(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定用基板上に形成した複数の空間に、検出可能な物性を有する濃度既知の標識物質を含む測定用液体の液滴を分注するとともに、一部の該空間を、前記測定用液体又は標識物質のみの液体を満たした空間およびブランク空間とし、
前記測定用液体又は標識物質のみの液体を満たした空間における物性と前記ブランク空間における物性とを検出するとともに、分注した前記測定用液体の液滴の物性を検出し、
前記測定用液体又は標識物質のみの液体を満たした空間における物性の検出値と前記ブランク空間における物性の検出値とから前記標識物質の物性の検出値と前記標識物質の絶対量との関係を求め、
求められた前記関係に基づいて、分注した前記測定用液体の液滴の物性の検出値から、分注した前記測定用液体の液滴の体積を測定することを特徴とする微量液滴の体積測定方法。
【請求項２】
前記測定用液体には分子量の大きな物質を添加し、該測定用液体の蒸発速度を低下させることを特徴とする請求項１に記載の微量液滴の体積測定方法。
【請求項３】
前記標識物質として吸光物質、蛍光物質、発光物質、または放射性同位体を用い、
前記分注した液滴を搭載した前記測定用基板をデンシトメータ、蛍光スキャナ、ルミノメータまたはオートラジオグラフィを用いてイメージ化し、
該標識物質から得られる吸光度、蛍光強度、発光強度、または放射線強度の物性値を画像として読み取ることで検出することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の微量液滴の体積測定方法。
【請求項４】
測定用基板上に形成した複数の空間に、検出可能な物性を有する濃度既知の標識物質を含む測定用液体の液滴を分注するとともに、一部の該空間を、前記測定用液体又は標識物質のみの液体を満たした空間およびブランク空間とし、
前記測定用液体又は標識物質のみの液体を満たした空間における物性と前記ブランク空間における物性とを検出するとともに、分注した前記測定用液体の液滴の物性を検出し、
前記測定用液体又は標識物質のみの液体を満たした空間における物性の検出値と前記ブランク空間における物性の検出値とから前記標識物質の物性の検出値と前記標識物質の絶対量との関係を求め、
求められた前記関係に基づいて、分注した前記測定用液体の液滴の物性の検出値から、分注した前記測定用液体の液滴の体積を測定することを特徴とする微量液滴の体積測定装置。
【請求項５】
前記空間は前記測定用基板と一体に形成した隔壁により隔離されていることを特徴とする請求項４に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項６】
前記空間は前記測定用基板とは別体に形成した隔壁の上下に貫通する複数の通孔であり、
該隔壁を該測定用基板と密着することにより隔離されていることを特徴とする請求項４に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項７】
前記隔壁に測定用基板側開口の周囲に溝を形成し、該溝に前記測定用基板と接触する密閉用Ｏリングを設けたことを特徴とする請求項６に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項８】
前記隔壁の前記空間を密閉する蓋を備え、光路長を規定する治具を用いたことを特徴とする請求項５又は請求項６に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項９】
前記隔壁に測定用基板側開口および蓋側開口の周囲に溝を形成し、該溝に前記測定用基板および前記蓋にそれぞれ接触する密閉用Ｏリングを設け、前記測定用基板と該隔壁と前記蓋とを該隔壁を挟持する固定部材により該Ｏリングを圧縮して一体化し固定し、該蓋を該隔壁に密着することにより高さを規定して、光路長を規定することを特徴とする請求項８に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項１０】
前記隔壁を弾性材料により形成するとともに、自由状態時に該隔壁よりも高さの低い規定部材を設け、前記蓋による空間密閉時に前記測定用基板と該隔壁と該蓋とを挟持する固定部材により該隔壁を圧縮して一体化し固定し、該蓋を該規定部材上面に密着することにより高さを規定して、光路長を規定することを特徴とする請求項８に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項１１】
