(57)【要約】ＲＡＮＫＬを投与することにより骨量減少症モデル動物を作出する方法及び骨量減少症モデル動物の提供。  可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物体内における破骨細胞の分化及び活性化を促進することを含む、骨量減少症モデル動物の作出方法並びに該方法により作出された骨量減少症モデル動物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物体内における破骨細胞の分化及び活性化を促進することを含む、骨量減少症モデル動物の作出方法。
【請求項２】
エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである請求項１記載の骨量減少症モデル動物の作出方法。
【請求項３】
可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を非ヒト動物に投与後、１週間以内に骨量減少症モデル動物を作出し得る請求項１又は２に記載の骨量減少症モデル動物の作出方法。
【請求項４】
５０時間以内に骨量減少症モデル動物を作出し得る請求項３記載の骨量減少症モデル動物の作出方法。
【請求項５】
２４時間以内に骨量減少症モデル動物を作出し得る請求項３記載の骨量減少症モデル動物の作出方法。
【請求項６】
非ヒト動物がげっ歯類に属する動物である請求項１〜５のいずれか１項に記載の骨量減少症モデル動物。
【請求項７】
非ヒト動物がマウス又はラットである請求項６記載の骨量減少症モデル動物の作出方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の骨量減少症モデル動物の作出方法であって、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量を変えることにより、重症度の異なる骨量減少症モデル動物を作出する、骨量減少症モデル動物の作出方法。
【請求項９】
さらに、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与する動物から卵巣を摘出する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の骨量減少症モデル動物の作出方法。
【請求項１０】
可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を非ヒト動物に投与後、７２時間以内に骨量減少症モデル動物を作出し得る請求項９記載の骨量減少症モデル動物の作出方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法により作出された骨量減少症モデル動物。
【請求項１２】
体内の骨吸収マーカーレベルが正常個体に比べ上昇した請求項１１記載の骨量減少症モデル動物。
【請求項１３】
骨密度及び／又は単位骨量が正常個体に比べ低下した請求項１１記載の骨量減少症モデル動物。
【請求項１４】
さらに、破骨細胞数及び／又は骨梁数が正常個体に比べ低下した請求項１３記載の骨量減少症モデル動物。
【請求項１５】
血中エストロゲン濃度、血中ＰＴＨ濃度及び血中ＯＰＧ濃度の少なくとも１つが正常個体に比べ変動していない請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の骨量減少症モデル動物。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の骨量減少症モデル動物に、骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質を投与し、骨量減少症モデル動物における減少した骨量が増加するか否かを指標にして、前記骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質の効果を評価する方法であって、骨量が増加した場合に骨吸収抑制に効果があると判定する、骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質を評価する方法。
【請求項１７】
骨量の増加を、骨量減少症モデル動物における体内の骨吸収マーカーレベルの上昇、骨密度の上昇、単位骨量の上昇、骨梁数の上昇、破骨細胞数の低下、骨芽細胞面の上昇、及びＣＴにより認められる骨量の増加からなる群から選択される少なくとも１つを指標に判断する請求項１６記載の骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質を評価する方法。
【請求項１８】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の骨量減少症モデル動物に、骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質を投与し、骨量減少症モデル動物における減少した骨量が増加するか否かを指標にして、前記骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質の効果を評価する方法であって、骨量が増加した場合に骨形成促進に効果があると判定する、骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質を評価する方法。
【請求項１９】
骨量の増加を、骨量減少症モデル動物における体内の骨形成マーカーレベルの上昇、骨密度の上昇、単位骨量の上昇、骨梁数の上昇、破骨細胞数の低下、骨芽細胞面の上昇、及びＣＴにより認められる骨量の増加からなる群から選択される少なくとも１つを指標に判断する請求項１８記載の骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質を評価する方法。
【請求項２０】
請求項８記載の方法により可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与しさらに卵巣を摘出して作出された骨量減少症モデル動物にホルモン又はホルモン受容体モジュレーターを投与し、骨量減少症モデル動物における減少した骨量が増加するか否かを指標にして、前記ホルモン又はホルモン受容体モジュレーターの効果を評価する方法であって、骨量が増加した場合に骨吸収抑制に効果があると判定する、ホルモン又はホルモン受容体モジュレーターを評価する方法。
【請求項２１】
ホルモン又はホルモン受容体モジュレーターが選択的エストロゲン受容体モジュレーターである、請求項２０記載のホルモン又はホルモン受容体モジュレーターを評価する方法。
【請求項２２】
骨量の増加を、骨量減少症モデル動物における体内の骨形成マーカーレベルの上昇、骨密度の上昇、単位骨量の上昇、骨梁数の上昇、破骨細胞数の低下、骨芽細胞面の上昇、及びＣＴにより認められる骨量の増加からなる群から選択される少なくとも１つを指標に判断する請求項２０又は２１に記載のホルモン又はホルモン受容体モジュレーターを評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨量が正常動物に比べて減少した骨量減少症モデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨破壊を司る破骨細胞は単球・マクロファージ系の造血細胞に由来する大型の多核細胞である。その前駆細胞は骨表面において骨芽細胞／間質細胞による調節を受け破骨細胞へと分化・成熟する。破骨細胞分化因子（ＲＡＮＫＬ；ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）は、骨吸収因子によって骨芽細胞／間質細胞上に誘導される腫瘍壊死因子（ＴＮＦ；ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ）ファミリーに属する膜結合タンパク質で、破骨細胞の分化・成熟に必須の因子である（非特許文献１及び２を参照）。ＲＡＮＫＬの一部は細胞外領域でメタロプロテアーゼにより切断されて、可溶型になることが知られている。実際に可溶型ＲＡＮＫＬはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＭ−ＣＳＦとの共存下で骨髄細胞、脾細胞、末梢血中の前駆細胞、あるいはマクロファージ細胞株などのマクロファージ系の前駆細胞から破骨細胞を誘導することが知られている。
一方、これまで骨量減少症のモデルとしては卵巣摘出（非特許文献３〜６を参照）、低カルシウム食（非特許文献７及び８を参照）、神経切除（非特許文献９を参照）、後肢懸垂による不動化（非特許文献１０を参照）などの方法が行われてきたが、どれも骨量減少症を発症するまでに、１〜４週間程度の期間を要した。このために、骨吸収抑制剤（ビスフォスホネート、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  阻害剤など）や骨形成促進剤｛副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）など｝などの薬剤の評価に時間がかかっていた。また、上記の動物モデルは、エストロゲンの消失、ＰＴＨの増加などによって間接的に破骨細胞を活性化させるので、薬物の評価をする際に生体内において、どの過程に効いているのかを証明することが容易ではなかった。
【非特許文献１】Ｙａｓｕｄａら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：３５９７，１９９８
【非特許文献２】Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ  ９３：１６５，１９９８
【非特許文献３】Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｂｏｎｅ  １７（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ１２５，１９９５
【非特許文献４】Ｗｒｏｎｓｋｉら、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ４２：１７９，１９８８
【非特許文献５】Ｗｒｏｎｓｋｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １２３：６８１，１９８８
【非特許文献６】Ｗｒｏｎｓｋｉら、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ４５：３６０，１９８９
【非特許文献７】ｄｅ  Ｗｉｎｔｅｒら、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  １７：３０３，１９７５
【非特許文献８】Ｇｅｕｓｅｎｓら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ６：７９１，１９９１
【非特許文献９】Ｗａｋｌｅｙら、Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ  ４３，３８３，１９８８
【非特許文献１０】Ｇｌｏｂｕｓら、Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  １：１９１，１９８６
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、ＲＡＮＫＬを投与することにより骨量減少症モデル動物を作出する方法及び骨量減少症モデル動物の提供を目的とする。
本発明者らは、従来の骨量減少症モデル動物の問題点を解消し得る骨量減少症モデル動物の作出方法について鋭意検討を行った。その結果、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を非ヒト動物に投与することにより、直接破骨細胞を活性化し、骨量減少を迅速に（数日間内で）引き起こすことができ、骨量減少症モデル動物を作出することができることを見出した。この骨量減少症モデル動物は迅速な薬物評価に有効である。本発明の骨量減少症モデル動物における骨量減少のメカニズムはＲＡＮＫＬによる破骨細胞の分化・活性化促進という極めて単純なものであり、純粋に破骨細胞の阻害剤（ビスフォスホネート、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  阻害剤など）を開発する場合には、評価系として極めて有効である。また、一度骨量減少が起こってから元に戻るまでの早さを比べることにより、骨量を増加させる薬剤（ＰＴＨなど）の評価にも用いることができる。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］  可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を非ヒト動物に投与し、該非ヒト動物体内における破骨細胞の分化及び活性化を促進することを含む、骨量減少症モデル動物の作出方法。
［２］  エピトープタグがグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである［１］の骨量減少症モデル動物の作出方法。
［３］  可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を非ヒト動物に投与後、１週間以内に骨量減少症モデル動物を作出し得る［１］又は［２］の骨量減少症モデル動物の作出方法。
［４］  ５０時間以内に骨量減少症モデル動物を作出し得る［３］の骨量減少症モデル動物の作出方法。
［５］  ２４時間以内に骨量減少症モデル動物を作出し得る［４］の骨量減少症モデル動物の作出方法。
［６］  非ヒト動物がげっ歯類に属する動物である［１］〜［５］のいずれかの骨量減少症モデル動物。
［７］  非ヒト動物がマウスである［６］の骨量減少症モデル動物の作出方法。
［８］  ［１］〜［７］のいずれかの骨量減少症モデル動物の作出方法であって、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量を変えることにより、重症度の異なる骨量減少症モデル動物を作出する、骨量減少症モデル動物の作出方法。
［９］  さらに、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与する動物から卵巣を摘出する、［１］〜［８］のいずれかの骨量減少症モデル動物の作出方法。
［１０］  可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を非ヒト動物に投与後、７２時間以内に骨量減少症モデル動物を作出し得る［９］の骨量減少症モデル動物の作出方法。
［１１］  ［１］〜［１０］のいずれかの方法により作出された骨量減少症モデル動物。
［１２］  体内の骨吸収マーカーレベルが正常個体に比べ上昇した［１１］の骨量減少症モデル動物。
［１３］  骨密度及び／又は単位骨量が正常個体に比べ低下した［１１］の骨量減少症モデル動物。
［１４］  さらに、破骨細胞数及び／又は骨梁数が正常個体に比べ低下した［１３］の骨量減少症モデル動物。
［１５］  血中エストロゲン濃度、血中ＰＴＨ濃度及び血中ＯＰＧ濃度の少なくとも１つが正常個体に比べ変動していない［１１］〜［１４］のいずれかの骨量減少症モデル動物。
［１６］  ［１１］〜［１５］のいずれかの骨量減少症モデル動物に、骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質を投与し、骨量減少症モデル動物における減少した骨量が増加するか否かを指標にして、前記骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質の効果を評価する方法であって、骨量が増加した場合に骨吸収抑制に効果があると判定する、骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質を評価する方法。
［１７］  骨量の増加を、骨量減少症モデル動物における体内の骨吸収マーカーレベルの上昇、骨密度の上昇、単位骨量の上昇、骨梁数の上昇、破骨細胞数の低下、骨芽細胞面の低下、及びＣＴにより認められる骨量の増加からなる群から選択される少なくとも１つを指標に判断する［１６］の骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質を評価する方法。
［１８］  ［１１］〜［１５］のいずれかの骨量減少症モデル動物に、骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質を投与し、骨量減少症モデル動物における減少した骨量が増加するか否かを指標にして、前記骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質の効果を評価する方法であって、骨量が増加した場合に骨形成促進に効果があると判定する、骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質を評価する方法。
［１９］  骨量の増加を、骨量減少症モデル動物における体内の骨形成マーカーレベルの上昇、骨密度の上昇、単位骨量の上昇、骨梁数の上昇、破骨細胞数の低下、骨芽細胞面の上昇、及びＣＴにより認められる骨量の増加からなる群から選択される少なくとも１つを指標に判断する［１８］の骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質を評価する方法。
［２０］  請求項８記載の方法により可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与しさらに卵巣を摘出して作出された骨量減少症モデル動物にホルモン又はホルモン受容体モジュレーターを投与し、骨量減少症モデル動物における減少した骨量が増加するか否かを指標にして、前記ホルモン又はホルモン受容体モジュレーターの効果を評価する方法であって、骨量が増加した場合に骨吸収抑制に効果があると判定する、ホルモン又はホルモン受容体モジュレーターを評価する方法。
［２１］  ホルモン又はホルモン受容体モジュレーターが選択的エストロゲン受容体モジュレーターである、［２０］のホルモン又はホルモン受容体モジュレーターを評価する方法。
