(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコール及びケトンからなる群から選ばれる１種以上の有機溶媒にラクトン化合物を溶かしてラクトン化合物溶液を製造する１段階；
前記ラクトン化合物溶液にベンゼン、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、ブタノール及びクロロホルムからなる群から選ばれる１種以上の有機溶媒を添加して混合溶液を製造する２段階；
前記２段階で生成された混合溶液に銀イオン（Ａｇ＋）水溶液を加えてラクトン化合物ＦＫ５０６が銀イオン水溶液に移動するようにする３段階；
前記ラクトン化合物ＦＫ５０６を含む銀イオン水溶液を有機溶媒層と分離して回収する４段階；
前記の回収された銀イオン水溶液にジクロロメタン、エチルアセテート、イソブチルアセテート、ｎ−ブチルアセテート及びｔ−ブチルアセテートからなる群から選ばれる１種以上の溶媒を加えてラクトン化合物ＦＫ５０６を抽出する５段階；及び
Ｃｌ−イオン含有水溶液を使用して前記の抽出されたラクトン化合物ＦＫ５０６に存在する銀イオンを除去し、結晶としてラクトン化合物ＦＫ５０６を収去する６段階；を含むラクトン化合物ＦＫ５０６を精製する方法。
【請求項２】
前記１段階の有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール及びアセトンからなる群から選ばれる１種以上である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記３段階で使用する銀イオンは、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）、酢酸銀（ＡｇＣＨ３ＣＯＯＨ）及び硫酸銀（ＡｇＳＯ４）からなる群から選ばれる１種以上である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記６段階でのＣｌ−イオン含有水溶液はＮａＣｌ水溶液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記精製過程で残った銀イオン溶液を再使用する請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不飽和アルキル基を有するラクトン化合物、特にＦＫ５０６を、その構造的類似体だが飽和アルキル基を有するラクトン化合物、特にＦＫ５２０、ジヒドロＦＫ５０６からカラムクロマトグラフィー過程を経ず銀イオン溶液を利用して分離する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＦＫ５０６は、ストレプトマイセス種の発酵によって生成される三員環マクロライドである。ＦＫ５０６は免疫抑制活性を有するマクロライド系ラクトン化合物であって、臓器移植、新生児赤芽球症（Ｒｈ  ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）の予防及び自己免疫疾患、感染性疾患等の治療に使用される。ＦＫ５０６は、１９８７年に初めて報告され（Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，１６，Ｎｏ．９，１２４９−１２５５，１９８７）アステラス製薬で販売中の化合物である。開発以降、様々な論文及び特許でＦＫ５０６の多様な分離及び精製方法が提示されている。
【０００３】
通常、微生物培養から得られる発酵産物は、培養液に培養培地と多様な代謝産物が共に存在する。ＦＫ５０６発酵産物には、ＦＫ５２０及びジヒドロＦＫ５０６のような構造的類似体が含まれている。これら物質は、主に微生物、特に、放線菌属微生物によって産生されると言われている。ＦＫ５０６は、ストレプトマイセスツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）９９９３、ストレプトマイセス属ＡＴＣＣ５５０９８、ストレプトマイセス属ＡＴＣＣ５３７７０、ストレプトマイセス属ＢＩＣＣ７５２２等の菌株で産生されると報告されており（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ．