(57)【要約】合成収率が高く実用的な方法で合成でき、インフルエンザウイルスの感染阻害活性が向上されたシアロ糖鎖含有ポリマーおよびその製造方法を提供する。下記構造式（Ｉ）で表され、γ−ポリグルタミン酸に末端にアミノ基とカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてシアロ糖鎖を結合させたＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマー。式（Ｉ）2009001805.tif 000011（式中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表される残基を意味し、ｎは１０以上の整数を示す。ただし、いずれか１以上のＺは式（ＩＩ）で表される残基である。）式（ＩＩ）2009001805.tif 000012（式中、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｙ１及びＹ２は水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｌは炭化水素を意味し、ｍは０又は１もしくは２の整数を示す。ただし、Ｙ１とＹ２は同一でない。）【選択図】  なし
2009001805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式（Ｉ）で表され、γ−ポリグルタミン酸に、一方の末端にアミノ基を有し他方の末端にカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてシアロ糖鎖を結合させたＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマー。
式（Ｉ）
2009001805.tif 000009
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表される残基を意味し、ｎは１０以上の整数を示す。ただし、いずれか１以上のＺは式（ＩＩ）で表される残基である。）
式（ＩＩ）
2009001805.tif 000010
（式（ＩＩ）中、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｙ１及びＹ２は水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｌは炭化水素を意味し、ｍは０又は１もしくは２の整数を示す。ただし、Ｙ１とＹ２は同一でない。）
【請求項２】
前記リンカーが、ω-アミノ酸である請求項１に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマー。
【請求項３】
前記Ｌで表される炭化水素が、炭素数１〜３０のものである請求項１に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマー。
【請求項４】
前記Ｌで表される炭化水素が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基もしくはそれらを２個以上アミド結合で縮合させたものである請求項１に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマー。
【請求項５】
糖の還元末端の１位をアミノ化した１−アミノ糖に、アミノ基とカルボキシル基をそれぞれの末端に有する化合物をリンカーとしてアミド結合させ、非還元末端側にアシアロ糖鎖部を有するＮ結合型アシアロ糖鎖を得る工程と、
前記Ｎ結合型アシアロ糖鎖を、このＮ結合型アシアロ糖鎖の還元末端に結合されている前記リンカーのアミノ基を介してポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合させアシアロ糖鎖含有ポリマーを合成する工程と、
前記アシアロ糖鎖含有ポリマーをシアリル化してＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーを得る工程と、を含むＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項６】
前記リンカーが、ω-アミノ酸である請求項５に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項７】
前記リンカーが含む炭化水素が、炭素数１〜３０のものである請求項５に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項８】
前記リンカーが含む炭化水素が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基もしくはそれらを２個以上アミド結合で縮合させたものである請求項５に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項９】
糖の還元末端の１位をアミノ化した１−アミノ糖に、アミノ基とカルボキシル基をそれぞれの末端に有する化合物をリンカーとしてアミド結合させ、非還元末端側にアシアロ糖鎖部を有するＮ結合型アシアロ糖鎖を得る工程と、
前記Ｎ結合型アシアロ糖鎖をシアリル化して、非還元末端側にシアロ糖鎖部が合成されたＮ結合型シアロ糖鎖を得る工程と、
前記Ｎ結合型シアロ糖鎖を、このＮ結合型シアロ糖鎖の還元末端に結合されている前記リンカーのアミノ基を介してポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合させシアロ糖鎖含有ポリマーを合成する工程と、を含むＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項１０】
水又は緩衝液と有機溶媒とを含む混合溶媒にγ−ポリグルタミン酸を溶解させ、カルボキシル基の活性エステル化剤、縮合剤及び／又は添加剤を用いて前記γ−ポリグルタミン酸を活性化した後、前記Ｎ結合型シアロ糖鎖と縮合させる請求項９に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項１１】
前記リンカーが、ω-アミノ酸である請求項９に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項１２】
前記リンカーが含む炭化水素が、炭素数１〜３０のものである請求項９に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項１３】
前記リンカーが含む炭化水素が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基もしくはそれらを２個以上アミド結合で縮合させたものである請求項９に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリグルタミン酸骨格の新規なＮ結合型人工シアロ糖鎖含有ポリマーおよびその効率的な製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、有効な治療法や感染防御法が見出されていない病原体の一つである。インフルエンザウイルスは、極めて感染性が強く、抗原変異を繰り返し、それまでの抗原性とは異なる新種が出現するため、ワクチンなどによる効果的な防御対策が立てにくいという問題がある。最近では、トリインフルエンザウイルスを起源とした新たなヒトインフルエンザウイルスの発生が危惧されている。そのため、インフルエンザ予防のため、インフルエンザウイルス吸着剤あるいは感染阻害剤などの開発が期待されている。【０００３】
インフルエンザウイルスの宿主細胞への感染は、ウイルス表面蛋白質であるヘマグルチニン（赤血球凝集素：ＨＡ）が宿主細胞表面のシアル酸含有複合糖鎖を受容体として認識して結合することによると考えられている。トリ類から単離したインフルエンザウイルスＡ型は末端にＮｅｕＡｃ（α２、３）Ｇａｌを有する糖鎖に優先的に結合するが、このウイルスと非常に類似したヒトウイルスは末端のＮｅｕＡｃ（α２、６）Ｇａｌ構造に高い結合親和性を示すことが報告されている。【０００４】
このように、インフルエンザウイルスには変異により種々の亜型が存在するため、より有効な抗インフルエンザウイルス剤としてはウイルスの亜型に関係なく広く受容体の結合を阻害する抗インフルエンザ作用を有するものが望まれており、シアル酸含糖鎖（シアロ糖鎖）化合物は、インフルエンザウイルス感染の最初のステップであるウイルス受容体への結合を阻害する感染阻害剤として、またはインフルエンザウイルス吸着剤として機能しうることが期待される。【０００５】
従来、種々のシアロ糖鎖化合物を使用し、赤血球凝集阻止活性を指標としたインフルエンザウイルスの付着阻止実験が行われてきたが、ウイルスの付着阻止活性が低い、あるいはその合成法が複雑で実用的でないなどの理由から、シアロ糖鎖化合物を有効成分とするインフルエンザウイルスの感染阻害剤は未だ開発されていないのが現状である。【０００６】
たとえば、特許文献１及び非特許文献１は、α−ポリグルタミン酸を骨格としてＮ−アセチルラクトサミンをα−ポリグルタミン酸の側鎖にパラ−アミノフェニル基をリンカーとして導入し、さらにオリゴ糖鎖の非還元末端にシアル酸を付与した、分子量２，０００〜１００万のシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドが開示され、広範囲なインフルエンザウイルス分離株に対し感染阻害活性を有することが確認されている。このシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン結合人工糖鎖ポリペプチドは、インフルエンザウイルスの感染阻害剤あるいは吸着剤として有用であるが、その原料であるα−ポリグルタミン酸やＮ−アセチルグルコサミン誘導体（パラ−ニトロフェニル配糖体）などは高価な化合物であり、また製造法も煩雑であり、極めて高い製造コストが必要であるのに対し、そのインフルエンザウイルスの感染阻害活性ＩＣ５０は、３−３０μｇ／ｍｌであり、実用上充分な活性とは言えなかった。【０００７】
また、特許文献２及び非特許文献２には、上記シアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドのポリペプチド部を安価に入手可能なγ−ポリグルタミン酸に、またシアロ糖鎖部とポリグルタミン酸のリンカー部を安価なアミノアルキルアルコールに改変したシアリル−Ｎ−アセチルラクトサミン含有人工糖鎖ポリペプチドが開示され、得られたポリマーが従来のポリマーと比べて数十倍のインフルエンザウイルス感染阻害活性を有することが報告されている。【０００８】
【特許文献１】特開２００３−７３３９７号公報
【特許文献２】国際公開パンフレット第ＷＯ２００７／０２６６６９号
【非特許文献１】Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，３１５−３２６（２００３）
【非特許文献２】Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５，１３８３−１３９３（２００７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
特許文献２及び非特許文献２に記載の人工シアロ糖鎖含有ポリマーは、安価な原料よりその合成が可能とはなっているが、実践的な製造にはまだ多くの課題がある。まず、アシアロ糖鎖部とリンカーとなるアミノアルキルアルコールとの縮合には高度に精製したトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来のセルラーゼが必要であり、かつ加水分解酵素の逆反応を利用するため、合成率は極めて低い（使用糖鎖の１％程度）という問題がある（問題点１）。【００１０】
また、これまでの人工シアロ糖鎖含有ポリマーの合成は、アシアロ糖鎖部に結合したアミノアルキルアルコールをリンカーとして用い、リンカーのアミノ基とポリグルタミン酸のカルボキシル基との縮合を過剰量の試薬を用いて行っている。これにより、有機溶媒に対する溶解性の低いポリグルタミン酸を均一に活性化させ、ゲル化などによる縮合反応の不均一化を防ぐことができるが、シアロ糖鎖を使用した場合では過剰量の試薬により非還元末端のシアル酸の有するカルボキシル基とリンカー末端のアミノ基が反応し、糖鎖部同士の縮合も生じるためこの方法を適用できない。そこで、アシアロ糖鎖部とリンカーとを結合してＯ結合型のアシアロ糖鎖を合成した後、このＯ結合型アシアロ糖鎖をγ−ポリグルタミン酸と縮合しアシアロ糖鎖含有ポリマーを合成し、最終的にラット由来のシアル酸転移酵素を用いてアシアロ糖鎖部の非還元末端にシアル酸を転移するという煩雑な工程で合成されていた（問題点２）。【００１１】
さらに、アシアロ糖鎖をポリグルタミン酸と縮合させた後にシアリル化することは、アシアロ糖鎖をシアリル化した後ポリグルタミン酸と縮合させるより困難である。例えば従来法の最終工程のシアル酸転移反応では微生物由来のシアル酸転移酵素は使用できず、アシアロ糖鎖含有ポリマーの分解を防ぐため、高度に精製された動物（ヒトを含む）由来のシアル酸転移酵素が必要となっているなど、結果的に製造コストを上昇させ、実用的な方法としては満足できる方法とはいえなかった（問題点３）。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、従来法の課題を解決すべく、鋭意検討の結果、１位を化学的にアミノ化して生成させたアミノ糖に、アミノ基を導入したアルキルカルボン酸など、一方の末端にアミノ基を有し他方の末端にカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてアミド結合させる、すなわちこれまでの糖鎖還元末端とリンカーのＯ結合型様式からＮ結合型に変更することで糖鎖部とリンカーの縮合を極めて簡便で高効率化できることを見出した。【００１３】
また、得られた新規なＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーが従来のＯ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの数倍のインフルエンザウイルス感染阻害活性を有することを見出した。【００１４】
さらに、シアロ糖鎖とポリグルタミン酸の縮合反応に、従来とは異なり含水系の混合溶媒を用いることで、ポリグルタミン酸の溶解性を改善し、過剰量の試薬を用いなくともポリグルタミン酸中のカルボキシル基を均一に活性エステル化できることを見出した。このように活性エステル化されたポリグルタミン酸溶液には過剰の試薬が存在しないため、シアロ糖鎖を添加することで過剰量の試薬によるシアロ糖鎖同士の縮合反応を未然に防ぐことができ、シアロ糖鎖のカルボキシル基を保護することなしに、リンカーを介したシアロ糖鎖部とポリグルタミン酸の縮合を高効率で行えることを確認し、本発明を完成させた。【００１５】
