(57)【要約】  ジフェニルアルシン酸を分解する能力を有する微生物、当該微生物によってジフェニルアルシン酸を分解するための方法、該微生物によって、汚染された土壌を浄化する方法、該微生物を含んでなるジフェニルアルシン酸の分解剤、該微生物を含んでなる汚染土壌あるいは汚染地下水の浄化剤を提供すること。  ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属微生物、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属する微生物、当該微生物を用いて、汚染された土壌を浄化する方法、当該微生物を含んでなるジフェニルアルシン酸の分解剤、当該微生物を含んでなる汚染土壌あるいは汚染地下水の浄化剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物。
【請求項２】
次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）  配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ、
を含む１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物。
【請求項３】
ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属するＬ２４０６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５８）。
【請求項４】
ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属する微生物。
【請求項５】
次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）  配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ、
を含む１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属する微生物。
【請求項６】
ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属するＬ２４１３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５９）。
【請求項７】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載された微生物を用いて、ジフェニルアルシン酸を分解する方法。
【請求項８】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載された微生物を用いて、土壌及び／又は汚染地下水を浄化する方法。
【請求項９】
鉄成分の存在下で微生物を用いる、請求の範囲第７項又は請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載された微生物を含んでなる、ジフェニルアルシン酸の分解剤。
【請求項１１】
鉄成分を含む、請求の範囲第１０項に記載の分解剤。
【請求項１２】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載された微生物を含んでなる、汚染土壌及び／又は汚染地下水の浄化剤。
【請求項１３】
鉄成分を含む、請求の範囲第１２項に記載の浄化剤。
【請求項１４】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載された微生物を用いて、フェニルアルソン酸を分解する方法。
【請求項１５】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載された微生物を用いて、ロキサルソンを分解する方法。
【請求項１６】
鉄成分の存在下で微生物を用いる、請求の範囲第１４項又は請求の範囲第１５項に記載の方法。
【請求項１７】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載された微生物を含んでなる、フェニルアルソン酸の分解剤。
【請求項１８】
請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載された微生物を含んでなる、ロキサルソンの分解剤。
【請求項１９】
鉄成分を含む、請求の範囲第１７項又は請求の範囲第１８項に記載の分解剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属し、かつジフェニルアルシン酸の分解能を有する微生物に関する。また、本発明は、エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属し、かつジフェニルアルシン酸の分解能を有する微生物に関する。さらに、当該微生物を少なくとも１種類以上用いるジフェニルアルシン酸の分解方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００３年３月、茨城県神栖市の飲用井戸水から水質基準の４５０倍という高濃度のヒ素が検出された。その後の調査により、このヒ素は有機ヒ素化合物の一種で、ジフェニルアルシン酸［（Ｃ６Ｈ５）２ＡｓＯ（ＯＨ）；構造式を式Ｉに示す］を主成分とするフェニル化ヒ素化合物であることが判明した。【０００３】
【化１】
2008026309.tif 000002
【０００４】
このフェニル化ヒ素化合物による汚染によって近隣住民が直接的な健康被害を被った他、近隣の水田で産出されるコメへのヒ素混入も発覚した。この地域における土壌や地下水の、ジフェニルアルシン酸が原因となったヒ素汚染は広く進行していると見られ、環境省によるモニタリング調査が現在も継続的に行われている。【０００５】
またジフェニルアルシン酸は、化学兵器の一種である嘔吐剤（くしゃみ剤）として使用されているジフェニルシアノアルシンやジフェニルクロロアルシンの合成原料であり、また加水分解生成物でもある。ジフェニルシアノアルシンやジフェニルクロロアルシンが土壌中に投棄されると、ジフェニルアルシンヒドロキシド及びビスジフェニルアルシンオキシドを経てジフェニルアルシン酸となる。これら有機ヒ素を含む化学兵器の遺棄によると考えられる土壌汚染は、我が国では６０年以上前の軍関連施設があった場所やその近傍で発見されている。また、海外でも化学兵器の投棄によるものと考えられる土壌や地下水の有機ヒ素汚染が確認されている。これらの有機ヒ素汚染土壌修復技術については、その確立が待たれている。【０００６】
既存の有機ヒ素化合物汚染土壌の浄化方法としては、洗浄処理によって有機ヒ素化合物を汚染土壌から抽出除去する方法が提案されている（特許文献１）。その際、洗浄剤として水酸化ナトリウムを含有する水溶液、リン酸もしくはその塩を含有する水溶液、硫酸を含有する水溶液、塩酸を含有する水溶液、酒石酸もしくはその塩を含有する水溶液、クエン酸もしくはその塩を含有する水溶液、またはシュウ酸もしくはその塩を含有する水溶液、のいずれかを用いる。【０００７】
