(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス除去フィルターに蛋白製剤中間製品を所定の蛋白質濃度および圧力で流す濾過方法において、
（１）蛋白製剤中間製品の入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、蛋白製剤中間製品の入口、出口のうち少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルであり、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルターを用い、
（２）該ウイルス除去フィルターに、精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として１時間以上５時間以下流し、
（３）ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る
濾過方法。
【請求項２】
請求項１に記載のウイルス除去フィルターに、
（４）精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として３時間以上５時間以下流し、
（５）ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る
請求項１に記載の濾過方法。
【請求項３】
ウイルスが、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、レオウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科、パポーバウイルス科のいずれかより選択されるウイルスである請求項１または２に記載の濾過方法。
【請求項４】
蛋白製剤中間製品中の蛋白質が、免疫グロブリンである請求項１乃至３のいずれかに記載の濾過方法。
【請求項５】
免疫グロブリンが、免疫グロブリンＧである請求項４に記載の濾過方法。
【請求項６】
ウイルス除去膜が、親水化された合成高分子よりなる請求項１乃至５のいずれかに記載の濾過方法。
【請求項７】
ウイルス除去膜が、中空糸型ウイルス除去膜である請求項１乃至６のいずれかに記載の濾過方法。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれかに記載の濾過方法の蛋白質濃度および入口圧力条件を、スケールアップしたときの運転条件として採用する方法。
【請求項９】
更に、請求項１乃至７のいずれかに記載の濾過方法の濾過時間を、スケールアップしたときの運転条件として採用する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ウイルス除去膜が、開孔率が大きい粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造層を有する、熱可塑性樹脂を含む微多孔膜であって、該粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが５．０μｍ以上であり、該緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であって、かつ該粗大構造層と該緻密構造層が一体化している多層微多孔膜である請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程における蛋白製剤中間製品の濾過方法及びこの方法に用いられるウイルス除去フィルターに関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬、組換え蛋白医薬、血漿製剤、血漿分画製剤、等の蛋白製剤には原料由来、工程由来のウイルスの混入が懸念されるため、これらの蛋白製剤を製造する過程でウイルスを不活化、あるいは除去する必要がある。【０００３】
蛋白製剤に混入するおそれのあるウイルスの不活化方法としては、加熱処理や化学薬品による処理などが行なわれているが、それら単独の処理だけではウイルスの不活化は充分でなく、またこれらの方法では蛋白製剤中の有用蛋白質そのものも変性するおそれがある。このような背景から、化学的な変性を伴わない物理的なウイルス除去手段として、濾過膜によるウイルスの分離除去が実施されている。【０００４】
ウイルス除去用の濾過膜としては、セルロースのような天然素材よりなる膜、あるいはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）のような合成高分子素材よりなるウイルス除去膜が知られている（非特許文献１〜４）。【０００５】
これらのウイルス除去膜を装填したウイルス除去装置による蛋白製剤中間製品の濾過は、短時間でより多くの量の蛋白質を濾過でき、かつ充分に高いウイルス除去性能をもってウイルスを除去できることが理想である。しかし実際には、例えばセルロース膜では２０ｍｇ／ｍｌ以上の蛋白質濃度でも膜の目詰まりを起こし難く、濾過できるが、耐圧性が低く、実使用圧力を１００ｋＰａ程度までしか上げられない、あるいは合成高分子膜では、耐圧性は高く、実使用圧力を３００ｋＰａ程度まで上げても問題ないが、蛋白質濃度を２０ｍｇ／ｍｌ程度に上げると膜が目詰まりを起こし、濾過できなくなってしまうというような問題があった。そのため、１０ｍｇ／ｍｌ以下の低濃度での濾過が行なわれるのが普通だった（特許文献１）。【０００６】
これらの理由から、各種クロマトグラフィーや限外濾過などの精製工程により高められた、高い蛋白質濃度の蛋白製剤中間製品を高圧でウイルス除去装置に流す濾過条件での、濾過方法の研究は進んでおらず、またこの方法に適するウイルス除去フィルターの開発も進んでいなかった。
また蛋白製剤中間製品は、蛋白製剤を製造するための貴重な材料であるため、製造スケールでウイルス除去工程の濾過方法、運転条件を決定することは、時間的にも経済的にも困難を伴うため、本発明者は、予め小スケールでウイルス除去工程の濾過方法、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度、ウイルス除去フィルターの入口圧力、及び／または濾過時間の運転条件を決定しておき、これをスケールアップした蛋白製剤の製造工程に適用することの重要性を強く認識した。
【特許文献１】特開２００４−２７７３２３号公報
【非特許文献１】Manabe.S、Removal of virus through novel membrane filtration method.、Dev. Biol. Stand.、(1996)88: 81-90.
