(57)【要約】  ３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の分子量低下を抑制しつつ、塩素残量を抑え、菌体構成成分を効率よく分解、除去する。微生物が産出した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を処理する方法であって、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物を含む水性懸濁液、又は３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液を、次亜塩素酸塩を含有する酸化剤で処理する工程と、残留する酸化剤を亜硫酸塩で中和する工程とを含む方法に関する。また、微生物が産生した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法であって、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液に溶剤を添加して、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の凝集体を回収する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物が産出した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を処理する方法であって、
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物を含む水性懸濁液、又は３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液を、次亜塩素酸塩を含有する酸化剤で処理する工程と、
残留する酸化剤を亜硫酸塩で中和する工程とを含むことを特徴とする処理方法。
【請求項２】
次亜塩素酸塩が次亜塩素酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載の処理方法。
【請求項３】
酸化剤処理時の温度を２０℃以下とすることを特徴とする請求項１又は２に記載の処理方法。
【請求項４】
酸化剤処理時のｐＨが１０以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項５】
酸化剤処理時に光を遮蔽することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項６】
酸化剤処理を非金属材質の装置内で実施することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項７】
中和処理後に３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を溶媒で洗浄する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項８】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、３−ヒドロキシヘキサノエートと他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体である請求項１〜７のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項９】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、および３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上のモノマーから構成される共重合体である請求項１〜７のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項１０】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、３−ヒドロキシヘキサノエートと３−ヒドロキシブチレートの２成分共重合体、または３−ヒドロキシヘキサノエートと３−ヒドロキシブチレートと３−ヒドロキシバレレートの３成分共重合体である請求項１〜７のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項１１】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、アエロモナス属に属する微生物である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項１２】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエまたはアエロモナス・ハイドロフィラである請求項１〜１０のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項１３】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体合成酵素群遺伝子が導入された菌株である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の処理方法。
【請求項１４】
微生物が産生した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法であって、
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液に溶剤を添加して、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の凝集体を回収することを特徴とする３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の精製方法。
【請求項１５】
溶剤が疎水性溶剤であることを特徴とする請求項１４に記載の精製方法。
【請求項１６】
添加する溶剤重量が水性懸濁液中の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体重量に対して１０倍以下であることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の精製方法。
【請求項１７】
水性懸濁液が、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む微生物に物理的破砕処理、化学的破砕処理、または両者の組合せ処理を行うことにより得られるものであることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１８】
水性懸濁液が、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する前記微生物を含む水性懸濁液、又は３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と前記微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液を、次亜塩素酸塩を含有する酸化剤で処理する工程と、残留する酸化剤を中和する工程とを行うことにより得られるものであることを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項１９】
溶剤添加時の温度が５０℃以下であることを特徴とする請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２０】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、３−ヒドロキシヘキサノエートと他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体である請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２１】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、および３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上のモノマーから構成される共重合体である請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２２】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が、３−ヒドロキシヘキサノエートと３−ヒドロキシブチレートの２成分共重合体、または３−ヒドロキシヘキサノエートと３−ヒドロキシブチレートと３−ヒドロキシバレレートの３成分共重合体である請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２３】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、アエロモナス属に属する微生物である請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２４】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエまたはアエロモナス・ハイドロフィラである請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の精製方法。
【請求項２５】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体合成酵素群遺伝子が導入された菌株である請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物菌体によって産生された３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を処理又は精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以後ＰＨＡと称す）は多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、プラスチック廃棄物は焼却、埋立てなどにより処理されているが、これらの処理方法には地球の温暖化や埋立地の地盤弛緩等の問題点がある。そのためプラスチックリサイクルへの社会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進みつつある。しかし、リサイクル可能な用途には限りがあり、実際には、プラスチック廃棄処理方法としては、焼却、埋立て、リサイクルだけでは対応しきれず、自然界に放置されたままになるものも多いのが現状である。そこで、廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が有害とならないＰＨＡの様な生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。特に、微生物が菌体内で生成蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響がほとんどないと予想されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体としての利用が可能と考えられる。【０００３】
