(57)【要約】  本発明は、バキュロウイルスを含む、肝障害の予防・治療剤；バキュロウイルスを含む、肝線維化の抑制剤；肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されているバキュロウイルス；肝障害以外の疾患の予防・治療に有効な因子をコードするバキュロウイルスを含み、かつ肝障害を患う被験体に適用される、該疾患の予防・治療薬；バキュロウイルス、及び肝障害の予防・治療薬を含む、併用剤及びキットなどを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バキュロウイルスを含む、肝障害の予防・治療剤。
【請求項２】
バキュロウイルスがバキュロウイルスベクターである、請求項１記載の剤。
【請求項３】
肝障害が、肝炎、肝硬変又は肝癌である、請求項１又は２記載の剤。
【請求項４】
バキュロウイルスを含む、肝線維化の抑制剤。
【請求項５】
肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されているバキュロウイルス。
【請求項６】
肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されているバキュロウイルスを含み、かつ肝障害を患う被験体に適用される、該疾患の予防・治療薬。
【請求項７】
バキュロウイルス、及び肝障害の予防・治療薬を含む、併用剤。
【請求項８】
バキュロウイルス、及び肝障害の予防・治療薬を含む、キット。
【請求項９】
肝障害の予防・治療剤を製造するための、バキュロウイルスの使用。
【請求項１０】
バキュロウイルスがバキュロウイルスベクターである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
肝障害が、肝炎、肝硬変又は肝癌である、請求項９又は１０記載の使用。
【請求項１２】
肝線維化の抑制剤を製造するための、バキュロウイルスの使用。
【請求項１３】
肝障害を患う被験体に適用される、肝障害の予防・治療剤を製造するための、肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されているバキュロウイルスの使用。
【請求項１４】
被験体に、バキュロウイルスの有効量を投与することを含む、該被験体における肝障害の予防・治療方法。
【請求項１５】
バキュロウイルスがバキュロウイルスベクターである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
肝障害が、肝炎、肝硬変又は肝癌である、請求項１４又は１５記載の方法。
【請求項１７】
被験体に、バキュロウイルスの有効量を投与することを含む、該被験体における肝線維化を抑制する方法。
【請求項１８】
肝障害を患う被験体に、肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されているバキュロウイルスの有効量を投与することを含む、該被験体における肝障害の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バキュロウイルスを含む肝障害の予防・治療剤などを提供する。
【背景技術】
【０００２】
肝炎は、我が国における生活習慣病のひとつである。肝炎の原因としては、肝炎ウイルス、アルコール、薬剤・毒物などが挙げられる。肝臓に炎症が起こると急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、肝癌と進行していく。急性肝炎は一般的に予後が良好な疾患であるが、場合によっては劇症肝炎へと進展し死に至る。急性肝炎から持続的な肝臓の炎症が６ヶ月以上続くと慢性肝炎へと進展する。慢性肝炎では高度の肝機能障害があっても自覚症状を欠くことが多いため、急性肝不全状態に陥らない限り死に至ることはない。しかし、慢性肝炎は肝硬変へ移行し肝細胞癌の発生へとつながる危険性が極めて高い。肝硬変は、ひとつの独立した疾患というよりも、種々の原因によって生じた肝病変が治癒せず、慢性の経過をたどった後の終末像である。肝硬変の死因は、２０〜３０年前には肝不全、消化管出血、肝細胞癌がそれぞれ３分の１を占めていたが、最近では肝細胞癌が７０％、肝不全が２０％、消化管出血が５％、その他が５％となっている。この背景には、栄養療法の進歩、食道静脈瘤に対する内視鏡的治療の向上、抗生物質、利尿薬およびアルブミン製剤などの開発と普及などによる食道静脈瘤出血死、感染死などの減少がある。肝硬変患者の生存率が高まることは、必然的に肝硬変患者の高齢化をきたし、同時に肝癌発生率の増加につながっている。【０００３】
