(57)【要約】  本発明は、ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解するアミダーゼ活性を有する新規ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、及び、該ポリペプチド又は該形質転換体を利用して、ラセミ体カルボン酸アミドを加水分解し、光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸を製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチド：
（ａ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表配列番号１に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
以下の理化学的性質を有するポリペプチド：
（ａ）ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有する、
（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が５２ｋＤａ程度である、
（ｃ）ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適ｐＨが８〜９である、
（ｄ）ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が５０℃である、
（ｅ）ｐＨ７付近において５０℃以下の温度で安定である。
【請求項４】
カプリアビダス（Cupriavidus）属に属する微生物に由来する請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
カプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３９）に由来する請求項4に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ：
（ａ）配列表配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｂ）配列表配列番号２に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列表配列番号２に示した塩基配列と７０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項８】
配列表配列番号２に示した塩基配列と８０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードする、請求項７に記載のＤＮＡ。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターで宿主微生物を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１１】
宿主微生物が大腸菌である請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載のポリペプチド、または、請求項１０および１１のいずれかに記載の形質転換体をラセミ体カルボン酸アミドに作用させ、光学活性カルボン酸アミドを残存させ、光学活性カルボン酸を生成することを特徴とする光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法。
【請求項１３】
ラセミ体カルボン酸アミドが、ラセミ体ニペコタミド、ラセミ体ピペコリン酸アミド、ラセミ体インドリンカルボン酸アミド、および、ラセミ体フェニルプロピオン酸アミドからなる群より選ばれるいずれか一つであり、光学活性カルボン酸アミドが、（Ｒ）−ニペコタミド、（Ｓ）−ピペコリン酸アミド、（Ｓ）−インドリンカルボン酸アミド、および、（Ｒ）−フェニルプロピオン酸アミドからなる群より選ばれるいずれか一つであり、光学活性カルボン酸が、（Ｓ）−ニペコチン酸、（Ｒ）−ピペコリン酸、（Ｒ）−インドリンカルボン酸、および、（Ｓ）−フェニルプロピオン酸からなる群より選ばれるいずれか一つである請求項１２に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有する新規なポリペプチド、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、及びそれらを利用した光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸、特に光学活性ニペコタミド及び光学活性ニペコチン酸は、農薬、医薬品等の合成原料及び中間体として有用な化合物である。従来、ラセミ体ニペコタミドを加水分解する方法については、シュードモナス  エスピー（Pseudomonas sp.）ＭＣＩ３４３４株由来のアミダーゼがラセミ体ニペコタミドに作用することが知られているが、立体選択性、生産性については不明である（特許文献１、非特許文献１）。
【特許文献１】特開２００４−１０５１５２号公報
【非特許文献１】Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００４年、２７１巻、１５８０頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、ラセミ体ニペコタミドを立体選択的に加水分解する活性を有する、新規アミダーゼ及びそれをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、及びそれらを利用した光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解するアミダーゼをカプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３９）から単離し、それをコードするＤＮＡを取得した。このＤＮＡを用いて製造されるアミダーゼに富んだ形質転換体又は高濃度アミダーゼ溶液により、高い生産性で高い立体選択的なカルボン酸アミド類の加水分解反応が進行すること見出し、本発明を完成するに至った。【０００５】
本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。【０００６】
（１）本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドである：
