(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経幹細胞の製造方法であって、
（i）体細胞にOct遺伝子群、Klf遺伝子群、Sox遺伝子群のそれぞれの遺伝子群から選択された遺伝子の遺伝子産物の組み合わせである脱分化因子を導入する工程と、
(ii)前記脱分化因子が導入された体細胞からｉＰＳ細胞を樹立せずに、増殖因子の存在下で浮遊培養して、ニューロスフェアを製造する工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記工程(i)において、体細胞に脱分化因子を導入したあと、２〜１４日培養することを特徴とする方法。
【請求項３】
前記工程(i)において、脱分化因子として、Sox2、Oct3/4、およびKlf4が体細胞に導入されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程(i)において、さらにc-Mycが体細胞に導入されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記工程(ii)において、前記脱分化因子が導入された体細胞が、ＬＩＦおよびＦＧＦの存在下で培養されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記工程(ii)において、前記脱分化因子が導入された体細胞が、ｃＡＭＰの存在下で培養されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記工程(ii)において、前記脱分化因子が導入された体細胞が、ＮＡＣの非存在下で、培養されることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記体細胞がマウスまたはヒト由来であることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記体細胞が、皮膚または肝臓由来であることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の神経幹細胞の製造方法であって、
前記体細胞が線維芽細胞または肝細胞であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は神経幹細胞の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経幹細胞は、脊髄損傷のような神経疾患を治療するための移植療法のドナー細胞として有用であり、再生医療への応用が期待されている（例えば、非特許文献１参照）。神経幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から作製できることが知られるが（例えば、非特許文献２参照）、ＥＳ細胞の使用は倫理的な観点から問題視されていた。
【０００３】
近年、線維芽細胞や肝細胞等の体細胞にOct3/4遺伝子、Sox2遺伝子、Klf4遺伝子、及びc-myc遺伝子を導入し増殖させて得られた細胞からFbx15遺伝子を発現する細胞を選択することにより、ＥＳ細胞様の多能性を持つ人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）の作製が可能となった（例えば、非特許文献３、４、５、特許文献１参照）。ｉＰＳ細胞は、胚を使用せず体細胞を用いて樹立されるため倫理的な問題が少ないこと、移植に使用する場合に本人の細胞から樹立できるため拒絶反応を避けることができること、などいくつかの利点がある。従って、ＥＳ細胞よりｉＰＳ細胞を用いて神経幹細胞を作製するほうが、利用価値は高いであろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Okano H, Ogawa Y, Nakamura M, kaneko S, Iwanami A, Toyama Y. (2003). “Transplantation of neural stem cells into the spinal cord after injury”.  Seminars in Cell& Developmental Biology 14(3): 191-198.
【非特許文献２】Okada Y, Matsumoto A, Shimazaki T, Enoki R, Koizumi A, Ishii S, Itoyama Y, Sobue G, Okano H. (2008). “Spatio-temporal recapitation of central nervous system development by murine ES cell-derived neural stem/progenitor cells”. Stem Cells 26(12):3086-98.（published on line, doi: 10.1634/stemcells.2008-0293）
【非特許文献３】Takahashi K, Yamanaka S. (2006). “Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.”. Cell 126: 663-676.
【非特許文献４】Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S. (2007). “Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures”. Nature Protocols 2: 3081-3089.
【非特許文献５】Aoi T, Yae K, Nakagawa M, Ichisaka T, Okita K, Takahashi K, Chiba T, Yamanaka S. (2008). "Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells". Science 321(5889): 699-702.
