(57)【要約】  本発明者らは、１）骨髄由来細胞が移植皮膚内に大量に動員されること、２）動員された骨髄由来細胞は移植皮膚片内で真皮線維芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、表皮角化細胞、のいずれにも分化しており、動員された骨髄由来細胞の中に骨髄由来間葉系幹細胞が含まれていること、３）骨髄由来間葉系幹細胞を末梢血から植皮片に動員しているのは、移植皮膚の壊死組織から放出されたHMGB1、HMGB2、HMGB3であること、４）精製したHMGB1、HMGB2、HMGB3は、骨髄から分離・培養した間葉系幹細胞の遊走を促進すること、５）骨髄間葉系幹細胞を遊走するHMGB1を含む活性物質を皮膚、脳、心臓を含む多数の臓器抽出液から簡便に精製できること、６）骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性物質を培養細胞から簡便に抽出できること、７）皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分が脳損傷時に骨髄由来細胞を大量に動員することを世界で初めて明らかにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の成分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
【請求項２】
骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項１に記載の誘導剤。
【請求項３】
以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進剤；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
【請求項４】
以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進用キット；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
【請求項５】
細胞を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される細胞の抽出液であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する抽出液。
【請求項６】
細胞を溶媒に浸す工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有する細胞の抽出液の製造方法。
【請求項７】
以下の工程を含む方法で製造されるヘパリン結合画分であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する画分； 
（ａ）細胞を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
【請求項８】
以下の工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有するヘパリン結合画分の製造方法；
（ａ）細胞を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
【請求項９】
請求項５に記載の抽出液もしくは請求項６に記載の方法によって製造された抽出液、または請求項７に記載の画分もしくは請求項８に記載の方法によって製造された画分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤。
【請求項１０】
骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、請求項９に記載の誘導剤。
【請求項１１】
請求項５に記載の抽出液もしくは請求項６に記載の方法によって製造された抽出液、または請求項７に記載の画分もしくは請求項８に記載の方法によって製造された画分を含有する、組織再生促進剤。
【請求項１２】
請求項５に記載の抽出液もしくは請求項６に記載の方法によって製造された抽出液、または請求項７に記載の画分もしくは請求項８に記載の方法によって製造された画分を含有する、組織再生促進用キット。
【請求項１３】
以下の工程を含む、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを評価する方法であって、工程（ｂ）における被験細胞の誘導活性が、対照と比較して高い場合に、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれると判定される方法；
（ａ）細胞の抽出液を調製する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で調製された抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する工程。
【請求項１４】
以下の工程を含む、被験細胞を誘導する因子が含まれる細胞の抽出液をスクリーニングする方法；
（ａ）複数の抽出液について、請求項１３に記載の方法で、該抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを評価する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で被験細胞を誘導する因子が含まれると評価された抽出液を選択する工程
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法によって、被験細胞を誘導する因子を含むと判定された抽出液から、被験細胞の誘導活性を指標に、被験細胞を誘導する因子を精製する工程を含む、被験細胞を誘導する因子の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、損傷組織の機能的再生促進医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷組織の修復過程に種々の幹細胞が寄与していることが明らかとなり、損傷部位に幹細胞を多数動員することにより機能的組織再生を誘導する新たな再生医療の開発が進められつつある。この新しい再生医療を実現するためには、１）損傷部位に動員可能な幹細胞が生体内に豊富に存在すること、２）幹細胞を損傷部位に動員する因子が単離・同定されていることが必要である。【０００３】
損傷部位に動員可能な幹細胞は、損傷部あるいはその近傍組織に存在する組織幹細胞と、末梢血中に存在する骨髄由来幹細胞がある。近年骨髄由来細胞が多くの損傷組織再生に寄与していることが報告されつつあるが、損傷組織への骨髄由来細胞動員機構については不明である。ここでいう骨髄由来細胞は血液細胞（白血球、赤血球）への分化能をもつ造血系幹細胞と区別され、これまで骨髄間葉系幹細胞と呼ばれている細胞に代表される幹細胞もしくは骨髄中に存在する組織前駆細胞集団を含む。骨髄間葉系幹細胞は骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞への分化能をもつ未分化幹細胞で、さらに線維芽細胞、筋肉細胞、ストローマ細胞、腱細胞等、その他の間葉系の細胞に分化することが可能とされている。近年では骨髄間葉系幹細胞が神経細胞、さらには上皮系細胞（皮膚ケラチノサイト等）や血管内皮細胞に分化することが証明されている（非特許文献９）。組織前駆細胞は、血液系以外の特定組織細胞への一方向性分化能を持つ未分化細胞と定義され、上述した間葉系組織、上皮系組織、神経組織、実質臓器、血管内皮への分化能を有する未分化細胞を含む。【０００４】
HMGB1（High mobility group box 1：高移動性グループ1蛋白質）は生体内殆どすべての細胞に存在する分子量約25,000の蛋白質で、過去の報告によれば、１）細胞内でDNAと結合し、クロマチン構造を制御することにより遺伝子発現を調節している（非特許文献１）、２）炎症性サイトカインTNF-αやIL-1、LPSの作用により炎症組織に存在する単球やマクロファージから分泌され、細胞外においてRAGE（糖化最終産物受容体）に結合し（非特許文献２）強力な炎症反応を誘導する（非特許文献３）、３）疎血により壊死に陥った細胞から周囲の組織へと放出される（非特許文献４）、４）重症感染症である敗血症患者における炎症の進展に関与している（非特許文献５）、５）心筋梗塞モデルにおいて、梗塞部に投与することにより心筋内に存在する幹細胞の分裂・増殖を促進して心筋の再生・機能回復を促進する（特許文献１）、６）疎血肝臓モデル動物において、疎血状態作製前に前投与することにより、肝障害の程度を軽減する（非特許文献６）、７）筋肉損傷モデルにおいて、損傷部位に投与したHMGB1は、同時に投与した血管前駆細胞を損傷部位に誘導し、筋組織再生を促進する（非特許文献７）、８）神経細胞において、神経突起の形成を誘導する（非特許文献８）、などの機能が知られている。しかし、骨髄由来幹細胞、特に骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、などに分化可能な、いわゆる間葉系幹細胞を損傷組織に動員するという報告は過去にない。
従来、脳や脊髄の中枢神経細胞は一度障害を受けると、再生はおこらないとされてきた。しかし、近年神経幹細胞の存在およびこの誘導が可能になった。また、正常神経系での神経幹細胞ニッチも同定されてきた。このため、もはや不可能とされていた損傷中枢神経系細胞の回復も期待できるようになった。現在、脳脊髄損傷、変性疾患などに対する神経再生に関する研究が果敢に展開されている。
脳組織（細胞）損傷の原因として、外傷による脳挫傷、脳虚血性疾患が主要なものである。他の原因として、脳腫瘍摘出手術をはじめとした脳外科的手術に起因するものがあげられる。とくに、脳実質細胞から発生するような、神経膠腫の全摘出は困難であり、運動や言語機能障害を避けるためには、姑息的摘出にとどまらざるを得えない。また、悪性神経膠腫は生命予後も悪く、化学療法や放射線療法をはじめ、近年研究が盛んに行われている免疫・遺伝子治療も十分な効果を示すまでには至っていない。よって、可及的に多くの腫瘍細胞の摘出を行い、その結果生じる脳機能損傷を回復させるような治療があれば理想的である。
【非特許文献１】Bustinら、 Mol Cell Biol、19：5237-5246、1999年
【非特許文献２】Horietら、J. Biol. Chem.、270、25752-25761、1995年
【非特許文献３】Wangら、Science、 285：248-251、1999年
【非特許文献４】Mullerら、EMBO J、20：4337-4340、2001年
【非特許文献５】Wangら、Science、 285：248-251、1999年
【非特許文献６】Germaniら、J. Leukoc. Biol.、 81、2007電子ジャーナル版
【非特許文献７】Palumboら、J. Cell Biol.、164：441-449、2004年
【非特許文献８】Merenmiesら、J. Biol. Chem.、266：16722-16729、1991年
【非特許文献９】Yaojiong ら、Stem cells、25:2648-1659
【特許文献１】特表2005-537253
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、損傷組織に分化する細胞を損傷部位に動員する因子を単離・同定し、該因子を利用した発明を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
損傷組織に分化する細胞の動員因子が明らかになれば、この因子を損傷部位に投与することにより、末梢血中に存在する損傷組織に分化する細胞や局所組織に存在する損傷組織に分化する細胞を損傷部位に多数動員することが可能になり、機能的組織再生を促進する新たな再生医療の開発が可能になる。【０００７】
本発明者らは、移植皮膚片が生体組織に生着する過程で骨髄由来細胞が皮膚外組織から移植皮膚片に動員され、皮膚組織再生に寄与している可能性を検討し、１）骨髄由来細胞が移植皮膚内に大量に動員されること、２）動員された骨髄由来細胞は移植皮膚片内で真皮線維芽細胞、脂肪細胞、筋肉細胞、血管内皮細胞、表皮角化細胞、のいずれにも分化しており、動員された骨髄由来細胞の中に骨髄由来間葉系幹細胞が含まれていること、３）骨髄由来間葉系幹細胞を末梢血から植皮片に動員しているのは、移植皮膚の壊死組織から放出されたHMGB1、HMGB2、HMGB3であること、４）精製したHMGB1、HMGB2、HMGB3は、骨髄から分離・培養した間葉系幹細胞の遊走を促進すること、５）骨髄間葉系幹細胞を遊走するHMGB1を含む活性物質を皮膚、脳、心臓を含む多数の臓器抽出液からヘパリンアフィニティーカラムを利用しカラムクロマトグラフィー法で簡便に精製できること、６）骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性物質を培養細胞から簡便に抽出できること、７）皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分が脳損傷時に骨髄由来細胞を大量に動員することを世界で初めて明らかにした。本願は、この知見に基づき、以下の発明を提供するものである。
〔１〕以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の成分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔２〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔１〕に記載の誘導剤。
〔３〕以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進剤；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔４〕以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の成分を含有する、組織再生促進用キット；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔５〕細胞を溶媒に浸す工程を含む方法で製造される細胞の抽出液であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する抽出液。
