(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内にポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を生成する能力を有する微生物を培養する培養工程を実施した後、下記（１）から（３）の中から少なくとも一つの工程を経て、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重量当りの有機窒素量が５００ｐｐｍ以下である未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を得、当該未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させて得られる乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸であって、
当該乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸２ｇを１７０℃で４０分間溶融させた後、６０℃で６０分間硬化させて得たポリ−３−ヒドロキシアルカン酸について測定したＹＩが２０以下であることを特徴とする乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸。
（１）ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を蓄積した細胞を破砕する工程、
（２）ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸以外の生物由来成分を分解および／または除去する工程、
（３）水および／または有機溶媒でポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を洗浄する工程。
【請求項２】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重量当りの有機窒素量が４００ｐｐｍ以下である未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させて得られることを特徴とする請求項１記載の乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸。
【請求項３】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重量当りの有機窒素量が３００ｐｐｍ以下である未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させて得られることを特徴とする請求項２記載の乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸。
【請求項４】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、および３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上のモノマーから構成される共重合体である請求項１〜３のいずれかに記載の乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸。
【請求項５】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、３−ヒドロキシヘキサノエートと３−ヒドロキシブチレートの２成分重合体である請求項４記載の乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸。
【請求項６】
微生物が、カプリアビダス・ネケータであることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸。
【請求項７】
微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−３−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子および／またはその変異体を導入した形質転換体であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸。
【請求項８】
細胞内にポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を生成する能力を有する微生物を培養する培養工程を実施した後、下記（１）から（３）の中から少なくとも一つの工程を経て、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重量当りの有機窒素量が５００ｐｐｍ以下である未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を得、当該未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を製造する方法。
