(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む配列を有する核酸：
ａ）テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフであって、該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、ＤＮＡヘリックスの向かい合った面に結合する当該少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフ；及び
ｂ）その５’末端で更なる一般的転写因子結合部位に機能的に結合するＴＡＴＡボックスを含む最小プロモーターであって、その３’末端で、カブ黄斑モザイク・ウイルス（ＴＹＭＶ）の５’ＵＴＲに結合している、該最小プロモーター。
【請求項２】
前記の一般的転写因子結合部位がＴＦＩＩＢ転写因子結合部位である、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフが、１７の連続（contiguous）ヌクレオチドよりなるスペーサーにより分離されている、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
前記のスペーサーが、シス調節エレメントを含まない、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記の最小プロモーターが、ｈＣＭＶ最小プロモーターに由来する、請求項１〜４の何れか一つに記載の核酸。
【請求項６】
前記の最小プロモーターが、SEQ ID No:５又は１０に示した核酸配列を含む、請求項５に記載の核酸。
【請求項７】
最小プロモーターが、ＤＳＥエレメントを含まず、５’ＵＴＲ配列が欠失している、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
下記を含む核酸：
ａ）テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフであって、該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、ＤＮＡヘリックスの向かい合った面に結合する当該少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフ；
ｂ）最小プロモーター；及び
ｃ）ＴＹＭＶの５’ＵＴＲ。
【請求項９】
前記のＴＹＭＶの５’ＵＴＲが、ＲＦＸ−１結合部位、ＡＰ４結合部位、ＨＰ１結合部位及び／又はＨＰ２結合部位を含まない、請求項１又は８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記のＴＹＭＶの５’ＵＴＲが、SEQ ID No:１１に示した核酸配列を有する、請求項１〜９の何れか一つに記載の核酸。
【請求項１１】
SEQ ID No:１３〜１７の何れか一つに示された核酸配列を含む、核酸。
【請求項１２】
SEQ ID No:１３〜１７の何れか一つに示された核酸配列を含む、請求項１〜１０の何れか一つの核酸。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか一つの核酸を含むベクター。
【請求項１４】
前記のベクターが、発現ベクターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
前記の核酸が、発現すべき核酸配列に機能的に結合された、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１〜１０の何れか一つに記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１１〜１４の何れか一つに記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１２の何れか一つに記載の核酸又は請求項１３〜１５の何れか一つに記載のベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項１９】
請求項１〜１２の何れか一つに記載の核酸又は請求項１３〜１５の何れか一つに記載のベクターを含むトランスジェニック植物。
【請求項２０】
請求項１〜１２の何れか一つの核酸に機能的に結合された核酸配列の発現を、宿主細胞において調節する方法であって、下記を含む当該方法：
ａ）該宿主細胞中で、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドを発現させること；及び
ｂ）該宿主細胞中のテトラサイクリン又はその類似体の濃度を調節すること。
【請求項２１】
請求項１〜１２の何れか一つに記載の核酸に機能的に結合された核酸配列の発現を、植物において調節する方法であって、下記を含む当該方法：
ａ）該植物において、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドを発現させること；及び
ｂ）該宿主細胞中のテトラサイクリン又はその類似体の濃度を調節すること。
【請求項２２】
前記のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターが、ｔｅｔオペレーターに、テトラサイクリン又はその類似体の非存在下で結合する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターが、核酸配列の発現を活性化し又は阻害する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターが、ｔｅｔオペレーターに、テトラサイクリン又はその類似体の存在下で結合する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターが、核酸配列の発現を活性化し又は阻害する、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現の調節のための誘導可能な転写制御配列に関するものである。特に、それは、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフ、及び最小プロモーターを含む転写制御配列に関するものであり、該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、隣接成分に関して、ＤＮＡ二重らせんの向かい合った面（opposite face）に結合し、最小プロモーターは、その５’端で一般的転写因子結合部位に結合したＴＡＴＡボックスを含んでいる。更に、本発明は、該転写制御配列を含むベクター、宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物に関係する。宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物において、本発明の転写制御配列に機能的に結合された核酸配列の発現を調節する方法も又、意図される。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチドの組換えによる製造のため、並びに、イン・ビボでの遺伝子発現の制御のためには、その発現過程の外因的制御（即ち、発現のオン又はオフ）が、特に重要である。このコンテキストにおいて、通常、該外因的制御を達成するために、発現制御のための誘導可能なシステムが適用される。特に、ある種の核酸の発現は、外因的刺激によって支配されうる。かかる刺激は、物理的培養条件における変化たとえば熱ショック、又はある種の化合物の存在若しくは非存在（即ち、離脱withdrawal）であってよい。
【０００３】
商業的及び科学的に重要な誘導可能な発現系は、いわゆる、「テトラサイクリン誘導可能なシステム」即ち「Ｔｅｔシステム」である。それは、Bujardとその共同研究者によって、１０年以上前に開発されている。Gossen 1992, Proc.Natl.Acad.Sci. 89: 5547-5551, US 5,888,981, US 5,814,618, US 6,004,941, US 5,814,618, US10/456,395, WO96/01313又はWO00/75347を参照されたい。
【０００４】
簡単には、このＴｅｔシステムは、核酸発現の制御を、発現すべき核酸に機能的に結合されたｔｅｔオペレーター配列を含むプロモーターを利用することにより与える。該プロモーターは、テトラサイクリン依存性転写アクチベーターのｔｅｔオペレーター配列への結合に際して、核酸配列の転写を開始することができ、又はそれは、構成的に活性なプロモーターの転写を、テトラサイクリン依存性転写サイレンサーの結合によって抑制することができる。
【０００５】
伝統的に、テトラサイクリン依存性レギュレーターは、テトラサイクリンの非存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合し、存在下では結合しない。従って、発現は、テトラサイクリン又はテトラサイクリン類似体の、例えば発現に用いられる細胞系統の培養培地からの離脱により開始することができる（US5,464,758, US6,914,124, US5,789,156, US6,271,348, WO96/01313, 又はWO00/75347）。
【０００６】
その後、反対（逆）の仕方での調節を可能にするテトラサイクリン依存性レギュレーターが開発された。かかるレギュレーターの使用により、発現を、テトラサイクリン又はその類似体の、例えば発現に用いられる細胞系統の培養培地への添加により開始することができる（US5,654,168, US6,136,954, US5,789,156, US6,271,348, US6,087,166, US6,271,341, US10/456,395, WO96/01313,又はWO00/75347）。
【０００７】
Ｔｅｔシステムの最近の改良は、テトラサイクリン依存性レギュレーターに集中した。特に、一層低い基礎活性を生じるが、高い誘導ポテンシャルを維持した改良されたレギュレーターが、開発された。こうして、誘導因子は、大いに改良された。その上、最大誘導が、一層低いテトラサイクリン又はテトラサイクリン類似体濃度で達成された。US10/456,395又はWO00/75347参照。
【０００８】
位置を変えたｔｅｔオペレーターエレメントを含むテトラサイクリン依存性プロモーターも又、報告された。Agha-Mohammadi 2004, J Gene Medicine, 6: 817-828又はUS2003/0221203参照。この開示されたプロモーターは、短くされたＣＭＶ最小プロモーター及び、該最小プロモーターの上流の６〜８ｔｅｔオペレーター配列モチーフを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願ＵＳ１０／４５６，３９５号
【特許文献２】国際公開ＷＯ００／７５３４７号
【特許文献３】米国特許出願ＵＳ２００３／０２２１２０３号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Agha-Mohammadi 2004, J Gene Medicine, 6: 817-828
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、改良された厳格な信頼できる調節を可能にするテトラサイクリン依存性転写制御配列、即ち低い基礎活性を有するが依然として高い誘導ポテンシャルを保持した該制御配列は、従来技術では報告されておらず、依然として、大いに望ましいものである。