［２２］  骨量の増加を、骨量減少症モデル動物における体内の骨形成マーカーレベルの上昇、骨密度の上昇、単位骨量の上昇、骨梁数の上昇、破骨細胞数の低下、骨芽細胞面の上昇、及びＣＴにより認められる骨量の増加からなる群から選択される少なくとも１つを指標に判断する［２０］又は［２１］のホルモン又はホルモン受容体モジュレーターを評価する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−２７８０２９号、２００７−０９５０１７号及び国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２００７／０６３８７１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中Ｃａ濃度を示す図である。
図２は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中ＣＴｘ濃度を示す図である。
図３は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中ＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図４は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中オステオカルシン濃度を示す図である。
図５は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中ＡＬＰ濃度を示す図である。
図６は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける大腿骨の骨密度を示す図である。
図７は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける脛骨の単位骨量を示す図である。
図８は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける脛骨の破骨細胞数を示す図である。
図９は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける脛骨の骨梁数を示す図である。
図１０は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスの大腿骨の、マイクロＣＴにより測定した骨形態を示す写真である。
図１１は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける脛骨の骨芽細胞面を示す図である。
図１２は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを２１３ｎｍｏｌ〜８５２ｎｍｏｌ投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中Ｃａ濃度を示す図である。
図１３は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを２１３ｎｍｏｌ〜８５２ｎｍｏｌ投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中ＣＴｘ濃度を示す図である。
図１４は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを２１３ｎｍｏｌ〜８５２ｎｍｏｌ投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中ＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図１５は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを２１３ｎｍｏｌ〜８５２ｎｍｏｌ投与したマウス及び投与しないマウスにおける大腿骨の骨密度を示す図である。
図１６は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを２１３ｎｍｏｌ〜８５２ｎｍｏｌ投与したマウス及び投与しないマウスの大腿骨の、マイクロＣＴにより測定した骨形態を示す写真である。
図１７は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与して作出した骨量減少症モデルマウスにリセドロネートを投与した場合の血中ＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図１８は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与して作出した骨量減少症モデルマウスにリセドロネートを投与した場合の血中ＣＴｘ濃度を示す図である。
図１９は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与して作出した骨量減少症モデルマウスにリセドロネートを投与した場合の血中ＡＬＰ濃度を示す図である。
図２０は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与して作出した骨量減少症モデルマウスにリセドロネートを投与した場合の血中オステオカルシン濃度を示す図である。
図２１は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与して作出した骨量減少症モデルマウスにリセドロネートを投与した場合の大腿骨の骨密度を示す図である。
図２２は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与して作出した骨量減少症モデルマウスにリセドロネートを投与したマウスの大腿骨の、マイクロＣＴにより測定した骨形態を示す写真である。
図２３は、可溶型ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中Ｃａ濃度を示す図である。
図２４は、可溶型ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中ＣＴｘ濃度を示す図である。
図２５は、可溶型ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中ＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図２６は、可溶型ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中オステオカルシン濃度を示す図である。
図２７は、可溶型ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける血中ＡＬＰ濃度を示す図である。
図２８は、可溶型ＲＡＮＫＬを投与したマウス及び投与しないマウスにおける大腿骨の骨密度を示す図である。
図２９は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスにおける単位骨量を表す図である。
図３０は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスにおける骨梁幅を表す図である。
図３１は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスにおける骨梁数を表す図である。
図３２は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスにおける類骨厚を表す図である。
図３３は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスにおける吸収面を表す図である。
図３４は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスにおける破骨細胞数を表す図である。
図３５は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスにおける破骨細胞面を表す図である。
図３６は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウス及びＰＢＳを投与したマウスにおける破骨細胞の増加を示すＴＲＡＰ染色像を示す写真である。
図３７は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウスにリセドロネートを投与した場合の血中Ｃａ、ＴＲＡＰ−５ｂおよびＡＬＰ濃度を示す図である。
図３８は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウスにリセドロネートを投与した場合の骨密度を示す図である。
図３９は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウスにリセドロネートを投与した場合のマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図４０は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウスにエチドロネート、アンドロネートまたはリセドロネートを投与した場合の血中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図４１は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウスにエチドロネート、アンドロネートまたはリセドロネートを投与した場合の骨密度を示す図である。
図４２は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与したマウスにエチドロネート、アンドロネートまたはリセドロネートを投与した場合のマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図４３は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与し卵巣を摘出したマウスの血中Ｃａ、ＴＲＡＰ−５ｂおよびＡＬＰ濃度を示す図である。
図４４は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与し卵巣を摘出したマウスの骨密度を示す図である。
図４５は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与し卵巣を摘出したマウスのマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図４６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与した場合の血中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図４７は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与した場合の骨密度を示す図である。
図４８は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与した場合のマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図４９は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与し卵巣を摘出したマウスにＰＴＨを投与した場合の血中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図５０は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与し卵巣を摘出したマウスにＰＴＨを投与した場合の骨密度を示す図である。
図５１は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与し卵巣を摘出したマウスにＰＴＨを投与した場合のマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図５２は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与したオスマウスの血中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図５３は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与したオスマウスの骨密度を示す図である。
図５４は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与したオスマウスのマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図５５は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与したＩＣＲマウスの血中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図５６は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与したＩＣＲマウスの骨密度を示す図である。
図５７は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与したＩＣＲマウスのマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図５８は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与したフィッシャーラットの血中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図５９は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与したフィッシャーラットの骨密度を示す図である。
図６０は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを投与したフィッシャーラットのマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図６１は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを単回投与したマウスの血清中ＲＡＮＫＬ濃度を示す図である。
図６２は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを単回投与したマウスの血清中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図６３は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを単回投与したマウスの骨密度を示す図である。
図６４は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを単回投与したマウスのマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図６５は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを７日間連続投与したマウスの血清中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図６６は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを７日間連続投与したマウスの骨密度を示す図である。
図６７は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを７日間連続投与したマウスのマイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図６８は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＢＳを頭蓋冠に投与したマウスの骨密度を示す図である。
図６９は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＬＦＭ−Ａ１３を投与した場合の骨量を示す写真である。
図７０は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＬＦＭ−Ａ１３を投与した場合の単位骨量（Ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ／ｔｉｓｓｕｅ  ｖｏｌｕｍｅ）を示す図である。
図７１は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＬＦＭ−Ａ１３を投与した場合の骨梁幅（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ／ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を示す図である。
図７２は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＬＦＭ−Ａ１３を投与した場合の骨梁数（Ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ／ｎｕｍｂｅｒ）を示す図である。
図７３は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＬＦＭ−Ａ１３を投与した場合の破骨細胞数（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｎｕｍｂｅｒ／ｂｏｎｅ  ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）を示す図である。
図７４は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＬＦＭ−Ａ１３を投与した場合の吸収面（Ｅｒｏｄｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ／ｂｏｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）を示す図である。
図７５は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＬＦＭ−Ａ１３を投与した場合の血中Ｃａ濃度を示す図である。
