(57)【要約】  本発明は、育種マーカーを用いた分子選抜方法を利用して、コフムロン率の低いホップ株、コルプロン率の低いホップ株、さらには、ファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株、を短期間で選抜することを目的としている。本発明は、配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの第６２３番目のヌクレオチド位置の多型、又は第１８２０番目のヌクレオチド位置の多型、を利用した育種マーカーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示される、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合の低いホップ株の選抜に用いる育種マーカー。
（ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第６２３番目はアデニン）の第６２３番目の塩基を含む２０〜３４３４の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第１８２０番目はアデニン）の第１８２０番目の塩基を含む２０〜３４３４の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２】
さらに、ホップのβ酸含有量に対するコルプロン含有量の割合が低いホップ株の選抜に用いる、請求項１記載の育種マーカー。
【請求項３】
さらに、ファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株の選抜に用いる、請求項１又は２記載の育種マーカー。
【請求項４】
ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合の低いホップ株の選抜方法であって、
被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、
前記ゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで消化して、消化ゲノムＤＮＡ断片を得る消化ステップと、
前記消化ゲノムＤＮＡ断片を分離し、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、
前記検出ステップで約８．６ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片が検出されない場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、
を備える選抜方法。
【請求項５】
ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合の低いホップ株の選抜方法であって、
被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、
配列表の配列番号５に示される塩基配列の第６２３番目のヌクレオチド位置におけるゲノムＤＮＡの多型を特定する特定ステップと、
を備える選抜方法。
【請求項６】
前記特定ステップは、
前記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第６２３番目より５’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第６２３番目より３’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列と相補的な配列からなるプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、
前記ＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩで消化する消化ステップと、
前記消化ステップで前記ＤＮＡが制限酵素ＰａｃＩによって切断されなかった場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、
を備える、請求項５記載の選抜方法。
【請求項７】
ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合の低いホップ株の選抜方法であって、
被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、
配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目のヌクレオチド位置におけるゲノムＤＮＡの多型を特定する特定ステップと、
を備える選抜方法。
【請求項８】
前記特定ステップは、
前記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目より５’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目より３’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列と相補的な配列からなるプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、
前記ＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化する消化ステップと、
前記消化ステップで前記ＤＮＡのすべての種類が制限酵素ＨｐａＩによって切断された場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、
を備える、請求項７記載の選抜方法。
【請求項９】
前記特定ステップは、
前記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、
前記ＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化する消化ステップと、
前記消化ステップで得られたＤＮＡ断片に約１３０４ｂｐのＤＮＡ断片が含まれない場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、
を備える、請求項７記載の選抜方法。
【請求項１０】
さらに、ホップのβ酸含有量に対するコルプロン含有量の割合が低いホップ株の選抜方法である、請求項４〜９のいずれか一項記載の選抜方法。
【請求項１１】
さらに、ファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株の選抜方法である、請求項４〜９のいずれか一項記載の選抜方法。
【請求項１２】
ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合の低いホップ株の選抜に用いるプライマーセットであって、
配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーと、
配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーと、
から構成される、プライマーセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ホップ株の選抜方法並びにホップ株の選抜に用いる育種マーカー及びプライマーセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ホップは、ビールに爽快な苦味と香りを与えるビールの主要原料である。ホップ中の苦味成分としては、フムロン、コフムロン及びアドフムロン等のα酸、並びにルプロン、コルプロン及びアドルプロン等のβ酸が知られている。α酸は抗菌活性、抗癌活性及び抗炎症作用等を有し、β酸は鎮静作用等を有し、いずれもが薬用資源としても注目されていている（非特許文献１）。【０００３】
