(57)【要約】  本発明の課題は、Ｘ線像によっては異常を認めることができない関節軟骨の変性又は損傷を、簡便に、高い精度で検知することを可能とする検知方法、並びに関節軟骨の変性又は損傷の進行速度の評価方法等を提供することである。  その解決手段としての本発明は、血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度を指標として使用する、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷の検知方法等を提供する。  また本発明は、血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度を指標として使用する、関節軟骨の変性又は損傷の進行速度の評価方法等を提供する。
2008096738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度を指標として使用する、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷の検知方法。
【請求項２】
下記ステップを含む請求項１に記載の検知方法：
ステップ１）血液由来の被験試料中のケラタン硫酸濃度を測定するステップ、および
ステップ２）ステップ１で測定したケラタン硫酸濃度と、健常者の血液ケラタン硫酸濃度との比較に基づいて、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷を評価するステップ。
【請求項３】
関節軟骨の変性又は損傷が、関節症を伴うものである、請求項１又は２に記載の検知方法。
【請求項４】
関節症が、外傷性関節症又は変形性関節症である、請求項３に記載の検知方法。
【請求項５】
関節症が、受傷後２ヶ月以内の外傷性関節症である、請求項４に記載の検知方法。
【請求項６】
関節症が、大関節の関節症である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の検知方法。
【請求項７】
血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度を指標として使用する、関節軟骨の変性又は損傷の進行速度の評価方法。
【請求項８】
請求項７に記載の評価方法により関節軟骨の変性又は損傷の進行速度を評価するステップを少なくとも含む、関節軟骨の変性又は損傷の経時的な状態変化の判定方法。
【請求項９】
治療前に採取した血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度と、治療後に採取した血液由来の被験試料中のケラタン硫酸濃度とを比較するステップを少なくとも含む、関節軟骨の変性又は損傷の治療効果の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度を指標とする、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷の検知方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節症と総称される疾患のうち、関節軟骨が、色調変化、けば立ち、粗造化等の変性を生じる、又は損傷する代表的疾患としては、変形性膝関節症、変形性股関節症及び変形性脊椎症等の変形性関節症、並びにスポーツや事故などによる外傷性関節症等が挙げられる。このような疾患の診断には一般的には単純Ｘ線撮影が行われており、関節間隙の状態および骨棘の有無等を評価することで疾患の進行度が診断される。しかしながら、単純Ｘ線撮影では異常が認められないのにもかかわらず、疼痛、腫脹等の関節症状を訴える症例も見られる。このような症例においては、直視や関節内視鏡による診断で、靱帯・腱その他の関節軟部組織の損傷が多く認められ、付随した関節軟骨表面に軽度の変性や損傷を認める例もある。【０００３】
上述のように、Ｘ線撮影によっては検知できないような関節軟骨や関節軟部組織の変性又は損傷も関節内視鏡を使用すれば検知し得る。しかしながら関節内視鏡による方法は、体外診断と比べて患者に対する負担が重く、汎用できる手段とは言えない。【０００４】
関節軟骨の細胞外マトリックスを形成するプロテオグリカンの成分としてケラタン硫酸（以下、「ＫＳ」という）が含まれていることから、血液、関節液などにおけるＫＳ濃度を指標として関節疾患を検知しようとする試みがなされている。【０００５】
例えば、宮内らは、関節液中のＫＳをβ-N-アセチルグルコサミニド結合分解能を有する酵素（ケラタナーゼII）で処理し、生成したGal-GlcNAc(6S)（m-ks）をHPLC法で測定し、関節疾患を検知する方法を提案している（特許文献１）。しかし、この方法は検体が関節液であるため、関節液の貯留がみられない初期の変形性膝関節症及び変形性股関節症に例示される関節症の診断への応用は困難である。【０００６】