，Ｓ．Ｉ．Ｍｏｋｈｔａｒ，Ｍ．Ｋａｔｓｕｏｋａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｅｚａｋｉ．２００５．米国特許第４，８９４，３６６号、ＷＯ０５／０９８０１１）、ＦＫ５０６の構造的類似体であるＦＫ５２０もまた、免疫抑制活性と抗真菌活性（ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）を有し、ストレプトマイセスハイグロスコピクス亜属アスコマイセチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ａｓｃｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ１４８９１、ストレプトマイセスハイグロスコピクス亜属ヤクシマエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｙａｋｕｓｉｍａｅｎｓｉｓ）７２３８とストレプトマイセスツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）９９９３等で産生されると報告されている。ＦＫ５０６産生菌株の発酵産物にはＦＫ５２０及びそれと類似する構造体が多数含まれており、高品質の医薬用ＦＫ５０６を産生するためには、ＦＫ５２０のような類似物質を除去することが非常に重要である。
【０００４】
そのため、産業界ではＦＫ５２０及びジヒドロＦＫ５０６を除去し、高純度のＦＫ５０６を得るための方法が模索されて来た。このような精製技術は、通常、カラムクロマトグラフィー方法を基盤としている。銀イオン（Ａｇ＋）を用いたカラムクロマトグラフィーは、通常、同一な炭素数を有する不飽和脂肪酸のシス−トランス異性質体を区分するために使用することが広く知られている（Ｊ．ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  １４９（１９７８）４１７）。高純度ＦＫ５０６の産生のために銀イオンを使用するカラムクロマトグラフィー法は、技術的に大きく二つに区別できる。一つは、銀イオンで前処理された樹脂を使用する方法（米国特許登録番号６，４９２，５１３、米国特許公開番号ＵＳ０８／００００８３４、国際特許公開番号ＷＯ０５／０５４２５３）で、もう一つは、分離しようとする化合物を樹脂に吸着させた後、銀イオンが含まれた溶媒で溶離させる方法（米国特許登録番号６，５７６，１３５及び６，８８１，３４１）である。
【０００５】
上の方法をより具体的に見ると、米国登録特許第６，４９２，５１３号には、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０等の高分子化合物を硝酸銀等の銀イオンで前処理されたスルホン酸グループ−含有強力陽イオン交換樹脂を使用して相互分離する方法が記述されている。
【０００６】
また、米国特許公開ＵＳ０８／００００８３４号には、酸化アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｏｘｉｄｅ）、酸化ジルコニウム（ｚｉｒｃｏｎｉｕｍ  ｏｘｉｄｅ）、スチレンジビニルベンゼンコポリマー（ｓｔｙｒｅｎｅ  ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、吸着樹脂、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、逆相シリカゲル、シアノシリカゲルに銀イオンで修飾された吸着樹脂を使用してクロマトグラフィー法によりＦＫ５０６を分離する方法が記述されている。
【０００７】
そして、国際特許公開番号ＷＯ０５／０５４２５３号には層分離が可能な溶媒を利用してＦＫ５０６を有機溶媒に転移させ、アンモニアガスで処理して相から不純物を除去したり、逆相クロマトグラフィー方法を繰り返し行ってＦＫ５０６を精製する方法が記述されている。
【０００８】
前記のＦＫ５０６の精製方法は、高価な樹脂、銀イオン及び多量の有機溶媒を使用するため、製造コストが高く非経済的であり、カラムクロマトグラフィーの遂行に多くの時間がかかる上に、精製度が高くない。
【０００９】
