(57)【要約】  本発明は、選択結合性物質がその表面に固定された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入された分析用チップであって、該微粒子表面が界面活性剤でコーティングされた分析用チップである。本発明により、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を阻害する気泡の発生を抑えてデータのばらつき、感度低下を抑え、測定の再現性を高めることができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入された分析用チップであって、該微粒子表面に界面活性剤がコーティングされている分析用チップ。
【請求項２】
微粒子の表面にコーティングされている界面活性剤が陰イオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤である、請求項１に記載の分析用チップ。
【請求項３】
前記基板が、その表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化された基板である、請求項１又は２に記載の分析用チップ。
【請求項４】
界面活性剤がコーティングされている微粒子が、その材質としてセラミックを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項５】
前記カバー部材が、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項６】
前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離が、微粒子の直径未満である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分析用チップ。
【請求項７】
前記選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析用チップ
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の分析用チップに被検物質を含む溶液を接触させて前記基板表面に固定化された選択結合性物質に該被検物質を選択的に結合させ、分析用チップ上に該選択結合性物質を介して結合した該被検物質量を測定する、被検物質の分析方法。
【請求項９】
前記の被検物質を含む溶液を該分析用チップに接触させる前に、被検物質を含む溶液を脱気処理する、請求項８に記載の被検物質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択結合性物質、すなわち被検物質と選択的に結合する物質を固定化した基板を備えた分析用チップ、及び当該分析用チップを用いた被検物質の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分析用チップは、遺伝子、タンパク質、脂質、糖などの選択結合性物質が固定化された基板を有し、この基板上の選択結合性物質被検物質を通常溶液として反応させて、反応結果から被検物質の存在の有無、状態又は量などを分析するために用いられる。この基板としては、一般にガラス製、金属製、樹脂製のものが用いられる。【０００３】
分析用チップの一態様として、数百〜数万という多数の遺伝子発現を同時に測定することを目的として、基板上にＤＮＡなどの分子を高密度に配置した分析用チップであって、マイクロアレイと呼ばれるものがある。マイクロアレイを使用することによって、各種疾患動物モデルや細胞生物学現象における体系的かつ網羅的な遺伝子発現解析を行うことができる。具体的には、遺伝子の機能、すなわち遺伝子がコードするタンパク質を明らかにするとともに、タンパク質が発現する時期や作用する場所を特定することが可能になる。生物の細胞又は組織レベルでの遺伝子発現の変動をマイクロアレイによって解析し、生理学的、細胞生物学的、生化学的事象データと組み合わせて遺伝子発現プロファイルデータベースを構築することによって、疾患遺伝子、治療関連遺伝子の検索や治療方法の探索が可能になると思われる。【０００４】
現在、分析用チップの作製は、主に２つの基本的な方法、すなわちＧｅｎｅＣｈｉｐ法及びｃＤＮＡ分析用チップ法が採用されている。【０００５】
ＧｅｎｅＣｈｉｐ法はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社によって開発された方法で、フォトリソグラフ法によりガラス板上で２５マー（ｍｅｒ）程度のオリゴＤＮＡを合成し、１つの遺伝子あたり、塩基配列データから１６カ所から２０カ所の２５マーを設定し、２５マーの完全一致と１３塩基目を意図的に違えた１塩基ミスマッチのオリゴマーセットを組にしてプローブＤＮＡとする。この方法は、プローブＤＮＡの長さが一定であり、配列が既知なため、ハイブリダイゼーションの強さに影響をあたえるＧＣ含量を一定にすることができるので、発現量の定量的解析には理想的な分析用チップと考えられている。一方、ｃＤＮＡ分析用チップ法は、Ｓｔａｎｆｏｒｄ大学によって開発された方法で、キャピラリー状のペンによるスポッティング方式や、インクジェット方式などの手法により、ガラス板にＤＮＡを固定するものである。いずれの方法によって作製された分析用チップも、あらかじめ蛍光標識した測定する試料（遺伝子）を、分析用チップ上のプローブＤＮＡとハイブリダイゼーションにより結合させ、スキャナーを用いてその蛍光強度を測定することにより、遺伝子の発現を測定するものである。【０００６】
分析用チップデータの解析の１つとして、階層的クラスタリングがある。これは発現パターンの類似した遺伝子を集めて系統樹を作製することができる方法であり、多数の遺伝子の発現レベルが色で模式的に表示されうる。このようなクラスタリングによって、ある疾患に関連する遺伝子を識別することができる。【０００７】
分析用チップは、ＤＮＡ等の核酸だけでなく、タンパク質や糖類などの検査、解析手段としても利用されるようになってきた。とりわけ、プロテイン分析用チップでは、抗体、抗原、酵素基質などのタンパク質が基板上に固定される。【０００８】
分析用チップの使用時は、調製した被験物質を含む溶液を、分析用チップ上の選択結合性物質が固定化された領域全体に均等に拡がるようにアプライすることが重要である。このための工夫として、分析用チップ内部に、被験物質を含む溶液を攪拌するための微粒子を備えた分析用チップが知られている。【０００９】
特許文献１には、被験物質ＤＮＡ溶液にあらかじめ微粒子を添加した微粒子分散溶液を分析用チップにアプライして、カバーガラスを被せ、シール剤により密閉し、カバーガラス、分析用チップ基板及びシール剤により規定される密閉された空隙を形成するような分析用チップが開示されている。この分析用チップは、微粒子の運動を利用して撹拌を行いながら、被験物質溶液が蒸発することなくハイブリダイゼーションを行うことができる。【００１０】
また、特許文献２には、分析用チップ基板に凹凸を設け、凸部上端面に選択結合性物質を固定化し、凹部に攪拌用微粒子を移動可能に格納して、反応液の攪拌を行うことができる分析用チップが開示されている。この分析用チップは、微粒子が凸部上端面と接触することがないため、選択結合性物質を傷つけずに微粒子による攪拌を行うことができる。【００１１】
しかし、このように微粒子を用いて攪拌を行う分析用チップにおいては、被験物質を含む液体をアプライする際に分析用チップ基板内部の表面又は微粒子表面に気泡が残留したり、反応液中に気泡が発生したりすることがある。生じた気泡が障害となって、気泡が滞留した部分において選択結合性物質と被験物質との反応が阻害されるという問題があった。また、気泡の滞留した部分とそれ以外の部分とで反応むらが生じるため、分析用チップ上で検出感度のばらつき又は検出感度の低下を生じるという問題があった。【００１２】
また、分析用チップ基板とカバーの間の空隙に攪拌用の微粒子を格納又は注入する際、静電気の発生等により、空隙内への微粒子の注入操作が困難となったり、十分量の微粒子を注入できなかったりすることがあった。さらに、注入された微粒子が凝集して動かなくなることがあり、このような状態でカバーと基板に囲まれた空隙に被験物質溶液を注入した場合、微粒子が凝集した箇所に溶液が染み渡らないために気泡が混入する結果となり、反応むらが生じることがあるという問題があった。
【特許文献１】特許第３５５７４１９号公報
【特許文献２】国際公開第２００５／０９０９９７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、前記課題を解決するものであり、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的反応を阻害する気泡の発生を抑え、反応むらによる検出感度のばらつきや検出感度の低下を抑える分析用チップを提供するものである。また、攪拌用微粒子の凝集を防ぎ、また分析用チップ基板とそのカバーとの間の空隙への攪拌用微粒子の注入が容易な分析用チップを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、攪拌用の微粒子の表面に界面活性剤をコーティングすることにより、上記課題を解決することができることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１５】
すなわち、本発明は、選択結合性物質が表面に固定化された基板と、該基板と接着されたカバー部材とを備え、該基板と該カバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入された分析用チップであって、該微粒子表面に界面活性剤がコーティングされている分析用チップである。【００１６】
本発明の分析用チップの好ましい一態様は、微粒子の表面にコーティングされている界面活性剤が陰イオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤である。【００１７】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、基板が、その表面に凹部及び凸部からなる凹凸部を有し、該凸部の上端面に選択結合性物質が固定化された基板である。【００１８】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、界面活性剤がコーティングされている微粒子が、その材質としてセラミックを含むものである。【００１９】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、カバー部材が、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものである。【００２０】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離が、微粒子の直径未満である。【００２１】
また、本発明の分析用チップの好ましい一態様は、選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質である。【００２２】
また、本発明は、本発明の分析用チップに被検物質を含む溶液を接触させて前記基板表面に固定化された選択結合性物質に該被検物質を選択的に結合させ、分析用チップ上に該選択結合性物質を介して結合した該被検物質量を測定する、被検物質の分析方法である。【００２３】
