(57)【要約】神経幹細胞調製物を調製するにおいて、クローン性の要件が必要かどうかについて検討することが課題のひとつであり、そして、神経幹細胞を簡便に調製する方法を提供することもまた課題のひとつである。本発明は、Musashi陽性脂肪組織由来細胞含有細胞の生産方法であって、脂肪組織由来細胞を提供する工程；および該脂肪組織由来細胞を、アグリゲーションが生じるに十分な期間浮遊培養する工程を包含する、方法を提供することによって上記課題を解決した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Musashi陽性脂肪組織由来細胞含有細胞。
【請求項２】
前記細胞は、アグリゲーション状態を呈する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記脂肪組織細由来細胞は、皮下または鼠径部または腹腔内の脂肪に由来する細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
前記脂肪組織由来細胞は、多能性を有する細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記脂肪組織由来細胞は、脂肪組織を採取し、コラゲナーゼ処理を行なった後に遠心分離してペレットとして回収される、Stromal-vascular-fraction細胞であるか、または廃液由来の脂肪由来幹細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
さらにnestinおよびCD133からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
未分化細胞マーカー、神経幹細胞マーカーおよび神経堤細胞マーカーを発現するが、神経分化細胞マーカーは低発現である、請求項１に記載の細胞。
【請求項８】
前記未分化細胞マーカーは、Oct3/4を含む、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記神経幹細胞マーカーは、Nestinに加えMusashiを含む、請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
前記神経堤細胞マーカーは、ｐ７５およびS100bを含む、請求項７に記載の細胞。
【請求項１１】
前記神経分化細胞マーカーは、b-III tubulinおよびNeurofilamentを含む、請求項７に記載の細胞。
【請求項１２】
神経再生のための組成物であって、Musashi陽性脂肪組織由来細胞含有細胞を含む、組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、脊髄損傷を処置するためのものである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記脂肪組織由来細胞は、皮下または鼠径部または腹腔内の脂肪に由来する細胞である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記脂肪組織由来細胞は、多能性を有する細胞である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記脂肪組織由来細胞は、脂肪組織を採取し、コラゲナーゼ処理を行なった後に遠心分離してペレットとして回収される、Stromal-vascular-fraction細胞であるか、または廃液由来の脂肪由来幹細胞である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
さらにMusashi-1およびCD133からなる群より選択されるマーカーを発現する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
未分化細胞マーカー、神経幹細胞マーカーおよび神経堤細胞マーカーを発現するが、神経分化細胞マーカーは低発現である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記未分化細胞マーカーは、Oct3/4を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記神経幹細胞マーカーは、Nestinに加えMusashiを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記神経堤細胞マーカーは、ｐ７５およびS100bを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
前記神経分化細胞マーカーは、b-III tubulinおよびNeurofilamentを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
Musashi陽性脂肪組織由来細胞含有細胞の生産方法であって、該方法は、
Ａ）脂肪組織由来細胞を提供する工程；および
Ｂ）該脂肪組織由来細胞を、アグリゲーションが生じるに十分な期間浮遊培養する工程
を包含する、方法。
【請求項２４】
前記Ａ）工程の前に、脂肪組織または吸引脂肪廃液を採取し、コラゲナーゼ処理を行なった後に遠心分離してペレットとして回収することによって、前記脂肪組織由来細胞を得る工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ａ）工程の後に、Ａ’）前記脂肪組織由来細胞を接着する工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ａ）工程の後に、Ａ’）前記脂肪組織由来細胞を接着し、その後、１回以上継代して前記脂肪組織由来細胞を脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）として得る工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記浮遊培養は、１０％ウシ胎児血清、ヘパリンおよび酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）を補充したM199培地、ＤＭＥＭ＋Ｆ１２  1:１培地またはニューロスフェア培地中で行なわれ、該ニューロスフェア培地は、ＤＭＥＭ＋Ｆ１２  1:1、２％  Ｂ２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２０ｎｇ／μｌ  塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、２０ｎｇ／μｌ  上皮増殖因子（ＥＧＦ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記浮遊培養は、１０％ウシ胎児血清を補充したDMEM中で行なわれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記浮遊培養において使用される容器は、非接着性であるかあるいは非接着性となるようにコーティングされたものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記非接着性のコーティングは、アガロースゲルでのコーティングである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記非接着性のコーティングは、１％アガロースゲルでのコーティングである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記非接着性のコーティングは、Type VIIアガロースゲルでのコーティングである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記浮遊培養は、血清を含む培地中で、かつ、使用される容器が非接着性であるかあるいは非接着性となるようにコーティングされたものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
未分化細胞マーカー、神経幹細胞マーカーおよび神経堤細胞マーカーを発現すること、神経分化細胞マーカーは低発現であることを確認する工程を包含する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記未分化細胞マーカーは、Oct3/4を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３６】
前記神経幹細胞マーカーは、Nestinに加えMusashiを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記神経堤細胞マーカーは、ｐ７５およびS100bを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記神経分化細胞マーカーは、b-III tubulinおよびNeurofilamentを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
Musashi陽性脂肪組織由来細胞含有細胞の生産のための、ダルベッコ最小基礎培地（ＤＭＥＭ）またはニューロスフェア培地の使用。
【請求項４０】
Musashi陽性脂肪組織由来細胞含有細胞の生産のための、非接着性のコーティングの培養容器。
【請求項４１】
神経系の状態、障害または疾患を予防または処置するための医薬であって、該医薬はMusashi陽性脂肪組織由来細胞含有細胞を含む、医薬。
【請求項４２】
前記神経系の状態、障害または疾患は、脊髄損傷を包含する、請求項４１に記載の医薬。
【請求項４３】
神経系の状態、障害または疾患を予防または処置するための医薬の製造における、Musashi陽性脂肪組織由来細胞含有細胞の使用。
【請求項４４】
前記神経系の状態、障害または疾患は、脊髄損傷を包含する、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
神経系の状態、障害または疾患を予防または処置するための方法であって、該方法はMusashi陽性脂肪組織由来細胞含有細胞を、該予防または処置を必要とする被検体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項４６】
前記神経系の状態、障害または疾患は、脊髄損傷を包含する、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞に関する。より詳細には、本発明は、再生技術に応用可能な種々の用途を有する幹細胞およびその生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞の利用を中心とした、再生医療は、ここ数年で、かなりの発展を遂げてきた。従来であれば、存在しないと考えられていた、種々の組織幹細胞が種々の組織から発見され、同定されてきた。このように、再生医療による疾患治療が注目を浴びている。【０００３】
しかし、再生医療は、臓器ないし組織機能不全を呈する多くの患者に対して日常的に適応するまでには至っていない。今日まで、臓器移植のほか、医療機器での補助システムの利用がごく限られたこのような患者に適応されているにすぎない。これらの治療法には、ドナー不足、拒絶、感染、耐用年数などの問題がある。特に、ドナー不足は深刻な問題である。【０００４】
受精卵は、原腸陥入の後、内胚葉、中胚葉および外胚葉の３つの胚葉に分かれ、外胚葉由来の細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞などが含まれる。中胚葉由来の細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞、造血幹細胞および間葉系幹細胞などが含まれる。内胚葉由来の細胞は、主に咽頭、肺、肝臓、膵臓、腸などに存在し、膵臓幹細胞、肝臓幹細胞などが含まれる。【０００５】
脂肪にも幹細胞があることが分かってきた。脂肪由来幹細胞は、もともと、骨、軟骨および脂肪組織のような間葉系組織に分化する脂肪吸引物（ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ  ａｓｐｉｒａｔｅ）から単離した間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＭＳＣ）のサブタイプとして報告されている（非特許文献１）。現在、脂肪由来幹細胞は、再生医療のための最も有望な成体幹細胞の１つとして考えられている（非特許文献２〜３）。なぜなら、脂肪由来間質細胞は、脂肪吸引により安全に回収でき、かつ、良好な収量を期待できるからである。【０００６】
幹細胞研究が進むにつれて、胚葉の境界を越えた細胞分化の新規な概念を見出されてきた。ＭＳＣおよび脂肪由来幹細胞は、本来、中胚葉系であるが、神経系（つまり、外胚葉）誘導体に分化し得る（非特許文献４および５）。最近、神経系の特徴を有する幹細胞が、中胚葉組織（例えば、真皮および心臓）から単離され得ることが報告されている（非特許文献６〜８）。これらの報告では、神経系の特徴を有する幹細胞は、ニューロスフェア（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ）法により回収されている。ニューロスフェア法は、胚およびヒト脳由来の神経幹細胞の単離スフェアの培養方法として開発されたものである。【０００７】
成体哺乳動物の中枢神経系は再生しないと長い間考えられてきたが、成体の中枢神経系にも神経幹細胞が存在することが報告された（非特許文献９）。しかし、その数は少なく、また、単離するにも非常に多くの労力を必要とし、神経系疾患などの再生医療において実際に用いることは困難である。したがって、神経系から神経系の多能性細胞を得ることは実用的でない。そこで、脂肪を用いた神経系の分化について検討がなされている。【０００８】
Ｋａｎｇ，ＫＳらのグループは、霊長類由来の脂肪組織間質細胞（非特許文献１０および１２では、アカケサルが使用されている。非特許文献１１では、使用した動物は、「非ヒト」霊長類であるとしか記載がないようである。）を神経細胞の維持のために開発されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍＴＭ培地中で培養することによってニューロスフェアを形成させる試みを行った（非特許文献１０〜１２）。Ｋａｎｇ  ＫＳらの報告においては、脂肪由来幹細胞をＭＥＭ中で１週間ほどの長期間接着培養させると培養細胞のモノレイヤー表面より細胞塊が生じ培養液中に放出されるので、これを上記Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  ｍｅｄｉｕｍを含んだｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ培地に移してさらに培養を継続して得られた細胞塊をｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅとみなしている。この方法は本発明の方法とは全く異なり、また一般の神経幹細胞のｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ培養法と比較してもかなり特殊である。しかしＫａｎｇ  ＫＳらはこの方法で得た細胞塊をｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅと呼んでいる上、実際得られた細胞塊はｎｅｓｔｉｎなどの神経幹細胞マーカーを発現し、また分化誘導実験によりＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、ＮＦ１６０等神経分化マーカーを発現するようになることから、Ｋａｎｇ  ＫＳの報告した細胞塊は従来の意味でのｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅとほぼ同等の性質を有するものと考えられる。すなわち、１週間以上の期間をかけて、脂肪由来幹細胞の集団から特に神経幹細胞の性質を有するｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを選択的に増殖させて生じた細胞塊とみなすべきものである。従って、Ｋａｎｇ  ＫＳらの報告においては、脂肪由来幹細胞自体を１−２日の短期間のうちに直接Musashi陽性またはnestin陽性の神経幹細胞（もしくは前駆細胞）に誘導・転換させうる可能性は全く想定されておらず、またその方法についても（例えば細胞を短期間のうちに凝集させるなどの方法）まったく記載も示唆もされていないといえる。【０００９】
このことについては、特許文献１〜６および非特許文献４、５、１３〜２２等の多数の文献にその証拠があるといえる。これらの文献には、脂肪由来幹細胞が神経に分化する能力を有するようであることが記載されている。これらの文献では、脂肪由来幹細胞から直接神経への分化能を有するかどうか、あるいは１週間以上の培養期間をかけて神経幹細胞の性質を有するｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎを選択的に増幅できるかどうかについて検討がなされている。しかし、これらの文献には、脂肪から細胞を凝集させて例えば１−２日という短期間でMusashi陽性またはnestin陽性にさせることができるかどうかについては、何ら記載されておらず、当該分野においては、細胞を凝集させることによって脂肪由来細胞を直接神経幹細胞（もしくは神経前駆細胞）へ誘導・転換させることはできないと考えられていたといえる。【００１０】
当該分野において、脊髄損傷では細胞移植のタイミングは受傷後１週間から２週間の間といわれている（特許文献７、非特許文献１４。特許文献７には、「脊髄損傷サルモデルの作成方法及びその利用」について実施例中に移植日についての記載がある。非特許文献１４には、ラットの例（９日目移植）がある。）。強い炎症が終わる１週間後くらいから瘢痕形成が始まる２週間くらいのウィンドウ内でなければ効果が薄いだろうと推測されている。この短い期間に移植細胞を準備するためには、スタートの細胞数が多いことと効率よく移植用細胞を得ることが条件になるが、このような条件で細胞を準備する方法はまだ確立されていない。【００１１】
脂肪、特に、脂肪由来幹細胞は、供給が豊富であることから、脂肪由来、特に、脂肪由来幹細胞を用いて、神経系の多能性細胞を生産することができれば、神経系の疾患、障害等の治療に画期的な変化をもたらすものといえ、そのような手法に対する需要が高まっているといえる。【００１２】
従来ニューロスフェア培地での浮遊培養法は、いわゆる神経幹細胞を効率よく単離・増殖させる方法として認知されており、本来的には単一細胞（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ）からのクローン性の（ｃｌｏｎａｌ）細胞増殖塊であることが原則とされていた。しかし２００６年１０月のＳｉｎｇｅｃらの報告（非特許文献１３＝Ｓｉｎｇｅｃ−Ｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ３：８０１−８０６，  ２００６）で、従来Ｃｌｏｎａｌとされた条件での培養でも、生じるニューロスフェアは必ずしもクローン性ではなくアグリゲーション（凝集体＝ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）である場合も多いことが判明し、クローン性であるべき必要性についての再検証が必要な状況にある。非特許文献１３では、マウス新生児の前脳由来神経幹細胞のニューロスフェアの論文で、脂肪細胞のものではなく、脂肪由来の細胞についての事項について予測させる記載もない。【００１３】
また、神経幹細胞は非接着細胞であるので、浮いてくる細胞を集めればよいことから、無血清培地で培養することが行われるのみである。皮膚、心臓等から神経堤細胞を回収するような実験でも、無血清培地で培養を繰り返し浮いている細胞を回収することが行われるのみである。
【特許文献１】国際公開２００３／００８５９２号パンフレット