したがって、本発明は、下記構造式（Ｉ）で表され、γ−ポリグルタミン酸に、一方の末端にアミノ基を有し他方の末端にカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてシアロ糖鎖を結合させたＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーに関するものである。【００１６】
式（Ｉ）
2009001805.tif 000003
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表される残基を意味し、ｎは１０以上の整数を示す。ただし、いずれか１以上のＺは式（ＩＩ）で表される残基である。）【００１７】
式（ＩＩ）
2009001805.tif 000004
（式（ＩＩ）中、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｙ１及びＹ２は水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｌは炭化水素を意味し、ｍは０又は１もしくは２の整数を示す。ただし、Ｙ１とＹ２は同一でない。）【００１８】
また、本発明は、次の工程からなることを特徴とするＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造法（製法１）に関する。【００１９】
（工程１）
糖の還元末端の１位をアミノ化し、一方の末端にアミノ基を有し他方の末端にカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてアミド結合させてＮ結合型の糖プライマーを合成する工程。【００２０】
（工程２）
必要に応じて工程１で得られた糖プライマーに糖転移酵素を用いて糖鎖を伸長させ、非還元末端に目的とするアシアロ糖鎖部を合成してＮ結合型アシアロ糖鎖を合成する工程。【００２１】
（工程３）
工程２で合成したＮ結合型アシアロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合してアシアロ糖鎖含有ポリマーを合成する工程。【００２２】
（工程４）
工程３で合成したアシアロ糖鎖含有ポリマーを、シアル酸転移酵素を用いてシアリル化し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを単離取得する工程。【００２３】
さらに、本発明は、次の工程からなることを特徴とするＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造法（製法２）に関する。【００２４】
（工程１）
糖の還元末端の１位をアミノ化し、一方の末端にアミノ基を有し他方の末端にカルボキシル基を有する化合物をリンカーとしてアミド結合させてＮ結合型の糖プライマーを合成する工程。【００２５】
（工程２）
工程１で得られた糖プライマーに糖転移酵素を用いて必要に応じて糖鎖を伸長させた後、シアル酸転移酵素を用いてシアリル化反応を行って前記糖プライマーの非還元末端に目的とするシアロ糖鎖部を合成してＮ結合型シアロ糖鎖を合成する工程。【００２６】
（工程３）
カルボキシル基の活性エステル化剤、縮合剤及び／又は添加剤を用いてγ−ポリグルタミン酸を活性化し、工程２で合成したシアロ糖鎖をポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合する工程。【００２７】
製法２において工程３で合成したシアロ糖鎖含有ポリマーを次の工程で単離精製し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得してもよく、同様に製法１において工程４で構成したシアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製する工程を設けてもよい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明は、従来のシアロ糖鎖含有ポリマーのシアロ糖鎖部とリンカーの結合様式を改変し、安価にかつ収率良く製造可能で、従来のシアロ糖鎖含有ポリマーの数倍のインフルエンザウイルス感染阻害活性を示すシアロ糖鎖含有ポリマーを提供したものである。より収率の点を具体的に説明すれば、従来のＯ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーを合成する際、アシアロ糖鎖部とリンカーとなるアミノアルキルアルコールとの縮合には高度に精製したトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）由来のセルラーゼを必要し、かつ極めて低い合成収率でしか目的化合物を合成できなかったのに対し（使用糖鎖の１％程度）、Ｎ結合型に変更するだけで８０％以上の合成収率で目的化合物を合成することが可能である。【００２９】
このような本発明のシアロ糖鎖含有ポリマーは、インフルエンザウイルスの感染やインフルエンザの流行を防止する様々な手段に適用できる。ウイルス吸着剤として、フィルターへ充填することによる空気中からのインフルエンザウイルス除去、マスクへ充填することによるウイルスの拡散防止や感染予防など、有用性は高い。さらには、糖鎖部の非還元末端のシアル酸の付与をα２，３型とすれば、トリ感染型のインフルエンザウイルスに対する感染阻害剤としての利用も可能である。【００３０】
さらに、本発明の製法によれば、シアロ糖部とポリグルタミン酸の縮合反応はかなり難しい反応であったが、従来とは異なり含水系の混合溶媒を用いることで、ポリグルタミン酸の溶解性を改善し、過剰量の試薬を用いなくともポリグルタミン酸中のカルボキシル基を均一に活性エステル化でき、このように活性エステル化されたポリグルタミン酸溶液には過剰の試薬が存在しないため、従来法でみられた過剰量の試薬によるシアロ糖鎖同士の縮合反応を未然に防ぐことができ、シアロ糖鎖のカルボキシル基を保護することなしにリンカーを介したシアロ糖鎖部とポリグルタミン酸の縮合を高効率で行わせることができるため、シアロ糖鎖含有ポリマーの実用的な製造法を初めて提供することを可能とした。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１で調製したＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］の構造と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図２】実施例１で調製したＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］の構造と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図３】実施例１で調製したＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］の構造と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図４】実施例１で調製したＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］の構造と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図５】実施例１で調製したＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］の構造と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図６】実施例１で調製したＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］の構造と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【図７】実施例２で調製したＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］の構造と１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（１）Ｎ結合型人工シアロ糖鎖含有ポリマー
本発明のＮ結合型人工シアロ糖鎖含有ポリマー（Ｎ結合型人工シアロ糖鎖含有ポリペプチドと称することもある）は、以下の構造式（Ｉ）で示されるものである。【００３３】
式（Ｉ）
2009001805.tif 000005
（式（Ｉ）中、Ｚは水酸基又は式（ＩＩ）で表される残基を意味し、ｎは１０以上の整数を示す。ただし、いずれか１以上のＺは式（ＩＩ）で表される残基である。）【００３４】
式（ＩＩ）
2009001805.tif 000006
（式（ＩＩ）中、Ｘは水酸基又はアセチルアミノ基、Ｙ１及びＹ２は水酸基又はＮ−アセチルノイラミン酸残基、Ｌは炭化水素を意味し、ｍは０又は１もしくは２の整数を示す。ただし、Ｙ１とＹ２は同一でない。）【００３５】
式（ＩＩ）中、Ｌで表される炭化水素としては、炭素数１〜３０のものが好ましく、飽和炭化水素基及び不飽和炭化水素基のいずれであってもよい。具体的にはアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基、もしくはそれらを２個以上アミド結合などで縮合させ組み合わせたもの等が挙げられる。【００３６】
ここで、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基としては、炭素数１〜２０の直鎖又は分枝鎖のものが挙げられる。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テトラデシル基等の直鎖アルキル基；イソプロピル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、２−エチルヘキシル基等の分枝鎖アルキル基が挙げられる。【００３７】
アルケニル基の具体例としてはビニル基、プロペニル基、アリル基等が挙げられる。アルキニル基の具体例としてはエチニル基、プロピニル基、ブチニル基などが挙げられる。【００３８】
シクロアルキル基としては、炭素数３〜１０のものが挙げられ、特に炭素数３〜８のもの、例えばシクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基等が好ましい。【００３９】
アリール基としては炭素数６〜１４のもの、例えばフェニル基、トリル基、ナフチル基等が挙げられる。アラルキル基としては、炭素数７〜１４のアラルキル基、具体的にはベンジル基、フェネチル基などが挙げられる。シクロアルキル置換アルキル基としてはＣ３−Ｃ８シクロアルキル置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、例えばシクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、シクロプロピルエチル基、シクロペンチルエチル基、シクロヘキシルエチル基、シクロプロピルプロピル基、シクロペンチルプロピル基、シクロヘキシルプロピル基等が挙げられる。【００４０】
また、当該炭化水素は置換基を有していても良く、そのような置換基としては、ヒドロキシル基、アジド基、シアノ基、アルコキシ基、シクロアルキルオキシ基、アリールオキシ基、エステル化されていてもよいカルボキシル基等が挙げられる。さらに、これら化合物を２個以上アミド結合などで縮合して組み合わせたものも使用できる。【００４１】
Ｙ１又はＹ２で表されるＮ−アセチルノイラミン酸残基は下記式（ＩＩＩ）で表されるものであり、水酸基、カルボキシル基又はアセチルアミノ基が、同一または別異にハロゲン基、アルキル基またはアシル基で化学的に修飾されていてもよい。【００４２】
式（ＩＩＩ）
2009001805.tif 000007
【００４３】
このようなＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーは、塩型、遊離酸型のいずれであってもよく、塩型としては、例えは、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）；アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）；有機塩基塩（例えばトリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、ジシクロヘキシルアミン塩等）等が挙げられる。また、水和物あるいはアルコール等との溶媒和物であってもよい。【００４４】
また、Ｎ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの分子量は、例えば、２,０００〜５００万の範囲であり、グルタミン酸単位重合度（ｎ）は、例えば１０〜１０,０００の範囲であり、グルタミン酸残基に対するシアリルオリゴ糖の導入率は、１０〜８０％の範囲である。【００４５】
（２）Ｎ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造法（製法１）
（工程１）糖プライマーの合成【００４６】
工程１は、容易に入手可能な糖類の還元末端の１位水酸基を化学的にアミノ化したもの（１−アミノ糖類）に、リンカーとして末端にアミノ基とカルボキシル基とをそれぞれ有する化合物をアミド結合させることでＮ結合型糖プライマーを得る工程である。【００４７】
反応に使用する糖としては、アノマー位の水酸基がその後のアミノ化反応において活性を有しているものであれば、その他の水酸基が修飾または置換されているものでもよく、これは単糖、二糖、オリゴ糖のいずれでも良い。具体的には、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミンなどがあげられる。【００４８】
１−アミノ糖類は、公知の方法で調製すればよく、たとえば、上記の糖類の溶液（水、メタノール、エタノール、またはこれらの混合溶媒など）中に炭酸水素アンモニウムを飽和させた後、１０〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃で１〜１００時間程度、必要により撹拌しながら反応させるか（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ，１２２６，１１７−１２２（１９９７））、上記糖類の溶液を耐圧容器に入れ、アンモニアガスを飽和させた状態で１０〜７０℃、好ましくは３０〜５０℃で１〜１００時間程度、必要により撹拌しながら反応させる（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２３，１３０９−１３１９（１９５８））ことでも実施できる。【００４９】
