(57)【要約】  本発明は、腫瘍の遠隔転移や生命予後に関連する遺伝子としてのザルコポディンの用途に関する。具体的には、本発明は、腫瘍組織における、ザルコポディンの発現レベルを測定することを含む、腫瘍の遠隔転移のリスク又は生命予後を判定する方法を提供する。更に、本発明は、ザルコポディンをコードするmRNAに相補的なポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを含む、転移阻害剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍組織における、以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルを測定すること、及び該発現レベルと遠隔転移発生率との間の相関に基づき、腫瘍の遠隔転移のリスクを判定することを含む、腫瘍の遠隔転移のリスクを判定する方法：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド；及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を用いて発現レベルが測定される、請求項１記載の方法：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項３】
測定に用いられる物質が以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、請求項２記載の方法：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項４】
腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、請求項１〜３のいずれか記載の方法。
【請求項５】
腫瘍組織における、以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルを測定すること、及び該発現レベルと腫瘍患者の生命予後の良否との間の相関に基づき、腫瘍患者の生命予後を判定することを含む、腫瘍患者の生命予後を判定する方法：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド；及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を用いて発現レベルが測定される、請求項５記載の方法：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項７】
測定に用いられる物質が以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、請求項６記載の方法：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項８】
腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、請求項５〜７のいずれか記載の方法。
【請求項９】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を含む、腫瘍の遠隔転移のリスクを判定するための剤：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項１０】
物質が以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、請求項９記載の剤：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項１１】
腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、請求項９又は１０記載の剤。
【請求項１２】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を含む、腫瘍患者の生命予後を判定するための剤：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項１３】
物質が以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、請求項１２記載の剤：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項１４】
腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、請求項１２又は１３記載の剤。
【請求項１５】
大腸粘膜組織における、以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を評価すること、及び該発現の有無に基づき、該組織中に大腸癌細胞が含まれるか否かを判定することを含む、大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出する方法：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド；及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１６】
以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を含む、大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出するための剤：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項１７】
腫瘍細胞内における、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドの局在を評価すること、及び該ポリペプチドの細胞質における発現の有無に基づき、該腫瘍細胞の悪性度を判定することを含む、腫瘍細胞の悪性度を判定する方法：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド。
【請求項１８】
腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、腫瘍細胞の悪性度を判定するための剤。
【請求項２０】
腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、請求項１９記載の剤。
【請求項２１】
以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを含む、肉腫の転移阻害剤：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
【請求項２２】
以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを含む、肉腫細胞の運動能又は浸潤能を阻害するための剤：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
【請求項２３】
以下の工程を含む、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法：
（Ｉ）被検物質と以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を測定可能な細胞とを接触させること：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド、及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ＩＩ）被検物質を接触させた細胞における上記（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における上記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量と比較すること；並びに
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、上記（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量を抑制する被検物質を、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
【請求項２４】
以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、肉腫の転移阻害剤：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
【請求項２５】
以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、肉腫細胞の運動能の阻害剤：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
【請求項２６】
以下の工程を含む、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能を阻害し得るペプチドを探索する方法：
（Ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に含まれる少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む被検ポリペプチドを、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内で発現させること；
（ＩＩ）被検ポリペプチドを発現させた細胞の運動能を測定し、該運動能を被検ポリペプチドを発現させていない対照肉腫細胞の運動能と比較すること；
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、肉腫細胞の運動能を抑制したポリペプチドを肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能を阻害し得るポリペプチドとして選択すること。
【請求項２７】
腫瘍の遠隔転移のリスクを判定するための、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項２８】
以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、請求項２７記載の物質：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項２９】
腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、請求項２７又は２８記載の物質。
【請求項３０】
腫瘍患者の生命予後を判定するための、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項３１】
以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、請求項３０記載の物質：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項３２】
腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、請求項３０又は３１記載の物質。
【請求項３３】
大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出するための、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
【請求項３４】
腫瘍細胞の悪性度を判定するための、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項３５】
腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、請求項３４記載の抗体。
【請求項３６】
肉腫の転移を阻害するための、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
【請求項３７】
肉腫細胞の運動能又は浸潤能を阻害するための、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
【請求項３８】
肉腫の転移を阻害するための、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクター：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
【請求項３９】
肉腫細胞の運動能を阻害するための、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクター：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
【請求項４０】
哺乳動物に、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における肉腫の転移を阻害するための方法：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
【請求項４１】
哺乳動物に、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における肉腫細胞の運動能又は浸潤能を阻害するための方法：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
【請求項４２】
哺乳動物に、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における肉腫の転移を阻害するための方法：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
【請求項４３】
哺乳動物に、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における肉腫細胞の運動能を阻害するための方法：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍の遠隔転移に関連する遺伝子の用途に関する。より具体的には、本発明は該遺伝子を利用した、紡錘形細胞肉腫や大腸癌の遠隔転移のリスクや生命予後の判定方法、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害するための医薬、該医薬の探索方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性軟部腫瘍、特に紡錘形細胞肉腫と総称される一群の肉腫は、病理学的に非常に多様であり、分類もまだ一定していない。従って、病理診断分類別に予後因子解析を行うことが著しく困難である。悪性度の判定に関しては、細胞分裂像、壊死像等を指標とした、いくつかのGradingが提唱されているが、患者の生命予後を決定する遠隔転移発生を予見できる指標は無い。そのため、全ての症例を同一のプロトコルにより加療せざるを得ず、予後良好例に対しても本来ならば不必要な補助療法を施行することになる。また、より積極的な治療を行うべき予後不良例にとっては、不十分な治療となる場合もある。そこで、紡錘形細胞肉腫の生命予後や、遠隔転移発生リスクを判定する方法の開発が望まれている。【０００３】
紡錘形細胞肉腫の局所再発に関しては、広範切除術の概念の確立・普及により、予防可能となってきた。しかし、紡錘形細胞肉腫の生命予後を決定する遠隔転移の発生に対しては、局所療法の意義は低いため、化学療法が主に行われている。現在、複数の抗癌剤を併用する治療法が標準的なプロトコルとして用いられているが、その奏功率は30％以下に留まっている。予後の改善のためには、転移抑制を目的とした治療法が理論的に最も有望なものであると考えられるが、これまで紡錘形細胞肉腫の転移と関連した因子は単離されておらず、従ってそのような転移関連因子を標的とした治療法も開発されていない。【０００４】
また、大腸癌は、日常的には、便の潜血反応、内視鏡検査等により初期診断を行い、生検により最終診断を行っている。生検サンプルの組織像による病理診断は、熟練を要するため、その診断を容易にするための診断マーカーの開発が望まれる。更に、大腸癌患者の生命予後や、遠隔転移発生リスクを判定する方法の開発が望まれている。【０００５】
一方、網羅的なcDNA獲得試験の結果得られた遺伝子として、GenBankにアクセッション番号AK074185（タンパク質としてはFLJ00258）として登録されている遺伝子及びアクセッション番号AK094067として登録されている遺伝子が登録されているが（非特許文献１）、その生物学的機能や臨床医学上の意義に関する報告はない。【０００６】