本発明の被検物質の分析方法の好ましい一態様は、被検物質を含む溶液を分析用チップに接触させる前に、被検物質を含む溶液を脱気処理する分析方法である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の分析用チップによれば、分析用チップ内部の反応液中での気泡の残留や発生が抑えられる。この結果、気泡が選択結合性物質と被験物質との反応を阻害して反応むらによる検出感度のばらつきや検出感度の低下が抑制され、被検物質を高い感度で検出することができる。【００２５】
また、本発明の分析用チップにより、微粒子の凝集を防ぎ、また分析用チップ基板とカバー部材との間の空隙に容易かつスムーズに微粒子を注入することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板の一例を概略的に示す断面図である。
【図２】図２は、図１の基板の使用により、基板表面に気泡が発生した例を概略的に示す断面図である。
【図３】図３は、本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板の一例を概略的に示す斜視図である。
【図４】図４は、図３の本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板の一例を概略的に示す断面図である。
【図５】図５は、本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板を用いた反応の結果を読み取る治具及びスキャナーの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図６】図６は、本発明の分析用チップにおける貫通孔及び液面駐止用チャンバーの一例を示す斜視図である。
【図７】図７は、本発明の分析用チップの一例を概略的に示す断面図である。
【図８】図８は、本発明の分析用チップの一例を概略的に示す断面図である。
【図９】図９は、本発明の分析用チップの一例を概略的に示す断面図である。
【図１０】図１０は、仕切り構造を有する本発明の分析用チップの一例を概略的に示す斜視図である。
【図１１】図１１は、仕切り構造を有する本発明の分析用チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１２】図１２は、本発明の分析用チップの凹凸部、カバー部材及び微粒子の好ましい関係の一例を概略的に示す縦断面図である。
【符号の説明】
【００２７】
１  基板
２  微粒子
３Ａ  カバー部材凸部
３、３Ｂ  カバー部材
１０  凹部
１１  凸部
１２  選択結合性物質が固定化された領域（凹凸部）
１３  平坦部
１４  基板凸部
２６  発生した気泡の例
３０、３０Ｃ  接着部材
３０Ａ、３０Ｂ  仕切り構造の接着部材
３１  空隙又は空間
３２  貫通孔
３３  液面駐止用チャンバー
３４  封止部材（テープ）
３５  基板とカバー部材との間隙
４０  マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
４１  治具
４２  治具突き当て面
４３  対物レンズ
４４  レーザー励起光
４５  基板に固定化された選択結合性物質
Ｌ１  凸部ピッチ
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の分析用チップは、選択結合性物質がその表面に固定された基板と、該基板と接着されたカバー部材との間に空隙を有し、該空隙に微粒子が移動可能に格納又は注入された分析用チップであって、該微粒子の表面に界面活性剤がコーティングされていることを特徴とする。界面活性剤によるコーティングとは、微粒子の表面の一部又は全部に、界面活性剤を塗布、付着又は被覆することを意味し、このコーティングは、例えば後述する方法によって行うことができる。【００２９】
本発明の微粒子を格納した分析用チップの一例を図１に示す。図１に示す例において、基板１の表面は、凹部１０及び凸部１１からなる凹凸部により構成されている。凹部１０に微粒子２が格納されており、凸部１１の上面には、選択結合性物質４５（例えば核酸）が固定化されている。【００３０】
この基板１に固定化された選択結合性物質４５（例えば核酸）と反応させるために、分析用チップに被験物質を含む溶液を加えると、微粒子２の表面に付着した微小気泡が液体中に遊離し、図２に示すように気泡２６となって凸部を覆うため、覆われた凸部表面上の選択結合性物質は被験物質と反応できない。本発明の分析用チップにおいては、微粒子２の表面に界面活性剤がコーティングされていることにより、微粒子表面に気泡が付着しない又は付着しにくいので、気泡の発生を抑制することができる。これにより、基板１表面の全ての選択結合性物質４５が被験物質と反応することが可能となり、得られるデータの信頼性と再現性とを上昇させることができる。【００３１】
微粒子表面を界面活性剤でコーティングする方法としては、微粒子を、界面活性剤を含む溶液に浸漬したのちに取り出して乾燥させる方法、微粒子表面に界面活性剤を含む溶液を噴霧したのちに乾燥させる方法、微粒子を界面活性剤の溶液を含んだ物質に触れさせる方法、微粒子を液体に触れさせた後、粉末状の界面活性剤をまぶして付着させる方法など、公知の方法を用いることができる。また、微粒子表面にこれらの方法により界面活性剤を噴霧、付着等によりコーティングした後、余剰の界面活性剤を水や有機溶媒で洗浄したものを使用することもできる。これらの方法で用いる界面活性剤を含む溶液の濃度は、０．０１％〜１０％が好ましく、０．０５％〜２％の濃度がより好ましく用いられる。【００３２】
微粒子の表面処理に使用する界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤が挙げられ、これらの中でも陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤が好ましく用いられる。【００３３】
陰イオン界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリルサルコシンナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、ラウロイルサルコシンナトリウムなどが挙げられる。【００３４】
陽イオン界面活性剤としては、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、エチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウムなどが挙げられる。【００３５】
両性界面活性剤としては、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳ）、ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ  ３−１２  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）などが挙げられる。【００３６】
非イオン界面活性剤としては、ジメチルデシルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１０）、ドデシルジメチルホスフィンオキシド（ＡＰＯ−１２）、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＢＲＩＪ−３５）、ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（ＢＲＩＪ−５８）、ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレイン酸エステル（ポリソルベート８０、Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウリン酸エステル（ポリソルベート２０、Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニルエーテル（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１１４、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−１０）、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−９）、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＭＥＧＡ−８）、ノニルフェニル−ポリエチレングリコール（ＮＰ−４０）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、モノステアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸ソルビタン、モノステアリン酸プロピレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）などが挙げられる。【００３７】
これらの中でも、陰イオン界面活性剤としては、界面活性効果が強力であることからドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウムが特に好ましく用いられ、非イオン界面活性剤としては、プルロニックＦ６８、プルロニックＦ１２７が特に好ましく用いられる。【００３８】
微粒子の形状は、被験物質溶液を攪拌することができれば特に限定されず、球状の形状以外に、多角形でも良く、円筒形、角柱形などのマイクロロッド状（微細な棒状）など任意の形状とすることができる。【００３９】
微粒子のサイズも特に限定されないが、微粒子の直径が、前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離未満であることが好ましい。例えば球状の微粒子の場合、０．１μｍ〜３００μｍの範囲とすることができる。微粒子が円筒形の微粒子の場合は、その底面直径を微粒子の直径と見なして、底面直径が前記基板の選択結合性物質固定化面とカバー部材との間隔の最短距離未満であることが好ましい。例えば、円筒形の微粒子の場合、長さ５０μｍ〜５０００μｍ、底面直径１０μｍ〜３００μｍの範囲とすることができる。【００４０】
微粒子の材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金、白金、ステンレス、鉄、酸化アルミ（アルミナ）、酸化チタン（チタニア）等の金属若しくは金属酸化物、ナイロンやポリスチレン等のプラスチックを用いることができる。【００４１】
また、界面活性剤がコーティングされる微粒子の表面は、適度な粗さを有していることが好ましい。即ち、微粒子の表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）が４０ｎｍ以上３００ｎｍ以下であることが好ましい。この範囲の表面粗さを有する微粒子を使用することで、ビーズの表面積がより大きいためにより多くの界面活性剤を微粒子表面にコーティングすることが可能となる。セラミックス製微粒子の場合、材質の強度を考慮すると、Ｒａ値が４０ｎｍ以上２００ｎｍ以下であることが好ましい。【００４２】