図７６は、卵巣を摘出したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにラロキシフェンを投与した場合の、血清中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図７７は、卵巣を摘出したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにラロキシフェンを投与した場合の、全骨密度を示す図である。
図７８は、卵巣を摘出したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにラロキシフェンを投与した場合の、皮質骨塩量を示す図である。
図７９は、卵巣を摘出したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにラロキシフェンを投与した場合の、皮質骨厚を示す図である。
図８０は、卵巣を摘出したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにラロキシフェンを投与した場合の、マイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図８１は、卵巣を摘出したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにラロキシフェンを投与した場合の、血中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図８２は、卵巣を摘出したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにラロキシフェンを投与した場合の、海綿骨密度を示す図である。
図８３は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＰＴＨを投与した場合の、全骨密度を示す図である。
図８４は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＰＴＨを投与した場合の、皮質骨密度を示す図である。
図８５は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＰＴＨを投与した場合の、皮質骨塩量を示す図である。
図８６は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＰＴＨを投与した場合の、皮質骨厚を示す図である。
図８７は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＰＴＨを投与した場合の、骨幹における皮質骨密度を示す図である。
図８８は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスにＰＴＨを投与した場合の、マイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
図８９は、１２週齢マウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与した場合の、血清中Ｃａ、ＡＬＰおよびＴＲＡＰ−５ｂ濃度を示す図である。
図９０は、１２週齢マウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与した場合の、全骨密度を示す図である。
図９１は、１２週齢マウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与した場合の、マイクロＣＴを用いた画像解析の結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の骨量減少症モデル動物は、非ヒト動物に可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与することにより作出することができる。
ＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｌｉｇａｎｄ）は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであるＲＡＮＫ（ＮＦ−κＢの受容体アクティベーター）のリガンドであり、細胞内ドメイン（ＲＡＮＫのＮ末端から第１番目から４８番目のアミノ酸からなるドメイン）、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する２型貫通タンパク質である（特表２００２−５０９４３０号公報、国際公開第ＷＯ９８／４６６４４号パンフレット（特許第３５２３６５０号公報））。細胞外ドメイン中、Ｎ末端から第１５２番目以降のアミノ酸からなるドメインは、ＴＮＦリガンドファミリー相同性ドメインである。可溶型ＲＡＮＫＬは、細胞内ドメインを含まない。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞の分化・活性化、リンパ球分化、樹状細胞活性化、乳腺上皮細胞分化、リンパ節形成等の機能を有する。
可溶型ＲＡＮＫＬには、可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体及び可溶型ＲＡＮＫＬアナログが含まれる。可溶型ＲＡＮＫＬの由来動物種は限定されず、ヒト由来ＲＡＮＫＬ、マウス由来ＲＡＮＫＬ、ラット由来ＲＡＮＫＬ等あらゆる動物種由来のＲＡＮＫＬを用いることができる。ヒト由来のＲＡＮＫＬの全長塩基配列及びアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び２に示す。可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体又は可溶型ＲＡＮＫＬアナログは、ＲＡＮＫＬのトランケート体等、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列の一部配列からなるタンパク質であって、ＲＡＮＫＬの活性を有するタンパク質を含む。可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体は、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列において、第１５２番目のアミノ酸から始まるＴＮＦリガンドファミリー相同ドメインを含む。可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体として、例えば、第１２７番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、第１４０番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は第１５９番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質等が挙げられる。また、ヒト以外の動物種由来のＲＡＮＫＬであって、上記のヒトＲＡＮＫＬの部分アミノ酸配列に対応する部分のアミノ酸配列からなるＲＡＮＫＬ誘導体も含まれる。さらに、可溶型ＲＡＮＫＬ誘導体又は可溶型ＲＡＮＫＬアナログは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＲＡＮＫＬの活性を有するタンパク質、あるいは上記のＲＡＮＫＬのアミノ酸配列の部分配列からなるタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつＲＡＮＫＬの活性を有するタンパク質を含む。ここで、１又は数個とは１〜９個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１若しくは２個である。
可溶型ＲＡＮＫＬと共に融合タンパク質を形成させるエピトープタグとして、抗体等の特定の化合物と結合し得る配列を有するタンパク質又はペプチドが挙げられる。通常、エピトープタグは、融合タンパク質の精製のために用いられるが、本発明においては、エピトープタグは可溶型ＲＡＮＫＬの活性を高めるという機能を有している。
エピトープタグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、２〜１２個、好ましくは４個以上、さらに好ましくは４〜７個、さらに好ましくは５個若しくは６個のヒスチジンからなるポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ（アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号３）、Ｍｙｃタグ（アミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号４）、Ｖ５タグ（アミノ酸配列ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ；配列番号５）、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＨＱタグ（アミノ酸配列ＨＱＨＱＨＱ；配列番号６）、ＨＡタグ（アミノ酸配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号７）、ＡＵ１タグ（アミノ酸配列ＤＴＹＲＹＩ；配列番号８）、Ｔ７タグ（アミノ酸配列ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧ；配列番号９）、ＶＳＶ−Ｇタグ（アミノ酸配列ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ；配列番号１０）、ＤＤＤＤＫタグ（アミノ酸配列ＤＤＤＤＫ；配列番号１１）、Ｓタグ（アミノ酸配列ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＩＤＳＣ；配列番号１２）、ＣｒｕｚＴａｇ０９（アミノ酸配列ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ；配列番号１３）、ＣｒｕｚＴａｇ２２（アミノ酸配列ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ；配列番号１４）、ＣｒｕｚＴａｇ４１（アミノ酸配列ＭＫＤＧＥＥＹＳＲＡＦＲ；配列番号１５）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ（アミノ酸配列ＥＥＥＥＹＭＰＭＥ；配列番号１６）、Ｈａ．１１タグ（アミノ酸配列ＣＴＰＴＤＶＰＤＹＡＳＬ；配列番号１７）、ＫＴ３タグ（アミノ酸配列ＰＰＥＰＥＴ；配列番号１８）、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、免疫グロブリンＦｃ領域、βガラクトシダーゼ等があるが、ここに列挙されたものには限定されない。この中でも、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが好ましい。
可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を得るには両者をそれぞれコードする遺伝子を連結し、発現させればよい。ＲＡＮＫＬをコードする遺伝子及びエピトープタグをコードする遺伝子の融合は、通常の遺伝子組換えの手法により行うことができる。この際、適当な制限部位を導入して行うことができる。この際、融合する遺伝子の間にストップコドンが現れないようにする。融合する遺伝子の間の距離は限定されず、両者の間にリンカーが含まれていてもよい。また、２つの遺伝子のオープンリーディングフレームを合わせるようにする。上記エピトープタグは、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列のＮ末端側に融合させてもよいし、Ｃ末端側に融合させてもよい。
配列番号１９及び２０に、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列中第１２７番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にＧＳＴが融合したタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号２１及び２２に、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列中第１４０番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にＧＳＴが融合したタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。また、配列番号２３及び２４に、ＲＡＮＫＬのアミノ酸配列中第１５９番目のアミノ酸から第３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質にＧＳＴが融合したタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列及び該タンパク質のアミノ酸配列を示す。
このようにして作製した融合遺伝子を入手可能な適当な発現ベクターに組み込んで、発現させ、目的の融合タンパク質を回収、精製することができる。また、この際無細胞系（セルフリーシステム）で発現させることもできる。
ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルス等の宿主細胞において複製可能である限りいかなるベクターも用いることができる。ベクターは、複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、転写終結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。また、あらかじめグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等のエピトープタグをコードする遺伝子を組み込んだベクターを用いることもできる。
ＤＮＡのベクターへの導入は、公知の方法で行うことができる。ベクターは、種々の制限部位をその内部に持つポリリンカーを含んでいるか、または単一の制限部位を含んでいることが望ましい。ベクター中の特定の制限部位を特定の制限酵素で切断し、その切断部位にＤＮＡを挿入することができる。融合遺伝子を含む発現ベクターを適切な宿主細胞の形質転換に用いて、宿主細胞に前記融合遺伝子がコードする融合タンパク質を発現、産生させることができる。
宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌等の細菌細胞、真菌細胞、パン酵母、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。
形質転換は、塩化カルシウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション等の公知の方法で行うことができる。
得られたリコンビナント融合タンパク質は、各種の分離精製方法により、分離・精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独でまたは適宜組合せて用いることができる。この際、発現産物がＧＳＴ等との融合タンパク質として発現される場合は、目的タンパク質と融合しているタンパク質またはペプチドの性質を利用して精製することもできる。例えばＧＳＴとの融合タンパク質として発現させた場合、ＧＳＴはグルタチオンに対して親和性を有するので、グルタチオンを担体に結合させたカラムを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより効率的に精製することができる。また、ヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現させた場合、ヒスチジンタグを有するタンパク質はキレートカラムに結合するので、キレートカラムを用いて精製することができる。さらに、いずれのエピトープタグを用いた場合も、そのエピトープタグが有するエピトープを認識する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与する動物種は限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、サル、イヌ、ネコ等ヒト以外のあらゆる哺乳動物が対象となり、これらの動物において骨量減少症モデル動物を作出することができる。また、雌雄ともに骨量減少症モデル動物の作出に用いることができる。また、骨量減少症モデル動物の作出に用いる動物の齢も限定されず、高齢動物を用いても本発明の骨量減少症モデル動物を作出することができる。例えば、動物としてマウスを用いる場合、１〜５２週齢、好ましくは４〜１２週齢のマウスを用いて骨量減少症モデル動物を作出することができる。
可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の動物への投与量は限定されず、動物種に応じて適宜決定され得るが、例えば、１頭当たり１０ｎｍｏｌ〜５０００ｎｍｏｌ、好ましくは５０ｎｍｏｌ〜１０００ｎｍｏｌ、あるいは投与する動物の体重当たりでは、１００μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５００μｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇを投与すればよい。投与経路は限定されず、静脈注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉注射、座薬、点眼、頭蓋冠投与などによって投与すればよい。
また、投与回数は限定されず、単回投与でもよいし、２〜十数回の複数回連続投与でもよい。連続投与を行う場合、投与間隔は限定されず、例えば、毎日数日間にわたって投与すればよい。また、トータルの投与量を調節することにより、モデル動物の骨量減少の程度を調節することができ、例えば単回投与を行う場合、１回の投与量を増やすことにより、骨量減少の程度の大きいモデル動物を作出することができる。
可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を動物に投与した場合、これらが動物体内において、破骨細胞を直接分化させ、活性化するという、他の物質を介在しない単純なメカニズムにより迅速に骨量減少症モデル動物を作出することができる。
