(57)【要約】  解析装置１６０は、試料Ｓの少なくとも一枚の蛍光画像が入力される画像入力部１６２と、画像入力部１６２に入力される少なくとも一枚の蛍光画像のデータを記憶する記憶部１６４と、少なくとも一枚の蛍光画像上の所望の領域における蛍光強度のデータを記憶部１６４に記憶された少なくとも一枚の蛍光画像のデータから蛍光画像ごとに抽出するデータ抽出部１７２と、データ抽出部１７２によって抽出された蛍光強度のデータを利用して所望の領域における相関とフォトンカウンティングヒストグラムを算出する解析部１７４とを含んでいる。
2008087869.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料の少なくとも一枚の蛍光画像が入力される画像入力手段と、
前記画像入力手段に入力された前記少なくとも一枚の蛍光画像のデータを記憶する記憶手段と、
前記少なくとも一枚の蛍光画像上の所望の領域における蛍光強度のデータを、前記記憶手段に記憶された前記少なくとも一枚の蛍光画像のデータから前記蛍光画像ごとに抽出する抽出手段と、
前記蛍光強度のデータを利用して前記所望の領域における相関とフォトンカウンティングヒストグラムの少なくともいずれかを算出する解析手段とを含む、蛍光信号解析装置。
【請求項２】
前記画像入力手段には、所定の時間間隔で繰り返し取得された試料の複数枚の蛍光画像が入力され、前記記憶手段は、前記複数枚の蛍光画像のデータを記憶し、前記抽出手段は、前記複数枚の蛍光画像上の所望の領域における蛍光強度のデータを、前記記憶手段に記憶された前記複数枚の蛍光画像のデータから前記蛍光画像ごとに抽出する、請求項１に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項３】
前記所望の領域は、一つの画素からなる画素領域である、請求項１に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項４】
前記所望の領域は、複数の画素からなる画素領域である、請求項１に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項５】
前記蛍光強度のデータは、前記複数の画素の蛍光強度についての統計値である、請求項４に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項６】
前記統計値は、前記複数の画素における蛍光強度の積算値、平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差のいずれかである、請求項５に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項７】
前記蛍光画像は、蛍光強度の分布によって構成されたものである、請求項１に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項８】
前記解析手段は、前記所定の時間間隔をさらに利用して拡散時間を算出する、請求項１に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項９】
前記所望の領域を指定する領域指定手段をさらに有する、請求項１に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項１０】
前記解析手段により算出された結果を、輝度と表とグラフと数値の少なくとも一つにより表示する表示手段をさらに含む、請求項１に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項１１】
前記記憶手段に記憶された前記少なくとも一枚の蛍光画像のうちの少なくとも一枚を表示する表示手段と、
前記表示手段に表示された蛍光画像上において前記所望の領域を指定するための領域指定手段とをさらに含む、請求項１に記載の蛍光信号解析装置。
【請求項１２】
試料の少なくとも一枚の蛍光画像のデータを記憶するステップと、
前記少なくとも一枚の蛍光画像上の所望の領域における蛍光強度のデータを、記憶した前記少なくとも一枚の蛍光画像のデータから前記蛍光画像ごとに抽出するステップと、
