(57)【要約】  長期間摂取し続けても安全で、かつ経口投与でも血管新生に伴う疾病を予防または治療する効果を充分に発揮する血管新生阻害活性を有する組成物並びにそれを含有する血管新生阻害剤及び血管新生阻害効果を有する飲食品を提供する。  ハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体に由来するβ−グルカン又はβ−グルカン含有物を含むことを特徴とする血管新生阻害活性を有する組成物。
2008084574.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体に由来するβ−グルカン又はβ−グルカン含有物を含む血管新生阻害活性を有する組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の血管新生阻害活性を有する組成物を有効成分として含む血管新生阻害剤。
【請求項３】
経口投与されるものである請求項２記載の血管新生阻害剤。
【請求項４】
請求項１に記載の血管新生阻害活性を有する組成物を含有する血管新生阻害効果を有する飲食品。
【請求項５】
ハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体に由来するβ−グルカン又はβ−グルカン含有物を含む血管新生阻害活性を有する組成物を有効量投与することを含む血管新生病の治療方法。
【請求項６】
ハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体に由来するβ−グルカン又はβ−グルカン含有物を含む血管新生阻害活性を有する組成物の血管新生阻害剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生阻害活性を有する組成物並びにそれを含有する血管新生阻害剤及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生とは、すでに胎生期や成育過程で完成された血管から何らかの刺激に伴って新しい血管が枝を伸ばすように作られることである。女性性周期や皮膚の切傷の治癒過程などにおいて見られるものであるが、多くの病気とも関わっている。そのような病気は血管新生病と呼ばれており、失明につながる糖尿病性網膜症や加齢性黄斑変性症、尋常性乾癬、関節リウマチ、腫瘍または癌の増殖・転移などが該当する。新生血管の形成は、腫瘍もしくは癌、組織などへの栄養供給を行うという役割を有することから、それらの増殖・肥大化に不可欠である。従って、このような新生血管の形成を抑制することができれば、腫瘍もしくは癌の増殖・転移、慢性炎症、網膜症などの病態を抑制することができると考えられている。【０００３】
腫瘍もしくは癌細胞は、1〜2 mm3程度の大きさになると血管を新生する必要が生じる。すなわち、腫瘍もしくは癌細胞は血管新生促進物質を産生し、それ自体が成長していくために必要な酸素や栄養を運搬するための血管の新生を誘導する。それによって、これらの細胞の増殖は促進される。このように、血管新生は腫瘍もしくは癌の増大に必須であるが、転移にも深く関与している。なぜならば、原発巣で増大した腫瘍もしくは癌が周辺結合組織へ浸潤後、血管内に侵入すると、癌細胞は血管を通じて他の組織へ移動しうるからである。さらに、その転移巣の増大にも血管新生が関与する。【０００４】
また、糖尿病患者が網膜症を発症し、網膜の毛細血管が閉塞をきたして低酸素状態に陥ると、網膜の酸素不足を補うために血管新生が生じる。こうして生じた新生血管は硝子体組織の癒着を引き起こし、またもろく出血しやすいため、症状が進行すると緑内障の発症や失明の危険性がある。さらに加齢性黄斑変性症では、網膜やブルッフ膜に加齢性の変化が生じ、脈絡膜からの血管新生が誘導される。この新生血管からの出血が繰り返されると、最終的には網膜の視細胞が破壊されて失明につながる。【０００５】
血管新生においては、さまざまな促進及び抑制因子が知られている。促進因子としては、血管内皮増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、腫瘍壊死因子（TNF-α）やインターロイキン-8（IL-8）などのサイトカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）などのプロテアーゼなどが知られ、抑制因子としては、インターフェロンα／β（IFN-α/β）やインターロイキン-12（IL-12）、形質転換増殖因子-β（TGF-β）などのサイトカイン、インターフェロンインデューシブルプロテイン-10（IP-10）、プラスミノーゲンアクチベータインヒビター（PAI）などのタンパク質が知られている。【０００６】
また、血管新生のプロセスは、がんや間質から産生される血管新生促進因子によって血管新生のスイッチが入る、MMPやプラスミノーゲンアクチベータの関与により血管内皮細胞下の基底膜が消化される、血管内皮細胞が遊走・増殖する、血管内皮細胞が管腔を形成する、という4つのステップに分けられる。これらの各段階において、上記の血管新生促進因子及び抑制因子が複雑に作用し合うことが知られている。【０００７】
通常は、抑制因子の発現は促進因子より亢進しているが、血管新生病の場合には、促進因子の発現が抑制因子の発現より亢進していることが明らかになってきている。従って、血管新生抑制因子を生体に投与して血管新生を抑制することが、血管新生病に対する効果的な治療法として期待されており、これまでにも腫瘍または癌の増殖や転移に対する血管新生阻害物質の効果に関して様々な研究が行われてきた。その場合、上記の4つのステップの内、いずれを阻害しても良いと考えられる。【０００８】
これまでの研究においては、アンギオスタチン（非特許文献１及び２）、エンドスタチン（非特許文献３）、アスペルギルス・フミガトゥス（Aspergillus fumigatus）に由来するフマギリン（fumagillin）及びその合成誘導体であるTNP-470（非特許文献４）、サイトジェニン（非特許文献５）、メタロプロテアーゼ阻害薬であるバチマスタット（BB-94）及びマリマスタット（BB-2516）（非特許文献６及び７）、などの合成化学物質の他、血管新生因子（EGF、TGF-α、VEGFなど）とそれらに対応するレセプターの結合を阻害するモノクローナル抗体（非特許文献８）が、血管新生阻害物質として知られている。しかしながら、これらの物質は、副作用などを考慮しなければならないため、容易には使用できないという欠点が存在した。【０００９】
このほかに、副作用の心配がほとんどないという特徴のため、食品由来の物質から血管新生阻害作用を有する物質を探す試みが行われてきた。例えば、サメ軟骨（非特許文献９）、緑茶成分であるエピガロカテキン（EGC）やエピガロカテキンガレート（EGCG）（非特許文献１０）、大豆のイソフラボンの一種であるゲニステイン（非特許文献１１及び１２）、アガリクス・ブラゼイ由来のエルゴステロール（非特許文献１３）やピログルタミン酸（非特許文献１４）などに、血管新生阻害作用が存在することが報告された。【００１０】
一方、キノコ類は古くから薬用／食用として利用されており、１９７０年代からそれらに含まれているβ−グルカンが抗腫瘍作用を発揮することが示された。【００１１】
