(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥由来のＩｇＹを含有してなる、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応抑制剤。
【請求項２】
鳥由来のＩｇＹの濃度が、０．０１〜１μｇ／μＬである請求項１に記載の非特異反応抑制剤。
【請求項３】
免疫測定法が、尿中の抗原を検出するための方法である請求項１又は２に記載の非特異反応抑制剤。
【請求項４】
抗原が、尿中の病原体抗原である請求項３に記載の非特異反応抑制剤。
【請求項５】
免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である請求項１〜４のいずれかに記載の非特異反応抑制剤。
【請求項６】
尿を被検体とし尿中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、非特異反応を抑制するために鳥由来のＩｇＹを含有してなる非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせることを特徴とする尿を被検体とした免疫測定法。
【請求項７】
免疫測定法が、尿中の被検出物質と特異的に結合する第一試薬、並びに尿中の被検出物質と特異的に結合する第二試薬及び標識物質からなる標識試薬を用いて尿中の被検出物質を特異的に検出する免疫測定法である請求項６に記載の免疫測定法。
【請求項８】
免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である請求項６又は７に記載の免疫測定法。
【請求項９】
非特異反応抑制剤が、イムノクロマトグラフ法における展開液として供給される請求項８に記載の免疫測定法。
【請求項１０】
非特異反応抑制剤が、クロマトグラフ媒体に固定されている請求項８に記載の免疫測定法。
【請求項１１】
免疫反応が、さらに界面活性剤の存在下で行われる請求項６〜１０のいずれかに記載の免疫測定法。
【請求項１２】
尿中の被検出物質が、尿中の抗原である請求項６〜１１のいずれかに記載の免疫測定法。
【請求項１３】
抗原が、尿中の病原体抗原である請求項１２に記載の免疫測定法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれかに記載の非特異反応抑制剤を含有してなる、尿を被検体とするイムノクロマトグラフ法における展開液。
【請求項１５】
尿中の被検出物質と特異的に結合する第一試薬が固定化された判定部位を有する尿を被検体としたクロマトグラフ媒体において、移動相を構成する液体が非特異反応抑制剤として鳥由来のＩｇＹを含有する構成となっていることを特徴とする、尿を被検体としたイムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体。
【請求項１６】
鳥由来のＩｇＹを含有してなる非特異反応抑制剤が、クロマトグラフ媒体に固定されている請求項１５に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項１７】
鳥由来のＩｇＹを含有してなる非特異反応抑制剤が、イムノクロマトグラフ法における展開液として供給される請求項１５に記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項１８】
鳥由来のＩｇＹの含有量が、１ストリップ当たり２〜２００μｇである、請求項１５〜１７のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項１９】
移動相を構成する液体が、さらに界面活性剤を含有する請求項１５〜１８のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項２０】
被検出物質と特異的に結合する第一試薬が、被検出物質の抗体である請求項１５〜１９のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項２１】
被検出物質が、尿中の病原体抗原である請求項１５〜２０のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
【請求項２２】
病原体抗原が、肺炎球菌由来の病原体抗原である請求項２１に記載のクロマトグラフ媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応を抑制するための、鳥由来のＩｇＹを含有してなる、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応抑制剤、及びそれを用いた免疫測定法に関する。
また、本発明は、尿を被検体としたイムノクロマトグラフ法における非特異反応を抑制するために鳥由来のＩｇＹを含有してなる非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせることができる、クロマトグラフ媒体、及びそのための展開液に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原抗体反応を利用した免疫測定法は微量成分を特異的に検出あるいは精度よく測定できることから、臨床検査に広く利用されている。特に、容易にかつ高感度で検出できる標識物質を用いた免疫測定法として、凝集法（血球やラテックスを担体として用いた方法）、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法等が知られている。
不溶性担体、放射性物質、酵素、螢光物質等を抗体に結合した標識抗体を用いるこれらの免疫測定法では、標識抗体は、一般に、抗体を固相に結合した固相化抗体と組み合わせて固相法に使用される。固相法には「固相化抗体−抗原−標識抗体」複合物を作らせ測定するサンドイッチ法や、固相化抗原と検体中の遊離抗原が反応系内に添加された一定量の標識抗体に対して競合的に反応することを原理とする競合法等がある。固相には、ポリスチレンマイクロプレート、ポリスチレンビーズ、磁性粒子、ガラスビーズ等を用いることができるが、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙等の多孔性物質を固相に用いたイムノクロマトグラフ法も知られている。
【０００３】
抗原抗体反応は、ある抗原決定基に対して誘導された抗体の抗原結合部位が、その抗原決定基と高い相補性をもつことにより生ずる、特異性の高い結合反応である。ところが、抗原抗体反応を利用した免疫測定においては、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異反応が生じ、測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められている。このような現象が起こる原因の１つには、被検出物質（抗原）以外の成分であるにもかかわらず、免疫測定に用いる抗体に結合する成分が、試料中に存在するという事実がある。例えば、試料中に存在する非特異因子が、標識抗体及び固相化抗体と反応して「固相化抗体−非特異因子−標識抗体」複合物を生じ、試料中に被検出物質が存在しないにもかかわらず、被検出物質が存在することを示す測定結果が得られることとなる（偽陽性、疑陽性）。
このような非特異因子は、被検出物質と特異的に反応する抗体のみならず、被検出物質と反応しない抗体とも結合する物質である。具体的な非特異因子としては、試料がヒトから採取されたものであり、被検出物質に対する標識抗体又は固相化抗体がマウスで作製された場合には、ヒト抗マウスＩｇＧ抗体、ヒト抗マウスＩｇＭ抗体等が挙げられる。非特異因子の例としては、異好性抗体（異種動物の抗原と反応する抗体）、リウマトイド因子（抗ＩｇＧ抗体）等が知られているが、成分が明らかとなっていない非特異因子も多く存在する。
【０００４】
試料中の非特異因子の存在は、微量成分を特異的かつ高感度に測定できるという免疫測定法の利点を損なうため、従来、非特異因子による非特異反応を抑制し正しい測定値を得るための様々な試みが行われてきた。
