(57)【要約】  本発明は、植物性原料をストレート換算で５０質量％以上、およびリンゴ酸を０．２〜２．０質量％またはフラクトースを２．０〜２０．０質量％含有し、かつｐＨが５．０〜７．０に調整された培地に、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌株を添加して、少なくとも該乳酸菌株の対数増殖期終了時まで発酵させる発酵飲食品の製造方法であって、発酵開始時から前記対数増殖期終了時までのいずれかの時点において、さらに、酸または乳酸生産菌株を培地に添加して、発酵開始時から対数増殖期終了時までの間は培地のｐＨ低下速度が０．０１〜０．３（１／時間）となるようにして、発酵終了時の培地のｐＨが３．３〜４．６となるように発酵させることを特徴とする発酵飲食品の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物性原料をストレート換算で５０質量％以上、およびリンゴ酸を０．２〜２．０質量％またはフラクトースを２．０〜２０．０質量％含有し、かつｐＨが５．０〜７．０に調整された培地に、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌株を添加して、少なくとも該乳酸菌株の対数増殖期終了時まで発酵させる発酵飲食品の製造方法であって、
発酵開始時から前記対数増殖期終了時までのいずれかの時点において、さらに、酸または乳酸生産菌株を培地に添加して、発酵開始時から対数増殖期終了時までの間は培地のｐＨ低下速度が０．０１〜０．３（１／時間）となるようにして、発酵終了時の培地のｐＨが３．３〜４．６となるように発酵させることを特徴とする発酵飲食品の製造方法。
【請求項２】
前記ラクトバチルス  ブレビスに属する乳酸菌株が、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株であることを特徴とする請求項１に記載の発酵飲食品の製造方法。
【請求項３】
前記乳酸生産菌株が、ラクトバチルス  ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５８株であることを特徴とする請求項１または２に記載の発酵飲食品の製造方法。
【請求項４】
発酵終了後に発酵物の温度を下げることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の発酵飲食品の製造方法。
【請求項５】
前記培地が、乳を無脂乳固形分として０．１〜２０質量％含有することを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の発酵飲食品の製造方法。
【請求項６】
前記培地が、リンゴ酸を０．２〜０．４５質量％含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の発酵飲食品の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法で得られることを特徴とする発酵飲食品。
【請求項８】
動物用飼料であることを特徴とする請求項７に記載の発酵飲食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物性原料を主原料として、これを発酵させて得られる発酵飲食品およびその製造方法に関する。
本願は、２００７年５月３１日に出願された特願２００７−１４５６７７号に基づいて優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸菌は、各種の発酵飲食品の製造に用いられているが、菌自体が整腸効果や病原菌抑制等の優れた生理活性を有するものがあり、このような有用な乳酸菌を発酵飲食品の製造に用いるだけでなく、発酵飲食品中に生きた状態で残すことで、健康増進を志向した優れた飲食品とすることができる。
一方、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌株（以下、ラクトバチルス  ブレビスと略記することがある）は、乳酸菌の中でも特に耐ストレス性が強く、極めて広範な優れた生理作用を有することが知られており、これまでに、例えば、抗アレルギー剤、インターフェロン産生能向上剤、抗胃炎剤および抗潰瘍剤、肝炎治療・予防剤、腫瘍増殖抑制剤、抗腫瘍活性剤、γ−アミノ酪酸の生産への利用について報告されている。【０００３】
このように、ラクトバチルス  ブレビスは、それ自体が極めて有用な乳酸菌であり、生きた状態で摂取すれば、容易に腸に到達して長く生存できるため、健康増進を志向した飲食品として、ラクトバチルス  ブレビスを生きた状態で含有する発酵飲食品の開発が望まれている。これまでに、このような発酵飲食品を製造する方法が種々提案されており、例えば、通常の乳酸発酵で用いる乳単独を原料とした発酵培地を用いて発酵飲食品を製造する方法や、果実や野菜、果汁や野菜汁、豆乳や麦芽汁等の植物性原料を用い、これにグルタミン酸またはグルタミン酸含有物を添加して発酵させて飲食品を製造する方法が開示されている（特許文献１参照）。
【特許文献１】特開２００４−２１５５２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、乳単独を原料とした発酵培地を用いると、ラクトバチルス  ブレビスの増殖が４８時間で５倍程度にとどまり発酵を十分に行うことができず、良好な品質の発酵飲食品を得ることができないという問題点があった。
また、乳単独以外のものを原料とした発酵培地を用いて、発酵が十分に進行した発酵飲食品を製造した場合でも、その飲食品中の生きた状態のラクトバチルス  ブレビスは耐ストレス性が強いために、該飲食品は冷蔵保存期間中にも発酵が進行してしまい、味や香りが変化して品質が劣化してしまうという問題点があった。
さらに、特許文献１に記載の方法は、種々の有用な生理活性を有するγ−アミノ酪酸を発酵で産生し、これを含有する発酵飲食品を得ることを目的としたものであり、発酵培地中に残存するグルタミン酸や、得られた飲食品中に含有されるγ−アミノ酪酸等の影響で、味や香り等の官能面で好ましくないものができてしまうという問題点があった。【０００５】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、ラクトバチルス  ブレビスを用いて植物性原料を主原料とする培地を発酵させて得られ、生きた状態のラクトバチルス  ブレビスを含有し、味や香りが良好で、製造後の保存性に優れた発酵飲食品およびその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第一の態様は、植物性原料をストレート換算で５０質量％以上、およびリンゴ酸を０．２〜２．０質量％またはフラクトースを２．０〜２０．０質量％含有し、かつｐＨが５．０〜７．０に調整された培地に、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する乳酸菌株を添加して、少なくとも該乳酸菌株の対数増殖期終了時まで発酵させる発酵飲食品の製造方法であって、発酵開始時から前記対数増殖期終了時までのいずれかの時点において、さらに、酸または乳酸生産菌株を培地に添加して、発酵開始時から対数増殖期終了時までの間は培地のｐＨ低下速度が０．０１〜０．３（１／時間）となるようにして、発酵終了時の培地のｐＨが３．３〜４．６となるように発酵させることを特徴とする発酵飲食品の製造方法である。
前記ラクトバチルス  ブレビスに属する乳酸菌株は、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株であることが好ましい。
前記乳酸生産菌株は、ラクトバチルス  ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５８株であることが好ましい。
前記発酵飲食品の製造方法において、発酵終了後に発酵物の温度を下げることが好ましい。
前記培地は、乳を無脂乳固形分として０．１〜２０質量％含有することが好ましい。
前記培地は、リンゴ酸を０．２〜０．４５質量％含有することが好ましい。
本発明の第二の態様は、前記製造方法で得られることを特徴とする発酵飲食品である。
前記発酵飲食品は、動物用飼料であることができる。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法によれば、生きた状態のラクトバチルス  ブレビスが含有され、冷蔵保存性に優れた味や香りの良い発酵飲食品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８の撮影画像である。（ａ）はコロニー画像を示し、（ｂ）は染色画像を示す。
【図２】実施例５における、培地のｐＨ低下速度を示すグラフである。
【図３】実施例６における、培地のｐＨ低下速度を示すグラフである。
【図４】実施例９における、培地のｐＨ低下速度を示すグラフである。
【図５】実施例１０における、培地のｐＨ低下速度を示すグラフである。
【図６】実施例５'における、培地のｐＨ低下速度を示すグラフである。
【図７】実施例６'における、培地のｐＨ低下速度を示すグラフである。
【図８】実施例９'における、培地のｐＨ低下速度を示すグラフである。
