(57)【要約】  Ｇ蛋白質共役型受容体としての機能を有する蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子を見出し、該遺伝子の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖、該ＤＮＡの相同物、前記ＤＮＡによりコードされる蛋白質、前記ＤＮＡによりコードされる蛋白質を発現する細胞のうち少なくともいずれか１を使用することを特徴とする前記蛋白質の機能の阻害剤である抗不安作用を有する化合物の同定方法、不安状態の改善剤および改善方法、不安障害の予防および／または治療方法並びに予防および／または治療剤、不安障害の診断用測定方法および診断方法を提供する。
2008053962.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質の機能の阻害剤である抗不安作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはそのホモログＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該ＤＮＡを含む細胞からなる群から選択される少なくともいずれか１を使用することを特徴とする同定方法。
【請求項２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能の阻害剤である抗不安作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよびそのスプライシングバリアントであるＤＮＡのうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該ＤＮＡを含む細胞からなる群から選択される少なくともいずれか１を使用することを特徴とする同定方法。
【請求項３】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能の阻害剤である抗不安作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１、１５、１７、１９または２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡを含む細胞と被検化合物とを接触させ、該細胞の細胞膜上に発現された該蛋白質の機能を測定し、該細胞を被検化合物と接触させないときと比較して該蛋白質の機能を低下または消失させる被検化合物を抗不安作用を有する化合物であると決定することを含む同定方法。
【請求項４】
細胞の細胞膜上に発現された蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添加により細胞内カルシウム濃度の上昇を惹き起こす機能である、請求項３に記載の同定方法。
【請求項５】
細胞の細胞膜上に発現された蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添加により膜電位変化を惹き起こす機能である、請求項３に記載の同定方法。
【請求項６】
下記の群；
（ｉ）コレシストキニンオクタペプチド硫酸化型（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ  ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｆｏｒｍ；配列番号１４、以下、ＣＣＫ−８Ｓと略称する）、
（ｉｉ）ＣＣＫ−８Ｓのアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加等の変異を有し、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチド、
および
（ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のペプチドのアミノ酸配列を含み、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチド、
より選択されるペプチドをリガンドとして使用する、請求項４または５に記載の同定方法。
【請求項７】
化合物の抗不安作用の評価を非ヒト動物を使用してその不安状態を測定する実験系において行うことをさらに含む請求項１から６のいずれか１項に記載の同定方法。
【請求項８】
非ヒト動物を使用してその不安状態を測定する実験系が、恐怖条件付け試験、ボーゲル（Ｖｏｇｅｌ）型抗コンフリクトテスト、ゲラー−セイフター（Ｇｅｌｌｅｒ−Ｓｅｉｆｔｅｒ）型抗コンフリクトテスト、高架式迷路法、ホール−ボードテスト（ｈｏｌｅ−ｂｏａｒｄ  ｔｅｓｔ）、明暗試験、社会性相互作用テスト、およびビー玉埋め法からなる群から選択される、請求項７に記載の同定方法。
【請求項９】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能および／または発現を阻害することを手段とする不安状態の改善方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の不安状態の改善方法を使用する不安障害の予防および／または治療方法。
【請求項１１】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択される少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる、不安障害の診断に使用するための測定方法。
【請求項１２】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択される少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる不安障害の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗不安作用を有する化合物の同定方法に関するものである。より詳しくは、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能の阻害剤である抗不安作用を有する化合物の同定方法に関する。また本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能および／または発現を阻害する化合物を含む不安状態の改善剤に関する。さらに本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能および／または発現を阻害することを手段とする不安状態の改善方法に関する。また本発明は、前記不安状態の改善剤を有効量含んでなる不安障害の予防および／または治療剤に関する。さらに本発明は、前記不安状態の改善剤または前記不安状態の改善方法を使用する不安障害の予防および／または治療方法に関する。また本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択される少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質を分析することを含んでなる、不安障害の診断に使用するための測定方法または不安障害の診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の細胞膜に存在する膜蛋白質受容体は、生体において細胞の重要なセンサーとして働いており、様々な疾患の治療薬を開発する上で重要な標的分子である。【０００３】
膜蛋白質受容体は、生体膜の脂質二重層を貫通するドメインを持ち、細胞膜に存在して、各種生理活性物質を特異的に認識し、その作用を伝達し発現する。膜蛋白質受容体に特異的に結合する生理活性物質を一般にリガンドと称する。リガンドとして、ペプチドホルモン、神経伝達物質、および増殖因子等が例示される。リガンドが膜蛋白質受容体に結合すると、セカンドメッセンジャーの形成、細胞内イオン濃度の変化、および蛋白質のリン酸化等を介して細胞応答が惹き起こされる。リガンドの膜蛋白質受容体への結合により細胞内でセカンドメッセンジャーの形成、細胞内イオン濃度の変化、および蛋白質のリン酸化等の変化が生じる一連の反応を一般的に情報伝達と称し、該一連の反応の過程を情報伝達経路と称する。【０００４】
Ｇ蛋白質共役型受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下、ＧＰＣＲと略称することがある）は細胞膜に存在する糖蛋白質で、細胞膜貫通ドメインを７個有するという構造的特徴を持つ細胞膜７回貫通型受容体の１種であり、多数のメンバーを有するスーパーファミリーを構成している。既に１０００種類以上のＧＰＣＲ遺伝子が同定され、ＧＰＣＲの３次元構造、ＧＰＣＲに対するリガンド、ＧＰＣＲを介する細胞内情報伝達経路、およびその機能等に関する研究が進められている。【０００５】
ＧＰＣＲは、光、匂い、味の受容体であると同時に、ホルモンや神経伝達物質の受容体でもあり、酵母からヒトまで、生体において細胞の主要なセンサーとして働いている。【０００６】
ＧＰＣＲはリガンドにより刺激を受けると、細胞内に存在するＧ蛋白質と結合する。Ｇ蛋白質は、ＧＰＣＲと共役し、情報伝達因子として機能する蛋白質である。Ｇ蛋白質は、細胞内情報伝達経路において情報伝達に関わる数々の因子（以下、エフェクターと称する）に対する機能と該蛋白質をコードする遺伝子の違いから、数種類のファミリーに大別されている。いずれのファミリーに属するＧ蛋白質も、α、βおよびγと称する３つのサブユニットからなる３量体であり、通常、グアノシン５´−二リン酸（ＧＤＰ）がαサブユニットに特異的に結合している。ＧＤＰ結合型Ｇ蛋白質は、エフェクターに対して作用を示さない不活性型である。ＧＰＣＲがリガンドにより刺激を受けると、Ｇ蛋白質に結合しているＧＤＰと細胞内に存在するグアノシン５´−三リン酸（ＧＴＰ）との交換反応が生じ、Ｇ蛋白質からＧＤＰが遊離し、それに続いてＧ蛋白質へＧＴＰが結合し、ＧＴＰ結合型Ｇ蛋白質が形成される。ＧＴＰ結合型Ｇ蛋白質は活性型と呼ばれ、ＧＴＰが結合しているαサブユニット（αＧＴＰ）とβおよびγサブユニットからなる２量体（βγ）とに速やかに解離する。αＧＴＰとβγは、エフェクター（例えばカルシウムイオンチャネルやカリウムイオンチャネル等）に直接作用して、細胞内情報伝達経路を活性化し、その結果、数々の細胞応答を惹き起こす。【０００７】
ＧＰＣＲスーパーファミリーのなかで、クラスＢ（Ｓｅｃｒｅｔｉｎ  ｌｉｋｅ）に分類されているヒト脳血管形成阻害因子２（ｈｕｍａｎ  ｂｒａｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ２、以下ｈＢＡＩ２と略称する）は、その遺伝子がＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＢ００５２９８として登録されている。【０００８】
ｈＢＡＩ２については、配列情報と発現分布に関する報告（非特許文献１）がある。ｈＢＡＩ２の機能および疾患との関連に関しては、ｈＢＡＩ２遺伝子および該遺伝子と高い相同性を有する遺伝子（特許文献１）によりコードされる蛋白質とうつ病との関連が本発明者らにより報告されている（特許文献２）ほかは報告がない。ＢＡＩ２のホモログであるＢＡＩ１との構造比較により、細胞外ドメイン中にトロンボスポンジン  タイプＩドメイン（以下、ＴＳＰ−Ｉドメインと称する）が存在すると考えられている（非特許文献２）。ＴＳＰ−Ｉドメインは、トロンボスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ）の第３８５番目から第５２２番目のアミノ酸配列で表される領域に認められる特徴のあるドメインであり、トロンボスポンジンの細胞外マトリックスへの関与およびその血管新生阻害能に重要な機能ドメインであることが知られている。【０００９】
ｈＢＡＩ１については、特異的にヒト脳組織での発現が高いこと、細胞外領域に血管新生抑制能を持つドメインが存在すること、ｐ５３による発現制御を受けている可能性があること等が報告されており、この遺伝子が脳における血管新生に関する機構に何らかの関与をしている可能性が示唆されている（非特許文献１−４）。【００１０】
ｈＢＡＩ２の関連遺伝子であるマウスＢＡＩ２については、脳虚血モデルラットの脳組織においてＢＡＩ２と血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）との間に発現量の負の相関が見られることが報告されており、ｈＢＡＩ１同様に血管新生に関与している可能性が考えられている。具体的には、低酸素状態の後、ＢＡＩ２の発現が低下し、その後ＶＥＧＦの発現が増加した。また、マウスＢＡＩ２のスプライシングバリアントの存在が報告されている（非特許文献３）。【００１１】
一方、コレシストキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ、以下、ＣＣＫと略称する）は、十二指腸粘膜中の内分泌細胞から放出される消化管ホルモン（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｈｏｒｍｏｎｅ）として知られている。ＣＣＫは、脂肪の摂取に伴って分泌され、胆嚢収縮や膵酵素分泌を促進する。そして、胆嚢収縮、膵臓酵素分泌促進、腸管運動刺激等の消化器官での作用を示す。また、ＣＣＫは満腹感を脳のニューロンに与える信号物質と考えられている。【００１２】
ＣＣＫは、そのＣ末端側から７番目のチロシン残基が硫酸化されていることが知られている。ＣＣＫは、翻訳後のプロセッシングにより、ＣＣＫ−４、ＣＣＫ−８、ＣＣＫ−１２、ＣＣＫ−３３、ＣＣＫ−５８等、Ｎ末端側の切断部位が異なる数種の長さの断片が生じる。これら各断片の生理活性や存在量が異なることが確認されている。また、ＣＣＫと類似した化学構造をもち、同一生物活性を示す化合物として、カエルの皮膚から抽出されたセルレイン（ｃｅｒｕｌｅｉｎ）が報告されている。【００１３】
ＣＣＫは、また、脳組織に広く分布しており、例えば、大脳皮質、海馬、扁桃体や視床下部に多く認められ、不安、鎮痛、鎮静、摂食抑制、記憶や学習への関与等の中枢神経での作用も報告されている。ＣＣＫは、ＤＡ（ドパミン；Ｄｏｐａｍｉｎｅ）やＧＡＢＡ（γアミノ酪酸；γ  ａｍｉｎｏ  ｂｕｔｙｒｉｃ  ａｃｉｄ）と一部共存しており、５ＨＴ（セロトニン；５−ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）作動性神経系等との相互作用も報告されている。また、ＣＣＫの放出がＧＡＢＡによって調節されているという報告もある。脳内に存在して生理活性を示すＣＣＫとして、主にＣＣＫ−８やＣＣＫ−４が報告されている。また、脳内に存在するＣＣＫ−８は、Ｃ末端側から７番目のチロシン残基が硫酸化されているコレシストキニンオクタペプチド硫酸化型（ＣＣＫ−８Ｓ：ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ  ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）である。【００１４】
近年、ＣＣＫが記憶の保持に必要不可欠であることが報告されている。例えば、ＣＣＫ−８Ｓが無いと記憶を意識レベルに呼び戻して行動に移すことが困難であること、また、ＣＣＫ−４（ＣＣＫ−３３のＣ末端テトラペプチド）が記憶の想起を妨げること等が明らかにされている。【００１５】
ＣＣＫの受容体として、ＣＣＫ−Ａ受容体とＣＣＫ−Ｂ受容体が報告されている。これらはいずれもＧ蛋白質共役型受容体である。ＣＣＫ−Ａ受容体の発現は、消化管由来の組織や細胞および血液中の白血球等で検出されている。ＣＣＫ−Ａ受容体は、細胞内情報伝達経路において、例えばホスホリパーゼＣやアデニルシクラーゼ等のエフェクターの促進を介して消化の調節に関与している。一方、ＣＣＫ−Ｂ受容体の発現は、脳や消化管由来の組織や細胞および血液中の白血球等で検出されている。ＣＣＫ−Ｂ受容体は、ガストリン受容体とも称され、細胞内情報伝達経路において、例えばホスホリパーゼＣや細胞内カルシウムイオン流入等のエフェクターの促進を介して消化の調節や細胞増殖に関与している。近年、ＣＣＫ−Ｂ受容体と不安との関係が注目されている。【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００５／４９８３３号パンフレット。
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６０２３４３０５号明細書。
【非特許文献１】シラツチ（Ｓｈｉｒａｔｓｕｃｈｉ，Ｔ．）ら、「サイトジェネティクス  アンド  セル  ジェネティクス（Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、１９９７年、第７９巻、ｐ．１０３−１０８。
【非特許文献２】ニシモリ（Ｎｉｓｈｉｍｏｒｉ，Ｈ．）ら、「オンコジーン（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）」、１９９７年、第１５巻、ｐ．２１４５−２１５０。
【非特許文献３】キー（Ｋｅｅ，Ｈ．Ｊ．）ら、「ジャーナル  オブ  セレブラル  ブラッド  フロー  アンド  メタボリズム（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）」、２００２年、第２２巻、ｐ．１０５４−１０６７。
【非特許文献４】カウル（Ｋａｕｒ，Ｂ．）ら、「アメリカン  ジャーナル  オブ  パソロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）」、２００３年、第１６２巻、ｐ．１９−２７。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明の課題は、ＧＰＣＲとしての機能を有する蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子と疾患との関連を見出し、該疾患の予防および／または治療に有効な手段を提供することである。さらに本発明の別の課題は、前記疾患の予防および／または治療に使用する化合物の同定方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは上記課題解決のために鋭意努力し、本発明者らが見出したＧＰＣＲとしての機能を有すると考えられる蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子並びにそのスプライシングバリアントが不安障害に関連することを見出した。具体的には、本発明者らは本遺伝子のホモログ遺伝子を標的としたノックアウトマウスが抗不安の表現型を示すことを実証し、それによりヒトにおいても該遺伝子が不安障害に関連すると考えた。本遺伝子は脳組織、特に大脳皮質、海馬および扁桃体で強く発現している。【００１９】
本遺伝子またはそのスプライシングバリアントを動物細胞において発現させると、該遺伝子によりコードされる蛋白質が細胞膜上に発現し、さらにリガンド刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答が生じた。【００２０】
本発明者らは、本遺伝子を発現させた動物細胞をリガンドで刺激して細胞応答を生じさせる実験系を使用することにより、該遺伝子によりコードされる蛋白質の機能、すなわち細胞応答を阻害する化合物を同定し得ることを実証した。【００２１】
本発明はこれら知見により完成したものである。【００２２】
本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質の機能の阻害剤である抗不安作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはそのホモログＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該ＤＮＡを含む細胞からなる群から選択される少なくともいずれか１を使用することを特徴とする同定方法に関する。【００２３】
また本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能の阻害剤である抗不安作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよびそのスプライシングバリアントであるＤＮＡのうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該ＤＮＡを含む細胞からなる群から選択される少なくともいずれか１を使用することを特徴とする同定方法に関する。【００２４】
さらに本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能の阻害剤である抗不安作用を有する化合物の同定方法であって、配列表の配列番号１、１５、１７、１９または２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡを含む細胞と被検化合物とを接触させ、該細胞の細胞膜上に発現された該蛋白質の機能を測定し、該細胞を被検化合物を接触させないときと比較して該蛋白質の機能を低下または消失させる被検化合物を抗不安作用を有する化合物であると決定することを含む同定方法に関する。【００２５】
さらにまた本発明は、細胞の細胞膜上に発現された蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添加により細胞内カルシウム濃度の上昇を惹き起こす機能である前記同定方法に関する。【００２６】
また本発明は、細胞の細胞膜上に発現された蛋白質の機能が、該蛋白質のリガンドの添加により膜電位変化を惹き起こす機能である前記同定方法に関する。【００２７】
さらに本発明は、下記の群；
（ｉ）コレシストキニンオクタペプチド硫酸化型（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ  ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｌｆａｔｅｄ  ｆｏｒｍ；配列番号１４、以下、ＣＣＫ−８Ｓと略称する）、
（ｉｉ）ＣＣＫ−８Ｓのアミノ酸配列において、１ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加等の変異を有し、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチド、
および
（ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のペプチドのアミノ酸配列を含み、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチド、
より選択されるペプチドをリガンドとして使用する前記同定方法に関する。【００２８】
さらにまた本発明は、化合物の抗不安作用の評価を非ヒト動物を使用してその不安状態を測定する実験系において行うことをさらに含む前記いずれかの同定方法に関する。【００２９】
また本発明は、化合物の抗不安作用の評価を非ヒト動物を使用して、恐怖条件付け試験、ボーゲル（Ｖｏｇｅｌ）型抗コンフリクトテスト、ゲラー−セイフター（Ｇｅｌｌｅｒ−Ｓｅｉｆｔｅｒ）型抗コンフリクトテスト、高架式迷路法、ホール−ボードテスト（ｈｏｌｅ−ｂｏａｒｄ  ｔｅｓｔ）、明暗試験、社会性相互作用テスト、およびビー玉埋め法からなる群から選択される実験系において行うことをさらに含む前記いずれかの同定方法に関する。【００３０】
さらに本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能および／または発現を阻害することを手段とする不安状態の改善方法に関する。【００３１】
さらにまた本発明は、前記不安状態の改善方法を使用する不安障害の予防および／または治療方法に関する。【００３２】
また本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択される少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる、不安障害の診断に使用するための測定方法に関する。【００３３】
さらに本発明は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択される少なくともいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる不安障害の診断方法に関する。
【発明の効果】
【００３４】
本発明により、ＧＰＣＲと考えられる７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として作用する蛋白質の機能の阻害剤である抗不安作用を有する化合物の同定方法を提供できる。また、本発明により、不安状態の改善剤および改善方法、不安障害の予防および／または治療方法並びに予防および／または治療剤の提供が可能である。さらに、本発明により、不安障害の診断用測定方法および診断方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１−Ａ】配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質が有する機能ドメインを、ｈＢＡＩ２によりコードされる蛋白質と比較して示した模式図である。（実施例１）
【００３６】
【図１−Ｂ】配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質の構造的特徴を、そのスプライシングバリアントと比較して示した模式図である。ｐｈ０１２０７は配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を示す。７ｔｍＨＲ、ｈｋ０１９４１およびｖａｒｉａｎｔ  ３はいずれも、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のスプライシングバリアントを示す。（実施例６）
【００３７】
【図１−Ｃ】配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質とそのスプライシングバリアントとのアミノ酸配列を比較して示した図である。図中、二重下線はトロンボスポンジンタイプＩドメイン（ＴＳＰ−Ｉドメイン）を、下線は膜貫通ドメインを示す。ｐｈ０１２０７は配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を示す。７ｔｍＨＲ、ｈｋ０１９４１およびｖａｒｉａｎｔ  ３はいずれも、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のスプライシングバリアントを示す。（実施例６）
【００３８】
【図２】ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質およびＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質としてそれぞれ動物細胞株ＣＨＯ−Ｋ１細胞で発現させたときに、これら蛋白質が細胞膜上に発現されたことを示す図である（それぞれ左パネルおよび右パネル）。細胞膜上の蛋白質の検出は、抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体および抗ＨＡ−ｔａｇ抗体並びにＦＩＴＣ標識した二次抗体（ＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧ抗体）を使用したフルオロサイトメトリーにより解析した。図中、黒で示された領域は各ｔａｇ融合蛋白質を発現させた細胞を、白で示された領域は該蛋白質を発現させなかったコントロール細胞を示す。（実施例２）
【００３９】
【図３】ＧＰＣＲのリガンド応答を細胞の膜電位変化により測定した場合に観察され得る波形（ＧＰＣＲ特異的な応答により生じる波形（波形１）、人為的要素等により生じる波形（波形２〜４）および応答が無いときに認められる波形（波形５および６））を示す図である。（実施例３）
【００４０】
【図４−Ａ】ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）において、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。一方、該ｃＤＮＡをトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株においては、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は認められなかった。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
【００４１】
【図４−Ｂ】ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）において、１ｎＭのＣＣＫ−８ＮＳ（ＣＣＫ−８  Ｎｏｎｓｕｌｆａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められなかったことを示す図である。ＣＣＫ−８ＮＳは、ＣＣＫ−８Ｓと同じアミノ酸配列で表されるＣＣＫオクタペプチドであるが、Ｃ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されていないペプチドである。ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７をトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株においても、ＣＣＫ−８ＮＳによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は認められなかった。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
【００４２】
【図４−Ｃ】ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）において、１ｎＭのＣＣＫ−４による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められなかったことを示す図である。該ｃＤＮＡをトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株においても、ＣＣＫ−４による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は認められなかった。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
【００４３】
【図４−Ｄ】ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）において、１０μＭのカルシウムイオノフォア  Ａ２３１８７により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。該ｃＤＮＡをトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株においても、Ａ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
【００４４】
【図４−Ｅ】ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を、ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株（ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６）または該ｃＤＮＡをトランスフェクションしていないＣＨＯ−Ｋ１細胞株において、バッファーを添加したときの細胞内Ｃａ２＋濃度を示す。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例５）
【００４５】
【図５−Ａ】７ｔｍＨＲ安定発現株において、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した代表的な結果を示す図である。７ｔｍＨＲ発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は観察されなかった。図中、７ｔｍＨＲ／ＣＨＯ＃６とは、７ｔｍＨＲ安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例８）
【００４６】
【図５−Ｂ】７ｔｍＨＲ安定発現株において、２０μＭのカルシウムイオノフォア  Ａ２３１８７により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。７ｔｍＨＲ発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞においても、Ａ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた。図中、７ｔｍＨＲ／ＣＨＯ＃６とは、７ｔｍＨＲ安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例８）
