(57)【要約】本発明は、活性型サイトカイニン合成量を直接制御することのできる酵素遺伝子を解明し、当該遺伝子を利用してサイトカイニン量が調節された形質転換植物を提供することを課題とする。  本発明によれば、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子が導入された形質転換植物が提供される。（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子が導入された形質転換体。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項２】
形質転換体が形質転換植物である、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
植物が、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞である請求項２に記載の形質転換体。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子又は請求項４に記載の組換えベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子の植物における発現量を制御することを特徴とする、植物における活性型サイトカイニン量の調節方法。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項７】
請求項１に記載の形質転換体を、ヌクレオチド型サイトカイニンを基質として添加した培地にて培養し、培養物から活性型サイトカイニンを採取することを特徴とする、活性型サイトカイニンの製造方法。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子を植物体内で過剰発現させることにより、植物の形質を変化させる方法。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
【請求項９】
植物の形質の変化が、花茎数の増加、大きな種子の形成、太い葉脈の形成、花序の変更である、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型サイトカイニン合成酵素遺伝子の利用に関する。より詳細には、ヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有する酵素遺伝子を用いて形質転換植物を作出する方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイニンは、細胞分裂の促進、細胞周期の調節、老化防止、腋芽の活性化など多用な生理活性を有し、作物の量的生産性を制御する極めて重要な植物ホルモンである。
サイトカイニンの基本骨格はアデニンの６位の窒素原子に炭素５つのプレニル基をもつ構造であり、側鎖構造の違いによりトランスゼアチン（ｔＺ）、イソペンテニルアデニン（ｉＰ）などがある。従来のサイトカイニン代謝系研究の知見から、活性型サイトカイニン（塩基体）合成は少なくとも以下の三段階の反応を経ると考えられてきた。まず、サイトカイニン合成の第一反応ではアデニンヌクレオチドとジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の縮合反応により、ヌクレオチド型サイトカイニンが生産される。このヌクレオチド体はサイトカイニンとしての活性を持たないが、その後、第二反応において、脱リン酸化酵素によりヌクレオシド型サイトカイニンになり、さらにヌクレオシダーゼの働きによりリボースが外れ、塩基体の活性型サイトカイニン分子に変換される（非特許文献１、総説：Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｈ．（２００６）Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ：Ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．５７：４３１−４４９．）。実際に１９８０年代の酵素レベルの研究において、それぞれの反応を触媒する酵素の存在が示唆されており、第一反応（縮合反応）、つまりヌクレオチド型サイトカイニンの合成反応を触媒する酵素遺伝子（ＩＰＴ）は２００１年に同定されている（特許文献１：ＷＯ２００２／０７２８１８）。しかし、残りの２段階からなる第二反応（活性化反応）を触媒する酵素遺伝子の実体は未だわかっていない。また、それらの遺伝子の実体がわかった場合においても、塩基体のサイトカイニンの生成量を人為的に制御するためにはヌクレオチド型からヌクレオシド型、さらに塩基型という２段階のステップを同時に改変しなければならないため、両反応を触媒する酵素遺伝子を同定した上、それらの酵素遺伝子を同時に制御する必要があり、その操作は容易ではない。一方、サイトカイニン分解反応を触媒する酵素遺伝子（ＣＫＸ）の制御によっても活性型サイトカイニンの量的制御を行うことは可能であるが（非特許文献２：Ｗｅｒｎｅｒ  Ｔ，Ｍｏｔｙｋａ  Ｖ，Ｓｔｒｎａｄ  Ｍ，Ｓｃｈｍｕｌｌｉｎｇ  Ｔ．（２００１）Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９８：１０４８７−１０４９２．、非特許文献３：Ａｓｈｉｋａｒｉ，Ｍ．，Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｈ．，Ｌｉｎ，Ｓ．−Ｙ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｔａｋａｓｈｉ，Ｔ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．，Ａｎｇｅｌｅｓ，Ｅ．Ｒ．，Ｑｉａｎ，Ｑ．，Ｋｉｔａｎｏ，Ｈ．ａｎｄ  Ｍａｔｓｕｏｋａ，Ｍ．（２００５）Ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ  ｏｘｉｄａｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｒｉｃｅ  ｇｒａｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：７４１−７４５．）、活性型サイトカイニン合成量を直接制御する技術は今まで存在しない。また、ＩＰＴの過剰発現でも塩基体の量は増加するものの、サイトカイニン総量も極端に増大し、植物体としての形態が大きく変わってしまうという問題がある（非特許文献４：Ｚｕｂｋｏ  Ｅ，Ａｄａｍｓ  ＣＪ，Ｍａｃｈａｅｋｏｖａ  Ｉ，Ｍａｌｂｅｃｋ  Ｊ，Ｓｃｏｌｌａｎ  Ｃ，Ｍｅｙｅｒ  Ｐ���２００２．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔａｇｇｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２９：７９７−８０８．）。
【発明の開示】
【０００３】
従って、本発明の課題は、活性型サイトカイニン合成量を直接制御することのできる酵素遺伝子を解明し、当該遺伝子を利用してサイトカイニン量が調節された形質転換植物を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、イネ茎頂分裂組織に発現している遺伝子に着目してその構造と機能解析を行ったところ、当該遺伝子はデータベース上ではリジンの脱炭酸に関わると予想されていた酵素遺伝子であったが、リジン脱炭酸酵素活性ではなく、ヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンを合成する反応（サイトカイニン活性化反応）を触媒する活性を有することを新たに見出した。しかも、従来２段階で進むことが想定されていたサイトカイニン活性化反応を、当該酵素遺伝子は１段階で行うことをも見出した。
本発明はかかる知見により完成されたものである。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子が導入された形質転換体。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（２）形質転換体が形質転換植物である、（１）に記載の形質転換体。
（３）植物が、植物体、植物器官、植物組織、又は植物培養細胞である（２）に記載の形質転換体。
