(57)【要約】  本発明は、常温もしくはそれ以上の過酷な条件においても長期間の保存安定性に優れ、高い血液凝固性能を長期間にわたって安定して発揮することのできる血液凝固促進剤及びこの血液凝固促進剤が収容された血液検査用容器を提供することにある。  ペプチド鎖において、アルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素、放射線照射により上記酵素を失活させた酵素失活物、並びにβ-アラニンからなることを特徴とする血液凝固促進剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド鎖において、アルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素、放射線照射により上記酵素を失活させた酵素失活物、並びにβ-アラニンからなることを特徴とする血液凝固促進剤。
【請求項２】
上記酵素の活性値１単位に対して、放射線照射により上記酵素を失活させた酵素失活物０．０１〜１０μg、β-アラニン０．１〜２００μgとからなることを特徴とする請求項１に記載の血液凝固促進剤。
【請求項３】
上記酵素がトロンビンである請求項１又は２に記載の血液凝固促進剤。
【請求項４】
さらにシリコーンオイル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキシアルキレン及びこれらの誘導体からなる群の少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の血液凝固促進剤。
【請求項５】
さらにアミン塩、第４級窒素を有する有機化合物、硫酸プロタミンの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の血液凝固促進剤。
【請求項６】
さらに吸着性無機物が併用されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の血液凝固促進剤。
【請求項７】
上記請求項１〜６のいずれか１項に記載の血液凝固促進剤が収容された血液検査用容器。
【請求項８】
上記血液凝固促進剤が血液検査用容器の内壁に塗布されていることを特徴とする請求項７に記載の血液検査用容器。
【請求項９】
上記血液凝固促進剤が塗布された比重１．０８以上の担持体が収容されていることを特徴とする請求項７又は８に記載の血液検査用容器。
【請求項１０】
上記血液凝固促進剤を乾燥して収容したことを特徴とする請求項７〜９のいずれか１項に記載の血液検査用容器。
【請求項１１】
有底の管状容器に上記血液凝固促進剤が収容され、密封可能な栓体で密封して管内を減圧状態としたことを特徴とする請求項７〜１０のいずれか１項に記載の血液検査用容器。
【請求項１２】
さらに上記血液検査用容器に窒素及び／又は不活性ガスを充填したことを特徴とする請求項７〜１１のいずれか１項に記載の血液検査用容器。
【請求項１３】
上記血液検査用容器が合成樹脂製であることを特徴とする請求項７〜１２のいずれか１項に記載の血液検査用容器。
【請求項１４】
上記血液検査用容器がガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性材料からなる包装袋で密封されていることを特徴とする請求項７〜１３記載の血液検査用容器。
【請求項１５】
上記包装袋中に脱酸素剤及び／または乾燥剤が収容されていることを特徴とする請求項１４に記載の血液検査用容器。
【請求項１６】
上記包装袋中に窒素及び／または不活性ガスが充填されていることを特徴とする請求項１４又は１５に記載の血液検査用容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液凝固促進剤及び血液検査用容器に関し、さらに詳しくは、血清生化学検査などの臨床検査等において用いられる血液凝固促進剤及びこの血液凝固促進剤が収容された血液検査用容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清生化学検査などの臨床検査等において、血液からより短時間に血清を採取したい場合に血液凝固促進剤が使用され、血液凝固促進剤としては酵素が使用されている。血液凝固促進剤として使用される酵素は、ペプチド鎖においてアルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得るものであり、代表的な酵素としてトロンビンが挙げられる。トロンビンは、シリカ等に代表される無機系の血液凝固促進剤よりも血液凝固活性が高く、急速に血液を凝固し、極めて短時間で血清を得ることができる。【０００３】