抽出した前記蛍光強度のデータを利用して前記所望の領域における相関とフォトンカウンティングヒストグラムの少なくともいずれかを算出するステップとを含む、蛍光信号解析方法。
【請求項１３】
前記記憶するステップは、所定の時間間隔で繰り返し取得された試料の複数枚の蛍光画像のデータを記憶し、前記抽出するステップは、前記複数枚の蛍光画像上の所望の領域における蛍光強度のデータを、記憶した前記複数枚の蛍光画像のデータから前記蛍光画像ごとに抽出する、請求項１２に記載の蛍光信号解析方法。
【請求項１４】
前記所望の領域は、一つの画素からなる画素領域である、請求項１２に記載の蛍光信号解析方法。
【請求項１５】
前記所望の領域は、複数の画素からなる画素領域である、請求項１２に記載の蛍光信号解析方法。
【請求項１６】
前記蛍光強度のデータは、前記複数の画素の蛍光強度についての統計値である、請求項１５に記載の蛍光信号解析方法。
【請求項１７】
前記統計値は、前記複数の画素における蛍光強度の積算値、平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差のいずれかである、請求項１６に記載の蛍光信号解析方法。
【請求項１８】
前記蛍光画像は、励起光の照射に対して前記試料から発せられた蛍光強度の分布によって構成されたものである、請求項１２に記載の蛍光信号解析方法。
【請求項１９】
前記所定の時間間隔を利用して拡散時間を算出するステップをさらに含む、請求項１２に記載の蛍光信号解析方法。
【請求項２０】
解析の結果を、輝度と表とグラフと数値の少なくとも一つにより表示するステップをさらに含む、請求項１２に記載の蛍光信号解析方法。
【請求項２１】
前記少なくとも一枚の蛍光画像のうちの少なくとも一枚を表示するステップと、
表示された蛍光画像上において前記所望の領域を指定するステップとをさらに含む、請求項１２に記載の蛍光信号解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光信号解析装置および光信号解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ＬＳＭ画像データを用いた光信号解析方法が「Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers  on Intace Cells.」, Paul W. Wiseman and Nils o. Petersen, Biophysical Journal, Vol.76, P963, 1999.に開示されている。この文献において、相関演算に用いるＬＳＭ画像データは１枚からなる。データは異なる空間位置における蛍光強度の積算値を用いて、空間位置のずれによる相関性を検討したものである。【０００３】
上記の従来技術のように、測定データが異なる空間位置における蛍光強度の積算値である場合、空間軸上の情報は有するが、時間軸上の揺らぎ情報は得られない。従って、時間軸における生細胞の挙動、相互作用の観察は不可能である。つまり、空間位置における蛍光強度画像のみでは、細胞内外で生じる反応、相互作用、細胞内のシグナル伝達などの時間経過による変化は観察不可能である。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、この様な実状を考慮して提案したものであり、その目的は、時間経過による変化を観察可能な蛍光信号解析装置および蛍光信号解析方法を提供することである。
【０００５】
本発明による蛍光信号解析装置は、試料の少なくとも一枚の蛍光画像が入力される画像入力手段と、前記画像入力手段に入力された前記少なくとも一枚の蛍光画像のデータを記憶する記憶手段と、前記少なくとも一枚の蛍光画像上の所望の領域における蛍光強度のデータを、前記記憶手段に記憶された前記少なくとも一枚の蛍光画像のデータから前記蛍光画像ごとに抽出する抽出手段と、前記蛍光強度のデータを利用して前記所望の領域における相関とフォトンカウンティングヒストグラムの少なくともいずれかを算出する解析手段とを含む。
【０００６】
