(57)【要約】  ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジンＦ２α若しくはケトン体又はその類似物を輸送する能力を有する、腎臓特異的な発現を示す、ケトアシドーシス治療のための薬剤を開発するためのリサーチツールとして有用なヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの新規な有機アニオントランスポーター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジンＦ２α若しくはケトン体又はその類似物を輸送する能力を有する、ヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの有機アニオントランスポーター。
【請求項２】
配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、腎臓特異的な発現を示す、ヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの有機アニオントランスポーター。
【請求項３】
配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジンＦ２α若しくはケトン体又はその類似物を輸送する能力を有する、腎臓特異的な発現を示す、ヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの有機アニオントランスポーター。
【請求項４】
前記トランスポーターが、腎臓皮質及び腎臓髄質外層に発現を示す、請求項１〜３のいずれか一項記載のトランスポーター。
【請求項５】
前記トランスポーターが、近位尿細管細胞の管腔側膜に特異的に発現を示す、請求項１〜４のいずれか一項記載のトランスポーター。
【請求項６】
パラアミノ馬尿酸、エストロン硫酸、ｃＡＭＰ、ジカルボン酸、テトラエチルアンモニウム、コリン又はカルニチンの輸送を示さない、請求項１〜５のいずれか一項記載のトランスポーター。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターをコードするヒト又はマウスＤＮＡ、或いは当該ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズしかつ当該トランスポーターと同じ能力及び／又は発現部位を示すトランスポーターをコードするヒト又はマウスＤＮＡ。
【請求項８】
配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列からなる、請求項７記載のＤＮＡ。
【請求項９】
請求項７又は８記載のＤＮＡが組み込まれた安定発現細胞、或いは請求項７又は８記載のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡと相補的なｃＲＮＡが導入された一過性発現細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体。
【請求項１１】
請求項1〜６のいずれか一項記載のトランスポーターを用いる工程を含む、当該トランスポーターの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
請求項1〜６のいずれか一項記載のトランスポーター又は請求項９記載の細胞を含む、当該トランスポーターの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング用キット。
【請求項１３】
４−フェニルブチル酸、２，４−ジクロロフェニルオキシ酢酸、３−フェニルプロピオン酸又はこれらに類似する物質を含有する、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターの活性阻害剤。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターの抗体医薬品又はアプタマーである、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターの活性阻害剤。
【請求項１５】
ケトン体排泄促進のための、請求項１３又は１４記載の活性阻害剤。
【請求項１６】
ケトアシドーシス治療又は改善のための、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の活性阻害剤。
【請求項１７】
糖尿病又は薬剤の副作用に起因したケトアシドーシスである、請求項１６記載の活性阻害剤。
【請求項１８】
尿中の、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーター又は請求項７若しくは８記載のＤＮＡを分析する工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターに関連した疾患の有無及び／又は重篤度を判断する診断方法。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターに関連した疾患の有無及び／又は重篤度を判断する診断キット。