（４）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子を含む組換えベクター。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（５）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子又は（４）に記載の組換えベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生することを特徴とする、形質転換植物の作出方法。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（６）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子の植物における発現量を制御することを特徴とする、植物における活性型サイトカイニン量の調節方法。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（７）（１）に記載の形質転換体を、ヌクレオチド型サイトカイニンを基質として添加した培地にて培養し、培養物から活性型サイトカイニンを採取することを特徴とする、活性型サイトカイニンの製造方法。
（８）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかの遺伝子を植物体内で過剰発現させることにより、植物の形質を変化させる方法。
（ａ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子
（ｂ）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５のいずれかに示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子
（ｃ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子
（ｄ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６のいずれかに示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
（９）植物の形質の変化が、花茎数の増加、大きな種子の形成、太い葉脈の形成、花序の変更である、（８）に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＬＯＧタンパク質の精製標品の電気泳動図を示す（レーン１：分子サイズマーカー、レーン２：ＬＯＧタンパク質の精製標品（３μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）。
図２Ａは、各基質標品混合物のクロマトグラム、ならびに図２ＢはｉＰＲＭＰ、図２ＣはｔＺＲＭＰ、図２ＤはｔＺを基質としてそれぞれ用いて精製ＬＯＧタンパク質と反応させた場合の各反応生成物のクロマトグラムを示す（上側：基質のみ、下側：反応生成物）。
図３は、（Ａ）カダベリン標品のクロマトグラム、（Ｂ）Ｌ−リジンを基質として用いて精製ＬＯＧタンパク質と反応させた場合の反応生成物のクロマトグラムを示す（（Ｂ）−１：基質のみ、（Ｂ）−２：反応生成物）。
図４は、ＬＯＧタンパク質の基質特異性を示す（ｉＰＲＭＰを基質としたときの活性を１として各化合物を同じ条件で反応させた際の活性を相対値で示した）。
図５は、ＬＯＧタンパク質によるヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応式を示す。
図６は、ＡｔＬＯＧ１，２，３，４，５，７，８タンパク質の精製標品のＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動結果を示す（一番左側のレーン：分子量マーカー、各レーン：分子量３１ｋＤａ付近にみられるバンドが各ＡｔＬＯＧタンパク質由来のバンド）。
図７は、ＡｔＬＯＧ１，２，３，４，５，７，８タンパク質の基質特異性を示す（ｉＰＲＭＰを基質にしたときの活性を１００％として、各化合物を同じ条件で反応させた際の活性を相対値で示した。エラーバーは、同一条件で３回反応を行った結果を元に計算した標準偏差を示す）。
図８は、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４，３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体におけるＡｔＬＯＧ４，７遺伝子の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す。
図９は、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体にみられるロゼット葉の異常を示す。発芽後１ヶ月半の野生型と３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７（系統♯６；Ｔ１世代）形質転換体のロゼット葉を実体顕微鏡によって観察した（スケールは１ｍｍ）。
図１０は、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４形質転換体にみられるロゼット葉の異常を示す。発芽後１ヶ月半の野生型と３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４（系統♯２６；Ｔ１世代）形質転換体のロゼット葉を７０％エタノールにより脱色固定したのちに実体顕微鏡によって観察した（スケールは左側が０．５ｃｍ、右側が２ｍｍ）。
図１１は、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体にみられる維管束の形態異常を示す。発芽後１ヶ月の野生型と３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７（系統♯２６；Ｔ２世代）形質転換体のロゼット葉を７０％エタノールにより脱色固定、テクノビット樹脂固定後、ミクロトームにより切断して横断切片を作成した。横断切片をトルイジンブルー染色後、光学顕微鏡により観察を行った。暗視野条件で白く映っている部分が導管を示す（スケールは５０μｍ）。
図１２は、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４形質転換体にみられる葉の老化遅延を示す。発芽後７０日目の野生型と３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４（系統♯６；Ｔ１世代）形質転換体のロゼット葉（スケールは１ｃｍ）。
図１３は、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４形質転換体にみられる側芽形成の促進を示す。発芽後３週間目の野生型と３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４（系統♯１３；Ｔ２世代）形質転換体の地上部を実体顕微鏡により観察した（矢印：抽苔した花茎、三角印：発達した側芽、スケールは１ｍｍ）。
図１４は、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体にみられる花序の異常を示す。発芽後３週間目の野生型と３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７（系統♯６；Ｔ１世代）形質転換体の花序（スケールは１ｃｍ）。
図１５は、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４形質転換体にみられる種子サイズの増加を示す。野生型と３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４（系統♯２６；Ｔ２世代）の種子を実体顕微鏡で観察した（スケールは左側が１ｃｍ、右側が０．２ｍｍ）。
図１６は、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体にみられる種子重量の増加を示す。野生型と３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７（系統♯６；Ｔ２世代）について種子１００粒の重量を測定し、一粒当たりの重量を計算した。エラーバーは、異なる３つの種子プールをもとに得られた結果を元に計算した標準偏差を示す。
本願は、２００６年９月４日に出願された日本国特許出願２００６−２３８６９１号の優先権を主張するものであり、該特許出願の明細書に記載される内容を包含する。
以下に、本発明について詳細に述べる。
（１）活性型サイトカイニン合成酵素遺伝子
本発明は、ヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子の利用に関する。