（１）ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を蓄積した細胞を破砕する工程、
（２）ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸以外の生物由来成分を分解および／または除去する工程、
（３）水および／または有機溶媒でポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を洗浄する工程。
【請求項９】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重量当りの有機窒素量が４００ｐｐｍ以下である未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させることを特徴とする請求項８記載の乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【請求項１０】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重量当りの有機窒素量が３００ｐｐｍ以下である未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させることを特徴とする請求項９記載の乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加熱溶融時の着色が低減されたポリ−３−ヒドロキシアルカン酸とその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸（以後、ＰＨＡと略す）は、多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが着目されている。中でも、自然界の物質循環に取り込まれ分解生成物が有害とならないＰＨＡの様な生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。特に、微生物が菌体内で生成蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されている。【０００３】
しかしながら、微生物から抽出したＰＨＡは、ペレットやシートに加工する際に加熱溶融を行うと着色しやすく、外観が非常に悪くなることがあり、製品化の大きな障害となっている。そこで、その解決の手段として、着色原因として考えられる生物由来成分を、分解および／または除去する方法が提案されている。【０００４】
ＰＨＡ以外の生物由来成分を分解および／または除去する方法として、ＰＨＡ以外の生物由来成分を物理的処理、化学的処理または生物学的処理によって可溶化させて除去する方法が提案されている。例えば、ＰＨＡ含有微生物菌体を破砕する処理と界面活性剤処理を組み合わせる方法（特許文献１）、アルカリを添加し加熱処理を行った後に破砕処理を行う方法（特許文献２）などが挙げられる。その他、微生物菌体の水性懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムや酵素などで処理してＰＨＡ以外の生物由来成分を可溶化し、ＰＨＡを得る方法（特許文献３）も提案されている。【０００５】
これらの処理により達成できるＰＨＡの精製度に関しては、ＰＨＡの純度による分析値が例示されている。例えば、酵素系ホモジナイザーおよび酸化剤を使う方法ではＰＨＡ純度が９８％〜９９％と示されている（特許文献４）。また、破砕処理、分画、酸化剤処理を行う方法では純度が９７．８％と示されている（特許文献５）。これらはクロロホルムに樹脂を溶解させ、ガスクロマトグラフィーで分析したときに得られるＰＨＡピークの面積比や抽出前後の重量比によって求められている。【０００６】
しかしながら、これらの処理を施しても、さらには組み合わせて施したとしても、ＰＨＡ以外の生物由来成分を完全に除去することは困難を極める。またこれらの処理はコストの面からも工業化することが非常に困難である。従って、既存の工業的製法で製造したＰＨＡをペレットやシートに加工する際に加熱溶融すると、ＰＨＡの着色が避けられなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表平０８−５０２４１５号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０６５６０８号
【特許文献３】特開２００５−３４８６４０号公報
【特許文献４】特開平７−１７７８９４号公報
【特許文献５】特開２００２−３０６１９０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、微生物を用いたＰＨＡの製造において、ＰＨＡ以外の生物由来成分を完全に除去することは難しく、ＰＨＡからシート作成やペレット作成、またプレス成型を実施する際の加熱溶融時に発生する着色を低減することは非常に困難であった。そこで、別のアプローチからの解決策が切望されていた。【０００９】
