(57)【要約】  解析データに対する評価のみの場合よりも精度の高い信頼度算定結果を得る。  以下の工程（Ａ）から（Ｃ）を含んで核酸塩基配列の信頼度を算定する。（Ａ）計測データを解析データに加工する際に、ｉ番目の塩基に対する計測データの品質及び加工処理の内容を評価する加工処理評価値E1 iを算出する加工処理評価値算出工程、（Ｂ）加工された解析データからｉ番目の塩基に対する解析データ評価値E2 iを算出する解析データ評価値算出工程、並びに（Ｃ）加工処理評価値E1 i及び解析データ評価値E2 iを使って、あらかじめ定めた算術式によって信頼度を算出する信頼度算出工程。
2008068831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）から（Ｃ）を含む核酸塩基配列の信頼度算定方法。
（Ａ）計測データを解析データに加工する際に、ｉ番目の塩基に対する計測データの品質及び又は加工処理の内容を評価する加工処理評価値E1 iを算出する加工処理評価値算出工程、
（Ｂ）加工された解析データからｉ番目の塩基に対する解析データ評価値E2 iを算出する解析データ評価値算出工程、並びに
（Ｃ）加工処理評価値E1 i及び解析データ評価値E2 iを使って、予め定めた算術式によって信頼度を算出する信頼度算出工程。
【請求項２】
工程（Ｃ）におけるｉ番目の塩基ピークに対する信頼度QV iを下記算術式によって算出する請求項１に記載の信頼度算定方法。
QV i= - constQV × Log10 (Err i)
ここで、constQVは補正定数、Err iはｉ番目の塩基のエラー率であり、
Err i  = (1 - E1 i)×(1 - E2 i)
であり、E1 iとE2 iは０と１の間の数値をとり、E1 iとE2 iには１未満の最大値Emaxを設ける。
【請求項３】
工程（Ａ）におけるｉ番目の塩基に対する前記加工処理評価値E1iとして、下式にて定義される評価指標E11iを算出する請求項１又は２に記載の信頼度算定方法。
E1i  = E11i
ただし、E11iはｉ番目の塩基ピークの計測データの信号対雑音比を評価する評価指標であり、
E11i=E11max×（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）/const E11（但し、（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）＜constE11の場合）、
E11i=  E11max（＜１）  （上記以外の場合）、
const E11は正規化定数である。
【請求項４】
工程（Ａ）におけるｉ番目の塩基に対する前記加工処理評価値E1iとして、下式にて定義される評価指標E12iを算出する請求項１又は２に記載の信頼度算定方法。
E1i  = E12i
ただし、E12iはｉ番目の塩基ピークの計測データの移動補正量（a, b, c）に対する評価指標であり、
E12i = ( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)、
（( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)）＞E12maxのとき、
E12i＝E12max（＜１）
T(a1, b1, c1)は移動補正量（a, b, c）の最適解（a1, b1, c1）のときのピーク面積総和、T(a2, b2, c2)は移動補正量（a, b, c）の次点解（a2, b2, c2）のときのピーク面積総和である。
【請求項５】
工程（Ａ）におけるｉ番目の塩基に対する前記加工処理評価値E1iとして、下式にて定義される評価指標E11i ・・E12iを算出する請求項１又は２に記載の信頼度算定方法。
E1i  = E11i ・・E12i
ただし、E11i はｉ番目の塩基ピークの計測データの信号対雑音比を評価する評価指標であり、
E11i =E11max×（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）/const E11 （但し、（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）＜constE11の場合）、
E11i =   E11max  （上記以外の場合）、
const E11は正規化定数、
E12iはｉ番目の塩基ピークの計測データの移動補正量（a, b, c）に対する評価指標であり、
