(57)【要約】  本発明は、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患に対する診断用試薬、及び新たな作用機序を有する、このような疾患に対する医薬等の開発に有用な手段を提供する。  より詳細には、本発明は、血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーとして使用し得る、新規ポリペプチド及びその特異的な部分ペプチド、並びに新規ポリヌクレオチド及びその特異的な部分ヌクレオチド；このようなポリヌクレオチド及びその特異的な部分ペプチドの発現ベクター；このような発現ベクターが導入された形質転換体；このようなバイオマーカーに対するアンチセンス分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、抗体、及びそれらを含む組成物；このようなバイオマーカーの発現又は機能が調節された、哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物；このようなバイオマーカーの測定用手段（例、プライマーセット、核酸プローブ、抗体、アプタマー）、及びそれらを含む試薬などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下１）〜１２）のいずれかのポリペプチド又はその特異的な部分ペプチド：
１）配列番号１０で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
２）配列番号３０若しくは配列番号３７で表されるアミノ酸配列又は配列番号３０で表されるアミノ酸配列において２４〜５４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、あるいはそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
３）配列番号５７で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
４）配列番号７３で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
５）配列番号８８で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
６）配列番号１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
７）配列番号１２０で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
８）配列番号１４３若しくは配列番号１５３で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
９）配列番号１７３若しくは配列番号１８０で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
１０）配列番号２０１で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
１１）配列番号２２６若しくは配列番号２３３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２２６で表されるアミノ酸配列において２５〜８５３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくは配列番号２３３で表されるアミノ酸配列において２５〜２１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、あるいはそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；あるいは
１２）配列番号２５１、配列番号２６６若しくは配列番号２７２で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
該ポリペプチドが以下１）〜１２）のいずれかのポリペプチドである、請求項１記載のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチド：
１）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列番号３０若しくは配列番号３７で表されるアミノ酸配列又は配列番号３０で表されるアミノ酸配列において２４〜５４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）配列番号８８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
６）配列番号１０４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
７）配列番号１２０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
８）配列番号１４３若しくは配列番号１５３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
９）配列番号１７３若しくは配列番号１８０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
１０）配列番号２０１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
１１）配列番号２２６若しくは配列番号２３３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２２６で表されるアミノ酸配列において２５〜８５３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくは配列番号２３３で表されるアミノ酸配列において２５〜２１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
１２）配列番号２５１、配列番号２６６若しくは配列番号２７２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項３】
異種アミノ酸配列からなるポリペプチドと融合している、請求項１又は２記載のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチド。
【請求項４】
以下１）〜１２）のいずれかの部分ペプチドである、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるポリペプチドに特異的な部分ペプチド：
１）配列番号１２若しくは配列番号１４で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいは配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む部分ペプチド；
２）配列番号３２若しくは配列番号３４で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいは配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む部分ペプチド；
３）配列番号５９で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
４）配列番号２９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
５）配列番号９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
６）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
７）配列番号１２４、配列番号１２５若しくは配列番号１２７で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
８）配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５５、配列番号１５７若しくは配列番号１５９で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
９）配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１８２若しくは配列番号１８４で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
１０）配列番号２０４若しくは配列番号２０６で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
１１）配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３５若しくは配列番号２３７で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；あるいは
１２）配列番号２５３、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６８、配列番号２７５、配列番号２７６若しくは配列番号２７８で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項１〜４のいずれか１項記載の特異的な部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下１）〜１２）のいずれかのポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチド：
１）配列番号８で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
２）配列番号２８若しくは配列番号３５で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、又は配列番号２８で表される核酸配列において３５７〜１９１９番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
３）配列番号５５で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
４）配列番号７１で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
５）配列番号８６で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
６）配列番号１０２で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
７）配列番号１１８で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
８）配列番号１４１若しくは配列番号１５１、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
９）配列番号１７１若しくは配列番号１７８で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
１０）配列番号１９９で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
１１）配列番号２２４若しくは配列番号２３１で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、又は配列番号２２４で表される核酸配列において１１８〜２６０４番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列若しくは配列番号２３１で表される核酸配列において１１８〜６９３番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；あるいは
１２）配列番号２４９、配列番号２６４若しくは配列番号２７０で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項７】
該１）〜１２）のいずれかのポリヌクレオチドが以下１）〜１２）のいずれかのポリヌクレオチドである、請求項６記載のポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチド：
１）配列番号８で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
２）配列番号２８若しくは配列番号３５で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、又は配列番号２８で表される核酸配列において３５７〜１９１９番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列からなるポリヌクレオチド；
３）配列番号５５で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
４）配列番号７１で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
５）配列番号８６で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
６）配列番号１０２で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
７）配列番号１１８で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
８）配列番号１４１若しくは配列番号１５１、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
９）配列番号１７１若しくは配列番号１７８で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
１０）配列番号１９９で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
１１）配列番号２２４若しくは配列番号２３１で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、又は配列番号２２４で表される核酸配列において１１８〜２６０４番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列若しくは配列番号２３１で表される核酸配列において１１８〜６９３番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列からなるポリヌクレオチド；あるいは
１２）配列番号２４９、配列番号２６４若しくは配列番号２７０で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下１）〜１２）のいずれかの部分ヌクレオチドである、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるポリヌクレオチドに特異的な部分ヌクレオチド：
１）配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３若しくは配列番号２７で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
２）配列番号３１、配列番号３３、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５３若しくは配列番号５４で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
３）配列番号５８、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６若しくは配列番号７０で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
４）配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８１若しくは配列番号８５で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
５）配列番号８９、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７若しくは配列番号１０１で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
６）配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１１０、配列番号１１３若しくは配列番号１１７で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
７）配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１３０、配列番号１３４若しくは配列番号１４０で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
８）配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６若しくは配列番号１７０で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
９）配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９０、配列番号１９３、配列番号１９７若しくは配列番号１９８で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
１０）配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１２、配列番号２１５、配列番号２１８、配列番号２２２若しくは配列番号２２３で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
１１）配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２４０、配列番号２４３、配列番号２４７若しくは配列番号２４８で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；あるいは
１２）配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７７、配列番号２８１、配列番号２８４、配列番号２８８若しくは配列番号２８９で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド。
【請求項９】
請求項５〜７のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、又は請求項６〜８のいずれか１項記載の特異的な部分ヌクレオチド、及びそれに機能可能に連結されたプロモーターを含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド、又は請求項１〜４のいずれか１項記載の特異的な部分ペプチドの発現ベクター。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項１１】
請求項７又は８記載の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列を含み、かつ血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチドの発現を抑制し得る、アンチセンス分子。
【請求項１２】
請求項７又は８記載の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列からなるセンス鎖、及びそれに相補的な核酸配列からなるアンチセンス鎖から構成され、かつセンス鎖及びアンチセンス鎖の一方又は双方の５’末端及び／又は３’末端においてオーバーハングを有していてもよい、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチドの発現を抑制し得る、ＲＮＡｉ誘導性核酸。
【請求項１３】
ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１２記載のＲＮＡｉ誘導性核酸。
【請求項１４】
請求項２〜４のいずれか１項記載の特異的な部分ペプチドに対応する領域を介して、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチドに結合し得る、アプタマー。
【請求項１５】
請求項２〜４のいずれか１項記載の特異的な部分ペプチドに対応する領域を介して、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチドに結合し得る、抗体。
【請求項１６】
抗体が以下ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかである、請求項１５記載の抗体：
ｉ）ポリクローナル抗体；
ｉｉ）モノクローナル抗体又はその一部；
ｉｉｉ）キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体。
【請求項１７】
請求項１５又は１６記載の抗体を産生する、細胞。
【請求項１８】
細胞がハイブリドーマである、請求項１７記載の細胞。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチド、請求項１１記載のアンチセンス分子、請求項１２又は１３記載のＲＮＡｉ誘導性核酸、請求項１４記載のアプタマー、請求項１５又は１６記載の抗体、あるいはそれらの発現ベクター、及び医薬として許容され得る担体を含む、組成物。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項記載のポリペプチドの発現又は機能が調節された、哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物。
【請求項２１】
以下（ａ）又は（ｂ）を含む、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチドに特異的なプライマーセット：
（ａ）請求項７記載のポリヌクレオチド、あるいは請求項７又は８記載の特異的な部分ヌクレオチドの第１の核酸配列に対応するセンスプライマー；及び
（ｂ）請求項７記載のポリヌクレオチド、あるいは請求項７又は８記載の特異的な部分ヌクレオチドの第２の核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマー。
【請求項２２】
以下（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチドに特異的な核酸プローブ：
（ａ）請求項７又は８記載の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド；又は
（ｂ）請求項７又は８記載の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列を含むセンス鎖、及びそれに相補的な核酸配列を含むアンチセンス鎖から構成される二本鎖ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１４記載のアプタマー、請求項１５又は１６記載の抗体、請求項２１記載のプライマーセット及び請求項２２記載の核酸プローブから選ばれる１以上の物質又はセットを含む、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出又は定量用試薬又はキット。
【請求項２４】
血球系又は破骨細胞の同定、又はそれらの分化の判定用試薬又はキットである、請求項２３記載の試薬又はキット。
【請求項２５】
哺乳動物から得られた生体試料、あるいは細胞又は組織培養物において、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を測定することを含み、かつ該生体試料又は該培養物が血球系又は破骨細胞あるいは造血組織、リンパ組織又は滑膜組織を含む、該ポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出又は定量方法。
【請求項２６】
哺乳動物から得られた生体試料、あるいは細胞又は組織培養物において、請求項２又は３記載のポリペプチドあるいは請求項７記載のポリヌクレオチドの発現を測定することを含む、該ポリペプチド又は該ポリヌクレオチドの検出又は定量方法。
【請求項２７】
該生体試料又は該培養物が血球系又は破骨細胞あるいは造血組織、リンパ組織又は滑膜組織を含む、請求項２６記載の検出又は定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血球系（blood cells）に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーとして使用され得る、ポリペプチド及びその部分ペプチド、並びにポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチド；発現ベクター；形質転換体；アンチセンス分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、抗体、及びそれらを含む組成物；哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物；血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーの測定用手段（例、プライマーセット、核酸プローブ、抗体、アプタマー）及び測定方法などを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム研究の進展により、ヒトの染色体配列の解析は大幅に進んだが、それによりヒト遺伝子機能の全てが明らかになったわけではない。ヒトでは、遺伝子の多様性がその遺伝子の機能の変化に大きく関連している。実際、ヒトでは、染色体の特定領域から複数のｍＲＮＡが転写され、異なるバリアントを生じることが知られている。【０００３】
血球系に特異的又は破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーとして使用され得る、本発明者らにより今回見出された一連の遺伝子（必要に応じて「血球系・破骨細胞特異的遺伝子」と省略）については、既知バリアントが報告されている。例えば、このような既知バリアントとして、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１（Genbankアクセッション番号：NM_012252.1；非特許文献１、２）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子２（Genbankアクセッション番号：NM_001637.1；非特許文献３、４）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子３（Genbankアクセッション番号：NM_002314.2；非特許文献５、６）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子４（Genbankアクセッション番号：NM_002830.2；非特許文献７、８）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子５（Genbankアクセッション番号：NM_006153.3；非特許文献９、１０）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子６（Genbankアクセッション番号：NM_000480.1；非特許文献１１、１２）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子７（Genbankアクセッション番号：NM_024850.1；非特許文献１３、１４）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子８（Genbankアクセッション番号：NM_015864.2；非特許文献１５、１６）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子９（Genbankアクセッション番号：NM_139241.1；非特許文献１７、１８）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１０（Genbankアクセッション番号：NM_178833.3；非特許文献１９）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１１（Genbankアクセッション番号：NM_005807.1；非特許文献２０、２１）、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１２（Genbankアクセッション番号：NM_031443.2；非特許文献２２、２３）の既知バリアントが報告されている。【０００４】
しかしながら、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２が血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーとして有用であり得ること、並びに血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２について、本発明者らにより見出された特定のバリアントが存在することは知られていない。
【非特許文献１】Zhao, G.Q. et al., Mol. Cell. Biol. 13 (8), 4505-4512 (1993)
【非特許文献２】Yasumoto, K. et al., Biochim. Biophys. Acta 1353 (1), 23-31 (1997)
【非特許文献３】McDermott, C.M. et al., Infect. Immun. 59 (2), 478-485 (1991)
【非特許文献４】Hagen, F.S. et al., Biochemistry 30 (34), 8415-8423 (1991)
【非特許文献５】Mizuno, K. et al., Oncogene 9 (6), 1605-1612 (1994)
【非特許文献６】Okano, I. et al., J. Biol. Chem. 270 (52), 31321-31330 (1995)
【非特許文献７】Gu, M.X. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88 (13), 5867-5871 (1991)
【非特許文献８】Gu, M. et al., J. Biol. Chem. 271 (44), 27751-27759 (1996)
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【非特許文献１０】Rivero-Lezcano, O.M. et al., J. Biol. Chem. 269 (26), 17363-17366 (1994)
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【非特許文献１６】Morrish, D.W. et al., J. Reprod. Immunol. 39 (1-2), 179-195 (1998)
【非特許文献１７】Obaishi, H. et al., J. Biol. Chem. 273 (30), 18697-18700 (1998)
【非特許文献１８】Ikeda, W. et al., Oncogene 20 (27), 3457-3463 (2001)
【非特許文献１９】Strausberg, R.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26), 16899-16903 (2002)
【非特許文献２０】Marcelino, J. et al., Nat. Genet. 23 (3), 319-322 (1999)
【非特許文献２１】Ikegawa, S. et al., Cytogenet. Cell Genet. 90 (3-4), 291-297 (2000)
【非特許文献２２】Scherer, S.W. et al., Science 300 (5620), 767-772 (2003)
【非特許文献２３】Liquori, C.L. et al., Am. J. Hum. Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーの解析は、例えば、血球系又は破骨細胞の同定又は破骨細胞の分化状態の判定用試薬、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患に対する診断用試薬、及び新たな作用機序を有する、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患に対する医薬等の開発につながる。本発明は、所定の遺伝子の発現プロファイル解析により得られた知見に基づき、このような試薬及び医薬等を提供すること、並びにこのような試薬及び医薬等の開発に有用な手段を提供することなどを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーとして、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２を見出した。本発明者らはまた、血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーとして使用され得る、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２の新規バリアントを見出した。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２及び／又はその新規バリアントを利用することにより、血球系又は破骨細胞の同定、血球系又は破骨細胞の分化状態の判定、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患に対する診断等が可能になると考えられる。特に、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２及び／又はその新規バリアントは血球系又は破骨細胞の特定の分化段階で特異的に発現していることから、このような特定の分化段階にある血球系又は破骨細胞の判定精度を高めることができる。また、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２及び／又はその新規バリアントを利用することにより、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患等の所定の疾患に対する新規医薬等の開発も可能になると考えられる。
以上の知見に基づき、本発明者らは本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明は、以下の発明などに関する：
〔１〕以下１）〜１２）のいずれかのポリペプチド又はその特異的な部分ペプチド：
１）配列番号１０で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
２）配列番号３０若しくは配列番号３７で表されるアミノ酸配列又は配列番号３０で表されるアミノ酸配列において２４〜５４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、あるいはそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
３）配列番号５７で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
４）配列番号７３で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
５）配列番号８８で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
６）配列番号１０４で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
７）配列番号１２０で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
８）配列番号１４３若しくは配列番号１５３で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
９）配列番号１７３若しくは配列番号１８０で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
１０）配列番号２０１で表されるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
１１）配列番号２２６若しくは配列番号２３３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２２６で表されるアミノ酸配列において２５〜８５３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくは配列番号２３３で表されるアミノ酸配列において２５〜２１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、あるいはそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド；あるいは
１２）配列番号２５１、配列番号２６６若しくは配列番号２７２で表されるアミノ酸配列、又はそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
〔２〕該ポリペプチドが以下１）〜１２）のいずれかのポリペプチドである、上記〔１〕のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチド：
１）配列番号１０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
２）配列番号３０若しくは配列番号３７で表されるアミノ酸配列又は配列番号３０で表されるアミノ酸配列において２４〜５４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
３）配列番号５７で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
４）配列番号７３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
５）配列番号８８で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
６）配列番号１０４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
７）配列番号１２０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
８）配列番号１４３若しくは配列番号１５３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
９）配列番号１７３若しくは配列番号１８０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
１０）配列番号２０１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
１１）配列番号２２６若しくは配列番号２３３で表されるアミノ酸配列又は配列番号２２６で表されるアミノ酸配列において２５〜８５３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列若しくは配列番号２３３で表されるアミノ酸配列において２５〜２１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるポリペプチド；あるいは
１２）配列番号２５１、配列番号２６６若しくは配列番号２７２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
〔３〕異種アミノ酸配列からなるポリペプチドと融合している、上記〔１〕又は〔２〕のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチド。
〔４〕以下１）〜１２）のいずれかの部分ペプチドである、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるポリペプチドに特異的な部分ペプチド：
１）配列番号１２若しくは配列番号１４で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいは配列番号１６で表されるアミノ酸配列を含む部分ペプチド；
２）配列番号３２若しくは配列番号３４で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいは配列番号３９で表されるアミノ酸配列を含む部分ペプチド；
３）配列番号５９で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
４）配列番号２９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
５）配列番号９０で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
６）配列番号１０６で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
７）配列番号１２４、配列番号１２５若しくは配列番号１２７で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
８）配列番号１４５、配列番号１４７、配列番号１４９、配列番号１５５、配列番号１５７若しくは配列番号１５９で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
９）配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１８２若しくは配列番号１８４で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
１０）配列番号２０４若しくは配列番号２０６で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；
１１）配列番号２２８、配列番号２３０、配列番号２３５若しくは配列番号２３７で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド；あるいは
１２）配列番号２５３、配列番号２５６、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６１、配列番号２６３、配列番号２６８、配列番号２７５、配列番号２７６若しくは配列番号２７８で表されるアミノ酸配列、又はそれらの部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド。
〔５〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかのポリペプチド、又は上記〔１〕〜〔４〕のいずれかの特異的な部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔６〕以下１）〜１２）のいずれかのポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチド：
１）配列番号８で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
２）配列番号２８若しくは配列番号３５で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、又は配列番号２８で表される核酸配列において３５７〜１９１９番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
３）配列番号５５で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
４）配列番号７１で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
５）配列番号８６で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
６）配列番号１０２で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
７）配列番号１１８で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
８）配列番号１４１若しくは配列番号１５１、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
９）配列番号１７１若しくは配列番号１７８で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
１０）配列番号１９９で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；
１１）配列番号２２４若しくは配列番号２３１で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、又は配列番号２２４で表される核酸配列において１１８〜２６０４番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列若しくは配列番号２３１で表される核酸配列において１１８〜６９３番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド；あるいは
１２）配列番号２４９、配列番号２６４若しくは配列番号２７０で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド。
〔７〕該１）〜１２）のいずれかのポリヌクレオチドが以下１）〜１２）のいずれかのポリヌクレオチドである、上記〔６〕のポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチド：
１）配列番号８で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
２）配列番号２８若しくは配列番号３５で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、又は配列番号２８で表される核酸配列において３５７〜１９１９番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列からなるポリヌクレオチド；
３）配列番号５５で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
４）配列番号７１で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
５）配列番号８６で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
６）配列番号１０２で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
７）配列番号１１８で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
８）配列番号１４１若しくは配列番号１５１、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
９）配列番号１７１若しくは配列番号１７８で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
１０）配列番号１９９で表される核酸配列、又はそのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド；
１１）配列番号２２４若しくは配列番号２３１で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列、又は配列番号２２４で表される核酸配列において１１８〜２６０４番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列若しくは配列番号２３１で表される核酸配列において１１８〜６９３番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列からなるポリヌクレオチド；あるいは
１２）配列番号２４９、配列番号２６４若しくは配列番号２７０で表される核酸配列、又はそれらのＯＲＦ対応核酸配列からなるポリヌクレオチド。
〔８〕以下１）〜１２）のいずれかの部分ヌクレオチドである、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるポリヌクレオチドに特異的な部分ヌクレオチド：
１）配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３若しくは配列番号２７で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
２）配列番号３１、配列番号３３、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４３、配列番号４６、配列番号４９、配列番号５３若しくは配列番号５４で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
３）配列番号５８、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６６若しくは配列番号７０で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
４）配列番号７４、配列番号７５、配列番号７８、配列番号８１若しくは配列番号８５で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
５）配列番号８９、配列番号９１、配列番号９４、配列番号９７若しくは配列番号１０１で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
６）配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１１０、配列番号１１３若しくは配列番号１１７で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
７）配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２６、配列番号１３０、配列番号１３４若しくは配列番号１４０で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
８）配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４８、配列番号１５０、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６６若しくは配列番号１７０で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
９）配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９０、配列番号１９３、配列番号１９７若しくは配列番号１９８で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
１０）配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０５、配列番号２０９、配列番号２１２、配列番号２１５、配列番号２１８、配列番号２２２若しくは配列番号２２３で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；
１１）配列番号２２７、配列番号２２９、配列番号２３４、配列番号２３６、配列番号２４０、配列番号２４３、配列番号２４７若しくは配列番号２４８で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド；あるいは
１２）配列番号２５２、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２６０、配列番号２６２、配列番号２６７、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７４、配列番号２７７、配列番号２８１、配列番号２８４、配列番号２８８若しくは配列番号２８９で表される核酸配列、又はそれらの部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド。
〔９〕上記〔５〕〜〔７〕のいずれかのポリヌクレオチド、又は上記〔６〕〜〔８〕のいずれかの特異的な部分ヌクレオチド、及びそれに機能可能に連結されたプロモーターを含む、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかのポリペプチド、又は上記〔１〕〜〔４〕のいずれかの特異的な部分ペプチドの発現ベクター。
〔１０〕上記〔９〕の発現ベクターが導入された形質転換体。
〔１１〕上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列を含み、かつ血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチドの発現を抑制し得る、アンチセンス分子。