本発明による蛍光信号解析方法は、試料の少なくとも一枚の蛍光画像のデータを記憶するステップと、前記少なくとも一枚の蛍光画像上の所望の領域における蛍光強度のデータを、記憶した前記少なくとも一枚の蛍光画像のデータから前記蛍光画像ごとに抽出するステップと、抽出した前記蛍光強度のデータを利用して前記所望の領域における相関とフォトンカウンティングヒストグラムの少なくともいずれかを算出するステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、本発明の第一実施形態による光信号解析装置を概略的に示している。
【図２】図２は、図１に示される制御部の機能ブロック図である。
【図３】図３は、相関カーブにおける最小遅延時間τ０と分子拡散時間Ｄｔを示している。
【図４】図４は、所定の時間間隔で取得される複数枚の蛍光画像を模式的に示している。
【図５】図５は、第一実施形態における光信号解析のフローチャートである。
【図６】図６は、解析結果のグラフを示している。
【図７】図７は、解析結果の輝度値を示している。
【図８】図８は、解析結果の表を示している。
【図９】図９は、解析結果の数値のピンポイント表示を示している。
【図１０】図１０は、第二実施形態における光信号解析のフローチャートである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、図面を参照しながら本発明の実施形態について説明する。【０００９】
＜第一実施形態＞
同一の所望の領域の抽出データによるＦＣＳ／ＦＣＣＳ
本実施形態は、試料における複数枚の蛍光画像のデータから同一空間位置におけるデータを抽出して解析する手法である。【００１０】
図１は、本発明の第一実施形態による光信号解析システムを概略的に示している。図１に示すように、光信号解析システム１００は、試料Ｓに励起光を照射する光照射部１１０と、試料Ｓの蛍光画像を所定の時間間隔で繰り返し取得する画像取得部１３０と、画像取得部１３０によって取得された蛍光画像に対して光信号解析を行う解析装置１６０とを有している。【００１１】
光照射部１１０は光源１１２とミラー１１６とダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６とを含んでいる。光源１１２は、試料Ｓに含まれる蛍光色素を励起して試料Ｓから光（蛍光）を発せされるための励起光を発する。ミラー１１６は、光源１１２から発せられる励起光をダイクロイックミラー１２２に向けて反射する。ダイクロイックミラー１２２は、励起光をガルバノミラー１２４に向けて反射し、試料Ｓから発せられる蛍光を透過する。ガルバノミラー１２４は、励起光を対物レンズ１２６に向けて反射するとともに、その反射方向を変更する。対物レンズ１２６は、励起光を収束して試料Ｓ内の測定点に照射するとともに、試料Ｓ内の測定点からの光を取り込む。【００１２】
画像取得部１３０は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２を光照射部１１０と共有している。画像取得部１３０はさらに、収束レンズ１３２とピンホール１３４とコリメートレンズ１３６と蛍光フィルター１３８と収束レンズ１４０と光検出器１４２とミラー制御部１４４と画像形成部１４６とを含んでいる。収束レンズ１３２は、ダイクロイックミラー１２２を透過した光を収束する。ピンホール１３４は、収束レンズ１３２の焦点に配置されている。つまり、ピンホール１３４は、試料Ｓ内の測定点に対して共役な位置にあり、測定点からの光だけを選択的に通す。コリメートレンズ１３６は、ピンホール１３４を通過した光を平行にする。蛍光フィルター１３８は、試料Ｓから発せられる蛍光だけを選択的に透過する。収束レンズ１４０は、蛍光フィルター１３８を透過した蛍光を収束する。収束レンズ１４０は、コリメートレンズ１３６と共同して、ピンホール１３４の像を光検出器１４２に投影する。光検出器１４２は、入射した光の強度に対応した信号を出力する。すなわち、光検出器１４２は、試料Ｓ内の測定点からの光の揺らぎに対応する揺らぎ信号を出力する。ミラー制御部１４４は、励起光の照射位置を試料Ｓの所定領域に対してラスター走査するようにガルバノミラー１２４を制御する。画像形成部１４６は、ミラー制御部１４４から入力される励起光の照射位置の情報と光検出器１４２の出力信号とから試料Ｓの所定領域の蛍光画像を形成する。【００１３】