また、米国登録特許第６，５７６，１３５号は、一つ以上のアルケニルグループとアルコキシグループ側鎖を有するラクトン含有高分子化合物の混合物を対象とする分離方法に対する内容であり、化合物を非イオン性吸着樹脂に吸着させ、銀イオンを含有する溶媒で溶出させる方法と、活性型アルミナに吸着後、溶出させてラクトン含有高分子化合物からＦＫ５０６のような類縁物質を除去する方法を開示している。
【００１０】
前記発明は、ＦＫ５２０及びジヒドロＦＫ５０６の分離度が大きな長所ではあるが、高価な樹脂及び銀イオンが含まれている多量の有機溶媒の使用により製造コストが非常に高く、また使用された樹脂内に存在する銀イオン及び硝酸の除去に多くの費用と時間がかかるため非経済的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、銀イオンと結合可能な不飽和アルキル基を有するラクトン化合物と、それと同一な骨格構造を有するが銀イオンと結合しない飽和アルキル基を有するラクトン化合物が銀イオン溶液で相互物性、特に溶媒に対する溶解度及び結晶化の違いが存在すると推定され、前記の２種類の化合物間の分離のために高価な樹脂を使用するカラムクロマトグラフィー法を用いなくても効率的な分離方法を提供しようとすることである。
【００１２】
ＦＫ５０６は、自己免疫疾患、臓器移植、新生児赤芽球症等の医学用治療剤として有用な医薬剤のため、不純物が混ざることは好ましくなく、各国の政府においては薬剤中の不純物の許容可能な水準に関する指針がある。よって、任意の薬剤中に不純物の水準を減少させる方法に対する必要性とこの商業的利用価値は自明である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記の目的を達成するために、本発明者等は銀イオンと結合可能な不飽和アルキル基を有するラクトン化合物と、それと同一な骨格構造を有するが銀イオンと結合しない飽和アルキル基を有するラクトン化合物間に銀イオン溶液と溶媒間で相互物性、特に溶解度の違いが生じると予測し、前記２種類の化合物の分離のために高価な樹脂を使用するカラムクロマトグラフィー法の代わりに銀イオン溶液を使用する、簡単でありながらも効率的な方法を発明した。
【００１４】
本発明者等は、不飽和アルキル基を有するラクトン化合物と飽和アルキル基を有するラクトン化合物の混合物から銀イオンが含まれた溶媒を使用して二つの化合物を選別抽出し、相互分離する方法を発明した。根本的に、銀イオンと親和力が高いＦＫ５０６のような不飽和アルキル基を有するラクトン化合物は銀イオン溶液に存在し、銀イオンと親和力がない類似体、つまりＦＫ５２０、ジヒドロＦＫ５０６、エベロリムス、ピメクロリムス、ラパマイシン等は、銀イオンが含まれない、より可溶性の高い他の溶媒層に存在することになる。本発明には、前記の方法により収得した銀イオン溶液内に存在する高純度ＦＫ５０６を回収する方法が含まれる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法は、カラムクロマトグラフィー法を用いないため、産業的適用が容易で、少量の溶媒を使用しても精製でき、且つ銀イオン溶液の再使用等により原価削減効果が大きく、工程が簡単である。また、精製時間と製造原価を大きく軽減させる一方で、ＦＫ５０６等の産生収率は著しく高いという効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】原試料に含まれているＦＫ５０６及びその類似体をＨＰＬＣ分析（ｄｉｏｌ−ＨＰＬＣ）したものである。
【図２】本発明の方法により精製した試料をＨＰＬＣ分析したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明が提供するものは、高価な樹脂を使用するカラムクロマトグラフィー方法を用いなくても効果的に不飽和アルキル基を有するラクトン化合物と、それと構造的類似体だが飽和アルキル基を有するラクトン化合物を分離するものである。本発明は、ラクトン化合物の構造変形をすることなく簡単な方法で不飽和アルキル基を有するラクトン化合物、特にＦＫ５０６を分子量、構造及び物性が類似するＦＫ５２０、ジヒドロＦＫ５０６等から分離、精製する方法に関するものである。
【００１８】