【図９】実施例１０'における、培地のｐＨ低下速度を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明について、詳しく説明する。
本発明で用いる植物性原料としては、具体的には、野菜、果実、穀類および豆類を挙げることができる。
野菜としては、例えば、トマト、赤ピーマン、ニンジン、キャベツ、はくさい、レタス、大根、ほうれん草、ケール、玉葱、なす、プチヴェール（登録商標）（ケールと芽キャベツの交雑種）、しいたけ、シメジ等を挙げることができる。
果実としては、例えば、グレープフルーツ、オレンジ、リンゴ、ブドウ、イチゴ、パイナップル、キウイ、グアバ、マンゴー、アセロラ、ブルーベリー、ザクロ、モモ、洋なし、パパイヤ、メロン、スイカ、バナナ、イチジク等を挙げることができる。
穀類としては、例えば、麦（麦芽）、米等を、豆類としては、例えば、大豆、エンドウ等を挙げることができる。
本発明においては、これら植物性原料を単独で用いても良く、二種以上を併用しても良い。目的とする製品にあわせて、適宜最適な組み合わせを選択することができる。【００１０】
本発明においては、前記植物性原料を、搾汁液、磨砕物または破砕物などの非濃縮物（非濃縮液）、あるいはこれらの濃縮物（濃縮液）、希釈物（希釈液）または乾燥物等に加工した形態で用いることができる。例えば、大豆であれば、豆乳や微細物の懸濁液の形態で用いることもできる。
中でも、透明で濁りのない液体状態のもの（清澄果汁とも称することがある）を用いると、発酵飲食品の製造に際して種々のものを混合することができ、汎用性が高く好ましい。前記清澄果汁は、例えば、果汁（野菜汁や豆乳なども含む）を限界濾過（ＵＦ）膜でろ過処理することにより得られる。【００１１】
本発明において、例えば、発酵培地中にリンゴ酸を含有させる場合には、植物性原料としては、ｐＨおよびリンゴ酸含量の値を考慮すると、ニンジンおよびプチヴェール（登録商標）からなる群から選択される一種以上を用いることが好ましい。これらは、リンゴ酸を適量含有し、その加工物のｐＨは、発酵前の発酵培地に必要なｐＨに近く、したがってこれらを用いることで、発酵培地のｐＨおよびリンゴ酸含量の調整が容易となる。
また、発酵性や発酵液の汎用性を考慮すると、ニンジンおよびプチヴェール（登録商標）からなる群から選択される一種以上の清澄果汁を用いることが好ましい。【００１２】
また、例えば、発酵培地中にフラクトースを含有させる場合には、植物性原料としては、ｐＨおよびフラクトース含量の値を考慮すると、トマト、赤ピーマン、プチヴェール（登録商標）およびスイカからなる群から選択される一種以上を用いることが好ましい。これらは、フラクトースを適量含有し、その加工物のｐＨは、発酵前の発酵培地に必要なｐＨに近く、したがってこれらを用いることで、発酵培地のｐＨおよびフラクトース含量の調整が容易となる。
また、発酵性や発酵液の汎用性を考慮すると、トマト、赤ピーマン、プチヴェール（登録商標）およびスイカからなる群から選択される一種以上の清澄果汁を用いることが好ましい。【００１３】
本発明において、前記植物性原料は、発酵培地中にストレート換算で５０質量%以上含有されるが、７５質量%以上含有されることが好ましい。ここで、ストレート換算とは、濃縮、希釈等の濃度変化を伴う加工を行っていない植物性原料の濃度への換算を指す。したがって、植物性原料として濃縮物を用いる場合には、ストレート換算で１００質量%以上含有させることもでき、目的に応じて適宜調整すれば良い。
なお、前記植物性原料の発酵培地中におけるストレート換算での含有量の上限値は特に限定されないが、発酵時間の観点から、発酵培地中にストレート換算で、３００質量％以下含有されることが好ましい。【００１４】
本発明において、発酵培地中にリンゴ酸を含有させる場合には、その含有量は０．２〜２．０質量％とするが、０．２〜０．４５質量％とすることが好ましい。発酵物中には、発酵培地中のリンゴ酸含量に依存して発酵で生じた炭酸が含有されるが、リンゴ酸含量を０．２〜０．４５質量％とすることで、発酵物中の炭酸ガスの量を少なくすることができ、得られる発酵飲食品は、刺激感が少なく官能上より好ましいものとなる。またリンゴ酸含有量は、例えば、前記植物性原料を適宜加工した後、蒸留水等で希釈することにより、植物性原料に含有されるリンゴ酸で前記範囲に調整することが好ましい。植物性原料だけでリンゴ酸含有量を調整することが困難な場合には、本発明の効果を損なわない範囲で、リンゴ酸を別途添加して調整しても良い。リンゴ酸を別途添加する場合には、リンゴ酸の
水溶液を用いることが好ましい。
ラクトバチルス  ブレビスは、リンゴ酸資化性を有するため、上記のように培地中に適度な量のリンゴ酸を含有させることで、発酵を良好に行うことができる。【００１５】
また、本発明において、発酵培地中にフラクトースを含有させる場合には、その含有量は２．０〜２０．０質量％とするが、例えば、前記植物性原料を適宜加工した後、蒸留水等で希釈することにより、前記植物性原料に含有されるフラクトースでこの値に調整することが好ましい。植物性原料だけでフラクトース含量を調整することが困難な場合には、本発明の効果を損なわない範囲で、フラクトースを別途添加して調整しても良い。フラクトースを別途添加する場合には、フラクトースの水溶液を用いることが好ましい。
ラクトバチルス  ブレビスは、フラクトース資化性も有するため、上記のように培地中に適度な量のフラクトースを含有させることで、発酵を良好に行うことができる。【００１６】
本発明においては、前記発酵培地に乳を無脂乳固形分として０．１〜２０質量％含有させて発酵を行っても良い。このように乳を添加することで、ラクトバチルス  ブレビスによる発酵をより良好に行うことができ、発酵物中の生菌数を増やすことができる。この時用いる乳としては、例えば、獣乳、脱脂粉乳、発酵乳、またはこれらの酵素処理物等を挙げることができ、これらの中でも脱脂粉乳を用いることが好ましい。
乳の添加量は、無脂乳固形分として０．１質量％よりも少ないと添加効果が見られなくなり、２０質量％よりも多くなるとラクトバチルス  ブレビスがストレスを受けて発酵が良好に進行しにくく、得られる発酵飲食品の味や香りも悪くなりやすく、発酵培地の調製自体も困難となる場合がある。【００１７】
本発明においては、発酵前の発酵培地のｐＨを５．０〜７．０の範囲に調整するが、例えば、前記植物性原料を適宜加工した後、蒸留水等で希釈して、ｐＨ調整剤を用いることなく、植物性原料の種類あるいは量を適宜調整することで前記範囲に調整することが好ましい。ｐＨ調整剤を用いる場合には、本発明の効果を損なわない範囲で、食品用に一般的に用いられているものを添加して調整すれば良く、その種類は特に限定されない。例えば、好ましい酸としてはクエン酸を、好ましい塩基としては炭酸カリウムを挙げることができる。用いるｐＨ調整剤が結晶である場合には、水溶液として添加することが好ましい。【００１８】
発酵培地の糖度（以下、Ｂｒｉｘ．と略記する）は、特に限定されないが、６〜２４％であることが好ましい。【００１９】
発酵に用いる培地は、例えば、前記植物性原料を適宜加工した後、蒸留水等で希釈することにより、リンゴ酸含有量またはフラクトース含有量およびｐＨを前記の範囲に調整すれば良いが、この方法に限定されない。この時、必要であれば、リンゴ酸またはフラクトースあるいはｐＨ調整剤を別途添加することもできる。このように調製した発酵培地は、ラクトバチルス  ブレビスを植菌する前に、所定の条件で加熱殺菌することが好ましい。【００２０】
本発明で用いる水としては特に限定されず、蒸留水、イオン交換水等、飲食品の製造に通常用いられるもので良い。【００２１】
本発明においては、前記発酵培地に、ラクトバチルス  ブレビスを添加して発酵を行う。
ラクトバチルス  ブレビスとしては、例えば、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６９３株（以下、ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株と略記することがある）、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ＪＣＭ１０５９）株等を挙げることができる。なかでも、発酵がより良好に進行し、発酵物中に十分な数の生菌をより得やすい点等から、ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株が好ましい。また、これらラクトバチルス  ブレビスは、単独で用いても良いし、二種以上を併用しても良い。【００２２】
ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株は独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号  ３０５−８５６６））より入手することができる。また、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより、入手することができる。【００２３】
ラクトバチルス  ブレビスは、前培養してから培地の発酵に用いることが好ましい。前培養は公知の方法で行えば良く、例えば、市販の乳酸菌用培地を、所定の濃度となるように蒸留水に溶解させ、オートクレーブ滅菌した後、ラクトバチルス  ブレビスを植菌して、所定時間前培養する方法が挙げられる。【００２４】
