(57)【要約】  本発明は、標的物質の精度良い検出を行うことのできるマイクロチップ検査システムを提供する。この発明は、少なくとも標的物質と前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬とを含み、標的物質と前記試薬との反応を検出するための蛍光強度の測定が行われる被検出部を有するマイクロチップと、マイクロチップの被検出部に対応して設けられ被検出部に励起光を照射するとともに被検出部からの蛍光を受光する光検出部と、光検出部による蛍光強度の測定に基づいて反応の検出を行う制御部と、を有し、光検出部は、第１の蛍光波長帯域を受光する第１受光手段と、第２の蛍光波長帯域を受光する第２受光手段とを有し、制御部は、第１受光手段で受光した第１の蛍光強度と、第２受光手段で受光した第２の蛍光強度との相対的な関係に基づいて前記反応の検出を行うことを特徴とする。
2008096564.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも標的物質と前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬とを含み、前記標的物質と前記試薬との反応を検出するための蛍光強度の測定が行われる被検出部を有するマイクロチップと、
前記マイクロチップを収容可能なマイクロチップ収容部と、
前記マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に対応して設けられ、前記被検出部に励起光を照射するとともに前記被検出部からの蛍光を受光する光検出部と、
前記光検出部による前記蛍光強度の測定に基づいて前記反応の検出を行う制御部と、
を有するマイクロチップ検査システムにおいて、
前記光検出部は、第１の蛍光波長帯域を受光する第１受光手段と、第２の蛍光波長帯域を受光する第２受光手段とを有し、
前記制御部は、前記第１受光手段で受光した第１の蛍光強度と、前記第２受光手段で受光した第２の蛍光強度との相対的な関係に基づいて前記反応の検出を行うことを特徴とするマイクロチップ検査システム。
【請求項２】
前記第１受光手段及び前記第２受光手段は、それぞれの検出対象である蛍光を透過させる第１検出光フィルタ及び第２検出光フィルタをそれぞれ有することを特徴とする請求の範囲第１項に記載のマイクロチップ検査システム。
【請求項３】
前記制御部は、前記第１の蛍光強度と前記第２の蛍光強度と比又は差に基づいて前記反応の検出を行うことを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載のマイクロチップ検査システム。
【請求項４】
前記制御部は、前記第２の蛍光強度の検出値を基に、前記第１の蛍光強度の検出値を補正することを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載のマイクロチップ検査システム。
【請求項５】
前記制御部は、少なくとも前記第１の蛍光強度が前記第２の蛍光強度より大きい場合に前記標的物質が存在すると判断することを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載のマイクロチップ検査システム。
【請求項６】
前記反応は、加熱により反応が進行する反応であり、
前記マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの前記被検出部を加熱する加熱手段を有し、
前記制御部は、前記加熱手段に前記被検出部を加熱させることにより前記反応を行わせることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第５項の何れか一項に記載のマイクロチップ検査システム。
【請求項７】
前記標的物質は、標的ＤＮＡであり、
前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬は、蛍光標識したＤＮＡプローブであり、
前記反応は、前記標的ＤＮＡと前記ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生じる反応であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第６項の何れか一項に記載のマイクロチップ検査システム。
【請求項８】
前記検出対象である第１の蛍光は、前記ＤＮＡプローブの標識蛍光物質が発する蛍光であり、
前記検出対象とは異なる第２の蛍光は、前記ＤＮＡプローブのクエンチャ物質が発する蛍光であることを特徴とする請求の範囲第７項に記載のマイクロチップ検査システム。
【請求項９】
少なくとも標的物質と前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬とを含み、前記標的物質と前記試薬との反応を検出するための蛍光強度の測定が行われる被検出部を有するマイクロチップを収容可能なマイクロチップ収容部と、
前記被検出部に励起光を照射するとともに前記被検出部からの蛍光を受光する光検出部と、
前記光検出部による前記蛍光強度の測定に基づいて前記反応の検出を行う制御部と、
を有するマイクロチップ検査装置において、
前記光検出部は、第１の蛍光波長帯域を受光する第１受光手段と、第２の蛍光波長帯域を受光する第２受光手段とを有し、
