(57)【要約】  血糖値を間接的に測定することによって食後高血糖を診断する新たな方法を提供する。リジンの側鎖アミノ基が糖化されたヘモグロビンのリジン糖化率（ＧＨｂＬｙｓ％）を測定することによって、食後高血糖を検出する。ＧＨｂＬｙｓ％の測定は、例えば、ヘモグロビンをプロテアーゼで切断し、得られたヘモグロビン切断物の側鎖アミノ基の糖化部分にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させ、前記糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの酸化還元反応を測定することによって決定できる。
2008018596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食後高血糖の診断のための食後高血糖マーカーであって、
リジン残基が糖化されたヘモグロビンを含むことを特徴とする食後高血糖マーカー。
【請求項２】
前記食後高血糖マーカーが、食後血糖値を反映した平均血糖値マーカーである、請求の範囲１記載の食後高血糖マーカー。
【請求項３】
食後高血糖マーカーの測定方法であって、
前記マーカーが請求の範囲１記載の食後高血糖マーカーであり、
前記食後高血糖マーカーの測定が、ヘモグロビンのリジン残基の糖化率の測定であることを特徴とする測定方法。
【請求項４】
前記リジン残基の糖化率の測定方法が、高速液体クロマトグラフィー法、免疫法、酵素法および電気泳動法からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲３記載の測定方法。
【請求項５】
前記リジン残基の糖化率の測定方法が、酵素法であって、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含む、請求の範囲３記載の測定方法。
（Ａ）  ヘモグロビンをプロテアーゼで切断する工程
（Ｂ）  得られたヘモグロビン切断物におけるリジン残基の糖化部分にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させる工程
（Ｃ）  前記糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの酸化還元反応を測定することにより、ヘモグロビンのリジン残基の糖化率を決定する工程
【請求項６】
前記ヘモグロビン切断物が、リジン、糖化されたリジン、リジン残基を含むペプチド、および、糖化されたリジン残基を含むペプチドからなる群から選択された少なくとも一つを含む、請求の範囲５記載の測定方法。
【請求項７】
前記ヘモグロビン切断物が、アミノ酸残基数２〜６個のペプチドを含む、請求の範囲５記載の測定方法。
【請求項８】
試料中に含まれる前記食後高血糖マーカーの検出方法であって、前記試料が、全血試料、血球試料、または、これらの溶血試料である、請求の範囲３記載の測定方法。
【請求項９】
ヘモグロビンの総量と、リジン残基が糖化されたヘモグロビンの量とから、前記ヘモグロビンのリジン糖化率を算出する、請求の範囲３記載の測定方法。
【請求項１０】
前記リジン残基が糖化されたヘモグロビンの量が、前記リジン残基の糖化量である、請求の範囲９記載の測定方法。
【請求項１１】
被検体が糖尿病を発症する危険度を決定する方法であって、
下記（ａ）工程を含むことを特徴とする危険度決定方法。
（ａ）  被検体から採取した血液試料について、請求の範囲３記載の測定方法により、ヘモグロビンのリジン残基の糖化率を測定することによって、請求の範囲１記載の食後高血糖マーカーを測定する工程
【請求項１２】
さらに（ｂ）工程を含む、請求の範囲１１記載の危険度決定方法。
（ｂ）  前記(ａ)工程において測定したヘモグロビンのリジン残基の糖化率を用いて、下記（ｂ１）〜（ｂ５）からなる群から選択された少なくとも一つの方法により、前記被検体が糖尿病を発症する危険度を決定する工程
（ｂ１）  健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と食後高血糖患者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率との境界値を評価基準として設定し、
前記評価基準よりも、前記(ａ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、危険度が相対的に高いと決定する。
（ｂ２）  健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と空腹時の健常者から採取した血液の血糖値との関係式に、空腹時の被検者から採取した血液の血糖値を代入して求めたヘモグロビンのリジン残基の糖化率の計算値を評価基準として設定し、
前記評価基準よりも、前記(ａ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、相対的に危険度が高いと決定する。
（ｂ３）  空腹時の被検体から採取した血液の血糖値を評価基準として設定し、
他方、健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と空腹時の健常者から採取した血液の血糖値との関係式に、前記（ａ）工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率を代入して、被検体の空腹時血糖値の計算値を求め、
前記評価基準よりも、被検体の空腹時血糖値の計算値が相対的に高い場合に、危険度が相対的に高いと決定する。
（ｂ４）  健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率との関係式に、被検者から採取した血液におけるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率を代入して求めたヘモグロビンのリジン残基の糖化率の計算値を評価基準として設定し、
前記評価基準よりも、前記(ａ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、危険度が相対的に高いと決定する。
（ｂ５）  被検体から採取した血液におけるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率を評価基準として設定し、
他方、健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率との関係式に、前記（ａ）工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率を代入して、被検体のヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率の計算値を求め、
前記評価基準よりも、被検体のヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸の糖化率の計算値が相対的に高い場合に、危険度が相対的に高いと決定する。
【請求項１３】
被検体の食後高血糖を診断する方法であって、
下記（ｃ）工程を含むことを特徴とする診断方法。
（ｃ）  被検体から採取した血液試料について、請求の範囲３記載の測定方法により、ヘモグロビンのリジン残基の糖化率を測定することによって、請求の範囲１記載の食後高血糖マーカーを測定する工程
【請求項１４】
さらに（ｄ）工程を含む、請求の範囲１３記載の診断方法。
（ｄ）  前記(ｃ)工程において測定したヘモグロビンのリジン残基の糖化率を用いて、下記（ｄ１）〜（ｄ５）からなる群から選択された少なくとも一つの方法により、前記被検体の食後高血糖を判断する工程
（ｄ１）  健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と食後高血糖患者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率との境界値を評価基準として設定し、
前記評価基準よりも、前記(ｃ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、食後高血糖と判断する。
（ｄ２）  健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と空腹時の健常者から採取した血液の血糖値との関係式に、空腹時の被検者から採取した血液の血糖値を代入して求めたヘモグロビンのリジン残基の糖化率の計算値を評価基準として設定し、
前記評価基準よりも、前記(ｃ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、食後高血糖と判断する。
（ｄ３）  空腹時の被検体から採取した血液の血糖値を評価基準として設定し、
他方、健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と空腹時の健常者から採取した血液の血糖値との関係式に、前記（ｃ）工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率を代入して、被検体の空腹時血糖値の計算値を求め、
前記評価基準よりも、被検体の空腹時血糖値の計算値が相対的に高い場合に、食後高血糖と判断する。
（ｄ４）  健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率との関係式に、被検者から採取した血液におけるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率を代入して求めたヘモグロビンのリジン残基の糖化率の計算値を評価基準として設定し、
前記評価基準よりも、前記(ｃ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、食後高血糖と判断する。
（ｄ５）  被検体から採取した血液におけるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率を評価基準として設定し、
他方、健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率との関係式に、前記（ａ）工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率を代入して、被検体のヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率の計算値を求め、
前記評価基準よりも、被検体のヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸の糖化率の計算値が相対的に高い場合に、食後高血糖と判断する。
【請求項１５】
請求の範囲３記載の食後高血糖マーカーの測定方法に使用するキットであって、
プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含むことを特徴とするマーカー測定用キット。
【請求項１６】
請求の範囲１１記載の糖尿病を発症する危険度の決定方法に使用するキットであって、
プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含むことを特徴とする危険度決定用キット。
【請求項１７】
請求の範囲１３記載の食後高血糖の診断方法に使用するキットであって、
プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含むことを特徴とする食後高血糖診断用キット。
【請求項１８】
食後血糖値を反映した平均血糖値の測定方法であって、
下記（ｘ）工程〜（ｙ）工程を含むことを特徴とする平均血糖値測定方法。
（ｘ）  平均血糖値マーカーを測定する工程であって、前記平均血糖値マーカーが、請求の範囲１記載のマーカーであり、被検体から採取した血液試料について、請求の範囲３記載の食後高血糖マーカーの測定方法により、ヘモグロビンのリジン残基の糖化率を測定する工程
（ｙ）  ヘモグロビンのリジン残基の糖化率と食後血糖値を反映した平均血糖値との関係式に、前記（ｘ）工程で測定したヘモグロビンのリジン残基の糖化率を代入して、食後血糖値を反映した平均血糖値を算出する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食後高血糖マーカー、その検出方法、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体の状態を示す指標として、各種タンパク質の糖化物について、糖化率の測定が行われている。中でも、血球中ヘモグロビン（Ｈｂ）の糖化物（以下、「Ｈｂ糖化物」ともいう）は、糖尿病の診断や治療等における重要な指標とされている。Ｈｂ糖化物には、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸（バリン）残基のα‐アミノ基にグルコースが結合したもの（以下、「ＨｂＡ１ｃ」ともいう）、Ｈｂのリジン残基の側鎖アミノ基にグルコースが結合したもの（以下、「ＧＨｂＬｙｓ」ともいう）、Ｈｂのアルギニン残基の側鎖アミノ基にグルコースが結合したもの等がある。特に、ＨｂＡ１ｃは、生体内血糖値の過去（約１〜２ヶ月）の履歴、具体的には、過去における普段の血糖値の平均値を反映することが知られている。ＨｂＡ１ｃの値（ＨｂＡ１ｃ％）は、通常、総Ｈｂ量（もしくは総ＨｂＡ量）に対するＨｂＡ１ｃ量の割合（％）で表され、例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率、もしくは、β鎖Ｎ末端アミノ基の糖化率ともいう。【０００３】