肝硬変の治療法は、発症の予防又は進展の抑制を目的とした治療法、及び合併症に対する治療法の２つに分けられる。それぞれの診断と治療法の進歩により生命予後が著しく改善はしているが、肝癌への進行を防ぐ程度の治療しか行われていない。肝硬変から肝炎レベルまで病状を軽減することができれば完治の可能性があるものと考えられる。【０００４】
肝硬変の特徴は、肝臓における線維形成である。通常の肝臓では細胞によるコラーゲン合成とプロテアーゼによる分解のバランスが均衡に保たれている（非特許文献１）。細胞にダメージが加わるとコラーゲンが分泌され傷跡として残り、多く分泌されたコラーゲンは分解される。しかし、慢性的な肝障害により、このバランスが不均衡となる。肝線維化は、繰り返される傷害に対する肝臓の創傷治癒の結果である（非特許文献２）。線維化の治療において肝細胞移植、遺伝子治療といった方法が現在研究されているが、未だによい成果は得られていない。【０００５】
ところで、バキュロウイルス（ＢＶ）は鱗翅目、膜翅目および双翅目などの昆虫に感染する昆虫病原ウイルスである。バキュロウイルスは、遺伝子として、約１３０ｋｂｐの環状２本鎖ＤＮＡを有する。バキュロウイルスとしては、例えば、感染細胞の核内に多角体と呼ばれる封入体を全細胞タンパクの４０〜５０％に達するほど大量に作るウイルスであるオートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus：ＡｃＮＰＶ）が知られている。封入体（多角体）は多数のウイルスを含んでおり、ウイルス粒子を保護している。封入体は、食物とともに昆虫の幼虫に取り込まれ、宿主の腸内でアルカリフォスファターゼによって消化後、感染粒子を放出し、腸上皮に感染する。その後、ウイルスは宿主の全身に広がり、他の細胞にも感染し、宿主の死とともに細胞より放出される。【０００６】
バキュロウイルスは、環境に対する影響が少なく、宿主特異性が高いことから農薬として用いられている。人畜に対する薬害、収穫物への残留毒性の心配も少ないため、安全性が極めて高い。また、バキュロウイルスは強力なプロモーターをもち、細胞内の全タンパク質の２０〜３０％に相当するタンパク質を合成し得ることから、タンパク質発現系としても広く用いられている。さらに、遺伝子治療ベクターとしての研究も進んでいる。バキュロウイルスは哺乳動物内では複製しないため、染色体に組みこまれず安全性が高い。ＣＭＶなど哺乳動物細胞内で動くプロモーターの下流に目的遺伝子が挿入された組換えバキュロウイルスは、ヒト肝癌細胞、腎臓細胞、ラット肝癌細胞、プライマリーなヒト肝実質細胞などの種々の哺乳動物細胞内で遺伝子を発現可能なことが確認されている。【０００７】
野生型バキュロウイルスは、哺乳動物に対して免疫活性化を誘導することが報告されている。例えば、非特許文献３には、バキュロウイルス感染により、マウスとヒトの培養細胞株からＩＦＮが誘導されたことが記載されている。非特許文献４には、ヒト培養肝細胞とクッパー細胞の混合培養内にバキュロウイルスを加えると、炎症性サイトカインが発現されることが記載されている。また、本発明者らの研究室では、バキュロウイルスを鼻腔投与して自然免疫を活性化させておくと、致死量のインフルエンザウイルスの投与に対して延命効果があること（非特許文献５）、並びにバキュロウイルスが自然免疫活性化に重要なＴｏｌｌ様レセプター９（Toll-like receptor 9：ＴＬＲ９）を刺激すること（非特許文献６）を報告している。【０００８】
しかしながら、バキュロウイルスが、肝障害を予防・治療し得ること、及び／又は肝線維化を抑制し得ることについては報告されていない。
【非特許文献１】中村ら，最新医学55巻8号，33-40頁 (2000)
【非特許文献２】Bataller et al., J Clin Invest 115, 209-218 (2005)
【非特許文献３】Gronowski et al., J Virol 73, 9944-9951 (1999)
【非特許文献４】Beck et al., Gene Ther 7, 1274-1283 (2000)
【非特許文献５】Abe et al., J Immunol 171, 1133-1139 (2003)