【非特許文献２】Brandwein Hら.、Membrane filtration for virus removal.、Dev Biol (Basel).、(2000)102: 157-63.
【非特許文献３】Aranha-Creadoら、Clearance of murine leukaemia virus from monoclonal antibody solution by a hydrophilic PVDF microporous membrane filter.、Biologicals. (1998) Jun;26(2):167-72.
【非特許文献４】L. Moce-Llivinaら、Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions、Journal of Virological Methods 、(2003) April、 Vol.109, Issue 1,Pages 99-101.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記問題点に鑑み本発明の課題は、高い蛋白質濃度の蛋白製剤中間製品を高い圧力でウイルス除去フィルターに流す条件下での、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の濾過方法を提供することであり、またこの方法に用いられるウイルス除去フィルターを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、蛋白製剤中間製品の入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、蛋白製剤中間製品の入口、出口のうち少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルであり、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルターを用い、該ウイルス除去フィルターに、精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として１時間以上５時間以下流し、ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る濾過方法を用いることにより、工業的スケールにスケールアップした時の蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度、ウイルス除去フィルターの入口圧力、及び／または濾過時間の運転条件を決定することができ、ウイルス除去工程の設備設計にも有用であることを見出し、本発明を得るに至った。【０００９】
即ち本発明は以下を含む。
［１］ウイルス除去フィルターに蛋白製剤中間製品を所定の蛋白質濃度および圧力で流す濾過方法において、
（１）蛋白製剤中間製品の入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、蛋白製剤中間製品の入口、出口のうち少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルであり、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルターを用い、
（２）該ウイルス除去フィルターに、精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として１時間以上５時間以下流し、
（３）ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る
濾過方法。
［２］［１］に記載のウイルス除去フィルターに、
（４）精製工程により蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下に高められた蛋白製剤中間製品を、蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の条件で、濾過時間として３時間以上５時間以下流し、
（５）ウイルス除去率ＬＲＶ≧３の蛋白製剤中間製品の濾液を得る
［１］に記載の濾過方法。
［３］ウイルスが、パルボウイルス科、レトロウイルス科、フラビウイルス科、レオウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、ピコルナウイルス科、パポーバウイルス科のいずれかより選択されるウイルスである［１］または［２］に記載の濾過方法。
［４］蛋白製剤中間製品中の蛋白質が、免疫グロブリンである［１］乃至［３］のいずれかに記載の濾過方法。
［５］免疫グロブリンが、免疫グロブリンＧである［４］に記載の濾過方法。
［６］ウイルス除去膜が、親水化された合成高分子よりなる［１］乃至［５］のいずれかに記載の濾過方法。
［７］ウイルス除去膜が、中空糸型ウイルス除去膜である［１］乃至［６］のいずれかに記載の濾過方法。
［８］［１］乃至［７］のいずれかに記載の濾過方法の蛋白質濃度および入口圧力条件を、スケールアップしたときの運転条件として採用する方法。
［９］更に、［１］乃至［７］のいずれかに記載の濾過方法の濾過時間を、スケールアップしたときの運転条件として採用する［８］に記載の方法。
［１０］［１］乃至［７］のいずれかに記載の濾過方法に用いられるウイルス除去フィルターであって、蛋白製剤中間製品の入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、蛋白製剤中間製品の入口、出口のうち少なくとも入口は６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造のノズルであり、ウイルス除去膜の有効膜面積が０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下であるウイルス除去フィルター。