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO2007/069666国際公開公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ｉＰＳ細胞樹立には、かなりの長期間を要し、マウスの場合約１ヶ月、ヒトの場合約３〜４ヶ月はかかる。従って、線維芽細胞からｉＰＳ細胞を通じて神経幹細胞を作製したとしても、例えばヒトの場合で半年以上という、長い期間を要すると考えられるため、再生医療への応用も考慮し、より簡易的で、より短期的な神経幹細胞製造法の開発が望まれている。
【０００７】
そこで、本発明は、ｉＰＳ細胞を樹立せず、体細胞から直接的に、短期間で容易に神経幹細胞を製造するための新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、線維芽細胞から神経幹細胞を製造する試みを行うため鋭意努力する中で、線維芽細胞に４つの脱分化因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4、c-Myc）を導入して数日間培養し、その後引き続いて、増殖因子の存在下で線維芽細胞を浮遊培養することによって、線維芽細胞がニューロスフェアの形状で神経幹細胞に分化しうることを見出し、本発明を完成するに至った。 
なお本明細書で、「遺伝子」「cDNA」などの用語無しに、「Sox2」、「Oct3/4」、「Klf4」、「c-Myc」というように因子名のみで用いられた場合、これらの遺伝子由来の遺伝子産物であるタンパク質を指すこととする。 
本発明の一実施態様は、神経幹細胞の製造方法であって、 
（i）体細胞に脱分化因子を導入する工程と、 
(ii) 前記脱分化因子が導入された体細胞を増殖因子の存在下で浮遊培養して、ニューロスフェアを製造する工程とを含む。ここで、体細胞に脱分化因子を導入したあと、２〜１４日培養することが好ましい。Sox2、Oct3/4、およびKlf4のような脱分化因子を体細胞に導入してもよいが、さらにc-Mycを含ませてもよい。また、前記脱分化因子が導入された体細胞は、ＬＩＦおよびＦＧＦのような増殖因子の存在下で培養してもよい。さらに、前記工程(ii)において、ｃＡＭＰの存在下で、前記脱分化因子が導入された体細胞を培養してもよいが、ＮＡＣ (N-acetyl-L-cycteine) の非存在下で、培養することが好ましい。前記体細胞が哺乳動物由来、特にマウスまたはヒト由来であることが好ましく、皮膚または肝臓由来であることが好ましく、線維芽細胞または肝細胞であることがさらに好ましい。
【０００９】
＝＝関連出願の相互参照＝＝
本出願は、２００９年１１月５日に出願された米国仮出願US61/198,365に対する優先権の利益を主張し、ここに援用するものとする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ｉＰＳ細胞を樹立せず、体細胞から直接的に、短期間で神経幹細胞を製造する方法を提供することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の一実施例において、脱分化因子を導入した線維芽細胞を浮遊培養した時のニューロスフェアの形成を示す。
【図２】図２は、本発明の一実施例で、線維芽細胞初期化工程で導入する脱分化因子の種類と、脱分化因子導入線維芽細胞培養後のニューロスフェアの形成数の関連を示すグラフである。
【図３】図３Ａは、本発明の一実施例で、分化誘導されたニューロスフェアにおける、ニューロン（緑色蛍光で示されている）、アストロサイト（青色蛍光で示されている）、オリゴデンドロサイト（赤色蛍光で示されている）の局在を示す。図では、３場面を示した。図３Ｂは、本発明の一実施例で、線維芽細胞から直接得られたニューロスフェアまたはｉＰＳ細胞から得られたものから分化した細胞タイプの割合を示したグラフである。
【図４】図４は、本発明の一実施例で、（Ａ）マウスニューロスフェア形成数に対する、ｐＣＲＴ−ｃＡＭＰ（図ではｃＡＭＰと記載）およびＮＡＣの効果、（Ｂ）ヒトニューロスフェア形成数に対する、ＬＩＦ、ｃＡＭＰ、およびＹ２７６３２の効果、を示すグラフである。右上の写真は、測定の際、ニューロスフェアを観察した顕微鏡写真である。
