(57)【要約】【課題】菌体リサイクルを行うアルコール連続生産において、リサイクル率と、希釈率の最適な範囲を特定して、高いエタノール生産性を有する、アルコール連続生産方法を提供すること。【解決手段】発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール培養液を前記発酵槽から引き抜いて、かつ前記引き抜いた液中の酵母菌体は回収し前記発酵槽内に返送する菌体リサイクルをしながらアルコール発酵を行う際に、前記発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、菌体のリサイクル比（ｒ）を０＜ｒ＜０．４とし、希釈率Ｄ（ｈ-１）が０．２≦Ｄ≦０．３とする条件で行われているときに、アルコール生産性（ｇ／Ｌ・ｈ）が１５ｇ／Ｌｈ以上となることを特徴とする。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール培養液を前記発酵槽から引き抜いて、かつ前記引き抜いた液中の酵母菌体は回収し前記発酵槽内に返送する菌体リサイクルをしながらアルコール発酵を行う際に、前記発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、
菌体のリサイクル比（ｒ）を０＜ｒ＜０．４とし、希釈率Ｄ（ｈ-１）が０．２≦Ｄ≦０．３とする条件で行われているときに、アルコール生産性（ｇ／Ｌ・ｈ）が１５ｇ／Ｌｈ以上となることを特徴とするアルコール連続生産方法。
【請求項２】
前記発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母の菌体の界面が形成されている状態でアルコール発酵することを特徴とする請求項１記載のアルコール連続生産方法。
【請求項３】
前記界面が、発酵槽内のアルコール発酵液に形成される、酵母菌体の濃度が高い層と低い層の、層の境目として観察できることを特徴とする請求項２記載のアルコール連続生産方法。
【請求項４】
前記界面の有無を、前記発酵槽の側面に形成される覗き窓から目視して判断することを特徴とする請求項２又は３記載のアルコール連続生産方法。
【請求項５】
前記界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発酵素子と受光素子を用いて測定することを特徴とする請求項２〜４の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項６】
前記界面の有無を、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって高さ方向に複数設けた濁度計によって検出することを特徴とする請求項２〜５の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項７】
前記凝集沈殿性を有する酵母が、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項８】
前記発酵槽内の平均酵母菌体濃度が、２８〜１７８ｇ（乾燥重量）／Ｌであることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項９】
前記発酵槽下方に液流を強制的に発生させる手段が、主として攪拌機の回転によることを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルコールの連続生産方法に関し、詳しくは凝集沈殿性を有する酵母を用いた、酵母菌体をリサイクルするアルコールの連続生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコールの生産方法に関しては、アルコールを微生物により生産する場合、アルコール原料が十分に存在している状態では、ある程度までは菌体の量とアルコール生産量は比例するので、発酵生産性を上げるためには発酵槽内の菌体濃度を高濃度に維持し運転することが必要とされている。【０００３】
発酵槽内では、アルコール原料と酵母の接触回数が多いほど反応効率が上がるので、攪拌等で完全混合することが好ましい。しかし、完全混合すれば、アルコール培養液を発酵槽から引き抜く際に、多量の酵母が一緒に抜き出されて、発酵槽内の菌体濃度が減少してしまう。【０００４】
アルコール培養液の引き抜き量に対して、酵母の増殖量が少なければ、流出した菌体分を補うことができないので、発酵槽内に存在する酵母の菌体量が減少し、アルコール原料と酵母の接触回数は酵母の減少により大幅に低下して、アルコール生成反応の効率が低下する問題がある。【０００５】
一方、発酵槽内を攪拌しなければ、凝集沈降性を有する酵母は沈降し、発酵槽底部に沈積してしまう。菌体は沈降が進むと、所定時間経過後は沈降領域から圧密領域に入るので、底部に菌体の層ゾーン（圧密ゾーン）が形成される。発酵槽の底部からアルコール原料を供給すると、この層ゾーンをアルコール原料が通過して、アルコール原料と酵母の接触が生じることになるが、かかる層ゾーンでの接触では圧密されていること、及びアルコール原料に対して酵母菌体量が過剰であることからアルコール原料と酵母の反応効率は極端に悪くなる問題がある。【０００６】
