(57)【要約】  本発明は、タンパク質として安定であり、抗原性が低く、未分化の膵臓幹細胞を膵島β細胞へと分化する活性を保持し且つ細胞増殖活性が低減されたベータセルリンムテインを提供することを課題とする。本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第３８番目〜第６２番目に相当するアミノ酸配列（但し、第５７番目に対応するＧｌｕは塩基性又は芳香族性のアミノ酸で置換されており、第３８番目〜５０番目に相当するアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されていてもよい）を有するベータセルリンムテインである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含むヒトベータセルリンムテイン：
（ａ）  配列番号１で示されるアミノ酸配列の第３８番目〜第６２番目に相当するアミノ酸配列（但し、第５７番目に対応するＧｌｕは塩基性又は芳香族性のアミノ酸で置換されており、第３８番目〜５０番目に相当するアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されていてもよい）；
（ｂ）  上記（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６３〜８０に相当するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列（但し、第６５番目〜７２番目に相当するアミノ酸配列及び第７７番目〜第８０番目に相当するアミノ酸配列において各々１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていてもよい）；
（ｃ）  上記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１番目〜第３７番目に相当するアミノ酸配列がさらに付加されたアミノ酸配列（但し、付加されるアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入されていてもよい）。
【請求項２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列において第５７番目のＧｌｕがＬｙｓ又はＡｒｇに置換されているヒトベータセルリンムテイン。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項６】
請求項１又は２に記載のヒトベータセルリンムテイン又はその塩の治療有効量並びに薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有する医薬組成物。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のヒトベータセルリンムテイン又はその塩の治療有効量並びに薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有する糖尿病の予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトベータセルリンムテイン、それをコードする遺伝子、該遺伝子を有するベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体及び前記ベータセルリンムテインを含有する糖尿病の予防又は治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトベータセルリンは、１７８アミノ酸からなる前駆体より切り出された８０アミノ酸からなるタンパク質性因子でその全アミノ酸配列が明らかにされている(非特許文献１）。生体内に存在するベータセルリンは極めて微量で、これを取得するのは困難であったが、遺伝子組換え技術を用いた製造法が報告されている（非特許文献２）。ベータセルリンはインシュリンを産生する膵島β細胞のその前駆体細胞からの分化を促進する作用（ＢＴＣ活性とも呼ばれる）を有することが知られており（非特許文献４）、この活性によって膵臓や肝臓における成体幹細胞に作用してインシュリンを産生する膵島β細胞の再生や新生を促すと考えられるため（非特許文献６〜９）、ベータセルリンは、糖尿病（例えば、インスリン依存性糖尿病）や糖尿病における膵臓機能障害などの予防ないし治療に有用であると考えられている（非特許文献５）。【０００３】
一方、ベータセルリンはマウス正常線維芽細胞、血管平滑筋細胞、網膜色素上皮細胞に対して増殖促進活性（ＥＧＦ活性）を有することも知られている（非特許文献３）。このような細胞増殖活性は、目的とする細胞以外の細胞、例えば癌細胞などの増殖をも促進すると考えられるため、ベータセルリンを上記のような糖尿病の予防ないし治療のために生体内に投与することには、安全性の面で懸念されるところがある。よって、ベータセルリンを糖尿病の予防ないし治療の目的で使用するためには、膵島β細胞への分化活性作用を保持したまま、細胞増殖活性を低減ないし抑制する必要がある。【０００４】
ベータセルリンのアミノ酸配列に変異を加えることで、細胞増殖活性を低減しようとする試みが既に報告されている（特許文献１）。しかし、細胞増殖活性は十分に低減されておらず、実用化するには更なる改善の必要がある。例えば、大幅なアミノ酸配列の改変はタンパク質の立体構造に影響を与えるため、タンパク質自体の抗原性を高めることにもなり、またタンパク質のプロテアーゼに対する感受性をも高めることとなるため、活性タンパク質としての安定性が低下し、結果としてベータセルリンの寿命を短くすることになる。さらに、過剰な変異の導入による立体構造の変化は、ＥＧＦ活性に伴ってＢＴＣ活性の低下も引き起こすこととなり、好ましくない。【０００５】
また、ＢＴＣのＣ末端側に通常存在するＣループ構造を欠失した改変型ＢＴＣも報告されている（非特許文献１０）。しかし、この改変型ＢＴＣは、野生型のＢＴＣ前駆体において通常細胞内領域に存在するポリペプチドがＣループの代わりにＣ末端側に付着した構造を有しており、細胞内タンパク質が分泌型タンパク質に付加された場合、高い抗原性を示す可能性が高いため、この改変型ＢＴＣも糖尿病の予防や治療のための用途には適していないと考えられる。【０００６】
よって、タンパク質として安定で抗原性が低く、未分化の膵臓幹細胞を膵島β細胞へと分化する活性を保持し且つ細胞増殖活性が低減されたベータセルリンムテインが従来求められていた。
【特許文献１】特開２０００−３１２５９１号公報
【特許文献２】特願平１０−１９１９８９号公報
【非特許文献１】Sasada et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 190, pp.1173, 1993
【非特許文献２】Seno et al., Growth Factors，vol. 13, pp. 181, 1996
【非特許文献３】Shing et al., Science，259, pp. 1604, 1993
【非特許文献４】Mashima et al., J. Clin. Invest.，vol. 97：1647, 1996
【非特許文献５】Miyagawaら、１９９７年日本糖尿病学会講演要旨集，１２５
【非特許文献６】Kojima, et al.,Nature Medicine, vol. 9, pp. 596, 2003
【非特許文献７】Ogata et al., Endocr. J., vol. 51, pp. 381, 2004
【非特許文献８】Yamada et al., Cell Transplant, vol. 14, pp. 647, 2005
【非特許文献９】Li et al., Diabetes, vol. 53 (3), pp. 608, 2004
【非特許文献１０】Ogata et al., Endocrinology, vol. 146, pp. 4673-4681