合成した１−アミノ糖は、炭酸水素アンモニウムを用いた場合は、過剰分の試薬を結晶化により除去するか、もしくは水との共沸を繰り返して試薬を除去することで精製し、アンモニアガスを用いた場合は、反応液をろ過し、回収した結晶を有機溶媒（エタノール、ジエチルエーテルなど）で洗浄することで単離精製し、次の反応に使用する。【００５０】
リンカーであるアミノ基とカルボキシル基を有する化合物としては、ＮＨ２−Ｌ−ＣＯＯＨで表される化合物であり、Ｌは前記説明のとおり炭化水素である。具体的には、アミノ基を導入したアルキルカルボン酸等のω‐アミノ酸を例示することができる。アミノ基とカルボキシル基を有する化合物は、アミノ基を常法により適切な保護基で保護していてもかまわない。ここで用いる保護基としては、後の反応条件下において安定であり、さらにシアロ糖鎖構造に影響を与えない条件下で脱保護できるものが好ましく、たとえばトリフルオロアセチル基、ベンジル基、ベンジロキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボニル基などがあげられる。【００５１】
１−アミノ糖とアミノ基を保護したリンカーとをアミド結合させる縮合反応は、有機溶媒（ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなど）中、塩基（トリエチルアミン、トリブチルアミンなど）存在下、縮合剤（カルボニルジイミダゾール、クロロ炭酸エチル、テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロリン酸塩など）で処理することで実施される。【００５２】
塩基および縮合剤の使用量は、通常リンカーに対して１当量以上あればよい。また必要に応じて４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの一般的なアシル化反応の触媒を添加してもかまわない。【００５３】
縮合反応は−１０℃から１００℃で実施することができ、特に０℃から３０℃が好ましい。このように、１−アミノ糖とリンカーとを縮合反応に供することで、還元末端のアミノ化された１位の部分にリンカーが結合されたＮ結合型糖プライマーが合成される。【００５４】
合成されたＮ結合型糖プライマーは、通常のオリゴ糖の分離精製手段を用いて単離精製でき、例えば逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィやイオン交換クロマトグラフィなどを適宜組み合わせることで単離精製できる。【００５５】
（工程２）アシアロ糖鎖部の合成
工程２は、工程１で合成した糖プライマー（Ｎ結合型糖プライマー）と糖供与体（糖ヌクレオチド：ウリジン５’−ジリン酸ガラクトース、ウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミンなど）を含有する反応系に合目的的な糖転移酵素（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼなど）を添加してＮ結合型糖プライマーの非還元末端側に糖鎖を伸長させ、Ｎ結合型糖プライマーの非還元末端側にアシアロ糖鎖部を合成する工程である。【００５６】
反応系に添加する糖転移酵素としては、目的とする酵素活性を有する限りどのような形態であってもよい。酵素調製の簡便さと共に調製効率を高めるため、該酵素遺伝子をクローン化し、微生物菌体内で大量発現させ、該酵素の大量調製を行う、いわゆるＤＮＡ組換え技術を用いた酵素生産が最も都合がよい。【００５７】
酵素標品としては具体的には、微生物の菌体、該菌体の処理物または該処理物から得られる酵素調製物などを例示することができる。微生物の菌体の調製は、当該微生物が生育可能な培地を用い、常法により培養後、遠心分離等で集菌する方法で行うことができる。具体的に、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のようにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌を例に挙げ説明すれば、培地としてはブイヨン培地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食塩）などを使用することができ、当該培地に種菌を接種後、３０〜５０℃で１０〜５０時間程度必要により撹拌しながら培養し、得られた培養液を遠心分離して微生物菌体を集菌することにより、目的の酵素活性を有する微生物菌体を調製することができる。【００５８】
微生物の菌体処理物としては、上記微生物菌体を機械的破壊（ワーリングブレンダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾などによる）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの一般的な処理法に従って処理して得られる菌体の破壊物または菌体の細胞壁もしくは細胞膜の変性物を例示することができる。【００５９】
酵素調製物としては、上記菌体処理物から当該酵素活性を有する画分を通常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィ処理など）を施して得られる粗酵素または精製酵素を例示することができる。【００６０】
糖供与体としての糖ヌクレオチドは、それぞれ市販の製品を使用することができる。使用濃度としては１〜２００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭの範囲から適宜設定できる。【００６１】
アシアロ糖鎖部の合成は、上記の糖プライマー及び糖ヌクレオチドを含有する反応系に、糖転移酵素を０．００１ユニット／ｍｌ以上、好ましくは、０．０１〜１０ユニット／ｍｌ程度になるようにそれぞれ添加し、５〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃で１〜１００時間程度、必要により撹拌しながら反応させることにより実施できる。このようにして還元末端にアミノ基およびカルボン酸を有するリンカーが結合され、非還元末端にアシアロ糖鎖部を有するＮ結合型アシアロ糖鎖が得られる。【００６２】
このようにして製造したＮ結合型アシアロ糖鎖は、オリゴ糖の通常の分離精製手段を用いて単離すればよく、例えば、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィやイオン交換カラムクロマトグラフィなどを適宜組み合わせることで単離精製できる。【００６３】
なお、工程２の糖鎖伸長反応は必要に応じて実施すればよく、工程１で用いる糖の種類によっては糖鎖の伸長反応は省略してもよい。例えば、工程１で２以上の糖を有する糖ポリマーをアミノ化した１−アミノ糖にリンカー化合物を結合させた場合は、得られたＮ結合型糖ポリマーは非還元末端にアシアロ糖鎖部を有し、還元末端にリンカーを有するため、工程１の反応物をＮ結合型アシアロ糖鎖として工程２を省略してそのまま、次に述べる工程３に供することができる。【００６４】
（工程３）アシアロ糖鎖とγ−ポリグルタミン酸の縮合
工程３は、工程２で合成したＮ結合型アシアロ糖鎖を、その還元末端にあるリンカーのアミノ基を介してγ−ポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に縮合する工程である。【００６５】
工程２で合成したＮ結合型アシアロ糖鎖は、非還元末端にアシアロ糖鎖部を有し、還元末端にリンカーとして導入された化合物由来のアミノ基を有する。リンカー中のアミノ基が保護基で保護されている場合、工程３の縮合反応を行う前にリンカー中のアミノ基の保護基を常法により脱保護し、場合によっては通常のオリゴ糖の精製手段（ゲルろ過や逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなど）を用いて単離精製した後、γ−ポリグルタミン酸との縮合反応に用いる。【００６６】
原料ポリマーとして用いるγ−ポリグルタミン酸は、市販のものを使用できる。【００６７】
縮合反応は、公知の方法（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）に従って行うことができる。このような縮合反応により、γ−ポリグルタミン酸のカルボキシル基にＮ結合型アシアロ糖鎖を縮合させた縮合反応物（Ｎ結合型アシアロ糖鎖含有ポリマー）が得られる。【００６８】
（工程４）
工程４は、工程３で合成したＮ結合型アシアロ糖鎖含有ポリマーを、シアル酸転移酵素を用いてシアリル化し、目的とするＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーを単離取得する工程である。シアル酸転移酵素を用いてＮ結合型アシアロ糖鎖含有ポリマーをシアリル化する工程は、公知の方法（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）により実施することができる。合成されたＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの単離精製は、通常、タンパクの精製に用いる方法で行えばよく、例えば、透析やゲルろ過などを適宜組み合わせることで単離精製することができる。【００６９】
このようにして調製したＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーのシアロ糖導入率の測定は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより測定することができる。例えば、シアロ糖鎖やリンカーに用いた化合物に特徴的なピークの積分値を、ポリグルタミン酸に特徴的なピークの積算値で除した値を糖導入率として利用すればよい。【００７０】
（３）Ｎ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造法（製法２）
（工程１）糖プライマーの合成【００７１】
工程１は、容易に入手可能な糖類の１位水酸基を化学的にアミノ化し、これにリンカーとしてアミノ基とカルボキシル基を有する化合物をアミド結合させることでＮ結合型糖プライマーを得る工程であり、製法１と同じである。【００７２】
（工程２）シアロ糖鎖部の合成
工程２は、糖プライマーと糖供与体（糖ヌクレオチド：ウリジン５’−ジリン酸ガラクトース、ウリジン５’−ジリン酸Ｎ−アセチルグルコサミン、シチジン５’−モノリン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸など）を含有する反応系に合目的的な糖転移酵素（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、α２，６−シアリルトランスフェラーゼなど）を添加して、目的とするシアロ糖鎖部を合成する工程である。【００７３】
酵素の調製及び反応条件は、製法１の工程２と同様の調製及び反応条件で実施することができる。なお、上記工程２は、糖鎖の伸長反応を行う段階とシアリル化反応を行う段階とを含む工程として記載している。すなわち、ここでは工程２について、製法１で用いたのと同じ糖プライマーと糖供与体、および糖転移酵素（β１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ、β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ）を用いて糖鎖の伸長反応を行った後、シアル酸転移酵素（α２，３−シアリルトランスフェラーゼ、α２，６−シアリルトランスフェラーゼなど）を用いたシアリル化反応を行う工程として記載している。【００７４】
ただし、製法２においても工程２の糖鎖の伸長反応は必要によって行えばよく、省略可能である。すなわち、製法２の工程２はＮ結合型糖プライマーの非還元末端にアシアロ糖鎖部ではなくシアロ糖鎖部を合成する工程であり、工程１で合成した糖プライマーによっては伸長反応を省略できる。例えば、工程１で非還元末端に２以上の糖を有する糖ポリマーをアミノ化して１−アミノ糖としてこれにリンカーを結合させた場合、工程２では糖鎖の伸長反応を行うことなく、工程１の反応物（Ｎ結合型アシアロ糖鎖）をシアル酸転移酵素でシアリル化してＮ結合型シアロ糖鎖を合成すればよい。【００７５】
かかる工程により、還元末端にアミノ基を有するリンカーが結合され、非還元末端にシアロ糖鎖部が合成されたＮ結合型シアロ糖鎖が得られる。このようにして製造したＮ結合型シアロ糖鎖は、オリゴ糖の通常の分離精製手段を用いて単離すればよく、例えば、逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィやイオン交換カラムクロマトグラフィなどを適宜組み合わせることで単離精製できる。【００７６】
（工程３）シアロ糖鎖とγ−ポリグルタミン酸の縮合
工程３は、工程２で合成したＮ結合型シアロ糖鎖を、その還元末端にあるリンカーのアミノ基を介してγ−ポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に化学的に縮合する工程である。【００７７】
工程２で合成したＮ結合型シアロ糖鎖は、非還元末端にシアロ糖鎖部を有し、還元末端にリンカーとして導入された化合物由来のアミノ基を有する。工程３ではリンカー中のアミノ基が保護されている場合はこの保護基を常法により脱保護し、場合によっては通常のオリゴ糖の精製手段（ゲルろ過や逆相ＯＤＳカラムクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィなど）を用いて単離精製した後、γ−ポリグルタミン酸との縮合反応に用いる。【００７８】
原料ポリマーとして用いるγ−ポリグルタミン酸は、市販のものを使用できる。【００７９】
縮合工程に用いる溶媒としては、水や緩衝液（炭酸塩など。ｐＨは４から１０のものが好ましい）と有機溶媒（ジメチルホルムアミドやジメチルスルホキシドなど）の混合溶媒を使用できる。この際、含水率が１％から８０％の溶媒を用いることができ、特に１０％から５０％の含水率のものが好ましい。【００８０】
縮合反応は、上記溶媒中、塩基（トリエチルアミンやトリブチルアミンなど）存在下、カルボキシル基の活性エステル化剤、縮合剤及び／又は添加剤を用いてγ−ポリグルタミン酸を活性化した後、上記脱保護反応によりリンカーの保護基を外したＮ結合型シアロ糖鎖と反応させることで実施できる。【００８１】