微生物が生成するＰＨＡは、通常顆粒体を形成してその微生物の菌体内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。ＰＨＡを微生物菌体から分離精製する既知の方法として、大別すると、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を破砕もしくは可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法と、ＰＨＡが可溶である有機溶媒を用いて菌体からＰＨＡを抽出する方法とに分けられる。【０００４】
ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化させて除くことによりＰＨＡを得る方法として、非特許文献１には、菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理してＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法が記載されている。この方法は、プロセスとしては簡単ではあるが、大量の次亜塩素酸ナトリウムを使用する必要があるためにコストが高くなる。また、ＰＨＡの著しい低分子化が引き起こされることなどから実用には適さないと考えられている。しかし、次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤は入手しやすく、またこれらによる処理は、処理条件が比較的マイルドであり、また工程が簡便であることから工業的な使用にも対応できる方法である。これらの酸化剤でＰＨＡを含有する培養微生物を処理すると、簡単に細胞質成分を分解し、タンパク質含量を低減させてＰＨＡの純度を向上することができる。【０００５】
特許文献１では、塩基性成分によりＰＨＡ含有菌体を処理し、次亜塩素酸塩を添加して高純度のＰＨＡが得られると述べられている。また、特許文献２には次亜塩素酸ナトリウム処理により樹脂内に無視できない量の塩酸が残存するため実用に適さないと述べられている。この残留塩素を低減させる方法として、特許文献３には温水での洗浄などが述べられており、ガス検知管による１５０℃での塩素放出量と官能検査によって低減効果を判断している。また、特許文献４には処理に用いる酸化剤の濃度、温度条件が記載されている。また、同様の例は特許文献５にも見られる。このように次亜塩素酸ナトリウムなどの酸化剤を用いる方法で、菌体構成成分を分解処理することの有用性は述べられているものの、菌体構成成分の分解の効果とＰＨＡの分子量低下抑制の方法および残留する塩素を低減させる手段について総合的に検討した例は見当たらない。【０００６】
特許文献６には、ＰＨＡを含有する微生物菌体懸濁液を１００℃以上で熱処理することで菌体構造を破壊し、次いでタンパク質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理とを組み合わせて、ＰＨＡ以外の菌体構成成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法が記載されている。この方法は、熱処理によってタンパク質が変性・不溶化するために、次のタンパク質分解酵素処理工程での負荷が増大すること、更には、処理工程が多く複雑であること、酵素は比較的高価であることからコストがかかる等の欠点を有している。【０００７】
また、ＰＨＡ含有微生物菌体を高圧ホモジナイザーで破砕してＰＨＡを分離する方法が提案されている（特許文献７、８参照）。しかし、これらの方法は微生物菌体懸濁液を少なくとも３回、場合によっては加温して１０回も高圧処理しなければ、タンパク質含量が低く純度の高いＰＨＡを得ることは出来ず、なおかつ得られるＰＨＡの純度は６５〜８９％程度と低いという欠点がある。ＰＨＡ含有微生物菌体を破砕処理と組み合わせる処理として、界面活性剤を組み合わせる方法（特許文献９、１０参照）、アルカリ添加し加熱処理を行った後に破砕処理を行う方法（特許文献１１、１２参照）などが挙げられるが、処理に伴う分子量低下や十分なＰＨＡ純度を得られていないこと、などが問題である。このようにＰＨＡ以外の菌体構成成分を破砕もしくは可溶化させて除く手段については、様々な方法が提案されているが、破砕もしくは可溶化だけでは十分なＰＨＡ純度を得られず、高価な酵素を使用するなどの問題を抱えている。また破砕もしくは可溶化した水性懸濁液からＰＨＡを取り出す手段は遠心分離操作を前提としているため、工業的に実施するためには高額の高速回転機器を必要とする問題がある。【０００８】
遠心分離工程を例えば沈降などの簡易な方法に置き換えたとしても、十分な沈降性を得るために凝集剤などの添加を必要とする。しかし、ＰＨＡや破砕された細胞質、分泌タンパク質などを含む水性懸濁液から目的であるＰＨＡだけを凝集させることは極めて困難であり、いまだにその例がない。活性汚泥処理などに広く用いられる硫酸アルミニウムなどを用いても、水性懸濁液中のほぼ全ての成分を凝集してしまうため目的物であるＰＨＡだけを選択的に凝集することはできない。また、高分子凝集剤などで選択的にＰＨＡを凝集できたとしてもこれらの添加剤はＰＨＡと分離回収することができないため、高分子材料としての品質に影響を及ぼしてしまう。特許文献１３には２価以上の金属塩と界面活性剤を用いる微生物菌体の凝集に関する例が見られる。これは微生物菌体の凝集性に関する例であり、破砕処理した水性懸濁液中のＰＨＡだけを選択的に凝集する点に関しては記述がない。また、特許文献１４には水に懸濁したＰＨＡを熱で凝集させる方法が記載されているが、加温により分子量低下を起こす問題があることと、また得られていたＰＨＡの純度に関して記載がない点が問題である。【０００９】
有機溶媒による抽出を利用したＰＨＡの分離精製方法では、例えば１，２−ジクロロエタンやクロロホルムといったハロゲン含有炭化水素を用いて抽出する方法がある（特許文献１５、１６参照）。これらは樹脂を抽出させる、すなわち完全に溶解させ、他の不純物と分離する方法である。ＰＨＡの分子量は数１０万あるいは数１００万の高分子量体であるため、完全に溶解させるためには大量の溶剤を使用するという問題、また溶解度の高い溶媒はハロゲン含有炭化水素などのように環境負荷が高いという問題がある。比較的環境負荷の低い非ハロゲン含有炭化水素を用いる場合には、溶媒に対する溶解度が低いためにさらに大量の溶剤を必要とすること、温度を上げて溶解度を高めると本来分解性の高いＰＨＡが抽出処理の段階で低分子量化してしまうため、工業的な生産性と高分子材料としての品質を両立しくにいという根本的な問題を抱えている。また仮に溶解度を高められたとしても、高粘度の粘ちょう性樹脂溶液となるため、例えば配管やフィルターでの流動性が著しく低下してしまう、さらにはこれらの配管途中で溶解したＰＨＡが析出し閉塞してしまうなどの問題を抱えている。【００１０】
ハロゲン含有炭化水素溶剤による抽出を基本とする精製法としては、抽出溶液中から水を共沸蒸留によって除去してＰＨＡを得る方法（特許文献１７参照）、抽出した溶液に熱水を注入しＰＨＡを析出させる方法（特許文献１８参照）などが挙げられる。これらは抽出溶液中から溶解したＰＨＡを回収する方法について述べたものであるが、抽出操作を前提としているために前述の課題を根本的に解決することはできない。【００１１】
他の溶剤を使った例として、例えばジオキサン（特許文献１９参照）またはプロパンジオール（特許文献２０参照）またはテトラヒドロフラン（特許文献２１参照）、の様な親水性溶媒を用いた抽出方法、低級ケトンを用いる方法（特許文献２２参照）、アセトン、アセトニトリル、ベンゼン、酢酸ブチルなどの溶剤を用いる方法（特許文献２３参照）も提案されている。これらの方法も全て抽出操作を基本としているため、前述の課題を根本的に解決することは出来ない。【００１２】
また、これらに属さない方法としては、ｐＨ調整と加熱を組み合わせる方法（特許文献２４参照）、ＰＨＡの融点以上に加温しこの時の融合を利用する方法（特許文献２５参照）が挙げられる。溶剤抽出を経ない方法であるが、加温やｐＨ条件による分子量低下の問題が残る。特許文献２６では融点以下で凝集させることが述べられているが、この温度は１００℃以上の加温条件であり、得られたＰＨＡの純度に関して記載がない。また、親水性溶媒と水の懸濁液中で沸点以下に攪拌してＰＨＡを凝集する例が見られるが（特許文献２７参照）、十分なＰＨＡ純度が得られていない点、また樹脂の回収率に関する記載がない。【００１３】
本発明における「３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液」とは、広義には液相中に微粒子が浮遊している系と捉えることができ、固体粒子が分散したサスペンションと呼ばれるコロイド分散系と考えることができる。液相中に分散した微粒子は、ブラウン運動、乱流などにより接近し、衝突合体し凝集するが、これには電気二重層による反発力、ファン・デル・ワールス力、吸着分子による斥力などの力が複雑に影響する。このような系で一般的に用いられる微粒子の凝集方法としては、電解質物質を添加したり、ｐＨを変えることにより液中のイオン濃度が増加し、粒子の帯電量が低下して凝集する方法が知られている（非特許文献２参照）。特許文献１４に述べられているように２価以上の金属塩を添加することでＰＨＡの凝集物を得る方法では、タンパク質などの細胞構成成分とＰＨＡが同時に凝集してしまうこと、また製品であるポリマーに金属塩が残留することが問題である。
【特許文献１】特開２００５−３４８６４０号公報
【特許文献２】特開平７−１７７８９４号公報
【特許文献３】特開２００３−４７４９５号公報
【特許文献４】特開２００２−３０６１９０号公報
【特許文献５】米国特許５１１０９８０号明細書
【特許文献６】特公平０４−６１６３８号公報
【特許文献７】特開平０７−１７７８９４号公報
【特許文献８】特開平０７−３１４８８号公報
【特許文献９】特表平０８−５０２４１５号公報
【特許文献１０】特開２００１−０４６０９４号公報
【特許文献１１】特開平０７−３１４８７号公報
【特許文献１２】国際公開第２００３／０９１４４４号パンフレット
【特許文献１３】特開２００１−０５７８８０号公報
【特許文献１４】特表２０００−５０２３９９号公報
【特許文献１５】特開昭５５−１１８３９４号公報
【特許文献１６】特開昭５７−６５１９３号公報