上記のヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子（以下、「ＬＯＧ遺伝子」という）は、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡからなる遺伝子であるか、又は配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子である。ＬＯＧ遺伝子の配列情報は、国際塩基配列データベースにおいて既に報告されており（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＫ０７１６９５）（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；ＢＡＤ５２８８０（ｐｒｏｔｅｉｎ）；Ｔｉｇｒｌｏｃｕｓ：ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４０６３０；ＲＡＰ  ｌｏｃｕｓ：ＯＳ０１ｇ０５８８９００）、本遺伝子がコードする２４２アミノ酸からなるタンパク質の機能は、ＮＣＢＩデータベース上（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）ではリジン脱炭酸酵素と予測されていた。しかしながら、本発明者らは、ＬＯＧ遺伝子がイネ茎頂分裂組織先端の幹細胞と呼ばれる未分化の細胞群とその周辺組織に発現していることから、茎長分裂組織維持に関わる可能性があると考え、その機能解析を進めたところ、リジン脱炭酸酵素活性ではなく、新たにヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性があることを見出した。
本発明に使用するＬＯＧ遺伝子は、ヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を保持する限り、配列番号２に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
ここで、欠失、置換若しくは付加されてもよいアミノ酸の数としては、好ましくは、１個から数個である。例えば、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示すアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示すアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
また、本発明に使用するＬＯＧ遺伝子は、配列番号２に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する遺伝子であって、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。上記８０％以上の相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性をいう。
ここで、「ヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性」とは、ヌクレオチド型サイトカイニンからリボース５’−一リン酸を外し、塩基体の活性型サイトカイニンを合成する反応を触媒する活性」をいう。
本発明において、「ヌクレオチド型サイトカイニン」には、イソペンテニルアデニンリボシド５’−一リン酸（ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｉｎｅ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｉＰＲＭＰ）、トランス−ゼアチンリボシド５’−一リン酸（ｔｒａｎｓ−ｚｅａｔｉｎ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｔＺＲＭＰ）、ジヒドロゼアチンリボシド５’−一リン酸（ｄｉｈｙｄｒｏｚｅａｔｉｎ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＤＺＲＭＰ）、シス−ゼアチンリボシド５’−一リン酸（ｃｉｓ−ｚｅａｔｉｎ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｃＺＲＭＰ）が含まれ、活性型サイトカイニンは上記ヌクレオチド型サイトカイニンがそれぞれ脱リボース５’−一リン酸されたイソペンテニルアデニン（Ｎ６−（ｄｅｌｔａ−２−ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ）ａｄｅｎｉｎｅ：ｉＰ）、トランス−ゼアチン（ｔｒａｎｓ−ｚｅａｔｉｎ：ｔＺ）、ジヒドロゼアチン（ｄｉｈｙｄｒｏｚｅａｔｉｎ：ＤＺ）、シス−ゼアチン（ｃｉｓ−ｚｅａｔｉｎ：ｃＺ）が含まれる。
また、「ヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有する」とは、上記の活性が、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質が有する活性と実質的に同等であることをいう。
本発明に係るＬＯＧ遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子であってもよい。
ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸、すなわち配列番号１で表わされる塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましく９５％以上の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。
本発明に用いるＬＯＧ遺伝子は、例えば配列番号１又は２の配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリー又はゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。またＬＯＧ遺伝子は、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、当該ＬＯＧ遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいはＬＯＧ遺伝子は、化学合成法等の当技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成してもよい。
上記アミノ酸の欠失、付加、及び置換は、上記タンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法又はＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎｔ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎｔ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて、あるいは、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットを用いて変異が導入される。
また、本発明に使用できるＬＯＧ遺伝子には、上記のＬＯＧ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＫ０７１６９５）と同じ遺伝子ファミリーに属すると予想される下記の遺伝子群が挙げられ、これらも本発明にいうＬＯＧ遺伝子に包含されるものとする。
2008029942.tif 000002
2008029942.tif 000003
上記の遺伝子群のうち、Ａｔ２ｇ２８３０５、Ａｔ２ｇ３５９９０、Ａｔ２ｇ３７２１０、Ａｔ３ｇ５３４５０、Ａｔ４ｇ３５１９０、Ａｔ５ｇ０６３００、Ａｔ５ｇ１１９５０の７遺伝子は、前記イネのＬＯＧタンパク質のアミノ酸配列に対して高い相同性を有するアミノ酸配列をコードするシロイヌナズナＬＯＧホモログ遺伝子（ＡｔＬＯＧ１，２，３，４，５，７，８とそれぞれ称する）である。これらのシロイヌナズナＬＯＧホモログ遺伝子は、後記実施例に示されるように、前記イネＬＯＧタンパク質と同様にヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有し、かつ過剰発現体では活性型サイトカイニン合成量の増加に基づく側芽の伸長促進などの形質変化が認められた。ＡｔＬＯＧ１，２，３，４，５，７，８遺伝子の塩基配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５にそれぞれ示され、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６にそれぞれ示されるアミノ酸配列をコードする。また、これらのシロイヌナズナＬＯＧホモログ遺伝子もまた、ヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応を触媒する活性を有する限り、それらの変異遺伝子であってもよく、配列の相同性の範囲、アミノ酸の欠失、置換、付加数の範囲は、前記のとおりである。