【請求項２０】
体液中の、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーター又は請求項７若しくは８記載のＤＮＡを分析する工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターの遺伝子異常を判断する診断方法。
【請求項２１】
全エクソンの情報を知り得るプライマーを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のトランスポーターの遺伝子異常を判断する診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓におけるケトン体及びその類似物質の輸送に関する新規な有機イオントランスポーター（膜輸送体）タンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法及びキット、該スクリーニング方法で得られるケトアシドーシス治療・改善剤などを提供する。
【背景技術】
【０００２】
ケトアシドーシスは、糖尿病患者において、ブドウ糖の利用を促進するホルモンであるインシュリンの絶対的欠乏がもたらす病態である。１型ＤＭ患者の発症時やＩＤＤＭ患者がインスリン注射を中断したときに生じ易い。インスリンが絶対的な不足状態に陥ると、肝臓や筋肉といった組織が血液中のブドウ糖を取り込めなくなるため、細胞内の脂肪等を強制的に代謝させるが、この際の代謝過程で、β−ヒドロキシ酪酸を主とするケトン体が生成する。この酸性物質であるケトン体が、アシドーシス（血液が酸性に傾いた状態）をもたらす。ここで、ヒトの体液はｐＨ７．４であり、ｐＨ７．０以下になると生命に危険が及ぶが、当該ケトン体が増加してケトアシドーシスが進行すると、体液がｐＨ７．０以下になって死亡するケースもある。尚、このケトアシドーシスは、糖尿病のみならず薬剤の副作用に基づいても生じ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ここで、ケトアシドーシスの治療は輸液がメインである。また、動脈血ｐＨが７．０を下回る高度のアシドーシスでは、重炭酸塩を投与する。しかしながら、輸液を用いる治療は患者にとっては面倒であるし、重炭酸塩を用いた場合には、深刻なケースでは塩水過剰になって、二酸化炭素レベルの急激な上昇により、電解質アンバランス、意識の鈍化、昏睡又は死に至ることがある。これを踏まえ、新たな治療手段として、特許文献１では、β−ラクトン系アルキレンカルボン酸を有効成分とする糖尿病性ケトアシドーシス治療剤が提案されている。【０００４】
本発明は、β−ラクトン系アルキレンカルボン酸よりも優れた、ケトアシドーシス治療のための薬剤を開発するためのリサーチツールを提供することを主目的とし、当該リサーチツールを用いての具体的薬剤を提供することを副次的目的とする。
【特許文献１】特開平２−１０４５２３号公報
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、前記課題を解決するに際し、ＳＬＣ２２有機イオントランスポーターファミリー（以下、「ＳＬＣ２２ファミリー」という）にまず着目した。ここで、ＳＬＣ２２ファミリーは、多くの腎尿細管薬物トランスポーターを包含し、有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）、有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）及び有機カチオン／カルニチントランスポーター（ＯＣＴＮ）の三つのサブファミリーが存在することが知られている。【０００６】
このような状況下、本発明者は、ＯＡＴについて研究を進めていたところ、従来知られていた各種有機アニオントランスポーターとは異なる性質を有する新たな有機アニオントランスポーター（ＯＡＴの新たなサブファミリー）が存在することを見出し、本発明を完成させたものである。【０００７】
具体的には、本発明に係るヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの有機アニオントランスポーターは、配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジンＦ２α若しくはケトン体又はその類似物を輸送する能力を有する、腎臓特異的な発現を示すタンパク質である。また、本発明に係るヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの有機アニオントランスポーターをコードするＤＮＡは、配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列である。【０００８】
ここで、当該新規ＯＡＴは、他のグループとは相同性の低いことをゲノムデータベースの検索結果からまず確認した。【０００９】
次に、当該新規ＯＡＴについて、ＲＩ標識化合物の取り込み測定での機能解析とともに、生体内での機能を明らかにする目的で遺伝子ノックアウトマウスを作製し、さらにアロキサン投与により糖尿病マウスを作成しその尿中ケトン体濃度の検討による生理機能の検討を行ったところ、ＳＬＣ２２に属する既知の、有機カチオントランスポーター（ＯＣＴ）、有機アニオントランスポーター（ＯＡＴ）、両性イオントランスポーター（ＯＣＴＮ）の輸送基質とは異なる選択性を示すことを確認した。【００１０】
