(57)【要約】  ＣＤ１０を発現する細胞を患者体内から除去するための治療剤は、ＣＤ１０が発現しているリンパ腫、白血病等の種々の癌、およびＣＤ１０が発現している細胞（Ｂ細胞、好中球）が介在する炎症性疾患の治療剤として有用であることが期待される。しかしながら、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤を連続投与された患者は、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤に対して耐性となるため、治療効果が低下するという問題がある。本発明は、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤を投与された患者に対して有効な抗腫瘍剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体または該抗体断片を有効成分とする、抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍の治療剤。
【請求項２】
抗体が、遺伝子組換え抗体または該抗体断片である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害活性および補体依存性細胞傷害活性の少なくとも１つである請求項１記載の治療剤。
【請求項４】
遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群から選ばれる請求項２記載の治療剤。
【請求項５】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求項１記載の治療剤。
【請求項６】
抗体が、放射性同位元素、蛋白質または薬剤が結合している融合抗体である請求項１〜５のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項７】
抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍が、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤の投与により腫瘍細胞上のＣＤ１０の発現量が増加している腫瘍である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項８】
抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍が、抗ＣＤ２０抗体の投与により腫瘍細胞上のＣＤ２０の発現量が低下または消失した腫瘍である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の治療剤。
【請求項９】
抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍の治療剤を製造するための、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体または該抗体断片の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体または該抗体断片を有効成分とする、抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍の治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液学の分野では抗血清あるいはモノクローナル抗体を用いた解析により、早くから血球関連の分化抗原の研究が進められ、ＣＤ（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）分類として国際的に整理が進んできた。今日では、白血球などの様々な細胞に発現する数多くの抗原がＣＤ分類されている（非特許文献１）。
また、モノクローナル抗体を用いた解析により、腫瘍関連抗原と呼ばれる腫瘍に特異的あるいは選択的に発現している抗原の生化学的解析や遺伝子のクローニング、機能解析が進められてきた。現在白血病、リンパ腫などの造血器腫瘍においても腫瘍関連抗原の発現解析は血清診断及び病期進展のモニタリングに広く使用されている。【０００３】
ＣＤ１０は前述のような過程で見出された分子で、急性リンパ球性白血病（ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＬＬ）細胞表面に発現が認められ、ｃｏｍｍｏｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＣＡＬＬＡ）と呼ばれていた腫瘍関連抗原の一つの分子である（非特許文献２）。その後の研究により、ＡＬＬのほか、慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｃｙｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＣＭＬ）やバーキットリンパ腫等の非ホジキンリンパ腫等の造血器腫瘍にも発現していることが明らかになった。また、白血球では好中球、一部のＢ細胞にも発現が認められることが知られている（非特許文献３）。【０００４】
以前からの生化学的な解析により、ＣＤ１０は分子量約１００ｋＤａの２型膜貫通型糖蛋白質であることがわかっていたが、さらに、分子生物学的手法を用いた解析により、これまでｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ（ＮＥＰ、ＥＣ３．４．２４．１１）、ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎａｓｅと呼ばれていた分子と同一であることが明らかになっている。また、ＣＤ１０はｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ、ａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒもしくはａｔｒｉａｌ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＮＦまたはＡＮＰ）、ｓｕｂｓｔａｎｓ  Ｐ等、種々のペプチドホルモンの分解活性を持ち、それらの活性を調節しており（非特許文献３、４）、Ｂ細胞の増殖・分化等に関与していることも報告されている（非特許文献４）。【０００５】
さらに最近、造血器腫瘍のみならず、肝癌、腎癌、移行上皮癌、前立腺癌、子宮内膜癌等の固形癌あるいはその間質組織にも発現していることが報告されている（非特許文献５、６、７）。
これまでに、ＣＤ１０に対する抗体は、Ｊ５抗体（非特許文献８）およびＮＬ−１抗体（非特許文献９）などが報告されているが、これらの抗体はいずれもマウス抗体である。また、マウスミエローマ細胞Ｘ６３Ａｇ８．６５３を宿主産生細胞に用いたヒトＣＤ１０発現細胞に対して細胞傷害活性を示すヒトＩｇＧ１型の抗ＣＤ１０キメラ抗体（非特許文献１０、特許文献１〜３）も報告されている。しかしながら、ＣＤ１０に特異的に反応性を有するＣＤＲ移植抗体は知られていない。【０００６】
一般にヒト以外の動物の抗体をヒトに投与すると、異物として認識され、副作用を惹起することや（非特許文献１１〜１４）、抗体の体内からの消失を速めることにより（非特許文献１２、１４、１５）、抗体の治療効果を減じてしまうことが知られている（非特許文献１６、１７）。
これらの問題点を解決するために遺伝子組換え技術を利用して、ヒト以外の動物の抗体をヒト型ＣＤＲ移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている（非特許文献１８）。ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が軽減され（非特許文献１９）、治療効果が延長される（非特許文献２０、２１）。【０００７】
リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、登録商標はＲｉｔｕｘａｎ（リツキサン））は、ＣＤ２０に特異的に結合するマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体を有効成分とする抗腫瘍剤である（特許文献４）。リツキシマブは、癌細胞上のＣＤ２０に結合することにより、補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）（非特許文献２２）や抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を介して（非特許文献２３）、ＣＤ２０を発現する細胞を傷害することが報告されている。【０００８】
リツキシマブは、Ｂ細胞性ノンホジキンリンパ腫の標準的な治療薬として知られている（非特許文献２４）。ＣＤ２０は、Ｂ細胞性ノンホジキンリンパ腫患者の腫瘍細胞上で高頻度に発現する。リツキシマブの再発もしくは難治性の低悪性度またはろ胞性Ｂ細胞性ノンホジキンリンパ腫患者を対象とした臨床試験において、化学療法に対して再発もしくは難治性の低悪性度またはろ胞性Ｂ細胞性ノンホジキンリンパ腫の患者１６６例の内、奏効率は４８％（部分寛解４２％、完全寛解６％）であり、残りの患者にはリツキシマブの抗腫瘍効果が認められなかった。このように、リツキシマブの有効性が確認されているが、一方でリツキシマブの治療効果が認められない、抵抗性を示す患者が存在することも知られている（非特許文献２５）。【０００９】
また、リツキシマブに対する抵抗性が付与されるのは、リツキシマブの治療を繰り返すことによるものであるということが指摘されている（非特許文献２６）。リツキシマブに対する抵抗性は、生体内の腫瘍上のＣＤ２０の発現量が低下ないしは消失するためであるといわれている（非特許文献２７）。標的細胞上に発現する抗原量が増加すると、抗体医薬の抗腫瘍活性は上昇するとされる。抗原であるヒトＣＤ２０の遺伝子を導入したマウス胸腺細胞腫株ＥＬ−４から樹立された、ヒトＣＤ２０の発現量が異なる複数の亜株にリツキシマブを反応させた結果、ＣＤ２０の発現量の多い細胞株ほど強い抗体依存性細胞傷害活性および補体依存性細胞傷害活性を示している（非特許文献２８）。しかしながら、抗ＣＤ２０抗体を用いた腫瘍の治療後に与える影響については知られていない。【００１０】
【非特許文献１】Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１，３７５（２００１）
【非特許文献２】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６８，１２４７（１９８８）
【非特許文献３】Ｂｌｏｏｄ，７３，６２５（１９８９）
【非特許文献４】Ｂｌｏｏｄ，８２，１０５２（１９９３）
【非特許文献５】Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１７，３２３３（１９９７）
【非特許文献６】Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５９，１４１５（２００１）
【非特許文献７】Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．，１１３，３７４（２０００）
【非特許文献８】Ｂｌｏｏｄ，５８，６４８（１９８１）
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，４３８６（１９８２）
【非特許文献１０】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７，９９９（１９８７）
【非特許文献１１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２，８８１（１９８４）
【非特許文献１２】Ｂｌｏｏｄ，６５，１３４９（１９８５）
【非特許文献１３】Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８０，９３２（１９８８）
【非特許文献１４】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，１２４２（１９８５）
【非特許文献１５】Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６，１０１１（１９８５）
【非特許文献１６】Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０（１９８５）
【非特許文献１７】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４６，６４８９（１９８６）
【非特許文献１８】Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２（１９８６）
【非特許文献１９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，４２２０（１９８９）
【非特許文献２０】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，１１１８（１９９６）
【非特許文献２１】Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８５，６６８（１９９５）
【非特許文献２２】Ｂｌｏｏｄ，８３，４３５（１９９４）
【非特許文献２３】Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０４，５５（２０００）
【非特許文献２４】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，１０：ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２００５）
【非特許文献２５】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，１６，２８２５（１９９８）
【非特許文献２６】Ａｍ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ａｎｎｕａｌ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ２００５，Ｅｄｕｃ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｎ  Ｄｅｃ，１０．２００５
【非特許文献２７】Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１１９，４１２（２００２）
【非特許文献２８】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１，２３２７（２００５）
【特許文献１】ＪＰ１９６６０４２
【特許文献２】ＥＰ１８４１８７
【特許文献３】ＵＳ４９３５４９６
【特許文献４】ＵＳ５７３６１３７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ＣＤ１０を発現する細胞を患者体内から除去するための治療剤は、ＣＤ１０が発現しているリンパ腫、白血病等の種々の癌、およびＣＤ１０が発現している細胞（Ｂ細胞、好中球）が介在する炎症性疾患の治療剤として有用であることが期待される。しかしながら、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤を連続投与された患者は、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤に対して耐性となるため、治療効果が低下するという問題がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の（１）〜（９）に関する。
（１）ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体または該抗体断片を有効成分とする、抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍の治療剤。
（２）抗体が、遺伝子組換え抗体または該抗体断片である上記（１）記載の治療剤。
（３）細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害活性および補体依存性細胞傷害活性の少なくとも１つである上記（１）記載の治療剤。
（４）遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体からなる群から選ばれる上記（２）記載の治療剤。
（５）抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である上記（１）記載の治療剤。
（６）抗体が、放射性同位元素、蛋白質または薬剤が結合している融合抗体である上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の治療剤。
（７）抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍が、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤の投与により腫瘍細胞上のＣＤ１０の発現量が増加している腫瘍である、上記（１）〜（６）のいずれか１項に記載の治療剤。
（８）抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍が、抗ＣＤ２０抗体の投与により腫瘍細胞上のＣＤ２０の発現量が低下または消失した腫瘍である、上記（１）〜（７）のいずれか１項に記載の治療剤。
（９）抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍の治療剤を製造するための、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体または該抗体断片の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体を有効成分とする、ＣＤ２０抗体耐性腫瘍に対する治療剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞とその親株であるＲａｊｉの細胞表面上の抗原発現量をフローサイトメーターで解析した結果を示す。上段はＲａｊｉ細胞の結果を、下段はＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞の結果をそれぞれ表す。縦軸は細胞数、横軸は蛍光強度を示す。■で囲まれたヒストグラムは陰性対照抗体の染色結果を示す。□で囲まれたヒストグラムは、左列から順に、抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１、抗抗ＣＤ１９抗体Ｊ４．１１９、ＣＤ２０抗体Ｂ１、抗ＣＤ２２抗体ＳＪ．１０．１Ｈ１１の染色結果をそれぞれ表す。
【図２】図２は、ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ細胞における、抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０（上図）および抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（下図）のＡＤＣＣ活性を示す。黒丸はＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞、白丸はＲａｊｉ細胞の結果を表す。縦軸は細胞傷害活性、横軸は抗体濃度を示す。