〔６〕細胞を溶媒に浸す工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有する細胞の抽出液の製造方法。
〔７〕以下の工程を含む方法で製造されるヘパリン結合画分であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する画分； 
（ａ）細胞を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
〔８〕以下の工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有するヘパリン結合画分の製造方法；
（ａ）細胞を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程。
〔９〕〔５〕に記載の抽出液もしくは〔６〕に記載の方法によって製造された抽出液、または〔７〕に記載の画分もしくは〔８〕に記載の方法によって製造された画分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤。
〔１０〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔９〕に記載の誘導剤。
〔１１〕〔５〕に記載の抽出液もしくは〔６〕に記載の方法によって製造された抽出液、または〔７〕に記載の画分もしくは〔８〕に記載の方法によって製造された画分を含有する、組織再生促進剤。
〔１２〕〔５〕に記載の抽出液もしくは〔６〕に記載の方法によって製造された抽出液、または〔７〕に記載の画分もしくは〔８〕に記載の方法によって製造された画分を含有する、組織再生促進用キット。
〔１３〕以下の工程を含む、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを評価する方法であって、工程（ｂ）における被験細胞の誘導活性が、対照と比較して高い場合に、細胞の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれると判定される方法；
（ａ）細胞の抽出液を調製する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で調製された抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する工程。
〔１４〕以下の工程を含む、被験細胞を誘導する因子が含まれる細胞の抽出液をスクリーニングする方法；
（ａ）複数の抽出液について、〔１３〕に記載の方法で、該抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを評価する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で被験細胞を誘導する因子が含まれると評価された抽出液を選択する工程
〔１５〕〔１３〕または〔１４〕に記載の方法によって、被験細胞を誘導する因子を含むと判定された抽出液から、被験細胞の誘導活性を指標に、被験細胞を誘導する因子を精製する工程を含む、被験細胞を誘導する因子の同定方法。
〔１６〕以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の物質を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄由来細胞を誘導する方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔１７〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔１６〕に記載の方法。
〔１８〕以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の物質を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔１９〕〔５〕に記載の抽出液または〔６〕に記載の方法によって製造された抽出液を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄由来細胞を誘導する方法。
〔２０〕〔７〕に記載の画分または〔８〕に記載の方法によって製造された画分を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄由来細胞を誘導する方法。
〔２１〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔１９〕または〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕〔５〕に記載の抽出液または〔６〕に記載の方法によって製造された抽出液、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法。
〔２３〕〔７〕に記載の画分または〔８〕に記載の方法によって製造された画分を、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法。
〔２４〕骨髄由来細胞の誘導剤の製造における以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の物質の使用；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔２５〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔２４〕に記載の使用。
〔２６〕組織再生促進剤の製造における以下の（ａ）から（ｉ）のいずれかに記載の物質の使用；
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
〔２７〕骨髄由来細胞の誘導剤の製造における〔５〕に記載の抽出液または〔６〕に記載の方法によって製造された抽出液の使用。
〔２８〕骨髄由来細胞の誘導剤の製造における〔７〕に記載の画分または〔８〕に記載の方法によって製造された画分の使用。
〔２９〕骨髄由来細胞が骨髄由来間葉系幹細胞である、〔２７〕または〔２８〕に記載の使用。
〔３０〕組織再生促進剤の製造における〔５〕に記載の抽出液または〔６〕に記載の方法によって製造された抽出液の使用。
〔３１〕組織再生促進剤の製造における〔７〕に記載の画分または〔８〕に記載の方法によって製造された画分の使用。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】GFP骨髄移植マウス作製法を示す図である。
【図２】GFP骨髄移植マウス背部への皮膚移植後に観察した移植皮膚片に対するGFP蛍光集積を示す写真である。上段左の写真は皮膚移植部の肉眼像を、上段中央の写真は移植皮膚とレシピエント皮膚の境界部（「↓」で示した部分）近傍でレシピエント皮膚のHE組織像を、上段右の写真は植皮皮膚のHE組織像を示す。また下段左の写真は植皮皮膚へのGFP蛍光の集積を、下段中央の写真は植皮部の拡大像を、下段右の写真は同拡大部皮膚へのGFP蛍光の集積を示す。
【図３】GFP骨髄移植マウス背部への移植皮膚片に集積した骨髄由来表皮細胞、骨髄由来真皮線維芽細胞を示す写真である。左から1列目はDAPI染色（核染色）で、上段の写真は植皮部皮膚の弱拡大像（100倍）を、中段の写真はその強拡大像（200倍）で表皮・真皮境界部を、下段は強拡大像（200倍）で毛包部を示す。左から2列目は1列目のそれぞれの領域のGFP蛍光像、左から3列目はそのケラチン5（K5）の免疫染色像を、左から4列目はそれぞれの蛍光を重ね合わせた像（Merge）を示す。GFP陽性表皮細胞および真皮線維芽細胞が多数観察されている。
【図４】皮膚抽出液内の骨髄由来間葉系幹細胞誘導因子同定の流れを示す図である。
【図５】切除皮膚片からの再生誘導因子（骨髄由来間葉系幹細胞動員因子）抽出法を示す図である。
【図６】ボイデン・チャンバーを用いた皮膚抽出液の骨髄由来間葉系幹細胞遊走能活性測定結果を示す写真である。上段左の写真はボイデン・チャンバーの上槽内からシリコン膜上の微細穴を通過して皮膚抽出液側（下槽側）に遊走し、シリコン膜下槽側に付着している骨髄間葉系幹細胞を、青色色素にて染色した像で、上から培養開始直後（0h）、12時間後（12h）、24時間後（24h）の染色像（各4ウエルずつ）を示す。上段右の写真は0hの強拡大像、下段左の写真は12hの強拡大像、下段右の写真は24hの強拡大像を示す。
【図７】皮膚抽出液精製分画標品群におけるボイデンチャンバーを用いた骨髄由来間葉系幹細胞遊走能活性測定結果と、それぞれの精製分画標品のSDS-PAGE電気泳動の結果との対応を示す写真である。左から第1レーン（M.W.）は分子量マーカーを泳動、第2レーン（C.E.）は精製前皮膚抽出液を泳動、第3レーン（H.E.）はヘパリンアフィニティーカラム結合分画（中間精製分画）を泳動、第4〜13レーン（A.E.）は種々のNaCl濃度で溶出した陰イオン交換カラム結合分画（最終精製分画）を泳動した後の銀染色像を示す。さらに、骨髄由来間葉系幹細胞遊走活性の最も強い最終精製分画番号4の泳動ゲル銀染色像（レーン７）における各染色バンドを切り出して質量分析およびデータベース解析を行った結果、「←」で示したバンドがHMGB1であることが明らかとなった。
【図８】ボイデンチャンバーを用いたHMGB1の骨髄由来間葉系幹細胞遊走活性測定結果を示す写真である。上段の二つは皮膚抽出液中へ遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の染色像を、中段の二つはHMGB1精製標品へ遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の染色像を、下段は中段に用いたHMGB1精製標品に抗HMGB1ポリクロナール抗体を加えて中和した溶液へ遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の染色像（殆ど遊走活性は消失）を示す。
【図９】生体内骨髄由来間葉系幹細胞誘導活性測定法を示す図である。
【図１０】HMGB1による生体内骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を示す写真である。HMGB1分画（最終精製分画番号4）は、対象コントロール（最終精製分画番号1）の約3倍の動員活性を示した。
【図１１】HMGB1分画（最終精製分画番号４）により生体内で動員された細胞の強拡大の写真である。
【図１２】シリコンチューブ内遊走細胞の培養開始直後の写真である。左の写真は培地内に播種した遊走細胞の明視野像を、右の写真はその暗視野におけるGFP蛍光像を示す。
【図１３】シリコンチューブ内遊走細胞の培養開始２４時間後の写真である。左の写真は培養プラスチックシャーレに付着して増殖している線維芽細胞様細胞および上皮細胞様細胞の明視野像を、右の写真はその暗視野におけるGFP蛍光像を示す。
【図１４】シリコンチューブ内遊走細胞の培養開始２週間後の写真である。左右の写真は同一の視野で、左の写真は明視野、右の写真は蛍光フィルター（BおよびDはGFPの蛍光を検出する、Fはケラチン５の蛍光を検出する）を通した写真である。培養プラスチックシャーレに円形にコロニーを形成する骨髄由来GFP陽性細胞集団の左側に、線状の毛髪状の形態を認める<△（矢印）で示す>。Fは骨髄由来細胞が毛髪状の形態変化を呈しさらにケラチン5を発現していることを示している（△（矢印）で示す）。
【図１５】新生マウス皮膚抽出液中のHMGBファミリーをWestern blot 法を用いて検出した写真である。
【図１６】哺乳類細胞におけるHMGB ファミリーの発現ベクターのMAPを示す図である。cytomegalovirus enhancerとchicken β-actin promoter を持ち、プロモータ下流に存在するHMGB ファミリーのcDNA（complementary DNA:相補DNA）がコードするmRNA を大量に合成する。
【図１７】HEK293細胞に発現させた精製リコンビナントFlag tag-HMGBファミリー融合タンパクのWestern blotの結果を示す写真である。
【図１８】ボイデンチャンバーを用いたリコンビナントHMGB1・HMGB2・HMGB3の骨髄間葉系幹細胞遊走活性を示す図である。いずれのリコンビナントタンパクもコントロール群に比べ遊走活性を示した。
【図１９】マウスの皮膚潰瘍治療モデルにおけるHMGB ファミリーによる治療結果を示す図である。HMGB1・HMGB2・HMGB3いずれもコントロール群に比べ有意に潰瘍面積の縮小効果を示した。
【図２０】ヒトHMGB1及びヒト皮膚抽出液がヒト骨髄由来間葉系幹細胞を遊走する活性をボイデン・チャンバーを用いて確認した写真である。
【図２１】マウス心臓、マウス脳及びマウス皮膚抽出液中の骨髄間葉系幹細胞誘導活性物質をヘパリンカラムで精製し、ボイデン・チャンバーを用いて、活性を確認した写真である。
【図２２】培養細胞株HEK293およびHeLa抽出液のヒト骨髄間葉系幹細胞遊走活性をボイデンチャンバー法を用いて確認した写真である。いずれの培養細胞株もヒト骨髄間葉系幹細胞遊走活性を示した。
【図２３】図２３Aはマウスを脳定位固定装置に固定し、メスにて頭部に正中切開しドリルを用いて穿頭を施した写真である。図２３Bは脳にシリンジを用いて、陰圧をかけ、脳組織を一部吸引した写真である。図２３Cはフィブリン糊製剤（フィブリノゲン）に溶解した皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を5μl注入し、次にフィブリン糊製剤（トロンビン）を5μl注入した後の写真である。図２３D, および図２３Eは脳損傷モデル治療後２週間後の写真である。コントロールの２３Dに比べ皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分による治療群の２３EでGFP陽性細胞の集積が認められた。図２３F, および図２３Gは脳損傷モデル治療後6週間後の写真である。コントロールの２３Fに比べ皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分による治療群の２３GでGFP陽性細胞の集積が認められた。