［１１］ウイルス除去膜が、中空糸型ウイルス除去膜である［１０］に記載のウイルス除去フィルター。
［１２］ウイルス除去膜が、開孔率が大きい粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造層を有する、熱可塑性樹脂を含む微多孔膜であって、該粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが５．０μｍ以上であり、該緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であって、かつ該粗大構造層と該緻密構造層が一体化している多層微多孔膜である［１０］または［１１］に記載のウイルス除去フィルター。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の濾過方法を用いることにより、高い蛋白質濃度の蛋白製剤中間製品を高い圧力でウイルス除去フィルターに流す条件下での、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定することができる。即ち予め小スケールでウイルス除去工程の濾過方法、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度、ウイルス除去フィルターの入口圧力、及び／または濾過時間の運転条件を決定しておき、これをスケールアップした蛋白製剤の製造工程に適用することができる。スケールアップは、蛋白製剤中間製品の体積増加割合に比例して、ウイルス除去フィルターの膜面積を増加させるだけで良い。
また付随する効果として、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程をより改善するためにも用いられ、もって、より短時間に、より大量の蛋白製剤を製造できるウイルス除去工程を設計するために用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定するにあたって、重要な項目は、蛋白製剤中間製品の平均蛋白濾過速度と、ウイルス除去率である。濾過速度は一般に蛋白質濃度と負の相関があり、蛋白質濃度が高くなると濾過速度が低下するため、濾過時間が長くかかってしまい好ましくない。蛋白質濃度を下げるために希釈工程を付加することは、設備面でもコストがかかることになり好ましくない。蛋白質濃度が高濃度のままで、濾過速度を低下させずに濾過するには、ウイルス除去フィルター自体の耐圧が６００ｋＰａ以上あることが前提であるが、入口と出口を夫々少なくとも一つ有する容器とウイルスを除去するためのウイルス除去膜とを有し、容器内空間がウイルス除去膜によって蛋白製剤中間製品の入口側空間と出口側空間に仕切られており、入口の構造が６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造を持つノズルであるウイルス除去フィルターを用いて濾過すればよい。【００１２】
ここで言う６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造を持つノズルには、例えばルアーロック式ノズルや、ワンタッチ接続ノズル(例えばＳＭＣ社製のインチサイズワンタッチミニ、インチサイズワンタッチ管継手、ワンタッチミニ（以上登録商標）など)、カプラー式ノズル、フェルール接続式ノズルなどがあり、これらを使用できる。これら以外でも、液漏れなく濾液を送り込むことができる、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ嵌合構造を持つノズルであれば、本発明に適用できることは言うまでもない。【００１３】
また、ウイルス除去膜の有効膜面積は、０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下である必要がある。０．０３ｍ２より大きいと、濾過に必要な蛋白製剤中間製品の量が大量になってしまうため、評価コストがかかる問題点が生じる。一方、有効膜面積が０．０００１ｍ２未満と小さいと濾過量が少なくなり、ウイルス除去性能を評価するための蛋白製剤中間製品の体積が少なすぎてウイルスの定量が困難になる問題点が生じる。従って、０．０００１ｍ２以上０．０３ｍ２以下が適当である。好ましくは０．０００３ｍ２以上０．０２ｍ２以下、より好ましくは０．０００５ｍ２以上０．０１ｍ２以下であり、最も好ましくは０．０００７ｍ２以上０．００２ｍ２以下である。【００１４】
なお、ウイルス除去膜の有効膜面積とは、ウイルス除去膜の表面積のうち、蛋白製剤中間製品が通過しうる部分の面積をいう。ウイルス除去膜が中空糸の場合で、中空糸の内側から外側に濾過する場合は、中空糸内側の表面積のうち、蛋白製剤中間製品が通過しうる部分の面積をいい、中空糸の外側から内側に濾過する場合は、中空糸外側の表面積のうち、蛋白製剤が通過しうる部分の面積をいう。また、ウイルス除去膜が平膜の場合は、蛋白製剤中間製品を流しこむ側の面の表面積のうち、蛋白製剤中間製品が通過しうる部分の面積をいう。【００１５】
ウイルス除去膜の有効膜面積の調整は、中空糸型フィルターでは、中空糸の本数を増減させることによって容易にスケールアップ・スケールダウン可能であり、スケールアップ・スケールダウン時の大きな外乱因子もないため、スケーラビリティを得ることが容易であるという特徴がある。すなわち、中空糸型フィルターの場合、膜面積が変わると濾過体積が変わるのみで、濾過性能は維持されると考えてよい。膜面積が変わることによる影響は、濾液が増減することによる影響である。少なすぎると、ウイルスの定量に弊害が生じ、多すぎると操作の利便性やコストに影響がでることは前述の通りである。平膜の場合も、著しいスケールアップは膜の形状を変える（円盤型から筒型へ、など）ことになるが、同様の影響しかないと考えられる。蛋白製剤製造工程におけるウイルス除去工程の工程設計が、実生産スケールではなく、小スケールで実施できるのは、このようなスケーラビリティの信頼性によるものである。【００１６】