一方Thonarらは、ＫＳに反応するモノクロナール抗体を用いた免疫測定法により血清中のＫＳを測定し、骨関節炎の症例では血清中ＫＳ濃度が異常に高かったことに基づき、血清中のＫＳを測定することによる軟骨組織異常の診断法を提案し、軟骨組織異常を示す血清ＫＳ濃度範囲についても言及している（特許文献２）。しかし、特許文献２においては、既に関節疾病の治療をしている患者の血液試料において、ＫＳ濃度が上昇する傾向がみられることについては開示されているものの、血液由来の試料中のＫＳ濃度を測定することにより、Ｘ線像によっては検知することができないレベルの関節軟骨の変性又は損傷までをも検知の対象とすることができることについては、一切記載も示唆もない。更に、その後も血清中のＫＳ濃度は関節軟骨の変性指標としては有用ではないとする報告も多く、例えばCampionらは1991年に、ＫＳに反応するモノクロナール抗体を用いた免疫測定法による実験結果から、変形性膝関節症の患者の血清中のＫＳ濃度は、患者の臨床症状やＸ線評価との相関は低く、血清ＫＳ濃度は関節軟骨の変性指標になるものではないと結論付けている（非特許文献１）。【０００７】
【特許文献１】特開２００１−５７９００号
【特許文献２】特公平６−８４９７１号
【非特許文献１】Campion GV. et al., ArthritisRheum.1991;34:1254-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、Ｘ線像によっては異常を認めることができない関節軟骨の変性又は損傷を、簡便に、高い精度で検知することを可能とする検知方法等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、施設倫理委員会の承認のもとに被験者からの同意を得て、Ｘ線像により変形性関節症などの関節症と診断された患者に加え、Ｘ線像では関節軟骨の変性又は損傷が認められなかったが、スキーやサッカー等のスポーツ時の転倒で膝関節に衝撃を負って軟骨変性をおこし、直視あるいは関節鏡検査で膝関節軟骨の変性又は損傷が認められた患者、並びに早期の変形性膝関節症の患者の血清中ＫＳ濃度を測定した。その結果、Ｘ線像では関節軟骨の変性又は損傷が認められなかったが、直視あるいは関節鏡検査で膝関節軟骨の変性又は損傷が認められた患者の血清中ＫＳ濃度が、健常者の血清中ＫＳ濃度より有意に高いことを見出した。さらに、Ｘ線像により変形性関節症と診断された患者に比べ、Ｘ線像では関節軟骨の変性又は損傷を診断できなかったが関節鏡検査で膝関節軟骨の変性又は損傷が認められた患者では、血清中ＫＳ濃度が高い傾向があることも見出した。【００１０】
これらの知見等に基づき、本発明は、血液由来の試料中のＫＳ濃度を指標として使用する、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷の検知方法（以下、「本発明検知方法」と記載することがある）を提供する。【００１１】
好ましい態様としては、本発明検知方法は下記ステップを含む。
ステップ１）血液由来の被験試料中のＫＳ濃度を測定するステップ、および
ステップ２）ステップ１で測定したＫＳ濃度と、健常者の血液ＫＳ濃度との比較に基づいて、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷を評価するステップ。【００１２】
ＫＳ濃度は、高速液体クロマトグラフィーにより測定することが好ましい。【００１３】
別の形態として、本発明は、血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度を指標として使用する、関節軟骨の変性又は損傷の進行速度の評価方法を提供する（以下、「本発明評価方法」と記載することがある）。
なお、本明細書において、「関節軟骨の変性又は損傷の進行速度」とは、ある時点における関節軟骨の変性又は損傷の進行の活発度を示す概念である。
別の形態として、本発明は、本発明評価方法により関節軟骨の変性又は損傷の進行速度を評価するステップを少なくとも含む、関節軟骨の変性又は損傷の経時的な状態変化の判定方法（以下、「本発明判定方法１」と記載することがある）を提供する。