例えば、特許文献１には、マウスモノクローナル抗体を用いた免疫測定法において、非特異反応吸収剤としてマウス血清、マウス腹水等を用いる方法が記載されている。特許文献２では、免疫測定法に使用される標識抗体と同一の抗体を、抗体本来の特異的な結合活性を失活させて非特異反応吸収剤として用いる方法が記載されている。特許文献３では、例えばウサギ由来の抗体を用いた免疫測定法における非特異因子（例えば、ヒト抗ウサギＩｇＧ抗体）の吸収剤として、ウサギで作製した非特異因子に対する抗体を用いる方法が記載されている。特許文献４では、免疫測定法に用いる抗体の産生動物種とは異なるウシ科動物種の血液成分を非特異反応抑制剤として用いることが記載されており、特許文献５では、γ−グロブリンを折衝させる方法が記載されている。
【０００５】
また、特許文献６では、捕捉物質として断片化された抗体を用いる免疫反応測定において未重合のＩｇＧを存在させることで非特異反応を抑制する方法が開示されている。特許文献７では、免疫反応測定において捕捉物質として用いられる抗体のＦｃ部位に特異的結合能を有する抗体あるいはその断片をブロッキング剤として用い、捕捉物質として用いられる抗体のＦｃ部位をブロックし非特異反応が抑制された免疫反応測定用抗体が開示されており、またそのブロック抗体としてリウマチ因子との干渉能を有さないＩｇＧが断片化せずに効果を発揮することが記載されている。特許文献８では、捕捉物質としてＩｇＭモノクローナル抗体を用いるヘテロジーニアス酵素免疫測定において免疫反応用緩衝液中に非特異的ＩｇＭ抗体を共存させることで非特異反応を抑制するヘテロジーニアス酵素免疫測定法が開示されている。特許文献９では、非ヒト種の体液を含むサンプルを用いる免疫反応測定系においてマウスＩｇＧ、ロバＩｇＧあるいはウサギＩｇＧを含有するブロッキングバッファーを用いることで非特異反応を抑制できることが開示されている。
さらに、特許文献１０では、ウサギに由来し被検出物質に特異的に結合しない免疫グロブリンを含んでなる、免疫測定法における非特異反応を抑制する方法が開示されている。
【０００６】
さらに、特許文献１１では、免疫学的方法において、非特異反応を抑制する方法として試薬中に低分子のペプチドを導入することによって非特異反応を抑制することが報告されており、特許文献１２では、非特異反応を抑制する為に、塩化ナトリウム及びエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを導入することが報告され、さらに、特許文献１３では、ホスホリルコリン基を有する重合体をある一定濃度抗体抗原反応中に存在させることにより非特異反応を抑制することが報告されている。
これらの従来技術での非特異抑制技術では、ペプチドなどを導入することにより感作粒子上の表面電荷を変化させることにより粒子の分散性を高め非特異反応を抑制することを目的としているものであり、また、塩化ナトリウムやエチレンジアミン四酢酸、ホスホリルコリン基を有する重合体を抗体抗原反応中に存在する方法も感作粒子の分散性を高め非特異反応を抑制するが抜本的に非特異反応を抑制する問題を解決するものではないと考えられる。
【０００７】
これらの非特異反応を抑制する方法は、血清や粘膜などを検体として使用した場合とするものが多く、尿のような粘性が低く比較的夾雑物が少ないとされるものを検体とする場合には非特異反応は少ないと考えられていた。
しかしながら、尿検体を用いるイムノクロマト法などの免疫測定においても非特異反応が起こる場合があり、尿中における微量の夾雑物が非特異反応を生起させ、検出の信頼性を著しく損なう結果となることがある。また、尿は粘性が低く検体の調製が容易であることから、イムノクロマト法などの免疫測定における検体として優れた特性を有しているが、微量成分の夾雑による非特異反応が有り、必ずしも信頼性の高い方法ではなかった。そこで、尿を被検体とする免疫測定に伴う非特異反応を簡便かつ効果的に抑制し、尿中の微量成分の正確な検出ならびに定量を実現するための、非特異反応抑制剤の開発が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開昭６１−６５１６２号公報
【特許文献２】特開平９−２８８１０８号公報
【特許文献３】特開平１１−２８７８０１号公報
【特許文献４】特開２００６−３８８２３号公報
【特許文献５】特開２０１０−６０２９７号公報
【特許文献６】特表平６−５０９４２０号公報
【特許文献７】特開平７−２７７６４号公報
【特許文献８】特開平９−６８５３１号公報
【特許文献９】特表２００８−５２７３３２号公報
【特許文献１０】特開２０１０−２５８６６号公報
【特許文献１１】特開昭５８−１４４７４８号公報
【特許文献１２】特開平８−１０５８９７号公報
【特許文献１３】特開２００８−５８３３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、尿を被検体とした免疫学的方法を用いたイムノクロマト法などの免疫測定における非特異反応を抑制し、かつ高感度の検出を可能にする高感度で信頼性の高い免疫測定法及びそのための免疫測定媒体を提供するものである。また、本発明は、尿を被検体とした免疫学的方法を用いたイムノクロマト法などの免疫測定における非特異反応抑制剤を提供するものである。
また、本発明は、尿を被検体とした肺炎球菌の断片を高感度でかつ高信頼性で検出できる免疫測定法及びそのための免疫測定媒体を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、尿を被検体とした、特に全尿を被検体とした免疫測定法を検討してきたが、尿中には被検出物質の濃度も低く、感度を上げると非特異反応も多くなり、その結果ＳＮ比の向上が難しくなっていた。特に、尿を被検体としたときの感度を上げた場合における非特異反応の抑制が大きな問題となっていた。そこで、本発明者らは、鋭意検討してきた結果、意外にも鳥由来のタンパク質であるＩｇＹが、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応の抑制剤として極めて優れていることを見出した。
【００１１】
即ち、本発明は、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応を抑制するための、鳥由来のＩｇＹを含有してなる、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応抑制剤に関する。
また、本発明は、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応を抑制するために、鳥由来のＩｇＹを含有してなる非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせることを特徴とする尿を被検体とした免疫測定法に関する。
さらに、本発明は、尿を被検体としたイムノクロマトグラフ法における非特異反応を抑制するために鳥由来のＩｇＹを含有してなる非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせることができる、クロマトグラフ媒体に関する。
また、本発明は、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応抑制剤として鳥由来のＩｇＹを含有してなる、尿を被検体とするイムノクロマトグラフ法における展開液を提供するものである。
さらに、本発明は、尿中に排泄される病原体抗原、例えば、肺炎球菌由来の夾膜（ポリサッカライド）を高感度でかつ高信頼性で検出するための免疫測定法及びそのための免疫測定媒体、例えばクロマトグラフ媒体に関する。
【００１２】
本発明をより詳細に説明すれば、以下のとおりとなる。
（１）鳥由来のＩｇＹを含有してなる、尿を被検体とした免疫測定法における非特異反応抑制剤。
（２）鳥由来のＩｇＹの濃度が、０．０１〜１μｇ／μＬである前記（１）に記載の非特異反応抑制剤。