従って、本発明が対象とする技術的問題は、高い基礎活性及び不適当又は信頼できない誘導の欠点を回避することを可能にする誘導可能な遺伝子の調節を改良する手段及び方法の提供といえる。この技術的問題は、請求の範囲及び下記において特徴付けられる具体例によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一般に、本発明は、ｔｅｔオペレーター配列及び最小プロモーターを含む転写制御配列に関係する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、
−該転写制御配列は、それに機能的に結合された核酸の発現の、少なくとも１００倍の、少なくとも２００倍の、少なくとも３００倍の、少なくとも４００倍の、少なくとも５００倍の又は少なくとも１０００倍の誘導を可能にし、そして
−この転写制御配列は、市販のＰｔｅｔ−１４プロモーター（米国、Clontech Laboratories Inc.）の基礎的活性より有意に少ない基礎的遺伝子発現即ち非誘導状態での遺伝子発現を可能にする。前述の誘導及び／又は基礎的活性は、好ましくは、下記の実施例に記載されたようにして測定される。
図面は、下記を示している：
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】転写制御配列Ｐtet−Ｔ１、Ｐtet−Ｔ２、Ｐtet−Ｔ３、Ｐtet−Ｔ４、Ｐtet−Ｔ５、Ｐtet−Ｔ６及びＰtet−Ｔ７の配列比較。調節ユニットＰｔｅｔ−Ｔ１〜Ｔ７中で用いられた最小プロモーターの配列アラインメント。ｈＣＭＶ最小プロモーターＴ１（＝Ｐtet-1）の改変後のプロモーター配列の変種。元の配列の変異は、太字で示されており、欠失は、ダッシュで示した。植物ウイルスリーダー（ＴＹＭＶ）における類似の配列改変を青色で示し、欠失は、ダッシュで示した。すべてのコンストラクトに共通するものは、ＴＡＴＡボックスとｈＣＭＶイニシエーター配列（＋１／＋１２、黄色）であり、転写開始部位をカバーしている。Ｔ２から、ＴＦＩＩＢコンセンサス結合部位が導入された。ＨｉｎｄＩＩＩ（５’）とＳａｌＩ（３’）のクローニング部位（下線）も、やはり共通であった。Ｔ１〜Ｔ４プロモーターは、ｈＣＭＶ５’−ＵＴＲ及びその変異体を含み、Ｔ５〜Ｔ７プロモーターは、ＴＹＭＶ５’−ＵＴＲ及びその変異体を含む。用いられるＴＹＭＶ−リーダーは、ウイルス配列の＋２−９０の配列を含む。これらの整列させた配列のSEQ ID NOは、これらの配列の後の括弧に示してある。
【図２】Ｐｔｅｔ−Ｔ１ −＞ Ｐｔｅｔ−Ｔ６の誘導状態及び非誘導状態におけるルシフェラーゼ誘導及び基礎的活性。
【図３】Ｐｔｅｔ−Ｔ６、Ｐｔｅｔ−Ｔ７、Ｐｔｅｔ−１４（Clontech Laboratories, Inc.（米国）から市販されている）Ｐｔｅｔ−１（Gossen 1992, loc. cit.）及び構成的に発現されているレポーターコンストラクト（ＰｈＣＭＶ）の誘導状態及び非誘導状態におけるルシフェラーゼ誘導及び基礎的活性を、同一条件下で分析した。
【図４】Ｐtet−Ｔ６の合成配列。Ａは、Ｐtet−Ｔ６の合成の（ＣｐＧアイランドフリー）配列（Ｐtet−Ｔ６syn）を示しており、Ｐｔｅｔ−Ｔ６と比較してのヌクレオチド変化は、小文字にし、下線を引いてあって、これらは、ＣｐＧジヌクレオチドを除くために導入され；Ｂは、二方向性のＰtet−Ｔ６synを示している。ＴＡＴＡボックスも又、下線を引いてある。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
用語「転写制御配列」は、ここで用いる場合、それに機能的に結合された他の核酸配列例えば関心ある遺伝子の発現を支配することのできる核酸配列を指す。この転写制御配列は、好ましくは、ＤＮＡ配列即ちＤＮＡポリヌクレオチドである。本発明による転写制御配列は、本書の他所で詳述してあるように、ｔｅｔオペレーター配列モチーフ及び最小プロモーター配列を含む。本発明に従って言及される転写制御配列は、好ましくは、ポリペプチド即ち転写因子により認識されて結合される配列モチーフを含む。該転写因子は、結合に際して、ＲＮＡポリメラーゼを、好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩを、一層好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩを、最も好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩをリクルートする。それにより、この転写制御配列に機能的に結合された核酸の発現が開始される。発現すべき核酸の種類によって、本願で意味される発現は、ＤＮＡ配列の（例えば、アンチセンスアプローチ、ＲＮＡｉアプローチ又はリボザイムアプローチに適切な）ＲＮＡポリヌクレオチドへの転写を含むことができ又はＤＮＡ配列のＲＮＡポリヌクレオチドへの転写とその後の該ＲＮＡポリヌクレオチドの（例えば、遺伝子発現及び組換えポリペプチド生成アプローチに適切な）ポリペプチドへの翻訳を含むことができるということは、理解されるべきである。核酸配列の発現を支配するために、この転写制御配列は、発現すべき核酸の直ぐ隣りに配置し、即ち、該核酸に、その５’末端で物理的に結合されてもよい。別法として、それは、物理的に近くに配置されてもよい。しかしながら、後者の場合には、この配列は、発現されるべき核酸との機能的相互作用が可能であるように配置されなければならない。
【００１６】
用語「ｔｅｔオペレーター配列モチーフ」、「ｔｅｔオペレーター」、又は「ｔｅｔＯ」は、ここで用いる場合、すべてのクラスのｔｅｔオペレーター配列を包含することを意図している。好ましくは、それは、ｔｅｔＯ（Ａ）、ｔｅｔＯ（Ｂ）、ｔｅｔＯ（Ｃ）、ｔｅｔＯ（Ｄ）、ｔｅｔＯ（Ｅ）、ｔｅｔＯ（Ｇ）、ｔｅｔＯ（Ｈ）、ｔｅｔＯ（Ｊ）及びｔｅｔＯ（Ｚ）に関する。これらのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｊ及びＺクラスのＴｅｔリプレッサーのメンバーのヌクレオチド配列、及びそれらの対応するｔｅｔオペレーター配列は、当分野で周知であり、例えば、Waters 1983, Nucl. Acids Res 11:6089-6105, Hillen 1983, Nucl. Acids Res. 11:525-539, Postle 1984, Nucl. Acids Res. 12:4849-4863, Unger 1984, Gene 31: 103-108, Unger 1984, Nucl Acids Res. 12:7693-7703及びTovar 1988, Mol. Gen. Genet. 215:76-80を参照されたい（これらを、特に、開示されたｔｅｔオペレーター配列に関して、参考として、そっくりそのまま、本明細書中に援用する）。ｔｅｔオペレーター配列は又、US5,464,758にも開示されている。本発明による好適なｔｅｔオペレーター配列モチーフは、SEQ ID No:１に示された核酸配列を有する。
【００１７】
用語「最小プロモーター」は、本発明の意味において、転写開始複合体の形成に関与するＤＮＡ結合性の一般的転写因子によって特異的に認識される核酸配列モチーフを含むプロモーターに関係する。しかしながら、最小プロモーターにより駆動される核酸配列の有意の転写の開始、従って発現の有意の開始は、更なるシグナル例えばエンハンサーエレメントから与えられるシグナルを必要とする。従って、ここで言及する場合、最小プロモーターは、単独では、それに機能的に結合された核酸の転写を有意な程度で可能にしない。しかしながら、該最小プロモーターと適当な制御エレメント、例えばここで言及されるｔｅｔオペレーター配列モチーフとの組合わせによって、その結果生成した転写制御配列は、ｔｅｔオペレーター結合性転写因子例えば本書の他所で言及されるテトラサイクリン依存性転写レギュレーターの誘導／活性化により、核酸の転写を可能にする。
【００１８】
本発明によれば、該最小プロモーターは、好ましくは、ＴＡＴＡボックス配列モチーフ及び少なくとも一つの（更なる）一般的転写因子結合部位を含む。好ましくは、ここで言及されるＴＡＴＡボックスは、核酸配列モチーフ「ＴＡＴＡＡＡＡ」（SEQ ID No:４）よりなる。この一般的転写因子結合部位は、好ましくは、ＴＡＴＡボックスの近くに位置し、一層好ましくは、ＴＡＴＡボックス配列の５’末端に直接隣接して配置される。最小プロモーターは、ＣＭＶ最小プロモーターの場合のように、既にＴＡＴＡボックスを含んでいるのが好ましいということは理解されるべきである。一般的転写因子結合部位は、天然には、最小プロモーター中に存在しえない。従って、そのような場合、該一般的転写因子結合部位は、好ましくは、人工的に、最小プロモーター中に、例えば位置指定突然変異誘発アプローチによって導入される。用語「更なる一般的転写因子結合部位」は、一般的転写因子と結合することのできるＴＡＴＡボックス以外の核酸配列モチーフを指す。一般的転写因子は、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼ好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩ又はＩＩＩをプロモーターにリクルートするのに必要とされる転写因子である。一般的転写因子並びにそれらにより認識されて結合される核酸配列モチーフは、当分野で周知である。好ましくは、一般的転写因子結合部位は、本発明の意味において、ＲＮＡポリメラーゼとのプレ開始複合体の形成に関与し、コアプロモーター領域と相互作用することのできる転写因子（即ち、ＤＮＡ結合性タンパク質である）のための結合部位である。一層好ましくは、本発明により言及される更なる一般的転写因子結合部位は、ＴＦＩＩＢ結合部位（SEQ ID No:３）である。
【００１９】
様々な十分に特性決定された最小プロモーターが、当分野では公知であり、例えば、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はヒトサイトメガロウイルスＩＥ（ｈＣＭＶ）の最小プロモーター又は非ウイルス性最小プロモーターが知られている。かかる最小プロモーターは、必要であれば、本発明により、ＴＡＴＡボックス及び更なる一般的転写因子結合部位を含むように、当業者によって更に骨を折ることなく、改変することができる。
【００２０】