【図３】図３は、ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ細胞における、抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０（上図）および抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（下図）のＣＤＣ活性を示す。黒丸実線はＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞、白丸実線はＲａｊｉ細胞の結果を表す。縦軸は細胞生存率、横軸は抗体濃度を示す。
【図４】図４は、ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ細胞を移植したマウスにおける、抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０（上図）および抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（下図）とを投与した際の抗腫瘍活性を示す。縦軸はＴ／Ｃ、横軸は抗体投与を開始した日からの経過（日）を示す。黒丸実線はＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞を移植したマウス、白丸実線はＲａｊｉ細胞を移植したマウスでの結果を表す。
【図５】図５は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブを投与したノンホジキンリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ細胞移植マウスにおける、抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５の抗腫瘍活性を示す。縦軸は腫瘍体積（Ｖ／Ｖ０）、横軸はリツキシマブの投与初日からの経過（日）を示す。リツキシマブの投与を開始した日をＤａｙ０とし、リツキシマブをＤａｙ１４（矢印）までに４回投与した。Ｄａｙ１４以降、ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５を４回投与した群（白丸実線）と、リツキシマブを４回投与した群（黒丸実線）を示す。
【図６】図６は、ノンホジキンリンパ腫細胞株Ｎａｍａｌｗａ細胞移植マウスにおける抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５および抗ＣＤ２０抗体リツキシマブの抗腫瘍活性を示す。縦軸は腫瘍体積（Ｖ／Ｖ０）、横軸は抗体投与を開始した日からの経過（日）を示す。生理食塩水投与群（白丸破線）、ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５投与群（白丸実線）、リツキシマブ投与群（黒丸実線）を示す。
【図７】図７は、プラスミドｐＣＲＨＶ０の構築を示した図である。
【図８】図８は、プラスミドｐＣＲＨＶ２の構築を示した図である。
【図９】図９は、プラスミドｐＣＲＬＶ０の構築を示した図である。
【図１０】図１０は、プラスミドｐＣＲＬＶ９の構築を示した図である。
【図１１】図１１は、抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ｃｈｉｍｅｒａＨＬＶ０の構築を示した図である。
【図１２】図１２は、抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶＯＬＶ０の構築を示した図である。
【図１３】図１３は、抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶＯＬＶ９の構築を示した図である。
【図１４】図１４は、抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ２ＬＶ９の構築を示した図である。
【図１５】図１５は、精製した抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５抗体および、抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５のヒト非ホジキンリンパ腫細胞株であるＤａｕｄｉ細胞またはＲａｊｉ細胞に対するＡＤＣＣ活性を示した図である。横軸に抗体濃度を、縦軸に各抗体濃度におけるＡＤＣＣ活性（％）をそれぞれ示す。Ａは標的細胞にＤａｕｄｉ細胞を、Ｂは標的細胞にＲａｊｉ細胞を用いた結果をそれぞれ示す。■はＭＳ７０５／ＣＤ１０、〇は抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５、△は抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５をそれぞれ示す。
【図１６】図１６は、精製した抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５抗体および、抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５のヒト非ホジキンリンパ腫細胞株であるＤａｕｄｉ細胞に対するＣＤＣ活性を示した図である。横軸に抗体濃度を、縦軸に各抗体濃度におけるＣＤＣ活性（％）をそれぞれ示す。
【図１７】図１７は、横軸は移植後の日数、縦軸は体重をそれぞれ表したグラフである。×はコントロール群、■はＭＳ７０５／ＣＤ１０  １ｍｇ／ｋｇ投与群、〇は抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５  ０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、△は抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５  １ｍｇ／ｋｇ投与群をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
【図１８】図１８は、横軸は移植後の日数、縦軸は生存率をそれぞれ表したグラフである。×はコントロール群、■はＭｓ７０５／ＣＤ１０  １ｍｇ／ｋｇ投与群、〇は抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５  ０．１ｍｇ／ｋｇ投与群、△は抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５  １ｍｇ／ｋｇ投与群をそれぞれ示す。バーは標準偏差を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明に用いられる、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体または該抗体断片を有効成分とする抗腫瘍剤としては、ＣＤ１０に特異的に結合し、腫瘍細胞を傷害または除去することができればいかなるものでもよく、好ましくは、ＣＤ１０の細胞外領域に結合し、細胞傷害活性によって、ＣＤ１０を発現している腫瘍細胞を傷害することができる抗体、より好ましくは、配列番号１に示されるアミノ酸配列の５２〜７５０番目に存在するエピトープに特異的に結合する抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００９９から生産されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに特異的に結合する抗体があげられる。本発明における細胞傷害活性としては、抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性という）および補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性という）の少なくとも１つの活性をいう。【００１６】
本発明に用いられる抗体としては、遺伝子組換え抗体があげられる。遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体断片などが挙げられる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域（以下、重鎖をＨ鎖、可変領域をＶ領域、Ｈ鎖Ｖ領域をＶＨとも称す）および軽鎖Ｖ領域（以下、軽鎖をＬ鎖、Ｌ鎖Ｖ領域をＶＬとも称す）とヒト抗体のＨ鎖定常領域（以下、定常領域をＣ領域、Ｈ鎖Ｃ領域をＣＨとも称す）およびヒト抗体のＬ鎖Ｃ領域（以下、ＣＬとも称す）とからなる抗体をである。ヒト以外の動物としては、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなる動物も用いることができる。例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、サルが挙げられる。【００１７】
本発明に用いられるヒト型キメラ抗体は、公知の方法、例えばＥＰ１２７０９５に記載された方法により製造することができる。ヒト型キメラ抗体は、抗ＣＤ１０抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ製造することができる。【００１８】
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（ｈＩｇ）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、ｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、γ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。【００１９】
抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０を生産する形質転換体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６）に平成１５年９月１１日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４７８として寄託されている。
ヒト化抗体は、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、ヒト以外の動物の抗体のＣＤＲ配列でそれぞれ置換した抗体であって、ヒト型ＣＤＲ移植抗体ともいう。【００２０】
本発明に用いられるヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗ＣＤ１０抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列で任意のヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列をそれぞれ置換したＶ領域をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびヒト抗体のＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。【００２１】
ヒト化抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、さらにｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３、γ４といったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト化抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいずれのものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択方法としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、またはヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられる。【００２２】
本発明に用いられるＣＤ１０に特異的に反応するヒト化抗体の具体例としては、
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号８で示されるアミノ酸配列、または配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、１番目のＧｌｕ、１６番目のＡｒｇ、１８番目のＬｅｕ、４２番目のＧｌｙ、８０番目のＴｙｒ、８４番目のＡｓｎおよび９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、ＣＤ１０に特異的に反応するヒト化抗体またはその抗体断片、
抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号１０で示されるアミノ酸配列、または配列番号１０で示されるアミノ酸配列のうち、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４７番目のＬｅｕ、４８番目のＬｅｕ、６１番目のＡｓｐ、７１番目のＡｓｐ、７２番目のＰｈｅ、７３番目のＴｈｒ、７９番目のＬｅｕ、８０番目のＧｌｎおよび８６番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、ＣＤ１０に特異的に反応するヒト化抗体またはその抗体断片、
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号８で示されるアミノ酸配列、または配列番号８で示されるアミノ酸配列のうち、１番目のＧｌｕ、１６番目のＡｒｇ、１８番目のＬｅｕ、４２番目のＧｌｙ、８０番目のＴｙｒ、８４番目のＡｓｎおよび９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号１０で示されるアミノ酸配列、または配列番号１０で示されるアミノ酸配列のうち、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、４２番目のＧｌｙ、４３番目のＧｌｎ、４４番目のＰｒｏ、４７番目のＬｅｕ、４８番目のＬｅｕ、６１番目のＡｓｐ、７１番目のＡｓｐ、７２番目のＰｈｅ、７３番目のＴｈｒ、７９番目のＬｅｕ、８０番目のＧｌｎおよび８６番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含む、ＣＤ１０に特異的に反応するヒト化抗体またはその抗体断片
であればいずれでもよく、好ましくは、
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号８、３５または３７で示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、ＣＤ１０に特異的に反応するヒト化抗体またはその抗体断片、
抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号１０、１２または３３で示されるアミノ酸配列のいずれかを含む、ＣＤ１０に特異的に反応するヒト化抗体またはその抗体断片、
抗体の重鎖（Ｈ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号８、３５または３７で示されるアミノ酸配列のいずれかを含み、かつ抗体の軽鎖（Ｌ鎖）可変領域（Ｖ領域）が、配列番号１０、１２または３３で示されるアミノ酸配列のいずれかを含むＣＤ１０に特異的に反応するヒト化抗体またはその抗体断片
などがあげられる。【００２３】
ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５を生産する形質転換体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成１６年８月１７日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−１００９９として国際寄託されている。
これらのアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加され、かつＣＤ１０と特異的に反応する抗体も本発明で用いられる抗体に包含される。
欠失、置換、挿入および／または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換、挿入または付加できる程度の数である。例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。【００２４】
上述の、アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入または付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよく、置換、挿入または付加されるアミノ酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００２５】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
本発明で用いられる抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。【００２６】
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で用いられるＦａｂは、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００２７】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で用いられるＦ（ａｂ’）２は、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはＳ−Ｓ結合させ、作製することができる。【００２８】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のＳ−Ｓ結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で用いられるＦａｂ’は、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体のＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００２９】
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを１２残基以上の適当なペプチドリンカー（Ｐ）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で用いられるｓｃＦｖは、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００３０】
Ｄｉａｂｏｄｙは、抗原結合特異性の同じまたは異なるｓｃＦｖが２量体を形成した抗体断片で、同じ抗原に対する２価の抗原結合活性または異なる抗原に対する２特異的な抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で用いられるＤｉａｂｏｄｙは、例えば、ＣＤ１０に特異的に反応する２価のＤｉａｂｏｄｙは、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、３〜１０残基のポリペプチドリンカーを有するｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することによりＤｉａｂｏｄｙを発現させ、製造することができる。【００３１】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のＳ−Ｓ結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明で用いられるｄｓＦｖは、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。【００３２】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。
