(57)【要約】【課題】劣化した部分を含む泳動データであっても塩基配列を正確に解析することができるようにする。【解決手段】以下の工程（Ａ）から（Ｃ）をその順に含んで核酸の塩基配列を決定する。（Ａ）試料核酸を電気泳動分離して得られた４種類の塩基種別のピークを含む電気泳動データから基盤ピークを抽出する基盤ピーク抽出工程、（Ｂ）抽出された基盤ピークにより構成される時系列データにおいて、探索を開始する探索始点基盤ピーク及びピーク間隔基準値を設定する条件設定工程、（Ｃ）前記時系列データにおいて、探索始点基盤ピークを始点として、隣接する基盤ピーク間を時系列の前方向及び後方向に順次走査し、基盤ピーク間の間隔を前記ピーク間隔基準値とを比較してピーク欠落区間に補間ピークを追加することにより塩基配列を決定する。【選択図】      図２
2008050426.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程（Ａ）から（Ｃ）をその順に含む核酸の塩基配列決定方法。
（Ａ）試料核酸を電気泳動分離して得られた４種類の塩基種別のピークを含む電気泳動データから基盤ピークを抽出する基盤ピーク抽出工程、
（Ｂ）抽出された基盤ピークにより構成される時系列データにおいて、探索を開始する探索始点基盤ピーク及びピーク間隔基準値を設定する条件設定工程、
（Ｃ）前記時系列データにおいて、探索始点基盤ピークを始点として、隣接する基盤ピーク間を時系列の前方向及び後方向に順次走査し、基盤ピーク間の間隔を前記ピーク間隔基準値とを比較してピーク欠落区間に補間ピークを追加することにより塩基配列を決定する塩基配列決定工程。
【請求項２】
前記工程（Ａ）と（Ｂ）の間に以下の工程（ａ）から（ｃ）をその順に含み、工程（ｃ）で移動度補正された時系列データを工程（Ｂ）での時系列データとする請求項１に記載の塩基配列決定方法。
（ａ）抽出された基盤ピークにより構成される時系列データを小区間に分割する区間分割工程、
（ｂ）分割された各区間の基盤ピークの配列状態の最も良い区間を抽出して最良区間とする最良区間抽出工程、及び
（ｃ）抽出された最良区間から塩基種別の移動度差に基づく移動度補正量を算出し、その移動度補正量を使用して前記時系列データ全体に移動度補正を実行する移動度補正工程。
【請求項３】
（ｂ）の最良区間抽出工程では、各小区間で塩基種別の移動度差に基づく最適移動度補正工程を行った後のピーク総面積が最大になる小区間を最良区間として抽出する請求項２に記載の塩基配列決定方法。
【請求項４】
前記最適移動度補正工程は、各小区間で４種類の塩基に対応する４種類の検出データを並べた状態で、４種類の検出データのうち１から３種類の検出データを固定し、残る検出データを前後方向に移動させてピーク波形の総面積が最大になるように検出データを移動させる工程である請求項３に記載の塩基配列決定方法。
【請求項５】
（ｂ）の最良区間抽出工程では、小区間ごとに基盤ピークのピーク間隔を計測し、そのばらつきが最小になる区間を最良区間として抽出する請求項２に記載の塩基配列決定方法。
【請求項６】
前記ばらつきの評価は、小区間内のピーク間隔最小値Dminとピーク間隔最大値Dmaxの比によって行ない、その比Dmin/Dmaxが大きいほどばらつきが小さいものとする請求項５に記載の塩基配列決定方法。
【請求項７】
リピート配列のみを含んでいる小区間であると判定されたときは、上記比Dmin/Dmaxに１より小さい数値をかけて評価を下げる請求項６に記載の塩基配列決定方法。
【請求項８】
（ａ）の区間分割工程では隣接する小区間を相互にオーバーラップさせて区間の数を多くする請求項２に記載の塩基配列決定方法。
【請求項９】
（ｃ）の移動度補正工程では、最良区間に対し、４種類の塩基に対応する４種類の基盤ピークを並べた状態で、４種類の基盤ピークのうち１から３種類の基盤ピークを固定し、残る基盤ピークを前後方向に移動させてピーク波形の総面積が最大になるように基盤ピークを移動させたときのその移動量をその基盤ピークにかかる塩基種の移動度補正量とする請求項２に記載の塩基配列決定方法。
【請求項１０】
