(57)【要約】  配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、又は前記アミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、もしくは置換の少なくとも１つが生じたアミノ酸配列からなり、かつ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチド、をコードするＤＮＡ。本発明のＤＮＡは、簡便な操作で高純度なエンドグリコセラミダーゼを製造できることから、スフィンゴ糖脂質の研究、人工スフィンゴ糖脂質の合成等に好適に用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）又は（２）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（２）前記アミノ酸配列（１）において１以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、もしくは置換の少なくとも１つが生じたアミノ酸配列からなり、かつ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項２】
配列表の配列番号２記載の塩基配列を含有する請求項１記載のＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２記載のＤＮＡの相補鎖に厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載の組換えＤＮＡを含有するベクター。
【請求項６】
請求項４記載の組換えＤＮＡ又は請求項５記載のベクターを含有する形質転換体。
【請求項７】
請求項６記載の形質転換体を培養し、該培養物からエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを採取する工程を含む、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。更に詳しくは、糖脂質の構造や機能の解析等を行う糖鎖工学において有用なエンドグリコセラミダーゼをコードする塩基配列及び前記酵素のアミノ酸配列に関する。本発明は、また、該ＤＮＡを用いるエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの工業的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
スフィンゴ糖脂質は、スフィンゴシン塩基の第一級アルコール性水酸基がグリコシド結合によって単糖またはオリゴ糖と結合し、さらに脂肪酸が酸アミド結合したものであり、スフィンゴシン塩基と脂肪酸からなる部分をセラミドと呼んでいる（脂質の化学、第３６５頁、東京化学同人社、１９７４年発行）。スフィンゴ糖脂質は動物界に幅広く分布しており細胞表層を構成する主要な成分であり、血液型物質、細胞の抗原性、シグナル伝達、分化等の機能との関連性が注目されている。【０００３】
エンドグリコセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．１２３）はスフィンゴ糖脂質の糖鎖とセラミドの間のグリコシド結合を加水分解し完全な形の糖鎖とセラミドを遊離する酵素であるが、セレブロシダーゼとは異なり単糖がセラミドに結合したセレブロシドには作用しない。エンドグリコセラミダーゼは放線菌ロドコッカスにおいて産生されることが最初に発見された［非特許文献１］。更にロドコッカスは基質特異性の異なる３種類のエンドグリコセラミダーゼ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）を産生することが明らかとなっている［非特許文献２］。その後ヒル由来のもの［非特許文献３］、ミミズ由来のもの［非特許文献４］、細菌由来のもの［非特許文献５］、はまぐり由来のもの［非特許文献６］が報告されている。【０００４】
しかし、これまで発見された生物からエンドグリコセラミダーゼを製造しようとする場合、生産量が少ない、糖質分解酵素やスフィンゴミエリナーゼの混在の為、精製が困難である等の理由により、他の酵素の混在しない本酵素を簡便にかつ大量に得ることは非常に困難であった。従って、より安価に高純度な酵素を製造する方法が求められている。従来、エンドグリコセラミダーゼを各種生物から精製する方法に関しては前述のように報告があるが、アミノ酸配列や遺伝子構造に関してはロドコッカス由来のエンドグリコセラミダーゼＩＩ［特許文献１］やユウレイクラゲ（Ｃｙａｎｅａ  ｎｏｚａｋｉｉ）由来のエンドグリコセラミダーゼ［非特許文献７］について知られているのみである。これらのアミノ酸配列中には、βグルコシダーゼの活性中心に見られるＮＥＰ（Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ）配列が見出されているものの、アミノ酸配列全体の相同性は２１．９％と低く、共通のモチーフ構造も不明なため、これらの配列情報から他のエンドグリコセラミダーゼ遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的にその他のエンドグリコセラミダーゼを製造することは困難である。
【特許文献１】特開平９−０７０２９４号公報
【非特許文献１】ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２６１巻、第１４２７８〜１４２８２頁（１９８６）
【非特許文献２】ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６４巻、第１６号、第９５１０〜９５１９頁（１９８９）
【非特許文献３】バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、第１４１巻、第３４６〜３５２頁（１９８６）
【非特許文献４】バイオケミカル  アンド  バイオフィジカル  リサーチ  コミュニケーションズ、第１４９巻、第１６７〜１７２頁（１９８７）
【非特許文献５】ヨーロピアン  ジャーナル  オブ  バイオケミストリー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２０５巻、第７２９〜７３５頁（１９９２）
