(57)【要約】ＲＡＮＫＬ単独よりも破骨細胞を分化・活性化させる作用が向上し、さらに保存安定性が向上したＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を含む試薬の提供。  可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグペプチドの融合タンパク質を有効成分として含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでの破骨細胞分化・活性化剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質であって、可溶型ＲＡＮＫＬの有する破骨細胞分化・活性化作用が向上した融合タンパク質を有効成分として含む破骨細胞分化・活性化剤。
【請求項２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いるための、請求項１記載の破骨細胞分化・活性化剤。
【請求項３】
ｉｎ  ｖｉｖｏで用いるための、請求項１記載の破骨細胞分化・活性化剤。
【請求項４】
保存安定性が向上した請求項１〜３のいずれか１項に記載の破骨細胞分化・活性化剤。
【請求項５】
動物種間交差性を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の破骨細胞分化・活性化剤。
【請求項６】
可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質であって、可溶型ＲＡＮＫＬの有する破骨細胞分化・活性化作用が向上した融合タンパク質を有効成分として含む動物の骨量減少化剤。
【請求項７】
動物種間交差性を有する請求項５記載の動物の骨量減少化剤。
【請求項８】
可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質であって、可溶型ＲＡＮＫＬの有する破骨細胞分化・活性化作用が向上した融合タンパク質を有効成分として含む骨量減少症モデル動物作製剤。
【請求項９】
動物種間交差性を有する請求項８記載の骨量減少症モデル動物作製剤。
【請求項１０】
エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである請求項１〜５のいずれか１項に記載の破骨細胞分化・活性化剤。
【請求項１１】
エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである請求項６または７に記載の動物の骨量減少化剤。
【請求項１２】
エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである請求項８または９に記載の骨量減少症モデル動物作製剤。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の破骨細胞分化・活性化剤の存在下で、動物から採取した骨髄細胞、脾細胞又は末梢血細胞を培養することを含む、骨髄細胞、脾細胞又は末梢血細胞から破骨細胞を分化形成させる方法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の破骨細胞分化・活性化剤を非ヒト動物に投与することを含む該非ヒト動物の骨量を減少させる方法。
【請求項１５】
可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質であって、可溶型ＲＡＮＫＬの有するリンパ球分化、樹状細胞活性化、乳腺上皮細胞分化及びリンパ節形成能からなる群の少なくともひとつの機能が向上した融合タンパク質を有効成分として含む、リンパ球分化剤、樹状細胞活性化剤、乳腺上皮細胞分化剤及びリンパ節形成剤からなる群から選択される組成物。
【請求項１６】
動物種間交差性を有する請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである請求項１５または１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞を分化・活性化し得る可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を含む試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨破壊を司る破骨細胞は単球・マクロファージ系の造血細胞に由来する大型の多核細胞である。その前駆細胞は骨表面において骨芽細胞／間質細胞による調節を受け破骨細胞へと分化・成熟する。破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ；ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）は、骨吸収因子によって骨芽細胞／間質細胞上に誘導される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーに属する膜結合タンパク質で、破骨細胞分化・成熟に必須の因子である（非特許文献１及び２を参照）。ＲＡＮＫＬの一部は細胞外領域でメタロプロテアーゼにより切断されて、可溶型になることが知られている。実際に可溶型ＲＡＮＫＬはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭ−ＣＳＦとの共存下でマクロファージ系の前駆細胞から破骨細胞を誘導することが知られている。しかし、市販のものも含め、可溶型ＲＡＮＫＬの生物活性は決して強いとは言えず、骨髄細胞、脾細胞、末梢血中の前駆細胞、あるいはマクロファージ細胞株などを用いた細胞培養で破骨細胞を形成させても、多数の巨大な破骨細胞が容易に得られるわけではなかった。
一方、組み換えタンパク質の産生量を上げたり、精製を容易にするため、あるいはタグとして様々なタンパク質やペプチドなどが用いられてきた。これらはグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）（非特許文献３を参照）、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）／チオレオドキシン（ＴＲＸ）（特許文献１及び２並びに非特許文献４及び５を参照）、フラッグタグ（ＦＬＡＧ）（特許文献３及び４を参照）、Ｍｙｃタグ（非特許文献６を参照）、Ｖ５タグ（非特許文献７を参照）、Ｘｐｒｅｓｓタグ、免疫グロブリン  Ｆｃ領域などを含む。これらのタンパク質やペプチドなどは、上記の目的のために用いられてきたが、融合されるタンパク質の活性を高める目的には用いられてはこなかった。
【特許文献１】米国特許第５２７０１８１号明細書
【特許文献２】米国特許第５２９２６４６号明細書
【特許文献３】特許第１９８３１５０号公報
【特許文献４】特許第２６６５３５９号公報
【非特許文献１】Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：３５９７，１９９８
【非特許文献２】Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ  ９３：１６５，１９９８
【非特許文献３】ＫａｅｌｉｎらＣｅｌｌ  ７０：３５１，１９９２
