(57)【要約】  トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうち、少なくとも２０５位のセリンが他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体であって、さらに下記のうち何れか１以上の置換がなされているトロンビン変異体：（Ｉ）Ｂ鎖８９位のアルギニンの他のアミノ酸への置換、（II）Ｂ鎖６９位のスレオニンまたはＢ鎖２２位のセリンの他のアミノ酸への置換、（III）Ｂ鎖２００位のアラニンの他のアミノ酸への置換、（ＩＶ）Ｂ鎖６５位のリジンのスレオニンへの置換。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうち、少なくとも２０５位のセリンが他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体であって、さらに下記のうち何れか１以上の置換がなされているトロンビン変異体：
（Ｉ）Ｂ鎖８９位のアルギニンの他のアミノ酸への置換、
（II）Ｂ鎖６９位のスレオニンまたはＢ鎖２２位のセリンの他のアミノ酸への置換、
（III）Ｂ鎖２００位のアラニンの他のアミノ酸への置換、
（ＩＶ）Ｂ鎖６５位のリジンのスレオニンへの置換。
【請求項２】
Ｂ鎖６９位のスレオニンおよびＢ鎖２２位のセリンを置換するアミノ酸が、側鎖にアルキル基を２個以上有するアミノ酸である請求項１に記載のトロンビン変異体。
【請求項３】
トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうち、少なくとも２０５位のセリンが他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体であって、さらにＢ鎖６５位のリジンがスレオニンに置換されたトロンビン変異体。
【請求項４】
トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうち、少なくとも２０５位のセリンと４３位のヒスチジンがそれぞれ他のアミノ酸に置換された請求項１〜３の何れか１項に記載のトロンビン変異体。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のトロンビン変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項８】
請求項７記載の形質転換体を培養し、請求項１〜４の何れか１項に記載のトロンビン変異体を生成させる工程を含むトロンビン変異体の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜４の何れか１項に記載のトロンビン変異体を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
抗血栓剤である請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗血栓能を有する不活性化トロンビン変異体のアミノ酸配列を最適化しさらに向上した抗血栓能を付与する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳、心臓における血管障害の大部分は血栓症である。その主な原因は、血流の異常、凝固成分の異常、血管内皮の異常であるが、実際には、それらが複合的に起因して血栓症を誘発する。その全てに関与し、血栓形成に中心的役割を担うのがセリンプロテアーゼであるトロンビンである。トロンビンは凝固カスケードの最終段階でフィブリン凝集塊を作ると同時に、XI、V、VIII因子を活性化して凝固カスケードを加速する。また、血小板及び血管内皮上のトロンビンレセプターであるＰＡＲ１を介して、血小板凝集と内皮細胞活性化を引き起こす。この内皮細胞の活性化は血管壁の凝固亢進を引き起こし、更に負の連鎖によって血栓形成が進むことが報告されている（非特許文献１）。【０００３】
非特許文献２には、トロンビンの主だった血液凝固に関連する基質認識に、エクソサイトI領域が重要な働きをすることが記載されている。非特許文献３には、トロンビンなどのセリンプロテアーゼは、活性中心にセリン、ヒスチジン、アスパラギン酸を有しており、この３つのアミノ酸のチャージリレーシステムによりプロテアーゼ活性が発現され、セリンプロテアーゼのミカエリス複合体から4面複合体への進展にはグリシン１９３（１９３はキモトリプシノゲンにおけるアミノ酸の位置、トロンビンではＢ鎖２０３位のグリシンにあたる）が関与していることが記載されている。【０００４】
アミノ酸が置換されたトロンビン変異体の研究も行われている。トロンビンの遺伝子組換えにより活性中心のアミノ酸が置換された組換え体について、従来下記のように幾つかの検討がなされてきた。例えば、非特許文献４には、活性中心セリンをアラニンに置換したトロンビン変異体が白血球に及ぼす影響について記載されている。非特許文献５には、Ｂ鎖２０３グリシンをアラニンに置換したトロンビン変異体、活性中心セリンをアラニン又はスレオニンに置換したトロンビン変異体、活性中心ヒスチジンをアスパラギンに置換したトロンビン変異体、さらには、活性中心アスパラギン酸をアスパラギンに置換したトロンビン変異体が記載されている。しかしながら、非特許文献４および５に記載のトロンビン変異体は、各文献に記載されている測定法では検出不能なレベルの酵素活性（トロンビン基質分解活性）が残存していること、トロンビン基質結合能が著しく低下していること、あるいは、血中に多量に存在するＦｂｇｎに高い結合能を有することなどにより、抗血栓、抗炎症剤としての十分な機能を有するとは言い難い。【０００５】
