(57)【要約】  【課題】    高等植物でのプロモーターを定性的かつ定量的に解析のための相同組換えによるノックイン法の開発が強く望まれていた。  【解決手段】    本発明は、Ｔ−ＤＮＡ由来のＲＢとＬＢとの間に下記の要素をＲＢから下記の順に含むことにより構成された、高等植物のプロモーター活性の解析用ベクターである。（１）発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子（２）宿主ゲノム中の標的プロモーターの３’末端を含む５００〜６０００ｂｐの塩基配列から成る第一の相同組換え領域（３）その開始コドンが前記プロモーターの３’末端から所望の間隔離れたレポーター遺伝子（４）発現可能に存在させたポジティブ選抜マーカー遺伝子（５）宿主ゲノム中の前記第一の相同組換え領域に続く５００〜６０００ｂｐの塩基配列から成る第二の相同組換え領域（６）発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と同一であってもよい第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子  このベクターを用いて抽出しやすい組織などで高発現するプロモーターを検索することにより、有用タンパク質遺伝子や有用物質生産に係る遺伝子をつなげ、有用タンパク質を大量生産すること等ができる。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ−ＤＮＡ由来のＲＢ（Right Border配列)とＬＢ（Left Border配列）との間に下記の要素をＲＢから下記の順に含むことにより構成された、高等植物のプロモーター活性の解析用ベクター。
（１）発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子
（２）宿主ゲノム中の標的プロモーターの３’末端又は標的遺伝子の５’領域を含む５００〜６０００ｂｐの塩基配列から成る第一の相同組換え領域
（３）その開始コドンが前記標的プロモーターの３’末端から所望の間隔離れたレポーター遺伝子
（４）発現可能に存在させたポジティブ選抜マーカー遺伝子
（５）宿主ゲノム中の前記第一の相同組換え領域に続く５００〜６０００ｂｐの塩基配列から成る第二の相同組換え領域
（６）発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と同一であってもよい第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子
【請求項２】
更に、
（７）前記レポーター遺伝子と前記ポジティブ選抜マーカー遺伝子との間に存在させた、部位特異的組換酵素の第一の認識配列
（８）前記ポジティブ選抜マーカー遺伝子の下流に存在させた転写終止領域
（９）該転写終止領域と前記第二の相同組換え領域との間に存在させた、部位特異的組換酵素の第二の認識配列
を有する請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記第一の相同組換え領域の３’末端を、標的プロモーターの３’末端又はこの３’末端に続く標的遺伝子の開始コドンの直前配列と一致するように設定した請求項１又は２に記載のベクター。
【請求項４】
前記第一の相同組換え領域の３’末端を、前記レポーター遺伝子の開始コドンに間隔を空けずに接続させた請求項１〜３のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のベクターを用いて、植物のゲノム改変を行うことから成る、プロモーター解析用のレポーター遺伝子をノックインした植物を作成する方法。
【請求項６】
請求項５の記載の方法によりゲノム改変された植物。
【請求項７】
請求項５に記載の植物において、前記レポーター遺伝子の活性を測定することから成る、該植物のプロモーター解析方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法により植物のプロモーターを解析する段階、その解析結果から、前記プロモーターの３’末端と前記レポーター遺伝子の開始コドンとの間隔を選択する段階、該間隔を有し、かつ前記レポーター遺伝子を発現させたい遺伝子に置き換えた請求項１又は２に記載のベクターを用意する段階、及び該ベクターを用いて植物のゲノム改変を行う段階から成る、ゲノム改変された植物の製法。
【請求項９】
前記レポーター遺伝子を発現させたい遺伝子に置き換えてなる、導入遺伝子発現のための請求項１又は２に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
高等植物において、ゲノム上の任意の位置における内在性（endogenous）プロモーター活性を解析する方法、内在性プロモーターを利用したゲノム改変された植物の製法、及びこれに用いるベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、プロモーター活性を観察・定量するために、プロモーターを含むＤＮＡ断片にＧＵＳ（β-glucuronidase）遺伝子などのレポーター遺伝子をつなげて、（１）アグロバクテリア菌のＴ-ＤＮＡを介した導入法や、（２）ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法、パーティクル・ボンバードメント（又はbiolistic）法などの直接導入法により、高等植物のゲノムに組込むと、導入遺伝子が１コピーだけゲノムにランダムに挿入する場合よりも、ＤＮＡ再編成を起して順反復配列や逆反復配列を形成した導入遺伝子が多コピーゲノム上の同一部位又は複数の部位のランダムな位置に挿入される場合が多く、その結果、エピジェネティックなジーンサイレンシング（gene silencing：遺伝子抑制）が起るため、導入プロモーター活性は形質転換カルスやトランスジェニック植物毎に大きく変動する（非特許文献１）。