【非特許文献４】Ｌａ  ＶａｌｌｉｅらＢｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１８７，１９９３
【非特許文献５】ＬｕらＪ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：５０５９，１９９６
【非特許文献６】ＥｖａｎｓらＭｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５，３６１０，１９８５
【非特許文献７】ＳｏｕｔｈｅｒｎらＪ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ７２，１５５１，１９９１
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ＲＡＮＫＬ単独よりも破骨細胞を分化・活性化させる作用が向上したＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を含む試薬の提供を目的とする。
本発明者等は、可溶型ＲＡＮＫＬを、タグとして用いられる様々なタンパク質やペプチドなどと融合させることにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける可溶型ＲＡＮＫＬの活性が強化されることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質であって、可溶型ＲＡＮＫＬの有する破骨細胞分化・活性化作用が向上した融合タンパク質を有効成分として含む破骨細胞分化・活性化剤。
［２］  ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いるための、［１］の破骨細胞分化・活性化剤。
［３］  ｉｎ  ｖｉｖｏで用いるための、［１］の破骨細胞分化・活性化剤。
［４］  保存安定性が向上した［１］〜［３］のいずれかの破骨細胞分化・活性化剤。
［５］  動物種間交差性を有する［１］〜［４］のいずれかの破骨細胞分化・活性化剤。
［６］  可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質であって、可溶型ＲＡＮＫＬの有する破骨細胞分化・活性化作用が向上した融合タンパク質を有効成分として含む動物の骨量減少化剤。
［７］  動物種間交差性を有する［５］の動物の骨量減少化剤。
［８］  可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質であって、可溶型ＲＡＮＫＬの有する破骨細胞分化・活性化作用が向上した融合タンパク質を有効成分として含む骨量減少症モデル動物作製剤。
［９］  動物種間交差性を有する［８］の骨量減少症モデル動物作製剤。
［１０］  エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである［１］〜［５］のいずれかの破骨細胞分化・活性化剤。
［１１］  エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである［６］または［７］の動物の骨量減少化剤。
［１２］  エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである［８］または［９］の骨量減少症モデル動物作製剤。
［１３］  ［１］〜［５］のいずれかの破骨細胞分化・活性化剤の存在下で、動物から採取した骨髄細胞、脾細胞又は末梢血細胞を培養することを含む、骨髄細胞、脾細胞又は末梢血細胞から破骨細胞を分化形成させる方法。
［１４］  ［１］〜［５］のいずれかの破骨細胞分化・活性化剤を非ヒト動物に投与することを含む該非ヒト動物の骨量を減少させる方法。
［１５］  可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質であって、可溶型ＲＡＮＫＬの有するリンパ球分化、樹状細胞活性化、乳腺上皮細胞分化及びリンパ節形成能からなる群の少なくともひとつの機能が向上した融合タンパク質を有効成分として含む、リンパ球分化剤、樹状細胞活性化剤、乳腺上皮細胞分化剤及びリンパ節形成剤からなる群から選択される組成物。
［１６］  動物種間交差性を有する［１５］の組成物。
［１７］  エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである［１５］または［１６］の組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−２７８０５２号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質による破骨細胞分化形成を示す写真である。
図２は、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質による破骨細胞分化形成をＴＲＡＰ活性（吸光度）により示す図である。
図３は、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質による破骨細胞の延命効果及び活性化効果を示す図である。
図４は、マウスに可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与した場合の血中カルシウム濃度の変動を示す図である。
図５は、マウスに可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与した場合の血中ＣＴｘ濃度の変動を示す図である。
図６は、マウスに可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与した場合の血中ＴＲＡＰ−５ｂ濃度の変動を示す図である。
図７は、マウスに可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与した場合の血中ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ濃度の変動を示す図である。
図８は、マウスに可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与した場合の血中ＡＬＰ濃度の変動を示す図である。
図９は、マウスに可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与した場合の大腿骨骨密度の変動を示す図である。
図１０Ａは、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質による破骨細胞分化活性をＴＲＡＰ活性（吸光度）により示す図である。
図１０Ｂは、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質による破骨細胞分化形成を示す写真である。
図１１は、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の保存安定性を示す図である。図１１Ａは保存前の破骨細胞分化活性をＴＲＡＰ活性（吸光度）により示し、図１１Ｂは２ヶ月保存後の破骨細胞分化活性をＴＲＡＰ活性（吸光度）により示す。