〔１２〕上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列からなるセンス鎖、及びそれに相補的な核酸配列からなるアンチセンス鎖から構成され、かつセンス鎖及びアンチセンス鎖の一方又は双方の５’末端及び／又は３’末端においてオーバーハングを有していてもよい、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチドの発現を抑制し得る、ＲＮＡｉ誘導性核酸。
〔１３〕ＲＮＡｉ誘導性核酸がｓｉＲＮＡである、上記〔１２〕のＲＮＡｉ誘導性核酸。
〔１４〕上記〔２〕〜〔４〕のいずれかの特異的な部分ペプチドに対応する領域を介して、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチドに結合し得る、アプタマー。
〔１５〕上記〔２〕〜〔４〕のいずれかの特異的な部分ペプチドに対応する領域を介して、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチドに結合し得る、抗体。
〔１６〕抗体が以下ｉ）〜ｉｉｉ）のいずれかである、上記〔１５〕の抗体：
ｉ）ポリクローナル抗体；
ｉｉ）モノクローナル抗体又はその一部；
ｉｉｉ）キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体。
〔１７〕上記〔１５〕又は〔１６〕の抗体を産生する、細胞。
〔１８〕細胞がハイブリドーマである、上記〔１７〕の細胞。
〔１９〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかのポリペプチド、上記〔１１〕のアンチセンス分子、上記〔１２〕又は〔１３〕のＲＮＡｉ誘導性核酸、上記〔１４〕のアプタマー、上記〔１５〕又は〔１６〕の抗体、あるいはそれらの発現ベクター、及び医薬として許容され得る担体を含む、組成物。
〔２０〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかのポリペプチドの発現又は機能が調節された、哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物。
〔２１〕以下（ａ）又は（ｂ）を含む、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチドに特異的なプライマーセット：
（ａ）上記〔７〕のポリヌクレオチド、あるいは上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの第１の核酸配列に対応するセンスプライマー；及び
（ｂ）上記〔７〕のポリヌクレオチド、あるいは上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの第２の核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマー。
〔２２〕以下（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリヌクレオチド又はその特異的な部分ヌクレオチドに特異的な核酸プローブ：
（ａ）上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列を含む一本鎖ポリヌクレオチド；又は
（ｂ）上記〔７〕又は〔８〕の特異的な部分ヌクレオチドの核酸配列を含むセンス鎖、及びそれに相補的な核酸配列を含むアンチセンス鎖から構成される二本鎖ポリヌクレオチド。
〔２３〕上記〔１４〕のアプタマー、上記〔１５〕又は〔１６〕の抗体、上記〔２１〕のプライマーセット及び上記〔２２〕の核酸プローブから選ばれる１以上の物質又はセットを含む、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出又は定量用試薬又はキット。
〔２４〕血球系又は破骨細胞の同定、又はそれらの分化の判定用試薬又はキットである、上記〔２３〕の試薬又はキット。
〔２５〕哺乳動物から得られた生体試料、あるいは細胞又は組織培養物において、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を測定することを含み、かつ該生体試料又は該培養物が血球系又は破骨細胞あるいは造血組織、リンパ組織又は滑膜組織を含む、該ポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出又は定量方法。
〔２６〕哺乳動物から得られた生体試料、あるいは細胞又は組織培養物において、上記〔２〕又は〔３〕のポリペプチドあるいは上記〔７〕のポリヌクレオチドの発現を測定することを含む、該ポリペプチド又は該ポリヌクレオチドの検出又は定量方法。
〔２７〕該生体試料又は該培養物が血球系又は破骨細胞あるいは造血組織、リンパ組織又は滑膜組織を含む、上記〔２６〕の検出又は定量方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のポリペプチド及び本発明の部分ペプチドは、例えば、血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーとして、並びに本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドを特異的に認識し得る物質、あるいは本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方を包括的に認識し得る物質、及び本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドの機能を特異的に調節し得る物質、あるいは本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の機能を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。
本発明のポリヌクレオチド及び本発明の部分ヌクレオチドは、例えば、血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なバイオマーカーとして、並びに本発明のポリヌクレオチド又は既知ポリヌクレオチドを特異的に認識し得る物質、あるいは本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方を包括的に認識し得る物質、及び本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドの発現を特異的に調節し得る物質、あるいは本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。
本発明の関連物質（例、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉ誘導性核酸、アプタマー及び抗体、並びにそれらの発現ベクター）は、例えば、医薬又は試薬として有用であり得る。
本発明の細胞は、例えば、本発明のポリペプチド及び本発明の部分ペプチド、並びに本発明の抗体の産生に有用であり得る。本発明の細胞はまた、医薬（例、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患の予防又は治療薬）の開発、血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なさらなるマーカー遺伝子の同定、及び血球系又は破骨細胞の分化に関連する機構の解析に有用であり得る。
本発明の動物は、例えば、医薬の開発、血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なさらなるマーカー遺伝子の同定、及び破骨細胞の分化に関連する機構の解析に有用であり得る。
本発明の測定用手段（例、プライマーセット、核酸プローブ、抗体、アプタマー）及び測定方法は、例えば、本発明のポリヌクレオチド若しくは既知ポリヌクレオチド、又は本発明のポリペプチド若しくは既知ポリペプチドの特異的な検出及び定量、あるいは本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の包括的な検出及び定量に有用であり得る。このような手段及び方法はまた、血球系又は破骨細胞の同定、破骨細胞の分化状態の判定、並びに医薬、試薬又は食品のスクリーニングに利用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１．血球系・破骨細胞特異的遺伝子
本発明の遺伝子は、任意の哺乳動物に由来する遺伝子であり得る。哺乳動物としては、例えば、霊長類及びげっ歯類、並びに実験用動物、家畜、使役動物、ペット等が挙げられる。詳細には、哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコなどが挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。【００１０】
本発明の遺伝子は、造血・リンパ組織又は滑膜組織で特異的に発現し得るか、又は特異的に発現し得ない。本発明の遺伝子はまた、既知ポリヌクレオチド及び／又は既知ポリペプチドに比し、造血・リンパ組織又は滑膜組織で高発現又は低発現し得る。このような造血・リンパ組織としては、例えば、骨髄、胸腺、脾臓などが挙げられる。【００１１】
本発明の遺伝子は、血球系又は破骨細胞で特異的に発現し得るか、又は特異的に発現し得ない。本発明の遺伝子はまた、既知ポリヌクレオチド及び／又は既知ポリペプチドに比し、血球系又は破骨細胞で高発現又は低発現し得る。このような血球系としては、例えば、マクロファージ、リンパ球（例、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、単球、顆粒球などが挙げられる。【００１２】
以下、本発明により提供される、ポリペプチド及びその部分ペプチド、並びにポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチドについて説明する。【００１３】
１．１．ポリペプチド及びその部分ペプチド
本発明は、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列（必要に応じて「配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等」と省略）を有するポリペプチドを提供する。【００１４】
「配列番号Ｘ」は、本明細書中に開示される任意のアミノ酸配列の配列番号を示す。また、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等を「有する（having）」ポリペプチドとは、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等「からなる（consisting of）」ポリペプチド、及び当該アミノ酸配列等を「含む（comprising）」ポリペプチドを意味する。【００１５】
一実施形態では、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と所定のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列同一性の程度は、約９０％以上、好ましくは約９２％以上、より好ましくは約９５％以上、さらにより好ましくは約９６％以上、最も好ましくは約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上であり得る。アミノ酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。特に断らない場合、アミノ酸配列同一性（％）は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより算出される。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。また、アミノ酸配列同一性（％）は、上記によらずに、当該分野で慣用のプログラム（例えば、BLAST、FASTA等）を初期設定で用いて決定することもできる。別の局面では、同一性（％）は、当該分野で公知の任意のアルゴリズム、例えば、Needlemanら(1970) (J. Mol. Biol. 48: 444-453)、Myers及びMiller (CABIOS, 1988, 4: 11-17)のアルゴリズム等を使用して決定することができる。Needlemanらのアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれており、同一性（％）は、例えば、BLOSUM 62 matrix又はPAM250 matrix、並びにgap weight: 16、14、12、10、8、6若しくは4、及びlength weight: 1、2、3、4、5若しくは6のいずれかを使用することによって決定することができる。また、Myers及びMillerのアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラムに組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する場合、例えば、PAM120 weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4を用いることができる。アミノ酸配列同一性の算出については、上記の方法のなかで最も低い値を示す方法を採用してもよい。【００１６】
別の実施形態では、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が置換、付加、欠失及び挿入から選ばれる１以上の修飾を施されたアミノ酸配列であり得る。修飾されるアミノ酸の数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１〜約５０個、好ましくは１〜約３０個、より好ましくは１〜約２０個、さらにより好ましくは１〜約１０個、最も好ましくは１〜約５個（例、１個又は２個）であり得る。【００１７】
配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、その特徴的な部分（例、後述の特異的な部分ポリペプチドに対応する部分）を完全に保持し、かつそれ以外の部分（例、既知ポリペプチド中に存在する部分）が、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列の対応部分と実質的に同一であってもよい。あるいは、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、非特徴的な部分が配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列の対応部分と同一であり、かつ特徴的な部分が、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列の対応部分と実質的に同一であってもよい。【００１８】
本発明のポリペプチドは、既知ポリペプチド（例、既知バリアント）と同種又は異種の機能を有し得る。本発明のポリペプチドはまた、既知ポリペプチド（例、既知バリアント）に比し、増強又は低下した機能を有し得る。【００１９】
詳細には、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２の新規ポリペプチドは、以下の通りである。【００２０】
１）血球系・破骨細胞特異的遺伝子１
D-SYNOV4003692.1（配列番号１０）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子１の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒト転写因子ＥＣ（ＴＦＥＣ）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１０４４個；タンパク質中のアミノ酸の総数３４７個；GenBankアクセッション番号：NM_012252.1参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子１の既知バリアントは、所定の機能（例、転写調節能）を有することが報告されている（例、Zhao, G.Q. et al., Mol. Cell. Biol. 13 (8), 4505-4512 (1993); Chung, M.C. et al., Biochemistry 40 (30), 8887-8897 (2001) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００２１】
２）血球系・破骨細胞特異的遺伝子２
D-D3OST2001534.1（配列番号３０）
D-NETRP1000046.1（配列番号３７）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子２の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトアシルオキシアシルヒドロラーゼ（ＡＯＡＨ）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１７２８個；タンパク質中のアミノ酸の総数５７５個；GenBankアクセッション番号：NM_001637.1参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子２の既知バリアントは、所定の機能（例、アシルオキシアシルヒドロラーゼ活性）を有することが報告されている（例、Hagen, F.S. et al., Biochemistry 30 (34), 8415-8423 (1991) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子２の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
なお、配列番号３０で表されるアミノ酸配列における１〜２３番目のアミノ酸残基からなる領域は、シグナル配列予測ツールであるSignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）及びPSORT II（http://psort.nibb.ac.jp/）により、シグナル領域と予測される。また、血球系・破骨細胞特異的遺伝子２の既知バリアントであるNM_001637.1でも、同一領域がシグナル配列に対応することが公知の情報としてデータベースに記載されている他、シグナル配列予測ツールであるSignalP及びPSORT IIでも同一の領域にシグナル配列が予測される。従って、本発明はまた、このようなシグナル領域が除去されたポリペプチド（即ち、配列番号３０で表されるアミノ酸配列において２４〜５４３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又はそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を提供する。【００２２】
３）血球系・破骨細胞特異的遺伝子３
D-PLACE7010497.1（配列番号５７）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子３の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトＬＩＭドメインキナーゼ１（ＬＩＭＫ１）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１９４４個；タンパク質中のアミノ酸の総数６４７個；GenBankアクセッション番号：NM_002314.2参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子３の既知バリアントは、所定の機能（例、キナーゼ活性）を有することが報告されている（例、Okano,I. et al., J. Biol. Chem. 270 (52), 31321-31330 (1995); Mizuno, K. et al., Oncogene 9 (6), 1605-1612 (1994) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子３の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００２３】
４）血球系・破骨細胞特異的遺伝子４
D-SPLEN2030304.1（配列番号７３）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子４の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトタンパク質チロシンホスファターゼ，非レセプター型４（ＰＴＰＮ４)；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：２７８１個；タンパク質中のアミノ酸の総数９２６個；GenBankアクセッション番号：NM_002830.2参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子４の既知バリアントは、所定の機能（例、チロシンホスファターゼ活性）を有することが報告されている（例、Gu, M. et al., J. Biol. Chem. 271 (44), 27751-27759 (1996) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子４の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００２４】
５）血球系・破骨細胞特異的遺伝子５
D-SYNOV4000324.1（配列番号８８）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子５の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトＮＣＫアダプタータンパク質１（ＮＣＫ１）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１１３４個；タンパク質中のアミノ酸の総数３７７個；GenBankアクセッション番号：NM_006153.3参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子５の既知バリアントは、所定の機能（例、Ｆａｓリガンド又はネフリンとの相互作用能）を有することが報告されている（例、Lettau,M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (15), 5911-5916 (2006); Jones,N. et al., Nature 440 (7085), 818-823 (2006) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子５の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００２５】
６）血球系・破骨細胞特異的遺伝子６
D-SYNOV4007243.1（配列番号１０４）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子６の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトアデノシンモノホスフェートデアミナーゼ（isoform E）（ＡＭＰＤ３）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：２３３１個；タンパク質中のアミノ酸の総数７７６個；GenBankアクセッション番号：NM_000480.1参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子６の既知バリアントは、所定の機能（例、アデノシンモノホスフェートデアミナーゼ活性）を有することが報告されている（例、Zydowo, M.M., Acta Biochim. Pol. 40 (4), 429-432 (1993); Yamada, Y. et al., Biochim. Biophys. Acta 1171 (1), 125-128 (1992) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子６の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００２６】
７）血球系・破骨細胞特異的遺伝子７
D-NETRP2004161.1（配列番号１２０）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子７の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトブチロフィリン様８（ＢＴＮＬ８），転写バリアント１；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１０４４個；タンパク質中のアミノ酸の総数３４７個；GenBankアクセッション番号：NM_024850.1参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子７の既知バリアントは、所定の機能（例、免疫系、原形質膜レセプター及び接着分子としての機能を含む、免疫グロブリン分子の機能）を有することが報告されている（例、Ogg, S. L. et al., Mammalian Genome 7: 900-905 (1996); Shibui, A. et al., J. Hum. Genet. 44: 249-252 (1999) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子７の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００２７】
８）血球系・破骨細胞特異的遺伝子８
D-NT2RI3001993.1（配列番号１４３）
D-SMINT2013276.1（配列番号１５３）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子８の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒト６番染色体オープンリーディングフレーム３２（Ｃ６ｏｒｆ３２）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１７７６個；タンパク質中のアミノ酸の総数５９１個；GenBankアクセッション番号：NM_015864.2参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子８の既知バリアントは、所定の機能（例、栄養芽細胞分化において、増殖性の細胞栄養芽層 (cytotrophoblast) から非有糸分裂多核シンシチウム(syncytium) の形成を刺激する機能）を有することが報告されている（例、Morrish, D.W. et al., Curr. Protein Pept. Sci. 2 (3), 245-259 (2001); Morrish, D.W. et al., J. Reprod. Immunol. 39 (1-2), 179-195 (1998); Dakour, J. et al., Gene 185 (2), 153-157 (1997) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子８の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００２８】
９）血球系・破骨細胞特異的遺伝子９
D-THYMU3006588.1（配列番号１７３）
D-D3OST2003177.1（配列番号１８０）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子９の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトＦＹＶＥ，ＲｈｏＧＥＦ及びＰＨドメイン含有４（ＦＧＤ４）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：２３０１個；タンパク質中のアミノ酸の総数７６６個；GenBankアクセッション番号：NM_139241.1参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子９の既知バリアントは、所定の機能（例、ＰＨ及びＤＨホモロジードメインを介する、Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅ  ｃｄｃ４２への特異的な結合能、及びイソプレニル化ｃｄｃ４２のＧＤＰ−ＧＴＰ交換の刺激能）を有することが報告されている（例、Zheng, Y. et al., J. Biol. Chem. 271: 33169-33172 (1996) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子９の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００２９】
１０）血球系・破骨細胞特異的遺伝子１０
D-D3OST2000831.1（配列番号２０１）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子１０の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトハイポセティカルタンパク質BC009732（LOC133308）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１６１４個；タンパク質中のアミノ酸の総数５３７個；GenBankアクセッション番号：NM_178833.3参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子１０の既知バリアントは、所定の機能（例、頂端 (apical) Ｎａ＋／Ｈ＋交換活性）を有することが報告されている（例、Klanke, C. A. et al., Genomics 25: 615-622 (1995) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１０の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００３０】
１１）血球系・破骨細胞特異的遺伝子１１
D-HCASM2001914.1（配列番号２２６）
D-SYNOV4003291.1（配列番号２３３）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子１１の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒトプロテオグリカン４（ＰＲＧ４）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：４２１５個；タンパク質中のアミノ酸の総数１４０４個；GenBankアクセッション番号：NM_005807.1参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子１１の既知バリアントは、所定の機能（例、骨髄単核細胞の造血細胞及び／又は内皮細胞への分化促進能、あるいは軟骨代謝における増殖促進能、細胞保護能又は潤滑能）を有することが報告されている（例、Liu, Y.J. et al., Blood 103 (12), 4449-4456 (2004); Flannery, C.R. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 254 (3), 535-541 (1999) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１１の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。
なお、配列番号２２６及び配列番号２３３で表されるアミノ酸配列における１〜２４番目のアミノ酸残基からなる領域は、シグナル配列予測ツールであるSignalP及びPSORT IIにより、シグナル領域と予測される。また、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１１の既知バリアントであるNM_005807.1でも、SignalP及びPSORT IIにより同一領域がシグナル配列と予測される。従って、本発明はまた、このようなシグナル領域が除去されたポリペプチド（即ち、配列番号２２６で表されるアミノ酸配列において２５〜８５３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、又は配列番号２３３で表されるアミノ酸配列において２５〜２１６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、あるいはそれらと実質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド）を提供する。【００３１】
１２）血球系・破骨細胞特異的遺伝子１２
D-NETRP2002051.1（配列番号２５１）
D-THYMU2031383.1（配列番号２６６）
D-THYMU3032318.1（配列番号２７２）
血球系・破骨細胞特異的遺伝子１２の既知バリアントとしては、例えば、実施例中に開示されるバリアント（ヒト脳海綿状形成異常（cerebral cavernous malformation）２（ＣＣＭ２）；ＯＲＦ核酸配列中のヌクレオチドの総数：１３３５個；タンパク質中のアミノ酸の総数４４４個；GenBankアクセッション番号：NM_031443.2参照）が報告されている。血球系・破骨細胞特異的遺伝子１２の既知バリアントは、所定の機能（例、ホスホチロシン結合ドメインに起因するホスホチロシン結合能）を有し得る（例、Liquori, C.L. et al., Am. J. Hum. Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003) 参照）。通常、単一のローカスから生じる複数のバリアント（スプライシングバリアント）はそれぞれ、その程度こそ異なり得るものの、同様の機能を有することが知られている。従って、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１２の新規バリアントもまた、これらの機能を有し得る。【００３２】
本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドを特異的に認識し得る物質、本発明のポリペプチドを特異的に認識し得ない物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方を包括的に認識し得る物質の開発、並びに本発明のポリペプチドの機能を特異的に調節し得る物質、本発明のポリペプチドの機能を特異的に調節し得ない物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の機能を包括的に認識し得る物質の開発に有用であり得る。【００３３】
本発明はまた、部分ペプチドを提供する。【００３４】
「部分ペプチド」は、所定の有用性（例、免疫原性又は抗原性ペプチド、特定のドメインを有する機能性ペプチドなどとしての用途）を有し得る、対象ポリペプチドから選ばれる少なくとも６個、好ましくは少なくとも８個、より好ましくは少なくとも１０個、さらにより好ましくは少なくとも１２個、最も好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基からなる。【００３５】
「本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列」とは、本発明のポリペプチド（例、新規バリアント）中に挿入されているが既知ポリペプチド（例、既知バリアント）中で欠失しているアミノ酸配列をいう。一方、「既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列」とは、既知ポリペプチド（例、既知バリアント）中に挿入されているが本発明のポリペプチド（例、新規バリアント）中で欠失しているアミノ酸配列をいう。これらの挿入アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００３６】
「本発明のポリペプチドの欠失アミノ酸配列」とは、本発明のポリペプチド（例、新規バリアント）中で欠失しているが既知ポリペプチド（例、既知バリアント）中に挿入されているアミノ酸配列をいう。一方、「既知ポリペプチドの欠失アミノ酸配列」とは、既知ポリペプチド（例、既知バリアント）中で欠失しているが本発明のポリペプチド（例、新規バリアント）中に挿入されているアミノ酸配列をいう。これらの欠失アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。「本発明のポリペプチドの欠失アミノ酸配列」は、「既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列」と同義であり得、「既知ポリペプチドの欠失アミノ酸配列」は、「本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列」と同義であり得る。【００３７】
本発明の部分ペプチドは、ａ）本発明のポリペプチドを既知ポリペプチドから識別可能である、本発明のポリペプチドの特異的な部分ペプチド（必要に応じて「特異的な部分ペプチドＡ」と省略）、ｂ）既知ポリペプチドを本発明のポリペプチドから識別可能である、既知ポリペプチドの特異的な部分ペプチド（必要に応じて「特異的な部分ペプチドＢ」と省略）、又はｃ）本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に共通する部分ペプチド（必要に応じて「共通部分ペプチド」と省略）であり得る。これらの特定の部分ペプチドは、本発明者らの知見により、作製する、又はマーカーとして利用する動機付けが生まれるものの、このような知見なしには、これらを作製する、又はマーカーとして利用する動機付けはない。血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるポリペプチドに特異的な部分ペプチドである、特異的な部分ペプチドＡ及びＢを、必要に応じて「本発明の特異的な部分ペプチド」又は「特異的な部分ペプチド」と省略する。【００３８】
本発明の特異的な部分ペプチドＡは、配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等を有するポリペプチド中にのみ存在し、かつ既知ポリペプチド中に存在しない部分ペプチドである。このような特異的な部分ペプチドＡとしては、例えば、ｉ）本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド、ｉｉ）本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその末端部分アミノ酸配列及びその隣接アミノ酸配列からなる部分ペプチド、並びにｉｉｉ）エクソンの欠失に起因して形成される、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する双方のアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列からなる部分ペプチドが挙げられる。【００３９】
上記ｉ）の特異的な部分ペプチドＡは、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる。このような部分アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００４０】
上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡは、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその末端部分アミノ酸配列及びその隣接アミノ酸配列からなる。このような末端部分アミノ酸配列としては、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列中のＮ末端部分に対応するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｎ末端部分アミノ酸配列Ａ」と省略）、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列中のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｃ末端部分アミノ酸配列Ａ」と省略）が挙げられる。このような隣接アミノ酸配列としては、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側に存在するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｎ末端隣接アミノ酸配列Ａ」と省略）、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＣ末端側に存在するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｃ末端隣接アミノ酸配列Ａ」と省略）が挙げられる。従って、上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡは、Ｎ末端隣接アミノ酸配列Ａの所定の位置から本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列の所定の位置にわたるアミノ酸配列からなる部分ペプチド、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列の所定の位置からＣ末端隣接アミノ酸配列Ａの所定の位置にわたるアミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいはＮ末端隣接アミノ酸配列Ａの所定の位置からＣ末端隣接アミノ酸配列Ａの所定の位置にわたる、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列全体を含むアミノ酸配列からなる部分ペプチドであり得る。上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡに含まれる、挿入アミノ酸配列（又はＮ末端若しくはＣ末端部分アミノ酸配列Ａ）あるいは隣接アミノ酸配列（又はＮ末端若しくはＣ末端隣接アミノ酸配列Ａ）中のアミノ酸残基数は、上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。このような末端部分アミノ酸配列及びこのような隣接アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００４１】
上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡは、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する双方のアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列（本発明のポリペプチドでは、エクソンの欠失に起因して、これらのアミノ酸配列は連結している）からなる、既知ポリペプチドに存在しない部分ペプチドである。上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡに含まれる、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する各アミノ酸配列中のアミノ酸残基数はそれぞれ、上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＡの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば、少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。【００４２】
本発明の特異的な部分ペプチドＡは、例えば、本発明のポリペプチドを特異的に検出するための標的として、及び血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の特異的な部分ペプチドＡはまた、本発明のポリペプチドを特異的に認識し得る物質、又は本発明のポリペプチドを特異的に認識し得ない物質の開発、あるいは本発明のポリペプチドの機能を特異的に調節し得る物質、又は本発明のポリペプチドの機能を特異的に調節し得ない物質の開発に有用であり得る。【００４３】
本発明の特異的な部分ペプチドＢは、既知ポリペプチド中にのみ存在し、かつ配列番号Ｘで表されるアミノ酸配列等を有するポリペプチド中に存在しない部分ペプチドである。このような特異的な部分ペプチドＢとしては、例えば、ｉ）既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる部分ペプチド、ｉｉ）既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその末端部分アミノ酸配列及びその隣接アミノ酸配列からなる部分ペプチド、ｉｉｉ）エクソンの欠失に起因して形成される、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する双方のアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列からなる部分ペプチドが挙げられる。【００４４】
上記ｉ）の特異的な部分ペプチドＢは、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列からなる。このような部分アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００４５】
上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢは、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列又はその末端部分アミノ酸配列及びその隣接アミノ酸配列からなる。このような末端部分アミノ酸配列としては、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列中のＮ末端部分に対応するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｎ末端部分アミノ酸配列Ｂ」と省略）、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列中のＣ末端部分に対応するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｃ末端部分アミノ酸配列Ｂ」と省略）が挙げられる。このような隣接アミノ酸配列としては、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側に存在するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｎ末端隣接アミノ酸配列Ｂ」と省略）、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＣ末端側に存在するアミノ酸配列（必要に応じて「Ｃ末端隣接アミノ酸配列Ｂ」と省略）が挙げられる。従って、上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢは、Ｎ末端隣接アミノ酸配列Ｂの所定の位置から既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列の所定の位置にわたるアミノ酸配列からなる部分ペプチド、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列の所定の位置からＣ末端隣接アミノ酸配列Ｂの所定の位置にわたるアミノ酸配列からなる部分ペプチド、あるいはＮ末端隣接アミノ酸配列Ｂの所定の位置からＣ末端隣接アミノ酸配列Ｂの所定の位置にわたる、既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列全体を含むアミノ酸配列からなる部分ペプチドであり得る。上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢに含まれる、挿入アミノ酸配列（又はＮ末端若しくはＣ末端部分アミノ酸配列Ｂ）あるいは隣接アミノ酸配列（又はＮ末端若しくはＣ末端隣接アミノ酸配列Ｂ）中のアミノ酸残基数は、上記ｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。このような末端部分アミノ酸配列及びこのような隣接アミノ酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００４６】
上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢは、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する双方のアミノ酸配列が連結したアミノ酸配列（既知ポリペプチドでは、エクソンの欠失に起因して、これらのアミノ酸配列は連結している）からなる、本発明のポリペプチドに存在しない部分ペプチドである。上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢに含まれる、本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列に対してＮ末端側及びＣ末端側に存在する各アミノ酸配列中のアミノ酸残基数はそれぞれ、上記ｉｉｉ）の特異的な部分ペプチドＢの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば、少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。【００４７】
本発明の特異的な部分ペプチドＢは、例えば、既知ポリペプチドを特異的に検出するための標的として、及び血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なマーカーとして、あるいはこれらに非特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の特異的な部分ペプチドＢはまた、既知ポリペプチドを特異的に認識し得る物質、又は既知ポリペプチドを特異的に認識し得ない物質の開発、あるいは既知ポリペプチドの機能を特異的に調節し得る物質、又は既知ポリペプチドの機能を特異的に調節し得ない物質の開発に有用であり得る。【００４８】
本発明の共通部分ペプチドは、本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に存在する、非特異的な部分ペプチドであり得る。このような部分ペプチドは、本明細書中の開示から明らかである。本発明の共通部分ペプチドは、例えば、本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方を包括的に検出するための標的として、及び血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なマーカーとして、あるいはこれらに非特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の共通部分ペプチドはまた、本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方を包括的に認識し得る物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の機能を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。【００４９】
本発明のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチドは、異種アミノ酸配列からなるポリペプチドと融合していてもよい。このようなポリペプチドとしては、精製又は可溶化を容易にするポリペプチドが挙げられる。詳細には、このようなポリペプチドとしては、ヒスチジンタグ、マルトース結合タンパク（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、ＦＬＡＧ、ＩｇＧ分子のＦｃ領域が挙げられる。【００５０】
本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドは塩の形態で提供されてもよい。塩としては、例えば、無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。【００５１】
本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドは、自体公知の方法により作製できる。例えば、本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドは、１）発現部位から回収してもよく、２）本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドを発現する後述の形質転換体又はその培養上清から回収してもよく、３）ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いる無細胞系により合成してもよく、あるいは４）有機化学的に合成（例、固相合成）してもよい。本発明のポリペプチド及びその部分ペプチドは、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィー、抗体の使用などの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；これらを組合せた方法などにより適宜精製される。【００５２】
