(57)【要約】【課題】異常型プリオンタンパク質の増加を抑制する効果に優れた抗プリオン活性化合物を提供することを解決すべき課題としている。さらには、この抗プリオン活性化合物を利用した、抗プリオン活性剤及び異常型プリオンタンパク質生成の阻害方法を提供する。【解決手段】本発明の抗プリオン活性化合物は、下記一般式（１）で示されるピラゾロン誘導体であることを特徴とする。2008053764.tif 000009式中Ｒ１は置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）を示し、Ｒ２は水素、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよい含窒素複素環官能基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）又はアシル基を示し、Ｒ３は置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−を示す（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）を示す）。【選択図】なし
2008053764.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害する抗プリオン活性化合物であって、
下記一般式（１）で示されるピラゾロン誘導体であることを特徴とする抗プリオン活性化合物。
【化１】
2008053764.tif 000008
式中Ｒ１は置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）を示し、Ｒ２は水素、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよい含窒素複素環官能基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）又はアシル基を示し、Ｒ３は置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−を示す（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）。
【請求項２】
前記Ｒ１は置換基を有してもよいフェニル基又はシクロアルキル基であることを特徴とする請求項１記載の抗プリオン活性化合物。
【請求項３】
前記Ｒ２は水素、フェニル基、ピリジル基、アルキル基（シクロアルキル基を含む）又はベンゾイル基であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗プリオン活性化合物。
【請求項４】
前記Ｒ３はアルキル基、アルケニル基、置換基を有してもよいフェニル基、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）を示す）であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の抗プリオン活性化合物。
【請求項５】
前記Ｒ１は置換基を有してもよいフェニル基又はシクロアルキル基であり、Ｒ２は水素、フェニル基、ピリジル基、アルキル基（シクロアルキル基を含む）又はベンゾイル基あり、Ｒ３はアルキル基、アルケニル基、置換基を有してもよいフェニル基、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）を示す）であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の抗プリオン活性化合物。
【請求項６】
前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の組み合わせが（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝シクロヘキシル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝4-NO2Ph）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CＦ3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3OCONH）、（Ｒ１＝4-ClPh，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝フェニル基，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝イソプロペニル基）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝イソブチル基，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝ベンゾイル基，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝PhCONH）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝2-ピリジル基，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝PhNHCO）、（Ｒ１＝2-ピリジル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝Ｉ-4-(1-CH3)Py+-）、（Ｒ１＝4-n-C12H25Ph，Ｒ２＝H，Ｒ３＝4-NO2Ph）、（Ｒ１＝4-n-C12H25Ph，Ｒ２＝H，Ｒ３＝4-CH3OPh）及び（Ｒ１＝2-ピリジル基，Ｒ２＝n-C13H27，Ｒ３＝CH3）のいずれかであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の抗プリオン活性化合物。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項記載の抗プリオン活性化合物を有効成分として含有することを特徴とする抗プリオン活性剤。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか１項記載の抗プリオン活性化合物を投与して異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害することを特徴とする異常型プリオンタンパク質生成の阻害方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異常型プリオンタンパク質の増加を抑制するピラゾロン骨格を有する抗プリオン活性化合物並びにそれを利用した抗プリオン活性剤及び異常型プリオンタンパク質生成の阻害方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロイツフェルト・ヤコブ病に代表されるプリオン病はプリオンタンパク質の関与する一群の神経変性疾患の総称であり、脳などの組織に変性した異常型プリオンタンパク質が蓄積することを特徴とする。プリオン病の感染因子はこの異常型プリオンタンパク質であると考えられており、異常型プリオンタンパク質は正常組織に発現するプリオンタンパク質を、異常型プリオンタンパク質へと変換することによって増殖する。このため、プリオン病は、感染症のような側面も併せ持つ。【０００３】
プリオン病の原因が上述のように、異常型プリオンタンパク質による正常組織に発現するプリオンタンパク質の異常型プリオンたんぱく質への変換にあるとすれば、この変換を阻害する物質が見つかれば、プリオン病の進行を食い止めることができるはずである。このような考え方から、異常型プリオンタンパク質の増殖を抑制する化合物（以下「抗プリオン活性化合物」という）がプリオン病の治療薬として注目されている。【０００４】
例えば、特許文献１には、ペントサンポリサルフェート、キニーネ類、キナクリンやクロロキン等のライソゾーム親和性薬剤、リアクティブグリーンやリアクティブレッド等のリアクティブダイ等が抗プリオン活性化合物として有効であることが記載されている。また、キノリン誘導体及びナフチル誘導体や（特許文献２）、クロロフィル誘導体（特許文献３）も、同様の効果を奏することが知られている。【０００５】
【特許文献１】特開２００３−４０７７８号公報
【特許文献２】特開２００４−９９５５３号公報
【特許文献３】特開２００３−１５５２３９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、上記従来の抗プリオン活性化合物では、いずれの化合物も治療薬としての効果は不十分であり、発病すると死の転帰をとるこの疾患の有効な治療法は未だ確立されていないのが現状である。本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、異常型プリオンタンパク質の増殖の抑制に優れた効果を奏する抗プリオン活性化合物を提供することを解決すべき課題としている。
また、さらには、本発明の抗プリオン活性化合物を利用した、異常型プリオンタンパク質の増殖の抑制に優れた効果を奏する抗プリオン活性剤及び異常型プリオンタンパク質生成の阻害方法を提供することを解決すべき課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、抗プリオン活性化合物として作用する化合物には、活性酸素種のスカベンジャーとなるようなフリーラジカル消去剤として知られているものが存在することに注目し、そのような性質を有する様々な化合物について、その抗プリオン活性を調べた。その結果、臨床において脳保護剤に用いられているエダラボン（３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン）が抗プリオン活性を備えていることを見出した。
【化１】
2008053764.tif 000003
さらには、このエダラボンをリード化合物として、そのピラゾロン骨格に結合する置換基の種類を変えた化合物を合成し、それらの抗プリオン活性について鋭意研究を行った。その結果、ピラゾロン骨格を有する一連の誘導体が、優れた抗プリオン活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明の抗プリオン活性化合物は、
異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害する抗プリオン活性化合物であって、
下記一般式（１）で示されるピラゾロン誘導体であることを特徴とする。
【化２】
2008053764.tif 000004
式中Ｒ１は置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）を示し、Ｒ２は水素、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよい含窒素複素環官能基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）又はアシル基を示し、Ｒ３は置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−を示す（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）。なお、上記式（１）のカルボニル基は、実際にはエノール型の互変異性体と相互変換されているが、便宜上上記一般式（１）で表現した。【０００９】
発明者らは、プリオン持続感染細胞を用いて上記の構造を有するピラゾロン誘導体の抗プリオン活性を調べたところ、優れた抗プリオン活性を示すことを確認している。【００１０】
上記一般式（１）において、Ｒ１は置換基を有してもよいフェニル基又はシクロアルキル基とすることができる。また、Ｒ２は水素、フェニル基、ピリジル基、アルキル基（シクロアルキル基を含む）又はベンゾイル基とすることができる。さらに、Ｒ３はアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）を示す）であるとすることができる。
このようなピラゾロン誘導体として、さらに、Ｒ１は置換基を有してもよいフェニル基又はシクロアルキル基であり、Ｒ２は水素、フェニル基、ピリジル基、アルキル基（シクロアルキル基を含む）又はベンゾイル基あり、Ｒ３はアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）を示す）とすることができる。【００１１】