【図５】図５は、本発明の一実施例で、Oct4発現によって示される、ニューロスフェアの未分化状態を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。ただし、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００１３】
実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.等の標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１４】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例等は、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１５】
＝＝脱分化因子の体細胞への導入＝＝
体細胞から神経幹細胞を製造するために、まず、体細胞に脱分化因子を導入する。
【００１６】
本明細書で使用される「体細胞」とは、生殖系列にある細胞（例えば、卵細胞、精子細胞、卵原細胞や精原細胞等とそれらの前駆細胞）または発生初期胚由来の万能性未分化細胞（例えば胚性幹細胞）以外の、動物個体を構成する分化細胞のことである。この体細胞は、哺乳動物由来であることが好ましいが、マウス、ヒト等どのような動物種に由来しても構わない。また、動物個体は成体であっても胎仔や胚であってもよい。体細胞は、株化された細胞であっても、組織から単離された初代培養細胞であってもよいが、染色体数などが正常であることが好ましい。体細胞の由来となる組織や器官も特に限定されず、皮膚、肝臓、血液などを含む。体細胞の性状としては、受精細胞が有する全分化能を一部でも失った細胞であれば特に限定されず、例えば、線維芽細胞、上皮細胞、肝細胞、血液細胞などを含む。本発明に係る方法で製造した神経幹細胞を患者の治療に用いる場合には、患者自身から単離した体細胞を用いることが好ましい。
【００１７】
体細胞に導入する脱分化因子は、特に限定されないが、ｉＰＳ細胞を作成する際に用いる初期化因子を用いてもよい。特に、Oct遺伝子群、Klf遺伝子群、Sox遺伝子群のそれぞれの遺伝子群から選択された遺伝子の遺伝子産物の組み合わせを含むことが好ましく、ニューロスフェア形成の効率という点では、myc遺伝子群から選ばれた遺伝子の遺伝子産物をさらに含んだ組み合わせがより好ましい。Oct遺伝子群に属する遺伝子としては、Oct3/4、Oct1A、Oct6などがあり、Klf遺伝子群に属する遺伝子としては、Klf1、Klf2、Klf4、Klf5などがあり、Sox遺伝子群に属する遺伝子としては、Sox1、Sox2、Sox3、Sox7、Sox15、Sox17、Sox18などがある。myc遺伝子群に属する遺伝子としては、c-myc、N-myc、L-mycなどがある。myc遺伝子群の遺伝子産物は、SCFやbFGFなどのサイトカインやアザシチジンやバルプロ酸ナトリウム（VPA）などの化合物で置換してもよい。
【００１８】
脱分化因子は、上記組み合わせ以外にも、Oct遺伝子群の遺伝子、Sox遺伝子群の遺伝子に加え、Nanog遺伝子及びlin-28遺伝子などを含む組み合わせを含む。初期化因子を細胞に導入する場合、上記組み合わせの遺伝子に加え、他にも遺伝子産物を導入してもよく、例えば、TERTのような不死化誘導因子などが挙げられる。ただし、用いる体細胞において、上記の脱分化因子のいずれか、または複数がすでに発現している場合には、その脱分化因子の導入を省略することもできる。また、特定の脱分化因子の機能を代替できる化合物があれば、その脱分化因子の代わりに用いてもよい。そのような化合物には、CHIR99021、SB431542、PD0325901、チアゾビビンなどがあるが、これらに限定されない。
【００１９】
脱分化因子をコードする遺伝子は、いずれも脊椎動物で高度に保存されている遺伝子であり、本明細書では特に動物名を示さない限り、ホモログを含めた遺伝子を表すものとする。また、遺伝子多型を含め、変異を有する遺伝子であっても野生型の遺伝子産物と同等の機能を有する限り、含まれるものとする。
【００２０】
これらの脱分化因子の体細胞への導入方法は、特に限定されず、例えば、これらの脱分化因子のタンパク質自体を導入してもよく（タンパク質導入法）、あるいは、これらの脱分化因子のタンパク質をコードするＤＮＡを体細胞に導入して発現させてもよい（遺伝子導入法）。
【００２１】
