(57)【要約】本発明は、焼酎残渣もろみの濃縮エキスまたは該焼酎残渣もろみの濾液もしくは上清の濃縮エキスを含むα−グルコシダーゼ阻害剤を提供する。本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、単独または繊維性物質と組み合わせて血糖降下剤とすることもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
焼酎残渣もろみの濃縮エキスまたは該焼酎残渣もろみの濾液もしくは上清の濃縮エキスを有効成分として含むα−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項２】
前記濃縮エキスが、焼酎残渣もろみの濾液もしくは上清から得られる分子量６０００以下の画分である、請求項１に記載のα−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項３】
焼酎残渣もろみの濃縮エキスまたは該焼酎残渣もろみの濾液もしくは上清の濃縮エキスと繊維性物質とを有効成分として含む、血糖降下剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコシダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病の治療は、血糖値を正常範囲に維持して合併症を防ぐことが目的とされる。合併症には、腎症、網膜症、神経障害、ならびに動脈硬化の進展による脳卒中および心筋梗塞がある。動脈硬化は、特に食後高血糖の段階から既に進展することが分かっている。したがって、食後高血糖を改善する血糖コントロールが動脈硬化の進展を防ぐためにも重要である。
食後高血糖を下げるためには、速効型インスリン分泌型新薬およびα−グルコシダーゼ阻害薬が用いられ得る。α−グルコシダーゼ阻害薬は、食事に含まれる澱粉または糖質の分解を抑制して体内へのブドウ糖の吸収を遅らせ、それにより食後の急激な血糖値の上昇を抑制する。α−グルコシダーゼ阻害薬としては、アカルボース、ボグリボース、およびミグリトールが公知である。
特開２００３−１１６４８６号公報は、食後の血糖値上昇を抑制する食品として乳酸を多く含む食品を記載している。上記文献には、乳酸がα−グルコシダーゼ阻害作用およびα−アミラーゼ阻害作用を示し、さらに食後の血糖値の上昇を抑制したことを示す旨が記載されている。上記文献は、乳酸を含む食品として、ヨーグルト、乳酸菌飲料、酸乳飲料など、乳酸菌を使って作る乳製品を例示しており、また、清酒醸造、清涼飲料、製菓用などのような食品製造において乳酸が利用されているが、これらの食品が、食後の血糖上昇を低く抑える作用を示したという報告がみられないとも記載している。
焼酎は、澱粉質原料（穀類、芋類）または糖質原料（黒糖、なつめやし）を発酵させ、次いで蒸留することにより製造される。焼酎の製造過程においては、蒸留後の残渣もろみは、通常、廃棄される。しかし、この焼酎残渣もろみの廃棄については環境上の問題が議論されており、その有効な利用が求められている。焼酎残渣もろみは家畜の飼料としての利用が知られているが、その有用性についてなお研究が続いている。
特開２００２−３７１００３号公報には、麦焼酎の蒸留残滓の濾液を濃縮して得た大麦発酵エキスが、食後の血糖値の上昇を抑制したことが記載されている。しかし、上記文献に記載の血糖値上昇抑制成分は、インスリン様作用によるものであり、グルコシダーゼおよびアミラーゼ阻害作用は認められなかったことが記載されている（段落番号００１３）。
特開２００５−２２４２０５号公報には、そば焼酎かすを利用した血糖低下作用を持つ健康食品が記載されている。上記文献には、α−グルコシーゼ阻害に関しては記載されていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、焼酎の製造において通常廃棄される焼酎残渣もろみの有用性を見出すことを目的とする。
本発明は、焼酎残渣もろみの濃縮エキスまたは該焼酎残渣もろみの濾液もしくは上清の濃縮エキスを有効成分として含むα−グルコシダーゼ阻害剤を提供する。