別の形態として、本発明は、治療前に採取した血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度と、治療後に採取した血液由来の被験試料中のケラタン硫酸濃度とを比較するステップを少なくとも含む、関節軟骨の変性又は損傷の治療効果の判定方法（以下、「本発明判定方法２」と記載することがある）を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明検知方法は、Ｘ線像上では異常が認められない早期において、関節軟骨の変性又は損傷を検知することを可能とすることから、症状の改善や症状の進行の遅延をはかる治療にもつながり極めて重要である。本発明検知方法は、加齢により発生する変形性関節症等の関節症を伴う関節軟骨の変性又は損傷に対しても好ましく適用することができることから、とりわけ高齢化社会を迎えようとしている我国をはじめとする先進国において極めて重要である。また、手術等の術後にも二次性の変形性関節症に進行する例もあり、このような場合において本発明検知方法により関節軟骨の変性又は損傷を検知すれば、症状の改善や症状の進行の遅延をはかる治療を行うことができ極めて有用である。更に本発明検知方法は、捻挫、打撲、むちうち症等の外傷性関節症を伴う関節軟骨の変性又は損傷を、Ｘ線像上では異常が認められない程度に軽度の段階で検知することをも可能とすることから極めて重要である。
本発明評価方法は、関節軟骨の変性又は損傷の進行速度を検知することによって、治療方針の決定等に応用することができ、症状の改善、症状の進行の遅延、健康管理の改善又は徹底等をはかることを可能とすることから極めて有用である。また本発明評価方法を応用することにより、本発明判定方法１を提供することができる。
本発明判定方法１は、関節軟骨の変性又は損傷の経時的な状態変化（悪化方向の変化・変化なし・治癒方向の変化）を判定することによって、関節軟骨の変性又は損傷の病態の経過予測、治療方針の決定等に応用することができ、症状の改善や症状の進行の遅延をはかることを可能とすることから極めて有用である。
本発明判定方法２は、関節軟骨の変性又は損傷の治療効果を判定することによって、治療方針の決定等に応用することができ、症状の改善や症状の進行の遅延をはかることを可能とすることから極めて有用である。【００１５】
更に、本発明検知方法、本発明評価方法、並びに本発明判定方法１及び２は、容易に採取可能な血液由来の試料を用いて実施することができることから、整形外科分野において極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】キモパパイン投与関節症モデルウサギ及び対照における血清中ＫＳの濃度の変化を示す図である。
【図２】膝外傷患者の受傷後期間と血清中ＫＳ濃度の関係を示す図である。
【図３】健常者及びグレードI及びIIの関節症患者の血清中ＫＳ濃度の分布を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。【００１８】
１．本発明検知方法
本発明検知方法は、血液由来の試料中のＫＳ（以下「ＫＳ」という）濃度を指標として使用する、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷の検知方法である。【００１９】
上記において、ＫＳ濃度を測定する血液由来の試料としては、ＫＳ濃度を本検知方法の目的が達成される程度に充分な精度をもって測定することができる限り特に限定されず、通常の採血方法により採取された血液試料から遠心法等によって他の血液成分から分離した血清又は血漿、血清又は血漿から抽出した画分などが挙げられ、これらは後述する測定方法等に応じて適宜選択することができるが、なかでも血清を用いることが好ましい。【００２０】
本発明の検知方法を行うための具体的方法は、血液由来の試料中のＫＳ濃度を指標として使用する限りにおいて特に限定されるものではないが、例えば、以下のステップにより行うことができる。
ステップ１）血液由来の被験試料中のＫＳ濃度を測定するステップ、および
ステップ２）ステップ１で測定したＫＳ濃度と、健常者の血液ＫＳ濃度との比較に基づいて、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷を評価するステップ。【００２１】
上記ステップ１において、血液由来の被験試料中のＫＳ濃度を測定する方法は、本発明検知方法の目的が達成される程度に充分な精度をもってＫＳ濃度を測定することが可能なものである限り特に限定されないが、例えば高速液体クロマトグラフィー法（ＨＰＬＣ法）、並びにエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ法（ＥＬＩＳＡ法）及びラジオイムノアッセイ法などの免疫測定法などが例示される。上記のなかでも、より精度の高い測定結果が期待されるといった観点から、ＨＰＬＣにより測定することが好ましく、なかでも血液由来の試料中のＫＳをＫＳ２糖に分解してＨＰＬＣにより測定することがより好ましい。なお、ＨＰＬＣ法は通常の方法、条件により行うことができる。
なかでも、例えば血清中のＫＳをＫＳ分解酵素であるケラタナーゼIIにより２糖分解することで、β−ガラクトシル−（１−４）−６−Ｏ−スルホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（m-ks）とβ−６−Ｏ−スルホ−ガラクトシル−（１−４）−６−Ｏ−スルホ−Ｎ−アセチルグルコサミン（d-ks）を得、両者の合計量でもってＫＳ濃度とする場合、アクチナーゼ等のプロナーゼで消化した血清を用いることが好ましい。