そこで、アルコール発酵が終了した発酵液から、微生物の菌体を回収し、再利用するという方法が知られている。【０００７】
特許文献１には菌体リサイクルを行うアルコール連続生産方法が開示されており、菌体増殖と低濃度アルコール発酵を行う発酵槽とその菌体分離を行う沈降槽、および高濃度アルコール発酵を行う発酵槽とその菌体分離を行う沈降槽を直列に配置し、各沈降槽からは、適正な菌体濃度となるように二つの発酵槽に菌体を返送して、菌体濃度を維持・調節しながらアルコール連続生産を行っている。【０００８】
特許文献２には、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株（以下、必要によりＡＭ１２菌株と称する）からなる酵母を用いたアルコールの生産方法が開示されており、ＡＭ１２菌株は優れたアルコール生産能とアルコール耐性、凝集沈降性を有するという記載がある。
【特許文献１】特開平６−２８４８９１号公報
【特許文献２】特開昭５９−１３５８９６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし、特許文献１の方法は、２つの発酵槽と２つの沈降槽を設ける必要があるので、設備コストが高くなってしまう。また、沈降槽では、リサイクルするための菌体液や、菌体濃度が希薄な液体を取り出す位置を状況に応じて調節しなければならず、管理の手間が必要であった。【００１０】
更に、菌体リサイクルを行なう場合、発酵槽から菌体が流出しても、沈降分離をおこなって菌体を発酵槽に戻すので、発酵槽から流出する菌体量について考えてはいない。しかし、返送する菌体量が多いと、返送する菌体液の粘度が高くなり返送が困難になってしまうので、リサイクルできる量も限界があることがわかった。【００１１】
このため本発明者らは、菌体リサイクルを行なうアルコール連続生産においても、発酵槽から流出する菌体量を抑制しながら菌体リサイクルを行うアルコール連続生産を行ったところ、良好な結果が得られた。【００１２】
そこで本発明の課題は、菌体リサイクルを行うアルコール連続生産において、リサイクル率と、希釈率の最適な範囲を特定して、高いエタノール生産性を有する、アルコール連続生産方法を提供することにある。【００１３】
また、本発明の他の課題は、菌体流出を防止し、アルコール原料と酵母の接触効率を向上させて、凝集沈殿性を有する酵母のアルコール生産能力を十分に生かすことが出来るアルコール連続生産方法を提供することにある。【００１４】
本発明の他の課題は、以下の記載により明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題は、以下の各発明によって解決される。【００１６】
請求項１記載の発明は、発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール培養液を前記発酵槽から引き抜いて、かつ前記引き抜いた液中の酵母菌体は回収し前記発酵槽内に返送する菌体リサイクルをしながらアルコール発酵を行う際に、前記発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、菌体のリサイクル比（ｒ）を０＜ｒ＜０．４とし、希釈率Ｄ（ｈ-１）が０．２≦Ｄ≦０．３とする条件で行われているときに、アルコール生産性（ｇ／Ｌ・ｈ）が１５ｇ／Ｌｈ以上となることを特徴とするアルコール連続生産方法である。【００１７】
請求項２記載の発明は、前記発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母の菌体の界面が形成されている状態でアルコール発酵することを特徴とする請求項１記載のアルコール連続生産方法である。【００１８】
請求項３記載の発明は、前記界面が、発酵槽内のアルコール発酵液に形成される、酵母菌体の濃度が高い層と低い層の、層の境目として観察できることを特徴とする請求項２記載のアルコール連続生産方法である。【００１９】
請求項４記載の発明は、前記界面の有無を、前記発酵槽の側面に形成される覗き窓から目視して判断することを特徴とする請求項２又は３記載のアルコール連続生産方法である。【００２０】
請求項５記載の発明は、前記界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発酵素子と受光素子を用いて測定することを特徴とする請求項２〜４の何れかに記載のアルコール連続生産方法である。【００２１】
請求項６記載の発明は、前記界面の有無を、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって高さ方向に複数設けた濁度計によって検出することを特徴とする請求項２〜５の何れかに記載のアルコール連続生産方法である。【００２２】