本発明は、水と混ざり得る有機溶媒にラクトン化合物を溶かしてラクトン化合物溶液を製造する１段階；
前記ラクトン化合物溶液にラクトン化合物難溶解性で水と難混合性の有機溶媒を添加する２段階；
前記２段階で生成された混合溶液に銀イオン（Ａｇ＋）水溶液を加えて不飽和アルキル基を有するラクトン化合物が銀イオン水溶液に移動するようにする３段階；
前記不飽和アルキル基を有するラクトン化合物を含む銀イオン水溶液を有機溶媒層と分離して回収する４段階；
前記銀イオン水溶液内の不飽和アルキル基を有するラクトン化合物を溶かすことができ、水と混ざり得ない有機溶媒を加えて不飽和アルキル基を有するラクトン化合物を抽出する５段階；
前記の抽出された不飽和アルキル基を有するラクトン化合物に存在する銀イオンを除去し、結晶として不飽和アルキル基を有するラクトン化合物を収去する６段階；を含む不飽和アルキル基を有するラクトン化合物を精製する方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は前記不飽和アルキル基を有するラクトン化合物がＦＫ５０６であることを特徴とする。また、前記飽和アルキル基を有するラクトン化合物は、ＦＫ５２０、ジヒドロＦＫ５０６、エベロリムス、ピメクロリムス及びラパマイシンからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする。
【００２０】
また、本発明は前記１段階の水と混ざり得る有機溶媒が、アルコール、ケトン及び極性非陽子性有機溶媒からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする。
【００２１】
また、本発明は前記１段階の水と混ざり得る有機溶媒が、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン及びアセトニトリルからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする。
【００２２】
また、本発明は前記３段階で使用する銀イオンが、硝酸銀 (ＡｇＮＯ３）、酢酸銀（ＡｇＣＨ３ＣＯＯＨ）及び硫酸銀（ＡｇＳＯ４）からなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする。 
また、本発明は前記２段階のラクトン化合物難溶解性であり水と難混合性の溶媒が、炭化水素, ヘテロサイクリック化合物、エーテル及びエステルからなる群から選ばれる１種以上で、好ましくは、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、ブタノール及びクロロホルムからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする。 
また、本発明は前記５段階の銀イオン水溶液のラクトン化合物を溶かすことができ、水と混合し難い有機溶媒が、炭化水素、ヘテロサイクリック化合物、エーテル又はエステルから選ばれ、好ましくはジクロロメタン、エチルアセテート、イソブチルアセテート、ｎ−ブチルアセテート及びｔ−ブチルアセテートからなる群から選ばれる１種以上であることを特徴とする。 
また、本発明は前記６段階での銀イオン除去時にＮａＣl水溶液を利用することを特徴とする。
【００２３】
それだけでなく、本発明は前記精製過程で残った銀イオン溶液を再使用する方法を提供する。
【００２４】
即ち、本発明の精製方法は、先ず水と混ざり得る有機溶媒にラクトン化合物を溶かした後、適定量の水と混合し難い溶媒を添加する。次いで、銀イオンが含まれている水溶液を加えて銀イオンと親和力のある不飽和アルキル基を有するラクトン化合物を選別抽出する。その後、不飽和アルキル基を有するラクトン化合物が含まれている銀イオン水溶液を回収した後、ラクトン化合物溶解性有機溶媒として不飽和アルキル基を有するラクトン化合物を抽出する。最後に、銀イオン除去及び結晶化段階によって高純度の製品を得る。
【００２５】