AFAP-110というタンパク質が、アクチンフィラメントに結合したpp60srcの基質であり、アクチンフィラメントの統合性を調節する分子として報告されている（非特許文献２及び３）。しかし、AFAP-110の癌転移への関与については報告されていない。
【非特許文献１】Nature Genetics, vol.36(1), p.40-45, 2004
【非特許文献２】Mol. Cell Biol., vol.13(12), p.7892-7900, 1993
【非特許文献３】Oncogene, vol.16(17), p.2185-2195, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の第１の目的は、紡錘形細胞肉腫等の腫瘍の遠隔転移や生命予後に関連する遺伝子を同定することである。
本発明の第２の目的は、紡錘形細胞肉腫等の腫瘍の遠隔転移発生リスクや生命予後を判定する方法を提供することである。
本発明の第３の目的は、紡錘形細胞肉腫の腫瘍の生命予後に重大な影響を及ぼす転移を抑制し得る医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、紡錘形細胞肉腫組織について網羅的遺伝子発現解析を行い、遠隔転移発生及び腫瘍関連死発生と相関した遺伝子の単離を試みた。その結果、GenBankにAK074185（タンパク質としてはFLJ00258）として登録されている機能未知な遺伝子を高発現している腫瘍は遠隔転移発生率が高く、生命予後不良であることを見出した。機能解析の結果、該遺伝子産物はアクチンやSrcと結合し、細胞の運動・浸潤能に関与するタンパク質であり、その発現をsiRNAにより抑制することで、肉腫細胞の運動・浸潤能が抑制されることが判明した。更に、この遺伝子には、AK094067として登録されているカルボキシル端部分のみからなるショートフォームが存在し、ロングフォームと競合的に作用することで肉腫細胞の運動・浸潤能を抑制する可能性を示す結果を得た。
更に、この遺伝子の大腸粘膜組織中の発現を解析したところ、正常組織やポリープではこの遺伝子はほとんど発現しておらず、大腸癌細胞に特異的に発現していることを見出した。また、異型度の低い大腸癌細胞内ではこの遺伝子産物は核に局在していたが、異型度の高い腫瘍細胞内ではこの遺伝子産物は細胞質に局在しており、大腸癌細胞の悪性度の変化に伴いこの遺伝子産物の細胞内局在が変化することが見出された。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。【０００９】
即ち、本発明は以下に関する。
[１]腫瘍組織における、以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルを測定すること、及び該発現レベルと遠隔転移発生率との間の相関に基づき、腫瘍の遠隔転移のリスクを判定することを含む、腫瘍の遠隔転移のリスクを判定する方法：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド；及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[２]以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を用いて発現レベルが測定される、[１]記載の方法：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[３]測定に用いられる物質が以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、[２]記載の方法：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[４]腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、[１]〜[３]のいずれか記載の方法。
[５]腫瘍組織における、以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルを測定すること、及び該発現レベルと腫瘍患者の生命予後の良否との間の相関に基づき、腫瘍患者の生命予後を判定することを含む、腫瘍患者の生命予後を判定する方法：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド；及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[６]以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を用いて発現レベルが測定される、[５]記載の方法：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[７]測定に用いられる物質が以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、[６]記載の方法：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[８]腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、[５]〜[７]のいずれか記載の方法。
[９]以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を含む、腫瘍の遠隔転移のリスクを判定するための剤：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[１０]物質が以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、[９]記載の剤：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[１１]腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、[９]又は[１０]記載の剤。
[１２]以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を含む、腫瘍患者の生命予後を判定するための剤：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[１３]物質が以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、[１２]記載の剤：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[１４]腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、[１２]又は[１３]記載の剤。
[１５]大腸粘膜組織における、以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を評価すること、及び該発現の有無に基づき、該組織中に大腸癌細胞が含まれるか否かを判定することを含む、大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出する方法：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド；及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
[１６]以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を含む、大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出するための剤：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[１７]腫瘍細胞内における、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドの局在を評価すること、及び該ポリペプチドの細胞質における発現の有無に基づき、該腫瘍細胞の悪性度を判定することを含む、腫瘍細胞の悪性度を判定する方法：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド。
[１８]腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、[１７]記載の方法。
[１９]配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、腫瘍細胞の悪性度を判定するための剤。
[２０]腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、[１９]記載の剤。
[２１]以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを含む、肉腫の転移阻害剤：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
[２２]以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを含む、肉腫細胞の運動能又は浸潤能を阻害するための剤：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
[２３]以下の工程を含む、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法：
（Ｉ）被検物質と以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を測定可能な細胞とを接触させること：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド、及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ＩＩ）被検物質を接触させた細胞における上記（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における上記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量と比較すること；並びに
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、上記（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量を抑制する被検物質を、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。
[２４]以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、肉腫の転移阻害剤：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
[２５]以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、肉腫細胞の運動能の阻害剤：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
[２６]以下の工程を含む、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能を阻害し得るペプチドを探索する方法：
（Ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に含まれる少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む被検ポリペプチドを、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内で発現させること；
（ＩＩ）被検ポリペプチドを発現させた細胞の運動能を測定し、該運動能を被検ポリペプチドを発現させていない対照肉腫細胞の運動能と比較すること；
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、肉腫細胞の運動能を抑制したポリペプチドを肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能を阻害し得るポリペプチドとして選択すること。
[２７]腫瘍の遠隔転移のリスクを判定するための、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[２８]以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、[２７]記載の物質：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[２９]腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、[２７]又は[２８]記載の物質。
[３０]腫瘍患者の生命予後を判定するための、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[３１]以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかである、[３０]記載の物質：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[３２]腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、[３０]又は[３１]記載の物質。
[３３]大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出するための、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質：
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。
[３４]腫瘍細胞の悪性度を判定するための、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体。
[３５]腫瘍が紡錘形細胞肉腫又は大腸癌である、[３４]記載の抗体。
[３６]肉腫の転移を阻害するための、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
[３７]肉腫細胞の運動能又は浸潤能を阻害するための、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクター：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
[３８]肉腫の転移を阻害するための、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクター：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
[３９]肉腫細胞の運動能を阻害するための、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクター：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
[４０]哺乳動物に、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における肉腫の転移を阻害するための方法：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
[４１]哺乳動物に、以下の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における肉腫細胞の運動能又は浸潤能を阻害するための方法：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。
[４２]哺乳動物に、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における肉腫の転移を阻害するための方法：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