ラクトバチルス  ブレビスを用いた培地の発酵は、少なくともラクトバチルス  ブレビスの対数増殖期終了時まで行う。すなわち、対数増殖期終了時に直ちに発酵を停止しても良いし、対数増殖期終了後も引き続きある時間だけ発酵を行ってから発酵を停止しても良い。ただし、発酵終了時の培地のｐＨは３．３〜４．６とする。
この時、発酵開始から対数増殖期の終了までの所要時間を事前に確認しておくと良く、そのためには、例えば、予め同様の条件で発酵を行って所要時間を確認すれば良い。発酵開始時から対数増殖期終了時までのいずれかの時点において、乳酸生産菌株ではなく酸を添加する場合には、発酵開始から対数増殖期終了までの所要時間は、酸添加の有無によらずほぼ一定となるので、予め所要時間を確認する場合に、必ずしも酸の添加は必要ではない。【００２５】
本発明においては、発酵開始時から対数増殖期終了時までのいずれかの時点において、さらに酸または乳酸生産菌株を培地に添加する。ここで「乳酸生産菌株」とは、ラクトバチルス  ブレビス以外の乳酸生産菌株のことを指す。酸または乳酸生産菌株を添加する回数は、一回でも良く複数回でも良い。複数回添加する場合、その回数は特に限定されない。そして添加する時期も上記範囲内であればいずれでも良い。乳酸生産菌株を添加する場合には、培地のｐＨ低下速度の調整が容易で、得られる発酵飲食品の品質が優れることから、発酵開始時に添加することが好ましい。また、酸および乳酸生産菌株は併用しても良い。
そして、発酵開始時から対数増殖期終了時までの間は、培地のｐＨ低下速度が０．０１〜０．３（１／時間）となるようにして、発酵終了時の培地のｐＨが３．３〜４．６となるように発酵させる。ここで、「ｐＨ低下速度（１／時間）」とは、一時間あたりのｐＨの低下値のことを指す。【００２６】
さらに酸または乳酸生産菌株を添加しないと、対数増殖期終了時のｐＨが概ね４．８〜５．８程度と高くなり、ラクトバチルス  ブレビスの発酵が比較的活発な状態のままとなり、得られる発酵飲食品は、さらなる発酵の進行により、味や香り、保存性すべての点で満足できる品質とはならない。
これに対し、本発明のように酸または乳酸生産菌株を添加すれば、ラクトバチルス  ブレビスの対数増殖期終了時のｐＨを、発酵終了時に必要とされるｐＨの範囲内（３．３〜４．６）とすることができ、対数増殖期以降においては過度な発酵が抑制されるので、発酵の度合いが、味や香り、保存性に優れた発酵飲食品を得る上で適した状態となる。
また、ｐＨ低下速度を上記のようにすることで、ラクトバチルス  ブレビスの対数増殖期終了時に向けて培地のｐＨは徐々に低下し、このｐＨ低下に伴ってラクトバチルス  ブレビスの発酵活性が徐々に弱まって適度に抑制され、得られる発酵飲食品の保存性が高まる。培地のｐＨ低下速度は、発酵開始時から対数増殖期終了時までの間、一定にしても良いし、変化させても良い。【００２７】
なお、乳酸生産菌株を添加する場合には、ラクトバチルス  ブレビスの対数増殖期終了時までに、該乳酸生産菌株の対数増殖期は必ずしも終了している必要はない。【００２８】
培地の発酵は、公知の方法に従って行えば良く、例えば、培地に前記前培養物を植菌し、ラクトバチルス  ブレビスを培養すれば良い。この時の植菌量は０．１〜１０容量％であることが好ましく、培養時の温度は２０〜４０℃であることが好ましく、時間は１２〜７２時間であることが好ましい。本発明においては、味や香り、保存性に優れた発酵飲食品を得る上で、発酵の度合いを制御することは重要であり、上記範囲であれば、より優れた品質の発酵飲食品を得ることができる。【００２９】
また、乳酸生産菌株を添加する場合には、その添加方法は特に限定されないが、該乳酸生産菌株を前培養してから添加することが好ましい。この時の乳酸生産菌株の前培養は、ラクトバチルス  ブレビスの場合と同様に行えば良い。そして、前記乳酸生産菌株は、例えば、植菌量が好ましくは０．１〜１０容量％となるように発酵培地に添加すれば良い。【００３０】
添加する酸としては、食品用として一般的に用いられているものであれば特に限定されず、例えば、乳酸、クエン酸、酢酸、リンゴ酸等の酸性の有機化合物、リン酸等の酸性の無機化合物を挙げることができ、これらから選択される一種以上を用いることができる。ただし、前記のように、発酵培地に乳を無脂乳固形分として０．１〜２０質量％含有させる場合には、乳酸を用いることが好ましい。また、用いる酸が結晶である場合には、水溶液として発酵物に添加することが好ましい。【００３１】
添加する乳酸生産菌株は、ラクトバチルス  ブレビス以外の乳酸生産菌株であれば特に限定されず、目的とする発酵飲食品の種類に応じて適宜選択できる。例えば、ラクトバチルス  ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）に属する乳酸菌株が挙げられ、なかでも特に好ましいものとして、ラクトバチルス  ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５８株（以下、ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株と略記することがある）が挙げられる。
ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株は、しば漬け(刻んだナスや赤紫蘇を塩漬けし、乳酸発酵させて得られる漬物)由来の菌株の中からスクリーニングにより選抜された新規乳酸菌株であり、後に詳しく説明する。【００３２】
本発明においては、本発明の効果を損なわない範囲で、発酵飲食品の味や香り、あるいは保存安定性を調整する目的で、発酵後の発酵物に副資材を添加しても良い。用いる副資材としては、食品用として一般的に用いられているものであれば特に限定されず、例えば、香料、糖液等を挙げることができる。また、これら副資材は一種以上を用いることができる。【００３３】
本発明においては、発酵終了後は、発酵物の温度を下げることが好ましい。発酵物の温度を下げることで、さらなる培地の発酵を確実に抑制でき、保存中における発酵飲食品の味や香りの変質をより効果的に抑制することができる。この時の温度は０〜１５℃であることが好ましい。具体的には、例えば、３０℃程度で発酵を行った場合には、１０℃程度まで冷却すれば良い。また、冷却は、発酵終了後速やかに行うことが好ましい。
また、発酵物の冷却を行う場合には、前記副資材の添加は、冷却の前後いずれにおいても行うことができる。【００３４】
得られた発酵物中のラクトバチルス  ブレビスの生菌数は、冷却保存中にはほとんど増加することがなく、発酵直後の優れた味や香りをそのまま保持できる。【００３５】
得られた発酵物は、そのまま発酵飲食品としても良いし、必要に応じて適当な添加物を加えたり、加工したりするなどして発酵飲食品としても良い。【００３６】
本発明の発酵飲食品は、上述の製造方法により得られるものである。また、該発酵飲食品は、動物用の飼料としても好適である。【００３７】
以下、本発明で用いるラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株について説明する。
＜ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の取得＞
京都市左京区大原地区で採取したしば漬けを、滅菌済みメスを使用して５ｍｍ角以下になるまで細かく刻み、無菌的に生理食塩水で１０倍希釈を段階的に８回繰り返して、８段階それぞれの希釈系列を調製した。
各希釈系列から希釈液１ｍＬをシャーレに滴下し、０．５％（ｗ/ｖ）沈降性炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地を用い、混釈法による寒天平板を無菌的に作製し、３０℃で４８時間嫌気培養を行った。
培養後、寒天の中程で形成されるコロニーの立体形態を観察し、白色、両凸レンズ型、直径が１ｍｍ程度のコロニーを釣菌して保存用高層培地（０．５％（ｗ/ｖ）沈降性炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地）に無菌的に穿刺接種し、３０ ℃で２４時間嫌気培養した。
保存用高層培地に生育した菌体を、白金線で釣菌して生理食塩水１ｍＬに懸濁した。
懸濁した生理食塩水と０．５％（ｗ/ｖ）沈降性炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地とを用い、混釈法による寒天平板を無菌的に作製し、３０℃で４８時間嫌気培養を行った。
培養後、寒天の中程で形成されるコロニーの立体形態を観察し、両凸レンズ型、直径が１ｍｍ程度のコロニーを釣菌して保存用高層培地（０．５％（ｗ/ｖ）沈降性炭酸カルシウム入りＭＲＳ寒天培地）に無菌的に穿刺接種し、３０℃で２４時間嫌気培養した。
保存用高層培地に生育した菌体を、無菌的に白金線を用いて釣菌して画線培養用培地（ＢＬ寒天培地）に画線し、３０℃で４８時間嫌気培養した。