本発明は、ＰＨＡ以外の生物由来成分を完全に除去せずとも、加熱溶融時の着色が低減されたＰＨＡとその製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従来の製法では、残存するＰＨＡ以外の生物由来成分を分解および除去するため、製法の過程でｐＨをアルカリ側にすることが一般的であった。【００１１】
例えば、ＰＨＡ含有微生物菌体を破砕する処理と界面活性剤処理を組み合わせる方法（特許文献１）や、アルカリを添加し加熱処理を行った後に破砕処理を行う方法（特許文献２）は、ｐＨをアルカリ側とすることでＰＨＡ以外の生物由来成分の分解を促進させている。また、過酸化水素を用いた化学的分解処理によりＰＨＡ以外の生物由来成分を分解除去する方法も提示されているが、ｐＨをアルカリ側に保ち処理することが推奨されている（国際公開第０４／０２９２６６号）。さらに、ＰＨＡ以外の生物由来成分を分解する方法として酵素を用いる方法も挙げられるが、用いる酵素がアルカリ性で活性を有するため、処理液をアルカリ性にせざるを得ない。総じて、従来の方法では、アルカリ側で処理するため、そこから得られたＰＨＡもアルカリ性であった。【００１２】
一方で、加熱溶融時に起こるＰＨＡの着色に関するメカニズムは不明であり、ＰＨＡ以外の生物由来成分を分解および／または除去する以外、着色を回避する手段は報告されていない。【００１３】
本発明者らは、予想外なことに、微生物からＰＨＡを分離し、最終的にＰＨＡを乾燥させて乾燥ＰＨＡを得る際に、当該乾燥を酸性条件下で行うことが、加熱溶融時のＰＨＡの着色の問題を克服するのに極めて有効であることを見出した。さらに、加熱溶融時の着色反応が最も抑制されるｐＨ領域を見出し、本発明を完成させた。【００１４】
本発明は、未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させて得られることを特徴とする乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸に関する。【００１５】
本発明では、乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重量当りの有機窒素量が５００ｐｐｍ以下、４００ｐｐｍ以下、または、３００ｐｐｍ以下である未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させて得られるこが好ましい。【００１６】
本発明では、乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸が、下記（１）から（３）の中から少なくとも一つの工程を経て製造されたポリ−３−ヒドロキシアルカン酸水性懸濁液をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させて得られることが好ましい。この際、前記乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸は、脱水操作等により、前記水性懸濁液から未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を回収し、当該未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を乾燥させて得ることもできるし、未乾燥ＰＨＡを脱水（回収）せずに、スプレードライなどにより前記水性懸濁液を直接乾燥させて得ることもできる。
（１）ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を蓄積した細胞を破砕する工程、
（２）ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸以外の生物由来成分を分解および／または除去する工程、
（３）水および／または有機溶媒でポリ−３−ヒドロキシアルカン酸を洗浄する工程。【００１７】
また本発明は、未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させることを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の製造方法にも関する。【００１８】
本発明では、前記製造方法において、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重量当りの有機窒素量が５００ｐｐｍ以下、４００ｐｐｍ以下、または、３００ｐｐｍ以下である未乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸をｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させることが好ましい。
さらに本発明は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸であって、当該ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸２ｇを１７０℃で４０分間溶融させた後、６０℃で６０分間硬化させて得たポリ−３−ヒドロキシアルカン酸について測定したＹＩが２５以下であることを特徴とするポリ−３−ヒドロキシアルカン酸にも関する。【００１９】