複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることにより製造することができる。
本発明で用いられるＣＤＲを含むペプチドは、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするｃＤＮＡを構築し、該ｃＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。【００３３】
上述の抗体または該抗体断片に、放射性同位元素、蛋白質または薬剤を結合させた抗体の誘導体も、本発明で用いることができる。
本発明で用いられる抗体の誘導体は、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体または該抗体断片のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、抗体中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体中の糖鎖に薬剤を化学的手法（抗体工学入門、金光修著、（株）地人書館（１９９４））により結合させることにより製造することができる。【００３４】
または、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質などの薬剤をコードするＤＮＡを連結させて発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入するという遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
薬剤としては、化学療法剤、抗体医薬、サイトカインなどの免疫附活剤、放射性同位元素、イムノアジュバンドなどがあげられる。【００３５】
さらに、抗体または該抗体断片に結合させる薬剤は、プロドラッグの形態を取ってもよい。本発明におけるプロドラッグとは、腫瘍環境に存在する患者自身の酵素などによって化学的な修飾を受け、癌細胞を傷害する作用を有する物質に変換される薬剤をいう。
化学療法剤としては、アルキル化剤、ニトロソウレア剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、ホルモン療法剤、ホルモン拮抗剤、アロマターゼ阻害剤、Ｐ糖蛋白阻害剤、白金錯体誘導体、Ｍ期阻害剤、キナーゼ阻害剤などのいかなる化学療法剤も包含される。化学療法剤としては、アミフォスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロフォスファミド、イホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、エピルビシン、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノゾーム）、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ダウノマイシン、ペプロマイシン、エストラムスチン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテア）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、イリノテカン、ノギテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ヒドロキシカルバミド、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパラガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、ゴセレリン、リュープロレニン、フルタミド、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、ハイドロコーチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビンデシン、ニムスチン、セムスチン、カペシタビン、トムデックス、アザシチジン、ＵＦＴ、オキザロプラチン、ゲフィチニブ（イレッサ）、イマチニブ（ＳＴＩ５７１）、エルロチニブ、Ｆｌｔ３阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ＦＧＦＲ阻害剤、ラディシコール、１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン、ラパマイシン、アムサクリン、オール−トランスレチノイン酸、サリドマイド、アナストロゾール、ファドロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、金チオマレート、Ｄ−ペニシラミン、ブシラミン、アザチオプリン、ミゾリビン、シクロスポリン、ラパマイシン、ヒドロコルチゾン、ベキサロテン（ターグレチン）、タモキシフェン、デキサメタゾン、プロゲスチン類、エストロゲン類、アナストロゾール（アリミデックス）、ロイプリン、アスピリン、インドメタシン、セレコキシブ、アザチオプリン、ペニシラミン、金チオマレート、マレイン酸クロルフェニラミン、クロロフェニラミン、クレマシチン、トレチノイン、ベキサロテン、砒素、ボルテゾミブ、アロプリノール、ゲムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、１３１トシツテマブ、タルグレチン、ＯＮＴＡＫ、オゾガミン、クラリスロマシン、ロイコボリン、イファスファミド、ケトコナゾール、アミノグルテチミド、スラミンおよびメトトレキセート、などがあげられる。【００３６】
化学療法剤と抗体とを結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介して化学療法剤と抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介して化学療法剤のアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
抗体医薬としては、癌細胞を直接傷害する腫瘍細胞に発現する抗原に対する抗体、あるいは腫瘍細胞の増殖や転移など、腫瘍の病態形成に関わる抗原に対する抗体のほかに、抗体を投与する生体内の免疫を調節する抗体、抗体を投与する生体内の血管新生を阻害する抗体などがあげられる。【００３７】
癌細胞を直接傷害する腫瘍細胞に発現する抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＨＬＡ−Ｃｌａｓｓ  ＩＩなどがあげられる。
抗体を投与する生体内の免疫を調節する抗体の抗原としては、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ）、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ１３７、ＴＮＦ受容体ファミリー分子（ＤＲ４、ＤＲ５、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２）、ＴＲＡＩＬファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４）、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体４、サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＧＦβ、ＴＮＦα等）、これらのサイトカインの受容体、ケモカイン（ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ−３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、ＣＴＡＣＫ等）、これらのケモカインの受容体が好ましい。【００３８】
抗体を投与する生体内の血管新生を阻害する抗体の抗原としては、ＶＥＧＦ、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＥＰＯ、ＴＧＦβ、ＩＧＦ、ＩＬ−８、Ｅｐｈｉｌｉｎ、ＳＤＦ−１などがあげられる。
免疫附活剤としては、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球などの細胞を亢進するサイトカインであればいかなるものでもよいが、具体例としては、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン−２、インターロイキン−１２、インターロイキン−１５、インターロイキン−１８、インターロイキン−２３、顆粒球刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球・マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）などがあげられる。また、免疫附活剤として知られている天然物でもよく、具体例としては、免疫を亢進する薬剤が、β（１→３）グルカン（レンチナン、シゾフィラン）、αガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）、菌体粉末（ピシバニール、ＢＣＧ）、菌体抽出物（クレスチン）があげられる。放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、６４Ｃｕ、１９９Ｔｃ、７７Ｌｕ、２１１Ａｔ等があげられる。放射性同位元素は、クロラミンＴ法等によって抗体に直接結合させることができる。また、放射性同位元素をキレートする物質を抗体に結合させてもよい。キレート剤としては、ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ（ＭＸ−ＤＴＰＡ）などがあげられる。【００３９】
本発明においては、本発明で用いられる抗体と、１つ以上の他の薬剤と組み合わせて投与することもできる。または放射線照射とを組み合わせることもできる。他の薬剤としては、上述の化学療法剤、抗体医薬、サイトカインなどの免疫附活剤等が含まれる。
放射線照射としては、Ｘ線、γ線などの光子（電磁波）照射、電子線、陽子線、重粒子線などの粒子線照射などが含まれる。【００４０】
組み合わせて投与する方法としては、本発明で用いられる抗体との同時投与でもよいし、また、本発明で用いられる抗体の投与と前後して投与しても構わない。
本発明の治療剤は、抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍に対して治療効果を有する。抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍とは、抗ＣＤ２０抗体を投与した際に、耐性を有さない腫瘍と比較して抗ＣＤ２０抗体の治療効果が低下または消失した腫瘍をいう。好ましくは、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤の投与により腫瘍細胞上のＣＤ１０の発現量が増加された腫瘍、抗ＣＤ２０抗体を有効成分とする抗腫瘍剤の投与により腫瘍細胞上のＣＤ２０の発現量が低下または消失した腫瘍があげられる。【００４１】
本発明における抗ＣＤ２０抗体としては、ＣＤ２０に特異的に結合するという性質を有していれば、いかなるものも含まれる。具体的には、ヒトとマウスのキメラ型抗ヒトＣＤ２０抗体のリツキシマブ、完全ヒト化抗体ＨｕＭＡＸ−ＣＤ２０（Ｂｌｏｏｄ；  １０６：４４８（２００５））、ヒト化抗ＣＤ２０抗体ｈＡ２０（Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ；  ２２：２３９３（２００３））、ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｔｒｉａｍｉｎｅｐｅｎｔａａｃｅｔｉｃａｃｉｄ（ＭＸ−ＤＴＰＡ）を共有結合させたマウス抗体であるｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ（Ｂｌｏｏｄ；  １０６：１１３１（２００５））、放射性ヨウ素標識されたマウス抗体である１３１Ｉ−ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ；  ２３：７１２（２００５））などがあげられる。【００４２】
本発明において、抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍における腫瘍は特に限定されないが、Ｂ細胞を起源とする腫瘍が好ましい。具体的には、ＷＨＯ分類（Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  ＩＡＲＣ−Ｐｒｅｓｓ、Ｌｙｏｎ、２００１）で分類されるＢ細胞性腫瘍（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）を包含し、具体的には前駆Ｂ細胞性リンパ腫（Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａ）、慢性リンパ性白血病（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、前リンパ球性リンパ性白血病（Ｂ−ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、リンパ形質細胞性リンパ腫（Ｌｙｍｐｈｏｐｌａｓｍａｃｙｔｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、マントル細胞リンパ腫（Ｍａｎｔｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、濾胞性リンパ腫（Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、皮膚濾胞中心リンパ腫（Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｃｅｎｔｅｒ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、辺縁帯リンパ腫（Ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（Ｎｏｄａｌ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、脾辺縁帯リンパ腫（Ｓｐｌｅｎｉｃ  ｍａｒｇｉｎａｌ  ｚｏｎｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、有毛細胞白血病（Ｈａｉｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、びまん性大細胞リンパ腫（Ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｒ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ’ｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ）、形質細胞腫（Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｍａ）、形質細胞性骨髄腫（Ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌ  ｍｙｅｌｏｍａ）などがあげられる。また、造血器腫瘍であってもよい。造血器腫瘍としては、白血病、リンパ腫および骨髄腫が含まれ、具体的には、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ノンホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫が含まれる。さらに、慢性骨髄性白血病ならびに慢性リンパ性白血病においては、いかなる病期の状態も含まれ、慢性期、移行期、急性転化期のいずれをも包含する。【００４３】
本発明の抗体は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。【００４４】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。【００４５】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。【００４６】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は本発明の抗体そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体または抗体断片を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。【００４７】
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。本発明の抗体および用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人１日当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
以下に、具体的に、本発明で用いられるＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有するヒト化抗体およびその抗体断片の作製方法、活性評価方法およびそれらの使用方法について説明する。【００４８】
１．  ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとは、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡが組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡをそれぞれクローニングすることにより構築することができる。【００４９】
