９５−１０１特異性ＴＣＬだけは、全ＭＢＰに対して反応する。これは、完全なＭＢＰの抗原処理は、９２−９８を認識しないが８９−９４及び９５−１０１を認識するＴ細胞に対するリガンドを優先的に生成することを示唆している。これは、９２−９８のエピトープが陰性であることを示している（すなわち、自然抗原の処理によって生成され得ない）。ＭＢＰ８９−１０１ペプチドが３つの分離したＴ細胞集団によって認識されるペプチド又はＭＨＣリガンドに帰するＭＨＣ分子とともに３つの異なった相互反応に関与できるものと思われる。しかしながら、ＭＢＰの処理は、これらのＴ細胞集団のうち２つに対してリガンドを生成するのみである（図１４参照）。
【０１２７】
ＥＡＥの導入は、完全なＭＢＰの減少の結果として生じるＣＮＳにおいて現れる自己抗原エピトープのＴ細胞認識性を要求する。上記識別された３つのＴ細胞エピトープのうち１つでも含んだペプチドによるマウスの免疫化は、自然に処理されたエピトープ（８９−９４又は９５−１０１）を含んでいるペプチドのみがＥＡＥを誘導できることを示している。これは、９２−９８が潜在エピトープであることの知見を指示するものである。
【０１２８】
ＭＢＰペプチド９２−９８は、ＭＢＰ８９−１０１に対して優性なエピトープである。
部位８９−１０１は、上述したように、３つの異なった重複しないペプチドを含んでいる。これらのうち、ペプチド９２−９８は、この部位に対して優性種であると思われる。例えば、Ｔ細胞クローンが８９−１０１ペプチドによって初回抗原刺激を受けたマウスから生成されると、全６つのクローンは９２−９８に対して反応性を持つようになる。それぞれの位置に単一のアラニン置換体を含んだ８９−１０１類似のペプチドを用いると、９２−９８位置の何れかの置換基が反応性の欠陥を導き、９２−９８核内の何れの残基が変更されていることがこのエピトープを認識する効果を高めることが判る。ＭＢＰペプチド８９−１０１は、自然に処理されたＭＢＰエピトープを認識するＥＡＥに関係したＴ細胞を寛容化することができない。
【０１２９】
上述した知見を要約するために、本発明者は、ａ）８９−１０１シーケンスは、３つの異なるＴ細胞エピトープを生成する可能性を持ち、ｂ）これらのエピトープのうち２つ（８９−９４及び９５−１０１）だけが（生体内及び試験管内の両方で）完全なＭＢＰの抗原処理によって生成され、ｃ）自然に処理されたエピトープを含むペプチド及び潜在エピトープを含まないペプチドがＥＡＥの誘導に効果的であり、ｄ）ペプチド治療試験において８９−１０１ペプチドは、ＥＡＥから保護することができない、ということを見出した。
【０１３０】
この情報は、Ｔ細胞と関係のある疾患を直接結紮することができないことから、ペプチド８９−１０１が、ＥＡＥに対して寛容化できないという仮説を研究するための基本を与えるものである。この仮説によれば、適切な構造にてＭＨＣ抑制因子（Ｉ−ＡＳ）に直接結合できないであろうから、ペプチド（８９−１０１）は、主要な脳炎誘発性エピトープ（８９−９４）に対して寛容を誘導できない。言い換えれば、８９−１０１は、８９−９４に対するＴ細胞のアピトープとして作用しない。
【０１３１】
この可能性を確かめるために、寛容性試験は、ペプチド８９−１０１及びペプチド８７−９６（図１５Ａ及びＢ）を用いて行われる。ペプチド８７−９６は、ＥＡＥを誘導するに最も効果的なエピトープ（８９−９４）を含んでいる。
【０１３２】
方法
マウスは、０日目にフロインド完全免疫増強剤であって、１００ｐｇのペプチドを投与されるに先立つこと８日、６日、４日に２００ｐｇのペプチドを含むＰＢＳ又はＰＢＳを単独で腹膜内に投与された。１０日後、リンパ節細胞（１穴当たり６×１０５）は、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５培地に５×１０−５Ｍの２メルカプトメタノール及び２ＭのＬ−グルタミンを入れ、抗原を加えたものと加えないものとを用意し、７２時間培養された。培養組織は、最後の１６時間をかけて０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンよって刺激され、組織は、液体シンチレーションカウンタを用いて測定された。結果は、培養組織が３倍になるまで分毎にカウントする方法で表される。
【０１３３】
結果
