(57)【要約】【課題】色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の有用な新規治療薬を提供すること。【解決手段】ミゾリビンを含有する色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療薬、より詳しくはミゾリビンを５０ｍｇ以上１ｇ以下の範囲内で含んでなる色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療薬。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミゾリビンを含有する色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療薬。
【請求項２】
前記ミゾリビンを５０ｍｇ以上１ｇ以下の範囲内で含んでなる請求項１記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療薬に関する。より具体的には、色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の増殖を抑制し、手術後の再発を予防する治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
色素性絨毛結節性滑膜炎と腱鞘骨巨細胞腫は同一疾患群に属し、炎症性疾患とも腫瘍性疾患とも呼ばれているが原因は不明である。これらは関節リウマチとは全く異なる疾患群であり、病理組織学的に滑膜の増殖、ヘモジデリンの沈着、巨細胞の出現を特徴としている。関節に発症すると色素性絨毛結節性滑膜炎といわれ、腱鞘に発症すると腱鞘骨巨細胞腫といわれる。これら疾患では関節破壊や骨浸潤が認められる。色素性絨毛結節性滑膜炎は１００万人に３〜４人に発症する程度と言われているが、今のところ治療方法は手術による切除しかなく、またその３０〜４０％には再発がみられるといった問題がある（例えば下記非特許文献１、２参照）。【０００３】
【非特許文献１】Ａｄａｍ  Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ著、守屋秀繁、北原宏、富田勝郎訳、「整形外科放射線診断学」、原著３版、南光堂、南光堂、２００４年、ｐ．７４３
【非特許文献２】鈴木昌彦、「専門医トレーニング講座（画像偏）・５４」、２００２年、第３７巻、第７号別冊、ｐ８４９−８５２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の有用な新規治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題につき鋭意検討を行っていたところ、ミゾリビンが色素性絨毛結節性滑膜炎と腱鞘骨巨細胞腫由来の細胞からのサイトカインの放出を抑制し、また、ＲＡＮＫＬ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  Ｌｉｇａｎｄ）の発現を低下させ破骨細胞の活性化を抑えて骨破壊を防ぐことを発見し、本発明を完成させるに至った。【０００６】
即ち、上記課題を解決する一手段に係る色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療薬は、ミゾリビンを含有する。ここで「ミゾリビン」とは、４−カルバモイル−１−β−Ｄ−リボフラノシル−イミダゾリウム−５−オレイトをいう。【０００７】
また、本手段において、限定されるわけではないが、治療薬はミゾリビンを５０ｍｇ以上１ｇ以下の範囲内で含んでなることが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
以上のとおり本発明は、ミゾリビンを含有している。ミゾリビンは色素性絨毛結節性滑膜炎と腱鞘骨巨細胞腫由来の細胞からのサイトカインの放出を抑制し、また、ＲＡＮＫＬの発現を低下させることで破骨細胞の活性化を抑制し骨破壊を防ぐことが可能であり、色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の有用な治療薬となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】細胞＋ｍｅｄｉｕｍにミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度で添加して４８時間培養後にＭＴＴ  ａｓｓａｙを用いて細胞障害性を検討した結果を示す図である。
【図２】細胞＋ｍｅｄｉｕｍ＋ＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）１０μｇ／ｍＬで刺激してミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加して４８時間培養後にＭＴＴ  ａｓｓａｙを用いて細胞障害性を検討した結果を示す図である。
【図３】細胞＋ｍｅｄｉｕｍ＋ＴＮＦα（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）１０００Ｕ／ｍＬで刺激してミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加して４８時間培養後にＭＴＴ  ａｓｓａｙを用いて細胞障害性を検討した結果を示す図である。
【図４】細胞＋ｍｅｄｉｕｍ＋ＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）１０００Ｕ／ｍＬで刺激してミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加して４８時間培養後にＭＴＴ  ａｓｓａｙを用いて細胞障害性を検討した結果を示す図である。