培養後、コロニーの表面形態を確認して、円形、周縁がスムース、隆起が半円状であり、色調が中心から周縁に向かって赤茶色か白色となるコロニーを選別して、ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８（以下、さらに「本菌株」と略記することがある）を取得した。この時の本菌株の撮影画像を図１に示す。撮影条件は以下の通りである。コロニー画像：デジタルカメラ  ＣＯＯＬＰＩＸ ４５００（株式会社ニコン製）／レンズから３ｃｍの距離で接写撮影。染色画像：顕微鏡 ＢＸ５１（オリンパス株式会社製）、デジタルカメラ ＤＰ７０（オリンパス株式会社製）／１００倍の対物油浸レンズを用いて撮影。【００３８】
＜ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の同定＞
（形態的性質）
本菌株の形態的性質は、前記各培地で培養した時のコロニーを顕微鏡観察することにより確認した。その結果、細胞形態は桿菌であり、ラクトバチルス  ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｅｎｔｏｓｕｓ）ＪＣＭ１５５８Ｔ株（以下、「基準株」と略記することがある）同様、胞子を有さず、運動性も有していなかった。【００３９】
（生理学的性質）
本菌株の生理学的性質を公知の方法により評価し、基準株と比較した。結果を表１に示す。
表１に示すように、本菌株は、基準株と同じ生理学的性質を示した。【００４０】
【表１】
2008149654.tif 000002
【００４１】
（炭水化物の分解性）
本菌株の各種炭水化物の分解性を、細菌検査同定用キットＡｐｉ  ５０  ＣＨ（ｂｉｏ  Ｍｅｒｉｅｕｘ社製）を使用して評価し、基準株と比較した。その結果を表２および３に示す。
表２および３から明らかなように、本菌株と基準株とは、Ｄ−キシロース、Ｄ−ラフィノースの資化性に相違が認められた（表中、「＊」で示した）。【００４２】
【表２】
2008149654.tif 000003
【００４３】
【表３】
2008149654.tif 000004
【００４４】
（塩基配列）
本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列（部分配列）を公知の方法で決定した。決定した塩基配列のうち、５'末端（１番目）から４９５番目までの塩基配列を配列番号１に示す。この決定した塩基配列について、大学共同利用機関法人  情報・システム研究機構  国立遺伝学研究所  生命情報・ＤＤＢＪ研究センターが運営している日本ＤＮＡデータバンクの相同性検索（ＢＬＡＳＴ）を行った。
その結果、本菌株の配列番号１に示す塩基配列は、２２番目の塩基が不明であるが、それ以外は基準株と同じであり、基準株とは９９％以上の相同性を示した。【００４５】
（カード形成能）
Ｂｒｉｘ．４２％のニンジン濃縮果汁を蒸留水で希釈し、ｐＨ６．４、Ｂｒｉｘ．１２％に調整したニンジン培地に、ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の凍結保存菌液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３０℃で１８時間培養して賦活した後、同様の条件で継代したものを前培養液とした。
次いで、市販の大豆粉を２５％（ｗ／ｖ）、グルコースを２％（ｗ／ｖ）、フラクトースを４％（ｗ／ｖ）それぞれ含む培地５０ｍＬに、前記前培養液を１％（ｖ／ｖ）接種し、３０℃で９時間培養した。
その結果、培養終了時には、カードが形成されていることが確認され、容器を倒立させても６０秒以上カードが崩れることはなかった。
一方、本菌株に代わり基準株を用いて同様に培養を行ったところ、培養終了時にカードが形成されていることが確認されたが、容器を倒立させたところ、形成されていたカードは６０秒経過前に速やかにカードが崩れた。
すなわち、本菌株は、基準株よりもカード形成能が顕著に優れていた。【００４６】
以上の結果に示される通り、本菌株は、基準株と比較すると、１６Ｓ  ｒＤＮＡの前記塩基配列が９９％以上の相同性を有し、前記形態的性質および生理学的性質は同じであるが、炭水化物の分解性が異なるものである。そして、培養時におけるカード形成能が基準株よりも顕著に優れており、これは従来のラクトバチルス  ペントーサスに属する乳酸菌株とは明らかに相違するものである。
以上より、本菌株は、ラクトバチルス  ペントーサスに属する新規の乳酸菌株である。【００４７】
ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株は、平成１９年３月９日付けで受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１２４８として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号  ３０５−８５６６））に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５８として国際寄託当局に移管されている。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を具体的な実施例に基づいてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は以下の実施例に何ら限定されるものではない。
表４、５、７、９、１０、および１２に示す条件で発酵培地を発酵させて発酵飲食品を製造し、得られた発酵飲食品の官能評価試験を行った。結果を表６、８、１１、および１３に示す。発酵培地の基質には、ニンジン果汁またはトマト果汁を用い（「発酵培地の条件」を参照）、該発酵培地を発酵させて野菜発酵液を調製し、これを発酵飲食品とした。発酵には前培養したラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株またはラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いた（「菌株」を参照）。発酵中のｐＨ低下は、クエン酸の添加またはラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った（「ｐＨ低下方法」を参照）。以下、より詳細に説明する。【００４９】
＜発酵飲食品の製造＞
（１）前培養物の調製
市販の乳酸菌用培地（Ｍ．Ｒ．Ｓ培地、ＯＸＯＩＤ社製）を、濃度が６２ｇ／Ｌとなるように蒸留水に溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。続いて、該滅菌済み培地にラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株またはラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を植菌し、３０℃で１８時間前培養した。【００５０】
（２）発酵培地の調製
（Ａ）ニンジン果汁を基質に用いた場合
ｐＨ５．５、Ｂｒｉｘ．４２％のニンジン濃縮果汁を蒸留水で希釈し、ｐＨ５．７、リンゴ酸含量０．３質量％、Ｂｒｉｘ．１２％に調整後、さらに表４、５、および７に示すように、ｐＨ、リンゴ酸含量、Ｂｒｉｘ．を適宜再調整した（「発酵培地の条件」を参照）。この時、表４、５、および７に示すように、一部の実施例において乳として脱脂粉乳を、一部の比較例において脱脂粉乳および／またはグルタミン酸を添加した。そして、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して発酵培地を調製した。植物性原料として透明ニンジン果汁を用いる場合は、前記ニンジン濃縮果汁を蒸留水で希釈した後、公知の方法によりＵＦ膜処理して透明果汁としてから、ｐＨ、リンゴ酸含量およびＢｒｉｘ．を調整した。【００５１】
（Ｂ）トマト果汁を基質に用いた場合
ｐＨ４．３、Ｂｒｉｘ．２０％のトマト濃縮果汁を蒸留水で希釈し、ｐＨ４．４、フラクトース含量２．５質量％、Ｂｒｉｘ．１２％に調整後、さらに表９、１０、および１２に示すように、ｐＨ、フラクトース含量、Ｂｒｉｘ．を適宜再調整した（「発酵培地の条件」を参照）。この時、表９、１０、および１２に示すように、一部の実施例において乳として脱脂粉乳を、一部の比較例において脱脂粉乳および／またはグルタミン酸を添加した。そして、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌して発酵培地を調製した。植物性原料として透明トマト果汁を用いる場合は、前記トマト濃縮果汁を蒸留水で希釈した後、公知の方法によりＵＦ膜処理して透明果汁としてから、ｐＨ、フラクトース含量およびＢｒｉｘ．を調整した。【００５２】
（３）対数増殖期終了時間の決定
前記前培養物を前記発酵培地に1容量％植菌し、３０℃で１８時間培養して発酵を行った。
発酵中、１時間ごとに生菌数を測定し、ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株およびラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株の対数増殖期終了時間が、いずれも１０時間であることを確認した。【００５３】
（４）野菜発酵液の調製
（ａ）クエン酸添加でのｐＨ調整
ｐＨ調整剤であるクエン酸を、４０質量％となるように蒸留水に溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌し、滅菌済みクエン酸水溶液を調製した。