本発明の分析用チップを構成する基板は、その表面に、凹部及び選択結合性物質を固定化する凸部からなる凹凸部を有することが好ましい。このような構造をとることにより、検出の際、非特異的に吸着した被検物質を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。ノイズが小さくなる具体的な理由は、以下の通りである。すなわち、凸部上面に選択結合性物質を固定化した基板をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、凹凸部の凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した被検物質の望まざる蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果があるためである。【００４３】
凹凸部の凸部の高さに関しては、それぞれの凸部上面の高さが略同一であることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した被検物質とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的には、高さが略同一とは、高さの差が５０μｍ以下であることをいう。高さの差は３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本発明でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍより大きいと、高さのずれた凸部上面でのレーザー光がぼやけてしまい、この凸部上面に固定化された選択結合性物質と反応した被検物質からのシグナル強度が弱くなる場合があるため好ましくない。【００４４】
本発明の分析用チップを構成する基板において、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化される領域は、該基板の表面であり、上述のような粗面化がなされていない領域であれば、特に限定されないが、具体的には、上述した凹凸部のうち凸部の上面（上端面）であることが好ましい。選択結合性物質の固定化は、予めなされるものであっても良いし、固定化しないで基板のみを用意しておき、被検物質の分析の際に所望の被検物質に応じた選択結合性物質を適宜選択し固定することもできる。【００４５】
凸部の上面に固定化できる選択結合性物質（例えば核酸）は、データとして必要なものを適宜選択することができるが、単なるダミーの選択結合性物質であっても良い。また、すべての凸部上面に選択結合性物質を結合する必要は無く、何も固定化していない凸部上面を有していても良い。【００４６】
本発明の分析用チップを構成する基板において、凸部上面に選択結合性物質が固定化される場合、当該凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。凸部の上面の面積が略同一であることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。【００４７】
選択結合性物質が固定化された凸部の上面の面積は、特に限定されるものではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、１０μｍ２以上、１ｍｍ２以下であることが好ましく、３００μｍ２以上、０．８ｍｍ２以下であることがより好ましい。【００４８】
本発明の分析用チップを構成する基板において、さらに好ましくは、その基板における選択結合性物質が固定化された領域を有する面の周囲がさらに凹凸部の凸部上端と略同一の高さの平坦部で囲まれていることが好ましい。このような構造とすることにより、凹凸部に被検物質を含む溶液をアプライすることが容易となり、攪拌用の微粒子を選択結合性物質に接触させること無く凹部に保持することが可能となる。【００４９】
凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部の高さは、略同一であることが好ましい。すなわち、平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であることが好ましい。凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍを超えると、検出できる蛍光強度が弱くなる場合があるため好ましくない。平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、より好ましくは３０μｍ以下であり、最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。【００５０】
本発明の分析用チップで好ましく用いられる基板の凹凸部における凸部の高さ、即ち凸部上面と凹部底面との高さの差は、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下がより好ましい。凸部の高さが１０μｍより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した被験物質試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがあるため好ましくない。また、凸部の高さが５００μｍより高いと、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合があり好ましくない。【００５１】
本発明の分析用チップを構成する基板の具体例を、図３及び図４に例示する。【００５２】
図３及び図４に示す例において、基板１の表面は、複数の凸部１１を含む凹凸部１２により構成されており、その周りに平坦部１３が設けられている。凸部１１の上面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。この平坦部を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部の上面に合わせることが可能となる。より具体的に説明すると、基板の表面に測定用のレーザー等の照射光を照射するにあたり焦点を合わせる際には、図５に示すように、バネ４０で付勢して治具４１に基板１を突き当て、この治具の突き当て面４２の高さにレーザー光４４が合焦するようレンズ４３等により予め焦点を調整しておくことが多い。本発明の分析用チップの基板の平坦部を治具の面４２に突き当てることにより、容易に基板の凸部上面に測定用の光線（スキャナーのレーザー光）の焦点を合わせることが可能となる。なお、図５の例においては、基板１は、選択結合性物質が固定化された面が下側になるよう固定されている。【００５３】
本発明の分析用チップの基板の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコーン樹脂、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー等のシリコーンゴムなどを挙げることができる。これらの中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス又はシリコーン樹脂を好ましく用いることができる。【００５４】
本発明の分析用チップの基板は、少なくとも一部が黒色であることが好ましい。このようにすることにより、基板からの自家蛍光を低減することができる。基板の黒色にする部分としては、凹凸部が設けられた基板の本体でも良いし、凸部の側面、凹部に設けられた疎水的な材料や絶縁層でも良いし、これらの全部でも良い。【００５５】
ここで、基板が黒色であるとは、可視光（波長４００ｎｍ〜８００ｎｍ）において、基板の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、基板の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることを意味する。【００５６】
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光（波長４００ｎｍ〜８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。尚、ここで言う分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を言う。【００５７】
黒色にする手段としては、本発明の分析用チップの基板に黒色物質を含有させることにより達成しうる。この黒色物質は、光を反射しない又は反射しにくいもの、あるいは透過しない又は透過し難いものであれば、特に制限はないが、好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ又はＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ又はＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。【００５８】
これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。例えば、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン樹脂などのポリマーの場合は、この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラックを好ましく含有させることができ、特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。ガラス、セラミックなどの無機材料の場合は、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ又はＣｕ等の金属酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ又はＣｒの炭化物を好ましく含有させることができる。【００５９】
本発明の分析用チップを構成する基板は、各種製法にて製造することができる。例えば、材質がポリマー等の場合、射出成形法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法等により成型することができる。また、材質がガラスやセラミック等の無機物の場合、サンドブラスト法、シリコーン樹脂の場合は公知の半導体プロセスなどで成型することができる。【００６０】
成型した基板は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。かかる表面処理としては、具体的には例えば特開２００４-２６４２８９号公報に記載されるものなどを挙げることができる。【００６１】
本発明の分析用チップは、被検物質（検体）を分析するための分析用チップとして用いることができる。【００６２】
本発明において、分析用チップとは、被検物質が含まれる溶液を当該チップにアプライし、被検物質の存在の有無や、被検物質の量や、被検物質の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、基板表面に固定化された選択結合性物質と被検物質との反応により、被検物質の量や、被検物質の有無を測定するバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を基板表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を基板表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を基板表面に固定化した糖鎖チップ、及び基板表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。【００６３】