前記固定部材は、前記測定用基板と前記蓋とを前記隔壁を挟持して固定するねじであることを特徴とする請求項９又は請求項１０に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項１２】
前記固定部材は、内部に前記測定用基板と前記隔壁とを挟持した状態でスライドして収納できる空間を備えた容器であることを特徴とする請求項９又は請求項１０に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項１３】
前記測定用基板を導電性材料により形成し、前記標識物質として電気化学活性物質を用いることを特徴とする請求項４に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項１４】
前記測定用基板には前記空間内における前記電気化学活性物質との間の電子移動反応を測定する電極を備えたことを特徴とする請求項１３に記載の微量液滴の体積測定装置。
【請求項１５】
前記電極は作用電極と対電極とを分離して形成したことを特徴とする請求項１４に記載の微量液滴の体積測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微量の液滴の体積を精度良くかつ正確に測定するのに適した微量液滴の体積の測定方法、およびその方法を実施する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、チップ分析法や多検体迅速分析技術の目覚しい発展により、環境・バイオ分野における分析装置のハイスループット化が加速している。それに伴い、試料溶液の微量化が加速しており、微量試料溶液を微小領域に多検体溶液を塗布するニーズも増大している。実際、近年開発されている環境・バイオ分野における試料分注装置が取り扱う試料量は、従来のマイクロリットルレベルからナノリットルレベルないしピコリットルレベルへと、より微量化している。
【０００３】
このような背景において、分析試料を高精度かつ正確に取り分けることは、分析結果の信頼性に大きく影響するため、微量試料溶液を精度良く正確に測定する手法の重要性も高まりつつある。また、同分野におけるトレーサビリティの観点からも、微量試料溶液を取り扱う試料分注装置の測定体積の校正は、ますます重要性を増すものと考えられる。
【０００４】
液滴の体積が大きい場合、従来法では水などの比重既知の液体の液滴を作成した後、この液滴の重量を測定することで、液滴の体積を求めている。この方法は、例えばマイクロピペットなどの、比較的大きな体積（０．５マイクロリットル以上）の液体を分注する機器の校正に広く使用されている。図１にこの方法の具体的手順を示した。すなわち、分注前および分注後の液体容器の重量（W1およびW2）と分注した液滴の個数nとから１個あたりの液滴重量wを求め、液体の比重rより液滴の体積Vを求める。または、分注した液体全体の重量Wを直接求め、同様の方法で液滴の体積Vを求める。この方法は、天秤など液滴の重量を測定する機器以外の特別な装置を用いることなく比較的容易に遂行可能であるが、測定中に液体の蒸発が起こるため液滴の正確な重量を測定することは難しく、特にその蒸発が無視できなくなるほど微量なナノリットルないしピコリットルレベルの液滴の場合には、この方法は適さない。
【０００５】
微量液滴の体積を求める他の方法として、インクジェット方式における吐出口から吐出した後の液滴の体積を、ストロボ、ＬＥＤ、レーザなどの光源を用い、パルス光で吐出口から飛び出している液滴を照明しながら顕微鏡で観察することによって測定する方法がある（例えば、特許文献１参照）。
【０００６】
この方法によれば、微量液滴の１個の体積を顕微鏡画像から測定することが可能であるが、吐出方向に対して直交する１方向ないし互いに直交する２方向からの外形寸法に基づいて液滴の断面形状を楕円で近似することにより体積を計算すること、顕微鏡画像撮影時に必要な光量を確保するため照射光パルス幅を０にできないこと、および微量液滴のため液体の蒸発が無視できないことから、誤差が生じやすかった。
【０００７】
微量液滴の体積を求める別の方法として、微量液滴を疎液体性表面で区切られた親液体性表面区域に付着させ、その区域内に全域に広がる液滴の三次元形状を光学式体積測定装置によって測定し、その三次元形状を積分することによって体積を計算する方法がある（例えば、特許文献２参照）。