β−グルカンとは、β−グルコースがグリコシド結合により直鎖状に重合した多糖類の総称であり、その結合様式によって、β−1,3−グルカン、β−1,4−グルカン、β−1,6−グルカンなどに分類される。例えば、β−1,3−結合により重合している場合にはβ−1,3−グルカンと呼ばれる。また、これらのβ−グルカンは、分岐したβ−グルコース残基を有する場合もある。例えば、β−1,3−グルカンにβ−1,6−結合でグルコースが１から数残基付加している場合などであり、この場合はβ−1,6−分岐β−1,3−グルカンと呼ばれる。β−グルカンは、種々の生物、特に植物、真菌類、細菌類の細胞壁の構成成分として豊富に含まれており、水や有機溶媒などに対してはわずかしか溶けず、熱に対しては安定な性質を持っている。【００１２】
なお、抗腫瘍性を発揮するβ−グルカンの多くはβ−1,3結合を主鎖とし、その2〜3残基毎にβ−1,6結合によって繋がったグルコースの側鎖を有するものであり、このようなβ−グルカンにタンパク質が結合して複合体となっているものも知られている。このようなβ−1,6結合を側鎖に持ったβ−1,3グルカンを注射もしくは経口で担癌マウスに投与すると、免疫担当細胞を活性化させて抗腫瘍作用を示すことが次々と証明され、クレスチン、レンチナン、シゾフィラン（いずれも商品名）などのβ−1,3−グルカン含有製剤が抗悪性腫瘍剤として実用化された。また、近年になって、アガリクス、メシマコブ、霊芝、ハナビラタケなどに含まれるβ−グルカンに抗腫瘍作用を期待し、それらのキノコ類の子実体や菌糸体の乾燥物や抽出物が健康食品素材として利用されるようになってきた（例えば、特許文献１、２及び３）。【００１３】
上記したキノコ類の中でもハナビラタケは、そのβ−グルカン含量が子実体乾燥粉末当たり４３質量％以上と非常に高含有であり、その構造はβ−1,6−分岐β−1,3−グルカンであることが知られている。また、担癌マウスを用いた抗腫瘍試験で顕著な活性が認められており、医薬品分野での用途も提案されている（特許文献４及び５、非特許文献１５）。【００１４】
このように、β−グルカンの生理活性については、その免疫賦活作用が特に注目されているためか、β−グルカンの抗腫瘍作用における血管新生阻害作用の関与について検討された報告は、クレスチンに関するものしかあらず、投与経路も腹腔内投与に限られている（非特許文献１６）。
【非特許文献１】M.S.オレイリー（O'Reilly）, L.ホルムグレン（Holmgren）, C.チェン（Chen） and J.ホークマン（Folkman）,「アンギオスタチンはマウスにおける原発腫瘍の休眠を誘導・維持させる（Angiostatin induces and sustains dormancy of human primary tumors in mice）.」, ネイチャー メディスン（Nature Med.）, (1996), 2:689-692
【非特許文献２】B.K.シム（Sim）, M.S.オレイリー（O'Reilly）, H.リアン（Liang）, A.H.フォティア（Fortier）, W.ヒ（He）, J.W.マドセン（Madsen）, R.ラプセビッヒ（Lapcevich） and C.A.ネイシー（Nacy）,「組み換え型ヒトアンギオスタチンは実験的原発癌及び転移癌を抑制する（A recombinant human angiostatin protein inhibits experimental primary and metastatic cancer）.」, キャンサー リサーチ（Cancer Res.）, (1997), 57:1329-1334
【非特許文献３】M.S.オレイリー（O'Reilly）, T.ボエム（Boehm）, Y.シン（Shing）, N.フカイ（Fukai）, G.バシオス（Vasios）, W.S.レーン（Lane）, E.フリン（Flynn）, J.R.バークヘッド（Birkhead）, B.R.オルセン（Olsen） and J.ホークマン（Folkman）, 「エンドスタチン：外因性の血管新生及び腫瘍増殖阻害剤（Endostatin: an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth）.」, セル（Cell）, (1997), 88:277-285
【非特許文献４】D.イングバー（Ingber）, T.フジタ（Fujita）, S.キシモト（Kishimoto）, K.スドウ（Sudo）, T.カナマル（Kanamaru）, H.ブレム（Brem） and J.ホークマン（Folkman）, 「血管新生と腫瘍増殖を阻害するフマギリンの合成アナログ（Synthetic analogues of fumagillin that inhibit angiogenesis and suppress tumour growth）.」 ネイチャー（Nature）, (1990), 348:555-557
【非特許文献５】T.オイカワ（Oikawa）, M.ササキ（Sasaki）, M.イノセ（Inose）, M.シマムラ（Shimamura）, H.クボキ（Kuboki）, S.ヒラノ（Hirano）, H.クマガイ（Kumagai）, M.イシズカ（Ishizuka） and T.タケウチ（Takeuchi）, 「新規の微生物由来産物であるサイトゲニンの、イン・ビボにおける胚性及び腫瘍誘導血管新生に対する影響（Effects of cytogenin, a novel microbial product, on embryonic and tumor cell-induced angiogenic responses in vivo）.」, アンチキャンサー リサーチ（Anticancer Res.）, (1997), 17:1881-1886
【非特許文献６】G.タラボレッティ（Taraboletti）, A.ガロファロ（Garofalo）, D.ベロッティ（Belotti）, T.ドルディス（Drudis）, P.ボルソッティ（Borsotti）, E.スカンジアニ（Scanziani）, P.D.ブラウン（Brown） and R.ギアバッジ（Giavazzi）,「マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤であるバチマスタットによる血管新生及びマウス血管腫の阻害（Inhibition of Angiogenesis and Murine Hemangioma Growth by Batimastat, a Synthetic Inhibitor of Matrix Metalloproteinases）.」, ジャーナル オブ ザ ナショナル キャンサー インスティテュート（J. Natl. Cancer Inst.）, (1995), 87:293-298
【非特許文献７】「マリマスタット：BB2516, TA2516（Marimastat: BB 2516, TA 2516）.」, ドラッグス イン アール アンド ディー（Drugs R.D.）, (2003), 4(3):198-203.