また、特許文献１、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８には、アミノ酸を置換することにより、酵素活性（トロンビン基質分解活性）と抗血液凝固効果とを有するトロンビン変異体が記載されている。それらのトロンビン変異体は、トロンボモデュリン（以下「ＴＭ」ということがある）への結合能が保持または増強され、且つフィブリノゲン分解能が著しく低下しており、ＴＭに特異的に結合しプロテインCを活性化することにより抗血栓効果を示すトロンビン変異体である。【０００６】
特許文献２には、活性中心のアミノ酸が置換され、さらに抗血栓剤としてヒルジンC末端ペプチドを患者に投与して、出血等の問題が発生した際、そのヒルジンC末端ペプチドの抗凝固活性を中和することを目的としたプロトロンビン変異体が開示されている。
特許文献３および４には、活性中心セリンがアラニンに置換されたトロンビン変異体、及び活性中心セリンがアラニンに、かつ活性中心アスパラギン酸がアスパラギンに置換されたトロンビン変異体が、洗浄血小板懸濁液中におけるトロンビンによるトロンビンレセプターへの刺激を抑制した事が記載されている。
特許文献５には活性中心のアミノ酸及びその他のアミノ酸が置換されることで、基質分解活性を喪失し、さらにフィブリノゲン親和性、ヘパリン親和性、トロンボモジュリン親和性が低下し、かつ高い抗血栓能を有する種々のトロンビン変異体が記載されている。
しかしながら、特許文献５に報告されているトロンビン変異体においても血管壁に存在するへパリン様物質（へパラン硫酸）、トロンボモジュリン及びインテグリンに対し、僅かに親和性を有しているため、実際に血管壁等に結合し血中循環量が十分得られなかったり、血管内皮によってエンドサイトーシスされるため半減期が短いなど改善の余地があった。
そこで、抗血栓作用を損なうことなく、へパリン、トロンボモジュリン及びインテグリンへの親和性をよりいっそう低下し、さらに抗血栓能の向上しているトロンビン変異体が望まれていた。
【特許文献１】国際公開第９５／１３３８５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９６／４１８６８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９２／１４７５０号パンフレット
【特許文献４】米国特許第５，２５６，７６６号明細書
【特許文献５】国際公開第２００５／０８９０７０パンフレット
【非特許文献１】J. Biol.Chem. 261(1986)15928-15933
【非特許文献２】日本血栓止血学会誌  第１０巻  ２，３号（１９９９）
【非特許文献３】ヴォート生化学  上巻  １９９６年  ｐ３３１−３４０  東京化学同人
【非特許文献４】Experimental cell research 219, 650-656(1995)
【非特許文献５】Biochimica et Biophyscia Acta 1451(1999) 173-186
【非特許文献６】J.Biol.Chem Vol.275, 39827-39830
【非特許文献７】J.Biol.Chem Vol.279,26387-26394
【非特許文献８】J.Biol.Chem Vol.277,27581-27584
【発明の開示】
【０００７】
本発明は抗血栓作用を損なわず、又は向上させつつ、へパリン、トロンボモジュリンまたはインテグリンへの親和性を低下させたトロンビン変異体を提供することを課題とする。
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうちの少なくとも２０５位のセリンおよびＢ鎖８９位のアルギニンを他のアミノ酸に置換することによって、へパリン親和性が低下し、且つAPTT延長効果が向上した不活性化トロンビン変異体が得られることを見出した。さらに、トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうちの少なくとも２０５位のセリン並びにＢ鎖６９位のスレオニン及びＢ鎖２２位セリンのうちの少なくとも1個を他のアミノ酸に置換することによって、トロンボモジュリン親和性が低下し、且つAPTT延長効果及びPAR1活性化阻害能を保持したトロンビン変異体が得られることを見出した。さらにトロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうちの少なくとも２０５位のセリンおよびＢ鎖２００位のアラニンを他のアミノ酸に置換することによってAPTT延長効果を損なうことなくインテグリンへの結合を低下させることができることを見出した。さらにはトロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうちの少なくとも２０５位のセリンを他のアミノ酸に置換し、かつＢ鎖６５位のリジンをスレオニンに置換することでより高いAPTT延長効果が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうち、少なくとも２０５位のセリンが他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体であって、さらに下記のうち何れか１以上の置換がなされているトロンビン変異体：
（Ｉ）Ｂ鎖８９位のアルギニンの他のアミノ酸への置換、
（II）Ｂ鎖６９位のスレオニンまたはＢ鎖２２位のセリンの他のアミノ酸への置換、
（III）Ｂ鎖２００位のアラニンの他のアミノ酸への置換、
（ＩＶ）Ｂ鎖６５位のリジンのスレオニンへの置換。
（２）Ｂ鎖６９位のスレオニンおよびＢ鎖２２位のセリンを置換するアミノ酸が、側鎖にアルキル基を２個以上有するアミノ酸である（１）のトロンビン変異体。
（３）トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうち、少なくとも２０５位のセリンが他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体であって、さらにＢ鎖６５位のリジンがスレオニンに置換されたトロンビン変異体。