（３）免疫測定法が、尿中の抗原を検出するための方法である前記（１）又は（２）に記載の非特異反応抑制剤。
（４）抗原が、尿中の病原体抗原である前記（３）に記載の非特異反応抑制剤。
（５）免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記（１）から（４）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤。
（６）尿を被検体とし尿中の被検出物質を特異的に検出するための免疫測定法において、非特異反応を抑制するために鳥由来のＩｇＹを含有してなる非特異反応抑制剤の存在下に免疫反応を行わせることを特徴とする尿を被検体とした免疫測定法。
（７）免疫測定法が、尿中の被検出物質と特異的に結合する第一試薬、並びに尿中の被検出物質と特異的に結合する第二試薬及び標識物質からなる標識試薬を用いて尿中の被検出物質を特異的に検出する免疫測定法である前記（６）に記載の免疫測定法。
（８）免疫測定法が、イムノクロマトグラフ法である前記（６）又は（７）に記載の免疫測定法。
（９）非特異反応抑制剤が、イムノクロマトグラフ法における展開液として供給される前記（８）に記載の免疫測定法。
（１０）非特異反応抑制剤が、クロマトグラフ媒体に固定されている前記（８）に記載の免疫測定法。
（１１）免疫反応が、さらに界面活性剤の存在下で行われる前記（６）〜（１０）のいずれかに記載の免疫測定法。
（１２）尿中の被検出物質が、尿中の抗原である前記（６）〜（１１）のいずれかに記載の免疫測定法。
（１３）抗原が、尿中の病原体抗原である前記（１２）に記載の免疫測定法。
（１４）前記（１）〜（５）のいずれかに記載の非特異反応抑制剤を含有してなる、尿を被検体とするイムノクロマトグラフ法における展開液。
（１５）尿中の被検出物質と特異的に結合する第一試薬が固定化された判定部位を有する尿を被検体としたクロマトグラフ媒体において、移動相を構成する液体が非特異反応抑制剤として鳥由来のＩｇＹを含有できる構成となっていることを特徴とする、尿を被検体としたイムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体。
（１６）鳥由来のＩｇＹを含有してなる非特異反応抑制剤が、クロマトグラフ媒体に固定されている前記（１５）に記載のクロマトグラフ媒体。
（１７）鳥由来のＩｇＹを含有してなる非特異反応抑制剤が、イムノクロマトグラフ法における展開液として供給される前記（１５）に記載のクロマトグラフ媒体。
（１８）鳥由来のＩｇＹの含有量が、１ストリップ当たり２〜２００μｇである、前記（１５）〜（１７）のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
（１９）移動相を構成する液体が、さらに界面活性剤を含有する前記（１５）〜（１８）のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
（２０）被検出物質と特異的に結合する第一試薬が、被検出物質の抗体である前記（１５）〜（１９）のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
（２１）被検出物質が、尿中の病原体抗原である前記（１５）〜（２０）のいずれかに記載のクロマトグラフ媒体。
（２２）病原体抗原が、肺炎球菌由来の病原体抗原である前記（２１）に記載のクロマトグラフ媒体。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、尿を被検体とした免疫測定法において、鳥由来のタンパク質であるＩｇＹを存在させることにより尿中の夾雑物により非特異的反応を顕著に抑制させることを見出したものである。本発明の鳥由来のＩｇＹは、抗原認識部位が異なっているＩｇＹであっても、非特異的反応を顕著に抑制させることができることから、抗原認識部位にかかわらず、ＩｇＹのＦｃ部分の存在により、非特異的反応を顕著に抑制させることができると考えられる。
【００１４】
尿は粘性が低く被検体の調製が容易であり、イムノクロマトグラフ法などの免疫測定法における被検体として優れているが、非特異的反応が多く、検出の信頼性において問題があった。しかし、本発明により尿を被検体として用いても非特異的反応を顕著に抑制させることができることから、尿を被検体として用いるイムノクロマトグラフ法などの免疫測定法を高感度で、高信頼性で、そしてより簡便な方法で尿を被検体とした免疫測定法を行うことが可能となる。
【００１５】
また、感染症患者の尿中に病原体抗原（例えば、病原体の夾膜多糖体抗原や内毒素抗原（lipopolysaccharide）など）が排出されることは約２０年以上前から報告されてきている。例えば、肺炎球菌、レジオネラ、インフルエンザ桿菌、髄膜炎菌などの病原体抗原が排出されることが知られている。呼吸器感染症患者からの痰などの呼吸器系の検体からの検出では口腔内常在菌の混入による感染菌の特定の困難さから、特に呼吸器感染症患者における尿中抗原の検出は重要とされている。また、尿は採取が容易であるだけでなく、比較的大量に採取することもできる。
このようなことから、非特異的反応を顕著に抑制させることができる尿を被検体とした新規な免疫測定法を提供することができる本発明は、尿中の病原体抗原の検出を簡便で高感度で、高信頼性で行うことを可能とするものであり、尿中の病原体抗原を検出する優れた方法を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明のクロマトグラフ媒体を用いて、本発明の非特異反応抑制剤である鳥由来のＩｇＹによる非特異的反応の抑制効果をグラフで示したものである。
【図２】図２は、本発明の非特異反応抑制剤である鳥由来のＩｇＹ、及び他のタンパク質による非特異的反応の抑制効果をグラフで比較して示したものである。
【図３】図３は、図２とは異なる抗体を用いて、本発明の非特異反応抑制剤である鳥由来のＩｇＹ、及び他のタンパク質による非特異的反応の抑制効果をグラフで比較して示したものである。
【図４】図４は、陽性検体を用いて、本発明の非特異反応抑制剤である鳥由来のＩｇＹ、及び他のタンパク質による非特異的反応の抑制効果をＳＮ比としてグラフで比較して示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の鳥由来のＩｇＹとしては、鳥類の免疫グロブリンであるＩｇＹであればよく、鳥類としてはニワトリが好ましい。また、ＩｇＹであれば、抗原認識部位はいずれであってもよく、モノクローナルＩｇＹであっても、ポリクローナルＩｇＹであってもよい。即ち、Ｆｃ部がＩｇＹとなっていればいずれのＩｇＹであってもよい。したがって、ニワトリのＩｇＹであって、入手のしやすいＩｇＹが好ましい。なお、本発明の鳥由来のＩｇＹは、被検出物質に特異的に結合しないものでなければならないことは当然のことである。好ましい鳥由来のＩｇＹとしては、例えば、ニワトリ抗ヒト血清アルブミンポリクローナルＩｇＹや、ニワトリ抗ポリサッカライドポリクローナルＩｇＹなどが挙げられる。
ニワトリのＩｇＹは、公知の方法（例えば、特許第３５９７７８４号公報等）に従って調製することができる。例えば、抗原で免疫したニワトリから卵を採取し、この卵から卵黄を分離して粉末化した卵黄粉末を、エタノール等の溶媒を用いて脱脂して脱脂卵黄粉末とし、この脱脂卵黄粉末に緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液等）を加えて撹拌・抽出して上清を回収し、この上清を適宜脱塩、濃縮、粉末化することにより各抗原蛋白質に対するニワトリＩｇＹを調製することができる。
【００１８】
本発明の非特異反応抑制剤は、鳥類の免疫グロブリンであるＩｇＹを含有するものであり、イムノクロマトグラフ法においては、これをニトロセルロース膜、セルロース濾紙等の多孔性物質に含有させておいてもよい。この場合には、尿自体に展開液としての機能を果たさせることもできるし、別途展開液を調製することもできる。
