(57)【要約】本発明は、骨形成能を促進し得る機能性水、及びその用途を提供する。本発明の骨形成促進用の機能性水は、水素を含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素を含むことを特徴とする骨形成促進用の機能性水。
【請求項２】
含有水素量が０．３５０ｐｐｍ以上である請求項１記載の機能性水。
【請求項３】
酸化還元電位が−３００ｍＶ以下である請求項１又は２記載の機能性水。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含有する飲料。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含有する食料。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含有する飼料。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含む医薬組成物。
【請求項８】
骨粗鬆症を予防及び／又は治療するための請求項７記載の組成物。
【請求項９】
炎症性疾患による骨形成抑制症状を予防及び／又は治療するための請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含む、骨形成用細胞及び／又は組織の培地。
【請求項１１】
請求項１０記載の培地中で骨形成用細胞及び／又は組織を培養することを特徴とする、前記細胞及び／又は組織の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性を有する機能性水、特に骨形成促進作用を有する機能性水、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化社会の進行に伴い、糖尿病、高血圧、骨粗鬆症などの生活習慣病といわれる疾患が多くなってきている。その中でも、骨粗鬆症やそれに伴う骨折頻度の増加は深刻な社会問題となっている。骨粗鬆症は骨組織における単位体積あたりの骨量が骨塩と骨基質の比率を保ったまま減少した症候群であり、この骨量減少は生理的老化による減少よりも著明である。
骨粗鬆症をはじめとする女性の加齢及び老年性疾患の原因は、更年期における女性ホルモンの急激な減少に由来する。治療法として、女性ホルモン補充療法が用いられているが、内因性のエストロゲンは、その作用が強力であり、副作用も数多く報告されている。従って、それに代わる安全でかつ安価な骨粗鬆症の治療薬及び予防薬が求められている。
ところで、骨粗鬆症及び炎症性疾患においては、骨形成が抑制されることが知られている。これは、生体内の活性酸素による骨芽細胞の骨形成能に対する機能抑制が関与しているためと考えられている。生体内の活性酸素は、各種代謝系を通じて生成されることが知られている。また、炎症性の疾患部位においては、免疫細胞のマクロファージ等により活性酸素が生成され、外来異物を攻撃する細胞障害作用の手段として用いられている。
近年、高濃度の水素溶存水に活性酸素を除去する作用があることが報告されている。このような水素溶存水の用途については、薬理機能性として、水酸化ストレス性疾患及び自己免疫疾患（特に関節リウマチ）の予防及び治療、並びに老化防止に用いることが知られているが（特開２００５−１２６３８４号公報）、骨形成の促進については不明である。
【発明の開示】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、骨芽細胞の骨形成を促進し得る機能性水、及びその用途を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、水素を含む機能性水（すなわち水素溶存水）が、骨芽細胞様細胞の骨結節形成能をより高めることができること、及び一旦抑制され又は低下した骨結節形成能を回復できること、さらには骨粗鬆症モデル動物において該疾患の治療及び予防に効果を示すことを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）水素を含むことを特徴とする骨形成促進用の機能性水。
本発明の機能性水は、例えば、含有水素量を０．３５０ｐｐｍ以上とすることができ、酸化還元電位を−３００ｍＶ以下とすることができる。
（２）上記（１）記載の機能性水を含有する飲料。
（３）上記（１）記載の機能性水を含有する食料。
（４）上記（１）記載の機能性水を含有する飼料。
（５）上記（１）記載の機能性水を含む医薬組成物。
本発明の医薬組成物としては、例えば、骨粗鬆症を予防及び／又は治療するための組成物、並びに、炎症性疾患による骨形成抑制症状を予防及び／又は治療するための組成物を挙げることができる。