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＩｇＧ１サブクラスのＣＨおよびκクラスのＣＬなどがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡとしてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡを用いることができ、また、ｃＤＮＡを用いることもできる。動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３，１３３（１９９０））、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３（１９８４））、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８，１５２７（１９８１））、ｐＳＧ１ｂｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４，１７３（１９９０））、ｐＳＥ１ＵＫ１Ｓｅｄ１−３（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１３，７９（１９９３））などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４９，９６０（１９８７））、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９（１９８５））とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７（１９８３））などがあげられる。【００５０】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（タンデム型）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４））。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９（１９９８））などがあげられる。【００５１】
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト化抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト化抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下の様にして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、それらの中でも、十分な活性を有するヒト化抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列と少なくとも６０％以上とできるだけ高い相同性を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。【００５２】
次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）や目的のヒト以外の動物の抗体の塩基配列を考慮して塩基配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００〜２００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行う。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも４本もしくは６本程度の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。【００５３】
（３）ヒト化抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１））。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲ移植に伴い、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうからと考えられている。この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基やＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６（１９９１））。ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１２，５３５（１９７７））あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１（１９９４））などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。【００５４】
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いてＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について本項１の（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（４）ヒト化抗体発現ベクターの構築
本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流に、本項１の（２）および（３）で構築したヒト化抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト化抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、本項１の（２）および（３）でヒト化抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、本項１の（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードするＤＮＡの上流にそれらが適切な形で発現する様にクローニングすることができる。【００５５】
（５）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、本項１の（４）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１））。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３（１９９１））、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））などがあげられる。【００５６】
発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））などにより測定できる。
（６）ヒト化抗体の安定発現
本項１の（４）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換株を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））などがあげられる。【００５７】
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６（１９８０））、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＹＢ２／０細胞；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）などがあげられるが、ＡＤＣＣ活性の高いヒト化抗体を発現させるためには、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性を有する細胞、例えば、細胞内糖ヌクレオチドＧＤＰ−フコースの合成に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された宿主細胞、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位にフコースの１位がα結合する糖鎖修飾に関与する酵素が失活するようにゲノムが改変された細胞などが好ましい。具体的には、より好ましくは宿主細胞内のα１，６−フコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がノックアウトされた宿主細胞があげられる（ＷＯ０２／３１１４０、ＷＯ０３／８５１０７）。【００５８】
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換株は、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（Ｇ４１８；ＳＩＧＭＡ社製）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４））。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地に牛胎児血清（ＦＢＳ）などの各種添加物を添加した培地等を用いることができる。得られた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性はＥＬＩＳＡなどにより測定できる。また、形質転換株は、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１（１９９４））。【００５９】
ヒト化抗体は、形質転換株の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０（１９７０））やウエスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２（１９８８）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６））などで測定することができる。【００６０】
２．  抗体断片の作製
抗体断片は、本項１に記載のヒト化抗体を元に遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５））。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５））。また、Ｆａｂは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することもできる。例えば、本項１の（２）および（３）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、Ｆａｂ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１（１９８８））などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９２））。【００６１】
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５））。また、本項２の（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサン等のようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢで処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９９６））。【００６２】
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することができる。例えば、本項１の（２）および（３）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＡＫ１９（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６３（１９９２））などがあげられる。Ｆａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラム等を用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９９６））。【００６３】
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌を用いて作製することができる。例えば、本項１の（２）および（３）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡを、１２残基以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドリンカーをコードするＤＮＡを介して連結し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製する。作製したＤＮＡをｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖのＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、Ｐｈｆａ（Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，５，４８（１９９４））などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズマ層にｓｃＦｖを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズマ層に発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーション等の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィー等を用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ（１９９６））。【００６４】
（５）Ｄｉａｂｏｄｙの作製
Ｄｉａｂｏｄｙは、上記のｓｃＦｖを作製する際のポリペプチドリンカーを３〜１０残基程度にすることで、作製することができる。１種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合には、２価のＤｉａｂｏｄｙを、２種類の抗体のＶＨおよびＶＬを用いた場合は、２特異性を有するＤｉａｂｏｄｙを作製することができる（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５３，１６４（１９９９）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７７，７６３（１９９８））。【００６５】
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは、大腸菌を用いて遺伝子工学的に作製することができる。まず、本項１の（２）および（３）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖ用のＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＶＨおよびＶＬを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＶＨおよびＶＬを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））。【００６６】
（７）ＣＤＲを含むペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズマ層にＣＤＲを含むペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズマ層からＣＤＲを含むペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過等により、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４））。【００６７】
３．  本発明の抗体の活性評価
精製した本発明の抗体の抗原との結合性、ＣＤ１０発現細胞に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３））、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ等を用いた表面プラズモン共鳴等により測定できる。抗原陽性培養細胞に対する細胞傷害活性は、補体依存性細胞傷害活性（以下、ＣＤＣ活性と略記する）、抗体依存性細胞傷害活性（以下、ＡＤＣＣ活性と略記する）等を測定し、評価する事が出来る（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３））。産生サイトカイン量の変化はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法等により測定できる。【００６８】
４．  ヒト化抗体または抗体断片の使用方法
ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体やキメラ抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来するため、ヒト体内において高い効果を示し、かつ、免疫原性が低く、その効果が長期間に渡り持続することが期待される。
また、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−グリコシド結合複合型糖鎖が、該糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖である抗体またはその抗体断片とすることにより、抗体または抗体断片のＡＤＣＣ活性を増強させることができる。【００６９】
以下に、本発明の実施例を示すが、これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
【実施例】
【００７０】
実施例１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗ＣＤ２０抗体耐性細胞における細胞表面抗原の発現量の解析
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでリツキシマブ（リツキシマブ）を長期間暴露したノンホジキンリンパ腫細胞株ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞の樹立
ノンホジキンリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）を、リツキシマブ（中外製薬社製）を含む培地で３〜４日間毎に継代しながら５９日間培養した。培地としては、１０容量％の熱非働化した子牛血清（インビトロジェン社製）、１．５６容量％のモルモット血清（アークリソース社製）および１容量％のペニシリン・ストレプトマイシン溶液（インビトロジェン社製）を添加したＲＰＭＩ−１６４０（インビトロジェン社製）に、リツキシマブを添加して調製したものを用いた。培地中に添加するリツキシマブの濃度は、継代数１〜７に０．０８μｇ／ｍｌ、８〜９に１０μｇ／ｍｌ、１０〜１６に１．０μｇ／ｍｌとした。このようにして得られた細胞をＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞と名付けた。【００７１】
ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞を継代維持する際には、１０容量％の熱非働化した子牛血清、０．８容量％のモルモット血清（シグマ）および１容量％のペニシリン・ストレプトマイシン溶液を添加したＲＰＭＩ−１６４０を培地として用いた。
（２）ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞とその親株Ｒａｊｉ細胞における細胞表面抗原の発現量の比較検討
ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ細胞の細胞表面におけるＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ２２の発現量をフローサイトメトリー法により解析した。【００７２】