【非特許文献６】ザ  ファセブ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、第８巻、第Ａ１４３９頁（１９９４）
【非特許文献７】ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２７５巻、第３１２９７〜３１３０４頁（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従って、本発明の第１の目的は、ロドコッカス  エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。本発明の第２の目的は、これらのＤＮＡを組込んだ組換体を利用して、遺伝子工学的に高純度のエンドグリコセラミダーゼを製造する方法を提供することにある。本発明の第３の目的は、該製造方法により得られるポリペプチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、以上の状況に鑑み、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを単離し、その塩基配列を解明するために鋭意研究を続けた結果、遂にロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの完全解明に成功し、この知見を基に遺伝子工学的手法により、高純度のエンドグリコセラミダーゼを簡易かつ容易に製造することに成功し、本発明の完成に至った。【０００７】
即ち、本発明の要旨は、
［１］  以下の（１）又は（２）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（１）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド
（２）前記アミノ酸配列（１）において１以上のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、もしくは置換の少なくとも１つが生じたアミノ酸配列からなり、かつ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチド、
［２］  配列表の配列番号２記載の塩基配列を含有する［１］のＤＮＡ、
［３］  ［２］のＤＮＡの相補鎖に厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
［４］  ［１］〜［３］いずれか記載のＤＮＡを含有する組換えＤＮＡ、
［５］  ［４］の組換えＤＮＡを含有するベクター、
［６］  ［４］の組換えＤＮＡ又は［５］のベクターを含有する形質転換体、及び
［７］  ［６］の形質転換体を培養し、該培養物からエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを採取することを特徴とする、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法
に関する
【発明の効果】
【０００８】
本発明によりエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡが提供される。当該ＤＮＡを利用することにより、高純度のエンドグリコセラミダーゼを簡便な操作で製造することが可能となる。本発明により製造されるエンドグリコセラミダーゼは市販されているエンドグリコセラミダーゼとは基質特異性が異なることから、スフィンゴ糖脂質の研究、人工スフィンゴ糖脂質の合成等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】組換体エンドグリコセラミダーゼによるＧｂ３分解の経時変化を示す図である。
【図２】組換体エンドグリコセラミダーゼＩの反応至適ｐＨを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に本発明を詳細に説明する。【００１１】
本明細書において、エンドグリコセラミダーゼとは、前記のようにスフィンゴ糖脂質の糖鎖とセラミドの間のグリコシド結合を加水分解し、完全な形の糖鎖とセラミドを生成する酵素をいい、各種の生物由来のものが含まれる。例えば、ロドコッカス(Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌には基質特異性の異なる３種のエンドグリコセラミダーゼ（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ）の存在が知られている。エンドグリコセラミダーゼＩはグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３Ｃｅｒ）、グロボシド（Ｇｂ４Ｃｅｒ）、フォルスマン抗原（Ｇｂ５Ｃｅｒ）などのグロボ系列のスフィンゴ糖脂質に良く作用するという基質特異性を有しており、前述のロドコッカス  エンドグリコセラミダーゼＩＩ、ＩＩＩやユウレイクラゲのエンドグリコセラミダーゼとは基質特異性やその他の酵素化学的性質（分子量や等電点、最適ｐＨ）の点でも全く異なる酵素である。なお、本明細書において「エンドグリコセラミダーゼ活性を有する」とは、上記エンドグリコセラミダーゼＩ活性を有する、もしくはエンドグリコセラミダーゼＩＩよりもグロボ系列糖脂質によく作用する活性を有することを意味し、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６４巻、第１６号、第９５１０〜９５１９頁（１９８９）又は後述の実施例に記載の方法で当該活性を測定することにより調べることができる。【００１２】
本発明は、エンドグリコセラミダーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供する。【００１３】
エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチド（本明細書においては、単にエンドグリコセラミダーゼと記載する場合がある）とは、本明細書に開示された天然型のアミノ酸配列を有するエンドグリコセラミダーゼのみならず、同等の活性が認められる限り、天然型のアミノ酸配列に、例えば１以上、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２５個、さらに好ましくは１若しくは数個のアミノ酸残基の範囲でアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加等が生じたアミノ酸配列のポリペプチドをも包含する。さらに、前記のポリペプチドのＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖（例えば精製に使用されるタグ配列等）を付加したポリペプチドも本発明に包含される。【００１４】
また、ここで言う天然型のアミノ酸配列を有するエンドグリコセラミダーゼとしては、例えばロドコッカス由来のエンドグリコセラミダーゼＩが挙げられるが、本発明においてはこれに限定されるものではなく、その他の細菌類（放線菌を包含する）はもちろん、酵母類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来のもの、あるいは植物、動物、昆虫等の生物体由来のものも含まれる。【００１５】
一般に、機能的に同等の活性を有するポリペプチドは、それをコードするＤＮＡが相同性を有することが多い。したがって、本発明のＤＮＡの相補鎖と厳密な条件においてハイブリダイズすることができ、かつ、エンドグリコセラミダーゼの活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。なお、本明細書において「厳密な条件においてハイブリダイズすることができるＤＮＡ」とは、例えば、後述の条件により得られるＤＮＡのことを意味する。【００１６】
以下にロドコッカス属細菌由来のエンドグリコセラミダーゼＩを例として本発明を詳細に説明する。【００１７】
ロドコッカス  エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）の全ゲノム配列が解読されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｒ＿ｅｑｕｉ／）。このゲノム配列情報に基づいて、既に遺伝子がクローニングされているロドコッカス  エンドグリコセラミダーゼＩＩのアミノ酸配列との比較を行い、機能未知であり、かつロドコッカス  エンドグリコセラミダーゼＩＩのアミノ酸配列との相同性が好ましくは２５％、より好ましくは３０％、さらに好ましくは４０％以上である配列をエンドグリコセラミダーゼＩ候補配列として選択することができる。配列候補は１つであっても良いし、複数個であっても良い。この候補配列の配列情報を元に、候補遺伝子をクローニングするには、一般的にＰＣＲ法あるいはハイブリダイゼーション法を用いる事ができる。なお、本明細書において「相同性」とは、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、ＦＳＡ−ＢＬＡＳＴ(http://www.fsa-blast.org/)、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ(http://blast.wustl.edu/)やＦＡＳＴＡ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘなど様々なアルゴリズムを搭載したプログラムにより算出することができる。【００１８】
ＰＣＲ法でクローニングを行う場合、まず、候補配列の開始コドン近傍と終止コドン近傍の配列に対応するＰＣＲプライマーをデザインする。この際、後のクローニング操作で利用するためにプライマーに制限酵素認識配列を付加しておくことが出来る。次にこれらのプライマーセットを用いて、ロドコッカス  エクイのゲノムＤＮＡを鋳型として、定法に従ってＰＣＲを行うことにより、候補遺伝子断片を得る。増幅産物の確認は情報に従ってアガロースゲル電気泳動などの方法によって行うことができる。目的のサイズの遺伝子断片が増幅されていた場合には、この断片をアガロースゲルから抽出、精製して適切なベクター、例えばプラスミドベクターに組込む。プラスミドベクターとしては、例えば市販のｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴＶ１１８Ｎ（全てタカラバイオ社製）などが使用できるがこれらに限定されるものではない。候補遺伝子断片とプラスミドベクターの双方を、例えば前述のＰＣＲプライマーに付加しておいた配列を認識する制限酵素で消化した後にライゲーションし、候補遺伝子断片をプラスミドベクターに組み込んだ組換えプラスミドを作製することができる。【００１９】
次いで、上記の組換えプラスミドを宿主細胞に導入して形質転換体を作製する。宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌や放線菌等の原核細胞、酵母、真菌や動物、植物由来の真核細胞のいずれも使用することができる。大腸菌は高い形質転換能を有する種々の菌株が知られており、また、容易に入手することができる。形質転換も公知の方法に従えばよい。【００２０】
形質転換されたクローンは、例えば組換えプラスミドに保持されているレポーター遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子の発現を指標に選択することができる。さらに、得られたクローンより目的の候補遺伝子断片を含むベクターを有するクローンを選択する。選択の方法はベクターの種類によって選択すればよく、特に限定はない。例えばコロニーハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法による挿入ＤＮＡの検出、クローンより調製したプラスミドの制限酵素による切断パターン確認、等の方法が利用できる。ベクターとしてファージベクターを使用した場合にはプラークハイブリダイゼーション法を使用してもよい。【００２１】
候補遺伝子断片を含むクローンが選別できればこのクローンより組換えプラスミドを調製する。さらに当該プラスミドに挿入されている候補遺伝子断片の塩基配列を通常の方法、例えばジデオキシチェーンターミネーター法により決定することによって、候補遺伝子がコードしているアミノ酸配列を確認する事ができる。【００２２】