本発明において、選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。基板の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。【００６４】
核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡでも良く、またＰＮＡでも良い。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。【００６５】
核酸は、生細胞等天然物由来のものであっても良いし、核酸合成装置により合成されたものであっても良い。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Favaloro et al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。【００６６】
また、蛋白質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。【００６７】
糖類としては、各種単糖のほか、オリゴ糖や多糖などの糖鎖を挙げることができる。【００６８】
脂質としては、単純脂質の他、複合脂質であっても良い。【００６９】
更に、上記核酸、蛋白質、糖類、脂質以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。また、選択結合性物質として、基板の表面に細胞を固定化してもよい。【００７０】
これらの選択結合性物質のうち特に好ましいものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖又は脂質を挙げることができる。【００７１】
本発明の分析用チップは、該基板の表面を覆い該基板と接着されたカバー部材を更に備えるものである。カバー部材を備えることにより、被検物質が含まれる溶液を簡便に密閉保持することができ、その結果、被検物質と、基板の領域（図３又は図４中の１２）に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。また、本発明の分析用チップには予め微粒子を注入（格納）しておくことができ、被験物質溶液をアプライする作業を容易に行うことが可能である。そして、被験物質溶液をアプライした後の貫通孔を塞ぐ作業においてもテープやシール剤が被験物質溶液と接触することがないので、バックグラウンドノイズが上昇しないという利点もある。【００７２】
図６は、前記基板に加え、更にカバー部材、接着部材、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを有する本発明の分析用チップの概略的な態様の例を示す斜視図であり、図７は図６の分析用チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した断面図である。図７に示す例においては、基板１が、接着部材３０を介してカバー部材３で覆われ、選択結合性物質が固定化された領域１２を含む空隙３１を形成している。空隙３１は、複数の貫通孔３２を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間である。【００７３】
前記カバー部材は、前記基板の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基板と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。そして、基板は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記基板に接着される。前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着される。【００７４】
前記カバー部材は、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものとすることができ、複数の貫通孔を有することが好ましい。より具体的には、貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３個から６個とすることにより、被検物質が含まれる溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、より好ましくは３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。カバー部材が複数の貫通孔を有する場合、それらの孔径は、同一でも異なっていてもよいが、複数の貫通孔のうちの一つをアプライ口とし、他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、被験物質溶液のアプライの容易さ及び該溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径としその他の貫通孔をより狭い孔径とすることが、好ましい。具体的には、アプライ口の貫通孔サイズは上記の通り直径０．０１ｍｍから２．０ｍｍの範囲内とし、その他の貫通孔の直径を０．０１ｍｍ〜１．０ｍｍとすることが好ましい。【００７５】
貫通孔３２は、その少なくとも１つが、その径を変化させて、上端に径の広い部分、いわゆる液面駐止用チャンバー３３を備えるものとしても良い。液面駐止用チャンバーを備えることにより、貫通孔３２からアプライされ空隙３１に充填された被験物質溶液の液面の上昇を抑え、貫通孔を封止部材３４（図１２）で封止する際の封止を容易かつ確実に行うことが可能となるとともに、被験物質溶液の中への空気の流入や被験物質溶液の流出を防ぐことができるので好ましい。液面駐止用チャンバーの形状は特に限定されるものではなく、円柱形、角柱形、円錐形、角錐形、半球形、又はこれに近似した形状とすることができる。これらのうち、製造の容易さ及び被験物質溶液の上昇を抑制する効果の高さ等の観点から、円柱形が特に好ましい。【００７６】
貫通孔の孔径サイズについては特に限定されるわけではないが、円柱形の貫通孔３２及び液面駐止用チャンバー３３との組み合わせの場合を例に挙げると、貫通孔３２の孔径サイズ（直径）は、０．０１ｍｍから２．０ｍｍが好ましく、０．３ｍｍから１．０ｍｍがより好ましい。孔径を０．０１ｍｍ以上とすることにより、被験物質溶液のアプライを容易に行うことができる。一方、貫通孔３２の直径を１．５ｍｍ以下とすることにより、アプライ後封止前の被験物質溶液の蒸発などをより効果的に抑制することができる。液面駐止用チャンバー３３の孔径サイズ（直径）については、１．０ｍｍ以上が好ましい。１．０ｍｍ以上とすることにより、貫通孔３２とのサイズの差を十分に得ることができ、十分な液面駐止効果が得られ好ましい。液面駐止用チャンバー３３の直径の上限は、特に限定されないが、１０ｍｍ以下とすることができる。また、液面駐止用チャンバー３３の深さは、特に限定されないが、０．１ｍｍ〜５ｍｍの範囲内とすることができる。【００７７】
このようなカバー部材は、前述の基板に、脱離可能に接着されていることが好ましい。本発明の分析用チップをＤＮＡチップとして用いる場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取ることが必要であるが、カバー部材が接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバー部材とスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバー部材を介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバー部材を取り外せるよう、カバー部材が脱離可能であることが好ましい。【００７８】
カバー部材を基板に脱離可能に接着する態様は、特に限定されないが、カバー部材と基板が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着することができる。【００７９】
接着部材として両面テープを用いる場合、両面で接着力の異なる両面テープを用いることが好ましく、具体的には、該両面テープの接着力の弱い面を基板側に接着し、接着力の強い面をカバー部材側に接着することが好ましい。このような態様とすることにより、カバー部材を剥離する際に、両面テープがカバー部材に接着した状態で同時に基板より脱離し易く、それにより、基板上への接着部材の残存による読み取りの工程における不都合を回避することができる。このような両面テープとしては、日東電工株式会社製の製品番号Ｎｏ．５３５Ａ、住友スリーエム株式会社製の製品番号９４１５ＰＣ及び４５９１ＨＬ、並びに株式会社寺岡製作所製の製品番号Ｎｏ．７６９１等が挙げられる。【００８０】
接着部材として樹脂組成物を用いる場合、当該樹脂組成物としては、アクリル系ポリマー、シリコーン系ポリマー、及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物等を用いることができる。これらの樹脂組成物を利用することにより、両面テープに比べて密閉性を高めることが可能となるとともに、両面テープに比べて、長期間のインキュベーションに対しても安定であるため、そのような長期間のインキュベーションが必要な分析系においては特に好ましい。特に、接着部材としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができる。このようなエラストマーとしては、具体的には、シルガード（シルガードはダウコーニング社の登録商標）や、信越化学工業社製の二液型ＲＴＶゴム（型取り用）を挙げることができる。【００８１】
上記カバー部材の形状は、前記基板の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基板と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されうるものであれば特に限定されないが、その外周部分において、基板に近い部分より基板に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものとすることができる。オーバーハング構造を設けることにより、基板を損傷せずにカバー部材を脱離することが容易となるので、好ましい。【００８２】
また、本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質が固定化された基板には、カバー部材及び任意に接着部材を含む構造により規定される空隙を有するが、当該空隙は、１つの空間でもよく、複数の仕切られた空間であってもよい。複数の仕切られた空間は、例えば図８に示すような仕切り構造により設けることができる。図８に示す例においては、カバー部材の凸部３Ａ及び基板１が接着部材３０Ａを介して接着することにより、複数の仕切られた空間３１を設けている。複数の仕切られた空間を設ける別の例として、例えば図９に示すような仕切り構造を設けることもできる。図９に示す例においては、基板の凸部１４及びカバー部材３が接着部材３０Ｂを介して接着することにより、複数の仕切られた空間３１を設けている。また、さらに別の例として、基板及びカバー部材に特に仕切り構造を設けるための凸部を設けず、接着部材３０Ａのみで空隙を仕切り、複数の仕切られた空間を設けることもできる。複数の仕切られた空間を設けたこれらの例においては、空間３１は、互いに連通せず、それぞれが別々に、１以上の貫通孔３２及び液面駐止用チャンバー３３を有することになる。このように、複数の仕切られた空間を設けることによって、１枚の分析用チップに複数種の被験物質溶液をアプライすることが可能となり、従って複数種の被検物質を同時に１枚の分析用チップで測定することができる。【００８３】
