(57)【要約】本発明は、癌細胞又は癌組織においてヒト細胞増殖制御因子ＤＲＥＦ又はＤＲＥＦ遺伝子のインビボ機能を抑制する、ＤＲＥＦに対するＲＮＡｉ核酸、アンチセンス核酸又は抗体を含むことを特徴とする癌治療用組成物、並びに、ヒト培養癌細胞、又はＤＲＥＦ強発現細胞株、においてＤＲＥＦ遺伝子の発現又はタンパク質翻訳の抑制、或いは細胞増殖抑制、細胞周期停止及び／又は細胞死誘導、を指標として癌治療用薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞又は癌組織においてヒト細胞増殖制御因子ＤＲＥＦ又はＤＲＥＦ遺伝子のインビボ機能を抑制する、ＤＲＥＦに対するＲＮＡｉ核酸、アンチセンス核酸又は抗体を含むことを特徴とする癌治療用組成物。
【請求項２】
ＤＲＥＦが、配列番号１に示されるアミノ酸配列、或いは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列、を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＤＲＥＦ遺伝子が、配列番号２の２０２位〜２２８６位に示されるヌクレオチド配列、或いは該ヌクレオチド配列と９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列、を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
インビボ機能の抑制が、癌細胞における、細胞増殖抑制、細胞周期停止及び／又は細胞死誘導である請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ＲＮＡｉ核酸又はアンチセンス核酸が、ＤＲＥＦ  ｍＲＮＡの切断又はその機能抑制を可能にするものである請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＲＮＡｉ核酸が、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、該ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ、或いは該ＤＮＡを含むベクターである請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
アンチセンス核酸が、アンチセンスＲＮＡ、該アンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクターである請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
ＲＮＡｉ核酸又はアンチセンス核酸が、ＤＲＥＦ遺伝子のヌクレオチド配列に由来するものである請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ＲＮＡｉ核酸又はアンチセンス核酸が、ＤＲＥＦのＣＲ２ドメイン又はＣＲ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号３及び４）に由来するものである請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
ＲＮＡｉ核酸が、配列番号５〜１５、１９、２２、２５及び２８のいずれか１つのＤＮＡ配列、又は該ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ベクターが、配列番号２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９及び３０のいずれか１つのＤＮＡ配列を含む請求項６に記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＲＥＦに対する抗体が、ＤＲＥＦのＣＲ１ドメイン、ＣＲ２ドメイン又はＣＲ３ドメイン（それぞれ配列番号１３８、１３３又は１３４）、或いは該ＣＲ１又はＣＲ３ドメイン中のＤＲＥＦのＤＮＡ結合に関連する機能ドメイン、のエピトープと結合する抗体である請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＤＲＥＦに対する抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体又はそのフラグメントである請求項１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
ヒト培養癌細胞、又はＤＲＥＦ強発現哺乳類細胞株、を含む培地に候補薬剤を加えて、ＤＲＥＦ遺伝子の発現又は翻訳を抑制する薬剤をインビトロでスクリーニングすることを含む、癌治療用薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項１５】
前記細胞又は細胞株の細胞増殖抑制、細胞周期停止及び／又は細胞死誘導を指標とする請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト細胞増殖制御因子ＤＲＥＦ又はＤＲＥＦ遺伝子を分子標的とする癌治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞増殖に関連する遺伝子を標的とする癌治療法は種々検討されている。ＤＲＥＦはＨｉｒｏｓｅらが単離したショウジョウバエの転写因子で、遺伝子プロモーター配列中のＤＲＥ−ｍｏｔｉｆと呼ばれるＤＮＡ配列を認識してそれに結合し、その遺伝子の発現を誘導する（非特許文献１）。ショウジョウバエでは、Ｓ期にＰＣＮＡ（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｔｉｇｅｎ）転写を誘導することが報告され、さらに細胞増殖に関連するいくつかの遺伝子が、ＤＲＥＦにより発現制御されることが報告されている。その後、ショウジョウバエＤＲＥＦのヒトホモログが、Ｏｈｓｈｉｍａらによってクローニング、配列決定され、ヒトＤＲＥＦがヒストンＨ１遺伝子の誘導に係わることが報告された（非特許文献２）。このとき、ヒトＤＲＥＦ遺伝子の発現がＤＲＥＦ  ＣＲ１ドメインに対して作製された２つのｓｉＲＮＡによって低下し、これによってヒストンＨ１遺伝子発現が抑制される（非特許文献２）。
ヒトＤＲＥＦ遺伝子は、Ｅｓｐｏｓｉｔｏら（非特許文献３）がヒト非誘導性男性奇形癌細胞株由来のｃＤＮＡライブラリーから見出した遺伝子Ｔｒａｍｐ（Ａｃ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ；ｐｕｔａｔｉｖｅ  Ａｃ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ；Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ：Ｘ，Ｙ；Ｌｏｃａｔｉｏｎ：Ｘｐ２２．３３；Ｙｐ１１）と同一である。
Ｓａｎｏらは、ヒトＤＲＥＦ遺伝子をノックダウンすることによってＤＲＥＦが細胞周期進行に関与する因子のひとつであること、またノックダウンによってリボソームタンパク質（ＲＰ）の発現低下が起こることから、ＤＲＥＦがタンパク合成遺伝子の調節を介して細胞増殖を刺激する役割を果たすことを指摘した（非特許文献４及び非特許文献５）。
これまでヒトＤＲＥＦについて細胞増殖能との関連が示唆されたが、しかし癌に対する治療との関連での詳細な機能解析は行われていなかった。
【非特許文献１】Ｈｉｒｏｓｅ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３９３０−３９３７，１９９６
【非特許文献２】Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２２９２８−３８，２００３
【非特許文献３】Ｅｓｐｏｓｉｔｏ，Ｔ．ら，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８（１）：６１−６７，１９９９
【非特許文献４】Ｓａｎｏ，Ｙ．ら，日本分子生物学会要旨集（平成１７年１１月２５日発行），講演番号１Ｐ−０８７３，２００５
【非特許文献５】Ｓａｎｏ，Ｙ．ら，第２０回国際生化学分子生物学会要旨集（平成１８年６月１８日発行），講演番号５Ｐ−Ａ−２１７，２００６
【発明の開示】
【０００３】
肺癌、食道癌などの難治性癌は、一般的な化学療法に対して抵抗性であり外科手術以外に治癒が期待できる有効な手段が確立されていない。そのために、癌の発症・増殖・転移に関与する遺伝子を標的とする分子標的治療薬を開発して、癌の治癒を目指した治療法を確立することが求められている。
本発明の目的は、癌に対する治療用組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、癌に対する治療用薬剤をスクリーニングする方法を提供することである。
本発明者らは、ヒトＤＲＥＦが癌治療の標的になることを見出し、本発明を完成させた。
ＤＲＥＦは、背景技術で記載したように、ショウジョウバエの転写因子として発見され、その後、ヒトにおいてもそのホモログが存在することが示された。本発明者らは今回、ヒトＤＲＥＦが正常細胞で実質的に発現されない一方で、癌細胞で有意に発現されることを見出し、これに基いて、ＤＲＥＦが癌治療の分子標的になりうると予測し、ＤＲＥＦの発現抑制が実際に癌の抑制と細胞死に導くことを実証した。
したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
本発明は、その一の態様において、癌細胞又は癌組織においてヒト細胞増殖制御因子ＤＲＥＦ又はＤＲＥＦ遺伝子のインビボ機能を抑制する、ＤＲＥＦに対するＲＮＡｉ核酸、アンチセンス核酸又は抗体を含むことを特徴とする癌治療用組成物を提供する。
ＤＲＥＦは、Ｈｉｒｏｓｅらによって命名されたＤＲＥ（ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒの略称であり、別名ＺＢＥＤ１（ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ，ＢＥＤ−ｔｙｐｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １）とも呼ばれている。本明細書中では以後、ヒトＤＲＥＦを単に「ＤＲＥＦ」と称する。
本発明の実施形態において、ＤＲＥＦは配列番号１に示されるアミノ酸配列、或いは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列、を含むタンパク質である。また、ＤＲＥＦ遺伝子は、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が配列番号１のアミノ酸配列によってコードされるヌクレオチド配列、より具体的には配列番号２の２０２位〜２２８６位に示されるヌクレオチド配列を含む。ＤＲＥＦのアミノ酸及びヌクレオチド配列はともに、ＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００４７２９として登録されている。本発明におけるＤＲＥＦは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤＲＥＦと同等のインビボ機能を有する変異体（例えば、多型性による変異体、スプライス変異体、縮重変異体、突然変異体など）も包含する。また、本発明におけるＤＲＥＦ遺伝子は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列（２０２位〜２２８６位）と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ翻訳後にＤＲＥＦと同等のインビボ機能を有する上記と同様の変異体も包含する。
本明細書において、ＤＲＥＦ遺伝子は、エキソンのみならずイントロン、３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域も包含することを意図して使用される。
本発明の別の実施形態において、インビボ機能の抑制は、癌細胞における、細胞増殖抑制、細胞周期停止及び／又は細胞死誘導作用である。
本明細書で使用される「インビボ機能」は、ＤＲＥＦの癌細胞内での働き、例えば細胞増殖、細胞周期進行などをいう。
本発明の別の実施形態において、ＲＮＡｉ核酸又はアンチセンス核酸はＤＲＥＦ  ｍＲＮＡの切断又はその機能の抑制を可能にするものである。
本明細書で使用される「ＲＮＡｉ」は、所謂ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と呼ばれるものであり、外から加えたＤＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により、それらと相同な配列をもつ遺伝子の発現が抑制される現象をいう（例えば、牛田千里、蛋白質核酸酵素Ｖｏｌ．４６（Ｎｏ．１０）、ｐｐ．１３８１−１３８６、２００１）。標的となるＲＮＡは該遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡであり、標的ｍＲＮＡはＲＮＡｉによって分解されるか或いは発現抑制される。