本発明の骨量減少症モデル動物は以下の特徴を有する。なお、以下の記載で正常動物とは、骨代謝疾患に罹患しておらず、また可溶型ＲＡＮＫＬ若しくは可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与されていない動物をいい、例えば、骨量減少症モデル動物作出の際に、コントロールとしてＰＢＳ等を投与した動物を正常な動物とすることができる。
（１）体液中の骨吸収マーカー濃度（レベル）が、同じ種類の正常な動物（正常個体）に比べ一時的に上昇する。可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量にもよるが、正常動物に対して、例えば１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上、さらに好ましくは１．３倍以上、特に好ましくは１．４倍以上上昇する。血清中骨吸収マーカーとして、血清中カルシウム、血清中コラーゲン分解物（ＣＴｘ｛Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド｝、ＮＴｘ｛Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド｝、ＰＩＣＰ｛Ｉ型プロコラーゲン−Ｃ−プロペプチド｝、またはＰＩＮＰ｛Ｉ型プロコラーゲン−Ｎ−プロペプチド｝）、血清中酒石酸耐性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ−５ｂ）等が挙げられ、尿中骨吸収マーカーとして、尿中ＣＴｘまたはＮＴｘ、尿中ハイドロキシプロリン、尿中ピリジノリン、デオキシピリジノリン等が挙げられる。そのほか、ヒドロキシリジン配糖体（血清中及び尿中）、骨シアロ蛋白（血清中）等が挙げられる。これらのマーカーは破骨細胞が増殖し、活性が促進されたときに上昇する。これらのマーカーは、通常骨粗鬆症の骨代謝疾患における骨代謝マーカーとして用いられている。これらのマーカーは、比色法や特異的抗体を用いた免疫学的測定法により測定することができる。
（２）血清中骨形成マーカー濃度（レベル）が正常な動物に対して変動しない。血清中骨形成マーカーとして、血清中オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、血清中アルカリフォスファターゼ（特に骨特異的アルカリフォスファターゼ）が挙げられる。これらのマーカーは、骨芽細胞由来のタンパク質であり、骨芽細胞が増殖したときに濃度が上昇する。これらのマーカーは、通常骨粗鬆症の骨代謝疾患における骨代謝マーカーとして用いられている。これらのマーカーは、比色法や特異的抗体を用いた免疫学的測定法により測定することができる。可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質は、直接骨芽細胞に対して作用しないが、骨吸収と骨形成のカップリング現象のため間接的に血清中骨形成マーカー濃度が変動することがある。変動の有無は可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量、投与回数、投与後の時間経過によって異なる。
なお、（１）の骨吸収マーカー及び（２）の骨形成マーカーを併せて骨代謝マーカーという。
（３）骨密度が正常動物に比べ低下する。骨密度とは、骨中のカルシウムなどミネラル成分の密度を数字で表したものをいう。骨密度には、海綿骨密度、全骨密度、皮質骨密度があるが、本発明において、単に骨密度という場合、海綿骨密度のことをいう。骨密度は、ｐＱＣＴ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ；末梢骨Ｘ線ＣＴ装置）、ＤＸＡ（Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ；二重エネルギーＸ線吸収法）等により計測することができる。可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量にもよるが、本発明の骨量減少症モデル動物においては、ｐＱＣＴで大腿骨又は脛骨の骨密度を計測した場合、成長板からの距離により異なるが、例えば骨密度が１％以上、２％以上、３％以上、５％以上、好ましくは７．５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上低下する。
また、全骨密度も正常動物に比べ低下し、ｐＱＣＴで大腿骨又は脛骨の骨密度を計測した場合、成長板からの距離により異なるが、例えば全骨密度が１％以上、２％以上、３％以上、５％以上、好ましくは７．５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上低下する。
また、皮質骨密度も正常動物に比べ低下し、ｐＱＣＴで大腿骨又は脛骨の骨密度を計測した場合、成長板からの距離により異なるが、例えば皮質骨密度が１％以上、２％以上、３％以上、５％以上、好ましくは７．５％以上、さらに好ましくは１０％以上、最も好ましくは２０％以上低下する。
また、皮質骨塩量が正常動物に比べ低下する。骨塩量は骨塩（ヒドロキシアパタイト）の量であり、骨密度を反映している。骨塩量はｐＱＣＴ等により計測することができる。ｐＱＣＴで大腿骨又は脛骨の皮質骨塩量を計測した場合、成長板からの距離により異なるが、例えば皮質骨塩量が５％以上、好ましくは７．５％以上、さらに好ましくは１０％以上、さらに、好ましくは１５％以上、最も好ましくは２０％以上低下する。
さらに、皮質骨厚が正常動物に比べ低下する。皮質骨厚はｐＱＣＴ等により計測することができる。ｐＱＣＴで大腿骨又は脛骨の皮質骨厚を計測した場合、成長板からの距離により異なるが、例えば皮質骨厚が５％以上、好ましくは７．５％以上、さらに好ましくは１０％以上、さらに好ましくは１５％以上、最も好ましくは２０％以上低下する。
（４）骨形態計測において、単位骨量（ＢＶ／ＴＶ；ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ／ｔｏｔａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｖｏｌｕｍｅ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ；ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｎｕｍｂｅｒ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ；ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）が正常な動物に比べ低下する。単位骨量とは、病理切片に置いて組織全体の面積に占める骨梁全体の面積をいう。骨梁とは、骨端海綿質の骨組織の、細かくほぐれたような部分をいう。本発明の骨量減少症モデル動物において、単位骨量及び骨梁数は、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量にもよるが、正常な動物に比べ、例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上減少している。
（５）破骨細胞数が正常な動物に比べ、増加している。破骨細胞数は、常法に従い、骨形態計測により測定することができる。破骨細胞数は、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量にもよるが、正常な動物に比べ、例えば２０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上上昇している。
（６）骨芽細胞面（Ｏｂ．Ｓ／ＢＳ；ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ／ｂｏｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）が正常な動物に比べて有意に上昇する。骨芽細胞面とは、骨梁表面全体における骨芽細胞が付着している面の割合（％）をいう。骨芽細胞面は、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量にもよるが、正常な動物に比べ、例えば２０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上上昇している。
なお、可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量を大きくした場合、例えばマウスに２ｍｇ／ｋｇで投与した場合、骨吸収と骨形成のカップリング現象が認められるまでに時間がかかり、骨芽細胞面の変化の出現が遅れる場合がある。従って、骨芽細胞面の観察時期によっては、骨芽細胞面の上昇が認められない場合もある。
（７）  類骨厚（Ｏ．Ｔｈ；ｏｓｔｅｏｉｄ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、吸収面（ＥＳ／ＢＳ；ｅｒｏｄｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ／ｂｏｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）及び破骨細胞面（Ｏｃ．Ｓ／Ｂｓ；ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ／ｂｏｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）が正常な動物に比べ上昇する。類骨とは、石灰化して骨基質になる前の状態をいい、吸収面とは、骨梁表面全体における浸食を受けて凹凸になっている面の割合をいう。破骨細胞面とは、骨梁表面全体における破骨細胞が付着している面の割合をいう。類骨厚、吸収面及び破骨細胞面は、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与量にもよるが、正常な動物に比べ、例えば２０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上上昇している。
（８）骨形態を観察した場合、正常な動物に比べ、骨の減少が認められる。骨形態はマイクロＣＴ等により測定することができる。
（９）本発明の骨量減少症モデル動物において、エストロゲンは体内で合成されるので、正常な動物と比べて血中エストロゲン濃度は変動しない。この点、従来の卵巣を摘出することにより作出されるモデル動物とは異なる。また、血中ＰＴＨ濃度は、正常な動物と比べて、上昇することはない。この点、従来の低カルシウム濃度の食餌を動物に与えることにより作出されるモデル動物とは異なる。
さらに、従来の卵巣を摘出することにより作出されるモデル動物及び低カルシウム濃度の食餌を動物に与えることにより作出されるモデル動物においては、血中ＯＰＧ（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ）濃度が低下するが、本発明の骨量減少症モデル動物では、変動しない。
さらに、動物に可溶型ＲＡＮＫＬ若しくは可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与し、さらに卵巣を摘出しても、骨量減少症モデル動物を作出することができる。この場合、好ましくはＲＡＮＫＬを投与した後に卵巣を摘出する。卵巣摘出と可溶型ＲＡＮＫＬ若しくは可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与を併用することにより、生理的な閉経状態に類似した骨量減少症モデル動物を作出することができる。本発明は、可溶型ＲＡＮＫＬ若しくは可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与し、さらに卵巣を摘出することにより作出できる骨量減少症モデル動物を包含する。該骨量減少症モデル動物は、閉経後の骨代謝に異常のあるヒトの病態モデル動物として利用することができる。
上記の特徴のうち、直接骨量の減少を反映しているマイクロＣＴにより観察される骨の減少、骨密度及び単位骨量の低下が特に特徴的であり、次いで破骨細胞数（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｎｕｍｂｅｒ／ｂｏｎｅ  ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ）の増加及び骨梁数の減少が特徴的である。さらに、皮質骨塩量の減少も認められる。
また、上記の特徴は投与するＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ量が多いほど、顕著に現れ、特徴の程度は投与量に依存する。上記の特徴の程度は、骨量減少症の重症度を示しており、本発明の骨量減少症モデル動物は、投与するＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの量を変えることにより、重症度をコントロールすることができる。すなわち、軽症の骨量減少症モデル動物を得ようとする場合は、小量のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与すればよく、重症の骨量減少症モデル動物を得ようとする場合は、大量のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを投与すればよい。ここで、重症の骨量減少症モデル動物とは、上記の特徴が強く現れているモデル動物をいい、例えば、体液中の骨吸収マーカー濃度（レベル）が、同じ種類の正常な動物（正常個体）に比べ一時的に比較的大きく上昇したモデル動物であり、正常動物に対して、例えば１．２倍以上、好ましくは１．３倍以上、さらに好ましくは１．４倍以上上昇したモデル動物である。また、骨密度が正常動物に比べ比較的大きく低下したモデル動物であり、ｐＱＣＴで大腿骨又は脛骨の骨密度を計測した場合、成長板からの距離により異なるが、例えば骨密度が７．５％以上、好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上低下したモデル動物である。さらに、骨形態計測において、単位骨量（ＢＶ／ＴＶ；ｂｏｎｅ  ｖｏｌｕｍｅ／ｔｏｔａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｖｏｌｕｍｅ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ；ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｎｕｍｂｅｒ）及び骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ；ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）が正常な動物に比べ比較的大きく低下したモデル動物であり、正常な動物に比べ、例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、特に好ましくは５０％以上減少しているモデル動物である。さらに、骨形態計測において、類骨厚（Ｏ．Ｔｈ；ｏｓｔｅｏｉｄ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、吸収面（ＥＳ／ＢＳ；ｅｒｏｄｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ／ｂｏｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）及び破骨細胞面（Ｏｃ．Ｓ／Ｂｓ；ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ／ｂｏｎｅ  ｓｕｒｆａｃｅ）が正常な動物に比べ比較的大きく上昇したモデル動物であり、正常な動物に比べ、例えば２０％以上、好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは６０％以上上昇しているモデル動物である。
従って、本発明の骨量減少症モデル動物の典型的な例として、骨密度及び／又は単位骨量が正常な動物に比べて減少している動物、さらに、破骨細胞数の増加及び／又は骨梁数の減少が正常な動物に比べて認められる動物が挙げられる。さらに、骨梁幅の減少が正常な動物に比べて認められる動物、類骨厚、吸収面、破骨細胞面等の上昇が正常な動物に比べて認められる動物が挙げられる。
なお、可溶型ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を動物に投与した後、上記の特徴が徐々に経時的に出現し、特徴が最も顕著に出現した後、今度は骨形成が進み、上記の特徴は徐々に失われ、やがては正常に戻る。すなわち、可溶型ＲＡＮＫＬ及び可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与して得られる骨量減少症モデル動物は、骨量減少という特徴に関して可逆的である。
特に、上記の特徴のうち、（１）の骨吸収マーカーは、可溶型ＲＡＮＫＬ若しくは可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与後変動するが、骨量減少症モデル動物の作出後徐々に上昇し、やがて正常値に戻る。
後記のように、本発明の骨量減少症モデル動物を用いて骨代謝に関する薬剤の評価やスクリーニングを行う場合、目的に応じて骨量が減少しつつある時期、骨量が最も減少した時期、又は一旦減少した骨量が再び増加しつつある時期の適切な時期のモデル動物を利用する。従って、発現している上記の特徴の強さにかかわらず、可溶型ＲＡＮＫＬ若しくは可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与した後、骨量が減少しつつある動物であって、上記の特徴が発現しつつある動物は、本発明の骨量減少症モデル動物に含まれる。
本発明の骨量減少症モデル動物は、上記のように他の物質を介在しない単純なメカニズムにより作出される。従って、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を正常な動物に投与後、１週間以内、好ましくは３日以内（７２時間以内）、さらに好ましくは２日以内（５０時間以内）、さらに好ましくは２４時間以内に上記の特徴を有するようになり、骨量減少症モデル動物が作出される。
本発明の骨量減少症モデル動物は、骨粗鬆症、高カルシウム血症、Ｐａｇｅｔ病、腎性骨異栄養症、クル病・骨軟化症、関節リウマチ等の骨量減少を伴う骨代謝異常疾患の疾患モデル動物として利用することができる。具体的には、以下のように利用することができる。