前出の宮内らは、関節液に対して何らの前処理も行わずにケラタナーゼIIを加えてＫＳを処理し、生成した２糖をＨＰＬＣ法で測定しているが、我々の検討では血清を試料とした場合、血清に対して何らの前処理も行わずにケラタナーゼIIを加えてＫＳを処理すると、その分解率が低いことがわかった。そこで血清中のＫＳのケラタナーゼIIによる分解率を上げるため種々の検討を行った結果、アクチナーゼ等のプロナーゼで消化した血清から陰イオン交換カラムを用いＫＳ画分を抽出した試料ではＫＳが完全に分解されることがわかった。従って、こういった前処理を行った血液由来の試料中のＫＳをＫＳ２糖に分解してＨＰＬＣにより測定することで、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷の検知を精度よく行うことができる。【００２２】
上記において免疫測定法を採用する場合、試料中のＫＳ濃度を十分に反映するような抗体を使用する必要がある。例えば、特許文献２で使用されている抗体が反応性を示す最小単位の構造は五硫酸化六糖であり、更に一硫酸化二糖、三硫酸化四糖、四硫酸化六糖には反応しないとMehmetらが報告しているが（Eur J Biochem,
1986;157(2):385-391）、ヒト血清中のＫＳには低硫酸化ＫＳが多く含まれている。従って、ヒト血清試料についてこのような抗体を使用すると、本発明で意図するＫＳ濃度の正確な測定ができない可能性がある。【００２３】
ステップ２においては、ステップ１で測定したＫＳ濃度と、健常者の血液ＫＳ濃度との比較に基づいて、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷を評価する。「健常者の血液ＫＳ濃度」とは、関節症の症状を訴えない個体又は集団における血液由来の試料中のＫＳ濃度を意味する。上記の「血液由来の試料」とは、前述と同様、通常の採血方法により採取された血液試料から遠心法等によって他の血液成分から分離した血清又は血漿、血清又は血漿から抽出した画分などが例示されるが、ステップ１における血液由来の被験試料と同種の試料であることが好ましい。具体的には、被験試料として血清を用いる場合、例えば「健常者の血液ＫＳ濃度」として、健常者の集団における血清中のＫＳ濃度の平均値を用い、関節軟骨の変性又は損傷が疑われる者の血液由来の試料（本出願書類において、「被験試料」と記載することがある）中のＫＳ濃度と比較してもよい。また、「健常者の血液ＫＳ濃度」として、関節軟骨の変性又は損傷が疑われる者自身の過去（健常時）における血液ＫＳ濃度を用いることもできる。この場合、被験試料中のＫＳ濃度を、その者自身の過去の標準的なＫＳ濃度と比較することができるため、より高い精度の評価を行うことができるものと期待される。なお、本出願書類において「健常者」とは、関節症の症状がみられない者を意味し、必ずしも如何なる疾患も有しない者のみを意味するわけではない。【００２４】
上記のステップ２においては、「血液由来の被験試料中のＫＳ濃度」が、「健常者の血液ＫＳ濃度」に比べて上昇している場合、関節軟骨に変性又は損傷が存在する可能性が高いと評価することができる。さらに関節軟骨に変性又は損傷の有無のみならず、そのＫＳ濃度の上昇の程度から、関節軟骨の変性又は損傷の程度についても評価し得る。なお、本発明検知方法は、関節軟骨の変性又は損傷の進行段階において関節軟骨から放出されるケラタン硫酸の測定を、関節軟骨の変性又は損傷の検知に応用したものである。したがって、本発明検知方法において「関節軟骨の変性又は損傷」とは、主として関節軟骨の変性又は損傷の進行の有無及び程度を反映しているということができる。【００２５】
本発明検知方法において、血液由来の試料中のＫＳ濃度は、測定方法や、本発明検知方法の適用の対象となる動物種により異なり得、その他の疾患等の有無などにも影響され得るので一概には規定できないが、例えばヒト血液由来の試料として血清を用いる場合、血清中のＫＳをＫＳ２糖に分解してＨＰＬＣにより測定した値として、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷が存在すると評価される血清ＫＳ濃度は、例えば健常者の血液ＫＳ濃度＋２標準偏差以上が例示され、具体的な数値としては、例えば好ましくは約1200ng/ml以上、より好ましくは約1300ng/ml以上が例示される。一方、健常者の血清ＫＳ濃度としては、例えば約600〜1100ng/mlが例示される。【００２６】
本発明検知方法は、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷を検知することを特徴とする。ここでＸ線像とは、整形外科分野で用いられる標準的なＸ線撮影によって得られるＸ線像を意味する。【００２７】