【００４７】
【図６−Ａ】ｈｋ０１９４１安定発現株において、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した代表的な結果を示す図である。ｈｋ０１９４１発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は観察されなかった。図中、ｈｋ０１９４１／ＣＨＯ＃１３とは、ｈｋ０１９４１安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例８）
【００４８】
【図６−Ｂ】ｈｋ０１９４１安定発現株において、２０μＭのカルシウムイオノフォア  Ａ２３１８７により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。ｈｋ０１９４１発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞においても、Ａ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた。図中、ｈｋ０１９４１／ＣＨＯ＃１３とは、ｈｋ０１９４１安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例８）
【００４９】
【図７−Ａ】ｖａｒｉａｎｔ３安定発現株において、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した代表的な結果を示す図である。ｖａｒｉａｎｔ３発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は観察されなかった。図中、ｖａｒｉａｎｔ３／ＣＨＯ＃１４−１８とはｖａｒｉａｎｔ３安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例９）
【００５０】
【図７−Ｂ】ｖａｒｉａｎｔ３安定発現株において、２０μＭのカルシウムイオノフォア  Ａ２３１８７により細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇したことを示す図である。ｖａｒｉａｎｔ３発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞においても、Ａ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた。図中、ｖａｒｉａｎｔ３／ＣＨＯ＃１４−１８とはｖａｒｉａｎｔ３安定発現株の１クローンを、ＣＨＯ−Ｋ１は宿主細胞を意味する。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例９）
【００５１】
【図８−Ａ】ｐｈ０１２０７遺伝子がヒト扁桃体の原型質性アストロサイトで強く発現していることを、抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体を使用した組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例１０）
【００５２】
【図８−Ｂ】ｐｈ０１２０７遺伝子がヒト扁桃体のニューロンおよびグリアで強く発現していることを、抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体を使用した組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例１０）
【００５３】
【図８−Ｃ】ｐｈ０１２０７遺伝子が海馬のＣＡ２領域のニューロンで強く発現していることを、抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体を使用した組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例１０）
【００５４】
【図８−Ｄ】ｐｈ０１２０７遺伝子が海馬のＣＡ１領域のニューロンで強く発現していることを、抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体を使用した組織免疫染色で解析したデータを示す図である。（実施例１０）
【００５５】
【図９−Ａ】マウスＢＡＩ２遺伝子を標的としたターゲティングベクターを導入したＥＳ細胞を使用して作製されたＦ１ヘテロ変異マウスの海馬で、ターゲティングベクターに含まれるＬａｃＺ−Ｎｅｏ遺伝子が強く発現していることを、ＬａｃＺ発現解析により検出した結果を示す図である。この結果は、マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入されたこと、すなわち該遺伝子が破壊されたことを示すと共に、マウスＢＡＩ２遺伝子が海馬で発現していることを示す。（実施例１１）
【００５６】
【図９−Ｂ】マウスＢＡＩ２遺伝子を標的としたターゲティングベクターを導入したＥＳ細胞を使用して作製されたＦ１ヘテロ変異マウスの扁桃体で、ターゲティングベクターに含まれるＬａｃＺ−Ｎｅｏ遺伝子が強く発現していることを、ＬａｃＺ発現解析により検出した結果を示す図である。この結果は、マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入されたこと、すなわち該遺伝子が破壊されたことを示すと共に、マウスＢＡＩ２遺伝子が扁桃体で発現していることを示す。（実施例１１）
【００５７】
【図１０】ＢＡＩ２ノックアウトマウスおよび野生型マウスを使用した恐怖条件付け試験における、それぞれの無動時間（％  ｆｒｅｅｚｉｎｇ）を示した図である。図中、黒丸は野生型マウス（ＷＴと表示）の結果を、白丸はＢＡＩ２ノックアウトマウス（ＫＯと表示）の結果を示す。恐怖条件付け試験は、野生型マウスおよびＢＡＩ２ノックアウトマウスをそれぞれ１０匹使用して行った。結果は一定の測定時間（横軸）における無動時間の割合（％）±標準誤差で示した。図中、アスタリスクはｔ−検定を使用した統計学的処理において有意差（Ｐ＜０．０１）が認められたことを示す。（実施例１１）
【００５８】
【図１１−Ａ】ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株において、１０ｎＭのＣＣＫ−８Ｓによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が、１０μｇ／ｍＬの化合物Ａ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ａ）の添加により阻害されたことを示す図である。コントロールとしてバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）を化合物Ａの代わりに添加した。化合物Ａまたはバッファーは測定開始１５秒後に添加し、ＣＣＫ−８Ｓは化合物Ａまたはバッファーの添加３５秒後に添加した。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例１２）
【００５９】
【図１１−Ｂ】ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株において、１０ｎＭのＣＣＫ−８Ｓによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が、１０μｇ／ｍＬの化合物Ｂ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｂ）の添加により阻害されたことを示す図である。コントロールとしてバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）を化合物Ｂの代わりに添加した。化合物Ｂまたはバッファーは測定開始１５秒後に添加し、ＣＣＫ−８Ｓは化合物Ｂまたはバッファーの添加３５秒後に添加した。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例１２）
【００６０】
【図１１−Ｃ】ｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７を安定的に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株において、１０ｎＭのＣＣＫ−８Ｓによる細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が、１０μｇ／ｍＬの化合物Ｃ（ｃｏｍｐｏｕｎｄ  Ｃ）の添加により阻害されたことを示す図である。コントロールとしてバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）を化合物Ｃの代わりに添加した。化合物Ｃまたはバッファーは測定開始１５秒後に添加し、ＣＣＫ−８Ｓは化合物Ｃまたはバッファーの添加３５秒後に添加した。横軸は細胞内Ｃａ２＋濃度の測定を開始してからの時間（秒）（Ｔｉｍｅ（ｓｅｃ））を示す。縦軸はＣａ２＋濃度を反映する蛍光色素の蛍光強度（ＲＦＵ）を示す。（実施例１２）
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本明細書において、単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「蛋白質」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドは最小サイズが２アミノ酸である。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。【００６２】
Ｇ蛋白質共役型受容体と考えられる７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質は、本発明者らによって見出されたＤＮＡおよびそのスプライシングバリアントによりコードされる蛋白質である（特許文献１および２）。本ＤＮＡおよびそのスプライシングバリアントによりコードされる蛋白質は動物細胞において細胞膜上に発現され、リガンド刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答を生じた。【００６３】
本蛋白質をコードする遺伝子のホモログ遺伝子を標的としたノックアウトマウスは抗不安の表現型を示した。このことから、本ホモログ遺伝子の遺伝子産物はマウスにおける不安状態に関連すると考えることができる。【００６４】
ヒトにおいても、本蛋白質をコードする遺伝子およびそのスプライシングバリアントが
不安状態や不安障害に関連すると本発明者らは考えている。具体的には、本遺伝子の発現やその機能の亢進が不安状態や不安障害に関連すると考えることができる。また、本遺伝子の発現は、脳組織、特に大脳皮質、海馬および扁桃体で強く認められている。【００６５】
本遺伝子の発現やその機能の亢進が不安状態や不安障害に関連すると考えることができることから、本遺伝子によりコードされる蛋白質の機能の阻害剤は抗不安作用を有すると本発明者らは考えている。【００６６】
本明細書において「蛋白質の機能の阻害剤」とは、蛋白質の機能を阻害する効果を有する化合物を意味する。ここで「化合物」とは蛋白質の機能を阻害するものであれば特に限定されず、例えば、低分子化合物やｓｉＲＮＡのような核酸分子が挙げられる。本蛋白質の機能として、本蛋白質が膜蛋白質受容体として機能することから、リガンドとの結合、細胞内情報伝達機構の活性化、細胞応答の誘発が例示される。したがって、「本蛋白質の機能の阻害剤」には、本膜蛋白質受容体の機能を阻害する効果を有する化合物が包含される。すなわち、「本蛋白質の機能の阻害剤」には、アンタゴニスト、受容体蛋白質のドメインに作用して細胞内情報伝達機構の活性化を阻害する化合物、および蛋白質の発現阻害剤等が包含される。「アンタゴニスト」は、受容体蛋白質の機能を阻害する化合物であればよく、例えば、受容体に結合してアゴニストの効果を阻害するがそれ自体は受容体と結合してもアゴニストが示す効果を発揮できない化合物、リガンドの受容体への結合を阻害する化合物、または受容体に対してインバースアゴニスト（逆作動薬）として作用する化合物が挙げられる。近年、ＧＰＣＲのような受容体がリガンドの作用とは関係なく活性型から不活性型に、若しくは不活性型から活性型に変換されることが知られている。ここで、ＧＰＣＲのような受容体がリガンドの作用とは関係なく不活性型から活性型に変換される工程を阻害する物質は、インバースアゴニストと呼ばれている。本蛋白質のインバースアゴニストも本蛋白質の機能を阻害すると考えられる。「受容体蛋白質のドメインに作用して細胞内情報伝達機構の活性化を阻害する化合物」は、例えば膜貫通ドメイン、細胞内ドメインおよびＭＡＧＵＫ相互作用部位等のドメインのいずれかに作用して下流の細胞内情報伝達を阻害し、それにより蛋白質の機能を阻害する化合物を意味する。「蛋白質の発現阻害剤」とは、蛋白質をコードするＤＮＡの遺伝子情報がｍＲＮＡに転写される過程、または、ｍＲＮＡに転写され、かつ蛋白質のアミノ酸配列として翻訳される過程で生じる様々な反応の少なくとも１つを妨げることにより、該蛋白質をコードする遺伝子の転写・翻訳による該蛋白質の生成を妨げる化合物を意味する。蛋白質の発現を阻害する化合物は、該白質の発現を阻害することによりその機能を阻害し得るので、本明細書において蛋白質の機能の阻害剤に包含される。【００６７】
「抗不安作用」とは、不安状態を改善する効果を意味する。【００６８】
「不安状態」とは、不安が過度に生じた状態を意味する。「不安」は、精神医学では「はっきりとした対象がない漠然と安心できない心の状態」を指す。不安が過度に生じた状態とは、不安により生理的、身体的、および／または精神的な様々な症状が引き起こされ、社会生活や日常生活に支障をきたす状態をいう。身体症状として、例えば、動悸、息切れ、めまい、手指振戦、発汗、嘔気、嘔吐、胸痛または不快感、悪寒またはのぼせ、痺れまたはうずき、下痢等の複数の症状を挙げられる。また、精神症状として、恐れ、緊張、心配、恐怖、不穏、焦燥、苦悶、興奮等を挙げられる。【００６９】
「不安状態の改善」とは、不安状態を改善する方法を実施する前と比較して、不安状態が軽減または回復されることをいう。例えば、動悸、息切れ、めまい、手指振戦、発汗、嘔気、嘔吐、胸痛または不快感、悪寒またはのぼせ、痺れまたはうずき、下痢等の複数の身体症状や、恐れ、緊張、心配、恐怖、不穏、焦燥、苦悶、興奮等の精神症状が軽減または回復することをいう。【００７０】
不安状態を改善する効果を有する薬剤を、本明細書において「不安状態の改善剤」あるいは「抗不安薬」と称することがある。【００７１】
「不安障害」は、不安を主徴とする神経症であり、過度の不安による自律神経系の過活動を伴い、生理的、身体的、精神的な様々な症状を生じる。不安障害の身体症状として、例えば、動悸、息切れ、めまい、手指振戦、発汗、嘔気、嘔吐、胸痛または不快感、悪寒またはのぼせ、痺れまたはうずき、下痢等の複数の症状が認められる。また、精神症状として、恐れ、緊張、心配、恐怖、不穏、焦燥、苦悶、興奮等が認められる。【００７２】
不安障害は、その症状や特徴により、全般性不安障害、パニック障害、強迫性障害、外傷性ストレス障害、社会恐怖等に分類される。【００７３】
全般性不安障害は、過度で極めて非現実的な心配が最低６ヶ月以上持続し、また、筋緊張、疲労感、集中困難、落ち着きの無さ、いらいら、易刺激性、睡眠障害等の症状を伴う。全般性不安障害で認められる症状は、他の不安障害、例えばパニック障害、強迫性障害、外傷性ストレス障害、社会不安障害等においても認められることがある。【００７４】
パニック障害では、明らかに他の事態と区別できる、強い恐怖や不快感、例えば現実感喪失や死の恐怖（パニック発作と呼ばれる）が発作的に、繰り返し、突然、発生する。発作に関連して、動悸、頻脈、発汗、息切れ、窒息感、胸痛、吐き気、めまい、異常感覚、感覚麻痺やうずき等が生じる。発作は突発し、１０分から２０分程度続き、３０分から１時間程度で収まるが、発作の頻度や程度は人によって異なる。また、予期不安、すなわち同様の発作がまた起こるのではないかという不安が形成され、外出が困難になることがあり、このような症例は広場恐怖症と呼ばれている。診断は、発作が物質や身体的疾患、例えば甲状腺機能亢進症等によらないこと、他の精神障害に伴うものではないこと等を基準にして行われる。【００７５】
強迫性障害は、強迫観念あるいは強迫行為のいずれかが認められるのが特徴である。強迫観念とは、反復性の思考・衝動のことである。強迫行為とは、強迫観念に呼応する行為で、行わずにはいられないような反復性の行動あるいは精神活動のことである。【００７６】
外傷性ストレス障害は、身体の傷害、または身体の傷害の恐れ等の外傷的事件を経験することにより発症し、次のような症状を示す：その外傷的事件の、記憶、夢、フラッシュバック等による持続的な再体験；その外傷的事件に関連した刺激に対する持続的回避、例えば事件自体の忘却や特定の活動の忌避；全般反応性の麻痺；不眠、易刺激性、集中力低下等、覚醒度の亢進；および障害の少なくとも１ヶ月以上の持続。【００７７】
社会不安障害は、他人にじっと見られることや、他人に評価されること、知らない人に会うこと、何かの行為を為すこと等の社会的状況に過剰な恐怖感を持つことにより、赤面、発汗、震え、悪寒、筋肉の緊張、声の震え、口渇、頻尿、動悸等の身体症状を示す。【００７８】
不安障害は、他の精神疾患と共存することがある。例えば、うつ病、身体表現性障害（自律神経失調症）または統合失調症と不安障害とが共存する症例や、不安障害からうつ病に発展する症例等が存在する。また、アルコール離脱の際に不安状態を伴うことがある。【００７９】
不安障害はうつ病等の他の精神疾患とは臨床的に区別されている。例えば、米国精神医学会（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により公表されている精神障害の診断および統計の手引き（ＤＭＳ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｎｔａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）や、世界保健機構により公表された疾病及び関連保健問題の国際統計分類（ＩＤＣ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ）等において不安障害はうつ病等の他の精神疾患とは別の範疇に分類されている。実際、不安障害はうつ病と比較して類似する症状もあるが多くの症状において異なる。【００８０】
「うつ病」は、抑うつ症とも呼ばれ、悲哀感等の感情障害、思考制止等の思考障害、意欲低下、行動抑制、睡眠障害、抑うつ状態の日内変動等を主症状とする情動性精神障害である。また、その発症には、生物学的な要因、心理的な要因、社会・環境的な要因が関わっていると考えられている。「抑うつ状態」とは、うつ病において一般的に認められる症状、例えば悲哀感等の感情障害、思考制止等の思考障害、意欲低下、行動抑制、睡眠障害等を意味する。【００８１】
うつ病は「双極性障害」と「うつ病性障害」に分類される。双極性障害は、気分と活動性の水準が著しく乱されるエピソード（挿間状態）を繰り返すことが特徴であり、気分の高揚、エネルギーと活動性の増大を示す場合（躁状態）と、気分の低下、エネルギーと活動性の減少を示す場合（うつ状態）がある。躁状態のみを繰り返すことはまれで、躁状態とうつ状態を呈するが、女性ではうつ状態が優勢となることが多い。また、双極性障害は再発性の高い疾患であり。再発に伴い疾病的転帰だけでなく社会的転帰も不良となる。特にうつ状態時には自殺企図を伴う場合がある。うつ病性障害はその病態について、以前は脳内神経伝達物質であるセロトニンやノルアドレナリンの欠乏仮説が有力であったが、最近では感情をつかさどっている脳領域におけるニューロンの接合が不十分なために起こっていると考えられている。失業や近親者との死別等のライフ・イベントや慢性的な社会的ストレスがうつ病の誘発因子と考えられている。【００８２】
不安障害に使用されている治療薬はうつ病に使用されている治療薬と一般的に異なる。例えば、不安障害の治療には、ベンゾジアゼピン系抗不安薬、チエノジアゼピン系抗不安薬、ピペラジン系抗不安薬、セロトニン作動性抗不安薬等の抗不安薬が使用されている。抗不安薬は、不安障害以外にも、身体表現性障害（自律神経失調症）や統合失調症（精神分裂病）、うつ病、アルコール離脱（禁断）症状の予防等、不安状態を伴う病態にも、不安状態の解消のため使用されることがある。一方、うつ病の治療には、神経伝達物質の働きを高める薬剤が使用され、主なものとして、三環系抗うつ薬、四環系抗うつ薬、トリアゾロピリジン系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（ＳＮＲＩ）が挙げられる。なお、ＳＳＲＩやＳＮＲＩは不安障害の治療に使用される場合がある。【００８３】
「膜蛋白質受容体」とは、生体膜の脂質二重層を貫通するドメインを持つ蛋白質からなり、細胞膜に存在して、各種生理活性物質を特異的に認識し、その作用を伝達し発現する蛋白質を意味する。ここで、蛋白質は、糖蛋白質を含む。「機能的膜蛋白質受容体」とは、リガンドの作用により、細胞内情報伝達を介した細胞応答を惹き起こす機能を有する膜蛋白質受容体を意味する。膜蛋白質受容体は、リガンドと相互作用する細胞外ドメイン、生体膜の脂質二重層を貫通するドメイン、および細胞内情報伝達を介する細胞内ドメインを有する。【００８４】
「Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）」とは、リガンドにより刺激を受けると、細胞内に存在するＧ蛋白質と結合し、Ｇ蛋白質を活性化する膜蛋白質受容体を意味する。「Ｇ蛋白質」とは、ＧＰＣＲと共役する蛋白質であり、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応によりＧＤＰ結合型Ｇ蛋白質からＧＴＰ結合型Ｇ蛋白質に移行し、細胞内情報伝達因子として数々の細胞応答を惹き起こす蛋白質を意味する。「Ｇ蛋白質を活性化する」とは、ＧＤＰ／ＧＴＰ交換反応を誘導および／または促進することにより、ＧＤＰ結合型Ｇ蛋白質からＧＴＰ結合型Ｇ蛋白質への移行を誘導および／または促進し、その結果、Ｇ蛋白質が共役しているＧＰＣＲが関与する数々の細胞応答を誘導および／または促進することを意味する。【００８５】
「リガンド」とは、膜蛋白質受容体に特異的に相互作用する生理活性物質を意味する。【００８６】
「相互作用」とは、例えば２つの同種あるいは別種の蛋白質が、特異的に作用し合い、その結果、一方のあるいは両方の機能が変化する、例えば亢進する、または低減することを意味する。特異的に作用するとは、その作用に関わる蛋白質以外の蛋白質に比べて、より選択的に作用することを意味する。相互作用には例えば、２つの別種の蛋白質の結合あるいは一方の蛋白質による他方の蛋白質の活性化等が含まれる。【００８７】
「細胞内情報伝達」とは、受容体に対するリガンドの作用により細胞内でセカンドメッセンジャーの形成、細胞内イオン濃度の変化、および蛋白質のリン酸化等の変化が生じる一連の反応を意味し、「細胞内情報伝達経路」とは該一連の反応の過程を意味する。【００８８】
本発明に係る同定方法は、本発明者らによって見出されたＤＮＡまたはそのホモログＤＮＡ、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該ＤＮＡを含む細胞からなる群から選択される少なくともいずれか１を使用して実施できる。【００８９】
本発明に使用されるＤＮＡは、より具体的には、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、またはそのホモログＤＮＡである。本明細書中、「ホモログＤＮＡ」とは、対象のＤＮＡと配列相同性を有しかつ該ＤＮＡによりコードされる蛋白質と構造的特徴や生物学的機能の類似性等を有する蛋白質をコードするＤＮＡをいう。【００９０】
本発明に使用される蛋白質は、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質である。本明細書中、「ホモログ蛋白質」とは、対象の蛋白質と配列相同性を有し、構造的特徴や生物学的機能の類似性等を有する蛋白質をいう。【００９１】
本発明に使用される細胞は、より具体的には、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはそのホモログＤＮＡを含む細胞である。好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたはそのホモログＤＮＡ、および／または該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の発現が確認された細胞が使用される。このような細胞として、本ＤＮＡおよび／または本蛋白質の発現が確認された真核細胞または培養細胞株を使用できる。また、適当な真核細胞または培養細胞に、本蛋白質をコードする遺伝子をトランスフェクションして、該蛋白質を発現させた細胞を使用することもできる。【００９２】
本発明において、ＤＮＡおよび蛋白質はヒト由来のＤＮＡおよび蛋白質であることが好ましいが、該ヒト由来のＤＮＡおよび蛋白質と同質の機能を有し、かつ構造的相同性を有する哺乳動物由来のＤＮＡおよび蛋白質、例えばマウス、ウマ、ヒツジ、ウシ、イヌ、サル、ネコ、クマ、ラットまたはウサギ等のＤＮＡおよび蛋白質であることができる。【００９３】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質をコードするＤＮＡである。配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、より具体的には、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質が好ましく例示できる。【００９４】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は構造的特徴として、３個のＴＳＰ−Ｉドメイン、１個のＧＰＳ（ＧＰＣＲ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｓｉｔｅ）ドメインおよび１個の７回膜貫通ドメインを有する（図１−Ａおよび図１−Ｂ参照）。７回膜貫通ドメインはＧＰＣＲファミリー２ドメインとも呼ばれ、ＧＰＳドメインと共に、Ｇ蛋白質共役型受容体に特徴的な構造である。ＴＳＰ−Ｉドメインは、トロンボスポンジンに認められる特徴のあるドメインであり、トロンボスポンジンの細胞外マトリックスへの関与およびその血管新生阻害能に重要な機能ドメインであることが知られている。【００９５】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの遺伝子産物は、実際、膜蛋白質受容体としての機能を示した。具体的には、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを導入した動物細胞において、細胞膜上に該ＤＮＡによりコードされる蛋白質が発現すること、およびリガンド刺激、例えばＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答が生じることが観察された。【００９６】
また、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの遺伝子産物はそのＣ末端領域において、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質であるＤＬＧ２、ＤＬＧ３およびＤＬＧ４や、ＡＩＰ１、ＭＡＧＩ３等と相互作用することが観察された。ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質は、蛋白質間相互作用において標的蛋白質の最もＣ末端のアミノ酸配列を認識するＰＤＺドメインを有し、細胞膜に局在して受容体やイオンチャネル等の膜蛋白質と相互作用することにより、これら膜蛋白質からの情報伝達に関与し、細胞間接着等に寄与していると考えられている。また、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと配列相同性を有するｈＢＡＩ２遺伝子の遺伝子産物とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用も同様に認められた。一方、ｈＢＡＩ２のホモログであるｈＢＡＩ１が、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質の１つであるＢＡＰ１（ＢＡＩ１−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ１）と、ｈＢＡＩ１の末端領域の部分配列（ＱＴＥＶ：配列番号３）を介して結合することが報告されている（シラツチ（Ｓｈｉｒａｔｓｕｃｈｉ，Ｔ．）ら、「バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９８年、第２４７巻、ｐ．５９７−６０４）。【００９７】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質および該遺伝子と配列相同性を有するｈＢＡＩ２遺伝子（配列番号２１）によりコードされる蛋白質はいずれも、そのＣ末端領域に配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＱＴＥＶ）が保存されていることから、この配列部分においてＰＤＺドメインを持つ蛋白質と相互作用すると発明者らは考えている。【００９８】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのホモログＤＮＡは、好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと配列相同性を有し、かつリガンドの作用によりＧＰＣＲと同質の機能を示す蛋白質をコードするＤＮＡである。【００９９】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのホモログＤＮＡとして、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのスプライシングバリアントが好ましく例示される。【０１００】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と構造的特徴や生物学的機能の類似性等を有する蛋白質として、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントが好ましく例示される。【０１０１】
「スプライシングバリアント」とは、真核生物における遺伝子の発現において、ゲノムから転写されたある遺伝子のｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングにより生成される２種類以上の成熟ｍＲＮＡ、該成熟ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡ、または該成熟ｍＲＮＡから翻訳される蛋白質のいずれかを意味する。真核生物における遺伝子の発現は、ゲノム上に分散して存在するエキソンとエキソンの間に存在するイントロンとからなる領域から転写されたｍＲＮＡ前駆体からスプライシングにより成熟ｍＲＮＡが形成されることにより行われる。さらに、該成熟ｍＲＮＡの翻訳により蛋白質が生成される。スプライシングとは、ｍＲＮＡ前駆体からイントロンがスプライス部位（イントロンとエキソンの境界点）で切り出され、成熟ｍＲＮＡが形成される過程を意味する。スプライシングの際、スプライス部位の位置や組み合わせが変化して２種類以上の成熟ｍＲＮＡが生成する、いわゆる選択的スプライシングが起こることがある。選択的スプライシングの結果、１つの遺伝子から２種以上の蛋白質が生成されることが多い。【０１０２】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのスプライシングバリアントは、該ＤＮＡからなる遺伝子のゲノムから転写されたｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングにより生成される２種類以上の成熟ｍＲＮＡまたは該成熟ｍＲＮＡの相補的ＤＮＡであり得る。【０１０３】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのスプライシングバリアントとして、配列番号１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡが好ましく例示できる。【０１０４】