ホップに含まれるα酸は、ビールの製造過程で加熱処理されると異性化してイソα酸（イソフムロン、イソコフムロン及びイソアドフムロン）となるが、イソα酸の大部分を占めるイソフムロンとイソコフムロンとを比べると、イソコフムロンの方が、官能上、苦味の質が悪く、ビールの泡持ちの面でも劣ることが知られている（非特許文献２）。イソコフムロンは、コフムロンが異性化してできるものであることから、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（以下、コフムロン率）の低いホップ株を選抜することがホップの育種目標となっている。【０００４】
ホップに含まれるβ酸は、その大部分がルプロンとコルプロンであるが、ホップのβ酸含有量によって、苦味の質をまろやかにしたり、粗くしたりすることが知られている（非特許文献３）。【０００５】
ファルネッセンは、ファインアロマホップと呼ばれる最高級のホップでのみ検出される成分であり、リナロールは、ビールにバラの花様の香りを与えることが知られている（非特許文献２）。ホップに含まれるファルネッセン及びリナロールは、ビールを特徴付ける成分の一つとしてホップの育種において重要視されている。【０００６】
有用植物の育種方法としては、優良株を交配して得られた交配後代を目的の形質を表現するまで栽培して選抜する方法の他に、交配後代のゲノムＤＮＡを種子や実生苗の段階で調べて、育種マーカー（ＤＮＡマーカー）を指標に選抜する分子選抜方法が利用されつつある。【０００７】
【非特許文献１】Ｇｅｒｈａｅｕｓｅｒ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２００５年、４１巻、１３号、ｐ．１９４１−１９５４
【非特許文献２】Ｐｅａｃｏｃｋら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ  ｍｏｎｏｇｒａｐｈ  ＸＸＩＩ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  ｈｏｐｓ  Ｚｏｅｔｅｒｗｏｕｄｅ、１９９４年、ｐ．２４７−２５０
【非特許文献３】Ｋｏｗａｋａら、ＥＢＣ  ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、１９８３年、１９巻、ｐ．７１−７８
【非特許文献４】Ｐｅａｃｏｃｋら、Ｊ．  Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、１９８０年、２８巻、ｐ．７７４−７７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、毬花を付けないホップの雄株については遺伝的な研究がほとんどなされておらず、雌株であってもホップの苦味等に関する上記成分の生合成に関与する遺伝子はほとんど明らかにされていない。このため、コフムロン率やコルプロン率、さらには、ファルネッセン、リナロールの含有量に着目したホップ株の選抜を行なうには、育種マーカーを指標にした分子選抜方法が利用できないのが現状であった。【０００９】
さらに、α酸、β酸、ファルネッセン及びリナロールは、ホップの毬花中のルプリン腺毛に特異的に蓄積するものであるため、これらの成分を多く含むホップ株を選抜するには、播種後、毬花が着生するまで待つ必要があり、これらの形質を安定させるためには、少なくとも数年の栽培期間が必要であった。【００１０】
そこで本発明は、育種マーカーを用いた分子選抜方法を利用して、コフムロン率の低いホップ株を短期間で選抜することを目的とする。さらに本発明は、コフムロン率の低いホップ株に加えて、コルプロン率の低いホップ株、ファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株を短期間で選抜することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するために、本発明は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示される、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜に用いる育種マーカーを提供する。
（ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第６２３番目はアデニン）の第６２３番目の塩基を含む２０〜３４３４の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第１８２０番目はアデニン）の第１８２０番目の塩基を含む２０〜３４３４の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド【００１２】
本発明者らは、ホップ毬花のルプリン腺毛由来のｃＤＮＡライブラリーから、コフムロン率の低いホップ株に共通して認められる多型として、配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの第６２３番目の塩基（アデニン）と、第１８２０番目の塩基（アデニン）を見出した。ホップのコフムロン率を予測する汎用性のある育種マーカーの報告はこれまでなかったが、上記の育種マーカーは、様々なホップ系統を交配して得た交配後代において、コフムロン率の低いホップ株を選抜できることが判明した。さらに、この育種マーカーで選抜したホップ株は、コフムロン率が低いことに加えて、コルプロン率も低く、ファルネッセン及び／又はリナロールを多く含んでいることが明らかとなった。【００１３】
ホップ株の育種において、上記の育種マーカーと同一の配列を有するホップ株を選抜すれば、ホップが生育して毬花を形成するまで待つことなく、種子又は実生苗の段階でコフムロン率の低いホップ株を選抜できる。また、この育種マーカーがあれば、これまでは勘と経験に頼っていた交配系統の組合せを、ゲノム情報に基づいて客観的に決定できる。さらに、この育種マーカーは、コフムロン率が低いことに加えて、コルプロン率も低いホップ株並びにさらにファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株の選抜にも好ましく使用できる。【００１４】
ここで「コフムロン率の低いホップ株」とは、任意の交配後代集団を上記の育種マーカーと同一の配列を有するか否かで分けた場合に、コフムロン率の平均値が低くなる集団に含まれるホップ株のことをいう。「コルプロン率の低いホップ株」とは、任意の交配後代集団を上記の育種マーカーと同一の配列を有するか否かで分けた場合に、コルプロン率の平均値が低くなる集団に含まれるホップ株のことをいう。「ファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株」とは、任意の交配後代集団を上記の育種マーカーと同一の配列を有するか否かで分けた場合に、ファルネッセン及び／又はリナロールの含有量の平均値が高くなる集団に含まれるホップ株のことをいう。【００１５】
また本発明は、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜方法であって、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで消化して、消化ゲノムＤＮＡ断片を得る消化ステップと、消化ゲノムＤＮＡ断片を分離し、（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、検出ステップで約８．６ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片が検出されない場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、を備える選抜方法を提供する。【００１６】