E12i = ( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)、
（( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)  ）＞E12maxのとき、
E12i＝E12max（＜１）
T(a1, b1, c1)は移動補正量（a, b, c）の最適解（a1, b1, c1）のときのピーク面積総和、T(a2, b2, c2)は移動補正量（a, b, c）の次点解（a2, b2, c2）のときのピーク面積総和である。
【請求項６】
工程（Ｂ）におけるｉ番目の塩基に対する解析データ評価値E2iとして、解析データのピーク間隔を評価する下記の特徴指標を算出する請求項１から５のいずれか一項に記載の信頼度算定方法。
E2i = dMini / dMaxi、
(dMini / dMaxi)＞E2maxのとき、E2i＝E2max（＜１）
ここで、dMaxi、はｉ番目の当該ピークの近傍の塩基ピーク間隔di(n)中の最大値、dMiniは最小値である。
【請求項７】
工程（Ｂ）におけるｉ番目の塩基に対する解析データ評価値E2 iとして、解析データの信号対雑音比を評価する下記の特徴指標を算出する請求項１から５のいずれか一項に記載の信頼度算定方法。
E2 i =E2max×（Smin i / Nmax i ）/ ConstE2 （但し、（Smin i / Nmax i ）＜ConstE2の場合）、
E2 i = E2max  （上記以外の場合）、
ここで、Smin iはｉ番目の当該ピークを含めて近傍の塩基ピーク中の最小ピークのピーク強度、Nmax iはその近傍の塩基ピーク中に存在し塩基ピークとしては決定されなかった雑音ピーク中の最大雑音ピークのピーク強度、ConstE2は正規化定数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの核酸塩基配列を決定するには、電気泳動等を使った遺伝子解析装置の計測データを解析して得られる核酸塩基配列をフラグメントとしてアセンブル（複数をつなぎ合わせること）という操作を行う。本発明は、そのアセンブル操作の際に必要となる核酸塩基配列の信頼度算定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの塩基配列決定に使用される遺伝子解析装置では、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）、Ｔ（チミン）の４種の塩基に応じた４本の時系列計測データが得られる。Ｐｈｒｅｄ(非特許文献１参照。)等の従来法では、これらの計測データに対して塩基種に応じた標識色素の移動速度差に起因する時系列データ相互のずれを補正する移動度補正や雑音除去などの加工を行って「解析データ」を得た後、「解析データ」から核酸塩基配列を決定し、核酸塩基配列の信頼度を「解析データ」の特徴指標を分析することによって決定する。【０００３】
Ｐｈｒｅｄ等の従来手法では「解析データ」の特徴指標として、ピーク間隔のばらつき、決定した核酸塩基ピークの大きさと雑音ピークの大きさの比、及び塩基種を決定できなかった部分との距離を使用する。そして、これら特徴指標の計測値を組み合わせて評価することによって、各々の塩基の信頼度値を算定している。これは、信頼性の高い「解析データ」は、ピーク間隔が揃い、決定した核酸塩基ピークの大きさと雑音ピークの大きさの比が大きく、塩基種を決定できなかった部分が近くにない、という知見に基づいている。【０００４】
１個の塩基の信頼度値はＱＶ（Quality value）値と呼ばれ、下記式（１）にて定義されている。
ＱＶ＝−１０×Ｌｏｇ10（Ｅｒｒ）
但し、Ｅｒｒ：エラー率            −−−−−（１）【０００５】
また、複数の特徴指標を総合的に評価するため、Ｐｈｒｅｄ等の従来手法では特徴指標が構成するパラメータ空間に対し、あらかじめ多数の塩基配列既知サンプルを計測してその塩基配列決定結果を正解配列と照合することによって実測した誤答率をマッピングした統計データを得ておく。これを参照して（１）式を使用することで、計測データの塩基配列に対する信頼度を算定している。【０００６】
すなわち、パラメータ（Ａｉ，Ｂｊ，Ｃｋ）をもつ多数の塩基を統計的に処理すると、エラー率Ｅｒｒ（ｉ，ｊ，ｋ）が実測される。未知のサンプルで決定した塩基がパラメータ（Ａｉ，Ｂｊ，Ｃｋ）をもつ場合、そのＱＶ値を（１）式から求める。
【非特許文献１】Ewing B, Green P: Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research 8:186-194, 1998
