(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えＤｎａＫ調製物を発現している大腸菌の細胞の溶解物から組み換えＤｎａＫ調製物を精製する方法であって、
ａ）陰イオン交換クロマトグラフィー、
ｂ）ヒドロキシアパタイトＩＩ型クロマトグラフィー、
ｃ）ゼラチンクロマトグラフィー
のステップをこの順に実施することを含み、
得られる精製された組み換えＤｎａＫ調製物が、
他のシャペロンタンパク質を加えなくともＡＴＰアーゼ活性を有し、
本質的にＴ細胞刺激性不純物を含まず、
純度が９８重量％以上である方法。
【請求項２】
前記ＤｎａＫが、腐生細菌由来である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＤｎａＫが、大腸菌由来である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ゼラチンクロマトグラフィーが、ゼラチンセファロースで行われる請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の方法により得られる精製された組み換えＤｎａＫ調製物であって、
他のシャペロンタンパク質を加えなくともＡＴＰアーゼ活性を有し、
本質的にＴ細胞刺激性不純物を含まず、
純度が９８重量％以上である
調製物。
【請求項６】
ｂ）タンパク質１ｍｇ当たり１ｎｇ以下の残存ＤＮＡ混入、
ｃ）５重量％未満の残存宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入、
ｄ）タンパク質１μｇ当たり０．５Ｅ．Ｕ．未満のエンドトキシン混入
を有する請求項５に記載の精製された組み換えＤｎａＫ調製物。
【請求項７】
ペプチド含有量がモル基準で１％未満である請求項５または請求項６に記載の組み換えＤｎａＫ調製物。
【請求項８】
前記残存ＤＮＡ混入が、０．５ｎｇ／ｍｇ以下、および／またはＨＣＰが０．１重量％未満である請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の組み換えＤｎａＫ調製物。
【請求項９】
前記残存ＤＮＡ混入が、０．５ｎｇ／ｍｇ以下、および／またはＨＣＰが０．０００１重量％未満である請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の組み換えＤｎａＫ調製物。
【請求項１０】
前記ＤｎａＫが加水分解されている請求項５〜請求項９のいずれか１項に記載の組み換えＤｎａＫ調製物。
【請求項１１】
前記エンドトキシン混入が、タンパク質１μｇ当たり０．０１Ｅ．Ｕ．未満である請求項５〜請求項１０のいずれか１項に記載の組み換えＤｎａＫ調製物。
【請求項１２】
前記ＤｎａＫが、本質的にヌクレオチドを含まないか、ＡＤＰとの複合体の形であるか、ＡＴＰとの複合体の形であるか、またはそれらの混合物である請求項５〜請求項１１のいずれか１項に記載の精製された組み換えＤｎａＫ調製物。
【請求項１３】
組み換えＤｎａＫと少なくともひとつのペプチドまたは少なくともひとつのタンパク質との間の複合体を形成する方法であって、
ａ）請求項５〜請求項１２のいずれか１項に記載の組み換えＤｎａＫ調製物とＡＴＰを、１：１〜１：１０のＨＳＰ：ＡＴＰモル比で混合するステップ、
ｂ）少なくとも１つのペプチド、または少なくとも１つのタンパク質を加えるステップ、
ｃ）１０℃〜６０℃の温度でインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項１４】
前記インキュベートが、２０℃〜４５℃の温度で行われる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項５〜請求項１２のいずれか１項に記載の組み換えＤｎａＫ調製物と、少なくとも１つのペプチドまたは少なくとも１つのタンパク質との混合物。
【請求項１６】
複合体の形である、請求項１５に記載の混合物。
【請求項１７】
請求項５〜請求項１２のいずれか１項に記載の組み換えＤｎａＫ調製物または請求項１５もしくは請求項１６に記載の混合物を含む組成物であって、該組成物がインビボおよび／またはインビトロ診断に使用される組成物。
【請求項１８】
アレルギー、自己免疫疾患、移植片拒絶もしくは神経変性疾患の寛容、治療もしくは予防を誘発するための医薬組成物、または液性応答もしくは調節性Ｔ細胞応答を誘発する免疫賦活剤を製造する方法であって、請求項５〜請求項１２のいずれか１項に記載の精製された組み換えＤｎａＫ調製物または請求項１５もしくは請求項１６に記載の混合物を使用することを含む方法。
【請求項１９】
請求項５〜請求項１２のいずれか１項に記載の精製された組み換えＤｎａＫ調製物または請求項１５もしくは請求項１６に記載の混合物を含む、医薬品。
【請求項２０】
アレルギー、自己免疫疾患、移植片拒絶もしくは神経変性疾患の寛容、治療もしくは予防を誘発するため、または液性応答もしくは調節性Ｔ細胞応答を誘発する免疫賦活剤として使用される、請求項１９に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熱ショックタンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（ＨＳＰ）の発現は、ストレス状態のもとであらゆる細胞において上方制御され得る。熱ショックタンパク質は、分子シャペロンであり、タンパク質の折り畳みに関与している。
【０００３】
ＨＳＰは約６つのファミリーに分類され、進化を通して非常に良く保存されている。
【０００４】
ＨＳＰとペプチドとの複合体は、抗原提示において役割を果たす。ＨＳＰは、また、いくつかの自己免疫疾患にも関与している。総説は、ｖａｎ  Ｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５  （２００５）３１８−３３０を参照。
【０００５】
ＤｎａＫは、ＨＳＰ７０ファミリーの細菌メンバーである。ＤｎａＫの精製方法は周知であるが、調製物の純度には疑問がある。一般的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてひとつのバンドのみが検出された場合、そのようなＤｎａＫ調整物は、純粋とみなされる。しかし、そのような調製物は、高度に純粋なわけではない。
【０００６】
ＳｃｈOｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９９５）２１８３−２１８９は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上は純粋なＤｎａＫを記述しているが、ゲルろ過分析により少なくとも３つのピークが示されている。
【０００７】
ＨＳＰの精製方法は周知であり、例えば、
Ｎａｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．、  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４）１７６：２５５−２６４、
Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｐ．ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  （２００４）２９７：１０８−１１７、
Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）２０４：１３−２１、および
Ｊｉｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：１１０５−１１０９
を参照のこと。
【０００８】
過去においては、ＨＳＰ、特にＤｎａＫの免疫学的性質に関して一貫性のないデータが報告されてきた。ＤｎａＫは、抗原提示細胞上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩを介する抗原処理を促進する（Ｔｏｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  １７２（２００４）５２７７−５２８６；Ｔｏｂｉａｎ，Ｃａｎａｄａｙ、Ｈａｒｄｉｎｇ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（２００４）５１３０−５１３７）。未変性の（ｎａｔｉｖｅ）ＤｎａＫは、その由来、用量および投与経路によって、異なった、相反しさえする種類の免疫学的効果を示し得る（ｖａｎ  Ｅｄｅｎ、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｚｅｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｋｋｅｎ  Ｎａｔ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５（２００５）：３１８−３３０）。慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、およびアテローム性動脈硬化のような慢性炎症性疾患において、自己ＨＳＰに対する自己免疫応答が観察されてきた。細菌ＨＳＰと自己ＨＳＰとの間の抗原交叉反応が、自己免疫の発生の原因であると疑われている。その一方、Ｉ型糖尿病や慢性関節リウマチの治験において、ＨＳＰはまた、炎症性サイトカイン分泌プロフィールＴ細胞から調節性サイトカイン分泌プロフィールＴ細胞への転換を促進することが示されており、このことは、炎症性疾患の免疫調節を示唆している（Ｂｌｏｅｍｅｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０（１９９７）：７２−７８）。より最近には、Ｇａｌｄｉｅｒｏらが、リンパ球およびマクロファージにおいて、ＤｎａＫは共起刺激分子（ＣＤ８０／ＣＤ８６）の発現の増加を誘発しないことを報告している（Ｇａｌｄｉｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８（２００５）６３７−６４４）。
【０００９】
これらの不一致は、様々な不純物および混入を伴ってＤｎａＫを産出する種々の精製方法に基づいていると信じられている。その上、ＤｎａＫはＡＴＰアーゼであるので、アデニンヌクレオチドと結合する。ＡＴＰを有するＤｎａＫ、ＡＤＰを有するＤｎａＫ、およびヌクレオチドを含まないＤｎａＫ等の異なった形のＤｎａＫが共存して精製され得る。これら異なった形のＤｎａＫは、異なる免疫学的効果を有し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】ｖａｎ  Ｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５（２００５）３１８−３３０
【非特許文献２】ＳｃｈOｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（１９９５）２１８３−２１８９
【非特許文献３】Ｎａｎｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９４）１７６：２５５−２６４，
【非特許文献４】Ｇｒｏｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｘｐ．ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．（２００４）２９７：１０８−１１７
【非特許文献５】Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９７）２０４：１３−２１
【非特許文献６】Ｊｉｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９５）１３：１１０５−１１０９
【非特許文献７】Ｔｏｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  １７２（２００４）５２７７−５２８６
【非特許文献８】Ｔｏｂｉａｎ，Ｃａｎａｄａｙ、Ｈａｒｄｉｎｇ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（２００４）５１３０−５１３７
【非特許文献９】Ｂｌｏｅｍｅｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０（１９９７）：７２−７８
【非特許文献１０】Ｇａｌｄｉｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１８（２００５）６３７−６４４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、従来技術の少なくともいくつかの欠点を解消するＤｎａＫの精製方法、特に、高い純度のＤｎａＫを供給するＤｎａＫの精製方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１に従ってＱ−セファロースＨＰクロマトグラフィー後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。
【図２】実施例１に従ってヒドロキシアパタイトＩＩ型クロマトグラフィー後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。
【図３】ダイアフィルトレーション／サイズ排除クロマトグラフィー後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。
【図４】ゼラチンセファロースクロマトグラフィー後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。試料（５μｇの各調製物）を変性し、１２％ビス／トリスＮＵ−ＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質を銀染色で染色した。ＱＳＨＰ＝ＱセファロースＨＰ；ＨＡ＝ヒドロキシアパタイト；ＧＳ＝ゼラチンセファロース。
【図５】精製ＤｎａＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示した図である。薬物物質を変性し、４〜１２％ビス／トリスＮＵ−ＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動に続いて、タンパク質を、クマシーブルーＲ２５０で染色した。
【図６】ＤｎａＫのＡＴＰアーゼ活性を示した図である。
