(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、ａβの残基１−１０内のエピトープに特異的に結合するキメラ抗体またはヒト化抗体を含んで成る、患者のアルツハイマー病またはダウン症候群または認知障害を予防または処置するための製薬学的製剤。
【請求項２】
抗体のアイソタイプがＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である請求項１記載の製薬学的製剤。
【請求項３】
抗体が
Ａβの残基１‐６、
Ａβの残基１‐４、
Ａβの残基１−３、または
Ａβの残基３−６
内のエピトープに特異的に結合する、請求項１または２に記載の製薬学的製剤。
【請求項４】
抗体がＡβの遊離Ｎ-末端残基を含んで成るエピトープに特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか一つに記載の製薬学的製剤。
【請求項５】
抗体がＡβの残基１−１０内のエピトープに結合し、ここでＡβの残基１および／または残基７はイソ−アスパラギン酸である、請求項１〜４のいずれか一つに記載の製薬学的製剤。
【請求項６】
抗体が軽鎖および重鎖の同じ対の２コピーを含んで成る、請求項１〜５のいずれか一つに記載の製薬学的製剤。
【請求項７】
抗体が、Ａβのエピトープに特異的に結合する第一の軽鎖および重鎖対、ならびにミクログリア細胞上のＦｃレセプターに特異的に結合する第二の軽鎖および重鎖対を含んで成る二重特異性抗体である、請求項１〜５のいずれか一つに記載の製薬学的製剤。
【請求項８】
抗体の一つの鎖がヘテロロガスなポリペプチドに融合している、請求項１〜１１のいずれか一つに記載の製薬学的製剤。
【請求項９】
抗体が完全長のアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）には結合せずに、Ａβペプチドに特異的に結合する、請求項１〜８のいずれか一つに記載の製薬学的製剤。
【請求項１０】
Ａβの異なるエピトープに結合する少なくとも１種の他の抗体をさらに含んで成る、請求項１〜９のいずれか一つに記載の製薬学的製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】（技術分野）
関連出願との関係
本出願は、1999年５月28日に出願されたUSSN 09/322,289号の一部継続出願であり、これはすべての目的のために引用により全部、本明細書に編入する。
【０００２】                              技術分野
本発明は、免疫学および医学の技術分野に属する。
【０００３】                              発明の背景
アルツハイマー病（AD）は、老年痴呆をもたらす進行性の疾患である。一般にはSelkoe,TINS,16,403-409(1993)；Hardy et al.,国際公開第92/13069号明細書；Selkoe,J.Neuroathol.Exp.Neurol.53,438-447(1994)；Duff et al.,Nature 373,476-477(1995)；Games et al.,Nature 373,523(1995)を参照にされたい。おおまかにこの疾患は２つの範疇に分けられる：高齢（65＋年）に発生する後期発生、および老年期からかなり前、すなわち35から60歳の間に発生する早期発生。両種類の疾患において、病状は同じであるが、より若い年代で始まる場合が異常はより重篤であり、しかも広範になる傾向がある。この疾患は脳内の少なくとも２種類の創傷、老人性斑および神経細線維変化が特徴である。老人性斑は、脳組織の切片の顕微鏡分析により中央で見ることができる細胞外のアミロイド沈着物を含む最高150μmにわたる組織崩壊した神経網の領域である。神経細線維変化は、対になって互いにねじれた２つのフィラメントから成るτタンパク質に結合した微小管の細胞内沈着物である。
【０００４】  斑の主要構成成分は、Ａβまたはβ-アミロイドペプチドと呼ばれるペプチドである。Ａβペプチドは、アミロイド前駆体タンパク質（APP）と呼ばれる前駆体タンパク質の39〜43アミノ酸の内部フラグメントである。APPタンパク質内の幾つかの突然変異がアルツハイマー病の存在と関連した。Goat et al.,Nature 349,704)(1991)（バリン717からイソロイシン）；Chartier Harlran et al.,Nature 353,844(1991)（バリン717からグリシン）；Murrell et al.,Science 254,97(1991)（バリン717からフェニルアラニン）；Mullan et al.,Nature Genet.1,345(1992)（リシン595-メチオニン596からアスパラギン595-ロイシン596への二重突然変異変化）を参照にされたい。そのような突然変異は、APPからＡβへの増加または改変したプロセッシングにより、特にAPPの増加した量のＡβの長い形態（すなわち、Ａβ1-42およびＡβ1-43）へのプロセッシングによりアルツハイマー病を引き起こすと考えられている。プレセニリン（presenilin）遺伝子、PS1およびPS2のような遺伝子他の遺伝子の突然変異は、APPのプロセッシングに間接的に影響を及ぼし、長い形態のＡβの量を増加させると考えられている（Hardy,TINS 20,154(1997)を参照にされたい）。このような考察は、Ａβそして特にその長い形態がアルツハイマー病の原因であることを示している。
【０００５】  McMichael、欧州特許第526,511号明細書では、Ａβのホメオパティックな投薬用量（10-2mg／日以下）を安定化される前のＡＤ患者に投与することを提案している。約５リットルの血漿を有する典型的なヒトでは、この投薬用量の上限は多くても２pg／mlの濃度を生じると予想される。ヒトの血漿中のＡβの正常な濃度は、典型的には50〜200pg/mlの範囲である（Seubert et al.,Nature 359,325-327(1992)）。欧州特許第526,511号明細書で薦める投薬用量は循環している内因性のＡβレベルを単に上昇させるだけであるので、しかも欧州特許第526,511号明細書では免疫刺激剤としてアジュバントの使用をすすめていないので、治療的利益を生じるとは思えない。
【０００６】  対照的に本発明は、患者に有益な免疫応答を生じる条件下で、ＡβのフラグメントまたはＡβ内の特定のエピトープに対する抗体を患者に投与することにより、とりわけアルツハイマー病および他のアミロイド形成疾患を処置することを対象とする。すなわち本発明は、神経病理学、そして患者の中にはアルツハイマー病に付随する認知障害を予防または緩和するための治療的処方について、長い間の必要性を満たす。
【０００７】  本出願は、1998年11月30日に出願された国際公開第99/27944号明細書、1997年12月2日に出願されたUSSN 60/067,740号明細書、1998年4月7日に出願されたUSSN 60/080,970号明細書および1998年11月30日に出願されたUSSN 09/201,430号明細書に関連し、すべての目的について各々を全部、引用により本明細書に編入する。
【０００８】                        特許請求する発明の要約
１つの観点では、本発明は患者の脳内のＡβのアミロイドの沈着物が関係する疾患を予防または処置する方法を提供する。そのような疾患には、アルツハイマー病、ダウン症候群および認知障害を含む。後者はアミロイド形成疾患の他の特徴を含んでも、含まなくても生じ得る。幾つかの方法は、アミロイド沈着物の成分に特異的に結合する抗体の有効用量を患者に投与することを必要とする。そのような方法は、ヒト患者のアルツハイマー病を予防または処置するために特に有用である。幾つかの方法は、Ａβに結合する抗体の有効用量を投与することを必要とする。幾つかの方法は、Ａβの残基1-10内のエピトープに特異的に結合する抗体の有効用量を投与することを必要とする。幾つかの方法では、抗体はＡβの残基1-6内のエピトープに特異的に結合する。幾つかの方法では、抗体はＡβの残基1-5内のエピトープに特異的に結合する。幾つかの方法では、抗体はＡβの残基1-7内のエピトープに特異的に結合する。幾つかの方法では、抗体はＡβの残基3-7内のエピトープに特異的に結合する。幾つかの方法では、抗体はＡβの残基1-3内のエピトープに特異的に結合する。幾つかの方法では、抗体はＡβの残基1-4内のエピトープに特異的に結合する。幾つかの方法では、抗体はＡβの遊離Ｎ-末端残基を含んで成るエピトープに結合する。幾つかの方法では、抗体はＡβの1-10の残基内のエピトープに結合し、ここでＡβの残基１および／または残基７はアルハラギン酸である。幾つかの方法では、抗体は完全長のアミロイド前駆体タンパク質（APP）に結合することなくＡβペプチドに特異的に結合する。幾つか方法では、抗体のアイソタイプはヒトIgG1である。
【０００９】  幾つかの方法では、抗体は患者のアミロイド沈着物に結合し、そしてアミロイド沈着物に対する除去（clearing）応答を誘導する。例えば、そのような除去応答はＦｃレセプターが媒介する食作用により行うことができる。
【００１０】  この方法は、無症候性患者および疾患の症状を現在示している患者の両方に使用することができる。そのような方法に使用する抗体は、ヒト、ヒト化、キメラまたは非ヒト抗体であることができ、そしてモノクローナルまたはポリクローナルであることができる。幾つかの方法では、抗体はＡβペプチドで免疫感作したヒトから調製され、このヒトは抗体で処置されるヒトであることができる。
【００１１】  幾つかの方法では、抗体は医薬組成物として医薬キャリアーと共に投与される。幾つかの方法では、抗体は0.0001〜100mg/kg、好ましくは少なくとも１mg/kg体重の抗体の用量で投与される。幾つかの方法では、抗体は長期間、例えば少なくとも６カ月間にわたり多回の投薬用量を投与される。幾つかの方法では、抗体は徐放性組成物として投与される。抗体は例えば、腹腔内、経口的、皮下、頭蓋内、筋肉内、局所的、鼻内または静脈内に投与することができる。
【００１２】  幾つかの方法では、抗体は少なくとも１つめ抗体鎖をコードするポリヌクレオチドを患者に投与することにより投与される。ポリヌクレオチドは、患者内で発現して抗体鎖を生成する。場合により、ポリヌクレオチドは抗体の重および軽鎖をコードする。ポリヌクレオチドは患者内で発現して重および軽鎖を生成する。幾つかの方法では、患者は患者の血中の投与された抗体レベルをモニタリングされる。
【００１３】  別の観点では、本発明は患者の脳内のＡβのアミロイド沈着物が関係する疾患を予防または処置する方法を提供する。例えばこの方法は、アルツハイマー病またはダウン症候群または認知障害を処置するために使用することができる。そのような方法は、Ａβ内の特定のエピトープに対する免疫原性応答を誘導するＡβのフラグメントまたはそれらの同族体を投与することを必要とする。幾つかの方法は、Ａβの少なくとも残基1-5のＮ-末端セグメントを含んで成るポリペプチドの有効用量を患者に投与することを必要とし、Ａβの第一残基がポリペプチドのＮ-末端残基であり、ここでポリペプチドにはＡβのＣ-末端セグメントが無い。幾つかの方法は、ＡβのＮ-末端セグメントを含んで成るポリペプチドの有効用量を患者に投与することを必要とし、セグメントはＡβの残基1-3で始まり、そしてＡβの残基7-11で終わる。幾つかの方法は、Ａβ43の残基12-43内のエピトープに対する免疫原性応答を誘導せずに、ＡβのＮ-末端セグメントに対する免疫原性応答を誘導する作用物質の有効用量を患者に投与することを必要とし、セグメントはＡβの残基1-3で始まり、そしてＡβの残基7-11で終わる。
【００１４】  上記の幾つかの方法では、ＡβのＮ-末端セグメントがそのＣ-末端でヘテロロガスなポリペプチドに連結されている。上記の幾つかの方法では、ＡβのＮ-末端セグメントがそのＮ-末端でヘテロロガスなポリペプチドに連結されている。上記の幾つかの方法では、ＡβのＮ-末端セグメントがそのＮおよびＣ末端で第一および第二のヘテロロガスなポリペプチドに連結されている。上記の幾つかの方法では、ＡβのＮ-末端セグメントがそのＮ末端でヘテロロガスなポリペプチドに連結し、そしてそのＣ-末端でＮ-末端セグメントの少なくとも１つのさらなるコピーに連結されている。上記の幾つかの方法では、ヘテロロガスなポリペプチドおよびそれによるＢ細胞応答はＮ-末端セグメントに対している。上記の幾つかの方法では、ポリペプチドはさらにＮ-末端セグメントの少なくとも１つのさらなるコピーを含んで成る。上記の幾つかの方法では、ポリペプチドはＮ-末端からＣ-末端、ＡβのＮ-末端セグメント、Ｎ-末端セグメントの複数のさらなるコピー、およびヘテロロガスなアミノ酸セグメントを含んで成る。上記の幾つかの方法では、Ｎ-末端セグメントはＡβ1-7から成る。上記の幾つかの方法では、Ｎ-末端セグメントはＡβ3-7から成る。
【００１５】  幾つかの方法では、フラグメントはＡβ43内の少なくとも５個のＣ-末端アミノ酸を含まない。幾つかの方法では、フラグメントはＡβからの最高10個の連続するアミノ酸を含んで成る。フラグメントは典型的には患者に１用量あたり10マイクログラムより多く投与される。
【００１６】  幾つかの方法では、フラグメントはＡβペプチドに対する免疫応答を強化するアジュバントと共に投与される。アジュバントおよびフラグメントは、いずれかの順序で、または組成物として一緒に投与することができる。アジュバントは例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、MPL(商標)、QS-21（Stimulon(商標))または不完全フロイントアジュバントであることができる。
【００１７】  本発明はさらに、Ａβのフラグメントまたは上記のようなＡβの同じエピトープに対する免疫原性応答を誘導する他の作用物質、およびアジュバントを含んで成る医薬組成物を提供する。本発明はまた、上記の任意の抗体および医薬的に許容され得るキャリアーを含んで成る医薬組成物も提供する。
【００１８】  別の観点では、本発明は患者の脳内のＡβの沈着物が関係する疾患（例えばアルツハイマー病）の処置における活性について、抗体をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、抗体を、Ａβの１と３の間の残基で始まるＡβのＮ-末端セグメントの少なくとも５個の連続するアミノ酸を含んで成るポリペプチドと接触させることを必要とし、ポリペプチドにはＡβのＣ-末端セグメントが無い。次に抗体がポリペプチドに特異的に結合するかどうかを決定し、特異的結合は抗体が疾患の処理に活性を有することの指標を提供する。
【００１９】  別の観点では、本発明は抗原が会合した生物学的物体の除去における活性について、抗体をスクリーニングする方法を提供する。そのような方法は、抗原に会合した生物学的物体および抗体およびＦｃレセプターを持つ食作用細胞を、媒質中で合わせることを必要とする。媒質中に残る抗原が会合した生物学的物体の量をモニタリングする。抗原が会合した生物学的物体の量の減少は、抗体が抗原に会合した生物学的物体に対する除去活性を有することを示す。抗原は組織サンプルまたは単離された形態として提供され得る。例えば抗原は、アルツハイマー病患者またはアルツハイマーの病状を有する哺乳動物の脳に由来する組織サンプルとして提供され得る。抗体の除去活性が試験される他の組織サンプルには、ガン性組織サンプル、ウイルスに感染した組織サンプル、炎症性細胞、非悪性の異常な細胞増殖を含んで成る組織細胞、または異常な細胞外マトリックスを含んで成る組織サンプルが含まれる。
【００２０】  別の観点では、本発明は患者のアミロイド沈着物を検出する方法を提供する。そのような方法は、Ａβのアミノ酸1-10内のエピトープに特異的に結合する抗体を患者に投与し、そして患者の脳内に抗体の存在を検出することを必要とする。幾つかの方法では、抗体はＡβの残基4-10内のエピトープに特異的に結合する。幾つかの方法では、抗体が常磁性標識で標識され、そして核磁気共鳴断層撮影法により検出される。
【００２１】  本発明はさらに、上記方法に使用するために適する診断キットを提供する。そのようなキットは、Ａβの残基1-10内のエピトープに特異的に結合する抗体を含んで成る。幾つかのキットは、アルツハイマー病をインビボ診断またはモニタリングする抗体の使用を記載するラベルを有する。
【００２２】                                定義
用語「実質的に同一」とは、２つのペプチド配列をプログラムGAPまたはBESTFITによりデフォルトギャップ加重値を使用して最適に並べた時、少なくとも65パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも80または90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセント以上（例えば99パーセント以上の配列同一性）の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは同一ではない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００２３】  配列比較に関しては、典型的には１つの配列が参照配列として作用し、それに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用して、試験および参照配列をコンピューターに入力する時、必要ならば配列の座標を設計し、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを設計する。次に配列比較アルゴリズムは、設計されたプログラムのパラメーターに基づき、参照配列に対して試験配列（１つまたは複数）のパーセント配列同一性を計算する。
【００２４】  比較のための最適な配列の整列は、例えばSmith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)の部分的相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性整列アルゴリズムにより、Pearson & Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)の類似性方法に関する調査により、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行により（ウィスコンシン州、マジソンの575 サイエンスドクター、遺伝子コンピュータグループのウィスコンシン 遺伝子ソフトウェア パッケージ中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)、あるいは視覚的観察により（一般的に、Ausubel et al.,同上を参照にされたい）行うことができる。パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適するアルゴリズムの１例は、BLASTアルゴリズムであり、これはAltschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)に記載されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、バイオテクノロジー情報に関する国立センター（National Center for Biotechnology Information）を通して公に入手可能である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。典型的にはデフォルトプログラムのパラメーターを使用して配列比較を行うことができるが、カスタマイズされたパラメーターも使用することができる。アミノ酸配列に関しては、BLASTPプログラムはデフォルトとして３のワード長（W）、10の予想値（Ｅ）およびBLOSUM62 スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,10915(1989)を参照にされたい）。
【００２５】  保存的または非保存的とアミノ酸置換を分類する目的で、アミノ酸を以下のように分類する：グループI（疎水性側鎖）：ノルロイシン、met、ala, leu, ile；グループII（中性の親水性側鎖）：cys、ser、thr；グループIII（酸性側鎖）：asp、glu；グループIV（塩基性側鎖）：asn、gln、his、lys、arg；グループV（鎖の方向に影響を与える残基）：gly、pro；およびグループVI（芳香族側鎖）：trp、tyr、phe。保存的置換には同じ種類中のアミノ酸間での置換を含む。非保存的置換は、これらの１種類の員を別の種類の員と交換することから成る。
【００２６】  本発明の治療薬は、典型的には望ましくない混入物の混じりがない。これは薬剤が典型的には少なくとも約50重量／重量％の純度であり、ならびに実質的に妨害タンパク質および混入物を含まないことを意味する。時折、この薬剤は少なくとも80重量／重量％、そしてより好ましくは少なくとも90または約95重量／重量％の純度である。しかし通例のタンパク質精製法を使用して、少なくとも約99重量／重量％の均一なペプチドを得ることができる。
【００２７】  ２つの物体間の特異的結合とは、少なくとも106、107、108、109M-1または1010M-1の親和性を意味する。108M-1より大きい親和性が好ましい。
【００２８】  用語「抗体」または「免疫グロブリン」とは、完全な抗体およびそれらの結合フラグメントを含むように使用する。典型的には、フラグメントはそれらが由来した完全な抗体と抗原フラグメントに対する特異的結合を競合し、フラグメントには別れた重鎖、軽鎖Fab、Fab'F(ab')2、FabcおよびFvを含む。フラグメントは組換えDNA法により、または完全な免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離により生成される。または用語「抗体」は他のタンパク質との融合タンパク質として、化学的に結合または発現された１以上の免疫グロブリン鎖を含む。また用語「抗体」は、二重特異性抗体も含む。二重特異性または二官能性抗体は、２種類の重／軽鎖対および２種類の結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'フラグメントの連結を含め、種々の方法により生成することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990)；Kostelny et al.,J.Immumol.148,1547-1553(1992)を参照にされたい。
【００２９】  APP695、APP751およびAPP770とは、それぞれヒトAPP遺伝子によりコードされる695、751および770アミノ酸残基長のポリヌクレオチドを称する。Kang et al.,Nature 325,773(1987)；Ponte et al.,Nature 331,525(1988)；およびKitaguchi et al.,Nature 331,530(1988)を参照にされたい。ヒトのアミロイド前駆体タンパク質（APP）内のアミノ酸は、APP770アイソフォームの配列に従い番号が割り当てられている。Ａβ39、Ａβ40、Ａβ41、Ａβ42およびＡβ43のような用語は、アミノ酸残基１−39、１−40、１−41、１−42および１−43を含むＡβペプチドを言う。
【００３０】  「抗原」とは、抗体が特異的に結合する物体である。
【００３１】  用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、Ｂおよび／またはＴ細胞が反応する抗原上の部位を称する。Ｂ-細胞エピトープは、隣接アミノ酸またはタンパク質の３次元折り畳みにより並列した非隣接アミノ酸の両方から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒に暴露されてもそのままであるが、３次元的な折り畳みにより形成されたエピトープは、典型的には変性溶媒を用いた処理で失われる。エピトープは典型的には少なくとも３個、そしてより多くは少なくとも５または８〜10個のアミノ酸を独特な空間的立体配置で含む。エピトープの空間的立体配置を決定する方法は、例えばｘ−線結晶回折および２次元核磁気共鳴を含む。例えば、エピトープ  マッピング  プロトコール  イン  メソッズ  イン  モレキュラー  バイオロジー（Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology)、第66巻、Glenn E.Morris,編集(1996)を参照にされたい。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する１抗体の能力を示す単純な免疫アッセイで同定守ることができる。Ｔ-細胞は、CD8細胞について約９個のアミノ酸またはCD4細胞について約13〜15個のアミノ酸の連続するエピトープを認識する。エピトープを認識するＴ細胞は、エピトープに応答して、適用したＴ細胞による3Ｈ-チミジンの取り込みにより測定されるような、抗原−依存的増殖を測定するインビトロアッセイにより（Burke et al.,J.Inf.Dis.170,1110-19(1994)、抗原−依存的致死作用により（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、Tigges et al.,J.Immunol.156,3901-3910)、またはサイトカイン分泌により同定することができる。
【００３２】  用語「免疫学的」または「免疫」応答とは、受容する患者中のアミロイドペプチドに対する有益な体液性（抗体により媒介される）および／または細胞性（抗原特異的なＴ細胞またはそれらの分泌産物により媒介される）応答である。そのような応答は免疫原の抗原により誘導される能動的応答、あるいは抗体または適用したＴ細胞の投与により誘導される受動的応答であることができる。細胞性免疫応答は、抗原特異的なCD4+Ｔヘルパー細胞および／またはCD8+細胞傷害性Ｔ細胞を活性化するために、クラスIまたはクラスIIMHC分子に会合したポリペプチドエピトープの提示により誘導される。応答は単球、マクロファージ、NK細胞、好塩基球、樹状細胞、星状細胞、ミクログリア細胞、好酸球または他の先天性免疫成分の活性化も含むことができる。細胞性免疫学的応答の存在は、増殖アッセイ（CD4+Ｔ細胞）またはCTL（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイにより測定することができる（Burke、同上；Tigges、同上を参照にされたい）。免疫原の防御的または治療的効果に対する体液性および細胞性応答の相対的貢献度は、抗体およびＴ細胞を免疫感作した同系動物から別個に単離し、そして防御的または治療的効果を第二個体で測定することにより識別することができる。
【００３３】  「免疫原性作用物質（immunogenic agent）」または「免疫原」は、場合によりアジュバントと一緒に哺乳動物に投与すると、それに自身に対する免疫学的応答を誘導することができる。
【００３４】  用語「裸（naked）のポリヌクレオチド」とは、コロイド状の材料を複合していないポリヌクレオチドを称する。裸のポリヌクレオチドは時折、プラスミドベクター中にクローン化される。
【００３５】  用語「アジュバント」は、抗原と一緒に投与した時に抗原に対する免疫応答を増強するが、単独で投与した時には抗原に対する応答を生じない化合物を称する。アジュバントはリンパ球の再集合、Ｂおよび／またはＴ細胞の刺激、およびマクロファージの刺激を含む幾つかのメカニズムにより免疫応答を強化することができる。
【００３６】  用語「患者」には、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物個体を含む。
【００３７】  分かれたまたは単量体Ａβとは、Ａβの可溶性の単量体ペプチド単位を意味する。単量体Ａβを調製するための一方法は、凍結乾燥したペプチドをDMSOのみに超音波処理しながら溶解する。生成した溶液を遠心して不溶性粒子を除去する。凝集したＡβはオリゴマーの混合物であり、ここで単量体単位は非共有結合により一緒に保持されている。
【００３８】  抗体間の競合は任意のアッセイで測定され、ここで試験下の免疫グロブリンは参照抗体の、Ａβのような共通抗原に対する特異的結合を阻害する。多種類の競合的結合アッセイ、例えば：固相直接または間接ラジオイムノアッセイ（RIA）、固相直接または間接酵素イムノアッセイ（EIA）、サンドイッチ競合アッセイ（Stahli et al.,Methods in Enzymology 9:242-253(1983)を参照にされたい)；固相直接ビオチン−アビジンEIA（Kirkland et al.,J.Immunol.137:3614-3619(1986)を参照にされたい）；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（Harlow and Lane，抗体、ア  ラボラトリーマニュアル（Antibodies,A Laboratory Manual）、コールドスプリングハーバー出版(1988)を参照にされたい）；Ｉ-125標識を使用した固相直接標識RIA（Morel et al.,Molec.Immunol.25(1):7-15(1988)を参照にされたい）；固相直接ビオチン−アビジンEIA（Cheung et al.,Virology 176:546-552(1990)）；および直接標識RIA（Moldenhauer et al.,Scand.J.Immunol.32:77-82(1990))が知られている。典型的には、そのようなアッセイには固体表面に結合した精製された抗原またはこれらのいずれかを持つ細胞、非標識試験免疫グロブリンおよび標識参照免疫グロブリンの使用を含む。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面または細胞に結合した標識の量を決定することにより測定する。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合アッセイにより同定される抗体は（競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体および立体傷害が起こるために参照抗体が結合するエピトープに十分近い隣接するエピトープに結合する抗体を含む。通常、競合抗体が過剰に存在する時、競合抗体は共通する抗原に対する参照抗体の特異的結合を少なくとも50または75％まで阻害する。
【００３９】  １以上の述べた要素を「含んで成る」組成物または方法は、具体的に述べていない他の要素を含んでもよい。例えばＡβペプチドを含んで成る組成物は、単離したＡβペプチドおよびより大きなポリペプチド配列の成分としてのＡβペプチドの両方を包含する。
【００４０】                              詳細な説明
Ｉ．概論
幾つかのアミロイド形成疾患および症状は、患者の脳内で不溶性塊にまで凝集したＡβペプチドの沈着物の存在を特徴とする。そのような疾患にはアルツハイマー病、ダウン症候群および認知障害が含まれる。後者はアルツハイマー病およびダウン症候群の症状ではあるが、このような両疾患の他の特徴を含むことがない。例えば、軽度な認知障害または加齢に関係する記憶喪失は、未だに発症していない、あるいは完全なアルツハイマー病を発症することはない患者にも起こることがある。軽度な認知障害は、慣例に従いミニ−精神−状態試験（Mini-Mental-State-Exam）に基づく採点により定めることができる。そのような疾患はβ−プリーツ化したシート構造を有し、コンゴーレッド色素により染色されるＡβの凝集を特徴とする。患者のアミロイド沈着物の成分に対する免疫原性応答を生成することにより、アルツハイマー病または他のアミロイド形成疾患の予防または処置の基本的取り組みは、国際公開第99/27944号明細書（引用により本明細書に編入する）に記載されている。本出願は基本的な取り組みの効力を反復し、そして確認する。しかし本出願は、主に改良された試薬および方法を対象とする。このような改良は、一部は出願人が免疫原性応答が向けられるべきＡβ内の好適なエピトープの位置を定めたことが前提となる。Ａβ内の好適なエピトープの同定は、増強した効力を有する作用物質および方法をもたらし、副作用の可能性を減らし、かつ／または製造、配合および投与の容易さを増す。