本発明では、前記ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸において、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸重量当りの有機窒素量が５００ｐｐｍ以下、４００ｐｐｍ以下、または、３００ｐｐｍ以下であるポリ−３−ヒドロキシアルカン酸２ｇを１７０℃で４０分間溶融させた後、６０℃で６０分間硬化させて得たポリ−３−ヒドロキシアルカン酸について測定したＹＩが２５以下であることが好ましい。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によれば、ＰＨＡ以外の生物由来成分を完全に除去する必要がなく、極めて簡便な手法により、加熱溶融時に発生する着色が低減されたＰＨＡとその製造法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】乾燥時ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸のｐＨと、加熱溶融後のＰＨＡの色調の関係を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明に用いる微生物は、細胞内にＰＨＡを生成する微生物である限りにおいて、特に限定されない。天然から単離された微生物や菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、または、それらから調製し得る変異体や形質転換体等を使用できる。例えばカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の菌等が挙げられる。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ．ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネケータ（Ｃ．necator）等の菌株がより好ましい。また、微生物が、本来ＰＨＡの生産能力を有しない場合、もしくは生産量が低い場合には、該微生物に目的とするＰＨＡの合成酵素遺伝子および／またはその変異体を導入し、得られる形質転換体を用いることもできる。このような形質転換体の作製に用いるＰＨＡの合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素の遺伝子が好ましい。これら微生物を適切な条件で培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積した微生物菌体を得ることができる。その培養方法については特に限定されないが、例えば特開平０５−９３０４９号公報等に記載された方法が用いられる。
【００２３】
本発明におけるＰＨＡとは、３−ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする重合体の総称である。構成する３−ヒドロキシアルカン酸としては特に限定されないが、具体的には、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）と他の３−ヒドロキシアルカン酸との共重合体、または、３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）を含む３−ヒドロキシアルカン酸の共重合体などが挙げられる。さらに、３−ヒドロキシプロピオネート、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート及び３−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される２種以上の３−ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする共重合体なども挙げられる。なかでもモノマーユニットとして３ＨＨを含む共重合体、例えば、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体（ＰＨＢＨ）（Macromolecules, 28, 4822-4828(1995)）、または、３ＨＢと３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）と３ＨＨとの３成分共重合体（ＰＨＢＶＨ）（特許第２７７７７５７号公報、特開平０８−２８９７９７号公報）が、得られるポリエステルの物性の面からより好ましい。ここで３ＨＢと３ＨＨの２成分共重合体ＰＨＢＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、全モノマーユニットの合計を１００モル％とした時に、３ＨＨユニットが１〜９９モル％、好ましくは１〜５０モル％、より好ましくは１〜２５モル％といった組成比が好適である。また、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体ＰＨＢＶＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、全モノマーユニットの合計を１００モル％とした時に、例えば、３ＨＢユニットの組成比は１〜９５モル％、３ＨＶユニットの組成比は１〜９６モル％、３ＨＨユニットの組成比は１〜３０モル％といった範囲が好適である。