（ａ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）配列表配列番号１に示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有るポリペプチド、
（ｃ）配列表配列番号１で示されるアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド。【０００７】
（２）本発明の別の特徴は、以下の理化学的性質を有するポリペプチドである：
（ａ）ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有する、
（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が５２ｋＤａ程度である、
（ｃ）ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適ｐＨが８〜９である、
（ｄ）ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が５０℃である、
（ｅ）ｐＨ７付近において５０℃以下の温度で安定である。【０００８】
（３）本発明の一つの特徴は、以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡである：
（ａ）配列表配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（ｂ）配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（ｃ）配列表配列番号２に示した塩基配列と７０％以上の配列同一性を示す塩基配列からなり、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【０００９】
（４）本発明の別の特徴は、前記ＤＮＡを含むベクターである。【００１０】
（５）本発明の別の特徴は、前記ベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である。【００１１】
（６）本発明の別の特徴は、前記ポリペプチド、又は、前記形質転換体を、ラセミ体カルボン酸アミドと反応させる工程、並びに、生成した光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸を採取する工程からなる、光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、新規アミダーゼ及びそれをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、該ベクターで形質転換された形質転換体、及びそれらを利用した光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を、実施形態を用いて詳細に説明する。本発明はこれらにより限定されるものではない。【００１４】
本明細書において記述されている、ＤＮＡの単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)等の成書に記載されている方法により実施できる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００１５】
１.アミダーゼ及びポリペプチド
本発明は、以下の理化学的性質を有する新規アミダーゼに関するものである。
（ａ）ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有する。
（ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が５２ｋＤａ程度である。
（ｃ）ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適ｐＨが８〜９である。
（ｄ）ラセミ体ニペコタミドを基質として用いたときのアミダーゼ反応の至適温度が５０℃である。
（ｅ）ｐＨ７付近において５０℃以下の温度で安定である。【００１６】
本発明のアミダーゼは、ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有し、光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸を生成する活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物などの生物から単離することができる。ポリペプチドの起源となる微生物は特に限定されないが、カプリアビダス（Cupriavidus）属に属するバクテリアが挙げられ、特に好ましいものとしてはカプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３９）があげられる。上記ＫＮＫ−Ｊ９１５株は、本発明者らによって土壌から分離された菌株である。【００１７】
上記のカプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株については、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３９の受託番号で、平成１８年１１月２８日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。以下に、カプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３９）の菌学的性質を示す。【００１８】
Ａ．形態
（１）細胞形態  ０．８〜１．０×１．５〜２．５μｍの桿状。
（２）運動性はない。
（３）胞子はない。
（４）グラム染色：陰性
（５）コロニーの形態：円形、レンズ状、全縁滑らか、黄色
Ｂ．生理学的性質
（１）ゼラチンの加水分解：陰性
（２）デンプンの加水分解：陰性
（３）硝酸塩の還元：陽性
（４）カタラーゼ活性：陽性
（５）オキシダーゼ活性：陽性
（６）ウレアーゼ活性：陰性
（７）Ｏ−Ｆ試験：酸化、発酵共に陰性
（８）炭水化物の分解：Ｔｗｅｅｎ８０は加水分解しない。アドニトール、サリシン、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、マンノース、ラフィノース、サッカロース、マルトース、セロビオース、ガラクトース、ラクトース、グリセロール、Ｄ−リボース、Ｌ−アラビノースからは酸を生成しない。フラクトースを酸化する。【００１９】