解析装置１６０は例えばパーソナルコンピューターで構成される。解析装置１６０は、試料Ｓの全体画像の取得と表示、観察領域の指定および最小遅延時間と最大遅延時間の設定の入力待ち、測定点の選定と位置の決定、解析（擬似分子数の算出）などを行う。【００１４】
図１に示される解析装置の機能ブロックを図２に示す。解析装置１６０は、図２に示すように、画像入力部１６２と記憶部１６４と画像読出部１６６と表示部１６８と入力部１７０とデータ抽出部１７２と解析部１７４とを含んでいる。解析装置１６０は例えばパーソナルコンピューターで構成される。画像入力部１６２は、画像取得部１３０によって所定の時間間隔で繰り返し取得される複数枚の蛍光画像が入力される。記憶部１６４は、画像入力部１６２に入力される複数枚の蛍光画像のデータを記憶する。画像読出部１６６は、記憶部１６４に記憶された複数枚の蛍光画像のうちの少なくとも一枚を読み出す。表示部１６８は、画像読出部１６６によって読み出された蛍光画像を表示する。入力部１７０は、例えばマウスやキーボードを含み、表示部１６８と共同してＧＵＩを構成する。このＧＵＩは、例えば、表示部１６８に表示された蛍光画像上において操作者が光信号解析の対象となる所望の領域を指定することに利用される。データ抽出部１７２は、複数枚の蛍光画像上の所望の領域における蛍光強度のデータを記憶部１６４に記憶された複数枚の蛍光画像のデータから蛍光画像ごとに抽出する。解析部１７４は、データ抽出部１７２によって抽出された蛍光強度のデータを利用して所望の領域における相関とフォトンカウンティングヒストグラムを算出する。また、表示部１６８は、解析部１７４による解析結果（相関とフォトンカウンティングヒストグラム）を表示し、表示部１６８と入力部１７０とからなるＧＵＩは、解析結果の表示の仕方の指定に利用される。【００１５】
図１において、光源１１２から発せられた励起光は、ミラー１１６とダイクロイックミラー１２２とガルバノミラー１２４と対物レンズ１２６を経て試料Ｓ内の測定点に照射される。励起光が照射される測定点は、ガルバノミラー１２４によってラスター走査される。励起光を受けた試料Ｓは測定点から蛍光を発する。試料Ｓからの光（蛍光のほかに不所望な反射光などを含む）は、対物レンズ１２６とガルバノミラー１２４とダイクロイックミラー１２２と収束レンズ１３２を経てピンホール１３４に至る。ピンホール１３４は測定点と共役な位置にあるため、試料Ｓ内の測定点からの光だけがピンホール１３４を通過する。ピンホール１３４を通過した光すなわち試料Ｓ内の測定点からの光はコリメートレンズ１３６を経て蛍光フィルター１３８に至り、試料Ｓ内の測定点から発せられた蛍光だけが蛍光フィルター１３８を透過する。蛍光フィルター１３８を透過した蛍光は収束レンズ１４０を経て光検出器１４２に入射する。光検出器１４２は、試料Ｓ内の測定点から発せられた蛍光強度に対応する信号を画像形成部１４６に出力する。画像形成部１４６は、ミラー制御部１４４から入力される励起光の照射位置の情報と光検出器１４２の出力信号とから、励起光の照射に対して試料Ｓから発せられた蛍光強度の分布によって構成された蛍光画像を形成する。蛍光画像は、解析装置１６０に入力され、解析処理に供される。【００１６】
本実施形態では、まず、ガルバノミラー１２４により試料Ｓの異なる部位に連続的に励起光を照射して１枚の蛍光画像を取得する。次に、蛍光画像の収集を１枚の蛍光画像の取得で終えるのではなく、同様の条件と同様の手順により所定の時間間隔で２枚目、３枚目と繰り返し、複数枚の蛍光画像を取得する。つまり、複数枚の蛍光画像は、同一試料の同一領域を同様な順番で繰り返し走査して得たものである。このため、同一の所望の領域における蛍光強度の時間変化の情報は、記憶された複数枚の蛍光画像のデータから蛍光画像ごとに抽出して得られる。【００１７】