そして、前記前培養物を前記発酵培地に1容量％植菌し、３０℃で１８時間（比較例２および比較例２'は１０８時間）培養して発酵を行った。
発酵中、１時間ごとにｐＨを測定し、前記滅菌済みクエン酸水溶液を用いて、対数増殖期終了時間（発酵開始後１０時間）まで表４、５、７、９、１０、および１２に示す速度でｐＨを低下させた（「対数増殖期後培地ｐＨ」を参照）。
発酵終了後、得られた発酵培地を直ちに１０℃に冷却して、野菜発酵液を得た。【００５４】
（ｂ）共培養でのｐＨ調整
市販の乳酸菌用培地（Ｍ．Ｒ．Ｓ培地、ＯＸＯＩＤ社製）を、濃度が６２ｇ／Ｌとなるように蒸留水に溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した。続いて、該滅菌済み培地にラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株を植菌し、３０℃で１８時間前培養した。
そして、前記前培養物とラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の前培養物とを前記発酵培地に各1容量％植菌し、３０℃で１８時間培養して発酵を行った。
発酵中、１時間ごとにｐＨを測定した。ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株またはラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株の対数増殖期終了時（１０時間）のｐＨは表４、５、９、および１０に示す通りであった（「対数増殖期後培地ｐＨ」を参照）。
発酵終了後、得られた発酵培地を直ちに１０℃に冷却して、野菜発酵液を得た。【００５５】
なお、表４、５、７、９、１０、および１２に示すリンゴ酸、フラクトース、乳（無脂乳固形分）およびグルタミン酸の含有量は、いずれも培地中における質量％表示である。また、乳およびグルタミン酸が「×」であることは、培地中にこれらを別途添加していないことを示す。
なお、一部の比較例においては発酵中のｐＨ調整を行わず、そのまま１０℃で３週間保存した。この場合は、表７および１２において、「ｐＨ低下速度」を「−」と表示した。【００５６】
（５）野菜発酵液の保存
ｐＨ調整済みの前記野菜発酵液を容器に充填して密封し、１０℃で３週間保存した。【００５７】
以下、製造方法の主たる特徴となる部分を抜粋し、各実施例および比較例ごとに示す。
（Ａ）ニンジン果汁を基質に用いた場合
（実施例１−１〜１−１３）
植物性原料として、ニンジン果汁（実施例１−１〜１−６、１−１０〜１−１３）または透明ニンジン果汁（実施例１−７〜１−９）を用いて、表４に示すｐＨ、リンゴ酸含量に調整し、Ｂｒｉｘ．を１２％（実施例１−１〜１−１２）または７％（実施例１−１３）に調整して発酵培地を調製した。そして、ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株を用いて発酵を行った。また、発酵中のｐＨ低下をクエン酸の添加で行った。【００５８】
以下の実施例および比較例については、実施例１−１〜１−１３とは異なる特徴部分を記載した。
（実施例２−１〜２−４）
乳を無脂乳固形分として表４に示す量を添加して発酵培地を調製した。
（実施例３−１〜３−３）
発酵時におけるｐＨ低下速度を表５に示すように、実施例３−１では最初の５時間は０．２５、続く５時間は０．１とし、実施例３−２では最初の５時間は０．３０、続く５時間は０．１とし、実施例３−３では最初の５時間は０．３０、続く５時間は０．２とした。
（実施例４−１〜４−３）
乳を無脂乳固形分として３質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、発酵時におけるｐＨ低下速度を表５に示すように、実施例４−１では最初の５時間は０．２５、続く５時間は０．１とし、実施例４−２では最初の５時間は０．３０、続く５時間は０．１とし、実施例４−３では最初の５時間は０．３０、続く５時間は０．２とした。
（実施例５）
発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った。なお、この時のｐＨ低下速度を図２に示す。
（実施例６）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った。なお、この時のｐＨ低下速度を図３に示す。
（実施例７）
ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行った。
（実施例８）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行った。
（実施例９）
ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用い、さらに、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った。なお、この時のｐＨ低下速度を図４に示す。
（実施例１０）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用い、さらに、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサス  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９５８株の共培養で行った。なお、この時のｐＨ低下速度を図５に示す。【００５９】
（比較例１−１〜１−３、および比較例２）
クエン酸の添加またはラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養による発酵中のｐＨ低下を行わなかった。
（比較例３）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、クエン酸の添加またはラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養による発酵中のｐＨ低下を行わなかった。
（比較例４−１〜４−６）
リンゴ酸含量を０．２質量％より小さく（比較例４−１）、または２．０質量％より大きく（比較例４−２）して発酵培地を調製し、あるいは、ｐＨを５．０より小さく（比較例４−３、４−５）、または７．０より大きく（比較例４−４、４−６）して発酵培地を調製し、発酵を行った。さらに、比較例４−１では、発酵培地中のＢｒｉｘ．を７％とした。
（比較例５）
発酵時におけるｐＨ低下速度を０．３より大きくした。
（比較例６）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、発酵時におけるｐＨ低下速度を０．３より大きくした。
（比較例７）
グルタミン酸を０．３質量％添加して発酵培地を調整した。
（比較例８）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％、グルタミン酸を０．３質量％添加して発酵培地を調製した。
（比較例９）
ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行い、さらに、クエン酸の添加またはラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養による発酵中のｐＨ低下を行わなかった。
（比較例１０）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製して、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行い、さらに、クエン酸の添加またはラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養による発酵中のｐＨ低下を行わなかった。【００６０】
（Ｂ）トマト果汁を基質に用いた場合
（実施例１'−１〜１'−１０）
植物性原料として、トマト果汁（実施例１'−１〜１'−３、１'−７〜１'−１０）または透明トマト果汁（実施例１'−４〜１'−６）を用いて、表９に示すｐＨ，フラクトース含量に調整し、Ｂｒｉｘ．を１２％（実施例１'−１〜１'−９）または７％（実施例１'−１０）に調整して発酵培地を調製した。そして、ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株を用いて発酵を行った。また、発酵中のｐＨ低下をクエン酸の添加で行った。【００６１】
以下の実施例および比較例については、実施例１'−１〜１'−１０とは異なる特徴部分を記載した。
（実施例２'−１〜２'−４）
乳を無脂乳固形分として表９に示す量を添加して発酵培地を調製した。
（実施例３'−１〜３'−３）
発酵時におけるｐＨ低下速度を表１０に示すように、実施例３'−１では最初の５時間は０．２５、続く５時間は０．１とし、実施例３'−２では最初の５時間は０．３０、続く５時間は０．１とし、実施例３'−３では最初の５時間は０．３０、続く５時間は０．２とした。
（実施例４'−１〜４'−３）