配列番号１９に記載の塩基配列で表わされるＤＮＡは、配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のうち最長のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードしている。【０１０５】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのスプライシングバリアントは、上記例示したスプライシングバリアントに限らず、該ＤＮＡと配列相同性を有し、該ＤＮＡの構造的特徴を有し、さらに該ＤＮＡによりコードされる蛋白質と同質の生物学的機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡである限りにおいて、いずれのＤＮＡも含む。【０１０６】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントは、ゲノムから転写された該蛋白質をコードする遺伝子のｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシングにより生成される２種類以上の成熟ｍＲＮＡから翻訳される蛋白質である。【０１０７】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントとして、配列番号１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質が好ましく例示できる。【０１０８】
配列番号１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号１６、１８、２０、および２２に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列で表される蛋白質が好ましく例示できる。【０１０９】
配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質は、配列番号２、１６、１８、２０および２２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質のうち最長のアミノ酸配列を有する蛋白質である。【０１１０】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントは、上記例示したスプライシングバリアントに限らず、該蛋白質と配列相同性を有し、該蛋白質の構造的特徴を有し、さらに該ＤＮＡによりコードされる蛋白質と同質の生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいて、いずれの蛋白質も含む。【０１１１】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のスプライシングバリアントは、言い換えれば、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と配列相同性を有し、該蛋白質の構造的特徴を有し、さらに該蛋白質と同質の生物学的機能を有する蛋白質である限りにおいて、いずれの蛋白質も含む。【０１１２】
本明細書中、「配列相同性」とは、通常、塩基配列またはアミノ酸配列の全体で５０％以上、好ましくは少なくとも７０％であることが適当である。より好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上であることが適当である。【０１１３】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと配列相同性を有するＤＮＡには、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの塩基配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１個〜数個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異が存する塩基配列で表されるＤＮＡが含まれる。好ましくは、このようなＤＮＡであって、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの生物学的機能と同質の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡが望ましい。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するＤＮＡが配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡと同様の構造的特徴を有し、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と同質の生物学的機能を有するものである限り特に制限されない。【０１１４】
変異を有するＤＮＡは、天然に存在するものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと略称する）等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用することもできる。【０１１５】
本発明に使用されるＤＮＡには、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントにストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするＤＮＡが含まれる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等が採用できる。具体的には、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳおよび５０％  ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件をいう。これらＤＮＡは配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントにハイブリダイゼーションするＤＮＡであれば相補的配列を有するＤＮＡでなくてもよい。好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることが望ましい。【０１１６】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質と配列相同性を有する蛋白質として、例えば、配列番号２に記載のアミノ酸配列において１個以上、例えば１〜１００個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個、さらにより好ましくは１個〜数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能を有する蛋白質が例示できる。アミノ酸の変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有する蛋白質が、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質と同質の機能を有するものである限り特に制限されない。【０１１７】
変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して取得したものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１）を利用することもできる。変異の導入において、当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。【０１１８】
構造的特徴として、ＤＮＡについては７回膜貫通ドメインコード領域やＴＳＰ−Ｉドメインコード領域を例示できる。また、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質については、構造的特徴として、７回膜貫通ドメインやＴＳＰ−Ｉドメインを例示できる。このようなドメインや領域における配列相同性が、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上であるＤＮＡまたは蛋白質が好ましい。さらに、これらドメインがその機能、例えば該ドメインを含む蛋白質を膜に局在させる機能あるいは血管新生阻害機能を保持しているドメインであることがより好ましい。【０１１９】
また構造的特徴として、ＤＮＡについては３´末端領域に配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＱＴＥＶ）をコードする領域が保存されていることが挙げられる。該ＤＮＡによりコードされる蛋白質については、Ｃ末端領域に配列番号３に記載のアミノ酸配列（ＱＴＥＶ）が保存されていることが挙げられる。【０１２０】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能として、膜蛋白質受容体としての機能を例示できる。【０１２１】
「膜蛋白質受容体としての機能」とは、動物細胞で発現させたときに膜蛋白質として発現され、リガンドの作用により細胞内情報伝達を促進し、細胞応答を誘発させる機能を意味する。例えば、ＧＰＣＲと同質の機能が挙げられる。【０１２２】
「ＧＰＣＲと同質の機能」とは、リガンドの作用によりＧ蛋白質に結合してこれを活性化させ、細胞内情報伝達を促進し、細胞応答を誘発する機能をいう。ＧＰＣＲが結合するＧ蛋白質は、α、βおよびγと称する３つのサブユニットからなる３量体であり、αサブユニットの相違から主に４つのファミリー（Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇ１２）に大別される。Ｇｑファミリーが関与する細胞内情報伝達経路が活性化されると、下流シグナルとしてカルシウム濃度の増加が惹き起こされる。他方、Ｇｓファミリーが関与する細胞内情報伝達経路が活性化されると、下流シグナルとしてサイクリックＡＭＰ（以下、ｃＡＭＰと称する）の増加が惹き起こされる。Ｇｉファミリーが関与する細胞内情報伝達経路が活性化されると、下流シグナルとしてｃＡＭＰの減少が惹き起こされる。Ｇ１２ファミリーが関与する細胞内情報伝達経路が活性化されると、下流シグナルとして細胞骨格の変化等が惹き起こされると報告されているがその作用は未だ明らかではない。【０１２３】
細胞応答として具体的には、細胞内カルシウム濃度の変化、細胞内ｃＡＭＰの変化、または細胞膜電位の変化を例示できる。これら細胞応答は自体公知の方法で測定できる。細胞内カルシウム濃度の変化は、例えば、カルシウムイオンと結合し得る蛍光色素を細胞内に取り込ませ、リガンドの存在下または非存在下で、励起光により蛍光現象を惹き起こし、その蛍光量を測定して比較することにより検出できる。蛍光量の測定は、公知の蛍光測定器、例えばＦＬＩＰＲやＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）等の蛍光プレートリーダーを使用して実施できる。細胞内ｃＡＭＰの変化は、リガンドを作用させた細胞または作用させなかった細胞それぞれから公知の方法で細胞溶解液を調整し、細胞溶解液に含まれるｃＡＭＰ濃度を測定して比較することにより検出できる。ｃＡＭＰ濃度の測定は、競合酵素免疫測定法（競合ＥＬＩＳＡ：ブレジロン（Ｂｒｅｚｉｌｌｏｎ，Ｓ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００３年、第２７８巻、ｐ．７７６−７８３；ホソイ（Ｈｏｓｏｉ，Ｔ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．３１４５９−３１４６５）や、均一時間分解蛍光（Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｔｉｍｅ  Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＨＴＲＦ）による測定方法を利用して実施できる。ＨＴＲＦによる測定方法は、例えば市販のｃＡＭＰ測定キット（Ｃｉｓ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）を使用して実施できる。細胞膜電位の変化は、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞に配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントを発現させ、リガンド刺激の存在下または非存在下で、膜蛋白質受容体特異的に発生する電流量を測定し、その電流量を比較することにより検出できる。【０１２４】
リガンドは細胞に発現した本ＤＮＡの遺伝子産物に作用して細胞応答を誘発させ得るものであればいずれでもよく、適当なリガンド供給源から同定して取得し使用できる。リガンド供給源として、各種細胞または組織から調製した試料、例えば、配列番号１に記載の塩基配列で表される遺伝子が発現している細胞または組織から調製した試料や、ペプチドライブラリー、蛋白質ライブラリー、化合物ライブラリー等を使用できる。【０１２５】
リガンドの同定は、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質と被検物質との結合を自体公知の結合解析方法により検出することにより得ることができる。あるいは、本蛋白質を発現する細胞を使用した同定方法において、該細胞に被検物質を接触させたときに誘発される該細胞の細胞応答を測定することにより目的とするリガンドを得ることができる。被検物質とは調べようとする物質を意味し、各種細胞または組織から調製した試料、記載の塩基配列で表される遺伝子が発現している細胞または組織から調製した試料や、ペプチドライブラリー、蛋白質ライブラリー、化合物ライブラリー等を包含する。細胞に被検物質を接触させたときの細胞応答が、接触させなかったときと比較して変化（促進、発生、低減または消失）した場合、被検物質はリガンドである、またはリガンドを含むと判定できる。細胞応答として具体的には、細胞内カルシウム濃度の変化、細胞内ｃＡＭＰの変化、または細胞膜電位の変化を例示できる。これら細胞応答の測定は、上記のような自体公知の方法により実施できる。あるいは、本蛋白質を発現する細胞を使用した同定方法において、細胞応答の指標として、本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用を測定することにより、目的とするリガンド得ることができる。被検物質を該蛋白質に接触させたときの細胞における本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用が、接触させなかったときと比較して変化（促進または発生）した場合、該被検物質はリガンドである、またはリガンドを含むと判定できる。本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用は、イムノブロッティング等の自体公知の方法により検出できる。【０１２６】
リガンドとして、各種細胞または組織から調製した試料自体を使用できる。試料の調製は、例えば細胞または組織を自体公知の方法で培養し、その培養上清を遠心処理等により得る方法や、細胞または組織を自体公知の方法で破砕あるいは溶解する方法により実施できる。リガンドは、上記試料から自体公知の蛋白質精製方法、例えばゲルろ過クロマトグラフィー等により精製して使用することもできる。リガンドとして具体的には、ＨｅＬａ細胞株の培養上清（実施例３参照）やＣＣＫ８−Ｓ（実施例５および７−９参照）を使用できる。【０１２７】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の生物学的機能と同質の機能としてまた、グアニル酸キナーゼ活性および／または細胞接着機能を有する蛋白質、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質と相互作用する機能を例示できる。ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質として具体的には、ＤＬＧ２、ＤＬＧ３およびＤＬＧ４や、ＡＩＰ１、ＭＡＧＩ３を例示できる。【０１２８】
上述のように、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントは、７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として機能する蛋白質をコードするＤＮＡである。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質は構造的特徴として、数個、好ましくは２個〜４個のＴＳＰ−Ｉドメイン、１個のＧＰＳドメインおよび１個の７回膜貫通ドメインを有する（図１−Ａおよび図１−Ｂ参照）。【０１２９】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基（配列番号２）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む４５５７ｂｐの塩基配列からなる。【０１３０】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質を好ましく挙げられる。【０１３１】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に３個のＴＳＰ−Ｉドメインの他、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメイン（７回膜貫通ドメイン）を有する（図１−Ａおよび図１−Ｂ参照）。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端側の１個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む５５アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している５５アミノ酸残基は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のアミノ酸配列において、第２９６番目のグリシン（Ｇ）から第３５０番目のプロリン（Ｐ）に相当する。３個のＴＳＰ−Ｉドメインはそれぞれ、配列番号２に記載のアミノ酸配列における第２９７番目のヒスチジン（Ｈｉｓ）から第３５０番目のプロリン（Ｐｒｏ）までの領域；第３５２番目のグルタミン酸（Ｇｌｕ）から第４０５番目のプロリン（Ｐｒｏ）までの領域；および第４０８番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）から第４６１番目のプロリン（Ｐｒｏ）までの領域からなる。７個の膜貫通ドメインはそれぞれ、配列番号２に記載のアミノ酸配列における第８７０番目のバリン（Ｖａｌ）から第８９０番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）までの領域；第８９９番目のセリン（Ｓｅｒ）から第９１９番目のグリシン（Ｇｌｙ）までの領域；第９２８番目のバリン（Ｖａｌ）から第９４８番目のロイシン（Ｌｅｕ）までの領域；第９７０番目のアルギニン（Ａｒｇ）から第９９０番目のトレオニン（Ｔｈｒ）までの領域；第１０１２番目のアラニン（Ａｌａ）から第１０３２番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）までの領域；第１０８７番目のロイシン（Ｌｅｕ）から第１１０７番目のアラニン（Ａｌａ）までの領域；および第１１１４番目のバリン（Ｖａｌ）から第１１３４番目のバリン（Ｖａｌ）までの領域からなる。【０１３２】
配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１４６３アミノ酸残基（配列番号１６）をコードするＯＲＦを含む４３８９ｂｐの塩基配列からなる。【０１３３】
配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。【０１３４】
配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１４６３アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に７回膜貫通ドメイン、２個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端側の２個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む１１０アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している１１０アミノ酸残基は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質のアミノ酸配列において、第２９６番目のグリシン（Ｇ）から第４０５番目のプロリン（Ｐ）に相当する。【０１３５】
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基（配列番号１８）をコードするＯＲＦを含む４５５４ｂｐの塩基配列からなる。【０１３６】
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号１８に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。【０１３７】
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基（配列番号１８）からなり、そのアミノ酸配列に７回膜貫通ドメイン、３個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端側から２番目のＴＳＰ−Ｉドメイン１個を含む５５アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している５５アミノ酸残基は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質において、第３５１番目のバリン（Ｖ）から第４０５番目のプロリン（Ｐ）に相当する。【０１３８】
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、７ｔｍＨＲ（ｓｅｖｅｎ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｒｉｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＢ０６５６４８）と称される。本ＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５７３アミノ酸残基（配列番号２０）をコードするＯＲＦを含む４７１９ｂｐの塩基配列からなる。【０１３９】
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号２０に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。【０１４０】
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、７ｔｍＨＲ（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＢ０６５６４８）と称される。本蛋白質は、１５７３アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に７回膜貫通ドメイン、４個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。【０１４１】
配列番号２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、公知ヒトＤＮＡであり、ｈＢＡＩ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＢ００５２９８）と称される。本ＤＮＡは、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５７２アミノ酸残基（配列番号２２）をコードするＯＲＦを含む５３９９ｂｐの塩基配列からなる。【０１４２】
配列番号２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質として、配列番号２２に記載のアミノ酸配列で表わされる蛋白質が挙げられる。【０１４３】
配列番号２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、公知ヒト蛋白質であり、ｈＢＡＩ２（ＧｅｎＢａｎｋ、アクセッション番号：ＡＢ００５２９８）と称される。本蛋白質は、１５７２アミノ酸残基からなり、そのアミノ酸配列に７回膜貫通ドメイン、４個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ａ参照）。本蛋白質のアミノ酸配列は、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列と比較して、Ｃ末端領域において第１４６１番目のリジンに相当する１アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。【０１４４】
配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡによりコードされる蛋白質はいずれも、このように、互いに相同性を有し、ＴＳＰ−Ｉドメイン、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメインを保存している。【０１４５】
配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡによりコードされる蛋白質はいずれも、配列の相同性および構造的特徴の類似性からスプライシングバリアントであると発明者らは考えている。【０１４６】
配列番号２、１６、１８、２０および２２に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列で表される蛋白質はいずれも、互いに相同性を有し、ＴＳＰ−Ｉドメイン、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメインを保存している。配列の相同性および構造的特徴の類似性からこれら蛋白質はスプライシングバリアントであると発明者らは考えている。【０１４７】
配列番号１５、１７および１９に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡの遺伝子産物は、実際、膜蛋白質受容体としての機能を示した。具体的には、該遺伝子産物を発現させた動物細胞において、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡの遺伝子産物を発現させた動物細胞と同様に、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）刺激により細胞内情報伝達を介した細胞応答が生じることが観察された。【０１４８】
本発明に使用されるＤＮＡは、上記ＤＮＡ、例えば配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列を含有する塩基配列で表されるＤＮＡであることができる。【０１４９】
ＤＮＡは、その機能、例えばコードする蛋白質の発現や、発現された蛋白質の機能が阻害されない限りにおいて、５´末端側や３´末端側に、例えばグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、β−ガラクトシダーゼ（以下、β−Ｇａｌと略称することがある）、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略称することがある）またはアルカリホスファターゼ（以下、ＡＬＰと略称することがある）等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、あるいはＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類等の遺伝子が、１つまたは２つ以上付加されたＤＮＡであることができる。これら遺伝子の付加は、慣用の遺伝子工学的手法により行うことができ、遺伝子やｍＲＮＡの検出を容易にするため有用である。【０１５０】
本発明に使用されるＤＮＡは、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの指定された領域に存在する部分塩基配列で表されるＤＮＡ断片であることができる。このようなＤＮＡ断片は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントを検出するためのプライマーやプローブ、あるいは本ＤＮＡを製造するためのプライマーとして使用できるため有用である。プライマーは、好ましくは１５個〜３０個、より好ましくは２０個〜２５個のヌクレオチドからなる。プローブは、好ましくは８個〜５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個〜３５個のヌクレオチド、さらに好ましくは１７個〜３０個のヌクレオチドからなる。プライマーやプローブの長さが適当な長さより長いと、偽ハイブリダイゼーションが増加するために特異性が低下する。また、長さが適当な長さより短いとミスマッチが生じるために特異性が低下する。【０１５１】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの指定された領域として、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質の断片であって該蛋白質におけるリガンド作用部位を含む断片をコードする領域が好ましく挙げられる。このような領域に存在する部分塩基配列で表されるＤＮＡ断片は、本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の断片であって該蛋白質におけるリガンド作用部位を含む断片の製造に使用できる。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の断片であって該蛋白質におけるリガンド作用部位を含む断片は、該蛋白質に対するリガンドの作用、例えば該蛋白質とリガンドとの結合の検出、また該作用を促進するまたは阻害する化合物の同定に有用である。あるいは、該蛋白質に対してリガンドと同様の作用を有する化合物、すなわちアゴニストの同定に有用である。このようなＤＮＡ断片は、その最小単位として好ましくは該領域において連続する５個以上のヌクレオチド、より好ましくは１０個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる。【０１５２】
配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの指定された領域に存在する部分塩基配列で表されるＤＮＡ断片はまた、蛋白質をコードするセンス鎖に相補的なＤＮＡ断片であるとき、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドとして有用である。一般的に２０個前後のヌクレオチドからなるＤＮＡ断片が、遺伝子の発現を阻害できることが知られていることから、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは１５個以上、より好ましくは２０個以上のヌクレオチドからなる。【０１５３】
これらＤＮＡ断片は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの塩基配列情報に従って、目的の配列を有するものを設計し、自体公知の化学合成法により製造できる。簡便には、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を使用して製造できる。【０１５４】
本同定方法に使用される蛋白質は、上記蛋白質、例えば配列番号２、１６、１８、２０および２２に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列で表される蛋白質であることができる。【０１５５】
また本同定方法に使用される蛋白質は、該蛋白質の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列で表される断片であることができる。本蛋白質の断片は、本蛋白質に対する抗体を作製するための抗原として使用できるため有用である。【０１５６】
本蛋白質の指定された領域として、本蛋白質においてリガンドが作用する部位が好ましく挙げられる。リガンド作用部位を含む断片は、本蛋白質に対するリガンドの作用、例えば本蛋白質とリガンドとの結合の検出、また該作用を促進するまたは阻害する化合物の同定に有用である。あるいは、本蛋白質に対してリガンドと同様の作用を有する化合物、すなわちアゴニストの同定に有用である。また、リガンド作用部位を含む断片のうち、リガンドと本蛋白質の相互作用を阻害する断片は、リガンドの作用による本蛋白質の機能の誘導を阻害する化合物として有用である。【０１５７】
