(57)【要約】  Ｉ型インターフェロンの発現誘導を制御することのできる発現調節剤を提供すること。  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を促進又は抑制する活性を有するタンパク質からなる、Ｉ型インターフェロンの発現調節剤。本発明は、Ｉ−ＩＦＮの産生を促進又は抑制することのできる発現調節剤を提供することができ、当該調節剤は感染症治療薬あるいは炎症治療薬として利用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を促進又は抑制する活性を有するタンパク質からなるＩ型インターフェロンの発現調節剤。
【請求項２】
ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を促進させる活性を有するタンパク質からなる、請求項１に記載の発現調節剤。
【請求項３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から２１番目〜６２番目の何れかのアミノ酸残基までが欠失したアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１番目〜６２番目の領域において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を抑制する活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項３に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項５】
配列番号４に示される塩基配列からなる、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
請求項４又は５に記載の核酸を含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターが導入されてなる形質転換細胞。
【請求項８】
請求項２に記載の発現調節剤を含む感染症治療薬。
【請求項９】
請求項３に記載のタンパク質からなる、Ｉ型インターフェロンの発現抑制剤。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現抑制剤を有効成分とする炎症治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｉ型インターフェロン遺伝子の発現を促進し又は抑制することのできるタンパク質からなるＩ型インターフェロンの発現調節剤、Ｉ型インターフェロン遺伝子の発現を抑制することのできるタンパク質とこれをコードする核酸、該核酸を含むベクターが導入された形質転換体、ならびにＩ型インターフェロン遺伝子の発現を促進し又は抑制することのできるタンパク質からなるＩ型インターフェロンの発現調節剤を有効成分とする感染症治療薬又は炎症治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスやバクテリア等の外来病原体に対する自然免疫応答は、細胞発現型認識レセプター（ＰＲＲ）が外来病原体に含まれる特定の構造パターンを認識することに始まり、レセプターからのシグナルが、細胞内シグナル伝達経路を経て、炎症誘発性サイトカインやβ（Ｉ型）インターフェロン（以下、Ｉ−ＩＦＮと表す）の誘導と共に、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を導くことが知られている。特に、ウイルス感染後のＩ−ＩＦＮの発現制御機構は、微生物病原体に対する自然免疫応答の中核をなしており、多くの研究者の関心を引き寄せている。【０００３】
これまでの研究の結果、ウイルス感染に関するＰＲＲとその免疫応答は、概ね図１に示されるような機構によって調節されていることが判明してきている。ウイルス由来の二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）等がＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）によって認識されると、そのシグナルはＴＬＲの細胞質ドメインを介してアダプター分子（ＴＩＣＡＭ１、ＴＩＣＡＭ−２、ＭｙＤ８８など）に伝えられる。特に、ＴＬＲ３やＴＬＲ４からＴＩＣＡＭ−１に伝えられたシグナルは、ＮＡＰ１／ＩＫＫε／ＴＢＫ１の複合体を介して転写因子ＩＲＦ３を活性化し、活性化ＴＲＦ３が核に移行してＩ−ＩＦＮ遺伝子の転写を誘導する。【０００４】
このＴＬＲ３やＴＬＲ４からのシグナルによるＩ−ＩＦＮ遺伝子の転写誘導とは別に、細胞内に存在するｄｓＲＮＡを認識してＩ−ＩＦＮ遺伝子の転写を誘導する機構が存在することが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。その様なシグナル伝達に関与する細胞内ＰＲＲとして、ＲＩＧ−Ｉタンパク質が同定されている（例えば、非特許文献２参照）。ＲＩＧ−Ｉタンパク質は、カスパーゼ（Ｃａｐａｓｅ）と結合するドメイン（ＣＡＲＤ）様モジュールを２個有するＤＥｘＤ／Ｈｂｏｘ型ＲＮＡヘリカーゼであることが分かっている。【０００５】
ＲＩＧ−Ｉタンパク質は、抗ウイルス応答に必須のタンパク質であると考えられており、ＲＩＧ−Ｉタンパク質を介したＩ−ＩＦＮの発現誘導に至るシグナル伝達に関与する分子は、ウイルス等の感染に対する自然免疫応答の制御に利用することができると期待される。【０００６】
これまでのところ、ＲＩＧ−Ｉタンパク質に対するアダプタータンパク質としては、ＩＰＳ−１と呼ばれるタンパク質（特許文献１）や、ＴＲＩＭ２５と呼ばれるタンパク質（非特許文献３）の単離が報告されている。
【非特許文献１】Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２００４年、第１９９巻、第１６４１−１６５０頁
【非特許文献２】Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４年、第５巻、第７３０−７３７頁
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ、２００７年、第４４６巻、第９１６−９２１頁
【特許文献１】特開２００７−５４０４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＲＩＧ−Ｉを介したＩ−ＩＦＮの発現誘導に至るシグナル伝達に関与するシグナル伝達分子と、それをコードするＤＮＡを特定し、これらを用いたＩ−ＩＦＮの発現調節剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法を用いて、ＲＩＧ−Ｉタンパク質に作用する因子を探索した結果、ＥＳＴデータベースに登録されてＤＮＡにコードされている、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と結合してＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を促進する活性を有していること、さらに当該タンパク質のＮ末端部分に存在するドメイン構造を失わせると、当該タンパク質は逆にＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を抑制する活性を示すことをそれぞれ見いだし、下記の各発明を完成した。【０００９】
