(57)【要約】  本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞であるＴｈ１細胞を誘導するエピトープを有する新たな腫瘍抗原とその利用法を提供する。  具体的には、ａ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列；ｂ）当該配列のアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜数十個付加されたアミノ酸配列；ｃ）当該配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１〜５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；ｄ）当該配列の１〜数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列；ｅ）当該配列の１〜数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸１〜数十個が付加されたアミノ酸配列；ｆ）当該配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１〜５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに１〜数個のアミノ酸残基が置換したアミノ酸配列；のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞にサイトカインを産生させる活性を有するポリペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のａ）〜ｆ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞にサイトカインを産生させる活性を有するポリペプチド。
ａ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜数十個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１〜５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列。
ｅ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜数十個付加されたアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１〜５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに１〜数個のアミノ酸残基が置換したアミノ酸配列。
【請求項２】
ｂ）〜ｆ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するエピトープであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞を誘導する当該エピトープを有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上を有効成分として含む、悪性新生物免疫治療用ワクチン。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とをインビトロでインキュベーションする工程を含む、ＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞を誘導する方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載のポリペプチドと該ポリペプチド又はＭＡＧＥ−Ａ４に対して特異的なＴｈ細胞とを含む、悪性新生物治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌免疫療法に利用可能な抗原性ポリペプチドと、当該ポリペプチドを含む悪性新生物治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
難治性の疾患である癌（悪性新生物）に対する治療法の一つに、患者個体の持つ免疫系を利用して癌細胞を退縮させる、いわゆる癌免疫療法が挙げられる。この方法における重要な点は、如何にして免疫系に癌細胞を異物として認識させ、癌細胞に対して攻撃性を有する免疫細胞を導くか、である。【０００３】
抗腫瘍免疫に関与する重要な免疫細胞に、細胞表面蛋白質であるＣＤ８を発現している細胞傷害性（ＣＤ８＋Ｔ細胞）と、細胞表面蛋白質であるＣＤ４を発現しているＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）とがある。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、活性化された場合、ＨＬＡクラスＩ分子に結合する抗原を提示している細胞を溶解するＴ細胞である。ＣＤ４＋Ｔ細胞はサイトカインを分泌するＴｈ細胞であって、ＨＬＡクラスＩＩ分子により抗原を提示するマクロファージおよびあるいは樹状細胞などにより活性化され、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導および維持のためのヘルパー機能を発揮する。また、Ｔｈ細胞は分泌するサイトカインの種類によってＴｈ１細胞(ＩＦＮ−γ等を産生する) 、Ｔｈ２細胞（ＩＬ−４等を産生する) 及びＴｈ０細胞(サイトカイン産生能は低いか、あるいはＩＦＮ−γ、ＩＬ−４等を共に産生する)に分類されることが知られており、各細胞の役割も解明されつつある。またＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子陰性腫瘍（ＭＨＣクラスＩＩ−腫瘍）に対する間接的な機構によって、例えばマクロファージの活性化を介して、またはＭＨＣクラスＩＩ陽性腫瘍に対する直接的な機構によって、エフェクター機能を持つこともできる。【０００４】
これまで、ヒトの癌免疫治療におけるＴ細胞の研究は、ＣＤ８＋ＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＴＬ応答(ＣＤ８＋ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅ)の同定および誘導に焦点が絞られていた（特許文献１）。ＣＤ４＋Ｔ細胞については、癌抗原の一つであるチロシナーゼとそのＣＤ４＋Ｔ細胞に対するエピトープの同定が報告されている（特許文献２）。チロシナーゼは、メラノサイト系列の正常細胞および腫瘍細胞の中で発現され、ＣＤ４＋メラノーマ反応性Ｔ細胞の特異的標的として示された、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する唯一のメラノーマ会合性組織特異的抗原である（非特許文献１）。しかし、チロシナーゼは限られた型の腫瘍でのみ発現する抗原であり、癌免疫治療における有望な癌抗原であるとは言い難い。【０００５】