本蛋白質の指定された領域に存在する部分アミノ酸配列で表される断片は、その最小単位として好ましくは５個以上、より好ましくは８個以上、さらに好ましくは１２個以上、とくに好ましくは１５個以上の連続するアミノ酸からなるものである。これら断片は、本蛋白質のアミノ酸配列情報に従って、目的の配列を有するものを設計し、例えば自体公知の化学合成法により製造できる。【０１５８】
本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、本蛋白質は、本蛋白質をコードする遺伝子を含む細胞において発現しているものであり得る。該細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であり得る。【０１５９】
本蛋白質はさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変できる。また、Ｎ末端側やＣ末端側に別の蛋白質等を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を使用して付加することにより標識化したものであってもよい。好ましくは、本蛋白質の基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加する蛋白質等として、例えばＧＳＴ、β−Ｇａｌ、ＨＲＰまたはＡＬＰ等の酵素類、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）またはフィコエリスリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）等の蛍光色素類、マルトース結合蛋白質、免疫グロブリンのＦｃ断片あるいはビオチン等を例示できるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することもできる。標識化に使用される物質は、１つまたは２つ以上を組合せて付加できる。これら標識化に使用された物質自体、またはその機能を測定することにより、本蛋白質を容易に検出または精製でき、また、例えば本蛋白質と他の蛋白質との相互作用を検出できる。【０１６０】
本ＤＮＡの取得は、当該ＤＮＡの配列情報に基づいて、公知の遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社等を参照）により容易に実施できる。例えば、配列表の配列番号１、１５、１７、１９および２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡは、その配列情報基づいて、公知の遺伝子工学的手法により取得できる。【０１６１】
本ＤＮＡの取得は、具体的には、本ＤＮＡの発現が確認されている適当な起源から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、該ＤＮＡに特有の適当なプローブやプライマーを使用して所望のクローンを選択することにより実施できる。ｃＤＮＡの起源として、本ＤＮＡの発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞等を例示できる。配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントの起源として、例えば、ヒトの脳組織や脳細胞を例示できる。【０１６２】
起源からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施できる。また、市販されているヒト脳、胎児脳、および脳海馬由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを構築して使用できる。所望のクローンをｃＤＮＡライブラリーから選択する方法も特に制限されず、慣用の方法を使用できる。例えば、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを使用したプラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法等やこれらを組合せた方法等を例示できる。ここで使用するプローブとして、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの塩基配列に関する情報に基づいて化学合成されたＤＮＡ等が一般的に使用できる。また、本ＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計したセンスプライマー、アンチセンスプライマーをこのようなプローブとして使用できる。【０１６３】
ｃＤＮＡライブラリーからの目的クローンの選択は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して各クローンについて発現蛋白質の確認を行い、その生物学的機能を指標にして実施できる。【０１６４】
ＤＮＡの取得にはその他、ＰＣＲ（ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス；サイキ（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８５年、第２３０巻、ｐ．１３５０−１３５４））によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。ｃＤＮＡライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法（「実験医学」、１９９４年、第１２巻、第６号、ｐ．６１５−６１８）、特に５´−ＲＡＣＥ法（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．）ら、「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９８８年、第８５巻、第２３号、ｐ．８９９８−９００２）等の採用が好適である。ＰＣＲに使用するプライマーは、ＤＮＡの塩基配列情報に基づいて適宜設計でき、常法に従って合成により取得できる。増幅させたＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製は常法により実施できる。例えばゲル電気泳動法等によりＤＮＡ／ＲＮＡ断片の単離精製を実施できる。【０１６５】
ＤＮＡの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法（「プロシーディングス  オブ  ザ  ナショナル  アカデミー  オブ  サイエンシズ  オブ  ザ  ユナイテッド  ステーツ  オブ  アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９７７年、第７４巻、ｐ．５４６３−５４６７）やマキサム−ギルバート法（「メソッズ  イン  エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９８０年、第６５巻、ｐ．４９９−５６０）等により、また簡便には市販のシーケンスキット等を使用して実施できる。【０１６６】
本蛋白質の取得は、例えば本蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー；村松正實編、「ラボマニュアル遺伝子工学」、１９８８年、丸善株式会社；ウルマー（Ｕｌｍｅｒ，Ｋ．Ｍ．）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１；エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）編、「ＰＣＲテクノロジー，ＤＮＡ増幅の原理と応用」、１９８９年、ストックトンプレス等を参照）により実施できる。例えば、本蛋白質をコードする遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞、例えばヒトの脳組織から常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該遺伝子に特有の適当なプライマーを使用して該遺伝子を増幅し、得られた遺伝子を公知の遺伝子工学的手法により発現誘導することにより取得できる。【０１６７】
具体的には例えば、上記ＤＮＡを含むベクターＤＮＡをトランスフェクションした形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とする蛋白質を回収することにより本蛋白質を製造できる。形質転換体の培養は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で実施できる。培養は、形質転換体により発現される本蛋白質自体またはその機能を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された本蛋白質自体またはその蛋白質量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。【０１６８】
目的とする蛋白質が形質転換体の細胞内あるいは細胞膜上に発現する場合には、形質転換体を破砕して目的とする蛋白質を抽出する。また、目的とする蛋白質が形質転換体外に分泌される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離処理等により形質転換体を除去した培養液を使用する。【０１６９】
本蛋白質はまた、一般的な化学合成法により製造できる。例えば、蛋白質の化学合成方法として、固相合成方法や液相合成方法等が知られているがいずれを使用することもできる。このような蛋白質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含し、本蛋白質の合成は、そのいずれによっても実施できる。上記蛋白質合成において使用される縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣ＋添加物（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を例示できる。化学合成により得られた蛋白質は、さらに上記のような慣用の各種精製方法に従って、適宜精製を実施できる。【０１７０】
本蛋白質は適当なペプチダーゼを使用して切断することにより断片化することができ、その結果、本蛋白質の断片が取得できる。【０１７１】
蛋白質は、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種分離操作方法により精製および／または分離できる。分離および／または精製は、本蛋白質の機能を指標にして実施できる。分離操作方法として、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組合せて使用できる。好ましくは、本蛋白質のアミノ酸配列情報に基づき、これらに対する特異的抗体を作成し、該抗体を使用して特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを使用することが推奨される。【０１７２】
本蛋白質またはその断片を抗原として使用することにより、該蛋白質に対する抗体を作製できる。抗原として使用される蛋白質またはその断片は、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ましくは少なくとも１２個、さらに好ましくは１５個以上のアミノ酸で構成される。本蛋白質および／またはその断片に特異的な抗体を作製するためには、該蛋白質またはその断片に固有なアミノ酸配列で表される領域を使用することが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも本蛋白質またはその断片のものと相同または同一である必要はなく、その立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は免疫学的に本蛋白質および／またはその断片を特異的に結合または認識する限り特に限定されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定できる。【０１７３】
抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、抗原をアジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および／または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体はそれ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットヘモシアニン等が例示できる。アジュバントは、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ）、Ｒｉｂｉ（ＴＤＭ）、Ｒｉｂｉ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ）、百日咳ワクチン（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ｖａｃｃｉｎｅ）、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、アルミニウムアジュバント（ＡＬＵＭ）、およびこれらの組み合わせが例示できる。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に使用される。【０１７４】
ポリクローナル抗体は、抗原を投与された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得できる。好ましい抗体回収手段として免疫アフィニティクロマトグラフィー法が挙げられる。【０１７５】
モノクロ−ナル抗体は、抗原を投与された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８株等のミエローマ株）を使用した形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイブリドーマを作製してこれをクローン化し、本蛋白質を特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。【０１７６】
本蛋白質を認識し結合し得るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、本蛋白質の精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。特に本蛋白質の機能を阻害する抗体、あるいは本蛋白質に結合して本蛋白質のリガンド様作用を示す抗体は、本蛋白質の機能調節に使用できる。これら抗体は、本蛋白質およびその機能の異常に起因する各種疾患の解明、予防、改善および／または治療のために有用である。【０１７７】
本ＤＮＡを含む組換えベクターの取得は、本ＤＮＡを適当なベクターＤＮＡに挿入することにより実施できる。組換えベクターは、該ＤＮＡが組込まれている組換えベクターである限りにおいて、いずれの組換えベクターであってもよい。【０１７８】
ベクターＤＮＡは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクターＤＮＡは、天然に存在するものを抽出したもののほか、複製に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落しているものでもよい。代表的なものとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターＤＮＡを例示できる。プラスミドＤＮＡとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド等を例示できる。バクテリオファージＤＮＡとして、λファージ等を例示できる。ウイルス由来のベクターＤＮＡとして、例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターＤＮＡ等を例示できる。あるいは、これらを組合せて作成したベクターＤＮＡ、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組合せて作成したベクターＤＮＡ（コスミドやファージミド等）を例示できる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等、いずれを使用することもできる。【０１７９】
ベクターには、目的遺伝子の機能が発揮されるように遺伝子を組込むことが必要であり、少なくとも目的遺伝子配列とプロモーターとをその構成要素とする。これら要素に加えて、所望によりさらに、複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えば、リボソーム結合配列、ターミネーター、シグナル配列、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、および選択マーカー等から選択した１つまたは複数の遺伝子配列を自体公知の方法により組合せてベクターＤＮＡに組込むことができる。選択マーカーとして、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等を例示できる。【０１８０】
ベクターＤＮＡに目的遺伝子配列を組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、目的遺伝子配列を適当な制限酵素により処理して特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が使用される。あるいは、目的遺伝子配列に適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。【０１８１】
本ＤＮＡを組込んだベクターＤＮＡを宿主に導入することにより、形質転換体が得られる。ベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、本ＤＮＡの発現を実施でき、さらに該ＤＮＡによりコードされる蛋白質を製造できる。該形質転換体には、本ＤＮＡ以外の所望の遺伝子を組込んだベクターＤＮＡの１つまたは２つ以上をさらに導入することもできる。【０１８２】
本ＤＮＡを組込んだ発現ベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体は、本発明に係る同定方法に使用することができる。【０１８３】
宿主として、原核生物および真核生物のいずれも使用できる。原核生物として、例えば大腸菌（エシェリヒアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））等のエシェリヒア属、枯草菌等のバシラス属、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウムメリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌を例示できる。真核生物として、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母、Ｓｆ９やＳｆ２１等の昆虫細胞、あるいはサル腎由来細胞（ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞や２９３ＥＢＮＡ細胞、アフリカツメガエル卵母細胞等の動物細胞を例示できる。好ましくは動物細胞を使用する。【０１８４】
ベクターＤＮＡの宿主細胞への導入は、自体公知の手段が応用でき、例えば成書に記載されている標準的な方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により実施できる。より好ましい方法として、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。具体的な方法として、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ負荷（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）および感染等が挙げられる。【０１８５】
動物細胞を宿主とする場合は、組換えベクターが該細胞中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、ＲＮＡスプライス部位、目的遺伝子、ポリアデニル化部位、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、所望により複製起点が含まれていてもよい。プロモーターとして、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター等を使用することができ、また、サイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を使用してもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法として、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を例示できる。【０１８６】
原核生物を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、目的遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【０１８７】
細菌を宿主として使用する場合、プロモーターとして、大腸菌等の宿主中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の、大腸菌やファージに由来するプロモーターが例示できる。ｔａｃプロモーター等の人為的に設計改変されたプロモーターを使用してもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されない。好ましくは例えば、カルシウムイオンを使用する方法、エレクトロポレーション法等を例示できる。【０１８８】
酵母を宿主とする場合、プロモーターとして、酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、いずれを使用してもよい。例えば、ｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が例示できる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、好ましくは例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を例示できる。【０１８９】
昆虫細胞を宿主とする場合は、組換えベクターの導入方法として、好ましくは例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法等を例示できる。【０１９０】
配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを含むベクターＤＮＡをトランスフェクションして得られた形質転換体として、具体的には、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株が挙げられる。ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのＯＲＦのうち、シグナル配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端より２０アミノ酸残基）をコードすると予測される部分を除いた塩基配列で表されるＤＮＡをＮ末端ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させるベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株にトランスフェクションすることにより樹立した細胞株である。ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、該Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質を安定的に発現している。本細胞株の具体的な作製方法は、実施例２に詳述する。【０１９１】
ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０１号として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に平成１６年８月１９日付けで寄託した。本細胞株の生存は、前記寄託センターにおいて平成１６年９月２２日に実施された試験により確認されている。【０１９２】
本蛋白質は、上述したように膜蛋白質受容体として機能する蛋白質であり、動物細胞において発現させたときにリガンドによる細胞応答を誘発することができた。以下、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体を本発明に係る膜蛋白質受容体と称することがある。【０１９３】
本蛋白質を発現させた動物細胞におけるリガンドによる細胞応答は、具体的には、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを安定的に導入した上記ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株において観察された。より具体的には、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株において、リガンドとしてＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）を作用させたときに、リガンド特異的な細胞応答、すなわち細胞内カルシウム濃度の上昇が観察された（実施例５参照）。このことから、本蛋白質は膜蛋白質受容体として機能することが判明した。リガンドによる細胞応答の惹起はまた、配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、または配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを導入した細胞のいずれにおいても観察された（実施例８参照）。【０１９４】
配列番号１、１５、１７および１９に記載の塩基配列から選択されるいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質は、そのアミノ酸配列においてＮ末端細胞外領域のＴＳＰ−Ｉドメインのリピート数が異なるが、該ドメイン以外のアミノ酸配列はほぼ同一である（図１−Ｂ）。配列番号１、１５、１７および１９に記載の塩基配列から選択されるいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡを導入した細胞のいずれにおいてもリガンドによる細胞応答が惹起された（実施例５、実施例８および実施例９）。したがって、配列番号１、１５、１７および１９に記載の塩基配列から選択されるいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質とリガンドとの結合および該結合により生じる細胞内シグナル伝達には、ＴＳＰ−Ｉドメインは大きく関与していないと発明者らは考えている。【０１９５】
本蛋白質をコードするＤＮＡの組織発現は、具体的には、大脳皮質、海馬および扁桃体で著しく強く認められることを発明者らは見出した（実施例１０および表３参照参照）。【０１９６】
本膜蛋白質受容体は、該受容体蛋白質をコードするＤＮＡのホモログ遺伝子を標的としたノックアウトマウスを使用した実験結果から、不安状態や不安障害に関連すると考えられることが明らかになった。【０１９７】
具体的には、本蛋白質をコードする遺伝子およびそのスプライシングバリアントのホモログ遺伝子であるマウスＢＡＩ２遺伝子を標的としたノックアウトマウスを使用した恐怖条件付け試験（学習性無力試験とも称される）において、該マウスは抗不安の表現型を示した（実施例１１参照）。本試験で使用したノックアウトマウスは、マウスＢＡＩ２遺伝子およびそのスプライシングバリアントに共通の領域を標的とした相同組換えによる遺伝子破壊により作製されたノックアウトマウスであり、ＢＡＩ２遺伝子およびそのスプライシングバリアントは発現されない。【０１９８】
恐怖条件付け試験は、不安の表現型を調べる試験法として一般的に使用されている手法であり、抗不安薬の評価等、不安障害との関連性を調べる試験系として使用されている（ヨシミズ（Ｙｏｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．）ら、「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００６年、第１８６巻、ｐ．５８７−５９３；ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．）ら、「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第４２０巻、ｐ．３３−４３）。【０１９９】
恐怖条件付け試験は、具体的には、本ノックアウトマウスおよび野生型マウスに嫌悪刺激を与え、翌日に該嫌悪刺激を受けた恐怖反応としての無動状態（無力状態とも称される）を嫌悪刺激の無い状態において測定することにより行った。本試験において無動状態を示す時間が少ければ抗不安状態であると判定される。本試験の結果、本ノックアウトマウスは野生型マウスと比較して無動状態をほとんど示さなかった（実施例１１および図１０参照）。この結果から、本ノックアウトマウスは野生型マウスと比較して強い抗不安状態を示すことが判明した。一方、生理学的検査、病理学的検査、解剖学的検査等、多くの検査項目においてノックアウトマウスと野生型マウスの間に有意な差は認められなかった。【０２００】
このように、本蛋白質をコードする遺伝子およびそのスプライシングバリアントのホモログ遺伝子であるマウスＢＡＩ２遺伝子の遺伝子産物が欠損したマウスにおいて、抗不安が誘導された。すなわち、マウスＢＡＩ２遺伝子およびそのスプライシングバリアントの発現が不安状態に関連すると考えることができる。【０２０１】
この結果から、ヒトにおいても配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントの遺伝子産物が不安状態および不安障害に関与していると発明者らは考えている。例えば、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡまたは該ＤＮＡのスプライシングバリアントの発現が増加するといった異常により、不安状態および不安障害が誘導されると発明者らは考えている。【０２０２】
本膜蛋白質受容体は、上記のようにＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）の作用により、細胞内情報伝達を活性化した。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）はＣＣＫの翻訳後スプライシングにより生じたペプチドである。ＣＣＫは、その発現が脳組織、特に大脳皮質、海馬、扁桃体や視床下部に多く認められる（表３参照）。また、ＣＣＫは、不安、鎮痛、鎮静、摂食抑制、記憶、学習といった生理機能に関与していることが知られている。【０２０３】
ＣＣＫ受容体としては、ＣＣＫ−Ａ受容体（ＣＣＫ１受容体とも呼称される）およびＣＣＫ−Ｂ受容体（ＣＣＫ２受容体とも呼称される）の２種類のＧＰＣＲが報告されている（ヘランツ（Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｒ．）、「メディカル  リサーチ  レビューズ（Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、２００３年、第２３巻、第５号、ｐ．５５９−６０５、レビュー）。これらはいずれもクラスＡ（ロドプシン類；ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｌｉｋｅ）に属するＧＰＣＲである。【０２０４】
ＣＣＫ−Ａ受容体は主に消化器官で強く発現しており、脳組織では一部で発現が認められる。ＣＣＫ−Ａ受容体のリガンド親和性については、ＣＣＫ−８Ｓ＞＞ＣＣＫ−８ＮＳ、ガストリン＞ＣＣＫ−４の順に強い。ＣＣＫ−Ａ受容体はＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）に強く応答するが、ＣＣＫ−Ａ受容体のリガンドに対する特異性は認められない。【０２０５】
一方、ＣＣＫ−Ｂ受容体は消化器官に加えて脳組織でも広く発現している。ＣＣＫ−Ｂ受容体のリガンド親和性についてはＣＣＫ−８Ｓ≧ＣＣＫ−８ＮＳ、ガストリン＞ＣＣＫ−４の順で強く、ＣＣＫ−Ａ受容体よりも選択性が低い。【０２０６】