【特許文献１７】特開昭６１−０３５７９０号公報
【特許文献１８】特開平４−２６４１２５号公報
【特許文献１９】特開昭６３−１９８９９１号公報
【特許文献２０】特開平０２−６９１８７号公報
【特許文献２１】特開平０７−７９７８８号公報
【特許文献２２】特表平１０−５０４４６０号公報
【特許文献２３】特表平１１−５１１０２５号公報
【特許文献２４】特開平１１−２６６８９１号公報
【特許文献２５】特表平１０−５０４４５９号公報
【特許文献２６】特表平７−５０９１３１号公報
【特許文献２７】国際公開第２００４／０３３７００号パンフレット
【非特許文献１】Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９５８年，第１９巻，ｐ．１９８−２０９
【非特許文献２】新体系化学工学、微粒子工学、オーム社
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
このように、次亜塩素酸ナトリウムなどの酸化剤を用いる菌体構成成分の分解処理は、入手しやすい試薬による比較的簡単な処理であるが、この処理に伴う分子量の低下の抑制と残留塩素の低減を両立する方法がないという問題を抱えていた。従い、残留塩素の低減のためには、残留する塩素を除去する工程や他の酸化剤を用いるなどの方法が必要であった。また、分子量低下についてはこれを抑制し得る明確な条件が得られていなかった。【００１５】
第一の本発明の目的は、上記現状に鑑み、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物を含む水性懸濁液、又は３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムなどの酸化剤で処理するにあたり、タンパク質の含量を低減させ、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の分子量の低下を抑え、かつ塩素の残留量を抑えて処理することを特徴とする処理方法を提供することである。【００１６】
また、従来の加温や抽出による精製処理においては、高分子材料として最も重要な物性である分子量を安定に確保することが難しいこと、また仮にこれらを満足させたとしても大量の溶剤を使うなど工業的な生産性の面で極めて不利であるという問題を抱えていた。【００１７】
第二の本発明の目的は、上記現状に鑑み、微生物によって産出された３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液から、生産性よくかつ分子量低下を引き起こすことなく純度の高い３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を回収することを特徴とする精製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液を次亜塩素酸塩で処理する方法を検討し、分子量低下を抑制しつつ、菌体構成成分を効率よく除去できる条件を見出した。また、処理条件により塩素残留量を抑える方法を見出した。ＰＨＡや菌体構成成分の塩素化は次亜塩素酸によるものであることに着目し、次亜塩素酸の発生を抑える高いｐＨ領域で処理することにより塩素残量を低減できる方法を見出した。また、ＰＨＡを構成する成分はＣ−Ｈ結合等により構成されるが、この結合を攻撃する塩素の形態が塩素ラジカルや塩素化物ラジカルであることに着目し、これらのラジカルを抑制することで塩素残量を抑えることも見出した。また、系中の有効塩素濃度と温度条件を組合せ、分子量の低下を抑制する手段を見出した。これらの方法を組合せ、分子量低下を抑制しつつ、塩素残量を抑え、菌体構成成分を効率よく分解、除去できる方法を見出した。【００１９】
すなわち第一の本発明は、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物を含む水性懸濁液、又は３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液を、次亜塩素酸塩を含有する酸化剤で処理して微生物の菌体構成成分を分解する工程と、残留する酸化剤を亜硫酸塩で中和する工程とを含む、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を処理する方法に関する。【００２０】
また、本発明者らは、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液が、水溶性のタンパク質などを多く含む水溶液と疎水性の高い３−ヒドロキシアルカン酸共重合体で構成されている点に着目し、鋭意検討を行った。精製された３−ヒドロキシアルカン酸共重合体は本来疎水性のポリエステルであるが、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を生産する微生物に由来するタンパク質や糖類を含有するために、親水性の固体物として水溶性のタンパク質などを多く含む水溶液に懸濁している。３−ヒドロキシアルカン酸共重合体に含まれる微生物に由来するタンパク質や糖類を分解・除去した後、疎水性の溶剤を３−ヒドロキシアルカン酸共重合体に対して少量添加すると、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を水溶性のタンパク質などを多く含む水溶液から固体として簡単に分離できることを見出し、本発明を完成させた。【００２１】
すなわち第二の本発明は、微生物が産出した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法であって、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液に溶剤を添加して３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の凝集体を固体として回収することからなる精製方法に関する。
【発明の効果】
【００２２】
第一の本発明の処理方法では、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物を含む水性懸濁液、又は３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液から、溶剤抽出などの複雑な処理を必要とせず簡単に菌体構成成分を分解でき、タンパク質の含有量が低く、純度が高い共重合体を得ることができる。また、温度や次亜塩素酸濃度条件を一定以下の条件に設定することでＰＨＡの分子量の低下を抑制することができ、かつＰＨＡや菌体構成成分に対する塩素化反応を抑制することで残留塩素の少ないＰＨＡを得ることができる。【００２３】
第二の本発明では、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を固体として水溶性のタンパク質などを多く含む水溶液から回収するため、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を抽出する必要がなくなる。抽出に必要な大量の溶剤の使用や抽出のための加温操作が不要であるため、分子量の低下を抑制することが可能であり、タンパク質の含有量が低く、純度が高い共重合体を得ることができる。すなわち生産性と高分子材料としての品質を保持し、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に本発明を詳細に説明する。【００２５】
第一の本発明
第一の本発明の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の処理方法は、微生物が産出した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を処理する方法であって、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物を含む水性懸濁液、又は３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液を、次亜塩素酸塩を含有する酸化剤で処理する工程と、残留する酸化剤を中和する工程を含む。【００２６】
本発明における微生物は、細胞内に３−ヒドロキシアルカン酸共重合体（ＰＨＡ）を蓄積している微生物であれば特に限定されない。例えばアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、ラルストニア属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）、シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）の菌等が挙げられる。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ．ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）等の菌株が好ましい。本発明で用いる微生物としては、アエロモナス属に属する微生物が好ましく、アエロモナス属の微生物としてはアエロモナス・キャビエまたはアエロモナス・ハイドロフィラが好ましい。【００２７】
更には、アエロモナス・キャビエ由来の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体合成酵素群の遺伝子を導入した菌株、特にラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）（旧名Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＣ３２）（ブダペスト条約に基づく国際寄託、国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６）、原寄託日：平成８年８月１２日、平成９年８月７日に移管、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８、原寄託ＦＥＲＭ  Ｐ−１５７８６より移管）（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７））等がより好ましい。本発明では、これら微生物を適切な条件で培養して菌体内に３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を蓄積させた微生物菌体が用いられる。その培養方法については特に限定されないが、例えば特開平０５−９３０４９号公報等に挙げられる方法が用いられる。【００２８】