【非特許文献６】Abe et al., J Virol 79, 2847-2858 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、肝障害を予防・治療し得る、及び／又は肝線維化を抑制し得る新規手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、バキュロウイルスの投与により、生体において、肝再生因子であるＨＧＦ及び肝線維化抑制因子であるＩＦＮｓを誘導し得、また肝線維化促進因子であるＴＧＦ−βの働きを抑制し得ること、並びにこのような作用により、肝障害を予防・治療し得ること、及び／又は肝線維化を抑制し得ることなどを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
即ち、本発明は、下記の通りである：
〔１〕バキュロウイルスを含む、肝障害の予防・治療剤；
〔２〕バキュロウイルスがバキュロウイルスベクターである、上記〔１〕の剤；
〔３〕肝障害が、肝炎、肝硬変又は肝癌である、上記〔１〕又は〔２〕の剤；
〔４〕バキュロウイルスを含む、肝線維化の抑制剤；
〔５〕肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されているバキュロウイルス；
〔６〕肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されているバキュロウイルスを含み、かつ肝障害を患う被験体に適用される、該疾患の予防・治療薬；
〔７〕バキュロウイルス、及び肝障害の予防・治療薬を含む、併用剤；
〔８〕バキュロウイルス、及び肝障害の予防・治療薬を含む、キット；
〔９〕肝障害の予防・治療剤を製造するための、バキュロウイルスの使用；
〔１０〕バキュロウイルスがバキュロウイルスベクターである、上記〔９〕記載の使用；
〔１１〕肝障害が、肝炎、肝硬変又は肝癌である、上記〔９〕又は〔１０〕記載の使用；
〔１２〕肝線維化の抑制剤を製造するための、バキュロウイルスの使用；
〔１３〕肝障害を患う被験体に適用される、肝障害の予防・治療剤を製造するための、肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されているバキュロウイルスの使用；
〔１４〕被験体に、バキュロウイルスの有効量を投与することを含む、該被験体における肝障害の予防・治療方法；
〔１５〕バキュロウイルスがバキュロウイルスベクターである、上記〔１４〕記載の方法；
〔１６〕肝障害が、肝炎、肝硬変又は肝癌である、上記〔１４〕又は〔１５〕記載の方法；
〔１７〕被験体に、バキュロウイルスの有効量を投与することを含む、該被験体における肝線維化を抑制する方法；
〔１８〕肝障害を患う被験体に、肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されているバキュロウイルスの有効量を投与することを含む、該被験体における肝障害の予防・治療方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のバキュロウイルス及び剤は、例えば、肝炎、肝硬変、肝癌等の肝障害の予防・治療、及び／又は肝線維化の抑制に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＤＭＮ、及びバキュロウイルス、ＬＰＳ又は生理食塩水の投与スケジュールを示す図である。  ＢＡＬＢ／ｃマウスにＤＭＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与し、その後、バキュロウイルス（１０３、１０５、１０７ｐｆｕ）、ＬＰＳ（７５μｇ）、生理食塩水を腹腔投与した。ＢＶ：バキュロウイルス（以下同様）。
【図２】バキュロウイルス投与マウスにおけるＧＯＴ値を示す図である。  各投与群から回収した血清中のＧＯＴ値を測定した。ＤＭＮ、生理食塩水投与群では高い値を示しているのに対し、バキュロウイルス投与群では有意に低い値を示した。バキュロウイルスの力価による有意差はみられなかった。  統計学的解析：ソフトウエアＳｔａｔＶｉｅｗ  Ｖｅｒ４．１１，ＡＮＯＶＡ，Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ  Ｆ検定
【図３】バキュロウイルス投与マウスにおけるＧＰＴ値を示す図である。  各投与群から回収した血清中のＧＰＴ値を測定した。ＤＭＮ、生理食塩水投与群では高い値を示しているのに対し、バキュロウイルス投与群では有意に低い値を示した。バキュロウイルスの力価による有意差はみられなかった。  統計学的解析：ソフトウエアＳｔａｔＶｉｅｗ  Ｖｅｒ４．１１，ＡＮＯＶＡ，Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ  Ｆ検定