更に１コピーだけ挿入した場合はトランスジェニック植物間での相違が比較的少ないとはいえ、挿入部位の違いによる位置効果により約２〜４倍の違いが観察され、しかも約１０％弱のトランスジェニック植物では発現が２０倍以下に低下している場合も観察されている。
この問題を解決するために、部位特異的組換え系（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系など）を用いて、ゲノム上の予め定められた部位に導入してトランスジェニック植物間の相違を最小限に抑えようとする研究も行われているが、（１）１コピーだけ挿入した場合以外にも、（２）多コピー挿入した場合、（３）挿入部位で１コピー又は多コピーがＤＮＡ再編成を起した場合、（４）多コピーのため挿入遺伝子のジーンサイレンシングを起した場合なども観察され（非特許文献２）、（１）の１コピーだけ挿入した場合は得られた形質転換体の約１／３〜１／２程度なので、これらを選び出すことによって上記問題についてある程度の改善が図られている。【０００３】
しかし、遺伝子本来の位置にレポーター遺伝子を導入することはできず、自然状況下で本来のプロモーターの活性を観察し、定量することは不可能である。また、導入遺伝子のサイレンシングを避け、導入遺伝子を高発現させるために、ジーンサイレンシングに係る変異体を用い、さらに核マトリックス結合領域（Matrix Attachment Region: MAR）の配列を導入遺伝子の両側に付けて導入遺伝子の高発現化を図る手法も提案されてはいるが、突然変異を用いているため、プロモーター解析には不適格である。
上記の問題以外にも、プロモーター活性を測定する場合、通常レポーター遺伝子につなげるプロモーター断片は（発現に影響を与え得るイントロン配列などを含む場合であっても）コード領域の上流約１ｋｂ〜３ｋｂ位を用いているが、遺伝子によっては、転写開始点の上流約１００ｋｂに発現に係る配列がある場合もあり（非特許文献３）、このような配列の影響をレポーター遺伝子をプロモーターにつなげて解析することは上記のような手法では不可能である。さらに、上記の如く挿入はランダムに起るので、たとえ組織特異的な発現様式を定性的に解析できたとしても（非特許文献４）、定量的解析は不可能なため、別の手段を併用する必要がある。
なお、発明者らは、イネなどの高等植物で強力なポジティブ・ネガティブ選抜法と大規模なアグロバクテリア菌のＴ-ＤＮＡを介した形質転換法に基づく相同組換えによる遺伝子ターゲティングにより、高効率かつ再現性良くゲノム改変する方法を開発している（特許文献１）。【０００４】
【特許文献１】国際公開 WO 03/020940
【非特許文献１】Mol. Breeding, 16: 79-91 (2005)
【非特許文献２】Plant Biotechnol. J., 2:169-179 (2004)
【非特許文献３】Genetics, 162:917-930 (2002)
【非特許文献４】Plant Cell, 9:355-365 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
相同組換えを利用した遺伝子ターゲティングによりレポーター遺伝子をゲノム上の本来の座位につなげて（ノックインして）内在性プロモーター活性を解析することはマウスのES細胞を用いたターゲティングではしばしば行われている（例えば、Development, 126:3437-3447 (1999)）。
しかし、相同組換えによる遺伝子ターゲティングが容易ではないと考えられている高等植物では、レポーター遺伝子を本来の座位で内在性プロモーターに直接つなげてプロモーター活性の解析に成功した例はなく、ただ種子で強く発現するシロイヌナズナの種子貯蔵タンパクＣＲＵＣＩＦＥＲＩＮのコード領域内に読取枠を合せたＧＦＰレポーター遺伝子をつなげ、酵母のＲＡＤ５４遺伝子を過剰発現させて相同組換えの活性を高めたシロイヌナズナで、緑色蛍光を指標にターゲットされた個体のスクリーニングに用いている報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:12265-12269 (2005)）が唯一の報告例であるが、プロモーター解析を行い得るか否かも他の遺伝子に応用可能か否かも開示されてはおらず、しかも、農業上極めて重要な単子葉穀類での報告例は１例もなく、高等植物でのプロモーターを定性的かつ定量的に解析するための相同組換えによるノックイン法の開発が強く望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、既に開発したゲノム改変方法（特許文献１）を更に改良して、ＧＵＳ遺伝子やＧＦＰ遺伝子などのレポーター遺伝子をゲノム上の本来の座位につなげて（ノックインして）プロモーター活性を解析する方法を提供する。
本発明により、目的遺伝子のプロモーター下流の任意の位置にレポーター遺伝子を導入することができるので、プロモーター本来の持つ活性を解析できる。例えば、プロモーターの活性を左右し得るｃｉｓ配列がプロモーターから遠く離れた位置に存在していても、この手法を用いれば、活性を正確に測定することが可能である。また、標的遺伝子のコード領域内に読取枠を合せてレポーター遺伝子をつなげて、標的遺伝子の発現や機能部位を遺伝子生成物の生成量や遺伝子生成物の細胞内局在を指標に解析することも可能である。さらに、この手法により、従来見いだされていなかった、遺伝子の本来の機能や有用性が見いだされる可能性が高い。またこの方法を利用して、たとえば、種子で大量に発現・蓄積する遺伝子のプロモーターの直下に人類に有用な遺伝子を組み込んで、有用タンパク質を種子に大量に含有するイネなどの作物を作出することも可能である。【０００７】