本発明の方法を段階別に詳しく説明する。本発明で使用されるラクトン化合物は、単環（ｍｏｎｏｃｙｃｌｉｃ）、二環（ｂｉｃｙｃｌｉｃ）又は三環（ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ）を有し得、単環ラクトンの化合物としては、エリスロマイシン、ロイコマイシン、メチマイシン等のようなものであり得、三環構造を有するものはＵＳ５，６２４，８４２とＵＳ４，８９４，３６６に言及されている構造の物質（一般式１参照）及びラパマイシンとその誘導体になり得る。また、一般式２に大別されるラクトン化合物としては、Ｒ基がアリル基、プロピル基、エチル基、メチル基でそれぞれ表されるＦＫ５０６及びジヒドロＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ＦＫ５２３になり得る。
【００２６】
【化１】
0005483127.tif 000002
【００２７】
（Ｒ１は、ヒドロキシ基又は１−（低級アルキルチオ）（−低級）アルキルオキシ基、トリ（低級）アルキルシリルオキシ基、低級アルキル−ジフェニルシリルオキシ基、薬学的に受用可能な有機カルボキシリックアシルオキシ基及び薬学的に受用可能な有機スルホニックアシルオキシ基から選ばれた薬学的に受用可能な保護されたヒドロキシ基、Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基又は低級アルケノイルオキシ基、Ｒ３は、メチル基、エチル基、プロピル基又はアリル基、ｎは１又は２、そして、実線と点線の表示は単一結合又は二重結合であり、Ｒ１とＲ２がそれぞれヒドロキシ基、ｎが２で、実線と点線が単一結合のとき、Ｒ３は、メチル基、プロピル基又はアリル基及びそれらの薬学的に受用可能な塩基性塩である。）
（又は、前記Ｒ１は、ヒドロキシ基；低級アルキルチオアルコキシ基；トリ（低級）アルキルシリルオキシ基；低級アルキルジフェニルシリルオキシ基；選択的にカルボキシ基で置換される低級アルケノイルオキシ基；選択的に低級シクロアルキル基部分上の二つの低級アルキル基で置換される低級シクロアルコキシ（低級）アルケノイルオキシ基；カンフルスルホニルオキシ基；選択的に一つ又はそれ以上のニトロ基で置換されるアロイルオキシ基、ここでアロイル部分は、ベンゾイル基、トルオイル基、キシロイル基及びナフトイル基で構成されたグループから選ばれる；選択的にハロゲンで置換されるアレーンスルホニルオキシ基、ここで前記アレーン部分は、ベンゼン、トルエン、キシレン及びナフタレンからなるグループから選ばれるものである；又は選択的に低級アルコキシ基及びトリハロ（低級）アルキル基で置換されるフェニル（低級）アルケノイルオキシ基；Ｒ２は、水素、ヒドロキシ基又は低級アルケノイルオキシ基、Ｒ３は、メチル基、エチル基、プロピル基又はアリル基、ｎは１又は２、そして、実線と点線は単一結合又は二重結合であり、Ｒ１とＲ２がそれぞれヒドロキシ基で、ｎが２、実線と点線が単一結合のとき、Ｒ３は、メチル基、プロピル基又はアリル基及びその薬学的に受用可能な塩基性塩である。）
【００２８】
【化２】
0005483127.tif 000003
【００２９】
（但し、前記一般式でＲ＝メチル基、ＦＫ５２３；Ｒ＝エチル基、ＦＫ５２０；Ｒ＝プロピル基、ジヒドロＦＫ５０６；Ｒ＝アリル基、ＦＫ５０６）
前記ラクトン化合物の不飽和アルキル基は、特別に低級アルケニル基（ｌｏｗｅｒ  ａｌｋｅｎｙｌ  ｇｒｏｕｐ）であり、ビニル基、プロフェニル基（アリル基又は１−プロフェニル基）、ブテニル基、イソブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基等のようなものであり、より好ましくは、ビニル基とプロフェニル基である。前記ラクトン化合物の飽和アルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、ヘキシル基等のようなものであり、より優先的なものはエチル基とプロピル基である。
【００３０】
ラクトン化合物を溶かすことができ、水と混ざり得る溶媒は、アルコール、ケトン又は極性非陽子性有機溶媒（ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ  ａｐｒｏｔｉｃ  ｓｏｌｖｅｎｔ）になり得、好ましくは、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、アセトニトリルが選ばれ得、これらの混合物になり得る。
【００３１】