最近になって、ＭＡＧＥと称される、ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される腫瘍特異抗原をコードしている遺伝子ファミリーが報告されている（非特許文献２〜非特許文献４、特許文献３、特許文献４）。このＭＡＧＥファミリーは、様々なタイプの腫瘍において発現される約１２のメンバーからなる。その内の一つであるＭＡＧＥ−Ａ３に関する研究の結果、ある一部のペプチド断片がＨＬＡクラスＩ分子によって提示されること（特許文献５）、また別のある一部のペプチド断片がＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する機能を有するペプチド（ＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチド）であることが示された（特許文献６、特許文献７）。【０００６】
しかし、ＭＡＧＥ−Ａ３がＨＬＡクラスＩＩ結合性ペプチドを含むことは示されたが、患者が適当なＨＬＡ分子を発現しないために、ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドによるヘルパーＴ細胞の活性化を含む治療が功を奏しない患者が多数存在する。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、かつＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識されるエピトープを含む、さらなる腫瘍関連抗原を同定する必要がある。【０００７】
ＭＡＧＥファミリーの一つであるＭＡＧＥ−Ａ４は、全３１７アミノ酸残基からなる腫瘍特異的抗原である（配列番号３）。ＭＡＧＥ−Ａ４は多くのメラノーマおよび食道癌、頭頚部癌、肺癌等の腫瘍組織型において高発現しているが、精巣および胎盤以外の正常細胞では発現していないことが知られている（非特許文献５）。【０００８】
ＭＡＧＥ−Ａ４の抗原性に関しては、ＭＡＧＥ−Ａ４の１４３−１５１位のアミノ酸配列が、ＣＤ８＋Ｔ細胞に認識されるエピトープを提示することが報告されている（非特許文献６）。また、ＭＡＧＥ−Ａ４の機能については、ガンキリンとの結合性が報告されており（特許文献８）、ＭＡＧＥ−Ａ４のＣ末端部分に相当する２１１〜３１７番目のアミノ酸に相当する部分がガンキリンとの結合性に関与していることが開示されている。ただし、同時に、ＭＡＧＥ−Ａ４の２１１番目のアミノ酸から９７残基までを含むＣ末端部分はガンキリンとの結合能を持っていないとも報告されている。
【非特許文献１】Ｔｏｐａｌｉａｎ, Ｓ．Ｌ．ら、１９９４年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、第９１巻、第９４６１−９４６５頁
【非特許文献２】Ｐｌａｅｎら、１９９４年、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、第４０巻、第３６０−３６９頁
【非特許文献３】Ｔｒａｖｅｒｓａｒｉら、１９９２年、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、第３５巻、第１４５頁
【非特許文献４】ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５４巻、第１６４３頁
【非特許文献５】Ｄｕｆｆｏｕｒ Ｍ．Ｔ．ら、１９９９年、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２９巻、第３３２９−３３３７頁
【非特許文献６】Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏ， Ｍ．ら、２００５年、Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、第１２１巻、第５５８１−５５８９頁
【特許文献１】ＷＯ９５／１９７８３号公報
【特許文献２】ＷＯ９７／１１６６９号公報
【特許文献３】ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３５４
【特許文献４】米国特許第５，３４２，７７４号公報
【特許文献５】米国特許第５，５９１，４３０号公報
【特許文献６】米国特許第５，９６５，５３５号公報
【特許文献７】ＰＣＴ／ＵＳ９９／２１，２３０
【特許文献８】特開２００４−１２３７５２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、腫瘍抗原を利用して悪性新生物を治療する方法において有用な新たな治療剤と、該治療剤に利用可能な腫瘍抗原を提供するものである。【００１０】
本発明者らは、腫瘍抗原と、該腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞とを含む治療剤が、該腫瘍抗原を発現している悪性新生物を著しく退縮させる効果を有していることを実験的に見いだし、さらに該腫瘍抗原として利用可能な新規な抗原性ペプチドを特定し、下記の各発明を完成した。【００１１】
（１）下記のａ）〜ｆ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞にサイトカインを産生させる活性を有するポリペプチド。
ａ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜数十個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１〜５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列。
ｅ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜数十個付加されたアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１〜５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに１〜数個のアミノ酸残基が置換したアミノ酸配列。【００１２】
（２）ｂ）〜ｆ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するエピトープであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞を誘導する当該エピトープを有するポリペプチドである、（１）に記載のポリペプチド。【００１３】
（３）（１）又は（２）に記載のポリペプチドをコードする核酸。【００１４】
（４）（３）に記載の核酸を含むベクター。【００１５】
（５）（１）又は（２）に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。【００１６】
（６）（１）又は（２）に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上を有効成分として含む、悪性新生物免疫治療用ワクチン。【００１７】
（７）（１）又は（２）に記載のポリペプチドの少なくとも一種以上と抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とをインビトロでインキュベーションする工程を含む、ＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞を誘導する方法。【００１８】