【図７】ＤｎａＫの炎症性効果を示した図である。全血を種々の濃度のＤｎａＫまたは細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の存在下で培養した。サイトカインであるインターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦａ）は、ＥＬＩＳＡで定量した。
【図８】Ｔ細胞応答へのＤｎａＫの効果を示した図である。ヒトＰＢＭＣをＤｎａＫ（１０μｇ／ｍＬ）またはフィトヘマグルチニン（５μｇ／ｍＬ）の存在下で６日間培養した。種々のサイトカインを、培地中でＥＬＩＳＡにより定量した。結果は、６人の異なるドナーの２回の測定の平均±偏差として表される。ＣＴＲＬ＝コントロール。
【図９】カンジジンによって誘導されたＩＦＮ−γ産生へのＤｎａＫの効果を示した図である。ヒトＰＢＭＣを、カンジジン（３．５μｇ／ｍＬ）および、濃度を増加させたＤｎａＫの存在下で３日間培養した。ＩＦＮ−γ産生を、培地中でＥＬＩＳＡにより定量した。結果は、４回の測定の平均±偏差として表わされる。
【図１０】ＴｒｅｇによるＩＬ−１０産生を示した図である。精製されたＣＤ４+／ＣＤ２５+細胞、および／またはＣＤ４+／ＣＤ２５-細胞を、ＤｎａＫ（１０μｇ／ｍＬ）またはＢＳＡ（１０μｇ／ｍＬ）で３日間前処理した精製樹状細胞に、正確な分量で加えた。細胞をＤｎａＫまたはＢＳＡの存在下でさらに培養し、ＰＨＡで刺激を与えるか、または刺激を与えなかった。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０を、培地中でＥＬＩＳＡにより定量した。２５-／２５+は、２つの集団を１対１の比率で混合したものを表す。
【図１１】ヒト血清中での抗ＤｎａＫ抗体の存在を示した図である。ＤｎａＫまたはＢＳＡを９６穴プレートにコートし、ＥＬＩＳＡ試験用の捕捉タンパク質として用いた。健康なボランティアおよびアレルギー患者の血清を１／１００に希釈して使用した。ＩｇＧを、抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ抗体で検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
ある態様において、前記課題は、
・他のシャペロンタンパク質を加えなくともＡＴＰアーゼ活性を有し、
・Ｔ細胞刺激性不純物を含まない
精製された組み換え熱ショックタンパク質ＨＳＰ、好ましくはＤｎａＫによって解決される。
【００１４】
精製された組み換え熱ショックタンパク質は、他のシャペロンタンパク質を加えなくともＡＴＰアーゼ活性を有することによって特徴付けられる。適切なＡＴＰアーゼ活性の試験方法は、実施例に説明されている。
【００１５】
さらに、前記調製物は、Ｔ細胞刺激性不純物を含まない。これには、エンドトキシン含有量が非常に低いことが求められる。前記調製物は、ＴＨ−１（インターフェロン−γ産生）、およびＴＨ−２（ＩＬ−５またはＩＬ−１３産生）に対して効果を示さない。このことは、実施例でさらに説明される。
【００１６】
前記調製物は、好ましくは、Ｔ細胞刺激性不純物を含などの免疫刺激性不純物を含まない。
【００１７】
「本質的に免疫刺激性不純物を含まない」とは、
・最大で３０μｇ／ｍＬまでＴ細胞の増殖がみられないこと、
・最大で１０μｇ／ｍＬまでＴＮＦ−αの産生がみられないこと
を意味する。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、
ａ）９５重量％以上の純度、
ｂ）タンパク質１ｍｇ当たり１ｎｇ以下の残存ＤＮＡ混入、
ｃ）５重量％未満の残存宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）混入、
ｄ）タンパク質１μｇ当たり０．５Ｅ．Ｕ．未満のエンドトキシン混入
を有するＤｎａＫである。
【００１９】
精製されたＤｎａＫの純度は、「タンパク質あたりの重量」基準で計算される。すなわち、全タンパク質の少なくとも９５％がＤｎａＫである。好ましくは、含有量は、タンパク質の重量で、少なくとも９７％であり、さらに好ましくは、少なくとも９８％である。
【００２０】
好ましくは、この値は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析に続く、クマシー染色および濃度測定によって決定される。
【００２１】
ＤＮＡの含有量は、好ましくは、非常に低い。すなわち、タンパク質１ｍｇ当たり１ｎｇ以下、好ましくは、タンパク質１ｍｇ当たり０．５ｎｇ以下である。ＤＮＡ混入は、特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲで測定される。
【００２２】
試験条件は、発現系の種類に依存する。例えば、大腸菌における発現に対しては、２３Ｓ  ＤＮＡに特異的なプライマーが適切である。Ｐ．ｐａｓｔｅｕｒｉｓに対しては、適切なプライマーは１８Ｓ  ＤＮＡから選択される。これらの方法は、当業者に周知である。
【００２３】
さらに、残存宿主細胞タンパク質混入は５重量％未満で、好ましくは、１重量％未満、さらに好ましくは、０．０００１重量％以下である。好ましくは、これは、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社、アメリカ合衆国から、大腸菌細胞タンパク質測定用に「Ｋｉｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」の商品名で市販されているＥＬＩＳＡ試験で決定される。試験系は、発現系に対応して選択されなければならない。すなわち、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社はまた、他の発現系用に対応するＥＬＩＳＡも開発している。他の選択肢として、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色、ＨＰＬＣ、またはウェスタンブロッティングのような方法が適切である。
【００２４】
エンドトキシン混入は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、アメリカ合衆国から、「Ｋｉｎｅｔｉｃ−ＱＣＬ（登録商標）」の商品名で市販されているＬＡＬ動態試験によって示されるように、タンパク質１μｇ当たり０．５Ｅ．Ｕ．未満である。好ましくは、含有量は、タンパク質１μｇ当たり０．１Ｅ．Ｕ．未満であり、好ましくは、タンパク質１μｇ当たり０．０１Ｅ．Ｕ．未満である。
【００２５】
現在では、ＤｎａＫは免疫刺激性不純物とともに、特に、
・タンパク質、
・ペプチド、
・核酸、
・リポ多糖類（ＬＰＳ）、
の混入を有する可能性があると理解されている。
【００２６】
ＤｎａＫは、シャペロンタンパク質であるので他のタンパク質およびペプチドと結合する。
【００２７】
従来技術の精製方法では、明らかに、ＤｎａＫ調製物中の結合不純物および非結合不純物の両方を取り除くことはできなかった。驚くべきことに、本発明の精製方法により、本質的に免疫刺激性不純物を含まない純度の高い組み換えＤｎａＫを得ることが可能になる。
【００２８】
医薬調製物において、特に、免疫賦活剤として用いるためには、ＤｎａＫが免疫刺激性不純物を含まないことが絶対に必要である。
【００２９】
本発明のさらなる態様は、細胞溶解物から組み換え熱ショックタンパク質、好ましくはＤｎａＫを精製する方法であって、
