(57)【要約】  ミッドカインに対する良質なアプタマーを提供する。  ミッドカインに対する阻害活性を有するアプタマー；ミッドカインに対する結合活性又は阻害活性を有するアプタマー及び機能性物質（例えば、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体、又は薬物など）を含む複合体；ミッドカインに対する結合活性又は阻害活性を有するアプタマー、又は当該アプタマー及び機能性物質を含む複合体を含む医薬、細胞遊走阻害剤、診断薬及び標識剤など。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカインに対する阻害活性を有するアプタマー。
【請求項２】
アプタマーがプレイオトロフィンに対する阻害活性を有しない、請求項１記載のアプタマー。
【請求項３】
ミッドカインのＮ−フラグメントに対する結合能を有する、請求項１記載のアプタマー。
【請求項４】
ミッドカインのＣ−フラグメントに対する結合能を有する、請求項１記載のアプタマー。
【請求項５】
ミッドカインのＮ−フラグメントに対する結合能を有する、請求項２記載のアプタマー。
【請求項６】
ミッドカインのＣ−フラグメントに対する結合能を有する、請求項２記載のアプタマー。
【請求項７】
ミッドカインとPTPζの結合を阻害することでミッドカインに対する阻害活性を示すアプタマー。
【請求項８】
以下（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、請求項１記載のアプタマー：
（ａ）配列番号１〜７０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマーであって、
該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドの２’位が、同一又は異なって、フッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドの２’位が、同一又は異なって、ヒドロキシ基であるか、あるいは水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー；
（ｂ）配列番号１〜７０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマーであって、
該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドの２’位が、同一又は異なって、フッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドの２’位が、同一又は異なって、ヒドロキシ基であるか、あるいは水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー。
【請求項９】
アプタマーに含まれるヌクレオチドが修飾されている、請求項１〜８のいずれか１項記載のアプタマー。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体。
【請求項１１】
機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、請求項１０記載の複合体。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項記載のアプタマーあるいは請求項１０又は１１記載の複合体を含む医薬。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項記載のアプタマーあるいは請求項１０又は１１記載の複合体を含む細胞遊走阻害剤。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項記載のアプタマーあるいは請求項１０又は１１記載の複合体を含む診断薬。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項記載のアプタマーあるいは請求項１０又は１１記載の複合体を含む標識剤。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項記載のアプタマーあるいは請求項１０又は１１記載の複合体を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミッドカインに対するアプタマー及びその利用方法などに関する。
【発明の背景】
【０００２】
ミッドカイン（midkine：以下、必要に応じて「ＭＫ」と省略する）は、肺性腫瘍細胞（ＥＣ）のレチノイン酸による分化誘導の過程で一過性に発現する遺伝子の産物として発見された増殖・分化因子で、塩基性アミノ酸とシステインに富む分子量１３ｋＤａのポリペプチドである（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００３】
ＭＫはその立体構造がＮＭＲにより決定され報告されている（例えば、非特許文献３参照）。ＭＫは、構造上の特徴より２つのドメインから主として構成されている。具体的には、ＭＫは、1〜５２番目のアミノ酸よりなるＮ末端側のフラグメント（以下、「Ｎ−フラグメント」という）、６２〜１２１番目のアミノ酸よりなるＣ末端側のフラグメント（以下、「Ｃ−フラグメント」という）及びそれらを結合するループ領域（５３〜６１番目のアミノ酸）よりなる。それぞれのドメインの外側には、塩基性アミノ酸に富むテイルが結合している。ＭＫ分子中で、Ｎ−フラグメント及びＣ−フラグメントのそれぞれは、主として３本の逆βシート構造からなる立体構造（以下、「ドメイン」といい、１５〜５２番目のアミノ酸からなるＮ−フラグメント中のドメインを「Ｎ−ドメイン」、６２〜１０４番目のアミノ酸からなるＣ−フラグメント中のドメインを「Ｃ−ドメイン」という）、及び、自由に動き特定の構造をとらない構造（以下、「テイル」といい、１〜１４番目のアミノ酸からなるＮ−フラグメント中のテイルを「Ｎ−テイル」、１０５〜１２１番目のアミノ酸からなるＣ−フラグメント中のテイルを「Ｃ−テイル」という）をもつ。
【０００４】