【０００９】
〔発明の実施の形態〕
本発明は、以下の（ａ）から（ｉ）に記載の成分のうち少なくとも１つの成分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤を提供する。
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
該誘導剤を使用することにより、局所（上記成分の投与・添加部位やその近傍）に骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を誘導して組織の機能的再生を促進することが可能になるため、該誘導剤は、再生医療、再生誘導医療開発のための基礎研究および臨床研究に必要な試薬として使用することができる。例えば、実験動物における必要な生体組織に骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を動員し、組織修復、組織機能再建の程度を検討することが可能になる。また試験管内で骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）の動員による組織再生誘導研究を行うことができる。
また、上記誘導剤を使用することにより、損傷組織の再生を促進することができる。また、上記誘導剤には、機能的組織再生誘導・促進剤としての用途のみならず、組織幹細胞の減少による組織・臓器機能の低下を予防する、いわゆる予防医薬としての用途、あるいは加齢性変化の進行を遅延させる、抗加齢医薬としての用途が期待できる。【００１０】
本発明はまた、以下の（ａ）から（ｉ）に記載の成分のうち少なくとも１つの成分を含有する、組織再生促進剤または組織再生促進用キットを提供する。
（ａ）HMGB1タンパク質
（ｂ）HMGB1タンパク質を分泌する細胞
（ｃ）HMGB1タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｄ）HMGB2タンパク質
（ｅ）HMGB2タンパク質を分泌する細胞
（ｆ）HMGB2タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター
（ｇ）HMGB3タンパク質
（ｈ）HMGB3タンパク質を分泌する細胞
（ｉ）HMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター。
該組織再生促進剤または組織再生促進用キットは、損傷組織部位またはその近傍に投与されることで、血液中に循環している骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を、末梢血中から該損傷組織に誘導（局所誘導する）することを特徴とする。
また組織再生促進用キットとしては、（１）フィブリノゲンに溶解した上記抽出液もしくは上記画分等、および（２）トロンビンを含む組織再生促進用キット、または、（１）上記抽出液もしくは上記画分等、（２）フィブリノゲン、および（３）トロンビンを含む組織再生促進用キットが例示できる。本発明においては、市販のフィブリノゲンやトロンビンを使用することができる。例えば、フィブリノゲンHT-Wf(ベネシスー三菱ウェルファーマー)、ベリプラスト（ZLBベーリング）、ティシール（バクスター）、ボルヒール（化血研）、タココンブ（ZLBベーリング）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。【００１１】
本発明は、細胞を溶媒に浸す工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有する細胞の抽出液の製造方法に関する。また、本発明は、該製造方法で製造される細胞の抽出液であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する抽出液に関する。
溶媒に浸される細胞としては、特に制限はないが、組織由来細胞、組織由来細胞から樹立された株化細胞（例えば、Hela、HEK293が例示できるが、これらに制限されない）、単離された細胞、単離されていない細胞（例えば単離された組織中に存在する細胞）、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAが導入された細胞などが例示できる。上記組織としては、どのような組織でもよく、例えば、生体皮膚組織、体内生検（手術）組織（脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など）が例示できるが、これらに制限されるものではない。
上記溶媒としては生理食塩水、PBS（Phosphate-buffered saline）、TBS（Tris-buffered saline）が例示できるが、これらに制限されない。また、細胞や組織を溶媒に浸す時間としては、細胞壊死が誘導されるために必要・十分な時間、すなわち1時間から48時間（例えば6時間から48時間）、好ましくは12から24時間であるが、この時間に限定されるものではない。よって、「細胞を溶媒に浸す工程」は「壊死が誘導されるために必要・十分な時間、細胞を溶媒に浸す工程」や「細胞を壊死させる工程」と言い換えることができる。また、細胞や組織を溶媒に浸す温度として4℃から25℃（例えば4℃から8℃）、好ましくは4℃が例示できるが、これに制限されない。また、細胞や組織を溶媒に浸すpHとしてはpH7から8、好ましくはpH7.5が例示できるが、これに制限されない。また、緩衝液の成分として、10 mM〜50mM、好ましくは10〜20mMの濃度のリン酸緩衝液が挙げられるが、これに制限されない。
また、本発明においては、細胞や組織を溶媒に浸した後に、細胞や組織を含む溶媒から該細胞や該組織を取り除くこともできる。溶媒から細胞や組織を取り除く方法は当業者に周知な方法であれば、特に制限されない。例えば、４℃〜２５℃（例えば４℃）、また重力加速度１０Ｇ〜４０００Ｇ（例えば４４０Ｇ）で遠心し、上清を分取することにより、溶媒から細胞や組織を取り除くことができるが、これに制限されない。該上清を細胞や組織の抽出液として利用できる。【００１２】
さらに、本発明は、以下の工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有するヘパリン結合画分の製造方法に関する。また、本発明は、該製造方法で製造されるヘパリン結合画分であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する画分に関する。
（ａ）細胞や組織を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、および
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分（ヘパリン精製画分、ヘパリンカラム精製画分とも表現しうる）を溶出する工程。
固定化ヘパリンとは、ヘパリンを不溶性担体に共有結合させたものである。上記不溶性担体としては、Sepharose beads(Sepharose 4B,Sepharose 6B等:GE Healthcare)が例示されるが、これに制限されるものではない。本発明においては、市販の固定化ヘパリン(Hitrap Hepalin HP column: GE Healthcare)を用いてもよい。
細胞や組織の抽出液と固定化ヘパリンの接触条件としては、pH7〜8程度（このましくはpH7.5）、塩濃度は0〜200mM、好ましくは100〜200mM程度が例示されるが、これらに制限されない。抽出液と固定化ヘパリンとが接触している時間は特に限定されないが、ヘパリン結合画分を固定化ヘパリンに十分吸着させるという観点では5分以上保持されることが好ましい。また、温度としては、4〜8℃、好ましくは4℃が挙げられるが、これらに制限されない。さらに、固定化ヘパリンに吸着したヘパリン結合画分の溶出条件としては、pH7〜8程度、塩濃度200〜1000mM（好ましくは1000mM程度）が例示されるが、これらに制限されるものではない。【００１３】
さらに、本発明は、以下の工程を含む骨髄由来細胞誘導活性を有する陰イオン交換体結合画分の製造方法に関する。また、本発明は、該製造方法で製造される陰イオン交換体結合画分であって、骨髄由来細胞誘導活性を有する画分に関する。
（ａ）細胞や組織を溶媒に浸す工程、
（ｂ）工程（ａ）で得られる抽出液を固定化ヘパリンに接触させる工程、
（ｃ）固定化ヘパリンからヘパリン結合画分を溶出する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られるヘパリン結合画分を陰イオン交換体に接触させる工程、および
（ｅ）陰イオン交換体から陰イオン交換体結合画分を溶出する工程。
陰イオン交換体としては、DEAE（diethylaminoethyl）やQ（quaternary ammonium）を利用した交換体が例示できるが、これらに制限されない。本発明においては、市販の陰イオン交換体(例えばSource15Q ,Source30Q, MonoQ,MiniQ,PC3.2/3,Mini Q4.6/50 PE,HiTrap IEX Columns,HiTrap SP HP,Q Sepharose High Performance, Hiload 16/10 Q Sepharose HP,HiPrep 16/10 SP XL,Q Sepharose XL,HiPrer 16/10 Q FF,HiPrep 16/10DEAE FF,Q Sepharose Fast Flow, DEAE Sepharose Fast Flow（いずれもGE Healthcare))を用いてもよい。
ヘパリン結合画分と陰イオン交換体の接触条件としては、pH7〜9程度（好ましくはpH8）、塩濃度は0〜100mM、好ましくは50mM程度が例示されるが、これらに制限されない。抽出液と陰イオン交換体とが接触している時間は特に限定されないが、陰イオン交換体結合画分を陰イオン交換体に十分吸着させるという観点では5分以上保持されることが好ましい。また、温度としては、4〜16℃、好ましくは4℃が挙げられるが、これらに制限されない。さらに、陰イオン交換体に吸着した陰イオン交換体結合画分の溶出条件としては、pH7〜9程度(好ましくは、pH 8程度)、塩濃度100〜2000mM（好ましくは1000mM程度）が例示されるが、これらに制限されるものではない。【００１４】
また、本発明は、上記抽出液もしくは上記画分、または上記方法によって製造された抽出液もしくは上記方法によって製造された画分を含有する、骨髄由来細胞の誘導剤に関する。
該誘導剤を使用することにより、局所（上記成分の投与・添加部位やその近傍）に骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を誘導して組織の機能的再生を促進することが可能になるため、該誘導剤は、再生医療、再生誘導医療開発のための基礎研究および臨床研究に必要な試薬として使用することができる。例えば、実験動物における必要な生体組織に骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を動員し、組織修復、組織機能再建の程度を検討することが可能になる。また試験管内で骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）の動員による組織再生誘導研究を行うことができる。
また、上記誘導剤を使用することにより、損傷組織の再生を促進することができる。また、上記誘導剤には、機能的組織再生誘導・促進剤としての用途のみならず、組織幹細胞の減少による組織・臓器機能の低下を予防する、いわゆる予防医薬としての用途、あるいは加齢性変化の進行を遅延させる、抗加齢医薬としての用途が期待できる。【００１５】
さらに、本発明は、上記抽出液もしくは上記画分、または上記方法によって製造された抽出液もしくは上記方法によって製造された画分を含有する、組織再生促進剤または組織再生促進用キットに関する。再生される組織としては、特に制限はなく、損傷している組織である限り、どのような組織でもよく、例えば、生体皮膚組織、体内生検（手術）組織（脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など）が例示できる。
該組織再生促進剤または組織再生促進用キットは、損傷組織部位またはその近傍に投与されることで、血液中に循環している骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）を、末梢血中から該損傷組織に誘導（局所誘導する）することを特徴とする。
また組織再生促進用キットとしては、（１）フィブリノゲンに溶解した上記抽出液もしくは上記画分等、および（２）トロンビンを含む組織再生促進用キット、または（１）上記抽出液もしくは上記画分等、（２）フィブリノゲン、および（３）トロンビンを含む組織再生促進用キットが例示できる。本発明においては、市販のフィブリノゲンやトロンビンを使用することができる。【００１６】
損傷組織に動員された骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）は、種々の細胞に分化し、損傷組織の機能的再生および機能維持、機能強化に寄与する。本発明において、損傷組織としては、虚血、疎血・低酸素状態をきたす種々の病態、外傷、熱傷、炎症、自己免疫、遺伝子異常などによって損傷した組織が挙げられるが、これら原因に限定されるものではない。また、損傷組織には、壊死組織も含まれる。
本発明における組織としては、骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）が分化可能な組織である限り、特に制限はないが、例えば皮膚組織、骨組織、軟骨組織、筋組織、脂肪組織、心筋組織、神経系組織、肺組織、消化管組織、肝・胆・膵組織、泌尿・生殖器など、生体内のすべての組織が例示できる。また、上記組織再生促進剤を用いることで、難治性皮膚潰瘍、皮膚創傷、水疱症、脱毛症などの皮膚疾患はもとより、脳梗塞、心筋梗塞、骨折、肺梗塞、胃潰瘍、腸炎、などの組織損傷において、機能的組織再生を誘導する治療が可能となる。上記組織再生促進剤が投与される動物種としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、これらに限定されるものではない。【００１７】