（ｃ）の移動度補正工程では、（ｂ）の最良区間抽出工程で移動度補正量を算出したときはその移動度補正量を用いる請求項２に記載の塩基配列決定方法。
【請求項１１】
（Ｂ）の条件設定工程で設定する探索始点基盤ピークは、最良区間内の最大面積を持つピークとする請求項２に記載の塩基配列決定方法。
【請求項１２】
（Ｂ）の条件設定工程で設定するピーク間隔基準値は、最良区間において基盤ピークが等間隔に並んでいる部分の間隔平均値とする請求項２に記載の塩基配列決定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動を使った遺伝子解析装置の計測データから、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）などの核酸の塩基配列を決定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡの塩基配列決定に使用される遺伝子解析装置では、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）、Ｃ（シトシン）及びＴ（チミン）の４種の塩基に応じた４本の時系列計測データが得られる。【０００３】
フレッド（Phred）を用いた方法を初めとして、従来法では、これらの時系列データに対して、塩基種に応じた標識色素の移動速度差に起因する時系列データ相互のずれを補正する移動度補正や雑音除去などの前処理を施した後に、ピーク検出を行い、高さや面積が大きいピークを塩基ピークとして決定していく（非特許文献１参照。）。【０００４】
電気泳動を使った計測では、泳動の初期、中期、末期で信号特性が大きく変動する。このため、本発明者の一人は、この変動を考慮して部分ごとに信号特性に合った雑音除去を行う方法を提案している（特許文献１参照。）。【０００５】
また、遺伝子解析装置で時系列に検出される４本の塩基ピークは、各塩基に対する標識色素の移動速度の違い等によって、出現時刻が相対的にずれる場合がある。このずれを補正する方法として、本発明者の一人は、検出したピークの重なりが最小になるように時系列信号を相互にシフトする補正方法も提案している（特許文献２参照。）。
【非特許文献１】Ewing B, Hillier L, Wendl M, Green P: Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Research 8:175-185 ,1998
【特許文献１】特開２００２−２０２２８６号公報
【特許文献２】特開２００２−２２８６３３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
泳動の末期は、ピーク幅が広がってきて形状的にピークとして検出が困難になる部分や、小さなピークが大きなピークの裾野に隠れてしまう部分が出てくる。このため、Phredなど、ピーク検出演算で検出したピークに基づく泳動データのみに依存する手法では、手がかりとなるピーク情報が欠落しやすくなる泳動末期の泳動データは解析が不正確になる。【０００７】
通常は泳動の中期では、間隔、形状とも安定したピークが観測できるが、計測対象物の反応状態等の要因で状態が部分的に劣化する場合もある。そして、劣化が生じた場合は、泳動の中期の泳動データといえども、安定状態を前提としたPhred等の処理では解析が不正確になる。【０００８】
本発明は、劣化した部分を含む泳動データであっても塩基配列を正確に解析することのできる方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の核酸塩基配列決定方法は以下の工程（Ａ）から（Ｃ）をその順に含む。
（Ａ）試料核酸を電気泳動分離して得られた４種類の塩基種別のピークを含む電気泳動データから基盤ピークを抽出する基盤ピーク抽出工程、
（Ｂ）抽出された基盤ピークにより構成される時系列データにおいて、探索を開始する探索始点基盤ピーク及びピーク間隔基準値を設定する条件設定工程、