本発明における３−ヒドロキシアルカン酸共重合体とは、３−ヒドロキシアルカン酸から構成される共重合体の総称である。３−ヒドロキシアルカン酸共重合体としては特に限定されないが、具体的には、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）と他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体、または、３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）を含む３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体などが挙げられる。さらに、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート及び３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上のモノマーから構成される共重合体なども挙げられる。なかでもモノマー成分として３ＨＨを含む共重合体、例えば、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体（ＰＨＢＨ）（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２８，４８２２−４８２８（１９９５））、または、３ＨＢと３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）と３ＨＨとの３成分共重合体（ＰＨＢＶＨ）（特許第２７７７５７号、特開平０８−２８９７９７号）が、得られるポリエステルの物性の面からより好ましい。ここで３ＨＢと３ＨＨの２成分共重合体ＰＨＢＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、３ＨＨユニットを１〜９９モル％といった組成比のものが好適である。また、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体ＰＨＢＶＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニットの含量は１〜９５モル％、３ＨＶユニットの含量は１〜９６モル％、３ＨＨユニットの含量は１〜３０モル％といった範囲のものが好適である。【００２９】
第一の本発明における「３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物を含む水性懸濁液」とは、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物が水中に懸濁したものであり、「３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液」とは、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と微生物の菌体構成成分とが水中に懸濁したものである。【００３０】
第一の本発明の方法では、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物を含む水性懸濁液をそのまま酸化剤処理に用いることもできるが、酸化剤処理の前に３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する微生物を物理的または化学的方法で破砕して、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液を調製しておくと、後に行う酸化剤による分解処理を効率的に実施することができ望ましい。【００３１】
物理的破砕の方法としては特に限定されないが、従来公知のフレンチプレスやホモジナイザー、Ｘ−プレス、ボールミル、コロイドミル、ＤＹＮＯミル、超音波ホモジナイザーなどの流体せん断力や固体せん断力、磨砕による方法が挙げられる。【００３２】
また、化学的破砕の方法としては、酸やアルカリ、界面活性剤、有機溶剤、細胞壁合成阻害剤などの薬剤を用いる方法、リゾチーム、ペクチナーゼ、セルラーゼ、チモリアーゼなどの酵素を用いる方法、その他の方法として超臨界流体を用いる方法や、浸透圧破砕法、凍結法、乾燥粉砕法などが挙げられる。また、細胞自身が有するプロテアーゼやエステラーゼなどの作用を利用する自己消化法も破砕法の一種として挙げられる。【００３３】
これらの方法のうち、一連の処理による３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の分子量低下を抑える方法が望ましい。またこれらの破砕方法は単独で用いてもよいし、複数の方法を組み合わせても良い。また、バッチ処理でもよいし、連続処理を行っても良い。【００３４】
本発明の方法では、酸化剤処理の前にホモジナイザーで処理を行うことが好ましい。【００３５】
通常、当該懸濁液には、微生物が分泌したタンパク質や、培養基質残分、また破砕処理を行った場合には菌体構成成分などが混入している。以降に述べる酸化剤を添加する処理の前にこれらのタンパク質等を含む水を脱水しておいても構わないが、本発明の方法では、これらのタンパク質等を含む水を予め脱水しておかなくても、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を効率よく回収することができる。脱水の方法としては特に限定されないが、ろ過や遠心分離、沈降分離による方法が挙げられる、これらを促進させるために無機塩や高分子凝集剤を添加してもよい。また当該懸濁液中の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の濃度は特に限定されないが、５００ｇ／Ｌ以下が好ましく、３００ｇ／Ｌ以下がより好ましい。３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の濃度を調整するために水を脱水してもよいし、また新たに水を加えても構わない。【００３６】
本発明で用いる酸化剤は、次亜塩素酸塩からなるものである。次亜塩素酸塩としては、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カリウム、次亜塩素酸カルシウム等が挙げられ、次亜塩素酸ナトリウムが好ましい。【００３７】
次亜塩素酸塩として代表的な次亜塩素酸ナトリウム（次亜塩素酸ソーダ）は、パルプの漂白、プールや上下水道の殺菌・消毒、産業廃水処理などの多方面で広く使用されており、同じ目的で用いられる塩素に比べて取扱いが容易である。次亜塩素酸ナトリウムは、一般的に苛性ソーダに塩素ガスを吸収させる化学反応により生成し、水溶液中で徐々に分解され酸素を放出する。この酸素が強力な酸化力を示すと云われている。この酸化力により当該懸濁液に含まれる培養基質残分、菌体構成成分などを分解できる。ただし、副生する塩素などにより対象とする有機物を塩素化してしまうことが懸念される。次亜塩素酸ナトリウムは、高い温度や低いｐＨにより分解されることが知られている（日本ソーダ工業会、ソーダハンドブック、１９９８など）。また溶存活性塩素の濃度分布はｐＨに依存しており、ｐＨが１０以下から３程度の弱アルカリから酸性の領域では次亜塩素酸の割合が高いことがわかっている。【００３８】
炭化水素などの有機物を構成するＣ−Ｈ結合と反応性の最も高い形態はＣｌラジカルであるが、このＣｌラジカルは、（１）次亜塩素酸ナトリウムが酸により分解して発生するＣｌ分子を出発物質とすること、（２）また、次亜塩素酸から発生する２塩素化酸素から発生すること（Ｆ．Ｍｉｎｉｓｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｄ．，７０，５０（１９８８））などが知られている。いずれにしても次亜塩素酸を出発原料とすることから、系のｐＨをアルカリ領域とし、次亜塩素酸ナトリウムの分解を抑制することが必要となる。さらに、副生した塩素分子や二塩素化酸素などからのラジカルを抑制するために、熱や光、金属との接触などを防止した状態で処理することが必要である。従い、当該水性懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理するにあたり、系のｐＨをアルカリ領域とし、熱や光、金属との接触を抑制した条件で実施することで、塩素残量の低いＰＨＡを得ることができる。【００３９】
酸化剤処理時のｐＨは８以上が望ましく、より望ましくはｐＨが１０以上、さらに望ましくはｐＨが１２以上である。好ましくは、ｐＨが１４以下である。ｐＨの調整には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、アンモニア等を用いることができる。ｐＨを調整するために、次亜塩素酸塩以外に酸やアルカリを酸化剤に添加することもできる。【００４０】
上記酸化剤処理は、光を遮蔽した条件で行うことが好ましく、また、非金属材質の装置内で実施することが好ましい。上記非金属材質の装置としては、例えば、テフロン（登録商標）などの樹脂材料でコーティングした槽類、ＦＰＲなどの非金属材料製の槽類、ガラス系材料でコーティングされた槽類等が挙げられる。【００４１】
また、当該懸濁液に含まれるＰＨＡの溶融性が高い場合には、酸化剤を添加する段階、また引き続いて実施する酸化剤の中和処理の段階で発生する溶解熱や反応熱、中和熱によりＰＨＡが一部溶融し、場合によっては凝集する。凝集した形態では、後の工程でＰＨＡの洗浄処理を実施する場合は、その洗浄効率が低下してしまう。従い、これらの熱を除去するためにも低温で処理することが望ましい。これは前述のＣｌラジカルの発生を抑制する方法とも一致する。酸化剤処理時の温度は４０℃以下が望ましく、より望ましくは３０℃以下であり、さらに望ましくは２０℃以下、確実に効果を発揮するためには１０℃以下で実施することが望ましい。好ましくは、５℃以上である。【００４２】
一方、酸化剤に含まれる次亜塩素酸塩の持つ酸化力により菌体構成成分の分解と同時にＰＨＡの分子量低下が引き起こされるが、当該懸濁液に次亜塩素酸塩を添加した後の有効塩素濃度を一定濃度以下、処理時間を一定時間以下に制限することで、実用により適したＰＨＡを得ることができることを併せて見出した。次亜塩素酸ナトリウム等の次亜塩素酸塩の濃度は有効塩素濃度で示されるが、ＰＨＡの分子量低下を抑制するためには、処理液中のこの有効塩素濃度が１０重量％以下が望ましく、より望ましくは８重量％以下、さらに望ましくは７重量％以下である。また、酸化剤による処理時間は短時間であることが望ましいが、１０時間以下が望ましく、より望ましくは５時間以下、さらに望ましくは３時間以下である。【００４３】
なお、有効塩素濃度とは、下記式（１）で表される、遊離するヨウ素に対する塩素量を表したものであり、１分子の次亜塩素酸ナトリウムから１分子の有効塩素を生じることになる（第五版、食品添加物公定書解説など）。
ＮａＯＣｌ＋２ＫＩ＋２ＣＨ３ＣＯＯＨ→Ｉ２＋２ＣＨ３ＣＯＯＫ＋ＮａＣｌ＋Ｈ２Ｏ（１）
次いで、残留する酸化剤の中和を行うことで、処理液中に残留する過剰な次亜塩素酸塩等を低減し、その結果として、ＰＨＡの塩素化を抑制し、ＰＨＡ中の残留塩素を低減することができる。【００４４】