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を促進又は抑制する活性を有するタンパク質からなるＩ型インターフェロンの発現調節剤。【００１０】
（２）ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を促進させる活性を有するタンパク質からなる、請求項１に記載の発現調節剤。【００１１】
（３）配列番号１に示されるアミノ酸配列のＮ末端から２１番目〜６２番目の何れかのアミノ酸残基までが欠失したアミノ酸配列、又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の２１番目〜６２番目の領域において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を抑制する活性を有するタンパク質。【００１２】
（４）（３）に記載のタンパク質をコードする核酸。【００１３】
（５）配列番号４に示される塩基配列からなる、（４）に記載の核酸。【００１４】
（６）（４）又は（５）に記載の核酸を含む組換えベクター。【００１５】
（７）（６）に記載の組換えベクターが導入されてなる形質転換細胞。【００１６】
（８）（２）に記載の発現調節剤を含む感染症治療薬。【００１７】
（９）（３）に記載のタンパク質からなるＩ型インターフェロンの発現抑制剤。【００１８】
（１０）（９）に記載の発現抑制剤を有効成分とする炎症治療薬。
【発明の効果】
【００１９】
本発明は、Ｉ−ＩＦＮの産生を促進又は抑制することのできるＩ−ＩＦＮの発現調節剤を提供する。係るＩ−ＩＦＮの発現調節剤は、感染症治療剤あるいは炎症治療薬として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ウイルス感染に関するＰＲＲとその免疫応答機能を模式的に示した図である。
【図２】本発明のタンパク質であるＲＮＦ１３５をＲＩＧ−Ｉタンパク質と共存させたＨＥＫ２９３細胞の抽出液における、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターによって転写されるルシフェラーゼ活性の変化を表す図である。
【図３】ＲＩＧ−Ｉタンパク質とＲＮＦ１３５とを共発現させた細胞抽出液に対してＲＮＦ１３５に対する抗体で免疫沈降させたタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。図中、ＩＰは免疫沈降産物を、ＷＣＥは全細胞抽出液を示す。
【図４】ＲＩＧ−Ｉタンパク質とＲＮＦ１３５とを共発現させた細胞における、各タンパク質の局在部を示す共焦点レーザー顕微鏡写真である。図左の緑色がＲＮＦ１３５を、図右の赤がＲＩＧ−Ｉタンパク質を示す。図中央は左右の写真のマージを示す。
【図５】ＲＩＧ−Ｉタンパク質を発現させたＨＥＫ２９３細胞（上段）、ＲＩＧ−Ｉタンパク質とＲＮＦ１３５を共発現させたＨＥＫ２９３細胞（中段）、及びＲＮＦ１３５を発現させたＨＥＫ２９３細胞（下段）にＶＳＶを異なるタイターで感染させたときのＶＳＶの感染に対する抵抗性を示す写真である。
【図６ａ】本発明のタンパク質であるＲＮＦ１３５−ＤＮをＲＩＧ−Ｉタンパク質と共発現させたＨＥＫ２９３細胞の抽出液における、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターによって転写されるルシフェラーゼ活性の変化を表す図である。
【図６ｂ】本発明のタンパク質であるＲＮＦ１３５−ＤＮをＭＤＡ５と共発現させたＨＥＫ２９３細胞の抽出液における、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターによって転写されるルシフェラーゼ活性の変化を表す図である。
【図６ｃ】本発明のタンパク質であるＲＮＦ１３５−ＤＮをＴＬＲ３と共発現させたＨＥＫ２９３細胞の抽出液における、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターによって転写されるルシフェラーゼ活性の変化を表す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、及び／又は配列番号１に示されるアミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を促進又は抑制する活性を有するタンパク質からなるＩ−ＩＦＮの発現調節剤に関する。以下、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をＲＮＦ１３５と表すことにする。【００２２】
ＲＮＦ１３５は、全４３２個のアミノ酸からなるタンパク質であり、後の実施例に示すように、酵母ｔｗｏ ｈｙｂｒｉｄ法によって検出された既知のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇ、ＮＭ＿０３２３２２）にコードされ、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を促進する活性を有するタンパク質である。【００２３】
ＲＮＦ１３５のＮ末端部分の２１番目〜６２番目のアミノ酸残基には、ユビキチンリガーゼ活性を示すことが知られているＲＩＮＧドメイン（Ｌｏｒｉｃｋら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第２８巻、第９６号、第１１３６４−１１３６９頁）と呼ばれるドメイン構造が含まれている。驚くべきことに、ＲＮＦ１３５のＮ末端部分にあるＲＩＮＧドメイン構造あるいはユビキチンリガーゼ活性を失ったタンパク質は、ＲＮＦ１３５とは逆に、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を抑制する活性を示すことが、本発明者らによって確認された。すなわち、本発明は、ＲＮＦ１３５のＮ末端から２１番目〜６２番目の何れかのアミノ酸残基までが欠失したアミノ酸配列、ＲＮＦ１３５のアミノ酸配列の２１番目〜６２番目の領域において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を抑制する活性を示すタンパク質も提供する。以下、この様なＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を抑制する活性を示す本発明のタンパク質を、ＲＮＦ１３５−ＤＮ（ＤＮはＤｏｍｉｎａｎｔ Ｎｅｇａｔｉｖｅの略である）と表すこととする。【００２４】
本発明にいうＲＩＧ−Ｉタンパク質とは、非特許文献２に記載されている細胞内ＰＲＲの一種のタンパク質であり、そのアミノ酸配列としては配列番号５に示すものが知られている。なお、ＳＮＩＰＳ等の影響によって配列番号５で示されるアミノ酸配列と一部がわずかに異なるアミノ酸配列からなるＲＩＧ−Ｉタンパク質もあり得るが、その様な配列番号５で示されるアミノ酸配列とは一部異なるアミノ酸配列からなるＲＩＧ−Ｉタンパク質であっても、細胞内ＰＲＲとしてＩ−ＩＦＮの発現誘導に関与しているタンパク質であれば、本発明にいうＲＩＧ−Ｉタンパク質として理解される。【００２５】
