(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の老化を操作する方法であって、該植物に改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターを含む遺伝子構築物を導入することを含み、
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、
配列中の１つ以上の根もしくは花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化させるように改変された、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子に作動可能に連結され、かつ
（ａ）根特異的モチーフの各々がコンセンサス配列ＡＴＡＴＴもしくはＡＡＴＡＴを含む、１つ以上の根特異的モチーフ、あるいは
（ｂ）花粉特異的モチーフの各々がコンセンサス配列ＴＴＣＴもしくはＡＧＡＡを含む、１つ以上の花粉特異的モチーフ、
を欠失もしくは不活化させるように改変される、方法。
【請求項２】
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、配列中の１〜１０個の根特異的モチーフを欠失もしくは不活化させるように改変された配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、配列中の１〜３０個の花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化させるように改変された配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、配列番号２、３および４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＬｏｔｕｓおよびＰｅｔｕｎｉａからなる群より選択される属由来のものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子が、配列番号５、７および９、ならびに配列番号６、８および１０の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子構築物が、植物細胞のアグロバクテリウム媒介型形質転換または微粒子銃型形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって前記植物に導入される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子構築物が組み込まれた植物細胞を選択し、次いで培養して形質転換植物を再生させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
植物の老化を操作することができるベクターであって、該ベクターは、改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターを含み、
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、
配列中の１つ以上の根もしくは花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化させるように改変さた、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子に作動可能に連結され、かつ
（ａ）根特異的モチーフの各々がコンセンサス配列ＡＴＡＴＴもしくはＡＡＴＡＴを含む、１つ以上の根特異的モチーフ、あるいは
（ｂ）花粉特異的モチーフの各々がコンセンサス配列ＴＴＣＴもしくはＡＧＡＡを含む、１つ以上の花粉特異的モチーフ、
を欠失もしくは不活化させるように改変される、ベクター。
【請求項１１】
さらにターミネーターを含み、前記プロモーター、遺伝子およびターミネーターが作動可能に連結されている、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、配列中の１〜１０個の根特異的モチーフを欠失もしくは不活化させるように改変された配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１０または１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、配列中の１〜３０個の花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化させるように改変された配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１０または１１に記載のベクター。
【請求項１４】
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のものである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１５】
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、配列番号２、３および４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１６】
前記イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＬｏｔｕｓおよびＰｅｔｕｎｉａからなる群より選択される属由来のものである、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
前記イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子が、配列番号５、７および９、ならびに配列番号６、８および１０の配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１８】
変更された老化特性を有するトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分であって、前記植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分は、改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターを含む遺伝子構築物を含み、
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、
配列中の１つ以上の根もしくは花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化させるように改変さた、配列番号１のヌクレオチド配列を含み、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子に作動可能に連結され、かつ
（ａ）根特異的モチーフの各々がコンセンサス配列ＡＴＡＴＴもしくはＡＡＴＡＴを含む、１つ以上の根特異的モチーフ、あるいは
（ｂ）花粉特異的モチーフの各々がコンセンサス配列ＴＴＣＴもしくはＡＧＡＡを含む、１つ以上の花粉特異的モチーフ、
を欠失もしくは不活化させるように改変される、
トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分。
【請求項１９】
請求項１８に記載のトランスジェニック植物細胞由来のトランスジェニック植物、植物種子、または他の植物部分。
【請求項２０】
請求項１８に記載のトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分由来のトランスジェニック植物、植物種子、または他の植物部分。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法により製造され、変更された老化特性を有するトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２００３年３月５日に出願された表題「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ
ｐｌａｎｔ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ＭＹＢ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇｅｎｅ」の米国特許出願第１０／３６３，７２３号の一部継続であり、米国特許出願第１０／３６３，７２３号は、２００１年８月３０日に出願された表題「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎ  ＭＹＢ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇｅｎｅｓ」の国際
特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２からの優先権を主張し、国際特許出願ＰＣＴ／ＡＵ０１／０１０９２は、２０００年９月６日に出願された表題「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎ  ＭＹＢ  Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｇｅｎｅｓ」の豪国特許出願ＰＱ９９４６からの優先権を主張する。これらの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、植物の老化を操作する方法に関する。また、本発明は、かかる方法に有用なベクター、改変された老化特性を有する形質転換植物、ならびにかかる植物の植物細胞、種子および他の部分に関する。
【背景技術】
【０００３】
葉の老化は、細胞死の前に細胞の代謝的および構造的変化を伴う。また、活発に生長している領域への栄養素の再循環も伴う。
【０００４】
サイトカイニンによる植物および植物器官の老化の調節は、農業上重要な成果をもたらす。葉内のサイトカイニンレベルの上昇は、老化を遅延させる傾向がある。その産物（イソペンテニルトランスフェラーゼ）がサイトカイニン合成の重要な段階を触媒するｉｐｔ遺伝子の発現を調節するために、いくつかのプロモーターが使用されている。しかしながら、一般に、ｉｐｔ遺伝子を過剰発現するトランスジェニック植物は、根およびシュートの生長の遅延、根の無形成、頂芽優性の低下、および葉面積の減少を有することが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、先行技術に伴う問題点または欠点の１つ以上を解決または少なくとも軽減することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本発明は、植物に、サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結された改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含む遺伝子構築物を導入することを含む、植物の老化を操作する方法を提供する。
【０００７】
老化の操作は、植物および／または特定の植物の器官に関連するものである。種々の植物の器官、例えば、葉、根、シュート、茎、塊茎、花、走根、および果実などの老化が操作され得る。植物および植物器官の老化の操作は、例えば、園芸製品および切り花における果実、花、葉および塊茎の貯蔵寿命の増大、園芸作物の腐り易さの低減、老化遅延葉内の炭素固定の増大による収穫率の増大、飼料植物におけるバイオマス生産の向上、採種の向上などの農業上重要な成果をもたらし得る。
【０００８】
「老化の操作」は、一般的に、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物における老化の遅滞に関する。しかしながら、一部の適用用途では、植物の老化を促進あるいは改変することが望ましい場合があり得る。老化は、例えば、アンチセンス遺伝子を利用することにより促進あるいは改変され得る。
【０００９】
有効量の前記遺伝子構築物は、任意の適当な手法、例えば、形質導入、トランスフェクションまたは形質転換によって植物に導入され得る。「有効量」とは、前記植物、または該植物に由来する植物、植物種子もしくは他の植物部分において同定可能な表現型形質がもたらされるのに充分な量を意図する。かかる量は、適切な当業者が植物の種類、投与経