本発明の分析用チップは、一枚の基板あたり一枚のカバー部材を有していてもよく、二枚以上のカバー部材を有していてもよい。具体的には、図１０又は図１１に示す通り、一枚の基板１上に、複数のカバー部材３Ｂを有することができる。複数のカバー部材３Ｂのそれぞれは、それぞれ別の接着部材３０Ｃを介して基板１上に設けることができる。好ましくは、複数のカバー部材３Ｂのそれぞれが、基板１との間に空隙３１を有し、且つ各空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することができ、そして、各カバー部材３Ｂがそれぞれ別の、選択結合性物質が固定化された領域１２を有することができる。このような態様をとることによって、上記複数の仕切られた空間を有する態様と同様に、複数種の被検物質を同時に１枚の分析用チップで測定する等の効果を得ることができる。さらに、このような態様をとることにより、それぞれの領域１２についてカバー部材を独立して脱離させることができるので、例えば一つの領域１２について分析を行った後に他の領域１２を用いて分析を行うといった、独立した使用を行いうる。【００８４】
本発明の分析用チップを構成するカバー部材の材料としては、特に限定されるものではないが、被験物質溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。そのような材質としては、ガラス又はプラスチックが挙げられる。特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の透明樹脂を好ましく用いることができる。カバー部材の作製方法も特に限定されるものではなく、切削加工や射出成型法による加工が可能である。大量生産が可能という観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。【００８５】
本発明の分析用チップにおいて、カバー部材を付けた基板に微粒子を注入（格納）する方法は特に限定されないが、微粒子が内部を通過可能な管形状を有しかつカバー部材の貫通口に挿入可能な細管部を有する器具を用い、これをカバー部材の貫通口に挿入して該器具中を通過させて空隙内に微粒子を注入する方法が挙げられる。ここで用いる器具としては、例えばピペット、ピペットチップ、カラム、キャピラリー、チューブ等を用いることができる。または、カバー部材を貼付する前の基板の選択結合性物質が固定化された領域（例えば、図３の凹部１０）に微粒子を添加し、その後にカバー部材を貼付してもよい。【００８６】
本発明の分析用チップにおける、凹凸部、カバー部材及び微粒子の関係の好ましい例を、図１２を参照して説明する。図１２に示した例では、ＤＮＡ等の選択結合性物質４５は、基板１の凸部１１の上面に固定化されている。そして、微粒子（この場合は球状のビーズ）２は、基板１の凹部の空隙内に載置されている。選択結合性物質４５及び微粒子２は、被検物質が含まれる溶液（図示せず）に触れることになる。被験物質溶液は、基板１、接着部材３０及びカバー部材３により規定される空隙内で保持されることになる。図１２の例においては、基板の凸部１１上面とカバー部材３との間隔の最短距離が、微粒子２の直径未満となっている。それにより、微粒子が凸部１１上面に接触できなくなり、凸部１１上面上の選択結合性物質４５を傷つけることを防ぐことができる。微粒子が、例えば楕円形等の非球状の形状である場合は、凸部上面と容器との最短距離が微粒子の最小径未満であれば、同様に凸部１１上面と微粒子との接触を防ぎ、選択結合性物質４５の損傷を防ぐことが可能となる。【００８７】
このような本発明の分析用チップは、各種被検物質の分析に利用することができる。すなわち、本発明の分析用チップの選択結合性物質を固定化した基板に、被検物質を接触させて該選択結合性物質と選択的に結合させ、基板上に該選択結合性物質を介して結合した該被検物質の有無又は量を測定することにより、被検物質を分析することができる。【００８８】
本発明の分析用チップを用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質が含まれる検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、基板を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、基板に結合した標識を測定することもできる。【００８９】
本発明の被検物質の分析方法においては、まず、前記本発明の分析用チップを構成する選択結合性物質を固定化した基板に被検物質を接触させて選択的に結合させる。すなわち、基板に上述のような標識、増幅等を施した被検物質を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させた溶液（本明細書において「被験物質溶液」ということがある）とし、基板に接触させれば良い。【００９０】
選択結合性物質が結合された基板への接触は、被験物質を水溶液や適当な緩衝液等の溶液とし、該基板の凹凸部にピペット等の通常の器具で注入することにより行うことができる。【００９１】
被検物質の溶液を本発明の分析用チップに注入して選択結合性物質が結合された基板へ接触させる前に、該溶液を脱気処理することにより、効果的に気泡発生を防ぐことができるので、好ましい。脱気処理の方法としては、真空ポンプやアスピレーターを用いて減圧にして脱気する方法、遠心操作により脱気する方法、超音波処理する方法、加熱処理する方法などの公知の方法を好ましく用いることができる。これらのうち、アスピレーターや真空ポンプを用いて減圧にして脱気する方法が、手軽で簡便な方法としてより好ましく用いられる。この場合の脱気の際の真空度は、溶液が突沸しない程度であればよく、圧力にして１０ｈＰａ（ヘクトパスカル）〜３００ｈＰａ、好ましくは２０ｈＰａ〜２００ｈＰａ、より好ましくは５０ｈＰａ〜１００ｈＰａが用いられる。また、脱気操作を行う時間は、２分から１時間が好ましく、より好ましくは３分から３０分であり、さらに好ましくは５分から２０分である。【００９２】
また、本発明の分析用チップを利用する場合には、前記カバー部材の貫通孔から被験物質をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記被験物質を前記分析用チップを構成する前記基板に選択的に結合させることができる。【００９３】
貫通孔からの被験物質のアプライは、例えば、前記貫通孔からピペット等の通常の器具で注入して行うことができる。【００９４】
カバー部材への封止部材の貼付は、貫通孔の一部又は全て、好ましくは全てを封止する態様にて行うことができる。前記封止部材としては、例えばカプトン（登録商標、東レ・デュポン社製）などのポリイミドフィルム製、ポリエステル製、セロハン製又は塩化ビニル製の粘着テープ等の可とう性のテープを好ましく挙げることができるが、これに限らず、非可とう性の板状の接着可能な任意の部材を用いることもでき、非定型のシーリング剤を用いることもできる。液面駐止用チャンバーによる本発明の効果をより良好に得るという観点からは、可とう性のテープ及び板状の部材が好ましく、操作の簡便性などの観点から、可とう性のテープがさらに好ましい。封止部材としてテープ又は板状の部材を用いる場合、その使用枚数は任意である。具体的には、カバー部材上の全ての貫通孔を一枚の封止部材で封止してもよく、複数の封止部材を用いてそれぞれで複数の貫通孔の一部を封止してもよい。また、前記の通り一枚の基板上に複数のカバー部材が設けられている場合、カバー部材のそれぞれに別々の封止部材を用いてもよく、複数のカバー部材上の貫通孔をまとめて一枚の封止部材で封止してもよい。通常は、一枚のカバー部材あたり一枚の封止部材を用いることが、簡便且つ確実な封止を達成しうることから好ましい。【００９５】
封止の具体例を、再び図１２を参照して説明する。図１２の例では、被験物質溶液（図示せず）を貫通孔３２よりアプライした後、封止部材として可とう性の粘着テープ３４を、液面駐止用チャンバー３３の全面を覆うように貼付し、貫通孔を封止している。このような態様により、簡便で且つ被験物質溶液の漏出や測定誤差を招かない封止を達成できる。【００９６】
本発明の分析方法において、選択的な結合とは、選択結合性物質と被験物質とを相互作用させ、前記被験物質を、前記選択結合性物質を介して前記選択結合性物質を固定化した基板に結合させることを意味する。本発明の分析用チップの場合には、前記チップを揺動、回転させることにより、重量、振動、遠心力によって微粒子が被験物質溶液中を移動するので、選択的結合を効率よく進めることができる。【００９７】
選択的結合を行うの際の反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる被験物質の核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、４０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜５０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、必要に応じて、選択結合性物質を固定化した基板を揺動、回転等させ、選択的結合を促進することができる。【００９８】
本発明の分析用チップは、ハイブリダイゼーションの際に微粒子を移動させることにより、被験物質液体を効率よく撹拌することができる。微粒子を移動させる手段としては、好ましくは分析チップを回転させて重力方向に微粒子を落下させる方法や、振とう機に微粒子を含んだ分析チップをセットし基板を振とう若しくは揺動させる方法や、磁性微粒子を用いて磁力により微粒子を移動させる方法が用いられるが、チップを振とう機にセットし、水平面内で旋回回転させる方法が、微粒子の移動範囲が大きく、偏り無く移動するため、その結果、効率よく液を攪拌できるため好ましく用いられる。このとき、旋回回転の回転数は、好ましくは１０〜１０００回転／分であり、より好ましくは１００〜５００回転／分である。【００９９】
選択的結合が終了した後、通常はカバー部材を脱離させた後、次の工程に供することができる。【０１００】
本発明の分析方法においては、上述の選択的結合の後、前記基板上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被験物質の質量を測定する。この測定も、従来の分析用チップにおける操作と全く同様に行うことができる。例えば、適宜蛍光標識され、選択結合性物質と結合した被験物質の質量について、公知のスキャナー等により、その蛍光量を読み取ることにより測定することができる。【０１０１】
本発明の分析方法において、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」には検出と定量の両者の意味が含まれる。
【実施例】