また「関節軟骨の変性又は損傷」は、その原因や関連疾患等によって限定されるものではないが、本発明検知方法は、関節軟骨の変性又は損傷が、例えば外傷性関節症及び変形性関節症に例示される関節症を伴うものである場合においてより好適に用いることができる。上記において関節症とは、関節を構成する軟骨、滑膜、靭帯などに変性又は損傷などを生じ、疼痛、腫脹、発熱などの症状を伴う関節疾患の総称であり、加齢により生じる変形性関節症、外傷により生じる外傷性関節症が含まれる。【００２８】
本発明検知方法において「外傷性関節症」とは、これが引き起こされる原因によって特に限定されるものではないが、本発明検知方法は、例えば外傷性関節症がスポーツ又は事故等による捻挫、打撲、むち打ち等に伴う外傷性関節症である場合について、好ましく適用することができる。また、部位についても特に限定されるものではないが、外傷性膝関節症及び外傷性股関節症も好ましい対象として例示される。変形性関節症は、一次性の変形性関節症であってもよく、外傷又はその術後経過に起因する二次性の変形性関節症であってもよい。変形性関節症の具体例としては、例えば変形性膝関節症、変形性股関節症及び変形性脊椎症等が挙げられる。本発明検知方法は、上述した関節以外の関節として、例えば肘関節、顎関節等の関節等に例示される関節の関節症に適用してもよいが、より高い精度が期待されるといった観点から、膝関節、股関節及び椎間板等の大関節の関節症に適用することがより好ましい。また同様の理由から、例えば関節リウマチに例示されるような関節症が多部位に及ぶ場合にも好ましく適用することができる。また本発明検知方法は、例えば一次性の変形性関節症の例であって疼痛を訴える部位以外の関節にも早期の関節症を併せ持つ例や、疼痛症状を伴わない関節症を有する例のように、罹患部位が特定できない関節症を伴う関節軟骨の変性又は損傷に対しても適用することができる。このような場合においては、本発明検知方法によって関節軟骨の変性又は損傷を検知し、更にＭＲＩや関節鏡検査などの他の方法により罹患部位を特定することによって早期治療を開始することもできる。また、外傷性関節症においては、外傷受傷後の早期において、疼痛、腫脹等の関節症状があるにも関わらず、Ｘ線像では以上が認められない例も多数あることから、本発明検知方法は、早期の外傷性関節症を伴う関節軟骨の変性又は損傷に非常に好ましく適用することができる。上記の「早期」とは、例えば受傷後２ヶ月以内の外傷性関節症を意味する。このような外傷性関節症においては、Ｘ線像によっては関節軟骨の変性又は損傷を検知することができなくても、本発明の検知方法により関節軟骨の変性又は損傷を有する関節症であると評価されれば、早期あるいは軽度の段階において、その治療措置を採ることができる。なお、関節軟骨においては、変性と損傷とが同時にみられる例が多数存在する。したがって本出願書類において、関節軟骨の「変性又は損傷」とは、変性と損傷とが同時にみられる場合についても包含する概念である。
本発明検知方法の適用対象としては、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、サル、イヌなどの哺乳動物が挙げられるが、なかでもヒトが好ましい。【００２９】
２．本発明評価方法
本発明評価方法は、血液由来の試料中のＫＳ濃度を指標として使用する、関節軟骨の変性又は損傷の進行速度の評価方法である。
本発明評価方法においては、関節軟骨の変性又は損傷の進行段階において関節軟骨から放出されるケラタン硫酸を指標とするため、血清中のケラタン硫酸濃度が高いほど関節軟骨の変性又は損傷の進行速度が速い、すなわち関節軟骨の変性又は損傷の進行の活発度が高いと判定することができる。
「血液由来の試料」、「ＫＳ濃度」の測定方法、「適用対象」等の用語の意義については、上記本発明検知方法における説明を参照されたい。
本発明評価方法においては、「Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷」における進行速度の評価のみならず、「Ｘ線像によって検知することができるグレードにおける関節軟骨の変性又は損傷」における進行速度の評価をも行うことができる。【００３０】
３．本発明判定方法１
本発明の判定方法１は、本発明評価方法により関節軟骨の変性又は損傷の進行速度を評価するステップを少なくとも含む、関節軟骨の変性又は損傷の経時的な状態変化の判定方法である。
上記において、「経時的な状態変化の判定」とは、例えば関節軟骨の変性又は損傷の病態が、将来的に悪化する傾向にあるか、治癒する傾向にあるか、変化しない傾向にあるかを予め判定すること等を意味する。
より具体的には、本発明評価方法によって評価される関節軟骨の変性又は損傷の進行速度が基準値に比べて速ければ、すなわち関節軟骨の変性又は損傷の進行の活発度が高ければ、上記の病態は将来的に悪化する傾向にあると判定することができる。
反対に、本発明評価方法によって評価される関節軟骨の変性又は損傷の進行速度が基準値に比べて遅ければ、すなわち関節軟骨の変性又は損傷の進行の活発度が低ければ、上記の病態は将来的に治癒する傾向又は変化しない傾向にあると判定することができる。
