(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
IFNAR1に特異的な改変IgG1クラスモノクローナル抗体であって、Fc領域に、Kabatに説明されるEUインデックスにより番号付けしたL234F、L235E、およびP331Sのアミノ酸置換を含み、未改変抗体と比較して少なくとも1つのFcリガンドに対して低下した親和性を示す、上記抗体。
【請求項２】
以下のCDR:
a. 配列番号１を含むヒト軽鎖可変領域CDR1;
b. 配列番号２を含むヒト軽鎖可変領域CDR2;
c. 配列番号３を含むヒト軽鎖可変領域CDR3;
d. 配列番号４を含むヒト重鎖可変領域CDR1;
e. 配列番号５を含むヒト重鎖可変領域CDR2;および
f. 配列番号６を含むヒト重鎖可変領域CDR3
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
以下のCDR:
a. 配列番号２１を含むヒト軽鎖可変領域CDR1;
b. 配列番号２２を含むヒト軽鎖可変領域CDR2;
c. 配列番号２３を含むヒト軽鎖可変領域CDR3;
d. 配列番号２４を含むヒト重鎖可変領域CDR1;
e. 配列番号２５を含むヒト重鎖可変領域CDR2;および
f. 配列番号２６を含むヒト重鎖可変領域CDR3
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
以下の可変領域:
a. 配列番号３８のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域;および
b. 配列番号４０のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
以下の可変領域:
a. 配列番号１８のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域;および
b. 配列番号２０のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
以下の可変領域:
a. 配列番号２８のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域;および
b. 配列番号３０のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸。
【請求項８】
請求項２〜６のいずれか１項に記載の抗体、および製薬上許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項９】
全身性エリテマトーデス(SLE)の治療用の、請求項８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2008年2月8日に出願された米国仮出願第61/006,962号、2007年3月7日に出願された同第61/034,618号、および2008年5月2日に出願された同第61/049,970号について米国特許法119(e)条の下で利益を主張し、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、Fcリガンドに対する低下した親和性を有する、インターフェロンα受容体1(IFNAR1)に特異的な単離抗体および組成物に関する。本発明はまた、そのような抗体をコードする核酸、相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、ならびに治療組成物、製剤、投与、およびデバイスを含むその製造方法および使用方法をもさらに含む。
【背景技術】
【０００３】
2.1 インターフェロン:
I型インターフェロン(IFN)(IFNα、IFNβ、IFNω、1FNτ)は、抗ウイルス効果、抗腫瘍効果、および免疫調節効果を有する、構造的に関連するサイトカインのファミリーである(Hardy et al. (2001) Blood 97:473; Cutrone and Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140)。ヒトIFNα遺伝子座は、2つのサブファミリーを含む。第1のサブファミリーは、14個の非対立遺伝子および4つの偽遺伝子から成り、少なくとも80％の相同性を有する。第2のサブファミリー、αIIまたはオメガ(ω)は、5つの偽遺伝子および1つの機能的遺伝子を含有し、IFNα遺伝子と70％の相同性を示す(Weissmann and Weber (1986) Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 33:251-300)。IFNαのサブタイプは、異なる特異的活性を有するが、それらは、同じ生物学的スペクトルを持ち(Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848)、同じ細胞受容体を有する(Agnet M. et al. in "Interferon 5" Ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press, London 1983)。以下の名称の付いたインターフェロンαサブタイプが同定されている:IFNα1、2a、2b、4、4b、5、6、7、8、10、14、16、17、および21。
【０００４】
インターフェロンβ(IFNβ)は、単一遺伝子によってコードされ、これは、IFNα遺伝子と約50％の相同性を有する。
【０００５】
インターフェロンγは、活性化リンパ球によって産生され、α/βインターフェロンといかなる相同性をも持たず、それは、それらの受容体と反応しない。
【０００６】
2.1.1 インターフェロン受容体:
ヒトI型インターフェロンはすべて、2つの膜貫通型タンパク質、IFNAR1およびIFNAR2からなる細胞表面受容体(IFNα受容体、IFNAR)に結合する(Uze et. al. (1990) Cell 60:225; Novick et al. (1994) Cell 77:391)。IFNAR1は、IFNAR複合体の高い親和性結合および示差的な特異性にとって不可欠である(Cutrone et al. 2001 J. Bio Chem 276(20):17140-8)。I型IFNサブタイプのそれぞれについての機能的差異は、同定されていないが、それぞれが、IFNAR受容体成分と異なる相互作用を示す可能性があり、可能性として、多様なシグナル伝達結果をもたらすと考えられる(Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:13448)。特に、IFNAR1およびIFNAR2の突然変異体形態を利用する研究は、αおよびβインターフェロンが、それぞれの鎖と示差的に相互作用することによって、受容体を通して別々にシグナル伝達することを示唆した(Lewerenz et al. (1998) J. Mol. Biol. 282:585)。
【０００７】
2.1.2 インターフェロンの機能:
I型IFNの初期の機能的研究は、ウイルス感染に対する先天性の防御に注目した(Haller et al. (1981) J. Exp. Med. 154:199; Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol. 78:181)。しかしながら、より最近の研究は、強力な免疫調節性サイトカインとしてのI型IFNが適応免疫応答に関係していることを証明する。具体的には、I型IFNは、Th1経路に沿ってナイーブT細胞の分化を促進すること(Brinkmann et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1655)、抗体産生を増強すること(Finkelman et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1179)、ならびにメモリーT細胞の機能的活性および生存を支持すること(Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777; Tough et al. (1996) Science 272:1947)が示された。
【０００８】
多くのグループによる最近の成果は、IFNαが、樹状細胞(DC)の成熟または活性化を増強する可能性があることを示唆する(Santini, et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777; Luft et al. (1998) J. Immunol. 161:1947; Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14:367; Radvanyi et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:499)。さらに、I型インターフェロンの発現の増加は、多数の自己免疫疾患において記載されてきた(Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423; Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396; Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48:192; Hopkins and Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88; Arvin and Miller (1984) Arthritis Rheum. 27:582)。この最も研究された例は、IFNαのレベルの上昇と関連するインスリン依存性糖尿病(IDDM)(Foulis (1987))および全身性エリテマトーデス(SLE)(Hooks (1982))、ならびにIFNβがより重要な役割を果たす可能性がある関節リウマチ(RA)(Hertzog (1988), Hopkins and Meager (1988), Arvin and Miller (1984))である。
【０００９】
さらに、インターフェロンαの投与は、乾癬および多発性硬化症を有する患者において基礎疾患を悪化させ、自己免疫疾患の既往歴を有していない患者においてSLE様の症候群を誘発することが報告された。インターフェロンαはまた、正常マウスにおいて糸球体腎炎を誘発し、NZB/Wマウスの特発性自己免疫疾患の発症を加速することもまた示された。さらに、IFNα療法は、いくつかの症例において、発熱および神経障害を含む、望まれない副作用をもたらすことが示された。したがって、I型IFN活性の阻害が、患者に有益となる可能性があり、I型IFN活性を阻害するのに有効な作用物質の必要性が存在する、病理学的な状況がある。
【００１０】
2.1.3 抗体エフェクター機能:
抗体のFc領域は、Fc受容体およびC1qを含む多くのリガンド(本明細書において「Fcリガンド」とも呼ばれ、Fc受容体およびC1qなどの、抗体のFc領域に特異的に結合する作用物質を含むが、これらに限定されない)と相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる、多くの重要な機能的性能を与える。Fc受容体は、抗体および免疫系の細胞性アーム(cellular arm)の間の連絡を媒介する(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。ヒトにおいて、このタンパク質ファミリーは、アイソフォームFcγRIA、FcγRIB、およびFcγRICを含むFcγRI(CD64);アイソフォームFcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIICを含むFcγRII(CD32);ならびにアイソフォームFcγRIIIAおよびFcγRIIBを含むFcγRIII(CD16)を含む(Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65)。これらの受容体は、典型的に、Fcへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内でいくつかのシグナル伝達事象を媒介する可能性がある細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、血小板、B細胞、大型顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、およびT細胞を含む、様々な免疫細胞において発現される。Fc/FcγR複合体の形成は、結合した抗原の部位にこれらのエフェクター細胞を動員し、典型的に、炎症媒介物質の放出、B細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、および細胞傷害性攻撃などの細胞内でのシグナル伝達事象および続く重要な免疫応答をもたらす。細胞傷害性および食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が、標的細胞を破壊する、可能性として考えられるメカニズムである。FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)と呼ばれる(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290)。FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて、標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介性反応は、抗体依存性細胞媒介性食作用(ADCP)と呼ばれる。さらに、分子のFc領域上の重複する部位もまた、その他に補体依存性細胞傷害(CDC)として知られている、補体によって媒介される細胞非依存的細胞傷害性機能の活性化を調節する。
【００１１】
2.1.4 異なるタイプのヒトFcγR:
ヒトFcγRは、3つの別個のクラスに分類される:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、およびFcγRIII(CD16)。FcγRIは、高親和性受容体(Ka:10-8〜10-9M-1)であり、免疫複合体および単量体IgG分子の両方に結合するが、Fc受容体FcγRIIおよびFcγRIIIは、より低い親和性(それぞれ<10-7M-1および2〜3×10-7)を示す(Gessner J.E. et al., 1998, Annn Hematology 76:231-48)。FcγRを通してのシグナル伝達は、すべての膜貫通型受容体について、免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)または免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)のいずれかを通してのものである(Presta 2006, Adv Drug Deli Rev 58:640-656)。
【００１２】
72kDaの細胞外糖タンパク質であるFcγRIは、単球、マクロファージのCD4+前駆細胞などの骨髄性細胞上で主に発現され、ADCC、エンドサイトーシス、および食作用の応答を誘発する可能性がある(Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111-118)。
【００１３】
40kDaのFcγRIIグループの受容体(A、B、およびCアイソフォーム)は、細胞外ドメインを示すが、活性情報伝達ドメインを含有していない。これらの受容体は、細胞質側末端ドメインのリン酸化を通してシグナルを伝える(Amigorena S. et al., 1992 Science. 256:1808-12)。FcγRIIAは、単球、マクロファージ、好中球、および血小板上で主に発現するが、FcγRIIC受容体は、NK細胞上で同定されたのみである。これらの2つの受容体は、ADCC、エンドサイトーシス、食作用、および炎症性媒介物質放出を起こさせることが示された(Cassel et al. 1993. Mol Immunol 30:451-60)。対照的に、FcγRIIB(B1およびB2タイプ)受容体は、B細胞、肥満細胞、好塩基球、単球、マクロファージ、および樹状細胞上で発現され、AおよびCアイソフォームによって引き起こされる免疫応答をダウンレギュレートすることが示された。
【００１４】
50kDaのFcγRIIIAは、NK細胞、単球、マクロファージ、およびTリンパ球のサブセット上で発現され、そこで、それは、ADCC、食作用、エンドサイトーシス、およびサイトカイン放出を活性化する(Gessner et al.)。FcγRIIIBアイソフォームは、脱顆粒および活性酸素中間体の産生に関与するグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー表在性膜タンパク質である(Salmon J.E. et al. 1995 J Clin Inves 95:2877-85)。
【００１５】
IgG分子はまた、FcγRに対して示差的なアイソタイプ特異性をも示す。IgG3分子は、すべてのFcγRアイソフォームに強く結合する。IgG1は、血液中で最も一般的なアイソフォームであり、FcγRIIA/Bアイソフォームに対する親和性はより低いものであるが、すべてのFcγRに結合する。IgG4は、FcγRIに対する中程度のバインダーであり、FcγRIIBに対する弱いバインダーである。最後に、IgG2は、FcγRIIAの1つの対立遺伝子形態 (FcγRIIA-H131)にわずかに弱く結合する(Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111-118)。
【００１６】
2.1.5 補体
補体炎症性カスケードは、先天性免疫応答の一部であり、個人が感染を避ける能力にとって重大である。他の重要なFcリガンドは、補体タンパク質C1qである。C1qへのFcの結合は、補体依存性細胞傷害(CDC)と呼ばれるプロセスを媒介する(Ward et al., 1995, Ther Immunol 2:77-94において概説される)。C1qは、6つの抗体に結合することができるが、2つのIgGへの結合は、補体カスケードを活性化するのに十分である。C1qは、補体経路のC1複合体を形成するために、C1rおよびC1sセリンプロテアーゼと複合体を形成する。
【００１７】
2.1.6 FcγR結合に関与する、IgGの領域およびアミノ酸残基
異なるFcγRに対するヒトIgG結合部位のマッピングは、広く研究されてきた。遺伝子改変IgG分子に基づくこれらの研究は、CH2ドメインのN末端部分のアミノ酸残基の短い連続的なストレッチ(234〜238)を、すべてのFcγRへの結合に直接関与するものとして同定した。さらに、残基268、297、327、および329は、FcγRのサブセットへの結合に影響を与える可能性がある。さらに、CH2およびCH3ドメインに位置する多数の残基もまた、FcγR結合に寄与する(Canfield SM. et al., 1991 J Exp Med 173:1483-91,Chappel MS. Et al. 1991, Proc Nat Acad Sci USA 888:9036-40,Gergely J. et al. 1990 FASEB J 4:3275-83)。
【００１８】
2.2 抗体治療薬関連性の毒性
多くの環境において、免疫グロブリンのFc領域によって媒介されるエフェクター機能の結合および刺激は、非常に有益であるが、ある場合において、エフェクター機能を減少させるかまたは排除することがより有利となる可能性がある。これは、標的細胞に薬剤(例えば毒素および同位体)を送達するように設計されたそれらの抗体に特に該当し、ここで、Fc/FcγR媒介性エフェクター機能が健常な免疫細胞を有害なペイロード(payload)の近くに導き、標的細胞と共に正常なリンパ組織の枯渇をもたらす(Hutchins et al., 1995, PNAS USA 92:11980-11984; White et al., 2001, Annu Rev Med 52:125-145)。これらの症例において、補体またはエフェクター細胞の動員が不十分な抗体の使用は、すばらしい利点となるであろう(例えばWu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Shields et al., 2001, J. Biol Chem 276:6591-6604; U.S. 6,194,551; U.S. 5,885,573、およびPCT公開WO 04/029207を参照されたい)。
【００１９】
他の場合において、例えば、広く発現される受容体とその関連するリガンドとの相互作用の遮断が目的である場合、不必要な毒性を低下させるために、すべての抗体エフェクター機能を減少させるかまたは排除することは有利となるであろう。さらに、治療用抗体が、多くのヒト組織にわたって無差別な結合を示す場合、毒性を制限するために、組織の多様なセットに対するエフェクター機能のターゲティングを制限することは賢明であろう。特異的なエフェクター機能を欠くヒト免疫グロブリンのある種のサブクラスがあるが、すべてのエフェクター機能を欠く、知られている、天然に存在する免疫グロブリンはない。代替のアプローチは、エフェクター機能を担う、Fc領域における決定的な残基を遺伝子工学的に作製するまたは突然変異させることであろう。例えば、それぞれその全体が参照により組み込まれるPCT公開WO2006076594、WO199958572、US20060134709、WO2006047350、WO2006053301、およびU.S. 5,624,821を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】U.S. 6,194,551
【特許文献２】U.S. 5,885,573
【特許文献３】WO 04/029207
【特許文献４】WO2006076594
【特許文献５】WO199958572
【特許文献６】US20060134709
【特許文献７】WO2006047350
【特許文献８】WO2006053301
【特許文献９】U.S. 5,624,821
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Hardy et al. (2001) Blood 97:473
【非特許文献２】Cutrone and Langer (2001) J. Biol. Chem. 276:17140
【非特許文献３】Weissmann and Weber (1986) Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol., 33:251-300
【非特許文献４】Streuli et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2848
【非特許文献５】Agnet M. et al. in "Interferon 5" Ed. I. Gresser p. 1-22, Academic Press, London 1983
【非特許文献６】Uze et. al. (1990) Cell 60:225; Novick et al. (1994) Cell 77:391
【非特許文献７】Cutrone et al. 2001 J. Bio Chem 276(20):17140-8
【非特許文献８】Cook et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:13448
【非特許文献９】Lewerenz et al. (1998) J. Mol. Biol. 282:585
【非特許文献１０】Haller et al. (1981) J. Exp. Med. 154:199
【非特許文献１１】Lindenmann et al. (1981) Methods Enzymol. 78:181
【非特許文献１２】Brinkmann et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1655
【非特許文献１３】Finkelman et al. (1991) J. Exp. Med. 174:1179
【非特許文献１４】Santini et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777
【非特許文献１５】Tough et al. (1996) Science 272:1947
【非特許文献１６】Santini, et al. (2000) J. Exp. Med. 191:1777
【非特許文献１７】Luft et al. (1998) J. Immunol. 161:1947
【非特許文献１８】Luft et al. (2002) Int. Immunol. 14:367
【非特許文献１９】Radvanyi et al. (1999) Scand. J. Immunol. 50:499
【非特許文献２０】Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423
【非特許文献２１】Hooks et al. (1982) Arthritis Rheum. 25:396
【非特許文献２２】Hertzog et al. (1988) Clin. Immunol. Immunopathol. 48:192
【非特許文献２３】Hopkins and Meager (1988) Clin. Exp. Immunol. 73:88
【非特許文献２４】Arvin and Miller (1984) Arthritis Rheum. 27:582
【非特許文献２５】Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220
【非特許文献２６】Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290
【非特許文献２７】Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65
【非特許文献２８】Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220
【非特許文献２９】Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766
【非特許文献３０】Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290
【非特許文献３１】Gessner J.E. et al., 1998, Annn Hematology 76:231-48
【非特許文献３２】Presta 2006, Adv Drug Deli Rev 58:640-656
【非特許文献３３】Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111-118
【非特許文献３４】Cassel et al. 1993. Mol Immunol 30:451-60
【非特許文献３５】Salmon J.E. et al. 1995 J Clin Inves 95:2877-85
【非特許文献３６】Siberil et al. 2006, J Immunol Lett 106:111-118
【非特許文献３７】Ward et al., 1995, Ther Immunol 2:77-94
【非特許文献３８】Canfield SM. et al., 1991 J Exp Med 173:1483-91
【非特許文献３９】Chappel MS. Et al. 1991, Proc Nat Acad Sci USA 888:9036-40
【非特許文献４０】Gergely J. et al. 1990 FASEB J 4:3275-83
【非特許文献４１】Hutchins et al., 1995, PNAS USA 92:11980-11984
【非特許文献４２】White et al., 2001, Annu Rev Med 52:125-145
【非特許文献４３】Wu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26
【非特許文献４４】Shields et al., 2001, J. Biol Chem 276:6591-6604
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
多くの疾患状態の治療におけるモノクローナル抗体の使用は、十分に立証されてきた。抗体が引き起こし得る無数のエフェクター機能がある場合、抗体治療薬の必要条件のうちの1つは、それらが、対象とする標的を特異的に標的とすることである。例えば、これに限定されないが、標的組織の特異性は、対象とする組織の免疫組織化学(IHC)を検査することによって分析される。治療薬が対象とする標的を含有する組織にのみ結合することは重要である。そうしなければ、非標的部位で誘発されるエフェクター機能の不適切な活性化により、抗体治療薬のより高い毒性をもたらし得る。エフェクター機能を縮小するかまたは消失させることができる場合、治療薬の広範囲の結合の危険性を回避することができる。これらをすべて考慮すると、エフェクター機能の促進を担う、少なくとも1つのFcリガンドに対する低下または消失した親和性を有する抗体についての未解決の必要性がある。そのような抗体は、慢性炎症および自己免疫状態の治療における使用のために特に有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本明細書における参考文献の引用または論述は、そのようなものが本発明に対する先行技術であることを認めるものと解釈されないものとする。
【００２４】
発明を例示する目的で、発明に関する特定の実施形態を図面に表す。しかし本発明は図面に表された実施形態の正確な構成および手段に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】CDR領域をオーバーラインで示した、3F11 VHの核酸(配列番号7)およびアミノ酸(配列番号8)の配列アライメントを示す図である。
【図１Ｂ】概説したCDR領域をオーバーラインで示した、3F11 VKの核酸(配列番号9)およびアミノ酸(配列番号10)の配列アライメントを示す図である。
【図２Ａ】概説したCDR領域をオーバーラインで示した、4G5 VHの核酸(配列番号17)およびアミノ酸(配列番号18)の配列アライメントを示す図である。
【図２Ｂ】概説したCDR領域をオーバーラインで示した、4G5 VKの核酸(配列番号19)およびアミノ酸(配列番号20)の配列アライメントを示す図である。
【図３Ａ】概説したCDR領域をオーバーラインで示した、11E2 VHの核酸(配列番号27)およびアミノ酸(配列番号28)の配列アライメントを示す図である。
【図３Ｂ】(概説したCDR領域をオーバーラインで示した、11E2 VKの核酸(配列番号29)およびアミノ酸(配列番号30)の配列アライメントを示す図である。
【図４Ａ】概説したCDR領域をオーバーラインで示した、9D4 VHの核酸(配列番号37)およびアミノ酸(配列番号38)の配列アライメントを示す図である。
【図４Ｂ】概説したCDR領域をオーバーラインで示した、9D4 VKの核酸(配列番号39)およびアミノ酸(配列番号40)の配列アライメントを示す図である。
【図５】9D4に関する重鎖定常領域のアミノ酸配列アライメントを示す図である。矢印は、安定性増加および少なくとも1つのFcリガンドに対する親和性低下のためのアミノ酸置換(未改変から改変)を示す。
【図６Ａ】様々な抗IFNAR1抗体で処理した、ヒト大脳組織の免疫組織化学的染色プロファイルを示す図である。9D4抗体は、ヒト大脳組織とともにインキュベートした場合、4G5およびMDX-1333抗体と比較して低い染色プロファイルを示す。
【図６Ｂ】様々な抗IFNAR1抗体で処理した、ヒト単球の免疫組織化学的染色プロファイルを示す図である。陽性対照として、様々な抗IFNAR1抗体を、ヒト単球に対する反応性に関して試験した。
【図７】STAT活性化アッセイに基づいて、抗IFNAR1抗体9D4が、細胞においてIFNαのシグナル伝達を阻害することを示す図である。市販のSTAT抗体を用いたウェスタンブロット分析により決定した場合、抗体9D4を用いた処理により、インターフェロンαの刺激に応答したSTAT 1/3/4のチロシンリン酸化が阻害される。
【図８】抗IFNAR1抗体が、様々な濃度のpDC細胞由来のI型IFNのシグナル伝達を遮断することを示す図である。3名の独立したドナーから精製したI型IFN上清を利用するルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、IFNシグナル伝達を遮断する抗体9D4に関するIC50値を提示する。個々の精製I型インターフェロン上清中のIFNα、IFNβおよびIFNωの相対量が含まれる。
【図９−１】(A、B、C)抗IFNAR1抗体9D4、9D4-DM(二重突然変異体(Double Mutant))および9D4-TM(三重突然変異体(Triple Mutant))が、同様の結合特性を示すことを示す図である。未改変9D4抗体ならびに2種の改変抗体、9D4-DMおよび9D4-TMを表すデータを提示する。改変抗体は、未改変抗体と同様のIFNAR1結合特性を示す。
【図９−２】(A、B、C)抗IFNAR1抗体9D4、9D4-DM(二重突然変異体(Double Mutant))および9D4-TM(三重突然変異体(Triple Mutant))が、同様の結合特性を示すことを示す図である。未改変9D4抗体ならびに2種の改変抗体、9D4-DMおよび9D4-TMを表すデータを提示する。改変抗体は、未改変抗体と同様のIFNAR1結合特性を示す。
【図９−３】(A、B、C)抗IFNAR1抗体9D4、9D4-DM(二重突然変異体(Double Mutant))および9D4-TM(三重突然変異体(Triple Mutant))が、同様の結合特性を示すことを示す図である。未改変9D4抗体ならびに2種の改変抗体、9D4-DMおよび9D4-TMを表すデータを提示する。改変抗体は、未改変抗体と同様のIFNAR1結合特性を示す。
【図１０Ａ】抗IFNAR1抗体9D4が、可溶性インターフェロンα受容体(sIFNαR1)に結合することを示す図である。9D4の可溶性インターフェロンα受容体に対する容量依存性結合を実証する、平衡結合データを提示する。
【図１０Ｂ】ヒトPBMCについての9D4のKdの決定を示す図である。ヒトPBMCに対する結合により測定された、9D4の解離定数の決定を提示する。
【図１１】ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、抗IFNAR1抗体が、IFNα誘導性シグナル伝達を阻害することを示す図である。ルシフェラーゼレポーターアッセイシステムにおいて、未改変抗体および改変抗体を含む抗IFNAR1抗体は、白血球IFNのシグナル伝達遮断に関して同様のIC50値を示す。
【図１２Ａ】9D4(未改変)および改変9D4抗体の等電点の決定を示す図である。9D4 WT(未改変)、9D4-DMおよび9D4-TM抗体に関する相対的pI値を記録するIEFゲルを提示する。
【図１２Ｂ】9D4抗体(未改変)および改変9D4抗体の熱融解温度の決定を示す図である。9D4、9D4-DMおよび9D4-TM抗体に関する相対融解温度(Tm)を記録する融解回復を提示する。
【図１３】抗IFNAR抗体を用いた予防的処置により、Adv-IFNα誘導性タンパク尿が阻害されることを示す図である。対照ベクター、Adv-IFNα、Adv-IFNα+アイソタイプ対照予備処置およびAdv-IFNα+抗IFNARによる予備処置を用いて処置したマウスを、9週間にわたってタンパク尿に関して分析した。抗IFNARを用いて予備処置したマウスは、IFNαの曝露後、タンパク尿を示さなかった。
【図１４】抗IFNAR抗体を用いた予防的処置により、血液中でIFNα応答遺伝子(IFIT1、IFI44、CXCL11、IFI202b、CXCL19、CXCL9)のアップレギュレーションが阻害されることを示す図である。抗IFNAR抗体を用いて予備処置したマウスは、対照ウイルス、PBSまたはアイソタイプIgG対照を用いて予備処置したマウスと比較して、アデノウイルスによりコードされたIFNαの曝露に対して、選択されたIFNα応答遺伝子のアップレギュレーションを示さなかった。Adv-IFNαの感染によるIFNαの誘導3週間後にマウスから採取された血液試料中の、IFNαに対して応答性であることが知られている6種の遺伝子の相対的発現を提示する。
【図１５】(A、B)抗IFNAR抗体を用いた予防的処置により、IFNα誘導性自己抗体産生が阻害されることを示す図である。抗IFNAR抗体を用いて予備処置したマウスは、対照ウイルス、PBSまたはアイソタイプIgG対照を用いて予備処置したマウスと比較して、アデノウイルスによりコードされたIFNαの曝露に対して、自己抗体産生の上昇を示さなかった。Adv-IFNαの感染によるIFNαの誘導6週間後にマウスから採取された血液試料中の、抗dsDNAおよび抗SSA/Roの濃度を提示する。
【図１６】(A、B)抗IFNAR抗体を用いた予防的処置により、腎臓におけるサイトカインのアップレギュレーションが阻害されることを示す図である。抗IFNAR抗体を用いて予備処置したマウスは、対照ウイルス、PBSまたはアイソタイプIgG対照を用いて予備処置したマウスと比較して、アデノウイルスによりコードされたIFNα5の曝露に対して、腎臓におけるサイトカインのアップレギュレーションを示さなかった。Adv-IFNα5の感染によるIFNαの誘導6週間後にマウスから採取された腎臓試料中のIP-10およびIL-18の測定結果を提示する。
【図１７】抗IFNAR抗体を用いた予防的処置により、IFN誘導性自己抗体産生が阻害されることを示す図である。マウス血清由来の抗核抗原(ANA)抗体の相対力価を提示する。抗IFNAR抗体を用いて予備処置したマウスは、IFNの曝露後、対照ウイルス、PBSまたはアイソタイプ対照を用いて予備処置したマウスより低いANA血清力価を示した。
【図１８】抗体が、SLE血漿媒介性の樹状細胞の発達の阻害を媒介したことを示す図である。SLE患者に由来するIFNを抗IFNAR1抗体9D4の存在下でインキュベートし、その後ヒト単球に加えた5つの個別実験の結果を提示する。抗IFNAR1抗体9D4の存在は、SLE患者に由来するIFNが分化中の単球において樹状細胞マーカーのCD38およびCD123を誘導する能力を阻害した。
【図１９−１】抗IFNAR1抗体が、白血球インターフェロンにより刺激された単球において、CD38、CD123およびCD86の発現を抑制することを示す図である。対照刺激発現に対する抑制割合により測定した場合、抗IFNAR1抗体9D4、9D4-DMおよび9D4-TMは、分化中の単球において、CD38、CD123およびCD86の発現に関して同様の阻害プロファイルを示した。
【図１９−２】抗IFNAR1抗体が、白血球インターフェロンにより刺激された単球において、CD38、CD123およびCD86の発現を抑制することを示す図である。対照刺激発現に対する抑制割合により測定した場合、抗IFNAR1抗体9D4、9D4-DMおよび9D4-TMは、分化中の単球において、CD38、CD123およびCD86の発現に関して同様の阻害プロファイルを示した。
【図１９−３】抗IFNAR1抗体が、白血球インターフェロンにより刺激された単球において、CD38、CD123およびCD86の発現を抑制することを示す図である。対照刺激発現に対する抑制割合により測定した場合、抗IFNAR1抗体9D4、9D4-DMおよび9D4-TMは、分化中の単球において、CD38、CD123およびCD86の発現に関して同様の阻害プロファイルを示した。
【図２０】改変抗IFNAR1抗体が、未改変抗IFNAR1抗体と比較してFc受容体FcγRIに対する結合の低下を示すことを示す図である。抗IFNAR1抗体9D4(未改変)、9D4-DM(改変)および9D4-TM(改変)を、ELISA実験において、プレート結合FcγRIに結合する能力に関して分析した。Fc受容体結合に関する陽性対照として、無関係な未改変抗体(対照抗体)を使用した。
【図２１Ａ】(A、B、C)改変抗IFNAR1抗体が、未改変抗IFNAR1抗体と比較して、Fc受容体FcγRIIIAに対する結合の低下を示すことを示す図である。プレート結合未改変抗IFNAR1抗体9D4(A)ならびに改変抗IFNAR1抗体9D4-DM(B)および9D4-TM(C)を、ELISA実験のフォーマットにおいて、遊離のFcγRIIIAに結合する能力に関して分析した。
【図２１Ｂ】(A、B、C)改変抗IFNAR1抗体が、未改変抗IFNAR1抗体と比較して、Fc受容体FcγRIIIAに対する結合の低下を示すことを示す図である。プレート結合未改変抗IFNAR1抗体9D4(A)ならびに改変抗IFNAR1抗体9D4-DM(B)および9D4-TM(C)を、ELISA実験のフォーマットにおいて、遊離のFcγRIIIAに結合する能力に関して分析した。
【図２１Ｃ】(A、B、C)改変抗IFNAR1抗体が、未改変抗IFNAR1抗体と比較して、Fc受容体FcγRIIIAに対する結合の低下を示すことを示す図である。プレート結合未改変抗IFNAR1抗体9D4(A)ならびに改変抗IFNAR1抗体9D4-DM(B)および9D4-TM(C)を、ELISA実験のフォーマットにおいて、遊離のFcγRIIIAに結合する能力に関して分析した。
【図２２Ａ】(A、B、C)改変抗IFNAR1抗体が、Fc受容体FcγRIIIAに対する結合の低下を示すことを示す図である。遊離の未改変抗IFNAR1抗体9D4(A)ならびに改変抗IFNAR1抗体9D4-DM(B)および9D4-TM(C)を、ELISA実験のフォーマットにおいて、プレート結合FcγRIIIAに結合する能力に関して分析した。
【図２２Ｂ】(A、B、C)改変抗IFNAR1抗体が、Fc受容体FcγRIIIAに対する結合の低下を示すことを示す図である。遊離の未改変抗IFNAR1抗体9D4(A)ならびに改変抗IFNAR1抗体9D4-DM(B)および9D4-TM(C)を、ELISA実験のフォーマットにおいて、プレート結合FcγRIIIAに結合する能力に関して分析した。
【図２２Ｃ】(A、B、C)改変抗IFNAR1抗体が、Fc受容体FcγRIIIAに対する結合の低下を示すことを示す図である。遊離の未改変抗IFNAR1抗体9D4(A)ならびに改変抗IFNAR1抗体9D4-DM(B)および9D4-TM(C)を、ELISA実験のフォーマットにおいて、プレート結合FcγRIIIAに結合する能力に関して分析した。
【図２３−１】(A〜E)SLE患者の血清における、IFNサブタイプの中和を示す図である。レポーターアッセイにより測定した場合、抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4-WTおよび9D4-TMは、α10(A)、白血球インターフェロン(B)、α2b(C)、ω(D)およびβ(E)のIFN媒介性シグナル伝達を阻害した。