【０１０２】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。本発明は下記実施例に限定されない。【０１０３】
実施例１
（１）分析用チップの基板の作製
公知の方法であるＬＩＧＡ（Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｉｅ  Ｇａｌｖａｎｏｆｏｒｍｕｎｇ  Ａｂｆｏｒｍｕｎｇ）プロセスを用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法により後述するような形状を有するポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の基板を得た。用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させて、基板を黒色にした。この黒色基板の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で、透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、基板からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。【０１０４】
基板としては、図３及び図４に例示される形状を有する基板である、外形が縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基板の中央部に、縦３９．４mm、横１９．０ｍｍ、深さ０．１５ｍｍの凹部（図３の凹部１０に相当）を設け、この凹部の中に、直径０．１ｍｍ、高さ０．１５ｍｍの凸部（図３の凸部１１に相当）を９２４８箇所設けた基板（以下「基板Ａ」とする）を用いた。この基板Ａにおいて、凸部（図３の凸部１１に相当）上面と平坦部（図３の凸部１３に相当）上面との高さの差（凸部は高さの平均値）は、３μｍ以下であった。また、凸部（図３の凸部１３に相当）上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）は、３μｍ以下であった。また、凸部のピッチ（図４のＬ１；凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）を０．５ｍｍとした。【０１０５】
上記基板Ａを１０Ｎの水酸化ナトリウム水溶液に７０℃で１２時間浸漬した。これを、純水、０．１ＮのＨＣｌ水溶液、純水の順で洗浄し、基板表面にカルボキシル基を生成させた。
（２）選択結合性物質の固定化
基板Ａに対し、以下の条件で、それぞれ選択結合性物質（プローブＤＮＡ）としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、オペロン社製ＤＮＡマイクロアレイ用オリゴヌクレオチドセット“Homo sapiens (human) AROS V4.0（各６０塩基）”を用いた。このオリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μＬの濃度となるよう溶解させて、ストック溶液とした。このストック溶液を基板にスポット（点着）する際は、ＰＢＳ（８ｇのＮａＣｌ、２．９ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．２ｇのＫＣｌ、及び０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４を合わせて純水に溶かし、１Ｌにメスアップしたものに、塩酸を加えてｐＨ５．５に調整したもの）で１０倍希釈して、プローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μＬとし、かつ、ＰＭＭＡ製基板表面に生成させたカルボキシル基とプローブＤＮＡの末端アミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液をアレイヤー（スポッター）（日本レーザー電子製；Ｇｅｎｅ  Ｓｔａｍｐ−ＩＩ）を用いて、基板Ａの全ての凸部上面にスポットした。次いで、スポットした基板を密閉したプラスチック容器に入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートした。最後に純水で基板を洗浄し、スピンドライヤーで遠心して乾燥した。【０１０６】
（３）分析用チップ基板へのカバー部材の貼付
選択結合性物質を固定化した上記基板Ａに対し、次のようにカバー部材を貼付した。【０１０７】
カバー部材としては、縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ平板を切削加工により作製してカバー部材とした。作製した該カバー部材には、貫通孔および液面駐止用チャンバーを図７の３２、３３に例示するように設けた。そして接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍを幅１ｍｍの両面テープを用い、この両面テープをカバー部材を縁取るように、かつ厚さ５０μｍで積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板Ａに貼付した。【０１０８】
（４）攪拌用微粒子表面の界面活性剤コーティング
直径１８０μｍのジルコニア製微粒子（東レ（株）製）１０ｇを、ステンレス製バット（１０ｃｍ×１０ｃｍ×５ｃｍ）に入れ、これに界面活性剤として０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液５０ｍｌを加えた。これを１０分間超音波処理したのち、上清（ＳＤＳ成分）を除去し、オーブンを用いて微粒子を７０℃にて、１２時間乾燥させた。なお、処理前の微粒子の表面粗さを測定したところ、表面の中心線平均粗さ（Ｒａ値）は１６５ｎｍであった。微粒子表面のＲａ値の測定は、その表面をＡｕで真空蒸着した後、走査型電子顕微鏡（株式会社エリオニクス製、型式ＥＳＡ−２０００）で測定した。中心線平均粗さは、観察倍率を１０，０００倍、カットオフ値を０とし、任意の１０個について測定し、その平均値を求めた。【０１０９】
（５）分析用チップへの微粒子の注入（格納）と注入（格納）操作性の評価
上記（３）でカバー部材を貼りつけた基板Ａに、上記（４）で界面活性剤をコーティングしたジルコニア製微粒子１２０ｍｇを、基板Ａとカバー部材とで形成される空隙（基板Ａ表面の凹凸構造の凹部）に注入（格納）した。微粒子の注入は、カバー部材の貫通孔（図７又は図１２に例示される貫通孔３２）から行った。以上のようにして得られた分析用チップを、「分析用チップ１」とした。【０１１０】
ここで、微粒子の分析用チップへの注入時における操作性を次のように評価した。１２０ｍｇの微粒子を注入するにあたり、操作が非常に容易で注入に要した時間が３分間未満であった場合、操作性を「Ａ」と評価し、操作が比較的容易で注入に要した時間が３分間以上５分間未満であった場合には「Ｂ」、操作が困難又は容易でないために５分間で全量の微粒子の注入が完了しなかった場合には「Ｃ」と評価した。【０１１１】
分析用チップ１における微粒子の注入操作性は、「Ａ」であった（表１）。【０１１２】
（６）被験物質ＤＮＡの調製
被験物質としては、マイクロアレイの被験物質として一般的な、ａＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ）を用いた。市販のヒト培養細胞由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＲＮＡ）５μｇから、Ａｍｂｉｏｎ社製ａＲＮＡ調製キットを使用して、５μｇのＣｙ３標識ａＲＮＡを得た。【０１１３】
本実施例、及び以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーションの際の被験物質溶液は、特に断りのない限り、上記で調製した標識ａＲＮＡを、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で希釈したものを用いた。【０１１４】
（７）ハイブリダイゼーション反応と気泡発生数の評価
マイクロピペットを用いて、分析用チップ１の基板Ａとカバー部材との空隙（反応槽）に、Ｃｙ３標識ａＲＮＡ２００ｎｇを含むハイブリダイゼーション被験物質溶液１６５μＬを貫通孔より注入した。このとき、容易に溶液を注入でき、気泡が混入することはなかった。封止材としてカプトンテープ（アズワン）を用い、４つの貫通孔を塞いだ。ハイブリダイゼーションチャンバー（Ｔａｋａｒａ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｈａｍｂｅｒ（タカラバイオ（株）製）を、シート振盪台（東京理化器械（株）製  ＭＭＳ  ＦＩＴ−Ｓ）に密着させて固定し、分析用チップ１をハイブリダイゼーションチャンバー内にセットした。このとき、分析用チップ１をセットする位置の両端の凹みに、１５μＬずつ超純水を滴下した。ハイブリダイゼーションチャンバー蓋を閉めた後、６本の固定ネジを締めて固定し、４２℃に設定した恒温チャンバー（東京理化器械（株）製  ＦＭＳ−１０００）内に据え付けた振盪機（東京理化器械（株）製  ＭＭＳ−３１０）の上に載せて固定した。恒温チャンバーの前面をアルミホイルで遮光して、２５０回転／分で旋回振盪しながら、４２℃で１６時間インキュベートした。インキュベート後、ハイブリダイゼーションチャンバーから分析用チップ１を取り出した。【０１１５】
カバー部材を通して、分析用チップ１の基板Ａ上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数した。分析用チップ１を用いたハイブリダイゼーション反応を１０回実施した結果、被験物質溶液中に発生した気泡数は、１回当たりの平均で４．５個であった（表１）。【０１１６】
（８）蛍光シグナル値の測定と検出感度ばらつきの評価
分析用チップ１の基板Ａに接着したカバー部材と両面テープを脱離した後、基板Ａを洗浄、乾燥した。ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ）に上記処理後の基板Ａをセットし、レーザー出力３３％、フォトマルチプライヤーの電圧設定を５００にした状態において、ハイブリダイゼーション反応した被験物質の標識体シグナル値（蛍光強度）、バックグラウンドノイズを測定した。全９２４８個のスポットのうち、３２個をバックグラウンド蛍光値測定用のネガティブコントロールスポットとし、個々のシグナル値からバックグラウンドシグナル値を差し引いて各スポットの真のシグナル値を算出した。【０１１７】
ハイブリダイゼーション反応の反応むらによる検出感度のばらつきの評価として、分析用チップ１を用いたハイブリダイゼーション反応を１０回実施し、各回におけるバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値＝全回のバックグラウンドシグナル値の標準偏差／全回のバックグラウンドシグナル値の平均値（％））を計算した。その結果、１０回の評価におけるバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）の平均値は８．４％であった（表１）。【０１１８】
実施例２
実施例１（６）で調製した被験物質溶液を次のように脱気処理を行ったこと以外は、実施例１と同様に分析用チップ１を用いた評価を実施した。【０１１９】