脱分化因子の体細胞への導入を、タンパク質自体の導入により行う方法は、特に限定されず、当業者に周知のいずれの方法を用いてもよい。例えば、SAINT-PhやCellvader等の市販品や陽イオン性脂質を用いて導入してもよく、Protein Transduction Domain（ＰＴＤ）と呼ばれるペプチドをタンパク質に結合させ、培地に添加することにより、脱分化因子を細胞内に導入してもよい。
【００２２】
一方、脱分化因子を体細胞へ導入するための遺伝子導入法が用いられる場合、まず当業者に周知の方法を用い、脱分化因子をコードするＤＮＡを体細胞で発現させるための適切なプロモーターの下流に挿入した組換え発現ベクターを作製する。このとき、一つのベクターに２種類以上の脱分化因子を挿入してもよい。ここで、使用する発現ベクターは特に制限されず、例えばｐＭＸレトロウイルスベクター等を含む。続いて、以上のように作製した組換え発現ベクターを体細胞に導入する。導入方法は、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、または、レトロウイルス感染を介する方法等、当業者に周知のいずれの方法を用いてもよい。このように、脱分化因子を発現することができる発現ベクターを体細胞に導入し、その体細胞で脱分化因子を発現させることによって、脱分化因子を体細胞に導入することができる。
【００２３】
このようにして得られた脱分化因子を導入した体細胞を２日間〜１４日間、好ましくは３日間〜１０日間、特に好ましくは、マウスの場合は３日間〜６日間、ヒトの場合は７日間〜１０日間、線維芽細胞を培養するのと同じ通常の条件で培養する。例えば、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを用い、５％ＣＯ２存在下、３５〜４０℃、好ましくは３７℃で培養すればよい。
【００２４】
＝＝脱分化因子を導入された体細胞のニューロスフェアへの分化誘導＝＝
次に、上記のように処理した体細胞を、増殖因子の存在下で浮遊培養することによって、ニューロスフェアとして神経幹細胞を分化誘導することができる。用いる培地は、グルコース、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレンを添加したＤＭＥＭ：ハムＦ−１２培地（Ｆ−１２）等の無血清培地が好ましい。また、培地に添加する増殖因子は、その体細胞をニューロスフェアに分化誘導することができる因子、あるいは、その組み合わせであれば特に制限がないが、ＦＧＦ、ＬＩＦ、Ｂ２７、またはそれらの組み合わせであることが好ましい。ＦＧＦは、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−８が好ましく、培地中のＦＧＦ濃度は５〜５０ｎｇ／ｍｌでよいが、１０〜４０ｎｇ／ｍｌが好ましい。培地中のＬＩＦ濃度は約１０００Ｕ／ｍｌが好ましい。Ｂ２７はInvitrogen社のマニュアル通り、約５０倍希釈で使用すればよい。培養は、５％ＣＯ２条件下、３５〜４０℃で行うのが好ましく、３７℃であることがさらに好ましい。また、培地に、約１００μＭのｃＡＭＰを添加することにより、ニューロスフェアへの分化誘導効率が著しく増加する。この際、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）の非存在下で行うことがより好ましい。なお、浮遊培養のための培養皿は、特に限定されないが、コートされていない、バクテリア培養用プラスティック培養皿が望ましい。
【００２５】
このような条件下で、脱分化因子を導入された体細胞の培養を、培地をしばしば交換しながら続けると、通常、マウス線維芽細胞やヒト線維芽細胞では約７日間で、一次ニューロスフェアが形成され始める。培地は、適宜交換するが、例えば１４日ごとに交換すればよい。培養期間は、ニューロスフェアが回収できるようになる限り、特に限定されないが、通常、マウス線維芽細胞やヒト線維芽細胞では２０日前後で回収できるようになる。なお、このように体細胞を分化誘導させて最初に得られたニューロスフェアを一次ニューロスフェア（primary neurosphereまたはPNS）と称する。
【００２６】
こうして得られた一次ニューロスフェアを解離し、再度同じ条件で二次ニューロスフェアを形成させることができる。このように、再度形成させたニューロスフェア、及び、このニューロスフェア解離−ニューロスフェア形成工程を繰り返して形成させたニューロスフェアを、全て二次ニューロスフェア（secondary neurosphereまたはSNS）と称する。
【００２７】
このように、本発明の方法に従えば、短期間で、体細胞からニューロスフェアを大量に形成することができる。