１つの実施態様では、濃縮エキスは、焼酎残渣もろみの濾液もしくは上清から得られる分子量６０００以下の画分である。
本発明はさらに、焼酎残渣もろみの濃縮エキスまたは該焼酎残渣もろみの濾液もしくは上清の濃縮エキスおよび繊維性物質を有効成分として含む血糖降下剤も提供する。
本発明によれば、焼酎残渣もろみからα−グルコシダーゼ阻害活性を有する成分が得られ、そしてこの活性成分を有するα−グルコシダーゼ阻害剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、麦、米、芋および蕎麦焼酎残渣もろみ上清画分のα−グルコシダーゼ活性に対する阻害率を示すグラフである。
図２は、麦焼酎残渣もろみ上清画分投与による、スクロースを与えた後の正常ラットの血糖値の経時変化に対する影響を示すグラフである。
図３は、分子量で分けた麦焼酎残渣もろみ上清画分のα−グルコシダーゼ活性に対する阻害率を示すグラフである。
図４は、分子量で分けた米焼酎残渣もろみ上清画分のα−グルコシダーゼ活性に対する阻害率を示すグラフである。
図５は、繊維性物質と組み合わせた焼酎残渣もろみ上清画分投与による、スクロースを与えた後の正常ラットの血糖値の経時変化を示すグラフである。
図６は、各種用量における投与でのスクロース負荷および被験物質投与前、被験物質投与３０分後および６０分後の血糖値の経時変化を示すグラフである。
図７は、被験物質０ｇ投与時（対照）および０．５ｇ投与時における血糖値の経時変化を示すグラフである。
図８は、被験物質０ｇ投与時（対照）および０．５ｇ投与時における投与前および投与後３０分の血中インスリン濃度を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明における「焼酎残渣もろみ」とは、澱粉質原料（穀類、芋類など）または糖質原料（黒糖、なつめやしなど）を発酵させ、次いで蒸留してアルコールを除去した後に残存するもろみをいう。焼酎の製造は、通常、麹菌による澱粉の糖化工程、酵母による糖の発酵工程、およびアルコール蒸留工程を含む。例えば、麦類または米を、常法により処理（水洗、浸漬、水切り、蒸煮、放冷など）し、これに焼酎製造に通常用いられる白麹菌（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｋａｗａｃｈｉｉ）の種麹を接種し、製麹適温にて適切な期間の間、製麹する。このようにして得られた麹に、水および通常の焼酎製造に用いられる酵母（例えば、鹿児島酵母または熊本酵母）を添加および混合し、そして常法により糖化発酵させて一次もろみを得る。一次もろみでは、焼酎酵母が増殖される。次に、この一次もろみに、必要に応じて常法により処理（水洗、浸漬、水切り、蒸煮、放冷など）した焼酎主原料および水を添加および混合し、常法により適温で適切な期間の間さらに糖化発酵させて二次もろみを得る。この焼酎主原料としては、通常用いられる任意の原料が使用でき、大麦、小麦、米、トウモロコシ、蕎麦などの穀類、芋類、黒糖、なつめやしなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、大麦である。上の説明は酵母発酵工程（仕込み）が二段階であるが、仕込みを二段階に必ずしも分ける必要はない。発酵後のもろみを蒸留に供し、アルコールを回収して焼酎とし、一方、アルコール分が除去された残渣もろみが得られる。
上記の焼酎残渣もろみは、そのまま濃縮しで、あるいは濾過、遠心分離などによって固液分離され、次いで濾液または上清の液部を加熱濃縮、凍結乾燥もしくはスプレードライなどして、濃縮エキスを得る。さらに、上記濃縮エキスは、シリカゲルカラム、ＯＤＳカラム、イオン交換樹脂、限外濾過膜分子ふるいなどの適当なカラムを用いて、その有効成分を濃縮することもできる。これらのうち、濾液または上清画分が好ましく、分子量６０００以下の画分が好ましい。
上記濃縮エキスには、後述する実施例に示されるように、α−グルコシダーゼの阻害活性が見られる。本発明においては、実施例１に記載の条件下のα−グルコシダーゼの酵素反応の阻害率が２０％以上である場合に、α−グルコシダーゼ阻害活性を有すると定義される。上記濃縮エキスはまた、後述する実施例に示されるように、食後血糖値の上昇を抑制している。したがって、濃縮エキスの血糖降下作用は、α−グルコシダーゼ阻害によるものと考えられ、上記濃縮エキスは、α−グルコシダーゼ阻害剤として使用され得る。