前記制御部は、前記第１受光手段で受光した第１の蛍光強度と、前記第２受光手段で受光した第２の蛍光強度との相対的な関係に基づいて前記反応の検出を行うことを特徴とするマイクロチップ検査装置。
【請求項１０】
少なくとも標的物質と前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬との反応を被検出部にて行うステップと、
光検出部により前記被検出部からの第１の蛍光波長帯域の蛍光を受光し、第１の蛍光強度を測定するステップと、
光検出部により前記被検出部からの第２の蛍光波長帯域の蛍光を受光し、第２の蛍光強度を測定するステップと、
前記第１の蛍光強度と前記第２の蛍光強度との相対的な関係に基づいて前記反応の検出を行うステップと、
をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロチップ検査システム、マイクロチップ検査装置及びプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、微細流路が集積加工されたマイクロチップ上において、複数の溶液を混合して反応させ、当該反応の状態を検出して分析を行うマイクロ総合分析システム（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；μＴＡＳ）が注目されている。【０００３】
μＴＡＳでは、試料の量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ない等のメリットがある。医療分野に使用した場合、検体（血液、尿、拭い液等）の量を少なくすることで患者への負担を軽減でき、試薬の量を少なくすることで検査のコストを下げることができる。また、検体、試薬の量が少ないことから、反応時間が大幅に短縮され、検査の効率化が図れる。さらに、装置が小型であるため小さな医療機関にも設置することができ、場所を選ばず迅速に検査を行うことができる。【０００４】
マイクロチップ検査システムでは、マイクロポンプ等からマイクロチップに駆動液を供給することにより、マイクロチップ内に収容されている検体及び試薬が流路に沿って送液される。これにより、検体及び試薬は、流路内で混合され反応を生じる。反応液はマイクロチップ内の被検出部に送液され、被検出部において反応液内の標的物質の濃度等の検出が行われる。【０００５】
例えば、特許文献１には、微細流路が集積加工されたマイクロチップを用いる標的遺伝子の検出例が記載されている。まず、マイクロチップの被検出部には、標的遺伝子をトラップする物質が予め固定化されている。次に、標的遺伝子の増幅に用いる試薬と検体とを反応させて増幅産物を生成する。これにより、検体に標的遺伝子が含まれていれば、増幅産物内に増幅された標的遺伝子が存在することになる。次に、増幅された標的遺伝子を一本鎖に変性する。これを被検出部に供給することで、被検出部に固定化されている標的遺伝子をトラップする物質に標的遺伝子をトラップさせる。次に、当該一本鎖の標的遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを被検出部に供給し、ハイブリダイゼーション反応により標的遺伝子とＤＮＡプローブとを結合させる。ＤＮＡプローブは予め蛍光標識されている。次に、トラップされた標的遺伝子に結合しているＤＮＡプローブに結合する金コロイド液を被検出部に供給し、金コロイドをＤＮＡプローブに結合させる。次に、結合していない金コロイドを被検出部から除去するため、被検出部に洗浄液を供給する。そして、被検出部の金コロイドの濃度を光学的に検出することにより、標的遺伝子の検出を行っている。【０００６】
また、特許文献２には、バイオチップ内の標的遺伝子の検出において、蛍光標識された標的遺伝子とＤＮＡプローブとがハイブリダイズした処理液に励起光を照射し、処理液から発せられる蛍光の蛍光強度を検出することが記載されている。【０００７】
また、特許文献３には、標的遺伝子の検出を高感度に行うことができる技術としてサイクリングプローブ法が記載されている。標的遺伝子を鋳型にしてＤＮＡプローブの標的遺伝子へのハイブリダイズ、遊離をサイクル的に繰り返すことにより、少数の標的遺伝子に対して多数の蛍光標識されたＤＮＡプローブを生成することができる方法である。【０００８】
サイクリングプローブ法では、蛍光共鳴エネルギー移動を利用した蛍光色素によりＤＮＡプローブの標識化がなされている。当該ＤＮＡプローブは、通常状態ではドナーである蛍光物質とアクセプタであるクエンチャとが対になって存在しており、励起光が照射されても蛍光物質から発せられた蛍光はクエンチャにより吸収され、ドナーの蛍光は発生しない。当該ＤＮＡプローブが標的遺伝子とハイブリダイゼーション反応を起こした状態では、蛍光物質とクエンチャとの結合が切断され、蛍光物質の蛍光が外部に発せられるようになる。蛍光物質とクエンチャとの結合が切断されると、当該ＤＮＡプローブは標的遺伝子から遊離する。そして、フリーになった標的遺伝子に通常状態のＤＮＡプローブが再びハイブリダイゼーション反応により結合する。このように、ハイブリダイゼーション反応が繰り返されることにより、クエンチャの切断されたＤＮＡプローブが増幅され、反応の進行に伴い、強い蛍光強度が得られる。
【特許文献１】国際公開第２００５／１０８５７１号パンフレット
【特許文献２】特開２００１−２５５３２８号公報