【非特許文献２】「科学計測のための波形データ処理」南茂夫著、１１１〜１１３頁、１８６〜１９１頁、昭和６１年、ＣＱ出版株式会社
【特許文献１】特開２００２−１６８８６８号公報
【特許文献２】特開２００２−２２８６３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
計測データに対して、塩基種に応じた標識色素の移動速度差に起因する時系列データ相互のずれを補正する移動度補正や雑音除去などの加工を行った結果である「解析データ」に対して、特徴指標の計測を行ってこれを利用するので、計測データの品質及び加工処理が包含するデータの信頼性に関する情報が利用できない。例えば、解析データの信号対雑音比が高いとしても、計測データそのものの信号対雑音比が高かったのか雑音低減処理の結果なのかは知る術がない。また、解析データのピーク間隔が揃ったとしても、他の補正量によってピーク間隔が揃う可能性もあったのか、他にはほとんど可能性がなかったのかで、移動度補正処理に対する信頼性は異なるが、結果としての解析データからはそれを知ることはできない。【０００８】
また、多数の塩基配列既知サンプルの計測データの塩基配列決定結果に対し、特徴指標の算出及び正解配列との照合による誤答率算出を行って、特徴指標の組合せと信頼度の相関を示す統計データを予め得ておき、これを利用する上記の方法では、既知サンプルで得られた相関が必ずしも未知サンプルに当てはまるとは限らない。例えば、統計データを形成する母集団に特殊な相関を持つデータ群が含まれていれば、誤答率はそれらに影響されて変化してしまい、これを元にした信頼度値も妥当でない数値を出力することになる。誤答率統計データを得るためには数多くの既知サンプルデータが必要になるが、母集団として質・量共に十分なデータを収集するのは困難である。【０００９】
本発明は、解析データに対する評価のみの場合よりも精度の高い信頼度算定結果を得ることを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、以下の工程（Ａ）から（Ｃ）を含む核酸塩基配列の信頼度算定方法である。
（Ａ）計測データを解析データに加工する際に、ｉ番目の塩基に対する計測データの品質及び加工処理の内容を評価する加工処理評価値E1 iを算出する加工処理評価値算出工程、
（Ｂ）加工された解析データからｉ番目の塩基に対する解析データ評価値E2 iを算出する解析データ評価値算出工程、並びに
（Ｃ）加工処理評価値E1 i及び解析データ評価値E2 iを使って、予め定めた算術式によって信頼度を算出する信頼度算出工程。【００１１】
工程（Ｃ）の一形態は、ｉ番目の塩基ピークに対する信頼度QV iを下記算術式によって算出する工程である。
QV i=-constQV × Log10 (Err i)
ここで、constQVは補正定数、Err iはｉ番目の塩基のエラー率であり、
Err i= (1 - E1 i)×(1 - E2 i)
であり、E1 iとE2 iは０と１の間の数値をとる評価値であり、１未満の最大値Emaxを設ける。E1 iとE2 iは例えば以下に示すようなものであるが、それらに限定されるものではない。【００１２】
工程（Ａ）の一形態は、ｉ番目の塩基に対する前記加工処理評価値E1iとして、下式にて定義される評価指標F1(ｉ)を算出する工程である。
E1i  = E11i
ただし、E11iはｉ番目の塩基ピークの計測データの信号対雑音比を評価する評価指標であり、
E11i = E11max×（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）/const E11 （但し、（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）＜const E11の場合）、
E11i =   E11max（＜１）（上記以外の場合）、
const E11は正規化定数である。【００１３】
工程（Ａ）の他の形態は、ｉ番目の塩基に対する前記加工処理評価値E1iとして、下式にて定義される評価指標E12iを算出する工程である。
E1i  = E12i
ただし、E12iはｉ番目の塩基ピークの計測データの移動補正量（a, b, c）に対する評価指標であり、
E12i = ( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)、（( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)）＞E12maxのとき、