カルボキシル基の活性エステル化剤としては、クロロギ酸ｐ−ニトロフェニル、ジスクシニルカーボネート、カルボニルジイミダゾール等を例示でき、縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（およびその塩酸塩）、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩などを例示でき、添加剤としては、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３−ヒドロキシ４−オキソ−３，４−ジヒドロ１，２，３−ベンゾトリアゾールなどを例示することができる。【００８２】
活性エステル化剤、縮合剤及び／又は添加剤の組み合わせとしては、合成目的のシアロ糖鎖含有ポリマーに応じて適宜選択すれば良く、好ましい組み合わせとしては縮合剤と添加剤との組み合わせを挙げることができ、より具体的にはＮ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの組み合わせが好適である。【００８３】
アミノ基の保護基を脱保護したＮ結合型シアロ糖鎖の使用量は、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーの糖置換率に応じて添加すればよく、通常、γ−ポリグルタミン酸のグルタミン酸単位に対して０．１当量以上あればよい。また、活性エステル化剤、縮合剤及び添加剤の使用量は、シアロ糖鎖の使用当量と同程度でよい。さらに、縮合反応に用いる塩基の使用量は、γ−ポリグルタミン酸のグルタミン酸単位に対して１当量以上あればよい。【００８４】
縮合反応は−１０℃〜１００℃で実施することができる。また必要に応じて４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどの一般的なアシル化反応の触媒を添加してもかまわない。【００８５】
なお、γ−ポリグルタミン酸を含水溶媒中に溶解させることで、γ−ポリグルタミン酸のカルボキシル基を反応しやすい状態にすることができる。このため、γ−ポリグルタミン酸を含水溶媒に溶解させる場合、シアロ糖鎖との縮合反応に必要な試薬（縮合剤）の添加量を少なくできる。具体的には、従来法ではシアロ糖鎖に対して縮合剤が３当量以上必要であったのに対し、含水溶媒を用いる本発明方法によれば使用する縮合剤はシアロ糖鎖と同当量程度でよい。【００８６】
さらに、γ−ポリグルタミン酸のグルタミン酸単位当量以下の縮合剤と、含水溶媒中で安定な活性エステルを形成することのできる添加剤を用いて、γ−ポリグルタミン酸を活性エステル体へと変換することで、シアロ糖鎖の副反応の原因となる縮合剤を実質的に完全に消費できる上、γ−ポリグルタミン酸のカルボキシル基を含水溶媒中で反応しやすい状態にすることができる。よって、シアル酸のカルボキシル基が反応してしまう副反応を抑制でき、シアロ糖鎖含有ポリマーとγ−ポリグルタミン酸とを縮合させる際に過剰量の試薬を用いることによる上記不都合を回避できる。このため、製法２によればシアロ糖鎖含有ポリマーをγ−ポリグルタミン酸と縮合させることができ、製法１のようにアシアロ糖鎖をグルタミン酸と縮合させた後にシアリル化する必要がない。【００８７】
（工程４）
工程４は、工程３で合成したＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーを単離精製し、目的とするシアロ糖鎖含有ポリマーを取得する工程である。合成されたシアロ糖鎖含有ポリマーの単離精製は、通常、タンパクの精製に用いる方法で行えばよく、例えば、透析やゲルろ過などを適宜組み合わせることで単離精製することができる。【００８８】
このようにして調製したＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーのシアロ糖導入率の測定は、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルより測定することができる。例えば、シアロ糖鎖やリンカーに用いた化合物に特徴的なピークの積分値を、ポリグルタミン酸に特徴的なピークの積算値で除した値を糖導入率として利用すればよい。【００８９】
（４）人工シアロ糖鎖含有ポリマーの有用性
本発明のＮ結合型人工シアロ糖鎖含有ポリマーは、その合成のし易さに加え、従来のＯ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの数倍のインフルエンザウイルス感染阻害活性を有することから、インフルエンザウイルス感染、インフルエンザウイルスの流行を防止する各種の手段に適用できる。例えば、マスクや空気清浄機、エアコンなどのフィルターにおけるウイルス吸着剤などの用途があげられる。さらには、ヒト感染型とトリ感染型のインフルエンザウイルスのレセプター認識の特異性の違い（レセプターのシアロ糖鎖のシアル酸結合様式の違い）から、α２，３型結合シアロ糖鎖含有ポリマーとα２，６型結合型糖鎖含有ポリマーを基材に用いて、インフルエンザウイルスのレセプター認識特異性の解析が可能であることから、新型インフルエンザウイルスのサーベーランスにも適用できる。【００９０】
なお、本発明において、対象となるウイルスは、特にインフルエンザウイルスに制限されず、用いるシアロ糖鎖含有ポリマーに対応し、様々なウイルスに適用可能である。例えば、パラミクソウイルス群、パラインフルエンザウイルス群、ロタウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、ポリオーマウイルス等が例示される。前記インフルエンザウイルスとしては、高病原性Ａ型トリインフルエンザウイルス、ヒトＡ型インフルエンザウイルスおよびヒトＢ型インフルエンザウイルス等が挙げられる。
【実施例】
【００９１】
つぎに、本発明の実施例について説明する。なお、本発明は、下記の実施例によって、なんら制限されない。【００９２】
＜材料調製法および分析方法＞
（１）ＨＰＬＣ
サンプルはすべて０．４５μｍのフィルター濾過した後、分析した。分析条件は下記に示したものを用いた。
カラム      ：Ｍｉｇｈｔｙｓｉｌ  Ｓｉ６０（φ４．６×２５０ｍｍ）
カラム温度  ：４０℃
流速        ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長    ：２１０ｎｍ
溶媒        ：９０％ＣＨ３ＣＮ
あるいは、
カラム      ：ＹＭＣ  Ｐｒｏ  Ｃ１８ＲＳ（φ６．０×１５０ｍｍ）
カラム温度  ：３０℃
流速        ：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長    ：２１０ｎｍ
溶媒        ：２０％ＣＨ３ＣＮ−２０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４【００９３】
（２）ＮＭＲ
分析機器    ：ＪＥＯＬ  ＥＸ−２７０  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，
ＪＥＯＬ  ｌａｍｄａ  ５００ＦＴ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶ−５００  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
外部標準    ：ＴＰＳ［ｓｏｄｉｕｍ３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ］
溶媒        ：Ｄ２Ｏ
温度        ：２５℃あるいは６０℃
サンプル管  ：φ３または５ｍｍ【００９４】
（３）酵素の調製
３−１．β１，４−ガラクトース転移酵素（β１，４−ＧａｌＴ）の調製
ＷＯ２００７／０２６６６９の記載に従って調製した。【００９５】
３−２．ヒトβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（β３ＧｎＴＩＩ）の調製
文献（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．，３５，５４−６１（２００４））の記載に従って調製した。【００９６】
３−３．シアル酸転移酵素
（３−３−１）ラットシアル酸転移酵素
α２，３−シアリルトランスフェラーゼ（Ｒａｔ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（Ｒａｔ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，  Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社より購入した。
（３−３−２）α２，３−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（α２，３−ＳｉａＴ）の調製
ＷＯ２００７／０２６６６９の記載の実施例に従って調製した。
（３−３−３）α２，６−Ｓｉａｌｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  （α２，６−ＳｉａＴ）の調製
ＷＯ２００７／０２６６６９の記載の実施例に従って調製した。【００９７】
（４）材料（反応基質および試薬）
Ｌａｃｔｏｓｅ  Ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ、５−ａｍｉｎｏ−１−ｐｅｎｔａｎｏｌは、和光純薬（株）より、γ−ＰＧＡは、明治製菓（株）より、糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ，ＵＤＰ−Ｇａｌ，ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）はヤマサ醤油（株）より、ＬａｃＮＡｃは焼津水産（株）より購入した。Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  Ａｎｈｙｄｒｉｄｅ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏは、和光純薬（株）より購入した。α−ＰＧＡ、ＢＯＰ、ＨＯＢｔ、およびＢＳＡは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した。【００９８】
使用材料の略語は以下の通りである。
ｐＮＰ：ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ
ｐＡＰ：ｐ−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ
Ｌａｃ：Ｌａｃｔｏｓｅ（Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）
Ｇａｌ：Ｇａｌａｃｔｏｓｅ
ＬａｃＮＡｃ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ（Ｇａｌ（β１−４）ＧｌｃＮＡｃ）
ＮｅｕＡｃ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ
ＧｌｃＮＡｃ：Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ
α−ＰＧＡ：α−ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄｓ
γ−ＰＧＡ：γ−ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄｓ
ＤＭＳＯ：Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ
ＤＭＦ：Ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｆｏｒｍａｍｉｄｅ
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ・２Ｎａ：Ｕｒｉｄｉｎｅ  ５‘−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ
ＵＤＰ−Ｇａｌ・２Ｎａ：Ｕｒｉｄｉｎｅ  ５‘−ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ  −α−Ｄ．−ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ
ＨＢＴＵ：ｏ−（Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌ）−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ＨＯＳｕ：Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ
ＥＤＣ：１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
ＢＯＰ：Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ−１−ｙｌｏｘｙｔｒｉｓ−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  
ＨＯＢｔ：１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  ｈｙｄｒａｔｅ
ＰＢＳ：１０ｍＭ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ｐＨ７．４）
ＴＰＳ：Ｓｏｄｉｕｍ  ３−（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ）−ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅＣＭＰ  ＮｅｕＡｃ：Ｃｙｔｉｄｉｎｅ−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  ａｃｉｄ【００９９】
＜実施例１：製法１による各種人工シアロ糖鎖含有ポリマーの合成＞
まず、工程１について、末端にアミノ基とカルボキシル基を有する化合物（６−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）を合成する工程（１−Ａ）、１−アミノ糖を合成する工程（１−Ｂ）、工程１−Ａで合成したリンカー化合物と工程１−Ｂで合成した１−アミノ糖とを縮合させＮ結合型糖プライマーを合成する工程（１−Ｃ）に分けて説明する。【０１００】