上記濃縮エキスには、後述する実施例に示されるように、α−グルコシダーゼ阻害活性に加え、インベルターゼおよびα−アミラーゼの阻害活性も見られる。このように、該濃縮エキスまたはα−グルコシダーゼ阻害剤は、多様な糖分解酵素を阻害し得る。
上記濃縮エキス（特に、焼酎残渣もろみの濾液または上清の分子量６０００以下の画分）は、コハク酸、ピログルタミン酸、およびピルビン酸を含む。これらの有機酸、すなわち、コハク酸、ピログルタミン酸、およびピルビン酸は、α−グルコシダーゼ阻害活性を有している。
上記濃縮エキスまたはα−グルコシダーゼ阻害剤は、糖質を分解するα−グルコシダーゼの働きを阻害して、小腸からのブドウ糖の吸収を遅らせ得るため、糖尿病およびそこから引き起こされる高血糖状態による神経障害、白内障、腎障害、網膜症、関節硬化症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性壊疽などの種々の合併症の治療または予防のために、経口投与され得る。その投与量は、投与方法と症状の程度、患者の年齢、体重などに依存するが、通常、成人一人１回投与当たり、濃縮エキス（特に、焼酎残渣もろみの濾液または上清の分子量６０００以下の画分）として０．０５ｇ〜１０ｇ、好ましくは、０．０７５ｇ〜５ｇ、より好ましくは０．１ｇ〜１ｇであり得る。この投与量は、ヒトによる公知の糖負荷試験によって適宜決定できる。
上記濃縮エキスまたはα−グルコシダーゼ阻害剤は、錠剤、散剤、液剤のような形態とすることができる。また、これを食品または飲料に添加することにより、α−グルコシダーゼ阻害作用または上述したような糖分解酵素阻害作用を有する健康保持用の食品とすることもできる。このような食品としては、例えば、在宅用糖尿病食、流動食、病者用食品（糖尿病食調整用組み合わせ食品など）、特定保健用食品、ダイエット食品、あるいは炭水化物を主成分とする食品が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な食品形態としては、例えば、コーヒー、清涼飲料水、スープ、果汁、ジャム、ビスケット、パン、およびパスタが挙げられるが、これらに限定されない。食品への添加または加工は、当業者が通常用いる方法によって行われ得る。ヒト以外への動物、例えば家畜またはペット用の飼料への添加も可能である。
上記濃縮エキスまたはα−グルコシダーゼ阻害剤は、血糖降下剤として、それ自体を単独で含むか、または繊維性物質と合わせて含むこともできる。特に食後血糖値の上昇の抑制に有用である。繊維性物質を含むことにより、さらに血糖降下作用が強化される。繊維性物質としては、セルロースおよび難消化デキストリンが挙げられるが、好ましくは、難消化デキストリンが用いられる。このような血糖降下剤も同様に、上記のような食品とすることができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
本実施例では、サツマイモ、大麦、米または蕎麦を原料とする焼酎の残渣もろみを、以下のようにして製造した。
（製造例１：麦焼酎残渣もろみの製造）
大麦を精製機で表皮を削り、これに水を加えて蒸煮し、次いで約３５〜４０℃に放冷した。これに種麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｋａｗａｃｈｉｉ；株式会社  樋口松之助商店）を混ぜ、５日間おいて麹菌を繁殖させた。次いで、これに水および焼酎酵母を適量加えて混合し、約２５〜３０℃で１０日間かけて発酵させ、もろみを得た。発酵が終了したもろみをポットスチルで蒸留し、もろみ中のアルコールを除去した。このアルコールが除去されたもろみが残渣もろみである。この残渣もろみを室温にて１００００ｇで３０分間遠心分離し、上清を採取した。この上清を限外濾過膜装置（旭化成；ペン型ＵＦ膜）に供し、分子量６０００以下の画分の溶液を採取し、次いで凍結乾燥した。さらに、残留している溶液を分子量５００００以下の画分と分子量が５００００を超える画分とに分離し、それぞれの溶液を凍結乾燥した。凍結乾燥物を以下の実施例で用いた。