ＭＫの受容体としては、受容体型タンパク質チロシンホスファターゼζ（ＰＴＰζ）、ＬＲＰ（low density lipoprotein receptor-related protein）、ＡＬＫ（anaplastic leukemia kinase）、インテグリン及びシンデカンなどが知られている。ＭＫは、塩基性アミノ酸であるリジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）を多く含んだ、正の帯電が強いタンパク質である。Ｃドメインにヘパリン結合部位を持ち、ヘパリンやコンドロイチン硫酸Ｅなど負に帯電した分子と強く結合することで知られている。変異導入解析とＮＭＲ解析の結果、ヘパリンとの結合にはＫ７９、Ｒ８１、Ｋ１０２で構成されるクラスターＩとＫ８６、Ｋ８７、Ｒ８９で構成されるクラスターＩＩが重要であると考えられている。一方、コンドロイチン硫酸Ｅとの結合にはクラスターＩのみが重要であるとする報告がある。クラスターＩのＲ８１をＡに変えると、ヘパリンとの結合能が低下する。その結果、ＰＴＰζへの結合能の低下や、ＭＫによる神経細胞の突起伸長および移動が抑制される。
【０００５】
繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）や血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）などいくつかの増殖因子はヘパリン結合部位を持っている。これらの増殖因子は細胞外マトリックスであるヘパラン硫酸プロテオグライカンに結合し、適所に留まり、必要に応じて放出されると考えられている。また、神経細胞や血管内皮細胞に発現しているヘパラン硫酸と結合して神経突起の伸長や線溶活性の上昇に寄与していることが知られている。シャーレをＭＫでコートしておき、この上にマウス胚の神経細胞をまくと、神経突起が伸長する。この際、神経細胞をヘパリチナーゼで消化すると神経突起の伸長が抑制される。一方、血管内皮細胞を培養しＭＫを添加すると、細胞のプラスミノーゲン活性化酵素の活性が上昇する。この場合も細胞をヘパリチナーゼ消化するとプラスミノーゲンの活性上昇が抑制される。
【０００６】
ＭＫはＰＴＰζと二カ所で結合していると考えられている。一カ所はコンドロイチン硫酸との高親和性の結合である（Ｋｄ＝０．５８ｎＭ）。この結合はコンドロイチナーゼ消化で消失する。もう一カ所はタンパク質との結合で、コンドロイチナーゼ消化後も残る低親和性結合である（Ｋｄ＝３ｎＭ）。ＭＫはＰＴＰζを発現している胎仔の神経細胞の遊走を促進するが、神経細胞をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理すると遊走が抑制される。骨芽細胞様ＵＭＲ１０６細胞はＰＴＰζを発現しているが、コンドロイチナーゼＡＢＣ処理により、ＭＫ依存性遊走が抑制されることが知られている。マクロファージのＭＫ依存性遊走もコンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＢ、ヘパリナーゼ処理により抑制される。マクロファージはＰＴＰζを発現していないと考えられているので、別の受容体が関与していると考えられている。
【０００７】
負に帯電したものはどんなものでもＭＫのヘパリン結合部位に結合するわけではない。ＭＫをアミノカップリングにより固定化し、表面プラズモン共鳴解析したところ、コンドロイチン硫酸ＥとヘパリンはＭＫに強く結合するが、コンドロイチン硫酸Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは結合しない結果を得ている。
【０００８】
ＭＫは様々な生物活性を有することが知られている。例えば、ヒトの癌細胞においてＭＫの発現が増大していることが知られている。この発現の増大は、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、ニューロブラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍といった多様な癌で確認されている（例えば、特許文献１及び非特許文献４参照）。また、ＭＫは癌細胞の生存と移動を促進し、血管新生を促し、癌の進展を助けると考えられている。
【０００９】
また、ＭＫは炎症像形成の過程で中核を占める分子の一つであることが知られている。例えば、血管に傷害を与えた時の新生内膜の形成と虚血傷害時の腎炎の発症が、ＭＫ遺伝子を欠失させたノックアウトマウスでは軽減されていることが知られている。また、リウマチモデル、手術後の癒着もノックアウトマウスで大きく軽減されることが知られている（例えば、特許文献２、特許文献３及び特許文献４参照）。このように、ＭＫは、関節炎、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、多発性硬化症、手術後の癒着、炎症性大腸炎、乾癬、狼瘡、喘息、好中球機能異常等の炎症性疾患に関与していることが知られている。更に、ＭＫはマクロファージや好中球といった炎症性細胞の移動（遊走）を促進することが知られている。この移動は炎症像の成立に必要なので、ミッドカインが欠失すると炎症に基盤がある病気が起こりにくいと考えられる。（例えば、特許文献５参照）。
【００１０】
また、進行子宮内膜症の女性の腹腔液において、ＭＫレベルが増加していること、及び、ＭＫが培養子宮内膜間質細胞の増殖を刺激することから、ＭＫが子宮内膜症の発症や進行に関与することが知られている（例えば、特許文献６参照）。
【００１１】
更に、ＭＫは、血管内膜肥厚作用を有することから、血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞等の血管閉塞性疾患に関与することが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【００１２】
細胞遊走は、癌細胞の浸潤・転移、動脈硬化巣での内膜肥厚、血管新生などの機序に重要であることが知られている。また、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、脳出血、高血圧などの循環器疾患に、炎症性の細胞の遊走が深く関わっていることが知られている。
【００１３】