（４）トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうち、少なくとも２０５位のセリンと４３位のヒスチジンがそれぞれ他のアミノ酸に置換された（１）〜（３）の何れかのトロンビン変異体。
（５）（１）〜（４）の何れかのトロンビン変異体をコードするポリヌクレオチド。
（６）（５）のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
（７）（６）の組換えベクターが導入された形質転換体。
（８）（７）の形質転換体を培養し、（１）〜（４）の何れかのトロンビン変異体を生成させる工程を含むトロンビン変異体の製造方法。
（９）（１）〜（４）の何れかのトロンビン変異体を含有する医薬組成物。
（１０）抗血栓剤である（９）の医薬組成物。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。【００１１】
本発明の第一のタイプのトロンビン変異体は、トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうちの少なくとも２０５位のセリン（Ｂ鎖２０５；配列番号２の２５４位のセリンに相当するセリン）、およびＢ鎖８９位のアルギニン（Ｂ鎖８９；配列番号２の１３８位のアルギニンに相当するアルギニン）がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体である。
本明細書において、トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸としては、２０５位のセリン以外に、２０３位のグリシン（Ｂ鎖２０３；配列番号２の２５２位のグリシンに相当するグリシン）、９９位のアスパラギン酸（Ｂ鎖９９；配列番号２の１４８位のアスパラギン酸に相当するアスパラギン酸）および４３位のヒスチジン（Ｂ鎖４３；配列番号２の９２位のヒスチジンに相当するヒスチジン）が挙げられ、本発明のトロンビン変異体の活性中心アミノ酸においては、２０５位のセリンに加えて、２０３位のグリシン、９９位のアスパラギン酸および４３位のヒスチジンのうちの１またはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていてもよい。本発明のトロンビン変異体のＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうち、２０５位のセリンと４３位のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。すなわち、本発明の第一のタイプのトロンビン変異体としては、Ｂ鎖２０５位のセリン、Ｂ鎖４３位のヒスチジンおよびＢ鎖８９位のアルギニンがそれぞれ他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体がより好ましい。
本発明の第一のタイプのトロンビン変異体のアミノ酸配列の一例を配列番号６（Ｂ鎖はアミノ酸番号５０〜３０８）に示す。【００１２】
Ｂ鎖８９位のアルギニンを置換するアミノ酸は、トロンビン変異体のへパリン親和性を低下させるアミノ酸であれば特に制限されないが、アラニンが好ましい。
本発明のトロンビン変異体において、Ｂ鎖２０５位のセリンは、アラニン、スレオニン、またはグリシンに置換されることが好ましく、その中でもアラニンへの置換が特に好ましい。Ｂ鎖２０３位のグリシンは、アラニン、セリン、スレオニンのいずれかに置換されることが好ましい。Ｂ鎖９９位のアスパラギン酸は、アスパラギンに置換されることが好ましい。Ｂ鎖４３位のヒスチジンは、アラニン、セリンまたはアスパラギンに置換されることが好ましく、アラニンに置換されることがより好ましい。【００１３】
上記第一のタイプのトロンビン変異体は、へパリン親和性が低下し、且つAPTT延長効果は置換前に比較し向上している。
なお、へパリン親和性が低下したことはヘパリンカラムなどを用いた結合アッセイなどによって確認することができる（国際公開第２００５／０８９０７０号パンフレット参照）。
また、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）延長は、通常のＡＰＴＴ測定方法に従って変異体を添加した血漿のＡＰＴＴを測定し、それをコントロールと比較することによって確認することができる。【００１４】
本発明の第二のタイプのトロンビン変異体は、トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうちの少なくとも２０５位のセリン、並びにＢ鎖６９位スレオニン（Ｂ鎖６９；配列番号２の１１８位のスレオニンに相当するスレオニン）及びＢ鎖２２位セリン（Ｂ鎖２２；配列番号２の７１位のセリンに相当するセリン）のうちの少なくとも1個がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体である。
この中には、（i）B鎖６９位スレオニン及びB鎖２０５位セリンがそれぞれ他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体、（ii）B鎖２２位セリン及びB鎖２０５位セリンがそれぞれ他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体、（iii）B鎖６９位スレオニン、B鎖２２位セリン及びB鎖２０５位セリンがそれぞれ他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体が含まれる。