具体的には、本発明で使用可能な好適なＲＮＡｉ核酸は、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、該ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ、或いは該ＤＮＡを含むベクターＤＮＡである。本発明において使用可能な別のＲＮＡｉ核酸には、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）も含まれる。ｍｉＲＮＡは、ＤＲＥＦ  ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合してＤＲＥＦ遺伝子の発現を抑制するものである。これらのＲＮＡｉ核酸のサイズは、１９〜３０ヌクレオチド長、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド長、さらに好ましくは１９〜２３ヌクレオチド長である。
本発明で使用される「アンチセンス核酸」は、ＤＲＥＦ  ｍＲＮＡの全体又はその部分に相補的なＲＮＡ配列、或いは該ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ、或いは該ＤＮＡ配列を含むベクターを含む。
本明細書で使用される「ベクター」は、目的のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ或いはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡの他に、プロモーター、ポリＴ配列、複製開始点、ターミネーターなどの調節配列、選択マーカーなどを含むことができる。本発明のベクターが癌細胞内に導入されると、該ＤＮＡの発現によって該ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡ、或いはアンチセンスＲＮＡが細胞内で産生される。
本発明の実施形態において、ＲＮＡｉ核酸又はアンチセンス核酸はＤＲＥＦのＣＲ２ドメイン又はＣＲ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号３及び４）に由来するものである。本発明における好ましいヌクレオチド配列は、例えば、ＤＲＥＦ遺伝子の配列番号２の配列において、１，３００位〜１，５００位（ＯＲＦの開始コドンＡＴＧの「Ａ」を第１位とした場合１０９９位〜１２９９位）、１，９００〜２，０００位（ＯＲＦの開始コドンＡＴＧの「Ａ」を第１位とした場合１６９９位〜１７９９位）などに存在する。
本明細書で使用する「ＣＲ」は、ヒトＤＲＥＦとショウジョウバエＤＲＥＦとの配列比較において、高度に保存された領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）を示す。そのような領域（アミノ酸配列；ヌクレオチド配列）は、ＣＲ１（配列番号１の４〜１４０位；配列番号２の２１１〜６２１位）、ＣＲ２（配列番号１の３７７〜５０６位；配列番号２の１３３０〜１７１９位）及びＣＲ３（配列番号１の５４１〜６８８位；配列番号２の１８２２〜２２６５位）からなり、同一性はそれぞれ２７．７％、２９．２％、２１．１％である（Ｏｈｓｈｉｍａ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２２９２８−３８，２００３）。
本発明でより好ましいＲＮＡｉ核酸は、配列番号５〜１５、１９、２２、２５及び２８のいずれか１つのＤＮＡ配列又は該ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列を含む。本明細書中で使用する、ＤＮＡなる用語は、デオキシリボ核酸を表わし、ＲＮＡなる用語は、リボ核酸を表わす。
また、本発明でより好ましいベクターは、配列番号２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９及び３０のいずれか１つのＤＮＡ配列を含む。
本発明によれば、本発明の組成物はＤＲＥＦのインビボ機能を抑制する、ＤＲＥＦに対する抗体を含むことができる。このような機能抑制が可能であれば、いかなる抗体も本発明において使用可能である。好ましい抗体は、ＤＲＥＦのＣＲ１ドメイン、ＣＲ２ドメイン又はＣＲ３ドメイン（それぞれ配列番号１３８、１３３又は１３４）、或いは該ＣＲ１又はＣＲ３ドメイン中のＤＲＥＦのＤＮＡ結合に関連する機能ドメイン（例えば配列番号１４０又は１４１）、のエピトープと結合する抗体である。本明細書で使用するエピトープなる用語は、抗原分子上の抗体が結合する部位を意味し、通常、そのような部位のアミノ酸数が８以上、好ましくは１０以上であり、アミノ酸は連続的配列からなっていてもよいし又は不連続的配列からなっていてもよい。従って、本発明の抗体は、上記ＤＲＥＦのアミノ酸配列中の連続する又は不連続の８以上、好ましくは１０以上のアミノ酸からなるエピトープと免疫学的に結合することができる。
本発明で使用可能な好ましいＤＲＥＦに対する抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体又はそのフラグメントである。
本発明はさらに、別の態様において、ヒト培養癌細胞を含む培地に候補薬剤を加えて、ＤＲＥＦ遺伝子の発現又は翻訳を抑制する薬剤をインビトロでスクリーニングすることを含む、癌治療用薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
本発明で使用可能な癌細胞は、癌細胞株、バイオプシー（生検）からの癌細胞を含む。特に後者の癌細胞は、患者由来のものであり、該患者に有効な薬剤の探索のために使用しうる。本発明において、癌細胞の種類は特に限定されないが、ＤＲＥＦが癌細胞で発現されるが正常細胞でほとんど又は全く発現されない癌細胞が望ましい。
本発明で使用可能な候補薬剤は、小分子から高分子のいずれでもよく、低分子有機化合物、ペプチド、タンパク質、オリゴ糖類、多糖類、脂質などを含む。
本発明において、スクリーニングは、癌細胞の細胞増殖抑制、細胞周期停止及び／又は細胞死誘導作用を指標として行うことができる。このような作用は、正常組織又は細胞では実質的に認められないが、これは、ＤＲＥＦが正常組織又は細胞でほとんど又は全く発現されないからである。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−２７５６９５号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ヒトＤＲＥＦ／ＺＢＥＤ１遺伝子（Ｘｐ２２．３３  ＆  Ｙｐ１１）のドメイン構造と、ＲＮＡｉ部位及び配列を示す
図２は、ＲＮＡｉ効果のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す。
図３は、ＲＮＡｉ効果のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析結果を示す。
図４は、細胞周期解析結果を示す。
図５Ａは、細胞周期解析結果を示す。
図５Ｂは、細胞周期解析結果を示す。
図５Ｃは、細胞周期解析結果を示す。
図６は、Ａは細胞増殖能解析結果を示す。Ｂは細胞増殖能解析結果を示す。
図７は、γＨ２ＡＸ（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈ２ＡＸ）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１）免疫染色結果を示す。
図８は、ＴＵＮＥＬ解析結果を示す。
図９は、細胞死及び細胞周期解析結果を示す。
図１０は、Ｍ期での細胞死（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈ）を示す。
図１１は、ＡＣＣ−ＬＣ−９１におけるｓｉＤＲＥＦ−＃３，＃４の遺伝子発現解析結果を示す。
図１２は、肺癌患者検体におけるＤＲＥＦの発現を示す。
図１３は、ＤＲＥＦ−ＲＮＡｉ＃４によって発現抑制される遺伝子の中で、癌の増殖に関連すると考えられるＲＰＬ１７遺伝子のＤＮＡ配列（Ａ；配列番号１３７）と、ＲＰＬ１７遺伝子のＤＲＥＦによる転写活性化の機序（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
１．癌治療用組成物
本発明は、癌細胞又は癌組織においてヒト細胞増殖制御因子ＤＲＥＦ又はＤＲＥＦ遺伝子のインビボ機能を抑制する、ＤＲＥＦに対するＲＮＡｉ核酸、アンチセンス核酸又は抗体を含むことを特徴とする癌治療用組成物を提供する。
ＤＲＥＦは、癌細胞又は癌組織で発現されるが、正常細胞又は正常組織では実質的に（或いは、ほとんど又は全く）発現されない。本発明者らは、この知見に加えて、癌細胞又は組織においてＤＲＥＦ遺伝子の発現又はタンパク質への翻訳を抑制（阻止又は阻害を含む）すると、癌の細胞増殖抑制、細胞周期停止、細胞死誘導などの事象が起こることを見出した。
本発明による治療の対象となる癌は、ＤＲＥＦの発現が可能である癌、以下のものに限定されないが、例えば肺癌、食道癌、膵癌、胃癌、肝癌、大腸癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、皮膚癌、胆癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、精巣癌、リンパ腫、メラノーマ、肉腫、骨肉種などを含む。好ましい癌は、肺癌、食道癌、乳癌、膵癌などである。
本発明の標的であるＤＲＥＦのアミノ酸配列及びＤＲＥＦ遺伝子のヌクレオチド配列はそれぞれ、例えば配列番号１、配列番号２（オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）：２０２位〜２２８６位）として公知である。ＤＲＥＦのアミノ酸及びヌクレオチド配列はともに、ＧｅｎＢａｎｋにＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＮＭ＿００４７２９として登録されている。本発明においては、ＤＲＥＦ又はＤＲＥＦ遺伝子の変異体、例えば、突然変異、多型、選択的スプライシング、縮重などに基づいた変異体のインビボ機能を抑制することも含む。
具体的には、本発明におけるＤＲＥＦは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、或いは該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列、を含むタンパク質である。或いは、本発明におけるＤＲＥＦは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＤＲＥＦと同等のインビボ機能を有する変異体も包含する。
また、本発明におけるＤＲＥＦ遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列によってコードされるヌクレオチド配列、より具体的には配列番号２に示されるヌクレオチド配列、特に２０２位〜２２８６位のＤＲＥＦ  ＯＲＦに対応するヌクレオチド配列を含む。本発明におけるＤＲＥＦ遺伝子はさらに、配列番号２の２０２位〜２２８６位に示されるヌクレオチド配列において１もしくは数個のヌクレオチドの欠失、置換又は付加を含むヌクレオチド配列を含むＤＮＡである。或いは、本発明におけるＤＲＥＦ遺伝子は、配列番号２の２０２位〜２２８６位に示されるヌクレオチド配列と９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、かつ翻訳後にＤＲＥＦと同等のインビボ機能を有する変異体も包含する。
本明細書で使用される「数個」なる用語は、約１０以下の整数、例えば９、８、７、６、５、４、３、２を意味する。
ＤＲＥＦは、細胞増殖や細胞周期進行などのインビボ機能をもつが、本発明は、癌においてＤＲＥＦのインビボ機能を抑制して癌の縮退や細胞死に導くことを可能にする。
本発明において、標的ＤＲＥＦ遺伝子の発現又はタンパク質翻訳を抑制する薬剤として、ＤＲＥＦに対するＲＮＡｉ核酸、アンチセンス核酸及び抗体を挙げることができる。これらの各薬剤について、以下にさらに具体的に説明する。
１．１  ＲＮＡｉ核酸
本発明で使用可能なＲＮＡｉ核酸は、ＤＲＥＦ遺伝子（エキソン、イントロン、３’非翻訳領域及び５’非翻訳領域からなる）のヌクレオチド配列、或いはＤＲＥＦ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列、に由来の連続する１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドを含むＤＮＡ又はＲＮＡである。
本発明で使用可能なＲＮＡｉ法は、１）短い二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞内に直接導入する、或いは２）ｓｈｏｒｔ−ｈａｉｒｐｉｎ型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を各種発現ベクターに組み込み、そのベクターを細胞内に導入する、或いは３）対立方向に並ぶ２個のプロモーターを持つベクターに、ｓｉＲＮＡに対応する短い二重鎖ＤＮＡをプロモーター間に挿入してｓｉＲＮＡを発現させるベクターを作製し、細胞内に導入する、などの手法を含む。