【００２４】
本発明においてＰＨＡ以外の生物由来成分等の不純物を分解および／または除去する前に、予め、ＰＨＡを含有する細胞を物理的処理、化学的処理もしくは生物学的処理によって破砕することが好ましい。これにより、後の分解および／または除去工程を効率的に実施することができる。破砕の方法としては、特に限定されないが、従来公知のフレンチプレスやホモジナイザー、Ｘ−プレス、ボールミル、コロイドミル、ＤＹＮＯミル、超音波ホモジナイザーなどの、流体せん断力や固体せん断力、磨砕を利用した方法が使用しうる。また、酸やアルカリ、界面活性剤、有機溶剤、細胞壁合成阻害剤などの薬剤を用いる方法、リゾチーム、ペクチナーゼ、セルラーゼ、チモリアーゼなどの酵素を用いる方法、超臨界流体を用いる方法や、浸透圧破砕法、凍結法、乾燥粉砕法などが挙げられる。また、細胞自身に含まれるプロテアーゼやエステラーゼなどの作用を利用する自己消化法も破砕法の一種として挙げられる。上記破砕方法においては、一連の処理によるＰＨＡの分子量低下を抑える方法を選択することが望ましい。また、これらの破砕方法は単独で用いても良いし、複数の方法を組み合わせても良い。また、バッチ処理でも良いし、連続処理を行っても良い。
【００２５】
通常、上記方法にてＰＨＡ含有菌体を破砕して得たＰＨＡ水性懸濁液には、細胞中のタンパク質や核酸、脂質、糖成分およびその他の菌体構成成分や、培養基質残分などが混入している。以降に述べる分解および／または除去工程の前に、これらのタンパク質等の水溶性成分を含む水を分離する脱水工程を実施することが好ましい。これにより、ＰＨＡ水性懸濁液に含まれる不純物の量を低減し、後の分解および／または除去工程を効率よく実施することができる。脱水の方法としては特に限定されないが、ろ過や遠心分離、沈降分離、電気泳動などによる方法が挙げられる。分解および／または除去工程に供する水性懸濁液中のＰＨＡの濃度は特に限定されないが、５０ｇ／L以上が好ましく、１００ｇ／L以上がより好ましく、さらに好ましくは２００ｇ／Ｌ以上、さらにより好ましくは３００ｇ／Ｌ以上である。また、水性懸濁液中のＰＨＡの濃度を調整することを目的に、上記脱水工程を実施してもよいし、また、新たに水を加えてもよい。
【００２６】
ＰＨＡ以外の生物由来成分等の不純物を分解および／または除去する方法としては、特に限定されないが、例えば酵素を用いる方法を挙げることができる。使用する酵素としては、蛋白質分解酵素、脂質分解酵素、細胞壁分解酵素、核酸分解酵素等が挙げられる。これらの酵素の具体例としては下記のものが挙げられる。これらは、単独で用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。
【００２７】
（１）蛋白質分解酵素
エスペラーゼ、アルカラーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等
（２）脂質分解酵素
リパーゼ、ホスホリパーゼ、コリンエステラーゼ、ホスファターゼ等
（３）細胞壁分解酵素
リゾチーム、アミラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、α−グリコシダーゼ、β−グリコシダーゼ、Ｎ−グリコシダーゼ等
（４）核酸分解酵素
リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等
ＰＨＡ以外の生物由来成分等の不純物の分解に用いられる酵素は、上記のものに限定されるわけではなく、工業的な製品に用いられ得るものであれば、生物由来成分を分解する活性を有する任意の酵素であってよい。また、一般に市販されている洗濯用酵素洗剤等も用いることができる。さらには、例えば、酵素の安定化剤や再汚染防止剤等と酵素とを含有する酵素組成物であってもよく、酵素のみには限定されない。好ましい蛋白質分解酵素としては、上記例示に含まれるもののうち、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＰ、プロテアーゼＮ（以上、天野エンザイム社製）、エスペラーゼ、アルカラーゼ、ザビナーゼ、エバラーゼ（以上、ノボザイム社製）等が工業的に使用可能なものとして挙げられ、分解活性の点からも好適に使用できる。しかし、これらに限られるものではない。
【００２８】
酵素処理時間は、所望の処理度を達成するまで行うのが好ましく、通常０．５〜２時間である。酵素の使用量は、酵素の種類及び活性に依存し、特に制限はされないが、ＰＨＡ１００重量部に対して、０．００１〜１０重量部が好ましく、さらにはコストの点から０．００１〜５重量部がより好ましい。
【００２９】