近年、糖尿病の初期段階である食後高血糖の検出が着目されている。食後高血糖とは、すなわち、空腹時の血糖値が正常範囲内（１１０ｍｇ／ｄＬ以下）であっても、食後約１〜２時間の血糖値が高くなる症状であり、一般的に、２時間後で１４０ｍｇ／ｄＬ以上とされている。この食後高血糖を放置すると、本格的な糖尿病に進行するおそれや、合併症、脳梗塞、心筋梗塞等の危険性が高まるという問題がある。したがって、糖尿病等の予防のために食後高血糖を検出することが重要になっている。しかしながら、食後高血糖の検出方法として採用される糖負荷試験は、例えば、患者にとって以下のような負担がかかる。まず、糖負荷試験を行うにあたって、患者は、検査前８時間以上（例えば、１４時間以上）絶食し、空腹の状態で、試験用のでんぷん加水分解物（ブドウ糖）７５ｇを服用する必要がある。その上、さらに、食後血糖は変化が早いことから、少なくとも、服用前、服用後３０分後、６０分後、１２０分後に採血を行い、血糖値を測定しなければならない。また、採取した血液試料中で血球細胞によるグルコース消化が起こるため、迅速な測定が可能である施設内で、この試験を行う必要がある。このような理由から、食後高血糖の検出のために、血中グルコースを直接的に測定することは、患者にとって、時間的、身体的にも負担がかかる。そこで、このような直接的な方法ではなく、間接的に食後血糖を判断できる方法が望まれている。【０００４】
しかしながら、前述のＨｂＡ１ｃは、糖尿病診断において非常に有効な指標ではあるが、あくまでも過去１〜２ヶ月の平均血糖値を反映するため、ＨｂＡ１ｃを指標として食後高血糖を検出することはできなかった。これは、以下のような原因によると考えられる。すなわち、短時間の血糖上昇では、ＨｂＡ１ｃの前駆体である不安定型ＨｂＡ１ｃは速やかに生成するが、不安定型ＨｂＡ１ｃから安定型ＨｂＡ１ｃは生成し難い。このため、安定型ＨｂＡ１ｃの測定によって、慢性的な高血糖は判断できても、食後のみに高血糖を示す食後高血糖は判断できないと考えられている（非特許文献１）。つまり、安定型ＨｂＡ１ｃは、過去における患者の普段の平均血糖値を示すものであって、食事に影響を受ける日内の血糖値変動が反映されないため、食後高血糖を把握するための指標にはならないということである。また、不安定型ＨｂＡ１ｃは、測定自体が困難であるため、不安定型ＨｂＡ１ｃの測定による食後高血糖の判断も実用的ではない。
【非特許文献１】Journal  of  Laboratory  and  Clinical  Medicine,  Vol  147,  1,  1-2006,  p21-26
【発明の開示】
【０００５】
そこで、本発明は、マーカーによって間接的に食後高血糖を検出すべく、新たな食後高血糖マーカーならびにその検出方法の提供を目的とする。
【０００６】
本発明は、食後高血糖の診断のための食後高血糖マーカーであって、リジン残基が糖化されたヘモグロビン（以下、「ＧＨｂＬｙｓ」ともいう）を含む。
【０００７】
本発明の食後高血糖マーカーの測定方法は、前記マーカーが、本発明の食後高血糖マーカー（ＧＨｂＬｙｓ）であり、前記食後高血糖マーカーの測定が、ヘモグロビン（以下、「Ｈｂ」ともいう）のリジン残基の糖化率の測定である。
【０００８】
本発明の危険度決定方法は、被検体が糖尿病を発症する危険度を決定する方法であって、下記（ａ）工程を含む。
（ａ）  被検体から採取した血液試料について、本発明の測定方法により、Ｈｂのリジン残基の糖化率を測定することによって、本発明の食後高血糖マーカーＧＨｂＬｙｓを測定する工程
【０００９】
本発明の診断方法は、被検体の食後高血糖を診断する方法であって、下記（ｃ）工程を含む。
（ｃ）  被検体から採取した血液試料について、本発明の測定方法により、Ｈｂのリジン残基の糖化率を測定することによって、本発明の食後高血糖マーカーＧＨｂＬｙｓを測定する工程
【００１０】
本発明の平均血糖値の測定方法は、食後血糖値を反映した平均血糖値の測定方法であって、下記（ｘ）〜（ｙ）を含むことを特徴とする。
（ｘ）  平均血糖値マーカーを測定する工程であって、前記平均血糖値マーカーが、本発明の食後高血糖マーカーであり、被検体から採取した血液試料について、本発明の食後高血糖マーカーの測定方法により、Ｈｂのリジン残基の糖化率を測定する工程
（ｙ）  Ｈｂのリジン残基の糖化率と食後血糖値を反映した平均血糖値との関係式に、前記（ｘ）工程で測定したＨｂのリジン残基の糖化率を代入して、食後血糖値を反映した平均血糖値を算出する工程
【００１１】
本発明のマーカー測定用キットは、本発明の食後高血糖マーカーの測定方法に使用するキットであって、プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含む。また、本発明のマーカー測定用キットは、本発明の平均血糖値の測定方法にも使用できる。
【００１２】
本発明の危険度決定用キットは、本発明の糖尿病を発症する危険度の決定方法に使用するキットであって、プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含む。
【００１３】
本発明の食後高血糖診断用キットは、本発明の食後高血糖の診断方法に使用するキットであって、プロテアーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含む。
【００１４】
本発明者らは、鋭意研究の結果、リジン残基の側鎖アミノ基が糖化されたヘモグロビン（ＧＨｂＬｙｓ）の糖化率が、食後高血糖と相関関係を示すことを、初めて見出した。糖化Ｈｂの一種であるＨｂＡ１ｃは、例えば、血糖値の動きに緩やかに応答して生成される。このため、数時間程度（例えば、５時間から１２時間）の高血糖が持続されなければ、前述のような安定型ＨｂＡ１ｃは生成し難く、ＨｂＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃ％）の上昇は確認されない。このため、ＨｂＡ１ｃの測定では、間接的に、過去約１〜２ヶ月の血糖値の履歴を検出できるにとどまり、食後高血糖を検出できなかった。これに対して、ＧＨｂＬｙｓは、例えば、食後数十分〜２時間程度という短時間であっても、高血糖状態に敏感に反応して生成され、また、血糖上昇と相関して、その量が増加することが、本発明者らによって明らかとなった。この新たな知見から、ＧＨｂＬｙｓを食後高血糖マーカーとして、その糖化率を測定することにより、食後高血糖を間接的に検出することが可能となったのである。食後高血糖は、いわゆる境界型糖尿病であり、この段階で十分な予防を図ることによって、糖尿病の進行の遅延や防止、合併症の抑制等が可能となる。このため、本発明により食後高血糖マーカーであるＧＨｂＬｙｓを検出すれば、例えば、食後高血糖であるか否かを判断できる。さらに、本発明の食後高血糖マーカーＧＨｂＬｙｓの測定により、例えば、糖尿病の発症危険度、すなわち、初期段階からの後期段階への進行の可能性を決定できる。したがって、本発明は、食後高血糖の診断や糖尿病の進行防止に極めて有用といえる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の実施例１において、グルコース添加血のインキュベート時間と血漿グルコース濃度との関係を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の前記実施例１において、グルコース添加血のインキュベート時間と血球ＨｂＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の前記実施例１において、グルコース添加血のインキュベート時間と血球不安定型ＨｂＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の前記実施例１において、グルコース添加血のインキュベート時間と血球ＧＨｂＬｙｓ％との関係を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例２において、ＨｂＡ１ｃ％と、グルコースとのインキュベーション時間との関係を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の前記実施例２において、ＧＨｂＬｙｓ％と、グルコースとのインキュベーション時間との関係を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例３において、全血の保存時間とＧＨｂＬｙｓ％との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
＜食後高血糖マーカー＞  本発明の食後高血糖マーカーは、前述のように、リジン残基が糖化されたヘモグロビン（ＧＨｂＬｙｓ）である。具体的には、リジン残基の側鎖アミノ基（ε−アミノ基）が糖化されたＨｂである。試料中のＧＨｂＬｙｓが食後高血糖の指標であることは、前述のように、本発明者らが初めて見出した事実である。このＧＨｂＬｙｓを食後高血糖マーカーとすることによって、後述のように、食後高血糖か否かもしくはその程度、さらに、糖尿病（中期や後期への進行）の危険性を判断できる。【００１７】
また、本発明において、ＧＨｂＬｙｓは、食後血糖値を反映した平均血糖値のマーカーでもある。前述のように、ＨｂＡ１ｃは、過去の血糖値の履歴を示す指標であるが、これは普段の血糖値の平均値と相関しており、日内変動は反映されていない。このため、食後に血糖値が上昇する場合（食後高血糖の場合）であっても、ＨｂＡ１ｃが指標となる平均血糖値には、それが反映されない。これに対して、ＧＨｂＬｙｓは、食後血糖値が反映された平均血糖値の指標となることが、本発明者らによって明らかとされた。このため、後述するように、本発明のマーカーＧＨｂＬｙｓを測定して、食後血糖値を反映した平均血糖値を算出することにより、例えば、食後高血糖であるか否かを判断することも可能となる。【００１８】
＜食後高血糖マーカーの測定＞  本発明の食後高血糖マーカーの測定方法は、前述のように、前記マーカーが、本発明の食後高血糖マーカーであり、前記食後高血糖マーカーの測定が、Ｈｂのリジン残基の糖化率の測定である。【００１９】
本発明において、Ｈｂのリジン残基の糖化率とは、通常、総Ｈｂに対するリジン残基が糖化されたＨｂの割合を意味し、具体的には、Ｈｂの総量（または濃度）に対するリジンが糖化されたＨｂの量（または濃度）の割合を意味する。リジン残基が糖化されたＨｂ量（または濃度）は、例えば、リジン残基の糖化量（または糖化濃度）である。そして、前述のように、ＧＨｂＬｙｓはリジン残基が糖化されたＨｂであることから、本発明において、Ｈｂのリジン残基の糖化率が、ＧＨｂＬｙｓの値といえる。本発明において、ＧＨｂＬｙｓ値である前記糖化率を、以下、ＧＨｂＬｙｓ％ともいう。【００２０】
本発明において、「総Ｈｂ」とは、例えば、ＨｂＡ、ＨｂＡ２およびＨｂＦ等のＨｂ全般を含むことを意味してもよいし、総ＨｂＡでもよい。なお、総Ｈｂは、例えば、糖化されていないＨｂと糖化されたＨｂとの両方を含む。また、本発明において、総Ｈｂとは、例えば、Ｈｂ中の総リジン残基でもよいし、Ｈｂ中の特定のリジン残基であってもよい。この場合も、総Ｈｂは、糖化されていないリジン残基と糖化されたリジン残基との両方を含む。【００２１】
本発明において、「リジン残基が糖化されたＨｂ」は、例えば、リジン残基が糖化されたＨｂＡを意味する。また、「リジン残基が糖化されたＨｂ」は、Ｈｂ中の糖化されたリジン残基、または、Ｈｂ中の糖化された特定のリジン残基であってもよい。すなわち、前記糖化率は、例えば、Ｈｂ中の総リジン残基に対する糖化されたリジン残基の割合や、Ｈｂ中の特定のリジン残基に対する糖化された特定のリジン残基の割合を意味してもよい。【００２２】
ＧＨｂＬｙｓ％は、例えば、下記式より算出できる。
ＧＨｂＬｙｓ％＝（ＧＨｂＬｙｓ／総Ｈｂ）×１００【００２３】
前記式において、ＧＨｂＬｙｓとしては、例えば、ＧＨｂＬｙｓ量（例えば、Ｈｂのリジン残基の糖化量）またはＧＨｂＬｙｓ濃度（例えば、Ｈｂのリジン残基の糖化濃度）があげられる。また、総Ｈｂとしては、例えば、Ｈｂの総量もしくはＨｂ濃度、または、ＨｂＡの総量もしくはＨｂＡ濃度があげられる。前記式に基づいて、例えば、Ｈｂのリジン残基の糖化量（Ｈｂのリジン残基の糖化濃度）と、試料中の総Ｈｂ量（Ｈｂ濃度）または総ＨｂＡ量（ＨｂＡ濃度）との比（１００分率）を算出することによって、ＧＨｂＬｙｓ％を求めることができる。【００２４】
食後高血糖とは、前述のように、一般的に、食後約１〜２時間の血糖値が高くなる症状をいい、通常、２００ｍｇ／ｄＬ以上で糖尿病、１４０ｍｇ／ｄＬ以上で境界型と分類される。本発明の測定方法によれば、食後約１〜２時間における血糖値（グルコース濃度）の測定に代えて、本発明の食後高血糖マーカーＧＨｂＬｙｓの測定によって、例えば、食後高血糖の判断が可能である。また、食後高血糖マーカーＧＨｂＬｙｓの測定によって、さらに、前述のように、食後血糖値を反映した平均血糖値への換算も可能である。【００２５】
本発明は、ＧＨｂＬｙｓ％が食後高血糖と相関関係を示すこと、すなわち、ＧＨｂＬｙｓ％の測定によって食後高血糖が検出できることを明らかにした点が特徴である。このため、ＧＨｂＬｙｓ％の測定方法自体は何ら制限されず、従来公知の測定方法が採用できる。ＧＨｂＬｙｓ％の測定方法としては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫法、酵素法、電気泳動法、質量分析法等があげられる。【００２６】