上記のＲＮＡｉ核酸は、ＤＲＥＦ  ｍＲＮＡの切断又はその機能抑制を可能にするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを含む。また、ＲＮＡｉ核酸は、インビボで使用したときに、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを産生することを可能にする、これらのＲＮＡをコードするＤＮＡ又は該ＤＮＡを含むベクターであってもよい。
本発明において、好ましいＲＮＡｉ核酸は、ＤＲＥＦのＣＲ２ドメイン又はＣＲ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号３及び４）に由来の連続する１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドを含むＤＮＡ、又は該ＤＮＡに対応するＲＮＡである。さらに好ましいＣＲ２ドメイン又はＣＲ３ドメインの標的部位はそれぞれ、例えば、ＤＲＥＦ遺伝子の配列番号２の配列において、１，３００位〜１，５００位（ＯＲＦの開始コドンＡＴＧの「Ａ」を第１位とした場合１０９９位〜１２９９位）、１，９００〜２，０００位（ＯＲＦの開始コドンＡＴＧの「Ａ」を第１位とした場合１６９９位〜１７９９位）などに存在する。
本発明において使用可能なＲＮＡｉ核酸は、例えば下記の配列番号５〜１５、１９、２２、２５及び２８のいずれかのＤＮＡ配列、又はそのＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列（すなわち、ＤＮＡ配列のＴをＵに置き換えた配列）、を含むものである。なお、下記の配列の後に記載の数字は、ＤＲＥＦのＯＲＦ上の開始部位の位置（但し、ＯＲＦの開始コドンＡＴＧの塩基「Ａ」を第１番目として番号づけする。）を表す。
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特に好ましい配列は、配列番号１９（ＲＮＡｉ  ＃３（１１３６〜１１５６位））、配列番号２２（ＲＮＡｉ  ＃４（１７１８〜１７３８位））、配列番号２５（ＲＮＡｉ  ＃５（１２４５〜１２６５位））、及び配列番号２８（ＲＮＡｉ  ＃６（１７３７〜１７５７位））のＤＮＡ配列、又はそのＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列（すなわち、ＤＮＡ配列のＴをＵに置き換えた配列）、である。なお、配列番号と共に括弧内に示した数字範囲は、配列番号２のヌクレオチド配列において、ＤＲＥＦ  ＯＲＦの開始コドンＡＴＧの塩基「Ａ」（２０２位）を第１番目として番号づけしたときの位置を表す。
ＤＲＥＦに対するＲＮＡｉ核酸の別の例は、下記の配列番号３３〜１３２のＤＮＡ配列、又はそのＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列（すなわち、ＤＮＡ配列のＴをＵに置き換えた配列）、である。
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本発明の好適な実施形態において、ＲＮＡｉ核酸は、配列番号２のヌクレオチド配列を含むＤＲＥＦ遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ又はその変異体の配列からの連続する１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドのセンス鎖配列とその相補的配列であるアンチセンス鎖配列とを含んでなるｓｉＲＮＡである。ここで、該ｓｉＲＮＡは、インビボ又はインビトロでＤＲＥＦ遺伝子又はｍＲＮＡの発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡを構成する対応のＤＮＡ配列の好ましい例は、ＤＲＥＦのＣＲ２ドメイン又はＣＲ３ドメインをコードするヌクレオチド配列（それぞれ配列番号３及び４）に由来の連続する１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、より好ましい例は、配列番号２のヌクレオチド配列において、１，３００位〜１，５００位（ＯＲＦの開始コドンＡＴＧの「Ａ」を第１位とした場合１０９９位〜１２９９位）、１，９００〜２，０００位（ＯＲＦの開始コドンＡＴＧの「Ａ」を第１位とした場合１６９９位〜１７９９位）の配列からの連続する１９〜３０ヌクレオチド、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド、より好ましくは１９〜２３ヌクレオチドを含むＤＮＡ配列、さらに好ましい例は、配列番号５〜１５、１９、２２、２５、２８、３３〜１３２によって示されるＤＮＡ配列である。
本発明において、ＤＲＥＦ  ＲＮＡｉ核酸の配列は、上記の配列に限定されず、ＤＲＥＦ遺伝子、対応するｍＲＮＡ又はその変異体のインビボにおける機能を抑制する限り、例えば、配列番号２のヌクレオチド配列において上記の配列番号５〜１５、１９、２２、２５、２８、３３〜１３２の各配列を５’方向又は３’方向に１〜５塩基シフトした配列も包含されるし、或いは上記の特定の配列と異なる、例えば１〜３個の塩基が異なる、配列であってもよい。
本発明のｓｉＲＮＡは、上に例示したようなｓｉＲＮＡの標的となるＤＲＥＦ配列に基づいて、周知の化学合成技術を用いて合成することができる。例えば、固相ホスホアミダイト法などのＤＮＡ合成技術を利用したＤＮＡ（／ＲＮＡ）自動合成装置を使用して化学的に合成するか、或いは、ｓｉＲＮＡ関連の受託合成会社（例えばフナコシ株式会社、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ社、Ａｍｂｉｏｎ社など）に委託して合成することも可能である。
本発明の実施形態によれば、本発明のｓｉＲＮＡは、その前駆体である二本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から、細胞内ＲＮアーゼであるダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によるプロセシングを介して誘導されてもよい。
ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列との間にループを有する二本鎖ＲＮＡであり、好ましくはその３’末端に１〜６個、好ましくは２〜４個のポリＵからなるオーバーハングを含む。ｓｈＲＮＡは、ＲＮアーゼＩＩＩファミリーに属するダイサーによってｓｉＲＮＡにプロセシングされたのち、ｓｉＲＮＡが一本鎖化され、そのアンチセンス鎖ＲＮＡがＲＮＡ切断活性をもつ分子等と複合体ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）を形成し、これによってｓｉＲＮＡ配列に相補的な配列を持つ標的ｍＲＮＡが切断され、その結果、ＤＲＥＦ遺伝子の発現が抑制される。
したがって、本発明の上記ｓｉＲＮＡ及びその前駆体ｓｈＲＮＡはいずれも、本発明の組成物の有効成分として使用することができる。
選択されたＲＮＡｉ核酸は、臨床使用の際にいわゆるオフターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）作用を示さないことが望ましい。オフターゲット作用とは、標的遺伝子以外に、使用したＲＮＡｉ核酸に部分的にホモロジーのある別の遺伝子の発現を抑制する作用をいう。オフターゲット作用を避けるために、候補ＲＮＡｉ核酸について、予めジーンチップなどを利用して交差反応がないことを確認するか、或いはＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）などのデータベースを利用して配列同一性のない又はほとんどないことを確認することが必要である。しかし幸いにも、ヒトＤＲＥＦは、ヒトにおいて、正常細胞で実質的に発現されない一方で、癌細胞で有意に発現されるため、オフターゲット作用の問題は回避できると予想される。
本発明のＲＮＡｉ核酸を患者の体内に導入するときには、核酸を患部に直接注入するか、又は核酸の発現が可能なベクターを使用することが好ましい。或いは、ｓｉＲＮＡ又はベクターを、リポソーム、例えばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン、他の正電荷リポソーム（例えば、正電荷コレステロール）、又はマイクロカプセル、と複合体形成し、この複合体を使用することもできる（例えば、中西守ら，蛋白質  核酸  酵素，４４巻１１号，４８〜５４頁，１９９９年；Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９：４３２５−４３３３，１９９９；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９，１９８７）。哺乳動物細胞の細胞膜は負電荷を帯びているため、正電荷リポソームが好ましく使用される。正電荷リポソーム−核酸複合体は、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれたのち、核酸はさらに細胞質又は核へ移行することができる。
或いは、本発明の治療用ＲＮＡｉ核酸を、粒径約５００ｎｍ以下のナノ粒子中に封入することもできる。ナノ粒子として、例えばＢ型肝炎ウイルスエンベロープＬ粒子から形成されるホローナノ粒子（ｈｏｌｌｏｗ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）が例示され、核酸は、エレクトロポレーションによってこの粒子内に封入される。この核酸封入粒子は、血中に投与されるとき肝臓に送達されうる（Ｔ．Ｙａｍａｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１（８）：８８５−８９０，２００３）ため、肝癌の治療に有用であろう。
或いは、本発明の治療用ＲＮＡｉ核酸をリポソーム中に封入するときには、核酸を硫酸プロタミンで処理して凝縮を起こし核酸−タンパク質複合体としたのち、正電荷脂質又は高分子ミセル中に封入することもできる。
リポソーム−核酸複合体は、例えば逆相蒸発法（Ｆ．Ｓｚｏｋａら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６０１：５５９，１９８０）、ボルテックス振とう法、カルシウム融合−ＥＤＴＡキレート法（金田安史，実験医学２２巻１４号（増刊），１４７〜１５２頁，２００４年）などの方法によって製造することができる。
本発明のｓｉＲＮＡやベクターなどの核酸を標的癌細胞の中に導入する別の方法は、マイクロインジェクション法、ウイルスベクター法などがある。
マイクロインジェクション法は、微細な注入針で核酸を細胞内に直接顕微注入する方法である。
ウイルスベクター法は、ウイルスベクターを用いて核酸を細胞内に導入する方法であって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを発現する発現ユニットを組み込んだ組換えウイルスを作製し、細胞に感染させて細胞内で発現させる方法である。ウイルスの例は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスなどを含む。
本発明の実施形態により、本発明で使用可能な核酸として、前記ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡなどのＲＮＡｉ核酸をコードするＤＮＡ配列をプロモーターの調節下に含む発現ベクターが含まれる。
発現ベクターの１つの例は、ヘアピン型ベクターである。このベクターは、前記センス鎖ＲＮＡ配列と前記アンチセンス鎖ＲＮＡ配列とが一本鎖ループ配列を介して共有結合されているヘアピン型ＲＮＡをコードするＤＮＡを含み、ここで該ＤＮＡは、細胞内で転写により該ヘアピン型ＲＮＡを形成し、ダイサーによりプロセシングされて前記ｓｉＲＮＡを形成するベクターである。
ｓｉＲＮＡをコードするヘアピン型ＤＮＡの３’末端には、転写停止シグナル配列として、或いはオーバーハングのために、１〜６個、好ましくは１〜５個のＴからなるポリＴ配列、例えば４個又は５個のポリＴ配列が連結される。ベクターＤＮＡから転写されたｓｉＲＮＡ前駆体としてのショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、そのアンチセンス鎖の３’末端に２〜４個のＵからなるオーバーハングを有することが望ましく、オーバーハングの存在によって、センス鎖ＲＮＡ及びアンチセンス鎖ＲＮＡはヌクレアーゼによる分解に対して安定性を増すことができる。ヒトには内在性のダイサーが１つ存在し、これが長鎖ｄｓＲＮＡや前駆体ｍｉＲＮＡをそれぞれｓｉＲＮＡと成熟ｍｉＲＮＡに変換する役割をもつ。
本発明における前記ループ配列の例は、５’−ＵＵＣＡＡＧＡＧＡ−３’（配列番号１３５）、５’−ＣＵＵＣＣＵＧＵＣＡ−３’（配列番号１３６）、５’−ＵＵＣＣＡＧ−３’（配列番号１３７）などであるが、これらに限定されない。