【非特許文献８】S.イクバル（Iqbal） and H.J.レンズ（Lenz）, 「直腸結腸癌の治療における新規物質の調和的利用（Integration of novel agents in the treatment of colorectal cancer）.」, キャンサー ケモセラピー アンド ファーマコロジー（Cancer Chemother. Pharmacol.（ (2004), 54 Suppl. 1:S32-39
【非特許文献９】八木田旭邦、「新免疫療法(仮称)(Novel Immunotherapy for Cancer; NITC)における血管新生阻害剤の役割」, バイオセラピー（Biotherapy）, (2000), 14(10):973-982
【非特許文献１０】Y.キャオ（Cao） and R.キャオ（Cao）, 「お茶によって阻害される血管新生（Angiogenesis inhibited by drinking tea）.」, ネイチャー（Nature）, (1999), 398:381
【非特許文献１１】T.フォトシス（Fotsis）, M.ペッパー（Pepper）, H.アドレークルーズ（Adlercreutz）, G.フレイシュマン（Fleischmann）, T.ヘイス（Hase）, R.モンテサノ（Montesano） and L.シュウェイゲラー（Schweigerer）, 「イン・ビトロで血管新生を阻害する食品由来成分ゲニステインについて（Genistein, a Dietary-Derived Inhibitor of in vitro Angiogenesis）.」, プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）, (1993), 90:2690-2694
【非特許文献１２】三浦健人、袁嵐、孫歩祥ら、「製品図解 天然抗腫瘍物質GCPの開発」, ニュー フード インダストリー（New Food Industry）, (2001), 43(3):17-22
【非特許文献１３】T.タカク（Takaku）, Y.キムラ（Kimura） and H.オクダ（Okuda）, 「アガリクス・ブラゼイ・ムリル由来の抗腫瘍化合物の単離とその作用メカニズム（Isolation of an Antitumor Compound from Agaricus blazei Murill and Its Mechanism of Action）.」, ジャーナル オブ ニュートリション（J. Nutr.）, (2001), 131:1409-1413
【非特許文献１４】Y.キムラ（Kimura）, T.キド（Kido）, T.タカク（Takaku）, M.スミヨシ（Sumiyoshi）, K.ババ（Baba）, 「アガリクス・ブラゼイ・ムリル由来の血管新生阻害物質の単離：その抗腫瘍作用と抗転移作用（Isolation of an anti-angiogenic substance from Agaricus blazei Murill: Its antitumor and antimetastatic actions）.」, キャンサー サイエンス（Cancer Sci.）, (2004), 95:758-764
【特許文献１】特開２００１−１０９７０号公報
【特許文献２】特開２００１−１３１０８３号公報
【特許文献３】特開２００３−１８３１７６号公報
【特許文献４】特開２０００−２１７５４３号公報
【特許文献５】日本特許第３５０９７３６号公報
【非特許文献１５】N.オオノ（Ohno）, N.N.ミウラ（Miura）, M.ナカジマ（Nakajima） and T.ヤドマエ（Yadomae）, 「栽培されたスパラシス・クリスパ子実体由来の抗腫瘍性１，３−ベータグルカン（Antitumor 1,3-beta-glucan from cultured fruit body of Sparassis crispa）.」, バイオロジカル アンド ファーマシューティカル ブレティン（Biol. Pharm. Bull.）, (2000), 23(7):866-872
【非特許文献１６】T.カノウ（Kanoh）, K.マツナガ（Matsunaga）, K.サイトウ（Saito） and T.フジイ（Fujii）, 「タンパク−多糖複合体ピーエスケーによるイン・ビボにおける腫瘍誘導血管新生の抑制（Suppression of in vivo tumor-induced angiogenesis by the protein-bound polysaccharide PSK）.」, (1994), イン ビボ（In Vivo）, 8:247-250
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
これまでに血管新生阻害作用が明らかにされたβ−グルカン含有組成物としてはクレスチンが挙げられ、血管新生病の予防または治療に有効であると考えられるが、その血管新生阻害作用については腹腔内投与による効果しか検証されておらず、経口投与による効果は不明確である。また、上記したβ−グルカン以外の血管新生阻害作用を有する化合物も同様に、血管新生病の予防または治療に有効であると考えられるが、いずれの化合物も、継続的に、例えば食品として長期間摂取し続けた際の安全性については必ずしも保証されているものではなく、また経口投与による効果が充分でない化合物も多い。いずれにせよ、現在のところ経口投与によって血管新生を阻害できる素材は極めて少なく、経口投与によって顕著な血管新生阻害作用を発揮できる素材が求められている状態にある。【００１６】