（６）上記（１）記載の機能性水若しくは上記（５）記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、骨粗鬆症の予防及び／又は治療方法。
（７）上記（１）記載の機能性水若しくは上記（５）記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及び／又は治療方法。
（８）骨粗鬆症の予防及び／又は治療用の上記（１）記載の機能性水。
（９）炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及び／又は治療用の上記（１）記載の機能性水。
（１０）骨粗鬆症を予防及び／又は治療するための医薬の製造のための上記（１）記載の機能性水の使用。
（１１）炎症性疾患による骨形成抑制症状を予防及び／又は治療するための医薬の製造のための上記（１）記載の機能性水の使用。
（１２）上記（１）記載の機能性水を含む、骨形成用細胞及び／又は組織の培地。
（１３）上記（１２）記載の培地中で骨形成用細胞及び／又は組織を培養することを特徴とする、前記細胞及び／又は組織の培養方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１の各培養系の操作手順を示す概略図である。
図２は、マウス骨芽細胞様細胞培養株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のカルシウム沈着に対する水素溶存水及び活性酸素（過酸化水素水）の影響を示すグラフである。
図３は、低Ｃａ食による卵巣摘出骨粗鬆症モデルラットの大腿骨のＸ線像を表す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願２００６−２１９８０１号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
１．本発明の概要
本発明者は、活性酸素により骨芽細胞の骨形成（以下、骨結節形成とも言う）の機能が抑制されることについて、その抑制効果を確認するため、骨芽細胞に対して過酸化水素による活性酸素刺激を行い、骨結節形成能の変化を観察した。その結果、骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ、骨シアロタンパク質及びＩ型コラーゲン等の遺伝子発現レベルが低下し、骨結節形成能が抑制される又は低下することが確認された。
次いで、本発明者は、水素溶存水を用いた骨芽細胞の各種培養実験を行った。
その結果、水素溶存水を含む培地中で骨芽細胞を培養した場合、水素溶存水を含まない系に比べて骨芽細胞の骨結節形成能を有意に高めることができた。また、培養前に、一旦、骨芽細胞を過酸化水素水で処理して骨結節形成能を抑制又は低下させた後、水素溶存水を含む培地で培養した場合は、水素溶存水を含まない系に比べて骨結節形成能を有意に回復することができた。さらに、培養前に骨芽細胞を過酸化水素水で処理する際に、併せて水素溶存水も加えておいた場合、水素溶存水を加えない系に比べて骨結節形成能の抑制又は低下を抑えることができた。なお、当業者においては、骨芽細胞様細胞に関する影響をみることと、骨芽細胞に関する影響をみることとは実質的に同一である。
また本発明者は、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験として、動物の卵巣を摘出することにより骨粗鬆症モデル動物を作製し、このモデル動物に飲料水として水素溶存水を与えた結果、水素溶存水を与えなかった動物に比べて、骨粗鬆症の症状を効果的に予防又は治療することができた。
以上の知見に基づき、本発明者は、水素溶存水が骨形成の促進に有効に用い得る機能性水となること、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて水素溶存水が骨芽細胞の骨結節形成能を有意に高めることができること、及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいては水素溶存水が骨粗鬆症の症状を有効に予防又は治療し得ることを見出し、本発明を完成した。
２．骨形成促進用の機能性水
本発明の機能性水は、水素を含むものであり、水素溶存水として使用するものである。ここで「水素溶存水」とは、原水に水素が溶解している水溶液を意味する。「原水」とは、水道水、精製水、蒸留水、天然水、活性炭処理水、イオン交換水、純水、超純水など、公知のすべての水を意味する。また、溶解している水素は、分子状水素であってもよいし原子状水素であってもよく、限定はされない。なお、原水が既に水素を含んだものである場合は、そのまま水素溶存水として用いることができる。