約２×１０７細胞のＲａｊｉ細胞またはＲａｊｉ／ＲＴＸ細胞を回収し、ＦＡＣＳバッファー［０．１ｗ／ｖ％のアジ化ナトリウム、１ｗ／ｖ％の牛血清アルブミン（生化学工業社製）、２ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ、ナカライテスク社製）を添加したｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｎｄ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ（ＰＢＳ、インビトロジェン社製）］に懸濁した。上清を除去して細胞塊をほぐし、ＦｃＲ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社製）を１０  μＬ添加した。氷上で約３０分間静置した後、ＦＡＣＳバッファーを添加して遠心分離（約５０００×ｇ、１分間、４℃）による洗浄を３回行った。２×１０７細胞／ｍＬになるようにＦＡＣＳバッファーを加えて懸濁し、５０μＬをチューブに分注した。５０μＬのＦＡＣＳバッファーを各チューブに加えて懸濁し、１次抗体溶液をチューブあたり２．５μＬを添加した。１次抗体溶液としては、マウス抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，４３８６（１９８２）］、抗ＣＤ２０抗体Ｂ１（ベックマンコールター社製）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１９抗体Ｊ４．１１９（ベックマンコールター社製）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ２２抗体ＳＪ．１０．１Ｈ１１（ベックマンコールター社製）それぞれ用いた。また、アイソタイプコントロール抗体としてはＦＩＴＣ標識Ｉｓｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ１（ベックマンコールター社製）、Ｉｓｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ２ａ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、ＦＩＴＣ標識Ｉｓｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩｇＧ２ａ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をそれぞれ用いた。氷上で約３０分間遮光下にて静置した後、ＦＡＣＳバッファーでの遠心分離（約５０００×ｇ、１分間、４℃）による洗浄を３回行った。マウス抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１および抗ＣＤ２０抗体Ｂ１を反応させたチューブには、さらに２次抗体溶液としてＦＩＴＣ標識Ｆ（ａｂ）２化抗マウスＩｇＧ（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製）を１００μＬ添加し、氷上で約３０分間遮光下にて静置した後、ＦＡＣＳバッファーでの遠心分離（約５０００×ｇ、１分間、４℃）による洗浄を３回行った。上清を除去後、チューブより５００μＬを採取し、アイソフロー（ベックマンコールター社製）に懸濁した。ナイロンメッシュにて濾過してテストチューブに移し、測定試料とした。フローサイトメーターＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ（ベックマンコールター社製）を用いて、細胞表面上のＣＤ抗原発現を測定した。結果を図１に示す。【００７３】
抗ＣＤ２０抗体を暴露した細胞であるＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞では、ＣＤ１０の発現量が亢進しており、またＲａｊｉ細胞よりもＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞においてＣＤ１０の発現量が高かった。一方、ＣＤ１９とＣＤ２２の発現量は、Ｒａｊｉ細胞よりもＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞において低かった。さらにＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞では、ＣＤ２０の発現が消失していた。【００７４】
実施例２  ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞に対する抗ＣＤ１０抗体の細胞傷害活性
（１）ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞およびそのＲａｊｉ細胞におけるＡＤＣＣ活性の比較検討
ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ細胞をターゲット細胞、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として、参考例１で製造した抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０および抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体リツキシマブのＡＤＣＣ活性を５１Ｃｒリリース法により解析した。【００７５】
Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ／ＲＴＸ細胞を、１０容量％の熱非働化した子牛血清および１容量％のペニシリン・ストレプトマイシン溶液を添加したＲＰＭＩ−１６４０（以下、アッセイ培地と称す）に２×１０６細胞／ｍＬとなるように懸濁した。細胞懸濁液１ｍＬに対して、クロム酸ナトリウムの放射性同位体（Ｎａ２５１ＣｒＯ４、３７ＭＢｑ／ｍＬ、以下単に５１Ｃｒと称す、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を５０μＬ添加した。３７℃、５容量％炭酸ガス（９５容量％空気）条件下のインキュベーター内に約１．５時間培養した。アッセイ培地での遠心分離（約３００×ｇ、３分間、室温）による洗浄を２回行った後、約１０ｍＬのアッセイ培地に懸濁して氷中で約３０分間静置し、自然遊離した５１Ｃｒを遠心分離（約３００×ｇ、３分間、室温）により除いた。細胞濃度が３×１０５細胞／ｍＬになるように培地に懸濁し、ターゲット細胞懸濁液とした。ヘパリン処理をした健常人末梢血をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ  Ｔｕｂｅ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）に移し、生理食塩水で約２倍に希釈して室温で遠心分離を行った（約８００×ｇ、２０分間）。単核球画分をＰＢＳで２倍以上に希釈して遠心分離（約３００×ｇ、５分間、室温）し、さらにアッセイ培地での遠心分離（約３００×ｇ、３分間、室温）による洗浄を２回行った。アッセイ培地で７．５×１０６細胞／ｍＬに調製してエフェクター細胞懸濁液とした。細胞培養用Ｕ字底９６穴プレートの穴にいずれかのターゲット細胞懸濁液５０μＬ、エフェクター細胞懸濁液５０μＬ、およびアッセイ培地により希釈された各抗体溶液５０μＬをそれぞれ加えた。プレートを室温で遠心（約３００×ｇ、１０秒間）後、３７℃、５容量％炭酸ガス（９５容量％空気）条件下のインキュベーター内に約３．５時間放置した。その後、遠心分離（約８００×ｇ、５分間、室温）により上清を回収し、その３０μＬをＬｕｍａＰｌａｔｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）に移し、約６０℃で２時間以上放置し乾燥させ、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で放射活性を測定した。結果を図２に示す。【００７６】
抗ＣＤ２０抗体を暴露した細胞であるＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞では、抗ＣＤ１０抗体によるＡＤＣＣ活性が亢進し（図２上）、抗ＣＤ２０抗体によるＡＤＣＣ活性は消失していた（図２下）。抗ＣＤ１０抗体によるＡＤＣＣ活性は、ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞においてＲａｊｉ細胞よりも強かった（図２上）。
（２）ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ細胞におけるＣＤＣ活性の比較検討
ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ細胞をターゲット細胞、抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０および抗ＣＤ２０ヒト型キメラ抗体リツキシマブのＣＤＣ活性をＷＳＴ−１アッセイ法により解析した。【００７７】
アッセイ培地に１×１０５細胞／ｍＬの濃度で懸濁したＲａｊｉ細胞およびＲａｊｉ／ＲＴＸ細胞を、９６穴平底プレートに５０μＬ／穴で添加した。そこに、アッセイ培地で希釈した各抗体を２５μＬ／穴で添加した。さらに、培地で４倍に希釈したヒト補体血清（シグマ社製）を２５μＬ／穴で添加した。３７℃、５容量％ＣＯ２存在下のインキュベーター内で７２時間培養後、ＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を１０μＬ／穴で添加し、さらに３時間培養した。マイクロプレートリーダー  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ２５０（和光純薬社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した（対照波長：６５０ｎｍ）。結果を図３に示す。【００７８】
抗ＣＤ１０抗体によるＣＤＣ活性は、抗ＣＤ２０抗体を暴露した細胞であるＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞においてＲａｊｉ細胞よりも亢進していた（図３上）。また、抗ＣＤ２０抗体によるＣＤＣ活性は、Ｒａｊｉ細胞では認められるものの、ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞では消失していた（図３下）。
（３）ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ細胞におけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍作用の比較検討
ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞またはＲａｊｉ細胞を移植したマウスに、抗ＣＤ１０抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０または抗ＣＤ２０抗体リツキシマブを投与し、腫瘍体積の増加を指標にｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果を検討した。【００７９】
抗体投与前日および７日前に抗Ａｓｉａｌｏ  ＧＭ１抗体（和光純薬工業社製）を１匹あたり２０μＬ腹腔内投与した雄性ＳＣＩＤマウスの腹側に、ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞またはＲａｊｉ細胞を１箇所あたり１×１０７個移植した。腫瘍の長径と短径を測定したのち、式１により腫瘍塊の体積を計算した。腫瘍体積の平均が約１５０ｍｍ３となったところで、腫瘍体積が群毎に偏らないように１群あたり５匹ずつのマウスを３群に振り分けた。
［式１］
腫瘍体積（ｍｍ３）＝長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）×０．５
３群に振り分けた日をＤａｙ０とし、Ｄａｙ０より投与を開始した。抗ＣＤ１０抗体処置群には、１匹あたり１００μｇの用量の抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０を、週に２回の間隔で合計８回尾静脈内に投与した。抗ＣＤ２０抗体処置群には、１匹あたり１００μｇの用量の抗ＣＤ２０抗体リツキシマブを、週に２回の投与間隔で合計８回尾静脈内に投与した。対照群には、１匹あたり２００μＬの生理食塩水を、週に２回の間隔で合計８回尾静脈内に投与した。Ｄａｙ０からＤａｙ２８まで、週に２回の間隔で腫瘍体積を測定した。【００８０】
Ｄａｙ０に腫瘍体積をＶ０、各測定日の腫瘍体積をＶとして、個体毎にＶとＶ０の比（Ｖ／Ｖ０）を計算した。群毎にＶ／Ｖ０の平均値を計算した。ＫＭ３３１７処置群およびリツキシマブ処置群のＶ／Ｖ０の平均値を、対照群のＶ／Ｖ０の平均値で除した値（Ｔ／Ｃ）を計算した。
抗ＣＤ１０抗体処置群および抗ＣＤ２０抗体処置群のＴ／Ｃの変化を、図４に示した。ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞を移植したマウスにおける抗ＣＤ１０抗体処置群のＴ／Ｃは、Ｒａｊｉ細胞を移植したマウスにおけるそれよりも小さな値を示した。この結果から、抗ＣＤ２０抗体を暴露した腫瘍細胞において、抗ＣＤ１０抗体の治療効果がより強まることが明らかとなった。一方、ＲＴＸ／Ｒａｊｉ細胞を移植したマウスにおける抗ＣＤ２０抗体処置群のＴ／Ｃは、Ｒａｊｉ細胞を移植したマウスにおけるそれよりも大きな値を示した。この結果から、抗ＣＤ２０抗体を暴露した腫瘍細胞は、抗ＣＤ２０抗体の治療効果が減弱することが明らかとなった。【００８１】
実施例３  抗ＣＤ２０抗体を投与した胆癌マウスにおける抗ＣＤ１０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果
ノンホジキンリンパ腫細胞株を移植したマウスに抗ＣＤ２０抗体リツキシマブを投与した後、参考例２で製造したヒト化抗ＣＤ１０抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５またはリツキシマブを投与した際のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果について比較した。
雄性ＳＣＩＤマウスの腹側に、１箇所あたり１×１０７個のＲａｊｉ細胞を移植した。また、移植の前日および７日前に抗Ａｓｉａｌｏ  ＧＭ１抗体（和光純薬工業社製）を１匹あたり２０μＬ腹腔内投与した。移植から２０日後、腫瘍体積が１０７．０〜３２２．４ｍｍ３（ｍｅａｎ±ＳＤ：２０６．９±６６．６ｍｍ３）となった２０匹のマウスにリツキシマブの投与を開始した。リツキシマブの投与を開始した日をＤａｙ０とした。１匹あたり１００μｇのリツキシマブを、Ｄａｙ０、３、７および１０に合計４回尾静脈内投与した。投与を行う日には、腫瘍塊の長径と短径を測定することで腫瘍体積を算出した。Ｄａｙ１４に、Ｄａｙ１４の腫瘍体積がＤａｙ０の腫瘍体積に比べて小さい個体、または、Ｄａｙ０からＤａｙ１４までの間に腫瘍体積が２回以上連続して減少した個体を棄却した。さらに、Ｄａｙ１４の時点の腫瘍体積が、リツキシマブを投与した２０匹の平均±標準偏差の範囲を逸脱した個体を棄却した。これらの棄却条件に合致しなかった２０匹中１１匹を用いて実験を行った。【００８２】
１１匹のマウスを、Ｄａｙ１４の腫瘍体積を基準として、腫瘍体積の偏りがないように２群に分けた。その後、１群は、抗ＣＤ２０抗体処置群として、１匹あたり１００μｇの用量のリツキシマブを、Ｄａｙ１４、１７、２１、２４に合計４回尾静脈内投与した（ｎ＝５）。もう１群は、抗ＣＤ１０抗体処置群として、１匹あたり１００μｇの用量の抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５を、Ｄａｙ１４、１７、２１、２４に合計４回尾静脈内投与した（ｎ＝６）。抗ＣＤ２０抗体処置群および抗ＣＤ１０抗体処置群の腫瘍体積は、それぞれの抗体を投与する日に測定した。【００８３】
Ｄａｙ０に腫瘍体積をＶ０、各測定日の腫瘍体積をＶとして、個体毎にＶとＶ０の比（Ｖ／Ｖ０）を計算した。群間に認められたＶ／Ｖ０の差異について、統計解析ソフトＳＡＳ（Ｒｅｌｅａｓｅ  ８．２、ＳＡＳインスティテュート製）を用いて統計学的有意差を計算した。Ｐ値が０．０５以下の時に、差異は有意であると判断した。
抗ＣＤ１０抗体処置群のＶ／Ｖ０は、抗ＣＤ２０抗体処置群のＶ／Ｖ０と比べて有意に小さかった（図５）。この結果から、抗ＣＤ２０抗体の投与を継続するよりも、抗ＣＤ１０抗体の投与に変更したほうがより強い治療効果を得られることが明らかとなった。【００８４】
実施例４  抗ＣＤ２０抗体耐性のノンホジキンリンパ腫細胞株における抗ＣＤ１０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ治療効果
ノンホジキンリンパ腫細胞株Ｎａｍａｌｗａ細胞（アメリカ国立衛生研究所）を移植したマウスを用いて、抗ＣＤ１０抗体と抗ＣＤ２０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効果を検討した。【００８５】
雄性ＳＣＩＤマウスの腹側に、Ｎａｍａｌｗａ細胞を１箇所あたり５×１０６個移植した。移植前日に抗Ａｓｉａｌｏ  ＧＭ１抗体（和光純薬工業）を１匹あたり２０μＬ腹腔内投与した。腫瘍体積が２００．１〜３９９．７ｍｍ３（平均±標準偏差は２８９．７±６３．２ｍｍ３）になったところで、腫瘍体積が群毎に偏らないように１群あたり５匹ずつのマウスを３群に分けた。抗ＣＤ１０抗体処置群には、１匹あたり１００μｇの用量の抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５を、週に２回の間隔で合計６回尾静脈内に投与した。抗ＣＤ２０抗体処置群には、１匹あたり１００μｇの用量の抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（中外製薬社製）を、週に２回の間隔で合計６回尾静脈内に投与した。対照群には、１匹あたり２００μＬの生理食塩水を、週に２回の間隔で合計６回尾静脈内に投与した。Ｄａｙ０からＤａｙ２８まで、週に２回の間隔で腫瘍体積を測定した。【００８６】
Ｄａｙ０に腫瘍体積をＶ０、各測定日の腫瘍体積をＶとして、個体毎にＶとＶ０の比（Ｖ／Ｖ０）を計算した。群毎にＶ／Ｖ０の平均値を計算した。群間に認められたＶ／Ｖ０の差異について、統計解析ソフトＳＡＳを用いて統計学的有意差を計算した。Ｐ値が０．０５以下の時に、差異は有意であると判断した。結果を図６に示す。
抗ＣＤ２０抗体処置群と対照群のＶ／Ｖ０は、ほぼ同等の速度で増加した。この結果から、抗ＣＤ２０抗体の治療効果が認められないこと、すなわちＮａｍａｌｗａ細胞がリツキシマブ耐性となっていることが明らかになった。一方で、抗ＣＤ１０抗体処置群のＶ／Ｖ０は、リツキシマブ処置群および対照群のＶ／Ｖ０と比べて有意に小さかった。この結果から、抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍に対して、抗ＣＤ１０抗体の投与が有効であることが示された。【００８７】
実施例５  ＣＤ１０発現量に対する抗ＣＤ２０抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ作用
ノンホジキンリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９６）を移植したマウスに抗ＣＤ２０抗体リツキシマブを投与し、Ｒａｍｏｓ細胞の腫瘍塊のＣＤ１０の発現量をフローサイトメトリー法で測定した。