しかしながら、トロンビンは不安定な酵素であり、安定に保存することは難しく、高い血液凝固性能を長期間にわたって安定して発揮させることは困難であった。トロンビンを安定に保存する方法としては、従来より凍結乾燥が用いられているが、長時間の安定性を得るためにアルミ包装やガラス容器等で保存し、常に適切な保存形態を維持する必要があり、特に透湿性のある容器で保存する場合は、安定に保存することは困難であった。【０００４】
また、トロンビンを水溶液中で安定に保存する方法として、例えば、安定化剤として糖及びアミノ酸を含むトロンビン水性液状組成物が開示されている(特許文献１参照)。しかしながら、この方法は低温で短期間の保存には有効であるが、特に常温もしくはそれ以上の過酷な条件で長期間の保存安定性が要求される血液凝固促進剤及び血液検査用容器に適用できるものではなかった。【０００５】
さらに、トロンビンの乾燥製剤の安定化技術として、例えば、糖類、塩基性アミノ酸及び有機酸塩からなる乾燥製剤が開示されている(特許文献２参照)。
しかしながら、この乾燥製剤は低温で短期間の保存には有効であるが、特に常温もしくはそれ以上の過酷な条件で長期間の保存安定性が要求される血液凝固促進剤及び血液検査用容器に適用できるものではなかった。また、湿度の影響を受けやすいため、特に透湿性のある容器で保存する場合は安定性に問題があった。【０００６】
【特許文献１】特開昭６４−４０４３３号公報
【特許文献２】特開平２−５３７３２号公報
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、常温もしくはそれ以上の過酷な条件においても長期間の保存安定性に優れ、高い血液凝固性能を長期間にわたって安定して発揮することのできる血液凝固促進剤及びこの血液凝固促進剤が収容された血液検査用容器を提供することにある。
【０００８】
本発明の血液凝固促進剤は、ペプチド鎖において、アルギニンと任意のアミノ酸残基との結合及び／又はリジンと任意のアミノ酸残基との結合を加水分解し得る酵素、放射線照射により上記酵素を失活させた酵素失活物、並びにβ-アラニンからなることを特徴とする。
【０００９】
上記血液凝固促進剤は急速に血液を凝固させる性能を有しているが故に、わずかな活性の違いで血液の凝固性能が大きく変化する性質を持ち合わせている。活性が高いと血液の凝固が速すぎて不均一な凝固となり、遠心分離後の血清中へのフィブリン析出を引き起こす可能性がある。活性が低いと血液の凝固が遅くなり所定の時間内に必要な血清が得られない可能性がある。上記血液凝固促進剤は常に一定の活性を有していることが品質上好ましく、製造直後から使用期限までできるだけ活性変動の少ない血液凝固促進剤とすることが望まれる。
本発明は、製造直後より活性変動が少なく極めて品質優良かつ安定な血液凝固促進剤を提供するものである。
【００１０】
上記加水分解性を有する酵素としては、例えば、トリプシン、トロンビン、蛇毒トロンビン様酵素などのセリンプロテアーゼ；カテプシンＢ、フィシンなどのチオールプロテアーゼ；キニナーゼIなどの金属プロテアーゼ等が挙げられ、これらの中でもセリンプロテアーゼが好ましく、その中でも特にトロンビンが好適に用いられる。トロンビンの調製方法は、特に限定されず、例えば動物(ヒト、ウシ等)の血漿から精製して得られたものを用いることができる。２種以上の酵素が併用されてもよい。
【００１１】
本発明の血液凝固促進剤における上記酵素の使用量は、少なくなると血液凝固に要する時間がかかりすぎ、多くなると血液凝固が速くなりすぎて、不均一な凝固となったり、検査値に悪影響を及ぼす可能性があるので、使用量の目安としては、活性値として０．１〜１００ＩＵ(国際単位：以下「単位」と記す)が好ましく、例えば、酵素としてトロンビンを使用する場合、その使用量は血液１ｍＬ当たり０．５〜５０単位が好ましく、より好ましくは１〜２０単位である。
【００１２】
本発明の血液凝固促進剤には、上記酵素の安定化剤として、放射線照射により上記酵素を失活させた酵素失活物とβ-アラニンが添加される。放射線照射における放射線とは、例えばガンマ線、電子線などが挙げられる。２種以上の酵素失活物が併用されてもよい。
【００１３】
本発明の血液凝固促進剤に添加される酵素失活物の量としては、トロンビン１単位あたり、好ましくは０．００１〜１００μg、より好ましくは０．０１〜１０μg、最も好ましくは０．０３〜５μgである。添加量が多いと製造コストにおいて不利となるため望む性能を達成できる必要最小量とすることが好ましい。酵素失活物としては、放射線照射により失活させた酵素失活物を添加してもよく、添加した活性のある酵素の一部を放射線照射により失活させて酵素失活物としてもよい。
【００１４】
