(57)【要約】  標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応を用いて標的核酸配列を蛍光検出を利用して検出する手法、すなわちサイクリング・プローブ法に代表される手法によって、簡易な構成でありながら、標識となる蛍光強度の測定を高感度・高精度に実現することができる蛍光検出装置、マイクロチップ、及びそれらから構成される蛍光検出装置を提供することを目的とする。そのためには、標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応を用いて標的核酸配列を検出する蛍光検出装置であって、蛍光発光をさせるための励起光の光源部と励起により発生する蛍光の検出部とを有し、該励起光の発光スペクトルの極大発光波長より長波長側部分が該蛍光の発光スペクトルと少なくとも部分的に重なることを特徴とする蛍光検出装置とする。
2008090760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応を用いて標的核酸配列を検出する蛍光検出装置であって、蛍光発光をさせるための励起光の光源部と励起により発生する蛍光の検出部とを有し、該励起光の発光スペクトルの極大発光波長より長波長側部分が該蛍光の発光スペクトルと少なくとも部分的に重なることを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記蛍光の発光スペクトルの極大発光波長における前記励起光の強度が、該励起光の発光スペクトルの極大発光波長の強度に対し１／２以下であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記蛍光を受光する受光部を有し、該受光部に入射する蛍光の光路に前記励起光と前記蛍光を分離するための光学フィルタを備えていることを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記蛍光の発光スペクトルの極大発光波長において、前記光学フィルタの分光透過率が５０％以上であることを特徴とする請求の範囲第３項に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記励起光の発光スペクトルの極大発光波長が可視光領域内の波長であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第４項の何れか一項に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
励起光源が交換可能であることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第５項の何れか一項に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより、蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応を行うマイクロチップと、請求の範囲第１項乃至第６項の何れか一項に記載の蛍光検出装置とから構成されることを特徴とする検査システム。
【請求項８】
請求の範囲第７項に記載の検査システムに用いられるマイクロチップであって、マイクロチップ内の蛍光反応部上に設けられたカバー部材を有し、前記カバー部材は、前記励起光及び前記蛍光を透過する分光透過特性を有することを特徴とするマイクロチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出装置、マイクロチップ、及びそれらにより構成される検査システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
標的の核酸配列を効率よく検出する方法として、サイクリング・プローブ法が知られている。このサイクリング・プローブ法は、ＲＮＡとＤＮＡからなるキメラプローブとＲｎａｓｅＨの組み合わせによる高感度な検出法で、増幅中や増幅後の遺伝子断片の標的配列を効率良く検出することができる。【０００３】
プローブはＲＮＡ部分を挟んで一方が蛍光物質で、もう一方がその蛍光物質の発する蛍光を消光する物質（クエンチャー）で標識されている。このプローブは、インタクトな状態ではクエンチングにより強い蛍光を発することはないが、増幅産物中の相補的な配列とハイブリッドを形成した後にＲｎａｓｅＨによりＲＮＡ部分で切断されることにより、強い蛍光を発するようになる。この蛍光強度を測定することで、増幅産物量をモニターすることができる。プローブのＲＮＡ部分がミスマッチであればＲｎａｓｅＨにより切断されることはないので、一塩基の違いも認識できる非常に特異性の高い検出方法である。【０００４】
すなわち、サイクリング・プローブ法では、蛍光物質によりＤＮＡプローブの標識化がなされている。当該ＤＮＡプローブは、エネルギーのドナーとして機能する蛍光物質とエネルギーアクセプターとして機能するクエンチャーとが、通常状態では、対になって存在しており、励起光が照射されても蛍光物質から発せられた蛍光はクエンチャーにより吸収され、蛍光は発生しない。しかし、当該ＤＮＡプローブが標的遺伝子とハイブリダイゼーション反応を起こした状態では、蛍光物質とクエンチャーとの結合が切断され、蛍光物質の蛍光が外部に発せられるようになる。蛍光物質とクエンチャーとの結合が切断されると、当該ＤＮＡプローブは標的遺伝子から遊離する。そして、フリーになった標的遺伝子に通常状態のＤＮＡプローブが再びハイブリダイゼーション反応により結合する。このように、ハイブリダイゼーション反応が繰り返されることにより、クエンチャーの切断されたＤＮＡプローブが増幅され、強い蛍光強度が得られる。【０００５】