II．治療薬
免疫原性応答は、免疫原が投与されて患者のＡβに反応性の抗体を誘導した時に能動的となり得るか、あるいは自身が患者のＡβに結合する抗体が投与された時に受動的となり得る。
１．能動的免疫応答を誘導する薬剤
治療薬はＡβペプチド内の特定のエピトープに特異的に向けられた免疫原性応答を誘導する。好適な薬剤はＡβペプチド自身およびそれらのセグメントである。Ａβペプチドの好適なエピトープに対する抗体を誘導し、かつ／またはそれと交差反応するそのような種々のセグメント、同族体および自然なＡβペプチドの模造物も使用することができる。
【００４１】  β-アミロイドペプチドとも知られているＡβ、またはＡ４ペプチド（米国特許第4,666,829号明細書；Glenner & Wong,Biochem.Biophys.Res.Commun.120,1131(1984)を参照にされたい）は39〜43アミノ酸のペプチドであり、これはアルツハイマー病の特徴的な斑の主成分である。Ａβはより大きなタンパク質APPを、βおよびγセクレターゼと呼ばれる２種類の酵素によりプロセッシングすることにより生成される（Hardy,TINS 20,154(1997)を参照にされたい）。アルツハイマー病と関係するAPPの既知の突然変異は、βまたはγ-セクレターゼの部位の近位、すなわちＡβ内で起こる。例えば717位はAPPのＡβへのプロセッシングでAPPのγ-セクレターゼ開裂部位に近く、そして670/671位は、β-セクレターゼ開裂の部位に近い。突然変異は、Ａβが形成される開裂反応と相互作用することにより、生成したＡβの42/43アミノ酸形の量が増えたためにＡＤを引き起こすと考えられている。
【００４２】  Ａβは、古典的でしかも代替的な補体カスケードを固定(fix）し、そして活性化する異常な特性を有する。特に、ＡβはClqそして最終的にはC3biに結合する。この会合はマクロファージの結合を容易とし、Ｂ細胞の活性化を導く。加えてC3biはさらに分解し、そして次にＴ細胞依存的様式でＢ細胞上のCR2に結合し、これらの細胞の活性化を10,000上昇させる。このメカニズムはＡβに過剰な他の抗原の免疫応答の中で免疫応答を生じさせる。
【００４３】  Ａβは、数種の自然に存在する形態を有する。ヒトのＡβ形は、Ａβ39、Ａβ40、Ａβ41、Ａβ42およびＡβ43と呼ばれている。これらのペプチドの配列およびそれらのAPP前駆体との関係は、Hardy et al.,TINS 20,155-158(1977)の図１により具体的に説明されている。例えばＡβ42は配列：
【００４４】
【表１】
0005580504.tif 000002
【００４５】を有する。
【００４６】  Ａβ41、Ａβ40およびＡβ39はＡβ42とは、Ｃ-末端からそれぞれAla、Ala-IleおよびAla-Ile-Valの省略により異なる。Ａβ43はＣ-末端のトレオニン残基の存在によりＡβ42とは異なる。
【００４７】  Ａβの免疫原性フラグメントは、幾つかの理由により本方法では完全な分子よりも有利である。第一に、Ａβ内の特定のエピトープのみがアルツハイマー病の処置に有用な免疫原性応答を誘導するので、そのようなエピトープを含むフラグメント塊の等しい投薬用量は、完全なＡβの投薬用量よりも有用な免疫原性エピトープをより高いモル濃度で提供する。第二に、Ａβの特定の免疫原性フラグメントは、Ａβが由来するAPPタンパク質に対して有意な免疫原性応答を生じることなくアミロイド沈着物に対する免疫原性応答を生成する。第三に、Ａβのフラグメントはそれらサイズが短いので完全なＡβよりも製造が単純である。第四に、Ａβのフラグメントは完全なＡβと同じ様式で凝集せず、医薬的組成物の調製およびそれらの投与を単純化する。
【００４８】  Ａβの免疫原性フラグメントの幾つかは、自然なペプチドに由来する少なくとも２、３、５、６、１０または２０個の連続するアミノ酸の配列を有する。幾つかの免疫原性フラグメントは、Ａβから多くても１０、９、８、７、５または３個の連続する残基を有する。ＡβのＮ-末端半分に由来するフラグメントが好適である。好適な免疫原性フラグメントには、Ａβ1-5、1-6、1-7、1-10、3-7、1-3および1-4を含む。Ａβ1-5の表示は、例えばＡβの残基1-5を含み、そしてＡβの他の残基を欠いているフラグメントを示す。Ａβの残基1-3で始まり、そしてＡβの残基7-11で終わるフラグメントが特に好適である。フラグメントＡβ1-12も使用することができるが、それほど好ましくはない。幾つかの方法では、フラグメントはＡβ1-10以外のＮ-末端フラグメントである。それほど好ましくはないが他のフラグメントには、Ａβ13-28、17-28、1-28、25-35、35-40および35-42を含む。これらのフラグメントは、使用前に実施例に記載するようなアミロイド沈着物を除去または防止する活性について、スクリーニングする必要がある。Ａβの自然に存在する形態中に存在する少なくとも１つ、そして時には少なくとも５または１０個のＣ-末端アミノ酸を欠くフラグメントを使用する方法もある。例えば、Ａβ43のＣ-末端から５個のアミノ酸を欠くフラグメントは、ＡβのＮ-末端から最初の38個のアミノ酸を含む。アミロイド斑の他の成分、例えばシヌクレイン（synuclein）およびそれらのエピトープ性フラグメントも免疫原性応答を誘導するために使用することができる。
【００４９】  特に示さない限り、Ａβに関しては上記に示した自然なヒトのアミノ酸配列ならびに対立遺伝的、種および誘導された変異体を含む同族体を含む。同族体は典型的には、しばしば保存的置換により１、２または幾つかの位置で自然に存在するペプチドとは異なる。同族体は典型的には少なくとも80または90％の自然なペプチドとの配列同一性を現す。幾つかの同族体は、１、２または幾つかの位置での非天然アミノ酸またはＮもしくはＣ末端アミノ酸の修飾も含む。例えば、Ａβの位置１および／または７での自然なアスパラギン酸残基は、イソアスパラギン酸に置き換えることができる。非天然アミノ酸の例は、Ｄ-アミノ酸、α，α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、ω-N-メチルアルギニンおよびイソアスパラギン酸を含む。フラグメントおよび同族体は、以下に記載するように、トランスジェニック動物モデルで未処理またはプラセボ対照と比較した予防的または治療的効力をスクリーニングすることができる。
【００５０】  Ａβ、そのフラグメントおよび同族体は、固相ペプチド合成または組換え発現により合成することができ、あるいは自然な供給源から得ることができる。自動化ペプチド合成器が、カリフォルニア州、ホスター市のアプライド  バイオシステムズ(Applied Biosysrems）のような様々な供給元から市販されている。組換え発現は、大腸菌（E.coli）のような細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞中で行うことができる。組換え発現に関する手法は、Sambrook et al.,モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual)（C.S.H.P.出版、NY 第２版、1989）により記載されている。Ａβペプチドの幾つかの形態も市販されている（例えば、アメリカン  ペプチド  カンパニー社(American Peptides Company,Inc.)、サニーヴァレ、カリフォルニア州およびカリフォルニア  ペプチド  リサーチ社(California Peptide Research Inc.)、ナパ、カリフォルニア州）。
【００５１】  治療薬には、より長いポリペプチド、例えば他のアミノ酸を一緒に含むＡβペプチドの活性フラグメントも含む。例えば好適な薬剤は、ヘテロロガスなアミノ酸配列に対してヘルパーＴ-細胞応答を誘導し、これによりＡβセグメントに対するＢ-細胞応答を誘導するヘテロロガスなアミノ酸配列に融合したＡβのセグメントを含んで成る融合タンパク質を含む。そのようなポリペプチドは以下に記載するように、動物モデルで未処理またはプラセボ対照と比較する予防的または治療的効力をスクリーニングを行うことができる。Ａβペプチド、同族体、活性フラグメントまたは他のポリペプチドは、会合して、または多量体形または解離形で投与することができる。治療薬は、単量体の免疫原性薬剤の多量体も含む。
【００５２】  さらなる変更態様では、Ａβのフラグメントのような免疫原性ペプチドは、免疫原性組成物の一部としてウイルスまたは細菌により提示され得る。免疫原性ペプチドをコードする核酸は、ウイルスまたは細菌のゲノムまたはエピソームに包含される。場合により核酸は免疫原性ペプチドが分泌されるタンパク質として、またはペプチドが表示されるようにウイルスの外表面タンパク質または細菌の膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現される様式で包含される。そのような方法に使用されるウイルスまたは細菌は、非病原性であるか、または弱毒化されている。適当なウイルスはアデノウイルス、HSV、ベネゼエラのウマの脳脊髄炎ウイルスおよび他のアルファウイルス、水痘性口内炎ウイルスおよび他のラブドウイルス、痘疹および鶏痘を含む。適当な細菌には、サルモネラ属および赤痢菌属を含む。免疫原性ペプチドのHBVのHBsAgへの融合が特に適当である。治療薬はＡβと有意なアミノ酸配列類似性を必ずしも持つ必要はないが、それでもＡβの模造物として役立ち、そして同様な免疫応答を誘導するペプチドおよび他の化合物も含む。例えば、β-プリーツ化シートを形成する任意のペプチドおよびタンパク質を適性についてスクリーニングすることができる。Ａβまたは他のアミロイド形成ペプチドに対するモノクローナル抗体に対する抗-イディオタイプ抗体も使用することができる。そのような抗-Id抗体は抗原を模し、そしてそれに対する免疫応答を生じる（エッセンシャル  イムノロジー(Essential Immunology)（Roit 編集、ブラックウェル  サイエンティフィック出版社（Blackwell Scientific Publications）、パロ  アルト、第６版）、181頁を参照にされたい）。Ａβペプチド以外の薬剤は、上記のＡβの好適な１以上のセグメント（例えば1-10、1-7、1-3および3-7）に対する免疫原性応答を誘導するべきである。好ましくはそのような薬剤は、Ａβの他のセグメントに対することなくこれらのセグメントの１つに特異的に向けられた免疫原性応答を誘導する。
【００５３】  ペプチドおよび他の化合物のランダムライブラリーも、適性についてスクリーニングすることができる。段階的様式で合成することができる多くの種類の化合物については、組み合わせライブラリーを作成することができる。そのような化合物には、ポリペプチド、ベータ−ターン模造物、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマー性Ｎ-置換グリシンおよびオリゴカルバメートを含む。化合物の大きな組み合わせライブラリーは、Affymax、国際公開第95/12608号明細書、Affymax、国際公開第93/06121号明細書、コロンビア大学、国際公開第94/08051号明細書、薬局方、国際公開第95/35503号明細書およびScripps、国際公開第95/30642号明細書（すべての目的のためにこれらの各々を引用により本明細書に編入する）に記載された、コードされた合成ライブラリー（ESL）法により構築することができる。ペプチドライブラリーも、ファージ表示法により作成することができる。例えばDevlin、国際公開第91/18980号明細書を参照にされたい。
【００５４】  組み合わせライブラリーおよび他の化合物は、Ａβまたは他のアミロイド形成ペプチドに対して特異的であることが知られている抗体またはリンパ球（ＢまたはＴ）に結合するそれらの能力を決定することにより適性を最初にスクリーニングされる。例えば最初のスクリーニングは、Ａβまたはそれらのフラグメントに対する任意のポリクローナル血清またはモノクローナル抗体を用いて行うことができる。化合物を次いで、Ａβ内の特異的エピトープ（例えば1-10、1-7、1-3、1-4、1-5および3-7）への結合についてスクリーニングすることができる。化合物は、抗体のエピトープ特異性をマッピングするために記載したものと同じ手法により試験することができる。そのようなスクリーニングにより同定された化合物は、さらにＡβまたはそれらのフラグメントに対する抗体または反応性リンパ球を誘導する能力について分析する。例えば血清の多回希釈物は、Ａβまたはそれらのフラグメントをプレコートしたマイクロタイタープレート上で試験することができ、および標準的なELISAを行ってＡβまたはフラグメントに対する反応性抗体についての試験を行うことができる。次いで化合物は、実施例に記載するように、アミロイド形成疾患に罹患し易くしたトランスジェニック動物で予防的および治療的効力を試験することができる。そのような動物には、例えばGames et al.,同上により記載されたAPPの717突然変異を持つマウス、およびMcConlogue et al.,米国特許第5,612,486およびHsiao et al.,Science 274,99(1996);Staufenbiel et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,13287-13292(1977);Sturchler-Pierrat et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,13287-13292(1977);Borchelt et al.,Neuron 19,939-945(1997)に記載されたようなAPPの670/671スウェーデン突然変異を持つマウスを含む。同じスクリーニング法を、上記のように、Ａβの他の有力な薬剤の同族体およびＡβのフラグメントを含むより長いペプチドに使用することができる。
２．受動免疫応答を誘導する薬剤
本発明の治療薬は、Ａβまたはアミロイド斑の他の成分に特異的に結合する抗体も含む。そのような抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであることができる。そのような抗体の中には、解離形には結合せずにＡβの凝集形に特異的に結合するものもある。中には凝集形には結合せずに解離形に特異的に結合するものもある。凝集形および解離形の両方に結合するものもある。そのような抗体の中には、自然に存在するＡβの長い形（すなわちＡβ42およびＡβ43）には結合せずに、自然に存在するＡβの短い形（すなわちＡβ39、40または41）には結合するものもある。抗体の中には短い形には結合せずに長い形に結合するものもある。抗体の中には完全長のアミロイド前駆体タンパク質には結合せずに、Ａβに結合するものもある。治療法に使用する抗体は通常、完全な定常領域またはFcレセプターと相互反応するために少なくとも十分な定常領域を有する。ヒトアイソタイプIgG1は、食作用細胞上のFcRIレセプターについて、最高の親和性を有するヒトアイソタイプなので好適である。二重特異性Fabフラグメントも使用することができ、ここで抗体の１つの腕はＡβに対する特異性を有し、そして他の腕はFcレセプターに対する特異性を有する。抗体の中には約106、107、108、109または1010M-1以上の結合親和性でＡβに結合するものもある。
【００５５】  ポリクローナル血清は、典型的にはＡβ長にわたり幾つかのエピトープに結合する混合した抗体群を含む。しかしポリクローナル血清は、Ａβ1-10のようなＡβの特定のセグメントに特異的であり得る。モノクローナル抗体は、立体配置的または立体配置的ではないエピトープとなり得るＡβ内の特異的エピトープに結合する。抗体の予防的および治療的効力は、実施例に記載するトランスジェニック動物モデル法を使用して試験することができる。好適なモノクローナル抗体は、Ａβの残基1-10内のエピトープに結合する（自然なＡβの第一Ｎ末端残基を１と呼ぶ）。好適なモノクローナル抗体の中には、アミノ酸1-5内のエピトープ、および中には5-10内のエピトープに結合するものもある。幾つかの好適な抗体は、アミノ酸1-3、1-4、1-5、1-6、1-7または3-7内のエピトープに結合する。幾つかの好適な抗体は、Ａβの残基１−３で始まり、そして残基７−１１で終わるエピトープに結合する。それほど好ましくはない抗体は、Ａβの残基10-15、15-20、25-30、10-20、20、30または10-25を含むエピトープに結合するものを含む。そのような抗体は、使用前に実施例に記載するマウスモデルで活性についてスクリーニングされる。例えば、残基10-18、16-24、18-21および33-42内のエピトープに結合する特定の抗体には活性が無いことが分かった。幾つかの方法では、異なるエピトープに対する結合特異性を有する多数のモノクローナル抗体を使用する。そのような抗体は、連続的に、または同時に投与することができる。Ａβ以外のアミロイド成分に対する抗体も使用することができる。例えば抗体をタンパク質であるシヌクレインに会合したアミロイドに向けることができる。
【００５６】  抗体が例えばＡβ1-5のような具体的残基内のエピトープに結合すると言われる時、これは具体的な残基（すなわちこの例ではＡβ1-5）を含むポリペプチドに特異的に結合することを意味する。そのような抗体はＡβ1-5内の各残基と接触する必要はない。またＡβ1-5内の各々の１つのアミノ酸置換または欠失が、結合親和性に有意に影響を及ぼす必要もない。抗体のエピトープ特異性は、例えばファージ表示ライブラリーを形成することにより決定することができ、ここで種々の員がＡβの異なるサブ配列を表示する。次いでファージ表示ライブラリーは、試験下で抗体に特異的に結合する員を選択される。配列のファミリーが単離される。典型的には、そのようなファミリーは共通するコア配列を含み、そして種々の員でフランキング配列の長さが異なる。抗体に対して特異的結合を表す最短のコア配列が、抗体に結合するエピトープを定める。また抗体は、すでにエピトープ特異性が決定された抗体との競合アッセイでエピトープ特異性について試験することもできる。例えばＡβに対する結合について3D6抗体と競合する抗体は、3D6と同じかまたは類似するエピトープ、すなわち残基Ａβ1-5内に結合する。同様に、10D5抗体と競合する抗体は、同じかまたは類似するエピトープ、すなわち残基Ａβ3-6内に結合する。エピトープ特異性に関して抗体をスクリーニングすることは、治療効力の有用な予測である。例えば、Ａβの残基1-7内のエピトープに結合すると決定された抗体は、アルツハイマー病の予防および処置に有効であると思われる。
【００５７】  Ａβの他の領域に結合することなく、Ａβの好適なセグメントに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、他の領域に結合するモノクローナル抗体または完全なＡβに結合するポリクローナル血清に比べて多数の利点を有する。第一に、等しい塊の投薬用量について、好適なセグメントに特異的に結合する抗体の投薬用量は、アミロイド斑の除去に有効なより高いモル投薬用量の抗体を含む。第二に好適なセグメントに特異的に結合する抗体は、完全なAPPポリペプチドに対する除去応答を誘導せずに、アミロイド沈着物に対する除去応答を誘導することができ、これにより副作用の可能性を滅らす。
i．免疫グロブリンの一般的特性
基本的な抗体構造単位は、四量体サブユニットから構成されることが知られている。各四量体は、２つの同一なポリペプチド鎖の対から成り、各対は１つの「軽」（約25kDa）および１つの「重」鎖（約50〜70kDa）を有する。各鎖のアミノ−末端部分は、抗原認識の原因である約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ−末端部分は、主にエフェクター機能の原因である定常領域を定める。
【００５８】  軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、mu、α、δまたはεに分類され、そしてそれぞれIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEとして抗体のアイソタイプを定める。軽および重鎖内で、可変および定常領域は約12以上のアミノ酸の“Ｊ"領域により連結され、重鎖は約10以上のアミノ酸の“Ｄ"領域も含む。（一般に、基礎免疫学(Fundmental Immunology)(Paul.W.編集、第２版、ラベン(Raven)出版、N.Y.、(1989)、第７章を参照にされたい）（これはすべての目的のために、引用により本明細書に編入する）。
【００５９】  各軽／重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。すなわち、完全な抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体を除き、２つの結合部位は同じである。鎖はすべて、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる３つの超可変領域により連結された比較的保存された枠組み構造領域（framework region：FR）の同じ一般構造を表す。各対の２つの鎖に由来するCDRは、枠組み構造領域により整列され、特異的エピトープへの結合を可能とする。Ｎ-末端からＣ-末端へ、両重および軽鎖は、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含んで成る。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat,免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Proteins of Immunological Interest（国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、1987および1991）、またはChothia & Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia et al.,Nature 342:878-883(1989)の定義に従う。
ii．非ヒト抗体の生産
非ヒト、すなわちマウス、モルモット、霊長類、ウサギまたはラットのモノクローナル抗体の生産は、例えば動物をＡβで免疫感作することにより行うことができる。ＡβまたはＡβの免疫原性フラグメントを含んで成る、より長いポリペプチドまたはＡβに対する抗体に対する抗-イディオタイプ抗体も使用することができる。Harlow & Lane、抗体：ア  ラボラトリーマニュアル（Antibodies:A Laboratory Manual）(CSHP NY,1988)（すべての目的めために、引用により本明細書に編入する）。そのような免疫原は、自然な供給源から、ペプチド合成により、または組換え発現により得ることができる。場合により、免疫原を以下に記載するようにキャリアータンパク質と融合するか、またはそうではなく複合化して投与することができる。場合により、免疫原はアジュバントと共に投与することができる。数種類のアジュバントを、以下の記載のように使用することができる。完全フロイントアジュバント、続いて不完全アジュバントは、実験動物の免疫感作に好適である。ラビットまたはモルモットは、典型的にはポリクローナル抗体を作成するために使用する。マウスは典型的にはモノクローナル抗体を作成するために使用する。抗体はＡβに対する特異的結合についてスクリーニングされる。場合により抗体は、Ａβの特異的領域に対する結合についてさらにスクリーニングされる。後者のスクリーニングは、抗体がＡβペプチドの欠失突然変異体の集合に対する結合を測定することにより行い、そしてどの欠失突然変異体が抗体に結合するかを決定することができる。結合は例えばウエスタンブロットまたはELISAにより評価することができる。抗体に対する特異的結合を示す最小のフラグメントが、抗体のエピトープを定める。あるいはエピトープの特異性は、競合アッセイにより決定することができ、ここで試験および参照抗体はＡβに対する結合を競合する。試験および参照抗体が競合するならば、それらは１つの抗体の結合が他の結合を妨害する十分に近位の同じエピトープ（１つまたは複数）に結合する。そのような抗体の好適なアイソタイプは、マウスのアイソタイプIgG2aまたは他の種の均等なアイソタイプである。マウスのアイソタイプIgG2aは、ヒトのアイソタイプIgG1の均等物である。
iii．キメラおよびヒト化抗体
キメラおよびヒト化抗体は、キメラおよびヒト化抗体の構築のための出発材料を提供するマウスまたは他の非ヒト抗体と同様な結合特異性および親和性を有する。キメラ抗体は、その軽および重鎖遺伝子が典型的には遺伝子工学により、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構築された抗体である。例えばマウスのモノクローナル抗体に由来する遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、IgG1およびIgG4のようなヒトの定常（Ｃ）セグメントに連結することができる。ヒトのアイソタイプIgG1が好適である。典型的なキメラ抗体は、このようにマウス抗体に由来するＶまたは抗原−結合ドメイン、およびヒト抗体に由来するＣまたはエフェクタードメインから成るハイブリッドタンパク質である。
【００６０】  ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（受容抗体と呼ぶ）に由来する可変領域の枠組み構造残基および実質的にマウス−抗体（供与抗体免疫グロブリンと呼ぶ）に由来する相補性決定領域を有する。Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)および国際公開第90/07861号明細書、米国特許第5,693,762号、同第5,693,761号、同第5,585,089号、同第5,530,101号明細書およびWinter、米国特許第5,225,539号明細書（すべての目的のために全部、引用により本明細書に編入する）を参照にされたい。存在するならば定常領域（1つまたは複数）も、実質的にまたは全部ヒトの免疫グロブリンに由来する。ヒトの可変ドメインは通常、枠組み構造配列がCDRが由来したマウス可変領域ドメインとの高度な配列同一性を表すヒトの抗体から選択される。重および軽鎖可変領域の枠組み構造残基は、同じかまたは異なるヒトの抗体配列に由来することができる。ヒトの抗体配列は自然に存在するヒト抗体の配列であるか、または幾つかのヒト抗体のコンセンサス配列であることができる。Carter et al.,国際公開第92/22653号明細書を参照にされたい。ヒトの可変領域の枠組み構造残基に由来する特定のアミノ酸が、CDRの立体配置および／または抗原への結合に及ぼす可能な影響に基づき、置換のために選択される。そのような可能な影響の調査は、特定位置でアミノ酸の特性をモデリングし、調査することにより、または特定のアミノ酸の置換または突然変異誘発の効果の経験的観察による。
【００６１】  例えば、アミノ酸がマウスの可変領域の枠組み構造残基と選択したヒトの可変領域の枠組み構造残基との間で異なる時、通常ヒトの枠組み構造のアミノ酸は、マウスの抗体に由来する均等な骨格アミノ酸が：
（１）非共有的に抗原に直接結合する、
（２）CDR領域に隣接する、
（３）あるいはCDR領域と相互作用する(例えば、CDR領域の約６Ａ内である）、あるいは
（４）VL-VH界面に参加する
と論理的に予測される時に、それと置き換えるべきである。
【００６２】  置換のための別の候補は、その位置でのヒトの免疫グロブリンに通常ではない受容体のヒト枠組み構造格アミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウス供与体抗体の均等な位置に由来するか、あるいはより多くのヒトの免疫グロブリンの均等な位置に由来するアミノ酸と置換することができる。置換のための他の候補は、その位置でヒトの免疫グロブリンには通常ではない受容体のヒト枠組み構造アミノ酸である。通常ヒト化免疫グロブリンの可変領域枠組み構造は、ヒトの可変領域枠組み構造配列またはそのような配列のコンセンサスと少なくとも85％の配列同一性を示す。
iv．ヒト抗体
Ａβに対するヒト抗体は、以下に記載する種々の技法により提供される。ヒト抗体の中には競合結合実験により、あるいは実施例XIに記載するマウスモノクローナル抗体の１つのような、特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有するように選択される。ヒト抗体は、免疫原としてＡβのフラグメントのみを使用することにより、かつ／またはＡβの欠失突然変異体の収集物に対する抗体をスクリーニングすることにより、特定のエピトープ特異性についてもスクリーニングすることができる。ヒト抗体は、好ましくはアイソタイプ特異性ヒトIgG1を有する。
（１）トリオーマ（trioma）法
基本的な取り組みおよびこの取り組みに使用する例示の細胞融合パートナー、SPAZ-4は、Oestberg et al.,Hybridoma 2:361-367(1983)；Oestberg、米国特許第4,634,664号明細書；およびEngelman et al.、米国特許第4,634,666号明細書に記載された（その各々は、すべての目的のために全部、引用により本明細書に編入する）。この方法により得られる抗体生産細胞系は、３種の細胞（２つのヒトおよび１つのマウス）に由来するので、トリオーマと呼ばれる。最初にマウスミエローマ系をヒトＢ-リンパ球と融合して、Oestberg、同上により記載されたSPAZ-4細胞系のような非−抗体−生産異種(xenogenic)ハイブリッド細胞を得る。この異種細胞を次いで免疫感作したヒトＢ−リンパ球と融合して抗体−生産トリオーマ細胞系を得る。トリオーマはヒト細胞から作成した通例のハイブリドーマより安定に抗体を生産することが分かった。
【００６３】  免疫感作したＢ−リンパ球は、ヒト供与体の血液、脾臓、リンパ節または骨髄から得られる。特異的抗原またはエピトープに対する抗体を所望する場合、免疫感作には抗原またはそれらのエピトープを使用することが望ましい。免疫感作はインビボまたはインビトロのいずれかであることができる。インビボの免疫感作には、Ｂ細胞は典型的にはＡβ、それらのフラグメント、Ａβまたはフラグメントを含むより大きなポリペプチド、あるいはＡβに対する抗体に対する抗-イディオタイプ抗体で免疫感作したヒトから単離される。幾つかの方法ではＢ細胞は、最終的に抗体治療を投与される同じ患者から単離される。インビトロの免疫感作にはＢ-リンパ球は、典型的には10％ヒト血漿を補充したRPMI-1640（Engleman、同上を参照にされたい）のような培地中で７〜14日間、抗原に暴露する。
【００６４】  免疫感作したＢ-リンパ球は、周知な方法によりSPAZ-4のような異種ハイブリッド細胞に融合する。例えば細胞をMW1000〜4000の40〜50％ポリエチレングリコールで約37℃にて約５〜10分間処理する。細胞を融合混合物から分離し、そして所望のハイブリッドを選択するための培地中で増殖させる（例えばHATまたはAH）。必要な結合特異性を有する抗体を分泌する細胞は、Ａβまたはそれらのフラグメントに結合する能力についてトリオーマ培養基をアッセイすることにより同定する。所望の特異性を有するヒト抗体を生産するトリオーマを、限界希釈法およびインビトロで培養基中で成長させることによりサブクローン化する。得られたトリオーマ細胞系は、次いでＡβまたはそれらのフラグメントに結合する能力について試験する。
【００６５】  トリオーマは遺伝的に安定であるが、それらは大変高いレベルで抗体を生産しない。発現レベルは、トリオーマからの抗体遺伝子を１以上の発現ベクターにクローニングし、そしてベクターを標準的な哺乳動物、細菌または酵母細胞系で形質転換させることにより上げることができる。
（２）トランスジェニック非ヒト哺乳動物