【００２８】
＝＝ニューロスフェアの神経細胞への分化誘導＝＝
このようにして得られた一次ニューロスフェア及び二次ニューロスフェアは、神経幹細胞としての機能を有する。例えば、通常の分化培地で培養すれば、ニューロンのみならず、グリア細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト、シュワン細胞など）が分化する。ここで分化誘導培地としては、グルコース、グルタミン、インスリン、トランスフェリン、プロジェステロン、プトレシン、塩化セレンを含むＤＭＥＭ：Ｆ１２培地、（すなわち、神経幹細胞増殖用培地からＦＧＦとヘパリンを除いた培地）を用いるのが好ましい。このとき、ソニックヘッジホッグ（Sonic hedgehog）タンパク質は存在しても、存在しなくてもよい。培養は５％ＣＯ2条件下、３５〜４０℃で、５〜７日間行うのが好ましい。
【００２９】
一方、ＥＳ細胞を用い、予め胚様体（embryoid body；ＥＢ）を形成させて、そのＥＢを培養条件下で神経幹細胞に分化誘導させた場合、二次ニューロスフェアを通常の分化培地で培養すれば、ニューロンのみならず、グリア細胞を分化するようになるが、一次ニューロスフェアを、同様の分化条件で培養しても、運動ニューロン及びＧＡＢＡ作動性ニューロンしか分化誘導されない（特開２００２−２９１４６９）。
【００３０】
このように、本発明の方法に従えば、体細胞から神経幹細胞を短期間で分化させることができるばかりでなく、一次ニューロスフェアの段階から、グリア細胞を分化させることができるようになる。
【実施例】
【００３１】
[実施例１]
本実施例では、本発明に係る神経幹細胞製造方法によって、線維芽細胞から神経幹細胞を分化誘導できることを示す。
【００３２】
＝＝マウス初代線維芽細胞の調製＝＝
マウスの皮膚からの線維芽細胞樹立のため、頸椎脱臼した成体マウス（８週齢ICRマウス♂）の体毛を除き、腹部の皮膚を採取した。単離した皮膚をペニシリン／ストレプトマイシン（５０Ｕ、５０mg/ml）、０．６％グルタミンを含有したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄した後、この単離した皮膚から真皮を除去した。この真皮を細胞培養用プラスティック皿に載せ、カバーガラスで覆い、初代細胞スターティング培地（東洋紡社）で培養した。
【００３３】
培養開始から６〜７日後、プラスティック皿とカバーグラスに付着した線維芽細胞を０．２５％トリプシンＥＤＴＡで洗浄することによって剥離し、新たなプラスティック皿に５００００細胞／ｍｌの濃度で播種し、初代培養スターティング培地を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で１０〜１４日培養した。
【００３４】
＝＝ヒト初代線維芽細胞の調製＝＝
ヒト皮膚組織から採取した真皮からマウスと同様の方法で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ、３７℃、５％ＣＯ２条件下で線維芽細胞を得た。組織片から増殖させた線維芽細胞をトリプシン処理にて播種し、初代線維芽細胞として増殖させた。そして、レトロウイルスの感染効率を高めるため、この初代線維芽細胞に、Slc7a1発現レンチウイルス（Takahashi and Yamanaka, Cell 2006 vol.126 p.663-676）を一晩感染させた後、増殖させることにより、初代線維芽細胞に、レトロウイルスの受容体であるSlc7a1を発現させ、得られた線維芽細胞を以後の実験に用いた。
【００３５】
＝＝樹立された線維芽細胞への脱分化因子の導入＝＝
各脱分化因子ＤＮＡを含んだ組換え発現ベクターpMXs-Oct3/4、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4、pMXs-c-Myc（全てaddgene社）を用い、４因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4、c-Myc）、３因子（c-Mycなし、Oct3/4、 Sox2、 Klf4）、または３因子（Klf4なし、Oct3/4、 Sox2、c-Myc）の組み合わせを発現するレトロウイルスを含む培地を作製した。一方、形質転換の指標、および、因子挿入群に対する陰性対照群として、pMX-GFP（Cell biolabs社）を用いてＧＦＰを含む培地を、以下のように作製した。なお、ベクターの作製方法は、Takahashi and Yamanaka, Cell 2006 vol.126 p.663-676にも詳細に記載されており、この文献を援用することにより、本明細書に含めるものとする。