ａ）イオン交換クロマトグラフィー、
ｂ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、
ｃ）ゼラチンクロマトグラフィー、
のステップを含む。
【００３０】
本発明の好適な態様において、ＤｎａＫは、大腸菌のような腐生細菌由来であるか、またはヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のような病原菌由来である。
【００３１】
好適な実施形態において、イオン交換クロマトグラフィーは、陰イオン交換クロマトグラフィーである。
【００３２】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーとしては、ヒドロキシアパタイトＩＩ型クロマトグラフィーが好ましい。
【００３３】
一実施形態では、ゼラチンクロマトグラフィーは、ゼラチンセファロースで行われる。好ましくは、ＤｎａＫはヌクレオチド、例えば、ＡＤＰ、ＡＴＰを用いてゼラチンから脱着される。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、組み換えＤｎａＫと、少なくとも１つのペプチドまたは少なくとも１つのタンパク質との複合体を形成する方法であって、
ａ）本発明の組み換えＤｎａＫとＡＴＰを、１：１〜１：１０のＤｎａＫ：ＡＴＰモル比で混合するステップ、
ｂ）少なくとも１つのペプチド、または少なくとも１つのタンパク質を添加するステップ、
ｃ）１０℃〜６０℃、好ましくは２０℃〜４５℃の温度でインキュベートするステップ
を含む。
【００３５】
さらなる態様は、本発明の組み換え精製ＤｎａＫと、少なくとも１つのペプチドまたは少なくとも１つのタンパク質との混合物もしくは複合体である。好ましくは、タンパク質は変性された形で用いられる。
【００３６】
本発明は、ＤｎａＫと２つ以上の異なるペプチドとの組み合わせ、またはＤｎａＫといくつかの（任意に変性された）タンパク質との組み合わせ、ならびにＤｎａＫとペプチドおよび（任意に変性された）タンパク質との複合体もまた範囲に含む。
【００３７】
適切なペプチドは、例えば、インスリン、サイログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、ＩＩ型コラーゲン、グリアジン、ＧＡＤ６５、プロテオリピドタンパク質、Ｓ抗原、アセチルコリン受容体、ハプテン化結腸タンパク質、光受容体間レチノイド結合タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、末梢神経Ｐ２、細胞質ＴＳＨ受容体、内因子、水晶体タンパク質、血小板、ヒストンのような核タンパク質、熱ショックタンパク質、ＭＨＣ  Ｉ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＭＨＣ−ペプチド複合体、牛乳アレルゲン、毒アレルゲン、卵アレルゲン、雑草アレルゲン、草アレルゲン、樹木アレルゲン、潅木アレルゲン、花アレルゲン、穀物アレルゲン、菌類アレルゲン、果物アレルゲン、液果（ｂｅｒｒｙ）アレルゲン、ナッツアレルゲン、種子アレルゲン、豆アレルゲン、魚アレルゲン、貝アレルゲン、肉アレルゲン、香辛料アレルゲン、昆虫アレルゲン、ダニアレルゲン、動物アレルゲン、動物鱗屑アレルゲン、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）のアレルゲン、凝固因子および血液型抗原、野菜アレルゲン、カビアレルゲン、サイトカイン、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）に関与するタンパク質またはペプチド、中毒物質を含むペプチドおよびその断片である。これらタンパク質は、直接的に、好ましくは変性した形で、またはより小さな断片に加水分解した後に利用され得る。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、医薬組成物において、担体タンパク質、または、液性応答や、他のＴ細胞応答が無い場合に調節性Ｔ細胞応答を誘発する免疫賦活剤として、本発明のＤｎａＫを利用することである。
【００３９】
さらなる態様は、本発明のＤｎａＫまたは本発明の混合物もしくは本発明の複合体を、インビボおよび／またはインビトロ診断のために使用すること、および本発明の組み換え精製ＤｎａＫまたは本発明の複合体を、寛容を誘発する医薬組成物の調製のために使用することであって、寛容は、アレルギー、自己免疫疾患もしくは移植片拒絶、あるいは神経変性疾患の治療および／または予防に適している。
【００４０】
あらゆる種類の応用において、本発明のＤｎａＫは、ＡＴＰとの複合体、ＡＤＰとの複合体、またはヌクレオチドを含まない形態で使用され得る。いくつかの用途では、本発明のＤｎａＫを加水分解することもまた有用である。「ヌクレオチドを含まない」とは、モル基準で５％未満のヌクレオチドとして理解される。
【００４１】
一般的な自己免疫疾患は、とりわけ、全身性エリテマトーデス病、シェーグレン症、リウマチ性多発性関節炎、ならびに、サルコイドーシスおよび骨減少症、脊椎関節炎、強皮症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、甲状腺機能亢進症、アディソン病、自己免疫溶血性貧血、クローン病、グッドパスチャー症候群、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、特発性紫斑出血、インスリン依存性糖尿病、筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、溶連菌感染後糸球体腎炎、乾癬および自然不妊症のような病状である。
【００４２】
薬剤は、例えば、静脈内、筋肉内、経口、鼻腔内、または肺内に投与されうる。好適な手段は、舌下送達、経口腔送達または腸管送達である。
【００４３】
「舌下投与」および「経口腔投与」は、口腔粘膜で少なくとも１つの物質が吸収されるよう医薬製剤中に物質を混合する方法である。舌下投与は、物質が口内を覆う粘膜を通して口内に拡散するあいだ、患者が（舌下）医薬組成物または剤形を舌下に保持するものである。経口腔投与において、患者はバックル（ｂｕｃｋｌｅ）医薬組成物または剤形を、舌下の代わりに頬と歯肉（歯茎）の間に保持する。経口腔投与では、より速やかな口腔内吸収または放出を可能とするように咀嚼される場合がある。従って、本発明は、好適な実施形態において、ガムを基にした製剤、またはチェーイングガム製剤を提供する。
【００４４】
「腸管送達」は、腸に入る前の吸収および／または分解から活性成分を保護する医薬製剤中に、物質が含まれている方法である。好ましくは、吸収は、回腸、十二指腸、または空腸でなされる。好適な一実施形態においては、前記医薬製剤は、坐薬であってもよい。
【００４５】
特に適切な製剤には、例えば、Ｄｅｇｕｓｓａ社、ドイツから市販され、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）の商標で販売されているもの、またはＦａｇｒｏｎ社より入手可能な酢酸フタル酸セルロース、あるいは信越化学工業株式会社より入手可能なヒドロキシプロピルメチルセルロースフタル酸エステルなどの高分子コーティングが含まれる。これら高分子は、腸で放出される固形経口製剤に適している。好適な実施形態において、適切な医薬製剤は、患者における塩酸（胃分泌物）の中和、および／またはペプシンの阻害、ならびに／または炭酸水素塩および粘液分泌を刺激するために必要な、任意の結合剤または賦形剤を含む。