酸化剤の中和に用いる中和剤としては、中和により得られる中和塩が硫酸塩となるような化合物を用いることができ、例えば、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カルシウム等の亜硫酸塩等が挙げられる。塩素化抑制の観点から、亜硫酸塩が特に好ましい。【００４５】
中和剤の添加量としては特に限定されないが、酸化剤による処理工程後に系中に残存する次亜塩素酸塩を中和するために、残存する次亜塩素酸塩の当量以上になる添加量が好ましい。具体的な数値としては、使用した次亜塩素酸塩に対して０．３当量以上が好ましく、０．５当量以上がより好ましく、さらに好ましくは１当量以上である。上限は特に限定されないが、例えば２当量以下程度でよい。。処理時の温度は、酸化剤処理時と同様の温度が好ましい。【００４６】
処理後のＰＨＡ中に残存する塩素は、ＰＨＡに結合した塩素、タンパク質等の菌体構成成分に結合した塩素、無機塩化物として残留する塩素等が考えられる。ＰＨＡの塩素化は、前述の方法で低減することができるが、より塩素化されやすいタンパク質などの塩素化物が残留するとＰＨＡ中のＣｌとしてカウントされてしまい、ＰＨＡの溶融成形などの工程で塩素（塩酸）を発生させることになる。従い、塩素化されたタンパク質や無機塩として残留する塩素を洗浄する工程が必要となる。【００４７】
本発明者らは鋭意検討の結果、アルコールなどの溶媒で中和処理後のＰＨＡを洗浄するとＣｌ残量を低減できることがわかった。同時にＮ含量で代表されるタンパク質含量が低減されることから、塩素化されたタンパク質などの洗浄除去に寄与していると考えられる。溶媒としては、アセトン、ケトン、アルコール、アミン、アミド類、水などを用いることができる。これらを単独で用いてもよいし、複数を組み合わせてもよい。また、処理時に加温してもよい。また、適当な界面活性剤や酵素などを添加してもよい。これらの溶剤の洗浄効果により、更に塩素残量を低減することが可能である。【００４８】
処理後のＰＨＡは、例えば遠心分離等の方法や、第二の本発明の方法により、上記水性懸濁液から回収することができる。【００４９】
すなわち第一の本発明では、次亜塩素酸塩を添加した後の系中の有効塩素濃度を一定濃度以下にしてＰＨＡの分子量低下を抑え、かつ処理時の温度やｐＨを調整し、光や金属との接触を絶つことでＣｌラジカル副生を抑制することでＣｌ化反応を低減することができる。【００５０】
第二の本発明
第二の本発明の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の精製方法は、微生物が産生した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法であって、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液に溶剤を添加して、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の凝集体を回収することからなる。【００５１】
本発明における微生物及び３−ヒドロキシアルカン酸共重合体は上述と同様である。【００５２】
第二の本発明の精製方法は、微生物が産生した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を回収する方法であるが、本発明における「３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液」とは、微生物に由来する菌体構成成分等が共重合体表面から除去された３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が懸濁しているものである。当該懸濁液には、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体以外に、微生物が分泌したタンパク質や培養基質残分や、微生物に由来する菌体構成成分などが混入していてもよい。【００５３】
第二の本発明の方法では、上記水性懸濁液が、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む微生物に物理的破砕処理、化学的破砕処理、または両者の組合せ処理を行うことにより得られるものであることが好ましい。【００５４】
上記物理的破砕処理としては特に限定されず、例えば、従来公知のフレンチプレスやホモジナイザー、Ｘ−プレス、ボールミル、コロイドミル、ＤＹＮＯミル、超音波ホモジナイザーなどの流体せん断力や固体せん断力、磨砕による方法等が挙げられる。【００５５】
上記化学的破砕処理としては特に限定されず、例えば、酸やアルカリ、界面活性剤、有機溶剤、細胞壁合成阻害剤などの薬剤を用いる方法、リゾチーム、ペクチナーゼ、セルラーゼ、チモリアーゼなどの酵素を用いる方法、その他の方法として超臨界流体を用いる方法や、浸透圧破砕法、凍結法、乾燥粉砕法等が挙げられる。【００５６】
上記破砕処理としては、次亜塩素酸塩を用いる方法が好ましく、上記ホモジナイザーで処理を行った後、次亜塩素酸塩で処理を行うことがより好ましい。さらには、第一の本発明で詳述したように、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含有する前記微生物を含む水性懸濁液、又は３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と前記微生物の菌体構成成分とを含む水性懸濁液を、次亜塩素酸塩を含有する酸化剤で処理する工程と、残留する酸化剤を中和する工程とを行うことによって得られた水性懸濁液を、後述の溶剤を添加する処理に付することが好ましい。この際の詳細な条件は第一の本発明と同様である。【００５７】
以降に述べる溶剤を添加する処理の前に、これらのタンパク質等を含む水を脱水しておいても構わないが、第二の本発明の方法では、これらのタンパク質等を含む水を予め脱水しておかなくても、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を効率よく回収することができる。脱水の方法としては特に限定されないが、ろ過や遠心分離、沈降分離による方法が挙げられ、これらを促進させるために無機塩や高分子凝集剤を添加してもよい。また当該懸濁液中の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の濃度は特に限定されないが、５００ｇ／Ｌ以下が好ましく、３００ｇ／Ｌ以下がより好ましい。３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の濃度を調整するために水を脱水してもよいし、また新たに水を加えても構わない。【００５８】
第二の本発明にて使用する溶剤としては、特に限定されないが、例えば、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、メチルシクロヘキサン等の炭化水素系溶剤；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジフェニルエーテル、アニソール、ジメトキシベンゼン等のエーテル系溶剤；塩化メチレン、クロロホルム、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素系溶剤；アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン等のケトン系溶剤；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブチルアルコール、ｔｅｒｔ−ブチルアルコール等のアルコール系溶剤；アセトニトリル、プロピオニトリル、ベンゾニトリル等のニトリル系溶剤；酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル系溶剤；エチレンカーボネート、プロピレンカーボネート等のカーボネート系溶剤；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド等のアミド系溶剤等が挙げられる。３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液にこれらの溶剤を添加する方法を工業的に実施する際には、溶剤の回収が必要となる。したがい、水溶性の低い疎水性溶剤が好ましく、炭化水素系溶剤、ハロゲン化炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、カーボネート系溶剤がより好ましく、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸ブチルが更に好ましく、酢酸エチル、酢酸ブチルが特に好ましい。【００５９】
３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液に溶剤を添加することにより、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が凝集し、この凝集した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む溶剤層が水層と分離する。【００６０】
添加する溶剤量は特に限定されないが、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を抽出溶解させない方法であるという第二の本発明の優位点を生かすため、できる限り少量であることが好ましい。また温度によっても溶解性が異なり、さらには凝集性が影響される。温度が高い場合にはＰＨＡが一部溶融する。共重合組成比により溶融性が影響を受けるため、組成ごとに最適な温度が異なる。ＰＨＡが溶融すると凝集体が大きくなる傾向にあり、凝集体が大きすぎる場合には、ＰＨＡ全体が塊状になる。従い、ＰＨＡを溶解させずに、より好ましいサイズの凝集体を得るために、溶剤の添加量はより少量であることが好ましく、また溶剤を添加する際の温度は低いことが好ましい。溶剤の添加量は溶剤種によって異なるが、水性懸濁液中の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体に対して重量比で１０倍以下であることが好ましく、より好ましくは５倍以下である。また、好ましくは、０．５倍以上である。溶剤を添加する際の温度は具体的には５０℃以下であり、好ましくは４０℃以下、さらに好ましくは３０℃以下、より好ましくは２０℃以下である。また、好ましくは５℃以上である。【００６１】
上記水性懸濁液に溶剤を添加することにより、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体が凝集体を形成する。上記凝集体は数１００μｍから数ｍｍの大きさである。上記凝集体を形成させる段階において、溶剤種、溶剤量、ｐＨなどを調整することにより、凝集体の形状、サイズをコントロールすることができる。【００６２】