Ａβに対するヒト抗体も、ヒトの免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１セグメントをコードする導入遺伝子を有する非-ヒトトランスジェニック哺乳動物から生産することができる。通常、そのようなトランスジェニック哺乳動物の内因性の免疫グロブリン遺伝子座は、機能的に不活性化されている。好ましくはヒトの免疫グロブリン遺伝子座のセグメントは、重および軽鎖成分の再整列していない配列を含む。内因性の免疫グロブリン遺伝子の不活性化および外因性の免疫グロブリン遺伝子の導入の両方は、標的とする相同的組換えにより、あるいはYAC染色体の導入により達成され得る。この方法からもたらされるトランスジェニック哺乳動物は、免疫グロブリン成分配列を機能的に再配列することができ、そして内因性の免疫グロブリン遺伝子を発現せずにヒトの免疫グロブリン遺伝子によりコードされる種々のアイソタイプの抗体のレパートリーを発現することができる。このような特性を有する哺乳動物の作出および特性は、例えばLonberg et al.、国際公開第93/12227号明細書（1993）；米国特許第5,877,397号、同第5,874,299号、同第5,814,318号、同第5,789,650号、同第5,770,429号、同第5,661,016号、同第5,633,425号、同第5,625,126号、同第5,569,825号、同第5,545,806号明細書、Nature 148,1547-1553(1994)、Nature Biotechnology 14,826(1996)、Kucherlapati、国際公開第91/10741(1991)号明細書に詳細に記載されている（これらの各々は、すべての目的のために全部、引用により本明細書に編入する）。トランスジェニックマウスが、特に適している。抗-Ａβ抗体は、LonbergまたはKucherlapati、同上により記載されたようなトランスジェニック非ヒト動物を、Ａβまたはそれらのフラグメントで免疫感作することにより得られる。モノクローナル抗体は、通例のKohler-Milstein法を使用して、例えばそのような哺乳動物に由来するＢ-細胞を適当なミエローマ細胞系に融合することにより調製する。ヒトポリクローナル抗体も、免疫原性作用物質で免疫感作したヒトに由来する血清の状態で提供され得る。場合により、そのようなポリクローナル抗体は、アフィニティ試薬としてＡβまたは他のアミロイドペプチドを使用したアフィニティー精製により濃縮することができる。
（３）ファージ表示法
ヒト抗-Ａβ抗体を得るためのさらなる取り組みは、Huse et al.,Science 246:1275-1281(1989)に概説された一般的プロトコールに従い、ヒトＢ細胞からのDNAライブラリーをスクリーニングすることである。トリオーマ法について記載したように、そのようなＢ細胞は、Ａβ、フラグメント、Ａβまたはフラグメントを含んで成る長いポリペプチドまたは抗-イディオタイプ抗体で免疫感作したヒトから得ることができる。場合により、そのようなＢ細胞は、最終的に抗体処置を受ける患者から得る。Ａβまたはそれらのフラグメントに結合する抗体を選択する。そのような抗体（または結合フラグメント）をコードする配列を、次にクローン化し、そして増幅する。Huseにより記載されたプロトコールは、ファージ−表示技術と組み合わせてより効率的になる。例えば、Dower et al.、国際公開第91/17271号明細書およびMcCafferty et al.、国際公開第92/01047号明細書、米国特許第5,877,218号、同第5,871,907号、同第5,858,657号、同第5,837,242号、同第5,733,743号および同第5,565,332号明細書を参照にされたい（この各々がすべての目的のために全部、引用により本明細書に編入する）。これらの方法では、ファージのライブラリーを作成し、この中の員はそれらの外面上の様々な抗体を表示する。抗体は通常、FvおよびFabフラグメントとして表示される。所望する特異性を有する抗体を表示するファージを、Ａβペプチドまたはそれらのフラグメントに対する親和性の濃縮(enrichment)により選択する。
【００６６】  ファージ−表示法の変法では、選択したマウス抗体の結合特異性を有するヒトの抗体を生成する。Winter、国際公開第92/20791号明細書を参照にされたい。この方法では、選択したマウス抗体の重または軽鎖可変領域のいずれかを、出発材料として使用する。例えば、軽鎖可変領域を出発材料として選択した場合、員が同じ軽鎖可変領域（すなわち、マウスの出発材料）および異なる重鎖可変領域を表示するファージライブラリーを構築する。重鎖可変領域は、ヒトの再配列した重鎖可変領域のライブラリーから得られる。Ａβに対する強力な特異的結合（例えば少なくとも108、そして好ましくは少なくとも109M-1）を示すファージを選択する。このファージに由来するヒトの重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリーを構築するための出発材料として役立つ。このライブラリーでは、各ファージは同じ重鎖可変領域（すなわち、最初の表示ライブラリーから同定された領域）および異なる軽鎖可変領域を表示する。軽鎖可変領域は、ヒトの再配列した軽鎖可変領域のライブラリーから得られる。ここでもＡβに対する強力な特異的結合を示すファージを選択する。これらのファージは、完全なヒト抗-Ａβ抗体の可変領域を表示する。これらの抗体は通常、マウス出発材料として同じかまたは類似するエピトープ特異性を有する。
v．定常領域の選択
キメラ、ヒト化またはヒト抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結することができる。定常領域の選択は、部分的には抗体−依存的補体および／または細胞性の毒性が所望されるか否かに依存する。例えば、アイソタイプIgG1およびIgG3は補体活性を有し、そしてアイソタイプIgG2およびIgG4は持たない。アイソタイプの選択は抗体の脳への通過にも影響を及ぼし得る。ヒトのアイソタイプIgG1が好適である。軽鎖定常領域は、λまたはκであることができる。抗体は２つの軽鎖および２つの重鎖を含む四量体として、分かれた重鎖、軽鎖として、Fab、Fab'(ab')2およびFvとして、あるいは重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを通して連結された単鎖抗体として発現され得る。vi．組換え抗体の発現
キメラ、ヒト化およびヒト抗体は、典型的には組換え発現により生産される。組換えポリヌクレオチドは構築物は、典型的には自然に会合したまたはヘテロロガスなプロモーター領域を含め、抗体鎖のコード配列に操作可能に連結された発現制御配列を含む。好ましくは発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることができるベクター中の真核プロモーター系である。いったんベクターが適当な宿主に導入されれば、宿主はヌクレオチド配列の高レベルな発現、ならびに回収および交差反応する抗体の精製について適当な条件下で維持される。
【００６７】  これらの発現ベクターは典型的には、エピソームとして、または宿主の染色体DNAに組込まれた部分のいずれかとして宿主生物中で複製可能である。通常は、発現ベクターは選択マーカー、例えばアンピシリン−耐性またはヒグロマイシン−耐性を含み、所望のDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能とする。
【００６８】  大腸菌（E.coli）は、本発明のDNA配列をクローニングするために特に有用な原核宿主の１つである。酵母のような微生物も発現に有用である。サッカロミセス（Saccharomyces）は好適な酵母宿主であり、発現制御配列、複製起点、終結配列等を所望するように有する適当なベクターを含む。典型的なプロモーターには、3-ホスホグリセリンキナーゼおよび他の解糖解酵素を含む。誘導性の酵母プロモーターには、中でもアルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームＣおよびマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素を含む。
【００６９】  哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントをコードするヌクレオチドセグメントを発現するための好適な宿主である。Winnacker、遺伝子からクローンへ（From Gene to Clones）（VCH出版、NY、1987）を参照にされたい。完全なヘテロロガスタンパク質を分泌することができる多数の適当な宿主細胞系が当該技術分野では開発され、そしてそれらにはCHO細胞系、種々のCOS細胞系、HeLa細胞、Ｌ細胞およびミエローマ細胞系を含む。好ましくは細胞は非ヒトである。これらの細胞のための発現ベクターには、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Queen et al.,Immunol.Rev.89:49(1986)）のような発現制御配列、ならびにリボゾーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデニレーション部位および転写終結点配列のような必要なプロセッシング情報部位を含むことができる。好適な発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等に由来するプロモーターである。Co et al.,J.Immunol.148:1149(1992)を参照にされたい。
【００７０】  あるいは抗体コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムに導入され、そして後にトランスジェニック動物のミルク中で発現させるために、導入遺伝子中に組み込まれることができる（例えば、米国特許第5,741,957号、同第5,304,489号、同第5,849,992号明細書を参照にされたい）。適当な導入遺伝子には、カゼインまたはベータラクトグロブリンのような乳腺特異的遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサーに操作可能に連結した軽鎖および／または重鎖のコード配列を含む。
【００７１】  目的のDNAセグメントを含むベクターは、宿主細胞の種類に依存して周知の方法により宿主細胞に移すことができる。例えば塩化カルシウムトランスフェクションは原核細胞に通常利用されており、一方リン酸カルシウム処理、電気穿孔、リポフェクション、バイオリスティクス（biolistics）またはウイルスに基づくトランスフェクションは、他の宿主細胞に使用することができる。哺乳動物細胞を形質転換するための他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔およびマイクロインジェクションの使用を含む（一般に、Sambrook et al.,同上を参照にされたい）。トランスジェニック動物の作出には、導入遺伝子を受精した卵母細胞にマイクロインジェクションすることができ、または胚性幹細胞のゲノムに包含することができ、そしてそのような細胞の核を除核した卵母細胞に移す。
【００７２】  いったん発現すれば、抗体をHPLC精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当該技術分野で標準的な手順に従い精製することができる（一般に、Scopes、タンパク質精製（Protein Purification)(スプリンガ（Springer）ー出版、NY、1982を参照にされたい）。
３．キャリアータンパク質
免疫応答を誘導するための作用物質の中には、アミロイド沈着物に対する免疫応答を誘導するが、免疫原としては小さすぎる適当なエピトープを含むものもある。このような状況では、ペプチド免疫原を適当なキャリアーに連結して、免疫応答の誘導を助けることができる。適当なキャリアーには、血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、卵白アルブミン、破傷風毒素、またはジフテリア、大腸菌（E.coli）、コレラまたはピロリ（H.pylori）のような他の病原性細菌に由来する毒素、あるいは弱毒化した毒素の誘導体を含む。他のキャリアーには、多数のMHC対立遺伝子、例えばすべてのヒトのMHC対立遺伝子の少なくとも75％に結合するＴ-細胞エピトープを含む。そのようなキャリアーは、しばしば当該技術分野では「ユニバーサルＴ-細胞エピトープ」として知られている。ユニバーサルＴ-細胞エピトープの例には以下を含む：
【００７３】
【表２】
0005580504.tif 000003
【００７４】  免疫応答を刺激または強化する他のキャリアーは、IL-1、IL-1αおよびβペプチド、IL-2、γINF、IL-10、GM-CSFのようなサイトカイン、およびMIPIαおよびβおよびRANTESのようなケモカインを含む。免疫原性作用物質は、O'Mahony、国際公開第97/17613号および同第97/17614明細書に記載されているように、組織にわたり輸送を強化するペプチドに連結することもできる。
【００７５】  免疫原性作用物質は、化学的架橋によりキャリアーに連結することができる。免疫原をキャリアーに連結するための技法には、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジル-チオ)プロピオネート（SPDP）およびスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート（SMCC）（ペプチドがスルフィドリル基を欠く場合、これはさらにシステイン残基の付加により提供することができる）を使用したジスルフィド結合の形成を含む。これらの試薬は、それら自身と１タンパク質上のペプチドのシステイン残基との間にジスルフィド結合を、そしてリシン上のε-アミノ酸、あるいは他のアミノ酸中の遊離アミノ基を通したアミド結合を作成する。そのような種々のジスルフィド／アミド-形成剤は、Immun.Rev.62,185(1982)に記載されている。他の二官能性カップリング剤は、ジスルフィド結合ではなくチオエーテルを形成する。多くのチオ−エーテル形成剤が市販されており、そして6-マレイミドカプロン酸、2-ブロモ酢酸および2-ヨード酢酸、4-(N-マレイミド-メチル)シクロヘキサン-1-カルボン酸の反応性エステルを含む。カルボキシル基はスクシンイミドまたは1-ヒドロキシ-2-ニトロ-4-スルホン酸、ナトリウム塩と混合することにより活性化することができる。
【００７６】  免疫原性ペプチドは、キャリアーとの融合タンパク質（ヘテロロガスペプチド）として発現することもできる。免疫原性ペプチドはそのアミノ末端で、そのカルボキシル末端で、またはその両方でキャリアーに連結することができる。場合により、免疫原性ペプチドの多数の反復が融合タンパク質中に存在することができる。場合により、免疫原性ペプチドは例えばペプチドの両ＮおよびＣ末端でヘテロロガスなペプチドの多数のコピーに連結することができる。キャリアーペプチドの中には、キャリアーペプチドに対するヘルパーＴ-細胞応答を誘導するために役立つものもある。誘導されたヘルパーＴ-細胞は、次にキャリアーペプチドに連結された免疫原性ペプチドに対するＢ-細胞応答を誘導する。
【００７７】  本発明の作用物質の中には、ＡβのＮ末端フラグメントがそのＣ末端でキャリアーペプチドに連結している融合タンパク質を含んで成るものもある。そのような作用物質は、ＡβのフラグメントのＮ-末端残基が融合タンパク質のＮ-末端残基を構成する。したがってそのような融合タンパク質は、遊離形態であるＡβのＮ-末端残基を必要とするエピトープへ結合する抗体を誘導するために有効である。本発明の幾つかの作用物質は、Ｃ末端でキャリアーペプチドの１以上のコピーに連結するＡβのＮ-末端セグメントの複数の反復を含んで成る。そのような融合タンパク質に取り込まれたＡβのＮ-末端フラグメントは時々、Ａβ1-3で始まり、そしてＡβ7-11で終わる。Ａβ1-7、Ａβ1-3、1-4、1-5および3-7がＡβの好適なＮ-末端フラグメントである。幾つかの融合タンパク質は、Ａβの異なるＮ-末端セグメントを直列に含んで成る。例えば融合タンパク質はＡβ1-7、続いてＡβ1-3、続いてヘテロロガスペプチドを含んで成ることができる。
【００７８】  幾つかの融合タンパク質では、ＡβのＮ-末端セグメントがそのＮ-末端でヘテロロガスがキャリアータンパク質に融合される。Ａβの同じ変化のＮ-末端セグメントを、Ｃ-末端融合で使用することができる。幾つかの融合タンパク質は、ＡβのＮ-末端セグメントのＮ-末端に連結されたヘテロロガスなペプチドを含んで成り、これは次に１以上のさらなるＡβのＮ-末端セグメントに直列に連結される。
【００７９】  本発明の使用に適する融合タンパク質の幾つかの例を以下に示す。これらの融合タンパク質の幾つかは、米国特許第5,196,512号明細書、欧州特許第378,881号および同第427,347明細書に記載されているような破傷風毒素エピトープに連結されたＡβのセグメントを含んで成る。幾つかの融合タンパク質は、米国特許第5,736,142号明細書に記載されているようなキャリアーペプチド質に連結されたＡβのセグメントを含んで成る。幾つかのヘテロロガスなペプチドは、ユニバーサルＴ-細胞エピトープである。幾つかの方法では、投与するための作用物質は直線的な立体配置でヘテロロガスなセグメントに連結されたＡβセグメントを含む１つの融合タンパク質である。幾つかの方法では、作用物質は式２x（式中、ｘは１〜５の整数である）により表される融合タンパク質の多量体である。好ましくはｘは１、２または３であり、２が最も好ましい。ｘが２である時、そのような多量体は、MAP4と呼ばれる好適な立体配置で連結された４つの融合タンパク質を有する（米国特許第5,229,490号明細書を参照にされたい）。Ａβのエピトープに下線が引かれている。
【００８０】  MAP4の立体配置を以下に示し、ここで分枝構造はリシンのＮ末端および側鎖アミンの両方でペプチド合成が始まることにより生成される。リシンが配列に取り込まれ、そして分枝化される回数に依存して、生成する構造には多数のＮ末端が存在するだろう。この例では、４つの同一なＮ末端がコアを含む分枝化リシン上に生成された。そのような多重度は、コグネイトＢ細胞の反応性を大きく強化する。
【００８１】
【表３】
0005580504.tif 000004
【００８２】
【表４】
0005580504.tif 000005
【００８３】  受動免疫感作に使用するためのＡβに対する抗体の生成に使用される免疫原を作成するためには、同じまたは類似のキャリアータンパク質および連結法を使用することができる。例えばＡβに対するモノクローナル抗体の生産において、キャリアーに連結されたＡβまたはフラグメントを実験動物に投与することができる。
４．治療薬をコードする核酸
アミロイド沈着物に対する免疫応答も、Ａβペプチドのセグメントおよびそれらのフラグメント、他のペプチド免疫原をコードする核酸、あるいは受動免疫感作に使用する抗体およびそれらの成分鎖の投与により誘導することができる。そのような核酸は、DNAまたはRNAであることができる。免疫原をコードする核酸セグメントは、典型的には、患者の意図する標的細胞中でDNAセグメントの発現を可能にするプロモーターおよびエンハンサーのような調節要素に連結される。免疫応答を誘導するために望ましい血液細胞中の発現には、軽または重鎖免疫グロブリン遺伝子に由来するプロモーターおよびエンハンサー要素またはCMV主要中間初期(makjor intermediate eary)プロモーターおよびエンハンサーが、発現を支配するために適当である。連結された調節要素およびコード配列はしばしばベクターにクローン化される。二重鎖抗体を投与するために、２つの鎖を同じか、または別のベクター中にクローン化することができる。
【００８４】  多数のウイルスベクター系が、レトロウイルス系（例えば、Lawrie and Tumin Cur.Opin.Genet.Develop.3,102-109(1993)を参照にされたい)；アデノウイルスベクター（例えばBett et al.,J.Virol.67,5911(1993)を参照にされたい)；アデノ−随伴ウイルスベクター（例えば、Zhou et al.,J.Exp.Med.179,1867(1994)を参照にさたい）、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルスを含むポックスファミリーに由来するウイルスベクター、シンドビスおよびセムリキ森林ウイルスに由来するようなアルファウイルス属に由来するウイルスベクター（例えば、Dubensky et al.,J.Virol.70,508-519(1996)を参照にされたた)、ベネゼエラのウマ脳脊髄炎ウイルス（米国特許第5,643,576号明細書を参照にされたい）および水痘性口内炎ウイルスのようなラブドウイルス（国際公開第96/34625号明細書を参照にされたい）およびパピローマウイルス（Ohe et al.,Human Gene Therapy 6,325-333(1995)；Woo et al.、国際公開第94/12629号明細書およびXiao & Brandsma,Nucleic Acids Res.24,2630-2622(1996))を含め入手することができる。
【００８５】  免疫原をコードするDNAまたはそれを含むベクターは、リポソーム中にパッケージすることができる。適当な脂質および関連する同族体は、米国特許第5,208,036号、同第5,264,618号、同第5,279,833号および同第5,283,185号明細書に記載されている。免疫原をコードするベクターおよびDNAは、特定のキャリアーに吸着または結合させることもでき、そのキャリアーの例には、ポリメチルメタクリレートポリマーおよびポリラクチドおよびポリ（ラクチド-コ-グリコライド）を含み、例えばMcGee et al.,J.Micro Encap.(1996)を参照にされたい。
【００８６】  遺伝子療法ベクターまたは裸（naked)のDNAは、典型的には全身投与により（例えば静脈内、腹腔内、鼻内、胃内、皮内、筋肉内、皮下または頭蓋潅流）あるいは局所的適用（例えば米国特許第5,399,346号明細書を参照にされたい）により、個々の患者に投与することによりインビボ送達され得る。そのようなベクターはさらにブピバカイン（米国特許第5,593,970号明細書）のような促進剤を含むことができる。またDNAは遺伝子銃を使用して投与することができる。Xiao & Brandsma、同上を参照にされたい。免疫源をコードするDNAを、顕微鏡的な金属ビーズの表面に沈殿させる。このマイクロプロジェクティル（microprojectile）をショック波または膨張するヘリウムガスで加速し、そして幾つかの細胞層の深さまで組織を透過させる。例えば、ウィスコンシン州、ミドルトンのアガセタス社（Agacetus Inc.)により製造されているAccel(商標)遺伝子送達デバイスが適当である。あるいは、化学的または機械的刺激によりDNAを皮膚上に単にスポット適用することにより、裸のDNAを皮膚を介して血流に通すことができる（国際公開第95/05853号明細書を参照にされたい）。
【００８７】  さらなる変法では、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄アスピレート、組織検体）、あるいは汎用的な供与体の造血幹細胞、続いて細胞の患者への再移植（通常は、組み込まれたベクターを有する細胞を選択した後）のように、免疫原をコードするベクターをエクスビボで細胞に送達することができる。
III．除去活性に関する抗体のスクリーニング
本発明は、アミロイド沈着物または任意の他の抗原、あるいは付随する生物学的物体の除去における活性について、除去活性が望まれる抗体をスクリーニングする方法を提供する。アミロイド沈着物に対する活性をスクリーニングするために、アルツハイマー病を有する患者または特徴的なアルツハイマーの病状を有する動物モデルの脳の組織サンプルを、ミクログリア細胞のようなFcレセプターを持つ食細胞および抗体と、インビトロの媒質中の試験下で接触させる。食細胞は、BV-2、C8-B4またはTHP-1のような初代培養または細胞系であることができる。幾つかの方法では、成分を顕微鏡スライド上で合わせて顕微鏡でのモニタリングを行い易くする。幾つかの方法では、マイクロタイター皿のウェル中で、平行して多数の反応を行う。そのような形式では、分かれた小型の顕微鏡スライドを分かれたウェルに乗せることができ、あるいはＡβのELISA検出のような非顕微鏡的検出形式を使用することができる。好ましくは、一連の測定は、反応が進行する前のベースライン値から出発し、そして反応中の１以上の試験値をインビトロ反応混合物中のアミロイド沈着物の量から作成する。抗原は、例えばＡβまたは他のアミロイド斑の成分に対する蛍光的に標識した抗体を用いて染色することにより検出することができる。染色に使用する抗体は、除去活性を試験する抗体と同じでも同じでなくてもよい。アミロイド沈着物の反応中、ベースラインに対する減少は抗体が試験下で除去活性を有することを示す。そのような抗体は、アルツハイマーおよび他のアミロイド形成疾患を予防または処置するために有用であろう。
【００８８】類似の方法を使用して、他の種類の生物学的物体を除去する活性について抗体をスクリーニングすることができる。このアッセイは、ほとんどの種類の生物学的物体に対して、除去活性を検出するために使用することができる。典型的には、生物学的物体はヒトおよび動物疾患に幾つかの役割を有する。生物学物体は組織サンプルまたは単離された状態で提供され得る。組織サンプルとして提供される場合、組織サンプルは好ましくは組織サンプルの成分を直ちに利用でき、そして固定にありがちな成分の立体配置の撹乱を避けるために固定されていない。このアッセイで試験することができる組織サンプルの例には、ガン組織、前ガン組織、突起または奇胎のような良性の成長を含む組織、病原性微生物に感染した組織、炎症性細胞が浸潤した組織、細胞間に病原性マトリックスを持つ組織（例えば、線維性心膜炎）、異常な抗原を持つ組織および瘢痕組織を含む。使用できる単離された生物学的物体の例には、Ａβ、ウイルス抗原またはウイルス、プロテオグリカン、他の病原性微生物の抗原、腫瘍抗原および接着分子を含む。そのような抗原は、中でも天然の起源、組換え発現またはキメラ合成から得ることができる。組織サンプルまたは単離された生物学的物体は、単球またはミクログリア細胞のようなFcレセプターを持つ食細胞および試験される抗体と媒質中で接触させる。抗体は試験下で生物学的物体に向けられるか、あるいは物体と会合した抗原に向けられる。後者の状況では、目的は生物学物体が抗原で代償的に食作用を受けるかどうかを試験する。通常は必ずしも必要ではないが、抗体および生物学的物体（時折、抗原と会合している）を、互いに接触させた後に食細胞を加える。媒質中に残る生物学的物体および／または会合した抗原が存在するならば、その濃度がモニタリングされる。媒質中の抗原または会合した生物学的物体の量または濃度における減少は、抗体が抗原および／または会合した生物学的物体に対する除去応答を、食細胞と一緒に有することを示す（例えば実施例１４を参照にされたい）。
IV．処置に反応する患者
処置に反応する患者は、症状を表さないが疾患の危険性にある個体ならびに現在症状を表している患者が含まれる。アルツハイマー病の場合、彼または彼女が十分に長く生きていれば、実際、誰でもアルツハイマー病に罹患する危険性がある。したがって、本発明は主題となる患者の危険性を評価する必要が無い一般的集団に予防的に投与することができる。本発明の方法は、アルツハイマー病の既知の遺伝的危険性を有する個体に特に有用である。そのような個体には、この疾患をすでに経験した親類を有する個体、および遺伝子または生化学的マーカーの分析により危険が決定された個体を含む。アルツハイマー病に対する危険性の遺伝子マーカーは、APP遺伝子に突然変異を含み、特にそれぞれハーディ(Hardy)およびスウェーデンの突然変異と呼ばれる717位ならびに670および671位での突然変異を含む（Hardy,TINS,同上を参照にされたい）。危険性の他のマーカーは、プレセニリン遺伝子、PS1およびPS2中の突然変異、およびApoE4、ADの家系、高コレステロール血症またはアテローム硬化症である。現在アルツハイマー病に罹患している個体は、特徴的な痴呆ならびに上記の危険因子の存在により認識され得る。さらに、ADを有する個体を同定するために多数の診断試験を利用することが可能である。これらにはCSFτおよびＡβ42レベルの測定を含む。上昇したτおよび減少したＡβ42レベルは、ADの存在を意味する。アルツハイマー病に罹患している個体は、実施例の部で検討するようなADRDA基準により診断することもできる。
【００８９】  無症候性患者では、処置は任意の年齢（例えば10、20、30）で始めることができる。しかし通常、患者が40、50、60または70に達するまで処置を始める必要はない。処置は典型的には一定期間にわたり多回の投薬を必要とする。処置は期間中、抗体をアッセイすることにより、あるいは治療薬(例えばＡβペプチド）に対して活性化されたＴ-細胞またはＢ-細胞応答をモニタリングすることができる。応答が落ちれば、追加免疫投与が指示される。ダウン症候群の可能性がある患者の場合は、処置は母親に投与することにより出生前に、または出生直後に始めることができる。
V．処置処方
予防的応用では、医薬組成物または薬剤をアルツハイマー病に罹患し易いか、または危険性のある患者に、疾患の生化学的、組織学的および／または行動的症状、疾患の発生中に現れるその合併症および中間的な病状の表現型を含め、危険性を排除または下げるために、重篤度を下げるために、または疾患の発症を遅らせるために十分な量で投与する。治療的応用では、組成物または薬剤をそのような疾患に罹患したと疑われるか、またはすでに罹患した患者に、疾患の発生における合併症および中間的な病状の表現型を含め、疾患の症状（生物化学的、組織学的および／または行動的症状）を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に停止するために十分な量で投与する。幾つかの方法では、薬剤の投与が特徴的なアルツハイマーの病状を未だに発症していない患者において、ミオコグニィティブ（mycognitive）障害を減らすか、または排除する。治療的または予防的処置を行うために十分な量は、治療的に−または予防的に−有効な用量であると定める。予防的または治療的処方の両方で、薬剤は通常、十分な免疫応答に達するまで何回かの投薬用量を投与される。典型的には免疫応答をモニタリングし、そして免疫応答が弱くなり始めたら繰り返して投薬が与えられる。
【００９０】  上記の症状を処置するために本発明の組成物の有効な投薬用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるかどうか、投与する他の薬剤、および処置が予防的または治療的であるかどうかを含む多くの異なる因子に依存して変動する。通常、患者はヒトであり、しかしトランスジェニック哺乳動物を含め非ヒト哺乳動物も処置することができる。処置の投薬用量は、安全性および効力を至適化するために滴定する必要がある。免疫原の量は、アジュバントが投与されるかどうかにも依存し、より高い投薬用量がアジュバントの不存在では必要である。投与のための免疫原の量は時折、患者あたり１〜500μgで変動し、そしてより通常はヒトの投与について１回の注射あたり５〜500μgである。時には１回の注射あたりより多い用量の１〜２mgを使用する。典型的には約10、20、50または100μgを各ヒトの注射に使用する。免疫原の塊も、免疫原全体の塊に対する免疫原内の免疫原性エピトープの塊比（mass ratio）に依存する。典型的には、10-3〜10-5マイクロモルの免疫凍性エピトープが、マイクログラムの免疫原について使用される。注射の時期は１日１回から、１年に１回まで、10年に１回まで有意に変動し得る。免疫原の投薬用量が与えられる任意の日に、投薬用量は１μg／患者より多く、そして通常はアジュバントも投与されるならば10μg／患者より多く、そして通常はアジュバントが不存在である場合、100μg／患者より多い。典型的な処方は、免疫感作に続いて６週間の間隔のような間隔での追加免疫注射から成る。別の処方は、免疫感作に続いて１、２そして12カ月後の追加免疫注射から成る。別の処方は、一生、２カ月毎の注射を必要とする。あるいは追加免疫注射は、免疫応答をモニタリングすることにより示されるように、不定期ベースで行うことができる。