【００４６】
胃での塩酸の中和および／またはペプシンの阻害は、例えば、スクラルファート、またはこれらに限定はされないが、ポリエチレンイミンのようなプロトン結合高分子、またはアルミニウム塩、ビスマス塩、マグネシウム塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、クエン酸カリウム、酒石酸カリウムナトリウム、リン酸三カルシウム、およびそれらの混合物からなる群から選択される任意の中和制酸剤（制酸薬）もしくは任意の酸遮断薬により達成され得る。
【００４７】
適切な製剤において使用できるいくつかの他の種類の酸遮断薬は、胃プロトンポンプ阻害剤（または胃Ｈ+／Ｋ+ＡＴＰアーゼ阻害剤）、プロスタグランジン類似物、およびヒスタミンＨ２受容体拮抗薬と呼ばれる。これらには、ミソプロストール、ラニチジン（ザンタック（登録商標）に用いられる）、シメチジン（タガメット（登録商標）に用いられる）、ニザチジン（アクシド（登録商標）に用いられる）、ファモチジン（ペプシド（登録商標）に用いられる）、スホチジン（ｓｕｆｏｔｉｄｉｎｅ）、ロキサチジン、ビスフェンチジン（ｂｉｓｆｅｎｔｉｄｉｎｅ）、チオチジン（ｔｉｏｔｉｄｉｎｅ）、ラムチジン（ｌａｍｔｉｄｉｎｅ）、ニペロチジン（ｎｉｐｅｒｏｔｉｄｉｎｅ）、ミフェンチジン（ｍｉｆｅｎｔｉｄｉｎｅ）、ザルチジン（ｚａｌｔｉｎｄｉｎｅ）、ロクスチジン（ｌｏｘｔｉｄｉｎｅ）、オメプラゾール（ＰＲＩＳＯＬＥＣ（登録商標）に用いられる）、およびラベプラゾールが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
好ましくは、ＤｎａＫは非還元糖から選ばれる増量剤とともに用いられる。
【００４９】
他の好適な実施形態では、適切な製剤は、どのような大きさまたは形であってもよい非活性粒子と結合、または非活性粒子にカプセル化された、少なくとも１つの前記物質の微小球を含む。該粒子は、約３０〜３５メッシュ（約６００μｍ〜５００μｍ）、または約４０メッシュより大きいメッシュサイズ、および最も好ましくは約４５〜２００メッシュの範囲のメッシュサイズを有し、例えばノンパレイユ（ｎｏｎｐａｒｅｉｌ）、シリカ粉末、塩結晶、または糖結晶であってもよい。
【実施例】
【００５０】
本発明を、次の実施例によって詳細に説明する。
【００５１】
実施例１：ＤｎａＫ産生および精製
ＤｎａＫ産生
細菌株
大腸菌株ＪＳ２１９／ｐＯＦＸｔａｃ−１／ＫＪ１を、大腸菌ＤｎａＫをコードするプラスミドを導入することによって、遺伝子改変する。クローニングステップおよびベクターｐＯＦＸｔａｃ−１／ＫＪ１の構築は、Ｃａｓｔａｎｉｅ  ＭＰ、Ｂｅｒｇｅｓ  Ｈ、Ｏｒｅｇｌｉａ  Ｊ、Ｐｒｅｒｅ  ＭＦ、Ｆａｙｅｔ  Ｏ  Ａ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｐＢＲ３２２−ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９７）２５４（１）：１５０−１５２に記述されている。
【００５２】
前培養
種菌（Ｍａｓｔｅｒ  Ｓｅｅｄ）のバイアル１本（１．５ｍＬ）を室温まで解凍する。５００ｍＬのＹＥＳ＋カナマイシン培地（３０ｇ／Ｌ  酵母抽出物、５ｇ／Ｌ  塩化ナトリウム、および５０ｍｇ／Ｌ  硫酸カナマイシン）を含む３つの２Ｌ振盪フラスコに、それぞれ４００μＬの種菌を播種し、ＯＤ600nmが０．７単位を超えるまで、６±０．５時間、３７℃で振盪（２７０ｒｐｍ）培養する。
【００５３】
醗酵
当該前培養液を、５０ＬのＮＲＪ１８＋カナマイシン培地（５．２ｇ／Ｌ  ＫＨ2ＰＯ4、１０．７ｇ／Ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、０．４ｇ／Ｌ  グリセロール、５０ｇ／Ｌ  酵母抽出物、３０ｇ／Ｌ  大豆ペプトン、２．５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．６ｍＬ／Ｌ  ＳＡＧ４７１、１００ｍｇ／Ｌ  硫酸カナマイシン）を含む、予め殺菌した発酵槽に加える。温度を３７℃±５℃に、圧力を３６０ｍｂａｒに維持する。吸光度が２５±１になったとき、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を添加することによって培養液を誘導する。その後、誘導条件を４時間維持する。培養液を２０℃未満に急速冷却する。培養液を５０ｐｍ  Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ  ＰＰ２濾過装置を通して濾過する。細胞沈殿物を４５００ｒｐｍ（５０００×ｇ）、３０分間、４℃の遠心分離により回収し、使用まで−２０℃で凍結する。
【００５４】
細胞の破壊および上清の濾過
細胞沈殿物は、室温において２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８中で解凍する。次いで、細胞ペースト濃度を、緩衝液を加えることによって、１Ｌ当たり１６６．６ｇの新鮮細胞重量に調節する。細胞懸濁液を、氷上においたタンクに充填する。ホモジナイズした細胞を、Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ  Ｐａｎｄａ高圧力破壊器を用いて、８００および５０ｂａｒｓの平均圧力で、２サイクル破壊する。
【００５５】
細胞溶解物を、３０分間、１６０００ｇ（８０００ｒｐｍ）、４℃で遠心分離する。上清を回収し、Ｓａｒｔｏｂｒａｎ  Ｐ  Ｍａｘｉｃａｐ  １０インチ（０．２μｍ）を通して濾過する。濾過した上清を、次のステップまで４℃で一晩保存する。
【００５６】
ＤｎａＫの精製
ＱセファロースＨＰクロマトグラフィー（ＱＨＰ）
陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＱセファロースＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行う。高度精製水を６８ｃｍ／ｈ（３３．４Ｌ／ｈ）の線流速でカラムに充填する。充填カラムベッドの寸法は、直径２５０ｍｍ、断面積１３２ｃｍ2、ベッド高２５．０ｃｍ、充填容積約１２．２７Ｌである。
【００５７】