（８）（１）又は（２）に記載のポリペプチドと該ポリペプチド又はＭＡＧＥ−Ａ４に対して特異的なＴｈ細胞とを含む、悪性新生物治療剤。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のペプチドは、これを抗原提示細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞とインキュベーションすることで、ＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞（以下、Ａ４／Ｔｈ細胞と表す）を誘導し、またこのＡ４／Ｔｈ細胞に対してサイトカインを産生させる活性を有している。このＡ４／Ｔｈ細胞はＭＡＧＥ−Ａ４を発現している悪性新生物を特異的に攻撃するので、本発明のペプチドは悪性新生物治療剤の成分として利用することができる。また本発明のポリペプチドは、構成アミノ酸残基数が少なく、遺伝子組み換え手法に限らず、有機合成的方法によって大量に製造することができるので、臨床研究あるいは臨床応用において、安定的にかつ安価に供給され得る。【００２０】
また本発明のポリペプチドを含む悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原を当該腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞と組み合わせることで、Ｔｈ細胞に対してサイトカインの産生をより強く促すことができる。産生されたサイトカインは該腫瘍抗原を発現している悪性新生物に対して特異的な抗腫瘍免疫反応を生体に惹起し、腫瘍を退縮させる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ−ＤＲＢ１であるヒトから誘導したＡ４／Ｔｈ細胞に混合ペプチドＭＩＸ１〜ＭＩＸ９をそれぞれ加えたときの、Ａ４／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ−γの産生を測定した結果を示すグラフである。
【図２】ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ−ＤＲＢ１であるヒトから誘導したＡ４／Ｔｈ細胞にポリペプチドＭ３６〜Ｍ４０をそれぞれ加えたときの、Ａ４／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ−γの産生を測定した結果を示すグラフである。
【図３】ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ−ＤＰＢ１であるヒトから誘導したＡ４／Ｔｈ細胞に、混合ペプチドＭＩＸ９ならびにポリペプチドＭ４１〜Ｍ４４をそれぞれ加えたときの、Ａ４／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ−γの産生を測定した結果を示すグラフである。
【図４ａ】実施例３の方法によって誘導されたＭ３８／Ｔｈ1細胞にＭ３８を加えたときの、Ｍ３８／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ−γの産生を測定した結果を示すグラフである。
【図４ｂ】実施例３の方法によって誘導されたＭ４１／Ｔｈ1細胞にＭ４１を加えたときの、Ｍ４１／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ−γの産生を測定した結果を示すグラフである。
【図５ａ】実施例４の方法によって誘導されたＡ４／Ｔｈ細胞にＭ４１を加えたときのＡ４／Ｔｈ1細胞によるＩＬ−４の産生を測定した結果を示すグラフである。
【図５ｂ】実施例４の方法によって誘導されたＡ４／Ｔｈ細胞にＭ４１を加えたときのＡ４／Ｔｈ1細胞によるＩＦＮ−γの産生を測定した結果を示すグラフである。
【図６】Ｍ４１の末端を欠失させたＭ４１改変体Ｔ１〜Ｔ１２のアミノ酸配列と、Ａ４／Ｔｈ細胞に各Ｍ４１欠失改変体を加えたときのＡ４／Ｔｈ1細胞によるＩＦＮ−γの産生を測定した結果を示すグラフである。
【図７】Ｍ４１のアミノ酸残基を置換させたＭ４１改変体Ｓ１〜Ｓ１３のアミノ酸配列と、Ａ４／Ｔｈ細胞に各Ｍ４１置換改変体を加えたときのＡ４／Ｔｈ1細胞によるＩＦＮ−γの産生を測定した結果を示すグラフである。
【図８】Ｍ４１にＣＴＬエピトープを提示するアミノ酸配列が付加されたＭ４１付加改変体のアミノ酸配列と、Ａ４／Ｔｈ細胞にＭ４１付加改変体を加えたときのＡ４／Ｔｈ1細胞によるＩＦＮ−γの産生を測定した結果を示すグラフである。
【図９】Ｍ３８と組み換えＭＡＧＥ−Ａ４のＩＦＮ−γの産生誘導能の比較実験の結果を示す。図中のＡは陰性コントロール、ＢはＭ３８（１０μｇ／ｍＬ）、Ｃは組み換えＭＡＧＥ−Ａ４（５０μｇ／ｍＬ）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ４の部分ポリペプチドである腫瘍抗原、及び該腫瘍抗原と該腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞とを含む、悪性新生物治療剤に関する。本発明の悪性新生物治療剤は、好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ４の部分ポリペプチドである腫瘍抗原と、治療対象患者から回収されるＣＤ４＋Ｔ細胞から該腫瘍抗原によって誘導される、該腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞とを含む治療剤である。【００２３】
本発明の悪性新生物治療剤は、ＭＡＧＥ−Ａ４の部分ポリペプチドである腫瘍抗原と該腫瘍抗原に特異的なＴｈ細胞を組み合わせてなるという構成によって、該腫瘍抗原又は該腫瘍抗原に特異的なＴｈ細胞をそれぞれ単独で患者に投与した場合に比べて、悪性新生物の退縮作用において顕著な効果を奏する。【００２４】
ＭＡＧＥ−Ａ４の部分ポリペプチドである腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞とは、該腫瘍抗原によって特異的に刺激されることによってサイトカインを産生するＴｈ細胞であれば、Ｔｈ０細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞のいずれであってもよいが、Ｔｈ１細胞であればなおよい。かかる腫瘍抗原に対して特異的なＴｈ細胞は、該腫瘍抗原、ＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している抗原提示細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞を適当な条件下でインキュベーションすることで、該ＣＤ４＋Ｔ細胞から誘導し、調製することができる。【００２５】
本発明の方法で利用可能なＣＤ４＋Ｔ細胞は、採取された血液から一般的な方法、例えばＭＡＣＳ (Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ社)等を用いた方法で単離することができる。本発明では、治療対象となる悪性新生物を有する患者から回収されたＣＤ４＋Ｔ細胞の利用が好ましい。【００２６】
本発明の方法で利用可能な抗原提示細胞は、表面にＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している細胞であればよく、樹状細胞の他にＢ細胞、マクロファージ、単球、非増殖性のトランスフェクタント等を挙げることができるが、これらには限定されない。【００２７】