また、有機ヒ素化合物含有水の浄化方法としては、鉄イオン、銅イオン、コバルトイオンおよびマンガンイオンからなる群より選ばれる少なくとも１種の金属イオンの存在下、過酸化水素を反応させて、有機ヒ素化合物を無機ヒ素に酸化分解する有機ヒ素化合物の処理方法が提案されている（特許文献２）。あるいは、塩化第二鉄などの無機凝集剤と有機高分子凝集剤を添加してフロック形成させ、このフロックを沈殿分離した後に沈殿処理水を砂ろ過器でろ過処理して、その処理水をさらに活性炭吸着処理することで、有機ヒ素化合物を低減する方法が提案されている（特許文献３）。さらには、有機ヒ素化合物含有水に対し紫外線を照射しながらオゾンガスを吹き込み、有機ヒ素化合物を無機ヒ素化合物に分解することを特徴とする方法が提案されている（特許文献４）。【０００８】
さらには、有機ヒ素を含有している水に凝集剤を加えて、含有している有機ヒ素を沈殿させて除去する沈殿工程の後に、さらに水中に残留する有機ヒ素を逆浸透膜にて除去する逆浸透膜工程を行うことを特徴とする水処理方法と、有機ヒ素を含有している水を処理する逆浸透膜装置を備えた水処理装置であって、前記水に凝集剤を混合して前記有機ヒ素を沈殿させる沈殿槽を、前記逆浸透膜装置の上流側に備えたことを特徴とする水処理装置とが提案されている（特許文献５）。【０００９】
しかしながら、上記に挙げた有機ヒ素化合物の浄化方法を汚染土壌に適用しようとする場合、汚染された土壌の掘削や水の汲み上げ、有機ヒ素の抽出等を行う必要があり、多大な労力とコストが必要になる。従って、より簡便で、原位置で浄化が可能な方法が望まれており、そのような要件に適合する新しい環境浄化技術の一つとして、バイオレメディエーションが注目を集めている。その実施には、対象となる汚染物質を効果的に分解・除去することが可能な微生物が不可欠であるが、有機ヒ素化合物による環境汚染にこの手法を適用する場合、有用な微生物が単離されていないことが課題であった。【００１０】
これまで、有機ヒ素化合物を分解する微生物としては、ジメチルアルシン酸を分解し得る微生物としてＫ８株、１２Ｍ１７株及び７Ｍ５株が、モノメチルアルソン酸を分解し得る微生物としてＫ−１´株及びＩＶ−１株が報告されている（特許文献６）。Ｋ−１´株及びＩＶ−１株はフェニルアルソン酸も僅かながら分解し得ることが報告されている（特許文献６）。しかしながら、上記神栖市でのヒ素汚染等において最も高濃度で検出される有機ヒ素化合物であるジフェニルアルシン酸の分解菌はこれまで知られていない。【００１１】
特許文献１（特開２００５−１６９１６２号公報）、特許文献２（特開２００１−１５８６２２号公報）、特許文献３（特開２００５−２３８１８４号公報）、特許文献４（特開２００５−３３４７６１号公報）、特許文献５（特開２００６−４３６１６号公報）、及び特許文献６（特開２００５−２２９９４５号公報）に記載の内容は、本明細書の記載の一部として取り込む。
【特許文献１】特開２００５−１６９１６２号公報
【特許文献２】特開２００１−１５８６２２号公報
【特許文献３】特開２００５−２３８１８４号公報
【特許文献４】特開２００５−３３４７６１号公報
【特許文献５】特開２００６−４３６１６号公報
【特許文献６】特開２００５−２２９９４５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ジフェニルアルシン酸は有機ヒ素化合物の一種で、ジフェニルアルシン酸そのものの投棄や、土壌中に遺棄された化学兵器（ジフェニルシアノアルシンやジフェニルクロロアルシン）の加水分解によって土壌や地下水の汚染を引き起こしている。このような状況を改善する手段として、ジフェニルアルシン酸を効率的に分解する手段が望まれている。【００１３】
従って、本発明は、ジフェニルアルシン酸を分解する能力を有する微生物、当該微生物によってジフェニルアルシン酸を分解するための方法、当該微生物を用いて、汚染された土壌及び／又は地下水を浄化する方法、当該微生物を含んでなるジフェニルアルシン酸の分解剤、当該微生物を含んでなる汚染土壌及び／又は汚染地下水の浄化剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、前記課題を解決するために集積培養を行ったところ、ジフェニルアルシン酸で汚染した水田土壌に有効な微生物が存在していることを見出し、これら微生物の中から単離した新規なエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属細菌及び新規なシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属細菌が高いジフェニルアルシン酸分解能を有することを見出した。また、当該微生物によるジフェニルアルシン酸分解が硫酸第一鉄等の鉄成分の添加によって促進されることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
従って、本発明は以下の[１]〜[１３]にある。
[１]  ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物。
[２]  次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）  配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ、
を含む１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物。
[３]  ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属するＬ２４０６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５８）。
[４]  ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属する微生物。
[５]  次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）  配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号２に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ、
を含む１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属する微生物。
[６]  ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属するＬ２４１３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５９）。
[７]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を用いて、ジフェニルアルシン酸を分解する方法。
[８]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を用いて、土壌及び／又は汚染地下水を浄化する方法。
[９]  鉄成分の存在下で微生物を用いる、[７]又は[８]に記載の方法。
[１０]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を含んでなる、ジフェニルアルシン酸の分解剤。
[１１]  鉄成分を含む、[１０]に記載の分解剤。
[１２]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を含んでなる、汚染土壌及び／又は汚染地下水の浄化剤。