（１−Ａ）６−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄの合成
Ｍｅｔｈｙｌ  ６−ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏａｔｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（１０ｇ，５５ｍｍｏｌ）にピリジン（７０ｍｌ）を加えて溶解した。これを氷冷、攪拌し、そこへ無水トリフルオロ酢酸（２５ｍｌ，１８０ｍｍｏｌ）を滴下しながら添加し反応を開始した。反応開始から５分おきに薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ：展開溶媒  クロロホルム：アセトン＝９：１）で、リンモリブデン酸発色を用い反応を確認した。２時間後、ＴＬＣで原料が消失したのを確認した後、クラッシュアイスを反応液と同量程度加えて反応を停止させ、続いて飽和炭酸水素ナトリウム水溶液２８０ｍｌを加えて反応液を中和した。反応液を濃縮後、アセトンを適量加え再び濃縮を行った。この操作を３回程度繰り返した。続いて、反応液をＨ２Ｏで溶解後、分液ロートに移し、等量のクロロホルムとＨ２Ｏで分配し、クロロホルム層を回収することで多量に存在する炭酸水素ナトリウムを除去した。次に、このクロロホルム層を濃縮し、クロロホルム：アセトン＝９：１で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したシリカゲルカラムクロマトグラフィ（３．５×５０ｃｍ）に供した。約２０ｍｌごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分はＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：アセトン＝９：１）で、リンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物は、フラクションナンバー２５〜５６（５００〜１１２０ｍｌ）に見られた。これを濃縮し、この工程の目的物であるＭｅｔｈｙｌ  ６−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｈｅｘａｎｏａｔｅを収量１２．４ｇ、収率９３％で得た。【０１０１】
次に、Ｍｅｔｈｙｌ  ６−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｈｅｘａｎｏａｔｅ（３．７ｇ，１５．４ｍｍｏｌ）を１０ｍＭ  ｂｏｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ８．０（３０００ｍｌ）に溶解した後、Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｉｖｅｒ由来カルボキシルエステラーゼ（２１６０Ｕ，１．２ｍｌ）を添加し、３０℃で反応を行った。反応開始から７２時間後、１００℃で１０分間煮沸し反応を停止した後、反応液を濃縮し、クロロホルム：アセトン＝８：２で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したシリカゲルカラムクロマトグラフィ（２．０×３０ｃｍ）に供した。約２０ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取後、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：アセトン＝８：２）で、リンモリブデン酸発色を用い、生成物を確認した。目的画分を含むフラクションナンバーＮｏ．５〜１５（１００〜３００ｍｌ）を濃縮後、凍結乾燥し、６−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄを得た（収量：３．１ｇ，収率：８９％）。【０１０２】
（１−Ｂ）１−アミノ糖の化学合成
糖類をメタノール（ＭｅＯＨ）溶液に溶解させ、アンモニアガスを飽和させるか、または炭酸水素アンモニウムを溶解させ、１−アミノ糖を調製した。糖類としては、ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン（ＬａｃＮＡｃ）、またはＮ−アセチルグルコサミンを用いた。
（１−Ｂ−１）β−Ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅの化学合成
耐圧ガラス容器にラクトース（５．０ｇ，０．０１４ｍｏｌ）を入れ、９５％ＭｅＯＨ
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ０．５％ＣＨ３ＣＯＯＨ（１１７ｍｌ）で溶解した。続いて、反応液を氷冷後、アンモニアガスを用いて反応液をアンモニア飽和させた。アンモニア飽和後、耐圧ガラス容器の蓋をきつく閉め、攪拌しながら４０℃で反応を行った。反応開始から４８時間後、エタノール（１１０ｍｌ）を加えて反応を停止した。次に、反応液をガラスフィルターでろ過後、エタノール（５００ｍｌ）とジエチルエーテル（５００ｍｌ）で順次洗浄し、白色粉末としてβ−Ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅを収量４．５ｇ，収率９５％で得た。【０１０３】
（１−Ｂ−２）β−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅの化学合成
耐圧ガラス容器にＬａｃＮＡｃ（１．０ｇ，２．６ｍｍｏｌ）とａｍｍｏｎｉｕｍｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ（０．２１ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を入れ、ＭｅＯＨ（８ｍｌ）で溶解した。続いて、反応液を氷冷後、アンモニアガスを用いて反応液をアンモニア飽和させた。アンモニア飽和後、耐圧ガラス容器の蓋をきつく閉め、攪拌しながら４０℃で反応を行った。反応開始から１２０時間後、エタノール（８ｍｌ）を加えて反応を停止した。次に、反応液をガラスフィルターでろ過後、エタノール（５０ｍｌ）とジエチルエーテル（５０ｍｌ）で順次洗浄し、白色粉末としてβ−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅを収量０．７１ｇ，収率７１％で得た。【０１０４】
（１−Ｂ−３）β−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅの化学合成
Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ（５．０ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）と炭酸水素アンモニウム（４０ｇ）を蒸留水（５０ｍｌ）に溶解し、４０℃で撹拌した。反応の進行をＴＬＣ（展開溶媒ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４：３：３：２、アニスアルデヒドにて呈色、Ｒｆ：Ｓ．Ｍ．＝０．６５、Ｐｒｏｄ．＝０．４８）で確認した。原料の消失をＴＬＣで確認後、反応溶液を冷却して過剰量の炭酸水素アンモニウムを析出させ、これをろ過することで除去した。ろ液を約１０ｍｌまで減圧下濃縮し、冷却後再び析出する炭酸水素アンモニウムをろ過により除去した。ろ液に蒸留水を加え、減圧下濃縮する操作を３回繰り返すことで、残存する炭酸水素アンモニウムを除去し、アメ状物質を得た。これを少量の蒸留水に溶解し凍結乾燥することでβ−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ白色粉末７．４ｇを得た。【０１０５】
（１−Ｃ）各種Ｎ結合型糖プライマーの化学・酵素合成
（１−Ｃ−１）  Ｎ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅの化学合成
６−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（３３４ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）を有機溶媒（ＤＭＳＯ：２．６ｍｌ）に溶解した後、塩基（ＤＩＥＡ：１．３ｍｌ，７．３５ｍｍｏｌ）と縮合剤（ＨＢＴＵ：５５７ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）を加え、５分間撹拌した。その後、あらかじめ別の容器でＤＭＳＯ（５．３ｍｌ）に溶解したβ−Ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ（５００ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら室温で反応を行った。反応の経時変化はオルシノール硫酸発色法を用いてＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）で分析した。反応開始から５時間
後反応を終了し、クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したシリカゲルカラムクロマトグラフィ（３．５×６０ｃｍ）に供した。約３０ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取後、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）で、オルシノール硫酸発色を用い、生成物を確認した。目的画分を含むフラクションナンバー６８〜１３５（２,０４０〜４,０５０ｍｌ）を濃縮後、凍結乾燥し、Ｎ結合型糖プライマーとして、Ｎ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅを収量６８５ｍｇ，収率８２％で得た。【０１０６】
（１−Ｃ−２）Ｎ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅの化学合成
６−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（４１ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（３３０μｌ）に溶解した後、ＤＩＥＡ（１６０μｌ，０．９ｍｍｏｌ）とＨＢＴＵ（６８ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を加え、５分間撹拌した。その後、あらかじめ別の容器でＤＭＳＯ（６６０μｌ）に溶解したβ−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ（７０ｍｇ，０．１８ｍｍｏｌ）を加え、攪拌しながら室温で反応を行った。反応の経時変化はオルシノール硫酸発色法を用いてＴＬＣ（クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）で分析した。反応開始から５時間後反応を終了し、クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５で平衡化（１０ｍｌ／ｍｉｎ）したシリカゲルカラムクロマトグラフィ（３．５×６０ｃｍ）に供した。約３０ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取後、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝７：３：０．５）で、オルシノール硫酸発色を用い、生成物を確認した。目的画分を含むフラクションナンバー６５〜９０（１９５０〜２７００ｍｌ）を濃縮後、凍結乾燥し、Ｎ結合型糖プライマーとしてＮ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅを収量８１ｍｇ，収率７５％で得た。【０１０７】
次に述べる工程１−Ｃ−３では、上記工程１−Ｂ−３で合成した１−アミノ糖であるβ−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ（ＧｌｃＮＡｃ−ＮＨ２）について、アミノ基を保護したリンカー化合物と縮合させてＮ結合型アシアロ糖鎖を得た。以下、具体的に説明する。【０１０８】
（１−Ｃ−３）Ｎ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｃｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅの化学合成
６−Ａｍｉｎｏｈｅｘａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（０．５３８ｇ、４．１ｍｍｏｌ）、Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（０．８６ｍｌ、６．２ｍｍｏｌ）にＭｅＯＨ（５ｍｌ）を加え懸濁した。これにＥｔｈｙｌ  ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ（０．７５ｍｌ、６．２ｍｍｏｌ）を滴下し、室温（約２２℃）で１時間撹拌した。ＴＬＣ（展開溶媒ＡｃＯＥｔ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４：３：３：２、ニンヒドリン呈色、Ｒｆ：Ｓ．Ｍ．＝０．６６、Ｐｒｏｄ．＝ｎｏｎｅ）にて原料の消失を確認後、反応溶液を減圧下濃縮した。残渣にＤＭＦを加え減圧下濃縮する操作を３回繰り返し、残存する試薬等を除去した。残渣をＤＭＦ（４０ｍｌ）に溶解し、氷浴にて０℃に冷却後Ｅｔｈｙｌ  ｃｈｌｏｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ（０．７８ｍｌ、８．２ｍｍｏｌ）、Ｔｒｉｅｔｈｌｙｌａｍｉｎｅ（１．１４ｍｌ、８．２ｍｍｏｌ）を添加した。０℃にて１０分間撹拌後、これをＧｌｃＮＡｃ−ＮＨ２（３．１ｇ、８．２ｍｍｏｌ、純度７５％として算出）のＤＭＦ（４０ｍｌ）懸濁液中に加え、氷浴から出して徐々に室温に戻しつつ１時間撹拌した。反応溶液を再び氷浴で冷却し、蒸留水（１０ｍｌ）を加え、反応を停止した後、析出した塩酸塩をろ過により除去した。ろ液を減圧下濃縮し、蒸留水により共沸操作を行うことで、残存するＤＭＦを除去した。残渣を蒸留水にて４０ｍｌに調製し、５％アセトニトリルにて平衡化したＯＤＳカラム（ＣＶ＝２００ｍｌ）に供した。流速４００ｍｌ／ｈｒ、１Ｆｒ＝２０ｍｌにて分取し、目的物の溶出をＴＬＣ及びＨＰＬＣにより確認し、溶出画分を回収した