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明はタンパク質として安定で抗原性が低く、未分化の膵臓幹細胞を膵島β細胞へと分化する活性を保持し且つ細胞増殖活性が低減されたベータセルリンムテインを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の態様の発明を提供する。
項１、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含むヒトベータセルリンムテイン：
（ａ）  配列番号１で示されるアミノ酸配列の第３８番目〜第６２番目に相当するアミノ酸配列（但し、第５７番目に対応するＧｌｕは塩基性又は芳香族性のアミノ酸で置換されており、第３８番目〜５０番目に相当するアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されていてもよい）；
（ｂ）  上記（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６３〜８０に相当するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列（但し、第６５番目〜７２番目に相当するアミノ酸配列及び第７７番目〜第８０番目に相当するアミノ酸配列において各々１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていてもよい）；
（ｃ）  上記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１番目〜第３７番目に相当するアミノ酸配列がさらに付加されたアミノ酸配列（但し、付加されるアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入されていてもよい）。
項２、配列番号１に示されるアミノ酸配列において第５７番目のＧｌｕがＬｙｓ又はＡｒｇに置換されているヒトベータセルリンムテイン。
項３、項１又は２に記載のアミノ酸配列をコードする遺伝子。
項４、項３に記載の遺伝子を含むベクター。
項５、項４に記載のベクターで形質転換された形質転換体。
項６、項１又は２に記載のベータセルリンムテイン又はその塩の治療有効量並びに薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有する医薬組成物。
項７、項１又は２に記載のベータセルリンムテイン又はその塩の治療有効量並びに薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含有する糖尿病の予防又は治療用組成物。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のベータセルリンムテインは、タンパク質として安定で抗原性が低く、野生型ＢＴＣよりも細胞増殖活性が低減され、且つ膵島β細胞分化誘導活性を保持するため、糖尿病等の治療に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、ヒトベータセルリンムテインとは、ヒト由来のベータセルリンの改変体であり、野生型ヒトベータセルリンと比較して細胞増殖活性が低減されており、且つ膵島β細胞の分化誘導活性を有するものが含まれる。【００１１】
ベータセルリン（以下、ＢＴＣと略記する場合がある）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーに属するタンパク質であり、上皮増殖活性に加え、未分化の膵臓幹細胞をインスリン産生能を有する膵臓β細胞へと分化誘導する活性を有する。本発明において、前記未分化の膵臓幹細胞の膵臓β細胞への分化を誘導する活性を、膵臓β細胞分化誘導活性という。ＢＴＣ前駆体は、分泌シグナル領域、細胞外領域、膜結合領域、細胞内領域の４つのドメインからなり、ヒト由来の前駆体は１７８アミノ酸で構成される。前駆体は膜貫通型タンパク質として存在し、プロテアーゼ消化を受けてシグナル領域及び膜結合領域が切断され、成熟型ＢＴＣが遊離される。【００１２】
本明細書において抗原性とは、タンパク質などが生体内で異物として認識され、一連の免疫反応を誘導する性質をいう。【００１３】
本明細書において、タンパク質が安定であるとは、あるタンパク質がその本質的な機能を発揮するために必要な特有の立体構造を失わない状態にあることを言う。一般に、この構造を不可逆的に大きく変化させるとその本質的な機能を失うばかりか、タンパク質分解酵素に対する感受性が高くなったり、疎水面同士が会合して沈殿を形成したり、あるいは通常は存在しないものとして生体内において抗原性を呈することもある。【００１４】
本発明において、ベータセルリンとはヒト由来の成熟型ＢＴＣを意味する。ヒト由来の野生型ＢＴＣは、配列番号１で表される８０アミノ酸からなる配列を有し、本明細書においては、シグナル配列が除去されたＮ末端側のＡｓｐをアミノ酸番号１とする。ＢＴＣは、ＥＧＦファミリーに特徴的なＥＧＦモチーフを有し、その構造は図１に示される。野生型の成熟型ＢＴＣにおける、３１番目のＡｒｇから８０番目のＴｙｒに相当するポリペプチドによって形成される構造がＥＧＦモチーフと呼ばれ、３つのジスルフィド結合によって形成される３つの特徴的な環状構造が存在する。３つの環は、それぞれ図１に示すようにＡループ、Ｂループ、及びＣループと呼ばれる。【００１５】
ＥＧＦファミリーに属する因子は、細胞膜の受容体ＥｒｂＢに結合して、細胞に生理作用を及ぼす。受容体ＥｒｂＢは、構成するタンパク質の種類によって、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４の４つに分けられる。ＢＴＣは、ＥｒｂＢ１とＥｒｂＢ４に結合することが知られている。【００１６】
本発明のベータセルリンムテインは、ＥｒｂＢ１に対する親和性ないし結合力及び表皮細胞増殖活性が野生型ＢＴＣと比較して低減されており、且つ膵島β細胞分化誘導活性を有する。本発明のベータセルリンムテインのＥｒｂＢ１に対する親和性は、好ましくは野生型ＢＴＣのＥｒｂＢ１に対する親和性の２５％、より好ましくは０％である。本発明のベータセルリンムテインの上皮細胞増殖活性については、好ましくは野生型ＢＴＣの活性に比べて２５％程度、より好ましくは０％である。本発明のベータセルリンムテインのＥａｒＢ４に対する結合を介した膵島β細胞分化誘導活性は、好ましくは野生型ＢＴＣの活性の１００％、より好ましくは７５％程度である。【００１７】
ＥｒｂＢ１に対するベータセルリンムテインの結合力ないし親和性は、例えば、遊離型の受容体を作成し、これに対する親和性を野生型ＢＴＣと比較して測定することができる。【００１８】
細胞増殖活性は、マウス由来の３Ｔ３細胞などを用いた［３Ｈ］チミジンの細胞内への取り込み量の測定や、ＭＴＴアッセイを用いて測定することができる。【００１９】
本発明の一実施形態において、野生型ＢＴＣと比較して細胞増殖活性が低減され、且つ膵島β細胞分化誘導活性を有する好ましいベータセルリンムテインとしては、例えば、以下を例示することができる。【００２０】
（Ａ）：配列番号１で示されるアミノ酸配列において、第５７番目に相当するＧｌｕが塩基性又は芳香族性のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列を有するベータセルリンムテイン。好ましくは、前記第５７番目のＧｌｕは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒから成る群から選択される１つのアミノ酸で置換されており、より好ましくは、前記５７番目のＧｌｕはＬｙｓ又はＡｒｇで置換されている。【００２１】