【００９１】  抗体を用いた受動免疫感作について、投薬用量範囲は、宿主の体重に基づき約0.0001〜100mg/kg、より通常は、0.01〜5mg/kgの範囲である。例えば投薬用量は、１mg/kg体重または10mg/kg体重または1〜10mg/kgの範囲内である。例示する処置計画は、２週間毎に１回、または１カ月に１回、または３〜６カ月に１回の投与を必要とする。幾つかの方法では、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体を同時に投与し、この場合は投与する各抗体の投薬用量は、示した範囲にある。抗体は通常、多回投与される。１回毎の間隔は、毎週、毎月または毎年であることができる。間隔は患者中のＡβに対する抗体の血中レベルを測定することにより、示した不定期であることができる。幾つかの方法では、投薬用量は１〜1000μg/ml、そして幾つかの方法では25〜300μg/mlの血漿抗体濃度を達成するように調整する。あるいは抗体は徐放性製剤として投与することができ、この場合はより低い頻度の投与が必要である。投薬用量および頻度は、患者内の抗体の半減期に依存して変動する。一般にヒト抗体が最長の半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体そして非ヒト抗体が続く。投薬用量および頻度は、処置が予防的かまたは治療的であるかどうかに依存して変動する。予防的応用では、比較的低い投薬用量が長期間にわたり、比較的低い頻度の間隔で投与される。患者の中には生涯、処置を受け続ける人もいる。治療的応用では、時折、比較的短い間隔で比較的高い投薬用量が疾患の進行が低下または停止するまで、そして好ましくは患者が疾患の症状の部分的または完全な改善を示すまで必要とされる。その後に、患者は予防的処方を投与される。
【００９２】  免疫原をコードする核酸の用量は、患者あたり約10ng〜１g、100ng〜100mg、１μg〜10mg、または30〜300μg DNAである。感染性のウイルスベクターは、用量あたり10〜100以上のビリオンで変動する。
【００９３】  免疫応答を誘導する作用物質は、予防的および／または治療的処置のために非経口的、局所的、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻内または筋肉内手段で投与することができる。免疫原性作用物質の最も多い投与経路は皮下であるが、他の経路も同等に有効である。次に最も多い経路は、筋肉内注射である。この種の注射は、最も典型的には腕または足の筋肉に行う。幾つかの方法では、作用物質を沈着物が蓄積している特定の組織に直接注射、例えば頭蓋内注射．する。抗体の投与には、静脈内潅流の筋肉内注射が好適である。幾つかの方法では、特定の治療用抗体を、頭蓋に直接注射する。幾つかの方法では、抗体を徐放性組成物またはMedipad(商標)デバイスのようなデバイスとして投与する。
【００９４】  本発明の作用物質は、アミロイド形成疾患の処置に少なくとも部分的に有効な他の作用物質と組み合わせて投与することができる。アミロイド沈着物が脳で生じるアルツハイマー病およびダウン症候群の場合、本発明の作用物質は血液−脳バリアをわたって本発明の作用物質の通過を増加させる他の作用物質と一緒に投与することができる。
【００９５】  ペプチドのような本発明の免疫原性作用物質は、時折アジュバントと組み合わせて投与される。種々のアジュバントをＡβのようなペプチドと組み合わせて使用して、免疫応答を誘導することができる。好適なアジュバントは、応答の質的な形態に影響を及ぼす免疫源に立体配置的変化を生じることなく、免疫原への固有の応答を増す。好適なアジュバントには、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、3 De-O-アシル化モノホスホリルリピドＡ（MPL(商標))(英国特許第2220211号明細書(リビイムノケム  リサーチ社(RIBIImmunoChem Research Inc.）、ハミルトン、モンタナ州、コリキサ（Corixa）の新しい部門、を参照にされたい）。Stimulon(商標)QS-21はトリテルペングリコシドまたは南アフリカで見られるキラヤ（Quillaja Saponaria Molina)の木の樹皮から単離されるサポニンである（Kensil et al.,ワクチンの設計:サブユニットおよびアジュバント法（Vaccine Design:The Subunits and Adjuvant Approach)(Powell & Newman編集、プレナム出版、NY、1995):米国特許第5,057,540号明細書(アクイラ  バイオファルマシューティカルズ(Aquila BioPharmaceuticals)、フラミンハム、マサチューセッツ州）を参照にされたい）。他のアジュバントは、場合によりモノホスホリルリピドＡと組み合わせた水中袖型のエマルション（スタアレンまたはピーナッツ油）である（Stoute et al.,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997)を参照にされたい)。別のアジュバントはCpG（国際公開第98/40100号明細書)である。あるいはＡβをアジュバントにカップリングすることができる。しかしそのようなカップリングは、Ａβに対する免疫応答の性質に影響を及ぼさないように、Ａβの立体配置を実質的に変えるべきではない。アジュバントは活性な作用物質を含む治療用組成物の成分として投与することができ、あるいは治療剤の投与前、同時、または後に別に投与することができる。
【００９６】  好適な種類のアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムのようなアルミニウム塩（alum）である。そのようなアジュバントは、MPLまたは3-DMP、QS-21、ポリグルタミン酸またはポリリシンのようなポリマー性またはモノマー性アミノ酸のような他の特異的免疫刺激剤を用いて、または用いずに使用することができる。別の種類のアジュバントは、水中油型のエマルション製剤である。そのようなアジュバントは、ムラミルペプチド（例えばN-アセチルムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(nor-MDP)、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(MTP-PE)、N-アセチルグルコサミニル-N-アセチルムラミル-L-Al-D-イソグル-L-Ala-ジパルミトキシ  プロピルアミド(DTP-DPP)テラミドTM)、または他の細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫刺激剤を用いて、または用いずに使用することができる。水中油型のエマルションには、（ａ）モデル110Y ミクロ流動装置（ミクロフルイディックス(Microfluidics)、ニュートン、マサチューセッツ州）のようなミクロ流動装置を使用してサブミクロン粒子に配合した、５％スクアレン、0.5％Tween80および0.5％Span85（場合により種々の量のMTP-PEを含む)MF59（国際公開第90/14837号明細書）、（ｂ）サブミクロンのエマルションにミクロ流動化されたか、またはボルテックス混合してより大きな粒子サイズのエマルションに生成した、10％スクアレン、0.4％Tween80、５％プルロニック−ブロックポリマーL121およびthr-MDPを含むSAF、および（ｃ）２％スクアレン、0.2％Tween80、およびモノホスホリルリピドＡ(MPL)、トレハロース  ジミコレート(TDM)および細胞壁骨格(CWS)から成る群からの１以上の細菌細胞壁成分、好ましくはMPL＋CWS(Detox(商標)を含むRibi(商標)アジュバント系(RAS)(リビ イムノケム、ハミルトン、マサチューセッツ州）を含む。別の種類の好適なアジュバントは、Stimulon(商標)(QS-21、アクイラ、フラミンハム、マサチューセッツ州）またはISCOMs(免疫刺激複合体)およびISCOMATRIXのようなそれらから生成した粒子のようなサポニンアジュバントである。他のアジュバントには、完全フロインドアジュバント（CFA）および不完全フロインドアジュバント（IFA）を含む。他のアジュバントには、インターロイキン類（IL-1、IL-2およびIL-12）、マクロファージ コロニー刺激因子（M-CSF）、腫瘍壊死因子（TNF）のようなサイトカインを含む。
【００９７】  アジュバントは１つの組成物として免疫原と投与することができ、あるいは免疫原の投与前、投与と同時または投与後に投与することができる。免疫原およびアジュバントは包装され、そして同じバイアルで供給することができ、あるいは別のバイアルに包装され、そして使用前に混合することができる。免疫原およびアジュバントは、典型的には目的とする治療的応用を示すラベルと共に包装される。免疫原およびアジュバントが別個に包装される場合、包装には典型的には使用前の混合のために使用説明書を含む。アジュバントおよび／またはキャリアーの選択は、アジュバントを含有する免疫原製剤の安定性、投与経路、投薬計画、予防接種される種に関するアジュバントの効力、およびヒトでは、医薬的に許容されるアジュバントが適切な調節体（pertinent regulatory body）によるヒト投与に認可されているか、または認可され得るものである、ということに依存する。例えば完全フロインドアジュバントはヒトへの投与に適さない。Alum、MPLおよびQS-21が好適である。場合により、２以上の異なるアジュバントを同時に使用することができる。好適な組み合わせば、alumとMPL、alumとQS-21、MPLとQS-21およびalum、QS-21とMPLが一緒の場合を含む。また不完全フロインドアジュバントも、場合によってはalum、QS-21、およびMPLおよびそれらのすべてと組み合わせて使用することができる（Chang et al.,進歩したドラッグデリバリーの総説（Advanced Drug Delivery Reviews 32,173-186(1998))。
【００９８】  本発明の作用物質は、しばしば活性な治療薬、すなわち、および他の様々な医薬的に許容される成分を含んで成る医薬組成物として投与される。レミングトンの製薬科学(Remington's Pharmaceutical Science)、第15版、マック(Mack)出版社編集、イーストン、ペンシルバニア州、1980を参照にされたい）。好適な形態は意図する投与様式および治療的応用に依存する。また組成物は所望する製剤に依存して、医薬的に許容され得る、非毒性のキャリアーまたは希釈剤を含むこともでき、これは動物またはヒトへ投与する医薬組成物を製剤するために通例使用する賦形剤と定める。希釈剤は組み合わせの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。さらに医薬組成物または製剤は、他のキャリアー、アジュバントまたは非毒性の非治療的、非免疫原性安定化剤等を含んでもよい。
【００９９】  また医薬組成物は、タンパク質、キトサンのような多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（ラテックス官能化sepharose（商標)、アガロース、セルロース等）、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集物（油滴またはリポソームのような）のような大きく、ゆっくりと代謝される高分子を含むことができる。さらにこれらのキャリアーは、免疫刺激剤（すなわちアジュバント）としても機能することができる。
【０１００】  非経口投与には、本発明の作用物質は水、油、塩水、グリセロールまたはエタノールのような滅菌液体であることができる医薬キャリアーを含む生理学的に許容されうる希釈剤中で、物質の溶剤または懸濁剤の注入可能な投薬用量として投与することができる。さらに湿潤剤または乳化剤、表面活性剤、pH緩衝化物質等のような補形剤が組成物中に存在できる。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物または合成起源の、例えばピーナッツ油、ダイズ油および鉱物油である。一般に、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールのようなグリコール類は、特に注入溶剤として好適な液体キャリアーである。抗体は、有効成分の徐放性放出を可能とする様式に製剤することができる、デポー注入(depot injection)またはインプラント調製物の状態で投与することができる。例示的な組成物には、HClでpH6.0に合わせた50mM L-ヒスチジン、150mM NaClを含む水性バッファー中に配合された５mg/mLのモノクローナル抗体を含んで成る。
【０１０１】  典型的には、組成物は液体溶剤または懸濁剤のいずれかとしての注入剤；溶液中に、または懸濁液中に適する固体形態として調製され、注入前に液体賦形剤を調製することもできる。また調製物は、上記のようにアジュバント効果を強化するため、乳化またはリポソームまたはポリラクチド、ポリグリコライドのような微粒子またはコポリマー中にカプセル化することもできる（Langer,Science 249,1527(1990)およびHanes、進歩したドラッグデリバリーの総説（Advancd Drug Delivery Reviews 28,97-119(1997)を参照にされたい)。本発明の作用物質は、有効成分の徐放性または拍動性放出を可能とするような様式で製剤することができる沈積注入またはインプラント調製物で投与することができる。例示される組成物は、50mM L-ヒスチジン、150mM NaClから成り、HClでpH6.0に調整された水性バッファー中に配合された５mg/mLのモノクローナル抗体を含んで成る。
【０１０２】  典型的には、組成物は液体、溶剤または懸濁剤のいずれかとして注入剤として；溶液中または懸濁液中に適する固体形態として調製され、注入前に液体賦形剤も調製することができる。調製物は乳化またはされるか、またはポリラクチド、ポリグリコライド、または強化するアジュバント効果のためにコポリマーにカプセル化され得る（Langer,Science 249,1527(1990)およびHans、進歩したドラッグデリバリーの総説（Agvanced Drug Delivery Reviews) 28,97-119(1997)を参照にされたい)。本発明の作用物質は、有効成分の徐放性または拍動性放出を可能とする様式のように製剤することができる、沈積注入またはインプラント調製物を形態で投与することができる。
【０１０３】  他の投与様式に適当なさらなる製剤は、経口、鼻内および肺への製剤、坐薬および経皮適用を含む。
【０１０４】  坐薬には、結合剤およびキャリアー、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含み；そのような坐薬は、0.5％〜10％、好ましくは１〜２％の範囲で有効成分を含有する混合物の状態から形成することができる。経口製剤には、医薬級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムのような賦形剤を含む。これらの組成物は、溶剤、懸濁剤、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉剤の形態をとり、そして10％〜95％の有効成分、好ましくは25％〜70％を含む。
【０１０５】  局所適用は、経皮または皮内送達をもたらすことができる。局所投与は、コレラトキシンまたはそれらの解毒誘導体またはそれらのサブユニットあるいは他の類似の細菌毒素を含む作用物質の同時投与(co-administration)により行うことができる（Glenn et al.,Nature 391,851(1988）を参照にされたい）。同時投与は、成分を混合物として、あるいは化学的架橋により得られる連結分子を使用することにより、または融合タンパ質として発現させることにより行うことができる。
【０１０６】  あるいは経皮送達は、皮膚パッチを使用して、またはトランスフェロソーム（transferosome)を使用して行うことができる（Paul et al.,Eur.J.Immunol.25,3521-24(1995)；Cevc et al.,Biochem.Biophys,Acta 1368,201-15(1998))。
VI．診断法
本発明は、アルツハイマー病に罹患しているか、またはその疑いがある患者中のＡβペプチドに対する免疫応答の検出法を提供する。本発明は、患者に投与する処置の経過をモニタリングするために特に有用である。この方法は、症状を有する患者の治療的処置に、および無症候性患者の予防的処置の両方をモニタリングするために使用することができる。この方法は、能動免疫感作（例えば、免疫原の投与に応答する抗体の生産）および受動免疫感作（例えば投与した抗体のレベルの測定）の両方をモニタリングするためにに有用である。
１．能動免疫感作
幾つかの方法は、作用物質の用量を投与する前に、患者の免疫応答のベースライン値を決定し、そしてこれを処置後の免疫応答の値と比較する必要がある。免疫応答の値において、有意な上昇（すなわち、同じサンプルの繰り返し測定で、典型的な許容される実験誤差より大きく、そのような測定の平均からの標準偏差で表されるような）は、陽性の処置結果を示す（すなわち、その作用物質の投与が免疫応答を達成したか、または増した）。免疫応答の値が有意に変化しないか、または減少したならば、陰性の処置結果を示す。一般に、免疫原性作用物質を用いた最初の処置のコースを受けている患者は、連続的な投薬で免疫応答の上昇を示すと予想され、これは最終的には安定水準に達する。作用物質の投与は一般に、免疫応答が上昇している間、続けられる。安定水準への到達は、処置の投与を中断できるか、または投薬用量または頻度を低下できることを示すものである。
【０１０７】  別の方法では、免疫応答の対照値（すなわち、平均および標準偏差）が対照群について決定される。典型的には対照群の個体は前処置を受けなかった。治療薬を投与された後に測定された患者の免疫応答の値は、次に対照値と比較される。対照値に対して有意な上昇（例えば、平均から１標準偏差よりも大きい）は、陽性の処置結果を示す。有意な上昇がないか、または減少のシグナルは、陰性の処置結果を示す。作用物質の投与は一般に、対照値に対して免疫応答が上昇している間は続行される。前記のように、対照値に比べて安定水準に達すると、処置の投与を中断できるか、または投薬用量または頻度を低下できることの指標である。
【０１０８】  別の方法では、免疫応答の対照値（例えば平均および標準偏差）は、治療薬での処置を受け、そしてその免疫応答が処置に応答して安定水準に達した個体の対照群から決定される。患者の免疫応答の測定値は、対照値と比較される。患者で測定されたレベルが対照値と有意に異ならないならば（例えば、１標準偏差より大きい）、処置を中断することができる。患者のレベルが対照値よりも有意に下ならば、投与の続行が認められる。その患者のレベルが対照値よりも低いままならば、処置計画の変更、例えば異なるアジュバントの使用を示しているのかもしれない。
【０１０９】  別の方法では、現在処置は受けていないが、既に処置のコースを受けたことがある患者を、処置の再開が必要であるかどうかを決定するために免疫応答をモニタリングする。患者の免疫応答の測定値は、患者が以前に達成した免疫応答の値と、前の処置コースの後に比較できる。以前の測定に比べて有意な減少（すなわち、同じサンプルの繰り返し測定で、典型的な許容誤差範囲よりも大きい）は、処置を再開できることを示している。あるいは患者の測定値を、処置のコースを受けた後の患者群で決定した対照値（平均に標準偏差を加えた）と比較することができる。あるいは患者の測定値を、疾患の症状がないままの予防的に処置した患者群または疾患の特徴の改善を示す治療的に処置した患者の群の対照値と、比較することができる。すべての場合で、対照レベルに対して有意な低下（すなわち、標準偏差よりも大きい）は、患者の処置を再開すべきであることを示す。
【０１１０】  分析用の組織サンプルは、典型的には患者に由来する血液、血漿、血清、粘膜もしくは脳脊髄液である。サンプルは任意の形態のＡβペプチド、典型的にはＡβ42に対する免疫応答の指標について分析する。免疫応答は、例えばＡβペプチドに特異的に結合する抗体またはＴ-細胞の存在から決定される。Ａβに特異的な抗体を検出するELISA法は、実施例の部に記載する。反応性Ｔ-細胞を検出する方法は、すでに記載した（定義を参照にされたい）。幾つかの方法では、免疫応答を上記第III章に記載したような除去アッセイを使用して決定する。そのような方法では、試験する患者からの組織サンプルを、アミロイド沈着物（例えばPDAPPマウスに由来する）、およびFcレセプターを持つ食細胞と接触させる。続いてアミロイド沈着物の除去をモニタリングする。除去応答の存在および程度は、試験下の患者の組織サンプル中のＡβを除去するために有効な抗体の存在およびレベルの指標を提供する。
２．受動免疫感作
一般に、受動免疫感作をモニタリングする手順は、上記の能動免疫感作をモニタリングする手順と同様である。しかし受動免疫感作後の抗体プロフィールは、典型的には抗体濃度の即座のピーク、続いて指数的減少を示す。さらなる投薬用量なしで、この減少は投与した抗体の半減期に依存して、数日から数カ月の期間内に前処置レベルに達する。例えばヒトの抗体の中には半減期が20日の単位のものもある。
【０１１１】  幾つかの方法では、患者のＡβに対する抗体のベースライン測定は投与前に行い、第二測定はピーク抗体レベルを決定するためにその後すぐに行い、そして１以上のさらなる測定を抗体レベルの減少をモニタリングするための間隔で行う。抗体のレベルがベースラインまたは予め定めた割合のピーク低下ベースライン（例えば、50％、25％または10％）に達した時、さらなる抗体の投薬用量の投与を投与する。幾つかの方法では、ピークまたは続いて測定されるバックグラウント未満のレベルを、既に定めた参照レベルと比較して、他の患者に有益な予防的または治療的処置計画を構成する。測定される抗体レベルが参照レベルよりも有意に低いならば（例えば、平均から処置の利益を享受する患者群の参照値の１標準偏差を引いたものより低い）、抗体のさらなる投薬用量を示している。
３．診断キット
本発明はさらに、上記の診断法を行うための診断キットを提供する。典型的には、そのようなキットはＡβに対する抗体に特異的に結合する作用物質を含む。キットは、標識も含むことができる。Ａβに対する抗体を検出するために、標識は典型的には標識された抗-イディオタイプ抗体の状態である。抗体の検出には、作用物質をマイクロタイター皿のウェルのような固体相に予め結合して供給することができる。またキットは、典型的にはキットの使用について指示するラベルを含む。こめラベルはＡβに対する抗体のレベルと測定したラベルのレベルを相関させるチャートまたは他の対応する型（regime）を含んでもよい。用語ラベルとは、製造、輸送、販売または使用の任意の時にキットに付けられた、または関連する記載または記録されたデータを称する。例えば、用語ラベルには広告用リーフレットおよび小冊子、包装材料、使用説明書、オーディオまたはビデオカセット、コンピューターディスク、ならびにキットに直接印字された記載を包含する。
【０１１２】  また本発明は、インビボ撮影を行うための診断キットを提供する。そのようなキットは典型的には、Ａβの、好ましくは残基1-10内のエピトープに結合する抗体を含む。好ましくは抗体は標識されているか、または２次標識試薬がキットに含まれている。好ましくはキットにはインビボ撮影アッセイを行うための使用説明書が貼られている。
VII．インビボ撮影
本発明は、患者内のアミロイド沈着物をインビボで撮影する方法を提供する。そのような方法は、アルツハイマー病またはそれに対する罹患性を診断または確認するために有用である。例えばこの方法は、痴呆を症状を表す患者について使用することができる。患者が異常なアミロイド沈着物を有するならば、患者はアルツハイマー病に罹患しているだろう。この方法は無症候性の患者にも使用することができる。アミロイドの異常な沈着物の存在は将来、症状のある疾患に対する罹患性を示す。またこの方法は、アルツハイマー病と以前に診断された患者において、疾患の進行および／または処置に対する応答をモニタリングするためにも有用である。
【０１１３】  この方法は、患者のＡβに結合する抗体のような試薬を投与し、そして次に作用物質を結合した後に検出することにより行う。好適な抗体は、完全長のAPPポリペプチドに結合せずに患者内のＡβ沈着物に結合する。アミノ酸1-10内のＡβのエピトープに結合する抗体は、特に好適である。幾つかの方法では、抗体はＡβのアミノ酸7-10内のエピトープに結合する。そのような抗体は、典型的には実質的な除去応答を誘導せずに結合する。別の方法では、抗体はＡβのアミノ酸1-7内のエピトープに結合する。そのような抗体は典型的には結合し、そしてＡβに対する除去応答を誘導する。しかし除去応答は、Fabのような完全長の定常領域を欠く抗体フラグメントを使用することにより回避することができる。幾つかの方法では、同じ抗体を処置および診断試薬として両方に役立てることができる。恐らくＣ-末端エピトープはアミロイド沈着物内に接近できないので、一般にＡβの残基10内のエピトープＣ-末端に結合する抗体は、Ａβの残基1-10内のエピトープに結合する抗体として強いシグナルを示さない。したがって、そのような抗体はそれほど好ましくない。
【０１１４】  診断試薬は、患者の体内に静脈内注入により、あるいは頭蓋内注入によりまたは頭骨に穴を空けることにより脳に直接投与することができる。試薬の投薬用量は、処置法と同じ範囲内にあるべきである。典型的には試薬を標識するが、方法によってはＡβに親和性を有する１次試薬を標識せず、そして２次標識試薬を使用して、１次試薬に結合させる場合もある。標識の選択は、検出手段に依存する。例えば、蛍光標識は光学的検出に適当である。常磁性標識は外科的介入なしで断層撮影的検出に適当である。放射性標識も、PETまたはSPECTを使用して検出することができる。
【０１１５】  診断は、対応するベースライン値と、標識した位置の数、サイズおよび／または強度を比較して行う。ベースライン値は、罹患していない個体群の平均レベルを表すことができる。またベースライン値は、同じ患者で測定した以前の値を表すこともできる。例えばベースライン値は、処置を始める前の患者で決定し、そして測定した値をその後にベースライン値と比較することができる。ベースラインに対する値の減少は、処置に対する陽性の応答を示す。
【実施例】
【０１１６】                                実施例
I．ＡＤに対するＡβの予防的効力
これらの実施例は、アルツハイマー様の神経病状を発症し易い717位（APP717V→F)での突然変異を有するAPPを過剰発現しているトランスジェニックマウスへのＡβ42ペプチドの投与を説明する。これらのマウス(PDAPPマウス）の作出および特性は、Gemes et al.,Nature、同上に記載されている。これらの動物はそれらのヘテロ接合体状態で、6カ月齢から先にＡβを沈着し始める。15月齢までに、それらはアルツハイマー病に見られるものに等しいＡβ沈着物のレベルを表す。PDAPPマウスには凝集したＡβ42（凝集Ａβ42）またはリン酸緩衝化生理食塩水を注射した。凝集したＡβ42は、Ａβの多くのエピトープに対する抗体を誘導できる能力から選択した。
Ａ．方法
１．マウスの起源
30匹のPDAPP異質メスマウスを、無作為に以下の群に分けた：10匹のマウスには凝集Ａβ42を注射し（１匹は移動中に死亡した）、５匹はPBS/アジュバントまたはPBSを注射し、そして10匹は未注射対照であった。５匹のマウスには血清アミロイドタンパク質（SAP）の配列から誘導したペプチドを注射した。【０１１７】  ２．免疫原の調製
凝集Ａβ42の調製：２ミリグラムのＡβ42（USペプチド社：ロットK-42-12）を、0.9mlの水に溶解し、そして0.1mlの10×PBSを加えて１mlとした。これをボルテックスで混合し、そして37℃で一晩、インキューベーションし、この条件下でペプチドが凝集した。使用しなかったＡβは乾燥した凍結乾燥粉末として次に注射するまで−20℃で保存した。【０１１８】  ３．注射の準備
各注射には、マウスあたりPBS中に100μgの凝集Ａβ42を、初回の免疫感作には１：１で完全フロイントアジュバント（CFA）と最終容量400μlのエマルションに乳化し、続いて同量の免疫原の追加免疫は、完全フロイントアジュバント（IFA）中で２週間目に行った。IFA中さらに２回の用量を１カ月の間隔で与えた。後の免疫感作は１カ月の間隔で500μlのPBS中で行った。注射は腹腔内（i.p.）に行った。【０１１９】  PBSの注射は同じスケジュールに従い、そしてマウスにはPBS/アジュバントの１：１の混合物をマウスあたり400μlで、またはマウスあたり500μlのPBSを注射した。SAP注射は、注射あたり100μgの用量を使用して同様に同じスケジュールに従った。【０１２０】  ４．マウス採血の滴定、組織プレパレーションおよび免疫組織化学
上記の方法は、以下の一般的な材料および方法に記載する。
Ｂ．結果
PDAPPマウスに、凝集したＡβ42（凝集Ａβ42）、SAPペプチドまたはリン酸緩衝化生理食塩水のいずれかを注射した。PDAPPマウスの群は、注射しない陽性対照としても残した。凝集Ａβ42に対するマウスの力値は、４回目の追加免疫から１カ月おきに、マウスが１年齢になるまでモニタリングした。マウスを13カ月目に屠殺した。調査したすべての時点で、９匹のうちの８匹の凝集Ａβ42マウスが、高い抗体力価を生じ、これは一連の注射を通して高いままであった（1/10000よりも高い力価）。９匹目のマウスは低いが、約1/1000の測定可能な力価であった（図１、表１）。SAPP-注射マウスは、この免疫原について1:1,000〜1:30,000の力価を有し、１匹のマウスだけが1:10,0000を越えた。【０１２１】  PBS-処置マウスは、凝集Ａβ42に対して６、10および20カ月目に滴定した。1/100希釈で、PBSマウスは凝集Ａβ42に対して滴定した時、１つのデータ点でバックグラウンドの４倍を越えただけで、それ以外はすべての時点でバックグラウンドより４倍少なかった（表１）。SAP-特異的応答は、すべての力価が300未満のこのような時点はすべて、無視することができた。【０１２２】  凝集Ａβ1-42処置群の９匹のうちの７匹のマウスが、それらの脳内に検出可能なアミロイドが無かった。対照的に、SAPおよびPBS群のマウスに由来する脳組織は、海馬ならびに前頭および帯状束皮質に多数のアミロイド沈着物を含んだ。沈着物のパターンは未処置対照のパターンに類似し、歯状回の外側分子層のような脆弱なサブ領域の特徴的な関与があった。Ａβ1-42注射群からの１匹のマウスには、海馬に限定されたアミロイド負荷量の大きな減少があった。単離した斑は別のＡβ1-42処置マウスで確認された。【０１２３】  海馬中のアミロイド負荷量の定量的な画像分析では、Ａβ４２(AN1792)-処置動物で劇的な減少が達成されたことが証明された（図２）。PBS群(2.22％)および未処置対照群（2.65％）のアミロイド負荷量は、AN1792で免疫感作した群よりも有意に大きかった（0.00％、ｐ＝0.0005）。対照的に、SAPペプチド(SAPP)で免疫感作した群の中央値は5.74％であった。未処置、対照マウスに由来する脳組織は、海馬ならびに夾板畳後皮質に、Ａβ-特異的モノクローナル抗体(mAb)3D6で視覚化される多数のＡβアミロイド沈着物を含んだ。同様なアミロイド沈着物パターンが、SAPPまたはPBSで免疫感作したマウスでも見られた（図２）。さらにこれらの３つの後者の群には、すべての３つのこのような群で歯状回の外側分子層のような、ＡＤで古典的に見られる脳の脆弱なサブ領域の特徴的な関与があった。【０１２４】  Ａβ沈着物を含まなかった脳は、典型的にはPDAPPマウスでヒトのAPP抗体8E5を用いて視覚化される神経炎斑も無かった。残りの群（SAP-注射、PBSおよび非注射マウス）の脳のすべてが、未処置PDAPPマウスに典型的な多数の神経炎斑を有した。少数の神経炎斑が、AN1792で処置した１匹のマウスに存在し、そして異栄養性の神経突起の１クラスターがAN1792で処置した第二マウスで見られた。海馬の画像分析および図３では、PBS受容体と比較して（中央値0.28％、ｐ＝0.0005）、AN1792-処置マウスにおける異栄養性の神経突起のほとんどの排除が実質的に示された（中央値0.00％）。【０１２５】  斑が関係する炎症の星状細胞増加症の兆候も、Ａβ1-42注射群の脳には存在しなかった。他の群の���ウスに由来する脳は、豊富な、しかもクラスターとなったＡβ斑が関係するグリオーシスに典型的なGFAP-陽性星状細胞を含んだ。GFAP-反応したスライドのサブセットを、Ａβ沈着物の位置を定めるためにチオフラビンSによりカウンター染色した。GFAP-陽性の星状細胞は、SAP、PBSおよび未処置対照でＡβ斑に関連した。そのような関連は、斑−陰性のＡβ1-42処置マウスでは見られず、一方、最小の斑が関係するグリオーシスはAN1792で処置した１匹のマウスで確認された。【０１２６】  図４に示す夾板骨後皮質に関する画像分析は、星状細胞増加症の減少がAN1792で処置した群について1.56％の中央値で有意であるが、SAPペプチド、PBSで免疫感作した群または未処置では６％より大きい中央値と確認された（ｐ＝0.0017）。【０１２７】  Ａβ1-42およびPBS-注射マウスのサブセットからの証拠は、斑が関係するMHCII免疫反応性がＡβ1-42注射マウスでは存在しないことを示し、Ａβ-関連炎症反応の欠如と一致した。【０１２８】  マウス脳の切片も、MAC-1、細胞表面タンパク質に特異的なモノクローナル抗体に特異的なmAbと反応した。MAC-1（CD11b)はインテグリンファミリーの員であり、そしてCD18とのヘテロ二量体として存在する。CD11b/CD18複合体は単球、マクロファージ、好中球およびナチュラルキラー細胞上に存在する（Mak and Simard）。脳内に存在するMAC-1-反応性細胞型は、MAC-1と免疫反応した切片中の類似する表現型的形態に基づきミクログリアであろう。斑が関係するMAC-1標識は、PBS対照群と比べてAN1792で処置したマウスの脳では低く、Ａβが誘導した炎症応答の欠如と一致することが分かった。