本発明の骨髄由来細胞は、造血系幹細胞及びこれに由来する白血球、赤血球、血小板以外の細胞であり、これまで骨髄間葉系幹細胞と呼ばれている細胞に代表される幹細胞もしくは骨髄中に存在する組織前駆細胞集団を含む。本発明の骨髄由来細胞としては、骨髄採血、あるいは末梢血採血により単離することができる細胞である。造血系幹細胞は非付着細胞であり、本発明の骨髄由来細胞は、骨髄採血、末梢血採血により得られた血液中の単核球分画細胞培養により付着細胞として得られる。また、本発明の骨髄由来細胞は間葉系幹細胞を含み、骨芽細胞（分化を誘導するとカルシウムの沈着を認めることで特定可能）、軟骨細胞（アルシアンブルー染色陽性、サフラニン-O染色陽性などで特定可能）、脂肪細胞（ズダンIII染色陽性で特定可能）、さらには線維芽細胞、平滑筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞、などの間葉系細胞、さらには神経細胞、上皮細胞（たとえば表皮角化細胞、腸管上皮細胞はサイトケラチンファミリーを発現する）、血管内皮細胞への分化能力を有することが好ましいが、分化後の細胞は上記細胞に限定されるものではなく、肝臓、腎臓、膵臓などの実質臓器細胞への分化能も含む。
本発明において、骨髄由来間葉系幹細胞とは、骨髄内に存在する細胞であって、骨髄から直接あるいはその他の組織（血液や皮膚、脂肪などの間葉系組織）から間接的に採取され、（プラスチックあるいはガラス製）培養皿への付着細胞として培養・増殖可能であり、骨、軟骨、脂肪などの間葉系組織への分化能を有するという特徴を持つ細胞であり、骨髄血採血、末梢血採血、さらには間葉組織からの採取によって取得することができる。また骨髄由来間葉系幹細胞は一度培養皿へ付着させた細胞を生体の損傷部に投与することにより、例えば皮膚を構成するケラチノサイトなどの上皮系組織への分化能も有するという特徴も持つ。
本発明の骨髄由来間葉系幹細胞は多能性幹細胞であり、骨芽細胞（分化を誘導するとカルシウムの沈着を認めること等で特定可能）、軟骨細胞（アルシアンブルー染色陽性、サフラニン-O染色陽性等で特定可能）、脂肪細胞（ズダンIII染色陽性等で特定可能）の他に、例えば線維芽細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞などの間葉系細胞、神経細胞、色素細胞、表皮細胞、毛包細胞(サイトケラチンファミリー、ヘアケラチンファミリー等を発現する)、上皮系細胞（たとえば表皮角化細胞、腸管上皮細胞はサイトケラチンファミリー等を発現する）、内皮細胞、さらに肝臓、腎臓、膵臓等の実質臓器細胞に分化する能力を有することが好ましいが、分化後の細胞は上記細胞に限定されるものではない。
また、ヒト骨髄間葉系幹細胞は骨髄採血、末梢血採血、脂肪採取し、直接あるいは単核球分画を分離後に培養して付着細胞として取得することができる細胞が例示できるが、これに制限されるものではない。ヒト骨髄間葉系幹細胞のマーカーとしては、Lin陰性、CD45陰性、CD44陽性、の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。
また、マウス骨髄間葉系幹細胞は、例えば、実施例の記載の方法によって取得できる細胞が例示できるが、これに制限されるものではない。マウス骨髄間葉系幹細胞のマーカーとしては、Lin陰性、CD45陰性、CD44陽性、Sca-1陽性、c-kit陰性、の全部または一部が例示できるが、これらに制限されるものではない。
組織前駆細胞は、血液系以外の特定組織細胞への一方向性分化能を持つ未分化細胞と定義され、上述した間葉系組織、上皮系組織、神経組織、実質臓器、血管内皮への分化能を有する未分化細胞を含む。【００１８】
本発明の誘導剤、および本発明の組織再生促進剤において、上記抽出液、上記ヘパリン結合画分、上記陰イオン交換体結合画分、または、上記（ａ）から（ｉ）に記載の成分のうち少なくとも１つの成分以外の成分としては、骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）の誘導や組織再生促進を阻害しない限り、特に制限はない。例えば、本発明の組織再生促進剤には、上記抽出液、上記ヘパリン結合画分、上記陰イオン交換体結合画分、または、上記（ａ）から（ｉ）に記載の成分のうち少なくとも１つの成分に加え、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3の機能的組織再生誘導機能を強化する関連分子（群）、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3の期待される効果以外の作用を抑制する分子（群）、骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）の増殖や分化を制御する因子、これら因子あるいは細胞の機能を強化・維持するその他の因子を含むことが可能である。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤における抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質の起源となる動物種としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、上記抽出液等が投与される動物種と同じ動物種であることが好ましい。【００１９】
本発明の誘導剤や組織再生促進剤におけるHMGB1タンパク質としては、配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のHMGB1タンパク質には、配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、１）配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、２）配列番号：２、４または６に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：１、３または５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤におけるHMGB2タンパク質としては、配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のHMGB2タンパク質には、配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、１）配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、２）配列番号：８、１０または１２に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：７、９または１１に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
本発明の誘導剤や組織再生促進剤におけるHMGB3タンパク質としては、配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質が例示できるが、これらに限定されるものではない。本発明のHMGB3タンパク質には、配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も含まれる。そのようなタンパク質としては、例えば、１）配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質、および、２）配列番号：１４または１６に記載の塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるタンパク質であって、配列番号：１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質が挙げられる。
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等な単離されたタンパク質は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質のホモログあるいはパラログでありうる。配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、当業者によって公知の方法（実験医学別冊・遺伝子工学ハンドブック, pp246-251、羊土社、1991年発行）で単離することができる。
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質としては、骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）の誘導活性を有するタンパク質が挙げられる。【００２０】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、天然に存在するタンパク質を含む。一般に真核生物の遺伝子は、インターフェロン遺伝子等で知られているように、多型現象(polymorphism)を有する。この多型現象によって生じた塩基配列の変化によって、１または複数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加される場合がある。このように自然に存在するタンパク質であって、かつ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が、置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有し、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、本発明のHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質に含まれる。【００２１】
また、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質である限り、人為的に作製された変異タンパク質も本発明に含まれる。与えられた塩基配列に対してランダムに変異を加える方法としては、たとえばDNAの亜硝酸処理による塩基対の置換が知られている（Hirose, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:7258-7260, 1982）。この方法では、変異を導入したいセグメントを亜硝酸処理することにより、特定のセグメント内にランダムに塩基対の置換を導入することができる。あるいはまた、目的とする変異を任意の場所にもたらす技術としてはgapped duplex法等がある（Kramer W. and Fritz HJ., Methods in Enzymol., 154:350-367, 1987）。変異を導入すべき遺伝子をクローニングした環状２本鎖のベクターを１本鎖とし、目的とする部位に変異を持つ合成オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。制限酵素により切断して線状化させたベクター由来の相補１本鎖DNAを、前記環状１本鎖ベクターにアニールさせ、前記合成ヌクレオチドとの間のギャップをDNAポリメラーゼで充填し、更にライゲーションすることにより完全な２本鎖環状ベクターとする。
改変されるアミノ酸の数は、典型的には50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内（例えば、1アミノ酸）であると考えられる。【００２２】
アミノ酸を人為的に置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、もとのタンパク質の活性が維持されやすいと考えられる。本発明のタンパク質には、上記アミノ酸置換において保存的置換が加えられたタンパク質であって、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる。保存的置換は、タンパク質の活性に重要なドメインのアミノ酸を置換する場合などにおいて重要であると考えられる。このようなアミノ酸の保存的置換は、当業者にはよく知られている。【００２３】
保存的置換に相当するアミノ酸のグループとしては、例えば、塩基性アミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸 (例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸 (例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性アミノ酸 (例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐アミノ酸 (例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族アミノ酸 (例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）などが挙げられる。
また、非保存的置換によりタンパク質の活性などをより上昇（例えば恒常的活性化型タンパク質などを含む）させることも考えられる。【００２４】
この他、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質を得る方法として、ハイブリダイゼーションを利用する方法を挙げることができる。すなわち、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４または１６に示すような本発明によるHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNA、あるいはその断片をプローブとし、これとハイブリダイズすることができるDNAを単離する。ハイブリダイゼーションをストリンジェントな条件下で実施すれば、塩基配列としては相同性の高いDNAが選択され、その結果として単離されるタンパク質にはHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質と機能的に同等なタンパク質が含まれる可能性が高まる。相同性の高い塩基配列とは、たとえば70%以上、望ましくは90%以上の同一性を示すことができる。【００２５】