プレイオトロフィン（ＰＴＮまたはＨＢ−ＧＡＭ）はＭＫの唯一のファミリータンパク質で約５０％のホモロジーを有している。ＭＫとＰＴＮはともにシステインと塩基性アミノ酸を多く含むタンパク質である。１０個全てのシステインはＭＫとＰＴＮで保存されており、構造上、同様にＮ−ドメインとＣ−ドメインに分けることができる。ＮＭＲ解析の結果、これら２つの分子の三次元構造は非常によく似ていることがわかっている。それぞれのドメインは三つのβシートから成っており、フレキシブルなリンカー領域でつながれている。コンドロイチン硫酸やヘパリンとの結合に重要だと考えられているＫ７９、Ｒ８１、Ｋ１０２は両タンパク質間で保存されている。Ｋ７９とＲ８１は同一のβシート上に存在するが、Ｋ１０２は別のβシート上に存在する。ＭＫおよびＰＴＮが立体構造を形成すると、これらの塩基性アミノ酸はタンパク質表面近傍に現れる。
【００１４】
ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるMacugenが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ法（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）を用いて作製することができる（非特許文献５、６）。ＳＥＬＥＸ法とは、１０１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別してくる方法である。使用されるＲＮＡは４０残基程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみ回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。
【特許文献１】特開平６−１７２２１８号公報
【特許文献２】国際公開第２０００／１０６０８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０７８２１０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０８５６４２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第１９９９／０３４９３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００６／０１６５７１号パンフレット
【非特許文献１】Kadomatsu, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 151:p.1312-1318
【非特許文献２】Tomokura, M. et al.,: J.Biol. Chem, 265: p.10765-10770
【非特許文献３】Iwasaki, W. et al., (1997) EMBO J. 16, p.6936-6946
【非特許文献４】Muramatsu, T., (2002) J. Biochem. 132, p.359-371
【非特許文献５】Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822
【非特許文献６】Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505-510
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、ミッドカインに対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、ミッドカインに対する良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。【００１７】
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである：
［１］ミッドカインに対する阻害活性を有するアプタマー、
［２］アプタマーがプレイオトロフィンに対する阻害活性を有しない、［１］記載のアプタマー、
［３］ミッドカインのＮ−フラグメントに対する結合能を有する、［１］記載のアプタマー、
［４］ミッドカインのＣ−フラグメントに対する結合能を有する、［１］記載のアプタマー、
［５］ミッドカインのＮ−フラグメントに対する結合能を有する、［２］記載のアプタマー、
［６］ミッドカインのＣ−フラグメントに対する結合能を有する、［２］記載のアプタマー、
［７］ミッドカインとPTPζの結合を阻害することでミッドカインに対する阻害活性を示すアプタマー、
［８］以下（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、［１］記載のアプタマー：
（ａ）配列番号１〜７０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマーであって、
該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドの２’位が、同一又は異なって、フッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドの２’位が、同一又は異なって、ヒドロキシ基であるか、あるいは水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー；
（ｂ）配列番号１〜７０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマーであって、
該アプタマーに含まれるヌクレオチドにおいて、
（ｉ）各ピリミジンヌクレオチドの２’位が、同一又は異なって、フッ素原子であるか、あるいは水素原子、ヒドロキシ基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されており、
（ｉｉ）各プリンヌクレオチドの２’位が、同一又は異なって、ヒドロキシ基であるか、あるいは水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されている、アプタマー、
［９］アプタマーに含まれるヌクレオチドが修飾されている、［１］〜［８］のいずれか１項記載のアプタマー、
［１０］［１］〜［９］のいずれか１項記載のアプタマー及び機能性物質を含む複合体、
［１１］機能性物質が、親和性物質、標識用物質、酵素、薬物送達媒体又は薬物である、［１０］記載の複合体、
［１２］［１］〜［９］のいずれか１項記載のアプタマーあるいは［１０］又は［１１］記載の複合体を含む医薬、
［１３］［１］〜［９］のいずれか１項記載のアプタマーあるいは［１０］又は［１１］記載の複合体を含む細胞遊走阻害剤、