発明者らは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の組み合わせが（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝シクロヘキシル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝4-NO2Ph）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CＦ3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3OCONH）、（Ｒ１＝4-ClPh，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝フェニル基，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝イソプロペニル基）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝イソブチル基，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝ベンゾイル基，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝PhCONH）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝2-ピリジル基，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝PhNHCO）、（Ｒ１＝2-Pyridyl-，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝2-ピリジル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝CH3）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝H，Ｒ３＝I? 4-(1-CH3)Py+-）、（Ｒ１＝4-n-C12H25Ph，Ｒ２＝H，Ｒ３＝4-NO2Ph）、（Ｒ１＝4-n-C12H25Ph，Ｒ２＝H，Ｒ３＝4-CH3OPh）及び（Ｒ１＝2-ピリジル基，Ｒ２＝n-C13H27，Ｒ３＝CH3）のいずれかである場合に、確実に抗プリオン活性を有することを確認している。【００１２】
本発明の抗プリオン活性化合物を用いることにより抗プリオン活性剤を製造することができる。すなわち、本発明の抗プリオン活性剤は、請求項１乃至５のいずれか１項記載の抗プリオン活性化合物を有効成分として含有することを特徴とする。【００１３】
また、本発明の抗プリオン活性化合物を用いることにより、異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害する。すなわち、本発明の異常型プリオンタンパク質生成の阻害方法は、請求項１乃至５のいずれか１項記載の抗プリオン活性化合物を投与して異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害することを特徴とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の抗プリオン活性化合物をさらに具体化した実施例１〜１９について、比較例1〜４と比較しつつ詳述する。
実施例１はエダラボンであり、実施例２〜１９は、エダボランに存在するフェニル基やピラゾロン環の３位のメチル基を変換したり、ピラゾロン環の４位に置換基を導入したりしたものである（具体的構造については後述する表1に示す）。
また、比較例１〜４は、特許文献１あるいは特許文献２において抗プリオン活性化合物であることが記載されている化合物であり、比較例１はキニーネ、比較例２はキニジン、比較例３はＭＱＡＡ（構造は後述する表１に示す）、比較例４は4-(4-ジメチルアミノスチリル）キノリンである。なお、抗プリオン活性化合物の合成に際して用いた、試薬及び物性データの測定装置は、以下に示すとおりである。
（融点）
融点は柳本のマイクロ融点測定装置かBuchi547融点測定装置を用いて測定した。
（プロトン1H NMR）
プロトン1H NMRは溶媒としてCDCl3あるいはDMSO-d6を用い、JEOL JNM−LA500スペクトロメータで記録した。化学シフト(δ)はｐｐｍ単位でテトラメチルシランを内部標準とした。
（元素分析）
元素分析はYanaco CHN CORDER NT-5アナライザーを用い、全ての値は計算値と0.4％以内で一致した。
（ＭＳ）
高分解能マススペクトルはJEOL JMS-SX102A質量分析計を用いて測定した。 GC-MS分析は島津製作所GCMS-QP2010で測定した。
（試薬）
実施例１０の抗プリオン活性化合物は、東京化成工業の試薬をそのまま用いた。 他のすべての試薬及び溶媒は市販の試薬を購入して、そのまま使用した。 フラッシュカラムクロマトグラフィーは、メルク社のシリカゲル60(粒径0.046-0.063mm)を用いた。【００１５】
（実施例１）
実施例１の抗プリオン活性化合物はエダラボンであり、市販試薬（東京化成工業株式会社製）をそのまま用いた。【００１６】
（実施例２）
エチル-3-オキソブタネート (2.60 g, 20.0 mmol) とシクロヘキシルヒドラジン塩酸塩 (20.0 mmol)とを酢酸(30 mL)に懸濁した液にトリメチルアミン (3.04 mL, 22.0 mmol)を加える。そしてこの混合液を17時間還流する。溶媒をエバポレータで留去し、残留物を酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和NaHCO3、水、及び食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムを加えて脱水した後、ろ過、真空濃縮した後、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（展開溶媒ｎ−ヘキサン/酢酸エチル = 1/1)を行うことにより、 黄色固体の実施例１の抗プリオン活性化合物である1-シクロヘキシル-3-メチル-5-ピラゾロンを得た（収率42％）。さらに粗製物をエタノールで再結晶して精製した。以下にその物性を示す。
mp 152-153°C; 
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δ ppm) 3.99 (1H, m), 3.20 (2H, s), 2.10 (3H, s), 1.50 (10H, m);
MS (EI) m/z: 180 (M+);
元素分析（C10H16N2O）計算値 C, 66.63; H, 8.95; N, 15.54. 測定値 C, 66.56; H, 8.81; N, 15.58【００１７】
（実施例３）
4-ニトロベンゾイル酢酸エチルエステル(10.0 mmol)を10mlのエタノールに溶解した溶液にフェニルヒドラジン(10.0 mmol).を加える。そして、この混合液を15時間還流し、冷却後生成した沈殿物をろ過によって採取し、実施例２の抗プリオン活性化合物である3-(4-ニトロフェニル)-1-フェニル-5-ピラゾロンを８５％の収率で得た。さらに粗製物をＴＨＦ／エタノールの混合溶媒で再結晶して精製した。以下にその物性を示す。
mp 190-191°C; 
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δ; ppm) 8.32 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.95 (2H, d, J = 8.7Hz), 
7.46 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.46 (2H, t, J = 7.6 Hz), 3.91 (2H, s); 
MS (EI) m/z: 291 (M+);
元素分析（C15H11N3O3）計算値C, 64.05; H, 3.94; N, 14.94. 測定値 C, 63.77; H, 4.02; N, 15.12.【００１８】
（実施例４）
実施例４の抗プリオン活性化合物は1-フェニル-3-トリフルオロメチル-5-ピラゾロンであり、実施例２と同様の方法によって合成した。すなわち、4，4，4-トリフルオロアセト酢酸エチルエステル(10.0 mmol)を10mlのエタノールに溶解した溶液にフェニルヒドラジン(10.0 mmol).を加える。そして、この混合液を15時間還流し、冷却後生成した沈殿物をろ過によって採取し、実施例３の抗プリオン活性化合物である1-フェニル-3-トリフルオロメチル-5-ピラゾロンを８５％の収率で得た。さらに粗製物を酢酸エチル／ｎ-ヘキサンの混合溶媒で再結晶して精製した。以下にその物性を示す。
mp 195-196°C; 
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δppm) 7.80 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.66 (2H, d, J = 7.8 Hz), 6.61 (1H, s), 5.91 (1H, s), 3.71 (2H, s);
MS (EI) m/z: 228 (M+);
元素分析（C10H7F3N2O）計算値: C, 52.64; H, 3.09; N, 12.28. 測定値C, 52.76; H, 3.17; N, 12.65.【００１９】
（実施例５）
3-アミノ-1-フェニル-5-ピラゾロン(1.75 g, 10.0 mmol)を１５ｍｌのピリジンに溶解した溶液に０°Ｃのクロロ蟻酸メチルエステル(0.95 g, 10.0 mmol)を滴下する。この混合溶液を０°Ｃで１時間撹拌し、さらに５０°Ｃで２時間の撹拌を行う。反応液を水に投入し、沈殿した固体をろ過によって採取し、水及びエタノールで洗浄した後、メタノール／クロロホルムの混合溶媒で再結晶させてメチル 5-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イルカルバメートの結晶545 mg（収率２３％）を得た。以下にその物性を示す。
mp 231-232°C; 
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δ; ppm) 7.82 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.38 (2H, t, J = 8.0 Hz), 
7.20 (2H, t, J = 7.3 Hz), 4.00 (2H, s), 3.82 (3H, s); 
MS (EI) m/z: 233 (M+); 
元素分析. 計算値（C11H11N3O3:） C, 56.65; H, 4.75; N, 18.02. 測定値: C, 56.84; H, 4.85; N, 17.89【００２０】
（実施例６）
3-アミノ-1-フェニル-5-ピラゾロン(1.75 g, 10.0 mmol)を１５ｍｌのピリジンに溶解した溶液に０°Ｃのクロロ蟻酸フェニルエステル(1.57g, 10.0 mmol)を滴下する。この混合溶液を０°Ｃで１時間撹拌し、さらに５０°Ｃで２時間の撹拌を行う。反応液を水に投入し、沈殿した固体をろ過によって採取し、水及びエタノールで洗浄した後、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し、フェニル5-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イルカーボネートを627mg得た（収率21％）以下にその物性を示す。
mp 225-226°C; 
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δ; ppm) 7.84 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.69 (1H, s), 7.42 (2H, t, J = 8.5 Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.29 (1H, t, J = 7.3 Hz), 7.19 (3H, t, J = 8.3 Hz); 
MS (EI) m/z: 295 (M+); 
元素分析. 計算値（C11H11NO3:） C, 65.08; H, 4.44; N, 14.23. 測定値: C, 65.17; H, 4.71; N, 14.40.