図１２は、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の交差性を示す図である。ＲＡＮＫＬ１はマウス可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）、ＲＡＮＫＬ２はマウス可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｒ＆Ｄ社製）を示す。
図１３は、可溶型ＲＡＮＫＬとＧＳＴ−ＲＡＮＫＬによる破骨細胞形成を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の破骨細胞分化・活性化剤、動物の骨量減少化剤及び骨量減少症モデル動物作製剤は、有効成分として可溶型ＲＡＮＫＬ（ｓＲＡＮＫＬ）とエピトープタグの融合タンパク質を有効成分として含む。
ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであるＲＡＮＫ（ＮＦ−κＢの受容体アクティベーター）のリガンドであり、細胞内ドメイン（ＲＡＮＫのＮ末端から第１番目から４８番目のアミノ酸からなるドメイン）、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する２型貫通タンパク質である（特表２００２−５０９４３０号公報、国際公開第ＷＯ９８／４６６４４号パンフレット（特許第３５２３６５０号公報））。細胞外ドメイン中、Ｎ末端から第１５２番目以降のアミノ酸からなるドメインは、ＴＮＦリガンドファミリー相同性ドメインである。可溶型ＲＡＮＫＬは、細胞内ドメインを含まない
可溶型ＲＡＮＫＬには、可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体及び可溶型ＲＡＮＫＬアナログが含まれる。可溶型ＲＡＮＫＬの由来動物種は限定されず、ヒト由来ＲＡＮＫＬ、マウス由来ＲＡＮＫＬ、ラット由来ＲＡＮＫＬ等あらゆる動物種由来のＲＡＮＫＬを用いることができる。ヒト由来のＲＡＮＫＬの全長塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体又は可溶型ＲＡＮＫＬアナログは、ＲＡＮＫＬのトランケート体等、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列の一部配列からなるタンパク質であって、ＲＡＮＫＬの活性を有するタンパク質を含む。可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体は、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列において、第１５２番目のアミノ酸から始まるＴＮＦリガンドファミリー相同ドメインを含む。可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体として、例えば、第１２７番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、第１４０番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は第１５９番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。また、ヒト以外の動物種由来のＲＡＮＫＬであって、上記のヒトＲＡＮＫＬの部分アミノ酸配列に対応する部分のアミノ酸配列からなるＲＡＮＫＬ誘導体も含まれる。さらに、可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体又は可溶型ＲＡＮＫＬアナログは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＲＡＮＫＬの活性を有するタンパク質、あるいは上記のＲＡＮＫＬのアミノ酸配列の部分配列からなるタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＲＡＮＫＬの活性を有するタンパク質を含む。ここで、１又は数個とは１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個である。
可溶型ＲＡＮＫＬと共に融合タンパク質を形成させるエピトープタグとして、抗体等の特定の化合物と結合し得る配列を有するタンパク質又はペプチドが挙げられる。通常、エピトープタグは、融合タンパク質の精製のために用いられるが、本発明においては、エピトープタグは可溶型ＲＡＮＫＬの活性を高めるという機能を有している。また、エピトープタグは可溶型ＲＡＮＫＬの溶液中での及び凍結保存中の保存安定性を高めるという機能を有している。
エピトープタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、２〜１２個、好ましくは４個以上、さらに好ましくは４〜７個、さらに好ましくは５個若しくは６個のヒスチジンからなるポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ（アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号３）、Ｍｙｃタグ（アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号４）、Ｖ５タグ（アミノ酸配列ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ；配列番号５）、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＨＱタグ（アミノ酸配列ＨＱＨＱＨＱ；配列番号６）、ＨＡタグ（アミノ酸配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号７）、ＡＵ１タグ（アミノ酸配列ＤＴＹＲＹＩ；配列番号８）、Ｔ７タグ（アミノ酸配列ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ；配列番号９）、ＶＳＶ−Ｇタグ（アミノ酸配列ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ；配列番号１０）、ＤＤＤＤＫタグ（アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ；配列番号１１）、Ｓタグ（アミノ酸配列ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＩＤＳＣ；配列番号１２）、ＣｒｕｚＴａｇ０９（アミノ酸配列ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ；配列番号１３）、ＣｒｕｚＴａｇ２２（アミノ酸配列ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ；配列番号１４）、ＣｒｕｚＴａｇ４１（アミノ酸配列ＭＫＤＧＥＥＹＳＲＡＦＲ；配列番号１５）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ（アミノ酸配列ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ；配列番号１６）、Ｈａ．１１タグ（アミノ酸配列ＣＴＰＴＤＶＰＤＹＡＳＬ；配列番号１７）、ＫＴ３タグ（アミノ酸配列ＰＰＥＰＥＴ；配列番号１８）、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、免疫グロブリンＦｃ領域、βガラクトシダーゼ等があるが、ここに列挙されたものには限定されない。この中でも、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが好ましい。