[４３]哺乳動物に、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターの有効量を投与することを含む、該哺乳動物における肉腫細胞の運動能を阻害するための方法：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法を用いれば、抗体を用いた免疫染色や特異的プローブを用いた定量的RT-PCRなどの簡便な手段を用いて、迅速に紡錘形細胞肉腫や大腸癌等の腫瘍の遠隔転移発生リスクや生命予後を判定することが可能となる。本発明の方法を用いれば、遠隔転移発生リスクの高低や、生命予後の善し悪しに基づき、患者に選択的治療を施すことが可能となり、腫瘍の治療の質が向上する。即ち、本発明の方法を用いて予後不良と判定された患者に対しては積極的に補助療法を行い、定期的な画像診断により転移巣の早期発見を目指すことで、予後の改善を目指すことができる。反対に本発明の方法を用いて予後良好と判定された患者に対しては、不必要な補助療法を回避することができる。特に、本発明の方法は、全てのタイプの紡錘形細胞肉腫に適用することができるので、病理診断が不確定の場合においても、的確に生命予後を判定することができる。
本発明の方法を用いれば、高い精度で大腸癌細胞の有無や悪性度を判定することができる。
本発明の転移阻害剤を用いれば、紡錘形細胞肉腫の転移を選択的に抑制することが可能となり、紡錘形細胞肉腫の生命予後を改善することができる。本発明の転移阻害剤は、紡錘形細胞肉腫の予後を決定する因子である遠隔転移発生を標的としている点で特徴的である。正常組織における発現レベルは腫瘍組織におけるものと比べてはるかに低いことから、siRNAによる発現抑制治療の副作用は軽微であると予想され、現行の治療法と組み合わせることにより効果的な紡錘形細胞肉腫の治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】cDNAマイクロアレイ解析の概要。紡錘形細胞肉腫及びMSCより抽出したRNAをT7で増幅した後、逆転写の際に標識した。23040種類の遺伝子に対して競合ハイブリダイゼーションを行い、各遺伝子の発現レベルを数値化した。
【図２】悪性度と関連した遺伝子の検索。65症例を再発、遠隔転移及び腫瘍関連死の３項目に関して、その有無で２群に分け、両群間で遺伝子発現レベルが異なる遺伝子としてC7059を同定した。
【図３】cDNAマイクロアレイにおけるC7059遺伝子の発現：遠隔転移発生に関して２群にわけ、各症例のC7059発現レベルを示す。転移発生症例群では病理診断と関係なくC7059発現陽性例が多いことが理解される。
【図４】多変量解析。腫瘍関連死をエンドポイントとして、C7059を含む９個の因子の多変量解析を行った。
【図５】C7059に関するゲノム及びタンパク質情報。
【図６】C7059及びctC7059のゲノム構造。
【図７】C7059タンパク質の一次構造。各機能ドメインを示す。Short formであるctC7059はC末端のタンパク質間結合ドメインは維持されている。
【図８】定量的RT-PCRを用いたC7059とctC7059の発現量の測定。対象として用いた肉腫細胞株U20SではctC7059の発現はC7059の約1/10であり、紡錘形細胞肉腫ではC7059の発現が優位であることが理解される。
【図９】定量的RT-PCRを用いたマイクロアレイデータの検証。A；定量的RT-PCRによるC7059発現レベルデータ。MSCにおける発現量を１としてC7059発現レベルを数値化した。マイクロアレイに使用した症例（黒丸、４４例）に加え、追加症例（黒四角、１０例）も解析した。B；マイクロアレイに使用した症例を、相対的発現レベル１０を基準として２群に分けた場合の、C7059発現レベルと遠隔転移発生との相関。両群で発生率に有意な差を認めた。C；追加症例に関する解析。相対的発現レベル１０以上の症例で遠隔転移発生頻度が高いことが理解される。
【図１０】C7059特異的ポリクローナル抗体の作成。A；C7059に特異性が高く、かつctC7059に含まれていないアミノ末端領域の７９アミノ酸とGSTとの融合タンパク質を抗原として家兎を免疫し、ポリクローナル抗体を作成した。B；ウエスタンブロットにて約110kDのタンパク質を認識した。発現レベルはC7059 mRNAレベルと一致していた。
【図１１】免疫細胞染色。C7059発現ベクターをC7059陰性肉腫細胞に導入した後、抗体を用いて染色した。C7059をFITCで緑色に、アクチンをPhalloidinで赤色に染色すると、両者が一部において共在し、特に葉状仮足の形態を示す部分に凝集していることが分かる。
【図１２】免疫細胞染色。肺転移を生じたKS976症例では、C7059発現が主として細胞質において強陽性で、核も陽性であったのに対して、遠隔転移陰性のKS991症例では核のみに染色性が認められた。
【図１３】発現ベクター導入によるC7059発現誘導及びsiRNAによるC7059発現抑制。A；プラスミドベクター（PCAGGS）にC7059を組み込み、C7059陰性肉腫細胞に導入することにより、良好なC7059発現を得た。B；C7059特異的なsiRNAを4種類作成した。その中でも特にsiRNA1-3がmRNA及びタンパク質レベルで著名なC7059発現抑制効果を示した。
【図１４】C7059の発現と細胞運動及び浸潤能との関係。A；C7059発現誘導により、浸潤能が亢進した。B；C7059発現阻害により、運動能及び浸潤能が低下した。
【図１５】C7059を安定に発現している不死化MSCの機能解析。C7059発現により、運動能（A）及び浸潤能（B）の両者が著名に亢進した。C；C7059発現により、不死化MSCが寒天培地における足場非依存性増殖能を獲得した。
【図１６】免疫共沈降によるC7059とSrcタンパク質との結合解析。抗FLAG抗体で免疫沈降を行い、抗Src抗体でウエスタンブロットを行うことによりSrcタンパク質が検出された（２）。逆に抗Src抗体で免疫沈降を行い、抗C7059抗体（３）及び抗FLAG抗体（４）でウエスタンブロットを行うことによりC7059タンパク質が検出された。以上より、C7059とSrcとが細胞内で結合していることが判明した。
【図１７】免疫細胞染色によるC7059とSrcとの共在の確認。C7059を安定に発現している不死化MSCにおいて、C7059をAF488で緑色に、SrcをAF555で赤色に染色した。両者が一部において共在し、特に葉状仮足において凝集していることが理解される。
【図１８】ctC7059の機能解析。A；プラスミドベクター（pCAGGS）にctC7059を組み込み、一過性発現を誘導した。B；C7059陽性肉腫細胞にctC7059を発現させると、細胞運動能が低下した。
【図１９】正常粘膜及びポリープでのC7059タンパク質の発現を示す。ポリープではC7059発現は細胞の核に認められたが、細胞質においては認められなかった。
【図２０】症例１（Stage IV）。正常粘膜及び大腸癌でのC7059タンパク質の発現を示す。C7059タンパク質発現は大腸癌細胞の細胞質に認められたが、正常粘膜においては認められなかった。
【図２１】症例２（Stage III）。肝転移及び脳転移を伴う患者。正常粘膜及び大腸癌でのC7059タンパク質の発現を示す。C7059タンパク質発現は大腸癌細胞の細胞質に認められたが、正常粘膜においては認められなかった。
【図２２】症例３（Stage IV）。正常粘膜及び大腸癌でのC7059タンパク質の発現を示す。C7059タンパク質発現は大腸癌細胞の細胞質に認められたが、正常粘膜においては認められなかった。
【図２３】症例４（Stage IV）。正常粘膜及び大腸癌でのC7059タンパク質の発現を示す。C7059タンパク質の発現は、異型度の低い部分では核で優位であったが、浸潤先端部においては細胞質で優位である。正常粘膜においてはC7059タンパク質の発現は認められない。
【図２４】正常粘膜（Ｎ）及び直腸結腸癌（Ｔ）でのC7059の発現をRT-PCRで検出した。ＢＡＣＴ：βアクチン。
【図２５】Stage IIIの直腸結腸癌患者の疾患未発症生存率とC7059発現レベル（０〜２）との相関を示す。
【図２６】結腸の治療的摘出手術を受けた患者の疾患未発症生存率と、C7059発現レベル（０〜２）との相関を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．腫瘍の遠隔転移発生のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定する方法
本発明は、腫瘍組織における、以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルを測定すること、及び該発現レベルと遠隔転移発生率又は腫瘍患者の生命予後の良否との間の相関に基づき、腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定することを含む、腫瘍の遠隔転移のリスク及び腫瘍患者の生命予後を判定する方法（本発明の判定方法（Ｉ））を提供するものである：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド；及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。【００１３】
本明細書中、腫瘍の種類は特に限定されない。腫瘍としては、肉腫、大腸癌等を挙げることができる。肉腫は、好ましくは紡錘形細胞肉腫である。大腸癌は、好ましくは結腸または直腸に発生した癌である。本発明の判定方法（Ｉ）は、紡錘形細胞肉腫又は大腸癌のために好適に用いられる。【００１４】
本発明の判定方法（Ｉ）において発現レベルが測定される対象遺伝子を、本明細書中、「ザルコポディン（sarcopodin）」と総称する。即ち、本発明の判定方法（Ｉ）においては、腫瘍組織におけるザルコポディンの発現レベルが測定される。本発明に用いられるザルコポディンは、通常ヒト由来である。即ち、上記（１）〜（３）のポリペプチドはヒトザルコポディンポリペプチドであり、上記（４）及び（５）のポリヌクレオチドはヒトザルコポディンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。【００１５】
ヒトザルコポディンのアミノ酸配列やヌクレオチド配列自体は、GenBankにアクセッション番号AK074185（ポリペプチドとしてはFLJ00258）等として登録されており、その推定ゲノム構造も解明されているものの、その生物学的機能や臨床医学上の意義に関する報告はない。本発明者らは、ザルコポディンの生物学的機能及び臨床医学上の意義を解明し、その成果に基づき本発明を提供するものである。【００１６】
本発明に用いられるザルコポディンポリペプチドは、細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有する。該細胞は、通常、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト、好ましくはヒト）由来である。該細胞は腫瘍細胞、非腫瘍細胞のいずれであってもよい。該細胞は、好ましくは間葉系の細胞である。即ち、好ましい腫瘍細胞としては、肉腫細胞を挙げることができる。好ましい非腫瘍細胞としては、間葉系幹細胞を挙げることができる。【００１７】
かかる活性の有無は、目的とするポリペプチドを発現し得る発現ベクターを、ザルコポディンを発現していない細胞（好ましくはSaos2等の肉腫細胞）に導入し、得られた細胞の運動能又は浸潤能を、陰性対照細胞のそれと比較することにより決定することができる。
運動能とは、細胞が能動的に運動する能力を意味する。浸潤能とは、細胞が細胞外マトリクスを破壊して、組織内に侵入していく能力を意味する。細胞の運動能は、例えば金コロイド法などに従い測定することができる。金コロイド法とは、コロイド状の金を付着させたカバーグラス上に細胞を蒔き、その運動軌跡上に形成された金の欠損部の面積を計算することにより、細胞の運動能を測定する方法である。細胞の運動能及び浸潤能は、ボイデンチャンバーアッセイ等により評価することができる。ボイデンチャンバーアッセイにおいては、まずコーティングされていない有孔PET膜を通過する細胞数で運動能を評価し、次に基底膜でコートしたPET膜を用いて、基底膜を分解して孔を通過し、膜の下側に移動した細胞の数を測定し、移動細胞数との比を測定することで、細胞の浸潤能が評価される。【００１８】
上記（２）のポリペプチドに含まれるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。【００１９】
ここで「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）を意味する。【００２０】
本明細書におけるアミノ酸配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST-2（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（マトリックス＝BLOSUM62；ギャップオープン＝11；ギャップエクステンション＝1；ｘ＿ドロップオフ＝50；期待値＝10；フィルタリング＝ON）にて計算することができる。アミノ酸配列の同一性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム(version 2.0) に組み込まれている（Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)）］、Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、Myers and Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム (version 2.0) に組み込まれている］、Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。【００２１】
上記（３）のポリペプチドに含まれるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、例えば、(1)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号２に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、(3)配列番号２に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)上記(1)〜(4)の変異が組み合わされたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）である。【００２２】
１つの好ましい態様において、上記（１）〜（３）のポリペプチドは、天然のヒトザルコポディンポリペプチドである。「天然の」とは、ポリペプチドを構成するアミノ酸配列が天然に存在することをいう。天然のヒトザルコポディンアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を挙げることができるが、これに限定されない。遺伝子を構成するヌクレオチド配列には通常多型（個体差）が存在することが知られている。このようなザルコポディン遺伝子の多型により生じた配列番号２で表されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドも、細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有する限り、天然のヒトザルコポディンポリペプチドに含まれる。【００２３】
上記（４）及び（５）のポリヌクレオチドは、DNA又はRNAであるが、好ましくはRNA（より好ましくはmRNA）である。mRNAとしては、成熟mRNA及び転写後プロセッシングにより成熟mRNAを生じる初期転写産物（未成熟mRNA）が挙げられる。mRNAは、好ましくは成熟mRNAである。即ち、上記（４）及び（５）のポリヌクレオチドは、ザルコポディンの成熟mRNAであり得る。上記（４）のポリヌクレオチドとしては、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを挙げることができる。尚、本明細書においてヌクレオチド配列は、特にことわりのない限りDNAの配列として記載するが、ポリヌクレオチドがRNAである場合は、チミン（Ｔ）をウラシル（Ｕ）に適宜読み替えるものとする。【００２４】
本発明の判定方法（Ｉ）においては、測定対象患者から摘出された腫瘍組織におけるザルコポディンポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばmRNA）の発現レベルが測定される。【００２５】
ザルコポディンポリペプチドの発現レベルは、ザルコポディンを特異的に認識する抗体、例えば、
（ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体
を用いて、免疫学的手法により測定することができる。免疫学的手法としては、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（RIA法）、ELISA法（Methods in Enzymol. 70: 419-439 (1980)）、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色等を挙げることができる。【００２６】
