(57)【要約】  本発明は、種々の活性成分を安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達することを可能とする組成物に関する。より詳しくは、本発明は、イオントフォレーシスにより活性成分を生体に投与するための組成物であって、リポソームに封入された活性成分を含んでなり、かつ該リポソームが、カチオン性脂質、ならびに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を構成成分として含んでなる組成物に関する。
2008053983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオントフォレーシスにより活性成分を生体に投与するための組成物であって、
リポソームに封入された前記活性成分を含んでなり、
前記リポソームが、カチオン性脂質、ならびに
飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質
を構成成分として含んでなる、組成物。
【請求項２】
毛孔を介して前記活性成分を生体に投与するための、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カチオン性脂質が、Ｃ１〜Ｃ２２アシルオキシ基およびトリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基で置換されたＣ１〜Ｃ２０アルカンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記カチオン脂質における前記Ｃ１〜Ｃ２２アシルオキシ基が２個であり、前記トリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基が１個である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記カチオン性脂質が１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記両親媒性グリセロリン脂質がホスファチジルコリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記両親媒性グリセロリン脂質が卵黄ホスファチジルコリンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記飽和脂肪酸がＣ１２〜Ｃ２２の飽和脂肪酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記飽和脂肪酸が、パルミチン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記不飽和脂肪酸が炭素−炭素不飽和二重結合を１〜６個含むものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記不飽和脂肪酸がＣ１４〜Ｃ２２の不飽和脂肪酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記不飽和脂肪酸が、オレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リポソームが構成成分としてステロール類をさらに含んでなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ステロール類が、コレステロール、Ｃ１２〜Ｃ３１脂肪酸コレステリルおよびＣ１２〜Ｃ３１脂肪酸ジヒドロコレステリルおよびポリオキシエチレンコレステリルエーテルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ステロール類が、コレステロール、ラノリン脂肪酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、マカデミアナッツ脂肪酸コレステリルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのものである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ステロール類がコレステロールである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記カチオン性脂質が、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパンであり、
前記両親媒性グリセロリン脂質が、卵黄ホスファチジルコリンであり、
前記ステロール類が、コレステロールである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質とのモル比が、３：７〜７：３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記カチオン性脂質と、ステロール類とのモル比が、３：７〜７：３である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記両親媒性グリセロリン脂質と、ステロール類とのモル比が、３：７〜７：３である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２１】
前記カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質およびステロール類の和とのモル比が、３：７〜７：３である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
前記カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質と、ステロール類とのモル比が、約２：１：１である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項２３】
前記リポソームの平均粒径が４００ｎｍ以上である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
前記リポソームの平均粒径が４００〜１０００ｎｍである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
前記リポソームが電流値０．１〜０．６ｍＡ／ｃｍ２でイオントフォレーシスにより生体に投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記活性成分が、薬物、色素、核酸、タンパク質、酵素、ペプチド、リポ多糖および菌体成分からなる群から選択されるものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