【特許文献３】国際公開第２００１／０４１９３１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
蛍光強度により検出を行う際、特許文献２では、マイクロチップのバックグラウンド部分からの光成分を除去するため、バックグラウンド部分からの光の強度を測定し、蛍光強度の値から当該光の強度の値を差し引いて補正を行っている。【００１０】
しかしながら、特許文献２においては、バックグラウンド部分即ちマイクロチップの基材の影響のみしか考慮されていない。【００１１】
処理液に励起光を照射した場合に、検出対象の蛍光とは異なる蛍光が生じることがある。【００１２】
例えば、サイクリングプローブ法を用いる場合には、蛍光物質を励起するために与えられた励起エネルギーが蛍光物質からクエンチャに移動し、クエンチャに移動したエネルギーが光エネルギーとして放出される場合には、クエンチャからの蛍光が生じる。【００１３】
このため、処理液からの検出対象の蛍光とは異なる蛍光（例えば、クエンチャからの蛍光）の蛍光強度についても測定を行い、検出対象の蛍光の蛍光強度の結果に反映することは、標的物質の精度良い検出を行う上で重要である。【００１４】
本発明は、このような要請に基づいてなされたものであり、標的物質の精度良い検出を行うことのできるマイクロチップ検査システム、マイクロチップ検査装置及びプログラムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のマイクロチップ検査システムは、少なくとも標的物質と前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬とを含み、前記標的物質と前記試薬との反応を検出するための蛍光強度の測定が行われる被検出部を有するマイクロチップと、前記マイクロチップを収容可能なマイクロチップ収容部と、前記マイクロチップ収容部に収容されたマイクロチップの被検出部に対応して設けられ、前記被検出部に励起光を照射するとともに前記被検出部からの蛍光を受光する光検出部と、前記光検出部による前記蛍光強度の測定に基づいて前記反応の検出を行う制御部と、を有するマイクロチップ検査システムにおいて、前記光検出部は、第１の蛍光波長帯域を受光する第１受光手段と、第２の蛍光波長帯域を受光する第２受光手段とを有し、前記制御部は、前記第１受光手段で受光した第１の蛍光強度と、前記第２受光手段で受光した第２の蛍光強度との相対的な関係に基づいて前記反応の検出を行うことを特徴としている。【００１６】
本発明のマイクロチップ検査装置は、少なくとも標的物質と前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬とを含み、前記標的物質と前記試薬との反応を検出するための蛍光強度の測定が行われる被検出部を有するマイクロチップを収容可能なマイクロチップ収容部と、前記被検出部に励起光を照射するとともに前記被検出部からの蛍光を受光する光検出部と、前記光検出部による前記蛍光強度の測定に基づいて前記反応の検出を行う制御部と、を有するマイクロチップ検査装置において、前記光検出部は、第１の蛍光波長帯域を受光する第１受光手段と、第２の蛍光波長帯域を受光する第２受光手段とを有し、前記制御部は、前記第１受光手段で受光した第１の蛍光強度と、前記第２受光手段で受光した第２の蛍光強度との相対的な関係に基づいて前記反応の検出を行うことを特徴としている。【００１７】
本発明のプログラムは、少なくとも標的物質と前記標的物質に特異的に結合する蛍光標識された試薬との反応を被検出部にて行うステップと、光検出部により前記被検出部からの第１の蛍光波長帯域の蛍光を受光し、第１の蛍光強度を測定するステップと、光検出部により前記被検出部からの第２の蛍光波長帯域の蛍光を受光し、第２の蛍光強度を測定するステップと、前記第１の蛍光強度と前記第２の蛍光強度との相対的な関係に基づいて前記反応の検出を行うステップと、をコンピュータに実行させることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、検出対象とは異なる第２の蛍光の蛍光強度を用いて検出対象の第１の蛍光における実質的な蛍光強度を得ることができるので、標的物質の精度良い検出を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の外観図である。
【図２】本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の構成図である。
【図３】本実施形態に係るマイクロチップの構成図である。図３（ａ）は、マイクロチップの上面図である。図３（ｂ）は、マイクロチップの側面図である。図３（ｃ）は、図３（ａ）において被覆基板１０９を取り外した図である。
【図４】本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の制御構成の要部を示す図である。
【図５】本実施形態に係る検出制御のフロー図である。
【符号の説明】
【００２０】
１  マイクロチップ
４  光検出部
４１  励起光源
４６１  第１検出光フィルタ
４６２  第２検出光フィルタ
４７  受光部
２３  ヒータ
８０  検査装置
９０  ＣＰＵ
９２  ＲＯＭ
１２０  検体収容部
１２４  プライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブの収容部