ザルコポディンを特異的に認識する抗体は、ザルコポディンポリペプチドやその抗原性を有する部分ペプチドを免疫原として用い、既存の一般的な製造方法によって製造することができる。本明細書において、抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（mAb）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又はこれらの結合性断片である。結合性断片とは、特異的結合活性を有する前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばF(ab')2、Fab'、Fab、Fv、sFv、dsFv、sdAb等が挙げられる（Exp. Opin. Ther. Patents， Vol.6, No.5, p.441-456, 1996）。抗体のクラスは、特に限定されず、IgG、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、IgG又はIgMであり、精製の容易性等を考慮するとより好ましくはIgGである。【００２７】
ザルコポディンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現レベルは、該ポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー、例えば、
（ｉｉ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー、或いは
（ｉｉｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー
を用いて、自体公知の方法により測定することが出来る。該測定方法としては、例えば、RT-PCR、ノザンブロッティング、in situ ハイブリダイゼーション、cDNAアレイ等を挙げることができる。【００２８】
１つの好ましい態様において、本発明の判定方法（Ｉ）に用いられる核酸プローブは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に含まれる、約15塩基以上、好ましくは約18〜約500塩基、より好ましくは約18〜約200塩基、いっそう好ましくは約18〜約50塩基の連続したヌクレオチド配列又はその相補配列を含むポリヌクレオチドである。【００２９】
別の好ましい態様において、本発明の判定方法（Ｉ）に用いられる核酸プローブは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning）第２版（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。ストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC（sodium chloride/sodium citrate）中45℃でのハイブリダイゼーション反応の後、0.2×SSC／0.1％ SDS中65℃での一回以上の洗浄などが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。核酸プローブの長さは、通常約15塩基以上、好ましくは約18〜約500塩基、より好ましくは約18〜約200塩基、更に好ましくは約18〜約50塩基である。【００３０】
核酸プローブは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。
また、核酸プローブは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。あるいは、蛍光物質（例：FAM、VIC等）の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。かかる実施態様においては、検出反応の際に蛍光物質とクエンチャーとが分離して蛍光が検出される。【００３１】
本発明の判定方法（Ｉ）に用いられる核酸プライマーは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの一部又は全部の領域を特異的に増幅し得るように設計されたものであればいかなるものであってもよい。例えば、上記ヌクレオチド配列の相補配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと、このハイブリダイゼーション部位より3’側の上記ヌクレオチド配列の一部にハイブリダイズする、約15〜約50塩基、好ましくは約18〜約30塩基のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとの組み合わせであり、それらによって増幅される核酸の断片長が約50〜約1,000塩基、好ましくは約50〜約500塩基、より好ましくは約50〜約200塩基である、一対のポリヌクレオチドが挙げられる。【００３２】
核酸プライマーは、特異的検出に支障を生じない範囲で付加的配列（検出対象のポリヌクレオチドと相補的でないヌクレオチド配列）を含んでいてもよい。
また、核酸プライマーは、適当な標識剤、例えば、放射性同位元素（例：125Ｉ、131Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ等）、酵素（例：β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素等）、蛍光物質（例：フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネート等）、発光物質（例：ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）などで標識されていてもよい。【００３３】
核酸プローブまたはプライマーは、DNAであってもRNAであってもよく、また、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は二本鎖DNA、二本鎖RNA、DNA／RNAハイブリッドのいずれであってもよい。従って、本明細書においてあるヌクレオチド配列を有する核酸について記載する場合、特に断らない限り、該ヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、該ヌクレオチド配列と相補的な配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、それらのハイブリッドである二本鎖ポリヌクレオチドをすべて包含する意味で用いられていると理解されるべきである。
上記核酸プローブまたはプライマーは、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の情報に基づいて、DNA／RNA自動合成機を用いて常法に従って合成することができる。【００３４】
ザルコポディン遺伝子は、第９イントロン内に第２の転写開始点を有し、この第２の転写により上述のザルコポディン（以下、ロングフォームと称することがある）のN端領域が欠損した構造を有するショートフォームが生じる（図６）。例えば、ショートフォームヒトザルコポディンとして、配列番号３で表されるヌクレオチド配列（コード領域：ヌクレオチド番号３１７〜１４６８）にコードされる配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。このショートフォームヒトザルコポディンは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトザルコポディンのN末端の３８５アミノ酸を欠いており、残りの部分（配列番号２のアミノ酸番号３８６〜７６８で表されるアミノ酸配列）からなる。従って、本発明の判定方法（Ｉ）において、ザルコポディンのロングフォームとショートフォームとに共通の領域を特異的に認識する抗体や、共通領域を特異的に検出する核酸プローブ又はプライマーを用いると、ロングフォームの発現量とショートフォームの発現量の和を測定することとなる。このような場合であっても、結果として測定される発現レベルに上述の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現レベルが含まれている限り、本発明の範囲内である。【００３５】
後述の実施例において示されるように、腫瘍（特に紡錘形細胞肉腫）においては、ショートフォームよりもロングフォームの発現がより優位である。従って、ロングフォームのザルコポディンを特異的に検出することによって、より高い感度で腫瘍の遠隔転移のリスクや生命予後を判定し得る。そこで、好ましい一態様において、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の抗体、核酸プローブ又はプライマーの中でも、ロングフォームには存在するがショートフォームには存在しない領域を特異的に検出し得るものが発現レベルを測定する際に用いられる。かかる抗体、核酸プローブ及びプライマーとしては以下の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）を挙げることができる：
（ｉａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉａ）配列番号１のヌクレオチド番号１〜１２２９で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉａ）配列番号２のアミノ酸番号１〜３８５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。【００３６】
これらのなかでも、以下の（ｉｂ）〜（ｉｉｉｂ）の抗体、核酸プローブ又はプライマーは、ロングフォームザルコポディンにとりわけ特異性の高い配列を有する領域を認識するものであるため、好ましい。
（ｉｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを特異的に認識する抗体であって、該抗体の認識エピトープが配列番号２のアミノ酸番号３５〜１１３で表される領域内にある、抗体；
（ｉｉｂ）配列番号１のヌクレオチド番号１１７〜４１３で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー；及び
（ｉｉｉｂ）配列番号２のアミノ酸番号３５〜１１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを特異的に検出し得る核酸プローブ又はプライマー。【００３７】
次に、測定されたザルコポディンの発現レベルに基づいて、腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後が判定される。後述の実施例に示すように、腫瘍組織におけるザルコポディンの発現レベルが高いほど遠隔転移の発生率が高く、患者の生命予後が悪い。上記判定は、ザルコポディンの発現レベルと腫瘍の遠隔転移発生率又は腫瘍患者の生命予後の良否との間のこのような相関に基づき行われる。【００３８】
例えば、遠隔転移を伴わず、生命予後がよい患者（ネガティブコントロール）及び、遠隔転移を伴い、生命予後が悪い患者（ポジティブコントロール）から腫瘍を摘出し、対象患者から摘出された腫瘍におけるザルコポディン発現レベルがポジティブコントロール及びネガティブコントロールのそれと比較される。あるいは、腫瘍におけるザルコポディン発現レベルと遠隔転移発生率又は生命予後（例、生存期間）との相関図をあらかじめ作成しておき、対象患者から摘出された腫瘍におけるザルコポディン発現レベルをその相関図と比較してもよい。発現レベルの比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。【００３９】
そして、ザルコポディン発現レベルの比較結果より、測定対象のザルコポディン発現レベルが相対的に高い場合には、腫瘍の遠隔転移を発生するリスクが相対的に高い、又は該患者の生命予後が相対的に悪いと判定することができる。逆に、測定対象のザルコポディン発現レベルが相対的に低い場合には、腫瘍の遠隔転移を発生するリスクが相対的に低い、又は該患者の生命予後が相対的に良いと判定することができる。【００４０】
また、ザルコポディン発現レベルのカットオフ値をあらかじめ設定しておき、測定されたザルコポディン発現レベルとこのカットオフ値とを比較することによって行うこともできる。例えば、測定されたザルコポディン発現レベルが前記カットオフ値以上である場合には、腫瘍の遠隔転移を発生するリスクが相対的に高い、又は患者の生命予後が相対的に悪いと判定することができる。逆に、ザルコポディン発現レベルがカットオフ値を下回る場合には、腫瘍の遠隔転移を発生するリスクが相対的に低い、又は患者の生命予後が相対的に良いと判定することができる。「カットオフ値」は、その値を基準として疾患や状態の判定をした場合に、高い診断感度（有病正診率）及び高い診断特異度（無病正診率）の両方を満足できる値である。例えば、遠隔転移を発生した被検者又は生存期間が一定の長さ以下であった被検者で高い陽性率を示し、かつ、遠隔転移を発生していない被検者又は生存期間が一定の長さを上回る被検者で高い陰性率を示す、ザルコポディン発現レベルをカットオフ値として設定することが出来る。【００４１】
また、本発明は、上述の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を含む、腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定するための剤（本発明の剤（Ｉ）と呼ぶ）を提供するものである。該物質は、好ましくは上述の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかの物質であり、より好ましくは上述の（ｉｂ）〜（ｉｉｉｂ）から選択されるいずれかの物質である。本発明の剤（Ｉ）は、腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定するためのキットであり得る。本発明の剤（Ｉ）を用いることにより、上述の方法により容易に腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定することができる。【００４２】
（ｉ）〜（ｉｉｉ）の物質は、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解し、約-20℃〜4℃で保存することができる。【００４３】
本発明の剤（Ｉ）は、ザルコポディン発現レベルの測定方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。
例えば、本発明の剤（Ｉ）が上記（ｉ）の物質を含むものであれば、免疫学的手法によりザルコポディン発現レベルを測定することにより、紡錘形細胞肉腫の遠隔転移のリスク又は生命予後を判定することができる。この場合、本発明の剤（Ｉ）は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ELISAプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。
本発明の剤（Ｉ）が上記（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の物質を含むものであれば、RT-PCR、ノザンブロッティング、in situ ハイブリダイゼーション、cDNAアレイ等によりザルコポディン発現レベルを測定することにより、腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定することができる。RT-PCRを測定に用いる場合には、本発明の剤（Ｉ）は、10×PCR反応緩衝液、10×MgCl2水溶液、10×dNTPs水溶液、Taq DNAポリメラーゼ（5U/μL）、逆転写酵素等をさらに含むことができる。ノザンブロッティングやcDNAアレイを測定に用いる場合には、本発明の剤（Ｉ）は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。in situ ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本発明の剤（Ｉ）は、標識化試薬、発色基質等をさらに含むことができる。【００４４】
２．大腸癌細胞を検出する方法
後述の実施例において示されるように、大腸粘膜組織において、ザルコポディンは正常組織やポリープにはほとんど発現していないが、大腸癌細胞中に特異的に発現している。従って、大腸粘膜組織におけるザルコポディンの発現を評価し、その発現の有無を解析することにより、大腸粘膜組織において大腸癌細胞を検出することができる。【００４５】