なおストリンジェントな条件とは、具体的には例えば 6×SSC、40%ホルムアミド、25℃でのハイブリダイゼーションと、1×SSC、55℃での洗浄といった条件を示すことができる。ストリンジェンシーは、塩濃度、ホルムアミドの濃度、あるいは温度といった条件に左右されるが、当業者であればこれらの条件を必要なストリンジェンシーを得られるように設定することは自明である。
ハイブリダイゼーションを利用することによって、たとえば配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質以外のHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質のホモログをコードするDNAの単離が可能である。【００２６】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３または１５に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも30％以上、好ましくは50％以上、さらに好ましくは80％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を指す。塩基配列やアミノ酸配列の同一性は、インターネットを利用したホモロジー検索サイトを利用して行うことができる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST、および SSEARCH 等の相同性検索が利用できる［例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）のウェブサイトの相同性検索（Search and Analysis）のページ ; http://www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html］。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うことができる（例えばNCBIのホームページのウェブサイトのBLASTのページ; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/; Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402）］。【００２７】
例えば Advanced BLAST 2.1におけるアミノ酸配列の同一性の算出は、プログラムにblastpを用い、Expect値を10、Filterは全てOFFにして、MatrixにBLOSUM62を用い、Gap existence cost、Per residue gap cost、および Lambda ratioをそれぞれ 11、1、0.85（デフォルト値）に設定して検索を行い、同一性（identity）の値（%）を得ることができる（Karlin, S. and S. F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. and S. F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7）。【００２８】
本発明によるタンパク質、またはその機能的に同等なタンパク質は、糖鎖等の生理的な修飾、蛍光や放射性物質のような標識、あるいは他のタンパク質との融合といった各種の修飾を加えたタンパク質であることができる。ことに後に述べる遺伝子組換え体においては、発現させる宿主によって糖鎖による修飾に差異が生じる可能性がある。しかしたとえ糖鎖の修飾に違いを持っていても、本明細書中に開示されたHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質と同様の性状を示すものであれば、いずれも本発明によるHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質、または機能的に同等なタンパク質である。【００２９】
HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質は、生体材料のみならず、これをコードする遺伝子を適当な発現系に組み込んで遺伝子組換え体（recombinant）として得ることもできる。HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質を遺伝子工学的な手法によって得るためには、先に述べたHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAを適当な発現系に組み込んで発現させれば良い。本発明に応用可能なホスト／ベクター系としては、例えば、発現ベクターpGEXと大腸菌を示すことができる。pGEXは外来遺伝子をグルタチオン S-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質として発現させることができる（Gene, 67:31-40, 1988）ので、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードする遺伝子を組み込んだpGEXをヒートショックでBL21のような大腸菌株に導入し、適当な培養時間の後に isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）を添加してGST融合HMGB1、GST融合HMGB2、またはGST融合HMGB3タンパク質の発現を誘導する。本発明によるGSTはグルタチオンセファロース4Bに吸着するため、発現生成物はアフィニティクロマトグラフィーによって容易に分離・精製することが可能である。【００３０】
HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質の recombinant を得るためのホスト／ベクター系としては、この他にも次のようなものを応用することができる。まず細菌をホストに利用する場合には、ヒスチジンタグ、HAタグ、FLAGタグ等を利用した融合タンパクの発現用ベクターが市販されている。酵母では、Pichia属酵母が糖鎖を備えたタンパク質の発現に有効なことが公知である。糖鎖の付加という点では、昆虫細胞をホストとするバキュロウイルスベクターを利用した発現系も有用である（Bio/Technology, 6:47-55, 1988）。更に、哺乳動物の細胞を利用して、CMV、RSV、あるいはSV40等のプロモーターを利用したベクターのトランスフェクションが行われており、これらのホスト／ベクター系は、いずれもHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質の発現系として利用することができる。また、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等のウイルスベクターを利用して遺伝子を導入することもできる。【００３１】
得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。【００３２】
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばHPLC、FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。【００３３】
また、本発明のタンパク質は、実質的に精製されたタンパク質であることが好ましい。ここで「実質的に精製された」とは、本発明のタンパク質の精製度（タンパク質成分全体における本発明のタンパク質の割合）が、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、100％若しくは100％に近いことを意味する。100％に近い上限は当業者の精製技術や分析技術に依存するが、例えば、99.999％、99.99％、99.9％、99％などである。【００３４】
また、上記の精製度を有するものであれば、如何なる精製方法によって精製されたものでも、実質的に精製されたタンパク質に含まれる。例えば、上述のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、または組み合わせることにより、実質的に精製されたタンパク質を例示できるが、これらに限定されるものではない。【００３５】
本発明の誘導剤や組織再生促進剤におけるHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質を放出または分泌する細胞としては、基本的に生体内のすべての組織由来細胞が該当する。採取および培養が容易な細胞としては、線維芽細胞（例えば正常皮膚線維芽細胞およびそれに由来する株化細胞）が例示できるが、これに限定されるものではない。また、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質を分泌する細胞は、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNA、あるいは、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAに分泌シグナルをコードするDNA（ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC；配列番号：１７）を結合させたDNAを、公知の発現ベクターや遺伝子治療用ベクターに挿入することで作製されたベクターを、線維芽細胞（例えば正常皮膚線維芽細胞およびそれに由来する株化細胞）などの哺乳類細胞や昆虫細胞、その他の細胞に導入することによっても作製することができる。これら細胞が由来する動物種に特に制限はないが、組織再生が行われる対象動物種の細胞、対象自身の細胞、あるいは組織再生が行われる対象の血縁にあたる者に由来する細胞を使用することが好ましい。【００３６】
本発明の誘導剤や組織再生促進剤におけるHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAは、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードする限り、cDNAであっても、ゲノムDNAであってもよく、また、天然のDNAであっても、人工的に合成されたDNAであってもよい。HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAは、通常、ベクター（例えば遺伝子治療用ベクター）に挿入された状態で、本発明の誘導剤や組織再生促進剤に含有される。【００３７】
本発明における遺伝子治療用ベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノアソシエートウイルスベクター、センダイウイルスベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、パピローマウイルスベクター、などが例示できるが、これらに限定されるものではない。該遺伝子治療用ベクターには、遺伝子発現を効果的に誘導するプロモーターDNA配列や、遺伝子発現を制御する因子、DNAの安定性を維持するために必要な分子が含まれてもよい。【００３８】
なお、本発明の誘導剤、および本発明の組織再生促進剤においては、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質の部分ペプチドであって骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞）の誘導活性を有するペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または、該部分ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターを含有することもできる。【００３９】
本発明の誘導剤や組織再生促進剤の投与方法は、経口投与または非経口投与が挙げられ、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の誘導剤や組織再生促進剤を全身または局部的（例えば、皮下、皮内、皮膚表面、眼球あるいは眼瞼結膜、鼻腔粘膜、口腔内および消化管粘膜、膣・子宮内粘膜、または損傷部位など）に投与できる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質を投与する場合、例えば、一回の投与につき、体重1 kgあたり0.0000001mgから1000mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.00001から100000mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質を分泌する細胞やHMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入された遺伝子治療用ベクターを投与する場合も、損傷組織において、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質の量が上記範囲内となるように投与することができる。しかしながら、本発明の誘導剤や組織再生促進剤はこれらの投与量に制限されるものではない。【００４０】
本発明の誘導剤や組織再生促進剤は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。【００４１】
また、上述した細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質を分泌する細胞、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または該部分ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターの用途は、以下（１）または（２）のように表現することもできる。