以下に、一例として、酵素法によるＧＨｂＬｙｓ％の測定方法を示す。本発明は、これらには制限されない。【００２７】
酵素法によるＧＨｂＬｙｓ％の測定方法は、例えば、下記（Ａ）〜（Ｃ）工程を含む。なお、プロテアーゼによる切断対象を「Ｈｂ」としているが、これは、糖化されたＨｂの意味も含む。また、切断物として得られるリジンやリジン残基を含むペプチドは、糖化されたリジンや、糖化されたリジン残基を含むペプチドの意味も含む。
（Ａ）  Ｈｂをプロテアーゼで切断する工程
（Ｂ）  得られたＨｂ切断物におけるリジン残基の糖化部分にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）を作用させる工程
（Ｃ）  前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することにより、Ｈｂのリジン残基の糖化率を決定する工程【００２８】
（Ａ）プロテアーゼ処理
Ｈｂからプロテアーゼによって切り出される切断物には、通常、リジン、糖化されたリジン（糖化リジン）、リジン残基を含むペプチド（リジンペプチド）、または、糖化されたリジン残基を含むペプチド（糖化リジンペプチド）が含まれる。Ｈｂにおいて糖化が確認されているリジン残基としては、例えば、α鎖の６１番目、４０番目、７番目、１６番目、1３９番目、１２７番目、β鎖の６６番目、１７番目、８番目、６１番目、６５番目、１３２番目、１４４番目等が報告されている。これらの中でも、糖化率の測定に特に有用なのは、例えば、α鎖の６１番目、４０番目、１２７番目、β鎖の６６番目、１７番目である（X.  Zhang  et  al.,  J.  Chromatogr.  B759  (2001)  1-15、R.  Shapiro  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  255  (1980)  3120）。前記プロテアーゼ処理によるＨｂの切断パターンは、制限されず、例えば、使用するプロテアーゼによって適宜決定できる。切り出されるペプチドの長さは、制限されず、プロテアーゼによって適宜設定できる。具体例としては、アミノ酸残基数が、例えば、２〜６個であり、より好ましくは２〜４個である。切り出されるペプチドの配列は、例えば、プロテアーゼの種類等によって異なるが、例えば、α鎖の１２７番目リジンを含むペプチドの場合、Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−ＰｈｅやＬｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ等が考えられる。【００２９】
前記プロテアーゼとしては、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Bacillus subtilis由来プロテアーゼ、Aspegillus oryzae由来プロテアーゼ等が使用でき、好ましくはエンドプロテアーゼである。市販品としては、例えば、メタロプロテアーゼ（アークレイ社製）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム社製）、パパインＭ−４０（天野エンザイム社製）、商品名プロテアーゼＮ（フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）、Bacillus属由来メタロプロテイナーゼ（東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。【００３０】
中でも、リジンもしくは糖化リジン、または、リジンペプチドもしくは糖化リジンペプチドを切り出す場合には、例えば、国際公開第２００２／００６５１９号パンフレットに記載のプロテアーゼ等を使用することが好ましい。これらのプロテアーゼは、例えば、後述する切断促進化合物の存在下で使用すれば、極めて迅速且つ特異的にＨｂの切断を行うことができる。【００３１】
Ｈｂの切断は、例えば、Ｈｂを含む試料へのプロテアーゼの添加によって行える。【００３２】
プロテアーゼ処理の反応液におけるプロテアーゼの添加割合は、例えば、０．００１〜３００,０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０.０１〜３０,０００ＫＵ／Ｌであり、特に好ましくは０.１〜１０，０００ＫＵ／Ｌである。前記反応液中のＨｂ濃度が０.００５ｍＭの場合、プロテアーゼの添加割合は、例えば、０.０１〜３００,０００ＫＵ/Ｌの範囲であり、好ましくは０.０５〜３０,０００ＫＵ／Ｌであり、特に好ましくは０.１〜１０,０００ＫＵ／Ｌである。ここで、プロテアーゼの活性「Ｕ」は、１分間に１マイクロモルのチロシンに相当する２７５ｎｍの吸光度の増加を与える酵素量を１Ｕとする。【００３３】
前記プロテアーゼ処理は、例えば、緩衝液中で行うことが好ましい。前記緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、リンゴ酸緩衝液等が使用できる。前記反応液のｐＨは、例えば、４〜１０の範囲であり、好ましくは６〜９である。前記ｐＨは、例えば、前述のような緩衝液によって調整してもよい。【００３４】
プロテアーゼ処理の条件は、制限されない。具体例として、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃、処理時間は、例えば、１〜１００分程度であり、好ましくは１〜１０分である。【００３５】
前記試料は、Ｈｂが含まれる試料であればよく、特に制限されない。具体例としては、例えば、全血試料、血球試料、それらの溶血試料等があげられる。全血試料や血球試料の溶血方法は、制限されず、例えば、浸透圧差を利用する方法、超音波による方法等が使用できる。浸透圧差を利用する場合、全血（または血球）に対して、例えば、２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させればよい。また、界面活性剤を試料に添加して溶血することもできる。【００３６】
前記プロテアーゼ処理は、例えば、以下に示すような促進化合物の存在下で行ってもよい。前記促進化合物の存在下で、Ｈｂをプロテアーゼ処理すれば、例えば、短時間でリジンやリジンペプチドを切り出すことができる。このため、例えば、プロテアーゼ処理の効率化・短縮化が可能になる。また、効率良いプロテアーゼ処理が可能であるため、例えば、処理に使用するプロテアーゼの増量も不要となる。なお、前記促進化合物によって、Ｈｂからリジンやリジンペプチドを効率良く切断できるメカニズムは不明であるが、前記促進化合物の共存により、Ｈｂがプロテアーゼで処理され易い構造に変化していると推測される。【００３７】
前記促進化合物としては、例えば、下記式（Ｉ）で表される化合物があげられる。
Ｒ−Ｘ      ・・・（Ｉ）【００３８】
前記式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数が９以上のアルキル基、置換アルキル基、アシル基または置換アシル基である。具体例としては、炭素数９〜１６の直鎖アルキル基もしくは直鎖アシル基、炭素数１０〜４０であり主鎖炭素数が９〜１６である分枝鎖アルキル基もしくは分枝鎖アシル基、または、シクロアルキルで置換された直鎖アルキル基等があげられる。シクロアルキルの炭素数は、例えば、３〜８であり、前記直鎖アルキル基は、シクロアルキルを除く直鎖の炭素数が、４〜１３であることが好ましい。前記シクロアルキルは、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロブチル等があげられる。【００３９】
前記式（Ｉ）において、Ｘは、糖残基である。前記糖残基は、例えば、単糖または二糖の残基が好ましい。前記単糖としては、例えば、マンノシド、グルコシド、チオグルコシド等があげられ、二糖としては、マルトシド、フルクトピラノシル-グルコピラノシド、チオマルトシド等があげられる。前記糖の構造は、例えば、α、β、Ｄ、Ｌのいずれでもよい。また、糖の環式構造に結合する水素や、ＯＨ基の水素は、例えば、Ｎａ、Ｋ、ハロゲン等で置換されてもよい。なお、本発明において、Ｒと糖残基の環式構造との結合を介している原子（例えば、−Ｏ−、−Ｓ−等）は、糖残基の構成要素とする。【００４０】
前記式（Ｉ）の促進化合物の具体例としては、例えば、以下のものがあげられる。例えば、ｎ-ドデシル-β-Ｄ-マルトシド（ｎ-ドデシル-β-Ｄ-マルトピラノシド）、６-シクロヘキシルヘキシル-β-Ｄ-マルトシド、スクロースモノラウレート（β-Ｄ-フルクトピラノシル-α-Ｄ-グルコピラノシドモノドデカノエート）、ｎ-デシル-β-Ｄ-マルトシド（ｎ-デシル-β-Ｄ-マルトピラノシド）、ｎ-ノニル-β-Ｄ-チオマルトシド（ｎ-ノニル-β-Ｄ-チオマルトシド）、５-シクロヘキシルペンチル-β-Ｄ-マルトシド、ウンデシル-β-Ｄ-マルトシド、ｎ-ドデシル-αβ-Ｄ-マルトシド、ヘキサデシル-β-Ｄ-マルトシド、および、３-オキサトリデシル-α-Ｄ-マンノシド等である。これらの化合物の化学式を以下に示す。これらの化合物は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。これらの中でも、前記式（Ｉ）におけるＲ（アルキル鎖）の炭素数が１２以上である、ｎ-ドデシル-β-Ｄ-マルトシド、スクロースモノラウレート、ヘキサデシル-β-Ｄ-マルトシド等が好ましい。また、Ｒの炭素数が同じ場合、例えば、炭素数が同じアルキル基とアシル基との場合、より好ましくはアシル基であり、ｎ-ドデシル-β-Ｄ-マルトシド（ｎ-ドデシル-β-Ｄ-マルトピラノシド）が好ましい。【００４１】
【化１】
2008018596.tif 000003
【化２】
2008018596.tif 000004
【００４２】
プロテアーゼ処理の前記反応液における前記促進化合物の添加割合は、例えば、０．０１〜２００ｍＭの範囲であり、好ましくは０．４〜１００ｍＭである。前記反応液中のＨｂ濃度が０．００５ｍＭの場合、前記促進化合物の添加割合は、例えば、０．４〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは１〜１００ｍＭである。なお、前記促進化合物とプロテアーゼとの添加順序は、制限されず、同時でもよいし、それぞれを順不同で添加することもできる。【００４３】
前記促進化合物を共存させる場合、プロテアーゼ処理の条件は、前述と同様に制限されない。処理時間は、制限されず、特に上限は制限されない。例えば、０.１〜６０分程度でプロテアーゼ処理を行うことができる。処理時間の具体例としては、例えば、０．１〜４５分が好ましく、より好ましくは０.２〜２０分、特に好ましくは０.２〜５分である。前記促進化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行えば、より迅速にアミノ酸やペプチドを切り出すことができる。このため、前述のような処理時間であっても、十分に切断処理が可能である。【００４４】
また、前記促進化合物としては、例えば、前記式（Ｉ）の化合物の他に、例えば、ニトロ化合物があげられる。前記ニトロ化合物は、いずれか一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。また、前記式（Ｉ）の化合物と併用してもよい。前記ニトロ化合物としては、例えば、亜硝酸やその塩があげられる。亜硝酸塩としては、特に制限されないが、例えば、亜硝酸カリウム、亜硝酸アミル、亜硝酸ブチル、ニトログリセリン、亜硝酸ナトリウム、パラニトロクロルベンゼン、トリニトロトルエン、ニトロベンゼン等があげられる。プロテアーゼ処理の前記反応液における前記ニトロ化合物の添加割合は、制限されない。具体例としては、例えば、前記反応液中のＨｂ濃度が０．００５ｍＭの場合、前記ニトロ化合物の添加割合は、例えば、０．００５ｍＭ以上が好ましく、より好ましくは０．０５〜２ｍＭである。また、前記促進化合物として、例えば、ＷＯ０２／２７０１２に示すようにテトラゾリウム化合物を用いてもよい。【００４５】
