(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝臓の炎症を予防および／または治療するための医薬の製造における、カスパーゼ−８またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくは塩の使用であって、前記ムテインがカスパーゼ−８の配列と少なくとも９０％の同一性または相同性を有し、カスパーゼ−８と同じ活性を有する同類アミノ酸置換されたムテインであり、前記融合タンパク質がイムノグロブリンとの融合タンパク質であり、および、前記機能的誘導体がポリエチレングリコール側鎖、カルボキシル基の脂肪族エステル、カルボキシル基のアミド、アミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体およびアミノ酸残基の遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む誘導体である使用。
【請求項２】
カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が、肝細胞において下方調節される請求項１記載の使用。
【請求項３】
炎症が肝臓の損傷後に現れる請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
損傷が肝臓切除により引き起こされる請求項３記載の使用。
【請求項５】
カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が下方調節される肝細胞を含む肝臓に発現し、該肝臓の損傷後に現れる、肝臓の炎症を予防および／または治療するための医薬の製造における、カスパーゼ−８またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくは塩の使用であって、前記ムテインがカスパーゼ−８の配列と少なくとも９０％の同一性または相同性を有し、カスパーゼ−８と同じ活性を有する同類アミノ酸置換されたムテインであり、前記融合タンパク質がイムノグロブリンとの融合タンパク質であり、および、前記機能的誘導体がポリエチレングリコール側鎖、カルボキシル基の脂肪族エステル、カルボキシル基のアミド、アミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体およびアミノ酸残基の遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む誘導体である使用。
【請求項６】
細胞内病原体により引き起こされる感染を治療するための医薬の製造における、カスパーゼ−８またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくは塩の使用であって、前記ムテインがカスパーゼ−８の配列と少なくとも９０％の同一性または相同性を有し、カスパーゼ−８と同じ活性を有する同類アミノ酸置換されたムテインであり、前記融合タンパク質がイムノグロブリンとの融合タンパク質であり、および、前記機能的誘導体がポリエチレングリコール側鎖、カルボキシル基の脂肪族エステル、カルボキシル基のアミド、アミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体およびアミノ酸残基の遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む誘導体であり、前記細胞内病原体がリステリア属（Listeria）である使用。
【請求項７】
感染が、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が下方調節される細胞を含む肝臓に現れる請求項６記載の使用。
【請求項８】
細胞が肝細胞である請求項７記載の使用。
【請求項９】
リステリア属がリステリア  モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）である請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が下方調節される細胞を含む肝臓において現れ、細胞内病原体により引き起こされる感染を治療するための医薬の製造における、カスパーゼ−８またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体もしくは塩の使用であって、前記ムテインがカスパーゼ−８の配列と少なくとも９０％の同一性または相同性を有し、カスパーゼ−８と同じ活性を有する同類アミノ酸置換されたムテインであり、前記融合タンパク質がイムノグロブリンとの融合タンパク質であり、および、前記機能的誘導体がポリエチレングリコール側鎖、カルボキシル基の脂肪族エステル、カルボキシル基のアミド、アミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体およびアミノ酸残基の遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体を含む誘導体であり、前記細胞内病原体がリステリア属（Listeria）である使用。
【請求項１１】
創傷または損傷した肝臓の治癒を円滑化または増進するための医薬の製造における、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、カスパーゼ−８特異的アンチセンスｍＲＮＡ、カスパーゼ−８特異的低分子干渉ＲＮＡおよび抗−カスパーゼ−８抗体より選択されるカスパーゼ−８阻害剤である使用。
【請求項１２】
創傷または損傷が、肝臓切除後に現れる請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
創傷または損傷が、外科的手術、咬傷、スポーツ事故、事故、肝臓切除および切断より選択される身体的外傷後に現れる請求項１１または１２記載の使用。
【請求項１４】
損傷した肝臓の創傷治癒を円滑化または増進するための医薬の製造における、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、カスパーゼ−８特異的アンチセンスｍＲＮＡ、カスパーゼ−８特異的低分子干渉ＲＮＡおよび抗−カスパーゼ−８抗体より選択されるカスパーゼ−８阻害剤である使用。
【請求項１５】
カスパーゼ−８の阻害剤が、数時間から１、２、３日間および４日未満の間使用される請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
損傷した肝臓の治癒を円滑化または増進するための医薬の製造における、炎症阻害剤と組み合わせてのカスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の阻害剤の使用であって、前記阻害剤が、カスパーゼ−８特異的アンチセンスｍＲＮＡ、カスパーゼ−８特異的低分子干渉ＲＮＡおよび抗−カスパーゼ−８抗体より選択されるカスパーゼ−８阻害剤である使用。
【請求項１７】
損傷が肝臓切除後に現れる請求項１５記載の使用。
【請求項１８】
肝臓の１／３が切除される請求項１６または１７記載の使用。
【請求項１９】
肝臓の２／３が切除される請求項１６または１７記載の使用。
【請求項２０】
炎症阻害剤が、免疫細胞を阻害することができる薬剤である請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
免疫細胞がマクロファージである請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
マクロファージがクッパー細胞である請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
炎症阻害剤がカスパーゼ−８の阻害剤の後に投与される請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
炎症阻害剤が、肝臓切除後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１日および／または１２日に投与される請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
カスパーゼ−８が、４日間以上５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６日間まで、および肝臓切除の１ヵ月後まで投与される請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
炎症阻害剤が塩化ガドリニウムを含む請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内病原体による感染、炎症および創傷治癒におけるカスパーゼ−８の調節的役割に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカインプロテアーゼのカスパーゼファミリーは、主に動物細胞のアポトーシス誘導におけるその中心的役割で知られている（Shiら、2002）。カスパーゼには、タンパク質分解部分の上流に位置する「プロドメイン（prodomain）」領域を特徴とし、アポトーシスを開始する役割を果たすものがある。それらのカスパーゼは、そのプロドメインの死−誘導受容体へのまたはこういった受容体に関連するアダプタータンパク質への結合に際して活性化され、一度活性化するとカスパーゼファミリーの他のメンバーを切断し、それによりそれらを活性化する。カスパーゼ−８（以前はＭＡＣＨ／ＦＬＩＣＥ／Ｍｃｈ４として知られていた）は、ＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの受容体のシグナル伝達複合体中で活性化されるイニシエーターカスパーゼであり、Ｆａｓ−関連デスドメイン（ＦＡＤＤ；ＭＯＲＴ１とも呼ばれる）とよばれるアダプタータンパク質へのカスパーゼ８プロドメインの結合により召集される（Boldinら、1996、Muzioら、1996およびWallachら、1999）。カスパーゼ−８の活性化は、これらの受容体により誘導されるアポトーシス死の機序（外因性細胞死経路）において決定的な開始事象となる（Varfolomeevら、1998）。カスパーゼ−８およびＦＡＤＤの両方ともが、いまだ知られていない機序によって多様な非アポトーシス細胞過程に寄与している（たとえば、Varfolomeevら、1998、Zhangら、1998、Walshら、1998，Newtonら、1998、Alamら、1999、Kennedyら、1999、Chunら、2002、Sakamakiら、2002、Salmenaら、2003、Kangら、2004、Suら、2005およびBeisnerら、2005参照）。
【０００３】
インビボでのカスパーゼ−８の働きは、多くの遺伝子導入マウスモデルを用いて探求されているが（Varfolomeevら、1998、Salmenaら、2003、Kangら、2004およびBeisnerら、2005）、いまだその酵素の生理学的または病態生理学的重要性についてはほとんど知られていない。
【発明の概要】
【０００４】
一側面での本発明は、皮膚以外の組織または器官の炎症を予防および／または治療するための医薬の製造における、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤および（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤の使用に関する。
【０００５】
他の側面での本発明は、皮膚以外の組織または器官の炎症を予防および／または治療する方法であって、必要とする患者に治療的に有効量の、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤および（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤を投与することを含む方法に関する。
【０００６】
一実施態様では、組織または器官はカスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が、下方調節される細胞を有する。
【０００７】
さらなる実施態様では、炎症が組織または器官切除により引き起こされる該組織または器官の損傷後に現れる。
【０００８】
他のさらなる実施態様では、器官が肝臓であり、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が肝細胞において下方調節される。
【０００９】
また他のさらなる実施態様では、炎症性疾患、障害または症状には、肝炎、炎症性腸疾患、脈管炎、関節炎症、静脈洞炎、強膜炎、歯周炎、子宮頚炎、ブドウ膜炎、外陰膣炎、結膜炎、肺胞炎、食道炎、急性糸球体腎炎、腎炎、急性気管支炎、急性胆嚢炎、膵炎および耳感染が含まれるが、これに限定されない。
【００１０】
本発明は、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が下方調節される細胞を含む組織または器官に発現し、該組織または器官の損傷後に現れる、皮膚以外の組織または器官の炎症を予防および／または治療するための医薬の製造における、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤および（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤の使用を提供する。
【００１１】