医薬として用いられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１に記載の組成物を保持している、イオントフォレーシスにより活性成分を生体に投与するための電極構造体。
【請求項２９】
請求項２７に記載の電極構造体を具備してなる、イオントフォレーシス装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、イオントフォレーシス（iontophoresis）によって各種活性成分を経皮的に投与する技術に関し、特に、イオントフォレーシスによって各種活性成分を安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達する上で有用な組成物に関するものである。
【０００２】
背景技術
生体の所定部位の皮膚ないし粘膜（以下、単に「皮膚」という）の表面上に配置されたイオン性の薬物に対してこのイオン性薬物を駆動させる起電力を皮膚に与えて、薬物を皮膚を介して体内に導入（浸透）させる方法は、イオントフォレーシス（iontophoresis、イオントフォレーゼ、イオン導入法、イオン浸透療法）と呼ばれている（特開昭６３−３５２６６号等参照）。
【０００３】
例えば、正電荷をもつイオンは、イオントフォレーシス装置の電気系統のアノード（陽極）側において皮膚内に駆動（輸送）される。一方、負電荷をもつイオンは、イオントフォレーシス装置の電気系統のカソード（陰極）側において皮膚内に駆動（輸送）される。
【０００４】
イオントフォレーシスによれば、肝臓の初回通過効果を回避でき、薬物等の投与の開始および中断も簡便に制御できる。そこで、近年、イオントフォレーシスは、局所作用のみならず、全身作用を目的とした投与方法として注目されている。
【０００５】
イオントフォレーシスにおいて、薬物は主に皮膚の角質層を介して生体に投与されるのが一般的である。しかしながら、角質層は脂溶性の高密度層であり、水溶性の高い物質やペプチド、核酸などの高分子を透過させることが困難な場合が少なくない。また、電荷を有しない物質はそのままではイオントフォレーシスを適用できないという問題がある。
【０００６】
種々の物理化学的性質を有する物質を経皮的に投与するため、イオントフォレーシスにおいて、荷電性のリポソームをキャリアーとして適用することが検討されている（Median VM et al., International Journal of Pharmaceutics, Dec. 8, 2005:306(1-2):1-14. Epub Nov. 2, 2005 Epub 2005 Nov 2. Review）。しかしながら、リポソームは粒子径が大きく、そのまま角質層を透過することは困難である。
【０００７】
一方、リポソームを効率的に経皮投与するため、皮膚表面から皮膚の深部にまで繋がる毛孔をターゲットとすることが知られている（例えば、Hoffman RT et al., Nat Med. 1995 Jul;1(7):705-706、Fleisher D et al, Life Sci. 1995;57(13):1293-1297を参照されたい）。
【０００８】
さらに、近年、イオントフォレーシスにおいても、毛孔を介してリポソームを投与することが検討されている。
例えば、Protopapa EE らは、酵素を封入したリポソームを、イオントフォレーシスにより毛孔中の毛母幹細胞へ送達したことを報告している（Protopapa EE et al., J Eur Acad Dermatol Venereol. 1999 Jul;13(1):28-35；非特許文献４）。
【０００９】
また、Han Iらは、光線力学治療用薬剤である５−アミノレブリン酸を封入したリポソームを、イオントフォレーシスにより毛孔上部の毛孔脂腺等に送達したことを報告している（Han I et al., Arch Dermatol Res. 2005 Nov;295(5):210-217. Epub 2005 Nov 11）。
【００１０】
さらに、Han Iらは、毛孔関連腫瘍用の治療剤であるアドリアマイシンを封入したリポソームを、イオントフォレーシスにより毛孔へ投与したことを報告している（Han I et al., Exp Dermatol. 2004 Feb;13(2):86-92；非特許文献６）。
【００１１】
毛孔をターゲットとした従前のイオントフォレーシスでは、皮膚関連疾患等を治療対象とし、皮膚組織の上部に薬物を送達させることを主目的としている。しかしながら、イオントフォレーシスにおいて全身作用を目的として薬物等を投与する場合、毛孔深部に存在する皮下血管を介して全身循環系へ薬物を送達することが望まれる。また、例えば、毛孔周辺内組織内に存在するランゲルハンス細胞等をターゲットとして抗体産生惹起を目的とする場合、ワクチン等の薬物を確実に毛孔周辺内組織に送達することが求められる。したがって、毛孔をターゲットとしたイオントフォレーシスにおいて、安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺内組織に薬物を封入したリポソームを送達する重要な課題である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、今般、一定の構成を有するリポソームに活性成分を封入してイオントフォレーシスに適用することにより、活性成分を安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達することができるとの知見を得た。
本発明はかかる知見に基づくものである。
【００１３】
したがって、本発明は、イオントフォレーシスにおいて、薬物等の活性成分を安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達することを可能とする組成物を提供することを目的とするものである。
【００１４】
そして、本発明による、イオントフォレーシスにより活性成分を生体に投与するための組成物は、
リポソームに封入された前記活性成分を含んでなり、
前記リポソームが、カチオン性脂質、ならびに
飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質
を構成成分として含んでなる。
【００１５】
このように本発明による組成物においては、活性成分を一定の構成を有するリポソームによって封入したので、活性成分をイオントフォレーシスにより安定かつ効率的に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明によるイオントフォレーシス装置を用いたin vitro皮膚透過試験の概要を示す図である。
【図２】ラット皮膚にin vitroで投与された、本発明におけるリポソーム外層中のＮＢＤ（4-chloro-7-nitrobenzofrazan）の蛍光のＣＬＳＭ写真（×１０）である。
【図３】ラット皮膚にin vitroで投与された、本発明におけるリポソームの内層中のSulfo rhodamine Ｂの蛍光のＣＬＳＭ写真（×１０）である。