この選抜方法では、（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるポリヌクレオチドをプローブとして用い、制限酵素ＸｂａＩによる制限酵素断片長多型（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；以下、ＲＦＬＰと略す。）を調べることにより、コフムロン率の低いホップ株に加えて、コルプロン率も低いホップ株、さらにはファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株を選抜できる。ゲノム断片のサイズを視覚的に識別できるため、ゲノムＤＮＡの塩基配列を調べることなく、これらの性質を備えたホップ株を客観的かつ迅速に選抜できる。【００１７】
また本発明は、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜方法であって、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第６２３番目のヌクレオチド位置におけるゲノムＤＮＡの多型を特定する特定ステップとを備える選抜方法を提供する。【００１８】
上記特定ステップは、上記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第６２３番目より５’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第６２３番目より３’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列と相補的な配列からなるプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、このＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩで消化する消化ステップと、消化ステップでこのＤＮＡが制限酵素ＰａｃＩによって切断されなかった場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、を備えることが好ましい。【００１９】
この選抜方法では、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡが制限酵素ＰａｃＩで切断されるか否かを指標とするため、サザンハイブリダイゼーションを行う必要がない。消化ステップ後のＤＮＡ断片のサイズを、例えば、アガロース電気泳動で分画して確認すれば、ＰＣＲステップで合成したＤＮＡが制限酵素ＰａｃＩによって切断されたか否かを容易に判断でき、コフムロン率の低いホップ株あるいはコフムロン率の低いことに加えてコルプロン率も低いホップ株、さらにはファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株を選抜できる。【００２０】
また本発明は、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜方法であって、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目のヌクレオチド位置におけるゲノムＤＮＡの多型を特定する特定ステップとを備える選抜方法を提供する。【００２１】
上記特定ステップは、上記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目より５’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目より３’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列と相補的な配列からなるプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、このＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化する消化ステップと、消化ステップでこのＤＮＡのすべての種類が制限酵素ＨｐａＩによって切断された場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、を備えることが好ましい。【００２２】
この選抜方法では、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡが制限酵素ＨｐａＩで切断されるか否かを指標とするため、サザンハイブリダイゼーションを行う必要がない。消化ステップ後のＤＮＡ断片のサイズを、例えば、アガロース電気泳動で分画して確認すれば、ＰＣＲステップで合成したＤＮＡが制限酵素ＨｐａＩによって切断されたか否かを容易に判断でき、コフムロン率の低いホップ株あるいはコフムロン率の低いことに加えてコルプロン率も低いホップ株、さらにはファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株を選抜できる。【００２３】
また、上記特定ステップは、上記ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、このＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化する消化ステップと、消化ステップで得られたＤＮＡ断片に約１３０４ｂｐのＤＮＡ断片が含まれない場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、を備えることが好ましい。【００２４】
この選抜方法では、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーとでＰＣＲを行なうため、目的とするＤＮＡ断片のみが効率的かつ特異的に増幅される。さらに、消化ステップで得られたＤＮＡ断片のサイズを、例えば、アガロース電気泳動で分画して確認すれば、約１３０４ｂｐの断片の有無を容易に判断でき、コフムロン率の低いホップ株あるいはコフムロン率の低いことに加えてコルプロン率も低いホップ株、さらにはファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株を選抜できる。【００２５】
また本発明は、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜に用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーとから構成される、プライマーセットを提供する。【００２６】
上記プライマーセットを用いれば、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目を含むＤＮＡ断片のみを特異的に増幅できる。上記プライマーセットは、コフムロン率の低いホップ株あるいはコフムロン率の低いことに加えてコルプロン率も低いホップ株、さらにはファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株の選抜に好適に利用できる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、コフムロン率の低いホップ株の育種マーカーを提供でき、この育種マーカーは、コルプロン率も低いホップ株、さらにはファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株の育種マーカーとしても利用できる。また本発明によれば、ホップが毬花を形成し、安定した形質を表現するまで待つことなく、ホップの種子又は実生苗を用いて、コフムロン率の低いホップ株あるいはコフムロン率の低いことに加えてコルプロン率も低いホップ株、さらにはファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株を客観的かつ迅速に選抜できる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ホップ株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで消化し、ゲノムサザンハイブリダイゼーションをすることにより得られたＸｂａＩ／３Ｄ０３多型を示す図である。