Ｃ．結論
Ａβ1-42-注射マウスの脳におけるＡβ斑の欠如および反応性ニューロンおよび膠状の変化は、それらの脳内に沈着物したアミロイドが無いか、または極めて少なく、そしてグリオーシスおよび神経炎的な病状といった病理学的な結末は存在しないことを示していた。Ａβ1-42で処置したPDAPPマウスは、本質的に対照の非トランスジェニックマウスと同じ病状の欠如を示す。したがってＡβ1-42の注射は脳組織からヒトＡβを沈着物の予防またば除去に、そして続いてニューロンおよび炎症変性的変化の排除に高度に有効である。すなわちＡβペプチドの投与は、ＡＤの防止に予防的および治療的利益の両方を有することができる。
II．投与量応答実験
５週齢のメスのスイス ウェブスターマウス（１群あたりＮ＝６）を、腹腔中に投与したCFA/IFA中に配合した300、100、33、11、3.7、1.2、0.4または0.13μgのＡβで免疫感作した。３回の用量を隔週の間隔で、続いて４回目を１カ月後に与えた。第一用量はCFAで乳化し、そして残りの用量はIFAで乳化した。動物は抗体力価を測定するために、２回目の投与量から始めて各免疫感作から４〜７日後に採血した。11、33または300μgの抗原で免疫感作した３群のサブセットの動物は、さらに免疫原製剤の投与量範囲にわたり抗体応答の減少をモニタリングするために、４回目の免疫感作後から４カ月間、およそ１カ月の間隔で採血した。これらの動物は実験開始後７カ月目に５回目の最終免疫感作を受けた。動物はAN1792に対する抗体応答を測定し、そして毒性学的分析を行うために１週間後に屠殺した。【０１２９】  減少する用量応答は、300から3.7μgで観察され、２つの低い用量では応答が無かった。平均抗体力価は、11〜300μgの抗原を３回の投与後に約１：1000、４回投与後に約１：10,000である（図５を参照にされたい）。【０１３０】  抗体力価はすべてについて劇的に上昇したが、最低の投与量群は３回目の免疫感作後に５-から25-倍の範囲でGMTが上昇した。低い抗体応答は、0.4μgの受容体でも検出できた。1.2および3.7μgの群は約1000のGMTに匹敵する力価を有し、そして最高から４つの用量は約25,000のGMTに一緒に集まったが、33μgの投与量群が3000の低いGMTであった。４回目の免疫感作後、力価の上昇はほとんどの群でより緩和であった。検出できる抗体が無い0.14μgの受容体から、36,000のGMTの11μgの受容体まで、0.14μgから11μgのより低い抗原投与量群の範囲で明らかな用量応答があった。ここでも、11〜300μgの４つの最高の投与量群の力価は、一緒になった。このように２回の免疫感作後、抗原用量に依存する抗体力価は、0.4〜300μgの広い範囲にわたった。第３の免疫感作までに、４つの最高の投与量の力価はすべて同等であり、そしてそれらはさらなる免疫感作後も安定水準のままであった。【０１３１】  ４回目の免疫感作から１カ月後、300μgの群で力価は免疫感作から５日後の血液からの測定値よりも２-から３-倍高かった（図６）。この観察は、ピークの既住性抗体応答が免疫感作から５日後よりも遅れて生じることを示唆している。より緩和な（50％）上昇が33μgの群で見られた。300μgの用量群は最後の投与から２カ月後に、GMTが約70％まで鋭く減少した。さらに１カ月後、この傾斜は45％(100μg)、および33および11μgで約14％と弱くなった。すなわち、免疫感作を終了した後の循環している抗体力値傾斜の速度は、ピーク応答の後に最初の月で鋭く傾斜し、続いてその後によりゆるやかな減少速度の２つの局面で現れる。【０１３２】  抗体力価およびこれらのスイス ウェブスターマウスの反応の動力学は、平行する様式で免疫感作した若いヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスのものと類似する。ヒトで免疫応答を誘導するために有効な投薬用量は、典型的にはマウスで有効な投薬用量に類似する。
III．安定したＡＤに対する治療的効力のスクリーニング
このアッセイは、加齢マウスにおけるＡＤの神経病理学的特徴を停止または好転する活性について、免疫原性作用物質を試験するために設計する。42アミノ酸長のＡβ（AN1792）を用いた免疫感作を、PDAPPマウスの脳にすでにアミロイド斑が存在する時点で開始した。【０１３３】  この実験を行った期間に、未処置PDAPPマウスはＡＤに見られるものに似た多数の神経変性的変化を生じる（Games et al.、同上およびJohnson-Wood et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94,1550-1555(1997)）。アミロイド斑中へのＡβの沈着物は、異栄養性の神経突起と呼ばれる迷走性の軸索および樹状突起要素から成る変性的なニューロン応答が付随する。異栄養性の神経突起に取り囲まれ、そしてそれを含むアミロイド沈着物は、神経炎症性局面と呼ぶ。ＡＤおよびPDAPPマウスの両方において、異栄養性の神経突起は顕著な球状構造を有し、APPおよび細胞骨格成分を認識する抗体パネルと免疫反応性であり、そして超微細構造レベルで複雑な細胞下の変性的変化を表す。これらの特徴は、PDAPP脳において疾患に関連する選択的かつ再現性のある神経炎症性局面の形成の測定を可能とする。PDAPP神経炎症性局面の異栄養性のニューロン成分は、ヒトAPPに特異的な抗体(モノクローナル抗体8E5）を用いて容易に視覚化され、そしてコンピューターによる画像分析で容易に測定可能である。したがって、アミロイド斑形成に及ぼすAN1792の効果を測定することに加えて、我々はこの処置が神経炎症性のジストロフィーの発生に及ぼす効果を監視した。【０１３４】  星状細胞およびミクログリアは、ニューロン傷害の程度に応答し、そして影響を与える非−ニューロン細胞である。GFAP-陽性星状細胞およびMHC II-陽性ミクログリアはＡＤで通常観察され、それらの活性化は疾患の重篤度を増す。したがって我々はAN1792-処置マウスにおける反応性星状細胞増加症および小膠細胞症の発生も監視した。
Ａ．材料および方法
チャールズ  リバー（Charles River）から得た48匹の、11〜11.5週齢のヘテロ接合性のメスPDAPPマウスを無作為に２群に分けた：24匹のマウスは100μgのAN1792で免疫感作し、そして24匹のマウスはPBSで免疫感作した（それぞれフロイントアジュバントと合わせた）。AN1792およびPBS群は再度、それらが〜15月齢に達した解きに分けた。15月齢で、各AN1792-およびPBS-処置動物のおよそ半分を安楽死させ（それぞれｎ＝10および９）、残りは〜18カ月で終了するまで免疫感作を受け続けた（それぞれｎ＝９および12）。全部で８匹の動物（５匹のAN1792および３匹のPBS）が、実験中に死亡した。免疫感作した動物に加えて、１年齢（ｎ＝10）、15月齢（ｎ＝10）および18月齢（ｎ＝10）の未処置PDAPPマウスを、脳内のＡβおよびAPPレベルをELISAで測定するために比較に含め；１年齢の動物も免疫組織化学的分析に含めた。【０１３５】  方法は外に示さない限り、実施例１の通りである。AN1792のUSペプチドロット12およびカリフォルニアペプチドロットME0339を使用して、15カ月時点以前に投与する６回の免疫感作用の抗原を調製した。カリフォルニアペプチドロットME0339およびME0439は、15から18カ月の間に３回のさらなる免疫感作投与に使用した。【０１３６】  免疫感作には、200μlPBS中の100μgのAN1792またはPBS単独を、完全フロイントアジュバント（CFA)または不完全フロイントアジュバント（IFA)またはPBSに、400μlの最終用量で1:1（容量／容量）に乳化した。初回免疫感作は、アジュバントとしてCFAを用いて送達し、次の４回の投与量はIFAを用いて与えられ、そして最後の４回の投与量はアジュバント無しのPBSのみを用いて与えられた。全部で９回の免疫感作を、７カ月間にわたり２週間のスケジュールで最初の３回の投与量を、続いて４週間の間隔で残りの注射を与えた。15月齢で安楽死させた４カ月の処置群は、最初の６回の免疫感作を受けただけであった。
Ｂ．結果
１．アミロイド負荷量に及ぼすAN1792処置の効果
定量的な画像分析により決定した皮質のアミロイド負荷量に及ぼすAN1792処置の結果を図７に示す。皮質のアミロイド負荷量の中央値は、未処置の12月齢PDAPPクウス群では0.28％であり、実験の開始でマウスの斑の負荷量を表す値であった。18カ月で、アミロイド負荷量はPBS-処置マウスで17-倍を超えて4.87％まで増加し、一方、AN1792-処置マウスはわずか0.01％のアミロイド負荷量に大きく減少し、12カ月の未処置および15-および18-カ月の両PBS-処置群よりも顕著に低かった。このアミロイド負荷量は、15-(96％の減少；ｐ＝0.003)および18-カ月（＞99％減少；ｐ＝0.0002）の両AN1792受容体で、有意に減少した。【０１３７】  典型的には、PDAPPマウスの皮質アミロイド沈着物は、前頭および夾板骨後皮質（RSC）から始まり、そして腹−側方向へ進行して側頭−エントルヒナル（entorhinal）皮質（EC）を含む。ほぼAN1792が最初に投与された時期である12月齢のマウスのECにはアミロイドはほとんど見いだされないか、または見いだされななかった。AN1792処置から４カ月後、アミロイド沈着物はRSCでは大きく減少し、そして進行的なECの関与はAN1792処置により完全に排除された。後者の観察はAN1792が、通常は側頭および側頭皮質を襲うアミロイドの進行を完全に止め、しかもRSC中の沈着物を停止させるか、あるいは好転させることを示した。【０１３８】  AN1792処置がPDAPPマウスの皮質アミロイド負荷量の発生に及ぼす甚大な効果は、さらに18-カ月までの７カ月間処置された群で示された。皮質アミロイドのほぼ完全な不在がAN1792-処置マウスで見られ、拡散した斑が全体的に欠如し、しかも緻密な沈着物に減少した。【０１３９】  ２．AN1792-処置に関連する細胞的および形態学的変化
Ａβ-陽性細胞群は、典型的にはアミロイド沈着物を含む脳の領域で見いだされた。注目すべきは、AN1792受容体の幾つかの脳で、皮質アミロイド斑がほとんど無いか、または全く見られなかったことであった。Ａβ免疫反応性の大部分が、大きな小葉または凝集細胞体を含む細胞内に含まれるようであった。表現型的には、これらの細胞は似ている活性化されたミクログリアまたは単球である。それらは活性化された単球およびミクログリア（MHCIIおよびCD11b)により発現されるリガンドを認識する抗体と免疫反応性であり、そして場合により血管の壁および管腔に付随していた。ＡβおよびMHCII-特異的抗体で標識した近-隣切片の比較により、これらの細胞の類似パターンが両クラスの抗体によりされたことが明らかとなった。AN1792-処置脳の詳細な調査により、MHCII-陽性細胞はこのような動物内に残る限定されたアミロイド付近に限られていることが明らかとなった。使用した固定条件下で、細胞はＴ細胞（CD3、CD3e）またはＢ細胞（CD45RA、CD45RB）リガンドまたは白血球共通抗原（CD45）を認議する抗体と免疫反応性ではなかったが、単球と交差反応するロイコシアリン（CD43）を認識する抗体と反応性であった。そのような細胞はPBS-処置マウスでは見いだされなかった。【０１４０】  PDAPPマウスは、海馬歯状回の外側分子層に重いアミロイド沈着物を一定して発生する。この沈着物はパーホラント（perforant)経路、ＡＤで古典的にアミロイド斑を含む領域下に明らかなすじを形成する。PBS-置マウスにおけるこれらの沈着物の特徴的な出現は、未処置PDAPPマウスですでに特徴つけられたものと似ていた。アミロイド沈着物は連続的バンド内に拡散および緻密化した斑の両方から成った。対照的に、AN1792-処置マウスに由来する多数の脳では、このパターンは劇的に変化した。海馬のアミロイド沈着物はすでに拡散したアミロイドを含まず、そしてバンド化したパターンは、完全に破壊された。代わりに抗-Ａβ抗体と反応性の多数の異常な点状構造が存在し、これらの幾つかはアミロイドを含有する細胞らしかった。【０１４１】  MHCII-陽性細胞は、AN1792-処置動物の細胞外アミロイド付近に観察されることが多かった。Ａβ-陽性細胞とアミロイドとの会合パターンは、AN1792-処置マウスに由来する幾つかの脳で大変類似した。このような単球性細胞の分布は、アミロイド沈着物の近位に限定され、そしてＡβ斑が無い他の脳の領域には全く存在しなかった。MHCII-およびＡβ-標識切片の共焦点顕微鏡では、斑の成分が多くの単球性細胞内に含まれることが明らかとなった。【０１４２】  MHCII-およびMACI-標識切片の定量的画像分析では、海馬におけるMACI反応性の測定を用いて、有意に達したPBS群に比較して、AN1792-処置マウスのRSCおよび海馬中で免疫反応性が上昇する傾向を明らかとした。【０１４３】  これらの結果は、斑を持つ脳の領域中のアミロイドの活発な細胞性除去を示している。【０１４４】  ３．Ａβレベルに及ぼすAN1792効果：ELISA測定
（ａ）皮質レベル
未処置PDAPPマウスでは、12カ月時点の皮質中の全Ａβの中央値レベルは1,600ng/gであり、これが15カ月までに8,700ng/gに増大した（表２）。18カ月で値は22,000ng/gであり、実験期間中に10倍以上に上昇した。PBS-処置動物は8,600ng/gの全Ａβを15カ月で有し、これは18カ月で19,000ng/gに上昇した。対照的に、AN1792-処置動物は15カ月の時点(1,600ng/g)で、PBS-免疫感作群よりも全Ａβが81％少なかった。有意に少ない（ｐ＝0.0001）全Ａβ（5,200ng/g)は、18カ月でAN1792およびPBS群を比較した時に見いだされ（表２）、存在する場合のＡβに72％の減少を表す。同様な結果がＡβ42の皮質レベルを比較した時に得られ、すなわちAN1792-処置群はより少ないＡβ42を含むが、この場合やAN1792とPBS群との間の差異は15カ月（ｐ＝0.04）および18カ月（ｐ＝0.0001、表２）で有意であった。【０１４５】
【表５】
0005580504.tif 000006
【０１４６】（ｂ）海馬レベル
未処置PDAPPマウスでは、12月齢で全Ａβの海馬レベルの中央値は15,000ng/gであり、これは15カ月で51,000ng/g、そしてさらに18カ月で81,000ng/gにまで上昇した（表３）。同様に、PBS免疫感作マウスは、15カ月および18カ月でそれぞれ40,000ng/gおよび65,000ng/gの値を示した。AN1792免疫感作動物は、少ない全Ａβを表し、特に15カ月および18カ月の時点でそれぞれ２5,000ng/gおよび51,000ng/gであった。18カ月のAN1792-処置群の値は、PBS処置群よりも有意に低くかった（ｐ＝0.0105；表３）。Ａβ42の測定では同じ結果のパターンを与え、すなわちAN1792-処置群のレベルは、18カ月の評価でPBS群よりも有意に低かった（それぞれ39,000ng/g対57,000ng/g；ｐ＝0.002）（表３）。【０１４７】
【表６】
0005580504.tif 000007
【０１４８】（Ｃ）小脳レベル
12カ月の未処置PDAPPマウスでは、全Ａβの小脳レベルの中央値は15ng/gであった（表４）。15カ月で、この中央値は28ng/gに上昇し、そして18カ月までに35ng/gまで上昇した。PBS-処置動物は15カ月で21ng/g、そして18カ月で43ng/gの全Ａβ値の中央値を示した。AN1792-処置マウスは15カ月で21ng/g、そして18カ月で43ng/gの全Ａβを有し、そして18カ月で対応するPBS群よりも有意に低い（ｐ＝0.002）全Ａβ（25ng/g)を有することが見いだされた（表４）。【０１４９】
【表７】
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【０１５０】  ４．APPレベルに及ぼすAN1792処置の効果
APP-αおよび完全長のAPP分子は、両方ともＡβ酷列の全部または一部を含み、、すなわちAN1792-が向けられる免疫応答の生成により影響を受け得る可能性がある。今日までの研究では、PDAPPマウスに神経病状が増えるとAPPレベルのわずかな上昇が記録された。皮質では、APP-αが18カ月の時点でAN1792-処置対PBS-処置で19％まで減少したことを除き、APP-α/FL(完全長)またはAPP-αのいずれのレベルも本質的には変化しなかった。18カ月のAN1792-処置APP値は、12カ月および15カ月の未処置ならびに15カ月のPBS群の値とは有意に異ならなかった。すべての場合て、APP値はPDAPPマウスで正常に見られる範囲内に留まった。【０１５１】  ５．神経変性的およびグリオティック(Gliotic)病状に及ぼすAN1792処置の効果
神経炎症性局面の負荷量は、PBS群に比較してAN1792-処置マウスの前頭皮質において15月齢（84％；ｐ＝0.03）および18月齢（55％；ｐ＝0.01）の両方で有意に減少した（図８）。神経炎症性局面の負荷量の中央値は、15月齢から18月齢の間でPBS群において0.32％から0.49％へと増加した。これは15月齢および18月齢の群でそれぞれ0.05％および0.22％の神経炎症性局面負荷量の中央値を有するAN1792群における神経炎症性局面の発生の大きな減少とは好対照であった。【０１５２】  AN1792を用いた免疫感作は十分に寛容であり、しかも反応性の星状細胞増加症も、両15月齢（56％；ｐ＝0.011）および18月齢（39％；ｐ＝0.028）でPBS群と比べた時、AN1792-処置したマウスのRSCで有意に減少したようだ（図９）。PBS群の星状細胞増加症のパーセントの中央値は、15カ月から18カ月の間で4.26%から5.21%へと増加した。AN1792-処置は両時点での星状細胞増加症の発生を、それぞれ1.89％および3.2％まで抑制した。これは神経網が除去プロセスにより損傷されなかったことを示唆している。【０１５３】  ６．抗体応答
上記のように、11月齢のヘテロ接合性PDAPPマウス（Ｎ＝24）は、フロイントアジュバントで乳化した100μgのAN1792で、０、２、４、８、および12週に一連の５回の免疫感作を腹腔内に投与され、そして６回目はPBSのみ（フロイントアジュバント無し）の免疫感作を16週に受けた。陰性対照として、平行した24匹の月齢を合わせたトランスジェニックマウスの組が、同じアジュバントで乳化され、そして同じスケジュールで送達されるPBSでの免疫感作を受けた。動物は２回目の投与から出発して各免疫感作から３〜７日以内に採血した。AN1792に対する抗体応答は、ELISAにより測定した。AN1792で免疫感作した動物に関する幾何平均力価（GMT）は、２回目、３回目および最後（６回目）の投与後にそれぞれ約1,900、7,600そして45,000であった。６回目の免疫感作後に対照動物のＡβ特異的抗体は測定しなかった。【０１５４】  約１／２の動物はさらに３カ月間、約20、24および27週に免疫感作を受ける処置を行った。これらの各投与量はフロイントアジュバントを含まないPBS賦形剤単独で送達された。平均抗体力価はこの期間中、変化しないままだった。実際には、抗体力価は５回目から９回目の注射を網羅する期間に対応する４回目から８回目の採血にわたり、安定であるように見えた。【０１５５】  AN1792処置マウスの血清中に検出されるＡβ-特異的抗体が免疫感作により誘導されたかどうかを決定することは、沈着物した脳アミロイドにも関連し、AN1792-およびPBS-処置マウスの切片のサブセットを、マウスIgGに特異的な抗体と反応させた。PBS群とは対照的に、AN1792-処置脳内のＡβ斑は内因性のIgGに覆われていた。この２群の間の差異は、15-および18-カ月の両群で見られた。これらのマウスには重度のアミロイド負荷量が存在するにもかかわらず、特に目立ったのはPBS群の標識が無かったことであった。これらの結果は、合成のＡβタンパク質を用いた免疫感作が、アミロイド斑中のＡβをインビボで認識し、そして結合する抗体を生成することを示す。【０１５６】  ７．細胞性免疫応答
脾臓を９匹のAN1792-免疫感作マウスおよび12匹のPBS-免疫感作した18月齢のPDAPPマウスから、９回目の免疫感作から７日後に摘出した。脾細胞を単離し、そして72時間、Ａβ40、Ａβ42またはＡβ40-1（逆順序のタンパク質）の存在下で培養した。マイトジェンCoAを陽性対照として役立てた。最適な応答は＞1.7μMタンパク質で得られた。すべての９匹のAN1792-処置動物に由来する細胞は、Ａβ1-40またはＡβ1-42タンパク質のいずれかに応答して増殖し、両方のタンパク質について等レベルで取り込まれた（図１０、上パネル）。Ａβ40-1逆タンパク質には反応しなかった。対照動物からの細胞は、いずれのＡβタンパク質にも応答しなかった（図１０、下パネル）。
Ｃ．結論
この実験の結果は、現存するアミロイド沈着物を有するPDAPPマウスのAN1792免疫感作が、進行性のアミロイド沈着物を遅らせ、そして防止し、そして結果的に加齢したPDAPPマウスの脳内を神経病理学的変化を遅らせることを示す。AN1792を用いた免疫感作は、通常はアミロイドーシスに圧倒される構造上のアミロイド発生を本質的に停止する。すなわちＡβペプチドの投与は、ＡＤの処置に治療的利益を有する。IV．Ａβフラグメントのスクリーニング
９〜11月齢の100匹のPDAPPマウスを、APPおよびＡβの９種の異なる領域で免疫感作し、どのエピトープが効力のある応答をもたらすかを決定した。９種の異なる免疫源および１つの対照を、上記のようにi.p.注射した。免疫原は４種のヒトＡβペプチド結合体1-12、13-28、32-42、1-5を含み、すべてヒツジ抗-マウスIgGにシステイン連結を介してカップリングした；APPポリペプチドアミノ酸592-695、凝集ヒトＡβ1-40および凝集ヒトＡβ25-35および凝集齧歯類Ａβ42。凝集Ａβ42およびPBSは、それぞれ陽性および陰性対照として使用した。１つの処置群あたり10匹のマウスを使用した。力価は上記のようにモニタリングし、そしてマウスは注射から４カ月の終わりに安楽死させた。組織化学、Ａβレベルおよび毒性学分析は死後に分析した。
Ａ．材料および方法
１．免疫原の調製
結合したＡβペプチド：４種のヒトＡβペプチド結合物（それぞれがヒツジ抗-マウスIgGに結合したアミノ酸残基1-5、1-12、13-28および33-42）は、架橋試薬スルホ-EMCSを使用してＡβペプチドに連結した人工的なシステインを通してカップリングすることにより調製した。Ａβペプチド誘導体は、以下の最終アミノ酸配列を用いて合成した。各々の場合で、挿入したシステイン残基の位置は、下線で示した。Ａβ13−28ペプチド誘導体も、示したカルボキシル末端システイン前に２つのグリシン残基を有した。【０１５７】
【表５】
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【０１５８】  カップリング反応を調製するために、10mgのヒツジ抗-マウスIgG（ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ:Jackson ImmunoResearch Laboratories）を、10mM ホウ酸ナトリウムバッファー、pH8.5に対して一晩透析した。透析した抗体を次いでアミコン（Amicon）のCentriprepチューブを使用して２mLの容量に濃縮した。10mg スルホ-EMS。【０１５９】  [N(ε-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド](モレキュラー サイエンス社:Molecular Science Co.)を、１mLの脱イオン水に溶解した。40-倍のモル過剰のスルホ-EMCSを撹拌しながらヒツジ抗-マウスIgGに滴下し、そして溶液をさらに10分間撹拌した。活性化したヒツジ抗-マウスIgGを精製し、そしてバッファーは0.1M NaPO4、5mM EDTA、pH6.5により平衡化した10mLのゲル濾過カラム(ピアス  ケミカルズ((Pierce Chemicals)から得たピアス Presto Column）を通すことにより交換した。280nmの吸収により同定した抗体含有画分をプールし、そして吸光係数としてODあたり1.4mgを使用して約１mg/mLの濃度に希釈した。40-倍モル過剰なＡβペプチドを20mLの10mM NaPO4、pH8.0に溶解したが、Ａβ33−42ペプチドに関しては10mgを最初に0.5mLのDMSOに溶解し、そして次いで10mM NaPO4バッファーで20mLに希釈した。ペプチド溶液をそれぞれ10mLの活性化ヒツジ抗-マウスIgGに加え、そして室温で４時間、振盪した。生成した結合物は、アミコンのCentriprepチューブを使用して10mL未満の最終容量に濃縮し、そして次いでPBSに対して透析して、バッファーを交換し、そして遊離ペプチドを除去した。結合物は滅菌のために0.22μm-孔サイズのフィルターを通し、そして１mgの画分に分け、そして-20℃で凍結保存した。結合物の濃度は、BCAタンパク質アッセイ（ピアス ケミカルズ）を使用してウマIgGを標準曲線として用いて決定した。結合は、活性化ヒツジ抗-マウスIgGに対して結合ペプチドの分子量の増加により証明された。Ａβ1-5ヒツジ抗マウス結合物は２つの結合のプールであり、残りは１つの調製物に由来した。【０１６０】  ２．凝集Ａβペプチドの調製
ヒト1-40（AN1528：カリフォルニアペプチド社、ロット ME0541）、ヒト1-42（AN1792：カリフォルニアペプチド社、ロット ME0339およびME0439）、ヒト25-35および齧歯類1-42（カリフォルニアペプチド社、ロット ME0218）ペプチドは、-20℃で乾燥して保存しておいた凍結乾燥粉末から、各組の注射物の調製に新たに可溶化した。この目的には、２mgのペプチドを0.9mlの脱イオン水に加え、そして混合物をボルテックス混合して、比較的均一な溶液または懸濁液を作成した。４つの中のAN1528が、この段階で可溶性の唯一のペプチドであった。100μlの10×PBSのアリコート（1×PBS:0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム、pH7.5）を次いで加え、この時点でAN1524が沈殿し始めた。懸濁液を再度ボルテックス混合し、そして翌日使用するために37℃で一晩、インキューベーションした。【０１６１】  pB×6タンパク質の調製：pB×6（100アミノ酸のバクテリオファージMS-2ポリメラーゼN-末端リーダー配列、続いてAPP(βAPP）のアミノ酸592-695から成る融合タンパク質）をコードする発現プラスミドを、Oltersdorf et al.,J.Biol.Chem.265,4492-4497(1990)により記載されているように構築した。プラスミドを大腸菌（E.coli）にトランスフェクトし、そしてタンパク質をプロモーターの誘導により発現させた。細菌は８M 尿素中で溶菌させ、そしてpB×6を調製用SDS PAGEにより部分精製した。pB×6を含有する画分は、ウサギ抗-pB×6ポリクローナル抗体を使用してウエスタンブロットにより確認し、プールし、アミコンCentriprepチューブを使用して濃縮し、そしてPBSに対して透析した。クマーシーブルー染色したSDS PAGEにより推定される調製物の純度は、約５〜10％であった。
Ｂ．結果および考察
１．実験計画
９-ないし11月齢の100匹のオスおよびメスのヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスを、チャールズリバーラボラトリーおよびタコニックラボラトリー（Taconic Laboratory）から得た。マウスは、フロイントアジュバントと組み合わせた異なる領域のＡβまたはAPPで免疫感作される10群に分けられた。動物はできるかぎり群内の性別、月齢、血統および供給源を合わせるように分割した。免疫原はヒト起源の配列1-5、1-12、13-28および33-42に由来する４種のＡβペプチドを含み、各々がヒツジ抗-マウスIgGに結合していた；４種の凝集したＡβペプチド、ヒト1-40（AN1528)、ヒト1-42（AN1792)、ヒト25-35、および齧歯類1-42；ならびに融合ポリペプチド、pB×6として設計し、APPアミノ酸残基592-695を含む。10番目の群は対照としてアジュバントと組み合わせたPBSで免疫感作した。【０１６２】  各免疫感作には、初回免疫感作用に、100μgの各Ａβペプチド（200μlのPBS中）、または200μgのAPP誘導体pB×6（同じ容量のPBS中）またはPBS単独を、1:1(容量:容量)の完全フロイントアジュバント(CFA)で400μlの最終容量に乳化し、続いて不完全フロイントアジュバント（IFA）中に同量の免疫原の追加免疫感作を次の４回の投与に、そして最後の投与はPBSを用いた。免疫感作は、最初の３回の投与量は隔週のスケジュールで、次にその後は毎月、腹腔内に送達された。抗体力価を測定するために、動物は２回目の投与後から始めて、各免疫感作から４〜７日後に採血された。動物は最終投与から約１週間後に安楽死させた。
２．脳内のＡβおよびAPPレベル