（Ｃ）前記時系列データにおいて、探索始点基盤ピークを始点として、隣接する基盤ピーク間を時系列の前方向及び後方向に順次走査し、基盤ピーク間の間隔を前記ピーク間隔基準値とを比較してピーク欠落区間に補間ピークを追加することにより塩基配列を決定する塩基配列決定工程。【００１０】
基盤ピークとは明瞭な塩基ピークのことをいう。基盤ピーク抽出工程で基盤ピークを抽出する一方法では、明らかに塩基ピークと認めることのできるピーク高さ及び／又はピーク面積をしきい値として設定しておく。そして、電気泳動データである全時系列データのピーク高さ及び／又はピーク面積をしきい値と比較し、そのしきい値よりも大きなピーク高さ又はピーク面積をもつピークを基盤ピークとする。【００１１】
その後、条件設定工程を経て、塩基配列決定工程ではピーク欠落区間に補間ピークの追加を行う。すなわち、各基盤ピーク間隔とピーク間隔基準値を比較して、ピーク間隔がピーク間隔基準値に近づくように、必要個数分の補間ピークをピーク欠落区間に追加する。【００１２】
補間ピークの塩基種は、電気泳動データにおいてその補間ピークが追加されるピーク位置に存在する電気泳動データに基づいて定める。補間ピーク位置に存在するピークは、基盤ピークとしては検出されなかったレベルの信号である。【００１３】
補間ピーク追加工程をもつことにより、泳動末期における形状的にピーク検出が困難なピークや、高さや面積が近傍の大きなピークの裾野に隠れてしまう小ピークも補間ピークとして再現することができる。また、泳動中期においてデータ劣化が生じた場合も含めて、何らかの原因で部分的にピーク形状劣化が生じた場合でも、正確な塩基配列情報を得ることができる。【００１４】
好ましい形態では、工程（Ａ）と（Ｂ）の間に以下の工程（ａ）から（ｃ）をその順に含み、工程（ｃ）で移動度補正された時系列データを工程（Ｂ）での時系列データとする請求項１に記載の塩基配列決定方法。
（ａ）抽出された基盤ピークにより構成される時系列データを小区間に分割する区間分割工程、
（ｂ）分割された各区間の基盤ピークの配列状態の最も良い区間を抽出して最良区間とする最良区間抽出工程、及び
（ｃ）抽出された最良区間から塩基種別の移動度差に基づく移動度補正量を算出し、その移動度補正量を使用して前記時系列データ全体に移動度補正を実行する移動度補正工程。【００１５】
（ａ）の区間分割工程での分割の単位とする小区間の大きさは、その区間内ではピーク間隔がほぼ一定であるとみなせる程度の大きさに予め決めておく。小区間の大きさが大きすぎると区間内でピーク間隔が変化してしまい、良い区間と悪い区間の区別がつきにくくなってしまう。逆に小区間の大きさが小さすぎると、区間に含まれるピーク数が少なくなってしまい、判別演算に使用できる情報が少なくなってしまう。そのため、小区間の大きさは、小区間に含まれる塩基数が例えば１００〜３００ｂｐ程度になるような大きさに設定しておくのが適当である。【００１６】
（ｂ）の最良区間抽出工程では、区間分割工程で分割された時系列データの小区間のうちから最良区間を抽出する。このとき、泳動状態が良いデータ部分ほど基盤ピークとなりうる明らかな塩基ピークが万遍なく等間隔で得られるという電気泳動データの特性を利用して、各小区間の基盤ピークの配列状態に対する評価を行う。評価が最も良かった区間を最良区間として抽出する。【００１７】
（ｂ）の最良区間抽出工程の一例は、各小区間で塩基種別の移動度差に基づく最適移動度補正工程を行った後のピーク総面積が最大になる小区間を最良区間として抽出するものである。最適移動度補正工程の例としては、各小区間で４種類の塩基に対応する４種類の検出データを並べた状態で、４種類の検出データのうち１から３種類の検出データを固定し、残る検出データを前後方向に移動させてピーク波形の総面積が最大になるように検出データを移動させる工程とすることができる。【００１８】
（ｂ）の最良区間抽出工程の他の例は、小区間ごとに基盤ピークのピーク間隔を計測し、そのばらつきが最小になる区間を最良区間として抽出するものである。ばらつきの評価方法の一例は、小区間内のピーク間隔最小値Dminとピーク間隔最大値Dmaxの比によって行ない、その比Dmin/Dmaxが大きいほどばらつきが小さいものとする方法である。その場合、リピート配列のみを含んでいる小区間であると判定されたときは、比Dmin/Dmaxに１より小さい数値をかけて評価を下げるようにするのが適当である。【００１９】