本発明のポリペプチドを生産する微生物は、野生株または変異株のいずれでもあり得る。あるいは、細胞融合または遺伝子操作などの遺伝学的手法により誘導された微生物も用いられ得る。遺伝子操作された本発明のポリペプチドを生産する微生物は、例えば、これらの酵素を単離及び／または精製して酵素のアミノ酸配列の一部または全部を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を決定する工程、このアミノ酸配列に基づいてポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を得る工程、このヌクレオチド配列を他の微生物に導入して組換え微生物を得る工程、及びこの組換え微生物を培養して、本発明の酵素を得る工程を包含する方法により得られ得る。【００２０】
本発明のポリペプチドの実施形態としては、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。また、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の配列同一性を有し、且つ、ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドと同等であり、本発明に含まれる。【００２１】
ここで配列の配列同一性は、例えば、相同性検索プログラムＢＬＡＳＴ(W.R. Pearson & D.J. Lipman P.N.A.S. (1988) 85:2444-2448）を用いて２つのアミノ酸配列を比較解析した場合に、配列全体に対するＩｄｅｎｔｉｔｙの値で表される。配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドと一定値以上の配列同一性を有するポリペプチドとしては、当該ポリペプチドとの配列同一性が７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上であるポリペプチドを挙げることができる。【００２２】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を、上記の相同性検索プログラムＢＬＡＳＴを用いて相同性検索をしたところ、ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）ＪＭＰ１３４株、ラルストニア  メタリドゥランス（Ralstonia metallidurans）ＣＨ３４株由来のアミダーゼとそれぞれ約７８％、７３％の配列同一性を示した。これらのアミノ酸配列はYP_295602およびYP_584021のアクセッションナンバーにてNational Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のデータベースに登録されており、何人もこれらの配列を取得することができる。【００２３】
本発明のポリペプチドは、例えば、先述の、配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより得られる。【００２４】
また、例えば、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失又は付加を生じさせることによっても取得できる。置換、挿入、欠失又は付加を生じさせるアミノ酸の数は、実施形態のポリペプチドが備える活性が失われない限り、その個数は制限されないが、好ましくは９０アミノ酸以下であり、より好ましくは、その個数は制限され６５アミノ酸以下、さらに好ましくは４５アミノ酸以下、最も好ましくは、２０アミノ酸以下である。【００２５】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。【００２６】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物からの該ポリペプチドの単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除き、無細胞抽出液を得る。そして、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトン又はエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、又は組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを単離することもできる。【００２７】
以下に、カプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３９）より単離された、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの物理学的、及び酵素学的性質を示す。
１．分子量：５２０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）
２０００００（ゲルろ過法により測定）
２．サブユニット構成：４量体
３．アミダーゼ反応至適ｐＨ：ｐＨ８．０〜９．０
４．アミダーゼ反応至適温度：５０℃
５．熱安定性：５０℃以下で安定である。
６．基質特異性：ニペコタミド、Ｎ−ベンジルニペコタミド、ピペコリン酸アミド、イソニペコタミド、インドリンカルボン酸アミドといった複素環化合物やプロピオン酸アミド、イソブチルアミド、マンデル酸アミド、フェニルプロピオン酸アミドといった脂肪族アミドに対して特に強い活性を示す。より好ましい基質としては、（Ｓ）−ニペコタミド、（Ｒ）−ピペコリン酸アミド、（Ｒ）−インドリンカルボン酸アミド、（Ｓ）−フェニルプロピオン酸アミドなどが挙げられる。【００２８】
２．ＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有し、光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該ポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該ポリペプチドが取得できれば、該ポリペプチドの起源となる微生物より、当業者であれば公知の方法で本発明のＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で本発明のＤＮＡを取得できる。【００２９】