このサイクリング・プローブ法は、標的核酸配列に対して標識化された合成核酸プローブを用いる。プローブの内部には、配列特異的なＲＮＡ鎖を含んでおり、標的核酸の目的配列と結合したプローブのＲＮＡ部分が、ＲｎａｓｅＨにより切断される。切断前のプローブは、ＲＮＡを挟んだ一端側に標識用の蛍光物質が、もう一方に蛍光物質を消光するためクエンチャーで修飾されている。切断前の蛍光物質とクエンチャーは、隣接しておりＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｔ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ：蛍光共鳴エネルギー遷移現象）と呼ばれる共鳴による励起エネルギーの遷移が蛍光物質からクエンチャー物質に起こり、蛍光物質の蛍光発光が抑制される。プローブ切断後は、両物質が解離しＦＲＥＴを起こさなくなるため、蛍光物質の蛍光強度が増大する。【０００６】
サイクリング・プローブ法は、この様に作製した標識プローブと反応を利用し、標的核酸配列と標識化プローブとの結合反応（ハイブリダイゼーション：混成化）、プローブのＲＮＡ部分の切断、切断プローブの標的からの解離と蛍光発光、を繰り返すことにより標識用蛍光物質を効率良く生成することができる。また、標的核酸配列の増幅反応との組合せにより、指数関数的に蛍光発光を増幅することができる。【０００７】
上記原理的作用機構から分かるように、当該方法は、反応時間やプローブ濃度により、蛍光発光量をある程度制御・増幅することができるので、発光量を検出する際のＳ／Ｎ比を高めることができ、少量の検体試料で分析可能であるという長所を有する。従って、この特長を活かす分析手法の進展が期待されている。【０００８】
一方、近年、微細流路が集積加工されたマイクロチップ上において、複数の溶液を混合して反応させ、当該反応の状態を検出して分析を行うマイクロ総合分析システム（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；以下において、「μＴＡＳ」ともいう。）が注目されている。【０００９】
μＴＡＳでは、試料の量が少ない、反応時間が短い、廃棄物が少ない等のメリットがある。特に、医療分野に使用した場合、検体（血液、尿、拭い液等）の量を少なくすることで患者への負担を軽減でき、試薬の量を少なくすることで検査のコストを下げることができる。また、検体、試薬の量が少ないことから、反応時間が大幅に短縮され、検査の効率化が図れる。さらに、装置が小型であるため小さな医療機関にも設置することができ、場所を選ばず迅速に検査を行うことができる。【００１０】
マイクロチップ検査システムでは、マイクロポンプ等からマイクロチップに駆動液を供給することにより、マイクロチップ内に収容されている検体及び試薬が流路に沿って送液される。これにより、検体及び試薬は、流路内で混合され反応を生じる。反応液はマイクロチップ内の被検出部に送液され、被検出部において反応液内の標的物質の濃度等の検出が行われる。【００１１】
例えば、特許文献１には、微細流路が集積加工されたマイクロチップを用いる標的遺伝子の検出例が記載されている。ここで、マイクロチップの被検出部には、標的遺伝子をトラップする物質が予め固定化されている。【００１２】
先ず、標的遺伝子の増幅に用いる試薬と検体とを反応させて増幅産物を生成する。これにより、検体に標的遺伝子が含まれていれば、増幅産物内に増幅された標的遺伝子が存在することになる。次に、増幅された標的遺伝子を一本鎖に変性させる。これを被検出部に供給することで、被検出部に固定化されている標的遺伝子をトラップする物質に標的遺伝子をトラップさせる。【００１３】
次に、当該一本鎖の標的遺伝子にハイブリダイズするＤＮＡプローブを被検出部に供給し、ハイブリダイゼーション反応により標的遺伝子とＤＮＡプローブとを結合させる。ここでＤＮＡプローブは、予め蛍光標識されている。続いてトラップされた標的遺伝子に結合しているＤＮＡプローブに、結合する金コロイド液を被検出部に供給し、金コロイドをＤＮＡプローブに結合させる。次に、結合していない金コロイドを被検出部から除去するため、被検出部に洗浄液を供給する。そして、被検出部の金コロイドの濃度を光学的に検出することにより、標的遺伝子の検出を行っている。【００１４】
また、特許文献２には、マイクロチップ内の標的遺伝子の検出において、蛍光標識された標的遺伝子とＤＮＡプローブとがハイブリダイズした処理液に励起光を照射し、処理液から発せられる蛍光の蛍光強度を検出することが記載されている。【００１５】
また、特許文献３には、標的遺伝子の検出を高感度に行うことができる技術としてサイクリング・プローブ法が適用されるマイクロチップの検査装置が開示されている。【００１６】
ところで、これらの従来技術においては、励起光としてレーザが用いられている。良く知られているように、レーザは高い単色性から、励起光と蛍光との波長分離や微小エリアの高効率な励起に有利で、ひいては蛍光検出のＳ／Ｎ比向上の観点からは望ましい。【００１７】