上記（Ａ）で示されるベータセルリンムテインは、１以上のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていてもよいが、タンパク質の安定性保持及び／又は抗原性抑制の観点から、前記１以上のアミノ酸が置換、欠失又は挿入され得る配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列において第１番目〜第５０番目に相当するアミノ酸配列及び第６５番目〜第８０番目に相当するアミノ酸配列であることが好ましい。より好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において第１番目〜第３２番目、第３７番目、第４７番目〜第５０番目、第６５番目〜７２番目及び第７７番目〜第８０番目に相当するアミノ酸配列において、1つ以上のアミノ酸が置換又は欠失されていてもよい。前記アミノ酸の置換、欠失又は挿入は、ベータセルリンムテインのポリペプチド全体において、０〜５個のアミノ酸に相当する割合で存在することが好ましく、より好ましくはタンパク質全体で０〜３個である。【００２２】
他の実施形態において、本発明に好ましいベータセルリンとしては、以下の（Ａ）及び（Ｂ）を例示することができる。【００２３】
（Ｂ）：以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列を含むヒトベータセルリンムテイン：
（ａ）  配列番号１で示されるアミノ酸配列の第３８番目〜第６２番目に相当するアミノ酸配列（但し、第５７番目に相当するＧｌｕは塩基性又は疎水性のアミノ酸で置換されており、第３８番目〜５０番目に相当するアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、挿入及び／又は欠失されていてもよい）；
（ｂ）  上記（ａ）のアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号１で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号６３〜８０に相当するアミノ酸配列が付加されたアミノ酸配列（但し、第６５番目〜７２番目に相当するアミノ酸配列及び第７７番目〜第８０番目に相当するアミノ酸配列において各々１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていてもよい）；
（ｃ）  上記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号１で示されるアミノ酸配列の第１番目〜第３７番目に相当するアミノ酸配列がさらに付加されたアミノ酸配列（但し、付加されるアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入されていてもよい）。【００２４】
上記（ａ）で示されるアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸が置換、挿入又は欠失され得るアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列において第４７番目〜第５０番目に相当する配列であり、より好ましくは、前記配列において１つ又は２つのアミノ酸が置換又は欠失されている。また、上記（ａ）において、第５７番目に相当するＧｌｕは、好ましくは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒから成る群から選択される１つのアミノ酸で置換されており、より好ましくは、Ｌｙｓ又はＡｒｇで置換されている。【００２５】
上記（ｂ）で示されるアミノ酸配列において１つ又は複数のアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていてもよい配列としては、好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において第６５番目〜７２番目に相当する配列であり、より好ましくは前記配列において１つ又は２つのアミノ酸が置換、欠失又は挿入されていてもよく、特に好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、第７６番目に相当するＧｌｙが他のアミノ酸に置換されていてもよい。【００２６】
また、上記（ｂ）で示されるアミノ酸配列は、上記（ａ）のアミノ酸配列のＮ末端側に、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応してアミノ酸が１つずつ付加されたアミノ酸配列であってもよい。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列において第３７番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第３６番目〜第６２番目に相当するアミノ酸配列、第３５番目〜第６２番目に相当するアミノ酸配列、第３４番目〜第６２番目に相当するアミノ酸配列、第３３番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第３２番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第３１番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第３０番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２９番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２８番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２７番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２６番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２５番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２４番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２３番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２２番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２１番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２０番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１９番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１８番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１７番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１６番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１５番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１４番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１３番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１２番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１１番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１０番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第９番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第８番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第７番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第６番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第５番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第４番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第３番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第２番目〜６２番目に相当するアミノ酸配列、第１番目〜第６２番目に相当するアミノ酸配列であってもよい。【００２７】