E12i＝E12max（＜１）
T(a1, b1, c1)は移動補正量（a, b, c）の最適解（a1, b1, c1）のときのピーク面積総和、T(a2, b2, c2)は移動補正量（a, b, c）の次点解（a2, b2, c2）のときのピーク面積総和である。【００１４】
工程（Ａ）のさらに他の形態は、ｉ番目の塩基に対する前記加工処理評価値E1iとして、下式にて定義される評価指標E11i ・・E12iを算出する工程である。
E1i  = E11i ・・E12i
ただし、E11iはｉ番目の塩基ピークの計測データの信号対雑音比を評価する評価指標であり、
E11i = E11max×（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）/const E11 （但し、（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）＜const E11の場合）、
E11i =   E11max  （上記以外の場合）、
const E11は正規化定数、
E12iはｉ番目の塩基ピークの計測データの移動補正量（a, b, c）に対する評価指標であり、
E12i = ( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)、
（( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)  ）＞E12maxのとき、
E12i＝E12max（＜１）
T(a1, b1, c1)は移動補正量（a, b, c）の最適解（a1, b1, c1）のときのピーク面積総和、T(a2, b2, c2)は移動補正量（a, b, c）の次点解（a2, b2, c2）のときのピーク面積総和である。【００１５】
工程（Ｂ）の一形態は、ｉ番目の塩基に対する解析データ評価値E2iとして、解析データのピーク間隔を評価する特徴指標を算出する工程である。
E2i = dMini / dMaxi、
(dMini / dMaxi)＞E2maxのとき、E2i＝E2max（＜１）
ここで、dMaxi、はｉ番目の当該ピークの近傍の塩基ピーク間隔di(n)中の最大値、dMiniは最小値である。【００１６】
工程（Ｂ）の他の形態は、ｉ番目の塩基に対する解析データ評価値E2 iとして、解析データの信号対雑音比を評価する特徴指標を算出する請求項１から５のいずれか一項に記載の信頼度算定方法。
E2 i = E2max（Smin i / Nmax i ）/ ConstE2 （但し、（Smin i / Nmax i ）＜ConstE2の場合）、
E2 i = E2max  （上記以外の場合）、
ここで、Smin iはｉ番目の当該ピークを含めて近傍の塩基ピーク中の最小ピークのピーク強度、Nmax iはその近傍の塩基ピーク中に存在し塩基ピークとしては決定されなかった雑音ピーク中の最大雑音ピークのピーク強度、ConstE2は正規化定数である。ピーク強度はピークトップの高さ又はピーク面積値である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、計測データを解析データに加工する際に加工処理評価値を算出して信頼度算定に使用するので、従来法のように解析データに対する評価のみの場合と比べて、計測データの品質及びそれを加工して解析データを得る加工処理内容に対する評価を行うことができ、より精度の高い信頼度算定結果を得ることができる。【００１８】
また、本発明によれば、予め定められた算術式によって信頼度を算定するため、従来法のように数多くの既知サンプルデータの計測が不必要であるため簡便な方法となる。さらに、既知サンプルデータの母集団の質又は量の不適切さに起因する信頼度の誤差も原理的に生じない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明が実施される装置の機能を概略的に示すブロック図である。
【図２】一実施例を示すフローチャートである。
【図３】同実施例における波形加工工程を示すフローチャートである。
【図４】４種類の塩基の電気泳動データを示すグラフである。
【図５】波形加工された後の電気泳動解析データを示すグラフである。
【図６】解析データから決定された核酸塩基配列と算定された信頼度の例を示すグラフである。
【図７】評価値Ｅ算定の関数形の一例を示すグラフである。