しかしながら、レーザを励起光とした場合、レーザ光源の設置や取扱上、細心の注意が必要である。特に、蛍光物質の励起感度に良く合致した波長のレーザは限られ、ガスレーザなどで各種の発振波長を選定しようとすると装置の小型化が非常に困難でコストも高くなる。また、単色性が高いレーザでは、可干渉性に優れるため、マイクロチップを介した検出において、干渉ノイズの影響などもしばしば問題となる。発光効率を高めることができるサイクリング・プローブ法の検査装置であれば、Ｓ／Ｎ比は高くし易いので、レーザのように扱いにくい光源を用いる意義は低い。
【特許文献１】国際公開第２００５／１０８５７１号パンフレット
【特許文献２】特開２００１−２５５３２８号公報
【特許文献３】国際公開第２００１／０４１９３１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、上記問題等に鑑みてなされたものであり、その解決課題は、標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより、蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応を用いて、標的核酸配列を、蛍光検出を利用して検出する手法、すなわちサイクリング・プローブ法に代表される手法によって、簡易な構成でありながら、標識となる蛍光強度の測定を高感度・高精度に実現することができる蛍光検出装置、マイクロチップ、及びそれらから構成される検査システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明に係る上記課題は下記手段によって解決される。【００２０】
１．標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応を用いて標的核酸配列を検出する蛍光検出装置であって、蛍光発光をさせるための励起光の光源部と励起により発生する蛍光の検出部とを有し、該励起光の発光スペクトルの極大発光波長より長波長側部分が該蛍光の発光スペクトルと少なくとも部分的に重なることを特徴とする蛍光検出装置。【００２１】
２．前記蛍光の発光スペクトルの極大発光波長における前記励起光の強度が、該励起光の発光スペクトルの極大発光波長の強度に対し１／２以下であることを特徴とする前記１に記載の蛍光検出装置。【００２２】
３．前記蛍光を受光する受光部を有し、該受光部に入射する蛍光の光路に前記励起光と前記蛍光を分離するための光学フィルタを備えていることを特徴とする前記１又は２に記載の蛍光検出装置。【００２３】
４．前記蛍光の発光スペクトルの極大発光波長において、前記光学フィルタの分光透過率が５０％以上であることを特徴とする前記３に記載の蛍光検出装置。【００２４】
５．前記励起光の発光スペクトルの極大発光波長が可視光領域内の波長であることを特徴とする前記１〜４の何れか一項に記載の蛍光検出装置。【００２５】
６．励起光源が交換可能であることを特徴とする前記１〜５の何れか一項に記載の蛍光検出装置。【００２６】
７．標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより、蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応を行うマイクロチップと、前記１〜６の何れか一項に記載の蛍光検出装置とから構成されることを特徴とする検査システム。【００２７】
８．前記７に記載の検査システムに用いられるマイクロチップであって、マイクロチップ内の蛍光反応部上に設けられたカバー部材を有し、前記カバー部材は、前記励起光及び前記蛍光を透過する分光透過特性を有することを特徴とするマイクロチップ。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の上記手段により、標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより、蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応を用いて、標的核酸配列を蛍光検出を利用して検出する手法、すなわちサイクリング・プローブ法に代表される手法によって、簡易な構成でありながら、標識となる蛍光強度の測定を高感度・高精度に実現することができる蛍光検出装置、マイクロチップ、及びそれらから構成される検査システムを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の実施形態に係るバイオチップを用いる検査装置の外観図
【図２】本発明の実施形態に係るバイオチップを用いる検査装置の内部構成図
【図３】励起光と蛍光の重なり態様についての概念図
【図４】本発明に係るバイオチップの構成図
【符号の説明】
【００３０】
１  バイオチップ
４  光検出部
５  マイクロポンプ
２３  ヒータ
８０  検査装置
９０  ＣＰＵ
１１１  被検出部
１２０  検体収容部
１２４  ＤＮＡプローブ収容部
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の蛍光検出装置は、標的ＤＮＡと蛍光標識したプローブとのハイブリダイゼーションにより、蛍光共鳴エネルギー遷移現象に変化を生ずる反応を用いて標的核酸配列を検出する蛍光検出装置であって、蛍光発光をさせるための励起光の光源部と励起により発生する蛍光の検出部とを有し、該励起光の発光スペクトルの極大発光波長より長波長側部分が該蛍光の発光スペクトルとが少なくとも部分的に重なることを特徴とする。この特徴は、請求の範囲第１項乃至第８項に係る発明に共通する技術的特徴である。【００３２】