さらにこのフェニル5-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イルカーボネート(295 mg, 1.0 mmol)をキシレンに溶かした溶液をシクロペンチルアミン(85.2 mg, 1.0 mmol)に加え、撹拌しながら３時間還流する。そして、反応液をエタノール中に注ぎ、生じた沈殿を水及びエタノールで洗浄した後、ろ過によって採取し、実施例６の抗プリオン活性化合物である1-シクロペンチル-3-(5-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イル)尿素を119 mg (収率42%)得た。さらこの粗製物をＴＨＦ／ｎ−ヘキサン混合溶媒で再結晶させて精製したものの物性データを以下に示す。
mp 184-185°C;
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δppm) 8.48 (1H, s), 7.74 (2H, d, J = 8.2 Hz), 7.41 (2H, t, J = 8.1 Hz), 7.19 (2H, t, J = 7.4Hz), 4.17 (1H, q, J = 6.0 Hz), 3.64 (1H, s), 2.03 (2H, m), 1.74 (4H, m); 
MS (EI) m/z: 286 (M+); 
元素分析. 計算値（C15H18N4O2:） C, 62.92; H, 6.34; N, 19.57. 測定値: C, 62.58; H, 6.36; 
N, 19.60.【００２１】
（実施例７）
実施例７では、実施例２におけるシクロヘキシルヒドラジン塩酸塩の代わりに４−クロロフェニルヒドラジン塩酸塩を用いて（ただし溶媒は酢酸の代わりにエタノールを用いた）、実施例２の場合と同様の操作を行い、実施例７の抗プリオン活性化合物である1-(4-クロロフェニル)-3-メチル-5-ピラゾロンを合成した。こうして得られた粗製物をエタノールを溶媒として再結晶させて精製を行った。この精製物の物性データを以下に示す。
mp 173-174°C; 
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δ; ppm) 7.85 (2H, d, J = 8.8 Hz), 7.35 (2H, d, J = 8.8 Hz), 3.44 (2H, s), 2.20 (3H, s); 
MS (EI) m/z: 208 (M+);
元素分析. 計算値（C10H9ClN2O:） C, 57.57; H, 4.35; N, 13.43. 測定値 C, 57.52; H, 4.40; 
N, 13.58.【００２２】
（実施例８）
実施例８の抗プリオン活性化合物は3-メチル-1,4-ジフェニル-5-ピラゾロンであり、次の2段階で合成した。
＜第１段階＞
水素化ナトリウム (60%, 1.50 g, 37.5 mmol)のTHF(30 mL)懸濁液を０°Ｃに冷却し、フェニル酢酸エチルエステル(5.00 g, 30.5 mmol)のTHF (10 mL)溶液を滴下する。その後、室温下で1時間撹拌し、無水酢酸 (3.20 mL, 33.9 mmol) のTHF (10 mL)溶液を０°Ｃに冷却して添加し１時間撹拌する。反応溶液を氷水中に注ぎ、酢酸エチルで抽出する。酢酸エチル層を分取し、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。その後、ろ過、減圧濃縮を行い、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１０：１）、黄色オイル状の3-オキソ-2-フェニル酪酸エチルエステル3.23 g (収率51%)を得た。以下にその物性を示す。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz, δppm) 7.52-7.10 (5H, m), 4.15 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.57 (0.5H, s), 2.24 and 1.90 (3H, each s), 1.22 and 1.20 (3H, each t, J = 7.1 Hz).
＜第２段階＞
上記第1段階で得られた3-オキソ-2-フェニル酪酸エチルエステル(2.22 g, 10.0 mmol)をエタノール10 mLに溶解し、これにフェニルヒドラジン(1.08 g, 10.0 mmol)を滴下し、混合物を１５時間還流した後、冷却し、生じた沈殿をろ過によって採取し、黄色オイル状の3-メチル-1,4-ジフェニル-5-ピラゾロンを0.4 g (収率13%)得た。こうして得られた粗製物をエタノールで再結晶させて精製を行った。この精製物の物性データを以下に示す。
mp 203-205°C;
1H-NMR (DMSO, 400 MHz, δppm) 11.35 (1H, br), 7.75 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.65-7.50 (2H, m), 7.48 (2H, t, J = 7.7 Hz), 7.39 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.25-7.20 (2H, m), 2.30 (3H, s); 
MS (EI) m/z: 250 (M＋); 
元素分析.  計算値（C13H14N2O:） C, 76.78; H, 5.64; N, 11.19. 測定値 C, 76.56; H, 5.73; N, 11.18.【００２３】
（実施例９）
実施例９の抗プリオン活性化合物は3-イソプロペニル-1-フェニル-5-ピラゾロンであり、次の2段階で合成した。
＜第１段階＞
マロン酸モノエチルカリウム塩(9.80 g, 57.6 mmol)と MgCl2(6.00 g, 63.0 mmol)と トリエチルアミン(17.50 mL, 126.0 mmol)とをアセトニトリル(100 mL)に溶解し、氷冷下にメタクリロイルクロライド(3.00 g, 28.7 mmol) を滴下する。３０分間撹拌後、2 Mの 塩酸を加えさらに30分間撹拌する。混合物を氷水に注ぎ、酢酸エチルで抽出し、有機層を分取し、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。その後、ろ過、減圧濃縮を行い、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝５：１）、無色オイル状の4-メチル-3-オキソペント-4-エノイック酸エチルエステル2.52 g (収率43%)を得た。以下にその物性を示す。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δ; ppm) 5.96 (1H, s), 5.93 (1H, s), 5.90 (1H, s), 5.89 (1H, s), 
5.35 (0.3H, s), 4.23 (2H, q, J = 7.1 Hz), 4.21 (2H, q, J = 7.1 Hz), 3.74 (1.4H, s), 1.90 (3H, s), 
1.31 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.27 (3H, t, J = 7.3 Hz).
＜第２段階＞
上記第1段階で得られた4-メチル-3-オキソ-ペント-4-エノイック酸エチルエステルを用い、実施例８の第２段階と同様の操作によって3-イソプロペニル-1-フェニル-5-ピラゾロンを１１％の収率で得た。以下にその物性を示す。
mp 56-57°C; 
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δ; ppm) 7.90 (2H, d, J = 7.8 Hz), 7.41 (2H, t, J = 7.6 Hz), 
7.20 (1H, t, J = 7.3 Hz), 5.43 (1H, s), 5.34 (1H, s), 3.64 (2H, s), 2.11 (3H, s); 
HRMS 計算値 C12H12N2O: 200.095, 実測値 200.094; 
元素分析. 計算値（C12H12N2O・0.2H2O:）C, 70.71; H, 6.13; N, 13.74. Found: C, 70.97; H, 5.99; 
N, 13.62.【００２４】
（実施例１０）
実施例９の抗プリオン活性化合物は4-イソブチル-3-メチル-1-フェニル-5-ピラゾロンであり、次の2段階で合成した。
＜第１段階＞
ナトリウムエトキシドのエタノール溶液（20%, 8.70 g, 25.6 mmol）にエチル-3-オキソブタネート(3.00 g, 23.1 mmol)を一気に加え、この混合物を８０°Ｃに加温する。そして、ヨウ化イソブチル (5.10 g 27.71 mmol)のTHF (5.0 mL)溶液を２時間かけて滴下し、反応溶液をさらに２時間の間８０°Cに保った。その後冷却し.氷冷した2Ｍの塩酸を注ぎ、酢酸エチルで抽出する。有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後、ろ過、減圧濃縮を行い、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２０：１）、無色オイル状の2-アセチル-4-メチルペンタン酸エチルエステル1.83 g (収率43%)を得た。以下にその物性を示す。
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δ; ppm) 12.91 (0.2H, s), 4.20 and 4.19 (2H, each q, J = 7.1 Hz), 
3.50 (0.8H, dd, J = 8.3, 6.6 Hz), 2.23 and 2.00 (3H, each s), 2.05 (0.4H, d, J = 7.1 Hz), 
1.80-1.76 (0.8H, m), 1.72-1.66 (0.8H, m), 1.56-1.51 (1H, m), 1.31 and 1.27 (3H, each t, J = 7.1 Hz), 0.92, 0.91 and 0.87 (6H, each d, J = 6.7 Hz).