１．２．ポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチド
本発明は、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２、あるいはそれらと実質的に同一の核酸配列（必要に応じて「配列番号Ｙで表される核酸配列等」と省略）を有するポリヌクレオチドを提供する。【００５３】
「配列番号Ｙ」は、本明細書中に開示される任意の核酸配列の配列番号を表す。また、配列番号Ｙ等を「有する」ポリヌクレオチドとは、配列番号Ｙ等「からなる」ポリヌクレオチド、あるいは当該核酸配列等を「含む」ポリヌクレオチドを意味する。【００５４】
「核酸配列Ｙ１」とは、配列番号Ｙで表される核酸配列において、コーディング部分（即ち、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全体又はその一部）に対応する核酸配列を示す。換言すれば、「核酸配列Ｙ１」とは、配列番号Ｙで表される核酸配列がコーディング部分のみに対応する核酸配列からなる場合、配列番号Ｙで表される核酸配列を示し、配列番号Ｙで表される核酸配列がコーディング部分及び非コーディング部分の双方に対応する核酸配列を含む場合、コーディング部分のみに対応する核酸配列を示す。【００５５】
「核酸配列Ｙ２」とは、配列番号Ｙで表される核酸配列において、非コーディング部分（例、５’又は３’非翻訳領域）に対応する核酸配列を示す。換言すれば、「核酸配列Ｙ２」とは、配列番号Ｙで表される核酸配列が非コーディング部分のみに対応する核酸配列からなる場合、配列番号Ｙで表される核酸配列を示し、配列番号Ｙで表される核酸配列が非コーディング部分及びコーディング部分の双方に対応する核酸配列を含む場合、非コーディング部分のみに対応する核酸配列を示す。【００５６】
従って、「配列番号Ｙ」で表される核酸配列は、ｉ）核酸配列Ｙ１（配列番号Ｙで表される核酸配列全体がコーディング部分に対応する核酸配列である場合）、ｉｉ）核酸配列Ｙ２（配列番号Ｙで表される核酸配列全体が非コーディング部分に対応する核酸配列である場合）、あるいはｉｉｉ）核酸配列Ｙ１及び核酸配列Ｙ２を含む核酸配列（配列番号Ｙで表される核酸配列がコーディング部分及び非コーディング部分に対応する核酸配列を含む場合）のいずれかにより表現できる。【００５７】
一実施形態では、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と所定の配列同一性を有する核酸配列であり得る。核酸配列同一性の程度は、約９０％以上、好ましくは約９２％以上、より好ましくは約９５％以上、さらにより好ましくは約９６％以上、最も好ましくは約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上であり得る。核酸配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、核酸配列同一性（％）は、上述したアミノ酸配列同一性（％）と同様の方法により決定できる。【００５８】
別の実施形態では、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２において１以上のヌクレオチドが置換、付加、欠失及び挿入から選ばれる１以上の修飾を施された核酸配列であり得る。修飾されるヌクレオチドの数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約７０個、より好ましくは１〜約５０個、さらにより好ましくは１〜約３０個、最も好ましくは１〜約２０個、１〜約１０個又は１〜約５個（例、１個又は２個）であり得る。【００５９】
さらに別の実施形態では、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２に相補的な核酸配列に対してハイストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであり得る。ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件は、既報の条件を参考に設定することができる（例、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 6.3.1-6.3.6 (1999) 参照）。例えば、ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）／45℃でのハイブリダイゼーション、次いで0.2×SSC／0.1％SDS／50〜65℃での１回又は２回以上の洗浄が挙げられる。【００６０】
配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、その特徴的な部分（例、後述の特異的な部分ヌクレオチドに対応する部分）を完全に保持し、かつそれ以外の部分（例、既知ポリヌクレオチド中に存在する部分）が、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２の対応部分と実質的に同一であってもよい。あるいは、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、非特徴的な部分が配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２の対応部分と同一であり、かつ特徴的な部分が、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２の対応部分と実質的に同一であってもよい。【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードし得る。従って、本発明のポリヌクレオチドは、それによりコードされるポリペプチドが本発明のポリペプチドと同様の機能を示し得るようなポリヌクレオチドであり得る。【００６２】
詳細には、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２についてのポリヌクレオチドの核酸配列Ｙ、及びそのＯＲＦ対応部分（核酸配列ＹにおけるＹａ〜Ｙｂ番目のヌクレオチド残基）の配列番号Ｙ、及びＹａ〜Ｙｂ番目は、以下の通りである。【００６３】
１）本発明の特異的遺伝子１
D-SYNOV4003692.1（配列番号８又は配列番号９、及び１７６〜１１２６番目）【００６４】
２）本発明の特異的遺伝子２
D-D3OST2001534.1（配列番号２８又は配列番号２９、及び２８８〜１９１９番目）
D-NETRP1000046.1（配列番号３５又は配列番号３６、及び５７〜９５０番目）
なお、配列番号２８又は配列番号２９で表される核酸配列における２８８〜３５６番目のヌクレオチド残基からなる領域は、シグナル配列予測ツールであるSignalP及びPSORT II（上記参照）により、シグナル領域をコードしていると予測される。また、血球系・破骨細胞特異的遺伝子２の既知バリアントであるNM_001637.1でも、同一領域がシグナル配列に対応することが公知の情報としてデータベースに記載されている他、シグナル配列予測ツールであるSignalP及びPSORT IIでも同一の領域にシグナル配列が予測される。従って、本発明はまた、ＯＲＦ対応部分のうち、このような推定シグナル領域をコードするポリヌクレオチドが除去されたポリヌクレオチド（即ち、配列番号２８で表される核酸配列において３５７〜１９１９番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列、あるいはそれと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド）を提供する。【００６５】
３）本発明の特異的遺伝子３
D-PLACE7010497.1（配列番号５５又は配列番号５６、及び３４〜１８７５番目）【００６６】
４）本発明の特異的遺伝子４
D-SPLEN2030304.1（配列番号７１又は配列番号７２、及び８９〜１７６８番目）【００６７】
５）本発明の特異的遺伝子５
D-SYNOV4000324.1（配列番号８６又は配列番号８７、及び４５〜９８６番目）【００６８】
６）本発明の特異的遺伝子６
D-SYNOV4007243.1（配列番号１０２又は配列番号１０３、及び２０２〜２５２６番目）【００６９】
７）本発明の特異的遺伝子７
D-NETRP2004161.1（配列番号１１８又は配列番号１１９、及び２９０〜１２４０番目）【００７０】
８）本発明の特異的遺伝子８
D-NT2RI3001993.1（配列番号１４１又は配列番号１４２、及び６３〜３２０６番目）
D-SMINT2013276.1（配列番号１５１又は配列番号１５２、及び９３〜２０３６番目）【００７１】
９）本発明の特異的遺伝子９
D-THYMU3006588.1（配列番号１７１又は配列番号１７２、及び８７〜２７２３番目）
D-D3OST2003177.1（配列番号１７８又は配列番号１７９、及び１６３〜２７１８番目）【００７２】
１０）本発明の特異的遺伝子１０
D-D3OST2000831.1（配列番号１９９又は配列番号２００、及び１７８〜１６２０番目）【００７３】
１１）本発明の特異的遺伝子１１
D-HCASM2001914.1（配列番号２２４又は配列番号２２５、及び４６〜２６０４番目）
D-SYNOV4003291.1（配列番号２３１又は配列番号２３２、及び４６〜６９３番目）
なお、配列番号２２４又は配列番号２２５あるいは配列番号２３１又は配列番号２３２で表される核酸配列における４６〜１１７番目のヌクレオチド残基からなる領域は、シグナル配列予測ツールであるSignalP及びPSORT II（上記参照）により、シグナル領域をコードしていると予測される。また、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１１の既知バリアントであるNM_005807.1でも、SignalP及びPSORT IIにより同一領域がシグナル配列と予測される。従って、本発明はまた、ＯＲＦ対応部分のうち、このような推定シグナル領域をコードするポリヌクレオチドが除去されたポリヌクレオチド（即ち、配列番号２２４で表される核酸配列において１１８〜２６０４番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列、配列番号２３１で表される核酸配列において１１８〜６９３番目のヌクレオチド残基からなる核酸配列、あるいはそれと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチド）を提供する。【００７４】
１２）本発明の特異的遺伝子１２
D-NETRP2002051.1（配列番号２４９又は配列番号２５０、及び３４〜５７９番目）
D-THYMU2031383.1（配列番号２６４又は配列番号２６５、及び３４〜８１６番目）
D-THYMU3032318.1（配列番号２７０又は配列番号２７１、及び３６〜４７０番目）【００７５】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識し得る物質、本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識し得ない物質、又は本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方を包括的に認識し得る物質の開発、並びに本発明のポリペプチドの発現を特異的に調節し得る物質、本発明のポリペプチドの発現を特異的に調節し得ない物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。【００７６】
本発明はまた、部分ヌクレオチドを提供する。【００７７】
「部分ヌクレオチド」とは、所定の有用性（例、プローブ、プライマー、免疫原性又は抗原性ペプチドをコードするポリヌクレオチド、特定のドメインを有する機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドなどとしての用途）を有し得る、対象ポリヌクレオチドから選ばれる少なくとも１５個、好ましくは少なくとも１６個、より好ましくは少なくとも１８個、さらにより好ましくは少なくとも２０個、最も好ましくは少なくとも２２個、２３個、２４個又は２５個の連続するヌクレオチド残基からなる。【００７８】
「本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列」とは、本発明のポリヌクレオチド（例、新規バリアント）中に挿入されているが既知ポリヌクレオチド（例、既知バリアント）中で欠失している核酸配列をいう。一方、「既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列」とは、既知ポリヌクレオチド（例、既知バリアント）中に挿入されているが本発明のポリヌクレオチド（例、新規バリアント）中で欠失している核酸配列をいう。これらの挿入核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００７９】
「本発明のポリヌクレオチドの欠失核酸配列」とは、本発明のポリヌクレオチド（例、新規バリアント）中で欠失しているが既知ポリヌクレオチド（例、既知バリアント）中に挿入されている核酸配列をいう。一方、「既知ポリヌクレオチドの欠失核酸配列」とは、既知ポリヌクレオチド（例、既知バリアント）中で欠失しているが本発明のポリヌクレオチド（例、新規バリアント）中に挿入されている核酸配列をいう。これらの欠失核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。「本発明のポリヌクレオチドの欠失核酸配列」は、「既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列」と同義であり得、「既知ポリヌクレオチドの欠失核酸配列」は、「本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列」と同義であり得る。【００８０】
本発明の部分ヌクレオチドは、ａ）本発明のポリヌクレオチドを既知ポリヌクレオチドから識別可能である、本発明のポリヌクレオチドの特異的な部分ヌクレオチド（必要に応じて「特異的な部分ヌクレオチドＡ」と省略）、ｂ）既知ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドから識別可能である、既知ポリヌクレオチドの特異的な部分ヌクレオチド（必要に応じて「特異的な部分ヌクレオチドＢ」と省略）、又はｃ）本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通する部分ヌクレオチド（必要に応じて「共通部分ヌクレオチド」と省略）であり得る。これらの特定の部分ヌクレオチドは、本発明者らの知見により、作製する、又はマーカーとして利用する動機付けが生まれるものの、このような知見なしには、これらを作製する、又はマーカーとして利用する動機付けはない。血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２によりコードされるポリヌクレオチドに特異的な部分ヌクレオチドである、特異的な部分ヌクレオチドＡ及びＢを、必要に応じて「本発明の特異的な部分ヌクレオチド」又は「特異的な部分ヌクレオチド」と省略する。【００８１】
本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡは、配列番号Ｙで表される核酸配列等を有するポリヌクレオチド中にのみ存在し、かつ既知ポリヌクレオチド中に存在しない部分ヌクレオチドである。このような特異的な部分ヌクレオチドＡとしては、例えば、ｉ）本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド、ｉｉ）本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその末端部分核酸配列及びその隣接核酸配列からなる部分ヌクレオチド、並びにｉｉｉ）エクソンの欠失に起因して形成される、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する双方の核酸配列が連結した核酸配列からなる部分ヌクレオチドが挙げられる。【００８２】
上記ｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡは、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその部分核酸配列からなる。このような部分核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００８３】
上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡは、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその末端部分核酸配列及びその隣接核酸配列からなる。このような末端部分核酸配列としては、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列中の５’末端部分に対応する核酸配列（必要に応じて「５’末端部分核酸配列Ａ」と省略）、本発明のポリペプチドの挿入核酸配列中の３’末端部分に対応する核酸配列（必要に応じて「３’末端部分核酸配列Ａ」と省略）が挙げられる。このような隣接核酸配列としては、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’に存在する核酸配列（必要に応じて「５’隣接核酸配列Ａ」と省略）、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して３’に存在する核酸配列（必要に応じて「３’隣接核酸配列Ａ」と省略）が挙げられる。従って、上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡは、５’隣接核酸配列Ａの所定の位置から本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列の所定の位置にわたる核酸配列からなる部分ヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列の所定の位置から３’隣接核酸配列Ａの所定の位置にわたる核酸配列からなる部分ヌクレオチド、あるいは５’隣接核酸配列Ａの所定の位置から３’隣接核酸配列Ａの所定の位置にわたる、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列全体を含む核酸配列からなる部分ヌクレオチドであり得る。上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡに含まれる、挿入核酸配列（又は５’末端若しくは３’末端部分核酸配列Ａ）あるいは隣接核酸配列（又は５’末端若しくは３’末端隣接核酸配列Ａ）中のヌクレオチド残基数は、上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。このような末端部分核酸配列及びこのような隣接核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００８４】
上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡは、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する双方の核酸配列が連結した核酸配列（本発明のポリヌクレオチドでは、エクソンの欠失に起因して、これらの核酸配列は連結している）からなる、既知ポリヌクレオチドに存在しない部分ヌクレオチドである。上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡに含まれる、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する各核酸配列中のヌクレオチド残基数はそれぞれ、上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＡの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。【００８５】
本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡは、例えば、本発明のポリヌクレオチドを特異的に検出するための標的として、及び血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡはまた、本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識し得る物質、又は本発明のポリヌクレオチドを特異的に認識し得ない物質の開発、あるいは本発明のポリペプチドの発現を特異的に調節し得る物質、又は本発明のポリペプチドの発現を特異的に調節し得ない物質の開発に有用であり得る。【００８６】
本発明の特異的な部分ヌクレオチドＢは、既知ポリヌクレオチド中にのみ存在し、かつ配列番号Ｙで表される核酸配列等を有するポリヌクレオチド中に存在しない部分ヌクレオチドである。このような特異的な部分ヌクレオチドＢとしては、例えば、ｉ）既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその部分核酸配列からなる部分ヌクレオチド、ｉｉ）既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその末端部分核酸配列及びその隣接核酸配列からなる部分ヌクレオチド、ｉｉｉ）エクソンの欠失に起因して形成される、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する双方の核酸配列が連結した核酸配列からなる部分ヌクレオチドが挙げられる。【００８７】
上記ｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢは、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその部分核酸配列からなる。このような部分核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００８８】
上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢは、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列又はその末端部分核酸配列及びその隣接核酸配列からなる。このような末端部分核酸配列としては、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列中の５’末端部分に対応する核酸配列（必要に応じて「５’末端部分核酸配列Ｂ」と省略）、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列中の３’末端部分に対応する核酸配列（必要に応じて「３’末端部分核酸配列Ｂ」と省略）が挙げられる。このような隣接核酸配列としては、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’に存在する核酸配列（必要に応じて「５’隣接核酸配列Ｂ」と省略）、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して３’に存在する核酸配列（必要に応じて「３’隣接核酸配列Ｂ」と省略）が挙げられる。従って、上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢは、５’隣接核酸配列Ｂの所定の位置から既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列の所定の位置にわたる核酸配列からなる部分ヌクレオチド、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列の所定の位置から３’隣接核酸配列Ｂの所定の位置にわたる核酸配列からなる部分ヌクレオチド、あるいは５’隣接核酸配列Ｂの所定の位置から３’隣接核酸配列Ｂの所定の位置にわたる、既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列全体を含む核酸配列からなる部分ヌクレオチドであり得る。上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢに含まれる、挿入核酸配列（又は５’末端若しくは３’末端部分核酸配列Ｂ）あるいは隣接核酸配列（又は５’末端若しくは３’末端隣接核酸配列Ｂ）中のヌクレオチド残基数は、上記ｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。このような末端部分核酸配列及びこのような隣接核酸配列は、本明細書中の開示から明らかである。【００８９】
上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢは、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する双方の核酸配列が連結した核酸配列（既知ポリヌクレオチドでは、エクソンの欠失に起因して、これらの核酸配列は連結している）からなる、本発明のポリヌクレオチドに存在しない部分ヌクレオチドである。上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢに含まれる、本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列に対して５’及び３’に存在する各核酸配列中のヌクレオチド残基数はそれぞれ、上記ｉｉｉ）の特異的な部分ヌクレオチドＢの特異性を確保できる数である限り特に限定されないが、例えば少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、より好ましくは少なくとも５個、さらにより好ましくは少なくとも６個、最も好ましくは少なくとも７個、８個、９個又は１０個であり得る。【００９０】
本発明の特異的な部分ヌクレオチドＢは、例えば、既知ポリヌクレオチドを特異的に検出するための標的として、及び血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なマーカーとして、あるいはこれらに非特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の特異的な部分ヌクレオチドＢはまた、既知ポリヌクレオチドを特異的に認識し得る物質、又は既知ポリヌクレオチドを特異的に認識し得ない物質の開発、あるいは既知ポリペプチドの発現を特異的に調節し得る物質、又は既知ポリペプチドの発現を特異的に調節し得ない物質の開発に有用であり得る。【００９１】
本発明の共通部分ヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に存在する、非特異的な部分ヌクレオチドであり得る。このような部分ヌクレオチドは、本明細書中の開示から明らかである。本発明の共通部分ヌクレオチドは、例えば、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方を包括的に検出するための標的として、及び血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なマーカーとして、あるいはこれらに非特異的なマーカーとして有用であり得る。本発明の共通部分ヌクレオチドはまた、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方を包括的に認識し得る物質、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現を包括的に調節し得る物質の開発に有用であり得る。【００９２】
本発明のポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチドは、本発明のポリペプチド又は本発明の部分ペプチドをコードし得る。本発明のポリヌクレオチド又は本発明の部分ヌクレオチドはまた、異種核酸配列からなるポリヌクレオチドと融合していてもよい。このような異種核酸配列としては、上述の異種アミノ酸配列をコードするものが挙げられる。【００９３】
本発明のポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチドは、塩の形態で提供されてもよい。塩としては、上述のものが挙げられる。【００９４】
本発明のポリヌクレオチド及びその部分ヌクレオチドは、自体公知の方法により作製できる。例えば、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と同一の核酸配列は、所定の組織又は細胞を用いてクローニングできる。また、配列番号Ｙで表される核酸配列、又は核酸配列Ｙ１若しくは核酸配列Ｙ２と実質的に同一の核酸配列は、上記の通りクローニングしたポリヌクレオチドに変異を導入することにより作製できる。変異導入法としては、例えば、合成オリゴヌクレオチド指定突然変異導入法、gapped duplex法、ランダムに点突然変異を導入する方法（例えば、亜硝酸若しくは亜硫酸での処理）、カセット変異法、リンカースキャニング法、ミスマッチプライマー法が挙げられる。【００９５】
２．関連物質
本発明は、本発明のポリペプチド及び本発明の部分ペプチド、並びに本発明のポリヌクレオチド及び本発明の部分ヌクレオチドに基づき開発が可能となる一連の関連物質を提供する。以下に記載される本発明の関連物質は、例えば、医薬として有用であり得る。本発明の関連物質が医薬である場合、対象疾患は、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患であり得、例えば、免疫性疾患、炎症性疾患、アレルギー性疾患が挙げられる。詳細には、このような疾患としては、免疫不全症、白血病、リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄腫、好中球機能異常症、自己免疫疾患、関節リューマチ、膠原病、アトピー性皮膚炎、脾機能亢進症、胸腺種、癌の骨転移、骨粗鬆症などが挙げられる。破骨細胞の障害に基づく疾患としては、関節リューマチ、癌の骨転移、骨粗鬆症などが挙げられる。【００９６】
２．１．アンチセンス分子
本発明は、アンチセンス分子を提供する。【００９７】
アンチセンス分子の種類はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいし、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。アンチセンス分子は、天然型のリン酸ジエステル結合を有するものであっても、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のＰ＝ＯをＰ＝Ｓに置換）や２’−Ｏ−メチル型等の修飾ヌクレオチドであってもよい。アンチセンス分子の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服できる。アンチセンス分子の長さは、転写産物と特異的にハイブリダイズし得る限り特に制限はなく、短いもので約１５個のヌクレオチド程度、長いもので転写産物の全配列に相補的な配列を含むような配列であってもよい。合成の容易さや抗原性の問題等から、例えば約１５個以上のヌクレオチド、好ましくは約１５個〜約１００個のヌクレオチド、より好ましくは約１８個〜約５０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが例示される。さらに、アンチセンス分子は、転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、ｍＲＮＡへの転写を阻害し得るものであってもよい。【００９８】
本発明のアンチセンス分子は、本発明の部分ヌクレオチド（例、本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡ及びＢ、本発明の共通部分ヌクレオチド）に対応する核酸配列に相補的な核酸配列を含み得る。従って、本発明のアンチセンス分子は、本発明のポリヌクレオチドに特異的なアンチセンス分子、既知ポリヌクレオチドに特異的なアンチセンス分子、又は本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通するアンチセンス分子であり得る。本発明のアンチセンス分子は、本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドの発現の特異的な抑制、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現の包括的な抑制に有用であり得る。【００９９】
２．２．ＲＮＡｉ誘導性核酸
本発明は、ＲＮＡｉ誘導性核酸を提供する。【０１００】
ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、細胞内に導入されることにより、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）効果を誘導し得るポリヌクレオチドをいい、好ましくはＲＮＡである。ＲＮＡｉ効果とは、ｍＲＮＡと同一の核酸配列又はその部分配列を含む２本鎖構造のＲＮＡが、当該ｍＲＮＡの発現を抑制する現象をいう。ＲＮＡｉ効果を得るには、例えば、少なくとも２０以上の連続する標的ｍＲＮＡと同一の核酸配列（又はその部分配列）を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが好ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていてもよいし、一つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。ＲＮＡｉ誘導性核酸としては、例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどが挙げられるが、ｓｉＲＮＡが好ましい。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを誘導できる限り特に制限されないが、例えば２１〜２７塩基長、好ましくは２１〜２５塩基長であり得る。【０１０１】
本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸は、本発明の部分ヌクレオチド（例、本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡ及びＢ、本発明の共通部分ヌクレオチド）に対応する核酸配列からなるセンス鎖、及びそれに相補的な核酸配列からなるアンチセンス鎖から構成される二重鎖ポリヌクレオチドであり得る。本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸はまた、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方又は双方の５’末端及び／又は３’末端においてオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’末端及び／又は３’末端における１〜数個（例、１、２又は３個）の塩基の付加により形成されたものであり得る。本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的なＲＮＡｉ誘導性核酸、既知ポリヌクレオチドに特異的なＲＮＡｉ誘導性核酸、又は本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通するＲＮＡｉ誘導性核酸であり得る。本発明のＲＮＡｉ誘導性核酸は、本発明のポリペプチド又は既知ポリペプチドの発現の特異的な抑制、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の発現の包括的な抑制に有用であり得る。【０１０２】
２．３．アプタマー
本発明は、アプタマーを提供する。【０１０３】
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性（又は阻害活性）を有するポリヌクレオチドをいう。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ヌクレオチド又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。アプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１６〜約２００個のヌクレオチドであり得るが、例えば約１００個のヌクレオチド以下であり、好ましくは約５０個のヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０個のヌクレオチド以下であり得る。また、本発明のアプタマーの長さは、例えば約１８個、約２０個、約２５個又は約３０個ヌクレオチド以上であってもよい。アプタマーは、結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化、Ｓ−アリル化及びアミノ化が挙げられる（例、Sproat et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635参照）。アプタマーはまた、プリン、ピリミジンが改変されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、リン酸基が、チオエート、ジチオエート又はアミデートで置換されていてもよい。アプタマーは、既報（例えば、Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510）に従って作製できる。【０１０４】
本発明のアプタマーは、本発明の部分ペプチドに対応する領域を介して、本発明のポリペプチド、既知ポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に特異的に結合し得る。従って、本発明のアプタマーは、本発明のポリペプチドに特異的なアプタマー、既知ポリペプチドに特異的なアプタマー、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に共通するアプタマーであり得る。このような特異的なアプタマーは、例えば、（ａ）本発明のポリペプチド又はその特異的な部分ペプチドに結合し、かつ既知ポリペプチドに結合しないポリヌクレオチド、（ｂ）既知ポリペプチド又はその特異的な部分ペプチドに結合し、かつ本発明のポリペプチドに結合しないポリヌクレオチド、あるいは（ｃ）本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方又は本発明の共通部分ペプチドに結合するポリヌクレオチドを、ＳＥＬＥＸ法により選抜することで作製できる。【０１０５】
２．４．抗体
本発明は、抗体を提供する。【０１０６】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体（抗血清）、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。モノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプであってもよいが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭである。【０１０７】
例えば、ポリクローナル抗体は、上記抗原（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）を、市販のアジュバント（例えば、完全又は不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。【０１０８】
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作成することができる。例えば、マウスに上記抗原を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法でも電圧パルス法であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡ又はＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、又はマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清及び動物の腹水から取得することができる。【０１０９】
本発明の抗体はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体であってもよい。【０１１０】
キメラ抗体は、その可変領域及び定常領域が互いに異なる動物種のイムノグロブリンに由来するモノクローナル抗体を意味する。例えば、キメラ抗体は、その可変領域がマウスイムノグロブリン由来の可変領域であり、かつその定常領域がヒトイムノグロブリン由来の定常領域であるマウス／ヒトキメラモノクローナル抗体であり得る。ヒトイムノグロブリン由来の定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ等のアイソタイプにより各々固有のアミノ酸配列を有するが、本発明における組換キメラモノクローナル抗体の定常領域はいずれのアイソタイプに属するヒトイムノグログリンの定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトＩｇＧの定常領域である。【０１１１】
キメラ抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、マウス／ヒトキメラモノクローナル抗体は、既報（例、実験医学(臨時増刊号), Vol. 6, No.10, 1988及び特公平3-73280号公報）に従って作製できる。詳細には、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから単離した該マウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＨ遺伝子（Ｈ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＤＪ遺伝子）の下流に、ヒトイムノグロブリンをコードするＤＮＡから取得したＣＨ遺伝子（Ｈ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、また該ハイブリドーマから単離したマウスモノクローナル抗体をコードするＤＮＡから取得した活性なＶＬ遺伝子（Ｌ鎖可変領域をコードする再配列されたＶＪ遺伝子）の下流にヒトイムノグロブリンをコードするＤＮＡから取得したＣＬ遺伝子（Ｌ鎖定常領域をコードするＣ遺伝子）を、各々発現可能なように配列して１つ又は別々の発現ベクターに挿入し、該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換細胞を培養することにより作製することができる。【０１１２】
ヒト化抗体は、遺伝子工学的に作製されるモノクローナル抗体であって、例えば、その超可変領域の相補性決定領域の一部又は全部がマウスモノクローナル抗体に由来し、その可変領域の枠組領域及びその定常領域がヒトイムノグロブリンに由来するヒト型モノクローナル抗体を意味する。超可変領域の相補性決定領域は、抗体の可変領域中の超可変領域に存在し、抗原と相補的に直接結合する部位である３つの領域（Complementarity-determining region；ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）であり、可変領域の枠組領域は、該３つの相補性決定領域の前後に介在する比較的保存された４つの領域（Framework；ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ＦＲ４）である。換言すれば、例えばマウスモノクローナル抗体の超可変領域の相補性決定領域の一部又は全部以外の全ての領域が、ヒトイムノグロブリンの対応領域と置き代わったモノクローナル抗体を意味する。【０１１３】
ヒト化抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、マウスモノクローナル抗体に由来する組換えヒト化抗体は、既報（例、特表平4-506458号公報及び特開昭62-296890号公報）に従って作製できる。詳細には、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、少なくとも１つのマウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子に対応する少なくとも１つのマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子を単離し、またヒトイムノグロブリン遺伝子から前記マウスＨ鎖ＣＤＲに対応するヒトＨ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＨ鎖遺伝子と、マウスＬ鎖ＣＤＲに対応するヒトＬ鎖ＣＤＲ以外の全領域をコードするヒトＬ鎖遺伝子を単離する。単離した該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＨ鎖遺伝子を発現可能なように適当な発現ベクターに導入し、同様に該マウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子と該ヒトＬ鎖遺伝子を発現可能なように適当なもう１つの発現ベクターに導入する。又は、該マウスＨ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＨ鎖遺伝子とマウスＬ鎖ＣＤＲ遺伝子／ヒトＬ鎖遺伝子を同一の発現ベクターに発現可能なように導入することもできる。このようにして作製された発現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりヒト化抗体産生細胞を得、該細胞を培養することにより培養上清中から目的のヒト化抗体を得ることができる。【０１１４】
ヒト抗体は、イムノグロブリンを構成するＨ鎖及びＬ鎖の可変領域及び定常領域を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来する抗体を意味する。【０１１５】
ヒト抗体は、自体公知の方法により作製できる。例えば、ヒト抗体は、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報（Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; 特表平4-504365号公報；国際出願公開WO94/25585号公報；Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; 及び特表平6-500233号公報）に従って作製できる。【０１１６】
本発明の抗体はまた、前述の本発明の抗体（例、モノクローナル抗体）の一部であり得る。このような抗体としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ断片、単鎖抗体が挙げられる。【０１１７】
本発明の抗体は、本発明の部分ペプチドに対応する領域を介して、本発明のポリペプチド、既知ポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に特異的に結合し得る。従って、本発明の抗体は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体、既知ポリペプチドに特異的な抗体、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に共通する抗体であり得る。このような特異的な抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの特異的な部分ペプチド、既知ポリペプチドの特異的な部分ペプチド、又は本発明の共通部分ペプチドを、抗原として用いることにより作製できる。【０１１８】
２．５．発現ベクター
本発明は、上述の物質の発現ベクターを提供する。【０１１９】
本発明の発現ベクターは、発現されるべき目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は発現されるべき目的ポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。「プロモーターがポリヌクレオチドに機能可能に連結されている」とは、プロモーターが、その制御下にあるポリヌクレオチド自体の発現又はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現を可能とするように、該遺伝子をコードするポリヌクレオチドに結合していることを意味する。【０１２０】
本発明の発現ベクターのバックボーン（backbone）としては、所定の細胞で目的の物質を産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。発現ベクターを医薬として用いる場合、哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。【０１２１】
宿主細胞として原核生物細胞を用いる場合、原核生物細胞を宿主細胞として利用可能な発現ベクターが用いられ得る。このような発現ベクターは、例えば、プロモーター−オペレーター領域、開始コドン、本発明のポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドン、ターミネーター領域、複製起点等のエレメントを含み得る。細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びShine-Dalgarno (SD) 配列を含むものである。これらのエレメントについては、自体公知のものを用いることができる。【０１２２】
また、宿主細胞として真核生物細胞を用いる場合、真核生物細胞を宿主細胞として利用可能な発現ベクターが用いられ得る。この場合、使用されるプロモーターは、哺乳動物等の真核生物で機能し得るものであれば特に制限されない。ポリペプチドの発現を目的とする場合、このようなプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ−アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。ポリヌクレオチドの発現を目的とする場合、プロモーターは、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）であり得る。【０１２３】
本発明の発現ベクターはさらに、転写開始及び転写終結のための部位、及び転写領域において翻訳に必要とされ得るリボソーム結合部位、複製起点並びに選択マーカー遺伝子（例、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール）などを含み得る。本発明の発現ベクターは、自体公知の方法により作製できる（例、Molecular Cloning, 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989）参照)。【０１２４】
３．組成物
本発明は、上述の物質を含む組成物を提供する。【０１２５】
本発明の組成物は、上述の物質に加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。【０１２６】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。【０１２７】
非経口的な投与（例えば、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。【０１２８】
本発明の組成物の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇである。【０１２９】
本発明の組成物は、本発明のポリペプチドの発現又は機能の調節（例、促進又は抑制）を可能とする。本発明の組成物は、例えば、医薬（例、上述したような疾患の予防又は治療薬）、試薬又は食品として有用であり得る。【０１３０】
４．細胞
本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の部分ペプチドを産生する形質転換体、本発明の抗体の産生細胞、及び本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現又は機能が調節された細胞を提供する。【０１３１】
４．１．形質転換体
本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチド又は本発明の部分ペプチドを発現する、本発明の発現ベクターで形質転換された細胞であり得る。形質転換体の作製に用いられる宿主細胞としては、発現ベクターに適合し、目的のポリヌクレオチド又はポリペプチド等を発現し得るものであれば特に限定されず、例えば、初代培養細胞又は細胞株が挙げられる。詳細には、このような宿主細胞としては、例えば、大腸菌、バチルス属菌（例、枯草菌）、放線菌等の原核生物細胞、並びに酵母、昆虫細胞、鳥類細胞、哺乳動物細胞（例、上述の哺乳動物に由来する細胞：例、ＣＨＯ細胞）等の真核生物細胞が挙げられる。本発明の形質転換体は、自体公知の方法により作製できる（例、Molecular Cloning, 2nd edition, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press (1989）参照)。【０１３２】