本発明の血液凝固促進剤に添加されるβ-アラニンの量としては、トロンビン１単位あたり、好ましくは０．０１〜１０００μg、より好ましくは０．１〜２００μg、最も好ましくは０．５〜５０μgである。添加量が多いと血液凝固促進剤中へのβ-アラニンの溶解が困難となり成分不均一な血液凝固促進剤となったりスプレー塗布が不可能な血液凝固促進剤となったりする可能性があるため、均一溶解できる添加量とすることが好ましい。
【００１５】
本発明の血液凝固促進剤には、上記酵素以外に吸着性無機物が併用されてもよい。吸着性無機物としては、特に限定されないが、例えば、シリカ、カオリン、ベントナイト、珪藻土等が挙げられる。上記吸着性無機物は、酵素を含む上記血液凝固促進剤とは別に後述する血液検査用容器に収容されてもよく、上記血液凝固促進剤に直接添加されてもよい。２種以上の吸着性無機物が併用されてもよい。上記吸着性無機物の使用量としては、血液１ｍＬあたり０．００１〜１０ｍｇが好ましい。より好ましくは０．０１〜１ｍｇである。
【００１６】
本発明の血液凝固促進剤には、血液検査用容器の内壁面に血液が付着するのを防止するため、血餅剥離成分を併用することができる。血餅剥離成分としては、例えば、シリコーンオイル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリオキシアルキレン、これらの誘導体等が挙げられ、これらは単独で用いられても２種以上が併用されてもよい。
シリコーンオイルとしては水溶性タイプの変性シリコーンオイルを用いることもできる。
好適に用いられるポリオキシアルキレン及びその誘導体としては、例えば、ポリオキシプロピレンブチルエーテル、ポリオキシエチレンブチルエーテル、ポリオキシプロピレングリセリルエーテル、ポリオキシエチレングリセリルエーテルなどが挙げられる。
また、上記血餅剥離成分は上記血液凝固促進剤に直接添加されてもよい。上記血餅剥離成分の使用量としては、血液１ｍＬあたり０．１μg〜１０ｍｇが好ましい。より好ましくは１μg〜１ｍｇである。
【００１７】
さらに本発明の血液凝固促進剤には抗線溶剤及び／または抗プラスミン剤が添加されてもよい。抗線溶剤及び抗プラスミン剤としては、例えば、アプロチニン、大豆トリプシンインヒビター、p-アミノメチル安息香酸、アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。上記抗線溶剤及び抗プラスミン剤の使用量としては０．１μg〜１０ｍｇが好ましい。より好ましくは１μg〜１ｍｇである。
【００１８】
さらに本発明の血液凝固促進剤には、透析患者等のヘパリン添加血液でも短時間に血清を得ることができるようにヘパリン中和剤が併用されてもよい。また、ヘパリン中和剤は上記血液凝固促進剤に直接添加されてもよい。例えば、上記血液凝固促進剤の血液凝固促進成分がトロンビンである場合、血液中にヘパリンが存在するとトロンビンの血液凝固性能が阻害されて血液は凝固しない。ヘパリン中和剤が併用されることで血液中のヘパリンが中和され、トロンビンは本来の血液凝固性能を発揮することができる。ヘパリン中和剤としては、例えばアミン塩、第４級窒素を有する有機化合物、硫酸プロタミン等が挙げられ、これらの中の少なくとも１つを使用することができる。上記アミン塩を構成するアミンは第１級、第２級及び第３級のいずれでもよく、アミン塩を構成する酸も無機酸及び有機酸のいずれでもよい。無機酸としては、例えば、塩酸等のハロゲン化水素、硫酸、亜硫酸などが挙げられ、有機酸としては、例えば、ギ酸、酢酸などが挙げられる。アミン塩の有機残基は通常アルキル基であるが、イミノ基やエーテル基等の異種元素を含む炭化水素基であってもよい。アミン塩は分子内塩でもよい。アミン塩の具体例としては、例えば、ヘキサデシルジメチルアミン塩酸塩やテトラデシルジ(アミノエチル)グリシン等が挙げられる。
【００１９】
上記第４級窒素を有する有機化合物としては、例えば、テトラアルキルアンモニウムが挙げられるが、アルキル基のかわりにアリール基を有する化合物やイミノ基、エーテル基等の異種元素を含む炭化水素基を有する化合物でもよい。第４級窒素を有する有機化合物の具体例としては、例えば、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライドが挙げられる。この他、第４級窒素を有する有機重合体も用いることができる。上記有機重合体としては、例えば、ポリアミンスルホンのようなポリカチオンが好適に使用される。ヘパリンの不活性化には高分子量のポリカチオンを用いることが効果的であり、ヘパリンと結合してヘパリンを不溶化し沈殿させる。ポリアミンスルホンとしては、例えば（Ｉ）式で表される繰り返し単位を有する重合体などが挙げられる。
【００２０】
【化１】