【図２３−２】(A〜E)SLE患者の血清における、IFNサブタイプの中和を示す図である。レポーターアッセイにより測定した場合、抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4-WTおよび9D4-TMは、α10(A)、白血球インターフェロン(B)、α2b(C)、ω(D)およびβ(E)のIFN媒介性シグナル伝達を阻害した。
【図２３−３】(A〜E)SLE患者の血清における、IFNサブタイプの中和を示す図である。レポーターアッセイにより測定した場合、抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4-WTおよび9D4-TMは、α10(A)、白血球インターフェロン(B)、α2b(C)、ω(D)およびβ(E)のIFN媒介性シグナル伝達を阻害した。
【図２３−４】(A〜E)SLE患者の血清における、IFNサブタイプの中和を示す図である。レポーターアッセイにより測定した場合、抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4-WTおよび9D4-TMは、α10(A)、白血球インターフェロン(B)、α2b(C)、ω(D)およびβ(E)のIFN媒介性シグナル伝達を阻害した。
【図２４】抗IFNAR1抗体が、SLE患者由来のI型インターフェロンを中和することを示す図である。レポーターアッセイにより、抗IFNAR1抗体9D4は、対照の無関係な抗体と比較して、I型インターフェロン媒介性シグナル伝達を阻害した。
【図２５】(A〜D)抗IFNAR抗体が、PBMCにおいて、IFNα誘導性pDC集団を抑制することを示す図である。抗IFNAR抗体は、細胞表面エピトープの発現により測定される、脾臓(A)、リンパ節(B)、末梢血(C)および骨髄(D)における、インターフェロンαの異所性アデノウイルス誘導性発現により誘導されるpDC細胞の増加を阻害した。
【図２６】抗IFNAR1抗体9D4-WT、9D4-DMおよび9D4-TMの、Fc受容体であるFcγRIに対する結合分析を、BIACore分析により測定したことを示す図である。簡潔に言うと、抗IFNAR1抗体を固定化し、遊離のFcγRIを加え、親和性を測定した。トレースにより実証されるように、改変抗体9D4-DMおよび9D4-TMは、未改変9D4-WT抗体と比較して、遊離のFcγRIに対して低い親和性を示した。
【図２７Ａ】(A〜C)抗IFNAR1抗体9D4-WT、9D4-DMおよび9D4-TMの、Fc受容体であるFcγRIに対する結合分析を、BIACore分析により測定したことを示す図である。簡潔に言うと、遊離の抗IFNAR1抗体を固定化FcγRIに通し、親和性を測定した。トレースにより実証されるように、改変抗体9D4-DM(B)および9D4-TM(C)は、未改変9D4-WT(A)抗体と比較して、固定化FcγRIに対して低い親和性を示した。
【図２７Ｂ】(A〜C)抗IFNAR1抗体9D4-WT、9D4-DMおよび9D4-TMの、Fc受容体であるFcγRIに対する結合分析を、BIACore分析により測定したことを示す図である。簡潔に言うと、遊離の抗IFNAR1抗体を固定化FcγRIに通し、親和性を測定した。トレースにより実証されるように、改変抗体9D4-DM(B)および9D4-TM(C)は、未改変9D4-WT(A)抗体と比較して、固定化FcγRIに対して低い親和性を示した。
【図２７Ｃ】(A〜C)抗IFNAR1抗体9D4-WT、9D4-DMおよび9D4-TMの、Fc受容体であるFcγRIに対する結合分析を、BIACore分析により測定したことを示す図である。簡潔に言うと、遊離の抗IFNAR1抗体を固定化FcγRIに通し、親和性を測定した。トレースにより実証されるように、改変抗体9D4-DM(B)および9D4-TM(C)は、未改変9D4-WT(A)抗体と比較して、固定化FcγRIに対して低い親和性を示した。
【図２８】抗IFNAR抗体が、腎臓においてIFNα応答遺伝子の誘導を阻害することを示す図である。簡潔に言うと、進行ループスマウスモデルにおいて、抗IFNAR抗体を用いた処置により、IFNαの異所的発現により媒介される6種の遺伝子(ICAM1、VCAM1、CXCL9、CXCL10およびIFIT1)の腎臓における誘導が、Taqmanアッセイにより測定した場合、対照マウスと比較して阻害される。
【図２９】抗IFNAR抗体が、進行ループスマウスモデルにおいて、抗dsDNA抗体の産生を阻害することを示す図である。簡潔に言うと、IFNαを異所的に発現し、抗IFNAR抗体を用いて処置されたマウスは、同様に感染し、IgG対照抗体を用いて処置されたマウスと同じレベルに抗dsDNA抗体を蓄積しなかった。
【図３０】抗IFNAR抗体が、進行ループスマウスモデルの治療設定において、タンパク尿を減少させることができることを示す図である。(A)簡潔に言うと、IFNαを異所的に発現するマウスは、タンパク尿などのループス様症状を発症した。治療研究において、タンパク尿スコアの閾値に達したら、抗IFNAR抗体をマウスに投与した。抗IFNAR抗体、PBSまたは対照IgGを、5週間の時間経過にわたって週2回投与した。抗IFNAR抗体処置群は、PBSのみ、または対照IgG処置群と比較して、実験期間にタンパク尿の重症度の低下を示した。
【図３１】抗IFNAR抗体が、進行ループスマウスモデルの治療設定において、生存率を上昇させることができることを示す図である。(A)簡潔に言うと、IFNαを異所的に発現するマウスは、タンパク尿などのループス様症状を発症後約8週間での生存率が低下した。治療的研究において、タンパク尿スコアの閾値に達したら、抗IFNAR抗体をマウスに1回投与した。抗IFNAR抗体、PBSまたは対照IgGを、5週間の時間経過にわたって、週2回投与した。5週間後、抗体処置を停止し、3種の処置群すべてに関して死亡率を追跡した。抗IFNAR抗体処置群は、PBS単独または対照IgG群より非常に低い死亡率を示し、PBS単独または対照IgG群は双方とも9週目までに完全な死亡率を示した。
【図３２】L234F/L235E/P331S突然変異を含むFc-TMの結晶の非対照ユニットの内容を表示する図である。突然変異P331を、赤で示す。1つの亜鉛イオンが、2つの空間的に隣接するヒスチジン残基によりキレートされている。297位に結合した炭水化物残基を、それらの電子密度に従ってモデル化した。
【図３３】動態画像が9D4-TMの内在化を実証することを示す図である。THP-1細胞を、1μMのCFSEを用いて、37℃のCO2インキュベーターで10分間、その後1μg/mlのAlexa647-9D4-TMを用いて氷上で1時間染色した。非結合物を除去後、細胞を、37℃において表示の時間(0、15、30および60分)インキュベートし、細胞の画像を撮影した。
【図３４】抗IFNAR1抗体9D4-TMが、in vitroアッセイにおいて、CDC活性を示さないことを示す図である。このパネルにおいて、CDC活性を誘発する9D4-TM抗体の能力を決定するための、CDCアッセイの結果を提示する。提示のように、9D4-TM抗体は、陽性対照抗体と比較して、CDC活性を少しも示さなかった。CDC活性はまた、無関係な対照抗体のR347に関しても検出不能であった。簡潔に言うと、IFNAR1抗原を発現する細胞を、陽性対照抗体、9D4-TMまたはR347のいずれかとともにインキュベートした。一連の洗浄後、新鮮に調製したヒト血清を加えた。補体依存性細胞傷害(CDC)を、LDH放出アッセイを使用して測定した。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
4. 用語
用語「インターフェロンα」、「IFNα」、「IFNa」、「IFNA」、および「IFNアルファ」は、区別なく使用され、IFNα1(GenBank登録番号NP_076918またはGenBank登録番号NM_024013によってコードされるタンパク質)に対する75％またはそれ以上の配列同一性を有する、インターフェロンα遺伝子座の機能的遺伝子によってコードされるIFNαタンパク質を指すものと意図される。IFNαサブタイプの例は、IFNα1、α2a、α2b、α4、α4b、α5、α6、α7、α8、α10、α13、α14、α16、α17、およびα21を含む。用語「インターフェロンα」、「IFNα」、および「IFNアルファ」は、様々なIFNαサブタイプの組換え形態ならびに白血球IFNおよびリンパ芽球様IFNなどのIFNαタンパク質を含む天然に存在する調製物を包含するものと意図される。
【００２７】
用語「インターフェロンα受容体1」、「IFNAR1」、「IFNAR-1」、および「IFNAR-1抗原」は、区別なく使用され、ヒトIFNAR-1の変異体、アイソフォーム、生物種相同体、およびIFNAR-1と少なくとも1つの共通のエピトープを有する類似体を含む。したがって、本発明のヒト抗体は、ある実施形態において、ヒト以外の生物種からのIFNAR-1またはヒトIFNAR-1と構造的に関連する他のタンパク質(例えばヒトIFNAR-1相同体)と交差反応してもよい。他の実施形態において、抗体は、ヒトIFNAR-1に完全に特異的であってもよく、生物種または他のタイプの交差反応性を示さない。ヒトIFNAR-1の完全cDNA配列は、Genbank登録番号NM_000629を有する。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に影響しないかまたはそれを変化させないアミノ酸改変を含むものと意図される。そのような保存的改変は、アミノ酸置換、付加、および欠失を含む。改変は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介性突然変異誘発などの、当技術分野において知られている標準的な技術によって、本発明の抗体の中に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似する側鎖を有するアミノ酸残基と交換されるものである。例えば、類似する極性の1つまたは複数のアミノ酸は、機能的等価物として作用し、ペプチドのアミノ酸配列内でサイレントな改変をもたらす。電荷中性であり、残基を、より小さな残基と交換する置換もまた、残基が異なるグループであっても(例えば、フェニルアラニンの、より小さなイソロイシンとの置換)、「保存的置換」と考えられてもよい。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されてきた。保存的アミノ酸置換のファミリーのいくつかの非限定的な例を表1に示す。
【表１】
0005608100.tif 000002
【００２９】
5. 詳細な説明
以前の教示とは対照的に、本発明者らは、低下または消失したエフェクター機能を有する抗IFNAR1抗体が、慢性自己免疫疾患および/または炎症性疾患の治療に望ましいことを見出した。これまで、IFNAR1に対する抗体は、エフェクター機能が、慢性自己免疫疾患状態および/または炎症性疾患状態の治療または少なくとも緩和を媒介するのに役割を果たすであろうという理解と共に開発された(例えば米国公開第20060029601号またはPCT公開WO06002177を参照されたい)。この概念を用いると、以前の教示の多くは、強いエフェクター機能を有する抗IFNAR1抗体を同定し、Fc受容体(例えばFcRn、FcγRIIIa、FcγRIIb)および/または補体タンパク質C1qに対する抗体の親和性を増加させることによってエフェクター機能をさらに増強するように当業者を指示するものであった。これらの結果として生じたエフェクター機能増強抗IFNAR1抗体は、疾患状態の治療において有利であると考えられた。
【００３０】
この、以前の理解とは対照的に、本発明は、低下または消失したエフェクター機能(ADCCおよび/またはCDCなど)を有する抗IFNAR1抗体を記載する。組織交差反応性研究を通して、驚いたことに、強いかまたは増強されたエフェクター機能を有する抗IFNAR1抗体は、非標的組織上に抗IFNAR1の染色が広く行きわたっていることにより、不必要な毒性の性質を示すことが分かった。この毒性は、不適切な部位でのADCCおよび/またはCDCの非特異的活性化に起因するであろう。この不必要な毒性を低下させるかまたは排除するために、本発明者らは、Fc領域を含むポリペプチドのエフェクター機能を低下させるための必要性を認識した。
【００３１】
したがって、本発明の一態様は、少なくとも1つのFcリガンドに対する低下または消失した親和性をもたらす、Fc領域に対する少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含む、改変抗体または抗体のFc領域を含む他のポリペプチドを包含する(本明細書において、「本発明の改変抗体」、「改変抗体」、または「本発明の抗体」と呼ばれる)。Fc領域は、Fc受容体(例えばFcRn、FcγRIIIa、FcγRIIb)、補体タンパク質C1q、ならびにプロテインAおよびGなどの他の分子を含むが、これらに限定されない多くのリガンドと相互作用する。これらの相互作用は、様々なエフェクター機能ならびに抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)および補体依存性細胞傷害(CDC)を含むがこれらに限定されない下流のシグナル伝達事象にとって不可欠である。したがって、一部の実施形態において、本発明の改変抗体は、本発明の抗体と同じアミノ酸配列を有するが、Fc領域に対する少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含まない抗体(本明細書において「未改変抗体」とも呼ばれる)と比較して、エフェクター機能の促進を担うFcリガンドに対する低下または消失した親和性を有する。ある実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも1つまたは複数の以下の特性を含む;低下または消失したエフェクター(ADCCおよび/またはCDC)機能、Fc受容体に対する低下または消失した結合、低下または消失した毒性。より具体的には、本発明の実施形態は、Fc受容体(例えばFcRn、FcγRIIIa、FcγRIIb)および/または補体タンパク質C1qに対する低下した親和性を有する抗IFNAR1抗体を提供する。
【００３２】
一実施形態において、本発明の抗体は、234、235、および331からなる位置から選択される、アミノ酸残基の少なくとも1つの付加、置換、または欠失を含むFc領域を含み、定常領域のナンバリングシステムは、Kabatらにおいて説明されるEUインデックスのナンバリングシステムである(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)。特定の実施形態において、本発明の抗体は、L234F、L235E、およびP331Sからなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸置換を含むFc領域を含み、第1の文字および数は、未改変アミノ酸およびその位置を表し、第2の文字は、上記位置での置換アミノ酸を表す。
【００３３】
他の実施形態において、本発明の抗体は、抗体の安定性の増加と関係する、アミノ酸残基の少なくとも1つの付加、置換、または欠失を含むFc領域をさらに含む。一実施形態において、アミノ酸残基の付加、置換、または欠失は、Fc領域の228位にあり、定常領域のナンバリングシステムは、Kabatらにおいて説明されるEUインデックスのナンバリングシステムである。特定の実施形態において、本発明の抗体は、228位でのアミノ酸置換を含むFc領域を含み、置換は、セリン残基である。他の特定の実施形態において、IgG4サブタイプの本発明の抗体は、Fc領域の228位にセリンのアミノ酸置換を含む。他の実施形態において、本発明の抗体は、既に、Fc領域の228位にセリン残基を含み、そのような実施形態において、改変は必要とされない。代替の実施形態において、本発明の抗体は、Fc領域の残基228の改変を必要とせず、または既に上記位置にセリンを含む。
【００３４】
他の実施形態において、本発明の抗体は、任意のクラスのいずれかであってもよい(例えば、これらに限定されないがIgG、IgM、およびIgE)。一部の実施形態において、本発明の抗体は、抗体のIgGクラスのメンバーである。特定の実施形態において、本発明の抗体は、IgG1サブクラスのものである。他の特定の実施形態において、本発明の抗体は、IgG1サブクラスのものであり、Fc領域の以下のアミノ酸置換:234F、235E、および331Sを含む。代替の実施形態において、本発明の抗体は、IgG4サブクラスのものである。特定の実施形態において、本発明の抗体は、IgG4サブクラスのものであり、Fc領域の以下のアミノ酸置換:S228PおよびL235Eを含む。
【００３５】
一部の実施形態において、本発明の改変抗体は、可変ドメインまたはその断片を、本明細書において開示される1つまたは複数のアミノ酸置換を含むFcドメインと組み合わせることによって産生することができる。他の実施形態において、本発明の改変抗体は、Fcドメインの中に1つまたは複数のアミノ酸置換残基を導入することによってFcドメイン含有抗体を改変することによって産生することができる。
【００３６】
5.1 Fcリガンドへの結合の低下
当業者は、本発明の抗体が、改変されたFcγRおよび/またはC1q結合特性を有していてもよい(未改変抗体と比較して)こと(結合特性の例は、結合特異性、平衡解離定数(KD)、解離および結合速度(それぞれKoffおよびKon)、結合親和性、ならびに/または結合活性を含むが、これらに限定されない)ならびにある種の改変が多かれ少なかれ望ましいことを理解するであろう。平衡解離定数(KD)は、koff/konとして定義されることが当技術分野において知られている。当業者は、どの反応速度パラメータが、所与の抗体適用に最も重要であるかを決定することができる。例えば、1つもしくは複数の正の制御因子(例えばFcγRIIIA)への結合を低下させ、かつ/または阻害性Fc受容体(例えばFcγRIIB)への結合を増強する改変は、ADCC活性を低下させるのに適する。したがって、結合親和性の比(例えば平衡解離定数(KD))は、本発明の抗体のADCC活性が増大するか減少するかを示すことができる。さらに、C1qへの結合を低下させる改変は、CDC活性を低下させるかまたは排除するのに適しているであろう。
【００３７】
そのリガンドに対するFc領域の親和性および結合特性は、平衡法(例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)もしくはラジオイムノアッセイ(RIA))または動態(例えばBIACORE(登録商標)分析)ならびに間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)、ゲル電気泳動、およびクロマトグラフィー(例えばゲル濾過)などの他の方法を含むが、これらに限定されない、Fc-FcγR相互作用、つまり、FcγRへのFc領域の特異的な結合を決定するための、当技術分野において知られている様々なin vitroアッセイ方法(生化学または免疫学ベースのアッセイ)によって決定することができる。これらおよび他の方法は、検査されている1つまたは複数の成分上の標識を利用してもよく、かつ/または発色性、蛍光性、発光、同位体標識を含むが、これらに限定されない様々な検出方法を用いてもよい。結合親和性および動態の詳細な説明は、Paul, W.E., ed., Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia (1999)において見出すことができる。
【００３８】
一実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、アイソフォームFcγRIA、FcγRIB、およびFcγRICを含むFcγRI(CD64); FcγRII(CD32、アイソフォームFcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIICを含む);ならびにFcγRIII(CD16、アイソフォームFcγRIIIAおよびFcγRIIBを含む)を含むが、これらに限定されない、1つまたは複数のFc受容体に対する低下した結合親和性を示す。一部の実施形態において、本発明の抗体は、未改変(例えば、野生型Fc領域を含有する)抗体と比較して、FcγRIIB受容体への結合における同時の増加を含まない。
【００３９】
一実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、FcγRIに対する減少した親和性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも2分の1、または少なくとも3分の1、または少なくとも5分の1、または少なくとも7分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも30分の1、または少なくとも40分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも60分の1、または少なくとも70分の1、または少なくとも80分の1、または少なくとも90分の1、または少なくとも100分の1、または少なくとも200分の1の、FcγRI受容体に対する親和性を示す。
【００４０】
他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、または少なくとも5％のFcγRI受容体に対する親和性を示す。
【００４１】
一実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、FcγRIIIA受容体に対する減少した親和性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも2分の1、または少なくとも3分の1、または少なくとも5分の1、または少なくとも7分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも30分の1、または少なくとも40分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも60分の1、または少なくとも70分の1、または少なくとも80分の1、または少なくとも90分の1、または少なくとも100分の1、または少なくとも200分の1の、FcγRIIIA受容体に対する親和性を示す。
【００４２】
他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、または少なくとも5％のFcγRIIIA受容体に対する親和性を示す。
【００４３】
FcγRIIIA受容体のF158V対立遺伝子変異体は、抗体に対する改変された結合特性を有することが当技術分野において理解される。一実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、FcγRIIIA(F158V)に対して減少した親和性で結合する。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも2分の1、または少なくとも3分の1、または少なくとも5分の1、または少なくとも7分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも30分の1、または少なくとも40分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも60分の1、または少なくとも70分の1、または少なくとも80分の1、または少なくとも90分の1、または少なくとも100分の1、または少なくとも200分の1の、FcγRIIIA(F158V)受容体に対する親和性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、または少なくとも5％のFcγRIIIA(FI58V)受容体に対する親和性を示す。
【００４４】
他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、FcγRIIB受容体に対する増加した親和性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、不変のまたは未改変抗体の少なくとも2倍、もしくは少なくとも3倍、もしくは少なくとも5倍、もしくは少なくとも7倍、もしくは少なくとも10倍、もしくは少なくとも20倍、もしくは少なくとも30倍、もしくは少なくとも40倍、もしくは少なくとも50倍、もしくは少なくとも60倍、もしくは少なくとも70倍、もしくは少なくとも80倍、もしくは少なくとも90倍、もしくは少なくとも100倍、もしくは少なくとも200倍増加した、FcγRIIB受容体に対する親和性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体よりも、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％増加した、FcγRIIB受容体に対する親和性を示す。
【００４５】
他の実施形態において、本発明の抗体は、約100nM〜約100μM、または約100nM〜約10μM、または約100nM〜約1μM、または約1nM〜約100μM、または約10nM〜約100μM、または約1μM〜約100μM、または約10μM〜約100μMの、FcγRI、FcγRIIIA、またはFcγRIIIA(F158V)受容体に対する親和性を示す。一部の実施形態において、本発明の抗体は、1μMよりも大きな、5μMよりも大きな、10μMよりも大きな、25μMよりも大きな、50μMよりも大きな、または100μMよりも大きな、FcγRI、FcγRIIIA、またはFcγRIIIA(F158V)受容体に対する親和性を示す。
【００４６】
他の実施形態において、本発明の抗体は、約100nM〜約100μM、または約100nM〜約10μM、または約100nM〜約1μM、または約1nM〜約100μM、または約10nM〜約100μM、または約1μM〜約100μM、または約10μM〜約100μMの、FcγRIIB受容体に対する親和性を示す。一部の実施形態において、本発明の抗体は、100μM未満の、50μM未満の、10μM未満の、5μM未満の、2.5μM未満の、1μM未満の、または100nM未満のもしくは10nM未満の、FcγRI、FcγRIIIA、またはFcγRIIIA(F158V)受容体に対する親和性を示す。
【００４７】
他の実施形態において、本発明の抗体は、約100nM〜約100μM、または約100nM〜約10μM、または約100nM〜約1μM、または約1nM〜約100μM、または約10nM〜約100μM、または約1μM〜約100μM、または約10μM〜約100μMの、FcγRIIB受容体に対する親和性を示す。一部の実施形態において、本発明の抗体は、100μM未満の、50μM未満の、10μM未満の、5μM未満の、2.5μM未満の、1μM未満の、または100nM未満のもしくは10nM未満の、FcγRI、FcγRIIIA、またはFcγRIIIA(F158V)受容体に対する親和性を示す。
【００４８】
5.2 低下したADCC活性
抗体が、総称して、抗体エフェクター機能として当技術分野において知られている多数のプロセスを通して、標的抗原の攻撃および破壊を指示することができることは、当技術分野において十分に知られている。「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ADCC」として知られているこれらのプロセスのうちの1つは、ある種の細胞傷害性細胞(例えばナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)上に存在するFc受容体(FcR)上に結合した分泌Igが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担持する標的細胞に特異的に結合し、続いて、細胞毒素を用いて標的細胞を死滅させることを可能にする細胞傷害の形態を指す。特異的な高親和性IgG抗体は、標的細胞の表面に細胞傷害性細胞の「アーム」を向け、そのような死滅に必要とされる。標的細胞の溶解は、細胞外のものであり、直接的な細胞間接触を必要とし、補体を伴わない。エフェクター機能という用語によって包含される他のプロセスは、補体系による抗体媒介性標的細胞破壊の生化学事象を指す補体依存性細胞傷害である(以後「CDC」と呼ぶ)。補体系は、抗体と結合して、病原菌および他の外来細胞を破壊する、正常な血漿において見つけられるタンパク質の複雑な系である。
【００４９】
任意の特定の抗体がADCCによる標的細胞の溶解を媒介する能力をアッセイすることができる。ADCC活性を評価するために、対象となる抗体を、抗原抗体複合体によって活性化され、標的細胞の細胞溶解をもたらすことができる免疫エフェクター細胞と組み合わせて標的細胞に添加する。細胞溶解は、溶解細胞からの標識(例えば放射性基質、蛍光性色素、または天然細胞内タンパク質)の放出によって一般に検出される。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞を含む。in vitro ADCCアッセイの特定の例は、Wisecarver et al., 1985 79:277-282; Bruggemann et al., 1987, J Exp Med 166:1351-1361; Wilkinson et al., 2001, J Immunol Methods 258:183-191; Patel et al., 1995 J Immunol Methods 184:29-38において記載されている。あるいは、またはさらに、対象となる抗体のADCC活性は、in vivoにおいて、例えば、Clynes et al., 1998, PNAS USA 95:652-656において開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。
【００５０】
本発明の抗体は、1つまたは複数のFcγR媒介性エフェクター細胞機能を決定するためのin vitro機能的アッセイによって特徴づけられることが企図される。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、in vivoモデル(本明細書において記載され、開示されるものなど)において、in vitroベースのアッセイと類似する結合特性およびエフェクター細胞機能を有する。しかしながら、本発明は、in vitroベースのアッセイにおいて望ましい表現型を示さないが、in vivoにおいて望ましい表現型を示す、本発明の抗体を除外しない。
【００５１】
一実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、減少したADCC活性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも2分の1、または少なくとも3分の1、または少なくとも5分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも100分の1のADCC活性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも300％、または少なくとも400％、または少なくとも500％低下したADCC活性を示す。ある実施形態において、本発明の抗体は、検出可能なADCC活性を有していない。特定の実施形態において、ADCC活性の低下および/または消失(ablatement)は、本発明の抗体がFcリガンドおよび/または受容体に対して示す、低下した親和性に起因し得る。
【００５２】
5.3 低下したCDC活性
補体活性化経路は、分子、例えば、関連する抗原と複合体を形成した抗体への、補体系の第1の成分(C1q)の結合によって起こされる。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods. 202:163において記載されるCDCアッセイが実行されてもよい。
【００５３】
一実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、C1qに対する減少した親和性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも2分の1、または少なくとも3分の1、または少なくとも5分の1、または少なくとも7分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも30分の1、または少なくとも40分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも60分の1、または少なくとも70分の1、または少なくとも80分の1、または少なくとも90分の1、または少なくとも100分の1、または少なくとも200分の1の、C1q受容体に対する親和性を示す。
【００５４】
他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、または少なくとも5％のC1qに対する親和性を示す。
【００５５】
他の実施形態において、本発明の抗体は、約100nM〜約100μM、または約100nM〜約10μM、または約100nM〜約1μM、または約1nM〜約100μM、または約10nM〜約100μM、または約1μM〜約100μM、または約10μM〜約100μMの、C1qに対する親和性を示す。ある実施形態において、本発明の抗体は、1μMよりも大きな、5μMよりも大きな、10μMよりも大きな、25μMよりも大きな、50μMよりも大きな、または100μMよりも大きな、C1qに対する親和性を示す。
【００５６】
一実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、減少したCDC活性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも2分の1、または少なくとも3分の1、または少なくとも5分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも100分の1のCDC活性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも300％、または少なくとも400％、または少なくとも500％低下したCDC活性を示す。ある実施形態において、本発明の抗体は、検出可能なCDC活性を示さない。特定の実施形態において、CDC活性の低下および/または消失は、本発明の抗体がFcリガンドおよび/または受容体に対して示す、低下した親和性に起因し得る。
【００５７】
5.4 抗体関連毒性の低下
生物学的療法は、不必要な細胞および/または標的を認識し、攻撃するように免疫系を指示する複雑な性質と関連する、有害な毒性の問題を有する可能性があることが当技術分野において理解される。攻撃のための認識および/またはターゲティングが、治療が必要とされるところで起こらないと、有害な毒性などの影響が生じる可能性がある。例えば、非標的組織の抗体染色は、可能性として考えられる毒性の問題を示す可能性がある。
【００５８】
一実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、低下した非標的組織の染色を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも2分の1、または少なくとも3分の1、または少なくとも5分の1、または少なくとも7分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも30分の1、または少なくとも40分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも60分の1、または少なくとも70分の1、または少なくとも80分の1、または少なくとも90分の1、または少なくとも100分の1、または少なくとも200分の1の、低下した非標的組織の染色を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも300％、または少なくとも400％、または少なくとも500％低下した非標的組織の染色を示す。
【００５９】
一実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、低下した抗体関連毒性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体の少なくとも2分の1、または少なくとも3分の1、または少なくとも5分の1、または少なくとも7分の1、または少なくとも10分の1、または少なくとも20分の1、または少なくとも30分の1、または少なくとも40分の1、または少なくとも50分の1、または少なくとも60分の1、または少なくとも70分の1、または少なくとも80分の1、または少なくとも90分の1、または少なくとも100分の1、または少なくとも200分の1の毒性を示す。他の実施形態において、本発明の抗体は、未改変抗体と比較して、少なくとも10％、または少なくとも20％、または少なくとも30％、または少なくとも40％、または少なくとも50％、または少なくとも60％、または少なくとも70％、または少なくとも80％、または少なくとも90％、または少なくとも100％、または少なくとも200％、または少なくとも300％、または少なくとも400％、または少なくとも500％低下した毒性を示す。
【００６０】
5.5 内在化抗体
本発明の抗体は、抗体を内在化し、細胞の中に抗体をさらに運搬する可能性がある細胞表面抗原に結合してもよい。一度、細胞の内部に入ると、抗体は、細胞質の中に放出され、特異的なコンパートメントを標的とし、または細胞表面に再循環され得る。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、内在化する細胞表面抗原に結合する。他の実施形態において、本発明の抗体は、細胞の特異的な細胞小器官またはコンパートメントを標的とすることができる。他の実施形態において、本発明の抗体は、内在化の後に細胞表面または周辺に再循環することができる。特定の実施形態において、本発明の抗体は、IFNAR1に特異的である。
【００６１】
抗体の内在化は、実施例34において示されるものなど、当技術分野において承認されている技術によって測定することができる。いくつかの実施形態において、内在化の程度は、細胞に結合した合計の抗体の割合として表される。他の実施形態において、抗体内在化の程度は、非特異的対照抗体に対する比較として表される。他の実施形態において、抗体内在化の程度は、内在化されない細胞表面抗原に結合する抗体に対する比較として表される。他の実施形態において、抗体内在化の程度は、抗体の分解と関係する。他の実施形態において、抗体内在化の程度は、細胞表面染色に対する細胞質染色の比として表される。
【００６２】
一実施形態において、本発明の抗体は、一度結合すると、細胞の中に内在化され、内在化は、非特異的対照抗体よりも、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約110％、少なくとも約130％、少なくとも約140％、少なくとも約150％、少なくとも約160％、または少なくとも約170％多い。
【００６３】
他の実施形態において、本発明の抗体は、一度結合すると、細胞の中に内在化され、内在化は、非特異的対照抗体よりも、1〜10％、10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50〜60％、60〜70％、70〜80％、80〜90％、90〜100％、100〜110％、110〜120％、120〜130％、130〜140％、140〜150％、150〜160％、160〜170％多い。
【００６４】
他の実施形態において、本発明の抗体は、一度結合すると、細胞の中に内在化され、内在化は、第2の抗体を使用する内在化アッセイによって決定されるように、対照抗体よりも、1〜10％、10〜20％、20〜30％、30〜40％、40〜50％、50〜60％、60〜70％、70〜80％、80〜90％、90〜100％、100〜110％、110〜120％、120〜130％、130〜140％、140〜150％、150〜160％、160〜170％多い。
【００６５】
5.6 ヒトFc領域の三次元構造
本発明はまた、ヒトIgG Fc領域の結晶形態を提供し、Fc-TMと示されるヒトFc領域は、Kabatに説明されるEUインデックスにより番号付けしたL234F、L235E、およびP331Sのアミノ酸置換を含み、低下もしくは消失したエフェクター(ADCCおよび/もしくはCDC)機能、Fc受容体への低下もしくは消失した結合、ならびに/または低下したもしくは消失した毒性を示す。一部の実施形態において、結晶は、a=50.18、b=147.30、およびc=75.47の単位セルを有する斜方晶空間群C2221によって特徴づけられる。一部の実施形態において、結晶は、(1つまたは複数の)結晶ポリペプチドの三次元X線回折構造の決定を高解像度まで、好ましくは約3Åよりも高い、典型的に、約2Å〜約3Åの範囲の解像度まで可能にするための回折品質である。
【００６６】
本発明は、Fc-TM結晶の高解像度三次元構造および原子構造座標をさらに提供する。結晶および構造座標を得るために使用される特定の方法は、実施例において以下に提供される。
【００６７】
2.3Å解像度までの結晶のC2221形態から得られる結晶Fc-TMの原子構造座標を表6に挙げる。236〜445位のすべての残基は、電子密度について調査することができ、電子密度は、L234FおよびL235Eの突然変異を含む、236位より前のヒンジ残基について観察されなかった。331位での電子密度はセリンに対応した。
【００６８】
Fc-TMの全体的な三次元構造は、リガンド非結合ヒトFc領域のこれまで報告された構造に非常に類似していた(Deisenhofer, (1981). Biochemistry, 20, 2361-2370; Krapp et al., (2003). J. Mol. Biol. 325, 979-989; Matsumiya et al., (2007). J. Mol. Biol. 368, 767-779; Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007,近刊)。個々に考慮した場合、Fc-TM CH2ドメインおよびCH3ドメインは、他のリガンド非結合非突然変異ヒトFc構造と比較した場合に、高い構造的保存および強剛性を示した。
【００６９】