本発明の骨量減少症モデル動物は、骨吸収抑制剤の評価又は新たな骨吸収抑制剤（骨吸収阻害剤）のスクリーニングに用いることができる。本発明においては、これらを骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質の評価と呼ぶことがある。公知の骨吸収抑制剤としては、リセドロネート、エチドロネート、アレンドロネートなどのビスフォスホネート、カルシトニン、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ  阻害剤、プロトンポンプ阻害剤などがある。骨吸収抑制剤は、骨量が減少しているときに効く。従って、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与後、骨量が減少している時期に評価するのが望ましい。この場合、骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質を本発明の骨量減少症モデル動物に投与し、骨量の減少が抑制されるか否かにより骨吸収抑制剤又は骨吸収抑制剤候補物質の効果を評価することができる。また、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与する前、例えば１〜３日、好ましくは１日前に候補物質を投与してもよい。すなわち、骨量減少症モデル動物における骨量の減少が低下、あるいは骨量が増加するか否かを指標にすればよい。具体的には、骨量の増加を、骨量減少症モデル動物における体内の骨吸収マーカーレベルの低下、骨密度の上昇、単位骨量の上昇、骨梁数、骨梁幅の上昇、類骨厚、吸収面の上昇、破骨細胞数の低下、骨芽細胞面の上昇、及びＣＴにより認められる骨量の増加からなる群から選択される少なくとも１つを指標に判断することができる。本発明のモデル動物を用いることにより、数日以内、例えば３〜４日程度で薬剤の評価を行うことができる。
さらに、卵巣を摘出した本発明の骨量減少症モデル動物は、エストロゲンやアンドロゲンなどのホルモンあるいはホルモン受容体モジュレーターの薬剤評価又は新たなホルモン受容体モジュレーターのスクリーニングに用いることができる。ホルモン受容体モジュレーターである選択的エストロゲン受容体モジュレーターは、骨形成吸抑制剤の１つであり、ホルモンであるエストロゲン様の作用により骨吸収を抑制するという効果を示す。内因性のエストロゲンが存在する通常の野生型動物による評価は困難である。本発明の骨量減少症モデル動物の卵巣を摘出（ＯＶＸ）することにより、単に卵巣を摘出しただけのモデル動物による評価よりも極めて迅速に選択的エストロゲン受容体モジュレーターの薬剤評価を行うことができる。単に卵巣を摘出しただけのモデル動物では、薬剤の効果が認められ薬剤の評価ができるまでに、数週間以上を要するが、卵巣を摘出した本発明の骨量減少症モデル動物を用いた場合、半分以下の期間、例えば２週間以内、好ましくは１週間以内、さらに好ましくは数日以内で評価を行うことができる。公知の選択的エストロゲン受容体モジュレーターとしては、ラロキシフェン等がある。また、作用が未知のホルモン様化合物やホルモン受容体モジュレーター候補物質の評価に用いることもできる。ホルモン又はホルモン受容体モジュレーター等の評価は、骨量減少症モデル動物にホルモン又はホルモン受容体モジュレーター等を投与し、骨量減少症モデル動物における減少した骨量が増加するか否かを指標にして評価することができる。
また、本発明の骨量減少症モデル動物は、骨形成促進剤の評価又は新たな骨形成促進剤のスクリーニングに用いることができる。本発明においては、これらを骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質の評価と呼ぶことがある。骨形成促進剤は、骨量が一旦減少し、元に戻るときに効く。従って、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与後、骨量が減少を続け骨量の減少が停止した時期から、一旦減少した骨量が再び上昇する時期に評価するのが望ましい。この場合、骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質を本発明の骨量減少症モデル動物に投与し、骨量の増加が促進されるか否かにより骨形成促進剤又は骨形成促進剤候補物質の効果を評価することができる。この場合、候補物質は、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を動物に投与し骨量の減少が認められた後に、投与するのが好ましい。評価は、骨量減少症モデル動物における減少した骨量が増加するか否かを指標にすればよい。具体的には、骨量の増加を、骨量減少症モデル動物における体内の骨形成マーカーレベルの上昇、骨密度の上昇、単位骨量の上昇、骨梁数、骨梁幅の上昇、類骨厚の上昇、破骨細胞数及び吸収面の低下、骨芽細胞面の上昇、及びＣＴにより認められる骨量の増加からなる群から選択される少なくとも１つを指標に判断することができる。骨形成促進剤としては、例えばＰＴＨ（副甲状腺ホルモン）等がある。
上記の骨吸収抑制剤、骨形成促進剤は骨粗鬆症や骨量減少症の治療薬として用いることができる。
さらに、本発明の骨量減少症モデル動物は、骨代謝研究のための実験用動物として用いることができる。すなわち、本発明の骨量減少症モデル動物においては、骨吸収に伴う骨形成（カップリング）が起こるので、骨再構築調節メカニズムの解明などの基礎研究に用いることができる。また、骨吸収と骨形成をカップリングしているカップリングファクターの探索に用いることができる。また、ＲＡＮＫＬシグナルを阻害する薬剤の評価及び破骨細胞分化をはじめとするメカニズム研究に利用することができる。ＲＡＮＫＬシグナルを抑制する薬剤としては、例えばＴｅｃキナーゼファミリーの阻害剤であるＬＦＭ−Ａ１３等がある。
さらに、本発明の骨量減少症モデル動物においては、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与後、わずか１−２日程度で骨量の減少が認められるので、大学などの教育機関において生体内における骨量減少の実習に用いることができる。また、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質を投与後、大学や製薬メーカーなどの研究機関に骨量減少症モデル動物を送付することにより、研究者に本発明の骨量減少症モデル動物を提供することができる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
骨量減少症モデルマウスの作出（１）
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの調製
ヒト型ＲＡＮＫＬ残基１４０−３１７をコードするｃＤＮＡにＰＣＲにてＳａｌ  Ｉ，Ｎｏｔ  Ｉサイトを付加し、これらのエンドヌクレアーゼを用いて、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｕ１３８５４）のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの下流にクローニングした。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅｓｃｈｅｒｉｓｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＩＰＴＧ（終濃度：０．５ｍＭ）によるタンパク質発現の誘導後、菌体を抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて懸濁し、４℃でソニケーターを用いて破砕した。１８０００×ｇ、１５ｍｉｎで遠心後、上清を回収しＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにかけた。続いて洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＤＴＴ，０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて洗浄した。その後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ溶液（２０ｍＭ  還元型グルタチオン，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）で溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて精製したＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの分子量及び純度を確認し、フィルターろ過した。分子量４７．０ｋＤａ、純度９５％以上であった。また、リムルス変形細胞溶解物試験（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ  ａｓｓａｙ）によりエンドトキシン濃度を測定し、１ＥＵ／μｇ未満であることを確認した。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与試験
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス雌１０匹にＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ、５７ｎｍｏｌ（低用量）及び４２６ｎｍｏｌ（高用量）を２４時間毎３回腹腔内投与し３回目投与より１．５時間後に全採血を行った。比較対象としてＰＢＳを同様に投与した群を用いた。
全血採血した血液は血清中の骨吸収パラメーター（カルシウム、ＣＴｘ、ＴＲＡＰ−５ｂ）と骨形成パラメーター｛オステオカルシン、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）｝の測定を行った。カルシウムはＯＣＰＣ法（ＷＡＫＯ，２７２−２１８０１）にて測定を行い、ＣＴｘ（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＴＲＡＰ−５ｂ（ＩＤＳ  Ｌｔｄ，ＳＢ−ＴＲ１０３）及びオステオカルシン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）はＥＬＩＳＡ法にて測定を行い、ＡＬＰはＢｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法（ＷＡＫＯ，２７４−０４４０１）にて測定を行った。
全血採血後のマウスは大腿骨、脛骨、大脳、肺、心臓、肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、皮膚を採取し、大脳、肺、心臓、肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、皮膚はＨＥ染色により自然発生病変を観察した。
大腿骨については、ｐＱＣＴを用い遠位端成長板より近位側に０．６ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍの海綿骨の位置で骨密度測定を行い、脛骨については、切片を作製し、骨形態計測を行った。それぞれの測定値はＤｕｎｎｅｔｔ法によりコントロール群と比較し検定を行った。
骨吸収パラメーターと骨形成パラメーター
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与により、高用量の投与で血中Ｃａ濃度は、約１．４倍程度有意（ｐ＜０．０１）に上昇した（図１）。コラーゲン代謝産物であるＣＴｘは高用量でコントロール群と比較し約１．５倍程度有意（ｐ＜０．０１）に上昇した（図２）。ＴＲＡＰ−５ｂについては、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ高用量の投与により約１．５倍程度有意に（ｐ＜０．０１）上昇した（図３）。血中のオステオカルシン、ＡＬＰについては、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与で高用量、低用量のどちらの場合においても変化は見られなかった（図４及び５）。
骨密度と骨形態計測
ｐＱＣＴによる大腿骨の骨密度測定の結果、成長板より近位側に０．６ｍｍの位置ではＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ高用量投与にて１０％、０．８ｍｍでは２３％、１．０ｍｍでは２０％の減少が見られた。Ａｎｏｖａ；Ｄｕｎｎｅｔｔ法により有意差を検定したところＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ高用量投与では測定したすべての位置においてｐ＜０．０１であった。またＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの低用量投与では有意差は得られなかった（図６）。
骨形態計測の結果単位骨量及び骨梁数は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ高用量の投与により約５０％まで減少し、破骨細胞数は増加した。また低用量の投与において減少は見られなかった（図７、８及び９）。
大腿骨の骨形態をマイクロＣＴにより測定したところ高用量のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群においては顕著な骨の減少が見られた（図１０）。
採取した大脳、肺、心臓、肝臓、胸腺、脾臓、腎臓、及び皮膚をＨＥ染色し観察したが、すべての群で異常所見及び自然発生病変は認められなかった。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ高用量の投与により骨吸収パラメーターの上昇、骨密度、単位骨量、骨梁数の減少、及び破骨細胞数の増加が見られたことから、骨量減少症のモデルマウスとして利用が可能であり、従来の方法に比べ簡便で、より短期間に骨量減少症モデルマウスの作製を行うことができる。
骨芽細胞面
高用量のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与により破骨細胞数の増加、骨量の減少、骨吸収が見られた。さらに骨芽細胞面を調べたところ、有意に上昇していることがわかった（図１１）。これは破骨細胞数の増加や破骨細胞の活性化による骨吸収の亢進により、骨形成が促進されるという現象、即ち骨吸収と骨形成のカップリングが認められるモデルであることを示唆している。しかしながら、骨芽細胞のマーカーである血清中のオステオカルシン濃度やアルカリフォスファターゼ活性には変化がないので、骨芽細胞の活性化は始まったばかりであることが示唆される。
【実施例２】
【０００７】
骨量減少症モデルマウスの作出（２）
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは実施例１と同様の方法で調製した。
ＲＡＮＫＬ投与試験
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス雌各１０匹にＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ２１３ｎｍｏｌ、４２６ｎｍｏｌ、８５２ｎｍｏｌを２４時間毎３回腹腔内投与し３回目投与より１．５時間後に全採血を行った。比較対象としてＰＢＳを同様に投与した。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの２１３ｎｍｏｌ、４２６ｎｍｏｌ及び８５２ｎｍｏｌは、それぞれ１０μｇ、２０μｇ及び４０μｇに相当する。
全血採血した血液は血清中の骨吸収パラメーター（カルシウム、ＣＴｘ、ＴＲＡＰ−５ｂ）と骨形成パラメーター｛オステオカルシン、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の測定を行った。カルシウムはＯＣＰＣ法（ＷＡＫＯ，２７２−２１８０１）にて測定を行い、ＣＴｘ（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＴＲＡＰ−５ｂ（ＩＤＳ  Ｌｔｄ，ＳＢ−ＴＲ１０３）及びオステオカルシン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）はＥＬＩＳＡ法にて測定を行い、ＡＬＰはＢｅｓｓｅｙ−Ｌｏｗｒｙ法（ＷＡＫＯ，２７４−０４４０１）にて測定を行った。
全血採血後のマウスは大腿骨、脛骨を採取し、大腿骨については、ｐＱＣＴを用い成長板から近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの海綿骨の骨密度測定を行った。
それぞれの測定値はＤｕｎｎｅｔｔ法によりコントロール群と比較し検定を行った。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与により、血中Ｃａ、ＣＴｘ、ＴＲＡＰ−５ｂは用量依存的に上昇した（それぞれ、図１２、１３及び１４）。カルシウムの上昇は、２１３ｎｍｏｌ投与では、ｐ＜０．０５と有意な上昇が見られ、さらに４２６ｎｍｏｌ、８５２ｎｍｏｌ投与でｐ＜０．０１とより顕著な上昇が見られた。ＣＴｘ及びＴＲＡＰ−５ｂについては、２１３ｎｍｏｌでは有意な上昇は見られなかったが、４２６ｎｍｏｌ、８５２ｎｍｏｌ投与でｐ＜０．０１と顕著な上昇が見られた。
ｐＱＣＴを用い骨密度の測定を行ったところ成長板より近位側に０．６ｍｍの位置ではＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ２１３ｎｍｏｌ投与では１１％、４２６ｎｍｏｌ投与で１９％（Ｐ＜０．０１）、８５２ｎｍｏｌ投与で３０％（Ｐ＜０．０１）の骨密度の減少が見られた。０．８ｍｍではそれぞれ２３％（ｐ＜０．０１）、２９％（ｐ＜０．０１）、４２％（ｐ＜０．０１）、１．０ｍｍでは、それぞれ２３％（ｐ＜０．０１）、３１％（ｐ＜０．０１）、４４％（ｐ＜０．０１）の骨密度の減少が見られた（図１５）。またこのような用量依存的な骨密度の減少は、マイクロＣＴを用いた画像解析においても確認できた（図１６）。上記の結果より従来法ではモデルマウスの作製に数週間単位の時間がかかり卵巣摘出（ＯＶＸ）等の特殊な技術を必要としたが、本法では、腹腔内投与という簡便な方法で、約５０時間でモデルマウスを作製できる。また従来骨粗鬆症及び骨量減少症の程度を簡単に変えるようなモデルマウスの作製技術はなかったが、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの用量を変えて投与することで骨吸収パラメーターの上昇および骨量の減少量を自由に調節し、骨粗鬆症及び骨量減少症の程度にあわせたモデルマウスを作製することができる。