上記の候補遺伝子がエンドグリコセラミダーゼＩをコードしていることは、当該遺伝子を保持する形質転換体におけるエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの発現を調べることにより確認できる。まず前記遺伝子を含む発現ベクターを構築して宿主細胞を形質転換し、形質転換体を作製する。次いで該転換体の培養を通常用いられる条件で行うことによって、前記遺伝子にコードされているポリペプチドを生産させ、その酵素活性を測定する。前記のロドコッカス属細菌由来のエンドグリコセラミダーゼＩ候補遺伝子をクローニングした場合には、得られた遺伝子がエンドグリコセラミダーゼＩをコードするものであることを確認するために、当該候補遺伝子から生産される産物がＮａｔｉｖｅ体のエンドグリコセラミダーゼと同じ酵素化学的性質、例えばエンドグリコセラミダーゼＩＩとは異なる基質特異性等を持つことを確認する必要がある。【００２３】
形質転換体において候補遺伝子を発現させるためには、例えば前記遺伝子を使用する宿主に適したプロモーターの下流に接続した発現ベクターが構築される。大腸菌の発現ベクターはさまざまな種類のものが開発されており、また、その多くが市販されている。これらはそれぞれのベクターの特性に応じて選択し、使用すればよい。前記発現ベクターを使用して候補遺伝子にコードされるポリペプチドを発現させた菌体を回収し、溶菌、超音波処理等により菌体内に生成蓄積されたポリペプチドを可溶化し、遠心分離上清として組換え体の無細胞抽出液（粗酵素液）を得ることができる。場合によっては該ポリペプチドを封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）の形で生産させることもできる。【００２４】
大腸菌以外の宿主、たとえばロドコッカス  エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）を使用して候補遺伝子にコードされているポリペプチドを発現させることができる。例えば国際公開第２００４／０２１６７９２号パンフレットに記載の発現ベクターｐＴｉｐベクターに前記の候補遺伝子を挿入して作製された組換えプラスミドでロドコッカス  エリスロポリスを形質転換し、得られた形質転換体を前記の公報に記載の条件で培養することによりポリペプチドを発現させることができる。【００２５】
発現されたポリペプチドの酵素活性は、例えば形質転換体の無細胞抽出液や培養上清を試料として、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２６４巻、第１６号、第９５１０〜９５１９頁（１９８９）に記載の方法に従ってＧＭ１を基質としパーク・ジョンソン法により測定することができる。また、グロボ系列糖脂質、例えばＧｂ３Ｃｅｒを基質としてエンドグリコセラミダーゼに特徴的なグロボ系列糖脂質に対する活性を測定することができる。目的のエンドグリコセラミダーゼの活性が認められた場合は、本発明の目的のエンドグリコセラミダーゼ遺伝子、すなわち本発明のＤＮＡが単離されたこと、並びに、その遺伝子配列、アミノ酸配列が確認されたこととなる。【００２６】
本発明のＤＮＡは、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを有する単離されたＤＮＡであり、具体例としては、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられる。また、配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列において１以上、好ましくは１〜８０個、より好ましくは１〜５０個、さらに好ましくは１〜２５個、さらに好ましくは１若しくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、もしくは置換の少なくとも１つが生じており、かつ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも含むものである。このようなアミノ酸配列としては、例えば、好ましくは配列番号１記載のポリペプチドに８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、より好ましくは配列番号１記載のポリペプチドに９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、さらに好ましくは配列番号１記載のポリペプチドに９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、さらに好ましくは配列番号１記載のポリペプチドに９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列が例示される。さらに、本発明の好適なＤＮＡの例としては、配列表の配列番号２に記載した塩基配列のＤＮＡを含有するものが挙げられる。また、本発明のＤＮＡはポリペプチドのシグナル配列部分をコードする領域を含むものも、含まないものも包含する。【００２７】
本発明においては、更にこれらのＤＮＡの相補鎖に厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡであって、かつ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをも含むものである。前記の「厳密な条件においてハイブリダイズ可能なＤＮＡ」は、例えば以下の方法により取得できる。【００２８】
まず他の細胞の遺伝子源から得た染色体ＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡより逆転写酵素により作製したｃＤＮＡを常法に従いプラスミドやファージベクターに接続して宿主に導入し、ライブラリーを作製する。そのライブラリーをプレート上で培養し、生育したコロニー又はプラークをニトロセルロースやナイロンの膜に移し取り、変性処理によりＤＮＡを膜に固定する。この膜をあらかじめ適当な化合物で標識したプローブ（使用するプローブとしては、配列表の配列番号２の塩基配列に相補的なＤＮＡ、または当該ＤＮＡの配列の連続した１２塩基以上からなるその一部を使用することができる）を含む溶液中で保温し、膜上のＤＮＡとプローブとの間でハイブリッドを形成させる。【００２９】