取得した複数枚の蛍光画像のデータは、画像入力部１６２に入力され、記憶部１６４に記憶される。記憶部１６４に記憶された複数枚の蛍光画像のデータは、同一の所望の領域における蛍光強度のデータが蛍光画像ごとにデータ抽出部１７２によって抽出される。抽出されたデータは解析部１７４に送られ、同一の所望の領域における相関解析およびフォトンカウンティングヒストグラム解析、あるいは同一の所望の領域におけるデータ再構成、相関解析およびフォトンカウンティングヒストグラム解析処理に用いられる。【００１８】
以下、本実施形態における光信号解析について図５のフローチャートに沿って説明する。【００１９】
［ステップＳ１０１］  
取得しようとする蛍光画像の枚数を指定する。【００２０】
蛍光画像の取得時間間隔（所定の時間間隔）を設定する。【００２１】
図３から分かるように、蛍光画像の取得時間間隔は、相関カーブの最小プロット点の遅延時間τ０に相当する。試料Ｓの分子拡散時間ＤｔはＧ（Ｄｔ）≒［Ｇ（τ０）−１］／２から推定できる。そのため、τ０＞Ｄｔの場合、描画される相関カーブからＤｔを推定するのは不可能で、フィッテングによる誤差も大きい。また、分子拡散時間Ｄｔは試料によって異なる。このため、蛍光画像の取得時間間隔は、解析によって得ようとする最も短い試料の分子拡散時間Ｄｔよりも短く設定する。【００２２】
［ステップＳ１０２］  
試料内の同一領域の蛍光画像を所定の時間間隔で繰り返し取得する。所定の時間間隔で取得される複数枚の蛍光画像を図４に模式的に示す。【００２３】
［ステップＳ１０３］  
取得した複数枚の蛍光画像を画像入力部１６２に入力する。【００２４】
［ステップＳ１０４］  
入力した複数枚の蛍光画像のデータを記憶部１６４に記憶する。【００２５】
［ステップＳ１０５］  
相関解析しようとする試料内の所望の領域（一つの画素からなる画素領域または隣接する複数の画素からなる画素領域）を指定する。【００２６】
［ステップＳ１０６］  
所望の領域が一つの画素からなる画素領域であるか否かを判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ１０７に進み、Ｎｏの場合はステップＳ１０８に進む。【００２７】
［ステップＳ１０６→Ｓ１０７→Ｓ１０９→Ｓ１１０］  
所望の領域が一つの画素からなる画素領域である場合、ステップＳ１０７において、指定された所望の領域における蛍光強度のデータを、記憶部１６４に記憶された複数枚の蛍光画像のデータから蛍光画像ごとに抽出する。【００２８】
ステップＳ１０９において、所望の領域における抽出した蛍光強度のデータにおいて、相関演算やフィッティングなどにより、分子数や拡散時間などを解析評価する。【００２９】
測定点Ｐにおける自己相関解析式は、次の（１）式で表される。
【数１】
2008087869.tif 000003
【００３０】
ここで、Ｄは所望の領域Ｐにおけるデータ、Ｎはデータの総数である。【００３１】
また、ステップＳ１１０において、所望の領域における抽出した蛍光強度のデータにおいて、フォトンカウンティングヒストグラム分析法を適用させる。【００３２】
［ステップＳ１０６→Ｓ１０８→Ｓ１０９→Ｓ１１０］  
所望の領域が一つの画素からなる画素領域でない場合、すなわち、所望の領域が隣接する複数の画素からなる画素領域の場合、ステップＳ１０８において、記憶された複数枚の蛍光画像のデータから、画素領域における蛍光強度のデータの統計値、例えば、積算値、平均値、最大値、最小値、相対差、絶対差のいずれかを蛍光画像ごとに算出する。【００３３】
また、この複数枚のデータ再構成結果において、指定された同一の所望の領域（画素領域）におけるデータをそれぞれ抽出する。【００３４】
複数枚のデータ再構成結果を用いて、ステップＳ１０９において、同一の所望の領域（画素領域）において、相関演算やフィッティングなどにより、分子数や拡散時間などを解析評価する。【００３５】
複数枚のデータ再構成結果を用いて、ステップＳ１１０において、同一の所望の領域（画素領域）において、フォトンカウンティングヒストグラム分析法を適用させる。【００３６】
［ステップＳ１１１］  