本願において、「励起光の発光スペクトルの極大発光波長より長波長側部分が該蛍光の発光スペクトルと少なくとも部分的に重なる」とは、励起光の発光スペクトルを構成する発光帯（「発光バンド」ともいう。）うち極大（最大）の発光強度の発光帯に帰属される極大発光波長の長波長側部分が、該励起光により励起された蛍光物質から発せられる蛍光の発光スペクトルの発光帯（発光バンド）と少なくとも部分的に重なることをいう。【００３３】
「マイクロチップ」とは、１枚の基板（チップ）上に数十〜数百ミクロンの微細流路（マイクロチャネル）を作製したものであって、当該チャネル内の小空間に混合、反応、分離、検出などの化学操作（分析システム）を集積化したものをいう。また、「検査システム」とは、ＤＮＡ，ＲＮＡなど核酸やタンパク質などのバイオ分子の混合、分離、合成、抽出などの化学操作と生化学反応を小型のチップ内で行い、さらにその反応結果を検出する装置と組み合わせて成るシステム（Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ：μ−ＴＡＳ）をいう。【００３４】
なお、「サイクリング・プローブ法」とは、［背景技術］の欄の冒頭において詳しく説明した核酸の標的配列等の検出方法をいう。【００３５】
以下、図面に基づいて本発明の実施形態、構成要素等について詳細な説明をするが、一例であり、本実施形態に限定するものではない。【００３６】
（検査システム）
本発明に係る検査システムは、後述する蛍光検出装置とマイクロチップにより構成される。この構成より、本発明に係る蛍光検出装置とマイクロチップを有効に活用する検査システムを構築することができる。【００３７】
以下では、当該検査システムにおいて用いられる蛍光物質とクエンチャーについて説明する。【００３８】
〈蛍光物質及びクエンチャー〉
蛍光物質は、特定の波長の励起光を吸収し、吸収したエネルギーを、非常に短時間で、吸収した波長とは異なる波長の光、いわゆる蛍光を発生じさせる物質である。この励起光の吸収から蛍光発生の過程では、熱放出によるエネルギー損失が起こるため、蛍光は、励起光に比べエネルギーが低い、つまり長波長側にシフトした波長となる（ストークス・シフト）。励起光波長及びストークス・シフト（及びそれに伴う蛍光波長）は、各種蛍光物質において特徴的な特性である。【００３９】
蛍光共鳴エネルギー遷移は、例えば、蛍光物質としての蛍光色素（Ｆ１）と色素（Ｆ２）（多くの場合蛍光色素）を互いに連結して相互作用している際に、Ｆ２の吸収波長がＦ１の蛍光波長と重複する場合に観察される。【００４０】
これは、第一の蛍光分子Ｆ１が波長λ１の光によって励起されたのちＦ１は、波長λ１＋ｓ１の光を蛍光として放射する。このときのｓ１は、Ｆ１のストークスシフト量である。第２の蛍光分子Ｆ２として、その吸収波長の広がりがλ１＋ｓ１と重複すれば、この光を吸収することができる。このように、Ｆ２は、λ１＋ｓ１によって励起され、続いて波長λ２＋ｓ２を放射する。【００４１】
この場合、励起光λ１で励起されないように第２の蛍光色素を選択することで、連結している場合には、λ１の励起でλ２＋ｓ２の蛍光が観察され、連結が切れた場合には、λ１の励起で、λ１＋ｓ１の蛍光が観察される。このような蛍光の遷移現象は統計的で、エネルギー遷移の効率は、ｒ−６に比例するといわれている。ｒは、２つの蛍光分子間の平均間隔を示す。【００４２】
本発明に使用できる、蛍光色素としては、フルオレセイン類、ローダミン類、クマリン類、ダンシル型（ジメチルアミノナフタレンスルホン酸型）蛍光色素、ＮＢＤ型色素、ピレン、ＢＯＤＩＰＹ誘導体、サイ（ｃｙ）色素，マラカイトグリーンなどが上げられ、特許文献などで例示されている蛍光色素としては、例えば米国特許第５４８６６１６号明細書、特開平２−１９１６７４号公報、同５−２８７２０９号公報、同５−２８７２６６号公報、同８−４７４００号公報、同９−１２７１１５号公報、同７−１４５１４８号公報、同６−２２２０５９号公報に記載される蛍光色素、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，５，２３１ページ（１９９５年）に記載される蛍光色素などを用いることができ、また、特開平２−１９１６７４号公報等に記載されている蛍光色素などを用いることが出来る。【００４３】
好ましい色素の組み合わせとしては、当業者が容易に組み合わせることが出来るもの（例えばインビトロジェン社、アプライドバイオシステムズ社、ロシュ社などのホームページ参照。）をあげることができ、好ましくはフルオレセインとカルボキシローダミンの組み合わせなどを挙げられる。【００４４】
Ｆ２に使用できる色素としては、蛍光をしていなくてもよく、例えば、ダビシル、特表２００３−５１６６１６記載のｅｃｌｉｐｓｅ（ｅｐｏｃｈ社商標）、米国特許７０１９１２９記載のＢｌａｃｋＨａｌｌＱｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＱＨ一般にダーククエンチャーＢｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社商標）、米国特許２００６０１７７８５７記載のＢｌａｃｃｂｅｒｒｙＱｕｅｎｃｈｅｒ（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社商標）などを使用することが出来る。【００４５】
≪蛍光検出装置（検査装置）の構成≫
〈外部構成〉