種々のＡβペプチドまたはAPP誘導体での免疫感作から約４カ月後に、塩類−潅流動物から脳を摘出した。１つの半球は免疫組織化学分析に調製し、そして２つ目はＡβおよびAPPレベルの定量に使用した。種々の形態のβアミロイドペプチドおよびアミロイド前駆体タンパク質の濃度を測定するために、半球を切開し、そして海馬、皮質および小脳領域のホモジネートを５M グアニジンで調製した。これらを希釈し、そしてアミロイドおよびAPPのレベルは、ELISA形式で既知濃度のＡβペプチドまたはAPPの一連の標準希釈物と比較することにより定量した。【０１６３】  PBSで免疫感作した対照群に関する全Ａβの中央値濃度は、皮質よりも海馬で5.8倍高かった（皮質の4,221ng/gに対して24,318ng/gの海馬の中央値）。対照群の小脳中の中央値レベル（23.4ng/g）は、海馬よりも約1,000倍低かった。これらのレベルはこの月齢のヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスについて以前に報告したレベルと同様であった（Johnson-Woods et al.,1997,同上）。【０１６４】  皮質に関して、処置群のサブセットは対照群とは有意に異なる全Ａβの中央値およびＡβ1-42レベルを有し（ｐ＜0.05）、これらの動物は図１１に示すようにAN1792、齧歯類Ａβ1-42またはＡβ1-5ペプチド結合物を受容した。これらの処置群について全Ａβの中央値レベルは、対照に比べてそれぞれ75％、79％および61％まで減少した。いかなる群にも脳内の皮質領域にＡβ-特異的抗体力価とＡβレベルとの間に識別できる相関はなかった。【０１６５】  海馬では、AN1792処置に関連した全Ａβの中央値の減少（46％、ｐ＝0.0543）は、皮質で観察されるよりも大きかった（75％、ｐ＝0.0021）。しかし減少の規模は皮質よりも海馬で一層大きく、皮質で正味3,171ng/g組織の減少に対して海馬では正味11,186ng/g組織の減少であった。齧歯類Ａβ1-42またはＡβ1-5を受けた動物群については、全Ａβレベルの中央値は、それぞれ36％および26％まで減少した。しかし群のサイズが小さいこと、および両群内の動物毎のアミロイドペプチドレベルの高い変動性を考慮すると、このような減少は有意ではなかった。Ａβ1-42レベルを海馬で測定した時、処置が誘導した減少が有意しなったものはなかった。すなわち皮質中のより小さいＡβ負荷量から、この領域での変化は処置効果のより敏感な指標である。皮質中でELISAにより測定されるＡβレベルの変化は同様であるが、免疫組織化学的分析からの結果とは同一ではない（以下を参照のこと）。【０１６６】  全Ａβは、ＡＤ病により典型的には最も影響を受けることが小さい小脳でも測定した。種々のＡβペプチドまたはAPP誘導体で免疫感作したいずれの群のＡβ濃度の中央値も、脳のこの領域において対照群と異ならなかった。この結果は、処置によりＡβの非病理学的レベルは影響を受けないことを示唆している。【０１６７】  APP濃度は、処置および対照動物に由来する皮質および小脳中でELISAでも決定した。２種の異なるAPPアッセイを使用した。第１はAPP-α/FLと呼び、APP-アルファ（α、Ａβ配列内が開裂されたAPPから分泌した）、およびAPPの完全長の形態（FL）を認識し、一方２つ目は、APP-αのみを認識する。処置群のサブセットでは処置が関係するＡαの減少とは対照的に、APPのレベルが対照動物と比較してすべての処置で変化しなかった。これらの結果は、Ａβペプチドでの免疫感作がAPPを減らさず；むしろ処置効果ばＡβに特異的であることを示す。【０１６８】  要約すると、全ＡβおよびＡβ1-42レベルは皮質中でAN1792、齧歯類Ａβ1-42またはＡβ1-5結合物を用いた処置により有意に減少した。海馬では、全ＡβがAN1792処置でのみ有意に減少した。海馬、皮質または小脳における他の処置が関与するＡβまたはAPPレベルの変化は、有意ではなかった。【０１６９】  ２．組織化学的分析
組織化学的分析用に６群のサブセットに由来する脳を調製し、Ａβペプチド結合物Ａβ1-5、Ａβ1-12およびＡβ13-28で免疫感作した３群；完全長のＡβ凝集物AN1792およびAN1528で免疫感作した２群、およびPBSで処置した対照群。これらの群からの脳切片中のアミロイド負荷量を画像分析の結果を、図１２に示す。３つの処置群対対照動物の皮質領域中で、アミロイド負荷量には有意な減少があった。アミロイド負荷量の最大の減少はAN1792を受けた群で観察され、ここで平均値は97％まで減少し準（ｐ＝0.01）。有意な減少はAN1528（95％、ｐ＝0.005）およびＡβ1-5ペプチド結合物（67％、ｐ＝0.02）で処置した動物でも観察された。【０１７０】  ELISAによる全ＡβまたはＡβ1-42の定量および画像分析によるアミロイド負荷量により得られた結果は、ある程度異なった。AN1528による処置は、定量的な画像分析により測定した時に皮質アミロイド負荷量のレベルに有意な影響を与えたが、ELISAにより測定した時の同じ領域の全Ａβ濃度には影響がなかった。このような２つの結果の差異は、アッセイの特異性によるものだろう。画像分析は斑への不溶性のＡβ凝集物のみを測定する。対照的に、ELISAは可溶性および不溶性の両方、単量体および凝集物のすべてのＡβの形態を測定する。疾患の病状は不溶性の斑が関連するＡβの形態であると考えられているので、画像分析法が処置の効果を明らかにするためにより感度がある。しかしELISAはより迅速で容易なアッセイであり、スクリーニングの目的には大変有用である。さらにELISAはＡβの処置が関連する減少を、全Ａβよりも斑に関連してより大きく明らかにすることができる。【０１７１】  処置動物の免疫感作により誘導されたＡβ−特異的抗体が、脳に沈着物したアミロイドと反応したかどうかを決定するために、処置動物および対照マウスに由来する切片のサブセットを、マウスIgGに特異的な抗体と反応させた。PBS群とは対照的に、Ａβペプチド結合物Ａβ1-5、Ａβ1-12およびＡβ13-28；および完全長Ａβ凝集物AN1792およびAN1582で免疫感作した動物については、Ａβ-含有斑は内因性のIgGに覆われた。他のＡβペプチドまたはAPPペプチドpB×6で免疫感作した動物に由来する脳はこのアッセイで分析しなかった。【０１７２】  ３．抗体力価の測定
マウスは２回目の免疫感作から始めて全部で５回、各免疫感作から４〜７日後に採血した。抗体力価はＡβ1-42で被覆したプラスチック製のマルチ-ウェルプレートを使用を用いたサンドイッチELISAを使用してＡβ1-42結合抗体として測定した。図１３に示すように、ピーク抗体力価は４種の免疫原製剤について４回目の投与後に誘導され、AN1792-特異的抗体の最大力価が誘導された：AN1792（ピークGMT:94,647）、AN1528（ピークGMT:88,231）、Ａβ1-12結合物（ピークGMT:47,216）および齧歯類Ａβ1-42（ピークGMT:10,766）。これらの群の力価は５およ６回目の投与後にいくぶん減少した。残りの５種の免疫原については、ピーク力価に５または６回目の投与後に到達し、そしてこれらは４種の最高の力価群よりも大変低い規模であった：Ａβ1-5結合物（ピークGMT:2,356）、pB×6（ピークGMT:1,986）、Ａβ13-28結合物（ピークGMT:1,183）、Ａβ33-42結合物（ピークGMT:658）、Ａβ25-35結合物（ピークGMT:125）。ホモロガスペプチドに対する抗体力価も同じELISAサンドイッチ形式を使用して、免疫原のサブセットについて測定し、このような群をＡβ1-5、Ａβ13-28、Ａβ25-35、Ａβ33-42および齧歯類Ａβ1-42で免疫感作した。ホモロガスな免疫原に対する抗体力価が約２倍高い齧歯類Ａβ1-42免疫原に関する力価を除き、これらの力価はＡβ1-42に対して測定した力価とおよそ同じであった。個々の動物のAN1792-特異的抗体力価の規模、または処置群の平均値は、皮質内のＡβの減少として測定された効力とは相関しなかった。【０１７３】  ４．リンパ球増殖的応答
Ａβ-依存的なリンパ球増殖を、最後の６回目の免疫感作から約１週間後に回収した脾臓細胞を使用して測定した。新しく回収した細胞（105／ウェル）を、５μMの刺激濃度のＡβ1-40の存在下で、５日間培養した。10群のうちの７群からのサブセットも、逆ペプチドＡβ40-1の存在下で培養した。陽性対照として、さらなる細胞をＴ細胞マイトジェン（PHA）と培養し、そして陰性対照として、細胞をペプチドを加えずに培養した。【０１７４】  大部分の動物に由来するリンパ球は、PHAに応答して増殖した。Ａβ40-1逆ペプチドに対する有意な応答はなかった。より大きな凝集したＡβペプチド、AN1792、齧歯類Ａβ1-42およびAN1528で免疫感作した動物に由来する細胞は、Ａβ1-40で刺激した時にしっかりと増殖し、最高のcpmはAN1792の受容体であった。Ａβ1-12結合物、Ａβ13-28結合物およびＡβ25-35で免疫感作した各群からの１動物は、Ａβ1-40に応答して増殖した。Ａβ1-5結合物、Ａβ33-42結合物pB×6またはPBSを受けた残りの群は、Ａβが刺激した応答を有する動物はいなかった。これらの結果を以下の表５にまとめる。【０１７５】
【表９】
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【０１７６】  これらの結果は、AN1792およびAN1528が強力なＴ細胞応答、最も多くはCD4+表現型を刺激することを示す。Ａβ1-5で免疫感作した動物においてＡβ特異的Ｔ細胞応答の不存在は、CD4+Ｔ細胞により認識されるペプチドのエピトープが通常は約15アミノ酸長であるが、より短いペプチドが低い効率で機能できるので、驚くことではない。すなわち４種の結合物ペプチドに対するヘルパーＴ細胞エピトープの大部分が、Ａβ領域ではなくIgG結合物パートナー中にあるらしい。この仮説は各処置群中の動物について、大変低い増殖応答の発生率に支持される。Ａβ1-5結合物は脳内でＡβレベルを有意に下げることに有効であるので、Ａβ-特異的Ｔ細胞の明らかな不存在で、このペプチドによる免疫感作により誘導された鍵となるエフェクター免疫応答は、抗体となるだろう。【０１７７】  すべてのＡβ残基を含むAPPアミノ酸592-695を包含する融合ペプチドpB×6からのＴ-細胞の欠如および低い抗体応答は、この特別な調製物の悪い免疫原性によるものかもしれない。Ａβ25-35凝集物の悪い免疫原性は、ペプチドが小さすぎて抗体応答を誘導するために役立つ良いＴ細胞エピトープを含まないからであろう。このペプチドがキャリアータンパク質と結合すれば、おそらくより免疫原性となるだろう。
V．受動防御用のポリクローナル抗体の調製
125匹の非-トランスジェニックマウスを100μｇのＡβ1-42にCFA/IFAアジュバントを加えて免疫感作し、そして４〜５カ月で安楽死させた。血液を免疫感作したマウスから集めた。IgGは他の血液成分から分離した。免疫原に特異的な抗体は、アフィニティクロマトグラフィーにより部分精製した。マウスあたり約0.5〜１mgの免疫原に特異的な抗体が得られ、全部で60〜120mgとなった。
VI．Ａβに対する抗体により受動免疫感作
７〜９月齢のPDAPPマウス群の各々を、以下に示すようにPBS中に0.5mgのポリクローナル抗-Ａβまたは特異的抗-Ａβモノクローナルを用いて注射した。すべての抗体調製物は低いエンドトキシンレベルを有するように精製した。モノクローナルはマウスにＡβのフラグメントまたはＡβのより長い形態を注射することによりフラグメントに対して調製することができ、ハイブリドーマを調製し、そしてＡβの他の非重複フラグメントに結合することなくＡβの所望のフラグメントに特異的に結合する抗体のハイブリドーマをスクリーニングした。【０１７８】
【表１０】
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【０１７９】  マウスは、Ａβ42または他の免疫原に対してELISAにより定めた1/1000より大きいELISA力価により測定された循環抗体濃度を維持するために、４カ月の期間中、必要こ応じてip注射された。力価は上記のようにモニタリングし、そしてマウスは注射の６カ月の終わりに安楽死させた。組織化学、Ａβレベルおよび毒性学は、死後に行った。１群あたり10匹のマウスを使用した。受動免疫感作に関するさらなる実験は、以下の実施例XIおよびXIIに記載する。
VII．様々なアジュバントの比較
この実施例は、CFA、alumおよび水中油型エマルションおよびMPLを免疫応答を刺激する能力について比較する。
Ａ．材料および方法
１．実験計画
エルム ヒル(Elm Hill)から得た100匹の６週齢のメスHartley種モルモットを、種々のアジュバントと組み合わせたAN1792またはそれらのパルミトイル化誘導体で免疫感作するために10群に分けた。７群がａ）PBS、ｂ）フロイントアジュバント、ｃ）MPL、ｄ）スクアレン、ｅ）MPL／スクアレン、ｆ）低用量のalumまたはｇ）高用量のalum（300μgAN1792)と組み合わせたAN1792（特定しない限り33μg）の注射を受けた。２群はAN1792のパルミトイル化誘導体（33μg）の注射をａ）PBSまたはｂ）スクアレンと組み合わせて受けた。最後に10番目の群は、抗原およびさらなるアジュバント無しでPBSのみを受けた。フロイントアジュバントを受ける群は、最初の投与量をCFAで乳化し、そして４投与量はIFAで乳化した。抗原は高投与量のalum群を除きすべての群で33μgの用量で投与され、高用量のalum群は300μgのAN1792を受けた。注射はCFA/IFAには腹腔内に、そしてすべての他の群については右および左側の後脚四頭筋に交互に筋肉内投与した。最初の３回の投与は隔週のスケジュールで、続いて毎月の間隔で与えた。抗体力価を測定するために血液は２回目の投与後から開始して各免疫感作から６〜７日後に採血した。【０１８０】  ２．免疫原の調製
２mgのＡβ42（カリフォルニア ペプチド ロットME0339）を、0.9mlの脱イオン水に加え、そして混合物をボルテックス混合して比較的な懸濁液を作成した。100μlの10×PBSのアリコート（1×PBS、0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム、pH7.5）を加えた。この懸濁液を再度ボルテックス混合し、そして翌日使用するために37℃で一晩、インキューベーションした。未使用のＡβ1-42は-20℃で凍結乾燥した粉末として乾燥剤と一緒に保存した。【０１８１】  パルミトイル化したAN1792の誘導体は、ジメチルホルムアミドに溶解した無水パルミチン酸をAN1792のアミノ末端残基にカップリングにさせた後、樹脂から、付いているペプチドをフッ化水素酸を用いた処理により取り出した。【０１８２】  完全フロイントアジュバント(CFA)を用いて配合用量を調製するために（群２）初回免疫感作には33μgのAN1792（200μlのPBS中）を、1:1(容量:容量)のCFAで400μlの最終容量に乳化した。続く免疫感作には、抗原を不完全フロイントアジュバント（IFA）を用いて同様に乳化した。【０１８３】  群５および８については、MPLを用いて配合用量を調製するために、凍結乾燥粉末（リビ  イムノケミリサーチ社、ハミルトン、マサチューセッツ州）を0.2％の水性トリエチルアミンに加え、１mg/mlの最終濃度とし、そしてボルテックス混合した。混合物を65〜70℃に30秒間加熱して、わずかに不透明で均一なミセルの懸濁液を作成した。溶液は各組の注射に新しく調製した。群５の各注射には、33μｇのAN1792(16.5μlのPBS中）、50μgのMPL(50μl)および162μlのPBSを、使用直前にホウ珪酸試験管中で混合した。【０１８４】  低い水中油型のエマルションを用いて配合用量を調製するために、PBS中のAN1792を５％スクアレン、0.5% Tween80、PBS中の0.5％Span85に加えて、250μl中に33μgの濃度のAN1792の最終単回投与量に達した。混合物は、エマルションの液滴が顕微鏡下で見た時に1.0μm直径の標準ラテックスビーズのおよそ等しい直径になるまで、２つのチャンバーを持つ手で持つデバイス（two-chambered hand-held device）に15〜20回通すことにより乳化した。生成した懸濁液は不透明な乳白色であった。エマルションは各々の一連の注射のために新たに調製した。群８に関しては、0.2％トリエチルアミン中のMPLを投与量あたり50μgの濃度でスクアレンおよび上記のような乳化のための界面活性剤混合物に加えた。パルミトイル化誘導体（群７）については、33μgのパルミトイル-NH-Ａβ-1-42をスクアレンに加え、そしてボルテックス混合した。Tween80およびSpan85を次いでボルテックス混合しながら加えた。混合物をPBSに加えて５％スクアレン、0.5％Tween80、0.5％Span85の最終濃度に到達し、そして混合物を上記のように乳化した。【０１８５】  alumを用いて配合用量を調製するために（群９および１０）、PBS中のAN1792をAlhydrogel（水酸化アルミニウムゲル、アキュレート（Accurate）、ウエストベリー、ニューヨーク州）に加えて、250μlの最終投与最中に５mgのalumあたり、33μg（低投与量、群９）または300μg（高投与量、群10）の濃度に到達した。懸濁液をRTで４時間、穏やかに混合した。【０１８６】  ３．抗体力価の測定
モルモットは、２回目の免疫感作から始めて免疫感作から６〜７日後に全部で４回採血した。Ａβ42に対する抗体力価は、一般材料および方法に記載したようにELISAにより測定した。【０１８７】  ４．組織プレパレーション
約14週後、すべてのモルモットはCO2を投与することにより安楽死させた。脳脊髄液を集め、そして脳を摘出し、そして３つの脳領域（海馬、皮質および小脳）を切開し、そしてELISAを使用して全Ａβタンパク質濃度を測定するために使用した。
Ｂ．結果
１．抗体応答
免疫感作後にAN1792に対する抗体応答として測定した時、種々のアジュバントに広い範囲の効力があった。図１４に示すように、AN1792をPBS中で投与した時、２または３回の免疫感作後に抗体は検出されず、そして無視できる応答が４および５回目の投与後にたった約45の幾何平均力価(GMT)で検出された。o/wエマルションは３回の投与後に適度の力価を誘導し（GMT 255）、これは４回目の投与後も維持され（GMT 301）、そして最終投与で落ちた（GMT 54）。alumに結合したAN1792に関して明らかな抗原投与量応答があり、すべての時点で300μgが33μgよりも免疫原性であった。抗体応答のピークで、４回目の免疫感作後に、２つの投与量の差異はGMTで約1940（33μg）および3400（300μg）であった。MPLを加えた33μgのAN1792に対する抗体応答は、alumに結合したほぼ10倍高い用量の抗原(300μg)用量で生成された応答に大変類似した。MPLをo/wエマルションに加えると、配合物の効力はMPLを単なるアジュバントとした場合に比べて最大75％まで減少した。AN1792のパルミトイル化誘導体は、PBS中で投与した時に完全に非免疫原性であり、そしてo/wエマルション中に存在する時に、３回目そして４回目の採血について340および105のGMTの適度な力価を与えた。最高の抗体力価は、フロイントアジュバントで生成され、約87,000のピークGMTであり、次に最も効力のある配合物MPLおよび高用量AN1792/alumのGMTよりもほぼ30倍大きい値であった。【０１８８】  この実験で最も有望なアジュバントは、MPLおよびalumである。これら２つの中で、MPLはalumで得られるものと同じ抗体力価を生成するために必要な抗原用量が、10倍低いので好ましい。応答は抗原かつ／またはアジュバントの用量を増すことにより、ならびに免疫感作スケジュールを至適化することにより上昇させることができる。o/wエマルションはAN1792には大変弱いアジュバントであり、そしてMPLアジュバントにo/wエマルションを加えることにより、MPL単独の固有のアジュバント活性が減少した。
２．脳内のＡβレベル
約14週で、モルモットに深く麻酔をかけ、脳脊髄液(CFS)を引き抜き、そしてフロイントアジュバント（群２）、MPL（群５）、高投与量、300μgのAN1792を含むalum（群１０）、およびPBSを免疫感作した対照群（群３）の動物のサブセットから脳を摘出した。Ａβペプチドのレベルを測定するために、１つの海馬を切開し、そして海馬、皮質および小脳領域のホモジネートを5M グアニジンで調製した。これらを希釈し、そしてELISA形式で一連の既知濃度のＡβ標準タンパク質の希釈物と比較することにより定量した。海馬、皮質および小脳中めＡβタンパク質のレベルは、これらの配合物によリ誘導されるＡβに対する広い範囲の抗体応答にもかかわらず、すべての４群で大変類似した。約25ng/g組織の平均Ａβレベルは海馬で、皮質で21ng/g、そして小脳で12ng/gが測定された。すなわちＡβに対する循環抗体力価の存在は、ほぼ３カ月間、これらの動物の幾匹かで脳内の全Ａβレベルを変化させなかった。CFS中のＡβレベルも群間でほぼ同様であった。内因性Ａβに及ぼすAN1792免疫感作の大きな効果の欠如は、免疫応答がＡβの病理学的状態の形成に集中していることを示す。
VIII．マウスにおける種々のアジュバントに対する免疫応答
６週齢のメスのスイス  ウェブスターマウスを１群あたり10〜13匹でこの実験に使用した。免疫感作は200μlの投与量で０、14、28、60、90および20日に皮下に与えた。PBSはバッファーとしてすべての配合に使用した。動物はELISAによる抗体力価の分析のために、２回目の投与後から開始して各免疫感作から７日後に採血した。各群の処置計画を表７にまとめる。【０１８９】
【表１１】
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【０１９０】  各群のＡβ42に対する抗体のELISA力価を、以下の表８に示す。【０１９１】
【表１２】
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【０１９２】IX．種々のアジュバントの治療的効力
治療的効力の実験は、Ａβに対する免疫応答を強化し、そして脳内のアミロイド沈着物の免疫性除去を誘導するアジュバントの能力を決定するために、ヒトの使用において適するアジュバントの組を用いて、PDAPPトランスジェニックマウスで行った。【０１９３】  180匹のオスおよびメスの7.5〜8.5月齢のヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスを、チャールズリバーラボラトリーから得た。マウスは種々のアジュバントと組み合わせたAN1792またはAN1528で免疫感作する群あたり15〜23匹の動物を含む９群に分けた。動物は群内でできるだけ性別、月齢および動物の血統を合わせるように分配した。アジュバントにはalum， MPLおよびQS-21を含み、各々を両抗原と合わせ、そしてAN1792のみと合わせたフロイントアジュバント（FA）を含んだ。さらなる群は保存剤チメロサールを加え、アジュバントを含まないPBSバッファー中に配合したAN1792で免疫感作した。９群目は陰性対照としてPBS単独で免疫感作した。【０１９４】  凝集したＡβペプチドの調製：ヒトＡβ1-40（AN1528；カリフォルニア ペプチド社、ナパ、カリフォルニア州；ロット ME0541）およびヒトＡβ1-42（AN1792；カリフォルニア ペプチド社；ロット ME0439）ペプチドは、-20℃で乾燥して保存しておいた凍結乾燥粉末から、各組の注射物の調製に新たに可溶化した。この目的のために、２mgのペプチドを0.9mlの脱イオン水に加え、そして混合物をボルテックス混合して、比較的均一な溶液または懸濁液を作成した。AN1792とは対照的に、AN1528はこの段階で可溶性のペプチドであった。100μlの10×PBSのアリコート（1×PBS:0.15M NaCl、0.01M リン酸ナトリウム、pH7.5）を次いで加え、この時点でAN1528が沈殿し始めた。懸濁液を再度ボルテックス混合し、そして翌日使用するために37℃で一晩、インキューベーションした。【０１９５】  alumを用いて配合用量を調製するために（群１および５）、PBS中のＡβペプチドをAlhydrogel（２％の水性水酸化アルミニウムゲル、サルジェント社（Sargent Inc.）、クリプトン、ニュージャージー州）に加えて、１mgのalumあたり100μgのＡβペプチド濃度に到達した。10×PBSを加えて、１×PBS中に200μlの最終投与量とした。次いで懸濁液は注射前にRTで約４時間、穏やかに混合した。【０１９６】  MPLを用いて配合用量を調製するために（群２および６）、凍結乾燥粉末（リビ イムノケミリサーチ社、ハミルトン、マサチューセッツ州：ロット67039−E0896B）を0.2％の水性トリエチルアミンに加え、１mg/mlの最終濃度とし、そしてボルテックス混合した。混合物を65〜70℃に30秒間加熱して、わずかに不透明で均一なミセルの懸濁液を作成した。溶液は４℃に保存した。各組の注射には、投与(50μlのPBS中）あたり100μgのペプチド、投与量(50μl)あたり50μgのMPLおよび投与量あたり100μlのPBSを、使用直前にホウ珪酸試験管中で混合した。【０１９７】  QS-21を用いて配合用量を調製するために（群３および７）、凍結乾燥粉末（アクイラ：Aquila、フラミンガム、マサチューセッツ州：ロットＡ7018R）をPBS、pH6.6〜6.7に加えて、１mg/mlの最終濃度とし、そしてボルテックス混合した。溶液を-20℃で保存した。各組の注射には、用量あたり100μgのペプチド(50μlのPBS中）、用量あたり25μgのQS-21(25μlのPBS中)および用量あたり125μlのPBSを、使用直前にホウ珪酸試験管中で混合した。【０１９８】  フロイント���ジュバントを用いて配合用量を調製するために（群４）、初回免疫感作には100μgのAN1792（200μlのPBS中）を、1:1(容量:容量)で完全フロイントアジュバント(CFA)と400μlの最終容量に乳化した。続く免疫感作には、抗原を不完全フロイントアジュバント（IFA）を用いて同様に乳化した。アジュバントalum、MPLまたはQS-21を含む配合には、投与量あたり100μgのAN1792またはAN1528を200μlPBSの最終投与量でalum（投与量あたり１mg）またはMPL（投与量あたり50μg）と合わせ、そして肩甲骨の間に皮下接種により送達した。FAを受ける群については、100μgのAN1792をを、1:1(容量:容量)の完全フロイントアジユバント(CFA)で400μlの最終容量に乳化し、そして初回の免疫感作には腹腔内に送達し、続いて５回の投与には不完全フロイントアジュバント（IFA）中の同量の免疫原を追加免疫感作した。アジュバントを含まないAN1792を受ける群には、10μgのAN1792を最終容量50μlのPBS中で5μgのチメロサールと合わせ、そして皮下で送達した。９番目の対照群は皮下送達された200μlのPBSのみ受けた。免疫感作は最初の３回については隔週のスケジュールで与え、次いでその後は毎月のスケジュールで、０、16、28、56、85および112日に与えた。動物は抗体力価を測定するために、２回目の投与後に初めて各免疫感作から６〜７日後に採血した。動物は最終投与から約１週間後に安楽死させた。結果は脳内のＡβおよびAPPレベルのELISAアッセイにより、そして脳切片内のアミロイド斑の存在の免疫組織化学的評価により測定した。さらにＡβ-特異的抗体力価、およびＡβ依存的増殖およびサイトカイン応答を決定した。【０１９９】  表９は、Ａβ1-42に対する最高の抗体がFAおよびAN1792により誘導されることを示し、その力価は４回目の免疫感作後にピークとなり（ピークGMT:75,386）、そして最後の６回目の免疫感作までには59％まで減少した。AN1792を含むMPLにより誘導されたピーク平均力価は、FA（ピークＧＭＴ：28,867）での生成よりも62％低く、そしてまた３回目の投与後の免疫感作スケジュールの初期に到達し、続いて６回目の免疫感作後にはピークの28％まで減少した。AN1792と合わせたQS-21で生成したピーク平均力価(GMT:1,511）は、MPLにより得られた価よりも約５倍低かった。さらに応答の動力学は、ピーク応答に達するまでにさらなる免疫感作が必要とされたので、ゆっくりとしていた。alum-結合AN1792により生成された力価は、QS-21で得た価よりもわずかに大きく、そして応答の動力学はより急速であった。チメロサールを含むPBS中で送達されたAN1792については、力価の頻度およびサイズがPBS単独よりもかろうじて大きかった。MPLおよびＡＮ１５２８で生成したピーク力価（ピークGMT 3099）は、AN1792を用いた価よりも約９倍低かった。alum-結合AN1792は大変悪い免疫原であり、低い力価が数匹の動物に生じただけであった。PBS単独で免疫感作した対照動物に観察された抗体応答は無かった。【０２００】
【表１３】
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【０２０１】  ELISAにより決定される12月齢のマウスにおける皮質アミロイド負荷量に及ぼす種々のアジュバントを用いたAN1792またはAN1528処置、あるいはチメロサールの結果を図１５に示す。PBS対照PDAPPマウスでは、12カ月での皮質中の全Ａβの中央値レベルは1,817ng/gであった。顕著なＡβの減少レベルは、CFA/IFAを加えたAN1792、alumを加えたAN1792、MPLを加えたAN1792およびAN1792を加えたQS-21で処置したマウスで観察された。統計的に有意（ｐ＜0.05）に達したのは、CFA/IFAを加えたAN1792であった。しかし実施例IおよびIIIに示すように、免疫感作がＡβレベルの減少に及ぼす効果は、15カ月および18カ月のマウスで実質的に大きくなった。すなわち少なくともalumを加えたAN1792、MPLを加えたAN1792およびQS-21を加えたAN1792の組成物は、より老年のマウスの処置で統計的な有意に到達するだろう。対照的に、保存剤チメロサールを加えたAN1792は、PBS処置マウスとおよそ同じＡβの中央値レベルを示した。同様な結果がＡβ42の皮質レベルを比較した時に得られた。PBS対照におけるＡβの中央値レベルは、1624ng/gであった。403、1149、620および714の中央値レベルが、それぞれCFA/IFAを加えたAN1792、alumを加えたAN1792、MPLを加えたAN1792およびQS-21を加えたAN1792で観察され、減少はCFA/IFAを加えたAN1792処置群について統計的に有意であった（ｐ＝0.05）。AN1792チメロサール処置マウスにおける中央値レベルは、1619ng/gＡβ42であった。【０２０２】  さらなる治療的アジュバント／免疫原効力実験を９〜10.5月齢のオスおよびメスのヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウで行った。実験の期間は処置群あたり29〜40匹の動物を用いて25週間であった；したがって動物は終了時に15〜16.5月齢であった。処置群を以下の表１０に確認する。【０２０３】
【表１４】