具体的には、例えばＤＮＡを固定化した膜を、６×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡ、５×デンハルツを含む溶液中で６５℃で２０時間、プローブとハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、非特異的吸着を洗い流し、オートラジオグラフィー等によりプローブとハイブリッド形成したクローンを同定する。この操作をハイブリット形成したクローンが単一になるまで繰り返す。前記の洗浄について、例えば０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃という条件が例示される。こうして得られたクローンの中には、本発明のＤＮＡと高い相同性を有するＤＮＡが保持されていると予想される。このクローンから得られたＤＮＡは、例えば公知の方法によりその塩基配列を決定し、得られた遺伝子が目的のエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであるかを確認することができる。また、前記と同様に適当な宿主−ベクター系を使用してこのＤＮＡがコードしているポリペプチドを発現させ、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するかどうかを調べることができる。【００３０】
上記の操作で得られたＤＮＡがエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする領域の全てを含まないと考えられる場合には、得られたＤＮＡの塩基配列に基づいて合成ＤＮＡプライマーを作製し、ＰＣＲにより足りない領域を増幅したり、得られた遺伝子の断片をプローブとして、更にＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしたりすることにより、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの全コード領域を含むＤＮＡを取得することができる。【００３１】
本発明のＤＮＡの塩基配列が明らかとされたことにより、前記塩基配列に基づいて、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを検出するためのプローブ、当該ＤＮＡまたはその断片を増幅するためのプライマーを作製することが可能となる。前記のプローブ、プライマーは、例えば配列番号２に示される塩基配列の一部の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、作製することができる。特に限定するものではないが、プローブの鎖長は好ましくは１２〜５０塩基、より好ましくは１５〜４０塩基であり、プライマーの鎖長は好ましくは１２〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基である。これらのプローブ、プライマーも本発明の態様の一つである。【００３２】
本発明のＤＮＡは、後述のエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの製造に使用することを目的として、適切なプロモーターの下流に接続した組換えＤＮＡとすることができる。プロモーターは使用しようとする宿主に応じたものを選択すればよい。さらに、こうして得られた組換えＤＮＡを挿入した、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチド発現用の発現ベクターを作製することもできる。例えば大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等において発現できるような発現ベクターがすでに多数知られており、本発明に使用することができる。前記の発現ベクターは公知のベクター、例えば市販のベクターに本発明のＤＮＡを挿入することでも作製してもよい。【００３３】
次に、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを遺伝子工学的に製造する方法について説明する。まず前記のような本発明のエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えＤＮＡや発現ベクターを適当な宿主細胞、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等に導入して作製された形質転換体を作製する。この形質転換体を培養することにより、エンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを生産させることが出来る。また、真核生物由来のエンドグリコセラミダーゼの場合、酵素自身に糖鎖を有している可能性があり、本発明のエンドグリコセラミダーゼ遺伝子にハイブリダイズする真核生物由来のエンドグリコセラミダーゼ遺伝子を用い、宿主として糖鎖生合成能力を持たない細胞、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌の様な原核生物、あるいは酵母、真菌、動物細胞、昆虫細胞及び植物細胞の糖鎖生合成能力を失った変異細胞を用いることによって糖鎖を持たないエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを発現させることができる。特に本発明を限定するものではないが、放線菌に属する微生物、たとえばロドコッカス属の微生物はエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを発現させるための宿主として好適である。【００３４】
ポリペプチドの発現は、前記のような方法によりエンドグリコセラミダーゼ活性を測定することにより確認できる。形質転換体からエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドを精製するには、通常のタンパク質精製の手法を用いることができる。例えば、培養菌体を破砕し、目的のポリペプチドが可溶化していればその上清を直接、もしくは適切な前処理（塩析や限外ろ過等）を施した後にアフィニティー、疎水、イオン交換、ゲル濾過等のクロマトグラフィーに供することによって目的のポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドが培地中に分泌されている場合も同様に精製すればよい。発現産物が細胞内に不溶物として蓄積されている場合は、細胞を破砕後、沈澱を回収し、尿素などの穏和な変性剤で可溶化する。その後、変性剤を除き、リフォールディングさせた後、前述のようなクロマトグラフィーにより目的の活性を持ったポリペプチドを得ることができる。【００３５】