可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を得るには両者のそれぞれをコードする遺伝子を連結し、発現させればよい。ＲＡＮＫＬをコードする遺伝子及びエピトープタグをコードする遺伝子の融合は、通常の遺伝子組換えの手法により行うことができる。この際、適当な制限部位を導入して行うことができる。この際、融合する遺伝子の間にストップコドンが現れないようにする。融合する遺伝子の間の距離は限定されず、両者の間にリンカーが含まれていてもよい。また、２つの遺伝子のオープンリーディングフレームを合わせるようにする。上記エピトープタグは、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列のＮ末端側に融合させてもよいし、Ｃ末端側に融合させてもよい。
配列番号１９及び２０に、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列中第１２７番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にＧＳＴが融合したタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号２１及び２２に、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列中第１４０番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にＧＳＴが融合したタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。また、配列番号２３及び２４に、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列中第１５９番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にＧＳＴが融合したタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。
このようにして作製した融合遺伝子を入手可能な適当な発現ベクターに組み込んで、発現させ、目的の融合タンパク質を回収、精製することができる。また、この際無細胞系（セルフリーシステム）で発現させることもできる。
ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。また、あらかじめグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等のエピトープタグをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いることもできる。
ＤＮＡのベクターへの導入は、公知の方法で行うことができる。ベクターは、種々の制限部位をその内部に持つポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限部位を含んでいることが望ましい。ベクター中の特定の制限部位を特定の制限酵素で切断し、その切断部位にＤＮＡを挿入することができる。融合遺伝子を含む発現ベクターを適切な宿主細胞の形質転換に用いて、宿主細胞に前記融合遺伝子がコードする融合タンパク質を発現、産生させることができる。
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、真菌細胞、パン酵母、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション等の公知の方法で行うことができる。
得られたリコンビナント融合タンパク質は、各種の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。この際、発現産物がＧＳＴ等との融合タンパク質として発現される場合は、目的タンパク質と融合しているタンパク質またはペプチドの性質を利用して精製することもできる。例えばＧＳＴとの融合タンパク質として発現させた場合、ＧＳＴはグルタチオンに対して親和性を有するので、グルタチオンを担体に結合させたカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に精製することができる。また、ヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現させた場合、ヒスチジンタグを有するタンパク質はキレートカラムに結合するので、キレートカラムを用いて精製することができる。さらに、いずれのエピトープタグを用いた場合も、そのエピトープタグが有するエピトープを認識する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
本発明の可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグとの融合タンパク質はｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、可溶型ＲＡＮＫＬの活性を強化することができる。ここで可溶型ＲＡＮＫＬの活性とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいては、骨髄細胞、脾細胞、末梢血中の前駆細胞、あるいはマクロファージ細胞株などを用いた細胞培養で破骨細胞を形成させる活性、あるいは単離精製した破骨細胞の延命や骨吸収能を促進する活性のことをいう。また、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいては、破骨細胞数を増加させ、破骨細胞を活性化し、骨吸収を促進する活性のことであり、具体的には骨表面の破骨細胞数や破骨細胞面の増加、骨密度の減少、骨量の減少、血清中骨吸収マーカー｛カルシウム、コラーゲン分解物（ＣＴｘ）、酒石酸耐性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ−５ｂ）など｝の上昇などによってＲＡＮＫＬの活性の増減を知ることができる。