また、例えば、試料中のアスコルビン酸やタンパク質等の還元物質による影響を軽減するために、次工程のＦＡＯＤ処理に先立って、試料にテトラゾリウム化合物を添加することが好ましい（例えば、特開２０００-２１０１００号公報参照）。テトラゾリウム化合物の添加は、例えば、プロテアーゼ処理の前後いずれでもよい。前記テトラゾリウム化合物としては、特に制限されないが、例えば、以下のものがあげられる。例えば、2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium  salt、2-(4-iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium  salt、2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium  salt、2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium  salt、3,3’-(1,1’-biphenyl-4,4’-diyl)-bis(2,5-diphenyl)-2H-tetrazolium  salt、3,3’-[3,3’-dimethoxy-(1,1’-biphenyl)-4,4’-diyl]-bis[2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium  salt]、2,3-diphenyl-5-(4-chlorophenyl)tetrazolium  salt、2,5-diphenyl-3-(p-diphenyl)tetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-(p-diphenyl)tetrazolium  salt、2,5-diphenyl-3-(4-styrylphenyl)tetrazolium  salt、2,5-diphenyl-3-(m-tolyl)tetrazolium  salt、2,5-diphenyl-3-(p-tolyl)tetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-(2-thienyl)tetrazolium  salt、2-benzothiazoyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium  salt、2,2’-dibenzothiazolyl-5,5’-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3’-(3,3’-dimethoxy-4,4’-biphenylene)ditetrazolium  salt、3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-cyanotetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-carboxytetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-methyltetrazolium  salt、2,3-diphenyl-5-ethyltetrazolium  salt等である。これらの中でも特に好ましくは、2-(4-iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium  saltである。【００４６】
前記テトラゾリウム化合物の添加量は、特に制限されない。例えば、試料１μＬ当たり、０．００１〜１００μｍｏｌになるように添加することが好ましく、より好ましくは０．００５〜３０μｍｏｌの範囲、特に好ましくは、０．０１〜１０μｍｏｌの範囲である。【００４７】
（Ｂ）ＦＡＯＤ処理
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られたＨｂ切断物をＦＡＯＤで処理し、リジンの側鎖アミノ基（ε‐アミノ基）の糖化部分にＦＡＯＤを作用させる。このＦＡＯＤ処理によって、リジンのε‐アミノ基に結合した糖が遊離し、過酸化水素が生成される。【００４８】
ＧＨｂＬｙｓ％の測定方法に使用するＦＡＯＤは、例えば、少なくとも、アミノ酸側鎖のアミノ基（例えば、ε-アミノ基）が糖化されたアミノ酸またはペプチドに作用して、下記式（１’）に示す反応を触媒する酵素（ＦＡＯＤ−Ｓ）が好ましい。
Ｒ１-ＣＯ-ＣＨ２-ＮＨ-Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ  ＋  Ｏ２
→Ｒ１-ＣＯ-ＣＨＯ  ＋  ＮＨ２-Ｒ２  ＋  Ｈ２Ｏ２      …（１’） 【００４９】
前記式（１’）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−[ＣＨ（ＯＨ）]ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。【００５０】
前記式（１’）において、Ｒ２は下記式（４’）で示すことができる。下記式（４’）において「−（ＣＨ２）４−」は、リジンの側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。
−（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７    …（４’）【００５１】
また、前記式（４’）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５’）で示すことができる。なお、下記式（５’）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＣＯ−ＣＲ３Ｈ−ＮＨ）ｎ−Ｈ        …（５’）【００５２】
また、前記式（４’）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（４’）で示すことができる。なお、下記式（６’）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ          …（６’）【００５３】
前記糖化されたアミノ酸側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ−Ｓとしては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会  平成１２年度  「Fusarium oxysporum由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀  他」）等があげられる。【００５４】
なお、ＦＡＯＤは、さらに、前記式（１’）以外の基質特異性を有してもよい。このようなＦＡＯＤとしては、糖化されたα−アミノ基と糖化されたアミノ酸側鎖基との両方に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）があげられる。具体例としては、例えば、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９）等があげられる。このようなＦＡＯＤの場合、前記プロテアーゼとして、例えば、国際公開第２００２／００６５１９号パンフレット等に記載のプロテアーゼを組合せることが好ましい。前記プロテアーゼは、Ｎ末端のα位アミノ基が糖化されたアミノ酸を生成（遊離）し難いプロテアーゼである。すなわち、リジンやリジンを含むペプチドを特異的に切断するプロテアーゼである。このようなプロテアーゼと前記ＦＡＯＤ−αＳとを組合せることによって、例えば、ＦＡＯＤが、他の糖化部位（例えば、α位アミノ基の糖化部位）に作用することを抑制できる。【００５５】
なお、糖化されたα−アミノ基に作用するＦＡＯＤの触媒反応とは、例えば、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸またはペプチドに作用して、α−ケトアルデヒドおよび過酸化水素を発生する反応である。これは、前記式（１’）の反応において、Ｒ２が下記式（２）のアミノ酸残基またはペプチド残基として表される反応である。以下、このような反応を触媒する酵素を「ＦＡＯＤ−α」という。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４              …（２）【００５６】
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示す。Ｒ４は、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ                …（３）【００５７】
ＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましい。前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。ＦＡＯＤ処理の条件は、制限されない。反応液のｐＨは、例えば、６〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜３８℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０.１〜６０分、好ましくは０.１〜５分である。【００５８】
ＦＡＯＤ処理の反応液におけるＦＡＯＤの添加割合は、例えば、０.０１〜５０ＫＵ/Ｌの範囲であり、好ましくは０.５〜１０ＫＵ／Ｌである。ＦＡＯＤの活性「Ｕ」は、フルクトシルバリンまたはフルクトシルリジンを基質として１分間に１マイクロモルの過酸化水素を生成する量を１Ｕとする。【００５９】
（Ｃ）酸化還元反応の測定
つぎに、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応の測定を行う。この測定は、例えば、前記反応により生じる過酸化水素量の測定や、前記反応で消費される酸素量の測定があげられる。過酸化水素の測定や酸素の測定は、従来公知の技術により行うことが可能である。一例として、前記過酸化水素量は、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と酸化により発色する基質(以下、「発色基質」という)とを用いて測定できる。すなわち、ＰＯＤを触媒とする発色基質と過酸化水素との反応により前記基質を発色させ、この発色程度の測定により行うことができる。また、過酸化水素量は、例えば、ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、電気的手法等によって測定することもできる。【００６０】
前記発色基質としては、制限されず、例えば、N-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-4,4’-ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（商品名ＤＡ−６４、和光純薬工業社製）、N,N,N’,N’,N”,N”-ヘキサ（3-スルホプロピル）-4,4’,4”-トリアミノトリフェニルメタンヘキサナトリウム塩（例えば、商品名ＴＰＭ−ＰＳ、同仁化学社製）、10-（カルボキシメチルアミノカルボニル）-3,7-ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその塩（例えば、商品名ＤＡ−６７、和光純薬社製）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合わせた基質等があげられる。トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、４−アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。【００６１】
ＰＯＤ反応は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行われることが好ましい。前記緩衝液としては、例えば、前述のような緩衝液が使用できる。ＰＯＤ処理の条件は、特に制限されない。ＰＯＤ反応の反応液のｐＨは、例えば、５〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０.１〜５分である。【００６２】
前記反応液におけるＰＯＤの添加割合は、例えば、０.０１〜３００ＫＵ/Ｌの範囲であり、好ましくは０.５〜４０ＫＵ／Ｌである。また、前記反応液における発色基質の添加割合は、例えば、０.００１〜１０ｍＭの範囲であり、好ましくは０.００５〜２ｍＭである。ＰＯＤの活性「Ｕ」は、１分間に１マイクロモルのグアイヤコールを酸化できる量を１Ｕとする【００６３】
前記発色基質を用いた場合、例えば、その発色（例えば、反応液の吸光度）を分光光度計等で測定すればよい。具体的には、反応液の吸光度測定や透過率測定等があげられる。また、測定波長は制限されず、例えば、使用した発色基質の種類に応じて適宜決定できる。過酸化水素量（または過酸化水素濃度）は、例えば、Ｈｂにおけるリジンの糖化量（または糖化濃度）に対応する。このため、測定した吸光度から、Ｈｂのリジンの糖化量を算出できる。そして、下記式に示すように、このＨｂのリジンの糖化量（または糖化濃度）と試料中の全Ｈｂ量（Ｈｂ濃度）との比（１００分率）を算出することによって、ＧＨｂＬｙｓ％を求めることができる。なお、総Ｈｂ量は、従来公知の方法や、市販の試薬キットによって測定できる。
ＧＨｂＬｙｓ％＝（Ｈｂのリジンの糖化量/総Ｈｂ量）×１００【００６４】
吸光度からのＨｂのリジンの糖化量の算出は、例えば、検量線を用いることによって行える。前記検量線は、例えば、Ｈｂのリジンの既知糖化量と吸光度との関係をプロットした検量線がある。例えば、リジンの糖化量が既知であるＨｂ標準物について、前述と同様にして吸光度測定を行い、この標準物の吸光度測定値と既知糖化量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、この検量線に前述のように測定した吸光度を代入することによって、ＨｂのＬｙｓの糖化量が算出できる。【００６５】
また、前述のような促進化合物等の存在下で試料を処理した場合、同じ試料を用いることによって、Ｈｂ量をより正確に測定することができる。そして、これに伴い、ＧＨｂＬｙｓ％をより正確に求めることができる。すなわち、まず、プロテアーゼによるＨｂの切断に先立って、前記Ｈｂを含む試料に前記促進化合物を添加し、前記促進化合物を添加した試料の光学的変化量を測定する。そして、この光学的変化量から前記試料中のＨｂ量を算出する。他方、前記促進化合物が添加された前記試料中のＨｂをプロテアーゼによって切断した後、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することにより、Ｈｂのリジン糖化量を測定する。そして、前記Ｈｂ量と前記リジン糖化量とからＧＨｂＬｙｓ値（ＧＨｂＬｙｓ％）を求めることが好ましい。なお、Ｈｂ量は、前述のようにプロテアーゼ処理に先立って行ってもよいし、プロテアーゼ処理後に行ってもよい。【００６６】