ＣＣＫ−Ａ受容体遺伝子のノックアウトマウスの表現型が報告されているが、このノックアウトマウスと不安障害との関連を示す報告はない。ＣＣＫ−Ａ受容体のノックアウトマウスの表現型については、胆石、膵酵素分泌および胆嚢収縮等の異常といった消化器系における機能異常の他には、体温調節等のホメオスタシスの異常（ノモト（Ｎｏｍｏｔｏ，Ｓ．）ら、「アメリカン  ジャーナル  オブ  フィジオロジー  レギュレイトリー  インテグレイティブ  アンド  コンパラティブ  フィジオロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ，  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」、２００４年、第２８７巻、第３号、Ｒ５５６−６１）、行動活性の上昇（ミヤサカ（Ｍｉｙａｓａｋａ，Ｋ．）ら、「ニューロサイエンス  レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００２年、第３３５巻、第２号、ｐ．１１５−１１８）、および食欲調節の異常（ビ（Ｂｉ，Ｓ．）ら、「ニューロペプタイズ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、２００２年、第３６巻、第２−３号、ｐ．１７１−１８１）が報告されている。【０２０７】
ＣＣＫ−Ｂ受容体のノックアウトマウスの表現型については、胃酸分泌異常、胃粘膜の形成異常といった消化器系の異常の他、不安、痛み、記憶等、中枢系の表現型に関する報告等、数多くの報告がある（ノーブル（Ｎｏｂｌｅ，Ｆ．）ら、「ニューロペプタイズ（Ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、２００２年、第３６巻、第２−３号、ｐ．１５７−１７０）。より具体的には、不安行動の抑制（ラウド（Ｒａｕｄ，Ｓ．）ら、「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００５年、第１８１巻、ｐ．３４７−３５７；ホリノウチ（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｙ．）ら、「ヨーロピアン  ニューロサイコファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、２００４年、第１４巻、第２号、ｐ．１５７−１６１）、不安行動の亢進（ミヤサカ（Ｍｉｙａｓａｋａ，Ｋ．）ら、「ニューロサイエンス  レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００２年、第３３５巻、第２号、ｐ．１１５−１１８）、行動活性の上昇や記憶障害（ダウジ（Ｄａｕｇｅ，Ｖ．）ら、「ニューロサイコファーマコロジー（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、２００１年、第２５巻、第５号、ｐ．６９０−６９８）、痛覚の異常およびオピオイドシステムとの相関（クリコフ（Ｋｕｒｒｉｋｏｆｆ，Ｋ．）ら、「ザ  ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス（Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、２００４年、第２０巻、第６号、ｐ．１５７７−１５８６）等が報告されている。【０２０８】
また、ＣＣＫ−Ａ受容体およびＣＣＫ−Ｂ受容体のダブルノックアウトマウスの表現系についても報告されているが、ダブルノックアウトマウスに特徴的な表現型は報告されていない（ミヤサカ（Ｍｉｙａｓａｋａ，Ｋ．）ら、「ニューロサイエンス  レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００２年、第３３５巻、第２号、ｐ．１１５−１１８）。【０２０９】
本膜蛋白質受容体はＣＣＫ−Ａ受容体と比較して、リガンド親和性が類似しているが、発現分布が異なる。したがって、本膜蛋白質受容体はＣＣＫ−Ａ受容体とは異なる生理作用を担っていると発明者らは考えている。具体的には、本蛋白質をコードするＤＮＡの発現が脳組織で特異的に高いことから、該蛋白質からなる本膜蛋白質受容体は、中枢神経系での作用に関与していると発明者らは考えている。それに対し、ＣＣＫ−Ａ受容体は脳組織においてはその発現が低いため、脳組織におけるＣＣＫの生理活性には関与していないと考えられる。【０２１０】
本膜蛋白質受容体はＣＣＫ−Ｂ受容体と比較して、いずれも脳組織で発現しており発現分布が類似しているが、リガンド親和性が異なる。また、本膜蛋白質受容体の配列はＣＣＫ−Ｂ受容体の配列と比較して相同性が非常に低い。具体的には、本膜蛋白質受容体とＣＣＫ−Ｂ受容体の配列相同性を数種類の相同性検索プログラムを使用してコンピュータ解析したところ、塩基配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｉｙ）および類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）はそれぞれ２１．０％および２１．０％であり、アミノ酸配列の同一性および類似性はそれぞれ５．６％および９．７％であった。このように、本膜蛋白質受容体とＣＣＫ−Ｂ受容体との配列相同性が低く、またリガンド親和性が異なることから、本膜蛋白質受容体およびＣＣＫ−Ｂ受容体は別個の受容体であり、脳内において別個の生理的役割を担っていると発明者らは考えている。【０２１１】
本膜蛋白質受容体、すなわち配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントの遺伝子産物が不安状態および不安障害に関与していると考えられることから、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能および／または発現を阻害することにより、不安状態を改善し、不安障害を回復させることができる。【０２１２】
言い換えれば、不安状態の改善および不安障害の治療は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能の阻害剤により実施できる。【０２１３】
本発明に係る抗不安作用を有する化合物の同定方法は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質またはそのホモログ蛋白質の機能の阻害剤を選別することを特徴とする。【０２１４】
本蛋白質の機能の阻害剤の同定方法は、より具体的には例えば、本蛋白質の機能を測定することのできる実験系を使用して実施できる。本実験系において、該蛋白質と調べようとする化合物（以下、被検化合物と称する）の相互作用を可能にする条件下で、該蛋白質と被検化合物とを共存させてその機能を測定し、ついで、被検化合物の非共存下での測定結果との比較における蛋白質の機能の変化（低減、増加、消失または出現）を検出することにより、本同定方法を実施できる。被検化合物を共存させた場合の本蛋白質の機能を、被検化合物を共存させなかった場合の本蛋白質の機能と比較することにより、該被検化合物が本蛋白質の機能に及ぼす効果を判定できる。例えば、被検化合物を共存させた場合の本蛋白質の機能が、被検化合物を共存させなかった場合の本蛋白質の機能と比較して減少した場合、該被検化合物は本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。また、このような被検化合物は本蛋白質の機能を阻害するがゆえに抗不安作用を有すると判定できる。【０２１５】
本蛋白質の機能として、本蛋白質が膜蛋白質受容体として機能することから、リガンドとの結合、細胞内情報伝達機構の活性化、細胞応答の誘発が例示される。より具体的には、本蛋白質の機能として、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）との結合、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用、細胞内カルシウム濃度の増加、細胞内ｃＡＭＰの変動、および膜電位変化等が例示できる。すなわち、本蛋白質の機能の阻害剤の同定方法は、該蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を阻害する化合物を同定すること、該蛋白質と他の蛋白質、例えばＭＡＫＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用を阻害する化合物を同定すること、該蛋白質による細胞内情報伝達機構の活性化を阻害する化合物を同定すること、該蛋白質による細胞応答の誘発を阻害する化合物を同定すること等により達成できる。【０２１６】
本蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合を阻害する化合物の同定は、本蛋白質と該蛋白質のリガンドとを被検化合物の存在下および非存在下で反応させ、本蛋白質とリガンドとの結合を測定することにより実施できる。本同定方法に使用する蛋白質は、細胞の細胞膜に発現した蛋白質であり得る。本蛋白質を細胞膜に発現した細胞として、天然に存在するかかる細胞を使用でき、また本蛋白質をコードするＤＮＡを含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体を使用することができる。本蛋白質と該蛋白質のリガンドとの結合の測定は、一般的な医薬品スクリーニングシステムで使用されている様々な結合解析方法を利用して実施できる。例えば、リガンドと本蛋白質との結合反応を行い、本蛋白質とリガンドとの結合により形成される複合体と、結合していない遊離のリガンドおよび本蛋白質を分離し、該複合体をイムノブロッティング等の公知の方法によって検出することにより実施できる。また、例えば、リガンドと本蛋白質との結合反応を行い、その後、本蛋白質に結合したリガンドを、抗リガンド抗体を使用して測定することにより、結合の測定が実施できる。リガンドに結合した抗リガンド抗体は、ＨＲＰやビオチン等で標識した二次抗体を使用して検出できる。あらかじめＨＲＰやビオチン等で標識化した抗リガンド抗体を使用して、本蛋白質に結合したリガンドを検出することもできる。あるいは、本蛋白質との結合反応に使用するリガンドとして、あらかじめ所望の標識物質で標識化したリガンドを使用して上記同定方法を行い、該標識物質を検出することにより、本蛋白質に結合したリガンドを測定できる。標識物質として、一般的な結合解析方法で使用されている物質がいずれも利用でき、ＧＳＴ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、あるいは蛍光色素等が例示できる。簡便には、放射性同位体元素が利用できる。【０２１７】
本蛋白質による細胞内情報伝達機構の活性化を阻害する化合物、および該蛋白質による細胞応答を阻害する化合物の同定は、本蛋白質を発現している細胞を使用した実験系において、該細胞と被検化合物とを接触させた後に、または被検化合物の共存下で、該蛋白質に対するリガンドを作用させ、細胞内情報伝達の変化や細胞応答の変化を測定することにより実施できる。細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターをトランスフェクションして得られた形質転換体であり得る。被検化合物の非存在下での測定結果との比較における細胞内情報伝達や細胞応答の変化（低減、増加、消失または出現）を検出することにより、本蛋白質の機能を阻害する化合物を選択できる。細胞内情報伝達の変化や細胞応答の変化として、例えば細胞内カルシウム濃度の変化、細胞内ｃＡＭＰの変化、細胞膜電位の変化、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用の変化やＧ蛋白質との結合変化等を挙げられる。被検化合物により、該細胞の細胞内情報伝達の変化が低減する、または細胞応答の変化が低減する等の変化が惹き起こされた場合、該被検化合物は、本蛋白質の機能を阻害すると判定できる。細胞内カルシウム濃度の変化、ｃＡＭＰの変化、細胞膜電位の変化、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用の変化やＧ蛋白質との結合変化の測定は、周知の方法を使用して実施できる。【０２１８】
リガンドとして、（ｉ）ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）、（ｉｉ）ＣＣＫ−８Ｓのアミノ酸配列において１ないし数個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個のアミノ酸の欠失、置換、負荷等の変異を有し、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチドおよび（ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）に記載のペプチドのアミノ酸配列を含み、かつＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチドからなる群より選択されるペプチドを使用することができる。「ＣＣＫ−８Ｓと同質の機能」とは、本膜蛋白質受容体の生物学的機能を誘導する機能、より具体的には、本膜蛋白質受容体を発現している細胞において、細胞内カルシウム濃度の上昇や膜電位の変化等の細胞応答を惹き起こす機能をいう。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）においてＣ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されていることが、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）のリガンド作用に重要であると考えられることから、本膜蛋白質受容体のリガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチドには、該硫酸化されたチロシン残基が保存されていることが好ましい。変異を有する蛋白質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたものであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たものであってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、上述の方法を利用できる。当該蛋白質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。【０２１９】
リガンドとしてまた、各種細胞または組織から調製した試料自体を使用できる。試料の調製は、例えば細胞または組織を自体公知の方法で培養し、その培養上清を遠心処理等により得る方法や、細胞または組織を自体公知の方法で破砕あるいは溶解する方法により実施できる。リガンドは、上記試料から自体公知の蛋白質精製方法、例えばゲルろ過クロマトグラフィー等により精製して使用することもできる。具体的には、ＨｅＬａ細胞培養上清をリガンドとして使用することができる。あるいは、上記リガンドの同定方法により同定された化合物を使用することができる。【０２２０】
本蛋白質の機能の阻害剤の同定方法はその他、本蛋白質を過剰に発現させた細胞を使用して実施できる。ＧＰＣＲを細胞に過剰発現させるとリガンドを作用させなくても下流のシグナルの活性化が惹き起こされる場合があることが報告されている（チェン（Ｃｈｅｎ，Ｇ）ら、「モレキュラー  ファーマコロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２０００年、第５７巻、ｐ．１２５−１３４；サママ（Ｓａｍａｍａ，Ｐ．）ら、「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９３年、第２８６巻、ｐ．４６２５−４６３６）。このような細胞を使用することによりリガンドを使用することなしに、アンタゴニスト（インバースアゴニスト）の同定方法を実施できると考えられる。すなわち、本蛋白質を細胞に過剰発現させて下流のシグナルを活性化させ、その活性化シグナルを阻害する化合物を同定することにより、本蛋白質のアンタゴニスト（インバースアゴニスト）を同定できると考えられる。具体的には、本蛋白質を過剰発現させた細胞と被検化合物を接触させ、細胞内情報伝達の変化や細胞応答の変化を測定することにより、本蛋白質のアンタゴニスト（インバースアゴニスト）の同定を実施できる。本蛋白質を過剰発現させた細胞は、本蛋白質をコードする遺伝子を含むベクターを自体公知の遺伝子操作法によりトランスフェクションすることにより得られる。本蛋白質を過剰発現させた細胞とは、本蛋白質をコードする遺伝子の導入により、該遺伝子を導入した細胞において検出される下流のシグナルの程度が、該遺伝子を導入していない細胞におけるその程度と比較して活性化されている細胞を意味する。被検化合物の非存在下での測定結果との比較における細胞内情報伝達や細胞応答の変化（低減、増加、消失または出現）を検出することにより、本蛋白質のアンタゴニスト（インバースアゴニスト）を選択できる。細胞内情報伝達の変化や細胞応答の変化として、例えば細胞内カルシウム濃度の変化、ｃＡＭＰの変化、細胞膜電位の変化、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用の変化やＧ蛋白質との結合変化等を挙げられる。本蛋白質を発現させた細胞の被検化合物により、該細胞の細胞内情報伝達の変化が低減する、または細胞応答の変化が低減する等の変化が惹き起こされた場合、該被検化合物は、本蛋白質のアンタゴニスト（インバースアゴニスト）であると判定できる。細胞内カルシウム濃度の変化、ｃＡＭＰの変化、細胞膜電位の変化、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用の変化やＧ蛋白質との結合変化の測定は、周知の方法を使用して実施できる。【０２２１】
実際に、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡを含むベクターでトランスフェクションした細胞を使用して細胞内情報伝達の変化を測定する実験系を使用し、該細胞応答に対して阻害効果を示す化合物の同定を実施した（実施例１２参照）。本実験系においては、上記細胞にＣＣＫ−８Ｓを作用させて細胞内情報伝達機構を活性化し、細胞内情報伝達の変化の測定は細胞内カルシウム濃度変化を測定することにより行った。被検化合物として、化合物ライブラリーであるソフトフォーカス  ジーピーシーアール  ターゲットダイレクティッド  ライブラリー（ＳｏｆｔＦｏｃｕｓ  ＧＰＣＲ  Ｔａｒｇｅｔ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ、ＢｉｏＦｏｃｕｓ社製）を使用した。その結果、上記細胞のＣＣＫ−８Ｓに対する応答における細胞内カルシウム濃度の変化を阻害する化合物が３種類同定できた（式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ））。これら化合物は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質の機能阻害剤として作用していると発明者らは考えている。【０２２２】
式（Ｉ）：
【化１】
2008053962.tif 000003
【０２２３】
式（ＩＩ）：
【化２】
2008053962.tif 000004
【０２２４】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
2008053962.tif 000005
【０２２５】
この結果から、本蛋白質を発現している細胞を使用した実験系、例えば該細胞を使用した細胞内カルシウム濃度変化測定系により、本蛋白質の機能阻害剤を同定できると発明者らは考えている。【０２２６】
本蛋白質と他の蛋白質、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用を阻害する化合物の同定は、例えば、単離した本蛋白質と単離した他の蛋白質、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質とを使用して、公知の蛋白質結合解析方法により本蛋白質と他の蛋白質、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との結合の検出を行うことにより実施できる。具体的には、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質を遺伝子工学的手法によりＧＳＴ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させ、その後グルタチオンセファロースに結合させ、これに結合する本蛋白質の量を、本蛋白質に対する抗体、例えばＨＲＰやＡＬＰ等の酵素、放射性同位元素、蛍光色素またはビオチン等で標識した抗体を使用して定量できる。または、タグペプチドを融合した本蛋白質を使用すれば、抗タグ抗体を使用して定量することもできる。勿論、本蛋白質を上記酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン等で直接標識してもよい。あるいは、上記酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン等で標識した二次抗体を使用してもよい。あるいは本蛋白質をコードするＤＮＡとＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質をコードするＤＮＡとを適当な細胞を使用して共発現させ、プルダウン法により両者の結合を検出することにより、両者の相互作用を測定できる。【０２２７】
本蛋白質と他の蛋白質、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用に影響する化合物の同定方法はまた、例えば、ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法を使用して、本蛋白質とＤＮＡ結合蛋白質を融合蛋白質として発現するプラスミド、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質と転写活性化蛋白質を融合蛋白として発現するプラスミド、および適切なプロモーター遺伝子に接続したｌａｃＺ等レポーター遺伝子を含有するプラスミドを酵母や真核細胞等に導入し、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量を被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量とを比較することにより実施できる。被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して減少した場合には、該被検化合物には本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との結合を阻害する作用があると判定できる。一方、被検化合物を共存させた場合のレポーター遺伝子の発現量が被検化合物非存在下でのレポーター遺伝子の発現量と比較して増加した場合には、該被検化合物には本蛋白質とＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との結合を安定化する作用があると判定できる。【０２２８】
本蛋白質と他の蛋白質、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用に影響する化合物の同定は、ビアコアシステム（ＢＩＡＣＯＲＥ  ｓｙｓｔｅｍ）等の表面プラズモン共鳴センサーを使用して実施することもできる。【０２２９】
本蛋白質と他の蛋白質、例えばＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用に影響する化合物の同定はまた、シンチレーションプロキシミティアッセイ法（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ、ＳＰＡ）や蛍光共鳴エネルギー転移（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）を応用した方法を使用して実施できる。【０２３０】
本同定方法に使用されるＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質として具体的には、ＤＬＧ２、ＤＬＧ３およびＤＬＧ４や、ＡＩＰ１、ＭＡＧＩ３を例示できる。ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質は、本蛋白質との相互作用に影響がない限りにおいて、一部を欠損したものであってよく、あるいは別の蛋白質等の標識物質が付加されたものであってもよい。【０２３１】
本蛋白質の発現を阻害することのできる化合物の同定方法は、より具体的には例えば、本蛋白質の発現を測定することのできる実験系を使用して実施できる。本実験系は、本ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体のうち少なくともいずれか１つを使用して、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築できる。【０２３２】
本蛋白質の発現を阻害することのできる化合物の同定方法は、本蛋白質をコードするＤＮＡの発現を測定できる実験系において、該ＤＮＡと被検化合物とを共存させてその発現を測定し、ついで、被検化合物の非存在下での測定結果との比較における発現の変化（低減または消失）を検出することにより実施できる。被検化合物を共存させた場合の発現が、被検化合物を共存させなかった場合の発現と比較して減少した場合、該被検化合物は本蛋白質の発現を阻害すると判定できる。発現の測定は、ＤＮＡによりコードされる蛋白質の直接的な検出により実施できるし、例えば発現の指標となるシグナルを実験系に導入して該シグナルを検出することにより実施できる。シグナルとして、ＧＳＴ、Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等のタグペプチド類、あるいは蛍光色素等を使用できる。【０２３３】
本蛋白質の発現を阻害することのできる化合物の同定方法において、本蛋白質をコードするＤＮＡの発現を測定できる実験系として、該ＤＮＡを含む細胞を使用した実験系を使用できる。細胞は、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクションした形質転換体が好ましく使用される。【０２３４】
本蛋白質の発現を阻害することのできる化合物の同定方法において、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ等の核酸分子を被検化合物として使用することにより、本蛋白質をコードする遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドや、ＲＮＡ干渉の手法により該遺伝子の発現を低下または消失させ得るｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）およびｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）（エルバシ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４−４９８；およびパディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．）ら、「ジーンズ  アンド  ディベロプメント（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」、２００２年、第１６巻、ｐ．９４８−９５８）を同定することができる。核酸分子は、本蛋白質をコードする遺伝子に基づいて設計し、自体公知の化学合成法により合成することにより取得できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡの取得のための核酸分子の設計は、これら核酸分子について報告されている多数の文献を参照して実施できる。【０２３５】
細胞を使用した実験系において、被検化合物として核酸分子を使用する場合、本ＤＮＡと核酸分子とのとの共存は、核酸分子を細胞内に導入することにより達成できる。核酸分子の細胞内への導入は公知の遺伝子操作法、例えばリポフェクションにより実施できる。【０２３６】
本蛋白質の発現を阻害することのできる化合物の同定方法は、具体的には、該蛋白質をコードするＤＮＡを含む細胞を使用した実験系において、該細胞と被検化合物とを接触させた後に、または該細胞に被検化合物を導入した後に、該蛋白質を測定することによって実施できる。被検化合物の非共存下での測定結果との比較における発現の変化（低減または消失）を検出することにより、本蛋白質の発現を阻害する化合物を選択できる。蛋白質の発現の有無または変化の検出は、公知の蛋白質検出法、例えばウエスタンブロッティング等により実施できる。また、蛋白質の発現の有無または変化の検出は、発現される蛋白質の生物学的機能や該蛋白質を介した細胞応答、例えばリガンドを作用させたときに発生するＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質との相互作用、細胞膜電位の変化、細胞内カルシウム濃度の変化を指標にして実施できる。【０２３７】
本蛋白質の発現を阻害する化合物の同定方法はまた、例えば該ＤＮＡを含む遺伝子のプロモーター領域の下流に、該ＤＮＡの代わりにレポーター遺伝子を連結したベクターを作成し、該ベクターを導入した細胞、例えば真核細胞等と被検化合物とを接触させ、レポーター遺伝子の発現の有無および変化を測定することにより実施できる。レポーター遺伝子として、レポーターアッセイで一般的に使用されている遺伝子を使用でき、例えば、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等の酵素活性を有する遺伝子を例示できる。レポーター遺伝子の発現の検出は、その遺伝子産物の活性、例えば、上記例示したレポーター遺伝子の場合は酵素活性を検出することにより実施できる。【０２３８】
被検化合物として、例えば化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーや天然物由来の化合物、または本蛋白質の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等を使用できる。あるいは、ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸分子を被検化合物として使用できる。【０２３９】