乳を無脂乳固形分として３質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、発酵時におけるｐＨ低下速度を表１０に示すように、実施例４'−１では最初の５時間は０．２５、続く５時間は０．１とし、実施例４'−２では最初の５時間は０．３０、続く５時間は０．１とし、実施例４'−３では最初の５時間は０．３０、続く５時間は０．２とした。
（実施例５'）
発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った。なお、この時のｐＨ低下速度を図６に示す。
（実施例６'）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った。なお、この時のｐＨ低下速度を図７に示す。
（実施例７'）
ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行った。
（実施例８'）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行った。
（実施例９'）
ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用い、さらに、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った。なお、この時のｐＨ低下速度を図８に示す。
（実施例１０'）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用い、さらに、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った。なお、この時のｐＨ低下速度を図９に示す。【００６２】
（比較例１'−１〜１'−３、および比較例２'）
クエン酸の添加またはラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養による発酵中のｐＨ低下を行わなかった。
（比較例３'）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、クエン酸の添加またはラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養による発酵中のｐＨ低下を行わなかった。
（比較例４'−１〜４'−６）
フラクトース含量を２．０質量％より小さく（比較例４'−１）、または２０．０質量％より大きく（比較例４'−２）して発酵培地を調製し、あるいは、ｐＨを５．０より小さく（比較例４'−３、４'−５）、または７．０より大きく（比較例４'−４、４'−６）して発酵培地を調製し、発酵を行った。さらに、比較例４'−１では、発酵培地中のＢｒｉｘ．を７％とした。
（比較例５'）
発酵時におけるｐＨ低下速度を０．３より大きくした。
（比較例６'）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製し、さらに、発酵時におけるｐＨ低下速度を０．３より大きくした。
（比較例７'）
グルタミン酸を０．３質量％添加して発酵培地を調製した。
（比較例８'）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％、グルタミン酸を０．３質量％添加して発酵培地を調製した。
（比較例９'）
ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行い、さらに、クエン酸の添加またはラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養による発酵中のｐＨ低下を行わなかった。
（比較例１０'）
乳を無脂乳固形分として３．０質量％添加して発酵培地を調製して、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行い、さらに、クエン酸の添加またはラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養による発酵中のｐＨ低下を行わなかった。【００６３】
＜発酵飲食品の生菌数の測定＞
野菜発酵液の発酵終了直後および保存後のラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株またはラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株の生菌数を、以下の方法により測定した。測定結果を表６、８、１１および１３に示す（「発酵終了直後菌数」、「保存後菌数」を参照）。
（１）ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株またはラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株のみで発酵させた場合の測定方法
ブロモクレゾールパープル(ＢＣＰ)加プレートカウント寒天培地（栄研化学株式会社製）を所定の濃度に溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した。そして得られた発酵液を適宜段階希釈し、この希釈液を前記滅菌培地に添加して、３５℃で７２時間培養し、菌数を測定した。
（２）ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株またはラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株と、ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株とで共発酵させた場合の測定方法
（ａ）総菌数の測定
ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地（栄研化学株式会社製）を所定の濃度に溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した。そして得られた発酵液を適宜段階希釈し、この希釈液を前記滅菌培地に添加して、３５℃で７２時間培養し、培養物中の総菌数を測定した。
（ｂ）ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の菌数の測定
上記ＢＣＰ加プレートカウント寒天培地に食塩を最終濃度が６．５質量％となるように添加した培地を調製した。そして得られた発酵液を適宜段階希釈し、この希釈液を前記滅菌培地に添加して、３５℃で７２時間培養し、培養物中のラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の菌数を測定した。
（ｃ）ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株またはラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株の菌数の測定
前記（ａ）の総菌数から前記（ｂ）のラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の菌数を差し引いて、ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株またはラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株の菌数とした。【００６４】
＜発酵飲食品の官能評価＞
（１）評価方法
発酵後の野菜発酵液を別途凍結保存しておき、その解凍品と、前記１０℃保存発酵液とを比較して、どちらが好ましいかを、男性２５名、女性２５名、合計５０名の評価員により官能評価した（評価１）。
また、前記１０℃保存発酵液を各実施例および比較例の間で比較して、どちらが好ましいかを、男性２５名、女性２５名、合計５０名の評価員により官能評価した（評価２）。
結果を表６、８、１１および１３に示す（「保管後官能評価を参照」）。【００６５】
【表４】
2008149654.tif 000005
【００６６】
【表５】
2008149654.tif 000006
【００６７】
【表６】
2008149654.tif 000007
【００６８】
【表７】
2008149654.tif 000008
【００６９】
【表８】
2008149654.tif 000009
【００７０】
【表９】
2008149654.tif 000010
【００７１】
【表１０】
2008149654.tif 000011
【００７２】
【表１１】
2008149654.tif 000012
【００７３】
【表１２】
2008149654.tif 000013
【００７４】
【表１３】
2008149654.tif 000014
【００７５】
（２）評価結果
（Ａ）ニンジン果汁を基質に用いた場合
実施例１−１〜１−１２の結果より、これらはいずれも、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。
すなわち、発酵培地中のリンゴ酸含量が０．３〜１．８質量％で、かつ発酵培地のｐＨが５．０〜７．０の範囲内においては、ｐＨ低下速度が０．１〜０．３のいずれにおいても、官能評価結果に有意差はなく、いずれも味や香り、保存性が良好であることが確認された。
一方、実施例１−１３の結果より、Ｂｒｉｘ．７％の場合も、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。【００７６】