（製造例２：米焼酎残渣もろみの製造）
米を精製機で表皮を削り、次いで水を加えて蒸煮した。蒸煮した米を約３５〜４０℃に冷却して種麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｋａｗａｃｈｉｉ；株式会社  樋口松之助商店）を混ぜ、５日間おいて麹菌を繁殖させた。次いで、これに水および焼酎酵母を適量加え、約２５〜３０℃で１０日間かけて発酵させ、もろみを得た。引き続いて、上記製造例１と同様にして、残渣もろみを製造し、そして分子量によって分画し、凍結乾燥した。
（製造例３：芋焼酎残渣もろみの製造）
サツマイモを、表面を洗浄し、次いで水を加えて蒸煮し、次いで粉砕した。上記製造例２の記載に従って米に種麹菌を植えつけて、製麹した。蒸煮粉砕したサツマイモ、水および焼酎酵母を適量で、製麹した米と混ぜ、約２５〜３０℃で３日間かけて発酵させ、もろみを得た。引き続いて、上記製造例１と同様にして、残渣もろみを製造し、そして分子量によって分画し、凍結乾燥した。
（製造例４：蕎麦焼酎残渣もろみの製造）
蕎麦米を精製機で表皮を削り、次いで水を加えて蒸煮した。蒸煮した蕎麦米を約３５〜４０℃に冷却して種麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｋａｗａｃｈｉｉ；株式会社  樋口松之助商店）を混ぜ、５日間おいて麹菌を繁殖させた。製麹した蕎麦に、上記製造例１および２の製麹した麦および米を、米：麦：蕎麦の比が１：１：１．２となるように添加して混ぜ合わせ、さらに水および焼酎酵母適量と混ぜ、約２５〜３０℃で１０日間かけて発酵させ、もろみを得た。引き続いて、上記製造例１と同様にして、残渣もろみを製造し、そして分子量によって分画し、凍結乾燥した。
（実施例１：焼酎残渣もろみのα−グルコシダーゼ活性への影響）
製造例１〜４の麦、米、芋、および蕎麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分の凍結乾燥物をそれぞれ１００ｍｇならびに対照としてアカルボース（商品名グルコバイ（登録商標）；バイエル）を１０ｍｇとり、０．０２Ｍリン酸緩衝液１ｍＬに溶解し、被験物質溶液を得た。α−グルコシダーゼ活性についての試験物質の作用を調べるために、以下の組成を有する反応液を調製した：０．４％  ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド（和光純薬）０．２ｍＬ；被験物質溶液０．２ｍＬ；および０．５Ｕ／ｍＬ  α−グルコシダーゼ（東洋紡）０．１ｍＬ。ここで、α−グルコシダーゼの１単位（Ｕ）は、上記の反応液を以下の標準反応条件において基質の非還元性末端側から１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量とする。上記反応液を３７℃にて１５分間インキュベーションして、酵素反応を進行させた。２Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨ７．０）を０．５ｍＬ加えて反応を停止させた。反応停止後の溶液０．０２ｍＬを採り、発色試薬（グルコースＣＩＩテストワコー；和光純薬）３．０ｍＬを加えで混和し、３７℃にて５分間インキュベーションし、分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ）にて５０５ｎｍで吸光度を測定した。測定はすべて２回で行った。
図１は、これらの焼酎残渣もろみのα−グルコシダーゼ活性に対する阻害率を示すグラフである。α−グルコシダーゼ阻害が公知であるアカルボースの結果も併せて示す。縦軸はα−グルコシダーゼ活性の阻害率（％）を表す。いずれの焼酎残渣もろみもα−グルコシダーゼ活性の阻害を示し、特に麦焼酎残渣もろみは、６０％を超える阻害を示した。
（実施例２：焼酎残渣もろみの食後血糖値への影響）