本蛋白質の機能を阻害する効果を有すると判定された化合物は、さらに非ヒト動物を使用してその抗不安作用を評価することが好ましい。化合物が抗不安作用を示すか否かの評価は、非ヒト動物を使用した一般的に使用されている抗不安作用の試験方法により実施できる。非ヒト動物を使用した不安状態を測定する試験方法は多数考案され、また使用されており、次に示すような試験法が例示される：恐怖条件付け試験（ヨシミズ（Ｙｏｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．）ら、「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００６年、第１８６巻、ｐ．５８７−５９３；ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．）ら、「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第４２０巻、ｐ．３３−４３）、ボーゲル（Ｖｏｇｅｌ）型抗コンフリクトテスト（バラード（Ｂａｌｌａｒｄ，Ｔ．Ｍ．）ら、「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００５年、第１７９巻、ｐ．２１８−２２９）、ゲラー−セイフター（Ｇｅｌｌｅｒ−Ｓｅｉｆｔｅｒ）型抗コンフリクトテスト（バラード（Ｂａｌｌａｒｄ，Ｔ．Ｍ．）ら、「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００５年、第１７９巻、ｐ．２１８−２２９）、高架式迷路法（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．）ら、「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第４２０巻、ｐ．３３−４３；トレイト（Ｔｒｅｉｔ，Ｄ．）ら、「ファーマコロジー  バイオケミストリー  アンド  ビヘイビア（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ）」、１９９３年、第４４巻、ｐ．４６３−４６９；シェファード（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｊ．Ｋ．）ら、「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、１９９４年、第１１６巻、ｐ．５６−６４；ザングロッシ（Ｚａｎｇｒｏｓｓｉ，Ｈ．Ｊｒ．）ら、「ブレイン  リサーチ  ブレティン（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）」、１９９７年、第４４巻、ｐ．１−５；グラエフ（Ｇｒａｅｆｆ，Ｆ．Ｇ．）ら、「ニューロサイエンス  アンド  バイオビヘイビアラル  レビューズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、１９９８年、第２３巻、ｐ．２３７−２４６）、ホール−ボードテスト（ｈｏｌｅ−ｂｏａｒｄ  ｔｅｓｔ：タケダ（Ｔａｋｅｄａ，Ｈ．）ら、「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第３５０巻、ｐ．２１−２９）、明暗試験（ヤング（Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．）ら、「ファーマコロジー  バイオケミストリー  アンド  ビヘイビア（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  Ｂｅｈａｖｉｏｒ）」、１９９１年、第４０巻、ｐ．７３３−７３７）、社会性相互作用テスト（ファイル（Ｆｉｌｅ，Ｓ．Ｈ．）ら、「ジャーナル  オブ  ニューロサイエンス  メソッズ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、１９８０年、第２巻、ｐ．２１９−２３８）、およびビー玉埋め法（ｍａｒｂｌｅ  ｂｕｒｙｉｎｇ  ｔｅｓｔ：ロンデイ（Ｌｏｎｄｅｉ，Ｔ．）ら、「ビヘイビアラル  ブレイン  リサーチ（Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９８年、第９４巻、ｐ．２４９−２５４）。これら試験法において、様々な抗不安薬の作用が試験されている。これら試験法は、該試験法を記載した文献や成書等を参照して実施できる。【０２４０】
非ヒト動物として、非ヒト哺乳動物、具体的にはマウス、ラット、ウサギおよびサル等が好適に使用される。より好ましくはマウスおよびラットが、さらに好ましくはマウスが使用される。【０２４１】
恐怖条件付け試験は、不安の表現型を調べる試験方法として一般的に使用されている手法であり、抗不安薬の評価等、不安障害との関連性を評価する試験方法として使用されている。恐怖条件付け試験は、具体的には例えば、非ヒト動物に嫌悪刺激を与え、翌日に該嫌悪刺激を受けた恐怖反応としての無動状態（無力状態とも称される）を嫌悪刺激の無い状態において測定することにより行われる。本試験において、非ヒト動物に被検化合物を投与し、該被検化合物を投与していないマウスと比較して無動状態を示す時間が短縮された場合、該被検化合物は抗不安作用を有すると判定できる。非ヒト動物への被検化合物の投与経路や投与量は、非ヒト動物を使用した薬剤の試験方法で一般的に使用されている方法に準じて決定できる。このような化合物は、抗不安薬として有用である。【０２４２】
本発明に係る同定方法により取得された化合物は、本蛋白質の機能、例えば、リガンドとの結合、細胞内情報伝達の活性化、細胞応答の誘発等の阻害剤、または拮抗剤等として利用できる。また、本発明に係る同定方法により、本蛋白質の発現を阻害する化合物も同定され、このような化合物は本蛋白質に対する遺伝子レベルでの発現阻害剤として利用できる。【０２４３】
本蛋白質をコードする遺伝子が不安状態や不安障害に関連することから、本蛋白質の機能を阻害する化合物は抗不安作用を示すと発明者らは考えている。このような化合物は不安状態の改善剤として使用することができる。すなわち、本発明において、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能の阻害剤を含む不安状態の改善剤を提供することができる。【０２４４】
本蛋白質の機能阻害剤は、好ましくは、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体においてＣＣＫ−８Ｓにより惹き起こされる機能の阻害剤であることができる。また、本蛋白質の機能阻害剤は、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体においてＣＣＫ−８Ｓと同質の機能を有するペプチドにより惹き起こされる機能の阻害剤であることができる。【０２４５】
本蛋白質の機能阻害剤として、上記同定方法により同定した３種類の化合物（上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ））が例示できる（実施例１２参照）。【０２４６】
本蛋白質の機能阻害剤としてまた、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体のリガンドが蛋白質であるとき、該リガンドの部分ペプチドであって、該膜蛋白質受容体とは結合するがリガンドが示す効果を発揮できないペプチドを使用できる。該膜蛋白質受容体のリガンドの部分ペプチドは、該リガンドを同定した後、そのアミノ酸配列から数々の部分ペプチドを設計して合成し、本発明に係る化合物の同定方法により、合成した部分ペプチドからアンタゴニストとしての活性を有するものを選択することにより取得できる。【０２４７】
本蛋白質の機能阻害剤は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮してさらに選別することにより医薬として調製できる。これら化合物は、本蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現の異常に起因する各種病的症状の予防効果および／または治療効果を期待できる。【０２４８】
本蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、抗体、リガンドまたは化合物は、本蛋白質の機能および／または発現を阻害する、拮抗する、または促進することに基づく医薬または医薬組成物の有効成分として有用である。【０２４９】
本発明に係る医薬または医薬組成物は、本蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現の異常に起因する疾患の予防および／または治療剤として使用できる。また、当該疾患の予防および／または治療方法に使用できる。【０２５０】
本蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現が過剰な場合、１つの方法として該蛋白質の機能および／または該ＤＮＡの発現を阻害する有効量の阻害剤を医薬上許容される担体とともに対象に投与して、該蛋白質の機能を阻害し、そのことにより異常な症状を改善できる。さらに、発現ブロック法を使用して内在性の該蛋白質をコードするＤＮＡの発現を阻害してもよい。例えば本ＤＮＡの断片をアンチセンスオリゴヌクレオチドとして遺伝子治療に使用し、本蛋白質をコードするＤＮＡの発現を阻害できる。アンチセンスオリゴヌクレオチオドとして使用するＤＮＡ断片は、本ＤＮＡの翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものであっても有用である。本ＤＮＡの発現を特異的に阻害するためには、該ＤＮＡに固有な領域の塩基配列を使用することが好ましい。【０２５１】
本蛋白質の機能および／または該蛋白質をコードするＤＮＡの発現の異常に起因する疾患として、神経性疾患、例えば不安障害が好ましく挙げられる。【０２５２】
本蛋白質の機能阻害剤および該阻害剤を有効量含む医薬組成物は、不安障害の緩和、改善、予防および／または治療に有効であると発明者らは考えている。本発明に係る医薬または医薬組成物は、不安障害の予防および／または治療方法に使用できる。具体的には、本医薬または医薬組成物は、本蛋白質の機能阻害剤を有効成分として、その有効量含んでなる不安障害の予防および／または治療剤であり得る。言い換えれば、本医薬または医薬組成物は、本発明に係る抗不安薬を有効成分として、その有効量含んでなる不安障害の予防および／または治療剤であり得る。本抗不安薬を適用することにより、不安障害の予防および／または治療方法を実施できる。【０２５３】
本発明に係る医薬は、上記蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、抗体、リガンドまたは化合物のうち少なくともいずれか１つを有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体を使用して医薬組成物を製造することが好ましい。【０２５４】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。【０２５５】
医薬用担体として、製剤の使用形態に応じて通常使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤や賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。【０２５６】
例えば水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。【０２５７】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤等を適宜使用して調製することもできる。【０２５８】
安定化剤としては、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。上記Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。界面活性剤も特に限定はなく、イオン性および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。これには、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエ−テル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。【０２５９】
緩衝剤として、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。【０２６０】
等張化剤として、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。【０２６１】
キレート剤として、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。【０２６２】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生埋的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。【０２６３】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を使用してこれらの用量を変更できる。上記投与量は１日１回〜数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。【０２６４】
本発明に係る医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。【０２６５】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与できる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施できる。【０２６６】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。【０２６７】
本発明に係る医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリポソーム製剤として調製することが好ましい。遺伝子治療剤が、遺伝子が導入された細胞を含む形態に調製される場合は、該細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態等に調製することもできる。また、プロタミン等の遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。遺伝子治療剤として使用する場合、本医薬組成物は、１日に１回または数回に分けて投与でき、また、１日から数週間の間隔で間歇的に投与できる。投与の方法は、一般的な遺伝子治療法で使用されている方法に従って実施できる。【０２６８】
本発明はまた、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能および／または発現を阻害することを手段とする不安状態の改善方法に関する。【０２６９】
本発明はさらに、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質または該蛋白質のスプライシングバリアントの機能および／または発現を阻害することを手段とする不安状態の改善方法を使用することを特徴とする不安障害の予防および／または治療方法に関する。【０２７０】
本蛋白質の機能阻害剤は、本蛋白質からなる膜蛋白質受容体の機能、例えばリガンドの結合、該膜蛋白質受容体による細胞内情報伝達、および該膜蛋白質受容体による細胞応答、並びに該受容体蛋白質の発現のうち少なくともいずれか１を阻害する効果を有する。本蛋白質をコードするＤＮＡの発現の増加といった異常により不安状態および不安障害が誘導されると考えられることから、本蛋白質の機能阻害剤により本蛋白質からなる膜蛋白質受容体の機能を阻害すれば、不安状態および不安障害を改善できると発明者らは考えている。【０２７１】
本発明はまた、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択されるいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる、不安障害の診断に使用するための測定方法に関する。【０２７２】
本測定方法は、被検試料中の目的とする遺伝子の定性的または定量的な測定方法、該遺伝子によりコードされる蛋白質の定性的または定量的な測定方法、および該遺伝子または該蛋白質のの特定領域の変異の定性的または定量的な測定方法を包含する。【０２７３】
本発明はさらに、配列表の配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡおよび該ＤＮＡのスプライシングバリアントから選択されるいずれか１のＤＮＡ、および／または、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質をマーカーとして定量的または定性的に分析することを含んでなる、不安障害の診断方法に関する。【０２７４】
本ＤＮＡを含む遺伝子の、個体若しくは各種組織における異常の有無あるいは発現の有無の特異的な検出は、例えば本ＤＮＡの一部または全部の塩基配列を利用することにより実施できる。本ＤＮＡの検出により、該遺伝子に起因する疾患の易罹患性、発症、および／または予後の診断が実施できる。該遺伝子に起因する疾患とは、該遺伝子の量的異常および／または機能異常等に起因する疾患を意味する。本遺伝子に起因する疾患として、神経性疾患、例えば不安障害等が挙げられる。【０２７５】
遺伝子の異常の有無あるいは発現の有無の検出は、例えば被検試料について、該遺伝子に相応する核酸の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を同定することによって実施できる。正常な対照試料との比較において、目的遺伝子に対応する核酸の存在の変化、その量的変化を検出できる。また、正常遺伝子型との比較において、目的遺伝子に対応する核酸を公知の手法により増幅した増幅生成物について、例えばサイズ変化を測定することにより欠失および挿入を検出できる。また増幅ＤＮＡを、例えば標識した本ＤＮＡとハイブリダイゼーションさせることにより点突然変異を同定できる。このような遺伝子の量的変化および変異の検出により、上記測定方法および診断方法を実施できる。【０２７６】
被検試料は、目的遺伝子および／またはその変異遺伝子の核酸を含むものである限り特に制限されず、例えば、細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。あるいは所望により生物学的試料から核酸を抽出して核酸試料を調製して使用することもできる。核酸は、ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前にＰＣＲまたはその他の増幅法を使用することにより酵素的に増幅してもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同様に使用してもよい。核酸試料は、また、標的配列の検出を容易にする様々な方法、例えば変性、制限酵素による消化、電気泳動またはドットブロッティング等により調製してもよい。【０２７７】
検出方法は、公知の遺伝子検出法を使用できる。例えばプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法、または逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）等が使用できる。また、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲや  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの測定を使用することもできる。目的遺伝子の検出に使用することのできる方法は上記方法に限定されず、自体公知の遺伝子検出法がいずれも使用できる。【０２７８】
このような遺伝子検出法において、目的遺伝子またはその変異遺伝子の同定および／またはその増幅の実施に、本ＤＮＡの断片であってプローブとしての性質を有するものまたはプライマーとしての性質を有するものが有用である。プローブとしての性質を有するＤＮＡ断片とは、目的のＤＮＡのみに特異的にハイブリダイゼーションできる該ＤＮＡ特有の配列からなるものを意味する。プライマーとしての性質を有するものとは本ＤＮＡのみを特異的に増幅できる該ＤＮＡ特有の配列からなるものを意味する。また、増幅できる変異遺伝子を検出する場合には、遺伝子内の変異を有する箇所を含む所定の長さの配列を持つプライマーあるいはプローブを作成して使用する。プローブまたはプライマーは、塩基配列長が一般的に５〜５０ヌクレオチド程度であるものが好ましく、１０〜３５ヌクレオチド程度であるものがより好ましく、１５〜３０ヌクレオチド程度であるものがさらに好ましい。プローブは、通常は標識したプローブを使用するが、非標識であってもよく、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出してもよい。プローブおよびリガンドを標識する方法は、数々の方法が知られており、例えばニックトランスレーション、ランダムプライミングまたはキナーゼ処理を利用する方法等を例示できる。適当な標識物質として、放射性同位体、ビオチン、蛍光色素、化学発光物質、酵素、抗体等が挙げられる。【０２７９】
遺伝子検出法は、ＰＣＲが感度の点から好ましい。ＰＣＲは、目的遺伝子を特異的に増幅することのできるＤＮＡ断片をプライマーとして使用する方法である限り特に制限されず、従来公知の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲが例示されるが、当該分野で使用される数々の変法を適用できる。【０２８０】
ＰＣＲにより、遺伝子の検出の他に、目的遺伝子および／またはその変異遺伝子のＤＮＡの定量も実施できる。このような分析方法として、Ｍｕｌｔｉ−ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ（ＭＳＳＡ）法のごとき競合的定量法、または一本鎖ＤＮＡの高次構造の変化に伴う移動度の変化を利用した突然変異検出法として知られるＰＣＲ−ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＰＣＲ−ＳＳＣＰ）法を例示できる。【０２８１】
本ＤＮＡによりコードされる蛋白質の、個体若しくは各種組織における異常の有無あるいは発現の有無の特異的な検出は、公知の蛋白質検出法に準じて実施できる。本蛋白質およびその機能の異常の検出により、該ＤＮＡを含む遺伝子に起因する疾患の易罹患性、発症および／または予後の診断が実施できる。【０２８２】
蛋白質の異常の有無あるいは発現の有無の検出は、例えば被検試料について、該蛋白質の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および／またはその変異を検出することによって実施できる。すなわち、本蛋白質および／またはその変異体を定量的あるいは定性的に測定する。正常な対照試料との比較において、目的蛋白質の存在の変化、その量的変化を検出できる。正常蛋白質との比較において、例えばアミノ酸配列を決定することによりその変異を検出できる。蛋白質のこのような量的変化および変異の検出により、上記測定方法および診断方法を実施できる。【０２８３】
被検試料は、目的蛋白質および／またはその変異体を含むものである限り特に制限されず、例えば、血液、血清、尿、生検組織等の生体生物由来の生物学的試料を例示できる。【０２８４】
本蛋白質および変異を有する該蛋白質の測定は、本蛋白質、例えば配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質、または該蛋白質のアミノ酸配列において１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列やこれらの断片を指標にして実施できる。【０２８５】
蛋白質の定量的あるいは定性的な測定は、この分野における慣用技術による蛋白質検出法あるいは定量法を使用して実施できる。例えば、目的蛋白質のアミノ酸配列分析により変異蛋白質の検出ができるが、さらに好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体）を使用して、目的蛋白質の配列の相違、または目的蛋白質の有無を検出できる。【０２８６】
具体的には、被検試料について、目的蛋白質に対する特異抗体を使用して免疫沈降を行い、ウェスタンブロット法またはイムノブロット法で目的蛋白質の解析を行うことにより、上記検出が実施できる。また、目的蛋白質に対する抗体により、免疫組織化学的技術を使用してパラフィンまたは凍結組織切片中の目的蛋白質を検出できる。【０２８７】
目的蛋白質またはその変異体を検出する方法の好ましい具体例として、モノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を使用するサンドイッチ法を含む、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫検定法（ＲＩＡ）、免疫放射線検定法（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素法（ＩＥＭＡ）等が挙げられる。その他、競争結合アッセイ等を利用することもできる。【０２８８】
本蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、それ自体を単独で、試薬等として使用でき、例えば、本発明に係る化合物の同定方法、あるいは発明に係る蛋白質および／またはＤＮＡの測定方法や診断方法に使用するための試薬として使用できる。該試薬は本蛋白質またはＤＮＡが関与する細胞情報伝達経路の解明、並びに該蛋白質および／またはＤＮＡの異常に起因する疾患等に関する基礎的研究等にも有用である。【０２８９】
本蛋白質、ＤＮＡ、組換えベクター、形質転換体、および抗体はいずれも、これらのうちの少なくともいずれか１つを含んでなる試薬キットに含まれる試薬として使用できる。これらは試薬キットであるとき、本蛋白質やＤＮＡを検出するための標識物質、標識の検出剤、反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤および反応停止液等、測定の実施に必要とされる物質を含むことができる。標識物質として、上述の標識用蛋白質、および化学修飾物質等が挙げられるが、予め該標識物質が本蛋白質あるいはＤＮＡに付加されていてもよい。【０２９０】
具体的には、本発明に係る試薬キットとして、配列表の配列番号１、１５および１７に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、該ＤＮＡによりコードされる蛋白質、および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キットが例示できる。より具体的には、配列表の配列番号１、１５および１７に記載の塩基配列のうちいずれか１の塩基配列で表されるＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターを導入されてなる形質転換体、配列番号２、１６および１８に記載のアミノ酸配列のうちいずれか１のアミノ酸配列で表される蛋白質および該蛋白質を認識する抗体のうち、少なくともいずれか１つを含有してなる試薬キットが例示できる。【０２９１】
これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。なお、製剤化にあたっては、各性質に応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。【０２９２】
本発明に係る試薬キットは、上記同定方法および測定方法に使用できる。さらに本発明は、前記測定方法を使用する検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。また、前記測定方法を使用する診断方法にも、診断剤並びに診断用キットとして使用できる。【０２９３】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【０２９４】
（ヒト脳由来ｃＤＮＡライブラリーの構築と遺伝子の分取）
市販ヒト脳、胎児脳、および脳海馬由来のｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製：カタログＮｏ．６５１６−１、６５２５−１、および６５７８−１）を出発原料として常法によりｃＤＮＡライブラリーを構築し、ｄｂＥＳＴ分析によりｃＤＮＡ断片を単離してｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。具体的には、小原らの方法（オハラ（Ｏｈａｒａ，Ｏ．）ら、「ディーエヌエー  リサーチ（ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９７年、第４巻、ｐ．５３−５９）に従って調製した上記ヒト脳由来のｃＤＮＡライブラリーから、約５０，０００個の組換え体をランダムに選択し、このうち約３０，０００個のクローンのｃＤＮＡについて、その５′末端および３′末端の塩基配列を決定した。さらに約１，１００個を主にインビトロの転写翻訳実験によって選択し、それらのｃＤＮＡの塩基配列を小原らの方法に従って決定した。【０２９５】
全塩基配列の決定を行ったｃＤＮＡクローンについて、コンピュータプログラムを使用した汎用解析方法によってＯＲＦを予想し、この領域について７回膜貫通ドメインを有するｃＤＮＡクローンを得た。【０２９６】
同定したｃＤＮＡクローンｐｈ０１２０７は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基からなるＯＲＦを含む全長４５５７ｂｐの塩基配列を有するＤＮＡ（配列番号１）である。相同性検索により、ｐｈ０１２０７は、ｈＢＡＩ２（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ００５２９８）の配列のうち、Ｎ末端領域の５５アミノ酸残基をコードする領域が欠損し、さらにＣ末端側領域に１アミノ酸残基（配列番号２に記載のアミノ酸配列における第１４０６番目のリジン）が挿入されたスプライシングバリアントであると考えられた（図１−Ａ）。【０２９７】
ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質には構造的特徴として、３個のＴＳＰ−Ｉドメインの他、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメインが存在することが判明した。【０２９８】
一方、ｈＢＡＩ２によりコードされる蛋白質は、４個のＴＳＰ−Ｉドメインの他、ＧＰＳドメインおよび７回膜貫通ドメインを有すると考えられる。ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質においては、ｈＢＡＩ２のＮ末端領域側の１個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む領域に相当する５５アミノ酸残基が欠失していることが明らかになった。【０２９９】
ｐｈ０１２０７遺伝子の発現組織解析により、正常の脳組織全般（例えば、大脳皮質（大脳側頭極（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｐｏｌｅ）、運動皮質（ｍｏｔｏｒ  ｃｏｒｔｅｘ））、海馬、扁桃体等）において本遺伝子の特異的に高い発現が認められた。さらに卵巣癌、肝臓癌および副腎癌において、各正常組織と比較して、発現の亢進が認められた。
【実施例２】
【０３００】
（ｐｈ０１２０７発現細胞株の作製と、該細胞株におけるＤＮＡの発現）
実施例１で同定したクローンｐｈ０１２０７を使用してｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質をＮ末端エピトープタグ（ｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇ）融合蛋白質として発現させた。【０３０１】
まず、ｐｈ０１２０７遺伝子を含む発現ベクターを構築した。実施例１で同定したクローンｐｈ０１２０７を使用して、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を除いたアミノ酸配列をコードするＤＮＡをＰＣＲおよび制限酵素処理によりｐＤＯＮＲ２０１にクローニングし、ｐｈ０１２０７エントリーベクターを構築した。ＰＣＲは、プライマーとして配列表の配列番号４〜１１のそれぞれに記載した塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドを使用し、ポリメラーゼとしてＰｆｕ  ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用して実施した。【０３０２】
Ｎ末端ｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇ融合型発現ベクターとして、ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９−ａｔｔＲとＴ８ＨＡ−ａｔｔＲ／ｐＣＩＮｅｏの２種類を準備した。ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９−ａｔｔＲは、ｐ３×ＦＬＡＧ−ＣＭＶ９（Ｓｉｇｍａ社製）をゲートウェイベクターコンバージョンシステム（ＧＡＴＥＷＡＹ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によりゲートウェイシステム（ＧＡＴＥＷＡＹ  ｓｙｓｔｅｍ）に対応化させたベクターである。Ｔ８ＨＡ−ａｔｔＲ／ｐＣＩＮｅｏは、文献情報（ケラー（Ｋｏｌｌｅｒ，Ｋ．Ｊ．）ら、「アナリティカル  バイオケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第２５０巻、ｐ．５１−６０）に従い、ｐＣＩＮｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）および合成オリゴ（Ｔ８ＳＰ−ＨＡ（配列番号１２）およびＴ８ＳＰ−ＨＡ  ａｓ（配列番号１３））、並びにＧＡＴＥＷＡＹ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して構築した。両ベクターともにｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇの前（Ｎ末端側）に分泌シグナル配列（ＦＬＡＧ：ＰＰＴＬＳ、ＨＡ：Ｔ８）を有する。これらベクターを使用して、マンマリアンエクスプレッションシステムウイズゲートウェイテクノロジー（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ＧＡＴＥＷＡＹ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＬＲ反応により、Ｎ末端ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＨＡ−ｔａｇ融合型発現ベクターを構築した。構築した各発現ベクターは、制限酵素処理およびシークエンス解析により、導入した配列の翻訳領域に塩基置換や欠損のないことを確認した。【０３０３】