即ち、本発明は、Ｔ−ＤＮＡ由来のＲＢ（Right Border配列)とＬＢ（Left Border配列）との間に下記の要素をＲＢから下記の順に含むことにより構成された、高等植物のプロモーター活性の解析用ベクターである。
（１）発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子
（２）宿主ゲノム中の標的プロモーターの３’末端又は標的遺伝子の５’領域を含む５００〜６０００ｂｐの塩基配列から成る第一の相同組換え領域
（３）その開始コドンが前記標的プロモーターの３’末端から所望の間隔離れたレポーター遺伝子
（４）発現可能に存在させたポジティブ選抜マーカー遺伝子
（５）宿主ゲノム中の前記第一の相同組換え領域に続く５００〜６０００ｂｐの塩基配列から成る第二の相同組換え領域
（６）発現可能に存在させた、第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子と同一であってもよい第二のネガティブ選抜マーカー遺伝子【０００８】
更に、
（７）前記レポーター遺伝子と前記ポジティブ選抜マーカー遺伝子との間に存在させた、部位特異的組換酵素の第一の認識配列
（８）前記ポジティブ選抜マーカー遺伝子の下流に存在させた転写終止領域
（９）該転写終止領域と前記第二の相同組換え領域との間に存在させた、部位特異的組換酵素の第二の認識配列
を有してもよい。【０００９】
また本発明は、このベクターを用いて、植物のゲノム改変を行い、この植物において、レポーター遺伝子の活性を測定することにより、この植物のプロモーターを解析する段階、その解析結果から、前記プロモーターの３’末端と前記レポーター遺伝子の開始コドンとの間隔を選択する段階、該間隔を有し、かつ前記レポーター遺伝子を発現させたい遺伝子に置き換えた上記のベクターを用意する段階、及び該ベクターを用いて植物のゲノム改変を行う段階から成る、ゲノム改変された植物の製法である。
更に、本発明は、前記レポーター遺伝子を発現させたい遺伝子に置き換えてなる、導入遺伝子発現のための上記のベクターである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、従来の方法ではなし得なかったゲノム上の本来の座位で内在性プロモーターの時期や組織特異的発現活性を正確に評価、定量することができるだけでなく、今まで見いだされていなかったプロモーターの組織特異性や発現様式を精密かつ正確に解析できる。
また、ＧＦＰ遺伝子のような生きた細胞や植物で発現をモニターできるレポーター遺伝子を、種々の環境の変化に対応して発現するプロモーターにつなげることにより、環境の変化をモニターできる植物の育成が可能である。この場合、標的遺伝子のコード領域内に読取枠を合せてＧＦＰ遺伝子をつなげれば、標的遺伝子の発現や活性、遺伝子生成物の細胞内局在や蓄積の動態などを解析することも可能である。
また、本発明の手法によって、ゲノム上のプロモーターにつなげる遺伝子は、レポーター遺伝子にとどまらず、有用な形質を賦与できる遺伝子やｃＤＮＡをつなげることも可能なので、有用な形質を有する遺伝子を望ましい特定の組織や時期にだけ発現させて、高等植物に有用形質を賦与できるので、高等植物の育種に非常に貢献することができる。
更には、抽出しやすい組織などで高発現するプロモーターを検索して、有用タンパク質遺伝子や有用物質生産に係る遺伝子をつなげ、有用タンパク質を大量生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、相同組換えによって、レポーター遺伝子を高等植物のゲノムの任意の場所に導入し、プロモーター活性を解析する手法である。この方法によってレポーター遺伝子を目的遺伝子のプロモーターの任意の場所、例えば、直下に導入し、プロモーターの活性をレポーター遺伝子の発現によって観察及び定量する。レポーター遺伝子の種類によって、発現している組織を特定したり、発現量を定量したりして、プロモーター活性の強度を比較することもできる。さらにレポーター遺伝子とプロモーター配列とのつなぎ目の部分に、ゲノム上には存在しないが、導入ベクター構築時に用いた人工的な制限酵素部位の配列（数塩基の回文構造をとる配列）が存在するため、プロモーター活性に影響を及ぼす可能性もあるが、これを回避するため、人工的な制限酵素部位を取り除き、この部位の影響をなくしてレポーター遺伝子によるプロモーター活性の解析が効率良く行えるように任意の配列に改変することも可能である。【００１２】
従来のプロモーター活性を解析するためにレポーター遺伝子を導入する方法では、プロモーター配列とレポーター遺伝子が１コピーだけゲノムにランダムに挿入する場合は少なく、多くの場合はＤＮＡ再編成を起して順反復配列や逆反復配列を形成した導入遺伝子が多コピーゲノム上の同一部位又は複数の部位のランダムな位置に挿入された結果、エピジェネティックなジーンサイレンシング（遺伝子抑制）が起るため、プロモーター活性が影響を受ける効果を無視することができなかった。
しかし、本発明の方法では自然条件下においてゲノム上の本来の座位で内在性プロモーターの活性をモニターできるだけでなく、プロモーター活性に影響を及ぼす可能性のある配列もすべて自然条件のままで活性を見ることができる。
さらに遺伝子の上流領域だけでなく、遺伝子内のｃｉｓ配列（例えばイントロン等）も遺伝子の発現に影響を与えることが知られている（Plant Cell, 9:355-365 (1997)）。この場合は、レポーター遺伝子を標的遺伝子の直下に組込み、遺伝子の発現に影響を与え得るｃｉｓ配列を除去してしまうと、本来の遺伝子発現の解析ができないことが予想される。このような場合には、重要なｃｉｓ配列を残すようにイントロン等の後にレポーター遺伝子を組込み、標的遺伝子のコード領域に読取枠を合せてレポーター遺伝子をつなげて、標的遺伝子のタンパク質とレポーター遺伝子の酵素の融合タンパク質を発現させその活性をモニターすることで遺伝子本来の活性や細胞内局在などを解析することが可能となる。