[１３]  鉄成分を含む、[１２]に記載の浄化剤。【００１６】
また、本発明は以下の[１４]〜[１８]にもある。
[１４]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を用いて、ジフェニルアルシン酸を分解してフェニルアルソン酸を製造する方法。
[１５]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を用いて、汚染された土壌から浄化された土壌を製造する方法。
[１６]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を用いて、汚染された地下水から浄化された地下水を製造する方法。
[１７]  鉄成分の存在下で微生物を用いる、[１４]〜[１６]のいずれかに記載の方法。
[１８]  ヒ素汚染土壌を湿潤土のままで採取する工程、
該ヒ素汚染土壌をジフェニルアルシン酸の存在下で培養して、培養液を得る工程、
得られた培養液を希釈して希釈系列を作製する工程、
希釈系列である培養液をジフェニルアルシン酸の存在下で培養する工程、
希釈系列のなかから、培養に伴ってジフェニルアルシン酸の濃度減少又は消失の生じる培養液を選択する工程、
を含む、ジフェニルアルシン酸分解能を有する菌株を選抜する方法。【００１７】
すなわち、本発明はまずジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物にある。このような微生物として、次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）  配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ、
を含む１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するシノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物が好ましい。上記の同一性は９５％以上が好ましく、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上であり、特に９９．５％以上、特に９９．８％以上、特に９９．９％以上の同一性であることが好ましい。このような微生物として、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属するＬ２４０６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５８）が極めて好ましい。【００１８】
また、本発明はジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属する微生物にある。このような微生物として、次の（Ａ）又は（Ｂ）：
（Ａ）  配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｂ）  配列番号１に記載の塩基配列と９５％以上の同一性を有するＤＮＡ、
を含む１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を有する、ジフェニルアルシン酸の分解能を有するエンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属する微生物が好ましい。上記の同一性は９５％以上が好ましく、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上であり、特に９９．５％以上、特に９９．８％以上、特に９９．９％以上の同一性であることが好ましい。このような微生物として、エンシファー（Ｅｎｓｉｆｅｒ）属に属するＬ２４１３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０６５９）が極めて好ましい。【００１９】
また、本発明は、上述の微生物の少なくとも１種以上を用いて、ジフェニルアルシン酸を分解する方法、ジフェニルアルシン酸を分解してフェニルアルソン酸を製造する方法、汚染された土壌及び／又は汚染地下水を浄化する方法、汚染された土壌から浄化された土壌を製造する方法、及び、汚染された汚染地下水から浄化された汚染地下水を製造する方法にもあり、これらの方法のための上述の微生物の使用にもある。さらに、これらの方法及び使用の好ましい態様において、鉄成分の存在下でこれを行うことができる。微生物とともに用いるために存在させる鉄成分の量は、鉄濃度[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]（体積１リットルあたりの鉄の質量ｍｇ）として一般に０．０１[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以上、好ましくは０．０４[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以上、より好ましくは０．１[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以上、さらに好ましくは０．２[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以上、さらに好ましくは０．３[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以上、さらに好ましくは０．４[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以上、さらに好ましくは１[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以上、さらに好ましくは２[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以上、さらに好ましくは４[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以上であり、鉄濃度は高いほど好ましい。鉄濃度の上限には、特に制限はなく、イオン積により定まる飽和濃度とすることができるが、一般に１０００[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]以下である。これらの鉄濃度の達成は、例えば硫酸第一鉄等の鉄成分の添加によって行うことができる。【００２０】
汚染された土壌又は地下水とは、主としてジフェニルアルシン酸を含んでヒ素汚染された土壌又は地下水を言う。ヒ素汚染された土壌又は地下水とは、一般にはヒ素元素を有機化合物及び無機化合物の形態で含むことにより汚染された土壌又は地下水を言うが、本発明においては、主としてジフェニルアルシン酸を含んでヒ素汚染された土壌又は地下水を言う。汚染土壌又は汚染地下水の浄化とは、主としてジフェニルアルシン酸が除去された土壌又は地下水とすることを言う。しかし、このような汚染土壌の浄化又は汚染地下水の浄化とは、ジフェニルアルシン酸を好適に除去した結果、ジフェニルアルシン酸の生成元となる有機ヒ素化合物が土壌又は地下水から速やかに除去されることをも含み、また、フェニルアルソン酸の分解を促進する公知の組成物及び方法を併用して、有機ヒ素化合物全般が土壌又は地下水から速やかに除去されることをも含んでいる。【００２１】