更に、in  vitro発現系での機能解析のために、新規ＯＡＴのマウスｃＤＮＡをマウス近位尿細管由来株Ｓ２細胞に導入して安定発現細胞を樹立した。これを用いて、様々な有機アニオン、有機カチオンの放射能標識化合物の取り込み実験を行ったところ、ニコチン酸、プロスタグランジンＦ2α、サリチル酸などの有機アニオンに対して顕著な輸送活性を示した。一方、ＯＡＴファミリーの代表的な輸送基質である有機アニオン（パラアミノ馬尿酸、エストロン硫酸、ｃＡＭＰ、ジカルボン酸）、ＯＣＴファミリーの代表的な輸送基質である有機カチオン（テトラエチルアンモニウム、コリン）、ＯＣＴＮファミリーの代表的な輸送基質である両極性有機イオン（カルニチン）の有意な輸送は示さなかった。以上のように既知のＳＬＣ２２ファミリーのトランスポーターとは異なる基質選択性を示し、構造上も新たなサブファミリーに属することから、この遺伝子産物をnovel type organic anion transporter 1（ＯＡＴＮ１）と名付けた。【００１１】
更に、ノーザンブロットにおいてＯＡＴＮ１は腎特異的な発現を示し、in situハイブリダイゼーションでは近位尿細管への発現が明らかとなった。さらにマウス腎臓を用いた免疫組織化学的検討により、ＯＡＴＮ１が近位尿細管管腔側膜に限局して存在することが示された。【００１２】
ＯＡＴＮ１は、腎近位尿細管の管腔側膜に存在し、腎近位尿細管でのβ-ヒドロキシ酪酸をはじめとするケトン体の再吸収を担当するトランスポーターである。ＯＡＴＮ１の抑制薬は、腎近位尿細管からのケトン体の再吸収を抑制し、ケトン体排泄薬としての機能を発揮すると想定される。そこで、Ｓ２細胞にマウスＯＡＴＮ１を発現させた安定発現細胞において、ＯＡＴＮ１の基質であるニコチン酸の取り込みに対する各種化合物の抑制効果を検討し、ＯＡＴＮ１の阻害剤を探索した。その結果、２，４−ジクロロフェニルオキシ酢酸、３−フェニルプロピオン酸、４−フェニルブタン酸又はこれらに類似する物質を含有する化合物が、大きな抑制効果を示した。【００１３】
これらのトランスポーター活性阻害剤は、ＯＡＴＮ１のインヒビターとして生体内で作用し、ケトンの排泄を促進することができる。すなわち、ケトン体が過剰になり体内のｐＨの低下が原因となるケトアシドーシスの治療又は改善のための医薬として用いることができる。糖尿病、飢餓状態又は薬剤の副作用によって起因するケトアシドーシス向けの医薬としても応用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明（１）は、配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジンＦ２α若しくはケトン体又はその類似物を輸送する能力を有する、ヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの有機アニオントランスポーターである。ここで、「タンパク質のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加」は、選択物質の輸送活性が失われない程度であればよく、通常１〜約１１０個、好ましくは１〜約５５個である。このようなタンパク質は、配列番号１又は２で示されたアミノ酸配列と通常、１〜８０％、好ましくは１〜９０％のアミノ酸配列の相同性を有する。また、「ケトン体」とは、β−ヒドロキシ酪酸、アセト酢酸及びアセトンを意味する総称である（主にβ−ヒドロキシ酪酸）。更に、「類似物」とは、本明細書の実施例７に従い試験を行った結果、有意に輸送が確認された物質を指す。また、「有機アニオントランスポーター」及び「ＯＡＴ」とは、従来の狭義のＯＡＴを意味するのではなく、有機アニオンのトランスポーターであることを意味する広義のＯＡＴである。【００１５】
本発明（２）は、配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、腎臓特異的な発現を示す、ヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの有機アニオントランスポーターである。【００１６】
本発明（３）は、配列番号１又は配列番号２で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジンＦ２α若しくはケトン体又はその類似物を輸送する能力を有する、腎臓特異的な発現を示す、ヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの有機アニオントランスポーターである。【００１７】
本発明（４）は、前記トランスポーターが、腎臓皮質及び腎臓髄質外層に発現を示す、前記発明（１）〜（３）のいずれか一つのトランスポーターである。【００１８】
本発明（５）は、前記トランスポーターが、近位尿細管細胞の管腔側膜に特異的に発現を示す、前記発明（１）〜（４）のいずれか一つのトランスポーターである。【００１９】