即ち、本発明は大腸粘膜組織における、以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を評価すること、及び該発現の有無に基づき、該組織中に大腸癌細胞が含まれるか否かを判定することを含む、大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出する方法（本発明の検出方法（Ｉ））を提供するものである：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド；及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。【００４６】
上記（１）〜（５）のポリペプチド又はポリヌクレオチドの定義は、（１．腫瘍の遠隔転移発生のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定する方法）の項で記載されたものと同一である。【００４７】
本発明の検出方法（Ｉ）においては、測定対象患者から摘出された大腸粘膜組織におけるザルコポディンポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えばmRNA）の発現が評価される。【００４８】
ザルコポディンポリペプチドの発現は、（１．腫瘍の遠隔転移発生のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定する方法）の項で詳述した方法に従い、上記（ｉ）〜（ｉｉｉ）、好ましくは上記（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）、より好ましくは上記（ｉｂ）〜（ｉｉｉｂ）の抗体、核酸プローブ、プライマー等を用いて評価することができる。【００４９】
次に、大腸粘膜組織におけるザルコポディンの発現の有無に基づき、該組織中に大腸癌細胞が含まれるか否かが判定される。【００５０】
測定対象の大腸粘膜組織において、ザルコポディンを発現している細胞が確認された場合は、該組織中に大腸癌細胞が含まれている可能性が高いと判定することが出来る。逆に、測定対象の大腸粘膜組織において、ザルコポディンを発現している細胞が確認されなかった場合は、該組織中に大腸癌細胞が含まれている可能性が低いと判定することが出来る。【００５１】
また、本発明は、上述の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択されるいずれかの物質を含む、大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出するための剤（本発明の剤（ＩＩ）と呼ぶ）を提供するものである。該物質は、好ましくは上述の（ｉａ）〜（ｉｉｉａ）から選択されるいずれかの物質であり、より好ましくは上述の（ｉｂ）〜（ｉｉｉｂ）から選択されるいずれかの物質である。本発明の剤（ＩＩ）は、大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出するためのキットであり得る。本発明の剤（ＩＩ）を用いることにより、上述の方法により容易に大腸粘膜組織における大腸癌細胞を検出することができる。【００５２】
（ｉ）〜（ｉｉｉ）の物質は、各々別個に（あるいは可能であれば混合した状態で）水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解し、約-20℃〜4℃で保存することができる。【００５３】
本発明の剤（ＩＩ）は、ザルコポディン発現の評価方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。
例えば、本発明の剤（ＩＩ）が上記（ｉ）の物質を含むものであれば、免疫学的手法によりザルコポディン発現を評価することにより、大腸粘膜組織における大腸癌細胞の有無を判定することができる。この場合、本発明の剤（ＩＩ）は、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液、ELISAプレート、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。
本発明の剤（ＩＩ）が上記（ｉｉ）又は（ｉｉｉ）の物質を含むものであれば、RT-PCR、ノザンブロッティング、in situ ハイブリダイゼーション、cDNAアレイ等によりザルコポディン発現レベルを測定することにより、大腸粘膜組織における大腸癌細胞の有無を判定することができる。RT-PCRを測定に用いる場合には、本発明の剤（Ｉ）は、10×PCR反応緩衝液、10×MgCl2水溶液、10×dNTPs水溶液、Taq DNAポリメラーゼ（5U/μL）、逆転写酵素等をさらに含むことができる。ノザンブロッティングやcDNAアレイを測定に用いる場合には、本発明の剤（ＩＩ）は、ブロッティング緩衝液、標識化試薬、ブロッティング膜等をさらに含むことができる。in situ ハイブリダイゼーションを測定に用いる場合には、本発明の剤（ＩＩ）は、標識化試薬、発色基質等をさらに含むことができる。【００５４】
３．腫瘍細胞の悪性度を判定する方法
後述の実施例において示されるように、遠隔転移を伴わない紡錘形細胞肉腫細胞や異型度の低い大腸癌細胞内ではザルコポディンが核に局在していたが、遠隔転移を伴う紡錘形細胞肉腫細胞や異型度の高い腫瘍細胞内ではザルコポディンは細胞質にも局在しており、腫瘍細胞の悪性度の変化に伴いザルコポディンの細胞内局在が変化することが把握される。従って、腫瘍細胞内におけるザルコポディンの局在を評価し、その細胞質における発現の有無を解析することにより、該腫瘍細胞の悪性度を判定することが出来る。【００５５】
即ち、本発明は、腫瘍細胞内における、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドの局在を評価すること、及び該ポリペプチドの細胞質における発現の有無に基づき、該腫瘍細胞の悪性度を判定することを含む、腫瘍細胞の悪性度を判定する方法（本発明の判定方法（ＩＩ））を提供するものである：
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド。【００５６】
上記（１）〜（３）のポリペプチドの定義は、（１．腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定する方法）の項で記載されたものと同一である。【００５７】
本発明の判定方法（ＩＩ）においては、測定対象である患者から摘出された腫瘍組織に含まれる腫瘍細胞内におけるザルコポディンポリペプチドの局在が評価される。【００５８】
ザルコポディンポリペプチドの細胞内局在は、上記（ｉ）、好ましくは上記（ｉａ）、より好ましくは上記（ｉｂ）の抗体を用い、免疫組織染色により評価することができる。【００５９】
次に、ザルコポディンの細胞質における発現の有無に基づき、腫瘍細胞の悪性度が判定される。ザルコポディン発現が測定対象の腫瘍細胞の細胞質において確認された場合には、該腫瘍細胞は悪性度が高いと判定することが出来る。逆に、ザルコポディン発現が測定対象の腫瘍細胞の細胞質において認められず、核にとどまる場合、あるいはザルコポディン発現が測定対象の腫瘍細胞内のいずれの部位においても認められない場合には、該腫瘍細胞は悪性度が低いと判定することが出来る。【００６０】
また、本発明は、上記（ｉ）の抗体を含む、腫瘍細胞の悪性度を判定するための剤（本発明の剤（ＩＩＩ）と呼ぶ）を提供するものである。該抗体は、好ましくは上記（ｉａ）の抗体であり、より好ましくは上記（ｉｂ）の抗体である。本発明の剤（ＩＩＩ）は、腫瘍細胞の悪性度を判定するためのキットであり得る。本発明の剤（ＩＩＩ）を用いることにより、上述の方法により容易に腫瘍細胞の悪性度を判定することができる。【００６１】
上記（ｉ）の抗体は、水もしくは適当な緩衝液（例：TEバッファー、PBSなど）中に適当な濃度となるように溶解し、約-20℃〜4℃で保存することができる。【００６２】
本発明の剤（ＩＩＩ）は、ザルコポディン発現の評価方法に応じて、当該方法の実施に必要な他の成分を構成としてさらに含んでいてもよい。例えば、本発明の剤（ＩＩＩ）は、免疫組織染色に有用な、標識二次抗体、発色基質、ブロッキング液、洗浄緩衝液等をさらに含むことができる。【００６３】
４．肉腫の転移、又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害するための剤
本発明は、ザルコポディンの発現又は機能を阻害する物質を含む、肉腫の転移、又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害するための剤（本発明の阻害剤（Ｉ））を提供する。該物質の好ましい一態様として、以下のポリヌクレオチドを挙げることができる：
（Ａ）ザルコポディンをコードするmRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）のヌクレオチド配列又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（DNA又はRNA）；及び
（Ｂ）ザルコポディンをコードするmRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）や染色体DNAと治療対象動物（好ましくはヒト）の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態でザルコポディンの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド（DNA又はRNA）。【００６４】
上記（Ａ）及び（Ｂ）のポリヌクレオチドは具体的には以下のように特定される：
（ａ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のそれらの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、若しくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物のヌクレオチド配列、又は１５塩基以上のその部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、及び
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ポリヌクレオチドを生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド；並びに
（ｄ）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、もしくは転写後プロセッシングにより該ヌクレオチド配列を生じる初期転写産物と、治療対象動物の生理的条件下でハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で（１）〜（３）のいずれかのポリペプチドの転写又は翻訳を抑制するポリヌクレオチド。【００６５】
上記（１）〜（３）のポリペプチドの定義は、（１．紡錘形細胞肉腫の遠隔転移のリスク又は生命予後を判定する方法、及びそのための剤）の項で述べたものと同一である。上記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドは、ザルコポディンに対するアンチセンス核酸又はsiRNAとして有用である。上記（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドの態様は、その用途に応じて適宜選択することができる。【００６６】
「アンチセンス核酸」とは、標的mRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）を発現する細胞の生理的条件下で該標的mRNAとハイブリダイズし得るヌクレオチド配列を含み、且つハイブリダイズした状態で該標的mRNAにコードされるポリペプチドの翻訳を阻害し得る核酸をいう。アンチセンス核酸の種類はDNAであってもRNAであってもよいし、あるいはDNA／RNAキメラであってもよい。また、天然型のアンチセンス核酸は、細胞中に存在する核酸分解酵素によってそのリン酸ジエステル結合が容易に分解されるので、本発明のアンチセンス核酸は、分解酵素に安定なチオリン酸型（リン酸結合のP=OをP=Sに置換）や2’-O-メチル型等の修飾ヌクレオチドを用いて合成することもできる。アンチセンス核酸の設計に重要な他の要素として、水溶性及び細胞膜透過性を高めること等が挙げられるが、これらはリポソームやマイクロスフェアを使用するなどの剤形の工夫によっても克服することができる。【００６７】
アンチセンス核酸中の標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、ザルコポディンの成熟mRNAもしくは初期転写産物と特異的にハイブリダイズし、且つハイブリダイズした状態でザルコポディンポリペプチドの翻訳を阻害し得る限り特に制限はなく、短いもので約１５塩基程度、長いものでmRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）の全長配列と同一の長さである。ハイブリダイゼーションの特異性を考慮すると、標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上である。また、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、例えば約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。即ち、標的mRNAとハイブリダイズする部分の長さは、例えば約１５〜約２００塩基、好ましくは約１８〜約５０塩基、より好ましくは約２０〜約３０塩基である。【００６８】
アンチセンス核酸の標的ヌクレオチド配列は、アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、ザルコポディンの翻訳が阻害される配列であれば特に制限はなく、ザルコポディンのmRNA（成熟mRNA又は初期転写産物）の全長配列であっても部分配列（例えば約１５塩基以上、好ましくは約１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上）であってもよいし、あるいは初期転写産物のイントロン部分であってもよいが、アンチセンス核酸としてオリゴヌクレオチドを使用する場合は、標的配列はザルコポディンのmRNAの５’末端からコード領域のＣ末端までに位置することが望ましい。【００６９】
アンチセンス核酸中の標的mRNAとハイブリダイズする部分のヌクレオチド配列は、標的配列の塩基組成によっても異なるが、生理的条件下でザルコポディンのmRNAとハイブリダイズし得るために、標的配列の相補配列に対して通常約９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％）の同一性を有するものである。ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST-2（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝5；ギャップエクステンション＝2；ｘ＿ドロップオフ＝50；期待値＝10；フィルタリング＝ON）にて計算することができる。【００７０】
アンチセンス核酸の大きさは、通常約１５塩基以上、好ましくは約１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基以上である。該大きさは、合成の容易さや抗原性の問題等から、通常約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。【００７１】
さらに、アンチセンス核酸は、ザルコポディンのmRNAもしくは初期転写産物とハイブリダイズして翻訳を阻害するだけでなく、二本鎖DNAであるザルコポディン遺伝子と結合して三重鎖（トリプレックス）を形成し、mRNAへの転写を阻害し得るものであってもよい。【００７２】
ザルコポディンに対するsiRNAは、ザルコポディンのmRNA（成熟mRNAもしくは初期転写産物）のヌクレオチド配列又はその部分配列（好ましくはコード領域内）（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相補的なヌクレオチド配列を含む二本鎖オリゴRNAである。短い二本鎖RNAを細胞内に導入するとそのRNAに相補的なmRNAが分解される、いわゆるRNA干渉（RNAi）と呼ばれる現象は、以前から線虫、昆虫、植物等で知られていたが、最近、この現象が動物細胞でも起こることが確認されたことから［Nature, 411(6836): 494-498 (2001)］、リボザイムの代替技術として注目されている。【００７３】