雄性ＳＣＩＤマウスの腹側に、Ｒａｍｏｓ細胞を１箇所あたり１×１０７個移植した。移植３日前に抗Ａｓｉａｌｏ  ＧＭ１抗体（和光純薬工業）を１匹あたり２０μＬ腹腔内投与した。腫瘍体積が９７．５〜１８７．６ｍｍ３の範囲（平均±標準偏差、１２８．６±２９．０ｍｍ３）になったところで、腫瘍体積が群毎に偏らないように１群あたり５匹ずつのマウスを２群に分けた。群を分けた日をＤａｙ０とした。抗ＣＤ２０抗体処置群には、１匹あたり１００μｇの用量の抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（中外製薬社製）を、週に２回の間隔で合計８回尾静脈内に投与した。対照群には、１匹あたり２００μＬの生理食塩水を、週に２回の間隔で合計８回尾静脈内に投与した。Ｄａｙ２９に、マウスを解剖し、腫瘍塊を摘出した。【００８８】
摘出した腫瘍塊を、氷上かつ少量のＤＭＥＭ中で、はさみを用いて１辺が１ｍｍ程度の小片に細断した。約２ｍＬの腫瘍ミンチを、１５ｍＬ丸底チューブに入れ、ほぼ同量のＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／ＤＮａｓｅ溶液［Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  Ｔｙｐｅ  １Ａ（和光純薬社製）を６４１ｍｇとＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）を８１ｍｇ計り取り、ＲＰＭＩ−１６４０で２００ｍＬにメスアップし、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過して調製した溶液］を添加し、３７℃で浸透しながら３０分間放置した。浸透処理後の腫瘍塊を、氷冷したＲＰＭＩ−１６４０を１０ｍＬ添加してよく攪拌して懸濁した。腫瘍塊の懸濁液を、ポア７０μｍのメッシュを通して、ろ液を細胞懸濁液として得た。細胞懸濁液を、１５ｍＬの氷冷ＲＰＭＩ−１６４０で遠心分離を行って２回洗浄した。細胞をＰＢＳに懸濁し、細胞濃度を計数した。【００８９】
細胞懸濁液を、１．５ｍＬチューブに５×１０５細胞となるよう分注し、１％のウシ血清アルブミンおよび０．０５ｗ／ｖ％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳを、０．７５ｍＬずつ添加した。５０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を捨てた。０．１ｍｇのＦＩＴＣ標識した抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８４７８）、０．４ｗ／ｖ％のウシ血清アルブミン、０．０１ｗ／ｖ％のアジ化ナトリウム、５０ｍｇ／ｍＬのヒトγグロブリンを含むＰＢＳ  ４０μＬに細胞を懸濁した。対照染色用の抗体として、蛍光色素（ＦＩＴＣ）標識したヒトＩｇＧを用いた。冷蔵庫で３０分間放置した後、１％のウシ血清アルブミン・０．０５ｗ／ｖ％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ０．７５ｍＬを用いて細胞を遠心分離を行って２回洗浄した。細胞を、１０μｇ／ｍＬのプロピジウムイオダイドを含むＩＳＯ  ＦＬＯＷに懸濁した。フローサイトメーターを用いて、プロピジウムイオダイドで染色されない細胞５０００個について、ＦＩＴＣ由来の平均蛍光強度を指標にＣＤ１０の発現量を解析した。群間に認められた平均蛍光強度の差異について、統計解析ソフトＳＡＳを用いて統計学的有意差を計算した。Ｐ値が０．０５以下の時に、差異は有意であると判断した。【００９０】
リツキシマブを投与したマウスから摘出したＲａｍｏｓ細胞株のＣＤ１０発現量は、対照群のそれより優位に高かった。この結果から、抗ＣＤ２０抗体はＣＤ１０発現量を増加させる作用があることが明らかとなった。
参考例１  マウス抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１の可変領域遺伝子のクローニング
１．  抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１のＶ領域をコードするｃＤＮＡの単離、解析
（ａ）抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１産生ハイブリドーマからのｍＲＮＡの調製
抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１産生ハイブリドーマ細胞ＮＬ−１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，４３８６（１９８２）］の５×１０７個より、ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ＮＬ−１由来のｍＲＮＡを調製した。【００９１】
（ｂ）抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記（ａ）項で取得したＮＬ−１のｍＲＮＡの５μｇから、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプター配列を有するｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡの全量を２０μＬの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動に供し、ＩｇＧクラス抗体のＨ鎖に対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκクラスのＬ鎖に対応する約１ｋｂのｃＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて回収した。【００９２】
次に、λＺＡＰＩＩ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、各ｃＤＮＡ断片０．１μｇと、キットに添付されているλＺＡＰＩＩベクターの１μｇを、添付の使用説明書に従って連結した。それぞれの該反応液の２．５μＬをＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って、λファージにパッケージングし、ＮＬ−１のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして５×１０４個、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして４×１０４個のファージクローンを取得した。次に、各々のファージを常法［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）］に従い、ナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄＮ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）上に固定した。【００９３】
（ｃ）抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡのクローニング
上記（ｂ）項で作製したＮＬ−１のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリー、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブリーのナイロンメンブレンフィルターを、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のＣ領域のｃＤＮＡをプローブとして用いた。Ｈ鎖はマウスＣγ２ａｃＤＮＡの断片［Ｎａｔｕｒｅ，２８３，７８６（１９８０）］、Ｌ鎖はマウスＣκｃＤＮＡの断片［Ｃｅｌｌ，２２，１９７（１９８０）］をそれぞれ用いた。プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖、Ｌ鎖各１０クローン取得した。次に、λＺＡＰＩＩ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の使用説明書に従って、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。このようにして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応後、同社の塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析し、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドおよびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドが得られたことを確認した。【００９４】
（ｄ）抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１のＶ領域のアミノ酸配列の解析
Ｈ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＮＬ−１Ｈに含まれていたＮＬ−１のＶＨの全塩基配列を配列番号２９に、該配列から推定されるＮＬ−１のＶＨの全アミノ酸配列を配列番号３０に、プラスミドｐＮＬ−１Ｌに含まれていたＮＬ−１のＶＬの全塩基配列を配列番号３１に、該配列から推定されるＮＬ−１のＶＬの全アミノ酸配列を配列番号３２にそれぞれ示した。【００９５】
配列番号３０および３２に表されるＮＬ−１のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を既知の抗体の配列データ［Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］と比較し、さらに精製した抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１のＶＨおよびＶＬのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて解析した結果と比較した。その結果、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ＣＤ１０抗体ＮＬ−１のＨ鎖およびＬ鎖をコードする完全長ｃＤＮＡであった。
２．ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞での安定発現
ＷＯ０３／８５１０７に記載のＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞および親株であるＣＨＯ／ＤＧ４４細胞を宿主細胞として用いて、抗ＣＤ１０キメラ抗体の安定生産細胞をＷＯ０３／８５１０７に記載の方法に従って作製した。なお、抗ＣＤ１０キメラ抗体発現ベクターは、本参考例の１項で取得したＮＬ−１のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡ（配列番号２９および配列番号３１）から、ＷＯ０３／０１８６３５の実施例１に記載の方法で作製した。図１１には、作製した抗ＣＤ１０キメラ抗体発現ベクターの概略図を示した。【００９６】
最終的にＧ４１８を５００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）培地で増殖可能かつ、抗ＣＤ１０キメラ抗体を生産する形質転換株を取得した。親株のＣＨＯ／ＤＧ４４細胞より得られた形質転換株をＤＧ４４／ＣＤ１０株と、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウト細胞より得られた形質転換株をＭｓ７０５／ＣＤ１０株と名付けた。
３．培養上清中のヒトＩｇＧ抗体濃度の測定（ＥＬＩＳＡ法）
ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）をＰｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ（以下、ＰＢＳと表記する）（インビトロジェン社製）で希釈して１μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、ＢＳＡを１％の濃度で含むＰＢＳ（以下、１％ＢＳＡ−ＰＢＳと表記する）（和光純薬社製）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、形質転換株の培養上清、または培養上清から精製した抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％の濃度で含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと表記する）（和光純薬社製）で各ウェルを洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウム（和光純薬社製）の０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素（和光純薬社製）を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と表記する）を測定した。
４．抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体の精製
本参考例の２項で得られた形質転換細胞株ＤＧ４４／ＣＤ１０株およびＭｓ７０５／ＣＤ１０株を用いて、それぞれが生産する抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体を以下のようにして精製した。【００９７】
各々の形質転換株を、Ｇ４１８を５００μｇ／ｍＬの濃度で含むＩＭＤＭ−ｄＦＢＳ（１０）に懸濁し、３０ｍＬを１８２ｃｍ２フラスコ（グライナー社製）に播種して５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、数日間培養した。細胞密度がコンフルエントになった時点で培養上清を除去し、２５ｍＬのＰＢＳで細胞を洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）３０ｍＬを注入した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間培養後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って上清を回収した後、０．２２μｍ孔径  Ｍｉｌｌｅｘ  ＧＶ  フィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。上述の方法により取得した培養上清より、Ｍａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体を精製した。精製した抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体は、ＤＧ４４／ＣＤ１０株より得られた抗体をＤＧ４４／ＣＤ１０抗体と、Ｍｓ７０５／ＣＤ１０株より得られた抗体をＭｓ７０５／ＣＤ１０抗体と名付けた。なお、ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０を生産する形質転換体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０は、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６）に平成１５年９月１１日付けでＦＥＲＭ  ＢＰ−０８４７８として国際寄託されている。
参考例２  ＣＤ１０に特異的に結合するヒト化抗体の作製
１．ＣＤ１０に特異的に結合するヒト化抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの設計
（１）ＣＤ１０に特異的に結合するヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列の設計
まず、ＣＤ１０に特異的に結合するヒト化抗体（以下、抗ＣＤ１０ＣＤＲ移植抗体と称す）のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。【００９８】
配列番号２、３および４に示したＶＨのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。ＢＬＡＳＴＰ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９（１９９７）］  により、ＮＬ−１と相同性の高いヒト抗体を既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース中より検索した。相同性スコアと実際のアミノ酸配列の相同性を比較したところ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴデータベースアクセッションナンバーＡＡＡ６９７３４に記載のＩｇ  Ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１６９１，６１４６（１９９０）］が８７．４％を示し、最も相同性の高いヒト抗体であったため、この抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を選択した。ただしデータベース上のクローンＡＡＡ６９７３４のＮ末端１番目のアミノ酸はヒト抗体の配列では出現頻度の低いグルタミン；Ｇｌｎであった。そこで、１番目のアミノ酸については、任意のヒト抗体の配列［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］においても高頻度に認められるグルタミン酸；Ｇｌｕに置換した。【００９９】
以上のようにして決定したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に配列番号２、３および４に示した抗ＣＤ１０マウス抗体ＮＬ−１のＶＨのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列を移植し、配列番号８に示される抗ＣＤ１０  ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０を設計した。該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号９に示した。
（２）抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸の設計
次に、抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下の様にして設計した。配列番号５、６および７に示した抗ＣＤ１０マウス抗体ＮＬ−１のＶＬのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択した。カバットらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧＩ〜ＩＶ）に分類し、更に、それら各サブグループ毎に共通配列を報告している［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］。そこで、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、ＮＬ−１のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を選択した。【０１００】
第１表には、ヒト抗体のＶＬの各サブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列とＮＬ−１のＶＬのＦＲのアミノ酸配列との間の相同性の検索結果を示した。第１表に示した様に、ＮＬ−１のＶＬのＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＶと最も高い相同性を有していた。【０１０１】