好ましくは、ここで言及される最小プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最小プロモーターに由来するものであってよく、一層好ましくは、ヒトＣＭＶ（ｈＣＭＶ）に由来するもの例えばGossen及びBujard 1992, loc. Cit.に記載されたようなｈＣＭＶ最初期プロモーター由来の最小プロモーターであってよい。一層好ましくは、該ｈＣＭＶ最小プロモーターは、SEQ ID No:２に示された核酸配列を有する。かかるｈＣＭＶ最小プロモーターの変異体も又、使用することができる。かかる変異体は、SEQ ID No:２に示された配列に関して、少なくとも一のヌクレオチドの欠失、置換及び／又は付加を含む。従って、変異体は、好ましくは、SEQ ID No:２に示された配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を有する。種々の配列を比較するために、当業者は、様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムを利用することができる。このコンテキストにおいて、Needleman及びWunsch又はSmith及びWatermanのアルゴリズムは、特に信頼できる結果を与える。これらの配列アルゴリズムを実行するためには、プログラムＰｉｌｅＵｐ（J. Mol. Evolution. 1987, 25, 351-360,及びHiggins 1989, CABIOS, 5: 151-153）又はプログラムＧａｐ及びＢｅｓｔＦｉｔ（Needleman 1970, J. Mol. Biol. 48; 443-453及びSmith 1981, Adv. Appl. Math. 2; 482-489）（これらは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Genetics Computer Group, 米国、ウィスコンシン、53711, Madison, Science Drive, 575, バージョン1991）の部分である）を使うべきである。上記の配列の同一性のパーセント値（％）は、好ましくは、全配列にわたって、プログラムＧＡＰを用いて、次のセッティングにて決定すべきである：ギャップ重み：５０、長さ重み：３、平均マッチ：１０．０００及び平均ミスマッチ：０．０００（これらは、別途特定されない限り、配列アルゴリズムに関して、標準セッティングとして常に用いられる）。変異体は又、前述の特異的核酸配列と好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることのできる核酸配列をも包含する。これらのストリンジェントな条件は、当業者には公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6中に見出すことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好適な例は、約４５℃の６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（＝ＳＳＣ）でのハイブリダイゼーションとその後の５０〜６５℃の０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄というものである。当業者は、例えば有機溶媒が存在する場合、これらのハイブリダイゼーション条件が核酸の種類によって、緩衝液の温度及び濃度に関して異なることを知っている。例えば、「標準的ハイブリダイゼーション条件」下で、これらの温度は、０．１〜５×ＳＳＣ濃度の水性緩衝液（ｐＨ７．２）中で、核酸の種類によって、４２〜５８℃で異なる。もし有機溶媒が前述の緩衝液中に存在するならば(例えば、５０％のホルムアミド)、標準的条件下での温度は、約４２℃である。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、例えば、０．１×ＳＳＣ及び２０〜４５℃、好ましくは、３０〜��５℃である。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、例えば、０．１×ＳＳＣ及び３０〜５５℃、好ましくは４５〜５５℃である。前述のハイブリダイゼーション温度は、ホルムアミドの非存在下で、例えば約１００ｂｐ（＝塩基対）長でＧ＋Ｃ含量が５０％の核酸について決定される。当業者は、必要なハイブリダイゼーション条件を如何にして決定するかを、上記のような又は次のような教本を参照することにより知る：Sambrook等、「Molecular Cloning」、Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; Hames及びHiggins (編) 1985, 「Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach」、IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (編) 1991, 「Essential Molecular Biology: A Practical Approach」、IRL Press, Oxford University Press, Oxford。
【００２１】
ＴＡＴＡボックス及び更なる一般的転写因子結合部位即ちＴＦＩＩＢ結合部位を有するｈＣＭＶ最小プロモーターに由来する好適な最小プロモーターを、SEQ ID No:５に示してある。かかる最小プロモーターを有する転写制御配列は、Ｐtet−Ｔ２である。SEQ ID No:５に示した配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を有するSEQ ID No:５に示した該最小プロモーターの変異体又はそれに好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする変異体も又、本発明により意図される（但し、これらの変異体は、上記の最小プロモーターの特性を保持し、上記のＴＡＴＡボックス及び更なる一般的転写因子結合部位を含む）ということは理解される。
【００２２】
その上、最小プロモーターは、好ましくは、通常ＣＭＶ最小プロモーター中に存在するＤＳＥエレメント（Ghazal 1991, J. Virol. 65: 2299-2307）の欠失又は不活性化により改変される。特に、ｈＣＭＶの５’−ＵＴＲ（即ち、SEQ ID No:５のヌクレオチド位置＋１／７５）を、SEQ ID No:５のヌクレオチド位置＋３３／５０に位置するＤＳＥエレメントの部分及びこのエレメントの３’側配列を欠失させるために切り詰めることができる。かかる最小プロモーターを有する転写制御配列は、Ｐtet−Ｔ３（SEQ ID No:１３）である。その上、SEQ ID No:５のヌクレオチド位置＋１／１２のイニシエーター配列エレメントの３’側に存在するＣＭＶ最小プロモーターの５’ＵＴＲも又、好ましくは、完全に欠失される。かかる最小プロモーターを有する転写制御配列は、Ｐtet−Ｔ４（SEQ ID No:１４）である。従って、本発明による転写制御配列に用いるべき好適な最小プロモーターは、SEQ ID No:１０に示した核酸配列を有する。SEQ ID No:１０に示した配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を有するSEQ ID No:１０に示した該最小プロモーターの変異体又はそれに好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする変異体も又、本発明により意図される（但し、これらの変異体は、上記の最小プロモーターの特性を保持し、上記のＴＡＴＡボックス及び更なる一般的転写因子結合部位及び前述の更なる改変を含む）ということは、当然、理解されよう。
【００２３】
好ましくは、ここで言及される最小プロモーターは、例えば、Loew等、2006, loc. cit.に記載されたように、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）最小プロモーターに由来してよい。一層好ましくは、該ＭＭＴＶ最小プロモーターは、SEQ ID No:１８に示された核酸配列を有する。かかるＭＭＴＶ最小プロモーターの変異体も又、使用することができる。かかる変異体は、SEQ ID No:１８に示した配列に関して、少なくとも一ヌクレオチドの欠失、置換及び／又は付加を含む。従って、変異体は、好ましくは、SEQ ID No:１８に示した配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列又はそれに対して好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を有する。かかるＭＭＴＶ最小プロモーターを有する転写制御配列は、SEQ ID No:１９に示した核酸配列を有するＰtet−Ｔ８である。
【００２４】
その上、この最小プロモーターは、好ましくは、上流の転写因子結合部位ＮＦ１、ＦｏｘＡ１及びＯｃｔ−１（ＯＴＦ−１）の欠失又は不活性化によって改変される。これらは、通常、ＭＭＴＶ最小プロモーター中に存在する（Cato 1988, J. Cell Biol., 106: 2119-2125; Xu 1994, Virus Res., 33: 167-178; Holmqvist 2005, Exp. Cell Res., 304:593-603; Belikov 2004, J. Biol. Chem., 279, 49857-49867）。特に、SEQ ID No:１８中の、ＭＭＴＶのＴＡＴＡボックスの５’側領域（即ち、ヌクレオチド位置−７５／−６２（ＮＦ−１、SEQ ID No:２１）、−５６／−４５（ＦｏｘＡ１1、SEQ ID No:２２）、−４４／−３４（ＦｏｘＡ１2、SEQ ID No:２２）、−５６／−４９（Ｏｃｔ１1、SEQ ID No:２０）及び−４４／−３７（Ｏｃｔ１2、SEQ ID No:２０））を、このシスエレメントを最小プロモーターから除去するために、欠失させることができる。かかる最小プロモーターを有する転写制御配列は、Ｐtet−Ｔ９（SEQ ID No:２３）である。SEQ ID No:２３に示した配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を有するSEQ ID No:２３に示した該最小プロモーターの変異体又はそれに好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする変異体も又、本発明により意図される(但し、これらの変異体は、上記の最小プロモーターの特性を保持し、上記のＴＡＴＡボックス及び更なる一般的転写因子結合部位及び前述の更なる改変を含む)ということは、当然、理解されよう。
【００２５】
ＴＡＴＡボックス及び更なる一般的転写因子結合部位即ちＴＦＩＩＢ結合部位を有するＭＭＴＶ最小プロモーターに由来する更なる好適な最小プロモーターを、SEQ ID No:３及びSEQ ID No:４に示してある。かかる最小プロモーターを有する転写制御配列は、SEQ ID No:２４に示したＰtet−Ｔ１０である。SEQ ID No:２４に示した配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である核酸配列を有する該転写制御配列の変異体又はそれに好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする変異体も又、本発明により意図される(但し、これらの変異体は、上記の最小プロモーターの特性を保持し、上記のＴＡＴＡボックス及び更なる一般的転写因子結合部位を含む)ということは理解されよう。
【００２６】
用語「機能的に結合された」は、ここで用いる場合、原則として、２つの核酸が、物理的に結合され又は機能的に結合され、それで、これらの核酸の少なくとも一方が他方の核酸に対して作用することができることを意味する。本発明の転写制御配列及び発現すべき核酸配列例えば関心ある遺伝子は、もしその核酸配列の発現を該転写制御配列により支配することができるならば、機能的に結合される。従って、この転写制御配列及び発現すべき核酸配列は、互いに物理的に結合することが、例えば、転写制御配列を発現すべき核酸配列の５’末端に挿入することによってできる。別法として、この転写制御配列と発現すべき核酸を、単に、物理的に近くに配置させ、それで、転写制御配列が発現すべき核酸配列に機能的に結合させることができる。この転写制御配列及び発現すべき核酸は、好ましくは、１，５００ｂｐ、５００ｂｐ、３００ｂｐ、１００ｂｐ、８０ｂｐ、６０ｂｐ、４０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ又は５ｂｐ以内で離れている。
【００２７】
本発明の転写制御配列に機能的に結合された核酸の発現は、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターを含む宿主細胞、非ヒトトランスジェニック動物又は植物をこの詳細な説明の他所で特定されるテトラサイクリン又はその類似体と接触させることにより誘導されうるということは理解される。