siRNAは、代表的には、標的遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列又はその部分配列（以下、標的ヌクレオチド配列）と相補的な配列を有するRNAとその相補鎖からなる二本鎖オリゴRNAである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖RNAであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造を形成するRNA（small hairpin RNA: shRNA）もsiRNAの好ましい態様の１つである。【００７４】
siRNAに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さは、通常、約１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、より好ましくは約２０塩基前後（代表的には約２１〜２３塩基長）の長さであるが、RNA干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されない。siRNAが２３塩基よりも長い場合には、該siRNAは細胞内で分解されて、約２０塩基前後のsiRNAを生じるので、理論的には標的ヌクレオチド配列と相補的な部分の長さの上限は、標的遺伝子のmRNA（成熟mRNAもしくは初期転写産物）のヌクレオチド配列の全長である。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、該相補部分の長さは、例えば約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。即ち、該相補部分の長さは、例えば約１５塩基以上、好ましくは約１８〜約２００塩基、より好ましくは約２０〜約５０塩基、更に好ましくは約２０〜約３０塩基である。【００７５】
また、siRNAの全長も、通常、約１８塩基以上、例えば約２０塩基前後（代表的には約２１〜２３塩基長）の長さであるが、RNA干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されず、理論的にはsiRNAの長さの上限はない。しかし、合成の容易さや抗原性の問題等を考慮すると、siRNAの長さは、例えば約２００塩基以下、好ましくは約５０塩基以下、より好ましくは約３０塩基以下である。即ち、siRNAの長さは、例えば約１８塩基以上、好ましくは約１８〜約２００塩基、より好ましくは約２０〜約５０塩基、更に好ましくは約２０〜約３０塩基である。なお、shRNAの長さは、二本鎖構造をとった場合の二本鎖部分の長さとして示すものとする。【００７６】
標的ヌクレオチド配列と、siRNAに含まれるそれに相補的な配列とは、完全に相補的であることが好ましい。しかし、siRNAの中央から外れた位置についての塩基の変異（少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性の範囲内であり得る）については、完全にRNA干渉による切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存し得る。他方、siRNAの中央部の塩基の変異は影響が大きく、RNA干渉によるmRNAの切断活性が極度に低下し得る。【００７７】
siRNAは、５’又は３’末端に塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基の長さは、通常５塩基以下である。該付加的塩基は、DNAでもRNAでもよいが、DNAを用いるとsiRNAの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’などの配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。【００７８】
shRNAのヘアピンループのループ部分の長さは、RNA干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されないが、通常、５〜２５塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、ループを形成することができ、且つ、shRNAがRNA干渉を引き起こすことができる限り、特に限定されない。【００７９】
上述のポリヌクレオチドは、ザルコポディンのmRNA配列（例えば配列番号１で表されるヌクレオチド配列）や染色体DNA配列に基づいて標的配列を決定し、市販のDNA／RNA自動合成機（アプライド・バイオシステムズ社、ベックマン社等）を用いて、これに相補的なヌクレオチド配列を合成することにより調製できる。siRNAは、センス鎖及びアンチセンス鎖をDNA／RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約９０〜約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０〜約７０℃で約１〜約８時間アニーリングさせることにより調製できる。また、相補的なオリゴヌクレオチド鎖を交互にオーバーラップするように合成して、これらをアニーリングさせた後リガーゼでライゲーションすることにより、より長い二本鎖ポリヌクレオチドを調製できる。【００８０】
本発明の阻害剤（Ｉ）は、上述の（ａ）〜（ｄ）から選択されるいずれかのポリヌクレオチドを発現し得る（コードする）発現ベクターを有効成分とすることもできる。当該発現ベクターにおいては、上述のポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸（好ましくはDNA）が、投与対象である哺乳動物（好ましくはヒト）の細胞（例えば、肉腫細胞）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。【００８１】
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター、並びにｔRNAプロモーター等のRNAプロモーター等が用いられる。【００８２】
siRNAの発現を意図する場合には、プロモーターとしてｐｏｌＩＩＩ系プロモーターを使用することが好ましい。ｐｏｌＩＩＩ系プロモーターとしては、例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、ｔRNAプロモーター等を挙げることができる。【００８３】
本発明の発現ベクターは、好ましくは上述のポリヌクレオチド又はそれをコードする核酸の下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。【００８４】
本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。このうち、アデノウイルスは、遺伝子導入効率が極めて高く、非分裂細胞にも導入可能である等の利点を有する。但し、導入遺伝子の宿主染色体への組込みは極めて稀であるので、遺伝子発現は一過性で通常約４週間程度しか持続しない。治療効果の持続性を考慮すれば、比較的遺伝子導入効率が高く、非分裂細胞にも導入可能で、且つ逆位末端繰り返し配列（ITR）を介して染色体に組み込まれ得るアデノ随伴ウイルスの使用もまた好ましい。【００８５】
上述のポリヌクレオチド又はこれを発現し得る発現ベクターを有効成分とする本発明の阻害剤（Ｉ）の投与は、投与対象の体内に直接ベクターを投与して導入を行うin vivo法で行われる。この場合、ウイルスベクターは、注射剤等の形態で静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内、腹腔内等に投与される。ウイルスベクターに対する中和抗体の産生が問題となる場合は、患部（肉腫組織）付近に局所的にベクターを注入すれば（in situ法）、抗体の存在による悪影響を軽減することができる。【００８６】
本発明の阻害剤（Ｉ）は、上記のポリヌクレオチド又はこれを発現し得る発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができる。【００８７】
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００８８】
ポリヌクレオチドの細胞内への導入を促進するために、本発明の阻害剤（Ｉ）は更に核酸導入用試薬を含むことができる。該ポリヌクレオチドがウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターに組み込まれている場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、フィブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、該ポリヌクレオチドがプラスミドベクターに組み込まれている場合は、リポフェクチン、リポフェクタミン（lipofectamine）、DOGS（トランスフェクタム）、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。【００８９】
経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。【００９０】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。【００９１】
医薬組成物中の上述のポリヌクレオチドの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約０．１ないし１００重量％である。【００９２】
本発明の阻害剤（Ｉ）の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇである。【００９３】
本発明の阻害剤（Ｉ）は、好ましくは、その有効成分である上記のポリヌクレオチド又はこれを発現し得る発現ベクターが肉腫組織（肉腫細胞）に送達されるように、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト）に対して安全に投与される。【００９４】
上記のポリヌクレオチドは、肉腫細胞の運動能や浸潤能を阻害する活性を有するので、本発明の阻害剤（Ｉ）を、肉腫（特に紡錘形細胞肉腫）の患者や、肉腫の遠隔転移のリスクを有する肉腫の治療後の患者等に対して投与することにより、肉腫（特に紡錘形細胞肉腫）の転移を阻害し、生命予後を改善することができる。【００９５】
５．肉腫の転移等を阻害し得る物質の探索方法（Ｉ）
本発明はまた、被検物質がザルコポディンの発現を抑制するか否かを評価することを含む、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害し得る物質を探索する方法、並びに当該方法により得られうる物質を提供する。本発明の探索方法（Ｉ）においては、ザルコポディンの発現を抑制する物質が、肉腫（特に紡錘形細胞肉腫）の転移又は肉腫細胞（特に紡錘形細胞肉腫細胞）の運動能若しくは浸潤能を阻害し得る物質として選択される。【００９６】
本発明の探索方法（Ｉ）に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。【００９７】
本発明の探索方法（Ｉ）は、以下の工程を含む：
（Ｉ）被検物質と以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現を測定可能な細胞とを接触させること；
（１）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、
（３）配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ細胞内に発現されたときに該細胞の運動能又は浸潤能を亢進する活性を有するポリペプチド、
（４）配列番号１で表されるヌクレオチド配列中のコード領域を含むポリヌクレオチド、及び
（５）上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
（ＩＩ）被検物質を接触させた細胞における上記（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量を測定し、該発現量を被検物質を接触させない対照細胞における上記ポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量と比較すること；並びに
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、以下の（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現量を抑制する被検物質を、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害し得る物質として選択すること。【００９８】
（１）〜（５）から選択されるいずれかのポリペプチド又はポリヌクレオチドの発現とは、即ちザルコポディンのポリペプチド又はポリヌクレオチド（好ましくはmRNA）の発現を意味する。（１）〜（５）のポリペプチド又はポリヌクレオチドの定義は（１．腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定する方法）の項で述べたものと同一である。【００９９】
「発現を測定可能な細胞」とは、測定対象のmRNA又は蛋白質の発現レベルを直接的又は間接的に評価可能な細胞をいう。測定対象のmRNA又は蛋白質の発現レベルを直接的に評価可能な細胞としては、測定対象を天然で発現可能な細胞が挙げられ、一方、測定対象のmRNA又は蛋白質の発現レベルを間接的に評価可能な細胞としては、測定対象の転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞が挙げられる。【０１００】
測定対象、即ちザルコポディンを天然で発現可能な細胞は、上述の（１）〜（５）のポリペプチド又はポリヌクレオチドを潜在的に発現するものである限り特に限定されず、当該細胞として、初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株などを用いることができる。ザルコポディンを天然で発現可能な細胞としては、例えば肉腫細胞等を挙げることが出来る。【０１０１】
測定対象、即ちザルコポディンの転写調節領域についてレポーターアッセイを可能とする細胞は、ザルコポディン遺伝子の転写調節領域（例えば、転写開始点から上流約２kbpの塩基配列からなるDNA）、当該領域に機能可能に連結されたレポーター遺伝子（例えばGFP遺伝子）を含む細胞である。ザルコポディンに対する生理的な転写調節因子を発現し、ザルコポディンの発現調節の評価により適切であると考えられることから、測定対象の細胞としては肉腫細胞が好ましい。【０１０２】
被検物質とザルコポディンの発現を測定可能な細胞との接触は、培養培地中で行われる。培養培地は、ザルコポディンの発現を測定可能な細胞に応じて適宜選択されるが、例えば、約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（MEM）、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）などである。培養条件も同様に適宜決定されるが、例えば、培地のpHは約６〜約８であり、培養温度は通常約３０〜約４０℃であり、培養時間は約１２〜約７２時間である。【０１０３】
ザルコポディンを発現可能な細胞を用いた場合、ザルコポディン（（１）〜（５）のポリペプチド又はポリヌクレオチド）の発現量の測定は、（１．腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定する方法）の項で述べた方法に従い行うことができる。また、レポーター遺伝子を含む細胞が用いられた場合、発現量は、レポーター遺伝子のシグナル強度に基づき測定される。【０１０４】
発現量の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検物質を接触させない対照細胞におけるザルコポディンの発現量は、被検物質を接触させた細胞におけるザルコポディンの発現量の測定に対し、事前に測定した発現量であっても、同時に測定した発現量であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した発現量であることが好ましい。【０１０５】
そして、比較の結果得られた、ザルコポディンの発現量を抑制する物質が、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害し得る物質として選択される。【０１０６】
本発明の探索方法（Ｉ）で得られる化合物は、新たな肉腫の転移阻害剤の開発のための候補物質として有用である。【０１０７】
６．肉腫の転移、又は肉腫細胞の運動能の阻害剤