ＰＨＡ以外の生物由来成分等の不純物を分解するその他の方法としては、次亜塩素酸や過酸化水素を用いる方法が挙げられる。次亜塩素酸を用いる際は、系のｐＨをアルカリ領域とし、熱や光、金属との接触を抑制した条件で実施することで、塩素残量の低いＰＨＡを得ることができる。ｐＨは８以上が望ましく、より望ましくは１０以上、さらに望ましくは１２以上である。処理温度は４０℃以下が望ましく、より望ましくは３０℃以下であり、さらに望ましくは２０℃以下、確実に効果を発揮するためには１０℃以下で実施することが望ましい。
【００３０】
上述したように前記脱水工程では、ＰＨＡと、それ以外の生物由来成分等の不純物を含む水とを分離するために、ろ過や遠心分離等を実施することができる。ろ過の方法は特に制限がないが、ヌッチェなどを用いる方法や、吸引ろ過や加圧ろ過などの方法が望ましい。工業的にはフィルタープレス、チューブプレス、プレートプレス、ゲージプレス、ベルトプレス、スクリュープレス、円板プレスなどの圧搾機能を有したろ過装置や、遠心脱水機、多室円筒ろ過機なども選択可能である。生産性を高める場合には多室円筒ろ過機などの連続式が望ましい。連続式ろ過機の粒子の除滓方法として、ストリング方式、スクレパー方式、プレコートスクレパー方式などが挙げられる。また、膜分離方式を用いてもよい。膜分離を含めたろ過の方法としては、デッドエンドろ過、クロスフローろ過を選択することができる。いずれもろ過性やろ材、膜などへの閉塞の程度などから選択できる。また減圧、あるいは真空にしてもよいし、加圧してもよい。また、遠心力を用いる方法であっても良い。ろ材としては、紙、織布、不織布、スクリーン、焼結板、素焼、高分子膜、パンチングメタル、ウェッジワイヤーなど様々な素材を選択できる。いずれも生産性や閉塞の程度などから選択できる。また、ろ過助剤を用いてもよいし、用いなくともよい。ろ過助剤を用いる場合にも、ろ材に予めプレコートしておく方法（プレコート方式）、ろ過原液に予め添加しておく方法がある（ボディーフィード法）。
【００３１】
前記脱水工程での遠心分離の方法は特に限定されないが、遠心沈降機や遠心脱水機等を使用できる。遠心沈降機であれば分離板型、円筒型、デカンター型が挙げられる。分離板型であれば、ディスク型、セルフクリーニング型、ノズル型、スクリューデカンター型、スキミング型などが挙げられる。それぞれ沈降成分の排出の方法により回分式と連続式がある。また遠心脱水機についても回分式と連続式が挙げられる。これらの機器によって比重差により、ＰＨＡを含む沈降物と、培養液成分とを分離することが可能である。
【００３２】
前記脱水工程で使用可能な他の方法としてはフローテーション法、電気泳動法、サイクロン処理などが挙げられる。ろ過や遠心分離、またフローテーションなどの方法を単独で用いてもよいし、組み合わせてもよい。また、ＰＨＡのろ過性能や沈降性を向上させるために、凝集操作を実施しても良い。凝集操作に関して特に限定はされないが、例えば、国際公開第２００４／０３３７００号に記載の方法などが挙げられる。
【００３３】
前記脱水工程でろ過や遠心分離などの方法でＰＨＡを回収した後、回収したＰＨＡを水等で洗浄することで、更に精製度を高めたＰＨＡを得ることができる。洗浄は水以外にも有機溶媒を使用してもよいし、水と有機溶媒を混合して用いても良い。また水のｐＨを調整してもよい。有機溶媒を洗浄溶剤として用いる場合、好ましくは、親水性溶媒、具体的にはメタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ケトン類、アミン類などを用いる。また界面活性剤などを水に添加してもよい。これらの有機溶媒や水を複数種類混合して用いてもよい。また、短時間であれば水やこれらの有機溶媒を加温あるいは蒸気として噴霧することで洗浄性を高めることもできる。
【００３４】
洗浄方式は、バッチ、連続いずれの方法であってもよい。洗浄の方法は特に限定されるものではないが、攪拌による方法、ポンプなどを用いた循環による方法で洗浄液中にＰＨＡを懸濁することで洗浄することができる。またろ過などで得られる湿状態のＰＨＡに洗浄液を添加して洗浄することもできる。洗浄効果を高めるために、洗浄を繰り返すことは効果的である。洗浄液の使用量削減のため洗浄液に蒸留や静分離など当業者が考えうる一般的な再生処理を施した後、リサイクル使用することもできる。また洗浄液と洗浄対象ＰＨＡを向流接触させ、洗浄液使用量を削減することも有効である。
以上説明したとおり、本発明の最も好適な態様によると、細胞内にＰＨＡを生成する能力を有する微生物を培養する培養工程、ＰＨＡを蓄積した前記微生物を破砕する破砕工程、破砕した微生物を含む水性懸濁液から水を分離する脱水工程、ＰＨＡ以外の生物由来成分等の不純物を分解および／または除去する精製工程、水および／または有機溶媒でＰＨＡを洗浄する洗浄工程、及び得られたＰＨＡ水性懸濁液から未乾燥ＰＨＡを回収する工程、未乾燥ＰＨＡをｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させて乾燥ＰＨＡを得る乾燥工程を順次実施することにより、乾燥ＰＨＡを効率よく製造することができる。しかし本発明は必ずしも上記すべての工程を実施することを必要とするものではない。
【００３５】