構造情報は、改変された生物学的特性を有する抗IFNAR抗体をスクリーニングする、設計する、または同定するために、様々な計算方法またはコンピューターベースの方法において使用することができる。例えば、そこから得られる結晶および構造座標は、Fc受容体に対する低下もしくは消失した結合、低下もしくは消失したエフェクター(ADCCおよび/もしくはCDC)機能、または低下もしくは消失した毒性をもたらす、Fc領域におけるアミノ酸の付加、置換、または欠失をスクリーニングする、設計する、または同定するために使用することができる。
【００７０】
抗体が、上記の方法によって設計され、選択されたら、そのエフェクター機能、Fc受容体への結合または毒性を、当業者らに知られている任意の方法によって試験し、最適化することができる。例示的な方法は、上記の5.1〜5.4部において記載されている。
【００７１】
本発明はまた、Fc-TMの構造情報の使用によって設計され、選択され、かつ望ましい生物学的活性を示す抗IFNAR1抗体を包含する。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、L234F、L235E、およびP331Sの突然変異を有するFc領域を含む。いくつかの実施形態において、そのような抗体は、アミノ酸残基234、235、および331以外のアミノ酸残基の1つまたは複数の付加、置換、または欠失を有するFc領域を含む。
【００７２】
5.7 抗IFNAR1抗体
一実施形態において、本発明の抗体は、IFNAR1に特異的である(つまり、特異的に結合する)。そのような抗体はまた、「本発明の抗IFNAR1抗体」と本明細書において呼ぶこともある。他の実施形態において、本発明の抗体は、ヒトIFNAR1に特異的である。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、ヒト以外の生物種由来のIFNAR1またはヒトIFNAR1と構造的に関連する他のタンパク質(例えばヒトIFNAR1相同体)と交差反応してもよい。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、ヒトIFNAR1のみに特異的であってもよく、生物種または他のタイプの交差反応性を示さなくてもよい。
【００７３】
一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、Fcリガンドに対する低下した結合親和性を示し、以下の特性の少なくとも1つを有する:未改変抗体と比較して、低下もしくは消失したエフェクター(ADCCおよび/もしくはCDC)機能、Fcリガンドに対する低下もしくは消失した結合、または低下もしくは消失した毒性。
【００７４】
一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、L234F、L235E、およびP331Sからなる群から選択される、少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含む。特定の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、Fc領域のアミノ酸置換:L234F、L235E、およびP331Sを含む。特定の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IgGアイソタイプ抗体である。
【００７５】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IgG4サブクラスのものである。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1 IgG4抗体は、Fc領域のアミノ酸置換L235Eを含む。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1 1gG4抗体はまた、安定性の増加と関係するアミノ酸変化をも含む。特定の実施形態において、本発明の抗IFNAR1 IgG4抗体は、Fc領域のアミノ酸置換S228Pをさらに含む。
【００７６】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、未改変抗体と比較して、Fc受容体(例えば、これらに限定されないが、アイソフォームFcγRIA、FcγRIB、およびFcγRICを含むFcγRI(CD64);アイソフォームFcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIICを含むFcγRII(CD32);ならびにアイソフォームFcγRIIIAおよびFcγRIIBを含むFcγRIII(CD16))に対する低下または消失した結合親和性を示す。特定の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、未改変抗体と比較して、FcγRIに対する減少した親和性を示す。他の特定の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、未改変抗体と比較して、FcγRIIIA受容体に対する減少した親和性を示す。他の特定の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、未改変抗体と比較して、F158V対立遺伝子のFcγRIIIAに減少した親和性で結合する。
【００７７】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、未改変抗体と比較して、C1qに対する低下または消失した結合親和性を示す。特定の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、未改変抗体と比較して、FcγRIに対する減少した親和性を示す。
【００７８】
一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、低下または消失したエフェクター機能を示す。特定の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、低下または消失したADCCおよび/またはCDC活性を示す。他の特定の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、低下または消失した毒性を示す。
【００７９】
5.7.1 抗IFNAR1抗体配列
一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体の重鎖可変領域および/または軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ、図1A、2A、3A、4Aおよび図1B、2B、3B、4Bに本明細書において提供される。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列は、それぞれ、図1A、2A、3A、4Aおよび図1B、2B、3B、4Bに本明細書において提供される。
【００８０】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体の選択される配列は、米国特許第5,919,453号、米国特許出願第10/831,459号、同第10/182,058号、同第11/157,494号、および同第11/521,102号において見つけることができ、これらはそれぞれ、すべての目的でその全体が参照により組み込まれる。代替の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体の配列は、米国特許第5,919,453号、米国特許出願第10/831,459号、同第10/182,058号、同第11/157,494号、および同第11/521,102号に見つけられる配列を含まない。
【００８１】
他の実施形態において、本発明の抗体は、2006年9月8日に出願された米国特許仮出願第60/842,925号、2006年11月22日に出願された同第60/866,917号;2007年4月12日に出願された同第60/911,397号;2007年5月22日に出願された同第60/915,309号;2007年9月7日に出願された米国特許出願第11/852,106号;2007年9月7日に出願されたPCT出願US2007/07791において開示され、これらはそれぞれ、すべての目的でその全体が組み込まれる。
【００８２】
一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体はまた、3F11、11E2、4G5、および9D4抗体の可変重鎖および/または可変軽鎖のアミノ酸配列に少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％同一である、可変重鎖および/または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体をも含む(配列については図1〜4を参照されたい)。
【００８３】
本明細書において言及される相捕性決定領域(CDR)残基番号は、Kabat(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)らのものであることが理解されるであろう。具体的には、軽鎖可変ドメインにおける残基24〜34(CDR1)、50〜56(CDR2)、および89〜97(CDR3)ならびに重鎖可変ドメインにおける31〜35(CDR1)、50〜65(CDR2)、および95〜102(CDR3)。CDRが抗体によってかなり変わることに注意されたい(当然、Kabatコンセンサス配列と相同性を示さないであろう)。フレームワーク残基の最大のアライメントは、しばしば、Fv領域に使用するために、ナンバリングシステムにおける「スペーサー」残基の挿入を必要とする。本明細書において言及されるCDRは、Kabatら前掲のものであることが理解されるであろう。さらに、任意の所与のKabat部位番号の一部の個々の残基の同一性は、異種間または対立遺伝子の多様化により、抗体鎖によって変わる可能性がある。
【００８４】
一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、表2において挙げられるVH CDRのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有する少なくとも1つのVH CDRを含む。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、表2において挙げられるVL CDRのうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有する少なくとも1つのVL CDRを含む。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、表2において挙げられる1つまたは複数のVH CDRおよび1つまたは複数のVL CDRを含む。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、表2において挙げられるVH CDRおよびVL CDRの任意の組み合わせを含む。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または少なくとも3つまたは少なくとも4つ、または少なくとも5つ、または少なくとも6つの、表2から選択されるCDRを含んでいてもよい。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、1つ、2つ、または3つのCDRをそれぞれ含むVHドメインおよび/またはVLドメインを含んでいてもよい。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、表2において挙げられる1つ、2つ、または3つの重鎖CDR(CDRH#)をさらに含むVHを含んでいてもよい。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、表2において挙げられる1つ、2つ、または3つの軽鎖CDR(CDRL#)をさらに含むVLを含んでいてもよい。
【００８５】
具体的な実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、抗体3F11のCDRを含む(例えば表2を参照されたい)。他の具体的な実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、抗体4G5のCDRを含む(例えば表2を参照されたい)。他の具体的な実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、抗体11E2のCDRを含む(例えば表2を参照されたい)。他の具体的な実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、抗体9D4のCDRを含む(例えば表2を参照されたい)。
【表２】
0005608100.tif 000003
【００８６】
一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、図1、2、3、または4において表される可変重鎖および/または可変軽鎖と比較して、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも10、少なくとも15、または少なくとも20のアミノ酸置換、付加、または欠失を含む可変重鎖および/または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、表2において挙げられる1つまたは複数のCDRの少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、または少なくとも10のアミノ酸置換、欠失、または付加を有する1つまたは複数のCDRを含む。
【００８７】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、ストリンジェントな条件下で、図1、2、3、または4において表されるヌクレオチド配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列によってコードされる抗体を含む。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、図1、2、3、または4において挙げられる1つまたは複数のCDRのヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる1つまたは複数のCDRを含む。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約45℃での、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中のフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、その後の、約50〜65℃での0.2×SSC/0.1％ SDS中での1回もしくは複数回の洗浄、約45℃での、6×SSC中のフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、その後の、約60℃での、0.1×SSC/0.2％ SDS中での1回もしくは複数回の洗浄などの高度にストリンジェントな条件、または当業者らに知られている任意の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を含むが、これらに限定されない(例えば、Ausubel, F.M. et al, eds. 1989 Current Protocols in Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley and Sons, Inc., NY at pages 6.3.1 to 6.3.6 and 2.10.3を参照されたい)。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、抗体3F11、11E2、4G5、または9D4をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる抗体を含むが、これらに限定されない(図1〜4を参照されたい)。
【００８８】
5.7.2 抗IFNAR1結合親和性
一部の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNAR1に対する高い結合親和性を示す。具体的な実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも105M-1s-1、少なくとも5×105M-s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1、または少なくとも108M-1s-1の結合速度(kon)を示す。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも2×105M-1s-1、少なくとも5×105M-1s-1、少なくとも106M-1s-1、少なくとも5×106M-1s-1、少なくとも107M-1s-1、少なくとも5×107M-1s-1、または少なくとも108M-1s-1のkonを示す。
【００８９】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、10-1s-1未満、5×10-1s-1未満、10-2s-1未満、5×10-2s-1未満、10-3s-1未満、5×10-3s-1未満、10-4s-1未満、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満、または5×10-10-1s-1未満の解離速度(koff)を示す。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満、または10-10s-1未満のkoffを示す。
【００９０】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも102M-1、少なくとも5×102M-1、少なくとも103M-1、少なくとも5×103M-1、少なくとも104M-1、少なくとも5×104M-1、少なくとも105M-1、少なくとも5×105M-1、少なくとも106M-1、少なくとも5×106M-1、少なくとも107M-1、少なくとも5×107M-1、少なくとも108M-1、少なくとも5×108M-1、少なくとも109M-1、少なくとも5×109M-1、少なくとも1010M-1、少なくとも5×101M-1、少なくとも1011M-1、少なくとも5×1011M-1、少なくとも1012M-1、少なくとも5×1012M、少なくとも1013M-1、少なくとも5×1013M-1、少なくとも1014M-1、少なくとも5×1014M-1、少なくとも1015M-1、または少なくとも5×1015M-1の親和性定数またはKa(kon/koff)を示す。
【００９１】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、10-2M未満、5×10-2M未満、10-3M未満、5×10-3M未満、10-4M未満、5×10-4M未満、10-5M未満、5×10-5M未満、10-6M未満、5×10-6M未満、10-7M未満、5×10-7M未満、10-8M未満、5×10-8M未満、10-9M未満、5×10-9M未満、10-10M未満、5×10-10M未満、10-11M未満、5×10-11M未満、10-12M未満、5×10-12M未満、10-13M未満、5×10-13M未満、10-14M未満、5×10-14M未満、10-15M未満、または5×10-15M未満の解離定数またはKa(kon/koff)を示す。
【００９２】
5.7.3 インターフェロンαサブタイプ特異性
一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはIFNα、IFNβ、もしくはIFNωを含むが、これらに限定されない1つもしくは複数のI型インターフェロン(IFN)の生物学的活性を中和する能力を示す。IFNαサブタイプの結合は、Antibodies: A Laboratory Manual, CSHLにおいて記載されるものなどの日常的な競合アッセイによって決定することができる。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNα、IFNβ、およびIFNωを含むが、これらに限定されないもののIFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはそれらの生物学的活性を中和する能力を示す。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNαサブタイプ1、2a、2b、4、4b、5、6、7、8、10、14、16、17、および21を含むが、これらに限定されないIFNαのIFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはそれらの1つもしくは複数のサブタイプの生物学的活性を中和する能力を示す。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはIFNαのすべてのサブタイプの生物学的活性を中和する能力を示す。本文脈において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNαサブタイプIFNα1、2a、2b、4、4b、5、6、7、8、10、14、16、17、および21の結合を阻害し、かつ/またはそれらの生物学的活性を中和する能力を示す。一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNαサブタイプ1、2a、2b、4、4b、5、6、7、8、10、14、16、17、および21を含むが、これらに限定されないIFNαのIFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはそれらの1つもしくは複数のサブタイプの生物学的活性を中和する能力を示さない。具体的な実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNα21以外のすべてのIFNαサブタイプのIFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはそれらの生物学的活性を中和する能力を示す。
【００９３】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、または少なくとも13の、以下のIFNαサブタイプ:1、2a、2b、4、4b、5、6、7、8、10、14、16、17および21のIFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはそれらの生物学的活性を中和する能力を示す。代替の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、少なくとも7つ、少なくとも8つ、少なくとも9つ、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、または少なくとも13の、以下のIFNαサブタイプ:1、2a、2b、4、4b、5、6、7、8、10、14、16、17、および21のIFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはそれらの生物学的活性を中和する能力を示さない。
【００９４】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、天然に存在しないI型様インターフェロンのIFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはそれらの生物学的活性を中和する能力を示す。そのような天然に存在しないI型様インターフェロンまたはハイブリッドI型様インターフェロンは、組換えまたは合成技術によってそれらの天然に存在する構造から改変された分子を表す。ハイブリッドインターフェロンは、米国特許第7,232,563号において記載されるように、増加した力価および/または低下した毒性を有する分子を生じさせるための、天然に存在するインターフェロン構造の様々なセグメントの分子の交換を表す。
【００９５】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNAR1への結合を阻害し、かつ/または突然変異I型インターフェロンの生物学的活性を中和する能力を示す。突然変異I型インターフェロンは、その全体が参照により組み込まれる米国特許第6,299,870号および同第6,300,474号において記載される。
【００９６】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、他の動物種に由来するI型様インターフェロンのIFNAR1への結合を阻害し、かつ/またはそれらの生物学的活性を中和する能力を示す。そのようなI型様インターフェロンは、ニワトリ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、または他の動物種から単離される。特定の実施形態において、ヒトI型インターフェロンは、ニワトリ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、または他の動物種に由来する細胞から単離される。他の実施形態において、ヒトI型インターフェロンは、ニワトリ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、または他の動物種に由来する場合、異なるグリコシル化パターンを引き起こす。他の動物種由来のインターフェロンのさらなる論述は、参照により本明細書に組み込まれるWIPO公開WO06099451A3において見出すことができる。
【００９７】
本発明の目的のために、IFNαの活性を中和する本発明の抗IFNAR1抗体の能力は、例えば、1995年6月1日に公開されたWO95/14930において記載されるKinase Receptor Activation (KIRA) Assayにおいて、IFNAR1/R2受容体複合体のチロシンリン酸化(リガンド結合に起因する)を低下させる候補抗体の能力を測定することによってモニターすることができる。
【００９８】
あるいは、または任意選択で、本発明の目的のために、IFNαによる細胞の応答の誘発を中和する本発明の抗IFNAR1抗体の能力は、Kawade, J. Interferon Res. 1:61 70 (1980)もしくはKawade and Watanabe, J. Interferon Res. 4:571 584 (1984)もしくはYousefi, et al., Am. J. Clin. Pathol 83: 735 740 (1985)によって記載されるようにIFNαの抗ウイルス活性の中和をモニターすることによって、またはKurabayashi et al., Mol. Cell Biol., 15: 6386 (1995).によって記載されるように、電気泳動移動度シフトアッセイにおいて、シグナル伝達分子、インターフェロン活性化因子3(ISGF3)の、インターフェロン活性化応答エレメント(ISRE)に由来するオリゴヌクレオチドへの結合を活性化するための、IFNαの能力を中和するため本発明の抗IFNAR1抗体の能力を試験することによって試験することができる。
【００９９】
一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNAR1受容体の少なくとも1つのIFNα媒介性の機能を阻害する能力を示す。一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％、IFNαまたはそのサブタイプに応じるIFNAR1受容体の活性を阻害する。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％、上記に記載されるKIRAアッセイによって測定されるように、IFNαまたはそのサブタイプに応じるIFNAR1受容体の活性を阻害する。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％、Kurabayashi et al., Mol. Cell Biol., 15: 6386 (1995)によって記載されるように、電気泳動移動度シフトアッセイにおいて、シグナル伝達分子、インターフェロン活性化因子3(ISGF3)の、インターフェロン活性化応答エレメント(ISRE)に由来するオリゴヌクレオチドへの結合によって測定されるように、IFNαまたはそのサブタイプに応じるIFNAR1受容体の活性を阻害する。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％、当技術分野において知られているアッセイによって測定されるように、IFNαまたはそのサブタイプに応じるIFNAR1受容体の活性を阻害する。
【０１００】
他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNαまたはそのサブタイプの抗ウイルス特性を中和する能力を示す。一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、Kawade (1980)またはYousefi (1985)の抗ウイルスアッセイによって測定した場合、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、または少なくとも約99％のIFNαまたはそのサブタイプの抗ウイルス活性を中和する。代替の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNαまたはそのサブタイプの抗ウイルス特性を中和しない。
【０１０１】
本発明の目的のために、IFNAR1へのIFNαまたはそのサブタイプの結合を阻害する本発明の抗IFNAR1抗体の能力は、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)において記載されるものなど、日常的な競合アッセイによって決定することができる。一実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNAR1への、以下のIFNαサブタイプ:1、2、4、5、8、10、および21の結合を遮断または阻害する能力を示す。他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、IFNAR1への、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、または少なくとも7つの以下のIFNαサブタイプ:1、2、4、5、8、10、および21の結合を遮断または阻害する能力を示す。
【０１０２】
本発明の抗体は、IFNARに作用してIFN-I応答性遺伝子を制御することができる。IFN-I応答性遺伝子は、以下の出願番号を有する「IFN alpha-induced Pharmacodynamic Markers」と題する米国特許出願:2006年12月6日に出願された第60/873,008号;2007年4月16日に出願された第60/907,762号;2007年5月21日に出願された第60/924,584号;2007年9月19日に出願された第60/960,187号;2007年11月5日に出願された第60/966,176号、および2007年12月6日に出願されたPCT出願番号PCT/US2007/02494において同定され、これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる。
【０１０３】
5.7.4 抗体
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、一本鎖Fv(scFv)、ジスルフィド結合Fv(sdFv)、および抗イディオタイプ(抗id)抗体ならびに上記のもののうちのいずれかのエピトープ結合断片を含んでいてもよい。特に、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、つまり、抗原結合部位を含有する分子を含み、これらの断片は、Fc領域またはその断片を含むが、これらに限定されない、他の免疫グロブリンドメインと融合していてもよく、または融合していなくてもよい。本明細書において概説されるように、用語「抗体」および「複数の抗体」は、本明細書において記載される改変抗体を特に含む。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、クラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、またはサブクラスのものとすることができる。本発明の抗体は、任意のアイソタイプのものとすることができる。一実施形態において、本発明の抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4アイソタイプのものである。本発明の抗体は、可変領域および定常領域を含む完全長抗体とすることができ、またはそれらは、単鎖抗体などの、その抗原結合断片とすることができる。
【０１０４】
抗体の「抗原結合断片」(または単に「抗体断片」)という用語は、本明細書において使用する場合、抗原(例えばIFNAR1)に特異的に結合する能力を保持する、抗体の1つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実現することができることが示されている。抗体の「抗原結合断片」という用語に包含される結合断片の例は、(i)Fab断片、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価断片;(ii)F(ab')2断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片;(iii)VHおよびCH1のドメインからなるFd断片;(iv)抗体の単一アームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片、(v)VHドメインからなるdAb断片(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546);ならびに(vi)単離相捕性決定領域(CDR)を含む。さらに、Fv断片、VL、およびVHのうちの2つのドメインは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、VL領域およびVH領域が、一価分子を形成するように対になる単一タンパク質鎖としてそれらが作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を使用してつなぐことができる(単鎖Fv(scFv)として知られている; Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい)。そのような単鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合断片」という用語に包含されるものと意図される。これらの抗体断片は、当業者らに知られている従来の技術を使用して得られ、断片は、完全な抗体と同じ方法において、有用性についてスクリーニングされる。
【０１０５】
他の実施形態において、本発明は、本発明の融合タンパク質と同じアミノ酸配列を有するがFc領域への少なくとも1つのアミノ酸残基の付加、置換、または欠失を含まないFc領域と比較して、エフェクター機能の促進を担うFcリガンドに対する低下または消失した親和性を有する改変Fc領域を含む融合タンパク質を提供する(以後「本発明の融合タンパク質」と呼ぶ)。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、改変Fc領域に融合されたペプチド、ポリペプチド、タンパク質足場、scFv、dsFv、二重特異性抗体、Tandab、または抗体ミメティックを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、改変Fc領域に、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質足場、scFv、dsFv、二重特異性抗体、Tandab、または抗体ミメティックを連結するリンカー領域を含む。新規な連結融合ポリペプチドの中にポリペプチドを連結するための天然に存在するペプチドリンカーおよび人工ペプチドリンカーの使用は、文献において十分に知られている(Hallewell et al. (1989), J. Biol. Chem. 264, 5260-5268; Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8, 725-731; Robinson & Sauer (1996), Biochemistry 35, 109-116; Khandekar et al. (1997), J. Biol. Chem. 272, 32190-32197; Fares et al. (1998), Endocrinology 139, 2459-2464; Smallshaw et al. (1999), Protein Eng. 12, 623-630;米国特許第5,856,456号)。
【０１０７】
一実施形態において、本発明の融合タンパク質は、234、235、および331からなる群から選択されるアミノ酸残基の少なくとも1つの付加、置換、または欠失を含むFc領域を含み、定常領域のナンバリングシステムは、Kabatらにおいて説明されるEUインデックスのナンバリングシステムである(1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, VA)。具体的な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、L234F、L235E、およびP331Sからなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基を含むFc領域を含む。
【０１０８】
他の実施形態において、本発明の融合タンパクは、融合タンパクの安定性の増加と関係する、アミノ酸残基の少なくとも1つの付加、置換、または欠失を含むFc領域をさらに含む。一実施形態において、アミノ酸残基の付加、置換、または欠失は、Fc領域の228位にあり、定常領域のナンバリングシステムは、Kabatら(前掲)において説明されるEUインデックスのナンバリングシステムである。特定の実施形態において、本発明の融合タンパクは、228位でのアミノ酸置換を含むFc領域を含み、置換は、セリン残基である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体または融合タンパク質は、1つまたは複数の遺伝子工学的に作製されたグリコフォーム、つまり、Fc領域を含む分子に共有結合された炭水化物組成物を含む。遺伝子工学的に作製されたグリコフォームは、エフェクター機能を低下させることを含むが、これらに限定されない、様々な目的に有用である可能性がある。遺伝子工学的に作製されたグリコフォームは、当業者に知られている任意の方法によって、例えば遺伝子工学的に作製されたかもしくは変異体発現株を使用することによって、1つもしくは複数の酵素、例えばDI N-アセチルグルコサミントランスフェラーゼIII(GnTI11)との同時発現によって、様々な生物もしくは様々な生物からの細胞株においてFc領域を含む分子を発現させることによって、またはFc領域を含む分子が発現した後に、(1つもしくは複数の)炭水化物を改変することによって、生成することができる。遺伝子工学的に作製されたグリコフォームを生成するための方法は、当技術分野において知られており、Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473)、米国特許第6,602,684号;米国特許出願第10/277,370号;米国特許出願第10/113,929号; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; Potillegent(商標)技術(Biowa, Inc. Princeton, N.J.); GlycoMAb(商標)グリコシル化光学技術(GLYCART biotechnology AG、Zurich、Switzerland)において記載されるものを含むが、これらに限定されず、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれるWO 00061739; EA01229125; US20030115614; Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49を参照されたい。
【０１１０】
5.7.5 抗体コンジュゲート
本発明は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、小分子、模倣作用物質、合成薬剤、無機分子、および有機分子を含むが、これらに限定されない1つまたは複数の成分とコンジュゲートまたは融合した抗体またはその断片の使用を包含する。
【０１１１】
本発明は、融合タンパク質を生成するために異種性タンパク質もしくはポリペプチド(またはその断片、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、または少なくとも100のアミノ酸のポリペプチド)と組換えで融合し、または化学的にコンジュゲートした(共有結合および非共有結合の両方を含む)抗体またはその断片の使用を包含する。融合は、必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を通して行ってもよい。例えば、抗体は、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と当該抗体を融合またはコンジュゲートすることによって、in vitroまたはin vivoにおいて、異種性ポリペプチドが特定の細胞型を標的とするように使用することができる。異種性ポリペプチドと融合またはコンジュゲートした抗体はまた、当技術分野において知られている方法を使用して、in vitroイムノアッセイおよび精製方法において使用することができる。例えば、その全体が参照により組み込まれる国際公開WO 93/21232;欧州特許EP 439,095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99;米国特許第5,474,981号; Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432;およびFell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452を参照されたい。
【０１１２】