また、様々なノックイン用の遺伝子ターゲティングを行うためのベクターは非常に長大で、複雑な構造となり、さらにレポーター遺伝子は標的遺伝子と翻訳のフレームを合わせ、有効なレポーター遺伝子の酵素を発現させなければならないので、導入ベクターを制限酵素などを用いて構築後に制限酵素部位などの配列を改変することが望ましい。このような場合、λＲｅｄシステム（Trend Biochem. Sci., 26:325-331 (2001)）を応用して、望ましい導入ベクターを容易に構築し改変することも可能である。
さらに、レポーター遺伝子と共にゲノムに組込まれたポジティブ選抜マーカー遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性ｈｐｔ遺伝子）を発現させるためのプロモーター（例えば、イネのアクチン遺伝子プロモーターｐＡｃｔ）領域に含まれるエンハンサーなどが（ＧＵＳやＧＦＰなどの）レポーター遺伝子の発現に影響を与えることも考えられ、この場合はｐＫＩＮ２のポジティブ選抜マーカー遺伝子の両端に順向きに導入してある、２箇所の順向きの部位特異的組換え部位に部位特異的組換え酵素遺伝子を発現させ作用させて除くことにより（Trends Biotechnol., 21:550-555 (2003)）、生じたマーカーフリーのトランスジェニック植物で解析すればよい。【００１３】
Ｔ−ＤＮＡは、アグロバクテリウム菌内で保持されているＴｉプラスミドの一部であり、植物がアグロバクテリウム菌に感染すると、菌体自身は植物細胞に侵入しないが、菌体内に存在するＴｉプラスミドの一部であるＴ−ＤＮＡ領域が植物細胞内に転移される。Ｔ−ＤＮＡは、ＲＢ（右ボーダー配列）とＬＢ（左ボーダー配列）によって、区切られており、各ボーダー配列は、約２５塩基の不完全な反復配列からなる。
本発明のベクターは、相同組換え体を非相同組換え体から効率良く選抜するために、ネガティブ選抜マーカーとポジティブ選抜マーカーを含む。ポジティブ選抜は、遺伝子が導入されて形質転換された細胞を選抜する時に、当該遺伝子産物が発現している細胞のみが生き残る条件にて選抜する方法であり、ネガティブ選抜は、遺伝子が導入されて形質転換された細胞を選抜する時に、当該遺伝子産物が発現している細胞が死滅する条件にて選抜する方法である。
ポジティブ選抜マーカーとして、ハイグロマイシン耐性遺伝子が挙げられる。他にもカナマイシン耐性遺伝子やイミダゾリン耐性遺伝子、グリフォセート耐性遺伝子、フォスフォマンノース−イソメラーゼ遺伝子、ブラストタイジンＳ耐性遺伝子、ｂａｒ遺伝子及びグリフォシネート耐性遺伝子等が挙げられる。
ネガティブ選抜マーカーは、植物細胞に対して毒性があり、ベクターを操作するために用いる大腸菌やアグロバクテリウム菌に対して毒性がないことが必要であり、ジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖遺伝子が好ましい。他にもネガティブ選抜マーカーとして利用できる遺伝子としては、ｃｏｄＡ遺伝子、シトクロムＰ−４５０遺伝子、ｂａｒｎａｓｅ遺伝子が挙げられる。
このネガティブ選抜マーカー遺伝子を、ＬＢ側とＲＢ側にそれぞれ使用するが、これらは異なる遺伝子であってもよいが、好ましくは同じ遺伝子である。
相同組換え体を非相同組換え体から選抜する場合、ポジティブ選抜マーカーによって形質転換体を選抜すると共に、ネガティブ選抜マーカーによって相同組換え以外により生じた形質転換体が致死となることを利用して、非相同組換え体を除いて相同組換え体を選択的に拾い上げることができる。【００１４】
第一の相同組換え領域は、標的プロモーター又は標的遺伝子を含む宿主ゲノム中の配列であって、標的プロモーターの３’末端（本発明においては、その上流（５’側）に標的遺伝子の転写開始点を含むと解釈する。）又は標的遺伝子の５’領域を含む塩基配列から成る。この領域は、標的プロモーターの３’末端を含むことが好ましいが、遺伝子によっては５'非翻訳領域やcis配列を含むイントロンなどが、第一の相同組換え領域に比べて長いものもあり、そのような場合に「標的プロモーターの３'末端」が含まれないこともあり、この場合は標的遺伝子の５'領域を含めばよい。この場合であっても、標的プロモーターの３’末端とレポーター遺伝子の開始コドンとの間隔は明確に把握することはできる。
この塩基配列のサイズは、相同組換えを起こすために必要な大きさであればよく、通常５００〜６０００ｂｐ、好ましくは２０００〜３５００ｂｐである。【００１５】
レポーター遺伝子をゲノム上の本来の座位につなげて内在性プロモーター活性を解析するために、所望の位置にレポーター遺伝子を配置させることが必要になるが、そのために、レポーター遺伝子の（翻訳）開始コドンが前記プロモーターの３’末端から所望の間隔離れるように、第一の相同組換え領域中の前記プロモーターの３’末端又は標的遺伝子の５’領域の位置を決めておけばよい。例えば、第一の相同組換え領域の３’末端を、標的プロモーターの３’末端又はこの３’末端に続く標的遺伝子の開始コドンの直前配列と一致するように設定してもよく、またベクターの構成にあたって、第一の相同組換え領域の３’末端を、前記レポーター遺伝子の開始コドンに間隔を空けずに接続させてもよい。この際、構成するベクター中に標的遺伝子の開始コドンとレポーター遺伝子の開始コドンの両方が並んで含まれないよう、いずれか一方の開始コドンを含むよう配慮する。なお、前記プロモーターの５’末端や３’末端が第一の相同組換え領域中に含まれなくてもよい。【００１６】