また、本発明は、上述の微生物を含んでなる、ジフェニルアルシン酸の分解剤、汚染土壌あるいは汚染地下水の浄化剤にもあり、これらの製造のために上述の微生物を使用する方法にもある。これらの分解剤、土壌浄化剤及び地下水浄化剤は、上述の微生物を有効成分として含み、さらに、その目的において許容される公知の補助成分を含んでなるものとすることができる。また、これらの分解剤、土壌浄化剤及び地下水浄化剤は、好ましい態様において、硫酸第一鉄等の鉄成分を含んでなるものとすることができる。好適な鉄成分の含有量は、分解あるいは浄化にあたって土壌、地下水等において微生物とともに用いる際に存在する鉄成分の量が、鉄濃度[ｍｇ−Ｆｅ／ｌ]（体積１リットルあたりの鉄の質量ｍｇ）として上述の範囲の値となるように設定することが好ましい。【００２２】
また、本発明は、ジフェニルアルシン酸の分解能を有する微生物の菌株を選抜（スクリーニング）するための次の方法：
ヒ素汚染土壌を湿潤土のままで採取する工程、
該ヒ素汚染土壌をジフェニルアルシン酸の存在下で培養して、培養液を得る工程、
得られた培養液を希釈して希釈系列を作製する工程、
希釈系列である培養液をジフェニルアルシン酸の存在下で培養する工程、
希釈系列のなかから、培養に伴ってジフェニルアルシン酸の濃度減少又は消失の生じる培養液を選択する工程、を含む、ジフェニルアルシン酸分解能を有する菌株を選抜する方法にもある。【００２３】
得られた培養液を希釈して希釈系列を作製する工程、希釈系列である培養液をジフェニルアルシン酸の存在下で培養する工程、及び、希釈系列のなかから、培養に伴ってジフェニルアルシン酸の濃度減少又は消失の生じる培養液を選択する工程は、所望により複数回を繰り返して行うことができる。また、効果的な選抜のために、好ましい態様において、ジフェニルアルシン酸の存在下での培養は、硫酸第一鉄等の鉄成分をさらに添加して行うことができる。ヒ素汚染土壌からの湿潤土の採取は、ヒ素汚染水田土壌からの採取によって好適に行うことができる。【００２４】
このようなジフェニルアルシン酸分解能を有する菌株を選抜する方法によれば、上述したような有用な微生物を選抜（スクリーニング）して取得することが可能である。【００２５】
さらに、本発明者等は、上記の微生物の菌株が、ジフェニルアルシン酸の代謝産物であるフェニルアルソン酸を分解して、無機ヒ素化合物を生成することを見いだした。【００２６】
フェニルアルソン酸は、有機ヒ素化合物の一種であり、上記の微生物の菌株は、ジフェニルアルシン酸を分解してフェニルアルソン酸［（Ｃ６Ｈ５）ＡｓＯ（ＯＨ）２；構造式を式ＩＩに示す］をいったん生成させる。しかし、土壌や地下水の浄化のためには、このフェニルアルソン酸をさらに分解除去することが望ましい。このフェニルアルソン酸を分解して無機ヒ素化合物とすることができれば、土壌や地下水の浄化はより徹底したものとなる。【００２７】
【化２】
2008026309.tif 000003
【００２８】
そこで、本発明者等は、さらに検討を行って、上記の微生物の菌株が、ジフェニルアルシン酸の代謝産物であるフェニルアルソン酸を分解して、無機ヒ素化合物を生成することを見いだした。【００２９】
すなわち、本発明は、次の[１９]〜[２２]にもある。
[１９]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を用いて、フェニルアルソン酸を分解する方法。
[２０]  鉄成分の存在下で微生物を用いる、[１９]に記載の方法。
[２１]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を含んでなる、フェニルアルソン酸の分解剤。
[２２]  鉄成分を含む、[２１]に記載の分解剤。【００３０】
さらに、本発明は、次の[２３]〜[２４]にもある。
[２３]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を用いて、フェニルアルソン酸を分解して無機ヒ素化合物を製造する方法。
[２４]  鉄成分の存在下で微生物を用いる、[２３]に記載の方法。【００３１】
さらに、本発明者等は、上記の微生物の菌株が、家禽の成長促進剤として使用されるロキサルソンを分解して、無機ヒ素化合物を生成することを見いだした。【００３２】
ロキサルソン［｛Ｃ６Ｈ３（ＮＯ２）（ＯＨ）｝ＡｓＯ（ＯＨ）２；構造式を式ＩＩＩに示す］は、成長促進剤として家禽に与えられているフェニル化有機ヒ素化合物である。米国では８３億羽のブロイラーの約７割に本剤が与えられており（２０００年の場合）、そこから出た厩肥には９００ｔのロキサルソンが含まれ、ヒ素に換算すると２５０ｔに相当する。近年、この厩肥を農地などに施すことによる、有機ヒ素汚染土壌の発生が懸念されており、その対策が求められている。【００３３】
【化３】
2008026309.tif 000004
【００３４】
そこで本発明者等は、今回単離した分解菌のロキサルソンに対する効果を明らかにするため、ロキサルソンを唯一の炭素源として含む無機塩培地にＬ２４０６株を植菌し、培地中のロキサルソンの分解が可能であるか、検討した。その結果、上記の微生物の菌株が、ロキサルソンを分解して、無機ヒ素化合物を生成することを見いだしたものである。【００３５】
すなわち、本発明は、次の[２５]〜[２８]にもある。
[２５]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を用いて、ロキサルソンを分解する方法。
[２６]  鉄成分の存在下で微生物を用いる、[２５]に記載の方法。
[２７]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を含んでなる、ロキサルソンの分解剤。
[２８]  鉄成分を含む、[２７]に記載の分解剤。【００３６】
さらに、本発明は、次の[２９]〜[３０]にもある。
[２９]  [１]〜[６]のいずれかに記載された微生物を用いて、ロキサルソンを分解して無機ヒ素化合物を製造する方法。
[３０]  鉄成分の存在下で微生物を用いる、[２９]に記載の方法。
【発明の効果】
【００３７】
本発明のジフェニルアルシン酸を分解する能力を有する微生物によれば、ある種のヒ素汚染等において最も高濃度で検出される有機ヒ素化合物であるジフェニルアルシン酸の分解が可能となる。この微生物を含んでなるジフェニルアルシン酸の分解剤は、ジフェニルアルシン酸を分解するための好適な方法を提供するものである。そして、このようなジフェニルアルシン酸の分解剤を、汚染土壌あるいは汚染地下水の浄化剤として使用して、有機ヒ素化合物による汚染土壌あるいは汚染地下水を浄化する方法を実施すれば、汚染された土壌の掘削や水の汲み上げ、有機ヒ素の抽出等を必要とせず、多大な労力とコストが必要とせず、より簡便で、原位置で浄化が可能となる。すなわち、本発明は、新しい環境浄化技術の一つである、バイオレメディエーションを、ジフェニルアルシン酸除去において、初めて可能とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、還流液中のジフェニルアルシン酸濃度の変化を示す図である。
【図２】図２は、Ｌ字管の培地中のジフェニルアルシン酸濃度の変化を示す図である。
【図３】図３は、三角フラスコの培地中のジフェニルアルシン酸濃度の変化を示す図である。