実施例２−１〜２−４の結果より、発酵培地への乳の添加量を０．２〜２０．０質量％の範囲内で変化させても、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、いずれも、味や香り、保存性が良好であることが確認された。【００７７】
実施例３−１〜３−３の結果より、発酵培地のｐＨが５．０〜７．０の範囲内においてはｐＨ低下速度を途中で変化させても、いずれも、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、味や香り、保存性が良好であることが確認された。【００７８】
実施例４−１〜４−３の結果より、発酵培地へ乳を３．０質量％添加した場合でも、ｐＨ低下速度を途中で変化させても、いずれも、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、味や香り、保存性が良好であることが確認された。【００７９】
実施例５および６の結果より、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った場合、発酵培地への乳の添加有無に関わらず、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、いずれも、味や香り、保存性が良好であることが確認された。
また、実施例５のサンプルは実施例１−２のサンプルよりも、また実施例６のサンプルは実施例２−２のサンプルよりも、それぞれ発酵風味が付与されて味や香りが一層良好であり、官能上より好ましいものであることが確認された。すなわち、ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養によるｐＨ低下が、発酵飲食品の呈味向上に効果的であることが示された。【００８０】
実施例７および８の結果より、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行った場合、発酵培地への乳の添加有無に関わらず、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、いずれも、味や香り、保存性が良好であることが確認された。【００８１】
実施例９および１０の結果より、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用い、さらに、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った場合、発酵培地への乳の添加有無に関わらず、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、いずれも、味や香り、保存性が良好であることが確認された。
また、実施例９のサンプルは実施例７のサンプルよりも、また実施例１０のサンプルは実施例８のサンプルよりも、それぞれ発酵風味が付与されて味や香りが一層良好であり、官能上より好ましいものであることが確認された。すなわち、ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養によるｐＨ低下が、発酵飲食品の呈味向上に効果的であることが示された。【００８２】
比較例１−１〜１−３のサンプルは、いずれも凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差が認められた。これは、発酵直後および保存後の菌数から明らかな通り、保存中に発酵が進行したことによるものであった。
そして、比較例１−１と実施例１−１、比較例１−２と実施例１−２、比較例１−３と実施例１−３の各サンプル間にも、いずれも官能評価結果に有意差が認められ、比較例１−１〜１−３のサンプルは、いずれも味や香りが満足できるものではなかった。
これらの結果は、比較例１−１〜１−３において、発酵中のｐＨ低下を行わなかった結果、対数増殖期終了時のｐＨが大きくなり過ぎたことが原因であった。【００８３】
比較例２のサンプルは、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかったものの、実施例１−１のサンプルに対して官能評価結果に有意差が認められ、発酵直後の段階ですでに味や香りが満足できるものではなかった。これは、発酵中にｐＨ低下を行わず、野菜発酵液の発酵度が高いことが原因であった。【００８４】
比較例３のサンプルは、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差が認められた。これは、保存中に発酵が進行したことによるものであった。
そして、実施例２−２のサンプルに対して官能評価結果に有意差が認められ、味や香りが満足できるものではなかった。
これらの結果は、比較例３において、発酵中のｐＨ低下を行わなかった結果、対数増殖期終了時のｐＨが大きくなり過ぎたことが原因であると考えられた。【００８５】
比較例４−１〜４−６のサンプルは、いずれも、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。しかし、比較例４−１と実施例１−１３、比較例４−２〜４−４と実施例１−２、比較例４−５〜４−６と実施例１−１１の各サンプル間には、いずれも官能評価結果に有意差が認められた。すなわち、比較例４−１〜４−６のサンプルは、いずれも保存前の段階ですでに、味や香りが満足できるものではなかった。
比較例４−１では、発酵直後の菌数から明らかなように、リンゴ酸含量が低いために発酵度が低いことが原因であった。
比較例４−２では、リンゴ酸含量が高いために、発酵前の発酵培地のｐＨ調整に用いた炭酸カリウムの量が多くなり、塩の副生量が多くなったことが原因であった。
比較例４−３および４−５では、発酵直後の菌数から明らかなように、発酵前の発酵培地のｐＨが低いために、発酵度が低いことが原因であった。
比較例４−４および４−６では、発酵直後の菌数から明らかなように、発酵前の発酵培地のｐＨが高いために発酵度が低いことに加え、発酵前のｐＨ調整に用いた炭酸カリウムおよび発酵中のｐＨ低下に用いたクエン酸の量がいずれも多く、その結果、塩の副生量が多くなったことが原因であった。【００８６】
比較例５および比較例６のサンプルは、いずれも凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。しかし、比較例５のサンプルは実施例１−２のサンプルに対して、比較例６のサンプルは実施例２−２のサンプルに対して、それぞれ官能評価結果に有意差が認められ、いずれも保存前の段階ですでに、味や香りが満足できるものではなかった。
これは、発酵直後の菌数から明らかなように、発酵培地への乳の添加の有無に関わらず、ｐＨ低下速度が大き過ぎ、その結果、対数増殖期終了時のｐＨが低くなり過ぎたために、発酵度が低いことが原因であった。【００８７】
比較例７および比較例８のサンプルは、いずれも凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。しかし、比較例７のサンプルは実施例１−２のサンプルに対して、比較例８のサンプルは実施例２−２のサンプルに対して、それぞれ官能評価結果に有意差が認められ、いずれも保存前の段階ですでに、味や香りが満足できるものではなかった。
これは、発酵培地への乳の添加の有無に関わらず、発酵培地へ添加したグルタミン酸が野菜発酵液中に残存していることと、ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株が発酵中にγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生したことが原因であった。【００８８】
比較例９および比較例１０のサンプルは、いずれも凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差が認められた。これは、発酵直後および保存後の菌数から明らかな通り、保存中に発酵が進行したことによるものであった。そして、比較例９のサンプルは実施例７のサンプルに対して、比較例１０のサンプルは実施例８のサンプルに対して、それぞれ官能評価結果に有意差が認められ、比較例９および比較例１０のサンプルは、いずれも味や香りが満足できるものではなかった。
これは、用いた菌株がラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株であっても、発酵培地への乳の添加の有無に関わらず、発酵中のｐＨ低下を行わなかった結果、対数増殖期終了時のｐＨが高くなり過ぎたことが原因であった。【００８９】
（Ｂ）トマト果汁を基質に用いた場合
実施例１'−１〜１'−９の結果より、これらはいずれも、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。
すなわち、発酵培地中のフラクトース含量が２．０〜２０．０質量％で、かつ発酵培地のｐＨが５．０〜７．０の範囲内においては、ｐＨ低下速度が０．１〜０．３のいずれにおいても、官能評価結果に有意差はなく、いずれも味や香り、保存性が良好であることが確認された。