【特許文献２】特表２００５−５０２３５２号公報（ＷＯ０３／０２２９８８）
【特許文献３】特表２００２−５３７８４９号公報（ＷＯ００／５３７９５）
【特許文献４】米国特許出願公開第２００１／００３３８３４号明細書
【特許文献５】特表２００３−５２３７６７号公報（ＷＯ０１／０６２９０１）
【特許文献６】特表２００５−５０２７１２号公報（ＷＯ２００３／０２４２１５）
【特許文献７】国際公開２００３/０４５１３７パンフレット
【非特許文献１】Ｚｕｋ  ＰＡ，Ｚｈｕ  Ｍ，Ｍｉｚｕｎｏ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．２００１；７：２１１−２２８
【非特許文献２】Ｚｕｋ  ＰＡ，Ｚｈｕ  Ｍ，Ａｓｈｊｉａｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ２００２；１３：４２７９−４２９５
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｋ，Ｓｈｉｇｅｕｒａ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６；２０８：６４−７６
【非特許文献４】Ａｓｈｊｉａｎ  ＰＨ，Ｅｌｂａｒｂａｒｙ  ＡＳ，Ｅｄｍｏｎｄｓ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．２００３；１１１：１９２２−１９３１
【非特許文献５】Ｋｏｋａｉ  ＬＥ，Ｒｕｂｉｎ  ＪＰ，Ｍａｒｒａ  ＫＧ．Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．２００５；１１６：１４５３−１４６０
【非特許文献６】Ｔｏｍａ  ＪＧ，Ａｋｈａｖａｎ  Ｍ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ＫＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００１；３：７７８−７８４
【非特許文献７】Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ＫＪ，ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ＩＡ，Ｍｉｌｌ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００４；６：１０８２−１０９３
【非特許文献８】Ｔｏｍｉｔａ  Ｙ，Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｋ，Ｗａｋａｍａｔｓｕ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２００５；１７０：１１３５−１１４６
【非特許文献９】岡野栄之、実験医学、第２０巻、第９号、２００２；１２７６−１２７９
【非特許文献１０】Ｋａｎｇ  ＳＫ，Ｐｕｔｎａｍ  ＬＡ，Ｙｌｏｓｔａｌｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．２００４；Ａｕｇ  １５；１１７（Ｐｔ  １８）：４２８９−９９
【非特許文献１１】Ｋａｎｇ  ＳＫ，Ｐｕｔｎａｍ  Ｌ，Ｄｕｆｏｕｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２００４；２２：１３５６−１３７２
【非特許文献１２】Ｂｕｎｎｅｌｌ  ＢＡ，Ｙｌｏｓｔａｌｏ  Ｊ，Ｋａｎｇ  ＳＫ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００６；Ｍａｙ  １２；３４３（３）：７６２−７１
【非特許文献１３】Ｓｉｎｇｅｃ−Ｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ３：８０１−８０６，  ２００６
【非特許文献１４】Ｗａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２００４；２６：２７５−２８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
非特許文献１３において、従来Ｃｌｏｎａｌとされた条件での培養でも、生じるニューロスフェアは必ずしもクローン性ではなくアグリゲーションである場合も多いことが判明し、クローン性の必要性についての再検証が必要な状況にある。このクローン性の要件が必要かどうかについて検討することが課題のひとつであり、そして、神経幹細胞を簡便に調製する方法を提供することもまた課題のひとつである。【００１５】
上記したように、当該分野において、脊髄損傷では細胞移植のタイミングは受傷後１週間から２週間の間といわれている。強い炎症が終わる１週間後くらいから瘢痕形成が始まる２週間くらいのウィンドウ内でなければ効果が薄いだろうと推測されている。この短い期間に移植細胞を準備するためには、スタートの細胞数が多いことと効率よく移植用細胞を得ることが条件になるが、このような条件で細胞を準備する方法はまだ確立されていない。そこで、数日から１週間以内に細胞を加工することができる方法の確立が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この背景の下、本発明者らは特殊コートした非接着プレートに高密度の脂肪組織由来細胞をニューロスフェア培地中で浮遊培養し、１−３日で得られるニューロスフェア様細胞塊がｎｅｓｔｉｎ，Musashi−１などの神経幹細胞マーカー陽性であることを見出した。従来技術において、こうした組織幹細胞からのニューロスフェア形成には１週間以上かかることが多く、今回の細胞塊はむしろアグリゲーションであると考えられた。すなわち神経幹細胞が選別され増殖したのではなく、脂肪由来細胞がアグリゲーションを作ること自体の刺激で神経幹細胞としての性質を持つようになった可能性がある。
・さらにこの点を検証するため、ニューロスフェア培地ではなく通常のＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳにて同様にアグリゲーションを作成したところ、驚くべきことにこれもｎｅｓｔｉｎ，Musashi−１の発現が増強した。
・そのため、非接着性特殊コートプレートに高濃度に浮遊培養させて作出した脂肪由来アグリゲーションは、従来のニューロスフェアとは全く違う意味合いで（アグリゲーションすることそれ自体の効果で）神経再生目的、ひいてはさらに他の組織再生目的に使用できる可能性を有するものと考えられるので、この細胞塊を特にアディポクラスター（ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ）と呼び、その形成方法を完成させた。【００１７】
神経幹細胞は非接着細胞であるので、浮いてくる細胞を集めればよいことから、無血清培地で培養することが行われるのみである。皮膚、心臓等から神経堤細胞を回収するような実験でも、無血清培地で培養を繰り返し浮いている細胞を回収することが行われるのみであるところ、好ましい実施形態では、本発明は、非接着細胞の神経幹細胞を、あえて血清入り培地で培養することに特徴がある。理論に束縛されることを望まないが、従来は、非接着性または非接着性処理プレート中で、いわば無理やり培養する処理は行われていなかったところ、本発明では、このような手法を採用することによって、神経幹細胞の塊を効率よく生産することができることを見出した点にその特徴があるというべきである。なお、非接着処理としては、アガロースやムチン、その他色々な高分子でコーティングする技術が知られてはいたが、このような処理で神経幹細胞の生産を効率よくすることができることは予想外であるというべきである。【００１８】
そして、本発明は、数日から１週間以内に細胞を加工することができることから、強い炎症が終わる１週間後くらいから瘢痕形成が始まる２週間くらいのウィンドウ内でなければ効果が薄いだろうと推測される短い期間に移植細胞を準備することができ、スタートの細胞数が多いことと効率よく移植用細胞を得るという条件を満たす。【００１９】
このような効果を奏する本発明の方法は、他の候補細胞（ＥＳ細胞、中絶胎児神経幹細胞、iPS細胞など）に比べ実用面で絶対的に有効であるといえる。すなわち、実用面の意味は「自己細胞が」「適切なタイミングで」入手できるという意味で本発明はその有用性、顕著性が認められるべきである。【００２０】
したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）  Musashiまたはnestin陽性脂肪組織由来細胞含有細胞。
（２）前記細胞は、アグリゲーション状態を呈する、上記項目に記載の細胞。
（３）前記脂肪組織細由来細胞は、皮下または鼠径部または腹腔内の脂肪に由来する細胞である、上記項目に記載の細胞。
（４）前記脂肪組織由来細胞は、多能性を有する細胞である、上記項目に記載の細胞。
（５）前記脂肪組織由来細胞は、脂肪組織を採取し、コラゲナーゼ処理を行なった後に遠心分離してペレットとして回収される、Stromal-vascular-fraction細胞であるか、または廃液由来の脂肪由来幹細胞である、上記項目に記載の細胞。
（６）さらにnestinおよびCD133からなる群より選択されるマーカーを発現する、上記項目に記載の細胞。
（７）未分化細胞マーカー、神経幹細胞マーカーおよび神経堤細胞マーカーを発現するが、神経分化細胞マーカーは低発現である、上記項目に記載の細胞。
（８）前記未分化細胞マーカーは、Oct3/4を含む、上記項目に記載の細胞。
（９）前記神経幹細胞マーカーは、さらにMusashiまたはnestinを含む、上記項目に記載の細胞。
（１０）前記神経堤細胞マーカーは、ｐ７５およびS100bを含む、上記項目に記載の細胞。
（１１）前記神経分化細胞マーカーは、b-III tubulinおよびNeurofilamentを含む、上記項目に記載の細胞。
（１２）神経再生のための組成物であって、Musashiまたはnestin陽性脂肪組織由来細胞含有細胞を含む、組成物。
（１３）前記組成物は、脊髄損傷を処置するためのものである、上記項目に記載の組成物。
（１４）前記脂肪組織由来細胞は、皮下または鼠径部または腹腔内の脂肪に由来する細胞である、項目１２に記載の組成物。
（１５）前記脂肪組織由来細胞は、多能性を有する細胞である、上記項目に記載の組成物。
（１６）前記脂肪組織由来細胞は、脂肪組織を採取し、コラゲナーゼ処理を行なった後に遠心分離してペレットとして回収される、Stromal-vascular-fraction細胞であるか、または廃液由来の脂肪由来幹細胞である、上記項目に記載の組成物。
（１７）さらにMusashiまたはnestin-1およびCD133からなる群より選択されるマーカーを発現する、上記項目に記載の組成物。
（１８）未分化細胞マーカー、神経幹細胞マーカーおよび神経堤細胞マーカーを発現するが、神経分化細胞マーカーは低発現である、上記項目に記載の組成物。
（１９）前記未分化細胞マーカーは、Oct3/4を含む、上記項目に記載の組成物。
（２０）前記神経幹細胞マーカーは、さらにMusashiまたはnestinを含む、上記項目に記載の組成物。
（２１）前記神経堤細胞マーカーは、ｐ７５およびS100bを含む、上記項目に記載の組成物。
（２２）前記神経分化細胞マーカーは、b-III tubulinおよびNeurofilamentを含む、上記項目に記載の組成物。
（２３）  Musashiまたはnestin陽性脂肪組織由来細胞含有細胞の生産方法であって、該方法は、
Ａ）脂肪組織由来細胞を提供する工程；および
Ｂ）該脂肪組織由来細胞を、アグリゲーションが生じるに十分な期間浮遊培養する工程
を包含する、方法。
（２４）前記Ａ）工程の前に、脂肪組織または吸引脂肪廃液を採取し、コラゲナーゼ処理を行なった後に遠心分離してペレットとして回収することによって、前記脂肪組織由来細胞を得る工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（２５）前記Ａ）工程の後に、Ａ’）前記脂肪組織由来細胞を接着する工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（２６）前記Ａ）工程の後に、Ａ’）前記脂肪組織由来細胞を接着し、その後、１回以上継代して前記脂肪組織由来細胞を脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）として得る工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（２７）前記浮遊培養は、１０％ウシ胎児血清、ヘパリンおよび酸性繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）を補充したM199培地、ＤＭＥＭ＋Ｆ１２  1:１培地またはニューロスフェア培地中で行なわれ、該ニューロスフェア培地は、ＤＭＥＭ＋Ｆ１２  1:1、２％  Ｂ２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２０ｎｇ／μｌ  塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、２０ｎｇ／μｌ  上皮増殖因子（ＥＧＦ）である、上記項目に記載の方法。
（２８）前記浮遊培養は、１０％ウシ胎児血清を補充したDMEM中で行なわれる、上記項目に記載の方法。
（２９）前記浮遊培養において使用される容器は、非接着性であるかあるいは非接着性となるようにコーティングされたものである、上記項目に記載の方法。
（３０）前記非接着性のコーティングは、アガロースゲルでのコーティングである、上記項目に記載の方法。
（３１）前記非接着性のコーティングは、１％アガロースゲルでのコーティングである、上記項目に記載の方法。
（３２）前記非接着性のコーティングは、Type VIIアガロースゲルでのコーティングである、上記項目に記載の方法。
（３３）前記浮遊培養は、血清を含む培地中で、かつ、使用される容器が非接着性であるかあるいは非接着性となるようにコーティングされたものである、上記項目に記載の方法。
（３４）未分化細胞マーカー、神経幹細胞マーカーおよび神経堤細胞マーカーを発現すること、神経分化細胞マーカーは低発現であることを確認する工程を包含する、上記項目に記載の方法。
（３５）前記未分化細胞マーカーは、Oct3/4を含む、上記項目に記載の方法。
（３６）前記神経幹細胞マーカーは、さらにMusashiまたはnestinを含む、上記項目に記載の方法。
（３７）前記神経堤細胞マーカーは、ｐ７５およびS100bを含む、上記項目に記載の方法。
（３８）前記神経分化細胞マーカーは、b-III tubulinおよびNeurofilamentを含む、上記項目に記載の方法。
（３９）Musashiまたはnestin陽性脂肪組織由来細胞含有細胞の生産のための、ダルベッコ最小基礎培地（ＤＭＥＭ）またはニューロスフェア培地の使用。
（４０）Musashiまたはnestin陽性脂肪組織由来細胞含有細胞の生産のための、非接着性のコーティングの培養容器。
（４１）神経系の状態、障害または疾患を予防または処置するための医薬であって、該医薬はMusashiまたはnestin陽性脂肪組織由来細胞含有細胞を含む、医薬。
（４２）前記神経系の状態、障害または疾患は、脊髄損傷を包含する、上記項目に記載の医薬。
（４３）神経系の状態、障害または疾患を予防または処置するための医薬の製造における、Musashiまたはnestin陽性脂肪組織由来細胞含有細胞の使用。
（４４）前記神経系の状態、障害または疾患は、脊髄損傷を包含する、上記項目に記載の使用。
（４５）神経系の状態、障害または疾患を予防または処置するための方法であって、該方法はMusashiまたはnestin陽性脂肪組織由来細胞含有細胞を、該予防または処置を必要とする被検体に投与する工程を包含する、方法。
（４６）前記神経系の状態、障害または疾患は、脊髄損傷を包含する、上記項目に記載の方法。【００２１】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読めば、明白である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、脂肪由来の神経幹細胞の機能を有するアグリゲーションを提供することができた。このアグリゲーションを用いて再生治療ができる。本発明は、さらに、脂肪から前駆細胞を回収し、その前駆細胞をアグリゲーションとする条件に供することにより、神経幹細胞の機能を有する細胞を調製することができる。さらに、本発明はまた、アグリゲーションを移植することにより、神経系疾患、障害または状態の処置を容易にする。これらの処置は、ほとんど副作用が予測されないこと、およびその供給源が豊富なことから、再生医療において簡易かつ効率のよい処置方法を提供する。本発明により、このような特殊機能を有するアグリゲーションを顕著に速い速度で提供することができた。脂肪を原料とすることができるので、神経幹細胞の機能を有する混合物を大量に提供することができるという効果も提供される。【００２３】
本発明は、数日から１週間以内に細胞を加工することができることから、強い炎症が終わる１週間後くらいから瘢痕形成が始まる２週間くらいのウィンドウ内でなければ効果が薄いだろうと推測される短い期間に移植細胞を準備することができ、スタートの細胞数が多いことと効率よく移植用細胞を得るという条件を満たす。【００２４】
このような効果を奏する本発明の方法は、他の候補細胞（ＥＳ細胞、中絶胎児神経幹細胞、iPS細胞など）に比べ実用面で、特に、実用面の意味は「自己細胞が」「適切なタイミングで」入手できるという意味で絶対的に有効であるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、実施例１の方法により得られたadipoclusterを示す。(1)の方法で2日後のものを示す。12穴プレート中のもので、大きいものは肉眼でも確認可能であった。
【図２】図２は、Nestin-EGFPtransgenic ラット皮下脂肪、腹腔内脂肪由来のadipoclusterを示す。（1）の方法で1日後のものであるが、すでにEGFPシグナル陽性でnestin発現の上昇と考えられる。
【図３】図３は、adipocluster培養1日目・2日目のNestin,Musashi-1発現（RT-PCR）の結果を示す。
【図４】図４は、neurosphere培地(左)と、DMEM+10%FBS (右)とで形成したadipoclusterの比較したものを示す。
【図５】図５は、neurosphere培地と、DMEM+FBSで培養したadipoclusterのマーカー発現を示す。
【図６】図６は、実施例５の結果であり、左から、M199＋ウシ胎児血清（FBS)+繊維芽細胞増殖因子（FGF）、DMEM/F12、およびDMEM/F12＋B27＋上皮増殖因子（EGF)+FGFで増殖させたadipoclusterを示す。いずれにおいても、adipoclusterの形成がみられた。
【図７】図７は、実施例６において、８日培養後のadipoclusterを回収し、４０μｍフィルターを通したクラスターをTrypsin-EDTA処理した。分散した細胞をＰＢＳに懸濁し移植細胞とした。脊髄損傷から９日後に細胞を移植しＢＢＢスコアから細胞移植効果を解析した結果を示す。SCIは、切除（脊髄損傷モデルの作成）時点、Injectionは注入時点を示す。太線と黒丸または黒三角の曲線は、本発明のAdipocluster注入の実験を示す。PBSおよび細い線と白四角はリン酸緩衝化生理食塩水を移植したものを示す。
【図８】図８は、第10胸椎に70kDynesで圧挫損傷を与えたC57BL/6雌マウスに、受傷9日後、分散したAdipoclusterを移植した結果を示す。移植細胞数は実験１：7.5x103cells/mouse 、実験２：7.5x103 cells/mouse。細胞を含まないPBSを注入した対象区のマウスでは、その後ほとんど回復は見られないが、Adipoclusterを移植したマウスでは下肢機能の回復が認められた。