さらなる融合タンパク質は、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、および/またはコドンシャッフリングの技術(総称して「DNAシャッフリング」と呼ばれる)を通して生成することができる。DNAシャッフリングは、本発明の抗体またはその断片(例えばより高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはその断片)の活性を改変するために用いることができる。一般に、米国特許第5,605,793号;同第5,811,238号;同第5,830,721号;同第5,834,252号;および同第5,837,458号ならびにPatten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson, et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76;およびLorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308-313を参照されたい(これらの特許および刊行物はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。抗体もしくはその断片またはコードされた抗体もしくはその断片は、組換えより前に、エラープローンPCR、ランダムヌクレオチド挿入、または他の方法により、ランダム突然変異誘発にかけることによって改変することができる。それらの部分がIFNAR1に特異的に結合する、抗体または抗体の断片をコードするポリヌクレオチドの1つまたは複数の部分を、1つまたは複数の異種性分子の1つまたは複数の成分、モチーフ、部、部分、ドメイン、断片などと組み換えることができる。
【０１１３】
さらに、抗体またはその断片は、精製を促進するために、ペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。他の実施形態において、マーカーアミノ酸配列は、とりわけ、pQEベクター(QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311)において提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、それらの多くは、市販で入手可能である。Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824において記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素「HA」タグ(Wilson et al., 1984, Cell 37:767)および「Flag」タグを含むが、これらに限定されない。
【０１１４】
他の実施形態において、本発明の抗体またはその断片、類似体、もしくは誘導体を、診断剤または検出可能な作用物質とコンジュゲートする。そのような抗体は、特定の療法の効果を決定するなど、臨床検査手順の一部として、炎症性障害の発症または進行をモニタリングまたは予知するのに有用となり得る。そのような診断および検出は、これらに限定されないが、ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素;これらに限定されないが、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンなどの補欠分子族;これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレスセイン、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレスセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンなどの蛍光性物質;これに限定されないが、ルミノールなどの発光物質;これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質;これらに限定されないが、ヨウ素(131I、125I、123I、121I)、炭素(14C)、硫黄(35S)、トリチウム(3H)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、およびテクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)、パラジウム(103Pd)、モリブデン(99Mo)、キセノン(133Xe)、フッ素(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、および117Tinなどの放射性物質;様々なポジトロン放出断層撮影の使用するポジトロン放出物質、非放射性常磁性金属イオン、および放射標識されたまたは特異的な放射性同位体とコンジュゲートした分子を含むが、これらに限定されない、検出可能な物質に抗体を結合させることによって達成することができる。
【０１１５】
抗体と治療成分をコンジュゲートするための技術は、周知である。例えば、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Rcisfeld et al. (eds.), pp. 243-56. (Alan R. Liss, Inc. 1985)中のArnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy"; Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)中のHellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery"; Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)中のThorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review":Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)中の"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy"、およびThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照されたい。
【０１１６】
あるいは、抗体は、米国特許第4,676,980号においてSegalによって記載されるように、抗体ヘテロコンジュゲートを形成するために第2の抗体とコンジュゲートすることができ、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
IFNAR1に特異的に結合する抗体またはその断片とコンジュゲートする治療成分または薬剤は、被験体における特定の障害に対して望ましい(1つまたは複数の)予防効果または治療効果を達成するために選ばれるべきである。臨床医または他の医療関係者は、どの治療成分または薬剤を、IFNAR1に特異的に結合する抗体またはその断片とコンジュゲートするかを決定する場合に、以下を考慮するべきである:疾患の性質、疾患の重症度、および被験体の状態。
【０１１８】
5.7.6 抗体を産生するための方法
抗体またはその断片は、抗体の合成のための当技術分野において知られている任意の方法によって、特に、化学合成または組換え発現技術によって産生することができる。
【０１１９】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイの技術またはその組み合わせの使用を含む、当技術分野において知られている種々様々の技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野において知られており、例えばHarlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)において教示されるものを含むハイブリドーマ技術を使用して産生することができる(上記参考文献は、その全体が参照により組み込まれる)。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を通して産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージのクローンを含む単一クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法を指すものではない。
【０１２０】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的な抗体を産生し、スクリーニングするための方法は、日常的なものであり、当技術分野において知られている。簡潔に言うと、マウスを、IFNAR1を用いて免疫することができ、免疫応答が検出されたら、例えば、IFNAR1に特異的な抗体がマウス血清中に検出され、マウス脾臓が摘出され、脾細胞が単離される。次いで、脾細胞は、周知の技術によって任意の適している骨髄腫細胞、例えばATCCから入手可能な細胞株SP20からの細胞に融合される。ハイブリドーマは、限界希釈法によって選択され、クローニングされる。次いで、ハイブリドーマクローンは、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞について、当技術分野において知られている方法によってアッセイされる。一般に高レベルの抗体を含有する腹水は、陽性ハイブリドーマクローンを有するマウスを免疫することによって生成することができる。
【０１２１】
したがって、モノクローナル抗体は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することによって生成することができ、ハイブリドーマは、IFNAR1を用いて免疫されたマウスから単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、次いで、IFNAR1に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについて、融合から結果として生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される。
【０１２２】
特異的なIFNAR1エピトープを認識する抗体断片は、当業者らに知られている任意の技術によって生成することができる。例えば、本発明のFab断片およびF(ab')2断片は、パパイン(Fab断片の産生)またはペプシン(F(ab')2断片の産生)などの酵素を使用して、免疫グロブリン分子のタンパク分解性切断によって産生することができる。F(ab')2断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のCH1ドメインを含有する。さらに、本発明の抗体はまた、当技術分野において知られている様々なファージディスプレイ法を使用して生成することができる。
【０１２３】
ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を運搬するファージ粒子の表面上に提示される。特に、VHドメインおよびVLドメインをコードするDNA配列は、動物cDNAライブラリー(例えばリンパ組織のヒトまたはマウスcDNAライブラリー)から増幅される。VHドメインおよびVLドメインをコードするDNAを、PCRによってscFvリンカーと共に組換え、ファージミドベクター(例えばpCANTAB 6またはpComb 3 HSS)の中にクローニングする。ベクターを、大腸菌(E. coli)中にエレクトロポレーションで導入し、大腸菌を、ヘルパーファージを用いて感染させる。これらの方法において使用されるファージは、典型的にfdおよびM13を含む線状ファージであり、VHドメインおよびVLドメインは、通常、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIのいずれかに組換えで融合される。対象となるIFNAR1エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識抗原または固体表面もしくはビーズに結合されたかもしくは捕捉された抗原を使用して、選択または同定することができる。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例は、Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50; Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods 184:177-186; Kettleborough et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:952-958; Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Burton et al., 1994, Advances in Immunology 57:191-280;国際出願PCT/GB91/01134;国際公開WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、およびWO97/13844;ならびに米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727号、同第5,733,743号、および同第5,969,108号において開示されるものを含み、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
上記の参考文献において記載されるように、ファージ選択の後に、ファージからの抗体コード領域は、単離され、ヒト抗体を含む完全な抗体または任意の望ましい抗原結合断片を生成するために使用し、下記に記載されるように、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む任意の望ましい宿主において発現することができる。Fab、Fab'、およびF(ab')2断片を組換えで産生するための技術はまた、国際公開WO 92/22324; Mullinax et al., 1992, Bio Techniques 12(6):864-869; Sawai et al., 1995, AJRI 34:26-34;およびBetter et al., 1988, Science 240:1041-1043において開示されるものなど、当技術分野において知られている方法を使用して用いることもできる(上記参考文献は、その全体が参照により組み込まれる)。
【０１２５】
完全な抗体を生成するために、VHまたはVLのヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むPCRプライマーを、scFvクローンにおいてVH配列またはVL配列を増幅するために使用することができる。当業者らに知られているクローニング技術を利用して、PCR増幅VHドメインは、VH定常領域、例えばヒトγ4定常領域を発現するベクターの中にクローニングすることができ、PCR増幅VLドメインは、VL定常領域、例えばヒトκまたはλ定常領域を発現するベクターの中にクローニングすることができる。ある実施形態において、VHドメインまたはVLドメインを発現するためのベクターは、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメイン、定常ドメインのためのクローニング部位、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含む。VHドメインおよびVLドメインはまた、必要な定常領域を発現する1つのベクターの中にクローニングすることができる。次いで、重鎖転換ベクターおよび軽鎖転換ベクターは、当業者らに知られている技術を使用して、完全長抗体、例えばIgGを発現する、安定なまたは一過性の細胞株を生成するために細胞株の中に同時トランスフェクトされる。
【０１２６】
ヒトにおける抗体のin vivoにおける使用およびin vitro検出アッセイを含むいくつかの使用について、ヒト抗体またはキメラ抗体を使用することは有利である可能性がある。完全ヒト抗体は、ヒト被験体の治療法に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、上記に記載されるファージディスプレイ法を含む、当技術分野において知られている様々な方法によって作製することができる。米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号;ならびに国際公開WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、W098/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、およびWO 91/10741もまた参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２７】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野において知られている。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるMorrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, Bio Techniques 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202;ならびに米国特許第5,807,715号、同第4,816,567号、同第4,816,397号、および同第6,311,415号を参照されたい。
【０１２８】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するCDRを含む抗体またはその断片である。ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのCDR領域が、非ヒト免疫グロブリン(つまりドナー抗体)に対応し、すべてまたは実質的にすべてのフレームワーク領域が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つおよび典型的に2つの可変ドメインのすべてを実質的に含む(Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv)。一部の場合において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも1つの部分、典型的にヒト免疫グロブリンのものを含む。通常、抗体は、軽鎖および重鎖の少なくとも可変ドメインを含有するであろう。抗体はまた、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、およびCH4領域を含んでいてもよい。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、および1gEならびにIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4を含む任意のアイソタイプを含む任意のクラスの免疫グロブリンから選択することができる。通常、定常ドメインは、ヒト化抗体が、細胞傷害性活性を示し、クラスが、典型的にIgG1であることが望ましい補体結合定常ドメインである。そのような細胞傷害性活性が望ましくない場合、定常ドメインはIgG2クラスのものであってもよい。ヒト化抗体は、1つを超えるクラスまたはアイソタイプからの配列を含んでいてもよく、望ましいエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当技術分野における通常の技術の範囲内にある。ヒト化抗体のフレームワーク領域およびCDR領域は、親の配列、例えばドナーCDRに正確に対応する必要はなく、またはコンセンサスフレームワークは、少なくとも1つの残基の置換、挿入、または欠失によって突然変異誘発されてもよく、その結果、その部位でのCDR残基またはフレームワーク残基は、コンセンサス抗体または移入抗体のいずれにも対応しない。しかしながら、そのような突然変異は、広範囲ではないであろう。通常、少なくとも75％の、より多くの場合90％の、おそらく95％より多くのヒト化抗体残基は、親のフレームワーク領域(FR)およびCDR配列のものに対応するであろう。ヒト化抗体は、CDRグラフティング(欧州特許EP 239,400;国際公開WO 91/09967;ならびに米国特許第5,225,539号、同第5,530,101号、および同第5,585,089号)、ベニヤリング(veneering)またはリサーフェシング(resurfacing)(欧州特許EP 592,106およびEP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814;およびRoguska et al., 1994, PNAS 91 :969-973)、鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号)、ならびに例えば米国特許第6,407,213号、同第5,766,886号、WO 9317105、Tan et al., J. Immunol. 169:1119-25 (2002)、Caldas et al., Protein Eng. 13(5):353-60 (2000)、Morea et al., Methods 20(3):267-79 (2000)、Baca et al., J. Biol. Chem. 272(16):10678-84 (1997)、Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)、Couto et al., Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995)、Couto et al., Cancer Res. 55(8):1717-22 (1995)、Sandhu J S, Gene 150(2):409-10 (1994)、およびPedersen et al., J. Mol. Biol. 235(3):959-73 (1994)において開示される技術を含むが、これらに限定されない、当技術分野において知られている様々な技術を使用して産生することができる。多くの場合、フレームワーク領域のフレームワーク残基は、抗原結合を改変するまたは改善するために、CDRドナー抗体からの対応する残基を用いて置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野において知られている方法によって、例えば、抗原結合にとって重要なフレームワーク残基を同定するための、CDR残基およびフレームワーク残基の相互作用のモデリングおよび特定の位置の異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定される(例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるQueen et al.、米国特許第5,585,089号;およびRiechmann et al., 1988, Nature 332:323を参照されたい)。
【０１２９】
5.7.7 抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、例えば上記に定義したように、高ストリンジェンシー、中間の、またはより低いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。
【０１３０】
当技術分野において知られている任意の方法によって、ポリヌクレオチドを得、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。抗体のアミノ酸配列が知られているので、これらの抗体をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野において知られている方法を使用して決定することができる、つまり、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンは、本発明の抗体またはその断片をコードする核酸を生成するように構築される。抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築することができ(例えばKutmejer et al., 1994, Bio Techniques 17:242において記載されるように)、これは、簡潔に言うと、抗体をコードする配列の部分を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング、およびライゲーションならびに次いで、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドのPCRによる増幅を伴う。
【０１３１】
あるいは、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適している供給源からの核酸から生成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手可能ではないが、抗体分子の配列が知られている場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、配列の3'末端および5'末端にハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用するPCR増幅によって、または例えば、抗体をコードする、cDNAライブラリーからのcDNAクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用してクローニングすることによって化学的に合成することもでき、または適切な供給源(本発明の抗体を発現するように選択されるハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する任意の組織または細胞から生成される抗体cDNAライブラリーもしくはcDNAライブラリーまたはそれから単離される核酸、通常ポリA+RNA)から得ることもできる。次いで、PCRによって生成される増幅核酸は、当技術分野において知られている任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターの中にクローニングすることができる。
【０１３２】
抗体のヌクレオチド配列が決定されたら、抗体のヌクレオチド配列は、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生成するために、例えばアミノ酸置換、欠失、および/または挿入を生じさせるために、ヌクレオチド配列の操作のための、当技術分野において知られている方法、例えば組換えDNA技術、部位特異的突然変異誘発、PCRなどを使用して遺伝子工学的に作製することができる(例えば、どちらも参照により本明細書に組み込まれるSambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYにおいて記載される技術を参照されたい。)。
【０１３３】
具体的な実施形態において、1つまたは複数のCDRは、日常的な組換えDNA技術を使用して、フレームワーク領域内に挿入される。フレームワーク領域は、天然に存在するフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域であってもよく、ある場合には、ヒトフレームワーク領域であってもよい(例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについて、Chothia et al., 1998, J. Mol. Biol. 278: 457-479を参照されたい)。任意選択で、フレームワーク領域およびCDRの組み合わせによって生成されるポリヌクレオチドは、IFNAR1に特異的に結合する抗体をコードする。任意選択で、1つまたは複数のアミノ酸置換は、フレームワーク領域内に生成されてもよく、一部の場合において、アミノ酸置換は、抗体のその抗原への結合を改善する。さらに、そのような方法は、1つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を欠く抗体分子を生成するために、鎖内ジスルフィド結合に関与する1つまたは複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を生成するために使用することができる。ポリヌクレオチドに対する他の改変は、本発明によって包含され、また当技術分野の技術の範囲内である。
【０１３４】
具体的な実施形態において、本発明の抗体は、図1〜4において例示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。他の特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、それぞれ配列番号41および42に対応する軽鎖定常領域および重鎖定常領域を含む抗体をコードする。他の特定の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号42に対応する重鎖定常領域を含む抗体をコードし、対立遺伝子変異が許容され、変異は、EUインデックスナンバリングシステムによって定義される214位、221位、356位、および358位からなる群から選択される少なくとも1つまたは複数の残基である。
【０１３５】
5.7.8 抗体の組換え発現
本発明の抗体、その誘導体、類似体、または断片(例えば本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖もしくはその部分または本発明の単鎖抗体)の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。本発明の抗体分子または抗体の重鎖もしくは軽鎖またはその部分(しかし、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを必ずしも含有する必要はない)をコードするポリヌクレオチドが得られたら、抗体分子の産生のためのベクターは、当技術分野において知られている技術を使用して、組換えDNA技術によって作製することができる。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体を含有するポリヌクレオチドを発現させることによって、タンパク質を調製するための方法が、本明細書において記載される。当業者によく知られている方法は、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、例えば、in vitro組換えDNA技術、合成技術、およびin vivo遺伝子組換えを含む。本発明は、したがって、プロモーターに機能的に連結された、本発明の抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメインまたはその部分または重鎖CDRもしくは軽鎖CDRコードするヌクレオチド配列を含む複製可能ベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでいてもよく(例えば国際公開WO 86/05807;国際公開WO 89/01036;および米国特許第5,122,464号を参照されたい)、抗体の可変ドメインは、全重鎖、全軽鎖、または全重鎖および全軽鎖の両方の発現のためにそのようなベクターの中にクローニングすることができる。
【０１３６】
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入され、次いで、トランスフェクトされた細胞は、本発明の抗体を産生するために、従来の技術によって培養される。したがって、本発明は、異種性プロモーターに機能的に連結された、本発明の抗体またはその断片またはその重鎖もしくは軽鎖またはその部分または本発明の単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二重鎖抗体の発現のための他の実施形態において、下記に詳述されるように、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは、全免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞において同時発現されてもよい。
【０１３７】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、本発明の抗体分子を発現させることができる(例えば、米国特許第5,807,715号を参照されたい)。そのような宿主発現系は、対象となるコード配列を産生し、続いて、精製することができる媒体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に、本発明の抗体分子をin situにおいて発現する細胞もまた表す。これらは、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば大腸菌および枯草菌(B. subtilis))などの微生物;抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えばサッカロミセス(Saccharomyces)およびピキア(Pichia));抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞株;組換えウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)を感染させたもしくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換された植物細胞株;または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えばアデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え発現構築物を内部に持つ哺乳動物細胞株(例えばCOS、CHO、BHK、293、NS0、および3T3細胞)を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、大腸菌などの細菌細胞および他の実施形態において、真核細胞は、特に完全な組換え抗体分子の発現のために、組換え抗体分子の発現に使用される。例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルスからの主要な中間初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと組み合わされて、抗体に有効な発現系となる(Foecking et al., 1986, Gene 45:101;およびCockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2)。特定の実施形態において、IFNAR1に特異的に結合する抗体またはその
断片をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘発性プロモーター、または組織特異的プロモーターによって制御される。
【０１３８】
細菌系において、抗体分子が発現することを意図する使用に応じて多くの発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、大量のそのようなタンパク質が、抗体分子の医薬組成物の生成のために産生されることになっている場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターは、望ましい可能性がある。そのようなベクターは、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列が、lacZコード領域を有するフレームにおいてベクターの中に個々にライゲーションできる大腸菌発現ベクターpUR278(Ruther et al., 1983, EMBO 12:1791); pINベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509)などを含むが、これらに限定されない。pGEXベクターもまた、グルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)を有する融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用することができる。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、その後の、遊離グルタチオンの存在下における溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、GST部分からクローニング標的遺伝子産物を放出することができるように、トロンビンまたは第Xa因子プロテアーゼの切断部位を含むように設計されている。
【０１３９】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、対象となる抗体コード配列は、アデノウイルス転写/翻訳調節複合体、例えば後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列とライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、in vitroまたはin vivo組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば領域E1またはE3)中への挿入は、生存可能であり、感染宿主において抗体分子を発現することができる組換えウイルスをもたらす(例えばLogan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359を参照されたい)。特異的な開始シグナルもまた、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳に必要とされ得る。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接する配列を含む。さらに、開始コドンは、全インサートの翻訳を保証するために、望ましいコード配列のリーディングフレームと同調しなければならない。これらの外来性翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の、様々な起源のものとすることができる。適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって発現の効率を増強することができる(例えばBittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544を参照されたい)。
【０１４０】
さらに、挿入された配列の発現を調節しまたは望ましい特定の方法において遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株を選ぶことができる。そのような修飾(例えばグリコシル化)およびタンパク質産物のプロセシング(例えば切断)は、タンパク質の機能にとって重要である場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的で、特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系は、正確な修飾および発現された外来タンパク質のプロセシングを保証するために選ぶことができる。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞機構を持つ真核生物の宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞は、CHO、VERY、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、およびT47D、NS0(内因的にいかなる免疫グロブリン鎖も産生しないマウス骨髄腫細胞株)、CRL7O3O、ならびにHsS78Bst細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１４１】
組換えタンパク質の長期高収率産生のために、安定的な発現が好ましい。例えば、安定に抗体分子を発現する細胞株を遺伝子工学的に作製することができる。ウイルス複製開始点を含有する発現ベクターを使用する代わりに、宿主細胞は、適切な発現調節エレメント(例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)および選択可能なマーカーによって調節されるDNAで形質転換することができる。外来DNAの導入に続いて、遺伝子工学的に作製された細胞は、強化培地中で1〜2日間、増殖させることができ、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞が、それらの染色体の中に安定にプラスミドを組み込み、増殖させて、フォーカスを形成することを可能にし、この細胞を、クローニングし、拡大増殖させて細胞株にすることができる。この方法は、抗体分子を発現させる細胞株を遺伝子工学的に作製するために有利に使用することができる。そのような遺伝子工学的に作製された細胞株は、抗体分子と直接的にまたは間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価において特に有用である可能性がある。