【図４】ラット皮膚にin vitroで投与された、Sulfo rhodamine Ｂの蛍光のＣＬＳＭ写真（×１０）である。
【図５】本発明によるイオントフォレーシス装置を用いたin vivo皮膚透過試験の概要を示す図である。
【図６】ラット皮膚にin vivoで投与された、本発明におけるリポソームの内層中のSulfo rhodamine Ｂの蛍光のＣＬＳＭ写真（×１０）である。
【図７】ラット皮膚にin vivoで投与された、Sulfo rhodamine Ｂの蛍光のＣＬＳＭ写真（×１０）である。
【発明の具体的説明】
【００１７】
本明細書において、特に断らない限り、基または基の一部における「Ｃ」とは基または基の一部における「炭素の総数」を意味する。したがって、例えば、「Ｃ１〜Ｃ６の飽和脂肪酸」とは、「総炭素数が１〜６個の飽和脂肪酸」を意味し、「Ｃ１２〜３１脂肪酸コレステリル」とは、「総炭素数が１２〜３１個の脂肪酸」を有する脂肪酸コレステリルを意味する。
【００１８】
また、基または基の一部としての「アルキル」、「アルケニル」または「アルキニル」という語は、基が直鎖状、分枝鎖状、または環状のアルキル、アルケニルまたはアルキニルを意味し、好ましくは直鎖状または分枝鎖状であり、より好ましくは直鎖状である。
【００１９】
また、「脂肪酸コレステリル」または「脂肪酸ジヒドロコレステリル」において、脂肪酸は飽和または不飽和であってよい。さらに、上記脂肪酸は、直鎖状、分枝鎖状、または環状の脂肪酸であってよい。そして、「脂肪酸コレステリル」における脂肪酸は、好ましくは直鎖状であり、「脂肪酸ジヒドロコレステリル」における脂肪酸は、好ましくは直鎖状である。
【００２０】
また、特に断らない限り、「アリール」とは、フェニルまたはナフチルを意味し、「ヘテロアリール」という語は、特に断らない限り、１−３個の窒素、酸素若しくは硫黄原子を含む５−６員ヘテロアリール（５−６員環芳香族複素環基）を意味する。
【００２１】
「前面」とは、リポソームの投与に際して電極構造体内を流れる電流の経路上における生体皮膚に近い側を意味する。
【００２２】
イオントフォレーシス用組成物
上述したように、本発明による組成物は、リポソームに封入された活性成分を含んでなり、かつリポソームが、カチオン性脂質、ならびに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を構成成分として含んでなることを一つの特徴とするものである。このような一定の構成成分を含有するリポソームが、活性成分を安定に毛孔の深部および毛孔周辺皮内組織に送達するのに有利であることは意外な事実である。
【００２３】
そして、本発明におけるリポソームの構成成分であるカチオン脂質は、好ましくはＣ１〜Ｃ２０アシルオキシ基およびトリＣ１〜Ｃ４アルキルアンモニウム基で置換されたＣ１〜Ｃ２０アルカンである。
さらに、上記Ｃ１〜Ｃ２０アルカンは、好ましくはＣ１〜Ｃ５アルカンであり、より好ましくはＣ１〜Ｃ３アルカンである。
【００２４】
また、上記Ｃ１〜Ｃ２０アルカンにおいて、置換基としてのＣ１〜Ｃ２０アシルオキシ基は、１〜４個であり、より好ましくは２個である。また、上記Ｃ１〜Ｃ２２アシルオキシ基は、好ましくはＣ１〜Ｃ２０アシルオキシ基であり、より好ましくはＣ１〜Ｃ１８アシルオキシ基である。
【００２５】
また、上記Ｃ１〜Ｃ２２アシルオキシ基としては、具体的には、アルキルカルボニルオキシ基、アケニルカルボニルオキシ基、アルキニルカルボニルオキシ基、アリールカルボニルオキシ基またはヘテロアリールカルボニルオキシ基等が挙げられるが、好ましくはアルキルカルボニルオキシ基、アケニルカルボニルオキシ基、アルキニルカルボニルオキシ基であり、より好ましくはアケニルカルボニルオキシ基である。
【００２６】
また、上記Ｃ１〜Ｃ２０アルカンにおいて、置換基としてのトリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基は、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１個である。また、上記トリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基は、好ましくはトリＣ１〜Ｃ４アルキルアンモニウム基である。また、上記トリアルキルアンモニウム基の対イオンとしては、特に限定されないが、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオン、亜硫酸イオンおよび亜硝酸イオン等が挙げられ、好ましくは塩素イオン、臭素イオンおよびヨウ素イオンである。
【００２７】
より具体的には、カチオン脂質としては、好ましくは、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン（1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane：ＤＯＴＡＰ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（dioctadecyldimethylammonium chloride：ＤＯＤＡＣ）、N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル-N,N,N,-トリメチルアンモニウム（N-（2,3-dioleyloxy）propyl-N,N,N-trimethylammonium：ＤＯＴＭＡ）、ジドデシルアンモニウムブロミド（didodecylammonium bromide：ＤＤＡＢ）、1,2-ジミリストイルオキシプロピル1-3-ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（1,2-dimyristoyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethyl ammonium：ＤＭＲＩＥ）、2,3-ジオレオイルオキシ-N-[2(Ｓペルミンカルボキサミド)エチル]-N,N-ジメチル-1-プロパナミウムトリフルオロアセテイト（2,3-dioleyloxy-N-[2（sperminecarboxamido）ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminum trifluoroacetate：ＤＯＳＰＡ）であり、より好ましくはＤＯＴＡＰである。
【００２８】
また、本発明における両親媒性グリセロリン脂質は、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含むことを一つの特徴とする。両親媒性グリセロリン脂質としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルイノシトール等が挙げられ、好ましくはホスファチジルコリンであり、より好ましくは卵黄ホスファチジルコリンである。