本発明の可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグペプチドの融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、破骨細胞分化を誘導し、さらに成熟破骨細胞に対しても骨吸収活性を活性化し促進する。エピトープタグが連結していない可溶型ＲＡＮＫＬ単独でもこれらの作用を発揮し得るが、本発明の可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグペプチドの融合タンパク質の破骨細胞分化・活性化能は単独のＲＡＮＫＬに比較して向上している。可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグペプチドの融合タンパク質の破骨細胞への分化・活性化能は、可溶型ＲＡＮＫＬ単独の場合よりも有意に向上し、例えば、ヒト、マウス、ラット等の動物由来の骨髄細胞若しくは脾細胞、マウスのマクロファージ系細胞であるＲＡＷ細胞等にｉｎ  ｖｉｔｒｏで添加した場合、可溶型ＲＡＮＫＬ単独で添加した場合に比べ、形成される破骨細胞の数、大きさが上昇する。また、可溶型ＲＡＮＫＬ単独で添加した場合に比べ、単離した成熟破骨細胞をより延命させ、また破骨細胞の骨吸収能を増加させる。さらに、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグペプチドの融合タンパク質においては、ＲＡＮＫＬ自体が有する能力・力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）が強化され、ＲＡＮＫＬ単独の添加では達成し得ない程度の、破骨細胞分化・活性化作用を示し得る。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いる場合、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグペプチドの融合タンパク質の添加濃度は、０．１ｎＭ以上、好ましくは０．５ｎＭ以上、さらに好ましくは１ｎＭ以上、さらに好ましくは２ｎＭ以上、さらに好ましくは２．５ｎＭ以上、さらに好ましくは５ｎＭ以上である。
また可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで破骨細胞を分化・活性化させる際にＭ−ＣＳＦを添加してもよい。
上記のように、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグペプチドの融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、破骨細胞分化・活性化剤として用いることができ、動物の骨代謝等の研究に好適に用いることができる。
また、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで動物に投与した場合、動物体内中で破骨細胞分化を誘導し、さらに成熟破骨細胞に対しても骨吸収活性を活性化し促進する。さらに、動物において骨表面の破骨細胞数や破骨細胞面の増加、骨密度の減少、骨量の減少、血清中骨吸収マーカーの上昇が認められる。これらの作用は、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を動物に投与した場合、可溶型ＲＡＮＫＬを単独で投与した場合よりも、有意に向上する。
可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与対象となる動物は限定されず、ヒト、サル、マウス、ラット等あらゆる動物が対象となる。可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質は、動物種を越えて作用する。すなわち、例えば、ヒト由来の可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質は、マウス、サル、ラット等の他の動物種のＲＡＮＫに作用し、他動物種に対しても破骨細胞誘導活性を示す。本発明において、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質が動物種を越えて作用することを、交差性がある、動物種間交差性がある、あるいは動物種間交差作用性があるという。
可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を動物に投与する場合も、Ｍ−ＣＳＦを加えてもよい。
可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の動物への投与量は限定されず、動物種に応じて適宜決定され得るが、例えばマウスの場合、１頭当たり１０ｎｍｏｌ〜５０００ｎｍｏｌ、好ましくは５０ｎｍｏｌ〜１０００ｎｍｏｌを投与すればよい。投与経路は限定されず、静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射、座薬、点眼などによって投与すればよい。
上記のように、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質は、動物の骨量減少剤として用いることができる。さらに、骨量が減少した動物は骨量減少症モデル動物として、骨密度や骨量の減少を特徴とする骨疾患の治療又は予防薬のスクリーニングに用いることができる。骨密度や骨量の減少を特徴とする骨疾患としては、例えば骨粗鬆症、骨量減少症などが挙げられる。
また、ＲＡＮＫＬの活性は破骨細胞分化・活性化だけに限定されず、リンパ球分化、樹状細胞活性化、乳腺上皮細胞分化、リンパ節形成なども含まれるので、これらの亢進を誘導するような利用法も含まれる。すなわち、本発明は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質であって、可溶型ＲＡＮＫＬの有するリンパ球分化、樹状細胞活性化、乳腺上皮細胞分化及びリンパ節形成能からなる群の少なくともひとつの機能が向上した融合タンパク質を有効成分として含む、リンパ球分化剤、樹状細胞活性化剤、乳腺上皮細胞分化剤及びリンパ節形成剤からなる群から選択される組成物をも包含する。
本発明の破骨細胞分化・活性化剤又は各種組成物は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの効果の確認
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの調製
ヒト型ＲＡＮＫＬ残基１４０−３１７をコードするｃＤＮＡにＰＣＲにてＳａｌ  Ｉ，Ｎｏｔ  Ｉサイトを付加し、これらのエンドヌクレアーゼを用いて、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ１３８５４）のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの下流にクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩＰＴＧ（終濃度：０．５ｍＭ）によるタンパク質発現の誘導後、菌体を抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて懸濁し、４℃でソニケーターを用いて破砕した。１８０００×ｇ、１５ｍｉｎで遠心後、上清を回収しＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけた。続いて洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて洗浄した。その後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ溶液（２０ｍＭ還元型グルタチオン，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの分子量及び純度を確認し、フィルターろ過した。分子量４７．０ｋＤａ、純度９５％以上であった。また、リムルス変形細胞溶解物試験（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ａｓｓａｙ）によりエンドトキシン濃度を測定し、１ＥＵ／μｇ未満であることを確認した。