また、本発明は、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が下方調節される細胞を有する組織または器官に発現し、該組織または器官の損傷後に現れる、皮膚以外の組織または器官の炎症を予防および／または治療する方法であって、必要とする患者に治療的に有効量の、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤および（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤を投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
さらなる側面での本発明は、細胞内病原体により引き起こされる感染を治療するための医薬の製造における、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤および（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤の使用に関する。
【００１３】
またさらなる一側面での本発明は、細胞内病原体により引き起こされる感染を治療する方法であって、必要とする患者に治療的に有効量の（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤および（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤を投与することを含む方法に関する。
【００１４】
本発明の一実施態様では、細胞内病原体には、ミコバクテリア属（Mycobacteria）、リステリア属（Listeria）、リーシュマニア属（Leishmania）、レジオネラ属（Legionella）、サルモネラ属（Salmonella）およびウイルスが含まれるが、これに限定されない。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様では、感染が、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が下方調節される細胞を含む組織または器官に現れる。
【００１６】
本発明のまたさらなる実施態様では、感染が肝臓に現れる。
【００１７】
本発明のまたまたさらなる実施態様では、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が下方調節される細胞が肝細胞である。
【００１８】
本発明のまたまたさらなる実施態様では、感染がたとえばリステリア  モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）などのリステリア属により引き起こされる。
【００１９】
本発明の一実施態様では、細胞内病原体がウイルスであり、したがって本発明はウイルス性感染などの疾患に関する。
【００２０】
またまたさらなる側面では、本発明はカスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が下方調節される細胞を含む組織または器官において現れ、細胞内病原体により引き起こされる感染を治療するための医薬の製造における、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤および（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤の使用に関する。
【００２１】
またまたさらなる側面では、本発明はカスパーゼ−８のレベルおよび／または活性が下方調節される細胞を有する器官または組織において現れ、細胞内病原体により引き起こされる感染を治療する方法であって、必要とする患者に治療的に有効量の、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤および（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤を投与することを含む方法に関する。
【００２２】
本発明の目的は、創傷または損傷した組織または器官の治癒を円滑化または増進するための医薬の製造における、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の阻害剤の使用を提供することである。
【００２３】
本発明の他の目的は、創傷または損傷した組織または器官の治癒を円滑化または増進する方法であって、必要とする患者に治療的に有効量のカスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の阻害剤を投与することを含む方法を提供することである。
【００２４】
本発明の一実施態様では、創傷または損傷が、組織または器官切除後に現れる。
【００２５】
本発明のさらなる実施態様では、器官が肝臓である。
【００２６】
本発明のまたさらなる実施態様では、創傷または損傷が、外科的手術、咬傷、スポーツ事故、事故、組織または器官切除および切断を含まれるが、これに限定されない身体的外傷後に現れる。
【００２７】
本発明の他の目的は、損傷した肝臓の創傷治癒を円滑化または増進するための医薬の製造における、カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の阻害剤の使用を提供することである。
【００２８】
本発明の他のさらなる目的は、損傷した肝臓の創傷治癒を円滑化または増進する方法であって、必要とする患者に治療的に有効量のカスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の阻害剤を投与することを含む方法を提供することである。
【００２９】
本発明のある実施態様では、カスパーゼ−８阻害剤には、アンチセンスｍＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、カスパーゼ−８特異的抗体および阻害低分子が含まれるが、これに限定されない。
【００３０】
本発明のさらなる実施態様では、阻害低分子がＺ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫなどの１００〜５０００ダルトンの分子量を有する低分子である。
【００３１】
本発明の他のさらなる目的は、損傷した肝臓の治癒を円滑化または増進するための医薬の製造における、炎症阻害剤と組み合わせてのカスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の阻害剤の使用を提供することである。
【００３２】
本発明の一実施態様では、損傷が肝臓切除後に現れる。
【００３３】
本発明のさらなる実施態様では、肝臓の１／３が切除される。
【００３４】
本発明の他のさらなる実施態様では、肝臓の２／３が切除される。
【００３５】
本発明の他のさらなる実施態様では、カスパーゼ−８阻害剤が、カスパーゼ−８特異的アンチセンスｍＲＮＡ、カスパーゼ−８特異的低分子干渉ＲＮＡ、抗−カスパーゼ−８抗体およびカスパーゼ−８阻害低分子より選択される。
【００３６】
本発明の他のさらなる実施態様では、阻害低分子が１００〜５０００ダルトンの分子量を有する。
【００３７】
本発明の他のさらなる実施態様では、阻害低分子がＺ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫである。
【００３８】
本発明の他のさらなる実施態様では、炎症阻害剤が、マクロファージ、たとえばクッパー細胞などの免疫細胞を阻害することができる薬剤である。
【００３９】
本発明の他のさらなる実施態様では、炎症阻害剤がカスパーゼ−８の阻害剤の後に投与される。
【００４０】
本発明の他のさらなる実施態様では、炎症阻害剤が、肝臓切除後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１日または１２日に投与される。
【００４１】
本発明の他のさらなる実施態様では、炎症阻害剤が塩化ガドリニウムを含む。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１−１】肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損のリステリア  モノサイトゲネス感染への効果を示す。全ての図において、黒棒はＣａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（正常肝細胞を有する）を表し、空の棒はＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（カスパーゼ−８欠損肝細胞を有する）を表す。感染後２４時間の、致死量以下での感染の後のマウス脾臓および肝臓から回復した生存リステリア生物。各時点でのＦ／＋またはＦ／−マウスの各群において、少なくとも５匹のマウスが含まれた。
【図１−２】肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損のリステリア  モノサイトゲネス感染への効果を示す。全ての図において、黒棒はＣａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（正常肝細胞を有する）を表し、空の棒はＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（カスパーゼ−８欠損肝細胞を有する）を表す。感染後６日の、致死量以下での感染の後のマウス脾臓および肝臓から回復した生存リステリア生物。各時点でのＦ／＋またはＦ／−マウスの各群において、少なくとも５匹のマウスが含まれた。
【図１−３】肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損のリステリア  モノサイトゲネス感染への効果を示す。全ての図において、黒棒はＣａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（正常肝細胞を有する）を表し、空の棒はＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（カスパーゼ−８欠損肝細胞を有する）を表す。感染後１４日の、致死量以下での感染の後のマウス脾臓および肝臓から回復した生存リステリア生物。各時点でのＦ／＋またはＦ／−マウスの各群において、少なくとも５匹のマウスが含まれた。
【図１−４】肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損のリステリア  モノサイトゲネス感染への効果を示す。（Ｄ〜Ｉ）リステリア感染後、６日および１４日のＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−ＣｒｅおよびＣａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス由来の肝臓切片の組織学的分析。（Ｄ、Ｅ）感染後６日の肝臓のＨ＆Ｅ染色、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓における白血球の蓄積を明示している（矢印）。（Ｆ、Ｇ）Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓の感染後１４日（Ｇ）では、大きな壊死性欠損がみられるが、一方、対照の肝臓では正常である（Ｆ）。ＤからＧの倍率（×２００）。（Ｈ、Ｉ）感染後１４日の肝臓の抗−Ｋｉ６７免疫染色、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅにおいては肝細胞の多数の増殖が明示されたが、Ｃａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅ肝臓では明示されなかった（Ｉ；茶色に染色された核）。倍率：×１００。
【図２Ａ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：早期増殖応答の減少を示す。ＰＨｘ後、早期（２日）および後期（１４日）の肝臓の抗−Ｋｉ６７免疫染色（茶色に染色された核）。倍率：×１００。
【図２Ｂ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：早期増殖応答の減少を示す。１／３ＰＨｘ後の種々の時点での肝細胞増殖、Ｋｉ６７に対する抗体（またはＢｒｄＵ；挿入画）で染色された肝細胞の数を決定することにより定量化され、Ａで示されるような、１０の高倍率視野（field）において数えられた。＊Ｐ＜．０５、＊＊Ｐ＜．０１。４つの独立した実験において、時点ごとに少なくとも８匹のマウスが試験された。
【図２Ｃ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：早期増殖応答の減少を示す。２／３ＰＨｘ後の種々の時点での肝細胞増殖、Ｋｉ６７に対する抗体で染色された肝細胞の数を決定することにより定量化され、Ａで示されるような、１０の高倍率視野において数えられた。＊Ｐ＜．０５、＊＊Ｐ＜．０１。４つの独立した実験において、時点ごとに少なくとも８匹のマウスが試験された。
【図２Ｄ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：早期増殖応答の減少を示す。１／３ＰＨｘ（左パネル）および２／３ＰＨｘ（右パネル）後の異なる時点での、肝臓における種々のＧ１／Ｓ−移行関連タンパク質（サイクリンＡ，サイクリンＥ，リン酸化網膜芽腫タンパク質）の量。各時点で少なくとも４匹のマウスにおいて行われた試験を代表する結果が示された。
【図２Ｅ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：早期増殖応答の減少を示す。上のパネル、１／３ＰＨｘ後２日の抗−サイクリンＤ１免疫染色。倍率：×４００。下のパネル、サイクリンＤ１の増加の定量、１／３ＰＨｘ後２日および４日、（上のパネルで示されたように）抗−サイクリンＤ１抗体で染色された肝細胞を、１５の高倍率視野で数えることにより決定された。