被験物質溶液１７５μｌを０．２ｍｌＰＣＲチューブ（アシスト社製７２．７３７．００２）にいれ、フタを開けたまま脱気装置（ＵＬＶＡＣ社製アスピレーターＮＤＡ−０１５型）にセットして脱気を行った。脱気時の到達圧力は、装置の表示で５０ｈＰａ、脱気時間は２５分間とした。【０１２０】
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の基板上に観察された被験物質溶液中の気泡数を計数したところ、気泡数は、６回実施した結果の１回当たりの平均値が０．４個であった（表１）。【０１２１】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、６．７％であった（表１）。【０１２２】
比較例１
実施例１において、微粒子として、界面活性剤のコーティング（実施例１（４））を行わずにジルコニア製微粒子をそのまま用いたことのみを変更して、「分析用チップ２」を作成した。この分析用チップ２用いて、実施例１と同様に評価を実施した。【０１２３】
実施例１（５）と同様にして微粒子の注入操作性の評価した結果、分析用チップ２への微粒子封入は困難を要し、所要時間は５分を越えたため、操作性の評価は「Ｃ」となった（表１）。【０１２４】
この分析用チップ２に対し、実施例１（７）と同様にしてハイブリダイゼーション反応後の被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、気泡数は、２４回実施した平均が１３．０個であった（表１）。【０１２５】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、１２．１％であった（表１）。【０１２６】
比較例２
実施例２において、分析用チップ１の代わりに、比較例１で作成した分析用チップ２を用いた以外は実施例２と同様にして、被験物質溶液を脱気処理して評価を実施した。【０１２７】
実施例１（７）と同様にして、ハイブリダイゼーション反応後の発生気泡数を計数したところ、３回の評価の平均が９．０個であった（表１）。【０１２８】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、１０．５％であった（表１）。【０１２９】
実施例３
実施例１（４）において、界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の代わりにデオキシコール酸ナトリウム（陰イオン界面活性剤の１種）を用いて、同様の手順で界面活性剤のコーティング処理を行った微粒子を１２０ｍｇ注入して「分析用チップ３」を作成した。この分析用チップ３を用い、実施例２と同様に被験物質溶液を脱気処理して、評価を実施した。【０１３０】
実施例１（５）と同様にして微粒子の注入操作性を評価した結果、分析用チップ３への微粒子の封入操作性は、１０回実施した所要時間平均が３分以上５分以内であったため、評価は「Ｂ」であった（表２）。【０１３１】
この分析用チップ３に対し、実施例１（７）と同様にしてハイブリダイゼーション反応後、被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、気泡数は、１０回実施した平均が０．６個であった（表２）。【０１３２】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．２％であった（表１）。【０１３３】
実施例４
実施例１（４）において、界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の代わりにプルロニックＦ６８（非イオン界面活性剤の１種）を用いて、次の手順で界面活性剤のコーティング処理を行った微粒子を使用して「分析用チップ４」を作成した。すなわち、ジルコニア製微粒子に対して実施例１（４）と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬで１回洗浄し、７０℃で４時間乾燥した。この微粒子を分析用チップに１２０ｍｇ注入して分析用チップ４を作成した。【０１３４】
実施例１（５）と同様にして分析用チップ４へのこの微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、所要時間はすべて３分以内であった。よって、操作性評価は「Ａ」であった（表２）。【０１３５】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液１６５μＬを分析用チップ４にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が１．２個であった（表２）。【０１３６】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、８．４％であった（表２）。【０１３７】
実施例５
実施例１（４）において、界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の代わりにプルロニックＦ１２７（非イオン界面活性剤の１種）を用いて、次の手順で界面活性剤のコーティング処理を行った微粒子を使用して「分析用チップ５」を作成した。すなわち、ジルコニア製微粒子に対して実施例１（４）と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬで１回洗浄し、７０℃で４時間乾燥した。この微粒子を分析用チップに１２０ｍｇ注入して分析用チップ５を作成した。【０１３８】
実施例１（５）と同様にしてこの微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、所要時間はすべて３分以内であった。よって、操作性評価は「Ａ」であった（表２）。【０１３９】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液１６５μＬを分析用チップ５にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生したの気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が１．８個であった（表２）。【０１４０】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．６％であった（表２）。【０１４１】
実施例６
実施例１（４）において、界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の代わりにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（非イオン界面活性剤の１種）を用いて、次の手順で界面活性剤のコーティング処理を行った微粒子を使用して「分析用チップ６」を作成した。すなわち、ジルコニア製微粒子に対して実施例１（４）と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬ中で３０秒間超音波洗浄し、７０℃で４時間乾燥した。この微粒子を分析用チップに１２０ｍｇ注入して分析用チップ６を作成した。【０１４２】
実施例１（５）と同様にしてこの微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、所要時間は７枚が３分以内、３枚が３分以上５分以内であった。よって、操作性評価は「Ｂ」であった（表２）。【０１４３】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液１６５μＬを分析用チップ６にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生したの気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が２．１個であった（表２）。【０１４４】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、８．３％であった（表２）。【０１４５】
実施例７
実施例１（４）において、界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の代わりにＴｗｅｅｎ  ２０（非イオン界面活性剤の１種）を用いて、次の手順で界面活性剤のコーティング処理を行った微粒子を使用して「分析用チップ７」を作成した。すなわち、ジルコニア製微粒子に対して実施例１（４）と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬで１回洗浄し、７０℃で４時間乾燥した。この微粒子を分析用チップに１２０ｍｇ注入して分析用チップ７を作成した。【０１４６】
実施例１（５）と同様にしてこの微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、所要時間は６枚が３分以内、４枚が３分以上５分以内であった。よって、操作性評価は「Ｂ」であった（表２）。【０１４７】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液１６５μＬを分析用チップ７にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が２．２個であった（表２）。【０１４８】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．０％であった（表２）。【０１４９】
実施例８
実施例１（４）において、界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の代わりに３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ；両性イオン界面活性剤の１種）を用いて、次の手順で界面活性剤のコーティング処理を行った微粒子を使用して「分析用チップ８」を作成した。すなわち、ジルコニア製微粒子に対して実施例１（４）と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬで１回洗浄し、７０℃で４時間乾燥した。この微粒子を分析用チップに１２０ｍｇ注入して分析用チップ８を作成した。【０１５０】
実施例１（５）と同様にして微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、所要時間は８枚が３分以内、２枚が３分以上５分以内であった。よって、操作性評価は「Ｂ」であった（表２）。【０１５１】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液１６５μＬを分析用チップ８にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が２．５個であった（表２）。【０１５２】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．６％であった（表２）。【０１５３】
実施例９
実施例１（４）において、界面活性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の代わりに臭化セチルトリメチルアンモニウム（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ、ＣＴＡＢ；陽イオン界面活性剤の１種）を用いて、次の手順で界面活性剤のコーティング処理を行った微粒子を使用して「分析用チップ９」を作成した。すなわち、ジルコニア製微粒子に対して実施例１（４）と同様の手順で処理を行った後、さらに、脱イオン水（ミリＱ水）４００ｍＬで１回洗浄し、７０℃で４時間乾燥した。この微粒子を分析用チップに１２０ｍｇ注入して分析用チップ９を作成した。【０１５４】