形質転換体の培養は、自体公知の方法により液体培地等の栄養培地中で行われ得る。培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが挙げられ、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機又は有機物質が挙げられ、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類などを添加してもよい。培養条件、例えば温度、培地のｐＨ及び培養時間は、本発明のポリペプチドが大量に生産されるように適宜選択される。培養温度は、例えば３０〜３７℃である。【０１３３】
４．２．抗体産生細胞
本発明の抗体の産生細胞は、本発明の抗体を産生する任意の細胞であり得る。本発明の抗体産生細胞としては、上述のハイブリドーマ、及び上述の抗体の発現ベクターが導入された形質転換細胞が挙げられる。本発明の抗体産生細胞が形質転換細胞である場合、形質転換細胞の作製に用いられる発現ベクター及び宿主細胞、並びに細胞培養等の詳細は、上述と同様であり得る。【０１３４】
４．３．本発明のポリペプチドの発現又は機能が調節された細胞
本発明は、本発明のポリペプチドの発現又は機能が調節された細胞を提供する。【０１３５】
本発明の細胞は、単離及び／又は精製されたものであり得る。本発明の細胞は、上述の組織に由来する細胞、又は上述の種類の細胞であり得る。本発明の細胞は、上述の哺乳動物に由来し得る。本発明の細胞は、初代培養細胞又は細胞株、あるいは正常細胞、又は上述の疾患を有する哺乳動物に由来する細胞であり得る。本発明の細胞は、本発明のポリペプチドの発現又は機能が特異的に調節された細胞であり得る。本発明の細胞は、本発明のポリペプチドの発現又は機能の調節（例、促進、抑制）により、血球系又は破骨細胞に関連する作用、あるいは血球系又は破骨細胞に関連する表現型が変化し得る。本発明の細胞は、本発明のポリペプチドの発現が一過的に調節された細胞、又は当該発現が恒常的に調節された細胞（例、ホモ接合性又はヘテロ接合性欠損細胞）であり得る。本発明の細胞はまた、形質転換体又は非形質転換体であり得る。【０１３６】
本発明の細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリペプチドの発現又は機能を調節し得る上述の物質（例、本発明のポリペプチド、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、抗体、又はこれらの発現ベクター）で細胞を処理することにより作製できる。本発明の細胞はまた、後述の遺伝子導入動物又は遺伝子欠損（いわゆるノックアウト）動物から細胞を単離及び／又は精製することにより作製できる。【０１３７】
本発明のポリペプチドの発現又は機能が調節された細胞は、例えば、医薬（例、上述したような疾患の予防又は治療薬）、試薬又は食品の開発、血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なさらなるマーカー遺伝子の同定、及び血球系又は破骨細胞の分化に関連する機構の解析に有用であり得る。これらは、例えば、マイクロアレイ、プロテインチップ（例、抗体チップ、又はサイファージェン社製チップ等の非抗体チップ）等を用いて本発明の細胞における発現プロファイルを測定し、対照細胞の発現プロファイルと比較することを含む、発現プロファイル解析により行われ得る。本発明の細胞はまた、上述したような疾患のモデル細胞として有用であり得る。【０１３８】
５．動物
本発明は、本発明のポリペプチドの発現又は機能が調節された動物を提供する。【０１３９】
本発明の動物は、ゲノムの改変を伴う、又は伴わない動物であり得る。本発明の動物の種は、例えば、上述の非ヒト哺乳動物と同様であり得る。【０１４０】
一実施形態では、本発明の動物は、ゲノムの改変を伴う遺伝子導入動物であり得る。本発明の遺伝子導入動物は、本発明のポリペプチドを発現し得る。本発明の遺伝子導入動物はまた、本発明のポリペプチドを上述の細胞又は組織特異的に発現し得る。【０１４１】
本発明の遺伝子導入動物は、自体公知の方法により作製できる。より詳細には、本発明の遺伝子導入動物は、例えば、発生の初期段階において、動物の受精卵又はその他の細胞（例、未受精卵、精子又はそれらの前駆細胞）に、所定のプロモーター（例、上述の細胞又は組織に非特異的又は特異的なプロモーター）に機能可能に連結された本発明のポリヌクレオチド（例、本発明の発現ベクターの形態でもよい）を導入することにより作製できる。遺伝子の導入法としては、例えば、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、凝集法、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクション法が挙げられる。本発明の遺伝子導入動物はまた、このように作製された動物と同種の他の動物（例、上述したような疾患のモデル動物）との交配により作製される動物であってもよい。【０１４２】
別の実施形態では、本発明の動物は、ゲノムの改変を伴う遺伝子欠損動物であり得る。本発明の遺伝子欠損動物は、本発明のポリペプチドを発現し得ない。本発明の遺伝子欠損動物はまた、本発明のポリペプチドを上述の細胞又は組織特異的に発現し得ない。【０１４３】
本発明の遺伝子欠損動物は、自体公知の方法により作製できる。より詳細には、本発明の遺伝子欠損動物は、血球系・破骨細胞特異的遺伝子を特異的に欠損する胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて作製され得る。このようなＥＳ細胞は、例えば、所定のターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入し、該ターゲティングベクターが導入されたＥＳ細胞から、相同組換えを生じたＥＳ細胞を選別することにより作製できる。【０１４４】
ターゲティングベクターとしては、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの特異的な発現不全を引き起こすような相同組換えを誘導し得るターゲティングベクターが用いられ得る。このようなターゲティングベクターは、血球系・破骨細胞特異的遺伝子に相同又は特異的に相同な第一のポリヌクレオチド及び第二のポリヌクレオチド（該ポリヌクレオチドのうち少なくとも一方は、血球系・破骨細胞特異的遺伝子のスプライシングドナーシグナルを含み、かつ該シグナルにおいて、少なくとも１つのアイソフォームを生じるスプライシングを不能とするような変異を含む）、並びに必要に応じて選択マーカーを含む。血球系・破骨細胞特異的遺伝子のスプライシングドナーシグナル、及び該シグナルにおける少なくとも１つのアイソフォームを生じるスプライシングを不能とするような変異は、当業者であれば、容易に決定することができる。第一及び第二のポリヌクレオチドは、血球系・破骨細胞特異的遺伝子に関連するゲノムＤＮＡに対して、相同組換えを生じるのに十分な程度の配列同一性及び長さを有するポリヌクレオチドである。第一及び第二のポリヌクレオチドは、特定のアイソフォームの特異的な欠損がもたらされるように選択される。選択マーカーとしては、ポジティブ選択マーカー（例、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ＢＰＨ）遺伝子、ブラスティシジンＳデアミナーゼ遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子）、ネガティブ選択マーカー（例、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ジフテリア毒素Ａフラグメント（ＤＴＡ）遺伝子）などが挙げられる。ターゲティングベクターは、ポジティブ選択マーカー、ネガティブ選択マーカーのいずれか一方、又は両方を含むことができる。ターゲティングベクターはまた、２以上のリコンビナーゼ標的配列（例、バクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ／ｌｏｘＰシステムで用いられるｌｏｘＰ配列、酵母由来のＦＬＰ／ＦＲＴシステムで用いられるＦＲＴ配列）を含んでいてもよい。本発明はまた、このようなターゲティングベクターを提供する。【０１４５】
ターゲティングベクターをＥＳ細胞に導入する方法としては、自体公知の方法が用いられ得る。このような方法としては、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法／リポソーム法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。ターゲティングベクターが細胞中に導入されると、当該細胞中で血球系・破骨細胞特異的遺伝子に関連するゲノムＤＮＡの相同組換えが生じる。ＥＳ細胞は、任意の動物の胚盤胞から分離した内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養することにより樹立してもよいが、既存のＥＳ細胞を利用してもよい。【０１４６】
相同組換えが生じたＥＳ細胞を選別するため、ターゲティングベクター導入後の細胞がスクリーニングされる。例えば、ポジティブ選別、ネガティブ選別等により選別を行った後に、遺伝子型に基づくスクリーニング（例えば、ＰＣＲ法、サザンブロットハイブリダイゼーション法）を行う。また、得られたＥＳ細胞の核型分析をさらに行うことも好ましい。核型分析では、選別されたＥＳ細胞において染色体異常がないことが確認される。核型分析は、自体公知の方法により行うことができる。なお、ＥＳ細胞の核型は、ターゲティングベクターの導入前に予め確認しておくことが好ましい。【０１４７】
本発明の遺伝子欠損動物は、上記のように得られたＥＳ細胞を胚に導入することにより得られたキメラ胚を動物に移植し、次いで、得られたキメラ動物を交配させることにより作製できる。胚としては、例えば胚盤胞、８細胞期胚などが挙げられる。胚はホルモン剤（例えばＦＳＨ様作用を有するＰＭＳＧ及びＬＨ作用を有するｈＣＧを使用）等により過排卵処理を施した雌動物を、雄動物と交配させること等により得ることができる。ＥＳ細胞を胚に導入する方法としては、マイクロマニピュレーション法、凝集法などが挙げられる。【０１４８】
キメラ胚が移植される動物は好ましくは偽妊娠動物である。偽妊娠動物は、正常性周期の雌動物を、精管結紮等により去勢した雄動物と交配することにより得ることができる。キメラ胚が導入された動物は、妊娠し、キメラ動物を出産する。次いで、出生した動物がキメラ動物か否かが確認される。出生した動物がキメラ動物であるか否かは自体公知の方法により確認でき、例えば、体色や被毛色で判別できる。また、判別のために、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行ってもよい。交配は好ましくは、野生型動物とキメラ動物との間で、又はキメラ動物同士で行われ得る。血球系・破骨細胞特異的遺伝子の欠損が、キメラ動物の生殖系列細胞へ導入され、血球系・破骨細胞特異的遺伝子を欠損するヘテロ接合体子孫が得られたか否かは、自体公知の方法により種々の形質を指標として確認でき、例えば、子孫動物の体色や被毛色により判別できる。また、判別のために、体の一部からＤＮＡを抽出し、サザンブロット解析やＰＣＲアッセイを行ってもよい。さらに、このようにして得られたヘテロ接合体同士を交配させることにより、ホモ接合体を作製できる。本発明の遺伝子欠損動物はまた、このように作製された動物と同種の他の動物（例、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患のモデル動物、遺伝子改変動物）との交配により作製される動物であってもよい。【０１４９】
さらに別の実施形態では、本発明の動物は、ゲノムの改変を伴わない動物であり得る。このような動物は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリペプチドの発現又は機能を調節し得る上述の物質（例、本発明のポリペプチド、アンチセンス分子、ＲＮＡｉ誘導性核酸、抗体、又はこれらの発現ベクター）で動物を処置することにより作製できる。このような動物はまた、局所的な処置により、本発明のポリペプチドを上述の組織特異的に発現し得る動物又は発現し得ない動物であり得る。動物の処置は、本発明の組成物で言及したような方法を用いて行われ得る。【０１５０】
本発明の動物は、例えば、医薬（例、上述したような疾患の予防又は治療薬）、試薬又は食品の開発、血球系に特異的あるいは破骨細胞分化に特異的なさらなるマーカー遺伝子の同定、及び血球系又は破骨細胞の分化に関連する機構の解析に有用であり得る。これらは、例えば、マイクロアレイ、プロテインチップ（例、抗体チップ、又はサイファージェン社製チップ等の非抗体チップ）等を用いて本発明の動物における発現プロファイル（特に血球系又は破骨細胞あるいは造血・リンパ組織の発現プロファイル）を測定し、対照動物の発現プロファイルと比較することを含む、発現プロファイル解析により行われ得る。本発明の動物はまた、上述したような疾患のモデル動物として有用であり得る。【０１５１】
６．測定用手段及び測定方法
本発明は、標的ポリヌクレオチド及びポリペプチドの測定用手段（例、プライマーセット、核酸プローブ、抗体、アプタマー）及び測定方法を提供する。【０１５２】
６．１．プライマーセット及びその使用方法
本発明のプライマーセットは、本発明のポリヌクレオチド又は既知ポリヌクレオチドの特異的な検出及び定量、あるいは本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方の包括的な検出及び定量に使用できる。例えば、このような検出及び定量は、生体試料からの総ＲＮＡの調製後、ＰＣＲ（例、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量的ＰＣＲ）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）（例、WO00/28082参照）、ＩＣＡＮ（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）（例、WO00/56877参照）等の遺伝子増幅法を利用して行うことができる。遺伝子増
幅法の種類に応じて必要とされるプライマー数が異なるため、プライマー数は特に限定されないが、例えば、本発明のプライマーセットは、センス及びアンチセンスプライマーから構成される２以上のプライマーを含み得る。２以上のプライマーは、予め混合されていても、混合されていなくてもよい。センス及びアンチセンスプライマーはそれぞれ、標的領域を特異的に増幅し得るようなサイズである限り特に限定されないが、１２個（例えば少なくとも約１５個、好ましくは少なくとも約１８個、より好ましくは少なくとも約２０個など）の連続するヌクレオチド残基からなる。センス及びアンチセンスプライマーは、それらにより増幅されるポリヌクレオチドのサイズが視認的に検出される場合には、視認的に検出可能であるように設計され得る。視認的に検出可能なサイズは、特に限定されないが、例えば少なくとも約５０個、好ましくは少なくとも７０個、より好ましくは少なくとも約１００個、さらにより好ましくは少なくとも約１５０個、最も好ましくは少なくとも約２００個、約３００個、約４００個、約５００個又はそれ以上のヌクレオチド残基長であり得る。センス及びアンチセンスプライマーはまた、それらにより増幅されるポリヌクレオチドが視認的に検出される必要はなく、リアルタイムＰＣＲにおいて汎用されるように、蛍光シグナル等により検出されてもよい。【０１５３】
本発明のプライマーセットは、ａ）本発明のポリヌクレオチドを既知ポリヌクレオチドから識別可能である、本発明のポリヌクレオチドに特異的なプライマーセット（必要に応じて「特異的なプライマーセットＡ」と省略）、ｂ）既知ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドから識別可能である、既知ポリヌクレオチドに特異的なプライマーセット（必要に応じて「特異的なプライマーセットＢ」と省略）、ｃ）本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドを互いに識別しない、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通するプライマーセット（必要に応じて「共通プライマーセット」と省略）であり得る。【０１５４】
本発明の特異的なプライマーセットＡは、ｉ）増幅される本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズが、増幅される既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズと区別できるように設計されたセンス及びアンチセンスプライマー、あるいはｉｉ）本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのみが増幅され、かつ既知ポリヌクレオチドが増幅されないように設計されたセンス及びアンチセンスプライマーを含み得る。【０１５５】
上記ｉ）のセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、ａ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）よりも５’に存在する核酸配列に対応するセンスプライマー、及び当該核酸配列よりも３’に存在する核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマー、あるいはｂ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）よりも５’に存在する核酸配列に対応するセンスプライマー、及び当該核酸配列よりも３’に存在する核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマーが好ましい。【０１５６】
上記ｉｉ）のセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、ａ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンスプライマー、及び所定のアンチセンスプライマー、ｂ）所定のセンスプライマー、及び上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンスプライマー、あるいはｃ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンス及びアンチセンスプライマーが好ましい。【０１５７】
本発明の特異的なプライマーセットＢは、ｉ）増幅される既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズが、増幅される本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズと区別できるように設計されたセンス及びアンチセンスプライマー、あるいはｉｉ）既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのみが増幅され、かつ本発明のポリヌクレオチドが増幅されないように設計されたセンス及びアンチセンスプライマーを含み得る。【０１５８】
上記ｉ）のセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、ａ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）よりも５’に存在する核酸配列に対応するセンスプライマー、及び当該核酸配列よりも３’に存在する核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマー、あるいはｂ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）よりも５’に存在する核酸配列に対応するセンスプライマー、及び当該核酸配列よりも３’に存在する核酸配列に相補的な核酸配列に対応するアンチセンスプライマーが好ましい。【０１５９】
上記ｉｉ）のセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、ａ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンスプライマー、及び所定のアンチセンスプライマー、ｂ）所定のセンスプライマー、及び上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンスプライマー、あるいはｃ）上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に対応するセンス及びアンチセンスプライマーが好ましい。【０１６０】
本発明の共通プライマーセットは、増幅される既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズが、増幅される本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドのサイズと同一であるように設計されたセンス及びアンチセンスプライマーを含み得る。このようなセンス及びアンチセンスプライマーとしては、例えば、増幅される本発明のポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチド、及び増幅される既知ポリヌクレオチド又はその部分ヌクレオチドが、上記の特異的な部分ヌクレオチドＡ及びＢの核酸配列を含まないように設計されたセンス及びアンチセンスプライマーが好ましい。【０１６１】
６．２．核酸プローブ及びその使用方法
本発明の核酸プローブは、本発明のポリヌクレオチド又は既知ポリヌクレオチドの特異的な検出及び定量、あるいは本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方の包括的な検出及び定量に使用できる。例えば、このような検出及び定量は、生体試料からの総ＲＮＡの調製後、ノザンブロッティング、本発明の核酸プローブが固定化された核酸アレイなどを利用して行うことができる。核酸プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾核酸又はそれらのキメラ分子などであり得るが、安定性、簡便性等を考慮するとＤＮＡが好ましい。核酸プローブはまた、１本鎖又は２本鎖ポリヌクレオチドのいずれでもよい。核酸プローブのサイズは、標的遺伝子の転写産物に特異的にハイブリダイズし得る限り特に限定されないが、例えば少なくとも約１５個又は１６個、好ましくは約１５個〜約１０００個、より好ましくは約２０個〜約５００個、さらにより好ましくは約２５個〜約３００個である。本発明の核酸プローブが１本鎖ポリヌクレオチドである場合、本発明の核酸プローブは本発明のアンチセンス分子と同様であり得る。本発明の核酸プローブが２本鎖ポリヌクレオチドである場合、本発明の核酸プローブは、本発明のアンチセンス分子及びそれに相補的なポリヌクレオチド分子から構成され得る。【０１６２】
本発明の核酸プローブは、ａ）本発明のポリヌクレオチドを既知ポリヌクレオチドから識別可能である、本発明のポリヌクレオチドに特異的な核酸プローブ（必要に応じて「特異的な核酸プローブＡ」と省略）、ｂ）既知ポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドから識別可能である、既知ポリヌクレオチドに特異的な核酸プローブ（必要に応じて「特異的な核酸プローブＢ」と省略）、ｃ）本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドを互いに識別しない、本発明のポリヌクレオチド及び既知ポリヌクレオチドの双方に共通する核酸プローブ（必要に応じて「共通核酸プローブ」と省略）であり得る。【０１６３】
本発明の特異的な核酸プローブＡは、上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチド）、又は上記の特異的な部分ヌクレオチドＡの核酸配列（特に本発明のポリヌクレオチドの挿入核酸配列）及び当該核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（二本鎖ポリヌクレオチド）であり得る。【０１６４】
本発明の特異的な核酸プローブＢは、上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチド）、又は上記の特異的な部分ヌクレオチドＢの核酸配列（特に既知ポリヌクレオチドの挿入核酸配列）及び当該核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（二本鎖ポリヌクレオチド）であり得る。【０１６５】
本発明の共通核酸プローブは、上記の共通部分ヌクレオチドの核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（一本鎖ポリヌクレオチド）、又は上記の共通部分ヌクレオチドの核酸配列及び当該核酸配列に相補的な核酸配列を有するポリヌクレオチド（二本鎖ポリヌクレオチド）であり得る。【０１６６】
本発明の核酸プローブは、支持体上に固定された形態で（即ち、アレイとして）提供されてもよい。このような核酸アレイの支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例えば、ナイロン膜）、ガラス、プラスチック、金属、プレートなどが挙げられる。本発明における核酸アレイの形態としては、自体公知の形態を用いることができ、例えば、支持体上で核酸が直接合成されるアレイ（いわゆるアフィメトリクス方式）、支持体上に核酸が固定化されるアレイ（いわゆるスタンフォード方式）、繊維型アレイ、電気化学的アレイ（ＥＣＡ）が挙げられる。【０１６７】
６．３．抗体及びアプタマー並びにその使用方法
本発明の抗体及びアプタマーは、本発明のポリペプチド、既知ポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の特異的な検出及び定量に使用できる。例えば、このような検出及び定量は、生体試料からの抽出液の調製後、又は生体試料を用いて、免疫学的手法により又は親和性を利用した方法により行なうことができる。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法が挙げられる。親和性を利用した方法は、上述の免疫学的手法に準じて行うことができる。本発明のポリペプチド、既知ポリペプチド、又は本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方の測定に用いられる抗体及びアプタマーは、上述の本発明の抗体及びアプタマーと同様であり得る。【０１６８】
本発明の抗体及びアプタマーは、ａ）本発明のポリペプチドを既知ポリペプチドから識別可能である、本発明のポリペプチドに特異的な抗体及びアプタマー（必要に応じて「特異的な抗体及びアプタマーＡ」と省略）、ｂ）既知ポリペプチドを本発明のポリペプチドから識別可能である、既知ポリペプチドに特異的な抗体及びアプタマー（必要に応じて「特異的な抗体及びアプタマーＢ」と省略）、ｃ）本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドを互いに識別しない、本発明のポリペプチド及び既知ポリペプチドの双方に共通する抗体及びアプタマー（必要に応じて「共通抗体及びアプタマー」と省略）であり得る。本発明の特異的な抗体及びアプタマーＡは、上記の特異的な部分ペプチドＡ（特に本発明のポリペプチドの挿入アミノ酸配列からなる部分ペプチド）に結合し得る。本発明の特異的な抗体及びアプタマーＢは、上記の特異的な部分ペプチドＢ（特に既知ポリペプチドの挿入アミノ酸配列からなる部分ペプチド）に結合し得る。本発明の共通抗体及びアプタマーは、上記の共通部分ペプチドに結合し得る。【０１６９】
本発明の抗体及びアプタマーは、支持体上に固定された形態で（即ち、アレイとして）提供されてもよい。このような核酸アレイの支持体としては、当該分野で通常用いられている支持体であれば特に限定されず、例えば、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチック、金属、プレート（例、マルチウェルプレート）が挙げられる。【０１７０】
６．４．本発明の測定用手段についての補足事項
本発明の測定用手段は、必要に応じて、標識用物質で標識された形態で提供され得る。標識用物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ等の蛍光物質、ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質などが挙げられる。【０１７１】
本発明の測定用手段は、測定用手段に加え、さらなる構成要素を含むキットの形態で提供されてもよい。この場合、キットに含まれる各構成要素は、互いに隔離された形態、例えば、異なる容器に格納された形態で提供され得る。例えば、測定用手段が標識用物質で標識されていない場合、このようなキットは、標識用物質をさらに含み得る。本発明のキットは、２以上の標的遺伝子（例、血球系・破骨細胞特異的遺伝子と既知遺伝子との組合せ、２以上の血球系・破骨細胞特異的遺伝子の組合せ）に対する２以上の測定用手段を含み得る。また、本発明の測定用手段がアレイの形態で提供される場合、本発明のアレイは、２以上の標的遺伝子に対する２以上の測定用手段が固定されたものであり得る。本発明のキット及びアレイはまた、ハウスキーピング遺伝子（例、ＧＡＰＤＨ、β-アクチン）について上述したような測定用手段を含み得る。【０１７２】
６．５．本発明の測定方法
本発明はまた、本発明の測定用手段を用いた、標的ポリペプチド又はポリヌクレオチドの検出又は定量方法を提供する。【０１７３】
標的ポリヌクレオチド及びポリペプチドの測定は、上述の方法により、測定用手段の種類に応じて適切に行われ得る。【０１７４】
本発明の方法では、上述の哺乳動物（例、ヒト）から得られた生体試料、あるいは培養物（例、細胞又は組織培養物）における標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現量が測定され得る。生体試料としては、例えば、標的ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの発現細胞又は組織を含む試料、あるいは標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドが分泌又は漏出等される場合には、このような分泌又は漏出等されたポリヌクレオチド又はポリペプチドを含む動物由来試料（例、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、涙液、尿）である限り特に限定されない。生体試料はまた、上述の細胞又は組織（例、血球系又は破骨細胞あるいは造血・リンパ組織又は滑膜組織）を含むものであり得る。本発明で用いられる生体試料は、特に断らない限り、哺乳動物から予め採取された生体試料であり得るが、特定の局面では、本発明の方法は、哺乳動物から生体試料を採取することを含み得る。【０１７５】
一実施形態では、本発明の方法は、血球系又は破骨細胞の同定、血球系又は破骨細胞の分化状態の判定、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患に対する診断（例、発症又は発症可能性の判定）に利用できる。このような方法は、動物から採取した生体試料において標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現量を測定し、測定された発現量又は相対的な発現比率に基づき対象疾患の発症又は発症可能性を評価することを含み得る。例えば、測定された発現量又は相対的な発現比率が、対象疾患に罹患していない哺乳動物（例、正常動物）における発現量と比較される。対象疾患に罹患していない哺乳動物における発現量又は発現比率は、自体公知の方法により決定できる。このような比較により、動物が対象疾患に罹患している可能性があるか否か、あるいは将来的に罹患する可能性が高いか低いかが判断される。特定の疾患を発症した哺乳動物では、当該疾患に関連する遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知られている。また、特定の疾患の発症前に、特定の遺伝子の発現の変化がしばしば観察されることが知られている。従って、このような解析により、対象疾患の発症又は発症可能性を判断することが可能である。このような方法は、例えば、対象疾患の簡便な判定及び早期の発見に有用であり得る。当然のことながら、本発明の測定用手段及び本発明の試薬又はキットもまた、このような判定に利用され得る。【０１７６】
詳細には、血球系又は破骨細胞あるいは造血・リンパ組織における血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２の発現プロファイルの変化は、実施例に記載の通りである。従って、本発明のポリヌクレオチド及び本発明の部分ヌクレオチド（例、本発明の特異的な部分ヌクレオチドＡ、本発明の特異的な部分ヌクレオチドＢ、本発明の共通部分ヌクレオチド）、並びに本発明のポリペプチド及び本発明の部分ペプチド（例、本発明の特異的な部分ペプチドＡ、本発明の特異的な部分ペプチドＢ、本発明の共通部分ペプチド）の特異的な測定を可能にする本発明の測定用手段を用いて、血球系・破骨細胞特異的遺伝子１〜１２の発現の程度及び／又はそれらの相対的な発現比率を評価することにより、血球系又は破骨細胞の同定、血球系又は破骨細胞の分化状態の判定、あるいは血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患に対する診断が可能である。【０１７７】
別の実施形態では、本発明の方法は、医薬、試薬又は食品等のスクリーニングに利用できる。例えば、一方法論では、スクリーニング方法は、被験物質が血球系又は破骨細胞数を調節（例、増加、減少）し得るか否かを評価することを含み得る。血球系又は破骨細胞数と血球系・破骨細胞特異的遺伝子の発現量は相関し得るので、血球系・破骨細胞特異的遺伝子の発現量を測定することにより、このようなスクリーニングを行うことができる。別の方法論では、スクリーニング方法は、被験物質が標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現又は機能を調節し得るか否かを評価することを含み得る。このようなスクリーニング方法は、例えば、標的の発現又は機能を調節し得る被験物質を選択することを含む、所定の疾患（例、血球系又は破骨細胞の障害に基づく疾患）に対して有効な医薬等のスクリーニング方法、並びに標的の発現又は機能を調節し得ない被験物質を選択することを含む、所定の作用（例、血球系又は破骨細胞の分化調節作用等の副作用）が低減した医薬等のスクリーニング方法として利用できる。スクリーニング方法に供される被験物は、公知又は新規の化合物又は組成物であり得、例えば、核酸、糖質、脂質、タンパク質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分、既存の医薬、試薬又は食品等が挙げられる。スクリーニング方法では、上述したような哺乳動物、細胞及び組織（例、血球系又は破骨細胞あるいは造血・リンパ組織又は滑膜組織）、あるいは再構成系（非細胞系）が用いられ得る。スクリーニング方法により得られる医薬等もまた、本発明により提供される。【０１７８】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【実施例】
【０１７９】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。【０１８０】
実施例１：ヒトcDNAライブラリー作製と配列解析
（１）改良オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製と配列解析
１）mRNA抽出と購入
ヒト組織（下記に示す）より、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989）記載の方法により全RNAとしてmRNAを抽出した。また、ヒト培養細胞やヒト初代培養細胞（下記に示す）をカタログ記載の方法で培養後、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989）記載の方法により全RNAとしてmRNAを抽出した。
以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来」の順に示した。サブトラクションしたものについては、サブトラクトライブラリーの作り方も示した。【０１８１】
＜ヒト組織よりmRNA抽出＞
NTONG：正常舌(Tongue)；CTONG：舌癌(Tongue, Tumor)；FCBBF：胎児脳(Brain, Fetal)；OCBBF：胎児脳(Brain, Fetal)；PLACE：胎盤(Placenta)；SYNOV：滑膜組織(Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis)；CORDB：臍帯血(Cord blood)。【０１８２】
＜培養細胞よりmRNA抽出＞
BNGH4：H4細胞(ATCC #HTB-148)；IMR32：IMR32細胞(ATCC #CCL-127)；SKNMC：SK-N-MC細胞(ATCC #HTB-10)；3NB69：NB69細胞(RCB #RCB0480)；BGGI1：GI1細胞(RCB #RCB0763)；NB9N4：NB9細胞(RCB #RCB0477)；SKNSH：SK-N-SH細胞(RCB #RCB0426)；AHMSC：HMSC細胞(間葉細胞, Human mesenchymal cell)；CHONS：軟骨細胞(Chondrocyte)；ERLTF：TF-1細胞(赤白血病細胞, erythroleukemia)；HELAC：HeLa細胞；JCMLC：白血病細胞(Leukemia, myelogenous)；MESTC：間葉系幹細胞(Mesenchyme stem cell)；N1ESE：間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell)；NCRRM：胎生期癌細胞(Embryonal carcinoma)；NCRRP：胎生期癌細胞(Embryonal carcinoma)をレチノイン酸(RA)処理誘導；T1ESE：間葉系幹細胞(Mesenchymal stem cell) をトリコスタチンと５アザシチジン処理誘導；NT2RM：NT2細胞(STARATAGENE #204101)；NT2RP：NT2細胞をレチノイン酸(RA)処理誘導5週間；NT2RI：NT2細胞をRA処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間；NT2NE：NT2細胞をRA処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収(NT2 Neuron)；NTISM：NT2細胞(STARATAGENE #204101)をRA処理誘導5週間後、生育阻害剤処理を2週間したmRNAから作製したcDNAライブラリーから、未分化NT2細胞のmRNAと重複するｃDNAをSubtract Kit (Invitrogen #K4320-01)を用いてサブトラクトしたライブラリー(NT2RI−NT2RM)。RCBは、理化学研究所ジーンバンク・細胞開発銀行より分譲をうけたものであり、ATCCは、American Type Culture Collectionより分譲をうけたものである。【０１８３】
＜初代培養細胞よりmRNA抽出＞
ASTRO：正常神経膠星状細胞(Normal Human Astrocyte) NHA5732, 宝酒造 #CC2565；DFNES：新生児正常皮膚繊維芽細胞(Normal Human Dermal Fibroblasts (Neonatal Skin); NHDF-Neo) NHDF2564, 宝酒造 #CC2509；MESAN：正常メサンギウム細胞(Normal human mesangial cells) NHMC56046-2, 宝酒造 #CC2559；NHNPC：正常神経前駆細胞(Normal human neural progenitor cells) NHNP5958, 宝酒造 #CC2599；PEBLM：正常末梢血単核細胞(Human peripheral blood mononuclear cells) HPBMC5939, 宝酒造 #CC2702；HSYRA：滑膜細胞HS-RA(Human synoviocytes from rheumatioid arthritis), 東洋紡 #T404K-05；PUAEN：正常肺動脈内皮細胞(Human pulmonary artery endothelial cells), 東洋紡 #T302K-05；UMVEN：正常臍帯静脈内皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells) HUVEC, 東洋紡 #T200K-05；HCASM：正常冠動脈平滑筋細胞HCASMC(Human coronary artery smooth muscle cells), 東洋紡 #T305K-05；HCHON：正常軟骨細胞HC(Human Chondrocytes), 東洋紡 #T402K-05；HHDPC：正常頭髪毛乳頭細胞HDPC(Human dermal papilla cells), 東洋紡#THPCK-001；CD34C：CD34+細胞(AllCells, LLC #CB14435M)；D3OST：CD34+細胞を破骨細胞分化因子(ODF)処理誘導3日間；D6OST：CD34+細胞をODF処理誘導6日間；D9OST：CD34+細胞をODF処理誘導9日間；ACTVT：活性化T細胞(Activated T-cell)；LYMPB：リンパ芽球(Lymphoblast, EB virus transferred B cell)；NETRP：好中球(Neutrophil)。【０１８４】
次いで、以下に示すヒト組織より全RNAとして抽出されたmRNAを購入した。以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来」の順に示した。サブトラクションしたものについては、サブトラクトライブラリーの作り方も示した。【０１８５】
＜ヒト組織よりのmRNAを全RNAで購入＞
ADRGL：副腎(Adrenal gland), CLONTECH #64016-1；BRACE：小脳(Brain, cerebellum), CLONTECH #64035-1；BRAWH：全脳(Brain, whole), CLONTECH #64020-1；FEBRA：胎児脳(Brain, Fetal), CLONTECH #64019-1；FELIV：胎児肝臓(Liver, Fetal), CLONTECH #64018-1；HEART：心臓(Heart), CLONTECH #64025-1；HLUNG：肺(Lung), CLONTECH #64023-1；KIDNE：腎臓(Kidney), CLONTECH #64030-1；LIVER：肝臓(Liver), CLONTECH #64022-1；MAMGL：乳腺(Mammary Gland), CLONTECH #64037-1；PANCR：膵臓(Pancreas), CLONTECH #64031-1；PROST：前立腺(Prostate), CLONTECH #64038-1；SALGL：唾液腺(Salivary Gland), CLONTECH #64026-1；SKMUS：骨格筋(Skeletal Muscle), CLONTECH #64033-1；SMINT：小腸(Small Intestine), CLONTECH #64039-1；SPLEN：脾臓(Spleen), CLONTECH #64034-1；STOMA：胃(Stomach), CLONTECH #64090-1；TBAES：乳癌(Breast, Tumor), CLONTECH #64015-1；TCERX：子宮頸管癌(Cervix, Tumor), CLONTECH #64010-1；TCOLN：結腸癌(Colon, Tumor), CLONTECH #64014-1；TESTI：精巣(Testis), CLONTECH #64027-1；THYMU：胸腺(Thymus), CLONTECH #64028-1；TLUNG：肺癌(Lung, Tumor), CLONTECH #64013-1；TOVAR：卵巣癌(Ovary, Tumor), CLONTECH #64011-1；TRACH：気管(Trachea), CLONTECH #64091-1；TUTER：子宮癌(Uterus, Tumor), CLONTECH #64008-1；UTERU：子宮(Uterus), CLONTECH #64029-1；ADIPS：脂肪組織(Adipose), Invitrogen #D6005-01；BLADE：膀胱(Bladder), Invitrogen #D6020-01；BRALZ：アルツハイマー患者大脳皮質(Brain, cortex, Alzheimer), Invitrogen #D6830-01；CERVX：子宮頸管(Cervix), Invitrogen #D6047-01；COLON：結腸(Colon), Invitrogen #D6050-0；NESOP：食道(Esophagus), Invitrogen #D6060-01；PERIC：心膜(Pericardium), Invitrogen #D6105-01；RECTM：直腸(Rectum), Invitrogen #D6110-01；TESOP：食道癌(Esophageal, Tumor), Invitrogen #D6860-01；TKIDN：腎臓癌(Kidney, Tumor), Invitrogen #D6870-01；TLIVE：肝臓癌(Liver, Tumor), Invitrogen #D6880-01；TSTOM：胃癌(Stomach, Tumor), Invitrogen #D6920-01；BEAST：成人乳房(Adult Breast), STARATAGENE #735044；FEHRT：胎児心臓(Heart, Fetal), STARATAGENE #738012；FEKID：胎児腎臓(Kidney, Fetal), STARATAGENE #738014；FELNG：胎児肺(Lung, Fetal), STARATAGENE #738020；NOVAR：成人卵巣(Adult Ovary), STARATAGENE #735260；BRASW：アルツハイマー患者大脳皮質組織［BRALZ：アルツハイマー患者大脳皮質(Brain, cortex, Alzheimer), Invitrogen #D6830-01］のmRNAから作製したcDNAライブラリーから、全脳組織［BRAWH：全脳(Brain, whole), CLONTECH #64020-1］のmRNAと重複するｃDNAをSubtract Kit (Invitrogen #K4320-01)を用いてサブトラクトしたライブラリー(BRALZ−BRAWH)。【０１８６】
さらに、次に示すヒト組織よりポリA(+) RNAとして抽出・精製されたmRNAを購入した。各組織由来のポリA(+) RNAに、ポリA(-)RNAを混ぜたRNAからcDNAライブラリーを作製した。ポリA(-)RNAは、全脳(Brain, whole), CLONTECH #64020-1の全RNAからポリA(+)RNAをオリゴdTセルロースで除くことにより調製した。以下にライブラリー名とその由来の関係を、「ライブラリー名：由来」の順に示した。【０１８７】
＜ヒト組織よりのmRNAをポリA(+) RNAで購入＞
BRAMY：扁桃(Brain, amygdala), CLONTECH #6574-1；BRCAN：尾状核(Brain, caudate nucleus), CLONTECH #6575-1；BRCOC：脳梁(Brain, corpus callosum), CLONTECH #6577-1；BRHIP：海馬(Brain, hippocampus), CLONTECH #6578-1；BRSSN：黒質(Brain, substantianigra), CLONTECH #6580-1；BRSTN：視床下核(Brain, subthalamic nucleus), CLONTECH #6581-1；BRTHA：視床(Brain, thalamus), CLONTECH #6582-1。【０１８８】
２）改良オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製
それぞれのRNAよりオリゴキャプ法[M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994)]を改良した方法（WO 01/04286）によりcDNAライブラリーを作製した。Oligo-cap linker（配列番号：１）及びOligo dT primer（配列番号：２）を用いて、WO 01/04286に記載したようにBAP（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理、TAP（Tobacco Acid Pyrophosphatase）処理、RNAライゲーション、第一鎖cDNAの合成とRNAの除去を行った。次いで、5'（配列番号：３）と3'（配列番号：４）のPCRプライマーを用いPCR (polymerase chain reaction)により2本鎖cDNAに変換し、SfiIで切断した。次いで、通常は2kb以上（場合によっては3kb以上）に分画したcDNA断片をDraIIIで切断したベクターpME18SFL3（GenBank AB009864, Expression vector）にcDNAの方向性を決めてクローニングし、cDNAライブラリーを作製した。
cDNAの５’-末端配列解析に用いたcDNAライブラリー名とその由来の関係を表1-1〜1-6に示す。また、ヒトゲノムにマップ後の各cDNAライブラリーのcDNAの５’-末端配列数も表1-1〜1-6に示す。【０１８９】
３）改良オリゴキャップ法で作製したcDNAライブラリーからのｃDNAの5'-末端配列解析
各cDNAライブラリーより取得したcDNAの5'-末端の核酸配列をDNAシーケンシング試薬（BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、DNAシーケンサー（ABI PRISM 3700, PE Biosystems社製）で解析した。得られたデータについてはデータベース化を行った。改良オリゴキャップ法で作製した各cDNAライブラリーの5'-末端の全長率は、平均９０％で高全長率であった（既知mRNAのタンパク質コード領域を指標にして算出した）。【０１９０】
４）全長cDNA核酸配列解析
全長cDNA核酸配列解析に選抜されたcDNAについて各々全長cDNAの核酸配列を決定した。核酸配列は、主にカスタム合成DNAプライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によるプライマーウォーキング法によって決定した。すなわち、カスタム合成DNAプライマーを用い、PE Biosystems社製のDNAシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応後、同社製のシーケンサーを用いてDNA核酸配列を解析した。全長核酸配列は上記方法により決定された部分核酸配列を完全にオーバーラップさせ最終的に確定した。次に、決定された全長cDNA核酸配列から、タンパク質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。【０１９１】
（２）オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製と配列解析
１）オリゴキャップ法によるcDNAライブラリーの作製
ヒト胎児精巣由来のテラトカルシノーマ細胞でレチノイン酸処理により神経細胞に分化可能なNT-2神経前駆細胞（Stratagene社より購入）を、添付のマニュアルにしたがって次のように処理したものを用いた。
・NT-2細胞をレチノイン酸で誘導しないで培養（NT2RM）
・NT-2細胞を培養後、レチノイン酸を添加して誘導後、2日間及び2週間培養（NT2RP）
また、ヒト培養細胞SK-N-MC（ATCC HTB-10）（SKNMC）、ヒト培養細胞Y79（ATCC HTB-18）（Y79AA）、ヒト培養細胞GI1（RCB RCB0763)（BGGI1）、ヒト培養細胞H4（ATCC HTB-148)（BNGH4）、ヒト培養細胞IMR32（ATCC CCL-127)（IMR32）、ヒト培養細胞NB9(RCB #RCB0477)（NB9N4）をカタログ記載の方法で培養した。RCBは、理化学研究所ジーンバンク・細胞開発銀行より分譲をうけたものであり、ATCCは、American Type Culture Collectionより分譲をうけたものである。
以上の培養細胞をそれぞれ集めて、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press 1989）記載の方法によりmRNAを抽出した。さらに、オリゴdTセルロースでpoly(A)+ RNAを精製した。
同様に、ヒト胎盤組織（PLACE）、ヒト卵巣癌組織（OVARC）、ヒト10週令胎児より頭部を多く含む組織（HEMBA）、ヒト10週令胎児より胴体部分を多く含む組織（HEMBB）、ヒト乳腺組織（MAMMA）、ヒト甲状腺組織（THYRO）、ヒト血管内皮組織の初代培養細胞（VESEN）より、文献（J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis, Molecular Cloning Second edition, Cold Spring harbor Laboratory Press, 1989）記載の方法によりmRNAを抽出した。さらに、オリゴdTセルロースでpoly(A)+ RNAを精製した。