（１）細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3タンパク質、該タンパク質を分泌する細胞、該タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター、該タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または該部分ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターを、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織の再生を促進する方法、
（２）細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3タンパク質、該タンパク質を分泌する細胞、該タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター、該タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または該部分ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターを、組織が損傷した対象に投与する工程を含む、該損傷した組織に骨髄細胞を誘導する方法、
（３）骨髄由来細胞の誘導剤または組織再生促進剤の製造における、細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3タンパク質、該タンパク質を分泌する細胞、該タンパク質をコードするDNAが挿入されたベクター、該タンパク質の部分ペプチド、該部分ペプチドを分泌する細胞、または該部分ペプチドをコードするDNAが挿入されたベクターの使用。
上記組織が損傷した対象としては、ヒト又は非ヒト動物が挙げられ、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、ハムスター、モルモットなどが例示できるが、これらに制限されない。【００４２】
また、本発明は、以下の工程を含む、細胞や組織の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを評価する方法であって、工程（ｂ）における被験細胞の誘導活性が、対照と比較して高い場合に、細胞や組織の抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれると判定される方法を提供する。
（ａ）細胞や組織の抽出液を調製する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で調製された抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する工程。【００４３】
本発明における被験細胞は、損傷組織の再生に寄与する可能性のある細胞（損傷組織の再生を誘導することが期待される細胞とも表現できる）である限り、特に制限はない。本発明における被験細胞としては、未分化な細胞、種々の分化段階にある細胞が挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明における被験細胞としては、幹細胞、非幹細胞などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明における被験細胞としては、循環性の細胞、非循環性の細胞が例示できる。該非循環性の細胞としては、組織定住性の細胞が例示できるが、これに制限されない。また、本発明における被験細胞としては、循環性の血液細胞、循環性の非血液細胞が例示できる。また、本発明における被験細胞としては、損傷した組織を再生するために必要とされる可能性のある細胞が例示できる。 【００４４】
また、本発明における被験細胞としては、骨髄由来細胞、骨髄由来造血系細胞、骨髄由来間葉系細胞、損傷組織由来の細胞、損傷により再生が必要とされる組織と同種の組織由来の細胞、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組織由来の細胞、損傷組織を有する個体の組織由来細胞、損傷組織を有する個体以外の同種個体の組織由来細胞、損傷組織を有する個体以外の異種個体の組織由来細胞、上述した細胞および組織由来細胞から樹立された株化細胞、上述した組織由来癌細胞、上述した細胞を遺伝子工学的に改変した細胞、などが挙げられるが、これらに限定されない。これら細胞には、上述の特徴を有する細胞が含まれる。【００４５】
本発明における被験細胞としては、骨髄、損傷組織、損傷により再生が必要とされる組織と同種の組織、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組織、損傷組織を有する個体の組織、損傷組織を有する個体以外の同種個体の組織、または損傷組織を有する個体以外の異種個体の組織から直接または間接的に単離された細胞が例示できる。また、本発明における被験細胞としては、骨髄、損傷組織、損傷により再生が必要とされる組織と同種の組織、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組織、損傷組織を有する個体の組織、損傷組織を有する個体以外の同種個体の組織、または損傷組織を有する個体以外の異種個体の組織由来の培養細胞も例示できる。また本発明における被験細胞としては、骨髄、損傷組織、損傷により再生が必要とされる組織と同種の組織、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組織、損傷組織を有する個体の組織、損傷組織を有する個体以外の同種個体の組織、または損傷組織を有する個体以外の異種個体の組織由来の細胞あるいは培養細胞を遺伝子工学的手法或いは細胞生物学的手法で修飾した細胞も例示できる。また本発明における被験細胞としては、骨髄、損傷組織、損傷により再生が必要とされる組織と同種の組織、損傷により再生が必要とされる組織と異なる組織、損傷組織を有する個体の組織、損傷組織を有する個体以外の同種個体の組織、または損傷組織を有する個体以外の異種個体の組織由来の腫瘍細胞も例示できる。【００４６】
また、本発明における被験細胞としては、特定の性質を有する単一細胞集団を複数種含有する細胞集団、または特定の性質を有する単一の細胞集団が例示できる。前者の具体例としては、骨髄あるいは損傷組織（血液、皮膚、脂肪など）から直接または間接的に採取された細胞群、後者の例としては骨髄由来間葉系幹細胞や皮膚線維芽細胞が例示できるが、これに限定されるものではない。【００４７】
上記方法では、まず細胞や組織を溶媒に浸す。上記細胞としては、特に制限はないが、組織由来細胞、組織由来細胞から樹立された株化細胞（例えば、Hela、HEK293が例示できるが、これらに制限されない）、単離された細胞、単離されていない細胞（例えば単離された組織中に存在する細胞）、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3タンパク質をコードするDNAが導入された細胞などが例示できる。上記組織としては、どのような組織でもよく、例えば、生体皮膚組織、体内生検（手術）組織（脳、肺、心臓、肝臓、胃、小腸、大腸、膵臓、腎臓、膀胱、脾臓、子宮、精巣や血液など）、損傷組織が例示できる。また、該溶媒としては、生理食塩水、PBS、TBSが例示できるが、これらに制限されない。また、細胞や組織を溶媒に浸す時間としては、細胞壊死が誘導されるために必要・十分な時間（通常24時間以上）であることが好ましいが、この時間に限定されるものではない。また、本発明においては、細胞や組織を溶媒に浸した後に、細胞や組織を含む溶媒から該細胞や該組織を取り除くこともできる。溶媒から細胞や組織を取り除く方法は当業者に周知な方法であれば、特に制限されない。【００４８】
次いで、得られた細胞や組織の抽出液による被験細胞の誘導活性を測定する。対照としては、細胞や組織を浸す前の溶媒が例示できる。被験細胞の誘導活性は、例えば実施例の記載の方法で測定することができるが、これに限定されず、その他の試験管内あるいは生体内細胞遊走能測定方法で測定することもできる。【００４９】
例えば、細胞由来抽出液や組織由来抽出液と被験細胞を、例えば穴を持つ膜（例えば8μメートルの穴を持つ膜）を隔てて近接・交通させる。次いで、被験細胞が細胞や組織の抽出液の側に遊走するか否かを確認する。また、例えば、細胞や組織の抽出液を、実施例に記載のGFP骨髄移植マウスに投与する。GFP骨髄移植マウスは、enhanced green fluorescent protein (EGFP)遺伝子が導入されたトランスジェニックマウス（GFPマウス）から単離された骨髄細胞を、致死性放射線照射したマウスに移植することで作製することができる。より具体的には、致死性放射線（10Gy）を照射した直後のマウス尾静脈内に、GFPマウスの長管骨から採取した骨髄細胞（約105個/匹）を投与し、生着を待つ（通常約6週間以上が必要）。次いで、被験細胞としてのGFP陽性骨髄由来細胞が、細胞や組織由来抽出液の投与部位に動員されているか否かを確認する。【００５０】
また、本発明は、以下の工程を含む、被験細胞を誘導する因子が含まれる細胞や組織の抽出液をスクリーニングする方法を提供する。
（ａ）複数の抽出液について、上記の評価方法で、該抽出液に被験細胞を誘導する因子が含まれるか否かを評価する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で被験細胞を誘導する因子が含まれると評価された抽出液を選択する工程【００５１】
さらに、本発明は、上記の評価方法やスクリーニング方法によって、被験細胞を誘導する因子を含むと判定された抽出液から、被験細胞の誘導活性を指標に、被験細胞を誘導する因子を精製する工程を含む、被験細胞を誘導する因子の同定方法を提供する。被験細胞を誘導する因子の精製には、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。精製された因子は、例えば質量分析等の当業者に周知の方法によって、同定することができる。同定された因子を使用することで、損傷組織の再生を促進することができる。よって、該因子は、損傷組織の再生を促進する因子や損傷組織の再生に寄与する因子と表現することができる。また、該因子は、損傷組織の再生を促進する候補や損傷組織の再生に寄与する候補と表現することもできる。【００５２】
本発明の方法においては、特定の性質を有する単一細胞集団を複数種含有する細胞集団から、特定の性質を有する単一細胞集団が遊走されることもありうる。このような場合は、本発明の方法によって、特定の性質を有する単一細胞集団、および、該細胞集団を誘導する因子の両方が同定される。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕
目的：生体移植皮膚組織の機能的再生時における骨髄由来細胞寄与の評価
方法：上記の目的に対して以下の方法により研究を行った。
１）GFP骨髄移植マウスに対する生体皮膚移植系を利用して、移植皮膚片の機能的再生時の骨髄由来細胞寄与程度を検討した。具体的には、C57BL/6雄マウス（6〜8週齢）に致死量放射線（10Gy）を照射し、その直後に尾静脈よりGFP（green fluorescent protein）トランスジェニックマウス由来骨髄細胞（5x106個/0.1ml 生理的リン酸緩衝溶液pH7.4）を移植した（図１）。
２）移植骨髄細胞の生着を待って（6週間）得られたGFP骨髄移植マウスの背部皮膚に、新生マウス皮膚（雌）を移植した。
３）移植皮膚片の生着と十分な皮膚組織再生を待って（4週間）、移植皮膚片領域におけるGFP蛍光の集積程度を、蛍光実体顕微鏡を利用して観察した。
４）吸入麻酔下に移植皮膚片を生検により採取し、冷却装置付ミクロトームを用いて皮膚凍結切片（6μm）を作製、4％パラホルムアルデヒド固定（30分間）、組織内細胞核をDAPIで染色、表皮細胞特異的ケラチン5の抗体を用いて免疫染色を施行した後、組織を封入して共焦点レーザー顕微鏡によりGFP陽性骨髄由来細胞の存在を検討した。また一部の標本はHE染色によりその組織構築を検討した。
結果：GFP骨髄移植マウスへの生体皮膚移植系において、再生した皮膚領域に一致した強いGFP蛍光の集積が観察された（図２）。また、移植皮膚片のHE標本を用いた組織学的観察では、多数の毛包を含む皮膚組織の機能的再生が確認された（図２）。共焦点レーザー顕微鏡による観察では、ケラチン5を発現している表皮角化細胞、真皮線維芽細胞、さらには平滑筋細胞や脂肪細胞の多くがGFP蛍光を示し、これらの細胞が骨髄由来であることが示された（図３）。即ち、移植皮膚の機能的再生時に必要な上皮系および間葉系細胞の多くが、骨髄由来幹細胞により供給されていることが初めて明らかとなった。
考察：これらの研究結果は、これまで臨床現場で日常的に行われている皮膚移植における皮膚再生時に、骨髄由来細胞が大きく寄与していることを初めて明確に示したものであり、極めて画期的な発見である。【００５４】
骨髄内には造血系幹細胞と間葉系幹細胞の二つの幹細胞システムが存在することが報告されている。今回の研究で示された、移植皮膚内に大量動員された骨髄由来上皮系細胞および間葉系細胞が骨髄由来造血系幹細胞から供給されていると予想するのは困難であり、移植組織の機能的再生には骨髄由来間葉系幹細胞が寄与している可能性が強く示唆される。即ち、植皮直後に疎血・壊死方向にある移植皮膚組織から骨髄由来間葉系幹細胞動員因子が放出され、骨髄から間葉系幹細胞を、末梢血液循環を介して移植皮膚片内に動員し、機能的皮膚組織再生を誘導していることが予想された。【００５５】
〔実施例２〕
目的：皮膚組織抽出液内に存在する骨髄間葉系幹細胞誘導因子の同定
方法：疎血状態にある切除皮膚からの放出が予想される骨髄間葉系幹細胞動員因子の同定を目的として、以下の方法により研究を進めた。
１）マウス骨髄由来間葉系幹細胞を得るために、C57BL/6マウスの骨髄細胞を大腿骨もしくは下腿の骨から採取し、10％胎仔ウシ血清含D-MEM(Nacalai 社製)を細胞培養培地として細胞培養皿に撒き、37℃、炭酸ガス濃度5％の条件下で培養した。細胞が占める面積が培養皿底面積に対して70から100％に増殖した時点で、0.25％トリプシン1mMEDTA（Nacalai社製）を用いて細胞を培養皿からはがし、さらに同じ条件で継代培養した。継代作業は少なくとも5回以上繰り返した。さらにこれらの付着細胞を単離培養しフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の分析を行いLin陰性、CD45陰性、CD44陽性、Sca-1陽性、c-kit陰性であることを確認した。これらの細胞は骨細胞、脂肪細胞に分化可能で骨髄間葉系幹細胞の性質を有することを確認した。