【図５】細胞＋ｍｅｄｉｕｍにミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加したときにどの程度Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生を抑制するかを検討した結果を示す図である。
【図６】細胞＋ｍｅｄｉｕｍ＋ＬＰＳ  １０μｇ／ｍＬで刺激してミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加したときにどの程度Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生を抑制するかを検討した結果を示す図である。
【図７】細胞＋ｍｅｄｉｕｍ＋ＴＮＦα  １０００Ｕ／ｍＬで刺激してミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度で添加したときにどの程度Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生を抑制するかを検討した結果を示す図である。
【図８】細胞＋ｍｅｄｉｕｍ＋ＩＬ−１β  １０００Ｕ／ｍＬで刺激してミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加したときにどの程度Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生を抑制するかを検討した結果を示す図である。
【図９】細胞＋ｍｅｄｉｕｍ＋ＬＰＳ  １０μｇ／ｍＬで刺激してミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加して４８時間培養し、その後細胞を集めてＲＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲで各サンプル中に存在するＲＡＮＫＬのｍＲＮＡ量を比較した結果を示す図である。
【図１０】細胞＋ｍｅｄｉｕｍ＋ＴＮＦα  １０００Ｕ／ｍＬで刺激してミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加して４８時間培養したし、その後細胞を集めてＲＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲで各サンプル中に存在するＲＡＮＫＬのｍＲＮＡ量を比較した結果を示す図である。
【図１１】細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＩＬ−１β  １０００Ｕ／ｍＬで刺激してミゾリビンをそれぞれ１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度で添加して４８時間培養し、その後細胞を集めてＲＮＡを抽出し、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲで各サンプル中に存在するＲＡＮＫＬのｍＲＮＡ量を比較した結果を示す図である。
【図１２】細胞をＩＬ−１β  １０００Ｕ／ｍＬで刺激して、ミゾリビンを１０μｇ／ｍＬの濃度で添加して７２時間培養し、その後細胞を集めて溶解し、免疫沈降法及び電気泳動法により、各サンプル中に存在するＲＡＮＫＬタンパク量を比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であることはいうまでもない。【００１１】
本実施形態に係る色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療薬（以下「本治療薬」という。）は、ミゾリビンを含有してなることを特徴とする。ミゾリビンは、色素性絨毛結節性滑膜炎と腱鞘骨巨細胞腫中の細胞のＲＡＮＫＬの発現を低下させることで破骨細胞の活性化を抑制して骨破壊を抑制することができ、色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療薬となる。【００１２】
実際にミゾリビンは、濃度依存性に色素性絨毛結節性滑膜炎由来細胞の増殖とＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生を抑制し、さらに該細胞のＲＡＮＫＬ発現も抑制した。Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６は、Ｂ細胞分化因子として発見されたサイトカインの一種であり、多くの炎症反応発現に関与し、Ｂ細胞を分化させ抗体産生を促すほか、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３との相乗効果に基づいた増殖促進作用を有することが知られている。このように、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６はさまざまな炎症性疾患や自己免疫疾患などの病態と関連をもつことが明らかになってきている。ＲＡＮＫＬは ＴＮＦ−α スーパーファミリーに属する膜結合型のサイトカインであり、主に骨芽細胞やＴ細胞上に発現する。骨芽細胞やＴ細胞上のＲＡＮＫＬが前駆破骨細胞に発現するＲＡＮＫに結合することにより前駆破骨細胞は破骨細胞へと分化・成熟し増殖する。