上記（ｃ）で示されるアミノ酸配列において、１つ又は複数のアミノ酸が置換、挿入又は欠失していても良い配列は、好ましくは配列番号１で示されるアミノ酸配列において第１番目〜第３０番目に相当するアミノ酸配列であり、より好ましくは、前記のアミノ酸配列において１つ又は２つのアミノ酸配列が置換、欠失又は挿入されていてもよい。【００２８】
また、上記（ｃ）で示されるアミノ酸配列は、上記（ｂ）で示されるアミノ酸配列のＣ末端側に、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応してアミノ酸が１つずつ付加されたアミノ酸配列であってもよい。例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列において第３８番目〜第６３番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第６４番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第６５番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第６６番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第６７番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第６８番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第６９番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７０番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７１番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７２番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７３番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７４番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７５番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７６番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７７番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７８番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第７９番目に相当するアミノ酸配列、第３８番目〜第８０番目に相当するアミノ酸配列であってもよい。【００２９】
本明細書において、アミノ酸配列に関して「相当する」とは、構造上類似するが同一ではない２以上のタンパク質間の対応するアミノ酸残基の位置関係を意味する。【００３０】
本発明のベーセルリンムテインには、その薬学的に許容される塩が含まれる。薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、アンモニウム等の無毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等が挙げられる。また、上記塩には、ポリペプチドと適当な有機酸又は無機酸との反応による無毒性酸付加塩も含まれる。代表的無毒性酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、塩化水素酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、硼酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩(トシレート)、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、スルホン酸塩、グリコール酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる。【００３１】
ベータセルリンムテインの製造方法
本発明のベータセルリンムテインは、特に限定されないが、例えば、野生型のヒトベータセルリンをコードするＤＮＡを用いて、以下に示すような公知の遺伝子工学的手法に従って製造することができる。即ち、野生型ＢＴＣをコードするＤＮＡの特定部位を変異させ、得られた変異型遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを用いて適当な宿主細胞を形質転換してベータセルリンムテインを産生させ、これを精製することによって本発明のベータセルリンムテインを製造することができる。【００３２】
配列番号１に示されるヒト由来の野生型ＢＴＣのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は公知であり、例えば配列番号２に示される。但し、本発明のベータセルリンムテインを得るもととなるＤＮＡ配列は、配列番号２に示されるものに限定されるものではない。配列番号２に示されるＤＮＡの単離方法は、例えば特開平６−８７８９４号公報に記載されている。ＤＮＡ配列に部位特異的に変異（塩基の置換、挿入、欠失など）を加える方法としては、当該技術分野において公知の種々の方法を使用することができ、例えば、Sambrook, J. et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに従って行うことができる。変異をランダムに加える場合は、エラープローンＰＣＲ法を用いることもできる。【００３３】
ここでエラープローンＰＣＲ法とは、ＤＮＡポリメラーゼが、４種の核酸塩基(ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ)のうちの一つを枯渇させた状態にすると残りの３種のうちの一つを取り込む傾向を利用した人為的に突然変異を起こさせる方法である。耐熱性DNA ポリメラーゼによるＰＣＲ反応系で１種類の塩基を少なくし、代わりにｄＩＴＰ（デオキシイノシン３リン酸）を入れた状態にすると、枯渇した塩基の代わりにイノシン塩基が取り込まれてしまう。ＰＣＲの次のサイクルのＤＮＡ合成反応において、イノシンが取り込まれた部位には、７５％の確率で変異が起こる。さらに、マンガンイオン(Ｍｎ２＋)がこの反応系に存在すると変異を起こす効率はさらに高まり、人為的な突然変異を誘起させる方法として利用されている。このような反応系で合成したＤＮＡにはｄＩＴＰが取り込まれたものが出来上がるが、これを大腸菌などの宿主へ導入すると細胞中でＤＮＡポリメラーゼがこれを本来の４種類の塩基へ置換修復するので、ここで変異が確定する。【００３４】