２）新生マウス400匹から得た遊離皮膚片を生理的リン酸緩衝液pH7.4（PBS）400ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して皮膚抽出液を作製した。
３）得られた皮膚抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認するため、ボイデン・チャンバーを用い、本発明者らが既に株化しているC57BL6マウス骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。具体的にはボイデン・チャンバーの下槽（容量25μl）に皮膚抽出液（25μl）を挿入し、8μmの微細穴を持つポリカーボネートメンブレンを乗せ、さらにこれに接してボイデン・チャンバー上槽（容量50μl）を載せて、その中に骨髄由来間葉系幹細胞浮遊液（5x104個/50ml培養液：DMEM/10％ウシ胎仔血清）を入れ、CO2インキュベーター内で37℃、4〜24時間培養した。培養後、チャンバーの上槽をはずし、シリコン薄膜を取り出して、その微細穴を通過してチャンバー下槽に遊走した骨髄由来間葉系幹細胞の数を染色により定量的に検討した。
４）皮膚抽出液内の骨髄由来間葉幹細胞動員活性をもつ因子を精製するために、ヘパリンアフィニティーカラム・クロマトグラフィー、および陰イオン交換カラム（Qカラム）クロマトグラフィーを施行した。皮膚抽出液を4℃の9倍容20 mM リン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希釈した（希釈液A）。あらかじめ、20 mM リン酸バッファー pH 7.5（30ml）をHiTrap Hepalin HP column（カラム容量： 5ml、GE Healthcare）の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液Aをカラムに結合させた。その後20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 100mM NaCl（30ml）でカラムを洗浄した。吸着したタンパクを溶出するため20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。吸着画分をそれぞれ、２）で説明したボイデン・チャンバーを利用した遊走活性評価法により遊走能を有する画分を集めた。これを9倍容50 mM Tris HCl pH 8.0で希釈した(希釈液B)。あらかじめ、50 mM Tris HCl pH 8.0(30ml）をHiTrap mono Q column（カラム容量： 1ml、GE Healthcare）の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液Bをカラムに結合させた。吸着したタンパクを溶出するためTris HCl pH 8.0, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。以上の精製過程はすべて4〜16℃で行うことが可能であるが、4〜8℃で行うことが好ましく、4℃で行うことが更に好ましい。この溶出液を２）で説明したボイデン・チャンバーを利用した遊走活性評価方法により評価した。【００５６】
５）ボイデン・チャンバーによる遊走活性評価およびカラム・クロマトグラフィーの組み合わせを利用して得られた骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つ皮膚抽出液由来精製標品を、SDS-PAGE電気泳動法により分子量を基にしてゲル内分画し、銀染色により泳動蛋白のバンドを検出した。
６）５）のSDS-PAGE電気泳動および銀染色により単一バンドとしてゲル内分画された皮膚抽出液由来蛋白群の中で、骨髄由来間葉系幹細胞動員活性の最も強いクロマトグラフィー精製標品から得られた蛋白バンドをすべて切り出して、質量分析およびデータベース解析により当該蛋白の同定を進めた。
７）同定した蛋白群の中から骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つ候補蛋白を選定し、その候補蛋白を含む精製標品を中和抗体で処理（精製標品溶液100μlを当該蛋白のポリクロナール抗体100倍希釈条件にて氷上で30分間インキュベート）した後、骨髄由来間葉系幹細胞動員活性の阻害程度を、ボイデン・チャンバーを用いた遊走能アッセイにて検討した。
８）得られた骨髄由来間葉系幹細胞精製標品をマトリゲルの中に約10％ボリュームとなるように混入し、直径約1mm、5mm長のシリコンチューブ内に挿入し、これをGFP骨髄移植マウス背部皮下に移植した。2週間後に挿入チューブを取り出して、チューブ内に遊走した骨髄由来細胞から出るGFP蛍光を蛍光測定装置により定量的に解析した。さらに、チューブ内から遊走細胞を取り出し、DMEM/10％ウシ胎仔血清培地に播種してCO2インキュベーター内で培養することにより、骨髄由来間葉系幹細胞の生体内動員活性を検討した。２週間継続して培養した細胞は２％パラホルムアルデヒドで25℃の条件下で、10分間固定した後、5分間ずつ4回PBSを用いてパラホルムアルデヒドを洗浄し、2%スキムミルク液で処理をし、0.5％ tween20含有2%スキムミルクで1000倍に希釈した抗マウスケラチン５抗体を4℃の条件下で16時間反応させた。5分間ずつ4回PBSを用いて抗体を洗浄し、2%スキムミルクで1000倍に希釈したAlexa546標識抗ウサギIgG抗体を25℃の条件下で1時間反応させた。以上の１）〜８）の実験過程は図4にまとめた。【００５７】
結果：切除した新生マウス皮膚からPBS中に抽出した溶液（図５）をスタート材料として、上述した方法により骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つ蛋白質の同定と機能解析を進めた。ボイデン・チャンバーによる遊走活性解析により、皮膚抽出液中に極めて強い骨髄由来間葉系幹細胞誘導活性があることが示された（図６）。この活性を指標にしてヘパリンアフィニティーカラムおよび陰イオン交換カラム（Qカラム）を用いて目的因子の精製を進め、得られた各分画をSDS-PAGE電気泳動にて解析した結果、銀染色により単一バンドとしてゲル内分画された数個の蛋白を含む精製標品内に強い骨髄由来間葉系幹細胞動員活性があることが示された（図７レーン７）。得られた銀染色バンドを切り出して、質量分析、データベース解析を進めた結果、矢印で示す分子量約25,000の蛋白がHMGB1であることが明らかとなった（図７）。この精製分画（レーン７）中に含まれるHMGB1が目的の骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つことを明らかにする目的で、抗HMGB1ポリクロナール抗体による遊走阻害実験を行った。その結果、抗HMGB1ポリクロナール抗体が当該精製標品中の骨髄由来間葉系幹細胞遊走活性を強く阻害することが明らかとなり（図８）、皮膚抽出液内に存在する骨髄由来幹細胞動員因子がHMGB1であることが明らかとなった。
さらに、HMGB1が生体内で骨髄由来間葉系幹細胞動員活性を持つことを確認する目的で、この精製標品を入れたシリコンチューブをGFP骨髄移植マウス背部皮下に挿入し、2週間後にチューブ内に動員された細胞の性質を検討した（図９）。その結果、対照コントロール（図７におけるSDS-PAGEレーン４に用いた精製標品）に比較して、HMGB1精製標品はGFP陽性の骨髄由来細胞をチューブ内に多数（対照コントロールの約3倍）動員していた（図１０）。図１１に蛍光実体顕微鏡による強拡大像を示す。さらに、チューブ内に動員されたGFP陽性細胞を取り出し、DMEM/10％ウシ胎仔血清培地内で培養した結果、培養開始直後は円形の浮遊細胞状態であったが（図１２）、24時間後にはGFP陽性骨髄由来細胞は培養シャーレに付着し、紡錘系の線維芽細胞様形態、さらには類円形の上皮細胞様形態の細胞として増殖することが確認された（図１３）。さらにこれらの細胞を2週間継続して培養するとGFP陽性骨髄由来細胞の中に毛包の形態を呈する細胞を確認した。（図14A;明視野、弱拡大、図14B；GFP蛍光、弱拡大、図14C明視野、強拡大、図14D；GFP蛍光、強拡大）また、上皮ケラチノサイトのマーカーであるケラチン５に対する免疫組織化学を行ったところ、GFP陽性骨髄由来細胞の中にケラチン５陽性細胞を確認した。（図14E;明視野、図14F;ケラチン５陽性細胞の蛍光）【００５８】
考察：今回本発明者らは、世界で初めて、遊離皮膚片がHMGB1を産生すること、産生されたHMGB1は骨髄由来間葉系幹細胞を皮膚片内に大量に動員する活性を持つこと、皮膚片内に動員された骨髄由来間葉系幹細胞は皮膚組織内で線維芽細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞などの間葉系細胞に分化し、さらには表皮細胞毛包を形成する細胞に分化することにより、移植皮膚組織の機能的再生を誘導していることを見出した。このHMGB１による骨髄由来間葉系幹細胞動員およびその結果としての機能的組織再生は、移植皮膚再生のみならず、疎血・壊死を伴う多くの臓器・組織損傷時に機能的組織再生誘導機序として機能していることが容易に予想される。HMGB１製剤による医薬品を開発することにより、損傷組織再生時に骨髄由来間葉系幹細胞を局所に動員することが可能になれば、線維性瘢痕治癒により機能不全に陥ることの無い、必要な機能的器官の伴う機能的組織再生誘導医療が可能になると確信する。【００５９】
〔実施例3〕
目的：皮膚抽出液中HMGB1ファミリーの同定と骨髄間葉系幹細胞誘導活性の検討
方法：新生マウス皮膚抽出液中に含まれるHMGB蛋白ファミリーの有無をWestern blot 法を用いて確認した。サンプルとして〔実施例2〕で得られた皮膚抽出液を10μl をSDS-PAGE法を用いて電気泳動し、ゲル中で分離した蛋白をブロッティング装置（ATTO）を用いPVDF膜にトランスファーした。3％スキムミルク0.1% Tween 20 含PBS（S-T-PBS）にて、室温で1時間インキュベートした後、S-T-PBSで1000倍に希釈したラビット抗マウスHMGB1 抗体、ラビット抗マウスHMGB2抗体、ラビット抗マウスHMGB3抗体をそれぞれ4℃で16時間反応させた。反応後、同PVDF膜をS-T-PBSにて5分間5回洗浄後、S-T-PBSで2000倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ラビットIgG抗体（GE Healthcare）にて同PVDF膜を25℃で1時間インキュベートした。さらにS-T-PBSにて5分間5回洗浄後ECL Western Blotting Detection System  (GE Healthcare)を同PVDF膜と反応させ、ECL film を感光させた後現像してHMGB1、HMGB2、HMGB3タンパクの存在を検出した。【００６０】
新生マウス皮膚からTrizol (invitrogen) を用いてRNA を抽出し更にSuperScript III cDNA synthesis kit（Invitrogen） を用いてcDNA を合成した。このcDNA をテンプレートとしてHMGB1、HMGB2、及びHMGB3 のcDNAをPCR （ポリメラーゼ連鎖反応）法を用いて増幅し、アミノ酸配列のN末端にFlag tagの配列（Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys；配列番号：１８）を付加したタンパクを発現するように、哺乳類細胞でタンパクを発現させるプラスミドベクターpCAGGSに挿入した。これらのプラスミドベクターをHEK293 （ヒト胎児腎細胞由来培養細胞株）に遺伝子導入し48時間培養しタンパクを発現させた。HMGB1、HMGB2、及びHMGB3タンパクをそれぞれ発現させた細胞及び培養上清は4℃で16時間インキュベートした後、4400g・5分間遠心し上清を回収した。この上清50mL あたり100μLのAnti Flag 抗体Gel（Sigma） を混合し4℃で16時間インキュベートした。 遠心しGelを回収した後PBSを用いて、5回洗浄した。更に 3X Flag peptide （final 100μg/ml） を用いて溶出した。リコンビナントタンパクの発現をS-T-PBS で1000倍希釈したマウス抗Flag 抗体、及びS-T-PBS で2000倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体（GE Healthcare） を用いたWestern blot 法にて確認した。これらの精製リコンビナントタンパクのマウス骨髄間葉系幹細胞の遊走活性を〔実施例2〕と同様にボイデン・チャンバーを用いて評価した。また、HMGBファミリーのin vivoでの薬効を観察するために、8週齢C57BL/6マウスの背部皮膚を直径8μmの円形に切除し皮膚潰瘍モデルを作製し、そこに精製したHMGB1・HMGB2・HMGB3それぞれ（100 ng）を、1g/100mL PBSの濃度のヒアルロン酸溶液と等量ずつ混合しそのうち100 μLを潰瘍面に投与した。潰瘍面は乾燥しないように、粘着性透明創傷被覆・保護材Tegaderm (スリーエムヘルスケア)で覆い、経時的に創傷面積を計測し治癒効果を測定した。【００６１】