濾過した上清を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８．０で２倍に希釈し、必要に応じて、１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液（ｐＨを調節してない溶液）で、ｐＨをｐＨ８±．０．１に調節する。最終伝導率は、１０ｍＳ／ｃｍ未満でなければならない。次に、希釈した上清を、流速２２．１Ｌ／ｈ（４５ｃｍ／ｈ）でカラムにロードする。ロード完了後、カラムを２．０〜３．０ＣＶの２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８．０を用いて、１９．６Ｌ／ｈ（４１．５ｃｍ／ｈ）で、ベースラインが０に達するまで洗浄する。２２．１Ｌ／ｈ（４５ｃｍ／ｈ）で、２つのステップで溶出を行う：第１のステップは、２〜３ＣＶの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ＋０．２５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０緩衝液を用いて行う。第２のステップは、２〜３ＣＶの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ＋０．４５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．０緩衝液を用いて行う。このステップで捕集した画分を、次の精製ステップのため保存する。吸光度を２８０ｎｍで測定する。溶出液は次の精製ステップまで、２〜８℃で一晩保存する。
【００５８】
試料（各画分２０μＬ）を変性し、４〜１２％ビス／トリスＮＵ−ＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質をクマシーブルーで染色した。（図１参照）
【００５９】
ヒドロキシアパタイトＩＩ型クロマトグラフィー（ＨＡ）
第２のクロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイトＩＩ型−４０μｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行う。樹脂（２０００ｇ）を、緩やかに攪拌しながら、３．２ＬのＮａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ＋ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ  ２００ｍＭ、ｐＨ６．８に注ぎ入れる。Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ＋ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ  ２００ｍＭ、ｐＨ６．８を、線流速１７５ｃｍ／ｈ（２６．９Ｌ／ｈ）でカラムに充填する。充填したカラムベッドの寸法は：直径１４ｃｍ、断面積＝１５４ｃｍ2、ベッド高＝２１．５ｃｍ、充填容量＝３．３１Ｌである。
【００６０】
ＱＨＰ溶出液を、６等分した画分でＨＡカラムにロードする。すべてのヒドロキシアパタイト工程は、流速１５０ｃｍ／ｈ（２３．１Ｌ／ｈ）で行う。
【００６１】
カラムを、２．５〜３．５ＣＶの２００ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ６．８で、次いで、２．５〜３．５ＣＶの５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ６．８で、ｐＨおよび伝導率が安定するまで平衡化する。
【００６２】
５０％塩酸を用いてｐＨを６．８±０．１に調節した後、ＱＨＰ溶出液（全容量の６分の１）をカラムにロードする（先のクロマトグラフィーステップのＮａＣｌ濃度は、ＨＡ吸着には重要ではないことに注意することが大切である。）。ロード完了後、カラムを１．５〜２．５ＣＶの５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4＋Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ６．８緩衝液で、Ｕ．Ｖ．がベースラインに戻るまで洗浄する。吸光度は２８０ｎｍで測定する。
【００６３】
その後、１０ＣＶの０％〜１００％勾配の２００ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4／Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ  ６．８緩衝液を用いて溶出を行う。通常、溶出は約６ＣＶで完了する。
【００６４】
溶出のピークを捕集し、プール画分を０．２２μｍのフィルターを通して濾過し、２〜８℃で保存する。
【００６５】
溶出後、次の試料をロードする前に、２．５〜３．５ＣＶの５ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4＋Ｎａ2ＨＰＯ4  ｐＨ６．８緩衝液で再生ステップを行う。
【００６６】
試料を変性し、４〜１２％ビス／トリスＮＵ−ＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質をクマシーブルーで染色した（図２参照）。
【００６７】
ダイアフィルトレーション／サイズ排除クロマトグラフィー
３０ｋＤａメンブランでのダイアフィルトレーション、およびＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００  ＨＲ樹脂でのクロマトグラフィーによって不純物を分離することを試みた。これら二つの方法で、不純物を取り除くことはできなかった。実際、ダイアフィルトレーションの滞留物中に、不純物がＤｎａＫとして回収される。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ１００  クロマトグラフィーにおいては、不純物がＤｎａＫと共溶出した。
【００６８】
これら異なる試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を図３に示す。試料を変性し、４〜１２％ビス／トリスＮＵ−ＰＡＧＥゲルにロードした。電気泳動後、タンパク質をクマシーブルーで染色した。
【００６９】
ゼラチンセファロースファストフロークロマトグラフィー（ＧＳＦＦ）
ＤｎａＫから不純物を分離するために試験した第３の方法には、ゼラチンセファロースファストフロー樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのクロマトグラフィーが含まれる。高度精製水を線流速１５０ｃｍ／ｈ（１９．９Ｌ／ｈ）でカラムに充填する。充填したカラムベッドの寸法は：直径１３ｃｍ、断面積１３３ｃｍ2、ベッド高１５ｃｍ、充填容積１．９９Ｌである。
【００７０】
ＨＡ溶出液のプールを、ＧＳＦＦカラムに９等分した画分でロードする。ＧＳＦＦサイクルの合間に、６Ｍの塩酸グアニジンで洗浄を行う。すべてのゼラチンセファロース工程は、流速１２０ｃｍ／ｈ（１５．９Ｌ／ｈ）で行う。
【００７１】
カラムを、１．５〜２．５ＣＶの７０％エタノール＋０．１Ｍ酢酸で、一時間の接触時間で浄化する。次いで、２．５〜３．５ＣＶの０．５Ｍ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５で平衡化する。
【００７２】
溶出液のＨＡプール（全容量の９分の１）をカラムにロードする。ロード完了後、カラムを１．５〜２．５ＣＶの０．５Ｍ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５緩衝液で、Ｕ．Ｖ．がベースラインに戻るまで洗浄する。吸光度を２８０ｎｍで測定する。
【００７３】
その後、３〜４ＣＶの０．５Ｍ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋３ｍＭ  ＡＴＰ＋１ｍＭ  ＭｇＣＩ2、ｐＨ７．５で溶出を行う。
【００７４】