このように、本発明によりエンドグリコセラミダーゼの一次構造及び遺伝子構造が提供される。更に、エンドグリコセラミダーゼの遺伝子工学的な製造が可能となる。本発明の遺伝子工学的製造方法を用いれば安価に高純度なエンドグリコセラミダーゼを得ることが可能となる。また、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズする合成オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、常法により本発明のＤＮＡの検出や増幅等に有用である。さらに、本発明により取得されたエンドグリコセラミダーゼを抗原として当該ポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片を得ることが可能となる。前記の抗体又はその断片は本発明のエンドグリコセラミダーゼの精製、検出等において有用である。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりなんら限定されるものではない。【００３７】
実施例１  エンドグリコセラミダーゼＩ構造遺伝子のクローニング
ロドコッカス  エクイの全ゲノム配列情報（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｒ＿ｅｑｕｉ／）を元にして、ロドコッカス  エンドグリコセラミダーゼＩＩ［特許文献１］とのアミノ酸配列との比較を行った。この比較によって見出された、エンドグリコセラミダーゼＩＩと２８％の相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子をエンドグリコセラミダーゼＩ候補遺伝子として選択した。【００３８】
選択したエンドグリコセラミダーゼＩ候補遺伝子の開始コドンと終止コドン周辺の核酸配列をもとに、センスプライマーＬＣＨ１６９−Ｅ１ｓ、アンチセンスプライマーＬＣＨ１６９−Ｅ１Ａｎをデザインし、ＤＮＡ合成機で合成した。配列表の配列番号３、４にそれぞれプライマーＬＣＨ１６９−Ｅ１ｓ、ＬＣＨ１６９−Ｅ１Ａｎの塩基配列を示す。センスプライマー中には制限酵素ＮｄｅＩの、アンチセンスプライマーには制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列が挿入してある。これらのプライマーを用いて、ロドコッカス  スピ−シズ  Ｍ７５０株（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ｓｔｒａｉｎ  Ｍ７５０；非特許文献２）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。前記菌株は１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列の解析からロドコッカス  エクイと同種であることが明らかにされている。【００３９】
ゲノムＤＮＡの抽出精製は以下の操作で実施した。ロドコッカス  スピ−シズ  Ｍ７５０株を１．５％マイコロジカルペプトン（オクソイド社製）、０．２％  ＮａＣｌ、０．１％  酵母エキスを含む培地９００ｍＬ（ｐＨ７．０）に接種し３日間、２８℃で振とう培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体を集め１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液（ｐＨ８．０）４．５ｍＬに懸濁した後、凍結、融解を行った。この菌体に５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、４ｍｇ／ｍＬリゾチームを含む緩衝液（ｐＨ８．０）２．５ｍＬを加え、３０℃で１６時間保温した。さらに抽出緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１％ＳＤＳ、０．４ｍｇ／ｍＬプロティナーゼＫ、ｐＨ７．５）１０ｍＬを加え５０℃で１６時間保温し、更に抽出緩衝液１０ｍＬを追加し１６時間保温した。この後、室温に戻し、等容量のＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム溶液を加えて穏やかな回転攪拌を１６時間行い、次いで３５００ｒ／ｍｉｎで３０分間遠心した後上層を回収した。この溶液を５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して４℃で透析を行いゲノムＤＮＡ溶液を得た。【００４０】
ＰＣＲは、前記のゲノムＤＮＡとＬＣＨ１６９−Ｅ１ｓ、ＬＣＨ１６９−Ｅ１Ａｎを含む反応液を９４℃、９分処理した後、９４℃、０．５分〜５６℃、０．５分〜７２℃、２分を１サイクルとする３０サイクルという条件で行なった。アガロースゲル電気泳動での分析で、このＰＣＲにより約１．５ｋｂｐの特異的なＤＮＡ断片が増幅していることが確認された。アガロースゲルからこのＤＮＡ断片のバンドを切り出し、イージートラップ（ＥＡＳＹＴＲＡＰ（登録商標）、タカラバイオ社製）を用いてＤＮＡ断片の抽出精製を行った。【００４１】
得られたＤＮＡ断片と発現ベクターｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．２［バイオテクノロジー  アンド  バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第８６巻、第１３６〜１４８頁（２００４）］の双方を制限酵素ＮｄｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ライゲーションミックス（ニッポンジーン社製）を用いてライゲーションして発現プラスミドｐＴｉｐ−ＥＧＣＩを得た。こうして得られた発現プラスミドｐＴｉｐ−ＥＧＣＩで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、５０μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ培地（１．５％寒天）に撒き、３７℃で一晩培養した。コロニーを釣菌して３ｍＬの５０μｇ／ｍＬアンピシリン入りＬＢ培地で一晩液体培養し、培養菌体を回収してプラスミドを抽出した。回収したプラスミドを制限酵素ＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化してアガロースゲル電気泳動で分析したところ、約１．５ｋｂのインサートの存在を確認する事が出来た。【００４２】