【図９】図９は、平面培養のASCに対するAdipoclusterの相対的発現量（倍）を示す。左からGFPマウス、野生型マウスの順に示し、それらの群の中で、ｎ＝３で示し平均を示す。左には、合計での平均を示す。RNA発現を比較したところ、Nestinおよびp75NTRの発現はAdipoclusterにおいて有意に高くなっていた（＊:P<0.05, §: P<0.01）。
【配列表フリーテキスト】
【００２６】
配列番号１は、Ｎｅｓｔｉｎ  ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＣＴＴＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＡＴＡＣＡ。【００２７】
配列番号２は、Ｎｅｓｔｉｎ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＧＡＧＧＡＴＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＧＧＣＡＣＴ。【００２８】
配列番号３は、Musashi−１  ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＧＧＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＧ。【００２９】
配列番号４は、Musashi−１  ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：  ＧＧＧＡＡＣＴＧＧＴＡＧＧＴＧＴＡＡＣ。【００３０】
配列番号５は、１８Ｓ  ｒＲＮＡ  ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＧＣＣＧＣＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＧ。【００３１】
配列番号６は、１８Ｓ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＧ。【００３２】
配列番号７は、ＧＡＰＤＨ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡ。【００３３】
配列番号８は、ＧＡＰＤＨ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧＧ。【００３４】
配列番号９は、Ｏｃｔ３／４  Ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡ。【００３５】
配列番号１０は、Ｏｃｔ３／４  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＣＡＧＡＴＧＧＴＣＧＴＴＴＧＧＣＴＧＡＡ。【００３６】
配列番号１１は、Ｎｅｓｔｉｎ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＡＣＴＴＣＣＣＴＣＡ。【００３７】
配列番号１２は、Ｎｅｓｔｉｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＡＧＧＧＡＡＧＴＴＧＧＧＣＴＣＡＧＧＡＣ。【００３８】
配列番号１３は、Musashi１  Ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＧＴＧＡＡＧＣＡＡＴ。【００３９】
配列番号１４は、Musashi１  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＡＡＡＣＧＴＧＡＣＡＡＡＣＣＣＧＡＡＣＣ。【００４０】
配列番号１５は、ｐ７５  Ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＴＡＴＴＣＣＧＡＣＧＡＧＧＣＣＡＡＣＣ。【００４１】
配列番号１６は、ｐ７５  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧＴＡＡＴＣＣＡＡＣＧ。【００４２】
配列番号１７は、ＴＵＢＢ  （ｂｅｔａ  ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ）  Ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＧＧＧＧＣＣＴＴＴＧＧＡＣＡＴＣＴＣＴＴ。【００４３】
配列番号１８は、ＴＵＢＢ  （ｂｅｔａ  ＩＩＩ  ｔｕｂｕｌｉｎ）  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＡＣＡＣＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＡＣＡＴ。【００４４】
配列番号１９は、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＧＴＧＧＴＴ。【００４５】
配列番号２０は、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＧＣＴＧＡＣＧＣＣＧＧＴＡＣＴＣＡＧＴＴ。【００４６】
配列番号２１は、ＧＦＡＰ  Ｆｏｒｗａｒｄプライマーである：ＴＴＧＡＧＴＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧ。【００４７】
配列番号２２は、ＧＦＡＰ  Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーである：ＧＣＴＣＣＡＣＡＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＴ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００４９】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味として定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界から生体を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明の方法においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使用される「細胞」の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）染色を行うことにより細胞外マトリクス（例えば、エラスチンまたはコラーゲン）および細胞に由来する核を染め分ける。この組織切片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積（例えば、２００μｍ×２００μｍ）あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞など）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織（例えば、脂肪組織）、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物などが挙げられるがそれらに限定されない。また、このような供給源をそのまま細胞として用いることもできる。【００５０】
本発明において使用される脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌまたはａｄｉｐｏｃｙｔｅ）およびその対応物は、以下の生物が脂肪細胞またはその対応物を有する限り、どの生物（例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来であってもよい。好ましくは、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来であってもよい。１つの実施形態では、霊長類（例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。【００５１】
本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」とは、分化細胞の前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒまたはｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）をいい、これは、単分化能性（ｍｏｎｏｐｏｔｅｎｃｙ）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）、全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する細胞をいう。本明細書では、「幹細胞」は、「前駆細胞」と交換可能に用いられ得る。したがって、本明細書のＡＳＣも幹細胞に含まれることが理解される。幹細胞は、特定の刺激に応答して分化され得る。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書で使用される幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞または組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう）または他の前駆細胞であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞（例えば、本明細書において使用される融合細胞、再プログラム化された細胞など）もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）である。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の程度が比較的限定されている細胞であり、組織中に存在し、未分化な細胞内構造をしている。組織幹細胞は、核／細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書において使用される場合は、幹細胞は好ましくは胚性幹細胞であり得るが、状況に応じて組織幹細胞も使用され得る。【００５２】
本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」とは、幹細胞または前駆細胞を少なくとも一定量含む組織をさすことがある。従って、幹細胞は、コラゲナーゼ処理して脂肪組織から採取した幹細胞（例えば、以下の実施例において使用される脂肪由来幹細胞など）を用いることができるがそれらに限定されない。【００５３】
細胞が由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵（共通）幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。【００５４】
本明細書において使用される場合、用語「間葉系幹細胞」とは、間葉に見出される幹細胞をいう。用語「間葉系幹細胞」とは、本明細書では「ＭＳＣ」と略されることがある。ここで、間葉とは、多細胞動物の発生各期に認められる、上皮組織間の間隙をうめる星状または不規則な突起をもつ遊離細胞の集団と，それに伴う細胞間質によって形成される組織をいう。間葉系幹細胞は、増殖能と、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、ストローマ細胞、腱細胞、脂肪細胞への分化能を有する。間葉系幹細胞は、患者から採取した骨髄細胞等を培養または増殖、軟骨細胞あるいは骨芽細胞に分化させるために使用され、また、例えば、歯槽骨、関節症等の骨、軟骨または関節などの再建材料として使用されており、その需要は大きい。また、間葉系幹細胞は、血液細胞、リンパ系細胞へも分化し得ることから、その需要がますます高まっている。【００５５】
本明細書において使用される場合、用語「脂肪由来幹細胞」とは、脂肪吸引により得られる幹細胞をいい、そしてまた、他の前駆細胞（例えば、末梢血もしくは血管ストローマ細胞（ｖａｓｃｕｌａｒ−ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）（脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ））由来の幹細胞）をいう。脂肪由来幹細胞は、脂肪組織に由来するか、または脂肪吸引手順により得られた任意の多能性前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ））もしくは単分化能性前駆細胞（ｍｏｎｏｐｏｔｅｎｔ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）の集団を意味する。これらとしては、脂肪由来血管ストローマ細胞（脂肪前駆細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、脂肪由来間質細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｅｌｌまたはａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ））、脂肪由来幹細胞、脂肪由来前駆細胞、脂肪幹細胞、内皮前駆細胞、造血幹細胞などが挙げられる。このような幹細胞の分離方法の一部は公知であり、例えば、非特許文献１、特許文献１および２に記載される。これらの文献に記載された事項は、本明細書において特に関連する場所が参考として援用される。本明細書において使用される場合、用語「脂肪由来幹細胞」とは、これらの公知の分離方法によって得られる脂肪組織由来幹細胞を含む、すべての脂肪組織由来幹細胞のことを指す。本明細書において使用される場合、用語「前駆細胞」とは、多能性未分化細胞だけでなく、単分化能性未分化細胞も含まれる。本明細書において使用される場合、用語「幹細胞」とは、前駆細胞を含む。【００５６】
本明細書において使用される用語「脂肪組織由来細胞」とは、脂肪組織に由来する任意の細胞をいい、たとえば、脂肪吸引物に由来する細胞を含む。代表的には、「脂肪由来幹細胞」を含む脂肪組織に由来する任意の細胞を含むがこれに限定されない。以下に代表的な脂肪マーカーを示す。【００５７】
【表１】
2008150001.tif 000002
【００５８】
これ以外にも、脂肪分化マーカーとしてＧＬＵＴ４（アクセッションナンバーＭ２０７４７（ヒト））およびＰＰＡＲγ（アクセッションナンバーＬ４０９０４（ヒト））を確認することによっても同定することができ、あるいはＯｉｌ  ｒｅｄ  Ｏ陽性であることを確認することができる。この確認方法は、以下のとおりである：培養細胞を４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定し、０．１８％オイルレッドＯ染色液で１５分染色する。【００５９】
脂肪吸引で採取される吸引物は、吸引瓶の中で二層に分離される。吸引物の上層は、浮遊する脂肪部分（吸引脂肪（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ））から成り、下層は液体部分（吸引廃液（ｌｉｑｕｉｄ−ａｓｐｉｒａｔｅまたはｌｉｐｏｓｃｕｔｉｏｎ−ａｓｐｉｒａｔｅ  ｆｌｕｉｄ））から構成される。本明細書において使用される場合、用語「ＰＬＡ（吸引脂肪由来細胞（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ  ｃｅｌｌ））」とは、脂肪吸引による吸引物の吸引脂肪より得られる前駆細胞をいう。本明細書において使用される場合、用語「ＬＡＦ細胞（吸引廃液細胞（ｌｉｑｕｉｄ−ａｓｐｉｒａｔｅ  ｃｅｌｌまたはｌｉｐｏｓｃｕｔｉｏｎ−ａｓｐｉｒａｔｅ  ｆｌｕｉｄ  ｃｅｌｌ））とは、脂肪吸引による吸引物の液体部分に由来する前駆細胞をいう。脂肪由来幹細胞は、ＰＬＡ細胞およびＬＡＦ細胞を含む。【００６０】
本明細書において使用される場合、用語「体細胞」は、卵子、精子などの生殖細胞以外の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に引き渡さない全ての細胞をいう。体細胞は通常、多能性が限定されているかまたは消失している。本明細書において使用される体細胞は、意図された処置を達成し得る限り、天然に存在するものであってもよく、遺伝子改変されたものであってもよい。【００６１】
本明細書において使用される場合、「神経幹細胞」とは、神経系に分化することができ、かつ、多能性を併せもつ細胞をいう。神経幹細胞は、神経幹細胞の細胞マーカーおよび多能性を確認することなどにより同定することができる。【００６２】
本明細書において使用される場合、好ましくは、幹細胞は、自己複製能を有していてもよいがそれに限定されず、自己複製能を有していない細胞であっても多能性を有している限り幹細胞の範囲内にあることが理解される。自己複製能とは、分裂を繰り返して自己と同じ細胞集団を生成する能力をいう）。神経幹細胞の「自己複製能」は、例えば、ニューロスフェア法により確認することができる。ニューロスフェア法は、Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １９９２；１２：４５６５−４５７４およびＳｃｉｅｎｃｅ  １９９２；２５５：１７０７−１７１０によって、もともと報告された方法である。ニューロスフェア法は、胚または成体中枢神経系から神経幹細胞を単離するために最も頻繁に使用される方法のうちの１つである。ニューロスフェア法の一例としては、増殖因子として上皮増殖因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂａｓｉｃ−ＦＧＦ、ｂ−ＦＧＦ）の存在下で、神経幹細胞を浮遊状態で培養し、単一細胞からなるニューロスフェアを形成させる工程、形成されたニューロスフェアを解離させて、解離した細胞を新しい培地に播種する工程、およびこの解離した細胞が再びニューロスフェアを形成するか否かを確認する工程を包含する方法がある。この方法では、解離した細胞が再びニューロスフェアを形成した場合に、神経幹細胞と判定される。【００６３】
本明細書において使用される場合、神経系細胞について、「多能性」または「多分化能」とは、神経細胞、グリア系細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト等）の神経系の複数の細胞へ分化する能力をいう。神経幹細胞の多能性は、例えば、ニューロスフェアを神経系の細胞への分化条件下に置いた場合に、神経細胞、グリア系細胞（アストロサイト、オリゴデンドロサイト等）の神経系へと分化した場合、その細胞は多能性を有すると判定する。好ましくは、多能性は、複数の神経系の細胞へ分化する能力を有することをいうが、これに限定されない。神経系の細胞への分化条件としては、例えば、神経系への分化培地（例えば、神経誘導培地（５０ｍｌ）中、ＤＭＥＭ／Ｆ１２：４９ｍｌ、神経誘導因子（例えば、Ｂ２７（ＧＩＢＣＯ））：１ｍｌ、抗生物質を含み得る。）における１週間の培養（２日おきに培地の半量を交換しながら培養する）が挙げられるが、これらに限定されない。グリア系細胞への分化条件としては、例えば、グリア誘導培地（培地５０ｍｌ中、ＤＭＥＭ／Ｆ１２：４５ｍｌ、ＦＢＳ：５ｍｌ、抗生物質を含み得る。）における１週間の培養（２日おきに半量の培地を交換する。）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用され得る神経栄養因子は、神経の誘導を補助または促進する作用を有しさえすればどのようなものであってもよい。１つの実施形態において、神経誘導因子は、ビオチン、Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）−ガラクトース、グルタチオン（還元型）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、レチニルアセテート、セレン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、ＤＬ−α−トコフェロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、アルブミン（ウシ）、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼ、トランスフェリンを含む。神経系の多能性細胞としては、例えば、神経幹細胞、神経堤細胞、神経前駆細胞等を挙げることができる。【００６４】