組換えＤＮＡを宿主細胞中に導入するためには、当該技術分野において公知のベクター（例えば、プラスミド、ファージ等）を使用することができ、プロモーターの下流に組換えＤＮＡを挿入することで発現させることができる。好ましい、プラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２などの大腸菌由来のものや酵母由来のプラスミドが挙げられる。宿主細胞としては、例えば大腸菌を用いることができ、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法などの公知の方法を用いて組換えＤＮＡを導入し、形質転換することができる。好ましいプロモーターの例としては、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、及びＴ７プロモーターなどを挙げることができる。【００３５】
このようにして得られる形質転換体を本発明のベータセルリンムテインをコードするＤＮＡが発現可能な条件下で培養することによって、本発明のベータセルリンムテインを製造することができる。宿主細胞が大腸菌である場合、通常液体の栄養培地を使用することができ、炭素源として、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、デキストリンなど、窒素源として、ペプトン、肉エキス、カゼインなどが利用できる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類を必要に応じて培地に添加することができる。【００３６】
培養は、通常２０〜４２℃程度で行い、本発明のベータセルリンムテインが十分に産生される時期を見計らって終了することができるが、一般的には３〜２４時間行う。培地のｐＨは、ｐＨ５〜９程度が好ましい。必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。【００３７】
このようにして宿主細胞を培養した後、目的の改変タンパク質が培養液中に存在する場合は、培養液を採取して、濾過や遠心分離などの手段を用いて改変タンパク質と宿主細胞とを分離し、さらなる精製工程を経てベータセルリンムテインを得ることができる。目的の改変タンパク質が宿主細胞から培養液中に分泌されない場合は、遠心分離などで菌体を回収し、フレンチプレスやソニケーション等の機械的手法を用いて菌体を破砕するか、又はリゾチームなどの酵素を用いて菌体を溶解し、目的のタンパク質を可溶化することができる。この際、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加することもできる。【００３８】
さらに水溶性画分に得られた目的タンパク質を公知の塩析、透析、及び各種のクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過、逆相、イオン交換、アフィニティー）などを適宜組み合せて精製することによって本発明のベータセルリンムテインを得ることができる。このようにして得られる本発明のベータセルリンは、公知の方法を用いて、塩に変換することもできる。【００３９】
本発明のベータセルリンムテインの塩基配列は、Maxam-Gilbert法又はジデオキシ法などを用いて決定することができ、市販されているキットを用いてもよい。【００４０】
得られたベータセルリンムテインの存在は、エンザイムイムノアッセイなどを用いて確認することができる。【００４１】
なお、本発明のベータセルリンムテインは、上述するような精製過程で付加され得るような公知のタグを有していてもよい。【００４２】
本発明のベータセルリンムテインは、糖尿病、糖尿病における膵臓機能障害、インシュリンの分泌低下に伴う膵臓機能低下症などの予防ないし治療のために使用することができる。このような目的で使用される本発明の糖尿病の予防ないし治療用組成物は、本発明のベータセルリンムテインのみから構成されていてもよいが、通常は薬学的に許容される１種以上の担体、賦形剤及び／又は希釈剤などと組み合せて常法に従って製剤化される。【００４３】
薬学的に許容される担体ないし希釈剤としては、例えば、水、薬学的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。【００４４】
添加剤としては、例えば、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、香味剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等が挙げられ、これらの添加剤は製剤の投与単位形態等に応じて適宜選択される。これらのうち、タンパク質製剤等に通常使用される成分、例えば、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等が好ましく選択される。【００４５】
安定化剤ないし賦形剤として具体的には、ヒト血清アルブミン、グリシン、グルタミン酸等のＬ−アミノ酸、グルコース、マンノース、ガラクトース等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、コーンスターチ、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類及びそれらの誘導体等の糖類等を挙げることができる。【００４６】
界面活性剤としては、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等の界面活性剤を挙げることができる。【００４７】
緩衝剤としては、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸及びそれらの塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）を挙げることができる。【００４８】
等張化剤としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等が挙げられる。【００４９】
本発明の糖尿病の予防ないし治療組成物の投与経路及び投与剤形は、治療に際して最も効果的なものを使用することが望ましい。投与経路としては、例えば、経口投与、口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与が挙げられ、投与剤形としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。【００５０】
経口投与に適当な剤形としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等が挙げられる。乳剤やシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として使用して製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を添加剤として使用して製造できる。【００５１】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤、噴霧剤等が挙げられる。例えば、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液又はこれらの混合物を担体として使用して製造できる。座剤は、カカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等を担体として使用して製造できる。噴霧剤は、受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体として、乳糖、グリセリン等を使用して製造でき、エアロゾル、ドライパウダー等に製剤化できる。【００５２】