ウイルス除去フィルターとしては、前述の構造をもつものが利用できる。膜の形状は、平膜構造や中空糸構造のものが利用できるが、好ましくは中空糸構造のものがよい。膜の材質としては、６００ｋＰａ以上の耐圧性を有するものが利用できる。例えば、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）やポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）のような合成高分子を素材として親水性を持たせた膜が好ましい。肝要な点は６００ｋＰａ以上の耐圧性を有するという点である。【００１７】
合成高分子を素材とする膜に親水性を持たせる方法には、ビニル基を１個有する親水性ビニルモノマーを微多孔膜の細孔表面に、３％以上、５０％以下のグラフト率でグラフト重合する方法（国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレット）や、架橋剤を介して多官能価アクリレートまたはメタクリレートから形成する高分子を結合させる方法（特開２０００−１５４８号公報）、さらに重合開始剤と親水性モノマーを含む溶液を膜に含浸させ、細孔中で重合させる方法（国際公開第９１／１６９６８号パンフレット）など多くの方法が知られる。親水性を持たせる目的は、疎水性の合成高分子を素材とする膜の蛋白製剤中間製品の濾過性を向上させることにある。したがって、親水性を持たせる方法はここに例示した限りではない。
なお、ここでいうグラフト率とは、下記式で定義される。
グラフト率（％）＝１００×｛（グラフト後の膜質量−グラフト前の膜質量）／グラフト前の膜質量｝【００１８】
膜の構造は、蛋白製剤中間製品を流す方向に従って、上流側に孔径が大きく、空孔率が高い粗大構造層が存在し、下流側に孔径が小さくウイルスを除去するのに適した緻密構造層が存在し、粗大構造層と緻密構造層のつながりは連続的に孔径が変化しているグラジエント構造であることが好ましい。
また更に好ましい膜の構造は、開孔率が大きい粗大構造層と、開孔率が小さい緻密構造層を有する、熱可塑性樹脂を含む微多孔膜であって、該粗大構造層が少なくとも一方の膜表面に存在し、その厚みが５．０μｍ以上であり、該緻密構造層の厚みが膜厚全体の５０％以上であって、かつ該粗大構造層と該緻密構造層が一体化している多層微多孔膜であるものが好ましい。
さらに、前記粗大構造層は、膜表面から緻密構造層に向かって部分開孔率が連続的に減少する傾斜構造で、一方の膜表面のみに存在するものが好ましい。この膜は、例えば特開平１１−３１９５２２号公報や、特開平９−１６９８６７号公報、国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレットに開示される方法で製造することができる。【００１９】
評価に使用するウイルスとしては、蛋白製剤に混入する恐れのある関連ウイルスや特異的モデルウイルス、非特異的モデルウイルスの中から任意に選択することができる。ここで言う関連ウイルス、特異的モデルウイルス、非特異的モデルウイルスの定義は日米ＥＵ医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）ガイドラインに記されているものと同義である。すなわち、関連ウイルスとは、蛋白製剤の製造工程で使用される細胞基材、その他の試薬類や各種物質に混在することが知られているか、あるいは存在の可能性があるウイルス類と同一または同種のウイルスと定義される。特異的モデルウイルスとは、存在が知られている、あるいは疑われているウイルスに密接に関連しているウイルス。すなわち同一の属または科のもので、検出されたウイルスまたは存在が疑われるウイルスと類似した物理的・化学的性質を有するものと定義される。非特異的モデルウイルスは、製造工程がウイルスの除去や不活化に関して一般にどの程度の能力を有するかを解析する目的、すなわち工程が確実にウイルスクリアランス能力を発揮するという面での特性（robustness）を解析する目的で行なうウイルスクリアランス工程特性解析試験に使用されるウイルスと定義される。【００２０】
例えば、製剤がモノクローナル抗体などマウス由来基材から製造される場合、関連ウイルスや特異的モデルウイルスとして、マウス白血病ウイルスなどのレトロウイルス、マウス最小ウイルスなどのパルボウイルス、牛下痢症ウイルスなどのフラビウイルスを用いることができる。非特異的モデルウイルスとして、ブタパルボウイルスなどのパルボウイルスを最小サイズのウイルスモデルとして使用することもできる。【００２１】
また、製剤が血漿分画製剤など、ヒト血漿由来基材から製造される場合は、関連ウイルスとして、ヒトパルボウイルスＢ１９（パルボウイルス科）やＨＩＶウイルス（レトロウイルス科）などを、Ｂ１９の特異的モデルウイルスとしてブタパルボウイルス（パルボウイルス科）や、Ｃ型肝炎ウイルスの特異的モデルウイルスとしての牛下痢症ウイルス（フラビウイルス科）などを用いることができる。同様に、単純ヘルペスウイルス、仮性狂犬病ウイルスなどヘルペスウイルス科や、パラインフルエンザウイルスなどパラミクソウイルス科、レオウイルス３型などレオウイルス科、ポリオウイルスなどピコルナウイルス科、ＳＶ４０ウイルスなどパポーバウイルス科などから選択して使用すればよい。使用するウイルスの選択については、ＩＣＨなどの公知要求事項をもとに決めるべきものである。【００２２】