＜第２段階＞
上記第1段階で得られた2-アセチル-4-メチルペンタン酸エチルエステルを用い、実施例８の第２段階と同様の操作によって4-イソブチル-3-メチル-1-フェニル-5-ピラゾロンを70%の収率で得た。ただし、エタノールの代わりに酢酸を用いた。こうして得られた粗製物をn-ヘキサン／酢酸エチルで再結晶を行って精製した。以下にその物性を示す。
mp 117-119°C; 
1H-NMR (CDCl3, 400MHz, δ; ppm) 7.89 and 7.72 (2H, each d, J = 7.8 Hz), 7.39 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.17 and 7.15 (1H, each t, J = 7.3 Hz), 6.80 (0.3H, br), 3.26 (0.7H, t, J = 6.3 Hz), 
2.18-2.15 (3.6H, m), 2.01-1.94 (1H, m), 1.78 (1.4H, t, J = 7.3 Hz), 0.962, 0.958, and 0.920 (6H, each d, J = 6.6 Hz); 
MS (EI) m/z: 230 (M+); 
元素分析. 計算値（C14H18N2O・0.2H2O） C, 73.01; H, 7.88; N, 12.16. Found: C, 73.26; H, 7.93; N, 12.38.【００２５】
（実施例１１）
3-メチル-1-フェニル-2-ピラゾリン-5-オン(349 mg, 2.00 mmol) のジオキサン (2.5 mL) 懸濁液に水酸化カルシウム(221 mg, 2.98 mmol)と塩化ベンゾイル(0.25 mL, 2.2 mmol) とを加え、混合物を100°Cで1時間撹拌する。反応液を2 M 塩酸 (8.0 mL) に注ぎ、酢酸エチルにて抽出する。そして、有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後、ろ過、減圧濃縮を行い、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝９：１）、黄色オイル状の4-ベンゾイル-3-メチル-1-フェニル-1H-ピラゾール-5(4H)-オン440 mg (収率79%)を得た。以下にその物性を示す。
mp 90-91°C; 
1H-NMR (CDCl3, 500MHz, ?; ppm) 7.88 (2H, d, J = 8.1 Hz), 7.65 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.58 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.52 (2H, t, J = 7.5 Hz), 7.47 (2H, t, J = 8.1 Hz), 7.31 (1H, t, J = 7.3 Hz), 2.10 (3H, s); MS (EI) m/z: 278 (M+); 
元素分析.計算値（C17H14N2O2:） C, 73.37; H, 5.07; N, 10.07. Found: C, 73.39; H, 4.84; N, 10.02.【００２６】
（実施例１２）
3-アミノ-1-フェニル-2-ピラゾリン-5-オン(351 mg, 2.00 mmol)のジオキサン (5.5 mL) 懸濁液に塩化ベンゾイル (0.25 mL, 2.17 mmol)を加え、室温下で3.5時間撹拌する。その後、反応液を2 M 塩酸 (8.0 mL) に注ぎ、酢酸エチルにて抽出する。そして、有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後、ろ過、減圧濃縮を行い、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：１）、淡褐色固体状のN-(5-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イル) ベンズアミド83 mg (収率15%)で得た。以下にその物性を示す。
mp 218-219°C; 
1H-NMR (CDCl3, 500MHz, δ; ppm) 8.58 (1H, s), 7.89 (2H, d, J = 7.3 Hz), 7.85 (2H, d, J = 7.5 Hz), 7.64 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.54 (2H, t, J = 7.7 Hz), 7.41 (2H, t, J = 8.1 Hz), 7.19 (1H, t, J = 7.5 Hz), 4.23 (2H, s); 
MS (EI) m/z: 279 (M+); 
元素分析 （C16H13N3O2:） C, 68.81; H, 4.69; N, 15.05. Found: C, 68.93; H, 4.89; N, 14.87.【００２７】
（実施例１３）
実施例１３の抗プリオン活性化合物は3-メチル-1-フェニル-4-（ピリジン-2-イル）-1H-5（4H）-オンであり、次の2段階で合成した。
＜第１段階＞
水素化ナトリウム (60%, 600 mg, 15.0 mmol) in THF (8.0 mL)に2-ピリジル酢酸エチルエステル (0.45 mL, 3.0 mmol) を氷水浴で冷却しながら滴下する。そして、混合物を35分間、６０°Cにて撹拌し、さらに無水酢酸 (1.25 mL, 13.2 mmol) のTHF (3.0 mL) 溶液を０°Ｃにて加え、16時間室温下で撹拌する。反応液を氷水に注ぎ、２Ｍ塩酸で中和し、酢酸エチルで抽出する。有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後、ろ過、減圧濃縮を行い、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝５：１）、黄色オイル状のエチル  3-オキソ-2-（ピリジン-2-イル）ブタノエート639 mgを得た。【００２８】
＜第２段階＞
上記第1段階で得られたエチル  3-オキソ-2-（ピリジン-2-イル）ブタノエート(50%, 639 mg, 1.50 mmol) をエタノール(7.0 mL) に溶解し、フェニルヒドラジン(162 mg, 1.50 mmol)を加え、混合物を82°Cで2時間撹拌した。反応液を氷水中に注ぎ、エタノールをエバポレーターによって溜出させ、酢酸エチルで抽出した。有機層を分取し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後、ろ過、減圧濃縮を行い、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し（展開溶媒：酢酸エチル）、黄色固体の3-メチル-1-フェニル-4-（ピリジン-2-イル）-1H-5（4H）-オン200 mg (２段階での全収率8%)を得た。以下にその物性を示す。
mp 184-185°C;
1H-NMR (CDCl3, 500MHz, δ; ppm) 8.04 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.91 (1H, d, J = 5.8 Hz), 
7.77 (1H, t, J = 7.9 Hz), 7.47 (1H, d, J = 8.8 Hz), 7.41 (2H, t, J = 7.9 Hz), 7.16 (1H, t, J = 7.5 Hz), 6.90 (1H, t, J = 6.7 Hz), 2.50 (3H, s); 
MS (EI) m/z: 251 (M+); 元素分析. 計算値（C15H13N3O:） C, 71.70; H, 5.21; N, 16.72. 測定値: C, 71.93; H, 5.29; N, 16.53【００２９】
（実施例１４）
実施例１４の抗プリオン活性化合物は5-オキソ-N,1-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-カルボキサミドであり、次の2段階で合成した。
＜第１段階＞ 
5-オキソ-1-フェニル-2-ピラゾリン-3-カルボン酸 (818 mg, 4.01 mmol)のジクロロメタン(15 mL)溶液へ、オキザリルクロライド (0.70 mL, 8.2 mmol)と、触媒量のＤＭＦとを滴下する。その後、混合液を３５分間、室温下で撹拌し、反応液をエバポレータで濃縮し、ジクロロメタンで3回洗浄し、褐色固体状の5-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-カルボニルクロライドを得た。【００３０】
＜第２段階＞
上記第1段階で得られた5-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-カルボニルクロライドをジクロロメタン(16 mL)に溶解し、アニリン(2.0 mL, 22 mmol)を加え、この混合物を19時間室温下で撹拌する。その後、反応液を２Ｍの塩酸 (15 mL)に氷冷下で注ぎ、酢酸エチルで抽出する。有機層を分取し、食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、その後、ろ過、減圧濃縮を行い、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで精製し（展開溶媒：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４：１、その後１：１）、淡褐色固体の5-オキソ-N,1-ジフェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-カルボキサミド825 mg (２段階での全収率74%)を得た。以下にその物性を示す。
mp 214-215°C; 
1H-NMR (DMSO, 500MHz, δ; ppm) 12.1 (1H, br), 9.93 (1H, br), 7.85 (2H, d, J = 8.5 Hz), 
7.80 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.53 (2H, t, J = 8.1 Hz), 7.37 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.34 (2H, t, J = 7.9 Hz), 7.08 (1H, t, J = 7.5 Hz), 6.02 (1H, s); 
MS (EI) m/z: 279 (M+); Anal. Calcd for C16H13N3O2: C, 68.81; H, 4.69; N, 15.05. Found: C, 69.04; H, 4.75; N, 15.01【００３１】
（実施例１５）
実施例１５の抗プリオン活性化合物は、3-メチル-1-（ピリジン-2-イル）-5-ピラゾロンであり、次のように合成した。すなわち、2-ヒドラジノビリジン(2.10g,20.0mmoL)を酢酸(20mL)に加えた溶液に３−オキソブタン酸エチルエステル(2.60g,20.0mmoL,1.0当量）を加え、該混合物を還流温度で３時間攪拌した。溶媒を留去し、残渣を酢酸エチルエステルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、真空濃縮、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチルエステル／ｎ−ヘキサン＝２／１）により、白色固形物の3-メチル-1-（ピリジン-2-イル）-5-ピラゾロンを2.72g得た。該固形物(1.00g)をｎ−ヘキサンと酢酸エチルエステルにより再結晶し、ろ取して507mg（収率５７％）の白色固形物を得た。以下にその融点、１Ｈ−ＮＭＲデータ、ＭＳデータ、ＨＲＭＳデータ、元素分析値を示す。
ｍ.p.:112.4-113.5℃;
1H-NMR(CDCl3,500MHz, δ:ppm)エノール型:12.7(1H,br),8.24(1H,d,J=3.7Hz)、
7.84(1H,m),7.12(1H,m),5.42(1H,s)2.26(3H,s);
MS(EI)m/z:175(M+);
HRMS:計算値(C9H9N3O)175.075,測定値175.075;
元素分析:計算値(C9H9N3O)C,61.70;H,5.18;N,23.99.測定値C,61.94;H,4.99;N,23.77.【００３２】
（実施例１６）
実施例１６の抗プリオン活性化合物は、ヨウ化1-メチル-4-（5-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イル）ピリジニウムであり、次の３段階で合成した。
<第１段階＞
マロン酸モノエチルエステルのカリウム塩（3.40g,20.0mmoL）、塩化マグネシウム（3.81g,40.0mmoL）およびトリエチルアミン（7.46mL,53.7mmoL）をアセトニトリル（100mL）に加えた懸濁液に、塩化イソニコチノイル塩酸塩（1.87g,10mmoL）を氷冷下徐々に加えた。該混合物を０℃で攪拌し４時間攪拌後、該反応混合物に２Ｎ塩酸（５０ｍＬ）を加え室温で１時間攪拌した。該反応混合物を氷冷水中に注ぎ込み、酢酸エチルエステルで抽出した。その有機層を分離し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、次に飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過、真空濃縮後、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチルエステル＝１／２）により精製して、白色固形物の3-オキソ-3-（ピリジン−４−イル）プロピオン酸エチルエステルを1.47g(収率７６％）得た。以下にその１Ｈ−ＮＭＲデータおよびＭＳデータを示す。
1H-NMR(CDCl3,500MHz, δ:ppm)
エノール形:12.4(1H,s),8.71(2H,d,J=6.1Hz),7.60(2H,d,J=4.4Hz),
5.77(1H,s),4.29(2H,q,J=7.3Hz),1.35(3H,t,J=7.0Hz);ケト形:8.84(0.5H,d,J=6.1Hz),
7.72(0.5H,d,J=6.1Hz),4.21(0.5H,q,J=7.0Hz),3.99(0.5H,s)、1.25(1H,t,J=7.0Hz);
MS(EI)m/z:193(M+).