レポーター遺伝子は、特に制限は無く、ＧＵＳ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、βガラクトシダーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、タウマチン遺伝子など適宜選択して用いることができる。
第二の相同組換え領域は、標的プロモーターを含む宿主ゲノム中の配列であって、第一の相同組換え領域に続く配列から成る。この塩基配列のサイズも、第一の相同組換え領域と同様に、相同組換えを起こすために必要な大きさであればよく、通常５００〜６０００ｂｐ、好ましくは２０００〜３５００ｂｐである。【００１７】
また、上記ベクターにより宿主植物を形質転換した後に、不要な領域を削除するために、部位特異的組換酵素の認識配列を導入してもよい。部位特異的組換え酵素は二つの短かなコンセンサスＤＮＡ配列（標的配列）間の組換えを触媒する。例えば、以下の部位特異的組換え酵素及びこの酵素に特異的な標的配列を用いることができる。
（１）Ｃｒｅ組換え酵素（リコンビナーゼ）又はその誘導体
Ｃｒｅタンパクは二つの３４塩基の長さの１ｏｘ（野生型ｌｏｘＰとその変異誘導体）認識サイト間の組換えを触媒する。この１ｏｘの配列は、８塩基の核となる配列を二つの１３塩基のパリンドローム配列が挟んだユニークな構造を取っている。この８塩基の非対象陸の配列は、１ｏｘサイトに方向性を与えている。Ｃｒｅ酵素による１ｏｘサイト間のＤＮＡ鎖の切断と組換えは、核配列の８塩基の最初の塩基の後と最後の塩基の前で起こる。
標的配列１ｏｘとしては、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ５１７１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ２３７２、ｌｏｘｍ２（ｍ２ともいう。）、ｌｏｘＦＡＳ、ｌｏｘ７１、ｌｏｘ６６、及びこれらの変異誘導体が挙げられる。変異誘導体とは、野生型のｌｏｘＰ配列等に対して１ヶ所以上の塩基に変異が導入された部位特異的組換え反応の標的配列をいう。
（２）Ｆ１ｐ組換え酵素（リコンビナーゼ）又はその誘導体
この組換え酵素は、出芽酵母から取られたＦｌｐ組換え酵素である。この酵素の活性は、Ｃｒｅ／ｌｏｘと同様又は若干劣る。しかし、最近開発された活性型Ｆｌｐ（Ｆ１ｐｅ）はこの酵素の効率が改良され、Ｃｒｅの効率と同等である。３４塩基のコンセンサス組換え配列はＦＲＴと呼ばれる。ＦＲＴは１ｏｘと同様な構造を有するが、配列は異なる。
このＦｌｐ酵素とその認識配列にも多くの誘導体が作られている。標的配列としては、ＦＲＴ、Ｆ３、Ｆ５、ＦＲＴ  ｍｕｔａｎｔ  -１０、ＦＲＴ  ｍｕｔａｎｔ  ＋１０、及びこれらの変異誘導体が挙げられる。変異誘導体とは、野生型のＦＲＴ配列等に対して１ヶ所以上の塩基に変異が導入された部位特異的組換え反応の標的配列をいう。
（３）ＰｈｉＣ３１インテグラーゼ又はその誘導体
ＰｈｉＣ３１インテグラーゼはストレストマイセス菌の細菌ウイルス由来でヒトの細胞内で機能する。この標的配列としては、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ及びこれらの変異誘導体が挙げられる。変異誘導体とは、野生型のａｔｔＰ配列等に対して１ヶ所以上の塩基に変異が導入された部位特異的組換え反応の標的配列をいう。この系は、ａｔｔＰＰ’とａｔｔＢＢ’の間のｔｔｇの３塩基で組換えを起こす酵素である。
これらの部位特異的組換え酵素とその標的配列の中で、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系が好ましい。【００１８】
例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘ組換え系を加えた本発明の遺伝子構築物を用いて相同組換え体（相同組換えした細胞又は個体）に、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現させると、ゲノムの相同組換えを生じた領域内の二つのｌｏｘ配列に挟まれたポジティブ選抜マーカー遺伝子を含む配列が削除できる。
相同組換え体にＣｒｅリコンビナーゼを発現させ、ｌｏｘ配列間の領域を削除するには、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子を遺伝子導入した別の植物と交配する、又は相同組換えにより得られた植物体にＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を遺伝子導入することにより実現することができる。
また、Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子をDexamethasone、Tetracycline、Ecdysone、Estradiol、Ethanol、Copper等による誘導型誘導型プロモーター系（Curr. Opin. Plant Biol., 6:169-177 (2003)）につなげて、特定の時期や組織でＣｒｅリコンビナーゼ遺伝子を発現させて、ポジティブ選抜マーカー遺伝子と転写終止を削除することもできる。さらに、また遺伝子の発現を制御するために、転写終止領域、好ましくはＥｎ／Ｓｐｍ型トランスポゾンの転写終止領域を導入してもよい。【００１９】
上記のベクターを用いて、常法に従って植物のゲノム改変を行うことにより、プロモーター解析用のレポーター遺伝子をノックインした植物を作成することができる。このような植物として、イネ、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ジャガイモ、ペチュニア、アブラナ、ワタ、トウモロコシ、大麦、小麦、サツマイモ、ダイズなどの高等植物を挙げることができる。