インキュベーションは、ＭＡＧＥ−Ａ４の部分ポリペプチドである腫瘍抗原と抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とを同時にインキュベーションしてもよく、あるいは該腫瘍抗原と抗原提示細胞を先にインキュベーションし、その後にＣＤ４＋Ｔ細胞を共存させてインキュベーションしても良い。インキュベーションの条件は、ＩＬ−２の存在下で、抗原提示細胞に所望の抗原をＨＬＡクラスＩＩ分子を介して提示させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞から当該抗原に特異的な成熟したＴｈ細胞を誘導するための一般的な方法、例えばＴｉｍら（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、１９９６年、第１７巻、第３号、第１３８−１４６頁）に記載の方法に従えばよい。また、西村ら（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１９９９年、第１９０巻、第５号、第６１７−６２７頁）の記載に基づいて、インキュベーションの諸条件を種々に変更することによって、ＣＤ４＋Ｔ細胞から、Ｔｈ０細胞、Ｔｈ１細胞、又はＴｈ２細胞のいずれかを特異的に誘導することが可能である。Ｔｈ０細胞、Ｔｈ１細胞、又はＴｈ２細胞が誘導されたことは、ＭＡＧＥ−Ａ４の部分ポリペプチドである腫瘍抗原で再刺激したときに産生される細胞毎のサイトカイン（例えば前述のＴｉｍら）を確認することで行うことができる。サイトカイン産生の確認は、ＥＬＩＳＡ法その他の種々の方法を利用することができる。【００２８】
本発明のポリペプチドの一態様は、ＭＡＧＥ−Ａ４と称される腫瘍抗原蛋白質（前記非特許文献５）の２５９〜２７８番目のアミノ酸配列（配列番号１、以下Ｍ３８とする）とＭＡＧＥ−Ａ４の２８０〜２９９番目のアミノ酸配列（配列番号２、以下Ｍ４１とする）に相当する抗原性ポリペプチドである。【００２９】
さらに、Ｍ３８（配列番号１）とＭ４１（配列番号２）の各ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、以下のｂ）〜ｆ）のような関係にあるアミノ酸配列からなるポリペプチドも、本発明の腫瘍抗原として利用することができる。
ｂ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜数十個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１〜５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列。
ｅ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜数十個付加されたアミノ酸配列；
ｆ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１〜５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列においてさらに１〜数個のアミノ酸残基が置換したアミノ酸配列。【００３０】
上記のｂ）〜ｆ）のアミノ酸配列は、Ｍ３８又はＭ４１に存在するエピトープを保持し、Ａ４／Ｔｈ細胞に対してサイトカインを産生させる活性を有する、あるいはＣＤ４＋Ｔ細胞からＭＡＧＥ−Ａ４、Ｍ３８及び／又はＭ４１に特異的なＴｈ細胞を誘導するエピトープを有するポリペプチドを構成するアミノ酸配列として規定したものである。【００３１】
ｂ）〜ｆ）において規定される置換、欠失あるいは付加されるアミノ酸残基の種類は、先に示したポリペプチドの活性ないし機能を保持する範囲において特に制限はないが、ｂ）ならびにｅ）における１〜数十個のアミノ酸の付加とは、１〜５０アミノ酸、好ましくは１〜３０アミノ酸、さらに好ましくは１〜１５アミノ酸の付加である。【００３２】
Ｍ３８とＭ４１は、ＭＡＧＥ−Ａ４と抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とをインキュベーションすることでＣＤ４＋Ｔ細胞から誘導されるＡ４／Ｔｈ細胞に対して、サイトカインを産生させる活性を有している。このことは、Ｍ３８とＭ４１がＡ４／Ｔｈ細胞によって認識されるエピトープを有しており、さらに当該エピトープが、ＭＡＧＥ−Ａ４を取り込んだ抗原提示細胞の表面に発現しているＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されるエピトープであることを意味する。従って、ＭＡＧＥ−Ａ４、Ｍ３８及び／又はＭ４１とＡ４／Ｔｈ細胞とを含む悪性新生物治療剤は、本発明の一態様である。また、ＭＡＧＥ−Ａ４、Ｍ３８及び／又はＭ４１と抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とをインキュベーションすることでＣＤ４＋Ｔ細胞から誘導されるＭ３８及び／又はＭ４１に特異的なＴｈ細胞とを含む悪性新生物治療剤も、本発明の一態様である。【００３３】
Ｍ３８はＨＬＡ−ＤＲＢ１*０１０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ１*１４０５というＨＬＡの遺伝子型を有するヒトにおいて、Ｍ４１はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１というＨＬＡの遺伝子型を有するヒトにおいて、それぞれ腫瘍抗原として同定されたポリペプチドであることから、Ｍ３８とこれに基づくｂ）〜ｆ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ−ＤＲＢ１、より具体的にはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１であるヒトに対して特に有効なポリペプチドであると考えられる。また、Ｍ４１とこれに基づくｂ）〜ｆ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ−ＤＰＢ１、具体的にはＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１であるヒトに対して特に有効なポリペプチドであると考えられる。【００３４】
上記の各ポリペプチドは、いずれも悪性新生物治療剤の一成分として利用可能な新規なポリペプチドであり、ＣＤ４＋Ｔ細胞から該ポリペプチドに特異的なＴｈ細胞を誘導する活性及び／又はかかるＴｈ細胞又はＡ４／Ｔｈ細胞にサイトカインを産生させる活性を有する。上記の各ポリペプチドにおける、該ポリペプチド又はＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞にサイトカインを産生させる活性は、該Ｔｈ細胞を該ポリペプチドで刺激し、産生されるサイトカインを種々の公知の方法で測定することで確認することができる。例えば、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の産生は、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製その他の市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、簡便に測定、確認することができる。【００３５】