【表１】
2008026603.tif 000002
【０１０２】
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に配列番号５、６および７に示した抗ＣＤ１０マウス抗体ＮＬ−１のＶＬのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列を移植し、配列番号１０に示される抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０を設計した。該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に示した。【０１０３】
（３）抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＬの改変
上記で設計した抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ＣＤ１０マウス抗体ＮＬ−１のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列であるが、一般にヒト化抗体では、マウス抗体のＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは抗原との結合活性が低下してしまうことが多い。そこで、抗原との結合活性の低下を回避するため、ヒト抗体とマウス抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、抗原との結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をＣＤＲのアミノ酸配列とともに移植するために、抗原との結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を同定することを検討した。【０１０４】
抗ＣＤ１０マウス抗体ＮＬ−１のアミノ酸配列と該マウス抗体のＣＤＲの移植先として選択したヒト抗体とのアミノ酸配列の相同性が低いＶＬから、以下のように改変を行った。
まず、上記で設計した抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０およびＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０よりなる抗体Ｖ領域ＨＶ０ＬＶ０の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＲａｓＭｏｌ（Ｇｌａｘｏ社製）を用いてそれぞれ添付の使用説明書に従い、行った。また、抗ＣＤ１０マウス抗体ＮＬ−１のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。【０１０５】
その結果ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の抗原との結合活性に影響を与えると考えられる残基として、ＬＶ０の２２番目のＡｓｎ、４４番目のＰｒｏ、４７番目のＬｅｕ、４８番目のＬｅｕ、６１番目のＡｓｐ、７１番目のＡｓｐ、７２番目のＰｈｅ、７３番目のＴｈｒおよび８６番目のＶａｌを選択した。これらの選択したアミノ酸残基のすべてをマウス抗体ＮＬ−１に見られるアミノ残基へ改変した配列番号１２に示されるヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ９を設計した。該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１３に示した。【０１０６】
（４）抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＨの改変
次にＶＨにおける抗原との結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を同定した。
まず、前記（３）記載の方法を用いて、三次元構造を表示させ、抗ＣＤ１０マウス抗体ＮＬ−１のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも同様にして構築した。【０１０７】
その結果ＨＶ０ＬＶ０のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の抗原との結合活性に影響を与えると考えられる残基として、ＨＶ０の１番目のＧｌｕ、１６番目のＡｒｇ、１８番目のＬｅｕ、４２番目のＧｌｙ、８０番目のＴｙｒ、８４番目のＡｓｎおよび９８番目のＡｒｇを選択した。これらの選択したアミノ酸残基のうち４２番目のＧｌｙ、９８番目のＡｒｇをマウス抗体ＮＬ−１に見られるアミノ残基へ改変した配列番号３７に示されるヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ２を設計した。該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を配列番号３８に示した。【０１０８】
２．  抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＨをコードするｃＤＮＡの構築
本参考例１第１項（１）で設計した抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲ法を用いて以下のようにして構築した。構築の過程は図７に示した。以下の記載において、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ用プライマーは、ファスマック社製の合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ用プライマーを使用した。【０１０９】
まず、設計したアミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１）］を考慮し、対応する遺伝子コドンを決定した。変換した遺伝子コドンの５’末端側に、配列番号４３記載のＨ鎖の５’非翻訳領域および分泌シグナル配列をコードする塩基配列を繋げて完全な抗体Ｖ領域のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、更に５’末端と３’末端にヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列を付加した。設計した塩基配列を５’末端側から１２０から１５０塩基ずつの計４本の塩基配列に分け（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有する）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号１４、１５、１６および１７にそれぞれ示される塩基配列を有する４本の合成オリゴヌクレオチドを合成した。【０１１０】
該合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ最終濃度が０．０２μＭとなるように０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む反応液に加え、さらに１μＭ  ＨＶ０−ＦＷ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１８）、１μＭ  ＨＶ０−ＲＶ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号１９）および２．５単位のＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃間、５５℃で３０秒間、７４℃で３０秒間のサイクルを３０サイクル、その後７４℃で１０分間を１サイクルで行った。ＰＣＲ後、該反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて約０．４７ＫｂｐのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付の使用説明書に従って、プラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔに挿入した。得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドを調製し、プラスミドに挿入されたＰＣＲ断片の塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応後、同社の塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有するプラスミドｐＣＲＨＶ０が取得できたことを確認した。【０１１１】
次に本参考例の第１項（４）で設計した抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ２をコードするｃＤＮＡを上記と同様にして構築した。構築の過程は図８に示した。ただし、合成オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１４、３９、４０および４１にそれぞれ示される塩基配列を有する４本の合成オリゴヌクレオチドを使用した。最終的に塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有するプラスミドｐＣＲＨＶ２が取得できたことを確認した。【０１１２】
３．  抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
本参考例の第１項（２）で設計した抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。構築の過程は図９に示した。５’非翻訳領域および分泌シグナル配列には、配列番号４２に記載の塩基配列を用いた。まず、配列番号２０、２１、２２および２３にそれぞれ示される塩基配列を有する４本の合成オリゴヌクレオチドを上記第２項と同様にして設計後、合成した。該合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ最終濃度が０．０２μＭとなる様に０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウムを含む反応液に加え、さらに１μＭ  ＬＶ０−ＦＷ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２４）、１μＭ  ＬＶ０−ＲＶ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２５）および２．５単位のＫＯＤ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲを行った。反応条件は９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で３０秒間のサイクルを３０サイクル、その後７４℃で１０分間を１サイクルで行った。該反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、ＱＩＡＥＸＩＩ  Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて約０．４４ＫｂｐのＰＣＲ産物を回収した。回収したＰＣＲ産物をＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて添付の使用説明書に従って、プラスミドｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔに挿入した。得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドを調製し、プラスミドに挿入されたＰＣＲ断片の塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応後、同社の塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有するプラスミドｐＣＲＬＶ０が取得できたことを確認した。【０１１３】
次に、本参考例の第１項（３）で設計したＬＶ９をコードするｃＤＮＡを上記と同様にして構築した。構築の過程は図１０に示した。ただし、合成オリゴヌクレオチドとしては、配列番号２０、２６、２７および２８にそれぞれ示される塩基配列を有する４本の合成オリゴヌクレオチド、ＬＶ０−ＦＷ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２４）および１μＭ  ＬＶ０−ＲＶ  ｐｒｉｍｅｒ（配列番号２５）を使用した。最終的に塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有するプラスミドｐＣＲＬＶ９が取得できたことを確認した。【０１１４】
４．  抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターの構築
参考例１の第２項記載の抗ＣＤ１０キメラ抗体発現ベクター、上記第２項で得られたプラスミドｐＣＲＨＶ０および上記第３項で得られたプラスミドｐＣＲＬＶ０を用いて、抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ｃｈｉｍｅｒａＨＬＶ０およびｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ０を以下のようにして構築した。構築の過程はそれぞれ図１１および図１２に示した。【０１１５】
プラスミドｐＣＲＬＶ０を制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約０．４４ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。一方、抗ＣＤ１０キメラ抗体発現ベクターを制限酵素ＢｓｉＷＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）および制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約１３．２ｋｂのＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片を回収した。【０１１６】
回収したプラスミドｐＣＲＬＶ０由来ＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片と抗ＣＤ１０キメラ抗体発現ベクター由来のＢｓｉＷＩ−ＥｃｏＲＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて添付の説明書に従って連結した。得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドを調製し、プラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応後、同社の塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有する抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ｃｈｉｍｅｒａＨＬＶ０が取得できたことを確認した。【０１１７】
次に、プラスミドｐＣＲＨＶ０を制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約０．４７ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。
一方、上記で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ｃｈｉｍｅｒａＨＬＶ０を制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約１３．２ｋｂのＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片を回収した。【０１１８】
回収したプラスミドｐＣＲＨＶ０由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片とプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ｃｈｉｍｅｒａＨＬＶ０由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて添付の説明書に従って連結した。得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドを調製し、プラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応後、同社の塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有する抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ０が取得できたことを確認した。【０１１９】
次に、上記で得られた抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ０およびプラスミドｐＣＲＬＶ９を用いて、抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ９を構築した。構築の過程は図１３に示した。
抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ０を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢｓｉＷＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約１３．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を回収した。【０１２０】
一方、プラスミドｐＣＲＬＶ９を制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＢｓｉＷＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約０．４７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ断片を回収した。
回収した抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ０由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片およびプラスミドｐＣＲＨＶ９由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて添付の説明書に従って連結した。得られた組換えＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドを調製し、プラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応後、同社の塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有する抗ＣＤ１０ヒト化抗体ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ９が取得できたことを確認した。【０１２１】