ラクトン化合物難溶解性で水と難混合性の溶媒は、炭水化物、ヘテロサイクリック化合物、エーテル又はエステルから１種以上を選択できるが、好ましくは、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、ヘプタン、ブタノール及びクロロホルムからなる群から選ばれる１種以上である。
【００３２】
前記段階で溶媒に溶け得るラクトン化合物の濃度は、多様な範囲で調節でき、例えば、ＦＫ５０６及びその構造類似体の場合は、１〜２００ｇ／水溶性有機溶媒（Ｌ）、好ましくは２５〜１５０ｇ／Ｌの範囲であり、溶媒としてはアセトンが好ましい。ラクトン化合物溶液の濃度が低い場合は、ＦＫ５０６の精製に相対的に銀イオン量の使用が多くなるため非経済的であり、高い濃度の場合は水を添加すると過度に結晶が生成されて選別結晶が困難である。
【００３３】
前記段階で水と混合し難い溶媒であって、目的ラクトン化合物の難溶解性である溶媒の使用量は、水溶性有機溶媒の種類及びラクトン化合物の析出有無に応じて水溶性有機溶媒量の体積比で１〜１００倍量の範囲に適切に調節できる。例えば、ラクトン化合物であるＦＫ５０６及びその類似体の場合は、水溶性溶媒としてアセトンが、非水溶性溶媒としてヘキサンが使用される場合、ヘキサンはアセトン使用量の５〜２０倍量が好ましい。
【００３４】
前記段階に使用された銀イオン水溶液は、銀イオンを供給できる硝酸銀のような銀塩を０．５〜１０Ｍの範囲で溶かした水溶液を使用し、好ましくは１〜５Ｍの範囲が適切である。銀イオン溶液の処理時間は十分に混合できる時間であり、０．５〜２４時間まで可能で、温度は−１０〜５０℃の範囲である。好ましい例として、ＦＫ５０６及びその類似体を対象としては１〜１２時間、１０〜４０℃での作業が適切である。さらに、銀イオン水溶液層を回収した後、ラクトン可溶性且つ水溶性の溶媒を適定量添加して繰り返し行うことができる。最終目的物の不純物含量に応じて、繰り返しの程度及び溶媒使用量が異なり得る。
【００３５】
本発明で使用された銀イオン溶液は、再使用できる。再使用のために適切な有機溶媒、即ち、ラクトン化合物を溶かすことができ、水と混ざらない有機溶媒を使用してラクトン化合物を分離できる。ＦＫ５０６を例に挙げると、エチルアセテートを使用して銀イオン水溶液層に存在するＦＫ５０６を抽出し、エチルアセテート層と分離された銀イオン水溶液を回収する。回収された銀イオン水溶液は再使用できる。
【００３６】
本発明のアルキル基を有するラクトン化合物は、微生物の発酵により収得でき、また人工的な合成でも提供できる。本発明では、通常、微生物の発酵によって収得される化合物として、不飽和アルキル基を有するラクトン化合物と飽和アルキル基を有するラクトン化合物の混合物、特にＦＫ５０６とその構造類似体であるＦＫ５２０、ジヒドロＦＫ５０６等が一部混ざった化合物を使用した。
【００３７】
前記試料を使用して銀イオン水溶液を使用した本発明は、銀イオンの濃度、銀イオン水溶液の量及び抽出回数、水と難混合性でＦＫ５０６難溶解性溶媒の処理量、及び処理回数が増加するほどＦＫ５０６の純度が増加し、相対的にＦＫ５２０及びジヒドロＦＫ５０６の比率が減少する。また、銀イオン濃度が増加したり、水と非混合性でＦＫ５０６難溶解性溶媒の処理量が少ないほどＦＫ５０６の回収率が増加する。
【００３８】
以下、実施例によって本発明の構成をより詳しく説明する。しかし、本発明の範囲が実施例によって制限されないということは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者に自明なことである。
【実施例１】
【００３９】
試料の調製 
アルキル基側鎖（ａｌｋｙｌ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）があるラクトン化合物、特にＦＫ５０６、ＦＫ５２０、ジヒドロＦＫ５００６混合液の準備のために前培養培地（酸化澱粉０．３ｇ、グリセリン０．２１ｇ、肉ペプトン０．０９ｇ、酵母抽出物０．０９ｇ、大豆ペプトン０．１５ｇ、ＡＺ−２０Ｒ  ０．０１５ｍｌ）２０ｍｌを製造して５００ｍｌ平板三角フラスコに入れて殺菌した後、ストレプトマイセス属ＧＴ１００５菌株を１ｍｌ接種して２７−３０℃、２４０ｒｐｍの条件で３６時間培養した。