神経幹細胞は、神経幹細胞マーカーのみを用いても同定することができる。【００６５】
本明細書において使用される場合、「神経幹細胞マーカー」とは、神経幹細胞において、その局在または発現が神経幹細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、Ｎｅｓｔｉｎ（ＮＭ００６６１７（ヒト））、Musashi−１（ＮＭ００２４４２（ヒト））、ＣＤ１３３（ＮＭ０００６０１７（ヒト））、ｎｏｔｃｈ１（ＮＭ０１７６１７（ヒト））、Ｈｅｓ１（ＮＭ００５５２４（ヒト））、Ｍａｓｈ１（ＮＭ００４３１６（ヒト））、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＭ００６１６１（ヒト））、Ｐａｘ６（ＮＭ００１６０４（ヒト））、ＣＤ１５（ＮＭ００２０３３（ヒト））、ＰＤＧＦＲ（ＮＭ００２６０９（ヒト）の局在または発現）によって神経幹細胞であることが同定できるものをいう。このように、神経幹細胞の細胞マーカーとしては、例えば、Ｎｅｓｔｉｎ（ＮＭ００６６１７（ヒト））、Musashi−１（ＮＭ００２４４２（ヒト））、ＣＤ１３３（ＮＭ０００６０１７（ヒト））、ｎｏｔｃｈ１（ＮＭ０１７６１７（ヒト））、Ｈｅｓ１（ＮＭ００５５２４（ヒト））、Ｍａｓｈ１（ＮＭ００４３１６（ヒト））、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＭ００６１６１（ヒト））、Ｐａｘ６（ＮＭ００１６０４（ヒト））、ＣＤ１５（ＮＭ００２０３３（ヒト））、ＰＤＧＦＲ（ＮＭ００２６０９（ヒト）などを挙げることができるがそれらに限定されない。【００６６】
【表２】
2008150001.tif 000003
【００６７】
本明細書において、「神経堤細胞（ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｃｅｌｌ：ＮＣＣ）」は、独自の遊走能および少なくとも１つの神経堤細胞の細胞マーカーの発現からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する細胞をいう。好ましくは、神経堤細胞は、独自の遊走能および少なくとも１つの神経堤細胞の細胞マーカーの発現の両方の特徴を確認することによって同定される。この独特の遊走能は、胚の頭部領域に移植し、その後前頭鼻隆起、上顎隆起、鰓弓の間充織に遊走することを観察することによって確認できる。神経堤細胞の細胞マーカーとしては、例えば、ＣＲＡＢＰ１（ＮＭ００４３７８（ヒト））、ＡＰ２（ＮＭ００２０９７（ヒト））、Ｓｌｕｇ（ＮＭ００３０６８（ヒト））、Ｓｏｘ１０（ＮＭ００６９４１（ヒト））、Ｓｎａｉｌ（ＮＭ００５９８５（ヒト））、Ｔｗｉｓｔ（ＮＭ０００４７４（ヒト））、Ｐａｘ３（ＮＭ０００４３８（ヒト））、Ｐａｘ７（ＮＭ００２５８４（ヒト））、ＨＮＫ１（ＮＭ００４８５４（ヒト））、ｐ７５またはｐ７５ＮＴＲ（ＮＭ００２５０７（ヒト））、ＴＲＰ２（ＮＭ００６２６７（ヒト））、Ｗｎｔ１（ＮＭ００５４３０（ヒト））、Ｐ０（ＮＭ００２７２３（ヒト））、ｔＰＡ（ＮＭ０００９３０（ヒト））、およびＳ１００（ＮＭ００６２７２）などを挙げることができるがこれらに限定されない。この神経堤細胞は、神経幹細胞マーカーを少なくとも１つ発現することを観察することによっても確認することができる。例えば、神経幹細胞マーカーは、Ｎｅｓｔｉｎ（ＮＭ００６６１７（ヒト））、Musashi−１（ＮＭ００２４４２（ヒト））、ＣＤ１３３（ＮＭ０００６０１７（ヒト））、ｎｏｔｃｈ１（ＮＭ０１７６１７（ヒト））、Ｈｅｓ１（ＮＭ００５５２４（ヒト））、Ｍａｓｈ１（ＮＭ００４３１６（ヒト））、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＭ００６１６１（ヒト））、Ｐａｘ６（ＮＭ００１６０４（ヒト））、ＣＤ１５（ＮＭ００２０３３（ヒト））、ＰＤＧＦＲ（ＮＭ００２６０９（ヒト））、などが挙げられるがこれらに限定されない。【００６８】
神経堤細胞は、胎性初期に神経管辺縁（神経堤）より生じ、胚内を広く遊走しつつ、きわめて広範かつ特異的なレパートリーに分化する細胞群（第４の胚葉）として同定された。神経堤細胞は、例えば、後根神経節細胞、自律神経節細胞、副腎髄質クロム親和性細胞、シュワン細胞、外皮色素細胞などに分化し得る。神経堤細胞は、神経冠細胞とも称される。神経堤細胞は、自己複製能と多分化能とを有し、神経幹細胞と非常に類似している。【００６９】
本明細書において使用される場合「神経堤細胞マーカー」とは、神経堤細胞において、その局在または発現が神経堤細胞を同定するにおいて補助となるものをいう。好ましくは、その局在または発現（例えば、ＣＲＡＢＰ１（ＮＭ００４３７８（ヒト））、ＡＰ２（ＮＭ００２０９７（ヒト））、Ｓｌｕｇ（ＮＭ００３０６８（ヒト））、Ｓｏｘ１０（ＮＭ００６９４１（ヒト））、Ｓｎａｉｌ（ＮＭ００５９８５（ヒト））、Ｔｗｉｓｔ（ＮＭ０００４７４（ヒト））、Ｐａｘ３（ＮＭ０００４３８（ヒト））、Ｐａｘ７（ＮＭ００２５８４（ヒト））、ＨＮＫ１（ＮＭ００４８５４（ヒト））、ｐ７５またはｐ７５ＮＴＲ（ＮＭ００２５０７（ヒト））、ＴＲＰ２（ＮＭ００６２６７（ヒト））、Ｗｎｔ１（ＮＭ００５４３０（ヒト））、Ｐ０（ＮＭ００２７２３（ヒト））、ｔＰＡ（ＮＭ０００９３０（ヒト））、Ｓ１００（ＮＭ００６２７２）によって神経堤細胞であることが同定できるものをいう。このように、神経堤細胞の細胞マーカーとしては、例えば、ＣＲＡＢＰ１（ＮＭ００４３７８（ヒト））、ＡＰ２（ＮＭ００２０９７（ヒト））、Ｓｌｕｇ（ＮＭ００３０６８（ヒト））、Ｓｏｘ１０（ＮＭ００６９４１（ヒト））、Ｓｎａｉｌ（ＮＭ００５９８５（ヒト））、Ｔｗｉｓｔ（ＮＭ０００４７４（ヒト））、Ｐａｘ３（ＮＭ０００４３８（ヒト））、Ｐａｘ７（ＮＭ００２５８４（ヒト））、ＨＮＫ１（ＮＭ００４８５４（ヒト））、ｐ７５ＮＴＲ（ＮＭ００２５０７（ヒト））、ＴＲＰ２（ＮＭ００６２６７（ヒト））、Ｗｎｔ１（ＮＭ００５４３０（ヒト））、Ｐ０（ＮＭ００２７２３（ヒト））、ｔＰＡ（ＮＭ０００９３０（ヒト））などを挙げることができるがそれらに限定されない。【００７０】
なお、ｐ７５およびＳ１００（神経堤細胞マーカー）は末梢系グリアのシュワン細胞マーカーでもある。シュワン細胞は中枢由来神経幹細胞（例えば、中絶胎児脳由来神経幹細胞）からは出現しないことが知られている。【００７１】
脊髄損傷の場合はグリア細胞（中枢由来の）が形成する瘢痕が神経再生を阻害しているとも言われている。しかし再生軸策はグリア細胞によるミエリン形成がなければ神経伝達しないことから、瘢痕化しない末梢系のシュワン細胞の利用が有効という考えがある。Adipoclusterは神経幹細胞に加え神経堤細胞の特徴を持つことから、神経堤細胞から分化するシュワン細胞が出現すると考えられる。以上から、本発明のadipoclusterは、シュワン細胞の原料として利用することができる。【００７２】
これらの神経幹細胞マーカーによる判定は、当該分野において公知の方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫染色、ＦＡＣＳなど）を用いて行うことができる。ここで、発現しているか、していないかは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫染色、ＦＡＣＳなどによって、適宜選択することができる。【００７３】
本明細書において、細胞を細胞マーカーで識別する場合、その発現の強度で識別することができる。本明細書においては、４段階で評価することができる。
＋＋＋＝強発現
＋＋＝中程度の発現
＋＝低発現
−＝発現なし。【００７４】
これらの発現の強さは、以下のような測定法によって測定されるときに、以下の範囲の値をとる場合にそれぞれの段階で評価される。なお、倍数の評価基準は、接着培養時の発現を１とし、同培地中で浮遊培養したときの発現が何倍に変化したかを表したものである。＜測定法＞
＜測定値＞
＋＋＋＝強発現      ＝    １０倍以上  
＋＋＝中程度の発現  ＝    ５〜１０倍
＋＝低発現          ＝    ２〜５倍
−＝発現変化なし        ＝１〜２倍。  【００７５】
本明細書において「アグリゲーション」とは、細胞が凝集した集合体である、いわゆるアグリゲートした細胞が呈する状態をいう。アグリゲーション状態にあるかどうかは、以下の試験（検定方法）により、凝集状態を観察することにより確定することができる。アグリゲーション状態であるかどうかについては、非特許文献13を参酌して、以下のような手法を行うことによって確認することができる。
（１）  通常singlecellからの増殖ならば数日かかるサイズの細胞塊が、わずか1−2日で出来たことからアグリゲーションだと論じる。
（２）  2種類の細胞(例えばGFPラット由来とb-galラット由来)を混ぜて培養し、生じた細胞塊がキメラであることを示す。
（３）  Time-lapseの観察で、経時的に細胞が凝集していく画像を記録する。【００７６】
理論に束縛されることは望まないが、以上においては、1→3の順に強い証拠となると考えられる。【００７７】
本明細書において使用される場合、「胚」または「胚細胞」とは、多細胞生物における発生の初期の時代の状態をいう。本明細書において使用される場合、胚の「頭部領域」とは、後脳、特に、第２鰓弓に遊走する部位、すなわちロンボメア３，４の周辺をいう。【００７８】
本明細書において使用される場合、用語「分化（した）細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞（例えば、筋細胞、神経細胞など）をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。本発明において用いられる場合、分化細胞は、集団または組織の形態であってもよい。【００７９】
幹細胞の由来は、外胚葉、中胚葉および内胚葉に分類され得る。外胚葉由来の幹細胞は、主に脳に存在し、神経幹細胞が含まれる。中胚葉由来の幹細胞は、主に骨髄に存在し、血管幹細胞およびその分化細胞、造血幹細胞およびその分化細胞ならびに間葉系幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。内胚葉由来の幹細胞は主に臓器に存在し、肝幹細胞およびその分化細胞、膵幹細胞およびその分化細胞などが含まれる。本明細書では、体細胞はどのような胚葉由来でもよい。好ましくは、体細胞は、間葉系由来の細胞が使用され得る。【００８０】
本明細書において使用される場合、用語「脂肪細胞」とは、組織間に散在、あるいは疎性結合組織の一つとして毛細血管の走行に沿う集団として脂肪組織を形成する、多量の脂肪を含む細胞をいう。脂肪細胞には、黄色脂肪細胞と褐色脂肪細胞とがあるが、本明細書では、いずれも等価に用いることができる。細胞内の脂肪はスダンＩＩＩまたは四酸化オスミウムにより容易に検出され得る。【００８１】
本明細書において使用される場合、用語「所望の部位」とは、被検体における任意の部位であって、処置が望まれる部位をいう。本発明では、そのような所望の部位は、被検体における任意の臓器または組織における部位が選択され得ることが理解される。【００８２】
本明細書において使用される場合、用語「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有する細胞集団であるが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであればよい。従って、本発明の幹細胞を用いて組織を再生する場合、２以上の異なる起源を有する細胞集団が一つの組織を構成し得る。通常、組織は、臓器の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物組織では、組織を構成する細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。本明細書において、任意の組織が処置される対象として意図され得る。【００８３】
本明細書において、「脂肪組織」とは、疎性結合組織のうち，特に脂肪細胞の多いものをいい、各脂肪細胞は格子繊維によって囲まれ，細胞間に毛細血管が密に分布する．脂肪体ともいわれる。代表的には、皮下脂肪組織をさす。他の組織から独立してほぼ一定した塊状もしくは房状の脂肪組織．脊椎動物では腎臓や生殖腺に接して腹腔内に存在する．白色・黄色，またときに橙色をなす。皮下脂肪組織は、皮下組織に存在し、脂肪(皮下脂肪panniculusadiposus, cushion of fat)を貯えて皮下脂肪組織(subcutaneous adipose tissue)をなす。【００８４】
本発明において、臓器が対象とされる場合、そのような臓器はどのような臓器でもよく、また本発明が対象とする組織または細胞は、生物のどの臓器または器官に由来するものでもよい。本明細書において使用される場合、用語「臓器」は、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立性をもっている構造体をいう。多細胞生物（例えば、動物、植物）では臓器は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、各組織は多数の細胞からなる。そのような臓器としては、血管系に関連する臓器が挙げられる。１つの実施形態では、本発明が対象とする臓器は、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において臓器が対象として使用される場合、どのような臓器が対象であってもよいが、好ましくは、間葉系の組織（例えば、脂肪、骨、靭帯など）が対象とされ得るがそれに限定されない。【００８５】
本明細書において使用される場合、用語「アグリゲーションが生じるに十分な期間浮遊培養する」とは、脂肪組織由来細胞がアグリゲーションを形成するような時間、培地、温度、湿度またはそれらの組み合わせなどを指す。本発明では、脂肪組織由来細胞から、アグリゲーションを生じさせ、そして、神経幹細胞を含むことを初めて見出したが、本明細書の内容を考慮すれば、当業者は技術常識を考慮して、このような条件を適宜決定することができることが理解される。したがって、そのような条件は、適宜変更することができる。また、いったんそのような好ましい条件が設定されると、以後、そのような条件は、同様に脂肪組織由来細胞をアグリゲーションを形成させるために用いられ得る。本発明では、このような脂肪組織由来細胞をアグリゲーションを形成させる十分な条件は、インビトロであってもインビボであってもエキソビボであっても使用され得る。インビボの場合は、移植された体内の部分における条件がそのまま適用されてもよく、改変を加えてもよい。自家移植の場合はエキソビボ移植とも呼ばれ得る。このような「脂肪組織由来細胞を、アグリゲーションが生じるに十分な期間浮遊培養する」ことによって、Musashi陽性またはnestin陽性が生じ、それにより神経幹細胞として機能しうる細胞が効率よく生成されたことは本発明において初めて見出された効果である。【００８６】
本明細書において「脂肪組織由来細胞を、アグリゲーションが生じるに十分な期間浮遊培養する条件」としては、実施例に記載されている条件のほか、以下の条件を有するものを挙げることができる。たとえば、遠心したペレットをそのまま培養する；ウェルの底面をU字型にして集まりやすくする、などを挙げることができる。このような条件としては、たとえば、Mori H et al. JNeurosci Res. 2006 Dec;84(8):1682-91を挙げることができる。【００８７】
本明細書において使用される場合、用語「インビボ」（ｉｎ  ｖｉｖｏ）は、生物の内部をいう。特定の文脈において、「インビボ」は、対象とする組織または臓器が配置されるべき位置（例えば、本明細書にいう所望の部位）をいう。【００８８】
本明細書において使用される場合、用語「インビトロ」（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）は、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「エキソビボ」（ｅｘ  ｖｉｖｏ）は、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子を細胞に導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。【００９０】
本明細書において「自己移植片（組織、細胞、臓器など）」というときは、広義には遺伝的に同じ他個体（例えば一卵性双生児）からの移植片（組織、細胞、臓器など）をも含み得る。本明細書では、このような自己との表現は、被験体に由来すると交換可能に使用される。従って、本明細書では、ある被験体に由来しないとの表現は、自己ではない（すなわち、非自己）と同一の意味を有する。【００９１】
本明細書において、Musashi陽性またはnestin陽性脂肪組織由来細胞含有細胞から得られうる神経幹細胞を単離する条件としては、それぞれ独立して、約１×１０４細胞／ｍｌ〜約１×１０６細胞／ｍｌ。（例えば、約１×１０５細胞／ｍｌ）の密度、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ）の添加、神経誘導因子（例えば、ビオチン、Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）−ガラクトース、グルタチオン（還元型）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、レチニルアセテート、セレン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、ＤＬ−α−トコフェロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、アルブミン（ウシ）、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼ、トランスフェリン）の添加、ペニシリンおよびストレプトマイシンの添加、ペニシリンの添加、ストレプトマイシンの添加、培地の選択（ＢＭＥ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭまたはＨＡＭＦ１２培地、あるいはそれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ１２（１：１））、２〜６日間（例えば、４〜５日間）に１度の培地交換、６〜１０日間（例えば、８日間）に１度の継代、２０℃〜４０℃の温度（例えば、３７℃）、炭酸ガス５％、８０％以上の湿度（例えば、１００％）、およびコートしていないディッシュの使用から選択される。一例として、１×１０５細胞／ｍｌの密度、ＥＧＦの添加、ｂＦＧＦの添加、神経栄養因子（例えば、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ））の添加、ペニシリンおよびストレプトマイシンの添加、ＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ１２（１：１）の使用、４〜５日間に１度の培地交換、８日間に１度の継代、３７℃、炭酸ガス５％、８０％以上の湿度、コートしていないディッシュの使用にて培養するという条件である。本明細書において使用され得る神経栄養因子は、神経の誘導を補助または促進する作用を有しさえすればどのようなものであってもよい。１つの実施形態において、神経誘導因子は、ビオチン、Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）−ガラクトース、グルタチオン（還元型）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、レチニルアセテート、セレン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、ＤＬ−α−トコフェロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、アルブミン（ウシ）、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼ、トランスフェリンを含む。１つの実施形態において、神経誘導因子は、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）であり得る。【００９２】