本発明判定方法１においては、「Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷」における経時的な状態変化の判定のみならず、「Ｘ線像によって検知することができるグレードにおける関節軟骨の変性又は損傷」における経時的な状態変化の判定をも行うことができる。【００３１】
４．本発明判定方法２
本発明判定方法２は、治療前に採取した血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度と、治療後に採取した血液由来の被験試料中のケラタン硫酸濃度とを比較するステップを少なくとも含む、関節軟骨の変性又は損傷の治療効果の判定方法である。【００３２】
本発明判定方法２においては、関節症患者に対して関節症の治療を行い、その治療効果が発揮されれば、治療後の血液由来の試料中のＫＳ濃度は徐々に健常者のレベルに近づくと考えられるので、血液由来の試料中のＫＳ濃度を指標として関節症の治療の効果を判定することができる。関節症の治療としては、ヒアルロン酸関節注射剤、非ステロイド性抗炎症剤、ステロイド等の各種薬剤の投与の他、運動療法、足底板などの治療具の使用、関節軟骨、靱帯、半月板等を含む関節手術などの外科的治療及び内視鏡的治療が例示される。【００３３】
上記の判定方法において使用する血液由来の試料、ＫＳ濃度の測定方法などは、上記本発明の診断方法と同様である。上記の判定方法は、治療前に採取した血液由来の試料中のケラタン硫酸濃度と、治療開始後に採取した血液由来の被験試料中のケラタン硫酸濃度との比較に基づいて、Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷の治療効果を評価するステップを含むことが好ましい。【００３４】
上記にける「治療」とは、関節軟骨の変性又は損傷の治療を意味する。
本発明判定方法２においては、「Ｘ線像によっては検知することができない関節軟骨の変性又は損傷」における治療効果の判定のみならず、「Ｘ線像によって検知することができるグレードにおける関節軟骨の変性又は損傷」における治療効果の判定をも行うことができる。
【実施例】
【００３５】
以下、下記実施例により本発明をより詳細に説明する。本発明は下記実施例により限定されるものではない。
実施例１：ウサギ膝関節腔内へのキモパパイン投与後の血清中ＫＳの濃度の測定【００３６】
ウサギの膝関節にキモパパインを投与することにより膝関節軟骨の変性を起こすことにより関節症モデルを作成し、該モデルの血清中ＫＳ濃度の変化をＨＰＬＣ法により測定した。【００３７】
（方法）
L-システインを0.8mg/mLの濃度で含有する生理食塩液にキモパパイン（シグマ社製）を1 mg/mLの濃度で溶解し、JW系ウサギ（体重2.8〜3.5 kg、n=4）の右後肢関節腔内に0.2 mL投与した。また、対照として生理食塩液0.2 mLを別のJW系ウサギ（n=4）の右後肢関節腔内に投与した。【００３８】
生理食塩液あるいはキモパパイン投与前、投与後1、2、3、4、5、6、7および10日に左耳静脈から血液を採取し、血清中のＫＳ濃度をＨＰＬＣ法により測定した。【００３９】
ＨＰＬＣ法による血清中ＫＳ濃度測定は、以下のように行った。血清0.2mLに水0.8mLを加えた後、2%アクチナーゼE溶液（科研製薬）0.1mLを添加し、55℃で24時間静置した後、100℃で10分間煮沸した。この反応液をQ
Sepharose (AmershamPharmacia Biotech Corp.)にアプライし、0.15M
NaClを含む25mM Tris-HClbuffer (pH 8.6)で洗浄後、2M NaClを含む50mM Tris-HCl buffer (pH 8.6)でＫＳを抽出した。得られた抽出液をPD-10(Amersham Pharmacia Biotech Corp.)を用いて脱塩し、減圧乾固した後、水0.2mLで再溶解した。再溶解液0.15mLに1mUのケラタナーゼII(生化学工業) 及び100mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)を加え、37℃で3時間消化した。消化液をUltrafree
C3GC (Millipore Ltd.)を用いて限外ろ過し、ろ液に含まれるＫＳ由来の一硫酸化飽和二糖（m-ks）および二硫酸化飽和二糖（d-ks）をＨＰＬＣにより定量した。また、ケラタナーゼIIによる分解率の確認には、ウシ角膜由来ＫＳ（生化学工業）と鮫軟骨由来ＫＳ用いた。ＨＰＬＣの条件は以下の通りである。【００４０】
Column：YMC gel PA-120（ポリアミン結合シリカゲル、ワイエムシィー）
Eluent：硫酸ナトリウム／水（0/100→100/0 45分）
Flow rate：0.5mL/min.