以上の全てのpoly(A)+ RNAよりオリゴキャプ法 [M. Maruyama and S. Sugano, Gene, 138: 171-174 (1994)]により、それぞれcDNAライブラリーを作製した。Oligo-cap linker（配列番号：１）及びOligo dT primer（配列番号：２）を用いて文献 [鈴木・菅野, 蛋白質 核酸 酵素, 41: 197-201 (1996)、 Y. Suzuki et al., Gene, 200: 149-156 (1997)]に書いてあるようにBAP（Bacterial Alkaline Phosphatase）処理、TAP（Tobacco Acid Phosphatase）処理、RNAライゲーション、第一鎖cDNAの合成とRNAの除去を行った。次いで、5'（配列番号：３）と3'（配列番号：４）のPCRプライマーを用いPCR (polymerase chain reaction)により2本鎖cDNAに変換し、SfiI切断した。次いで、DraIIIで切断したベクターpUC19FL3（NT2RMとNT2RPの一部のみ）又はpME18SFL3（GenBank AB009864, Expression vector）にcDNAの方向性を決めてクローニングし、cDNAライブラリーを作製した。
cDNAの５’-末端配列解析に用いたcDNAライブラリー名とその由来の関係を表1-1〜1-6に示す。また、ヒトゲノムにマップ後の各cDNAライブラリーのcDNAの５’-末端配列数も表1-1〜1-6に示す。【０１９２】
【表１−１】
2008114709.tif 000002
【０１９３】
【表１−２】
2008114709.tif 000003
【０１９４】
【表１−３】
2008114709.tif 000004
【０１９５】
【表１−４】
2008114709.tif 000005
【０１９６】
【表１−５】
2008114709.tif 000006
【０１９７】
【表１−６】
2008114709.tif 000007
２）オリゴキャップ法で作製したcDNAライブラリーからのcDNAの5'-末端配列解析
各cDNAライブラリーより取得したcDNAの5’-端又は3'-端の核酸配列をDNAシーケンシング試薬（Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit又はBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit, PE Biosystems社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、DNAシーケンサー（ABI PRISM 377, PE Biosystems社製）でDNA核酸配列を解析した。得られたデータをデータベース化した。オリゴキャップ法で作製した各cDNAライブラリーの5'-末端の全長率は、平均６０％であった（既知mRNAのタンパク質コード領域を指標にして算出した）。【０１９８】
３）全長cDNA核酸配列解析
全長cDNA核酸配列解析に選抜されたcDNAについて各々全長cDNAの核酸配列を決定した。核酸配列は、主にカスタム合成DNAプライマーを用いたダイデオキシターミネーター法によるプライマーウォーキング法によって決定した。すなわち、カスタム合成DNAプライマーを用い、PE Biosystems社製のDNAシーケンシング試薬でマニュアルに従ってシーケンシング反応後、同社製のシーケンサーを用いてDNA核酸配列を解析した。一部のクローンについては、Licor社製DNAシーケンサーも利用した。また、一部のｃDNAについてはカスタムプライマーを用いずcDNA が含まれるプラスミドをランダムに切断するショットガン法を用いて同様にDNAシーケンサーでDNA核酸配列を決定した。全長核酸配列は上記方法により決定された部分核酸配列を完全にオーバーラップさせ最終的に確定した。次に、決定された全長核酸配列から、タンパク質への翻訳領域を推定しアミノ酸配列を求めた。【０１９９】
実施例２：ゲノムマッピングとクラスタリング
（１）配列データセット
以下の配列をデータセットとして使用した。
・ヒトゲノム配列：UCSC hg 17 (NCBI Build 35)（http://www.genome.ucsc.edu/）
・我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったヒト全長cDNA 19,265配列
・我々が取得し全長cDNA配列解析を行い既存の公共データベース（DDBJ / GenBank / EMBL）に登録済みのヒト全長cDNA配列（アクセッション番号: AB038269, AB045981, AB056476, AB056477, AK000001〜AK002212, AK021413〜AK027260, AK027263〜AK027902, AK054561〜AK058202, AK074029〜AK074481, AK074483〜AK075325, AK075326〜AK075566, AK090395〜AK098842, AK122580〜AK129030, AK129488〜AK131107, AK131190〜AK131575, AK160364〜AK160386, AK172724〜AK172740, AK172741〜AK172866）のうちゲノムマッピングに使用可能な30,754配列
・2005年2月3日までに財団法人かずさDNA研究所のデータベースHUGEに登録されていた2039配列(http://www.kazusa.or.jp/huge/) 
・2005年1月30日までにMammalian Gene Collection (http://mgc.nci.nih.gov/) のWebページのFull Length Clone Listに記載され、かつGenBenk gbpri (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/) に含まれていたヒト全長cDNA 20,878配列
・2005年1月30日までのGenBenk gbpriにDeutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)として登録のあったヒト全長cDNA 9,280配列
・2005年1月31日版のヒトRefSeq配列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/）の構成配列でmRNAとして登録され、かつGenBenk gbpri に含まれていたヒト全長cDNA 13,984配列
・2005年1月31日版のヒトRefSeq配列（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/）28,931配列
・2005年2月10日のEnsembl（http://www.ensembl.org/）のヒトゲノムアセンブル配列（NCBI35.nov_26.35）のうち、UCSC（University of California, Santa Cruz, http://www.genome.ucsc.edu/）にてhg 17ヒトゲノムへマッピング済みであった NCBI35.nov_26.35の33,666配列
・我々のプロジェクトにおいて配列解析を行ったヒトcDNA 5'末端配列 1,456,213配列、及び 3'末端配列 109,283配列 (うち公開済み配列アクセッション番号：AU116788〜AU160826, AU279383〜AU280837, DA000001〜DA999999, DB000001〜DB384947)【０２００】
（２）ゲノムマッピング
上記データセットをBLASTN（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/）を用いて相同性（Identity） 95%以上、コンセンサス長50塩基対（bp）以上の条件下でゲノムマッピングを行った。マッピングに使用したデータセットの約99％の配列がゲノムマッピングできた。【０２０１】
（３）クラスタリング
ゲノムマッピング後、ゲノム領域に含まれる配列群を1つの固まりとしてクラスターを形成させた。つまり、各クラスターは、配列群の各ゲノム領域の両端の外側が各ゲノム領域にマップされた配列に重なりがなくなるように選択されたものである。その結果、全部で 87,173クラスター存在した。そこから我々のプロジェクトにおいて取得し配列解析を行ったヒトcDNA 3'末端配列のみによって構成される17,535クラスターを除外すると、69,638クラスターとなった。このうち、36,782クラスターは、我々のプロジェクトにおいて取得し配列解析を行ったヒトcDNA 5'末端配列のみによって構成されていたので除外した（全長cDNA、RefSeq、Ensembl配列が存在しないものは除外した）。この結果、全長cDNA、RefSeq、Ensembl配列を1つでも含むクラスターは、32,856クラスターであった。そのうち一定水準以上の信頼性のあるORF（open reading frame, 翻訳領域）が予測される全長cDNA、RefSeq、Ensembl配列を1本以上含むクラスターを選択することにより、21,703クラスターを取得した。この21,703クラスターについて発現特異性判別を行った。【０２０２】
実施例３：リアルタイムPCRの実験方法
（１）鋳型 （Template） cDNAの合成
１）ヒトmRNA（Human Total RNA）を鋳型に用いた場合
Human Total RNA 50μgに対して150μlの系にて反応を行った。
87μlのH2Oに溶解した50μg のTotal RNAに10μlのランダムプライマー （濃度65ng/μl）と7.5μlのdNTP Mix （濃度10mM each dNTP Mix）を加えた。65℃ 5分インキュベート、氷上で1分インキュベートした。30μlの5×反応緩衝液 （Invitrogen SuperScript III RTキットに添付）と7.5μlの0.1M DTTと3μlのRNase Inhibitor（STRATAGENE）と5μlのSuperScript III RT（Invitrogen）を加えた。25℃ 5分インキュベート、50℃ 60分インキュベート、70℃ 15分インキュベートした。反応後、フェノール・クロロホルム抽出を行い、酵素を失活させた。3μlのEDTA （0.5M）と22.5μlの0.1N NaOHを加えることでアルカリ処理を行い、RNAの分解を行った。30μlのTris （1M pH 7.8）を加えて、反応液を中和した後、エタノール沈殿を行い、100μlのTE緩衝液に溶解した。
mRNAソースからのヒトmRNA（Human  Total RNA）については、実施例１に記載した方法により取得した。
実験に使用したヒトmRNAのリストを表2に示した。【０２０３】
【表２】
2008114709.tif 000008
【０２０４】
（２）プライマー（Primer）とプローブ（Probe）の設計
Applied Biosystems社のリアルタイムPCR 7500 Fastに付属されているPrimer設計ソフト Primer Express software 3.0を用いて、ソフトが推奨する条件内で比較検討したいcDNAと同じ染色体領域から転写されるほかのスプライスパターンをもつcDNAを個別に検出できるように、変化領域の境界となる部分の配列を用いて、Primer, Probeの設計を行った。また、それらの設計したPrimerを用いて、リアルタイムPCRを行い、それらのバンドが単一であり、1種類のcDNAのみを特異的に検出できることについては、確認を行った。【０２０５】
（３）リアルタイムPCRを用いた発現解析
１）使用したmRNA
使用したmRNAは全てヒト由来である。
12の実験系のうちクラスターchr7+1084、chr7-1842、chr7+710、chr2+1780、chr3+1925、chr11+275、chr1+3150、chr7-669、chr6-1987、chr12+613、chr4-770、の11クラスターの実験ではリアルタイムPCRの反応系としてSYBR GREENを用い、テンプレートcDNAとして、骨髄 （Bone Marrow）、胸腺 （Thymus）、脾臓 （Spleen）、CD34+細胞（CD34+）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導3日間（CD34+ ODF 3days）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子(ODF) 処理誘導6日間 (CD34+ ODF 6days)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導9日間 (CD34+ ODF 9days)、滑膜 (Synovial)、Jurkat細胞(Jurkat)、脊髄 （Spinal Cord）、脳 （Brain, whole）、内臓組織混合物 (Mix, viscus tissues) ［心臓 （Heart）、腎臓 （Kidney）、肝臓 （Liver）、肺 （Lung）、結腸 （Colon）、胃（Stomach）］計12種のサンプルを用いた実験を行った。
12の実験系のうちクラスターchr5+2320の1クラスターの実験ではリアルタイムPCRの反応系としてApplied Biosystems社製の TaqManを用い、テンプレートcDNAとして、骨髄 （Bone Marrow）、胸腺 （Thymus）、脾臓 （Spleen）、CD34+細胞（CD34+）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）、 CD34+細胞を破骨細胞分化因子(ODF) 処理誘導6日間 (CD34+ ODF 6days)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導9日間 (CD34+ ODF 9days)、滑膜 (Synovial)、Jurkat細胞(Jurkat)、脊髄 （Spinal Cord）、脳 （Brain, whole）、内臓組織混合物 (Mix, viscus tissues) ［心臓 （Heart）、腎臓 （Kidney）、肝臓 （Liver）、肺 （Lung）、結腸 （Colon）、胃 （Stomach）］計12種のサンプルを用いた実験を行った。【０２０６】
２）SYBR GREENを用いた場合の反応系
SYBR GREEN I DyeアッセイケミストリーはSYBR GREENが2本鎖DNAに結合することで強い蛍光を発する特徴を利用した実験系である。PCR反応時、DNAが一本鎖に変性する際SYBR GREENはDNAから遊離し蛍光は急激に減少するが、その後のアニーリング・伸張反応に伴い2本鎖DNAに結合し再び蛍光を発する。SYBR GREEN I DyeアッセイケミストリーではPCRサイクル毎に増加する蛍光強度を検出するものである。
鋳型としてそれぞれの組織由来のcDNA 0.2μl （Total RNAに換算して 100ng相当）に、Forward Primer （最終濃度250nM）、Reverse Primer （最終濃度250nM）、SYBR Green PCR Master Mix (ABI 4309155) を加えて全量を20μlにした。内在性コントロールとして常に全てのテンプレートにGAPDH (Accession No; NM_002046.2) を反応コントロールとしておいた。
Applied Biosystems社のリアルタイムPCR 7500 Fastの標準プロトコールである以下の条件でPCRを行った。初期ステップ 50℃ 2分, 95℃ 10分後、変性95℃ 15秒、アニール伸長60℃ 1分を40サイクル繰り返した。
GAPDH-F (配列番号５) ：内在性コントロールGAPDHのForward Primer 
GAPDH-R (配列番号６) ：内在性コントロールGAPDHのReverse Primer【０２０７】
３）TaqManを用いた場合の反応系
TaqManアッセイケミストリーは、3’末端をリン酸化したプローブの5’末端にFluorescenin系の蛍光色素（リポーター）、3’末端にRhodamine系の蛍光色素（クエンチャー）をラベルしたTaqManプローブを用いる実験系である。TaqManプローブは単体で存在する際にはリポーターの励起光を照射しても蛍光波長がクエンチャーと近似している為、リポーターの蛍光エネルギーがクエンチャーの励起エネルギーとして使用され、リポーターの蛍光が抑制される。しかし、PCR反応時プライマーよりの伸張反応中、TaqManプローブがDNAポリメラーゼの5’-3’エキソヌクレアーゼ活性により分解されると、リポーター蛍光色素がTaqManプローブの5’末端より遊離し、クエンチャー蛍光色素と距離が離れる事で蛍光を発する。TaqManアッセイケミストリーでは、PCRサイクル毎に増加するリポーターの発する蛍光強度を検出するものである。
鋳型としてそれぞれの組織由来のcDNA 0.2μl （Total RNAに換算して 100ng相当）に、Forward Primer （最終濃度900nM）、Reverse Primer （最終濃度900nM）、TaqMan Probe （最終濃度250nM）、TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (ABI 466073) を加えて全量を20μlにした。内在性コントロールとして常に全てのテンプレートにGAPDHの反応コントロールをおいた。
Applied Biosystems社のリアルタイムPCR 7500 FastのFastプロトコールである以下の条件でPCRを行った。酵素Activation 95℃ 20秒後、変性95℃ 3秒、アニール伸長60℃ 30秒を40サイクル繰り返した。
GAPDH-Probe (配列番号７) ：内在性コントロールGAPDHのTaqMan Probe 【０２０８】
（４）データの統計解析方法
相対定量方法を用いて結果を解析した。
Applied Biosystems社のリアルタイムPCR 7500 FastのRQ studyソフトを用いて、増幅曲線の指数関数的増幅領域に閾値(Threshold)を設定。その時のサイクル数をCt (Threshold cycle) とした。初期RNA量を補正するために、得られたCtから内在性コントロールであるGAPDHのCtを引いた値を算出、それをdCtとした。[dCt = Target Ct - ENDOGENUS Ct (GAPDH)]  得られたdCtからさらに基準となるサンプル （コントロール）のdCtを引いた値を算出、それをddCtとした。[ddCt = Target dCt - Control dCt]その値をもとに、相対値を算出、それをRQとした。[RQ = 2 -ddCt]その結果をもとに、ログ系でグラフを作製、それぞれのPrimer, Probeでの増幅量つまり発現量を比較した。
各実施例において、RQ及びLog10RQの解析結果を示した。RQの数値は小数点1桁で表示した。リアルタイムPCRで検出出来なかったものについては、RQ数値及びLog10RQの数値のところに”Undet.”と記載した。Log10RQの数値は小数点2桁で表示した。ただし、コントロールの正常内臓組織を混合させたサンプル（Mix, viscus tissues）（RQ数値“1.0”）については、Log10RQ の数値のところに“0.0”と記載した（実施例9のみ全脳（Brain, whole）をコントロールとして使用）。【０２０９】
実施例４：クラスターchr7-669（データセット：047）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr7-669 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体7番、115,150,000 bp〜115,400,000 bp) にゲノムマッピングされた8配列の全長cDNA [D-SYNOV4003692.1, AL110232.1, BC029891.1, BX538223.1, D43945.1, ENST00000265440, ENST00000320239, NM_012252.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより4種類に分類されるが、転写開始点に注目すると主なものとして以下の2種類が存在した。
[1] D-SYNOV4003692.1
[2] D43945.1, ENST00000265440, NM_012252.1
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]よりも上流にある染色体領域より発現するため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２１０】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-SYNOV4003692.1（[1]）の特徴
047_[1]_1-N0 (配列番号8) : D-SYNOV4003692.1の核酸配列全領域
047_[1]_1-NA0 (配列番号9) : D-SYNOV4003692.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
047_[1]_1-A0 (配列番号10) : D-SYNOV4003692.1のアミノ配列全領域
D-SYNOV4003692.1の1〜373塩基 (配列番号11) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_012252.1では存在しないエクソンが挿入するバリアントでNM_012252.1と相同性がない。この挿入するエクソン上に翻訳開始点と存在する為、NM_012252.1と比較するとN末端のアミノ酸が90残基 (配列番号12) 異なっていた。
また、D-SYNOV4003692.1の1,110〜1,245塩基 (配列番号15) は既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_012252.1では存在しないエクソンが挿入するバリアントでNM_012252.1と相同性がない。この挿入するエクソン上に翻訳終止点と存在する為、NM_012252.1と比較するとC末端のアミノ酸が5残基 (配列番号16) 異なっていた。
047_[1]_1-N1 (配列番号11) : D-SYNOV4003692.1の373塩基の挿入核酸配列領域
047_[1]_1-A1 (配列番号12) : D-SYNOV4003692.1の90残基の挿入アミノ配列領域
047_[1]_1-N2 (配列番号13) : D-SYNOV4003692.1の373塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
047_[1]_1-A2 (配列番号14) : D-SYNOV4003692.1の373塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域
047_[1]_1-N3 (配列番号15) : D-SYNOV4003692.1の136塩基の挿入核酸配列領域
047_[1]_1-A3 (配列番号16) : D-SYNOV4003692.1の5残基の挿入アミノ配列領域
047_[1]_1-N4 (配列番号17) : D-SYNOV4003692.1の136塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
047_[1]_1-A4 (配列番号16と同一) : D-SYNOV4003692.1の136塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域【０２１１】
3）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
047_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer047_01F (配列番号18) とPrimer047_01R (配列番号19) によって増幅される断片047_01 (配列番号20)
047_02 - 既存の公共DBに登録されている[2]の転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer047_02F (配列番号21) とPrimer047_02R (配列番号22) によって増幅される断片047_02 (配列番号23)
047_05 - [1]、[2]が共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer047_05F (配列番号24) とPrimer047_05R (配列番号25) によって増幅される断片047_05 (配列番号26)
上記に示された[1]、[2]のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が2配列存在し、その由来は滑膜組織 (Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) が2配列 (解析母数 27,489)であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [2]のパターンでは5’末端配列が8配列存在し、その由来はCD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導9日間(D9OST) が2配列 (解析母数 4,407)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導3日間(D3OST) が1配列 (解析母数 5,092)、正常末梢血単核細胞 (Human peripheral blood mononuclear cells) が1配列 (解析母数 7,900)、膀胱 (Bladder) が1配列 (解析母数 8,431)、胃 (Stomach) が1配列 (解析母数 8,685)、肺 (Lung) が1配列 (解析母数 16,146)、気管(Trachea) が1配列 (解析母数 52,352) であった。
この結果より、[1]の転写開始点は、滑膜組織 (Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) での発現が多いことがわかった。また、[2]の転写開始点では、様々な組織での発現がみられた。これにより、滑膜組織(Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) とそれ以外の組織では、この染色体領域において、転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。【０２１２】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系組織の中でもどのような組織、どのような状態のときに発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表3に示した。【０２１３】
【表３】
2008114709.tif 000009
【０２１４】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳 （Brain, whole） を用いて比較した。
047_01 (配列番号20) と047_02 (配列番号23) で比較される転写開始点の選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織で大きく変化していた。
骨髄 （Bone Marrow）、CD34+細胞（CD34+）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子（ODF） 処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）、CD34+細胞をODF処理誘導6日間 (CD34+ ODF 6days)、CD34+細胞をODF処理誘導9日間 (CD34+ ODF 9days)及び脊髄（Spinal Cord）では047_02 (配列番号23) で表される下流の既知の転写開始点からの転写物（mRNA）が多いのだが、滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）では、047_01 (配列番号20) で表される新たに取得した上流の転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった（表3）。
つまり滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）では、他の組織とは異なり転写因子もしくは、転写機構によって転写開始点に多様性があることで、ORF領域の異なるmRNAが発現していた。
これらの結果より、047_01 (配列番号20) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）047_[1]_1-N1 (配列番号11) の発現を比較することにより、リューマチ患者の滑膜 (Synovial) 組織に特異的な治療・診断マーカーとして利用することが可能であることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についてもリューマチ患者の滑膜 (Synovial) 組織に特異的な治療・診断マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-SYNOV4003692.1においてPrimer047_01R (配列番号19) がプライミングする361〜380塩基目を含む上流配列047_[1]_1-N5 (配列番号27)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer047_01F (配列番号18) とPrimer047_01R (配列番号19) によって増幅される領域047_01 (配列番号20)【０２１５】
実施例５：クラスターchr7-1842（データセット：002）
（１）クラスターの解析
1）クラスターの特徴
クラスターchr7-1842 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体7番、36,325,000 bp〜36,550,000 bp) にゲノムマッピングされた6配列の全長cDNA [D-D3OST2001534.1, D-NETRP1000046.1, BC025698.1, ENST00000258749, M62840.1, NM_001637.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより以下のように3種類に分類できた。
[1] D-D3OST2001534.1
[2] D-NETRP1000046.1
[3] BC025698.1, ENST00000258749, M62840.1, NM_001637.1
[1]、[2]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DB（DDBJ / Genbank / EMBL） に登録されていた[3]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[3]と同じ転写開始点、翻訳開始点をもつが、[3]の第2エクソンに相当する領域が欠失しているため、ORF領域が異なっていた。
[2]は、[1]、[3]よりも下流にある染色体領域より発現し、相同性のないエクソン上に翻訳開始点をもつため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[3]の3種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、エクソンが欠失することや、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２１６】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-D3OST2001534.1（[1]）の特徴
002_[1]_1-N0 (配列番号28) : D-D3OST2001534.1の核酸配列全領域
002_[1]_1-NA0 (配列番号29) : D-D3OST2001534.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
002_[1]_1-A0 (配列番号30) : D-D3OST2001534.1のアミノ配列全領域
既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_001637.1の402〜497塩基に存在する96塩基のエクソン (配列番号33) がD-D3OST2001534.1の414〜415塩基の領域には存在せず欠失している。その為、NM_001637.1と比較するとアミノ酸長が32残基短くなっていた。
002_[1]_1-N1 (配列番号31) : D-D3OST2001534.1の欠失核酸配列領域
002_[1]_1-A1 (配列番号32) : D-D3OST2001534.1の変化しているアミノ配列領域
002_[1]_1-N2 (配列番号31と同一) : D-D3OST2001534.1の欠失領域中のORF核酸配列領域
002_[1]_1-A2 (配列番号32と同一) : D-D3OST2001534.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
002_[1]_C-N1 (配列番号33) : D-D3OST2001534.1の414〜415塩基の領域に挿入されるNM_001637.1の402〜497塩基に存在する96塩基の挿入核酸配列
002_[1]_C-A1 (配列番号34) : D-D3OST2001534.1の414〜415塩基の領域に挿入されるNM_001637.1の402〜497塩基に存在する96塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域。【０２１７】
３）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NETRP1000046.1（[2]）の特徴
002_[2]_1-N0 (配列番号35) : D-NETRP1000046.1の核酸配列全領域
002_[2]_1-NA0 (配列番号36) : D-NETRP1000046.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
002_[2]_1-A0 (配列番号37) : D-NETRP1000046.1のアミノ配列全領域
D-NETRP1000046.1の1〜67塩基 (配列番号38) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_001637.1では存在しないエクソンでありNM_001637.1と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が4残基 (配列番号39) 変化していた。
002_[2]_1-N1 (配列番号38) : D-NETRP1000046.1の67塩基の挿入核酸配列領域
002_[2]_1-A1 (配列番号39) : D-NETRP1000046.1の4残基の挿入アミノ配列領域
002_[2]_1-N2 (配列番号40) : D-NETRP1000046.1の67塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
002_[2]_1-A2 (配列番号39と同一) : D-NETRP1000046.1の67塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
この変化に伴いSignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 及びPSORT （http://psort.nibb.ac.jp/） でNM_001637.1の1〜22アミノ酸目に存在すると予測されたN末端分泌シグナル配列は消失していた。【０２１８】
４）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
002_01 - [1]のcDNAパターンのエクソンが欠失している領域の境界にある配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの欠失領域
→Primer002_01F (配列番号41) とPrimer002_01R (配列番号42) によって増幅される断片002_01 (配列番号43)
002_02 - 既存の公共DBに登録されている[3]のcDNAパターンの[1]の欠失領域と比較した場合に挿入領域に相当する特異的な領域であり、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer002_02F (配列番号44) とPrimer002_02R (配列番号45) によって増幅される断片002_02 (配列番号46)
002_03 - [2]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[2]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer002_03F (配列番号47) とPrimer002_03R (配列番号48) によって増幅される断片002_03 (配列番号49)
002_04 -[1]〜[3]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]、[2]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[3]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域→Primer002_04F (配列番号50) とPrimer002_04R (配列番号51) によって増幅される断片002_04 (配列番号52)
上記に示された[1]〜[2] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに取得し解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が7配列存在し、その由来は脾臓 (Spleen) が5配列 (解析母数 33,950)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導3日間(D3OST) が2配列 (解析母数 5,092)であった。
我々が新たに解析したcDNAの[2]のパターンでは5’末端配列が1配列存在し、その由来は好中球 (Neutrophil)が1配列 (解析母数 9170)であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる[3]のパターンでは5’末端配列が49配列存在しその由来は、脾臓 (Spleen) が20配列 (解析母数 33,950)、胸腺 (Thymus) が5配列 (解析母数 70,578)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導9日間 (D9OST) が4配列 (解析母数 4,407)、滑膜組織(Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) が3配列 (解析母数 27,489)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導3日間(D3OST) が2配列 (解析母数 5,092)、乳癌 (Breast, Tumor) が2配列 (解析母数 8,416)、肺 (Lung) が2配列 (解析母数 16,146)、子宮 (Uterus) が2配列 (解析母数 49,561) など様々な組織で発現していた。
この結果より、血球系の組織において発現が多く、相対的に比較して[1]のパターンでは、脾臓、CD34+細胞をODF処理誘導したもので発現が多いことがわかった。また、[2]のパターンでは、好中球での発現が多かった。これにより、何らかの発現機構により、血球系の組織の中でも特定の組織での発現、もしくは細胞の分化といった特異的な細胞状態での発現が多くなる可能性が考えられた。【０２１９】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系でどのような状態の時に発現に変化が現れるのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表4及び表5に示した。【０２２０】
【表４】
2008114709.tif 000010
【０２２１】
【表５】
2008114709.tif 000011
【０２２２】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳 （Brain, whole） を用いて比較した。
002_01 (配列番号43) と002_02 (配列番号46) で比較されるmRNAにおける欠失によってORFが変化する比率は、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導以外の血球系組織では、ほぼ変わらなかった。つまり、どの血球系組織でも同じ割合で2種類のORFが発現していると思われる。しかし、CD34+細胞の破骨細胞への分化において、その比率は大きく変化した。CD34+細胞をODF 処理誘導3日間（CD34+ ODF 3days）、CD34+細胞をODF 処理誘導9日間（CD34+ ODF 9days）のステージにおいて002_01 (配列番号43) で示されるmRNAにおける欠失が起こる割合が高くなっていた（表4・表5）。
002_03 (配列番号29) で示される新しい転写開始点からの発現は、滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）、CD34+細胞をODF 処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）、CD34+細胞をODF 処理誘導9日間 （CD34+ ODF 9days）、及び骨髄 （Bone Marrow）において増加していた（表4・表5）。
つまり滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）と骨髄（Bone Marrow）では、転写物（mRNA）に多様性があることで、ORFに多様性が生じていた。さらに、破骨細胞への分化のステージによって転写物 （mRNA） を変化させるような機構が働き、転写開始点やエクソンの選択性に多様性が生じていた。
これらの結果より、002_01 (配列番号43), 002_03 (配列番号46) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域002_[1]_1-N1 (配列番号31), 002_[2]_1-N1 (配列番号38) の発現を比較することにより、リューマチ患者の滑膜 (Synovial) 組織の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞の分化に特異的な治療・診断マーカーとして、また骨髄 （Bone Marrow）の血球系に特異的なマーカーとして利用することが可能であることが立証された。さらに、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についてもリューマチ患者の滑膜 (Synovial) 組織の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞の分化に特異的な治療・診断マーカーとして、また骨髄 （Bone Marrow）の血球系に特異的なマーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-D3OST2001534.1においてPrimer002_01R (配列番号42) がプライミングする396〜420塩基目を含む上流配列002_[1]_1-N3 (配列番号53)。
[2]のcDNAパターンのD-NETRP1000046.1においてPrimer002_03R (配列番号48) がプライミングする53〜77塩基目を含む上流配列002_[2]_1-N3 (配列番号54)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer002_01F (配列番号41) とPrimer002_01R (配列番号42) によって増幅される領域002_01 (配列番号43)
[2]のcDNAパターンにおいてPrimer002_03F (配列番号47) とPrimer002_03R (配列番号48) によって増幅される領域002_03 (配列番号49)【０２２３】
実施例６：クラスターchr7+1084（データセット：012）
（１）クラスターの解析
1）クラスターの特徴
クラスターchr7+1084 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体7番、72,940,000 bp〜72,985,000 bp) にゲノムマッピングされた9配列の全長cDNA [D-PLACE7010497.1, AF134379.1, C-FCBBF3003373, C-KAT04587,D26309.1, ENST00000336180, ENST00000355120, NM_002314.2, NM_016735.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより5種類に分類されるが、主なものとして以下の3種類が存在した。
[1] D-PLACE7010497.1
[2] D26309.1, ENST00000336180, ENST00000355120, NM_002314.2
[3] AF134379.1, NM_016735.1
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2],[3]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2],[3]よりも下流にある染色体領域より発現し、[2],[3]と相同性のない新しいエクソン上に翻訳開始点をもつため、ORF領域が異なっていた。
[2]、[3]は、同じ転写開始点、翻訳開始点をもちスプライシングのパターン変化によりORF領域が異なっていた。
[1]〜[3]の3種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことや、スプライシングのパターンが変化することで、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２２４】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-PLACE7010497.1（[1]）の特徴
012_[1]_1-N0 (配列番号55) : D-PLACE7010497.1の核酸配列全領域
012_[1]_1-NA0 (配列番号56) : D-PLACE7010497.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
012_[1]_1-A0 (配列番号57) : D-PLACE7010497.1のアミノ配列全領域
D-PLACE7010497.1の1〜83塩基 (配列番号58) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_002314.2では存在しないエクソンが挿入するバリアントで、NM_002314.2と相同性がない。挿入するエクソン上に翻訳開始点が存在する為、NM_002314.2と比較するとN末端のアミノ酸が17残基 (配列番号59) 異なっていた。
012_[1]_1-N1 (配列番号58) : D-PLACE7010497.1の83塩基の挿入核酸配列領域
012_[1]_1-A1 (配列番号59) : D-PLACE7010497.1の17残基の挿入アミノ配列領域
012_[1]_1-N2 (配列番号60) : D-PLACE7010497.1の83塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
012_[1]_1-A2 (配列番号59と同一) : D-PLACE7010497.1の83塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域【０２２５】
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
012_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer012_01F (配列番号61) とPrimer012_01R (配列番号62) によって増幅される断片012_01 (配列番号63)
012_02 - 既存の公共DBに登録されている[2],[3]が共有する転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer012_02F (配列番号64) とPrimer012_02R (配列番号65) によって増幅される断片012_02 (配列番号66)
002_03 - [1]〜[3]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2],[3]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer012_03F (配列番号67) とPrimer012_03R (配列番号68) によって増幅される断片012_03 (配列番号69)
上記に示された[1]、[2]のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が12配列存在し、その由来は滑膜組織 (Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) が3配列 (解析母数 27,489)、胸腺(Thymus) が3配列 (解析母数 70,578)、脾臓 (Spleen) が2配列 (解析母数 33,950)、CD34+細胞 (CD34+) が1配列 (解析母数 1,420)、白血病細胞(Leukemia, myelogenous) が1配列 (解析母数 2,156)、黒質 (Brain, substantia nigra) が1配列 (解析母数 15,897)、胎盤 (Placenta) が1配列 (解析母数 46,090) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [2] 又は [3] のパターンでは5’末端配列が9配列存在し、その由来は胎児脳 (Brain, Fetal) が2配列(解析母数 47,574)、視床 (Brain, thalamus) が2配列 (解析母数 53,267)、扁桃(Brain, amygdala) が2配列 (解析母数 58,640)、SK-N-SH細胞(Neuroblastoma) が1配列 (解析母数 8,662)、海馬 (Brain, hippocampus) が1配列 (解析母数 57,918)、全脳(Brain, whole) が1配列(解析母数 59,069)であった。
この結果より、[1]の転写開始点は、滑膜組織 (Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis), 胸腺 (Thymus) などでの血球系組織での発現が多いことがわかった。また、[2]、[3]の共有する転写開始点では、脳での発現が多かった。これにより、血球系組織とそれ以外の組織（特に脳）では、この染色体領域において、転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なるのではないかということがわかった。【０２２６】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系組織の中でもどのような組織、どのような状態の時に発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表6及び表7に示した。【０２２７】
【表６】
2008114709.tif 000012
【０２２８】
【表７】
2008114709.tif 000013
【０２２９】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳（Brain, whole）を用いて比較した。
012_01 (配列番号63) と012_02 (配列番号66) で比較される転写開始点の選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織、細胞で大きく変化していた。
脾臓（Spleen）、滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子（ODF）処理誘導3日間（CD34+ ODF 3days）、CD34+細胞をODF 処理誘導9日間 （CD34+ ODF 9days）では、012_01 (配列番号63) で表される下流の転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった（表6・表7）。さらにODFで処理誘導したCD34+細胞について詳細に比較すると、分化の初期のステージであるCD34+細胞をODF 処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）でもっとも大きく差が見られた（表6・表7）。
また、全脳（Brain, whole）、脊髄 （Spinal Cord）では、012_02 (配列番号66) で表される既存の公共DBに登録されている転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった。
つまり脾臓（Spleen）、滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）、ODFで処理誘導したCD34+細胞では、脳とは異なる転写因子もしくは転写機構により、転写開始点に多様性が生じて、異なるORF領域をもつmRNAが発現している。さらに、破骨細胞への分化のステージにおいても変化が見られ、特に分化が起こる初期の段階で転写物（mRNA）を変化させるような機構が働き、転写開始点に多様性が生じていた。