本発明の機能性水の含有水素量は、特に限定はされず、本発明の機能性水の用途や保存形態などに応じて任意に設定することができる。そのため、含有水素量は、常温常圧下（例えば２５℃，１気圧下）で溶存可能な量には限定されず、飽和濃度を超える量であってもよいし、様々な圧力及び温度条件下で溶存可能な範囲の量であってもよい。また、上記含有水素量は、例えば、０．３５０ｐｐｍ以上の範囲であることが好ましく、より好ましくは０．４５０ｐｐｍ以上の範囲である。上記含有水素量は、例えば、０．３５０〜１．５０ｐｐｍ、０．３５０〜１．３３ｐｐｍ、０．３５０〜１．００ｐｐｍ、０．３５０〜０．５００ｐｐｍ、又は０．３５０〜０．４５０ｐｐｍの範囲であってもよい。含有水素量が上記範囲である場合、本発明の機能性水による骨形成促進作用が効果的に発揮される。
本発明の機能性水の酸化還元電位は、特に限定はされず、上記含有水素量と同様に、任意に設定することができるが、例えば−３００ｍＶ以下の範囲であることが好ましく、より好ましくは−３５０ｍＶ以下の範囲である。また、上記酸化還元電位は、例えば、−３００〜−７５０ｍＶ、−３００〜−７００ｍＶ、−３００〜−６５０ｍＶ、−３００〜−６０５ｍＶ、又は−３５０〜−６０５ｍＶの範囲であってもよい。酸化還元電位が上記範囲である場合、本発明の機能性水による骨形成促進作用が効果的に発揮される。
本発明の機能性水は、上述のように原水に水素が溶解しているものであればよく、その他の溶液物性については限定はされない。例えば、水素溶存水は、酸性、中性及びアルカリ性のいずれであるかは、特に限定されない。
本発明の機能性水の製造方法は、限定はされず、原水に水素を溶解させることができる公知のすべての方法を適用することができ、例えば原水に水素ガスをバブリングする方法等により製造することができる。
本発明の機能性水は、水素以外に他の成分を含むことができる。他の成分としては、例えば、各種ビタミン類、アミノ酸及び還元剤等が好ましく挙げられる。
上記他の成分の含有割合は、限定はされず、水素を含有させたことによる骨形成促進作用が損なわれない範囲で、適宜設定することができる。
本発明の機能性水は、骨形成を促進するために極めて有用なものである。具体的には、本発明の機能性水は、ヒト又は非ヒト動物の骨芽細胞及び骨芽細胞様細胞、及び／又はこれら細胞を含む生体組織又は組織片の骨形成能を促進するために極めて有用なものである。ここで、「骨形成能を促進する」とは、骨形成能をさらに向上させること、及び／又は一旦抑制され若しくは低下した骨形成能の全部又は一部を回復させることを意味する。
３．飲料、食料及び飼料
本発明の飲料、食料及び飼料は、いずれも、上述した本発明の機能性水を含むことを特徴とするものである。
本発明の飲料、食料及び飼料において、本発明の機能性水の含有割合は、限定はされず、飲料、食料又は飼料の種類及び状態等に応じて、適宜設定することができる。但し、溶存した水素が保管中に消失しないようにするため、密封パック等に保存することが好ましい。また、本発明の飲料、食料及び飼料は、本発明の機能性水以外に、必要に応じ適宜他の成分を含むことができる。
本発明の飲料としては、例えば、野菜ジュース、果物ジュース、乳飲料、乳性飲料、お茶、清涼飲料、スープ、アルコール飲料、炭酸飲料、ミネラルウォーター等の水、コーヒー、豆乳、滋養強壮ドリンク及びその他の各種飲料が挙げられる。
本発明の食料及び飼料は、その形態は限定されず、流動状のもの、ゲル状のもの及び各種レトルト加工されたものなど、一般に水分を含み得る状態で食料及び飼料として取り扱われている公知のものが全て例示できる。
本発明の食料としては、例えば、ヨーグルト、クリーム、味噌、水餡、プリン、ゼリー、ジャム、アイスクリーム、シャーベット、マヨネーズ、ドレッシング、シチュー、パスタソース及びその他の各種食料が挙げられる。
本発明の飼料としては、例えば、家畜用の餌、ペットフード及びその他飼料等が挙げられる。家畜用の餌としては、例えば、牛、豚、馬及び鳥等の餌が挙げられる。ペットフードとしては、例えば、犬、猫及び鳥等のペットフードが挙げられる。
４．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、前述した本発明の機能性水を含むことを特徴とするものである。本発明の機能性水は、前述した通り、骨形成促進作用に優れたものである。そのため、当該医薬組成物は、骨粗鬆症を予防及び／又は治療するため、あるいは、炎症性疾患による骨形成抑制の症状を予防及び／又は治療するために好ましく使用することができる。