実施例１（５）と同様にしてこの微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、所要時間は７枚が３分以内、３枚が３分以上５分以内であった。よって、操作性評価は「Ｂ」であった（表２）。【０１５５】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液１６５μＬを分析用チップ９にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が３．０個であった。【０１５６】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、７．９％であった（表２）。【０１５７】
実施例１０
実施例１（１）において、分析用チップの基板として、基板Ａの代わりに、基板の中央部に縦３９．４mm、横１９．０ｍｍ、深さ０．０５ｍｍの凹部のみを設けた基板（図３及び図４に例示される形状の基板において、凸部１１を有さないもの）である「基板Ｂ」を使用した。また、実施例１（２）の選択結合性物質の固定化は、凹部底面に、上下３９．４ｍｍ、横１９．０ｍｍの方形に、基板Ａと同様の間隔にて９２４８個スポットすることによって行った。【０１５８】
さらに、実施例１（３）のカバー部材として、縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ平板を切削加工により作製して使用した。作製した該カバー部材には、貫通孔および液面駐止用チャンバーを図７の３２、３３に例示するように設けた。そして接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍを幅１ｍｍの両面テープを用い、この両面テープをカバー部材を縁取るように、かつ厚さ５０μｍで積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板Ｂに貼付した。【０１５９】
これらの他は実施例１の（１）〜（４）と同様の手順で、界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をコーティングしたジルコニア製微粒子１２０ｍｇを注入した「分析用チップ１０」を作成した。【０１６０】
実施例１（５）と同様にして、微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、所要時間はすべて３分以上５分以内であった。よって、操作性評価は「Ｂ」であった（表３）。【０１６１】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液１６５μＬを分析用チップ１０にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が０．５個であった（表３）。【０１６２】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、９．５％であった（表３）。【０１６３】
実施例１１
実施例１（１）において、分析用チップの基板として、基板Ａの代わりに、凹部及び凸部のいずれも有さない平板（図３及び図４に例示される形状の基板において、凹部１０及び凸部１１を有さないもの）である「基板Ｃ」を使用した。また、実施例１（２）の選択結合性物質の固定化は、基板Ｃの平面上面に、上下３９．４ｍｍ、左右の１９．０ｍｍの間隔を取った方形に、基板Ａと同様の間隔にて９２４８個スポットすることによって行った。【０１６４】
さらに、実施例１（３）のカバー部材として、縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍ、厚さ１ｍｍのＰＭＭＡ平板を切削加工により作製して使用した。作製した該カバー部材には、貫通孔および液面駐止用チャンバーを図７の３２、３３に例示するように設けた。そして接着部材として縦４１．４ｍｍ、横２１ｍｍを幅１ｍｍの両面テープを用い、この両面テープをカバー部材を縁取るように、かつ厚さ２００μｍで積層させて貼り付けたのち、該カバー部材を基板Ｃに貼付した。【０１６５】
これらの他は実施例１の（１）〜（４）と同様の手順で、界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）をコーティングしたジルコニア製微粒子１２０ｍｇを注入した「分析用チップ１１」を作成した。【０１６６】
実施例１（５）と同様にして、微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、所要時間は７枚が３分以内、３枚が３分以上５分以内であった。よって、操作性評価は「Ｂ」であった（表３）。【０１６７】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液１６５μＬを分析用チップ１１にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が０．６個であった（表３）。【０１６８】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、９．３％であった（表３）。【０１６９】
実施例１２
実施例１（４）において、微粒子として、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子の代わりに、直径２００μｍの鉄製微粒子（三昌研磨株式会社製）を用い、実施例１（４）と同様にして界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のコーティング処理を行った微粒子１２０ｍｇを注入して「分析用チップ１２」を作成した。【０１７０】
実施例１（５）と同様にして、微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、すべて所要時間は３分以上５分以内であった。よって、操作性評価は「Ｂ」であった（表３）。【０１７１】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液を分析用チップ１２にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が２．２個であった（表３）。【０１７２】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、８．０％であった（表３）。【０１７３】
比較例３
実施例１２において、微粒子として、界面活性剤のコーティング処理（実施例１（４））を行わずに直径２００μｍの鉄製微粒子をそのまま用いたことのみを変更して、「分析用チップ１３」を作成した。この分析用チップ１３を用いて、実施例１と同様に評価を実施した。【０１７４】
実施例１（５）と同様にして微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、注入操作は困難を要し、すべて所要時間は５分を越えた。よって、操作性評価は「Ｃ」であった（表３）。【０１７５】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液を分析用チップ１３にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が１０．０個であった（表３）。【０１７６】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、１３．３％であった（表３）。【０１７７】
実施例１３
実施例１（４）において、微粒子として、直径１８０μｍのジルコニア製微粒子の代わりに、直径２００μｍのガラス製微粒子（株式会社バイオメディカルサイエンス製）を用い、実施例１（４）と同様にして界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のコーティング処理を行った微粒子１２０ｍｇを注入して「分析用チップ１４」を作成した。【０１７８】
実施例１（５）と同様にして、微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、すべて所要時間は３分以上５分以内であった。よって、操作性評価は「Ｂ」であった（表３）。【０１７９】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液を分析用チップ１４にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が１．０個であった（表３）。【０１８０】
また、実施例１（８）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、８．２％であった（表３）。【０１８１】
比較例４
実施例１３において、微粒子として、界面活性剤のコーティング処理（実施例１（４））を行わずに直径２００μｍのガラス製微粒子をそのまま用いたことのみを変更して、「分析用チップ１５」を作成した。この分析用チップ１５用いて、実施例１と同様に評価を実施した。【０１８２】
実施例１（５）と同様にして、微粒子の注入操作性を１０回評価した結果、注入操作は困難を要し、すべて所要時間は５分を越えた。よって、操作性の評価は「Ｃ」であった（表３）。【０１８３】
実施例２と同様にして脱気処理した被験物質溶液を分析用チップ１５にアプライして、実施例１（７）と同様にハイブリダイゼーション反応を行った。被験物質溶液中に発生した気泡数を計数したところ、６回の評価の平均値が８．８個であった（表３）。【０１８４】
また、実施例１（５）と同様にしてバックグラウンドシグナル値のばらつき（ＣＶ値）を計算したところ、１２．９％であった（表３）。【０１８５】
【表１】
2008090922.tif 000003
【０１８６】
【表２】
2008090922.tif 000004
【０１８７】
【表３】
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【０１８８】
以上の実施例１〜１３、比較例１〜４の結果から、微粒子表面を界面活性剤でコーティングすることによって、気泡の発生が抑制されてデータのばらつき（バックグラウンドシグナルのＣＶ値）を低減できること、微粒子を分析用チップに注入する際の操作性が向上すること、また被験物質溶液の脱気処理と組み合わせることにより、さらに効果的に気泡の発生を抑制できること、がわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１８９】
本発明は、被検物質と選択的に結合する選択結合性物質を固定化した基板を備え、微粒子によって被験物質溶液を攪拌することのできる分析用チップにおいて、検出感度のばらつきを抑え、高感度の検出を可能とするものである。本発明は、特に医薬・医療分野における様々な生体関連物質の検出等のための分析用チップとして有用であり、その他、食品、環境分野における微量物質の検出のための分析用チップとしても有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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