まず、単離された本発明のポリペプチドを適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（Applied Biosystems社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部又は全部を決定する。【００３０】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、ＡＢＩ３１３０ｘｌ型  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Applied Biosystems社製）等を用いて行うことができる。【００３１】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、ｉ−ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）によりその全体の配列を決定することができる。【００３２】
このようにして得られる本発明のＤＮＡの実施形態としては、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、配列番号２において１若しくは数個の塩基が置換、挿入、欠失および／または付加された塩基配列を有し、且つラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、本発明に含まれる。「数個の塩基」とは、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドが上記活性を失わない限り、その個数は制限されないが、好ましくは２７０塩基以下であり、より好ましくは２００塩基以下、さらに好ましくは１３０塩基以下、最も好ましくは、７０塩基以下である。【００３３】
また、配列表配列番号２で示される塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、更に好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、且つ上記活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡは、本発明に含まれる。【００３４】
さらに、配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、且つ、ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。さらに、配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、且つ、ラセミ体カルボン酸アミドを加水分解し、光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸を生成する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡに包含される。【００３５】
配列表配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。【００３６】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。【００３７】
本明細書において記述されている、上記ＤＮＡの単離、および後述するベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)等の成書に記載されている方法により実施できる。【００３８】
３．ベクター
本発明のベクターは、適当な宿主細胞内で前記ＤＮＡがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。【００３９】
このようなベクターは、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８が好適に使用できる。プラスミドｐＵＣＮ１８は、ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミドである。【００４０】
前記制御因子は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００４１】
上記の「作動可能に連結」という用語は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。本発明のベクターの例としては、上記ｐＵＣＮ１８に配列番号１に示すＤＮＡを導入した、後述するプラスミドｐＮＣＳを挙げることができる（実施例４参照）。【００４２】
４．宿主細胞
本明細書内に記載される宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられるが、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。本発明のＤＮＡを含むベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のEscherichia coli HB101コンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。【００４３】
５.形質転換体
本発明の形質転換体」は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを、前記ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本発明の「形質転換体」は、培養菌体は言うまでもなく、その処理物も含まれる。ここで言う処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。ラセミ体ニペコタミドを（Ｓ）体選択的に加水分解する活性が残存する限りにおいては、これら処理物を本発明の反応に使用しうる。本発明の形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。【００４４】
上記形質転換体の例としては、後述する実施例にあるE. coli HB101 (pNCS)が挙げられる。【００４５】
６．光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法
本発明の「光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造」は、適当な溶媒中に、基質となるラセミ体カルボン酸アミドと、本発明のポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む形質転換体とを添加することにより実施できる。【００４６】