本発明は、このような実情に鑑みなされたものであり、長期間摂取し続けても安全で、かつ経口投与によって、血管新生の異常な亢進に伴って発症する糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、尋常性乾癬、関節リウマチ、癌の増殖や転移などの予防及び治療効果を充分に発揮する血管新生阻害活性を有する組成物並びにそれを含有する血管新生阻害剤及び血管新生阻害効果を有する飲食品を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、上記課題を解決するため新規な素材の開発を求めて鋭意検討した結果、ハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体から得られたβ−グルカン含有組成物が血管新生を顕著に阻害し、血管新生病に対する予防及び治療効果を発揮するという事実を見いだした。また、該組成物が経口投与でも充分な効果を発揮することも新たに見出し、本発明に到達した。【００１８】
本発明において血管新生病とは、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性症、尋常性乾癬、関節リウマチ、癌の増殖や転移など、血管新生の異常な亢進によって発症または進行する病態のことを指すが、血管新生の亢進が原因となる疾病であればこれらに限定されない。【００１９】
すなわち、本発明の第一の態様は、ハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体に由来するβ−グルカン又はβ−グルカン含有物を含む血管新生阻害活性を有する組成物を要旨とするものである。【００２０】
本発明の第二の態様は、前記した本発明の血管新生阻害活性を有する組成物を有効成分として含む血管新生阻害剤を要旨とするものであり、好ましくは、経口投与されるものである。【００２１】
本発明の第三の態様は、前記した本発明の血管新生阻害活性を有する組成物を含有する血管新生阻害効果を有する飲食品を要旨とするものである。【００２２】
本発明の第四の態様は、ハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体に由来するβ−グルカン又はβ−グルカン含有物を含む血管新生阻害活性を有する組成物を有効量投与することを含む血管新生病の治療方法を要旨とするものである。【００２３】
本発明の第五の態様は、ハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体に由来するβ−グルカン又はβ−グルカン含有物を含む血管新生阻害活性を有する組成物の血管新生阻害剤の製造のための使用を要旨とするものである。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、優れた血管新生阻害活性を示す組成物が提供できる。また、古くから薬用・食用として利用されているハナビラタケを原料としているため、極めて安全性が高いことから、飲食品に含ませて用いることができる他、経口投与剤に含ませて用いることもできる。従って、上記したような血管新生病を患った患者ごとに適した投与方法を選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】DAS法による血管新生誘導系において、ハナビラタケ由来のβ−グルカン含有物の経口投与が、血管新生の程度に与える影響を示した図である。縦軸は、血管新生スコアを示す。
【図２】マトリゲルプラグ法による血管新生誘導系において、ハナビラタケ由来のβ−グルカン含有物の経口投与が、マトリゲル重量に与える影響を示した図である。縦軸は、マトリゲル重量（g）を示す。
【図３】マトリゲルプラグ法による血管新生誘導系において、ハナビラタケ由来のβ−グルカン含有物の経口投与が、マトリゲル中のヘモグロビン含量に与える影響を示した図である。縦軸は、マトリゲル中のヘモグロビン含量（mg/マトリゲル）を示す。
【図４】マウス転移モデル系において、ハナビラタケ由来のβ−グルカン含有物の経口投与が、腫瘍サイズの増大に与える影響を示した図である。縦軸は腫瘍サイズ（mm3）を示す。
【図５】マウス転移モデル系において、ハナビラタケ由来のβ−グルカン含有物の経口投与が、肺への転移コロニー数に与える影響を示した図である。縦軸は転移コロニー数（コロニー／肺）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。【００２７】
本明細書において、特に断らない限り、比率、百分率、等は全て重量によるものである。用語「質量％」は、「重量％」と同義である。
ハナビラタケは、カラマツ等の針葉樹に生えるキノコであって、非常に希少なキノコである。歯ごたえがよく、その純白の色合いと葉牡丹のような形態が特徴である食用キノコである。これまで、このハナビラタケは成長が遅く人工栽培は非常に困難であるとされてきたが、最近になって、比較的短期間で栽培可能な新しい栽培法が確立され、商業規模での供給が可能となっている。【００２８】
本発明において用いられるハナビラタケ子実体は、天然のものでも栽培されたものでもよい。人工栽培の方法としては、従来から知られている人工栽培用の菌床を作成することにより行うことができる（詳細は、例えば、特開平１１−５６０９８号公報、日本特許第３７４６４４０号、日本特許第３５０９７３６号参照）。【００２９】
