(57)【要約】  本発明は、これまでに知られる乳酸菌株よりも強い抗アレルギー作用を有する、ワイセラ属に属する菌株を提供すること、及び、この菌株の菌体を含有する飲料及び食品並びにこれらを有効成分として含有する抗アレルギー剤を提供することを目的としている。本発明は、ワイセラ属に属し、抗アレルギー作用を有する菌株を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属に属し、抗アレルギー作用を有する菌株。
【請求項２】
前記抗アレルギー作用は、インターフェロンγ及び／又はインターロイキン１２の産生促進作用である、請求項１記載の菌株。
【請求項３】
前記抗アレルギー作用は、ＩｇＥ抗体の産生抑制作用である、請求項１記載の菌株。
【請求項４】
ワイセラ・コンフサ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ）ＢＰ２８６５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８６５）である、請求項１〜３のいずれか一項記載の菌株。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項記載の菌株の菌体を含有する飲料。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項記載の菌株の菌体を含有する食品。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項記載の菌株の菌体を有効成分として含有する抗アレルギー剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗アレルギー作用を有する菌株並びにその菌株を含有する飲料、食品及び抗アレルギー剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー性疾患の治療は、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤及びステロイド剤等を用いた薬物療法が一般的である。しかし最近では、薬物療法の限界と予防医学の観点から、腸管免疫に作用する乳酸菌が、アレルギー疾患の予防及び治療に効果があるとして注目されている（特許文献１〜３）。腸管免疫とは、経口的に取り込まれた病原微生物等を排除する免疫機構であり、過剰反応する腸管免疫を抑制できれば、アレルギー性疾患の予防及び治療に貢献できると考えられている。【０００３】
例えば、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のインファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）種、ブレーベ（ｂｒｅｖｅ）種、ロンガム（ｌｏｎｇｕｍ）種及びビフィダム（ｂｉｆｉｄｕｍ）種の菌株には、食物アレルギーの治療に効果を有するものがあり（特許文献１）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）及びラクトバチルス・ロイテリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）の菌株（特許文献２）並びにラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）及びストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（特許文献３）の菌株には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎及びアトピー性皮膚炎等に効果を有するものがあると報告されている。【０００４】
【特許文献１】特開平１０−３０９１７８号公報
【特許文献２】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献３】特開２００５−１３９１６０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、抗ヒスタミン剤、抗アレルギー剤及びステロイド剤等の薬物療法は、血中で免疫反応に関与する分子に直接作用し、生体の恒常性維持に必要な免疫反応まで抑制するため、副作用が大きいという問題点がある。また、アレルギー疾患のような慢性疾患を予防するには、これまでに報告されている乳酸菌の活性では、実用上、効果が不十分であった。さらに、これまで、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属に属する乳酸菌の菌株が、抗アレルギー作用を有することについては、これまで報告がなかった。【０００６】
そこで本発明の目的は、これまでに知られる乳酸菌株よりも強い抗アレルギー作用を有する、ワイセラ属に属する菌株を提供することにある。また本発明の目的は、このワイセラ属に属する菌株の菌体を含有する飲料及び食品並びにこれらを有効成分として含有する抗アレルギー剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、ワイセラ属に属し、抗アレルギー作用を有する菌株を提供する。【０００８】
本発明者らは、ワイセラ属に属する菌株が、特に効果的に、マウス脾臓細胞からのＴｈ１型サイトカインの産生を誘導し、また、卵白アルブミン（ＯＶＡ）免疫マウスの脾臓細胞におけるＩｇＥの産生を抑制することを見出した。これらの作用は、ヒトのアレルギー性疾患の予防及び治療に効果的な作用であり、その活性は、これまでに報告のある乳酸菌の菌株と比較して顕著に強いものであった。乳酸菌は、古くから発酵食品に利用されている細菌であり、化学合成された抗アレルギー剤と比較して、人体に対する安全性がはるかに優れている。このような菌株としては、ワイセラ・コンフサ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ）ＢＰ２８６５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８６５）が特に好ましい。【０００９】
上記の抗アレルギー作用は、インターフェロンγ及び／又はインターロイキン１２の産生促進作用であることが好ましい。【００１０】