これらの、評価に使用するウイルスは、蛋白製剤中間製品にある一定量添加され、ウイルス除去フィルターによる濾過前後のウイルス量を測定して、ウイルス除去性能評価を測定する。このとき添加するウイルス量は、必要となるウイルス除去率から逆算して求めることができる。しかし、ウイルス溶液に混在している夾雑物（不純物）が原因でフィルターに目詰まりを起こすことがあり、濾過試験に弊害が生じる可能性があるため、添加ウイルス量は、そのウイルス溶液の純度によって調整することが望ましい。ウイルス溶液が精製されている場合は、蛋白製剤中間製品の体積に対して１０％体積以下、好ましくは５％体積以下まで、より好ましくは１％体積以下のウイルス溶液を添加してもよいが、精製されておらず夾雑物を多く含む場合は、１％体積以下、好ましくは０．５％体積以下、より好ましくは０．１％体積以下の少ない量を添加するのが望ましい。ただし、ＬＲＶ≧３が検出可能な必要最低限の量以上の体積のウイルス溶液を添加することが望ましい。【００２３】
なお、ここで言うウイルス除去率ＬＲＶは、ウイルス除去フィルターで濾過する前の溶液のウイルス量に対する、濾過したあとの溶液のウイルス量の低下率を対数値で示したものである。例えば、下記式で計算することができる。
ＬＲＶ＝ｌｏｇ１０Ａ−ｌｏｇ１０Ｂ
ただし  Ａ  ＝  ウイルス除去フィルターで濾過する前の溶液のウイルス濃度
Ｂ  ＝  ウイルス除去フィルターで濾過した後の溶液のウイルス濃度【００２４】
また、ウイルスの調製法によっては、大量の夾雑物を含有し、濾過速度に大きなダメージを与える場合がある。その場合は、ウイルスを精製して夾雑物を分離してから使用すればよい。ウイルスの精製法は超遠心分離を用いた方法などがすでに公知である。【００２５】
ウイルス除去フィルターのウイルスの除去率ＬＲＶは３以上であることを満たす条件を設定する。ウイルス除去フィルターの孔径よりも大きなサイズのウイルスの除去率は、通常ＬＲＶ≧３となり、一方ウイルス除去フィルターの孔径よりも小さなウイルスの除去率は通常ＬＲＶ＜３となる（ 泉 浩業ら、血漿分画製剤の安全性に関する検討II.モノクローナル抗体精製乾燥濃縮人血液凝固第VIII因子製剤（クロスエイトＭ（登録商標））及び筋注用人免疫グロブリン製剤（抗HBs人免疫グロブリン「日赤」（登録商標）,人免疫グロブリン「日赤（登録商標）」）の製造工程におけるウイルス除去膜の効果について、Japanese Journal of Transfusion Medicine 、(1999) 、 Vol.45. No.3, Pages 357-361.）。このとき、決して除去率は必ずＬＲＶ＝０となるわけではなく、３以下のある程度の除去率が得られることがあるが、それはウイルス除去フィルターのサイズ分離による本来あるべき除去率ではなく、ウイルス分子の部分的凝集や吸着によるものと考えられる。従って、フィルターの孔径以上のサイズのウイルスを意図して除去しようとする際には、ＬＲＶ≧３以上の除去率を満たすべきである。【００２６】
本発明の濾過方法に使用される蛋白製剤中間製品としては、抗体医薬中間製品、組換え蛋白医薬中間製品、血漿製剤中間製品、血漿分画製剤中間製品などが適用できるが、特に免疫グロブリン製剤中間製品が好ましい。さらに好ましくは、免疫グロブリンＧ製剤中間製品であり、最も好ましくは、免疫グロブリンＧのモノクローナル抗体製剤中間製品である。【００２７】
これら蛋白製剤中間製品を、まずはウイルス添加を行なわずに、ウイルス除去フィルター装置で濾過することにより、蛋白製剤中間製品の平均蛋白濾過速度を評価する。蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下という高濃度で、かつ蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下の高圧条件で、１時間以上５時間以下濾過することにより、平均蛋白濾過速度（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）を評価する。平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上である蛋白質濃度及び圧力の条件を確認した後、この蛋白質濃度と圧力の範囲内で、蛋白製剤中間製品に所定量のウイルスを添加して、ウイルス除去フィルターで濾過することにより、ウイルス除去工程のウイルス除去性能を評価する。【００２８】
蛋白製剤の製造工程における１バッチの製造量は、総重量拡大化の傾向にある。蛋白製剤の１バッチの総量（総重量）は、例えば抗体医薬製剤では、生産性向上の研究が進み、１バッチが５０ｋｇ以上という高い生産能力が示されている例もある。このような高い生産能力の蛋白製剤においても、ウイルス除去工程という一つの工程は１日で完了することが、蛋白製剤中間製品の安定性や、製造工程の効率の面から望ましい。そのためには、ウイルス除去フィルターの平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上であるべきである。１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上であれば、５０ｋｇの蛋白製剤中間製品の濾過を４ｍ２フィルター１本で１２．５時間以内に、２本で６．２５時間以内に濾過することが可能である。【００２９】