【図４】図４は、培養液中のフェニルアルソン酸濃度の変化を示す図である。
【図５】図５は、培養液中のヒ素の形態分析結果（クロマトグラム）を示す図である。
【図６】図６は、培養液中のロキサルソン濃度の変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下、本発明を詳述する。
本願の優先権主張の基礎となる特願２００６−２３８３５０及び特願２００７−１１５９２０の明細書等に記載された内容は、本明細書の記載の一部として取り込む。
本発明のジフェニルアルシン酸分解能を有する微生物は下記の様にして土壌から分離された細菌である。【００４０】
ジフェニルアルシン酸分解菌の集積培養は土壌・木炭還流法にて行った。まず表１に示す組成を有するオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）済の還流液を用意した。ただし、硫酸マグネシウム・七水和物は、それのみで適当な濃度の溶液を調製し、別にオートクレーブ滅菌した後に加えた。【００４１】
【表１】
2008026309.tif 000005
【００４２】
微生物源としては茨城県神栖市にて採取したヒ素汚染水田土壌I及びIIを供試した。これらの土壌を湿潤土のまま３０ｇ−乾土相当量秤取して少量の木炭（チャコールＡ、東洋電化工業株式会社製）と混合し、還流装置内の所定の位置にセットした。この装置を２５℃に保った恒温室に置き、還流液２００ｍｌを還流させながら分解微生物の集積を行った。２週間毎に還流液をすべて抜き取り、同組成の新鮮な還流液と交換した。今回運転した還流装置における供試土壌と還流液中ジフェニルアルシン酸濃度の組み合わせを表２にまとめた。【００４３】
【表２】
2008026309.tif 000006
【００４４】
集積培養中、還流液を微量採取してジフェニルアルシン酸の濃度を表３に示す測定条件に設定した高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて測定した。その結果を図１に示す。【００４５】
【表３】
2008026309.tif 000007
【００４６】
図１において、１〜５はそれぞれ還流装置の番号（表２参照）を示し、縦軸は初期ジフェニルアルシン酸濃度に対する相対値であり、矢印は還流液の交換時期を示している。【００４７】
還流を開始してから１９日後に、今回運転した還流装置の中で、還流液中のジフェニルアルシン酸の濃度低下が著しく、ジフェニルアルシン酸分解菌が十分に集積したと思われた還流装置３及び４から、土壌を湿潤状態でそれぞれ２ｇ採取し、各々滅菌した生理食塩水２０ｍｌに分散させて土壌懸濁液を調製した。これら土壌懸濁液０．１ｍｌを、Ｌ字管に分注した還流液と同組成の滅菌済液体培地６ｍｌに接種し、２５℃にて振とう培養を行った。この際のジフェニルアルシン酸の濃度は５ｍｇ／ｌとし、各土壌懸濁液についてＬ字管４本づつ、合計８本で本実験は実施した。各Ｌ字管の培地中ジフェニルアルシン酸濃度を経時的にＨＰＬＣにて測定した結果、いずれも９日後にはジフェニルアルシン酸がほぼ消失した（図２参照）。【００４８】
そこで、任意に選んだＬ字管の培養液を滅菌済生理食塩水で希釈して希釈系列を作製し、１０４及び１０５倍希釈液０．１ｍｌを、別のＬ字管に分注した還流液と同組成の滅菌済液体培地６ｍｌに接種し、２５℃にて振とう培養を行った。培養は各希釈系列につき２本ずつ行った。各Ｌ字管の培地中ジフェニルアルシン酸濃度を経時的にＨＰＬＣにて測定したところ、培養開始から１７日後にはいずれのＬ字管においてもジフェニルアルシン酸がほぼ消失した（図３参照）。【００４９】
同様に、１０５倍希釈液を接種したＬ字管の培養液を基に希釈と植え継ぎを繰り返して、培養液に含まれる微生物種を安定化させた後、その一部を、表４に示す組成のＤＰＡＡ２０ＶＴＥ培地に１．５％の寒天を加えて作製したプレートに播種し、３０℃にて静置培養した。１週間後、出現したコロニーを釣ってＲ２Ａ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）に画線し、３０℃にてさらに静置培養して複数の純粋分離株を得た。これら純粋分離株について、あらかじめＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地２０ｍｌを分注した１００ｍｌ容三角フラスコに各１白金耳を植菌して、２５℃・１２０ｒｐｍにて旋回培養を行った。そして培地中のジフェニルアルシン酸濃度を経時的にＨＰＬＣにて測定することにより、ジフェニルアルシン酸分解能を有する菌株の選抜を行った。【００５０】
【表４】
2008026309.tif 000008
【００５１】
【表５】
2008026309.tif 000009
【００５２】
【表６】
2008026309.tif 000010
【００５３】
以上の操作により、ジフェニルアルシン酸に対する分解能を有する菌株の選抜を行ったところ、Ｌ２４０６株及びＬ２４１３株にジフェニルアルシン酸を分解する能力があることを見出した。それぞれの株についてＲ２Ａ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）にて再度単コロニー分離を行い、各５株についてＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地６ｍｌを分注したＬ字管に接種した。これを２５℃にて１４日間振とう培養し、ジフェニルアルシン酸の残存量をＨＰＬＣにて、代謝物であるフェニルアルソン酸の生成量をＬＣ−ＭＳにて測定した結果を表７に示す。なお、ＬＣ−ＭＳの分析条件は表８の通りとした。【００５４】
【表７】
2008026309.tif 000011
【００５５】
【表８】
2008026309.tif 000012
【００５６】
以上のような手順で見出されたＬ２４０６株及びＬ２４１３株について、１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子（１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子）の塩基配列に基づいた遺伝子分類学的な検討を実施した。まずそれぞれの菌株をＲ２Ａ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）に植菌し、３０℃・暗所にて前培養した。生じたコロニーを１白金耳とって滅菌済生理食塩水１ｍｌに分散させ、ここからＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型に、既知のＤ１ｆとＤ１ｒをプライマーとしてＰＣＲを行い、１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にて精製後、サイクルシーケンス反応に供し、その反応物をＤＮＡシーケンサー（日立製ＳＱ−５５００Ｅ）にて解析して塩基配列を決定した。その結果、Ｌ２４０６株については１，１０１塩基対（配列番号１：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、Ｌ２４１３株については１，２７６塩基対（配列番号２：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）が決定された。【００５７】