構築した２種類の発現ベクターをそれぞれＣＨＯ−Ｋ１細胞株へフュージーン６（Ｆｕｇｅｎｅ６、Ｒｏｃｈｅ社製）を使用してトランスフェクションした後、Ｇ４１８を含む培地（４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８および１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）で培養することにより発現細胞株の選抜を行った。生育した発現細胞株について、ｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇに対するパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識抗体（抗ＦＬＡＧ  Ｍ２−ＰＯＤ抗体および抗ＨＡ−ＰＯＤ抗体：３Ｆ１０）を使用してセルエンザイムイムノアッセイ（ｃｅｌｌ  ＥＩＡ）により、さらに選抜を行った。選抜した細胞株について、さらに一次抗体（抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体および抗ＨＡ抗体：クローンＨＡ−７）およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した二次抗体（ＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧ抗体）を使用したフルオロサイトメトリー（ＦＣＭ）解析による選抜を行い、発現細胞株を取得した。【０３０４】
ＦＣＭ解析の結果、細胞膜上に抗ＦＬＡＧ抗体により認識される蛋白質（ＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質）を発現しているクローン８株、抗ＨＡ抗体により認識される蛋白質（ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質）を発現しているクローン４株が得られた。いずれのクローンも、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＨＡ−ｔａｇを認識する抗体が結合したことによる蛍光シグナルが宿主細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１）よりも明らかに強いことから、目的の遺伝子が発現していることが明らかになった。代表的な結果を図２に示す。【０３０５】
ＦＣＭ解析の結果から、Ｎ−末端ｅｐｉｔｏｐｅ−ｔａｇ融合型のｐｈ０１２０７遺伝子産物が細胞膜上に発現することが判明した。【０３０６】
ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質の発現が認められたクローンのうちＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６と称する細胞株を、受託番号  ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１０１号として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１６年８月１９日付けで寄託した。本細胞株の生存は、前記寄託センターにおいて平成１６年９月２２日に実施された試験により確認されている。ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のうち、シグナル配列（配列番号２に記載のアミノ酸配列のＮ末端より２０アミノ酸残基）をコードすると予測される部分を除いた塩基配列で表されるＤＮＡをＮ末端ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として発現させるベクターを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株にトランスフェクションすることにより樹立した細胞株であり、Ｎ末端ＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質を安定的に発現している。
【実施例３】
【０３０７】
（ｐｈ０１２０７遺伝子産物の機能解析）
ｐｈ０１２０７遺伝子産物の機能解析は、ｐｈ０１２０７を発現させたアフリカツメガエル卵母細胞にリガンドを添加したときの細胞応答の測定により実施した。細胞応答の測定は、コントロール卵母細胞（遺伝子導入していないもの）および遺伝子（ｐｈ０１２０７  ｃＤＮＡクローン）を発現させた卵母細胞をそれぞれ６個ずつ使用して、リガンドを添加したときの卵母細胞の膜電位変化の測定により行った。リガンドとして、ｐｈ０１２０７を発現していることが認められたＨｅＬａ細胞株の培養上清を使用した。培養上清は、細胞数１．２×１０６のＨｅＬａ細胞株を１０％牛胎仔血清を含むＤＭＥＭにて２日間培養した後に培養上清を回収し、フィルターろ過（０．４５μｍ）することにより調製した。リガンドとして、同様に調製したロットの異なる２種類の培養上清を使用した（以下、リガンドサンプル１および２と称する）。【０３０８】
ｐｈ０１２０７遺伝子を発現させた卵母細胞とコントロール卵母細胞にリガンドサンプル１または２を添加し、膜電位変化を測定した。評価は電流量の変化と電流量の変化を示す波形により行い、電流量の変化が０．２μＡ以上であり、かつＧＰＣＲ特異的なパターンの波形が認められた場合に、リガンド刺激に対する応答があると判定した。ＧＰＣＲ特異的なパターンとは図３に示す波形１のパターンをいう。図３に示す波形２〜４のようなパターンは溶媒等何らかの成分の影響あるいは高濃度のリガンド等の人為的要素により生じる波形パターンであり、リガンド刺激に対する応答ではないと判定した。また、波形５および６のようなパターンが認められた場合は、リガンド刺激に対する応答が無いと判定した。【０３０９】
その結果、ｐｈ０１２０７発現細胞にのみ電流量の変化が認められた（表１および表２）。表２中ＮＤとは、 電流変化量が０．２μＡ以下であり、応答が認められなかったことを示す。表１に示すように、ｐｈ０１２０７発現細胞株６検体の全てにおいてリガンド刺激に対する応答が認められた。それに対し、コントロール細胞は全くリガンドに対して応答しなかった（表２）。このことから、ｐｈ０１２０７発現細胞のリガンド刺激による応答は、発現させた受容体に特異的な応答であると考える。リガンドサンプル１および２のどちらを使用しても同様の結果が得られた。【０３１０】
【表１】
2008053962.tif 000006
【０３１１】
【表２】
2008053962.tif 000007
【０３１２】
ｐｈ０１２０７遺伝子の発現によりリガンド刺激による細胞応答が生じたことから、ｐｈ０１２０７遺伝子産物は、リガンドに応答して細胞内情報伝達経路を活性化する機能を有するＧＰＣＲであると考える。
【実施例４】
【０３１３】
（ｐｈ０１２０７遺伝子産物の蛋白質相互作用解析）
ｐｈ０１２０７遺伝子産物の蛋白質相互作用解析をイーストツーハイブリッドシステムを使用して検討した。【０３１４】
ｐｈ０１２０７配列情報とｈＢＡＩ２配列情報に基づいて、ｐｈ０１２０７遺伝子産物のＮ末端領域（４ヶ所）とＣ末端領域（２ヶ所）、およびｈＢＡＩ２遺伝子産物のＮ末端領域（ｐｈ０１２０７で５５アミノ酸残基欠失している領域）とＣ末端領域（ｐｈ０１２０７で１アミノ酸残基挿入のある領域）にそれぞれｂａｉｔ（ベイト）を設定し、ｈＢＡＩ２の発現分布に関する報告（非特許文献１）より選択したｃＤＮＡライブラリー（脳、海馬、乳癌と前立腺癌、心臓、骨格筋に由来する）に対してスクリーニングを行った。【０３１５】
ｐｈ０１２０７遺伝子産物（配列番号２０に記載のアミノ酸配列の第１４６１番目に相当する１アミノ酸残基の挿入有り）およびｈＢＡＩ２遺伝子産物（前記アミノ酸残基の挿入なし）の各Ｃ末端領域に設計したｂａｉｔのいずれを使用したときも、ｐｒｅｙ（プレイ）としてＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質であるＤＬＧ２、ＤＬＧ３およびＤＬＧ４や、ＡＩＰ１、ＭＡＧＩ３等が得られた。この他、ｈＢＡＩ２遺伝子産物特異的なｐｒｅｙとして、ＨＯＭＥＲ２、Ｃｉｔｒｏｎ、ＳＹＮＥ−１、ＫＩＦ５ＡおよびＫＩＦＡＰ３が得られた。【０３１６】
ｐｈ０１２０７遺伝子産物のＮ末端領域（５５アミノ酸残基の欠失有り）に設計されたｂａｉｔに対しては、ＢＡＴ１（ＨＬＡ−Ｂ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ３）のみがｐｒｅｙとして得られたが、ｈＢＡＩ２遺伝子産物のＮ末端領域（前記アミノ酸残基の欠失なし）に設計されたｂａｉｔに対しては、ＫＣＮＮ２（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ／ｓｍａｌｌ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｃａｌｃｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ，  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  Ｎ，  ｍｅｍｂｅｒ２）等がヒットした。【０３１７】
このように、ｐｈ０１２０７遺伝子産物とｈＢＡＩ２遺伝子産物とでは、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質を除いて、イーストツーハイブリッドシステムにより検出される相互作用蛋白質に違いがあることが判明した。【０３１８】
ｐｈ０１２０７遺伝子産物およびｈＢＡＩ２遺伝子産物は、それぞれのＣ末端領域において、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質と相互作用することが判明した。ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質は細胞質内に存在し、細胞膜に存在する受容体やイオンチャネル等の膜蛋白質と結合することにより、これら膜蛋白質からの情報伝達に関与している。したがって、ｐｈ０１２０７遺伝子産物とｈＢＡＩ２遺伝子産物は、ＭＡＧＵＫファミリー関連蛋白質を介して細胞内情報伝達に関与する機能的膜蛋白質受容体であると考える。
【実施例５】
【０３１９】
（ＣＣＫ８によるｐｈ０１２０７発現細胞株の細胞内カルシウム濃度変化の測定）
実施例２で作製したｐｈ０１２０７発現細胞株を使用して、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）、ＣＣＫ−８ＮＳまたはＣＣＫ−４による細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を測定した。実施例２で作製した細胞株は、ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質をＦＬＡＧ−ｔａｇ融合蛋白質として発現している８株およびｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質をＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として発現している４株である。このうち、本実施例においては、ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質をＨＡ−ｔａｇ融合蛋白質として安定的に発現している細胞株の１つを細胞クローニングして得られた株である、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株を使用した。ＣＣＫ−８ＮＳは、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）と同じアミノ酸配列で表されるＣＣＫオクタペプチドであるが、Ｃ末端から７番目のチロシン残基が硫酸化されていない。ＣＣＫ−４は、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）のＣ末端から４番目までのアミノ酸残基からなるテトラペプチドである。【０３２０】
ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）によるＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の変化の具体的な測定方法とその結果を以下に述べる。ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株を、９６ウエルプレート（壁面が黒色で底面が透明なもの）に、細胞数２×１０４／１００μＬ  ｍｅｄｉｕｍ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養した。培地（ｍｅｄｉｕｍ）は、１０％  牛胎仔血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製）を使用した。翌日、各ウエルより培地を５０μＬずつ抜き取り、ローディングバッファー（Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬずつ各ウエルに添加して、室温で１．５時間反応させ、ローディングバッファー中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。ローディングバッファーは、ＦＬＩＰＲカルシウム３  アッセイキット（ＦＬＩＰＲ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ３  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）のコンポーネントＡを、９．９ｍＬのコンポーネントＢに０．１ｍＬの５００ｍＭ  プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えた溶液にて溶解することにより調製した。反応後、フレックスステーション（ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を使用してＣＣＫ−８Ｓ（ペプチド研究所製）添加時の蛍光強度の経時変化をウエル毎に測定した。また、ＣＣＫ−８ＮＳ（ペプチド研究所製）およびＣＣＫ−４（ペプチド研究所製）についても同様の測定を行なった。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、０．５２ｍｇを４．５ｍＬの１％  ＮａＨＣＯ３（Ｗａｋｏ社製）で溶解し、０．１ｍＭ濃度の溶液を調製した。ＣＣＫ−８ＮＳは、０．５３ｍｇを０．５０ｍＬのジメチルスルホキサイド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ社製）で溶解後、４．５０ｍＬの再蒸留水Ｈ２Ｏを添加し、０．１ｍＭ濃度の溶液を調製した。ＣＣＫ−４は、０．５４ｍｇを０．４６ｍＬのＤＭＳＯで溶解後、４．０９ｍＬの再蒸留水を添加し、０．２ｍＭ濃度の溶液を調製した。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）、ＣＣＫ−８ＮＳおよびＣＣＫ−４は、それぞれリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して５ｎＭ溶液とし、各２５μＬ添加（終濃度１ｎＭ）して測定を行った。細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を惹き起こすポジティブコントロールとしてＡ２３１８７（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を終濃度１０μＭで使用した。ネガティブコントロールとして、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の作製において宿主として使用したＣＨＯ−Ｋ１細胞株を使用した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞株にはｐｈ０１２０７発現ベクターがトランスフェクションされていないため、ｐｈ０１２０７遺伝子産物は発現していない。【０３２１】
その結果、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により刺激したＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度（図４−Ａ）が、無刺激のＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株（図４−Ｅ）と比較して上昇した。しかし、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は、ＣＣＫ−８ＮＳやＣＣＫ−４による刺激では認められなかった（図４−Ｂおよび図４−Ｃ）。また、Ａ２３１８７によるＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇が認められた（図４−Ｄ）。【０３２２】
１ｎＭ  ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）によるＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇の程度（図４−Ａ）は、ポジティブコントロールに使用したＡ２３１８７による細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇の程度（図４−Ｄ）と、ほぼ同等であった。【０３２３】
一方、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株は、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）、ＣＣＫ−８ＮＳおよびＣＣＫ−４のいずれで刺激したときも、細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇を示さなかった（図４−Ａ、図４−Ｂおよび図４−Ｃ）。しかし、Ａ２３１８７によるＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇は認められた（図４−Ｄ）。【０３２４】
これら結果から、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株が、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）に対して特異的に応答することが明らかになった。また、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）によるＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇には、該細胞株で発現されたｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質が関与することが明らかになった。これらから、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、ｐｈ０１２０７遺伝子産物のリガンドであると考える。【０３２５】
また、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株は、１ｎＭのＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）により、十分に高い細胞応答を示した。１ｎＭという低濃度のＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）が、ＨＡ−ｐｈ０１２０７＃１０−６細胞株の細胞応答を惹き起こしたことから、ＣＣＫ−８は生体内で実際に、ｐｈ０１２０７によりコードされる蛋白質を介して細細胞応答を惹き起こしていると考える。つまり、ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、ＧＰＣＲと予想されたｐｈ０１２０７の生体内リガンドの一つであると考える。
【実施例６】
【０３２６】
（ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの同定）
ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントを、ＲＴ−ＰＣＲによるクローニングを行って取得した。【０３２７】
ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの取得は、次のように実施した。まず、ヒト脳由来のｐｏｌｙＡ（＋）  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を出発原料として常法によりｃＤＮＡライブラリーを構築し、ｄｂＥＳＴ分析によりｃＤＮＡ断片を単離してｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定した。具体的には、ｐｏｌｙＡ（＋）  ＲＮＡ  ０．１μｇを含む１０μＬの反応系で、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してＲＴ−ＰＣＲを行いｃＤＮＡライブラリーを構築した。このｃＤＮＡを鋳型として配列番号２３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドおよび配列番号２４の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーに使用してＰＣＲを行った。これらプライマーを使用したＰＣＲにより、ｈＢＡＩ２（配列番号２２）の第４４番目のアスパラギン酸（Ｄ）から第４７５番目のシステイン（Ｃ）までのアミノ酸配列をコードする領域のＤＮＡ、およびｈＢＡＩ２（配列番号２２）のスプライシングバリアントにおいて、該領域に相当するＤＮＡが増幅される（図１−Ｃ参照）。得られた各クローンとｐｈ０１２０７  ｃＤＮＡクローンとの間で、ＳｃａＩおよびＸｈｏＩによる組換えを行い、３種類の全長ｃＤＮＡクローンを得た。各クローンの塩基配列の確認は、シーケンス解析により実施した。【０３２８】
その結果、配列相同性および構造類似性からｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントと考えられる３種類の全長ｃＤＮＡクローンが得られた。これらｃＤＮＡクローンを、７ｔｍＨＲ遺伝子、ｈｋ０１９４１遺伝子およびｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子と称する。これらスプライシングバリアントは全て、Ｎ末端細胞外領域のＴＳＰ−Ｉドメインのリピート数が異なるバリアントである（図１−Ｂ）。これらスプライシングバリアントのうち、７ｔｍＨＲ遺伝子が最長の蛋白質をコードしている。【０３２９】
７ｔｍＨＲ遺伝子は、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５７３アミノ酸残基（配列番号２０）をコードするＯＲＦを含む４７１９ｂｐの塩基配列からなる（配列番号１９）。７ｔｍＨＲ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＡＢ０６５６４８として登録されている。本遺伝子によりコードされる蛋白質は、７回膜貫通ドメインを有し、４個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。該蛋白質は、ｈＢＡＩ２（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号ＡＢ００５２９８）の配列と比較して、Ｃ末端側領域において１アミノ酸残基が挿入されている以外は、ｈＢＡＩ２と同一のアミノ酸配列を有する。該１アミノ酸残基の挿入は、ｈＢＡＩ２のアミノ酸配列の第１４６０番目のグルタミン酸（Ｅ）と第１４６１番目のバリン（Ｖ）の間に認められ、該挿入されたアミノ酸残基はリジンである。該挿入されたリジンは、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質（配列番号２０）のアミノ酸配列において第１４６１番目に相当する。配列相同性および構造類似性から、７ｔｍＨＲ遺伝子および該遺伝子によりコードされる蛋白質は、ｈＢＡＩ２遺伝子のスプライシングバリアントであると考えられた。【０３３０】
ｈｋ０１９４１遺伝子は、新規遺伝子であり、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１４６３アミノ酸残基（配列番号１６）をコードするＯＲＦを含む４３８９ｂｐの塩基配列からなる（配列番号１５）。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質は、７回膜貫通ドメインを有し、２個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質（配列番号２０）と比較して、Ｎ末端側の２個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む１１０アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している１１０アミノ酸残基は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２０）において、第２９６番目のグリシン（Ｇ）から第４０５番目のプロリン（Ｐ）に相当する。【０３３１】
ｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子は、新規遺伝子であり、シグナル配列と予測される部分（Ｎ末端より２０アミノ酸残基）を有する１５１８アミノ酸残基（配列番号１８）をコードするＯＲＦを含む４５５４ｂｐの塩基配列からなる（配列番号１７）。本ＤＮＡによりコードされる蛋白質は、７回膜貫通ドメインを有し、３個のＴＳＰ−Ｉドメインおよび１個のＧＰＳドメインを有する（図１−Ｂ参照）。ＤＮＡによりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質（配列番号２０）と比較して、Ｎ末端側から２番目のＴＳＰ−Ｉドメイン１個を含む５５アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している５５アミノ酸残基は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２０）において、第３５１番目のバリン（Ｖ）から第４０５番目のプロリン（Ｐ）に相当する。【０３３２】
ｐｈ０１２０７遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２０）と比較して、Ｎ末端側の１個のＴＳＰ−Ｉドメインを含む５５アミノ酸残基が欠失している以外は同一である。欠失している５５アミノ酸残基は、７ｔｍＨＲ遺伝子によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２０）において、第２９６番目のグリシン（Ｇ）から第３５０番目のプロリン（Ｐ）に相当する。
【実施例７】
【０３３３】
（ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株の構築）
ｐｈ０１２０７遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株を構築し、該安定発現株においてＣＣＫ−８Ｓによる細胞応答が惹き起こされるか検討した。スプライシングバリアントとして、実施例６で取得した３種類のスプライシングバリアント、７ｔｍＨＲ遺伝子、ｈｋ０１９４１遺伝子およびｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子を使用した。【０３３４】
まず、各全長ｃＤＮＡクローンの発現ベクターを、動物細胞用発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用して各全長ｃＤＮＡクローンとの組換え反応を、Ａｓｐ７１８ＩおよびＮｏｔＩにより行うことにより構築した。得られた発現ベクターを、７ｔｍＨＲ／ｐｃＤＮＡ３．１、ｈｋ０１９４１／ｐｃＤＮＡ３．１およびｖａｒｉａｎｔ３／ｐｃＤＮＡ３．１と称する。【０３３５】
７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株は、７ｔｍＨＲ発現ベクター（７ｔｍＨＲ／ｐｃＤＮＡ３．１）およびｈｋ０１９４１発現ベクター（ｈｋ０１９４１／ｐｃＤＮＡ３．１）をそれぞれ、ＣＨＯ−Ｋ１細胞株にトランスフェクションすることにより作製した。具体的には、発現ベクターをリポフェクトアミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００、ＬＦ２０００と略称することがある、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と混合し（４μｇ  ＤＮＡ／２５０μＬ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋１０μＬ  ＬＦ２０００／２５０μＬ  ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）、６ウエルプレートに培養したＣＨＯ−Ｋ１株（２ｍＬ  培地／ｗｅｌｌ）に添加してトランスフェクションを行った。翌日、細胞を回収し９６ウエルプレートに１細胞／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍＬ）を含む選択培地（１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）による培養を行い、発現細胞株を選抜した。また、選抜した発現細胞株について、抗ｈＢＡＩ２抗体を使用したＦＣＭ解析、ウエスタンブロッティング解析を行い、それぞれ導入遺伝子の発現を確認した。【０３３６】
ｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子のスプライシングバリアントの安定発現株は、ｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子発現ベクターを使用して、上記と同様の方法により作製た。
【実施例８】
【０３３７】
（７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株の機能解析）
実施例７で作製した７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株を使用して、ＣＣＫ−８Ｓによる細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を、実施例５に記載の方法と同様の方法で測定した。コントロールとして、７ｔｍＨＲ発現ベクターもｈｋ０１９４１発現ベクターもトランスフェクションしていない宿主細胞を使用した。【０３３８】
細胞は、細胞数３×１０４／１００μＬ  培地／ｗｅｌｌを、９６ウエルプレート（黒色の壁および透明な底を持つプレート）に播種し、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。翌日、各ウエルより培地を５０μＬを抜き取り、ローディングバッファー（Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬずつ各ウエルに添加して、室温で１時間反応させ、ローディングバッファー中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。ローディングバッファーは、実施例５に記載の方法と同様の方法で調製した。反応後、フレックスステーション（ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を使用してＣＣＫ−８Ｓ添加時の蛍光強度の経時変化をウエル毎に測定した。ＣＣＫ−８Ｓは終濃度１０ｐＭ−１μＭで使用した。また、アッセイのポジティブコントロールとしてＡ２３１８７を終濃度２０μＭで使用した。【０３３９】