本発明のＲＮＡｉ核酸のなかで特に好ましいＲＮＡｉ＃３、ＲＮＡｉ＃４、ＲＮＡｉ＃５及びＲＮＡｉ＃６を発現するためのベクターに組み込まれるＤＮＡ配列の組み合わせはそれぞれ、下記の配列番号２０と２１、配列番号２３と２４、配列番号２６と２７、配列番号２９と３０である。なお、下線は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖に対応する配列を示す。
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本発明の上記発現ベクターは、上記ヘアピン型ＤＮＡの５’側にプロモーターを含むことができる。プロモーターの例は、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えばヒトもしくはマウス由来のＵ６プロモーター又はＨ１プロモーター、ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、或いはサイトメガロウイルスプロモーターである。
本発明の発現ベクターの別の例は、タンデム型ベクターである。このベクターは、前記ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列とアンチセンス鎖ＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列とを連続して含み、かつ各鎖の５’末端にプロモーターが、また各鎖の３’末端にポリＴ配列がそれぞれ連結されたＤＮＡを含み、ここで該ＤＮＡは、細胞内で転写後に該センス鎖ＲＮＡと該アンチセンス鎖ＲＮＡとがハイブリダイズして前記ｓｉＲＮＡを形成するベクターである。
タンデム型ベクターにおけるプロモーターの例は、ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えばヒトもしくはマウス由来のＵ６プロモーター又はＨ１プロモーター、或いはサイトメガロウイルスプロモーターである。
また、ポリＴ配列は、１〜６個、好ましくは１〜５個のＴからなるポリＴ配列、例えば４個又は５個のポリＴ配列である。
本発明のタンデム型ベクターは、細胞内に導入されたのち、センス鎖とアンチセンス鎖に相当するＲＮＡに転写され、互いにハイブリダイズして目的のｓｉＲＮＡを生成することができる。
本発明の実施形態により、上記ヘアピン型及びタンデム型ベクターは、プラスミドベクター又はウイルスベクターである。
プラスミドベクターは、後述の実施例に記載の手法又は文献記載の方法を用いて調製してもよいし、或いは市販のベクター系、たとえばｐｉＧＥＮＥＴＭＵ６系ベクター及びｐｉＧＥＮＥＴＭＨ１系ベクター（タカラバイオ株式会社）を利用することもできる（Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２），２９６：５５０−５５３；Ｎ．Ｓ．Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），２０：５００−５０５；Ｍ．Ｍｉｙａｇｉｓｈｉら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２），２０：４９７−５００；Ｐ．Ｊ．Ｐａｄｄｉｓｏｎら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．（２００２），１６：９４８−９５８；Ｔ．Ｔｕｓｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００２），２０：４４６−４４８；Ｃ．Ｐ．Ｐａｕｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），２０：５０５−５０８；多比良和誠ら編、ＲＮＡｉ実験プロトコル、羊土社、２００３年）。
プラスミドベクターは一般に、本発明のｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡ配列及びプロモーターの他に、薬剤耐性遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子など）、転写停止配列、ユニーク制限部位もしくはマルチプルクローニングサイト、複製開始点などを含むことができる。
ウイルスベクターは、たとえばアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター（白血病ウイルスベクターなど）、ヘルペスウイルスベクターなどを使用することができる。ウイルスベクターは、ヒトに使用する際に疾病を引き起こさないように例えば自己複製能を欠損したタイプのものが好ましい。たとえばアデノウイルスベクターの場合には、Ｅ１遺伝子及びＥ３遺伝子を欠失した自己複製能欠損型アデノウイルスベクター（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＡｄｅｎｏ−Ｘ）を使用することができる。ウイルスベクターの構築は、文献記載の方法を利用することができる（米国特許第５２５２４７９号、国際公開ＷＯ９４／１３７８８など）。
本発明のプラスミドベクターは、上記のとおり、例えばリポフェクタミン、リポフェクチン、セルフェクチン、又は正電荷コレステロールなどの正電荷リポソームと複合体を形成しカプセル化された状態で患者の体内に導入することができる（中西守ら，上記；Ｗｕら，上記）。また、ウイルスベクターは患部に導入し細胞感染させることによって細胞内に遺伝子導入することができる（Ｌ．Ｚｅｎｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３），１００：７７７９７−７８０２；Ｈ．Ｘｉａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００２），２０：１００６−１０１０；Ｘ．Ｆ．Ｑｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００３），１００：１８３−１８８；Ｇ．Ｍ．Ｂａｒｔｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００２），９９：１４９４３−１４９４５；Ｊ．Ｄ．Ｈｏｍｍｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．（２００３），９：１５３９−１５４４）。特にアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターは種々の細胞種に非常に高い効率で遺伝子導入可能であることが確認されている。このベクターはまた、ゲノム中に組み込まれることがないため、その効果は一過性であり安全性も他のウイルスベクターと比べて高いと考えられる。
本発明のベクターに組み込まれるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡは、ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖配列とアンチセンス鎖配列とが一本鎖ループ配列を介して共有結合されているヘアピン型ＲＮＡをコードし、かつ細胞内で転写により該ヘアピン型ＲＮＡを形成し、ダイサーによりプロセシングされて該ｓｉＲＮＡを形成するものである。
本発明のベクターに組み込まれるｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡの別の例は、ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖配列をコードするＤＮＡ配列とアンチセンス鎖配列をコードするＤＮＡ配列とを連続して含み、かつ各鎖の５’末端にプロモーターが、また各鎖の３’末端にポリＴ配列がそれぞれ連結されており、該ＤＮＡは、細胞内で転写後に該センス鎖ＲＮＡと該アンチセンス鎖ＲＮＡとがハイブリダイズして前記ｓｉＲＮＡを形成するものである。
１．２  アンチセンス核酸
本発明の組成物の有効成分としての別の核酸は、アンチセンス核酸である。このアンチセンス核酸は、配列番号２（２０２位〜２２８６位）のヌクレオチド配列を含むＤＲＥＦ遺伝子に対応するｍＲＮＡの配列、又はその部分配列、に相補的な配列を含むＲＮＡか、或いは配列番号２（２０２位〜２２８６位）のヌクレオチド配列、又はその部分配列、に相補的な配列を含むＤＮＡのいずれかである。
前記部分配列は、ＤＲＥＦ遺伝子又はｍＲＮＡの配列において連続する約３０以上、５０以上、７０以上、１００以上、１５０以上、２００以上又は２５０以上から全長以下、例えば５０〜１５０、のヌクレオチドからなる配列を含むことができる。
アンチセンス核酸のヌクレオチドは、天然のヌクレオチドに加えて、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）、メチル、カルボキシメチル又はチオ基などの基を有する修飾ヌクレオチドを含むことができる。
アンチセンス核酸は、周知のＤＮＡ／ＲＮＡ合成技術又はＤＮＡ組換え技術を用いて合成することができる。ＤＮＡ組換え技術によって合成する場合、配列番号２の配列を含むベクターＤＮＡを鋳型にして、増幅しようとする配列を挟み込むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って標的配列を増幅し、必要に応じてベクター中にクローニングして、アンチセンスＤＮＡを生成することができる。或いは、このようにして得られた増幅標的配列を有するＤＮＡをベクターに挿入し、該ベクターを真核又は原核細胞に導入し、その転写系を利用してアンチセンスＲＮＡを得ることができる。ベクターは、上に記載のウイルスベクター、プラスミドベクターを使用することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、それがＤＮＡであってもＲＮＡであっても、ＤＲＥＦ  ｍＲＮＡに結合することによって、タンパク質への翻訳を抑制することができる。
本発明のアンチセンス核酸を患者に送達するために、アンチセンス核酸を、上述したような正電荷リポソーム等のリポソームに封入してもよいし、或いはアンチセンス核酸を、例えば強力なｐｏｌ  ＩＩ又はｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの調節下にあるようにベクター（上述のプラスミド又はウイルスベクター）に組み込んでもよい。
１．３  抗体
本発明はさらに、配列番号１のアミノ酸配列を含むＤＲＥＦタンパク質又はその変異体のインビボ機能を抑制する抗体又はそのフラグメントを含む、癌治療用組成物を提供する。
本発明の前記標的タンパク質は、ＤＲＥＦ遺伝子によってコードされるタンパク質であり、ヒト癌の細胞増殖や細胞周期進行に関与するタンパク質である。したがって、癌細胞内に発現された該タンパク質の機能を阻害又は抑制することによって、結果として癌の増殖の抑制や細胞死に導くことができる。この目的のための薬剤は、ＤＲＥＦタンパク質又はその部分に対する抗体である。
好ましくは、ＤＲＥＦに対する抗体は、ＤＲＥＦのＣＲ１ドメイン、ＣＲ２ドメイン又はＣＲ３ドメイン（それぞれ配列番号１３５、１３３又は１３４）、或いはその部分に対する抗体である。特に好ましい抗体の例は、ＤＲＥＦ上のＤＲＥ（ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ）結合領域に対する抗体である。ＤＲＥＦのＤＮＡ結合ドメインは「ＢＥＤジンクフィンガー」と呼ばれ、亜鉛イオン（一個）をもつ蛋白構造を有する。このドメインはＣＲ１内の一部であり、配列番号１のＤＲＥＦアミノ酸配列の２０番目〜７４番目の配列（配列番号１４０）を含む。ＤＲＥＦのこのドメインを含む領域に対する抗体は、ＤＲＥＦのＤＮＡ結合を阻害し、その結果ＤＲＥＦのインビボ機能を阻害することができる。
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また、別のＤＮＡ結合に関連するドメインは、ＤＲＥＦのＣＲ３内の一部であり、配列番号１のＤＲＥＦアミノ酸配列の５７１番目〜６５１番目の配列（配列番号１４１）を含む。このドメインは、アクチベータースーパーファミリー（ｈＡＴ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）と呼ばれ、二量体形成ドメイン（ｄｉｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）である。ＤＲＥＦのこのドメインを含む領域に対する抗体は、ＤＲＥＦの二量体形成を阻害するため、結果としてＤＲＥＦのＤＮＡ結合が阻害され、ＤＲＥＦのインビボ機能が阻害されうる。
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本発明に有用な抗体の作製については、下記のＣＲ１、ＣＲ２及びＣＲ３ドメインのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を利用して、公知のペプチド合成技術又はＤＮＡ組換え技術を用いて（ポリ）ペプチドを合成し目的の抗体を作製することができる。
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このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、二重特異抗体、合成抗体などが含まれる。抗体の特性及び構造については、小関至ら，実験医学２２巻１４号（増刊）１２５〜１３０頁，２００４年、羊土社（東京、日本）に記載されており、その開示は本発明のために使用できる。