インターフェロンγは、Ｔｈ１細胞が分泌するサイトカインであって、Ｂ細胞がＩｇＥを産生するのを阻害するほか、ウイルス、糸状菌及び結核菌等を攻撃するキラーＴ細胞やマクロファージ等の細胞性免疫能を増大させる作用を有する。また、インターロイキン１２は、マクロファージ等の抗原提示細胞が分泌するサイトカインであって、ＮＫ細胞を刺激してＴｈ１細胞を誘導する作用を有し、Ｔｈ１細胞によるインターフェロンγの産生をも誘導する。本発明の菌株は、インターフェロンγ及び／又はインターロイキン１２の産生促進し、ＩｇＥの産生を抑制できるため、Ｉ型アレルギー反応を抑制することが可能である。【００１１】
上記の抗アレルギー作用は、ＩｇＥの産生抑制作用であることが好ましい。【００１２】
ＩｇＥは、アレルギー性疾患を引き起こす原因物質である。すなわち、アレルゲンが侵入すると、これに反応してＩｇＥが産生され、ＩｇＥがマスト細胞や好塩基球に結合して感作が成立する。その後、同じアレルゲンが侵入すると、ＩｇＥはアレルゲンを認識し、マスト細胞や好塩基球からヒスタミン等の炎症性物質が遊離されることになる。このアレルギー反応は、気管支の収縮や蕁麻疹等のさまざまな症状を呈し、発症部位により、花粉症、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、喘息等のアレルギー性疾患を引き起こすことになる。本発明の菌株は、ＩｇＥの産生を抑制できるため、アレルギー反応を抑制することが可能であり、上記疾患の予防及び治療に利用できる。【００１３】
また、本発明は、上記菌株の菌体を含有する飲料及び食品を提供する。【００１４】
上記菌株の菌体は、抗アレルギー作用を有し、人体に対して安全であることから、健康食品素材として飲料及び食品に含有させて利用できる。さらに、上記菌株はγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するため、抗ストレス作用、血圧降下作用及び精神安定作用を併せ持ち、健康食品素材として利用価値が高い。【００１５】
また、本発明は、上記菌株の菌体を有効成分として含有する抗アレルギー剤を提供する。【００１６】
上記菌株の菌体は、インターロイキン１２及びインターフェロンγの産生促進作用、並びにＩｇＥの産生抑制作用を有するため、この菌体を有効成分として含有する抗アレルギー剤を製造すれば、化学合成された医薬品よりも安全性に優れた抗アレルギー剤として利用できる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、これまでに知られる乳酸菌株よりも強い抗アレルギー作用を有するワイセラ属に属する菌株を提供できる。また本発明によれば、上記菌株の菌体を含有し、安全性に優れ、かつ、抗アレルギー作用を有する飲料、食品及び抗アレルギー剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＯＶＡと各菌株の菌体縣濁液の添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞が産生したインターフェロンγの量を示したものである。
【図２】ＯＶＡと各菌株の菌体縣濁液の添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞が産生したインターロイキン１２の量を示したものである。
【図３】ＯＶＡと各菌株の菌体縣濁液の添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞が産生したインターロイキン４の量を示したものである。
【図４】ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスの指標として、インターフェロンγ／インターロイキン４を算出し、グラフ化したものである。
【図５】ＯＶＡの添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に誘導される総ＩｇＥの産生に及ぼす各菌株の菌体縣濁液の効果を示したものである。
【図６】ＯＶＡの添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に誘導されるＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生に及ぼす各菌株の菌体縣濁液の効果を示したものである。
【図７】各菌株を腹腔内投与したＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌される総ＩｇＥの産生量を示したものである。
【図８】各菌株を腹腔内投与したＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌されるＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生量を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００２０】
本発明の菌株は、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属に属する菌株であって、抗アレルギー作用を有することを特徴としている。【００２１】
ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属には、コンフサ（ｃｏｎｆｕｓａ）種、パラメセンテロイデス（ｐａｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、シバリア（ｃｉｂａｒｉａ）種、ハロトレランス（ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）種、ヘレニカ（ｈｅｌｌｅｎｉｃａ）種、カンデリ（ｋａｎｄｌｅｒｉ）種、キムチ（ｋｉｍｃｈｉｉ）種、コリーンシス（ｋｏｒｅｅｎｓｉｓ）種、マイナ（ｍｉｎｏｒ）種、ソリ（ｓｏｌｉ）種、タイランデス（ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）種、ビリデセン（ｖｉｒｉｄｅｓｃｅｎ）種が存在するが、コンフサ種及びパラメセンテロイデス種の菌株であることが好ましく、コンフサ種の菌株であることがさらに好ましい。【００２２】