図１は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の外観図である。検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体と試薬とを自動的に反応させ、反応結果を自動的に出力する装置である。【００４６】
検査装置８０の筐体８２には、マイクロチップ１を装置内部に挿入するための挿入口８３、表示部８４、メモリカードスロット８５、プリント出力口８６、操作パネル８７、外部入出力端子８８が設けられている。【００４７】
検査担当者は、図１の矢印方向にマイクロチップ１を挿入し、操作パネル８７を操作して検査を開始させる。【００４８】
開始操作に伴って、後述するように、検査装置８０内にあるマイクロチップ１内では蛍光反応が開始され、蛍光の検出結果に基づく検査結果が表示部８４に表示される。【００４９】
検査結果は操作パネル８７の操作により、プリント出力口８６よりプリントを出力したり、メモリカードスロット８５に挿入されたメモリカードに記憶したりすることができる。また、外部入出力端子８８からケーブルを介して、パソコンなどに検査結果を転送し保存することができる。検査終了後、検査担当者はマイクロチップ１を挿入口８３から取り出す。【００５０】
〈内部構成〉
図２は、本実施形態に係るマイクロチップを用いる検査装置８０の内部構成図である。図２においては、マイクロチップが図１に示す挿入口８３から挿入され、セットが完了している状態を示している。【００５１】
検査装置８０は、マイクロチップ１に予め注入された検体及び試薬を送液するための駆動液１１を貯留する駆動液タンク１０、マイクロチップ１に駆動液１１を供給するためのマイクロポンプ５、マイクロポンプ５とマイクロチップ１とを駆動液１１が漏れないように接続するパッキン６、マイクロチップ１の必要部分を温調する温度調節ユニット３、マイクロチップ１を温度調節ユニット３及びパッキン６に密着させ、保持させるためのチップ押圧板２、チップ押圧板２を昇降させるための押圧板駆動部２１、マイクロチップ１をマイクロポンプ５に対して正確に位置決めする規制部材２２、マイクロチップ１内の検体と試薬との反応状態等を検出する光検出部４、等を備えている。【００５２】
《チップ押圧板》
チップ押圧板２は、初期状態においては、図２に示す位置より上方に退避している。これにより、マイクロチップ１は矢印Ｘ方向に挿抜可能であり、検査担当者は挿入口８３（図１参照）から規制部材２２に当接するまでマイクロチップ１を挿入する。【００５３】
その後、チップ押圧板２は、押圧板駆動部２１により下降してマイクロチップ１に当接し、マイクロチップ１の下面が温度調節ユニット３及びパッキン６に密着される。これにより、マイクロチップ１のセットが完了する。【００５４】
規制部材２２、押圧板２、温度調節ユニット３及びパッキン６等で本発明のマイクロチップ収容部が構成される。また、チップ押圧板２の内部には、セットされたマイクロチップ１の被検出部１２５，１２６（図４参照）を加熱するためのヒータ２３が設けられている。【００５５】
《温度調節ユニット》
温度調節ユニット３は、マイクロチップ１と対向する面にペルチェ素子３１及びヒータ２３を備え、マイクロチップ１が検査装置８０にセットされたときに、ペルチェ素子３１及びヒータ２３がマイクロチップ１に密着するようになっている。試薬が収容されている部分をペルチェ素子３１で冷却して試薬が変性しないようにしたり、検体と試薬とが反応する部分をヒータ２３で加熱して反応を促進させたりする。【００５６】
《光検出部》
光検出部４は、本発明の発光部としてのＬＥＤ等の励起光源４１、励起光源４１から発せられた励起光の波長帯域を制限する励起光フィルタ４２、励起光フィルタ４２を透過した励起光をマイクロチップ１の２つの被検出部１２５，１２６（図４参照）をカバーするサイズに適合したビームスポットに整形するための集光レンズ４３、集光レンズ４３を透過した励起光を反射してマイクロチップ１の２つの被検出部１２５，１２６に照射するとともに当該励起光により発せられたマイクロチップ１の被検出部１２５，１２６からの蛍光を透過するダイクロイック・ミラー４４、ダイクロイック・ミラー４４を透過した蛍光を受光部の４７に導光するための受光レンズ４５、受光レンズ４５を透過した蛍光の波長帯域を制限する検出光フィルタ４６、検出光フィルタ４６を透過した蛍光を受光するフォトダイオード４７からなる受光部等から構成されている。【００５７】
次に、本発明に係る光検出部（蛍光検出光学系）の構成要素、好ましい条件等について説明する（図３を参照）。【００５８】
１）励起光源：
ここでは、特に好ましい例として、ピーク発光波長４７０ｎｍ（青）の青色発光ダイオードを用いたものを例示するが、測定対象の蛍光物質の吸光スペクトルのピーク波長に適合した励起光源を選ぶことが好ましい。ピーク発光波長が、３６５ｎｍ（近紫外光）、４７０ｎｍ（青）、５３０ｎｍ（緑）などの発光ダイオードを使用することができる。【００５９】
なお、光源としては白色発光ダイオードを用いて励起光フィルタ４２により励起波長を適宜選択しても良い。【００６０】
また、ＬＥＤに限らず、ピーク発光波長が４１０ｎｍ（青紫）などのレーザダイオード（ＬＤ）も使用しても構わない。その他、従来用いられていたガスレーザとは異なる取扱が容易な各種光源を用いることができる。【００６１】
本発明においては、励起光源の発光スペクトルにおけるピーク発光波長より長波長側部分が、蛍光の発光スペクトルＦと重なることを要する。具体的には、励起光源である青色発光ダイオード４１の発光スペクトル４１１におけるピーク発光波長（４７０ｎｍ）より長波長側部分４１２が、蛍光の発光スペクトルＦと重なっている。【００６２】