【０００８】
この方法によれば、親液体性表面区域内に形成された液滴の体積を前述のような形状近似を行うことなく直接的に測定することが可能であるが、親液体性表面区域全域を覆うのに比較的大きな液体体積を必要とするため、微量液滴１個の体積を求めることは困難である。また、微量液滴のため液体の蒸発が無視できないことから、誤差が生じやすかった。これは、基板上に滴下した微量液滴を撮像し、液滴と基板間の接触角や接触径等の数値から液滴体積を計算する手法（例えば、特許文献４参照）でも同様である。
【０００９】
液体の蒸発をなるべく抑制するようにするため、シャーレ等に液滴を滴下した後に液滴に接するようにふたをすることで、液滴の大きさを規制し測定精度向上を図った微量液滴の体積測定法も報告されている（例えば、特許文献３参照）。しかし、液体がシャーレおよびふたとの間に残存する空気層へと蒸発することは避けられず、むしろ界面張力により液体の蒸発が促進されることで、測定誤差が生じやすい。これは、微量液滴を微細管に吸い込み、液滴が保持されている微細管の長さと断面積とから液滴の体積を計算する手法（例えば、特許文献５参照）でも同様である。
【００１０】
液体の形状や光学的特徴に依存しない液滴の体積測定法の観点から、電場を形成した流路に液滴を通過させることで、電場における静電容量の変化から液滴の体積を求める方法（例えば、特許文献６）も提案されている。しかし、比較的大きな液滴体積を必要とし、液体の蒸発が無視できないため、微量液滴への適応は困難であった。
【００１１】
静電気力に基づきパルス印加により微量液滴を形成させる手法に基づく科学分野においては、ノズル−基板間にパルス電位を印加させた状態で粒子を含む液体の液滴をノズルから基板上に滴下し、滴下の際に流れる電荷量を積分することで液滴の体積を求める方法（例えば、特許文献７）がある。しかし、液滴の分注と同時に電荷量を測定する必要があるため、液滴にパルス電位を印加させる機構を装備した分注装置にしか適用することはできず、適用可能な液体も粒子を含む必要があるため、微量液滴の体積を測定する一般的な手法とは言い難い。
【００１２】
水などの液体が一定量満たされたキュベットやマイクロタイタープレート等の小型容器内に、濃度既知の色素溶液を分注して希釈し、希釈前後の吸光度の変化から希釈倍率を求めることで分注した液滴の体積を求める方法がある。吸光光度計で測定するため、測定可能容量にメスアップする必要がある。しかし、希釈することで吸光度測定の誤差が大きくなることに加え、液体の蒸発が無視できないため、微量液滴への適応は困難であった。
【００１３】
すなわち、精度良く微量液滴の体積を求めるには、従来法では液体の蒸発が無視できず誤差が生じやすかった。従って、液体の蒸発に無関係な微量液滴の体積の測定法が必要であるが、現状ではそのようは方法の開発はなされておらず、上述のいずれかの方法により微量液滴の体積を求めているのが実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】特許公報第２９６２８８０号
【特許文献２】特開２００４−１７７２４３
【特許文献３】特開２００１−４１７９９
【特許文献４】特開２００６−１６７５３４
【特許文献５】特開２００３−１４４４２
【特許文献６】特開２００４−５１３７１０
【特許文献７】特開２００６−５８１８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであって、液体の蒸発に無関係に、精度良くかつ正確に微量液滴の体積を測定する方法およびその方法を実施する装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、検出可能な物性を有する濃度既知の標識物質を含む測定用液体を用いて液滴の分注を行い、分注した液滴内の標識物質の物性を検出するという方法によって、この液滴の体積を知るという上記目的が達成できるという知見を得た。また、液滴内の標識物質の物性検出を行う際に、液滴を載せるための測定用領域および必要であれば濃度を補正するための参照用領域を備えた基板を用い、参照用領域にて得られる物性値を基準とすることで、測定用領域の液滴に含まれる標識物質の絶対量が測定できることにより、上記目的が達成できるという知見を得た。
【００１７】