また、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターとは、ヒトの細胞、特にリンパ球や繊維芽細胞の染色体上でＩ−ＩＦＮの発現を調節しているプロモーターであり、その塩基配列はＦｕｇｉｔａらの論文（Ｃｅｌｌ、１９８５年、第４１巻、第２号、第４８９−４９６頁）において報告されている。ただし、前記図１に示されるような発現制御機構の中でＩ−ＩＦＮの発現誘導を調節しているプロモーターであれば、前記Ｆｕｇｉｔａらの論文において報告されている塩基配列の一部が異なっていてもよい。なお、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターは既にクローニングされ、例えば市販ベクターＰｉｃａＧｅｎｅ Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（東洋インキ社）の様に、適当なベクターに組み換えられて利用されている。【００２６】
本発明で使用されるタンパク質は、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を制御する活性を有する。本発明における「Ｉ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を制御する活性」とは、当該プロモーターの下流に位置する遺伝子、特にＩ−ＩＦＮの当該プロモーターによって誘導される転写を促進させる、あるいは抑制する活性をいう。【００２７】
本発明で使用されるタンパク質のＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を制御する活性の測定は、Ｉ−ＩＦＮを発現する細胞、例えばＨｅＬａ細胞を、前記のＲＩＧ−Ｉタンパク質を発現することのできる発現ベクターと本発明のタンパク質を発現することのできるベクターによって形質転換し、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と本発明のタンパク質を形質転換細胞内で発現させ、Ｉ−ＩＦＮの産生をＩ−ＩＦＮをコードするｍＲＮＡ量の測定あるいはＩ−ＩＦＮの活性を測定することで確認することができる。また、プロモーターを含むＩ−ＩＦＮ遺伝子を組み込んだＩ−ＩＦＮ発現ベクターで形質転換させた細胞を、ＲＩＧ−Ｉタンパク質を発現することのできる発現ベクターと本発明のタンパク質を発現することのできるベクターによってさらに形質転換し、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と本発明のタンパク質を形質転換細胞内で発現させてもよい。また、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターの下流に適当なマーカー遺伝子を組み込み、このマーカー遺伝子の発現を指標にして、本発明で使用されるタンパク質の活性を測定することもできる。【００２８】
なお、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と結合してＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を制御する活性を有する限り、ＲＮＦ１３５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質の使用も、本発明の一態様である。本発明におけるアミノ酸配列の置換、欠失、及び／又は付加に関する「１若しくは数個」とは、１〜数十アミノ酸以内、好ましくは１〜７０個、より好ましくは１〜５０個、更に好ましくは１〜３０個、特に好ましくは１〜１５個のアミノ酸残基の変化を意味する。アミノ酸配列の同一性（％）で表せば、配列番号１で示されるアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列として表すことができる。【００２９】
タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の電荷、大きさ、疎水性等の物理化学的性質について、保存性の高い変異が許容され得ることが、経験的に認められている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等が挙げられる。また、上述の保存性を超えた場合でも、なおそのタンパク質の本質的な機能を失わない変異が存在し得ることも当業者において経験されるところである。従って、配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と結合してＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を制御する活性を有する場合もあり、これらの使用は本発明の一態様として理解される。【００３０】
前記したＲＮＦ１３５−ＤＮは、ＲＮＦ１３５のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加したアミノ酸配列からなるタンパク質であって、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と結合してＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を制御する活性、具体的にはＲＩＧ−Ｉタンパク質と結合してＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を抑制する活性を有するタンパク質の例である。また、ＲＮＦ１３５−ＤＮにおいて、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と結合してＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を抑制する活性を有する限り、ＲＮＦ１３５−ＤＮのアミノ酸配列において、上記のような意味において、さらに１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／又は付加されていてもよい。【００３１】
本発明で使用されるタンパク質は、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、本発明のタンパク質以外の機能性タンパク質又はポリペプチドを付加させた、いわゆる融合タンパク質として製造し、又利用してもよい。この様な融合タンパク質も、本発明の一態様である。【００３２】
かかる融合タンパク質は、機能性タンパク質が示す機能が付加される点で、本発明で使用されるタンパク質を単独で製造し、あるいは使用する場合に比べて、高められた有用性を有する。機能性タンパク質の例としては、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、プロテインＡ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼその他の、融合蛋白質の製造に汎用されるタンパク質を挙げることができる。また、核移行シグナル配列などの機能性ポリペプチドを付加させることにより、細胞内でＲＮＦ１３５を効率的に核内に移行させ、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターによるＩ−ＩＦＮの転写をより効果的に促進させることができる。また、ＦＬＡＧタグ、ヒスチジンタグ又はキチン結合配列のように、組み換えタンパク質の製造、特に組み換えタンパク質の精製を容易にする機能性ポリペプチドを利用すれば、本発明のタンパク質の製造をより有利に行うことができる。【００３３】