2006098350.tif 000002
【００２１】
ポリアミンスルホンは合成化合物であるため、天然物の硫酸プロタミンと比べて取り扱いやすい。精製しやすく、血液凝固促進剤を調製する際にも配合が容易である。かつヘパリン中和能力に極めて優れている。
上記ヘパリン中和剤の添加量は、凝固させようとする血液に含まれるヘパリン量により適宜決定される。例えば、一般の透析患者のヘパリン添加血液を凝固させる場合、上記ヘパリン中和剤の添加量は、血液１ｍＬあたり０．００１〜１０ｍｇが好ましく、より好ましくは０．００５〜１ｍｇ、最も好ましくは０．０１〜０．５ｍｇである。
【００２２】
本発明の血液凝固促進剤は、水などの溶媒で溶解、分散された液とすることができ、中でも水溶液が好適に用いられる。
【００２３】
上記血液凝固促進剤の血液検査用容器への収容方法は特に限定されないが、例えば、上記血液凝固促進剤の水溶液を容器内に滴下する方法、容器内壁にスプレーなどにより塗布する方法等が挙げられる。効率的に血液を凝固させるためには容器内壁に血液凝固促進剤を塗布する方法が好ましい。
【００２４】
また、血液凝固促進剤である酵素の安定性を考えた場合、血液検査用容器に収容された血液凝固促進剤は乾燥されて収容されることが好ましい。乾燥方法は特に限定されず、例えば、真空乾燥、加熱乾燥、除湿空気や加温空気などによる送風乾燥、シリカゲルなどの乾燥剤による乾燥等が挙げられる。このように血液凝固促進剤を乾燥して収容することで血液凝固促進剤の保存安定性が向上する。
【００２５】
さらに、上記血液凝固促進剤は、例えば、乾燥粉末や乾燥顆粒等のように予め乾燥した状態で収容されてもよい。この他にも、例えば、不織布、織布、樹脂製やガラス製のシートやビーズ等の担持体に上記血液凝固促進剤が担持された状態で収容されてもよい。この場合、担持体の比重は１．０８以上であることが好ましい。
【００２６】
上記血液検査用容器の材質は合成樹脂製であってもガラス製であってもよく、材質は特に限定されない。合成樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン等が挙げられ、特にポリエチレンテレフタレートが好適に用いられる。合成樹脂製の血液検査用容器は落下させたり衝撃を与えても破損しにくいため、血液検査容器の破損による血液感染を防止するためにも合成樹脂製の血液検査用容器が安全上好ましい。
容器材質はガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性に優れる材質であることが好ましい。
上記容器の形状も特に限定されず、例えば、有底の管状容器が好適に用いられる。
【００２７】
上記血液検査用容器は、栓体と組み合わせて使用されることが多い。上記栓体としては、例えば、合成樹脂、エラストマー、ゴム等の材質からなるものが挙げられ、ゴムとしては、例えば、ブチルゴム、ハロゲン化ブチルゴム等が好適に用いられる。上記の２つ以上の材料からなる栓体を使用してもよい。例えば、ゴムやエラストマーからなる栓体を合成樹脂製のカバーで覆ったオーバーキャップタイプの栓体などが挙げられる。
ガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性に優れる材料からなる栓体を用いることが好ましい。
【００２８】
上記血液検査用容器は、容器内を減圧状態とした真空採血管とすることができる。上記血液凝固促進剤等を収容した容器を減圧状態となるように栓体等で密封して、真空採血管とする。容器としては、例えば、有底の管状容器が好適に使用され、栓体としては、血液検査用容器内の減圧状態が維持でき、採血時に刺通可能な材質、形状のものが使用される。真空採血管内の減圧度は採血したい血液量にあわせて設定される。
【００２９】
採血管内を減圧状態として栓体で密封する方法については特に限定されない。例えば、上記血液検査用容器に真空チャンバー等の減圧環境下で上記栓体を嵌合させて密封する方法がよく用いられるが、他にも、例えば、金属箔のラミネートフィルム等で容器開口部をシールして密封してもよい。
【００３０】
上記血液検査用容器は、容器内に窒素もしくは不活性ガスを充填することができる。中でも、窒素が好適に使用される。不活性ガスとしては、例えば、ヘリウム、ネオン、アルゴンなどの第１８属元素が挙げられる。上記窒素もしくは不活性ガスの中から２種以上を併用してもよい。上記血液検査用容器に上記窒素及び／又は不活性ガスを充填し、上記血液検査用容器内を通常の空気から窒素及び／又は不活性ガスに置換することで上記酵素の安定性が向上する。また、窒素及び／又は不活性ガスを充填した血液検査用容器を真空採血管とする方法としては、例えば、真空チャンバー等の内部及び血液検査用容器の内部を窒素及び／または不活性ガスで置換した後、所定の減圧度に減圧して栓体で密封する方法が挙げられる。