【図２】ｅ型ｇ３Ｄ０３、ｆ型ｇ３Ｄ０３及びｇ型ｇ３Ｄ０３ｍ型の塩基配列のホモロジーを解析し、一塩基多型を示した図である。
【図３】ホップ株のＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析を行うことにより得られたＨｐａＩ／ｇ３Ｄ０３多型を示す典型的なバンドパターンを示す図である。
【図４】ホップの９系統のゲノムＤＮＡを解析して得られたＨｐａＩ／ｇ３Ｄ０３多型を示した図である。
【図５】ホップの９系統のゲノムを解析して得られたＸｂａＩ／３Ｄ０３多型を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００３０】
本発明の育種マーカーは、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるポリヌクレオチドであり、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜に用いることを特徴としている。
（ａ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第６２３番目はアデニン）の第６２３番目の塩基を含む２０〜３４３４の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）前記（ａ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列表の配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド（第１８２０番目はアデニン）の第１８２０番目の塩基を含む２０〜３４３４の連続した塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｄ）前記（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと相補的な配列からなるポリヌクレオチド【００３１】
「育種マーカー」とは、育種に使用するＤＮＡマーカーであって、目的とする形質に関与する遺伝子の近傍のゲノムに存在し、この遺伝子と共に行動するＤＮＡ配列のことをいう。育種マーカーは、被検植物の種子や実生苗のゲノムＤＮＡを用いて、病気に対する抵抗性等の肉眼では分からない形質や成熟期に現れる形質の有無を判定できる。育種マーカーは、遺伝子そのものであっても、遺伝子そのものでなくてもよい。【００３２】
「コフムロン率」とは、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合いい、「コルプロン率」とは、ホップのβ酸含有量に対するコルプロン含有量の割合をいう。「α酸」とは、フムロンとその同族体を主体としたホップの苦みのもとになる物質の総称であり、コフムロン及びアドフムロン等が含まれる。また、「β酸」とは、ルプロンとその同族体を主体としたホップの苦みのもとになる物質の総称であり、コルプロン及びアドルプロン等が含まれる。【００３３】
本明細書では、「ホップ」とは、アサ科の多年生の植物（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ  Ｌ）の植物体そのもののことをいい、「毬花」とは、ホップの雌株にできる雌花であって、雌花序が松かさ状の房となったもののことをいう。また、「ホップ株」とは、ホップを交配して得られた交配後代の各１個体のことをいう。【００３４】
「ポリヌクレオチド」とは、プリン塩基又はピリミジン塩基が糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド)が複数個結合した分子のことをいう。【００３５】
上記の（ａ）〜（ｄ）に示されるポリヌクレオチドは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載された方法に従って、配列表の配列番号５の塩基配列情報をもとに合成した標識ＤＮＡプローブを用いて、ホップのゲノムライブラリーからクローニングできる。【００３６】
さらに、（ａ）〜（ｄ）に示されるポリヌクレオチドは、ホップの葉等の組織から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として配列表の配列番号５の塩基配列情報をもとにデザインしたプライマーセットを用いれば、ＰＣＲ法で合成できる。さらに、（ａ）〜（ｄ）に示されるポリヌクレオチドの部分配列をＤＮＡ合成機で合成し、酵素的手法及びサブクローニングの手法を使ってつなぎ合わせ、目的とするサイズのポリヌクレオチドとすることもできる。【００３７】
上記の育種マーカーは、コフムロン率の低いホップ株の選抜に用いることができるが、コフムロン率の低いホップ株に加えて、コルプロン率の低いホップ株、ファルネッセン及び／又はリナロールールを多く含むホップ株の選抜に用いることが好ましい。【００３８】
また、本発明の選抜方法は、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜方法であって、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、ゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで消化して、消化ゲノムＤＮＡ断片を得る消化ステップと、消化ゲノムＤＮＡ断片を分離し、前記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片を検出する検出ステップと、検出ステップで約８．６ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片が検出されない場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、を備えることを特徴とする。【００３９】
このような選抜方法としては、例えば、ＲＦＬＰを利用した方法が挙げられる。具体的には、ゲノムＤＮＡ中に制限酵素の認識部位に変異が生じたり、塩基挿入又は塩基欠損が生じていたりした場合に、当該制限酵素で処理した後に生じるＤＮＡ断片の大きさを比較して、目的とする形質を有するか否かを判定する方法である。【００４０】
上記検出ステップでは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載されたゲノミックサザンハイブリダイゼーション法に従って、（ａ）〜（ｄ）に示されるポリヌクレオチドにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ断片を検出できる。具体的には、制限酵素ＸｂａＩで消化した被検ホップの消化ゲノムＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動で分画し、分画したゲノムＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトランスファーし、標識した（ａ）〜（ｄ）に示されるポリヌクレオチドをプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、プローブの標識を指標にハイブリダイズしたバンドを検出できる。【００４１】
プローブの標識方法としては、例えば、クレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）又はビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）又はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５'端を３２Ｐ等でリン酸化することにより標識する方法が挙げられる。【００４２】