１次種培養培地（酸化澱粉２０ｇ、グリセリン２０ｇ、生大豆粉１０ｇ、炭酸カルシウム４ｇ、ＣＳＬ（４５％）１０ｍｌ、ＡＺ−２０Ｒ  １ｍｌ、ｐＨ６．５）２Ｌを５Ｌ平板三角フラスコに入れて殺菌し、前記前培養液１０ｍｌを接種して２７−３０℃で３６時間培養した。５００Ｌ発酵槽に酸化澱粉６ｋｇ、グリセリン３ｋｇ、生大豆粉１．５ｋｇ、酵母抽出物０．６ｋｇ、炭酸カルシウム０．６ｋｇ、ＣＳＬ（４５％）１．５Ｌ、ＡＺ−２０Ｒ  ０．３ｋｇを含有した２次種培養培地３００Ｌを調製した後、殺菌し、１次種培養菌液２Ｌを植菌した。２７−３０℃で通気量０．５−１ＶＶＭ、攪拌速度５０−３００ｒｐｍで２４時間培養した。５ｋｌ発酵槽に酸化澱粉２１０ｋｇ、生大豆粉１５ｋｇ、酵母粉５１ｋｇ、炭酸カルシウム３ｋｇ、硫酸アンモニウム３ｋｇ、ＡＺ−２０Ｒ  ６Ｌを含有した本培養培地２．７ｋｌを調製し、苛性ソーダを添加してｐＨ８．５に補正し殺菌した。吸着樹脂ＨＰ−２０  １５０Ｌを水で水和して３００Ｌを製造して別殺し、殺菌した培地と別殺した吸着樹脂を混合溶液に２次種培養液全量を無菌的に植菌した後、２７−３０℃で、通気量０．５−１ＶＶＭ、攪拌速度５０−２００ｒｐｍで６日間培養した。
【実施例２】
【００４０】
調整剤試料の準備
培養液にＨＰ２０樹脂（１５０Ｌ）をヌッチェフィルターで回収した後、水で洗浄した。アセトン５００Ｌを使用して樹脂からＦＫ５０６及びＦＫ５２０、ジヒドロＦＫ５０６等を含む抽出液を得た。前記抽出液に同一体積の水を加えた後、ＨＰ２０樹脂２００Ｌが充填されているカラムに２ＲＶ（Ｒｅｓｉｎ  ｖｏｌｕｍｅ）／ｈｒ流速で吸着させ、７５％アセトンを１ＲＶ（Ｒｅｓｉｎ ｖｏｌｕｍｅ）／ｈｒ流速で３ＲＶを溶出させた。溶出液のＨＰＬＣ分析の結果、純度は６２％で、８７３．６ｇのＦＫ５０６を収得できた。前記溶出液に過量のＮａＣｌを添加して水とアセトン層を分離した後、上澄液を回収して減圧濃縮した。濃度液をアセトン：ヘキサン：トリエチルアミン＝２０：８０：０．５溶媒に溶かした後、同一溶媒で充填されたシリカゲル（３０ｋｇ）に吸着させた。同一溶媒１００Ｌを１ＲＶ／ｈｒの流速で洗浄した後、アセトン：ヘキサン：トリエチルアミン＝３０：７０：０．５溶媒２００Ｌとアセトン：ヘキサン：トリエチルアミン＝４０：６０：０．５  １００Ｌをそれぞれ１ＲＶ／ｈｒの流速で溶出した。ＨＰＬＣで分析してＦＫ５０６を含む溶出液を集め、５０℃で減圧濃縮した。前記濃縮液を８０Ｌのアセトンに溶かした後、水２４０Ｌを加え、４℃で１２時間結晶を形成させた。形成された結晶を濾過布で濾過した後、４５℃の真空乾燥機で６時間乾燥した。乾燥されたＦＫ５０６の純度は８７．２％で、計４５３．７ｇを収得した。前記の回収された結晶中、１００ｇをエチルアセテート１Ｌに溶かした後、２０ｇの活性炭を添加して１時間攪拌した。濾過紙（Ｗａｔｔｍａｎ  ｆｉｌｔｅｒ  ｐａｐｅｒ  Ｎｏ．２）で濾過した後、濾過液を減圧濃縮した。濃縮液を４Ｌのアセトンに溶かした後、水１２Ｌを加え、４℃で１２時間結晶を形成させた。形成された結晶を濾過布で濾過した後、４５℃の真空乾燥機で６時間乾燥した。このような過程によって原試料を得た。
【実施例３】
【００４１】
分析法 
ＦＫ５０６及びその類似体の含量及び純度を確認するために二つの分析法を用いて確認した。水溶液上の含量分析は、Ｃ１８カラムを用いたＨＰＬＣ方法（カラム、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＧＯＬＤ  Ｃ１８ ［４．６ｘ２５０ｍｍ］；移動相、５０％アセトニトリル；流速、１ｍｌ／ｍｉｎ；カラム温度、５５℃；検出波長、２１０ｎｍ）で分析し、結晶化された最終化合物の純度分析は、ジオールカラムを用いたＨＰＬＣ（カラム、直列連結された二つのＳｕｐｅｒｃｏｓｉｌ  ＬＣ−Ｄｉｏｌ分析カラム［４ｘ２５０ｍｍ，５μｍ］；移動相、ｎ−ヘキサン：塩化ｎ−ブチル：アセトニトリル、［７：２：１］；流速、１ｍｌ／ｍｉｎ；検出波長、２２５ｎｍ）方法で行った。本発明の以下の実施例で使用した試料は、Ｃ１８カラムＨＰＬＣ分析結果、９３．３％  ＦＫ５０６、２．５６％  ＦＫ５２０、０．６％ジヒドロＦＫ５０６、同一試料のジオールＨＰＬＣ分析結果は、図１の通りであり、９２．７％  ＦＫ５０６、４．３％  ＦＫ５２０、２．１％ジヒドロＦＫ５０６の純度だった。