なお、本発明のベータセルリンムテインは、リポソーム内に取り込んだ状態で、上述するような本発明の糖尿病の予防ないし治療用組成物とすることもできる。【００５３】
本発明のベータセルリンムテインの投与量及び投与回数は、目的とする予防ないし治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重、及び症状等により異なるが、投与量は、有効成分量に換算して成人１日当たり通常０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から適宜選択できる。投与回数は、１日１回から数回の範囲から適宜選択できる。投与対象は特に限定されないが、例えば、ヒトを含む哺乳動物等が挙げられる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、これは本発明の範囲を限定するものではない。【００５５】
実施例１
組換えＤＮＡの作製
エラープローンＰＣＲ法を用いて、ヒトベータセルリンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡに変異を加えた。２０ｎｇのｐＢＯ９１０（Ｔ７プロモーター−Ｈｉｓ−Ｍｙｃ−ＢＴＣ−ＨＡ−Ｔ７ターミネータ）をテンプレートに、ＢＴＣのＥＧＦモチーフ上流をコードするセンスプライマー（５’−ｇａｃｃｃｙｇａｇｇａａａａｃｔｇｔｇｃａｇｃｔａｃｃａｃｃａｃａｃａａｔｃａａａｇｃｇｇａａａ−３’（配列番号６））、ＢＴＣのＣ末端に融合するＨＡ−ｔａｇをコードするリバースプライマー（５‘−ｇａｔｃａａｇｃｇｔａａｔｃｔｇｇａａｃａｔｃｇｔａｔｇｇｇｔａｇ−３’（配列番号７））を用いて０．２μＭ  ｄＴＴＰ、０．２μＭ  ｄＧＴＰ、０．２μＭ  ｄＣＴＰ、０．２μＭ  ０．０２μＭ  ｄＡＴＰ、０．２μＭ  ｄＩＴＰ及びＭｎＣｌ２含有の溶液を調製し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使ってＰＣＲを行った。反応条件は９５℃で５分間加熱した後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒のサイクルを２５回繰り返し、最後に７２℃で５分間反応させた。反応液をアガロースゲル電気泳動して増幅されたｅｇｆモチーフをゲルから切り出し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ(ＱＩＡＧＥＮ社製)を用いてＤＮＡを抽出した。抽出した液を１μＬ使って再びｅｇｆモチーフを増幅するＰＣＲを行った。２０ｎｇのｐＢＯ９１０をテンプレートとし、抽出したＤＮＡフラグメントをプライマーにして、Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行った。反応条件は９５℃で２分間加熱した後、９５℃で１分、５５℃で１分、６８℃で２０分のサイクルを２０回繰り返し、最後に７２℃で１０分間反応させた。最後に制限酵素ＤｐｎＩで処理し、テンプレートを消化した。【００５６】
実施例２
形質転換体の作成及びベータセルリンムテインの発現
上記のエラープローンＰＣＲ法を用いて作成したＢＴＣの組換えＤＮＡライブラリー１〜２μＬをＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳコンピテントセルに形質転換して１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天培地に植菌し一晩３７℃で培養した。各ウェルに４００μｌずつ１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび１５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール含有ＬＢ培地（ＬＢ−Ａｍｐ１００Ｃｍ１５）を４００μｌずつ注いだ１ｍｌディープウェルプレートにコロニーを植菌し、Ｄｅｅｐ  Ｗｅｌｌ  Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ（ＴＡＩＴＥＣ社製）で３７℃で一晩震盪培養した。この培養液を８５０μｌ／ウェルでＬＢ−Ａｍｐ１００Ｃｍ１５を加えた２ｍｌディープウェルプレートの各ウェルに５０μｌずつ加え更に３時間培養した。その後、５ｍＭ  ＩＰＴＧ含有ＬＢ−Ａｍｐ１００Ｃｍ１５を１００μｌ／ウェルで加えて８時間培養し、集菌し、−８０℃で保存した。次にこれを解凍し、ＰＢＳを１５０μｌ／ウェル加えて懸濁した。再び−８０℃で凍結した後、解凍して、プレート用カップホーンを取り付けたソニケータで破砕した（１分間を２０回、各回の間には氷上で1分間冷却した）。その後、チップ型のソニケータで各ウェルを１０秒間ずつ処理し、１２００ｒｐｍで２０分間遠心して上清を回収した。【００５７】
実施例３
ベータセルリンムテインの精製
各変異体はスクリーニングの時点でＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換済みである。この菌体をまず２０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ１００Ｃｍ１５で一晩培養した。次に３００〜４００ｍｌの培地に前培養液を培養液量の１／２０加えてＯＤ６００が０．６〜１になるまで３７℃で震盪培養した（１５０〜１６０ｒｐｍ）。それから、１Ｍ  ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように加えて更に３〜４時間培養した。培養後、５０００ｒｐｍ、１０分、２０℃で遠心して菌体を回収し使用するまで−８０℃で保存した。次に菌体を解凍して１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％シュークロース（ｐＨ７．４）を１０ｍｌ加えて菌体を懸濁した。そして４℃で１時間ゆっくり震盪した。エタノールドライアイスバスに浸して急速凍結させた後再び解凍し、菌体を２分間、３〜５回（各回終了後２分間氷上に静置）のソニケーションを行い、菌体を潰した。これを１１０００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心して上清を捨てた。沈殿は０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で洗った（３回、各回終了後１０分間遠心）。この沈殿を２〜４ｍｌの０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、６Ｍ  Ｇｄｍ−Ｃｌ  （ｐＨ８．５）に溶かし、１００ｍｌナス型フラスコに移した。そして、終濃度０．１Ｍとなるようにメルカプトエタノールを加え、脱気、窒素置換を行った。その後、３７℃で１時間震盪還元した。そしてこの還元液を２０倍液量の１０ｍＭＴｒｉｓ, ０．５ｍＭ ＧＳＳＧ （ｐＨ８．５）に分散して４℃で一晩静置し、巻き戻しを行った。次に巻き戻し液を１２０００ｒｐｍ、２０分間遠心して上清を回収し、これを５０ｍＭリン酸カリウムバッファ（ｐＨ７．５）で平衡化したＮｉ−ＮＴＡＡｇａｒｏｓｅカラム（ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ： １ｍｌ）に通した。５０ｍＭリン酸カリウムバッファと１０ｍＭイミダゾール含有リン酸カリウムバッファでそれぞれカラムを洗浄した後、１５０ｍＭイミダゾール含有リン酸カリウムバッファで溶出した。ピークフラクションを回収してこれをＭＷＣＯ６〜８０００の透析膜に入れ、４℃でＵＰＷに対して透析を行った。外液は３時間〜一晩おきに４回交換した。透析後、１２０００ｒｐｍ、２０分、４℃で遠心して上清を遠心濃縮機で凍結乾燥した。そして、これを−８０℃で保存した。【００５８】
実施例４
エンザイムイムノアッセイを用いた測定