。回収した溶離液を減圧下濃縮後、残渣を少量の蒸留水で溶解して凍結乾燥することで、目的物であるアミノ基が保護基で保護されたＮ結合型アシアロ糖鎖Ｎ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｃｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ（ＧｌｃＮＡｃ−６ＡＨＡ−ＴＦＡ）を収量０．６３ｇ、収率３６％で得た。【０１０９】
次に、上記工程１−Ｃ−１で合成したＮ結合型糖プライマーについて、これを糖受容体とし、糖転移酵素の存在下で糖供与体と反応させ非還元末端に糖鎖を伸長させる工程２を説明する。【０１１０】
（２）  Ｎ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅの酵素合成
１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．８，５．７ｍｌ）に受容体基質となるＮ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅを５０ｍｇ（０．０９ｍｍｏｌ）、供与体基質としての糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ・２Ｎａ）を１１７ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏを１４．５ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）溶解させ、防腐剤として１％（ｗ／ｖ）ＮａＮ２を０．０９ｍｌ加えた後、３．３ｍｌ（２５０ｍＵ）の精製した糖転移酵素（β３ＧｎＴＩＩ）を添加して３７℃で反応を行った。１４４時間後、供与体基質のＧｌｃＮＡｃの転移が１００％進んだところで反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。次に、反応液に別の糖ヌクレオチド（ＵＤＰ−Ｇａｌ・２Ｎａ）を１１１ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）加え、別の糖転移酵素（β４ＧａｌＴＩ）  ５００μｌ（９５０ｍＵ）を添加してＧａｌ転移反応を行った。１５６時間後、Ｇａｌ転移が１００％進んだところで反応液を５分間煮沸することにより反応を停止した。反応液を濃縮後、５％ＭｅＯＨで平衡化（２．０ｍｌ／ｍｉｎ）したＯＤＳカラムクロマトグラフィ（２．５×５０ｃｍ）に供した。５％ＭｅＯＨ（７６０ｍｌ）で非吸着部を溶出した後、５％（５００ｍｌ）−１５％（５００ｍｌ）のＭｅＯＨ直線濃度勾配法により２０ｍｌ／ｔｕｂｅずつ分取後、各フラクションを２１０ｎｍの吸光度で測定し、生成物を確認した。目的画分を含むフラクションナンバー２８〜３８（５６０ｍｌ〜７６０ｍｌ）を濃縮後、凍結乾燥し、非還元末端側に糖鎖を伸長させたＮ結合型アシアロ糖であるＮ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅを収量６７ｍｇ、収率８０％で得た。【０１１１】
工程３については、工程１−Ｃ−１、工程１−Ｃ−３で合成したＮ結合型アシアロ糖鎖、および工程２で伸長反応を行って得られたＮ結合型アシアロ糖鎖について、保護基を脱保護する工程３−Ａと、工程３−Ａで脱保護処理を行ったＮ結合型アシアロ糖鎖をγ−ポリグルタミンと縮合させる工程３−Ｂに分けて説明する。【０１１２】
（３−Ａ−１）Ｎ−（ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅの化学合成
工程１−Ｃ−１で合成したＮ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ（１５０ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＮａＯＨ（１．５ｍｌ）を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から３０分おきにＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。１時間後、ＴＬＣで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（０．５ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィ（２．５×５５ｃｍ）に供した。約３．０ｍｌごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）でリンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物は、フラクションナンバー４７〜５８（１４１ｍｌ〜１７４ｍｌ）に
見られた。これを濃縮し、この工程の目的物であるＮ−（ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅを収量１２３ｍｇ、収率９９％で得た。【０１１３】
（３−Ａ−２）  Ｎ−（ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅの化学合成
工程１−Ｃ−３で得られたＮ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ（１６０ｍｇ，０．２７ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＮａＯＨ（１．６ｍｌ）を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から３０分おきにＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。１時間後、ＴＬＣで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（０．５ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィ（２．５×５５ｃｍ）に供した。約３．０ｍｌごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）でリンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物は、フラクションナンバー４５〜５６（１３５ｍｌ〜１６８ｍｌ）に見られた。これを濃縮し、この工程の目的物であるＮ−（ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅを収量１２３ｍｇ、収率９２％で得た。【０１１４】
（３−Ａ−３）  Ｎ−（ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅの化学合成
工程２で得られたＮ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ（４５ｍｇ，０．０５ｍｍｏｌ）に１．０Ｍ  ＮａＯＨ（１．０ｍｌ）を加えて溶解し、室温で反応を開始した。反応開始から３０分おきにＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）で、オルシノール硫酸発色とリンモリブデン酸発色とを用い反応を確認した。１時間後、ＴＬＣで原料が消失したのを確認したのち反応液を、水で平衡化（０．５ｍｌ／ｍｉｎ）したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィ（２．５×５５ｃｍ）に供した。約３．０ｍｌごとにカラムを通過してきた移動層をサンプリングした。溶出画分は、ＴＬＣ（展開溶媒  クロロホルム：メタノール：水＝６：４：１）でリンモリブデン酸発色を用い生成物を確認した。目的物は、フラクションナンバー５０〜６１（１５０ｍｌ〜１８３ｍｌ）に見られた。これを濃縮し、目的物であるＮ−（ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅを収量４０ｍｇ、収率９９％で得た。【０１１５】
（３−Ｂ−１）Ｐｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］の合成
γ−ＰＧＡ（Ｍ．Ｗ．：９９００００，３０．０ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ１０．０（３．６ｍｌ）に溶解後、予めＤＭＳＯ（１０．９ｍｌ）に溶解しておいた縮合剤（ＢＯＰ：２９８ｍｇ）、および添加剤（ＨＯＢｔ：２９．５ｍｇ）を加えスターラーで攪拌した。最後に工程３−Ａ−１で得られたＮ−（ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ（４５．１ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ１０．０（１．８ｍｌ）に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液が１７．５ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。その後、ＰＤ−１０カラム１本あたり２．５ｍｌの反応液をＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（１．７×５．０ｃｍ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラムに供し、３．５ｍｌのＰＢＳでＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］を溶出した。次にこの画分を２．５Ｌの超純水に対して３日間透析した。その間、超純水の交換を６回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析に供し、糖置換度を算出した。糖残基置換度
（％）の計算は１Ｈ−ＮＭＲより、γ−ＰＧＡのβおよびγ位プロトンとＮ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅのアグリコン部のα位のプロトン２個分の積分比の和（Ａ）とＮ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅのアグリコン部位のプロトン６個分の積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度３１％のＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］を収量３４．３ｍｇで得た。
（計算式）
４×１００    
Ａ−２（Ｂ／６）【０１１６】
（３−Ｂ−２）Ｐｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］
γ−ＰＧＡ（Ｍ．Ｗ．：９９００００，３０．０ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ１０．０（３．６ｍｌ）に溶解後、予めＤＭＳＯ（１０．９ｍｌ）に溶解しておいたＢＯＰ（２９８ｍｇ）、ＨＯＢｔ（２９．５ｍｇ）を加えスターラーで攪拌した。最後に工程３−Ａ−２で得られたＮ−（ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ（４９．３ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ１０．０（１．８ｍｌ）に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液が１７．５ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。その後、ＰＤ−１０カラム１本あたり２．５ｍｌの反応液をＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（１．７×５．０ｃｍ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラムに供し、３．５ｍｌのＰＢＳでＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］を溶出した。次にこの画分を２．５Ｌの超純水に対して３日間透析した。その間、超純水の交換を６回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析に供し、糖置換度を算出した。糖残基置換度（％）の計算は１Ｈ−ＮＭＲより、γ−ＰＧＡのβおよびγ位プロトンとＮ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅのアグリコン部のα位のプロトン２個分およびＮ−アセチル基に由来するプロトン３個分の積分比の和（Ａ）とＮ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅのアグリコン部位のプロトン６個分の積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度３２％のＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］を収量３６．６ｍｇで得た。
（計算式）
４×１００    
Ａ−５（Ｂ／６）  【０１１７】
（３−Ｂ−３）Ｐｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］