決定された塩基配列に基づき、ジェネティクスＰＤＢ（ＧＥＮＥＴＹＸ  ＰＤＢ）を用いてＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に対するＦＡＳＴＡ検索を行った結果、Ｌ２４０６株はシノリゾビウム  モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）と９９．５％の、Ｌ２４１３株はエンシファー  アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）と９９．５％の相同性を有していた。【００５８】
次にＬ２４０６株及びＬ２４１３株の形態学的及び生理学的性質を調べた結果を表９に示す。表９中の「＋」は有り又は陽性を示し、「−」は無し又は陰性を示す。【００５９】
【表９】
2008026309.tif 000013
【００６０】
また、両株の生化学的な性状をＡＰＩシステム（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）のＡＰＩ２０ＮＥの測定方法に従って調べた結果を表１０に示す。【００６１】
【表１０】
2008026309.tif 000014
【００６２】
以上の結果は、「Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｋｒｉｅｇ，Ｎ．Ｒ．，Ｓｔａｌｅｙ，Ｊ．Ｔ．，Ｇａｒｒｉｔｙ，Ｇ．Ｍ．共著、バージーの系統学的微生物学のマニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２版、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ」に記載されているシノリゾビウム属細菌及びエンシファー属細菌の特徴と矛盾がなかった。【００６３】
以上の結果から、発明者らはＬ２４０６株をシノリゾビウム  ｓｐ．  Ｌ２４０６（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２４０６）と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５８として寄託し、またＬ２４１３株をエンシファー  ｓｐ．  Ｌ２４１３（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｓｐ．  Ｌ２４１３）と同定して独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５９として寄託した。【００６４】
Ｌ２４０６株及びＬ２４１３株の単離に用いたＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地には、微量元素として鉄、亜鉛、マンガン、ホウ素、コバルト、銅、モリブデン及びカルシウムが含まれる。両菌株のジフェニルアルシン酸分解におけるこれら元素の必要性について試験したところ、鉄の添加が非常に重要であることが判明した。そこで、添加する硫酸第一鉄・七水和物の量を変えることによって培地中の鉄濃度を０、０．０４、０．２、０．４、１、２及び４ｍｇ−Ｆｅ／ｌとしたＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地を用意し、培地中の鉄濃度がジフェニルアルシン酸分解菌の分解能にどのような影響を与えるかについて検討した。【００６５】
それぞれの培地をＬ字管に６ｍｌずつ分注し、これにＬ２４０６株あるいはL２４１３株を植菌した。これを２５℃にて７日間振とう培養後、培養液中のジフェニルアルシン酸濃度をＨＰＬＣにて測定してその分解率を求めた。その結果、Ｌ２４０６株及びL２４１３株によるジフェニルアルシン酸分解は培地中の鉄濃度が高いほど促進された（表１１）。【００６６】
【表１１】
2008026309.tif 000015
【実施例】
【００６７】
以下、本発明を実施例によって説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。【００６８】
[ジフェニルアルシン酸分解菌の集積培養]
ジフェニルアルシン酸分解菌の集積培養は土壌・木炭還流法にて行った。まず表１に示す組成を有するオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分）済の還流液を用意した。ただし、硫酸マグネシウム・七水和物は、それのみで適当な濃度の溶液を調製し、別にオートクレーブ滅菌した後に加えた。【００６９】
微生物源としては茨城県神栖市にて採取したヒ素汚染水田土壌I及びIIを供試した。これらの土壌を湿潤土のまま３０ｇ−乾土相当量秤取して少量の木炭（チャコールＡ、東洋電化工業株式会社製）と混合し、還流装置内の所定の位置にセットした。この装置を２５℃に保った恒温室に置き、還流液２００ｍｌを還流させながら分解微生物の集積を行った。２週間毎に還流液をすべて抜き取り、同組成の新鮮な還流液と交換した。今回運転した還流装置における供試土壌と還流液中ジフェニルアルシン酸濃度の組み合わせを表２にまとめた。【００７０】
[ジフェニルアルシン酸の濃度の測定]
集積培養中、還流液を微量採取してジフェニルアルシン酸の濃度を表３に示す測定条件に設定した高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて測定した。その結果を図１に示す。【００７１】
還流を開始してから１９日後に、今回運転した還流装置の中で、還流液中のジフェニルアルシン酸の濃度低下が著しく、ジフェニルアルシン酸分解菌が十分に集積したと思われた還流装置３及び４から、土壌を湿潤状態でそれぞれ２ｇ採取し、各々滅菌した生理食塩水２０ｍｌに分散させて土壌懸濁液を調製した。これら土壌懸濁液０．１ｍｌを、Ｌ字管に分注した還流液と同組成の滅菌済液体培地６ｍｌに接種し、２５℃にて振とう培養を行った。この際のジフェニルアルシン酸の濃度は５ｍｇ／ｌとし、各土壌懸濁液についてＬ字管４本づつ、合計８本で本実験は実施した。各Ｌ字管の培地中ジフェニルアルシン酸濃度を経時的にＨＰＬＣにて測定した結果、いずれも９日後にはジフェニルアルシン酸がほぼ消失した（図２参照）。【００７２】
[希釈系列の作製と培養液の選択]
任意に選んだＬ字管の培養液を滅菌済生理食塩水で希釈して希釈系列を作製し、１０４及び１０５倍希釈液０．１ｍｌを、別のＬ字管に分注した還流液と同組成の滅菌済液体培地６ｍｌに接種し、２５℃にて振とう培養を行った。培養は各希釈系列につき２本ずつ行った。各Ｌ字管の培地中ジフェニルアルシン酸濃度を経時的にＨＰＬＣにて測定したところ、培養開始から１７日後にはいずれのＬ字管においてもジフェニルアルシン酸がほぼ消失した（図３参照）。【００７３】
同様に、１０５倍希釈液を接種したＬ字管の培養液を基に希釈と植え継ぎを繰り返して、培養液に含まれる微生物種を安定化させた後、その一部を、表４に示す組成のＤＰＡＡ２０ＶＴE培地に１．５％の寒天を加えて作製したプレートに播種し、３０℃にて静置培養した。１週間後、出現したコロニーを釣ってＲ２Ａ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）に画線し、３０℃にてさらに静置培養して複数の純粋分離株を得た。これら純粋分離株について、あらかじめＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地２０ｍｌを分注した１００ｍｌ容三角フラスコに各１白金耳を植菌して、２５℃・１２０ｒｐｍにて旋回培養を行った。そして培地中のジフェニルアルシン酸濃度を経時的にＨＰＬＣにて測定することにより、ジフェニルアルシン酸分解能を有する菌株の選抜を行った。【００７４】