請求項７記載の発明は、前記凝集沈殿性を有する酵母が、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株であることを特徴とする請求項１〜６の何れかに記載のアルコール連続生産方法である。【００２３】
請求項８記載の発明は、前記発酵槽内の平均酵母菌体濃度が、２８〜１７８ｇ（乾燥重量）／Ｌであることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載のアルコール連続生産方法である。【００２４】
請求項９記載の発明は、前記発酵槽下方に液流を強制的に発生させる手段が、主として攪拌機の回転によることを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載のアルコール連続生産方法である。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によると、菌体リサイクルを行うアルコール連続生産において、リサイクル率と、希釈率の最適な範囲を特定して、高いエタノール生産性を有する、アルコール連続生産方法を提供することができる。【００２６】
また、本発明によると、菌体流出を防止し、アルコール原料と酵母の接触効率を向上させて、凝集沈殿性を有する酵母のアルコール生産能力を十分に生かすことが出来るアルコール連続生産方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】連続エタノール発酵槽の概略図
【図２】界面が形成される好ましい位置を高さで示している場合の模式図
【図３】酵母菌体の濃度が高い層（Ｂ）が、アルコール発酵液の体積Ｖに占める割合で好ましい界面の位置を示した模式図
【図４】界面観察窓を設けた発酵槽の概略図
【符号の説明】
【００２８】
１：糖液供給タンク
１１：供給ポンプ
１２：供給ライン
２：発酵槽
２１：攪拌装置
２２：取液ポンプ
２３：取液ライン
２４：ライン
３：沈降分離槽
３１：アルコールポンプ
３２：アルコールライン
３３：リサイクルポンプ
３４：リサイクルライン
３５：排出ライン
１００：発酵槽
１０１：発酵槽
１０２：観察窓
１１０：原料供給口
１１１：排出口
１１２：攪拌機
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の実施の形態について説明する。【００３０】
本発明のアルコール連続生産方法は、発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール培養液を前記発酵槽から引き抜いて、かつ前記引き抜いた液中の酵母菌体は回収し前記発酵槽内に返送する菌体リサイクルをしながらアルコール発酵を行う際に、前記発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産する方法である。【００３１】
ここで、発酵槽下方の強制的な液流を発生させるのは、発酵原料と酵母の接触回数を増加させて発酵反応効率を上昇させるためである。しかし、発酵槽内に、攪拌等に由来する液流を発生させると、菌体が舞い上がり、そのまま発酵槽から外部に発酵液と共に排出されるおそれがあるが、本発明に用いる凝集沈殿性を有する酵母は、その菌体特有の性質として凝集沈降する働きが顕著であるので、発酵槽内の液面付近では菌体濃度が低くなり、発酵槽からの菌体流出は抑制される。【００３２】
本発明者らは、アルコール連続生産方法において、凝集沈殿性を有する酵母を用いて、発酵槽下方の強制的な液流を調整すると、発酵槽内に、攪拌等に由来する液流によって菌体が舞い上がる働きと、酵母の持つ凝集沈殿性によって菌体が凝集沈降する働きとによって、その層の境目が界面として観察できることを見出した。【００３３】
本発明において、アルコール連続生産というのは、発酵槽にアルコール原料である糖液を例えば連続的に供給しながら、一方で、生成物を例えば連続的に取り出すことをいう。従って、アルコール原料を供給するのが不連続であっても、時間当たりの供給量が一定していればよい。【００３４】
また、本発明における「菌体リサイクルがある」とは、発酵槽から取り出したエタノールと酵母の混ざった培養液を静置して酵母菌体を沈殿させて分離し、再培養の有無に係らず分離した菌体の一部を発酵槽に戻してアルコール発酵を行うことと定義される。【００３５】
本発明では菌体のリサイクル比（ｒ）を０＜ｒ＜０．４とし、希釈率Ｄ（ｈ-１）が０．２≦Ｄ≦０．３とする条件で行われていると、アルコール生産性（ｇ／Ｌ・ｈ）が１５ｇ／Ｌｈ以上の高エタノール生産を維持できる。即ち、本発明者らは、本発明で用いる酵母が、高エタノール生産を有するリサイクル率と、希釈率の範囲を見出したものである。【００３６】
なお、リサイクル比（ｒ）は回収した菌体全量に対して、リサイクルする菌体量を（重量・体積）比で表したものであり、希釈率Ｄは、糖化液供給速度を培養体積で割ったものである。また、エタノール生産性は発酵槽内のエタノール濃度と希釈率Ｄの積として求められる。【００３７】