（ａ）の区間分割工程では隣接する小区間を相互にオーバーラップさせて区間の数を多くしてもよい。【００２０】
（ｃ）の移動度補正工程では、最良区間に対し、４種類の塩基に対応する４種類の基盤ピークを並べた状態で、４種類の基盤ピークのうち１から３種類の基盤ピークを固定し、残る基盤ピークを前後方向に移動させてピーク波形の総面積が最大になるように基盤ピークを移動させたときのその移動量をその基盤ピークにかかる塩基種の移動度補正量とすることができる。【００２１】
（ｃ）の移動度補正工程では、（ｂ）の最良区間抽出工程で移動度補正量を算出したときはその移動度補正量を用いてもよい。【００２２】
（Ｂ）の条件設定工程で設定する探索始点基盤ピークは、最良区間内の最大面積を持つピークとすることができる。【００２３】
（Ｂ）の条件設定工程で設定するピーク間隔基準値は、最良区間において基盤ピークが等間隔に並んでいる部分の間隔平均値とすることができる。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、まず基盤ピークを確定した後に、基盤ピーク間のピーク欠落区間に補間ピークを追加するので、信頼性の高い情報を確保した上でその情報を利用しつつ信頼性の劣る情報を汲み取ることができる。例えば、計測対象物の反応状態等の要因で状態が部分的に劣化した場合などのように、データが部分的に劣化してピーク検出ができない形状の信号波形となったり、隣接ピーク裾野に隠れる小ピークになったりした場合でも、塩基配列情報の読み取り精度を正確に保つことができる。【００２５】
さらに、最良区間から算出した移動度補正量を使用して移動度補正手段により移動度補正を行なうようにすれば、塩基種別の移動速度差に起因する塩基ピークの追い越しや重なりなどの障害が軽減される。区間分割工程、最良区間抽出工程、及び移動度補正工程を備えるようにすれば、塩基配列決定工程ではピーク欠落区間を正確に見つけることができるようになり、補間ピークを正しく追加することができるようになり、塩基配列決定の精度が向上する。このことから、遺伝子解析装置の計測データから、より長い塩基配列情報をより正確に読み取ることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】一実施例を機能的に示すブロック図である。
【図２】同実施例を示すフローチャートである。
【図３】４種類の塩基の電気泳動データを示すグラフである。
【図４】移動度補正を施した後の電気泳動データを示すグラフである。
【図５】さらに補間ピークの追加を行なった後の電気泳動データを示すグラフである。
【図６Ａ】基盤ピークがほぼ等間隔で並んでいる電気泳動データを示すグラフである。
【図６Ｂ】基盤ピークが不等間隔で並んでいる電気泳動データを示すグラフである。
【符号の説明】
【００２７】
１０      コンピュータ
１２      基盤ピーク抽出手段
１４      最良区間抽出手段
１６      移動度補正手段
２０      塩基配列決定手段
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
図1に一実施例の処理工程を実行する機能をブロック図として示す。基盤ピーク抽出手段１２は基盤ピーク抽出工程を行なう機能を示したものである。最良区間抽出手段１４は区間分割工程と最良区間抽出工程を行なう機能を示したものである。移動度補正手段１６は移動度補正工程を行なう機能を示したものであり、時系列データ全体に対して移動度補正工程を行なう。塩基配列決定手段２０は、時系列データを移動度補正手段１６から取り込んだ全時系列データに対して、条件設定工程を経て、ピーク欠落区間に補間ピークを追加する塩基配列決定工程を実行する。【００２９】