この例では、プロテアーゼの添加に先立って、Ｈｂを含む試料に前記促進化合物を添加し、例えば、前記試料の吸光度測定を行う。そして、測定した吸光度と予め準備した検量線とからＨｂ量を求めればよい。このように、前記促進化合物でＨｂを処理しておけば、Ｈｂの量を容易かつ正確に求めることができる。そのメカニズムは不明であるが、前記促進化合物によって、Ｈｂの構造が変化し、不安定なＨｂの形状が安定化されているためと推測される。前記検量線は、例えば、既知Ｈｂ量（既知Ｈｂ濃度）である複数のＨｂ含有試料を前述の方法により測定し、これらの測定値と既知Ｈｂ量（既知Ｈｂ濃度）とから作成することができる。なお、吸光度の測定波長は特に制限されないが、例えば、４００〜６６０ｎｍの範囲であり、前記化合物による試料の処理時間は、例えば、０．２〜３０分の範囲である。この方法によりＨｂ測定を行う場合、試料への前記化合物の添加後であってプロテアーゼの添加前に吸光度測定を行う以外は、前述と同様にして引き続きプロテアーゼ処理等を行い、Ｈｂのリジンの糖化量（濃度）を求めることができる。このため、より簡便な測定方法となる。【００６７】
ＧＨｂＬｙｓ％の測定において、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合わせで各処理を同時に行ってもよい。また、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ＰＯＤ、発色基質の添加順序も特に制限されない。
１：溶血処理＋プロテアーゼ処理
２：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
３：ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
４：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理【００６８】
なお、ＧＨｂＬｙｓは、生体内ならびに採取した血液内等において安定である。このため、例えば、採血の時期や、採血後に測定を行う時期は、何ら制限されない。Ｈｂの寿命の間（一般に４ヶ月程度）、ＧＨｂＬｙｓは安定である。このため、例えば、従来のように、食事を基準にして決められた所定時間での採血や複数回の測定を行う必要がなく、任意に採血や測定を行うことができる。採血後の試料について、例えば、すぐにＧＨｂＬｙｓ％の測定を行ってもよいし、保存後に、ＧＨｂＬｙｓ％の測定を行ってもよい。【００６９】
ＧＨｂＬｙｓ％の測定方法は、このような酵素法には限定されず、前述のように、例えば、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法、質量分析法等であってもよい。例えば、まず、Ｈｂから、リジンまたはリジンを含むペプチドを切り出し、ＨＰＬＣによって、リジンの側鎖アミノ基が糖化された糖化物（糖化リジンまたは糖化リジンペプチド）と糖化されていない非糖化物（リジンまたはリジンペプチド）とに分離精製する。そして、この精製物を、キャピラリー電気泳動やＬＣ-ＭＳに供して、定量を行ってもよい。【００７０】
また、これらの方法においても、例えば、前述のように、リジンやリジンペプチドを特異的に切り出すプロテアーゼを使用したり、前記促進化合物存在下でプロテアーゼ処理を行ってもよい。これらの方法により、例えば、リジンや糖化リジン、リジンペプチドや糖化リジンペプチドを効率良く切り出すことができる。このため、例えば、切り出した糖化リジンや糖化リジンペプチドを抗原とする免疫法も有用である。また、ＨＰＬＣ法や電気泳動法での分離を向上することも可能である。なお、本発明は、食後高血糖マーカーとして、Ｈｂのリジン残基の糖化率（ＧＨｂＬｙｓ％）を測定することが特徴であって、ＧＨｂＬｙｓ％の測定方法自体は、何ら制限されない。【００７１】
＜食後高血糖マーカーの検出＞
本発明の食後高血糖マーカーの検出方法は、前記マーカーが本発明の食後高血糖マーカーであり、前記食後高血糖マーカーの検出が、Ｈｂのリジン残基の糖化の検出である。Ｈｂのリジンの糖化の検出は、前記食後高血糖マーカーの測定により行うことができる。【００７２】
＜糖尿病の危険度決定方法＞
本発明は、被検体が糖尿病を発症する危険度を決定する方法であって、下記（ａ）工程を含む。
（ａ）  被検体から採取した血液試料について、本発明の測定方法により、Ｈｂのリジン残基の糖化率を測定することによって、本発明の食後高血糖マーカーを測定する工程【００７３】
前述のように、ＧＨｂＬｙｓ％が食後高血糖と相関関係を示すことが、本発明者らにより明らかとされた。そして、前述のように、食後高血糖は、糖尿病の初期段階であることが知られている。このため、任意の時の患者血液におけるＧＨｂＬｙｓ％の測定によって、例えば、糖尿病を発生する危険度の有無や、危険度の程度（糖尿病中期および後期への進行等）を決定できる。前記被検体としては、制限されず、例えば、ヒト、ヒトを除く哺乳類、その他の動物があげられる。【００７４】
本発明の危険度決定方法において、さらに、下記（ｂ）工程を含むことが好ましい。なお、後述する（ｂ１）〜（ｂ５）は、危険度の判断方法の具体例であるが、本発明は、これらには限定されない。
（ｂ）  前記（ａ）工程において測定したＨｂのリジン残基の糖化率を用いて、下記（ｂ１）〜（ｂ５）からなる群から選択された少なくとも一つの方法により、前記被検体が糖尿病を発症する危険度を決定する工程【００７５】
（ｂ１）は、健常者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率と食後高血糖患者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率との境界値を評価基準として設定し、前記評価基準よりも、前記(ａ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、糖尿病発症の危険度が相対的に高いと決定する方法である。【００７６】
この方法の具体例を示す。予め、評価基準となる境界値の設定を行う。まず、健常者と食後高血糖患者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。そして、これらの結果から、健常者の測定値ＧＨｂＬｙｓ％と食後高血糖患者の測定値ＧＨｂＬｙｓ％との境界値を決定し、前記境界値を評価基準とする。ここで設定した評価基準は、一般的な評価基準値として用いることができる。このため、例えば、被検体について危険度の決定を行う度に、評価基準（境界値）を設定することは不要である。他方、危険度の決定が求められる被検者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。そして、この測定値と前記評価基準とを比較する。この測定値が前記評価基準より高い値を示した場合（測定値＞境界値）は、糖尿病の危険性が相対的に高いと判断し、前記評価基準より低い値を示した場合（測定値＜境界値）は、糖尿病の危険性が相対的に低いと判断する。【００７７】
境界値を決定するための健常者と食後高血糖患者とは、例えば、従来公知の方法による血糖値の測定によって分類できる。前記方法としては、例えば、試験用のでんぷん加水分解物７５ｇ（例えば、商品名トレーランＧ７５；味の素社製）を空腹時に服用して、食後３０分から２時間の血糖値を測定する方法があげられる（日本糖尿病学会「糖負荷試験における糖尿病診断基準委員会の指針」）。【００７８】
（ｂ２）は、健常者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率と空腹時の健常者から採取した血液の血糖値との関係式に、空腹時の被検者から採取した血液の血糖値を代入して求めたＨｂのリジン残基の糖化率の計算値を評価基準として設定し、前記評価基準よりも、前記(ａ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率（ＧＨｂＬｙｓ％）が相対的に高い場合に、相対的に危険度が高いと決定する方法である。【００７９】
この方法の具体例を示す。予め、評価基準の設定を行う。まず、健常者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。また、前記健常者について、空腹時の血液を採取し、空腹時血糖値を測定する。そして、健常者のＧＨｂＬｙｓ％と、健常者の空腹時の血糖値との関係式を求めておく。前記関係式としては、例えば、「ＧＨｂＬｙｓ％＝（ａ×空腹時血糖値）＋ｂ」のような一次式等を用いることができる。ここで求めた関係式は、一般的な評価の標準式として用いることができる。このため、例えば、被検体について危険度の決定を行う度に、関係式を求めることは不要である。つぎに、危険度の決定が求められる被験者について、空腹時血糖値を測定する。先に求めた関係式を用いて、前記被験者の空腹時血糖値（測定値）からＧＨｂＬｙｓ％計算値を求める。このＧＨｂＬｙｓ％計算値を評価基準とする。他方、前記被検者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。そして、この測定値と前記評価基準（ＧＨｂＬｙｓ％計算値）とを比較する。このＧＨｂＬｙｓ％測定値が、評価基準よりも高い値を示した場合（測定値＞ＧＨｂＬｙｓ％計算値）は、糖尿病の危険性が相対的に高いと判断し、前記評価基準より低い値を示した場合（測定値＜ＧＨｂＬｙｓ％計算値）は、糖尿病の危険性が相対的に低いと判断する。【００８０】
なお、ＧＨｂＬｙｓ％測定に使用する血液試料は、前述のように制限されず、任意の時に採取できる。また、合わせて空腹時血糖値を測定する場合、例えば、空腹時血液試料を用いてＧＨｂＬｙｓ％を測定してもよい。【００８１】
空腹時血糖値は、例えば、前回の食事から１０〜１４時間後の血液試料について、従来公知の方法により測定することが好ましい。具体例としては、前回の食事を２０時（もしくは２２時）までに済ませ、当日の８時以降に血液試料を採取する方法が、一般的である。【００８２】
（ｂ３）は、空腹時の被検体から採取した血液の血糖値を評価基準として設定し、他方、健常者から採取した血液におけるヘモグロビンのリジン残基の糖化率と空腹時の健常者から採取した血液の血糖値との関係式に、前記（ａ）工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率を代入して、被検体の空腹時血糖値の計算値を求め、前記評価基準よりも、被検体の空腹時血糖値の計算値が相対的に高い場合に、危険度が相対的に高いと決定する方法である。【００８３】
この方法の具体例を示す。予め、評価基準の設定を行う。危険度の決定が求められる被験者について、空腹時に血液試料を採取し、空腹時血糖値を測定する。この空腹時血糖を評価基準とする。他方、健常者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。また、前記健常者について、空腹時の血液を採取し、空腹時血糖値を測定する。そして、健常者のＧＨｂＬｙｓ％と、健常者の空腹時の血糖値との関係式を求めておく。前記関係式としては、前記（ｂ２）と同様に、例えば、「ＧＨｂＬｙｓ％＝（ａ×空腹時血糖値）＋ｂ」のような一次式等を用いることができる。この関係式は、前述と同様に、一般的な評価の標準式として用いることができる。このため、例えば、被検体について危険度の決定を行う度に、関係式を求めることは不要である。続いて、危険度の決定が求められる前記被験者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。先に求めた関係式を用いて、前記被験者の測定値ＧＨｂＬｙｓ％から、空腹時血糖値の計算値を求める。この被験者のＧＨｂＬｙｓ％から求めた空腹時血糖値の計算値が、前記評価基準よりも高い値を示した場合（計算値＞測定した空腹時血糖値）は、糖尿病の危険性が相対的に高いと判断し、前記評価基準より低い値を示した場合（計算値＜測定した空腹時血糖値）は、糖尿病の危険性が相対的に低いと判断する。【００８４】
なお、ＧＨｂＬｙｓ％測定に使用する血液試料は、前述のように制限されず、任意の時に採取できる。また、合わせて空腹時血糖値を測定する場合、空腹時血液試料を用いてＧＨｂＬｙｓ％を測定してもよい。【００８５】
（ｂ４）は、健常者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率と健常者から採取した血液におけるＨｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率との関係式に、被検者から採取した血液におけるＨｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率を代入して求めたＨｂのリジン残基の糖化率の計算値を評価基準として設定し、前記評価基準よりも、前記(ａ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、危険度が相対的に高いと決定する方法である。【００８６】