かかる条件下で運転する際に、発酵槽内に菌体の界面が形成されると、その界面より下の菌体濃度が高い領域は、凝集沈降による圧密領域とは異なり、界面下の菌体濃度と界面上の菌体濃度が極端に違うものであり、この界面の形成されている状態で、アルコール原料の発酵反応を阻害せず却って反応を促進することを見出した。またかかる攪拌下での界面が存在する場合には、その界面の上部の発酵液を引き抜けば菌体流出を防止でき、アルコール原料と酵母の接触効率を向上させて、ＡＭ１２菌のアルコール生産能力を十分に生かすことが出来ることを見出した。【００３８】
なお、本発明のアルコール連続生産においては、発酵槽から菌体の流出を抑制しているが若干の菌体は流出する可能性がある。しかし、かかる菌体流出によって発酵槽内の菌体濃度が減少することは防止されている。本発明では発酵槽の上下方向で適度な濃度バランスが維持されているために発酵槽内での菌体増殖量は流出量に比べれば多く、菌体を常時発酵槽に追加していくことは基本的に意図していない。しかし、種菌として追加することはあるだろうし、若干流出した菌体を分離して発酵槽内に返送することは本発明の効果を何等阻害するものでない。【００３９】
本発明で用いるアルコール原料は、穀物由来の原料が好ましく、例えば米、麦、イモなどは、糖濃度が高いので好ましい例として挙げられる。糖濃度としては、穀物原料の糖化反応効率の観点から、グルコース換算で１００〜３００ｇ／Ｌの範囲が好ましく、より好ましくは１５０〜２００ｇ／Ｌの範囲である。【００４０】
好気発酵温度は、酵母の至適発酵温度の観点から、４０℃以下が好ましく、より好ましくは３０〜３５℃の範囲である。温度調節には、ヒーターおよび冷却器などの調節手段を採用できるが、格別限定されない。【００４１】
本発明において、発酵槽内のＤＯ（溶存酸素濃度）は、０〜３ｐｐｍの範囲が好ましく、より好ましくは、０〜０．１ｐｐｍの範囲である。菌の生育状態によっては、ＤＯはなくても良い。ＤＯの調整は、空気供給量および発酵槽内攪拌翼の回転速度を増減することにより可能であり、例えばＤＯメータと空気供給量制御手段を連動させる手法を採用することもできる。【００４２】
ｐＨは、酵母の至適ｐＨの観点から、３〜７の範囲が好ましく、より好ましくは３．５〜５．０の範囲である。ｐＨ調整手法としては、ｐＨメータで計測したデータに基づきｐＨ調整剤を連続的に供給してｐＨを調整するｐＨ制御システムを採用することができる。【００４３】
凝集沈殿性を有する酵母としては、攪拌が行われていても、界面が形成される沈降性を備えた酵母であれば構わないが、好ましくは、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株（ＡＭ１２菌）や、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＪ１菌株といった酵母が用いられる。【００４４】
ＡＭ１２菌株及びＴＪ１菌株は、工業技術院生物工業研究所  微生物工業技術研究所（現：独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ））に、それぞれ微工研受託番号第６７４９号、微工研受託番号第６７４７号として寄託されており、入手できる。【００４５】
以下、本発明の実施の形態について図面に基づいて説明する。【００４６】
図１において、１は糖液供給タンクであり、２は発酵槽であり、３は菌体分離装置である沈降分離槽である。【００４７】
糖液供給タンク１から発酵槽２への原料の供給は供給ポンプ１１、供給ライン１２を通して行われる。供給ライン１２からは原料となる糖液のほか、ペプトンや微量金属塩溶液等の菌体増殖に必要な栄養液も加えることができる。【００４８】
発酵槽２は、内部に菌体と供給された原料とを十分に混合するための攪拌装置２１を備えている。攪拌装置としては、発酵槽内の混合が十分に行われるものであれば良いが、プロペラ等の攪拌翼を備えたものが好ましく、攪拌回転数は酵母にとって最適値となるように調節される。また、発酵槽には図示しないがｐＨ、温度、溶存酸素濃度を維持するために特に限定されないシステムを備えることが好ましい。【００４９】
発酵槽２では、酵母によってアルコール発酵が行われ、原料糖液はアルコールと酵母菌体を含む液体となり、取液ポンプ２２、取液ライン２３から沈降分離槽３へ送られる。【００５０】
また、アルコール発酵に伴って生じるガスはライン２４から排出される。【００５１】
沈降分離槽３では静置による沈降分離が行われ、凝集性酵母は沈降し、アルコール液と分離される。アルコール液はアルコールポンプ３１、アルコールライン３２から次の精製過程へ送られる。【００５２】
沈降し濃縮された菌体の一部は取り出され、リサイクル比から求められる規定量の菌体がリサイクルポンプ３３、供給ライン１２へとつながるリサイクルライン３４を通して供給ライン１２から原料と共に発酵槽１へ返送される。【００５３】