路および他の関連要素を考慮することによって容易に決定され得る。かかる当業者は、適当な量および投与方法を容易に決定することができよう。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（その全開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００１０】
「改変ｍｙｂ遺伝子プロモーター」とは、通常ｍｙｂ遺伝子と関連しているプロモーターであって、前記プロモーター内の１つ以上の根特異的モチーフおよび／または花粉特異的モチーフが欠失もしくは不活化されるように改変されたプロモーターを意図する。
【００１１】
本出願人は理論に拘束されることを望まないが、前記ｍｙｂ遺伝子プロモーター内の１つ以上の根特異的モチーフの欠失もしくは不活化により、一部の植物種で根の発育に影響し得る植物の成長点におけるサイトカイニン生合成酵素をコードする遺伝子の漏出性（ｌｅａｋｙ）発現の問題が軽減または解決され得ると仮定する。また、前記ｍｙｂ遺伝子プロモーター内の１つ以上の花粉特異的モチーフの欠失もしくは不活化により、一部の植物種で花粉の発育に影響し得る花粉におけるサイトカイニン生合成酵素をコードする遺伝子の漏出性発現の問題が軽減または解決され得ると仮定する。
【００１２】
好ましくは、改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、改変ｍｙｂ３２遺伝子プロモーターである。好ましくは、改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のもの、より好ましくはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のものである。
【００１３】
本発明に従って改変され得る好適なプロモーターは、Ｌｉら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ＭＹＢ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＰＧＲ  ９９−１３８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２１  ：３１３（１９９９）（その全開示内容は、引用により本明細書に組み込まれる）に記載されたものである。
【００１４】
「根特異的モチーフ」とは、植物の根内の関連遺伝子の発現を指令する３〜７ヌクレオチド、好ましくは４〜６ヌクレオチド、より好ましくは５ヌクレオチドの配列を意図する。
【００１５】
好ましくは、根特異的モチーフは、コンセンサス配列ＡＴＡＴＴまたはＡＡＴＡＴを含む。
【００１６】
好ましくは、前記ｍｙｂ遺伝子プロモーター内の１〜１０個、より好ましくは３〜８個、さらにより好ましくは５〜７個の根特異的モチーフを欠失もしくは不活化させ、好ましくは欠失させる。
【００１７】
根特異的モチーフは、個々のモチーフを除去すること、または１つ以上のモチーフを含む該プロモーターの断片を除去することにより欠失させ得る。例えば、シロイヌナズナｍｙｂ遺伝子プロモーターのヌクレオチド１〜５３０、好ましくはヌクレオチド１１０〜５３０の領域の全部または一部を欠失させ得る。
【００１８】
該欠失は、例えば制限エンドヌクレアーゼで核酸を切断し、切断末端をライゲートし、断片が除去されたプロモーターを作製することにより行なわれ得る。
【００１９】
例えば、改変シロイヌナズナｍｙｂ遺伝子プロモーターは、１６２〜１７６位のＸｃｍＩ部位と５２０〜５２５位のＳｓｐＩ部位の間の断片を除去することにより作製され得る。これにより、７つの根特異的モチーフのうち６つが欠失した改変ｍｙｂ遺伝子プロモー
ターが作製される。あるいはまた、例えば、５２０〜５２５位のＳｓｐＩ部位の上流の領域を欠失させること、またはヌクレオチド１〜１２０の領域を、１６２〜１７６位のＸｃｍＩ部位と５２０〜５２５位のＳｓｐＩ部位の間の領域とともに欠失させることにより、７つの根特異的モチーフすべてを欠失させ得る。
【００２０】
根特異的モチーフは、該モチーフ内の１つ以上のヌクレオチドを、好ましいコンセンサス配列を有しなくなるように付加、欠失、置換または誘導体化することにより不活化させ得る。
【００２１】
好ましくは、改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、添付の図２、３および４に示す配列（それぞれ、配列番号２、３および４）、ならびにその機能的に活性な断片および改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
「花粉特異的モチーフ」とは、植物の花粉内の関連遺伝子の発現を指令する３〜７ヌクレオチド、好ましくは４〜６ヌクレオチド、より好ましくは４または５ヌクレオチドの配列を意図する。
【００２３】
好ましくは、花粉特異的モチーフは、ＴＴＣＴおよびＡＧＡＡからなる群より選択されるコンセンサス配列を含む。
【００２４】
好ましくは、前記ｍｙｂ遺伝子プロモーター内の１〜３０個、より好ましくは３〜１５個、さらにより好ましくは４〜１０個の花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化させ、好ましくは欠失させる。
【００２５】
花粉特異的モチーフは、個々のモチーフを除去すること、または１つ以上のモチーフを含む該プロモーターの断片を除去することにより欠失させ得る。例えば、ヌクレオチド１〜５４０、好ましくはヌクレオチド３９０〜５４０のシロイヌナズナｍｙｂ遺伝子プロモーターの領域の全部または一部を欠失させ得る。
【００２６】
該欠失は、例えば制限エンドヌクレアーゼで核酸を切断し、切断末端をライゲートし、断片が除去されたプロモーターを作製することにより行なわれ得る。
【００２７】
例えば、改変シロイヌナズナｍｙｂ遺伝子プロモーターは、１６２〜１７６位のＸｃｍＩ部位と５２０〜５２５位のＳｓｐＩ部位の間の断片を除去することにより作製され得る。これにより、２３個の花粉特異的モチーフのうち４個が欠失した改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターが作製される。あるいはまた、例えば、５２０〜５２５位のＳｓｐＩ部位の上流の領域を欠失させることにより１０個の花粉特異的モチーフを欠失させ得る。
【００２８】
花粉特異的モチーフは、該モチーフ内の１つ以上のヌクレオチドを、好ましいコンセンサス配列がなくなるように付加、欠失、置換または誘導体化することにより不活化させ得る。
【００２９】
好ましくは、改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、添付の図２、３および４に示す配列（それぞれ、配列番号２、３および４）ならびにその機能的に活性な断片および改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３０】
本発明のさらなる態様において、植物に、サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結されたｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含む遺伝子構築物を導入することを含む、植物のバイオマスを増大させる方法が提供される。
【００３１】
ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体は、完全長のｍｙｂ遺伝子プロモーターまたは改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターであり得る。
【００３２】
完全長のｍｙｂ遺伝子プロモーターは、ｍｙｂ３２遺伝子プロモーターであり得る。好ましくは、ｍｙｂ遺伝子プロモーターはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のもの、より好ましくはシロイヌナズナ由来のものである。最も好ましくはｍｙｂ遺伝子プロモーターは、添付の図１に示す配列（配列番号１）ならびにその機能的に活性な断片および改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００３３】
好適なプロモーターは、Ｌｉら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ＭＹＢ−ｌｉｋｅ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（ＰＧＲ  ９９−１３８）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２１  ：３１３（１９９９）に記載されたものである。
【００３４】
改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターは、本明細書において前述の改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターであり得る。
【００３５】
「バイオマスの向上」とは、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物における、総葉面積、累積葉面積、葉の生長動態（dynamics）（すなわち、経時的な葉の数）、走根長さ、開花植物の割合および花１つまたは種蒔き面積あたりの種子収量からなる群より選択される生長特性の向上または増大を意図する。また、「バイオマスの向上」は、非形質転換対照植物と比べて形質転換植物における走根死の割合の低下または減少を包含する。
【００３６】
特に、本発明によるトランスジェニック植物の種子重量（すなわち、千個の種子の重量）は非トランスジェニック対照植物と識別不可能であるが、同等の開花強度の非トランスジェニック対照植物と比較すると、花１つまたは種蒔き面積あたりの基準で示す総種子収量は、トランスジェニック植物において有意に高いことを、本出願人らは見い出した。
【００３７】
ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたは改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターに関連する「機能的に活性な」とは、その断片または改変体（類縁体、誘導体もしくは変異型など）が、本発明の方法による植物の老化の操作能を有することを意図する。かかる改変体には、天然に存在する対立遺伝子改変体および天然に存在しない改変体が包含される。１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および誘導体化が想定されるが、修飾によって該断片または改変体の機能的活性の低下がもたらさないものとする。
【００３８】
好ましくは、機能的に活性な断片または改変体は、該断片または改変体に相当する上記配列の関連部分と少なくともほぼ８０％の同一性を有し、より好ましくは少なくともほぼ９０％の同一性、最も好ましくは少なくともほぼ９５％の同一性を有する。好ましくは、該断片は、少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドのサイズを有する。
【００３９】
「サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子」とは、カイネチン、ゼアチンおよびベンジルアデニンなどのサイトカインの合成に関与している酵素をコードする遺伝子、例えば、イソペンチルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）をコードする遺伝子、またはｓｈｏ遺伝子（例えば、Ｐｅｔｕｎｉａ由来のもの）などのｉｐｔ様遺伝子を意図する。好ましくは、該遺伝子は、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子またはｓｈｏ遺伝子である。好ましい実施形態において、該遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、より好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；Ｌｏｔｕｓ、より好ましくはミヤコグサ（Ｌｏｔｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）；およびＰｅ