γ−ＰＧＡ（Ｍ．Ｗ．：９９００００，１２．０ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ１０．０（１．４ｍｌ）に溶解後、予めＤＭＳＯ（４．４ｍｌ）に溶解しておいたＢＯＰ（９４．７ｍｇ）、ＨＯＢｔ（１１．８ｍｇ）を加えスターラーで攪拌した。最後に工程３−Ａ−３で得られたＮ−（ε−Ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ（３２．６ｍｇ）を１００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３  ｐＨ１０．０（０．７ｍｌ）に溶解後、添加し、攪拌しながら室温で２４時間反応を行った。反応終了後、反応液が７．５ｍｌになるようにＰＢＳを添加した。その後、ＰＤ−１０カラム１本あたり２．５ｍｌの反応液をＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（１．７×５．０ｃｍ，Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラムに供し、３．５ｍｌのＰＢＳでＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］を溶出した。次にこの画分を２．５Ｌの超純水に対して３日間透析した。その間、超純水の交換を６回行った。透析後、濃縮し、凍結乾燥した。次に、これを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析に供した。次に、これを１Ｈ−ＮＭＲによる構造解析に供し、糖置換度を算出した。糖残基置換度（％）の計算は１Ｈ−ＮＭＲより、γ−ＰＧＡのβおよびγ位プロトンとＮ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅのアグリコン部のα位のプロトン２個分およびＮ−アセチル基に由来するプロトン３個分の積分比の和（Ａ）とＮ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅのアグリコン部位のプロトン６個分の積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、糖残基置換度３２％のＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］を収量１９．６ｍｇで得た。
（計算式）
４×１００  
Ａ−５（Ｂ／６）【０１１８】
最後に工程４として、工程３で合成された３種類のアシアロ糖鎖含有ポリマーをシアリル化してＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーを合成する工程について説明する。工程４では公知の方法に従い、ＣＭＰシアル酸および糖転移酵素を用いる酵素反応により、アシアロ糖鎖含有ポリマーへのシアル酸導入を行った。【０１１９】
（４−１）Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］
受容体基質として工程（３−Ｂ−１）で合成したＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］［３１％，  １８００ｋＤａ］７．１ｍｇをｌａｃｔｏｓｅ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰシアル酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）１６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１％、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう反応液を調製した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのラットα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を工程（３−Ｂ−１）と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅのＧｌｃの１位のプロトン１個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比（Ｂ，Ｂ’）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率１００％のＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］を収量８．４ｍｇで得た。
（計算式）
（Ｂ＋Ｂ’）／２×１００    
Ａ／１【０１２０】
（４−２）Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］
受容体基質として工程（３−Ｂ−２）で合成したＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］［３２％，  １９００ｋＤａ］  ７．０ｍｇをＬａｃＮＡｃ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１％、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調製した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのラットα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を工程（３−Ｂ−２）と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅのＧｌｃＮＡｃの１位のプロトン１個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンの積分比（Ｂ）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が約１００％のＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−３−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］を収量７．９ｍｇで得た。
（計算式）
Ｂ×１００  
Ａ／１【０１２１】
（４−３）Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］
受容体基質として工程（３−Ｂ−３）で合成したＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］［３２％，  ２６００ｋＤａ］  ５．１ｍｇをＬＮｎＴ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ
０．１％、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調製した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，３−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を工程（３−Ｂ−３）と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅのＧｌｃの１位のプロトン１個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比（Ｂ，Ｂ’）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が約１００％のＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−３ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］を収量５．２ｍｇで得た。
（計算式）
（Ｂ＋Ｂ’）／２×１００
Ａ／１【０１２２】
（４−４）Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］
酵素を代え、工程４−１と同様の操作を行った。具体的には受容体基質として工程（３−Ｂ−１）で合成したＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］［３１％，  １８００ｋＤａ］  ７．０ｍｇをｌａｃｔｏｓｅ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１％、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調製した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を工程（３−Ｂ−１）と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅのＧｌｃの１位のプロトン１個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比（Ｂ，Ｂ’）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率７１％のＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］を収量７．２ｍｇで得た。
（計算式）
（Ｂ＋Ｂ’）／２×１００    
Ａ／１【０１２３】
（４−５）Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］
酵素を代え、工程４−２と同様の操作を行った。具体的には受容体基質として工程（３−Ｂ−２）で合成したＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］［３２％，  １９００ｋＤａ］  ７．０ｍｇをＬａｃＮＡｃ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１％、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調製した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのラットα２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を工程（３−Ｂ−２）と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏｓｙｌａｍｉｎｅのＧｌｃＮＡｃの１位のプロトン１個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比（Ｂ，Ｂ’）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が約１００％のＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］を収量７．９ｍｇで得た。
（計算式）
（Ｂ＋Ｂ’）／２×１００
Ａ／１【０１２４】
（４−６）Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］
酵素を代え、工程４−３と同様の操作を行った。具体的には受容体基質として工程（３−Ｂ−３）で合成したＰｏｌｙ［Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ／γ−ＰＧＡ）］［３２％，  ２６００ｋＤａ］  ５．１ｍｇをＬＮｎＴ−単位当たり８．０ｍＭ、供与体基質としてＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ  １６．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＢＳＡ  ０．１％、ＭＯＰＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）５０ｍＭとなるよう調製した。次に、反応液に対し１０Ｕ／ｍｌのアルカリフォスファターゼおよび４０ｍＵ／ｍｌのα２，６−（Ｎ）−シアリルトランスフェラーゼを添加し、３７℃で４８時間反応を行った。続いて、この反応液を工程（３−Ｂ−３）と同様の方法で処理した。シアリル化率は１Ｈ−ＮＭＲより、Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅのＧｌｃの１位のプロトン１個分の積分比（Ａ）と、Ｎｅｕ５Ａｃに特徴的な３位エクアトリアルプロトンおよびアキシアルプロトンの積分比（Ｂ，Ｂ’）を以下に示す式にあてはめ算出した。その結果、シアリル化率が約１００％のＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］を収量５．４ｍｇで得た。
（計算式）
（Ｂ＋Ｂ’）／２×１００    
Ａ／１【０１２５】
＜実施例２：製法２による人工シアロ糖鎖含有ポリマーの合成＞
（１）Ｎ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｃｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅの合成
実施例２の工程１として、実施例１の工程（１−Ｃ−３）記載と同じ方法で、アミノ基が保護されたリンカー化合物と１−アミノ糖とを縮合させ、Ｎ−（ε−Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｃｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ（ＧｌｃＮＡｃ−６ＡＨＡ−ＴＦＡ）を調製した。【０１２６】
（２）Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）−β−ｎｅｕ５Ａｃ−α２，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ（α２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ）の合成
工程２では、前記工程（１）で調製したＮ結合型アシアロ糖鎖（ＧｌｃＮＡｃ−６ＡＨＡ−ＴＨＡ）をシアリル化してシアロ糖鎖部を合成した後（工程２−１）、これを精製した（工程２−２）。以下、具体的に説明する。【０１２７】
（２−１）シアロ糖鎖部の合成
前記工程（１）で調製したＧｌｃＮＡｃ−６ＡＨＡ−ＴＦＡ  ４２０ｍｇ（１．０４ｍｍｏｌ）、２０ｍＭ塩化マグネシウム、７．５ｍＭ  ＵＤＰ−Ｇａｌ、０．１Ｕ／ｍｌ反応液アルカリフォスファターゼを含有する１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１９０ｍｌにＨ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来β１，４−ガラクトース転移酵素を０．１６Ｕ／ｍｌ反応液になるように添加し、３７℃にて振とうしながら反応を開始した。反応開始２６時間後、沸騰湯浴中に反応液を移し、内液を８０℃に達温させることでβ１，４−ガラクトース転移酵素反応を停止させた。熱処理したβ１，４−ガラクトース転移酵素反応液を十分に放冷した後、７．５ｍＭ  ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）分を更に添加し、続いて０．１Ｕ／ｍｌ反応液になるようにＰ．  ｄａｍｓｅｌａｅ由来α２，６−シアル酸転移酵素を添加し、３７℃で振とうしながらシアリル化反応を開始した。反応開始１７時間後、沸騰浴中に反応液を移し、内液を８０℃に達温させることでα２，６−シアル酸転移酵素反応を停止させ、非還元末端側にシアロ糖鎖部を有するＮ結合型シアロ糖鎖（α２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ−ＴＦＡ）を合成した。【０１２８】