各ステップで算出した結果を、例えば、図６に示すように、グラフとして、または、図７に示すように、輝度値として、または、図８に示すように、表として、または、図９に示すように、ピンポイント表示方式の数値として、表示部１６８に表示する。このましくは、算出結果を、輝度と表とグラフと数値の一つ以上の表示の仕方で表示部１６８に表示するとよい。【００３７】
図６の上側は一つの所望の領域における相関曲線、図６の下側は一つの所望の領域の異なる時間におけるフォトンカウンティングデータまたは統計値を曲線で表示している。図７は一つの所望の領域の異なる時間におけるフォトンカウンティングデータまたは統計値を輝度値で表示している。または、複数の所望個所における統計値または相関パラメータ（例えば分子数）を輝度値で表示している。図８は一つの所望の領域の異なる時間におけるフォトンカウンティングデータまたは統計値を表で表示している。または、複数の所望個所における統計値または相関パラメータ（例えば分子数）を表で表示している。図９は一つの所望の領域の異なる時間におけるフォトンカウンティングデータまたは統計値を輝度値で表示するとともに、そのピンポイント値をさらにデータとして表示する。または、複数の所望個所における統計値または相関パラメータ（例えば分子数）を表で表示するとともに、そのピンポイント値をさらにデータとして表示する。【００３８】
本実施形態では、所定の時間間隔をおいて取得した複数枚の蛍光画像から同一領域における蛍光強度のデータを抽出して、相関演算やフィッティングなどにより分子数や拡散時間などを解析評価したり、フォトンカウンティングヒストグラム解析法を適用させたりすることにより、試料Ｓ内外で生じる反応、相互作用、試料Ｓ内のシグナル伝達などの時間経過による変化を観察することが可能である。また、解析の諸結果を、グラフや輝度値や表やピンポイント表示として表示することにより、試料の物理的性質を多方面から観察や評価することが可能である。【００３９】
ここでは、複数枚の蛍光画像のデータから解析する例を述べたが、一枚の蛍光画像のデータから解析してもよい。【００４０】
＜第二実施形態＞
異なる所望の領域の抽出データによるＦＣＳ／ＦＣＣＳ
本実施形態は、試料における複数枚の蛍光画像のデータから異なる空間位置におけるデータを抽出して解析する手法である。【００４１】
本実施形態による光信号解析システムは基本的に第一実施形態と同じ構成である。相違部分は、本実施形態では、同一の所望の領域のデータのみを複数枚の蛍光画像から抽出するのではなく、指定された異なる複数個の所望の領域のデータをそれぞれ抽出して相関解析を行う点である。【００４２】
つまり、本実施形態において、複数枚の蛍光画像を取得して記憶する手順までは第一実施形態と同じである。【００４３】
しかし、本実施形態では、記憶されたデータの解析は異なる所望の領域間におけるフォトンカウンティングヒストグラム解析法および相関解析法の適応が主な手法となる。【００４４】
以下、本実施形態における光信号解析について図１０のフローチャートに沿って説明する。【００４５】
［ステップＳ２０１］  
取得しようとする蛍光画像の枚数を指定する。【００４６】
蛍光画像の取得時間間隔（所定の時間間隔）を設定する。【００４７】
［ステップＳ２０２］  
試料において所定の時間間隔を有する蛍光画像を取得する。【００４８】
［ステップＳ２０３］  
取得した複数枚の蛍光画像を画像入力部１６２に入力する。【００４９】
［ステップＳ２０４］  
入力した蛍光画像のデータを記憶部１６４に記憶する。【００５０】
［ステップＳ２０５］  
相関解析しようとする複数個の試料内の所望の領域（一つの画素からなる画素領域または隣接する複数の画素からなる画素領域）を指定する。【００５１】
［ステップＳ２０６］  
所望の領域が一つの画素からなる画素領域であるか否かを判断し、Ｙｅｓの場合はステップＳ２０７に進み、Ｎｏの場合はステップＳ２０８に進む。【００５２】
［ステップＳ２０６→Ｓ２０７→Ｓ２０９→Ｓ２１０］  
所望の領域が一つの画素からなる画素領域である場合、ステップＳ２０７において、指定された複数個の所望の領域におけるデータを、記憶された複数枚の蛍光画像のデータから蛍光画像ごとに抽出する。【００５３】