ｔｕｎｉａ、より好ましくはツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）からなる群より選択される種に由来するものである。
【００４０】
最も好ましくは、該遺伝子は、添付の図６、８および１０に示す配列（配列番号５、７および９）、添付の図７、９および１１に示すポリペプチドをコードする配列（配列番号６、８および１０）ならびにその機能的に活性な断片および改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
サイトカイニン生合成酵素をコードする遺伝子に関連する「機能的に活性な」とは、その断片または改変体（類縁体、誘導体または変異型など）が、本発明の方法による植物の老化の操作能を有することを意図する。かかる改変体には、天然に存在する対立遺伝子改変体および天然に存在しない改変体が包含される。ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、置換および誘導体化が想定されるが、該修飾によって該断片または改変体の機能的活性の低下をもたらさないものとする。好ましくは、機能的に活性な断片または改変体は、該断片または改変体に相当する上記配列の関連部分と少なくともほぼ８０％の同一性を有し、より好ましくは少なくともほぼ９０％の同一性、最も好ましくは少なくともほぼ９５％の同一性を有する。かかる機能的に活性な改変体および断片としては、例えば、保存的核酸変化、または対応するアミノ酸配列内の１つ以上の残基の保存的アミノ酸置換をもたらす核酸変化を有するものが挙げられる。例えば、機能的に活性な改変体は、図６、８または１０に示す配列の１つ以上の保存的核酸置換を含むものであり得、得られる機能的に活性な改変体は、それぞれ図７、９または１１に示すアミノ酸配列をコードする。好ましくは、該断片は、少なくとも２０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドのサイズを有する。
【００４２】
遺伝子構築物は植物に、任意の適当な手法によって導入され得る。本発明の遺伝子構築物を植物細胞内に組み込むための手法（例えば、形質導入、トランスフェクションまたは形質転換）は、当業者によく知られたものである。かかる手法としては、アグロバクテリウム媒介型誘導、組織、細胞およびプロトプラストへのエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、生殖器官内への注入、未熟胚内への注入ならびに細胞、組織、カルス、未熟および成熟胚に対する高速プロジェクタイル誘導、微粒子銃形質転換ならびにその組合せが挙げられる。手法の選択は、形質転換対象の植物の種類に大きく依存し、適切な当業者によって容易に決定され得る。
【００４３】
本発明の遺伝子構築物が組み込まれる細胞は、後述するようにして選択し、次いで、当該技術分野でよく知られた手法を用いて適切な培地中で培養すると、形質転換植物が再生し得る。例えば温度、ｐＨなどの培養条件は当業者には自明であろう。得られた植物は、当該技術分野でよく知られた方法を用い、有性生殖または無性生殖のいずれかによって形質転換植物の後続世代を生成してもよい。
【００４４】
本発明の方法は、さまざまな植物、例えば、単子葉［草（例えば、牧草、芝生およびバイオエネルギー草、例えば、ペレニアルライグラス、トールフェスク、イタリアンライグラス、レッドフェスキュー、リードカナリーグラス、ビッグブルーステム、コードグラス、ネピアグラス、野生ライムギ、野生サトウキビ、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ））、トウモロコシ、オートムギ、小麦および大麦）など］、双子葉［Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、タバコ、大豆、クローバ（例えば、シロツメクサ、ムラサキツメクサ、サブタレニアンクローバ）、アルファルファ、アブラナ、アブラナ科野菜、レタス、ホウレンソウなど］および裸子植物に適用され得る。
【００４５】
本発明のさらなる態様において、サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコード
する遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結された改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含む植物の老化を操作することができるベクターが提供される。
【００４６】
本発明のまたさらなる態様において、サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結されたｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含む、植物のバイオマスを増大させることができるベクターが提供される。
【００４７】
ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体は、本明細書において上記の完全長のｍｙｂ遺伝子プロモーターまたは改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターであり得る。
【００４８】
本発明のこの態様の好ましい実施形態において、ベクターは、さらにターミネーターを含むものであり得、前記プロモーター、遺伝子およびターミネーターは、作動可能に連結されている。
【００４９】
「作動可能に連結されている」とは、前記プロモーターが植物細胞において前記遺伝子の発現をもたらし得ること、および前記ターミネーターが植物細胞において前記遺伝子の発現を終了させ得ることを意図する。好ましくは、前記プロモーターは前記遺伝子の上流であり、前記ターミネーターは前記遺伝子の下流である。
【００５０】
ベクターは、任意の適当な型のものであり得、ウイルス系または非ウイルス系であり得る。ベクターは、発現ベクターであり得る。かかるベクターとしては、染色体、非染色体および合成の核酸配列、例えば、植物ウイルスの誘導体；細菌系プラスミド；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のＴｉプラスミドの誘導体；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来のＲｉプラスミドの誘導体；ファージＤＮＡ；酵母人工染色体；細菌系人工染色体；バイナリー細菌系人工染色体；プラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導したベクターが挙げられる。しかしながら、植物細胞内で複製可能または組込み可能またはバイアブルである限り、任意の他のベクターが使用され得る。
【００５１】
プロモーター、遺伝子およびターミネーターは、任意の適当な型のものであり得、標的植物細胞に対して内在性であってもよく、外来性であってもよいが、標的植物細胞において機能性であるものとする。
【００５２】
また、本発明のベクターに使用され得るさまざまなターミネーターは、当業者に充分知られている。ターミネーターは、プロモーター配列と同じ遺伝子由来のものであってよく、異なる遺伝子由来のものであってもよい。特に好適なターミネーターは、ポリアデニル化シグナル（ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ポリＡなど）ならびにノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子およびオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子由来の他のターミネーターである。
【００５３】
ベクターには、プロモーター、遺伝子およびターミネーターに加えて、さらに、遺伝子の発現に必要なエレメント、例えば、ベクターバックボーン、複製起点（ｏｒｉ）、マルチクローニング部位、スペーサー配列、エンハンサー、イントロン（トウモロコシユビキチンＵｂｉイントロンなど）、抗生物質耐性遺伝子および他の選択可能マーカー遺伝子［ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔｌｌ）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ）遺伝子、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｂａｒまたはｐａｔ）遺伝子など］、ならびにレポーター遺伝子（β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子（ｇｕｓＡ）など］が種々の組合せで含まれることがあり得る。また
、ベクターには、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含めてもよい。また、ベクターには、発現の増幅のための適切な配列を含めてもよい。
【００５４】
形質転換宿主細胞選択のための表現型形質をもたらすのに選択可能マーカー遺伝子を使用することの代替法として、形質転換細胞内のベクターの存在を、当該技術分野でよく知られた他の手法、例えば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロットハイブリダイゼーション解析、組織化学的アッセイ（例えば、ＧＵＳアッセイ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ノーザンおよびウエスタンブロットハイブリダイゼーション解析などによって調べてもよい。
【００５５】
当業者には、ベクターの種々の成分は、前記遺伝子の発現がもたらされるように作動可能に連結されていることが認識されよう。本発明のベクターの成分を作動可能に連結させるための手法は、当業者には充分知られている。かかる手法としては、リンカー（例えば、１つ以上の制限酵素部位を含む合成リンカーなど）の使用が挙げられる。
【００５６】
本発明のさらなる態様において、改変された老化特性または向上したバイオマスを有するトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分が提供される。好ましくは、前記植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分は、本発明によるベクターを含む。好ましくは、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分は、本発明による方法によって生成されるものである。
【００５７】
また、本発明は、本発明の植物細胞由来のトランスジェニック植物、植物種子、または他の植物部分を提供する。
【００５８】
また、本発明は、本発明の植物由来のトランスジェニック植物、植物種子、または他の植物部分を提供する。
【００５９】
次に、本発明を、以下の実施例および添付の図面に関して、より充分に説明する。しかしながら、以下の説明は例示にすぎず、上記の本発明の一般説明をなんら制限するものと解釈されるべきでないことを理解されたい。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
植物の老化を操作する方法であって、該植物に、サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結された改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含む遺伝子構築物を導入することを含み、該改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターにおいて、１つ以上の根特異的モチーフおよび／または花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化させている、方法。
（項目２）
各々がコンセンサス配列ＡＴＡＴＴまたはＡＡＴＡＴを含む１つ以上の根特異的モチーフを欠失もしくは不活化させる、項目１に記載の方法。
（項目３）