【０１４２】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1992, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 48:202)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., 1980, Cell 22:8-17)遺伝子を含むが、これらに限定されない多くの選択系を使用することができ、tk、hgprt、またはaprt細胞においてそれぞれ用いることができる。さらに、代謝拮抗剤抵抗性は、以下の遺伝子の選択の基準として使用することができる:dhfr、メトトレキサートに対する抵抗性を付与する(Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo、アミノグリコシドG-418に対する抵抗性を付与する(Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, 1993, Science 260:926-932;およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):155-2 15);ならびにhygro、ハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する(Santerre et al., 1984, Gene 30:147)。組換えDNA技術の技術分野において一般に知られている方法は、望ましい組換えクローンを選択するために日常的に適用することができ、そのような方法は、例えばAusubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990);およびChapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150: 1において記載され、これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる(検討のために、Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vo1.3. (Academic Press, New York, 1987)を参照されたい)。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピーの数を増加させるであろう。増幅領域が抗体遺伝子と関連するので、抗体の産生もまた増加するであろう(Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257)。
【０１４４】
宿主細胞は、本発明の2つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第1のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第2のベクターを用いて同時トランスフェクションすることができる。2つのベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含有していてもよい。あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現することができる単一ベクターを使用することができる。そのような状況において、軽鎖は、過剰な無毒性重鎖を回避するために重鎖の前に配置されるべきである(Proudfoot, 1986, Nature 322:52;およびKohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2 197)。重鎖および軽鎖のコード配列は、cDNAまたはゲノムDNAを含んでいてもよい。
【０１４５】
本発明の抗体分子が組換え発現によって産生されたら、それは、免疫グロブリン分子の精製について当技術分野において知られている任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に、プロテインAの後の特異的な抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによるもの、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、示差的な可溶性、またはタンパク質の精製のための他の標準的な技術によって精製することができる。さらに、本発明の抗体またはその断片は、本明細書において記載されるかまたはその他の形で精製を促進することが当技術分野において知られている異種性ポリペプチド配列に融合させることができる。
【０１４６】
5.8 抗体のスケール変更可能な産生
大量の抗体を得るために、本発明の抗体は、スケール変更可能なプロセスによって産生することができる(以後、「本発明のスケール変更可能なプロセス」と呼ぶ)。いくつかの実施形態において、抗体は、分析的な規模のバイオリアクターにおいて本発明の抗体を産生するためにスケールアップすることができる、実験室の本発明のスケール変更可能なプロセスによって産生することができる(例えば、5L、10L、15L、30L、または50Lのバイオリアクターを含むが、これらに限定されない)。他の実施形態において、抗体は、生産規模のバイオリアクターにおいて本発明の抗体を産生するためにスケールアップすることができる、実験室の本発明のスケール変更可能なプロセスによって産生することができる(例えば、75L、100L、150L、300L、または500Lを含むが、これらに限定されない)。いくつかの実施形態において、本発明のスケール変更可能なプロセスは、実験室において実行される生産プロセスと比較して、生産効率の低下をほとんどまたは全くもたらさない。他の実施形態において、本発明のスケール変更可能なプロセスは、約10mg/L、約20mg/L、約30mg/L、約50mg/L、約75mg/L、約100mg/L、約125mg/L、約150mg/L、約175mg/L、約200mg/L、約250mg/L、約300mg/L、またはそれ以上の生産効率で抗体を産生する。他の実施形態において、融合タンパク質は、本発明のスケール変更可能なプロセスによって産生することができる。
【０１４７】
他の実施形態において、本発明のスケール変更可能なプロセスは、少なくとも約10mg/L、少なくとも約20m/L、少なくとも約30mg/L、少なくとも約50mg/L、少なくとも約75mg/L、少なくとも約100mg/L、少なくとも約125mg/L、少なくとも約150mg/L、少なくとも約175mg/L、少なくとも約200mg/L、少なくとも約250mg/L、少なくとも約300mg/L、またはそれ以上の生産効率で、抗体を産生する。
【０１４８】
他の実施形態において、本発明のスケール変更可能なプロセスは、約10mg/L〜約300mg/L、約10mg/L〜約250mg/L、約10mg/L〜約200mg/L、約10mg/L〜約175mg/L、約10mg/L〜約150mg/L、約10mg/L〜約100mg/L、約20mg/L〜約300mg/L、約20mg/L〜約250mg/L、約20mg/L〜約200mg/L、20mg/L〜約175mg/L、約20mg/L〜約150mg/L、約20mg/L〜約125mg/L、約20mg/L〜約100mg/L、約30mg/L〜約300mg/L、約30mg/L〜約250mg/L、約30mg/L〜約200mg/L、約30mg/L〜約175mg/L、約30mg/L〜約150mg/L、約30mg/L〜約125mg/L、約30mg/L〜約100mg/L、約50mg/L〜約300mg/L、約50mg/L〜約250mg/L、約50mg/L〜約200mg/L、50mg/L〜約175mg/L、約50mg/L〜約150mg/L、約50mg/L〜約125mg/L、または約50mg/L〜約100mg/Lの生産効率で抗体を産生する。
【０１４９】
5.8.1 抗体を遺伝子工学的に作製するためのさらなる方法
他の実施形態において、本発明の抗体のFcヒンジ領域を突然変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、1つまたは複数のアミノ酸突然変異は、抗体が、本来のFc-ヒンジドメインSpA結合と比較して、ブドウ球菌プロテインA(SpA)結合を損なうように、Fc-ヒンジ断片のCH2-CH3ドメインインターフェース領域の中に導入される。このアプローチは、Ward et al.による米国特許第6,165,745号においてさらに詳細に記載される。
【０１５０】
他の実施形態において、抗体は、その生物学的半減期を増加させるために改変される。様々なアプローチが可能である。例えば、米国特許第6,277,375号において記載されるように、1つまたは複数の以下の突然変異を導入することができる:T252L、T254S、T256F。他の実施形態において、米国特許第7,083,784号において記載されるように、1つまたは複数の以下の突然変異を導入することができる:M252Y、S254T、T256E。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体は、Presta et al.による米国特許第5,869,046号および同第6,121,022号において記載されるように、IgGのFc領域のCH2ドメインの2つのループから得られるサルベージ受容体結合エピトープを含有するように、CH1またはCL領域内で改変することができる。
【０１５１】
他の実施形態において、Fc領域は、抗体の(1つまたは複数の)エフェクター機能を低下させるために、少なくとも1つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基と交換することによって改変される。例えば、アミノ酸残基234、235、236、237、297、318、320、および322から選択される1つまたは複数のアミノ酸は、抗体が、エフェクターリガンドに対する低下した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基と交換することができる。親和性が低下したエフェクターリガンドは、例えばFc受容体または補体のC1成分とすることができる。このアプローチは、共にWinter et al.による米国特許第5,624,821号および同第5,648,260号においてさらに詳細に記載されている。
【０１５２】
他の例において、アミノ酸残基329、331、および322から選択される1つまたは複数のアミノ酸は、抗体が、低下したC1q結合および/または低下したもしくは消滅した補体依存性細胞傷害(CDC)を有するように、異なるアミノ酸残基と交換することができる。このアプローチは、Idusogie et al.による米国特許第6,194,551号においてさらに詳細に記載される。
【０１５３】
他の例において、アミノ酸位置231および239内の1つまたは複数のアミノ酸残基を改変し、それによって、抗体が、補体を固定する能力を低下させる。このアプローチは、Bodmer et al.によるPCT公開WO 94/29351においてさらに記載されている。
【０１５４】
他の実施形態において、本発明の抗体のFc領域は、以下の位置:238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438、または439の1つまたは複数のアミノ酸を改変することによって、抗体が、抗体依存性細胞傷害(ADCC)を媒介する能力を減少させるために、かつ/またはFcγ受容体に対する抗体の親和性を減少させるためにさらに改変される。このアプローチは、PrestaによるPCT公開WO 00/42072においてさらに記載されている。
【０１５５】
本発明によって企図される、本明細書における抗体の他の改変は、ペグ化である。例えば、抗体は、抗体の生物学的(例えば血清)半減期を増加させるためにペグ化することができる。抗体をペグ化するために、抗体またはその断片を、典型的に、1つまたは複数のPEG基が、抗体または抗体断片に付加されるようになる条件下で、PEGの反応性のエステル誘導体またはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール(PEG)と反応させる。一部の場合において、ペグ化は、反応性PEG分子(または類似した反応性水溶性高分子)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実行される。本明細書において使用する場合、用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(C1-C10)アルコキシもしくはアリールオキシポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコールマレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているPEGの形態のうちのいずれかを包含するものと意図される。一部の実施形態において、ペグ化されることになる抗体は、アグリコシル化(aglycosylated)抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当技術分野において知られており、本発明の抗体に適用することができる。例えばNishimura et al.によるEP 0 154 316およびIshikawa et al.によるEP 0 401 384を参照されたい。
【０１５６】
したがって、本発明の他の態様において、抗IFNAR1抗体、例えば、これらに限定されないが3F11、4G5、11E2、および9D4の構造的特徴は、IFNAR1への結合などの、本発明の抗体の少なくとも1つの機能的特性を保持する、構造的に関連する抗IFNAR1抗体を作製するために使用される。例えば3F11、4G5、11E2、もしくは9D4の1つまたは複数のCDR領域またはその突然変異は、上記に論じたように、組換えで遺伝子工学的に作製されたさらなる本発明の抗IFNAR1抗体を作製するために、公知のフレームワーク領域および/または他のCDRと組換えで組み合わせることができる。他のタイプの改変は、先の節において記載したものを含む。遺伝子工学的作製方法のための出発物質は、本明細書において提供される1つもしくは複数のVH配列および/もしくはVL配列または1つもしくは複数のそのCDR領域である。遺伝子工学的に作製された抗体をつくるために、本明細書において提供される1つもしくは複数のVH配列および/もしくはVL配列または1つもしくは複数のそのCDR領域を有する抗体を実際に調製する(つまり、タンパク質として発現させる)ことは必要ではない。むしろ、(1つまたは複数の)配列中に含有される情報は、(1つまたは複数の)もとの配列に由来する(1つまたは複数の)「第2の生成」配列を作製するために、出発物質として使用され、次いで、(1つまたは複数の)「第2の生成」配列をタンパク質として調製し発現させる。
【０１５７】
5.9 組成物
他の態様において、本発明は、担体と共に製剤化される、本明細書において記載されるモノクローナル抗体またはそのFc領域を含む融合タンパク質の1つまたはその組み合わせを含有する組成物を提供する。そのような組成物は、本発明の(例えば2つまたはそれ以上の異なる)抗体、融合タンパク質、免疫コンジュゲート、または二特異性分子の1つまたはその組み合わせを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、そのような組成物は生理学的に許容可能であり、そのため、被験体への投与に適している(「本発明の医薬組成物」とも呼ばれる)。例えば、本発明の医薬組成物は、標的抗原上の異なるエピトープに結合するかまたは相補的な活性を有する抗体(または免疫コンジュゲートもしくは二特異体(bispecific))の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１５８】
他の実施形態において、本発明の組成物は、1つまたは複数の製薬上許容される塩を含んでいてもよい。そのような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの無毒性無機酸に由来するものならびに脂肪族系モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸などの無毒性有機酸に由来するものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するものならびにN,N'-ジベンジルエチレンジアミン、N-メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの無毒性有機アミンに由来するものを含む。
【０１５９】
他の実施形態において、本発明の組成物はまた、製薬上許容される抗酸化剤を含んでいてもよい。製薬上許容される抗酸化剤の例は、(1)アスコルビン酸、塩酸システイン、硫化水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤;(2)アスコルビン酸パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール(BRA)、ブチルヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α-トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤;ならびに(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤を含む。
【０１６０】
本発明の企図される組成物において用いることができる、適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)ならびにその適切な混合物、オリーブオイルなどの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。ふさわしい流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材の使用によって、分散液の場合において必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１６１】
他の実施形態において、本発明の組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などの補助剤を含有していてもよい。微生物の存在の予防は、滅菌手順ならびに様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの包含の両方によって確実にすることができる。組成物の中に、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むこともまた望ましい可能性がある。さらに、注射可能な医薬形態の吸収の延長は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる作用物質の含有によって引き起こすことができる。
【０１６２】
製薬上許容される担体は、無菌の注射可能な溶液または分散液の即座の調製のための滅菌水溶液または分散液および滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような溶媒および作用物質の使用は、当技術分野において知られている。いかなる従来の溶媒または作用物質も、活性化合物と不適合性である場合を除いて、本発明の医薬組成物におけるその使用が企図される。追加の活性化合物もまた、組成物の中に組み込むことができる。治療組成物は、典型的に、製造および保管の条件下で無菌であり、安定でなければならない。組成物は、高薬剤濃度に適した溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または他の指示される構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)ならびに適した混合物を含有する溶剤または分散媒とすることができる。ふさわしい流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合において必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合において、組成物において、等張剤、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの糖、多価アルコールを含むことは適しているであろう。注射可能な組成物の吸収の延長は、組成物において、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによってもたらすことができる。
【０１６３】
無菌の注射可能な溶液は、必要とされる、上記に列挙される成分のうちの1つまたはその組み合わせを有する適切な溶剤における、必要とされる量の活性化合物の組み込み、その後の滅菌精密濾過によって調製することができる。一般に、分散液は、上記に列挙されるものからの塩基性分散媒および必要とされる他の成分を含有する無菌の媒体の中に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、そのあらかじめ滅菌濾過された溶液から活性成分および任意のさらなる望ましい成分の粉末を産出する真空乾燥および冷凍乾燥(凍結乾燥)である。
【０１６４】
一実施形態において、本発明の組成物(例えば液体製剤)は、エンドトキシンおよび/または関連する発熱物質が実質的にないパイロジェンなしの製剤である。エンドトキシンは、微生物の内部に閉じ込めらており、微生物が分解されるかまたは死ぬ場合に放出される毒素を含む。発熱物質はまた、細菌および他の微生物の外膜からの発熱誘発性熱安定性物質(糖タンパク質)を含む。これらの物質の両方は、ヒトに投与された場合、発熱、低血圧、およびショックを引き起こし得る。可能性として考えられる悪影響により、静脈内投与される医薬品溶液から低量のエンドトキシンでさえ除去することは有利である。米国食品医薬品局(「FDA」)は、静脈内の薬剤適用について、1時間1回で、体重1キログラム当たり用量当たり5エンドトキシンユニット(EU)の上限を設定した(The United States Pharmacopeial Convention, Pharmacopeial Forum 26 (1):223 (2000))。治療タンパク質が、体重1キログラム当たり数百または数千ミリグラムの量で投与される場合、モノクローナル抗体にあり得ることだが、微量のエンドトキシンでも除去することは有利である。一実施形態において、組成物中のエンドトキシンおよびパイロジェンのレベルは、10EU/mg未満、または5EU/mg未満、または1EU/mg未満、または0.1EU/mg未満、または0.01EU/mg未満、または0.001未満EU/mgである。他の実施形態において、組成物中のエンドトキシンおよびパイロジェンのレベルは、約10EU/mg未満、または約5EU/mg未満、または約1EU未満/mgまたは約0.1EU/mg未満、または約0.01EU/mg未満、または約0.001EU/mg未満である。
【０１６５】
単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療対象の被験体および投与の特定の形態に依存して変わるであろう。単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす組成物のその量となるであろう。一般に、100パーセントのうち、この量は、製薬上許容される担体と組み合わせて、約0.01パーセント〜約99パーセントの活性成分、さらに約0.1パーセント〜約70パーセント、さらに約1パーセント〜約30パーセントの活性成分で変動するであろう。
【０１６６】
投薬レジメンは、最適な望ましい応答(例えば治療応答)を提供するように調整される。例えば、単一ボーラスが投与されてもよく、いくつかの分割用量がある時間にわたって投与されてもよく、または用量は、治療の状況の緊急性によって示されるように、比例的に低下させてもよくもしくは増加させてもよい。投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投薬ユニット形態で非経口組成物を製剤化することは特に有利である。本明細書において使用する場合、投薬ユニット形態は、治療対象の被験体に対して単一の投薬として適した物理的に個別のユニットを指し、各ユニットは、必要とされる医薬担体と組み合わせて望ましい治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性化合物を含有する。本発明の投薬ユニット形態についての規格は、(a)活性化合物の特有の特性および達成されるべき特定の治療効果ならびに(b)個体の治療の感受性に関してそのような活性化合物を調合することについての当技術分野において内在する限界によって規定され、それらに直接的に依存する。
【０１６７】
抗体の投与については、投薬は、約0.0001〜100mg/宿主体重kg、およびより通常では0.01〜5mg/宿主体重kgで変動する。例えば、投薬は、0.3mg/体重kg、1mg/体重kg、3mg/体重kg、5mg/体重kg、もしくは10mg/体重kgまたは1〜10mg/kgの範囲内とすることができる。例示的な治療プログラムは、1週間当たりに一度、2週間ごとに一度、3週間ごとに一度、4週間ごとに一度、月に一度、3ヵ月ごとに一度、または3〜6ヵ月ごとに一度の投与を要する。本発明の抗IFNAR1抗体のための投薬レジメンは、静脈内投与を介しての1mg/体重kgまたは3mg/体重kgを含み、抗体は、以下の投薬スケジュールのうちの1つを使用して与えられる:(i)6回の投薬について4週間ごと、次いで、3ヵ月ごと;(ii)3週間ごと;(iii)3mg/体重kgを一度、その後、3週間ごとに1mg/体重kg。
【０１６８】
あるいは、融合タンパク質の抗体は、徐放性製剤として投与されてもよく、この場合には、それほど頻繁ではない投与が必要とされる。投薬および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変わる。一般に、ヒト抗体は、最長の半減期を示し、次いでヒト化抗体、キメラ抗体、および非ヒト抗体となる。投与の投薬および頻度は、治療が予防薬か治療薬か依存して変わり得る。予防的適用において、比較的低い用量が、長い期間にわたって、比較的低頻度の間隔で投与される。何人かの患者は、残りの生活の間、治療を受け続ける。治療的適用において、比較的短い間隔での比較的高い用量は、疾患の進行が低下するまたは終結するまで、通常、患者が、疾患の症状の部分的なまたは完全な回復を示すまで時に必要とされる。その後、患者に、予防的プログラムが施され得る。
【０１６９】
本発明の医薬組成物における活性成分の実際の投薬レベルは、患者に対する毒性を伴うことなく、特定の患者、組成物、および投与の形態にとって望ましい治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るために変えることができる。選択される投薬レベルは、用いられる本発明の特定の組成物またはそのエステル、塩、もしくはアミドの活性、投与の経路、投与の時間、用いられている特定の化合物の排泄の速度、治療の期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物、および/または物質、治療されている患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態、および前の病歴、ならびに医学技術分野においてよく知られている同様の因子を含む、様々な薬物動態学的因子に依存するであろう。
【０１７０】
本発明の抗IFNAR1抗体の治療有効投薬量は、疾患症状の重症度の減少、疾患無症状期間の頻度および期間の増加、または疾患罹患による欠陥もしくは障害の予防をもたらす。例えば全身性エリテマトーデス(SLE)の場合には、治療有効用量は、例えば痛み、疲労、または脱力感などの、SLEと関連する身体的な症状の悪化をさらに予防できる。治療有効用量はまた、疾患の初期または早期のサインが存在する場合に望ましい可能性があるように、SLEの発症を予防することもできまたは遅延させることもできる。同様に、それは、SLEと関連する慢性の進行を遅延させることを含む。SLEの診断において利用される臨床検査は、化学、血液学、血清学、および放射線学を含む。したがって、先のもののうちのいずれかをモニターするあらゆる臨床または生化学アッセイは、特定の治療が、SLEを治療するための治療有効用量となるかどうかを決定するために使用することができる。当業者は、被験体のサイズ、被験体の症状の重症度、および特定の組成物、または選択される投与の経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
【０１７１】
本発明の組成物は、当技術分野において知られている1つまたは複数の様々な方法を使用して、投与の1つまたは複数の経路を介して投与することができる。当業者によって十分に理解されるように、投与の経路および/または形態は、望ましい結果に依存して変わるであろう。本発明の抗体のための投与の選択される経路は、投与の静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または例えば注射もしくは注入による他の非経口経路を含む。非経口投与は、経腸および局所投与以外の、通常、注射による投与の形態となり得、限定を伴うことなく静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内(intrasternal)注射および注入を含む。
【０１７２】
あるいは、本発明の抗体は、投与の局所、表皮、または粘膜経路などの非非経口(non-parenteral)経路を介して、例えば、鼻腔内に、経口的に、経膣的に、直腸に、舌下に、または局所的に投与することができる。
【０１７３】
活性化合物は、移植片、経皮的パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤などの、急速な放出から化合物を保護するであろう担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生物分解性で生物学的適合のポリマーは、使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は、特許を受けており、一般に当業者らに知られている。例えばSustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
【０１７４】
治療組成物は、当技術分野において知られている医学的デバイスを用いて投与することができる。例えば他の実施形態において、本発明の治療組成物は、米国特許第5,399,163号;同第5,383,851号;同第5,312,335号;同第5,064,413号;同第4,941,880号;同第4,790,824号;または同第4,596,556号において開示されるデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。本発明において有用な、よく知られている移植片およびモジュールの例は、制御速度で医薬を分注するための、移植可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第4,487,603号;皮膚を通して薬を投与するための治療デバイスを開示する米国特許第4,486,194号;正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する米国特許第4,447,233号;連続的な薬剤送達のための可変流量の移植可能な注入装置を開示する米国特許第4,447,224号;マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透性薬剤送達系を開示する米国特許第4,439,196号;および浸透性薬剤送達系を開示する米国特許第4,475,196号を含む。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。他の多くのそのような移植片、送達系、およびモジュールは、当業者らに知られている。
【０１７５】
一部の実施形態において、本発明の抗体は、in vivoにおいてふさわしい分布を保証するために製剤化することができる。例えば、脳血液関門(BBB)は、多くの高度に親水性の化合物を除外する。本発明の治療化合物がBBBを横断することを保証するために(望ましい場合に)、それらは、例えばリポソーム中で製剤化することができる。リポソームを製造する方法については、例えば米国特許第4,522,811号;同第5,374,548号;および同第5,399,331号を参照されたい。リポソームは、特異的な細胞または器官の中に選択的に輸送され、したがって標的薬剤送達を増強する1つまたは複数の部分を含んでいてもよい(例えばV.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685を参照されたい)。例示的な標的部分は、葉酸またはビオチン(例えばLowらに対する米国特許第5,416,016号を参照されたい);マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038);抗体(P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180);界面活性剤プロテインA受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994)J. Biol. Chem. 269:9090)を含む。K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273もまた参照されたい。
【０１７６】
5.10 診断上の使用
他の実施形態において、本発明の抗体は、in vitroおよびin vivoにおける診断上および治療上の有用性を有する。例えば、これらの分子は、様々な障害を治療する、予防する、または診断するために、培養中の細胞に、例えばin vitroもしくはex vivoにおいてまたは被験体に、例えばin vivoにおいて投与することができる。
【０１７７】
一実施形態において、本発明の抗体は、IFNAR1のレベルまたはIFNAR1を発現させる細胞のレベルを検出するために使用することができる。例えば、これは、例えば、抗体およびIFNAR1の間の複合体の形成を可能にする条件下で、試料(in vitro試料など)および対照試料を抗IFNAR1抗体と接触させることによって達成することができる。抗体およびIFNAR1の間で形成される任意の複合体を検出し、試料および対照において比較する。例えば、ELISAおよびフローサイトメトリーアッセイなどの、当技術分野において周知の標準的な検出方法は、本発明の組成物を使用して実施することができる。
【０１７８】
したがって、一態様において、本発明は、試料におけるIFNAR1(例えばヒトIFNAR1抗原)の存在を検出するためのまたはIFNAR1の量を測定するための方法であって、抗体またはその部分およびIFNAR1の間で複合体の形成を可能にする条件下で、試料および対照試料を、IFNAR1に特異的に結合する本発明の抗体またはその抗原結合部分と接触させるステップを含む方法をさらに提供する。次いで、複合体の形成が検出され、対照試料と比較した試料の複合体形成の差異は、試料におけるIFNAR1の存在を示す。
【０１７９】
5.11 治療上の適用
IFNAR1は、I型インターフェロンに対する細胞受容体の一部であり、I型インターフェロンは、T細胞分化、抗体産生、ならびにメモリーT細胞の活性および生存に関与する免疫調節性サイトカインであることが知られている。さらに、I型インターフェロンの発現の増加は、多数の自己免疫疾患において、HIV感染において、移植拒絶において、および移植片対宿主病(GVHD)において記載されてきた。したがって、本発明の抗IFNAR1抗体またはその断片は、I型インターフェロンの機能的活性を阻害するが、異常なまたは望まれないI型インターフェロン活性を伴う、様々な臨床的な徴候において使用することができる。本発明は、I型インターフェロン介在性疾患または障害を予防する、治療する、維持する、回復させる、または阻害するための方法であって、本発明の抗体またはその抗原結合部分を投与するステップを含む方法を包含する。
【０１８０】
本発明の抗体を使用することができる自己免疫状態の特定の例は、以下のものを含むが、これらに限定されない:全身性エリテマトーデス(SLE)、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、炎症性腸疾患(IBD)(クローン病、潰瘍性大腸炎、およびセリアック病を含む)、多発性硬化症(MS)、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ(RA)、ならびに糸球体腎炎。さらに、本発明の抗体組成物は、移植拒絶を阻害もしくは予防するためにまたは移植片対宿主病(GVHD)の治療においてまたはHIV感染/AIDSの治療において使用することができる。
【０１８１】
高レベルIFNαは、全身性エリテマトーデス(SLE)を有する患者の血清において観察された(例えばKim et al. (1987) Clin. Exp. Immunol. 70:562-569を参照されたい)。さらにIFNαの投与は、例えば癌またはウイルス感染の治療において、SLEを誘発することが示されている(Garcia-Porrua et al. (1998) Clin. Exp. Rheumatol. 16:107-108)。したがって、他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、治療を必要とする被験体に抗体を投与することによって、SLEの治療において使用することができる。
【０１８２】
SLEを治療するための他の方法は、以下の出願番号を有する「Methods of treating SLE」と題する米国特許出願:07年4月16日に出願された第60/907,767号;2007年11月5日に出願された第60/966,174号、および2007年12月9日に出願されたPCT出願番号PCT/US2007/02494において記載され、これらはそれぞれ、その全体が参照により組み込まれる。
【０１８３】
IFNαはまた、I型糖尿病の病理において関係していることも証明された。例えば、I型糖尿病患者の膵臓β細胞における免疫反応性IFNαの存在が報告された(Foulis et al. (1987) Lancet 2:1423-1427)。抗ウイルス療法におけるIFNαの使用の延長もまた、I型糖尿病を誘発することが示された(Waguri er al. (1994) Diabetes Res. Clin. Pract. 23:33-36)。したがって、他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体またはその断片は、治療を必要とする被験体に抗体を投与することによって、I型糖尿病の治療において使用することができる。抗体は、単独でまたはインスリンなどの他の抗糖尿病作用物質と組み合わせて使用することができる。
【０１８４】
IFNAR1に対する抗体は、炎症性腸疾患の動物モデルにおいて有効であることが示されている(米国特許出願第60/465,155号を参照されたい)。したがって、本発明の抗IFNAR1抗体またはその断片は、治療を必要とする被験体に抗体を投与することによって、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む炎症性腸疾患(IBD)の治療において使用することができる。
【０１８５】
IFNαを用いる治療もまた、自己免疫性甲状腺炎を誘発することが観察された(Monzani et al. (2004) Clin. Exp. Med. 3:199-210; Prummel and Laurberg (2003) Thyroid 13:547-551)。したがって、他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、治療を必要とする被験体に本発明の抗体を投与することによって、自己免疫原発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、橋本甲状腺炎、および甲状腺機能低下症を有する破壊性甲状腺炎を含む自己免疫甲状腺疾患の治療において使用することができる。本発明の抗体は、単独でまたは抗甲状腺薬剤、放射性ヨウ素、および甲状腺亜全摘などの他の作用物質または治療と組み合わせて使用することができる。
【０１８６】
高レベルのIFNαはまた、HIV感染の患者の血行路においても観察され、その存在は、AIDS進行の予測的マーカーとなる(DeStefano et al. (1982) J Infec. Disease 146:451; Vadhan-Raj et al. (1986) Cancer Res. 46:417)。したがって、他の実施形態において、本発明の抗IFNAR1抗体は、治療を必要とする被験体に本発明の抗体を投与することによって、HIV感染またはAIDSの治療において使用することができる。他の実施形態において、本発明の抗体は、単独でまたはヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、および融合阻害剤などの他の抗HIV作用物質と組み合わせて使用することができる。
【０１８７】
IFNAR1に対する抗体は、同種移植片拒絶を阻害し、同種移植片の生存を延長するのに有効であることが実証されている(例えばTovey et al. (1996) J. Leukoc. Biol 59:512-517; Benizri et al. (1998) J. Interferon Cytokine Res. 18:273-284を参照されたい)。したがって、本発明の抗IFNAR1抗体はまた、同種移植片拒絶を阻害し、かつ/または同種移植片の生存を延長するために移植レシピエントにおいて使用することができる。本発明は、治療を必要とする移植レシピエントに本発明の抗IFNAR1抗体を投与することによって、移植拒絶を阻害するための方法を提供する。治療することができる組織移植の例は、移植片対宿主病(GVHD)の治療だけでなく、肝臓、肺、腎臓、心臓、小腸、および膵島細胞を含むが、これらに限定されない。本発明の抗体は、単独でまたは免疫抑制剤(例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、ラパマイシン、タクロリムス)、抗感染薬(例えばアシクロビル、クロトリマゾール、ガンシクロビル、ナイスタチン、トリメトプリムスルファメトキサゾール)、利尿薬(例えばブメタニド、フロセミド、メトラゾン)、および潰瘍医薬(例えばシメチジン、ファルノチジン(farnotidine)、ランソプラゾール、オメプラゾール、ラニチジン、スクラルファート)などの、移植拒絶を阻害するための他の作用物質と組み合わせて使用することができる。
【０１８８】