「抗アレルギー作用」とは、アレルギー反応を抑制する作用のことをいう。ここで、アレルギーとは、ある種の物質の摂取又は接触により生体内に抗体が作られ、同じ物質の再摂取又は再接触により過剰な抗原抗体反応が起きて病的症状が現れる状態をいう。また、アレルギー反応とは、生体の防御機構である免疫反応が、本来排除すべきでない自分自身の細胞や摂取した食品等を攻撃してしまう現象をいう。免疫反応には、抗原提示細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞が関与し、液性免疫として主にＩｇＧ及びＩｇＡが作られるが、アレルギー反応には、Ｔ細胞のうちのＴｈ２細胞が主に関与し、ＩｇＥが通常の免疫反応の１００〜１００００倍高い濃度で作られる。この大量のＩｇＥは、マスト細胞と結合し、マスト細胞にヒスタミン、ロイコトリエン等の炎症性物質の遊離を促すことになる。【００２３】
抗アレルギー作用としては、例えば、抗原提示細胞、Ｔ細胞又はマスト細胞に作用して、ＩｇＥの産生や上記の炎症性物質の遊離を抑制する作用や、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１側にシフトさせる作用が挙げられ、より具体的には、ＩｇＥの産生抑制作用、インターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生促進作用等が挙げられる。【００２４】
上記の菌株の抗アレルギー作用としては、ＩｇＥの産生抑制作用、インターフェロンγの産生促進作用及び／又はインターロイキン１２の産生促進作用が好ましく、これらの作用を２つ以上併せ持つことがより好ましい。【００２５】
ワイセラ属に属する菌株は、自然界から容易に分離でき、１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を調べることにより同定できる。また、ＡＴＣＣ等の細胞バンクから購入できる。【００２６】
ワイセラ属に属する菌株のうち、抗アレルギー作用を有する菌株は、例えば、i)マウス脾臓細胞に対するインターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生促進作用、ii)卵白アルブミン（以下、ＯＶＡ）免疫マウスの脾臓細胞で誘導されるＩｇＥの産生抑制作用、iii)ＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌されるＩｇＥの産生抑制作用、等を試験することによって選抜できる。【００２７】
i)では、マウスの脾臓から脾臓細胞を分離して培養し、そこに被検菌株の菌体を滅菌して調製した菌体縣濁液を加えて一定時間培養し、脾臓細胞から分泌されるインターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生量をＥＬＩＳＡ等で測定し、インターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生促進作用の有無を調べればよい。【００２８】
ii)では、追加免疫から２週間後のＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を分離して培養し、そこに被検菌株の菌体を滅菌して調製した菌体縣濁液とＯＶＡを加えて一定時間培養し、脾臓細胞から分泌されるＩｇＥの産生量をＥＬＩＳＡ等で測定し、ＩｇＥ産生抑制作用を調べればよい。【００２９】
iii)では、ＯＶＡマウスの腹腔内に被検菌株の菌体を滅菌して調製した菌体縣濁液を投与して一定時間飼育し、末梢血中に分泌されるＩｇＥの量をＥＬＩＳＡ等で測定し、菌体懸濁液を腹腔内投与していないＯＶＡマウスの末梢血に分泌されるＩｇＥの産生量と比較すればよい。【００３０】
尚、ワイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属に属し、抗アレルギー作用を有する菌株であるワイセラ・コンフサ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ  ｃｏｎｆｕｓａ）ＢＰ２８６５（受託の日：１９９０年４月１３日；受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８６５）は、国際寄託当局である通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現・独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託されており、入手可能である。【００３１】
本発明の飲料、食品及び抗アレルギー剤は、ワイセラ属に属する菌株であって、抗アレルギー作用を有する、上記の菌株を含有することを特徴としている。【００３２】
上記菌株の菌体は、アレルギー性疾患の予防及び治療を目的として飲料及び食品に添加できる。上記飲料及び食品は、上記の菌株の菌体のみからなっていてもよく、当該分野で通常使用される添加物を含んでいてもよい。この添加物としては、例えば、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂、グルコース等の単糖類、スクロース、フルクトース及びマンニトール等の二糖類、デキストロース及びデンプン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール及びソルビトール等の糖アルコール類、ビタミンＣ等のビタミン類が挙げられ、これらの添加物は単独種又は複数種であってもよい。【００３３】
さらに、アレルギー性疾患の予防や症状の緩和の目的で、食品添加物として、特定保健用食品、特殊栄養食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品や病者用食品等の飲食物に配合することもできる。【００３４】