平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上である蛋白質濃度及び圧力の条件を確認した後、この蛋白質濃度と圧力の範囲内で、蛋白製剤中間製品に所定量のウイルスを添加して、ウイルス除去フィルターで濾過することにより、ウイルス除去工程のウイルス除去性能を評価する。すなわち、ウイルス除去率ＬＲＶ≧３を満たす蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度条件、及び入口圧力条件を選択する。蛋白質濃度が２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下という高濃度で、かつ蛋白製剤中間製品の入口圧力が１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下の高圧で濾過した場合に、同様に１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上の平均蛋白濾過速度が得られ、かつＬＲＶ≧３となるウイルス除去率を確認し、スケールアップした場合の設備、操作条件等を予想する。なお、ウイルス溶液を添加しないで実施する平均蛋白濾過速度の測定は省略し、ウイルスを添加した系で同時に測定することもできる。【００３０】
また、蛋白質濃度は高濃度で濾過するほうが、濾過装置・容器・配管などのスケールアップによるコストアップを防止することができるメリットがある。その反面、高濃度になりすぎると、安定性の面から問題が生じる。したがって、蛋白質濃度は２０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下で実施するが、好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは３０ｍｇ／ｍｌ以上１００ｍｇ／ｍｌ以下、最も好ましくは３０ｍｇ／ｍｌ以上５０ｍｇ／ｍｌ以下である。【００３１】
濾過の際の入口圧力は、高圧の方が短時間で迅速に濾過を行なえるメリットがあるが、圧力が高すぎると、装置への圧力によるダメージやリークのリスクが増えるため、入口圧力は、１５０ｋＰａ以上６００ｋＰａ以下で実施する。好ましくは１９６ｋＰａ以上５００ｋＰａ以下、より好ましくは２４５ｋＰａ以上４００ｋＰａ以下、さらに好ましくは２９４ｋＰａ以上４００ｋＰａ以下、最も好ましくは２９４〜３００ｋＰａである。蛋白質濃度および入口圧力は、上記範囲内で、平均蛋白濾過速度が１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ以上であり、かつＬＲＶがＬＲＶ≧３を同時に満たせるように数点振って評価することが好ましい。【００３２】
また、蛋白製剤中間製品をウイルス除去フィルターに流す濾過時間は、１時間以上、５時間以下であるが、スケールアップしたときの蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程を、ウイルス除去フィルターの膜面積は大きくなっても短時間で完了したい場合は、短時間に、多少長くかかってもウイルス除去膜の有効膜面積を小さくしたい場合には、長時間に設定することができる。また濾過開始後３時間後もＬＲＶ≧３であることを満たす条件を決定するために、蛋白製剤中間製品をウイルス除去フィルターに３時間以上５時間以下流すことも好適である。
【実施例】
【００３３】
以下実施例により、本発明をより詳細に説明する。
[実施例１]   
ウイルス除去フィルターとして、国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレット実施例１に示される方法に準じて、すなわち、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つポリフッ化ビニリデンよりなる微多孔中空糸膜を、親水性ビニルモノマー（ヒドロキシプロピルアクリレート）でグラフト率１０％となるようグラフト重合させた親水化微多孔中空糸膜であって、開孔率が大きい粗大構造層が中空糸膜内表面に存在し、その厚みが７．０μｍであり、これと一体化している開孔率が小さい緻密構造層の厚みが膜厚全体の８０％である多層微多孔中空糸膜を有効膜面積０．００１ｍ２有するフィルターで、フィルター入口に６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つルアーロック式ノズルを有し、中空糸膜で容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られているウイルス除去フィルターを使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）液を０．５体積％添加し、３５ｎｍの孔径を有する中空糸フィルター（旭化成メディカル社製、ＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）３５Ｎ）で前濾過を行なった。前濾過後の免疫グロブリン濃度は３０ｍｇ／ｍｌ、ＰＰＶの濃度は６．１（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）であった。
このＰＰＶを含む３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液を、上記濾過装置を用いて、２９４ｋＰａの圧力でデッド−エンド（Ｄｅａｄ−ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。このとき、平均蛋白濾過速度は、濾過開始３時間後、４時間後、５時間後において、それぞれ１．９、１．９、１．８ｋｇ／ｍ２／Ｈｒであった。いずれの時点においても、１．０（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）以上の高速濾過の濾液で、ウイルス除去率を評価することができた。ウイルス除去率は、濾過開始後1時間までの濾液、３時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧５．６となった。