【００２８】
好ましくは、本発明により言及される転写制御配列の誘導倍率(fold induction)を測定するために、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターを発現する宿主細胞を作成することができる。該細胞系統は、更に、発現すべき核酸配列好ましくはレポーター遺伝子例えばホタルのルシフェラーゼに機能的に結合された転写制御配列を含む。この転写制御配列は、細胞系統に、当分野で公知の安定に細胞をトランスフェクトするための技術によって導入することができる。誘導倍率を測定するために、核酸配列の発現を、非誘導状態と誘導後に測定する。誘導は、テトラサイクリン又はその類似体の存在下でｔｅｔオペレーターに結合するテトラサイクリン依存性レギュレーターの場合には、宿主細胞をテトラサイクリン又はその類似体と接触させることにより達成することができるということは理解されるべきである。テトラサイクリン又はその類似体の非存在下でｔｅｔオペレーターに結合するテトラサイクリン依存性レギュレーターの場合には、誘導は、細胞系統の細胞を予めテトラサイクリン又はその類似体に接触させた後で、該テトラサイクリン又はその類似体の離脱により達成される。誘導された転写活性及び基礎的（即ち、未誘導での）転写活性を、レポーター遺伝子活性（好ましくは、ルシフェラーゼ）の量を、エフェクター分子即ちテトラサイクリン又はその類似体の添加又は離脱の２４時間後に測定することにより測定する。かかる測定のために、好ましくは、レポーター遺伝子を、転写されるべき核酸として利用し、転写物の量を、レポーター遺伝子の遺伝子産物の量及びその活性を測定することにより測定する。適当なレポーター遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼ又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを包含する。これらのテトラサイクリン依存性転写レギュレーターを利用する遺伝子発現の真正の及び逆向きの調節の原理は、当分野で周知であり、US5,888,981, US5,814,618, US6,004,941, US5,814,618, US10/456,395, WO96/01313,又はWO00/75347に詳細に記載されている。相対的誘導倍率を、誘導された状態における核酸発現の、非誘導状態における核酸発現に対する比として計算することができる。一層詳細には、この転写制御配列の誘導倍率は、実施例に詳細に記載したようにして測定することができる。転写制御配列の基礎的転写は、非誘導状態での発現されるべき核酸の転写物の量を、参照用プロモーター好ましくはＰtet−１４（Clontech Laboratories, Inc., 米国）からの非誘導状態で転写された発現されるべき当該核酸の転写物の量と比較することにより決定することができる。
【００２９】
ここで用いる場合、「テトラサイクリン類似体」は、構造的にテトラサイクリンと関連し、Ｔｅｔリプレッサー又はテトラサイクリン依存性転写レギュレーター（以下、本明細書中で言及）に約１０-6ＭのＫaで結合する化合物を包含することを意図している。好ましくは、このテトラサイクリン類似体は、約１０-9Ｍ以上の親和性で結合する。好ましくは、テトラサイクリン類似体は、アンヒドロテトラサイクリン（ａｔｃ）、ドキシサイクリン（ｄｏｘ）、クロロテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、又はデオキシテトラサイクリンである。更なる類似体は、Hlavka及びBoothe「The Tetracyclines」（Handbook of Experimental Pharmacology 78, R.K. Blackwood等（編）、Springer-Verlag, Berlin, N.Y., 1995中）; Mitscher, 「The Chemistry of the Tetracycline Antibiotics」、Medicinal Research 9, Dekker, N.Y., 1978; Noyee Development Corporation, 「Tetracycline Manufacturing Processes」Chemical Process Reviews, Park Ridge, N.J., 第二巻、1969；Evans,「The Technology of the Tetracyclines」Biochemical Reference Series 1, Quadrangle Press, New York, 1968; 及び Dowling,「Tetracycline」Antibiotic Monographs, no. 3, Medical Encyclopedia, New York, 1955 に開示されている。加えて、テトラサイクリン類似体は、WO2007/133797及びWO2007/133798に開示されたものを包含する。
【００３０】
上記に照らして、本発明は、一層特には、下記を含む転写制御配列に関する：
ａ）テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフ（該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、ＤＮＡらせんの向かい合った面に結合する）；及び
ｂ）その５’末端で更なる一般的転写因子結合部位に機能的に結合したＴＡＴＡボックスを含む最小プロモーター。
【００３１】
用語「少なくとも２つ」は、ここで用いる場合、好ましくは、２つ又はそれより多く、即ち、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ又は少なくとも８つを意味する。本発明の転写制御配列に含まれるべきオペレーター配列モチーフの特に好適な数は、７である。
【００３２】
前記のテトラサイクリン依存性レギュレーターは、隣接したｔｅｔオペレーター配列モチーフにトランス配向で結合する、即ちＤＮＡらせんの向かい合った面（又は表面:opposing faces or surfaces）と相互作用するということが考えられる。従って、少なくとも２つの隣接するｔｅｔオペレーターの中央のヌクレオチド（SEQ ID No:１の中央のＧ）は、互いに３６ヌクレオチド離れている（３．５らせん回転に等しい）。従って、スペーサーは、好ましくは、１７連続ヌクレオチド長である。かかるスペーサーは、テトラサイクリン依存性転写アクチベーターの、ｔｅｔオペレーター配列モチーフに結合した際の、最適の配置を可能にするということが、本発明により見出された。一層好ましくは、該スペーサーは、シス調節用エレメント、パリンドローム配列及び／又はスプライス部位を含まない。該スペーサーは、好ましくは、核酸合成により得ることができる。その上、潜在的なシス調節用エレメントを、当分野で周知の核酸配列分析用のアルゴリズム（好ましくは、Matys 2003, Nucleic Acids Res 31: 374-378に詳細に記載されている）によって同定することができる。好ましくは、Biological Database GmbH（ドイツ国）の商業的に利用可能なＴＲＡＮＳＦＡＣデータベース（リリース７．０）が利用される。この発明によるシス調節用エレメントを有しない配列を生成するために、一般に、シス調節用エレメントは、例えばそれらの共通配列中に突然変異を導入することにより欠失されうるか又は不活性化されうる。その上、一つより多くのスペーサーが必要とされるならば（即ち、３つ以上のｔｅｔオペレーター配列モチーフが用いられる場合）、該ｔｅｔオペレーターを隔てるこれらのスペーサー核酸配列は、異なる核酸配列を有するのが好ましい。再び、かかるスペーサーは、核酸合成により、容易に得ることができる。
【００３３】
本発明の転写制御配列の好適具体例において、該最小プロモーターは、その３’末端で、カブ黄斑モザイク・ウイルス（ＴＹＭＶ）の５’ＵＴＲに結合される。該ＴＹＭＶの５’ＵＴＲは、SEQ ID No:１１に示した核酸配列又は該配列に関して少なくとも一ヌクレオチドの欠失、置換及び／又は付加を含む変異体を有する。かかる変異体は、好ましくは、SEQ ID No:１１に示した核酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるか又はそれと好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配列を有する。この配列同一性は、上記のアルゴリズム及び技術により測定することができる。かかるＴＹＭＶを有する転写制御配列は、Ｐtet−Ｔ５（SEQ ID No:１５）である。好ましくは、ＴＹＭＶの該５’ＵＴＲは、本書の他所に記したように、シス調節用エレメントを含まない。一層好ましくは、ＴＹＭＶ５’ＵＴＲは、ＲＦＸ−１結合部位（SEQ ID No:６）、ＡＰ４結合部位（SEQ ID No:７）、ＨＰ−１結合部位（SEQ ID No:８）、及び／又はＨＰ−２結合部位（SEQ ID No:９）を含まない。前述の転写因子結合部位の核酸配列モチーフも又、当分野で周知である（Ｔｒａｎｓｆａｃ Ｄａｔａｂａｓｅ参照）。該シス調節用エレメントを有しないＴＹＭＶを有する転写制御配列は、Ｐtet−Ｔ６（SEQ ID No:１６）及びＰtet−Ｔ１１（SEQ ID No:２５）である。それ故、本発明による転写制御配列で用いるのに特に好ましい５’ＵＴＲは、SEQ ID No:１２に示した核酸配列を有する。SEQ ID No:１２に示した配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一である核酸配列を有する該５’ＵＴＲの変異体又はそれと好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする変異体も又、シス調節用エレメントを有さず、５’ＵＴＲとして役立ちうるということは理解されよう。
【００３４】
本発明による好適な転写制御配列は、SEQ ID No:１３〜１７、２４若しくは２５の何れか一つに示した核酸配列又はそれらの変異体を含むものであり、該変異体は、SEQ ID No:１３〜１７、２４若しくは２５に示した配列に関して、少なくとも一ヌクレオチドの欠失、置換又は付加を含みうる。従って、変異体は、好ましくは、SEQ ID No:１３〜１７、２４若しくは２５の何れか一つに示した配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一である核酸配列又は、本書の他所に記したように、該特異的配列に好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることのできる核酸を有する。上記の配列同一性は、好ましくは、上記のアルゴリズム及び技術によって測定される。しかしながら、本発明による変異型転写制御配列は、依然として、少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフ及び最小プロモーターを含み、これは、ＴＡＴＡボックス及び更なる一般的転写因子結合部位を含み、それにより、該転写制御配列は、それに機能的に結合された核酸の発現の少なくとも１００倍の誘導を可能にし、且つ市販のＰｔｅｔ−１４プロモーター（Clontech Laboratories Inc., 米国）の基礎的活性より有意に低い基礎的遺伝子発現（即ち、非誘導状態での遺伝子発現）を可能にする。前述のSEQ ID No:１３（Ｐtet−Ｔ3）、１４（Ｐtet−Ｔ4）、１５（Ｐtet−Ｔ5）、１６（Ｐtet−Ｔ6）及び１７（Ｐtet−Ｔ7）の好適な転写制御配列も又、下記の図１に示してある。