判断ステップでは、例えば、被検ホップ株由来の消化ゲノムＤＮＡ断片をＤＮＡサイズマーカーと共に電気泳動し、ナイロンメンブレンにトランスファーする際に、ウェルの位置とサイズマーカーが移動した位置をナイロンメンブレンにマーキングしておけば、ウェルからの移動距離とＤＮＡサイズマーカーのサイズとの関係から、ハイブリダイズした被検ホップ株由来の消化ゲノムＤＮＡ断片のサイズを計算できる。その結果、約８．６ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片が検出されなければ、この被検ホップ株はコフムロン率の低いホップ株であると判断できる。【００４３】
また、本発明の選抜方法は、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜方法であって、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第６２３番目のヌクレオチド位置におけるゲノムＤＮＡの多型を特定する特定ステップとを備えることを特徴とする。【００４４】
上記特定ステップは、ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第６２３番目より５’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第６２３番目より３’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列と相補的な配列からなるプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、このＤＮＡを制限酵素ＰａｃＩで消化する消化ステップと、消化ステップでこのＤＮＡが制限酵素ＰａｃＩによって切断されなかった場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、を備えることが好ましい。【００４５】
このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられる。具体的には、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲで増幅させたＤＮＡ断片中に制限酵素の認識部位に変異が生じたり、塩基挿入又は塩基欠損が生じていたりした場合に、当該制限酵素で処理した後に生じるＤＮＡ断片の大きさを比較して、目的とする形質を有するか否かを判定する方法である。【００４６】
上記のＰＣＲステップで用いるプライマーは、配列表の配列番号５に示される塩基配列を基に１８〜５０の連続した塩基配列を選択し、ＤＮＡ合成機で合成できる。プライマーのサイズは、１８塩基以上３０塩基以下であることが好ましく、２０塩基以上２２塩基以下であることがさらに好ましい。【００４７】
判断ステップでは、例えば、制限酵素ＰａｃＩで消化した被検ホップ株由来のＤＮＡ断片をＤＮＡサイズマーカーと共にアガロース電気泳動又はポリアクリルアミド電気泳動で分画し、ＤＮＡサイズマーカーのウェルからの移動距離とＤＮＡサイズマーカーのサイズとの関係から、被検ホップ株由来のＤＮＡ断片のサイズを計算できる。被検ホップ株由来のＤＮＡ断片のサイズが明らかとなれば、ＰＣＲステップで合成したＤＮＡが制限酵素ＰａｃＩによって切断されたか否かを判定することができ、切断が確認できた場合に被検ホップ株はコフムロン率の低いホップ株であると判断できる。尚、電気泳動後のゲル中に存在する消化ＤＮＡ断片及びサイズマーカーは、例えば、臭化エチジウム又はサイバーグリーン等で処理することにより、ＵＶ照射下で検出できる。【００４８】
また、本発明の選抜方法は、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜方法であって、被検ホップ株からゲノムＤＮＡを抽出する抽出ステップと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目のヌクレオチド位置におけるゲノムＤＮＡの多型を特定する特定ステップとを備えることを特徴とする。【００４９】
この特定ステップは、ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目より５’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号５に示される塩基配列の第１８２０番目より３’側に位置する１８〜５０の連続した塩基配列と相補的な配列からなるプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、このＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化する消化ステップと、消化ステップでこのＤＮＡのすべての種類が制限酵素ＨｐａＩによって切断された場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、を備えることが好ましい。【００５０】
このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等が挙げられ、その具体例及びプライマーの合成については上記の通りである。プライマーのサイズは、１８塩基以上３０塩基以下であることが好ましく、２０塩基以上２２塩基以下であることがさらに好ましい。【００５１】
判断ステップでは、例えば、制限酵素ＨｐａＩで消化した被検ホップ株由来のＤＮＡ断片をＤＮＡサイズマーカーと共にアガロース電気泳動又はポリアクリルアミド電気泳動で分画し、ＤＮＡサイズマーカーのウェルからの移動距離とＤＮＡサイズマーカーのサイズとの関係から、被検ホップ株由来のＤＮＡ断片のサイズを計算できる。被検ホップ株由来のＤＮＡ断片のサイズが明らかとなれば、ＰＣＲステップで合成したＤＮＡが制限酵素ＨｐａＩによって切断されたか否かを判定することができ、このＤＮＡのすべての種類が制限酵素ＨｐａＩによって切断された場合に被検ホップ株はコフムロン率の低いホップ株であると判断できる。尚、電気泳動後のゲル中に存在する消化ＤＮＡ断片及びサイズマーカーは、例えば、臭化エチジウム又はサイバーグリーン等で処理することにより、ＵＶ照射下で検出できる。【００５２】
また、上記特定ステップは、ゲノムＤＮＡを鋳型に、配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーとでＰＣＲを行ない、ＤＮＡを合成するＰＣＲステップと、ＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化する消化ステップと、消化ステップで得られたＤＮＡ断片に約１３０４ｂｐのＤＮＡ断片が含まれない場合にコフムロン率の低いホップ株であると判断する判断ステップと、を備えることが好ましい。【００５３】
上記のＰＣＲステップで用いるプライマーは、配列表の配列番号７に示される塩基配列及び配列表の配列番号８に示される塩基配列を基にそれぞれＤＮＡ合成機で合成できる。【００５４】
判断ステップでは、例えば、制限酵素ＨｐａＩで消化した被検ホップ株由来のＤＮＡ断片を、ＤＮＡサイズマーカーと共にアガロース電気泳動又はポリアクリルアミド電気泳動を行い、ＤＮＡサイズマーカーのウェルからの移動距離とサイズマーカーの塩基配列のサイズとの関係から、被検ホップ株由来のＤＮＡ断片のサイズを計算することができる。その結果、被検ホップ株由来のＤＮＡ断片の少なくとも一種のサイズが１３０４ｂｐ付近で検出されなければ、この被検ホップ株はコフムロン率の低いホップ株であると判断できる。尚、電気泳動後のゲル中に存在する消化ＤＮＡ断片及びサイズマーカーは、例えば、臭化エチジウム又はサイバーグリーン等で処理することにより、ＵＶ照射下で検出できる。【００５５】
尚、本発明の選抜方法は、コフムロン率の低いホップ株の選抜に用いることができるが、コフムロン率の低いホップ株に加えて、コルプロン率の低いホップ株、ファルネッセン及び／又はリナロールールを多く含むホップ株の選抜に用いることが好ましい。【００５６】
本発明のプライマーセットは、ホップのα酸含有量に対するコフムロン含有量の割合（コフムロン率）の低いホップ株の選抜方法に用いるプライマーセットであって、配列表の配列番号７に示される塩基配列を含むプライマーと、配列表の配列番号８に示される塩基配列を含むプライマーとから構成されることを特徴とする。【００５７】