上記の条件は、神経幹細胞などを維持するために採用され得るがそれに限定されない。【００９３】
本明細書において使用される場合、用語「Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞」とは、脂肪組織由来細胞を含む細胞であって、少なくとも一部がMusashi陽性(またはnestin陽性)を示すものをいう。Musashi陽性(またはnestin陽性)細胞と脂肪由来細胞とを含んでおり、アグリゲーション状態にあれば、どのような形態であってもよい。本発明の混合物は、神経幹細胞をさらに含み得る。Musashiまたはｎｅｓｔｉｎのいずれをより好ましい指標として採用するかは、原料となる細胞において変動し、もともといずれかの細胞マーカーの発現が見られる場合は、他方のマーカーを基準に判断することが好ましい。本発明では、原料となる細胞においてｎｅｓｔｉｎの発現が見出されたことから、Musashiのほうが好ましいがこれに限定されないことが理解される。【００９４】
本明細書において使用される場合、用語「移植」とは、本発明の細胞、混合物、組成物、医薬などを、単独で、または他の治療剤と組み合わせて体内に移入することをいう。本発明は、以下のような治療部位（例えば、骨など）への導入方法，導入形態および導入量が使用され得る：本発明の医薬などを障害部位へ直接注入し、貼付後に縫合し、挿入する等の方法があげられる。本発明の脂肪由来幹細胞と、分化細胞との組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、分化促進因子など）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。【００９５】
本明細書において使用される場合、用語「自己」または「自家」とは、ある個体についていうとき、その個体に由来する個体またはその一部（例えば、細胞、組織、臓器など）をいう。本明細書において使用される場合、用語「自己」または「自家」というときは、広義には遺伝的に同じ他個体（例えば一卵性双生児）からの移植片をも含み得る。【００９６】
本明細書において使用される場合、用語「同種」（同種異系）とは、同種であっても遺伝的には異なる他個体から移植される個体またはその一部（例えば、細胞、組織、臓器など）をいう。同種異系の個体は、遺伝的に異なることから、同種異系のものは、移植された個体（レシピエント）において免疫反応を惹起し得る。そのような細胞などの例としては、親由来の細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。【００９７】
本明細書において使用される場合、用語「異種」とは、異種個体から移植されるものをいう。従って、例えば、ヒトがレシピエントである場合、ブタからの移植物は異種移植物という。【００９８】
本明細書において使用される場合、用語「レシピエント」（受容者）とは、移植される細胞などを受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植される細胞などを提供する個体は、「ドナー」（供与者）という。レシピエントとドナーとは同じであっても異なっていてもよい。【００９９】
本発明で使用される細胞は、同系由来（自己（自家）由来）でも、同種異系由来（他個体（他家）由来）でも、異種由来でもよい。拒絶反応が考えられることから、自己由来の細胞が好ましいが、拒絶反応が問題でない場合、同種異系由来であってもよい。【０１００】
本明細書において「神経系疾患、障害または状態」とは、神経系の細胞が関与する任意の疾患、障害または異常状態をいう。【０１０１】
本明細書において使用される場合、用語「診断、予防、処置または予後上有効な量」とは、それぞれ、診断、予防、処置（または治療）または予後において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができる。【０１０２】
本発明が医薬として使用される場合、そのような医薬は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬において、当該分野において公知の任意の薬学的に受容可能なキャリアが使用され得る。【０１０３】
適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクルおよび／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、本発明の細胞および他の有効成分を、少なくとも１つの生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射溶液、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的に使用される他の物質を補充することが可能である。【０１０４】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、好ましくは、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、好ましくは、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリン）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられる。【０１０５】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ約７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ約４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。【０１０６】
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができることに注意されたい。【０１０７】
本発明の細胞などは、薬学的に受容可能なキャリアと必要に応じて配合し、例えば、注射剤、懸濁剤、溶液剤、スプレー剤等の液状製剤として非経口的に投与することができる。薬学的に受容可能なキャリアの例としては、賦形剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、吸収剤、湿潤剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じ、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤等の製剤添加物を用いることができる。また、本発明の組成物には本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドなど以外の物質を配合することも可能である。非経口の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、局所投与、皮膚投与など等が挙げられるがそれらに限定されない。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製について、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。【０１０８】
液状製剤における溶剤の好適な例としては、目的に適合する限り、注射溶液、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油およびトウモロコシ油等が挙げられる。【０１０９】
液状製剤における溶解補助剤の好適な例としては、目的に適合する限り、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム等が挙げられるがそれらに限定されない。【０１１０】
液状製剤における懸濁化剤の好適な例としては、目的に適合する限り、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。【０１１１】
液状製剤における等張化剤の好適な例としては、目的に適合する限り、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトール等が挙げられるがそれらに限定されない。【０１１２】
液状製剤における緩衝剤の好適な例としては、目的に適合する限り、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩およびクエン酸塩等が挙げられるがそれらに限定されない。【０１１３】
液状製剤における無痛化剤の好適な例としては、目的に適合する限り、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウムおよび塩酸プロカイン等が挙げられるがそれらに限定されない。【０１１４】
液状製剤における防腐剤の好適な例としては、目的に適合する限り、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、２−フェニルエチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸等が挙げられるがそれらに限定されない。【０１１５】
液状製剤における抗酸化剤の好適な例としては、目的に適合する限り、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールおよびシステイン等が挙げられるがそれらに限定されない。【０１１６】
注射剤として調製する際には、液剤および懸濁剤は殺菌され、かつ血液または他の目的のための注射部位における溶媒と等張であることが好ましい。通常、これらは、細菌保留フィルター等を用いるろ過、殺菌剤の配合または照射などによって無菌化する。さらにこれらの処理後、凍結乾燥等の方法により固形物とし、使用直前に無菌水または無菌の注射用希釈剤（塩酸リドカイン水溶液、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノールまたはこれらの混合溶液等）を添加してもよい。【０１１７】
さらに、本発明の医薬組成物は、目的に適合する限り、着色料、保存剤、香料、矯味矯臭剤、甘味料等、ならびに他の薬剤を含んでいてもよい。【０１１８】
本発明の処置方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。投与する量は、処置されるべき部位が必要とする量を見積もることによって確定することができる。【０１１９】
本明細書において使用される場合、用語「指示書」とは、本発明の医薬を投与する方法または診断する方法などを、本発明の医薬などの投与を行う人または投与を行われる人、診断する人または診断される人（例えば、医師、患者など）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する適切な方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メールなど）のような形態でも提供され得る。【０１２０】
本発明の方法による治療の終了の判断は、商業的に利用できるアッセイもしくは機器使用による標準的な臨床検査の結果または意図された治療に関連する疾患（例えば、骨疾患、心臓疾患、神経疾患など）に特徴的な臨床症状の消滅あるいは美容状態の回復（例えば、視覚的な回復など）によって支持され得る。治療は、分化細胞の欠損などに関連する疾患（例えば、神経疾患）の再発または美容状態の損傷により再開することができる。【０１２１】
本発明はまた、医薬組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。このキットは、注入デバイスを備え得る。【０１２２】
本発明の細胞等の毒性研究は、モデルを用いて行われ得る。例えば、毒性研究は、以下のような適切な動物モデルにおいて行われ得る：（１）細胞組成物または化合物がマウスに投与される（未処置のコントロールマウスもまた、使用されるべきである）；（２）各々の処置群中の１匹のマウスから尾静脈を介して血液サンプルを周期的に得る；そして（３）上記サンプルを、神経系の細胞等について分析する。各々の投薬レジメンについての結果とコントロールとの比較は、毒性が存在するか否かを示す。【０１２３】
各々の毒性研究の終了の際に、動物を屠殺することによって、さらなる研究を行い得る（好ましくは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｕｔｈａｎａｓｉａ，（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０２：２２９−２４９に従う）。次いで、各処置群からの代表的な動物が、転移、異常な病気または毒性の直接的な証拠のために全体的な検屍によって試験され得る。組織における全体の異常が記載され、組織が組織学的に試験される。神経系の異常を惹起したり、体重の減少または血液成分の減少を引き起こす医薬は、主要な臓器に対する有害作用を有する化合物と同様に好ましくない。一般的に、有害作用が大きいほど、その化合物は好ましくない。【０１２４】
（ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒの用途）
本発明のMusashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞または「ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ」は、種々の用途、例えば、神経系の処置に使用することができる。例えば、神経系の細胞が関与する任意の疾患、障害または異常状態などの処置が挙げられるが、これらに限定されない。【０１２５】
アディポクラスターの用途としては、たとえば、脊髄損傷や脳卒中などの中枢神経系の損傷；外傷、顔面神経麻痺、腕神経叢麻痺などに末梢神経系の損傷；おそらくclusterをさまざまな形態に加工できる（たとえば長いひも状の物を作る）ことなどが企図され加工可能である点は、従来の細胞塊では困難であったこともあり、その点も本発明が達成した利点のひとつであると考えられる。【０１２６】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。【０１２７】
（ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ）
１つの局面において、本発明は、Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞を提供する。本発明において、アディポクラスター（ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ）は、Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞を含むことが明らかとなった。したがって、Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞を含むアグリゲーション状態のクラスター状の組成物を、アディポクラスターと呼ぶことができる。【０１２８】
したがって、一つの実施形態では、本発明の細胞は、アグリゲーション状態を呈する。【０１２９】
一つの実施形態では、本発明の脂肪組織細由来細胞は、鼠径部または腹腔内の脂肪に由来する細胞であるがそれに限定されない。これらの鼠径部または腹腔内の脂肪は、比較的収集がしやすく、その後の処理が比較的容易であることから好ましいが、その他の組織であっても脂肪組織を収集することができることから、他の組織のものも使用することができる。【０１３０】
一つの実施形態では、本発明の脂肪組織由来細胞は、多能性を有する細胞であり得る。脂肪組織由来の細胞は、幹細胞を多量に含んでいることが知られており、本発明において使用される脂肪組織由来細胞としてこのように多能性を有する細胞を使用することができる。理論に束縛されることを望まないが、多能性を有する細胞を使用することによって、神経幹細胞のマーカーとして知られているMusashi陽性(またはnestin陽性)細胞を誘導することが容易にすることができるという利点も考慮することができる。【０１３１】
１つの実施形態において、本発明の脂肪組織由来細胞は、脂肪組織を採取し、コラゲナーゼ処理を行なった後に遠心分離してペレットとして回収される、ASC細胞、Stromal-vascular-fraction細胞であってもよく、または廃液由来の脂肪由来幹細胞であってもよい。【０１３２】
１つの実施形態では、本発明のMusashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞は、さらにnestin、Nestin、Musashi−１、ＣＤ１３３のほか、本明細書の表２に記載されるマーカーを発現するものであってもよい。【０１３３】
（ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ組成物）
１つの局面において、本発明は、神経再生のための組成物であって、Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞を含む、組成物を提供する。Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞をもちいて、神経再生をすることができることは、従来見出されておらず、特に、アグリゲーション状態のものを含む組成物を用いることによって、神経再生をすることができることを見出した点は、クローン性を不要とするという意味において重要である。【０１３４】
１つの実施形態では、本発明において用いられる脂肪組織由来細胞は、鼠径部または腹腔内の脂肪に由来する細胞であり得る。【０１３５】
一つの実施形態では、本発明において使用される脂肪組織由来細胞は、多能性を有する細胞であり得る。脂肪組織由来の細胞は、幹細胞を多量に含んでいることが知られており、本発明において使用される脂肪組織由来細胞としてこのように多能性を有する細胞を使用することができる。理論に束縛されることを望まないが、多能性を有する細胞を使用することによって、神経幹細胞のマーカーとして知られているMusashi陽性(またはnestin陽性)細胞を誘導することが容易にすることができるという利点も考慮することができる。特に、アグリゲーション状態のものを含む組成物を用いることによって、神経再生をすることができることを見出した点は、クローン性を不要とするという意味において重要である。【０１３６】
１つの実施形態では、本発明において用いられる脂肪組織由来細胞は、脂肪組織を採取し、コラゲナーゼ処理を行なった後に遠心分離してペレットとして回収される、Stromal-vascular-fraction細胞であるか、または廃液由来の脂肪由来幹細胞であってもよい。【０１３７】
１つの実施形態では、本発明において用いられるMusashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞は、さらにnestin、Musashi−１、ＣＤ１３３のほか、本明細書において、記載された他のマーカーを発現するものを用いることができる。このような神経幹細胞識別能を有しうる他のマーカーを有することが確認された細胞を用いることによって、神経再生により適した細胞を選択することができるという点において、好ましい結果を得ることができることが理解される。【０１３８】