これら（i）〜（iii）の組合わせにおいてさらに、２０３位のグリシン、９９位のアスパラギン酸、および４３位のヒスチジンのうちの１またはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていてもよく、上記（i）〜（iii）の組合わせにおいてさらに４３位のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。
本発明の第二のタイプのトロンビン変異体のアミノ酸配列の一例を配列番号１２（Ｂ鎖はアミノ酸番号５０〜３０８）に示す。【００１５】
Ｂ鎖６９位のスレオニンは側鎖にアルキル基を2個以上有するアミノ酸（例えば、グルタミン、アルギニン、ロイシン、メチオニン、リシン、イソロイシン、グルタミン酸またはバリン）に置換されることが好ましく、グルタミンに置換されることが特に好ましい。
Ｂ鎖２２位のセリンも同様に、側鎖にアルキル基を2個以上有するアミノ酸（例えば、グルタミン、アルギニン、ロイシン、メチオニン、リシン、イソロイシン、グルタミン酸またはバリン）に置換されることが好ましく、グルタミンに置換されることが特に好ましい。【００１６】
上記第二のタイプのトロンビン誘導体は、トロンボモジュリン親和性が低下し、且つＢ鎖６９位スレオニンまたはB鎖２２位セリンの置換前と同等のAPTT延長効果及びPAR1活性化阻害能を有している。
なお、トロンボモジュリン親和性が低下したことは、後述するようなトロンビン結合キュベットを用いた結合アッセイなどによって確認することができる。【００１７】
本発明の第三のタイプのトロンビン変異体は、トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうちの少なくとも２０５位のセリンおよびB鎖２００位のアラニン（Ｂ鎖２００；配列番号２の２４９位のアラニンに相当するアラニン）がそれぞれ他のアミノ酸に置換されたトロンビン変異体である。
Ｂ鎖２００位のアラニンおよび２０５位のセリンに加えてさらに、２０３位のグリシン、９９位のアスパラギン酸および４３位のヒスチジンのうちの１またはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていてもよく、Ｂ鎖２００位のアラニンおよび２０５位のセリンに加えてさらに４３位のヒスチジンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。
本発明の第三のタイプのトロンビン変異体のアミノ酸配列の一例を配列番号１６（Ｂ鎖はアミノ酸番号５０〜３０８）に示す。【００１８】
Ｂ鎖２００位のアラニンを置換するアミノ酸は、トロンビン変異体のインテグリン親和性を低下させるアミノ酸であれば特に制限されないが、セリンが好ましい。
上記第三のタイプのトロンビン変異体は、インテグリンへの親和性が低下し、且つAPTT延長効果は置換以前と同様に保持している。【００１９】
本発明の第一〜第三のタイプのトロンビン変異体においては、さらに、B鎖65位のリジン（Ｂ鎖６５；配列番号２の１１４位のリジンに相当するリジン）が他のアミノ酸に置換されていてもよい。B鎖65位のリジンを置換するアミノ酸としては、アラニン、スレオニンなどが挙げられるが、スレオニンがより好ましい。【００２０】
本発明の第四のタイプのトロンビン変異体は、トロンビンのＢ鎖の活性中心のアミノ酸のうちの少なくとも２０５位のセリンが他のアミノ酸に置換され、かつ、B鎖65位のリジン（Ｂ鎖６５；配列番号２の１１４位のリジンに相当するリジン）がスレオニンに置換されたトロンビン変異体である。
Ｂ鎖６５位のリジン及び２０５位のセリンに加えてさらに、２０３位のグリシン、９９位のアスパラギン酸、および４３位のヒスチジンのうちの１またはそれ以上のアミノ酸が置換されていてもよく、Ｂ鎖６５位のリジン及び２０５位のセリンに加えてさらに、４３位のヒスチジンが置換されていることが好ましい。
本発明の第四のタイプのトロンビン変異体のアミノ酸配列の一例を配列番号１４（Ｂ鎖はアミノ酸番号５０〜３０８）に示す。【００２１】
上記第四のタイプのトロンビン変異体は、B鎖65位のリジンがアラニンに置換された場合に比較しAPTT延長効果が向上している。【００２２】
なお、本明細書中において、Ｂ鎖２０５のセリン、Ｂ鎖８９位のアルギニン、Ｂ鎖６９位スレオニン、Ｂ鎖２２位セリン、Ｂ鎖２００位のアラニン、Ｂ鎖６５位のリジンなどは、Ｂ鎖の１位のアミノ酸（例えば、配列番号２のアミノ酸番号５０のイソロイシン）から数えた位置を示している。なお、上記のような置換アミノ酸の位置はアミノ酸の欠失、挿入、付加などによって位置が前後することがある。例えば、Ｎ末端部に１つのアミノ酸残基が挿入されれば本来２０５位のセリンは２０６位となるが、そのような２０５位のセリンに相当するセリンも、本発明において２０５位のセリンと呼ぶこととする。【００２３】
本発明のトロンビン変異体においては、上記第一から第四のタイプのアミノ酸の置換が組み合わされることも可能である。
さらに、本発明のトロンビン変異体は、発明の効果を損なわない範囲であれば、B鎖（配列番号２のアミノ酸番号５０〜３０８）において、上記特定のアミノ酸に加えて、さらに、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されたアミノ酸配列を有するトロンビン変異体であってもよい。なお、ここで１または数個とは、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜５個を意味する。また、本発明のトロンビン変異体は、A鎖（配列番号２のアミノ酸番号１〜４９）においても、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されたアミノ酸配列を有するトロンビン変異体であってもよい。ここで１または数個とは、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個を意味する。