【図３Ａ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：一連のＭＲＩスキャニングおよび組織学的分析により評価された、病変部位および残りの肝臓組織における体積回復への異なる効果を示す。ＰＨｘ後４日に得られた、肝臓の代表的軸方向Ｔ1強調スピン−エコー画像。Ｃａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓の代表的画像。破線は虚血域の輪郭を描く。矢印は、縫合材料を示す。
【図３Ｂ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：一連のＭＲＩスキャニングおよび組織学的分析により評価された、病変部位および残りの肝臓組織における体積回復への異なる効果を示す。ＰＨｘ後４日に得られた、肝臓の代表的軸方向Ｔ1強調スピン−エコー画像。Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓の代表的画像。矢印は、縫合材料を示す。
【図３Ｃ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：一連のＭＲＩスキャニングおよび組織学的分析により評価された、病変部位および残りの肝臓組織における体積回復への異なる効果を示す。ＰＨｘ後の異なる時点での、ＰＨｘ前肝臓体積のパーセンテージで表現された虚血域の体積、対照におけるよりもＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスで病変部位のサイズがより速く減少することが明示されている。各時点での各群において、少なくとも８匹のマウスが調査された。
【図３Ｄ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：一連のＭＲＩスキャニングおよび組織学的分析により評価された、病変部位欠損の領域および残りの肝臓組織における体積回復への異なる効果を示す。Ｃａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅ（■）およびＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅ（○）マウスにおけるＰＨｘ前のパーセンテージ（平均±ＳＤ）で表現されるＰＨｘ後の肝臓体積、冠状方向および軸方向ＭＲＩスキャンで評価され、カスパーゼ−８欠損マウスの肝臓のより速いサイズ増加および異常に大きいサイズを明示している。＊Ｐ＜．０５、＊＊Ｐ＜．０１。早期の時点では（１〜４日）、群あたり少なくとも８匹のマウスが調査され、後期の時点では群あたり少なくとも４匹のマウスが調査された。
【図３Ｅ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：一連のＭＲＩスキャニングおよび組織学的分析により評価された、病変部位および残りの肝臓組織における体積回復への異なる効果を示す。ＰＨｘ後２日のマウス肝臓の虚血域の組織学的分析を示す。上のパネル−ＰＨｘ後２日のＣａｓｐ８F/+Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓の虚血域のＨ＆Ｅ染色した切片。手術域において、肝実質の幽霊細胞および壊死［Ｎ］の大きな病巣がある。縫合材料［Ｓ］は、壊死性領域内にみられる。壊死性実質は浸潤白血球［Ｉ］の縁によって囲まれている。下のパネル、左−上のパネルの挿入部分で示された領域のＴＵＮＥＬ染色、この区域で見出された大量のアポトーシス（染色）を明示している。この領域の上方は、死んだ細胞および幽霊細胞であり（染色なし）、一方下方は生きた細胞（ＤＡＰＩ染色された核）である。下のパネル、右−創傷した肝実質の縁に位置する肝細胞の抗活性カスパーゼ−３免疫染色。細胞質と核の両方が染色されている。倍率：上のパネル×２０；下のパネル、左×１００；下のパネル、右×４００。
【図４Ａ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：早期灌流および血流力学的変化を示す。再生の間の肝臓における血流力学的変化は、機能的ＭＲＩによって評価された。ＭＲＩスキャンは、ＰＨｘ前およびＰＨｘ後４日に得られた（各時点で群あたりｎ＝４）。代表的ＭＲＩ画像、ΔＳｏ2およびΔＳｃｏ2写像。上列、ＰＨｘ前；下列、ＰＨｘ後４日。左欄、Ｔ1強調スピン−エコー画像（ＳＥ）；中欄、ΔＳｏ2写像；右欄、ΔＳｃｏ2写像。棒＝１ｃｍ。値は彩色棒に示される通り。
【図４Ｂ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：早期灌流および血流力学的変化を示す。再生の間の肝臓における血流力学的変化は、機能的ＭＲＩによって評価された。ＭＲＩスキャンは、ＰＨｘ前およびＰＨｘ後４日に得られた（各時点で群あたりｎ＝４）。Ｃａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅ（黒棒）およびＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウス（空の棒）における平均ΔＳｏ2およびΔＳｃｏ2値±ＳＤ、＊Ｐ＜．０２。
【図５Ａ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：持続的炎症および肝細胞増殖を示す。ＰＨｘ後４日および６日の肝臓のＦ４／８０免疫染色。倍率：×４００。
【図５Ｂ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：持続的炎症および肝細胞増殖を示す。材料および方法に記載されたような、正常肝臓のＰＨｘ後１４日のＨ＆Ｅ染色ならびに抗−Ｋｉ６７および抗−Ｆ４／８０抗体での免疫染色（Ｆ／＋、上）、カスパーゼ−８欠損肝臓（Ｆ／−、中、同一肝臓における異なる領域を示している）、および塩化ガドリニウムで処置されたマウスのカスパーゼ−８欠損肝臓（ＧｄＣｌ、下）。Ｈ＆Ｅ染色の倍率、×４００；抗−Ｋｉ６７抗体での免疫染色、×２００；および抗−Ｆ４／８０抗体での免疫染色、×１００。
【図５Ｃ】ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：持続的炎症および肝細胞増殖を示す。上のパネル、ＰＨｘ後１４日の肝臓におけるＳＴＡＴ−３のリン酸化のウェスタンブロッティング分析。下のパネル、ＰＨｘ後の示した時間での肝臓のｐ−ＳＴＡＴ３免疫染色。倍率：主パネルでは、×２００；挿入画では、×４００。黒矢印、マクロファージ；白矢印、肝細胞。
【図６Ａ】ＰＨｘ後の後期におけるカスパーゼ−８欠損肝細胞の増殖の増加は、炎症の次であることを示す。ＭＲＩスキャンで評価されたような、ＰＨｘ後１４日目の肝臓体積に対する塩化ガドリニウム処置の効果。各群において少なくとも４匹のマウスが試験された。＊Ｐ＜．０５；＊＊Ｐ＜．０１。
【図６Ｂ】ＰＨｘ後の後期におけるカスパーゼ−８欠損肝細胞の増殖の増加は、炎症の次であることを示す。抗−Ｋｉ６７抗体により染色され、１０の高倍率視野内の染まった核を数えることにより評価された、ＰＨｘ後１４日目の肝細胞増殖に対する塩化ガドリニウム処置の効果。各群において少なくとも４匹のマウスが試験された。＊Ｐ＜．０５；＊＊Ｐ＜．０１。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明にしたがって、カスパーゼ−８が細胞内病原体による肝臓感染、炎症および治癒において調節的役割を有することが見出された。したがって、本発明は細胞内病原体により引き起こされる感染の治療、炎症の治療および創傷の治癒の円滑化のためのカスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の調節に関する。
【００４４】
本発明は、肝細胞におけるカスパーゼ−８の欠損の肝機能への効果を調査する間に得られた知見に基づいている。本発明により、肝細胞におけるカスパーゼ−８の欠損は、細胞内病原体リステリア  モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）による感染に対するマウスの耐性を危うくすること、部分肝切除（ＰＨｘ）は、肝細胞にカスパーゼ−８が存在しない場合、慢性炎症段階の兆候を伴うこと、肝細胞にカスパーゼ−８が存在しないことが肝臓の外傷の早急な治癒を促進することが発見された。
【００４５】
ヒト損傷肝臓の性質は、実施例部分に記載するように、肝臓の中間葉の摘出（３０％ＰＨｘ）または中間、左および右上葉摘出（７０％ＰＨｘ）によるマウスの部分肝切除（ＰＨｘ）からなる関連実験的動物モデルにより模倣可能であった。本発明により、肝細胞におけるカスパーゼ−８の欠損が、肝臓損傷後の肝臓再生に幾通りかの方法で影響することがＰＨｘモデルを用いて見出された。たとえば、カスパーゼ−８が存在しない場合に、より早急にＰＨｘにおける外傷が治癒する。外傷治癒の改善は、損傷誘導直後、ＰＨｘ後約２日および４日に観察された。これらの発見を考慮すると、本発明の一側面は、器官または組織における外傷、損傷または創傷の治癒を促進または円滑化するためのカスパーゼ−８の活性および／またはレベルの阻害に関する。一実施態様では、本発明はカスパーゼ−８の活性および／またはレベルを阻害することにより、虚血性外傷の回復を改善することに関する。本発明は、特に創傷または損傷した組織または器官の治癒を円滑化または増進するためのカスパーゼ−８レベルおよび／または活性の阻害剤の使用に関する。創傷および損傷は、外科的手術、咬傷、スポーツ事故、事故、組織または器官切除および切断を含むが、これに限定されない身体的外傷により引き起こされ得る。
【００４６】
カスパーゼ−８の阻害剤は、器官または組織切除前、中または後の外科的方法において使用され得る。術後のカスパーゼ−８の阻害処理は、肝臓の術後外傷の治癒に有利な効果を有し得る。
【００４７】
本発明では、治癒を増進および／または円滑化するための組織切除前、中および／または後のカスパーゼ−８の阻害剤の使用を検討する。本発明の一実施態様では、カスパーゼ−８の阻害は組織切除前に行われる。
【００４８】
本発明にしたがって、カスパーゼ−８阻害の創傷治癒に対する有利な効果は、炎症兆候の前に、部分肝切除により引き起こされる損傷後、初期とすでに数日経た後とに検出された（図３Ｄ）。したがって、カスパーゼ−８の阻害剤は、損傷および／または器官切除前、中または後の短期間に有利に投与され得る。たとえば、カスパーゼ−８阻害剤は、創傷治癒を増進するために数時間から１、２、３日間および４日未満の間適用され得る。カスパーゼ−８の阻害剤は、創傷治癒を増加させるため１０〜６０分間、１０、２０、３０もしくは４５分間以上または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間まで使用することができる。
【００４９】
本発明にしたがって、クッパー細胞の機能を妨害しその除去を誘導する塩化ガドリニウム（ＧｄＣｌ）の注射は、結果として遅延した肝細胞増殖を制止させ、肝細胞において長期にカスパーゼ−８が存在しない場合に生じる肝腫を予防する。ＰＨｘ後すぐに促進される肝細胞増殖が減少せず、むしろＧｄＣｌ処理により増強されるという事実を考慮すると、この遅延した肝細胞増殖の制止は特に驚くべきことである。よって、カスパーゼ−８阻害剤を用いた損傷した組織のより長時間の治療には、カスパーゼ−８阻害剤と抗炎症剤または炎症細胞の蓄積を除去することができる薬剤を併用することが有益であり得る。たとえば、カスパーゼ−８の阻害剤は、創傷の治癒、損傷からの組織の回復および／または組織再生の円滑化のために、塩化ガドリニウムなどの抗炎症剤と共に、４日間までまたはより長く、たとえば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６日間および１ヵ月間まで投与することができる。
【００５０】
カスパーゼ−８の阻害剤のみで、または抗炎症剤もしくは炎症細胞の蓄積を除去しうる剤と共に、損傷した肝臓の治癒、損傷からの肝臓の回復および／または肝臓の再生を円滑化するために、たとえば悪性腫瘍、転移または硬変域が肝臓から除去または切除された場合において、使用することができる。
【００５１】
生存ドナーと患者間の肝臓提供には、移植片とレムナント肝臓のどちらも提供者および／または移植者の生命を支持するには小さ過ぎるので問題がある。概して、移植片の体重に対する割合が０．８以上であると安全なようである（Leeら、2004）。カスパーゼ−８の阻害のみ、または抗炎症剤もしくは炎症細胞の蓄積を除去することができる薬剤を併用する阻害は、ドナーの肝臓における現在の安全限界より小さい肝臓塊にまで、肝臓切除をさらに拡大することを可能にし得る。
【００５２】
本発明は、創傷部位において全身的におよび／または局所的に投与されるカスパーゼ−８の阻害剤の使用を検討する。
【００５３】
「カスパーゼ−８の阻害剤」という用語は、本発明の文脈では、カスパーゼ−８産生および／または作用が軽減、減少または部分的に、実質的にもしくは完全に予防もしくは防害されるように、カスパーゼ−８産生および／または作用を調節する任意の分子をいう。用語「カスパーゼ−８阻害剤」は、カスパーゼ−８産生の阻害剤およびカスパーゼ−８作用の阻害剤を含むことを意味する。カスパーゼ−８の阻害剤は、たとえば肝細胞を標的とし得る（以下参照）。
【００５４】