本発明は前記のような技術思想によって課題を解決したものであるが、より具体的には次のようなものである。即ち、本発明に係る微量液体の体積測定方法は、前記課題を解決するため、検出可能な物性を有する濃度既知の標識物質を含む測定用液体を用いて液体の分注を行い、分注した液体内の標識物質の物性を検出することにより、分注後の微量液体の体積を測定することを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定方法は、前記微量液体の体積測定方法において、基板上に形成した複数の空間に標識物質を含む測定用液体を分注するとともに、一部の空間に標識物質のみの液体を入れ、前記分注した測定用液体中の標識物質の物性を検出するとともに、標識物質のみの液体の物性を検出し、両検出値により分注後の測定用液体の体積を測定することを特徴とする。
【００１９】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定方法は、前記微量液体の体積測定方法において、基板上に形成した複数の空間の一部を液体を含まない空間とし、前記標識物質の液体の物性検出時の参照用空間として用いることを特徴とする。
【００２０】
前記測定用液体には分子量の大きな物質を添加し、測定用液体の蒸発速度を低下させることを特徴とする請求項１または２に記載の微量液滴の体積測定方法。
【００２１】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定方法は、前記微量液体の体積測定方法において、前記標識物質として吸光物質、蛍光物質、発光物質、または放射性同位体を用い、分注した液滴を搭載した基板をデンシトメータ、蛍光スキャナ、ルミノメータ、またはオートラジオグラフィを用いてイメージ化し、測定用液体内の標識物質から得られる吸光度、蛍光強度、発光強度、または放射線強度の物性値を画像として読み取り、標識物質のみの物性値と比較して測定用液体の体積を計算することを特徴とする。
【００２２】
また、本発明に係る微量液体の体積測定装置は、基板上に複数の空間を形成し、前記空間の一部に標識物質を含む測定用液体を分注するとともに、他の一部の空間に標識物質のみの液体を入れ、前記分注した測定用液体中の標識物質の物性を検出するとともに、標識物質のみの液体の物性を検出し、両検出値により分注後の測定用液体の体積を測定することを特徴とする。
【００２３】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記空間は前記基板とは別体に形成した隔壁の上下に貫通する複数の通孔であり、前記空間における基板側開口の周囲に形成した溝には、基板と接触する密封用Ｏリングを設けた治具を用いたことを特徴とする。
【００２４】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記空間の一部を液体を入れない空間とし、前記標識物質の液体の物性検出時の参照用空間として用いることを特徴とする。
【００２５】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記基板を導電性材料により形成し、電気化学活性物質を標識物質として用いることを特徴とする。
【００２６】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記隔壁の空間を密封する蓋を備え、前記標識物質のみを入れる空間には標識物質を全て充填して前記蓋により密封して光路長を規定する治具を用いたことを特徴とする。
【００２７】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記空間における基板側開口及び蓋側開口の周囲に形成した溝には、基板及び蓋にそれぞれ接触するＯリングを設け、基板と隔壁と蓋とを前記隔壁を挟持する固定部材によりＯリングを圧縮して一体化し固定したことを特徴とする。
【００２８】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記固定部材は、前記基板と蓋とを前記隔壁を挟持して固定するねじであることを特徴とする。
【００２９】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記固定部材は、内部に前記基板と蓋とを前記隔壁を挟持した状態でスライドして収納できる空間を備えた容器であることを特徴とする。