（２）植物形質転換用組換えベクター
植物形質転換に用いる本発明の組換えベクターは、上記ＬＯＧ遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ここで、ベクターとしては、例えば、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特にｐＢＩ系のバイナリーベクター又は中間ベクター系が好適に用いられ、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３等が挙げられる。バイナリーベクターとは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウムにおいて複製可能なシャトルベクターで、バイナリーベクターを保持するアグロバクテリムを植物に感染させると、ベクター上にあるＬＢ配列とＲＢ配列より成るボーダー配列で囲まれた部分のＤＮＡを植物核ＤＮＡに組み込むことが可能である。一方、ｐＵＣ系のベクターは、植物に遺伝子を直接導入することができ、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。また、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターも用いることができる。
バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記のバイナリーベクターの境界配列（ＬＢ，ＲＢ）間に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増幅する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５あるいはアグロバクテリウム・リゾゲネスＬＢＡ１３３４等に、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを植物の形質導入に用いる。
ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
また、目的遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、ベクターには、目的遺伝子の上流、内部、あるいは下流に、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、バイナリーベクター系を使用するための複製開始点（Ｔｉ又はＲｉプラスミド由来の複製開始点など）、選抜マーカー遺伝子などを連結することができる。
「プロモーター」としては、植物細胞において機能し、植物の特定の組織内あるいは特定の発育段階において発現を導くことのできるＤＮＡであれば、植物由来のものでなくてもよい。具体例としては、イネのＬＯＧ遺伝子自身のプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Ｐｎｏｓ）、トウモロコシ由来ユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来ＰＲタンパク質プロモーター等が挙げられる。
エンハンサーとしては、例えば、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域などが挙げられる。
ターミネーターとしては、プロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、例えば、ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素（ＯＣＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓ  ＲＮＡ遺伝子のターミネーター等が挙げられる。
選抜マーカー遺伝子としては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子などが挙げられる。
また、選抜マーカー遺伝子は、上記のように目的遺伝子とともに同一のプラスミドに連結させて組換えベクターを調製してもよいが、あるいは、選抜マーカー遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターと、目的遺伝子をプラスミドに連結して得られる組換えベクターとを別々に調製してもよい。別々に調製した場合は、各ベクターを宿主にコトランスフェクト（共導入）する。
（３）形質転換植物およびその作出方法
本発明の形質転換植物は、上記遺伝子又は組換えベクターを対象植物に導入することによって作出することができる。本発明において「遺伝子の導入」とは、例えば公知の遺伝子工学的手法により、目的遺伝子を上記宿主植物の細胞内に発現可能な形で導入することを意味する。ここで導入された遺伝子は、宿主植物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれてもよいし、外来ベクターに含有されたままで存在していてもよい。
上記遺伝子又は組換えベクターを植物中に導入する方法としては、既に報告され、確立されている種々の方法を適宜利用することができ、例えば、アグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法を用いる場合は、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、及び植物体そのものを用いる場合（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ法）がある。プロトプラストを用いる場合は、ＴｉプラスミドないしはＲｉプラスミドをもつアグロバクテリウム（それぞれＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）と共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。また種子あるいは植物体を用いるｉｎ  ｐｌａｎｔａ法を適用する場合、すなわち植物ホルモン添加の組織培養を介さない系では、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物などへのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。これらの植物形質転換法は、「島本功、岡田清孝  監修、新版  モデル植物の実験プロトコール遺伝学的手法からゲノム解析まで（２００１）、秀潤社」などの一般的な教科書の記載に従って行うことができる。
遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロッティング法等により行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＬＯＧ遺伝子特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲを行った後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法でもよい。さらに、その植物細胞からタンパク質を抽出し、２次元電気泳動を行って分画し、ＬＯＧ遺伝子がコードするタンパク質のバンドを検出することにより、植物細胞に導入されたＬＯＧ遺伝子が発現されていること、すなわちその植物が形質転換されていることを確認してもよい。続いて、検出されたタンパク質についてエドマン分解等によりＮ末端のアミノ酸配列を決定し、配列番号２のＮ末端の配列と一致するかどうかを確認することにより、その植物細胞の形質転換をさらに実証することができる。
あるいは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等の遺伝子を目的遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、該ベクター導入したアグロバクテリムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することによっても確認できる。