後述の実施例において示されるように、ロングフォームのザルコポディンを発現している肉腫細胞内にそのショートフォームを導入することにより、この肉腫細胞の運動能を阻害することができる。従って、ザルコポディンのショートフォームポリペプチドや、これを発現し得る発現ベクターは肉腫の転移阻害剤として有用である。
即ち、本発明は以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチド又は該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを含む、肉腫の転移、又は肉腫細胞の運動能の阻害剤（本発明の阻害剤（ＩＩ））を提供するものである：
（１）配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド；及び
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列を含み、且つ配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに、該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有するポリペプチド。【０１０８】
本発明の阻害剤（ＩＩ）において用いられるショートフォームザルコポディンポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内に発現されたときに該肉腫細胞の運動能を阻害する活性を有する。該活性は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ロングフォームザルコポディン）が有する細胞の運動能を亢進する活性を阻害することによるものであり得る。かかるショートフォームザルコポディンの活性の有無は、目的とするポリペプチドを発現し得る発現ベクターを、ロングフォームザルコポディンを発現している肉腫細胞に導入し、得られた細胞の運動能を、対照肉腫細胞の運動能と比較することにより決定することができる。【０１０９】
上記（２）のポリペプチドに含まれるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。「同一性」の定義は、（１．腫瘍の遠隔転移のリスク又は腫瘍患者の生命予後を判定する方法）の項で述べたものと同一である。【０１１０】
上記（３）のポリペプチドに含まれるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列、例えば、(1)配列番号４に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号４に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、(3)配列番号４に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号４に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)上記(1)〜(4)の変異が組み合わされたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）である。【０１１１】
１つの好ましい態様において、上記（１）〜（３）のポリペプチドは、天然のショートフォームヒトザルコポディンポリペプチドである。「天然の」とは、ポリペプチドを構成するアミノ酸配列が天然に存在することをいう。天然のショートフォームヒトザルコポディンアミノ酸配列としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列を挙げることができるが、これに限定されない。遺伝子を構成するヌクレオチド配列には通常多型（個体差）が存在することが知られている。このようなザルコポディン遺伝子の多型により生じた配列番号４で表されるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドも、肉腫細胞内に発現されたときに該肉腫細胞の運動能を抑制する活性を有する限り、天然のショートフォームヒトザルコポディンポリペプチドに含まれる。【０１１２】
上記（１）〜（３）のポリペプチドは、ポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグや、ポリペプチドの細胞内への導入を容易にならしめるためのProtein Transduction Domain（PTD）等の配列等の付加配列を含んでいてもよい。より具体的には、タグとしては、Flagタグ、ヒスチジンタグ、c-Mycタグ、HAタグ、AU1タグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばGFP、YFP、RFP、CFP、BFP等）、イムノグロブリンFcタグ等を挙げることが出来る。また、PTDとしては、ANTENNAPEDIA、HIV/TAT、HSV/VP-22等の細胞通過ドメイン、７〜１１個のポリアルギニン等を挙げることが出来る。付加配列の位置は、上記（１）〜（３）のポリペプチドが有する肉腫細胞の運動能を阻害する活性を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは、該ポリペプチドの末端（Ｎ末端又はＣ末端）である。【０１１３】
上記（１）〜（３）から選択されるいずれかのポリペプチドを発現し得る発現ベクターも本発明の阻害剤（ＩＩ）の有効成分であり得る。該発現ベクターにおいては、通常、上述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号３で表されるヌクレオチド配列）を含むポリヌクレオチド（好ましくはDNA）が、投与対象である哺乳動物（好ましくはヒト）の細胞（例えば、肉腫細胞）内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。【０１１４】
本発明において使用されるプロモーターとしては、（４．肉腫の転移、又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害するための剤）の項において列挙したものと同様のものを挙げることができる。【０１１５】
該発現ベクターは、好ましくは上述のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。【０１１６】
本発明において使用されるベクターとしては、（４．肉腫の転移、又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害するための剤）の項において列挙したものと同様のものを挙げることができる。【０１１７】
本発明の阻害剤（ＩＩ）は、上記のポリペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含むことができ、本発明の阻害剤（Ｉ）と同様に製剤化することができる。【０１１８】
医薬組成物中の上記のポリペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約０．１ないし１００重量％である。【０１１９】
本発明の阻害剤（ＩＩ）の投与量は、有効成分の活性や種類、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり一概に云えないが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇである。【０１２０】
本発明の阻害剤（ＩＩ）は、好ましくは、その有効成分である上記のポリペプチド又はこれを発現し得る発現ベクターが肉腫組織（肉腫細胞）に送達されるように、哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル、ヒト）に対して投与される。【０１２１】
上記のポリペプチドは、肉腫細胞の運動能や浸潤能を阻害する活性を有するので、本発明の阻害剤（ＩＩ）を、肉腫（特に紡錘形細胞肉腫）の患者や、肉腫の遠隔転移のリスクを有する肉腫の治療後の患者等に対して投与することにより、肉腫（特に紡錘形細胞肉腫）の転移を阻害し、生命予後を改善することができる。【０１２２】
７．肉腫の転移等を阻害し得る物質の探索方法（ＩＩ）
上述の様に、ロングフォームのザルコポディンを発現している肉腫細胞内にそのショートフォームを導入することにより、この肉腫細胞の運動能を阻害することができる。このことは、適切にデザインされたザルコポディンの欠損変異体（部分ペプチド）によって、ロングフォームザルコポディンの機能を阻害することにより、肉腫細胞の運動能を阻害し、肉腫の転移を阻害し得ることを示す。実施例に示されるように、ロングフォームザルコポディンはアクチンやSrcと結合する。従って、欠損変異体はこの結合を阻害するものであり得るが、この阻害様式に限定されるものではない。【０１２３】
このような知見に基づき、本発明は以下の工程を含む、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能を阻害し得るポリペプチドを探索する方法、並びに当該方法により得られうるポリペプチドを提供するものである：
（Ｉ）配列番号２で表されるアミノ酸配列に含まれる少なくとも３個の連続したアミノ酸を含む被検ポリペプチドを、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを発現している肉腫細胞内で発現させること；
（ＩＩ）被検ポリペプチドを発現させた細胞の運動能を測定し、該運動能を被検ポリペプチドを発現させていない対照肉腫細胞の運動能と比較すること；
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の比較結果に基づいて、肉腫細胞の運動能を抑制したポリペプチドを肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能を阻害し得るポリペプチドとして選択すること。【０１２４】
本発明の探索方法（ＩＩ）に供される被検ポリペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に含まれる少なくとも３個の連続したアミノ酸からなる部分配列を含む。該部分配列の長さは特に限定されるものではないが、十分な阻害活性を達成するため、好ましくは５アミノ酸以上、より好ましくは１０アミノ酸以上である。【０１２５】
ショートフォームザルコポディンの導入により、肉腫細胞の運動能を阻害することができるので、このショートフォームザルコポディンに基づき被検ポリペプチドを設計することにより、より高い確率で肉腫細胞の運動能を強力に阻害するポリペプチドが得られ得る。従って、好ましい態様において、本発明の探索方法（ＩＩ）に供される被検ポリペプチドは、配列番号４で表されるアミノ酸配列に含まれる少なくとも３個の連続したアミノ酸からなる部分配列を含む。【０１２６】
肉腫細胞内での被検ポリペプチドの発現は、該被検ポリペプチドを発現し得る発現ベクターを肉腫細胞に導入することにより達成することができる。該発現ベクターにおいては、被検ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが、肉腫細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターに機能的に連結されている。【０１２７】
使用されるプロモーターとしては、（４．肉腫の転移、又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害するための剤）の項において列挙したものと同様のものを挙げることができる。【０１２８】
該発現ベクターは、好ましくは被検ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。【０１２９】
本発明において使用されるベクターとしては、（４．肉腫の転移、又は肉腫細胞の運動能若しくは浸潤能を阻害するための剤）の項において列挙したものと同様のものを挙げることができる。【０１３０】
肉腫細胞への発現ベクターの導入は、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、エレクトロポレーション法、またはリポフェクション法等の一般的な遺伝子導入法等の一般的な遺伝子導入法により行うことができる。ウイルスをベクターに用いる場合には、上述の一般的な遺伝子導入法によりウイルスのゲノムを細胞に導入してもよいし、ウイルス粒子を、細胞へ感染させることによっても、該ウイルスのゲノムを細胞に導入することができる。【０１３１】
本発明の方法において用いられる肉腫細胞は、通常、哺乳動物由来であり、好ましくはヒト由来である。該肉腫細胞は配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド（ロングフォームヒトザルコポディン）を天然に又は強制的に発現している。該ポリペプチドの強制発現は、上述と同様に、該ポリペプチドを発現し得る発現ベクターの導入により達成することができる。【０１３２】
被検ポリペプチドを発現させた細胞の運動能は、例えば金コロイド法、ボイデンチャンバーアッセイなどに従い測定することができる。【０１３３】
そして、被検ポリペプチドを発現させた細胞の運動能が被検ポリペプチドを発現させていない対照肉腫細胞の運動能と比較される。【０１３４】
運動能の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれ得る。なお、被検ポリペプチドを発現させない対照細胞の運動能は、被検ポリペプチドを発現させた細胞の運動能の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。【０１３５】
そして、比較の結果得られた、肉腫細胞の運動能を抑制したポリペプチドが、肉腫の転移又は肉腫細胞の運動能を阻害し得るポリペプチドとして選択される。【０１３６】
本発明の探索方法（ＩＩ）で得られるポリペプチドは、新たな肉腫の転移阻害剤の開発のための候補物質として有用である。【０１３７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１３８】
実施例１：紡錘形細胞肉腫におけるザルコポディンの発現及びその機能解析
ザルコポディン遺伝子の同定
以下の実施例において、ロングフォームザルコポディンをC7059と、ショートフォームザルコポディンをctC7059と称する。
65例の紡錘形細胞肉腫組織より抽出したRNAよりcDNAを作成し、東京大学医科学研究所において作成された約23000種の遺伝子を対象としたcDNAマイクロアレイを用いて網羅的遺伝子発現解析を行った（図１）。比較対照としては、間葉系幹細胞（以下MSC）より抽出したRNAより作成されたcDNAを用いた。65例を遠隔転移発生あるいは腫瘍関連死の有無に基づき２群に分類し、両群間で統計学的に有意な差をもって発現レベルに相違がある遺伝子群を検索した。その結果、遠隔転移発生と腫瘍関連死の両者において、最も強い相関を示す遺伝子としてC7059を同定した（図２）。
病理所見に基づき紡錘形細胞肉腫患者をいくつかのグループに分類したが、病理分類とは関係なく、C7059の発現レベルは遠隔転移陽性例において高かった（図３）。
遺伝子発現量以外のファクターに関しても、紡錘形細胞肉腫の腫瘍関連死との相関を解析した。しかし、解析した因子の中では、C7059発現レベルが唯一、腫瘍関連死と有意な相関を示した（図４）。
以上の結果より、紡錘形細胞肉腫組織中のC7059の発現レベルを測定することにより、遠隔転移の発生リスクや患者の生命予後を判定し得ることが示唆された。【０１３９】
C7059に関する情報解析
C7059はGenBankにAK074185（配列番号１）として登録されている機能未知の遺伝子であった。C7059は第５染色体長腕（5q32）の領域に存在し、19個のエクソンからなる遺伝子であり、cDNA及びORFは、それぞれ4153bp、2304bpの長さを有しており、768アミノ酸より構成されるタンパク質（アクセッション番号：FLJ00258）（配列番号２）をコードしていた（図５）。また、第９イントロン内に転写開始点を有し、C7059のC末端と同一の構造を有するC7059のshort form（ctC7059と称する）がAK094067（配列番号３）として登録されていた（図６及び７）。
以下のプライマーによりC7059をコードするDNAの一部をPCR増幅し、cDNAマイクロアレイ用のプローブとして使用した。
Forward: tggtggtgcagtgtaaagagacaaga (配列番号１のヌクレオチド番号2786〜2811：配列番号５)
Reverse: gtttagcacccatgtgacagaa (配列番号１のヌクレオチド番号3355〜3334：配列番号６)