Detection：2-cyanoacetamideと反応後、蛍光検出器（Excitation:331nm、Emission: 383nm）により検出【００４１】
（結果）
上記で測定した血清中ＫＳ濃度の変化を図１に示す。膝関節腔内へ生理食塩液を投与したウサギの血清中ＫＳ濃度については投与前後で変動はみられず、約200 ng/mlの濃度で推移した。一方、膝関節腔内にキモパパインを投与した群では、ＫＳの平均血清中濃度は漸増し、４日後に最高濃度643±64 ng/mlに達し、以降減少し、10日後には生理食塩液投与群とほぼ同レベルに戻った。【００４２】
血清中ＫＳ濃度の増加は、キモパパインにより変性した膝関節軟骨から遊離したＫＳが血液に移行したことによるものであり、関節軟骨から遊離したＫＳが速やかに血液中に移行し血清試料のＫＳ測定により検出できた。また、関節軟骨の変性が鎮静化したと考えられる時点では血清中ＫＳ濃度は正常レベルに戻ることから、血清中ＫＳ濃度の測定が関節軟骨の変性又は損傷の状態の指標となり得ることが示された。【００４３】
以下の実施例２及び３は、施設のＩＲＢの承認を受けた上で、被験者からのインフォームドコンセントのもとに実施をした。
実施例２：健常者および関節症患者の血清中ＫＳ濃度の測定
健常者24名、膝関節にスポーツ・打撲等で受傷を負い来院し、X線像で異常が認められず、直視あるいは関節内視鏡検査で関節軟骨の変性又は損傷が認められた患者（TA患者）18名、並びに、変形性膝関節症の疑いで来院しX線像で変形性膝関節症と診断された患者およびX線像では異常が認められず関節内視鏡検査で関節軟骨の変性又は損傷が認められた患者（OA患者）18名の血清中ＫＳ濃度と関節症状との比較を行った。【００４４】
（方法）
血清中ＫＳ濃度は実施例１と同様の方法で測定した。関節症状は膝部X線写真評価および関節鏡検査により行った。膝部X線写真評価は、Kellgren and Lawrenceの方法（Ann. Rheum. Dis. 1957, 16, 494-502）に従って行い、関節鏡検査による評価ではAyralらの方法（Osteoarthritis 1998, 494-505）に従ってSFA（Societe Francaised’Arthroscopie）を算出した。【００４５】
（結果）
上記測定の結果を表１、図２および図３に示す。表１中の数値はいずれも平均±標準偏差で示す。図２は、TA患者の受傷後期間と血清中ＫＳ濃度の関係を示す。図３は、健常者及びグレード０及びＩのOA患者の血清中ＫＳ濃度の分布を示す。【００４６】
TA患者の関節鏡検査による平均SFAは3.3±3.6で、血清中ＫＳ濃度は1566±574 ng/mLを示し、健常者の910±145 ng/mlに比べ有意に高値であった（p<0.001）。また、TA患者の18例中12例が健常者の血清中ＫＳ濃度の平均値＋2標準偏差（1200 ng/ml）より高値を示した。TA患者の受傷後の期間を２ヶ月で区切った場合、２ヶ月未満の患者のＫＳは2239±577ng/mlの高値を示し、受傷後２ヶ月〜２年のTA患者の1373±418ng/mlに対しても有意に高かった。OA患者でも血清中ＫＳ濃度は高値を示したが、関節鏡評価結果との相関はみられず、低グレードで高いＫＳ濃度を示す傾向が認められた。X線像で異常なし（グレード０）と診断されたOA患者7例の関節鏡評価による関節軟骨の変性度は、上述のTA患者の関節鏡検査結果とほぼ同等であった。この7例の血清中ＫＳ濃度は1501±360ng/mlで、健常者の血清中ＫＳ濃度の平均値＋2標準偏差より高値を示す症例は7例中6例であった。【００４７】
上記のとおり、TA患者及びOA患者のいずれにおいても血清ＫＳ濃度は健常者の血清ＫＳ濃度と有意に異なり、さらにTA患者においては受傷後期間によって血清ＫＳ濃度が異なり、またOA患者では各グレードによって血清ＫＳ濃度が異なり、血清ＫＳ濃度が早期の関節症の診断や、関節症のグレードの判定などの指標として有用であることが示された。【００４８】
HPLCによる血清ＫＳ濃度測定では、ケラタナーゼIIにより分解したm-ksとd-ksを測定しているが、血清中のＫＳのm-ksとd-ksの比は、例えば健常人の血清ＫＳの場合には約3.4であった。この結果は、血中には低硫酸化度のＫＳが多く含まれていることを示している。【００４９】
【表１】