【００３０】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記隔壁を弾性材料により形成するとともに、自由状態時に該隔壁よりも高さの低い規定部材を設け、前記蓋による空間密封時に前記弾性材料の隔壁を圧縮し、該蓋を規定部材上面に密着することにより高さを規定して、光路長を規定することを特徴とする。
【００３１】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記基板には前記空間内の液体の物性を測定する電極を備え、電気化学活性物質からなる標識物質の性情を測定可能にしたことを特徴とする。
【００３２】
また、本発明に係る他の微量液体の体積測定装置は、前記微量液体の体積測定装置において、前記電極は作用電極と対電極とを分離して形成したことを特徴とする。
【発明の効果】
【００３３】
本発明は以上のように構成したので、液体の蒸発に無関係な微量液滴の体積の測定を、精度良くかつ正確に実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】従来法を説明する図である。
【図２】隔壁を説明する図である。
【図３】測定用基板上の参照用領域を説明する図である。
【図４】参照用領域の光路長を規定する方法を説明する図である。
【図５】参照用領域の光路長を規定する別の方法を説明する図である。
【図６】参照用領域の光路長を規定する別の方法を説明する図である。
【図７】参照用領域の光路長を規定する別の方法を説明する図である。
【図８】吸光物質を標識物質として用いた場合の、標識物質の絶対量を計算する方法を説明する図である。
【図９】電気化学活性物質を標識物質として用いた場合の、標識物質の絶対量を測定する方法を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、液体の蒸発に無関係に、精度良くかつ正確に微量液滴の体積の測定を提供するという課題を、検出可能な物性を有する濃度既知の標識物質を含む測定用液体を用いて液滴の分注を行い、分注した液滴内の標識物質の物性を検出するという方法によって実現したものである。また、液滴内の標識物質の物性検出を行う際に、液滴を載せるための測定用領域および必要であれば濃度を補正するための参照用領域を備えた基板を用い、参照用領域にて得られる物性値を基準とすることで、測定用領域の液滴に含まれる標識物質の絶対量を測定することによって実現したものである。
【００３６】
本発明における測定のポイントは、分注から測定までの段階で分注した液滴の液体が蒸発したとしても、分注する液体に含まれる標識物質の濃度と分注した液滴に含まれる標識物質の絶対量とから、液滴体積を正確に計算できるところにある。標識物質としては、吸光物質、蛍光物質、発光物質、放射性同位体、電気化学活性物質などを挙げることができ、また、標識物質の検出可能な物性としては、吸光度、濁度、蛍光強度、発光強度、放射線強度、電荷量（電子数）などを挙げることができる。
【００３７】
測定用液滴は、液体が蒸発することで液量が減少しても構わないし、また物性測定を容易にするため外部から液体を供給するなどして液量が増加しても構わない。蒸発速度を緩慢にするため、分子量の大きなアルコールやエーテル、糖、ペプチド、タンパク質などを添加しても良い。
【００３８】
測定用基板は、標識物質の物性に影響を与えない材質であることが望ましい。例えば、吸光物質を標識物質として使用する際には光を吸収しないガラスや石英などの材質の基板を用いることが望ましく、電気化学活性物質を標識物質として使用する際には電気伝導性を有する金や白金などの材質の基板を用いることが望ましい。
【００３９】
図２は、測定時に各液滴間での物性値が互いに干渉しないように、隔壁２などによって区切られた空間を有する測定用基板１の例である。この区切られた空間に各液滴を分注する。この隔壁２の材質としては、着色した石英・ガラス、樹脂、金属などを挙げることができる。例えば、吸光物質、蛍光物質、発光物質を標識物質として使用する際には、測定光が互いに干渉しないように、測定光を透過しない材質で作製された隔壁２を備えた基板１上に液滴を分注することが望ましい。
【００４０】