他の特定の実施形態において、本発明は、これらに限定されないが、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、および十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵臓炎、潰瘍性、偽膜性、急性、および虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ホイップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体疾患、器官虚血、再灌流傷害、器官壊死、花粉症、敗血症(sepsis、septicemia)、エンドトキシンショック、悪液質、異常高熱症、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、嚢胞性線維症、間質性肺炎、珪性肺塵症、肺胞炎、毛細気管支炎、咽頭炎、肋膜炎、副鼻腔炎、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス感染、ヘルペス感染、HIV感染、B型肝炎ウイルス感染、C型肝炎ウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、やけど、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、疣贅、膨疹、血管炎、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓静脈炎、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、多発性動脈炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、セリアック病、鬱血性心不全、再狭窄、COPD成人型呼吸窮迫症候群、脳膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラン-バレー症候群、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎症、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、I型糖尿病、強直性脊椎炎、ベルジェ病、ライター症候群、ならびにホジキン病などの、慢性および急性の両方の状態を含む広範囲の炎症性の状態を治療および予防するために、組成物および本発明の抗体を投与および使用する方法を提供する。
【０１８９】
他の実施形態において、投与の方法および本発明の抗体の組成物は、以下の状態または疾患状態と関連する症状の予防、治療、回復において有用であり得る:グレーブス病、橋本甲状腺炎、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、交感性眼炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性リンパ増殖性症候群、抗リン脂質症候群、シェーグレン症候群、強皮症、アジソン病、多内分泌欠陥症候群、ギランバレー症候群、免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、混合性結合組織疾患、白斑、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、セリアック病、疱疹状皮膚炎、自己免疫性肝炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、自己免疫性心筋炎、自己免疫性血管炎、円形脱毛症自己免疫性アテローム動脈硬化症、ベーチェット病、自己免疫性ミエロパシー、自己免疫性血友病、自己免疫性間質性膀胱炎、自己免疫性尿崩症、自己免疫性子宮内膜症、再発性多発性軟骨炎、強直性脊椎炎、自己免疫性蕁麻疹、皮膚筋炎、ミラーフィッシャー症候群、IgA腎症、グッドパスチャー症候群、および妊娠性疱疹。
【０１９０】
他の実施形態において、投与の方法および本発明の抗体の組成物は、シェーグレン症候群と関連する症状の予防、治療、回復において有用であり得る。シェーグレン症候群は、涙および唾液を産生する外分泌腺を免疫細胞が攻撃し、破壊する自己免疫障害である。それは、最初にそれを記載したスウェーデンの眼科医ヘンリック・シェーグレン(1899〜1986)にちなんで命名された。シェーグレン症候群はまた、関節リウマチなどのリウマチ障害と関連し、症例の90パーセントにおいてリウマチ因子陽性である。障害の特徴となる症状は、乾燥した口およびドライアイである。さらに、シェーグレン症候群は、皮膚、鼻、および膣の乾燥を引き起こす可能性があり、腎臓、血管、肺、肝臓、膵臓、および脳を含む身体の他の器官に影響する可能性がある。シェーグレンは、女性および男性の両方におけるすべての年齢群において生じるが、10人のシェーグレン患者のうち9人は女性であり、発症の平均年齢は、40歳代の後半である。合衆国のみで400万人もの人々を襲っていると推定され、第2の最も一般的な自己免疫リウマチ性疾患である。
【０１９１】
筋炎は、骨格筋または髄意筋の炎症によって特徴づけられる一般的な状態である。筋肉炎症は、アレルギー反応、毒性物質もしくは薬への曝露、癌もしくはリウマチ様の状態などの他の疾患、またはウイルスもしくは他の感染病原体によって引き起こされ得る。慢性炎症性筋疾患は、特発性であり、それらが、知られている原因を有していないことを意味する。それらは、身体の白血球(通常疾患と戦う)が、器官、骨格、および関節における血管、正常な筋線維、および結合組織を攻撃する自己免疫障害であることが理解される。
【０１９２】
多発性筋炎は、身体の両側の骨格筋(運動を成すことと関連する)を冒す。それは、年齢18歳未満の人においてめったに見られず、ほとんどの症例は、31歳〜60歳の患者におけるものである。上記に挙げた症状に加えて、進行性の筋力低下は、嚥下、話すこと、座位から立ち上がること、階段に登ること、物体を持ち上げること、または頭上に動かすことについての障害をもたらす。多発性筋炎を有する患者はまた、関節炎、息切れ、および心臓不整脈をも経験する場合がある。
【０１９３】
皮膚筋炎は、進行性の筋力低下に先行するまたはそれを伴う発疹によって特徴づけられる。皮疹は、まだら状に見え、青みを帯びた紫色または赤色の変色を伴い、まぶた上ならびに指関節、肘、かかと、およびつま先を含む関節を伸長するまたは真っすぐにするために使用される筋肉上で特徴的に発症する。赤色の皮疹はまた、顔、首、肩、上部の胸、背中、および他の位置の上で生じる可能性があり、冒されたエリアにおいて腫脹がある場合がある。皮疹は、時に、明らかな筋肉の関与を伴うことなく生じる。皮膚筋炎を有する成人は、体重減少または微熱を経験し、炎症を起こしている肺を有し、光に対して敏感である場合がある。成人の皮膚筋炎は、多発性筋炎と異なり、乳房、肺、女性の生殖器、または腸の腫瘍を伴う場合がある。皮膚筋炎を有する小児および成人は、カルシウム沈着を発症する場合があり、これは、皮膚下でまたは筋肉中で硬い隆起として現われる(石灰沈着症と呼ばれる)。石灰沈着症は、疾患発症の1〜3年後に生じることが最も多いが、長年後に生じる可能性がある。これらの沈着は、成人において始まる皮膚筋炎よりも幼年期皮膚筋炎においてより見られることが多い。皮膚筋炎は、膠原血管疾患または自己免疫疾患と関連する可能性がある。
【０１９４】
封入体筋炎(IBM)は、進行性の筋力低下および筋消耗によって特徴づけられる。IBMは、多発性筋炎に類似するが、それ自体の示差的特徴を有する。筋力低下の発症は一般に緩やかで(数ヵ月または数年にわたり)、近位および遠位の筋肉を冒す。筋力低下は、身体の片側のみを冒す場合がある。空胞と呼ばれる小さな穴が、冒された筋線維の細胞において見られる。転倒およびつまずきは、通常、IBMの第1の注目すべき症状である。一部の患者については、障害は、つまみ取ること、ボタンをかけること、および物体をつかむことに関する障害を引き起こす、手首および指の脱力感から始まる。手首および指の筋肉の脱力感ならびに脚部における前腕筋肉および大腿四頭筋の萎縮(やせ細りまたは筋肉の体積の減少)がある場合がある。嚥下障害は、IBMの症例の約半分において生じる。疾患自体はそれおり早く生じ得るが、疾患の症状は、通常、50歳より後に始まる。多発性筋炎および皮膚筋炎と異なり、IBMは、女性よりも男性において、より頻繁に生じる。
【０１９５】
若年性筋炎は、成人の皮膚筋炎および多発性筋炎といくつかの類似点を有する。それは、典型的に、2〜15歳の小児を冒し、近位の筋力低下および炎症、浮腫(腫脹を引き起こす、体内組織内での体液の異常な集合)、筋肉痛、疲労、発疹、腹痛、発熱、ならびに拘縮(関節が自由に動くのを妨げる、筋腱における炎症によって引き起こされる、関節のまわりの筋肉または腱の慢性の短縮)を含む症状を伴う。若年性筋炎を有する小児はまた、嚥下障害および呼吸障害をも有する可能性があり、心臓が冒される可能性がある。若年性皮膚筋炎を有する小児の約20〜30パーセントは、石灰沈着症を発症する。若年性患者は、それらの血液中に、正常なレベルよりも高い筋酵素クレアチンキナーゼを示さない場合があるが、正常なレベルよりも高い他の筋酵素を有する。
【０１９６】
したがって、他の実施形態において、本発明の抗体は、筋炎、炎症性筋炎、特発性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体筋炎(IBM)、若年性筋炎、またはこれらの状態と関連する症状の予防、治療、または回復において有用であり得る。
【０１９７】
他の実施形態において、本発明の抗体は、血管炎と関連する症状の予防、治療、または回復において有用であり得る。
【０１９８】
本発明の抗体は、強皮症の治療に有用であり得る。強皮症を治療するための方法は、2007年11月5日に出願された出願番号第60/996,175号を有する「Methods Of Treating Scleroderma」と題する米国特許出願およびPCT出願PCT/US2008/82481において記載され、これらは、すべての目的でその全体が参照により組み込まれる。
【０１９９】
他の実施形態において、本発明の抗体は、サルコイドーシスと関連する症状の予防、治療、または回復において有用であり得る。サルコイドーシス(サルコイドまたはベスニエ-ベック疾患とも呼ばれる)は、非壊死性肉芽腫(小さな炎症性の結節)によって特徴づけられる免疫系障害である。実際は、あらゆる器官が冒され得るが、肉芽腫は、肺またはリンパ節において現われることが最も多い。症状は、時々、急に現われ得るが、通常徐々に現われる。肺のX線を調べると、サルコイドーシスは、結核またはリンパ腫の所見を有し得る。
【０２００】
本発明の組成物(例えば抗IFNAR1抗体)および使用のための説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内である。キットは、少なくとも1つのさらなる試薬または1つもしくは複数のさらなる本発明の抗体(例えば第1の抗体とは異なる標的抗原上のエピトープに結合する相補的な活性を有する抗体)をさらに含有することができる。キットは、典型的に、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キットの上もしくはそれと共に供給されるあらゆる文書または記録物を含み、これは、他の場合には、キットに添付される。
【０２０１】
5.12 組み合わせ
本発明の組成物はまた、他の作用物質と組み合わせるなどして、併用療法において投与することができる。例えば、併用療法は、少なくとも1つの他の免疫抑制剤と組み合わせた本発明の抗IFNAR1抗体を含むことができる。
【０２０２】
一部の方法において、異なる結合特異性を有する2つまたはそれ以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合には、投与される各抗体の投薬量は、示される範囲内にある。抗体は、通常、複数回投与される。1回の投薬の間の間隔は、例えば、毎週、毎月、3ヵ月ごと、または毎年とすることができる。間隔はまた、患者における標的抗原に対する抗体の血液レベルの測定によって示されたときに、不規則にもなり得る。一部の方法において、投薬量は、約1〜1000μg/mlの血漿抗体濃度を達成するように調整され、一部の方法において、約25〜300μg/mlである。
【０２０３】
IFNAR1に対する抗体が、他の作用物質と共に投与される場合、2つは、いずれかの順序でまたは同時に投与することができる。例えば、本発明の抗IFNAR1抗体は、以下の1つまたは複数の作用物質と組み合わせて使用することができる:メサラミンを含有する薬剤(スルファサラジンならびにオルサラジンおよびバルサラジドなどの、5-アミノサリチル酸(5-ASA)を含有する他の作用物質を含む)、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、鎮痛剤、コルチコステロイド(例えばプレドニソン、ヒドロコルチゾン)、TNF阻害剤(アダリムマブ(HUMIRA(登録商標))、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、およびインフリキシマブ(REMICADE(登録商標))を含む)、免疫抑制剤(6-メルカプトプリン、アザチオプリン、およびシクロスポリンAなど)、ならびに抗生物質抗IFNα抗体、抗IFNγ受容体抗体、および可溶性IFNγ受容体。さらに、本発明の抗IFNAR1抗体は、Flt3リガンドアンタゴニストと組み合わせて使用することができる。(例えば米国出願2002/0160974を参照されたい)。
【０２０４】
他の実施形態において、本発明の組成物はまた、SLEの治療において有用な作用物質を含んでいてもよい。そのような作用物質は、鎮痛剤、コルチコステロイド(例えばプレドニソン、ヒドロコルチゾン)、免疫抑制剤(シクロホスファミド、アザチオプリン、およびメトトレキサートなど)、抗マラリア剤(ヒドロキシクロロキンなど)、ならびにdsDNA抗体の産生を阻害する生物学的薬剤(例えばLJP 394)を含む。
【０２０５】
5.13 等価物
当業者らは、日常的な実験以上のものを使用しないで、本明細書において記載される本発明の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または確認することができるであろう。
【０２０６】
本明細書において言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、個々の各刊行物、特許、または特許出願が、具体的かつ個々に、参照により本明細書に組み込まれることが示される場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０７】
さらに、以下の米国仮特許出願:2008年2月8日に出願された第61/006,962号、2007年3月7日に出願された第61/034,618号、および2008年5月2日に出願された第61/049,970号は、すべての目的でその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
5.14 具体的な実施形態
1. IFNAR1に特異的な改変IgGクラスモノクローナル抗体であって、Fc領域に、Kabatに説明されるEUインデックスにより番号付けしたL234F、L235E、およびP331Sからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含み、未改変抗体と比較して少なくとも1つのFcリガンドに対して低下した親和性を示す、上記抗体。 
2. IgG1またはIgG4サブクラスである、実施形態1に記載の抗体。 
3. IgG1クラス分子である、実施形態2に記載の抗体。 
4. P331Sのアミノ酸置換を含む、実施形態3に記載の抗体。 
5. アミノ酸置換:L234FおよびL235Eを含む、実施形態3に記載の抗体。 
6. アミノ酸置換:L234F、L235EおよびP331Sを含む、実施形態3に記載の抗体。 
7. IgG4クラス分子である、実施形態3に記載の抗体。 
8. Fc領域のL235Eのアミノ酸置換を含む、実施形態7に記載の抗体。 
9. Fc領域にアミノ酸置換S228Pをさらに含む、実施形態7に記載の抗体。 
10. 表2から選択される少なくとも1つの相捕性決定領域(CDR)を含む、実施形態1〜9のいずれか1項に記載の抗体。
【０２０９】
11. 以下のCDR:
a.配列番号31を含むヒト重鎖可変領域CDR1;
b.配列番号32を含むヒト重鎖可変領域CDR2;
c.配列番号33を含むヒト重鎖可変領域CDR3;
d.配列番号34を含むヒト軽鎖可変領域CDR1;
e.配列番号35を含むヒト軽鎖可変領域CDR2;および
f.配列番号36を含むヒト軽鎖可変領域CDR3
を含む、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の抗体。 
12. 以下のCDR:
a.配列番号1を含むヒト重鎖可変領域CDR1;
b.配列番号2を含むヒト重鎖可変領域CDR2;
c.配列番号3を含むヒト重鎖可変領域CDR3;
d.配列番号4を含むヒト軽鎖可変領域CDR1;
e.配列番号5を含むヒト軽鎖可変領域CDR2;および
f.配列番号6を含むヒト軽鎖可変領域CDR3
を含む、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の抗体。 
13. 以下のCDR:
a.配列番号11を含むヒト重鎖可変領域CDR1;
b.配列番号12を含むヒト重鎖可変領域CDR2;
c.配列番号13を含むヒト重鎖可変領域CDR3;
d.配列番号14を含むヒト軽鎖可変領域CDR1;
e.配列番号15を含むヒト軽鎖可変領域CDR2;および
f.配列番号16を含むヒト軽鎖可変領域CDR3
を含む、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の抗体。 
14. 以下のCDR:
a.配列番号21を含むヒト重鎖可変領域CDR1;
b.配列番号22を含むヒト重鎖可変領城CDR2;
c.配列番号23を含むヒト重鎖可変領域CDR3;
d.配列番号24を含むヒト軽鎖可変領域CDR1;
e.配列番号25を含むヒト軽鎖可変領域CDR2および
f.配列番号26を含むヒト軽鎖可変領域CDR3
を含む、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の抗体。 
15. 以下の可変領域:
a.配列番号38のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域;および
b.配列番号40のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の抗体。 
16. 以下の可変領域:
a.配列番号8のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域;および
b.配列番号10のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の抗体。 
17. 以下の可変領域:
a.配列番号18のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域;および
b.配列番号20のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の抗体。 
18. 以下の可変領域:
a.配列番号28のアミノ酸配列を含むヒト重鎖可変領域;および
b.配列番号30のアミノ酸配列を含むヒト軽鎖可変領域
を含む、実施形態1〜10のいずれか1項に記載の抗体。 
19. 配列番号41の軽鎖定常領域配列を含む、実施形態1〜18のいずれか1項に記載の抗体。 
20. 配列番号42の重鎖定常領域を含む、実施形態1〜18のいずれか1項に記載の抗体。
【０２１０】
21. 配列番号41のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域および配列番号42のアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含む、実施形態1〜18のいずれか1項に記載の抗体。 
22. EUインデックスナンバリングシステムにより定義される214、221、356および358からなる群より選択される少なくとも1以上の位置の対立遺伝子変異を含む重鎖アミノ酸配列を含む、実施形態19〜21のいずれか1項に記載の抗体。 
23. ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、イントラボディ、および合成抗体からなる群より選択される、実施形態1〜22のいずれか1項に記載の抗体。 
24. 実施形態1〜23のいずれか1項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸。 
25. 複製可能ベクターである、実施形態24に記載の核酸。 
26. 上記ポリヌクレオチド配列がプロモーターに機能的に連結されている、実施形態25に記載の核酸。 
27. 実施形態25または26に記載のベクターを含むかまたは上記ベクターで形質転換されている、宿主細胞。 
28. ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子を含み、実施形態1〜23のいずれか1項に記載の抗体を発現する、トランスジェニックマウス。 
29. 上記抗体を産生する、実施形態28に記載のマウスから調製したハイブリドーマ。 
30. 実施形態1〜23のいずれか1項に記載の抗体、および製薬上許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【０２１１】
31. それを必要とする被験体に有効量の実施形態30に記載の組成物を投与するステップを含む、免疫障害を伴う状態または疾患の治療方法。 
32. 上記疾患がI型インターフェロン介在性疾患である、実施形態31に記載の方法。 
33. I型インターフェロンがインターフェロンαである、実施形態32に記載の方法。 
34. I型インターフェロン介在性疾患がI型インターフェロン受容体に関連する、実施形態33に記載の方法。 
35. 上記疾患または障害がAIDSのHIV感染である、実施形態31に記載の方法。 
36. 上記疾患または障害が全身性エリテマトーデスである、実施形態31に記載の方法。
【０２１２】
37. 上記疾患または障害がシェーグレン症候群である、実施形態31に記載の方法。 
38. 上記疾患または障害が筋炎である、実施形態31に記載の方法。 
39. 上記疾患または障害が炎症性筋炎である、実施形態31に記載の方法。 
40. 上記疾患または障害が多発性筋炎である、実施形態31に記載の方法。
【０２１３】
41. 上記疾患または障害が皮膚筋炎である、実施形態31に記載の方法。 
42. 上記疾患または障害が封入体筋炎である、実施形態31に記載の方法。 
43. 上記疾患または障害が若年性筋炎である、実施形態31に記載の方法。 
44. 上記疾患または障害が特発性炎症性筋炎である、実施形態31に記載の方法。 
45. 上記疾患または障害が血管炎である、実施形態31に記載の方法。 
46. 上記疾患または障害がサルコイドーシスである、実施形態31に記載の方法。 
47. 上記疾患または障害が、炎症性腸疾患、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病、糸球体腎炎、および移植片対宿主病からなる群より選択される、実施形態31に記載の方法。 
48. 上記疾患または障害が乾癬またはそれをもたらす状態である、実施形態31に記載の方法。 
49. 上記疾患または障害が移植拒絶または移植片対宿主病である、実施形態31に記載の方法。
【０２１４】
50. 上記疾患または障害が、グレーブス病、橋本甲状腺炎、クローン病、乾癬、乾癬性関節炎、交感性眼炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、自己免疫性リンパ増殖性症候群、抗リン脂質症候群、シェーグレン症候群、強皮症、アジソン病、多内分泌欠陥症候群、ギランバレー症候群、免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、重症筋無力症、原発性胆汁性肝硬変、混合性結合組織疾患、白斑、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、セリアック病、疱疹状皮膚炎、自己免疫性肝炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、水疱性類天疱瘡、自己免疫性心筋炎、自己免疫性血管炎、円形脱毛症、自己免疫性アテローム動脈硬化症、ベーチェット病、自己免疫性ミエロパシー、自己免疫性血友病、自己免疫性間質性膀胱炎、自己免疫性尿崩症、自己免疫性子宮内膜症、再発性多発性軟骨炎、強直性脊椎炎、自己免疫性蕁麻疹、皮膚筋炎、ミラーフィッシャー症候群、IgA腎症、グッドパスチャー症候群、および妊娠性疱疹からなる群より選択される、実施形態31に記載の方法。
【０２１５】
51. 光線療法、コルチコステロイド、プレドニゾン、NSAIDS、血漿交換、免疫抑制剤、メトトレキサート、レチノイン酸、チオグアニン、ミコフェノール酸モフェチル、フマル酸エステル、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリン、および免疫グロブリンからなる群より選択される少なくとも1つの薬剤を投与するステップをさらに含む、実施形態31〜50のいずれか1項に記載の方法。 
52. アレファセプト(AMEVIVE(商標))、エタネルセプト(ENBREL(登録商標))、アダリムマブ(HUMIRA(登録商標))、インフリキシマブ(REMICADE(登録商標))、ベリムマブ(LYMPHOSTATB(商標))、リツキシマブ(rituxumab)(RITUXAN(登録商標))、およびエファリズマプ(RAPTIVA(登録商標))からなる群より選択される少なくとも1つの薬剤を投与するステップをさらに含む、実施形態31〜51のいずれか1項に記載の方法。
【０２１６】
53. Kabatに説明されるEUインデックスにより番号付けしたL234F、L235E、およびP331Sからなる群より選択される少なくとも1つのアミノ酸置換を含むヒトIgGFc領域を含む結晶であって、上記断片が未改変のFc領域と比較して少なくとも1つのFcリガンドに対して低下した親和性を示す、上記結晶。 
54. ヒトIgG Fc領域がアミノ酸置換L234F、L235EおよびP331Sを含む、実施形態53に記載の結晶。 
55. 回折品質である、実施形態53に記載の結晶。 
56. 生結晶(native crystal)である、実施形態53に記載の結晶。 
57. a=50.18±0.2Å、b=147.30±O.2Å、およびc=75.47±O.2Åの斜方晶単位格子を特徴とする、実施形態53に記載の結晶。 
58. C2221の空間群を有する、実施形態53に記載の結晶。
【０２１７】
59. Fc領域に、Kabatに説明されるEUインデックスにより番号付けしたアミノ酸置換L234F、L235E、およびP331Sを含み、未改変抗体と比較して少なくとも1つのFcリガンドに対して低下した親和性を示す、上記抗体。 
60. Kabatに説明されるEUインデックスにより番号付けしたアミノ酸置換L234F、L235E、およびP331Sを含み、Fc領域と比較して少なくとも1つのFcリガンドに対して低下した親和性を示す改変Fc領域を含む、融合タンパク質。 
61. 実施形態1〜23または59のいずれか1項に記載の抗体の製造方法。 
62. 内在化抗体である、実施形態1〜23または59のいずれか1項に記載の抗体。 
63. 内在化融合タンパク質である、実施形態60に記載の融合タンパク質。 
64. IFNAR1に特異的に結合する、実施形態63に記載の融合タンパク質。 
65. 上記未改変抗体と比較して、低下したかまたは消失した抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を示す、実施形態1〜23、59または62のいずれか1項に記載の抗体。 
66. 上記未改変抗体と比較して、低下したかまたは消失した補体媒介性細胞傷害(CDC)を示す、実施形態1〜23、59または62のいずれか1項に記載の抗体。 
67. 上記未改変抗体と比較して、低下したかまたは消失したADCCおよびCDCを示す、実施形態1〜23、59または62のいずれか1項に記載の抗体。
【０２１８】
5.15  配列
軽鎖定常領域(配列番号41)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
重鎖定常領域(配列番号42)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPASIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
【実施例】
【０２１９】
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は、例示の目的でのみ提供され、本発明がこれらの実施例に限定されると解釈されるべきでは決してなく、本明細書に提供された教示の結果として明らかになるあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【０２２０】
実施例１
6.1  複数の抗IFNAR1抗体のIHCプロファイル
目的:様々な組織セットに対する抗IFNAR1抗体のIHCプロファイルを評価すること。
【０２２１】
方法:抗体の結合特性を研究するための免疫組織化学技術は、当分野において容易に理解でき、例えば、所望の細胞または組織を単離し、標準的固定および標本化技術により顕微鏡用にそれらを調製することによって実施できた。
【０２２２】
マウスマクロファージ:細胞懸濁液を遠沈し、緩いペレットを形成させた。ペレットをOCT凍結培地中で凍結し、ブロックを形成させた。スライド用切片を5ミクロンの厚さに切断し、アセトンに10分間浸し、乾燥剤を用いて一晩乾燥させた。使用前に、スライドを10％中性緩衝ホルマリンに10秒間漬け、緩衝液(0.01％ Tween20含有1×TBS)で3回洗浄した。
【０２２３】
ヒト単球:細胞懸濁液を直接スライドに塗沫/スポットした。スライドを一晩乾燥させ、その後アセトンに10分間浸し、風乾させた。使用前に、スライドを10％中性緩衝ホルマリンに10秒間漬け、緩衝液(0.01％ Tween20含有1×TBS)で3回洗浄した。
【０２２４】
ヒト大脳および心臓組織:ドナー由来の組織試料をOCT凍結培地中で凍結させ、ブロックを形成させた。スライド用切片を5ミクロンの厚さに切断し、アセトンに10分間浸し、乾燥剤を用いて一晩乾燥させた。使用前に、スライドを10％中性緩衝ホルマリンに10秒間漬け、緩衝液(0.01％ Tween20含有1×TBS)で3回洗浄した。
【０２２５】
抗体標識化:抗体を、下記のプロトコルによりビオチンにコンジュゲートした。およそ500μgの抗体を、20倍過剰なビオチンと混合し、暗所で4℃において2時間インキュベートした。2時間インキュベート後、抗体/ビオチン混合物を、1×PBSを用いて予備平衡化したPD10カラムに添加した。次いで、ビオチンコンジュゲート抗体を、YM-30 Centricon濃縮チューブを使用して所望の濃度に濃縮した。
【０２２６】
スライドの染色:緩衝液中で洗浄後、スライドを、グルコースオキシダーゼ(1U/ml、Sigma G0543)、B-D(+)グルコース(10mM、Sigma G5250)、アジ化ナトリウム(1mM、Sigma、S8032)の溶液で、1時間室温において処理することにより、内在性ペルオキシダーゼを失活させる処理をした。その後、スライドを、洗浄緩衝液(0.01％ Tween20含有1×TBS)ですすいだ。スライドを、タンパク質ブロッキング溶液(1×PBS pH7.2、0.5％カゼイン(N-Zアミン、Sigma C0626)、1％BSA(Sigma A7906)、1.5％正常ヤギ血清(Jackson Labs #005-000-001))中に室温において30分間置いた。ビオチン化抗体(上記を参照されたい)を、タンパク質ブロッキング溶液で希釈し、スライドにかけた。ビオチン化抗体をかけたスライドのインキュベーションを、室温において2時間実施した。スライドを、洗浄緩衝液(0.01％ Tween20含有1×TBS)で、3回すすいだ。抗体検出を、Vectastain Kit(Vector Laboratories)を使用して実施した。スライドを洗浄し、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。スライドを脱水し、観察前にカバースリップを装着させた。
【０２２７】
結果:図6Aに、様々な抗IFNAR1抗体および対照抗体で染色したヒト大脳組織のIHC分析の結果を提示する。抗体MDX-1333(75μg/ml)および4G5(50μg/ml)により、試料全体にわたってみられる褐色/暗色の染色により例証されるように、大脳組織の強い染色が示された。抗体9D4(50μg/ml)は、試料全体にわたる褐色/暗色の染色の低下により実証されるように、MDX-1333および4G5と同様にはヒト大脳組織試料を染色しなかった。IgG1アイソタイプ対照は、個々の抗体の結合特異性を実証するために含まれた。
【０２２８】
図6Bに、様々な抗IFNAR1抗体および対照抗体で染色した単球のIHC分析の結果を提示する。抗体MDX-1333(50および20μg/ml)、4G5(50μg/ml)および9D4(50および20μg/ml)すべてにより、試料の褐色/暗色の染色により実証されるように、ヒト単球の顕著な染色が示された。アイソタイプ対照抗体R3-47(50μg/ml)は、ヒト単球について顕著な染色を示さなかった。さらに、MDX-1333(50μg/ml)は、精製マウスマクロファージを染色しなかった。
【０２２９】
結論:IHC研究において、抗IFNAR1抗体9D4は、MDX-1333および4G5などの他の抗IFNAR1抗体と比較してより低いレベルの染色を示した。
【０２３０】
実施例２
6.2:抗体9D4 TMの作製
「9D4-TM」と称する改変抗IFNAR1抗体を、下記の手順を介して作製した;
第1に総RNAを単離し、cDNAを転写し、哺乳動物ベクターPEE6の中にクローン化するための制限部位ApaIおよびEcoRIを含有する遺伝子特異的プライマーで定常領域をPCR増幅することにより、ヒトγ1 FcをヒトPBLからクローン化し、遺伝子工学的に操作した。三重変異体(TM)は、ヒトIgG中に、ADCCエフェクター機能を低下させる3個のアミノ酸変化を含む(L234F、L235EおよびP331S)。TMを、ヒトIgGl(KOL)を鋳型として使用し、Fc中に3残基の変化をコードする部位特異的突然変異誘発(QuickChange XL、Stratagene)を利用して、TMを遺伝子工学的に作製した。L234F/L235E/P331Sの変化をコードするために使用した、突然変異誘発プライマーの配列は下記の通りであった:
MD1056 = 5'  cgtgcccagcacctgaaTtcGAggggggaccgtcagtcttc 3'L234F, L235E 順方向 (配列番号43)
MD1057 = 5' gaagactgacggtccccccTCgaAttcaggtgctgggcacg 3' L234F, L235E 逆方向 (配列番号44)
MD1058 = 5' ccaacaaagccctcccagccTccatcgagaaaaccatctcc 3' P331S 順方向 (配列番号45)
MD1059 = 5' ggagatggttttctcgatggAggctgggagggctttgttgg 3' P331S 逆方向 (配列番号46)
9D4-TM抗体をコードするクローンを配列決定し、三重の突然変異を確認し、ABI3100遺伝子解析システムにおいて解読した。
【０２３１】
実施例３
6.3:抗体9D4 DMの作製
「9D4-DM」と称する改変抗IFNAR1抗体を、下記の手順を介して作製した;
第1に総RNAを単離し、cDNAを転写し、哺乳動物ベクターPEE6の中にクローン化するための制限部位ApaIおよびEcoRIを含有する遺伝子特異的プライマーで定常領域をPCR増幅することにより、ヒトγ4 FcをヒトPBLからクローン化し、遺伝子工学的に操作した。
【０２３２】
二重突然変異体(DM)は、ヒトIgG4 Fcにおける2つの突然変異:S228PおよびL235Eからなる。DMをコードする突然変異誘発プライマーは、下記を含む:
MD1060 = 5' ggtcccccatgcccaCcatgcccagcacctg 3'ヒンジS228P 順方向 (配列番号47)
MD1061 = 5' caggtgctgggcatgGtgggcatgggggacc 3'ヒンジS228P 逆方向 (配列番号48)
MD1062 = 5' ccagcacctgagttcGAggggggaccatcagtc 3'IgG4 L234F, L235E 順方向 (配列番号49)
MD1063 = 5' gactgatggtccccccTCgaactcaggtgctgg 3' IgG4 L234F, L235E 逆方向 (配列番号50)
9D4-DM抗体をコードするクローンを配列決定し、コードされた変化を確認し、ABI3100遺伝子解析システムにおいて解読した。
【０２３３】
実施例４
6.4  抗IFNAR1抗体は、IFN媒介性STATリン酸化を阻害する
目的:抗IFNAR1抗体9D4-TMの、末梢血単核細胞においてIFN媒介性STATリン酸化を阻害する能力を確立すること。
【０２３４】
方法:末梢血単核細胞を、健康なヒトドナーから、LSM培地(MP Biomedical、Solon OH)を使用して精製した。PBMCを定量化し、106細胞/条件/ウェルで播種した。抗体を、適切なウェルに10μg/mLで加え、37℃、5％CO2において10分間インキュベートした。抗体とともにプレインキュベート後、組み換えヒトIFNα2a(PBL Biomedical、Piscataway NJ)またはヒト形質細胞様樹状細胞由来IFN(PDC由来I型IFN上清の作製に関しては、下記を参照されたい)を、適切なウェルに、100または500IU/mLで20分間加えた。細胞を、1200rpm、5分間遠心分離し、滅菌1×PBSを用いて洗浄した。さらにもう1度遠心分離し、PBSを取り除き、細胞を、300μLの1×ホスファターゼ阻害剤カクテル1および2(Sigma、St. Louis MO)ならびに1×プロテアーゼ阻害剤(Roche Biomedical、Nutley NJ)を添加した哺乳動物タンパク質抽出試薬(Pierce、Rockford IL)を使用して溶解した。溶解物をオービタルシェイカーにおいて10分間インキュベートして確実に完全溶解するようにし、マイクロ遠心チューブに移し、14000rpmにおいて遠心分離し、細胞の残渣を除去した。NuPAGEサンプルバッファー(Invitrogen、Carlsbad CA)およびdTT(Sigma、St. Louis MO)を、最終濃度1×で溶解物に加え、全試料を、100℃においておよそ10分間ヒートブロックで変性させた。15μLの各試料を、NuPage10％Bis-trisポリアクリルアミドゲル(Invitrogen、Carlsbad CA)に、1×NuPAGE酸化防止剤緩衝液を添加したNuPAGE MES SDS泳動緩衝液中で加えた。試料を、タンパク質のバンドを分離するために、180Vにおいて30分間泳動させた。その後タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、ブロットを、5％BSA(Sigma、St. Louis MO)含有1×PBS(Gibco BRL、Carlsbad CA)を用いて一晩、4℃においてブロッキングした。次いで、ブロッキング培地を除去し、0.2μg/mLの抗STAT1、抗STAT1 pY701またはβ-アクチン抗体の1:1000希釈(Cell Signaling Technology、Danvers MA)を適切なブロットに加え、4℃において一晩インキュベートした。ブロットを、0.05％ Tween20(Sigma、St. Louis MO)含有1×TBSを用いて3回洗浄した。1:2500に希釈した、HRPコンジュゲート抗ウサギ二次抗体をブロットに加え、1時間室温においてインキュベートした。ブロットを、先に記載したように洗浄し、3mLのPico Supersignal West試薬(Pierce、Rockford IL)1:1混合物を、各ブロットに1分間加えた。ブロットの水気を切り、過剰な試薬を除去し、Kodak X-omat1000A Processorを使用してバンドを可視化した。
【０２３５】
結果:図7に、抗IFNAR1抗体の存在下または不在下において、細胞を、白血球IFNを用いて刺激したSTAT活性化アッセイの結果を提示する。抗体の不在下では、白血球インターフェロンは、STATアイソフォーム1、3および5のリン酸化を刺激する。9D4-TM抗体とともに細胞をインキュベートすることにより、白血球インターフェロンを用いた処理により媒介されるリン酸化が阻害される。アイソタイプ対照抗体R3-47を用いて処理された細胞は、白血球インターフェロンを用いた刺激に応答したSTATリン酸化の阻害は示さない。
【０２３６】
結論:図7の結果は、9D4-TMが、末梢血単核細胞におけるSTATリン酸化の誘導などの、IFNαに対する応答を阻害できることを実証している。
【０２３７】
実施例５
6.5:抗IFNAR1抗体は、I型IFNのシグナル伝達を阻害する
目的:pDC細胞由来の精製I型IFNを使用し、レポーターアッセイを使用して、抗IFNAR1抗体がI型IFNのシグナル伝達を遮断する能力を検査した。
【０２３８】
方法:形質細胞様樹状細胞(PDC)を、リンパ球分離用培地(MP Biomedical、Solon OH)、その後CD304(BDCA-4/Neuropilin-l)MicroBead Kit(Milteny Biotec、Auburn CA)を使用する陽性選択を使用して、健康なドナー由来の全血から単離した。その後、精製PDCを、1×106細胞/mLで、10％FBS(Gibco BRL)および6μg/mL CpGA(InVivogen、San Diego CA)を添加したRPMI 1640において培養した。上清を回収し、培養20時間後に清澄化し、I型IFNを、安定にトランスフェクトされたHEK293-ISREレポーター細胞株を使用して、ヒト白血球IFNの標準曲線に対して定量化した(PBL Biomedical、Piscataway NJ)。
【０２３９】
3名の健康なヒトドナー由来のpDCを使用して、上記のようにヒトpDC由来I型インターフェロン上清を作製した。HEK293(ATCC、Manassas VA)細胞に、pHTS-ISREレポータープラスミド(Biomyx Technology, San Diego CA)を安定にトランスフェクトし、10％FBS、1×NEAAおよび700μg/mL G418(Invitrogen、Carlsbad CA)を添加したDMEM中で維持した。細胞を、80,000細胞/ウェルの濃度で、Optilix白色/透明96ウェルプレート(VWR、West Chester PA)に播種した。適切な濃度の抗体(611 - 0.00004nM)を、各ウェルに加え、その後、適切な濃度のヒトPDC由来I型インターフェロン上清を加えた。細胞、IFNおよび抗体を、37℃、5％CO2において一晩インキュベートし、ルシフェラーゼタンパク質の増幅を、細胞を、細胞培養溶解試薬を用いて溶解し、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、Madison WI)を使用して可視化することによって評価した。シグナルをcpsで測定し、IC50値を求めた。