【００３６】
上記組換え発現ベクターのパッケージングに先立ち、パッケージング用Platinum-E細胞を１０％FBS含有ＤＭＥＭ培地で１４日間、３７℃で培養した。各組換え発現ベクターの混合物を、それぞれPlatinum-E細胞にトランスフェクトし、２４時間後に培地を交換し、さらに１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地５％ＣＯ2条件下、３５〜４０℃で２４時間培養した後に培地上清を回収した。各培地上清には、パッケージングに用いた各組換え発現ベクターに対して、４因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4、c-Myc）のそれぞれを発現するレトロウイルスの混合物、c-Mycなし３因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4）のそれぞれを発現するレトロウイルスの混合物、Klf4なし３因子（Oct3/4、Sox2、c-Myc）のそれぞれを発現するレトロウイルスの混合物、またはＧＦＰを発現するレトロウイルスが含まれる。
【００３７】
こうして得られた各培地上清を初代線維芽細胞の培地に適量添加することによってレトロウイルスを感染させ、マウス初代線維芽細胞には４因子、３因子、またはＧＦＰを発現させ、ヒト初代線維芽細胞には４因子またはＧＦＰを発現させた。
【００３８】
このレトロウイルス感染線維芽細胞を培養用プラスティック皿に播種し、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地５％ＣＯ2条件下、３５〜４０℃で２４時間から５日間培養した。
【００３９】
＝＝ニューロスフェアへの分化誘導＝＝
上記のように培養した、脱分化因子導入線維芽細胞を、０．２５％トリプシンＥＤＴＡで洗浄して解離させ、ＬＩＦ（組み替えヒトＬＩＦ;ケミコン社  １００Ｕ／ｍｌ）およびＦＧＦ（ペプロテック社 ２０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ/Ｆ−１２無血清培地（１：１、Invitrogen社、０．６％Ｄ−グルコース、５ｍＭヘペス、３ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭグルタミン、２５μg／ｍｌインスリン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０ｎＭプロゲステロン、６０μＭプトレスシン、３０ｎＭセレン酸ナトリウムを含む）１０ｍｌに５０細胞／μｌの細胞密度でバクテリア用プラスティック培養皿に播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、１４日毎に培地を交換しながら、浮遊培養した。浮遊培養途中、培養３日目および培養２０日目の細胞の状態を観察した。
【００４０】
図１に、マウス細胞に対し、４つの脱分化因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4、c-Myc）を導入した場合（Ａ、Ｂ）、c-Myc以外の３つの脱分化因子を導入した場合（Ｃ、Ｄ）、ＧＦＰを導入した場合（Ｅ、Ｆ）の、脱分化因子導入線維芽細胞の培養３日目（Ａ、Ｃ、Ｅ）および培養２０日目（Ｂ、Ｄ、Ｆ）における、細胞塊としてのニューロスフェアの形成を示す。図１に示すように、導入した脱分化因子がc-Myc以外の３因子であっても４因子全てであっても、線維芽細胞を浮遊培養後、ニューロスフェアが得られた。
【００４１】
また、図１に、ヒト細胞に対し、４つの脱分化因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4、c-Myc）を導入した場合（Ｇ）、およびＧＦＰを導入した場合（Ｈ）の、脱分化因子導入線維芽細胞の浮遊培養３日目におけるニューロスフェアの形成を示す。図１に示すように、ヒトの細胞を用いても、線維芽細胞を浮遊培養後、ニューロスフェアが得られた。
【００４２】