【００３５】
最も好ましくは、本発明の転写制御配列は、SEQ ID No:１６（Ｐtet−Ｔ6）に示した核酸配列又はその変異型配列である。
【００３６】
その上、本発明の転写制御配列の他の好適具体例において、該配列は、ＣｐＧ島、即ち、ＣＧジヌクレオチドが涸渇している。かかる最適化された転写制御配列は、好ましくは、それに機能的に結合された核酸の発現を、ゲノムインプリンティング機構及び他の潜在的に干渉性の後成的現象と無関係に支配することができる。
【００３７】
有利には、少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフ、一般的転写因子結合部位及びＴＡＴＡボックスを含む転写制御配列は、上記の優れた特性、即ち増大した誘導レベル及び減少した基礎的活性を有するということが本発明により見出されている。特に好適な転写制御配列は、下記のエレメントを５’から３’の順序で含むことが見出された：
ａ）テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフ（該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、ＤＮＡらせんの向かい合った面に結合する）；
ｂ）一般的転写因子結合部位、好ましくは、ＴＦＩＩＢ（これは、その３’末端でＴＡＴＡボックスに機能的に結合される）を含む最小プロモーター；
ｃ）５’末端でＴＡＴＡボックスに結合された、好ましくはｈＣＭＶプロモーターに由来する、イニシエーター配列エレメントである非翻訳（５’ＵＴＲ）領域；及び
ｄ）５’末端でイニシエーター配列に機能的に結合され、好ましくは、無関係の転写レギュレーターと相互作用するシス調節用エレメントを含まない非翻訳リーダー領域（５’ＵＴＲ）。
本発明の転写制御配列は、厳格な調節が可能であるので、特に、組換えポリペプチド生成、アンチセンスアプローチ、ＲＮＡｉアプローチ又はリボザイムアプローチに有用であることが見出されている。その上、有意に減少した基礎的活性のために、本発明の転写制御配列は、更に、遺伝子治療における利用に適している。
【００３８】
本発明は、基本的に、下記を含む転写制御配列をも意図している：
ａ）テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの結合を可能にする少なくとも２つのｔｅｔオペレーター配列モチーフ（該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターの各々は、その隣接成分に関して、ＤＮＡらせんの向かい合った面に結合する）；
ｂ）最小プロモーター；及び
ｃ）ＴＹＭＶの５’ＵＴＲ。
【００３９】
特に、本発明の転写制御配列の優れた特性は、一般に、植物ウイルス５’ＵＴＲ即ちＴＹＭＶ５’ＵＴＲと、ｔｅｔオペレーター配列により支配される最小プロモーターとの組合せによっても与えられるということが見出されている。好適なかかる転写制御配列は、上記のようなＰtet−Ｔ８（SEQ ID No:１９）及びＰtet−Ｔ９（SEQ ID No:２３）又はそれらの変異体である。
【００４０】
本発明は又、本発明の転写制御配列を含むベクターにも関係する。
用語「ベクター」は、好ましくは、ファージ、プラスミド、ウイルス性又はレトロウイルスベクター、並びに人工染色体例えば細菌又は酵母の人工染色体を包含する。その上、この用語は又、ターゲティング用コンストラクトのゲノムＤＮＡへのランダムな又は位置指定した組込みを可能にするターゲティング用コンストラクトにも関係する。かかるターゲティング用コンストラクトは、好ましくは、以下に詳述するように、相同組換え又は異種組込みに十分な長さのＤＮＡを含む。本発明の転写制御配列を包含するベクターは、好ましくは、更に、宿主における増殖及び／又は選択のための選択マーカーを包含する。このベクターは、当分野で周知の様々な技術によって、宿主細胞に取り込まれうる。例えば、プラスミドベクターは、沈澱物、例えば沈澱リン酸カルシウム若しくは沈澱塩化ルビジウムに、又は帯電脂質との複合体に又は炭素ベースのクラスター例えばフラーレンに導入することができる。別法として、プラスミドベクターは、熱ショック又はエレクトロポレーション技術によって導入することができる。ベクターがウイルスであるならば、それを、宿主細胞への投与前に、イン・ビトロで適当なパッケージング細胞系統を用いてパッケージ化することができる。レトロウイルスベクターは、複製能を有するものであっても欠損したものであってもよい。後者の場合には、ウイルスの増殖は、一般に、補足性宿主細胞においてのみ起こる。
【００４１】
本発明のベクターの好適具体例において、該ベクターは、発現ベクターである。一層好ましくは、この発明のベクターにおいて、転写制御配列は、発現すべき核酸配列に機能的に結合されている。かかる機能的結合は、好ましくは、該核酸配列の真核細胞又は単離されたその画分における発現を与える。原則として、真核細胞好ましくは哺乳動物細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当分野で周知である。それらは、好ましくは、本発明の転写制御配列からなるような転写の開始を確実にする調節用配列並びに転写の終結及び転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。このベクターには、更なる調節用エレメント例えば転写のための並びに翻訳のためのエンハンサーを含むことができる。このコンテキストにおいて、適当な発現ベクターは、当分野で公知であり、例えば、レンチウイルスを含むレトロウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、アデノ随伴ウイルス、麻疹ウイルス、ワクシニアウイルス、又はウシパピローマウイルスに由来するベクターを、この発明のベクターの標的細胞集団への送達に利用することができる。当業者に周知の方法を用いて、組換えウイルスベクターを構築することができる；例えば、Sambrook, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.及びAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)を参照されたい。
【００４２】
本発明のベクターの更なる好適具体例において、該ベクターは、更に、ポリアデニル化シグナルを含む。一層好ましくは、該ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリＡ、β−グロビンポリＡ、ＬＴＲポリＡ又は成長ホルモンポリＡである。
【００４３】
その上、本発明は、本発明の転写制御配列又はベクターを含む宿主細胞に関係する。
ここで用いる場合、「宿主細胞」は、異種ＤＮＡの導入により改変することのできる任意の培養可能な細胞を包含する。好ましくは、宿主細胞は、転写調節用タンパク質が安定に発現され、翻訳後修飾され、適当な細胞内区画に局在化され、適当な転写装置に参加させられうるものである。適当な宿主細胞の選択は又、検出シグナルの選択によっても影響される。例えば、上記のようなレポーターコンストラクトは、転写調節用タンパク質に応じて、遺伝子転写の活性化又は抑制に際して、選択可能な又はスクリーニング可能な特徴を与えることができ；最適な選択又はスクリーニングを達成するために、宿主細胞の表現型が考慮される。本発明の宿主細胞は、原核細胞及び真核細胞を包含する。原核生物は、グラム陰性又は陽性微生物例えば大腸菌又はバチルス細菌を包含する。原核細胞は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを含む転写制御配列又はベクターの増殖のために用いられるということは理解されるべきである。トランスフォーメーションのための適当な原核宿主細胞は、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、及びシュードモナス属、ストレプトミセス属及びブドウ球菌属を包含する。真核細胞は、酵母細胞、植物細胞、真菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）、哺乳動物細胞、及び寄生性生物例えばトリパノゾーマを包含するが、これらに限られない。ここで用いる場合、酵母は、厳密な分類学的意味での酵母即ち単細胞生物だけでなく、糸状菌の酵母様多細胞性真菌をも包含する。典型的種は、クルイベライ・ラクティス、シゾサッカロミセス・ポンベ、及びトウモロコシ黒穂菌（Ustilago maydis）を包含するが、サッカロミセス・セビシエが好ましい。本発明の実施において使用することのできる他の酵母は、アカパンカビ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニデュランス、ピキア・ パストリス、カンジダ・トロピカリス、及びハンセヌラ・ポリモルファである。哺乳動物宿主細胞培養系は、樹立された細胞系統例えばＣＯＳ細胞、Ｌ細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、胚性幹細胞を包含するが、ＢＨＫ、ＨｅＫ又はＨｅＬａ細胞が好ましい。真核細胞は、好ましくは、本発明の転写制御配列又は発現ベクターを適用することにより、組換え遺伝子発現に用いられる。
【００４４】
更に、本発明は、本発明の転写制御配列又はベクターを含む非ヒトトランスジェニック動物に関係する。
本発明の転写制御配列を含む、好ましくは発現すべき核酸（即ち、トランス遺伝子）に機能的に結合されたポリヌクレオチド又はベクターを、非ヒト動物の受精卵母細胞にトランスファーして、非ヒトトランスジェニック動物を創出することができる。前記の非ヒトトランスジェニック動物は、該核酸を、一種以上の細胞型又は組織で発現することができる（但し、これらの細胞又は組織は、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターを同時発現し、テトラサイクリン又はその類似体と接触される）。ここで意味するトランスジェニック非ヒト動物は、トランス遺伝子を含む細胞を有し、該トランス遺伝子は、非ヒト動物又は該非ヒト動物の先祖に出生前に例えば胎児期に導入された。トランス遺伝子は、トランスジェニック非ヒト動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡであり、それは、成熟非ヒト動物のゲノム中にとどまり、それにより、コードされる遺伝子産物の、トランスジェニック非ヒト動物の一種以上の細胞型又は組織での発現を指示する。好適な非ヒトトランスジェニック動物は、哺乳動物、特に、ゲッ歯類、マウス及びラット、大規模なタンパク質生産に有用なヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ及びウマを含む家畜（いわゆる「遺伝子農業（gene farming）」）及び昆虫である。昆虫は、いわゆる無菌昆虫制御アプローチに利用することができる。トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、トランス遺伝子を、受精卵母細胞の雄性前核に、例えばマイクロインジェクションにより導入して、その卵母細胞を偽妊娠雌養育動物にて発生させることにより創出することができる。トランスジェニック動物特にマウスなどの動物の生成のための方法は、当分野では、慣用的なものとなっており、例えば、米国特許第4,736,866号及び4,870,009号及びHogan 1986, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratoryに記載されている。トランスジェニック創出動物を用いて、そのトランス遺伝子を有する更なる動物を繁殖させることができる。