本発明の非特異反応抑制剤を溶液として使用する場合には、鳥由来のＩｇＹを０．０１〜１μｇ／μＬ好ましくは０．０２〜０．５μｇ／μＬ、さらに好ましくは０．０２〜０．０．２μｇ／μＬの濃度とするのが好ましい。また、多孔性物質に含有させるには、１検体の測定（１ストリップ）当たり、２〜２００μｇ、好ましくは３〜２００μｇ、より好ましくは３〜１００μｇ、さらに好ましくは３〜５０μｇである。この場合の１検体の量としては、全尿で１０〜３００μＬ、好ましくは３０〜２００μＬ、さらに好ましくは４０〜２００μＬが挙げられる。
【００１９】
本発明における被検体としての尿としては、ヒトの尿が好ましいが、これに限定されるものではない。尿は、初尿でも中間尿でもよい。被検出物質が病原体抗原である場合には、病原体抗原が比較的熱に強いことから、熱処理が施された尿であってもよい。また、尿は展開液などで希釈されたものであってもよいが、希釈されないものであってもよい。本明細書においては、希釈されず、加熱処理などで処理がされていない採取した尿を「全尿」ということにする。
本発明における免疫測定法としては、抗原抗体反応を利用する免疫測定法であれば、公知のいずれの免疫測定法でもよく、例えば、凝集法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法等を挙げることができる。これらの測定法においては、固相に結合した固相化抗体又は固相化抗原を用いて、被検出物質及び標識抗体の分離が行われる。固相には、一般に、ポリスチレンマイクロプレート、ポリスチレンビーズ、磁性粒子、ガラスビーズ、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙等を用いることができる。マイクロプレートを固相に用いた場合には個々のウェル内に反応溶液が満たされ、また、ビーズ、粒子等を固相に用いた場合には試験管、チューブ等の容器内に満たされた反応溶液中にそれらが分散されるので、免疫反応は比較的多量の溶液中で進行する。一方、ニトロセルロース膜、セルロース濾紙等の多孔性物質を固相に用いたイムノクロマトグラフ法では、わずかな展開液が多孔性物質中を移動していく環境下で免疫反応が進行するので、非特異因子と固相化抗体がより密に接触し、非特異反応が促進する可能性が考えられるが、本発明の非特異反応抑制剤は、このような免疫測定法においても優れた免疫抑制効果を奏するものである。
【００２０】
本発明において、免疫測定法に用いる抗体とは、被検出物質に特異的に結合する免疫グロブリンであればよく、当該抗体としては、被検出物質上の様々な抗原決定基を認識する、様々なクラスの免疫グロブリン分子が混在した状態のポリクローナル抗体であってもよく、単一の抗原決定基を認識する単一の分子種からなるモノクローナル抗体であってもよい。
本発明において、免疫測定法に用いる抗体が由来する動物種とは、抗体が被検出物質を動物に投与することにより作製されたものである場合には、被検出物質を投与され抗体を産生した動物の種をいう。抗体が、抗体を産生する動物から細胞を採取し、当該細胞により産生されたものである場合には、当該細胞が由来する動物種をいう。複数の細胞を融合した融合細胞により抗体を産生する場合には、融合前の各々の細胞が由来するそれぞれの動物種をいう。さらに、抗体を、分子生物学的手法により、異種の動物の免疫グロブリン遺伝子断片をつなげてキメラ抗体として作製する場合には、抗体が由来する動物種とは、免疫グロブリン遺伝子断片を取得したそれぞれの動物種をいう。
免疫測定法に用いる抗体が由来する動物種の具体例としては、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ及びヒト等を挙げることができるが、これらに限定されない。本発明における好ましい動物種としては抗原の種類によるが、抗原が病原体抗原である場合には、マウスやウサギが挙げられる。
【００２１】
本発明の非特異反応抑制剤は、被検出物質を含む被検体としての尿と接触させることにより、本来の目的とする抗原抗体反応以外の非特異反応を抑制することができる。本発明の非特異反応抑制剤と尿との接触はどのような方法で行われてもよいが、例えば、被検出物質を含む尿と被検出物質に対する抗体とを接触させる前に、あらかじめ尿に本発明の非特異反応抑制剤を添加して、非特異因子と反応させることによって、非特異反応を抑制してもよいし、被検出物質に対する抗体と非特異反応抑制剤を含む反応溶液中に、被検出物質を含む尿を添加して、非特異因子と非特異反応抑制剤を反応させることによって、非特異反応を抑制してもよい。
【００２２】
本発明の一態様として、例えば、イムノクロマトグラフ法による免疫測定に、本発明の非特異反応抑制剤を適用する場合には、多孔性物質からなるクロマトグラフ媒体上で移動相を構成する展開液に、予め本発明の非特異反応抑制剤を添加しておくことができる。展開液による展開は、被検出物質を含む尿と同時に行ってもよいし、尿をクロマトグラフ媒体に先行して滴下した後、被検出物質が固相化抗体の結合した反応部位に到達可能となるように、適量の展開液を後から展開してもよい。本発明の他の態様としては、クロマトグラフ媒体における移動相の展開経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の展開液が適用される端部又は当該端部と反応部位との間の領域に、本発明の非特異反応抑制剤を乾燥・保持しておき、移動相を構成する尿及び／又は展開液により溶解して、尿と接触させることもできる。
【００２３】
この接触時における、本発明の非特異反応抑制剤の濃度としては、非特異反応抑制剤と被検体としての尿との混合比率や接触時間等の条件、あるいは尿の個体差により異なり一概に言うことはできないが、通常は、鳥由来のＩｇＹとして尿１０μＬ当たり０．１〜１００μｇの範囲にあることが好ましく、０．５〜２０μｇの範囲があることが特に好ましい。また、被検出物質に特異的に結合する抗体に対しての混合比は特に制限されるものではないが、通常、４０：１〜1：４０の範囲にあることが好ましい。
【００２４】
本発明の非特異反応抑制剤が適用できる免疫測定法において、検出できる被検出物質としては、尿中に存在する抗原となる物質であって、それに特異的に結合する抗体が存在する抗原であれば特に限定されず、蛋白質、ペプチド、多糖類、複合糖質などを例示することができる。尿中に存在し得る病原体抗原（例えば、病原体の夾膜多糖体抗原や内毒素抗原（lipopolysaccharide）など）が好ましい。特に、尿中に微量に含まれる抗原が好適である。なぜなら、抗原の含まれる濃度が微量である程、相対的に非特異的反応の影響が大きくなるので、本発明の非特異反応抑制剤が有用となるからである。
具体的な被検出物質としては、例えば、尿中に存在し得る病原体抗原（例えば、病原体の夾膜多糖体抗原や内毒素抗原（lipopolysaccharide）など）を挙げることができるが、これに限定されるものではない。
【００２５】
本発明は、尿を被検体とするものであり、被検体の採取の容易性から、取り扱いが容易とされているイムノクロマトグラフ法において特に有用である。したがって、以下では、特にイムノクロマトグラフ法について詳細に説明する。
クロマトグラフ媒体
本発明のイムノクロマトグラフ法において用いるクロマトグラフ媒体は、毛管現象を示す微細多孔性物質からなる不活性のものであって、使用される検出試薬、固定化試薬、被検出物質などと反応しないものであり、短時間での判定で十分な感度が得られる展開速度を有していれば、特にその素材が限定されるものではない。
本発明において、クロマトグラフ媒体としては、シリカ、チタニア、ジルコニア、セリア、アルミナ等のセラミック微粒子又は有機高分子の微粒子、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース又は酢酸セルロース等のセルロース誘導体等で構成される繊維状又は不織繊維状マトリクス、膜、濾紙、ガラス繊維濾紙、布、綿等が挙げられる。微粒子はそれ自体が多孔性でなくとも、充填された状態では微粒子間に空隙が生じクロマトグラフ媒体として機能する。好ましくはセルロース誘導体やナイロンの膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等であり、より好ましくはニトロセルロース膜、混合ニトロセルロースエステル（ニトロセルロースと酢酸セルロースの混合物）膜、ナイロン膜、濾紙である。