また、本発明においては、ハナビラタケの菌糸体も用いることができる。菌糸体は液体培養法によって得ることができる。培地に使用する炭素源としては、グルコースなどの単糖の他、デキストリン、グリセロールなど通常用いられる炭素源が使用できる。また、窒素源としては無機又は有機窒素源が使用できるが、生育速度の観点からは有機窒素源を用いるほうが好ましい。また、必要に応じて微量元素やビタミン等の生育因子を添加することは通常の培養と何ら変わりはない。培養温度は１５℃〜３０℃、好ましくは１８℃〜２８℃、２０℃〜２５℃が最も好ましい。ｐＨは２．５〜８．０、好ましくは３．０〜７．０、３．５〜５．０が最も好ましい。培地成分には不溶成分を添加することが均一に生育させることができることから好ましい。培養期間は培地組成や菌株により、数日から数週間程度に設定されうる。【００３０】
なお、ハナビラタケのβ−グルカン含量は、人工栽培された子実体乾燥重量当たり４３質量％以上であることが知られている。人工培養した菌糸体におけるβ−グルカン含有量は、乾燥重量当たり１８質量％前後であることから、本発明のβ−グルカン含有組成物を高効率に抽出するためには子実体を用いることが好ましい。【００３１】
本発明で用いられるβ−グルカンあるいはβ−グルカン含有物を抽出するには、このようにして得られたハナビラタケの子実体あるいは菌糸体をそのまま抽出工程に移してもよいし、まず乾燥した後、破砕機などを用いてハナビラタケの組織を機械的に破砕したものを供試してもよい。乾燥するには、熱風や凍結乾燥のような方法が挙げられる。また、ここで用いられる破砕機としては、ミキサーや石臼などが挙げられる。【００３２】
本発明における抽出操作は、酵素を用いてハナビラタケ中のβ−グルカン以外の成分を分解させる方法を適用することが好ましい。また、アルカリ溶液を用いてβ−グルカンを抽出することもできる。さらに、得られた抽出液に対してアルコール沈殿を行ったり、真空乾燥や凍結乾燥を行ったりすることで、β−グルカン含有物を濃縮することができる。【００３３】
本発明における酵素処理で用いられる酵素の種類としては、市販されているα−アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、プロテアーゼなど、ハナビラタケに含まれるβ−グルカン以外の多糖類やタンパク質成分の分解酵素を使用することが望ましい。このような酵素は単独で使用してもよいし、複数の酵素を組み合わせて使用することもできる。【００３４】
酵素処理に用いる酵素の量に特に制限はないが、ハナビラタケの乾燥粉末重量に対して０．１〜１０質量％、０．２〜５質量％を用いることが好ましく、０．５〜２質量％がさらに好ましい。０．２質量％以下では酵素処理の効率が悪く、５質量％以上ではコスト面での負担が高くなる。【００３５】
また、酵素処理は１種又は複数種の酵素を用いて、複数回行うこともできる。複数回行う場合は、ハナビラタケからの抽出でもよいし、ハナビラタケから得られた抽出画分あるいは抽出後のハナビラタケ残渣をさらに抽出してもよい。また、それらを組み合わせて行うことができる。【００３６】
抽出操作の際の温度は、特に制限はないが２〜２００℃が好ましく、２５〜１５０℃がさらに好ましく、６０〜１００℃が最も好ましい。２℃以下では抽出効率が悪く、２００℃以上では抽出物が熱変性し性状が変化したりなどする。抽出時間にも特に制限はないが、１０分〜１２時間程度が好ましく、２０分〜６時間がさらに好ましく、３０分〜２時間が最も好ましい。１０分以下では抽出量が少なく、３日間以上では作業効率が低い。また、抽出は静置のまま行うこともできるが、撹拌又は振盪などすることによって抽出効率を高めることができる。【００３７】
本発明におけるアルカリ抽出で用いるアルカリ成分としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムなどを用いることができる。その溶液濃度としては、０．１〜１０Mが好ましく、０．５〜５Mがさらに好ましく、１〜２．５Mが最も好ましい。０．１M以下では抽出効率が悪く、１０M以上ではコスト面での負担が高くなる。【００３８】
また、アルカリ抽出は複数回行うこともできる。複数回行う場合は、ハナビラタケからの抽出でもよいし、ハナビラタケから得られた抽出画分あるいは抽出後のハナビラタケ残渣をさらに抽出してもよい。また、それらを組み合わせて行うことができる。特に、抽出物中のβ−グルカン含有量を高めるためには、エタノール抽出を済ませたハナビラタケの抽出残渣に対してアルカリ抽出を行うことが、β−グルカンを高濃度で抽出できるため好ましい。【００３９】
アルカリ抽出操作の際の温度は、特に制限はないが２〜１００℃が好ましく、４〜６５℃がさらに好ましい。２℃以下では抽出効率が悪く、１００℃以上では抽出作業に危険性が伴う。抽出時間にも特に制限はないが、３０℃以下の低温域で抽出する場合は６時間〜５日間が好ましく、１２時間〜３日間がさらに好ましく、１日間〜２日間が最も好ましい。６時間以下では抽出量が少なく、５日間以上では作業効率が悪い。逆に、３０℃以上の高温域で抽出する場合は、１０分〜１日間程度が好ましく、２０分〜８時間がさらに好ましく、３０分〜３時間が最も好ましい。１０分以下では抽出量が少なく、１日間以上では作業効率が低い。また、抽出は静置のまま行うこともできるが、撹拌又は振盪などすることによって抽出効率を高めることができる。【００４０】
本発明の血管新生阻害活性を有する組成物は、以上のようにしてハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体の乾燥粉末から得られた抽出画分であるβ−グルカンあるいはβ−グルカン含有物を含むものである。本発明においては、以上のようにして得られた処理液を脱塩・濃縮することが好ましい。脱塩の方法としては、透析膜を用いる方法、カラムを用いた方法などが挙げられる。濃縮の方法としては、アルコール沈殿、乾燥などの周知の分離手段が用いられる。具体的には以下のようにして行うことができる。【００４１】