【００２９】
また、両親媒性グリセロリン脂質の構成脂肪酸のうち、飽和脂肪酸としては、好ましくはＣ１２〜Ｃ２２の飽和脂肪酸であり、より好ましくはＣ１４〜Ｃ１８の飽和脂肪酸である。具体的には、飽和脂肪酸は、好ましくはパルミチン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、より好ましくはパルミチン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸またはステアリン酸である。
【００３０】
また、両親媒性グリセロリン脂質の構成脂肪酸のうち、不飽和脂肪酸としては、好ましくはＣ１４〜Ｃ２２の不飽和脂肪酸であり、より好ましくはＣ１４〜Ｃ２０の不飽和脂肪酸である。さらに、上記不飽和脂肪酸は、好ましくは炭素−炭素二重結合を１〜６個、より好ましくは１〜４個含むものである。
【００３１】
具体的には、不飽和脂肪酸は、好ましくはオレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、より好ましくはオレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸およびアラキドン酸である。
【００３２】
また、本発明の別の好ましい態様によれば、両親媒性グリセロリン脂質において、飽和脂肪酸が、パルミチン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸およびステアリン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、不飽和脂肪酸が、オレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸およびアラキドン酸からなる群から選択される少なくとも一つのものである。
【００３３】
本発明のより好ましい態様によれば、リポソームは、構成成分としてステロール類をさらに含んでなる。本発明におけるステロール類は、好ましくはコレステロール、Ｃ１２〜Ｃ３１脂肪酸コレステリルおよびＣ１２〜Ｃ３１脂肪酸ジヒドロコレステリル、ポリオキシエチレンコレステリルエーテルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのものであり、より好ましくは、コレステロール、ラノリン脂肪酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、マカデミアナッツ脂肪酸コレステリルおよびジヒドロコレステロールポリエチレングリコールエーテル（具体的にはジヒドロコレス−３０等が挙げられる）からなる群から選択される少なくとも一つのものであり、さらに好ましくはコレステロールである。
【００３４】
構成成分の組み合わせ
本発明におけるリポソームは、上述のように、カチオン性脂質、ステロール類、ならびに飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を、いずれも構成成分として含んでいることが好ましい。
【００３５】
そして、本発明のより好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、２個のＣ１〜Ｃ２２アシルオキシ基および１個のトリＣ１〜Ｃ６アルキルアンモニウム基により置換されたＣ１〜Ｃ２０アルカン；ステロール類；Ｃ１２〜Ｃ２２の飽和脂肪酸、およびＣ１４〜Ｃ２２の不飽和脂肪酸であって、炭素−炭素不飽和二重結合を１〜６個のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００３６】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン；コレステロール、ラノリン脂肪酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、マカデミアナッツ脂肪酸コレステリルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのステロール類；Ｃ１２〜Ｃ２２の飽和脂肪酸、およびＣ１４〜Ｃ２２の不飽和脂肪酸であって、炭素−炭素不飽和二重結合を１〜６個のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００３７】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン；ステロール類；パルミチン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸からなる群から選択される少なくとも一つの飽和脂肪酸、およびオレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される少なくとも一つの不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００３８】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン；コレステロール、ラノリン脂肪酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、ノナン酸コレステリル、マカデミアナッツ脂肪酸コレステリルおよびポリオキシエチレンジヒドロコレステリルエーテルからなる群から選択される少なくとも一つのステロール類；パルミチン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ツベルクロステアリン酸、アラキジン酸およびベヘン酸からなる群から選択される少なくとも一つの飽和脂肪酸、およびオレイン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エルカ酸、ネルボン酸、リノール酸、α-リノレン酸、エレオステアリン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、イワシ酸およびドコサヘキサエン酸からなる群から選択される少なくとも一つの不飽和脂肪酸のいずれも構成脂肪酸として含む両親媒性グリセロリン脂質を含んでなる。
【００３９】
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、上記両親媒性グリセロリン脂質がホスファチジルコリンである。
また、本発明のさらに好ましい態様によれば、リポソームの構成成分は、１,２−ジオレオイルオキシ−３−(トリメチルアンモニウム)プロパン、コレステロール、卵黄ホスファチジルコリンを含んでなる。
【００４０】
また、本発明におけるリポソームにおいて、カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質とのモル比は、イオントフォレーシスにおけるリポソームの安定性および送達効率を勘案すれば、好ましくは３：７〜７：３であり、より好ましくは４：６〜６：４である。