余分な沈殿物は排出ライン３５より排出される。【００５４】
本発明では凝集沈殿性を有する酵母を用いることによって、よりアルコール生産性が高く効率的な連続エタノール生産を行うことができる。【００５５】
本発明において菌体を返送するリサイクル比（ｒ）の範囲は０＜ｒ＜０．４が好ましく、より好ましくは０＜ｒ＜０．３、さらに好ましくは０＜ｒ＜０．２２である。【００５６】
リサイクル率０ではリサイクルを行うことができないのでこの発明に有効でなく、リサイクル率が０．４を超えると発酵槽内の菌体濃度が過剰になり、槽内に返送された酵母菌のエタノール発酵能力の低下や、死滅が起きるという問題や、返送液の粘度が高くなり返送が困難となる問題がある。【００５７】
また、好ましい希釈率Ｄ（ｈ-１）の範囲は、０．２≦Ｄ≦０．３であり、より好ましくは０．２≦Ｄ≦０．２５である。【００５８】
希釈率Ｄが０．２より小さいとリサイクルを行うアルコール連続発酵の効果が小さく、
０．３を超えると酵母に供給される糖液が過剰となり、取液ライン２３から取り出される
発酵液に、消費されないで残った糖（残糖）が存在するようになる。残糖は、未反応の原料であるので、エタノール生産性（発酵収率）を低下させる一因となる。【００５９】
このような条件で運転するとき、発酵槽内の菌体濃度が十分に維持され高濃度のエタノール生産が行われている。【００６０】
発酵槽内のエタノール濃度と希釈率Ｄの積で計算されるエタノール生産性は少なくとも１５ｇ／Ｌ・ｈ以上、通常では２０ｇ／Ｌ・ｈとなる。【００６１】
次に、上記のエタノール生産性を実現する好ましい手法を説明する。【００６２】
図２は、発酵槽内に界面を形成してアルコール生産する例であり、図２において、１００は発酵槽であり、アルコール原料及び返送菌体は発酵槽１００の底部の原料供給口１１０から供給される。発酵槽１００内には凝集沈殿性を有する酵母が入れられている。【００６３】
原料供給口１１０から発酵槽１００内に例えば連続的にアルコール原料が供給されると、酵母によってアルコール発酵され、アルコール発酵液が得られる。アルコール発酵液は、排出口１１１から引き抜かれる。なお、アルコール原料は発酵槽の底部から供給されれば供給の方法は限定されず、原料供給口１１０の設置は一例を示したに過ぎない。同様にアルコール発酵液の引き抜きも上部から引き抜くものであればその引き抜き方法は限定されない。【００６４】
本発明において、発酵槽１００内のアルコール発酵液には、攪拌などによって液流が生じている状態であっても界面が形成されている状態でアルコール発酵を行うことを大きな特徴とする。【００６５】
界面とは、アルコール発酵液内に観察される、濁度（透明度）、或いは色相が異なる二つの層の境目に形成される線状の境界面である。なお、線状の境界は、発酵槽を横方向から観察したときにみられるものであり、直線でなくてもよい。【００６６】
各層はアルコール発酵液中に含まれる酵母菌体濃度が劇的に異なっているので、濁度（透明度）、或いは色相が異なる二つの層として認められるものである。【００６７】
例えば、界面より上ではアルコール発酵液自体の色が観察され、濁度は低く、界面より下は酵母菌体が多いため不透明で濁度が高くなるので、ＡとＢの差が明確にわかり、目視にて界面の有無を観察することが出来る。【００６８】
界面より上（Ａ）は、酵母菌体の濃度が極端に低い層であり、界面より下（Ｂ）は、酵母菌体の濃度が高い層である。  【００６９】
菌体濃度で定量的に表現すれば、発酵槽内のアルコール発酵液中の平均酵母菌体濃度（完全混合状態の時に測定される菌体濃度であり、発酵槽内の全酵母菌体量（乾燥重量：ｇ）を発酵槽内のアルコール発酵液量（Ｌ）で除した値に等しい）は、好ましくは２８〜１７８ｇ（乾燥重量）／Ｌ、より好ましくは５０〜１２０ｇ（乾燥重量）／Ｌ、更に好ましくは、７０〜１００ｇ（乾燥重量）／Ｌであり、それに対して、界面より上にある、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）の酵母菌体濃度は、好ましくは１７ｇ（乾燥重量）／Ｌ未満、より好ましくは１４ｇ（乾燥重量）／Ｌ未満、更に好ましくは１０ｇ（乾燥重量）／Ｌ未満であり、界面より下にある酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の酵母菌体濃度は、好ましくは３５〜１８０ｇ（乾燥重量）／Ｌ、より好ましくは５５〜１５０ｇ（乾燥重量）／Ｌ、更に好ましくは７５〜１２０ｇ（乾燥重量）／Ｌである。【００７０】
界面は、アルコール発酵液を抜き取る排出口１１１よりも下方に形成されていることが重要である。そうすると発酵槽からは、菌体濃度が低い層からアルコール発酵液が抜き取られるため、酵母菌体の流出を抑制することができる。【００７１】