さらに、本発明で使用されるタンパク質には、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な標識化合物を付加したり、種々の化学修飾物質やポリエチレングリコール等の高分子を結合させたりすることが可能であり、あるいは本発明で使用されるタンパク質を不溶性担体へ結合させたりすることも可能である。こうしたタンパク質を対象とした化学的修飾法は当業者に広く知られており、本発明で使用されるタンパク質の機能を損なわない限り、どの様に修飾し、利用してもよい。【００３４】
本発明は、ＲＮＦ１３５−ＤＮをコードする核酸を提供する。核酸はＲＮＡ又はＤＮＡを含み、その形態としてはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。また本発明の核酸は１本鎖であっても、それに相補的な配列を有する核酸やＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該核酸は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。【００３５】
本発明の好ましい核酸はＤＮＡであり、ＲＮＦ１３６のＮ末端の２〜６９番目までのアミノ酸が欠失したタンパク質（ＲＮＦ１３５−ＤＮ）をコードするＤＮＡの塩基配列の例が、配列番号４に示される塩基配列である。また、配列番号４に示される塩基配列と相補する塩基配列からなる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ本発明のタンパク質をコードする核酸も本発明の核酸に含まれる。本発明におけるストリンジェントな条件とは、塩濃度１．５Ｍを含む６５℃の緩衝液中で配列番号４に相補的な塩基配列からなる核酸にハイブリダイズし、５０℃の２×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）でＤＮＡを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でハイブリダイズが維持される条件を言う。また、塩基配列の同一性（％）で示せば、配列番号４の塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸であればよい。【００３６】
配列番号４に示される塩基配列からなる核酸は、ＲＮＦ１３５のアミノ酸配列（配列番号１）をコードするＤＮＡ、具体的には配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡを基に、ＰＣＲその他の一般的な遺伝子工学的手法によって調製することができる。また配列番号４に示される塩基配列からなる核酸は、当該塩基配列情報を基に、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法により、あるは市販のＤＮＡシンセサイザー等を用いて製造することもできる。【００３７】
また、配列番号２に示される塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列を基に、ヒトゲノムのｃＤＮＡに対して一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いてクローニングすることができる。本発明の核酸をｃＤＮＡライブラリーから得る例としては、ヒトゲノムｃＤＮＡライブラリーに対して、配列番号２に示された塩基配列又はそれらに相補する塩基配列からなるＤＮＡをプローブとしたハイブリダイゼーションによるスクリーニング、又は本発明のタンパク質に対する特異抗体を用いたイムノスクリーニング法を行い、目的の核酸を有するクローンを増幅させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。【００３８】
ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号２に示された塩基配列又はそれらに相補する塩基配列からなる核酸を３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２年）に従って行うことができる。また、イムノスクリーニング法で用いる抗体は、前記した本発明のタンパク質に対する特異抗体を使用して行うことができる。【００３９】
配列番号２に示される塩基配列からなる核酸は、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。例えば、配列番号２示される塩基配列情報を基にＰＣＲプライマーを設計、合成し、ｃＤＮＡライブラリーに対して公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）に従ってＰＣＲ反応を行うことで、配列番号２に示される塩基配列からなる核酸を得る事ができる。上記の方法で使用するｃＤＮＡライブラリーとしては、好ましくはヒト肺由来のｃＤＮＡライブラリーであれば、いかなるものも使用可能である。また配列番号２に示される塩基配列からなる核酸は、本明細書に開示された塩基配列情報を基に、ホスホアミダイト法などの化学合成的手法により、あるは市販のＤＮＡシンセサイザー等を用いて製造することもできる。【００４０】
本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸であるＤＮＡは、適当な発現ベクターに組み込むことができ、かかるベクターは前記した本発明で使用されるタンパク質の組換え的生産に利用される。あるいは、本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸は、遺伝子治療用ベクターに組み換えて生体内で発現させることを特徴とする遺伝子治療にも利用することができる。この様なタンパク質の生産用の組み換えベクターや、遺伝子治療用ベクターも本発明に含まれる。【００４１】
本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸を有する組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列とは、エンハンサー配列、プロモーター配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。【００４２】
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸に付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させたりあるいは消失させたりすることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、当業者は本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸を基に任意かつ容易に加工することができる。【００４３】