なお、本発明の一態様である前記の各ポリペプチドは、それらを構成するアミノ酸配列を有する限り、例えば蛋白質の分離精製に有用なタグ配列として汎用されているＨｉｓ−Ｔａｇや、適当なリンカー配列、ＧＦＰの様なマーカー蛋白質のアミノ酸配列等をさらに付加したり、あるいはビオチンなどの標識化合物をポリペプチドに付加させたりすることも可能である。従って、本発明の一態様であるポリペプチドを構成するアミノ酸配列に、それらのポリペプチドに特異的なＴｈ細胞やＡ４／Ｔｈ細胞にサイトカインを産生させること、あるいはＣＤ４＋Ｔ細胞から前記細胞を誘導すること以外の目的のために利用される任意のアミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドや、本発明のポリペプチドに適当な標識化合物が付加されたポリペプチドであっても、該細胞にサイトカインを産生させる活性あるいはＣＤ４＋Ｔ細胞から特異的なＴｈ細胞を誘導するエピトープを有する限り、その様なポリペプチドは依然として本発明の範囲内である。【００３６】
本発明のポリペプチドは、それらをコードするＤＮＡに種々の公知の遺伝子組み換え手法を適用することで、当該ポリペプチドを組み換え蛋白質として製造することが可能である。典型的には、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを適当なＤＮＡ合成機を用いて合成し、当該技術分野における参考書、例えばＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９年等）に紹介されている種々の手法を適当に選択あるいは組み合わせて本発明のポリペプチドを発現する発現ベクターを構築し、大腸菌等の適当な宿主細胞をこの発現ベクターで形質転換させ、当該ポリペプチドを生産させればよい。その際、先に述べたように、Ｈｉｓ−ｔａｇの付加などの様に、組み換えポリペプチドの製造に利用される種々の操作を加えることが出来る。【００３７】
また、本発明のポリペプチドは、種々の保護基で修飾されたアミノ酸を原料として化学合成的に製造することも出来る。ポリペプチドを遺伝子や宿主細胞を用いずに有機化学的に合成する方法は当業者に広く知られている。例えば、「第５版 実験化学講座１６ 有機化合物の合成ＩＶ」（相本三郎ら著、日本化学会編）などは、ポリペプチドの化学合成法を種々紹介しており、本発明のポリペプチドはこれらのいずれの方法を用いても合成することが出来る。また、一般にペプチドシンセサイザーと称される市販機器を用いて合成することもできる。【００３８】
上記のポリペプチドは、適当な条件下での抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とのインキュベーションにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ細胞に誘導することができる。この様に、本発明は、ＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している抗原提示細胞と、ＣＤ４＋Ｔ細胞と、上記のポリペプチドとをインビトロでインキュベーションして、上記のポリペプチド及び／又はＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞を誘導する方法も提供する。インキュベーションにおいて、ＩＬ−２に加えて、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、又は抗ＩＬ−４抗体の１以上を添加することが好ましく、かかる条件において、ＩＦＮ−γを産生し、かつＩＬ−４の産生が低いＴｈ１細胞を誘導することができる。【００３９】
この方法で利用可能な抗原提示細胞は、前述と同様に、表面にＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している細胞であれば利用可能であり、樹状細胞の他にB細胞、マクロファージ、単球、非増殖性のトランスフェクタント等を挙げることができるが、これらには限定されない。また、インキュベーションは、上記のポリペプチドと抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とを同時にインキュベーションしてもよく、また本発明のポリペプチドと抗原提示細胞を先にインキュベーションし、その後ＣＤ４＋Ｔ細胞を共存させてインキュベーションしても良い。また、本発明のペプチドと細胞表面にＨＬＡクラスＩＩ分子を発現している抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞とのインキュベーションの諸条件は、前述の通り、抗原提示細胞に所望の抗原をＨＬＡクラスＩＩ分子を介して提示させ、ＣＤ４＋Ｔ細胞から当該抗原に特異的な成熟したＴｈ細胞を誘導するための一般的な方法、例えば前記Ｔｉｍらに記載の方法におけるインキュベーションの条件に準じて定めることができる。【００４０】
本発明の方法によれば、患者から抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞を回収し、これらと本発明のポリペプチドとをインキュベーションすることにより、Ａ４／Ｔｈ細胞をインビトロで誘導、培養することができる。この方法によって誘導されたＡ４／Ｔｈ細胞を患者に戻すことによって、患者自身の免疫系を活性化させ、腫瘍細胞を退縮させることで、悪性新生物を治療することができるものと期待される。また、この方法によって誘導されたＡ４／Ｔｈ細胞又はＭＡＧＥ−Ａ４を用いて誘導されたＡ４／Ｔｈ細胞と本発明のポリペプチドとを患者に投与することで、悪性新生物を治療することができる。【００４１】
また本発明のポリペプチドは、これをウサギ等の適当な動物に投与することで、ＭＡＧＥ−Ａ４を特異的に認識することのできる抗体を当該動物において誘導することができる。この様な抗体は、ＭＡＧＥ−Ａ４が発現している細胞の存在、すなわち癌細胞の存在を特異的に検出することができ、効率的な悪性新生物の診断に利用することができる。【００４２】
さらに本発明のポリペプチドは、患者の体内においてＭＡＧＥ−Ａ４を発現している腫瘍細胞を攻撃する免疫細胞の状態を確認する方法、あるいは本発明の悪性新生物治療剤又はワクチンの投与によるＭＡＧＥ−Ａ４を発現している腫瘍細胞を攻撃する免疫細胞の誘導をモニタリングする方法に、それぞれ使用することができる。【００４３】
本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該腫瘍特異抗原に対して特異的なＴｈ細胞の他に、これらの作用を阻害しない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分等を含んでいてもよい。特に、本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該腫瘍特異抗原に対して特異的なＴｈ細胞を安定に保持できる緩衝液あるいは液体培地の形態にあることが好ましい。緩衝液の非限定的な例としては、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水などを挙げることができる。また、例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の糖質、タンパク質、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、浸透圧調節剤、懸濁剤、増粘剤および／または保存剤などをさらに含んでいてもよい。また本発明の悪性新生物治療剤は、腫瘍抗原と該腫瘍特異抗原に対して特異的なＴｈ細胞とが混合されている形態にあることが好ましいが、腫瘍抗原と該腫瘍特異抗原に対して特異的なＴｈ細胞とが別々に保存され、使用時に混合して投与することのできる、いわゆるキットの形態であってもよい。【００４４】