破骨細胞形成（１）
７週令のｄｄＹマウスから骨髄細胞を採取し、Ｍ−ＣＳＦ（１万Ｕ／ｍＬ）存在下で培養後、浮遊細胞を取り除き、さらにＭ−ＣＳＦ存在下で２日間培養した。その後４８穴プレートに上記の細胞を５×１０５個／ｗｅｌｌで撒きＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を０．５、１、２．５、５ｎＭの濃度で添加し、３７℃  ＣＯ２インキュベーターで培養した。３日間培養後の細胞は、上清を捨て中性緩衝ホルマリン溶液にて２分間固定し、アセトン／エタノール（アセトン：エタノール＝１：１）を加え１分再固定した。固定後アセトン／エタノールを除き、乾燥させ５００μｌの基質液（ＮａＰＨＴＯＬ  Ａｓ−ＭＸ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ０．２６ｍＭ、ジメチルホルムアミド１５０ｍＭ、ＴＲＡＰ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＨ３ＣＯＯＨ  ３０ｍＭ、酢酸Ｎａ三水和物８５ｍＭ、酒石酸Ｎａ２５ｍＭ）Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（ＳＩＧＭＡ）２．３３ｍＭ）を加え、顕微鏡で観察し、染色されたことを確認し水洗いをした。破骨細胞が赤色に濃度依存的に染色された（図１Ａ）。またＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ添加細胞は可溶型ＲＡＮＫＬ添加細胞と比較しより染色されていることが分かった。さらに顕微鏡下で破骨細胞を観察するとＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ添加細胞は可溶型ＲＡＮＫＬ添加細胞より大きな破骨細胞を形成していた。可溶型ＲＡＮＫＬ添加量を１０ｎＭに上げ同様に検討したところ５ｎＭと比較し、より大きな破骨細胞形成が確認されたが、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ  ５ｎＭ添加細胞と比較してもより大きな破骨細胞は見られなかった（図１Ｂ）。
破骨細胞形成にＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは強く作用し、さらに破骨細胞の大きさに対しても明確な違いが見られＧＳＴが付加することにより強い活性を示すことが分かった。
破骨細胞形成（２）
９６穴プレートにＲＡＷ２６４細胞２０００個／ｗｅｌｌで撒きＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を０．６２５、１．２５、２．５ｎＭの濃度で添加し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターで培養した。３日後同濃度のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬを添加したメディウムでさらに１日培養した。またコントロールとしてＰＢＳ及びＧＳＴを同様に添加し比較対照とし、それぞれの測定値はＡＮＯＶＡ；Ｄｕｎｎｅｔｔ法により検定を行った。
培養後のＲＡＷ２６４細胞は、上清を捨てアセトン／エタノール（アセトン：エタノール＝１：１）を１００μｌづつ加え１分固定した。固定後アセトン／エタノールを除き、乾燥させ１００μｌの基質液｛１．５ｇ／ｍｌ  ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５０ｍＭクエン酸バッファーｐＨ４．５（クエン酸Ｎａ二水和物３．３ｍＭにクエン酸一水和物５０ｍＭを加えｐＨ４．５にあわせた。）に５０ｍＭ酒石酸ナトリウム溶液を１／１０量加えた。｝を加え、３０分室温でインキュベートした。
ＴＲＡＰ活性はＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬ濃度依存的に上昇し、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは可溶型ＲＡＮＫＬと比較し１．２５、２．５ｎＭにおいて有意に高い活性を示した（図２）。またこの時の破骨細胞はＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬともに濃度依存的に増加した。
成熟破骨細胞の延命評価と破骨細胞の骨吸収能
マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養により得られた破骨細胞にＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ、可溶型ＲＡＮＫＬを１ｎＭ、５ｎＭにてそれぞれ添加し、０時間と２０時間後にＴＲＡＰ染色を施し、ＴＲＡＰ陽性多核細胞を計測した。計測した２０時間後のＴＲＡＰ陽性多核細胞数を０時間の細胞数で割り、生存率を算出した（図３Ａ）。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬ添加により濃度依存的に細胞生存率が上がり、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ  ５ｎＭではコントロール群に比べ約２倍（ｐ＜０．０１）の生存率であった。また、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは可溶型ＲＡＮＫＬよりも強い作用を示した。
マウス骨芽細胞と骨髄細胞の共存培養により、破骨細胞と骨芽細胞を含むすべての細胞を象牙片に播種し、２時間培養後、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬと可溶型ＲＡＮＫＬをそれぞれ添加し２４時間培養した。培養後、象牙片から細胞を除去しＨＥ染色にて吸収窩数を計測した。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬおよび可溶型ＲＡＮＫＬ濃度に依存しともに骨吸収を促進したが、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは可溶型ＲＡＮＫＬよりも強い作用を示した（図３Ｂ）。
【実施例２】
【０００７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの効果の確認
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの調製は、実施例１と同様の方法で行った。