反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。反応は例えば１０℃〜７０℃の温度で行われ、反応液のｐＨは例えば４〜１０に維持する。反応は、バッチ方式あるいは連続方式で実施できる。バッチ方式の場合、反応基質は例えば０．１％から７０％（ｗ／ｖ）の仕込み濃度で添加される。【００４７】
基質となる「ラセミ体カルボン酸アミド」としては、例えば、ラセミ体ニペコタミド、ラセミ体ピペコリン酸アミド、ラセミ体インドリンカルボン酸アミド、ラセミ体フェニルプロピオン酸アミド等が挙げられるが、上述の反応条件において加水分解され、「光学活性アミド及び光学活性カルボン酸に変換されるものであれば、特に限定されない。上述の反応条件において、ラセミ体ニペコタミドを基質とした場合、（Ｒ）−ニペコタミド、（Ｓ）−ニペコチン酸、ラセミ体ピペコリン酸アミドを基質とした場合、（Ｓ）−ピペコリン酸アミド、（Ｒ）−ピペコリン酸、ラセミ体インドリンカルボン酸アミドを基質とした場合、（Ｒ）−インドリンカルボン酸アミド、（Ｓ）−インドリンカルボン酸、ラセミ体フェニルプロピオン酸アミドを基質とした場合、（Ｒ）−フェニルプロピオン酸アミド、（Ｓ）−フェニルプロピオン酸が得られる。反応で生じたアミド及び酸、例えば（Ｒ）−ニペコタミド、（Ｓ）−ニペコチン酸は、常法により、それぞれを単離、精製できる。加水分解反応で生じた（Ｒ）−ニペコタミドを含む反応液を、酢酸エチル、トルエン等の有機溶媒で抽出し、有機溶媒を減圧下で留去した後、蒸留、再結晶、または、クロマトグラフィー等の処理を行うことにより、単離、精製できる。或いは、反応液から微生物菌体を除去したろ液を塩酸等を用いて中和晶析し、析出した目的物をろ別することによっても単離、精製できる。また、反応液から微生物菌体を除去したろ液を二炭酸ジ−ｔ−ブチル等を用いて誘導化し、析出した目的物をろ別することによっても単離、精製できる。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００４９】
（実施例１）カプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３９）由来アミダーゼの精製
以下に説明する各実施例では、アミダーゼ活性の測定は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、Ｎ−ベンジルニペコタミド１％、及び酵素溶液を添加し、３０℃で１時間反応後、高速液体クロマトグラフィー分析条件Ａにより分析した。この条件において、１分間に１μｍｏｌのＮ−ベンジルニペコチン酸を生成する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。【００５０】
高速液体クロマトグラフィー分析条件Ａ
カラム：ＹＭＣ−Ａ３０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝９／１
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ。【００５１】
肉エキス  １．０％、ポリペプトン  １．５％、バクト・イーストエキス  ０．５％、ＮａＣｌ  ０．３％の組成からなる液体培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌を行った。この液体培地にカプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株を無菌的に接種し、３５℃で７２時間振とう培養を行った。得られた培養液４．２Ｌについて、遠心分離により菌体を集め、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌで洗浄し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２００ｍｌに懸濁した。この懸濁した菌体をＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０（BRANSON社製）を用いて超音波破砕し、遠心分離にて菌体残渣を除去して無細胞抽出液を取得した。【００５２】
この無細胞抽出液に２０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、４℃で３０分攪拌後、生じた沈殿を遠心分離により除去した。さらに、この上清に４０％飽和となるまで硫酸アンモニウムを添加し、４℃で３０分攪拌後、生じた沈殿を遠心分離により取得し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析した。【００５３】
透析後の酵素液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（４００ｍｌ）に供し、酵素を吸着させ、同一緩衝液でカラムを洗浄後、０Ｍから０．３Ｍまでの塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。【００５４】
この活性画分に０．８Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、０．８Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー社製）カラム（７５ｍｌ）に供し、酵素を吸着させ、同一緩衝液でカラムを洗浄後、０．８Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウムのリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。【００５５】
この活性画分に０．８Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、０．８Ｍの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）であらかじめ平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ（東ソー社製）カラム（２５ｍｌ）に供し、酵素を吸着させ、同一緩衝液でカラムを洗浄後、０．８Ｍから０Ｍまでの硫酸アンモニウムのリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。【００５６】
この活性画分を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で透析後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）であらかじめ平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ(Pharmacia Biotech社製)カラム（６ｍｌ）に供し、酵素を吸着させ、同一緩衝液でカラムを洗浄後、０Ｍから０．５Ｍまでの塩化ナトリウムのリニアグラジエントにより活性画分を溶出させた。【００５７】