ウイルス除去工程の運転条件として、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度３０ｍｇ／ｍｌ、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａ、濾過時間５時間以内、という条件を決定できた。【００３４】
[実施例２〜４]
ウイルス除去フィルターとして、国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレット実施例１に示される方法に準じて、すなわち、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つポリフッ化ビニリデンよりなる微多孔中空糸膜を、親水性ビニルポリマー（ヒドロキシプロピルアクリレート）でグラフト率１０％となるようグラフト重合させた親水化微多孔中空糸膜であって、開孔率が大きい粗大構造層が中空糸膜内表面に存在し、その厚みが７．０μｍであり、これと一体化している開孔率が小さい緻密構造層の厚みが膜厚全体の８０％である多層微多孔中空糸膜を有効膜面積０．００１ｍ２有するフィルターで、フィルター入口に６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つルアーロック式ノズルを有し、中空糸膜で容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られているウイルス除去フィルターを使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、下記の３種のウイルス液をそれぞれ０．５体積％添加して３種類の溶液を作成した。それぞれの溶液を３５ｎｍの孔径を有する中空糸フィルター（旭化成メディカル社製、ＰＬＡＮＯＶＡ（登録商標）３５Ｎ）で前濾過を行なった。
ウイルス溶液１）  マウス白血病ウイルス（Ａ−ＭｕＬＶ）（実施例２  ウイルス濃度５．０）
ウイルス溶液２）  レオウイルス３型  （Ｒｅｏ−３）（実施例３  ウイルス濃度５．６）
ウイルス溶液３）  マウス最小ウイルス  （ＭＶＭ）（実施例４  ウイルス濃度５．７）
これら３種の３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（ウイルス溶液を含む）を、上記ウイルス除去フィルターを用いて、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａの圧力でデッド−エンド（Ｄｅａｄ−ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。【００３５】
その結果、(実施例２)Ａ−ＭｕＬＶ添加の場合、濾過開始後1時間、２時間、３時間、４時間、５時間までの濾過速度はそれぞれ、２．２、２．０、１．９、１．７、１．６ｋｇ／ｍ２／Ｈｒとなった。いずれの時点においても、１．０（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）以上の高速濾過の濾液で、ウイルス除去率を評価することができた。ウイルス除去率は、濾過開始後１時間までの濾液、３時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧４．５となった。ウイルス除去工程の運転条件として、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度３０ｍｇ／ｍｌ、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａ、濾過時間５時間以内、という条件を決定できた。
(実施例３)Ｒｅｏ−３添加の場合、濾過開始後１時間、２時間、３時間、４時間、５時間までの濾過速度はそれぞれ、２．５、２．３、２．１、２．０、１．８ｋｇ／ｍ2／Ｈｒとなった。いずれの時点においても、１．０（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）以上の高速濾過の濾液で、ウイルス除去率を評価することができた。ウイルス除去率は、濾過開始後1時間までの濾液、３時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧５．１となった。ウイルス除去工程の運転条件として、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度３０ｍｇ／ｍｌ、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａ、濾過時間５時間以内、という条件を決定できた。
(実施例４)ＭＶＭ添加の場合、濾過開始後１時間、２時間、３時間、４時間、５時間までの濾過速度はそれぞれ、２．４、２．３、２．１、２．０、２．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒとなった。いずれの時点においても、１．０（ｋｇ／ｍ２／Ｈｒ）以上の高速濾過の濾液で、ウイルス除去率を評価することができた。ウイルス除去率は、濾過開始後1時間までの濾液、３時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧５．２となった。ウイルス除去工程の運転条件として、蛋白製剤中間製品の蛋白質濃度３０ｍｇ／ｍｌ、ウイルス除去フィルター入口圧力２９４ｋＰａ、濾過時間５時間以内、という条件を決定できた。【００３６】
[比較例１] 