<第２段階＞
上記第１段階で得た3-オキソ-3-（ピリジン-4-イル）プロピオン酸エチルエステルを用いて、次のように1-フェニル-3-（ピリジン-4-イル）-5-ピラゾロンを合成した。すなわち、3-オキソ-3-（ピリジン-4-イル）プロピオン酸エチルエステル（１．６３ｇ，８．４５ｍｍｏＬ）をエチルアルコール（２０ｍＬ）に加えた溶液にフェニルヒドラジン（９１２ｍｇ，１．０当量）を加えた。該混合物を還流温度で４時間加熱した。その溶媒を留去し酢酸エチルエステルで抽出した。その有機層を分離し、水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過、真空濃縮後、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチルエステル／メタノール＝１０／１）により精製して、淡黄色固形物の1-フェニル-3-（ピリジン-4-イル）-5-ピラゾロンを1.21g（収率６０％）得た。以下にその１Ｈ−ＮＭＲデータおよびＭＳデータを示す。
1H-NMR(CDCl3,500MHz,δ:ppm)
:8.74(2H,d,J=6.1Hz),7.94(2H,d,J=7.6Hz),7.63(2H,d,J=6.1Hz),7.45(2H,t,J=7.6Hz),7.25-7.30(1H,m),3.86(2H,s);
MS(EI)m/z:237(M+).
<第３段階＞
上記第２段階で得た1-フェニル-3-（ピリジン-4-イル）-5-ピラゾロンを用いて、次のようにヨウ化1-メチル-4-（５-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イル）ピリジニウムを合成した。すなわち、1-フェニル-3-（ピリジン-4-イル）-5-ピラゾロン（300mg,1.26mmoL）をクロロホルム（10mL）に加えた溶液にヨウ化メチル（3.0mL,38.0当量）を加えた。該混合物を６０℃で１８時間攪拌した。その溶媒を留去し、ジエチルエーテルを加えた。沈殿した固形物をろ取し、ジエチルエーテルとｎ−ヘキサンで洗浄し、褐色固形物を443ｍｇ（収率９２％）得た。該粗製物（200ｍｇ）をエチルアルコールとｎ−ヘキサンにより再結晶し、褐色固形物のヨウ化1-メチル-4-(5-オキソ-1-フェニル-4,5-ジヒドロ-1H-ピラゾール-3-イル）-ピリジニウムを133mg（収率６６％）得た。以下にその融点、１Ｈ−ＮＭＲデータ、ＭＳデータを示す。
m.p.:269.8 -271.5℃;
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz,δ:ppm):
8.91(2H,d,J=6.7Hz),8.45(2H,d,J=7.0Hz),7.84(2H,d,J=7.6Hz),7.54(2H,t,J=7.6Hz),
7.40(1H,t,J=7.3Hz),6.50(2H,s),4.30(3H,s);
MS(FAB)m/z:252(M+-I).【００３３】
（実施例１７）
実施例１７の抗プリオン活性化合物は、1-〔4-（n-ドデシル）フェニル〕-3-(4-ニトロフェニル）-5-ピラゾロンであり、次の４段階で合成した。
<第１段階＞
4-ヨードニトロベンゼン（25.0g,100mmoL），1-ドデシン（19.0g,117mmoL），テトラキス（トリフェニルフォスフィン）パラジウム（3.1g,2.8mmoL），ヨウ化銅（3.8g,20.0mmoL），トリエチルアミン（50mL）およびアセトニトリル（200mL）の混合物を１００℃で１３時間攪拌した。該混合物を濃縮し、水中に注ぎ込み、その全体を酢酸エチルエステルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、２Ｎ塩酸、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、真空濃縮およびシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチルエステル＝１／５）により精製して、褐色油状物の1-(n-ドデシ-1-イニル）-4-ニトロベンゼンを23.9g（収率８３％）得た。以下にその１Ｈ−ＮＭＲデータ、ＭＳデータを示す。
1H-NMR(CDCl3,500MHz,δ:ppm):
8.15(2H,d,J=7.0Hz),7.51(2H,d,J=7.0Hz),2.44(2H,t,J=7.3Hz),1.63(2H,quin,J=7.3Hz),
1.44(2H,quin,J=7.0Hz),1.30-1.21(12H,m),0.88(3H,t,J=7.3Hz);
MS(EI)m/z:287(M+).
<第２段階＞
上記第１段階で得た1-(n-ドデシ-1-イニル)-4-ニトロベンゼンを用いて、次のように４−ドデシルフェニルアミンを合成した。すなわち、水素雰囲気下で、1-(n-ドデシ-1-イニル)-4-ニトロベンゼン（7.81g,27.2mmoL）とパラジウムカーボン（780mg）をエチルアルコール（80mL）に加えた混合物を室温で７日間攪拌した。該混合物をセライト層を通してろ過し、その有機層を分離して無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、真空濃縮およびシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチルエステル＝５／１）により精製して、無色油状物の4-(n-ドデシル）フェニルアミンを3.09g（収率４４％）得た。以下にその１Ｈ−ＮＭＲデータ、ＭＳデータを示す。
1H-NMR(CDCl3,500MHz, δ:ppm):
6.96(2H,d,J=8.5Hz),6.62(2H,d,J=8.2Hz),3.53(2H,s),2.48(2H,t,J=7.9Hz),1.30-1.20(18H,m),
0.87(3H,t,J=7.3Hz);
MS(EI)m/z:261(M+).
<第３段階＞
上記第２段階で得た４−（ｎ−ドデシル）フェニルアミンを用いて、次のように４−（ｎ−ドデシル）フェニルヒドラジン塩酸塩を合成した。すなわち、亜硝酸ナトリウム（１．０４ｇ，１５ｍｍｏＬ，３当量）を水（１０ｍＬ）に加えた溶液を、６Ｎ塩酸（１５ｍＬ）に４−（ｎ−ドデシル）フェニルアミン（１．３０ｇ，５．０ｍｍｏＬ）を加え氷冷下攪拌した懸濁液に１５分間かけて加えた。氷浴中更に３０分経過後、塩化第一錫（２．６５ｇ，１４．０ｍｍｏＬ，２．８当量）を６Ｎ塩酸に加えた溶液をゆっくり加え、生じた懸濁液を３時間攪拌した。生成した固形物をろ取し、４０％水酸化カリウム溶液（１００ｍＬ）と酢酸エチルエステル（１００ｍＬ）の混合液に溶解した。その有機層を分離し４Ｎ塩酸−酢酸エチルエステルと共に振蘯した。沈殿物をろ取しヘキサンで洗浄して、白色固形物の４−（ｎ−ドデシル）フェニルヒドラジン塩酸塩を１．２８ｇ（収率８２％）得た。以下にその１Ｈ−ＮＭＲデータ、ＭＳデータを示す。
1H-NMR(DMSO-d6,500MHz,δ:ppm):
10.1(2H,br),8.1(1H,br),7.10(2H,d,J=8.5Hz),6.90(2H,d,J=8.5Hz)
1.52-1.48(2H,m), 1.30-1.20(20H,m),0.85(3H,t,J=7.0Hz);MS(EI)m/z:277(M+).