基盤ピーク抽出手段１２、最良区間抽出手段１４、移動度補正手段１６及び塩基配列決定手段２０はコンピュータ１０により実現される機能である。コンピュータ１０は電気泳動装置に備えられた専用のコンピュータ又は汎用のパーソナルコンピュータである。【００３０】
泳動データは電気泳動装置により検出され、いったん記憶装置に保持された後、コンピュータ１０に取り込まれて処理される。塩基配列決定手段２０により読み取られた塩基配列が出力として記録計やディスプレーに出力され、記憶装置に保持されたり、他のコンピュータに送られる。【００３１】
Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔの４種の塩基に対する標識色素間の移動速度の差が移動度補正をするほど大きくない場合には、基盤ピーク抽出手段１２で基盤ピーク抽出工程を実行した後、移動度補正手段１６を経由しないで、塩基配列決定手段２０へ進んで塩基配列決定工程を実行するようにしてもよい。【００３２】
図２に一実施例をフローチャートとして示す。また、図３にＡ，Ｇ，Ｃ，Ｔの４種の塩基に対する標識色素を使った電気泳動計測によって得られる泳動データの波形例を示す。図３の横軸は時間を表わし、表示されている数値は電気泳動装置の検出部における蛍光検出の際の励起光による走査数であり、時間に比例した数値である。縦軸はそれぞれの標識色素の蛍光波長での蛍光検出強度である。【００３３】
この実施例では、図３で示されるように、標識色素の移動速度の差によって各時系列データは時間方向にずれを生じているものを扱う。以下、図1の構成ブロック図及び図２のフローチャートに従ってこの実施例の動作について説明する。【００３４】
（基盤ピーク抽出）
まず、図３に示される塩基種別の各時系列データのピークごとに基盤ピーク抽出手段１２で基盤ピーク抽出工程を実行して、基盤ピーク、すなわち明瞭なピークを抽出する。【００３５】
基盤ピークの抽出にはピーク検出演算も必要になるが、ピーク検出演算は既に知られている一般的な手法を用いることができる。基盤ピークの抽出の一例として、計測データ信号値の勾配が正から負に変わる点をピークトップの候補として順次探索する。得られたピークトップのピーク高さの信号値及び／又はそのピークの面積値が予め定めたしきい値Ｉthより大きいもののみを基盤ピークとして抽出する。【００３６】
実際の計測データ中の塩基ピークの中には、高さが低いものや形状がはっきりしないものも含まれており、しきい値を下げれば、これらの塩基ピークと共に雑音波形もピークとして混入してしまう。そこでこの工程においては、雑音波形を確実に廃棄できるようにしきい値を高くしておき、確実に塩基ピークであるもののみを基盤ピークとして抽出する。【００３７】
（最良区間抽出）
次に、最良区間抽出手段１４により区間分割工程と最良区間抽出工程を実行する。区間分割工程では、抽出された基盤ピークにより構成される時系列データを小区間に分割する。小区間の大きさは特に限定されるものではないが、小区間に含まれる塩基数が１００〜３００ｂｐになる大きさに設定しておく。図３に示される区間は小区間よりも小さく、１つの小区間の一部を示している。【００３８】
その分割された各小区間の基盤ピークの配列状態に対する評価を行い、評価が最も良かった区間を「最良区間」として抽出する。この工程では、泳動状態が良いデータ部分ほど基盤ピークが万遍なく等間隔で得られるという電気泳動データの特性を利用して、区間に対する評価を行う。【００３９】
その評価方法の一例は、最適な移動度補正量は移動後のピーク波形の総面積値が最大になる値であるという知見（特許文献２参照。）にしたがう方法である。その方法では、各小区間に対する評価値は最適移動度補正を行った後のピーク総面積となる。そして、そのピーク総面積が最大になる小区間を最良区間として抽出する。より具体的に示すと、各小区間で４種類の塩基に対応する４種類の検出データを並べた状態で、４種類の検出データのうち１から３種類の検出データを固定する。残る検出データを前後方向に移動させてピーク波形の総面積が最大になるように検出データを移動させる。これが各小区間で最適移動度補正を行うことである。そして、最適移動度補正を行った後のピーク波形の総面積が最大になる小区間を最良区間として選択する。【００４０】