以下、実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４５】
＜実施例１＞Ｍ３８の同定
１）組み換えＭＡＧＥ−Ａ４の調製
手術摘出腫瘍よりＲＮＡをＩＳＯＧＥＮ(ニッポンジーン)を用いて抽出した後，ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ワンステップＲＴ−ＰＣＲシステム（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を用いてプライマー Ａ４Ｆ(ｇｇａｔｃｃａｔｇｔｃｔｔｃｔｇａｇｃａｇａａｇａｇ、配列番号５)、Ａ４Ｒ(ａａｇｃｔｔｔｃａｇａｃｔｃｃｃｔｃｔｔｃｃｔｃｃｔｃｔａａ、配列番号６)で増幅反応を行い ＭＡＧＥ−Ａ４をコードしているｃＤＮＡ（配列番号４）を得た。増幅産物はＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を用いてクローニングし、ＭＡＧＥ−Ａ４ｃＤＮＡ部分の塩基配列をＧｅｎＢａｎｋ ＮＭ_００１０１１５５０との比較により確認した。確認後、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩとを用いてフラグメントを調製し、同じ制限酵素を用いて開環させた市販の発現ベクタープラスミドｐＱＥ９ (ＱＩＡＧＥＮ)に組み込んで、ＭＡＧＥ−Ａ４を発現することのできる発現ベクターｐＱＥ９−ＭＡＧＥＡ４を調製した。【００４６】
発現ベクターｐＱＥ９−ＭＡＧＥＡ４を用いて大腸菌ＢＬ−２１(ＤＥ３)ｃｏｄｏｎ ｐｌｕｓ(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社)を形質転換して得られた組み換え細胞を、ＬＢ培地でＯＤ＝１．０となるまで培養し、発現誘導のためにＩＰＴＧ (ＳＩＧＭＡ)を終濃度１ｍＭになるように添加、さらに３７℃で４時間培養した。その後６０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離で菌体を回収し、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１０ｍｌに懸濁後、超音波破砕した。破砕菌体溶液の上清を１５０００ｒｐｍ、１５分の遠心分離にて回収後、０．４５μｍフィルター(ザルトリウス)に通し、平衡化したＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ (Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)を用いてｐＨ濃度勾配法 (ｐＨ８．０〜４．５)にて溶出し、ＭＡＧＥ−Ａ４を含む画分を、１５%アクリルアミドゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認し、回収した。回収された画分に含まれるＭＡＧＥ−Ａ４をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １００００カット (ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ)を用いて遠心濃縮し、同時にＰＢＳへ緩衝液の置換を行い、以下の実験に使用する組み換えＭＡＧＥ−Ａ４を得た。【００４７】
２）単球由来樹状細胞 (ｍＤＣ)の調製
ＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１及びＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４０５である健常人の末梢血より、ファイコール (Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ; ＧＥ ＨｅａｌＴｈｃａｒｅ)重層法を用いてｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ（以下ＰＢＭＣと表す）を分離した。ＰＢＭＣを血清不含ＡＩＭ−Ｖ培地（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）にて２時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で培養した後、培地交換により非付着性細胞を取り除いた。３０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦと３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３ (どちらもＰｅｐｒｏＴｅｃｈ ＥＣ Ｌｔｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄより購入)を含む無血清ＡＩＭ−Ｖ培地で付着細胞を培養し、３日後と５日後に培養液を同じ組成の新しいものに交換した。培養開始から７日後に２．５ｍｇ／ｍｌトリプシン (Ｓｉｇｍａ)にて処理し、ピペッティングして付着性の細胞を培養容器より剥離後回収し、抗原提示細胞 (ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ;ＡＰＣ)としてのｍＤＣを得た。さらに、ＭＡＣＳ (Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈより購入)を使用して、ｍＤＣを誘導する際に得られた非付着性細胞から抗ＣＤ４抗体吸着性細胞を単離し、ＣＤ４＋Ｔ細胞を得た。【００４８】
３）組み換えＭＡＧＥ−Ａ４を用いたＭＡＧＥ−Ａ４特異的Ｔｈ細胞の樹立
２）で調製したｍＤＣ １×１０６個／ｍＬ培地に終濃度が５０μｇ／ｍｌになるように組み換えＭＡＧＥ−Ａ４を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２時間培養した後、マイトマイシンＣ (ＭＭＣ、協和発酵)を加えて４５分間インキュベーションして、抗原提示処理を行った。２４穴プレート(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ)の１つの穴に、ＣＤ４＋Ｔ細胞(１×１０６／ｗｅｌｌ)と抗原提示処理したｍＤＣ（１×１０５／ｗｅｌｌ)を加え、培養液１０００μＬ中で共培養した。培養液は、５％ＡＢ型健常人血清 (複数のボランティアより供与)を含むＡＩＭ−Ｖ培地を用いた。共培養開始から７日後、別のウェルで前記と同様に抗原提示処理したｍＤＣ（１×１０５／ｗｅｌｌ）を用意し、７日間共培養していたＣＤ４＋Ｔ細胞を移すことにより、再刺激をおこなった。その２日後、組み換えＩＬ−２を最終濃度１０Ｕ／ｍＬになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養することにより、Ａ４／Ｔｈ細胞を樹立した。【００４９】
４）ペプチドの合成
ＭＡＧＥ−Ａ４の１〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチド、７〜２７番目のアミノ酸配列からなるペプチド、１４〜３４番目のアミノ酸配列からなるペプチドの様に、Ｃ末端及び／又はＮ末端に７アミノ酸のオーバーラップ配列を有する２０アミノ酸残基からなるペプチドを、ＭＡＧＥ−Ａ４のＮ末端からＣ末端に至るまで全４４種類（Ｍ１〜Ｍ４４とする）設計し、それぞれ化学合成した。さらに、Ｍ１〜Ｍ５のペプチド混合物、Ｍ６〜Ｍ１０のペプチド混合物というように、Ｍ１〜Ｍ４０の順序で、５種類のペプチドからなるペプチド混合物を８種類（ＭＩＸ１〜ＭＩＸ８）、及びＭ４１〜Ｍ４４の４種類のペプチド混合物１種類（ＭＩＸ９）を調製した。【００５０】