８７−９６による準備刺激は、それ自体に対して強い再反応を誘導し、８９−１０１に対して弱い反応を誘導した（図１５Ａ及びＢにおける□及び○の各々）。これは、８９−１０１から８９−９４を生成する抗原処理の必要性と関係している。８７−９６による準備刺激に先立って寛容原として８７−９６を使用することで、８７−９６及び８９−１０１（図１５Ａにおける■及び●）に対する再反応が抑制された。この８９−９４による活性化はＴ細胞に反発し、一旦体内にて反応しなくなれば、８９−９６又は８９−１０１から生成されたものであっても、試験管内では８９−９４に対して反応できない。しかしながら、最終的に８７−９６による準備刺激に先立って寛容原として８９−１０１を用いても、８７−９６又は８９−１０１の何れに対しての再反応をも抑制できなかった（図１５Ａ及びＢにおける■と●）。これらの結果は、免疫寛容原性型におけるペプチド８９−１０１の投与が８９−９４シーケンスに基づく天然処理された脳髄炎誘発性エピトープを寛容化できないことを示している。すなわち、８９−１０１ペプチドは、８９−９４エピトープに対するアピトープとして作用することはできない。
【０１３４】
理論的には結合することは望めないが、本発明者は、実験結果が、ＭＨＣペプチドの結合側面におけるペプチド８９−１０１の位置によって説明できるものと確信している。仮に、部位９２−９８がペプチド結合ポケット内にあるためにペプチドが優先的に結合するのであるならば、ＭＢＰ９２−９８特異性Ｔ細胞によって認識されるはずである。これが、なぜ、マウスがＭＢＰ８９−１０１ペプチドによる初回抗原刺激を受けると、生成される全Ｔ細胞クローンがＭＢＰ９２−９８を認識するか、また同様に、８９−１０１が寛容化Ｔ細胞として用いられると、ＭＢＰ９２−９８エピトープを認識する細胞を主に寛容化するか、を説明している。仮に、ＭＢＰ９２−９８が潜在エピトープであるならば、全抗原の自然な処理からは生成されず、Ｔ細胞が認識するエピトープは、生体内にはおそらく存在しないことになる。たとえ、ＭＢＰ９２−９８特異性Ｔ細胞が生体内に存在したとしても疾患に関係ない。それゆえ、８９−１０１は、全ＭＢＰにおいてＥＡＥ起因性を防ぐことができない。
【０１３５】
例３−ＭＳ型マウスのペプチド治療
本発明者は、腹腔経由（Liu and Wraith (1995) Int Immunol 8: 1255-1263）、又は鼻腔経由（Metzler and Wraith (1993) 5: 1159-1165）の何れかの方法にて全身に投与された１用量のペプチド抗原は、３ヶ月間は、実験的な自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）から効果的にマウスを守ることを予め示した。少なくとも５用量のペプチドは、ＥＡＥ特異性Ｔ細胞レセプタを（Liu et al (1995) Immunity 3: 407-415）表すＴｇ４遺伝子導入マウス（Burkhart et al (1999) 11: 1625-1634）に寛容を誘導することが要求された最近の研究は、両投与方法は、遺伝子非導入マウスでは等しく安全であるが、Ｔｇ４マウスにおいては、鼻腔（ＩＮ）経由が腹腔（ＩＰ）経由よりも安全であることを示している。
【０１３６】
ＭＢＰの８３−９９ペプチドは、適切なＨＬＡ−ＤＲ２クラスＩＩＭＨＣ分子及びこのペプチドに特異的なヒトＴ細胞クローン由来のＴＣＲの両方を表すＦｕｇ／Ｄ６遺伝子導入マウスにて検査される。マウスは、Ｔｇ４遺伝子導入マウスの治療に用いた標準的な１用量（Ｔｇ４プロトコル）、又はアレルギー患者の治療に用いられるように投与用量を段階的に増大するペプチドの減感プロトコル（減感プロトコル）の何れかのペプチドによって治療される。
【０１３７】
Ｔｇ４プロトコル：マウス群は、ペプチド８３−９９（リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に４ｍｇ／ｍｌ混合する）又はＰＢＳ単独の合計２５μｌを鼻腔投与にて治療される。マウスは、５週間、週の初日から５日目まで毎日、合計１０用量が与えられて治療される。週のはじめには、６匹のマウスの各々は、フロインド完全免疫増強剤にてペプチド８３−９９を投与され、また、１日に１及び３回の百日咳毒素（２００ｎｇ）ＩＰ射出を受ける。少なくとも３０日間、ＥＡＥの進行を監視する。
【０１３８】