ＲＡＮＫＬ投与試験
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス雌１０匹にＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ、可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）５７ｎｍｏｌ（低用量）及び４２６ｎｍｏｌ（高用量）を２４時間毎３回腹腔内投与し３回目投与より１．５時間後に全採血を行った。比較対象としてＰＢＳを同様に投与した群を用いた。
全血採血した血液は血清中の骨吸収パラメーター（カルシウム、ＣＴｘ｛Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド｝、ＴＲＡＰ−５ｂ）と骨形成パラメーター｛ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ，アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）｝の測定を行った。カルシウムはＯＣＰＣ法（ＷＡＫＯ，２７２−２１８０１）にて、ＣＴｘ（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＴＲＡＰ−５ｂ（ＩＤＳ  Ｌｔｄ，ＳＢ−ＴＲ１０３）、ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）はＥＬＩＳＡ法にて、ＡＬＰはＢｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法（ＷＡＫＯ，２７４−０４４０１）にて測定を行った。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬ投与により、どちらの薬剤投与においても高用量の投与で血中Ｃａ濃度は、約１．４倍程度有意（ｐ＜０．０１）に上昇した（図４）。コラーゲン代謝産物であるＣＴｘは高用量でコントロール群と比較し約１．５倍程度有意に上昇しＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、ｐ＜０．０１、可溶型ＲＡＮＫＬはｐ＜０．０５の有意差であった（図５）。ＴＲＡＰ−５ｂについては、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ高用量の投与により約１．５倍程度有意に（ｐ＜０．０１）上昇し可溶型ＲＡＮＫＬ投与では、有意な上昇は見られなかった（図６）。血中のｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ、ＡＬＰについては、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬまたは可溶型ＲＡＮＫＬ投与で高用量、低用量のどちらの場合においても変化は見られなかった（図７及び８）。
骨密度と骨形態計測
全血採血後のマウスは大腿骨、脛骨、大脳、肺、心臓、肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、皮膚を採取し、大脳、肺、心臓、肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、皮膚はＨＥ染色により自然発生病変を観察した。
大腿骨については、ｐＱＣＴを用い成長板より近位側に０．６ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍの海綿骨の位置で海綿骨の骨密度測定を行った。
ｐＱＣＴによる大腿骨の骨密度測定の結果、０．６ｍｍではＧＳＴ−ＲＡＮＫＬまたは可溶型ＲＡＮＫＬ高用量投与にて１０％、０．８ｍｍではそれぞれ２３％、１７％、１．０ｍｍではそれぞれ３０％、２０％の減少が見られた（図９）。Ａｎｏｖａ；Ｄｕｎｎｅｔｔ法により有意差を検定したところ可溶型ＲＡＮＫＬ高用量投与群において成長板より０．６ｍｍの距離ではｐ＜０．０５であり、０．８ｍｍ、１．０ｍｍの距離及びＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ高用量投与では測定したすべての距離においてｐ＜０．０１であった（図９Ｂ）。またＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ、可溶型ＲＡＮＫＬの低用量投与では有意差は得られなかった（図９Ａ）。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬ高用量の投与により破骨細胞分化、成熟破骨細胞の延命評価、破骨細胞の骨吸収能、骨吸収パラメーターの上昇、骨密度の減少、単位骨量の減少、及び破骨細胞数の増加が見られ、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは、破骨細胞形成能において可溶型ＲＡＮＫＬよりも強い活性を示した。ＧＳＴが融合することにより可溶型ＲＡＮＫＬは、破骨細胞の分化・延命・活性化段階でその活性を強めることが示唆された。
【実施例３】
【０００８】
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの活性
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）をＲＡＷ２６４細胞に１０、５、２．５ｎＭと順次段階希釈した濃度で添加し、４日後に実施例１に記載の方法でＴＲＡＰ活性を測定した。１０ｎＭの可溶型ＲＡＮＫＬ添加での破骨細胞分化活性は既に飽和しており、これ以上濃度を上げても活性は上がらない。このように可溶型ＲＡＮＫＬはＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに及ばず、ＧＳＴ融合により活性が高まり、ＲＡＮＫＬ自体が有する能力・力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）が強化され、ＲＡＮＫＬ単独の添加では達成し得ない程度の、破骨細胞分化・活性化作用を示し得ることがわかった（図１０Ａ）。また、この時の破骨細胞を顕微鏡下にて観察したところ、可溶型ＲＡＮＫＬと比較しＧＳＴ−ＲＡＮＫＬはより大きな破骨細胞を誘導することが分かった（図１０Ｂ）。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの保存安定性
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬと可溶型ＲＡＮＫＬの安定性を比較するため５ｎＭ  ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）の破骨細胞誘導活性をＴＲＡＰ活性にて測定し、その後−２０℃以下にて２ヶ月間保存し、同様に破骨細胞誘導活性を測定した。得られた測定結果は、同時期に測定したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの活性を１とし、可溶型ＲＡＮＫＬの活性をＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに対する割合で示した。凍結乾燥品である可溶型ＲＡＮＫＬを溶媒に溶解して直ぐに行った実験では、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬに対し可溶型ＲＡＮＫＬは約６割の活性であったのに対し、その２ヵ月後の可溶型ＲＡＮＫＬの活性は、約２割に減少した。この結果からＧＳＴ融合によりＲＡＮＫＬの保存安定性が顕著に増したことがわかった（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの交差性