各々がコンセンサス配列ＴＴＣＴまたはＡＧＡＡを含む１つ以上の花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化させる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、配列番号２、３および４、ならびにその機能的に活性な断片および改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の
方法。
（項目６）
サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする前記遺伝子が、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｆ）遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体である、項目１に記載の方法。
（項目７）
サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする前記遺伝子が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＬｏｔｕｓおよびＰｅｔｕｎｉａからなる群より選択される属由来のものである、項目６に記載の方法。
（項目８）
サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする前記遺伝子が、配列番号５、７および９、配列番号６、８および１０の配列を有するポリペプチドをコードする配列、ならびにその機能的に活性な断片および改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記遺伝子構築物が、植物細胞のアグロバクテリウム媒介型または微粒子銃型形質転換（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって前記植物に導入される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記遺伝子構築物が組み込まれた植物細胞を選択し、次いで培養して形質転換植物を再生させる、項目９に記載の方法。
（項目１１）
植物の老化を操作することができるベクターであって、該ベクターは、サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結された改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含み、前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターにおいて、１つ以上の根特異的モチーフおよび／または花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化させている、ベクター。
（項目１２）
さらにターミネーターを含み、前記プロモーター、遺伝子およびターミネーターが作動可能に連結されている、項目１１に記載のベクター。
（項目１３）
前記改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターにおいて、各々がコンセンサス配列ＡＴＡＴＴまたはＡＡＴＡＴを含む前記１つ以上の根特異的モチーフが欠失もしくは不活化されている、項目１１に記載のベクター。
（項目１４）
前記改変ｍｙｂプロモーターにおいて、各々がコンセンサス配列ＴＴＣＴまたはＡＧＡＡを含む１つ以上の花粉特異的モチーフが欠失もしくは不活化されている、項目１１に記載のベクター。
（項目１５）
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターがＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ由来のものである、項目１１に記載のベクター。
（項目１６）
前記ｍｙｂ遺伝子プロモーターが、配列番号２、３および４、ならびにその機能的に活性な断片および改変体からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１１に記載のベクター。
（項目１７）
サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする前記遺伝子が、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体である、項目１１に記載のベクター。
（項目１８）
サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする前記遺伝子が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＬｏｔｕｓおよびＰｅｔｕｎｉａからなる群より選択される属由来のものである、項目１７に記載のベクター。
（項目１９）
サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする前記遺伝子が、配列番号５、７および９、ならびに配列番号６、８および１０の配列を有するポリペプチドをコードする配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、項目１７に記載のベクター。
（項目２０）
変更された老化特性を有するトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分であって、該植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分は、サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結された改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含む遺伝子構築物を含み、該改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターにおいて、１つ以上の根特異的モチーフおよび／または花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化されている、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分。（項目２１）
植物に、サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結された改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含む遺伝子構築物を導入することを含む方法によって生成される、項目２０に記載のトランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分であって、該改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターにおいて、１つ以上の根特異的モチーフおよび／または花粉特異的モチーフを欠失もしくは不活化されている、トランスジェニック植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分。
（項目２２）
項目２０に記載の植物細胞由来のトランスジェニック植物、植物種子、または他の植物部分。
（項目２３）
項目２０に記載の植物由来のトランスジェニック植物、植物種子、または他の植物部分。（項目２４）
植物の老化を操作する方法であって、該方法は、該植物に、コンセンサス配列ＡＴＡＴＴまたはＡＡＴＡＴを有する１〜１０個の根特異的モチーフが欠失もしくは不活化されているか、またはコンセンサス配列ＴＴＣＴまたはＡＧＡＡを有する１〜３０個の花粉特異的モチーフが欠失もしくは不活化されている改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターを含む遺伝子構築物を導入することを含み、該改変ｍｙｂ遺伝子プロモーターがｉｐｔまたはｓｈｏ遺伝子に作動可能に連結されている、方法。
（項目２５）
植物のバイオマスを増大させる方法であって、該植物に、サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結されたｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含む遺伝子構築物を導入することを含む、方法。
（項目２６）
サイトカイニンの生合成に関与している酵素をコードする遺伝子またはその機能的に活性な断片もしくは改変体に作動可能に連結されたｍｙｂ遺伝子プロモーターまたはその機能的に活性な断片もしくは改変体を含む、植物のバイオマスを増大させることができるベクター。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、シロイヌナズナのｍｙｂ３２遺伝子（ａｔｍｙｂ３２）由来のプロモーターのヌクレオチド配列であるＡｔｍｙｂ３２プロモーター配列を示し（配列番号１）、ＭＹＢ型、花粉特異的および根特異的モチーフを強調表示している。ＷＡＡＣＣＡ（下線／イタリック体）ＭＹＢ１ＡＴ；ＧＴＴＡＧＴＴ（太字／線で囲んだ範囲）ＭＹＢ１ＬＥＰＲ；ＣＣＷＡＣＣ（線で囲んだ範囲）ＭＹＢＰＺＭ；ＧＧＡＴＡ（イタリック体）ＭＹＢＳＴ１；ＡＧＡＡＡ（下線）花粉１ＬＥＬＡＴ５２；ＡＴＡＴＴ（太字）根モチーフＴＡＰＯＸ１。
【図２】図２は、ＸｃｍＩ−ＳｓｐＩ植物配列欠失型Ａｔｍｙｂ３２プロモーター配列改変体（Ａｔｍｙｂ３２ｘｓ）を示す。ＭＹＢ型、花粉特異的および根特異的モチーフを強調表示している。ＷＡＡＣＣＡ（下線／イタリック体）ＭＹＢ１ＡＴ；ＧＴＴＡＧＴＴ（太字／線で囲んだ範囲）ＭＹＢ１ＬＥＰＲ；ＣＣＷＡＣＣ（線で囲んだ範囲）ＭＹＢＰＺＭ；ＡＧＡＡＡ（下線）花粉１ＬＥＬＡＴ５２；ＡＴＡＴＴ（太字）根モチーフＴＡＰＯＸ１（配列番号２）。
【図３】図３は、すべての根モチーフを欠失させたＡｔｍｙｂ３２プロモーター改変体配列を示す。ＭＹＢ型、花粉特異的および根特異的モチーフを強調表示している。ＷＡＡＣＣＡ（下線／イタリック体）ＭＹＢ１ＡＴ；ＣＣＷＡＣＣ（線で囲んだ範囲）ＭＹＢＰＺＭ；ＡＧＡＡＡ（下線）花粉１ＬＥＬＡＴ５２（配列番号３）。
【図４】図４は、ＳｓｐＩ部位上流配列を欠失させたＡｔｍｙｂ３２プロモーター改変体配列を示す。ＭＹＢ型、花粉特異的および根特異的モチーフを強調表示している。ＷＡＡＣＣＡ（下線／イタリック体）ＭＹＢ１ＡＴ；ＣＣＷＡＣＣ（線で囲んだ範囲）ＭＹＢＰＺＭ；ＡＧＡＡＡ（下線）花粉１ＬＥＬＡＴ５２（配列番号４）。
【図５】図５は、Ａｔｍｙｂ３２プロモーター配列およびＡｔｍｙｂ３２ｘｓプロモーター配列内のモチーフを示す。
【図６】図６は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図７】図７は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ由来のイソペンチルトランスフェラーゼ遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【図８】図８は、ミヤコグサ由来のイソペンチルトランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）を示す。
【図９】図９は、ミヤコグサ由来のイソペンチルトランスフェラーゼ遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号８）を示す。
【図１０】図１０は、ツクバネアサガオ由来のサイトカイニン生合成Ｓｈｏ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号９）を示す。
【図１１】図１１は、ツクバネアサガオ由来のサイトカイニン生合成Ｓｈｏ遺伝子の推定アミノ酸配列（配列番号１０）を示す。