その評価方法の他の例は、各小区間ごとに基盤ピークのピーク間隔を計測し、そのばらつきを評価してばらつきが最小になる区間を最良区間として抽出する方法である。図６（Ａ），図６（Ｂ）に、基盤ピーク間隔のばらつきの異なる小区間の例を示す。図６（Ａ）は基盤ピークがほぼ等間隔に得られている小区間、図６（Ｂ）は塩基ピークの形状が不明瞭だったり高さが低かったりして基盤ピークとして検出されずに欠落したために、基盤ピークが不等間隔に得られた小区間の例である。両者のピーク間隔のばらつきは大きく異なる。これを評価するために、例えば、小区間内のピーク間隔最小値Dminとピーク間隔最大値Dmaxの比を利用する。すなわち、Dmin/Dmaxが大きいほどばらつきが小さく、小さいほどばらつきが大きい。図６（Ａ）のDmin1/Dmax1の方が図６（Ｂ）のDmin2/Dmax２より大きく、図６（Ａ）の方が図６（Ｂ）よりばらつきが小さいと判定できる。【００４１】
同様に、全ての小区間  ｋ＝１，２，…Ｎの中で、次の評価値式
Evaluation(k) = Dmin(k) / Dmax(k)           -----(1)
が最大になる小区間kbを検出することにより、最も基盤ピーク間隔のばらつきの小さい小区間を「最良区間」として選択することができる。【００４２】
一般に、塩基配列決定法が直面する困難な問題の１つに、Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ４種の塩基のうち特定の種類だけ連続して入っている「リピート配列」と呼ばれる遺伝子配列が解析対象となった場合、正確な移動度補正が行なえなくなってしまう。最良区間を抽出するための上の評価方法では、小区間内の基盤ピーク間隔のばらつきによる計算を行なうとともに、「リピート配列」のみを含んでいる場合には小区間の評価を下げるようにするのが好ましい。「リピート配列」のみを含んでいる小区間であるかどうかは、小区間内の塩基種を探索して何種を含むかを調べることで判別できる。そして、「リピート配列」のみを含んでいる小区間であると判定された場合には、例えば上にあげた評価値式(1)の評価値に１より小さい数値、例えば０.５をかけることにより当該小区間に対する評価を下げ、結果として他の小区間を最良区間として選択させることができるようになる。
小区間に分割する際、隣接する小区間を相互にオーバーラップさせて区間の数を多く取ってもよい。【００４３】
このようにして、４種の塩基の基盤ピークを含み、かつ基盤ピーク間隔のばらつきの少ない小区間を最良区間として抽出することができる。【００４４】
（移動度補正）
次に、このようにして抽出された「最良区間」に対し、移動度補正手段１６によって移動度補正量を算出する。移動度補正は、例えば次のように行なう。例えば、塩基Ｇの基盤ピークからなる信号列を固定し、これに対して塩基Ａ，Ｃ，Ｔの基盤ピークからなるそれぞれの信号列を時間軸に対して移動させ、それぞれの信号列の移動量をΔＡ（ｉ），ΔＣ（ｊ），ΔＴ（ｋ）とする。
ΔＡ（ｉ）＝０，±１，±２，…（ただし、ｉ＝１，２，３，…）
ΔＣ（ｊ）＝０，±１，±２，…（ただし、ｊ＝１，２，３，…）
ΔＴ（ｋ）＝０，±１，±２，…（ただし、ｋ＝１，２，３，…）
である。【００４５】
移動量ΔＡ（ｉ），ΔＣ（ｊ），ΔＴ（ｋ）の組合せに対してその最良区間に含まれる基盤ピークの総面積Ｓ（ｉ，ｊ，ｋ）を求め、総面積Ｓ（ｉ，ｊ，ｋ）が最大になる移動量の組合せΔＡ（ｉｂ），ΔＣ（ｊｂ），ΔＴ（ｋｂ）が塩基Ａ，Ｃ，Ｔの移動度補正量となる。【００４６】
最良区間抽出工程で「最良区間」を抽出するために移動度補正量を算出した場合は、その移動度補正量を用いることができる。
この移動度補正量をデータ全体に適用して移動度補正を実行する。【００４７】
（補間ピーク追加）
図３の信号列に対して移動度補正された結果を図４に示す。図４に示されるように、移動度補正によって時系列データ間のずれが補正されてピークの重なりや追い越しが解消され、全体的にはピークがほぼ等間隔に並ぶ形となる。図４に示されたインパルス状の信号がピーク検出位置を示している。しかし、基盤ピークだけでは全ての塩基ピークは網羅されず、図４の破線の矢印で示されるような、塩基ピークの部分的欠落が生じる。【００４８】