１２５、１２６  被検出部
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、図面に基づいて本実施形態について説明するが、一例であり、本実施形態に限定するものではない。【００２２】
ここで、「マイクロチップ」と「検査システム」とは、ＤＮＡ，ＲＮＡなど核酸やタンパク質などのバイオ分子の混合、分離、合成、抽出などの化学操作と生化学反応を小型のチップ内で行い、さらにその反応結果を検出する装置と組み合わせて成るシステムをいう。【００２３】
（装置構成）
図１は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の外観図である。検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体と試薬とを自動的に反応させ、反応結果を自動的に出力する装置である。【００２４】
検査装置８０の筐体８２には、マイクロチップ１を装置内部に挿入するための挿入口８３、表示部８４、メモリカードスロット８５、プリント出力口８６、操作パネル８７、外部入出力端子８８が設けられている。【００２５】
検査担当者は、図１の矢印方向にマイクロチップ１を挿入し、操作パネル８７を操作して検査を開始させる。開始操作に伴って、後述するように、検査装置８０内にあるマイクロチップ１内では蛍光反応が開始され、蛍光の検出結果に基づく検査結果が表示部８４に表示される。検査結果は操作パネル８７の操作により、プリント出力口８６よりプリントを出力したり、メモリカードスロット８５に挿入されたメモリカードに記憶することができる。また、外部入出力端子８８から例えばＬＡＮケーブルを使って、パソコンなどにデータを保存することができる。検査終了後、検査担当者はマイクロチップ１を挿入口８３から取り出す。【００２６】
図２は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の構成図である。図２においては、マイクロチップが図１に示す挿入口８３から挿入され、セットが完了している状態を示している。【００２７】
検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体及び試薬を送液するための駆動液１１を貯留する駆動液タンク１０、マイクロチップ１に駆動液１１を供給するためのマイクロポンプ５、マイクロポンプ５とマイクロチップ１とを駆動液１１が漏れないように接続するパッキン６、マイクロチップ１の必要部分を温調する温度調節ユニット３、マイクロチップ１をずれないように温度調節ユニット３及びパッキン６に密着させるためのチップ押圧板２、チップ押圧板２を昇降させるための押圧板駆動部２１、マイクロチップ１をマイクロポンプ５に対して精度良く位置決めする規制部材２２、マイクロチップ１内の検体と試薬との反応状態等を検出する光検出部４、等を備えている。【００２８】
チップ押圧板２は、初期状態においては、図２に示す位置より上方に退避している。これにより、マイクロチップ１は矢印Ｘ方向に挿抜可能であり、検査担当者は挿入口８３（図１参照）から規制部材２２に当接するまでマイクロチップ１を挿入する。その後、チップ押圧板２は、押圧板駆動部２１により下降してマイクロチップ１に当接し、マイクロチップ１の下面が温度調節ユニット３及びパッキン６に密着される。これにより、マイクロチップ１のセットが完了する。規制部材２２、押圧板２、温度調節ユニット３及びパッキン６等で本発明のマイクロチップ収容部が構成される。また、チップ押圧板２の内部には、セットされたマイクロチップ１の被検出部１２５、１２６（図３参照）を加熱するための、本発明の加熱手段としてのヒータ２３が設けられている。【００２９】
温度調節ユニット３は、マイクロチップ１と対向する面にペルチェ素子３１を備え、マイクロチップ１が検査装置８０にセットされたときに、ペルチェ素子３１がマイクロチップ１に密着するようになっている。試薬が収容されている部分をペルチェ素子３１で冷却して試薬が変性しないようにする。【００３０】
光検出部４は、本発明の発光部としてのＬＥＤ等の励起光源４１、励起光源４１から発せられた励起光の波長帯域を制限する励起光フィルタ４２、励起光フィルタ４２を透過した励起光をマイクロチップ１の被検出部１２５、１２６（図３参照）のサイズに適合したビームスポットに整形するための集光レンズ４３、集光レンズ４３を透過した励起光を反射してマイクロチップ１の被検出部１２５、１２６に照射するとともに当該励起光により発せられたマイクロチップ１の被検出部１２５、１２６からの蛍光を透過するダイクロイックミラー４４、ダイクロイックミラー４４を透過した蛍光を受光部４７に導光するための受光レンズ４５、受光レンズ４５を透過した蛍光の波長帯域を制限する検出光フィルタ４６、検出光フィルタ４６を透過した蛍光を受光するフォトダイオード等からなる受光部４７、等から構成されている。【００３１】
検出光フィルタ４６は、ＤＮＡプローブの標識蛍光物質の発光スペクトル（本発明の第１の蛍光）を選択的に透過させるための第１検出光フィルタ４６１及びＤＮＡプローブのクエンチャの発光スペクトル（本発明の第２の蛍光）を選択的に透過させるための第２検出光フィルタ４６２から構成されている。第１検出光フィルタ４６１及び第２検出光フィルタ４６２は、検出光フィルタ切換手段４６３（図４参照）により切り換え可能となっている。【００３２】