吸光度が上昇するとき、画分を２ＣＶの間に捕集する。９番目のＧＳＦＦサイクルの後、カラムを１．５〜２．５ＣＶの６Ｍ塩酸グアニジンで清浄し、次に、３ＣＶの０．５Ｍ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５緩衝液で洗浄し、２０％エタノール中に保存する。
【００７５】
図４に示されるように、ゼラチンセファロース樹脂でのクロマトグラフィーにより、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後に得られた試料と比較して、明らかにＤｎａＫの純度が向上される（レーン２とレーン３の比較）。この場合、ＤｎａＫの純度は、９８．２５％より高い（実施例２および図５参照）。
【００７６】
細胞溶解物の上清をゼラチンセファロースカラムに直接ロードする場合は、このステップ後のＤｎａＫの純度は約９５％である。
【００７７】
ＱセファロースＨＰ後にゼラチンセファロースステップを行う場合は、ＱセファロースＨＰおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後に得られる試料と比較して、ＤｎａＫ調製物の純度は増加しない（図４のレーン２とレーン４の比較）。
【００７８】
これらの結果は、これら３種のクロマトグラフィー（ＩＥＸ、ＨＡ、およびＧＳＦＦ）の組み合わせが、純度９８％を超えるＤｎａＫ調製物を得るために絶対的に必要であることを証明している。
【００７９】
濃縮、および接線流濾過によるダイアフィルトレーション
濃縮は、２つのＰＬＣＴＫ  ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ２  メンブラン（カットオフ分子量３０ｋＤａ、０．１ｍ2、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、Ｐｒｏｆｌｕｘ  Ｍ  １２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて行う。
【００８０】
メンブランを３Ｌの注入用水で２回洗浄し、操作の前にメンブランの完全性を試験した。０．５Ｍの水酸化ナトリウムで、６０分間継続的に再循環することによって浄化を行う。次に、メンブランを３０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ＋２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．３緩衝液で、透過物のｐＨが７．３±０．１に達するまで洗浄する。
【００８１】
プールしたゼラチンセファロース溶出液（ＧＳＦＦ−Ｅプール）を、２０００ｍＬに濃縮し、次いで、緩衝液を交換するために、１０倍量の３０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ＋２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．３緩衝液に対してダイアフィルトレートする。次の工程パラメーターを用いる：Ｐin＝１．５±０．１ｂａｒ、Ｐout＝０．５±０．１ｂａｒ、ＴＭＰ＝１ｂａｒ。
【００８２】
ダイアフィルトレーションに続いて、システムおよびメンブランを、２００ｍＬの３０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ＋２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．３緩衝液で、２回洗浄する。使用した洗浄溶液を、ダイアフィルトレートした滞留物に加える。
【００８３】
ダイアフィルトレーションに続いて、システムおよびメンブランを注入用水で洗浄する。０．５Ｍの水酸化ナトリウムで６０分間継続的に再循環することによって浄化を行う。システムを０．１Ｍの水酸化ナトリウムで保存する。
【００８４】
無菌濾過
ダイアフィルトレートした滞留物で行ったＵＶアッセイに従って、その濃度を、３０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ＋２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．３緩衝液で２．５ｍｇ／ｍＬに調節する。
【００８５】
ステップ４の、ダイアフィルトレートしたＤｎａＫ−ＡＴＰ画分の濾過は、Ｍｉｌｌｉｐａｋ６０（０．２２μｍフィルター）で行う。濾過の前に、フィルターを、３０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ＋２０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、ｐＨ７．３緩衝液で洗浄する。すべてのＤｎａＫ−ＡＴＰアリコートを−２０℃で保存する。
【００８６】
実施例２：ＤｎａＫ特性
実施例１によって得られたＤｎａＫは非常に純粋である。
タンパク質純度
タンパク質に関しては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色で決定されたように、純度は９８．２５％を超える（図５）。当該物質を変性し、量を減少させながら４〜１２％ビス／トリスＮＵ−ＰＡＧＥゲルにロードした。タンパク質を電気泳動で分離し、クマシーブルーＲ２５０（０．１％）で染色した。産物の純度を、異なる希釈度におけるＤｎａＫのバンド強度と、レーン２で検出可能な、混入物と考えられる各バンドの強度とを比較することで評価する。
【００８７】
残存ＤＮＡ含有量
２３Ｓ染色体ＤＮＡに対する細菌ＤＮＡ特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲで定量した残存ＤＮＡ含有量は、タンパク質１ｍｇ当たり０．２２ｎｇである。定量リアルタイムＰＣＲは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によるゲノムＤＮＡの増幅に基づいている。この方法においては、増幅されたＤＮＡの量を、新しく形成された二本鎖ＤＮＡに結合するＳＹＢＲグリーン色素を用いた蛍光測定によってリアルタイムで追跡する。細菌ＤＮＡに対するプライマーは、Ｓｍｉｔｈらによって提案されているように２３Ｓ染色体ＤＮＡから選択された（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ（１９９９）２６：５１８−５２６）。
【００８８】
残存宿主細胞タンパク質含有量
ＥＬＩＳＡで決定された残存宿主細胞タンパク質含有量は０．００００４％である。Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．により開発された細菌タンパク質含有量測定は、サンドイッチＥＬＩＳＡの原理に基づいている。簡潔に言うと、９６穴プレートを、抗大腸菌捕捉抗体でコーティングする。試料に含まれる大腸菌タンパク質は、これらの抗体に捕捉され、アルカリホスファターゼと結合した別の特異的大腸菌抗体を用いて検出される。洗浄して非結合の試薬を取り除いた後、酵素の基質（ｐ−ニトロフェニルリン酸：ｐＮＰＰ）を加える。吸光度測定は、反応生成物濃度、すなわち試料中に存在する宿主細胞タンパク質に比例する。
【００８９】
エンドトキシン含有量