【図１２】図１２は、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ）植物のＰＣＲおよびサザンＤＮＡ解析を示す。ａ）制限酵素部位およびサザンハイブリダイゼーション解析に使用されたプローブの位置を示すｐａｔｍｙｂ３２：ｉｐｔのＴ−ＤＮＡ領域、ｂ）ＰＣＲ増幅させた５９９ｂｐ  ｎｐｔｌｌ産物および５８３ｂｐ  ｉｐｔ産物の臭化エチジウム染色１％アガロースゲル、ｃ）ｉｐｔプローブとハイブリダイズさせたＰＣＲ陽性シロツメクサ植物から単離したＨｉｎｄＩＩＩ消化全ゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーション、ｄ）ｎｐｔｌｌプローブとハイブリダイズさせたＰＣＲ陽性シロツメクサ植物から単離したＨｉｎｄＩＩＩ消化全ゲノムＤＮＡのサザンブロットハイブリダイゼーション。レーン１〜２：２つの独立したカナマイシン耐性ｃｖ．Ｈａｉｆａ  再生体（ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔ）、コード：それぞれ、Ｈｍｉ０１、Ｈｍｉ０８；レーン３〜１２：１２個の独立したカナマイシン耐性ｃｖ．Ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ再生体、コード：それぞれ、Ｉｍｉ０６、Ｉｍｉ０７、Ｉｍｉ０８、Ｉｍｉ０９、Ｉｍｉ１０、Ｉｍｉ１１、Ｉｍｉ１２、Ｉｍｉ１４、Ｉｍｉ１６、Ｉｍｉ１８；レーンＣ：非形質転換シロツメクサ；レーンＰ：陽性対照プラスミドｐａｔｍｙｂ３２ｉｐｔ。
【図１３】図１３は、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ（Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ）植物におけるｉｐｔ  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲ解析を示す。レーン１〜１１は、図４．８の場合の対応植物コードを有する１１種類の独立したトランスジェニック系統由来の試料である；レーンＣ、対照非形質転換植物；レーンＰ、陽性対照としてのプラスミド。全ＲＮＡを葉組織から単離した。全ＲＮＡ（１３μｇ）を各逆転写反応に使用し、ＲＴ産物の１／５をＰＣＲによって増幅させた。右側のゲル上のＤＮＡ産物は、２×３０サイクルの集中的（ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）ＰＣＲによって増幅させた。１つおきのレーンにロードした対応ＲＴ−ＰＣＲ反応液には、逆転写酵素は添加しなかった。
【図１４】図１４は、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ（Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ）植物から切除した葉の老化バイオアッセイを示す。各植物系統から少なくとも３０枚の葉を、各系統の走根上の類似した位置から収集した。Ａ．切除した葉の総数に対する分数としての黄変葉の数。Ｂ．光の下で水上に２週間維持した葉の典型的な外観。植物系統に対するキー：それぞれ、ＨＣ、ＩＣおよびＨｍｇ、Ｉｍｇ、非形質転換およびａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡトランスジェニック植物（ｃｖ．ＨａｉｆａおよびＩｒｒｉｇａｔｉｏｎ）；それぞれ、０１および０８、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックＨａｉｆａ系統Ｈｍｉ０１およびＨｍｉ０８；それぞれ、１１、１２、１６および１８、ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックＩｒｒｉｇａｔｉｏｎ系統Ｉｍｉ１１、Ｉｍｉ１２、Ｉｍｉ１６およびＩｍｉ１８。
【図１５】図１５は、対照植物（左）と比較したａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ（Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ）（右）植物における、Ａ）一般的な植物の形態、Ｂ）正常なシュートの発育、およびＣ）正常な根の発育を示す。
【図１６】図１６は、ｐＢＭＶｋＡｔＭＹＢ３２−９００：：ｉｐｔ［遺伝子：イソペンチルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）；ベクター：ｐＢＭＶｋＡｔＭＹＢ３２−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓ（バックボーンｐＰＺＰＲＣＳ２）；選択可能マーカー：ｓｐｅｃ；植物選択可能マーカーカセット：３５Ｓ：：ｋａｎ：：３５ＳＴ；遺伝子プロモーター：ＡｔＭＹＢ３２−９００；遺伝子ターミネーター：ｎｏｓ．］のベクターの詳細を示す。
【図１７】図１７は、ベクターｐＢＭＶｋＡｔＭＹＢ３２−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓのヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図１８】図１８は、ｐＢＭＶｋＡｔＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓ［遺伝子：イソペンチルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）；ベクター：ｐＢＭＶｋＡｔＭＹＢ３２ＸＳ：：ｉｐｔ−ｎｏｓ（バックボーンｐＰＺＰＲＣＳ２）；選択可能マーカー：ｓｐｅｃ；植物選択可能マーカーカセット：３５Ｓ：：ｋａｎ：：３５ＳＴ；遺伝子プロモーター：ＡｔＭＹＢ３２−ｘｓ；遺伝子ターミネーター：ｎｏｓ．］のベクターの詳細を示す。
【図１９】図１９は、ベクターｐＢＭＶｋＡｔＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓのヌクレオチド配列（配列番号１２）を示す。
【図２０】図２０は、ｐＢＭＶｈＡｔＭＹＢ３２−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓ［遺伝子：イソペンチルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）；ベクター：ｐＢＭＶｈＡｔＭＹＢ３２−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓ（バックボーンｐＰＺＰＲＣＳ２）；選択可能マーカー：ｓｐｅｃ；植物選択可能マーカーカセット：３５Ｓ：：ｈｐｈ：：３５ＳＴ；遺伝子プロモーター：ＡｔＭＹＢ３２−９００；遺伝子ターミネーター：ｎｏｓ．］のベクターの詳細を示す。
【図２１】図２１は、ベクターｐＢＭＶｈＡｔＭＹＢ３２−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓのヌクレオチド配列（配列番号１３）を示す。
【図２２】図２２は、ｐＢＭＶｈＡｔＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓ［遺伝子：イソペンチルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）；ベクター：ｐＢＭＶｈＡｔＭＹＢ３２ＸＳ：：ｉｐｔ−ｎｏｓ（バックボーンｐＰＺＰＲＣＳ２）；選択可能マーカー：ｓｐｅｃ；植物選択可能マーカーカセット：３５Ｓ：：ｈｐｈ：：３５ＳＴ；遺伝子プロモーター：ＡｔＭＹＢ３２−ｘｓ；遺伝子ターミネーター：ｎｏｓ．］のベクターの詳細を示す。
【図２３】図２３は、ベクターｐＢＭＶｈＡｔＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓのヌクレオチド配列（配列番号１４）を示す。
【図２４】図２４は、ｐＢＳｕｂｎ−ＡｔＭＹＢ３２−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓ［遺伝子：イソペンチルトランスフェラーゼ（ＩＰＴ）；ベクター：ｐＢＳｕｂｎ−ＡｔＭＹＢ３２−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓ（バックボーンｐＰＺＰＲＣＳ２）；選択可能マーカー：ｓｐｅｃ；植物選択可能マーカーカセット：Ｕｂｉ：：ｂａｒ：：ｎｏｓ；遺伝子プロモーター：ＡｔＭＹＢ３２−９００；遺伝子ターミネーター：ｎｏｓ．］のベクターの詳細を示す。
【図２５】図２５は、ベクターｐＢＳＡｔＭＹＢ３２９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓのヌクレオチド配列（配列番号１５）を示す。
【図２６】図２６は、ｐＢＭＶｈＡＴＭＹＢ３−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓおよびｐＢＭＶｈＡＴＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓを含むトランスジェニックアブラナの生成を示す。Ａ．アブラナ種子をインビトロで発芽させる；Ｂ．胚軸部を７日齢の実生から切除し、アグロバクテリウム懸濁液を接種する；ＣおよびＤ．ハイグロマイシン選択下、接種胚軸部からの再生  ；Ｅ〜Ｊ．ｐＢＭＶｈＡＴＭＹＢ３−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓおよびｐＢＭＶｈＡＴＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓベクターを有するトランスジェニックＴ０アブラナ植物。
【図２７】図２７は、小麦の微粒子銃形質転換のためのプロセスを示す。
【図２８】図２８は、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．ＭＰＢ  Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ２６）の微粒子銃形質転換を示す。ドナー植物生産（ＡおよびＢ）；接合子胚単離（ＣおよびＤ）；グルホシネート選択下での再生（Ｅ〜Ｇ）；選択下での根形成（Ｈ）；トランスジェニック子孫の回収のための閉鎖温室条件下でのＴ０植物栽培（Ｉ）。
【図２９】図２９は、キメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物の隔離圃場試験を示す。
【図３０】図３０は、キメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物と、非トランスジェニック対照シロツメクサ植物での生長速度と生長動態の比較評価を示す。Ａ）生長速度  Ｂ）生長動態  Ｃ）生長特性（４５日後）  白抜きの四角（明）  トランスジェニックシロツメクサ、黒塗りの四角（暗）  非トランスジェニック対照シロツメクサ
【図３１】図３１は、隔離圃場条件下での、キメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物（すなわち、ＬＸＲ  １２、ＬＸＲ  １８およびＬＸＲ  １１）と、非トランスジェニック対照シロツメクサ植物（すなわち、ＷＴ）の開花強度（すなわち、１ｍ２あたりの成熟花の数）を示す。
【図３２】図３２は、隔離圃場条件下での、キメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物（すなわち、ＬＸＲ  １２、ＬＸＲ  １８およびＬＸＲ  １１）と、非トランスジェニック対照シロツメクサ植物（すなわち、ＷＴ）の種子重量（すなわち、千個の種子の重量、単位：グラム）を示す。
【図３３】図３３は、隔離圃場条件下での、キメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物（すなわち、ＬＸＲ  １２、ＬＸＲ  １８およびＬＸＲ  １１）と、非トランスジェニック対照シロツメクサ植物（すなわち、ＷＴ）の花１つあたりの種子収量（単位：ミリグラム）を示す。
【図３４】図３４は、隔離圃場条件下での、キメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物（すなわち、ＬＸＲ  １２、ＬＸＲ  １８およびＬＸＲ  １１）と、非トランスジェニック対照シロツメクサ植物（すなわち、ＷＴ）の単位面積あたりの種子収量（単位：ｋｇ／ヘクタール）を示す。
【図３５】図３５は、キメラｐＢＭＶｋＡＴＭＹＢ３−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓおよびｐＢＭＶｋＡＴＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓ遺伝子を含むトランスジェニックアルファルファ植物の生成を示す。Ａ．アルファルファクローンＣ２−３、Ｃ２−４および１９−１７由来の葉柄外植片をアグロバクテリウム懸濁液の接種に使用し、カナマイシンの存在下での選択後、形質転換胚形成性カルスの発生をもたらす；Ｂ〜Ｄ．インビトロで培養した体細胞胚からの、ｐＢＭＶｋＡＴＭＹＢ３−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓおよびｐＢＭＶｋＡＴＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓベクター由来のキメラ遺伝子を有するトランスジェニックアルファルファ小植物の再生。