本発明の抗アレルギー剤は、上記の菌株の菌体を有効成分として含み、担体、賦形剤及び／又はその他の添加物を加えて製剤化すれば、安全性に優れた抗アレルギー剤として利用できる。薬学的に許容される添加物としては、例えば、グルコース等の単糖類、スクロース、フルクトース及びマンニトール等の二糖類、デキストロース及びデンプン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール及びソルビトール等の糖アルコール類、ビタミンＣ等のビタミン類、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、珪酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体、トラガカント、ゼラチン、シロップ、ヒドロキシ安息香酸メチル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、水、鉱油が挙げられ、これらの添加物は単独種又は複数種であってもよい。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３６】
１）実験に用いた各菌株について
ワイセラ・コンフサに属する４菌株（菌株１〜４）は発明者が分離し、実験に用いるまで凍結乾燥菌体として４℃で保管した。また、ラクトバチラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）に属する菌株Ｘは、市販のヨーグルトから分離し、実験に用いるまで凍結乾燥菌体として４℃で保管した。【００３７】
２）抗アレルギー作用の評価
i)菌体懸濁液の調製
上記の各菌株の抗アレルギー作用を評価するために、各菌株の菌体懸濁液を調製した。まず、各菌株を嫌気的条件下（Ｎ２：ＣＯ２：Ｈ２＝９０：５：５のガス組成）、ＭＲＳ液体培地（ディフコ社製、組成：１％プロテオースペプトン、１％牛肉エキス、０．５％酵母エキス、２％ブドウ糖、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．５％クエン酸アンモニウム、０．０１％硫酸マグネシウム、０．００５％硫酸マンガン、０．２％リン酸二カリウム）で３日間静置培養し、その培養液を１，５００回転で１０分間遠心分離して、各菌株の菌体を回収した。得られた菌体は、ＰＢＳで洗浄した後に凍結乾燥し、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁した。こうして得られた菌体懸濁液は、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）して以下の実験に使用した。【００３８】
ii)ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に対する菌株１〜４のＴｈ１サイトカイン産生促進作用、Ｔｈ２サイトカイン産生抑制作用及びＩｇＥ産生抑制作用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
ＯＶＡ免疫マウス脾臓細胞にワイセラ属に属する４菌株の菌体縣濁液を加えて一定時間培養し、ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に対するＴｈ１サイトカイン（インターフェロンγ及びインターロイキン１２）産生促進作用、Ｔｈ２サイトカイン（インターロイキン４）産生抑制作用及びＩｇＥ産生抑制作用を評価した。その際、ラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘの作用についても同時に調べ、ワイセラ属に属する４菌株の作用と比較した。【００３９】
（ＯＶＡ免疫マウスの作成）
ＯＶＡ免疫マウスは、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）にＯＶＡを腹腔内投与し、人為的にアレルギーを惹起して作成した。具体的には、まず、１００μｇのＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、Ｅｇｇｗｈｉｔｅ、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び１０ｍｇの水酸化アルミニウムを１ｍＬのＰＢＳに溶解してＯＶＡ抗原溶液を調製し、その２００μＬをマウスの腹腔内に投与して初回免疫を行なった。その１週間後、上記と同じようにＯＶＡ抗原溶液を調製し、再度、その２００μＬをマウスの腹腔内に投与して追加免疫を行なった。追加免疫がされたマウスは、約１週間後にアレルギーが惹起され、このマウスをＯＶＡ免疫マウスとして以下の実験に用いた。【００４０】
（ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞の調製）
まず、追加免疫から２週間後のＯＶＡ免疫マウスから脾臓を無菌的に摘出し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に浸漬した。その後、脾臓をシャーレに移して乳棒ですり潰し、マウス脾臓細胞の縣濁液を、目開き７０μｍ、線径３９μｍのナイロンフィルターネット（日本理化学機器株式会社）に通した。このナイロンフィルターネットを通過したマウス脾臓細胞の縣濁液は、１，５００回転で１０分間遠心分離し、上清を捨てた後に赤血球溶血試薬（０．１６Ｍ塩化アンモニウム、トリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．２）を沈殿したマウス脾臓細胞に加え、５分間、室温で静置した。その後、新しい１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加えてマウス脾臓細胞を洗浄し、１，５００回転で１０分間遠心分離し、上清を捨てた後に細胞数が５×１０６個／ｍＬになるように１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加えた。こうして得られたＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を、以下の実験に用いた。【００４１】
（インターフェロンγ、インターロイキン１２及びインターロイキン４のＥＬＩＳＡによる測定）