【図４】バキュロウイルス投与マウスにおけるコラーゲン量を示す図である。  各投与群の肝臓のコラーゲン量を測定した。ＤＭＮ、生理食塩水投与群では高い値を示しているのに対し、バキュロウイルス投与群では有意に低い値を示した。また、バキュロウイルスによる力価の有意差はみられなかった。  統計学的解析：ソフトウエアＳｔａｔＶｉｅｗ  Ｖｅｒ４．１１，ＡＮＯＶＡ，Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ  Ｆ検定
【図５】バキュロウイルス又はＬＰＳの投与スケジュールを示す図である。  ＢＡＬＢ／ｃマウスにバキュロウイルス（１０７ｐｆｕ）、ＬＰＳ（７５μｇ）を腹腔内投与した。投与後、２、１２、２４、４８時間後に解剖をし、腸管リンパ節、腹腔内細胞、脾臓、肝臓、血液を回収した。ＬＰＳ投与群は投与してから２時間後に解剖を行った。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、バキュロウイルスを含む剤を提供する。【００１５】
バキュロウイルスは、野外の罹病昆虫から５００株以上が分離されており、仮の種として登録されているものは６０３種存在する。バキュロウイルス科は核多角体病ウイルス（Nuclear polyhedrosis virus : NPV）属と顆粒病ウイルス（Granulo virus : GV）属に大別されている。本発明では、バキュロウイルスベクターとして、ＮＰＶが好ましく用いられる。本発明で用いられ得るＮＰＶとしては、例えば、ウワバの一種より分離されたAutographa californica NPV（ＡｃＮＰＶ）、カイコ由来のBombyx mori NPV（ＢｍＮＰＶ）、ドクガ由来のOrgyia pseudotsugata NPV（ＯｐＮＰＶ）、マイマイガ由来のLymantria dispar NPV（ＬｄＮＰＶ）、シロイチモジヨトウ由来のSpodoptera exigua NPV（ＳｅＮＰＶ）が挙げられるが、なかでもＡｃＮＰＶが好ましい。【００１６】
バキュロウイルスは、所定の疾患の予防・治療に有効な因子をコードする核酸が発現可能な様式で挿入されていてもよい。このような核酸としては、所定の疾患に対する予防・治療に有効な因子（ペプチド、タンパク質）をコードする核酸または核酸自体が挙げられる。核酸自体としては、例えば、アンチセンス核酸、リボザイム、ＲＮＡｉ誘導核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、アプタマー、デコイ核酸が挙げられる。バキュロウイルスはまた、遺伝子発現効率を向上させる因子を含んでいてもよい。遺伝子発現効率を向上させる因子としては、例えば、ＶＳＶ−Ｇ、ＲＶＧ（rabies virus G glycoprotein）、ＭＨＶ（mouse hepatitis virus）が挙げられる。本発明はまた、このようなバキュロウイルスを提供する。【００１７】
バキュロウイルスは、所定の疾患の予防・治療に有効な因子をコードする核酸を含む場合、当該核酸に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。プロモーターは、核酸によりコードされる因子又は核酸自体のいずれを発現させるべきかによって適宜選択され得る。このようなプロモーターとしては、例えば、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）、哺乳動物用プロモーター（例、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター）が挙げられる。【００１８】
所定の疾患の予防・治療に有効な因子をコードする核酸を含むバキュロウイルスは、自体公知の方法により作製できる。例えば、当該因子をコードする核酸を含むバキュロウイルスは、当該因子をコードする核酸をバキュロウイルストランスファーベクターに組み込み、次いで、組換えトランスファーベクターとバキュロウイルスとを昆虫細胞に導入し、相同組換えを生じさせることにより作製できる。【００１９】
バキュロウイルスが、所定の疾患の予防・治療に有効な因子をコードする核酸を含む場合、当該因子により予防・治療され得る所定の疾患は特に限定されない。所定の疾患は、例えば、後述する肝障害、又はそれ以外の疾患であり得る。バキュロウイルスが、肝障害の予防・治療に有効な因子をコードする核酸を含む場合、そのようなバキュロウイルスは、バキュロウイルス自体に起因する薬理効果、及び当該因子に起因する薬理効果により、肝障害に対して相乗的な予防・治療効果を奏する。肝障害の予防・治療に有効な因子は、例えば、後述のＩＦＮ、ＨＧＦであってもよい。一方、バキュロウイルスは、肝障害以外の疾患の予防・治療に有効な因子をコードする核酸を含む場合、当該疾患及び肝障害を併発している、又は併発する危険性がある被験体に適用され得る。このような疾患としては、例えば、肝臓以外の臓器又は組織（例、脳、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、胃、大腸、小腸）、心臓、胸腺、脾臓、リンパ節、末梢血液、骨髄）における疾患、感染症（例、エイズ、インフルエンザ等のウイルス性疾患）、癌、自己免疫疾患、神経免疫疾患、並びに／あるいは後述の疾患が挙げられる。【００２０】