前記ＰＨＡ水性懸濁液に含まれる溶媒は、水、水と相溶性のある有機溶媒、又は、水と前記有機溶媒との混合溶媒を含むものであってもよい。前記有機溶媒は１種類のみを使用してもよいし、２種類以上を併用してもよい。また、水と前記有機溶媒との混合溶媒中の前記有機溶媒の濃度としては、使用する有機溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されない。また、水と相溶性のある有機溶媒としては特に限定されるものではないが、例えばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノールなどのアルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、テトラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、ジメチルホルムアミド、アセトアミドなどのアミド類、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピペリジンなどが挙げられる。なかでも、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリルなどが除去の容易さの面などから好適である。さらに、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、ｉｓｏ−ブタノール、アセトンなどが入手容易であることからより好ましい。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、アセトンである。なお、本発明の本質を損なわない限り、他の溶媒や菌体由来の成分および精製時に発生する化合物を含んでいても構わない。
【００３６】
ＰＨＡ水性懸濁液から未乾燥ＰＨＡを回収するには、上述したろ過や遠心分離、フローテーション法、電気泳動法、サイクロン処理などの方法を使用できる。
【００３７】
前記乾燥工程において、未乾燥ＰＨＡを乾燥させる際のｐＨ条件を３．２以上にする方法は特に限定されない。ｐＨ３．２以上の酸性領域に調整したＰＨＡの水性懸濁液を脱液して未乾燥ＰＨＡを回収することで、未乾燥ＰＨＡのｐＨを３．２以上としてもよいし、ＰＨＡの水性懸濁液を脱液して未乾燥ＰＨＡを回収した後に、当該未乾燥ＰＨＡにｐＨを酸性に調整した水性溶液を添加することで、未乾燥ＰＨＡのｐＨを３．２以上としても良い。ＰＨＡの水性懸濁液のｐＨを３．２以上の酸性領域に調整する方法は、特に限定されないが、例えば酸を添加する方法や、有機塩や無機塩を添加する方法などが使用できる。酸添加の方法を用いる場合、その酸は特に限定されず、有機酸、無機酸のいずれでもよく、揮発性の有無は問わない。また、例えば、硫酸、塩酸などの強酸、リン酸や酢酸などの弱酸いずれも使用でき、いずれでも同様の色調改善効果が得られる。また、ＰＨＡの水性懸濁液を脱液した後に、ｐＨを酸性に調整した水性溶液を添加する際、その水性溶液のｐＨを調整する際に用いる酸種は限定されず、例えば上記同様の酸が使用可能である。また、有機塩や無機塩の添加も適用でき、ｐＨ３．２以上の酸性領域に調整可能な限り、ｐＨ水性溶液の添加と同様の効果が得られる。また、脱水洗浄の際に所定のｐＨに調整した水性溶液を用いて酸添加の代用とすることも可能である。
【００３８】
酸性条件下でＰＨＡを乾燥させる際、そのｐＨの下限は３．２以上、好ましくは３．３以上、より好ましくは３．４以上、さらにより好ましくは３．５以上の酸性領域である。このｐＨ領域を逸脱すると、加熱溶融時の着色を促進してしまう。このメカニズムの詳細は未だに不明であるが、該ｐＨ領域では、加熱溶融時に起こる反応が抑制されているものと考えられる。ｐＨの上限は、加熱溶融時の着色を抑制する観点から、７未満が好ましく、６．５以下がより好ましい。乾燥の方法に関しては特に限定されず、気流乾燥機や振動乾燥機、流動層乾燥機、バンド乾燥機、回転乾燥機など当業者が考えうる乾燥方式を使用することができ、減圧下および加圧下での乾燥も適用できる。なお、本発明で乾燥ＰＨＡとは実質的に揮発分が混入していないＰＨＡを指し、これに対し、未乾燥ＰＨＡとは、揮発分が混入しており、上述した乾燥手法により前記揮発分が除去され得るＰＨＡを指す。
【００３９】
特に微生物が産生したＰＨＡには、タンパク質や多糖類や脂質成分などの不純物が多く付着している。少なくともこれら成分を現存する方法、例えば上記記載の方法において分解および／または除去することで、本発明の効果を顕著に得ることができる。ＰＨＡに含まれる有機窒素量をＰＨＡ重量当り好ましくは５００ｐｐｍ以下、より好ましくは４００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは３００ｐｐｍ以下、さらにより好ましくは１００ｐｐｍ以下にすることで本発明の効果をより顕著に達成できる。なお、有機窒素成分は非揮発性であるので、ＰＨＡに含まれる有機窒素量はＰＨＡの乾燥工程の前後で変化しない。
【００４０】