この形質転換植物において、レポーター遺伝子の活性を測定することにより、この植物ゲノム中の任意に位置における、内在性プロモーターの活性を解析することができる。
その解析の結果、当該プロモーターにより高発現したり特定の組織や時期にだけ特定位置の遺伝子が発現することが分ったとしたら、同じベクターのレポーター遺伝子を、発現させたい遺伝子に置き換えたベクターを用意して、その植物のゲノム改変を行うことにより、当該プロモーターの下流の適当な位置に外来遺伝子を組み込んだ形質転換植物を作ることができる。この植物を用いて有用タンパク質の生産などを行うことができる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
実施例１
イネのＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子（ＡＦ４６２０２９）の開始コドンＡＴＧの５’側（第一の相同組換え領域）と３’側（第二の相同組換え領域）各々約３．１ｋｂの相同領域をもち、ノックインのレポーター遺伝子としてＧＵＳ遺伝子の開始コドンＡＴＧをＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子本来の開始コドンＡＴＧと合致するように配置したベクターを構築した。このベクターの構造を図１に示す。このベクターは、Ｔ−ＤＮＡ由来のＲＢ（Right Border配列)とＬＢ（Left Border配列)との間に、ＲＢから順に、ＤＴ-Ａ（第一のネガティブ選抜マーカー遺伝子）、ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子のＡＴＧの５’側の３１０２ｂｐの配列（第一の相同組換え領域）、ＧＵＳ（レポーター遺伝子）、ｌｏｘ（部位特異的組換酵素の認識配列）、ｈｐｔ（ポジティブ選抜マーカー遺伝子）、Ｅｎ／Ｓｐｍ（転写終止領域）、ｌｏｘ（部位特異的組換酵素の認識配列）、ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子のＡＴＧの３’側の３０９０ｂｐの配列（第二の相同組換え領域）、ＤＴ-Ａ（ネガティブ選抜マーカー遺伝子）を含む。【００２１】
このベクターを用いて、日本晴（野生型）イネの種子から得られたカルスに、１度に約３３００粒の種子から１０７ｇのカルスを誘導して、上記ベクターを用いて形質転換を行い、ポジティブ・ネガティブ選抜によって２８４個の生残りカルスを得た。これらの形質転換カルスよりＤＮＡを抽出して、５’側と３’側各々約３．３ｋｂと３．５ｋｂのＰＣＲ反応の増幅断片の出現の有無を検討して相同組換体のＰＣＲ反応のスクリーニングを行い、１回の実験で独立な１５個のターゲティングノックインされたカルスを得た。
５'側のＰＣＲ反応のスクリーニングには、プライマーとして、Ｍ１ａＳｃ５'-Ｆ : 5' TTGAAGGCTGAAGCTGACC 3'（配列番号１）及びＧＵＳ-Ｒ : 5' ACGGGTTGGGGTTTCTACA 3'（配列番号２）を用い、３'側のＰＣＲ反応のスクリーニングには、プライマーとして、ｌｏｘＰ-Ｆ : 5' GTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTTT 3'（配列番号３）及びＭ１ａＳｃ３'-Ｒ : 5' CCTTCCAGCCTTGTAGGTCTC 3'（配列番号４）を用いた。
その結果、図２に示すように、カルスのＧＵＳ染色の結果から、何れもほぼ同じ程度のＧＵＳ遺伝子の発現が観察された。【００２２】
比較例１
比較のために、図３に示すように、従来から行われているＯｓＭＥＴ１ａの３．１ｋｂのプロモーターにＧＵＳレポーター遺伝子をつなげたＴ-ＤＮＡをイネゲノムにランダムに挿入した。選抜ポジティブマーカーであるハイグロマイシン耐性のカルスを選択した。なお、プロモーター領域はノックインターゲティングを行ったベクターよりも長い領域を用いた。その結果、ポジティブ・ネガティブ選抜法を用いてはいないため、図４に示すように、ＧＵＳレポーター遺伝子はランダムに挿入し、コピー数も一定しないためか、さまざまな強度のＧＵＳ遺伝子の発現が観察された。【００２３】
実施例２
イントロン内に発現を制御する因子がある可能性（Plant Cell, 9:355-365 (1997)）を考慮して、図５に示すように、ＯｓＭＥＴ１ｂ遺伝子（ＴＰＡ  ＢＫ００１４０５）の２．６ｋｂのイントロンの下流の２番目のＡＴＧコドンの５’側（第一の相同組換え領域）と３’側（第二の相同組換え領域）各々約３．６ｋｂと１．８ｋｂの相同領域をもつベクターを構築した。ＧＵＳ遺伝子の開始コドンＡＴＧをＯｓＭＥＴ１ｂ遺伝子の２番目の開始コドンＡＴＧと合致するように配置している。それ故、ＧＵＳ遺伝子はＯｓＭＥＴ１ｂ遺伝子の長いイントロンの下流につなげられている。このベクターを用いて、実施例１（ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子の場合）と同様に、３回の実験を行った。
各々１度に約２２００粒、２２００粒、１１００粒の種子から７５ｇ、１０８ｇ、９５ｇのカルスを誘導し、アグロバクテリウム菌を介した形質転換とポジティブ・ネガティブ選抜によって２９０個、１１４個、２７６個の生残りカルスを得た。これら形質転換カルスよりＤＮＡを抽出して、５’側と３’側各々約３．７ｋｂと２．０ｋｂのＰＣＲ反応の増幅断片の出現の有無を検討して相同組換体のＰＣＲ反応によるスクリーニングやサザンブロット法解析を行い、３回の実験で各々独立に２個、１個、３個のノックインターゲティングされたカルスを得た。