本発明によるトランス遺伝子を有するトランスジェニック動物を、更に、別のトランス遺伝子を有する別のトランスジェニック動物と例えばテトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドを発現するトランスジェニック動物と交配させることができる（以下で、一層詳細に検討する）。この発明は又、上記の、本発明のベクター又は転写制御配列を、好ましくはトランス遺伝子の形態で、含む相同組換え非ヒト動物をも提供する。かかる非ヒト相同組換え動物において、該核酸は、ゲノムの特異的部位に導入されている（即ち、該核酸分子は、ゲノムの内因性遺伝子又は他の部分と相同組換えされている）。該場合には、動物は、好ましくはマウスである。かかる相同組換え動物を創出するために、好ましくは、導入すべき核酸をコードするＤＮＡを、その５’及び３’末端で、相同組換えが起きる遺伝子又はゲノムの部分の更なる核酸と隣接して含むベクターを調製する。この隣接する更なる核酸は、融合タンパク質をコードしており、真核遺伝子との上首尾の相同組換えに十分な長さのものである。典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’及び３’末端の両方で）が、このベクターに含まれる（例えば、相同組換え用ベクターの説明���、Thomas, 1987, Cell 51:503 を参照されたい）。このベクターは、胚性幹細胞系統に導入され（例えば、エレクトロポレーションによって）、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞を選択する（例えば、Li 1992, Cell 69:915を参照されたい）。これらの選択した細胞を、次いで、動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入して、凝集キメラを形成させる（例えば、Bradley, A., Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson編（IRL, Oxford, 1987）pp. 113-152を参照されたい）。キメラ胚を、次いで、適当な偽妊娠雌養育動物に移植して、該胚を出産予定日までもたらすことができる。この相同組換えされたＤＮＡを生殖細胞中に有する子孫を用いて、全細胞が該相同組換えされたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。これらの「生殖細胞系列伝達」動物を、更に、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードする遺伝子を有する動物と交配させることができる。上記の相同組換えアプローチに加えて、酵素補助された位置指定組込み系が、当分野で公知であり、この発明の調節系の成分に適用して、ＤＮＡ分子を、第二の標的ＤＮＡ分子中の予め決めた位置に統合することができる。かかる酵素補助された統合システムの例は、Ｃｒｅレコンビナーゼ−ｌｏｘ標的システム（例えば、Baubonis 1993, Nucl. Acids Res. 21:2025-2029;及びFukushige 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7905-7909に記載されたもの）及びＦＬＰレコンビナーゼ−ＦＲＴ標的システム（例えば、Dang 1992, Dev. Genet. 13:367-375;及びFiering 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8469-8473に記載されたもの）を包含する。
【００４５】
本発明は又、本発明の転写制御配列又はベクターを含むトランスジェニック植物にも関係する。
用語「植物」は、ここで用いる場合、植物及び藻類を包含する。好ましくは、この用語は、多細胞の陸生植物を指す。一層好ましくは、これらの多細胞の陸生植物は、高等植物例えば、トウモロコシ、菜種、大豆、米、マンジュギク、アブラナ属各種蔬菜、トリシウム(tricium)又はグリシンを含む作物。原則として、トランスジェニック植物は、Becker 1992, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197, Bevan 1984, Nucleic Acids Res. 12:8711-8721,及び「Vector for Gene Transfer in Higher Plants」: Transgenic Plants, Vol.1, Engineering and Utilization,編：Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, p. 15-38に記載されたようにして得ることができる。好ましくは、植物細胞のトランスフォーメーション、即ちトランスジェニック植物の生成は、アグロバクテリウム媒介のトランスフォーメーションにより又は物理的力を適用すること（例えば、「遺伝子銃」）により達成される。
【００４６】
加えて、本発明は、宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物中の本発明の転写制御配列に機能的に結合された核酸配列の発現を調節する方法であって、下記を含む当該方法に関係する：
ａ）前記の宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物における、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドの発現；及び
ｂ）該宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物におけるテトラサイクリン又はその類似体の濃度の調節。
【００４７】
テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞、植物又は動物において、そのポリヌクレオチドからのテトラサイクリン依存性転写レギュレーターの発現を与える任意の手段によって発現させることができる。この発現の結果として、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターポリペプチドが、宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物中に、転写制御配列に結合された核酸配列の発現を支配するのに十分な量で存在するということは理解されるべきである。テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドは、この目的のために、一時的に又は安定に、宿主細胞、植物又は動物に、当分野で周知の技術及び例えばUS5,888,981, US5,814,618, US6,004,941, US5,814,618, US5,854,310, US5,866,755, US5,912,411, US5,866,755, US6,252,136, US6,242,667, US10/456,395, WO96/01313,又はWO00/75347に記載された技術によって導入することができる。その上、それは、植物又は動物の場合に、交雑育種により導入することができ、宿主細胞の場合には、細胞融合により導入することができる。別法として、テトラサイクリン依存性転写レギュレーターをコードするポリヌクレオチドを、例えばウイルスベクターによって導入することができる。
【００４８】
本発明の方法により言及されるテトラサイクリン依存性転写レギュレーターは、ポリペプチドであり、好ましくは、ｔｅｔオペレーター配列モチーフを特異的に認識することのできるドメインを含む融合ポリペプチドである。その上、このテトラサイクリン依存性転写レギュレーターは、更に、核酸配列の発現を支配するドメイン、即ち、トランス活性化ドメイン又はサイレンシングドメインを包含する。テトラサイクリン依存性転写レギュレーターのｔｅｔオペレーターへの結合は、更に、ある量のテトラサイクリン又はその類似体の存否に依存している。最初に細菌で特性決定されたＴｅｔリプレッサーは、ｔｅｔオペレーター結合性ドメインを含む。その上、そのｔｅｔオペレーターへの結合は、テトラサイクリン又はその類似体に依存している。特に、テトラサイクリン又はその類似体の存在下では、結合は起きず（いわゆる「Ｔｅｔリプレッサー」）、テトラサイクリン又はその類似体の非存在下では、Ｔｅｔリプレッサーのｔｅｔオペレーターへの親和性が増大して結合が起きる。Ｔｅｔリプレッサーの様々な変異体が生成されている。特に、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合するが非存在下では結合しない、変異体の一種が記載されている（いわゆる「逆Ｔｅｔリプレッサー」）。真核生物における発現の制御のためには、前述のＴｅｔリプレッサー変異体は、例えばＶＰ−１６トランスアクチベーターのトランス活性化ドメインに融合され（例えば、US6,087,166又はUS6,271,341参照）、又は例えばｋｒｕｐｐｅｌ関連転写因子のサイレンシングドメインに融合される。Ｔｅｔリプレッサー又はその変異体についての詳細は、US5,464,758, US6,914,124, US5,789,156, US6,271,348, US5,654,168, US6,136,954, US5,789,156, US6,271,348, US6,087,166, US6,271,341, US10/456,395, WO96/01313又はWO00/75347を参照されたい。
【００４９】
本発明の方法の好適具体例において、前記のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターは、テトラサイクリン又はその類似体の非存在下で、ｔｅｔオペレーターに結合する（いわゆる「真正テトラサイクリン依存性転写アクチベーター」又は「ｔＴＡ」）。該特性を有する好適なテトラサイクリン依存性転写レギュレーターは、US5,464,758, US6,914,124, US5,789,156, US6,271,348, WO96/01313又はWO00/75347に開示されており、それらを、本明細書中に参考として援用する。
【００５０】
本発明の方法の他の好適具体例において、該テトラサイクリン依存性転写レギュレーターは、ｔｅｔオペレーターにテトラサイクリン又はその類似体の存在下で結合する（いわゆる、「逆テトラサイクリン依存性転写アクチベーター」即ち「ｒｔＴＡ」）。該特性を有する好適なテトラサイクリン依存性転写レギュレーターは、US5,654,168、US6,136,954、US5,789,156、US6,271,348、US6,087,166、US6,271,341、US10/456,395、WO96/01313又はWO00/75347（これらを、参考として、本明細書中に援用する）に記載されている。
【００５１】
一層好ましくは、前述のテトラサイクリン依存性転写レギュレーターは、核酸配列の発現を、活性化し（US5,464,758、US6,914,124、US5,654,168、US6,136,954、US6,087,166、US6,271,341、US10/456,395、WO96/01313又はWO00/75347（これらを、参考として、本明細書中に援用する）参照）又は抑制する（US5,789,156、US6,271,348、US5,789,156、US6,271,348、US10/456,395、WO96/01313又はWO00/75347（これらを、参考として、本明細書中に援用する）参照）。
【００５２】