そこで、次に、塩基配列決定手段２０により、これらの取り落とした塩基ピークを探知して追加する。ここでは、探索始点基盤ピーク及びピーク間隔基準値を定め、探索始点基盤ピークを始点として、隣接する基盤ピークから前方向及び後方向に順次走査して、ピーク欠落区間には必要な個数分の補間ピークの追加を行う。【００４９】
探索始点基盤ピークは、例えば最良区間内の最大面積を持つピーク、等の条件で決定する。【００５０】
ピーク間隔基準値は、例えば最良区間において基盤ピークが等間隔に並んでいる部分の間隔平均値を算出してピーク間隔基準値とする等の方法で定める。また、ピーク間隔は泳動の中期から泳動の初期及び泳動の末期にかけて徐々に小さくなるという電気泳動の特性を利用し、前方向及び後方向への順次走査においてピーク間隔基準値を徐々に単調減少させたり、既に補間ピーク探索・追加処理を完了した隣接区間のピーク間隔値を使って徐々に修正して使用したりしてもよい。【００５１】
ピーク欠落区間の探索と補間ピークの追加は次のように行なう。図４でこの処理例を説明する。図４の区間で右側（塩基対番号の大きい側）のピークがほぼ等間隔に抽出されている部分に着目し、その部分の平均ピーク間隔ｄを求め、それをピーク間隔基準値と定める。これに続く部分でもピーク間隔はｄに近い値を取ることが期待されるが、実際の間隔が図４で示されるようにｄ´であったとする。このとき、ｎ個の補間ピークをこの区間に追加すると仮定した場合、新たなピーク間隔NewD(n) は下式で表すことができる。
NewD(n)＝ｄ´／（ｎ＋１）・・・      −−−−−  （２）
但し、ｎ＝０，１，２【００５２】
そこで、新たなピーク間隔NewD(n) がピーク間隔基準値ｄと最も近い値を取るｎを、追加すべき補間ピークの数として決定し、NewD(n)が与える間隔の位置ごとに補間ピークを検出していく。【００５３】
追加する補間ピークの塩基種の決定は次のように行なう。上の例では間隔がｄ´となったピーク間隔の両端の基盤ピークと補間ピークが等間隔に並ぶための想定時刻中心を求める。そして、その近傍でしきい値を下げてピークが検出されればそのピークの塩基種と決定する。また、形状がピークとなっていなくてピーク検出が困難であるときは、最も高い信号値をもった時系列データの塩基種を選択する。最終的に、補間ピークの追加処理の結果、図５に示すようなピーク配列が得られる。【００５４】
（塩基配列決定）
図５のように得られたピーク配列を順に読み取っていくことにより塩基配列を決定することができる。【００５５】
実施例では、前段で、信頼性の高い情報を提示すると考えられる基盤ピークのみを使った処理で、最良区間の抽出を実施し、この最良区間の算定した移動度補正量を使った移動度補正を実行するので、部分的に状態劣化をきたしたデータを処理する際にも信頼性の低い情報による攪乱が入りにくい。したがって、泳動データの部分的な質の劣化等の変化に強く、安定した塩基配列決定結果が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明はＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を電気泳動して得られる計測データから塩基配列を決定するのに利用することができる。
【図１】
2008050426.tif 000003
【図２】
2008050426.tif 000004
【図３】
2008050426.tif 000005
【図４】
2008050426.tif 000006
【図５】
2008050426.tif 000007
【図６Ａ】
2008050426.tif 000008
【図６Ｂ】
2008050426.tif 000009
【国際調査報告】
2008050426.tif 000010
2008050426.tif 000011
2008050426.tif 000012
2008050426.tif 000013