５'側のＰＣＲ反応によるスクリーニングには、プライマーとして、Ｍ１ｂＳｃ５'-Ｆ: 5' TGCTGATGTGGTGATTTTGG 3（配列番号５）'及びＧＵＳ-Ｒ: 5' ACGGGTTGGGGTTTCTACA 3'（配列番号６）を用い、３'側のＰＣＲ反応によるスクリーニングには、プライマーとして、ｌｏｘＰ-Ｆ：5' GTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGTTT 3'（配列番号７）及びＭ１ｂＳｃ３'-Ｒ： 5' TGGAATCTTCAGGGAAATGG 3'（配列番号８）を用いた。【００２４】
ノックインターゲティングされた６個のカルスのＧＵＳ染色の結果を図６に示す。得られたノックインターゲティングされたカルスをＧＵＳ染色すると、いずれも同じようによく染まっている。
また、ノックイン再生植物体のＧＵＳ染色の結果を図７に示す。再分化後の幼植物体のＧＵＳ染色による解析の結果、ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子の場合同様に、分裂の盛んな組織である根端分裂組織などで青色の強いＧＵＳ染色が観察されたが、ＯｓＭＥＴ１ｂの方がＯｓＭＥＴ１ａよりも遙かに強く発現しており、これはＲＴ-ＰＣＲ解析の結果ともよく一致する。【００２５】
評価
ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子のノックインターゲティングに成功したカルスと再生した植物の各組織及びＯｓＭＥＴ１ａのプロモーターにＧＵＳ遺伝子をつなげてランダムに挿入された形質転換カルスをＧＵＳ染色した結果を図２、図４及び図８に示す。
ＧＵＳ染色の方法は以下の通りである。
Ｘ-Ｇｌｕｃ  染色液（ＧＵＳ染色の基質となる溶液）の組成
5mg X-Gluc
50μl dimetyl formamide
50mM NaPO4 (pH7.0)
0.5mM Potassium ferricyanide
0.5mM Potassium ferrocyanide
以上の組成の溶液に使用直前に１５％メタノールを添加し、組織を加え３７℃にて、染色する。染色時間はＧＵＳ活性の強さに応じて、数分から最大でも一晩程度である。その後、緑色の組織では、７０％から１００％エタノールにてクロロフィルを抽出し、観察しやすくする場合もある。ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子に関するカルスの場合、ノックインターゲティングに成功したカルス（図２）はどれも同じように染色されているのに対して、ランダムに挿入された形質転換カルスの場合（図４）は、染色のばらつきが顕著である。また、ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子のノックインターゲティングに成功した植物体のＧＵＳ染色の結果（図８）を示した。頂端分裂組織、根端分裂組織、など分裂の盛んな組織で強いＧＵＳ染色が観察されたので、細胞分裂が盛んな部位で特異的に発現するプロモーターであると思われる。【００２６】
ＯｓＭＥＴ１ｂ遺伝子のノックインターゲティングに成功したカルスと再生植物体のＧＵＳ染色の結果を図６及び図７に示す。ＧＵＳ染色の方法は、ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子の場合と同様であり、やはり分裂の盛んな組織で強いＧＵＳ染色が観察された。【００２７】
ＯｓＭＥＴ１ａとＯｓＭＥＴ１ｂの両遺伝子の組織特異的発現様式をノックインターゲティングした植物体のＧＵＳ染色の結果と比較検討するために、両遺伝子の発現様式をＲＴ-ＰＣＲ法により解析し、その結果を図９及び図１０に示す。各組織よりＲＮＡを抽出し、Ｍｏｒｉｔａらの方法（Plant Cell Physiol., 47:457-470 (2006)）に従ってＲＴ-ＰＣＲを行った。逆転写反応によるｃＤＮＡ合成後の増幅断片の長さとＰＣＲ反応の増幅の条件は以下の通りである。
ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子の増幅断片：  ３８２ｂｐ
プライマー  Ｍ１ａ３'-Ｆ  : 5' GAAGCTGTCCACAGGGCAGA 3'（配列番号９）
プライマー  Ｍ１ａ３'-Ｒ  ： 5' AAATGAGGGCGATGCAGTGAAG 3'（配列番号１０）
ＰＣＲ反応は９４．０℃  １分、及び（９４℃  ３０秒、６２．０℃  ３０秒、７２．０℃  １分）を３５回繰り返した後で、７２℃  ７分の処理を行った。
ＯｓＭＥＴ１ｂ遺伝子の増幅断片：  ３８０ｂｐ
プライマー  Ｍ１ｂ３'-Ｆ  ： 5' ACTATCATCTGGCCAACTGGTGG 3'（配列番号１１）
プライマー  Ｍ１ｂ３'-Ｒ  ： 5' CCCTCGATCATCGGAGAAGG 3'（配列番号１２）
ＰＣＲ反応は、９４．０℃  １分、及び（９４℃  ３０秒、６０．０℃  ３０秒、７２．０℃  １分）を３２回繰り返した後で７２℃  ７分の処理を行った。【００２８】
ＯｓＭＥＴ１ａとＯｓＭＥＴ１ｂの両遺伝子とも同じような組織で発現しているが、ＲＴ-ＰＣＲの増幅のためのサイクル数からもＯｓＭＥＴ１ｂ遺伝子の方がＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子よりも強く発現していることが分る。また、ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子の発現様式は、図８のＧＵＳ染色の結果とも一致しているので、本発明のプロモーター解析の有効性を示している。【００２９】
実施例３