９６穴プレートに１００ｎｇ／ウェルとなるように可溶性ＥｒｂＢ 受容体（ｓＥｒｂＢ−ＨＦ）を加え４℃で一晩静置した。０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳを２００μｌ／ウェル加えて室温で１時間または４℃で一晩ブロッキングを行った。ＰＢＳＴでウェルを洗い、実施例３で調製した大腸菌抽出液を３０倍と９０倍に希釈して各サンプルの希釈液を２ウェルに１００μｌずつ加えた。室温で１時間反応させたあと、ＰＢＳＴで洗った。そこへ、２０００倍希釈したペルオキシダーゼで標識されたａｎｔｉ−ＨＡタグ抗体を５０μｌ／ウェルを加え、更に１時間反応させた。ＰＢＳＴで各ウェルを洗ったのち、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ反応基質ＯＰＤを加え室温で３０分間反応させ、最後に１Ｎ硫酸でクエンチングしてプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ｓＥｒｂＢ１−ＨＦに対する結合力が顕著に低下している変異体ＢＴＣ−Ｅ８８Ｋが得られた。なお、ＢＴＣ−Ｅ８８Ｋとは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、５７番目に相当するＧｌｕがＬｙｓに置換されている変異型ＢＴＣである。【００５９】
これをさらに確認するために、ヒスチジンカラムを用いて精製したＢＴＣ−Ｅ８８ＫとＢＴＣを競合させることによりｓＥｒｂＢ−ＨＦへの結合特異性を調べた。ＢＴＣあるいはＢＴＣ−Ｅ８８ＫをＰＢＳで１ｎｇ／μｌに希釈して９６ウェルプレートに５０μｌ／ウェル加えてシールして４℃で１２時間置いた。次に液を捨てて、０．１％ＢＳＡ−ＰＢＳを２００μｌ／ウェル加えて４℃で一晩置き、ブロッキングした。一方、ＢＴＣ濃度を６μＭから３倍毎の系列希釈、あるいは２００ｎＭから２倍系列希釈で１０本チューブを作り、そこへ等量の５０ｎＭ  ｓＥｒｂＢ１−ＨＦまたは５００ｎＭ  ｓＥｒｂＢ１−ＨＦまたは５０ｎＭ  ｓＥｒｂＢ４−ＨＦを混合して３０分間室温で静置したものをリガンド−受容体混合液とした。ブロッキングが終わったプレートは液を捨てて２００μｌのＰＢＳＴで各ウェルを３回ずつ洗浄した。そして、リガンド-受容体混合液を９０μｌ／ウェル加えて３０分間反応させた。このときＢＴＣを固定したプレートには２００ｎＭから２倍系列希釈のＢＴＣと５０ｎＭｓＥｒｂＢ１−ＨＦあるいは６μＭから３倍系列希釈のＢＴＣと５０ｎＭｓＥｒｂＢ４−ＨＦのリガンド-受容体混合液を、また、ＢＴＣ−Ｅ８８Ｋを固定したプレートには６μＭから３倍系列希釈のＢＴＣと５００ｎＭ  ｓＥｒｂＢ１−ＨＦあるいは６μＭから３倍系列希釈のＢＴＣと５０ｎＭ  ｓＥｒｂＢ４−ＨＦのリガンド−受容体混合液を反応させた。それから、各ウェルをＰＢＳＴで３回洗い、ＰＢＳで１００００倍希釈したＨＲＰ標識ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体を５０μｌ／ウェル加えて室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴで８回洗い、０．０５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５）で希釈した０．４５ｍｇ／ｍｌ  ＯＰＤ溶液（０．０３％過酸化水素含有）を１００μｌ／ウェル加えて１５分間発色反応させた。それから、１Ｎ硫酸を５０μｌ／ウェル加えて色止めをして、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。この結果からリガンド-受容体結合の解離定数を求めたところ、ＢＴＣ−Ｅ８８ＫはｓＥｒｂＢ４−ＨＦとの親和性がＢＴＣと同程度であるのに対し、ｓＥｒｂＢ１−ＨＦとの結合が約１６０倍弱くなっていることが示された（図２）。【００６０】
このｓＥｒｂＢ１−ＨＦとの結合の著しい低下は、１アミノ酸が置換したことによる構造の変化による結合機能の消失を示すと考えられる。しかし、ｓＥｒｂＢ４−ＨＦに対する親和性が野生型ＢＴＣに比べて変化していないことを考慮すると、野生型ＢＴＣとＢＴＣ−Ｅ８８Ｋの間に立体構造の著しい変化は無いと考えられる。すなわち、ＢＴＣ−Ｅ８８ＫとｓＥｒｂＢ１−ＨＦの接触面で静電的反発あるいは立体的障害が起こっていると考えることが妥当である。したがって、ＢＴＣ−Ｅ８８Ｋにおいて立体構造が大きく変化したことに起因する抗原性発現の懸念や安定性を失って半減期が著しく低下する恐れはないと考えられる。【００６１】
ここで用いる可溶性ＥｒｂＢ受容体、ｓＥｒｂＢ−ＨＦ、とは、ＥｒｂＢ１受容体またはＥｒｂＢ４受容体の細胞外領域のカルボキシル末端側に抗体分子、例えばマウスＩｇＧ、の重鎖に由来するヒンジ領域（抗体重鎖分子の二量体形成に必要なジスルフィド結合を担っているＣｙｓ残基が存在する領域）を融合し、さらにそのカルボキシル末端側にＦＬＡＧタグ（アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫＧＣ（配列番号５）を有し、抗ＦＬＡＧ抗体（シグマアルドリッチ社製）で認識される）を融合したタンパク質である。このタンパク質をコードする遺伝子をＣＭＶプロモーターなどの適当なプロモーターの下流につないだプラスミドを作成して、ヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞などで定常的に発現させるとホモ2量体として培地中に分泌発現させることができる。本来ＥｒｂＢ受容体は膜結合型タンパク質であり、細胞膜上で特異的なリガンドと結合して２量体を形成して細胞内へシグナルを伝達する機能を持つ。しかし、このような完全な構造ではなく、細胞外ドメインのみを２量体化させても本来のリガンドと結合する能力を表すことが知られている（Fitzpatrick et al., FEBS Lett. 1998; 431 (1): 102-106）ので、細胞の存在しない溶液中で特異的リガンドと受容体の結合を調べるのに有用である。このような２量体形成はヒンジ領域の寄与によって効率的に生成するものであり、ヒンジ領域を持たない可溶性ＥｒｂＢ受容体は２量体形成を示さず、リガンドとの特異的結合能力を示さない。【００６２】
実施例５
細胞増殖活性の測定
上記で得られたｓＥｒｂＢ１−ＨＦに対する親和性の低下したベータセルリンムテインについて、次のようにして細胞増殖活性を測定した。マウス正常繊維芽細胞株Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３のクローンＡ３１−７１４Ｃ４細胞を１０％ＦＢＳを含むＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭで希釈して４ｘ１０５細胞／ｍｌに希釈し１ウェルあたり５０μｌ（２０００個）ずつ加え、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間培養した。次いで、培地を吸引除去し速やかに５０μｌの血清を含まないＥａｇｌｅ’ｓＭＥＭに置換した。そして、あらかじめ１％  ＦＢＳを含むＥａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭで希釈したリガンド（ｗｔＢＴＣ又は上記実施例で得たＢＴＣ−Ｅ８８Ｋ）含有培地を５０μｌ／ｗｅｌｌ（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）加えて更に４８時間培養した。それから各ウェルへＰＢＳに溶解した５ ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴを２０μｌずつ加えて６時間、３７℃で反応させてＭＴＴフォルマザンを生成させた。その後、１０％ ＳＤＳ、０．０２Ｎ  ＨＣｌを１００μｌ／ｗｅｌｌ添加して３７℃で一晩反応させＭＴＴフォルマザンを溶解させた。そして、５７０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。得られた結果を図３に示す。【００６３】