本発明（６）は、パラアミノ馬尿酸、エストロン硫酸、ｃＡＭＰ、ジカルボン酸、テトラエチルアンモニウム、コリン又はカルニチンの輸送を示さない、前記発明（１）〜（５）のいずれか一つのトランスポーターである。ここで、「輸送を示さない」とは、本明細書の実施例７に従い輸送活性を測定した場合、Ｍｏｃｋとの差が２倍未満であることを指す。【００２０】
本発明（７）は、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターをコードするヒト又はマウスＤＮＡ、或いは当該ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズしかつ当該トランスポーターと同じ能力及び／又は発現部位を示すトランスポーターをコードするヒト又はマウスＤＮＡである。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズ」とは、通常、ハイブリダイゼーションを、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、３７〜４２℃の温度条件下、約１２時間行い、５ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、１ｘＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。【００２１】
本発明（８）は、配列番号３又は配列番号４で表される塩基配列からなる、前記発明（７）のＤＮＡである。【００２２】
本発明（９）は、前記発明（７）又は（８）のＤＮＡが組み込まれた安定発現細胞、或いは前記発明（７）又は（８）のＤＮＡ若しくは当該ＤＮＡと相補的なｃＲＮＡが導入された一過性発現細胞である。【００２３】
本発明（１０）は、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。ここで、当該抗体は、医薬（抗体医薬）やアッセイ（検出用抗体）等として使用され得る。【００２４】
本発明（１１）は、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターを用いる工程を含む、当該トランスポーターの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法である。ここで、「トランスポーターを用いる」は、当該トランスポーターを細胞に発現させて活性促進／阻害物質をスクリーニングする等の直接的使用のみならず、当該トランスポーターの立体構造解析に基づき活性促進／阻害物質をスクリーニングする（インシリコ解析）等の間接的使用をも包含する。【００２５】
本発明（１２）は、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーター又は前記発明（９）の細胞を含む、当該トランスポーターの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング用キットである。尚、キットの他の構成パーツは、特に限定されないが、例えば、培地、取り込み標準物質（ＲＩ標識物質）、取り込み実験用各種塩類緩衝液、可溶化剤、シンチレーター、２４穴プレート、バイアル瓶を挙げることができる。【００２６】
本発明（１３）は、４−フェニルブチル酸、２，４−ジクロロフェニルオキシ酢酸、３−フェニルプロピオン酸又はこれらに類似する物質を含有する、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターの活性阻害剤である。ここで、「類似する物質」とは、少なくとも、スルフィンピラゾン、フェニルブタゾン、ベンズブロマゾン、バルプロ酸、ブタン酸、吉草酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、カプリル酸、ノナン酸、デカン酸などの同様の作用を奏する化合物を含むものとする。【００２７】
本発明（１４）は、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターの抗体医薬品又はアプタマーである、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターの活性阻害剤である。【００２８】
本発明（１５）は、ケトン体排泄促進のための、前記発明（１３）又は（１４）の活性阻害剤である。【００２９】
本発明（１６）は、ケトアシドーシス治療又は改善のための、前記発明（１３）〜（１５）のいずれか一つの活性阻害剤である。【００３０】
本発明（１７）は、糖尿病又は薬剤の副作用に起因したケトアシドーシスである、前記発明（１６）の活性阻害剤である。【００３１】
本発明（１８）は、尿中の、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーター又は前記発明（７）若しくは（８）のＤＮＡを分析する工程を含む、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターに関連した疾患の有無及び／又は重篤度を判断する診断方法である。【００３２】