【実施例３】
【０００８】
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与マウスを用いた骨粗鬆症治療薬の評価
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは実施例１と同様の方法で調製した。
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス雌各５〜６匹にＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ４２６ｎｍｏｌを２４時間ごとに３回腹腔内投与し、骨粗鬆症治療薬（リセドロネート）は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与３日前より０．０１ｍｇ／ｋｇにて皮下投与し、２４時間ごとに実験終了まで投与を続けた。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ３回目の投与より１．５時間後に血清並びに大腿骨及び脛骨の採取を行い、血清中の骨吸収パラメーター（カルシウム、ＣＴｘ、ＴＲＡＰ−５ｂ）と骨形成パラメーター（オステオカルシン、ＡＬＰ）の測定を行った。大腿骨は、ｐＱＣＴ及びマイクロＣＴを用いて骨密度を測定した。それぞれの測定値はＤｕｎｎｅｔｔ法によりコントロール群と比較し検定を行った。
骨吸収マーカーであるＴＲＡＰ−５ｂは、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群ではコントロール群と比較し約１．５倍程度の有意な上昇が見られ（Ｐ＜０．０１）、ＣＴｘは、１．４倍程度の有意な上昇が見られた（ｐ＜０．０５）。しかしながらＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ、リセドロネート併用投与群でＴＲＡＰ−５ｂ及びＣＴｘはコントロール群と比較し３割程度減少した。（図１７及び１８）。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ、リセドロネート併用投与群での減少は、マウス生体内にもともと存在する破骨細胞がリセドロネートによって抑制されたためと考えられる。また骨形成マーカーであるアルカリフォスファターゼ及びオステオカルシンは、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群及びＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ、リセドロネート併用投与群でコントロール群と比較し変化がなかった（図１９及び２０）。
骨密度は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群でコントロール群と比較し有意な減少が見られ、成長板より近位側に０．６ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍのどの位置においても２割程度の有意な減少が見られた（ｐ＜０．０１）。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ、リセドロネート併用投与群ではコントロール群と同程度の骨密度の値を示した。これらの結果は、マイクロＣＴを用いた画像解析においても同様に確認できた。図２１は大腿骨の骨密度を示し、図２２はマイクロＣＴにより測定した骨形態を示す。
上記の結果より上記の結果より骨粗鬆症及び骨量減少症治療薬をこのモデルマウスに投与することで新たな治療薬の評価に利用でき、従来のＯＶＸ等を利用した骨量減少症モデルマウスでの薬剤評価と比較し、数週間の時間の短縮及び利用する薬剤量を大幅に減少することが可能と考えられる。
【実施例４】
【０００９】
可溶型ＲＡＮＫＬを用いた骨量減少症モデルマウスの作製
可溶型ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社製）の５７ｎｍｏｌ、４２６ｎｍｏｌを７週令Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス雌各１０匹に２４時間毎３回腹腔内投与し、３回目の投与より１．５時間後の血清並びに大腿骨及を採取した。血清は骨吸収マーカー及び骨形成マーカーを測定し、大腿骨はｐＱＣＴにより成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置の骨密度を測定した。骨吸収マーカーである血中カルシウム、ＣＴｘは４２６ｎｍｏｌの高用量投与によりそれぞれ１．４倍程度、１．５倍程度有意に上昇し（図２３及び２４）、ＴＲＡＰ−５ｂは有意な差ではないものの１．２５倍程度の上昇傾向を示した（図２５）。また骨形成マーカーであるオステオカルシン、アルカリフォスファターゼには変化がなかった（図２６及び２７）。大腿骨の骨密度は、２割程度有意に減少した（図２８）。
上記のことから骨量減少症モデルマウスは、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ特異的に作製できるものではなく可溶型ＲＡＮＫＬすべてに適応し作製できる技術であり、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ同様に薬剤評価にも利用できると考えられる。
【実施例５】
【００１０】
骨量減少症モデルマウスの評価
形態計測
７週齢メスＣ５７ＢＬ／６ＮマウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを２ｍｇ／ｋｇにて２４時間ごとに３回腹腔内投与した後、解剖し、脛骨をトルイジンブルー染色後、形態計測を行った。コントロール群は溶媒（ＰＢＳ）を同様に投与した。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ腹腔内投与群の脛骨の骨形態計測を行ったところコントロール群と比較し、単位骨量（ＢＶ／ＴＶ）は約３０％（ｐ＜０．０３）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）は約１０％（Ｐ＜０．０３）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）は約２０％（ｐ＜０．０５）減少した（図２９〜３１）。また類骨厚（Ｏ．Ｔｈ）は約１．２倍（ｐ＜０．０４）、吸収面（ＥＳ／ＢＳ）は約１．８倍（ｐ＜０．００１）、破骨細胞数（Ｎ．Ｏｃ／Ｂ．Ｐｍ）は約１．９倍（ｐ＜０．００１）、破骨細胞面（Ｏｃ．Ｓ／ＢＳ）は約１．８倍（ｐ＜０．００１）に上昇した（図３２〜３５）。またこの時の切片をＴＲＡＰ染色したところ、破骨細胞がコントロール群と比較し多く観察された（図３６）。この結果から血清及び骨密度だけでなく、破骨細胞数、破骨細胞面等の骨形態計測によっても骨量の減少を評価できることがわかった。また、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与により類骨厚は有意に増加したが、骨芽細胞面の増加は認められず、吸収面、破骨細胞数、破骨細胞面等の吸収系の項目にて有意な上昇が認められることから、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは骨芽細胞には作用することなく、直接、破骨細胞を分化・活性化させることにより骨量減少を引き起こしたことが分かった。即ち、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与骨量減少症のメカニズムは、骨形成の低下ではなく、骨吸収の亢進であった。しかし、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの投与量、投与回数、投与後の時間経過によっては、カップリング現象により骨形成が促進され、骨芽細胞面の増加が認められることもある。
ビスフォスフォネート（リセドロネート）を用いた薬剤評価の検討
７週令Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスにリセドロネートを３、１０、３０μｇ／ｋｇと用量を振りＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与前日より実験終了まで２４時間ごとに皮下投与した。３回目のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与後１．５時間後に大腿骨、血清を採取し、ＴＲＡＰ−５ｂ、カルシウム（Ｃａ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の測定を行い、大腿骨はｐＱＣＴにより骨密度の測定及びマイクロＣＴを用い画像解析を行った。
Ｃａは大きな変化は見られなかったが、ＴＲＡＰ−５ｂはＲＡＮＫＬ投与により約２倍に有意に上昇した（ｐ＜０．０１）。この上昇したＴＲＡＰ−５ｂの濃度はリセドロネート投与によりＲＡＮＫＬ単独投与群と比較し、それぞれ約３０％（ｐ＜０．０１）、５０％（ｐ＜０．０１）、７０％（ｐ＜０．０１）と用量依存的に減少した。またＡＬＰはリセドロネート３０μｇ／ｋｇ投与により、ＲＡＮＫＬ単独投与群と比較し有意な減少（ｐ＜０．０１）が見られた（図３７）。大腿骨はｐＱＣＴにより成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置の骨密度を測定したところ、ＰＢＳ投与群と比較してＲＡＮＫＬ投与群ではそれぞれ２７％（ｐ＜０．０１）、３５％（ｐ＜０．０１）、３５％（ｐ＜０．０１）の減少が見られた。この骨密度の減少は、それぞれ０．６、０．８、１．０ｍｍの位置においてリセドロネート投与では３μｇ／ｋｇの用量で１２％（ｐ＜０．０５）、１８％（ｐ＜０．０５）、２４％、１０μｇ／ｋｇでは１３％（ｐ＜０．０５）、２８％、３０％、３０μｇ／ｋｇでは１０％（ｐ＜０．０５）、１８％（ｐ＜０．０５）、２０％（ｐ＜０．０５）まで抑えられた（図３８）。またこれらの結果は、マイクロＣＴを用いた画像解析においても同様に確認できた（図３９）。
複数のビスフォスフォネートを比較した薬剤評価の検討
７週令メスＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスにエチドロネートを３、３０ｍｇ／ｋｇ、アレンドロネートを３、３０、３００μｇ／ｋｇ、リセドロネートを１、１０、１００μｇ／ｋｇと用量を振り、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与前日より実験終了まで２４時間ごとに皮下投与した。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬは１ｍｇ／ｋｇにて２４時間ごとに３回腹腔内投与した。３回目のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与後１．５時間後に大腿骨、脛骨、血清を採取し、血清中のＴＲＡＰ−５ｂ、カルシウム（Ｃａ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の測定を行い、大腿骨はｐＱＣＴにより骨密度の測定及びマイクロＣＴを用い画像解析を行った。
Ｃａはアレンドロネートを３００μｇ／ｋｇ、リセドロネートを１又は１００μｇ／ｋｇ投与によりそれぞれＲＡＮＫＬ投与と比較し有意に減少が（ｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０１）見られた（図４０）。
ＴＲＡＰ−５ｂはＲＡＮＫＬ投与により約４０％上昇したが、有意差は得られなかった。アレンドロネート投与においては３００μｇ／ｋｇの用量においてＴＲＡＰ−５ｂの増加が有意に（ｐ＜０．０１）抑制された。またリセドロネート投与ではそれぞれ１、１０、１００μｇ／ｋｇの用量において有意に（ｐ＜０．０５，ｐ＜０．０１，ｐ＜０．０１）抑制された（図４０）。ＡＬＰはアレンドロネート及びリセドロネート投与によりＲＡＮＫＬ投与群に比べ、約２０から３０％（ｐ＜０．０１）の減少が見られ、この減少は用量依存的であった（図４０）。大腿骨はｐＱＣＴにより成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置の骨密度を測定したところ、ＰＢＳ投与群と比較してＲＡＮＫＬ投与群ではそれぞれ７％（ｐ＜０．０１）、１３％（ｐ＜０．０１）、１８％（ｐ＜０．０１）の減少が見られた。この骨密度の減少は、エチドロネート投与では３０ｍｇ／ｋｇ投与により全ての位置で２から４％（ｐ＜０．０５）まで減少が抑えられた。同様に、アレンドロネート投与においては３００μｇ／ｋｇの用量において０．６、０．８ｍｍでそれぞれ１％（ｐ＜０．０１）、５％（ｐ＜０．０５）まで減少が抑えられた。またリセドロネート投与では１００μｇ／ｋｇの用量において０．６ｍｍで１％まで減少が抑えられた（ｐ＜０．０１）（図４１）。またこれらの結果は、マイクロＣＴを用いた画像解析においても同様に確認できた（図４２）。
上記の結果より第１世代から第３世代までのビスフォスフォネートをＲＡＮＫＬ投与１日前に事前投与することで、その薬理効果を評価することができた。また、その効果を示した用量は、エチドロネートは３０ｍｇ／ｋｇ、アレンドロネートは３００μｇ／ｋｇ、リセドロネートは１００μｇ／ｋｇであり、それぞれの薬理効果の強さを反映していた。これらの結果から、ＲＡＮＫＬ投与骨量減少モデルが、より薬理効果の強い新規の薬剤のスクリーニング、評価に応用可能であることが分かった。また、ビスフォスフォネート事前投与からマウスの解剖までの時間はわずか７３．５時間であり、骨代謝マーカーや骨密度の測定も含めて、わずか４日間で薬理効果の評価ができたことから、迅速な骨吸収抑制剤の評価系としても応用可能であることが分かった。
短期ＯＶＸマウス作製法
７週令メスのＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを２５日間飼育後、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて２４時間ごとに２回腹腔内投与した。２回目の投与より２４時間後に卵巣摘出を行い、さらに卵巣摘出より２４時間後、大腿骨、脛骨、血清を採取した。これらのサンプルを、卵巣摘出後４週間飼育した群から得たサンプルと比較した。またＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与の比較対照としてＰＢＳ投与を行い、卵巣摘出の比較対照として擬似手術（Ｓｈａｍ）を行った。
骨代謝マーカーは、血中のＴＲＡＰ−５ｂ、カルシウム（Ｃａ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の測定を行い、大腿骨はそれぞれｐＱＣＴにより骨密度の測定、マイクロＣＴにより画像解析を行った。飼育開始後、ＯＶＸあるいはＳｈａｍの手術を行った日を（ｄａｙ  Ｘ）で表した。
ＴＲＡＰ−５ｂはＰＢＳ投与＋Ｓｈａｍ（ｄａｙ２７）群と比較し全てのＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群で約１．８倍に上昇したが有意な差は見られなかった。ＣａはＯＶＸ（ｄａｙ０）群でＳｈａｍ（ｄａｙ０）に比較して約１１％の上昇は見られたものの、全てのＯＶＸ処理群に変化はなかった。またＡＬＰに関してはＳｈａｍ（ｄａｙ０）群とＯＶＸ（ｄａｙ０）群では変化がなく、ＰＢＳ投与Ｓｈａｍ（ｄａｙ２７）群と比較し、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ（ｄａｙ２７）群では約４０％（ｐ＜０．０１）の上昇が見られた（図４３）。
大腿骨の骨密度は成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置で測定したところ、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与Ｓｈａｍ（ｄａｙ２７）群及びＯＶＸ（ｄａｙ０）群において、それぞれの対照群であるＰＢＳ投与Ｓｈａｍ（ｄａｙ２７）群及びＳｈａｍ（ｄａｙ０）群と比べ０．６ｍｍでは約７％、約４％、０．８ｍｍでは約１４％（ｐ＜０．０１）、約９％、１．０ｍｍでは約１６％（ｐ＜０．０１）、約１２％（ｐ＜０．０５）の減少が見られた。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ（ｄａｙ２７）群では約４％、約１３％、約１５％（ｐ＜０．０１）と対照群であるＰＢＳ投与Ｓｈａｍ（ｄａｙ２７）群と比べて有意に減少していたが、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与Ｓｈａｍ（ｄａｙ２７）群とは差がなかった（図４４）。またこれらの結果はマイクロＣＴによる画像解析においても確認できた（図４５）。
上記の結果よりＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与により作製した骨量減少症モデルマウスは、従来の卵巣摘出マウスと同様の症状を示した。通常、卵巣摘出による骨量減少症モデルマウス作製には４週間以上の期間が必要であるが、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与後に卵巣摘出を行うことで、その作製期間をわずか７２時間に短縮することができた。これらＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与後に卵巣摘出を行ったマウスは、摘出の１日後にはエストロゲンがほぼ消失し、ホルモンバランスも通常の卵巣摘出による骨量減少症モデルマウスと類似した状態になる。従って、卵巣摘出による骨量減少症モデルマウスとほぼ同じ状態のマウスを、簡易的にしかも短期間で作製することができた。このＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ／ＯＶＸモデルは生理的に閉経後の女性の状態に近い骨量減少モデルであり、７２時間という短期間で作製できることから、ホルモンバランスを考慮した上での迅速な薬剤評価に応用できる。
骨治癒