また本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸を保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であるが、遺伝子治療用に開発されたウイルスベクターの利用が特に好ましい。【００４４】
利用可能な市販の発現ベクターとしては、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ（フナコシ社製）、ｐｃＤＮＡＩ／ＡｍＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＥＧＦＰ-Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＢＴ−９(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製)、等を例示することができる。本発明で使用されるタンパク質の発現は、該タンパク質をコードする遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。あるいは、本発明で使用されるタンパク質をコードする塩基配列の上流に別の適当な発現プロモーターを連結して使用することもできる。その様な発現プロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等を挙げることができる。本発明で使用されるタンパク質をコードする核酸、好ましくはＤＮＡを上記に例示されたプロモーターに連結する、あるいは発現ベクターに組み込む等の操作は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）を初めとする、種々の遺伝子組み換え操作を詳細に解説した実験操作マニュアル書の指示に基づいて行うことができる。【００４５】
本発明で使用されるタンパク質は、例えばＦｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)やｔＢｏｃ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の、有機化学的合成方法、あるいは市販されている適当なペプチド合成機を用いて製造することもできるが、遺伝子組換え技術によって、前記の核酸、特に発現ベクターに組み込まれたＤＮＡを原核生物もしくは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた好適な発現系に導入することによって製造することが好ましい。【００４６】
宿主細胞の例としては、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、エルウニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属細菌、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属細菌、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属微生物、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母等の微生物、カイコなどの昆虫細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＭＥＦ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ１２７細胞、ＨＫＧ細胞、ヒト腎細胞株等の動物細胞を挙げることができる。【００４７】
宿主細胞に発現ベクターを導入する方法としては、前記のＳａｍｂｒｏｏｋらを初めとする実験操作マニュアル書に記載されている方法、例えば、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法等により行うことができる。Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞の利用については、バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２年）やＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８８年、第６巻、第４７頁等に記載されている。【００４８】
本発明で使用されるタンパク質は、前記の発現ベクターを上記の宿主細胞内で発現させ、宿主細胞或いは培地から目的とするタンパク質を回収し、精製することによって得ることができる。タンパク質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。【００４９】
また、本発明で使用されるタンパク質を他の機能性タンパク質やポリペプチドとの融合タンパク質として発現させた場合には、その機能性タンパク質やポリペプチドに特徴的な精製法を採用することが好ましい。融合タンパク質は、適当なプロテアーゼ（トロンビン、トリプシン等）を用いて切断し、本発明のタンパク質を回収することができる。【００５０】
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（前出のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら）で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。【００５１】
この様に本発明で使用されるタンパク質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本発明で使用されるタンパク質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合、リポソームへの封入など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。【００５２】
また、本発明で使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を挙げることができるが、特にモノクローナル抗体が好ましい。かかる抗体は、本発明で使用されるタンパク質を抗原として用いた通常の操作により、非ヒト動物を免疫し、血清を回収して、あるいはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を誘導して製造することができる。また、定法に従って、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）やテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質、放射性同位元素、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼ等の酵素タンパク質で標識してもよい。【００５３】