本発明での使用に適する好ましい抗体は、アナフィラキシーによる副作用を全く又はほとんど起こさないヒト抗体又はヒト化抗体、特にヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。また、抗体のクラス、サブクラスは任意のタイプのものでよい。例えば、抗体のタイプには、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２が含まれる。抗体はまた、ペグ化、アセチル化、グリコシル化、アミド化などによって誘導体化されていてもよい。
ヒト抗体は、例えばファージジスプレイライブラリー（ｐｈａｒｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）法（Ｔ．Ｃ．Ｔｈｏｍａｓら，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３：１３８９−１４０１，１９９６）又はヒト抗体産生動物（例えばマウス、有蹄類など）を用いる方法（Ｉ．Ｉｓｈｉｄａら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４：９１−１０２，２００２）によって製造できる。
ヒト抗体産生マウスは、例えば、ヒト人工染色体にヒト抗体産生遺伝子を含むヒト染色体断片を導入したのち、ミクロセル法を用いて例えばマウス胚性幹細胞ゲノムに人工染色体を組み込み、仮親マウスの子宮に移植し、キメラマウスを出産し、雌雄のキメラマウスの交配、或いはキメラマウスと同種の野生型マウスとの交配によって、ヒト抗体遺伝子を含み、したがってヒト抗体の産生が可能である、ホモ型の子孫マウスを作出するなどの方法によって作製することができる（例えば、再表０２／０９２８１２、国際公開ＷＯ  ９８／２４８９３、国際公開ＷＯ  ９６／３４０９６など）。このヒト抗体産生トランスジェニックマウスに、本発明の標的ＤＲＥＦタンパク質を抗原として免疫したのち、脾臓を摘出し、慣用技術によってこの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを形成し、目的のモノクローナル抗体を作製することができる（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ及びＣ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７，１９７５）。
ファージディスプレイ・ライブラリー法は、未処置のヒトリンパ細胞から直接入手した免疫グロブリン遺伝子のライブラリーから、目的の抗体をコードするＤＮＡをスクリーニングし、このＤＮＡと、抗体鎖との間に、ファージ粒子を用いて物理的会合を確立し、これによって、標的に親和性をもつ抗体を提示するファージを親和性スクリーニングによって富化することを含む。この方法を用いて、標的に対する結合親和性をもつ抗体を、通常の手法によって大量に合成することができる（例えば、特表２００３−５２７８３２）。
ヒト化抗体は、例えば、ヒトＤＲＥＦタンパク質を免疫したマウスから作製した該ＤＲＥＦに対するマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、ヒトＩｇＧに結合することによって得ることができる。このようなヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を用いることに作製可能である。抗体をヒト化する技術は、例えば米国特許第６６３９０５５号、同５５３０１０１号などに記載されている。
本発明において、ＤＲＥＦタンパク質の変異体は、ヒト個体内で自然発生的に生ずるすべての変異体を含み、例えば多型性や突然変異に基づくような変異体、或いは選択的スプライシングによる変異体を含む。変異体は、配列番号１のアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加された配列を有し、かつ癌の細胞増殖に関与するインビボ機能を有する。本明細書において「数個」とは、１０個以下、８個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下又は２個を意味する。或いは、変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上の％同一性を有する配列を含むものである。本明細書において「％同一性」は、配列アラインメントにおいてギャップの導入が可能な公知のＢＬＡＳＴプログラム（ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮ）に基づいて決定されうる（例えばＳ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２１５：４０３−４１０，１９９０など）。
本発明の抗体又はその断片は、単独で、或いは抗癌剤（化学療法剤、放射性物質など）などの薬剤を結合させた形態で、癌に対する治療剤として用いることができる。抗癌剤には、例えばタキソール、シタラビン、シスプラチン、エトポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、パクリタキセルなどの化学療法剤、放射性インジウム、テクネチウム、イッテルビウムなどの放射性金属などが含まれるが、これらに限定されない。抗体への抗癌剤の結合は、例えばリンカーを介して共有結合によって、或いは金属イオンとの配位結合によって、抗体定常領域の任意の部位に抗癌剤を結合することを含む方法によって行うことができる。
患者への抗体又はそのフラグメントの送達は、単独か又は例えばリポソーム（好ましくは、正電荷リポソーム）、マイクロカプセル又はナノ粒子中に抗体又はそのフラグメントを封入した形態で、通常は適当な担体、賦形剤又は希釈剤と組み合わせて、非経口経路（例えば、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与など）にて行うことができる。
１．４  組成物
本発明の組成物は、癌、特にＤＲＥＦを発現する癌をもつ患者を治療するために使用することができる。そのような癌の例は、以下のものに限定されないが、肺癌、食道癌、膵癌、胃癌、肝癌、大腸癌、甲状腺癌、前立腺癌、膀胱癌、腎癌、皮膚癌、胆癌、脳腫瘍、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、精巣癌、リンパ腫、メラノーマ、肉腫、骨肉種などを含み、より好ましい癌は、肺癌、食道癌、乳癌、膵癌などである。
本発明の組成物中の核酸の用量は、ｓｉＲＮＡ分子又はアンチセンス核酸分子に換算すると、以下のものに限定されないが、１投与単位あたり、１ｎＭ〜１００μＭ、好ましくは１０ｎＭ〜５０μＭ、より好ましくは１００ｎＭ〜２０μＭである。
本発明の組成物中の抗体又はそのフラグメントの用量は、以下のものに限定されないが、１投与単位あたり、約１〜約１００ｍｇ／ｍｌ、約５〜約７０ｍｇ／ｍｌ、約１０〜５０ｍｇ／ｍｌである。
しかし、上記の用量又は投与量は、患者の状態、年齢、性別、重篤度などに応じて変化しうるものであり、専門医の判断により用量又は投与量が決定されるべきである。
本発明の組成物は、通常、製薬上許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤、例えば滅菌水、生理食塩水、緩衝液、非水性液体（例えば、アーモンド油、植物油、エタノールなど）などを含むことができる。該組成物にはさらに、製薬上許容可能な安定剤（例えばメチオニンなどのアミノ酸類）、保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ソルビン酸）、等張化剤（例えば塩化ナトリウム）、乳化剤（例えばレシチン、アラビアゴム）、懸濁化剤（例えばセルロース誘導体）などを含有させることができる。
好ましい医薬製剤は、溶液剤、懸濁液剤、乳剤、リポソーム封入剤などである。
本発明の組成物の投与方法は、非経口投与、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与などを含む。局所投与には、外科手術又は内視鏡下で患部に直接注射する方法などが含まれる。また、専門医が決定した治療計画に基づいて、一定の時間間隔、例えば１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１年又は２年などの間隔で、患者に対して、本発明の組成物を１〜数回に分けて投与することができる。
本発明のＲＮＡｉ核酸、アンチセンス核酸、又は抗体を癌、特に肺癌に適用したとき、肺癌細胞で強く細胞周期停止とともに細胞死誘導を起こすことができる。特に一部の肺癌細胞では、ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈと呼ばれる、Ｍ期での細胞死誘導が見られた。一方、正常肺由来細胞株では、肺癌に比して、細胞周期停止は軽度であった。
本発明のＤＲＥＦを標的とする癌治療法は、下記に述べる治療剤のスクリーニング法と組み合わせることによって、癌患者の症例に最適なオーダーメイド医療として使用できるだろう。
２．癌治療薬のスクリーニング
本発明はさらにヒト培養癌細胞、或いは強発現可能にＤＲＥＦ遺伝子をトランスフェクションした（正常又は非正常）ヒト細胞株、を含む培地に候補薬剤を加えて、ＤＲＥＦ遺伝子の発現又は翻訳を抑制する薬剤をインビトロでスクリーニングすることを含む、癌治療用薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
薬剤のスクリーニングは、具体的には、癌細胞、或いはＤＲＥＦ強発現哺乳類（例えばヒト、マウスなど、好ましくはヒト）細胞株、の細胞増殖抑制、細胞周期停止及び／又は細胞死誘導を指標とすることができる。
具体的には、本発明の方法は、ヒト培養癌細胞、又はＤＲＥＦ強発現細胞株、を準備し、該細胞を候補薬剤の存在下で培養し、ＤＲＥＦ遺伝子又はｍＲＮＡの発現の抑制について、或いは上記細胞又は細胞株の細胞増殖抑制、細胞周期停止及び／又は細胞死誘導について、候補薬剤をスクリーニングすることを含む。
ヒト培養癌細胞には、公知の癌細胞株、癌患者からのバイオプシー由来の癌細胞などが含まれ、本発明において使用できる。癌細胞株の例は、いずれも肺癌細胞株である、ＡＣＣ−ＬＣ−９１（Ｈ．Ｏｓａｄａら，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．２００５，４４：２３３−２４１）等のＡＣＣ−ＬＣ、Ａ５４９（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＤ）、ＰＣ１０（免疫生物研究所、群馬、日本）、Ｃａｌｕ６（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌ，ＭＤ）などである。
ＤＲＥＦ強発現細胞株は、例えば次のようにして作製することができる。レンチウイルスベクター（例えばＣＳＩＩ−ＣＭＶ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｂｓｄベクター（理化学研究所（埼玉、日本）の三好浩之博士から入手）にＤＲＥＦ  ｃＤＮＡを挿入したレンチウイルスを作製し、これを、ヒト正常気道上皮由来細胞株ＢＥＡＳ２Ｂに感染させ、Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で選択培養することで、ＤＲＥＦを恒常的に強発現している株を選択する。培養培地としては、例えば胎児牛血清１％添加Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）を使用できる。増殖速度は、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒＯｎｅＴＭ（生化学工業、東京、日本）を用いるＭＴＴアッセイなどによって測定できる。このようにして実際に作製されたＤＲＥＦ強発現細胞株（例えばＢＥＡＳ２Ｂ−ＤＲＥＦ株）は、６日の培養で対照株と比べて約３倍の増殖速度の亢進が観察された。
本発明の方法において、ＤＲＥＦ遺伝子又はｍＲＮＡの発現の抑制の程度は、候補薬剤を添加しない対照との比較実験によって判定できる。発現レベルは、癌細胞、又はＤＲＥＦ強発現細胞株、から周知の方法（例えばフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール法やグアニジウム／ＣｓＣｌ法、オリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィーなど）で得た全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ又はポリＡ（＋）ＲＮＡについて、或いは逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法によってＲＮＡから合成されたｃＤＮＡについて、定量ＲＴ−ＰＣＲ法、蛍光又は放射性標識したプローブを用いるハイブリダイゼーション法（例えばノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロアレイ、組織マイクロアレイなど）によって決定することができる（西郷薫ら訳、分子生物学実験プロトコールＩ，ＩＩ，ＩＩＩ、１９９７年、丸善）。或いは、発現レベルは、ＤＲＥＦ遺伝子によってコードされるタンパク質（配列番号１）の細胞内レベルを、該タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントを用いる免疫測定法、ウエスタンハイブリダイゼーション法、組織染色法などによって測定することによって間接的に決定することができる。