この方法の具体例を示す。予め、評価基準の設定を行う。まず、健常者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。また、前記健常者について、任意の時に血液試料を採取し、ＨｂＡ１ｃ％を測定する。そして、健常者のＧＨｂＬｙｓ％と、健常者のＨｂＡ１ｃ％との関係式を求めておく。前記関係式としては、例えば、「ＧＨｂＬｙｓ％＝（ａ×ＨｂＡ１ｃ％）＋ｂ」のような一次式等を用いることができる。ここで求めた関係式は、一般的な評価の標準式として用いることができる。このため、例えば、被検体について危険度の決定を行う度に、関係式を求めることは不要である。つぎに、危険度の決定が求められる被験者について、任意の時に血液試料を採取し、ＨｂＡ１ｃ％を測定する。先に求めた関係式を用いて、前記被験者のＨｂＡ１ｃ％測定値からＧＨｂＬｙｓ％計算値を求める。このＧＨｂＬｙｓ％計算値を評価基準とする。他方、前記被検者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。そして、この測定値と前記評価基準（ＧＨｂＬｙｓ計算値）とを比較する。このＧＨｂＬｙｓ％測定値が、前記評価基準よりも高い値を示した場合（測定値＞ＧＨｂＬｙｓ計算値）は、糖尿病の危険性が相対的に高いと判断し、前記評価基準より低い値を示した場合（測定値＜ＧＨｂＬｙｓ計算値）は、糖尿病の危険性が相対的に低いと判断する。【００８７】
なお、ＧＨｂＬｙｓ％測定に使用する血液試料は、前述のように制限されず、任意の時に採取できる。また、ＨｂＡ１ｃ％測定に使用する血液試料も、制限されず、任意の時に採取できる。ＨｂＡ１ｃ％とＧＨｂＬｙｓ％とを測定する場合、同じ血液試料を用いて両者を測定することもできる。また、ＨｂＡ１ｃ％の測定方法については後述する。【００８８】
（ｂ５）は、被検体から採取した血液におけるＨｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率を評価基準として設定し、他方、健常者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率と前記Ｈｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率との関係式に、前記（ａ）工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率を代入して、被検体のＨｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率の計算値を求め、前記評価基準よりも、被検体のヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸の糖化率の計算値が相対的に高い場合に、危険度が相対的に高いと決定する方法である。【００８９】
この方法の具体例を示す。予め、評価基準の設定を行う。危険度の決定が求められる被験者について、任意の時に血液試料を採取し、ＨｂＡ１ｃ％を測定する。このＨｂＡ１ｃ％測定値を評価基準とする。他方、健常者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。また、健常者について、任意の時に血液試料を採取し、ＨｂＡ１ｃ％を測定する。そして、健常者のＧＨｂＬｙｓ％と、健常者のＨｂＡ１ｃ％との関係式を求めておく。前記関係式としては、前記（ｂ４）と同様に、例えば、「ＧＨｂＬｙｓ％＝（ａ×ＨｂＡ１ｃ％）＋ｂ」のような一次式等を用いることができる。この関係式は、前述と同様に、一般的な評価の標準式として用いることができる。このため、例えば、被検体について危険度の決定を行う度に、関係式を求めることは不要である。つぎに、危険度の決定が求められる前記被験者について、任意の時に血液試料を採取し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。先に求めた関係式を用いて、前記被験者のＧＨｂＬｙｓ％測定値から、ＨｂＡ１ｃ％の計算値を求める。この測定値（ＨｂＡ１ｃ％）と前記評価基準（ＨｂＡ１ｃ％計算値）とを比較する。この測定値（ＨｂＡ１ｃ％）が、前記評価基準（ＨｂＡ１ｃ％計算値）よりも低い値を示した場合（測定値＜ＨｂＡ１ｃ％計算値）は、糖尿病の危険性が相対的に高いと判断し、前記評価基準（ＨｂＡ１ｃ％計算値）より高い値を示した場合（測定値＞ＨｂＡ１ｃ％計算値）は、糖尿病の危険性が相対的に低いと判断する。【００９０】
なお、ＧＨｂＬｙｓ％測定に使用する血液試料は、前述のように制限されず、任意の時に採取できる。また、ＨｂＡ１ｃ％測定に使用する血液試料も、制限されず、任意の時に採取できる。ＨｂＡ１ｃ％とＧＨｂＬｙｓ％とを測定する場合、同じ血液試料を用いて両者を測定することもできる。【００９１】
これらの他にも、例えば、被検者のＨｂＡ１ｃ％とＧＨｂＬｙｓ％とを測定し、両者の差（ＧＨｂＬｙｓ％−ＨｂＡ１ｃ％）や比率（ＧＨｂＬｙｓ％／ＨｂＡ１ｃ％）を単に計算して診断することも可能である。【００９２】
さらに、これらの診断においては、例えば、相対的に差が大きいほど、糖尿病の危険性が高いことを示すといえる。具体的には、例えば、空腹時血糖値の計算値と空腹時血糖値の測定値との差、ＧＨｂＬｙｓ％計算値とＧＨｂＬｙｓ％測定値との差、ＨｂＡ１ｃ％計算値とＨｂＡ１ｃ％測定値との差、ＧＨｂＬｙｓ％とＨｂＡ１ｃ％の比率等であり、これらの差や比率が相対的に大きいほど、糖尿病の危険性が高いと判断することができる。【００９３】
また、本発明においては、例えば、ＧＨｂＬｙｓの測定だけでなく、あわせて、ＨｂＡ１ｃの測定を行うことが好ましい。ＨｂＡ１ｃを測定することによって、例えば、ＧＨｂＬｙｓ測定により、被検者の糖尿病の危険度を判断するだけでなく、すでに糖尿病を患っているか否かも判断することが可能である。【００９４】
＜食後高血糖の診断＞
本発明は、被検体の食後高血糖を診断する方法であって、下記（ｃ）工程を含む、診断方法である。
（ｃ）  被検体から採取した血液試料について、本発明の測定方法により、Ｈｂのリジン残基の糖化率を測定することによって、本発明の食後高血糖マーカーを測定する工程【００９５】
前述のように、ＧＨｂＬｙｓ％が食後高血糖と相関関係を示すことが、本発明者らにより明らかとされた。このため、任意の時の患者血液におけるＧＨｂＬｙｓ％を測定することによって、食後高血糖か否かを決定することができる。【００９６】
本発明の食後高血糖診断方法において、さらに、下記（ｄ）工程を含むことが好ましい。なお、後述する（ｄ１）〜（ｄ５）は、食後高血糖の判断方法の具体例であるが、本発明は、これらには限定されない。
（ｄ）  前記(ｃ)工程において測定したＨｂのリジン残基の糖化率を用いて、下記（ｄ１）〜（ｄ５）からなる群から選択された少なくとも一つの方法により、前記被検体の食後高血糖を判断する工程【００９７】
（ｄ１）は、健常者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率と食後高血糖患者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率との境界値を評価基準として設定し、前記評価基準よりも、前記(ｃ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、被検体を食後高血糖と判断する方法である。前記（ｄ１）は、前述の（ｂ１）と同様に行うことができる。具体的には、被検体のＧＨｂＬｙｓ％測定値が前記評価基準より高い値を示した場合（測定値＞境界値）は、食後高血糖の可能性が相対的に高いと判断し、前記評価基準より低い値を示した場合（測定値＜境界値）は、食後高血糖の可能性が相対的に低いと判断する。【００９８】
（ｄ２）は、健常者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率と空腹時の健常者から採取した血液の血糖値との関係式に、空腹時の被検者から採取した血液の血糖値を代入して求めたＨｂのリジン残基の糖化率の計算値を評価基準として設定し、前記評価基準よりも、前記(ｃ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、前記被検体を食後高血糖と判断する方法である。前記（ｄ２）は、前述の（ｂ２）と同様に行うことができる。具体的には、被検体のＧＨｂＬｙｓ％測定値が、前記評価基準よりも高い値を示した場合（測定値＞ＧＨｂＬｙｓ％計算値）は、食後高血糖の可能性が相対的に高いと判断し、前記評価基準より低い値を示した場合（測定値＜ＧＨｂＬｙｓ％計算値）は、食後高血糖の可能性が相対的に低いと判断する。【００９９】
（ｄ３）は、空腹時の被検体から採取した血液の血糖値を評価基準として設定し、他方、健常者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率と空腹時の健常者から採取した血液の血糖値との関係式に、前記（ｃ）工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率を代入して、被検体の空腹時血糖値の計算値を求め、前記評価基準よりも、被検体の空腹時血糖値の計算値が相対的に高い場合に、食後高血糖と判断する方法である。前記（ｄ３）は、前述の（ｂ３）と同様に行うことができる。具体的には、被検体の空腹時血糖値の計算値が、前記評価基準（空腹時血糖値の測定値）よりも高い値を示した場合（計算値＞測定値）は、食後高血糖の可能性が相対的に高いと判断し、前記評価基準（空腹時血糖値の測定値）より低い値を示した場合（計算値＜測定値）は、食後高血糖の可能性が相対的に低いと判断する。【０１００】
（ｄ４）は、健常者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率と健常者から採取した血液におけるＨｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率との関係式に、被検者から採取した血液におけるＨｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率を代入して求めたＨｂのリジン残基の糖化率の計算値を評価基準として設定し、前記評価基準よりも、前記(ｃ)工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率が相対的に高い場合に、前記被検体を食後高血糖と判断する方法である。前記（ｄ４）は、前述の（ｂ４）と同様に行うことができる。具体的には、被検体のＧＨｂＬｙｓ％測定値が、前記評価基準（ＧＨｂＬｙｓ％計算値）よりも高い値を示した場合（測定値＞計算値）は、食後高血糖の可能性が相対的に高いと判断し、前記評価基準（ＧＨｂＬｙｓ％計算値）より低い値を示した場合（測定値＜計算値）は、食後高血糖の可能性が相対的に低いと判断する。【０１０１】
（ｄ５）は、被検体から採取した血液におけるＨｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率を評価基準として設定し、他方、健常者から採取した血液におけるＨｂのリジン残基の糖化率と前記Ｈｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率との関係式に、前記（ａ）工程において測定した被検体のリジン残基の糖化率を代入して、被検体のＨｂのβ鎖Ｎ末端アミノ酸残基の糖化率の計算値を求め、前記評価基準よりも、被検体のヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端アミノ酸の糖化率の計算値が相対的に高い場合に、食後高血糖と判断する方法である。前記（ｄ５）は、前述の（ｂ５）と同様に行うことができる。具体的には、被検体のＨｂＡ１ｃ％計算値が、前記評価基準（ＨｂＡ１ｃ％測定値）よりも高い値を示した場合（計算値＞測定値）は、食後高血糖の可能性が相対的に高いと判断し、前記評価基準（ＨｂＡ１ｃ％測定値）より低い値を示した場合（計算値＜測定値）は、食後高血糖の可能性が相対的に低いと判断する。【０１０２】
これらの他にも、例えば、被検者のＨｂＡ１ｃ％とＧＨｂＬｙｓ％とを測定し、両者の差（ＧＨｂＬｙｓ％−ＨｂＡ１ｃ％）や比率（ＧＨｂＬｙｓ％／ＨｂＡ１ｃ％）を単に計算して診断することも可能である。【０１０３】
さらに、これらの診断においては、相対的に差が大きいほど、食後高血糖の程度が高いことを示すといえる。具体的には、例えば、空腹時血糖値の計算値と空腹時血糖値の測定値との差、ＧＨｂＬｙｓ％計算値とＧＨｂＬｙｓ％測定値との差、ＨｂＡ１ｃ％計算値とＨｂＡ１ｃ％測定値との差、ＧＨｂＬｙｓ％とＨｂＡ１ｃ％の比率等であり、これらの差や比率が相対的に大きいほど、食後高血糖の程度が高いと判断することができる。【０１０４】
また、本発明においては、ＧＨｂＬｙｓの測定だけでなく、あわせて、ＨｂＡ１ｃの測定を行うことが好ましい。ＨｂＡ１ｃを測定することによって、例えば、ＧＨｂＬｙｓ測定により、被検者の食後高血糖を診断するだけでなく、すでに糖尿病を患っているか否かも判断することが可能である。【０１０５】
（ＨｂＡ１ｃ％の測定方法）
ＨｂＡ１ｃ％の測定方法は、制限されず、例えば、従来公知の方法（例えば、酵素法、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法、質量分析法等）が採用できる。一例として、以下に、酵素法による測定方法を示す。【０１０６】
酵素法によるＨｂＡ１ｃ％の測定方法は、例えば、Ｈｂをプロテアーゼ処理して、β鎖Ｎ末端バリンまたはβ鎖Ｎ末端バリンを含むペプチド（末端ペプチド）を切り出し、バリンのα−アミノ基の糖化部分にＦＡＯＤを作用させる以外は、前述のＧＨｂＬｙｓ％の測定方法と同様である。【０１０７】