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【０２０４】表１０略号：MAP−多-抗原性ペプチド；TT−破傷風毒素ｔ-細胞エピトープ（830-844)；QS−皮下；IP−腹腔内；PBS−リン酸緩衝化生理食塩水；ISA-51は市販されているIFAに類似するアジュバント；GCSはグリシン／クエン酸塩／シュクロース配合物、MPL-SEは安定化された水および油エマルションである。【０２０５】  免疫感作のスケジュールは、略記したスケジュール群QS21/AN1792である群３を除き、すべての処置群で同一であった。マウスに０、２、４、８、12、16、20、24週に注射し、３、５、９、13、17、21および25週に採血した。群１、２は８回の注射を受け、そして群３は実験の25週間の実験中に４回の注射を受けた。スケジュール群を略記したQS21/AN1792の群４は、０、２、４および８週のみに注射を受けた。この群は、残りの実験で注射を受けなかったが、力価の減少を追跡するために実験の残りでは同じ採血スケジュールで採血した。それぞれQS-21/AN1792およびPBSである群３および５は、この実験の陽性および陰性対照として役立てた。【０２０６】  力価は抗-Ａβ抗体力価アッセイにより決定した。【０２０７】  群１、MPL-SE/AN1792群は、９週で17,100のピーク幾何平均力価（GMT）に上昇し、25週で10,000のGMTに落ちた。最初にMPL-SE力価はQS-21/AN1792対照群（群４）よりも幾分高い速度で上昇した。【０２０８】  群２、ISA 51/AN1792群は、実験を通じて高い力価を生成し、実験の最後の９週で100,000を越えるGMTに達した。【０２０９】  群３、QS-21/AN1792対照群は、17週にそのピーク力価16,000のGMTに達した。次いで力価は次の８週にわたり落ちて、8,700のGMTで終了した。この群では１動物が実験の全期間にわたり力価を上げることができなかった。【０２１０】  群４、略記した注射スケジュール群であるQS-21/AN1792は、最終注射から５週間後の13週で7,300のピーク力価に到達した。次いで力価は最終採血で（25週）2,100のGMTに落ちた。対照群におけるように、１匹の動物が検出できる力価に上げることができず、一方別の動物は減少期間の終わりまでにすべての力価を失った。【０２１１】  群５、PBS単独群は力価が無かった。【０２１２】  皮質Ａβレベルを評価するために、全ＡβおよびＡβ1-42をELISAにより測定した。簡単に説明すると、１つの脳半球を皮質、海馬および小脳組織に切開し、続いて５M グアニジンバッファーで均質化し、そして脳のＡβについてアッセイした。皮質の全ＡβおよびＡβ42は同じ結果をもたらした。Mann-Whitney統計分析を行って、群間の有意を決定し、0.05の値がＡβにおける有意な変化を示す。【０２１３】  すべての処置群がPBS対照群と比較して、全Ａβレベルを有意に下げた（表１１を参照にされたい）。MPL-SE/AN1792群はＡβにおいて最大の変化を示し、これは他の処置群よりも有意に良好であった。略記したQS-21/AN1792群は、そのＡβの全体的変化においてすべての８回の注射を受けたQS-21対照群と同様であった。ISA 51/AN1792群のＡβレベルは、CFA/IFA:MAP(Ａβ1-7)群に比較して同様に下がった。【０２１４】
【表１５】
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【０２１５】  結論すると、AN1792と組み合わせたMPL-SE、ISA 51およびQS21アジュバントは、皮質内のＡβ沈着物を防止するために十分な免疫応答を有意に誘導するために有効である。
X．毒性分析
実施例２、３および７に記載の実験の終わりに、組織病理学的調査のために組織を集めた。さらに血液学および臨床化学を、実施例３および７からの最終血液サンプルについて行った。脳、肺、リンパ、胃腸管、肝臓、腎臓、甲状腺および生殖巣を含む主な器官のほとんどを評価した。散発性の損傷が実験動物に見られたが、AN1792処置と未処置動物間で影響を受けた組織または損傷の重篤度のいずれにも明らかな差異はなかった。PBS-処置または未処置動物に比較して、AN-1528-免疫感作動物に記録された独特な組織病理理学的損傷はなかった。また実施例７でアジュバント群とPBS処置群との間に臨床的な化学的プロフィールにおいて差異は無かった。実施例７ではPBS処置動物に比べてAN1792とフロイントアジュバントで処置した動物間で、幾つかの血液学的パラメーターに有意な上昇があったが、これらの効果の型は、フロイントアジュバントの処置から予想され、そして腹膜炎を伴い、そしてAN1792処置からの悪い効果は示していない。毒性学的評価の一部ではないが、PDAPPマウスの脳の病状を効力の終点の一部として徹底的に評価した。脳の形態学に及ぼす処置に関連した悪影響の兆候はいずれの実験にも無かった。これらの結果は、AN1792の処置が十分に耐容され、そして少なくとも実質的に副作用が無いことを示している。
XI．抗-Ａβ抗体を用いた治療的処置
この実施例は、ヘテロ接合性トランスジェニックマウスの脳内で、Ａβの沈積を抑制するためのＡβ対する種々のモノクローナルおよびポリクローナル抗体の能力を試験する。【０２１６】  １．実験計画
8.5〜10.5月齢の６匹のオスおよびメスのヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスは、チャールズリバーラボラトリーから得た。マウスはＡβに対する種々の抗体で処置する６群に分けた。動物はできる限り群内の動物の性別、月齢、血統および供給源を合わせるように分配した。図１０に示すように、抗体には４種のマウスＡβ-特異的モノクローナル抗体、2H3（Ａβ残基1-12に向けられた）、10D5（Ａβ残基1-16に向けられた）、266（Ａβ残基13-28に向けられ、そして単量体には結合するが、凝集したAN1792には結合しない）、21F12（Ａβ残基33-42に向けられた）を含んだ。５番目の群は、Ａβ-特異的ポリクローナル抗体画分（凝集したAN1792による免疫感作により生じた）で処置した。陰性対照群は抗体を含まない希釈物PBSを受けた。【０２１７】  モノクローナル抗体を、約10mg/kgの容量で注射した（マウスは50gと想定された）。注射は平均７日毎に1000より高い抗-Ａβ力価を維持するために投与した。mAb266はこのアッセイで捕捉抗原として使用した凝集したAN1792にはよく結合しないので低い力価が観察されたが、同じ投与スケジュールをこの群でも維持した。モノクローナル抗体2H3を受けた群は、抗体がインビボで急速に除去されすぎたので、最初の３週間内で中止した。動物は各抗体力価を測定するために、各投与前に採血された。処置は６カ月間、全部で196日にわたり続行した。動物は最終投与から１週間後に安楽死させた。【０２１８】
【表１６】
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【０２１９】  ２．材料および方法
ａ．抗体の調製
抗-Ａβポリクローナル抗体は、２群の動物から集めた血液から調製した。第１群は、６〜８週齢の100匹のメスのスイス ウェブスターマウスから成った。それらは、０、15および29日にCFA/IFAと合わせた100μgのAN1792で免疫感作した。４回目の注射は、1/2の用量のAN1792を36日に与えた。動物は42日の屠殺時に全採血し、血清を調製し、そして血清をプールして全部で64mlとした。第２群はPDAPPマウスと同系であるが、ヒトAPP遺伝子に関しては非トランスジェニックな24匹の６〜９週齢のメスから成った。それらは０、14、28および56日にCFA/IFAと合わせた100μgのAN1792で免疫感作した。これらの動物も63日の屠殺時に全採血し、血清を調製し、そして全14ml血清をプールした。血清の２ロットをプールした。抗体面分は連続して２回の50％飽和硫酸アンモニウム沈殿を使用して精製した。最後の沈殿物をPBSに透析し、そしてエンドトキシンについて試験した。エンドトキシンのレベルは１EU/mgで未満あった。【０２２０】  抗-Ａβモノクローナル抗体は腹水から調製した。流体は最初に濃硫酸デキストランナトリウムを氷冷腹水に氷上で撹拌しながら加えて脱脂して0.238％の最終濃度とした。濃CaCl2を次いで撹拌しながら加えて64mMの最終濃度とした。この溶液を10,×000gで遠心し、そしてペレットを捨てた。上清は等容量の飽和硫酸アンモニウムを滴下しながら氷上で撹拌した。溶液を再度10,×000gで遠心し、そして上清を捨てた。ペレットを再懸濁し、そして20mM Tris-HCl、0.4M NaCl、pH7.5に対して透析した。この画分をファルマシア（Pharmacia）FPLC Sepharose Ｑカラムに添加し、そして0.4Mから0.275M NaCl(20mM Tris-HCl、pH7.5中）の逆勾配から溶出した。【０２２１】  抗体ピークは280nmの吸収により同定し、そして適切な画分をプールした。精製した抗体調製物はBCA法を使用してタンパク質濃度を、そしてSDS-PAGEを使用して純度を測定した。このプールもエンドトキシンについて試験した。エンドトキシンのレベルは１EU/mgで未満あった。力価は、100未満の力価を25の力価として任意に割り当てた。【０２２２】  ３．脳内のＡβおよびAPPレベル
種々の抗-Ａβ抗体調製物を用いた処置からおよそ６カ月後、塩類の潅流後に動物から脳を摘出した。１つの半球は免疫組織化学的分析のために調製し、そして２つ目はＡβおよびAPPレベルの定量に使用した。βアミロイドペプチドおよびアミロイド前駆体タンパク質（APP）の種々の形態の濃度を測定するために、半球を切開し、そして海馬、皮質および小脳領域のホモジネートを５M グアニジンで調製した。これらは連続的に希釈して、ELISA形式で一連の既知濃度のＡβペプチドまたはAPPの希釈物と比較することにより、アミロイドペプチドまたはAPPのレベルを定量した。【０２２３】  ELISAにより測定した皮質および海馬のホモジネート中の全ＡβおよびＡβ1-42のレベル、ならびに小脳中の全Ａβのレベルを、それぞれ表１１、１２および１３に示す。PBSを接種した対照群の全Ａβレベルの中央濃度は、皮質よりも海馬で3.6倍高かった（皮質の17,818ng/gと比較して、海馬組織は63,389ng/gの中央値）。対照群の小脳中の中央値レベル（30.6ng/g組織）は、海馬中よりも2,000倍多かった。これらのレベルはこの月齢のヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスで我々が以前に報告した値と同様である（Johnson-Wood et al.,1997）。【０２２４】  皮質については、１匹の処置群が対照群とは有意に異なる（ｐ＜0.05）Ａβ1-42として測定されたＡβレベル中央値を有し、これらの動物は表１３に示すポリクローナル抗-Ａβ抗体を受容した。Ａβ1-42の中央値レベルは、この処置群に関する対照と比べて65％まで減少した。Ａβ1-42の中央値レベルは、１つのさらなる処置群において対照と比べて55％まで減少し、これらの動物はmAb 10D5を投与された（ｐ＝0.0433）。【０２２５】
【表１７】
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【０２２６】  海馬では、ポリクローナル抗-Ａβ抗体を用いた処置に関連する全Ａβの減少パーセント中央値（50％、ｐ＝0.0055）は、皮質で観察された値よりも大きくなかった（65％）（表１４）。しかし、減少の絶対的規模は皮質のほぼ３倍大きく、正味の減少は海馬の31,683ng/g組織対皮質の11,658ng/g組織であった。全ＡβではなくＡβのよりアミロイド形成性状態のＡβ1-42のレベルとして測定した時、ポリクローナル抗体を用いて達成された減少が有意であった（ｐ＝0.0025）。mAb 10D5および266を用いて処置した群の中央値レベルは、それぞれ33％および21％まで減少した。【０２２７】
【表１８】
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【０２２８】  全Ａβは、小脳でも測定した（表１５）。ポリクローナル抗-Ａβおよび266抗体を投与したそれらの群は、有意な全Ａβレベルの減少を示し（それぞれ43％および46％、ｐ＝0.0033およびｐ＝0.0184）、そして10D5で処置した群はほぼ有意な減少を示した（29％、ｐ＝0.0675）。【０２２９】
【表１９】
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【０２３０】  APP濃度も、抗体-処置および対照、PBS-処置マウスに由来する皮質および小脳でELISAにより決定した。２つの異なるAPPアッセイを使用した。第１に、APP−α/FLと名付けたアッセイは、APP-アルファ（α、Ａβ配列内で開裂されたAPPから分泌)、およびAPPの完全長形態（FL）を認識し、一方２番目のアッセイはAPP-αのみを認識する。処置が関係するＡβの減少とは対照的に、処置群のサブセットでは、対照動物と比較してすべての処置においてAPPのレベルがほとんど変らなかった。これらの結果は、Ａβ抗体を用いた免疫感作が、APPを減らさずにＡβを減らすことを示している。【０２３１】  まとめると、ＡβレベルはAN1792に対するポリクローナル抗体で処置した動物の皮質、海馬および小脳で有意に減少した。程度は低いがＡβ1-42のアミノ末端領域、特にアミノ酸1-16および13-28に対するモノクローナル抗体も有意な処置効果を示した。【０２３２】  ４．組織化学的分析：
PBS、ポリクローナルＡβ42、21F12、266および10D5処置群のマウスに由来するサブセット中のＡβ-免疫応答性斑の形態を、Ａβ42を用いた標準的な免疫感作手順に従った以前の実験と定量的に比較した。【０２３３】  アミロイド斑の程度および出現の両方において最大の変化は、ポリクローナルＡβ42抗体で免疫感作した動物で生じた。アミロイド負荷量の減少、衰退する斑の形態および細胞性のＡβ免疫反応性は、標準的な免疫感作手順により生じた効果に極めて似ていた。これらの観察は、全ＡβおよびＡβ42の両方で有意な減少がポリクローナルＡβ42抗体の投与により達成されたELISAの結果を指示している。【０２３４】  同様な定量的評価で、10D5群におけるアミロイド斑も数および外観が減少し、幾つかの細胞性Ａβ免疫反応性の証拠を示す。対照-処置動物に関して、Ａβに対するポリクローナルIg画分およびモノクローナル抗体の１つ（10D5）が、斑負荷量をそれぞれ93％および81％まで減少させた（ｐ＜0.05）。21F12は斑の負荷量に対して比較的小さな効果を有するようであった。pabＡβ1-42処置後の脳の顕微鏡写真は、対照処置動物に対してpabＡβ1-42処置群で、拡散した沈着物、および多くのより大きな緻密な斑が存在しないことを示した。【０２３５】  ５．抗体力価の測定：
各群からの３つの無作為に選択したマウスのサブセットから、各腹腔内接種の直前に全部で30匹から採血した。抗体力価は一般材料および方法で詳細に記載しように、Ａβ1-42を被覆したプラスチック製のマルチ−ウェルプレートを使用したサンドイッチELISAでＡβ1-42結合抗体として測定した。各採血の平均力価は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体 10D5および21F12については、図１６〜１８にそれぞれ示す。ポリクローナル抗体調製物について、この期間にわたる力価は平均約1000を越え、そして10D5-および21F12-処置動物よりもこのレベルはわずかに高かった。【０２３６】  ６．リンパ球増殖応答：
Ａβ-依存的なリンパ球増殖を、最後の抗体注入から８日後に回収した脾細胞を使用して測定した。新しく回収した細胞（105／ウェル）を、５μMの刺激濃度のＡβ1-40の存在下で、５日間培養した。陽性対照として、さらなる細胞をＴ細胞マイトジェン（PHA）と培養し、そして陰性対照として、細胞はペプチドを加えずに培養した。【０２３７】  種々の抗-Ａβ抗体で受動免疫感作した老いたPDAPPマウスに由来する脾細胞は、インビトロでAN1792をいて刺激し、そして増殖およびサイトカイン応答を測定した。これらのアッセイの目的は、受動免疫感作が抗原提示を可能にするかどうか、すなわちAN1792に特異的なＴ細胞応答をプライミング（Priming）するかどうかを決定することであった。AN1792-特異的増殖またはサイトカイン応答が、抗-Ａβ抗体で受動免疫感作したマウスで観察された。
XII．受動免疫感作のさらなる実験
第２実験では、10D5による処置を繰り返し、そして２つのさらなる抗-Ａβ抗体、モノクローナル抗体3D6（Ａβ1-5）および16C11（Ａβ33-42）を試験した。対照群はPBSまたは無関係なアイソタイプが合った抗体（TM2a）のいずれかを受けた。マウスは以前の実験よりも年老いており（11.5〜12月齢のヘテロ接合性）、それ以外は実験計画は同じであった。ここでもう一度、６カ月間の処置後に、10D5は斑の負荷量をPBSまたはアイソタイプが合った抗体対照のいずれに対しても80％以上減少させた（ｐ＝0.003）。Ａβに対する他の抗体、3D6は同等に有効であり、86％の減少を生じた（ｐ＝0.003）。対照的に、ペプチドに対する第３抗体、16C11は斑の負荷量に効果を及ぼすことができなかった。同様な知見は、Ａβ42ELISA測定を用いて得られた。これらの結果は、Ａβペプチドに対する抗体応答がＴ細胞免疫の不存在下で、PDAPPマウスのアミロイド沈着物を減少させるために十分であるが、すべての抗-Ａβ抗体に効力があるわけではないことを示している。Ａβのアミノ酸1-5または3-7を含んで成るエピトープに対する抗体が特に効力を有する。【０２３８】  まとめると、我々は受動的に投与されたＡβに対する抗体がアルツハイマー病のマウスモデルにおいて斑の沈着物の程度を減少させることを示した。適度な血清濃度（25〜70μg/ml）に保持される時、抗体はβ-アミロイド斑を修飾する(decorate）ために十分なレベルでCNSへの接近を獲得した。CNSへ抗体が入ることは、PDAPPマウスでエバンス ブルー（Evans Blue）により測定される脈管透過性が上昇しなかったので、血管−脳バリアの異常な漏れによるものではなかった。さらに、年老いたPDAPPマウスの脳実質中の抗体濃度は非トランスジェニックマウスでの濃度と同じであり、血清中0.1％の抗体濃度を表した（アイソタイプにかかわらず）。
XIII．抗体結合のモニタリング
Ａβに対する抗体がCNS中で実際に作用できたのかどうかを決定するために、実施例XIIの終わりに塩類を潅流したマウスから摘出した脳を、末梢に投与した抗体の存在について調査した。非固定の凍結保持脳切片をマウス免疫グロブリン（ヤギ抗-マウスIgG-Cy3）に対する蛍光試薬に暴露した。10D5および3D6群の脳内の斑は、抗体により強く修飾され、一方16C11群には染色はなかった。完全な程度の斑の沈着物を明らかにするために、各脳の連続切片を最初に抗-Ａβ抗体と免疫反応させ、そして次に２次試薬と反応させた。末梢投与後に10D5および3D6は、CNS内のほとんどの斑への接近を得た。斑の付加量は16C11群に比べてこのような処置群で大いに減少した。これらのデータは、末梢に投与した抗体がアミロイド除去を直接引き起こす（trigger）ことができる場所のCNSへ入ることができることを示す。16C11も斑に接近できるが、結合できなかったらしい。
XIV．アミロイド沈着物に対する抗体の活性に関するエクスビボスクリーニングアツセイ
抗体の斑除去に及ぼす効果を調査するために、我々は初代ミクログリア細胞をPDAPPマウスまたはヒトＡＤ脳の非固定の凍結保持切片と培養するエクスビボアッセイを樹立した。ミクログリア細胞は、新生児DBA/2Nマウス（１〜３日）の大脳皮質から得た。皮質は50μg/mlのDNaseI(シグマ(Sigma))を含むHBSS--（ハンクスバランス塩溶液、シグマ)中で機械的に切開した。解離した細胞を100μm細胞ステイナー(ファルコン:Falcon)で濾過し、そして1000rpmで５分間遠心した。ペレットを成長培地に再懸濁し（高グルコースDMEM、10％FBS、25ng/ml GM-CSF）、そして細胞をT-75プラスチック培養フラスコあたり２個の脳密度でまいた。７〜９日後、フラスコを軌道シェーカー上で200rpmにて、37℃で２時間回転させた。細胞懸濁液を1000rpmで遠心し、そしてアッセイ媒質中に再懸濁した。【０２３９】  PDAPPマウスまたはヒトAD脳（死後間隔＜３時間）の10-μmの凍結保持切片を、ポリ-リシンを被覆したガラスカバースリップ上で解凍し、そして24ウェル組織培養プレート中に置いた。カバースリップは、H-SFM（ハイブリドーマ-無血清培地、ギブコ(Gibco)-BRL）、１％FBS、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび５ng/ml rmGM-CSF（Ｒ＆Ｄ）から成るアッセイ媒質で２回洗浄した。対照または抗-Ａβ抗体を２×濃度（最終５μg/ml）で１時間加えた。次いでミクログリア細胞を0.8×106細胞／mlアッセイ媒質の密度でまいた。培養は加湿インキュベーター（37℃、５％CO2）中で24時間以上維持した。インキューベーションの終わりに、カルチャーを４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして0.1％Triton-X100で透過した。切片をビオチン化3D6、続いてストレプトアビジン/Cy3結合物（ジャクソン イムノリサーチ）により染色した。外因性のミクログリア細胞を核染色により視覚化した（DAPI）。カルチャーを逆転蛍光顕微鏡（ニコン（Nicon）、TE300）で観察し、そして顕微鏡写真をSPOTソフトウェア（ダイアグノスティック インスツルメンツ（Diagnostic instruments）を使用して、SPOTデジタルカメラで取った。ウエスタンブロット分析に関しては、カルチャーを８M尿素で抽出し、還元トリシンサンプルバッファー中で1:1に希釈し、そして16％トリシンゲル（ノベックス(Novex））に乗せた。イモビロン（immobilon）上に移した後、ブロットを５μg/mlのpabＡβ42、続いてHRP-結合化抗-マウス抗体に暴露し、そしてECL(アマーシャム(Amersham)で現像させた。
アッセイを16C11（インビボで効力の無い、Ａβにする抗体の１つ）の存在下でPDAPP脳切片で行った時、β-アミロイド斑は完全なまま残り、そして食作用は観察されなかった。対照的に、隣接する切片を10D5の存在下で培養した時、アミロイド沈着物は大部分が無くなり、そしてミクロダリア細胞はＡβを含有する多数の食作用小胞を示した。同一の結果がＡＤ脳切片でも得られた；10D5はＡＤ斑の食作用を誘導したが、16C11は有効ではなかった。さらに、アッセイではマウスまたはヒトのミクログリアに細胞のいずれか、およびＡβに対するマウス、ウサギまたは霊長類の抗体で行った時に匹敵する結果を提供した。【０２４０】  表１６は結合および／または食作用が数種の異なる抗体結合特異性について得られるかどうかを示す。aa1-7内のエピトープに結合する抗体は両方とも結合し、そしてアミロイド沈着物を除去することが分かるが、アミノ酸4-10内のエピトープに結合する抗体は、アミロイド沈着物を除去せずに結合した。残基10のエピトープＣ-末端に結合する抗体は、結合もアミロイド沈着物の除去もしなかった。【０２４１】
【表２０】
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【０２４２】  表１７は、Ａβに対する幾つかの抗体を用いて得られた結果を示し、受動輸送実験においてエクスビボアッセイで食作用を誘導し、そしてインビボの斑の負荷量を減少させる抗体の能力を比較する。16C11および21F12は凝集した合成Ａβペプチドに高い親和力で結合し、これらの抗体は非固定脳切片中のβ-アミロイド斑と反応することができず、エクスビボアッセイで食作用を引き出すことができず、そしてインビボで効力的ではなかった。Ａβに対する10D5、3D6およびポリクローナる抗体は、すべてのこれらの測定で活性であった。22C8抗体は、１および７位のアスパラギン酸がイソ-アスパラギン酸に置き換えられた自然なＡβの同族形態により強く結合する。これらの結果は、インビトロの効力がCNS中の斑の直接的な抗体が媒介する除去によることを示し、そしてエクスビボのアッセイがインビボの効力を予報することを示す。【０２４３】  同じアッセイを使用して、NACと呼ばれるシヌクレインのフラグメントに対する抗体の除去を試験した。NACに対する抗体はアミロイド斑を含む脳組織サンプル、ミクログリア細胞と前のように接触させる。ウサギの血清を対照として使用した。続くモニタリングでは、抗体の除去活性を示す斑の数およびサイズの著しい減少を示した。【０２４４】
【表２１】
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【０２４５】  共焦点顕微鏡を使用して、Ａβがエクスビボアッセイ中に内面化したことを確認した。対照抗体の存在下で、外因性ミクロダリア細胞は、組織上の共焦点板に残り、Ａβを含む食作用小胞は無く、そして斑は切片内こ完全に残った。10D5の存在下で、ほとんどすべての斑材料が外因性ミクログリア細胞内の小胞に含まれた。内面化されたペプチドの運命を決定するために、10D5処理カルチャーを８M尿素で様々な時点で抽出し、そしてウエスタンブロット分析により調査した。１時間の時点で、食作用は未だに起こっていない時、Ａβに対するポリクローナル抗体との反応で強い４kDバンド（Ａβペプチドに対応する）が明らかとなった。Ａβ免疫反応性は、１日で減少し、そして３日までに無かった。すなわち抗体性のＡβの食作用はその分解を導く。【０２４６】  エクスビボアッセイにおける食作用がFc-媒介であるかどうかを決定するために、抗-Ａβ抗体3D36のF(ab')2フラグメントを調製した。F(ab')2フラグメントはそれらが斑と反応するための完全な能力を保持するが、ミクログリア細胞による食作用を引き出す（trigger）ことができなかった。さらに全抗体での食作用は、マウスFcレセプターに対する試薬（抗-CD16/32）により遮断された。これらのデータは、Ａβのインビボ除去がFc-レセプターが媒介する食作用を通して起こることを示している。
XV．抗体の血管脳バリアの通過
この実施例では、正常またはPDAPPマウスの抹消組織に静脈注射された後に、脳に送達された抗体の濃度を測定する。PDAPPまたは対照正常マウスは、0.9％ NaClを潅流した。脳領域（海馬または皮質）を切開し、そして急速に冷凍した。脳は0.1％トライトン＋プロテアーゼインヒビター中で均質化した。免疫グロブリンが抽出物中でELISAにより検出された。捕捉試薬としてFab'2ヤギ抗-マウスIgGを、RIAプレート上に被覆した。血清または脳抽出物を１時間インキューベーションした。アイソタイプを抗-マウスIgG1-HRPまたはIgG2a-HRPまたはIgG2b-HRP（カルタグ:Caltag）で検出した。アイソタイプにかかわらず抗体はCNSに、血中に見られる濃度の1:1000で存在した。例えば、IgG1の濃度が血中のIgG2aの３倍である時、脳にもIgG2aの３倍で存在し、両方ともそれぞれの血中レベルの0.1％で存在する。この結果はトランスジェニックおよび非トランスジェニックマウスの両方で観察されるので、PDAPPで独自に血管脳バリアを漏れたのではなかった。
XVI．MAPの立体配置におけるＡβペプチドの治療的効力
治療的アジュバント／免疫原効力実験を、９〜10.5月齢のオスおよびメスのヘテロ接合性PDAPPトランスジェニックマウスで行い、上記のような四量体のMAP立体配置でＡβ1-7を含んで成る融合タンパク質の効力を試験した。試験期間は処置群あたり20〜40動物を用いて25週間であり；したがって動物は終了時に15〜16.5月齢であった。この実験に使用した方法は、上記実施例VIIIの種々のアジュバントの治療的実験で使用した方法と同じである。処置群は以下の表８で確認する。【０２４７】
【表２２】
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【０２４８】表の略号：MAP−多−抗原性ペプチド；TT−破傷風毒素ｔ-細胞エピトープ（830-844）；SC−皮下；IP−腹腔内；PBS−リン酸緩衝化生理食塩水；GCSはグリシン／クエン酸塩／シュクロース配合物。【０２４９】  免疫感作スケジュールは、すべての処置群で同一であった。マウスは０、２、４、８、12、16、20、24週に注射し、３、５、９、13、17、21および25週に採血した。群１、２、３、４および６は８回の注射を受け、群２および３はそれぞれQS21/AN1792およびPBSを受け、この実験の陽性および陰性対照とした。【０２５０】  力価は抗-Ａβ抗体力価アッセイにより測定した。【０２５１】  群１、CFA/IFA:MAP(Aβ1-7:TT)群は、力価レベルが低かった。ピークGMTは13週に1,200に達し、25週までに600のGMTに落ちた。力価が上がらなかったマウスが30匹の内３匹おり、そして別の７匹のマウスは実験の終わりまでに400の力価を越えなかった。【０２５２】  群２、QS21/AN1792対照群は、17週で16,000のGMTのそのピーク力価に達した。次いで力価は次の８週にわたり落ちて、8,700のCMTで終了した。この群の１匹の動物は実験の全経過にわたり力価が上がらなかった。【０２５３】  群３、PBS単独群は力価が無かった。【０２５４】  両処置群が、PBS対照群と比較して皮質でＡβレベルの有意な減少を示した（表１９を参照にされたい）。CFA/IFA:MAP(Aβ1-7)群は、抗-Ａβ抗体の比較的低い力価にもかかわらず、PBS対照群に比べて有意にＡβを下げた。【０２５５】
【表２３】
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【０２５６】  結論すると、Ａβ1-7MAP免疫原は、皮質のＡβ沈着物を有意に阻止するために十分な免疫応答を誘導のに有効である。
XVII．サルを対象としたＡβに対する免疫原性応答のエピトープマッピング
この実施例では、AN1792（すなわちＡβ1-42）を用いた免疫感作に対する霊長類の応答を分析する。11群のサル(４／性別／群）を、QS-21アジュバント（50または100μg／投与量）または水中５％の滅菌デキストロース（D5W、対照群）と組み合わせたAN1792（75または300μg／投与量)で免疫感作した。すべての動物は、表２０に示す３つの注射スケジュールの１つで、１M注射を全部で４、５または８投与受けた。実験の175日目に集めた血清サンプル（４匹のサル／性別／群から）、および実験の176日目に集めた（６カ月目の検死）CSFサンプル（３匹のサル／性別／群から）を、それらがＡβ1-40ペプチドおよびAPPに結合する能力について評価した。【０２５７】
【表２４】
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【０２５８】ａ．スケジュール１、投与日１、15、29、57、85、113、141、169;スケジュール２、投与日１、29、57、113、169;スケジュール３、投与日１、43、85、169。
ｂ．Ｄ５Ｗ注射対照群