ステップＳ２０９において、同一の所望の領域間の抽出データまたは異なる所望の領域間の抽出データにおいて、相関演算やフィッティングなどにより、分子数や拡散時間などを解析評価する。【００５４】
また、ステップＳ２１０において、同一の所望の領域間の抽出データまたは異なる所望の領域間の抽出データにおいて、フォトンカウンティングヒストグラム分析法を適用させる。【００５５】
［ステップＳ２０６→Ｓ２０８→Ｓ２０９→Ｓ２１０］  
複数個の所望の領域が一つの画素からなる画素領域でない場合、すなわち、複数個の所望の領域が隣接する複数の画素からなる画素領域の場合、ステップＳ２０８において、記憶された複数枚の蛍光画像のデータから、複数個の画素領域における蛍光強度のデータの統計値、例えば、積算値、平均値、最大値、最小値、ある画素に対する相対差、絶対差の統計値を蛍光画像ごとに算出する。【００５６】
また、この複数枚の再構成結果において、指定された複数個の同一の所望の領域（画素領域）におけるデータをそれぞれ抽出する。【００５７】
複数枚のデータ再構成結果を用いて、ステップＳ２０９において、同一の所望の領域または異なる所望の領域間の抽出データにおいて、相関演算やフィッティングなどにより、分子数や拡散時間などを解析評価する。【００５８】
同一の所望の領域においては前述の（１）式を用い、異なる所望の領域においては、次の（２）式を用いて相関解析を行う。
【数２】
2008087869.tif 000004
【００５９】
ここで、Ｄ１は所望の領域Ｐ１におけるデータ、Ｄ２は所望の領域Ｐ２におけるデータ、Ｎ１２はＤ１とＤ２のうちの少ない方のデータ数である。【００６０】
複数枚のデータ再構成結果を用いて、ステップＳ２１０において、同一の所望の領域または異なる所望の領域間の抽出データにおいて、フォトンカウンティングヒストグラム分析法を適用させる。【００６１】
［ステップＳ２１１］  
各ステップで算出した結果を、例えば、図５に示すように、グラフとして、または、図６に示すように、輝度値で表現した画像として、または、図７に示すように、表として、または、図８に示すように、ピンポイント表示方式の数値として、表示部１６８に表示する。このましくは、算出結果を、輝度と表とグラフと数値の一つ以上の表示の仕方で表示部１６８に表示するとよい。【００６２】
本実施形態では、所定の時間間隔をおいて取得した複数枚の蛍光画像から同一領域における蛍光強度のデータを抽出して、相関演算やフィッティングなどにより分子数や拡散時間などを解析評価したり、フォトンカウンティングヒストグラム解析法を適用させたりすることにより、試料Ｓ内外で生じる反応、相互作用、試料Ｓ内のシグナル伝達などの時間経過による変化を観察することが可能である。また、解析の諸結果を、グラフや輝度値や表やピンポイント表示として表示することにより、試料の物理的性質を多方面から観察や評価することが可能である。【００６３】
ここでは、複数枚の蛍光画像のデータから解析する例を述べたが、一枚の蛍光画像のデータから解析してもよい。【００６４】
これまで、図面を参照しながら本発明の実施形態を述べたが、本発明は、これらの実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。【００６５】
上述した実施形態では、蛍光画像は、励起光の照射に対して前記試料から発せられた蛍光強度の分布によって構成されたものであるが、蛍光画像は、レーザ走査型顕微鏡によって得られたものであってもよい。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明によれば、時間経過による変化を観察可能な蛍光信号解析装置および蛍光信号解析方法が提供される。
【図１】
2008087869.tif 000005
【図２】
2008087869.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図７】
2008087869.tif 000013
【図９】
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【国際調査報告】
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