インターフェロンγ、インターロイキン１２及びインターロイキン４を測定するために、２．５×１０５個のＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を９６ウェルプレートに播種し（細胞密度は、２．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を培養している各ウェルにＯＶＡ（最終濃度：１００μｇ／ｍＬ）と各菌株の菌体縣濁液（最終濃度：１μｇ／ｍＬ）をそれぞれ添加し、７２時間経過後に培養上清中に分泌された各サイトカインの量をＥＬＩＳＡで定量した。その際、菌体縣濁液の代わりにＰＢＳを添加したコントロールを設けた。【００４２】
インターフェロンγを定量するためのＥＬＩＳＡは、以下のようにして行なった。まず、１．２５μｇ／ｍＬに調製した一次抗体（Ｒａｂｂｉｔ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ；ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ社）を９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ；ＮＵＮＣ社）の各ウェルに５０μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することにより固相した。その後、この９６ウェルプレートをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ社）でブロッキングした。引き続き、各培養上清又は予め濃度が明らかであるインターフェロンγの標品を、それぞれ５０μＬずつ各ウェルに添加して一次抗体である抗インターフェロンγ抗体と９０分間反応させ、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後に、０．５μｇ／ｍＬに調製した二次抗体（Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ／ｒａｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ  ｂｉｏｔｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ社）を各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で９０分間反応させた。その後、各ウェルをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ社）を添加して反応させ、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄した後にＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質溶液（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  （ＴＭＢ）  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＳＩＧＭＡ社）を加えて反応させた。発色が十分進行した後に２Ｎ硫酸を各ウェルに５０μＬずつ加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。インターフェロンγの標品の吸光度から標準曲線を作成し、この標準曲線からＯＶＡマウスの脾臓細胞が産生したインターフェロンγの量を定量した。【００４３】
インターロイキン１２の定量については、一次抗体に１μｇ／ｍＬのＰｕｒｉｆｉｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社)を用い、二次抗体に１μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−１２（ｐ４０／ｐ７０）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて、インターフェロンγの定量と同様の手順でＥＬＩＳＡを行なった。インターロイキン４の定量については、一次抗体に１μｇ／ｍＬのＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ.）を用い、二次抗体に１μｇ／ｍＬのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩＬ−４  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ.）を用いて、インターフェロンγの定量と同様の手順でＥＬＩＳＡを行なった。【００４４】
図１は、ＯＶＡと各菌株の菌体縣濁液の添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞が産生したインターフェロンγの量を、図２はインターロイキン１２の量を、図３はインターロイキン４の量を示したものである。図４は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスの指標として、インターフェロンγ／インターロイキン４を算出し、グラフ化したものである。その結果、ＯＶＡとＰＢＳを添加したコントロールでは、Ｔｈ１型サイトカインであるインターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生はほとんど認められず、Ｔｈ２型サイトカインであるインターロイキン４の産生が顕著に誘導された。このことより、ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスがＴｈ２側にシフトし、アレルギー反応が亢進していることが示唆された。【００４５】
一方、ＯＶＡと菌株１〜４の菌体縣濁液を添加した処理区では、Ｔｈ１型サイトカインであるインターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生が、コントロール及びラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘに比べて促進され、Ｔｈ２型サイトカインであるインターロイキン４の産生が顕著に抑制されていた。また、菌株１〜４の菌体縣濁液の作用は、ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞のＴｈ１／Ｔｈ２バランスを大きくＴｈ１側にシフトさせるものであった。この結果より、菌株１〜４は強い抗アレルギー作用を有することが示唆された。【００４６】