【００２６】
本発明の実施に供されるクロマトグラフ媒体の形態及び大きさは特に制限されるものではなく、実際の操作の点及び反応結果の観察の点において適切であればよい。操作をより簡便にするためには、反応部位が表面に形成されているクロマトグラフ媒体の裏面に、プラスチックなどよりなる支持体を設けることが好ましい。この支持体の性状は特に制限されるものではないが、目視判定によって測定結果の観察を行う場合には、支持体は、標識物質によりもたらされる色彩と類似しない色彩を有するものであることが好ましく、通常、無色又は白色であることが好ましい。
【００２７】
判定部位
本発明において用いるクロマトグラフ媒体上には、尿中の被検出物質と特異的に結合する第一試薬、例えば抗体が任意の位置に固定化された判定部位が形成される。抗体などの第一試薬をクロマトグラフ媒体に固定化する方法としては、第一試薬をクロマトグラフ媒体に物理的又は化学的手段により直接固定化する方法と、第一試薬をラテックス粒子などの微粒子に物理的又は化学的に結合し、この微粒子をクロマトグラフ媒体に捕捉して固定化する間接固定化方法がある。
直接的に固定化する方法としては、物理吸着を利用しても良いし、共有結合によってもよい。一般にクロマトグラフ媒体がニトロセルロース膜又は混合ニトロセルロースエステル膜の場合、物理吸着を行うことができる。共有結合ではクロマトグラフ媒体の活性化には一般的に臭化シアン、グルタルアルデヒド、カルボジイミド等が用いられるが、いずれの方法も用いることができる。間接的に固定化する方法としては、不溶性微粒子に第一試薬を結合した後に、クロマトグラフ媒体に固定化する方法がある。不溶性微粒子の粒径はクロマトグラフ媒体に捕捉されるが移動することのできないサイズのものを選択することができ、好ましくは平均粒径１０μｍ程度以下の微粒子である。これらの粒子としては抗原抗体反応に使用されるものが種々知られており、例えば、ポリスチレン、スチレン−ブタジエン共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共重合体などの乳化重合法によって得られる有機高分子ラテックス粒子などの有機高分子物質の微粒子、ゼラチン、ベントナイト、アガロース、架橋デキストランなどの微粒子、シリカ、シリカ−アルミナ、アルミナなどの無機酸化物や無機酸化物にシランカップリング処理などで官能基を導入した無機粒子等が挙げられる。
本発明においては、感度調整の容易さ等から直接固定化の方が好ましい。また、クロマトグラフ媒体への第一試薬の固定化には、いろいろな方法が使用できる。例えば、マイクロシリンジ、調節ポンプ付きペン、インキ噴射印刷等、種々の技術が使用可能である。判定部位の形態としては特に限定されないが、円形のスポット、クロマトグラフ媒体の展開方向に垂直にのびるライン、数字、文字や＋、−などの記号等として固定化することもできる。
【００２８】
第一試薬を固定化した後、非特異的な吸着により分析の精度が低下することを防止するため、必要に応じて、クロマトグラフ媒体に、公知の方法でブロッキング処理を行うことができる。一般にブロッキング処理はウシ血清アルブミン、スキムミルク、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質が好適に用いられる。かかるブロッキング処理後に、必要に応じて、ツイーン２０、トリトンＸ−１００、ＳＤＳ等の界面活性剤を１つ又は２つ以上組み合わせて洗浄してもよい。
その他、クロマトグラフ媒体には、必要に応じて、被検出物質を含む尿を添加するための尿添加部位（サンプルパッド等）、尿中の不溶物質を除去する部位、展開液を添加するための展開液添加部位、判定部位に捕獲されなかった被検出物質や展開液を吸い取る吸収部位（吸収パッド等）、測定が正常に行われたことを示す対照部位等を組み入れてもよい。これらの部位の部材は、毛管現象により試料液や展開液が移動できれば特に限定されず、一般的には、ニトロセルロース膜、濾紙、ガラス繊維濾紙等の複数の多孔性物質からその目的に応じたものを選択して用い、第一試薬が固定化されたクロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置することができる。
【００２９】
標識試薬
本発明における標識試薬は、尿中の被検出物質と特異的に結合する第二試薬及び標識物質からなっており、一般的には第二試薬が吸着や化学結合などにより標識物質に結合している。
標識物質
本発明で用いられる検出試薬は、尿中の被検出物質と特異的に結合する第二試薬、例えば抗体であり、標識物質により標識化される。イムノクロマトグラフ法における検出試薬の標識には、一般に酵素等も使用されるが、尿中の被検出物質の存在を目視で判定するのに適していることから、本発明の標識物質としては不溶性担体を用いるのが好ましい。本発明においては、第二試薬を不溶性担体に感作することにより標識化した第二試薬を標識試薬として調製する。
本発明で用いられる標識物質としての不溶性担体としては、金、銀、白金のようなコロイド状金属粒子、酸化鉄のようなコロイド状金属酸化物粒子、硫黄などのコロイド状非金属粒子及び合成高分子よりなるラテックス粒子、その他を用いることができる。
【００３０】
不溶性担体は、被検出物質の存在を視覚的に判定するのに適した標識物質であり、目視による判定を容易にするためには有色であることが好ましい。コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子は、それ自体が粒径に応じた特定の自然色を呈するものであり、その色彩を標識として利用することができる。合成高分子よりなるラテックス粒子は自然の状態で白色であるため、そのままでは標識物質として使用することはできないが、例えば油溶性染料によって、特に水系媒体中のラテックス粒子を、油溶性染料の油性有機溶剤による溶液のエマルジョンによって染色することにより、所望の色彩を所望の濃さで有するものとすることができる。このようなラテックス粒子としては、種々のモノマーを重合又は共重合させることによって得ることができる。ここにモノマーとしては、例えばスチレン、クロルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエンなどの重合性不飽和芳香族類、例えば（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマール酸などの重合性不飽和カルボン酸類、例えば（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）アクリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニルなどの重合性不飽和カルボン酸エステル類、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−メチロール−（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニルなどの不飽和カルボン酸アミド類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類などを挙げることができる。これらのモノマーは、標識物質として要求される表面特性、比重などによって適宜選択され、１種を単独で又は２種以上を混合して使用することができる。
【００３１】