前記プローブは、配列番号２（２０２位〜２２８６位）のヌクレオチド配列又はそれと相補的な配列、或いはその連続する例えば約２０以上、約３０以上、５０以上、７０以上、１００以上、１５０以上、２００以上、２５０以上のヌクレオチドからなる配列、を有するＤＮＡである。プローブは、蛍光又は放射性標識を結合した標識プローブとするのが好ましい。蛍光性標識には、例えばフルオレサミン、ローダミン、それらの誘導体、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが含まれる、放射性標識には、例えば放射性リン又はイオウ原子が含まれる。
ハイブリダイゼーションは、低ハイブリダイゼーション、中ハイブリダイゼーション又は高ハイブリダイゼーション条件によって、好ましくは高ハイブリダイゼーション条件によって行うことができる。例えば、約４５〜５０℃で２〜６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１５ｍＭクエン酸ナトリウム）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、約５０〜６５℃での０．２〜２×ＳＳＣ／０．１〜１％ＳＤＳによる洗浄からなる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５年，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＵＳ；西郷薫ら訳、分子生物学実験プロトコールＩ，ＩＩ，ＩＩＩ、１９９７年、丸善）。或いは、６０〜６５℃で６×ＳＳＣ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションののち、６０〜６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄などからなる。ハイブリダイゼーション温度は、一般に融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低い温度を使用することができる。Ｔｍは、例えば、式：Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッドの塩基数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファ中のＮａ＋の濃度である。）によって求めることができる（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ  ２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
候補薬剤は、小分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）などを含むが、これらに限定されない。
免疫測定法は、抗原−抗体反応を利用する分析法であり、例えば酵素結合抗体法（例えばＥＬＩＳＡ）、蛍光抗体法、固相法、均一法、サンドイッチ法、ビオチン／アビジン系などを適宜組み合わせて行うことができる。固相としては、例えば市販のプラスチック製プレート（例えばポリスチレン製の９６ウエルプレートなど）を使用することができる。これらの方法は、当業界で周知であり、その慣用技術を本発明で使用できる。
ヒト培養癌細胞、又はＤＲＥＦ強発現細胞株、において、ＤＲＥＦ遺伝子又はｍＲＮＡの発現が、候補薬剤の存在によって、候補薬剤無添加の対照と比べて、有意に阻害又は抑制される場合、該候補薬剤は癌治療剤として同定しうる。
定量ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼの存在下でｍＲＮＡ又はポリＡ（＋）ＲＮＡを鋳型に、ＤＲＥＦ遺伝子の配列由来のプラーマーを用いるＰＣＲによって行うことができる。プライマーのサイズは、約１５〜３０ヌクレオチド、好ましくは１７〜２５ヌクレオチドである。このとき発現変動のないハウスキーピング遺伝子の発現量に対するＤＲＥＦ遺伝子の発現量を決定する。
候補薬剤のスクリーニングはまた、ヒト培養癌細胞、又はＤＲＥＦ強発現細胞株、の細胞増殖の抑制、細胞周期の停止、又は細胞死を調べることによっても行うことができる。
細胞増殖は、次の手法によって測定できる。遺伝子導入の翌日、細胞を蒔き直した後にｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（２μｇ／ｍｌ）で２日間選択し、更にｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（０．５μｇ／ｍｌ）で１０日間選択を続ける。その後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒＯｎｅＴＭ（生化学工業、東京、日本）５％入り培地に置き換え、３７℃で１時間反応させる。その後その培地を回収しプレートリーダーにてＯＤ４５０ｎｍを測定し（このとき、ＯＤ６３０ｎｍを対照とする。）、生存細胞数とする（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）。又、その後、細胞はメタノール固定後に、５％Ｇｉｅｍｓａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）水溶液にて染色する。
細胞周期及び細胞死は、次の手法によって測定できる。遺伝子導入細胞をｐｕｒｏｍｙｃｉｎ選択後に回収し、低張液（７５ｍＭ  ＫＣｌ）に浮遊させる（３７℃，２０分）。その後、攪拌しながら固定液（メタノール：氷酢酸＝３：１混合液）約３容を加えて細胞を固定する。遠心上清除去後に再度固定液に浮遊させる。細胞浮遊液をスライドガラス上に１、２滴滴下し風乾する。その後５％  Ｇｉｅｍｓａ水溶液にて核染色体を染色する。実体顕微鏡ＢＨＴ−３２３（Ｏｌｙｍｐｕｓ）にて観察し、細胞を間期（Ｇｏ／Ｇ１，Ｓ，Ｇ２）、細胞分裂前期（Ｐｒｏｐｈａｓｅ）、細胞分裂中期（Ｍｅｔａｐｈａｓｅ）、細胞分裂後期／終期（Ａｎａｐｈａｓｅ／ｔｅｌｏｐｈａｓｅ）、及び死細胞（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈ及びａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に分けて計測する。
３．ＤＲＥＦ遺伝子の発現抑制によって影響を受ける遺伝子群
ＤＲＥＦ遺伝子の発現をＲＮＡｉ核酸によって抑制したときに、発現が変化する遺伝子群を、マイクロアレイを使用して解析した。
ＤＲＥＦ−ＲＮＡｉ＃４によるＤＲＥＦ遺伝子の発現抑制によって、表１（下記参照）に示される遺伝子群の発現に変化が認められた。
ＤＲＥＦ−ＲＮＡｉ＃３によるＤＲＥＦ遺伝子の発現抑制によって、表２（下記参照）に示される遺伝子群の発現に変化が認められた。
遺伝子の多くが、癌の発症、癌の進展、癌の転移と関連の高いものであることが判明した。これらの解析からも、ＤＲＥＦが種々の癌にとって重要な因子であることが分かる。それゆえに、ＤＲＥＦを分子標的とする本発明の方法は、癌の治療にとって有効な方法を提供するものであるといえる。
以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【０００６】
（実験方法）
１．ヒト癌細胞株
ヒト肺癌細胞株（ＡＣＣ−ＬＣ−９１又はＡ５４９）、５％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）を用いて５％ＣＯ２存在下で培養し、以下の実験に使用した。又、ヒト正常気道上皮細胞株（ＢＥＡＳ２Ｂ又はＨＰＬ１）は１％牛胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５μｇ／ｍｌ牛インスリン（Ｓｉｇｍａ）、５μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、０．１μＭハイドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ）及び０．２ｎＭトリヨードサイロニン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＨａｍ  Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）を用いて５％ＣＯ２存在下で培養し、以下の実験に使用した。
２．トランスフェクション及びＤＲＥＦ発現ベクター
細胞へのＤＲＥＦ発現ベクター及びＲＮＡｉ−ベクターの遺伝子導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）は、３．５ｃｍ培養皿に３×１０５の細胞を蒔き、翌日ＤＮＡとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を混合し、培地中に添加して行った。ＲＮＡｉベクター等のｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を持つベクターをトランスフェクトした場合は、トランスフェクションの翌日より（必要に応じ細胞を蒔き直した後に）ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）２μｇ／ｍｌ培地に添加し２日間選択後に遺伝子導入細胞を回収し、ＲＮＡ及び蛋白試料の作成、或いはＦＡＣＳ解析等を施行した。ＤＲＥＦ発現ベクターは、ＲＴ−ＰＣＲにより得られたＤＲＥＦ  ｃＤＮＡのＯＲＦ部分を発現ベクターのｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入したものを廣瀬富美子博士（兵庫県立大学、兵庫、日本）より分与された。
３．ＲＮＡｉ−オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡｉベクター
図１に示すように、対照としての公知の２つのＲＮＡｉ部位（＃１，＃２）のうちの１箇所（＃１）及び新規ＲＮＡｉ４箇所（＃３，＃４，＃５及び＃６）に対するＤＮＡオリゴヌクレオチドをＧｒｅｉｎｅｒ  Ｊａｐａｎ（東京、日本）に依頼して作製した。その塩基配列は以下のとおりである（なお、ＲＮＡｉの部位の数字はＤＲＥＦ  ＯＲＦ中の開始コドンの塩基「Ａ」を第１位としたときの核酸残基の位置番号を表わす）。
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（注１）ＲＮＡｉ＃３〜＃６の最初のＧはベクター上のＧが読まれるため、ｏｌｉｇｏ配列ではＲＮＡｉ部位の最初のＧが含まれず、２番目の残基から始まっている。
（注２）下線部はＤＲＥＦ  ＲＮＡｉ部位を示す。
ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を持つプラスミドベクター（ｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ）〔（注）このベクターは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のプラスミドｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２（５．２ｋｂ長）から、不要な部分１．０ｋｂ長を切り取って作製されたものである。〕に、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩによって転写するプロモーターであるマウスＵ６遺伝子プロモーターを挿入したＲＮＡｉベクターを作製した（ｐＵ６−ｐｕｒｏ）（Ｏｓａｄａ．，Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６５：１０６８０−５，２００５）。同様にヒトＨ１遺伝子プロモーターを挿入したＲＮＡｉベクターを作製した（ｐＨ１−ＲＮＡｐｕｒｏ）。
ＲＮＡｉベクターの作製のために、ＲＮＡｉ＃１用ｏｌｉｇｏは、ｐＨ１−ＲＮＡｐｕｒｏをＢｇｌＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化後に挿入した。ＲＮＡｉ  ＃３〜＃６は、ｐＵ６−ｐｕｒｏをＡｐａＩ消化、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ処理、及びＥｃｏＲＩ消化した後に挿入した。
Ｂｌａｎｋ  ｏｌｉｇｏは、ｐＵ６−ｐｕｒｏをＡｐａＩ−ＥｃｏＲＩ消化後に挿入した。
４．ＲＴ−ＰＣＲ解析