本発明においては、当該医薬組成物は、本発明の機能性水のみからなるものであってもよいし、本発明の機能性水以外に他の成分を含むものであってもよい。他の成分としては、当該医薬組成物の用法（使用形態）に応じて必要とされる製薬上の各種成分（薬学的に許容し得る各種担体等）が挙げられる。他の成分は、本発明の機能性水により発揮される効果が損なわれない範囲で適宜含有することができる。
本発明の医薬組成物中、有効成分である本発明の機能性水の配合割合は、限定はされず、骨形成促進作用、具体的には骨芽細胞の骨形成能の向上作用あるいは一旦抑制され若しくは低下した骨形成能の回復作用を効果的に発揮することができるように、適宜設定することができる。また、使用する本発明の機能性水の含有水素量は、前記２．（１）の項で述べた範囲内であることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、ヒト又は非ヒト哺乳動物に対し、種々の投与経路、具体的には、経口又は非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与）で投与することができる。従って、医薬組成物として本発明の機能性水を単独で用いることも可能であるが、投与経路に応じて慣用される方法により薬学的に許容し得る担体を用いて適当な剤形に製剤化することができる。
好ましい剤形としては、液状である本発明の機能性水を含有しうる剤形であれば限定はされず、経口剤では、例えば、シロップ剤及びカプセル剤等が好ましく挙げられ、非経口剤では、例えば、注射剤（点滴剤を含む）等が好ましく挙げられる。注射剤として使用する場合は、水素を生理食塩水に溶解させることが好ましい。
これら製剤の製剤化に用い得る担体としては、例えば、通常用いられる賦形剤、着色剤、及び矯味矯臭剤のほか、必要に応じ、安定化剤、乳化剤、吸収促進剤、界面活性剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、抗酸化剤、増量剤、湿潤化剤、表面活性化剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、及び無痛化剤等が挙げられ、医薬品製剤の原料として用いることができる公知の成分を配合して、常法により製剤化することが可能である。
本発明の医薬組成物に使用可能な無毒性の成分としては、例えば、大豆油、牛脂、及び合成グリセライド等の動植物油；流動パラフィン、スクワラン、及び固形パラフィン等の炭化水素；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ひまし油、及びポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー等の界面活性剤；ヒドロキシエチルセルロース、ポリアクリル酸、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びメチルセルロース等の水溶性高分子；エタノール、及びイソプロパノール等の低級アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ソルビトール、及びポリエチレングリコール等の多価アルコール（ポリオール）；グルコース、及びショ糖等の糖；塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム等の無機塩；精製水等が挙げられ、いずれもその塩またはその水和物であってもよい。
本発明の医薬組成物を非経口投与（例えば注射投与）する場合、その有効な投与量は、例えば、症状の程度、年齢、性別、体重、投与形態、塩の種類、及び疾患の具体的な種類等に応じて異なり、限定はされないが、例えば、成人の場合は体重６０ｋｇの人で１日あたり２００〜１，０００ｍｌを、それぞれ１回で又は複数回に分けて投与することができる。
本発明の医薬組成物を経口投与する場合、その投与形態及び有効な投与量は、投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、及び医師の判断等に左右されるものであり、限定はされないが、例えば、成人の場合は体重６０ｋｇの人で１日あたり３００〜３，０００ｍｌ、好ましくは５００〜３，０００ｍｌを、それぞれ１回で又は複数回に分けて投与することができる。投与経路の効率が異なることを考慮すれば、必要とされる投与量は適宜広範に設定することができる。
本発明の医薬組成物の骨形成促進作用の確認方法は、特に限定はされない。