前記プロテアーゼとしては特に制限されないが、前述のようなものが使用できる。中でも、β鎖Ｎ末端に特異的に作用してＮ末端ペプチドの切断を触媒するプロテアーゼが好ましく、例えば、特開２０００−３００２９４号公報、特開２００４−３４４０５２号公報等に開示されるプロテアーゼがあげられる。また、β鎖Ｎ末端バリンの切断を触媒するプロテアーゼとしては、例えば、国際公開第２０００／５０５７９号パンフレット（日本国特許３６６８８０１）、国際公開第２０００／６１７３２号パンフレット、特開２００２−３１５６００号公報等に開示されているプロテアーゼがあげられる。【０１０８】
ＨｂＡ１ｃの測定方法に使用するＦＡＯＤは、特に制限されないが、α-アミノ基が糖化されたアミノ酸またはペプチドに作用して、α-ケトアルデヒドおよび過酸化水素を発生する反応を触媒する酵素（前記ＦＡＯＤ−α）が好ましい。【０１０９】
このようなＦＡＯＤ−αの具体例としては、例えば、商品名ＦＰＯＸ-ＣＥ（キッコーマン社製）、商品名ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）、国際公開第２００４／０２９２５１号パンフレットに記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ、特開２００４−２７５０１３号公報や特開２００４−２７５０６３号公報記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ、ペニシリウム属由来のＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６号公報）等が使用できる。【０１１０】
プロテアーゼ処理によって、例えば、Ｈｂβ鎖Ｎ末端からフルクトシルＶａｌ-Ｈｉｓが切り出された場合、このＦＡＯＤ処理によって、Ｖａｌのα-アミノ基に結合した糖が遊離し、α-ケトアルデヒド（糖残基）、Ｖａｌ-Ｈｉｓおよび過酸化水素が生成される。【０１１１】
そして、例えば、下記式からＨｂＡ１ｃ値を算出することができる。ＨｂＡ１ｃ値は、例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端バリンの糖化率であり、ＨｂＡ１ｃ％ともいう。      ＨｂＡ１ｃ％＝（ＨｂＡ１ｃ/総Ｈｂ）×１００【０１１２】
前記式において、ＨｂＡ１ｃとしては、例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端バリンの糖化量（または糖化濃度）があげられる。また、総Ｈｂとしては、例えば、Ｈｂの総量（もしくはＨｂ濃度）もしくはＨｂＡの総量（もしくはＨｂＡ濃度）、または、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端バリンの総量（糖化されたバリンを含む）があげられる。前記式に示すように、例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端バリンの糖化量（ＨｂＡ１ｃ濃度）と、試料中の総Ｈｂ量（Ｈｂ濃度）との比（１００分率）を算出することによって、ＨｂＡ１ｃ％を求めることができる。【０１１３】
前記糖化量の算出は、ＨｂのＬｙｓの糖化量と同様に、例えば、発色基質の発色程度を測定することにより行うことができる。具体的には、例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端の既知糖化量と吸光度との関係をプロットした検量線を用いることによって行える。例えば、β鎖Ｎ末端糖化量が既知であるＨｂ標準物について、前述と同様にして吸光度測定を行い、この標準液の吸光度測定値と既知糖化量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、この検量線に前述のように測定した吸光度を代入することによって、β鎖Ｎ末端の糖化量が算出できる。【０１１４】
（ＨｂＡ１ｃとＧＨｂＬｙｓの測定）
ＨｂＡ１ｃおよびＧＨｂＬｙｓは、例えば、ＦＡＯＤの基質特異性を利用することによって、同じ試料を用いて連続的に測定することも可能である。すなわち、Ｈｂを含む試料をプロテアーゼ処理し、β鎖Ｎ末端バリンもしくはβ鎖Ｎ末端ペプチドと、リジンもしくはリジンを含むペプチドとを切り出す。そして、まず、α-アミノ基の糖化部分（例えば、バリンの糖化部分）に特異的に作用し且つアミノ酸側鎖の糖化部分には作用し難いＦＡＯＤ−αで処理することによって、ＨｂＡ１ｃを測定する。その後、さらに、リジン側鎖の糖化部分に特異的に作用し且つα−アミノ基の糖化部分には作用し難いＦＡＯＤ−Ｓで処理することによって、ＧＨｂＬｙｓを測定すればよい。また、ＦＡＯＤの処理順序は、これには制限されず、例えば、ＦＡＯＤ−Ｓで処理することによってＧＨｂＬｙｓを測定した後、ＦＡＯＤ−αで処理することによってＨｂＡ１ｃを測定してもよい。【０１１５】
また、全血試料を用いて血球内Ｈｂの糖化率を測定する場合、前述のような促進化合物を使用することによって、さらに以下のような効果を得ることも可能である。血球内タンパク質の糖化率の測定にあたって、通常、全血試料に溶血処理が施され、溶血試料として使用される。この際、溶血試料中には血清中の糖化タンパク質（例えば、糖化アルブミン）が共存する。しかし、前記促進化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行えば、メカニズムは不明であるが、前述のような糖化Ｈｂの切断は促進されるものの、糖化アルブミンの切断は抑制される。このため、例えば、試料中に糖化アルブミン等が混在し、その糖化部位にもＦＡＯＤが作用するという問題も回避でき、測定精度をより一層向上することが可能である。なお、このような問題は、例えば、プロテアーゼがＨｂにもアルブミンにも作用し、且つ、後に添加するＦＡＯＤが、いずれのタンパク質切断物にも作用する場合に生じるものである。したがって、この問題は、前述のように目的タンパク質の目的部位（ＦＡＯＤが作用する糖化アミノ酸や糖化ペプチド）を選択的に切り出すプロテアーゼを選択することによっても解消できる。【０１１６】
＜平均血糖値の測定方法＞
本発明の平均血糖の測定方法は、食後血糖値を反映した平均血糖値の測定方法であって、下記（ｘ）〜（ｙ）を含むことを特徴とする。
（ｘ）  平均血糖値マーカーを測定する工程であって、前記平均血糖値マーカーが、本発明の食後高血糖マーカーであり、本発明の食後高血糖マーカーの測定方法により、Ｈｂのリジン残基の糖化率を測定する工程
（ｙ）  Ｈｂのリジン残基の糖化率と食後血糖値を反映した平均血糖値との関係式に、前記（ｘ）工程で測定したＨｂのリジン残基の糖化率を代入して、食後血糖値を反映した平均血糖値を算出する工程【０１１７】
前述のように、ＨｂＡ１ｃは、過去の普段の平均血糖値の指標であって、日内変動を反映した平均血糖値の指標とはならない。これに対して、本発明のマーカーは、食後血糖値を反映した平均血糖値の指標となることが明らかとなった。このため、本発明の平均血糖値マーカー（食後高血糖マーカー）を測定することによって、食後血糖値を反映した平均血糖値を算出することが可能となる。そして、この算出した平均血糖値が、例えば、健常者の平均血糖値よりも相対的に高い場合には、食後高血糖の可能性があると判断することができる。また、あわせてＨｂＡ１ｃの測定を行うことによって、より信頼性に優れる判断結果を得ることもできる。【０１１８】
前記関係式は、特に制限されないが、例えば、以下のようにして作成することができる。食後血糖値が異なる複数の患者から採血し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定する。一方、同じ複数の患者から、食後を含む所定のタイミングで複数回採血を行い、各血液サンプルについて血糖値を測定する。各サンプルの血糖値を合計して、各患者の平均値を算出する。この平均値が、食後の血糖値が反映された平均血糖値となる。なお、血糖値測定用サンプルの採血のタイミングは、例えば、早朝空腹時、就寝前、食直前、食直後、食後３０分、食後１時間、食後２時間である。そして、各患者について、ＧＨｂＬｙｓ％と食後血糖値が反映された平均血糖値とをプロットすることによって、検量線が作成できる。【０１１９】
＜キット＞
本発明のマーカー測定用キットは、前記本発明の食後高血糖マーカーの測定方法に使用するキットであって、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび酸化により発色する基質を含む。これを用いれば、前述の本発明の食後高血糖マーカーの測定方法を、簡易且つ簡便に行うことができる。本発明のキットにおける前記構成成分は、前述と同様のものが使用できる。また、本発明のキットは、本発明の食後高血糖マーカーの測定において使用できる前述の物質を、適宜含んでもよい。前記物質としては、例えば、前記促進化合物やテトラゾリウム化合物等があげられる。【０１２０】
本発明の危険度決定用キットは、本発明の糖尿病を発症する危険度の決定方法に使用するキットであり、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび酸化により発色する基質を含む。また、本発明の食後高血糖診断用キットは、本発明の食後高血糖の診断方法に使用するキットであって、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび酸化により発色する基質を含む。これらのキットの構成は、例えば、前記本発明のマーカー測定用キットと同様であってもよい。【０１２１】
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１２２】
実験の一日前に、グルコースを０．８５重量％生理食塩水に溶解して、所定濃度のグルコース溶液を調製した。前記濃度は、５００ｍＭ、９００ｍＭ、１９００ｍＭ、３５００ｍＭとした。ブランク（ＢＬＫ）は、０．８５重量％生理食塩水を使用した（グルコース濃度０ｍＭ）。【０１２３】
健常者の血液をヘパリンＮａ管に採取し、遠心分離によって血漿と血球とに分離した。分離した血球３ｍＬをスクリュー管（１３．５ｍｌ）に分取し、さらに、分離した血漿２．７ｍｌ、および、前記生理食塩水０．３ｍＬ（ブランク）または各グルコース溶液０．３ｍｌを、それぞれ混合して、グルコース添加血を調製した。なお、グルコース添加血におけるグルコース濃度は、それぞれ、０ｍＭ、５０ｍＭ、９０ｍＭ、１９０ｍＭ、３５０ｍＭとなる。これらのグルコース添加血をウェーブローダーで混合しながら３７度のインキュベーターで保温し、保温開始から所定時間（３時間、６時間、２４時間）後に、１．２５ｍｌずつ分取した。分取したグルコース添加血を遠心分離によって血球と血漿とに分離し、血漿を、糖化アルブミンとグルコース濃度の測定用試料とした。他方、分離した血球から０．６ｍｌを分取し、これに約１０倍体積量の１．３％（ｗ／ｖ）食塩水を添加し、室温で１０分間転倒混和して血球を洗浄した。その後、遠心分離によって血球と上清とに分離し、上清を除去した。前記血球を、再度、前記食塩水により洗浄し、回収した血球を、糖化Ｈｂの測定用試料とした。【０１２４】
ＨｂＡ１ｃおよび不安定型ＨｂＡ１ｃの測定は、前記血球試料をそのまま用いて、ＨＰＬＣ法であるＡＤＡＭＳ−Ａ１ｃ ＨＡ−８１６０（アークレイ社製）により行った。【０１２５】
一方、ＧＨｂＬｙｓの測定には、前記血球試料を下記溶血試薬で５１倍（体積）に希釈して調製した溶血試料を使用した。前記溶血試料２０μＬと下記プロテアーゼ試薬７６μＬとを混合して、３７℃で５分間インキュベートした。さらに、下記発色試薬１９μＬを添加して３７℃で３分間インキュベートして、３分間における吸光度増加量を測定した（波長７５１ｎｍおよび５７１ｎｍ）。吸光度測定には、自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８、日本電子社製）を使用した。７５１ｎｍの吸光度は、ＧＨｂＬｙｓ濃度を示し、５７１ｎｍの吸光度は、Ｈｂ濃度を示す。【０１２６】
【表１】
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【０１２７】
そして、予め作成したＨｂ濃度（ｇ／Ｌ）またはＧＨｂＬｙｓ濃度（ｇ／Ｌ）と、吸光度との関係を示す検量線に、測定したそれぞれの吸光度を代入してＧＨｂＬｙｓ濃度およびＨｂ濃度を求め、下記式からＧＨｂＬｙｓ％を算出した。なお、前記検量線は、Ｈｂ濃度（ｇ／Ｌ）およびＧＨｂＬｙｓ濃度（ｇ／Ｌ）が既知である検体群について、吸光度とＨｂ濃度（ｇ／Ｌ）またはＧＨｂＬｙｓ濃度（ｇ／Ｌ）とをプロットして作成した。
ＧＨｂＬｙｓ（％）＝（ＧＨｂＬｙｓ濃度／Ｈｂ濃度）×１００【０１２８】
グルコースの測定には、測定キットである商品名リキテックＧｌｕ  ＨＫ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）を使用し、前記キットのメーカーにより提示された分析パラメーターならびに使用説明書に基づいて測定した。なお、吸光度測定には、前記自動分析装置を使用した。【０１２９】
これらの結果を、図１〜４に示す。図１は、グルコース添加血のインキュベート時間と血漿グルコース濃度との関係を示すグラフである。図２は、グルコース添加血のインキュベート時間と血球ＨｂＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。図３は、グルコース添加血のインキュベート時間と血球不安定型ＨｂＡ１ｃ％との関係を示すグラフである。図４は、グルコース添加血のインキュベート時間と血球ＧＨｂＬｙｓ％との関係を示すグラフである。【０１３０】