（総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥのＥＬＩＳＡによる測定）
総ＩｇＥを測定するために、９６ウェルプレートに２．５×１０５個のＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を播種し（細胞密度は、２．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。その後、ＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞を培養している各ウェルにＯＶＡ（最終濃度：１００μｇ／ｍＬ）及び各菌株の菌体縣濁液（最終濃度：１μｇ／ｍＬ）をそれぞれ添加し、１４日経過後に培養上清中に分泌された総ＩｇＥの量をＥＬＩＳＡで定量した。コントロールには、菌体縣濁液の代わりにＰＢＳを添加し、同様にＥＬＩＳＡで定量した。【００４７】
一方、ＯＶＡ特異的ＩｇＥを測定するために、４８ウェルプレートに２．５×１０６個の脾臓細胞を播種し（細胞密度は、２．５×１０６  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。脾臓細胞にＯＶＡ（最終濃度：１００μｇ／ｍＬ）及び各菌株の菌体縣濁液（最終濃度：１μｇ／ｍＬ）を添加して３日間培養し、新しい培地で脾臓細胞を３回洗浄してＯＶＡを除去し、洗浄後の脾臓細胞に、再度、各菌株の菌体縣濁液を１μｇ／ｍＬとなるように加えて１１日間培養し、培養上清中に分泌されたＩｇＥをＯＶＡ特異的ＩｇＥとしてＥＬＩＳＡで定量した。コントロールには、菌体縣濁液の代わりにＰＢＳを添加し、同様にＥＬＩＳＡで定量した。【００４８】
総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥを定量するためのＥＬＩＳＡは、以下のようにして行なった。まず、１０μｇ／ｍＬに調製した抗マウスＩｇＥ抗体（Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）を９６ウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ；ＮＵＮＣ社）の各ウェルに５０μＬずつ添加し、４℃で一晩静置することにより固相した。その後、この９６ウェルプレートをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；シグマ社）でブロッキングした。引き続き、各培養上清又は予め濃度が明らかであるＩｇＥの標品を各ウェルに添加して抗マウスＩｇＥ抗体と９０分間反応させ、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで３回洗浄した後に、Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）で作製したビオチン化ＯＶＡを各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で９０分間反応させた。その後、各ウェルをＷａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＩＯ  ＳＯＵＲＣＥ社）を添加して反応させ、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄した後にＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）基質溶液（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  （ＴＭＢ）  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ；ＳＩＧＭＡ社）を加えて反応させた。発色が十分進行した後に２Ｎ硫酸を各ウェルに５０μＬずつ加えて反応を停止し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＩｇＥの標品の吸光度から標準曲線を作成し、この標準曲線からＯＶＡマウスの脾臓細胞が産生したＩｇＥの量を定量した。尚、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ量については、ＯＶＡ特異的ＩｇＥの標品がないためコントロール（陰性対照）の吸光度に対する相対値で表した。【００４９】
図５は、ＯＶＡの添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に誘導される総ＩｇＥの産生に及ぼす各菌株の菌体縣濁液の効果を示したものである。図６は、ＯＶＡの添加によりＯＶＡ免疫マウスの脾臓細胞に誘導されるＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生に及ぼす各菌株の菌体縣濁液の効果を示したものである。【００５０】
その結果、菌株１〜４の菌体縣濁液の添加により、ＯＶＡで誘導される総ＩｇＥ量及びＯＶＡ特異的ＩｇＥ量は顕著に抑制され、特に、ＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生抑制作用は、菌株１で顕著であり、ほぼ１００％抑制するものであった。【００５１】
一方、ラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘは、ＯＶＡで誘導される総ＩｇＥ量及びＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生を抑制するものの、菌株１と比較して弱い作用であった。【００５２】