【００３１】
上記血液検査用容器は、ガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性材料からなる包装袋に収容して密封することができる。
さらに上記包装袋中には、脱酸素剤及び／又は乾燥剤を収容することができる。これにより、上記血液検査用容器内への酸素や水分の侵入を抑制することができ、上記血液検査用容器に収容されている酵素の安定性を向上させることができる。乾燥剤としては、例えば、シリカゲル、ゼオライト、塩化カルシウム、酸化カルシウム、水酸化カルシウムなどが挙げられる。特にシリカゲルやゼオライトが好適に使用される。
【００３２】
また、上記包装袋中には窒素及び／又は不活性ガスを充填することができる。
これにより、上記血液検査用容器内への酸素の侵入を防ぐことができる。加えて、上記血液検査用容器に充填された窒素及び／又は不活性ガスの置換漏洩を防ぐことができるため、放射線の照射や長期間の保存においても上記血液検査用容器に収容されている酵素の安定性は極めて高い。
なお、この構成を、上記脱酸素剤及び／又は乾燥剤を収容する構成と併用してもよい。
【００３３】
上記包装袋の形状は、上記血液検査用容器が収容でき、密封できる形状であれば特に限定されない。例えば、３方シール袋や４方シール袋、パウチ袋、またはガセット袋などが挙げられる。上記包装袋中へのガスもしくは水蒸気の透過量をできるだけ少なくするため、包装袋の内容積は必要最低限の大きさとし、包装袋の表面積を小さくすることが好ましい。
【００３４】
上記包装袋の材質は、ガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性を有するものであれば特に限定されない。包装袋の材質としては、例えば、アルミニウムなどの金属箔や合成樹脂などが挙げられる。合成樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、セロファン、エチレン−ビニルアルコール共重合体などが挙げられる。ガスバリア性及び／又は水蒸気バリア性を高めるため、もしくはヒートシール性を持たせるため、これらの２つ以上の材質をラミネート等により積層して構成された包装袋が好ましく用いられる。このような包装袋としては、例えば、アルミニウム箔とポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンとのラミネートフィルム等からなる包装袋が挙げられる。
【００３５】
上記材質に、例えば、シリカ、アルミナ、セラミック、アルミニウムなどが蒸着されたものも包装袋として用いることができる。具体例としては、ポリエチレンテレフタレートやポリエチレンにシリカ、アルミナ、セラミック、アルミニウムなどが蒸着されたフィルムとポリエチレン、ポリプロピレンなどのヒートシール性を有するフィルムをラミネートした積層フィルムからなる包装袋が挙げられ、好適に用いることができる。シリカ、アルミナ及びセラミックの蒸着フィルムは、ガスバリア性や水蒸気バリア性に優れるとともに透明性にも優れ、包装袋の外から内容物が視覚的に確認できるとともに、焼却廃棄が可能である等の利点が挙げられる。アルミニウム蒸着フィルムは、透明性は得られないものの、アルミニウム箔のラミネートフィルムに匹敵する程の優れたガスバリア性及び水蒸気バリア性が得られる。
【００３６】
上記血液凝固促進剤は、血液検査用容器が透湿性のある材料からなる場合においても保存安定性に優れ、高い血液凝固促進性能を長期間にわたって安定して発揮することができる。
【００３７】
また、検査用血清を効率的に採取するために真空採血管中に血清分離剤等が収容されてもよい。血清分離剤としては、例えば、血清と血餅の中間となる比重のチクソトロピー性をもつゲル状物質が好適に用いられる。血液凝固後、遠心分離を行うことで比重差を利用して血清と血餅の間に血清分離剤の隔壁を形成し、血清を容易に分離することを可能とする。
【００３８】
（発明の効果）
本発明の血液凝固促進剤及び血液検査用容器は上述の通りの構成であり、血液凝固促進成分である酵素の品質安定性に優れている。特に透湿性のある材料を用いた血液検査用容器の場合では、高温多湿のような過酷な条件においても保存安定性が優れ、高い血液凝固促進性能を長期間にわたって安定して発揮することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。【００４０】