７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株のどちらにおいても、ＣＣＫ−８Ｓ添加により、細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度の上昇が観察された。それに対して、７ｔｍＨＲ発現ベクターまたはｈｋ０１９４１発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ添加による細胞内カルシウム濃度の変化は観察されなかった。両方の安定発現株共に複数のクローンで同様の傾向が確認できた。７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株の代表的なクローンについて、生理的濃度（１ｎＭ）のＣＣＫ−８Ｓを添加したときの細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を図５−Ａおよび図６−Ａに示す。また、ポジティブコントロールに使用したＡ２３１８７（２０μＭ）に対しては発現細胞株および宿主細胞のいずれにおいても同様の応答が観察された（図５−Ｂおよび図６−Ｂ）。【０３４０】
７ｔｍＨＲ安定発現株およびｈｋ０１９４１安定発現株において、ＣＣＫ−８Ｓ添加により、宿主細胞では認められない細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化が観察されたことから、７ｔｍＨＲ遺伝子およびｈｋ０１９４１遺伝子の遺伝子産物はいずれも、ＣＣＫ−８Ｓにより惹き起こされる細胞応答を媒介すると考える。すなわち、７ｔｍＨＲ遺伝子およびｈｋ０１９４１遺伝子の遺伝子産物はいずれも細胞膜表面上に発現され、細胞外のＣＣＫ−８Ｓの作用により、細胞内情報伝達経路を活性化して細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度の上昇という細胞応答を惹き起こしたと考える。
【実施例９】
【０３４１】
（ｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子安定発現株の機能解析）
ｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子の機能を解析するために、実施例７で作製したｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子の安定発現株を使用して、ＣＣＫ−８Ｓによる細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を検討した。細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化は、実施例５に記載の方法と同様の方法で測定した。【０３４２】
細胞は、細胞数３×１０４／１００μＬ  培地／ｗｅｌｌを、９６ウエルプレート（黒色の壁および透明な底を持つプレート）に播種し、３７℃にて５％  ＣＯ２インキュベーターで一晩培養した。翌日、各ウエルより培地を５０μＬを抜き取り、ローディングバッファー（Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を５０μＬずつ各ウエルに添加して、室温で１時間反応させ、ローディングバッファー中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。ローディングバッファーは、実施例５に記載の方法と同様の方法で調製した。反応後、フレックスステーション（ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を使用してＣＣＫ−８Ｓ添加時の蛍光強度の経時変化をウエル毎に４０秒間測定した。ＣＣＫ−８Ｓは終濃度１０ｐＭ−１μＭで使用した。また、アッセイのポジティブコントロールとしてＡ２３１８７を終濃度２０μＭで使用した。【０３４３】
ｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子安定発現株において、ＣＣＫ−８Ｓ添加により、細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度の上昇が観察された。それに対して、ｖａｒｉａｎｔ  ３発現ベクターをトランスフェクションしていない宿主細胞では、ＣＣＫ−８Ｓ添加による細胞内カルシウム濃度の変化は観察されなかった。ｖａｒｉａｎｔ  ３安定発現株の代表的なクローンについて、生理的濃度（１ｎＭ）のＣＣＫ−８Ｓを添加したときの細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化を図７−Ａに示す。また、ポジティブコントロールに使用したＡ２３１８７（２０μＭ）に対しては発現細胞株および宿主細胞のいずれにおいても同様の応答が観察された（図７−Ｂ）。【０３４４】
ｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子安定発現株において、ＣＣＫ−８Ｓ添加により、宿主細胞では認められない細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度変化が観察されたことから、ｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子の遺伝子産物は、ＣＣＫ−８Ｓにより惹き起こされる細胞応答を媒介すると考える。すなわち、ｖａｒｉａｎｔ  ３遺伝子の遺伝子産物はいずれも細胞膜表面上に発現され、細胞外のＣＣＫ−８Ｓの作用により、細胞内情報伝達経路を活性化して細胞内カルシウム（Ｃａ２＋）濃度の上昇という細胞応答を惹き起こしたと考える。
【実施例１０】
【０３４５】
（ｐｈ０１２０７遺伝子の組織発現）
ｐｈ０１２０７遺伝子の組織発現を、ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ  ＤａｔａｂａｓｅＴＭ（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の検索、およびＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社）の検索により解析した。【０３４６】
ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＤｒｕｇＴａｒｇｅｔ  ＤａｔａｂａｓｅＴＭ（ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）の検索による解析により、３種類のウサギ抗ヒトＢＡＩ２ポリクローナル抗体（ＬＳ−Ａ９８１、Ａ９８２、Ａ９８４；Ｌｉｆｅ  Ｓｐａｎ社製）により得られた組織免疫染色データから、扁桃体、海馬、髄質、視床、黒質、大脳皮質の各部位のニューロンとアストロサイト、および下垂体前葉の一部の細胞、下垂体後葉のへリング体が共通して強く染色されることが明らかになった。図８−Ａおよび図８−Ｂにそれぞれ、扁桃体の原型質性アストロサイト（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅ）、並びに扁桃体のニューロンおよびグリアのＬＳ−Ａ９８１による組織免疫染色データを示す。また、図８−Ｃおよび図８−Ｄにそれぞれ、海馬のＣＡ２領域のニューロンおよびＣＡ１領域のニューロンのＬＳ−Ａ９８１による組織免疫染色データを示す。【０３４７】
ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｇｅｎｅ  Ｌｏｇｉｃ社）のＧｅｎｅｔｉｐ解析データを使用した発現解析は、ｐｈ０１２０７（ｈＢＡＩ２）、ＣＣＫ−Ａ受容体（ＣＣＫ−ＡＲ）、ＣＣＫ−Ｂ受容体（ＣＣＫ−ＢＲ）およびＣＣＫについて行った。その結果を表３に示す。【０３４８】
ｐｈ０１２０７（ｈＢＡＩ２）遺伝子は、脳組織、特に大脳皮質（大脳側頭極、運動皮質等）、海馬、および扁桃体等に限局して強く発現していることが認められた（表３）。本遺伝子は消化管、例えば膵臓、小腸、胃および胆嚢等ではほとんど認められなかった。【０３４９】
それに対し、ＣＣＫ−Ａ受容体（表中ＣＣＫ−ＡＲと表示する）は脳組織内での発現はほとんど認められず、消化管、例えば膵臓、胃および胆嚢等で発現していることが確認できた（表３）。また、ＣＣＫ−Ｂ受容体（表中ＣＣＫ−ＢＲと表示する）は膵臓および小腸での発現が高く、また脳組織、例えば大脳皮質、海馬および扁桃体等で発現していることが確認できた（表３）。ｐｈ０１２０７（ｈＢＡＩ２）遺伝子の脳組織内での発現量は、ＣＣＫ−Ｂ受容体の発現量と比較して、より高い発現量であった。【０３５０】
ＣＣＫの組織発現を解析したところ、ｐｈ０１２０７の組織発現と同様の分布が認められた。したがって、ｐｈ０１２０７とＣＣＫとは同じ部位で強く発現していることが確認された（表３）。【０３５１】
【表３】
2008053962.tif 000008
【実施例１１】
【０３５２】
ノックアウトマウスの機能に関する情報データベース（Ｄｅｌｔａｇｅｎ社）から、ＢＡＩ２ノックアウトマウスの機能に関する情報を得た。【０３５３】
ＢＡＩ２ノックアウトマウスは、相同組換えによる遺伝子破壊により作製された。相同組換えによる遺伝子破壊は、具体的には、マウスＢＡＩ２遺伝子（１５６０アミノ酸残基をコードする）の塩基配列中の、マウスＢＡＩ２の第８７６番目のアスパラギン酸（Ｄ）から第９１７番目のロイシン（Ｌ）をコードする領域（８７６Ｄ−９１７Ｌ領域）を標的としたターゲティングベクターを作成し、該ターゲティングベクターを１２９／ＯｌａＨｓｄマウス由来のＥＳ細胞に導入することにより実施された。ターゲティングベクターには、ＬａｃＺ−Ｎｅｏ遺伝子カセットが含まれ、該カセットの５´側（５´ａｒｍ）にはマウスＢＡＩ２遺伝子の８７６Ｄ−９１７Ｌ領域の上流にあるイントロンより０．８ｋｂ上流側のゲノム配列、３´側（３´ａｒｍ）には同遺伝子の８７６Ｄ−９１７Ｌ領域の下流にあるイントロンより１．２ｋｂ下流側のゲノム配列が含まれている。本ターゲティングベクターを使用した相同組換えにより、マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にはＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入される。相同組換えが起きたＥＳ細胞をＧ４１８含有の選択培地により選抜し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用して常法によりキメラマウスが作製された。得られたキメラマウスとＣ５７ＢＬ／６マウスを交配することにより、雑種第一代（Ｆ１）ヘテロ変異マウスが作製された。さらにＦ１ヘテロ変異マウス同士の交配により雑種第二代（Ｆ２）ホモ変異マウスが作製された。【０３５４】
Ｆ１ヘテロ変異マウスおよびＦ２ホモ変異マウスの遺伝子型の確認は、ＰＣＲおよびノザン解析により実施された。【０３５５】
マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入されたか否かの確認は、Ｆ１ヘテロ変異マウスについてＬａｃＺ発現解析により行われた。その結果、Ｆ１ヘテロ変異マウスにおいて、組織、特に海馬および扁桃体でＬａｃＺの強い発現が認められた（図９−Ａおよび図９−Ｂ）。この結果から、Ｆ１ヘテロ変異マウスにおいて、マウスＢＡＩ２遺伝子の標的部位にＬａｃＺ−Ｎｅｏ断片が挿入されたこと、すなわち該遺伝子が破壊されたことが確認された。この結果はまた、Ｆ１ヘテロ変異マウスにおいて、マウスＢＡＩ２遺伝子が、脳組織、特に海馬および扁桃体で強く発現していることを示すものである。【０３５６】
ＢＡＩ２ノックアウトマウスの機能の検討を、行動学的検査、生理学的検査、病理学的検査および解剖学的検査により行った。【０３５７】
ＢＡＩ２ノックアウトマウスは、行動学的検査において恐怖条件付け試験の結果に、野生型マウスと比較して有意な差が観察された（図１０）。一方、生理学的検査、病理学的検査、解剖学的検査等、多くの検査項目において野生型マウスと比較して有意な差は認められなかった。【０３５８】
恐怖条件付け試験は、マウスに嫌悪刺激を与え、翌日に嫌悪刺激の無い状態において該嫌悪刺激を受けた恐怖反応としての無動状態（無力状態とも称される）を測定する試験法であり、不安の表現型を調べる試験法として一般的に使用されている手法である。恐怖条件付け試験は、抗不安薬の評価等、不安障害との関連性を調べる試験系として使用されている（ヨシミズ（Ｙｏｓｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．）ら、「サイコファーマコロジー（Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００６年、第１８６巻、ｐ．５８７−５９３；ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．）ら、「ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第４２０巻、ｐ．３３−４３）。【０３５９】
恐怖条件付け試験において、嫌悪刺激を与えた翌日の嫌悪刺激の無い状態における無動状態を示す時間が長いほど不安状態にあり、短いほど抗不安状態であると判定される。【０３６０】
恐怖条件付け試験は、ＢＡＩ２ノックアウトマウス１０匹を使用して実施された。コントロールとして、野生型マウス１０匹を使用して同様に恐怖条件付け試験を実施した。いずれのマウスも１０−１３週齢のマウスを使用した。具体的には、マウスをフェアードコンデション計測装置に入れ、恐怖条件付けの電気刺激（１５秒毎に１秒間の０．３ｍＡの電気刺激負荷）を４分間行った。翌日、再度フェアードコンデション計測装置に入れ、電気刺激なしの条件下で無働時間（無力時間とも称される）を測定した。【０３６１】
ＢＡＩ２ノックアウトマウスは、恐怖条件付け試験において野生型マウスと比較して無働時間が有意に短縮された（図１０）。すなわち、野生型マウスが実験当初から無力状態であるのに対し、ＢＡＩ２ノックアウトマウス結果では全く無力状態が見られなかった。結果は、ＢＡＩ２ノックアウトマウス群および野生型マウス群の各マウスの無動時間の平均値±標準誤差で示した。有意差はＴテストを使用した統計学的処理において認められた。【０３６２】
恐怖条件付け試験の結果から、ＢＡＩ２ノックアウトマウスが強い抗不安状態にあると解釈できる。ＢＡＩ２ノックアウトマウスが抗不安の表現型を示すことから、ＢＡＩ２遺伝子は不安状態や不安障害に関連していると考えられる。【０３６３】
ＢＡＩ２ノックアウトマウスでは、ＢＡＩ２遺伝子が破壊されているため、ＢＡＩ２遺伝子およびそのスプライシングバリアントは発現されない。したがって、ＢＡＩ２遺伝子のみならず、そのスプライシングバリアントも不安状態や不安障害に関与すると考える。
【実施例１２】
【０３６４】
ｐｈ０１２０７発現細胞株を使用した細胞内カルシウム濃度変化測定系により、リガンドに対するｐｈ０１２０７遺伝子産物の応答を阻害する化合物の同定を行った。【０３６５】
ｐｈ０１２０７発現細胞株は、次のように構築した。まず、実施例１で同定したｐｈ０１２０７  ｃＤＮＡクローンとｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）との間でＡｓｐ７１８Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社製）およびＮｏｔＩ（ＴＡＫＡＲＡ社製）による組換えを行い、エピトープタグを含まないｐｈ０１２０７発現ベクターを構築した。ｐｈ０１２０７発現ベクターを宿主細胞であるＣＨＯ−Ｋ１株にリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してトランスフェクションし、Ｇ４１８を含む選択培地により安定発現株の選抜を行った。細胞における導入遺伝子の発現の検出は、抗ｐｈ０１２０７抗体を使用してＦＣＭ解析により行った。【０３６６】
その結果、ｐｈ０１２０７を安定発現する複数の細胞株が得られた。その中の１クローンであるｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株を使用して化合物の同定を実施した。【０３６７】
リガンドは、ＣＣＫ−８Ｓ（ペプチド研究所製）を使用した。ＣＣＫ−８Ｓ（配列番号１４）は、０．５２ｍｇを４．５ｍＬの１％  ＮａＨＣＯ３（Ｗａｋｏ社製）で溶解し、０．１ｍＭ濃度の溶液を調製した。被検化合物として、化合物ライブラリーであるソフトフォーカス  ジーピーシーアール  ターゲットダイレクティッド  ライブラリー（ＳｏｆｔＦｏｃｕｓ  ＧＰＣＲ  Ｔａｒｇｅｔ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ、ＢｉｏＦｏｃｕｓ社製）を使用した。化合物はいずれも、２ｍｇ／ｍＬ  ＤＭＳＯ溶液をＰＢＳで２５倍希釈し、８０μｇ／ｍＬの濃度に調製して使用した。【０３６８】
化合物の同定は、具体的には以下のように行った。ｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株を、９６ウエルプレート（壁面が黒色で底面が透明なもの）に、細胞数３×１０４／１００μＬ  ｍｅｄｉｕｍ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃にて５％ＣＯ２存在下で培養した。培地（ｍｅｄｉｕｍ）は、１０％  牛胎仔血清（Ｍｏｒｅｇａｔｅ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製）を使用した。翌日、各ウエルに、６×ローディングバッファー（Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）を２０μＬずつ添加して３７℃で１時間反応させ、ローディングバッファー中に含まれる蛍光色素を細胞内に取り込ませた。６×ローディングバッファーは、ＦＬＩＰＲカルシウム３  アッセイキット（ＦＬＩＰＲ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ３  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）のコンポーネントＡをコンポーネントＢで溶解後、プロベネシド（ｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄ、Ｓｉｇｍａ社製）を終濃度１５ｍＭとなるように加えて調製した。反応後、ＣＣＫ−８Ｓ（ペプチド研究所製）および化合物を添加して、蛍光強度の経時変化をウエル毎に８０秒間測定した。コントロールとして、化合物の代わりにバッファーを使用して同様の測定を行った。測定開始１５秒後に化合物を終濃度１０μｇ／ｍＬとなるように添加するかまたはバッファーを添加し、化合物またはバッファーの添加３５秒後にＣＣＫ−８Ｓを終濃度１０ｎＭとなるように添加した。蛍光強度の経時変化の測定は、フレックスステーション（ＦＬＥＸｓｔａｔｉｏｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社製）を使用して行った。【０３６９】
試験した化合物のうちいくつかの化合物がｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株のＣＣＫ−８Ｓに対する応答を阻害した。代表例として、３つの化合物（化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃ）をそれぞれ添加したときの、ｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株のＣＣＫ−８Ｓに対する応答を図１１−Ａ、図１１−Ｂおよび図１１−Ｃに示す。化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃはそれぞれ上記式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で表される化合物である。【０３７０】
測定開始１５秒後に化合物Ａを添加したときもバッファーを添加したときも蛍光強度の変化はなかった。化合物Ａまたはバッファー添加の３５秒後にリガンドであるＣＣＫ−８Ｓを添加したとき、バッファーを添加したウェルでは蛍光強度が上がり、リガンドに対するｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株の応答が観察されたが、化合物Ａを添加したウェルではこのような応答が阻害された（図１１−Ａ）。このことは、化合物Ａが、ＣＣＫ−８Ｓとｐｈ０１２０７の相互作用に対する阻害剤として作用していることを示唆する。【０３７１】
化合物Ｂおよび化合物Ｃはいずれも、化合物Ａと同様に、リガンドに対するｐｈ０１２０７＃３Ｆ８−１７株の応答を阻害した（図１１−Ｂおよび図１１−Ｃ）。このことは、化合物Ｂおよび化合物Ｃがいずれも、ＣＣＫ−８Ｓとｐｈ０１２０７の相互作用に対する阻害剤として作用していることを示唆する。【０３７２】
上記結果より、ｐｈ０１２０７発現細胞株を使用した細胞内カルシウム濃度変化測定系により、ｐｈ０１２０７のそのリガンド、例えばＣＣＫ−８Ｓに対する応答を阻害する化合物を同定できると考える。
【産業上の利用可能性】
【０３７３】
本発明により、ＧＰＣＲと考えられる７回膜貫通ドメインを有する機能的膜蛋白質受容体として作用する蛋白質の機能阻害剤である抗不安作用を有する抗不安作用を有する化合物の同定方法を提供できる。また、不安状態の改善剤および改善方法、不安障害の予防および／または治療方法並びに予防および／または治療剤の提供が可能になる。さらに、不安障害の診断用測定方法および診断方法を提供できる。【０３７４】
このように、本発明は基礎科学分野から医薬開発分野まで広く寄与する有用なものである。
【配列表フリーテキスト】
【０３７５】
配列番号１：機能的膜蛋白質受容体をコードするＤＮＡ。
配列番号２：配列番号１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号２：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２：（３５２）：（４０５）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２：（４０８）：（４６１）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２：（８７０）：（８９０）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（８９９）：（９１９）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（９２８）：（９４８）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（９７０）：（９９０）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（１０１２）：（１０３２）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（１０８７）：（１１０７）膜貫通ドメイン。
配列番号２：（１１１４）：（１１３４）膜貫通ドメイン。
配列番号３：配列番号２に記載のアミノ酸配列で表されるペプチド、ｈＢＡＩ１、およびｈＢＡＩ２のそれぞれのＣ末端側領域に存在する部分アミノ酸配列。
配列番号４：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号５：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号６：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号７：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号８：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号９：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１０：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１１：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号１２：合成オリゴヌクレオチド。
配列番号１３：合成オリゴヌクレオチド。
配列番号１４：ＣＣＫ−８Ｓ
配列番号１４：（２）：（２）硫酸化。
配列番号１５：配列番号１に記載のＤＮＡのスプライシングバリアント。
配列番号１６：配列番号１５に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号１６：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１６：（３５３）：（４０６）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１６：（８１５）：（８３５）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（８４４）：（８６４）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（８７３）：（８９３）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（９１５）：（９３５）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（９５７）：（９７７）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（１０３２）：（１０５２）膜貫通ドメイン。
配列番号１６：（１０５９）：（１０７９）膜貫通ドメイン。
配列番号１７：配列番号１に記載のＤＮＡのスプライシングバリアント。
配列番号１８：配列番号１７に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号１８：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１８：（３５２）：（４０５）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１８：（４０８）：（４６１）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号１８：（８７０）：（８９０）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（８９９）：（９１９）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（９２８）：（９４８）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（９７０）：（９９０）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（１０１２）：（１０３２）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（１０８７）：（１１０７）膜貫通ドメイン。
配列番号１８：（１１１４）：（１１３４）膜貫通ドメイン。
配列番号１９：配列番号１に記載のＤＮＡのスプライシングバリアント。
配列番号２０：配列番号１９に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号２０：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２０：（３５２）：（４０５）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２０：（４０７）：（４６０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２０：（４６３）：（５１６）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２０：（９２５）：（９４５）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（９５４）：（９７４）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（９８３）：（１００３）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（１０２５）：（１０４５）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（１０６７）：（１０８７）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（１１４２）：（１１６２）膜貫通ドメイン。
配列番号２０：（１１６９）：（１１８９）膜貫通ドメイン。
配列番号２１：ｈＢＡＩ２をコードするＤＮＡであり、配列番号１に記載のＤＮＡのスプライシングバリアント。
配列番号２２：配列番号２１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡによりコードされる蛋白質。
配列番号２２：（２９７）：（３５０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２２：（３５２）：（４０５）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２２：（４０７）：（４６０）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２２：（４６３）：（５１６）ＴＳＰ−Ｉドメイン。
配列番号２２：（９２５）：（９４５）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（９５４）：（９７４）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（９８３）：（１００３）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（１０２５）：（１０４５）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（１０６７）：（１０８７）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（１１４２）：（１１６２）膜貫通ドメイン。
配列番号２２：（１１６９）：（１１８９）膜貫通ドメイン。
配列番号２３：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号２４：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
【図１−Ａ】
2008053962.tif 000009
【図１−Ｂ】
2008053962.tif 000010
【図１−Ｃ】
2008053962.tif 000011
【図２】
2008053962.tif 000012
【図３】
2008053962.tif 000013
【図４−Ａ】
2008053962.tif 000014
【図４−Ｂ】
2008053962.tif 000015
【図４−Ｃ】
2008053962.tif 000016
【図４−Ｄ】
2008053962.tif 000017
【図４−Ｅ】
2008053962.tif 000018
【図５−Ａ】
2008053962.tif 000019
【図５−Ｂ】
2008053962.tif 000020
【図６−Ａ】
2008053962.tif 000021
【図６−Ｂ】
2008053962.tif 000022
【図１０】
2008053962.tif 000023
【図１１−Ａ】
2008053962.tif 000024
【図１１−Ｂ】
2008053962.tif 000025
【図１１−Ｃ】
2008053962.tif 000026
【図７−Ａ】
2008053962.tif 000027
【図７−Ｂ】
2008053962.tif 000028
【図８−Ａ】
2008053962.tif 000029
【図８−Ｂ】
2008053962.tif 000030
【図８−Ｃ】
2008053962.tif 000031
【図８−Ｄ】
2008053962.tif 000032
【図９−Ａ】
2008053962.tif 000033
【図９−Ｂ】
2008053962.tif 000034
【配列表】
2008053962000001.app
【国際調査報告】
2008053962.tif 000035
2008053962.tif 000036
2008053962.tif 000037
2008053962.tif 000038
2008053962.tif 000039