［１４］［１］〜［９］のいずれか１項記載のアプタマーあるいは［１０］又は［１１］記載の複合体を含む診断薬、
［１５］［１］〜［９］のいずれか１項記載のアプタマーあるいは［１０］又は［１１］記載の複合体を含む標識剤、
［１６］［１］〜［９］のいずれか１項記載のアプタマーあるいは［１０］又は［１１］記載の複合体を検出する方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のアプタマー及び複合体は、自己免疫疾患、癌、術後癒着、子宮内膜症などの種々の疾患に対する医薬、あるいは診断薬などの試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、ＭＫの精製及び濃縮、並びにＭＫの検出及び定量に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】配列番号1で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される２つの二次構造のうちの一方を示す図である。
【図１Ｂ】配列番号1で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される２つの二次構造のうちの他方を示す図である。
【図２Ａ】配列番号2で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される２つの二次構造のうちの一方を示す図である。四角で囲んだ部分はコンセンサス領域を示す。
【図２Ｂ】配列番号2で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される２つの二次構造のうちの他方を示す図である。四角で囲んだ部分はコンセンサス領域を示す。
【図３Ａ】配列番号3で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される２つの二次構造のうちの一方を示す図である。
【図３Ｂ】配列番号3で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される２つの二次構造のうちの他方を示す図である。四角で囲んだ部分はコンセンサス領域を示す。
【図４】配列番号4で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される二次構造を示す図である。四角で囲んだ部分はコンセンサス領域を示す。
【図５】配列番号5で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される二次構造を示す図である。
【図６】配列番号5で表されるRNAとミッドカイン及びヒトIgG1の相互作用（BIAcore2000を用いて得られたセンサーグラム）を示す図である。
【図７】配列番号4で表されるRNAとミッドカインの相互作用（BIAcore2000を用いて得られたセンサーグラム）を示す図である。
【図８】配列番号20で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される二次構造を示す図である。
【図９】配列番号61で表されるRNAのMFOLDプログラムにより予想される二次構造を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、ミッドカイン（ＭＫ）に対して結合活性を有するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、ＭＫの活性を阻害し得る。【００２１】
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。【００２２】
ＭＫに対する阻害活性とは、ＭＫが保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。ＭＫが保有する活性としては、例えば、細胞（例、マクロファージ、好中球、好酸球、血管平滑筋細胞、腫瘍細胞、骨芽細胞、神経細胞及びそれらの前駆細胞）の遊走活性（Takada et al., 1997, J. Biochem. 122, 453-458, Horiba et al., 2000, J. Clin. Invest. 105, 489-495, Maeda et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 12474-12479, Qi et al., 2001, J. Biol.Chem. 276, 15868-15875）、細胞（例、腫瘍細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、神経細胞、軟骨細胞及びそれらの前駆細胞）の増殖及び分化促進活性（Muramatsu and Muramatsu, 1991, Biochem. Biophys.Res. Commun. 177, 652-658, Muramatsu et al., 1993, Dev. Biol. 159, 392-402, Takei et al., 2001, Cancer Res. 61, 8486-8491）、調節性T細胞の増殖および機能阻害活性、神経細胞の神経突起の伸長促進活性、細胞（例、腫瘍細胞、神経細胞）のアポトーシス阻害活性、細胞（例、腫瘍細胞）の血管新生の誘導活性、筋原細胞のシナプス形成誘導活性、血管内皮細胞の線溶系促進活性、血管平滑筋細胞のＩＬ−８産生促進活性などが挙げられる。従って、ＭＫに対する阻害活性としては、例えば、これらの活性に対する阻害活性が挙げられる。【００２３】
本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するＭＫに対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられる。【００２４】