産生の阻害剤は、カスパーゼ−８の合成、プロセシングまたは成熟に否定的に影響する任意の分子であり得る。本発明にしたがって、阻害剤はたとえば、カスパーゼ−８の遺伝子発現のサプレッサー、カスパーゼ−８ｍＲＮＡの転写を減少もしくは予防するため、またはｍＲＮＡの分解に導くためのアンチセンスｍＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ様低分子干渉ＲＮＡ（Hunterら、1975）、カスパーゼ−８の正確な折り畳みを害するタンパク質、一旦合成された場合、カスパーゼ−８を分解するプロテアーゼ、および活性なカスパーゼ−８を産出するためのプロカスパーゼ−８の開裂の阻害剤であり得ると考えられる。
【００５５】
カスパーゼ−８作用の阻害剤は、カスパーゼ−８のアンタゴニストであり得る。アンタゴニストは、充分な親和性および特異性でカスパーゼ−８分子自身に結合または分子を隔離し、部分的にまたは実質的にカスパーゼ−８を中和することができる。
【００５６】
カスパーゼ−８作用の阻害剤は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体などのカスパーゼ−８特異的抗体、またはカスパーゼ−８の標的への結合を防止することによりカスパーゼ−８が調節する反応の誘発を減少または防止する他の任意の薬剤または分子であり得る。
【００５７】
用語「タンパク質の阻害剤」は、本発明の文脈では、タンパク質の産生および／または作用を、該タンパク質の産生および／または作用を軽減、減少または部分的に、実質的にもしくは完全に予防もしくは妨害するような方法で、下方調節することができるタンパク質（たとえば、抗体）、ポリヌクレオチド（たとえば、アンチセンスおよび低分子干渉ＲＮＡ）および低分子阻害剤（small inhibitory molecule）などの任意の剤をいう。
【００５８】
低分子阻害剤は、１００〜５０００、２００〜５０００、２００〜２０００または２００〜１０００ダルトンの分子量の有機（炭素を含有する）または無機化合物であり得る。低分子は、代謝産物、代謝類似体、ペプチド、ペプチド類似体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、ヘテロ有機化合物および有機金属化合物を含むが、これに限定されるものではない。たとえば、カスパーゼ−８阻害低分子は、カスパーゼ結合を首尾よく競合するペプチドであり得る。ペプチドＷＥＨＤ、ＶＤＶＡＤおよびＤＥＶＤは、カスパーゼに結合するペプチドの例である。一定のアルデヒド、亜硝酸塩またはケトン化合物にカスパーゼ特異的ペプチドを連結することにより、カスパーゼ活性化の可逆的または不可逆的阻害剤を産出することが可能である。Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫなどのフルオロメチルケトン（ＦＭＫ）誘導ペプチドは、効果的な不可逆的阻害剤として作用する。Ｎ−末端およびＯ−メチル側鎖にベンジルオキシカルボニル基（ＢＯＣまたはＺとして知られる）を有するよう合成された阻害剤は、細胞透過性の増強を示し、それによりインビボでの使用を円滑化する。
【００５９】
カスパーゼ−８の阻害剤の例は、（ｉ）ｃＦＬＩＰショート（ＣＡＳＨベータ）、（ii）ｃＦＬＩＰロング（ＣＡＳＨアルファ）、（iii）カスパーゼ−８およびカスパーゼ−１０関連ＲＩＮＧタンパク質（ＣＡＲＰｓ、McDonald ER 3rd，El-Deiry WS，Proc Natl Acad Sci USA．2004 Apr 20；101（16）:6170-5）、ならびにＩＥＴＤ−ＦＭＫ（R&D Systems Cat No. FMK007）などのカスパーゼ−８の化学的阻害剤を含むが、これらに限定されるものではない。
【００６０】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、キメラ抗体、可溶型または結合型において標識され得る抗体に対する抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、およびヒト化抗体、ならびに酵素的開裂、ペプチド合成または組換え技術などの、しかしこれらに限定されない公知技術により得られるそれらの断片を含むことを意味する。
【００６１】
モノクローナル抗体は、実質的に類似のエピトープ結合部位を有する、抗原に特異的な抗体の実質的に均質な集団を含包する。Ｍａｂｓは当業者に公知の方法により、得られ得る。たとえば、KohlerおよびMilstein, Nature, 256:495-497（1975）；米国特許第４，３７６，１１０号明細書；Ausubelら編、HarlowおよびLane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory（1988）；およびColliganら編、Current Protocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.およびWiley Interscience N. Y.、（1992-1996）参照、これら参考文献の内容は、本明細書中に参考文献により完全に組み込まれている。これら抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤを含む任意の免疫グロブリン類およびその任意の下位分類であり得る。本発明のｍＡｂを産出するハイブリドーマは、インビトロ、インサイチュまたはインビボで培養され得る。インビボまたはインサイチュでの高力価のＭａｂｓの産出は、現在好ましい産出方法である。
【００６２】
キメラ抗体は、マウスのＭａｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子などの、異なる部分が異なる動物種由来の分子である。キメラ抗体は、たとえばマウスＭａｂｓがハイブリドーマからのより高い産出高を有するが、ヒトにおいて免疫原性がより高い場合にヒト／マウスキメラＭａｂｓが使用されるように、主に適用において免疫原性を減じるためおよび産出において産出高を増加させるために使用される。キメラ抗体およびその産出方法は、その技術分野において公知である（Cabillyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277（1984）；Morrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81：6851-6855（1984）；Boulianneら、Nature 312:643-646（1984）；Cabillyら、欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書（１９８４年１１月１４日公開）；Neubergerら、Nature 314:268-270（1985）；Taniguchiら、欧州特許出願公開第１７１４９６号明細書（１９８５年２月１９日公開）；Morrisonら、欧州特許出願公開第１７３４９４号明細書（１９８６年３月５日公開）；Neubergerら、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット（１９８６年３月１３日公開）；Kudoら、欧州特許出願公開第１８４１８７号明細書（１９８６年６月１１日公開）；Sahaganら、J. Immunol. 137:1066-lO74（1986）；Robinsonら、国際公開第８７／０２６７１号パンフレット（１９８７年５月７日公開）；Liuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443（1987）；Sunら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218（1987）；Betterら、Science 240:1041-1043（1988）；Riechmannら、Nature 332:323-327、ならびにHarlowおよびLane、ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL、上記）。これらの参考文献は、参考文献により完全に本明細書に組み込まれている。
【００６３】
「完全ヒト化抗体」は、ヒト免疫グロブリンの可変および定常領域の両方を含んでいる分子である。完全ヒト化抗体は、自己免疫性疾患などの慢性および再発性疾患に繰り返しの治療が必要とされるような治療用途に潜在的に使用することができる。完全ヒト化抗体の１つの製造方法としては、マウス体液免疫システムの「ヒト化」、即ち内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスにヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）座を導入することにより、ヒトＩｇを産出できるマウス系統（ゼノマウス（Xenomice））を産出することからなる。Ｉｇ座は、その物理的構造、ならびに広い免疫応答を最終的に産出するために必要とされる、遺伝子再配列および発現過程の両方の点において非常に複雑である。抗体の多様性は、主にＩｇ座に存在する異なるＶ、ＤおよびＪ遺伝子間の組み合わせ再配列により発生する。これらの座は、抗体発現、対立遺伝子排除、クラススイッチおよび親和性成熟を制御する散在性制御エレメントも含有している。マウスへの非再配列ヒトＩｇ導入遺伝子の導入は、マウス組換え機構がヒト遺伝子に適合できることを立証した。さらに、様々なイソ型の抗原特異的ｈｕ−ｍＡｂｓを分泌するハイブリドーマは、抗原でゼノマウスに免疫性を与えることで得られる。
【００６４】
完全ヒト化抗体およびその製造方法は、その技術分野において公知である（Mendezら、Nature Genetics 15:146-156（1997）；Buggemannら、Eur. J. Immunol. 21:1323-1326（1991）；Tomizukaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727（2000）、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット。
【００６５】
ある分子に特異的に反応でき、それにより抗体にその分子を結合するモノクローナル抗体は、その分子に「結合できる」といわれる。用語「エピトープ」は、任意の分子の抗体により結合され得る部分を意味し、その抗体により認識することもできる。エピトープまたは「抗原決定基」は、通例アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グルーピングからなり、特異的３次元構造特性および特異的電荷特性を有する。
【００６６】
本発明にしたがって、カスパーゼ−８欠損肝細胞を有する肝臓の肝切除は、最終的に炎症を誘発し、したがって、カスパーゼ−８の役割は、炎症の抑制に関連していることが見出された。カスパーゼ−１２（Salehら、2006）は炎症性メディエーターを抑制すると報告され、カスパーゼ−１、４、５、１１（Martinonら、2004）などの他の哺乳類のカスパーゼは炎症性メディエーター、ＩＬ−１およびＩＬ−１８の産生を触媒すると報告されたが、炎症におけるこのカスパーゼ−８の新規な役割は、発表されている文献からは予測不可能であった。カスパーゼ−８欠損マウスにおいては、カスパーゼ−８を欠いていない対照同腹子と比較して、肝臓切除後数日では細胞増殖は少ないことが観察されたが、後にカスパーゼ−８の欠損の効果は逆転し、カスパーゼ−８欠損肝細胞は増殖し続けた。過度の増殖は、結果として異常に肥大した肝臓をもたらした。本発明者らによる発見は、持続した肝細胞の増殖は、炎症の結果であることを示唆した。これらの発見を考慮に入れると、本発明は、組織または器官における炎症を予防または減少させるためのカスパーゼ−８活性／レベルの誘導または増強にも関連している。抗炎症剤としてのカスパーゼ−８の使用は有益であるが、カスパーゼ−８レベルまたは活性が下方調節されている細胞を有する組織または器官に限定されるものではない。よって、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤、ならびに（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤が、炎症性疾患、障害または症状を治療するために使用され得る。炎症性疾患、障害または症状の例としては、肝炎、炎症性腸疾患、脈管炎、関節炎症、静脈洞炎、強膜炎、歯周炎、子宮頚炎、ブドウ膜炎、外陰膣炎、結膜炎、肺胞炎、食道炎、急性糸球体腎炎、腎炎、急性気管支炎、急性胆嚢炎、膵炎および耳感染があげられるが、これに限定されるものではない。
【００６７】
カスパーゼ−８機能の肝細胞における免疫応答に対する寄与は、カスパーゼ−８欠損肝細胞を有するマウス（Ｃａｓｐ８F/―:Ａｌｂ−Ｃｒｅ）に致死量以下のリステリア  モノサイトゲネス（L. monocytogenes）を静脈接種した後の異なる時点での感染からの回復について、対照同腹子（Ｃａｓｐ８F/+:Ａｌｂ−Ｃｒｅ）と比較することで評価された。本発明にしたがって、肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損は、細胞内病原体リステリア  モノサイトゲネスに対するマウスの耐性を減じることが見出された。
【００６８】
肝臓は、血液循環からのリステリア除去の主たる部位であり、リステリア感染が持続する主要な部位でもある。感染の制止は、感染した肝細胞を殺すための免疫系の細胞の能力に大きく依存している。感染後の早期では、肝細胞にカスパーゼ−８が存在しないことはリステリアの産生量に何ら影響しないようであり、感染の後期ではカスパーゼ−８欠損肝細胞を有するマウスは、増加し持続する肝臓感染を示した。カスパーゼ−８作用の作動機序または様式に関する如何なる説にも縛られず、本発明者らの発見は、カスパーゼ−８は、感染細胞の破壊を増強することにより感染との闘いを補助できることを示唆する。しかしながら、カスパーゼ−８の他の防御機序への寄与は、しかしながら排除できない。本明細書中に示される結果と、肝細胞におけるカスパーゼ−８の欠失が、これらの細胞に受容体Ｆａｓの細胞毒効果に対する耐性を与える（Kangら、2004）ことを示す近年の報告とから、カスパーゼ−８欠損肝細胞における増加し持続する細胞内病原体の感染は、Ｔリンパ球がＦａｓを通して感染肝細胞を除去することに失敗したためである可能性が提起される。