<第４段階＞
上記第３段階で得た4-(n-ドデシル）フェニルヒドラジン塩酸塩を用いて、次のように1-〔４-(n-ドデシル）フェニル〕-3-(4-ニトロフェニル）-5-ピラゾロンを合成した。すなわち、4-(n-ドデシル）フェニルヒドラジン塩酸塩（312mg,1.0mmoL）を酢酸（10mL）に加えた懸濁液に4-ニトロベンゾイル酢酸エチルエステル（237mg,1.0mmoL,１当量）、トリエチルアミン（0.08mL,1.2当量）を加え、還流温度で７．５時間攪拌した。該反応混合物を酢酸エチルエステルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、真空濃縮およびシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチルエステル＝１／４）により精製して、黄色固形物の1-〔4-（ｎ−ドデシル）フェニル〕-3-(4-ニトロフェニル）-5-ピラゾロンを151.8mg（収率３４％）得た。該固形物をｎ−ヘキサンにより再結晶し、ろ取して黄色固形物の1-〔4-(n-ドデシル）フェニル〕-3-（４-ニトロフェニル）-5-ピラゾロンを129.5mg（収率８５％）得た。以下にその融点、１Ｈ−ＮＭＲデータ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＨＲＭＳデータ、元素分析値を示す。
m.p.:116.2-117.2℃;
1H-NMR(CDCl3,500MHz,δ:ppm):
8.31(2H,d,J=8.8Hz),7.93(2H,d,J=8.8Hz),7.81(2H,d,J=8.5Hz),7.25(2H,d,J=8.5Hz),3.88(2H,s),
2.63(1H,t,J=7.6Hz),1.70-1.55(2H,m),1.45-1.30(18H,m),0.88(3H,t,J=7.0Hz);
13C-NMR(CDCl3,600MHz,δ:ppm):
14.1,22.7,29.2,29.4,29.5,29.6,29.7,31.4,31.9,35.5,39.2,119.4,124.3,126.6,128.9,135.4,136.6,140.9,151.9,169.7;
HRMS:計算値(C27H35N3O3) 449.268,測定値449.268;
元素分析：計算値(C27H35N3O3)C,72.13,;H,7.85;N,9.35;測定値C,72.15;H,7.84;N,9.21.【００３４】
（実施例１８）
実施例１８の抗プリオン活性化合物は、1-〔4-(n-ドデシル）フェニル〕-3-(4-メトキシフェニル）-5-ピラゾロンであり、実施例１７の4-(n-ドデシル）フェニルヒドラジン塩酸塩を用いて、次のように合成した。すなわち、4-(n-ドデシル）フェニルヒドラジン塩酸塩（312mg,1.0mmoL）を酢酸（10mL）に加えた懸濁液に4-メトキシベンゾイル酢酸エチルエステル（222mg,1.0mmoL,1.0当量）、トリエチルアミン（0.08mL,1.2当量）を加え、還流温度で７．５時間攪拌した。該反応混合物を酢酸エチルエステルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、真空濃縮およびシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチルエステル＝１／３）により精製して黄色粗製物を得た。該粗製物をｎ−ヘキサンにより再結晶し、ろ取して黄色固形物の1-〔4-(n-ドデシル）フェニル〕-3-(4-メトキシフェニル）-5-ピラゾロンを138.5mg（収率３２％）得た。以下にその融点、１Ｈ−ＮＭＲデータ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＨＲＭＳデータ、元素分析値を示す。
m.p.:92.0-92.5℃;
1H-NMR(CDCl3,500MHz,δ:ppm):
7.84(2H,d,J=8.2Hz),7.71(2H,d,J=8.5Hz),7.22(2H,d,J=8.2Hz),6.96(2H,d,J=8.5Hz),3.87(3H,s),
3.82(2H,s),2.61(2H,t,J=7.3Hz),1.64-1.57(2H,m),1.31-1.14(18H,m),0.88(3H,t,J=7.3Hz);
13C-NMR(CDCl3,600MHz,δ:ppm)
14.1,22.7,29.3,29.4,29.5,29.6,29.7,31.4,31.9,35.5,39.7,55.4,114.3,119.2,123.8,127.6,128.8,135.4,
135.9,140.1,154.3,161.6,170.1;
HRMS:計算値(C28H38N2O2)434.293,測定値434.293;
元素分析:計算値(C28H38N2O2) C,77.38,;H,8.81;N,6.45;測定値C,77.41;H,8.89;N,6.70.【００３５】
（実施例１９）
実施例１９の抗プリオン活性化合物は、3-メチル-1-（ピリジン-2-イル）-4-（n-トリデシル）-5-ピラゾロンであり、次の２段階で合成した。
<第１段階＞
２０％ナトリウムエトキシドのエチルアルコール溶液（21.01g,64.1mmoL,1.1当量）に３−オキソブタン酸エチルエステル（7.58g,58.3mmoL）を氷冷下加え、該溶液を室温で３０分間攪拌した。該混合物に臭化ｎ−トリデシル（18.48g,70.2mmoL,1.2当量）をＴＨＦ（５ｍＬ）に溶かした溶液を３０分かけて滴下し、該反応混合物を８０℃で２０時間攪拌した。該反応混合物を２Ｎ塩酸−氷に注ぎ込み、酢酸エチルエステルで抽出した。該酢酸エチルエステル層を分離し、水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、真空濃縮およびシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチルエステル＝１０／１）により精製して、淡黄色油状物の2-アセチル−ペンタデカン酸エチルエステルを8.27g（収率４６％）得た。以下にその１Ｈ−ＮＭＲデータ、ＭＳデータを示す。1H-NMR(CDCl3,500MHz,δ:ppm)
4.15(2H,q,J=7.3Hz),3.35(1H,t,J=7.6Hz),2.18(3H,s),1.86-1.74(2H,m),1.32-1.23(25H,m),
0.84(3H,t,J=7.0Hz);
MS(EI)m/z:312(M+).
<第２段階＞
上記第１段階で得た２−アセチル−ペンタデカン酸エチルエステルを用いて、次のように3-メチル-1-（ピリジン-2-イル）-4-(n-トリデシル）-5-ピラゾロンを合成した。すなわち、2-ヒドラジノピリジン（353mg,3.2mmoL,1.0当量）を酢酸（１０ｍＬ）に溶かした溶液に２−アセチル−ペンタデカン酸エチルエステル（1.01g,3.2mmoL）を加え、還流温度で７時間攪拌した。該反応混合物を酢酸エチルエステルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、真空濃縮およびシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチルエステル＝２／１、次に酢酸エチルエステルで溶出）により精製して、白色固形物の3-メチル-1-（ピリジン-2-イル）-4-(n-トリデシル）-5-ピラゾロンを965mg（収率８４％）得た。該固体をn-ヘキサンにより再結晶し、ろ取して3-メチル-1-（ピリジン-2-イル）-4-（n-トリデシル）-5-ピラゾロンの無色の結晶を712mg（収率３４％）得た。以下にその融点、１Ｈ−ＮＭＲデータ、ＭＳデータ、ＨＲＭＳデータ、元素分析値を示す。
m.p.:56.2-56.8℃;
1H-NMR(CDCl3,500MHz,:ppm):
12.5(1H,br),8.22(2H,d,J=5.2Hz),7.84-7.79(2H,m),7.10-7.05(1H,m),
2.33(2H,d,J=7.6Hz),2.22(3H,s),1.55-1.46(2H,m),1.40-1.30(20H,m),
0.88(3H,t,J=7.0Hz);MS(EI)m/z:357(M+);
HRMS:計算値(C22H35N3O)357.278,測定値357.279;
元素分析:計算値(C22H35N3O)C,73.91;H,9.87;N,11.75;測定値C,73.69;H,9.8 9;N,11.77.【００３６】
（比較例１）
比較例１はキニーネであり、市販の試薬をそのまま用いた。この化合物は特許文献１に記載の抗プリオン活性化合物である。【００３７】
（比較例２）
比較例２はキニジンであり、市販の試薬をそのまま用いた。この化合物は特許文献２に記載の抗プリオン活性化合物である。【００３８】
（比較例３）
比較例３はＭＱＡＡ（下記化学式参照）であり、市販の試薬をそのまま用いた。この化合物は特許文献２に記載の抗プリオン活性化合物である。
【化３】
2008053764.tif 000005
【００３９】
（比較例４）
比較例４は4-(4-ジメチルアミノスチリル）キノリン（下記化学式参照）であり、市販の試薬をそのまま用いた。この化合物は特許文献２に記載の抗プリオン活性化合物である。
【化４】
2008053764.tif 000006
【００４０】
＜評  価＞
以上のようにして得られた実施例１〜１９の抗プリオン活性化合物及び比較例１〜４の抗プリオン活性化合物について、以下に示す方法によって抗プリオン活性の評価を行った。【００４１】
評価は２種類のＴＳＥ（伝達性海綿状脳症）由来プリオン感染マウス神経芽腫細胞株(N2a)を用いて行った。すなわち、RML株で感染させたN2a細胞（ScN2a）及びFukuoka-1株で感染させたN2a#58細胞（F3）である。N2a#58細胞は、正常型プリオンタンパク質（PrP）の発現が、N2a細胞に比べて５倍多いことが知られている。 ScN2a細胞とF3細胞は、６穴培養プレートを用い、１０％ウシ胎児血清を添加したOpti-MEM（Invitrogen社製品）培養液中で増殖させた。これらの細胞は、培養容器に密になるまで培養し、次にこのうち５％を用いて継代培養する際に、抗プリオン活性化合物を様々な濃度で培養液に添加した。なお、抗プリオン活性化合物を溶解させるためにDMSOやエタノールを用いる場合、それらの濃度は培地に対して0.2%以下となるように添加した。こうして抗プリオン活性化合物を添加したＴＳＥ由来プリオン感染マウス神経芽腫細胞株(N2a)を培養容器に密になるまで（３〜４日間）増殖させた。【００４２】
抗プリオン活性の測定
抗プリオン活性化合物の抗プリオン活性の測定は、ScN2aあるいはF3の異常型プリオンの形成が５０％抑制される濃度（以下「ＩＣ５０」という）を測定することによって行われた。その方法は次のとおりである。