図２に、マウス細胞を用いた場合の各条件で作製したニューロスフェア数を測定して得られた結果を示す。４因子が導入された線維芽細胞では培養液１０ｍｌあたり平均７．５個、c-Mycなし３因子が導入された線維芽細胞では平均１個のニューロスフェアが得られたが、Klf4なし３因子あるいはＧＦＰが導入された線維芽細胞ではニューロスフェアが得られなかった。なお、計測では、球形の細胞塊のうち、直径５０μｍ以上のものをカウントした。
【００４３】
纏めると、本発明の方法によると、ｉＰＳ細胞を樹立することなく、直接、体細胞からニューロスフェアを作製することができる。
【００４４】
＝＝ニューロスフェアの分化誘導＝＝
次に、このようにして得られたニューロスフェアが、神経幹細胞としての性質を有することを示す。
【００４５】
浮遊培養開始から１４日目以降に形成したニューロスフェア（直径＞７５μｍ）を一つずつ、Poly-Oおよびフィブロネクチンでダブルコーティングしたチャンバー付スライドガラスに移し、２％ＦＢＳを添加した０．５ｍｌのＤＭＥＭ/Ｆ−１２無血清培地（１：１、Invitrogen社、０．６％Ｄ−グルコース、５ｍＭヘペス、３ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２ｍＭグルタミン、２５μg／ｍｌインスリン、１００μｇ／ｍｌトランスフェリン、２０ｎＭプロゲステロン、６０μＭプトレスシン、３０ｎＭセレン酸ナトリウムを含む）を用い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で、７日間付着培養した。得られた分化細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分固定した。ＰＢＳで洗浄後、分化細胞を、抗ヒトβIII−チューブリンモノクローナル抗体（カタログ番号T8660、Sigma社、１０００倍希釈）、ウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）ポリクローナル抗体（カタログ番号Z0334、DAKO社、４００倍希釈）、抗Ｏ４（オリゴデンドロサイト）モノクローナル抗体（カタログ番号MAB345、Chemicon社、１０００倍希釈）で、４℃で一晩、処理した。なお、βIII−チューブリンはニューロンのマーカー、ＧＦＡＰはアストロサイトのマーカー、Ｏ４はオリゴデンドロサイトのマーカーとして用いられた。二次抗体として、Alexa 488標識抗マウスIgGヤギ抗体（Invitrogen社、５００倍希釈）、Alexa 350標識抗ウサギIgGヤギ抗体（Invitrogen社、５００倍希釈）、Alexa 555標識抗マウスIgMヤギ抗体（Invitrogen社、１０００倍希釈）を適宜用い、得られた標本を蛍光顕微鏡で観察した。
【００４６】
図３Ａに示すように、付着培養した細胞はニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化しており、得られたニューロスフェアが神経細胞及びグリア細胞への分化能を有していることが確認された。
【００４７】
次に、線維芽細胞から直接得られたニューロスフェアと、ｉＰＳ細胞（３８Ｃ２）から得られたニューロスフェアとの間で、複数の分化した細胞タイプを生成する能力を比較した。線維芽細胞から直接得られたニューロスフェアは、上述したように分化させた。他方、３８Ｃ２細胞（Okita et al., Nature vol.448, pp.313-317, 2007）は、１０−８Ｍレチノイン酸の存在下で胚様体を作製し、２０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を添加した無血清培地（Okada et al., Dev.Bio. vol.275, pp.1224-142, 2004）で培養し、培養７日目に、胚様体は一次ニューロスフェアを形成した。得られた一次ニューロスフェアを、線維芽細胞から直接得られたニューロスフェアと同様の方法で分化させた。分化した細胞は、顕微鏡下で観察し、細胞タイプを同定しながら細胞数を数えた。図３Ｂに、分化した神経細胞とグリア細胞のそれぞれの割合を示す。図３に示したように、ｉＰＳ細胞から得られた一次ニューロスフェア（１１ニューロスフェア）は、全て、神経細胞にしか分化しなかった。一方、線維芽細胞から直接得られたニューロスフェアの６５％（２６ニューロスフェア中の１７ニューロスフェア）は、神経細胞だけでなくグリア細胞にも分化した。
【００４８】
このように、本発明の方法によって得られた一次ニューロスフェアはグリア細胞への分化能を有するため、それ自身、移植源としての利用価値が高い。