また、ＲＡＮＫＬの発現がＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１やプロスタグランジンＥなどの炎症メデイエーターによって誘導されることが知られており、これらの炎症性メデイエーターによるＲＡＮＫＬの過剰産生が炎症局所における破骨細胞の増殖や活性化を招き、炎症性骨吸収を引き起こすと考えられている。したがって、ミゾリビンを使用して、病変部位の細胞の増殖、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生、及び該細胞のＲＡＮＫＬ発現を抑制することにより、炎症反応、破骨細胞の増殖や活性化、及び炎症性骨吸収を抑制でき、それにより色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療を実施できる。このようにミゾリビンは、滑膜細胞の増殖の抑制剤、滑膜細胞のＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生阻害剤、滑膜細胞のＲＡＮＫＬ発現阻害剤、並びに色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療薬として使用できる。【００１３】
本治療薬は、ミゾリビンの他、薬学的に許容しうる通常の担体や、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝材、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤などの各種調剤用配合成分を含有することができる。また、本治療薬は、ミゾリビンに加えて、その他の化合物を活性成分として含んでいてもよい。【００１４】
薬学的に許容しうる通常の担体や調剤用配合成分として、例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。これらは、剤形に応じて適宜１種類又は２種類以上を組み合わせて使用される。【００１５】
また本治療薬は、経口的又は非経口的に投与することができる。非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内などへの投与を挙げることができる。経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば錠剤、丸剤、粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などとして投与する形態を採用することができる。非経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば水溶液製剤、乳剤、懸濁液、リポソーム製剤などにしたものをそのまま又は注射によって局所的に投与する形態が採用できる。また本治療薬は、持続性又は徐放性剤形として調製することができる。【００１６】
本治療薬の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状及び他の医薬の使用の有無など）、及び担当医師の判断などに応じて適宜選択される。例えば経口投与の場合１日当り５０ｍｇ以上１ｇ以下の範囲内で投与することが好ましく、より好ましくは３００ｍｇ以上６００ｍｇの範囲内である。しかしながら、用量は上記例示した用量に限定されず、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記用量は１日１回乃至数回に分けて投与することができ、数日又は数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。【００１７】
また、本治療薬は、限定されるわけではないが、色素性絨毛結節性滑膜炎と腱鞘骨巨細胞腫であることが判明した場合に投与することが好ましく、また患部の摘出手術を行う場合、その一定の期間前に投与することも好ましく、摘出手術を行った後に再発防止のために投与することも好ましい。更には、摘出手術の際、この手術部位を本治療薬に浸すことも好ましい。【００１８】
本発明の別の実施形態として、ミゾリビンを含有する治療薬を色素性絨毛結節性滑膜炎又は腱鞘骨巨細胞腫の患者に投与することを特徴とする、これら疾患の治療、進行の予防、及び／又は手術後の再発防止を実施できる方法を挙げることができる。【００１９】
また、本発明の別の実施形態として、色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療薬の製造、並びに色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫の治療方法、これら疾患の進行の予防方法及びこれら疾患の手術後の再発防止方法におけるミゾリビンを含有する治療薬の使用を挙げることができる。【００２０】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定して解釈されない。以下の実施例は、色素性絨毛結節性滑膜炎に罹患した患者よりインフォームドコンセントを得て、該患者の摘出患部から調製した滑膜細胞を使用して実施した。
【実施例１】
【００２１】
ここで、ミゾリビンを含有する治療薬の効果について確認を行った。この結果を以下に示す。【００２２】
まず、色素性絨毛結節性滑膜炎に罹患した７名の患者から、摘出手術により患部を摘出し、コラゲナーゼとトリプシンＥＤＴＡで単一細胞（Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ）となるように処理し、３〜５代系代培養した。次に、ＤＭＥＭ溶液（以下「ｍｅｄｉｕｍ」という。）約１０ｍＬに先ほど培養した細胞１×１０６個含まれるように（１）〜（４）のサンプルを作製した。そして、９６ウェルプレートを使用して１ウェルあたり１×１０４として実験を行った。【００２３】