【符号の説明】
【００２０】
１２      波形加工手段
１４      塩基配列決定手段
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１に本発明の構成ブロック図であり、これはコンピュータにより行われるデータ処理を機能的に表現したものである。図２にその動作をフローチャートとして示す。以下、図１、図２に従って本発明の一実施例を説明する。【００２２】
まず計測データを波形加工手段１２によって「解析データ」に加工する。この加工工程で「加工処理の評価値」も算出する。図３に、波形加工手段による計測データの加工処理例のフローチャートを示す。また、図４に標識色素を使った電気泳動計測によって得られる計測データの例を示す。【００２３】
以下、これらを使って、波形加工手段の動作例を説明する。
図４は、Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔの４種の塩基に対して標識色素を使った電気泳動計測により、４本の計測データ１、２、３、４を得た例である。なお、場合によっては塩基種の数、時系列信号の数は必ずしも等しいとは限らず、またその数も４とは限らず、本発明はその数を限定するものではない。【００２４】
図４に示すように、各計測データはベースラインや高周波雑音など、信号本来の情報を見えにくくする攪乱情報を持っているのが通例である。図３の処理例では、まず各計測データからベースラインと高周波雑音を除去して、攪乱情報を除く。ベースライン除去や高周波雑音除去は信号処理の一般的な手法を利用することができる（非特許文献２参照。）。【００２５】
そのような一般的な手法として、例えば、フーリエ変換やウエーブレット変換など周波数解析を行なう数学変換を使って、計測データを周波数成分に変換し、特定の周波数成分のみを除去又は低減した後に逆変換を行なう手法がある。具体的に述べると、変換によりベースラインは直流成分又は低周波成分に、雑音は高周波成分に分布するのが一般的である。また、計測系によってある程度その周波数特性が定まる。そのため、その手法では、予めベースラインと高周波成分に対応する分布範囲を調べておき、変換後の周波数成分からベースラインと高周波成分に対応する周波数成分を除去するか低減する。こうすることによって、逆変換後にベースライン及び雑音が除去又は低減された信号波形を得ることができる。【００２６】
電気泳動装置で標識色素を使って得られる計測データには、複数の塩基種の蛍光強度情報が重畳している場合が多い。図３の処理例では、標識色素のスペクトル特性及び計測光学系の分光特性に応じてこれらを分離するマトリクス補正を実行して、攪乱情報除去後の計測データを塩基種ごとの蛍光強度信号に変換している。マトリクス補正の処理内容は特に限定されるものではないが、例えば特許文献１に示される手法を使用することができる。【００２７】
特許文献１に示される手法では、複数の異なる蛍光波長を持つ蛍光色素を用いる蛍光色素ターミネーターラベル法で、蛍光色素ごとの検出部から得られた波形信号にマトリクス変換を行なって塩基ごとの信号波形を求め、それに基づいて塩基配列決定を行なう。その際、以下の工程を順に実行して、マトリクス変換を行なうためのマトリクス値を実際のサンプルの泳動から得る。
（Ａ）適当な範囲からピークを抽出する工程、
（Ｂ）ピーク間隔の揃っていないピークを排除する工程、
（Ｃ）Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔの４つの信号を含むピーク群を信号の強度に基づいて塩基の種類に対応する４グループに分類する工程、
（Ｄ）分類された４グループにおけるＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔの信号強度比率を求める工程、
（Ｅ）分類された４グループに対して、対応する塩基を割り当てる工程、及び
（Ｆ）各塩基グループのピーク波形の信号強度比によりマトリクス値を得る工程。【００２８】
また、標識色素間の移動速度差によって各蛍光情報の時系列信号が時間的にずれを生じる場合も多い。図３の処理例では、これら標識色素間の移動速度差に起因するずれを補正する移動度補正を実行して、各塩基種の蛍光強度信号間のずれを補正している。【００２９】
移動度補正の処理内容は特に限定されるものではないが、例えば特許文献２に示される手法を使用することができる。【００３０】