５）ポリペプチドの同定
３）で調製したＡ４／Ｔｈ細胞を９等分し、４）で調製したＭＩＸ１からＭＩＸ９を終濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにそれぞれ添加し、ＭＭＣ処理したＰＢＭＣと共培養することにより再刺激を行った。再刺激から１週間後に、細胞を同濃度の混合ペプチドを含む新しい培地に移す操作を３〜４回繰り返した。また再刺激開始から１４日目以降は、ＩＬ−２の最終濃度を２０Ｕ／ｍＬにして培養を続けた。培養後、培養上清中に含まれるＩＦＮ−γを、ＥＬＩＳＡキット (ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ)を用いて測定した。【００５１】
その結果、混合ペプチドＭＩＸ８による再刺激を行ったＡ４／Ｔｈ細胞においてＩＦＮ−γの産生が確認された（図１）。さらに、ＭＩＸ８に含まれる５種類のポリペプチド（Ｍ３６〜Ｍ４０までの５種類）の中からＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されるエピトープを有するポリペプチドを特定するために、ＭＩＸ８に含まれるペプチドＭ３６〜Ｍ４０をそれぞれ単独で用いてＰＢＭＣを刺激し、培養上清中に含まれるＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡキット (ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ)を用いて測定した。その結果、Ｍ３８による再刺激がＡ４／Ｔｈ細胞によるＩＦＮ−γの産生を促していることが確認され（図２）、Ｍ３８が、遺伝子型がＨＬＡ−ＤＲＢ１であるＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されるエピトープを有するポリペプチドであることが確認された。【００５２】
＜実施例２＞ Ｍ４１の同定
実施例１の２）でＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１である健常人の末梢血からファイコール (Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ; ＧＥ ＨｅａｌＴｈｃａｒｅ)重層法を用いてＰＢＭＣを分離したこと、及び選択されたペプチドＭＩＸが異なることの他は、実施例１の１）〜５）と同様の操作を行い、Ｍ４１が、遺伝子型がＨＬＡ−ＤＰＢ１であるＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示されるエピトープを有するポリペプチドであることを確認した（図３）。【００５３】
＜実施例３＞Ｍ３８、Ｍ４１によるＡ４／Ｔｈ1細胞の誘導
実施例１の２）で調製したｍＤＣ１．５×１０５個／ｍＬ培地に終濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにＭ３８又はＭ４１を添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２時間培養した後、マイトマイシンＣ (ＭＭＣ、協和発酵)を加えて４５分間インキュベーションして、抗原提示処理を行った。２４穴プレート(ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ)の１つの穴に、ＣＤ４＋Ｔ細胞(１×１０６／ｗｅｌｌ)と抗原提示処理したｍＤＣ（１×１０５／ｗｅｌｌ)にＩＬ−１２（１００ＩＵ／ｍＬ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社より供与)と抗ＩＬ−４抗体（５μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を加え、培養液１０００μＬ中で共培養した。培養液は、５％ＡＢ型健常人血清 (複数のボランティアより供与)を含むＡＩＭ−Ｖ培地を用いた。共培養開始から７日後、別のウェルで前記と同様に抗原提示処理したｍＤＣ（１×１０５／ｗｅｌｌ）を用意し、７日間共培養していたＣＤ４＋Ｔ細胞を移すことにより、再刺激をおこなった。その２日後、組み換えＩＬ−２を最終濃度 １０Ｕ／ｍＬになるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で７日間培養し、Ｍ３８、Ｍ４１それぞれからＴｈ1細胞（Ｍ３８／Ｔｈ1細胞、Ｍ４１／Ｔｈ1細胞）を得た。
Ｍ３８／Ｔｈ1細胞、Ｍ４１／Ｔｈ1細胞に対して、実施例１の１）で調製した組み換えＭＡＧＥ−Ａ４ ５０μｇ／ｍＬを加えたところ、いずれもＩＦＮ−γの産生が確認された。また、組み換えＭＡＧＥ−Ａ４に代えてＭ３８又はＭ４１の１０〜２０μｇ／ｍＬをそれぞれ加えたところ、組み換えＭＡＧＥ−Ａ４の添加と同様にＩＦＮ−γの産生が確認された（図４ａ、図４ｂ）。【００５４】
＜実施例４＞Ｍ４１によるＡ４／Ｔｈ細胞によるサイトカインの産生
実施例２の方法を用い、ＭＡＧＥ−Ａ４組換え蛋白質の代わりにＭ４１を１０μｇ／ｍＬの濃度で加えた実験を行ったところ，ＩＬ−４およびＩＦＮ−γの産生が確認された(図５ａ、図５ｂ)【００５５】
＜実施例５＞
１）実施例１の２）及び３）に記載の方法に準じて、ＨＬＡの遺伝子型としてＨＬＡ−ＤＰＢ１＊１４０３を有する健常人から、ＰＢＭＣ及び同遺伝子型のＡ４／Ｔｈ細胞を新たに調製した。
２）上記１）のＨＬＡの遺伝子型としてＨＬＡ−ＤＰＢ１＊１４０３を有するＰＢＭＣ、及び実施例２において調製したＨＬＡの遺伝子型がＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１であるＰＢＭＣを、５０％ＥＢウイルス産生細胞Ｂ９５−８（ＪＣＲＢ ＣＥＬＬ ＢＡＮＫより）の培養上清、１０％のＦｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ）及びシクロスポリンＡを含むＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）で、それぞれ３７℃、５％ＣＯ２で１０日間培養した。培養後、細胞を洗浄し、１０％ＦＣＳを含む新鮮なＲＰＭＩ培地に播き直し、同培地で増殖する細胞を回収し、遺伝子型の異なる２種類のＥＢウイルス不死化細胞株（ＬＣＬ）を調製した。
３）Ｍ４１のアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端及び／又はＣ末端を５〜９残基欠失させたアミノ酸配列からなるＭ４１の改変ポリペプチドＴ１〜Ｔ１２（配列番号７〜１８）をそれぞれ化学合成した。上記２）の２種類のＬＬＣを２×１０5個／１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地を１５ｍLのコニカルチューブに入れ、前記各ペプチド１０μｇを加えて３７℃で２時間培養後、遠心分離で培地を除去してＰＢＳで洗浄した。２×１０４個の洗浄した細胞／１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地とそれぞれに対応する遺伝子型を有するＡ４／Ｔｈ細胞５×１０4個／１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地を９６穴Ｕ底プレートで混合し、２０〜２４時間３７℃で培養した後の培養上清を回収し、培養上清中に含まれるＩＦＮ−γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。その結果を図６に示す。【００５６】