（１）細胞＋ｍｅｄｉｕｍのみ（コントロール）
（２）細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＋ＬＰＳ  １０μｇ／ｍＬで刺激
（３）細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＋ＴＮＦα  １０００Ｕ／ｍＬで刺激
（４）細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＩＬ−１β  １０００Ｕ／ｍＬで刺激【００２４】
次に、上記（１）から（４）の各サンプルに対して、ミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ添加して４８時間培養し、ＭＴＴ  ａｓｓａｙを用いてミゾリビンの細胞障害性を検討した。なお、ＭＴＴ  ａｓｓａｙは、淡黄色物質であるＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）が生細胞のミトコンドリア中に存在する酵素により暗青色に変化する際発する光の吸光度を測定し、その変化量を定量化する方法である。【００２５】
この結果を図１〜図４にそれぞれ示す（図中、ＰＶＳ１〜７は各患者から摘出した。サンプルの番号を示す。）。この結果、細胞障害性がミゾリビンに対して濃度依存性を有していることを確認した。【００２６】
次にＬｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（以下「ＬＰＳ」という。）、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α（以下「ＴＮＦ−α」という。）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β（以下「ＩＬ−１β」という。）などで刺激すると細胞はＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６の産生を増加させるが、ミゾリビンを同時に１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度で添加したときにどの程度Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生を抑制するかを検討した。【００２７】
（５）細胞＋ｍｅｄｉｕｍのみ  （コントロール）
（６）細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＋ＬＰＳ  １０μｇ／ｍＬで刺激
（７）細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＋ＴＮＦα  １０００Ｕ／ｍＬで刺激
（８）細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＩＬ−１β  １０００Ｕ／ｍＬで刺激【００２８】
これらの（５）から（８）の群に対してミゾリビンを１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度で添加して４８時間培養した。このときに培養液中に放出されているＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６濃度をＥＬＩＳＡ法で評価した。Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ６の放出はミゾリビンの濃度依存性に低下していた。代表的なサンプル（図１におけるＰＶＳ３）のデータを図５乃至図８に示す。この結果、ミゾリビンは無刺激でＰＶＳのＩＬ−６産生を抑制するとともに、ＬＰＳ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β刺激によるＰＶＳのＩＬ−６産生も抑制することを確認した。【００２９】
また、色素性絨毛結節性滑膜炎と腱鞘骨巨細胞腫由来の細胞はＲＡＮＫＬを発現している。ＲＡＮＫＬは、ＴＮＦスーパーファミリーに属する膜結合型蛋白であり、骨芽細胞などの破骨細胞形成支持細胞の表面上に発現し、細胞接触を介して前駆細胞にシグナルを伝達し、破骨細胞への分化を誘導する。Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ、Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α、Ｉｎｅｒｌｅｕｋｉｎ−１などで刺激すると細胞はＲＡＮＫＬの発現を増加させるが、ミゾリビンを同時に添加したときにどの程度ＲＡＮＫＬの発現を抑制するかを検討した。【００３０】
（９）細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＋ＬＰＳ  １０μｇ／ｍＬで刺激
（１０）細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＋ＴＮＦα  １０００Ｕ／ｍＬで刺激
（１１）細胞＋ｍｅｄｉｕｍ  ＩＬ−１β  １０００  Ｕ／ｍＬで刺激【００３１】
これらの（９）から（１１）の群に対してミゾリビンをそれぞれ１，１０，１００μｇ／ｍＬの濃度で添加して４８時間培養した。４８時間後に細胞を集めてＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成した。これをＲｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲで分析することで各サンプル中に存在するＲＡＮＫＬのｍＲＮＡ量を比較した。培養細胞中のＲＡＮＫＬ遺伝子ｍＲＮＡ発現量はミゾリビンの濃度依存性に低下していた。代表的なサンプルのデータ（ＰＶＳ６）を図９乃至図１１に示す。この結果、ミゾリビンはＬＰＳ、ＴＮＦα、ＩＬ−１β刺激によるＰＶＳのＲＡＮＫＬ発現を抑制することを確認した。【００３２】