【００６９】
概して、細胞内病原体に対する免疫防御の調査に広く採用される動物モデル系を用い、本発明にしたがって、カスパーゼ−８レベルおよび／または活性が肝臓における細胞内病原体に対する防御に関与すること、ならびにカスパーゼ−８レベルおよび／または活性の増加は細胞内病原体の根絶に利用され得ることが見出された。一実施態様では、カスパーゼ−８レベルおよび／または活性の増加は、ヒトの肝細胞から細胞内病原体を根絶するために使用することができる。
【００７０】
よって、本発明の他の側面は、哺乳類において細胞内病原体により引き起こされる感染を減じるためにカスパーゼ−８活性および／もしくはレベルを増強または誘導することに関する。細胞内病原体の例には、ミコバクテリア属（Mycobacterium）、リステリア属（Listeria）、リーシュマニア属（Leishmania）、レジオネラ属（Legionella）、サルモネラ属（Salmonella）およびウイルス（Steinertら、2002ならびにGruenheidおよびGros, 2002）が含まれるが、これらに限定されるものではない。ミコバクテリア感染の例には、ミコバクテリア  ボビス（Mycobacterium bovis）、ミコバクテリア  ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）、ミコバクテリア  アビウム（Mycobacterium avium）およびミコバクテリア  レプラムリウム（Mycobacterium lepraemurium）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
カスパーゼ−８活性および／もしくはレベルを増強または誘導することは、炎症性疾患、障害または症状を治療するために使用され得る、（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤、ならびに（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤から選択される少なくとも１つの薬剤を使用することにより効果をあげることができる。
【００７２】
カスパーゼ−８、ムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体は、カスパーゼ−８またはムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体をコードし、それらを発現することができる発現ベクターを使用し投与することができる。
【００７３】
「タンパク質を上方調節することができる薬剤」または「タンパク質のアクチベーター」という用語は、本発明の内容においては、該タンパク質レベルおよび／または活性を上方調節することができるタンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび低分子などの任意の薬剤もしくはアクチベーターをいう。
【００７４】
カスパーゼ−８のアクチベーターの例には、ＦＡＤＤ、カスパーゼ−８を開裂できるカスパーゼ−６およびカスパーゼ−３のようなカスパーゼ、ならびに間接的にはＴＮＦ／ＮＧＦファミリーの様々な死受容体が含まれるが、これらに限定されるものではない。構成された的確な細胞に依っては、ｃＦＬＩＰロングもまたカスパーゼ−８アクチベーターとしての役目を果たし得る。
【００７５】
本明細書中で使用されるように、用語「ムテイン」は、元のカスパーゼ−８と比べて結果としてできた産物の活性が相当に変化することなしに、カスパーゼ−８の天然発生要素の１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ段残基によって置換されている、もしくは欠損している、または１以上のアミノ酸残基が元のカスパーゼ−８配列に付加されているカスパーゼ−８の類似体をいう。これらのムテインは、公知の合成および／もしくは特定部位の突然変異誘発手法によって、または他の公知なそれに適した手法によって製造される。
【００７６】
本発明にしたがって使用されるムテインは、カスパーゼ−８をコードするＤＮＡまたはＲＮＡに、本発明にしたがってストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸によってコードされるタンパク質を含む。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者が通常「ストリンジェント」と呼ぶハイブリダイゼーションおよびそれに続く洗浄条件をいう。Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, 上記、Interscience, N. Y., §§6.3および6.4（1987, 1992）、ならびにSambrookら（Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., およびManiatis, T.（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）参照。
【００７７】
限定なしに、ストリンジェントな条件の例は、調査下で産出されたハイブリッドのＴｍの１２〜２０℃低い洗浄条件を含み、たとえば２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳに５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳに１５分間、０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳに３７度で３０〜６０分間ならびにその後０．１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳに６８℃で３０〜６０分間である。当業者は、ストリンジェントな条件はＤＮＡ配列、（１０〜４０塩基などの）オリゴヌクレオチドプローブまたは混合オリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存していることを理解する。もし混合プローブが使用される場合、ＳＳＣの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を用いることが好ましい。Ausubel、上記参照。
【００７８】
任意のこのようなムテインは、実質的に類似の、またはよりよいカスパーゼ−８に対する活性を有するように、好ましくはカスパーゼ−８のアミノ酸配列を充分に複製したアミノ酸配列を有する。
【００７９】
カスパーゼ−８の特徴的活性として、特異的基質部位におけるそのタンパク質分解活性がある。よって、任意の与えられたムテインがカスパーゼ−８と少なくとも実質的に同じ活性を有するかどうかは、決まりきった実験方法によって決定できる。変異体がタンパク質分解活性を有する限り、カスパーゼ−８と実質的に類似の活性を有するとみなすことができる。
【００８０】
よって、任意の所定の変異体がカスパーゼ−８と少なくとも実質的に同じ活性を有するかどうかは、たとえば米国特許第６，３９９，３２７号明細書の実施例３に記載の基質にこのような変異体をさらすことを含む、決まりきった実験方法によって決定できる。
【００８１】
好ましい実施態様では、任意のこのようなムテインはカスパーゼ−８の配列と少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。より好ましくは、カスパーゼ−８の配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、またはもっとも好ましくは少なくとも９０％の同一性または相同性を有する。
【００８２】
同一性は、配列を比較することにより決定される、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係を示す。概して、同一性とは、配列の長さの全体にわたって比較される、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの、それぞれヌクレオチドに対するヌクレオチドのまたはアミノ酸に対するアミノ酸の正確な一致をいう。
【００８３】
正確な一致が存在しない配列には、「％同一性」が決定され得る。概して、比較される２つの配列は、配列間の最大の相関が生じるように並べられる。これには、アライメントの程度を高めるために、配列の片方または両方どちらかに「ギャップ（gap）」の挿入を含んでもよい。％同一性は、比較される配列それぞれの長さ全体にわたって決定され得（いわゆるグローバルアラインメント）、これは同一かかなり類似の配列に特に適しており、またはより短い定義された長さにわたって決定され得（いわゆるローカルアラインメント）、これは不揃いな長さの配列に適している。
【００８４】
２以上の配列の同一性および相同性の比較の方法は、その技術分野においてよく知られている。よって、たとえばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを例とするウィスコンシン配列分析パッケージ（Wisconsin Sequence Analysis Package）、バージョン９．１（Devereux Jら、1984）で得られるプログラムが、２つのポリヌクレオチド配列間の％同一性ならびに２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定するために使用され得る。ＢＥＳＴＦＩＴは、SmithおよびWaterman（1981）の「ローカル相同性」アルゴリズムを用いており、２つの配列間の類似性が最もよい単一領域を見出す。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムも、当業者に公知であり、たとえばＢＬＡＳＴファミリーのプログラム（Altschul S Fら、1990、Altschul S Fら、1997、ＮＣＢＩのホームページwww.ncbi.nlm.nih.govを通じてアクセス可能）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R, 1990；Pearson, 1988）がある。
【００８５】
本発明にしたがって使用することのできるカスパーゼ−８のムテイン、またはそれをコードする核酸には、本明細書中に示される教示や指導に基づいて、当業者が過度の実験なしに通常得られる置換ペプチドやポリペプチドとして実質的に一致する配列の有限な集合を含む。
【００８６】
本発明にしたがったムテインに好ましい変化は、「同類（conservative）置換」として知られるものである。カスパーゼ−８の同類アミノ酸置換には、群のメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保持するような、充分に類似の物理化学的特性を有する群内の同義アミノ酸が含まれ得る（Grantham、1974）。アミノ酸の挿入および欠損もまた、それらの機能を変化させることなく、とりわけ挿入または欠損が数個のアミノ酸、たとえば３０以下、および好ましくは１０以下のみが関与するものである場合、そして機能的配置に重要であるアミノ酸、たとえばシステイン残基を除去または置換しない場合に、前記に定義した配列中で行われてもよい。
【００８７】
好ましくは、同義アミノ酸群は表Ａに定義されるものである。より好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｂに定義されるものであり、最も好ましくは、同義アミノ酸群は表Ｃに定義されるものである。
【００８８】
【表１】
0005576657.tif 000002
【００８９】
【表２】
0005576657.tif 000003
【００９０】
【表３】
0005576657.tif 000004
【００９１】
本発明において使用されるための、カスパーゼ−８ポリペプチドのムテインを得るために使用できる、タンパク質におけるアミノ酸置換の製造例には、Markらに対する米国特許第４，９５９，３１４号、同第４，５８８，５８５号および同第４，７３７，４６２号、Kothsらに対する米国特許第５，１１６，９４３号、Namenらに対する米国特許第４，９６５，１９５号、Chongらに対する米国特許第４，８７９，１１１号およびLeeらに対する米国特許第５，０１７，６９１号などに紹介されている任意の公知の方法工程、ならびに米国特許第４，９０４，５８４号明細書（Shawら）に紹介されているリジン置換タンパク質が含まれる。
【００９２】
用語「融合タンパク質」は、たとえば体液中での延長した滞留時間を有するような他のタンパク質に融合した、カスパーゼ−８またはそのムテインもしくは断片を含むポリペプチドをいう。カスパーゼ−８は、よってたとえば免疫グロブリンまたはその断片に融合されてもよい。
【００９３】
本明細書中で使用される「機能的誘導体」とは、その技術分野で公知の方法により、残基またはＮ−もしくはＣ−末端基上に側鎖として存在する官能基から製造され得る、カスパーゼ−８、ならびにそのムテインおよび融合タンパク質の誘導体に及び、それらが薬学的に許容され得るものである限り、すなわちカスパーゼ−８の活性に実質的に類似するタンパク質の活性を破壊せず、それを含有する組成物に毒性を与えない限り本発明に含まれる。