本発明（１９）は、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターに関連した疾患の有無及び／又は重篤度を判断する診断キットである。【００３３】
本発明（２０）は、体液中の、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーター又は前記発明（７）若しくは（８）のＤＮＡを分析する工程を含む、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターの遺伝子異常を判断する診断方法である。【００３４】
本発明（２１）は、全エクソンの情報を知り得るプライマーを含む、前記発明（１）〜（６）のいずれか一つのトランスポーターの遺伝子異常を判断する診断キットである。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例をもって本説明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。なお、下記実施例において、各操作は特に断りがない限り、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，  Ｆｒｉｔｓｈ，  Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  著、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊」に記載の方法により行うか、又は、市販のキットを用いる場合には市販品の取扱説明書に従って使用した。【００３６】
実施例１（ＯＡＴＮ１の分子クローニングと解析） 
ヒトＯＡＴ１の翻訳領域の塩基配列を用いたＮＣＢＩのゲノムデータベース解析により、有機イオントランスポーターファミリー（ＳＬＣ２２）に属する新しいアイソフォーム（ＯＡＴＮ１）を見出した（マウスＯＡＴＮ１ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：  ＮＭ＿１３３９８０．１、ヒトＯＡＴＮ１ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．：  ＮＭ＿００４２５６．１[ＧｅｎＢａｎｋＴＭ／ＥＢＩ／ＤＤＢＪ]）。このデータベースの配列を参考に、ＰＣＲのためのプライマーをデザインし、マウス及びヒトの腎臓から抽出したｍＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。ここで、プライマーの配列は以下の通りである。
マウス
Ｆｗ：  ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＡＧＣ  ＡＧＡ  Ｃ
ＲＶ：  ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  Ｃ
ヒト
ＦＷ：  ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＴＡ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＡ  Ｃ
ＲＶ：  ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＡ  ＧＣＣ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  Ｇ
ＲＴ−ＰＣＲ→ｃＤＮＡの増幅により、目的とするｃＤＮＡをｍＲＮＡをｔｅｍｐｌａｔｅとして取得し（ＯＡＴＮ１の分子クローニング）、それをプラスミドベクターに取り込み、後の解析が可能な形とした。プラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）に組み込んだＯＡＴＮ１ｃＤＮＡは、安定発現細胞の作製、ＤＮＡシーケンシングによる配列決定、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションやノーザンブロット用のプローブ作製に使用される。
尚、上記において、ｐｃＤＮＡ３．１のマルチクローニングサイトであるＢａｍＨＩ及びＸｂａＩサイトにＰＣＲ産物を導入した。また、ｔｅｍｐｌaｔｅ塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシークエンス法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により、ｃＤＮＡの全長の塩基配列を決定した（図１及び図２）。また、ｃＤＮＡの塩基配列を常法により解析して、ｃＤＮＡの翻訳領域とそこにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定した（図３及び図４）。【００３７】
実施例２｛マウスの種々の組織におけるＯＡＴＮ１遺伝子の発現（ノーザンブロッティングによる解析）｝