すなわち、抗プリオン活性化合物を目的の濃度となる様に添加した抗プリオン活性化合物含有培養液を用意し、細胞を密になった状態の１０％の密度で新しいプレートに継代培養する際に、その抗プリオン活性化合物含有培養液で培養した。こうしてＴＳＥ由来プリオン感染マウス神経芽腫細胞株(N2a)が密な状態まで増殖した後、細胞を溶解バッファー（0.5%デオキシコレートナトリウム、0.5%Nonidet P-40、リン酸緩衝液生理食塩水）で溶解した。細胞溶解液を10 mg/ml濃度のプロテナーゼK（蛋白質分解酵素の１種）で３０分間消化して（異常型プリオンタンパク質はプロテナーゼKによっては消化されないために残る）、その後GLASSFOG（微細なガラスビーズ）とともに２４°C、15,000 x gで５分間遠心分離した。遠心分離で得た沈殿をサンプルローディングバッファー（電気泳動用の試料溶解液）に再懸濁させ、煮沸処理した。こうして得られた試料を15% Tris-glycine-SDS-polyacrylamideゲルで電気泳動して分離し、ウェスターンブロッティング用のメンブレンに転写した。異常型プリオンタンパク質は、SAF83抗体（原液を1:5000希釈で適用、入手先はフランス・SPI-Bio社）と結合させ、さらにアルカリフォスファターゼを結合した二次抗体を結合させて、検出した。免疫学的に反応して検出された信号（すなわちメンブレン上に検出された異常型プリオンタンパク質のバンド）は、CDP-Star検出試薬（米国・アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて可視化し、蛋白質バンドの密度計測であるデンシトメータによって濃度を求めた。測定に際しては、対照群に対して異常型プリオンタンパク質の生成を５０％抑制するときの抗プリオン活性化合物の濃度を少なくとも３回の独立した実験から決定した。【００４３】
＜結  果＞
以上のようにして抗プリオン活性の測定を行った結果を表１に示す。
【表１】
2008053764.tif 000007
【００４４】
表１に示すように、ＳｃＮ２ａ細胞については、実施例７（Ｒ1＝４−クロロフェニル、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル）、実施例１９（Ｒ1＝２−ピリジル、Ｒ2＝ｎ−トリデシル、Ｒ3＝メチル）、実施例３（Ｒ1＝フェニル、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝４−ニトロフェニル）、実施例１７（Ｒ1＝４−（ｎ−ドデシル）フェニル、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝４−ニトロフェニル）、実施例５（Ｒ1＝フェニル、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メトキシカルボニルアミノ）および実施例１１（Ｒ1＝フェニル、Ｒ2＝ベンゾイル、Ｒ3＝メチル）のＩＣ５０（ｎＭ）がそれぞれ０．５０、１、３．１６、５．０１、６．３１および６．３１であり、比較例１〜４に比して高い抗プリオン活性を示した。また、実施例２は比較例４とほぼ同等の抗プリオン活性を示し、実施例８、実施例１３、実施例６、実施例９、実施例１８、実施例１６、実施例４および実施例１４は比較例３より高い抗プリオン活性を示し、実施例１および実施例１２は比較例２より高い抗プリオン活性を示した。一方、Ｆ３細胞については、実施例８（Ｒ1＝フェニル、Ｒ2＝フェニル、Ｒ3＝メチル）および実施例３（Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝４−ニトロフェニル基）のＩＣ５０（ｎＭ）がそれぞれ１．２６および３．１６であり、実施例１〜１９の中で高い抗プリオン活性を示した。また、実施例１０、実施例２、実施例６、実施例１９および実施例５は比較的高い抗プリオン活性を示し、実施例４、実施例１３、実施例９、実施例１５、実施例１１、実施例１２および実施例１４も抗プリオン活性を示した。
以上のように、実施例７、実施例１９、実施例３、実施例１７、実施例５、実施例１１および実施例８がＦ３細胞及びＳｃＮ２ａ細胞のうち少なくとも一方について高い抗プリオン活性を示すことが明らかになった。更に、実施例３（Ｒ1＝フェニル、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝４−ニトロフェニル）がＦ３細胞、ＳｃＮ２ａ細胞の双方について高い抗プリオン活性を示したことから、当該ピラゾロン誘導体については広域の抗プリオン活性スペクトルが期待できる。【００４５】
表１に示すように、Ｒ1としてフェニル基や置換基の結合したフェニル基やシクロアルキル基を導入したり、Ｒ2にシクロアルキル基やアシル基を導入したり、Ｒ3にフェニル基、置換基の結合したフェニル基、シクロアルキル基、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−及びＲＮＨＣＯＮＨ−といった置換基を導入したりした実施例１〜１４のピラゾロン誘導体が、いずれも抗プリオン活性を有することが分かった。これらの結果から、
Ｒ１が置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）であり、Ｒ２が水素、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）又はアシル基であり、Ｒ３が置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）であるピラゾロン誘導体が抗プリオン活性を有することは、当業者であれば当然に類推できる範囲である。
これらの中でも、特に優れた抗プリオン活性を有するのは、実施例２（Ｒ1＝シクロヘキシル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝メチル基）、実施例３（Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝Ｈ、Ｒ3＝４−ニトロフェニル基）、実施例８（Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝フェニル基、Ｒ3＝メチル基）、実施例１０（Ｒ1＝フェニル基、Ｒ2＝イソブチル基、Ｒ3＝メチル基）であった。【００４６】
この発明は、上記発明の実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の抗プリオン活性化合物は、現在は有効な治療法がないクロイツフェルト・ヤコブ病などヒトプリオン病治療薬や、狂牛病対策としての動物用医薬品に利用可能である。また、系統的な化合物群を活用できるため、プリオン病の感染・発症機構解明、治療法開発のための研究開発用試薬としても有用である。
【手続補正書】
【提出日】平成21年1月8日(2009.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害する抗プリオン活性剤であって、
下記一般式（１）で示されるピラゾロン誘導体（ただし、２−［２−［４−（３−メチル−５−オキソ−２−ピロゾリン−１−イル）フェニル］エテニル］ベンゾオキサゾールを除く）を有効成分として含むことを特徴とする抗プリオン活性剤。
【化１】
2008053764.tif 000010
式中Ｒ１は置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）を示し、Ｒ２は水素、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよい含窒素複素環官能基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）又はアシル基を示し、Ｒ３は置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−を示す（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）。
【請求項２】
前記Ｒ１は置換基を有してもよいフェニル基又はシクロアルキル基であることを特徴とする請求項１記載の抗プリオン活性剤。
【請求項３】
前記Ｒ２は水素、フェニル基、ピリジル基、アルキル基（シクロアルキル基を含む）又はベンゾイル基であることを特徴とする請求項１又は２記載の抗プリオン活性剤。
【請求項４】
前記Ｒ３はアルキル基、アルケニル基、置換基を有してもよいフェニル基、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）を示す）であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項記載の抗プリオン活性剤。
【請求項５】
前記Ｒ１は置換基を有してもよいフェニル基又はシクロアルキル基であり、Ｒ２は水素、フェニル基、ピリジル基、アルキル基（シクロアルキル基を含む）又はベンゾイル基あり、Ｒ３はアルキル基、アルケニル基、置換基を有してもよいフェニル基、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）を示す）であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載の抗プリオン活性剤。
【請求項６】
前記Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の組み合わせが（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝シクロヘキシル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝４−ＮＯ２Ｐｈ）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＦ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３ＯＣＯＮＨ）、（Ｒ１＝４−ＣｌＰｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝フェニル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝イソプロペニル基）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝イソブチル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝ベンゾイル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＰｈＣＯＮＨ）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝２−ピリジル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＰｈＮＨＣＯ）、（Ｒ１＝２−ピリジル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝Ｉ−４−（１−ＣＨ３）Ｐｙ＋−）、（Ｒ１＝４−ｎ−Ｃ１２Ｈ２５Ｐｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝４−ＮＯ２Ｐｈ）、（Ｒ１＝４−ｎ−Ｃ１２Ｈ２５Ｐｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝４−ＣＨ３ＯＰｈ）及び（Ｒ１＝２−ピリジル基，Ｒ２＝ｎ−Ｃ１３Ｈ２７，Ｒ３＝ＣＨ３）のいずれかであることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項記載の抗プリオン活性剤。
【請求項７】
下記一般式（１）で示されるピラゾロン誘導体。
【化２】
2008053764.tif 000011