本発明において形質転換に用いられる植物としては単子葉植物又は双子葉植物のいずれであってもよく、例えば、アブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ等）、イネ科（イネ、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、等）、ナス科（トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ等）、マメ科（ダイズ、エンドウ、インゲン等）等に属する植物が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。
本発明において、形質転換の対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂等の植物器官、葯、花粉等の植物組織やその切片、未分化のカルス、それを酵素処置して細胞壁を除いたプロプラスト等の植物培養細胞のいずれであってもよい。またｉｎ  ｐｌａｎｔａ法適用の場合、吸水種子や植物体全体を利用できる。
本発明において、形質転換植物とは、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、穀実、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束等）、又は植物培養細胞（例えばカルス）のいずれをも意味するものである。
植物培養細胞を対象とする場合において、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させるためには既知の組織培養法により器官又は個体を再生させればよい。このような操作は、植物細胞から植物体への再生方法として一般的に知られている方法により、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば、以下のように行うことができる。
まず、形質転換の対象とする植物材料して植物組織又はプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。
カルス誘導は寒天等の固型培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率良くかつ大量に行うことができる。次に、上記の継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、更に完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（例えばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞及び組織等）で貯蔵等を行ってもよい。
本発明の形質転換植物は、当該遺伝子を導入した植物体（形質転換された細胞やカルスから再生された植物体を含む）の有性生殖又は無性生殖により得られる子孫の植物体、及びその子孫植物体の組織や器官等の一部（種子、プロトプラストなど）も包含するものとする。本発明の形質転換植物は、ＬＯＧ遺伝子を導入して形質転換した植物体から、種子、プロトプラストなどの繁殖材料を取得し、それを栽培又は培養することによって量産することができる。
上記のようにして得られる形質転換植物は、ＬＯＧ遺伝子の発現により活性型サイトカイニン量が局所的に又は全体的に増加する。その結果、当該形質転換植物は、サイトカイニンの作用により、例えば側芽の伸長促進（頂芽優勢の阻害）、種子発芽の促進、休眠打破、細胞分裂促進、クロロフィル合成促進、老化抑制、果実の肥大促進、花茎数の増加、大きな種子の形成、太い葉脈の形成、葉の老化遅延、花序の変更などが認められるようになる。また、これまでの研究知見からＬＯＧ遺伝子は茎頂分裂組織の限られた領域で発現し、この遺伝子の破壊株ではイネ粒数が著しく減少すること、花芽分化期における茎頂分裂組織中のサイトカイニン含量と粒数の間には相関があることが示唆されている。従って、ＬＯＧ遺伝子を例えば茎頂分裂組織に特異的に発現させるように形質転換したイネは、子実粒数増加が期待できる。
さらに、植物内におけるＬＯＧ遺伝子の発現量を、例えば使用するプロモーター、ＬＯＧプロモーター、サイトカイニンオキシダーゼ２（ＯｓＣＫＸ２）プロモーター、老化誘導性遺伝子（ＳＡＧ）プロモーター、などにより局所的に又は全体的に制御（促進又は抑制）することによって、植物内における活性型サイトカイニン量が調節でき、その結果、サイトカイニンが関与する様々な植物の成長と生理作用、例えば、穀粒数、側芽（腋芽）の形成と伸長、老化、休眠、落果、細胞周期、光合成量、蒸散などを調節することが可能である
（４）酵素タンパク質の生産
上記のＬＯＧ遺伝子によりコードされるタンパク質は、該遺伝子を導入した組換えベクターで宿主を形質転換して形質転換体を得、該形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。ここで、「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
ここで、組換えベクターは、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等の宿主中で複製可能な組換えベクターであればいずれでもよい。例えば、プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
上記ベクターには複製開始点、プロモーター、選択マーカーを含み、必要に応じてエンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
複製開始点としては、大腸菌用ベクターには、例えばＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子由来のものが、酵母用ベクターには、例えば２μｍＤＮＡ、ＡＲＳ１由来のものが、動物細胞用ベクターには、ＳＶ４０、アデノウイルス由来のものが用いられる。
プロモーターとしては、大腸菌用ベクターには、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ｃｓｐＡプロモーター等が、酵母用ベクターには、ｇａｌ１プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が、動物細胞用ベクターには、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等が用いられる。
選択マーカーとしては、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が、酵母用ベクターには、Ｌｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝子等が、動物細胞用ベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等が用いられる。
宿主としては原核生物又は真核生物のいずれも用いることができる。原核生物としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌が挙げられる。また、真核生物としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母；ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ、Ｃ１２３細胞等の動物細胞、あるいはＳｆ９、ＳＦ１２等の昆虫細胞などが挙げられる。
上記の形質転換細胞を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、例えば、２５〜３５℃で１２〜４８時間程度行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、目的タンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のタンパク質採取する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的タンパク質を単離精製することができる。
（５）活性型サイトカイニン合成
本発明においては、上記のＬＯＧ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換した形質転換体を培地に培養する際に、該培地にヌクレオチド型サイトカイニンを基質として添加することにより、培養物中に活性型サイトカイニンを合成することができる。基質として用いるヌクレオチド型サイトカイニンは前述のとおりである。