また本発明は、当該医薬組成物を患者に投与する、すなわち前述した本発明の機能性水（骨形成促進用の機能性水）を患者に投与することを含む、骨粗鬆症の予防及び／又は治療方法、ならびに炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及び／又は治療方法を含むものである。さらに本発明は、骨粗鬆症の予防及び／又は治療用の、あるいは炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及び／又は治療用の、骨形成促進用の機能性水を含むものである。さらに本発明は、骨粗鬆症を予防及び／又は治療するための、あるいは炎症性疾患による骨形成抑制症状を予防及び／又は治療するための医薬組成物の製造のための、骨形成促進用の機能性水の使用を含むものである。
５．骨形成用細胞等の培養
本発明の骨形成用細胞及び／又は組織の培地は、前述した本発明の機能性水を含むことを特徴とするものである。
本発明の培地の種類は、限定はされず、公知の各種液体培地が好ましく例示できるが、水分を含有しうるものであれば公知の各種固形培地であってもよい。
骨形成用細胞及び／又は組織の種類は、限定はされず、ヒト又は非ヒト動物の骨芽細胞及び骨芽細胞様細胞など、ならびにこれら細胞を含む生体組織又は組織片が挙げられる。
本発明の培地中、本発明の機能性水の含有割合は、限定はされず、培養する骨形成用細胞及び／又は組織の骨形成能の向上作用あるいは一旦抑制され若しくは低下した骨形成能の回復作用を効果的に発揮することができるように、適宜設定することができる。また、使用する本発明の機能性水の含有水素量は、前記２．（１）の項で述べた範囲内であることが好ましい。
本発明の培地は、本発明の機能性水以外に他の成分を含むことができ、例えば、培養する骨形成用細胞及び／又は組織の種類等に応じ、培地成分として通常必要とされる公知の成分を含むことができる。
また本発明は、上記本発明の培地中で骨形成用細胞及び／又は組織を培養することを特徴とする、骨形成用細胞及び／又は組織の培養方法も含む。当該培養方法において、各種培養手順及び条件等（培養温度及び培養時間等）は、培養する骨形成用細胞及び／又は組織の種類等に応じ、常法に従い適宜設定することができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０００６】
マウス骨芽細胞様細胞培養株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１のカルシウム沈着（骨結節形成）に対する、水素溶存水及び過酸化水素水（活性酸素）の影響を調べるため、以下の手順で実験を行った。
１．試料細胞の調製（図１（ｉ）を参照）
マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を、７５ｃｍ２組織培養フラスコを用いて、３７℃、９５％Ａｉｒ及び５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中で培養した。培養液には、１０％ＦＢＳ、及び抗生物質（ゲンタマイシン、アンフォテリシン、ペニシリン）を含むα−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を用い、培養液は週３回交換した。細胞の継代は、コンフルエントになる前にトリプシンにて播きかえて行った。
２．前処理（図１（ｉｉ）を参照）
上記１．で得られた培養細胞を３つの系に分けて、マルチウェルプレートの各ウェルに適宜移し、それぞれの系に対して下記（２−１）、（２−２）又は（２−３）の処理を行った。
（２−１）純水（ＭＱ）による処理
上記１．で用いた培養液中、溶媒成分として、ミリポアー純水装置で得られたＭＱを用いた培養液を調製し、この培養液に交換して上記１．の培養細胞を培養した。培養は、３７℃、９５％Ａｉｒ及び５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中で、３時間行った。
（２−２）Ｈ２Ｏ２水による処理
上記（２−１）で調製した培養液に、終末濃度４００μＭ  Ｈ２Ｏ２となるようにＨ２Ｏ２水を添加した培養液を調製し、この培養液に交換して上記１．の培養細胞を培養した。培養条件は、上記（２−１）と同様にして行った。この処理によって、培養細胞に対して活性酸素により３時間刺激したこととなる。
（２−３）Ｈ２Ｏ２水と水素溶存水との混合液による処理
上記（２−１）で調製した培養液において、ＭＱの代わりにＭＱに水素を溶存させた水素溶存水（含有水素量：０．３５０〜０．４５０ｐｐｍ，酸化還元電位：−３００〜−６０５ｍＶ）を用いた培養液を調製した。次いで、得られた培養液に、終末濃度４００μＭ  Ｈ２Ｏ２となるようにＨ２Ｏ２水を添加した培養液を調製し、この培養液に交換して上記１．の培養細胞を培養した。培養条件は、上記（２−１）と同様にして行った。この処理によって、水素溶存水により直接的に活性酸素の消去を行ったことになる。