７週齢の正常雄ラット（九動株式会社）を１２時間絶食させた。絶食後、対照群には、２ｇ／ｋｇのスクロースを経口摂取させ、セルロース投与群には、２ｇ／ｋｇのスクロースの経口摂取と共に２０ｍｇ／ｋｇのセルロースを胃内投与し、アカルボース投与群には、２ｇ／ｋｇのスクロースの経口摂取と共に２０ｍｇ／ｋｇのアカルボースを胃内投与し、そして焼酎残渣もろみ上清画分投与群には、上記製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分凍結乾燥物２０ｍｇ／ｋｇを胃内投与した。各群５匹となるようにした。処理前、処理３０分後、６０分後、および１２０分後の血糖値を測定した。ここでの血糖値は、血清グルコース濃度である。
図２は、スクロースを与えた後の各処理群における血糖値の経時変化を示すグラフである。横軸は食後時間（分）、そして縦軸は血糖値（血清グルコース濃度：ｍｇ／ｍＬ）を表す。図中、黒丸は対照群、白丸はセルロース投与群、白三角はアカルボース投与群、そして白四角は焼酎残渣もろみ上清画分投与群である。スクロースを経口投与しただけの対照群では、処理３０分後までに血糖値が急激に上昇し、それ以降は徐々に低下していく。セルロース投与群もコントロール群と同様の傾向を示した。これに対して、アカルボース投与群および焼酎残渣もろみ上清画分投与群では、処理の３０分後に血糖値は上昇するが、その上昇はコントロールに対して有意に低かった（図２中＊＊；ｒ＜０．０５）。
（実施例３：麦焼酎残渣もろみのα−グルコシダーゼ活性阻害）
上記製造例１で得られた麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下；分子量が６０００を超えて５００００以下；および分子量が５００００を超える画分の凍結乾燥物を用いて、上記実施例１に記載の手順に従って、α−グルコシダーゼ活性に対する影響を調べた。
図３は、これらの麦焼酎残渣もろみ上清画分のα−グルコシダーゼ活性に対する阻害率を示すグラフである。縦軸はα−グルコシダーゼ活性の阻害率（％）を表す。図中、分子量６０００以下の画分をＭ．Ｗ．＜６０００；分子量が６０００を超えて５００００以下の画分を６０００＜Ｍ．Ｗ．＜５００００；および分子量が５００００を超える画分を５００００＜Ｍ．Ｗ．で表す。いずれの画分においてもα−グルコシダーゼ活性の阻害が示されたが、分子量６０００以下の画分で阻害率が特に高かった。
（実施例４：米焼酎残渣もろみのα−グルコシダーゼ活性阻害）
上記製造例２で得られた米焼酎残渣もろみの分子量６０００以下；分子量が６０００を超えて５００００以下；および分子量が５００００を超える画分の凍結乾燥物を用いて、上記実施例１に記載の手順に従って、α−グルコシダーゼ活性に対する影響を調べた。
図４は、これらの米焼酎残渣もろみ上清画分のα−グルコシダーゼ活性に対する阻害率を示すグラフである。縦軸はα−グルコシダーゼ活性の阻害率（％）を表す。図中、分子量６０００以下の画分をＭ．Ｗ．＜６０００；分子量が６０００を超えて５００００以下の画分を６０００＜Ｍ．Ｗ．＜５００００；および分子量が５００００を超える画分を５００００＜Ｍ．Ｗ．で表す。分子量６０００以下の画分を含む全ての画分において、５０％を超えるα−グルコシダーゼ活性阻害が見られた。
（実施例５：繊維性物質と組み合わせた焼酎残渣もろみの食後血糖値への影響）
７週齢の正常雄ラット（九動株式会社）を１２時間絶食させた。絶食後、スクロース摂取群には、２ｇ／ｋｇのスクロースを経口摂取させ、それ以外には何も投与しなかった。焼酎残渣もろみ上清画分投与群には、２ｇ／ｋｇのスクロースの経口摂取と共に、５ｍｇ／ｋｇの上記製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分凍結乾燥物を胃内投与し、セルロース添加群には、２ｇ／ｋｇのスクロースの経口摂取と共に、５ｍｇ／ｋｇの上記製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分凍結乾燥物およびその５倍量のセルロースを混合して胃内投与し、そして難消化デキストリン添加群には、５ｍｇ／ｋｇの上記製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分凍結乾燥物およびその５倍量の難消化デキストリンを混合して胃内投与した。各群５匹となるようにした。上記処理前および処理３０分後の血糖値を測定した。ここでの血糖値は、血清グルコース濃度である。