[菌株の選抜と特定]
以上の操作により、ジフェニルアルシン酸に対する分解能を有する菌株の選抜を行ったところ、Ｌ２４０６株及びＬ２４１３株にジフェニルアルシン酸を分解する能力があることを見出した。それぞれの株についてＲ２Ａ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）にて再度単コロニー分離を行い、各５株についてＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地６ｍｌを分注したＬ字管に接種した。これを２５℃にて１４日間振とう培養し、ジフェニルアルシン酸の残存量をＨＰＬＣにて、代謝物であるフェニルアルソン酸の生成量をＬＣ−ＭＳにて測定した結果を表７に示す。なお、ＬＣ−ＭＳの分析条件は表８の通りとした。【００７５】
[菌株と特定と寄託]
以上のような手順で見出されたＬ２４０６株及びＬ２４１３株について、１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づいた遺伝子分類学的な検討を実施した。まずそれぞれの菌株をＲ２Ａ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）に植菌し、３０℃・暗所にて前培養した。生じたコロニーを１白金耳とって滅菌済生理食塩水１ｍｌに分散させ、ここからＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型に、既知のＤ１ｆとＤ１ｒをプライマーとしてＰＣＲを行い、１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子を増幅した。このＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にて精製後、サイクルシーケンス反応に供し、その反応物をＤＮＡシーケンサー（日立製ＳＱ−５５００Ｅ）にて解析して塩基配列を決定した。その結果、Ｌ２４０６株については１，１０１塩基対（配列番号１：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）、Ｌ２４１３株については１，２７６塩基対（配列番号２：ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）が決定された。【００７６】
決定された塩基配列に基づき、ジェネティクスＰＤＢ（ＧＥＮＥＴＹＸ  ＰＤＢ）を用いてＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に対するＦＡＳＴＡ検索を行った結果、Ｌ２４０６株はシノリゾビウム  モレレンス（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｒｅｌｅｎｓｅ）と９９．５％の、Ｌ２４１３株はエンシファー  アドヘレンス（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ）と９９．５％の相同性を有していた。【００７７】
次にＬ２４０６株及びＬ２４１３株の形態学的及び生理学的性質を調べた結果を表９に示す。表９中の「＋」は有り又は陽性を示し、「−」は無し又は陰性を示す。【００７８】
また、両株の生化学的な性状をＡＰＩシステム（ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社）のＡＰＩ２０ＮＥの測定方法に従って調べた結果を表１０に示す。【００７９】
以上の結果は、「Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｋｒｉｅｇ，Ｎ．Ｒ．，Ｓｔａｌｅｙ，Ｊ．Ｔ．，Ｇａｒｒｉｔｙ，Ｇ．Ｍ．共著、バージーの系統学的微生物学のマニュアル（Ｂｅｒｇｅｙ‘ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第２版、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ」に記載されているシノリゾビウム属細菌及びエンシファー属細菌の特徴と矛盾がなかった。【００８０】
以上の結果から、発明者らはＬ２４０６株をシノリゾビウム  ｓｐ．  Ｌ２４０６（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．  Ｌ２４０６）と同定し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５８として寄託し、またＬ２４１３株をエンシファー  ｓｐ．  Ｌ２４１３（Ｅｎｓｉｆｅｒ  ｓｐ．  Ｌ２４１３）と同定して独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６５９として寄託した。【００８１】
[ジフェニルアルシン酸の分解条件の検討]
Ｌ２４０６株及びＬ２４１３株の単離に用いたＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地には、微量元素として鉄、亜鉛、マンガン、ホウ素、コバルト、銅、モリブデン及びカルシウムが含まれる。両菌株のジフェニルアルシン酸分解におけるこれら元素の必要性について試験したところ、鉄の添加が非常に重要であることが判明した。そこで、添加する硫酸第一鉄・七水和物の量を変えることによって培地中の鉄濃度を０、０．０４、０．２、０．４、１、２及び４ｍｇ−Ｆｅ／ｌとしたＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地を用意し、培地中の鉄濃度がジフェニルアルシン酸分解菌の分解能にどのような影響を与えるかについて検討した。【００８２】
それぞれの培地をＬ字管に６ｍｌずつ分注し、これにＬ２４０６株あるいはＬ２４１３株を植菌した。これを２５℃にて７日間振とう培養後、培養液中のジフェニルアルシン酸濃度をＨＰＬＣにて測定してその分解率を求めた。その結果、Ｌ２４０６株及びＬ２４１３株によるジフェニルアルシン酸分解は培地中の鉄濃度が高いほど促進された（表１１）。【００８３】
[フェニルアルソン酸の分解の検討]
表７にあるように、Ｌ２４０６株及びＬ２４１３株は、ジフェニルアルシン酸を分解してフェニルアルソン酸［（Ｃ６Ｈ５）ＡｓＯ（ＯＨ）２；構造式を式ＩＩに示す］を生成させる。しかし、いずれの菌株においても、検出されたフェニルアルソン酸の量は、分解されたジフェニルアルシン酸の、ヒ素換算で１／３程度に過ぎず、このことから、これらの菌株がフェニルアルソン酸をさらに分解している可能性が考えられた。そこで次に、フェニルアルソン酸を唯一の炭素源として含む無機塩培地にジフェニルアルシン酸分解菌を植菌し、培地中のフェニルアルソン酸の量を経時的に測定した。【００８４】