本発明においてバキュロウイルスが投与される被験体は通常哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来る。【００２１】
本発明はまた、バキュロウイルス、及び肝障害の予防・治療薬の組合せ物を提供する。【００２２】
肝障害の予防・治療薬は、肝障害に対する有効な薬理活性を有するものである限り特に限定されず、例えば、低分子有機化合物（例、非ペプチド性化合物、非タンパク質性化合物、非核酸性物質）、及び肝障害の予防・治療に有効な因子（例、ペプチド、タンパク質、核酸）が挙げられる。【００２３】
本発明の組合せ物は、例えば併用剤であり得る。本発明の併用剤は、バキュロウイルス、及び肝障害の予防・治療薬が共に混合して配合されたものであり得る。【００２４】
本発明の組合せ物はまた、キットであり得る。本発明のキットは、バキュロウイルス、及び肝障害の予防・治療薬を個別に（即ち、非混合様式で）含むものであり得る。【００２５】
本発明の剤又は組合せ物は、バキュロウイルスに加え、任意の担体、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００２６】
非経口的な投与（例、静脈内注射、局所適用など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の製剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。【００２７】
バキュロウイルスの投与量は、有効成分の活性や種類、投与様式、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なり得るため、適宜設定され得る。【００２８】
本発明の剤又は組合せ物は、医薬として有用であり得る。例えば、肝障害の予防・治療に有用であり得る。バキュロウイルスにより予防・治療され得る肝障害としては、例えば、肝炎（急性肝炎、慢性肝炎）、肝硬変、肝癌が挙げられる。肝炎としては、例えば、肝炎ウイルス、アルコール、又は薬剤・毒物に起因するものが挙げられる。【００２９】
本発明の剤又は組合せ物はまた、肝障害以外の疾患の予防・治療に有用であり得る。例えば、バキュロウイルスは生体においてＩＦＮ（例、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）を誘導し得ることから、本発明の剤は、生体におけるＩＦＮの誘導が所望される疾患の治療に有用であり得る。ＩＦＮの誘導が所望される疾患としては、ＩＦＮの薬理活性により予防又は治療され得る疾患である限り特に限定されず、例えば、癌（白血病、悪性リンパ腫、肉腫を含む。以下同様であり得る）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、狂犬病、神経疾患、胃・十二指腸疾患が挙げられる。【００３０】
また、バキュロウイルスは生体において肝再生因子であるＨＧＦを誘導し得ることから、本発明の剤は、生体におけるＨＧＦの誘導が所望される疾患の治療に有用であり得る。ＨＧＦの誘導が所望される疾患としては、ＨＧＦの薬理活性により予防又は治療され得る疾患である限り特に限定されず、例えば、神経疾患、閉塞性動脈硬化症、糖尿病性末梢神経障害、血管新生、癌、脱毛症（例、男性脱毛症）、炎症性腸疾患が挙げられる。【００３１】
さらに、バキュロウイルスは生体においてＴＧＦ−β発現を抑制し得ることから、本発明の剤は、生体におけるＴＧＦ−β発現の抑制が所望される疾患の治療に有用であり得る。ＴＧＦ−β発現の抑制が所望される疾患としては、ＴＧＦ−βによりその症状を増悪され得る疾患である限り特に限定されず、例えば、リウマチ、アレルギー、口腔癌が挙げられる。【００３２】
本発明の剤又は組合せ物は、例えば、上述した１以上の疾患を併発している、又は併発する危険性がある被験体に適用（投与）されてもよい。【００３３】
本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【００３４】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【００３５】