実施例２  組換体エンドグリコセラミダーゼＩの放線菌における発現
実施例１で得られた発現プラスミドｐＴｉｐ−ＥＧＣＩを用いてロドコッカス  エリスロポリスを形質転換した。当該微生物の形質転換は国際公開第２００４／０２１６７９２号パンフレットあるいはバイオテクノロジー  アンド  バイオエンジニアリング  第８６巻、第１３６−１４８頁（２００４）に記載の方法に従って行った。【００４３】
まず、ロドコッカス  エリスロポリス  ＪＣＭ３２０１株（独立行政法人  産業技術総合研究所）をＬＢ培地１００ｍＬにて対数増殖期まで３０℃で振とう培養した。培養液を３０分間氷冷し遠心分離によって菌体を回収した。氷冷滅菌水１００ｍＬで洗浄後、遠心分離によって回収した菌体を、さらに氷冷１０％グリセロール溶液で２回洗浄した。洗浄後遠心分離で回収した菌体を５ｍＬの氷冷１０％グリセロール溶液に懸濁した。この懸濁液を４００μＬずつ分注したのち、液体窒素で瞬間凍結して使用時まで−８０℃にて保存した。以後これをエレクトロセルと呼ぶ。【００４４】
エレクトロセルを氷上で融解し、実施例１で得られた発現プラスミドｐＴｉｐ−ＥＧＣＩを数１００ｎｇ程度加えた。このエレクトロセルと発現プラスミドの混合液をエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製：０．２ｃｍギャップキュベット）に移し、ジーンパルサーＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、電場強度２．５ｋＶ、キャパスタンス２５μＦ、外部抵抗４００Ωの条件で電気パルスを与えた。処理後の混合液を１ｍＬのＬＢ培地と混合し、２５℃で５時間振とう培養を行った。培養液１０μＬを生理食塩水５０μＬに加えて、終濃度１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りＬＢ寒天培地に撒いた。これを３０℃で４日間培養して形質転換体を得た。【００４５】
形質転換体のコロニーを釣菌して１０ｍＬの１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りＬ培地に接種し、１５０ｒ／ｍｉｎ、２５℃で３．５日間振とう培養して前培養を行った。引き続き、１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコール入りＬ培地２０ｍＬに前培養の培養液を１／１０量添加して振とう培養して本培養を行った。波長６００ｎｍにおける吸光度が０．６に達すると（対数増殖期に入ると）終濃度１μｇ／ｍＬになるようにチオストレプトンを加えて発現誘導を行った。誘導後さらに１５０ｒ／ｍｉｎ、２５℃で１６時間振とう培養を行った。【００４６】
培養終了後、培養液５００μＬを遠心分離して上清を回収した。培養上清５００μＬに終濃度１０％になるようにトリクロロ酢酸を加えて生成した沈殿を遠心分離で回収した。沈殿を５００μｌＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、２００μＬのＰＢＳに懸濁して、０℃で３０秒間、合計１０回ソニケーションを行い、遠心分離（４℃、１５０００ｒ／ｍｉｎで１５分）して上清を回収し、粗酵素液とした。【００４７】
実施例３  組換体エンドグリコセラミダーゼＩの精製
発現プラスミドｐＴｉｐ−ＥＧＣＩに用いた発現ベクターｐＴｉｐ−ＬＣＨ２．２は発現タンパク質のＮ末端にＨｉｓ−Ｔａｇが付加するようにデザインされているので、実施例２で発現した粗酵素はニッケルアフィニティークロマトグラフィによる精製が可能である。【００４８】
まず、実施例２で得られた粗酵素液を７０％硫酸アンモニウムで沈殿させ、遠心分離によって回収した沈殿に１００ｍＬの２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を加えて溶解した。これをＨｉＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ（ｈｉｇｈ  ｓｕｂ）（５ｍＬ：ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を用いた疎水クロマトグラフィーに供した。０．２５ｍＭ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）でカラムを洗浄した後、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で溶出を行った。【００４９】
疎水クロマトグラフィーの溶出液を透析用セルロースチューブ（Ｖｉｓｋａｓｅ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，  ｉｎｃ．製）に充填し、１００倍容量の０．１％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）中で透析を行った。次に透析後の疎水クロマトグラフィーの溶出液を、Ｎｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）に供した。結合バッファーとして２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）を用い、カラムからの溶出は１５０ｍＭ  イミダゾールと１％トリトンＸ−１００を含む２０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で行った。溶出画分を０．１％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）に対して一晩透析を行い、精製組換体エンドグリコセラミダーゼＩとした。【００５０】