次に、上記で得られた抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ９およびプラスミドｐＣＲＨＶ２を用いて、抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ２ＬＶ９を構築した。構築の過程は図１４に示した。一方、プラスミドｐＣＲＨＶ２を制限酵素ＮｏｔＩ（宝酒造社製）および制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動に供し、約０．４７ｋｂのＮｏｔＩ−ＡｐａＩ断片を回収した。【０１２２】
回収した抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ９由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片およびプラスミドｐＣＲＨＶ９由来のＡｐａＩ−ＮｏｔＩ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を用いて添付の説明書に従って連結した。得られた組換えＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換し、形質転換株のクローンより各プラスミドを調製し、プラスミドの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応後、同社の塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７により塩基配列を解析し、目的の塩基配列を有する抗ＣＤ１０ヒト化抗体ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ２ＬＶ９が取得できたことを確認した。【０１２３】
５．  動物細胞を用いた抗ＣＤ１０ヒト化抗体の安定発現および抗体の精製
本参考例の第４項で作製した３種の抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ９、およびｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ２ＬＶ９を使用し、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトＣＨＯ細胞を宿主細胞として、それぞれ抗ＣＤ１０ヒト化抗体の安定発現株を取得した。ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトＣＨＯ細胞の製造は、ＷＯ０３／８５１０７記載の方法に従った。【０１２４】
以下、ＦＵＴ８遺伝子ダブルノックアウトＣＨＯ細胞を宿主として取得した形質転換株は、抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ０を導入して得られた形質転換株をＨＶ０ＬＶ０ＭＳ７０５株と、抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ０ＬＶ９を導入して得られた形質転換株をＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５株と、それぞれ称する。抗ＣＤ１０ヒト化抗体発現プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ３０６１ＨＶ２ＬＶ９を導入して得られた形質転換株をＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５株と称する。【０１２５】
上記の各形質転換株を、Ｇ４１８を５００μｇ／ｍＬの濃度で含む基本培地（１０％ウシ胎児透析血清［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製］）および５０μｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ（ナカライテスク社製）および１×ＨＴ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を添加したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に懸濁し、３０ｍＬを１８２ｃｍ２フラスコ（グライナー製）に播種して５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、数日間培養した。細胞密度がコンフルエントに達した時点で培養液を除去し、２５ｍＬのＰＢＳで細胞を洗浄後、ＥＸＣＥＬＬ３０１培地（ＪＲＨ  バイオサイエンス社製）３０ｍＬを注入した。５％ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、７日間培養後、細胞懸濁液を回収し、３０００ｒｐｍ、４℃の条件で５分間の遠心分離を行って培養上清を回収した後、培養上清は０．２２μｍ孔径ＭｉｌｌｅｘＧＶフィルター（ミリポア社製）を用いて濾過滅菌した。上述の方法により取得した培養上清よりＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ（アマシャム・バイオサイエンス社製）カラムを用いて添付の説明書に従い、各抗ＣＤ１０ヒト化抗体を精製した。以下、ＨＶ０ＬＶ０ＭＳ７０５株より得られた抗ＣＤ１０ヒト化抗体をＨＶ０ＬＶ０ＭＳ７０５抗体、ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５株より得られた抗ＣＤ１０ヒト化抗体をＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５抗体、ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５株より得られた抗ＣＤ１０ヒト化抗体をＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５抗体、とそれぞれ称する。抗ＣＤ１０ヒト化抗体を生産する形質転換株であるＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５株は、平成１６年８月１７日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００９９として寄託されている。【０１２６】
参考例３  抗ＣＤ１０ヒト化抗体の生物活性の測定
１．抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＣＤ１０に対する結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
参考例２で取得された各種抗ＣＤ１０ヒト化抗体を以下に記載の方法で測定した。抗原は、ＣＤ１０高発現であるヒト肺小細胞癌細胞株ＳＢＣ−３細胞（ＪＣＲＢ０８１８）から調製した膜画分を用いた。膜画分は１ｍＭ  ＥＤＴＡと２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）緩衝液に懸濁した状態でホモゲナイザーにより細胞を破砕し、８０００×ｇの低速で遠心分離することで細胞内顆粒や未破砕の細胞を沈殿させて取り除き、８００００×ｇの高速で遠心分離することで目的の細胞膜を分離した。分離した膜画分は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を０．１％の濃度で含むＰＢＳに溶解して、蛋白を定量した後、１０μｇ／ｍＬとし、９６穴のＥＬＩＳＡ用プレート（グライナー社製）に５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、参考例２の第３項で調製したＤＧ４４／ＣＤ１０抗体またはＭｓ７０５／ＣＤ１０抗体の各種希釈溶液を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＴｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳで２０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）抗体溶液を二次抗体溶液として、それぞれ５０μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５を測定した。【０１２７】
その結果、いずれの抗ＣＤ１０ヒト化抗体においても抗体濃度依存的な抗原に対する結合活性が認められた。
２．  抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性
参考例２で取得した精製抗ＣＤ１０ヒト化抗体のＡＤＣＣ活性を、以下に記載の方法で測定した。ただし、標的細胞には、Ｒａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）およびＤａｕｄｉ細胞（ＪＣＲＢ９０７１）を用い、エフェクター細胞溶液の調製にはＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）を用いた。【０１２８】
（１）標的細胞溶液の調製
ＲＰＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地（ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で培養したＲａｊｉ細胞（ＪＣＲＢ９０１２）およびＤａｕｄｉ細胞（ＪＣＲＢ９０７１）を遠心分離操作及び懸濁によりＡＤＣＣ活性測定用培地［１０％透析血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）］で洗浄した後、ＡＤＣＣ活性測定用培地によって、２×１０５細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。【０１２９】
（２）エフェクター細胞溶液の調製
健常人静脈血５０ｍＬを採取し、ヘパリンナトリウム（清水製薬社製）０．５ｍＬを加え穏やかに混ぜた。これをＰｏｌｙｍｏｒｐｈｐｒｅｐ（ＮＹＣＯＭＥＤ社製）を用いて使用説明書に従い、単核球層を分離した。ＡＤＣＣ活性測定用培地で３回遠心分離して洗浄後、同培地を用いて７×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁し、エフェクター細胞溶液とした。【０１３０】
（３）ＡＤＣＣ活性の測定
９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ社製）の各ウェルに上記（１）で調製した標的細胞溶液の５０μＬ（１×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで（２）で調製したエフェクター細胞溶液を５０μＬ（２．５×１０５細胞／ウェル、エフェクター細胞と標的細胞の比は３５：１となる）添加した。更に、各種抗ＣＤ１０キメラ抗体をＡＤＣＣ活性測定用培地で希釈し、各最終濃度０．００１〜１μｇ／ｍＬとなるように加えて全量を１５０μＬとし、３７℃で４時間反応させた。反応後、プレートを遠心分離し、上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、添付の説明書にしたがって吸光度データを取得することで測定した。標的細胞自然遊離の吸光度データは、エフェクター細胞溶液、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、また、エフェクター細胞と標的細胞混合自然遊離の吸光度は、抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、上記と同様の操作を行うことで取得した。標的細胞全遊離の吸光度データは、抗体溶液、エフェクター細胞溶液の代わりに培地を用い、反応終了４５分前に１５μＬの９％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液を添加し、上記と同様の操作を行うことで取得した。ＡＤＣＣ活性は次式により求めた。
（式）
ＡＤＣＣ活性（％）＝｛（各サンプル濃度での吸光度−エフェクター細胞と標的細胞混合自然遊離の吸光度）／（標的細胞全遊離の吸光度−標的細胞自然遊離の吸光度）｝×１００
さらに、上記数式で得られた値から、更に抗体非添加時のバックグランドを差し引いた値を算出し、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）とした。【０１３１】
結果を図１５に示す。抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５抗体およびＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５抗体は標的細胞に対してＡＤＣＣ活性が認められた。
（４）ＣＤＣ活性の測定
ａ）標的細胞溶液の調製
ＭＩ１６４０−ＦＣＳ（１０）培地（ＦＣＳを１０％含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製））で培養したバーキットリンパ腫細胞株Ｄａｕｄｉ（ＪＣＲＢ９０７１）を遠心分離操作及び懸濁によりＣＤＣ活性測定用培地（１．４％ウシ血清アルブミン（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地）で洗浄した後、ＣＤＣ活性測定用培地によって、１×１０６細胞／ｍＬに調製し、標的細胞溶液とした。【０１３２】
ｂ）ヒト補体溶液の調製
ヒト血清凍結乾燥品ＳＥＲＡ，ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴ（ＳＩＧＭＡ社製）に、脱イオン水を１ｍＬ添加して溶解した後、等量のＣＤＣ活性測定用培地を加えて２倍希釈し、ヒト補体溶液とした。
ｃ）ＣＤＣ活性の測定
９６ウェル平底プレート（ＳＵＭＩＬＯＮ社製）の各ウェルに、上記ａ）で調製した標的細胞溶液５０μＬ（５×１０４細胞／ウェル）を分注した。次いで各種抗体溶液をＣＤＣ活性測定用培地で希釈し、各最終濃度０．００１〜１０μｇ／ｍＬとなるように５０μＬ加えた。更にｂ）で調製した補体溶液を５０μＬ添加して全量を１５０μＬとし、３７℃で２時間反応させた。また、補体溶液５０μＬ、ＣＤＣ活性測定用培地１００μＬを加えたウェル（Ｂｌａｎｋ）、および標的細胞溶液、補体溶液、ＣＤＣ活性測定用培地を各５０μＬずつ加えたウェル（Ｔｏｔａｌ）を作製した。反応後、各ウェルに細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を１５μＬずつ添加して攪拌し、３７℃で４時間反応させ、吸光度４５０ｎｍを測定した。ＣＤＣ活性は次式により求めた。
（式）
細胞傷害活性（％）＝〔１−（Ｓａｍｐｌｅ吸光度−Ｂｌａｎｋ吸光度）／（Ｔｏｔａｌ吸光度−Ｂｌａｎｋ吸光度）〕×１００
図１６に、抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５、抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５および抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０のＤａｕｄｉ細胞に対する活性を示した。抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ０ＬＶ９ＭＳ７０５および抗ＣＤ１０ヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５は、抗ＣＤ１０ヒト型キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０と同等のＣＤＣ活性を示した。
参考例４  抗ＣＤ１０キメラ抗体およびヒト化抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ薬効試験
Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ細胞）をターゲットとして、抗ＣＤ１０キメラ抗体Ｍｓ７０５／ＣＤ１０およびヒト化抗体ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５のｉｎ  ｖｉｖｏ薬効試験を、マウスゼノグラフト延命モデルの系で実施した。移植前日にＳＣＩＤマウス（日本クレア、雌、７週齢）の体重を測定し、コントロール群、抗体投与群Ｍｓ７０５／ＣＤ１０−１ｍｇ／ｋｇ、ＨＶ２ＬＶ９ＭＳ７０５−０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇの計４群（１群７匹）に群分けした。【０１３３】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養したＣＤ１０陽性Ｂ−ＡＬＬ細胞ＮＡＬＭ−６（東北大学加齢研）を５×１０７個／ｍＬでＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に懸濁し、マウスの尾静脈内に１００μＬずつ移植した（５×１０６個／ｍｏｕｓｅ）。その同日から、抗体投与群はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で希釈調製した各抗体溶液を、コントロール群はＰＢＳのみを１００μＬずつ尾静脈内投与した。投与は１週間に２回、計８回行い、移植日を０日目としてその後の体重と生存日数を測定した。【０１３４】
各群の体重と生存率の経日的推移を図１７および図１８に示す。コントロール群のみ、移植後２０日目から体重減少が認められ、４０日前後には生存率が０％となった。一方、抗体投与群はいずれも、試験終了日の１２１日目まで体重および生存率に変化は認められなかった。延命評価の指標とされるＩｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｐａｎ（ＩＬＳ）％を算出した結果、抗体投与群は２２１％となり、Ｂ−ＡＬＬに対する抗ＣＤ１０抗体の顕著な延命効果が示された。また、キメラ抗体とヒト化抗体は同等の抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。【０１３５】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱すること無く様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００６年８月２８日出願の日本特許出願（特願２００６−２３０３００）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は、ＣＤ１０に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体または該抗体断片を有効成分とする、抗ＣＤ２０抗体耐性腫瘍の治療剤を提供する。
【配列表フリーテキスト】
【０１３７】
配列番号８−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３７−人工配列の説明：抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号３８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
2008026603.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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