本発明において、標識物質として特に好ましい標識物質としては、コロイド状金属粒子及びコロイド状金属酸化物粒子、例えば、コロイド状金粒子、コロイド状銀粒子、コロイド状白金粒子、コロイド状酸化鉄粒子、コロイド状水酸化アルミニウム粒子などが挙げられる。特に、コロイド状金粒子とコロイド状銀粒子が適当な粒径において、コロイド状金粒子は赤色、コロイド状銀粒子は黄色を示す点で好ましい。これらのコロイド状金属粒子の平均粒径は１〜５００ｎｍ、特に強い色調が得られる１０ｎｍ〜１５０ｎｍ、より好ましくは２０〜１００ｎｍの範囲内であることがさらに好ましい。
これらの不溶性担体に関しては、ラテックス粒子又はコロイド状金属粒子のいずれにおいても、その表面が負に荷電していることが知られている（例えば、特開平５−１３３９５６号公報参照）。例えば、コロイド状金属粒子では、その製造過程で添加される還元剤由来のアニオンがその表面に吸着しており、相互の凝集が妨げられて分散した状態を保っている。そして、この状態のコロイド状金属粒子に、表面電荷を中和しない程度の低濃度の界面活性剤を添加すると、粒子が鎖状に数個程度凝集することが知られている（特開２００６−５８７８１号公報）。このように、本発明のイムノクロマトグラフ法においても、移動相を構成する展開液に界面活性剤を添加すると、クロマトグラフ媒体上の判定部位に捕捉された不溶性担体が数個程度凝集することにより、反応部位で観察される陽性シグナルの増幅が見られると推測される。特に、コロイド状金属粒子においては、凝集によって反応部位に蓄積する粒子の数が増加することにより、目視判定されるシグナル量が増加するのみならず、粒子の光吸収スペクトル特性が変化することにより、判定部位においてより明瞭な陽性シグナルを得ることが可能となると推測される。このような利点を有することから、コロイド状貴金属粒子、特にコロイド状金粒子は、本発明の標識物質として好ましいものである。
コロイド状金属粒子として、例えばコロイド状金粒子を用いる場合には、市販のものを用いてもよい。あるいは、常法、例えば塩化金酸をクエン酸ナトリウムで還元する方法によりコロイド状金粒子を調製することができる。
【００３２】
本発明で用いられる第二試薬をコロイド状金属粒子に感作する方法としては、物理吸着や化学結合などの公知の方法が使用できる。例えば、コロイド状金粒子に第二試薬として抗体を感作した標識試薬は、金粒子がコロイド状に分散した溶液に抗体を加えて物理吸着させた後、牛血清アルブミン溶液を添加して抗体が未結合である粒子表面をブロッキングすることにより調製することができる。
【００３３】
本発明のイムノクロマトグラフ法の実施において、標識物質により標識化した第二試薬は、移動相を構成する展開液に分散して適用することもできるし、固定相を構成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用される端部又は当該端部と判定部位との間の領域に固定化して存在させて適用することもできる。クロマトグラフ媒体上に存在させる場合、標識試薬が展開液に速やかに溶解して毛管作用によって自由に移動できるように、標識試薬を支持させるのが好ましい。支持させる部位には、標識試薬の再溶解性を良好にするため、サッカロース、マルトース、ラクトース等の糖類、マンニトール等の糖アルコールを添加して塗布したり、これらの物質を予めコーティングしたりしておくこともできる。標識試薬を塗布・乾燥等によりクロマトグラフ媒体上に存在させる場合には、クロマトグラフ媒体に直接、塗布・乾燥等することもできるし、別の多孔性物質、例えばセルロース濾紙、ガラス繊維濾紙、ナイロン不織布に塗布・乾燥等して標識試薬の保持部材（コンジュゲートパッド）を形成した後、クロマトグラフ媒体と毛管で繋がるように配置させることもできる。
【００３４】
第一試薬及び第二試薬
第一試薬及び第二試薬は同じであっても、異なっていてもよいが、同じ有る方が簡便で好ましい。これらの第一試薬及び第二試薬としては、尿中の被検出物質と特異的に結合することができる試薬であれば特に制限はされないが、被検出物質が抗原である場合には、それに特異的に結合することができる抗体が好ましい。抗体はモノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、特別な場合を除きポリクローナル抗体が簡便性の点からも好ましい。このような抗体は、被検出物質である抗原で動物を感作することによる公知の方法で製造することができる。
尿中の被検出物質として、尿中の病原体抗原、特に病原体の夾膜多糖体抗原とする場合には、ウサギ由来のポリクローナル抗体が好ましい。
【００３５】
展開液
本発明で用いられる展開液は、イムノクロマトグラフ法において移動相を構成する液体であり、固定相であるクロマトグラフ媒体上を、尿中の被検出物質を含む尿及び標識試薬と共に移動する。
本発明で用いられる展開液は、通常、水を溶媒とし、上記の酸素原子含有極性基を有するビニル系水溶性ポリマー及び非イオン性界面活性剤に加え、緩衝剤を含有することが好ましい。緩衝剤の好ましい例としては、リン酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩衝剤等を挙げることができる。また、さらに他の成分として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のタンパク質成分（含有量は通常０．０１重量％〜１０重量％）を任意で含んでいてもよい。
また、本発明は被検体として粘性の低い尿を使用することから、被検体の尿を展開液として使用することもできる。
【００３６】
界面活性剤
本発明の方法においては、界面活性剤を添加することが好ましい。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が好ましく、特にＨＬＢ値が１０〜１８、好ましくはＨＬＢ値が１３〜１８のポリオキシエチレン系界面活性剤がより好ましい。ポリオキシエチレン系界面活性剤の好ましい例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（商品名「Ｔｗｅｅｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチルフェニルエーテル（商品名「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズ）、ポリオキシエチレン脂肪族エーテル（商品名「Ｂｒｉｊ」シリーズ）、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン−アルキルエーテル（商品名「ノニオンＭＮ」）等を挙げることができ、より具体的には、「Ｔｗｅｅｎ」シリーズでは、特にＴｗｅｅｎ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ４０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ６０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ８０（商品名）；「Ｔｒｉｔｏｎ」シリーズでは、特にＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（商品名）、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４（商品名）、ＮＰ−４０（商品名）；「Ｂｒｉｊ」シリーズでは、Ｂｒｉｊ５８（商品名）、Ｂｒｉｊ３５（商品名）；「ノニオンＭＮ」では、アルキル基の炭素数＝１４、オキシプロピレンのモル比／オキシエチレンのモル比＝１．１のＭＮ−８１１等を挙げることができる。これらのなかでは、Ｂｒｉｊ３５、Ｂｒｉｊ５８、ＭＮ−８１１、Ｔｗｅｅｎ８０などが好ましい。
界面活性剤は、単独でも２種以上を混合して用いることもできる。上記した界面活性剤の含有量は、特に限定されないが、組成物全体の質量に対し０．０１〜１０質量％の範囲であり、好ましくは０．０５〜５質量％、より好ましくは０．１〜２質量％の範囲が挙げられる。
【００３７】