これらの結果より、012_01 (配列番号63) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）012_[1]_1-N1 (配列番号58) の発現を比較することにより、リューマチ患者の滑膜 (Synovial) 組織の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞への分化、特に分化の初期段階を検出する治療・診断マーカーとして、また脾臓（Spleen）の血球系に特異的なマーカーとして、利用することが可能であることが立証された。さらに、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についてもリューマチ患者の滑膜 (Synovial)組織の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞への分化、特に分化の初期段階を検出する治療・診断マーカーとして、また脾臓 （Spleen）の血球系に特異的なマーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-PLACE7010497.1においてPrimer002_01R (配列番号62) がプライミングする67〜87塩基目を含む上流配列012_[1]_1-N3 (配列番号70)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer012_01F (配列番号61) とPrimer012_01R (配列番号62) によって増幅される領域012_01 (配列番号63)【０２３０】
実施例７：クラスターchr2+1780 （データセット：009）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr2+1780 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体2番、120,200,000 bp〜120,500,000 bp) にゲノムマッピングされた6配列の全長cDNA [D-SPLEN2030304.1, BC010674.1, BX648614.1, ENST00000263708, M68941.1, NM_002830.2] がマッピングされている領域の解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより3種類に分類されるが、主なものとして以下の2種類が存在した。
[1] D-SPLEN2030304.1
[2] BC010674.1, ENST00000263708, M68941.1, NM_002830.2
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]よりも下流にある染色体領域より発現するため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域の異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２３１】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-SPLEN2030304.1（[1]）の特徴
009_[1]_1-N0 (配列番号71) : D-SPLEN2030304.1の核酸配列全領域
009_[1]_1-NA0 (配列番号72) : D-SPLEN2030304.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
009_[1]_1-A0 (配列番号73) : D-SPLEN2030304.1のアミノ配列全領域
D-SPLEN2030304.1の1〜57塩基（配列番号74）のエクソン（第1エクソン）は既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_002830.2には存在しないエクソンであり相同性がない。D-SPLEN2030304.1の第2エクソンはNM_002830.2の第14エクソンに相当し、これ以降のエクソンは両cDNA共に共通して存在している。NM_002830.2のORFの翻訳開始点は第2エクソン上に存在するのに対してD-SPLEN2030304.1の翻訳開始点は第2エクソン（NM_002830.2の第14エクソン）の領域に存在するため、NM_002830.2に比べN末端側のアミノ酸が367残基短くなっていた。（配列番号290）。
009_[1]_1-N1 (配列番号74) : D-SPLEN2030304.1の57塩基の挿入核酸配列領域
009_[1]_1-N2 (配列番号75) : D-SPLEN2030304.1の89塩基目を翻訳開始点とするORFの5’UTR領域88塩基
009_[1]_C-A1（配列番号290）: NM_002830.2に存在するD-SPLEN2030304.1の367残基の欠失アミノ酸配列領域
この変化に伴い、NM_002830.2の31〜222アミノ酸目に存在するPfamモチーフ “FERM domain (Band 4.1 family)” が消失していた （http://pfam.janelia.org/）。【０２３２】
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
009_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer009_01F (配列番号76) とPrimer009_01R (配列番号77) によって増幅される断片009_01 (配列番号78)
009_02 - 既存の公共DBに登録されている[2]の転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer009_02F (配列番号79) とPrimer009_02R (配列番号80) によって増幅される断片009_02 (配列番号81)
009_03 - [1]、[2]が共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer009_03F (配列番号82) とPrimer009_03R (配列番号83) によって増幅される断片009_03 (配列番号84)
上記に示された[1]、[2] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が4配列存在し、その由来は脾臓 (Spleen) が3配列 (解析母数 33,950)、肺 (Lung) が1配列 (解析母数 16,146) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [2]のパターンでは5’末端配列が24配列存在し、その由来は視床 (Brain, thalamus) が6配列 (解析母数 53,267)、全脳(Brain, whole) が3配列 (解析母数 59,069)、正常神経膠星状細胞 (Normal Human Astrocyte) が2配列 (解析母数 17,162)、NT2細胞をレチノイン酸処理誘導 (NT2RP) が2配列 (解析母数 39,242)、胎児脳 (Brain, Fetal) が3配列(解析母数 79,560)、気管 (Trachea) が2配列 (解析母数 52,352)、胸腺 (Thymus) が2配列 (解析母数 70,578)、腎臓癌 (Kidney, Tumor) が1配列 (解析母数 15,970)、腎臓 (Kidney) が1配列 (解析母数 17,008)、NT2細胞をレチノイン酸処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間(NT2RI) が1配列 (解析母数 32,662)、小脳 (Brain, cerebellum) が1配列 (解析母数 82,880) であった。
この結果より、[1]の転写開始点は、脾臓 （Spleen）での発現が多いことがわかった。また、[2]の転写開始点では、脳など様々な組織での発現がみられた。これにより、血球系の組織とそれ以外の組織では、この染色体領域において、転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。【０２３３】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系組織の中でもどのような組織、どのような状態の時に発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表8及び表9に示した。【０２３４】
【表８】
2008114709.tif 000014
【０２３５】
【表９】
2008114709.tif 000015
【０２３６】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳（Brain, whole）を用いて比較した。
009_01 (配列番号78) と009_02 (配列番号81) で比較される転写開始点の選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織、細胞で大きく変化していた。
脾臓 （Spleen）, 骨髄 （Bone Marrow） では、009_01 (配列番号78) で表される下流の転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった（表8・表9）。
また、破骨細胞分化因子（ODF）で処理誘導したCD34+細胞について詳細に比較すると、009_02 (配列番号81) で表される既存の公共DBに登録されている転写開始点からの転写物（mRNA）が全ての分化ステージでほぼ変わらない発現量であるのに対して、009_01 (配列番号78) で表される下流の転写開始点からの転写物（mRNA）は、未分化のCD34+細胞の状態で最も発現量が多く、CD34+細胞ODF処理誘導3日間（CD34+ ODF 3days）、CD34+細胞ODF処理誘導6日間（CD34+ ODF 6days）と分化のステージが進むにつれて発現量が減少し、CD34+細胞ODF処理誘導9日間 （CD34+ ODF 9days）では、発現が見られなかった（表8・表9）。
また、009_02 (配列番号81) では009_01 (配列番号78) 比べ全脳（Brain, whole）、脊髄（Spinal Cord）で発現が多く見られた。
つまり脾臓 （Spleen）, 骨髄 （Bone Marrow）では、他の組織とは異なり転写因子もしくは、転写機構によって転写開始点に多様性が生じ、ORF領域の異なるmRNAが発現していた。さらに、破骨細胞へ分化することによって、転写物（mRNA）を変化させるような機構が機能しなくなり、転写開始点の多様性がなくなることが分かった。
これらの結果より、009_01 (配列番号78) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）009_[1]_1-N1 (配列番号74) の発現を比較することにより、破骨細胞の分化段階を検出する分化マーカー（骨粗鬆症・リューマチやそれに至る過程の診断・治療マーカー）として、また脾臓（Spleen）、骨髄 （Bone Marrow）の血球系に特異的なマーカーとして、利用することが可能であることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても破骨細胞の分化段階を検出する分化マーカー、また脾臓、骨髄の血球系に特異的なマーカーとしてとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-SPLEN2030304.1においてPrimer009_01R (配列番号77) がプライミングする89〜112塩基目を含む上流配列009_[1]_1-N 3 (配列番号85)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer009_01F (配列番号76) とPrimer009_01R (配列番号77) によって増幅される領域009_01 (配列番号78)【０２３７】
実施例８：クラスターchr3+1925（データセット：045）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr3+1925 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体3番、138,060,000 bp〜138,160,000 bp) にゲノムマッピングされた4配列の全長cDNA [D-SYNOV4000324.1, BC006403.2, ENST00000288986, NM_006153.3] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより以下のように2種類に分類できた。
[1] D-SYNOV4000324.1
[2] BC006403.2, ENST00000288986, NM_006153.3
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]よりも下流にある染色体領域より発現し、[2]と相同性のない新しいエクソン上に翻訳開始点をもつため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことで、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２３８】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-SYNOV4000324.1（[1]）の特徴
045_[1]_1-N0 (配列番号86) : D-SYNOV4000324.1の核酸配列全領域
045_[1]_1-NA0 (配列番号87) : D-SYNOV4000324.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
045_[1]_1-A0 (配列番号88) : D-SYNOV4000324.1のアミノ配列全領域
D-SYNOV4000324.1の1〜78塩基 (配列番号89) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_006153.3では存在しないエクソンでありNM_006153.3と相同性がない。このエクソン上に翻訳開始点が存在する為、N末端側のアミノ酸が12残基 (配列番号90) 変化していた。
045_[1]_1-N1 (配列番号89) : D-SYNOV4000324.1の78塩基の挿入核酸配列領域
045_[1]_1-A1 (配列番号90) : D-SYNOV4000324.1の12残基の挿入アミノ配列領域
045_[1]_1-N2 (配列番号91) : D-SYNOV4000324.1の78塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
045_[1]_1-A2 (配列番号90と同一) : D-SYNOV4000324.1の78塩基の挿入領域中のORFアミノ酸配列領域
この変化に伴い、NM_006153.3の5〜59アミノ酸目に存在するPfamモチーフ“SH3 domain”が消失していた。【０２３９】
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
045_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer045_01F (配列番号92) とPrimer045_01R (配列番号93) によって増幅される断片045_01 (配列番号94)
045_02 - 既存の公共DBに登録されている[2]が存在する転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer045_02F (配列番号95) とPrimer045_02R (配列番号96) によって増幅される断片045_02 (配列番号97)
045_03 - [1]〜[2]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer045_03F (配列番号98) とPrimer045_03R (配列番号99) によって増幅される断片045_03 (配列番号100)
上記に示された[1]、[2]のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が3配列存在し、その由来は滑膜組織 (Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) が1配列 (解析母数 27,489)、結腸(Colon) が1配列 (解析母数 8,398)、NT2細胞をレチノイン酸処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間(NT2RI) が1配列 (解析母数 32,662) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [2]のパターンでは5’末端配列が34配列存在し、その由来は胸腺 (Thymus) が9配列 (解析母数 70,578)、心膜 (Pericardium) が3配列 (解析母数 8,781)、尾状核 (Brain, caudate nucleus) が2配列 (解析母数 25,786)、気管(Trachea) が2配列 (解析母数 52,352)、海馬 (Brain, hippocampus) が2配列 (解析母数 57,918)、全脳 (Brain, whole) が2配列(解析母数 59,069) など様々な組織で発現していた。
この結果より、[1]の転写開始点は、滑膜組織 (Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) などで発現していることがわかった。また、[2]の転写開始点からは、[1]の転写開始点に比べ様々な組織由来のcDNAが発現していた。つまり、この染色体領域において、[1]のパターンようなエクソンの選択性で、アミノ酸配列が変化し、異なるタンパク質を発現させるようなmRNAのパターン変化の選択機構が特定の組織で起こる可能性が考えられた。【０２４０】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
組織間において発現に使われる転写開始点がどのように変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表10及び表11に示した。【０２４１】
【表１０】
2008114709.tif 000016
【０２４２】
【表１１】
2008114709.tif 000017
【０２４３】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳 （Brain, whole） を用いて比較した。
045_01 (配列番号94) と045_02 (配列番号97) で比較される転写開始点の選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織、細胞で大きく変化していた。
滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）及びCD34+細胞ODF（破骨細胞分化因子）処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）、 CD34+細胞ODF処理誘導6日間（CD34+ ODF 6days）、CD34+細胞ODF処理誘導9日間（CD34+ ODF 9days）のCD34+細胞をODFで処理誘導した全てのステージにおいて、045_01 (配列番号94) で表される下流の転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった（表10・表11）。
全脳 (Brain, whole) では045_02 (配列番号97) で表される既存の公共DBに登録されている転写開始点からの転写が多かった。
つまり滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）やODFで処理誘導したCD34+細胞では、脳とは異なる転写因子もしくは転写機構によって、転写開始点に多様性があることで、ORF領域の異なるmRNAが発現することが分かった。
これらの結果より、045_01 (配列番号94) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）045_[1]_1-N1 (配列番号89) の発現を比較することにより、血球系特にリューマチ患者の滑膜 (Synovial) 組織に特異的な治療・診断マーカーとして、また破骨細胞への分化に特異的な治療・診断マーカー（骨粗鬆症・リューマチやそれに至る過程の診断・治療マーカー）として利用することが可能であることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても血球系特にリューマチ患者の滑膜組織に特異的な治療・診断マーカー、また破骨細胞への分化に特異的な治療・診断マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-SYNOV4000324.1においてPrimer045_01R (配列番号93) がプライミングする130〜153塩基目を含む上流配列045_[1]_1-N3 (配列番号101)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer045_01F (配列番号92) とPrimer045_01R (配列番号93)によって増幅される領域045_01 (配列番号94)【０２４４】
実施例９：クラスターchr11+275（データセット：064）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr11+275 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体11番、10,275,000 bp〜10,500,000 bp) にゲノムマッピングされた13配列の全長cDNA [D-SYNOV4007243.1, Z-TRACH3025625-01, D-BRAMY3006431.1, D-BRAWH3035395.1, D-NT2RI3008791.1, D-PLACE7015823.1, D-TESTI4045452.1, Z-CD34C3000530-01, Z-NT2RI3008366-01, Z-TESTI4015893-01, NM_000480.1, ENST00000256183, ENST00000356959,] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより6種類に分類されるが、転写開始点に注目すると主なものとして以下の2種類が存在した。
[1] D-SYNOV4007243.1
[2] NM_000480.1, ENST00000256183
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]よりも下流にある染色体領域より発現するため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２４５】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-SYNOV4007243.1（[1]）の特徴
064_[1]_1-N0 (配列番号102) : D-SYNOV4007243.1の核酸配列全領域
064_[1]_1-NA0 (配列番号103) : D-SYNOV4007243.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
064_[1]_1-A0 (配列番号104) : D-SYNOV4007243.1のアミノ配列全領域
D-SYNOV4007243.1の1〜217塩基 (配列番号105) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_000480.1では存在しないエクソンが挿入するバリアントでNM_000480.1と相同性がない。この挿入するエクソン上に翻訳開始点と存在する為、NM_000480.1と比較するとN末端のアミノ酸が6残基 (配列番号106) 異なっていた。
064_[1]_1-N1 (配列番号105) : D-SYNOV4007243.1の217塩基の挿入核酸配列領域
064_[1]_1-A1 (配列番号106) : D-SYNOV4007243.1の6残基の挿入アミノ配列領域
064_[1]_1-N2 (配列番号107) : D-SYNOV4007243.1の217塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
064_[1]_1-A2 (配列番号106と同一) : D-SYNOV4007243.1の217塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域【０２４６】
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
064_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer064_01F (配列番号108) とPrimer064_01R (配列番号109) によって増幅される断片064_01 (配列番号110)
064_02 - 既存の公共DBに登録されている[2]の転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer064_02F (配列番号111) とPrimer064_02R (配列番号112) によって増幅される断片064_02 (配列番号113)
064_03 - [1]、[2]が共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer064_03F (配列番号114) とPrimer064_03R (配列番号115) によって増幅される断片064_03 (配列番号116)
上記に示された[1]、[2] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が13配列存在し、その由来は滑膜組織(Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) が3配列 (解析母数 27,489)、気管(Trachea) が3配列 (解析母数 52,352)、全脳 (Brain, whole) が2配列 (解析母数 59,069)、精巣 (Testis) が2配列 (解析母数 90,188)、脾臓 (Spleen) が1配列 (解析母数 33,950)、子宮 (Uterus) が1配列 (解析母数 49,561)、胸腺 (Thymus) が1配列 (解析母数 70,578) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [2]のパターンでは5’末端配列が11配列存在し、その由来は海馬 (Brain, hippocampus) が4配列 (解析母数 57,918)、全脳(Brain, whole) が3配列 (解析母数 59,069)、視床 (Brain, thalamus) が2配列 (解析母数 53,267)、扁桃 (Brain, amygdala) が2配列 (解析母数 58,640)  であった。
この結果より、[1]の転写開始点は、滑膜組織 (Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) などの血球系組織での発現が多いことがわかった。また、[2]の転写開始点では、脳での発現が多かった。これにより、滑膜組織（Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis）などの血球系組織とそれ以外の組織（特に脳）では、この染色体領域において、転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。【０２４７】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系組織の中でもどのような組織で、どのような状態の時に発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表12及び表13に示した。【０２４８】
【表１２】
2008114709.tif 000018
【０２４９】
【表１３】
2008114709.tif 000019
【０２５０】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル（Mix, viscus tissues）と全脳（Brain, whole）を用いて比較した。
064_01（配列番号110）と064_02（配列番号113）で比較される転写開始点の選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織で大きく変化していた。
骨髄（Bone Marrow）、胸腺（Thymus）、脾臓（Spleen）、CD34+細胞（CD34+）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子（ODF）処理誘導3日間（CD34+ ODF 3 days）、CD34+細胞をODF処理誘導6日間（CD34+ ODF 6 days）、CD34+細胞をODF処理誘導9日間（CD34+ ODF 9 days）、滑膜（Synovial）組織（リューマチ患者）、Jurkat細胞（Jurkat）、脊髄（Spinal Cord）において、064_01（配列番号110）で表される下流の転写開始点からの転写物（mRNA）が特に多かった（表12・表13）。
つまりこれらの組織では、他の組織とは異なり、転写因子もしくは、転写機構によって、転写開始点に多様性があることで、異なるORFをもつmRNAが発現していた。
これらの結果より、064_01（配列番号110）という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）064_[1]_1-N1（配列番号105）の発現を比較することにより、骨髄（Bone Marrow）、胸腺（Thymus）、脾臓（Spleen）、Jurkat細胞（Jurkat）の血球系に特異的なマーカーとして、また滑膜（Synovial）組織（リューマチ患者）のマーカーや破骨細胞の分化に特異的な分化マーカーとして用いることが可能になることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても骨髄（Bone Marrow）、胸腺（Thymus）、脾臓（Spleen）、Jurkat細胞（Jurkat）の血球系に特異的なマーカーとして、また滑膜（Synovial）組織（リューマチ患者）のマーカーや破骨細胞の分化に特異的な分化マーカーとしてとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-SYNOV4007243.1においてPrimer064_01R（配列番号109）がプライミングする185〜205塩基目を含む上流配列064_[1]_1-N3（配列番号117）。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer064_01F（配列番号108）とPrimer064_01R（配列番号109）によって増幅される領域064_01（配列番号110）【０２５１】
実施例１０：クラスターchr5+2320（データセット：074）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr5+2320 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体5番、180,240,000 bp〜 180,380,000 bp) にゲノムマッピングされた11配列の全長cDNA [D-NETRP2004161.1, D-COLON2000670.1, Z-NETRP2006158-01, AY358385.1, C-COL04713, C-COL07391, ENST00000231229, ENST00000342868, NM_006707.2, NM_024850.1, NM_197975.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより5種類に分類されるが、転写開始点に注目すると主なものとして以下の2種類が存在した。
[1] D-NETRP2004161.1
[2] C-COL04713 (AK025111.1), ENST00000231229, NM_024850.1
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]よりも下流にある染色体領域より発現するため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２５２】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NETRP2004161.1（[1]）の特徴
074_[1]_1-N0 (配列番号118) : D-NETRP2004161.1の核酸配列全領域
074_[1]_1-NA0 (配列番号119) : D-NETRP2004161.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
074_[1]_1-A0 (配列番号120) : D-NETRP2004161.1のアミノ酸配列全領域
D-NETRP2004161.1の1〜134塩基（配列番号121）のエクソン（第1エクソン）は既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_024850.1には存在しないエクソンであり相同性がない。NM_024850.1のORFの翻訳開始点はD-NETRP2004161.1には存在しないエクソンである第1エクソン上に存在するのに対してD-NETRP2004161.1の翻訳開始点は第2エクソン（NM_024850.1の第3エクソン）の領域に存在する。その為NM_024850.1に比べN末端側のアミノ酸が184残基短くなっていた。
この変化に伴いSignalP及びPSORTでNM_024850.1の1〜16アミノ酸目に存在すると予測されたN末端分泌シグナル配列がD-NETRP2004161.1では存在しない。
また既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_024850.1の941〜1,070塩基に存在する130塩基のエクソン（配列番号126）がD-NETRP2004161.1の525〜526塩基の領域には存在せず欠失している。この変化に伴いORFの翻訳フレームが変化し、NM_024850.1と比較するとC末端のアミノ酸が238残基変化していた。
074_[1]_1-N 1（配列番号121）: D-NETRP2004161.1の134塩基の挿入核酸配列領域
074_[1]_1-N 2（配列番号122）: D-NETRP2004161.1の290塩基目を翻訳開始点とするORFの5’UTR領域289塩基
074_[1]_1-N3（配列番号123）: D-NETRP2004161.1の欠失核酸配列領域
074_[1]_1-A1（配列番号124）: D-NETRP2004161.1の欠失に伴い変化しているアミノ配列領域
074_[1]_1-N4 (配列番号123と同一) : D-NETRP2004161.1の欠失領域中のORF核酸配列領域074_[1]_1-A2 (配列番号125) : D-NETRP2004161.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
074_[1]_C-N1 (配列番号126) : D-NETRP2004161.1の525〜526塩基の領域に挿入されるNM_024850.1の941〜1,070塩基に存在する130塩基の挿入核酸配列
074_[1]_C-A1 (配列番号127) : D-NETRP2004161.1の525〜526塩基の領域に挿入されるNM_024850.1の941〜1,070塩基に存在する130塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域【０２５３】
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーとTaqManプローブの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
074_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer074_01F (配列番号128) とPrimer074_01R (配列番号129) によって増幅される断片074_01 (配列番号130)
使用したTaqManプローブ074_01TP：(配列番号131)
074_03 - 既存の公共DBに登録されている[2]の転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer074_03F (配列番号132) とPrimer074_03R (配列番号133) によって増幅される断片074_03 (配列番号134)
使用したTaqManプローブ074_03TP：(配列番号135)
074_04 - [1]、[2]が共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer074_04F (配列番号136) とPrimer074_04R (配列番号137) によって増幅される断片074_04 (配列番号138)
使用したTaqManプローブ074_04TP：(配列番号139)
上記に示された[1]、[2] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1] のパターンでは5’末端配列が6配列存在し、その由来は好中球 (Neutrophil) が5配列 (解析母数 9,170)、肺 (Lung) が1配列 (解析母数 16,146) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [2] のパターンでは5’末端配列が19配列存在し、その由来は結腸 (Colon) が12配列 (解析母数 8,398)、小腸 (Small Intestine) が6配列 (解析母数 16,767)、直腸 (Rectum) が1配列 (解析母数 2,723)であった。
この結果より、[1] の転写開始点は、好中球 (Neutrophil) での発現が多いことがわかった。また、[2] の転写開始点では、結腸 (Colon)、小腸 (Small Intestine) で発現が多くみられた。これにより、血球系組織とそれ以外の組織では、この染色体領域において、転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。【０２５４】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系組織の中でも、どのような組織、どのような状態の時に発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表14に示した。【０２５５】
【表１４】
2008114709.tif 000020
【０２５６】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳 （Brain, whole） を用いて比較した。
074_01 (配列番号130) と074_03 (配列番号134) で比較される転写開始点の選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織で大きく変化していた。
骨髄 （Bone Marrow）、脾臓 （Spleen）、滑膜 （Synovial）組織（リューマチ患者）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子（ODF）処理誘導3日間（CD34+ ODF 3days）では074_01 (配列番号130) で表される下流の転写開始点からの転写物（mRNA）が特に多かった（表14）。骨髄 （Bone Marrow）、脾臓 （Spleen）、滑膜 （Synovial）組織（リューマチ患者）、CD34+細胞をODF処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）では、他の組織とは転写因子もしくは転写機構が異なり、転写開始点に多様性が生じることでORF領域の異なるmRNAが発現していた。
これらの結果より、074_01 (配列番号130) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）074_[1]_1-N1 (配列番号121) の発現を比較することにより、リューマチ患者の滑膜 (Synovial)組織の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞への分化、特に分化の初期段階を検出する治療・診断マーカー（骨粗鬆症・リューマチやそれに至る過程の診断・治療マーカー）として、また骨髄（Bone Marrow）、脾臓 （Spleen）の血球系に特異的なマーカーとして、利用することが可能であることが立証された。さらに、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についてもリューマチ患者の滑膜 (Synovial)組織の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞への分化、特に分化の初期段階を検出する治療・診断マーカーとして、また骨髄 （Bone Marrow）、脾臓 （Spleen）の血球系に特異的なマーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-NETRP2004161.1においてPrimer074_01R (配列番号129) がプライミングする128〜146塩基目を含む上流配列074_[1]_1-N5 (配列番号140)
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer074_01F (配列番号128) とPrimer074_01R (配列番号129) によって増幅される領域074_01 (配列番号130)【０２５７】
実施例１１：クラスターchr6-1987（データセット：026）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr6-1987 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体6番、24,900,000 bp〜25,200,000 bp) にゲノムマッピングされた8配列の全長cDNA [D-NT2RI3001993.1, D-SMINT2013276.1, AB002384.1, BC001232.1, C-KIDNE2007944, ENST00000229635, ENST00000259698, NM_015864.2] について解析を行った。それらは、転写開始点の発現パターンの違いにより5種類に分類されるが、主なものとして以下の4種類が存在した。
[1] D-NT2RI3001993.1
[2] D-SMINT2013276.1
[3] AB002384.1
[4] NM_015864.2, BC001232.1
[1]、[2]は、我々が新たに取得しに全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[3]、[4]とORFが異なっていた。
[1]、[2]は、既知の[3]、[4]よりも上流にある染色体領域より発現するため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[4]の4種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２５８】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NT2RI3001993.1（[1]）の特徴
026_[1]_1-N0 (配列番号141) : D-NT2RI3001993.1の核酸配列全領域
026_[1]_1-NA0 (配列番号142) : D-NT2RI3001993.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
026_[1]_1-A0 (配列番号143) : D-NT2RI3001993.1のアミノ配列全領域
D-NT2RI3001993.1の1〜123塩基 (配列番号144) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015864.2では存在しないエクソンが挿入するバリアントでNM_015864.2と相同性がない。この挿入するエクソン上に翻訳開始点が存在する為、NM_015864.2と比較するとN末端のアミノ酸が29残基 (配列番号145) 異なっていた。
D-NT2RI3001993.1の1,920〜3,256塩基 (配列番号148) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015864.2では存在しないエクソンが挿入するバリアントでNM_015864.2と相同性がない。この挿入するエクソン上に翻訳終止点が存在する為、NM_015864.2と比較するとC末端のアミノ酸が428残基 (配列番号149) 異なっていた。
026_[1]_1-N1 (配列番号144) : D-NT2RI3001993.1の123塩基の挿入核酸配列領域
026_[1]_1-A1 (配列番号145) : D-NT2RI3001993.1の29残基の挿入アミノ配列領域
026_[1]_1-N2 (配列番号146) : D-NT2RI3001993.1の123塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
026_[1]_1-A2 (配列番号147) : D-NT2RI3001993.1の123塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域
026_[1]_1-N3 (配列番号148) : D-NT2RI3001993.1の1,337塩基の挿入核酸配列領域
026_[1]_1-A3 (配列番号149) : D-NT2RI3001993.1の428残基の挿入アミノ配列領域
026_[1]_1-N4 (配列番号150) : D-NT2RI3001993.1の1,337塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
026_[1]_1-A4 (配列番号149と同一) : D-NT2RI3001993.1の1,337塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域【０２５９】
３）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-SMINT2013276.1（[2]）の特徴
026_[2]_1-N0 (配列番号151) : D-SMINT2013276.1の核酸配列全領域
026_[2]_1-NA0 (配列番号152) : D-SMINT2013276.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
026_[2]_1-A0 (配列番号153) : D-SMINT2013276.1のアミノ配列全領域
D-SMINT2013276.1の1〜168塩基 (配列番号154) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015864.2では存在しないエクソンが挿入するバリアントでNM_015864.2と相同性がない。この挿入するエクソン上に翻訳開始点が存在する為、NM_015864.2と比較するとN末端のアミノ酸が34残基 (配列番号155) 異なっていた。
D-SMINT2013276.1の1,965〜2,415塩基 (配列番号158) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_015864.2では存在しないエクソンが挿入するバリアントでNM_015864.2と相同性がない。この挿入するエクソン上に翻訳終止点が存在する為、NM_015864.2と比較するとC末端のアミノ酸が23残基 (配列番号159) 異なっていた。
026_[2]_1-N1 (配列番号154) : D-SMINT2013276.1の168塩基の挿入核酸配列領域
026_[2]_1-A1 (配列番号155) : D-SMINT2013276.1の34残基の挿入アミノ配列領域
026_[2]_1-N2 (配列番号156) : D-SMINT2013276.1の168塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
026_[2]_1-A2 (配列番号157) : D-SMINT2013276.1の168塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域
026_[2]_1-N3 (配列番号158) : D-SMINT2013276.1の451塩基の挿入核酸配列領域
026_[2]_1-A3 (配列番号159) : D-SMINT2013276.1の23残基の挿入アミノ配列領域
026_[2]_1-N4 (配列番号160) : D-SMINT2013276.1の451塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
026_[2]_1-A4 (配列番号159と同一) : D-SMINT2013276.1の451塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域【０２６０】
４）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
026_02 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer026_02F (配列番号161) とPrimer026_02R (配列番号162) によって増幅される断片026_02 (配列番号163)
026_03 - 既存の公共DBに登録されている[3]の転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer026_03F (配列番号164) とPrimer026_03R (配列番号165) によって増幅される断片026_03 (配列番号166)
026_05 - [1]、[3]が共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[3]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer026_05F (配列番号167) とPrimer026_05R (配列番号168) によって増幅される断片026_05 (配列番号169)
上記に示された[1]、[3]のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が95配列存在し、その由来は好中球 (Neutrophil) が56配列(解析母数 9,170)、脾臓 (Spleen) が21配列 (解析母数 33,950)、正常末梢血単核細胞 (Human peripheral blood mononuclear cells) が8配列 (解析母数 7,900)、胸腺 (Thymus) が5配列 (解析母数 70,578)、NT2細胞をレチノイン酸処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間(NT2RI) が2配列 (解析母数 32,662)、視床(Brain, thalamus) が2配列 (解析母数 53,267)、滑膜 (Synovial) が1配列 (解析母数 27,489) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる[3]のパターンでは5’末端配列が26配列存在し、その由来は海馬 (Brain, hippocampus) が6配列 (解析母数 57,918)、扁桃(Brain, amygdala) が3配列 (解析母数 58,640)、子宮 (Uterus) が3配列 (解析母数 49,561)、胎児脳 (Brain, Fetal) が3配列(解析母数 47,574)、NT2細胞をレチノイン酸処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間(NT2RI) が2配列 (解析母数 32,662) など様々な組織で発現していた。
この結果より、[1]の転写開始点は、好中球 (Neutrophil)、脾臓 (Spleen)などの血球系の組織での発現が多いことがわかった。また、[3]の転写開始点では脳組織など様々な組織での発現がみられた。これにより、血球系の組織とそれ以外の組織では、この染色体領域において、転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。【０２６１】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系組織の中でもどのような組織、どのような状態のときに発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表15に示した。【０２６２】