本発明で使用されるタンパク質は、前記の通り、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を促進し、又は抑制する活性を有する。例えばＲＮＦ１３５はＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を促進し、またＲＮＦ１３５−ＤＮはＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を抑制する。従って、これらのタンパク質の何れかを生体に投与するあるいは生体内でこれらのタンパク質の遺伝子を発現させることによって、生体におけるＩ−ＩＦＮの発現を促進あるいは抑制することが可能である。Ｉ−ＩＦＮ発現の促進は、生体に対するウイルスや微生物等による感染症の抑制を可能とすることから、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ型インターフェロンのプロモーターによる転写を促進する活性を有するタンパク質は、Ｉ−ＩＦＮの発現調節剤として利用することができ、当該発現調節剤はウイルスや微生物等に対する感染症治療薬として利用することができる。【００５４】
また、Ｉ−ＩＦＮ発現の抑制は、過剰な炎症反応の抑制を可能とすることから、ＲＩＧ−Ｉタンパク質の存在下でＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写を抑制する活性を有する本発明のタンパク質、例えばＲＮＦ１３５−ＤＮは、Ｉ−ＩＦＮの発現調節剤として利用することができ、当該発現調節剤は抗炎症剤として利用することができる。【００５５】
本発明の発現調節剤、感染症治療薬、炎症治療薬は、本発明で使用されるタンパク質単体であってもよく、また薬学的に許容される担体、例えば水、塩類溶液、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたはこれらの組合せや、賦形剤、特にタンパク質を有効成分とする医薬で用いられる乳化剤、防腐剤、緩衝剤などと混合した医薬組成物の形態にあってもよい。医薬組成物の形態は投与形態および治療の適用例により異なってよく、液剤（溶液、分散液、懸濁液、リポソーム製剤など）、錠剤や座剤等の固形剤などの剤型を採り得るが、好ましい剤型は注射可能な、あるいは経口投与が可能な液剤である。投与経路としては、皮下注射、静脈注射、輸液、あるいは経口投与である。なお、投与量は、患者、疾患の程度、必要とされる薬効に応じて、適宜設定すればよい。【００５６】
さらに、例えばＲＮＦ１３５とＲＩＧ−Ｉタンパク質を存在させることによってＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写が促進された状況下で、この促進された転写を逆に抑制するあるいはさらに促進させる活性を有する化合物をスクリーニングすれば、そのような化合物はＩ−ＩＦＮの発現を促進する薬物あるいは抑制する薬物として利用し得るものと期待される。本発明は、かかるスクリーニング方法も提供する。具体的には、Ｉ−ＩＦＮを発現する細胞、例えばＨｅＬａ細胞を、ＲＩＧ−Ｉタンパク質を発現することのできる発現ベクターと本発明で使用されるタンパク質を発現することのできるベクターによって形質転換し、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と本発明のタンパク質を形質転換細胞内で発現させた形質転換細胞と試験化合物とをインキュベートし、Ｉ−ＩＦＮの産生をＩ−ＩＦＮをコードするｍＲＮＡ量の測定あるいはＩ−ＩＦＮの活性を測定すればよい。また、プロモーターを含むＩ−ＩＦＮ遺伝子を組み込んだＩ−ＩＦＮ発現ベクターで形質転換させた細胞を、ＲＩＧ−Ｉタンパク質を発現することのできる発現ベクターと本発明のタンパク質を発現することのできるベクターによってさらに形質転換し、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と本発明のタンパク質を形質転換細胞内で発現させた形質転換細胞を用いてもよい。また、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターの下流に適当なマーカー遺伝子を組み込み、このマーカー遺伝子の発現を指標にしてもよい。【００５７】
[実施例]
以下、非限定的な実施例により本発明を更に詳しく説明する。
【実施例１】
【００５８】
（１）ＲＮＦ１３５遺伝子のクローニング
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社の酵母ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム「Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ ｓｙｓｔｅｍ ３」（登録商標）に添付された製造者の指示書に従い、ヒトＲＩＧ−Ｉタンパク質を用いてＣｌｏｎｔｅｃｈ社のヒト肺ライブラリーをスクリーニングした。その結果、約２ｋｂｐのｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ１）が単離された。このｃＤＮＡ１の塩基配列を決定したところ、ｃＤＮＡ１に含まれているもっとも大きなＯＲＦは、終止Ｐコドンを含むが、その５’末端側に開始コドン（ＡＴＧ）が存在しなかった。このｃＤＮＡ１の塩基配列を基に相同性検索を行い、対応するＥＳＴクローンとしてＮＭ＿０３２３２２が検索された。このＥＳＴに含まれるＯＲＦの５’末端側の塩基配列を含むｃＤＮＡを取得するために、下記の塩基配列からなるＤＮＡプライマーを合成し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のヒト肺ライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行った。【００５９】
フォワードプライマー１：GCCTCGAGGCCACCATGGCGGGCCTGGGCCTGGG
リバースプライマー  ２：CGGCCAGGTCCTGCAGTAGC
得られた約３００ｂｐの増幅断片（ｃＤＮＡ２）の塩基配列を決定し、開始コドンの位置を決定した。ｃＤＮＡ２の開始コドンからｃＤＮＡ１の終止コドンまでを含む完全長のＯＲＦを含むＤＮＡを、下記の塩基配列からなるＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡ１とｃＤＮＡ２を鋳型としてＰＣＲを行って調製した。【００６０】
フォワードプライマー３：GCCTCGAGGCCACCATGGCGGGCCTGGGCCTGGG
リバースプライマー  ４：GGGGATCCCACCTTTACTTGCTTTATTATCAGG
得られた約１．３ｋｂｐの増幅断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込み、塩基配列を決定して、目的とするＤＮＡ、すなわちＲＮＦ１３５をコードするＤＮＡがクローニングされていることを確認した。このＤＮＡの塩基配列を配列番号２に示す。【００６１】
（２）ＲＮＦ１３５発現ベクターの作製
（１）でｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター上にクローニングされたＲＮＦ１３５の全長をコードするＤＮＡを鋳型とし、下記の一組のプライマーＤＮＡとＰｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社）とを用いて、ＰＣＲを行った。【００６２】