用語「テトラサイクリン又はその類似体の濃度の調節」は、ここで用いる場合、テトラサイクリン又はその類似体の濃度を変えることを意味する。特に、テトラサイクリン又はその類似体の存在下でｔｅｔオペレーターに結合するテトラサイクリン依存性転写レギュレーターを本発明の方法で使用するならば、発現すべき核酸の発現は、ある量のテトラサイクリンを新たに加えるか又は宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物中に存在するテトラサイクリンの量を増すことにより達成することができる。逆に、もしもテトラサイクリン又はその類似体の非存在下でｔｅｔオペレーターに結合するテトラサイクリン依存性転写レギュレーターを使用するならば、宿主細胞、植物又は非ヒトトランスジェニック動物中に存在するテトラサイクリンの量を低下させ又はテトラサイクリンを完全に離脱することができる。テトラサイクリン又はその類似体を、好ましくは宿主細胞を含む培養培地を介して宿主細胞に送達することができる。植物の場合、テトラサイクリン又はその類似体は、植物又は非ヒトトランスジェニック動物の個々の細胞に、水若しくは栄養分の供給により又は注入により送達することができる。これらの技術は、当業者に周知であり、更に困難なく、個々の条件に適合させることができる。
【００５３】
上記のように、この転写制御配列は、ヒト又は非ヒトの様々な病気又は障害の遺伝子治療のために用いることができる。それ故、本発明は又、本発明の転写制御配列、ベクター又は宿主細胞と、好ましくは製薬上許容しうるキャリアーとを含む医薬組成物をも包含する。一層好ましくは、本発明の転写制御配列は、発現に際して治療効果を生じる核酸配列に機能的に結合される。従って、上記の医薬組成物は、この転写制御配列に機能的に結合され、治療上有効なポリペプチドをコードする核酸、又はアンチセンスＲＮＡ又はＲＮＡｉ等の治療上有効なポリヌクレオチドとして発現されうる核酸を更に含む。
【００５４】
これらの医薬組成物は、好ましくは、局所投与され又は全身投与される。薬物投与に慣用的に用いられる投与経路は、経口投与経路、静脈内投与経路、又は非経口投与経路並びに吸入法である。しかしながら、化合物の性質及び作用様式によって、これらの医薬組成物は、他の経路によっても投与することができる。これらのポリヌクレオチド即ち本発明の転写制御配列又はベクターは、遺伝子治療アプローチにおいて、ウイルスベクター、ウイルス又はリポソームを用いることにより投与することができる。宿主細胞は、手術により又は点滴によって移植することができる。
【００５５】
これらの化合物は、好ましくは、薬物を標準的な製薬用キャリアーと、慣用手順によって合わせることにより調製される慣用の投薬形態で投与する。これらの手順は、成分を、所望の製剤となるように、適宜、混合し、粒状化しそして圧縮し又は溶解させることを含みうる。製薬上許容しうるキャリアー又は希釈剤の形態及び特性は、それが合わせられる活性成分の量、投与経路及び他の周知の可変要素によって規定されるということは認められよう。
【００５６】
好ましくは、この医薬組成物は、治療上有効な投与量の成分を与える。治療上有効な投与量は、治療されるべき病気又は状態に伴う症状を改善し又は治療する成分の量を指す。かかる化合物の治療的効力と毒性は、標準的な製薬手順により、細胞培養物又は実験用動物において測定することができる（例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に治療効果のある投与量）及びＬＤ５０（集団の５０％に致死的である投与量））。治療効果と毒性効果との間の投与量比は、治療インデックスであり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表すことができる。この場合の治療上有効な薬剤は、発現されるべき核酸であるということは理解されよう。しかしながら、該核酸の発現は、本発明の転写制御配列により厳密に制御されるので、該転写制御配列は、治療上許容しうる量であって且つ有効でもある量で与えられることを必要とする。
【００５７】
投薬養生法は、担当医及び他の医療因子によって決定され；好ましくは、上記の方法の何れか一つによる。医療分野では周知であるが、如何なる患者に対する投薬量も、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、一般的健康状態、及び同時に投与される他の薬物を含む多くの因子に依存する。経過は、周期的評価によってモニターすることができる。
【００５８】
本明細書で言及される医薬組成物及び医薬配合物は、この明細書に列挙された病気又は状態を治療し又は改善し又は予防するために、少なくとも一回投与される。しかしながら、該医薬組成物は、一回より多く、例えば１日１〜４回、無制限の日数にわたって投与することができる。
【００５９】
本発明の転写制御配列は、テトラサイクリン誘導システムにおける核酸の発現に必要とされる他の成分と一緒に、本発明の方法を実施するために採用されるキットとして与えることができる。キットの他の成分は、好ましくは、テトラサイクリン又はその類似体、テトラサイクリン依存性転写レギュレーター又はそれをコードするポリヌクレオチド（例えば、発現ベクターの形態）、及び／又は発現に用いられる宿主細胞である。
【００６０】
用語「キット」は、ここで用いる場合、本発明の、前述の化合物、手段又は試薬の集合を指し、これらは、一緒にパッケージ化されていてもいなくてもよい。このキットの成分は、別々の薬瓶に入れられてもよいし（即ち、別々の部分のキット）、又は単一の薬瓶にて与えてもよい。その上、本発明のキットは、上記の方法を実施するために用いられるべきであるということは理解されるべきである。好ましくは、すべての成分は、上記の方法を実施するためにすぐ使用できる仕方で与えられるとういうことが構想される。更に、このキットは、好ましくは、該方法を実施するための指示書を含む。この指示書は、紙のユーザーズマニュアルにより又は電子形式で与えることができる。例えば、このマニュアルは、本発明のキットを用いて前述の方法を実施したときに得られる結果の解釈のための指示を含むことができる。
【００６１】
上記の配列同定番号（SEQ ID NO）についての説明を、下記のように与える：
SEQ ID No：説明
１：ｔｅｔオペレーター
２：ｈＣＭＶ最小プロモーター
３：ＴＦＩＩＢ結合部位
４：ＴＦＩＩＤ結合部位、ＴＡＴＡボックス
５：Ｐｔｅｔ−Ｔ２からの最小プロモーター
６：ＲＦＸ−１結合部位
７：ＡＰ４結合部位
８：ＨＰ−１結合部位
９：ＨＰ−２結合部位
１０：Ｐｔｅｔ−Ｔ４からの改変された最小プロモーター
１１：ＴＹＭＶ５’ＵＴＲ
１２：Ｐｔｅｔ−Ｔ６からの改変されたＴＹＭＶ５’ＵＴＲ
１３：Ｐｔｅｔ−Ｔ３
１４：Ｐｔｅｔ−Ｔ４
１５：Ｐｔｅｔ−Ｔ５
１６：Ｐｔｅｔ−Ｔ６
１７：Ｐｔｅｔ−Ｔ７
１８：ＭＭＴＶ最小プロモーター
１９：Ｐｔｅｔ−Ｔ８
２０：Ｏｃｔ−１1 Ｏｃｔ１2（ＯＴＦ−１）結合部位
２１：ＮＦ１結合部位
２２：ＦＯＸＡ１結合部位
２３：Ｐｔｅｔ−Ｔ９
２４：Ｐｔｅｔ−Ｔ１０
２５：Ｐｔｅｔ−Ｔ１１
【００６２】
この明細書中で引用されたすべての参考文献は、それらの全開示内容及びこの明細書において特に言及された開示内容を、参考として本明細書中に援用する。
【００６３】
下記の実施例は、単に、この発明を説明するためのものである。それらは、何であれ、この発明の範囲を制限するものと解するべきではない。
【実施例】
【００６４】
実施例１：一層低い基礎的活性及び一層優れた誘導ポテンシャルを有するテトラサイクリン依存性転写制御配列の生成
Ｉ）ｔｅｔ−オペレーター７量体の合成及び最小プロモーターへの結合
オリゴヌクレオチドを合成して、対（ＴＯＨ−１〜ＴＯＨ−６、下記の表１参照）をアニーリングにより形成させた。ｄｓオリゴＴＯＨ−１〜ＴＯＨ−６をＰＡＧＥで精製して連結した。最小プロモーター（Ｔ３）の一つを含む完全なオペレーター７量体の初期合成を以下に示す。
【００６５】
この合成は、ＴＯＨ−２／ＴＯＨ−３及びＴＯＨ−４／ＴＯＨ−５の連結で開始される。連結した対をＰＡＧＥ精製し、その結果生成したＤＮＡ断片ＴＯＨ−２．３とＴＯＨ−４．５を連結した。その結果生成したＤＮＡ断片（ＴＯＨ−２．３．４．５）を再びＰＡＧＥ精製してＴＯＨ−１に連結し（ＴＯＨ−１．２．３．４．５）、精製後、ＴＯＨ−６に連結した。この最後の連結は、ＴＯ７断片を生じ（その後、Ｐtet−Ｔ３と呼ばれる）、これは、ＳＫ−ｅＧＦＰプラスミドへの直接的挿入のための５’側ＸｈｏＩ制限部位及び３’側ＮｃｏＩ制限部位を与える（下記参照）。
【００６６】
【表１】
0005576382.tif 000002
【００６７】
この合成のＴＯ７ ＰＣＲ断片を、ＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ制限酵素で消化した。それを、同様に消化したＳＫ−ｅＧＦＰプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ＋ベース）に挿入する。このプラスミドは、既に、ＰＣＲ増幅された増強されたグリーン蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）のオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を含んだものであり、調節ユニットの該ｏｒｆの５’側への直接的導入のためのＸｈｏＩ／ＮｃｏＩ制限部位を与える。その結果生成したプラスミドは、ＳＫ−ＴＯ７．ｇと呼ばれた。このプラスミドは、すべての最小プロモーター変異体の挿入｛ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ（Ｔ１及びＴ２）断片としての、アニールしたｄｓ−オリゴ（Ｔ４）としての、又はＥｘ部位突然変異導入による（Ｔ３、Ｔ５、Ｔ６及びＴ７）、新規なｔｅｔオペレーターの３’側（ＨｉｎｄＩＩＩ）で且つｅＧＦＰレポーター遺伝子の５’側（ＳａｌＩ）での挿入｝のための基礎として役立った。
【００６８】
最小プロモーター変異体のＳＫ−ＴＯ７．ｇへの挿入により生じた新規な調節ユニットは、それらが新たにデザインされたｔｅｔオペレーター７量体に融合されたという事実を示すために、Ｐtet−Ｔ１〜Ｐtet−Ｔ７と呼ばれた。
【００６９】
Ｐtet−Ｔ１プロモーターは、以前に記載された（Gossen及びBujard, 1992loc. cit.）ようにＣＭＶ最小プロモーター（−５３／＋７５）を含み、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌIとしてサブクローンから放出されて、同様の消化を受けたＳＫ−ＴＯ７．ｇプラスミドに導入された。
【００７０】
Ｐtet−Ｔ２プロモーターは、ＳＫ−Ｐｔｅｔ−Ｔ１．ｇの位置指定突然変異導入によって、造られた。ＴＡＴＡボックスの上流のジヌクレオチド「ａｇ」を「ｃ」で置き換えた突然変異オリゴヌクレオチドをデザインし、ＴＦＩＩＢ結合部位を造り、そしてＴＡＴＡボックスコンセンサス配列を造るために、−２５位の「ｔ」を「ａ」に交換した。
【００７１】
Ｐtet−Ｔ３プロモーターは、ＰＣＲにて、Ｅｘ部位突然変異により、重複するオリゴヌクレオチド（下記の表２に列記）及びＳＫ−ＴＯ７．ｇプラスミド（テンプレート）を用いて生成された。
【００７２】
Ｐtet−Ｔ４プロモーターは、二本鎖オリゴヌクレオチドとして造られ（下記の表２に列記）、これは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩオーバーハングを与え、それは、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ消化されたＳＫ−ＴＯ７．ｇプラスミドに挿入された。
【００７３】