光検出部４は、光検出部移動手段４８（図４参照）により、後述の被検出部１２５、１２６のそれぞれの位置に対向して移動することができるようになっている。【００３３】
マイクロポンプ５は、ポンプ室５２、ポンプ室５２の容積を変化させる圧電素子５１、ポンプ室５２のマイクロチップ１側に位置する第１絞り流路５３、ポンプ室の駆動液タンク１０側に位置する第２絞り流路５４、等から構成されている。第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４は絞られた狭い流路となっており、また、第１絞り流路５３は第２絞り流路５４よりも長い流路となっている。【００３４】
駆動液１１を順方向（マイクロチップ１に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を急激に減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第１絞り流路５３の方に支配的に押し出され送液される。【００３５】
次に、ポンプ室５２の容積を緩やかに増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなり、ポンプ室５２内には第２絞り流路５４の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が順方向に送液されることになる。【００３６】
一方、駆動液１１を逆方向（駆動液タンク１０に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を緩やかに減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第２絞り流路５４の方に支配的に押し出され送液される。【００３７】
次に、ポンプ室５２の容積を急激に増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内には第１絞り流路５３の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が逆方向に送液されることになる。【００３８】
（マイクロチップの構成）
図３は、本実施形態に係るマイクロチップ１の構成図である。図３（ａ）は、マイクロチップ１の上面図である。図３（ｂ）は、マイクロチップ１の側面図である。図３（ｃ）は、図３（ａ）において被覆基板１０９を取り外した図である。一例の構成を示すものであり、これに限定されない。【００３９】
図３（ａ）において矢印は、検査装置８０にマイクロチップ１を挿入する挿入方向であり、図３（ａ）は挿入時にマイクロチップ１の下面となる面を図示している。また、２つの被検出部１２５，１２６に示した円は励起光のビームスポットを示す。図３（ｂ）はマイクロチップ１の側面図である。【００４０】
図３（ｂ）に示すように、マイクロチップ１は溝形成基板１０８と、溝形成基板１０８を覆う被覆基板１０９から構成されている。【００４１】
溝形成基板１０８には、図３（ｃ）に示すように、検体と試薬とをマイクロチップ１上
で混合・反応させるための微細流路及び流路エレメントが配設されている。図３（ｃ）では、微細流路を矢印で、流路エレメントを四角形で模式的に示している。【００４２】
マイクロチップ１上には、以下の流路エレメントが設けられている。【００４３】
駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅは、マイクロポンプから駆動液１１を注入するための注入部である。【００４４】
検体注入部１１３は、マイクロチップ１に検体を注入するための注入部である。【００４５】
駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅの下流には、それぞれ、検体を収容する検体収容部１２０、標的遺伝子のポジティブコントロール用試薬を収容するポジティブコントロール収容部１２１、ネガティブコントロール用試薬を収容するネガティブコントール収容部１２２、標的遺伝子を増幅するための酵素及び基質の収容部１２３、プライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブの収容部１２４、が設けられている。各試薬は、予め各収容部に収容されている。標的遺伝子は、本発明の標的物質あるいは標的ＤＮＡに相当する。【００４６】
ポジティブコントロール用試薬及びネガティブコントロール用試薬は、検査が正常に行われたか否かをモニタリングするための試薬である。【００４７】
サイクリングプローブ法で用いる蛍光標識されたＤＮＡプローブは、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラオリゴヌクレオチドで、一方の末端が蛍光物質で、もう一方の末端がクエンチャで修飾されている。インタクトな状態では、蛍光共鳴エネルギー遷移現象により、蛍光を発しないが、標的遺伝子とハイブリダイゼーション反応を起こすと、ＲＮＡ部分が切断されて蛍光を発する。【００４８】
上記の各収容部は、マイクロチップ１を検査装置８０にセットした際にペルチェ素子３１に対向し、収容されている検体や試薬が変性しないように冷却される。【００４９】