実施例１：肝線維化モデルマウスの樹立
肝線維化誘導薬剤としてはジメチルニトロサミン（dimethylnitrosamine：ＤＭＮ）を用いた。ＤＭＮは肝臓に影響を与え、肝機能障害、肝硬変を生じることが知られており、ラット・マウス実験などでも頻繁に用いられている（Suzuki et al., Gene Ther 10, 765-773(2003); Kitamura et al., Lab Invest 82, 571-583(2002); Hata et al., J Histochem Cytochem 50, 1461-1468(2002)）。肝臓は再生能力が高く、炎症が生じても比較的短時間で回復する。しかし、炎症による細胞死、再生を繰り返すことで線維形成の誘導が行われる。そこでＤＭＮを１日おきに２回投与するということを繰り返し、慢性肝炎様症状を引き起こさせることにより、肝線維化モデルの構築を試みた。肝線維化の構築にはＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、７週齢）を用い、ＤＭＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに２回投与し、この投与条件を１〜５週間続けた（群１：本投与条件を１週間持続；群２：本投与条件を２週間持続；群３：本投与条件を３週間持続；群４：本投与条件を４週間持続；群５：本投与条件を５週間持続）。各週、その週でのＤＭＮ投与日に解剖をし、血液と肝臓を摘出した。結果は以下の通りである。
（１）体重
各群のマウスとも体重減少は同様の挙動を示し、各週の初めにＤＭＮを投与してから４、５日目で体重の減少が著しく観察された。生理食塩水投与したマウスは未投与のマウスと同じ体重の増減を示した。
（２）ＧＯＴ・ＧＰＴ値
各群の血液から回収した血清中のトランスアミナーゼ、グルタミン酸・オキザロ酢酸アミノ基転移酵素（Glutamic-Oxaloacetic Transaminase：ＧＯＴ）とグルタミン酸・ピルビン酸アミノ基転移酵素（Glutamic-Pruvate Transaminase：ＧＰＴ）を測定することによって、組織障害の解析を行った。その結果、各群においてＤＭＮ投与群でＧＯＴ・ＧＰＴともに上昇が見られた。特にＤＭＮを三週間投与したマウスにおいて高い値を示しており、肝臓で障害が起きていることが確認された。
（３）肝臓コラーゲンの蓄積量
肝臓中でコラーゲンの蓄積が著しく起こると肝線維化が誘導されることから、肝臓中のコラーゲンを定量することにより、実際に肝線維化が起こっているかを検討した。ＤＭＮを三週間又は四週間投与したマウスにおいてＤＭＮ投与群でコラーゲン量が高い値を示した。
以上より、三週間のＤＭＮ投与（群３の投与条件）が肝線維化の誘導に優れることが確認された。【００３６】
実施例２：バキュロウイルスの調製
（１）バキュロウイルスの増殖
バキュロウイルスとして、核多角体病ウイルス（Nuclear polyhedrosis virus：ＮＰＶ）であるＡｃＮＰＶ（Autographa californica NPV）を培養細胞系にて増殖した。培養細胞として昆虫由来のＳｆ−９細胞を用いた。培養皿（φ１０ｃｍ）にＳｆ−９細胞をまいた。Ｓｆ−９細胞が８０％コンフルエントの状態になった時点でウイルス液を滴下した。その後、２７℃で３〜４日培養し、ウイルスを増殖させた。最終的に培養上清が１〜２Ｌになるまでこの操作を続けた。
（２）バキュロウイルスの回収および濃縮
回収した培養上清は１５００ｒｐｍ、１０分間遠心して細胞とウイルス液に分離した。ウイルス液は８０００ｒｐｍ、４℃、１２時間遠心して上清を除去し、ウイルス塊を１×ＰＢＳ（−）に懸濁した。この溶液をショ糖勾配によって精製した。
（３）バキュロウイルスの力価測定
バキュロウイルスの力価はプラークアッセイによって測定した。培養皿（φ６０ｍｍ）にＳｆ−９細胞を８０％コンフルエントになるようにまき、１時間静置して接着させた。接着後、無血清のＳｆ−９００II培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、４００μｌの無血清培地を加えた。ウイルス液を無血清のＳｆ−９００II培地で段階希釈し、ウイルス希釈液を調製した。このウイルス液１００ｍｌをＳｆ−９細胞に滴下し、常温で９０分間吸着感染させた。吸着感染中、１０分毎にウイルス液をＳｆ−９細胞になじませた。吸着感染後、ウイルス液を取り除き、寒天培地を重層し、２７℃で７２時間静置してプラークを形成させた。形成されたプラーク数を測定し、下記（Ｉ）式によってウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）を算出した。