式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の組み合わせは、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝シクロヘキシル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝４−ＮＯ２Ｐｈ）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＦ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３ＯＣＯＮＨ）、（Ｒ１＝４−ＣｌＰｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝フェニル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝イソプロペニル基）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝イソブチル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝ベンゾイル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＰｈＣＯＮＨ）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝２−ピリジル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＰｈＮＨＣＯ）、（Ｒ１＝２−ピリジル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝Ｉ−４−（１−ＣＨ３）Ｐｙ＋−）、（Ｒ１＝４−ｎ−Ｃ１２Ｈ２５Ｐｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝４−ＮＯ２Ｐｈ）、（Ｒ１＝４−ｎ−Ｃ１２Ｈ２５Ｐｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝４−ＣＨ３ＯＰｈ）及び（Ｒ１＝２−ピリジル基，Ｒ２＝ｎ−Ｃ１３Ｈ２７，Ｒ３＝ＣＨ３）のいずれかである。
【請求項８】
請求項１乃至６のいずれか１項記載の抗プリオン活性剤を投与して異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害することを特徴とする異常型プリオンタンパク質生成の阻害方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
［発明の開示］
［発明が解決しようとする課題］
［０００６］
しかし、上記従来の抗プリオン活性化合物では、いずれの化合物も治療薬としての効果は不十分であり、発病すると死の転帰をとるこの疾患の有効な治療法は未だ確立されていないのが現状である。本発明は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであり、異常型プリオンタンパク質の増殖の抑制に優れた効果を奏する抗プリオン活性化合物を提供することを解決すべき課題としている。
また、さらには、本発明の抗プリオン活性化合物を利用した、異常型プリオンタンパク質の増殖の抑制に優れた効果を奏する抗プリオン活性剤及び異常型プリオンタンパク質生成の阻害方法を提供することを解決すべき課題としている。
［課題を解決するための手段］
［０００７］
発明者らは、抗プリオン活性化合物として作用する化合物には、活性酸素種のスカベンジャーとなるようなフリーラジカル消去剤として知られているものが存在することに注目し、そのような性質を有する様々な化合物について、その抗プリオン活性を調べた。その結果、臨床において脳保護剤に用いられているエダラボン（３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン）が抗プリオン活性を備えていることを見出した。
［化１］
2008053764.tif 000012
さらには、このエダラボンをリード化合物として、そのピラゾロン骨格に結合する置換基の種類を変えた化合物を合成し、それらの抗プリオン活性について鋭意研究を行った。その結果、ピラゾロン骨格を有する一連の誘導体が、優れた抗プリオン活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
［０００８］
すなわち、本発明の抗プリオン活性剤は、
異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害する抗プリオン活性剤であって、
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
下記一般式（１）で示されるピラゾロン誘導体（ただし、２−［２−［４−（３−メチル−５−オキソ−２−ピロゾリン−１−イル）フェニル］エテニル］ベンゾオキサゾールを除く）を有効成分として含むことを特徴とする。
［化２］
2008053764.tif 000013
式中Ｒ１は置換基を有してもよいアリール基又は置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）を示し、Ｒ２は水素、置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよい含窒素複素環官能基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）又はアシル基を示し、Ｒ３は置換基を有してもよいアリール基、置換基を有してもよいアルキル基（シクロアルキル基も含む）、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−を示す（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）。なお、上記式（１）のカルボニル基は、実際にはエノール型の互変異性体と相互変換されているが、便宜上上記一般式（１）で表現した。
［０００９］
発明者らは、プリオン持続感染細胞を用いて上記の構造を有するピラゾロン誘導体の抗プリオン活性を調べたところ、優れた抗プリオン活性を示すことを確認している。
［００１０］
上記一般式（１）において、Ｒ１は置換基を有してもよいフェニル基又はシクロアルキル基とすることができる。また、Ｒ２は水素、フェニル基、ピリジル基、アルキル基（シクロアルキル基を含む）又はベンゾイル基とすることができる。さらに、Ｒ３はアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）を示す）であるとすることができる。
このようなピラゾロン誘導体として、さらに、Ｒ１は置換基を有してもよいフェニル基又はシクロアルキル基であり、Ｒ２は水素、フェニル基、ピリジル基、アルキル基（シクロアルキル基を含む）又はベンゾイル基あり、Ｒ３はアルキル基、置換基を有してもよいフェニル基、ＲＣＯＮＨ−、ＲＮＨＣＯ−、ＲＯＣＯＮＨ−又はＲＮＨＣＯＮＨ−（ここでＲはアリール基又はアルキル基（シクロアルキル基を含む）を示す）とすることができる。
［００１１］
発明者らは、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３の組み合わせが（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
、（Ｒ１＝シクロヘキシル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝４−ＮＯ２Ｐｈ）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＦ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３ＯＣＯＮＨ）、（Ｒ１＝４−ＣｌＰｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝フェニル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝イソプロペニル基）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝イソブチル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝ベンゾイル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＰｈＣＯＮＨ）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝２−ピリジル基，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＰｈＮＨＣＯ）、（Ｒ１＝２−Ｐｙｒｉｄｙｌ−，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝２−ピリジル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝ＣＨ３）、（Ｒ１＝フェニル基，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝Ｉ−４−（１−ＣＨ３）Ｐｙ＋−）、（Ｒ１＝４−ｎ−Ｃ１２Ｈ２５Ｐｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝４−ＮＯ２Ｐｈ）、（Ｒ１＝４−ｎ−Ｃ１２Ｈ２５Ｐｈ，Ｒ２＝Ｈ，Ｒ３＝４−ＣＨ３ＯＰｈ）及び（Ｒ１＝２−ピリジル基，Ｒ２＝ｎ−Ｃ１３Ｈ２７，Ｒ３＝ＣＨ３）のいずれかである場合に、確実に抗プリオン活性を有することを確認している。
［００１２］
［００１３］
また、本発明の抗プリオン活性剤を用いることにより、異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害する。すなわち、本発明の異常型プリオンタンパク質生成の阻害方法は、請求項１乃至６のいずれか１項記載の抗プリオン活性剤を投与して異常型プリオンタンパク質の増殖を阻害することを特徴とする。
［発明を実施するための最良の形態］
［００１４］
以下、本発明の抗プリオン活性剤をさらに具体化した実施例１〜１９について、比較例１〜４と比較しつつ詳述する。
実施例１はエダラボンであり、実施例２〜１９は、エダボランに存在するフェニル基やピラゾロン環の３位のメチル基を変換したり、ピラゾロン環の４位に置換基を導入したりしたものである（具体的構造については後述する表１に示す）。
また、比較例１〜４は、特許文献１あるいは特許文献２において抗プリオン活性剤であることが記載されている化合物であり、比較例１はキニーネ、比較例２はキニジン、比較例３はＭＱＡＡ（構造は後述する表１に示す）、比較例４は４−（４−ジメチルアミノスチリル）キノリンである。なお、抗プリオン活性化合物の合成に際して用いた、試薬
【国際調査報告】
2008053764.tif 000014
2008053764.tif 000015
2008053764.tif 000016
2008053764.tif 000017
2008053764.tif 000018
2008053764.tif 000019