【図３６】図３６は、トランスジェニックアブラナ植物（Ｔ１  ＬＸＲアブラナ植物Ｌｉｎｅ  ４）のＰＣＲ解析を示す。ゲノムＤＮＡは、Ｔ１  ＬＸＲ０４系統の異なるトランスジェニックアブラナ植物から単離し、Ａ．選択可能マーカー（ｈｐｈ）またはＢ．目的の候補遺伝子（ＩＰＴ）に特異的なプライマーを用いてＰＣＲに供した。
【図３７】図３７は、Ｔ１トランスジェニックアブラナ植物におけるＩＰＴ遺伝子の発現解析を示す（Ｔ１  ＬＸＲアブラナの葉での相対ＩＰＴ発現）。
【図３８】図３８は、切り取って７日後、野生型対照子葉と比較したときの、切り取り子葉の老化の遅延を示すトランスジェニックアブラナを示す。
【図３９】図３９は、切り取って７日後のＴ１トランスジェニックアブラナ子葉の老化スコアを示す。
【００６１】
【化１】
0005608552.tif 000002
【図４０】図４０は、切り取って１４日後、野生型対照子葉と比較したときの、切り取り若幼葉の老化の遅延を示すトランスジェニックアブラナを示す。
【図４１】図４１は、切り取って１４日後、Ｔ１トランスジェニックアブラナの第１の若幼葉の老化スコアを示す。
【００６２】
【化２】
0005608552.tif 000003
【図４２】図４２は、トランスジェニック小麦系統のサザンハイブリダイゼーション解析を示す。レーンは、ＭＷ−分子量；ＷＴ−野生型；トランスジェニック小麦系統ＬＸＲ３、ＬＸＲ４、ＬＸＲ１３、ＬＸＲ１６ならびに１０ｐｇおよび２０ｐｇを含む陽性対照プラスミドを含む。
【図４３】図４３は、独立したＴ１トランスジェニック小麦系統の発現解析（小麦におけるＩＰＴ定量的発現）を示す。定量的転写物の値は、標的配列を含むプラスミドＤＮＡで得た標準曲線を用いて、フェトモル（ｆｍｏｌ）／マイクログラムＲＮＡで測定した。試料は、候補遺伝子ＩＰＴに対して高、中および低クラスの発現を表す。
【図４４】図４４は、温室栽培Ｔ１トランスジェニック小麦植物の表現型多様性を示す。Ａ．ヌル対照小麦植物と比較したとき、正常表現型を示すＴ１  ＬＸＲ  １３小麦植物。Ｂ．ヌル対照小麦植物と比較したとき、成長阻害表現型および止め葉数の増加を示すＴ１  ＬＸＲ  ０４小麦植物。
【図４５】図４５は、切り取って７日後、ヌル対照葉と比較したときの、葉の老化の遅延を示すトランスジェニック小麦を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
実施例
実施例１
Ａｔｍｙｂ３２プロモーター配列およびプロモーター配列改変体
Ａｔｍｙｂｂ３２プロモーター配列およびその改変体を図１〜４に示す。
【００６４】
実施例２
サイトカイニン生合成遺伝子
本発明における使用に適したサイトカイニン生合成遺伝子の例を、図６、８および１０に示す。また、好適な遺伝子としては、図７、９および１１に示すポリペプチドをコードするものが挙げられる。
【００６５】
実施例３
トランスジェニックシロツメクサ植物の生成
トランスジェニックシロツメクサ植物（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ  ｃｖ．ＨａｉｆａおよびＩｒｒｉｇａｔｉｏｎ）を、キメラａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子バイナリーベクター（図１２ａ）を使用し、アグロバクテリウム媒介型形質転換によって生成した。トランスジェニック植物を、ｉｐｔプライマーおよびｎｐｔｌｌプライマー（図１２ｂ）を用いてＰＣＲによってスクリーニングした。ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡ試料をサザンＤＮＡハイブリダイゼーション解析に供すると、ｉｐｔプローブとｎｐｔｌｌプローブの両方によって、４．４ｋｂより大きいＤＮＡ断片がすべてのレーンに検出されることが示され、これは、完全長Ｔ−ＤＮＡの存在およびそのシロツメクサゲノム内への組込みを示す（図１２）。トランスジェニック系統Ｈｍｉ０１、Ｉｍｉ０６、Ｉｍｉ１１およびＩｍｉ１８（それぞれ、レーン１、３、５、８および１２）は、ゲノム内に組み込まれた単一コピーの完全長Ｔ−ＤＮＡを有するようであった。他のトランスジェニック系統は、多コピーのａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ導入遺伝子を有した。
【００６６】
実施例４
トランスジェニックシロツメクサ植物におけるＩＰＴ遺伝子発現
トランスジェニックシロツメクサ（Ｔ．ｒｅｐｅｎｓ）植物におけるａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ導入遺伝子の発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。ｉｐｔ  ｍＲＮＡは、調べたａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ植物すべての葉組織内で検出され、種々のレベルのＰＣＲ産物が検出された（図１３）。
【００６７】
実施例５
トランスジェニックシロツメクサ植物における切り取り葉の老化の遅延
ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック植物の切り取り葉の老化を評価するための実験を行なった。１週間以内に、両方の品種の非形質転換型およびａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡトランスジェニックシロツメクサ植物から切り取られた葉において、急速な黄変が観察された。トランスジェニック系統Ｈｍｉ０１、Ｈｍｉ０８、Ｉｍｉ１６およびＩｍｉ１８では、老化の遅延が示されたが、Ｉｍｉ１１とＩｍｉ１２では、７日間の最後までに黄変の兆候は示されなかった。２週間後、すべてのａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック植物の葉は、非形質転換型およびａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡ対照トランスジェニック植物のものよりもずっと緑色であった（図１４）。切除した葉における老化の程度は、ｃｖ．Ｈａｉｆａでは、ＨＣ、Ｈｍｇ＞Ｈｍｉ０１＞Ｈｍｉ０８、ならびにｃｖ．Ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎでは、ＩＣおよびＩｍｇ＞Ｉｍｉ１６＞Ｉｍｉ１８＞Ｉｍｉ１１およびＩｍｉ１２の順であった。ＨＣは、Ｈａｉｆａ非形質転換対照であり、Ｈｍｇは、Ｈａｉｆａ  ａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡ対照であり、ＩＣは、Ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ非形質転換対照であり、Ｉｍｇは、Ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ  ａｔｍｙｂ３２：：ｇｕｓＡ対照である。Ｈｍｉ０１、Ｈｍｉ０８、Ｉｍｉ１６、Ｉｍｉ１８、Ｉｍｉ１１およびＩｍｉ１２は、それぞれ、品種Ｈａｉｆａ（Ｈ）およびＩｒｒｉｇａｔｉｏｎ（Ｉ）に由来する独立したａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ植物である。
【００６８】
実施例６
トランスジェニックシロツメクサ植物における植物の形態と根の発育
正常な植物の形態ならびに正常なシュートの発育と正常な根の発育が、ａｔｍｙｂ３２：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ植物において観察され（図６）、したがって、ａｔｍｙｂ３２プロモーターの制御下でのｉｐｔ遺伝子の発現の調節は、トランスジェニックシロツメクサ植物の根発育にも頂芽優性にもマイナスの影響を及ぼさないことが示された（表１）。
【００６９】
【表１】
0005608552.tif 000004
分析した１０種類の独立したａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ系統において、正常な植物の形態および正常な根発育が観察された。この１０種類の独立したａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ系統の推定ｉｐｔ遺伝子コピー数を示す。
【００７０】
実施例７
植物形質転換用のベクターの作製
植物のアグロバクテリウム媒介型形質転換のため、４種類のバイナリーベクターを作製した（図１６〜１９）。各ベクターは、ｐＰＺＰ２００ベクターバックボーン（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚら，１９９４）を有し、キメラＡｔｍｙｂ３２−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓまたはＡｔｍｙｂ３２−ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓのいずれかを、キメラ３５Ｓ：：ｎｐｔｌｌ−３５ｓｔまたは３５Ｓ：：ｈｐｈ−３５ｓｔ選択可能マーカーカセットとともに、またはなしで含む。
【００７１】
形質転換ベクターの１つは、微粒子銃形質転換のために構築した（図２０および２１）。この形質転換ベクターは、キメラＡｔｍｙｂ３２−９００：：ｉｐｔ−３５ｓｔをキメラＵｂｉ：：ｂａｒ−ｎｏｓ選択可能マーカーカセットとともに含む。
【００７２】
Ａｔｍｙｂ３２プロモーター、プロモーター改変体Ａｔｍｙｂ３２ｘｓ、イソペンチルトランスフェラーゼ遺伝子ならびにターミネーター３５ｓｔおよびｎｏｓを、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）適合プライマーを用いてＰＣＲによって増幅し、ｐＤＯＮＲ２２１エントリーベクター内にクローニングした。続いて、これらを組換えを用いて、慣用的にクローニングされる選択可能マーカーカセットを含むデスティネーションベクター内にクローニングした。すべてのベクターは、厳密な品質保証プロトコルに従って完全に配列決定した。
【００７３】
実施例８
アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）のアグロバクテリウム媒介型形質転換
Ａｔｍｙｂ３２プロモーター（図１）および根特異的モチーフを欠失させたＡｔｍｙｂ３２ｘｓ改変体プロモーター配列（図２）の制御下のキメラｉｐｔ遺伝子を含むバイナリーベクターｐＢＭＶｈＡＴＭＹＢ３−９００：：ｉｐｔ−ｎｏｓ（図２０）およびｐＢＭＶｈＡＴＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓ（図２２）を、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕ
ｓ胚軸セグメントのアグロバクテリウム媒介型形質転換に使用した（図２６）。
【００７４】
Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓの種子を７０％エタノール中で２分間表面消毒し、滅菌水中で３回洗浄し、次いで、１％（ｗ／ｖ）の次亜塩素酸カルシウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ  ２０を含有する溶液中で、３０分間さらに表面消毒する。種子を滅菌水中で少なくとも３回洗浄し、１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ，１５：４７３−４９７，１９６２）多量養素、１×微量栄養素およびＢ５有機ビタミン群（５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、２％（ｗ／ｖ）のスクロースを補給、ｐＨ５．８）を含有し、４ｇ／ＬのＧｅｌｒｉｔｅを添加した固形発芽培地を入れた１２０ｍｌ容の培養容器内に植え付ける。容器を１６時間明／８時間暗条件下、２５℃で７日間インキュベートして発芽を促進する。
【００７５】