図５は、スクロースを与えた後の各処理群における血糖値の経時変化を示すグラフである。縦軸は血糖値（血清グルコース濃度：ｍｇ／ｍＬ）を表す。図中、白丸はスクロース摂取群、×は麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分凍結乾燥物を投与した群（麦焼酎残渣もろみ上清画分投与群）、白三角は上記製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分凍結乾燥物と共にセルロースを添加した群（セルロース添加群）、そして白四角は上記製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分凍結乾燥物と共に難消化デキストリンを添加した群（難消化デキストリン添加群）である。セルロース添加群および難消化デキストリン添加群は、麦焼酎残渣もろみ上清画分投与群に比較して、食後の血糖値の上昇がさらに抑制されていた。特に、麦焼酎残渣もろみ上清画分に難消化デキストリンを組み合わせることにより、優れた血糖降下作用がみられた。
（実施例６：焼酎残渣もろみの組成解析）
製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分の凍結乾燥物の２．０ｇを超純水（ｍｉｌｌＱ水）に溶かし、シリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０Ｎ（ｓｐｈｅｒｉｃａｌ，ｎｅｕｔｒａｌ），６３〜２１０μｍ；関東化学株式会社）１０ｇに吸着させて乾燥させた。２ｃｍ×６０ｃｍのフィルター付き（Ｎｏ．２）（ＶＩＤＴＥＣ社）のカラムに約５０ｇの上記シリカゲルを充填し、シリカゲルを吸着させた上記麦焼酎残渣もろみをのせた。単一溶媒（ＣＨＣｌ３：メタノール：Ｈ２Ｏ＝５：３：０．４）を流し、分画した。各フラクションを薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ：Ｐａｒｔｉｓｉｌ（登録商標）Ｋ５Ｆ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  １５０Å、２０×２０ｃｍ、Ｗｈａｔｍａｎ）に付し、発色剤（ｐ−アニスアルデヒド、エタノール溶液、東京化成工業株式会社）で噴霧して加熱し、スポットを確認した。同じＲｆ値のスポットを集めて濃縮し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）でさらに精製した。
ＨＰＬＣは、以下の条件下で実施した：
使用機器：高速液体クロマトグラフィー  ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＬＣ−１０Ａ
ポンプ：ＬＣ−１０ＡＤ  ×  ２台
検出器：ＣＤＤ−６Ａ（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ）
コントローラ：ＳＣＬ−１０Ａ
カラムオーブン：ＣＴＯ−１０Ａ
オートインジェクター：ＳＩＬ−１０Ａ
クロマトパック：
カラム：Ｓｈｉｍ−Ｐａｃｋ  ＳＣＲ−１０２Ｈ  ３００×８ｍｍ（内径）（島津製作所）
移動相：
５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸
流速：０．８ｍＬ／分
温度：４５℃
分析時間：４０分
検出：ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ
検出はポストカラム緩衝化法による
緩衝液：５ｍＭ  ｐ−トルエンスルホン酸および１００μＭ  ＥＤＴＡ含有、２０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ溶液
流速：０．８ｍＬ／分
Ｐｏｌａｒｉｔｙ：＋
Ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ｓｌｏｗ
検体は、試料２．０ｍｇを２０００μＬのｍｉｌｌＱ水に溶解し、さらにこれを０．４５μｍメンブレンフィルターにて濾過して調製した。インジェクション量は１０μＬであった。
ＨＰＬＣの結果、画分ｆｒ１−２〜１−３のピークが得られた。得られたピークを標準液チャートのピークと比較して成分およびその含有量を決定した。標準液チャートの作成のために以下の有機酸の標準液を用い、１０μＬをインジェクトした：リン酸（５４６．９ｍｇ／Ｌ）、クエン酸（２２０．６ｍｇ／Ｌ）、リンゴ酸（２２０．４ｍｇ／Ｌ）、コハク酸（２９８．８ｍｇ／Ｌ）乳酸（６０６．０ｍｇ／Ｌ）、酢酸（５７５．９ｍｇ／Ｌ）、ピログルタミン酸（２８８．５ｍｇ／Ｌ）、ピルビン酸（２１８．４ｍｇ／Ｌ）。この結果、ｆｒ１−２〜１−３の１ｍｇ中にコハク酸０．６９３ｍｇ、ピログルタミン酸０．０６８ｍｇ、およびピルビン酸０．０１４ｍｇが含まれていることが判明した（約２５％存在する残余分は不明）。さらに、上記実施例１に記載の手順に従って、コハク酸、ピログルタミン酸、およびピルビン酸のα−グルコシダーゼ活性に対する影響を調べたところ、これらがグルコシダーゼ阻害活性を有することを確認した（コハク酸：ＩＣ５０  ４．９９ｍｇ／ｍＬ、およびピログルタミン酸：ＩＣ５０  ７．３８ｍｇ／ｍＬ、ピルビン酸：ＩＣ５０  ４．８４ｍｇ／ｍＬ）。
（実施例７：焼酎残渣もろみの種々の糖分解酵素の活性に対する影響）
（７−１．インベルターゼ（スクラーゼ）阻害活性）
検体溶液を、製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分１００ｍｇ／ｍＬに０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）（以下の溶液においても溶媒として使用）を加えて種々の濃度に調整した。基質として５％スクロース溶液をそして酵素液として０．５Ｕ／ｍＬインベルターゼを用いた。
基質０．２ｍＬ、酵素液０．１ｍＬ、および検体溶液０．２ｍＬを混合して３７℃にて１５分間インキュベートした。その後、９０℃以上での水浴で１０分間加熱し、反応を停止させた。反応後の液から０．０５ｍＬを採り、発色試薬（グルコースＣＩＩテストワコー；和光純薬）３．０ｍＬを加え、混和後、３７℃にて５分間インキュベートし、分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ）にて５０５ｎｍで吸光度を測定した。測定はすべて２回で行った。その結果、検体溶液の濃度の増大と共に酵素活性の阻害が見られた。検体溶液の濃度が４０ｍｇ／ｍＬの場合、阻害率は約７０％程度であった。
（７−２．α−アミラーゼ阻害活性）
アミラーゼ測定キット（キッコーマン社）を用いて、プロトコルを以下のように改変して、α−アミラーゼ阻害活性を測定した。検体溶液は、製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分１００ｍｇ／ｍＬに１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）（以下の溶液においても溶媒として使用）を加えて種々の濃度に調整した。基質として２−クロロ−４−ニトロフェニル−６−アジド−６−デオキシ−β−マルトペンタオシドの溶液、発色用酵素液としてグルコアミラーゼおよびβ−グルコシダーゼの溶液、試験酵素液として０．２８Ｕ／ｍＬのアスペルギルス・オリゼα−アミラーゼ溶液を調製した。
まず、基質溶液２５μＬと発色用酵素液２５μＬとをプレートにいれ、次いで検体溶液２５μＬを添加し、次いで、試験酵素液のα−アミラーゼ溶液２５μＬを添加し、３７℃にて１５分間インキュベートした。その後、炭酸ナトリウム溶液１００μＬを添加して反応を停止させた。分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ）にて、プレートリーダーのフィルターは４０５ｎｍを用いて４００ｎｍで吸光度を測定した。測定はすべて２回で行った。