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬはヒト可溶型ＲＡＮＫＬの一つであるが、マウス可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製およびＲ＆Ｄ社製）と破骨細胞誘導活性を１０ｎＭ、５ｎＭにて比較したところ、ＲＡＷ２６４細胞がマウス由来の細胞であるにもかかわらず、マウス可溶型ＲＡＮＫＬに対しＧＳＴ−ＲＡＮＫＬが２倍以上高い活性を持つことがわかった（図１２）。この結果より、ＧＳＴ融合ヒト可溶型ＲＡＮＫＬ（ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ）は、ＲＡＮＫＬのレセプターであるマウスＲＡＮＫを有するＲＡＷ２６４細胞に対して、マウス可溶型ＲＡＮＫＬよりもさらに強い破骨細胞誘導活性を示すことがわかった。これはＧＳＴ融合ヒト可溶型ＲＡＮＫＬが種を越えてマウスＲＡＮＫにも作用し、マウス可溶型ＲＡＮＫＬとマウスＲＡＮＫというマウス同士のリガンド−レセプター反応よりも強い作用を示すことを意味する。
【実施例４】
【０００９】
破骨細胞分化
７週令のｄｄＹマウスから骨髄細胞を採取し、Ｍ−ＣＳＦ（１万Ｕ／ｍＬ）存在下で培養後、浮遊細胞を取り除き、さらにＭ−ＣＳＦ存在下で２日間培養した。その後４８穴プレートに上記の細胞を５×１０５個／ｗｅｌｌで撒きＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社）を１、２．５、５、１０ｎＭの濃度で添加し、３７℃  ＣＯ２インキュベーターで培養した。３日間培養後の細胞は、上清を捨て中性緩衝ホルマリン溶液にて２分間固定し、アセトン／エタノール（アセトン：エタノール＝１：１）を加え１分再固定した。固定後アセトン／エタノールを除き、乾燥させ５００μｌの基質液（ＮａＰＨＴＯＬ  Ａｓ−ＭＸ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ０．２６ｍＭ、ジメチルホルムアミド１５０ｍＭ、ＴＲＡＰ  ｂｕｆｆｅｒ（ＣＨ３ＣＯＯＨ  ３０ｍＭ、酢酸Ｎａ三水和物８５ｍＭ、酒石酸Ｎａ  ２５ｍＭ）Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（ＳＩＧＭＡ）２．３３ｍＭ）を加え、顕微鏡で観察し、染色されたことを確認し水洗いをした。破骨細胞が赤色に濃度依存的に染色された（図１３）。またＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ添加細胞は可溶型ＲＡＮＫＬ添加細胞と比較し、より強く染色されていることが分かった。さらに顕微鏡下で破骨細胞を観察するとＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ添加細胞は可溶型ＲＡＮＫＬ添加細胞より大きな破骨細胞を形成していた（図１３）。
破骨細胞形成にＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは強く作用し、さらに破骨細胞の大きさに対しても明確な違いが見られた。ＧＳＴが付加することによりＲＡＮＫＬは強い活性を示すことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのようなＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を作製することにより、可溶型ＲＡＮＫＬの比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を高めるだけではなく、その能力（ｐｏｔｅｎｃｙ）をも強化する。すなわち、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのようなＲＡＮＫＬ融合タンパク質はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの破骨細胞形成系において、可溶型ＲＡＮＫＬの濃度を飽和するまで上昇させた場合に形成される破骨細胞の数や大きさよりも、さらに多数の巨大な破骨細胞を形成させることが可能である。このことは、単に比活性が高まっただけではなく、どれだけ多くの破骨細胞を形成させ、活性させることができるかという能力（ｐｏｔｅｎｃｙ）が向上したことを示している。これにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏだけでなくｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもＲＡＮＫＬの強力な活性を発揮させることが可能となった。ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質は、骨代謝の研究のための試薬として好適に用いることができ、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで動物に投与することにより、動物の骨密度や骨量が減少することから、骨量減少症モデル動物の作製にも用いることができる。また、ＲＡＮＫＬの活性は破骨細胞分化・活性化だけに限定されず、リンパ球分化、樹状細胞活性化、乳腺上皮細胞分化、リンパ節形成なども含まれる。
ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質は、骨代謝の研究のための試薬として好適に用いることができ、さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏで動物に投与することにより、動物の骨密度や骨量が減少することから、骨量減少症モデル動物の作製にも用いることができる。また、ＲＡＮＫＬの活性は破骨細胞分化・活性化だけに限定されず、リンパ球分化、樹状細胞活性化、乳腺上皮細胞分化、リンパ節形成なども含まれるので、これらの亢進を誘導するような試薬としての利用も本発明に含まれる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【００１１】
配列番号３〜１８  合成
［配列表］
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
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【図１０Ｂ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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