このプライマーセットは、配列表の配列番号７に示される塩基配列及び配列表の配列番号８に示される塩基配列を基にそれぞれＤＮＡ合成機で合成できる。
【実施例】
【００５８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５９】
１．実験方法
１）ホップ毬花に含まれるα酸及びβ酸の定量：
ホップ毬花に含まれるα酸及びβ酸の量は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｂｒｅｗｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ（ＡＳＢＣ）による公定法の変法を用いて測定した。具体的には、まず、１００ｍＬの共栓三角フラスコに１ｇの粉砕したホップ毬花を入れ、そこに４ｍＬのメタノール及び２０ｍＬのジエチルエーテルを加えて３０分間振盪した。その後、８ｍＬの０.１Ｍ塩酸をそこに加えて１０分間振盪し、静置後、エーテル層から０.２ｍＬを採取し、そこにメタノールを加えて１０ｍＬとし、その一部を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で分析した。ＨＰＬＣの分析条件については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｒｅｗｅｒｙ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ（ＥＢＣ）による公定法７．７に従って行い、３１４ｎｍの波長でα酸及びβ酸の各成分の検出を行ない定量した。【００６０】
コフムロン率及びコルプロン率は、ホップ苦味成分の標準サンプルであるＩＣＥ−２（Ｌａｂｏｒ  Ｖｅｒｉｔａｓ社製）におけるフムロン、コフムロン、ルプロン及びコルプロンの量と比較して算出した。【００６１】
２）ホップ毬花に含まれるファルネセン及びリナロールの定量：
ファルネセン及びリナロールの定量は、以下の手順に従って行った。まず、１０ｍｌの共栓遠沈管に１ｇの粉砕毬花と６ｍｌのｎ−ヘキサンを加えて４５分間振盪し、３０００ｒｐｍ、２０℃の条件で１０分間遠心分離した。次に、その上澄の１．５ｍｌを１０ｍｌの共栓遠沈管に回収し、そこに３ｍｌの５％炭酸カリウムを加えて５分間振盪し、３０００ｒｐｍ、２０℃で１０分間遠心分離し、その上澄の一部をガスクロマトグラフィー（ＨＰ５８９０；Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ社製）で分析した。カラムには、Ｊ＆Ｗキャピラリーカラム（ＤＢ−１、０．２５ｍｍ×３０ｃｍ×１．０μｍ；ジーエルサイエンス社製）を用い、ファルネセン及びリナロールの標準サンプルには、（Ｅ）−β−ｆａｒｎｅｓｅｎｅ（和光純薬社製）及び（±）−Ｌｉｎａｌｏｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。【００６２】
３）ホップ毬花のルプリン腺毛由来全ＲＮＡ及びｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡの調製：
まず、ホップ雌株の毬花を凍結状態で粉砕し、メッシュ径２５０μｍの篩を透過した画分をルプリン腺毛画分とした。次に、ルプリン腺毛画分を液体窒素中でホモジナイズし、２％ＣＴＡＢ溶液（２％  セチルトリメチルアンモニウムブロミド、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、５％  β−メルカプトエタノール、０.１Ｍ  トリス、ｐＨ９.５）を加えて懸濁し、６５℃で１０分間保温した後にクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出した。得られた水溶性画分に１／３倍量の１０Ｍ  塩化リチウムを加えて一晩放置し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈殿をＲＮａｓｅフリーの滅菌水で溶解した。その後、この溶液に１／３倍量の１０Ｍ  塩化リチウムを再度加えて一晩放置し、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた沈殿をＲＮａｓｅフリーの滅菌水で溶解して全ＲＮＡサンプルとした。  【００６３】
得られた全ＲＮＡサンプルは、分光光度計で２６０ｎｍの吸光度を測定することにより定量し、タカラバイオ社のＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０  Ｓｕｐｅｒを用い、添付のプロトコールに従って、ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡを調製した。【００６４】
４）ホップ毬花のルプリン腺毛由来ｃＤＮＡライブラリーの作製：
ＢＤバイオサイエンス社のＣｒｅａｔｅｒ  ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて、得られたホップ毬花のルプリン腺毛由来ｐｏｌｙ  Ａ＋  ＲＮＡからホップ毬花のルプリン腺毛由来ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡライブラリーの作製手順は、上記キットに添付されたプロトコールに従って行なった。【００６５】
２．実験結果
（実施例１）コフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量に関与する育種マーカーの探索
まず、ホップ毬花（品種Ｓａａｚ）のルプリン腺毛由来ｃＤＮＡライブラリーからランダムにクローンを選び、各クローンに導入されているルプリン腺毛由来ｃＤＮＡを鋳型に、ジゴケシゲニン（ＤＩＧ）標識ｄＵＴＰの存在下でＰＣＲを行い、ＤＩＧ標識プローブを作製した。ＰＣＲによるＤＩＧ標識プローブの作製は、ロシュ・ダイアグノスティクス社のＰＣＲ  ＤＩＧプローブ合成キットを用いた。【００６６】
次に、サッポロビール株式会社が保有するホップの品種Ｃｈｉｎｏｏｋと品種ＳａＭとの交配後代１１０個体からそれぞれゲノムＤＮＡを抽出し、上記のＤＩＧ標識プローブと制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ又はＸｂａＩとの組み合わせでＲＦＬＰ解析を行い、コフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量と相関性を示す多型を検出する育種マーカーの探索を行なった。ゲノムＤＮＡの抽出及びゲノミックサザンハイブリダイゼーションの手法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９年、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）に記載された方法に従って行なった。【００６７】
その結果、ルプリン腺毛由来のｃＤＮＡクローン３Ｄ０３（以下、３Ｄ０３）と制限酵素ＸｂａＩとの組み合わせで検出された多型（以下、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型）が、コフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量と相関性を示すことが判明し、育種マーカーとして利用できることが示唆された。【００６８】
そこで、３Ｄ０３が、品種Ｃｈｉｎｏｏｋと品種ＳａＭとの交配後代以外の広い範囲のホップ系統においても、コフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量と相関性を示す育種マーカーとして利用できるか否かについて、実施例２で調べた。尚、３Ｄ０３の塩基配列は、配列表の配列番号１に示した通りである。【００６９】
（実施例２）コフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量又はリナロール含有量と、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型との相関性：