フォワードプライマー５：GCCTCGAGGCCACCATGGCGGGCCTGGGCCTGGG
リバースプライマー６  ：GGGGATCCCACCTTTACTTGCTTTATTATCAGG
得られた約・１．２ｋｂｐの増幅断片を制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで処理した。ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９９０年、第１８巻、第１７号、第５３２２頁）にマルチクローニングサイトを挿入し、さらに組み換えタンパク質にＨＡタグが付加されるようにＨＡタグをコードする塩基配列を付加したプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで開環させ、これに制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで処理した前記増幅断片を連結して、ＲＮＦ１３５発現ベクターｐＨＯ７０３を作製した。この発現ベクターｐＨＯ７０３に組み込まれたＲＮＦ１３５をコードするＤＮＡは、ＥＦ−１ａｌｐｈａプロモーターによってその発現が誘導される。【００６３】
（３）ＲＮＦ１３５によるＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写の促進活性の測定
２４ウェルプレートに培養したＨＥＫ２９３細胞（２×１０５細胞／ウェル）に、ＲＩＧ−Ｉタンパク質発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ／ＦＬＡＧ−ＲＩＧ−Ｉ（Ｙｏｎｅｙａｍａら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００４年、第５巻、第７号、第７３０−７３７頁）と、（２）で作製したＲＮＦ１３５発現ベクターｐＨＯ７０３と、Ｉ−ＩＦＮのプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結されたプラスミドであるｐ１２５ｌｕｃ（Ｆｕｇｉｔａら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１９８８年、第７巻、第１１号、第３３９７−３４０５頁）、さらに内部コントロールとしてｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）をＦｕＧｅｎｅ ＨＤ（Ｒｏｃｈ社）を用いて、リポフェクション法によって共形質転換を行った。  各プラスミドを加えて２４時間培養した後の培養上清を取り除き、ｐｏｌｙＩＣ（５０ｕｇ／ｍｌ)とＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ を含む培地を２．５ｍL加えた。さらに３７℃で１時間培養した後に再び培養上清を除き、ｐｏｌｙＩＣとＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎを含まない培地を加え、３時間さらに培養した。その後、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞抽出液を調製し、抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果を図２に示す。【００６４】
その結果、ＲＮＦ１３５をＲＩＧ−Ｉタンパク質と共存させたＨＥＫ２９３細胞の抽出液におけるルシフェラーゼ活性は、コントロール細胞におけるルシフェラーゼ活性に比べて約５倍の値を示した。【００６５】
（４）ＲＩＧ−Ｉタンパク質とＲＮＦ１３５の結合
前記ＲＩＧ−Ｉタンパク質発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ／ＦＬＡＧ−ＲＩＧ−Ｉを用いて、リポフェクション法によって形質転換したＨＥＫ２９３細胞、及び前記ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＦＬＡＧ−ＲＩＧ−Ｉと上記（２）で作製したＲＮＦ１３５発現ベクターｐＨＯ７０３とを用いて、リポフェクション法によって共形質転換したＨＥＫ２９３細胞をそれぞれ調製し、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地で２４時間培養後、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞抽出液を調製し、ＨＡに対するポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社）を用いて免疫沈降を行った。得られた沈降サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた後、ＨＡに対するポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社）及びＦＬＡＧに対するモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社）それぞれを用いて、ＲＩＧ−Ｉタンパク質とＲＮＦ１３５を検出した。その結果を図３に示す。図中、ＩＰは免疫沈降産物を、ＷＣＥは全細胞抽出液を示す。【００６６】
図３に示されるように、ＲＩＧ−Ｉタンパク質は、同一細胞内でＲＮＦ１３５を共発現させると、ＲＮＦ１３５に含まれるＨＡに対するポリクローナル抗体によってＲＮＦ１３５と共に免疫沈降し、従ってＲＮＦ１３５はＲＩＧ−Ｉタンパク質に結合していることが確認された。【００６７】
（５）ＲＮＦ１３５の局在性
前記ＲＩＧ−Ｉタンパク質発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ／ＦＬＡＧ−ＲＩＧ−Ｉと上記（２）で作製したＲＮＦ１３５発現ベクターｐＨＯ７０３とを用いて、リポフェクション法によってＨｅＬａ細胞を形質転換した。１０％ＦＣＳを含むＥａｇｌｅ−ＭＥＭ培地で２４時間培養後、細胞を３%ホルマリンで固定し、１×ＰＢＳで３回洗浄した後、５００分の１に希釈したＨＡに対するポリクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ社）及びＦＬＡＧに対するモノクローナル抗体を加えて１時間室温で反応させた。【００６８】
反応液を除いた後、ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８及び、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）を用い、室温で３０分反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、スライドガラスにマウントし、共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｗｉｓｓ社）を用いて蛋白質の局在を観察した。その結果を図４に示す。図中、緑はＲＮＦ１３５, 赤はＲＩＧ−Ｉタンパク質をそれぞれ示す。【００６９】