溶剤を添加する前にｐＨを調整する手段としては特に限定しない。ｐＨを特定の範囲に限定できるものであればよく、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウムなどを含めたアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウムなどの有機酸のアルカリ金属塩；ほう砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸３ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウムなどのアルカリ金属のリン酸塩；あるいはアンモニア水などが挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア水などが好ましい。アルカリの添加によってコントロールするｐＨは特に限定されないが、ｐＨ７以上が好ましく、ｐＨ８以上がより好ましく、さらに好ましくはｐＨ１０以上である。ｐＨを高くすることにより疎水性の高いＰＨＡをマイナスに帯電させ、この帯電により凝集性を補っていると考えることができる。ただし、溶剤の添加量等により十分な凝集性を発揮できる場合にはｐＨが低い領域でも凝集させることができる。【００６３】
これらの凝集化条件により凝集体を水性懸濁液中に均等に分散させたり、凝集体を浮遊状態とさせたり、沈降状態とさせることが可能である。凝集体が水洗懸濁液中に均等に分散している場合にはろ過などの方法で回収することが好ましく、凝集体が浮遊状態となっている場合には静置分離や浮上分離などの方法で回収することが好ましく、凝集体が沈降している場合には沈降回収などの方法が望ましい。また、凝集体の分散、浮遊、沈降状態に関わらず、回収可能な方法としては遠心分離が挙げられる。【００６４】
ろ過の方法は特に制限がないが、ヌッチェなどを用いる方法や、吸引ろ過や加圧ろ過などの方法が望ましい。工業的にはフィルタープレス、チューブプレス、プレートプレス、ゲージプレス、ベルトプレス、スクリュープレス、円板プレスなどの圧搾機能を有したろ過装置や、遠心脱水機、多室円筒ろ過機なども選択可能である。生産性を高める場合には多室円筒ろ過機などの連続式が望ましい。連続式ろ過機の、凝集体の除滓方法として、ストリング方式、スクレパー方式、プレコートスクレパー方式などが挙げられる。また、ろ材としては、織布、不織布、金属性メッシュ、セラミックフィルター、多孔質ろ材、高分子膜など様々なろ材を選定でき、更にろ過助剤を用いてもよい。ろ過助剤としては、けいそう土、パーライト、アスベスト、セルロース、炭素質ろ過助剤、酸性白土、ベントナイト、活性炭などが挙げられる。しかし、本発明の凝集体は数１００μｍから数ｍｍの粒子であるため、広く一般的に用いられる織布、不織布を用いたろ過が可能であり、けいそう土などのろ過助剤などを特に必要とせずともろ過効率が高く、工業的な生産性が高いという利点を有している。【００６５】
凝集体が浮上している場合には、静置分離によって回収することができる。工業的には凝集物などの懸濁物質に微細な気泡を付着あるいは包含させる方法がとられる。加圧下で空気を溶解させた水を大気下で懸濁水に放出させ、懸濁物を核として気泡を発生させ、この気泡の浮上力を利用する、いわゆる加圧浮上法、また水中の電解作用により気泡を発生させる電解浮上法が一般的である。また捕集剤などの薬剤添加を行っても良い。【００６６】
凝集体が沈降している場合には、沈降槽などで沈降した凝集体を回収すればよい。工業的には傾斜板沈降槽やスラッジブランケット型凝集沈降槽、円筒円錐型槽などの連続式シックナーなどを用いることができる。【００６７】
遠心分離による方法は、凝集体を含む水性懸濁液を高速回転場に置くことにより、重力の数千から数万倍を超える遠心力を印加することができる。方式としては種々挙げられるが、円筒が回転し、比重の小さい液体などを円筒外に排出させる円筒型遠心分離機、傾斜を持った多層に重ねられた傘の斜面で分離を行う分離板型（ドラバル型）、回転するスクリューコンベアで分離させるデカンター型などが挙げられる。【００６８】
このように凝集体の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の回収方法は様々な方法を挙げることができるが、これらの方法は、工業的規模や経済的状況を考慮して選ばれる。しかし、本発明によれば凝集体を数１００μｍから数ｍｍのサイズで得ることができるため、バクテリアや酵母などの分離、バイオリアクターで生産される有用物の分離等に用いられる、膜分離や限外ろ過、精密ろ過、超高速遠心を利用する方法、などの特殊な分離方法を選択する必要がないというメリットがある。【００６９】
本発明では、溶剤の添加により凝集体の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を得ることができるが、水溶性の低いすなわち疎水性の溶剤を３−ヒドロキシアルカン酸共重合体と接触させることにより細胞質成分などの懸濁水を排斥させる効果も得ることができる。この効果により、タンパク質の含有量が低く純度が高い３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の凝集体を得ることが可能である。【００７０】
次いで、ろ過や静置分離などの方法で回収した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の凝集粒子体を水で洗浄することで、精製された３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を得ることができる。洗浄は水以外にも有機溶媒を使用してもよいし、水と有機溶媒を混合して用いても良い。また水のｐＨを調整してもよい。有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ケトン類、アミン類などを用いることができる。また界面活性剤などを水に添加しても構わない。これらの溶媒や水を複数混合して用いてもよい。また、短時間であれば水やこれらの有機溶媒を加温あるいは蒸気として噴霧することで洗浄性を高めることもできる。【００７１】
水や有機溶媒で凝集体を洗浄した後、乾燥させることによって、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を単離することができる。【００７２】
上述の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体分離の段階や乾燥の段階で、懸濁液に含まれている３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の凝集体を得るために添加した溶剤を回収することができる。この溶剤が疎水性溶剤であれば、静置分離等の簡単な方法で水と溶剤を分離することができる。従って、第二の本発明の精製方法は、蒸留分離などの方法を必要としないで溶剤を回収し、再利用することができるという経済上のメリットを有する。【００７３】
第二の本発明では、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液からの当該共重合体の回収に際して、溶剤、特に疎水性溶剤を共重合体に対して少量添加し、抽出せずに、凝集体として簡易に共重合体を回収することができる。特に第一の本発明と第二の本発明を組み合わせて、すなわち中和処理の後に、溶剤を添加して凝集体を形成させることによって、共重合体の分子量の低下が少なく、次亜塩素酸塩の処理に伴う残留塩素の問題もなく、かつ生産性よく共重合体を回収することができる。【００７４】
本発明の方法により得られる３−ヒドロキシアルカン酸共重合体は、重量平均分子量が１００万以上であることが好ましい。より好ましくは１５０万以上である。本明細書において、３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の重量平均分子量は、Ｓｈｏｄｅｘ    Ｋ８０５Ｌ（３００×８ｍｍ、２本連結、昭和電工社製）を装着したＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＧＰＣシステムを用いクロロホルムを移動相として分析した値である。【００７５】
また、本発明の方法により得られる３−ヒドロキシアルカン酸共重合体は、クロルメトリー法（三菱化成製、ＴＯＸ−１０Σ）で測定した時の塩素の含有量が２００ｐｐｍ以下であることが好ましく、１００ｐｐｍ以下であることがより好ましい。【００７６】
更に、本発明の方法により得られる３−ヒドロキシアルカン酸共重合体は、ダイヤインスツルメンツ社製の微量窒素分析装置ＴＮ−１１０で測定した時の窒素の含有量が２００ｐｐｍ以下であることが好ましく、１００ｐｐｍ以下であることがより好ましい。
【実施例】
【００７７】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施例において、室温は２５℃を意味する。【００７８】
（重合体の分子量の測定方法）
菌体より分離して得られた精製ＰＨＢＨ１５ｍｇを、クロロホルム７００μｍに溶解したのち、不溶物を濾過（ウルトラフリーＭＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）により除いた。この溶液を用いて、Ｓｈｏｄｅｘ    Ｋ８０５Ｌ（３００×８ｍｍ、２本連結、昭和電工社製）を装着したＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＧＰＣシステムを用いクロロホルムを移動相として重合体の分子量を測定した。【００７９】
（重合体中の残留窒素量の測定方法）
各サンプルに関し、ダイヤインスツルメンツ社製の微量窒素分析装置ＴＮ−１１０、または炭素・水素・窒素同時定量装置ＣＨＮ−ＣＯＲＤＥＲ、ＭＴ−５（ヤナコ社製）を用いて測定した。【００８０】
（塩素分析）
分析は、クロルメトリー法（三菱化成製、ＴＯＸ−１０Σ）で実施した。【００８１】
（ＰＨＢＨを含有する微生物を含む水性懸濁液の調製）
アエロモナス・キャビエ由来の３−ヒドロキシアルカン酸共重合体合成酵素群遺伝子を導入したラルストニア・ユートロファ（旧名アルカリゲネス・ユートロファス  ＡＣ３２（上述の寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８））をＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４８２１−４８３０頁（１９９７）に記載の方法で培養し、ＰＨＢＨを約８０ｗｔ％含有した菌体を得た。【００８２】
（滅菌の方法）
得られた培養液を内温６０〜８０℃で２０分加熱・攪拌処理し、滅菌処理を行った。【００８３】