サッポロビール株式会社が保有するホップ系統のうち９系統（大満州、９８０６９０、Ｍ９１６００１００３、北鮮在来、０００４Ｂ、９７１１７４、９８０５７３、モニカ、Ｍ８４３５０１２４６）を選択し、これらを交配して得られた交配後代のホップ毬花のコフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量を調べ、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型との相関性について調べた。【００７０】
交配は、大満州×９８０６９０、大満州×Ｍ９１６００１００３、北鮮在来×９８０６９０、０００４Ｂ×９７１１７４、０００４Ｂ×９８０５７３、モニカ×Ｍ８４３５０１２４６、モニカ×９８０５７３の組み合わせで行い、得られた交配後代の毬花のコフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量について調べた。【００７１】
ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型とコフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量との相関性の有無は、交配の組み合わせで得られた交配後代をＸｂａＩ／３Ｄ０３多型ごとに群分けし、群ごとに各成分の含有量の平均値を求め、Ｔ検定により統計的有意差の有無を調べて判断した。尚、Ｔ検定を行う際には、各ホップ系統の組み合わせ毎にＸｂａＩ／３Ｄ０３多型間で分析値の分散に差があるか否かをＦ検定により調査し、分散に差がない場合は等分散を仮定した検定を行ない、分散に差がある場合は分散が等しくないと仮定した検定を行なった。また、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型のコフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量に対する影響を表す寄与率は、遺伝分散／母分散として求めた。遺伝分散は、対象とする３Ｄ０３の遺伝子型以外の要因（他の遺伝子座の影響や環境による影響）を受けてない仮定の集団の分散とした。すなわち、母集団の平均値をＸＰ、母分散をＶＰ、遺伝子型１、２、・・・の集団の平均値をＸ１、Ｘ２、・・・、各遺伝子型の個体数をＮ１、Ｎ２とすると、遺伝分散（ＶＧ）及び寄与率（Ｈ）は以下の式で求められる。
・遺伝分散（ＶＧ）＝（（ＸＰ−Ｘ１）２×Ｎ１＋（ＸＰ−Ｘ２）２×Ｎ２＋・・・）／（Ｎ１＋Ｎ２＋・・・）
・寄与率（Ｈ）＝ＶＧ／ＶＰ【００７２】
図１は、ホップ株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで消化し、ゲノムサザンハイブリダイゼーションをすることにより得られた、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型を示す図である。各交配の組み合わせで得られた交配後代は、ｅｅ型、ｅｆ型、ｅｇ型、ｆｇ型、ｇｇ型の５種類のパターンを示した。【００７３】
表１は、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型とコフムロン率との相関について示した表である。【００７４】
【表１】
2008053834.tif 000002
有意差は危険率５％以下で示した。ａとｂの差は有意であるが、ａとａｂ、ａｂとｂの差は有意ではない。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを示す。【００７５】
その結果、ｅｆ型とｆｇ型を示す交配後代においてコフムロン率が高く、ｅｅ型とｅｇ型及びｇｇ型を示す交配後代においてコフムロン率が低くなる傾向が認められた。これらの結果より、ｆ型のゲノムを有さないホップ株は、ｆ型のゲノムを有するホップ株よりコフムロン率が低くなることが示唆された。【００７６】
表２は、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型とコルプロン率との相関について示した表である。【００７７】
【表２】
2008053834.tif 000003
有意差は危険率５％以下で示した。ａとｂの差は有意であるが、ａとａｂ、ａｂとｂの差は有意ではない。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを示す。【００７８】
その結果、ｅｆ型とｆｇ型を示す交配後代においてコルプロン率が高く、ｅｅ型とｅｇ型及びｇｇ型を示す交配後代においてコルプロン率が低くなる傾向が認められた。これらの結果より、ｆ型のゲノムを有さないホップ株は、ｆ型のゲノムを有するホップ株よりコルプロン率が低くなることが示唆された。【００７９】
表３は、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型とファルネセン含有量との相関について示した表である。【００８０】
【表３】
2008053834.tif 000004
有意差は危険率５％以下で示した。ａとｂの差は有意であるが、ａとａｂ、ａｂとｂの差は有意ではない。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを示す。【００８１】
その結果、ｅｆ型とｆｇ型を示す交配後代においてファルネッセンの含有量が低く、ｅｅ型とｅｇ型及びｇｇ型を示す交配後代においてファルネッセンの含有量が高くなる傾向が認められた。これらの結果より、ｆ型のゲノムを有さないホップ株は、ｆ型のゲノムを有するホップ株よりファルネッセンの含有量が高くなることが示唆された。【００８２】
表４は、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型とリナロール含有量との相関について示した表である。【００８３】
【表４】
2008053834.tif 000005
有意差は危険率５％以下で示した。ａとｂの差は有意であるが、ａとａｂ、ａｂとｂの差は有意ではない。Ｎ．Ｓ．は有意差なしを示す。【００８４】
その結果、ｅｆ型とｆｇ型を示す交配後代においてリナロールの含有量が低く、ｅｅ型とｅｇ型及びｇｇ型を示す交配後代においてリナロールの含有量が高くなる傾向が認められた。これらの結果より、ｆ型のゲノムを有さないホップ株は、ｆ型のゲノムを有するホップ株よりリナロールの含有量が高くなることが示唆された。【００８５】
以上の結果、任意のホップ株のＸｂａＩ／３Ｄ０３多型を解析することにより、コフムロン率、コルプロン率、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量が高いか低いかを予測できることが示唆され、ｆ型のゲノムを有さないホップ株は、コフムロン率及びコルプロン率が低く、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量が高いホップ株であることが示唆された。【００８６】
（実施例４）３Ｄ０３を含むゲノムＤＮＡ断片のクローニング
ｆ型のゲノムを有さないホップ株は、コフムロン率及びコルプロン率が低く、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量が高いホップ株であることが示唆されたため、３Ｄ０３の塩基配列を利用して、ｅ型、ｆ型及びｇ型のゲノムＤＮＡ断片をクローニングし、塩基配列の違いを解析することによって、３Ｄ０３遺伝子座における多型の同定を試みた。【００８７】
まず、３Ｄ０３の両末端領域の配列を基に以下のプライマーを設計した。
ｐ３Ｄ０３−Ｆ１プライマー：５’−ＡＣＴＡＧＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＡＴＣＴＣＴＧＣ−３’（配列番号２）