７週齢メスＣ５７ＢＬ／６ＮマウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて２４時間毎に２回腹腔内投与し、２回目の投与より２４時間後を０週とし０、１、４、６、８週の血清及び大腿骨を採取し、同様にＰＢＳ投与したマウスと比較した。骨代謝マーカーは血中のＴＲＡＰ−５ｂ、カルシウム（Ｃａ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の測定を行い、大腿骨はそれぞれｐＱＣＴにより骨密度の測定及びマイクロＣＴを用い画像解析を行った。
血清中のＣａに大きな差はなかったが、ＴＲＡＰ−５ｂはＲＡＮＫＬ投与２４時間後（０週）にてＰＢＳ投与群と比較し、約３倍に上昇しており、その後ＰＢＳ投与群と同様な挙動を示した。ＡＬＰに関しては０及び１週にて約１．４倍の上昇が見られ、その後ＰＢＳ投与群と同様な挙動を示した（図４６）。
大腿骨は、ｐＱＣＴにより成長板から近位側に０．６ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍの位置で骨密度測定を行った。
ｐＱＣＴによる骨密度測定の結果、ＰＢＳ群と比較し、０、１、４週において０．６ｍｍではそれぞれ５、７、９％、０．８ｍｍでは１０、１１、１５％、１．０ｍｍでは１６、１３、１１％の骨密度の減少が見られた。０．６ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍの全ての位置において、ＲＡＮＫＬ投与後４週目までＰＢＳ投与群と比較して骨密度の減少が認められ、その後、６週にてＰＢＳ投与群と同程度まで回復した（図４７）。またこれらの結果はマイクロＣＴによる画像解析においても確認できた（図４８）。
上記の結果よりＲＡＮＫＬ投与による骨量減少症モデルマウスは、骨量の回復を比較する上でも有用であることがわかった。即ち、２回のＲＡＮＫＬ投与後、６週までの期間に骨量増加を促進する薬剤の評価が可能であることが分かった。
ＰＴＨによる骨量増加評価
７週令メスのＣ５７ＢＬ／６ＮマウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて２４時間毎に２回投与し、２回目の投与より２４時間後に卵巣摘出を行った。また卵巣摘出の２４時間後から副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を皮下投与にて１６０μｇ／ｋｇで１０日間連続投与した。また比較対照としてＰＢＳ投与及び擬似手術（Ｓｈａｍ）を行い、血清マーカー及び大腿骨の骨密度を測定した。
血清中のＡＬＰは全てのＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群にて約２４％の減少が見られ、Ｃａに変化は見られなかった。またＴＲＡＰ−５ｂではすべてのＰＴＨ投与群においてそれぞれのＰＴＨ非投与群と比較し、約１．５倍（ｐ＜０．０５）の有意な上昇が見られた（図４９）。またＰＢＳ投与＋Ｓｈａｍ群と比較し、ＰＢＳ投与ＯＶＸ群とＲＡＮＫＬ投与Ｓｈａｍ群は差が見られなかった。
骨密度は、成長板から近位側に０．６ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍの位置で測定したところＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ＋Ｓｈａｍ群ではＰＢＳ＋Ｓｈａｍ群と比較しそれぞれ約１７％（ｐ＜０．０５）、１５％（ｐ＜０．０５）、１８％（ｐ＜０．０５）の減少が見られた。またＯＶＸ群ではそれぞれ約５％、４％、８％の減少が見られたが、ＯＶＸ後１０日間では十分に骨密度の減少が見られなかった。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ＋ＯＶＸ群ではＰＢＳ＋Ｓｈａｍ群と比較し、骨密度の減少は見られなかった。ＰＢＳ＋Ｓｈａｍ群にＰＴＨを投与した場合、１．０ｍｍの位置でのみ有意な骨密度の上昇（ｐ＜０．０５）が見られた。ＯＶＸ群にＰＴＨを投与しても、骨密度の上昇は見られるが、有意ではなかった。一方、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ＋Ｓｈａｍ群にＰＴＨを投与した場合は、骨密度の減少は有意に抑制され（ｐ＜０．０５）、ＰＢＳ＋Ｓｈａｍ群の骨密度よりも高かった（図５０）。またこれらの結果はマイクロＣＴによる画像解析においても確認できた（図５１）。
上記の結果よりＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与による骨量減少症モデルマウスは、評価時期及び期間を変えることにより、ビスフォスフォネートのような骨吸収抑制剤のみならず、ＰＴＨのような骨形成促進剤の評価にも利用できることが分かった。また、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与により骨形成が活性化され、ＰＴＨの評価をより短期間かつ高感度に行えることが分かった。
オスでの評価
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス７週令オスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて２４時間毎に３回腹腔内投与し、３回目の投与より１．５時間後に大腿骨、血清を採取しＰＢＳ投与群と比較した。骨代謝マーカーは、血中のＴＲＡＰ−５ｂ、カルシウム（Ｃａ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の測定を行い、大腿骨はｐＱＣＴにより骨密度の測定及びマイクロＣＴを用い画像解析を行った。
ＣａはＰＢＳ投与群と比較し７％上昇が見られたが有意な差は得られず、ＴＲＡＰ−５ｂは約６５％（ｐ＜０．００３）の有意な上昇が見られた。またＡＬＰは変化が無かった（図５２）。大腿骨の骨密度は成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置で測定したところ、０．６ｍｍでは約６％、０．８ｍｍでは約１０％、１．０ｍｍでは約１５％（ｐ＜０．０３）の減少が見られた（図５３）。またこれらの結果はマイクロＣＴによる画像解析においても確認できた（図５４）。
この結果からＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与による骨量減少症モデルマウスは、従来の卵巣摘出によるモデルマウスとは異なり、雌雄を選ばず利用することができることがわかった。またオスでも利用できるモデルとして後肢懸垂、低カルシウム食、神経切除等が知られているが、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与骨量減少モデルはより短期間に作製できる点で、これらより優れている。
他系統のマウスでの評価
ＩＣＲマウス７週令メスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて２４時間毎に３回腹腔内投与し、３回目の投与より１．５時間後に大腿骨、血清を採取しＰＢＳ投与群と比較した。骨代謝マーカーは、血中のＴＲＡＰ−５ｂ、カルシウム（Ｃａ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）の測定を行い、大腿骨はｐＱＣＴにより骨密度の測定及びマイクロＣＴを用い画像解析を行った。
コントロール群と比較し血中Ｃａに変化はなかったものの、ＴＲＡＰ−５ｂはＰＢＳ投与群と比較し１．８倍に上昇した（ｐ＜０．０１）。またＡＬＰは変化が無かった（図５５）。大腿骨の骨密度は成長板より近位側に１．０、１．２、１．４ｍｍの位置で測定したところ、対照群と比べ１．０ｍｍでは、約２０％、１．２ｍｍでは、約２０％、１．４ｍｍでは、約２２％（ｐ＜０．０５）の減少が見られた（図５６）。またこれらの結果はマイクロＣＴによる画像解析においても確認できた（図５７）。この結果からＲＡＮＫＬ投与による骨量減少症モデルマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスだけでなく他系統のマウスにおいても作製することができることがわかった。
フィッシャーラットを用いた検討。
フィッシャーラット７週令メスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて２４時間毎に３回腹腔内投与し、３回目の投与より１．５時間後に血清および大腿骨を採取しＰＢＳ投与群と比較した。血清を用いて骨吸収マーカーであるＣａ、ＴＲＡＰ−５ｂ（ＩＤＳ  Ｌｔｄ，ＳＢ−ＴＲ１０２キット使用）、骨形成マーカーであるＡＬＰを測定し、大腿骨はｐＱＣＴにより骨密度の測定及びマイクロＣＴを用い画像解析を行った。
血清中のＴＲＡＰ−５ｂ、Ｃａ、ＡＬＰはコントロール群と比較し変化がなかったが（図５８）、大腿骨の骨密度は成長板より近位側に３ｍｍの距離を測定したところ約２０％（ｐ＜０．０２）の減少が見られた（図５９）。またこれらの結果はマイクロＣＴによる画像解析においても確認できた（図６０）。この結果からＲＡＮＫＬ投与による骨量減少症モデルは、マウスのみならず、ラットなどの他動物にも利用できることが分かった。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの単回投与
７週令メスのＣ５７ＢＬ／６ＮマウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて腹腔内投与し１２、２４、４８時間後の血清中の骨吸収マーカー、骨形成マーカーを測定した。血清中ヒトＲＡＮＫＬ濃度はＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与前と投与後、２、４、８、１２、２４、４８、７２時間後に採血し、ＥＬＩＳＡを用いて測定した。また、投与後２４、４８時間後の大腿骨の骨密度もｐＱＣＴにて測定した。
血清中ヒトＲＡＮＫＬ濃度は投与後速やかに上昇し、４時間後にピークに達した。その後、急速に減少し、２４時間後には検出できなくなった（図６１）。血清中のＣａに変化は見られず、ＴＲＡＰ−５ｂにおいては投与後１２時間で約１．７倍（ｐ＜０．０１）に有意に上昇した。またＡＬＰにおいてはＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群において約３０％（ｐ＜０．０１）の有意な減少が見られた（図６２）。大腿骨の骨密度は成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置で測定したところ２４時間後、４８時間後の骨密度は対照群と比べ０．６ｍｍではそれぞれ約４％、約５％、０．８ｍｍでは約９％、約９％、１．０ｍｍでは約１２％（ｐ＜０．０５）、約１５％（ｐ＜０．０１）の減少が見られた（図６３）。またこれらの結果はマイクロＣＴによる画像解析においても確認できた（図６４）。
この結果は、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて単回投与で骨量を有意に減少させることを示している。しかしながら、１回の投与と２回の投与を比較すると２回の投与の方が、成長板より近位側に０．６ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍの３点全てで、有意な骨密度の減少が見られることから望ましいと考えられるが、単回投与でも十分に骨密度を減少させることが可能であることを示している。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを２回投与する場合、投与量を２ｍｇ／ｋｇにすることで投与量０．５ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇに比べて骨量減少効果が増加したので、単回投与でも投与量を増加させることにより自由に骨量減少の程度を調節することができる。即ち、単回投与でも例えば投与量を２ｍｇ／ｋｇにすることで、成長板より近位側に０．６ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍの３点全てで、有意な骨密度の減少が見られることが期待できる。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬの７日間連日投与
７週令メスＣ５７ＢＬ／６マウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙにて７日間連続腹腔内投与し、７回目の投与後１．５時間後に血清及び大腿骨の採取を行なった。得られた血清及び大腿骨は血清マーカーの測定及び骨密度をｐＱＣＴにて測定した。
骨吸収マーカーであるＣａは約２０％上昇が見られたが有意な差は得られず、ＴＲＡＰ−５ｂにおいても約３０％の上昇傾向は見られるものの有意な差は見られなかった。またＡＬＰは約３０％の有意な上昇が見られた（ｐ＜０．０２）（図６５）。大腿骨の骨密度は成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの距離を測定したところ、対照群と比べ０．６ｍｍでは、約２１％（ｐ＜０．０５）、０．８ｍｍでは、約３２％（ｐ＜０．０５）、１．０ｍｍでは、約４７％（ｐ＜０．０１）の減少が見られた。（図６６）。またこれらの結果はマイクロＣＴによる画像解析においても確認できた（図６７）。
上記の結果より７日間の連続投与により骨吸収マーカーだけでなく骨形成マーカーの上昇が見られたことから骨吸収と骨形成のカップリング現象が起こっていると推測される。よってこのモデルマウスは骨量減少症、骨粗鬆症研究だけでなくカップリング現象の解明にも利用できることがわかった。
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬのマウス頭蓋冠投与
８週令メスＣ５７ＢＬ／６ＮマウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを頭蓋冠へ３日間投与した。実験開始５日目に大腿骨を採取し、その骨密度をｐＱＣＴにより評価した。実験群としては、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを０．５ｍｇ／ｋｇで１日２回投与する実験群１、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇで１日１回投与する実験群２、比較対照としてＰＢＳを投与するＰＢＳ群の計３群で実験を行った。採取した大腿骨は、ｐＱＣＴにより成長板から近位側に０．６ｍｍ、０．８ｍｍ、１．０ｍｍの位置で海綿骨の骨密度測定を行った。
ｐＱＣＴによる骨密度測定の結果、ＰＢＳ群と比較して、実験群１では計測したすべての位置で骨密度の減少が見られた。実験群２では、成長板より近位側に０．８ｍｍ、１．０ｍｍの位置で骨密度の減少が見られた（図６８）。
また、実験群１と実験群２を比較すると、実験群１の方でより骨密度が減少していたことから、１日当たりのＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与量が同量の場合、単回投与より複数回投与する方がより骨密度減少が顕著であることが分かった。
【実施例６】
【００１１】
骨量減少症モデルマウスを用いてのＲＡＮＫＬシグナル阻害化合物の評価
７週令のＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウスに２０μｇのＧＳＴあるいはＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを２４時間ごとに３回投与した。ＬＦＭ−Ａ１３（２０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈ）あるいは生理食塩水をＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与１時間前に投与した。３回目のＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与より１．５時間後に血中Ｃａの測定及び骨形態計測を行なった。またマイクロＣＴにより３Ｄ画像解析を行なった。
ＴｅｃファミリーキナーゼであるＴｅｃ、ＢｔｋはＫＯマウスを用いた解析等から破骨細胞分化に重要な役割を担っていることが示唆されている。ＬＦＭ−Ａ１３はＴｅｃファミリーキナーゼに属するＢｔｋのＡＴＰ結合領域に特異的に結合することによってＴｅｃキナーゼの活性を阻害する薬剤である（Ｍａｈａｊａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，９５８７−９５９９，１９９９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．，７８，５２４−５３２，２００５）。
マイクロＣＴによる画像解析の結果より、ＬＦＭ−Ａ１３を投与することでＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与による骨量減少が抑えられた（図６９）。また、骨形態計測においてＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与による単位骨量（ＢＶ／ＴＶ）の減少がＬＦＭ−Ａ１３投与によって有意に（ｐ＜０．０１）抑制された（図７０）。骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ）および骨梁数（Ｔｂ．Ｎ）はＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与により減少するが、ＬＦＭ−Ａ１３投与によってそれぞれ有意に（ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１）減少が抑えられた（図７１及び７２）。破骨細胞数（Ｎ．Ｏｃ／Ｂ．Ｐｍ）および吸収面（ＥＳ／ＢＳ）についてはＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与により増加するが、ＬＦＭ−Ａ１３投与によってそれぞれ有意に（ｐ＜０．０１）増加が抑えられた（図７３及び７４）。血中Ｃａ濃度はＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与により増加するがＬＦＭ−Ａ１３投与により有意に（ｐ＜０．０５）抑制された（図７５）。
上記の結果よりＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与骨量減少症モデルがＲＡＮＫＬシグナルを阻害する薬剤の評価及び破骨細胞分化をはじめとするメカニズム研究にも応用できることが分かった。