（機械的菌体破砕の方法）
得られた滅菌処理すみ培養液を、高圧ホモジナイザー処理（ＰＡ２Ｋ型、Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｓ．Ｐ．Ａ）によって処理した。高圧ホモジナイザー処理では培養液にＮａＯＨ水溶液を添加してｐＨを１２．５まで上げながら処理を行い、ｐＨ＝１２．５まで達した時点から一定時間、一定ホモジナイズ圧を保った。【００８４】
（実施例１）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝２１８万、ＰＨＢＨ含量＝２０８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝４．５モル％）を機械的破砕処理せずに次亜塩素酸Ｎａ処理（系中有効塩素濃度５％、室温、１ｈｒ攪拌）した。この次亜塩素酸Ｎａ処理では、系のｐＨは１２．５から９〜１０程度まで低下した。処理液を中和処理（亜硫酸Ｎａを次亜塩素酸Ｎａの０．６倍当量添加、亜硫酸Ｎａは１５ｗｔ％水溶液で添加、室温で３０分攪拌）した後、遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。洗浄操作として遠心分離後の上清液を廃棄した後、純水を添加し、沈殿層と十分に攪拌した後に更に遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。この洗浄操作を５回繰り返した。使用した培養液中のＰＨＢＨ含量（２０８ｇ／Ｌ）から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して４０倍の水（次亜塩素酸Ｎａ処理や亜硫酸Ｎａ処理に伴う水を含める）で洗浄処理した後のＰＨＢＨを乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）した後、微量窒素分析装置で窒素含量を測定したところ５１０ｐｐｍであった。また分子量は１３４万であった。培養後のＰＨＢＨが有するタンパクは窒素含量で約１００００ｐｐｍである。従い、これらの方法で分子量を１００万以上に保ったまま、タンパク含量を窒素換算で５１０ｐｐｍまで精製できることがわかった。【００８５】
（実施例２）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝２１８万、ＰＨＢＨ含量＝２０８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝４．５モル％）を機械的破砕処理（高圧ホモジナイザー処理、ｐＨ＝１２．５以上で６００ｂａｒで９０分保持）した。この処理液を次亜塩素酸Ｎａ処理（系中有効塩素濃度５％、室温、１ｈｒ攪拌）した。この次亜塩素酸Ｎａ処理では、系のｐＨは１２．５から９〜１０程度まで低下した。さらに中和処理（亜硫酸Ｎａを次亜塩素酸Ｎａの０．６倍当量添加、亜硫酸Ｎａは１５ｗｔ％水溶液で添加、室温で３０分攪拌）した後、遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。洗浄操作として遠心分離後の上清液を廃棄した後、純水を添加し、沈殿層と十分に攪拌した後に更に遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。この洗浄操作を５回繰り返した。使用した培養液中のＰＨＢＨ含量（２０８ｇ／Ｌ）から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して４０倍の水（次亜塩素酸Ｎａ処理や亜硫酸Ｎａ処理に伴う水を含める）で洗浄処理した後のＰＨＢＨを乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）した後、微量窒素分析装置で窒素含量を測定したところ３３０ｐｐｍであった。また分子量は１８７万であった。実施例１に記載の方法に高圧ホモジナイズ処理を組み合わせることでタンパク含量を窒素換算で３３０ｐｐｍまで低下できることがわかった。【００８６】
（実施例３）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝３０７万、ＰＨＢＨ含量＝１３８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝５．８モル％）を機械的破砕処理（高圧ホモジナイザー処理、ｐＨ＝１２．５以上で６００ｂａｒで単通処理を５回実施）した。この処理液を次亜塩素酸Ｎａ処理（系中有効塩素濃度６．５％、室温、１ｈｒ攪拌）した。この次亜塩素酸Ｎａ処理では系のｐＨは１２．５から９〜１０程度まで低下する。さらに中和処理（亜硫酸Ｎａを次亜塩素酸Ｎａの０．６倍当量添加、亜硫酸Ｎａは１５ｗｔ％水溶液で添加、室温で３０分攪拌）した。さらに中和処理（亜硫酸Ｎａを次亜塩素酸Ｎａの０．４倍当量添加、亜硫酸Ｎａは１５ｗｔ％水溶液で添加、室温で６０分攪拌）した後、培養液中のＰＨＢＨ含量から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して当量の酢酸エチルを添加し、室温で９０分攪拌した。得られた凝集物をろ過・脱水し、純水を添加する洗浄操作を繰り返した。ＰＨＢＨ理論量に対して１４倍の水で洗浄した後、得られた凝集体を乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）した。乾燥した精製ＰＨＢＨの窒素含量は３００ｐｐｍ（炭素・水素・窒素同時定量装置）であり、塩素含量は１０１００ｐｐｍ（クロルメトリー法）であった。分子量は１１４万であった。分子量を１００万以上に保持したまま、タンパク質を窒素含量で３００ｐｐｍまで低減できるが、塩素の残留物が多い。【００８７】
（実施例４）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝３０７万、ＰＨＢＨ含量＝１３８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝５．８モル％）を機械的破砕処理（高圧ホモジナイザー処理、ｐＨ＝１２．５以上で６００ｂａｒで単通処理を５回実施）した。この処理液をＮａＯＨ添加によりｐＨを１２に維持したまま、次亜塩素酸Ｎａ処理（系中有効塩素濃度６．５％、室温、１ｈｒ攪拌、ｐＨ＝１２維持）した。中和処理（亜硫酸Ｎａを次亜塩素酸Ｎａの０．５倍当量添加、亜硫酸Ｎａは１５ｗｔ％水溶液で添加、室温で６０分攪拌）した後、培養液中のＰＨＢＨ含量から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して当量の酢酸エチルを添加し、室温で９０分攪拌した。得られた凝集物をろ過・脱水し、純水を添加する洗浄操作を繰り返した。ＰＨＢＨ理論量に対して４０倍の水で洗浄した後、得られた凝集体を乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）した。乾燥した精製ＰＨＢＨの窒素含量は４００ｐｐｍ（炭素・水素・窒素同時定量装置）であり、塩素含量は２８００ｐｐｍ（クロルメトリー法）であった。分子量は２１６万であった。分子量を１００万以上に保持したまま、タンパク質を窒素含量で４００ｐｐｍまで低減でき、かつ塩素残量を２８００ｐｐｍまで低減できている。【００８８】
（実施例５）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝２４２万、ＰＨＢＨ含量＝１８８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝８．３モル％）を機械的破砕処理（高圧ホモジナイザー処理、ｐＨ＝１２．５以上で６００ｂａｒで単通処理を５回実施）した。この処理液をＮａＯＨ添加によりｐＨを１２に維持し、かつ温度を２０℃以下に保ったまま次亜塩素酸Ｎａ処理（系中有効塩素濃度６．５％、２０℃以下、２ｈｒ攪拌、ｐＨ＝１２維持）した。中和処理（亜硫酸Ｎａを次亜塩素酸Ｎａの０．５倍当量添加、亜硫酸Ｎａは１５ｗｔ％水溶液で添加、室温で６０分攪拌）した後、培養液中のＰＨＢＨ含量から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して０．４４倍量のトルエンを添加し、室温で６０分攪拌した。得られた凝集物をろ過・脱水し、純水を添加する洗浄操作を繰り返した。ＰＨＢＨ理論量に対して４０倍の水で洗浄し、さらにＰＨＢＨ理論量に対して６０倍のメタノールで洗浄した後、得られた凝集体を乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）した。乾燥した精製ＰＨＢＨの窒素含量は６５ｐｐｍ（微量窒素分析）であり、塩素含量は１００ｐｐｍ（クロルメトリー法）であった。分子量は１４７万であった。分子量を１００万以上に保持したまま、タンパク質を窒素含量で６５ｐｐｍまで低減でき、かつ塩素残量を１００ｐｐｍまで低減できている。【００８９】
また、この精製ＰＨＢＨに関してＴＧ−ＭＳ法（ＴＧ―ＤＴＡ／ＭＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）にて遊離する塩素の発生温度を追跡した。室温から５００℃までの領域でＴＧ曲線を測定したが、ＰＨＢＨの分解温度より低温領域での重量変化が見られず、またＭＳでも塩素（塩酸）は検出できない。従い、ＰＨＢＨの溶融に伴い遊離する塩素（塩酸）は極めて微量であることがわかった。【００９０】
（実施例６）
実施例４、５に述べた塩素残量低減の効果を確認するために、予め溶剤抽出法で精製したＰＨＢＨを使ってモデル実験を行った（表１）。アセトンを抽出溶剤として精製したＰＨＢＨ（精製後分子量５４万、３ＨＨ組成＝１３．４モル％、塩素残量＝２０〜３０ｐｐｍ、窒素含量＝２０ｐｐｍ）の乾燥物をアセトンと水の混合液で湿潤状態とし、脱水した後に以下に述べる条件で次亜塩素酸Ｎａと接触させた。次亜塩素酸Ｎａ処理後は中和処理（亜硫酸Ｎａを次亜塩素酸Ｎａの１．５倍当量添加、亜硫酸Ｎａは１５ｗｔ％水溶液で添加、室温で６０分攪拌）した後、乾燥ＰＨＢＨ量に対して１００倍の水で洗浄した。４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥させた後、クロルメトリー法で塩素残量を測定した。【００９１】
タンパク質等の菌体構成成分を含む培養液に次亜塩素酸Ｎａを添加すると、タンパク質の分解により発生するカルボン酸などにより系のｐＨが徐々に低下するが、このモデル実験では精製ずみＰＨＢＨ（窒素含量＝２０ｐｐｍ）を用いたために、次亜塩素酸Ｎａ処理時にｐＨが低下しない。塩素化の要因検討のためにＮａＯＨによりｐＨを酸側に調整した。また次亜塩素酸Ｎａ処理時の温度、光を遮蔽する効果などを検討した。表１に示すように、次亜塩素酸Ｎａ処理時のｐＨを高く保ったり、温度を下げたり、光を遮蔽することで、Ｃｌ残量をコントロールできることがわかった。最も低減できる条件では１００ｐｐｍ以下まで低減できる。数平均分子量が約１５万であるため、１分子に対してＣｌ原子の結合が１個以下まで低減できていることとなる。【００９２】