遺伝子導入後の細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収した。Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にて、添付の使用説明書にしたがってＲＴ−ＰＣＲを施行し、ＲＴ−ＰＣＲ産物をＴＢＥ−ａｇａｒｏｓｅゲル電気泳動にかけて、ＤＲＥＦ遺伝子の発現を検討した（図２）。
2008044787.tif 000018
５．Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析
ＤＲＥＦタンパク質は、ＤＲＥＦ−ｃＤＮＡの付加されたＨＡ−ｔａｇ／ｍｙｃ−ｔａｇに対する抗体を用いて検出された。遺伝子導入後の細胞を４％ＳＤＳ溶液で溶解、加熱処理した後に、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動し、セミドライ電気転写システムＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ＳＤ  ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。メンブレンに抗ＨＡ−ｔａｇ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）及び抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体（９Ｅ１０，Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ）を重層し、洗浄後ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅが結合した二次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を再度重層し、ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて、ＤＲＥＦタンパク質を検出した。
６．ＦＡＣＳ解析
遺伝子導入後の細胞を、ＩＧＥＰＡＬ（登録商標）ＣＡ−６３０（０．５％，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｄｅ（２０μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＢＳ溶液で浮遊させて、裸核中のＤＮＡを染色し、ＤＮＡ量をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて定量し、細胞周期解析ソフトＭｏｄＦｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で細胞周期（Ｇ０／Ｇ１，Ｓ，Ｇ２／Ｍ）を解析した。
７．細胞増殖解析
遺伝子導入の翌日、細胞を蒔き直した後にｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（２μｇ／ｍｌ）で２日間選択し、更にｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（０．５μｇ／ｍｌ）で１０日間選択を続ける。その後、ＴｅｔｒａＣｏｌｏｒ  Ｏｎｅ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ｋｏｇｙｏ、東京、日本）５％入り培地に置き換え、３７℃で１時間反応させる。その後その培地を回収しプレートリーダーにてＯＤ４５０ｎｍを測定し（このとき、ＯＤ６３０ｎｍを対照とする。）、生存細胞数とした（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ）。又、その後、細胞はメタノール固定後に、５％  Ｇｉｅｍｓａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）水溶液にて染色した。
８．免疫染色
遺伝子導入の翌日、細胞を培養皿に置いたカバーグラス上に蒔き直し、２日間ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（２μｇ／ｍｌ）選択する。その後、３．７％  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（１０％  Ｆｏｒｍａｌｉｎ）（Ｗａｋｏ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）ＰＢＳ溶液にて細胞を固定し（室温、８分）、ＴＢＳ溶液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６））にて洗浄後、０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ（Ｗａｋｏ）ＴＢＳ溶液にて、細胞透過処理する（室温、８分）。その後、各種一次抗体（抗γＨ２ＡＸ（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ），抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＴＭ−Ｓｅｒ１９８１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ），抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｈｉｓｔｏｎｅＨ３（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ））を添加し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８等の蛍光色素結合二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に添加した。洗浄後封入剤ＰｅｒｍａＦｌｕｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を加えてスライドガラスに載せ、共焦点レーザー蛍光顕微鏡Ｒａｄｉａｎｃｅ２１００（ＢＩＯ−ＲＡＤ）にて観察した。
９．ＴＵＮＥＬ解析
免疫染色実験と同様に、遺伝子導入細胞をカバーグラス上に蒔き、２日間ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ選択する。その後、３．７％  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ（１０％  Ｆｏｒｍａｌｉｎ）（Ｗａｋｏ）ＰＢＳ溶液にて細胞を固定する（室温、１０分）。その後、１％過酸化水素含有メタノール溶液処理（室温、２分）、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳ溶液処理（室温、５分）の後に、Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（Ｒｏｃｈｅ）にて、細胞内のＤＮＡ切断部位をＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ結合核酸にて標識する。その後必要に応じて、抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ｈｉｓｔｏｎｅＨ３等で免疫染色し、洗浄後、蛍光封入剤Ｓｈａｎｄｏｎ  ＰｅｒｍａＦｌｕｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，ＭＡ，ＵＳＡ）を加えてスライドガラスに載せ、共焦点レーザー蛍光顕微鏡にて観察した
１０．細胞死・細胞周期解析
遺伝子導入細胞をｐｕｒｏｍｙｃｉｎ選択後に回収し、低張液（７５ｍＭ  ＫＣｌ）に浮遊させる（３７℃，２０分）。その後、攪拌しながら固定液（メタノール：氷酢酸＝３：１混合液）約３容を加えて細胞を固定する。遠心上清除去後に再度固定液に浮遊させる。細胞浮遊液をスライドガラス上に１、２滴滴下し風乾する。その後５％  Ｇｉｅｍｓａ水溶液にて核染色体を染色した。実体顕微鏡ＢＨＴ−３２３（Ｏｌｙｍｐｕｓ）にて観察し、細胞を間期（Ｇｏ／Ｇ１，Ｓ，Ｇ２），細胞分裂前期（Ｐｒｏｐｈａｓｅ），細胞分裂中期（Ｍｅｔａｐｈａｓｅ），細胞分裂後期／終期（Ａｎａｐｈａｓｅ／ｔｅｌｏｐｈａｓｅ），及び死細胞（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈ及びａｐｏｐｔｏｓｉｓ）に分けて計測した。
１１．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ解析
理化学研究所・バイオリソースセンター（和光市、埼玉、日本）の三好浩之博士よりレンチウイルスシステム（ｐＥＮＴＲ４−Ｈ１，ＣＳ−ＲｆＡ−ＥＧ，ｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ，ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖ）の分与を受ける。ｐＵ６−ｐｕｒｏ−ＲＮＡｉベクターのＵ６ｐｒｍｏｔｅｒ−ＲＮＡｉ−オリゴ部分をｐＥＮＴＲ４−Ｈ１ベクターに挿入し、その後ＬＲｃｌｏｎａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてＣＳ−ＲｆＡ−ＥＧベクターに組み込む。ｐＣＡＧ−ＨＩＶｇｐ，ｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ−ＲＳＶ−Ｒｅｖと共に、２９３Ｔ細胞にｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍｉｎ２０００にてトランスフェクションする。翌日Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１０μＭ添加培地に置換し２４時間培養し、培養上清を回収する。培養上清をＳｗｉｎｇ  ｒｏｔｏｒ  ＳＷ２８にて１９，４００ｒｐｍで２時間超遠心し、レンチウイルス粒子沈渣を回収し、約５０倍に濃縮するように培地に溶かし、ウイルスストックとする（−７０℃保存）。ＡＣＣ−ＬＣ−９１細胞にレンチウイルス５０×濃縮ストック（１×１０４細胞あたり１．５μｌ）を添加する。添加後３６，５４，７２時間後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ解析、ＲＮＡ試料作製を行う。得られた３６時間のＲＮＡ試料２５０ｎｇから、ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）及びＴ７プロモーター配列を付加したオリゴｄＴプライマーを用いてｃＤＮＡを合成する。次にＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含むＬｏｗ  ＲＮＡ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｌｉｎｅａｒ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と、Ｃｙａｎｉｎｅ３（Ｃｙ３）−ＣＴＰ及びＣｙａｎｉｎｅ５（Ｃｙ５）−ＣＴＰ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）にて、Ｃｙ３／Ｃｙ５標識ｃＲＮＡを合成する。Ｃｙ３／Ｃｙ５標識ｃＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｗｈｏｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ４４Ｋ）にハイブリダイズさせ、アレースキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、蛍光色素量を定量し解析した。ＲＮＡｉ＃３及びＲＮＡｉ＃４のＲＮＡ試料と対照レンチウイルスのＲＮＡ試料との組み合わせでＣｙ３／Ｃｙ５標識を交換（Ｃｏｌｏｒ  ｓｗａｐｐｉｎｇ）して２回行い、平均値でＲＮＡｉ後の遺伝子変化を検討した。
（結果）
図１に、ヒトＤＲＥＦ／ＺＢＥＤ１遺伝子のドメイン構造と、ＲＮＡｉ部位及び配列を示す。ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ耐性遺伝子を持つｐｌａｓｍｉｄベクター（ｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ）に、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩが転写するプロモーターであるマウスＵ６プロモーターを挿入し、さらにｓｈｏｒｔ−ｈａｉｒｐｉｎ型ｏｌｉｇｏを挿入してＤＲＥＦ−ＲＮＡｉ系を作製した（ｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ−ｓｉＤＲＥＦ＃１〜＃６）。ＤＲＥＦ−ＲＮＡｉ系をヒト肺癌細胞株にトランスフェクションし、その後２４〜４８時間ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ処理により遺伝子導入細胞を選択し、ＤＲＥＦ−ＲＮＡｉ作用を解析した。
また、ＲＮＡｉのためにｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓベクターも用いた。ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓベクターに同様にｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ型ｏｌｉｇｏを挿入して、定法にしたがって２９３Ｔ細胞に遺伝子導入し、ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡを発現するｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ粒子を回収し、それを細胞培養液に添加して、解析した。
図２は、ＲＮＡｉ効果のＲＴ−ＰＣＲ解析結果を示す。肺癌細胞Ａ５４９に、ＲＮＡｉベクターｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ−ｓｉＤＲＥＦ＃１，＃３，＃４，＃５，＃６を導入し、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ４８時間処理後に、細胞を採取し、ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲにてＤＲＥＦ発現を検討した。ＤＲＥＦ−ｓｉＲＮＡを発現しない対照ベクター（ｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ−）Ｕ６ｂｌａｎｋに比して、すべてのｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ−ｓｉＤＲＥＦベクターでＲＮＡｉによる発現低下が見られた。
図３は、ＲＮＡｉ効果のＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ解析結果を示す。ＲＮＡｉ効果を更に検討するために、ＤＲＥＦ全長ｃＤＮＡ発現ベクター、及び、＃３，＃４のＲＮＡｉ部位をそれぞれｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎを起こし、ＲＮＡｉ抵抗性となったＤＲＥＦ全長ｃＤＮＡ発現ベクターを用い、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔにてＤＲＥＦ蛋白の発現変化を検討した。検出はＤＲＥＦ  ｃＤＮＡのＮ末に挿入したＨＡ−ｔａｇに対する抗体である抗ＨＡポリクローナル抗体を用いた。ｓｉＤＲＥＦ＃３，＃４でともに野生型ＤＲＥＦタンパク質の著名な減少がみられた。＃３，＃４のｓｉｌｅｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎをもつＤＲＥＦ（＃３ｍｕｔ，＃４ｍｕｔ）はＲＮＡｉに対して抵抗性であった。
図４は、細胞周期解析（１）の結果を示す。肺癌細胞株ＡＣＣ−ＬＣ−９１にｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ−ｓｉＤＲＥＦ＃１，＃３，＃４，＃５，＃６（及び対照ベクターのＵ６ｂｌａｎｋ）を導入し、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ選択後に、ＰＩ染色のＦＡＣＳにて細胞周期解析（ＤＮＡ含量解析）を行った。ｓｉＤＲＥＦ−＃３，＃５でＳ期の低下が見られＧ１−Ｓ移行段階での細胞周期停止（Ｇ１停止）傾向が見られた。又、＃４ではＧ１が著減しＧ２／Ｍの著増が見られて、非常に強いＧ２／Ｍステップでの細胞周期停止が見られた。＃３でもＧ２／Ｍの軽度の増加が見られ、＃３は強いＧ１停止と比較的軽度のＧ２／Ｍ停止を起こすと考えられた。
そこで、以降は強い細胞周期停止作用を示した＃３，＃４を中心に解析した。
図５Ａ，５Ｂ，５Ｃは、細胞周期解析（２）の結果を示す。数種の肺癌細胞株に同様にｐＣＭＶ−ｐｕｒｏ−ｓｉＤＲＥＦ，＃３，＃４（及びＵ６ｂｌａｎｋ）を導入し細胞周期を解析した。ＡＣＣ−ＬＣ−１７２では、ＡＣＣ−ＬＣ−９１と同様に、＃３は強いＧ１停止と比較的軽度のＧ２／Ｍ停止を起こし、＃４では強いＧ２／Ｍでの細胞周期停止が見られた。Ｃａｌｕ６・ＡＣＣ−ＬＣ−３１９でも＃４でＧ２／Ｍ停止傾向が見られた。Ａ５４９−＃４・ＰＣ１０−＃３及び−＃４では、Ｓの減少が見られ、Ｇ１停止傾向であった。また、正常肺由来細胞株のＢＥＡＳ２Ｂ及びＨＰＬ１で、細胞周期停止はほとんど見られなかった。
図６Ａ，６Ｂは、細胞増殖能解析結果を示す。ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １０日後の細胞数をＭＴＴアッセイ（細胞増殖キット使用）で解析した。ｓｉＤＲＥＦ−＃３，＃４により非常に強い細胞増殖抑制作用が得られ、抑制の強さは、＃４の方が強いと考えられた。＃１は弱い増殖抑制効果しか得られなかった。
図７は、γＨ２ＡＸ（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈ２ＡＸ）、Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１）染色結果を示す。ＭＴＴ解析での増殖抑制の機序として、ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ誘導の可能性を考え、ＤＮＡ損傷に反応し活性化されるキナーゼのＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１リン酸化が活性化の指標）、およびこのＡＴＭによりリン酸化されるヒストンＨ２ＡＸ（γＨ２ＡＸ＝ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｈ２ＡＸ）を免疫蛍光で検討した。ＡＣＣ−ＬＣ−９１及びＡＣＣ−ＬＣ−１７２でともに、＃３、＃４によりγＨ２ＡＸシグナルの増加がみられ、特に＃４では著増していた。ＡＣＣ−ＬＣ−９１のＰｈｏｓｐｈｏ−ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１）染色では、シグナルの著増がみられ、ｓｉＤＲＥＦ−＃３，＃４特に＃４で、ＤＮＡ障害が誘導され、ＡＴＭ活性化、Ｈ２ＡＸ等のＡＴＭ基質のリン酸化、細胞周期停止というシグナルが働いていると考えられる。ＡＣＣ−ＬＣ−９１と比較して、Ａ５４９・ＰＣ１０の＃３によるγＨ２ＡＸシグナルは、ほぼ同程度で見られた（データ示さず）。また、ＡＣＣ−ＬＣ−９１と比較して、Ａ５４９・ＰＣ１０の＃４によるγＨ２ＡＸシグナルは、Ａ５４９（±）＜ＰＣ１０（＋）＜ＡＣＣ−ＬＣ−９１（＋＋）であった（データ示さず）。
図８は、ＴＵＮＥＬ解析結果を示す。ＤＮＡ断片化を検出するＴＵＮＥＬ解析で、アポトーシス（細胞死）の誘導を検討した。Ｕ６ｂｌａｎｋと比較して、＃３及び＃４でアポトーシス誘導が見られた。アポトーシス頻度は＃３及び＃４で差異があり、＃３はＡ５４９、ＰＣ１０、ＡＣＣ−ＬＣ−９１及びＡＣＣ−ＬＣ−１７２の４株でほぼ同程度であったが、＃４では、Ａ５４９はＰＣ１０とほぼ同程度であり、またＡＣＣ−ＬＣ−９１はＡＣＣ−ＬＣ−１７２とほぼ同程度であり、ＡＣＣ−ＬＣ−９１はＡ５４９よりかなり大きなアポトーシス誘導を示した（一部データを示さず）。
図９は、細胞周期の変化を示す。ＦＡＣＳではＧ２とＭとの区別が容易ではないので、細胞をギムザ染色して細胞周期（間期（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ＝Ｇ１，Ｓ，Ｇ２）Ｍ期（ｐｒｏｐｈａｓｅ，ｍｅｔａｐｈａｓｅ，ａｎａｐｈａｓｅ−ｔｅｌｏｐｈａｓｅ））を検討した。ＡＣＣ−ＬＣ−９１ではｓｉＤＲＥＦ  ＃３，＃４でＭ期の増加が見られた。また、＃４では強いクロマチン凝集を起こしたＭ期細胞が増加しＭ期での細胞死誘導（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈ）が起こっていることが示された。
図１０は、Ｍ期での細胞死（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｃａｔａｓｔｒｏｐｈ）を示す。Ｍ期にリン酸化されるｐｈｏｓｐｈｏ−ｈｉｓｔｏｎ  Ｈ３（Ｈ３−Ｐ）とγＨ２ＡＸとを免疫染色し、ＤＮＡ障害・細胞死誘導と細胞周期との関係を検討した。ＡＣＣ−ＬＣ−９１ではＨ３−Ｐ陽性のＭ期細胞の多くがγＨ２ＡＸ陽性であり、Ｍ期でＤＮＡ障害により細胞死が誘導されていることが示された。
図１１は、ｓｉＤＲＥＦ−＃３，＃４の遺伝子発現解析結果を示す。ＡＣＣ−ＬＣ−９１にｓｉＤＲＥＦ＃３，ｓｉＤＲＥＦ＃４のｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓを感染させＲＮＡｉを誘導した。細胞周期停止（５４時間及び７２時間）が起こる前の、感染後３６時間でＲＮＡを採取し、対照ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ感染群のＲＮＡを対照ＲＮＡとして、ｓｉＤＲＥＦ＃３，＃４によって引き起こされる遺伝子発現の変化を検討した。この段階で変化する遺伝子群は、ＤＲＥＦによって直接発現制御され、細胞周期停止・細胞死誘導を引き起こしてくる遺伝子群である可能性が高い。
図１２は、肺癌患者検体におけるＤＲＥＦの発現を示す。
肺癌患者検体よりＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）にてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを回収し、そのｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５μｇからＭｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＭＭＬＶ−ＲＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて、ＲＴを施行しｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡ（ＲＮＡ  ２０ｎｇ相当）を用いて、ＤＲＥＦ遺伝子発現量及び内部対照として１８ＳリボゾームＲＮＡ発現量を、図２のＤＲＥＦプライマー及び１８Ｓプライマーを用いて、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ  ７９００（ＡＢＩ）にて定量した。有意さの検定は、ＳｔａｔＶｉｅｗ（ＳＡＳ）のｔ検定にて行った。
肺癌では全例ＤＲＥＦ発現が見られたのに対して、正常肺ではＤＲＥＦ発現が無かった。又、肺癌の中で組織型間でのＤＲＥＦの発現を比較してみると、組織型毎にＤＲＥＦ発現が異なり、特に腺癌と（腺癌、扁平上皮癌以外の）その他の組織型の肺癌とでは有意差（Ｐ＝０．０１２）があった。これらの事から、ＤＲＥＦ発現と肺癌発症との関連が示唆された。
図１３は、ＤＲＥＦ−ＲＮＡｉ＃４によって発現抑制される遺伝子の中で、癌の増殖に関連すると考えられるＲＰＬ１７遺伝子のＤＮＡ配列（Ａ）と、ＲＰＬ１７遺伝子のＤＲＥＦによる転写活性化の機序（Ｂ）を示す。転写開始点より＋７ｎｔ〜＋１６ｎｔの位置にＤＲＥＦタンパク質のＤＮＡ結合モチーフＴＧＴＣＧＹＧＡＹＡ（Ｙ＝Ｃ又はＴ）にほぼ一致（９０％）する配列が見出された。この配列にＤＲＥＦが結合してＲＰＬ１７  ＤＲＥＦ発現を誘導しており、ＤＲＥＦ−ＲＮＡｉ＃４によってＤＲＥＦ発現が低下するために、ＲＰＬ１７遺伝子も発現低下すると考えられる。
図１１のマイクロアレイによる遺伝子発現解析結果を表１（＃４）及び表２（＃３）示す。これらのＲＮＡｉ誘導の早期（３６時間）で発現が変化する遺伝子群はＤＲＥＦによって直接発現制御され、細胞周期停止、細胞死誘導を引き起こしてくる遺伝子群である可能性が高く、癌治療の標的となると考えられる。
【表１】
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【表２】
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【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明によるＤＲＥＦを標的とする癌治療は、正常組織に実質的に影響を及ぼすことなく、癌細胞に対して非常に強い細胞増殖抑制、Ｍ期での細胞死誘導、及びＧ２／Ｍ期での非常に強い細胞周期停止作用を有するため、癌の退縮と細胞死に非常に有効である。
本発明は、ＤＲＥＦを分子標的とする癌治療を可能とする。すなわち、本発明の治療剤は、癌の退縮と細胞死に非常に有効であるため、ＤＲＥＦを発現する癌の治療に有効に使用できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
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【図１】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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