また、蛍光のピーク発光波長（極大発光波長）における、励起光の強度は励起光のピーク発光波長における強度の１／２以下（発光スペクトルの裾野部分）であることが好ましい。具体的には、蛍光Ｆのピーク発光波長（５２０ｎｍ）における、青色発光ダイオードの強度はピーク発光波長（４７０ｎｍ）における強度の１／２以下（発光スペクトルの裾野部分）であることが好ましい。【００６３】
このようにすることで、ガスレーザより発光波長領域が広い励起光源、例えば発光ダイオードを用いて、サイクリング・プローブ法のメリットを活かした小型で簡便なマイクロチップの蛍光検出装置を実現することができる。また、発光ダイオードを用いれば、通電後短時間に光量の安定化が図れるため、電源起動後短時間で検査が開始できる。【００６４】
なお、本発明においては、励起光のピーク発光波長が可視光領域（凡そ３６０〜８３０ｎｍ）内の波長であることが好ましい。受光素子の分光特性の制約を受けにくいため、利用できる受光素子の選択肢が多くなるからである。【００６５】
２）励起光フィルタ４２：
上述のように、発光波長領域が広い励起光源を用いることで様々なメリットがあるが、その場合に、今度は、発光スペクトル４１１の裾野部分からの励起光がマイクロチップ上で反射したり、光路内で散乱したりして受光部４７に入射すると、蛍光検出のＳ／Ｎが悪くなるという問題がある。そのため、本発明の蛍光検出装置においては、励起光の帯域を制限する励起光フィルタ４２を備えていることが好ましい。【００６６】
なお、励起光フィルタ４２としては、干渉フィルタや色ガラスフィルターなどの光学的なフィルタを使用することができる。【００６７】
３）ダイクロイック・ミラー４４：
励起光フィルタ４２を介した励起光の帯域の光を反射してマイクロチップ１の被検出部１１１に照射する一方で、励起光により発せられたマイクロチップ１からの蛍光を透過する様に設計した色分離ミラーである。なお、励起光を反射する際に、蛍光のスペクトルＦとは重ならない波長のみを反射させるようにすることで、励起光フィルタを省略することもできる。【００６８】
４）検出光（発光）フィルタ４６：
励起光による散乱光やマイクロチップ１自身や光路中の周辺部材からの自家発光を除去し、測定対象である試料の目的波長の蛍光成分を分離透過させるための光学フィルタであり、干渉フィルタや色ガラスフィルターなどを使用することができる。
なお図3に示す符号４６１は、受光部に入射する蛍光の光路に設置した光学フィルタの分光透過率を示したものである。当該光学フィルタは、図2の実施形態においては、検出光フィルタ４６とダイクロイック・ミラー４４から構成される。つまり図3に示す分光透過率４６１は、検出光フィルタ４６及びダイクロイック・ミラー４４、の分光透過率を掛け合わせた特性となる。当該光学フィルタの分光透過率４６１は、検査対象の蛍光の発光スペクトルＦのピーク波長に対しては５０％以上、より好ましくは７０％以上であることを要する。このような光学フィルタを設けることにより、Ｓ／Ｎ比即ち検出の分解能を一層向上させた精度良い蛍光検出をすることができる。【００６９】
５）フォトダイオードＰＤ４７：
蛍光光量測定用のフォトダイオードであり、図示しない受光アンプに接続されている。なお、蛍光が微弱な場合には、アバランシェ型フォトダイオードや光電子増倍管等の光電変換素子を使用することが好ましい。【００７０】
６）集光レンズ４３／受光レンズ４５：
マイクロチップ１の２つの被検出部１２５，１２６をカバーするサイズに合わせ、励起用光源のビームスポットを整形し効率良く照射するための励起光学系の集光レンズ４３、測定対象から発せられる蛍光を高効率で受光素子に導くための受光レンズ４５が設けられている。【００７１】
７）発光ダイオードドライバー（ＬＥＤドライバー）：
励起光源である発光ダイオード４１へ電力を供給し、また検出時にはＯＮ、未使用時にＯＦＦ、アイドリング時に弱点灯させるなど点灯状態を制御する。ＬＥＤドライバーは定電流制御により安定したＤＣ点灯をさせるほか、パルス点灯させることにより受光部で同期検出する事でノイズ抑制したり、さらに、発光ダイオードを点滅制御させるためのクロックを参照信号として、受光部のフォトダイオード４７の受光信号を図示しないロックインアンプで処理することで、ノイズに埋もれた微量蛍光を信号として取り出すこともできる。【００７２】
《マイクロポンプ》
マイクロポンプ５は、ポンプ室５２、ポンプ室５２の容積を変化させる圧電素子５１、ポンプ室５２のマイクロチップ１側に位置する第１絞り流路５３、ポンプ室の駆動液タンク１０側に位置する第２絞り流路５４、等から構成されている。第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４は絞られた狭い流路となっており、また、第１絞り流路５３は第２絞り流路５４よりも長い流路となっている。【００７３】
駆動液１１を順方向（マイクロチップ１に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を急激に減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第１絞り流路５３の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を緩やかに増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなり、ポンプ室５２内には第２絞り流路５４の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が順方向に送液されることになる。【００７４】