以上の結果より、ワイセラ属に属する菌株１は、インターフェロンγ及びインターロイキン１２の産生促進作用並びにＩｇＥ産生抑制作用を有し、これまでに知られる乳酸菌の菌株と比較して強い抗アレルギー作用を発揮することが判明した。菌株１は、ＢＰ２８６５と命名され、国際寄託当局である通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所（現・独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター；日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託済みの菌株であった（受託の日：１９９０年４月１３日；受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−２８６５）。【００５３】
iii)ＯＶＡ免疫マウスに対するＢＰ２８６５のＩｇＥ産生抑制作用（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験で強い抗アレルギー作用を有することが判明したＢＰ２８６５について、ＯＶＡ免疫マウスに対するＩｇＥ産生抑制作用をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。その際、ラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘの作用についても同時に調べ、ＢＰ２８６５の作用と比較した。【００５４】
ＯＶＡ免疫マウスは、上記のようにＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、Ｅｇｇｗｈｉｔｅ、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で初期免疫及び追加免疫をすることによって作成し、ＢＰ２８６５若しくは菌株Ｘの菌体縣濁液、又はＰＢＳ（コントロール）を初回免疫の1週間前から追加免疫の1週間後まで２日に１回、２００μＬずつ腹腔内投与した。尚、各菌体縣濁液は、上記のように凍結乾燥した菌体を１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで懸濁し、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）することにより調製した。【００５５】
追加免疫の1週間後、マウスの尾静脈から血液を採取し、そこから分離した血清中の総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥの量をＥＬＩＳＡで測定した。血清中の総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥのＬＩＳＡによる測定は、上記と同じ方法で行なった。【００５６】
図７は、各菌株を腹腔内投与したＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌される総ＩｇＥの産生量を示したものである。図８は、同様に各菌株を腹腔内投与したＯＶＡ免疫マウスの末梢血中に分泌されるＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生量を示したものである。グラフ中の＊は、コントロールに対してｐ＜０．０５で統計的有意であることを示している。【００５７】
その結果、ＢＰ２８６５の菌体縣濁液の添加により、ＯＶＡマウスの末梢血に分泌される総ＩｇＥ量は約８０％抑制され、ＯＶＡ特異的ＩｇＥは約４５％抑制された。総ＩｇＥの抑制作用は、ＰＢＳを投与したコントロールと比べて統計的に有意なものであった。【００５８】
一方、ラクトバチラス・ラムノサスに属する菌株Ｘは、ＯＶＡマウスの末梢血に分泌される総ＩｇＥ及びＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生を抑制するものの、ＢＰ２８６５と比較して弱い作用であり、コントロールと比べて統計的に有意なものではなかった。【００５９】
以上の結果より、ワイセラ属に属するＢＰ２８６５は、強い抗アレルギー作用を有する菌株であることが判明した。【００６０】
３）ＢＰ２８６５を用いて製造した果汁乳酸発酵液の官能検査
抗アレルギー作用を有するＢＰ２８６５を用いて果汁乳酸発酵液を製造し、得られた果汁乳酸発酵液の香りと風味について官能検査を行なった。【００６１】
表１は、乳酸発酵に使用した果汁について、果実の種類、糖度及びｐＨを示したものである。【００６２】
【表１】
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【００６３】
各果汁は、それぞれグレープフルーツ濃縮果汁、りんご濃縮果汁、白ぶどう濃縮果汁及びレモン濃縮果汁を滅菌水で希釈して所定の糖度になるように調製し、ｐＨはＮａＯＨを添加して調整した。乳酸発酵は、各果汁１００ｍＬに対し５．７４×１０８細胞のＢＰ２８６５を植菌し、１日１回の撹拌を行い、３０℃で７２時間、静置条件下で行なった。発酵終了後、各乳酸発酵液の濁度を分光光度計（タイテック社）で測定し、乳酸量をＦ−ｋｉｔ  Ｄ−／Ｌ−乳酸（Ｊ．Ｋ．インターナショナル社）で測定した。各乳酸発酵液の濁度は、ＢＰ２８６５の増殖の指標とし、乳酸量は乳酸発酵の程度の指標とした。【００６４】
表２は、各乳酸発酵液の濁度、乳酸量及び官能検査の結果を示したものである。【００６５】
【表２】
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【００６６】
その結果、試験に用いた総ての果汁でＢＰ２８６５の乳酸発酵は進み、果汁乳酸発酵液を製造するに至った。特に、ＧＦ−１０、ＡＰ−１０及びＬＥ−５では、ベース果汁の風味が保持され、乳酸発酵飲料として好ましい性質を備えるものであった。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明によれば、これまでに知られる乳酸菌株よりも強い抗アレルギー作用を有するワイセラ属に属する菌株を提供できる。また本発明によれば、上記菌株の菌体を含有し、安全性に優れ、かつ、抗アレルギー作用を有する飲料、食品及び抗アレルギー剤を提供できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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