測定用基板１と隔壁２は一体として作製しても良いし両者を別々に作製して合わせても良い。両者を別々に作製して合わせる場合には、図２（ｃ）に示すように空間３の上下端周囲の溝にＯリング４、６など樹脂製のパッキンを設けることが望ましい。隔壁２が樹脂製である場合にはこれに限らない。両者を分離することで、液滴の分注を様々な表面性状を持つ基板１上に行うことができる。例えば、実際に分注される液滴の体積は、測定用基板表面、分注装置の吐出口表面および測定用液体の３者間の表面張力に依存する。分注装置の分注精度を液滴体積から測定する場合には、測定用基板の種類に応じた分注精度を求めることが可能となる。
【００４１】
図３は、濃度を補正するための参照用領域を備えた測定用基板１の例である。例えば、吸光物質を標識物質として使用する際には、光路長が規定された参照用領域を少なくとも２箇所装備し、少なくとも１箇所（領域Ｒ）を測定用液体で満たし、他の少なくとも１箇所（領域Ｂ）をブランクとすることで、吸光度と標識物質の絶対量との関係を知ることができる。この関係を用いることで、液滴中の標識物質の絶対量を計算することができるため、液滴の体積を計算することができる。同様の方法は、蛍光物質、発光物質、放射性同位体を標識物質として用いた場合にも適用可能である。
【００４２】
図４は、上記参照用領域における光路長を規定するための治具の例である。隔壁２に対して蓋を被せることで、参照用領域に満たされた測定用液体の光路長を隔壁の高さにより規定する。隔壁２と蓋との密着性を高めるため、図４（ｃ）に示すようにＯリングなどの樹脂製のパッキンを介して合わせることが望ましい。測定用基板１と隔壁２の両者が分離している場合にも、パッキンを介して合わせることは同様に望ましい。隔壁２が測定用基板１に対して密着性の良い樹脂製である場合にはこれに限らない。
【００４３】
図５は、上記参照用領域における光路長を規定するための治具の別の例である。隔壁が樹脂など容易に圧縮しうる軟質な材料で構成されている場合、硬質な材料で構成された参照用領域の光路長を規定する規定部材としての枠７を設け、この枠７の高さにより参照用領域の光路長を規定する。当該枠７の高さは隔壁２よりも低めに構成される。測定用基板１と当該枠７は一体として作製しても良いし、この例のように両者別々に作製して合わせても良い。
【００４４】
図６は、上記参照用領域における光路長を規定するための治具の別の例である。図４におけるパッキンを圧縮し、隔壁の高さにより参照用領域の光路長を規定するため、測定用基板１の垂直方向に対して圧力を掛けることで固定する。この例では４本のねじとしてのボルト９とナット１０で留める形式になっているが、他の固定の仕方でも良い。
【００４５】
図７は、上記参照用領域における光路長を規定するための治具の別の例である。この例では高さの規定された開口枠としての容器１１に側方からスライドして挿入する形式になっているが、他の固定の仕方でも良い。
【００４６】
分注した液滴に含まれる標識物質の絶対量は、次のようにして求めることができる。標識物質が吸光物質・蛍光物質・発光物質、放射性同位体の場合、分注した液滴を搭載した測定用基板をデンシトメータ・蛍光スキャナ・ルミノメータ・オートラジオグラフィ等でイメージ化し、液滴内の標識物質から得られる吸光度・蛍光強度・発光強度、放射線強度の物性値を画像として読み取り、参照用領域における物性値と比較して画像処理を行うことで、各液滴の体積を計算する。
【００４７】
図８に、吸光物質を用いた場合を例に計算方法を示した。測定用基板上に分注した液滴を図８−ａ、この測定用基板をイメージ化した画像を図８−ｂ、分注した液滴を横から見た図を図８−ｃに示した。液滴の体積をＶ、この液滴における吸光物質のモル数、濃度、およびモル吸光係数をｍ、ｃ、εとする。ｂにおける液滴のイメージ面積Ｓにおける微小面積をｓ（＝ｄＳ）とし、これを底面とする液滴の微小体積をｄＶ（＝ｄＳ×ｌｓ）、この微小体積における吸光物質のモル数をｄｍとする。また、強度Ｉ０の照射光が微小体積を透過して強度Ｉｓの透過光となったとする。この場合、微小面積ｓにおける吸光度Ａｓは、
【数１】
0005483134.tif 000002
と表される。一方、微小体積における吸光物質のモル数ｄｍは、
【数２】
0005483134.tif 000003
であるから、式(1)と式(2)より、
【数３】
0005483134.tif 000004
と表すことができる。ここで、実際に画像処理により得られる情報は、微小面積としてのイメージ化装置の画素（ピクセル）、その画素における照射光や透過光の強度としての輝度である。照射光および透過光の強度に相当する輝度をそれぞれｋ０、ｋｓとすると、以下のように表すことができる。