その結果、検体溶液の濃度の増大と共に酵素活性の阻害が見られた。対照として用いたアカルボース（商品名グルコバイ（登録商標）；バイエル）は、０．００３ｍｇ／ｍＬの濃度で約５０．５１％のα−アミラーゼ活性阻害率を示した。検体溶液では５ｍｇ／ｍＬの濃度で約４３％の阻害率であった。アカルボースに比較すると、α−アミラーゼ阻害活性は著しく低かった。
（実施例８：焼酎残渣もろみの食後血糖値への影響）
焼酎残渣もろみの食後血糖値への影響を調べるに際してボランティアを募集し、２０歳以上５０歳未満の男女７名を登録した（男性１名；女性６名；全員の平均年齢３３．４±６．６歳）。登録にあたっては糖尿病の既往歴がないことおよび試験時に特別な疾病等を有していないことを条件とし、責任医師による総合診断を受けた。ここで、特別な疾病等とは、１）重篤な肝・腎・心機能障害、２）薬剤過敏体質、３）判断能力に欠ける精神障害や意識障害、４）妊婦、授乳婦および本試験中に妊娠する計画のある者、５）その他、担当医が本試験に不適当と判断した者を指す。
被験物質は、製造例１の麦焼酎残渣もろみの分子量６０００以下の画分を用いた。被験者は、試験開始前１０時間絶食し（自由飲水）、試験開始に際して２５ｇのスクロース（和光純薬株式会社）負荷と同時に、０ｇ（対照）、０．１ｇまたは０．５ｇの被験物質を服用投与した。スクロース負荷および被験物質投与前、被験物質投与３０分後および６０分後の血糖値を測定した。また、０ｇ投与時（対照）および０．５ｇ投与時には、投与前および投与後３０分に血液検査用の採血も実施した。なお、各試験の間は２４時間以上の間隔で行うものとし、被験者への過剰な摂食抑制は避けた。
全ての検査項目について、平均値および標準偏差を求め、投与前後の差はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ検定を行った。なお、有意差検定はいずれの場合も有意差水準は５％以下とした。
用量作用に関する血糖値についての結果を図６に示す。図６では、測定値を、スクロース負荷前の血糖値を１００％とした相対値で表す。図中、黒丸は対照、三角は被験物質０．１ｇ投与、そして白丸は被験物質０．５ｇ投与を表す。２５ｇスクロースの負荷によって、被験物質の０ｇ投与（対照）では、３０分後には血糖値は３０％程度上昇し、６０分後でも１０％以上上昇したままであった。これに対して、被験物質０．１ｇ投与では、投与３０分後および６０分後共に、対照よりも有意に低い値を示した（Ｐ＜０．０５）。被験物質の量を０．５ｇまで増加させたが、０．１ｇの場合と差は生じなかった。これは、血糖上昇レベルが、０．１ｇ投与で１０％増加程度まで抑えられていることから、用量作用関係が見え難くなっているためと考えられる。
上記図６の試験とは異なった日に、被験物質０ｇ投与時（対照）および０．５ｇ投与時における血糖値の経時変化を測定した。その結果を、スクロース負荷前の血糖値を１００％とした相対値に換算して図７に示す。図中、黒丸は対照、そして白丸は被験物質０．５ｇ服用を表す。投与３０分後では、２５ｇスクロースの負荷によって生じた約３０％の血糖上昇が、被験物質０．５ｇ投与によって１６％程度まで減少した。ただし、両群の間に統計的有意差は観察されなかった。なお、両群とも投与後１２０分では血糖値は空腹時レベル（スクロース負荷前）まで戻った。
さらに、被験物質０ｇ投与時（対照）および０．５ｇ投与時に、投与前および投与後３０分の時点でそれぞれ採血を行い、血中インスリン濃度を測定した。その結果を図８に示す。２５ｇスクロース負荷によって血中インスリン濃度は上昇したが、このインスリン濃度上昇には、被験物質は影響を与えなかった。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のα−グルコシダーゼ阻害剤は、糖尿病およびその合併症の治療または予防のために有用である。また、本発明によれば、環境上の問題が議論されてきた、焼酎の製造において通常廃棄される焼酎残渣もろみを有効利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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