本発明の一態様としては、展開液に予め界面活性剤を添加した後、クロマトグラフ媒体上で移動層を構成する液体として展開液をクロマトグラフ媒体上で展開させることができる。本発明の他の態様としては、界面活性剤を、固定相を構成するクロマトグラフ媒体における移動相の展開移動経路上、すなわちクロマトグラフ媒体の移動相が適用される端部又は当該端部と判定部位との間の領域に存在させておき、尿などの展開液により移動層が形成された際に溶解させて混合させることもできる。さらに、本発明の他の態様としては、被検出物質を含む尿中に界面活性剤を添加し、これを展開させて、移動層を構成する液体として展開液をクロマトグラフ媒体上で展開させることもできる。
【００３８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３９】
イムノクロマト試薬の作製
（１）判定部位の作製
ニトロセルロースからなる膜の判定ライン領域に、抗体塗布機（BioDot社）を用いて抗肺炎球菌ウサギポリクローナル抗体（Polyclonal Rabbit anti Streptcoccus pneumoniae antibody）を塗布した。抗体は、予め１０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）に希釈し、４ｍｇ／ｍＬとした。本試験では、４ｍｇ／ｍＬの抗体溶液９５μＬ、２０％シュクロース溶液７５μＬ、イソプロパノール（Wako）１５μＬ、１０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）１１５μＬをそれぞれ混合し、合計３００μＬの抗体溶液を作製した。作製した抗体溶液中の抗体濃度はおよそ１．３ｍｇ／ｍＬとし、これを１ｃｍあたりおよそ１．１１６μＬの割合で塗布し、４２℃で１時間乾燥した。
なお、コントロール用ライン領域にはマウスＩｇＧに対するヤギ由来の抗血清を用いた。抗体は、予め１０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）に希釈し、２．２５ｍｇ／ｍＬとした。２．２５ｍｇ／ｍＬの抗体溶液６０μＬ、イソプロパノール(Wako)１５μＬ、１０ｍＭ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．５）２２５μＬをそれぞれ混合し、合計３００μＬの抗体溶液を作製した。作製した抗体濃度は０．４５ｍｇ／ｍＬとし、これを１ｃｍあたり０．７４４μＬの割合で塗布した。
【００４０】
（２）コンジュゲートパッドの作製
コンジュゲートパッドは、以下のように作製した。およそ６０ｐｐｍの金コロイド溶液５００μＬに対して、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９．０）１００μＬを加えた後、混和し、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳで１５ｍｇ／ｍＬに調製しておいた前記（１）に記載した判定部位の作製に用いられる抗体と同じ抗体（抗肺炎球菌ウサギポリクローナル）の溶液１００μＬを添加し、すぐに混和した。室温で１０分間放置した後、ＣＥ５１０（ＪＳＲ社）を１００μＬ、及び５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．５）に溶解した１％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ（分子量２０，０００）溶液を１００μＬずつそれぞれ添加し、混和した。室温で１０分間放置したのち、遠心分離機（クボタ）を用いて８，０００×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心分離した。上澄み液を除去し、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ（分子量２０，０００）、０．１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．２からなる金コロイド保存液を加えた。超音波破砕機を用いて金コロイド粒子をよく分散させた後、８，０００×ｇ、４℃の条件で１０分間遠心分離した。上澄み液を除去し、金コロイド保存液を加えて超音波破砕機にてよく分散させた。ＵＶ測定器（島津）を用いて溶液のＯＤ値を測定し、ＯＤ値がほぼ９になるように調製した。これを抗体感作金コロイド溶液（標識試薬溶液）とした。この抗体感作金コロイド溶液３２１μＬに対して純水あるいは超純水を４２６μＬ、及び２５％（ｗ／ｖ）トレハロース溶液を１０６．６μＬそれぞれ加えて、よく混和した。本試験では、この溶液８５３．６μＬを、縦１６ｍｍ、横１０ｃｍのガラス繊維パッド（ミリポア社）に添加し、均一に馴染ませた。真空乾燥機を用いて十分に乾燥させ、コンジュゲートパッドを得た。
【００４１】
（３）サンプルパッドの作製
サンプルパッドは、以下のように作成した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ１５０μＬ、１０％Ｂｒｉｊ３５  １５０μＬ、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  １０μＬ、及び純水あるいは超純水６９０μＬをそれぞれ加えて、よく混和した。この溶液１０００μＬを、縦２０ｍｍ、横１０ｃｍのガラス繊維パッド（ミリポア社）に添加し、均一に馴染ませた。真空乾燥機を用いて十分に乾燥させ、サンプルパッドを得た。
（４）クロマトグラフ媒体の作製
前記（１）で作製した判定部位及びコントロール用ライン領域を有するクロマトグラフ媒体上に、前記（２）及び（３）で作製したコンジュゲートパッド及びサンプルパッドを設置し、展開された水溶液を吸収する吸収パッドをコントロールライン下流に設置して、本発明のクロマトグラフ媒体を製造した。
【実施例２】
【００４２】
尿を被検体としたイムノクロマト試薬でのＩｇＹの非特異抑制評価
尿を被検体として鳥由来のＩｇＹの導入濃度を変化させ非特異抑制効果を評価した。
（１）イムノクロマトグラフ法のためのクロマトグラフ媒体の作製
抗体として、抗肺炎球菌ウサギポリクローナル抗体（Polyclonal Rabbit anti Streptcoccus pneumoniae antibody）を用い、鳥由来のＩｇＹを０、２、３、７、１０、及び２０μｇ／１ストリップ（strip）それぞれ導入して、真空乾燥機を用いて十分に乾燥させて、実施例１と同様にしてサンプルパッドを得た。
得られたサンプルパッドを用いて、実施例１と同様にして、鳥由来のＩｇＹを０、２、３、７、１０、及び２０μｇ／１ストリップ（strip）それぞれ有する本発明のクロマトグラフ媒体を製造した。
【００４３】
（２）非特異抑制効果の評価
被検体として、尿のみ、及び尿に肺炎球菌（Streptcoccus pneumoniae）の夾膜抗原を精製したものを１１．５ｎｇ／ｍＬの濃度になるように添加した尿サンプルを用いた。被検体量は１５０μＬとして、これを前記（１）で製造した本発明のクロマトグラフ媒体のサンプルパッドの上に滴下した。被検体１５０μＬを導入後、１５分後に判定部位における発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社）で測定した。
結果を図１のグラフに示す。図１の縦軸は判定部位における発色強度を示し、横軸は鳥由来のＩｇＹの添加量（μｇ／ストリップ）を示す。各棒グラフの左側は、被検体として尿のみを使用した場合を示し、右側は、尿に肺炎球菌夾膜抗原を添加した尿サンプルの場合を示す。
【００４４】
（３）評価結果
この結果、鳥由来のＩｇＹを存在させることにより非特異的反応が顕著に抑制されることがわかった。即ち、抗原を含有していない尿のみのサンプル（陰性のサンプル）であっても、鳥由来のＩｇＹが存在していない場合には、２５０程度の発色強度が観察され、これは目視でも十分に確認できる発色強度（発色強度が１０以上）であり、強い非特異反応があることがわかる。しかし、鳥由来のＩｇＹの２μｇ／ストリップの添加により、発色強度は１００以下に顕著に減少し、３μｇ／ストリップの添加により、１０程度に極端な減少を示した。３μｇ／ストリップの添加では、目視可能ラインのギリギリであったが、７μｇ／ストリップの添加では、完全に目視できない程度にすることができた。