一方、駆動液１１を逆方向（駆動液タンク１０に向かう方向）に送液する場合には、まず、ポンプ室５２の容積を緩やかに減少させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて長さが短いので、第２絞り流路５４の方が第１絞り流路５３と比べて流路抵抗が小さくなる。これにより、ポンプ室５２内の駆動液１１は、第２絞り流路５４の方に支配的に押し出され送液される。次に、ポンプ室５２の容積を急激に増加させるように圧電素子５１を駆動する。そうすると、ポンプ室５２内の容積増加に伴って駆動液１１が第１絞り流路５３及び第２絞り流路５４から流れ込む。このとき、短い絞り流路である第２絞り流路５４において乱流が発生し、第２絞り流路５４における流路抵抗が長い絞り流路である第１絞り流路５３に比べて相対的に大きくなる。これにより、ポンプ室５２内には第１絞り流路５３の方から支配的に駆動液１１が流入する。以上の動作を圧電素子５１が繰り返すことにより、駆動液１１が逆方向に送液されることになる。【００７５】
（マイクロチップの構成）
図４は、本実施形態に係るマイクロチップ１の構成図である。一例の構成を示すものであり、これに限定されない。【００７６】
図４（ａ）において矢印は、検査装置８０にマイクロチップ１を挿入する挿入方向であり、図４（ａ）は挿入時にマイクロチップ１の下面となる面を図示している。また、２つの被検出部１２５，１２６部に示した円は励起光のビームスポットを示す。図４（ｂ）はマイクロチップ１の側面図である。【００７７】
図４（ｂ）に示すように、マイクロチップ１は溝形成基板１０８と、溝形成基板１０８を覆う被覆基板１０９から構成されている。【００７８】
溝形成基板１０８には、図４（ｃ）に示すように、検体と試薬とをマイクロチップ１上で混合・反応させるための微細流路及び流路エレメントが配設されている。図４（ｃ）では、微細流路を矢印で、流路エレメントを四角形で模式的に示している。【００７９】
マイクロチップ１上には、以下の流路エレメントが設けられている。【００８０】
駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅは、マイクロポンプから駆動液１１を注入するための注入部である。【００８１】
検体注入部１１３は、マイクロチップ１に検体を注入するための注入部である。【００８２】
駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅの下流には、それぞれ、検体を収容する検体収容部１２０、標的遺伝子のポジティブコントロール用試薬収容部１２１、ネガティブコントロール用試薬収容部１２２、標的遺伝子を増幅するための酵素及び基質の収容部１２３、プライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブの収容部１２４が設けられている。【００８３】
なお、標的遺伝子及びその増幅産物は、本発明に係る標的分子に相当する。ＤＮＡプローブは、本発明に係る標的ＤＮＡとハイブリダイゼーション反応を起こす蛍光標識したプローブに相当する。ポジティブコントロール用試薬は、標的遺伝子として特定したいＤＮＡ配列を持つ試薬である。【００８４】
標的遺伝子を増幅させるための試薬、ポジティブコントロール用試薬、ネガティブコントロール用試薬、プライマー及びＤＮＡプローブは、各収容部に予め収容されている。【００８５】
ポジティブコントロール用試薬とネガティブコントロール用試薬は、検査が正常に行われたか否かをモニタリングするための試薬である。【００８６】
これらの各収容部は、マイクロチップ１を検査装置８０にセットした際にペルチェ素子３１に対向し、収容されている検体や試薬が変性しないように冷却される。【００８７】
検体収容部１２０及びポジティブコントロール収容部１２１の下流には、標的遺伝子とポジティブコントロール用試薬を増幅させるための試薬とが反応して増幅産物を生成するための反応部１２５が設けられている。【００８８】
また、ネガティブコントロール収容部１２２及び検体収容部１２０の下流には、標的遺伝子を増幅させるための試薬とが反応して増幅産物生成するための反応部１２６が設けられている。この反応部１２５、１２６は、被検出部を兼ねる。【００８９】
反応部１２５、１２６は、マイクロチップ１を検査装置８０にセットした際にヒータ２３に対向し、増幅促進のために過熱される。【００９０】
反応部１２５、１２６には、１２３及び１２４の収納部からからの流路が合流し、増幅用試薬やプローブが同時もしくは、遂次供給される。【００９１】
これら試薬の反応により、標的遺伝子の増幅と、増幅産物と蛍光プローブのハイブリダイゼーション反応及び蛍光物質とクエンチャーとの遊離反応も同時進行させ、増幅から蛍光物質生成までの反応を一括して進行させる。【００９２】
被検出部１２５，１２６の窓にあたる被覆基板１０９は、光学的な検出を行うことができるよう、透明なガラスや樹脂等の材料から構成されている。【００９３】
検体及び各試薬の流れについて説明する。まず、マイクロチップ１による検査を行うに先立って、検査担当者は検体を検体注入部１１３から注射器等を用いて注入する。検体注入部１１３から注入された検体は、連通する微細流路を通って検体収容部１２０に収容される。【００９４】