ｃ．AN1792の補形剤であるグリシン／クエン酸塩／シュクロースバッファーから成る賦形剤。【０２５９】  AN1792により免疫感作した動物に由来する血清サンプル中の抗体により認識される直線状ペプチドの正確な配列は、このような抗体の全Ａβ1-42配列を網羅する重複ペプチドへの結合を測定するELISAにより決定した。AN1792の部分配列を有するビオチン化ペプチドは、ペプチドあたり９個の残基の重複および１残基のステップを含む10アミノ酸ペプチドとして、キロン テクノロジーズ（Chiron Technologies）から得た（合成番号5366、番号5331および番号5814）。最初の32ペプチド（AN1792のＮ-末端の上流の８アミノ酸位から、AN1792の24番目のアミノ酸に下がる）を、GGKのリンカーを用いてＣ-末端でビオチン化する。最後の10ペプチド（前の連続から32番目のペプチドを繰り返す）を、EGEG（配列番号：７６）から成るリンカーを用いてＮ-末端でビオチン化する。凍結乾燥したビオチン化ペプチドを、５mMの濃度でDMSO中に溶解した。これらのペプチドストックをTTBS（0.05％Tween 20、25mM Tris HCl、137mM NaCl、5.1mM KCl、PH=7.5）中、５μMに希釈した。この５μM溶液の100μlのアリコートは、ストレプトアビジンを前−被覆した96-ウェルプレート（ピアス：Pierce）に２連で加えた。プレートを室温で１時間インキューベーションし、次いで４回、TTBSで洗浄した。血清サンプルは力値を標準化するためにアザイドを含まない検体希釈液で希釈し、そしてウェルあたり100μlを加えた。これらのプレートを室温で１時間インキューベーションし、そして次いで４回、TTBSで洗浄した。HRP-結合ヤギ抗-ヒト抗体（ジャクソン イムノリサーチ：Jackson ImmunoResearch）を、1:10,000でアザイドを含まない検体希釈液で希釈し、そしてウェルあたり100μlを加えた。プレートを再度インキューベーションし、そして洗浄した。発色反応を行うために、TMB(ピアス)をウェルあたり100μlで加え、そして15分間インキューベーションした後に、30μlの2N H2SO4を加えて、反応を止めた。光学密度はVmax またはSpectramax 比色プレートリーダーで450nmにて測定した。【０２６０】  AN1792での免疫感作は、175日までにすべての投与群で100％の動物に抗体の生産をもたらした。群内の平均力価は14596〜56084の範囲であった。より高い抗原および／またはより高いアジュバント濃度の存在下の免疫感作スケジュール内でより高い力価となる傾向があったが、免疫感作に対する個々の動物応答における高い変動性のために有意差は示すことができなかった。【０２６１】  AN1792に対して陽性の血清は、Ａβ1-40に対する抗体についても陽性であった。群内の平均力価は36867〜165991の範囲であり、そして抗-AN1792力価に関しては、175日で群間の統計的な有意差は示されなかった。AN1792への結合は、Ａβ1-40への結合と高い陽性の相関（Spearman r=0.8671）を示した。【０２６２】  AN1792により様々なスケジュールで免疫感作した48匹のサルの中で、33匹が分析に十分な容量および量のCSFサンプルを生じた。このような中の32匹（97％）が、AN1792に対して陽性の力価を有した。この力価は２〜246の範囲であり、49.44±21.34の平均であった。CSF抗-AN1792レベルは血清中で測定されたものの0.18±0.11％であり、そして血清力価との高い陽性の相関を示した（Spearman r=0.7840）。CSF中の抗体の割合に群差または性差は見られなかった。CSF中の抗体のレベルは血管脳−バリアから中枢神経径をわたって、末梢に生成された抗体の受動輸送に合致する。【０２６３】  抗-AN1792陽性CSFサンプルのサブセットの試験では、血清サンプル中の抗体のように、Ａβ1-40と交差反応するCSF中の抗体を示した。Ａβ1-40に対する力価は、それらの各々のAN1792力価と高い相関を示した（Spearman r=0.9634）。AN1792に対して最高の力価を持つCSFのサンプルのサブセットの試験では、血清抗体に関するようにAPPへの結合は示さなかった。【０２６４】  175日からの血清を一連の重複10-merペプチドに対して試験した時、すべてのサルからの抗体がAN1792ペプチドのアミノ酸1-10を網羅する配列（APPのアミノ酸653-672）のペプチドに結合した。幾つかの動物では、これが結合を測定できた唯一のペプチドであった（図１９を参照にされたい）。【０２６５】  別の動物では他の反応性を測定することができたが、すべての場合でＮ-末端ペプチド配列に対する反応性が優占するものであった。さらなる反応性は２群に分かれた。第１の、そして多くの結合は、Ｎ-末端1-10AN1792ペプチドの中央を囲むペプチドへの結合であった（図２０）。他の種類の結合は、AN1792ペプチドのアミノ酸1-8、1-9および2-11を網羅するペプチドに向けられた。これらの反応性は、1-10ペプチドへの反応性と合わせると、すべての動物において圧倒的な大部分の反応性を表す。期間中の個々の動物のエピトープマッピングは、1-10ペプチドに対する抗体反応性が隣接するペプチドへの広がりを進めることを示す。これはAN1792ペプチドのＮ-末端のその遊離末端アスパラギン酸残基への免疫反応性に強力に傾くことを示す。数匹の動物中でわずかに検出可能な２つ目の活性は、主領域およびAN1792ペプチドのアミノ酸7-16、11-20および16-25を覆う中央部ペプチドへに対してＣ-末端に位置するペプチドへの結合であった。これらの反応性はサルのわずか10〜30％で見られた。【０２６６】  種々の動物間の応答の変動は（例えば、アミノ酸1-10が排除されているか、または優勢な反応性エピトープであるかにかかわらず）、抗原／アジュバント用量、投与スケジュール、または抗体力価と相関せず、そしておそらく個々の動物の遺伝的構成（make-up）の影響によるものだろう。
XVIII．ヒト個体の予防および処置
ヒトでの安全性を決定するために、単回投与のフェイズI試験を行う。治療薬は効力が予想される約0.01のレベルから始めて、有効なマウス投薬用量の約10倍のレベルに達するまで３の因子で増加させて、異なる患者に対して投薬用量を増して投与する。【０２６７】  フェイズII試験は、治療効力を決定するために行う。アルツハイマーの可能性についてアルツハイマー病および関連障害随伴基準（ADRDA）を使用して定めた初期から中期アルツハイマー病の患者を選択する。適当な患者はミニ-精神-状態試験(MMSE)において12〜26点の範囲である。他の選択基準は、患者が試験期間中に生存し、そして妨害するかもしれない併用薬剤の使用といった複雑化する問題が無いことである。患者の機能のベースライン評価は、MMSEおよびアルツハイマー病状態および機能を持つ患者を評価するための総合的尺度であるADASのような古典的な精神測定を使用して行う。【０２６８】  このような精神的尺度はアルツハイマー症状の進行の測定を提供する。適当な定性的生活尺度も処置をモニタリングするために使用できる。疾患の進行はMRIによりモニタリングすることもできる。患者の血液プロフィールも、免疫原-特異的抗体およびＴ-細胞応答のアッセイを含め、モニタリングすることができる。【０２６９】  ベースライン測定の後、患者は処置を受け始める。彼らは無作為化され、そして治療薬またはプラセボをいずれかにより盲検的様式で処置される。患者は少なくとも６カ月間、監視される。効力はプラセボ群に対して処置群で進行における有意な減少により決定する。【０２７０】  第２フェイズIIの試験は、非アルツハイマー病の初期の記憶喪失（時折、加齢による記憶障害（AAMI）とも呼ばれるが）、または軽度の認知障害（MCI）から、ADRDA基準により定められる恐らくはアルツハイマー病への転換を評価するために行う。アルツハイマー病への転換の高い危険性を持つ患者は、記憶喪失の初期の兆候または前−アルツハイマー病の総合的症状に付随する他の困難について参照群をスクリーニングすることにより非臨床的群から、アルツハイマー病の家系から、遺伝的危険因子、年齢、性別およびアルツハイマー病について高い危険性を示すことが分かっている他の特徴から選択する。MMSEおよびADASを含む適当な測定基準のベースライン採点が、より正常な群を評価するために設計された他の測定基準と一緒に集められる。これらの患者群は適当な群に分割し、プラセボを薬剤を含む投与選択肢に対して比較する。これらの患者群は約６カ月の間隔で追跡され、そして各患者の終点は、彼または彼女が観察の終了時にADRDA基準により定められるアルツハイマー病を好転させているかどうかである。
XIX．一般材料および方法
マウスは尾の静脈に小さい傷を作ることにより採血し、そして約200μlの血液をミクロ遠心管に集めた。モルモットは最初に後膝領域の毛を剃り、18ゲイジ針を使用して中足骨静脈に傷をつけ、そして血液をミクロ遠心管に集めることにより採血した。血液は室温（RT）で１時間凝固させ、ボルテックス混合し、次いで14,000×gで10分間遠心して、血清から凝固物を分離した。次いで血清を清浄なミクロ遠心管に移し、そして滴定するまで４℃で保存した。【０２７１】  抗体力価は、により測定した。96-ウェルマイクロタイタープレート(コスター(Costar) EIAプレート）は、10μg/mlのＡβ42またはSAPPあるいは他の抗原のいずれかを含む100μlの溶液（ウェルコーティングバッファー:0.1M リン酸ナトリウム、pH8.5，0.1％アジ化ナトリウム)で個別の報告にそれぞれ記載されているように被覆し、そしてRTで一晩保持した。ウェルを吸引し、そして血清を検体希釈液（0.014M リン酸ナトリウム、pH7.4、0.15M NaCl、0.6％ウシ血清アルブミン、0.05％チメロサール）で1/100希釈から始めてウェル加えた。サンプルの３倍づつ７回の連続希釈物をプレートに直接作成して、最終的に1/218,000の希釈物を作成した。この希釈物を被覆したプレートウェル中でRTにて１時間インキューベーションした。次いでプレートを４回、0.05％Tween 20を含むPBSバッファーで洗浄した。２次抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗-マウスIg（ベーリンガーマンハイム(Boehringer Mannheim）から得た）をウェルに100μlの1/3000希釈物（検体希釈液中）として加え、そしてRTで１時間インキューベーションした。プレートを再度４回、PBS、Tween 20で洗浄した。色原体を発色させるために、100μlのSlow TMB（ピアスケミカルズから得た3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン)を各ウェルに加え、そしてRTで15分間インキューベーションした。反応は25μlの２M H2SO4を添加することにより停止した。次に色の強度を、モレキュラー デバイスイズ(Molecular Devices)のVmaxで読んだ（450nm〜650nm）。【０２７２】  力価は血清の相互の希釈として定め、最大ＯＤの1/2を与えた。最大ＯＤは、一般に大変高い力価の場合（この場合は、最大ＯＤを確立するために、より高い初期の希釈が必要であった）を除き最初の1/100希釈から取られた。50％点が２つの希釈の間に落ちたら、直線的外挿入を行って最終力価を算出した。幾何平均抗体力価を算出するために、100未満の力価は任意に25の力価に割り当てた。【０２７３】  ２．リンパ球増殖アッセイ
マウスにイソフルランで麻酔をかけた。脾臓を摘出し、そして10％熱−不活性化ウシ胎児血清を含む５mlのPBS（PBS-FBS）で２回洗浄し、そして50℃のCentriconユニット(ダコ社(Daco A/S)、デンマーク）中、1.5mlのPBS-FBSで10秒間、100rpmでMedimachine(ダコ）にて均質化し、続いて100ミクロン孔サイズのナイロンメッシュを通して濾過した。脾細胞を15mlのPBS-FBSで１回洗浄し、次いで200×gで５分間遠心することによりペレットとした。赤血球はペレットを５mLのバッファー(0.15M NH4Cl、１M KHCO3、0.1M NaEDTA、pH7.4を含む)中にRTで５分間、再懸濁することにより溶解した。次いで白血球は上記のように洗浄した。新しく単離した脾細胞（ウェルあたり105細胞）を、96-ウェルのU-底組織培養-処理マイクロタイタープレート（コーニング(Corning)、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）中、2.05mM グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび10％熱−不活性化FBSを補充したRPMI1640培地（JHR バイオサイエンス（Bioscience）、レネキサ、カンザス州）に３連で準備して、37℃で96時間培養した。種々のＡβペプチド、Ａβ1-16、Ａβ1-40、Ａβ1-42またはＡβ40-1逆配列タンパク質も、４段階で５〜0.8マイクロモルの範囲の用量で加えた。対照ウェル中の細胞は、タンパク質を加えずにコンカナバリンＡ(ConA)(シグマ(Sigma)、カタログ#C-5275、１マイクログラム／ml）で培養した。細胞は3H-チミジン（イリノイ州、アーリントンのアマーシャム社（Amersham Corp.）から得た１μCi／ウェル）を最後の24時間適用した。次いで細胞をUniFnterプレート上に回収し、そしてTop Count Microplate シンチレーション カウンターでカウントした（パッカード ルンスツルメンツ(Packard Instruments)、ダウナーズ グローブ、イリノイ州)。結果は分あたりに不溶性高分子中に取り込まれた放射活性のカウントとして示す（cpm）。【０２７４】  ４．脳組織プレパレーション
麻酔後に脳を摘出し、そして１つの半球を免疫組織化学分析用に調製し、一方３つの脳領域（海馬、皮質および小脳）を別の半球から切開し、そして種々のＡβタンパク質およびAPP形態の濃度を特異的ELISAを用いて測定するために使用した（Johnson-Wood et al.、同上）。【０２７５】  ELISA用の組織を10容量の氷-冷グアニジンバッファー(5.0M グアニジン-HCl、50mM Tris-HCl、pH8.0）中で均質化した。ホモジネートはAdams Nutator（フィッシャー:Fisher）を使用してRTにて３〜４時間、ゆるやかに撹拌し、次いでＡβおよびAPPの定量前に−20℃で保存した。事前の実験では、被検体はこの保存条件下で安定であり、そして合成Ａβタンパク質（バッケム：Bachem）がマウスの同腹子に由来する対照脳組織のホモジネートに注射した（spiked）時、定量的に回収された（Johnson-Wood et al.、同上）。【０２７６】  ５．Ａβレベルの測定
脳のホモジネートを氷冷カゼイン希釈液（0.25％カゼイン、PBS、0.05％アジ化ナトリウム、20μg/ml アプロチニン、5mM EDTA pH8.0、10μg/ml ロイペプチン）で1:10に希釈し、そして16,000×gで４℃にて20分間遠心した。合成Ａβタンパク質標準（1-42アミノ酸）およびAPP標準は、最終組成物に0.5Mグアニジンおよび0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むように調製した。「全」ＡβサンドイッチELISAは、捕捉抗体としてＡβ13-28のアミノ酸に特異的なモノクローナル抗体モノクローナル抗体266、レポーター抗体としてＡβのアミノ酸1-5に特異的なビオチン化モノクローナル抗体3D6（Johnson-Wood et al.）を利用する。3D6モノクローナル抗体は分泌されたAPPまたは完全長APPを認識せず、アミノ末端アスパラギン酸を含むＡβ種のみを検出する。このアッセイは〜50ng/ml（11nM）の感度の下限を有し、そして１ng/mlの濃度まで内因性のマウスＡβタンパク質との交差反応を示さない（Johnson-Wood et al.、同上）。【０２７７】  Ａβ1-42特異的サンドイッチELISAは、捕捉抗体としてＡβのアミノ酸33-42に特異的なmＡβ21F12を利用する。このアッセイにも約125μg/ml（28μM、Johnson-Wood et al.)の感度の下限を有するビオチン化mＡβD6をレポーター抗体として使用する。ＡβELISAには、100μlのmＡβ266（10μg/mlで）またはmＡβ21F12（５μg/mlで）のいずれかを、RTで一晩インキューベーションすることにより96-ウェルのイムノアッセイプレート（コスター）に被覆した。溶液を吸引除去し、そしてウェルは200μlの0.25％ヒト血清アルブミンをPBSバッファーに少なくともRTで１時間、加えることによりブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、そしてプレートを使用するまで4℃で乾燥保存した。プレートは洗浄バッファー［Tris−緩衝化生理食塩水(0.15M NaCl、0.01M Tris-HCl、pH7.5)に0.05％Tween20を加えた］で使用前に再水和した。サンプルおよび標準をウェルあたり100μlの３連のアリコートで加え、そして次いで４℃で一晩インキューベーションした。プレートを少なくとも３回、アッセイの各工程間で洗浄バッファーを用いて洗浄した。カゼインアッセイバッファー（0.25％カゼイン、PBS、0.05％Tween 20、pH7.4）中に0.5μg/mlに希釈したビオチン化mＡβ 3D6を加え、そしてウェル中でRTにて１時間、インキューベーションした。カゼインアッセイバッファーで1:4000に希釈したアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物（カリフォルニア州、バーリンガムのベクター（Vector）から得たアビジン−HRP）をウェルにRTで１時間加えた。比色基質、Slow TMB-ELISA（ピアス）を加え、そしてRTで15分間反応させ、その後に酵素反応を25μlの2N H2SO4を加えることにより停止した。反応生成物はモレキュラー  デバイスイズのＶmaxを、450nmおよび650nmの異なる吸収で測定することにより定量した。【０２７８】  ６．APPレベルの測定
２種類のAPPアッセイを利用した。第一は、APP-α/FLと呼ばれ、APP-アルファ(α）およびAPPの完全長(FL)形態の両方を認識する。第二アッセイは、APP-αに特異的である。APP-α/FLアッセイは、Ａβの最初の12アミノ酸を含む分泌したAPPを認識する。レポーター抗体(2H3)はα-クリップ-部位に特異的ではないので、APP695のアミノ酸612-613間で起こる（Esch et al.,Science 248,1122-1124(1990)；このアッセイは完全長APP(APP-FL)も認識する。脳のAPP-FLのホモジネートを消費させるために、APP-FLの細胞質テイルに固定化したAPP抗体を使用した予備実験では、APP-α/FLの約30〜40％がFLであることを示唆している(データは示さず）。APP-α/FLおよびAPP-αアッセイの両方のための捕捉抗体は、mAb 8E5であり、APP695形態のアミノ酸444〜592に対して生じた（Games et al.、同上）。APP-α/FLアッセイ用のレポーターmAbは、APP695のアミノ酸597〜608に特異的なmAb 2H3であり（Johnson-Wood et al.、同上）、そしてAPP-αアッセイ用のレポーター抗体は、APPのアミノ酸605〜611に対して生じたmAb 16H9のビオチン化誘導体である。APP-α/FLアッセイの感度の下限は約11ng/ml(150pM)であり(Johnson-wood et al.)、そしてAPP-α特異的アッセイの下限は22ng/ml(0.3nM)である。両APPアッセイについて、mAb 8E5を96-ウェルEIAプレートのウェルにmAb 266について記載したように被覆した。精製した組換え分泌APP-αを、APP-αアッセイおよびAPP-α/FLアッセイの参照標準として使用した（Esch et al.,同上）。５M グアニジン中の脳のホモジネートサンプルを、ELISA検体希釈液（0.014M リン酸バッファー、pH7.4、0.6％ウシ血清アルブミン、0.05％チメロサール、0.5M NaCl、0.1％NP40）に1:10で希釈した。それらを次いで0.5M グアニジンを含有する検体希釈液で1:4に希釈した。希釈したホモジネートを次いで16,000×ｇでRTにて15秒間遠心した。APP標準およびサンプルを、プレートに２連のアリコートで加え、そしてRTで1.5時間インキューベーションした。ビオチン化レポーター抗体 2H3または16H9をサンプルとRTで１時間インキューベーションした。検体希釈液で1:1000に希釈したストレプトアビジン−アリカリホスファターゼ（ベーリンガー  マンハイム：Boehringer Mannheim）を、ウェル中でRTで１時間インキューベーションした。蛍光基質、4-メチル-ウンベリフェリル-ホスフェートをRTで30分間インキューベーションに加え、そしてプレートをCytofluor tm 2350蛍光計(ミリポア:Millipore)で365nmの励起および450nmの発光で読んだ。【０２７９】  ７．免疫組織化学
脳は40Cで３日間、４％パラホルムアルデヒド（PBS中)で固定し、そして次に１〜７日間、４℃で１％パラホルムアルデヒド、PBS中に切開するまで保存した。40ミクロン厚の冠状面区分をビブラトーメ(vibratome)上でRTにて切断し、そして免疫組織化学処理前に、低温保護下（リン酸塩バッファー中の30％グリセロール、30％エチレングリコール）に−20℃で保存した。各脳について、背側海馬のレベルで連続する240μmの間隔により各々が分けられた６つの切片を、以下の1つの抗体と一晩インキューベーションした：(1)PBSおよび１％ウマ血清中に２μg/ml濃度に希釈されたビオチン化抗-Ａβ（mAb、3D6、ヒトＡβに特異的）；または(2)PBSおよび1.0％ウマ血清中に３μg/ml濃度に希釈された、ヒトAPPに特異的なビオチン化mAb；または(3）0.25％TritonX-100および１％ウマ血清（Tris-緩衝化生理食塩水、pH7.4（TBS）中）で1:500に希釈された、グリアの原線維性酸性タンパク質に特異的なmAb（GFAP;シグマケミカル社）；または(4)0.25%TritonX-100および１％ウサギ血清（TBS中）で1:100に希釈された、CD11b、MAC-l抗原に特異的なmAb；または(5)0.25%TritonX-100および１％ウサギ血清（TBS中）で1:100に希釈された、MHC II抗原に特異的なmAb(ファミンゲン)；または(6)PBS中の１％ウサギ血清で1:100に希釈された、CD43に特異的なmAb(ファミンゲン)または(7)PBS中の１％ウサギ血清で1:100に希釈された、CD45RAに特異的なラットmAb(ファミンゲン)；または(8)PBS中の１％ウサギ血清で1:100に希釈された、CD45RBに特異的なラットモノクローナルＡβ(ファミンゲン)；または(9)PBS中の１％ウサギ血清で1:100に希釈された、CD45に特異的なラットモノクローナルＡβ；または(10)PBS中の１％ウサギ血清で1:100に希釈された、CD3eに特異的なビオチン化ポリクローナルハムスターＡβ(ファミンゲン)または(11)PBS中の１％ウサギ血清で1:200に希釈された、CD3に特異的なラットmAb（セロテック；Serotec）；または(12)１％正常ウマ血清を含有する１次抗体を欠くPBS溶液。【０２８０】  上記１、２および６〜１２に掲げた抗体溶液と反応させた切片は、1.0％TritonX-100、0.4％過酸化水素（PBS中）でRTにて20分間前処理し、内因性のペルオキシダーゼをブロックした。それらを次いで１次抗体と4℃で一晩インキューベーションした。3D6または8E5またはCD3e mAbと反応させた切片は、次いでRTで１時間、PBS中で1:75に希釈したキット成分“Ａ”および“Ｂ”を含む西洋ワサビペルオキシダーゼ−アビジン−ビオチン−複合体（Vector Elite Standard キット、ベクターラボズ(Vector Labs）、ベーリンガム、カリフォルニア州）と反応させた。CD45RA、CD45RB、CD45、CD3に特異的な抗体および１次抗体を含まないPBS溶液と反応した切片を、RTで１時間、PBSで1:75に希釈したビオチン化抗-ラットIgG(ベクター)と、またはPBSで1:75に希釈したビオチン化抗-マウスIgG(ベクター)と、それぞれインキューベーションした。切片を次いでRTで１時間、PBS中で1:75に希釈したキット成分“Ａ”および“Ｂ”を含む西洋ワサビペルオキシダーゼ-アビジン-ビオチン-複合体と反応させた（Vector Elite Standard キット、ベクターラボズ、ベーリンガム、カリフォルニア州）。【０２８１】  切片はRTで0.01％過酸化水素、0.05％ 3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)中にて発色させた。GFAP-、MAC-1-およびMHCII-特異的抗体とのインキューベーションのための切片は、0.6％過酸化水素によりRTで前処理し、内因性���ペルオキシダーゼをブロックし、そして１次抗体と共に４℃で一晩インキューベーションした。GFAP抗体と反応した切片を、RTで１時間、TBSで1:200に希釈したウマで作成したビオチン化抗-マウスIgG（ベクターラボズ；Vectastain Elite ABCキット）と反応させた。次いで切片を１時間、TBSで1:1000に希釈したアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体（ベクターラボラトリーズ；Vectastain Elite ABCキット）と反応させた。１次抗体としてMAC-1またはMHCII-特異的モノクローナル抗体とインキューベーションした切片は、続いてRTで１時間、TBSで1:200に希釈したウサギで作成したビオチン化抗-ラットIgGと反応させ、続いて１時間、TBSで1:1000に希釈したアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体とインキューベーションした。GFAP-、MAC-1-およびMHCII-異的抗体とインキューベーションした切片は、次いでRTで0.05％DAB、0.01％過酸化水素、0.04％塩化ニッケル、TBSを用いて、それぞれ４および11分間処理することにより視覚化した。【０２８２】  免疫標識した切片をスライドガラスに乗せ（VWR、Superfrostスライド）、一晩風乾し、Propar(アナテック:Anatech）に浸し、そしてマウンティング媒質としてPermount（フィッシャー）を使用してカバースリップをかぶせた。【０２８３】  Ａβ斑をカウンター染色するために、GFAP-陽性切片のサブセットをSuperfrostスライドに乗せ、そして免疫組織化学的処理後に水性１％Thioflavin S(シグマ)中に７分間インキューベーションした。切片を次いで脱水し、そしてPropar中で清浄化し、そしてPermountを用いてカバースリップをかぶせた。【０２８４】  ８．画像分析
ニコン（Nikon) Microphot-FX 顕微鏡をCCDビデオカメラおよびソニー(Sony) Trinitronモニターに連結したVideometric 150 Image System（オンコール社（Oncor,Inc.)、ゲチスバーグ、メリーランド州）を、免疫反応スライドの定量に使用した。切片の画像はビデオ緩衝器に保存し、そして免疫標識された構造により占有される総ピクセル領域を選択し、そして計算するために色-および飽和-に基づく閾値を決定した。各切片について、海馬は手で外形を書き、そして海馬により占有される総ピクセル領域を算出した。パーセントアミロイド負荷量は以下のように測定した：（mAb 3D6と免疫反応性のＡβ沈着物を含む海馬領域の画分)×100。同様に、パーセント神経炎負荷量は以下のように測定した：（モノクローナル抗体 8E5と反応性のジストロフィー軸索を含む海馬領域の画分)×100。Simple 32 ソフトウェア  アプリケーションプログラムを操作するC-Imaging System（コンピックス社（Compix,Inc)、クランベリータウンシップ、ペンシルベニア州）をニコンMicrophot-FX顕微鏡に光学カメラを介して連結し、そしてGFAP-陽性星状細胞およびMAC-1-およびMHCII-陽性ミクログリアにより占有される夾板骨後皮質の割合を定量するために使用した。免疫反応した切片の画像は、ビデオ緩衝器に保存し、そして免疫標識した細胞により占有される総ピクセル領域を選択し、そして算出するためにモノクロムに基づく閾値を決定した。各切片について、夾板骨後皮質(RSC）を手で外形を描き、そしてRSCにより占有される総ピクセル領域を算出した。パーセント星状細胞増加症は、以下のように定めた：（GFAP-反応性星状細胞により占有されるRSCの画分）×100。同様に、パーセント小膠細胞症は、以下のように定めた：（MAC-1-またはMHCII-反応性ミクログリアにより占有されるRSCの画分）×100。すべての画像分析に関して、背側海馬のレベルで６つの切片（各々が連続する240μmの間隔で分かれている）を各動物について定量した。すべての場合で、動物の処置状況は観察者には知らされていない。【０２８５】  前述の発明は理解を明確する目的で詳細に記載してきたが、特定の修飾が前記の特許請求の範囲内で実施できることは明らかである。本明細書に引用したすべての公報および特許明細書は、それぞれが個別に記載しているものと同じ程度で、すべての目的のためにそれらの全部を引用により本明細書に編入する。【０２８６】  前述の記載から、本発明が多くの用途を提供することが明らかであろう。例えば本発明は、アミロイド形成性疾患の処置、予防または診断に、あるいは同じ用途の薬剤または診断用組成物の製造において、上記のＡβ沈着物に対する任意の抗体の使用を提供する。同様に本発明は、アミロイド形成性疾患の処置または予防に、あるいは同じ用途の薬剤の製造において、上記のＡβの任意のエピトープフラグメントの使用を提供する。【０２８７】
【表２５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  トランスジェニックマウスにＡβ1-42を注射した後の抗体力価である。
【図２】  海馬のアミロイド負荷量。Ａβ-特異的抗体 3D6との反応性により定めたアミロイド斑に占有された海馬領域の面積の割合は、免疫反応した脳切片のコンピーターによる定量的画像分析により決定した。個々のマウスに関する値は、処置群により分けて示す。各群の水平線は、分布の中央値を示す。
【図３】  海馬内の神経炎性ジストロフィー。ヒトAPP-特異的抗体 8E5との反応性により定めたジストロフィー軸索により占有される海馬領域の面積の割合は、免疫反応した脳切片の定量的なコンピーターによる画像分析により決定した。個々のマウスに関する値は、AN01792-処置群およびPBS-処置対象群について示す。各群の水平線は、分布の中央値を示す。
【図４】  夾板骨後皮質の星状細胞増加症。グリアの原線維性酸性タンパク質（GFAP)-陽性星状細胞により占有される皮質領域の面積の割合は、免疫反応した脳切片の定量的なコンピーターによる画像分析により決定した。個々のマウスに関する値は処置群に分けて示し、そして水平線により示す。
【図５】  ０、14、0.4、1.2、3.7、11、33、100または300μgAN01792を含む８種の投与量範囲で免疫感作した後のＡβ1-42に対する幾何平均抗体力価。
【図６】  AN01792での免疫感作に対する抗体応答の動力学。力価は各群６匹の動物に関する値の幾何平均として表す。
【図７】  PBS-およびAN01792-処置マウスにおける皮質のアミロイド負荷量の定量的画像分析。
【図８】  PBS-およびAN01792-処置マウスにおける神経炎病状局面の負荷量の定量的画像分析。
【図９】  PBS-およびAN01792-処置マウスにおける、星状細胞増加症により占有される夾板骨後皮質の割合の定量的画像分析。
【図１０】  AN01792-処置（上パネル）およびPBS-処置（下パネル）に由来する脾細胞のリンパ球増殖アッセイ。
【図１１】  皮質中の全Ａβレベル。フロイントアジュバントと組み合わせたＡβまたはAPP誘導体で免疫感作したマウスにおける各Ａβプロフィールの散布プロット。
【図１２】  皮質中のアミロイド負荷量を、Ａβペプチド結合物1-5、Ａβ1-12およびＡβ13-28；完全長Ａβの凝集化AN01792（Ａβ1-42）およびAN1528（Ａβ1-40)で免疫感作したマウスおよびPBS-処置対照群に関して免疫反応した脳切片の定量的画像分析により決定した。
【図１３】  フロイントアジュバントと組み合わせたＡβまたはAPP誘導体で免疫感作したマウス群に関するＡβ−特異的抗体の幾何平均力価。
【図１４】  種々のアジュバントと組み合わせたAN1792またはそれらのパルミトイル化誘導体で免疫感作したモルモット群に関するＡβ-特異的抗体の幾何平均力価。
【図１５】  15(A-E)；種々のアジュバントを含むAN1792またはAN1528で処置した12月齢のPDAPPマウスの皮質中のＡβレベル。
【図１６】  Ａβに対するポリクローナル抗体で処置したマウスの平均力価。
【図１７】  Ａβに対するモノクローナル抗体 10D5で処置したマウスの平均力価。
【図１８】  Ａβに対するモノクローナル抗体 2F12で処置したマウスの平均力価。
【図１９】  エピトープマップ：拘束されたＮ-末端応答。カニクイザルに由来する175日の血清は、完全なAN01792配列を網羅する一連の10-mer重複ペプチド（配列番号：１−４１）に対して、ELISAにより試験した。動物番号F10920Mは、免疫感作の抗原として使用したAN1792ペプチドのアミノ酸1-10を網羅するペプチドDAEFRHDSGY（配列番号：９）に対する各々のＮ-末端拘束応答を示す。
【図２０】  エピトープマップ：非-拘束Ｎ-末端応答。カニクイザルに由来する175日の血清は、完全なAN01792配列を網羅する一連の10-mer重複ペプチド（配列番号：１−４１）に対して、ELISAにより試験した。動物番号F10975Fは、それぞれの非-拘束Ｎ-末端応答を表す。反応性はAN1792ペプチドのアミノ酸1-10を網羅するペプチドDAEFRHDSGY（配列番号：９）に対する２つのペプチドＮ-末端および１つのペプチドＣ-末端に対して見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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