以上のとおり、ミゾリビンは濃度依存性に色素性絨毛結節性滑膜炎由来細胞の増殖とＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生を抑制し、色素性絨毛結節性滑膜炎由来細胞のＲＡＮＫＬ発現も抑制した。これにより、色素性絨毛結節性滑膜炎と腱鞘骨巨細胞腫を縮小させ、破骨細胞の活性化も抑制することから、ミゾリビンは色素性絨毛結節性滑膜炎と腱鞘骨巨細胞腫の病巣を縮小させる治療薬として、また進行を予防する治療薬として使用することが可能となる。
【実施例２】
【００３３】
色素性絨毛結節性滑膜炎由来の滑膜細胞におけるＲＡＮＫＬ発現に対するミゾリビンの作用の検討を検討した。【００３４】
まず、色素性絨毛結節性滑膜炎に罹患した患者から摘出手術により摘出した患部を、コラゲナーゼとトリプシンＥＤＴＡで単一細胞（Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ）となるように処理し、３〜５代系代培養した。コンフリュエントに達した細胞をＴｒｉｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで回収し、４℃にて２８００ｒｐｍ，５分間の遠心処理を行った。上清を吸引除去して、５％ＦＢＳ加ＤＭＥＭ  １０ｍＬに懸濁した。細胞数１×１０５／ｍＬとなるよう５％ＦＢＳ加ＤＭＥＭにて調製し、６ウエルプレートに２ｍＬ／ｗｅｌｌにて播種し、３７℃、５％ＣＯ２にて培養を開始した。培養開始２４時間後にメディウムを１％ＦＢＳ加ＤＭＥＭに交換した。メディウム交換４８時間後に３７℃に加温した１２％ＦＢＳ加ＤＭＥＭを２ｍＬ／ｗｅｌｌずつ加えた。【００３５】
次に、下記の濃度になるよう調製した各薬剤を２００μＬ／ｗｅｌｌにて添加した（ｎ＝４）。【００３６】
１．Ｃｏｎｔｒｏｌ
２．ＩＬ−１β（１０００Ｕ／ｍＬ）
３．ＩＬ−１β（１０００Ｕ／ｍＬ）＋ミゾリビン（１０μｇ／ｍＬ）【００３７】
薬剤添加７２時間後に培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、液体窒素で凍結３秒、室温解凍３０秒を３回繰り返した。Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、セルスクレイパーを用いて細胞を回収し、マイクロチューブに移した。４℃にて１５０００ｒｐｍで２０分間遠心処理後、上清を回収し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｄｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いてタンパク定量を行った。【００３８】
タンパク定量後、タンパク４０μｇを含む量の上清とＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを合わせて２００μＬにし、以下の方法で免疫沈降を行った。【００３９】
Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ／Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズをマイクロチューブに入れて５０００ｒｐｍで３０秒間遠心処理し、上清を除去した。その後、５０％エタノールを加えて攪拌ローターで１分間攪拌し、５０００ｒｐｍで１０〜２０秒間遠心処理し、上清を除去することにより洗浄を行った。１０％エタノールを用いて遠心処理による洗浄を同様に繰り返した。その後、蒸留水を用いて遠心処理による洗浄を同様に３回繰り返した。さらに、Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加えて１０分攪拌し、５０００ｒｐｍで３０秒間遠心処理して上清を除去することによる洗浄を３回繰り返した。ビーズの体積と同量のＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒを加えて懸濁した。【００４０】
上記のように滑膜細胞から調製したＴｏｔａｌ  ｌｙｓａｔｅにウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を加えて１時間攪拌し、さらに上記ビーズ懸濁液を加えて１時間攪拌後、遠心処理して上清を除去した。ビーズをＰＢＳで攪拌洗浄（５分間，３回）し、ビーズと同量のＳａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（×２）を加え、９９℃で３分間煮沸した。氷冷した後遠心処理し、ボルテックスミキサーにて１０秒間攪拌してさらに遠心処理したものをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）用サンプルとして用いた。【００４１】