特許文献２に示される手法では、核酸断片試料を電気泳動し、その検出データに基づいて核酸の塩基配列を決定する際の前処理として、４種類の塩基に対応する４種類の検出データを重ねた状態で、４種類の検出データのうち１から３種類の検出データを固定し、残る検出データを前後方向に移動させてピーク波形の総面積が最大になる検出データの移動量を求める検出データ移動工程を含む。【００３１】
特許文献２に示される手法は、より具体的には、４種類の塩基の検出データを得、予め定めた基準塩基の検出データを基準検出データとして他の検出データを移動させ、ピーク波形の総面積の計算を行ない、移動度補正用の関数を直線的シフトとしてピーク波形の総面積が最大になる他の検出データのシフト量を求め、そのシフト量により検出データの位置情報を補正する。その後、仮の塩基配列を決定し、基準塩基の検出データを基準検出データとし、基準検出データの基準ピークが前後に存在する対象ピークを他の検出データから選出し、対象ピークと前後の基準ピークとのピーク間隔をそれぞれ求め、両ピーク間隔が等しくなるように対象ピークのシフト量を算出し、それを対象ピークの属する検出データのシフト量として検出データの位置情報を補正する。【００３２】
図５に、図４で示した計測データを図３に示した処理によって加工して得られる「解析データ」の例を示す。図５では、４種の塩基種Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔの蛍光強度の時間変化を示す４本の解析データＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔが得られている。塩基ピークは「解析データ」上でほぼ等間隔に並ぶ形となり、これらを同定していくことで塩基配列を決定する。【００３３】
このようにして決定された塩基配列の個々の塩基の信頼度（＝塩基決定の確からしさ）は、当該塩基ピークの近傍の塩基ピーク間隔や塩基ピーク以外の雑音ピークの大きさなど、解析データから得られる情報を使用してその特徴指標を計算することによって見積もることができる。【００３４】
図６に、図５の解析データから決定した塩基配列及び後述する算定法により算定した信頼度の例を示す。図６中に、ｉ番目の塩基ピークに対する、前後の塩基ピーク間隔di(n)(n=±1,±2,・・・)及び雑音ピークの例を示す。【００３５】
例えば、ｉ番目の当該ピークの近傍±３個の塩基ピーク間隔di(n)中の最大値をdMaxi、最小値をdMiniとし、解析データ評価値E2 iとして解析データのピーク間隔を評価する特徴指標E21iを下記のように定義して計算する。
E21i = dMini / dMaxi 
（dMini / dMaxi）＞E21maxのとき、E21i＝E21max（＜１）  −−−−−  （２）
ここで、E21maxは、評価値の信頼性が最大である時の正解率として定義しておく、１未満の定数であり、例えば、E21max＝0.999999とすることができる。後に出てくるE22max,E11max,E12maxも同じく、各評価値の信頼性が最大である時の正解率として定義しておく。それぞれ、１未満であれば、等しい値Emaxをとっても異なる値をとってもよい。【００３６】
E21iは０〜E21maxの値を取り、値がE21max（＜１）に近いほど信頼性が高いと見積もることができる。すなわちこれは、解析データ中で塩基ピークの間隔が揃っているほど信頼性が高いという公知の知見に基づくものであり、非特許文献１中にもその記載がある。【００３７】
また例えば、ｉ番目の当該ピークを含めて近傍±３個の塩基ピーク中の最小ピークのピーク強度（ピークトップの高さ及び／又はピーク面積値）をSmin i、この間に存在する雑音ピーク（＝塩基ピークとして決定されなかったピーク）中の最大雑音ピークのピーク強度を Nmax iとし、解析データ評価値E2 iとして解析データの信号対雑音比を評価する特徴指標E22 iを、正規化定数ConstE22を使って下記のように定義して計算する。
E22 i =E22max×（Smin i / Nmax i ）/ ConstE22（但し、（Smin i / Nmax i ）＜ConstE22の場合）、
E22 i = E22max（＜１）  （上記以外の場合）              −−−−−  （３）【００３８】
ConstE22は（Smin i / Nmax i ）値に対するしきい値の意味をもつ。（Smin i / Nmax i ）値がしきい値ConstE22以上ならE22 iは満点値E22maxとなり、しきい値ConstE22未満なら０〜E22maxの間の評価値となる。ConstE22は予め経験的に定めておく。例えば、（Smin i / Nmax i ）値が１０より大きい場合にE22 iを満点値E22maxと評価する場合、ConstE22＝１０とする。【００３９】