別の局面において、本発明は、ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを含む、神経系疾患、障害または状態の処置のための細胞移植のための組成物を提供する。神経系疾患、障害または状態は、例えば、神経系の分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または状態であり得るがこれらに限定されない。この組成物は、神経系疾患、障害または状態を処置または予防するためであれば、任意の目的で使用することができる。使用される組成物中のａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒは、本明細書において、「ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ」および「ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを調製するための方法」において説明したような任意の形態であり得る。【０１３９】
ここで、Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞を含む組成物、またはａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒは、それぞれ独立して、移植されるべき宿主に対して、異種、同種異系または同系であり得る。好ましくは、同種異系または同系であり、より好ましくは同系であるが、それに限定されない。理論に束縛されないが、同系であれば、免疫拒絶反応が抑制できるからである。しかし、拒絶反応が予測される場合は、拒絶反応を回避する工程をさらに包含してもよい。拒絶反応を回避する手順は当該分野において公知であり、例えば、新外科学体系、第１２巻、心臓移植・肺移植  技術的，倫理的整備から実施に向けて（改訂第３版）、中山書店を参照のこと。そのような方法としては、例えば、免疫抑制剤、ステロイド剤の使用などの方法が挙げられるが、それらに限定されない。拒絶反応を予防する免疫抑制剤は、例えば、現在、「シクロスポリン」（サンディミュン／ネオーラル）、「タクロリムス」（プログラフ）、「アザチオプリン」（イムラン）、「ステロイドホルモン」（プレドニン、メチルプレドニン）、および「Ｔ細胞抗体」（ＯＫＴ３、ＡＴＧなど）があり、予防的免疫抑制療法として世界の多くの施設で行われている方法は、「シクロスポリン、アザチオプリンおよびステロイドホルモン」の３剤併用である。免疫抑制剤は、本発明の薬剤と同時期に投与されることが望ましいが、必ずしも必要ではない。従って、免疫抑制効果が達成される限り免疫抑制剤は本発明の再生療法・治療の前または後にも投与され得る。【０１４０】
このような組成物は、医薬として提供され得る。このような医薬は、神経系疾患、障害または状態（例えば、神経系の分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または状態）を処置または予防するために用いられる。本発明の医薬には、このような組成物のほか、薬学的に受容可能なキャリアが含まれていてもよい。そのようなキャリアとしては、その用途に応じて当業者によって、本明細書において記載される任意のキャリアが選択され、そして用いることができる。【０１４１】
（ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒの調製するための方法）
１つの局面において、本発明は、ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを調製するための方法を提供する。この方法によって、ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを一定量以上で提供することができる。この方法は、Ａ）脂肪から細胞を得る工程；およびＢ）該細胞を、ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを誘導する条件に供する工程を包含する。【０１４２】
別の局面では、本発明は、Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞の生産方法を提供する。この方法は、Ａ）脂肪組織由来細胞を提供する工程；およびＢ）該脂肪組織由来細胞を、アグリゲーションが生じるに十分な期間浮遊培養する工程を包含する。【０１４３】
ここで、脂肪由来の細胞は、国際公開第００／５３７９５号パンフレット、同第０３／０２２９８８号パンフレット、同第０１／６２９０１号パンフレット、Ｚｕｋ，Ｐ．Ａ．ら、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．７，２１１−２２８、２００１、およびＺｕｋ，Ｐ．Ａ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌ．，１３，４２７９−４２９５、２００２などに記載される方法またはその改変のように脂肪吸引による吸引物（吸引脂肪（ｌｉｐｏａｓｐｉｒａｔｅ））の脂肪部分から分離することができる。具体的には、例えば、（１）吸引脂肪（ｓｕｃｔｉｏｎｅｄ  ｆａｔ）を１リットル大の分液漏斗を用いて生理食塩水で十分に洗浄し；（２）上層に吸引脂肪、下層に生理食塩水が十分に分離したのを確認し、下層を捨てる。肉眼で見て生理食塩水がほぼ透明になるまでこれを繰り返し；（３）吸引脂肪と同量の０．０７５％コラゲナーゼ／ＰＢＳを加え、３７℃でよく攪拌しながら３０分間インキュベートし；（４）上記の試料に等量の１０％血清加ＤＭＥＭを加え；（５）上記の試料を１２００ｇで１０分間遠心分離し；（６）得られたペレットに０．１６Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ／ＰＢＳを加えて懸濁し、室温で１０分間インキュベートし；（７）上記の試料を口径１００μｍのメッシュを用いて吸引ろ過し；および（８）得られたろ過物を１２００ｇで５分間遠心分離することによって分離することができる。ここで、調製量に応じて、上記プロトコールをスケールアップまたはスケールダウンすることは、当業者の技術範囲内である。【０１４４】
他方、脂肪由来幹細胞を用いることが好ましい場合、そのような脂肪由来幹細胞は、例えば、以下のような脂肪吸引による吸引物の液体部分（液体吸引物）より単離され得る：（１）脂肪吸引による吸引物の液体部分が調製される；（２）この液体部分は、細胞画分を得るために遠心分離される；（３）この細胞画分は、密度勾配遠心分離に供され、そして細胞分離は、比重に基づいて実施される；そして（４）細胞は、赤血球よりも低い比重を有する細胞層から回収される。吸引物の液体部分は、生理食塩水またはリンガー注入液を用いて調製され得る。遠心分離は、約８００×ｇ以下、または約４００×ｇ以上の速度で実施され得る。密度勾配遠心分離は、約３７０×ｇ〜１，１００×ｇの速度で実施される。密度勾配遠心分離は、約１．０７６ｇ／ｍｌ〜１．０７８ｇ／ｍｌの比重（２０℃）を有する溶媒を用いて実施される。密度勾配遠心分離において使用される溶媒は、ＦｉｃｏｌｌＴＭ、ＰｅｒｃｏｌｌＴＭまたはスクロースであり得る。回収される細胞層の比重は、約１．０５０〜１．０７５の範囲であり得る。細胞層は、ピペットを用いて回収され得る。【０１４５】
本発明において使用される脂肪由来幹細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１５１、およびＳＨ３からなる群より選択される少なくとも１つ（好ましくは、２つ、３つ、．．．ｎ個）のタンパク質を発現し得るものであり得る。さらに好ましくは、本発明において用いられる脂肪由来幹細胞は、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１５１、およびＳＨ３のすべてを発現し得るものである。【０１４６】
これらのＣＤ抗原の判定は、当該分野において公知の方法（例えば、抗体を使用する免疫学的手法など）を用いて行うことができる。ここで、発現しているか、またはしていないかは、免疫学的方法などによって、適宜選択することができる。【０１４７】
好ましくは、本発明において用いられる脂肪由来幹細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６２ｅ、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ６９、ＣＤ１０４、ＣＤ１３５、およびＣＤ１４４の少なくとも１つ（特に、ＣＤ５６）を発現しない。そのようなＣＤ抗原は、分化細胞のマーカーであり、発現しないことが幹細胞の指標であり得るからであるがそれらに限定されない。従って、好ましい実施形態では、本発明において使用される脂肪由来幹細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ６１、ＣＤ６２ｅ、ＣＤ６２ｐ、ＣＤ６９、ＣＤ１０４、ＣＤ１３５、およびＣＤ１４４のいずれも発現しない細胞であることが有利であり得る。【０１４８】
別の実施形態では、簡便に、脂肪由来幹細胞として、ＣＤ４９ｄを発現し、ＣＤ５６を発現しない細胞を選択してもよい。【０１４９】
本発明において用いられる脂肪由来幹細胞は、吸引脂肪に由来し得る。従来、吸引脂肪は、捨てられていたが、本発明において、脂肪由来幹細胞からａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを調製することができるようになった。従って、実際に神経系疾患、障害または状態の治療に用いることができる幹細胞の供給源として使用できることが明らかになった。従って、そのような吸引脂肪は、例えば、脂肪吸引による吸引物の液体部分または脂肪部分であってもよい。【０１５０】
本発明において用いられる脂肪由来幹細胞は、分離されたものを使用しても良いが、部分精製したものまたは完全に精製したものを使用しても良い。【０１５１】
１つの実施形態では、本発明において使用される脂肪幹細胞は、現代人が不要とする部分の脂肪（例えば、腹部、胸部、臀部、大腿部、上腕部、顔部などの脂肪）から脂肪細胞より調製ができることからその産業上利用可能性が注目される。腹部、臀部、鼠径部または腹腔などは、脂肪がたまりやすい部位であり、除去することが所望されることが多いことから、そのような部分から細胞を入手してもよい。【０１５２】
１つの実施形態では、本発明の方法は、本発明におけるＡ）工程の前に、脂肪組織または吸引脂肪廃液を採取し、コラゲナーゼ処理を行なった後に遠心分離してペレットとして回収することによって、脂肪組織由来細胞を得る工程をさらに包含することができる。理論に束縛されることを望まないが、この工程を包含させることが好ましいのは、成熟脂肪細胞を除去しより濃縮した前駆細胞を集められるためであると考えられるがそれに限定されない。【０１５３】
１つの実施形態では、本発明の方法は、本発明におけるＡ）工程の後に、Ａ’）脂肪組織由来細胞を接着する工程をさらに包含することができる。理論に束縛されることを望まないが、この工程を包含させることが好ましいのは、血球系など浮遊する異種細胞を除去できるためであるがそれに限定されない。【０１５４】
１つの実施形態では、本発明の方法は、本発明におけるＡ）工程の後に、Ａ’）脂肪組織由来細胞を接着し、その後、１回以上継代して前記脂肪組織由来細胞を脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）として得る工程をさらに包含することができる。理論に束縛されることを望まないが、この工程を包含させることが好ましいのは、細胞数をより増やせるためであるがそれに限定されない。【０１５５】
１つの実施形態では、本発明の方法では、浮遊培養は、ダルベッコ最小基礎培地（ＤＭＥＭ）またはニューロスフェア培地中で行なわれ、該ニューロスフェア培地は、ＤＭＥＭ＋Ｆ１２  １：１、２％  Ｂ２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２０ｎｇ／μｌ  ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／μｌ  ＥＧＦであり得る。理論に束縛されることを望まないが、Ｂ２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔは内容物不明であることから、このような内容不明の添加物を使用しない、短時間でクラスターを形成するという意味で、Ｂ２７を加えないＤＭＥＭでもＢ２７を加えないＦ１２が好ましいと考えられる。【０１５６】
１つの実施形態では、本発明における浮遊培養は、血清（たとえば、１０％ウシ胎児血清）を補充したDMEM中で行なわれ得る。理論に束縛されることを望まないが、血清を加えると栄養分や成長因子が補給されるから有利であるからである。ただし、臨床に用いる場合はウシ由来のものは、薬事申請において条件を付されることが想定されることからそれほど好ましくない。むしろ、自己血清を使えるのであれば、そのほうが好ましいと考えられる。理論に束縛されることを望まないが、自己血清を用いるためことは以下のように有利な点がある。すなわち、自己血清は、培養期間が短く多量の自己血清を必要としないという理由があるからである。【０１５７】
１つの実施形態では、本発明の方法では、浮遊培養において使用される容器は、非接着性となるようにコーティングされたものである。理論に束縛されることを望まないが、非接着性となるようにコーティングされたものが有利であるのは、このほうが圧倒的にアグリゲーションを形成しやすくなるからである。【０１５８】
１つの実施形態では、上記非接着性のコーティングは、アガロースゲルでのコーティングであり得る。理論に束縛されることを望まないが、アガロースが好ましいのは、既知の成分で毒性が少ないことが判明していることをその理由として挙げることができる。【０１５９】
１つの実施形態では、この接着性のコーティングは、１％以上のアガロースゲルでのコーティングであり得る。１％以上の、それなりの強度のあるものであれば、あまり濃度は問題ではない。【０１６０】
１つの実施形態では、上記非接着性のコーティングは、Type VIIアガロースゲルでのコーティングであり得る。理論に束縛されることを望まないが、Type VIIアガロースゲルが好ましいのは、細胞培養用のものとして市販され広く使用されている（3次元培養など）からであるがそれに限定されない。【０１６１】
１つの実施形態では、本発明により得られる組成物を神経系に分化させる条件に供する工程を本発明の方法に加えてもよい。そのような条件としては、それぞれ独立して、約１×１０４細胞／ｍｌ〜約１×１０６細胞／ｍｌ（例えば、約１×１０５細胞／ｍｌ）の密度、増殖因子（例えば、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ）の添加、神経誘導因子（例えば、ビオチン、Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）−ガラクトース、グルタチオン（還元型）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、レチニルアセテート、セレン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、ＤＬ−α−トコフェロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、アルブミン（ウシ）、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼ、トランスフェリンを含む）、ペニシリンおよびストレプトマイシンからなる群より選択される少なくとも１つの添加、培地の選択（ＢＭＥ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭまたはＨＡＭＦ１２培地、あるいはそれらの混合培地（例えば、ＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ１２（１：１））、２〜６日間（例えば、４〜５日間）に１度の培地交換、６〜１０日間（例えば、８日間）に１度の継代、２０℃〜４０℃の温度（例えば、３７℃）、炭酸ガス５％、８０％以上の湿度（例えば、１００％）、およびコートしていないディッシュの使用から選択され得る。一例として、１×１０５細胞／ｍｌの密度、ＥＧＦの添加、ｂＦＧＦの添加、神経栄養因子（例えば、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ））の添加、ペニシリンおよびストレプトマイシンの添加、ＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ１２（１：１）の使用、４〜５日間に１度の培地交換、８日間に１度の継代、３７℃、炭酸ガス５％、８０％以上の湿度、コートしていないディッシュの使用にて培養するという条件であり得る。本明細書において使用され得る神経栄養因子は、神経の誘導を補助または促進する作用を有しさえすればどのようなものであってもよい。【０１６２】
１つの実施形態において、神経誘導因子は、ビオチン、Ｌ−カルニチン、コルチコステロン、エタノールアミン、Ｄ（＋）−ガラクトース、グルタチオン（還元型）、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、レチニルアセテート、セレン、トリヨードサイロニン（Ｔ３）、ＤＬ−α−トコフェロール、ＤＬ−α−トコフェロールアセテート、アルブミン（ウシ）、カタラーゼ、インスリン、スーパーオキシドジスムターゼ、トランスフェリンを含む。１つの実施形態において、神経誘導因子は、Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ）であり得る。【０１６３】
上記の条件は、神経幹細胞を維持するために採用され得るがそれに限定されない。【０１６４】
別の実施形態において、本方法は、幹細胞が脂肪細胞マーカーを発現しているレベルを確認する工程をさらに包含し得る。本方法において用いられる脂肪細胞マーカーは、脂肪細胞を判定できるものであれば、どのようなものであってもよいが、好ましくは、Ｌｅｐｔｉｎ（ＮＭ０００２３０（ヒト））が使用され得るが、これに限定されない。従って、脂肪細胞マーカーのレベルの確認は、Ｌｅｐｔｉｎ（ＮＭ０００２３０（ヒト））の減少によって確認され得る。【０１６５】
別の実施形態において、本方法は、幹細胞が神経幹細胞マーカーを発現しているかどうかを確認する工程、および前記幹細胞が脂肪細胞マーカーを発現のレベルを確認する工程をさらに包含することができる。好ましくは、例えば、神経幹細胞マーカーは、Ｎｅｓｔｉｎ（ＮＭ００６６１７（ヒト））、Musashi−１（ＮＭ００２４４２（ヒト））、ＣＤ１３３（ＮＭ０００６０１７（ヒト））、ｎｏｔｃｈ１（ＮＭ０１７６１７（ヒト））、Ｈｅｓ１（ＮＭ００５５２４（ヒト））、Ｍａｓｈ１（ＮＭ００４３１６（ヒト））、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ（ＮＭ００６１６１（ヒト））、Ｐａｘ６（ＮＭ００１６０４（ヒト））、ＣＤ１５（ＮＭ００２０３３（ヒト））、ＰＤＧＦＲ（ＮＭ００２６０９（ヒト））などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、神経幹細胞マーカーは、ＮｅｓｔｉｎおよびMusashi−１を含む。【０１６６】
これらの神経幹細胞マーカー、または脂肪細胞マーカーによる判定は、当該分野において公知の方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫染色、ＦＡＣＳなど）を用いて行うことができる。ここで、発現しているかまたはしていないかは、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロット、免疫染色、ＦＡＣＳなどによって、適宜選択することができる。【０１６７】