この活性画分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動により解析した結果、単一なバンドであったため、この活性画分に含まれる酵素を精製酵素とした。【００５８】
精製酵素の比活性は１．７Ｕ／ｍｇ−ｐｒｏｔｅｉｎであった。以後、本酵素をＨＣＳと呼ぶ。【００５９】
（実施例２）精製ＨＣＳの酵素学的性質
基質としてＮ−ベンジルニペコタミドを用いて、実施例１で取得した精製酵素のアミダーゼ反応の至適ｐＨ、至適温度、及び熱安定性を加水分解反応によって生じるＮ−ベンジルニペコチン酸をＨＰＬＣで定量することによって調べた。至適ｐＨ測定時には各ｐＨで３０℃で１時間反応を行い、アセトニトリルの添加により停止し、分析は実施例１に記載の高速液体クロマトグラフィー分析条件Ａで行った。至適温度測定時には各温度で１時間反応を行い、アセトニトリルの添加により停止し、分析は実施例１に記載の高速液体クロマトグラフィー分析条件Ａで行った。熱安定性測定時には各温度において３０分インキュベーションを行った後１時間反応を行い、アセトニトリルの添加により停止し、分析は実施例１に記載の高速液体クロマトグラフィー分析条件Ａで行った。【００６０】
結果を以下の表１に示した。【００６１】
【表１】
2008120554.tif 000002
【００６２】
次に、ＨＣＳの基質特異性について調べた。基質化合物は１％の濃度で添加し、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、３０℃で酵素反応を行い、分析は実施例１に記載の高速液体クロマトグラフィー分析条件Ａ或いは、以下に記載の高速液体クロマトグラフィー分析条件Ｂで行った。【００６３】
高速液体クロマトグラフィー分析条件Ｂ
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）
溶離液：２ｍＭ  ＣｕＳＯ４  水溶液
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２５４ｎｍ。【００６４】
(ＲＳ)−ニペコタミドに対する活性を１００として、その相対活性を表２に示した。【００６５】
【表２】
2008120554.tif 000003
【００６６】
ＨＣＳのアミダーゼ活性は、ニペコタミド、Ｎ−ベンジルニペコタミド、ピペコリン酸アミド、イソニペコタミド、インドリンカルボン酸アミドといった複素環化合物やプロピオン酸アミド、イソブチルアミド、マンデル酸アミド、フェニルプロピオン酸アミドといった脂肪族アミドに対して特に強い活性を示し、フェニルアラニンアミドやベンズアミドに弱い活性を示した。【００６７】
（実施例３）ＨＣＳのクローニング
実施例１で得られた精製ＨＣＳを用いて、ＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（Applied Biosystems社製）によりＮ末端アミノ酸配列を解析した。また、精製ＨＣＳを８Ｍ尿素存在下で変性させた後、アクロモバクター由来のリジルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列を解析した。これらのアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列を考慮し、プライマー１（配列表配列番号３）及びプライマー２（配列表配列番号４）を合成した。プライマー２種（プライマー１及びプライマー２）各４０ｐｍｏｌ、カプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株の染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９５℃、１分）、アニーリング（５０℃、１分）、伸長反応（７２℃、０．５分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。本反応に用いたカプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株の染色体ＤＮＡの調製は、分子生物学実験プロトコール１（丸善）Ｐ．３６に記載されている細菌ゲノムＤＮＡの少量調製法により行なった。【００６８】
増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Novagen社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。その結果、増幅ＤＮＡはプライマー配列を除いて１９６塩基からなっていた。その配列を配列番号５に示す。以後この配列を「コア配列」と記す。【００６９】
コア配列の５’側に近い部分の塩基配列をもとに、その相補配列となるプライマー３（配列表配列番号５）を作成し、更に３’側に近い部分の塩基配列をもとに、プライマー４（配列表配列番号６）を作製した。逆ＰＣＲの鋳型として、まずカプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株の染色体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩにより消化し、その消化物をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環した。この自己閉環物２００ｎｇ、プライマー２種（プライマー３及びプライマー４）各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９７℃、１分）、アニーリング（６０℃、１分）、伸長反応（７２℃、５分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。【００７０】
増幅ＤＮＡをｐＴ７Ｂｌｕｅ  Ｖｅｃｔｏｒ（Novagen社製）にサブクローニングし、その塩基配列を決定した。この結果とコア配列の結果より、カプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株由来のＨＣＳをコードする遺伝子の全塩基配列を決定した。ＨＣＳをコードする遺伝子の全塩基配列を配列番号２に、また該遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を配列番号１に示した。【００７１】