本実施例では、ノックイン基本ベクター（ｐＫＩＮ２）（図１１）に５'及び３'の相同領域をクローン化した後、５'相同領域とレポーター遺伝子の結合部位の制限酵素部位の配列を取り除いた。Chaveroche らの方法（Nucleic Acids Res., 28:e97 (2000)）を基に、ｐＫＯＢＥＧプラスミッドを導入した大腸菌にアラビノースを添加することで菌内での相同組換えを誘発し、目的の塩基配列に置換した。具体的には図１２に示すように制限酵素部位  ＳｒｆＩ  を含むプラスミッドとｐＫＯＢＥＧプラスミッドの両方を持った大腸菌をアラビノースにて相同組換えを誘発し、ＳｒｆＩ部位を持たない人工的なオリゴＤＮＡを形質転換した。このとき用いたオリゴＤＮＡの配列はセンス鎖が5' ctccaaaaagtttggaggggcggtttaagaaggttcatctgacccccacaATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACG 3（配列番号１３）'、アンチセンス鎖が 5' CGTCGAGTTTTTTGATTTCACGGGTTGGGGTTTCTACAGGACGTAACATtgtgggggtcagatgaaccttcttaaaccgcccctccaaactttttggag 3'（配列番号１４）（小文字（センス鎖１〜５０番目及びアンチセンス鎖５０〜９９番目）は標的遺伝子のプロモーター配列、大文字（センス鎖５１〜９９番目及びアンチセンス鎖１〜４９番目）はＧＵＳレポーター遺伝子と相同な配列を示す。）を用い、人工的にアニーリングさせて、二本鎖ＤＮＡとして大腸菌に導入した。次に、以下のＰＣＲ反応を行い、合成ＤＮＡと置き変わったプラスミドを選抜した。
ＰＣＲ反応には、プライマー１：5'aggttcatctgacccccacaATG 3'（配列番号１５）及びプライマー２：5' CCGCCCTGATGCTCCATCACTTC 3'（配列番号１６）を用い、ＰＣＲ反応（９４．０℃  １分及び（９４．０℃  ３０秒、６８．１℃  ３０秒、７２．０℃  １分）を３０回繰り返す。）を行った。
合成ＤＮＡと置き変わったプラスミッドは、プロモーター領域を含む５'相同領域とレポーター遺伝子の結合部位に人為的な外来配列は存在せず、より自然な条件でプロモーター活性を測定、観察することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子のプロモーター解析のためのノックインターゲティングの模式図である。ｐＵｂｉはトウモロコシ・ユビキチン１プロモーター、ＤＴ-Ａはジフテリア毒素タンパク質Ａ鎖の遺伝子、ＧＵＳは大腸菌のＧＵＳ遺伝子、ｔＮＯＳはノパリンシンターゼターミネーター、ｌｏｘはバクテリオファージのＣｒｅ／ｌｏｘ組換え系のｌｏｘ配列、ｐＡｃｔはイネ・アクチンプロモーター、ｈｐｔはハイグロマイシン耐性遺伝子、ｔ３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター、Ｅｎ／ＳｐｍはＥｎ／Ｓｐｍ型トランスポゾンの転写終止領域及びｐ３５Ｓはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターを表す。なお、ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子のＡＴＧの５’側の３１０２ｂｐの配列と、ＡＴＧの３’側の３０９０ｂｐの配列は相同組換え領域を表す。
【図２】ノックインカルスのＧＵＳ染色の結果を示す図である。
【図３】３．１ｋｂのＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子プロモーターにＧＵＳレポーター遺伝子をつなげた従来のプロモーター解析用ベクターの構造を示す図である。
【図４】ランダム形質転換カルスのＧＵＳ染色の結果を示す図である。
【図５】ＯｓＭＥＴ１ｂ遺伝子のプロモーター解析のためのノックインターゲティングの模式図である。
【図６】ノックインターゲティングされた６個のカルスのＧＵＳ染色の結果を示す図である。
【図７】ノックイン再生植物体のＧＵＳ染色の結果を示す図である。
【図８】ＯｓＭＥＴ１ａ遺伝子のノックイン再生植物体のＧＵＳ染色の結果を示す図である。再分化後の３系統の植物体をＧＵＳ染色した解析の結果、頂端分裂組織、根端分裂組織、など分裂の盛んな組織で青色の強いＧＵＳ染色が観察された。
【図９】ＯｓＭＥＴ１ａとＯｓＭＥＴ１ｂの両遺伝子の発現様式をＲＴ-ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。
【図１０】ＯｓＭＥＴ１ａとＯｓＭＥＴ１ｂ遺伝子の構造とＲＴ-ＰＣＲためのプライマーの位置。
【図１１】ノックイン基本ベクター（ｐＫＩＮ２）の構造を示す図である。ｉＵｂｉはトウモロコシ・ユビキチン１第１イントロン、ｔＮＯＳはノパリンシンセターゼターミネーター、ｉＡｃｔはイネ・アクチン第１イントロン、及びｉＣａｔはヒマ・カタラーゼ遺伝子の第１イントロンを表し、その他は図１と同様を表す。
【図１２】λＲｅｄシステムを用い相同領域とレポーター遺伝子の結合部位の制限酵素部位を除去する方法を示す図である。除くべき制限酵素（ＳｒｆＩ）サイトの両側５０ｂｐづつ全体で１００ｂｐの長さで、ベクターと同一配列だが制限酵素サイトを持たない合成二本鎖オリゴヌクレオチドとベクターを３．３Ｘ１０６対１の割合で混ぜ、λＲｅｄシステム（Nucleic Acids Res., 28: e97 (2000); Trend Biochem. Sci., 26:325-331 (2001)）を用いて改変ベクターを得て、制限酵素サイトを持たないと増幅するようなスクリーニングをコロニーＰＣＲ反応により行い、最終的には改変ベクターの改変部分の塩基配列を決定して確認した。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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