実施例６
膵島β細胞分化誘導活性の測定
ラット膵臓腫瘍由来細胞株ＡＲ４２ＪのクローンであるＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞を用いて、ＢＴＣによるインスリン産生細胞への分化誘導活性を評価した。通常アクチビンＡはＡＲ４２Ｊ細胞の分化誘導を起こすが、ランゲルハンス島細胞に特有の膵ペプチド(pancreatic peptide, 機能の詳細は未詳)の発現を促すが、インスリン産生細胞へと分化を成熟させるには不十分で、この過程を促進して分化を進行させるにはＢＴＣが必須であると考えられている。ＡＲ４２Ｊ−Ｂ１３細胞は５％ＣＯ２存在下３７℃で１０％子牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でディッシュに接着させて培養した。分化の測定方法はMashimaら（J. Clin. Invest. 1996,97(7):1647-1654）の方法に従った。直径３５ｍｍの細胞培養用プラスチックディッシュの底にあらかじめ敷いておいたガラスカバーグラス上に２ｘ１０５個の細胞を播き接着させた。その後、２ｎＭのアクチビンＡ存在下に、ＢＴＣあるいは本発明のＢＴＣムテインを２ｎＭになるように添加して４８時間培養した。細胞を固定した後、抗インスリン・モノクローナル抗体（スプリングバイオサイエンス社製、クローンＳＰＭ１３９）を用いて免疫化学的に染色して、顕微鏡下で写真を撮影し（図５）、インスリン陽性細胞の数を数えた。一方、４’，６-ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を用いて核を染色してその数を全細胞数とした。インスリン陽性細胞の全細胞数に対する割合を図４に示す。また、図５ではインスリン陽性細胞が染色されているが、ＢＴＣＥ８８Ｋを加えた時が強く染色されており、インスリン産生がより強く促進されることが示唆される。【００６４】
実施例７
配列決定 
ＢＴＣムテインをコードする遺伝子の配列は、Ｔ７プロモーター・プライマー （５‘−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号３））およびＴ７ターミネータ・プライマー （５‘−ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ−３’（配列番号４））を用いて、プラスミドＤＮＡを鋳型としてＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ(Perkin Elmer Applied Biosystems社製)により得られる反応産物をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ (Perkin Elmer Applied Biosystems社製)で解析して決定した。さらに、得られた塩基配列をＢＴＣの塩基配列と比較して突然変異の場所を特定、さらにアミノ酸へ翻訳して、置換されたアミノ酸を特定した。【００６５】
実施例８
タグを有しないＢＴＣムテインのＥｒｂＢ１及びＥｒｂＢ４への結合力
ヒトベータセルリンを発現するプラスミドｐＢＯ４１ (Seno M et al., 1996, Growth Factors. 13(3-4):181-191記載)のＤＮＡを鋳型として、２１ｍｅｒのＤＮＡプライマー５‘−ＧＧＧＣＧＴＣＴＧＴＴＴＧＧＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号８）(＃１３８５)を用いて部位特異的変異を行いコドンＧＡＧをＡＡＡへ置換することによりヒトＢＴＣの５７番目のアミノ酸残基ＧｌｕをＬｙｓ残基に置換した。これによりタグ配列を持たないＢＴＣ−Ｅ８８Ｋを発現するプラスミドベクターｐＢＯ１２６０を構築した。【００６６】
同様に２１ ｍｅｒのＤＮＡプライマー５‘−ＧＧＧＣＧＴＣＴＧＧＣＧＧＧＣＣＡＣＣＡＣ−３’（配列番号９）(＃１３８６)を用いて部位特異的変異を行いコドンＧＡＧをＣＧＣへ置換することによりヒトＢＴＣの５７番目のアミノ酸残基ＧｌｕをＡｒｇ残基に置換した。これによりタグ配列を持たないＢＴＣ−Ｅ８８Ｒを発現するプラスミドベクターｐＢＯ１２６７を構築した。【００６７】
これらのＢＴＣムテインを発現するプラスミドを用いて、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＬｙｓＳ株を形質転換し得られたコロニーを、培養し、ＩＰＴＧで組換えタンパク質の発現を誘導した。これらの菌体をそれぞれ回収して、Seno M et al., 1996, Growth Factors. 13(3-4):181-191に記載された方法に従って精製を行い、ＢＴＣムテインＢＴＣ−Ｅ８８ＫおよびＢＴＣ−Ｅ８８Ｒを得た。【００６８】
これらのＢＴＣムテインおよび野生型ベータセルリンＢＴＣ−ｗｔを、９６ウエルプレートに１０ｎｇ／ｗｅｌｌで固相化し、これを異なる濃度の可溶性ＥｒｂＢ１−ＨＦと可溶性ＥｒｂＢ４−ＨＦを用いて検出した。実施例４に記述したとおり、可溶性ＥｒｂＢ１−ＨＦと可溶性ＥｒｂＢ４−ＨＦのＣ末端には抗体分子のヒンジ領域とＦＬＡＧ−ｔａｇが付加している。可溶性受容体はヒンジ領域を介して２量体を形成するデザインでＥＧＦやＴＧＦαを細胞表面上の受容体と同程度の強さの親和性を持つ。固相化されたＢＴＣムテインおよびＢＴＣ−ｗｔに結合した可溶性受容体にホースラディッシュ由来ペルオキシダーゼを結合させ、ＯＰＤ（オルトフェニレンジアミン）を用いて１０分間反応して発色させ４９２ｎｍの吸収を測定した。可溶性ＥｒｂＢ１−ＨＦとの結合力を測定した結果を図６に、可溶性ＥｒｂＢ４−ＨＦとの結合力を測定した結果を図７に示す。【００６９】
図６及び図７に示す結果より、ＢＴＣムテインＢＴＣ−Ｅ８８ＫおよびＢＴＣ−Ｅ８８Ｒはともに可溶性ＥｒｂＢ１−ＨＦへの結合が顕著に低下し、可溶性ＥｒｂＢ４−ＨＦへの結合はＢＴＣ−ｗｔのものと実質的に変わらないことが認められた。これはタグを付加している場合とほとんど同様の結果であることから、ムテインを発現するときのタグの影響は無いと考えられた。【００７０】
このようにして得られた。ムテインＢＴＣ−Ｅ８８Ｋを用いてＡＲ４２Ｊ細胞への効果を実施例６と同様の方法により調べた。添加後４８時間で細胞を固定し抗インスリン抗体により蛍光染色して観察した。その結果を図８に示す。図８に示されるように、タグが付加されていないＢＴＣ−Ｅ８８Ｋはタグが付加しているものと同程度の活性を示したので、タグの付加により活性への影響を考慮する必要は無いことがわかった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、野生型ＢＴＣの構造を示す。
【図２】図２は、本発明のベータセルリンムテインの受容体ＥｒｂＢ１及び４に対する結合力を示す。
【図３】図３は、本発明のベータセルリンムテインについてのＭＴＴアッセイの結果を示す。
【図４】図４は、本発明のベータセルリンムテインの膵島β細胞誘導活性を測定した結果を示す。
【図５】図５は、実施例においてインスリン陽性細胞を染色し、顕微鏡かで撮影した写真を示す。
【図６】図６は、ＢＴＣムテインBTC-E88KおよびBTC-E88Rと可溶性ＥｒｂＢ１-HFとの結合力を測定した結果を示す。
【図７】図７は、ＢＴＣムテインBTC-E88KおよびBTC-E88Rと可溶性ＥｒｂＢ４-HFとの結合力を測定した結果を示す。
【図８】図８は、ＢＴＣムテインＢＴＣ−Ｅ８８Ｋによる膵島β細胞分化誘導活性を測定した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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