まず、Ｌ２４０６株をＲ２Ａ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）（組成を表１２に示す）にて前培養し、生じたコロニーを掻きとって滅菌済の生理食塩水に懸濁した。次に、表４のＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地から、ジフェニルアルシン酸を除いて替わりにフェニルアルソン酸１ｍｇを添加したものをＰＡＡ１ＶＴＥ培地と命名し、ＰＡＡ１ＶＴＥ培地２０ mlを１００ｍｌ容三角フラスコに入れた。各三角フラスコに、先に調製したＬ２４０６株の菌体懸濁液を０．１ｍｌずつ植菌して、３０℃・暗所にて旋回培養（１２０ｒｐｍ）を行った。植菌を施さない三角フラスコも用意し、対照とした。本試験はｎ＝２で実施した。培地中のフェニルアルソン酸の定量にはＬＣ−ＭＳを用い、表８の分析条件を適用した。【００８５】
その結果を図４に示す。図４の白丸（○）は、Ｌ２４０６株を植菌したときの培養液中フェニルアルソン酸濃度の経時変化の平均値を示す。図４の縦軸は、培養液中のフェニルアルソン酸濃度の対照のフェニルアルソン酸濃度に対する相対値を示し、横軸は培養日数を示す。図４で明らかな様に、Ｌ２４０６株はフェニルアルソン酸を唯一の炭素源として含む無機塩培地中で、フェニルアルソン酸濃度を減少させる能力を有した。【００８６】
また、１４日後の培養液について、ＬＣ−ＩＣＰ／ＭＳを用いてヒ素の形態分析を行った。ＬＣ−ＩＣＰ／ＭＳでの分析時の、分離条件は表１３の通りである。【００８７】
【表１２】
2008026309.tif 000016
【００８８】
【表１３】
2008026309.tif 000017
【００８９】
ＬＣ−ＩＣＰ／ＭＳで得られたクロマトグラムを図５に示す。縦軸はピーク強度、横軸は溶出時間を示す。上段は標準試料のクロマトグラムで、ＡｓＩＩＩは亜ヒ酸、ＤＭＡＡ＋ＭＡＡはジメチルアルシン酸とモノメチルアルソン酸、ＡｓＶはヒ酸、ＤＭＰＡＯはジメチルフェニルアルシンオキシド、ＭＰＡＡはメチルフェニルアルシン酸、ＰＡＡはフェニルアルソン酸、ＭＤＰＡＯはメチルジフェニルアルシンオキシド、ＤＰＡＡはジフェニルアルシン酸のピーク溶出位置を示す（各２０ｍｇ／ｌ）。下段は２８日間培養して得たＬ２４０６株の培養液のクロマトグラムで、亜ヒ酸（図５下段の（１）のピーク）とヒ酸（図５下段の（２）のピーク）に相当するピークが検出された。さらに、未知なる３種類のヒ素化合物も検出された（図５下段の（３）のピーク）。なお、分解されずに残存したフェニルアルソン酸は、図５下段の（４）の位置にて検出された。一方、対照（植菌なし）ではフェニルアルソン酸のピークしか出現しなかった。以上のことから、Ｌ２４０６株はフェニルアルソン酸を分解して無機ヒ素を生じさせる能力を有すると結論付けられた。【００９０】
フェニルアルソン酸を分解し、無機ヒ素を発生させる微生物としては、Ｋ−１´株及びＩＶ−１株が報告されている（特許文献６）。しかしそれらのフェニルアルソン酸分解率（％）は、２週間の培養でＫ−１´株が０．６３％、ＩＶ−１株が２．２０％と極めて遅い。これに対してＬ２４０６株の場合、２週間での分解率は１０％程度、４週間では４０％に達し、バイオレメディエーションへの利用可能性はより高いものと判断された。【００９１】
[ロキサルソンの分解の検討]
ロキサルソン［｛Ｃ６Ｈ３（ＮＯ２）（ＯＨ）｝ＡｓＯ（ＯＨ）２；構造式を式ＩＩＩに示す］は、成長促進剤として家禽に与えられているフェニル化有機ヒ素化合物である。米国では８３億羽のブロイラーの約７割に本剤が与えられており（２０００年の場合）、そこから出た厩肥には９００ｔのロキサルソンが含まれ、ヒ素に換算すると２５０ｔに相当する。近年、この厩肥を農地などに施すことによる、有機ヒ素汚染土壌の発生が懸念されており、その対策が求められている。そこで本研究では、今回単離した分解菌のロキサルソンに対する効果を明らかにするため、ロキサルソンを唯一の炭素源として含む無機塩培地にＬ２４０６株を植菌し、培地中のロキサルソンの分解が可能であるか、検討した。【００９２】
まず、Ｌ２４０６株をＲ２Ａ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）にて前培養し、生じたコロニーを掻きとって滅菌済の生理食塩水に懸濁した。次に、表４のＤＰＡＡ５ＶＴＥ培地から、ジフェニルアルシン酸を除いて替わりにロキサルソン６ｍｇを添加したものをＲＯＸ６ＶＴＥ培地と命名し、ＲＯＸ６ＶＴＥ培地２０ mlを１００ｍｌ容三角フラスコに入れた。各三角フラスコに、先に調製したＬ２４０６株の菌体懸濁液を０．１ｍｌずつ植菌して、３０℃・暗所にて旋回培養（１２０ｒｐｍ）を行った。植菌を施さない三角フラスコも用意し、対照とした。本試験はｎ＝２で実施した。培地中のロキサルソンの定量にはＨＰＬＣを用い、表１３の分析条件を適用した。【００９３】
その結果を図６に示す。図６の黒菱（◆）は、Ｌ２４０６株を植菌したときの培養液中ロキサルソン濃度の経時変化の平均値を示す。図６の縦軸は、培養液中ロキサルソン濃度を対照のロキサルソン濃度に対する相対値を示し、また横軸は培養日数を示す。図６で明らかな様に、Ｌ２４０６株はロキサルソンを唯一の炭素源として含む無機塩培地中で、ロキサルソン濃度を減少させる能力を有した。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のジフェニルアルシン酸を分解する能力を有する微生物によれば、ある種のヒ素汚染等において最も高濃度で検出される有機ヒ素化合物であるジフェニルアルシン酸の分解が可能となる。この微生物を含んでなるジフェニルアルシン酸の分解剤は、ジフェニルアルシン酸を分解するための好適な方法を提供するものである。そして、このようなジフェニルアルシン酸の分解剤を、汚染土壌あるいは汚染地下水の浄化剤として使用して、有機ヒ素化合物による汚染土壌あるいは汚染地下水を浄化する方法を実施すれば、汚染された土壌の掘削や水の汲み上げ、有機ヒ素の抽出等の多大な労力とコストを必要とせず、より簡便で、原位置で浄化が可能となる。すなわち、本発明は、新しい環境浄化技術の一つである、バイオレメディエーションを、ジフェニルアルシン酸除去において、初めて可能とするものである。【００９５】
従って、本発明は優れた環境浄化技術を新たに提供する発明であり、産業上有用に利用できる発明である。
【配列表フリーテキスト】
【００９６】
配列番号１：本発明の分解菌Ｌ２４０６株の１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の１１０１塩基。
配列番号２：本発明の分解菌Ｌ２４１３株の１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の１２７６塩基。
【図１】
2008026309.tif 000018
【図２】
2008026309.tif 000019
【図３】
2008026309.tif 000020
【図４】
2008026309.tif 000021
【図５】
2008026309.tif 000022
【図６】
2008026309.tif 000023
【配列表】
2008026309000001.app
【国際調査報告】
2008026309.tif 000024
2008026309.tif 000025
2008026309.tif 000026
2008026309.tif 000027
2008026309.tif 000028
2008026309.tif 000029
2008026309.tif 000030