本発明のトロンビン変異体のアミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上相同であることが好ましい。【００２４】
本発明に用いるトロンビン変異体は、A鎖とB鎖を含み、該B鎖において上記特定のアミノ酸が置換されたトロンビン変異体である。本発明に用いるトロンビン変異体は、生体内において、A鎖及びB鎖がS-S結合によって架橋された立体構造をとることができるものであれば特に制限されない。A鎖及びB鎖はトロンビン前駆体タンパク質がプロセシングされて生じるため、本発明のトロンビン変異体をプレトロンビンやプロトロンビンなどの前駆体タンパク質の形で生体に投与し、生体内でプロセシングされて前記立体構造をとるようにしてもよい。また、A鎖及びB鎖を遺伝子組換えや化学合成などで別々に製造し、それらをインビトロでS-S結合させてもよいし、それらを別々に投与し、生体内で前記のA鎖及びB鎖がS-S結合によって架橋された立体構造をとるようにしてもよい。
ここで、A鎖とは、野生型ヒトトロンビンでいえば、配列番号２のアミノ酸番号１〜４９に相当する領域であり、B鎖とは、野生型ヒトトロンビンでいえば、配列番号２のアミノ酸番号５０〜３０８に相当する領域である。
ヒトトロンビンにおいてはA鎖N末端の１３アミノ酸残基は自己分解により切り離される。よってA鎖はN末端から１３アミノ酸残基（例えば、配列番号２のアミノ酸番号１〜１３の残基）が切り離された配列でも良い。さらに、生体内で前記の立体構造をとることのできるプロトロンビンやプレトロンビンなどのトロンビン前駆体蛋白質も本発明のトロンビン変異体に含まれる。なお、野生型ヒトプロトロンビンのアミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのデータベースにアクセション番号Ｐ００７３４として開示されている。
本発明で得られるトロンビン変異体はプロトロンビン体にて生体内に投与されることも可能である。その場合、血栓部位にて抗血栓効果を持ったトロンビンに活性化を受け、血栓形成箇所にて抗血栓効果を発揮し、生体内にてより部位特異的な抗血栓効果が得られる。【００２５】
本発明のトロンビン変異体は、例えば、ＰＣＲなどで野生型トロンビン遺伝子（例えば、配列番号３）を取得し、部位特異的変異導入法などにより目的の変異を導入して各変異体をコードするDNAを作製し、該DNAをベクターなどに組み込んでＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞などの哺乳動物細胞などで発現させることによって得られる。このようなDNAは前述のようにA鎖及びB鎖の両方をコードするものであってもよいし、各鎖をそれぞれ発現させてもよい。部位特異的変異導入法は特に限定されるものではないが、例えば、市販のQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）などを用いて行っても良い。また、化学合成によってトロンビン変異体を得ることもできる。
本発明のトロンビン変異体をコードするポリヌクレオチドとしては、例えば配列番号５、１１、１３、１５の塩基配列を有するポリヌクレオチドが挙げられるが、本発明のトロンビン変異体をコードする限りこれらに限定されない。なお、本発明のトロンビン変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号５、１１、１３、１５の塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、少なくとも上記特定の変異を有し、上記所望の効果を有するトロンビン変異体をコードするポリヌクレオチドであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。【００２６】
本発明のトロンビン変異体を薬学的に許容しうる担体と組み合わせることによって医薬組成物として使用することができる。薬学的に許容しうる担体としては特に制限されないが、通常の薬剤に汎用される注射剤用溶剤、安定剤、希釈剤、界面活性剤等を使用できる。本発明の医薬組成物の投与単位形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択できる。例えば、注射剤等を例示できる。本発明の医薬組成物の投与量は、症状などに応じて適宜選択される。
なお、医薬組成物の用途として好ましくは、抗血栓治療薬、抗炎症剤、血小板凝集抑制剤、血小板粘着抑制剤、トロンビンレセプター活性化抑制剤などを挙げることができる。
【実施例】
【００２７】
[実験例１]
（１）ヒト野生型トロンビンの発現
ヒト野生型トロンビンのＡ鎖及びＢ鎖を含むDNA（配列番号３）をベクターに挿入しCHO細胞にトランスフェクションし、プレトロンビン生産細胞を得た。
なお、配列番号４で示されるヒト野生型プレトロンビンの配列は、アミノ酸番号１〜４３がシグナル配列、４４〜９２がＡ鎖であり、９３〜３５１がＢ鎖である。
プレトロンビン生産細胞をCD-CHO培地２リットルで１０日間培養した。得られたプレトロンビン生産細胞の培養液２リットルを２０リットルの１０ｍM PIPES緩衝液（pH7）4℃に6時間ずつ2回透析したのち、CMセルロファイン（チッソ社）５００ｍｌに添加し、１０ｍM PIPES緩衝液（pH7）１リットルにて洗浄した。次に、１０ｍM PIPES緩衝液（pH7）0〜1M,NaClの直線的濃度勾配にて溶出を行った。溶出液を各２５ｍｌずつの分画に分け、それぞれを抗ヒトトロンビンポリクローナル抗体（コスモバイオ社）を用いたウェスタンブロッティングによって確認したところ、ヒト野生型トロンビンは約０．５Ｍで溶出された。【００２８】
（２）ヒト野生型トロンビンの精製