（実施例１）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)１０ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物１０ｍｇと、β-アラニン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤をポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)製の有底の管状容器(内径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ)の内部に２０μＬスプレーし、真空乾燥機で１２時間乾燥した後、採血量が５ｍLとなるようにブチルゴム製の栓体で減圧密封して真空採血管を得た。【００４１】
（実施例２）〜（実施例９）
トロンビン、トロンビン失活物及びβ-アラニンの量を下記の表１のように変更した以外は実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００４２】
【表１】
2006098350.tif 000003
【００４３】
（実施例１０）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３３万単位と、β-アラニン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤をポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)製の有底の管状容器(内径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ)の内部に２０μＬスプレーし、真空乾燥機で１２時間乾燥し、採血量が５ｍLとなるようにブチルゴム製の栓体で減圧密封して真空採血管とした。その後、この真空採血管にガンマ線を照射して、真空採血管１本の血液凝固促進剤に含まれるトロンビン６６単位のうち６単位分を失活させてトロンビン失活物(４μg相当)を得た。このようにして、真空採血管１本あたり、トロンビン６０単位、トロンビン失活物４μg、β−アラニン０．４ｍｇ及び水溶性シリコーンオイル０．２ｍｇからなる血液凝固促進剤を収容した真空採血管を得た。【００４４】
（実施例１１）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３６万単位と、β-アラニン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤をポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)製の有底の管状容器(内径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ)の内部に２０μＬスプレーし、真空乾燥機で１２時間乾燥し、採血量が５ｍLとなるようにブチルゴム製の栓体で減圧密封して真空採血管とした。その後、この真空採血管に電子線を照射して、真空採血管１本の血液凝固促進剤に含まれるトロンビン７２単位のうち１２単位分を失活させてトロンビン失活物(８μg相当)を得た。このようにして、真空採血管１本あたりトロンビン６０単位、トロンビン失活物８μg、β−アラニン０．４ｍｇ及び水溶性シリコーンオイル０．２ｍｇからなる血液凝固促進剤を収容した真空採血管を得た。【００４５】
（実施例１２）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)２０ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物２０ｍｇと、β-アラニン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤をポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)製の有底の管状容器(内径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ)の内部に２０μＬスプレーし、真空乾燥機で１２時間乾燥した。この後、真空チャンバー内及び有底の管状容器内を窒素置換したのち、採血量が５ｍLとなるようにブチルゴム製の栓体で減圧密封して真空採血管を得た。【００４６】
（実施例１３）
窒素で置換する代わりにヘリウムで置換したこと以外は実施例１２と同様にして真空採血管を得た。【００４７】
（実施例１４）
実施例４において、水溶性シリコーンオイルの代わりにポリビニルピロリドンを用いたこと以外は実施例４と同様にして真空採血管を得た。【００４８】
（実施例１５）
実施例４において、水溶性シリコーンオイルの代わりにポリビニルアルコールを用いたこと以外は実施例４と同様にして真空採血管を得た。【００４９】