また、リポソームがステロール類を含む場合、カチオン性脂質と、ステロール類とのモル比は、好ましくは３：７〜７：３であり、より好ましくは４：６〜６：４である。また、本発明におけるリポソームにおいて、両親媒性グリセロリン脂質と、ステロール類とのモル比は、好ましくは３：７〜７：３であり、より好ましくは４：６〜６：４である。また、本発明におけるリポソームにおいて、カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質およびステロール類の和とのモル比は、好ましくは３：７〜７：３であり、より好ましくは４：６〜６：４である。また、本発明の一つの態様によれば、カチオン性脂質と、両親媒性グリセロリン脂質と、ステロール類とのモル比は、約２：１：１である。
【００４１】
また、本発明におけるリポソームの平均粒径は、好ましくは約４００ｎｍ以上であり、より好ましくは４００〜１０００ｎｍである。リポソームの平均粒径は、例えば、動的光散乱法、静的光散乱法、電子顕微鏡観察法および原子間力顕微鏡観察法等の方法によって確認することができる。
【００４２】
また、本発明における活性成分は、リポソームに封入可能な限り、疎水性物質であっても水溶性物質であってもよく、さらに電荷を有していない物質であっても電荷を有している物質であってもよい。また、本発明における活性成分としては、リポソームに封入可能な限り、低分子化合物のみならず、核酸、ペプチド等の高分子化合物を用いることができる。活性成分の好ましい例としては、薬物（ワクチン、発毛剤、育毛剤、脱毛剤、ホルモン等）、色素、核酸（DNA、RNA、PNA等）、ペプチド、タンパク質、酵素、リポ多糖および菌体成分等が挙げられる。上記菌体成分としては、例えば、細胞壁画分、線維状構造画分、線毛成分画分、グルコシルトランスフェレース（ＧＴＦ）画分、プロテイン抗原画分が挙げられるが、これらは抗原として使用することができる。リポソームに封入する活性成分の量は、活性成分の物理化学的性質や投与量等を考慮して適宜決定することができる。
【００４３】
本発明におけるリポソームおよびこれを含む組成物の製造方法としては、例えば、以下の方法を用いることができる。まず、カチオン性脂質、両親媒性グリセロリン脂質および所望によりステロール類を、ＣＨＣｌ３等の有機溶媒中に所望の比率で混合し、懸濁液を得る。この懸濁液を減圧留去した後、有機溶媒の添加および減圧留去を繰り返し、脂質フィルムを得る。次に、脂質フィルムに、１０〜５０ｍＭのＨＥＰＥＳ(2-[4-(2-hydroxyethy)-1piperazinyl] ethanesulfonic acid)等のバッファーおよび所望の量の活性成分を添加する。得られた混合液を室温で１０分間放置して水和させ、ソニケーションを行う。ソニケーションの条件としては、例えば、８５Ｗ、室温、１分間程度が挙げられるが、これに限定されない。さらに混合液をメンブランフィルターやエクストリューダー等により処理して粒径を調節し、本発明におけるリポソームを得る。さらに、得られたリポソームを薬理学的に許容可能な担体等とともに、さらに適宜混合し、本発明による組成物を得ることができる。
【００４４】
本発明に用いられる薬理学的に許容可能な担体としては、イオントフォレーシスによるリポソームの投与を妨げない限り特に限定されないが、例えば、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、ＨＥＰＥＳ等の緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、抗酸化剤および着色剤等の添加剤等が挙げられる。さらに、本発明による組成物は、イオントフォレーシスによるリポソームの投与を妨げない限り、所望により適当な剤型とすることができる。しかしながら、イオントフォレーシスによる効率的なリポソームの投与を勘案すれば、ＨＥＰＥＳバッファーや後述する電解液とともに溶液または懸濁液とすることが好ましい。上述のような本発明による組成物は、リポソームに封入される活性成分の種類、性質に応じて、種々の用途に適用することができる。また、活性成分を薬物とした場合、本発明による組成物は、医薬として用いられる。したがって、本発明の別の態様によれば、医薬組成物の製造のための、本発明におけるリポソームの使用が提供される。本発明におけるリポソームは、毛孔の深部や皮内組織への安定かつ効率的な送達を可能とすることから、局所疾患の治療や皮内ワクチンへの応用、さらには全身作用を必要とする種々の疾患の治療等に有利に利用することができる。
【００４５】
また、本発明のさらに別の態様によれば、イオントフォレーシスにより活性成分を生体に投与する方法であって、本発明による組成物を生体の皮膚表面に配置し、上記皮膚に通電することを少なくとも含んでなる方法が提供される。上記方法において、組成物中のリポソームに封入された活性成分は、毛孔を介して生体に投与される。
【００４６】
本発明による組成物を皮膚表面に配置する方法としては、例えば、組成物をそのまま皮膚に塗布してもよく、イオントフォレーシス装置の電極構造体に組成物を保持させ、この電極構造体を皮膚表面に配置してもよい。活性成分を封入した本発明におけるリポソームは、そのまま通電してイオントフォレーシスに用いてもよく、本発明にはかかる態様も包含される。
【００４７】
通電においては、本発明におけるリポソームはカチオン性であるため、電気系統の陽極側において陽電流を印加することが好ましい。通電条の際、その電流値は、好ましくは０．１〜０．６ｍＡ／ｃｍ２であり、より好ましくは０．３〜０．５ｍＡ／ｃｍ２であり、さらに好ましくは約０．４５Ａ／ｃｍ２である。また、通電時間は、好ましくは０．５〜１．５時間であり、より好ましくは０．７５〜１．２５時間であり、さらに好ましくは約１時間である。
【００４８】
また、上記生体としては、好ましくは哺乳類であり、より好ましくはラット、ヒトモルモット、ウサギ、マウスおよびブタであり、さらに好ましくはヒトである。
【００４９】
イオントフォレーシス用の電極構造体および装置
本発明による組成物は、上述の通り、イオントフォレーシス用の電極構造体に保持させて用いることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、本発明による組成物を保持している、イオントフォレーシスにより活性成分を生体に投与するための電極構造体が提供される。本発明におけるリポソームはカチオン性であり、電極構造体はイオントフォレーシス装置の電気系統の陽極側に接続される。したがって、本発明による電極構造体は、陽電極と、該陽電極の前面に配置された、本発明による組成物を保持している活性成分保持部とを少なくとも含んでなる。電極構造体においては、上記活性成分保持部を陽電極の前面に直接配置してもよく、イオントフォレーシスによるリポソームの投与を妨げない限り、陽電極と活性成分保持部との間にイオン交換膜等の他の部材を配置してもよい。このような他の部材を用いる電極構造体としては、例えば、陽電極と、陽電極の前面に配置された電解液を保持する電解液保持部と、該電解液保持部の前面に配置されたアニオン交換膜と、本発明による組成物を保持する活性成分保持部とを少なくとも含むものが挙げられる。さらに、上記活性成分保持部の前面には、所望によりカチオン交換膜をさらに配置してもよい。