また、より増殖能の高い形質転換体を用いた方が、単位培養液及び単位時間当たりの活性型サイトカイニン生産量が高くなるため、まず前培養によって形質転換体を活性化させ、これを活性型サイトカイニン生産用の本培養の培地に接種して培養を行うことが好ましい。
前培養及び本培養用培地中の基質含有量は、培地中の固形分換算で０．１〜１．０％程度である。形質転換体の培地への使用量は、例えば、菌体を接種する場合、培地１Ｌあたり、１〜１００ｍｇ程度であればよく、基質含有量により適宜増減すればよい。
基質は培養開始時にその全量を添加しても、培養中に連続的又は間欠的に添加してもよい。また、生成した活性型サイトカイニンを培養終了後に一括して取り出しても、培養中に連続的又は間欠的に取り出してもよい。
培養は、培養液中の所望の活性型サイトカイニン生成量が最高に達した時点で終了させる。培養液中の活性型サイトカイニンは、培養終了後、常法によって培養液から精製する。精製は、当該技術分野において通常使用されている周知の手段、例えば、ろ過、遠心分離、イオン交換又は吸着クロマトグラフィー、溶媒抽出等の操作が必要に応じて、適宜組み合わせて行えばよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
組換えＬＯＧタンパク質の大腸菌による大量発現と精製
ＬＯＧ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ：ＡＫ０７１６９５（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；ＢＡＤ５２８８０（ｐｒｏｔｅｉｎ）；Ｔｉｇｒ  ｌｏｃｕｓ：ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４０６３０；ＲＡＰ  ｌｏｃｕｓ：ＯＳ０１ｇ０５８８９００）は２４２アミノ酸からなるタンパク質をコードすると予想され、ＮＣＢＩデータベース上（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）ではリジン脱炭酸酵素としてその機能が予測されていた。しかし、ＬＯＧ遺伝子に相同性を示す遺伝子が、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｓｃｉｅｎｓのｆａｓ  ｌｏｃｕｓやＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓのＲｉプラスミド上において、サイトカイニン生合成の初発反応を触媒するｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＩＰＴ）の極近傍に存在することから、以下の実験を行って、ＬＯＧタンパク質のもつ機能について検討した。
まず、ＬＯＧ遺伝子ｃＤＮＡのタンパク質コード領域を大腸菌によるＨｉｓ−ｔａｇタンパク質発現ベクターであるｐＣＯＬＤ−Ｉ（ＴａＫａＲａ）に挿入したプラスミド（ｐＣＯＬＤ−ＬＯＧ）を構築した。これを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）［ｐＧ−Ｔｆ２］に形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ寒天培地上にまくことによって、形質転換大腸菌のコロニーを得た。この大腸菌コロニーを５０μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で３７℃終夜培養した後、その終夜培養液３０ｍＬを１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１ｎｇ／ｍＬテトラサイクリンを含む改変Ｍ９培地（Ｍ９  ｓａｌｔ，１Ｍ  ｓｏｒｂｉｔｏｌ，１％ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ，２％ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４，０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２，１０μｇ／ｍＬ  ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ，２．５ｍＭ  ｂｅｔａｉｎｅ）２７０ｍＬに加え、ＯＤ６００＝０．５程度になるまで３７℃で振とう培養した。この液体培地を１５℃の水浴に移し３０分間静置後、終濃度０．５ｍＭになるように１Ｍ  ＩＰＴＧを加え、さらに２５時間１５℃で振とう培養したのち、遠心により大腸菌細胞を回収した。
大腸菌からのタンパク質抽出とニッケルＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎによるＬＯＧタンパク質の精製は、以下の方法で行った。まず、大腸菌ペレットを６ｍＬのＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ  ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ），ｐＨ８．０］に懸濁し、ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｘ１００，Ｓｉｇｍａ）６０μＬと６ｍｇの塩化リゾチームを加え、氷上で３０分間静置した。その後、超音波破砕機（タイテック）で大腸菌細胞を破壊した。破壊条件は、マイクロチップ使用、２０秒×８回，ｄｕｔｙ  ｃｙｃｌｅ５０％，ｏｕｔｐｕｔ５とした。この破砕液を３０，０００ｇ，４℃で５０分間遠心し、上清を予めＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで平衡化したニッケルＮＴＡ  ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎ（Ｑｉａｇｅｎ）で作ったカラムに通した（カラム体積１ｍＬ）。洗浄バッファー［５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，１５％（ｗ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｐＨ８．０］２０ｍＬで２回カラムを洗浄後、溶出バッファー［５０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，２５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，１５％（ｗ／ｖ）ｇｌｙｃｅｒｏｌ，ｐＨ８．０］でＨｉｓ−ｔａｇ  ＬＯＧタンパク質を溶出した。最終精製標品の純度をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって確認し（図１）、以後の実験に使用した。
【実施例２】
【０００７】
組換えＬＯＧタンパク質の酵素活性の検出
実施例１で得られた組換えＬＯＧタンパク質３μｇを、サイトカイニン各種を基質として反応させた。用いたサイトカイニン基質は、Ｎ６−（ｄｅｌｔａ−２−ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ）ａｄｅｎｉｎｅ（ｉＰ），ｔｒａｎｓ−ｚｅａｔｉｎ（ｔＺ），ｃｉｓ−ｚｅａｔｉｎ（ｃＺ），ｉＰ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ（ｉＰＲ），ｔＺ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ（ｔＺＲ），ｃＺ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ（ｃＺＲ），ｉＰＲ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｉＰＲＭＰ），ｔＺＲ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｔＺＲＭＰ）の８種である。反応条件は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５０μＭ基質，ｐＨ７で、３０℃で２時間インキュベートし、反応液体積は１００μＬとした。２０％酢酸を１０μＬ加えることで反応を止め、１５，０００ｒｐｍにて２０分間室温で遠心し、上清２０μＬをＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５／ＰＤＡ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ２９９６）による液体クロマトグラフィーにより解析した。カラムはＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８，３．５μｍ，２．１×１００ｍｍ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた。溶出は溶媒Ｃ（１００％ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ），溶媒Ｄ（２％ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）を用い、溶出条件および溶媒の濃度勾配プログラムは下記表１の通りである。