【００９４】
これらの誘導体には、たとえば、抗原部位をマスクし、カスパーゼ−８の体液中での滞留を延長し得るポリエチレングリコール側鎖が含まれ得る。他の誘導体には、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（たとえば、アルカノイルまたは炭素環式アロイル基）、またはアシル部分と形成される遊離ヒドロキシル基の（たとえば、セリルまたはスレオニル残基の）Ｏ−アシル誘導体が含まれる。
【００９５】
本発明にしたがった「活性画分」は、たとえばカスパーゼ−８の断片であってもよい。用語、断片は分子の任意の下位集合、すなわち所望の生物学的活性を保持するより短いペプチドをいう。断片は、カスパーゼ−８分子の両端のいずれかからアミノ酸を除去し、結果として得られた断片をタンパク質分解活性について試験することで容易に製造し得る。ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端のどちらかから一度に１つアミノ酸を除去するためのプロテアーゼが知られており、所望の生物学的活性を保持する断片を決定することにも決まりきった実験のみが関与する。
【００９６】
カスパーゼ−８、そのムテインおよび融合タンパク質の活性画分として、該画分がカスパーゼ−８に実質的に類似の活性、たとえばタンパク質分解活性を有するならば、本発明はさらに、タンパク質分子単独の、または関連分子もしくはそこに連結している残基、たとえば糖もしくはリン酸残基と一緒のタンパク質分子の、ポリペプチド鎖の任意の断片または前駆物質、またはタンパク質分子もしくは糖残基のそれら自身による凝集体に及ぶ。
【００９７】
本明細書中の用語「塩」は、カルボキシル基の塩およびカスパーゼ−８分子またはその類似体のアミノ基の酸付加塩の両方をいう。カルボキシル基の塩は、その技術分野で知られる方法により形成され得、たとえばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄もしくは亜鉛塩などの無機塩、およびたとえばトリエタノールアミン、アルギニンもしくはリジン、ピペリジン、プロカインなどのアミンと共に形成された塩のような、有機塩基を有する塩を含む。酸付加塩には、たとえば、塩酸または硫酸などの無機酸との塩、およびたとえば酢酸またはシュウ酸などの有機酸との塩が含まれる。もちろん、任意のこれらの塩は、カスパーゼ−８の生物学的活性、たとえばタンパク質分解活性を保持していなくてはならない。
【００９８】
カスパーゼ−８の「アイソフォーム」は、タンパク質分解活性を有し得るタンパク質またはその断片であり、選択的スプライシングまたは選択的翻訳開始部位により産出され得る。
【００９９】
本明細書中で使用されるように、用語「円順列誘導体」は、末端が直接またはリンカーを介してのいずれかで、互いに接続されることで環状分子が産生され、その後、元の分子の末端と異なる末端を有する新しい直線分子を産生するために、別の位置で環状分子が開環された直線分子をいう。円順列には、環化ついで開環された分子と等価な構造の分子が含まれる。よって、円順列分子は、直線分子としてデノボ合成され得、環状化および開裂工程を経由しない。円順列誘導体の製造は、国際公開第９５／２７７３２号パンフレットに記載されている。
【０１００】
ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドなどの本発明による物質には、生体の細胞へのそれらの導入を必要とするものがある。この目的のために、ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの膜透過性を改良することが望ましい。脂溶性構造での誘導体化は、膜透過性を強化したペプチドおよびタンパク質を創出するために用いられ得る。たとえば、上記のような公知の膜屈性ペプチドの配列を、ペプチドまたはタンパク質の配列に加えてもよい。さらに、ペプチドまたはタンパク質を、少なくとも１つの極性または荷電基によって置換されている、上記炭化水素鎖のような部分的な脂容性構造によって誘導体化してもよい。たとえば、ペプチドのラウロイル誘導体が、Muranishiら、1991によって記載されている。ペプチドおよびタンパク質のさらなる修飾には、Zachariaら、1991によって記載されているように、メチオニン残基の酸化が含まれ、それによってスルホキシド基が生じる。Zachariaと共同研究者らはまた、比較的疎水性のペプチド結合が、そのケトメチレンイソエステル（ＣＯＣＨ２）によって置換されているペプチドまたは誘導体も記載している。これらのおよび他の、タンパク質およびペプチド化学の技術分野における当業者に公知な修飾が、膜透過性を強化する。
【０１０１】
膜透過性を強化する他の方法は、ペプチドまたはタンパク質の細胞取り込みを誘導するために、細胞表面上の、ウイルス受容体などの受容体の使用である。この機序は、特定の細胞表面分子に特異的に結合するウイルスなどにより頻繁に用いられる。結合に際して、細胞はウイルスをその内部に取り込む。細胞表面分子は、ウイルス受容体と呼ばれる。たとえば、インテグリン分子ＣＡＲおよびＡｄＶは、アデノウイルスに対するウイルス受容体として記載されている。Hemmiら、1998およびその参考文献参照。ＣＤ４、ＧＰＲ１、ＧＰＲ１５およびＳＴＲＬ３３分子は、ＨＩＶに対する受容体／補助受容体（co-receptor）と認められている。Edingerら、1998およびその参考文献参照。
【０１０２】
よって、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを、細胞表面受容体に結合すると知られている分子に結合することは、該ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性を強化するであろう。結合体を形成するのに適した基の例としては、糖、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、トランスフェリンおよびアシアロ糖タンパク質などの分子がある。Lowらの米国特許第５，１０８，９２１号明細書には、ペプチド、タンパク質およびオリゴヌクレオチドの膜透過性を強化することを目的とするこれらの分子の使用、ならびに前記結合体の製法が記載されている。Lowと共同研究者らはさらに、葉酸またはビオチンなどの分子は、これらの分子に対する豊富で非特異的な受容体の発現のため、生体における多くの細胞に対して結合体を標的化するために用いられ得ることを示した。
【０１０３】
本発明のペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドの膜透過性を強化するための、上記の細胞表面タンパク質の使用は、該本発明のペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを特定の細胞型または組織に対して標的化することに用いてもよい。Wangら、1998は、癌細胞を標的化するための葉酸の使用方法を教示し、Zhangら、1998は、多様な型のがんおよび正常細胞における、上記他の各抗原の相対的存在量を教示する。
【０１０４】
本発明のタンパク質、ペプチドおよびアンチセンス配列は、ウイルス性ベクターを用いて細胞内に導入してもよい。この目的のためのワクシニアベクターの使用が、Current Protocols in Molecular Biologyの１６章に詳述されている。アデノウイルスベクターの使用は、たとえばTeohら、1998、Narumiら、1998、Pedersonら、1998、Guang-Linら、1998、およびその参照、Nishidaら、1998、Schwarzenbergerら、1998、ならびにCaoら、1998に記載されている。アンチセンス配列のレトロウイルス移送は、Danielら、1998に記載されている。
【０１０５】
ウイルスをベクターとして用いる場合、ウイルスを標的化するためにウイルス性表面タンパク質が一般的に使用される。上記アデノウイルスなどの多くのウイルスが、その細胞向性においてはかなり非特異的であるので、細胞型または組織特異的プロモーターを用いてさらなる特異性を与えることが望まれ得る。Griscelliら、1998は、アデノウイルスによりその移送が媒介される遺伝子の心臓特異的標的化のための、心室特異的心臓ミオシン軽鎖２プロモーターの使用を教示する。
【０１０６】
あるいは、ウイルス性ベクターは追加のタンパク質をその表面上で発現するために設計されてもよいし、またはウイルス性ベクターの表面タンパク質が、所望のペプチド配列を組み込むように変化させられてもよい。ウイルス性ベクターは、よって、該ウイルス性ベクターを標的化するために用いられ得る１以上の追加のエピトープを発現するように設計されてもよい。たとえば、サイトカインエピトープ、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド、またはホーミング分子由来のエピトープが、本発明の教示にしたがってウイルス性ベクターを標的化するために用いられてもよい。
【０１０７】
本発明による活性物質を、肝細胞に対して標的化することは有益である。肝細胞に対する標的化は、活性物質を肝細胞へ特異的および有効に送達させる。活性物質の肝細胞に対する標的化は、活性物質を、肝細胞に結合し吸収される化合物またはリガンド、たとえばアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）と反応するリガンド［Gromanら、1994；RogersおよびKornfeld、1971；Fiumeら、1997］、［Wuら、2002、Wuら、2004］およびＴ７リガンド（米国特許第７，０７１，１６３号明細書）に結びつけることによって行うことができる。
【０１０８】
本発明による発見は、創傷の治癒、炎症の治療および細胞内病原体によって引き起こされる感染の治療を円滑化するための、少なくとも１つの許容され得る担体と組み合わせたカスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を調節することができる活性物質を含む医薬組成物を設計するための道を開く。
【０１０９】
本発明は、本発明による活性物質および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。たとえば、医薬組成物は、炎症または感染の場合には、以下の本発明の薬剤または物質：（ｉ）カスパーゼ−８またはそのムテイン、アイソフォーム、融合タンパク質、機能的誘導体、活性画分、円順列誘導体もしくは塩、（ii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性を上方調節することができる薬剤、ならびに（iii）カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の天然阻害剤の阻害剤、の少なくとも１つを含んでもよい。たとえば、医薬組成物は、創傷治癒の場合には、つぎの本発明の薬剤または物質：カスパーゼ−８のレベルおよび／または活性の阻害剤、ならびに薬学的に許容され得る担体を含んでもよい。
【０１１０】
本発明による医薬組成物は、肝臓切除に続く肝不全の治療にも適している。よって、本発明の医薬組成物は、損傷の治癒を円滑化および促進することにより肝不全の確立または進行を予防するために、肝臓移植のドナーにまたは肝臓切除後の患者に投与することができる。本発明の医薬組成物は、たとえば肝臓損傷を治療するために、カスパーゼ８の阻害剤および抗炎症剤を含んでもよい。本発明の組成物により治療される具体的な対象としては、肝炎、アルコール、ウイルス、薬物もしくは未知の原因による肝硬変、または肝癌などの肝臓の疾患のために損傷した肝臓の一部分が部分的に切除された患者、および移植処置のために肝臓の一部が部分的に切除された健康なドナーがあげられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
本発明による医薬組成物は、意図する目的を達成するために充分な量の本発明による物質を含有する。また、医薬組成物は、活性な化合物を医薬として使用される製剤に加工するのを円滑化する、およびこういった製剤を必要とする患者に投与するために安定できる、当業者によく知られた、賦形剤および助剤を含む適切な薬学的に許容され得る担体を含んでもよい。
【０１１２】
本発明による物質は、それを必要とする患者に多様な方法で投与され得る。投与経路には、肝臓内、皮内、経皮（たとえば徐放処方で）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内経路が含まれる。さらに、その物質は、薬学的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどの、生物学的に活性な薬剤の他の成分と一緒に投与することができる。
【０１１３】
単回または複数回用量として個体に投与される投薬量は、物質の薬物動力学的性質、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、併用治療、治療の頻度ならびに望まれる効果などの種々の因子に依存して変化する。確立した投薬量の範囲の調整および操作は、充分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１４】
「薬学的に許容され得る」の定義は、活性成分の生物学的活性の効力を妨害しない、そして投与される宿主に対して毒性ではない任意の担体を包含することを意味する。たとえば、非経口投与については、本発明による物質を、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー溶液のようなビヒクル中の注射用のユニット剤形で処方してよい。