Ｐtet−Ｔ５、Ｐtet−Ｔ６及びＰtet−Ｔ７プロモーターは、ＰＣＲにて、Ｅｘ部位突然変異導入により、重複するオリゴヌクレオチド（下記の表２に列記）及びＳＫ−ＴＯ７．ｇプラスミド（テンプレート）を用いて生成された。ＰＣＲ反応及びプラスミドの再結合の後に、更なるクローニング工程は、必要なかった。
【００７４】
【表２−１】
0005576382.tif 000003
【００７５】
【表２−２】
0005576382.tif 000004
【００７６】
【表２−３】
0005576382.tif 000005
【００７７】
Ｐtet−Ｔ８最小プロモーターの合成を、ＭＭＴＶ−５’（−８９）及びＭＭＴＶ−３’オリゴ（ｓ．表２）及びｐΔＭｔｅｔＯ−ｌｕｃ（Hofmann 1977, Nucleic acids Res., 25, 1078-1079）をテンプレートとして用いて行なった。最小プロモーター（−８８／＋１２２）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ＋プラスミド中にサブクローン化して、配列決定した。ｔｅｔ調節されるプロモーターのコンテキストにおけるこの最小プロモーターの機能は、既に、公表されている（Loew 2006, loc cit.）。この最小プロモーターは、ＳＫ−ＴＯ７．ｇプラスミド中の新たなｔｅｔオペレーターに、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ断片として同様の消化を受けたプラスミドへの挿入により融合された。その結果生成したプラスミドは、ＳＫ−ＴＯ７．５と呼ばれる。Ｐtet−Ｔ８プロモーターの放出は、（５’）ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ又はＮｃｏＩ（３’）断片として可能である。
【００７８】
Ｐtet−Ｔ９プロモーターは、ＰＣＲにおいて、ＭＭＴＶ−５’（−３７）及びＭＭＴＶ−３’オリゴ（ｓ．表２）及びＳＫ−ＭＭＴＶ（−８８／＋１２２）（テンプレート）を用いる全プロモーターの増幅により生成された。この最小プロモーター（−３７／＋１２２）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ＋プラスミド中にサブクローン化して配列決定した。Ｐtet−Ｔ９最小プロモーターの、ＳＫ−ＴＯ７．ｇプラスミド中の新規なｔｅｔオペレーターへの融合は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ断片として同様の消化を受けたプラスミドへの挿入によりなされた。その結果生成したプラスミドは、ＳＫ−ＴＯ７．６と呼ばれる。Ｐｔｅｔ−Ｔ９プロモーターの放出は、（５’）ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ又はＮｃｏＩ（３’）断片として可能である。
【００７９】
Ｐtet−Ｔ１０最小プロモーターの合成を、ＴＯ７．７ｓ及びＴＯ７.ａｓ（ｓ．表２）オリゴヌクレオチド並びにＳＫ−ＭＭＴＶ（−３７／＋１２２）プラスミド（テンプレート）を用いるＰＣＲにより行った。ＴＦＩＩＢ及びＴＡＴＡコンセンサス配列を、５’−オリゴにより、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位と一緒に導入した。同様に、ＳａｌＩ及びＮｃｏＩ制限部位を、３’オリゴにより導入した。その結果生成した増幅したプロモーター断片（−４１／＋１２２）を「Ｔ１０」と呼ぶ。この最小プロモーターをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化してＳＫ−ＴＯ７．ｇに直接挿入して配列決定した。従って、Ｐtet-Ｔ１０最小プロモーターの、ＳＫ−ＴＯ７．ｇプラスミド中の新規なｔｅｔオペレーターへの融合を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ断片を同様の消化を受けたプラスミドに挿入することにより行った。その結果生成したプラスミドは、ＳＫ−ＴＯ７．７と呼ばれる。Ｐtet-Ｔ１０プロモーターの放出は、（５’）ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ又はＮｃｏＩ（３’）断片として可能である。
【００８０】
Ｐtet−Ｔ１１最小プロモーターの合成は、テンプレートなしのＰＣＲにおいて、重複するオリゴを用いて行われる。最終的なＰtet−Ｔ１１最小プロモーター中では、ＣＭＶプロモーター起源のＰtet−Ｔ６最小プロモーターの配列は、ＭＭＴＶ配列により置き換えられた。しかしながら、この測定によって、Ｏｃｔ−１2及び重複するＦｏｘＡ１2認識部位が最小プロモーターに再導入されたことは注意されるべきである。この改変は、オリゴヌクレオチドベースの合成によって実施された。ＴＯ７．８−ｓ１及びＴＯ７．８−ａｓ１オリゴをアニールさせて、３’末端をＴ４ポリメラーゼによるＤＮＡ合成によって鈍端化し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、その後、二本鎖オリゴの精製を行なった。同様に、ＴＯ７．８−ｓ２及びＴＯ７．８−ａｓ２オリゴをアニールさせて、鈍端化して、精製した。最後に、これら２つのｄｓオリゴヌクレオチドを、等モル比（各１ｐモル）で混合して、ＰＣＲ増幅を行なった。その結果生成した増幅されたプロモーター断片は、「Ｔ１１」と呼ばれる。この最小プロモーターをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで消化し、ＳＫ−ＴＯ７．ｇに直接挿入して、配列決定した。それ故、Ｐtet−Ｔ１１最小プロモーターの、ＳＫ−ＴＯ７．ｇプラスミド中の新たなｔｅｔオペレーターへの融合は、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ断片の同様に消化されたプラスミドへの挿入により為された。その結果生成したプラスミドは、ＳＫ−ＴＯ７．８と呼ばれる。Ｐtet−Ｔ１１プロモーターの放出は、（５’）ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ又はＮｃｏＩ（３’）断片として可能である。
【００８１】
ＩＩ）発現用プラスミドの構築及び標的細胞のトランスフェクション
プロモーターＴ１〜Ｔ１１は、Ｘｈｏ及びＮｃｏＩにより、直接、ｐＵＨＣ１３１−１プラスミド（Bonin １９９４、Gene １４１:75-77）に導入された。Ｐｔｅｔ−１の参照プラスミドを、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩにより、Ｐｔｅｔ−１を、Ｔ２プロモーターを含むｐＵＨＣ１３１−１プラスミドに導入することによって生成した。Ｐｔｅｔ−１の参照プラスミドは、ｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔプラスミド（Clontech Laboratories, Inc., 米国）からのＰｔｅｔ−１４を、ＸｈｏＩ及びＳａｃＩにより、Ｔ４プロモーターを含むｐＵＨＣ１３１−１プラスミド中に導入することにより生成された。すべてのコンストラクトのヌクレオチド配列を、配列決定により確認した。
【００８２】
実施例２：転写制御配列の機能分析
これらの新規なプロモーターシリーズの性能を、現在使用可能なテトラサイクリン依存性プロモーターと、ＨｅＬａＭ２細胞への一時的トランスフェクション後に、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を伴って（＋）又は伴わないで（−）比較した。
【００８３】
逆テトラサイクリン依存性トランスアクチベーターを安定に発現しているＨｅＬａＭ２細胞を、０．５μｇの様々なプロモーターの制御下のレポーターコンストラクト（ルシフェラーゼ）で、非誘導条件下で、一時的にトランスフェクトした。非調節時の活性（−Ｄｏｘ）の測定は、Ｐｔｅｔ−Ｔ１が、測定可能な活性がＰtet−Ｔ１〜Ｐtet−Ｔ６で徐々に減少する最大バックグラウンドを与えることを示した（図２参照）。
【００８４】
誘導状態及び非誘導状態におけるレポーター活性の比較のために、Ｐtet−Ｔ６、Ｐtet−Ｔ７、Ｐtet−１４、Ｐtet−１及び構成的に発現されるレポーターコンストラクト（ＰhCMV）を、同じ条件下で分析した（図３）。これらの実験から、誘導条件下（＋Ｄｏｘ）ではレポーター活性がＰtet−Ｔ６、Ｐtet−Ｔ７、Ｐtet−１４のトランスフェクション後と同レベル（ＰhCMVと比較して約２倍増）に達するが、有意の差異が、非誘導条件下で見られることは明らかである。ここで、Ｐtet−１のトランスフェクションは、ＰhCMV駆動されるコンストラクトの活性の約１０００倍低い最大活性を与える。Ｐtet−Ｔ１４、Ｐtet−Ｔ７、Ｐtet−６からのルシフェラーゼ活性は、徐々に減少するが、Ｐtet−１（Gossen 1992loc. cit.）より１００倍低いバックグラウンド活性を与える。
【００８５】
分析したプロモーターの内で、Ｐtet−Ｔ６が、最適のｔｅｔ応答性プロモーターであり、一時的発現実験において、そのバックグラウンド活性は、Ｐtet−１（Gossen 1992,loc. cit.）の活性より１００倍低く、Ｐｔｅｔ−１４（Clontech Laboratories, Inc.,米国から市販されている）より１０倍低かった。
【００８６】
実施例３：ＣｐＧ−Ｐｔｅｔ変異体の定量
Ｈｅｌａ−Ｍ２細胞を、標準的条件下で、下記の表３に列挙した発現用コンストラクトによりリポフェクションにより、トランスフェクトした。発現の定量をＰ／Ｒｌｕｃアッセイにより行なった。この表には、ホタルルシフェラーゼに結合された示したプロモーターコンストラクトの活性が、標準化のためのＴＫ−Ｒｌｕｃ（レニラ）内部対照と共に示されている。与えられたＲｌｕ値は、＋ｄｏｘ条件（誘導時）に対するものである。如何なる場合にも、−ｄｏｘ値は、アッセイ系のバックグラウンド読みと同じであったので、定量されなかった。最小調節因子は、有効バックグラウンドが機器のブランク読みの１０％より低いと仮定して評価された。
【００８７】
他の（一時的）実験において、ＣｐＧフリーＰtet−Ｔ６synの活性は、繰り返して、元のＴ６より３〜６倍低かったが、ＣｐＧフリーの二方向性Ｔ６ｓｙｎは、常に、有意に一層活性であった。
【００８８】
【表３】
0005576382.tif 000006
【００８９】
実施例４：ＭＭＴＶベースのＰtetプロモーターのＨＥＫ２９３細胞における一時的トランスフェクション
ＭＭＴＶベースのＰtetプロモーターをＨＥＫ２９３細胞にて試験して、ｐＴＲＥ−Ｔｉｇｈｔプラスミド(Clontech Laboratories, Inc., 米国)由来のＰtet−１４及び上記のＰtet−Ｔ６と比較した。ＨＥＫ２９３細胞は、バックグラウンド効果に関して重要であると記されてきているので選択した。培養、トランスフェクション及び活性測定は、実施例２又は３においてＨｅＬａ細胞について記載したように行なった。ＨＥＫ２９３細胞は、ｒｔＴＡ発現プラスミド（Ｔｅｔ−Ｏ−Ａｄｖａｎｃｅｄ，Clontech, 米国）で、一時的に、同時トランスフェクトされた。結果は、下記の表４に示してある。すべてのＭＭＴＶベースのＰtetプロモーターが、市販のＰtet−１４プロモーター（ｔｉｇｈｔ）より有意に低い基礎的活性を示すということは明らかである。その上、これらのプロモーターは、Ｔ６プロモーターより低い基礎的活性さえ示す。
【００９０】
【表４】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【配列表】
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