【表１】
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基質及び反応生成物は２７０ｎｍの吸収でモニターした。解析の結果、ｉＰ，ｔＺ，ｃＺ，ｉＰＲ，ｔＺＲ，ｃＺＲを基質にした場合には基質への反応性は全く認められなかったが、ｉＰＲＭＰ，ｔＺＲＭＰを基質にした場合には、それぞれの基質が全てｉＰとｔＺに変換されていた。図２に各基質標品混合物のクロマトグラムと、ｔＺ，ｉＰＲＭＰ，ｔＺＲＭＰを基質にした場合の反応生成物のクロマトグラムを示す。ｉＰ，ｃＺ，ｉＰＲ，ｔＺＲ，ｃＺＲを基質にした場合の結果は、ｔＺの場合と同様であったため省略した。
【実施例３】
【０００８】
ＬＯＧタンパク質のリジンに対する反応性
ＬＯＧタンパク質は従来、リジン脱炭酸酵素と予想されていたので、リジンに対する反応性の有無について検討した。組換えＬＯＧタンパク質３μｇを、５００ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ６．０，５ｍＭ  Ｌ−ｌｙｓｉｎｅから成る反応液１００μＬ中で４０℃、６０分間インキュベートした。そこへ２０％ｔｒｉｃｈｌｏｒｏａｃｅｔａｔｅを３４μＬ加え、１０，０００ｇで２０分間遠心後、上清１００μＬを用いてベンゾイル化した。具体的操作は以下の通りである。反応液１００μＬに２Ｎ  ＮａＯＨを１００μＬ加え、さらにｂｅｎｚｏｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅを０．５μＬ加えた後、室温で２０分間静置した。そこへ飽和ＮａＣｌ溶液を２００μＬ、ｄｉｅｔｈｙｌｅｔｈｅｒを２００μＬ加え、撹拌、遠心後、上層を回収した。これを減圧乾燥後、１００μＬのメタノールに溶解し、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５／ＰＤＡ  ｄｅｔｅｃｔｏｒ２９９６）による液体クロマトグラフィーにより解析した。カラムはＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８，３．５μｍ，２．１×１００ｍｍ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ｗａｔｅｒｓ）を用い、溶出は溶媒Ａ（ＭｉｌｌｉＱ水），溶媒Ｂ（１００％ｍｅｔｈａｎｏｌ）を用い、溶出条件および溶媒の濃度勾配プログラムは下記表２の通りである。
【表２】
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基質及び反応生成物は２２６ｎｍの吸収でモニターした。リジン脱炭酸酵素により生ずる精製物質はカダベリンと予想されるので、カダベリン標品１ｎｍｏｌを別途インジェクトし、反応生成物の溶出時間を特定した。図３に示したように、ＬＯＧタンパク質はリジンに対する反応性を示さなかった。よってデータベース上で予想されているリジン脱炭酸酵素としての機能は持たないものと判断した。
【実施例４】
【０００９】
ヌクレオチド型サイトカイニン体に対する基質特異性の有無の検討
ＬＯＧタンパク質のヌクレオチド型サイトカイニン体に対する反応特異性を検討した。同時にＡＭＰに対する反応性の有無についても検討した。基質として、ｉＰＲＭＰ，ｔＺＲＭＰ，ｄｉｈｙｄｒｏｚｅａｔｉｎ  ｒｉｂｏｓｉｄｅ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＺＲＭＰ），ｃＺＲ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＺＲＭＰ），ｉＰＲ５’−ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｉＰＲＤＰ），ｉＰＲ５’−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｉＰＲＴＰ），ＡＭＰの７種類を用いた。反応条件は以下の通りである。１反応につき０．０２μｇのＬＯＧタンパク質を用い、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ６．５の反応液２００μＬ中で、基質濃度１００μＭで反応開始後０分，４分で６００μＬの冷アセトンを加えることで反応を停止し、−８０℃で３０分間静置後、１５，０００ｒｐｍ，２０分間遠心し、上清を遠心濃縮機で乾固させた。それらを２％酢酸１００μＬに溶解し、実施例２の液体クロマトグラフィーと同じ条件で反応生成物を検出・定量した。インジェクション量のみ５０μＬに変更した。なお、ｉＰＲＤＰ，ｉＰＲＴＰについては反応液量１００μＬとし、使用タンパク質量は０．０１μｇ、反応時間は２分間とした。
図４の結果から、ＬＯＧタンパク質はｉＰＲＭＰの他に、ｔＺＲＭＰ，ＤＺＲＭＰ，ｃＺＲＭＰなどのサイトカイニンヌクレオシド５’−一リン酸を基質にすることが明らかになった。ただし、ＡＭＰやｉＰＲＤＰ，ｉＰＲＴＰには全く反応性を示さなかった。
本結果から、ＬＯＧタンパク質はデータベース上ではリジン脱炭酸酵素としてその機能が予測されているものの、実際にはヌクレオチド型サイトカイニンからリボース５’−一リン酸を外し、塩基体の活性型サイトカイニンを生成する、全く新規の反応を触媒する酵素であることが判明した。ＬＯＧタンパク質が触媒する反応を図５に示す。以上の結果から、ＬＯＧタンパク質は、ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ５’−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｈｙｄｒｏｌａｓｅが慣用名として適切であるといえる。
【実施例５】
【００１０】
ｉＰＲＭＰ及びｔＺＲＭＰに対するＫｍ値の測定
代表的な基質であるｉＰＲＭＰとｔＺＲＭＰに対するＫｍ値を求めるため、以下の実験を行った。１反応につき０．０２μｇのＬＯＧタンパク質を用い、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ６．５の反応液２００μＬ中で、基質濃度５，８，１５，３０，１００μＭで反応させ、反応開始後０，２，４分で６００μＬの冷アセトンを加えることで反応を停止し、−８０℃で３０分間静置後、１５，０００ｒｐｍ，２０分間遠心し、上清を遠心濃縮機で乾固させた。それを１００μＬの２％酢酸に溶解し、実施例２の液体クロマトグラフィーと同じ条件で反応生成物を検出・定量した。なお、インジェクション量のみ５０μＬに変更した。以上の実験を３連で行い、Ｋｍ値を算出した。その結果、ｉＰＲＭＰに対するＫｍ値は１１．７±１．４μＭ、比活性は５．６μｍｏｌ・ｍｉｎ−１・ｍｇ−１ｐｒｏｔｅｉｎ、ｔＺＲＭＰに対するＫｍ値は２２．０±３．６μＭ、比活性は４．２μｍｏｌ・ｍｉｎ−１・ｍｇ−１ｐｒｏｔｅｉｎであった。
【実施例６】
【００１１】
シロイヌナズナＬＯＧホモログ遺伝子（ＡｔＬＯＧｓ）のｃＤＮＡ単離
イネだけでなくシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）においても、ＬＯＧタンパク質と同様の機能を持つサイトカイニン活性化酵素が存在しているかどうかについての調査を行った。まず、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）においてＬＯＧタンパク質のアミノ酸配列をもとにｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ検索を行い、シロイヌナズナにおける相同性遺伝子を探索した。その結果、ＬＯＧタンパク質と高い相同性を持つタンパク質をコードすると予測される９つのシロイヌナズナ遺伝子ＡｔＬＯＧ１〜９（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ＬＯＧ１〜９；表３）を発見した。これらの遺伝子が、シロイヌナズナ植物体においてＴＡＩＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）で予測されているｍＲＮＡ配列として転写されているかどうかについての調査を行った。シロイヌナズナ植物体からｍＲＮＡを抽出し、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型として、推測されるタンパク質コード領域を増幅させるように設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。その結果、ＡｔＬＯＧ１，２，３，４，５，７，８に関してＴＡＩＲデータベースにおいて予測されたｃＤＮＡ配列と同一の配列の増幅断片を得ることに成功した。これら７遺伝子の産物について、イネＬＯＧタンパク質と同様のサイトカイニン活性化酵素としての機能を持っていることが予想された。そこで、これら７遺伝子のｃＤＮＡ配列をイネＬＯＧ  ｃＤＮＡと同様の方法で大腸菌によるタンパク質の発現誘導及び精製を行った。最終精製標品の純度をＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動によって確認し（図６）、以後の実験に使用した。
【表３】
2008029942.tif 000006
【実施例７】
【００１２】
シロイヌナズナＬＯＧホモログタンパク質（ＡｔＬＯＧｓ）のＬＯＧ酵素活性の確認
精製されたＡｔＬＯＧタンパク質について、実施例２と同じ反応条件において酵素活性を評価したところ、ＬＯＧタンパク質と同様にｉＰＲＭＰ、ｔＺＲＭＰ，ＤＺＲＭＰ，ｃＺＲＭＰなどのサイトカイニンヌクレオシド５’−一リン酸を基質にすることが明らかになった（図７）。ＬＯＧタンパク質と同様にＡＭＰやｉＰＲＤＰ，ｉＰＲＴＰにはほとんど反応性を示さなかった。また、実施例５と同様にして各ＡｔＬＯＧタンパク質のｉＰＲＭＰに対する酵素特性を決定した（表４）。表４中、Ｋｍ，Ｖｍａｘ，ｋｃａｔ値は各ＡｔＬＯＧタンパク質の至適ｐＨの条件における反応を元に計算した。±は、同一条件で３回行った結果を元に計算した標準偏差を示す。
【表４】
2008029942.tif 000007
【実施例８】
【００１３】
シロイヌナズナＬＯＧホモログ遺伝子（ＡｔＬＯＧｓ）の過剰発現形質転換体の作成
シロイヌナズナにおいてサイトカイニン活性化酵素遺伝子ＡｔＬＯＧｓを過剰に発現させたときの植物体への影響を調査した。転写産物の酵素活性の存在が確認された遺伝子ＡｔＬＯＧ１，２，３，４，５，７，８のうちＡｔＬＯＧ４，７について、酵素活性において単離されたｃＤＮＡを、ＧＵＳ遺伝子が除かれたプラスミドｐＢＩ１２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のタバコモザイクウイルス３５Ｓプロモーターの下流に挿入した。合成されたプラスミドをアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に導入し、ＰＣＲによりプラスミドの導入が確認されたアグロバクテリウムを野生型シロイヌナズナに感染させた。採取した種子をカナマイシン５０ｎｇ／ｍｌを含むＭＳ培地に播種した。ｐＢＩ１２１のＴ−ＤＮＡ領域にはカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）が存在していることを利用し、カナマイシン耐性を示す個体を選抜した。遺伝子導入が成功したカナマイシン耐性の系統（以下３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４，３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７と呼ぶ）を各２６系統選抜した。選抜されたＴ１世代の３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４，３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体は互いに類似した表現型を示した。
ロゼット葉から抽出したＴ１世代の３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４（系統♯６，♯２６），３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７（系統♯３，♯２６）形質転換体のｍＲＮＡを逆転写反応により合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＡｔＬＯＧ４，７遺伝子およびＡｃｔｉｎ２遺伝子の増幅用プライマーを用いて半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析を行った。対照として野生型ロゼット葉由来のｃＤＮＡ（ＷＴ）を用いた。ＲＴ−ＰＣＲ反応はＡｔＬＯＧ４において２５サイクルで、Ａｃｔｉｎ２とＡｔＬＯＧ７において３５サイクルで行った。その結果、各２系統の植物体についてＡｔＬＯＧ４およびＡｔＬＯＧ７遺伝子の過剰な発現が確認された（図８）。
【実施例９】
【００１４】
シロイヌナズナＬＯＧホモログ遺伝子（ＡｔＬＯＧｓ）の過剰発現形質転換体の表現型
３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４，３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体は互いに類似した表現型を示し、表現型はＴ１世代からＴ２世代へ受け継がれていることが確認された。３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４，３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体は発芽後１週間目前後までは野生型と特に形態的に異常がみられないが、ロゼット葉が多く形成し発達する発芽後２週間目前後から顕著な形態の異常がみられた。３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４，３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体は葉脈に沿って深い緑色のロゼット葉を形成した（図９）。７０％エタノールで固定し脱色させると、野生型と比べて葉の維管束が顕著に発達していることが観察された（図１０）。そこで葉の横断面を観察すると、導管の異所的な形成など、維管束系に顕著な形態異常がみられた（図１１）。また、葉の老化が遅い現象もみられた（図１２）。
野生型では花茎が抽苔したあとしばらくは側芽が発達しないが、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４，３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体においては抽苔後すぐに複数の側芽が発達し葉が展開していた（図１３）。また、シロイヌナズナは通常、総状花序の形態を示すが、３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ４，３５Ｓ：：ＡｔＬＯＧ７形質転換体では花序の軸が直線にならずに互散花序に近い形態を示した（図１４）。さらに、さやに付ける種のサイズと重量が野生型と比較して顕著に大きくなっていることが観察された（図１５、１６）。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明によれば、これまでリジン脱炭酸酵素タンパク質をコードする遺伝子とされていたイネ遺伝子に、サイトカイニンの生合成経路におけるヌクレオチド型サイトカイニンから活性型サイトカイニンの合成反応（サイトカイニンの活性化反応）を触媒する機能があることが新たに解明された。従って、従来はサイトカイニンの分解反応を改変することででしか可能でなかった活性型サイトカイニン（塩基体）量の制御が、本遺伝子を利用することにより直接的に行うことが可能となる。さらに、本遺伝子を過剰発現させた植物体では、花茎数の増加、大きな種子の形成、太い葉脈の形成、花序の変更などの形質変化が認められ、農作物の収量増産、切花、観葉植物などの表現形質の多様化による商品価値の向上が期待できる。
［配列表］
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１６】
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【図１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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