（２−２）Ｎ結合型シアロ糖鎖の精製
以上の手順で合成したＮ結合型シアロ糖鎖を以下の手順により精製した。まず、工程（２−１）の反応停止液を放冷後、遠心分離（２０，０００ｇ×１０ｍｉｎ）し、さらに得られた上清を０．４５μｍフィルターろ過することで、残渣を完全に取り除き、上清画分を回収した。これを５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで平衡化したＯＤＳカラム（２００ｍｌ）に通液しα２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ−ＴＦＡを吸着させた後、続いて５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで洗浄を行うことで、核酸、糖等の親水性物質を除去した。１０％メタノールを含有する炭酸水素アンモニウムで吸着剤に吸着したα２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ−ＴＦＡを溶出した後、これをエバポレーター濃縮乾固、水共沸を行うことで含有する炭酸水素アンモニウムを除去した。上記手順で調製したα２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ−ＴＦＡ乾固物を蒸留水で５０ｍｌに溶解した後、ＤＥＡＥカラム（５０ｍｌ、炭酸水素型）に通液することで、α２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ−ＴＦＡをカラムに吸着させた。このカラムを蒸留水で洗浄することで残存していたアシアロ糖鎖を取り除いた後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを通液することでカラムに吸着されたα２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ−ＴＦＡを溶出させた。【０１２９】
（３−１）保護基の脱保護
α２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ−ＴＦＡは、アミノ酸を保護する保護基（ＴＦＡ基）を持つことから、ポリグルタミン酸との縮合反応を行う前に、保護基を脱保護した。具体的には、上記操作で得られたα２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ−ＴＦＡを減圧下濃縮することにより乾固させた後、１Ｍ  ＮａＯＨで溶解、室温で１時間攪拌することでα２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ−ＴＦＡ中のＴＦＡ基を外した。【０１３０】
脱ＴＦＡ化液を０．５Ｍ塩酸で中和した後、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（１．６×１００ｃｍ）に通過させた。糖を含有する画分は、分画した画分をＴＬＣ上にスポットし、これをアニスアルデヒト呈色することで確認し、得られた糖含有画分を回収した。これを減圧下濃縮、乾固し、メタノール共沸を行った後、５０℃、２時間減圧乾燥することで、保護基を外したＮ結合型シアロ糖鎖（α
２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ）のアンモニウム塩を３５７ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ）回収した。【０１３１】
（３−２）Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］（α２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ／γ−ＰＧＡ）の合成
次に、工程３−１で得られた（α２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ）のアンモニウム塩とγ−ポリグルタミン酸とを縮合させた。具体的にはγ−ＰＧＡ（４．３ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ  ａｓ  Ｇｌｕ）に蒸留水０．０５ｍｌ、ＤＭＦ  ０．４５ｍｌを加え均一な溶液とし、氷浴中で０℃に冷却した。γ−ＰＧＡ溶液に縮合剤としてＨＯＳｕ：１．４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（２．６ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を加え０℃で２時間撹拌した。続いて反応溶液にα２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ（１１．２ｍｇ、  ０．０１３ｍｍｏｌ）、Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ（１３．８μＬ、０．１ｍｍｏｌ）を加え２５℃で９時間撹拌し、Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］（α２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ／γ−ＰＧＡ）を合成した。反応液を０℃に冷却後１．０Ｍ  ＮａＯＨ水溶液０．５ｍｌを添加し、０℃で３０分間撹拌して反応を停止した。【０１３２】
（４）Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２，６−Ｎ−ａｃｅｔｙｌｌａｃｔｏｓａｍｉｎｙｌａｍｉｎｅ  β−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］（α２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ／γ−ＰＧＡ）の単離
１．０Ｍ  ＡｃＯＨ水溶液を用いて上記反応液をｐＨ７に調整し、これを透析チューブに入れ、蒸留水（１,０００ｍｌ×７）にて透析を行った。透析チューブ内の溶液を回収
し、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ  ５０Ｗ−８Ｘ，Ｎａ  ｆｏｒｍ，ＣＶ＝２ｍｌ）へ通液しＮａ塩へと変換した。回収液を減圧下濃縮し、残渣を少量の蒸留水に溶解し、凍結乾燥することで、α２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ／γ−ＰＧＡの白色粉末を１２．２ｍｇ得た。得られたα２，６−ＳＬＮ−６ＡＨＡ／γ−ＰＧＡについて、１Ｈ−ＮＭＲ分析を行い、下記式に基づき糖残基置換度（ＤＳ）を求めた結果、３７％と算出された。
ＤＳ＝Ａ／（Ｂ−Ａ／２−３Ａ／４−３Ｃ×３Ａ／４）
Ａ＝１．５ｐｐｍ：６ＡＨＡ（２ＣＨ２）
Ｂ＝１．８〜２．５ｐｐｍ：（γ−ＰＧＡ（２ＣＨ２）＋Ａｃ（ＧｌｃＮＡｃ）＋Ａｃ（ＮｅｕＡｃ）＋６ＡＨＡ（ＣＨ２）
Ｃ＝２．７ｐｐｍ：ＮｅｕＡｃ（２−ＣＨ’）【０１３３】
実施例３：Ａ型インフルエンザウイルスを用いた各種人工糖鎖含有ポリペプチドの赤血球凝集阻害試験
赤血球凝集活性測定用マイクロプレートを氷上に置き、各ウエルに０．０１％  ｇｅｌａｔｉｎｅ含有ＰＢＳを２５μｌずつ加えた。次に、実施例１の工程３−Ｂで調製された３種類の人工アシアロ糖鎖含有ポリペプチドおよび工程４で調製された６種類の人工シアロ糖鎖含有ポリマーを０．０１％  ｇｅｌａｔｉｎ含有ＰＢＳに溶解させ、各々２５μl
をＮｏ.１のウエルに加え、Ｎｏ．２のウエルから連続２倍希釈となるように調製する。
続いて、試料を希釈した各ウエルにＰＢＳで懸濁したインフルエンザウイルス（Ｈｕｍａｎ  ｓｔｒａｉｎ：Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／２８（Ｈ３Ｎ２），感染価２２０ＨＡＵ、Ａｖｉａｎ  ｓｔｒａｉｎ：Ａ／Ｄｕｃｋ／ＨｏｎｇＫｏｎｇ／３１３／４／７６（Ｈ５Ｎ２），感染価２１７ＨＡＵ）（それぞれ２２ＨＡＵ）を２５μｌずつ加え、マイクロプレートミキサーで数秒間攪拌後、４℃で１時間静置した。この各ウエルに０．６％（ｖ／ｖ）モルモット赤血球含有ＰＢＳ懸濁液を５０μｌずつ加え、マイクロプレートミキサーで数秒間攪拌後、４℃で２時間静置した。最後に赤血球凝集像を観察しＨＩ活性（Ｈｅｍａｇｇｕｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を求めた。ＨＩ活性はインフルエンザウイルスの完全凝集阻止が認められる試料の最高希釈濃度で表した。【０１３４】
【表１】
2009001805.tif 000008
表１から明らかなように、実施例１で調製されたＮ−結合型のＰｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−ＬａｃＮＡｃβ−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ）（表１の下から２つめの化合物）は、文献（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１５，１３８３−１３９３（２００７））で報告されている従来の糖鎖部分の構造は同じであるＯ−結合型人工シアロ糖鎖含有ポリマー（Ｐｏｌｙ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ＬａｃＮＡｃβ−５−ａｍｉｎｏｐｅｎｔｙｌ／γ−ＰＧＡ）の数倍のヒトインフルエンザウイルス感染阻害活性を示ており、またＰｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｎｅｏｔｅｔｒａｏｓｙｌａｍｉｎｅβ−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］（表１の最下部の化合物）は、Ｐｏｌｙ［Ｎｅｕ５Ａｃα２−６−ＬａｃＮＡｃβ−Ｎ−（ε−ａｍｉｎｏｃａｐｒｏｙｌ）／γ−ＰＧＡ］のさらに数倍高いヒトインフルエンザウイルス感染阻害活性を示した。
【図１】
2009001805.tif 000013
【図２】
2009001805.tif 000014
【図３】
2009001805.tif 000015
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2009001805.tif 000019
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月29日(2008.8.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
糖の還元末端の１位をアミノ化した１−アミノ糖に、アミノ基とカルボキシル基をそれぞれの末端に有する化合物をリンカーとしてアミド結合させ、非還元末端側にアシアロ糖鎖部を有するＮ結合型アシアロ糖鎖を得る工程と、
前記Ｎ結合型アシアロ糖鎖を、このＮ結合型アシアロ糖鎖の還元末端に結合されている前記リンカーのアミノ基を介してポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合させアシアロ糖鎖含有ポリマーを合成する工程と、
前記アシアロ糖鎖含有ポリマーをシアリル化してＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーを得る工程と、を含むＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項６】
前記リンカーが、ω−アミノ酸である請求項５に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項７】
前記リンカーが含む炭化水素が、炭素数１〜３０のものである請求項５に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項８】
前記リンカーが含む炭化水素が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基もしくはそれらを２個以上アミド結合で縮合させたものである請求項５に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項９】
糖の還元末端の１位をアミノ化した１−アミノ糖に、アミノ基とカルボキシル基をそれぞれの末端に有する化合物をリンカーとしてアミド結合させ、非還元末端側にアシアロ糖鎖部を有するＮ結合型アシアロ糖鎖を得る工程と、
前記Ｎ結合型アシアロ糖鎖をシアリル化して、非還元末端側にシアロ糖鎖部が合成されたＮ結合型シアロ糖鎖を得る工程と、
前記Ｎ結合型シアロ糖鎖を、このＮ結合型シアロ糖鎖の還元末端に結合されている前記リンカーのアミノ基を介してポリグルタミン酸のカルボキシル基側鎖に縮合させシアロ糖鎖含有ポリマーを合成する工程と、を含むＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項１０】
水又は緩衝液と有機溶媒とを含む混合溶媒にγ−ポリグルタミン酸を溶解させ、カルボキシル基の活性エステル化剤、縮合剤及び／又は添加剤を用いて前記γ−ポリグルタミン酸を活性化した後、前記Ｎ結合型シアロ糖鎖と縮合させる請求項９に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項１１】
前記リンカーが、ω−アミノ酸である請求項９に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項１２】
前記リンカーが含む炭化水素が、炭素数１〜３０のものである請求項９に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【請求項１３】
前記リンカーが含む炭化水素が、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、シクロアルキル置換アルキル基もしくはそれらを２個以上アミド結合で縮合させたものである請求項９に記載のＮ結合型シアロ糖鎖含有ポリマーの製造方法。
【国際調査報告】
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