検体収容部１２０、ポジティブコントロール収容部１２１、酵素及び基質の収容部１２３、プライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブの収容部１２４の下流には、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液に対して増幅反応及び検出を行うための被検出部１２５が設けられている。【００５０】
また、検体収容部１２０、ネガティブコントール収容部１２２、酵素及び基質の収容部１２３、プライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブの収容部１２４の下流には、検体とネガティブコントール用の試薬との混合液に対して増幅反応及び検出を行うための被検出部１２６が設けられている。【００５１】
被検出部１２５、１２６は、マイクロチップ１を検査装置８０にセットした際にヒータ２３に対向し、増幅促進のために加熱される。【００５２】
被検出部１２５、１２６、及び被検出部１２５、１２６に対応する被覆基板１０９の部分は、光学的な検出を行うことができるよう、透明なガラスや樹脂等の材料から構成されている。【００５３】
検体及び各試薬の流れについて説明する。【００５４】
まず、マイクロチップ１による検査を行うに先立って、検査担当者は検体を検体注入部１１３から注射器等を用いて注入する。検体注入部１１３から注入された検体は、連通する微細流路を通って検体収容部１２０に収容される。【００５５】
次に、検体の注入されたマイクロチップ１は、検査担当者により図１に示す検査装置８０の挿入口８３に挿入され、図２に示すようにセットされる。これにより、マイクロポンプ５を駆動して駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅから駆動液１１を注入することが可能となる。【００５６】
まず、駆動液注入部１１０ａから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通って検体収容部１２０に収容されている検体が押し出され、被検出部１２５、１２６に検体が送り込まれる。【００５７】
次に、駆動液注入部１１０ｂから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通ってポジティブコントロール収容部１２１に収容されているポジティブコントロール用試薬（標的遺伝子と同一のＤＮＡ配列箇所をもつ試薬）が押し出され、被検出部１２５にポジティブコントロール用試薬が送り込まれ、先に送液された検体と混合される。【００５８】
次に、駆動液注入部１１０ｃから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通ってネガティブコントロール収容部１２２に収容されているネガティブコントロール用試薬（例えば純水）が押し出され、被検出部１２６にネガティブコントロールが送り込まれ、先に送液された検体と混合される。【００５９】
次に、駆動液注入部１１０ｄと１１０ｅから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通って、１２３、１２４の各収容部から酵素及び基質、並びにプライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブが被検出部１２５、１２６にそれぞれ送りこまれ、先に送液された検体及びコントロール液の混合液と混合される。【００６０】
次に、被検出部１２５，１２６をヒータ２３により加熱すると、それぞれの被検出部において標的遺伝子（及びポジティブコントロールＤＮＡ）の増幅反応、標的遺伝子と蛍光標識されたＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション反応、及び蛍光物質とクエンチャとの遊離反応が同時進行し、増幅から蛍光物質生成までの反応が一括して行われる。【００６１】
そして、被検出部１２５、１２６に光検出部４の励起光源４１から励起光を照射し、被検出部１２５、１２６から発せられる蛍光を受光部４７で受光することにより光検出を行うことが可能となる。【００６２】
尚、変形例として、増幅反応、ハイブリダイゼーション反応、検出を別個の流路エレメントで行うようにしても構わない。また、装置構成上、ヒータ２３やペルチェ素子３１の位置は、それらの機能を満足する限り多少変動することがあっても構わない。【００６３】
表１に、被検出部１２５、１２６の検出結果を基づいて検査の総合判定を行うルールの一例を示す。【００６４】
【表１】
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【００６５】
ポジティブコントロールは、その試薬単独でも、標的遺伝子と同等の増幅反応、ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応、及び蛍光物質の生成反応を起こす。ネガティブコントロールは、その試薬単独では、蛍光物質の生成反応を起こさない。【００６６】
これらの試薬を検体と混合した混合液に対して反応及び検出を行うことで、表１に示した検査結果の良否判定が可能となる。【００６７】