【数４】
0005483134.tif 000005
参照用領域から得られる情報により、式(3)のεおよび式(4)のｋ０を求めることができる。測定用液体を満たした領域Ｒの光路長をｌＲ、透過光をＩＲ、輝度をｋＲとすると、
【数５】
0005483134.tif 000006
と表すことができる。また、照射光の輝度ｋ０はブランク領域Ｂにおける輝度ｋＢと等しいとすることができる。
【数６】
0005483134.tif 000007
式(3)を式(4)、式(5)、式(6)によって表すと、
【数７】
0005483134.tif 000008
したがって、液滴の体積Ｖは以下のように表すことができる。
【数８】
0005483134.tif 000009
この式により、液体の蒸発に無関係に液滴の体積Ｖを計算することができる。
【００４８】
標識物質が電気化学活性物質の場合、電極を装備した測定用基板上に液滴を分注し、液滴中の電気化学活性物質を酸化もしくは還元することにより流れた電荷量（電子数）から、各液滴の体積を計算する。
【００４９】
図９に電気化学活性物質を用いた場合を例に測定方法を示した。電気化学活性物質を濃度c含む液体の液滴を測定用基板上に滴下し、液滴内部に少なくとも作用電極および対電極の２つの電極を配置し、両電極間に電圧を印加した際に流れる電流値iを測定する。電流値が０となるまで測定を行い、その際電流値から計算される全電荷量Ｑから、液滴中の電気化学活性物質のモル数ｍを計算することができる。電気化学活性物質の酸化還元電位よりも十分な電圧を印加する。液体そのものの酸化還元反応が妨害とならないよう、適切な酸化還元電位を有する電気化学活性物質を用い、印加電圧を選択する。液体中の電気化学活性物質の全てが酸化還元反応を完了すると、それ以上の反応が起こらないので測定電流値が自動的に０となる。全電荷量Ｑは、
【数９】
0005483134.tif 000010
と表される。電気化学活性物質が酸化還元反応によりｎ個の電子が移動するとすると、液滴中の電気化学活性物質のモル数はファラデー定数Ｆを用いて
【数１０】
0005483134.tif 000011
と表すことができる。したがって、液滴の体積Ｖは以下のように表すことができる。
【数１１】
0005483134.tif 000012
液体の蒸発が多少起こったとしても、もともとの液体における電気化学活性物質の濃度ｃを用いて、液滴の体積Ｖを計算することができる。
【００５０】
微量体積のバルク電解では、電気化学活性物質の拡散領域が微小領域に限定されており、また希釈を行わず微量液滴をそのまま電解に供することで電気化学活性物質の拡散速度の低下を回避することが可能になるため、電解完了までの時間が短いという利点がある。
【００５１】
図９に電極の配置の例を示した。（ａ）のように作用電極を測定用基板上に作製し、対電極を別の平面で配置しても良いし、（ｂ）、（ｃ）のように作用電極と対電極との両方を測定用基板上に作製しても良い。電極の形状は、（ｂ）のようにそれぞれの領域を完全に分離させても良いし、（ｃ）のようにお互いの間に入り込むくし型の形状でも良い。これら以外の他の配列・形状でも良い。
【００５２】
図９では作用電極と対電極による２電極系について説明したが、酸化還元電位を詳細に制御する目的でさらに参照電極を液滴内部に配置して、３電極系としても良い。この場合、参照電極は銀／塩化銀電極やカロメル電極等を使用できる。
【符号の説明】
【００５３】
１  基板
２  隔壁
３  空間
４  Ｏリング
５  蓋
６  Ｏリング
７  枠
８  孔
９  ボルト
１０  ナット
１１  容器
【図１】
0005483134.tif 000013
【図２】
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【図３】
0005483134.tif 000015
【図４】
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【図５】
0005483134.tif 000017
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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