コントロールとしてβ−アクチン（β−ａｃｔｉｎ）を測定した。β−ａｃｔｉｎについては免疫沈降を行わず、タンパク量が１５μｇ／ｗｅｌｌになるように各サンプルをＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで希釈し、Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（×４）を加え、９９℃で３分間煮沸後氷冷し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとして用いた。【００４２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを次のように行った。まず、１０％  ポリアクリルアミドゲルを用い、スタッキングゲルを５０Ｖ、ランニングゲルを１００Ｖで泳動した。その後、ゲルをトランスファーバッファーに浸した後、ニトロセルロース膜を用い、２００ｍＡで３０分間転写を行った。ニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔで軽く洗浄し、５％−スキムミルク・ＴＢＳ−Ｔ溶液中にて３０分間ブロッキングを行い、ＴＢＳ−Ｔで５分間、３回振とう洗浄した。１次抗体を添加し、４℃で一晩振とうして抗体を反応させた。その後、ニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回振とう洗浄した。次に２次抗体を添加し、室温で１時間振とうして抗体を反応させた。ＴＢＳ−Ｔで１５分間、３回振とう洗浄した。ＥＣＬ試薬により発光させ、ＬＡＳ−１０００Ｐｌｕｓイメージスキャナーで検出した。ＲＡＮＫＬの検出には１次抗体としてウサギ抗ＲＡＮＫＬ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１％ＢＳＡ／０．５％ＦＢＳ／ＴＢＳ−Ｔ溶液で１／２５０希釈して用い、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を１％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで１／５０００希釈して用いた。β−ａｃｔｉｎの検出には１次抗体としてマウス抗β−ａｃｔｉｎ抗体（ＳＩＧＭＡ社製）を１％ＢＳＡ／０．５％ＦＢＳ／ＴＢＳ−Ｔ溶液で１／１０００希釈して用い、２次抗体としてＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を１％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで１／５０００希釈して用いた。【００４３】
使用した各バッファーの組成を以下に示す。
Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ：５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭ−β−グリセロホスフェート、１ｍＭ  オルトバナジン酸ナトリウム、１％  プロテアーゼインヒビターカクテル、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）／エタノール。但し、ＰＭＳＦは使用直前に添加。
Ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ：１０％  シュークロース、５％  ２−メルカプトエタノール、２％  ＳＤＳ、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１％  ブロモフェノールブルー（数滴）。
Ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  グリシン、０．１％  ＳＤＳ。
Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｕｆｆｅｒ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９２ｍＭ  グリシン、２０％  メタノール。
ＴＢＳ−Ｔ：１３．７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２６８ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０。
Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ：５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔ。【００４４】
滑膜細胞中のＲＡＮＫＬタンパクはＩＬ−１βの添加により増加し、ＩＬ−１βの添加により増加したＲＡＮＫＬタンパクはミゾリビンの添加により低下した。その結果を図１２に示す。この結果、ミゾリビンは、色素性絨毛結節性滑膜炎由来の滑膜細胞におけるＬＰＳ刺激によるＲＡＮＫＬ発現を抑制することを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
ミゾリビンは濃度依存性に色素性絨毛結節性滑膜炎由来滑膜細胞の増殖とＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６産生を抑制し、さらに色素性絨毛結節性滑膜炎由来滑膜細胞のＲＡＮＫＬ発現も抑制する作用を示した。本発明に係るミゾリビンを含む治療薬により、色素性絨毛結節性滑膜炎及び腱鞘骨巨細胞腫における細胞増殖、炎症反応及び骨破壊の抑制が可能であり、それによりこれら疾患の治療、進行の予防、及び手術後の再発防止が可能である。このように、本発明は医薬開発分野において利用可能な有用な発明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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