（実施例４）ＨＣＳ遺伝子を含む組換えベクターの作製
大腸菌においてＨＣＳを発現させるために、形質転換に用いる組換えベクターを作製した。まず、ＨＣＳ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加し、かつ終始コドンの直後に新たな終始コドンとＥｃｏＲＩ部位を付加した二本鎖ＤＮＡを以下の方法により取得した。【００７２】
実施例３で決定した塩基配列に基づき、ＨＣＳ遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー５（配列表配列番号７）、及びＨＣＳ遺伝子の終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ部位を付加したプライマー６（配列表配列番号８）を合成した。プライマー２種（プライマー５及びプライマー６）各５０ｐｍｏｌ、カプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５株の染色体ＤＮＡ１０ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含むＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９７℃、１分）、アニーリング（６０℃、１分）、伸長反応（７２℃、１．５分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＣＳを構築した。【００７３】
（実施例５）  形質転換体の作製
実施例４で構築した組換えベクターｐＮＣＳを用いて、E. coli HB101コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、E. coli HB101 (pNCS)を得た。【００７４】
E. coli HB101の菌学的性質は、「BIOCHEMICALS FOR LIFE SCIENCE」（東洋紡績株式会社、１９９３年、１１６−１１９頁）およびその他種々の公知文献に記載されており当業者に周知である。上記E. coli HB101 (pNCS)は、遺伝子組換えによって特定の酵素を産生し得る性質以外は、E. coli HB101と同様の菌学的性質を有する。【００７５】
（実施例６）形質転換体におけるＨＣＳの発現
実施例５で得た形質転換体、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮ１８を含む形質転換体であるE. coli HB101 (pUCN18)（比較例）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のアミダーゼ活性を測定し、比活性として表したものを、表３に示した。【００７６】
【表３】
2008120554.tif 000004
【００７７】
表３に示すように、実施例５で得られた形質転換体において、アミダーゼ活性の発現が認められた。アミダーゼ活性は、実施例１に記載の方法で測定した。【００７８】
（実施例７）ラセミ体ニペコタミドのＳ体選択的加水分解
ラセミ体ニペコタミド１０．１ｇを水に溶解し、ｐＨ８．０に調整した基質溶液２００ｍｌに実施例６と同様に培養したE. coli HB101 (pNCS)の培養液２ｍｌに添加し、４５℃にて２５時間攪拌した。反応終了後、反応液を７０℃、３０分加熱処理し、遠心分離にて菌体等の固形物を除去した後、反応液中の基質及び生成物を、クロロギ酸ベンジルを用いて誘導化した。得られた誘導体を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、変換率（％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は５０．２％、（Ｒ）−ニペコタミドの光学純度は９８．３％ｅ．ｅ．、（Ｓ）−ニペコチン酸の光学純度は９７．１％ｅ．ｅ．であった。【００７９】
変換率（％）＝Ｐ／（Ｓ１＋Ｐ）×１００
（Ｐ：生成物量（ｍｏｌ）、Ｓ１：残存基質量（ｍｏｌ））
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００
（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）。【００８０】
高速液体クロマトグラフィー分析条件
［変換率の分析］
カラム：ＹＭＣ−Ａ３０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝７／３
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−ＲＨ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝７／３
流速：０．５ｍｌ／分
カラム温度：室温
測定波長：２１０ｎｍ。【００８１】
（実施例８）ラセミ体ピペコリン酸アミドのＲ体選択的加水分解
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、ラセミ体ピペコリン酸アミド１％、及び実施例１で得られた精製酵素溶液を添加し、３０℃で反応後、高速液体クロマトグラフィーにより分析することにより、変換率（％）及び光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は１８．３％、（Ｒ）−ピペコリン酸の光学純度は８０．１％ｅ．ｅ．であった。【００８２】
変換率（％）＝Ｐ／（Ｓ１＋Ｐ）×１００
（Ｐ：生成物量（ｍｏｌ）、Ｓ１：残存基質量（ｍｏｌ））
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００
（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）。【００８３】
高速液体クロマトグラフィー分析条件
［変換率・光学純度の分析］
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）
溶離液：２ｍＭ  ＣｕＳＯ４  水溶液
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２５４ｎｍ。【００８４】
（実施例９）ラセミ体インドリンカルボン酸アミドのＲ体選択的加水分解