陽性すなわち検体に標的遺伝子が含まれる場合、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液、及び検体とネガティブコントロール用試薬との混合液のいずれの混合液も蛍光発光が生じる。陰性すなわち検体に標的遺伝子が含まれない場合、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液は、ポジティブコントロールの反応による蛍光発光が生じるが、検体とネガティブコントロール用試薬との混合液は、反応が生じず蛍光発光は生じない。これら２つのケースは、正常な反応が行われた検査結果として扱う事ができる。【００６８】
一方、例えば、検体に反応の阻害物質が混入した場合等は、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液、及び検体とネガティブコントロール用試薬との混合液のいずれの混合液も蛍光発光は生じない。また、検体とポジティブコントロール用試薬との混合液での蛍光発光無し、検体とネガティブコントロール用試薬との混合液での蛍光発光有りの場合は、マイクロチップ１に収容した試薬の失活などの異常が考えられる。これら２つのケースは、異常な反応を行った検査結果として、再検査を促すことが可能となる。【００６９】
（制御構成）
図４は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置の制御構成の要部を示す図である。本発明の制御に関係する主な構成要素について示している。【００７０】
プログラムに従って検査装置８０の制御を実行するＣＰＵ９０を中心に、バス９１により、ＲＯＭ９２、ＲＡＭ９３、不揮発性メモリ９４、光検出部４、検出光フィルタ切換手段４６３、光検出部移動手段４８、ペルチェ素子３１、ヒータ２３、マイクロポンプ５、表示部８４、操作パネル８７、等が相互に接続されている。【００７１】
ＲＯＭ９２は、ＣＰＵ９０によって実行される各種制御プログラムやデータ等を記憶する。【００７２】
ＲＡＭ９３は、ＣＰＵ９０によってワークエリアとして利用され、ＣＰＵ９０が制御を実行する際に必要なプログラムやデータを一時的に記憶する。【００７３】
不揮発性メモリ９４は、光検出部４による検出結果等を記憶する。【００７４】
ＣＰＵ９０がＲＯＭ９２に記憶されているプログラムに基づいて制御を実行する。ＣＰＵ９０及びＲＯＭ９２に記憶されているプログラムは、本発明の制御部及びコンピュータとして機能する。【００７５】
光検出部４、検出光フィルタ切換手段４６３、光検出部移動手段４８、ペルチェ素子３１、ヒータ２３、マイクロポンプ５、表示部８４及び操作パネル８７についての説明は、前述したので省略する。【００７６】
（検出制御フロー）
図５及び図６は、本実施形態に係る検出制御のフロー図である。ヒータ２３による加熱が行われることによりサイクリングプローブ法による標的遺伝子の増幅反応、標的遺伝子とＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応、及び蛍光物質とクエンチャとの遊離反応が開始される場合を一例に説明する。被検出部１２５及び１２６は共に同様の検出制御であり、以下、代表して被検出部１２５の検出制御について説明する。【００７７】
検出制御は、ＲＯＭ９２に記憶されている検出制御プログラムに基づいてＣＰＵ９０が処理を実行することにより行われる。【００７８】
尚、前提として、検査装置８０の操作パネル８７から検査開始の入力がされて検査が開始され、マイクロポンプ５が駆動され、既に被検出部１２５に、検体収容部１２０からの検体、ポジティブコントロール収容部１２１からのポジティブコントール用試薬、収容部１２３からの酵素及び基質、及び収容部１２４からのプライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブがそれぞれ送り込まれ充填されているものとする。【００７９】
まず、初期設定として、ＣＰＵ９０は、ｉ＝０を設定する（ステップＳ１）。【００８０】
次に、ＣＰＵ９０は、ヒータ２３に被検出部１２５、１２６の加熱を開始させる（ステップＳ２）。これにより、被検出部１２５、１２６において標的遺伝子の増幅反応、標的遺伝子とＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応、及び蛍光物質とクエンチャとの遊離反応が進行する。【００８１】
次に、ＣＰＵ９０は、所定時間Ｔ（ｉ）が経過したか否かを判断する（ステップＳ３）。所定時間Ｔ（ｉ）により蛍光強度の測定を行うタイミングが決定される。所定時間Ｔ（ｉ）のそれぞれの所定時間（Ｔ（０），Ｔ（１），Ｔ（２），・・・）は、ＲＯＭ９２に予め記憶されている。例えば、Ｔ（０）は反応開始前の蛍光強度の測定を行うタイミングであり、上記加熱開始後すぐに測定が行われる値に設定される。【００８２】
所定時間Ｔ（ｉ）が経過していないと判断すると（ステップＳ３；Ｎｏ）、ＣＰＵ９０は、所定時間Ｔ（ｉ）が経過するまで待機する。【００８３】
所定時間Ｔ（ｉ）が経過したと判断すると（ステップＳ３；Ｙｅｓ）、ＣＰＵ９０は、光検出部移動手段４８を駆動し、光検出部４を被検出部１２５に対向する位置に移動させる（ステップＳ４）。【００８４】
次に、ＣＰＵ９０は、ＤＮＡプローブの標識蛍光物質の発光スペクトルを選択的に透過させるための第１検出光フィルタ４６１を受光部４７の手前にセットする（ステップＳ５）。【００８５】
次に、ＣＰＵ９０は、光検出部４の励起光源４１を点灯させる（ステップＳ６）。これにより、被検出部１２５に励起光が照射される。【００８６】