減感プロトコル：マウス群は、ペプチド８３−９９又はＰＢＳ単独の合計２５μｌを鼻腔投与にて段階的に投与量を増大させて治療される。用量の段階変化は、０．１ｐｇから始めて１μｇ，３μｇ，６μｇ，１２μｇ，５０μｇと続けられ、１００μｇは、３回投与される。マウスは、５週間、週の初日から５日目まで毎日、合計１０用量が与えられて治療される。週のはじめには、６匹のマウスの各々は、フロインド完全免疫増強剤にてペプチド８３−９９を投与され、また、１日に１及び３回の百日咳毒素（２００ｎｇ）ＩＰ射出を受ける。少なくとも３０日間、ＥＡＥの進行を監視する。
【０１３９】
例４−ＭＳ患者に対するアピトープ複合薬の鼻腔投与
ワクチンは、ＭＢＰペプチド３０−４４、８３−９９、１１０−１２４及び１３０−１４４（すなわち、アピトープとして識別されるＭＢＰエピトープのうちの幾つか。）からなる。ワクチンは、フェイズＩａ／Ｉｂ試験において、３５人の患者から得られる。試験は、患者にペプチド（Ｉａ）を１用量投与し、３ヶ月間は何もしない一回の交差試験である。患者は、安全性を評価するためにワクチンの１用量投与後の３ヶ月間監視される。治療は、鼻腔堆積による週２回の投与からなる。各患者に対して：臨床的な活性は、毎月磁気共鳴画像によって解析され、免疫学的活性は、増殖のために動的反応性試験を用いて監視される。また、サイトカイン産生は細胞に基づくＥＬＩＳＡを用いて監視される。
【０１４０】
試験は、慢性進行性（ＣＰ）疾患を持つ５人の患者に対する治療を含んでいる。これらの患者は、低いＭＲＩ活性に基づいて選択され、最初に高い用量のペプチドに治療する。ＣＰ患者群は、ＭＲＩ活性の増加によって顕著となる如何なる危険な影響を示しそうなため、治療はＣＰ患者群にて開始される。回帰熱が小康状態にある患者の治療を一旦開始すれば、単一及び複合投与治療の両方ともがＣＰ群に対して安全であるということは明らかである。回帰熱が小康状態にある患者３０人からなるグループは、３ヶ月の監視期間中にＭＲＩ損傷が酷くなることに基づいて集められた。これらは、高用量のペプチド、中程度の用量のペプチド、低用量のペプチドにて治療される３つのグループに分けられる。
【０１４１】
【表１】
0005431628.tif 000002
【０１４２】
また、以下に略語略号を示す。
ＡＰＣ＝抗原提示細胞（antigen presenting cells）；ＭＨＣ＝主要組織適合抗原複合体（major histocompatability complex；ＴＣＲ＝Ｔ細胞レセプタ（T cell receptor）；ＥＡＥ＝実験的自己免疫脳脊髄炎（experimental autoimmune encephalomyelitis）；ＡＰＩＴＯＰＥ＝抗原処理非依存エピトープ（antigen processing independent epitope）；ＡＰＩＰＳ＝提示組織非依存抗原系（antigen processing independent presentation system）；ａａ＝アミノ酸（amino acid）；ＭＳ＝多発性硬化症（Multiple Sclerosis）；ＭＢＰ＝ミエリン塩基性タンパク（myelin basic protein）；ＰＬＰ＝プロテオリピドタンパク質（）proteolipid protein）；ＴＣＬ＝Ｔ細胞株（T cell line）；ＴＣＣ＝Ｔ細胞クローン（T cell clone）；ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cells）；ＰＰＤ＝ヒト結核菌精製タンパク質誘導体（Mycobacterium tuberculosis purified protein derivative）；ＰＨＡ＝植物性血球凝集素（phytohemagglutinin）
【０１４３】
発明のシステム及び方法には、種々の変形例があって、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。また、特に好ましい実施例に関して説明されているが、請求された発明はこの特定の実施例に過度に制限されない。発明を実現するために記述された様々な変形例は、化学、生物学、又は本発明が含まれる関連分野では熟練されたものであることは明白である。上記詳細な説明にて言及した全ての刊行物は、ここでは参考として全て含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、多発性硬化症（ＭＳ）の患者及び健康な個体における結核菌精製ツベルクリンタンパク質（ＰＰＤ）及びＭＢＰに対する運動性のプロフィールの代表的な例を示すグラフである。ＭＳ患者（Ａ）及び正常個体（Ｂ）から分離された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＰＰＤ及び全部のＭＢＰの存在のもとでの増殖能力に対して試験し、ＭＢＰに対する増殖反応の運動性のプロフィールを、二次性抗原ＰＰＤのそれと比較したものである。