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、ラセミ体インドリンカルボン酸アミド１％、及び実施例１で得られた精製酵素溶液を添加し、３０℃で反応後、無水酢酸を用いて誘導化した。得られた誘導体を高速液体クロマトグラフィーで分析することにより変換率（％）、光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は３９．２％、（Ｒ）−インドリンカルボン酸の光学純度は９７．８％ｅ．ｅ．であった。【００８５】
高速液体クロマトグラフィー分析条件
［変換率の分析］
カラム：ＹＭＣ−Ａ３０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝９／１
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＳＵＭＩＣＨＩＲＡＬ  ＯＡ−５０００（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、住化分析センター社製）
溶離液：２ｍＭ  ＣｕＳＯ４  水溶液／メタノール＝７／３
流速：２．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２５４ｎｍ。【００８６】
（実施例１０）ラセミ体フェニルプロピオン酸アミドのＳ体選択的加水分解
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、ラセミ体フェニルプロピオン酸アミド１％、及び実施例１で得られた精製酵素溶液を添加し、３０℃で反応後、高速液体クロマトグラフィーで分析することにより変換率（％）、光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は３６．０％、（Ｓ）−フェニルプロピオン酸の光学純度は８９．１％ｅ．ｅ．であった。【００８７】
高速液体クロマトグラフィー分析条件
［変換率の分析］
カラム：ＹＭＣ−Ａ３０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝７／３
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−Ｈ（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：ヘキサン／イソプロパノール／ＴＦＡ＝９５／５／０．０２
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３０℃
測定波長：２５４ｎｍ。【００８８】
（実施例１１）ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）ＪＭＰ１３４株由来ｐｕｔａｔｉｖｅ  ａｍｉｄａｓｅをコードするＤＮＡによって形質転換した大腸菌の作製
実施例３で決定したカプリアビダス  エスピー（Cupriavidus sp.）ＫＮＫ−Ｊ９１５（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７３９）由来の本発明の塩基配列と高い配列同一性を示した、ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）ＪＭＰ１３４株由来ｐｕｔａｔｉｖｅ  ａｍｉｄａｓｅの塩基配列（配列表配列番号９）に基づき、開始コドン部分にＮｄｅＩ部位を付加したプライマー７（配列表配列番号１０）、及び終始コドンの直後にＳａｃＩ部位を付加したプライマー８（配列表配列番号１１）を合成した。プライマー２種（プライマー７及びプライマー８）各５０ｐｍｏｌ、ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）ＪＭＰ１３４株の染色体ＤＮＡ１０ｎｇ、ｄＮＴＰ各１０ｎｍｏｌ、ＥｘＴａｑ（宝酒造社製）２．５Ｕを含む ＥｘＴａｑ用緩衝液５０μｌを調製し、熱変性（９７℃、１分）、アニーリング（６０℃、１分）、伸長反応（７２℃、１．５分）を３０サイクル行い、４℃まで冷却後、アガロースゲル電気泳動により増幅ＤＮＡを確認した。上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＳａｃＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＲＥを構築した。構築した組換えベクターｐＮＲＥを用いて、E. coli HB101コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、E. coli HB101 (pNRE)を得た。【００８９】
（実施例１２）ラルストニア  ユートロファ（Ralstonia eutropha）ＪＭＰ１３４株由来ｐｕｔａｔｉｖｅ  ａｍｉｄａｓｅをコードするＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いたラセミ体Ｎ−ベンジルニペコタミドのＳ体選択的加水分解
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、ラセミ体Ｎ−ベンジルニペコタミド１％、及び実施例１１で得られたE. coli HB101 (pNRE)の培養液を添加し、３０℃で反応後、高速液体クロマトグラフィーで分析することにより変換率（％）、光学純度（％ｅ．ｅ．）を求めた結果、変換率は５０．１％、残存する（Ｒ）−Ｎ−ベンジルニペコタミドの光学純度は９９．４％ｅ．ｅ．であった。【００９０】
変換率（％）＝Ｐ／（Ｓ１＋Ｐ）×１００
（Ｐ：生成物量（ｍｏｌ）、Ｓ１：残存基質量（ｍｏｌ））
光学純度（％ｅ．ｅ．）＝（Ａ−Ｂ）／（Ａ＋Ｂ）×１００
（Ａは対象とする鏡像異性体量でＢは対応する鏡像異性体量）。【００９１】
高速液体クロマトグラフィー分析条件
［変換率の分析］
カラム：ＹＭＣ−Ａ３０３（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸水溶液（ｐＨ２．５）／アセトニトリル＝９／１
流速：１．０ｍｌ／分
カラム温度：３５℃
測定波長：２１０ｎｍ
［光学純度の分析］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＡＤ−ＲＨ（４．６ｍｍφ×１５０ｍｍ、ダイセル社製）
溶離液：２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）／アセトニトリル＝７／３
流速：０．５ｍｌ／分
カラム温度：室温
測定波長：２１０ｎｍ
【配列表】
2008120554000001.app
【国際調査報告】
2008120554.tif 000005
2008120554.tif 000006