次に、ＣＰＵ９０は、被検出部１２５からの蛍光が第１検出光フィルタ４６１を介して光検出部４の受光部４７に受光される際の蛍光強度ＦＩ１（ｉ）を測定し、測定結果を所定時間Ｔ（ｉ）に対応付けて不揮発性メモリ９４に記憶する（ステップＳ７）。蛍光強度ＦＩ１（ｉ）は、本発明の第１の蛍光強度に相当する。【００８７】
次に、ＣＰＵ９０は、ＤＮＡプローブのクエンチャの発光スペクトルを選択的に透過させるための第２検出光フィルタ４６２を受光部４７の手前にセットする（ステップＳ８）。【００８８】
次に、ＣＰＵ９０は、被検出部１２５からの蛍光が第２検出光フィルタ４６２を介して光検出部４の受光部４７に受光される際の蛍光強度ＦＩ２（ｉ）を測定し、測定結果を所定時間Ｔ（ｉ）に対応付けて不揮発性メモリ９４に記憶する（ステップＳ９）。蛍光強度ＦＩ２（ｉ）は、本発明の第２の蛍光強度に相当する。【００８９】
次に、ＣＰＵ９０は、光検出部４の励起光源４１を消灯させる（ステップＳ１０）。【００９０】
次に、ＣＰＵ９０は、ｉ＝Ｎであるか否かを判断する（ステップＳ１１）。Ｎは予め定められた自然数であり、ＲＯＭ９２に予め記憶されている。つまり、標的遺伝子の増幅反応、標的遺伝子とＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応、及び蛍光物質とクエンチャとの遊離反応が十分に進行するのに必要な時間が経過したか否かを判断する。【００９１】
ｉ＝Ｎであると判断すると（ステップＳ１１；Ｙｅｓ）、ＣＰＵ９０は、ヒータ２３による加熱を停止させた後（ステップＳ１２）、ステップＳ７で得られた蛍光強度ＦＩ１（ｉ）とステップＳ９で得られた蛍光強度ＦＩ２（ｉ）との比（ＦＩ１（ｉ）／ＦＩ２（ｉ））をそれぞれの所定時間Ｔ（ｉ）において算出し、当該所定時間Ｔ（ｉ）に対応付けて不揮発性メモリ９４に記憶する（ステップＳ１３）。【００９２】
また、ＣＰＵ９０は、ＦＩ１（Ｎ）＞ａ×ＦＩ２（Ｎ）であるか否かを判断する（ステップＳ１４）。ａは係数で、ＲＯＭ９２に予め記憶されている。係数ａは、少なくとも１以上であり、検査の種類等により適宜決定される。これにより、当該条件式を満たせば被検出部１２５内に標的遺伝子が存在すると判断でき、当該条件式を満たさなければ被検出部１２５内に標的遺伝子が存在しないと判断することができる。【００９３】
このように、蛍光強度ＦＩ１（ｉ）と蛍光強度ＦＩ２（ｉ）との相対的な関係に基づいて反応の検出を行うことにより、蛍光強度ＦＩ１（ｉ）のみを用いて反応の検出を行う場合に比べて、反応状態の検出及び標的遺伝子の有無判定をより正確に行うことができる。例えば、蛍光強度ＦＩ１（ｉ）が大きな値であっても、蛍光強度ＦＩ２（ｉ）も同じように大きい値であり陽性反応を起こしていないことも考えられる。被検出部１２５に存在するＤＮＡプローブの数が元々多く、全体的に蛍光強度が強い場合等がそうである。【００９４】
また、上記のように、相対的な関係に基づいた検出を行っているので、別の検査において得られた測定結果とそのまま比較を行うことができる。【００９５】
ステップＳ１１において、ｉ＝Ｎでないと判断すると（ステップＳ１１；Ｎｏ）、ＣＰＵ９０は、ｉ＝ｉ＋１というようにｉを１つ増加させて（ステップＳ１５）、ステップＳ３に戻る。【００９６】
ステップＳ１４において、ＦＩ１（Ｎ）＞ａ×ＦＩ２（Ｎ）であると判断すると（ステ
ップＳ１４；Ｙｅｓ）、ＣＰＵ９０は、表示部８４に標的遺伝子が検出された旨の表示を行う（ステップＳ１６）。【００９７】
ステップＳ２２において、ＦＩ１（Ｎ）＞ａ×ＦＩ２（Ｎ）でないと判断すると（ステップＳ１４；Ｎｏ）、ＣＰＵ９０は、表示部８４に標的遺伝子が検出されなかった旨の表示を行う（ステップＳ１７）。【００９８】
尚、ステップＳ１６及びＳ１７における表示の際に、不揮発性メモリ９４に記憶されているＦＩ１（ｉ）、ＦＩ２（ｉ）又は（ＦＩ１（ｉ）／ＦＩ２（ｉ））の時間経過グラフ等を合わせて表示するようにしてもよい。【００９９】
以上のように、本実施形態によれば、蛍光強度ＦＩ１（ｉ）と蛍光強度ＦＩ２（ｉ）との相対的な関係に基づいて反応の検出を行うことにより、蛍光強度ＦＩ１（ｉ）のみを用いて反応の検出を行う場合に比べて、反応状態の検出及び標的遺伝子の有無判定をより正確に行うことができる。【０１００】
上記では、被検出部１２５における検体＋ポジティブコントール用試薬の場合について示したが、被検出部１２６における検体＋ネガティブコントール用試薬の場合についても同様である。【０１０１】
本実施形態では、蛍光強度ＦＩ１（ｉ）と蛍光強度ＦＩ２（ｉ）との比（ＦＩ１（ｉ）／ＦＩ２（ｉ））を用いて反応の検出を行ったが、蛍光強度ＦＩ１（ｉ）と蛍光強度ＦＩ２（ｉ）との差（ＦＩ１（ｉ）−ＦＩ２（ｉ））を用いて反応の検出を行ってもよい。あるいは、ＲＯＭ９２等に予め記憶した補正係数を蛍光強度ＦＩ２（ｉ）に適用し、これに基づいて蛍光強度ＦＩ１（ｉ）を補正し、当該補正した値により検出を行ってもよい。【０１０２】
本実施形態では、ＤＮＡプローブの標識蛍光物質の発光スペクトルとＤＮＡプローブのクエンチャの発光スペクトルとを選択的に検出する際に、検出光フィルタを切り換えて検出したが、回折格子等で分光し波長分離して検出したり、分光感度の異なる受光素子で検出するようにしてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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