このように、E22 iは０〜E22maxの値を取り、値がE22max（＜１）に近いほど信頼性が高いと見積もることができる。すなわちこれは、解析データ中で塩基ピークが大きく雑音ピークが小さいほど信頼性が高いという既知の知見に基づくものであり、非特許文献１中にもその記載がある。【００４０】
しかしながら塩基決定の信頼度は、上記のような「解析データ」から得た各種の特徴指標のみでは正確に算定することができない。これらの特徴指標は「解析データ」の品質に対する評価であるが、塩基決定の信頼度は、解析データの元となる計測データの品質及びそれを加工して「解析データ」を得る加工処理の内容によっても大きく左右されるからである。【００４１】
本発明の特徴の１つは、計測データの品質及びそれを加工して「解析データ」を得る加工処理の内容を、「加工処理の評価値」として定義して計算し、「解析データ」から得た各種の特徴指標とともに塩基の信頼度算定に使用する点にある。【００４２】
「加工処理の評価値」の例を以下に説明する。
例えば、加工処理前の計測データにおいて、ピークｉ（ｉ番目の塩基ピークを示す。）を含む前後Δｔの時間における計測データの雑音振幅値 Noise(ｉ)、信号振幅値 Signal(ｉ) を求め、加工処理の評価値E1iとして、計測データの信号対雑音比を評価する評価指標E11iを、正規化定数const E11を使って下記のように定義して計算しておく。
E11i = E11max×（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）/const E11 （但し、（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)）＜  constE11の場合）
E11i=  E11max（＜１）  （上記以外の場合）        −−−−−  （４）【００４３】
E11iは０〜E11maxの値を取り、E11max（＜１）に近いほどピークｉにおける計測データの品質が良いことを示す。正規化定数const E11は（Signal(ｉ)/Noise(ｉ)値に対するしきい値の意味をもつ。
ここで、計測データは横軸が時間軸として得られるため、実際には、i番目の塩基ピークのピークトップの時間ｔiを含む前後Δｔ時間を用いる。【００４４】
また、前述の加工処理の一部である移動度補正においては、移動補正量を算定して補正を行うが、移動補正量の算定値の確からしさの評価指標を定めることもできる。例えば、特許文献２の方法により、例えば、塩基Ｇのピーク位置を固定し、他の塩基Ａ，Ｔ，Ｃのピーク位置をそれぞれａ，b，ｃだけ移動させるように補正量（a, b, c）を求める場合、重なりの無いピーク面積の総和T(a, b, c)が大きくなるほど好ましい移動補正量であるとして（a, b, c）の最適解を決定する。この場合、最適解（a1, b1, c1）のピーク面積総和T(a1, b1, c1)と次点解（a2, b2, c2）のピーク面積総和T(a2, b2, c2)を使って、加工処理の評価値E1として、評価指標E12を下記のように定義して計算しておく。
E12 = ( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)   
（( T(a1, b1, c1) - T(a2, b2, c2) ) / T(a1, b1, c1)  ）＞E12maxのとき、
E12＝E12max（＜１）      −−−  （５）【００４５】
E12 は０〜E12maxの値を取り、値がE12max（＜１）に近いほど他に可能性がなく決定的な移動補正量であり、０に近いほど他にも可能性があり不確かな移動補正量であることを示す。なお、移動補正量を時間ごとに変化する量として求める際には、E12も時間ごと、つまりi番目の塩基ピークのピークトップの時間ごとに得られる。従って、以下ではより一般的な値としてE12iと表記しておく。【００４６】
本発明のもう１つの特徴は、「解析データの評価値」及び「加工処理の評価値」を使って、あらかじめ定められた算術式によって核酸塩基配列の信頼度を算定する点にある。
ｉ番目の塩基ピークに対する信頼度QV iを、例えば下記式で算定する。
QV i = - constQV × Log10 (Err i)  −−−−−  （６）