上記のようにして得られたハナビラタケの子実体及び／又は菌糸体の処理液を一旦真空乾燥処理により乾燥物とした後、適当量の水に再懸濁し、透析膜を用いて脱塩処理を行う。透析膜は、市販の透析用セルロースチューブを用いればよく、透析外液には蒸留水を用いる。透析外液（蒸留水）を満たした容器に上記の処理液乾燥物を再懸濁した水溶液を入れた透析膜（チューブ）を浸漬し、１〜３日静置、あるいは攪拌下で放置する。これにより透析内液中の塩類を取り除くことが出来る。また、透析外液を３〜４回交換することで、透析内液中の塩類を完全に除くことができる。【００４２】
次に、得られた透析内液からエタノール沈殿によってβ−グルカンあるいはβ−グルカン含有物を沈殿させる。すなわち、上記で得られた透析内液に、終濃度が８０％になるようにエタノールを添加し、室温に１時間静置する。その後、遠心分離（８０００×g、１０分）によって沈殿を回収し、上清を破棄することでβ−グルカン含有物が得られる。【００４３】
本発明の血管新生阻害活性を有する組成物は、通常、ハナビラタケの子実体または菌糸体から得られたβ−グルカン含有物を０．０１〜１００質量％配合するのが好ましい。さらに好ましくは、０．１〜８０質量％配合するのが好ましい。この範囲であれば製剤化が容易であり、かつ十分な効果を期待できる。【００４４】
本発明の血管新生阻害活性を有する組成物の形態は、適用の仕方に応じて種々の形態にすることができる。経口投与する場合には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。【００４５】
製剤には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤を含むことができるが、これらに限定されない。本発明の血管新生阻害活性を有する組成物を持続性、徐放性のものとしてもよい。【００４６】
本発明の第二の態様の血管新生阻害剤は、上記した本発明の血管新生阻害活性を有する組成物を含有するものである。この組成物は、上記したように、ハナビラタケの子実体または菌糸体に由来するものであり、ハナビラタケは古くから食用・薬用とされてきたことから極めて安全な素材である。この点から、血管新生阻害活性を有する組成物の使用量は厳しく制限されるものではないと考えられるが、概ね、下限は予防又は治療という目的に応じた効果を発揮しうる量を、上限は使用のしやすさ、経済性等の観点から実際的な量を基準とし、通常、ハナビラタケ乾燥物に換算して成人１日あたり約０．０１ｇ〜約１００ｇ、好ましくは約０．１ｇ〜約１０ｇを使用すればよい。もちろん、使用する者の年齢、体重、症状、使用期間、治療経過等に応じて変化させることもできる。１日あたりの量を数回に分けて投与することもできる。また、他の血管新生阻害剤（例えば、他のキノコ類から同様に抽出したβ−グルカン含有組成物を含む血管新生阻害剤など）や、転移阻害剤、抗悪性腫瘍剤、抗サイトカイン剤、抗炎症剤など、血管新生病の予防や治療に用いられる種々の薬剤並びに組成物と組み合わせて使用することもできる。【００４７】
本発明の血管新生阻害剤は、服用の仕方に応じて種々の剤形にすることができる。中でも経口投与することが好ましく、その場合には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。【００４８】
製剤には薬剤的に許容できる種々の担体を加えることができる。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、コーティング剤を含むことができるが、これらに限定されない。本発明の血管新生阻害剤を持続性、徐放性のものとしてもよい。【００４９】
本発明の第三の態様の飲食品は、上記した本発明の血管新生阻害活性を有する組成物を含有するものである。ハナビラタケは古くから食用・薬用とされてきたことから極めて安全な素材である。この点から、血管新生阻害活性を有する組成物の使用量は厳しく制限されるものではないと考えられるが、概ね、下限は予防又は治療という目的に応じた効果を発揮しうる量を、上限は摂取のしやすさ、経済性等の観点から実際的な量を基準とし、通常、ハナビラタケ乾燥物に換算して成人１日あたり約０．０１ｇ〜約１００ｇ、好ましくは約０．１ｇ〜約１０ｇを摂取すればよい。もちろん、摂取する者の年齢、体重、症状、投与期間、治療経過等に応じて変化させることもできる。１日あたりの量を数回に分けて摂取することもできる。【００５０】
本発明の飲食品は、加工飲食品、医薬部外品、医薬品に用いられる水性成分、油性成分、植物抽出液、動物抽出液、粉末、界面活性剤、油剤、アルコール、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の血管新生阻害活性を有する組成物とともに原材料に配合することにより調製される。形態としては、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁剤、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤などの健康飲食品類；麺類；パン類；無果汁飲料、果汁入り飲料、乳酸菌飲料、茶類飲料、コーヒー飲料、豆乳飲料、スープ類等の飲料類；スナック、クッキー、ガム、キャンディー等の菓子類；アイスクリーム、シャーベット、みぞれなど冷菓類；プリン、ババロア、ゼリー、ヨーグルト、ケーキなどのデザート食品類及びその他のインスタント食品とすることができる。【００５１】
本発明の飲食品は、本発明の血管新生阻害活性を有する組成物及び上記した成分などのほかに、さらに、鉄、カルシウム等の無機成分、種々のビタミン類、オリゴ糖、キトサン等の食物繊維、大豆抽出物等のタンパク質、レシチンなどの脂質、ショ糖、乳糖等の糖類、乳酸菌を含んでいてもよい。【００５２】