３．培養（図１（ｉｉｉ）を参照）
上記２．で行った３種の前処理後の培養細胞を、別のマルチウェルプレートの各ウェルに適宜移し、それぞれの系について、ＭＱを用いた培養と、水素溶存水を用いた培養とを行った。各培養の詳細を下記（３−１）及び（３−２）に示す。合計６種の培養系を図１（ｉｉｉ）に示す通り（Ａ）〜（Ｆ）とした。また、培養系（Ａ）〜（Ｆ）のそれぞれについて、７、１４、２１及び３０日間の４種の培養期間で培養を行った。
（３−１）ＭＱを用いた培養
上記２．（２−１）で調製した培養液に交換して培養を行った。なお、培養系（Ａ）については、培養液の種類に変更は無いが、他の系と同様に培養液の交換を行った。
培養は、培養は、３７℃、９５％Ａｉｒ及び５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター中で行い、培養液は週３回交換した。
（３−２）水素溶存水を用いた培養
上記２．（２−３）で調製した水素溶存水を用いた培養液（Ｈ２Ｏ２は含まない）に交換して培養を行った。培養条件は、上記（３−１）と同様にして行った。
４．カルシウム濃度の測定
Ｓｉｇｍａ  ＃５８７カルシウム測定キットを用いて、各培養系（Ａ）〜（Ｆ）の培養後のカルシウム濃度（ｍｇ／ｄｌ）を定量的に測定した。カルシウム濃度が高いほど、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞株のカルシウム沈着が大きいことを示し、骨結節形成能が高いことを意味する。
具体的には、培養後の各細胞は、上清を取り除きＰＢＳにて２回洗浄した後、０．５Ｍ  ＨＣｌを加えて１時間室温にて放置して、採取した。次いで、前記キットを用い、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍでの吸光度測定を行った。その結果を図２に示す。なお、カルシウム濃度の算出は、以下の式に従って行った。
Ｃａ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｍｇ／ｄｌ）
＝〔Ｓａｍｐｌｅ  ＯＤ／Ｃａ２＋  ｓｔａｎｄａｒｄ  ＯＤ〕×ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ｍｇ／ｄｌ）
５．考察
図２のグラフに示す結果より、水素溶存水を含む培地中で培養した場合（（Ｂ），（Ｄ），（Ｆ））は、水素溶存水を含まない系（（Ｂ），（Ｄ），（Ｆ）に対し順に（Ａ），（Ｃ），（Ｅ））に比べて細胞の骨結節形成能が有意に高いことが確認された。特に、培養系（Ａ）と（Ｂ）とでは有意差が顕著であった。
また、培養前に、一旦、細胞をＨ２Ｏ２で処理して骨結節形成能を抑制又は低下させた後（（Ｃ），（Ｄ））、水素溶存水を含む培地で培養した場合（（Ｄ））は、水素溶存水を含まない系（（Ｃ））に比べて骨結節形成能を有意に回復できることが確認された。
さらに、培養前にＨ２Ｏ２で処理する際に、併せて水素溶存水も加えておいた場合（（Ｅ），（Ｆ））は、水素溶存水を加えない系（（Ｃ），（Ｄ））に比べて骨結節形成能の抑制又は低下が抑えられることが確認された。
【実施例２】
【０００７】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける水素含有水の骨量減少に対する抑制作用を明らかにする目的で、卵巣摘出骨粗鬆症モデルラットを用いて、体重、子宮重量、骨密度及び血清の骨代謝マーカーを測定し、水素含有水の骨代謝に対する作用について検討した。
１．実験動物
実験動物は、６週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系雌ラット（静岡実験動物）を１週間予備飼育した後、実験に用いた。１群６匹の計６群に分け、そのうち４群は常法に従い背部より両側卵巣摘出術（ＯＶＸ）を施し、骨粗鬆症モデルラットの群（ＯＶＸ群）とした。残りの２群は、ＯＶＸ群に対する対照として、偽手術（ｓｈａｍ）を施した群（ｓｈａｍ群）とした。２週間の予備飼育をした後、９週齢より、与える飼料の違いによって、正常Ｃａ飼料（１．１２％Ｃａ含有の粉末飼料ＭＰ（登録商標），オリエンタル酵母工業（以下同様））群と、低Ｃａ飼料（０．０５％Ｃａ含有の粉末飼料，オリエンタル酵母工業（以下同様））群とに分け、ＯＶＸラットには飲料水として蒸留水又は水素含有水（含有水素量：約１．３３ｐｐｍ，酸化還元電位：約−７００ｍＶ）を自由飲水させた。動物の飼育は、室温２３±１℃、湿度６０±１０％、１２時間ごとの明暗サイクルの環境下で行った。
２．実験材料