【００５０】
さらに、本発明の別の態様によれば、上記電極構造体を具備してなる、イオントフォレーシス装置が提供される。該イオントフォレーシス装置は、電源装置と、電源装置に接続された、本発明による組成物を保持している電極構造体と、該電極構造体の対電極としての電極構造体とを少なくとも具備してなる。対電極としての電極構造体の構成は、イオントフォレーシスによるリポソームの投与を妨げない限り特に限定されないが、例えば、陰電極と、陰電極の前面に配置された電解液を保持する電解液保持部と、該電解液保持部の前面に配置されたイオン交換膜とから構成することができる。上記イオン交換膜は、アニオン交換膜またはカチオン交換膜であってよいが、好ましくはアニオン交換膜である。
【００５１】
上述のような、本発明による電極構造体およびイオントフォレーシス装置の具体例としては、後述する図１および図５ならびに本出願人による国際公開ＷＯ０３／０３７４２５Ａ１に記載されているもの等が挙げられる。
【００５２】
本発明によるイオントフォレーシス装置において、リポソームは、通電時には電場（電界）により陽電極の反対側へ泳動して、電極構造体から効率的に放出される。したがって、本発明の別の態様によれば、イオントフォレーシス装置の作動方法であって、本発明による電極構造体および該対電極としての電極構造体を生体の皮膚表面に配置し、イオントフォレーシス装置を通電し、本発明による電極構造体からリポソームを放出させる方法が提供される。
【００５３】
上記イオントフォレーシス装置において、活性成分保持部または電解液保持部は、本発明による組成物または電解液で満たされた、アクリル製等のセル（電極室）として構成してもよく、本発明による組成物または電解液を含浸保持する特性を有する薄膜体で構成してもよい。この薄膜体は、活性成分保持部および電解液保持部において同種の材料が使用可能である。
【００５４】
また、電解液としては、適用する活性成分等の条件に応じて適宜所望のものが使用できるが、電極反応により生体の皮膚に障害を与えるものは回避すべきである。本発明において好適な電解液においては、生体の代謝回路において存在する有機酸やその塩は無害性という観点から好ましい。例えば、乳酸、フマル酸等が好ましく、具体的には、１Ｍの乳酸と１Ｍのフマル酸ナトリウムの１：１比率の水溶液が好ましい。
【００５５】
また、活性成分保持部を構成する薄膜体としては、組成物や電解液を含浸し保持する能力が充分であり、所定の電場条件のもとで含浸保持したイオン化されたリポソームを皮膚側へ移行させる能力（イオン伝達性、イオン導電性）の能力が充分であることが重要である。良好な含浸保持特性と良好なイオン伝達性の双方を具備する材料としては、アクリル系樹脂のヒドロゲル体（アクリルヒドロゲル膜）、セグメント化ポリウレタン系ゲル膜、あるいはゲル状固体電解質形成用のイオン導電性多孔質シート（例えば、特開昭１１−２７３４５２に開示された、アクリロニトリルが５０モル％以上、好ましくは７０〜９８モル％以上であり、空隙率が２０〜８０％であるアクリルニトリル共重合体をベースにした多孔質重合体）等を挙げることができる。また、上記のような活性成分保持部を含浸させる場合、その含浸率（乾燥時の重量をＤ、含浸後の重量をＷとして場合の１００×（Ｗ−Ｄ）／Ｄ［％］）は、好ましくは３０〜４０％である。
【００５６】
本発明による組成物または電解液を活性成分保持部または電解液保持部において含浸させる条件は、電解液およびイオン性薬剤の含浸量、含浸速度等に応じて適宜決定される。
このような含浸条件としては、例えば、４０℃にて３０分とすることができる。
【００５７】
また、電極構造体の電極としては、例えば、炭素、白金のような導電性材料からなる不活性電極が好ましく用いられ得る。
【００５８】
また、電極構造体に使用されるイオン交換膜としては、カチオン交換膜とアニオン交換膜を併用することが好ましい。カチオン交換膜としては、好ましくは、（株）トクヤマ製ネオセプタ（ＮＥＯＳＥＰＴＡ，ＣＭ―１、ＣＭ―２、ＣＭＸ、ＣＭＳ、ＣＭＢ、ＣＬＥ０４−２）等が挙げられる。また、アニオン交換膜としては、好ましくは、（株）トクヤマ製ネオセプタ（ＮＥＯＳＥＰＴＡ，ＡＭ―１、ＡＭ―３、ＡＭＸ、ＡＨＡ、ＡＣＨ、ＡＣＳ、ＡＬＥ０４−２、ＡＩＰ−２１）等が挙げられる。また、他の好ましい例としては、多孔質フィルムの空隙部の一部または全部に、陽イオン交換機能を有するイオン交換樹脂が充填されたカチオン交換膜、または陰イオン交換機能を有するイオン交換樹脂が充填されたアニオン交換樹膜が挙げられる。
【００５９】
上述したような各構成材料等の詳細については、本出願人による国際公開ＷＯ０３／０３７４２５Ａ１に記載されており、本発明はこの文献に記載された内容を含めるものとする。
【実施例】
【００６０】
試験例１
リポソームの経毛孔送達における通電条件の検討
リポソームの調製
１０ｍＭ ＤＯＴＡＰ（ＡＶＡＮＴＩ社)のＣＨＣｌ３溶液 ３５０μＬ、１０ｍＭ コレステロール(以下、「Ｃｈｏｌ」という；ＡＶＡＮＴＩ社)のＣＨＣｌ３溶液  １５０μＬ、Ｒｈｏ−ＤＯＰＥ（1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N(lissamine  rhodamine B sulfonyl) のＣＨＣｌ３溶液６．４μＬを混合し、５００μＬのＣＨＣｌ３を添加して、懸濁液（モル比；ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ：Ｒｈｏ−ＤＯＰＥ＝７：３：０．１）を得た。この懸濁液をエバポレーターにより減圧留去した後、４００μＬのＣＨＣｌ３を添加して再度減圧留去し、脂質フィルムを得た。この脂質フィルムに１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー1mLを添加した。得られた混合液を室温で１０分間放置して水和した後、ソニケーション（アイワ医科工業(株)社製AU-25C超音波洗浄装置、８５Ｗ、室温、１分間）を行った。さらに混合液をポアサイズ４００ｎｍおよび１００ｎｍのＰＣメンブラン（製品名：Nuclepre Track-Etch Membrane、Whatman社製）を用い、エクストリューダー（製品名：Mini-Extruder、Avanti Polar Lipids, Inc.社製）により処理してリポソーム懸濁液を得た。【００６１】
通電試験
ＳＤラット（オス、１０週齢、日本クレア社製）の背中の毛を剃り、皮膚を採取した。