マウスＯＡＴＮ１の遺伝子の第１６９１−１９５１番目の塩基に相当するｃＤＮＡ断片を３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルし、これをプローブとして用いて、マウスの種々の組織から抽出したＴｏｔａｌ  ＲＮＡを電気泳動・ブロッティングしたナイロンメンブレンに対して、ノーザンハイブリダイゼーションを以下のようにして行った。メンブレンを58度で３２Ｐ−ｄＣＴＰでラベルしたＯＡＴＮ１ｃＤＮＡ断片を含んだハイブリダイゼーション液（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｈｙｂｒｉ，  Ｔａｋａｒａ）で一晩ハイブリダイゼーションを行った。メンブレンを、６５度にて、０．１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣで洗浄した。これをイメージングプレートにラジオオートグラフィーし、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  Ｆｉｌｍ）にて検出した（図５）。その結果、当該ＯＡＴＮ１遺伝子が腎臓特異的な発現を示すことが確認された。【００３８】
実施例３｛腎臓組織におけるＯＡＴＮ１遺伝子発現（Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる解析）｝
マウスの腎臓を４％パラホルムアルデヒドで灌流することにより固定した後、これを細切し、４％  パラホルムアルデヒドでさらに固定した。得られたマウス腎臓を５μｍの厚さに薄切し、得られた切片を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いた。全長のＯＡＴＮ１  ｃＤＮＡから、Ｔ７若しくはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いてセンスｃＲＮＡとアンチセンスｃＲＮＡを合成し、プローブとして用いた。切片をハイブリダイゼーション液で一晩プローブでハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣで３０分、３７℃にて洗浄した。発色は酵素法にて行った。その結果、マウス腎臓では、ＯＡＴＮ１  ｍＲＮＡは、腎臓の皮質と髄質外層外帯に発現が認められた（図６）。【００３９】
実施例４（マウスＯＡＴＮ１及びヒトＯＡＴＮ１のＮ末抗体の作製）
マウスＯＡＴＮ１の細胞内Ｎ末端領域のマウス：第５−１６番目（ＡＱＶＭＡＥＶＧＤＦＧＲ）、ヒト：第２−１６番目（ＡＱＦＶＱＶＬＡＥＩＧＤＦＧＲ）のアミノ酸をペプチド合成し、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）にコンジュゲートさせ、アジュバンドと混和後、ウサギに免疫した。最初に免疫してから一月後に２度目、さらに二週間後に３度目の免疫を行い、血清を採取し、これをＯＡＴＮ１抗血清とした。抗血清を、抗原を用いたアフィニティーカラムにて精製を行い、アフィニティー抗体を得た。【００４０】
実施例５（抗ＯＡＴＮ１抗体を用いた腎臓における免疫組織染色）
Ｃ５７ＢＬブラックマウスにｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ：２０ｍＭ リン酸、１４０ｍＭ  塩化ナトリウム、ｐＨ  ７．４）を還流し、続いて４％パラホルムアルデヒド溶液を還流し、その後、腎臓を摘出した。４％パラホルムアルデヒド溶液に摘出した腎臓を浸し、２時間固定した。ＯＣＴ  ｃｏｍｐｏｕｎｄを用いて包埋し、凍結切片を作製した（５  μｍ）。マウスＯＡＴＮ１のＮ末を抗原として得られた抗体（実施例４で製造したマウスＯＡＴＮ１）を５００倍に希釈し、腎臓切片と反応させ、続いてパーオキシダーゼが結合した二次抗体（Ｅｎｖｉｓｏｎ／ＨＲＰ，  ＤＡＫＯ）を反応させ、ＤＡＢ（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）発色を行った。結果、マウス腎臓では、ＯＡＴＮ１は、腎臓の近位尿細管の管腔側膜に局在していることが確認された（図７）。【００４１】
実施例６（Ｓ２−ＯＡＴＮ１安定発現細胞の作製）
近位尿細管由来の細胞株であるＳ２細胞に、ｐｃＤＮＡ３．１−ＯＡＴＮ１をリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてトランスフェクションし、４００  ｍｇ／ｍｌのｇｅｎｅｔｉｃｉｎにて約一ヶ月間セレクションをかけて、ＯＡＴＮ１の安定発現細胞を作製した。培養条件は以下の通りである。
培養槽：３３度、５％CO２
培養液： RITC 80-7 medium containing 5% fetal bovine serum, 10mg/ml transferring, 0.08 U/ml insulin, 10ng/ml recombinant epidermal growth factor, and 400mg/ml geneticin.【００４２】
実施例７（マウスＯＡＴＮ１の輸送活性の測定）