ここでconstQVは補正定数であり、前述の（１）式で示した実測エラー率から定義される信頼度値と定量的に符合する数値が（６）式から得られるように、あらかじめ適切な値を定めておく。【００４７】
Erriはｉ番目の塩基のエラー率Err iであり、このErriを、（２）から（５）式で定めるような、「解析データの評価値」及び「加工処理の評価値」のそれぞれから少なくとも一つの評価値を用いて定義する。【００４８】
具体的なErriの定義式としては、例えば下記式で定義する。
Rrr i= (1 - E2 i) × (1 - E1 i)  −−−  （７）
ここで、E2iとしてはE21iもしくはE22iのいずれか、又は、E2i = E21i × E22iとしてもよい。
E1iとしては、E11iもしくはE12iのいずれか、又は、E1i＝E11i×E12iとしてもよい。【００４９】
（７）式より、評価値E2 i , E1i がそれぞれ１に近いほど信頼度が高いことを示すが、その際エラー率Err i  は０に近づき、逆に各評価値が０に近いほどエラー率は１に近づくことになる。【００５０】
このように、エラー率Err i  を求めるための、E2 i及びE1 iは上述した式（２）〜（５）等に限らない。「解析データの評価値」E2 iとしては、解析データの品質を評価するための、０から１未満の値域を持つ無次元化した特徴指標を当業者であれば適宜選択することができる。「加工処理の評価値」E1iとしては、計測データの品質若しくはそれを加工して「解析データ」を得る加工処理の内容を評価するための、０から１未満の値域を持つ無次元化した特徴指標を当業者であれば適宜選択することができる。【００５１】
以上により、（２）〜（５）式で定めるような「解析データの評価値」及び「加工処理の評価値」を、（６）〜（７）式で定めるようなあらかじめ定めた算術式に入力することにより、核酸塩基配列の信頼度を算定することができる。図６中に「信頼度」として記入されている数値は、この（６）式から求められた数値である。【００５２】
なお、上記実施例では（２）〜（５）式で定めるような「解析データの評価値」及び「加工処理の評価値」を用いたが、これに限らず、他の関数形を用いることもできる。【００５３】
図７に各評価値Ｅの関数形を示す。例えば、加工処理の評価値E21iの場合、横軸が計測データのSN比の計測値Xとなる。横軸値Ｘが予め設定したしきい値Ａより大きい場合の評価値Ｅは一様に最高値Emaxを取る。核酸塩基決定においては、特定の評価値が突出して大きい場合よりも、各評価値が一定の水準を満たしている方が信頼性が高いという特性がある。そのため、この関数形を使用すると、特定の評価値がある程度よりも大きい場合はその評価値の大小によらず、他の評価値によって判断する、という算定法を実現できて前記特性を反映するためには効果的である。【００５４】
更に好ましくは、各評価値Ｅの関数形は、図７に示すように、横軸値Xが予め設定したしきい値Ｂよりも小さい場合に、一様に最小値Ｅminを取るように設定することが好ましい。最小値Eminを設けることで、特定の評価値が突出して小さい場合、必要以上に信頼度の評価を下げることなく他の評価値の寄与を保持しつつ、信頼度値を求めることができ、核酸塩基配列決定において有利である。【００５５】
物理的由来の異なる複数の評価値を使って１つの指標値（本発明においては信頼度値）の算定を試みる場合、各々の評価値のバランスを取ることが難しいが、本実施例の（２）〜（５）式で示した評価値計算方法及び図７で示した関数形を使ってあらかじめ各々の評価値の飽和特性を調整しておくことにより、特定の評価値が全体の評価に与える影響が、他の評価値に比べて大きすぎたり小さすぎたりしないよう適切に制御することができるようになる。先験的に得られている複数の要因に関する知見的情報を、物理的由来の異なる複数の評価値として表し、より正確に利用することができるため、より精度の高い信頼度算定式を定めるのに効果的である。【００５６】
また、本実施例の（６）〜（７）式で示した評価値から信頼度を算定する計算方法は、０から１未満の値域を持つ各評価値を（７）式で原理的なエラー率に相当する値に変換した後に、（１）式と近い関数形（６）式で信頼度値に変換するため、（１）式で示されるエラー率と関連づけられた信頼度値と原理的に符合した信頼度値を算定することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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