（実施例１６）
実施例４において、水溶性シリコーンオイルの代わりにポリオキシプロピレングリセリルエーテルを用いたこと以外は実施例４と同様にして真空採血管を得た。【００５０】
（実施例１７）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)２０ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物２０ｍｇと、β-アラニン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇ及びシリカ３ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤をポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)製の有底の管状容器(内径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ)の内部に２０μＬスプレーし、真空乾燥機で１２時間乾燥した後、採血量が５ｍLとなるようにブチルゴム製の栓体で減圧密封して真空採血管を得た。【００５１】
（実施例１８）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)２０ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物２０ｍｇと、β-アラニン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤２０ｍｇをポリエチレンテレフタレート製ビーズ（比重１．４）の表面にコーティングし乾燥した後、ポリエチレンテレフタレート(ＰＥＴ)製の有底の管状容器(内径１０ｍｍ×長さ１００ｍｍ)に収容し、採血量が５ｍLとなるようにブチルゴム製の栓体で減圧密封して真空採血管を得た。【００５２】
（実施例１９）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)１００ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物１００ｍｇと、β-アラニン２ｇと、第４級窒素を有する有機化合物として下記式（Ｉ）で表されるポリアミンスルホン０．５ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００５３】
【化１】
2006098350.tif 000004
【００５４】
（実施例２０）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)２０ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物２０ｍｇと、β-アラニン２ｇと、ヘキサデシルジメチルアミン塩酸塩１ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００５５】
（実施例２１）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)６００ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物６００ｍｇと、β-アラニン２ｇと、硫酸プロタミン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００５６】
（実施例２２）
実施例４で得た真空採血管１００本とシリカゲル２０ｇとをＰＥＴ／アルミナ蒸着ＰＥＴ／ポリエチレンのように積層したラミネートフィルムからなるガセット袋（袋底面１２０×３００ｍｍ）に収容し、袋内の空気を真空吸引してできるだけ空気を除いてから底面より２５０ｍｍの高さ位置でヒートシールしてガセット袋を密封した。【００５７】
（実施例２３）
実施例１２で得た真空採血管１００本とシリカゲル２０ｇとをＰＥＴ／アルミナ蒸着ＰＥＴ／ポリエチレンのように積層したラミネートフィルムからなるガセット袋（袋底面の寸法は１２０×３００ｍｍ）に収容し、袋内の空気を真空吸引してできるだけ空気を除いてから底面より２５０ｍｍの高さ位置でヒートシールしてガセット袋を密封した。【００５８】
（実施例２４）
実施例１２で得た真空採血管１００本と脱酸素剤とをＰＥＴ／アルミナ蒸着ＰＥＴ／ポリエチレンのように積層したラミネートフィルムからなるガセット袋（袋底面の寸法は１２０×３００ｍｍ）に収容し、袋内の空気を真空吸引してできるだけ空気を除いてから底面より２５０ｍｍの高さ位置でヒートシールしてガセット袋を密封した。【００５９】
（実施例２５）