Ｓ２細胞を２４穴の培養細胞用のプレートに１ x ５１０ 細胞／ｗｅｌｌになるようにまき、２日間培養後、Dulbecco’s modified phosphate-buffered saline (Ｄ−ＰＢＳ：  １３７ｍＭ  ＮａＣｌ，  ３ｍＭ  ＫＣｌ，  ８ｍＭ  ＮａＨＰＯ４，  １ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，  １ｍＭ  ＣａＣｌ２  ａｎｄ  ０．５ＭｇＣｌ２；  ｐＨ７．４)で細胞を洗浄し、１０分間Ｄ−ＰＢＳでプレインキュベーションした。各々のＲＩ標識化合物を含んだ取り込み溶液中にてインキュベートし、アップテイク後速やかに４度に冷やしたＤ−ＰＢＳにて洗浄、取り込みを止めた。０．１Ｍの水酸化ナトリウムにて細胞を懸濁し、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ−３１００；  Ａｌｏｋａ）にて測定を行った。この結果、図８及び図９に示すように、ＯＡＴＮ１を発現させたＳ２−ＯＡＴＮ１安定発現細胞は、ケトン体の主成分であるβ―ヒドロキシ酪酸（１４Ｃ標識）、ニコチン酸（３Ｈ標識）、プロスタグランジンＦ２α（３Ｈ標識）、サリチル酸（１４Ｃ標識）の当該細胞への取り込みを示すことが判明した。一方、有機アニオントランスポーターの取り込み基質であるパラアミノ馬尿酸（１４Ｃ標識）、エストロン硫酸（１４Ｃ標識）、α―ケトグルタル酸（１４Ｃ標識）、尿酸（１４Ｃ標識）、タウロコール酸（１４Ｃ標識）、オクラトキシンＡ（３Ｈ標識）、有機カチオントランスポーターの取り込み基質であるテトラエチルアンモニウム（１４Ｃ標識）、有機両性イオントランスポーターの取り込み基質であるカルチニン（３Ｈ標識）の取り込みを示さなかった（図１０）。尚、図１１に、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ2）によるβ-ヒドロキシ酪酸の濃度依存的な取り込みを調べた結果を示す。【００４３】
実施例８（ＯＡＴＮ１の阻害物質のスクリーニング）
実施例７と同様の方法に従い、３Ｈ−ニコチン酸１μＭに非ＲＩ化合物１００μＭと取り込み溶液中に混ぜることで、輸送阻害実験を実施した。その結果、２，４−ジクロロフェニルオキシ酢酸、３−フェニルプロピオン酸、４−フェニルブタン酸、ジクロロフェナク、３から９の炭素数からなるアルキル置換基を有するカルボン酸等のアニオン性物質の添加で、ニコチン酸の取り込み効果の阻害が確認された（図１２〜図１７）。【００４４】
実施例９（ＯＡＴＮ１ノックアウトマウスの作製）
マウスＯＡＴＮ１遺伝子の第一エキソン及びそのプロモーター領域と予想される第一エキソン以前のイントロン部分に、ターゲティングベクターを用いた相同組換えによりネオマイシン遺伝子を挿入することで、ＯＡＴＮ１遺伝子の発現調節部位及びファーストメチオニンを含むＮ末端翻訳領域を破壊した。【００４５】
実施例１０（糖尿病モデルマウスにおける尿中のβ−ヒドロキシ酪酸濃度の比較）
糖尿病を惹起することが知られているアロキサン（１００mg/kg）を尾静脈から投与することで糖尿病マウスを作成した。尿糖の確認は試験紙を用いて行った。糖尿病になった野生型マウス及びＯＡＴＮ１ノックアウトマウスから、アロキサン投与後４日目の尿を採取し、尿中のβ−ヒドロキシ酪酸濃度を、試験紙を用いた定性的検討及び生化学的手法を用いた定量的検討にて測定した。その結果を図１８に示す。ここで、図１８（１）は、尿中ケトン体定性反応試験の結果であり、上が野生型マウス、下がＯＡＴＮ１ノックアウトマウス、左がアロキサン投与糖尿病群、右が生食投与群を示している。当該図から分かるように、ＯＡＴＮ１ノックアウトマウスのアロキサン投与糖尿病群のみが、発色（紫色）する結果となった。尚、図中、生食投与群が黒く見えるのは、紫色に発色しているのではなく黄色が濃く写っているためである。次に、図１８（２）は、尿中β−ヒドロキシ酪酸の定量結果である。当該図から分かるように、野生型マウスではβ−ヒドロキシ酪酸は検出されなかったのに対し、ＯＡＴＮ１ノックアウトマウスでは大量のβ−ヒドロキシ酪酸が検出された。また、図１９は、アロキサン投与後における、尿中の全ケトン排泄量の経時変化を示した図である。当該図から分かるように、野生型マウスと比較すると、ＯＡＴＮ１ノックアウトマウスの全ケトン体排泄量は非常に大きい値を示した。尚、本明細書における「全ケトン体」は、ケトン基に反応する化学反応を用いた周知の試験法で測定した。【００４６】
実施例１１（尿中ケトン体排泄促進確認試験）
ＯＡＴＮ１のインヒビターのうち、４−フェニルブチル酸、２,４−ジクロロフェニルオキシ酢酸、３−フェニルプロピオン酸を腹腔内投与し、尿中ケトン体排泄への影響を検討した。オス８週の野生型マウスにアロキサンを１００  ｍｇ／ｋｇ  ｂｗ（２％アロキサン、０．０５  ｍｌ／１０ｇ  ｂｗ）尾静脈から投与し、静脈内投与４日後、ＯＡＴＮ１インヒビター(上記)を腹腔内投与し、投与後３０分、６０分、９０分、１８０分に尿を採取し、尿中ケトン体濃度を測定した。各インヒビター投与前（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（−））と投与後（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（＋））の尿中ケトン体濃度を比較した。４−フェニルブチル酸、２，４−ジクロロフェニルオキシ酢酸、３−フェニルプロピオン酸ともに、有意に尿中ケトン体排泄を上昇させた（図２０）。さらに、４−フェニルブチル酸による尿中ケトン体濃度上昇の時間依存性を測定したところ、４−フェニルブチル酸の投与により速やかに尿中のケトン体排泄量の上昇が観測された（図２１）。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、マウスＯＡＴＮ１の塩基配列を示した図である。