次に、この皮膚の表面には上記リポソーム懸濁液１００μLを塗布して皮膚をリポソーム懸濁液になじませた。次に、図１に示される通り、電源装置２と、作用電極構造体３と、対電極として非作用電極構造体４とを備えたイオントフォレーシス装置１を配置した。ここで、作用電極構造体３は毛孔６の存在する皮膚５の表面側に配置し、対電極として非作用電極構造体４は、皮膚５の裏面側に配置し、両電極構造体（３，４）はコード（７，８）を介して電源装置に接続した。作用電極構造体３は、陽電極３１と、陽電極３１の前面に配置された電解液1  ｍＬを保持する電解液保持部３２と、アニオン交換膜３３と、リポソーム懸濁液８５０μLを保持する活性成分保持部３４とから構成し、非作用電極構造体４は、陰電極４１と、陰電極４１に隣接して配置された電解液１ｍＬを保持する電解液保持部４２と、カチオン交換膜４３とから構成した。【００６２】
なお、活性成分保持部３４および電解液保持部（３２，４２）は、活性成分または電解液をその内部空間に保持することが可能な、アクリル製のセルを使用した。また、上記アニオン交換膜３３（製品名：ALE04-2、(株)トクヤマ製）およびカチオン交換膜４３（製品名：CLE04-2、(株)トクヤマ製）は予め生理食塩水中に保管していたものを使用した。
また、上記電解液は、フマル酸二ナトリウム（420mＭ）、Ｌ−アスコルビン酸2-リン酸エステル三ナトリウム（18.5mM）およびポリアクリル酸（0.4mM）を含んでなるものを使用した。【００６３】
次に、図１に示されるイオントフォレーシス装置１を、後述の表１中に記載の種々の条件により通電した。通電後、皮膚５をイオントフォレーシス装置から外し、表面を濾紙でふき取った後、皮膚切片を採取し、液体窒素を用いてOTC compound に包埋した。さらに、得られた凍結ブロックからクライオスタット（ＣＭ３０００、Leica社製）により厚さ１５μｍの切片を作成し、切片におけるrhodamineの蛍光を共焦点レーザー顕微鏡（ＣＬＳＭ）で観察した。【００６４】
イオントフォレーシス装置１の通電条件およびその試験の結果は、表１に示される通りであった。
なお、以下の表１において、＋＋とは毛孔の長さに対して50%以上深い部分にリポソームの送達が認められる状態であることを示し、＋とは毛孔の長さに対して0（毛孔入り口）から50%未満の深部にリポソームの送達が認められる状態であることを示し、−とは毛孔内にリポソームの存在が確認できない状態であることを示す。
【表１】
2008053983.tif 000003
【００６５】
表１の結果から、以下の試験では、通電条件１．４１ｍＡ（０．４５ｍＡ／ｃｍ２）、１時間を用いることとした。【００６６】
試験例２
リポソームの脂質組成の検討
リポソームの調製
以下の表２に示す脂質組成(モル比)のリポソームを調製した。なお、以下において、「EPC」とは卵黄ホスファチジルコリン（日本油脂製）であり、「DOPE」とは1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine（ＡＶＡＮＴＩ社製）であり、「CHEMS」とはCholesteryl hemisuccinate（ＡＶＡＮＴＩ社製）であり、「DOTAP」および「Chol」は上述の通りである。
【表２】
2008053983.tif 000004
【００６７】
リポソームの調製においては、各脂質を表２に記載のモル比となるように混合し、１mol% Rhodamine-DOPEを標識のために添加し、試験例１と同様の方法によりリポソームを得た。例えば、表２の（ｂ）においては、１０ｍＭ ＤＯＴＡＰのＣＨＣｌ３溶液 ３５０μＬと、１０ｍＭ ＣｈｏｌのＣＨＣｌ３溶液とを混合し、さらに、１mol% Rhodamine-DOPE（６．４μＬ）を標識のために添加した後、試験例１と同様の方法によりリポソームを得た。【００６８】
イオントフォレーシス試験
表２に記載のリポソームを用い、通電条件１．４１ｍＡ（０．４５ｍＡ／ｃｍ２）、１時間にてイオントフォレーシス試験を行った。なお、表２の（ａ）〜（ｈ）に記載のカチオン性リポソームを用いる場合、図１に示されるイオントフォレーシス装置1をそのまま用いた。一方、（ｉ）および（ｊ）に記載のアニオン性リポソームを用いる場合、イオントフォレーシス装置は、図１のイオントフォレーシス装置1において、作用電極構造体３の陽電極３１およびアニオン交換膜３３に代えて陰電極およびカチオン交換膜を配置し、非作用電極構造体４の陰電極４１およびカチオン交換膜４３に代えて陽電極およびアニオン交換膜を配置したものを用いた。【００６９】
結果は、表３に示される通りであった。なお、表３において、＋とは毛孔の長さに対して0（毛孔入り口）から50%未満の深部にリポソームの送達が認められる状態であることを示し、＋＋とは毛孔の長さに対して50〜75%の深い部分にリポソームの送達が認められる状態であることを示し、＋＋＋とは毛孔の長さに対して76〜100%以上深い部分にリポソームの送達が認められる状態であることを示し、−とは毛孔内にリポソームの存在が確認できない状態であることを示す。
【表３】
2008053983.tif 000005
【００７０】
表３に示される通り、ＤＯＴＡＰおよびＥＰＣを含む（ｃ）と、ＤＯＴＡＰ、ＥＰＣおよびＣｈｏｌを含む（ｆ）および（ｇ）が＋＋〜＋＋＋示した。【００７１】
試験例３
リポソームの粒径が経毛孔送達に与える影響の検討
種々の粒子径のリポソームの調製
表２の（ｆ）と同様の組成のリポソーム（DOTA／EPC／Chol=５／２．５／２．５）を、試験例１と同様の手法に従って調製した。次に、以下に記載の方法に従ってリポソームの粒径を調製した。【００７２】
３−ａ：粒径  約４００ｎｍ
試験例１において、混合液を室温で１０分間放置して水和する工程の後、得られた脂質フィルムをＶＯＲＴＥＸで３０秒処理し（Tube mixer TRIO HM-2F、Asone社製）、平均粒径 約４００ｎｍのリポソーム懸濁液を調製した。【００７３】
３−ｂ：粒径  約２５０ｎｍ
３−ａと同様の手法により、４００ｎｍのＰＣメンブランを用いてエクストリューダーにより処理し、平均粒径  約２００ｎｍのリポソーム懸濁液を得た後、この懸濁液を液体窒素より３０秒間凍結処理し、４０℃にて３分間融解処理することを３回繰り返し、平均粒径 約２５０ｎｍのリポソーム懸濁液を調製した。なお、平均粒径は、動的光散乱法（Photal ELS-8000HO、Otsuka electronics製）によって確認した。【００７４】
３−ｃ：粒径  約２００ｎｍ
３−ａで得られてリポソーム懸濁液を４００ｎｍのＰＣメンブランを用いてエクストリューダーにより処理し、平均粒径  約２００ｎｍのリポソーム懸濁液を得た。【００７５】
３−ｄ：粒径  約１５０ｎｍ
エクストリューダーで処理しない以外、試験例１と同様の手法により、平均粒径 約１５０ｎｍのリポソーム懸濁液を調製した。【００７６】
３−ｅ：粒径  約１００ｎｍ
試験例１と同様の手法により平均粒径 約１００ｎｍのリポソーム懸濁液を調製した。【００７７】