これらの結果、鳥由来のＩｇＹは本イムノクロマト試薬において１ストリップあたりに３μｇ、好ましくは７μｇ以上を抗体抗原反応中に導入することにより非特異反応を目視できない程度に抑制することができることがわかった。
また、尿に肺炎球菌夾膜抗原を添加した尿サンプル（陽性のサンプル）においても同様の傾向が見られるが、鳥由来のＩｇＹが３μｇ／ストリップ以上添加された場合には、発色強度は殆ど変化せず、安定した発色強度が保たれた。そして、発色強度の絶対値は鳥由来のＩｇＹの添加により減少するが、ＳＮ比は大幅に改善され、例えば、鳥由来のＩｇＹ無添加の場合には、約１．４（３４０／２５０）であったものが、鳥由来のＩｇＹが３μｇ／ストリップの場合には約１０（１００／１０）と大幅な改善が見られることがわかった。このように、鳥由来のＩｇＹの添加により、被検体としての尿における特異性を高め検出感度を飛躍的に向上させる効果が得られることがわかった。
【実施例３】
【００４５】
各種のタンパク質による尿を被検体とした場合の非特異抑制効果１
尿を被検体として各種のタンパク質を添加した場合の非特異的反応の抑制効果を判定部位とコントロール用ライン領域を有するクロマトグラフ媒体に吸収パッドのみを設置したクロマトグラフ媒体（以下「ハーフストリップ」という）で評価した。
被検体として界面活性剤Ｂｒｉｊ３５を０．５％の濃度で添加した尿を用いた。
被検体４０μＬに対して、抗肺炎球菌ウサギポリクローナル抗体（Polyclonal Rabit anti Streptcoccus pneumoniae antibody）を感作させた金コロイド（標識試薬）を５μＬ導入し、これにさらに、鳥類由来のタンパク質であるＩｇＹ（これをＩｇＹ１という）、比較対象としてマウス由来のタンパク質であるＩｇＧ、兎由来のタンパク質であるＩｇＧ、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び抗原認識部位の違う鳥由来のＩｇＹ（これをＩｇＹ２という）を、それぞれ２μｇ添加して試料を作製した。対照としてこれらのタンパク質を添加しない尿のみのものを使用した。
これらの試料に、判定ラインに前記の感作抗体と同じ抗体を塗布したハーフストリップの先端を浸漬させ、１５分後に判定ラインの発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社）で測定した。
【００４６】
この結果を図２に示す。図２の縦軸は判定部位における発色強度を示し、横軸は各種のタンパク質の場合を示す。最も左側の棒グラフは対照の無添加の場合を示す。
この結果、ＩｇＹ以外のマウスＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、及びＢＳＡなどのタンパク質では、尿における非特異的反応を抑制することができないことがわかった。さらに、驚くべきことに、鳥由来のＩｇＹはその他のタンパク質と比較して特異的に非特異的反応を抑制できるだけでなく、その抗原認識部位が異なっていてもＩｇＹであれば、同様な非特異的反応の抑制効果が有ることがわかった。
【実施例４】
【００４７】
各種のタンパク質による尿を被検体とした場合の非特異抑制効果２
尿を被検体として各種のタンパク質を添加した場合の非特異的反応の抑制効果をハーフストリップで評価した。
被検体として界面活性剤Ｂｒｉｊ３５を０．５％の濃度で添加した尿を用いた。
被検体４０μＬに対して、抗ブタＴタンパクウサギモノクローナル抗体（Polyclonal Rabit anti Pig Troponin antibody）を感作させた金コロイド（標識試薬）を５μＬ導入し、これにさらに、鳥類由来のタンパク質であるＩｇＹ（これをＩｇＹ１という）、比較対象としてマウス由来のタンパク質であるＩｇＧ、兎由来のタンパク質であるＩｇＧ、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び抗原認識部位の違う鳥由来のＩｇＹ（これをＩｇＹ２という）を、それぞれ２μｇ添加して試料を作製した。対照としてこれらのタンパク質を添加しない尿のみのものを使用した。
これらの試料に、判定ラインに前記の感作抗体と同じ抗体を塗布したハーフストリップの先端を浸漬させ、１５分後に判定ラインの発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社）で測定した。
【００４８】
この結果を図３に示す。図３の縦軸は判定部位における発色強度を示し、横軸は各種のタンパク質の場合を示す。最も左側の棒グラフは対照の無添加の場合を示す。
この結果、検出用の抗体が異なっても、前記の実施例３と同様な結果が得られることがわかった。即ち、本発明の鳥由来のＩｇＹの添加により、被検体が尿であれば、非特異的反応を特異的に抑制できる効果が得られることがわかった。
【実施例５】
【００４９】
尿を被検体とした夾膜抗原検出系でのＳＮ比評価
尿を被検体として各種タンパク質を導入し、非特異的反応の抑制効果をハーフストリップにおけるＳＮ比で評価した。
被検体として、界面活性剤Ｂｒｉｊ３５を０．５％の濃度で、かつ肺炎球菌（Streptcoccus pneumoniae）の夾膜抗原を精製したものを１１５ｎｇ／ｍＬの濃度となるように添加した尿を用いた。
被検体４０μＬに対して、抗肺炎球菌ウサギポリクローナル抗体（Polyclonal Rabit anti Streptcoccus pneumoniae antibody）を感作させた金コロイド（標識試薬）を５μＬ導入し、これにさらに、鳥類由来のタンパク質であるＩｇＹ（これをＩｇＹ１という）、比較対象としてマウス由来のタンパク質であるＩｇＧ、兎由来のタンパク質であるＩｇＧ、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び抗原認識部位の違う鳥由来のＩｇＹ（これをＩｇＹ２という）を、それぞれ２μｇ添加して試料を作製した。対照としてこれらのタンパク質を添加しない尿のみのものを使用した。
これらの試料に、判定ラインに前記の感作抗体と同じ抗体を塗布したハーフストリップの先端を浸漬させ、１５分後に判定ラインの発色強度をイムノクロマトリーダー（浜松ホトニクス社）で測定し、測定値から以下の計算式でＳ／Ｎ（ＳＮ比）を算出した。
Ｓ／Ｎ＝抗原入り被検体での測定値／抗原無し被検体での測定値
【００５０】
この結果を図４に示す。図４の縦軸は判定部位における発色強度に基づいたＳＮ比の値を示し、横軸は各種のタンパク質の場合を示す。最も左側の棒グラフは対照の無添加の場合を示す。
この結果、ＩｇＹ以外のマウスＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、及びＢＳＡなどのタンパク質では、尿における非特異的反応を抑制することができず、ＳＮ比は極めて低いことがわかった。さらに、驚くべきことに、鳥由来のＩｇＹはその他のタンパク質と比較して特異的に非特異的反応を抑制でき、ＳＮ比を２０倍〜５０倍まで増加させることができるという顕著な効果があることが示されただけでなく、その抗原認識部位が異なっていてもＩｇＹであれば、同様な非特異的反応の抑制効果が有り、ＳＮ比が大幅に改善できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明は、尿を被検体とする免疫測定法、特にイムノクロマトグラフ法における非特異的反応を顕著に抑制させるものであり、採取が容易で、常在菌の少ない尿による簡便で高感度、高信頼性の測定手段を提供するものであり、産業上有用であり、産業上の利用可能性を有している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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