一方、実施例１'−１０の結果より、Ｂｒｉｘ．７％の場合も、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。【００９０】
実施例２'−１〜２'−４の結果より、発酵培地への乳の添加量を０．２〜２０．０質量％の範囲内で変化させても、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、いずれも、味や香り、保存性が良好であることが確認された。【００９１】
実施例３'−１〜３'−３の結果より、ｐＨ低下速度を途中で変化させても、いずれも、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、味や香り、保存性が良好であることが確認された。【００９２】
実施例４'−１〜４'−３の結果より、発酵培地へ乳を３．０質量％添加した場合でも、ｐＨ低下速度を途中で変化させても、いずれも、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、味や香り、保存性が良好であることが確認された。【００９３】
実施例５'および６'の結果より、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサス  ＢＰ−１０９５８株の共培養で行った場合、発酵培地への乳の添加有無に関わらず、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、いずれも、味や香り、保存性が良好であることが確認された。
また、実施例５'のサンプルは実施例１'−２のサンプルよりも、また実施例６'のサンプルは実施例２'−２のサンプルよりも、それぞれ発酵風味が付与されて味や香りが一層良好であり、官能上より好ましいものであることが確認された。すなわち、ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養によるｐＨ低下が、発酵飲食品の呈味向上に効果的であることが示された。【００９４】
実施例７'および８'の結果より、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用いて発酵を行った場合、発酵培地への乳の添加有無に関わらず、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、いずれも、味や香り、保存性が良好であることが確認された。【００９５】
実施例９'および１０'の結果より、ラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株を用い、さらに、発酵中のｐＨ低下をラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養で行った場合、発酵培地への乳の添加有無に関わらず、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められず、いずれも、味や香り、保存性が良好であることが確認された。
また、実施例９'のサンプルは実施例７'のサンプルよりも、また実施例１０'のサンプルは実施例８'のサンプルよりも、それぞれ発酵風味が付与されて味や香りが一層良好であり、官能上より好ましいものであることが確認された。すなわち、ラクトバチルス  ペントーサスＢＰ−１０９５８株の共培養によるｐＨ低下が、発酵飲食品の呈味向上に効果的であることが示された。【００９６】
比較例１'−１〜１'−３のサンプルは、いずれも凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差が認められた。これは、発酵直後および保存後の菌数から明らかな通り、保存中に発酵が進行したことによるものであった。
そして、比較例１'−１と実施例１'−１、比較例１'−２と実施例１'−２、比較例１'−３と実施例１'−３の各サンプル間にも、いずれも官能評価結果に有意差が認められ、比較例１'−１〜１'−３のサンプルは、いずれも味や香りが満足できるものではなかった。
これらの結果は、比較例１'−１〜１'−３において、発酵中のｐＨ低下を行わなかった結果、対数増殖期終了時のｐＨが大きくなり過ぎたことが原因であった。【００９７】
比較例２'のサンプルは、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかったものの、実施例１'−１のサンプルに対して官能評価結果に有意差が認められ、発酵直後の段階ですでに味や香りが満足できるものではなかった。これは、発酵中にｐＨ低下を行わず、野菜発酵液の発酵度が高いことが原因であった。【００９８】
比較例３'のサンプルは、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差が認められた。これは、保存中に発酵が進行したことによるものであった。
そして、実施例２'−２のサンプルに対して官能評価結果に有意差が認められ、味や香りが満足できるものではなかった。
これらの結果は、比較例３'において、発酵中のｐＨ低下を行わなかった結果、対数増殖期終了時のｐＨが大きくなり過ぎたことが原因であると考えられた。【００９９】
比較例４'−１〜４'−６のサンプルは、いずれも、凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。しかし、比較例４'−１と実施例１'−１０、比較例４'−２〜４'−４と実施例１'−２、比較例４'−５〜４'−６と実施例１'−８の各サンプル間には、いずれも官能評価結果に有意差が認められた。すなわち、比較例４'−１〜４'−６のサンプルは、いずれも保存前の段階ですでに、味や香りが満足できるものではなかった。
比較例４'−１では、発酵直後の菌数から明らかなように、フラクトース含量が低いために発酵度が低いことが原因であった。
比較例４'−２では、フラクトース含量が高いために、甘味が強過ぎることが原因であった。
比較例４'−３および４'−５では、発酵直後の菌数から明らかなように、発酵前の発酵培地のｐＨが低いために、発酵度が低いことが原因であった。
比較例４'−４および４'−６では、発酵直後の菌数から明らかなように、発酵前の発酵培地のｐＨが高いために発酵度が低いことに加え、発酵前のｐＨ調整に用いた炭酸カリウムおよび発酵中のｐＨ低下に用いたクエン酸の量がいずれも多く、その結果、塩の副生量が多くなったことが原因であった。【０１００】
比較例５'および比較例６'のサンプルは、いずれも凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。しかし、比較例５'のサンプルは実施例１'−２のサンプルに対して、比較例６'のサンプルは実施例２'−２のサンプルに対して、それぞれ官能評価結果に有意差が認められ、いずれも保存前の段階ですでに、味や香りが満足できるものではなかった。
これは、発酵直後の菌数から明らかなように、発酵培地への乳の添加の有無に関わらず、ｐＨ低下速度が大き過ぎ、その結果、対数増殖期終了時のｐＨが低くなり過ぎたために、発酵度が低いことが原因であった。【０１０１】
比較例７'および比較例８'のサンプルは、いずれも凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差は認められなかった。しかし、比較例７'のサンプルは実施例１'−２のサンプルに対して、比較例８'のサンプルは実施例２'−２のサンプルに対して、それぞれ官能評価結果に有意差が認められ、いずれも保存前の段階ですでに、味や香りが満足できるものではなかった。
これは、発酵培地への乳の添加の有無に関わらず、発酵培地へ添加したグルタミン酸が野菜発酵液中に残存していることと、ラクトバチルス  ブレビスＢＰ−４６９３株が発酵中にγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生したことが原因であった。【０１０２】
比較例９'および比較例１０'のサンプルは、いずれも凍結保存サンプルと１０℃保存サンプルとの間に、官能評価結果の有意差が認められた。これは、発酵直後および保存後の菌数から明らかな通り、保存中に発酵が進行したことによるものであった。そして、比較例９'のサンプルは実施例７'のサンプルに対して、比較例１０'のサンプルは実施例８'のサンプルに対して、それぞれ官能評価結果に有意差が認められ、比較例９'および比較例１０'のサンプルは、いずれも味や香りが満足できるものではなかった。
これは、用いた菌株がラクトバチルス  ブレビスＪＣＭ１０５９株であっても、発酵培地への乳の添加の有無に関わらず、発酵中のｐＨ低下を行わなかった結果、対数増殖期終了時のｐＨが高くなり過ぎたことが原因であった。【０１０３】
以上の結果より、本発明の製造方法により製造された発酵飲食品は、味や香りに優れ、１０℃で３週間保存しても変質し難いことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０４】
本発明により、味や香りが良く保存性に優れた、生きた乳酸菌を含有した健康増進志向の発酵飲食品を提供できる。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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