（神経系疾患、障害または状態の処置のための細胞移植の方法）
別の局面において、本発明は、神経系疾患、障害または状態の処置（例えば、神経系の分化細胞の欠損に起因する疾患、障害または状態）のための細胞移植のための方法を提供する。この方法は、ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを投与する工程を包含する。ここで、移植に使用されるａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒは、本明細書において、「ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ」、「ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ組成物」および「ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒの調製するための方法」において説明したような任意の形態であり得る。【０１６８】
このａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒは、当該分野において公知の任意の方法によって投与することができる。例えば、このａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒは、シリンジ、カテーテル、チューブなどを用いて注入され得るがそれらに限定されない。好ましくは、例示的な投与形態としては、局所注入（皮下注入、筋肉や脂肪など臓器内注入）、静脈内注入、動脈内注入、組織上投与などが挙げられるが、それらに限定されない。本発明のこの移植による処置または予防方法がもたらす、例えば、従来技術と比べて有利な点としては、例えば、（１）生体外で再生組織を作る（エキソビボ産生）必要がない；（２）より確実に大きな組織の再生が可能である；（３）簡便かつ短時間の処理により産生が可能である；（４）皮膚など臓器を切開する手術を必要とせず、針を刺すことによって細胞および組織を投与（移植）することが可能であることなどが挙げられるがそれらに限定されない。【０１６９】
（使用）
別の局面において、本発明は、ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒの、神経系疾患、障害または状態を処置または予防するための医薬の調製のための使用を提供する。ここで、医薬の調製のために使用される神経堤細胞は、本明細書において、「ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ」および「ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを調製するための方法」において説明したような任意の形態であり得る。【０１７０】
１つの実施形態では、本発明は、Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞の生産のための、ダルベッコ最小基礎培地（ＤＭＥＭ）またはニューロスフェア培地の使用を提供する。【０１７１】
１つの実施形態では、本発明は、Musashi陽性(またはnestin陽性)脂肪組織由来細胞含有細胞の生産のための、非接着性のコーティングの培養容器を提供する。【０１７２】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記実施形態にも下記実施例にも限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１７３】
以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Ｓｉｇｍａから得た。動物の飼育は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈが作成した「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」およびＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅが作成、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが公表した「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．８６−２３，１９８５，改訂）に遵って、動物愛護精神に則って行った。ヒトを対象とする場合は、事前に同意（インフォームドコンセント）を得た上で実験を行った。【０１７４】
（調製例１：コラゲナーゼを用いる脂肪由来細胞の調製）
本調製例では、まず、脂肪組織由来細胞を、本実験に対して同意を示したヒトから吸引脂肪より調製した。詳細には、吸引脂肪を１リットル大の分液漏斗を用いて生理食塩水で十分に洗浄した。上層に吸引脂肪、下層に生理食塩水が十分に分離したのを確認し、下層を捨て、肉眼で見て生理食塩水がほぼ透明になるまでこれを繰り返した。この調製例では、５回行った。【０１７５】
吸引脂肪を１０ｍｌと同量の０．０７５％コラゲナーゼ／ＰＢＳを加え、３７℃でよく攪拌しながら３０分間インキュベートした。この試料に、同量の１０％血清加ＤＭＥＭを加え、１２００×ｇで１０分間遠心分離した。【０１７６】
遠心分離により得られたペレットに０．１６Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ／ＰＢＳを加えて懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。この試料を口径１００μｍのメッシュ（Ｗｈａｔｍａｎ）を用いて吸引ろ過した。この得られたろ過物を１２００×ｇで５分間遠心分離した。この細胞調製物は、ＰＬＡとも呼ぶ。幹細胞であることは、細胞マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ１３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ７１、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１１７、ＣＤ１５１等）を用いて確認する。【０１７７】
（調製例２：脂肪吸引による吸引物の液体部分からの、細胞懸濁液の調製）
脂肪吸引による吸引物の液体部分について、以下の２方法のいずれかを用いて処理することによって、幹細胞懸濁液を調製した。以下の２方法のいずれも、コラゲナーゼなどの酵素を用いる処理が不要であるため、コラゲナーゼなどの酵素の混入がない点において、従来法とは異なる。【０１７８】
（Ｉ）調製方法１
１）脂肪吸引による吸引物の液体部分（通常、２〜４リットル程度）を４００×ｇ、１０分間、遠心分離した。
２）上清を捨てた。ただし、沈殿した細胞は浮遊しやすいため、アスピレーターを用いて、細胞を損傷しないよう慎重に吸引した。
３）沈殿した細胞（ほとんどが赤血球）を５０ｍｌのポリプロピレン製チューブ数本に移し、遠心分離（４００×ｇ、５分間）した。
４）上清を吸引し、総量が１５〜２０ｍｌとなるように沈殿細胞を集めた。マトリクス成分が多く含まれる場合は、マトリクス成分を、１００μｍフィルターで濾過・除去した。その後必要に応じて、遠心分離を行なった。
５）５０ｍｌのチューブにフィコール（登録商標）１５ｍｌを入れ、その上に層を作るように極力ゆっくりと細胞液１５〜２０ｍｌを加えた。
６）チューブを４００×ｇ、３０分間、遠心分離した。（１８〜２０℃）
７）遠心分離後、細胞溶液を４層に分離した。上から（Ａ層）無細胞層（透明）、（Ｂ層）単核球層（淡赤色）、（Ｃ層）フィコール層（透明）、（Ｄ層）赤血球層（濃赤色）で、幹細胞を含む接着細胞群が、Ｂ層およびＣ層に含まれていた。Ａ層を吸引後、Ｂ層および約３ｍｌ程度のＣ層を細胞懸濁液として回収し、５０ｍｌのチューブに移した。
８）回収した細胞懸濁液に、血清加ＰＢＳ（１０％ＦＢＳ、もしくは１０％ヒト血清を加えたＰＢＳ）を加えて５０ｍｌとし、ピペッティングによる混和後、遠心分離（４００×ｇ、５分間）した。
９）上清を吸引し、再度血清加ＰＢＳを加えて５０ｍｌとし、ピペッティングによる混和後、遠心分離（４００×ｇ、５分間）した。
１０）上清を吸引し、沈殿した幹細胞を含む細胞群を回収した。【０１７９】
（ＩＩ）調製方法２
１）クリーンベンチ内で、吸引管を用いて脂肪吸引による吸引物の液体部分を吸引し、フィルター（ポアサイズ；１２０μｍ）付きリザーバーを通して、ろ過液を閉鎖分離バックに封入した。
２）セルセパレーター（血液成分分離装置ＡＳＴＥＣ２０４、（株）アムコ、東京、日本）で遠心分離法にて３回プロセシングを行い、比重の軽い血小板成分、比重の重い赤血球、顆粒球成分を可及的に除去した。
３）幹細胞を高濃度に含む分画（約３０〜４０ｍｌ）を採取した。単離した細胞の比重は、１．０５０〜１．０７５の範囲であった。【０１８０】
おおまかな細胞の比重は、パーコールＴＭ、レディグラッドＴＭなどのような密度勾配遠心分離媒体を塩化ナトリウム溶液またはスクロース溶液に配合し、収集した細胞およびデンシティーマーカービーズ（ｄｅｎｓｉｔｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｂｅａｄｓ）を混合物に加えて遠心し、ビーズによって分けられた５−１０層のうち、どの層に細胞があるか（細胞を含む層が細胞の比重を示す）を確認することで、調べることが可能である。【０１８１】
（調製例３：回収した幹細胞の特徴付け）
調製例２において回収した幹細胞を、以下の手順でＦＡＣＳを用いて特徴付けした。【０１８２】
約５ｍｌの細胞懸濁液を、染色培地（ＳＭ；０．５％  ウシ血清アルブミンおよび０．０５％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で２回洗浄した。必要に応じて、細胞を計数した。【０１８３】
約１〜１０×１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁液に対して、最終濃度として０．００１〜０．１μｇ／ｍｌの標識化抗体（標識には、フィコエリトリン（ＰＥ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）および／またはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いた）を添加した。【０１８４】
氷上で３０分間ほど、混合物をインキュベーションした後、細胞を洗浄し、ＳＭを用いて細胞浮遊液の濃度を５×１０５細胞／ｍｌ程度に調整した。【０１８５】
ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を使用した。抗体の標識を指標として、単離した幹細胞における各種ＣＤタンパク質の発現を解析した。その結果、脂肪吸引による吸引物の液体部分由来の幹細胞は、表３に示すように、ＣＤ９０およびＣＤ４９ｄを発現することが判明した。【０１８６】
単離した幹細胞を、ＤＭＥＭ培地において２回継代培養した。継代は、８０％のコンフルエンス時に行った。２度の継代培養後の細胞を、上記と同様の手順でＦＡＣＳによる分析を行った。その結果を以下の表３に示す。【０１８７】
（表３：２回継代培養した後の幹細胞における種々のＣＤの発現）
ＣＤ        発現量    
３          −
４          −
１１ｃ        −
１３          ＋＋
１４          −
１５          −
１６          −
１９          −
２９          ＋＋
３１          ＋
３３          −
３４          ＋
３６          ＋＋
３８          −
４４          ＋
４５          ＋
４９ｄ        ＋＋
５４          ＋
５６          −
５８          ＋
６１          −
６２Ｅ        −
６２Ｐ        −
６９          −
７１          ＋＋
７３          ＋＋
９０          ＋＋
１０４          −
１０５          ＋＋
１０６          −
１１７          ＋
１３５          −
１４４          −
１４６          ＋
１５１          ＋＋
２３５ａ        −
ＳＨ３          ＋
ＳＴＲＯ−１          ＋      
「−」＝発現検出されず、
「＋」＝２０％以下の細胞に検出される
「＋＋」＝２０％以上の細胞に検出される
以上の結果から、脂肪吸引による吸引物の液体部分から調製された幹細胞には、間葉系幹細胞は含まれるものの、従来法によって調製される脂肪由来幹細胞群と異なり、ＣＤ３１、３４陽性細胞が含まれた。従って、本発明の方法によって調製された幹細胞は、血管内皮への分化（血管新生）が容易かつ高効率で可能な細胞群であることが理解できる。さらに、本明細書中で指標として用いたＣＤ発現は、２回継代培養した後に確認されていることから、本発明の幹細胞は、２回程度の継代培養後もその表現型をほとんど変化しないことが理解される。この細胞を、以下の実施例において使用することができる。【０１８８】
（実施例１：脂肪組織由来細胞の培養（１））
（材料）
使用するラットはＳＤラット成体（約８−１２週前後）、雄雌いずれも用いる。一部データでＮｅｓｔｉｎ−ＥＧＦＰ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃラット（Ｓａｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）を用いる。【０１８９】
ニューロスフェア培地：DMEM/F12(1:1) (Gibco #11330, Lot# 1382854)に、2％ B-27 supplement(Gibco #17504-044, LOT 1378016)、ヒト組換えEGF 20ng/ml(R&D systems #236-EG, LOT#HLM166041）、ヒト組換えbasic-FGF 20ng/ml(R&D systems #233-FB, LOT# HKW29) を加えて作製した。【０１９０】
ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）：DMEM (Gibco#11885 LOT# 1362582)に、非働化した10％FBS (EQUITECH-BIO LOT# SFB30-1696)を加えて作製した。【０１９１】
（ＡＳＣの調製）
ラット鼠径部および腹腔内脂肪を採取し、コラゲナーゼ処理を行った後に遠心してペレットとして回収されるいわゆる間質血管画分（ｓｔｒｏｍａｌ−ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）の細胞を、通常の１０ｃｍシャーレを用い、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳによって接着培養し、最低限１回以上継代を行った、脂肪由来間質細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ（ＡＳＣ））を用いた。【０１９２】
（ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒの形成）
あらかじめ１％アガローズゲル（Ｓｉｇｍａ：  Ａｇａｒｏｓｅ  ｔｙｐｅ  ＶＩＩ  ＃Ａ９０４５）で非接着となるように底面をコーティングした１２穴プレートを用意する。ＡＳＣをニューロスフェア形成培地（ＤＭＥＭ＋Ｆ１２  １：１，２％  Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ，２０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ）に、０．５−１ｘ１０５個／ｍｌの密度で１穴２ｍｌずつ注入し、５％ＣＯ２インキュベーターにて培養した。【０１９３】
翌日の段階でａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒはすでに形成されていた。ただし理由は不明だがアガロースコートディッシュでこれ以上培養を続けると細胞生存性（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が落ちるようであったので、この時点で非組織培養処理（ｎｏｎ−ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｔｒｅａｔｅｄ；ノントリートメント）の１２穴プレートに移した。【０１９４】
その後接着しないよう適宜１−２回／日ピペッティングしながら、翌日もしくは翌々日（通算２−３日）まで培養を続けたのちａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを回収した。【０１９５】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；ドイツ）にて細胞よりＲＮＡを回収した。回収したサンプルを、ＴａＫａＲａ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ；日本）を用いてＲＴ−ＰＣＲをおこなった。用いたプライマーデザインは以下のとおりである。
Ｎｅｓｔｉｎ
ＦＯＲＷＡＲＤ  ：ＣＴＴＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＴＡＣＡＴＡＣＡ（配列番号１）
ＲＥＶＥＲＳＥ：ＧＡＧＧＡＴＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴＡＧＧＣＡＣＴ（配列番号２）
Musashi−１  
ＦＯＲＷＡＲＤ  ：ＧＧＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＴＴＣＡＴＧＧＡＣＣＡＧＧＣＧ（配列番号３）
ＲＥＶＥＲＳＥ：  ＧＧＧＡＡＣＴＧＧＴＡＧＧＴＧＴＡＡＣ（配列番号４）
１８Ｓ  ｒＲＮＡ  
ＦＯＲＷＡＲＤ：ＧＣＣＧＣＴＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＧ（配列番号５）
ＲＥＶＥＲＳＥ：ＣＡＴＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＴＴＴＣＧ（配列番号６）
（結果）
形成されたａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを図１に示す。上記（１）の方法で２日後のものを示す。１２穴プレート中のもので、大きいものは肉眼でも確認可能であった。【０１９６】
Ｎｅｓｔｉｎ−ＥＧＦＰトランスジェニックラット皮下脂肪、腹腔内脂肪由来のａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを図２に示す。上記（１）の方法で１日後のものであるが、すでにＥＧＦＰシグナル陽性でｎｅｓｔｉｎ発現の上昇と考えられる。【０１９７】
ａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ培養１日目・２日目のＮｅｓｔｉｎ，Musashi−１発現（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果を図３に示す。厳密には０．２−０．５ｘ１０５／ｍｌと上記条件よりやや薄まきで、かつアガロースコートをしていないノントリートメントプレートで形成したものであるが、この産婦で回収されたものは上記の方法によるａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒとほぼ同様の性質と考えられる。１−２日の間に発現が増強している。【０１９８】