このプローブは、C7059及びctC7059に共通する領域にハイブリダイズするものである。即ち、C7059とctC7059との発現量の和を検出する。
また、紡錘形細胞肉腫におけるctC7059の発現はC7059と比較すると低いことが定量的RT-PCRにより判明した（図８）。以上より遠隔転移発生及び腫瘍関連死と相関するものは主としてC7059の発現量であると推定された。
尚、上記RT-PCRに使用したプライマーのヌクレオチド配列は以下の通りである：
C7059増幅用プライマー
Forward: atcggcagccacatctgaggttg (配列番号１のヌクレオチド番号841〜863：配列番号７)
Reverse:ttgtcacccacacccacgct  (配列番号１のヌクレオチド番号1150〜1131：配列番号８)
ctC7059増幅用プライマー
Forward: gtatggtatgaggcacaggatag (配列番号3のヌクレオチド番号30〜52：配列番号９)
Reverse:gcgttcacatgggttcgcag (配列番号１のヌクレオチド番号1453〜1434：配列番号１０)
このことから、C7059を特異的に検出することによって紡錘形細胞肉腫の遠隔転移の発生リスクや患者の生命予後を判定し得ることが示唆された。【０１４０】
マイクロアレイデータの検証
C7059のゲノム配列より、定量的RT-PCR用のプローブを作成し、TaqMan法により、マイクロアレイに使用した紡錘形細胞肉腫組織におけるC7059の発現を定量的に解析した。
TaqMan法に用いたプライマー及びプローブのヌクレオチド配列は以下の通りである：
Forward: aacaagcctccccctgaggact (配列番号１のヌクレオチド番号429〜450：配列番号１１)
Reverse:gttgcagggtagctgctgtc (配列番号１のヌクレオチド番号580〜561：配列番号１２)
TaqManプローブ: ggcccttcctctgggacccggc (配列番号１のヌクレオチド番号461〜482：配列番号１３)
これらのプライマーはC7059特異的であり、ctC7059は検出しないことより、C7059のみの発現量を定量的に測定できる。
その結果、定量的RT-PCRの結果はマイクロアレイのデータとほぼ一致しており（図８Ａ及びＢ）、比較対照とした間葉系幹細胞の発現レベルを１とし、１０以上の群と１０を下回る群との２群に分類し、遠隔転移発生率を比較すると、１０以上の群は統計的に有意な差をもって高率に遠隔転移が発生していた（図９Ａ及びＢ）。更に、新規症例１０例を用いて、同様の解析を行った結果、やはりC7059の高発現症例では高頻度で遠隔転移が発生していた（図９Ａ及びＣ）。【０１４１】
特異的抗体の作製
C7059のアミノ末端領域（配列番号２のアミノ酸番号３５〜１１３で表される領域）とＧＳＴとの融合タンパク質を抗原として用い、家兎を免疫することによりC7059特異的なポリクローナル抗体を作製した（図１０Ａ）。得られた抗体を用いたウエスタンブロットにより、C7059は主として細胞質に存在する約110kDのタンパク質であることが判明した（図１０Ｂ）。【０１４２】
免疫組織染色
C7059陰性肉腫細胞（SaOS2）に下述のC7059発現ベクターを導入した。該細胞を、上述の抗C7059抗体を用いて染色した。その結果、C7059はアクチンと結合し、特に葉状仮足（Lamellipodia）において凝集していることが判明した（図１１）。
また、紡錘形細胞肉腫患者から採取されたホルマリン固定腫瘍組織を、上述の抗C7059抗体を用いて染色した。その結果、C7059の染色性は、主として細胞質に、一部核に認められた。RNAレベルでの解析結果と一致して、遠隔転移陽性且つ腫瘍関連死陽性の症例からの肉腫組織はC7059が強陽性であり、遠隔転移陰性且つ腫瘍関連死陰性の症例からの肉腫組織はC7059が弱陽性であった（図１２）。この結果から、組織切片を用いた免疫組織染色によっても、紡錘形細胞肉腫の遠隔転移の発生リスクや患者の生命予後を判定し得ることが示された。
また、遠隔転移陽性且つ腫瘍関連死陽性の症例からの肉腫組織は細胞質及び核に強いC7059発現が認められたが、遠隔転移陰性且つ腫瘍関連死陰性の症例からの肉腫組織は核のみに弱いC7059発現が認められた（図１２）。この結果から、肉腫細胞の悪性度に伴い、C7059タンパク質の細胞内局在が変わる可能性が示された。【０１４３】
C7059発現誘導又は阻害の細胞運動能・浸潤能に対する効果
C7059をコードするDNAをpCAGGSのマルチクローニングサイトに挿入することによりC7059タンパク質を一過性に強発現できるベクターを作製した（図１３）。C7059発現ベクターを、C7059陰性培養肉腫細胞（SaOS2）に導入し、該細胞の運動能及び浸潤能を評価した。
該細胞の運動能及び浸潤能はボイデンチャンバーアッセイにより評価された。2.5×104個の該細胞を8マイクロの孔をもつPET膜を底面にもつ24穴プレートに播種し、22時間後に膜を通過した細胞数を計測し、細胞運動能の指標とした。次に合成基底膜組織を塗布した有孔PET膜を用いて同様の実験を行い、基底膜組織を破壊して浸潤した細胞数を計測した。浸潤細胞数を移動細胞数で除した数をもちいて細胞浸潤能を評価した。
その結果、C7059発現ベクターの導入により、肉腫細胞の運動能は変わらなかったが、浸潤能が有意に亢進した（図１４Ａ）。この結果より、紡錘形細胞肉腫におけるC7059発現の上昇が浸潤能の亢進をもたらし、その結果、遠隔転移の発生率が上昇し、患者の生命予後が悪くなる可能性が示唆された。【０１４４】
C7059に対する以下の４種類のsiRNAをデザインした：
C7059siRNA1-1：cagggugaacggcgagcuuaa (配列番号１のヌクレオチド番号581〜601：配列番号１４)
C7059siRNA1-2：cagcaucaucuacgugcccaa (配列番号１のヌクレオチド番号878〜898：配列番号１５)
C7059siRNA1-3：aucccucuuugaagaauuuga (配列番号１のヌクレオチド番号284〜304：配列番号１６)
C7059siRNA1-4：aaaggaggucuccuaccugua (配列番号１のヌクレオチド番号221〜241：配列番号１７)
これらのsiRNAより二重鎖RNAを作成し、C7059陽性培養肉腫細胞(U2OS)に導入し、C7059発現のmRNAレベル及びタンパク質レベルでの発現抑制を確認した（図１３Ｂ）。これらのうち、最も抑制効果が強いC7059siRNA1-3を以下のアッセイに用いた。
C7059siRNA1-3をC7059陽性培養肉腫細胞に導入し、該細胞の運動能及び浸潤能を評価した。
その結果、siRNAによるC7059発現の阻害により、肉腫細胞の運動能及び浸潤能が著しく阻害されていることが判明した（図１４Ｂ）。この結果より、肉腫細胞におけるC7059発現を抑制することにより、肉腫の転移を阻害し、患者の生命予後を改善し得る可能性が示された。【０１４５】
レンチウイルスベクターによるC7059安定発現不死化MSCの樹立
C7059タンパク質を強発現できるレンチウイルスベクターを構築した。
配列番号1のヌクレオチド番号75〜2381の領域をPCRにより増幅し、クローニングベクターpENTR/D/TOPOにTOPOクローニングにより挿入することにより、pENTR/C7059を作成した。
続いてpENTR/C7059とpLenti6/V5-DESTをLR recombinationし、ampicilinとblasticidinによる二重選択より、pLenti/C7059を作成した。
BBRC, vol.353, p.60-66 (2007)及びJ Gene Med, vol.6, p.833-845(2004)に記載された方法に従い、BIOWHITTAKER社より購入したヒトMSC（Mesenchymal stem cells）に、レトロウイルスを用いてBmi1遺伝子及びヒトTERT遺伝子を導入し、薬剤選抜（G418 100μg/ml、またはhygromycin B 50μg/ml）をすることにより、不死化した親MSC株を取得した。
C7059発現レンチウイルスベクターを、不死化MSCに導入することにより、C7059を安定して発現する不死化MSC株を樹立し、該細胞の該細胞の運動能、浸潤能及び足場非依存性増殖を評価した。
足場非依存性増殖については下記の方法で評価した。60mmディッシュを用いて、下層0.7%、上層0.35%の二重寒天培地を作成し、上層に1×104個の細胞を播種した。4週間培養後、形成されたコロニーを染色し、その数を計測した。
その結果、C7059発現ベクターの導入により、MSCの運動能、浸潤能及び足場非依存性増殖能が有意に亢進した（図１５）。この結果より、C7059の発現誘導は、不死化MSCを癌化させ得る可能性が示唆された。【０１４６】
C7059とSrcとの結合
C7059のN末端にFlagタグが３つ連結されたポリペプチド（3xFlag-c7059）をコードするDNAをpCAGGSのマルチクローニングサイトに挿入することにより3xFlag-c7059タンパク質を一過性に強発現できるベクターを作製した。pCAGGS-3xFlag-c7059をC7059陰性肉腫細胞（SaOS2）に導入し、C7059とSrcとの相互作用の有無を免疫沈降により解析した。
抗Flag抗体で免疫沈降し、抗Src抗体でブロットすると、pCAGGS-3xFlag-c7059を導入した細胞のみで特異的バンドが確認された（図１６（２））。抗Src抗体で免疫沈降し、抗C7059抗体又は抗Flag抗体でブロットしても、pCAGGS-3xFlag-c7059を導入した細胞のみで特異的バンドが確認された（図１６（３）及び（４））。
これらの結果から、C7059はSrcと結合能を有することが明らかとなった。免疫細胞染色でも、C7059はSrcと共在し、特に葉状仮足において強く凝集していることが判明した（図１７）。【０１４７】
ctC7059のN末端にFlagタグが３つ連結されたポリペプチド（3FH-ctC7059）をコードするDNAをpCAGGSのマルチクローニングサイトに挿入することにより3FH-ctC7059タンパク質を一過性に強発現できるベクターを作製した（図１８Ａ）。3FH-ctC7059発現ベクターを、C7059強陽性肉腫細胞株（U2OS）に導入し、該細胞の運動能を評価した。
その結果、ctC7059発現ベクターの導入により、肉腫細胞の運動能が有意に低下した（図１８Ｂ）。この結果より、ctC7059はC7059に対して拮抗作用を有し、肉腫の転移を阻害する活性を有する可能性が示唆された。【０１４８】
実施例２：大腸癌におけるザルコポディンの発現
（方法）
１９９９年から現在までに京都大学病院で手術を受けた結腸直腸癌症例３９例を対象として用いた。摘出された腫瘍組織をホルマリンにより固定し、実施例１にて作製した抗C7059抗体を用いた免疫組織染色に付した。腫瘍組織に隣接する非腫瘍部位を正常粘膜として用いた。【０１４９】
（結果）
正常粘膜においては、C7059タンパク質の発現はほとんど認められなかった（図１９〜２３）。まれに核に限局した発現が認められた。
ポリープでも、C7059タンパク質の発現そのものが認められないか、あるいは核に限局したC7059タンパク質発現が認められた。細胞質における発現は認められなかった。
これに対して、腫瘍細胞においては多くの症例でC7059タンパク質の発現が認められた（２６／３９）（図１９〜２３）。細胞質での発現が優位であるが、核での発現も認められた。細胞質における染色性を４段階（染色なし、弱陽性、陽性、強陽性）で評価した結果は以下の通りである。
染色なし：１３（３３．３％）
弱陽性  ：１２（３０．１％）
陽性    ：１２（３０．１％）
強陽性  ：  ２（  ０．５％）【０１５０】
これらの結果から、C7059は大腸粘膜細胞の腫瘍化に伴って発現が上昇する分子であり、C7059の発現の有無を評価することにより、腫瘍細胞であるか否かを判定可能であることが示された。また、C7059の細胞内における発現部位が細胞質であるか、あるいは核に限局しているかを評価することにより、大腸における腫瘍とポリープとを見分けることができることが示された。【０１５１】
異型度の低い腫瘍部位では核でのC7059発現が目立ったが、浸潤先端部（invasive front）のような異型度の高い腫瘍部位では細胞質でのC7059発現が優位となった（図２３）。このことから、大腸癌においても紡錘形細胞肉腫と同様に、細胞の悪性度に伴い、C7059タンパク質の局在が変わる可能性が示された。【０１５２】
また、陽性症例は、臨床情報を付き合わせると予後不良群（Stage IV）あるいは局所再発、転移を来たした症例であった。
このことから、C7059の発現レベルを評価することにより大腸癌の転移のリスクや生命予後を判定し得る可能性が示された。【０１５３】
実施例３：大腸癌におけるザルコポディンの発現（２）
２００６年から２００７年までに京都大学病院で手術を受けた結腸直腸癌症例１５例を対象として用いた。摘出された結腸直腸の正常組織及び腫瘍組織を凍結保存し、実施例１と同様に定量的RT-PCRにてC7059発現を測定した。その結果、１５名中１０名において、正常結腸直腸組織と比較して、結腸直腸腫瘍組織においてC7059発現が亢進していた（図２４）。【０１５４】
この結果から、C7059は大腸粘膜細胞の腫瘍化に伴って発現が上昇する分子であり、C7059の発現の有無を評価することにより、腫瘍細胞であるか否かを判定可能であることが示された。【０１５５】
実施例４：大腸癌におけるザルコポディンの発現（３）
（方法）
１９９９年から２００１年までに京都大学病院で手術を受けた結腸直腸癌症例１６４例を対象として用いた。摘出された腫瘍組織をホルマリンにより固定し、実施例１にて作製した抗C7059抗体を用いた免疫組織染色に付した。腫瘍組織に隣接する非腫瘍部位を正常粘膜として用いた。【０１５６】
（結果）
腫瘍細胞においては多くの症例でC7059タンパク質の発現が認められた（１２４／１６４）。細胞質における染色性を３段階（染色なし、弱陽性、強陽性）で評価した結果は以下の通りである。
染色なし：４０（２４．４％）
弱陽性  ：５３（３２．３％）
強陽性  ：７１（４３．３％）【０１５７】
これらの結果から、C7059は大腸粘膜細胞の腫瘍化に伴って発現が上昇する分子であり、C7059の発現の有無を評価することにより、腫瘍細胞であるか否かを判定可能であることが示された。【０１５８】
C7059を強発現しているStage IIIの患者（２１／５２）はC7059を発現していない同ステージの患者（９／５２）と比較して、局所再発又は転移を起こす確率が高い傾向が認められた（図２５）。【０１５９】
また、腫瘍部位の治癒切除術を受けた直腸癌患者（８０名）において、C7059を強発現している患者は、C7059を発現していない患者と比較して、局所再発又は転移を起こす確率が高い傾向が認められた（図２６）。【０１６０】
以上の結果から、C7059の発現レベルを評価することにより大腸癌の再発・転移のリスクや生命予後を判定し得る可能性が示された。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明の方法を用いれば、抗体を用いた免疫染色や特異的プローブを用いた定量的RT-PCRなどの簡便な手段を用いて、迅速に紡錘形細胞肉腫や大腸癌等の腫瘍の遠隔転移発生リスクや生命予後を判定することが可能となる。本発明の方法を用いれば、遠隔転移発生リスクの高低や、生命予後の善し悪しに基づき、患者に選択的治療を施すことが可能となり、腫瘍の治療の質が向上する。即ち、本発明の方法を用いて予後不良と判定された患者に対しては積極的に補助療法を行い、定期的な画像診断により転移巣の早期発見を目指すことで、予後の改善を目指すことができる。反対に本発明の方法を用いて予後良好と判定された患者に対しては、不必要な補助療法を回避することができる。特に、本発明の方法は、全てのタイプの紡錘形細胞肉腫に適用することができるので、病理診断が不確定の場合においても、的確に生命予後を判定することができる。
本発明の方法を用いれば、高い精度で大腸癌細胞の有無や悪性度を判定することができる。
本発明の転移阻害剤を用いれば、紡錘形細胞肉腫の転移を選択的に抑制することが可能となり、紡錘形細胞肉腫の生命予後を改善することができる。本発明の転移阻害剤は、紡錘形細胞肉腫の予後を決定する因子である遠隔転移発生を標的としている点で特徴的である。正常組織における発現レベルは腫瘍組織におけるものと比べてはるかに低いことから、siRNAによる発現抑制治療の副作用は軽微であると予想され、現行の治療法と組み合わせることにより効果的な紡錘形細胞肉腫の治療が可能となる。
本出願は日本で出願された特願２００７−１４５８２７（出願日：２００７年５月３１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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