また本発明の飲食品は、既存の健康食品類、飲料類、菓子類、冷菓類、デザート類及びその他インスタント食品類に、上記した本発明のβ−グルカン含有組成物を含む血管新生阻害剤を含ませることによっても得ることができる。【００５３】
さらに本発明の飲食品は、上記した本発明の血管新生阻害活性を有する組成物のほかに、他の血管新生阻害成分（他のキノコ類から同様に抽出したβ−グルカン含有組成物を含む血管新生阻害剤を含む）や、転移阻害剤、抗悪性腫瘍剤、抗サイトカイン剤、抗炎症成分、他の有効成分を含ませるものであってもよく、そうした場合、腫瘍壊死因子(TNF-α)、インターロイキン-8(IL-8)など複数の血管新生促進因子も同時に抑制することができることから、より高い血管新生病予防効果及び治療効果を有する飲食品とすることができる。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明の実施例を挙げるが、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００５５】
製造例１〔ハナビラタケ子実体の製造〕
ハナビラタケ子実体を以下のようにして製造した。カラマツの大鋸屑、小麦粉、栄養分(バナナ、蜂蜜、エビオス、ペプトン、塩化カルシウム、ハイポネックス)及び水を、大鋸屑:小麦粉:栄養分:水=100:11.5:1.9:51の重量比で含む菌床基材を準備した。この菌床基材(520g)を、850ml容のポリプロピレン製の培養瓶に入れ、常法に従って培養瓶を滅菌した後に、ハナビラタケの種菌(16g)を接種した。その後、この培養瓶を、23℃の温度下で、56日間放置することによりハナビラタケ子実体を収穫した。子実体の重量は培養瓶1本当たり140gであった。【００５６】
製造例２〔ハナビラタケ菌糸体の製造〕
ハナビラタケ菌糸体を以下のようにして製造した。イーストエキス0.4質量％、グルコース2質量％、リン酸2水素カリウム0.1質量％、リン酸水素2ナトリウム0.1質量％となるように水に溶解し、1Nの塩化水素でpH5.0に調製し、500ml容三角フラスコにそれぞれ200ml入れ、常法に従って滅菌した。この液体培地にハナビラタケの種菌を生育させた平板培地から径6ｍｍの寒天片を打ち抜き、その一片を接種し、24℃の暗黒下で、21日間振とう培養(100rpm)することによりハナビラタケ菌糸体を収穫した。菌糸体の乾燥重量は三角フラスコ１本当たり2ｇであった。【００５７】
実施例１〔ハナビラタケ子実体からのβ−グルカン含有物の抽出〕
ハナビラタケのβ−グルカン含有画分を以下のようにして抽出した。製造例１のハナビラタケ子実体を凍結乾燥後、石臼を用いて粉末化した。この0.25gを250mlの0.08Mリン酸緩衝液(pH6.0)に懸濁し、耐熱性α−アミラーゼ（SIGAM社製）を50μl添加して100℃で30分間反応させた。これを室温まで放冷した後、NaOH溶液を用いてpH7.5に再調整し、プロテアーゼ溶液(50mg/ml；SIGMA社製)を50μl添加して60℃で30分間反応させた。これを再度室温まで放冷し、HCl溶液を用いてpH4.3に再調整し、アミログルコシダーゼ液(SIGMA社製)を50μl添加して60℃で30分間反応させた。得られた酵素処理液に終濃度が80%になるようにエタノールを添加し、室温下に１時間静置後、遠心分離（8000×g、10分）によって沈殿物を得た。この沈殿をイオン交換水に再懸濁し、蒸留水に対する透析により塩や低分子性の物質を取り除いた。この透析内液を回収し、再度終濃度が80%になるようにエタノールを添加し、室温に１時間静置後、再度遠心分離（8000×g、10分）によって沈殿物を得た。この沈殿物を真空乾燥させ、得られた画分をβ−グルカン含有物とした。なお、本画分の収量は1.54g、収率は61.6%であった。【００５８】
〔β−グルカン含有物の成分分析〕
製造例３で得たβ−グルカン含有物をイオン交換水に溶解し、糖含量、タンパク質含量をそれぞれフェノール硫酸法、ブラッドフォード法によって算出した。その結果、糖含量は94.0%、タンパク質含量は3.9%であった。【００５９】
試験例１〔血管新生阻害作用(in vivo〜DAS法)、オイカワ(Oikawa)ら、「Effects of cytogenin, a novel microbial product, on embryonic and tumor cell-induced angiogenic responses in vivo」、Anticancer Res.、(1997)、17:1881-1886の方法を一部改変〕
実施例１で得られたハナビラタケ子実体由来β−グルカン含有物を含む組成物のin vivoにおける血管新生阻害作用を検討するため、Dorsal Air Sac（DAS）法により検討した。【００６０】
すなわち、ディフュージョンチャンバーリング（外径14 mm、内径10 mm、高さ2 mm、ミリポア製）の両面に、MFセメント（ミリポア製）を用いてメンブレンフィルター（ポアサイズ0.45μm、ミリポア製）を接着させ、内部に空洞を有するチャンバーを作製し、乾燥後、EOG滅菌した。その後、このチャンバーに、PBSに1.33×107個/mlの濃度で懸濁したB16-F10細胞（ATCCより購入）を注射器で150μl注入し、注入口をナイロン棒で封入した。細胞注入後のチャンバーは、マウスに移植するまで氷冷PBS中に静置した。なお、陰性対照としては、B16-F10細胞の代わりにPBSを注入したチャンバーを用いた。【００６１】