次にヒルジンC末端ペプチド結合実験に使用した残りのエカリン活性化後のトロンビンを含む溶液９８ｍｌを、５０ｍM トリス塩酸緩衝液、０．１M NaCl（pH8）で平衡化した硫酸化セルロファインカラム（チッソ社）２００ｍｌに添加し、同緩衝液２００ｍｌで同カラムを洗浄した後、５０ｍM トリス塩酸緩衝液、１M NaCl（pH8）にて溶出した。さらに溶出液を５０ｍM トリス塩酸緩衝液（pH8）に透析し  同緩衝液で平衡化されたヒルジンC末端ペプチドカラム（ヒルジンC末端ペプチドを２００ｍｇ、NHS活性化セルロファイン（チッソ社）を３０ｍｌに添加した。５０ｍM トリス塩酸緩衝液１５０ｍｌで該ヒルジンC末端ペプチドカラム（ＷＯ２００５／０８９０７０）を洗浄した後、５０ｍM トリス塩酸緩衝液、１M NaCl 4M グアニジン塩酸（pH8）にて溶出し、SDS-PAGE上ほぼ純化されたヒルジン結合能のヒト野生型トロンビン  約５ｍｇを得た。【００２９】
（３）APTT測定方法
本実施例において方法に関し特に指定が無い限り、APTTの測定は下記の方法にて行った。
標準血漿（国際試薬社）とサンプルを混和し、総量の２５％のAPTT試薬（国際試薬社）を加え３７℃  ５分インキュベーションを行う。５分後  ０．１M CaCl2を8ｍMになるように添加し、カルシウム添加から凝固までの時間を測定する。【００３０】
（４）ヘパリン結合能の確認法方法F：ヒト野生型トロンビンもしくはトロンビン変異体５ｍｌを50mM NaHCO3 /50mM NaCl溶液で平衡化したＨＩ−ＴＲＡＰ  ＨＥＰＡＲＩＮカラム(アマシャム・ファルマシア社)に添加し１５mlの50mM NaHCO3 /0.1M NaCl溶液で洗浄した後バッファーA：50mM NaHCO3
/0.1M NaClバッファーB：50mM NaHCO3 /1M NaCl を用い流速  0.5ml/min 100分間で  バッファーＢ：０％  からバッファーＢ：１００％ へのグラジエント溶出を行った。【００３１】
実施例１
（１）B鎖89アルギニンをアラニンにB鎖65リジンをアラニンにB鎖43ヒスチジンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンに置換したトロンビン変異体（以下89A65A43A205Aトロンビン）の発現
89A65A43A205AトロンビンをコードするDNAは、各変異に相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。89A65A43A205AトロンビンをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号５に示す。
89A65A43A205Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じて硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。SDS-PAGE上でほぼ純化された89A65A43A205Aトロンビンが約５ｍｇ得られた。ヘパリンゲルへの結合能を測定したところ約0.3M NaClで溶出された。（野生型ヒトトロンビンは、約0.5M NaClにて溶出されている。）【００３２】
（２）89A65A43A205AトロンビンのＡＰＴＴの測定
50μg/mlの89A65A43A205Aトロンビン（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4,1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTTを測定した。PBSのみを同様に添加した標準血漿をコントロールとして測定したところ、コントロールが46秒、89A65A43A205Aトロンビンでは121秒であり2.63倍に延長した。【００３３】
比較例１
（１）B鎖43ヒスチジンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンに置換したトロンビン変異体（以下43A205Aトロンビン）の発現
43A205AトロンビンをコードするDNAは各変異点に相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。43A205AトロンビンをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号７に示す。
43A205Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じて硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。SDS-PAGE上でほぼ純化された43A205Aトロンビンが約５ｍｇ得られた。実験例１の（４）の方法に準じてヘパリンゲルへの結合能を測定したところ野生型ヒトトロンビンと同等の約0.5M NaClで溶出された。【００３４】
（２）43A205AトロンビンのＡＰＴＴの測定
50μg/mlの43A205Aトロンビン（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTTを測定した。PBSのみを同様に添加した標準血漿をコントロールとして測定したところ、コントロールが43秒、43A205Aトロンビンでは75.5秒であり1.76倍に延長した。【００３５】
比較例２
（１）B鎖65リジンをアラニンにB鎖43ヒスチジンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンに置換したトロンビン変異体（以下65A43A205Aトロンビン）の発現