【表１５】
2008114709.tif 000021
【０２６３】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳 （Brain, whole） を用いて比較した。
026_02 (配列番号163) と026_03 (配列番号166) で比較される転写開始点の選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織、細胞で変化していた。
脾臓 (Spleen), 骨髄 （Bone Marrow）では、026_02 (配列番号163) で表される上流の転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった（表15）。
つまり脾臓 (Spleen), 骨髄 （Bone Marrow）では、他の組織とは異なり転写因子もしくは、転写機構によって、転写開始点に多様性があることで、異なるORFをもつmRNAが発現している。
また、CD34+細胞を破骨細胞分化因子（ODF） 処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）、CD34+細胞をODF処理誘導9日間 (CD34+ ODF 9days)、全脳 (Brain, whole) では026_03 (配列番号166) で表される既知の下流よりの転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった。
これらの結果より、026_02 (配列番号163) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）026_[1]_1-N1 (配列番号144) の発現を比較することにより、脾臓(Spleen), 骨髄 （Bone Marrow）の血球系に特異的なマーカーとして利用することが可能であることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても脾臓 (Spleen)、骨髄（Bone Marrow）の血球系に特異的なマーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-NT2RI3001993.1においてPrimer026_02R (配列番号162) がプライミングする99〜122塩基目を含む上流配列026_[1]_1-N5 (配列番号170)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer026_02F (配列番号161) とPrimer026_02R (配列番号162) によって増幅される領域026_02 (配列番号163)【０２６４】
実施例１２：クラスターchr12+613（データセット：040）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr12+613 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体12番、32,400,000 bp〜 32,700,000 bp) にゲノムマッピングされた9本の全長cDNA [D-THYMU3006588.1, D-D3OST2003177.1, AL713762.1, AL832064.1, C-BRAMY2019963, C-FEBRA2017154, C-TESTI2001141, ENST00000266482, NM_139241.1] について解析を行った。それらは、転写開始点の発現パターンの違いにより4種類に分類されるが、主なものとして以下の3種類が存在した。
[1] D-THYMU3006588.1
[2] D-D3OST2003177.1
[3] C-TESTI2001141 (AK057294.1), ENST00000266482, NM_139241.1
[1]、[2]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[3]とORFが異なっていた。
[1]は既知の[3]よりも下流の染色体領域、[2]は既知の[3]よりも上流にある染色体領域より発現するため、ORF領域が異なっていた。
[1]〜[3]の3種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行うことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２６５】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-THYMU3006588.1（[1]）の特徴
040_[1]_1-N0 (配列番号171) : D-THYMU3006588.1の核酸配列全領域
040_[1]_1-NA0 (配列番号172) : D-THYMU3006588.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
040_[1]_1-A0 (配列番号173) : D-THYMU3006588.1のアミノ配列全領域
D-THYMU3006588.1の1〜177塩基 (配列番号174) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_139241.1では存在しないエクソンが挿入するバリアントでNM_139241.1と相同性がない。この挿入するエクソン上に翻訳開始点が存在する為、NM_139241.1と比較するとN末端のアミノ酸が112残基 (配列番号175) 異なっていた。
040_[1]_1-N1 (配列番号174) : D-THYMU3006588.1の177塩基の挿入核酸配列領域
040_[1]_1-A1 (配列番号175) : D-THYMU3006588.1の112残基の挿入アミノ配列領域
040_[1]_1-N2 (配列番号176) : D-THYMU3006588.1の177塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
040_[1]_1-A2 (配列番号177) : D-THYMU3006588.1の177塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域【０２６６】
３）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-D3OST2003177.1（[2]）の特徴
040_[2]_1-N0 (配列番号178) : D-D3OST2003177.1の核酸配列全領域
040_[2]_1-NA0 (配列番号179) : D-D3OST2003177.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
040_[2]_1-A0 (配列番号180) : D-D3OST2003177.1のアミノ酸配列全領域
D-D3OST2003177.1の1〜172塩基 (配列番号181) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_139241.1では存在しないエクソンが挿入するバリアントでNM_139241.1と相同性がない。この挿入するエクソン上に翻訳開始点が存在する為、NM_139241.1と比較するとN末端のアミノ酸が85残基 (配列番号182) 異なっていた。
040_[2]_1-N1 (配列番号181) : D-D3OST2003177.1の172塩基の挿入核酸配列領域
040_[2]_1-A1 (配列番号182) : D-D3OST2003177.1の85残基の挿入アミノ配列領域
040_[2]_1-N2 (配列番号183) : D-D3OST2003177.1の172塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
040_[2]_1-A2 (配列番号184) : D-D3OST2003177.1の172塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域【０２６７】
４）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
040_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer040_01F (配列番号185) とPrimer040_01R (配列番号186) によって増幅される断片040_01(配列番号187)
040_02 - [2]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[2]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer040_02F (配列番号188) とPrimer040_02R (配列番号189) によって増幅される断片040_02 (配列番号190)
040_03 - 既存の公共DBに登録されている[3]の転写開始点領域、[1]、[2]を比較検討するためのコントロール
→Primer040_03F (配列番号191) とPrimer040_03R (配列番号192) によって増幅される断片040_03 (配列番号193)
040_04 - [1]〜[3]が共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]、[2]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[3]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer040_04F (配列番号194) とPrimer040_04R (配列番号195) によって増幅される断片040_04 (配列番号196)
上記に示された[1]〜[3] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が4配列存在し、その由来は正常胸腺 (Thymus) が1配列 (解析母数 70,578)、軟骨細胞HC (Human Chondrocytes) が1配列 (解析母数 9,397)、正常メサンギウム細胞 (Normal human mesangial cells) が1配列 (解析母数 16,053)、NT2細胞をレチノイン酸処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収 (NT2 Neuron) が1配列 (解析母数 16,337) であった。
我々が新たに解析したcDNAの[2]のパターンでは5’末端配列が3配列存在し、その由来は好中球 (Neutrophil) が2配列 (解析母数 9,170)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導3日間(D3OST) が1配列 (解析母数 5,092) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [3]のパターンでは5’末端配列が15配列存在し、その由来は精巣 (Testis) が12配列 (解析母数 90,188)、胎児脳 (Brain, Fetal) が2配列 (解析母数 55,564)、海馬 (Brain, hippocampus) が1配列 (解析母数 57,918) であった。
この結果より、[1]、[2]の転写開始点は、胸腺(Thymus)、好中球 (Neutrophil)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導などでの発現が多かった。また、[3]の転写開始点では、精巣 (Testis) での発現が多かった。これにより、血球系の組織とそれ以外の組織では、この染色体領域において、転写の機構が異なり用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。【０２６８】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系組織の中でもどのような組織、どのような状態のときに発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表16に示した。【０２６９】
【表１６】
2008114709.tif 000022
【０２７０】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳（Brain, whole）を用いて比較した。
040_01 (配列番号187)、040_02 (配列番号190) と040_03 (配列番号193) で比較される転写開始点の選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織、細胞で大きく変化していた。
骨髄 （Bone Marrow）、胸腺（Thymus）、脾臓（Spleen）、CD34+細胞（CD34+）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導3日間（CD34+ ODF 3days）、CD34+細胞をODF 処理誘導6日間 (CD34+ ODF 6days)、CD34+細胞をODF処理誘導9日間 (CD34+ ODF 9days)、滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）、脊髄（Spinal Cord）では040_01 (配列番号187)、040_02 (配列番号190) で表される新たに見つけた転写開始点からの転写物（mRNA）が040_03 (配列番号193) に比べ多かった（表16）。
特に040_01 (配列番号187) で表される転写開始点では、胸腺 （Thymus）、脾臓 （Spleen）、CD34+細胞をODF処理誘導6日間 (CD34+ ODF 6days)、CD34+細胞をODF処理誘導9日間 (CD34+ ODF 9days)、滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）、脊髄（Spinal Cord）において発現が多く、040_02 (配列番号190) で表される転写開始点では、骨髄（Bone Marrow）、CD34+細胞（CD34+）、CD34+細胞をODF処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）での発現が多かった。
つまり血球系組織では、他の組織とは異なり転写因子もしくは、転写機構によって、転写開始点に多様性があることで、異なるORFをもつmRNAが発現していた。
これらの結果より、040_01 (配列番号187) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）040_[1]_1-N1 (配列番号174) の発現を比較することにより、リューマチ患者の滑膜 (Synovial)組織の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞の分化、特に分化の中・後期段階を検出する治療・診断マーカー（骨粗鬆症・リューマチやそれに至る過程の診断・治療マーカー）として、また胸腺（Thymus）、脾臓（Spleen）の血球系に特異的なマーカーとして、利用することが可能であることが立証された。
また、040_02 (配列番号190) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）040_[2]_1-N1 (配列番号181) の発現を比較することにより、破骨細胞への分化、特に分化の初期段階を検出する治療・診断マーカー（骨粗鬆症・リューマチやそれに至る過程の診断・治療マーカー）として、また骨髄 （Bone Marrow）の血球系に特異的なマーカーとして、利用することが可能であることが立証された。
さらに、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についてもリューマチ患者の滑膜 (Synovial) 組織の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞の分化、特に分化の中・後期段階を検出する治療・診断マーカーとして、また胸腺（Thymus）、脾臓（Spleen）の血球系に特異的なマーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-THYMU3006588.1においてPrimer040_01R (配列番号186) がプライミングする182〜202塩基目を含む上流配列040_[1]_1-N3 (配列番号197)。
[2]のcDNAパターンのD-D3OST2003177.1においてPrimer040_02R (配列番号189) がプライミングする162〜179塩基目を含む上流配列040_[2]_1-N3 (配列番号198)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer040_01F (配列番号185) とPrimer040_01R (配列番号186) によって増幅される領域040_01(配列番号187)
[2]のcDNAパターンにおいてPrimer040_02F (配列番号188) とPrimer040_02R (配列番号189) によって増幅される領域040_02 (配列番号190)【０２７１】
実施例１３：クラスターchr4-770（データセット：069）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr4-770 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体4番、104,290,000 bp〜104,360,000 bp) にゲノムマッピングされた11配列の全長cDNA [D-D3OST2000831.1, D-MESAN2002178.1, D-OCBBF3022929.1, BC047447.1, BX640844.1, C-HEP22543, ENST00000339611, ENST00000355967, ENST00000358643, ENST00000360917, NM_178833.3] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより7種類に分類されるが、転写開始点に注目すると主なものとして以下の2種類が存在した。
[1] D-D3OST2000831.1
[2] C-HEP22543 （AK172823.1）, ENST00000360917, NM_178833.3
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]よりも下流にある染色体領域より発現するが共通した翻訳開始点をもつため、転写開始点の変化によるORFの変化は存在しない。しかし、欠失領域が存在するためORF領域が異なっていた。
[1]〜[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点から発現を行い欠失がおこることにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２７２】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-D3OST2000831.1（[1]）の特徴
069_[1]_1-N0 (配列番号199) : D-D3OST2000831.1の核酸配列全領域
069_[1]_1-NA0 (配列番号200) : D-D3OST2000831.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
069_[1]_1-A0 (配列番号201) : D-D3OST2000831.1のアミノ配列全領域
D-D3OST2000831.1の1〜135塩基 (配列番号202) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_178833.3では存在しないエクソンが挿入するバリアントで、NM_178833.3とは相同性がない。また、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_178833.3の904〜1,074塩基に存在する171塩基のエクソン (配列番号205) がD-D3OST2000831.1の448〜449塩基の領域には存在せず欠失している。D-D3OST2000831.1とNM_178833.3では翻訳開始点・翻訳終止点は共通しているが、171塩基の欠失が存在することでORFが異なり、D-D3OST2000831.1のアミノ酸長はNM_178833.3と比較すると57残基短くなっていた。
この変化に伴い、NM_178833.3の80〜102アミノ酸目、114〜136アミノ酸目に存在するとSOSUIによって予測した、2ヶ所の膜貫通ドメインがD-D3OST2000831.1では消失していた。069_[1]_1-N1 (配列番号202) : D-D3OST2000831.1の135塩基の挿入核酸配列領域
069_[1]_1-N2 (配列番号203) : D-D3OST2000831.1の欠失核酸配列領域
069_[1]_1-N3 (配列番号203と同一) : D-D3OST2000831.1の欠失領域中のORF核酸配列領域069_[1]_1-A1 (配列番号204) : D-D3OST2000831.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
069_[1]_C-N1 (配列番号205) : D-D3OST2000831.1の448〜449塩基の領域に挿入されるNM_178833.3の904〜1,074塩基に存在する171塩基の挿入核酸配列
069_[1]_C-A1 (配列番号206) : D-D3OST2000831.1の448〜449塩基の領域に挿入されるNM_178833.3の904〜1,074塩基に存在する171塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域【０２７３】
３）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
069_01 - [1]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer069_01F (配列番号207) とPrimer069_01R (配列番号208) によって増幅される断片069_01 (配列番号209)
069_02 - 既存の公共DBに登録されている[2]の転写開始点領域、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer069_02F (配列番号210) とPrimer069_02R (配列番号211) によって増幅される断片069_02 (配列番号212)
069_03 -[1]のcDNAパターンのエクソンが欠失している領域の配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの欠失領域
→Primer069_03F (配列番号213) とPrimer069_03R (配列番号214) によって増幅される断片069_03 (配列番号215)
069_04 -既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの[1]の欠失領域と比較した場合にどちらとも区別できるような特異的な領域であり、[1]を比較検討するためのコントロール
→Primer069_04F (配列番号216) とPrimer069_04R (配列番号217) によって増幅される断片069_04 (配列番号218)
069_05 -[1]、[2]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer069_05F (配列番号219) とPrimer069_05R (配列番号220) によって増幅される断片069_05 (配列番号221)
上記に示された[1]、[2] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が14配列存在し、その由来はCD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導9日間(D9OST) が5配列 (解析母数 4,407)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導3日間(D3OST) が2配列 (解析母数 5,092)、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導6日間(D6OST) が2配列 (解析母数 888)、尾状核 (Brain, caudate nucleus) が2配列 (解析母数 25,786)、視床 (Brain, thalamus) が1配列 (解析母数 53,267)、NT2細胞をRA処理と生育阻害剤処理により神経分化後、神経を濃縮回収 (NT2 Neuron) が1配列 (解析母数 16,337)、軟骨細胞 (Chondrocyte) が1配列(解析母数 2,687) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [2]のパターンでは5’末端配列が79配列存在し、その由来は胎児脳 (Brain, Fetal) が19配列 (解析母数 71,152)、小脳(Brain, cerebellum) が9配列 (解析母数 82,880)、扁桃 (Brain, amygdala) が8配列 (解析母数 58,640)、全脳 (Brain, whole) が5配列(解析母数 59,069)、視床 (Brain, thalamus) が4配列 (解析母数 53,267)、腎臓癌 (Kidney, Tumor) が3配列 (解析母数 15,970)、NT2細胞をレチノイン酸処理誘導5週間後、生育阻害剤処理2週間(NT2RI) が3配列 (解析母数 32,662)、精巣(Testis) が3配列 (解析母数 90,188) など、様々な組織で見られた。
この結果より、[1]のパターンは、破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導したCD34+細胞での発現が多いことがわかった。また、[2]のパターンでは、脳を中心に様々な組織で発現していた。これにより、破骨細胞とそれ以外の組織（特に脳）では、この染色体領域において、転写の機構が異なり、用いられている転写開始点も異なる可能性が考えられた。【０２７４】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系組織の中でもどのような組織、どのような状態のときに発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表17-1、17-2及び表18-1、18-2に示した。【０２７５】
【表１７−１】
2008114709.tif 000023
【０２７６】
【表１７−２】
2008114709.tif 000024
【０２７７】
【表１８−１】
2008114709.tif 000025
【０２７８】
【表１８−２】
2008114709.tif 000026
【０２７９】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳（Brain, whole）を用いて比較した。
069_01 (配列番号209) と069_02 (配列番号212) で比較される転写開始点の選択性と069_03 (配列番号215) と069_04 (配列番号218) で比較されるエクソンの選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織で大きく変化していた。
骨髄 （Bone Marrow）、胸腺 （Thymus）、脾臓 （Spleen）、CD34+細胞（CD34+）、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）、 CD34+細胞をODF 処理誘導6日間 (CD34+ ODF 6days)、CD34+細胞をODF 処理誘導9日間 (CD34+ ODF 9days)、滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）、Jurkat細胞 (Jurkat)、脊髄 （Spinal Cord）では、069_01 (配列番号209) で表されるエクソンよりの転写物（mRNA）と、069_03 (配列番号215) で表されるエクソンが欠失するパターンでのmRNAの発現が多かった（表17-1、17-2・表18-1、18-2）。
つまりこれらの血球系組織では、他の組織とは異なり転写因子もしくは、転写機構によって、転写開始点に多様性があり、エクソンの選択性にも多様性があることで、ORF領域の異なるmRNAが発現していた。
これらの結果より、069_01 (配列番号209) という検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）069_[1]_1-N1 (配列番号202) の発現頻度と、069_03 (配列番号215) という検出領域で示されるエクソン欠失領域069_[1]_1-N2 (配列番号203) の発現頻度を比較することにより（それぞれ単独でも組み合わせての比較でも）、骨髄 （Bone Marrow）、胸腺 （Thymus）、脾臓 （Spleen）、CD34+細胞（CD34+）、Jurkat細胞 (Jurkat)、の血球系に特異的なマーカーとして、また滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）のマーカーや破骨細胞の分化マーカーとして利用することが可能であることが立証された。さらに、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても骨髄（Bone Marrow）、胸腺（Thymus）、脾臓（Spleen）、CD34+細胞（CD34+）、Jurkat細胞(Jurkat)の血球系に特異的なマーカーとして、また滑膜(Synovial) 組織（リューマチ患者）のマーカーや破骨細胞の分化マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-D3OST2000831.1においてPrimer069_01R (配列番号208) がプライミングする88〜109塩基目を含む上流配列069_[1]_1-N4 (配列番号222)。
[1]のcDNAパターンのD-D3OST2000831.1においてPrimer069_03R (配列番号214) がプライミングする530〜551塩基目を含む上流配列069_[1]_1-N5 (配列番号223)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer069_01F (配列番号207) とPrimer069_01R (配列番号208) によって増幅される領域069_01 (配列番号209)
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer069_03F (配列番号213) とPrimer069_03R (配列番号214) によって増幅される領域069_03 (配列番号215)【０２８０】
実施例１４：クラスターchr1+3150（データセット：108）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr1+3150 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体1番、182,997,500 bp〜183,017,500 bp) にゲノムマッピングされた8本の全長cDNA [D-HCASM2001914.1, D-SYNOV4003291.1, D-SYNOV4005198.1, C-SYNOV2000178, C-SYNOV4003981, ENST00000251819, NM_005807.1, U70136.1] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより6種類に分類されるが、主なものとして2種類が存在した。
[1] D-HCASM2001914.1、D-SYNOV4003291.1
[2] ENST00000251819, NM_005807.1, U70136.1
[1]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[2]とORFが異なっていた。
[1]は、既知の[2]と比較すると、ORF領域内の他のパターンと異なるエクソンが欠失しているため、ORF変化し、ORF領域が異なっていた。
[1]、[2]の2種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なるスプライシングのパターンをもつことにより、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２８１】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-HCASM2001914.1（[1]）の特徴
108_[1]_1-N0 (配列番号224) : D-HCASM2001914.1の核酸配列全領域
108_[1]_1-NA0 (配列番号225) : D-HCASM2001914.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
108_[1]_1-A0 (配列番号226) : D-HCASM2001914.1のアミノ配列全領域
既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_005807.1の353〜631塩基に存在する279塩基のエクソン (配列番号229) がD-HCASM2001914.1の364〜365塩基の領域には存在せず欠失している。その為、NM_005807.1と比較するとアミノ酸が93残基欠失していた。
108_[1]_1-N1 (配列番号227) : D-HCASM2001914.1の欠失核酸配列領域
108_[1]_1-A1 (配列番号228) : D-HCASM2001914.1の変化しているアミノ配列領域
108_[1]_1-N2 (配列番号227と同一) : D-HCASM2001914.1の欠失領域中のORF核酸配列領域108_[1]_1-A2 (配列番号228と同一) : D-HCASM2001914.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
108_[1]_C-N1 (配列番号229) : D-HCASM2001914.1の364〜365塩基の領域に挿入されるNM_005807.1の353〜631塩基に存在する279塩基の挿入核酸配列
108_[1]_C-A1 (配列番号230) : D-HCASM2001914.1の364〜365塩基の領域に挿入されるNM_005807.1の353〜631塩基に存在する279塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域。【０２８２】
３）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-SYNOV4003291.1（[1]）の特徴
108_[1]_2-N0 (配列番号231) : D-SYNOV4003291.1の核酸配列全領域
108_[1]_2-NA0 (配列番号232) : D-SYNOV4003291.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
108_[1]_2-A0 (配列番号233) : D-SYNOV4003291.1のアミノ配列全領域
既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_005807.1の109〜231塩基に存在する123塩基のエクソン (配列番号236) がD-SYNOV4003291.1の120〜121塩基の領域には存在せず欠失している。その為、NM_005807.1と比較するとアミノ酸が41残基欠失していた。
108_[1]_2-N1 (配列番号234) : D-SYNOV4003291.1の欠失核酸配列領域、その1
108_[1]_2-A1 (配列番号235) : D-SYNOV4003291.1の変化しているアミノ配列領域
108_[1]_2-N2 (配列番号234と同一) : D-SYNOV4003291.1の欠失領域中のORF核酸配列領域108_[1]_2-A2 (配列番号235と同一) : D-SYNOV4003291.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
108_[1]_C-N1 (配列番号236) : D-SYNOV4003291.1の120〜121塩基の領域に挿入されるNM_005807.1の109〜231塩基に存在する123塩基の挿入核酸配列
108_[1]_C-A1 (配列番号237) : D-SYNOV4003291.1の120〜121塩基の領域に挿入されるNM_005807.1の109〜231塩基に存在する123塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域。
この変化に伴い、NM_005807.1の28〜69アミノ酸目に存在するPfamモチーフ “Somatomedin B domain” が消失していた。
また既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_005807.1の353〜631塩基に存在する279塩基のエクソン (配列番号229) がD-SYNOV4003291.1の241〜242塩基の領域には存在せず欠失している。その為、NM_005807.1と比較するとアミノ酸が93残基欠失していた。
108_[1]_2-N3 (配列番号227と同一) : D-SYNOV4003291.1の欠失核酸配列領域、その2
108_[1]_2-A3 (配列番号228と同一) : D-SYNOV4003291.1の変化しているアミノ配列領域
108_[1]_2-N4 (配列番号227と同一) : D-SYNOV4003291.1の欠失領域中のORF核酸配列領域108_[1]_2-A4 (配列番号228と同一) : D-SYNOV4003291.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
108_[1]_C-N3 (配列番号229と同一) : D-SYNOV4003291.1の241〜242塩基の領域に挿入されるNM_005807.1の353〜631塩基に存在する279塩基の挿入核酸配列
108_[1]_C-A3 (配列番号230と同一) : D-SYNOV4003291.1の241〜242塩基の領域に挿入されるNM_005807.1の353〜631塩基に存在する279塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域。【０２８３】
４）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
上記で示されたような特徴的な領域を明確に区別して、それぞれの発現量を調べるために、以下のような領域を検出領域とした。その検出領域の発現量を比較することにより、個々の発現量を比較することが可能であると思われた。
108_01 - [1]のcDNAパターンで共通して欠失しているエクソン領域の境界にある配列情報を利用して特異的に抽出した領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターンにおいて、ORFを変化させているエクソンの欠失領域
→Primer108_01F (配列番号238) とPrimer108_01R (配列番号239) によって増幅される断片108_01 (配列番号240)
108_03 - 既存の公共DBに登録されている [2]のcDNAパターンと[1]の欠失領域と比較した場合に挿入領域に相当する特異的な領域
→Primer108_03F (配列番号241) とPrimer108_03R (配列番号242) によって増幅される断片108_03 (配列番号243)
108_04 - [1]、[2]全てが共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている [2]のcDNAパターンの全体としての発現量を比較するためにコントロールとなる全てのパターンが共通している領域
→Primer108_04F (配列番号244) とPrimer108_04R (配列番号245) によって増幅される断片108_04 (配列番号246)
上記に示された[1]、[2]のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が17配列存在し、その由来は滑膜組織 (Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) が14配列 (解析母数 27,489)、胸腺(Thymus) が2配列 (解析母数 70,578)、正常冠動脈平滑筋細胞HCASMC (Human coronary artery smooth muscle cells) が1配列 (解析母数 8,949) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [2]のパターンでは5’末端配列が42配列存在し、滑膜組織(Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) が42配列 (解析母数 27,489) 存在した。
この結果より、[1]、[2]両方のパターンで、滑膜組織(Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) での発現が多いことがわかった。つまり、滑膜組織(Synovial membrane tissue from rheumatioid arthritis) では、この染色体領域において、[1]、[2]のパターンのように、エクソンのスプライシングのパターンに多様性があることでORFが変化し、異なるタンパクを発現させるような機構が働くことがわかった。【０２８４】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
どのような組織でエクソンの選択性によるタンパク発現の多様性がどのように変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表19及び表20に示した。【０２８５】
【表１９】
2008114709.tif 000027
【０２８６】
【表２０】
2008114709.tif 000028
【０２８７】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳（Brain, whole）を用いて比較した。
108_01 (配列番号240) で表される新たに取得したmRNA発現のパターンと、108_03 (配列番号243) で表される既知のmRNA発現のパターンでは、共に滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）での発現が多く、比較されるエクソンの挿入・欠失のmRNAにおけるスプライシングによる選択性は、滑膜 (Synovial) 組織（リューマチ患者）において多様性があることがわかった（表19・表20）。また、108_03 (配列番号243) で表される既知のmRNA発現のパターンでは、CD34+細胞ODF（破骨細胞分化因子) 処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）、CD34+細胞 ODF 処理誘導9日間 （CD34+ ODF 9days）、脊髄 （Spinal Cord）で発現が高かった。
これらの結果より、108_01 (配列番号240) という検出領域で示される新たに取得したcDNAの選択的なエクソン領域108_[1]_1-N1(配列番号227) 及び108_[1]_2-N3 (配列番号227) の発現を検出することにより、血球系の中でも特にリューマチ患者の滑膜(Synovial)組織に特異的な診断・治療マーカーとして利用することが可能であることが立証された。また、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についても血球系の中でも特にリューマチ患者の滑膜(Synovial) 組織に特異的な診断・治療マーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-HCASM2001914.1においてPrimer108_01R (配列番号239) がプライミングする438〜458塩基目を含む上流配列108_[1]_1-N3 (配列番号247)。
[1]のcDNAパターンのD-SYNOV4003291.1においてPrimer108_01R (配列番号239) がプライミングする315〜335塩基目を含む上流配列108_[1]_2-N5 (配列番号248)。
[1]のcDNAパターンにおいてPrimer108_01F (配列番号238) とPrimer108_01R (配列番号239) によって増幅される領域108_01 (配列番号240)【０２８８】
実施例１５：クラスターchr7+710（データセット：076）
（１）クラスターの解析
１）クラスターの特徴
クラスターchr7+710 (Human genome UCSC hg18 (NCBI Build34) 染色体7番、44,810,000 bp〜44,890,000 bp) にゲノムマッピングされた14配列の全長cDNA [D-NETRP2002051.1, D-THYMU2031383.1, D-THYMU3032318.1, AL832992.1, BC004903.2, BC008859.2, BC016832.2, BC063663.1, BX641167.1, C-HRC00201, C-SYNOV2007758, C-THYMU2024071, ENST00000258781, NM_031443.2] について解析を行った。それらは、発現パターンの違いにより9種類のORFに分類されるが、主なものとして我々が新たに全長cDNA配列解析を行った3種類、既存の公共DBに登録されているパターンとして1種類の計4種類が存在した。
[1] D-NETRP2002051.1
[2] D-THYMU2031383.1
[3] D-THYMU3032318.1
[4] BC004903.2, BC008859.2, BC016832.2, ENST00000258781, NM_031443.2
[1]、[2]、[3]は、我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったcDNAであり、既存の公共DBに登録されていた[4]とORFが異なっていた。
[1]、[2]、[3]は、既知の[4]よりも下流にある染色体領域より発現し、[4]と相同性のない新しいエクソン上に翻訳開始点が存在するため、ORF領域が異なっていた。また[1]、[2]、[3]は、それぞれスプライシングのパターンが異なるため、同じ転写開始点、翻訳開始点をもつが、ORFが異なっていた。
[1]〜[4]の4種類のcDNAパターンがもつORF領域は、同じ染色体領域より、異なる転写開始点、異なるスプライシングパターンをもつことで、アミノ酸配列が変化し、多様性をもつタンパクやmRNAが生みだされていることが判った。【０２８９】
２）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-NETRP2002051.1（[1]）の特徴
076_[1]_1-N0 (配列番号249) : D-NETRP2002051.1の核酸配列全領域
076_[1]_1-NA0 (配列番号250) : D-NETRP2002051.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
076_[1]_1-A0 (配列番号251) : D-NETRP2002051.1のアミノ配列全領域
D-NETRP2002051.1の1〜126塩基 (配列番号252) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_0314443.2では存在しないエクソンが挿入するバリアントで、NM_0314443.2とは相同性がなく、挿入するエクソン上に翻訳開始点と存在する為、NM_0314443.2と比較するとN末端のアミノ酸が31残基 (配列番号253) 異なっていた。
076_[1]_1-N1 (配列番号252) : D-NETRP2002051.1の126塩基の挿入核酸配列領域
076_[1]_1-A1 (配列番号253) : D-NETRP2002051.1の31残基の挿入アミノ酸配列領域
076_[1]_1-N2 (配列番号254) : D-NETRP2002051.1の126塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
076_[1]_1-A2 (配列番号253と同一) : D-NETRP2002051.1の126塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域
また、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_0314443.2の286〜369塩基に存在する84塩基のエクソン (配列番号260) がD-NETRP2002051.1の300〜301塩基の領域には存在せず欠失している。その為、NM_0314443.2と比較するとアミノ酸が28残基 (配列番号261) 欠失していた。
076_[1]_1-N3 (配列番号255) : D-NETRP2002051.1の欠失核酸配列領域、その1
076_[1]_1-A3 (配列番号256) : D-NETRP2002051.1の変化しているアミノ酸配列領域
076_[1]_1-N4 (配列番号255と同一) : D-NETRP2002051.1の欠失領域中のORF核酸配列領域076_[1]_1-A4 (配列番号256と同一) : D-NETRP2002051.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
076_[1]_C-N1 (配列番号260) : D-NETRP2002051.1の300〜301塩基の領域に挿入されるNM_0314443.2の286〜369塩基に存在する84塩基の挿入核酸配列
076_[1]_C-A1 (配列番号261) : D-NETRP2002051.1の300〜301塩基の領域に挿入されるNM_0314443.2の286〜369塩基に存在する84塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域。
また、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_0314443.2の554〜690塩基に存在する137塩基のエクソン (配列番号262) がD-NETRP2002051.1の484〜485塩基の領域には存在せず欠失している。この変化に伴い、ORFの翻訳フレームが変化するため、NM_0314443.2と比較するとC末端のアミノ酸が38残基 (配列番号258) 異なっていた。
076_[1]_1-N5 (配列番号257) : D-NETRP2002051.1の欠失核酸配列領域、その2
076_[1]_1-A5 (配列番号258) : D-NETRP2002051.1の変化しているアミノ酸配列領域
076_[1]_1-N6 (配列番号257と同一) : D-NETRP2002051.1の欠失領域中のORF核酸配列領域076_[1]_1-A6 (配列番号259) : D-NETRP2002051.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
076_[1]_C-N2 (配列番号262) : D-NETRP2002051.1の484〜485塩基の領域に挿入されるNM_0314443.2の554〜690塩基に存在する137塩基の挿入核酸配列
076_[1]_C-A2 (配列番号263) : D-NETRP2002051.1の484〜485塩基の領域に挿入されるNM_0314443.2の554〜690塩基に存在する137塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域。【０２９０】
３）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-THYMU2031383.1（[2]）の特徴
076_[2]_1-N0 (配列番号264) : D-THYMU2031383.1の核酸配列全領域
076_[2]_1-NA0 (配列番号265) : D-THYMU2031383.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
076_[2]_1-A0 (配列番号266) : D-THYMU2031383.1のアミノ酸配列全領域
D-THYMU2031383.1の1〜126塩基 (配列番号252) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_0314443.2では存在しないエクソンが挿入するバリアントで、NM_0314443.2とは相同性がなく、挿入するエクソン上に翻訳開始点と存在する為、NM_0314443.2と比較するとN末端のアミノ酸が31残基 (配列番号253) 異なっていた。