【０２４０】
結果:I型IFN上清を、3名の個別のドナーに由来するpDC細胞から回収した。ルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、抗IFNAR1抗体のインキュベーションにより、様々な濃度のI型IFN上清のシグナル伝達能力が阻害された(図8)。
【０２４１】
結論:これらの結果は、抗IFNAR1抗体が、レポーターアッセイの活性により測定した場合、I型IFN媒介性シグナル伝達を阻害できることを実証している。
【０２４２】
実施例６
6.6:改変抗IFNAR1抗体は、親未改変抗体と同様の結合特性を示す
目的:親未改変型と比較した、改変抗体のIFNAR1結合特性を調査すること。図9に、9D4、9D4DMおよび9D4TMに関する結合親和性曲線を表示する。9D4、9D4DMおよび9D4TM抗IFNAR1抗体に関する結合定数(Kd)を結合曲線から決定した。
【０２４３】
方法:200,000個のHEK293F細胞を、10％FBSを添加した50μLのRPMI1640培地を使用して、丸底の96ウェルプレートに播種した。ユーロピウム標識9D4-TMを、PerkinElmer LifeおよびAnalytical Sciencesによる規約に基づき調製した。非特異的ユーロピウムシグナルを測定するために、25μLの100倍過剰な、非標識の、段階的に希釈した抗IFNAR1抗体を96ウェルの適切なウェルに、標識9D4-TMの添加5〜10分前に加えた。その後、25μLの、ユーロピウムをコンジュゲートした段階希釈抗体を、適切なウェルに加え、細胞および抗体を、室温において1〜2時間穏やかに撹拌した。結合インキュベーション後、150μLの細胞培地をすべてのウェルに加え、プレートを、1200rpmにおいて5分間、室温で遠心分離した。プレートを素早くデカントし、250μLの細胞培地をすべてのウェルに加えた。遠心分離および洗浄を、総計3回繰り返した。その後、細胞を、100μLの細胞培地に再懸濁した。50μLの再懸濁細胞を、DELPHIA黄色マイクロタイタープレート中の200μLのDELPHIA増強溶液(PerkinElmer)に移し、ユーロピウムの放射を、Victor2 Multilabel reader (PerkinElmer)において測定した。シグナルをcpsで測定し、Kd値およびBmax値を、GraphPad Prism 4解析ソフトウェアを使用して求めた。
【０２４４】
結果:図9に表示したデータは、改変抗体9D4-TMおよび9D4-DMが、IFNAR1に対して、親未改変抗体と同様の結合親和性を示すことを実証している(9D4=0.06 +/- 0.02 nM、9D4-DM=0.06 +/- 0.02 nM、9D4-TM=0.03 +/- 0.01 nM)。
【０２４５】
結論:この実施例において提示したデータは、改変抗体が、親未改変抗体と同様のIFNAR1結合特性を共有していることを実証している。
【０２４６】
実施例７
6.7:9D4-TMとsIFNαRIに関する平衡結合アッセイのデータ
目的:可溶性IFNAR1(srIFNAR1)を使用して、9D4-TMに関する平衡結合データを測定すること。
【０２４７】
方法:srIFNAR1リガンドを、UltraLink(登録商標)Biosupportビーズ(PIERCE、Rockford、IL)上に、コーティング緩衝液(50mMの炭酸ナトリウム緩衝液、pH9)中5μg/mLおよび50μg/mLの濃度で、4℃において1〜2日間コーティングした。その後、コーティングしたビーズを、未反応のリガンド溶液から分離(穏やかなパルススピン)し、ブロッキング緩衝液(1mLの、10mg/mLのBSA含有1M Tris、pH8)中で、室温(RT)において約15分間穏やかに揺らした。この後、ビーズのスラリーを再度遠心分離し、ブロッキング溶液を除去し、次いで新鮮なブロッキング緩衝液のアリコートを使用して、RTにおいて約2時間ブロッキングステップを繰り返した。ブロッキングステップ後、コーティングされたビーズを、使用まで4℃において保存した。使用前に、srIFNAR1コーティングビーズをビーズバイアルに移し、27mLの装置泳動緩衝液(PBS、pH7.4-0.02％ NaN3)に再懸濁し、KinExA 3000装置に装填させた。
【０２４８】
すべての平衡結合定数(KD)は、KinExA 3000装置(Sapidyne Instruments、Boise、ID)において出された測定値から得た。簡潔に言うと、9D4-TM IgGを1pM、10pMおよび50pMに調製し、3連のチューブ中に分配した。この範囲のIgG濃度は、受容体およびKd双方の調節条件下で測定値を求められるように設計した。その後、srIFNAR1リガンドの2倍段階的希釈を、19.5fM〜1nMの範囲の濃度のこれらのIgG溶液にわたって滴定した。販売業者により提供された、ソフトウェア(Sapidyne Instruments、Boise、Idaho)を介して利用可能な理論的曲線シミュレーションに基づき、これらの平衡混合物を、RTにおいて2〜6日のいずれかの間インキュベートした。この時間の終わりに、シグナル試験実験を実施し、適切な実行条件を決定した。遊離抗体の検出は、動物種特異的Cy5標識二次抗体試薬(Cy5 AffiniPure F(ab')2断片ヤギ抗ヒトIgG、品番109-176-097、Jackson ImmunoResearch Laboratories)を使用し、0.1、1.0または2.0μg/mLの、1mg/mLのBSA含有PBS、pH7.4-0.02％ NaN3を用いて可能になった。その後、実験から得られたデータを、n曲線分析の特徴を提供するソフトウェアを使用して同時にフィッティングし、報告された結合定数(KD)を得た。
【０２４９】
結果:図10Aに、3種の濃度の9D4-TM(1pM、10pMおよび50pM)と、sIFNαR1とに関する結合曲線を表した。少なくとも3つの独立した実験から得られたデータを、ソフトウェアに由来する結合曲線にフィッティングし、9D4-TMに関する相対的KDを確立した。この結合アッセイにおける9D4-TMのKDは、0.603pM〜1.8pMの95％信頼区間において1.1pMであることが決定された。1.1pMのKD決定のパーセント誤差は、1.96％であった。9D4-TMに関するKonおよびKoffが、それぞれ、7×106+/-1.3×106 S-1および7.7×10-6 +/-1.57×10-61/Ms(データ非掲載)であることもまた決定された。
【０２５０】
結論:改変抗IFNAR1抗体9D4=TMは、KinExaアッセイにより決定したsIFNAR1に対して、およそ1.1pMの非常に低いKDを示した。
【０２５１】
実施例８
6.8:ヒトPBMCについての9D4-TMの結合親和性の測定
目的:ヒトPBMCについての結合親和性を測定すること。
【０２５２】
方法:末梢血単核細胞をLSM培地(MP Biomedical、Solon OH)を使用して健康なヒトドナーから精製した。細胞を数え、200,000細胞を、50μLの、10％FBSを添加したRPMI1640培地を使用して丸底の96ウェルプレートに播種した。ユーロピウム標識9D4-TMを、PerkinElmer LifeおよびAnalytical Sciencesによる規約に基づき調製した。非特異的ユーロピウムシグナルを測定するために、25μLの100倍過剰な非標識の段階希釈した9D4-TMを、96ウェルプレートの適切なウェルに、標識9D4-TMの添加5〜10分前に加えた。その後、25μLの、ユーロピウムをコンジュゲートした段階希釈9D4-TMを、適切なウェルに加え、細胞および抗体を、室温において1〜2時間穏やかに撹拌した。結合インキュベーション後、150μLの細胞培地をすべてのウェルに加え、プレートを、1200rpmにおいて5分間、室温で遠心分離した。プレートを素早くデカントし、250μLの細胞培地をすべてのウェルに加えた。遠心分離および洗浄を、総計3回繰り返した。その後、細胞を、100μLの細胞培地に再懸濁した。50μLの再懸濁細胞を、DELPHIA黄色マイクロタイタープレート中の200μLのDELPHIA増強溶液(PerkinElmer)に移し、ユーロピウムの放射を、Victor2 Multilabel reader(PerkinElmer)において測定した。シグナルをcpsで測定し、Kd値およびBmax値を、GraphPad Prism 4解析ソフトウェアを使用して求めた。
【０２５３】
結果:図10Bに記録された親和性測定結果を使用して、ヒトPBMCに対する9D4-TMの結合に関するKdが、0.29nM +/- 0.11nMであり、結合部位の数が1448 +/- 447であったことを決定した。同様のアプローチを使用して、カニクイザルIFNARに関する親和性結合定数が0.65 +/- 0.42 nMであり、結合部位の数が648 +/-204(データ非掲載)であったことを決定した。
【０２５４】
結論:図10Bに提示した結果は、9D4-TMがヒトPBMCに、特異的かつ高い親和性で結合することを実証している。
【０２５５】
実施例９
6.9:改変抗IFNAR1抗体は、親未改変抗体と同様の有効性を示す
目的:改変抗IFNAR2抗体(すなわち、低下したFcリガンド親和性を有する抗IFNAR1抗体)が親未改変抗体と同様の有効性を示すことを実証すること。
【０２５６】
方法:この実施例に使用したルシフェラーゼレポーターアッセイシステムは、既に上に記載してある(実施例3を参照されたい)。この実施例に使用したIFNAR1に対する抗体は、9D4、9D4-DM、9D4-TM、MDX-1333を含む。対照抗体R3-47を含む。
【０２５７】
結果:ルシフェラーゼレポーターシステムを使用して、IC50値を、上記の様々な抗IFNAR1抗体に対して求めた(図11Aを参照されたい)。抗IFNAR1抗体9D4(0.01nM)ならびに9D4-DM(0.01nM)および9D4-TM(0.02nM)などの改変抗体は、レポーターアッセイにおいて、同様のIC50値をそれぞれ示し、このことは、それらが同様の有効性を示すことを実証する。別の抗IFNAR1抗体のMDX1333 (0.04nM)もまた、未改変9D4抗体に対して同様の有効性を示す。アイソタイプ対照は、このルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、I型IFN媒介性シグナル伝達を阻害しない。
【０２５８】
結論:改変抗IFNAR1抗体は、IFNシグナル伝達事象を定量化するために設計されたルシフェラーゼレポーターアッセイシステムにおいて求められたIC50値により実証されるように、未改変型と同様の有効性を共有する。
【０２５９】
実施例１０
6.10:9D4-TMは、複数のI型インターフェロンαのアイソフォームの活性を阻害する
目的:9D4-TMが、特異的かつ複数のインターフェロンαのアイソフォームに起因すると考えられるシグナル伝達を阻害することを実証すること。
【０２６０】
方法:この実施例に使用したルシフェラーゼレポーターアッセイシステムは、既に上に記載してある(実施例5を参照されたい)。
【０２６１】
結果:I型インターフェロン活性の9D4-TM媒介性阻害に関するIC50値を表4に提示する。
【表３】
0005608100.tif 000004
【０２６２】
示したように、9D4-TMは、複数のインターフェロンαのアイソフォーム、白血球インターフェロンおよびインターフェロンオメガに対して、ナノモル以下の範囲のIC50値を示す。
【０２６３】
結論:改変抗IFNAR1抗体9D4-TMは、レポーターアッセイにおいて、複数の特異的インターフェロンαサブタイプならびに白血球インターフェロンαに起因すると考えられるシグナル伝達を阻害する能力を示す。
【０２６４】
実施例１１
6.11:9D4、9D4DMおよび9D4TMの等電点の決定
目的:改変抗体9D4-DMおよび9D4-TMと比較した親未改変抗体9D4の、生物物理学的特性を評価すること。
【０２６５】
方法:ネイティブ等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Native Isoelectric Focusing Polyacrylamide Gel Electrophoresis)(IEF-PAGE)分析を、下記のように実施した:プレキャストアンフォライン(ampholine)ゲル(Amersham Biosciences、pI範囲3.5〜9.5)に8μgのタンパク質を載せた。タンパク質試料は、ゲルに載せる前に10mMヒスチジンpH6中で透析した。広範囲pIマーカー標準(Amersham、pI範囲3〜10、8μL)を使用して、Mabの相対pIを決定した。電気泳動を、1500V、50mAで105分間実施した。ゲルを、精製水で1×に希釈したSigmaの固定溶液(5×)を使用して、45分間固定した。Simply Blue stain (Invitrogen)を使用して、一晩室温において染色を実施した。25％エタノール、8％酢酸および67％精製水からなる溶液を用いて脱染を実施した。Bio-Rad GS-800 Densitometerを使用し、Quantity One Imaging Softwareを用いて、等電点を決定した。
【０２６６】
結果:図12Aに、抗体9D4WT、9D4DMおよび9D4TMに対する等電点(pI)の決定を表した。抗体試料を上記の方法に従って泳動し、以下の特性が示された。9D4 WT抗体は、8.2、8.35および8.51に相当する顕著なタンパク質のバンドを示した。9D4DM抗体は、7.13に相当する一本の顕著なタンパク質のバンドを示した。9D4TM抗体は、8.09および8.18に相当する顕著なタンパク質のバンドを示した。
【０２６７】
結論:この実施例に提示するように、改変抗体9D4-DMおよび9D4-TMは、親未改変抗体9D4と非常に類似した生物物理学的特性(pI)を示す。
【０２６８】
実施例１２
6.12: 9D4、9D4-DMおよび9D4-TMの熱安定性
目的:改変抗体9D4-DMおよび9D4-TMと比較した親未改変抗体9D4の、生物物理学的特性を評価すること。
【０２６９】
方法:示差走査熱量測定(Differential Scanning Calorimetry)を下記のように実施した:熱融解温度(Tm)を、VP-DSC(MicroCal、LLC)を用い、1.0℃/分の走査速度および20〜110℃の温度範囲を使用して測定した。フィルター時間(filter period)8秒を15分のプレスキャン時間とともに使用した。試料を、Pierce透析カセット(3.5kD)を使用して、10mMのヒスチジン-HCl、pH6中で透析することによって調製した。Mab濃度は、A280により決定して0.14mg/ml、0.79mg/mlおよび0.64mg/mlであった。溶融温度は、システムに同梱されているOriginソフトウェアを使用して、製造業者の手順に従って決定した。簡潔に言うと、試料セルおよび参照セルの双方に、複数のベースラインを緩衝液とともに流し、熱平衡を確立した。ベースラインを試料のサーモグラムから差し引いた後、データを濃度に関して標準化した。
【０２７０】
結果:抗体9D4、9D4-DM、9D4-TMを、上記のように示差走査熱量測定に供し、結果を図12Bに提示した。研究した抗体は個々に、このアッセイにおいて同様の溶融温度を示した。具体的には、抗体は下記の溶融温度を示した;9D4 WT=70.41℃、9D4-DM=70.41℃および9D4-TM=70.88℃。
【０２７１】
結論:この実施例に提示するように、改変抗体9D4-DMおよび9D4-TMは、親未改変抗体9D4と非常に類似した生物物理学的特性(Tm)を示す。
【０２７２】
実施例１３
6.13:代理抗IFNAR抗体は、IFNα誘導性タンパク尿からマウスを保護する
目的:抗IFNAR抗体が、SLEのモデルにおいて誘導性タンパク尿から保護されることを実証すること。
【０２７３】
方法:雌NZB/W F1マウスをJackson Labsから購入し、無病原体バリア施設において飼育した。CMVプロモーター/エンハンサーの調節下でマウスIFNαサブタイプ5 cDNAを含有する組み換えアデノウイルスベクター(Adv-mIFNα5)を使用して、これらのマウスに早期ループスを誘導した。マウス(8マウス/群)を、8〜11週齢で、0.3×1010Adv-mIFNα5ウイルス粒子(vp)の単回i.v.注射により処置した。対照には、同量の対照Adv粒子を投与した。一部の実験において、マウスに、0.01×l010から1.0×1010vp/マウスの範囲の漸増用量のAdv-mIFNα5を注射した。抗IFNAR1の有効性を試験するために、マウスを、Adv送達時から出発して10mg/kgで、連続5日間毎日、抗体のi.p.投与により処置した。タンパク尿に関しては、尿を、試験紙(Chemstrip 2 GP; Roche Diagnostics)を使用して検査した。タンパク尿は、30mg/dlのレベルを1、100mg/dlを2および500mg/dl以上のレベルを3と判定した。マウスは、尿試料が連続2回2以上と判定された場合、タンパク尿を有するとみなした。
【０２７４】
結果:抗IFNAR1抗体を用いて処置したアデノウイルス感染マウスの結果を図13に提示する。Adv-mIFNα5に感染したマウスは、タンパク尿を示し、約3週間で発症する。対照マウスIgG抗体を用いて処置した感染マウスは、約4週間のタンパク尿の発症により実証されるように、実験の間にタンパク尿の発症から保護されなかった。抗IFNAR抗体を用いて処置したマウスは、8週間の時間経過の間タンパク尿の兆候を示さない。アデノウイルス対照を用いて処置したマウスは、実験の時間経過にわたってタンパク尿を示さない。
【０２７５】
結論:総合すれば、この実施例のデータは、抗IFNAR抗体の存在が、in vivoマウスモデルにおいてadv-IFN誘導性タンパク尿に対して保護能力を有することを実証している。
【０２７６】
実施例１４
6.14:抗IFNAR抗体は、I型IFN誘導性遺伝子調節を遮断する
目的:抗IFNAR1抗体が、SLEのマウスモデルにおいて、I型インターフェロン遺伝子の調節を阻害または低下させることを実証すること。
【０２７７】
方法:実施例13に記載の実験手順によるマウスは、さらにこの実施例においても分析用試料を提供した。RNAを、RLT溶解緩衝液(Qiagen)を使用して組織から調製した。固形組織(腎臓、脾臓、皮膚)に関しては、組織の50mg以下を毎回RNA処理に使用した。試料を、溶解緩衝液およびlysing matrix A(Qbiogene)中に置き、Fastprep24ホモジナイザー装置(Thermo Electron Corporation、Waltham、MA)を使用して、4.5m/sにおいて30秒処理した。PBMCに関しては全血試料を遠心分離にかけ、ペレットをRLT緩衝液中で溶解した。溶解の状態で、試料を、-80℃においてさらなる処理まで急速凍結した。RNAを単離するために、解凍組織溶解物を、まず、Qiashredderスピンカラムを使用して処理し、その後、等量の70％エタノールを組織溶解物に加え、RNAを、Rneasyミニスピンカラムキットを使用して、製造業者の指示に従って精製した。
【０２７８】
cDNAを、3μgのRNAから、Superscript III逆転写酵素およびオリゴd(T)を使用して、製造業者のプロトコル(Invitrogen、Corp. Carlsbad、CA)に記載のように作製した。cDNAの試料を、ヌクレアーゼ不含水で希釈し、-80℃において保存した。
【０２７９】
選択した遺伝子の発現レベルを、ABI 7900HT FastリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して、リアルタイムPCR TaqMan(登録商標)分析により測定した。ハウスキーピング遺伝子のβ-アクチンを、内在性対照に使用した。反応混合物は、最終容量20μlであり、1μlのcDNA、2μlの20×プライマーおよびプローブ(TaqMan(登録商標)Gene Expression Assays、Applied Biosystems)および18μlの希釈したTaqMan(登録商標)Fast Universal PCR Master Mixからなる。増幅条件は、95℃で20秒、95℃で1秒および60℃で20秒を50サイクルであった。CT値は0から50の範囲であり、後者の数字は、産物が形成されなかったことを表すとみなされる。遺伝子発現の定量化は、比較CT法(Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems)を使用して実施し、ハウスキーピング遺伝子に対する倍差として記録した。
【０２８０】
結論:マウスにおいて異所的に発現するI型インターフェロン(実施例13を参照されたい)は、多くの遺伝子の誘導をもたらす。図14に、この実施例に使用したマウスの様々な集団における6種のI型インターフェロン応答遺伝子の変化倍率を提示した。具体的には、遺伝子IFIT1、IFI44、IFI202b、CXCL9、CXCL10およびCXCL11はすべて、IFNαを異所的に発現し、非特異的マウスIgGを用いて処置されたマウスにおいて誘導された。IFNαを異所的に発現し、抗IFNAR抗体を用いて処置されたマウスは、6種のI型インターフェロン応答遺伝子のいずれの誘導も示さない。アデノウイルスによりコードされたIFNαの特異性を実証するための対照として、PBSまたは対照アデノウイルスを用いて処置されたマウスは、これら6種の遺伝子のいずれの誘導も示さない。これらの結果は、抗IFNAR抗体の投与が、in vivoマウスモデルにおいて、IFNαに対する遺伝子の誘導を阻害できることを実証している。
【０２８１】
結論:抗IFNAR抗体は、SLEのマウスモデルにおいてI型応答遺伝子の調節を阻害できる。
【０２８２】
実施例１５
6.15:抗IFNAR抗体は、I型インターフェロンにより誘導される、抗dsDNA抗体および抗SSA/Ro(抗核抗原)抗体の産生を阻害する
目的:抗IFNAR抗体の、SLEのマウスモデルにおいてI型インターフェロンにより誘導される、抗dsDNAおよび抗SSA/Roなどの抗核抗体の産生を阻害する能力を実証すること。
【０２８３】
方法:マウスを、実施例13に記載のように調製し処置した。血清抗dsDNA自己抗体レベルを、ELISAにより評価した。簡潔に言うと、ポリ(L-リジン)(100μg/ml)を用いて予備処理したELISAプレートを、ウシ胸腺活性化DNA(炭酸-重炭酸緩衝液中5μg/ml)(SIGMA)でコーティングした。4℃において一晩インキュベート後、プレートを、PBS/10％FCSでブロッキングした。血清(1/200希釈)を、室温で30分間インキュベートした。結合IgGを、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(1/4000)(KPL)をプレートに30分間加えることで検出した。結合を、TMB基質(KPL)および停止溶液(KPL)を加えることによって測定し、ODを450nmで読み取った。血清中のマウス抗ds DNA IgG標準を、各プレートにおいて段階希釈(625ng/mlから)(Alpha Diagnostic)を実行し、標準化した。血清抗SSA/Ro自己抗体のレベルを、ELISA(Alpha Diagnostic)により、製造業者の指示書に従って測定した。
【０２８４】
結果:マウスにおいて異所的に発現されるI型インターフェロン(実施例13を参照されたい)は、抗dsDNA抗体および抗SSA/Ro抗体の蓄積をもたらす。図15に、ELISAにより測定された、マウスの様々な集団(対照アデノウイルス、Adv-IFNα+PBS、Adv-IFNα+MuIgGおよびAdv-IFNα+Anti-IFNAR)中の抗dsDNA抗体(A)および抗SSA/Ro抗体(B)の相対量を提示する。対照アデノウイルス感染マウスは、この実験において、抗dsDNA抗体および抗SSA/Ro抗体の蓄積をほとんど示さない。IFNαをコードするアデノウイルスに感染し、PBSを用いて処置されたマウスは、抗dsDNA抗体および抗SSA/Ro抗体を蓄積する。抗IFNAR抗体を用いて処置されたAdv-IFNα感染マウスは、非特異的IgGを用いて処置されたAdv-IFNα感染マウスほど、抗dsDNA抗体および抗SSA/Ro抗体を獲得しない。これらの結果は、抗IFNAR抗体を用いた処置が、異所的に発現されるI型IFNに応答した抗dsDNA抗体および抗SSA/Ro抗体の蓄積を阻害することを実証している。
【０２８５】
実施例１６
6.16:抗IFNAR抗体は、I型インターフェロンにより誘導されるIP-10およびIL-18の産生を阻害する
目的:抗IFNAR抗体の、SLEのマウスモデルにおいてIFNα誘導性サイトカインの蓄積を阻害する能力を実証すること。
【０２８６】
方法:実施例13に記載の実験手順によるマウスは、さらにこの実施例においても分析用試料を提供した。サイトカインの血清中レベルを、ELISA(R&D systems)により、製造業者の指示書に従って測定した。
【０２８７】
結果:マウスにおいて異所的に発現されるI型インターフェロン(実施例13を参照されたい)は、IP-10およびIL-18サイトカインの蓄積をもたらす。図16に、ELISAにより測定された、マウスの様々な集団(PBS、対照アデノウイルス、Adv-IFNα+MuIgGおよびAdv-IFNα+Anti-IFNAR)中のIP-10(A)およびIL-18(B)の相対量を提示する。マウスにおいて異所的に発現されるI型インターフェロン(実施例12を参照されたい)は、サイトカインIP-10およびIL-18の蓄積をもたらす。対照アデノウイルス感染マウスは、この実験において、IP-10(A)およびIL-18(B)サイトカインの蓄積をほとんど示さない。抗IFNAR抗体を用いて処置されたAdv-IFNα感染マウスは、非特異的IgGを用いて処置されたAdv-IFNα感染マウスほど、IP-10およびIL-18サイトカインを蓄積しない。これらの結果は、抗IFNAR抗体を用いた処置が、異所的に発現されるI型IFNに応答したサイトカインIP-10およびIL-18の蓄積を阻害することを実証している。
【０２８８】
結論:抗IFNAR抗体は、SLEのマウスモデルにおいてIFNα誘導性サイトカインの蓄積を阻害できる。
【０２８９】
実施例１７
6.17:抗IFNAR抗体は、I型インターフェロンにより誘導されるANA(抗核抗体)の産生を阻害する
目的:抗IFNAR抗体の、SLEのマウスモデルにおいてIFNα誘導性抗核抗体の蓄積を阻害する能力を実証すること。
【０２９０】
方法:実施例13に記載の実験手順によるマウスは、さらにこの実施例においても分析用試料を提供した。抗核抗体(ANA)のレベルを、Hep-2安定化基質を含むANA検査キット(Antibodies Incorporated)および有糸分裂像により、製造業者の指示書に従って測定した。血清を段階希釈し、スライド上でHep-2細胞とともにインキュベートし、結合抗核抗体をHi-FITC標識ヤギ抗マウスIgG(H+L)(Antibodies Incorporated)により検出した。ANAの力価は、ANAがもはや検出不能である血清希釈因子として定義した。
【０２９１】
結果:マウスにおいて異所的に発現されるI型インターフェロン(実施例13を参照されたい)は、抗ANA抗体の蓄積をもたらす。図17に、HEP2細胞についての段階希釈染色により測定された、マウスの様々な集団(ウイルスなし、対照アデノウイルス、Adv-IFNα+PBS、Adv-IFNα+MuIgGおよびAdv-IFNα+抗IFNAR)中の抗ANA抗体の血清力価を提示する。対照アデノウイルス感染マウスは、この実験において、抗ANA抗体の蓄積をほとんど示さない。IFNαをコードするアデノウイルスに感染し、PBSを用いて処置されたマウスは、抗ANA抗体を蓄積する。抗IFNAR抗体を用いて処置されたAdv-IFNα感染マウスは、非特異的IgGを用いて処置されたAdv-IFNα感染マウスほど、抗ANA抗体を獲得しない。これらの結果は、抗IFNAR抗体を用いた処置が、異所的に発現されるI型IFNに応答した抗ANA抗体の蓄積を阻害することを実証している。
【０２９２】
結論:抗IFNAR抗体は、SLEのマウスモデルにおいてIFNαにより誘導される抗核抗体の蓄積を阻害できる。
【０２９３】
実施例１８
6.18:SLE血漿により媒介される樹状細胞発達の抗体による阻害
目的:SLE血漿は、正常なヒト単球からの樹状細胞の発達を誘導する。この実施例において、精製モノクローナル抗体9D4-TMを、SLE血漿による、細胞表面マーカーのCD38およびCD123の誘導を阻害する抗体の能力により評価して、樹状細胞発達の阻害に関して検査した。
【０２９４】
方法:本方法は、米国特許出願第20006/0029601号に既に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。基本的に、本実験は、下記のように実施した:25mlのバフィーコートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で4倍に希釈した。試料を、4×50mlのコニカルチューブに分離し、15mlのリンパ球分離用培地(ICN Biomedicals)を下部に積層した。500gにおいて30分間遠心分離後、末梢血単核細胞(PBMC)を含有するバフィー層を取り出し、PBSで洗浄した。細胞を、1％の加熱不活性化ヒト血清を含有する培養培地に、4×106細胞/mlで再懸濁した。単球を、PBMC(2.0×107細胞/5ml/25cm2フラスコ)を培養培地中で37℃で1.5時間インキュベートすることによって単離し、その後、非接着性細胞を2回洗い流した。単球の成熟を誘導するために、細胞を、健康なボランティア由来またはSLEを有する患者由来の25％のヒト血漿を含有する培地でインキュベートした。抗体遮断研究を、30μg/mlの抗IFNAR1抗体またはアイソタイプ対照のIgG1を培養物に加えることによって実施した。細胞を4日間インキュベートし、PBSで洗浄し、1:5000のヴェルセンを用いて37℃において10分間処理した。必要に応じて、細胞を、洗浄および分析前に穏やかに細胞を掻き取ることによって剥がした。個々の培養物を染色培地(0.2％の重炭酸ナトリウム、0.01％アジ化ナトリウム、0.1mM EDTA、20mM HEPESおよび2％ウシ胎児血清を含むHanks's Balanced Salt Solution)に再懸濁し、V底の96ウェルプレートの6個のウェルに等分した。細胞を、Sorvall RTH-750ローターで2100rpmにおいてパルススピンし、25μlの染色培地に再懸濁した。1μgの特異的フィコエリトリンコンジュゲート抗体を各ウェルに加え、氷上で45分間インキュベートした。細胞を3回洗浄し、200μlのPBS中2％パラホルムアルデヒドに再懸濁し、Becton Dickinson FACScaliburを用いたフローサイトメトリーにより分析した。前方散乱対側方散乱のグラフにゲートをかけ、混入した細胞を分析から外した。
【０２９５】
結果:この実験において、9D4-TMを用いた処理により阻害される、SLE患者の血漿由来のIFNに応答したヒト単球から樹状細胞への分化を、2種の樹状細胞マーカーであるCD38およびCD123の表面発現により測定した。図18において、SLE患者由来の複数の血清試料は、9D4-TMの存在下でCD38およびCD123の表面発現を増加できなかった。9D4-TMに関するIC50値は、CD38およびCD123の双方に関して0.02nMから0.06nMに変化した。
【０２９６】
結論:抗IFNAR1抗体9D4-TMは、細胞表面マーカーの発現により測定した場合、SLE患者由来のIFNαの、pDCの成熟を誘導する能力を阻害できた。
【０２９７】
実施例１９
6.19:抗IFNAR抗体は、白血球IFNにより刺激された単球において、CD38、CD123およびCD86の発現を抑制する
目的:この実施例において、抗体9D4、9D4-DMおよび9D4TMを、白血球IFNによる、細胞表面マーカーCD38およびCD123の誘導を阻害する能力により評価して、樹状細胞発達の阻害に関して検査した。
【０２９８】
方法:単球を、健康なドナーの全血から、リンパ球分離用培地(MP Biomedical、Solon OH)を使用し、その後、単球単離キットII(Milteny Biotec、Auburn CA)を使用する陽性選択により単離した。次いで、精製した単球を、10％FBS(Gibco BRL)を添加したRPMI1640において1×106細胞/mLで培養した。段階希釈した抗体を、培地中の最終濃度3μg/mL〜20pg/mLで調製し、細胞の適切なウェルに加えた。およそ5分のプレインキュベーション後、100IU/mLのヒト白血球IFN(PBL Biomedical、Piscataway NJ)を、適切なウェルに加え、培養物を37℃、5％CO2において48時間インキュベートし、その後CD38およびCD123の表面発現を評価した。簡潔に言うと、細胞を、1200rpmにおいて5分間でペレット化し、培養培地を単層から吸引により除去し、その後滅菌PBSで1回洗浄した。PBSを除去し、1mLの滅菌細胞分散緩衝液(Gibco BRL、Carlsbad CA)または0.05％トリプシン(Invitrogen、Carlsbad CA)をウェルに加え、単層から細胞を除去した。5分後、短時間撹拌し、10％FBSを添加した等量のRPMI1640を各ウェルに加え、その後、遠心分離および滅菌PBSを用いた洗浄を2回繰り返した。5％BSA(Sigma、St. Louis MO)および10μg/mLの全ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories、West Grove PA) を添加した50μLの1×PBSを、非特異的Fc抗体の結合を遮断するために各ウェルに加え、室温で10分間インキュベートした。5％BSAを添加した50μLの1×PBSならびにPE-抗ヒトCD123抗体およびFITC-抗ヒトCD38抗体(Becton Dickinson、Franklin Lakes NJ)を適切なウェルに加え、氷上で30分間インキュベートした。細胞を、5％BSAを添加した1×PBSで1回洗浄し、表面タンパク質の発現を、BD LSRII(Becton Dickinson、Franklin Lakes NJ)において測定した。
【０２９９】
結果:図19に、抗IFNAR抗体の9D4、9D4DMおよび9D4TMとともにインキュベートした白血球-IFN刺激性PBMCにより示された、CD38(A)、CD123(B)およびCD86(C)の発現の抑制曲線を提示する。個々のCD分子に関して、抗IFNAR抗体は、IC50値を求めるために利用された同様の抑制曲線を導き出した。白血球IFNにより刺激されたPBMCでのCD38の発現(A)に関しては、抗IFNAR抗体は下記のIC50値を導き出した:9D4=4.3ng/ml、9D4DM=40ng/ml、9D4TM=25ng/ml。白血球IFNにより刺激されたPBMCでのCD123の発現(B)に関しては、抗IFNAR抗体は下記のIC50値を導き出した:9D4=7ng/ml、9D4DM=21ng/ml、9D4TM=10ng/ml。白血球IFNにより刺激されたPBMCでのCD86の発現(C)に関しては、抗IFNAR抗体は下記のIC50値を導き出した:9D4=20ng/ml、9D4DM=20ng/ml、9D4TM=26ng/ml。
【０３００】
結論:この実施例の結果は、本発明の抗体である9D4-DMおよび9D4-TMが、親9D4抗体と比較して、pDC細胞表面マーカーのIFN誘導の同様の抑制曲線を示すことを実証する。
【０３０１】
実施例２０
6.20:改変抗IFNAR1抗体は、Fc受容体のFcγRIに対して低下した結合を示す
目的:改変抗IFNAR1抗体に対する、特異的Fc受容体の低下した結合を実証すること。
【０３０２】
方法:改変抗体9D4-DMおよび9D4-TMの、ヒトFcγRI(CD64)に対する結合活性を、ELISAにより評価した。20μg/mlの濃度のPBS(pH7.4)中のFcγRIを、25μl/ウェルでマイクロタイタープレート(Costarカタログ番号3690)に、一晩、4℃においてコーティングした。洗浄および4％のミルクで室温において1時間ブロッキング後、500μg/mlで開始し、次いで2倍段階希釈のビオチン化9D4、9D4TM、9D4DMおよび対照抗体を、予めブロッキングされたプレートに加え、37℃において1時間インキュベートした。このプレートを0.05％のTween 20含有PBS(pH7.4)で洗浄し、25μlのHRPコンジュゲートアビジンを各ウェルに加えた。37℃において1時間インキュベーション後、プレートを再度洗浄し、50μl/ウェルの基質-SureBlue TMBペルオキシダーゼ(KPLカタログ番号52-00-03)を加えた。5〜10分の発色後、反応を、50μlの0.2M H2SO4を用いて停止させた。ELISAシグナルを450nMにおいて読み取った。
【０３０３】
結果:ELISAに基づく結合アッセイ(図20)において、改変抗IFNAR1抗体9D4DMおよび9D4TMは、FcγRIに対して未改変9D4WT抗体および対照抗体より低い結合親和性を示した。
【０３０４】
結論:これらの結果は、改変抗IFNAR1抗体9D4-DMおよび9D4-TMが、未改変9D4抗体と比較して、Fc受容体のFcγRIに対してより低い親和性を導き出すことを実証している。FcγRI受容体に対する親和性の低下により、ADCCの誘導が低下すると思われる。
【０３０５】
実施例２１
6.21:Fc受容体のFcγRIIIAは、改変抗IFNAR1抗体に対して低下した結合を示す
目的:未改変抗IFNAR1抗体9D4と比較して、改変抗IFNAR1抗体9D4-DMおよび9D4-TMに対する特異的Fc受容体の低下した結合を実証すること。
【０３０６】
方法:50μg/mlの、PBSで希釈した9D4、9D4TMおよび9D4DM抗体を、ImmunlonIVマイクロタイタープレートに、4℃において一晩コーティングした。洗浄および4％のミルクで室温において1時間ブロッキング後、50μg/mlで開始し、次いで2倍段階希釈の、Flagタグを有するFcγRIIIA変異体158F(低親和性)および158V(高親和性)を、ブロッキングされたプレートのウェルに加えた。このプレートを1時間後に洗浄し、2μg/mlのビオチンコンジュゲート抗Flag抗体(Sigma)とともにインキュベートした。洗浄後、25μlのHRPコンジュゲートアビジンを、各ウェルに加えた。非結合材料をインキュベーションの1時間後に洗浄により除去した。結合シグナルを、基質TMBを用いて検出した。
【０３０７】
結果:抗IFNAR1抗体(9D4WT、9D4DMおよび9D4TM)と、高および低親和性Fc受容体のFcγRIIIAとの間の、ELISAに基づく結合アッセイの結果を図21(A、B、C)に提示する。図21(A)において、ELISAプレートにコーティングされた9D4WT抗体は、高親和性FcγRIIIA受容体に3ng/mlを超える濃度で効率的に結合し、一方、検査したすべての濃度において、低親和性FcγRIIIA受容体の結合には限度がある。図21(B)において、ELISAプレートにコーティングされた改変9D4DM抗体は、検査したいずれの濃度においても高または低親和性FcγRIIIA受容体と効率的に結合しない。同様に、図21(C)において、ELISAプレートにコーティングされた改変9D4TM抗体は、検査したいずれの濃度においても高または低親和性FcγRIIIA受容体と効率的に結合しない。
【０３０８】
結論:これらの結果は、改変抗IFNAR1抗体9D4-DMおよび9D4-TMが、未改変抗IFNAR1抗体9D4と比較して、FcγRIIIA受容体に対して減少した親和性を有することを示唆している。さらに、特異的Fc受容体に対する減少した親和性は、ADCCのエフェクター機能の低下をもたらし得る。
【０３０９】
実施例２２
6.22:改変抗体9D4DMおよび9D4TMは、Fc受容体FcγRIIIAに対して低下した結合を示す
目的:特異的Fc受容体の、改変抗体9D4DMおよび9D4TMに対する低下した結合を実証すること。
【０３１０】
方法:PBS中50μg/mlのFcγRIIIA変異体(FcγRIIIA-10 158FおよびFcγRIIIA-10 158V)を、Immunlon IVマイクロタイタープレートに、4℃において一晩コーティングした。洗浄および4％のミルクで室温において1時間ブロッキング後、100μg/mLのビオチン化9D4、9D4TMおよび9D4DM抗体を、ブロッキングされたプレートのウェルに加えた。このプレートを1時間後に洗浄し、HRPコンジュゲートアビジンとともにインキュベートした。非結合物質をインキュベーションの1時間後に洗浄により除去した。結合シグナルを、基質TMBを用いて検出した。
【０３１１】
結果:高および低親和性Fc受容体のFcγRIIIAと、抗IFNAR1抗体(9D4WT、9D4DMおよび9D4TM)との間の、ELISAに基づく結合アッセイの結果を図22(A、B、C)に提示する。図22(A)において、3ng/mlを超える濃度では未改変抗IFNAR1抗体9D4は、ELISAプレートに固定化された高親和性FcγRIIIA受容体に効率的に結合し、一方、固定化された低親和性FcγRIIIA受容体は、検査したすべての濃度において結合に限度があることを実証している。図22(B)において、改変抗IFNAR1抗体9D4DMは、未改変9D4WT抗IFNAR1抗体と比較して、検査したいずれの濃度においても、固定化された高または低親和性FcγRIIIA受容体に効率的に結合しない。同様に、図22(C)において、改変抗IFNAR1抗体9D4TMは、未改変9D4WT抗IFNAR1抗体と比較して、検査したいずれの濃度においても、固定化された高または低親和性FcγRIIIA受容体に効率的に結合しない。
【０３１２】
結論:この実施例は、改変抗体9D4DMおよび9D4TMが、親未改変9D4抗体と比較してFc受容体のFcγRIIIAに対して減少した親和性を示すことを実証している。この減少した親和性は親抗体と比較して、FcγRIIIA媒介性ADCCエフェクター機能の低下をもたらし得る。
【０３１３】
実施例２３
6.23:抗IFNAR1抗体によるIFNαサブタイプの中和
目的:レポーターアッセイにおいて、抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4WTおよび9D4TMの、特異的IFNαサブタイプを中和する能力を実証すること。
【０３１４】