ウイルス除去フィルターとして、１００ｋＰａの耐圧性を持つセルロースを材質とする、熱可塑性樹脂を含まない中空糸膜を用い、中空糸膜の入口と出口に６００ｋＰａ以上の耐圧性を持たないタケノコ型のノズルを有し、有効膜面積０．００１ｍ２の中空糸膜で容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られている濾過装置（旭化成メディカル社製、Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）２０Ｎ）を使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）液を０．５体積％添加し、３５ｎｍの孔径を有する中空糸フィルター（Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）３５Ｎ）で前濾過を行なった。前濾過後の免疫グロブリン濃度は３０ｍｇ／ｍｌ、ＰＰＶの濃度は５．９であった。
この３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（ＰＰＶを含む）を、上記ウイルス除去フィルターを用いて、セルロース膜にかけられる上限圧力９８ｋＰａの圧力でデッド−エンド（Ｄｅａｄ−ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。
その結果、ウイルス除去率は、濾過開始後１時間までの濾液、５時間までの濾液ともにＬＲＶ≧５．４となった。濾過速度は、濾過開始１時間後、５時間後において、それぞれ０．８、０．７ｋｇ／ｍ２／Ｈｒとなり、１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒに満たなかった。結果として、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定することができなかった。【００３７】
[比較例２]
ウイルス除去フィルターとして、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つ親水化ポリフッ化ビニリデンを材質とする、特公平７−７１６２４号公報の例Ｉに記載されている方法に準じて製造された、表面に緻密なスキン層を持ち、膜の厚さに対してその緻密構造層の厚さが２０％以下の平膜を用い、平膜の入口にルアーロック式のノズルを有する、有効膜面積０．０００３ｍ２のフィルターで容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られている濾過装置を使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）液を０．５体積％添加し、３５ｎｍの孔径を有する中空糸フィルター（Ｐｌａｎｏｖａ（登録商標）３５Ｎ）で前濾過を行なった。前濾過後の免疫グロブリン濃度は３０ｍｇ／ｍｌ、ＰＰＶの濃度は５．２であった。
この３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（ＰＰＶを含む）を、上記ウイルス除去フィルターを用いて、２９４ｋＰａの圧力でデッド−エンド（Ｄｅａｄ−ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。その結果、濾過開始後1時間までの濾液は、濾過速度が遅いため濾過体積が少なすぎて、ウイルス濃度の測定ができなかった。濾過開始後３時間までの濾液のウイルス除去率はＬＲＶ≧４．０となった。このとき、濾過量は、濾過開始３時間後において０．０９ｋｇ／ｍ２で、１時間平均の濾過速度は０．０３ｋｇ／ｍ２／Ｈｒとなり、１．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒに満たなかった。
結果として、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定することができなかった。【００３８】
[比較例３]
ウイルス除去フィルターとして、国際公開第２００４／０３５１８０号パンフレット実施例１に示される方法に準じてすなわち、６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つポリフッ化ビニリデンよりなる微多孔中空糸膜と、親水性ビニルポリマー（ヒドロキシプロピルアクリレート）でグラフト率１０％となるようグラフト重合させた粗大構造層のみからなる微多孔中空糸膜を有効膜面積０．００１ｍ２有するフィルターで、フィルター入口に６００ｋＰａ以上の耐圧性を持つルアーロック式ノズルを有し、中空糸膜で容器内空間が入口側空間と出口側空間に仕切られているウイルス除去フィルターを使用した。蛋白製剤中間製品のモデルとして、濃度３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（０．１Ｍ食塩水を溶媒とする）を用い、この溶液に、ブタパルボウイルス（ＰＰＶ）液を０．５体積％添加した。ＰＰＶの濃度は６．０であった。この３０ｍｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリンＧ溶液（ＰＰＶを含む）を、上記ウイルス除去フィルターを用いて、２９４ｋＰａの圧力でデッド−エンド（Ｄｅａｄ−ｅｎｄ）式濾過を５時間実施した。平均蛋白濾過速度は、濾過開始１時間後、３時間後、５時間後において、それぞれ２．３、２．２、２．０ｋｇ／ｍ２／Ｈｒであった。濾過開始後1時間までの濾液、３時間前の濾液、５時間までの濾液ともにウイルス除去率はＬＲＶ＝０．５となり、ＬＲＶ≧３を満たさなかった。結果として、蛋白製剤製造工程中のウイルス除去工程の運転条件を決定することができなかった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明の濾過方法は、抗体医薬、組換え蛋白医薬、血漿製剤、血漿分画製剤、等の蛋白製剤の製造工程中のウイルス除去工程のスケールアップされた実運転条件設定、設備設計等に有用な情報を非常に小さいスケールで収集可能なため、タンパク製剤製造産業に大変有用である。