【実施例７】
【００１２】
選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ラロキシフェン）を用いた薬剤評価の検討
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ雌マウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて２４時間毎に２回腹腔内投与し、２回目の投与より２４時間後に卵巣摘出（ＯＶＸ）あるいは擬似手術（Ｓｈａｍ）を行い、その後２４時間後からラロキシフェン１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ２４時間おきに１４日間経口投与し続けた。またＧＳＴ−ＲＡＮＫＬおよびラロキシフェン投与の比較対象としてそれぞれＰＢＳ（ｉ．ｐ．）、超純水（ｐ．ｏ．）を用いた。ラロキシフェンの１４日目の投与より２４時間後に血清および大腿骨の採取を行った。
採取した血清は、血中の骨吸収マーカー（Ｃａ、ＴＲＡＰ−５ｂ）および骨形成マーカー（ＡＬＰ）の測定を行い、大腿骨は、ｐＱＣＴにより成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの距離にて骨密度、骨塩量、皮質骨厚の測定を行った。またマイクロＣＴにより画像解析を行った。
血中のＣａ、ＴＲＡＰ−５ｂは、大きな変化は見られず、ＰＢＳ投与ＯＶＸ群においてＰＢＳ投与Ｓｈａｍ群よりも有意なＣａの上昇が見られたのみであった（図７６）。ＡＬＰは、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においてＰＢＳ投与Ｓｈａｍ群よりも上昇傾向がみられたが、ラロキシフェン１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ投与により、それぞれ有意に減少した（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）（図７６）。ｐＱＣＴを用い骨密度の測定では、各群間で海綿骨密度に大きな変化は見られなかった。一方、全骨密度ではＰＢＳ投与ＯＶＸ群においてＰＢＳ投与Ｓｈａｍ群よりも有意な減少が見られたが、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においては、減少傾向はあるものの有意な差は見られなかった。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においてはラロキシフェン１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ投与により、成長板より近位側に１．０ｍｍの位置でそれぞれ１０％（ｐ＜０．０５）、１１％（ｐ＜０．０５）増加した（図７７）。また、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においてラロキシフェン１０ｍｇ／ｋｇ投与により、全骨密度は成長板より近位側に０．６，０．８ｍｍの位置でそれぞれ１０％（ｐ＜０．０５）、１１％（ｐ＜０．０５）増加した（図７７）。ｐＱＣＴ測定による皮質骨塩量では、ＰＢＳ投与ＯＶＸ群およびＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においてＰＢＳ投与Ｓｈａｍ群よりも、成長板より近位側に１．０ｍｍの位置でそれぞれ３４％（ｐ＜０．０５）、４９％（ｐ＜０．０１）減少が見られた（図７８）。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においてはラロキシフェン１０ｍｇ／ｋｇ投与により、皮質骨塩量は成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置でそれぞれ８７％（ｐ＜０．０５）、１１８％（ｐ＜０．０１）、１３７％（ｐ＜０．０１）増加した（図７８）。また、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においてラロキシフェン１ｍｇ／ｋｇ投与により、皮質骨塩量は成長板より近位側に０．８、１．０ｍｍの位置でそれぞれ９３％（ｐ＜０．０５）、１３６％（ｐ＜０．０１）増加した（図７８）。同様に、ｐＱＣＴ測定による皮質骨厚では、ＰＢＳ投与ＯＶＸ群およびＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においてＰＢＳ投与Ｓｈａｍ群よりも、成長板より近位側に１．０ｍｍの位置でそれぞれ３５％（ｐ＜０．０５）、４９％（ｐ＜０．０１）有意な減少が見られた（図７９）。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においてはラロキシフェン１０ｍｇ／ｋｇ投与により、皮質骨厚は成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置でそれぞれ９２％（ｐ＜０．０１）、１２３％（ｐ＜０．０１）、１３３％（ｐ＜０．０１）増加した（図７９）。また、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群においてラロキシフェン１ｍｇ／ｋｇ投与により、皮質骨厚は成長板より近位側に０．８、１．０ｍｍの位置でそれぞれ１０１％（ｐ＜０．０５）、１３７％（ｐ＜０．０１）増加した（図７９）。これらの結果は、マイクロＣＴを用いた画像解析においても同様に確認できた（図８０）。この結果よりＲＡＮＫＬ投与による骨量減少症モデルマウスは、ラロキシフェン等の選択的エストロゲン受容体モジュレーターの薬剤評価に利用できることが分かった。
【実施例８】
【００１３】
低用量のＰＴＨを用いた骨量増加評価
７週齢メスのＣ５７ＢＬ／６ＮマウスにＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて２４時間毎に２回腹腔内投与し、２回目の投与より２４時間後から２４時間おきに１０日間連続でＰＴＨを４０、８０μｇ／ｋｇにてそれぞれ皮下投与を行った。またＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ及びＰＴＨ投与の比較対照としてそれぞれＰＢＳを投与した。投下間投与後２４時間のマウスから血清および大腿骨の採取を行った。
採取した血清は、血中の骨吸収マーカー（Ｃａ、ＴＲＡＰ−５ｂ）および骨形成マーカー（ＡＬＰ）の測定を行い、大腿骨は、ｐＱＣＴにより成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置にて全骨密度、皮質骨密度、皮質骨厚、皮質骨塩量、及び骨幹の皮質骨密度の測定を行った。またマイクロＣＴにより画像解析を行った。
血中のＣａ、ＴＲＡＰ−５ｂは、大きな変化は見られず、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群において８０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与により、Ｃａはわずかであるが有意に減少した（ｐ＜０．０５）（図８１）。一方、ＡＬＰは、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群において８０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与により、有意に減少し（ｐ＜０．０１）、４０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与によっても減少傾向を示した（図８１）。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群においては４０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与によりＰＢＳ投与と比べて、海綿骨密度は成長板より近位側に０．６、０．８ｍｍの位置でそれぞれ２５％（ｐ＜０．０１）、２８％（ｐ＜０．０５）増加した（図８２）。また、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群において８０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与により、海綿骨密度は成長板より近位側に０．６ｍｍの位置で２０％（ｐ＜０．０１）増加した（図８２）。一方、全骨密度ではＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群において４０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与によりＰＢＳ投与と比べて、成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置でそれぞれ１４％（ｐ＜０．０１）、１７％（ｐ＜０．０１）、１９％（ｐ＜０．０１）増加した（図８３）。また、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群において８０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与により同様に１０％（ｐ＜０．０１）、１３％（ｐ＜０．０１）、１３％（ｐ＜０．０１）増加した（図８３）。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群においては４０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与によりＰＢＳ投与と比べて、皮質骨密度は成長板より近位側に０．８、１．０ｍｍの位置でそれぞれ４％（ｐ＜０．０１）、５％（ｐ＜０．０１）増加した（（図８４）。また、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与ＯＶＸ群において８０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与により、皮質骨密度は成長板より近位側に１．０ｍｍの位置で３％（ｐ＜０．０５）増加した（図８４）。皮質骨塩量ではＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群において４０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与によりＰＢＳ投与と比べて、成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置でそれぞれ８０％（ｐ＜０．０１）、１２３％（ｐ＜０．０１）、１００％（ｐ＜０．０１）増加し、８０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与によってもそれぞれ４６％（ｐ＜０．０５）、８３％（ｐ＜０．０１）、７７％（ｐ＜０．０１）増加した（図８５）。同様に、皮質骨厚においてもＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群において４０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与によりＰＢＳ投与と比べて、成長板より近位側に０．６、０．８、１．０ｍｍの位置でそれぞれ８６％（ｐ＜０．０１）、１２７％（ｐ＜０．０１）、９８％（ｐ＜０．０１）増加し、８０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与によってもそれぞれ５０％（ｐ＜０．０５）、８９％（ｐ＜０．０１）、７９％（ｐ＜０．０１）増加した（図８６）。一方、骨幹における皮質骨密度はＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与によりＰＢＳ投与のコントロール群と比べ、３％（ｐ＜０．０１）減少した（図８７）。ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群において４０、８０μｇ／ｋｇのＰＴＨ投与によりＰＢＳ投与と比べて、それぞれ３％（ｐ＜０．０１）、３％（ｐ＜０．０１）増加した（図８７）。これらの結果は、マイクロＣＴを用いた画像解析においても同様に確認できた（図８８）。
この結果よりＲＡＮＫＬ投与による骨量減少症モデルマウスは、低用量のＰＴＨによる骨量増加作用を短期間に検出することができることがわかった。
【実施例９】
【００１４】
可溶型ＲＡＮＫＬとＧＳＴの融合タンパク質を１２週令のマウスに投与した骨量減少症モデルマウスの作製
ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬを１ｍｇ／ｋｇにて２４時間毎に１２週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス雌雄に２４時間毎３回腹腔内投与し、３回目の投与より１．５時間後の血清並びに大腿骨及を採取した。採取した血清は、血中の骨吸収マーカー（Ｃａ、ＴＲＡＰ−５ｂ）および骨形成マーカー（ＡＬＰ）の測定を行い、大腿骨は、ｄｕａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ（ＤＥＸＡ）により骨密度を測定し、マイクロＣＴにより画像解析を行った。
血中のＴＲＡＰ−５ｂは雄ではＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与によりＰＢＳ投与と比べて、有意な上昇がみられた（ｐ＜０．０５）。ＣａおよびにＡＬＰは上昇傾向が認められるものの、有意な変化は見られなかった（図８９）。一方、血中のＣａおよびＴＲＡＰ−５ｂは雌においてＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与によりＰＢＳ投与と比べて、それぞれ有意な上昇がみられた（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）。しかしながら、ＡＬＰには上昇傾向が認められるものの、有意な変化は見られなかった（図８９）。ＤＥＸＡによる骨密度測定の結果、ＧＳＴ−ＲＡＮＫＬ投与群で雄雌共にコントロール群と比較しそれぞれ８％（ｐ＜０．０５）、６％（ｐ＜０．０５）の全骨密度減少が見られた（図９０）。これらの結果は、マイクロＣＴを用いた画像解析においても同様に確認できた（図９１）。１２週齢の雌雄マウスの結果よりＲＡＮＫＬ投与による骨量減少症モデルマウスは週齢を選ばず、比較的高週齢のマウスにも利用できることがわかった。また、ＲＡＮＫＬ投与による骨量減少症モデルマウスは１２週齢においても雌雄に関係なく、作製できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００１５】
本発明により、可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与による破骨細胞の直接的な分化・活性化促進という単純なメカニズムにより、迅速に骨量減少症のモデル動物を作出することができる。このようにして得られた骨量減少症モデル動物を用いることにより、薬剤の評価も迅速に行えるようになる。また、本発明の骨量減少症モデル動物においては、ＲＡＮＫＬにより直接破骨細胞の分化・活性化が起こるので、純粋に破骨細胞の作用による骨破壊に対する骨吸収抑制剤の効果を評価できる。さらに、骨量減少症のモデル動物を作製した後、骨量を元に戻す早さに着目すれば、骨量増加薬の評価も可能である。
さらに、卵巣摘出と可溶型ＲＡＮＫＬ又は可溶型ＲＡＮＫＬとエピトープタグの融合タンパク質の投与を組合せることにより、生理的にホルモンバランスが閉経に類似した状態で、通常作製に数週間程度要する卵巣摘出モデルよりも、さらに迅速に骨量減少症モデル動物を作出することができる。
本発明の骨量減少症モデル動物は、骨代謝疾患の治療等に用いる薬剤のスクリーニングに用いることができ、さらに骨代謝疾患の研究用動物として用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表フリーテキスト】
【００１６】
配列番号３〜１８  合成
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６８】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８９】
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【図９０】
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【図１０】
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【図１６】
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【図２２】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５４】
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【図５７】
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【図６０】
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【図６４】
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【図６７】
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【図６９】
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【図８０】
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【図８８】
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【図９１】
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【国際調査報告】
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