図４のマージに示されるように、緑色で示されるＲＮＦ１３５の局在と、赤色で示されるＲＩＧ−Ｉタンパク質の局在は、これらをマージさせるとほぼ一致することから、ＲＮＦ１３５とＲＩＧ−Ｉタンパク質は細胞内においても同じ部位に局在していることが確認された。【００７０】
（６）ＲＮＦ１３５によるウイルス抵抗性実験の方法詳細
前記ＲＩＧ−Ｉタンパク質発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ／ＦＬＡＧ−ＲＩＧ−Ｉで形質転換したＨＥＫ２９３細胞、上記（２）で作製したＲＮＦ１３５発現ベクターｐＨＯ７０３で形質転換したＨＥＫ２９３細胞、及びこれら２種類の発現ベクターで共形質転換したＨＥＫ２９３細胞をそれぞれ用意し、２４ウェルプレートで２４時間培養した後、図に示すＭＯＩになるように水泡性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＶＳＶ）を加えた。形質転換から２４時間後、細胞上清を除き、１０分の１希釈したＮｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄを２５μＬ加え細胞を染色した後、写真で撮影した。その結果を図５に示す。【００７１】
図５に示されるように、ＲＮＦ１３５はＲＩＧ−Ｉタンパク質によるＶＳＶ感染に対する抵抗性を促進させた。
【実施例２】
【００７２】
（１）ＲＮＦ１３５−ＤＮ発現ベクターの作製
実施例１で作成したＲＮＦ１３５発現ベクターｐＨＯ７０３を鋳型とし、下記の一組のプライマーＤＮＡとＰｙｒｏｂｅｓｔ（Ｔａｋａｒａ社）とを用いて、ＰＣＲを行った。【００７３】
フォワードプライマー７：GCTCGAGGCCACCATGCCGCACCTGCGGAAGAACACGC
リバースプライマー８  ：GGGGATCCCACCTTTACTTGCTTTATTATCAGG
得られた約１ｋｂｐの増幅断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した後、制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで処理して、挿入断片を切り出した。ｐＥＦ−ＢＯＳにマルチクローニングサイトを挿入し、さらに組み換えタンパク質にＨＡタグが付加されるようにＨＡタグをコードする塩基配列を付加したプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで開環させ、これに制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで処理した前記挿入断片を連結して、ＲＮＦ１３５−ＤＮ発現ベクターｐＨＯ７０１を作製した。この発現ベクターに組み込まれたＲＮＦ１３５−ＤＮをコードするＤＮＡは、ＥＦ１−ａｌｐｈａプロモーターによってその発現が誘導される。【００７４】
（２）ＲＮＦ１３５−ＤＮによるＩ−ＩＦＮのプロモーターによる転写の抑制活性の測定
２４ウェルプレートに培養したＨＥＫ２９３細胞（２×１０５細胞／ウェル）に、前記ＲＩＧ−Ｉタンパク質発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ／ＦＬＡＧ−ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ／ＦＬＡＧ−ＭＤＡ５（Ｙｏｎｅｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００５年、第１７５巻、第５号、第２８５１−２８５８頁）、ＴＬＲ３発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ／ＦＬＡＧ（Ｏｓｈｉｕｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００３年、第４巻、第２号、第１６１−１６７頁）それぞれとＩ−ＩＦＮのプロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子が連結されたプラスミドであるｐ１２５ｌｕｃと共に加えてリポフェクション法によって共形質転換を行った。さらに、前記のＲＩＧ−Ｉタンパク質発現ベクター、ＭＤＡ５発現ベクター、ＴＬＲ３発現ベクターそれぞれと、（１）で作製したＲＮＦ１３５−ＤＮ発現ベクターｐＨＯ７０１と、ｐ１２５ｌｕｃとを共に加えてリポフェクション法によって共形質転換を行った。また、ＲＮＦ１３５−ＤＮ発現ベクターに換えてｐｈＲＬ−ＴＫを用いて同様に共形質転換させたＨＥＫ２９３細胞を、コントロール細胞として用意した。【００７５】
各プラスミドを加えて２４時間培養した後、前記ＲＩＧ−Ｉタンパク質発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳ／ＦＬＡＧ−ＲＩＧ−ＩとＭＤＡ５発現ベクターで形質転換したＨＥＫ２９３細胞の培養上清を取り除き、ｐｏｌｙＩＣ（５０ｕｇ／ｍｌ)とＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎ を含む培地を２．５ｍL加えた。さらに３７℃で１時間培養した後に再び培養上清を除き、ｐｏｌｙＩＣとＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎを含まない培地を加え、３時間さらに培養した。その後、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞抽出液を調製し、抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。また、ＴＬＲ３発現ベクターで形質転換したＨＥＫ２９３細胞については、細胞上清を除いたあと、ｐｏｌｙＩＣを５０ μｇ／ｍＬ含む１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を加え、６時間後にＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞抽出液を調製し、抽出液中のルシフェラーゼ活性を測定した。この結果を図６ａ−図６ｃに示す。【００７６】
図６ａ−６ｃに示されるように、ＲＮＦ１３５−ＤＮは、ＲＩＧ−Ｉタンパク質と共存させることによって、ＲＩＧ−Ｉタンパク質単独を発現させたときのルシフェラーゼ活性を約１／５にまで抑制することが確認された。
【図１】
2009001555.tif 000002
【図２】
2009001555.tif 000003
【図３】
2009001555.tif 000004
【図４】
2009001555.tif 000005
【図５】
2009001555.tif 000006
【図６ａ】
2009001555.tif 000007
【図６ｂ】
2009001555.tif 000008
【図６ｃ】
2009001555.tif 000009
【配列表】
2009001555000001.app
【国際調査報告】
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2009001555.tif 000011
2009001555.tif 000012
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