ニューロスフェア培地（左）と、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（右）とで形成したａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒの比較したものを図４に示す。いずれも同様のａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒとなっている。いずれも１日後を示す。【０１９９】
ニューロスフェア培地と、ＤＭＥＭ＋ＦＢＳで培養したａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒのマーカー発現を図５に示す。培養開始しニューロスフェア培地は３日後、ＤＭＥＭ＋ＦＢＳは２日後の回収したものを示す。いずれも同様にｎｅｓｔｉｎ，Musashi−１が発現している。ＮＳＣはコントロールの１５日ラット胚線条体由来の神経幹細胞を示す。【０２００】
（考察）
従来ニューロスフェア培地での浮遊培養法は、いわゆる神経幹細胞を効率よく単離・増殖させる方法として認知されており、本来的にはｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌからのｃｌｏｎａｌな細胞増殖塊であることが原則とされていた。しかしＳｉｎｇｅｃらの報告で、従来クローン性とされた条件での培養でも、生じるニューロスフェアは必ずしもクローン性ではなくａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎである場合も多いことが判明し、クローン性の必要性についての再検証が必要な状況にあった。【０２０１】
この背景の下、本発明者らは特殊コートした非接着プレートに高密度の脂肪組織由来細胞をニューロスフェア培地中で浮遊培養し、１−３日で得られるｓｐｈｅｒｅ様細胞塊がｎｅｓｔｉｎ，  Musashi−１などの神経幹細胞マーカー陽性であることを見出した。文献的にはこうした組織幹細胞からのニューロスフェア形成には１週間以上かかることが多く、今回の細胞塊はむしろアグリゲーション状態にあると考えられた。すなわち神経幹細胞が選別され増殖したのではなく、本発明において実証されるように、脂肪由来細胞がアグリゲーションを作ること自体の刺激で神経幹細胞としての性質を持つようになったものと考えられる。【０２０２】
そのため、非接着性特殊コートプレートに高濃度に浮遊培養させて作出した脂肪由来アグリゲーションは、従来のニューロスフェアとは全く違う意味合いで（アグリゲーションすることそれ自体の効果で）神経再生目的、ひいてはさらに他の組織再生目的に使用できる可能性を有するものと考えられる。本発明では、この細胞塊を特にａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒとも呼ぶ。【０２０３】
（実施例２：脂肪組織由来細胞の培養（２））
脂肪由来細胞がアグリゲーションを作ること自体の刺激で神経幹細胞としての性質を持つようになったものと考えられる点をさらに検証するため、ニューロスフェア培地ではなく通常のＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳにて同様にアグリゲーションを作成した。すなわち、本実施例では、別の条件でもａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒが形成されるかについて検証する目的で、別の条件を用いた。【０２０４】
上記方法（１）で用いたｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ形成培地を、通常のＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに変えた。それ以外の点はすべて上記（１）と同じものを使用した。【０２０５】
（結果）
本実施例において、ニューロスフェア培地ではなく通常のＤＭＥＭ；１０％ＦＢＳにて同様にアグリゲーションを作成したところ、驚くべきことにこれもｎｅｓｔｉｎ，Musashi−１の発現が増強した。【０２０６】
したがって、実施例１において結論付けたように、非接着性特殊コートプレートに高濃度に浮遊培養させて作出した脂肪由来アグリゲーションは、従来のニューロスフェアとは全く違う意味合いで（アグリゲーションすることそれ自体の効果で）神経再生目的、ひいてはさらに他の組織再生目的に使用できる可能性を有するものと考えられる。種々の条件で、この細胞塊をａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒとも呼ぶことができるものが生成されることが確認された。【０２０７】
（実施例３：神経再生能の確認）
上記実施例において作製したａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒの神経再生能を確認する実験を本実施例において行う。ラットにおける脊髄損傷モデルを、専用のインパクターを用い再現性良く作成した（Ｉｋｅｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２００５  Ｄｅｃ；２２（１２）：３０３６−４６．）。２週間経過後、損傷脊髄の部位に、マイクロマニピュレーターを用い、ＧＦＰ動物由来のａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを移植した。６週経過後、当該ラットを屠殺し、損傷部位の脊髄を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定したのち、凍結切片を作成し、ＧＦＰ陽性の移植細胞が生着しているかを確認した。さらにニューロンマーカー（ＮＦなど）およびグリアマーカー（ＧＦＡＰ，ＣＮＰａｓｅなど）による免疫染色を行い、移植細胞の分化運命を検討した。【０２０８】
（結果）
ＧＦＰ陽性の移植細胞が損傷脊髄内で生着していることが明瞭に認められた。免疫染色により、この移植細胞がニューロンおよびグリアのマーカーが共陽性であることが確認された。これにより、移植したａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒは神経構成細胞に分化しうること、すなわち神経再生能を有することが判明した。【０２０９】
（実施例４：ニューロスフェアの細胞培養における培地の確認）
ニューロスフェア培養に用いる培地を、ＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ１２（１：１）を用いる代わりに、ＢＭＥ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭまたはＨＡＭＦ１２培地を用いて、培地がニューロスフェアの細胞培養に与える影響について検討する。それ以外の材料および方法は、実施例５と同じものを用いる。【０２１０】
（結果）
以上の結果より、ＢＭＥ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭまたはＨＡＭＦ１２培地のいずれの培地で培養したニューロスフェアを用いた場合でも、ＤＭＥＭ／ＨＡＭＦ１２（１：１）培地を用いた場合と同様の結果を示すことが確認できる。【０２１１】
（実施例５  ヒト脂肪由来幹細胞を用いたadipoclucter形成）
次に、ヒト脂肪由来幹細胞を用いてadipoclucterが実現するかどうかを確認した。【０２１２】
（材料と方法）
（ヒト脂肪由来幹細胞の分離）
ヒト吸引脂肪の脂肪部分を0.075%コラゲナーゼで３７℃３０分処理し、細胞を回収した。回収した細胞は１００μｍのフィルターを通し、Ｍ１９９培地（詳細以下）で維持した。【０２１３】
ASC継代培養培地（500mlあたり）
・  M199(GIBCO#11150)                               500ml
・  FBS(biowest#S1820)                               10%
・  acidicFGF (Peprotech#100-17A)                    2 ng/ml （終濃度）
・  Heparin+ (SIGMA#H4784)                          5μg/ml （終濃度）
・  Penicillin/streptomycin(GIBCO #15070-063)          1%
（adipocluster形成）
0.25%Trypsin-EDTAで５分間処理し回収したASCを、培養培地（（１）ASC継代培養培地、（２）DMEM/F12培地添加物無し、（３）ニューロスフェア培地）に再浮遊させ、2%アガロースコーティングした96ウェルディッシュに播種した（1〜2.5x104/200μl/well）。１、２または７日間培養しクラスターを形成させた。【０２１４】
ニューロスフェア培地（50mlあたり）
・  DMEM/F12(GIBCO#11330-032)                49ml
・  bFGF(GIBCO#13256-029)                    20 ng/ml （終濃度）
・  EGF(GIBCO#13247-051)                     20 ng/ml （終濃度）
・  B27supplement (GIBCO#17504-044)           1ml
・  200mML-Glutamine (GIBCO#25030-081)               500μl
・  Penicillin/streptomycin(GIBCO #15070-063)          500μl
（結果）
結果を図６に示す。示されるように、（１）ASC継代培養培地、（２）DMEM/F12培地添加物無し、（３）ニューロスフェア培地のいずれの培地においてもクラスターが形成された。【０２１５】
したがって、本発明では、培地の選択は本質的ではないことが示された。【０２１６】
（実施例６）ヒトadipoclusterの遺伝子発現
次に、ヒトadipoclusterの細胞マーカーの状況を調べるため、その遺伝子発現の調査を行った。以下に、その手順および結果を示す。【０２１７】
（材料と方法）
（リアルタイムＰＣＲ）
培養細胞からのRNAはQIAGEN社製RNAeasy plus mini kit (# 741334) を用いて抽出し、Applied Biosystem社製High capacity cDNART-kit (# 4374966)を用いてRT反応をおこなった。リアルタイムRT-PCRはApplied Biosystem社製Step one plus およびPowerSYBR Green PCR Master Mix (# 4367659) を用いておこなった。PCR条件、プライマーの塩基配列は以下示す。【０２１８】
（使用したプライマー塩基配列）【０２１９】
【表３】
2008150001.tif 000004
【０２２０】
（結果）
表４では、細胞マーカーの発現レベルを平均値と標準誤差で表示したものを示す。接着培養（controlと表示）を１にして表示する。【０２２１】
【表４】
2008150001.tif 000005
【０２２２】
表中、１列目の上段は、マーカーを示し、下段は、それぞれＭ１９９は（１）ASC継代培養培地を示し、ＤＭ／Ｆ１２は、（２）DMEM/F12培地添加物無しを示し、ＢＥＦは（３）ニューロスフェア培地を示す。【０２２３】
以下の判定基準にして
＜測定値＞
＋＋＋＝強発現      ＝    １０倍以上  
＋＋＝中程度の発現  ＝    ５〜１０倍
＋＝低発現          ＝    ２〜５倍
−＝発現変化なし        ＝１〜２倍。  
表４を分類すると、左から、
Oct3/4         Nestin      Musashi        p75     TUBB     NFH
+++ +++ ++  /  -- +  /  + +++ +  /  + + +  /  - - -  /  - + -
と表現することができる。【０２２４】
なお、元の細胞であるＡＳＣの時点でＮｅｓｔｉｎが少ないながらも発現していることから、本実施例では、相対値が低く見える結果となった。しかし、絶対量としては顕著な量を発現しており、他の細胞と比較すれば、マーカーとして陽性であるといえる。また、S100についても陽性であると期待される。【０２２５】
未分化マーカー、神経幹細胞および神経堤細胞マーカーの上昇が認められた。これらと比較して神経分化マーカーの上昇は抑制されていた。Adipoclusterは一般的に用いられているニューロスフェア培地のみならず、無添加の基礎培地によるクラスター形成でも神経系または未分化マーカーの発現が誘導可能であることが分かった。本実施例では、Ｎｅｓｔｉｎに比べてMusashiの方が発現促進が高かった。これは元の細胞であるＡＳＣの時点でＮｅｓｔｉｎが少ないながらも発現しているからであり、相対評価で示す場合、変動後の数値が相対的に低く表現されるからである。そして、絶対的には、神経幹細胞マーカーが通常発現する程度の量が見られたといえる。【０２２６】
（実施例７  マウスadipoclusterの脊髄損傷モデルマウスへの移植実験）
（材料と方法）
ＡＳＣの分離およびａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒ形成については明細書に記載の方法とした。また脊髄損傷モデルの作成も明細書に記載のラットを用いた方法と同じである。【０２２７】
（Adipoclusterの回収・分散）
８日培養後のadipoclusterを回収し、４０μｍフィルターを通したクラスターをTrypsin-EDTA処理した。分散した細胞をＰＢＳに懸濁し移植細胞とした。脊髄損傷から９日後に細胞を移植しＢＢＢスコアから細胞移植効果を解析した。【０２２８】
第10胸椎に70kDynesで圧挫損傷を与えたC57BL/6雌マウスに、受傷9日後、分散したAdipoclusterを移植した。【０２２９】
移植細胞数は実験１、２共に7.5×103個とした。細胞を含まないPBSを注入した対象区のマウスでは、その後ほとんど回復は見られないが、Adipoclusterを移植したマウスでは下肢機能の回復が認められた。ＢＢＢスコアの詳細は以下の表に示す。なお、以下の表は、細胞工学Ｖｏｌ２４．Ｎｏ．５  ２００５  進化する疾患藻モデル動物  脊髄損傷モデルの作成法と機能評価に基づいて作成したものである。
[表５]
ＢＢＢスコアの判定リスト
０点  後肢の動きがまったくない
１点  後肢１，２関節の微小な動き
２点  後肢１関節の大きな動きともう１関節の微小な動き
３点  後肢２関節の大きな動き
４点  後肢３関節の微小な動き
５点  後肢２関節の微小な動きと残りの１関節の大きな動き
６点  後肢２関節の大きな動きと残りの１関節の微小な動き
７点  後肢３関節の大きな動き
８点  荷重のない、後肢全体を使った伸縮運動（sweeping）
９点  静止時の、足底を地面に付けた荷重状態
１０点  前肢後肢の協調性のまったくない、時折の荷重歩行
１１点  前肢後肢の協調性のまったくない、高頻度あるいは連続的な荷重歩行
１２点  前肢後肢の協調性の時折ある、高頻度あるいは連続的な荷重歩行
１３点  前肢後肢の協調性が高頻度にある、高頻度あるいは連続的な荷重歩行
１４点  前肢後肢の協調性のある荷重歩行であるが、ほぼ常に後肢の位置が外旋位にある
１５点  前肢後肢の協調性のある荷重歩行である。後肢接地時に後肢の方向が体幹と平行だが、離床時につま先で地面を勢いよく蹴る動作（Ｔｏｅ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ）がほとんど認められない
１６点  前肢後肢の協調性のある荷重歩行である。後肢接地時に後肢の方向が体幹と平行で、離床時につま先で地面を勢いよく蹴る動作が高頻度に認められるが、つま先は離床時に外旋する。
１７点  前肢後肢の協調性のある荷重歩行である。離床時につま先で地面を勢いよく蹴る動作が高頻度に認められｒ、つま先の方向は接地時も離床時も体幹と平行である。
１８点  前肢後肢の協調性のある荷重歩行である。つま先で地面を勢いよく蹴る動作が常に認められ、つま先の方向は接地時も離床時も体幹と平行である。
１９点  １８点に加えて尾の状態を見る、尾が荷重歩行時にたまに上がる
２０点  １８点に加えて尾の状態を見る、尾が荷重歩行時に常に上がっているが、体幹動揺性が認められる  
２１点  ２０点に加え、体幹動揺性もない
（結果）
結果を図７に示す。表中に記載されるように、本評価法では、８点と９点との間に臨界的な境界線があり、機能の差異が説明されるところ、本願発明のASC細胞を移植した例では、顕著に機能改善が見られるのに対して、処置なしの群では、そのような改善は見られなかった。【０２３０】
（脊髄損傷マウスにおけるAdipoclusterの移植効果）
移植効果についての写真を図８に示す。細胞を含まないPBSを注入した対象区（下段）のマウスの脊髄は、受傷部が細くなったり（左下）、大きく窪んでいる（右下）が、Adipo-clusterを移植したマウスの脊髄（上段）では、ほぼ正常な太さと形状であった。【０２３１】
ＢＢＢスコアでは微妙な差であるように見えるが、８点以下であるか９点以上かの臨界的な相違が見られた。なお、本試験では、８点以下であるか９点以上かの臨界的であるといわれるのは、荷重歩行の可否が最も評価を分けるポイントであるからである。そして、このことは、実際のマウスの動きは明らかに回復効果が見られたこととも一致する。したがって、Adipoclusterの移植によって、機能改善が生じることが理解される。【０２３２】
（実施例８  マウスadipoclusterとマウスＡＳＣの遺伝子発現比較）
（材料と方法）
マウスASCをアガロース・コーティング培養器内で1週間培養し、Adipoclusterを作製した。対象は平面培養したマウスASCとし、いずれも培養液はDMEM＋10%FBSを用いた。GFPトランスジェニック（GFP）およびWild type（WT）マウスのASCで同様に行い、それぞれ繰り返しは3回とした。【０２３３】
Adipoclusterと平面培養細胞からＲＮＡを抽出し、リアルタイムＰＣＲでＮｅｓｔｉｎおよびｐ７５の発現量を測定した。プライマーは市販のＴａｑＭａｎプローブを用いた（MouseNestin: Mm03053244_s1、Mouse p75NTR (Ngfr): Mm00446294_m1）。【０２３４】
（結果）
結果を以下の表および図９に示す。【０２３５】
【表６】
2008150001.tif 000006
【０２３６】
図９において、グラフは、平面培養のASCに対するAdipoclusterの相対的発現量（倍）を示す。RNA発現を比較したところ、Nestinおよびp75NTRの発現はAdipoclusterにおいて有意に高くなっていた（＊:P<0.05, §: P<0.01）。したがって、Adipoclusterを移植すると、機能的神経分化細胞も増加することが示される。【０２３７】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【０２３８】
本発明は、脂肪組織の細胞から、幹細胞の機能を有する凝集体であるａｄｉｐｏｃｌｕｓｔｅｒを簡便な方法で取得できることを証明した。したがって、本発明の産業上の利用は、医薬品業界において見出される。
【図１】
2008150001.tif 000007
【図２】
2008150001.tif 000008
【図３】
2008150001.tif 000009
【図４】
2008150001.tif 000010
【図５】
2008150001.tif 000011
【図６】
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【図７】
2008150001.tif 000013
【図８】
2008150001.tif 000014
【図９】
2008150001.tif 000015
【配列表】
2008150001000001.app
【国際調査報告】
2008150001.tif 000016
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