含まれる酵母菌体濃度が違うことから、当然酵母菌体濃度が低い層（Ａ）と酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）では、酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の方が、アルコール生産性は高い。そのため、界面より酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）が占める割合が高い方が生産性は向上する。【００７２】
すなわち、界面が、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって０．１Ｈ〜０．８Ｈ（Ｈ：液面高さ）の深さ領域に形成され、好ましくは０．２Ｈ〜０．６Ｈ、より好ましくは０．２Ｈ〜０．５Ｈに形成されている、あるいは酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）がアルコール発酵液の体積Ｖの２０〜９０％、好ましくは４０〜８０％、より好ましくは５０〜８０％を占めており、発酵槽の底側（下方）に形成されていることが望ましい。  【００７３】
図２には、界面が形成される高さ方向の好ましい位置が示されている。【００７４】
円筒状の発酵槽など、断面積が一定の発酵槽においては、界面が観察される位置は、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって０．１Ｈ〜０．８Ｈ（Ｈ：液面高さ）の深さ領域に形成され、好ましくは０．２Ｈ〜０．６Ｈ、より好ましくは０．２Ｈ〜０．５Ｈの深さ領域が望ましい。【００７５】
界面が０．１Ｈ〜０．８Ｈ、好ましくは０．２Ｈ〜０．６Ｈ、より好ましくは０．２Ｈ〜０．５Ｈの深さ領域に形成されているときは、攪拌と沈降のバランスが取れている状態であり、発酵槽１００内の菌体濃度を高く維持し、かつアルコール原料との接触効率が良いので、エタノール生産性を高くすることができる。【００７６】
界面の位置が０．１Ｈより上である場合は、ほとんど完全混合に近い場合であり、そうすると、排出口１１から菌体が流出しやすくなり、発酵槽内の菌体量が少なくなるのでアルコール生産性が落ちてしまい好ましくない。【００７７】
また、界面の位置が０．８Ｈより下である場合は発酵槽内の菌体は、発酵槽底部に沈積しはじめ、沈降領域や圧密領域ゾーンが形成される。発酵槽の底部からアルコール原料を供給していても、これらの沈降領域や圧密領域ではアルコール原料に対して酵母が多すぎるためアルコール原料と酵母の反応効率は極端に悪くなり、これもアルコール生産性を低下させるので好ましくない。【００７８】
なお、界面が観察されない状態とは、完全混合による場合、あるいは発酵槽中の菌体量が少なすぎて濃度差がわからない状態などが考えられるが、いずれも本発明のアルコール生産方法を行う上では好ましくない状態である。  【００７９】
図３は、酵母菌体の濃度が高い層（Ｂ）が、アルコール発酵液の体積Ｖに占める割合で好ましい界面の位置を示した模式図である。界面は、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）と酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の境目に形成されるものであるから、発酵槽の底側（下方）に形成されている酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）の割合をアルコール発酵液の体積Ｖの２０〜９０％、好ましくは４０〜８０％、より好ましくは５０〜８０％とすることで、界面の形成される位置が規定できる。なお、酵母菌体の濃度が高い層（Ｂ）の体積をｖ１とし、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）をｖ２とすると、Ｖ＝ｖ１＋ｖ２である。【００８０】
体積の概念で菌体濃度が高い層を設定すると、発酵槽の断面積が一定でない形状をし、高さによる規定が難しい場合にも対応することができる。【００８１】
本発明において、酵母菌体の高い層（Ｂ）の体積ｖ１がアルコール発酵液の体積Ｖの９０％より多くを占めるようになると、完全混合に近い場合であり、そうすると、排出口１１から菌体が流出しやすくなり、発酵槽内の菌体量が少なくなるのでアルコール生産性が落ちてしまい好ましくない。【００８２】
また、酵母菌体の高い層（Ｂ）の体積ｖ１がアルコール発酵液の体積Ｖの２０％より少ないと、発酵槽内の菌体は、発酵槽底部に沈積しはじめ、沈降領域や圧密領域ゾーンが形成される。発酵槽の底部からアルコール原料を供給していても、これらの沈降領域や圧密領域ではアルコール原料に対して酵母が多すぎるためアルコール原料と酵母の反応効率は極端に悪くなり、これもアルコール生産性を低下させるので好ましくない。【００８３】
本発明では、アルコール発酵液の供給によって生じる液流の他に、発酵槽下方に強制的な液流を発生する手段が設けられ、液流を強制的に発生させる手段は、主として攪拌機の回転によるものが好ましい。即ち、攪拌機だけでもよいし、攪拌機と空気曝気の併用のいずれでも良いが、制御の便宜性を考慮すれば攪拌機のみによることが好ましい。【００８４】