水素含有水は、蒸留水に水素ガスを飽和させて作製した（含有水素量：約１．３３ｐｐｍ，酸化還元電位：約−７００ｍＶ）。この水素含有水を１日２回（朝晩１回ずつ）新しく入れ替えて、ラットに自由飲水させた。なお、水素含有水の含有水素量（溶存水素濃度）は、ポータブル溶存水素計（東亜ディケーケー株式会社）を用いて測定した。
３．実験方法
動物は、ペントバルビタールナトリウム（ネンブタール（登録商標），大日本製薬）を２５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内投与して全身麻酔し、手術野を電気バリカンで剃毛した後、希ヨードチンキ液で消毒した。その後、常法に従って、動物の背部から卵巣を摘出した。
動物は、１群６匹として６群用意し、第１〜３群の動物は正常Ｃａ飼料で飼育し、第４〜６群の動物は低Ｃａ飼料で飼育した。そして、第１群は偽手術をし蒸留水を与えた群（ｓｈａｍ−Ｃａ群）、第２群はＯＶＸで蒸留水を与えた群（ＯＶＸ−Ｃａ群）、第３群はＯＶＸで水素含有水を与えた群（ＯＶＸ−Ｃａ−Ｈｙ群）、第４群は偽手術をし蒸留水を与えた群（ｓｈａｍ−ＬＣａ群）、第５群はＯＶＸで蒸留水を与えた群（ＯＶＸ−ＬＣａ群）、第６群はＯＶＸで水素含有水を与えた群（ＯＶＸ−ＬＣａ−Ｈｙ群）とした。以上、第１〜６群の詳細について、下記の表１にまとめた。
実験期間は、約９ヵ月間とし、実験期間中は、動物の一般状態を毎日観察し、週１回、体重、飼料摂取量及び摂水量を測定した。ただし、飲料水の水素含有水は１日２回（朝晩１回ずつ）新しく入れ替えた。
【表１】
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４．軟Ｘ線及び骨密度測定
歯科用デンタルＸ線によるＫｏｄａｋ社製の超高感度のＵｌｔｒａ  Ｓｐｅｅｄ（７５ｍｍ×５５ｍｍ）のＸ線フィルムを用い、右大腿骨を画像処理した。その結果を図３に示す。
５．軟Ｘ線及び骨密度測定の結果
軟Ｘ線画像（図３）に基づいて、海綿骨の骨梁変化を形態学的に検討した結果、正常Ｃａ飼料及び低Ｃａ飼料を与えた動物は、いずれも、ｓｈａｍ群に比べてＯＶＸ群の方が、有意に骨量低下傾向が認められた。また、低Ｃａ飼料を与えた動物においては、ＯＶＸ−ＬＣａ群に比べてＯＶＸ−ＬＣａ−Ｈｙ群の方が、骨量の増加が認められた。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明によれば、骨形成促進作用、すなわち骨形成能の亢進及び回復作用に優れた機能性水を提供することができる。
また本発明の機能性水は、飲料、食料、飼料、骨形成用細胞及び／又は組織培養用培地、並びに医薬組成物等の各種用途に用いることができ、さらに、骨粗鬆症の予防及び／又は治療方法、並びに炎症性疾患による骨形成抑制症状の予防及び／又は治療方法に用いることができるため、極めて有用性が高いものであると言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年6月11日(2008.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水素を含むことを特徴とする骨形成促進用の機能性水。
【請求項２】
含有水素量が０．３５０ｐｐｍ以上である請求項１記載の機能性水。
【請求項３】
酸化還元電位が−３００ｍＶ以下である請求項１又は２記載の機能性水。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含有する飲料。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含有する食料。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含有する飼料。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含む医薬組成物。
【請求項８】
骨粗鬆症を予防及び／又は治療するための請求項７記載の組成物。
【請求項９】
炎症性疾患による骨形成抑制症状を予防及び／又は治療するための請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の機能性水を含む、骨形成用細胞及び／又は組織の培地。
【請求項１１】
請求項１０記載の培地中で骨形成用細胞及び／又は組織を培養することを特徴とする、前記細胞及び／又は組織の培養方法。
【請求項１２】
酸化還元電位が−３００〜−６５０ｍＶである水素溶存水を含むことを特徴とする、骨粗鬆症の予防及び／又は治療用医薬組成物。
【国際調査報告】
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