実施例１２で得た真空採血管１００本をＰＥＴ／シリカ蒸着ＰＥＴ／ポリエチレンのように積層したラミネートフィルムからなるガセット袋（袋底面の寸法は１２０×３００ｍｍ）に収容し、袋内の空気を窒素に置換した後、底面より２５０ｍｍの高さ位置でヒートシールしてガセット袋を密封した。【００６０】
（実施例２６）
実施例１３で得た真空採血管１００本をＰＥＴ／Ａ１／ナイロン／ポリプロピレンのように積層したラミネートフィルムからなるガセット袋（袋底面の寸法は１２０×３００ｍｍ）に収容し、袋内の空気をヘリウムに置換した後、底面より２５０ｍｍの高さ位置でヒートシールしてガセット袋を密封した。【００６１】
（比較例１）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位を１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００６２】
（比較例２）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、β-アラニン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００６３】
（比較例３）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、β-アラニン１０ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００６４】
（比較例４）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)２０ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物２０ｍｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００６５】
（比較例５）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)２００ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物２００ｍｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００６６】
（比較例６）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)２０ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物２０ｍｇと、β−アラニンの代わりにα−アラニン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００６７】
（比較例７）
トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)３０万単位と、トロンビン(持田製薬製：比活性１５００単位／ｍｇ)２０ｍｇをガンマ線照射して失活させたトロンビン失活物２０ｍｇと、グリシン２ｇとを１００ｇの精製水に溶かして血液凝固促進剤の水溶液を調製し、さらに水溶性シリコーンオイル１ｇを上記血液凝固促進剤の水溶液に添加した。このようにして得られた血液凝固促進剤から、実施例１と同様にして真空採血管を得た。【００６８】
上記実施例及び比較例で得られた真空採血管を３５℃、７５％ＲＨの恒温恒湿槽で保存し、製造直後、保存２週間後及び保存１ヶ月後のトロンビン活性(製造直後に対する残存率)を測定して安定性の評価を行った。本評価は真空採血管の製造後すぐに実施した。
また、上記の製造直後、保存２週間後及び保存１ヶ月後の真空採血管について、健常人より血液５ｍＬを真空採血し、速やかにかつ緩やかに５回転倒混和を行い、５分間放置した後遠心分離を行った。このときの血清中におけるフィブリン発生の有無、血清収率について観察した。結果を表２に示した。【００６９】
【表２】
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【００７０】
また、血液１ｍLあたりヘパリン１単位を添加したヘパリン添加血液５ｍLを上記実施例１９、２０、２１の真空採血管(製造直後、２週間後、１ヶ月後)に加え、速やかにかつ緩やかに５回転倒混和を行った結果、製造直後、２週間後、１ヶ月後のいずれの真空採血管も５分以内に血液は凝固し、これを遠心分離することでフィブリンの析出なく２ｍL以上の血清を得ることができた。その他の実施例、比較例の真空採血管においては血液を加えて転倒混和してから１時間放置しても血液は凝固しなかった。
【国際調査報告】
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