65A43A205AトロンビンをコードするDNAは各変異点に相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。65A43A205AトロンビンをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号９に示す。
65A43A205Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じて硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。SDS-PAGE上でほぼ純化された65A43A205Aトロンビンが約５ｍｇ得られた。ヘパリンゲルへの結合能を測定したところ野生型ヒトトロンビンと同等の約0.5M NaCl溶出された。【００３６】
（２）65A43A205AトロンビンのＡＰＴＴの測定
50μg/mlの65A43A205Aトロンビン（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTTを測定した。PBSのみを同様に添加した標準血漿をコントロールとして測定したところ、コントロールが44.5秒、65A43A205Aトロンビンでは105.5秒であり2.37倍に延長した。
以上の実験結果より８９位のアルギニンの置換によりヘパリン親和性が低下し、且つAPTT延長効果が向上したトロンビン誘導体が得られることがわかった。【００３７】
実施例２
（１）B鎖69スレオニンをグルタミンにB鎖65リジンをアラニンにB鎖43ヒスチジンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンに置換したトロンビン変異体（以下69Q65A43A205Aトロンビン）の発現
69Q65A43A205AトロンビンをコードするDNAは各変異点に相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。69Q65A43A205AトロンビンをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１１に示す。
69Q65A43A205Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じて硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。SDS-PAGE上でほぼ純化された69Q65A43A205Aトロンビンが約５ｍｇ得られた。
実験例１の（４）の方法に準じてヘパリンゲルへの結合能を測定したところ野生型ヒトトロンビンと同等の約0.5M NaClにて溶出された。【００３８】
（２）69Q65A43A205AトロンビンのＡＰＴＴの測定
50μg/mlの69Q65A43A205Aトロンビン（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4,1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTTを測定した。PBSのみを同様に添加した標準血漿をコントロールとして測定したところ、コントロールが45秒、69Q65A43A205Aトロンビンでは105.5秒であり65A43A205Aトロンビンとほぼ同等の延長効果であった。【００３９】
（３）69Q65A43A205AトロンビンのＴＭへの結合特異性の確認
69Q65A43A205Aトロンビンの0.1mg/ml  10mM リン酸バッファー（pH7）溶液、および65A43A205Aトロンビンの0.1mg/ml  10mM リン酸バッファー（pH7）溶液を、それぞれNHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン変異体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、69Q65A43A205Aトロンビン固定化キュベットおよび65A43A205Aトロンビン固定化キュベットを得た。69Q65A43A205Aトロンビンキュベットには約1365arcの蛋白質が65A43A205Aトロンビンキュベットには約1800arcの蛋白質が固相化された。引き続き１M エタノールアミン（pH８）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。
さらに両キュベットを50mM  リン酸緩衝液、２M NaCl、30mM  ベンズアミジン（pH7.4）で洗浄、再生後、69Q65A43A205Aトロンビン固定化キュベットおよび65A43A205Aトロンビン固定化キュベットそれぞれに、50nMの可溶性ＴＭ溶液（コスモバイオ）（50mM  リン酸緩衝液、0.15M NaCl（pH7.4）に溶解）を100μｌ加えたところ、10分後  69Q65A43A205Aトロンビン固相化キュベットには約8arc secのＴＭが吸着され、65A43A205Aトロンビン固相化キュベットには約18arc secのＴＭが吸着された。（固定化量を1000 arc secとした場合、69Q65A43A205Aトロンビン固相化キュベットには、5.8 arc sec 、65A43A205Aトロンビン固相化キュベットには10 arc ｓｅｃのＴＭが吸着された。） 69セリンのグルタミンへの置換によりAPTT延長効果を保持したまま、ＴＭ結合能はさらに低下した。【００４０】
実施例３
（１）B鎖65リジンをスレオニンにB鎖43ヒスチジンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンに置換したトロンビン変異体（以下65T43A205Aトロンビン）の発現
65T43A205AトロンビンをコードするDNAは各変異点に相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。65T43A205AトロンビンをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１３に示す。