076_[2]_1-N1 (配列番号252と同一) : D-THYMU2031383.1の126塩基の挿入核酸配列領域
076_[2]_1-A1 (配列番号253と同一) : D-THYMU2031383.1の31残基の挿入アミノ酸配列領域
076_[2]_1-N2 (配列番号254と同一) : D-THYMU2031383.1の126塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
076_[2]_1-A2 (配列番号253と同一) : D-THYMU2031383.1の126塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域
また、D-THYMU2031383.1の668〜1,459塩基 (配列番号267) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_0314443.2では存在しないエクソンが挿入するバリアントで、NM_0314443.2とは相同性がなく、挿入するエクソン上に翻訳終止点が存在する為、NM_0314443.2と比較するとC末端のアミノ酸が49残基 (配列番号268) 異なっていた。
076_[2]_1-N3 (配列番号267) : D-THYMU2031383.1の792塩基の挿入核酸配列領域
076_[2]_1-A3 (配列番号268) : D-THYMU2031383.1の49残基の挿入アミノ酸配列領域
076_[2]_1-N4 (配列番号269) : D-THYMU2031383.1の792塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
076_[2]_1-A4 (配列番号268と同一) : D-THYMU2031383.1の792塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域【０２９１】
４）我々が新たに取得し全長cDNA配列解析を行ったD-THYMU3032318.1（[3]）の特徴
076_[3]_1-N0 (配列番号270) : D-THYMU3032318.1の核酸配列全領域
076_[3]_1-NA0 (配列番号271) : D-THYMU3032318.1の核酸配列全領域とアミノ酸配列の併記
076_[3]_1-A0 (配列番号272) : D-THYMU3032318.1のアミノ酸配列全領域
D-THYMU3032318.1の1〜128塩基  (配列番号273) は、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_0314443.2では存在しないエクソンが挿入するバリアントで、NM_0314443.2とは相同性がなく、挿入するエクソン上に翻訳開始点と存在する為、NM_0314443.2と比較するとN末端のアミノ酸が31残基 (配列番号253) 異なっていた。
076_[3]_1-N1 (配列番号273) : D-THYMU3032318.1の128塩基の挿入核酸配列領域
076_[3]_1-A1 (配列番号253と同一) : D-THYMU3032318.1の31残基の挿入アミノ酸配列領域
076_[3]_1-N2 (配列番号254と同一) : D-THYMU3032318.1の128塩基の挿入領域中のORF核酸配列領域
076_[3]_1-A2 (配列番号253と同一) : D-THYMU3032318.1の128塩基の挿入領域に関わるORFアミノ酸領域
また、既存の公共DBに登録されているコントロールとなるNM_0314443.2の286〜553塩基に存在する268塩基のエクソン (配列番号277) がD-THYMU3032318.1の302〜303塩基の領域には存在せず欠失している。この変化に伴い、ORFの翻訳フレームが変化するため、NM_0314443.2と比較するとC末端のアミノ酸が55残基 (配列番号275) 異なっていた。
076_[3]_1-N3 (配列番号274) : D-THYMU3032318.1の欠失核酸配列領域
076_[3]_1-A3 (配列番号275) : D-THYMU3032318.1の変化しているアミノ酸配列領域
076_[3]_1-N4 (配列番号274と同一) : D-THYMU3032318.1の欠失領域中のORF核酸配列領域076_[3]_1-A4 (配列番号276) : D-THYMU3032318.1の欠失領域に関わるORFアミノ酸領域
076_[3]_C-N1 (配列番号277) : D-THYMU3032318.1の302〜303塩基の領域に挿入されるNM_0314443.2の286〜553塩基に存在する268塩基の挿入核酸配列
076_[3]_C-A1 (配列番号278) : D-THYMU3032318.1の302〜303塩基の領域に挿入されるNM_0314443.2の286〜553塩基に存在する268塩基の挿入核酸配列に関わるアミノ酸領域。【０２９２】
５）発現特異性解析とリアルタイムPCR用プライマーの設計
[1]〜[4]の4種類のcDNAパターンがもつORF領域は、それぞれが転写開始点領域に注目して分類すると2種類に分けられ、その転写開始領域を比較することにより、どちらの転写開始点より発現するのかを比較することが可能であると思われた。
076_01 - [1]、[3]のcDNAパターンのN末側に存在する特異的な領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]、[3]のcDNAパターンの転写開始領域であり、既存の公共DBに登録されていない新規性のある領域
→Primer076_01F (配列番号279) とPrimer076_01R (配列番号280) によって増幅される断片076_01 (配列番号281)
076_02 - 既存の公共DBに登録されている[4]が存在する転写開始点領域、[1]、[2]、[3]を比較検討するためのコントロール
→Primer076_02F (配列番号282) とPrimer076_02R (配列番号283) によって増幅される断片076_02 (配列番号284)
076_04 - [1]、[2]、[4]に共有する共通領域 : 我々が新たに全長cDNA配列解析を行った[1]、[2]のcDNAパターン、さらには既存の公共DBに登録されている[4]のcDNAパターンの発現量を比較するためのコントロールとなる共通している領域
→Primer076_04F (配列番号285) とPrimer076_04R (配列番号286) によって増幅される断片076_04 (配列番号287)
上記に示された[1]〜[4] のcDNAパターンのそれぞれに特異的なエクソン領域は、オリゴキャップ法を用いて取得した約144万配列の5’末端配列をヒトゲノム配列にマップし比較解析することにより下記のような頻度で発現している結果を得た。
我々が新たに解析したcDNAの[1]のパターンでは5’末端配列が2配列存在し、その由来は好中球 (Neutrophil) が1配列 (解析母数 9,170)、脾臓 (Spleen) が1配列 (解析母数 33,950) であった。
我々が新たに解析したcDNAの[2]のパターンでは5’末端配列が7配列存在し、その由来は胸腺 (Thymus) が5配列 (解析母数 70,578)、脾臓 (Spleen) が1配列 (解析母数 33,950)、視床 (Brain, thalamus) が1配列 (解析母数 53,267) であった。
我々が新たに解析したcDNAの[3]のパターンでは5’末端配列が1配列存在し、その由来は胸腺 (Thymus) が1配列 (解析母数 70,578) であった。
既存の公共DBに登録されているコントロールとなる [4]のパターンでは5’末端配列が存在しなかった。
この結果より、[1]、[2]、[3]の転写開始点は、胸腺(Thymus)、脾臓 (Spleen) での発現が多いことがわかった。つまり、胸腺 (Thymus)、脾臓 (Spleen) では、この染色体領域において、[1]、[2]、[3]のパターンのように染色体上で下流に位置する転写開始点を選択的に用いるような転写の機構が働くことがわかった。【０２９３】
（２）リアルタイムPCRによる発現特異性の解析
血球系組織の中でもどのような組織、どのような状態のときに発現に使われる転写開始点が変化するのかを知るために、発現量の詳細をリアルタイムPCRにて解析した。結果を表21に示した。【０２９４】
【表２１】
2008114709.tif 000029
【０２９５】
実施例3記載の血球系の組織やCD34+細胞、CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) で処理誘導した細胞など、12種類のサンプルを用いて発現量の比較を行った。実験的なコントロールとして、実施例3記載の正常内臓組織を混合したサンプル (Mix, viscus tissues) と全脳（Brain, whole）を用いて比較した。
076_01 (配列番号281) と076_02 (配列番号284) で比較される転写開始点の選択性によってmRNAが変わり、その結果としてORFが変化する比率は、以下の組織、細胞で大きく変化していた。
滑膜 （Synovial）組織（リューマチ患者）、胸腺（Thymus）、骨髄（Bone Marrow）、脾臓（Spleen）の血球系の組織では、076_01 (配列番号281) で表される下流の転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった（表21）。 また、脳では076_02 (配列番号284) で表される既知の転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった（表21）。
CD34+細胞を破骨細胞分化因子 (ODF) 処理誘導したものを用いて分化段階の比較をすると、分化の段階により転写開始点の選択性が大きく変化することがわかった。分化初期のCD34+細胞をODF 処理誘導3日間 （CD34+ ODF 3days）までは、076_01 (配列番号281) で表される下流の転写開始点からの転写物（mRNA）が多かったのだが、分化の後期のCD34+細胞をODF処理誘導6日間 （CD34+ ODF 6days）、CD34+細胞をODF処理誘導9日間 （CD34+ ODF 9days） では選択性が逆転し、076_02 (配列番号284) で表される既知の転写開始点からの転写物（mRNA）が多かった（表21）。
つまり血球系の組織と脳では異なる転写因子もしくは、転写機構によって、転写開始点に多様性があることで、異なるORFをもつmRNAが発現していた。さらに、破骨細胞では、分化が進むにつれて、選択する転写開始点が変化していくことがわかった。
これらの結果より、076_01 (配列番号281) というという検出領域で示される新たに取得したcDNA領域の5’-末端領域（転写開始点付近の領域）076_[1]_1-N1 (配列番号252)、076_[2]_1-N1 (配列番号252)、076_[3]_1-N1 (配列番号273) の発現を比較することで、リューマチ患者の滑膜 (Synovial)組織 の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞への分化、特に分化の初期段階を検出する治療・診断マーカー（骨粗鬆症・リューマチやそれに至る過程の診断・治療マーカー）として、また胸腺 （Thymus）、骨髄（Bone Marrow）、脾臓（Spleen）の血球系に特異的なマーカーとして、利用することが可能であることが立証された。さらに、特異性を示す領域を標的とした化合物、抗体、siRNA等による新薬開発も可能と思われる。
また以下の領域についてもリューマチ患者の滑膜 (Synovial) 組織 の血球系に特異的な治療・診断マーカーとして、破骨細胞への分化、特に分化の初期段階を検出する治療・診断マーカーとして、また胸腺（Thymus）、骨髄（Bone Marrow）、脾臓（Spleen）の血球系に特異的なマーカーとして有用であると思われる。
[1]のcDNAパターンのD-NETRP2002051.1においてPrimer076_01R (配列番号280) がプライミングする149〜174塩基目を含む上流配列076_[1]_1-N7 (配列番号288)。
[3]のcDNAパターンのD-THYMU3032318.1においてPrimer076_01R (配列番号280) がプライミングする151〜176塩基目を含む上流配列076_[3]_1-N5 (配列番号289)。
[1]、[3]のcDNAパターンにおいてPrimer076_01F (配列番号279) とPrimer076_01R (配列番号280) によって増幅される領域076_01 (配列番号281)【０２９６】
実施例１６：全長cDNA配列のORF情報と相同性解析結果及びモチーフ等の解析結果
我々が新たに取得し全長cDNA配列解析行った18配列の全長cDNAの機能を知るためにORF予測とアノテーション解析を行った。アノテーション解析結果は比較するデータベースや解析ソフトがバージョンアップされた時には更新することができる。それにより、アノテーションが記載されていないものにも同一条件で新たに付けることが可能となることがある。【０２９７】
１）全長cDNA配列解析したcDNAのORF予測
ATGpr (A. Salamov et al. (1998) Bioinformatics 14: 384-390) 、TRins (K. Kimura et al. (2003) Genome Informatics 14: 456-457) などのORF予測・評価システムを用い全長cDNA配列からORFを予測した。全長cDNA配列から予測したORF領域情報を以下に示す。
ORF領域の記載方法は「DDBJ/EMBL/GenBank Feature Table Definition」(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/collab/FT/index.html) の規則に則って記載した。ORF開始位置はメチオニンをコードする塩基である ”ATG” の一文字目であり、終止位置は終止コドンの3文字目を示している。これを「..」で区切り記載した。ただし、終止コドンが現れないORFについては記載規則に則って” > ” を用いて終止位置を記載した。
-  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -
cDNA配列名                ORF領域
-  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -
D-SYNOV4003692.1      176..1126
D-D3OST2001534.1       288..1919
D-NETRP1000046.1       57..950
D-PLACE7010497.1       34..1875
D-SPLEN2030304.1        89..1768
D-SYNOV4000324.1       45..986
D-SYNOV4007243.1       202..2526
D-NETRP2004161.1       290..1240
D-NT2RI3001993.1         63..3206
D-SMINT2013276.1        93..2036
D-THYMU3006588.1      87..2723
D-D3OST2003177.1       163..2718
D-D3OST2000831.1       178..1620
D-HCASM2001914.1      46..>2604
D-SYNOV4003291.1       46..>693
D-NETRP2002051.1        34..579
D-THYMU2031383.1      34..816
D-THYMU3032318.1      36..470
-  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -  -【０２９８】
２）ＢＬＡＳＴＰによる相同性解析結果（SwissProt）
実施例16の1）に記載した18配列のORFについてBLASTP (blastall 2.2.6; ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) を用い、2006年8月22日のバージョンのSwissProt (ftp://us.expasy.org/databases/swiss-prot/) に対して相同性解析を行った。相同性解析を行った結果より最も高い相同性を示したものでE-valueの値が1E-10以下の相同性を示すものを以下に記載する。ただし、次の条件に当てはまる時は該当候補を選択せず次候補を記載した。
「ALU SUBFAMILY」で始まるdefinitionのもの
「Alu subfamily」で始まるdefinitionのもの
「!!!! ALU SUBFAMILY」で始まるdefinitionのもの
「B-CELL GROWTH FACTOR PRECURSOR」で始まるdefinitionのもの
「NRK2」を含むdefinitionのもの
「PROLINE-RICH」で始まるdefinitionのもの
「GLYCINE-RICH」で始まるdefinitionのもの
「EXTENSIN PRECURSOR」で始まるdefinitionのもの
「COLLAGEN」で始まるdefinitionのもの
「100KD」で始まるdefinitionのもの
「RETROVIRUS-RELATED POL POLYPROTEIN」で始まるdefinitionのもの
「CUTICLE COLLAGEN」で始まるdefinitionのもの
「HYPOTHETICAL」で始まるdefinitionのもの
「Hypothetical」で始まるdefinitionのもの
「SALIVARY PROLINE-RICH PROTEIN」 で始まるdefinitionのもの
「IMMEDIATE-EARLY PROTEIN」 で始まるdefinitionのもの
アクセッションNoが「P49646」であるもの
各データは、cDNA配列名、ORF領域、ヒットデータのアクセッション番号、ヒットデータのDefinition、ヒットデータのキーワード、E-value、コンセンサス長 (アミノ酸長)、Identityの順に ”//” で区切って記載した。
D-SYNOV4003692.1// 176..1126// O75030// Microphthalmia-associated transcription factor// Activator; Albinism; Alternative splicing; Deafness; Developmental protein; Disease mutation; DNA-binding; Nuclear protein; Phosphorylation; Transcription; Transcription regulation; Waardenburg syndrome.// 7E-60// 158// 46
D-D3OST2001534.1// 288..1919// P28039// Acyloxyacyl hydrolase precursor (EC 3.1.1.77)[Contains: Acyloxyacyl hydrolase small subunit;Acyloxyacyl hydrolase large subunit]// Direct protein sequencing; Glycoprotein; Hydrolase; Polymorphism; Signal; Zymogen.// 0// 543// 94
D-NETRP1000046.1// 57..950// P28039// Acyloxyacyl hydrolase precursor (EC 3.1.1.77)[Contains: Acyloxyacyl hydrolase small subunit;Acyloxyacyl hydrolase large subunit]// Direct protein sequencing; Glycoprotein; Hydrolase; Polymorphism; Signal; Zymogen.// 1E-176// 293// 100
D-PLACE7010497.1// 34..1875// P53667// LIM domain kinase 1 (EC 2.7.11.1) (LIMK-1)// Alternative splicing; ATP-binding; Kinase; LIM domain; Metal-binding; Nucleotide-binding; Phosphorylation; Repeat; Serine/threonine-protein kinase; Transferase; Williams-Beuren syndrome; Zinc.// 0// 596// 99
D-SPLEN2030304.1// 89..1768// P29074// Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type4 (EC 3.1.3.48) (Protein-tyrosine phosphatase MEG1)(PTPase-MEG1) (MEG)// 3D-structure; Cytoskeleton; Hydrolase; Protein phosphatase; Structural protein.// 0// 558// 99
D-SYNOV4000324.1// 45..986// P16333// Cytoplasmic protein NCK1 (NCK adaptor protein1) (SH2/SH3 adaptor protein NCK-alpha)// 3D-structure; Direct protein sequencing; Phosphorylation; Repeat; SH2 domain; SH3 domain.// 1E-180// 303// 99
D-SYNOV4007243.1// 202..2526// Q01432// AMP deaminase 3 (EC 3.5.4.6) (AMP deaminaseisoform E) (Erythrocyte AMP deaminase)// Alternative splicing; Hydrolase; Nucleotide metabolism; Polymorphism.// 0// 767// 100
D-NETRP2004161.1// 290..1240// Q6UX41// Butyrophilin-like protein 8 precursor// Alternative splicing; Direct protein sequencing; Glycoprotein; Immunoglobulin domain; Membrane; Repeat; Signal; Transmembrane.// 0// 315// 99
D-NT2RI3001993.1// 63..3206// Q96MK2// Uncharacterized protein C20orf175// // 1E-99// 245// 38
D-SMINT2013276.1// 93..2036// Q96MK2// Uncharacterized protein C20orf175// // 7E-96// 232// 38
D-THYMU3006588.1// 87..2723// Q96M96// FYVE, RhoGEF and PH domain-containing protein4 (Actin filament- binding protein frabin) (FGD1-relatedF-actin-binding protein) (Zinc finger FYVEdomain-containing protein 6)// Actin-binding; Alternative splicing; Cytoskeleton; Guanine-nucleotide releasing factor; Metal-binding; Repeat; Zinc; Zinc-finger.// 0// 764// 99
D-D3OST2003177.1// 163..2718// Q96M96// FYVE, RhoGEF and PH domain-containing protein4 (Actin filament- binding protein frabin) (FGD1-relatedF-actin-binding protein) (Zinc finger FYVEdomain-containing protein 6)// Actin-binding; Alternative splicing; Cytoskeleton; Guanine-nucleotide releasing factor; Metal-binding; Repeat; Zinc; Zinc-finger.// 0// 765// 99
D-HCASM2001914.1// 46..>2604// Q92954// Proteoglycan-4 precursor (Lubricin)(Megakaryocyte-stimulating factor) (Superficial zoneproteoglycan) [Contains: Proteoglycan-4 C-terminal part]// Alternative splicing; Glycoprotein; Polymorphism; Proteoglycan; Repeat; Signal.// 0// 744// 99
D-SYNOV4003291.1// 46..>693// Q92954// Proteoglycan-4 precursor (Lubricin)(Megakaryocyte-stimulating factor) (Superficial zoneproteoglycan) [Contains: Proteoglycan-4 C-terminal part]// Alternative splicing; Glycoprotein; Polymorphism; Proteoglycan; Repeat; Signal.// 2E-82// 151// 99
D-NETRP2002051.1// 34..579// Q9BSQ5// Malcavernin (Cerebral cavernous malformations2 protein)// Disease mutation; Polymorphism.// 9E-59// 120// 78
D-THYMU2031383.1// 34..816// Q9BSQ5// Malcavernin (Cerebral cavernous malformations2 protein)// Disease mutation; Polymorphism.// 4E-99// 181// 98
D-THYMU3032318.1// 36..470// Q9BSQ5// Malcavernin (Cerebral cavernousmalformations 2 protein)// Disease mutation; Polymorphism.// 5E-27// 58// 98【０２９９】
３）ＢＬＡＳＴＰによる相同性解析結果 (RefSeq)
実施例16の1）に記載した18配列のORFについてBLASTP (blastall 2.2.6; ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) を用い、2006年7月15日のバージョンのRefSeq (human, mouse, rat； ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/) に対して相同性解析を行った。相同性解析を行った結果より最も高い相同性を示したものでE-valueの値が1E-10以下の相同性を示すものを以下に記載する。ただし、次の条件に当てはまる時は該当候補を選択せず次候補を記載した。
「hypothetical protein FLJ」で始まるdefinitionのもの
「KIAA」で始まるdefinitionのもの
「hypothetical protein DKFZ」で始まるdefinitionのもの
「DKFZ」で始まるdefinitionのもの
「RIKEN cDNA」で始まるdefinitionのもの
「hypothetical protein MGC」で始まるdefinitionのもの
「hypothetical protein」 であるdefinitionのもの
「hypothetical protein PP」で始まるdefinitionのもの
「neuronal thread protein」であるdefinitionのもの
「clone FLB」で始まるdefinitionのもの
「hypothetical protein PRO」で始まるdefinitionのもの
「PRO0483 protein」であるdefinitionのもの
「MNC」を含むdefinitionのもの
「MOST-1」を含むdefinitionのもの
「similar to」で始まるdefinitionのもの
「TPR gene on Y」を含むdefinitionのもの
「HSPC」で始まるdefinitionのもの
「CGI-」で始まるdefinitionのもの
各データは、cDNA配列名、ORF領域、ヒットデータのアクセッション番号、ヒットデータのDefinition、E-value、コンセンサス長 (アミノ酸長)、Identityの順に ”//” で区切って記載した。
D-SYNOV4003692.1// 176..1126// NP_036384.1// transcription factor EC isoform a [Homo sapiens]// 1E-125// 221// 100
D-D3OST2001534.1// 288..1919// NP_001628.1// acyloxyacyl hydrolase precursor [Homo sapiens]// 0// 543// 94
D-NETRP1000046.1// 57..950// NP_001628.1// acyloxyacyl hydrolase precursor [Homo sapiens]// 1E-177// 293// 100
D-PLACE7010497.1// 34..1875// NP_002305.1// LIM domain kinase 1 [Homo sapiens]//0// 596// 99
D-SPLEN2030304.1// 89..1768// NP_002821.1// protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 4 [Homo sapiens]// 0// 558// 99
D-SYNOV4000324.1// 45..986// NP_006144.1// NCK adaptor protein 1 [Homo sapiens]// 0// 303// 99
D-SYNOV4007243.1// 202..2526// NP_001020561.1// erythrocyte adenosine monophosphate deaminase isoform 1C [Homo sapiens]// 0// 774// 100
D-NETRP2004161.1// 290..1240// NP_001035552.1// butyrophilin-like 8 long form [Homo sapiens]// 0// 315// 99
D-THYMU3006588.1// 87..2723// NP_640334.1// FYVE, RhoGEF and PH domain containing 4 [Homo sapiens]// 0// 764// 99
D-D3OST2003177.1// 163..2718// NP_640334.1// FYVE, RhoGEF and PH domain containing 4 [Homo sapiens]// 0// 765// 99
D-HCASM2001914.1// 46..>2604// NP_005798.2// proteoglycan 4 [Homo sapiens]// 0//744// 99
D-SYNOV4003291.1// 46..>693// NP_005798.2// proteoglycan 4 [Homo sapiens]// 1E-82// 151// 99
D-NETRP2002051.1// 34..579// NP_001025006.1// cerebral cavernous malformation 2 isoform 1 [Homo sapiens]// 2E-78// 151// 82
D-THYMU2031383.1// 34..816// NP_113631.1// cerebral cavernous malformation 2 isoform 2 [Homo sapiens]// 2E-99// 181// 98
D-THYMU3032318.1// 36..470// NP_001025006.1// cerebral cavernous malformation 2 isoform 1 [Homo sapiens]// 9E-47// 89// 100【０３００】
４）Pfamによるモチーフ相同性解析結果
実施例16の1）に記載した18配列のORFについてPfam （ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/databases/Pfam/）を用い、モチーフ相同性解析を行った。解析プログラムにはhmmpfam  v2.3.2を使用し、2005年11月バージョンのPfam19.0に対して解析を実施した。相同性解析を行った結果より最も高い相同性を示したものでE-valueの値が1E-10以下の相同性を示すものを以下に記載する。
各データは、cDNA配列名、ORF領域に続き、ヒットデータのアクセッション番号、ヒットデータの名前、ヒットデータのDescription、E-value、InterPro IDの順に”￥”で区切ったものをヒットデータの数だけの”//” 区切りで繰り返し記載した。
D-SYNOV4003692.1// 176..1126// PF00010.15\HLH\Helix-loop-helix DNA-binding domain\1.8e-15\IPR001092
D-D3OST2001534.1// 288..1919// PF00657.11\Lipase_GDSL\GDSL-like Lipase/Acylhydrolase\1e-39\IPR001087
D-NETRP1000046.1// 57..950// PF00657.11\Lipase_GDSL\GDSL-like Lipase/Acylhydrolase\8.5e-29\IPR001087
D-PLACE7010497.1// 34..1875// PF00069.14\Pkinase\Protein kinase domain\4.6e-49\IPR000719// PF07714.5\Pkinase_Tyr\Protein tyrosine kinase\1.8e-48\// PF00412.11\LIM\LIM domain\1e-21\IPR001781// PF00595.12\PDZ\PDZ domain (Also known as DHR or GLGF)\4.7e-19\IPR001478
D-SPLEN2030304.1// 89..1768// PF00102.16\Y_phosphatase\Protein-tyrosine phosphatase\2.9e-110\IPR000242// PF00595.12\PDZ\PDZ domain (Also known as DHR or GLGF)\4.5e-25\IPR001478
D-SYNOV4000324.1// 45..986// PF00017.12\SH2\SH2 domain\8.8e-34\IPR000980// PF00018.16\SH3_1\SH3 domain\5.3e-23\IPR001452// PF07653.5\SH3_2\Variant SH3 domain\1.3e-11\IPR011511
D-SYNOV4007243.1// 202..2526// PF00962.11\A_deaminase\Adenosine/AMP deaminase\4.1e-232\IPR001365
D-NETRP2004161.1// 290..1240// PF00622.17\SPRY\SPRY domain\6e-30\IPR003877
D-THYMU3006588.1// 87..2723// PF00621.10\RhoGEF\RhoGEF domain\5e-59\IPR000219// PF01363.12\FYVE\FYVE zinc finger\4.9e-24\IPR000306// PF00169.17\PH\PH domain\4.3e-18\IPR001849
D-D3OST2003177.1// 163..2718// PF00621.10\RhoGEF\RhoGEF domain\2.2e-61\IPR000219// PF01363.12\FYVE\FYVE zinc finger\4.9e-24\IPR000306// PF00169.17\PH\PH domain\4.3e-18\IPR001849
D-HCASM2001914.1// 46..>2604// PF01033.7\Somatomedin_B\Somatomedin B domain\1.1e-19\IPR001212
D-SYNOV4003291.1// 46..>693// PF01033.7\Somatomedin_B\Somatomedin B domain\1.3e-16\IPR001212【０３０１】
５）SOSUIによる膜貫通ドメイン予測解析
実施例16の1）に記載した18配列のORFについてSOSUI （http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/）を用い、膜貫通ドメイン予測解析を行った。解析にはSOSUIバージョン1.5を用いた。SOSUI解析において膜貫通ドメインが予測できたものについて以下に記載する。
各データは、cDNA配列名、ORF領域、膜貫通ドメイン回数を”//” 区切りで記載した。
D-NETRP2004161.1// 290..1240// 1
D-D3OST2000831.1// 178..1620// 10
D-HCASM2001914.1// 46..>2604// 1
D-SYNOV4003291.1// 46..>693// 1【０３０２】
６）PSORTによるN末端分泌シグナル配列予測解析
実施例16の1）に記載した18配列のORFについてPSORT （http://psort.nibb.ac.jp/） を用い、N末端分泌シグナル配列予測を行った。解析にはPSORT IIを用いた。PSORT解析においてN末端分泌シグナル配列が予測できたものについて以下に記載する。
各データは、cDNA配列名、ORF領域を”//” 区切りで記載した。
D-D3OST2001534.1// 288..1919
D-HCASM2001914.1// 46..>2604
D-SYNOV4003291.1// 46..>693【０３０３】
７）SignalP ver.3.0によるN末端分泌シグナル配列予測解析
実施例16の1）に記載した18配列のORFについてSignalP （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） を用い、N末端分泌シグナル配列予測を行った。解析にはSignalP バージョン3.0を用いた。SignalP解析においてN末端分泌シグナル配列が予測できたものについて以下に記載する。
各データは、cDNA配列名、ORF領域を”//” 区切りで記載した。
D-D3OST2001534.1// 288..1919
D-HCASM2001914.1// 46..>2604
D-SYNOV4003291.1// 46..>693【０３０４】
（実施例１〜１６に対する総括）
ヒトゲノム研究の進展により、ヒトの染色体配列の解析は大幅に進んだが、それによりヒト遺伝子の機能の全てが明らかになったわけではない。我々は、ヒトの遺伝子をその多様性に重点をおいて解析することにより、多様性が遺伝子の機能の変化に大きく関連していることを解明した。
ヒトゲノムの配列情報とそこから転写された産物であるヒトcDNAのデータを比較することにより、染色体のある領域から複数のmRNAが転写されていることがわかった。それらは、タンパク質をコードすると予測されるORF領域に違いがあり異なるタンパク質ができると予測される場合と、非翻訳領域である5’UTR領域や3’UTR領域に違いがありタンパク質としては同じものとなる場合が存在した。我々は、その中でも特にすでに解析されている既知のcDNAと異なるタンパク質をコードすると予測されるcDNAに重点をおいて、そのようなcDNAの探索と配列解析を行った。すると、多様性が生み出される原因は、主に転写開始点の選択性とエクソンの選択性にあることがわかった。転写開始点の選択性では、ある染色体領域において使われる転写因子が変化することにより、転写の始まる位置が異なり、cDNAに多様性が生じていた。また、エクソンの選択性では、転写されスプライシングが起こる際に、同じ染色体領域から転写していても使われるエクソンが増えたり減ったりすることでcDNAに多様性が生じていた。
遺伝子の多様性が機能とどのような関連があるのかを我々のもつ約150万のヒトcDNAの5’末端配列（5’-onepass配列）によるmRNAの発現頻度情報をもとに解析した。すると、ある臓器のみ選択的に転写開始領域が異なっていたり、ある病態になった時のみエクソンが欠失するなどといった多様性が機能に大きく影響していると思われる例が多数見つかった。我々は、血球系由来の破骨細胞の分化段階、リューマチ患者の滑膜組織や血球系の臓器組織において、mRNAの多様性に変化が現れる遺伝子を見つけ出して詳細な解析を行った。
解析方法としては、リアルタイムPCR（polymerase chain reaction）を用いてその発現量を比較した。例えば、血球系細胞であるCD34陽性（CD34+）細胞が多核破骨細胞へ分化する場合にのみ選択的に挿入されると予測されるエクソンがある場合、そのエクソン領域を特異的に検出するPrimer (01)を設計、またそのエクソンが挿入されないパターンのみを特異的に検出するPrimer (02)を設計、さらにどちらのパターンも共有してもつ領域を検出するPrimer (03)を設計する。これらの3種類のPrimerを使って、破骨細胞の分化のステージ別での増幅量を比較する。共有領域の03の増幅量をコントロールとして、特異的な領域の検出結果である01、02の破骨細胞の分化のステージ別の増幅量を比較することにより、エクソンの選択性が破骨細胞の分化によってどのように変化したのかを知ることができるのである。つまり、エクソンの選択性と組織特異的な発現の相関をみることが出来るのである。
この方法によって、我々は、遺伝子の多様性が組織特異的な発現と関連している遺伝子を多く見つけ出した。発現している組織に特異性があるということは、多様性がその遺伝子の機能に大きく影響していることが示唆される。つまり、多様性が生じている特異的な領域を遺伝子マーカーとして使用することで、破骨細胞の分化段階を詳細に検出することが可能になったり、滑膜組織などの血球系組織の病態の状況を知ることが可能になるとおもわれる。さらには、例えば血球系組織から発現する特異的な領域をもつタンパク質を標的にして医薬品の開発を進めることにより、より副作用の少なく効果の高い医薬品の開発が可能になると思われる。【０３０５】
＜in vitro破骨細胞形成法と破骨細胞についての説明＞
１）破骨細胞
破骨細胞は単球、マクロファージ系の前駆細胞に由来する多核細胞であり、正常な骨リモデリングのみならず慢性関節リューマチ、癌の骨転移などの病的な骨吸収においても中心的な役割を果たしている（Miyamoto, T. and Suda, T., Keio J Med. (2003) 52: 1-7; Udagawa, N. et al., Arthritis Res. (2002) 4: 281-289）。破骨細胞の研究が進んでいなかった理由のひとつは、破骨細胞が分裂能のない細胞であり、株細胞が存在しなかったことであった。しかし、最近、単独細胞を破骨細胞に分化させることが可能になった。【０３０６】
２）マウス破骨細胞形成系
1988年に高橋らは、マウス骨髄細胞を活性型ビタミンD3や副甲状腺ホルモンなどの骨吸収因子の存在下で培養することで破骨細胞様の多核細胞が形成されることを発見した（Takahashi, N. et al., Endocrinology (1988) 123: 1504-1510）。この方法で形成された多核細胞は、酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（tartrate-resistant acid phosphoatase, TRAP）陽性で多数のカルシトニンレセプターをもち、象牙質切片上で吸収窩を形成するなど破骨細胞としての性質を全て満足するものであった。このとき形成される破骨細胞様細胞が、アルカリホスファターゼ陽性の骨芽細胞様のストローマ細胞に近接して形成されることから、彼らは骨芽細胞が血球系の細胞から破骨細胞への分化を支持しているのではないかと考えた。そこでマウス頭蓋骨から得られた骨芽細胞と純粋に血球系の細胞である脾細胞との共存培養を行ったところ、予想通り骨吸収因子の存在下で破骨細胞様細胞が形成された（Takahashi, N. et al., Endocrinology (1988) 123: 2600-2602）。興味深いことに骨芽細胞、脾細胞を単独で培養すると、骨吸収因子が存在しても破骨細胞は形成されず、骨芽細胞と破骨細胞前駆細胞との直接の接触が破骨細胞形成に必須であることが明らかになった。この時の骨芽細胞の役割については永らく不明であったが、最近骨芽細胞の産生するマクロファージコロニー刺激因子（macrophage colony-stimulating factor, M-CSF）（Yoshida, H. et al., Nature (1990) 345: 442-444）及びOsteoclast Differentiation Factor（ODF）（Yasuda, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 3597-3602）が破骨細胞の分化において極めて重要な役割を果たすことが明らかになった。【０３０７】
３）ヒト破骨細胞形成系
1998年に保田ら（Yasuda, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95: 3597-3602）がODFをクローニングして以来、単独細胞による破骨細胞分化の研究が進められ、須田らのグループにより、ヒト齊帯血由来CD34陽性（CD34+）細胞をM-CSF及びODF処理すると、約10日目に多核破骨細胞が形成されることが見出された。この細胞はマクロファージとしても増殖するが、分化の条件を整えることにより効率的に（純度よく）破骨細胞に分化させることができるようになった。【０３０８】
４）分化誘導細胞からのcDNAライブラリー作製と遺伝子発現解析
ヒト齊帯血由来CD34+細胞をM-CSF及びODF処理すると、約10日目に多核破骨細胞が形成される。ヒト齊帯血由来CD34+細胞をAllCells, LLCのCB-CD34＋を購入し、3週間培養して増やした後、ODFで分化誘導した。分化誘導後、各分化段階の状況を見てみると、6日で多核破骨細胞に分化した細胞が見られるようになり、9日ではほとんどが多核破骨細胞に分化していた。この未分化及び分化誘導後、3日、6日及び9日より改良オリゴキャップ法でcDNAライブラリーを作成し、5'-端の配列解析することにより遺伝子発現頻度解析をおこなった。その結果を他のcDNAライブラリーからの5'-端配列などと比較することにより、発現特異性のあるcDNAを取得し、更なる解析を行った。【０３０９】
５）骨粗鬆症に関連する遺伝子・mRNA
骨粗鬆症とは、骨の成分が全体として減少し、骨折しやすくなった病態であるが、その発症には骨を産生する骨芽細胞と、骨を吸収する破骨細胞の働きのバランス、すなわち骨代謝が関与する。したがって単球／マクロファージ系の前駆細胞から分化する破骨細胞の増加に関連する遺伝子・mRNAは、骨代謝に関連した骨粗鬆症に関する遺伝子・mRNAであると言える。【０３１０】
＜CD34陽性(CD34+)細胞＞
CD34+細胞は、ヒトの血液幹細胞を豊富に含む細胞分画である。CD34は、分子量約110kDaの膜蛋白質であり、ヒト骨髄細胞の約1%に発現していて、接着分子として機能していると考えられている。CD34+細胞の約３分の１がin vitroでコロニーを形成する。ヒトCD34+細胞は、Ｔ細胞にも分化でき、ヒトの造血幹細胞はCD34を発現していることが明らかになっている。現在では、CD34+細胞を移植する造血幹細胞移植も実用化されている。造血幹細胞はヒトの末梢血中や臍帯血中にも存在し、CD34+細胞はそれぞれ0.01%, 0.3%程度であると言われている。【０３１１】
＜滑膜(synovial)組織と関節リューマチの説明＞
関節とは骨と骨をつなぐ部分であり、固い骨と骨が直接ぶつからないように、わずかな隙間(関節腔)は粘りのある関節液(滑液)で満たされ、骨の先を弾力のある軟骨が覆ってクッションの役割を果たしている。軟骨は水を80％も含む弾力のあるやわらかい骨で、コラーゲンという繊維成分を含み強さを保っている。軟骨は加齢や加重によりすり減るなど変化する。関節全体は関節胞に包まれ、その内側にある滑膜が関節液を分泌して、関節の動きをスムーズにして栄養を補給する。この滑膜に炎症が起こると関節に腫れや痛みが起こる。
慢性関節リューマチに特徴的な症状は関節の腫れと痛みである。この腫れと痛みの原因は関節に起こる炎症である。「炎症反応」は組織が傷ついたときに修復を行おうとする防御反応のひとつである。滑膜の炎症は、免疫細胞が自己を攻撃しはじめることで引き起こされる。１）Ｔ細胞や好中球などの免疫細胞が滑膜の中に入り込む。２）滑膜の中にリューマチ因子があらわれ関節液へこぼれだす。３）リューマチ因子は、IgGという抗体と結びつき「免疫複合体」になり、さらに補体というタンパク質と結びつき好中球やマクロファージ及びよせる。４）好中球はライソゾームやプロスタグランジンという物質を出して「免疫複合体」を攻撃する。これらの物質や酵素は滑膜に炎症を起こしたり、骨や軟骨を破壊する。多量の関節液が分泌されて関節が腫れあがって痛む。Ｔ細胞やＢ細胞が攻撃に加わるとさらに炎症が進み慢性化する。滑膜の炎症が慢性化すると、徐々に関節の変形が起こってくる。骨の破壊や変形は元へは戻せないので、早期発見で治療を行い、炎症をくい止めることが大切である。
関節リューマチのステージは次のようである。ステージ1(初期)：関節腔に関節液が増えると骨のカルシウム分が失われていき、まだ骨の破壊は起きていないが骨にスが入ったような骨萎縮がみられる場合がある。ステージ2(中等度)：滑膜の細胞が増殖し肉芽(パンヌス)を形成、肉芽が軟骨と軟骨下の骨を侵食しはじめ、骨びらんがみられる。関節周辺の筋肉に萎縮がみられる。ステージ3(高度)：軟骨の侵食が進み骨も破壊され関節がうまく噛み合わなくなり関節の変形や亜脱臼・脱臼が起こる。筋肉に強い萎縮がみられ筋肉や腱の伸縮が悪くなり関節の変形が起きる。ステージ4(末期)：肉芽が繊維化して硬くなり、二つの骨の端がくっついて骨癒合の状態となり関節がまったく動かせない状態になる。【０３１２】
＜骨髄(bone marrow)＞
骨髄は、骨の中に存在する柔組織である。骨髄は血液に富み、あらゆる血球系細胞（赤血球、白血球、リンパ球、血小板のもとになる巨核球など）に分化できる造血幹細胞が存在する。マウスにおいては一個の造血幹細胞を移植することによって、すべての造血系細胞を再構成させることができることが証明されており、ヒトにおいても骨髄移植は白血病など造血系の疾患の根治的治療として有効である場合がある。【０３１３】
＜胸腺(thymus)＞
胸腺は胸腔に存在する免疫系に関与する臓器である。思春期までは活発に機能するが、その後はだんだん小さくなり、やがて脂肪になる。胸腺において、Tリンパ球を分化する役割を持つ。しかし、年齢による萎縮によりTリンパ球の分化が徐々に行えなくなるため、加齢と共に自己抗体が作られ正常な細胞を破壊していくため、老化の要因の一因として考えられている。【０３１４】
＜脾臓(spleen)＞
脾臓は脾動脈及び脾静脈に介在する臓器である。脾臓の機能は次のようである。免疫機能：白脾髄でリンパ球を作る。造血機能：骨髄で造血が始まるまでの胎生期には、脾臓で赤血球が作られている。生後はその機能は失われるが、大量出血や骨髄の機能が抑制された状態では再び脾臓での造血が行われることがある。血球の破壊：古くなった赤血球の破壊を行う。赤血球中のヘモグロビンも破壊され鉄を回収する働きもある。血液の貯蔵機能：血液を蓄える機能がある。人間ではそれほど多くの血液の貯留はされない。筋肉が大量の酸素を必要とするような運動時には、脾臓から貯蔵されていた血液を駆出することで充分な酸素を筋肉へ送り届けることが出来る。【０３１５】
＜Jurkat細胞＞
ヒトT細胞株である（T-cell leukemia）。【０３１６】
本出願は、日本国で出願された特願２００７−０６６４３４（出願日：２００７年３月１５日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表】
2008114709000001.app
【国際調査報告】
2008114709.tif 000030
2008114709.tif 000031
2008114709.tif 000032
2008114709.tif 000033
2008114709.tif 000034
2008114709.tif 000035