ウイルス力価＝［｛（希釈倍率）×（プラーク数）｝の和／（希釈倍率の数）］×１０  （Ｉ）【００３７】
実施例３：バキュロウイルス投与による肝線維化の治療
実施例１より、肝線維化モデルマウスの構築にはＤＭＮ週２回投与で３週間繰り返せばよいことがわかった。従って、本実施例では週にＤＭＮを２回目投与後から体重の減少がピークとなる２日後にバキュロウイルスを投与し、肝線維化治療効果を検討した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス７週齢）の腹腔内にＤＭＮ（１０ｍｇ／ｋｇ）を１日おきに２回投与し、これを３週間続けることで肝線維化モデルを構築した。バキュロウイルスによる肝線維化治療効果を検討するため投与日のマウスを解剖し各測定の基準とした。バキュロウイルス（１０３、１０５、１０７ｐｆｕ／２００μｌ／匹）およびＬＰＳ（７５μｇ／２００μｌ／匹）、生理食塩水（２００μｌ／匹）は、ＤＭＮ最終投与の２日後に腹腔に２回投与した。ＬＰＳをコントロールとして使用した。バキュロウイルス投与の２日後に解剖を行いマウスの血液および肝臓を回収し、投与前のＤＭＮ誘導肝線維化マウスと比較した。投与スケジュールを図１に示した。さらに血清を回収しＧＯＴ・ＧＰＴを測定した。肝臓からは０．５Ｍ酢酸バッファーを用いてコラーゲン抽出を行い、コラーゲン量を測定した。また、肝臓の一部は２０％ホルマリン溶液を用いて固定化後、コラーゲン蓄積や細胞の状態を解析するため、マッソン・トリクローム（Masson trichrome）染色およびヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行い顕微鏡下で観察した。
（１）体重
３週間ＤＭＮ投与後にバキュロウイルス、生理食塩水、ＬＰＳを投与したときの体重の増減を測定した。生理食塩水、ＬＰＳ投与群ではマウスに毛羽立ちが見られたが、バキュロウイルス投与群では体重が減少しているにもかかわらず毛羽立ちが観察されなかった。
（２）ＧＯＴ・ＧＰＴ値
各投与群の血液から回収した血清中のＧＯＴ・ＧＰＴを測定することによって、組織障害の解析を行った（図２、３）。生理食塩水投与ではＤＭＮによる肝臓への影響を軽減せずＧＯＴ、ＧＰＴともに高い値を示したのに対し、バキュロウイルス投与では各濃度間で有意差は示されなかったが、生理食塩水投与に比較して有意に低い値を示した。
（３）肝臓コラーゲンの蓄積量
肝線維化の指標となる肝臓コラーゲンの蓄積量が、バキュロウイルス投与によりどのような変化をもたらしたか検討するために、肝臓のコラーゲン量を測定した（図４）。生理食塩水投与ではＤＭＮによるコラーゲン蓄積に影響を与えず高い値を示した。バキュロウイルス投与では、各濃度間で有意差は示されなかったが、生理食塩水と比較して有意に低い値を示した。
（４）マッソン・トリクローム染色
バキュロウイルス投与によってコラーゲン線維形成が改善されているのかを確認するため、マッソン・トリクローム染色を行い、病理学的解析を行った。マッソン・トリクローム染色は鉄ヘマトキシリンで核を染め、その後に拡散速度の大きい小色素分子（酸フクシン、ポンソーキシリジン）が細胞の細網孔へ浸透し、次いで拡散速度の小さい大色素分子（アニリン青）が膠原線維の粗構造に入り込み青色に染め出す染色方法で、コラーゲン線維が青色に、細胞質が桃色に、細胞核が黒紫色に染色される。生理食塩水投与ではＤＭＮによる類洞内線維形成の改善は観察されなかったが、バキュロウイルス投与では線維化が軽減しており、コラーゲン量と相関を示した。
（５）ヘマトキシリン・エオシン染色
この時の肝臓の細胞状態をＨＥ染色により観察した。ＨＥ染色は最も一般的な染色法で主に細胞病理診断に使われる。ヘマトキシリン液が核・リボソーム等を青藍色に、エオシン液が細胞質・繊維・赤血球を赤色に染色する。ＤＭＮ投与では顕著な小葉中心性空砲変性が観察され、生理食塩水投与では変性の改善は観察されなかった。しかし、バキュロウイルス投与では投与量（ウイルス力価）に比例して変性が軽減していた。
以上より、バキュロウイルスが肝線維化を改善したことが示された。【００３８】
実施例４：バキュロウイルス投与によるマウス生体応答
実施例３で、バキュロウイルス投与により肝線維化が改善され、特に１０７ｐｆｕのバキュロウイルスで高い改善効果が得られたことを示した。ウイルス感染によるサイトカインの遺伝子発現は感染後短時間で発現するため、バキュロウイルスをマウスの腹腔内へ投与してどのような細胞に感染し、どのようなサイトカインが発現しているのかを経時的に確認した。