【００４９】
なお、マウス胎仔の皮膚から採取した線維芽細胞においても、本発明の方法によって、ほぼ同じ効率でニューロスフェアが製造できた。
【００５０】
[実施例２]
本実施例では、実施例１に記載の神経幹細胞製造方法において、ｃＡＭＰの存在下で脱分化因子導入線維芽細胞を培養することにより、ニューロスフェアへの分化誘導効率が著しく増加することを示す。 
細胞死阻害剤であるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ、１ｍＭ、Sigma社）及び膜透過性ｃＡＭＰアナログ、８−クロロフェニルチオ-ｃＡＭＰ（ｐＣＰＴ−ｃＡＭＰ、１００μＭ、Sigma社）によるニューロスフェア分化誘導の効率改善を調べるため、実施例１に記載の浮遊培養において、どちらか一方または両方を添加した培地を用いた。その他の工程は実施例１と同様に行い、培養２０日目のニューロスフェアの数を測定した。
【００５１】
図４Ａに示すように、ｐＣＰＴ−ｃＡＭＰのみを添加した場合、培地１０ｍｌあたりのニューロスフェア数は、いずれの細胞死阻害剤も添加しない場合（対照群）と比較して１００倍以上に増加した。一方で、ＮＡＣのみを添加したときは、対照群に比べてほとんど変化が無かった。また、ＮＡＣとｐＣＰＴ−ｃＡＭＰを両方添加した群では、ｐＣＰＴ−ｃＡＭＰのみを添加した場合に比べ、得られたニューロスフェア数がかなり減少した。すなわち、ＮＡＣは、ｐＣＰＴ−ｃＡＭＰの分化誘導効率改善作用を抑制した。
【００５２】
従って、脱分化因子導入線維芽細胞を培養してニューロスフェアに分化誘導する際、ｃＡＭＰの存在下で行うことにより、その分化誘導効率が著しく増加する。この際、ＮＡＣの非存在下で行うことがより好ましい。
【００５３】
なお、マウス胎仔の皮膚から採取した線維芽細胞においても、本発明の方法を用いて、ｃＡＭＰによる同様の効果が得られた。
【００５４】
ヒト線維芽細胞の場合、培地に、ＬＩＦに代えて、あるいはＬＩＦに加えてｃＡＭＰを添加するか、またはｃＡＭＰ、ＬＩＦ、ＲＯＣＫ阻害剤Y27632を添加し、２５００００個の細胞から得られたニューロスフェアの数を数えた。図４Ｂに示すように、ＬＩＦとｃＡＭＰは相加的な効果を有したが、Y27632はニューロスフェア形成に効果はなかった。
【００５５】
[実施例３]
本実施例では、Ｏｃｔ４−ＧＦＰのトランスジーンを有するトランスジェニックマウスの胚と成体を用いてニューロスフェアを作製し、未分化細胞で発現するOct4遺伝子の発現を指標にニューロスフェアの分化段階を調べた。
【００５６】
成体マウスの線維芽細胞を、実施例１の方法によって調製し、マウス胚線維芽細胞を調製した。
【００５７】
そのあと、これらの繊維芽細胞を用い、実施例１の方法に従って、４つの因子（Oct3/4、 Sox2、 Klf4、c-Myc）でニューロスフェアを製造した。顕微鏡下で、ＧＦＰ陽性細胞を含むニューロスフェア（ＧＦＰ陽性ニューロスフェア）及びＧＦＰ陽性細胞を含まないニューロスフェア（ＧＦＰ陰性ニューロスフェア）の数を数えた。ＧＦＰ陽性ニューロスフェアとＧＦＰ陰性ニューロスフェアの割合を図５Ａに示した。
【００５８】
胚の線維芽細胞と成体の線維芽細胞に由来するＧＦＰ陽性ニューロスフェアのうち、それぞれ８５％（１００ニューロスフェア中の８５個）と６％（１００ニューロスフェア中の６個）がＧＦＰ陽性ニューロスフェアだった。このことは、胚由来のニューロスフェアは成体由来のニューロスフェアより、より未分化であることを示している。移植後の腫瘍化という観点からは、分化段階の進んだニューロスフェアのほうがリスクは少ない。そのため、成体由来のニューロスフェアのほうが、胚由来のニューロスフェアより好ましい。
【００５９】
同様に、ｉＰＳ細胞由来のＧＦＰ陽性ニューロスフェアの割合を調べ、成体由来のニューロスフェアと比較した。図５Ｂに示すように、ｉＰＳ細胞由来のニューロスフェアについて、ＧＦＰ陽性ニューロスフェアは９７％であった。このことは、ｉＰＳ細胞由来のニューロスフェアは、さらに未分化であることを示している。この事実は、本発明によって製造されるニューロスフェアは、移植後の腫瘍化という点で、ｉＰＳ細胞由来のニューロスフェアより有利であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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