ｐ３Ｄ０３−Ｒ１プライマー：５’−ＧＧＴＧＧＡＡＴＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧＴＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号３）【００８８】
次に、ｅ型とｆ型のゲノムをヘテロで保有する品種Ｃｈｉｎｏｏｋと、ｇ型のゲノムをホモで保有する品種ＳａＭとからゲノムＤＮＡを抽出し、ｐ３Ｄ０３−Ｆ１プライマーとｐ３Ｄ０３−Ｒ１プライマーを用いてＰＣＲを行い、特異的に増幅されるゲノムＤＮＡ断片をクローニングした。その後、品種ＣｈｉｎｏｏｋのゲノムＤＮＡからクローニングしたＤＮＡ断片及び品種ＳａＭのゲノムＤＮＡからクローニングしたＤＮＡ断片について、それぞれ塩基配列を解析した。ＰＣＲは、タカラバイオ社のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、製造元のプロトコールに従って行なった。塩基配列の解析は、マクロジェン社の委託解析サービスを利用して行なった。【００８９】
この結果、品種ＣｈｉｎｏｏｋのゲノムＤＮＡからクローニングしたＤＮＡ断片は、二種類の塩基配列に分類され、そのうちの一種は制限酵素ＨｐａＩで切断され、残りの一種は制限酵素ＨｐａＩで切断されなかった。ｅ型のゲノムをホモで保有する品種ＮｕｇｇｅｔのゲノムＤＮＡを鋳型にｐ３Ｄ０３−Ｆ１プライマーとｐ３Ｄ０３−Ｒ１プライマーを用いてＰＣＲを行い、特異的に増幅されるＤＮＡ断片が制限酵素ＨｐａＩで切断されるか否かを調べたところ、ｅ型ゲノム由来のＤＮＡ断片は制限酵素ＨｐａＩで切断されることが判明したため、品種ＣｈｉｎｏｏｋのゲノムＤＮＡからクローニングしたＤＮＡ断片のうち、制限酵素ＨｐａＩで切断された方の塩基配列をｅ型、制限酵素ＨｐａＩで切断されなかった方の塩基配列をf型と同定した。また、品種ＳａＭは、ｇ型のゲノムをホモで保有する品種であるため、品種ＳａＭのゲノムＤＮＡからクローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列をｇ型と同定とした。ｅ型のゲノムＤＮＡ断片（ｅ型ｇ３ＤＯ３）の塩基配列は、配列表の配列番号４に示し、ｆ型のゲノムＤＮＡ断片（ｆ型ｇ３ＤＯ３）の塩基配列は、配列表の配列番号５に示し、ｇ型のゲノムＤＮＡ断片（ｇ型ｇ３ＤＯ３）の塩基配列は、配列表の配列番号６に示した。【００９０】
図２は、ｅ型ｇ３ＤＯ３、ｆ型ｇ３ＤＯ３及びｇ型ｇ３ＤＯ３の塩基配列のホモロジーを解析した図である。その結果、図２（Ａ）中に矢印で示したｆ型ｇ３ＤＯ３の第６２３番目のヌクレオチドと、図２（Ｂ）中に矢印で示したｆ型ｇ３ＤＯ３の第１８２０番目のヌクレオチドに一塩基多型が認められた。ｆ型ｇ３ＤＯ３の第６２３番目の一塩基多型は、制限酵素ＰａｃＩで切断されることによりｅ型ｇ３ＤＯ３及びｇ型ｇ３ＤＯ３から識別でき、ｆ型ｇ３ＤＯ３の第１８２０番目の一塩基多型は、制限酵素ＨｐａＩで切断されないことによりｅ型ｇ３ＤＯ３及びｇ型ｇ３ＤＯ３から識別できることが判明した。【００９１】
（実施例５）ｆ型ｇ３Ｄ０３に認められた一塩基多型の解析
ｆ型ｇ３Ｄ０３には、制限酵素ＨｐａＩで切断されないことによって識別可能な一塩基多型が存在することが判明したので、この一塩基多型を利用して、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型と同様に、フムロン率及びコルプロン率が低く、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量が高いホップ株の選抜が可能であるか否かについて検討を加えた。【００９２】
まず、ホップの９系統（大満州、９８０６９０、Ｍ９１６００１００３、北鮮在来、０００４Ｂ、９７１１７４、９８０５７３、モニカ、Ｍ８４３５０１２４６）のゲノムＤＮＡを用いて、制限酵素ＨｐａＩと、以下のｐ３ＤＯ３−Ｆ２プライマー及びｐ３ＤＯ３−Ｒ２プライマーからなるプライマーセットとの組み合わせでＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析を行い、得られる多型（以下、ＨｐａＩ／ｇ３ＤＯ３多型）を検出した。
ｐ３Ｄ０３−Ｆ２プライマー：５’−ＴＧＣＴＧＴＴＴＣＴＡＡＧＧＧＡＴＴＣＧ−３’（配列番号７）
ｐ３Ｄ０３−Ｒ２プライマー：５’−ＴＴＴＣＣＡＧＧＡＣＣＴＡＴＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号８）【００９３】
具体的には、ホップの９系統の各ゲノムＤＮＡを鋳型に、ｐ３Ｄ０３−Ｆ２プライマーとｐ３Ｄ０３−Ｒ２プライマーを用いてＰＣＲを行ってＤＮＡを合成し、引き続きこのＤＮＡを制限酵素ＨｐａＩで消化し、消化したＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動で分画し、アガロースゲル中で分画されたＤＮＡ断片のバンドパターンを調べた。ＨｐａＩ／ｇ３ＤＯ３多型の解析では、１３０４ｂｐ付近にバンドが検出された場合に、当該ゲノムＤＮＡはｆ型ゲノムを有していることとなる。【００９４】
図３は、ホップ株のＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析を行うことにより得られたＨｐａＩ／ｇ３ＤＯ３多型を示す典型的なバンドパターンであり、図４は、ホップの９系統のゲノムＤＮＡを解析して得られたＨｐａＩ／ｇ３ＤＯ３多型を示した図である。【００９５】
その結果、大満州、北鮮在来、９７１１７４、９８０５７３はｆ型ゲノムを有するホップ系統であり、０００４Ｂ、モニカ、９８０６９０、Ｍ９１６００１００３、Ｍ８４３５０１２４６は、ｆ型ゲノムを有さないホップ系統であることが示唆された。【００９６】
次に、ホップの同じ９系統のゲノムＤＮＡを用いて、制限酵素ＸｂａＩと、３Ｄ０３の組み合わせでＲＦＬＰ解析を行い、得られるＸｂａＩ／３Ｄ０３多型を調べることにより、上記のＨｐａＩ／ｇ３ＤＯ３多型による判定結果が正しいか否かについて検討した。【００９７】
具体的には、ホップの９系統の各ゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩで切断し、消化したゲノムＤＮＡ断片を１％アガロースゲル電気泳動で分画し、分画したゲノムＤＮＡ断片をナイロンメンブレンにトランスファーし、標識した３Ｄ０３をプローブとしてハイブリダイゼーションを行い、プローブの標識を指標にハイブリダイズしたバンドを検出した。【００９８】
図５は、ホップの９系統のゲノムを解析して得られたＸｂａＩ／３Ｄ０３多型を示した図である。【００９９】
その結果、大満州、北鮮在来、９７１１７４、９８０５７３はｆ型ゲノムを有するホップ系統であり、０００４Ｂ、モニカ、９８０６９０、Ｍ９１６００１００３、Ｍ８４３５０１２４６は、ｆ型ゲノムを有さないホップ系統であることが判明した。【０１００】
以上の結果より、ＨｐａＩ／ｇ３Ｄ０３多型は、ＸｂａＩ／３Ｄ０３多型と同様に、ホップ株がｆ型ゲノムを有するか否かの判定に使用できることが判明し、フムロン率及びコルプロン率が低く、ファルネッセン含有量及びリナロール含有量が高いホップ株の選抜方法に使用できることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明によれば、コフムロン率の低いホップ株の育種マーカーを提供でき、この育種マーカーは、コルプロン率も低いホップ株、さらにはファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株の育種マーカーとしても利用できる。また本発明によれば、ホップが毬花を形成し、安定した形質を表現するまで待つことなく、ホップの種子又は実生苗を用いて、コフムロン率の低いホップ株あるいはコフムロン率の低いことに加えてコルプロン率も低いホップ株、さらにはファルネッセン及び／又はリナロールを多く含むホップ株を客観的かつ迅速に選抜できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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