図２や図３の例では、攪拌羽根を持つ攪拌機１１２が攪拌手段として示されている。【００８５】
界面の位置は、上記の好ましい領域に形成されるように攪拌の強度等、連続発酵の運転条件を適宜変更することで維持できる。【００８６】
界面は、液流によって菌体を巻き上げる働きが強くなると上昇し、巻き上げる働きが弱くなると沈降が進行するため下降する。【００８７】
例えば、攪拌機の回転を上げれば界面は上昇する。【００８８】
また、アルコール原料や空気の供給が多くなることによって、上昇流が起きれば界面は上昇する。【００８９】
また、完全混合状態のときに攪拌機の回転を停止あるいは回転を下げれば界面が形成される。【００９０】
界面の有無の観察については、酵母菌体濃度が低い層（Ａ）と酵母菌体濃度が高い層（Ｂ）に色相あるいは透明度の違いがあるので、目視にて観察することが出来る。【００９１】
ステンレス製など、不透明の発酵槽の場合は、図４のように発酵槽１０１に覗き窓（観察窓）１０２を設け、界面の有無を観察することが出来る。【００９２】
他に、前記界面の有無は、発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって、上下方向に位置が異なる２つ以上の濁度計を設けて菌体濃度を測定し、確認することもできる。【００９３】
さらに、界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発光素子と受光素子を用い、発光素子からの光を界面で反射させその反射光を受光素子で受けて光量変化を求めて測定することもできる。
【実施例】
【００９４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。【００９５】
実施例１
＜酵母種菌培養液の調整＞
２００ｍｌフラスコにＹＰＤ培地（酵母エキス  １％、ペプトン  ２％、グルコース  ５％、ｐＨ５．０）を１０ｍｌ入れ滅菌処理したものに、ストックしていた酵母をそれぞれ一白金耳植菌し、３０℃、２００ｒｐｍの好気条件にて２０時間培養し、酵母（ＡＭ１２菌株）を培養可能な状態に復元した。【００９６】
２５０ｍｌフラスコにＹＰＤ培地１００ｍｌを入れ滅菌処理したものに復元した場酵母培養液１０ｍｌを接種し、３０℃、２００ｒｐｍの好気条件にて２０時間培養し、対数増殖期にある酵母種菌をさらに増殖させた。【００９７】
＜ジャーファーメンタによる連続発酵＞
スタートアップ用滅菌済みＣＳＬ培地（コーンスティープリカー（ＣＳＬ）  １％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ  ０．０１％、グルコース  １０％、ｐＨ５．０）９００ｍｌの入ったジャーファーメンタに前記酵母種菌培養液１１０ｍｌを植菌した。【００９８】
植菌は送液ポンプより行い酵母培養液を外気に触れないように接種した。【００９９】
ジャーファーメンタ運転条件は以下のように設定した。【０１００】
ｐＨ：５．０（２Ｎ  ＮａＯＨ、ＨＣｌで調整）
通気：０．５〜１．５ｖｖｍ（コンプレッサーからの空気を無菌フィルターを通して通気）
攪拌速度：５０〜１５０ｒｐｍ
温度：３０℃【０１０１】
途中、開始２４時間後と４８時間後に発酵槽から培養液を採取してグルコース濃度を測定し、発酵液糖濃度が５ｇ／Ｌであることを確認した。【０１０２】
ジャーファーメンタに連続生産用滅菌済みＣＳＬ培地（ＣＳＬ  １％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ  ０．０１％、グルコース  ２０％、ｐＨ５．０）を連続的に供給すると共に、供給する培地と同じ速度で培養液を抜き出し、界面が形成されるように攪拌速度を調整しながら連続発酵を開始した（連続発酵の開始）。抜き取った培養液を槽内体積３Ｌの凝集沈殿槽に貯留し、３Ｌを超えた分は液面から抜き出した。【０１０３】
培養液の一部を取り出して分析し、酵母菌体、グルコース、エタノールの発酵槽内濃度が定常値に到達したら沈殿槽下部に沈降した酵母菌体を規定のリサイクル比に従い返送し、菌体リサイクルを開始した（菌体リサイクルの開始）。なお、酵母の増殖状況、グルコース消費、およびエタノール生成量は、以下の方法で分析した。【０１０４】
酵母の増殖：濁度（ＯＤ６００ｎｍの吸光度）測定し、菌体濃度への換算係数（０．３７×ＯＤ６００ｎｍ）を用いて濃度を算出した。
グルコース消費：グルコースキット（和光純薬工業（株）製  グルコーステスト−ｃ−ワコー）により測定した。
エタノール生成の経時変化：培養液のエタノール濃度分析（ＳｈｉｍａｄｚｕＧＣ−２０１４、検出器ＦＩＤ）により測定した。【０１０５】
この条件のとき、菌体リサイクルのリサイクル比を０．１、希釈率を０．２２として運転を行ったところ、エタノール生産性は２２．１ｇ／Ｌ・ｈだった。【０１０６】
実施例２
実施例１と同様に発酵槽を調整し、リサイクル比を０．３として運転を行ったところ、エタノール生産性は２１．９ｇ／Ｌ・ｈだった。【０１０７】