【０１１５】
「治療的に有効量」とは、投与したときに、本発明の前記物質が炎症、細胞内病原体の感染および創傷治癒において、有益な効果を誘導する量である。単回または複数回用量として個体に投与される投薬量は、投与経路、患者の状態および特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、症状の程度、併用治療、治療の頻度ならびに望まれる効果などの種々の因子に依存して変化する。確立した投薬量の調整および操作は、充分に当業者の能力の範囲内である。
【０１１６】
本発明に関する化合物は、その薬物動力学的性質と一致した任意の経路より投与されるように調製されてもよい。
【０１１７】
活性物質または成分は、無菌媒体において非経口投与されてもよい。使用されるビヒクルおよび濃度に応じて、薬物はビヒクル内に懸濁または溶解され得る。
【０１１８】
用語「投薬量」は、投与の頻度および回数の決定および調節に関する。
【０１１９】
雑誌論文もしくは要約、公開されたもしくは未公開の米国もしくは外国特許出願、発行された米国もしくは外国特許または任意の他の参考文献を含む、本明細書中で引用されたすべての参考文献が、引用された参考文献中に示されたすべてのデータ、表、図および本文を含んで、完全に本明細書中に参照によって組み込まれている。さらに、本明細書中で引用された参考文献内に引用された参考文献の全内容がまた、すべて参照によって組み込まれている。
【０１２０】
公知の方法の工程、従来の方法の工程、公知の方法または従来の方法の引用は、決して本発明の任意の側面、記載または実施態様が、関連技術分野において開示、教示または示唆されたことを認めるものではない。
【０１２１】
本発明は今や説明されたので、例証を経て提供された、そして本発明を限定することを意図するものでない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解され得るであろう。
【実施例】
【０１２２】
材料および方法
（ｉ）マウス系統
カスパーゼ−８ノックアウト対立遺伝子を持つマウスの系統（Ｃａｓｐ８-/+）（Varfolomeevら、1998）または条件付きカスパーゼ−８対立遺伝子を持つマウス系統（Ｃａｓｐ８F/+）（Kangら、2004）、ならびに肝臓特異的アルブミンプロモーターの制御下にＣｒｅを発現するマウス（Ａｌｂ−Ｃｒｅ）（Kellendonkら、2000）および肝細胞に特異的なカスパーゼ−８遺伝子の欠損のためのその使用（Kangら、2004）に関しては、先に述べた。リステリア感染に関する実験は、Ｃ５７Ｂ１／６系統のマウスとの１１回の戻し交配により得られた純粋なＣ５７Ｂ１／６バックグラウンドのマウスで行われた。ＰＨｘ後の肝臓の再生に関する示された実験は、示したように、元の遺伝的に混合したバックグラウンドのマウスおよび純粋なＣ５７Ｂ１／６バックグラウンドのマウスで実施された。全てのマウスは、特定の無菌設備内で管理された。マウスは、国立科学アカデミー（the National Academy of Sciences）により作成され、国立保健研究所（the National Institutes of Health）により出版された「実験動物の管理と使用の手引（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）」にまとめられた基準にしたがって扱われた。全ての実験は、施設内動物倫理管理委員会により承認された。
【０１２３】
（ii）リステリア  モノサイトゲネス感染および定量化
マウスは、２×１０3プラーク−形成ユニットのリステリア  モノサイトゲネス（１０４０３Ｓ株）を静脈内に注射され、その後異なる時間後に殺された。それらの肝臓と脾臓が摘出され、重量が測定された。肝臓および脾臓の一部が、計量され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に別々にホモジネートされた。器官ホモジネートの連続１０倍希釈液は、脳心臓浸出物寒天上でプレート培養された。器官あたりのコロニー形成ユニットの数は、寒天プレートを３７℃で２４時間インキュベートした後測定された。肝臓および脾臓の残りの部分は、１０％中性緩衝ホルマリンに２４〜４８時間固定された。組織はその後、切り取られ、ごく普通にパラフィンにおいて処理され、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）または抗Ｋｉ６７抗体（ダコサイトネイション（DakoCytonation）、グロストルップ（Glostrup）、デンマーク）で染色された。
【０１２４】
（iii）部分肝切除および塩化ガドリニウム投与
齢の一致したＣａｓｐ８F/―：Ａｌｂ−ＣｒｅマウスおよびＣａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスは、腹腔内に（ｉ.ｐ.）投与された１０ｍｇ／ｇ体重のキシラジン（チャネル  ファーマシューティカルズ  マニュファクチュアリング（Chanelle Pharmaceuticals Manufacturing）、ラックレア（Loughrea）、ゴールウェイ、アイルランド）および４５０ｍｇ／ｇ体重のケタミン（フォート  ドッジ  アニマル  ヘルス（Fort Dodge Animal Health）、フォートドッジ、アイオワ州）で軽く麻酔をかけられた。記載されたように、「１／３」（３０％）ＰＨｘは肝臓の中間葉を切除し、「２／３」（７０％）ＰＨｘは中間、左および右上葉を切除することで実施された（Higginsら、1931およびGreeneら、2003）。マウスは、ＰＨｘ前と後０〜５６日間（第１週は１日おきに、その後は毎週）画像をとられた。ＰＨｘ後１０日および１２日に、マウスは腹腔内に生理食塩水中の塩化ガドリニウム（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、セントルイス、ミズーリ州）を１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で注射された。
【０１２５】
（iv）ＭＲＩ分析技術
磁気共鳴画像（ＭＲＩ）実験は、水平方向４．７Ｔバイオスペック（Biospec）分光計（ブルカー  メディカル（Bruker Medical）、エトリンゲン（Ettlingen）、ドイツ）と４．２ｃｍの鳥かご型コイルを用いて行われた。マウスは麻酔をかけられ（腹腔内ペントバルビタール３０ｍｇ／ｋｇで）、仰向けに肝臓がコイルの中心に位置するよう置かれた。肝臓体積は、マルチスライス冠状方向および軸方向のＴ１強調スピンエコー画像（反復時間＝４００ｍｓ；エコー時間＝１８ｍｓ；スライスの厚み＝１ｍｍ）から決定された。簡単に述べると、各スライスにおいて視覚化された肝臓の境界は、画像加工ソフトウェア（ＮＩＨ イメージ）を用いて輪郭を描かれた。肝臓のピクセル数を領域に変換するために、本発明者らは要素によって多重化した［（視野）2／（マトリクス）2］。合計の肝臓の体積は、スライスの厚みによって多重化された、全てのスライスの領域の合計として計算された。それぞれのマウスごとに、肝臓の体積は、手術前の肝臓体積のパーセンテージで表現された。
【０１２６】
肝性の灌流および血行力学は、マウスが空気、空気とＣＯ2（９５％空気、５％ＣＯ2）およびカルボゲン（９５％Ｏ2、５％ＣＯ2）を呼吸している間に得られた、Ｔ２*強調傾斜エコー画像（反復時間＝１００ｍｓ；エコー時間＝１０ｍｓ；視野＝３．４ｃｍ；スライスの厚み＝１．２ｍｍ）から、先に記載されたように（Abramovitchら、1998および1999）評価された。それぞれの混合気体について、５反復を得た。
【０１２７】
ＭＲＩ血行力学データは、ＩＤＬソフトウェア（リサーチ  システムズ（Research Systems）、ボールダー、コロラド州）を用いて、ＰＣコンピューター上で分析された。異なる気体（Ｓ空気、Ｓｃｏ2およびＳｏ2）の吸入の間に得られた各ピクセルの平均信号強度値の写像は、４つの各気体の値の平均から計算された（気体交換中に得られた値は切り捨てられた）。高炭酸ガス（ΔＳｃｏ2）および高酸素（ΔＳｏ2）により誘導されたＭＲＩ信号強度の変化の割合は、以下の方程式にしたがって計算された：
【数１】
0005576657.tif 000005
【０１２８】
結果は平均±ＳＤで示した。平均値は、示されたようにｎ匹のマウスの関心のある領域から、およびマウスあたり３つのスライスから計算された。
【０１２９】
（ｖ）虚血域の体積の計算
切開域の周囲の、健全な肝臓組織よりも高い信号強度を示している異常域は、ＭＲＩによって検出可能であった。この領域は、「虚血域」と称され、その境界および体積が決定された。各マウスにおける体積は、スライスの厚みにより多重化された、全てのスライスの高信号強度の領域の合計として算出された。虚血域の体積は、ＰＨｘ後２日および４日に、ＰＨｘ前の肝臓体積に対する割合として算出された。
【０１３０】
（vi）統計分析
群間の差は、対応のない（unpaired）スチューデントのＴ検定により同定された。Ｐ＜０．０５の値は、統計的に有意であると考えられた。
【０１３１】
（vii）組織学および免疫染色
肝臓は１０％中性緩衝ホルマリンで固定され、パラフィン内に埋められ、４μｍの切片に切られ、Ｈ＆Ｅで染色された。プロセシングされたカスパーゼ−３を発現する細胞を検出するために、切片はパラフィンをはがされ、再水和され、ウサギ抗マウス切断カスパーゼ−３（Ａｓｐ１７５）抗体（セル  シグナリング  テクノロジー（Cell Signaling Technology）、ビバーリー（Beverly）、マサチューセッツ州）とともに、製造者の使用説明書にしたがってインキュベートされた。切片はその後、ビオチン化ペルオキシダーゼ抗ウサギ抗体（ダコ  エンビジョンプラスシステム（DAKO Envision＋System）、グロストルップ、デンマーク）で染色された。
【０１３２】
Ｋｉ６７を発現する細胞を検出するために、肝臓パラフィン切片は、パラフィンをはがされ、再水和され、１０ｍＭの沸騰クエン酸（ｐＨ６．０）内で１０分間変性させられた。２０分間で室温まで冷却され、その後ＰＢＳ内で３度洗浄された。３％Ｈ２Ｏ２内での５分間の処置の後、スライドは、ＣＡＳ−Ｂｌｏｃｋ（ザイムド  ラボラトリーズ（Zymed Laboratories）、サンフランシスコ、カリフォルニア州）中に１：１００で希釈されたラット抗マウスＫｉ６７抗体とともに４℃で一晩インキュベートされた。それらはその後、ＰＢＳで３度洗浄され、免疫ペルオキシダーゼポリマー抗ラット（ニチレイ  バイオサイエンス、東京、日本）とともに１時間インキュベートされ、１０分間３，３’−ジアミノベンジジン（シグマ−アルドリッチ）で展開された。
【０１３３】
Ｆ４／８０を発現する細胞は、抗原回復のためにパラフィン切片が２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１％トリプシン、および０．１％塩化カルシウムを含む溶液で、室温で３分間処置されたことを除いて、ラット抗マウスＦ４／８０抗体（セロテック  オクスフォード（Serotec Oxford）、イギリス）を用いて同様に検出された。肝臓のマクロファージ含量は、スライド内のＦ４／８０陽性領域をイメージジェイ（ImageJ）１．３７ｒソフトウェアを用いて定量化し決定された。
【０１３４】
ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を、マウスの殺される３時間前に腹腔内に注射し、アマシャム細胞増殖キット（アマシャム  バイオサイエンス（Amersham Bioscience）、ピスカタウェイ（Piscataway）、ニュージャージー州）を使用し、製造者の使用説明書にしたがって検出した。
【０１３５】
転写３タンパク質のホスホシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（ｐ−ＳＴＡＴ３、炎症中に活性化するシグナル伝達タンパク質）の免疫組織化学的検出のために、パラフィン切片はパラフィンをはがされ、再水和され、内因性のペルオキシダーゼを失活させるために３％過酸化水素内で１０分間インキュベートされ、その後、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）内で１５分間煮沸することにより抗原回復を受けた。スライドはその後、ＴＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）で３度洗浄され、ウサギ抗マウスｐ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）抗体（セル  シグナリング  テクノロジー、１：５００）とともに４℃で一晩インキュベートされた。一連のＴＢＳＴ内でのすすぎ洗いの後、それらはビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体（ジャクソン  イムノリサーチ  ラボラトリーズ（Jackson ImmunoResearch Laboratories）、ウェスト  グローブ（West Grove）、ペンシルベニア州）においてインキュベートされた。結合抗体はＴＳＡビオチンシステム（Biotin System）（パーキン  エルマー（Perkin Elmer）、ボストン、マサチューセッツ州）を用いて検出した。免疫活性は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール高感度基質色素体（ダコ）との５〜１０分間のインキュベーション後に可視化された。
【０１３６】