方法:IFNαの中和に関するレポーターアッセイは、当分野において十分検証されている。この実施例において、IFNαの中和を、HiL3に基づくレポーターアッセイにより測定する。HiL3細胞をレポーターとして使用するIFNα中和アッセイの方法の例は下記の通りである:ヒト肝癌細胞株HiL3に、IFNα刺激応答エレメント-ルシフェラーゼ(ISRE-Luc)およびネオマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミドをトランスフェクトした。これらの細胞は、Dr Michael Tovey(CNRS、Paris、France)のご厚意で提供された。30,000細胞/ウェルのHil3を白色反射性96ウェルプレート(DYNEX Micro lite)で培養し、10％ウシ胎児血清および1mg/mlG418(+ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン)含有ダルベッコ変法イーグル培地中で一晩増殖させた。このインキュベーション後、様々な形態のインターフェロンを加え、プレートを18時間培養した。反応を、10mlの溶解緩衝液をルシフェラーゼ基質のバイアル(Luc Lite Plus kit、Perkin-Elmer)に加えることによって停止させ、100μlのこの基質溶液を各ウェルに加え、Top Countにおいて10分間、読み取った(10分間暗所で待ち、次いで1秒/ウェルで読み取る)。各IFN濃度におけるカウント毎秒(cps)を決定し、各試料のIFN濃度またはcpsを、Prismソフトウェア(San Diego、CA)および線形回帰パラメータを使用して、IFN滴定曲線から計算した。
【０３１５】
結果:HiL3レポーターアッセイにおける様々なIFN種に対する抗IFNAR1抗体に関する中和能力を、図23(A-E)に提示する。抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4WTおよび9D4TMは、複数のI型インターフェロンサブタイプを、同様の効力で阻害する。抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4WTおよび9D4TMは、それぞれ0.09880μg/ml、0.008345μg/mlおよび0.004287μg/mlのIC50値でIFNα10(A)を中和する。抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4WTおよび9D4TMは、それぞれ1.121μg/ml、0.02104μg/mlおよび0.02120μg/mlのIC50値でヒト白血球IFN(B)を中和する。抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4WTおよび9D4TMは、それぞれ0.0006462μg/ml、0.002789μg/mlおよび0.0008279μg/mlのIC50値でIFNα2b(C)を中和する。抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4WTおよび9D4TMは、それぞれ5.323μg/ml、0.01015μg/mlおよび0.01423μg/mlのIC50値でIFNω(D)を中和する。抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4WTおよび9D4TMは、それぞれ18.97μg/ml、0.7403μg/mlおよび0.2611μg/mlのIC50値でIFNβ(E)を中和する。
【０３１６】
結論:これらの結果は、抗IFNAR1抗体MDX-1333、9D4WT(未改変)および9D4TM(改変)が複数のI型インターフェロンに対して同様の中和特異性および中和能力を示すことを示している。
【０３１７】
実施例２４
6.24:抗IFNAR1抗体は、SLE患者由来の血漿中でI型IFNを中和する
目的:抗IFNAR1抗体の、レポーターアッセイにより測定される、SLE患者から単離した血漿中でI型IFNを中和する能力を実証すること。
【０３１８】
方法:安定にトランスフェクトされたPIL-5 ISRE細胞を、RPMI1640+1×Pen-strep-グルタミン+10％FBS中で維持し、100,000細胞/ウェルでOptilix白色/透明96ウェルプレート(VWR、West Chester PA)に播種した。抗体を力価測定し90μg/mL〜60pg/mLの範囲の最終濃度になるように適切なウェルに加えた。I型インターフェロン陽性ヒトSLE患者血清試料を、最終血清パーセントが50％/ウェルになるように各ウェルに加えた。細胞、IFNおよび抗体を、37℃、5％CO2において一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、細胞を短時間、1200rpmにおいて5分間ペレット化し、ルシフェラーゼタンパク質の増幅を、Cell Culture Lysis試薬を用いて細胞を溶解し、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega、Madison WI)を使用して可視化することによって評価した。シグナルをcpsで測定し、IC50曲線を、GraphPad Prism 4分析ソフトウェアを使用して求めた。
【０３１９】
結果:9D4-TMは、SLE患者の血漿中でI型インターフェロンを中和する。SLE患者血漿中のI型インターフェロンの中和アッセイによる結果を、図24に提示する。SLE患者の血漿試料中に含まれるI型インターフェロンの中和は、漸増抗体濃度においてアイソタイプ対照と比べて9D4-TMで特異的に中和される。具体的には、9D4-TMは、SLE患者から採取したこの血漿試料中のI型インターフェロンの中和に関して0.04nMのIC50を示す。
【０３２０】
結論:この結果は、改変抗IFNAR1抗体9D4-TMが、SLE患者中のI型インターフェロンを効率的に中和する能力を有することを示唆している。
【０３２１】
実施例２５
6.25:抗IFNAR抗体は、PBMCにおいてIFNα誘導性pDC集団を抑制する
目的:抗IFNAR抗体の、SLEモデル由来マウス末梢血におけるpDC細胞の蓄積を抑制する能力を実証すること。
【０３２２】
方法:実施例13に記載の実験手順によるマウスは、さらにこの実施例においても分析用試料を提供した。PBMCを、脾臓、リンパ節、骨髄および末梢血から、標準的単離技術を使用して単離し、B220およびLy6C表面マーカーに関して染色した。単離したPBMCをFACSにより分析し、二重陽性(B220およびLy6C)細胞を、pDC細胞として判定し、相対的集団を図25に提示する。
【０３２３】
結果:図25に表示したように、IFNα異所性発現は、PBSまたはマウス非特異的IgGの存在下で脾臓(A)、リンパ節(B)、血液(C)および骨髄(D)から単離されたPBMC内でpDC細胞の増加を誘発する。抗IFNAR抗体を用いて処置されたマウスは、IFN-αに応答してpDC細胞を蓄積しない。対照アデノウイルスを用いて処置されたマウスは、PBMC集団においてpDCを蓄積しない。
【０３２４】
結論:これらの結果は、抗IFNAR抗体が、IFNαにより誘導されるpDC細胞のアップレギュレーションを特異的に阻害することを示唆している。
【０３２５】
実施例２６
6.26:改変抗IFNAR1抗体は、Fc受容体に対してより低い結合親和性を示す
目的:様々なFc受容体に対する、改変抗IFNAR1抗体9D4-DMおよび9D4-TMと、親未改変抗体9D4との相対的結合親和性を評価すること。
【０３２６】
方法:すべての実験は、BIAcore 3000装置(BIAcore, Inc.、Uppsala、Sweden)において実施した。通常の実験において、9D4 IgGの1μM溶液を使用して、タンパク質の約7000RU〜約11,000RUの範囲でCM5センサーチップ表面上に、標準的アミノカップリングプロトコル(BIAcore、Inc.)を使用して固定化した。それとは別に、ブランク表面を、タンパク質を抜いた同一のプロトコルを使用して、各チップ上にさらに調製した。このブランク表面を、実験を通して参照セルとして使用し、非特異的結合および一部のハウスキーピングアーチファクト双方の補正に役立てた。被験結合実験のために、FcγRIを、HBS-EP緩衝液(BIAcore, Inc、10mM HEPES緩衝液、pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、および0.005％ P20からなる)中20nMに調製した。FcγRI注入とFcγRI注入の間に、IgG表面を、5mM HClの1分の注入で再生した。センサーグラムの重ね合わせを、BIAevaluation 4.1ソフトウェア(BIAcore, Inc、Uppsala、Sweden)を使用して作製した。
【０３２７】
結果:抗IFNAR1抗体9D4および改変抗IFNAR1抗体9D4-TMおよび9D4-DMを、BIAcoreアッセイのフォーマットにおいて固定化されたFcγRIタンパク質に対する結合親和性に関して検査した。図26に表したように、抗IFNAR1抗体9D4は、固定化されたFcγRIに対して高い親和性を示す。オボアルブミンを用いて実施した同様のアッセイは、固定化された受容体に対して非常に低い親和性を示すので、抗IFNAR1抗体9D4のFcγRIに対する結合は特異的である。改変抗IFNAR1抗体9D4-TMおよび9D4-DMは、未改変9D4抗IFNAR1抗体と比較して固定された受容体FcγRIに対してより低い親和性を示す。
【０３２８】
結論:結果として得られた、改変抗IFNAR1抗体9D4-TMおよび9D4-DMにより示されるFcγRIに対する低い親和性は、これらの抗体でin vivoでADCCを活性化する能力が減少したことを示唆する。
【０３２９】
実施例２７
6.27: Fc受容体は、改変抗IFNAR1抗体に対する低下した結合親和性を示す
目的:改変抗IFNAR1抗体9D4-DMおよび9D4-TMならびに親未改変抗IFNAR1抗体9D4に対する様々なFc受容体の相対的結合親和性を評価すること。
【０３３０】
方法:表面プラズモン共鳴の測定
すべての実験は、BIAcore3000装置(BIAcore, Inc.、Uppsala、Sweden)において実施した。通常の実験において、FcγRIの1μM溶液を使用して、タンパク質の約7000RU〜約11,000RUの範囲でCM5センサーチップ表面上に、標準的アミノカップリングプロトコル(BIAcore、Inc.)を使用して固定化した。それとは別に、ブランク表面を、タンパク質を抜いた同一のプロトコルを使用して、各チップ上にさらに調製した。このブランク表面を、実験を通して参照セルとして使用し、非特異的結合および一部のハウスキーピングアーチファクト双方の補正に役立てた。被験結合実験のために、抗体を、HBS-EP緩衝液(BIAcore, Inc、10mM HEPES緩衝液、pH7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、および0.005％ P20からなる)中333nMに調製した。抗体注入と抗体注入の間に、FcγRI表面を、3M MgCl2の1分の注入で再生した。センサーグラムのオーバーレイを、BIAevaluation 4.1ソフトウェア(BIAcore, Inc、Uppsala、Sweden)を使用して作製した。
【０３３１】
結果:抗IFNAR1抗体9D4、9D4-TMおよび9D4-DMを固定化し、可溶性FcγRIとともにインキュベートした。個々の抗IFNAR1抗体に対する可溶性FcγRI受容体の結合親和性を、BIAcoreアッセイで測定し、結果として得られたトレース図を図27A、B、Cに提示する。図27Aに表示するように、FcγRIは、固定化された抗IFNAR1抗体9D4に高い親和性で結合した。可溶性オボアルブミンは、固定化された抗IFNAR1抗体9D4に対して全く結合を示さなかったので、この相互作用は非常に特異的であった。改変抗体9D4-TMおよび9D4-DMは、野生型未改変9D4抗体ほど強くは結合しない。図27Bにおいて、改変抗IFNAR1抗体9D4-DMを固定化し、可溶性FcγRIまたはオボアルブミンのいずれかとともにインキュベートした。FcγRIは、固定化された9D4-DM抗体に対して低い結合親和性を示した。この結合親和性は、可溶性オボアルブミンに見られる非特異的相互作用と同様である。図27Cにおいて、改変抗IFNAR1抗体9D4-TMを固定化し、可溶性FcγRIまたはオボアルブミンのいずれかとともにインキュベートした。FcγRIは、固定化された9D4-TM抗体に対して低い結合親和性を示した。この結合親和性は、可溶性オボアルブミンに見られる非特異的相互作用と同様である。
【０３３２】
結論:未改変抗IFNAR1抗体9D4に対して、固定化された改変抗IFNAR1抗体9D4-TMおよび9D4-DMに関するFc受容体FcγRIにより示される低い親和性は、改変抗体の、ADCC応答を引き起こす能力がより低いと思われることを示唆する。
【０３３３】
実施例２８
6.28:抗IFNAR抗体は、IFNα応答遺伝子誘導を阻害する
目的:SLEのマウスモデルにおいて、抗IFNAR抗体の、IFNα応答遺伝子誘導を阻害する能力を実証すること。
【０３３４】
方法:実施例13に記載の実験手順によるマウスは、さらにこの実施例においても分析用試料を提供した。実験開始8週間後に、マウスを屠殺し、腎臓組織を取り出した。組織の50mg以下を、RLT溶解緩衝液(Qiagen)を使用してRNAの抽出に使用した。試料を、溶解緩衝液およびlysing matrix A(Qbiogene)中に置き、Fastprep24ホモジナイザー装置(Thermo Electron Corporation、Waltham、MA)を使用して、4.5m/sにおいて30秒間処理した。RNAを単離するために、解凍組織溶解物を、まず、Qiashredderスピンカラムを使用して処理し、その後、等量の70％エタノールを組織溶解物に加え、RNAを、Rneasyミニスピンカラムキットを使用して、製造業者の指示に従って精製した。cDNAを、3μgのRNAから、Superscript III逆転写酵素およびオリゴd(T)を使用して、製造業者のプロトコル(Invitrogen, Corp. Carlsbad, CA)に記載のように作製した。cDNAの試料を、ヌクレアーゼ不含水で希釈し、-80℃において保存した。
【０３３５】
選択した遺伝子の発現レベルを、ABI 7900HT FastリアルタイムPCRシステム(Applied Biosystems、Foster City、CA)を使用して、リアルタイムPCR TaqMan(登録商標)分析により測定した。ハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンを、内在性対照に使用した。反応混合物は、最終容量20μlであり、1μlのcDNA、2μlの20×プライマーおよびプローブ(TaqMan(登録商標)Gene Expression Assays、Applied Biosystems)および18μlの希釈したTaqMan(登録商標)Fast Universal PCR Master Mixからなる。増幅条件は、95℃で20秒、95℃で1秒および60℃で20秒を50サイクルであった。CT値は0から50の範囲であり、後者の数字は、産物が形成されなかったことを表すとみなされる。遺伝子発現の定量化は、比較CT法(Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems)を使用して実施し、ハウスキーピング遺伝子に対する倍差として記録した。
【０３３６】
結果:図28に、進行ループスマウスモデルにおいて、8週間後にインターフェロンαにより誘導された6種の遺伝子の腎臓における比較発現分析の結果を提示する。インターフェロンαを異所的に発現するマウスを、マウスIgGまたは抗IFNAR抗体を用いて処置した。8週間後、対照IgGを用いて処置したマウスは、ICAM1、VCAM1、CXCL9、CXCL10およびIFIT1と名付けられたIFNα応答遺伝子の高度の誘導を示した。抗IFNAR抗体を用いて処置したマウスは、8週間後にIFNα応答遺伝子の誘導を示さなかった。
【０３３７】
結論:進行ループスマウスモデルにおいて、抗IFNAR抗体を用いた処置は、Taqmanアッセイにより測定した場合、対照マウスと比較して、IFN-αの異所性発現により媒介される6種の遺伝子(ICAM1、VCAM1、CXCL9、CXCL10およびIFIT1)の腎臓における誘導を阻害する。これらの結果は、抗IFNAR抗体が、SLEマウスモデルにおいて、IFNα媒介性シグナル伝達を阻害できることを実証している。
【０３３８】
実施例２９
6.29:抗IFNAR抗体は、血清において自己抗体の蓄積を阻害する
目的:抗IFNAR抗体の、SLEモデルにおいてマウスの血清中の自己抗体の蓄積を阻害する能力を実証すること。
【０３３９】
方法:実施例13に記載の実験手順によるマウスは、さらにこの実施例においても分析用試料を提供した。全血試料を、レジメンの2〜7週間目から1週間間隔で採取した。血清中抗dsDNA自己抗体レベルを、ELISAにより評価した。簡潔に言うと、ポリ(L-リジン)(100μg/ml)を用いて予備処理したELISAプレートを、ウシ胸腺活性化DNA(炭酸-重炭酸緩衝液中5μg/ml)(SIGMA)でコーティングした。4℃において一晩インキュベート後、プレートを、PBS/10％FCSでブロッキングした。血清(1/200希釈)を、室温で30分間インキュベートした。結合IgGを、ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスIgG(1/4000)(KPL)をプレートに30分間加えることで検出した。結合を、TMB基質(KPL)および停止溶液(KPL)を加えることによって測定し、ODを450nmで読み取った。血清中のマウス抗dsDNA IgG標準を、各プレートにおいて段階希釈(625ng/mlから)(Alpha Diagnostic)で実行し、標準化した。
【０３４０】
結果:図29に、進行ループスマウスモデルの時間経過の間、マウス血清中の抗dsDNA抗体のレベルのELISAに基づく分析の結果を提示する。IFNαを異所的に発現するマウスを、7週間のレジメンの間に抗IFNAR抗体またはマウスIgG対照抗体を用いて処置した。抗IFNAR抗体を用いて処置したマウスは、対照IgG抗体を用いて処置したマウスと同じ速度または同じ程度に抗dsDNA抗体を蓄積しなかった。対照アデノウイルスに感染したマウスは、時間経過にわたって抗dsDNA抗体を発生しなかった。
【０３４１】
結論:これらの結果は、抗IFNAR抗体が、IFNαのレベルの上昇に応答して抗dsDNA抗体の蓄積を低下させたことを実証している。
【０３４２】
実施例３０
6.30:抗IFNAR抗体は、進行ループスマウスモデルにおいてタンパク尿を減少させる
目的:抗IFNAR抗体の、SLEマウスモデルにおいて確立されたタンパク尿(治療的設定)を減少させる能力を実証すること。
【０３４３】
方法:実施例13に記載の実験手順によるマウスは、さらにこの実施例においても分析用試料を提供した。しかし、治療アプローチにおいて、ループスの症状として、抗体の投与前にマウスにタンパク尿を発症させた。具体的には、前述のように、マウスに、2.0〜2.5のスコアのタンパク尿を発症させた。タンパク尿の閾値を超えたら、PBS、対照IgGまたは抗IFNAR抗体の週2回投与の治療レジメンを、さらに5週間実施した。週2回の間隔で尿試料を検査し、タンパク尿のスコアを得た。
【０３４４】
結果:図30Aに、進行ループスモデルのマウスのタンパク尿スコアを低下させる、抗IFNAR抗体の治療的研究の結果を提示する。簡潔に言うと、マウスにタンパク尿を発症させたその時点で、コホートに、治療として、PBS、対照IgGまたは抗IFNAR抗体のいずれかを投与した。図の中に記録したように、タンパク尿スコアは、抗IFNAR抗体を投与した群だけで減少した。治療としてPBSまたは対照IgGを投与したマウスは、時間とともにタンパク尿スコアが上昇し続けた。(B)5週間にわたる結果に関する曲線下面積の分析は、抗IFNAR抗体処置群がPBS単独またはIgG対照群とは異なることを決定し、PBS単独およびIgG対照群は双方とも非常に類似していた。
【０３４５】
結論:これらの結果は、抗IFNAR抗体が、SLEの治療的設定に使用できることを実証している。
【０３４６】
実施例３１
6.31:抗IFNAR抗体は、進行ループスマウスモデルの死亡率を低下させる
目的:抗IFNAR抗体の、SLEループスマウスモデルの治療的設定において死亡率を低下させる能力を実証すること。
【０３４７】
方法:実施例30に記載の実験手順によるマウスは、さらにこの実施例においても分析用試料を提供した。治療アプローチにおいて、ループスの症状として、抗体の投与前にマウスにタンパク尿を発症させた。具体的には、前述のように、マウスに、2.0〜2.5のスコアのタンパク尿を発症させた。タンパク尿の閾値を超えたら、PBS、対照IgGまたは抗IFNAR抗体の週2回投与の治療レジメンを、さらに5週間実施した。全死亡率を、さらに4週間追跡した。
【０３４８】
結果:図31に、進行ループスモデルにおける、抗IFNAR抗体の治療的研究の死亡率を提示する。簡潔に言うと、マウスにタンパク尿を発症させたその時点で、コホートに、治療として、PBS、対照IgGまたは抗IFNAR抗体のいずれかを投与した。抗IFNAR抗体を用いて処置したマウスは、5週目に死亡を示さなかったが、一方、PBSまたは対照IgGを用いて処置したマウスは、それぞれ87.5％および62.5％の死亡率を示した。さらに9週間の研究にわたって、抗IFNAR処置動物は、PBSまたは対照IgG処置動物と比較して、高い生存率を示した。
【０３４９】
結論:この実施例の結果は、抗IFNAR抗体が、ループスに伴う死亡率を減少させ得ることを実証している。
【０３５０】
実施例３２
6.32:9D4-TM媒介性ADCC活性の不在
目的: 9D4-TMが、FcγRIおよびFcγRIIIAに対するその結合親和性の低さから、ADCC活性を誘導できないことを実証するために、一連の実験を実施した。
【０３５１】
方法:293F標的細胞を、DiO細胞標識(Invitrogen、実験IおよびII)を用いて標識し、非標識エフェクターPBMCと組み合わせた(37℃において4時間、10μg/mlの9D4-TM、ヒトIgG1アイソタイプ陰性対照R3-47、9D4-WTまたは陽性対照として使用する抗EphA2抗体の存在下または不在下)。標的細胞の溶解を、DiO+/PI+(ヨウ化プロピジウム)二重陽性染色を測定することにより評価した。エフェクター-標的比=50-1、溶解のパーセントは、式:[(抗体の存在下の二重陽性染色のパーセント-培地単独の二重陽性染色のパーセント)/(溶解緩衝液の存在下の二重陽性染色のパーセント-培地単独の二重陽性染色のパーセント)]に従って算出した。溶解緩衝液(Promega)を加えることにより、100％の溶解を達成した。
【０３５２】
あるいは、293F標的細胞を、FcγRIIIAを安定に発現するトランスジェニックNK細胞株由来の細胞とともに、37℃において4時間、10μg/mlの9D4-TM、ヒトIgGlアイソタイプ陰性対照R3-47、9D4-WTまたは陽性対照として使用する抗EphA2抗体の存在下または不在下でインキュベートした(実験III)。エフェクター-標的比=4-1および溶解パーセントは、式:100×(実験値-自然発生エフェクター-自然発生標的)/(標的最大値-自然発生標的)に従って算出した。
【０３５３】
実験IおよびII (PBMC-293H比=50-1)において、溶解パーセントは、式:[(抗体の存在下の二重陽性染色のパーセント-培地単独の二重陽性染色のパーセント)/(溶解緩衝液の存在下の二重陽性染色のパーセント-培地単独の二重陽性染色のパーセント)]に従って算出した。実験III(FcγIIIAを発現するトランスジェニックNK細胞株-293H比=4-1)では、溶解パーセントは、式:100×(実験値-自然発生エフェクター-自然発生標的)/(標的最大値-自然発生標的)に従って算出した。
【０３５４】
結果:改変抗体9D4-TMまたは未改変抗体9D4-WTは、R3-47抗体を用いて観察される、293F細胞についてのADCC活性を上回る検出可能なADCC活性を示さなかった(表4)。対照的に、陽性対照抗体、抗EphA2抗体は、バックグラウンドレベルを上回る2倍に増加した細胞傷害性を引き起こした。これらの結果は、9D4-TMが、IFNAR1発現標的においてADCCを媒介できないことを裏付ける。
【表４】
0005608100.tif 000005
【０３５５】
結論:これらの結果は、改変抗IFNAR1抗体9D4-TMが、IFNAR1発現標的細胞に対して、検出可能なADCC活性を刺激しないことを実証している。
【０３５６】
実施例３３
6.33: L234F/L235E/P331Sの突然変異を含むヒトFc領域の三次元構造
目的:L234F/L235E/P331Sの突然変異を含むヒトIgG1 Fc領域(Fc-TM)の三次元構造を決定すること。
【０３５７】
方法:Fc-TMの精製:ヒトFc/TM断片を、9D4-TMの酵素的切断から得た。消化を、固定化フィシンを使用して、製造業者の指示書(Pierce)に従って実施した。まず、精製を、HiTrapプロテインAカラムにおいて、製造業者の指示書(GE Healthcare, Piscataway、NJ)に従って実施した。50mMのNaOAc/pH5.2中で透析後、タンパク質溶液をHiTrap SP HPカラム(GE Healthcare)に添加し、フロースルーに回収した。フロースルーをHiTrap Qカラム(GE Healthcare)にロードし、NaCl勾配で溶出し、還元および非還元SDS-PAGEにより判定して均一なFc/TM調製物を得た。Fc-TM SDS-PAGEのプロファイルは、還元または非還元条件下でそれぞれ25kDaまたは50kDa周辺に1本だけバンドが存在することを示した。この知見により、少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合が、C226および/またはC229位に存在することが明らかに実証された。その結果として、突然変異した「下流」残基F234およびE235が、結晶を含むポリペプチド鎖内に存在した。
【０３５８】
Fc-TMの結晶化:精製Fc-TMを、Centricon concentrator (Millipore、Billerica MA,30 KDa cutoff)を使用して約5mg/mlに濃縮した。結晶化条件を、Hampton Research (Hampton Research、Aliso Viejo, CA)、Emerald BioSystems (Emerald BioSystems, Inc.、Bainbridge Island、WA)およびMolecular Dimensions(Molecular Dimensions Inc.、Apopka、FL)による市販のスクリーニングを使用して特定した。各スクリーニングによって、いくつかの使用可能な結晶化条件を得た。最適化について、0.2M酢酸亜鉛、0.1Mマレイン酸イミダゾール、pH8.0、5％PEG 3350、5％グリセロール、タンパク質濃度2.0mg/mlにより回折品質結晶を得た。これらの条件下で、0.1から0.2mmの範囲の三次元の、形状の整った結晶が、2〜3日で成長した。
【０３５９】
データ収集:回折データを、Center for Advanced Research in Biotechnology (CARB、University of Maryland Biotechnology Institute、Rockville、MD)において、Rigaku MicroMax(商標)007回転陽極発生装置およびR-AXIS IV++イメージングプレート(Rigaku/MSC、The Woodlands、TX)を使用して、単結晶から収集した。冷却前に、結晶を、20％グリセロールを添加したその成長溶液中に2〜3分保った。その後、結晶を、X-stream 2000 Cryogenic cooler(Rigaku/MSC)で105ケルビンまで冷却した。2.3Åまでの回折を、記載(Oganesyan et al., 2007)のように1ラウンドのアニーリング後に達成した。234の画像を含む回折データを振幅0.5°、結晶/検出装置の距離200mmおよび露出時間600秒を使用して、収集した。データを統合し、HKL2000ソフトウェア(Otwinowski & Minor, 1997)を使用して計測した。
【０３６０】
構造決定:分子置換、精密化および電子密度の計算を、CCP4(Collaborative Computational Project)プログラム一式を使用して実施した。C面心斜方晶は、58％の溶媒容量、2.9のVMを有し細胞の非対照単位中に1つのFcポリペプチドが推測される。Fc/TMの結晶構造を、分子置換および2.3Å分解能における精密化により決定した。PDB ID番号2DTQ (Matsumiya et al., (2007) J. Mol. Biol. 368:767-779)に対応するヒトFc構造を、その高分解能および非リガンド結合状態のため、モデルとして使用した。特に、CH2およびCH3ドメインを個別に考えドメインの相対的コンホメーションに関する任意のバイアスを最小化した。3.0Åまでのデータを、Phaser(McCoy et al,(2005) Acta Cryst. D61,458-464)を使用する分子置換問題に使用した。溶液の精密化後、最終のLLの増加およびZスコアは、それぞれ1192および31であった。3.0ÅにおいてFWT/PHWTを用いて計算した、加重電子密度はCH2およびCH3ドメインのいくつかのループを除いてモデルとの優れた一致を示した。DELFWT/PHDELWTを用いて計算した、強い正の差の電子密度が、N297に結合したN結合炭水化物残基の期待された位置に可視化された。それに先立つ236位のヒンジ残基には密度は存在せず、結果はおそらくこの領域の高い柔軟性に起因する。前述の2つのリガンド非結合ヒトFc構造のみが、234位および235位を明らかにし得ることに留意されたい(2DTQ/2DTS; Matsumiya et al, (2007) J. Mol. Biol. 368:767-77 9)。同様に、446位および447位の残基は可視化できなかった。331位の残基を、アラニンとしてまずモデル化した。
【０３６１】
「Refmac 5」(Murshudov et al, (1997) Acta Cryst. D53, 240-255)による精密化および「O」グラフィックソフトウェア(Jones et al, (1991) Acta Cryst. A47, 110-119)を使用するマニュアル構築のいくつかの交互のラウンドは、2.3Å分解能までのデータに関してRfactorが21.6、FreeRfactorが27.5で収束した。精密化の第1ラウンド後、電子密度により、炭水化物の配置および331位においてセリン残基による置換が認められた。精密化の後期段階において、モデルを、ウェブサーバー上で実行されるTLS Motion Determination (TLSMD)プログラム(Painter et al. (2006). J. Appl. Cryst. 39, 109-111; Painter et al. (2006) Acta Cryst. D62, 439-450)を使用して分析した。その後、さらなる精密化を、Refmac 5を用いて、残基の5つの異なる群(236〜324、325〜341、342〜358、359〜403および404〜445)を使用して、TLSおよび拘束精密化形態で実施した。結晶化緩衝液中に存在する亜鉛イオンが電子密度に検出され、配位圏および距離が可能な場合、そのようなものとしてモデル化した。特に、1つの亜鉛イオンは、H310およびH435により配位されて発見された。もう1つは、対称性関連ポリペプチドのH285およびH268により配位された。他の2つは、E318およびE345に結合していた。すべての場合において、水分子が、亜鉛イオンの期待された四面配位圏を完成していた。炭水化物部分を、その電子密度に従ってモデル化し、本質的に別のヒトFc構造の文脈において本発明者らが記載したように(Oganesyan et al, (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007,近刊)、最終モデルは9の糖残基を含んだ。最終モデルは、75の溶媒分子を含んだ。結晶学的データおよび精密化統計を表6に示す。
【表５】
0005608100.tif 000006
【０３６２】
結果:非対照単位中に1つのポリペプチドを有する空間群C2221におけるFc-TMの結晶化(図32)。結晶を2.3Å分解能で回折し、1.26°の比較的高い平均モザイク角を示した。この高いモザイク角は、冷却および非冷却結晶の双方の特性であると思われる。236位から445位のすべての残基は、電子密度で追跡でき、236位の前のヒンジ残基には電子密度が観察されず、したがって、L234FおよびL235Eに起こる突然変異は不可視であった。331位の電子密度は、セリンに相当する。
【０３６３】
Fc-TMの原子座標および実験的構造因子を、登録番号3C2SでProtein Data Bankに登録した。
【０３６４】
Fc-TMの全三次元構造は、リガンド非結合ヒトFc領域の既に報告された構造(Deisenhofer, (1981).Biochemistry, 20: 2361-2370、Krapp et al, (2003). J. Mol. Biol. 325, 979-989、Matsumiya et al, (2007). J. Mol. Biol. 368:767-779、Oganesyan et al, (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, 近刊)と非常によく似ている。より正確には、PDB ID番号1H3W (Krapp et al., (2003). J. Mol. Biol. 325:979-989)に相当し、2QL1(Oganesyan et al., (2007) Molecular Immunology, December 11, 2007, 近刊)に対応するヒトFcの構造は、格子パラメーター、非対照ユニットの内容、空間群およびパッキングの観点からFc-TMに最も近かった。個々に考えた場合、Fc-TMのCH2およびCH3ドメインは、他のリガンド非結合、非突然変異ヒトFc構造と比較した場合、大きな構造的保存および厳密性を示した。例えば、Fc-TMと、PDB ID番号2DTQ(Matsumiya et al., (2007). J. Mol. Biol. 368, 767-779)のA鎖とを重ね合わせた場合、Cα原子のrms座標変異は、それぞれCH2およびCH3ドメインに関して0.6および0.4Åであった。
【０３６５】
下記の表7は、Fc-TMの原子構造座標を提供する。下記の略語を、表7において使用する。 
「Atom Type(原子型)」は、その座標を提供する元素を指す。列の最初の文字は、元素を定義する。
【０３６６】
「A.A.」はアミノ酸を指す。 
「X、YおよびZ」は、元素のデカルト座標を提供する。 
「B」は、原子中心周辺の原子の運動を測定する熱因子である。 
「OCC」は、占有率を指し、原子型が特定の座標を占有する時間のパーセントを表す。OCC値は0から1の範囲であり、1は100％である。
【表６】
0005608100.tif 000007
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【０３６７】
結論:Fc/TMの三次元構造は、他のリガンド非結合、非突然変異ヒトFc領域のものと非常に似ていることが分かった。置換のTMセットの劇的な広範囲の機能的効果は、Fc構造の重要な構造転位により起こるのではなく、突然変異部位のいくつかの相互作用の限局性欠損による。
【０３６８】
実施例３４
6.34:抗IFNAR1抗体の内在化
目的:抗IFNAR1抗体が細胞中に内在化する能力を調査すること。
【０３６９】
方法:THP-1細胞を、0.05mMの2-メルカプトエタノールおよび10％ウシ胎児血清を含有するRPMI-1640培地において、37℃において5％CO2のインキュベーター中で培養した。THP-1細胞を、実験の1日前に、2×105細胞/mlで新鮮な増殖培地に播種した。実験の日に、細胞を洗浄し、計数し、PBSに3×106細胞/mlで再懸濁した。細胞を、1μMのCFSEを用いて、37℃においてCO2インキュベーターで10分間染色した。さらに2回PBSで洗浄後、細胞を氷上に置き、20μl/106細胞を使用して氷上で5分間 FcRブロックとともにインキュベートし、次いで、1μg/mlのAlexa647-9D4-TMまたはAlexa647-R347(非特異的対照抗体)を用いて、氷上で1時間染色した。PBSで3回洗浄し、未結合のmAbを除去後、細胞を、2％BSAおよびアジ化ナトリウムを含有するPBSに再懸濁した。内在化を、細胞を37℃、5％CO2および湿度70％環境的に調節されたチャンバーに移すことで開始し、Alexa647-9D4-TMの内在化動態を、細胞の蛍光を画像化することによって経時的に記録した。
【０３７０】
細胞の蛍光画像を、アルゴリズムを使用して分析した。このアルゴリズムは、CFSE細胞質性染料を使用し、細胞と膜領域との境界を特定した。このアルゴリズムは、細胞内部および膜上の9D4-TMに伴う蛍光を定量化した。細胞内部の蛍光蓄積率を、SAAMIIソフトウェアを使用するデータのモデルフィッティングにより計算した。
【０３７１】
結果:THP-1細胞に結合したAlexa647-9D4-TM。9D4-TMのアイソタイプ対照であるAlexa647-R347が結合しないことが、同じ細胞に関して観察された。この結果は、9D4-TMがTHP-1細胞に特異的に結合することを実証している(図33)。4℃において、9D4-TMの結合は、主に細胞表面に位置した(0分-図33)。37℃において細胞をインキュベートしたところ、9D4-TM染色の蛍光シグナルが、細胞表面から顕著に減少し、断続的なスポットとして細胞質コンパートメントに蓄積した。60分にわたり記録された動態画像は、細胞表面から細胞質コンパートメントに位置する断続的なスポットへ徐々に移動していることを示した (15、30および50分の時点、図33)。この結果は、THP-1細胞での9D4-TMの内在化を明らかに実証した。
【０３７２】
実施例３５
6.35: 9D4-TM媒介性CDC活性の不在
目的:9D4-TMがCDC活性を誘導できないかどうかを決定するために、一連の実験を実施した。
【０３７３】
方法:新たに単離したヒト血液を、健康なヒトドナーから採取し(およそ100ml)、3000Gにおいて10分間遠沈させ、細胞から血清を分離した。血清分画を、2つのチューブに分けた。第1のチューブを、フェノールを含まないRPMI1640を用いて最終濃度10％血清(非加熱不活性化またはNHI)に希釈した。第2のチューブは、56℃のウォーターバス中に30分間置き、補体成分を加熱不活性化した。続いて第2のチューブを、フェノールを含まないRPMI1640培地を用いて最終濃度10％加熱不活性化(HI)ヒト血清に希釈した。
【０３７４】
CD20(陽性対照抗体の標的)およびIFNAR1を発現するので、Daudi B細胞を標的細胞として使用した。標的細胞を洗浄し、10％の非加熱不活性化血清を含むフェノールを含まないRPMI1640培地または10％の加熱不活性化血清を含むフェノールを含まないRPMI1640培地のいずれかに、最終濃度0.4×106細胞/mLで再懸濁した。抗体溶液を、50μg/mL〜1.3×10-6μg/mLの範囲の濃度で3倍段階希釈として調製した。抗体希釈の複製調製物を、加熱不活性化または非加熱不活性化のヒト血清を含むいずれかの培地で作製した。CDCアッセイを、NHIまたはHI培地の50μLを、丸底の96ウェルプレートの適切なウェルに加えることによって調製した。50μLの抗体希釈系列を適切なウェルに加えた。続いて、50μLの標的細胞調製物を、対照として標的細胞単独を有する追加のウェルを含むウェルに加えた。プレートを、37℃において4時間、5％CO2中でインキュベートした。3.5時間のインキュベーション後、20μLの溶解緩衝液を、最大溶解シグナルの決定用に指定された適切な対照ウェルに加えた。Quantitate(商標)LDH放出アッセイを、Promega非放射性細胞傷害アッセイ(non-radioactive cytotoxicity assay)、G1780番において定義されたプロトコルを使用して実施した。吸光度を490nMにおいて測定し、Kd値をGraphPad Prism 4解析ソフトウェアを使用して求めた。
【０３７５】
結果:図34に、上記のように実施したCDCによる結果を提示する。改変抗IFNAR1抗体9D4-TMは、標的Daudi B細胞における検出可能なCDC活性を、R347抗体で観察されるCDC活性を超えては示さなかった。対照的に、Daudi B細胞で発現されるCD20に結合する陽性対照抗体は、バックグラウンドレベルを超える細胞傷害性の用量依存性上昇を引き起こした。これらの結果は、9D4-TMが、IFNAR1発現標的細胞においてCDCを媒介できないことを裏付けた。
【０３７６】
実施例３６
6.36:改変抗IFNAR1抗体9D4-TMは、有害毒性を全く表さない
目的:9D4-TMが、有害毒性を全く生じないことを確立するために、単回投与毒性研究をカニクイザルで実施した。
【０３７７】
方法:この研究において、それぞれ10匹の動物の4群(5匹/性別/群)に、0、5、30または100mg/kgの9D4-TMの単回投与を1日目に投与した。投与後、2匹の動物/性別/群を、3日目に死体解剖に充て、残りの動物はすべて70日目までモニターし、その後、死体解剖はせずに研究から外した。毒性を、死亡率、臨床的兆候(月経を含む)、免疫表現型、体重、身体検査(心拍、呼吸速度および体温を含む)、臨床的病理、臓器重量および顕微鏡的データに基づいて評価した。
【０３７８】
結果:上記で概説した条件下で、死亡率、臨床的兆候(月経を含む)、体重、身体検査(心拍、呼吸速度および体温)、臨床的病理、臓器重量および顕微鏡的データに、9D4-TMに関連する有害な変化はなかった。これらの結果は、改変抗IFNAR1抗体9D4-TMが、有害毒性を全く引き起こさないことを示唆している。
【０３７９】
本発明の特定の実施形態は、説明の目的で上に記載しているが、添付の特許請求の範囲に記載した本発明から逸脱することなくその詳細の多くの変形を行うことができることは当業者には明らかであろう。
【０３８０】
本明細書において言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、個々の各刊行物、特許および特許出願が、具体的かつ個別に、参照により本明細書に組み込まれることが示される場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
0005608100.tif 000183
【図２９】
0005608100.tif 000184
【図３０】
0005608100.tif 000185
【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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