図１は、血漿グルコース濃度の変動を示す。同図に示すように、血球細胞がグルコースを消化するため、グルコース濃度は経時的に低下しているが、インキュベート開始から２４時間後の試料についてもグルコースの残存が確認された。図２は、血球の安定型ＨｂＡ１ｃ％の変動を示す。同図に示すように、安定型ＨｂＡ１ｃ％は、グルコースとのインキュベート開始から６時間経過後においても測定値の上昇が見られなかった。また、グルコース濃度を３５０ｍＭとしても、２４時間後に測定値が０．８％程度上昇するにとどまった。これは、前述のように、不安定型ＨｂＡ１ｃから安定型ＨｂＡ１ｃに変化し難いためである。つぎに、図３は、血球の不安定型ＨｂＡ１ｃ％の変動を示す。不安定型ＨｂＡ１ｃ％は、試料に添加したグルコース濃度に従って変動を示したが、図１に示すように血漿中のグルコース濃度が低くなると、それに伴って同様に減少した。これは、不安定型ＨｂＡ１ｃの生成が、グルコース濃度と平衡関係にあり、グルコースの減少に伴って再びＨｂに戻るためである。これに対して、図４に示すように、血球のＧＨｂＬｙｓは、次のような挙動を示した。すなわち、同図に示すように、ＧＨｂＬｙｓ％は、試料に添加したグルコース濃度に従って変動し、且つ、３時間という短時間のインキュベートでも生成が確認された。さらに、ＧＨｂＬｙｓ％は、インキュベート時間に対応して測定値も上昇した。すなわち、ＧＨｂＬｙｓは、安定型ＨｂＡ１ｃや不安定型ＨｂＡ１ｃとは異なり、短時間の血糖値上昇でも生成される糖化タンパク質であり、その測定値は、短時間の血糖値上昇にも敏感に対応する指標といえる。【０１３１】
なお、グルコース無添加の測定試料（ＢＬＫ）について、試料調製から１４日目に再度測定を行った。その結果、グルコース濃度は０であり、また、ＨｂＡ１ｃ％およびＧＨｂＬｙｓ％はいずれも変動が見られなかった。このことから、生成した糖化物は、分解することなく存在することを確認した。このため、これらの値は、Ｈｂの寿命とグルコース濃度のみに依存することは明らかである。【０１３２】
以上の結果から、ＧＨｂＬｙｓを測定すれば、例えば、食後の短時間にのみ血糖値が上昇する食後高血糖であっても、間接的に血糖値を検出できることがわかった。
【実施例２】
【０１３３】
健常者の全血をヘパリンリチウム入りの採血管により採取した。この血液を室温で２時間放置して血球を沈降させ、血球画分と血漿画分とに分離した。分離した血漿０．５ｍＬにグルコース１００ｍｇを添加して溶解させ、室温で３時間放置することによって、グルコース添加血漿を調製した。そして、前述の分離した血球と血漿（グルコース無添加血漿、グルコース添加血漿）とを下記割合で混合し、緩やかに攪拌し、３７℃で保温した。混合開始から０分後、３０分後、１時間後、２時間後、３．５時間後の試料について、下記方法によりＨｂＡ１ｃ％とＧＨｂＬｙｓ％の測定を行った。【０１３４】
【表２】
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【０１３５】
＜ＨｂＡ１ｃ％測定方法＞  試料０．０６５ｍＬと精製水０．０６５ｍＬとを混合し、下記組成の試薬Ｒ１を０．０７８ｍＬ添加して３７℃で５分間インキュベートした。ここで、この反応液について、６５８ｎｍにおける１回目の吸光度測定（Ａ１）と、５７１ｎｍにおける吸光度測定（Ｂ１）とを行った。つぎに、前記反応液に、下記組成の試薬Ｒ２を０．０１８５ｍＬ添加して３７℃で５分間インキュベートした。ここで、この反応液について、６５８ｎｍにおける吸光度測定（Ａ２）を行った。そして、ＨｂＡ１ｃ濃度（Ｈｂのβ鎖Ｎ末端バリンの糖化濃度）に相当する吸光度を算出した。この算出は、２回目の吸光度（Ａ２）に、容量変化を補正する０．０８１／０．１０９５を乗じ、得られた値から、１回目の吸光度（Ａ１）を差し引くことで算出した。これを、ＨｂＡ１ｃ吸光度という。なお、１回目の５７１ｎｍにおける吸光度（Ｂ１）は、試料中のＨｂ濃度に相当する。続いて、予め準備した検量線から、各試料について、ＨｂＡ１ｃ濃度およびＨｂ濃度を算出した。前記検量線は、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度との関係を示す検量線と、Ｈｂ濃度と吸光度との関係を示す検量線である。そして、算出したＨｂＡ１ｃ濃度の値を算出したＨｂ濃度の値で割って、さらに１００倍した値を、ＨｂＡ１ｃ％として求めた。前記検量線は、ＨｂＡ１ｃ濃度およびＨｂ濃度が既知である標準物質を用いて、同様の方法により吸光度を測定し、各濃度と吸光度との関係をプロットすることによって作成した。これらの吸光度測定には、自動分析装置ＢＭ‐８（日本電子社製）を使用した。【０１３６】
【表３】
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【０１３７】
＜ＧＨｂＬｙｓ％測定方法＞  試料０．０６５ｍＬと精製水０．０６５ｍＬとを混合し、下記組成の試薬Ｒ１を０．０７８ｍＬ添加して３７℃で５分間インキュベートした。ここで、この反応液について、６５８ｎｍにおける１回目の吸光度測定（Ａ１’）と、５７１ｎｍにおける吸光度測定（Ｂ１’）とを行った。つぎに、前記反応液に、下記組成の試薬Ｒ２を０．０１８５ｍＬ添加して３７℃で５分間インキュベートした。ここで、この反応液について、６５８ｎｍにおける吸光度測定（Ａ２’）を行った。そして、ＧＨｂＬｙｓ濃度（Ｈｂのリジン側鎖の糖化濃度）に相当する吸光度を算出した。この算出は、２回目の吸光度（Ａ２’）に、容量変化を補正する０．０８１／０．１０９５を乗じ、得られた値から１回目の吸光度（Ａ１’）を差し引くことで算出した。これを、ＧＨｂＬｙｓ吸光度という。なお、１回目の５７１ｎｍにおける吸光度（Ｂ１’）は、試料中のＨｂ濃度に相当する。続いて、予め準備した検量線から、各試料について、ＧＨｂＬｙｓ濃度およびＨｂ濃度を算出した。前記検量線は、ＧＨｂＬｙｓ濃度と吸光度との関係を示す検量線と、Ｈｂ濃度と吸光度との関係を示す検量線である。そして、算出したＧＨｂＬｙｓ濃度の値を算出したＨｂ濃度で割って、さらに１００倍した値を、ＧＨｂＬｙｓ％として求めた。前記検量線は、ＧＨｂＬｙｓ濃度およびＨｂ濃度が既知である標準物質を用いて、同様の方法により吸光度を測定し、各濃度と吸光度との関係をプロットすることによって作成した。これらの吸光度測定には、自動分析装置ＢＭ‐８（日本電子社製）を使用した。【０１３８】
【表４】
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【０１３９】
これらの結果を、図５および図６に示す。図５は、各試料のＨｂＡ１ｃ％と、各試料におけるグルコースとのインキュベート時間との関係を示すグラフである。図６は、各試料のＧＨｂＬｙｓ％と、各試料におけるグルコースとのインキュベート時間との関係を示すグラフである。両図において、◇◆はグルコース濃度０ｍｍｏｌ／Ｌの試料１、■はグルコース濃度１８０ｍｍｏｌ／Ｌの試料２、▲はグルコース濃度３６０ｍｍｏｌ／Ｌの試料３、●はグルコース５４０ｍｍｏｌ／Ｌの試料４の結果を示す。【０１４０】
図５に示すように、試料におけるグルコース濃度を０ｍｍｏｌ／Ｌから５４０ｍｍｏｌ／Ｌに変化させた試料であっても、各試料間のＨｂＡ１ｃ％の値はほとんど変化が見られなかった。また、同じグルコース濃度の試料であって、グルコースとのインキュベート時間を０時間〜３．５時間に変化させた場合であっても、ＨｂＡ１ｃ％にほとんど変化は見られなかった。このことから、グルコースとのインキュベーション時間０〜３．５時間の範囲において、試料中のグルコース濃度にかかわらず、ＨｂＡ１ｃがほとんど生成されていないことがわかる。これに対して、図６に示すように、ＧＨｂＬｙｓ％は、試料中のグルコース濃度の増加に応じて測定値が増加している。さらに、グルコースとのインキュベート時間の増加に応じても、ＧＨｂＬｙｓ％の測定値が増加している。このことから、試料中のグルコース濃度ならびにインキュベーション時間に依存して、ＧＨｂＬｙｓが生成されていることがわかる。【０１４１】
さらに、これらの結果から、以下に示すように、ＧＨｂＬｙｓ％の測定にあわせてＨｂＡ１ｃ％を測定すれば、食後高血糖と糖尿病とを区別できることも証明された。図５に示すように、グルコースとのインキュベート時間が単時間であるとＨｂＡ１ｃは増加しない。他方、糖尿病のように、空腹時においても血糖値が高い場合、Ｈｂとグルコースとの接触時間も長くなるため、ＨｂＡ１ｃが生成される。このため、ＨｂＡ１ｃは、食後高血糖ではなく、糖尿病の指標となる。一方、ＧＨｂＬｙｓは、食後高血糖で生成される。したがって、ＧＨｂＬｙｓ％とＨｂＡ１ｃ％の両方を測定すれば、ＧＨｂＬｙｓ％測定により、食後高血糖か否かを判断でき、さらに、ＨｂＡ１ｃ％測定により、すでに糖尿病に進行しているか否かを判断することができる。
【実施例３】
【０１４２】
前記実施例２と同様にして、糖尿病患者および健常者から全血を採取した。この全血を室温で１日放置した後、冷蔵庫に保存した（０〜２５日）。保存後の全血を緩やかに攪拌した後、全血０．０２ｍＬに精製水０．５０ｍＬを添加して溶血した。この溶血試料を用いて、前記実施例２と同様にしてＧＨｂＬｙｓ％の測定を行った。【０１４３】
この結果を図７に示す。図７は、全血の保存時間とＧＨｂＬｙｓ％との関係を示すグラフである。同図において、◆は健常者試料、■は糖尿病患者試料の結果を示す。【０１４４】
同図に示すように、ＧＨｂＬｙｓ％の測定値は、全血を０日から２５日放置した場合であってもほとんど変動しなかった。このことから、被検者の生体内における血液、また、被検者から採取した血液においてＧＨｂＬｙｓ％は変動しないといえる。つまり、従来の直接的な血糖値の測定方法とは異なり、ＧＨｂＬｙｓ％の測定によれば、例えば、採血時期や採取した血液の分析時期等は、何ら制限されず、患者や医療機関の労力を軽減できる。
【実施例４】
【０１４５】
糖尿病患者は、恒常的な高血糖を示すが、Ｉ型患者とII型患者とによって、その抑制方法は異なっている。まず、Ｉ型患者は、体内でインスリンを生産できないため、外部よりインスリンを注入する。この食前に注射したインスリンによって、速やかに血糖は低下する。しかし、血糖に応じたインスリン量を生体が分泌するわけではないため、一時的なインスリン不足により、食後高血糖が発生し、その後、血糖が低下するという挙動を示す。したがって、Ｉ型患者は、インスリンの投与によって、インスリン未投与の状態よりも、普段の平均血糖値を表すＨｂＡ１ｃ％は低い値を示すが、食後高血糖の指標となるＧＨｂＬｙｓ％は、依然高い値を示すと考えられる。一方、II型患者は、ある程度、血糖に応じたインスリン量を体内で生産できるため、緩やかな血糖変動を示す。したがって、II型患者は、インスリン未投与であっても、インスリン未投与のＩ型患者と比較して、普段の平均血糖値を示すＨｂＡ１ｃ％は低い値を示す。そして、インスリンや、小腸での糖の吸収を遅らせる遅延剤等を使用することによって、食後高血糖は発生し難い。このため、糖吸収遅延剤の投与によって、糖吸収遅延剤未投与の状態よりも、食後高血糖の指標となるＧＨｂＬｙｓ％が低い値を示すと考えられる。そこで、Ｉ型患者には、インスリンを投与し（糖吸収遅延剤は未投与）、II型患者には、インスリンと共に糖吸収遅延剤を投与し、ＧＨｂＬｙｓ％を測定して、食後高血糖を示すＧＨｂＬｙｓ％と血糖の平均値を示すＨｂＡ１ｃ％との関係を確認した。【０１４６】
まず、糖尿病患者２７人を、インスリンのみを投与しているＩ型患者と、インスリンと糖吸収遅延剤を投与しているII型患者とに分類した。そして、各患者について、ＨｂＡ１ｃ％とＧＨｂＬｙｓ％の測定を行った。ＨｂＡ１ｃ％は、市販の測定器（商品名ＡＤＡＭＳ  Ａ１ｃ  ＨＡ−８１６０、アークレイ社製）を用いて、その使用説明書に従って測定した。ＧＨｂＬｙｓ％は、前記実施例２と同様の方法により測定した。ＨｂＡ１ｃ％、ＧＨｂＬｙｓ％、および、これらの差（ＧＨｂＬｙｓ％−ＨｂＡ１ｃ％）の結果を、下記表に示す。【０１４７】
【表５】
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【０１４８】
前記表に示すように、インスリンを投与しているＩ型患者は、ＨｂＡ１ｃ％よりもＧＨｂＬｙｓ％が大きい値を示し、糖吸収遅延剤を投与しているII型患者は、ＨｂＡ１ｃ％よりもＧＨｂＬｙｓ％が小さい値を示した。前述のように、インスリンを投与しているＩ型患者は、食後高血糖を示し易く、インスリンと糖吸収遅延剤とを投与しているII型患者は、食後高血糖を示し難い。このため、前記表１に示すように、Ｉ型患者について、食後の血糖値を示すＧＨｂＬｙｓ％がＨｂＡ１ｃ％よりも大きな値を示し、「ＧＨｂＬｙｓ％−ＨｂＡ１ｃ％」が、II型患者の「ＧＨｂＬｙｓ％−ＨｂＡ１ｃ％」よりも大きい値を示したことは、ＧＨｂＬｙｓ％が、食後の血糖値を反映していることを裏付けているといえる。また、これらの結果から、ＧＨｂＬｙｓ％の検出だけでなく、ＧＨｂＬｙｓ％とＨｂＡ１ｃ％との関係により、食後高血糖（境界型糖尿病）を判断できることもわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
以上のように、本発明によれば、ＧＨｂＬｙｓの測定によって、食後高血糖を間接的に検出することが可能である。食後高血糖は、いわゆる境界型糖尿病であり、この段階で十分な予防を図ることによって、糖尿病の進行の遅延や防止、合併症の抑制等が可能となる。このため、本発明は、食後高血糖の診断方法として極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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