イオントフォレーシス試験
３−ａ〜３−ｅのリポソーム懸濁液を用いて、試験例２と同様の条件によりイオントフォレーシスを行った。【００７８】
結果は、表４に示される通りであった。なお、表４において、＋、＋＋＋は表３と同様の意味である。ここで、rhodamineの蛍光は、試験例１と同様に、ＣＬＳＭにより測定した。
平均粒径  約４００ｎｍのリポソームは、Bulge region等の毛孔深部へ送達されていた。
【表４】
2008053983.tif 000006
【００７９】
試験例４
リポソーム経毛孔送達のin vitro確認試験
リポソームの調製
外層がＮＢＤ（4-chloro-7-nitrobenzofrazan）により標識され、内層がSulfo rhodamine Ｂにより標識されたリポソームを以下の方法により調製した。【００８０】
１０ｍＭ ＤＯＴＡＰのＣＨＣｌ３溶液 ２５０μＬ、１０ｍＭ ＥＰＣのＣＨＣｌ３溶液 １２５μＬ、１０ｍＭＣｈｏｌのＣＨＣｌ３溶液 １２５μＬ、ＮＢＤ−ＤＯＰＥのＣＨＣｌ３溶液９．２μＬを混合し、５００μＬのＣＨＣｌ３をさらに添加して、懸濁液（ＤＯＴＡＰ：ＥＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＮＢＤ−ＤＯＰＥ＝７：３：０．１）を得た。この懸濁液をエバポレーターにより減圧留去した後、４００μＬのＣＨＣｌ３を添加して再度減圧留去し、脂質フィルムを得た。この脂質フィルムに２．５ｍＭ Sulfo rhodamineのＨＥＰＥＳバッファー溶液1ｍＬを添加した。得られた混合液を室温で１０分間放置して水和した後、８５Ｗ、室温、１分間にてソニケーション（AU-25C超音波洗浄装置、アイワ医科工業(株)製）を行った。さらに混合液をポアサイズ４００ｎｍおよび１００ｎｍのＰＣメンブラン（Nuclepre Track-Etch Membrane、Whatma製）を用い、エクストリューダー（Mini-Extruder、Avanti Polar Lipids, Inc.製）により処理して懸濁液を得た。さらに、この懸濁液を２０℃、５３００ｒｐｍ、４ｈｒの超遠心分離により処理し、遊離したSulfo rhodamineを除去した。【００８１】
イオントフォレーシス試験
上記リポソーム懸濁液を用いて、試験例３と同様の条件によりイオントフォレーシスを行った。なお、コントロールとしては、２．５ｍＭ Sulfo rhodamineのＨＥＰＥＳバッファー溶液を用いた。また、リポソームの外層を標識するＮＢＤの検出においては、λex＝４７５ｎｍおよびλem＝５４０ｎｍの波長を用い、Sulfo rhodamine Ｂの検出では、λex＝５７０ｎｍおよびλem＝５９０ｎｍの波長を用いて、共焦点型レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ； LSM510 META、Zeiss製）により写真（×１０）を撮影した。【００８２】
結果は、図２〜４に示される通りであった。図２〜４において、（Ａ）は皮膚切片の暗視野における水溶性蛍光色素（Rhodamine）および蛍光ラベル化脂質（NBD）の蛍光顕微鏡による写真であり、（Ｂ）は（Ａ）と同じ皮膚切片の明視野における顕微鏡による写真である。リポソーム懸濁液を用いた場合、リポソームの外層を標識するＮＢＤ（図２）と、その内層を標識するSulfo rhodamine Ｂ（図３）とは同様の位置で検出され、リポソームはその構造を保持したまま毛孔中に送達されていたことが確認された。一方、コントロールであるSulfo rhodamine Ｂ（図４）は、毛孔中において検出されず、そのままでは毛孔中に送達されないことが確認された。【００８３】
試験例５
リポソーム経毛孔送達のin vivo確認試験
リポソームの調製
試験例４と同様の手法によりリポソーム懸濁液を調製した。【００８４】
ＳＤラットを用いたイオントフォレーシス試験
ＳＤラット（オス、１０週齢、日本クレア製）に麻酔（ケタミン／キシラジン＝１０／１、１ｍｇ／体重ｋｇ）を投与し、背中の毛を剃った。次に、図５に示される通り、露出した皮膚５上に、電源装置２と、作用電極構造体３と非作用電極構造体４とから構成されるイオントフォレーシス装置１を配置した。ここで、露出した皮膚５と、作用電極構造体３との接触面には上記リポソーム懸濁液１００μLを予め塗布した。また、上記イオントフォレーシス装置１において、作用電極構造体３は試験例１と同様の構成であり、陽電極３１と、陽電極３１の前面に配置された電解液１ｍＬを保持する電解液保持部３２と、アニオン交換膜３３と、アニオン交換膜３３の前面に配置された、リポソーム懸濁液８５０μLを保持する活性成分保持部３４とから構成した。一方、非作用電極構造体４は、陰電極４１と、陰電極４１の前面に配置された電解液１ｍＬを保持する電解液保持部４２と、カチオン交換膜４３と、カチオン交換膜４３の前面に配置された生理食塩水８００μLを保持する電解液保持部４４と、電解液保持部４４の前面に配置されたアニオン交換膜４５とから構成した。また、上記アニオン交換膜３３，４５（ALE04-2、(株)トクヤマ製）およびカチオン交換膜４３（CLE04-2、(株)トクヤマ製）は予め生理食塩水中に保管していたものを使用した。【００８５】
次に、通電条件１．４１ｍＡ（０．４５ｍＡ／ｃｍ２）、１時間にてイオントフォレーシス試験を行った。通電終了３時間後、ＳＤラットを炭酸ガスにより安楽死させ、第１電極構造体３を配置した位置の皮膚５を採取し、試験１と同様の手法により皮膚切片を得た。この切片について、リポソームの外層を標識するＮＢＤ、およびSulfo rhodamine Ｂの検出を試験４と同様の手法により行った。【００８６】
結果は図６および図７に示される通りであった。図6および７において、（Ａ）は皮膚切片における水溶性蛍光色素（Rhodamine）および蛍光ラベル化脂質(NBD)の暗視野における蛍光顕微鏡による写真であり、（Ｂ）は（Ａ）と同じ皮膚切片の明視野における顕微鏡による写真である。in vivoにおいてもＮＢＤの蛍光（図６）と、およびSulfo rhodamine Ｂ（図７）の蛍光は、同様の位置において検出された。また、in vivo試験では、リポソームが毛孔から皮内へとその構造を保持したまま拡散していることが特に確認された。
【図１】
2008053983.tif 000007
【図５】
2008053983.tif 000008
【図２】
2008053983.tif 000009
【図３】
2008053983.tif 000010
【図４】
2008053983.tif 000011
【図６】
2008053983.tif 000012
【図７】
2008053983.tif 000013
【国際調査報告】
2008053983.tif 000014
2008053983.tif 000015
2008053983.tif 000016
2008053983.tif 000017