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【００５０】
実施例３：健常者および関節症患者の血清中のCSDdi6SおよびCOMP濃度の測定
実施例２で使用した血清中のＣＳ由来不飽和二糖(CSDdi6S)および軟骨オリゴマーマトリクスタンパク質(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)の濃度を測定し、関節症の指標としての有用性をＫＳ濃度と比較した。【００５１】
（方法）
CSDdi6SおよびCOMPの具体的な測定法を以下に示す。
１．CSDdi6S
血清0.2mLに250mUのコンドロイチナーゼABC (生化学工業)と25mUのコンドロイチナーゼAC-II(生化学工業)の混液0.05mL及び100mM Tris-HCl緩衝液(pH8.0) 0.08mL、水 0.07mLを加え、37℃で2時間消化した。【００５２】
消化液をUltrafree C3GC (Millipore Ltd.)を用いて限外ろ過し、ろ液に含まれるCSDdi6SをＨＰＬＣにて分析した。ＨＰＬＣの条件は下記の通りとした。
Column：YMC gel PA-120（ポリアミン結合シリカゲル：ワイエムシィー）
Eluent：硫酸ナトリウム／水（0/100→100/0 55分）
Flow rate：0.5mL/min.
Detection：2-cyanoacetamideと反応後、蛍光検出器（Excitation:346nm Emission: 410nm）【００５３】
２．COMP
50倍もしくは100倍に希釈した血清75μLをディープウェルに分取した後、Anti-COMP溶液 75μLを添加した。攪拌後、4℃で16時間インキュベートした。標準として10ng/mLから80ng/mLに調製したCOMP溶液を同様に処理した。インキュベーションの後、予めCOMPを固相化したプレートに、反応液を100μLずつ添加した。1時間室温で反応させた後、反応液を除去し、各ウェルを洗浄した。アルカリホスファターゼでラベル化されたAnti-rabbit IgG溶液を各ウェルに100μLずつ添加し、室温で1時間反応させた。反応液を除去し、各ウェルを洗浄した後、酵素基質溶液（pNPP）100μLを添加し、室温で60分間発色反応を行った。反応後、10分以内に405nmの吸光度を測定した。各検体の濃度は、標準曲線から算出された測定濃度に希釈倍率を乗して求めた。【００５４】
（結果）
上記の測定の結果を表１に併せて示す。健常者の血清のCSDdi6SおよびCOMPの平均濃度はそれぞれ97ng/mlおよび1030ng/mlであった。関節症患者では、OAおよびTA患者でCOMPに有意な増加がみられたが、ＫＳの増加に比べ増加率は僅かであった。CSDdi6Sについても増加傾向はみられるが、増加率はわずかであった。このように、これらの物質と比較して、血清中ＫＳの関節軟骨の変性又は損傷の早期診断マーカーとしての有用性がより高いことが確認された。【００５５】
実施例４：関節症患者の治療前後の血清中ＫＳ濃度の測定
臨床所見およびＸ線像から変形性膝関節症と診断された関節症患者24名を対象にして、治療前および治療開始１年後の血清中ＫＳ濃度推移と関節症の進行の有無との比較を行った。
（方法）
血清中ＫＳ濃度は実施例１と同様の方法で測定した。関節症の進行については、治療前の膝関節部Ｘ線像と治療開始１年後の膝関節部Ｘ線像とを複数の医師が評価し、評価医師全員が関節裂隙の狭小化が進行したと評価した症例を「進行症例」と判定した。
（結果）
24名の患者のうち、5名は「進行症例」であった。「進行症例」の5名では、治療前後の血清中ＫＳ濃度に有意な差はみられなかった。１年後の膝関節部Ｘ線像で関節裂隙の狭小化がみられなかった症例は19名で、治療前の血清中ＫＳ濃度に比べ治療開始１年後の血清中ＫＳ濃度は有意に低下していた。このうち、治療前に比べ１年後のＫＳ濃度が30％以上低下した症例は7名であった。
このように、Ｘ線像で進行がみられなかった症例ではＫＳ濃度の低下がみられ、ＫＳ濃度測定は治療効果の判定に応用できることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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