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス７週齢）の腹腔内にバキュロウイルス（１０７ｐｆｕ／２００μｌ／匹）、ＬＰＳ（７５μｇ／２００μｌ／匹）を投与し、２時間後、１２時間後、２４時間後および４８時間後に解剖して腹腔リンパ節、腹腔内細胞、脾臓および肝臓を回収した。バキュロウイルスとＬＰＳを１回ないし２回投与した。回収した腹腔リンパ節、腹腔内細胞、脾臓および肝臓からトータルＲＮＡとＤＮＡを抽出した。実施例３では、バキュロウイルスを二回投与して治療効果を検討していることから、肝臓はバキュロウイルス二回投与後のサンプルからトータルＲＮＡを回収した。バキュロウイルス感染を確認するためにＰＣＲを用いてｖｐ３９遺伝子発現を解析し、バキュロウイルス感染によるＩＦＮｓ遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲを用いて解析した。実際の投与スケジュールを図５に示す。
バキュロウイルスの腹腔内投与によってどの細胞へ感染しているか確認するため、腹腔リンパ節（腸管リンパ節）、腹腔内細胞および脾臓からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを用いてｖｐ３９遺伝子の検出を行った。各組織でバキュロウイルスの侵入が確認することができた。バキュロウイルス１回投与、２回投与の両方で存在が確認された。とくに、腹腔内細胞、脾臓では４日目でもバキュロウイルスＤＮＡの存在を確認することができた。また腹腔内細胞で存在していることから、バキュロウイルスが補体レセプターをもつ貪食細胞に感染し、免疫応答を誘導する組織に運ばれていることが考えられる。そのため、脾臓においてｖｐ３９遺伝子発現が見られた。脾臓は二次リンパ組織とも言われ、免疫細胞が集積している。病原体が侵入すると、感染初期に強い免疫応答を誘導するための重要な器官であるため、脾臓でのバキュロウイルスの存在により、免疫応答が活性化されていることが示唆される。またバキュロウイルスの感染によりＩＦＮｓの発現が報告されている（Gronowski et al., J Virol 73, 9944-9951 (1999)）ことから、各組織でのＩＦＮｓ遺伝子発現をＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した。ＩＦＮ−βは腸管リンパ節、腹腔内細胞および脾臓で遺伝子発現が確認され、ＩＦＮ−γは腹腔内細胞と脾臓で遺伝子発現が確認された。ＩＦＮ−α遺伝子の発現は確認できなかった。腸管リンパ節ではバキュロウイルスを２回投与してからＩＦＮ−β遺伝子発現が確認できたことから、初回投与で免疫が立ち上がって記憶され、２回目のバキュロウイルス進入によりウイルス排除するべくＩＦＮ−β遺伝子が発現したと考えられる。また、ＩＦＮ−γは腹腔内細胞で２度目にバキュロウイルス投与してから１２時間後でも遺伝子発現が確認できた。
次に、肝臓におけるＩＦＮｓ、ＨＧＦ、ＴＧＦ−β  ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって検討した。バキュロウイルス二回投与後の１２、２４、４８時間後においてＩＦＮ−βの遺伝子発現が確認された。また、肝臓の再生因子であるＨＧＦは２時間後で強い発現がみられた。ＴＧＦ−β遺伝子発現は１２時間後から減少していた。これは、バキュロウイルス投与により強く誘導されたＨＧＦタンパク質がＴＧＦ−βの遺伝子発現を抑制しているためであることが示唆される。ＨＧＦの遺伝子発現が１２時間後で減少しているのは、バキュロウイルスによりＨＧＦが過剰発現したためであり、４８時間後にはＢＡＬＢ／ｃマウスと同様の発現量に戻っている。
以上より、バキュロウイルスの投与によって肝線維化抑制因子であるＩＦＮｓ、肝再生因子であるＨＧＦが誘導され、肝線維化促進因子であるＴＧＦ−βの働きを抑制することで肝線維化が改善されることが示唆された。従って、バキュロウイルスは、肝線維化の抑制、肝障害の改善などに有効であり得ることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明のバキュロウイルス及び剤は、例えば、肝炎、肝硬変、肝癌等の肝障害の予防・治療、及び／又は肝線維化の抑制に有用であり得る。
本出願は日本で出願された特願２００６−２７５７１５（出願日：２００６年１０月６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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