比較例１
実施例１と同様に発酵槽を調整し、リサイクル比を０．５として運転を行ったところ、発酵槽内の平均酵母菌体濃度が２００．９ｇ／Ｌに対して、エタノール生産性は２２．０ｇ／Ｌ・ｈだった。菌体濃度は実施例１や２に比べて倍以上であるのに、エタノール生産性は実施例１とほとんど差が見られなかった。【０１０８】
比較例２
実施例１と同様に発酵槽を調整し、リサイクル比を０．１、希釈率を０．１として運転を行ったところ、エタノール生産性は１０．２ｇ／Ｌ・ｈだった。【０１０９】
比較例３
実施例１と同様に発酵槽を調整し、リサイクル比を０．１、希釈率を０．４として運転を行ったところ、エタノール生産性は１２．１ｇ／Ｌ・ｈだった。【０１１０】
比較例４
実施例１と同様に発酵槽を調整し、リサイクル比を０．１、希釈率を０．６として運転を行ったところ、エタノール生産性は８．０ｇ／Ｌ・ｈだった。【０１１１】
実施例３
ＡＭ１２菌株に代えて、ＴＪ１菌株を用いて、実施例１と同条件で運転を行ったところ、エタノール生産性は１７．６ｇ／Ｌ・ｈだった。【０１１２】
実施例４
実施例３において、リサイクル比を０．３とした以外は同条件で運転を行ったところ、エタノール生産性は１６．７ｇ／Ｌ・ｈだった。【０１１３】
比較例５
実施例３と同様に発酵槽を調整し、リサイクル比を０．１、希釈率を０．１として運転を行ったところ、エタノール生産性は７．４８ｇ／Ｌ・ｈだった。【０１１４】
参考例１
ＡＭ１２菌株に代えて、実施例１と同条件で、凝集沈降性を示さない酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＪＣＭ７２５５）ｔｙｐｅｓｔｒａｉｎ）を用いて連続運転を行ったところ、エタノール生産性は１０．１ｇ／Ｌ・ｈだった。【０１１５】
以上の実験の結果を表１に示す。【０１１６】
【表１】
2008120644.tif 000003
【図１】
2008120644.tif 000004
【図２】
2008120644.tif 000005
【図３】
2008120644.tif 000006
【図４】
2008120644.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】平成20年7月30日(2008.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母、サッカロマイセス属セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＭ１２菌株を存在させ、発酵槽にアルコール原料を供給してアルコール発酵を行い、得られたアルコール培養液を前記発酵槽から引き抜いて、かつ前記引き抜いた液中の酵母菌体は回収し前記発酵槽内に返送する菌体リサイクルをしながらアルコール発酵を行う際に、前記発酵槽下方に強制的な液流を発生させてアルコールを生産するアルコール連続生産方法であって、
菌体のリサイクル比（ｒ）を０＜ｒ＜０．４とし、希釈率Ｄ（ｈ−１）が０．２≦Ｄ≦０．３とする条件で行われているときに、アルコール生産性（ｇ／Ｌ・ｈ）が２０ｇ／Ｌ・ｈ以上となることを特徴とするアルコール連続生産方法。
【請求項２】
前記発酵槽内に凝集沈殿性を有する酵母の菌体の界面が形成されている状態でアルコール発酵することを特徴とする請求項１記載のアルコール連続生産方法。
【請求項３】
前記界面が、発酵槽内のアルコール発酵液に形成される、酵母菌体の濃度が高い層と低い層の、層の境目として観察できることを特徴とする請求項２記載のアルコール連続生産方法。
【請求項４】
前記界面の有無を、前記発酵槽の側面に形成される覗き窓から目視して判断することを特徴とする請求項２又は３記載のアルコール連続生産方法。
【請求項５】
前記界面の有無を、前記発酵槽の液面の上方に設けた発光素子と受光素子を用いて測定することを特徴とする請求項２〜４の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項６】
前記界面の有無を、前記発酵槽内のアルコール発酵液の液面から下方に向かって高さ方向に複数設けた濁度計によって検出することを特徴とする請求項２〜５の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
前記発酵槽内の平均酵母菌体濃度が、２８〜１７８ｇ（乾燥重量）／Ｌであることを特徴とする請求項１〜７の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【請求項９】
前記発酵槽下方に液流を強制的に発生させる手段が、主として攪拌機の回転によることを特徴とする請求項１〜８の何れかに記載のアルコール連続生産方法。
【国際調査報告】
2008120644.tif 000008
2008120644.tif 000009
2008120644.tif 000010
2008120644.tif 000011