さらにヒト骨髄間葉系幹細胞をヒト皮膚抽出液およびヒト精製HMGB1が遊走する活性があるかを調べるために、〔実施例2〕と同様にボイデンチャンバーを用いて評価した。面積１cm2のヒト皮膚を１mlのPBSに浸し、4℃の条件下で16時間インキュベーションした後、4℃の条件下で10分間44OGで遠心した。上清のみを回収し、ヒト皮膚抽出液として使用した。また、ボイデンチャンバーの上部に入れる細胞はヒト骨髄間葉系幹細胞（Cambrex社）を用いた。（本細胞はフローサイトメトリーによる細胞表面抗原の分析の結果、CD105陽性、CD166陽性、CD29陽性、CD44陽性、CD34陰性、CD45陰性とされている。さらに分化誘導試験によって脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞への分化が陽性である。）また、チャンバー下部には、ヒトHMGB1を100ng /well (R &D社)及びPBSにて10倍希釈したヒト皮膚抽出液を入れ、コントロールとしてPBSを用いた。【００６２】
結果：Western blot の結果、HMGB1のバンドの他にHMGB2やHMGB3のバンドが検出された。よって新生マウス皮膚抽出液の中には、HMGB1の他にファミリータンパクであるHMGB2およびHMGB3が含有されていることが確認された（図１５）。それぞれのタンパクのＮ末端にFlag tagを付加したHMGB1・HMGB2・HMGB3の発現ベクターを作製した（図１６）。HEK293細胞に発現ベクターを遺伝子導入し、発現したタンパクをFlag tag を用いて精製した後、Western blot 法を用いてタンパクを確認した（図１７）。これらの精製タンパクを用いたマウス骨髄間葉系幹細胞の遊走活性を測定したところ、いずれのタンパクにおいても活性が確認された（図１８）。マウスの背部に作製した潰瘍面積を７日毎に計測したところ、非治療群に比べHMGB1,2および3による治療群の方が有意に潰瘍面積の縮小効果を確認できた（図１９）。マウスの場合と同様に、ヒトHMGB1及びヒト皮膚抽出液はヒト骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性があることが明らかとなった（図２０）。【００６３】
考察：HMGB1 と相同性が高いタンパクとしてHMGB2及びHMGB3が知られている。これらのタンパクもHMGB1と同様の性質を有することが期待される。そこで、遊離皮膚片抽出液からHMGB1のファミリーであるHMGB2およびHMGB3も産生されることを確認した。さらに HMGB１・HMGB2・HMGB3のリコンビナントタンパクを作製し、in vitro での骨髄間葉系幹細胞遊走活性を確認し、in vivo における皮膚潰瘍治療効果も確認した。新生マウス遊離皮膚片中のHMGBファミリー（HMGB1・HMGB2・HMGB3）およびリコンビナントHMGBファミリーには骨髄間葉系幹細胞誘導活性や骨髄由来の上皮系に分化可能な幹細胞を局所に誘導する活性があり、さらにこれらの誘導された骨髄由来の細胞群が損傷組織において表皮ケラチノサイトや毛包や線維芽細胞のようなさまざまな細胞に分化して損傷組織の治癒を促進する効果があることが明らかになった。また骨髄間葉系幹細胞は多能性幹細胞であるので、他の組織損傷状態、例えば、脳損傷、心筋梗塞、骨折などの組織損傷の治療にHMGBファミリーを全身投与もしくは局所投与することで同様に治療効果が期待できると確信する。【００６４】
また、ヒトとマウスのHMGB1はそれぞれを構成するアミノ酸配列で98%（213/215）の相同性があり、HMGB2はそれぞれを構成するアミノ酸配列で96%(202/210)の相同性があり、HMGB3はそれぞれを構成するアミノ酸配列で97%(195/200)の相同性があることがわかっている。そこで、ヒトのHMGBがマウスのHMGBと同様の活性を有することが考えられるが、本実施例の結果から、ヒトの皮膚抽出液やHMGB1がマウスの皮膚抽出液や、HMGB1と同様に骨髄間葉系幹細胞を誘導する活性があることが明らかになった。【００６５】
〔実施例4〕
目的：骨髄間葉系幹細胞誘導因子組織抽出液の作製方法の確立
方法：6週齢C57BL6一匹分の脳、心臓、腸、腎臓、肝臓及び新生マウス皮膚一匹分を生理的リン酸緩衝液pH7.4（PBS）1ml内に浸し、4℃で24時間インキュベーションした後、組織を取り除くために、4℃の条件下で10分間、440Gで遠心し上清を回収して組織抽出液とした。得られた抽出液の中に骨髄間葉系幹細胞誘導活性が存在することを確認するため、ボイデン・チャンバーを用い、〔実施例2〕と同様に骨髄由来間葉系幹細胞に対する遊走活性を検討した。また、同じサンプル中に含まれるHMGB1の濃度をHMGB1 ELISA kit(シノテスト)を用いて計測した。更に脳、心臓および皮膚の組織抽出液を〔実施例2〕と同様に、ヘパリンアフィニティーカラムに結合させ、結合画分のタンパクの骨髄間葉系幹細胞誘導活性をボイデンチャンバーを用いて確認した。【００６６】
結果：マウス脳抽出液には新生マウス皮膚抽出液と同等のHMGB1が含有されていた。さらに、骨髄間葉系幹細胞の誘導活性はマウス脳でも皮膚と同様に認められた。マウス腸抽出液とマウス心臓抽出液中にHMGB1はほとんど含まれなかったが、骨髄間葉系幹細胞の誘導活性は認められた。また、マウス脳、マウス心臓のヘパリンカラム結合画分はマウス皮膚のヘパリンカラム結合画分と同様に骨髄間葉系幹細胞を誘導する活性があった（図２１）。表１は、マウス各組織抽出液のHMGB1濃度と骨髄間葉系幹細胞の誘導活性を測定した結果を示す。【００６７】
【表１】
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【００６８】
考察：皮膚のみならず脳でも臓器を生理的緩衝液に浸すだけという簡便な方法でHMGB1を簡便に抽出する方法を開発した。この方法は、他の臓器例えば、肝臓や腎臓でも同様である。また心臓や腸からの抽出液にはHMGB1をほとんど含有しないにもかかわらず骨髄間葉系幹細胞誘導活性を認めた。このことは抽出液中にHMGB1と異なる、他の骨髄間葉系幹細胞誘導物質が含まれていることが考えられる。これらの抽出液に含まれる物質は、もともとそれぞれの組織に存在するものであり、生理的には組織損傷時に骨髄間葉系幹細胞を損傷組織に誘導していると考えられる。本発明によってHMGB1を含む複数の骨髄間葉系幹細胞誘導物質を各種臓器から機能的にかつ簡便に抽出する新規の方法を開発できた。さらに、組織抽出液から骨髄間葉系幹細胞誘導物質を精製するためにヘパリンカラムに結合させる方法を開発した。また、これらの骨髄間葉系幹細胞誘導活性を有する成分は皮膚と同様の方法で脳や心臓からもヘパリンカラムを用いて精製することが可能である。【００６９】
〔実施例5〕
目的：培養細胞から間葉系幹細胞遊走活性物質を抽出する方法を確立する。
方法：ヒト胎児腎由来培養細胞株HEK293及びヒト子宮頸癌細胞株HeLaはそれぞれ1０％胎仔牛血清含D-MEM(nacalai 社製）で培養した。それぞれの細胞をPBSで洗浄後、細胞１０7個を４℃の5mlのPBS(nacalai社製)に1６時間浸した。重力加速度４４０Gで４℃で５分間遠心し上清を回収した。ボイデンチャンバーの上層にヒト骨髄間葉系幹細胞をいれ、下層にDMEMで5倍希釈した細胞抽出液をいれ、ヒト骨髄間葉系幹細胞遊走活性を確認した。
結果：HEK293抽出液もHeLa抽出液も同様に骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性を示した（図２２）。
考察：培養細胞をPBSに浸すという簡便な方法で骨髄間葉系幹細胞を遊走する活性物質を抽出することに成功した。【００７０】
〔実施例6〕
目的：マウス脳欠損モデルを作成し、局所損傷部位に皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を徐放化して投与することで、自己の骨髄系に含まれる幹細胞を局所損傷部位に遊走させ、神経系細胞の再生を誘導できないか検討する。
方法：
(1) 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の作製
切除した新生マウス皮膚からPBS（一匹/ｍｌ）中に４℃で16時間インキュベーションし抽出した皮膚抽出液を4℃の9倍容20 mM リン酸バッファー pH 7.5を用い 10倍に希釈した。あらかじめ、20 mM リン酸バッファー pH 7.5（30ml）をHiTrap Hepalin HP column（カラム容量： 5ml、GE Healthcare）の中に流しカラムを平衡化した。さらに、希釈液をカラムに結合させた。その後20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 100mM NaCl（30ml）でカラムを洗浄した。吸着したタンパクを溶出するため20 mM リン酸バッファー pH 7.5, 1000mM NaClをカラム内に流入し、溶出液をチューブに分画した。吸着画分をそれぞれ、マウス骨髄由来細胞株の遊走活性を実施例２で示したボイデンチャンバー法を用いて評価し遊走能を有する画分を集めた。この活性を有する溶液を皮膚抽出液ヘパリン精製画分として以下の実施例に使用した。【００７１】
（2）骨髄抑制マウスの作成
マウスに10GyのX線単回照射を行い、骨髄抑制マウスを作成した。【００７２】
（3）骨髄抑制マウスへのGFPマウス骨髄移植
GFPマウスの両側大腿骨および下腿骨より骨髄細胞を採取した。これを照射後24時間経過した骨髄抑制マウスの尾静脈より投与した。なお、投与はイソフルランによる吸入麻酔下に施行した。【００７３】
（4）マウス脳損傷（脳組織欠損）モデルの作成
GFPマウスの骨髄細胞を移植した骨髄抑制マウスにイソフルランにて吸入麻酔を行い、ペントバルビタール（45mg/kg）を腹腔内に注入した。マウスを脳定位固定装置に固定し、メスにて頭部に正中切開を加えた。ブレグマから右外側2.5mm、前方1mmにドリルを用いて穿頭を施した(図２３A)。この部位から深さ3ｍｍの位置を先端にして、20Gサーフロー針の外筒を挿入して固定した。ここでシリンジを用いて、陰圧をかけ、脳組織を一部吸引した（図２３B）。【００７４】
（5）皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の脳組織欠損部への投与
前述の位置に、ハミルトンシリンジと26Gシリンジを用いて、フィブリン糊製剤（フィブリノゲン）（ボルヒール（化血研））に溶解した皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分を5μl注入し、次にフィブリン糊製剤（トロンビン）（ボルヒール（化血研））を5μl注入した(図２３C)。この操作によって、皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分の徐放剤としての効果を狙った。【００７５】
（6）脳組織欠損部における神経系細胞再生効果の評価
コントロール群と治療群のマウスとを用いて評価した。適切な経過設定を決め（経時的に）、マウスを4%パラホルムアルデヒドにて灌流固定後、脳の切り出しを行った。さらに、4％パラホルムアルデヒドを外固定した。15%と30％の勾配をつけたショ糖にて脱水後、凍結切片を作成した。
DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)solusionにて核染色を行い、退光防止剤を用いて封入した。共焦点レーザー顕微鏡にて損傷部位（脳組織欠損部）でのGFP陽性細胞の集積を評価した。
結果：投与後、2週間および6週間後のGFP陽性細胞集積を定性的に示す。2週間後（コントロール；図２３D, 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分；図２３E）および6週間後（コントロール；図２３F 皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分；図２３G）ともに、コントロール群に比して治療群の損傷部位にGFP陽性細胞の集積が高い傾向にあった。
考察：皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分投与により、骨髄由来細胞が脳組織欠損部位に集積し神経細胞の形態を示した。骨髄由来間葉系幹細胞は神経細胞にも分化することが知れており、本結果から、皮膚抽出液ヘパリンカラム精製画分によって脳損傷部位における神経系細胞再生の誘導できることが明らかになった。また、これは、脳虚血性疾患や脳挫傷における脳組織障害部位での神経再生にも応用可能である。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明によって、骨髄由来細胞（例えば骨髄由来間葉系幹細胞。以下同様。）誘導活性を有する細胞抽出液、骨髄由来細胞誘導活性を有するヘパリン結合画分、および、骨髄由来細胞誘導活性を有する陰イオン交換体結合画分が提供された。また、細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3を含有する骨髄由来細胞誘導剤や組織再生促進剤が提供された。細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3を骨髄由来細胞動員医薬として開発することにより、難治性損傷組織の機能的再生を促進する新たな再生医療が可能になる。HMGB1、HMGB2、HMGB3は、血流低下により低酸素状態に陥り、壊死方向にある組織細胞から放出され、その局所に骨髄由来細胞、あるいはそれを由来とする種々の細胞を動員する作用を持つ。動員された骨髄由来細胞は、それぞれの組織で必要とされる細胞系譜に分化することにより、疎血・壊死により喪失した機能の回復、いわゆる機能的組織再生を促進する。例えば、皮膚の血流障害によって生じた難治性皮膚潰瘍部に、細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、またはHMGB3を投与することにより、潰瘍面に骨髄由来細胞を動員し、動員された細胞が血管内皮細胞に分化すれば局所の血流が改善される。同時に線維芽細胞、神経細胞、毛包細胞、さらには表皮細胞に分化することにより、線維性瘢痕治癒ではなく、必要な皮膚附属器官を備えた機能的皮膚再生が誘導、促進される。心筋梗塞や脳梗塞などのその他臓器の疎血性壊死状態でも、その機能的組織再生誘導剤として細胞抽出液、ヘパリン結合画分、陰イオン交換体結合画分、HMGB1、HMGB2、HMGB3が同様に有効であると期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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