マウスへのB16-F10細胞注入チャンバーの移植は以下のように行った。まず、予め背部を剃毛しておいたICRマウス(メス、7週齢、日本エスエルシー)の背部皮下に26G針と注射筒を用いて尾根部から空気を8ml注入した。尾根部から頭側に1.5cmのところで皮膚を体軸と垂直方向に切開し、先のチャンバーを背部皮下に１匹当たり2個移植した。切開した皮膚はスキンステープラーによって縫合したのち、ポビドンヨード(イソジン液)で消毒した。【００６２】
なお試験群は、1)：PBS／水群(陰性対照群)、2)：B16-F10／水群（陽性対照群）、3)：B16-F10／β−グルカン低用量群、4)：B16-F10／β−グルカン高用量群の4群とし、チャンバー移植6日前から1)群と2)群は水を、3)群と4)群はハナビラタケβ−グルカン（それぞれ8mg/kg/day、160mg/kg/day)を、それぞれ移植6日後まで胃ゾンデを用いて連日経口投与（1回／日）した。【００６３】
移植後７日目にチャンバーを皮膚から丁寧に剥離し、チャンバー移植部位の新生血管数をカウントした。なお、長さ3mm以上の蛇行した血管をチャンバー移植に伴う新生血管とし、その本数をチャンバー移植部位ごとにカウントした。そして、群ごとに１チャンバー当たりの平均新生血管数と標準誤差を求めた。【００６４】
結果を、以下の図１に示す。図中、異なる記号を付した群間には統計学的な有意差（p<0.05）があることを示す。【００６５】
図１より、ハナビラタケの子実体由来のβ−グルカン含有物は、in vivoにおいて、癌細胞によって誘導される血管新生を顕著に阻害することが示された。【００６６】
試験例２〔血管新生阻害作用(in vivo〜マトリゲルプラグ法)、キムラ(Kimura)ら、「Isolation of an anti-angiogenic substance from Agaricus blazei Murill: Its antitumor and antimetastatic actions」、(2004)、Cancer Sci.、95:758-764の方法に準ずる〕
実施例１で得られたハナビラタケ子実体由来β−グルカン含有物につき、上記した実施例１とは異なる実験系でも血管新生阻害作用が認められるかどうかを確認するため、マトリゲルプラグ法によりさらに検討した。【００６７】
すなわち、VEGF(20ng/ml)とヘパリン(32U/ml)をマトリゲル（日本BD製）に混合して氷上に静置し、その0.5mlを麻酔下の7週齢の雌性C57BL/6Jマウス（日本クレア）に皮下注射して血管新生を誘導した。なお、陰性対照群にはVEGFを添加していないマトリゲルを同様に皮下注射した。【００６８】
試験群は、1)：マトリゲル／水群(陰性対照群)、2)：VEGF添加マトリゲル／水群（陽性対照群）、3)：VEGF添加マトリゲル／β−グルカン低用量群、4)：VEGF添加マトリゲル／β−グルカン高用量群の4群とし、チャンバー移植6日前から1)群と2)群は水を、3)群と4)群はハナビラタケβ−グルカン（それぞれ40mg/kg/day、160mg/kg/day)を、それぞれ移植6日後まで胃ゾンデを用いて連日経口投与（1回／日）した。【００６９】
移植後７日目にマトリゲルを摘出し、その重量を測定した。また、マトリゲル中のヘモグロビン含量をヘモグロビンアッセイキット（フナコシ製）により測定した。各測定結果について、群ごとに平均値と標準誤差を求めた。【００７０】
結果を、以下の図２と図３に示す。図中、異なる記号を付した群間には統計学的な有意差（p<0.05）があることを示す。【００７１】
図２及び図３より、ハナビラタケの子実体由来のβ−グルカン含有物は、in vivoにおいて、VEGFによって誘導される血管新生を顕著に阻害することが示された。【００７２】
試験例３〔転移阻害作用(in vivo)〕
実施例１で得られたハナビラタケ子実体由来β−グルカン含有物につき、転移阻害作用を検討した。【００７３】
すなわち、5週齢の雌性C57BL/6Jマウスの右足裏の皮下にB16-BL6細胞(大阪大学医学部保健学科より分譲)を1.5×105個移植した。移植後は腫瘍サイズを以下の式１に従って継時的に計測し、群ごとに平均値と標準誤差を求めた。移植24日後には腫瘍塊ごと右脚を切除し、さらにマウスの飼育を継続した。移植から45日後にマウスを屠殺し、肺への転移コロニー数を実体顕微鏡下で計測し、群ごとに平均値と標準誤差を求めた。【００７４】
【数１】
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【００７５】
試験群は、1)：対照群、2)：β−グルカン低用量(40mg/kg/day)群、3)：β−グルカン高用量(160mg/kg/day)群とした。投与はB16-BL6細胞を移植する5日前からマウスを屠殺する前日まで、胃ゾンデを用いて連日経口投与（1回／日）した。なお、対照群にはPBSを投与した。【００７６】
結果を図４及び図５に示す。統計学的な有意差はアスタリスクで示す。【００７７】
図４及び図５より、ハナビラタケの子実体由来のβ−グルカン含有物は、腫瘍の増殖や転移を顕著に阻害することが示された。【００７８】
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、2006年12月25日出願の日本特許出願（特願2006−347695）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明は、血管新生病の治療に有効な、優れた血管新生阻害活性と安全性を有する組成物を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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