エンドトキシン含有量（ＬＡＬ法で測定）は、タンパク質１μｇ当たり０．００２Ｅ．Ｕ．である。エンドトキシンを定量するために用いた方法は、Ｃａｍｂｒｅｘ社によって開発されたＫｉｎｅｔｉｃ−ＱＣＬ（登録商標）テストである。この方法は、グラム陰性細菌エンドトキシンが、カブトガニ血球細胞溶解物（ＬＡＬ）中の酵素前駆体の活性化を触媒する次の原理に基づいている。この酵素の活性化に際し、ｐ−ニトロアニリン（ｐＮＡ−ｙｅｌｌｏｗ）がＡｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｇ−ｐＮａ（無色）から遊離される。培養中、４０５ｎｍでの吸光度を継続的に測定する。吸光度は培地中のｐＮＡ濃度に比例する。試料中のエンドトキシン濃度を、その反応時間から、既知の量の大腸菌エンドトキシンスタンダードの反応時間と比較することによって計算する。
【００９０】
ヌクレオチド含有量
この方法で得られた精製ＤｎａＫの４０％はヌクレオチドを含まないＤｎａＫに相当し、残りの６０％がＤｎａＫ−ＡＤＰである。
【００９１】
実施例３：ＤｎａＫのＡＴＰアーゼ活性
ＤｎａＫの機能性を確認するため、そのＡＴＰアーゼ活性を測定した。外因性のＡＴＰを加え、ＡＤＰ産生を経時的に追跡した。ヌクレオチドはＣ１８カラムを用いたイオン対逆相クロマトグラフィーによって分析する。ＡＴＰ加水分解の速度は、０．０５分-1であり、これは、文献（Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ＭｃＭａｃｋｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：４５６３−４５６９）で報告された値に一致している。詳細には、外因性のＡＴＰ（６モル当量）を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１０ｍＭ  ＫＣｌの存在下でＤｎａＫに加えた。反応培地のアリコート（５００μＬ）を５、１５、３０、４５、および６０分後に収集し、１００μＬの１Ｍ塩酸を加えることによって反応を停止した。１０ｋＤａフィルターで濾過してＤｎａＫからヌクレオチドを分離し、濾液を中和した後、Ｃ１８カラムでのイオン対逆相クロマトグラフィーによって分析した（図６）。溶離液は、１００ｍＭリン酸緩衝液、および２０％メタノールからなり、テトラブチルアンモニウムを対試薬として用いた。
【００９２】
実施例４：ＤｎａＫの生物学的特性
ＤｎａＫは炎症性効果を有しない：
ＤｎａＫは、全血に添加された場合、細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）と比較して、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の非常に低い産生しか誘導しなかった。これらサイトカインの産生は、高濃度のＤｎａＫ（３０μｇ／ｍＬ）でのみ検出可能であった（図７）。サイトカイン産生は、ＤｎａＫまたはＬＰＳの存在下で２４時間培養した全血で定量し、測定はＥＬＩＳＡで行った。
【００９３】
ＤｎａＫ自身はＴH１応答またはＴH２応答を誘発しない：
ヒトＰＢＭＣ（末梢血リンパ球）をＤｎａＫのみの存在下で培養（６日間）したとき、ＴH１タイプのリンパ球の活性化を示すインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）は産生されなかった（図８）。ＴH１リンパ球の活性化およびＩＦＮ−γ産生は、炎症性応答を活性化する。
【００９４】
ＴH２リンパ球の活性化に続いて産生されるインターロイキン５またはインターロイキン１３（ＩＬ−５、ＩＬ−１３）の産生は、みられない（図８）。ＴH２応答は、ＩｇＥ抗体の産生およびマスト細胞の脱顆粒に関与している。
【００９５】
ポジティブコントロールは、非特異的にリンパ球を活性化するＰＨＡ（フィトヘマグルチニン）である。５人の異なるボランティアに対して、培地中でＥＬＩＳＡによりサイトカイン産生を測定した（各測定は二度ずつ行った。）。
【００９６】
６試料中２試料において、ＤｎａＫに応答したインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の弱い産生が検出された。ＩＬ−１０は寛容現象の発現に関与する。
【００９７】
ＤｎａＫはＰＢＭＣ増殖を刺激しない：
ヒト血液から精製したＰＢＭＣを、ＤｎａＫ（１〜９μｇ／ｍＬ）または水痘帯状疱疹ウイルス抗原（ポジティブコントロールとして、１ＣＰＡＵ／ｍＬ）の存在下で、９６穴プレートで５日間培養した。１００μＬの培地を、１μＣｉのトリチウム標識チミジンを含む新鮮培地に置換し、細胞をさらに１６時間培養した。第６日目、トリチウム標識チミジンの取り込みを、液体シンチレーションを用いたベータ計数器で測定した。
【００９８】
【表１】
0005580047.tif 000002
【００９９】
ＤｎａＫは、他の抗原によって誘発されたＩＦＮ−γ産生を阻害する：
ヒトＰＢＭＣを、カンジジンのみ、またはカンジジンと濃度を増加させたＤｎａＫ（１〜２０μｇ／ｍＬ）の存在下で３日間培養した。培地中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで定量した。結果は４回測定の平均±ＳＤとして表す。
【０１００】
ＩＦＮ−γは抗原への炎症性応答に関与するので、その産生がＤｎａＫの存在下で阻害されたという事実は、ＤｎａＫが何らかの抗炎症性効果を有し得ることを示唆している（図９）。
【０１０１】
ＤｎａＫはＴｒｅｇ細胞によるＩＬ−１０産生を刺激する：
ＩＬ−１０は、寛容のひとつのメディエーターである。ＩＬ−１０は、細胞表面にＣＤ２５を強く発現するいくつかのＴｒｅｇ細胞（これらはＣＤ２５+細胞である）によって産生される。
【０１０２】
ヒト血液から、樹状細胞、ＣＤ２５+細胞、およびＣＤ２５-細胞を精製し、正確な比率でそれらを混合した。樹状細胞を、まずＢＳＡまたはＤｎａＫ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下で培養し、次いでリンパ球：ＣＤ２５-のみ、ＣＤ２５+のみ、またはＣＤ２５-／ＣＤ２５+（比１：１）の混合物を加えた。培養を３日間維持し、細胞をＰＨＡで刺激を与えるか、または刺激を与えなかった。
【０１０３】
予想された通り、培養中のＣＤ２５+細胞の存在により、ＣＤ２５-細胞によるＩＦＮ−γの産生が阻害された（図１０）。ＣＤ２５+細胞によるＩＬ−１０産生は、ＢＳＡで培養した細胞と比べて、ＤｎａＫで培養した細胞にとってより重要であり、ＩＬ−１０産生は、細胞集団の混合物においてさらに増加した。このことは、ＰＨＡによるＴ細胞の活性化に続いて、ＤｎａＫがＴｒｅｇによるＩＬ−１０産生を刺激することを示唆している。
【０１０４】
ヒト血液中には、抗ＤｎａＫ抗体が存在する：
ＥＬＩＳＡ試験を用いて、ヒト血清中に抗ＤｎａＫ  ＩｇＧが存在することを指摘した。（健康なボランティア、およびアレルギー患者からの）試験試料の４０％において、ＯＤ405nmは、ＢＳＡの場合よりもＤｎａＫの場合のほうが大きかった（図１１）。これは、ＢＳＡに対してよりもＤｎａＫに対してのほうがよりＩｇＧの力価が高いことを示している。
【図８】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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