【表１】
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（参考例）
実施例１〜５に述べた分子量を１００万以上に保持する次亜塩素酸塩処理条件を確認するために、滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝１４１万、ＰＨＢＨ含量＝２４３ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝６．６モル％）を様々な次亜塩素酸塩処理条件で処理した場合の分子量の結果を示した（表２）。系中有効塩素濃度が５％以下であっても２４ｈｒ以上の長時間の次亜塩素酸塩処理を行うと、分子量が２０万以下と著しく低下してしまうが、系中有効塩素濃度と処理時間を一定濃度以下、一定時間以下に制限すれば、分子量を１００万程度に維持できることが確認できる。また、３ＨＨ組成を変えた培養液（Ｍｗ＝１３５万、ＰＨＢＨ含量＝６５．７ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝１０．４モル％）でも同様の効果が確認できた（表３）。【００９３】
表２中のビーズミル破砕処理は、破砕媒体であるガラスビーズを処理液と同容量添加し、１０分間ミル処理を実施した。【００９４】
表３中の高圧ホモジナイザー破砕処理は、ｐＨ＝１２．５以上、６００ｂａｒで９０分保持したあと、遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。【００９５】
【表２】
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【００９６】
【表３】
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（比較例１）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝２１８万、ＰＨＢＨ含量＝２０８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝４．５モル％）を機械的破砕処理および次亜塩素酸Ｎａ処理せずに、遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。遠心分離後の上清液を廃棄した後、純水を添加し、沈殿層と十分に攪拌した後に更に遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。この洗浄操作を５回繰り返した。使用した培養液中のＰＨＢＨ含量（２０８ｇ／Ｌ）から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して４０倍の水で洗浄処理した後のＰＨＢＨを乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）した後、微量窒素分析装置で窒素含量を測定したところ１２０００ｐｐｍであった。破砕処理や次亜塩素酸Ｎａ処理を経ないと水で洗浄する処理を行ってもＰＨＢＨ中のタンパク含量を実用的なレベルに低下することはできない。【００９７】
（比較例２）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝２１８万、ＰＨＢＨ含量＝２０８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝４．５モル％）を機械的破砕処理（高圧ホモジナイザー処理、ｐＨ＝１２．５以上で６００ｂａｒで９０分保持）した。次亜塩素酸Ｎａ処理せずに、遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。遠心分離後の上清液を廃棄した後、純水を添加し、沈殿層と十分に攪拌した後に更に遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。この洗浄操作を５回繰り返した。使用した培養液中のＰＨＢＨ含量（２０８ｇ／Ｌ）から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して３０倍の水で洗浄処理した後のＰＨＢＨを乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）した後、微量窒素分析装置で窒素含量を測定したところ１０００ｐｐｍであった。破砕処理を行っても、水で洗浄する処理だけではＰＨＢＨ中のタンパク含量を１０００ｐｐｍまでしか低減できない。【００９８】
（比較例３）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝１４１万、ＰＨＢＨ含量＝２４３ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝６．６モル％）を次亜塩素酸Ｎａ処理（系中有効塩素濃度２．５％〜５％、室温から成行き温度、７２ｈｒ攪拌、ｐＨは成行き（ｐＨ＝８〜９））した後、遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。遠心分離後の上清液を廃棄した後、純水を添加し、沈殿層と十分に攪拌した後に更に遠心分離処理（８０００Ｇで１０分処理）を行った。この洗浄操作を５回繰り返した。使用した培養液中のＰＨＢＨ含量から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して約１０倍の水で洗浄処理した後、ＰＨＢＨ乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）させた。この乾燥体の分子量を測定したところ、表２に示すごとく分子量が２０万以下に低下する（表２、Ｎｏ．１および２）。中和処理を行わなかったところ、ＰＨＢＨの分子量が著しく低下した。
（実施例８）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝３０７万、ＰＨＢＨ含量＝１３８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝５．８モル％）を機械的破砕処理（高圧ホモジナイザー処理、ｐＨ＝１２．５以上、６００ｂａｒで単通処理を５回実施）した。この処理液をＮａＯＨ添加によりｐＨを１２に維持したまま、次亜塩素酸Ｎａ処理（系中有効塩素濃度６．５％、室温、１ｈｒ攪拌、ｐＨ＝１２維持）した。中和処理（亜硫酸Ｎａを次亜塩素酸Ｎａの０．５倍当量添加、亜硫酸Ｎａは１５ｗｔ％水溶液で添加、室温で６０分攪拌）した後、培養液中のＰＨＢＨ含量から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して当量の酢酸エチルを添加し、室温で９０分攪拌した。得られた凝集体をろ過・脱水し、純水を添加する洗浄操作を繰り返した。ＰＨＢＨ理論量に対して４０倍の水で洗浄した後、得られた凝集体を乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）した。乾燥した精製ＰＨＢＨの窒素含量は４００ｐｐｍ（炭素・水素・窒素同時定量装置）であった。塩素含量は２８００ｐｐｍ（クロルメトリー法）であり、分子量は２１６万であった。分子量を１００万以上に保持したまま、タンパク質を窒素含量で４００ｐｐｍまで低減できている。
（実施例９）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝２４２万、ＰＨＢＨ含量＝１８８ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝８．３モル％）を機械的破砕処理（高圧ホモジナイザー処理、ｐＨ＝１２．５以上、６００ｂａｒで単通処理を５回実施）した。この処理液をＮａＯＨ添加によりｐＨを１２に維持し、かつ温度を２０℃以下に保ったまま次亜塩素酸Ｎａ処理（系中有効塩素濃度６．５％、２０℃以下、２ｈｒ攪拌、ｐＨ＝１２維持）した。中和処理（亜硫酸Ｎａを次亜塩素酸Ｎａの０．５倍当量添加、亜硫酸Ｎａは１５ｗｔ％水溶液で添加、室温で６０分攪拌）した後、培養液中のＰＨＢＨ含量から計算されるＰＨＢＨ理論量に対して０．４４倍量のトルエンを添加し、室温で６０分攪拌した。得られた凝集体をろ過・脱水し、純水を添加する洗浄操作を繰り返した。ＰＨＢＨ理論量に対して４０倍の水で洗浄した後、得られた凝集体を乾燥（４０℃〜４５℃で一昼夜乾燥）した。乾燥した精製ＰＨＢＨの窒素含量は３２０ｐｐｍ（炭素・水素・窒素同時定量装置）であり、分子量は１４７万であった。また塩素含量は１４００ｐｐｍ（クロルメトリー法）であった。分子量を１００万以上に保持したまま、タンパク質を窒素含量で４００ｐｐｍ以下まで低減できている。
（比較例４）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝２１８万、ＰＨＢＨ含量＝２０８．２ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝４．５モル％）にクロロホルムを添加し、ＰＨＢＨを抽出した。培養液中のＰＨＢＨ理論量に対して４０倍のクロロホルムを添加し、シェイカーで振とうしながら一晩以上放置した。得られた抽出液を、ろ紙でろ過した後、エバポレーターで濃縮し、ヘキサンをＰＨＢＨ理論量に対して２０倍添加してＰＨＢＨを晶析させた。晶析を吸引ろ過した後、真空乾燥（５０℃）で一昼夜放置した。得られた精製体のタンパク質は窒素含量で３９ｐｐｍであった（微量窒素分析装置）。この方法では、窒素含量４０ｐｐｍ以下まで精製できるが、抽出溶剤であるクロロホルムおよび晶析用の貧溶媒を大量に使う点に問題がある。
（比較例５）
滅菌すみ培養液（Ｍｗ＝２１８万、ＰＨＢＨ含量＝２０８．２ｇ／Ｌ、３ＨＨ組成＝４．５モル％）を機械的破砕処理（高圧ホモジナイザー処理、ｐＨ＝１２．５以上、６００ｂａｒで９０分保持）した。この処理液に無機塩として、硫酸アルミニウム水溶液を添加した。培養液の理論ＰＨＢＨ量に対して、３％（金属／ＰＨＢＨ、重量基準）の量を添加した。添加した培養液中のＰＨＢＨ、菌体構成成分など全ての固形分が凝集沈降しており、培養液中からＰＨＢＨを分離することは出来なかった。硫酸アルミニウムの代わりに塩化アルミニウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩を用いても同様の結果であった。機械的破砕処理を経た滅菌すみ培養液に無機塩水溶液を添加し、凝集沈降物を得ることができるが、ＰＨＢＨとタンパク質等の菌体構成成分を分離することができない。
【国際調査報告】
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