また、乾燥工程における未乾燥ＰＨＡのｐＨを酸性領域にする限りにおいて、ｐＨを調整する工程はどの段階に行っても良い。しかし、ＰＨＡに付着している生物由来成分を分解および／または除去した後に行うのが好ましく、より好ましくは、生物由来成分が十分除去された乾燥工程直前のＰＨＡの水性懸濁液に対して行う。また、生物由来成分の分解および／または除去に関しては上記の方法を単独で行なっても良いし、それらを組み合わせて行なっても良い。これらの操作は連続式でもバッチ式でもよい。
【００４１】
本発明により、ＹＩ値が２５以下であるＰＨＡを工業的に製造することが可能になった。さらに、ＹＩ値が２０以下、１０以下であるＰＨＡを工業的に製造することが可能になった。ここでＹＩ値とは、イエローインデックスのことで、最終的に得られる乾燥ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の色の指標であり、黄色度が低いほど良い。本発明におけるＹＩ値は、加熱溶融を経て硬化したＰＨＡについて測定した値を指し、具体的には、ＰＨＡ２ｇを１７０℃で４０分間溶融させた後、６０℃で６０分間硬化させて得たＰＨＡについて測定した値をいう。この値が低いほど、加熱溶融による着色の程度が低いことを意味する。
【００４２】
以上のようにして製造されたＰＨＡは、色調に優れているため、フィルムやボトルなどの汎用品において、幅広い応用が期待できる。さらにＰＨＡ重量当りの有機窒素量を低減させたＰＨＡは低アレルゲンであるため医療用としての適用も期待できる。
【実施例】
【００４３】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。【００４４】
（実施例１）
国際公開第２００８／０１０２９６号［００４９］に記載のラルストニア・ユートロファＫＮＫ−００５株を、同［００５０−００５３］に記載の方法で培養し、ＰＨＡを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネケータに分類されている。【００４５】
得られた菌体培養液を８０℃で１時間滅菌した。そこに、０．２％のドデシル硫酸ナトリウムを添加した。さらに、ｐＨが１１．５になるように水酸化ナトリウムを添加した後、５０℃で１時間保温した。その後、高圧破砕機（ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルＰＡ２Ｋ型）で４５０〜５５０ｋｇｆ／ｃｍ2の圧力で高圧破砕を行った。【００４６】
高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を排除した。沈降したＰＨＡに、排除した上清と同量の水を添加して、懸濁し、０．２％のドデシル硫酸ナトリウムと、ＰＨＡの１／１００量のプロテアーゼ（ノボザイム社製、エスペラーゼ）を添加し、ｐＨ１０で５０℃に保持したまま、２時間攪拌した。得られた反応液からＰＨＡを遠心分離により回収し、水、次いでメタノールで十分に洗浄した。得られたＰＨＡの水性懸濁液を、ＰＨＡの濃度が１０重量％になるように調整した。【００４７】
その後、リン酸、酢酸、硫酸、または、塩酸を適当量用いてＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを図１の値に調整し、３０分攪拌した後にＰＨＡを回収した。回収した未乾燥ＰＨＡを４５℃で１２時間乾燥した。【００４８】
乾燥したＰＨＡ２ｇをスクリュー管（マルエム社製Ｎｏ．３スクリュー管２１ラ４５）に入れ、内温が１７０℃になるようにブロックヒーター（ＥＹＥＬＡ  ＭＧ−２２００）で４０分間加温しＰＨＡを溶融させた。溶融後のＰＨＡを６０℃の恒温槽で６０分間硬化させた後、この硬化ＰＨＡについて色差計ＳＥ−２０００（日本電色工業社製）によりＹＩを測定した。なお、色差計レンズのφ＝１０ｍｍを用い反射光で測定した。また、測定は暗下で行なった。その結果、図１に示す結果が得られた。これより、ＰＨＡをｐＨ３．２以上の酸性条件下で乾燥させることで好ましいＹＩ値（２５以下）を示すことが分かった。【００４９】
また、上記で得られた乾燥ＰＨＡに対して５ＭのＮａＯＨを添加し、９５℃で加水分解反応を実施した。この加水分解液を等量の６０％酢酸水溶液で中和し、酢酸緩衝液とニンヒドリン溶液を添加し１００℃で呈色反応を行った。この呈色反応液の吸光度を日立製作所社製レシオビーム分光光度計Ｕ−１８００形により測定した。この吸光度と、ロイシン試料を用いて作成した検量線とを比較することで、加水分解前のＰＨＡ中のＰＨＡ重量当りの有機窒素量を算出した。加水分解前のＰＨＡの重量あたりの有機窒素量は、概ね５００ｐｐｍ以下であった。【００５０】
（比較例１）
実施例１と同じ菌体培養液を用いて、実施例１記載の方法で精製したＰＨＡに対して、３０％水酸化ナトリウム溶液を添加して、ｐＨがアルカリ領域（ｐＨ８）である１０％ＰＨＡの水性懸濁液を作製した。続いて、ＰＨＡを回収し４５℃で１２時間乾燥した。乾燥したＰＨＡについて、実施例１記載の方法によりＹＩを測定したところ、２９であった。また、このＰＨＡに含まれるＰＨＡ重量当りの有機窒素量を実施例１記載の方法にて測定したところ、３８１ｐｐｍであった。
【図１】
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