（viii）ウェスタン分析
ＰＨｘ後の異なる時間後に、肝臓組織は摘出され、すぐに液体窒素の中で凍結され、使用まで−８０℃で保存された。凍結組織の０．３ｍｇの試料を計量し、ホモジネート緩衝液［５０ｍＭ  β−グリセロホスフェート  ｐＨ７．３、１．５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１’完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ  ダイアグノスティクス（Roche Diagnostics）、マンハイム（Mannheim）、ドイツ）を含む１ｍＭジチオスレイトール］にホモジネートされ、１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル上に分画され、ニトロセルロースにブロットし、ウサギ抗マウスサイクリンＡ抗体、ウサギ抗マウスホスホＳＴＡＴ−３抗体（両方ともサンタ  クルーズ  バイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology））、ウサギ抗マウスサイクリンＥ抗体（アップステート（Upstate）、シカゴ、イリノイ州）、ウサギ抗マウスホスホ−Ｒｂ抗体（セル  シグナリング  テクノロジー）、ラット抗マウスカスパーゼ−８モノクローナル抗体（１Ｇ１２、親切にもＡ．Ｓｔｒａｓｓｅｒ博士およびＬ．Ａ．Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ博士から寄贈された、ＷＥＨＩ、メルボルン、オーストラリア）、またはモノクローナル抗−β−アクチン抗体（シグマ）とともに４℃で一晩インキュベートされた。これは、続いて西洋わさびペルオキシダーゼ共役二次抗体（ジャクソン  イムノリサーチ  ラボラトリーズ、ウェスト  グローブ、ペンシルベニア州）とともにインキュベートされ、１：５０００に希釈された。特異的バンドが、化学発光により可視化された。
【０１３７】
実施例１  肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損がリステリア感染への耐性を危うくする
肝臓は、真核細胞の細胞質に侵入し、そこで多数化するグラム陽性菌、リステリア  モノサイトゲネスの複製の主な部位である。マウスの実験的感染後の肝臓からこの病原体を根絶することが、よって細胞内病原体に対する免疫防御の機序の研究のモデルシステムとして広く用いられた（Wingら、2002）。カスパーゼ−８機能の肝細胞における免疫応答への寄与を調査するために、カスパーゼ−８欠損肝細胞を有するマウス（Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅ）に致死量以下のリステリア  モノサイトゲネスが静脈内に接種された後異なる時点で、その感染からの回復がその対照同腹子（Ｃａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅ）と比較された。
【０１３８】
感染１日後では、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの器官内の菌量は、その対照同腹子と同様であった。６日目には、しかしながら、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓と脾臓の双方において、菌力価が１０〜１００倍その対照よりも高かった（図１−１、１−２）。１４日目までに、対照マウスの肝臓および脾臓双方から病原体は完全に消えており、一方Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓内の力価は高いままであった（図１−３）。長引く感染は、結果として炎症（図１−４、Ｄ、Ｅ）および肝臓の壊死性病変の進行（図１−４、Ｆ、Ｇ）、ならびに肝細胞の増殖の増加（図１−４、Ｈ、Ｉ）につながった。感染後６日目までには、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの１５％が死に至ったが、対照マウスでは死に至るものはなかった。
【０１３９】
実施例２  ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：早期増殖反応の弱化
損傷からの組織回復に対するカスパーゼ−８の寄与を評価するために、肝細胞からカスパーゼ−８が欠損することのＰＨｘ後の肝臓再生に対する効果が評価された。先の報告と一致して、ＰＨｘは肝細胞の爆発的増殖を促すことが見いだされた（Faustoらにより概説された、2006）。Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓においては、しかしながら、増殖ならびにＧ１／Ｓ移行に関連するいくつかの分子の変化の誘導（サイクリンＡ、ＤおよびＥの発現、および網膜芽腫タンパク質のリン酸化の増加）もまた、対照同腹子におけるよりも有意に少なく生じた（図２Ａ〜２Ｅ）。この減少は、１／３ＰＨｘおよび２／３ＰＨｘの後に観察され、それがより旺盛で良好な同調したＤＮＡ合成およびより効果的な細胞周期の進行につながる（Mitchellら、2005  19）。切除後の最初の数時間の死亡数は２／３ＰＨｘ後で有意に高かったので、その後の全てのカスパーゼ−８欠損の効果の分析は１／３ＰＨｘからのマウスの回復に限定された。
【０１４０】
実施例３  ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：虚血病変部位の回復の改善
インビボでの細胞増殖の厳格な制御は、その通常のサイズを維持する肝臓の能力および切開後の元のサイズの正確な回復により印象的に現れた（Diehl、2000、ならびにMichalopoulosおよびDeFrances、1997）。種々の病原体症状では、しかしながら、この制御は失敗し、結果として異常に肥大する（肝腫）（Adachiら、1995、Andersら、2005およびZimmersら、2003）。ＰＨｘ後の肝臓の回復に対するカスパーゼ−８欠損の効果をさらに評価するために、肝臓体積の変化がＭＲＩを使用して監視された。肝切除前は、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの平均肝臓体積は、Ｃａｓｐ８F/+：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスのものと同一であった（データは示していない）。ＰＨｘ後は、しかし、この２群は肝臓成長の反応速度において有意に異なった（図３Ｃ）。Ｔ1強調スピンエコーＭＲＩ上で、２つの領域は肝切除術を受けた肝臓において区別が可能であり：切開の結果として生み出された虚血病変部位には、壊死性組織および死んだ細胞が含まれることが組織学的分析で見出され（図３Ｅ）、そのサイズは再生の間に徐々に減少し；肝臓の残りの部分では切開した組織の喪失を補うためにサイズが増加した。Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスにおける虚血病変部位のサイズの減少は、対照マウスにおけるよりも有意に速く（図３Ａ〜３Ｃ）、肝細胞におけるカスパーゼ−８の不在が、その部位での組織の迅速な治癒または吸着を促すことを示唆する。
【０１４１】
実施例４  ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：持続的な遅延した肝細胞増殖
驚くべきことに、カスパーゼ−８欠損肝細胞の初期の増殖反応は、正常肝細胞におけるよりも穏やかで、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓の残りの部分のサイズの増加は、その対照同腹子におけるよりゆっくりではなく、有意に速かった。その上、対照マウスの肝臓は、一旦その元のサイズに至ると成長を止めるのに対し、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスにおける肝臓の最終的なサイズは正常よりも有意に大きく（図３Ｄ）、ＰＨｘ前のサイズの１２０％に至った。
【０１４２】
肝切除後の後期における肝細胞増殖の評価に際して、対照マウスでは肝臓における細胞増殖は初期の突発の後治まるが、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝細胞の増殖は切開後数週間続く；よって最終的に、初期の抑制にも関わらず、正常マウスを有意に上回ることが見出された（図２Ａ、下のパネル、および図２Ｂ）。同様なＰＨｘ後の持続的な遅延した増加は、サイクリンＡおよびＥの肝細胞レベルにおいても観察された（図２Ｄ）。
【０１４３】
実施例５  ＰＨｘからの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：慢性炎症反応
Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅ肝細胞はＰＨｘ後長く増殖を続けるとの本観察は、肝切除後の後期においてこれらのマウスの肝臓のサイズが持続的に増加することに一致するようである。しかしながら、より速い体積増加は既に肝切除の数日後には認識できるという事実は（図３Ｄ）、カスパーゼ−８欠損肝細胞の増殖率が正常よりもまだ遅い時には、この差異にも付加的な因子が寄与していることを示唆した。
【０１４４】
高炭酸ガスおよび高酸素と組み合わせた機能的ＭＲＩプロトコールは、病理学的変化の多様性に起因する灌流および血流力学的変化の感度のよい方法を提供する（Barashら、2006）。この研究では、対照マウスでは肝臓血管分布像および血液容量の減少を反映し、ＰＨｘの後にΔＳｃｏ2およびΔＳｏ2の双方において減少した。対照的に、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓では、ＰＨｘの４日後双方のパラメーターが、血液体積および流量の増加の結果として増加した（図４Ａ、４Ｂ）。こういった増加は炎症状態に関連して起きることが見出された（Barash H、非公開データ）。組織学的分析は、当然、肝切除されたＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓での白血球の大量の蓄積を明らかにし、炎症を示唆した。抗−Ｆ４／８０抗体での染色は、蓄積する白血球はマクロファージであることを示唆した（図５Ａ、５Ｂ）。ウェスタン分析は、リン酸化ＳＴＡＴ−３、炎症中に活性化するシグナル伝達タンパク質の、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓における有意な増加を明らかにした（図５Ｃ）。
【０１４５】
上述したように、Ｃａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスにおける炎症および増強した肝細胞増殖は、それらのリステリア  モノサイトゲネス感染後にも観察された（図１−４、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ）。本発明者らのマウスは、特定の無菌設備で管理され、にもかかわらず、リステリア感染のこの効果を考慮し、ＰＨｘ後に観察された炎症および増強した肝臓成長が、本発明者らが気付かなかったいくつかの病原体の効果を反映する可能性をさらに排除しようと試みた。したがって、帝王切開術により再び得られ、ノトバイオートの養母と共に置かれ、その後無菌アイソレータ内に保たれたマウスで繰り返された。これらの再び得られたマウスの部分肝切除は、再び得る前に観察されたのと同じ慢性炎症状態を起こした（データは示さない）。
【０１４６】
実施例６  部分肝切除からの回復に対する肝細胞におけるカスパーゼ−８欠損の効果：慢性炎症反応の結果として起きる持続する遅延した肝細胞増殖
持続した肝細胞増殖期間中の肝切除されたＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスの肝臓由来の異なる切片の比較組織学的分析は、細胞成長の程度における切片間の多様性が対応する領域において蓄積するマクロファージ数と相関することを開示し（図５Ｂ）、肝細胞増殖および肝臓の炎症状態には因果関係があると示唆した。この関係をさらに調査するために、マウスは塩化ガドリニウム、クッパー細胞の一時的な消耗を誘導する薬剤（Canbayら、2003）を、その炎症が最高潮に至ったＰＨｘ後１０日および１２日に注射された。図５Ｂ（下のパネル）ならびに図６Ａおよび６Ｂで示されたように、実質的にＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅ肝臓に蓄積した炎症細胞を減少させることに加えて、この治療はまた、これらのマウスにおける肝細胞増殖の増加を実質的に一掃した。さらに、それらの肝臓のサイズの過度の増加（おそらく部分的には炎症に関連した血液体積および流量の増加ならびにクッパー細胞の増加が原因で、また部分的には同時に主に起きる肝細胞数の増加が原因である）は、削減された。これらの発見は、肝切除後の後期のＣａｓｐ８F/-：Ａｌｂ−Ｃｒｅマウスにおける肝細胞の構成的な成長は、それらの肝臓で起きる持続的炎症の結果であることを示唆する。
【０１４７】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図１−４】
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【図２Ａ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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