精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（クマシー染色）で分析した結果、５３ｋＤａ付近に単一のバンドが観察された。【００５１】
実施例４  組換体エンドグリコセラミダーゼＩの活性確認
実施例３で精製したエンドグリコセラミダーゼＩの活性を非特許文献２の記載に従って、アシアロＧＭ１を基質としパーク・ジョンソン法により測定した。すなわち、終濃度５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に２．５ｎｍｏｌの精製アシアロＧＭ１、適当量の精製酵素および終濃度０．１％トリトンＸ−１００を溶解した２０μＬの反応混合液を３７℃にて１５分間インキュベートした。反応は５０μＬのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を添加して停止させた。ついで、生成した還元糖をパーク・ジョンソン法［ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第１８１巻、第１４９〜１５１頁（１９４９）］で測定した。コントロールとしては、酵素を添加しない反応液を３７℃で１５分間インキュベートした後に反応停止液を添加し、その後に酵素を添加したものを用いた。本酵素の１ユニットは、上記の条件下で１分間当たり１μｍｏｌのＧＭ１の加水分解を触媒するに要する酵素量と定義する。その結果、精製エンドグリコセラミダーゼＩには２１０Ｕ／ｍｇの活性を確認する事が出来た。【００５２】
実施例５  組換体エンドグリコセラミダーゼＩによるグロボトリアオシルセラミドの分解
実施例３で精製したエンドグリコセラミダーゼＩによるグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３、ナカライテスク株式会社製）の加水分解反応を行った。対象として組換体エンドグリコセラミダーゼＩＩ（タカラバイオ株式会社製）を用いた。反応に用いたバッファーは０．１％トリトンＸ−１００を含む２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで、エンドグリコセラミダーゼＩはｐＨ５．５、エンドグリコセラミダーゼＩＩはｐＨ５．０であった。基質Ｇｂ３を２．５ｎｍｏｌ、酵素を３ｍＵ含有する反応液２０μＬを３７℃で１６時間まで反応させた。反応液に５０μＬのクロロホルム／メタノール（２：１、ｖ／ｖ）混合液を加えて反応を停止させた後、全量をＴＬＣプレート（シリカゲルプレート、メルク社製）にアプライし、クロロホルム／メタノール／０．０２％ＣａＣｌ２（５：４：１、ｖ／ｖ／ｖ）で展開した。検出はオルシノール硫酸試薬を用いて行った。図１は、組換体エンドグリコセラミダーゼによるＧｂ３の加水分解反応を経時的に観測した結果である。図中ＥＧＣａｓｅＩは組換体エンドグリコセラミダーゼＩを、ＥＧＣａｓｅＩＩは組換体エンドグリコセラミダーゼＩＩを意味する。縦軸に基質Ｇｂ３の分解率（％）、横軸は反応時間を表す。組換体エンドグリコセラミダーゼＩはグロボ系糖脂質であるＧｂ３を組換体エンドグリコセラミダーゼＩＩよりも効率よく分解した。【００５３】
実施例６  組換体エンドグリコセラミダーゼＩの反応最適ｐＨ
基質Ｇｂ３を２．５ｎｍｏｌ、組換体エンドグリコセラミダーゼＩを１０μＵ含有する反応液１０μＬを３７℃で３０分間反応させた。用いたバッファーは以下の通り：ｐＨ３．５−６．０：酢酸ナトリウムバッファー（系列１）；  ｐＨ６．５−８．５：リン酸ナトリウムバッファー（系列２）；  ｐＨ９．０：トリス塩酸バッファー（系列３）。バッファー終濃度は２５ｍＭで、全て０．１％トリトンＸ−１００を含有する。結果を図２に示す。図中縦軸は基質Ｇｂ３の分解率、横軸は反応ｐＨを示す。組換体エンドグリコセラミダーゼＩの反応最適ｐＨは５〜６の範囲であった。【００５４】
実施例７  組換体エンドグリコセラミダーゼＩの基質特異性
各種スフィンゴ糖脂質２．５ｎｍｏｌを含むバッファー（０．１％トリトンＸ−１００を含む２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーｐＨ５．５）中、以下の条件で反応を行った。
条件Ｉ：  組換体エンドグリコセラミダーゼＩ酵素量０．３ｍＵ、２時間反応
条件II：  組換体エンドグリコセラミダーゼＩ酵素量１．５ｍＵ、１６時間反応
ＧＭ１ａ、ＬａｃＣｅｒはシグマ  アルドリッチ社から、ＧＤ１ａは和光純薬工業から、Ｇｂ３はナカライテスク社から、それぞれ購入した。Ｇｂ４は理化学研究所、鈴木實氏に恵与いただいた。ＴＧＣはザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー、第２８２巻、第１１３８６〜１１３９６頁（２０００）に記載された方法により合成した。【００５５】
反応後、実施例５と同様の方法でＴＬＣによって分解率を測定した。結果を表１に示す。組換体エンドグリコセラミダーゼＩはグロボ系糖脂質を良く分解し、組換体エンドグリコセラミダーゼＩＩよりもグロボ系糖脂質に対する基質特異性が高いことが示唆された。【００５６】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明によりエンドグリコセラミダーゼＩのアミノ酸配列及び塩基配列が初めて明らかとなり、これによりエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することが可能となった。また、該ＤＮＡを用いるエンドグリコセラミダーゼ活性を有するポリペプチドの工業的に有利な遺伝子工学的製造方法が提供される。
【配列表フリーテキスト】
【００５８】
SEQ ID NO:3 ; Primer LCH169-E1s to amplify the DNA encoding Endoglycoceramidase I.
SEQ ID NO:4 ; Primer LCH169-E1An to amplify the DNA encoding Endoglycoceramidase I.
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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