次に、検体の注入されたマイクロチップ１は、検査担当者により図１に示す検査装置８０の挿入口８３に挿入され、図２に示すようにセットされる。これにより、マイクロポンプ５を駆動して駆動液注入部１１０ａ〜１１０ｅから駆動液１１を注入することが可能となる。【００９５】
駆動液注入部１１０ａから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通って検体収容部１２０に収容されている検体が押し出され、被検出部１２５に検体が送り込まれる。【００９６】
駆動液注入部１１０ｃから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通ってネガティブコントロール収容部１２２に収容されているネガティブコントロール用試薬（例えば純水）が押し出され、反応部（被検出部）１２６にネガティブコントロール用試薬が送り込まれ、先に送液された検体と混合する。【００９７】
駆動液注入部１１０ｂから駆動液１１を注入すると、連通する微細流路を通ってポジティブコントロール収容部１２１に収容されているポジティブコントロール用試薬（標的と同一のＤＮＡ配列箇所を持つ試薬）が押し出され、反応部（被検出部）１２５にポジティブコントロールが送り込まれ、先に送液された検体と混合する。【００９８】
駆動液注入部１１０ｄと１１０ｅから駆動液１１を注入し、連通する微細流路を通って収容部１２３、１２４から、標的遺伝子を増幅するための酵素及び基質とプライマー及び蛍光標識されたＤＮＡプローブが、反応部（被検出部）１２５、１２６にそれぞれ送りこまれ、先に送液された検体・コントロール液の混合液と混合する。【００９９】
その後、反応部（被検出部）１２５，１２６をヒータ２３により加熱することでそれぞれの被検出部において標的遺伝子（及びポジティブコントロールＤＮＡ）の増幅と、増幅産物と蛍光プローブのハイブリダイゼーション反応及び蛍光物質とクエンチャーとの遊離反応も同時進行させ、増幅から蛍光物質生成までの反応を一括して進行させる。【０１００】
そして、被検出部１２５、１２６に光検出部４の励起光源４１から励起光を照射し、被検出部１２５、１２６から発せられる蛍光を受光部４７で受光することにより光検出を行うことが可能となる。【０１０１】
なお、被検出部１２５、１２６の検出結果を基に、検査の総合判定を行うルールの一例を次に記載する（表１参照。）。【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
ポジティブコントロール用試薬は、その試薬単独でも、標的遺伝子と同等の増幅反応と蛍光プローブとのハイブリダイゼーション反応及び蛍光物質の生成反応を起こす。ネガティブコントロール用試薬は、その試薬単独では、蛍光物質の生成反応を起こさない。【０１０４】
これらの試薬を検体と混合した液で反応と検出を行うことで、検査結果の良否の判定が可能となる。【０１０５】
陽性すなわち検体に標的遺伝子が含まれる場合、ポジティブコントロール用試薬＋検体、及びネガティブコントロール用試薬＋検体のいずれも蛍光発光が測定される。【０１０６】
陰性すなわち検体に標的遺伝子が含まれない場合、ポジティブコントロール用試薬＋検体は、ポジティブコントロール用試薬の反応による蛍光発光が測定されるが、ネガティブコントロール用試薬＋検体は、反応が生じず蛍光が発光しない。これら２つのケースは、正常な反応を行った検査結果として扱うことができる。【０１０７】
一方、例えば、検体に反応の阻害物質が混入した場合などは、ポジティブコントロール用試薬＋検体及びネガティブコントロール用試＋検体のいずれも蛍光発光が生じない。【０１０８】
また、ポジティブコントロール用試薬＋検体の蛍光発光無し、ネガティブコントロール用試＋検体の蛍光発光は有りの様な検査結果が得られる場合は、チップに収容した試薬の失活などの異常が考えられる。これら２つのケースは、異常な反応を行った検査結果として、再検査を促すことが可能となる。【０１０９】
なお、バイオチップ内での反応制御等について補足説明をする。【０１１０】
１）チップ内でＤＮＡ増幅や標的ＤＮＡと蛍光物質で修飾された標識プローブとの反応を制御・促進させる。【０１１１】
２）チップに設けた微細流路に、予め反応試薬を導入しておき、マイクロポンプによる送液制御で、所定の手順・時間・タイミングで、混合・分岐などの化学操作が自動的に進行する様に制御される。【０１１２】
３）反応を促進させたり、制御するために、試薬や混合試薬を温調する機構を設ける。また、装置に搭載したヒータなどの温調機構により、チップを介して温度制御する。【０１１３】
４）チップ上の反応検出部は、標的ＤＮＡを検出するエリアの他に、試薬や反応の正常／異常、反応阻害物質の混入などを試験するためのインターナルコントロールの反応を併設する方が、確度を高めるために好ましい。【０１１４】
５）この様に、インターナルコントロールなど複数の反応を同時に検出するために、蛍光検出部を走査してチップ上の各検出部を測定できる様な構成にする。【０１１５】
６）なお、当該チップは、励起光を透過する分光透過特性を持つカバー部材（図４における被覆基板１０９、特に被検出部の窓部）を蛍光発光部の上面に有していることが好ましい。また、当該カバー部材は蛍光をも透過する分光透過特性を持っていることが好ましい。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【国際調査報告】
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