【図２】
図２は、ＭＳ患者におけるＭＢＰ及びそのペプチドに対するＰＢＭＣ反応を示す表である。特定の個体を、約４〜７ヵ月の間隔で３回分析した。
【図３】
図３は、健康な個体におけるＭＢＰ及びＭＢＰペプチドに対するＰＢＭＣ反応を示す表である。各分析時点は、４〜７ヶ月離れている。
【図４】
図４は、２つの異なる時点のおける複合ペプチドに反応するＭＳ患者（ＭＳ４９）の例を示すグラフであり、４ヵ月後に測られた第２の時点間のプロフィールは、かなり異なることが認識された。ＰＢＭＣは、ＭＢＰ及びＭＢＰの長さ全体に亘るペプチドのパネルの存在のもとに培養され、増殖は、３Ｈ−チミジン取込によって測られた。第１の時点で観察された幅広のＴ細胞増殖反応は、７ヵ月後の第２の時点で測られた反応とかなり異なっている。
【図５】
図５は、エピトープ反応が広がり（第１の時点）、退行し（第２の時点）、１２ヵ月の期間経過後（第３の時点）に再び現れた患者の例を示すグラフである。
【図６】
図６は、ＭＳ患者及び健康な個体から生成されるＴＣＣのを使用して得られる運動性の反応分析評価で確認されたペプチド部位の微細特異性のマップを示す図である。スクリーニング分析評価で使われる殆どのペプチドは、長さが１５ｍｅｒであるが、少しのペプチドは１０ｍｅｒであり、１ペプチドは、１７ｍｅｒである。各ＴＣＣの特異性は、少なくとも２回試験される。
【図７】
図７ａは、ＭＳ患者からのＴリンパ球によって認められるミエリン塩基性タンパク質内におけるＴ細胞エピトープの特性を示す表である。図７ｂは、全てのＴ細胞エピトープが凝固したＡＰＣよって必ずしも示されるというわけでなく、したがって、アピトープではない。
【図８】
図８は、活性の及び定着したＡＰＣによるＴ細胞クローンに対する様々なＭＢＰペプチドの現れ方を示す図である。図８Ａは、ペプチドが３０−４４であり、図８Ｂは、ペプチドが１１０−１２４である。
【図９】
図９は、活性の及び定着したＡＰＣによるＴ細胞クローンに対する様々なＭＢＰペプチドの現れ方を示す図である。図９Ａは、ペプチドが１３０−１４４であり、図９Ｂはペプチドが１５６−１７０である。
【図１０】
図１０は、３つの離れた時点において得られるＭＳ患者のＭＢＰ及びＭＢＰペプチドに対するピーク刺激指数（ＳＩ）を示す表である。第２の時点のサンプルは、第１の時点の４〜８ヶ月後に、第３の時点のサンプルは、第２の時点の３〜５月後に収集された。バックグラウンドｃｐｍは、各日毎に測定され、８０〜７００ｃｍｐ間を変化し、ＳＩ＞３、δｃｐｍ＞１０００によって陽性と定義した。（患者ＭＳ１９及びＭＳ６７から全ての３の時点に対するサンプルを集めることできなかった）。
【図１１】
図１１は、健康な個体におけるＭＢＰ及びＭＢＰペプチドに対するピーク刺激指数（ＳＩ）値を示す表である。バックグラウンドｃｐｍは、各日毎に測定され、８０〜７０００ ｃｐｍ間を変化し、ＳＩ＞３、δｃｐｍ＞１０００によって陽性と定義した。
【図１２】
図１２は、ＡＰＣによる部位７７−１００における入れ子ＭＢＰペプチド（nested  ＭＢＰ）ＤＲ２：ＭＢＰ８２−１００の遺伝子導入マウスから分離されたＴ細胞の反応を示す図である。
【図１３】
図１３は、ＡＰＣによる部位１２５−１４８におけるＭＢＰペプチドの存在に対するＴ細胞クローンＭＳ１７：Ａ３の反応を示す図である。
【図１４】
図１４は、ＭＢＰ８９−１０１の配列内におけるＴ細胞エピトープ認識を示す図である。配列：８９−９４、９２−９８及び９５−１０１内には、異なるが、重なり合った３つのＴ細胞エピトープがある。アスパラギニルエンドペプチダーゼ（ＡＥＰ）の作用による残基９４及び９５間の分割に対する潜在性は示される。
【図１５】
図１５は、８９−９４エピトープに反応するＴ細胞に対して、アピトープとして働くＭＢＰペプチド８７−９６（Ａ）及び８９−１０１（Ｂ）の吸収力を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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