【図２】図２は、ヒトＯＡＴＮ１の塩基配列を示した図である。
【図３】図３は、マウスＯＡＴＮ１のアミノ酸配列を示した図である。
【図４】図４は、ヒトＯＡＴＮ１のアミノ酸配列を示した図である。
【図５】図５は、マウスの各臓器組織におけるＯＡＴＮ１遺伝子ｍＲＮＡの発現をノーザンブロッティングにより解析した結果を示した図である。調べた臓器の中で、腎臓にのみ強く発現していることが示された。
【図６】図６は、マウス腎臓切片を用いたＯＡＴＮ１のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果を示した図である。皮質部分と髄質外層外帯に強いシグナルが確認された。
【図７】図７は、マウス腎臓切片における抗ＯＡＴＮ１抗体を用いた免疫組織染色の結果を示した図である。近位尿細管の管腔側膜に局在していることが確認された。
【図８】図８は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ２−ＯＡＴＮ１）によるβ−ヒドロキシ酪酸の取り込み実験の結果を示した図である。マウスＯＡＴＮ１によるβ−ヒドロキシ酪酸の有意な輸送活性が確認された。
【図９】図９は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ２−ＯＡＴＮ１）によるβ−ヒドロキシ酪酸以外の取り込みの見られた化合物の取り込み実験の結果を示した図である。ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジンＦ２αの有意な輸送活性が確認された。
【図１０】図１０は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ２−ＯＡＴＮ１）による取りこみの見られなかったＳＬＣ２２ファミリーの代表基質の取りこみ実験の結果を示した図である。有機イオントランスポーターの代表基質であるパラアミノ馬尿酸、エストロン硫酸、α−ケトグルタル酸、尿酸、オクラトキシンＡ、タウロコール酸、有機カチオントランスポーターの代表基質であるテトラエチルアンモニウム、有機カチオン／両極性イオントランスポーターの代表基質であるカルニチンのＯＡＴＮ１による輸送活性は確認されなかった。
【図１１】図１１は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ2−ＯＡＴＮ１）によるβ-ヒドロキシ酪酸の濃度依存的な取り込みを調べた結果を示した図である。横にはEadie-Hofsteeプロットの結果を示す。
【図１２】図１２は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ２−ＯＡＴＮ１）によるニコチン酸取りこみ実験において、系への各種有機アニオン添加の影響を調べた結果を示した図である。
【図１３】図１３は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ２−ＯＡＴＮ１）によるニコチン酸取りこみ実験において、系への各種利尿薬添加の影響を調べた結果を示した図である。
【図１４】図１４は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ２−ＯＡＴＮ１）によるニコチン酸取りこみ実験において、系への様々な有機アニオン添加の影響を調べた結果を示した図である。
【図１５】図１５は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ２−ＯＡＴＮ１）によるニコチン酸取りこみ実験において、系への短鎖脂肪酸添加の影響を調べた結果を示した図である。
【図１６】図１６は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ２−ＯＡＴＮ１）によるニコチン酸取りこみ実験において、系への神経伝達物質の代謝産物添加の影響を調べた結果を示した図である。
【図１７】図１７は、マウスＯＡＴＮ１の安定発現細胞（Ｓ２−ＯＡＴＮ１）によるニコチン酸取りこみ実験の総括的な結果を示した図である（図１２〜図１６に不掲載の一部化合物のデータも掲載）。
【図１８】図１８は、糖尿病になった野生型マウス及びＯＡＴＮ１ノックアウトマウスにおける、尿中のβ―ヒドロキシ酪酸濃度を示した図である。
【図１９】図１９は、アロキサン投与後における、尿中の全ケトン排泄量の経時変化を示した図である。
【図２０】図２０は、ＯＡＴＮ１インヒビター処理をした後の、糖尿病ＷＴマウスにおける尿中の全ケトン体濃度を示した図である。
【図２１】図２１は、４−フェニルブチル酸（ＰＢＡ）処理をした後の、尿中の全ケトン体濃度の時間依存を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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