65T43A205Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じて硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。SDS-PAGE上でほぼ純化された65T43A205Aトロンビンが約５ｍｇ得られた。ヘパリンゲルへの結合能を測定したところ野生型ヒトトロンビンと同等の約0.5M NaClにて溶出された。【００４１】
（２）65T43A205AトロンビンのＡＰＴＴの測定
50μg/mlの65T43A205Aトロンビン（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTTを測定した。PBSのみを同様に添加した標準血漿をコントロールとして測定したところ、コントロールが45秒、65T43A205Aトロンビンでは120秒であり2.67倍に延長した。65位のリジンをアラニンに置換したトロンビン（65A43A205Aトロンビン）よりも65位のリジンをスレオニンに置換したトロンビン（65T43A205Aトロンビン）は効果的にAPTTを延長した。【００４２】
実施例４
（１）B鎖200アラニンをセリンにB鎖65リジンをアラニンにB鎖43ヒスチジンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンに置換したトロンビン変異体（以下200S65A43A205Aトロンビン）の発現
200S65A43A205AトロンビンをコードするDNAは各変異点に相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。200S65A43A205AトロンビンをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１５に示す。
200S65A43A205Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じて硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。SDS-PAGE上でほぼ純化された200S65A43A205Aトロンビンが約５ｍｇ得られた。ヘパリンゲルへの結合能を測定したところ野生型ヒトトロンビンと同等の約0.5M NaClにて溶出された。【００４３】
（２）200S65A43A205AトロンビンのＡＰＴＴの測定
50μg/mlの200S65A43A205Aトロンビン（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTTを測定した。PBSのみを同様に添加した標準血漿をコントロールとして測定したところ、コントロールが44秒、200S65A43A205Aトロンビンでは104秒であり2.36倍に延長した。200S65A43A205Aトロンビンは65A43A205Aトロンビンと同等のAPTT延長効果を示した。
Ｂ差200アラニンをセリンに置換することでトロンビン特有のインテグリン結合配列（RGDA配列）を変異させた配列で且つAPTT延長効果が保持された誘導体が得られた。【００４４】
比較例３
（１）B鎖197アルギニンをアラニンにB鎖65リジンをアラニンにB鎖43ヒスチジンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンに置換したトロンビン変異体（以下197A65A43A205Aトロンビン）の発現
197A65A43A205AトロンビンをコードするDNAは各変異点に相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。197A65A43A205AトロンビンをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１７に示す。
197A65A43A205Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じて硫酸化セルロファインによる精製を行った。ヒルジンＣ末端ペプチドカラムには結合しなかった。SDS-PAGE上でほぼ純化された197A65A43A205Aトロンビンが約５ｍｇ得られた。【００４５】
（２）197A65A43A205AトロンビンのＡＰＴＴの測定
50μg/mlの197A65A43A205Aトロンビン（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTTを測定した。PBSのみを同様に添加した標準血漿をコントロールとして測定したところ、コントロールが46秒、197A65A43A205Aトロンビンでは83秒であり1.8倍に延長した。197A65A43A205Aトロンビンは65A43A205Aトロンビンに比較しAPTT延長効果が低下した。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のトロンビン変異体は血管壁に存在するへパリン様物質（へパラン硫酸）、トロンボモジュリン及び／またはインテグリンへの親和性が顕著に低下し、且つ高い抗血栓能を有しているため、血栓症などの治療に副作用なく効果的に用いることができる。
【配列表】
2008059917000001.app
【国際調査報告】
2008059917.tif 000002
2008059917.tif 000003
2008059917.tif 000004
2008059917.tif 000005
2008059917.tif 000006
2008059917.tif 000007
2008059917.tif 000008
2008059917.tif 000009