Ｍ４１のＣ末端から５番目までのアミノ酸の欠失はＩＦＮ−γの産生誘導能に影響は与えないが、Ｃ末端から６番目のアミノ酸までの欠失は、ＨＬＡの遺伝子型がＤＲＢ１＊１４０３である場合にはＩＦＮ−γの産生誘導能を低下させることが確認された。またＭ４１のＮ末端から４番目までのアミノ酸の欠失はＩＦＮ−γの産生誘導能に影響は与えないが、Ｎ末端から５番目のアミノ酸までの欠失は、ＨＬＡの遺伝子型によらずＩＦＮ−γの産生誘導能を低下させることが確認された。このことから、本発明のポリペプチドにおけるアミノ酸配列の欠失は、Ｎ末端では１〜４番目、Ｃ末端では１〜６番目、好ましくは１〜５番目までとすることが望ましい。【００５７】
＜実施例６＞
Ｍ４１のアミノ酸配列（配列番号２）のＮ末端から６番目〜１８番目までのアミノ酸残基を一つずつＡｌａに（１７番目のＡｌａのみＧｌｙに）に置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドＳ１〜Ｓ１３（配列番号１９〜３１）を合成した。実施例５の２）で調製したＬＣＬ（遺伝子型はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１）２×１０4個／１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地を１５ｍLのコニカルチューブに入れ、前記各ペプチド１０μｇを加えて３７℃で２時間培養後、遠心分離で培地を除去してＰＢＳで洗浄した。２×１０４個の洗浄した細胞／１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地と実施例２で調製したＡ４／Ｔｈ細胞（遺伝子型はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１）５×１０4個とを９６穴Ｕ底プレートで混合し、２０〜２４時間３７℃で培養した後の培養上清を回収し、培養上清中に含まれるＩＦＮ−γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。その結果を図７に示す。【００５８】
Ｍ４１のアミノ酸配列において、Ｎ末端から７〜１０番目のアミノ酸残基と１２番目及び１３番目のアミノ酸残基のアラニンへの置換によってＩＦＮ−γの産生誘導能が低下することが確認された。またＮ末端から１４番目以降のアミノ酸残基の置換は、ＩＦＮ−γの産生誘導能を殆ど変化させなかった。ただし、今回の置換はＬｙｓ、ＡｒｇやＧｌｕといった電荷を有するアミノ酸やＬｅｕ、Ｖａｌといった疎水性に高いアミノ酸をいずれもＡｌａという小型のアミノ酸に置換したものであり、保存性の高いアミノ酸置換、例えばＬｙｓとＡｒｇの相互置換、ＧｌｕからＡｓｐへの置換、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ等の疎水性アミノ酸同士の置換の影響は、Ａｌａへの置換とは異なることが予想される。一方、末端部分では、実施例５の結果と合わせると、何れもアミノ酸への置換も許容され得ると考えられる。以上から、Ｍ４１のＡ４／Ｔｈ細胞に対するＩＦＮ−γの産生誘導能は、Ｍ４１のＮ末端から５番目〜１４番目までのアミノ酸残基と、さらにＭ４１の７番目〜１０番目と１２番目〜１３番目のアミノ酸残基の種類に関連していると推察される。【００５９】
＜実施例７＞
Ｍ４１にＣＴＬエピトープを提示するアミノ酸配列（１８アミノ酸残基）が付加された４０アミノ酸残基からなるＭ４１の付加改変体（ＬｏＭ４１）を合成した。実施例５の２）で調製したＬＣＬ（遺伝子型はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１）２×１０4個／１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地をを１５ｍLのコニカルチューブに入れ、ＬｏＭ４１、Ｍ４１、コントロールとしてＭＡＲＴ１ポリペプチド各８μｇを加えて２時間培養後、遠心分離で培地を除去してＰＢＳで洗浄した。２×１０４個の洗浄した細胞／１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地と実施例２で調製したＡ４／Ｔｈ細胞（遺伝子型はＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１及びＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０５０１）５×１０4個とを９６穴Ｕ底プレートで混合し、２０〜２４時間３７℃で培養した後の培養上清を回収し、培養上清中に含まれるＩＦＮ−γを、ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。その結果を図８に示す。この実験により、ＬｏＭ４１がＭ４１と同等の誘導能を有するポリペプチドであることが確認された。【００６０】
＜実施例８＞
実施例１で調製したＡ４／Ｔｈ細胞とＭＭＣ処理したＰＢＭＣを用い、実施例１の５）に記載した方法に従って、１μｇ／ｍＬのＭ３８と５０μｇ／ｍＬの組み換えＭＡＧＥ−Ａ４のＩＦＮ−γの産生誘導能を測定した。その結果を図９に示す。この実験により、本発明のポリペプチドであるＭ３８が組み換えＭＡＧＥ−Ａ４よりもＡ４／Ｔｈ細胞に対して強いＩＦＮ−γ産生誘導能を有することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月29日(2008.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
下記のａ）〜ｄ）のいずれかのアミノ酸配列からなり、かつＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞にサイトカインを産生させる活性を有するポリペプチド。
ａ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に任意のアミノ酸が１〜数十個付加されたアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端の１〜５アミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜数個のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失したアミノ酸配列。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
ｂ）〜ｄ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドが、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが有するエピトープであって、ＣＤ４＋Ｔ細胞からＭＡＧＥ−Ａ４に特異的なＴｈ細胞を誘導する当該エピトープを有するポリペプチドである、請求項１に記載のポリペプチド。
【国際調査報告】
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