７日後、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓの実生（実生全体）を、１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ多量養素、１×微量栄養素およびＢ５有機ビタミン群（５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを補給、ｐＨ５．８）からなる液体培地に移す。実生を集め、根と子葉を除去した後、胚軸を７〜１０ｍｍ切片に切断し、１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ多量養素、１×微量栄養素およびＢ５有機ビタミン群（５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを補給、ｐＨ５．８）からなり、６．４ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−Ａｇａｒで固化したプレコンディショニング培地を入れた９×１．５ｃｍのペトリ皿の上で平板培養する。
【００７６】
胚軸部を２４時間培養した後、１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ多量養素、１×微量栄養素およびＢ５有機ビタミン群（５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、１００μＭのアセトシリンゴン、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを補給、ｐＨ５．８）からなるアグロバクテリウム懸濁液ＯＤ６００＝０．２を３０分間接種する。
【００７７】
接種後、胚軸部を滅菌ペーパータオル上にブロットし、１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ多量養素、１×微量栄養素およびＢ５有機ビタミン群（５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、１００μＭのアセトシリンゴン、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを補給、ｐＨ５．８、８ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−Ａｇａｒで固化）を入れた９×１．５ｃｍのペトリ皿に移す。外植片を１６時間明／８時間暗条件下、２５℃で７２時間インキュベートして共存培養する。
【００７８】
共存培養後、２０〜３０個の胚軸外植片を１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ多量養素、１×微量栄養素およびＢ５有機ビタミン群（５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを補給、ｐＨ５．８）からなり、８ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−Ａｇａｒ（２５０ｍｇ／ｌのチメンチンおよびハイグロマイシン耐性シュートを選択するための１０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを補給）で固化した固形選択培地を入れた９×１．５ｃｍのペトリ皿に移す。プレートを１６時間明／８時間暗条件下、２５℃でインキュベートする。
【００７９】
７日後、胚軸外植片を、１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ多量養素、１×微量栄養素およびＢ５有機ビタミン群（５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、３％（ｗ／ｖ）のスクロースを補給、ｐＨ５．８）からなり、８ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−Ａｇａｒ（４ｍｇ／ｌのＢＡＰ、２ｍｇ／ｌのゼアチン、５ｍｇ／ｌの硝酸銀、２５０ｍｇ／ｌのチメンチンおよび１０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを補給）で固化した固形再生培地を入れた９×２．０ｃｍのペトリ皿に移す。プレートを、蛍光灯条件（１６時間明／８時間暗の光周期；５５μｍｏｌ  ｍ−２秒−１）下の直接照明下、２５℃で４週間インキュベートしてシュートの発育を促進する。
【００８０】
再生を毎週モニタリングし、胚軸外植片を、固形再生培地ＲＭ（４ｍｇ／ｌのベンジルアデニン、２ｍｇ／ｌのゼアチン、５ｍｇ／ｌの硝酸銀、２５０ｍｇ／ｌのチメンチンおよび１０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを補給）を入れた新たな９×２．０ｃｍのペトリ皿に６〜８週間移し、シュートの発育を促進する。
【００８１】
ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇｒ）シュートを、１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ多量養素、１×微量栄養素およびＢ５有機ビタミン群（５００ｍｇ／ＬのＭＥＳ、１ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄ、１％（ｗ／ｖ）のスクロースを補給、ｐＨ５．８）からなり、８ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−Ａｇａｒ（２５０ｍｇ／ｌのチメンチンを補給）で固化した固形根誘導培地ＲＩＭ１を入れた１２０ｍｌ容器に移す。シュートを、直接蛍光灯（１６時間明／８時間暗の光周期；５５μｍｏｌ  ｍ−２秒−１）下、２５℃でインキュベートしてシュートの伸張と根の発育を４〜５週間にわたって促進する。シュートと根系の発育を有するＨｙｇｒシュートをすべて土壌に移し、温室条件下で生長させる。
【００８２】
実施例９
小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）の微粒子銃形質転換
Ａｔｍｙｂ３２プロモーター（図１）および根特異的モチーフを欠失させたＡｔｍｙｂ３２ｘｓ改変体プロモーター配列（図２）の制御下のキメラｉｐｔ遺伝子を含む形質転換ベクターを、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．ＭＰＢ  Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ２６）の微粒子銃形質転換に使用した。代表的なベクターを図２４に示す。小麦の微粒子銃形質転換の手順の概略を図２７に示す。形質転換手順は、以下の工程を含む。
【００８３】
工程１（ドナー植物生産）：
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ（Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ２６）の種子をドナー植物材料の生産に使用する。小麦植物は、堆肥化したマツ樹皮、パーライトおよびバーミキュライトからなる種苗用（ｎｕｒｓｅｒｙ）ミックス中で栽培し、鉢１つあたり植物５本とし、最大鉢サイズを２０ｃｍとする。植物をほぼ２２〜２４℃の温室条件下に１２〜１６週間維持する（図２８Ａ）。止め葉から最初の穂状花序（ｓｐｉｋｅ）が現れたら植物にタグを付け、開花１２〜１５日後に最も高い頭部から胚を収集する。
【００８４】
工程２（第１日目）
所望の発育段階の穂状花序を採取する（図２８Ｂ）。穀果を穂状花序から取り出し、０．８％（ｖ／ｖ）のＮａＯＣｌ溶液中で２０分間表面消毒し、滅菌蒸留中で少なくとも４回すすぐ。
【００８５】
長さ１０ｍｍまでの胚を各穀果から、解剖顕微鏡を用いて無菌的に切除し（軸部の取り出し）、軸面を下にして、２×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（１９６２）多量養素、１×微量栄養素および有機ビタミン群、４０ｍｇ／Ｌのチアミン、１５０ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン（１５％（ｗ／ｖ）のマルトース、０．８％（ｗ／ｖ）のＳｉｇｍａ製寒天および２．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを補給）からなる浸透圧培地（Ｅ３マルトース）上で培養する（図２８ＣおよびＤ）。胚を、１５ｍＬの培地を入れた６０ｍｍ×１５ｍｍの透明なポリプロピレン製ペトリ皿の上で培養する。培養プレートを２４℃で、暗所にて４時間インキュベートした後、ボンバードメント（bombardment）を行なう。胚には、９００ｐｓｉで６ｃｍのＢｉｏＲａｄ  ＰＤＳ１０００遺伝子銃で、１μｇのベクタープラスミドＤＮＡ（０．６μｍの金粒子上に沈殿させたもの）を用いてボンバードメントを行なう。ボンバードメント後、胚を浸透圧培地上で、暗所にて一晩インキュベートする。
【００８６】
工程３（第２日目）：
胚を、２×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（１９６２）多量養素および１×
微量栄養素ならびに有機ビタミン群、４０ｍｇ／Ｌのチアミン、１５０ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン（６％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．８％（ｗ／ｖ）のＳｉｇｍａ製寒天および２．５ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを補給）からなるカルス誘導培地（Ｅ３カルス）に移す。胚を２４℃で暗所にて２週間培養する。
【００８７】
工程４（第１６日目）：
Ｅ３カルス上での２週間の培養後、胚から胚誘導性カルスが発生し、２×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（１９６２）多量養素および１×微量栄養素ならびに有機ビタミン群、４０ｍｇ／Ｌのチアミン、１５０ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン（２％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．８％（ｗ／ｖ）のＳｉｇｍａ製寒天、５ｍｇ／ＬのＤ，Ｌホスフィノトリシン（ＰＰＴ）を補給、植物生長調節因子なし）からなる選択培地（Ｅ３Ｓｅｌｅｃｔ）上に継代培養する（図２８Ｅ〜Ｇ）。培養物を、さらに１４日間、Ｅ３Ｓｅｌｅｃｔ上で２４℃にて明るい場所で１２時間の光周期でインキュベートする。
【００８８】
工程５（第３０日）：
Ｅ３Ｓｅｌｅｃｔ上での１４日間の培養後、胚誘導性カルスを新たなＥ３Ｓｅｌｅｃｔ上で、さらに１４日間継代培養する（図２８Ｅ−Ｇ）。
【００８９】
工程６（第４４日）：
Ｅ３Ｓｅｌｅｃｔ上で約４週間後、生長中の小植物を胚性カルス塊から切除し、根誘導培地（ＲＭ）を入れた６５ｍｍ×８０ｍｍまたは６５ｍｍ×１５０ｍｍのポリカーボネート製組織培養容器内で、さらに３週間生長させる。根誘導培地は、１×Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ  ａｎｄ  Ｓｋｏｏｇ（１９６２）多量養素、微量栄養素ならびに有機ビタミン群、４０ｍｇ／Ｌのチアミン、１５０ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン（２％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．８％（ｗ／ｖ）のＳｉｇｍａ製寒天、および５ｍｇ／ＬのＰＰＴを補給）からなるものである（図２８Ｈ）。残りの胚誘導性カルスはＥ３Ｓｅｌｅｃｔ上で、さらに１４日間継代培養する。
【００９０】
工程７（第６５日以降）：
ＲＭ上で３週間より長く生存し、健常な根形成を有する再生小植物を、泥炭と砂（１：１）からなる種苗用ミックス中に植え、種苗用湿度チャンバシステムにて高湿度で２２〜２４℃に維持する（図２８）。２週間後、植物を湿度チャンバから取り出し、手での水やりと、液状肥料Ａｑｕａｓｏｌ（商標）の供給を毎週、充分生長するまで与える。Ｔ０植物をゲノムＤＮＡと分子解析のために試料採取する。Ｔ１種子を採取し、ハイスループットＱ−ＰＣＲ解析のために植える（図２８Ｊ）。