【実施例４】
【００４２】
銀イオン水溶液を利用したＦＫ５０６の選別抽出 
試料が完全に溶ける溶媒であるアセトンにラクトン混合物を溶かした。試料が十分に溶けた状態でヘキサンを入れ、攪拌してアセトンとヘキサンを十分に混合した。この溶液に硝酸銀水溶液をゆっくり攪拌しながら入れた。一定時間攪拌した後、停止して層を分離した。層は銀イオン水溶液が含まれた下層、そしてヘキサンが含まれた上層に分離された。銀イオンが含まれた水溶液層のＦＫ５０６とＦＫ５２０、ジヒドロＦＫ５０６の含量を定量し、２回或いは３回以上の繰り返し抽出時には、ヘキサンの処理で消失したアセトン量を補充するために銀イオン水溶液層にアセトンを本来の体積分添加した。その後、再度ヘキサンを添加して抽出した。銀イオン水溶液に存在するＦＫ５０６及びＦＫ５２０、ジヒドロＦＫ５０６の含量は、Ｃ１８  ＨＰＬＣで分析した。使用した試料濃度及び量、銀イオン濃度及び量、ヘキサン使用量及び抽出時間等を多様に組み合わせて実施し分析した。その条件及び結果を表１にまとめた。銀イオンが含まれていない水で抽出する場合、ＦＫ５２０の含量が３．５％であり、使用された試料の含量と比べて変化が観察されなく、回収率は２．７８％と非常に悪かった（表１、試験区１）。しかし、同じ条件で銀イオンが添加された水溶液で抽出したものは、ＦＫ５２０及びジヒドロＦＫ５０６の含量が大きく減少した（表１；試験区２）。ＦＫ５２０とＤＨ−ＦＫ５０６等、ＦＫ５０６の純度に絶対的な影響を与える不純物は、繰り返し抽出（表１；試験区３，４）又は抽出時間の増加（表１；試験区１４，１５，１６，１７，１８）によって減少した。しかし、抽出時間の増加による効果を３時間抽出と比較すると、３時間以上の処理群では３つの主要三環化合物の含量比の変化が大きくなかった。ＦＫ５０６の回収率の増大のために銀イオン濃度の増加、試料の濃度、ヘキサン使用量及び銀イオン水溶液の量の変化による収率を調査した結果、銀イオン濃度の増加により回収率が急激に増大し（表１；試験区４，５，６，７，１０，１１）、使用する試料の濃度が高くなるほど（表１；試験区４，８，９）又ヘキサン使用量が多くなるほど（表１；試験区４，５，６，７，１１，１２，１３）回収量が減少した。これにより類推できる最適な銀イオン水溶液抽出条件は、ＦＫ５０６の試料濃度２８．９〜１４４．８Ｍ、ヘキサン使用量はアセトン対比５〜１０倍体積、そして、銀イオン水溶液中、銀イオン濃度は０．９〜３．６Ｍで、銀イオン水溶液使用量はアセトン体積対比２倍程度が適切だった。
【００４３】
【表１】
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【実施例５】
【００４４】
銀イオン溶液に存在するラクトン化合物の収去 
実施例２の試験区１２から抽出した銀イオン水溶液からラクトン化合物を収去した。銀イオン水溶液に２倍体積のエチルアセテート添加後、１時間以上強く混合した。ＦＫ５０６が含まれたエチルアセテート層を回収して減圧濃縮した。減圧濃縮液に試験区で使用したものと同一な体積のアセトンを加えて完全に溶かした後、ＮａＣｌ飽和水溶液を添加して銀イオンをＡｇＣｌ形態で沈殿させた。ここに同一体積のエチルアセテートで強く１時間以上混合した後、停止させて層を分離した。エチルアセテート層だけを回収して完全に減圧濃縮した後、試料をアセトンに溶かし、ここに４倍の体積の水をゆっくり加えて結晶化した。結晶は白色で、凍結乾燥後の結晶の重さは５０７．３ｍｇ、ジオール−ＨＰＬＣで最終確認したＦＫ５０６の純度は９８．６％で、０．５％以上の不純物は存在しなかった（図２）。これから換算したＦＫ５０６の回収率は７０．７％だった。試験区１３を使用した同一抽出方法の場合、ＦＫ５０６の純度は９８．５％で、回収率は７２．３％だった。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明は、ＦＫ５０６を始めとする不飽和アルキル基を有するラクトン化合物を精製する有用な方法を提供するために医薬分野に利用できる。
【図１】
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【図２】
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