【００９１】
実施例１０
トランスジェニックシロツメクサ植物の農業生産力
非トランスジェニック対照シロツメクサ植物のものと比べたａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニックシロツメクサ（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｒｅｐｅｎｓ）植物の農業生産力を、環境制御生長チャンバ条件下で隔離圃場試験にて評価した（図２９）。
【００９２】
生長制御チャンバ条件下で評価したキメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物は、非トランスジェニック対照シロツメクサ植物と比べて、有意なバイオマス蓄積の向上および老化の兆候の低減を示した（図３０）。キメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物は、非トランスジェニック対照シロツメクサ植物と比べて、総葉面積の増大、累積葉面積増大、葉の高生長動態（すなわち、経時的な葉の数）、走根長さの増大および開花植物％の増大ならびに走根の老化および枯死の低減を示した（図３０Ａ〜Ｃ）。
【００９３】
また、トランスジェニックシロツメクサ植物をもたらす３つの独立したａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ（すなわち、ＬＸＲ  １２、ＬＸＲ  １８およびＬＸＲ  １１）の種子収量の成績を、隔離圃場条件下で、非トランスジェニック対照植物（すなわち、野生型、ＷＴ）と比較評価した。非トランスジェニック対照植物（すなわち、ＷＴ）と識別不可能な開花強度（すなわち、１ｍ２あたりの成熟花の数）を有するトランスジェニックシロツメクサ植物をもたらした２つの独立したａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ（すなわち、ＬＸＲ  １２およびＬＸＲ  １８）を、圃場評価に選択した（図３１）。
【００９４】
キメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物（すなわち、ＬＸＲ  １２、ＬＸＲ  １８およびＬＸＲ  １１）の種子重量（すなわち、千個の種子の重量）は、非トランスジェニック対照シロツメクサ植物（すなわち、ＷＴ）と識別不可能であったが（図３２）、花１つあたり（図３３）、および種蒔き面積あたり（図３４）の基準で示す総種子収量は、同等の開花強度の非トランスジェニック対照シロツメクサ植物（すなわち、ＷＴ）と比べて、キメラＡｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックシロツメクサ植物（すなわち、ＬＸＲ  １２およびＬＸＲ  １８）において２倍であった。
【００９５】
実施例１１
アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）のアグロバクテリウム媒介型形質転換
根特異的モチーフを欠失させたＡｔｍｙｂ３２ｘｓ改変体プロモーター配列（図２）の制御下のキメラｉｐｔ遺伝子を含むバイナリーベクターｐＢＭＶｋＡＴＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓ（図１８）を、高度に再生可能なアルファルファ（Ｍ．ｓａｔｉｖａ）クローンＣ２−３、Ｃ２−４および１９−１７由来のＭｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａの葉柄外植片のアグロバクテリウム媒介型形質転換に使用した（図３５）。
【００９６】
バイナリーベクターｐＢＭＶｋＡＴＭＹＢ３２ｘｓ：：ｉｐｔ−ｎｏｓを保有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＬＢＡ  ４４０４との共存培養後、アルファルファ外植片をセフォタキシム含有培地で洗浄し、２５ｍｇ／ｌのカナマイシンを含有する選択培地下で、胚誘導性カルスの誘導に使用した。トランスジェニック胚形成性アルファルファカルスを回収し、トランスジェニックアルファルファシュートを再生させ、これを根発育培地に移し、Ａｔｍｙｂ３２ｘｓ改変体プロモーターの制御下で、キメラｉｐｔ遺伝子発現トランスジェニックアルファルファ植物の回収に至るようにした（図３５）。
【００９７】
本明細書において開示および規定した本発明は、本文または図面に記載し、これらから明白な個々の特徴の２つ以上の択一的なあらゆる組合せに拡張されることは理解されよう。このような種々の組合せはすべて、本発明の種々の択一的態様を構成する。
【００９８】
実施例１２
トランスジェニックアブラナ植物の生成
トランスジェニックアブラナ植物（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）を、キメラａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子を保有するバイナリーベクター（図２０および２２）を用いて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介型形質転換によって生成した。遺伝子改変を、候補遺伝子（ＩＰＴ）または選択可能マーカー（ｈｐｈ）の存在について、Ｔ１世代でＰＣＲを用いてキャラクタライズした（図３６）。
【００９９】
図３６は、トランスジェニックアブラナ植物のＰＣＲ解析を示す。ゲノムＤＮＡをＴ１
ＬＸＲ０４系統の種々のトランスジェニックアブラナ植物から単離し、選択可能マーカー（ｈｐｈ遺伝子）または目的の候補遺伝子（ＩＰＴ）に特異的なプライマーを用いてＰ
ＣＲに供した。図３６Ａでは、ｈｐｈ特異的プライマーを用いてゲノムＤＮＡから産物を増幅し、アガロースゲル上で可視化した。図３６Ｂは、蛍光ＰＣＲ法を用いてゲノムＤＮＡを増幅するためのＩＰＴ特異的プライマーの使用を示す。これらのプライマーは、ＰＣＲ産物の蓄積量に反比例する検出可能な蛍光をもたらす標的配列に特異的である。
【０１００】
実施例１３
トランスジェニックアブラナ植物におけるＩＰＴ遺伝子発現
トランスジェニックアブラナにおけるａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ導入遺伝子の発現を、標的配列に特異的な蛍光ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて評価した（図３７）。組織内のＩＰＴ  ｍＲＮＡを検出し、相対発現レベルを系統間およびヌル対照と比較した。ヌル対照は、形質転換プロセスを受けたが、交配後、標的配列を含まない子孫系統である。
【０１０１】
実施例１４
トランスジェニックアブラナ植物における切り取り葉の老化の遅延
ａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔトランスジェニック植物の切り取り葉の老化を評価するための実験を行なった。図３８〜４１は、アブラナにおける候補遺伝子の発現に関する切り取り葉の老化（ｄｅｔａｃｈｅｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）アッセイのデータを示す。切り取り子葉と葉のアッセイは、老化を誘導し、形質転換アブラナの老化表現型を野生型対照と比較して評価するために行なった。切り取り葉の老化アッセイの第７日目および第１４日目、老化の進行を、各組織試料について、０−老化の可能性の兆候なし；１−初期の老化の兆候がみられ、緑色が薄くなっている：２−さらに老化が進行、黄変が目立つようになっている；３−組織がほぼ黄変しているが、薄緑色が明白に残っている；４−完全な黄変に進行；５−黄変し、一部脱色および壊死斑を伴う、のいずれかとして定性的にスコアリングした（図３９および４１）。
【０１０２】
実施例１５
トランスジェニック小麦植物の生成
小麦の遺伝的形質転換は、図２７および２８に概要を示したＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ  Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ２６系統小麦由来の接合子胚の微粒子銃形質転換に基づいたものとした。
【０１０３】
キメラａｔｍｙｂ３２：：ｉｐｔ遺伝子を小麦ゲノム内に、パーティクルボンバードメントによって、ベクターバックボーン配列もまたゲノム内に組み込まれるように完全体プラスミドを用いて挿入した（図２４）。
【０１０４】
形質転換ベクターは充分に配列決定されたものとした（図２５）。遺伝子改変は、候補遺伝子の存在について、Ｔ１世代でサザン解析によってキャラクタライズした（図４２）。
【０１０５】
図４２は、トランスジェニック小麦植物のサザンハイブリダイゼーション解析を示す。ゲノムＤＮＡを異なるＴ１系統のトランスジェニック小麦植物から単離し、制限酵素で消化し、候補遺伝子コピー数を測定した。対照は、非形質転換野生型Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ  ２６」である。消化物を電気泳動させ、ナイロン膜に移し、プローブとしての完全長ＤＩＧ標識ＩＰＴ遺伝子とプローブ結合させた。ある範囲のコピー数が観察された。
【０１０６】
実施例１６
トランスジェニック小麦植物におけるＩＰＦ遺伝子発現
ＡｔＭＹＢ３２プロモーターによって駆動させたＩＰＴ遺伝子を含む温室栽培トランスジェニックＴ１小麦植物の若幼葉組織から、ＲＮＡを抽出し、第１ｃＤＮＡ鎖を調製した
。
【０１０７】
導入遺伝子の定量的発現は、標的配列のためのプローブ系ｑＲＴ−ＰＣＲ法を用いて調べた。各構築物の高、中および低発現系統の代表例を図４３に示す。また、内在性スクロースシンターゼ遺伝子に対して設計されたプライマー／プローブセットを対照として使用した。対照遺伝子のすべての増幅プロットは、互いの１サイクル内で始まり、これは、ＧＭＯの検出レベル差が発現の多様性によるものであることを示す。
【０１０８】
ＰＣＲプライマーおよびプローブは、ともに、ＰＣＲ産物の蓄積量に比例する検出可能な蛍光をもたらす標的配列に特異的である。検出対象の標的配列を含む連続希釈プラスミドＤＮＡを用いて、定量のための標準曲線を作成した。
【０１０９】
実施例１７
トランスジェニック小麦植物の植物形態
生長特性の違いを、温室内で、トランスジェニック小麦系統内および系統間で観察した。Ｔ１小麦植物間で主に観察された表現型には、植物丈、分げつ（ｔｉｌｌｅｒｉｎｇ）強度、葉の数、ならびに植物性バイオマスの抑制が含まれた（図４４）。
【０１１０】
実施例１８
トランスジェニック小麦植物における切り取り葉の老化の遅延
切り取り葉アッセイを使用し、ヌル対照と比較したときの形質転換小麦葉の誘導老化および老化表現型を評価（ａｓｓｅｓ）した（図４５）。ヌル対照は、形質転換プロセスを受けたが、交配後、標的配列を含まない子孫系統である。
【０１１１】
また、本明細書で用いる用語「〜を含む／包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」（またはその文法的語尾変化）は、用語「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と等価であり、他の要素または特徴の存在を排除するものと解されるべきでないことは理解されよう。
【０１１２】
本明細書で挙げた文献は、参照目的のためにすぎず、該文献を含めることによって該文献が関連技術分野における周知の一般知識の一部を構成することの承認ではない。
【０１１３】
最後に、種々の変形、変更および／または付加が、本明細書に概要を示した本発明の精神から逸脱することなく行なわれ得ることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図４２】
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【図５】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２７】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【配列表】
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