本発明のアプタマーは、ＭＫの任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されないが、例えば、ＭＫのＮ−フラグメント又はＣ−フラグメントに結合することにより、ＭＫの活性を阻害し得る。ヒトＭＫのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０１１７０４に示されているものであり、分泌タンパクは２３番目のリジンから１４３番目のアスパラギン酸の１２１アミノ酸で構成されている。一般に２３番目のリジンを１番目のアミノ酸として表示する。ヒトＭＫは、1〜５２番目のアミノ酸よりなるＮ−フラグメント、６２〜１２１番目のアミノ酸よりなるＣ−フラグメント及びそれらを結合するループ領域よりなるが、Ｎ−フラグメントとＣ−フラグメントの境界はＭＫ（５３−６１）のループ部分であればいずれでもよく、厳密に定義できるものではない。【００２５】
本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約１５〜約２００ヌクレオチドであり得るが、例えば約１００ヌクレオチド以下であり、好ましくは約８０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約６０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは約４５ヌクレオチド以下であり得る。本発明のアプタマーの長さはまた、例えば約１８、２０又は２５ヌクレオチド以上であってもよい。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。【００２６】
本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＨＯ基）、アミノ基（例、−ＮＨ２基）で置換されているヌクレオチドが挙げられる。本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。本発明のアプタマーはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及び−Ｏ−Ｍｅ基からなる群より選ばれる同一の基を含むヌクレオチドであり得る。【００２７】
本発明のアプタマーの一例は、一本鎖部分（例、ｇｇｇａｇａｇｇａａｃ）、第一ステム部分（例、ｇａｃｇ及びその相補鎖）、インターナルループ部分（例、ａｇｇａｇｕａ及びｇｇ）、第二ステム部分（例、ｇｃｃとその相補鎖）、インターナルループ部分（例、ｇｇａａａｇａａ）からなる群より選ばれる１以上の部分を含む潜在的二次構造を有し得る。本発明のアプタマーの別の例は、一本鎖部分（例、ｇｇｇａａｇｇａｇｇａａ）、第一ステム部分（例、ｇｕｇｃａｃ及びその相補鎖）、インターナルループ部分（例、ａｇ及びｇｇ）、第二ステム部分（例、ｇｇ及びその相補鎖）、インターナルループ部分（例、ｇｕｕｇｇｕｇ）からなる群より選ばれる１以上の部分を含む潜在的二次構造を有し得る。【００２８】
本明細書中で用いられる場合、「潜在的二次構造」とは、生理条件下で安定に存在し得る二次構造をいい、例えば、潜在的二次構造を有するか否かは、実施例記載の構造予測プログラムによって決定できる。ステム部分とは、２以上の連続するヌクレオチドにおける塩基対合（例、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｕ、Ａ−Ｔ）により、２重鎖が形成される部分をいう。インターナルループ部分とは、２つの異なるステム部分間で形成される非ステム部分をいう。ヘアピンループ部分とは、１つのステム部分により形成される部分構造であって、アプタマー鎖の５’末端及び３’末端に対して反対側に形成されるループ部分をいう。一本鎖部分とは、ポリヌクレオチド鎖の末端部分であって、上記のステム部分、インターナルループ部分及びヘアピンループ部分に該当しない部分をいう。【００２９】
本発明のアプタマーはまた、ＭＫのＮ−フラグメント及び／又はＣ−フラグメントに対する結合能を有し得る。配列番号３９で表されるアプタマーおよびその改変体は、ヘパリンやコンドロイチン硫酸Ｅと同様にＣ−フラグメントに対して高い結合活性を有する。ヘパリンはＣ−フラグメントのクラスターＩとクラスターＩＩ部分で結合すると考えられている。また、コンドロイチン硫酸ＥはＣ−フラグメントのクラスターＩ部分で結合すると考えられている。ＭＫはコンドロイチン硫酸を構成分子として含むＰＴＰζと相互作用することが知られている。ＰＴＰζは胎仔の神経細胞や骨芽細胞様細胞に発現しており、ＭＫ存在下でこれらの細胞の遊走が促進される。本発明では、このようなＣ−フラグメントに結合して細胞遊走を阻害し得るアプタマー、およびＮ−フラグメントに主に結合して細胞遊走を阻害するアプタマーが提供される。【００３０】
本発明のアプタマーはまた、ＭＫの活性（例、ＭＫの細胞遊走活性）を阻害し得るが、ＰＴＮの活性（例、ＰＴＮの細胞遊走活性）を阻害し得ないという特徴を有し得る。ＰＴＮはホモロジー５０％のＭＫの唯一のファミリータンパク質であるが、三次元構造は非常によく似ており、また、コンドロイチン硫酸やヘパリンとの結合に重要なアミノ酸は保存されている。【００３１】
本発明のアプタマーはまた、（ａ）配列番号１〜７０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー、（ｂ）配列番号１〜７０のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー、（ｃ）上記（ａ）の複数の連結物、上記（ｂ）の複数の連結物、上記（ａ）及び（ｂ）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物であり得る。上記（ｂ）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、数個である限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。上記（ｃ）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。上記（ａ）〜（ｃ）における各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。【００３２】
特定の局面では、本発明のアプタマーは、その構造に基づいて、大きく３種類に分類され得る。第１のアプタマーは、配列番号６１で表されるヌクレオチド配列からなるアプタマー及びその変異体である。配列番号６１で表されるヌクレオチド配列からなるアプタマーは、ＭＦＯＬＤプログラムにより二次構造を予測すると図９に示されるような潜在的二次構造を有し、一本鎖部分、第一ステム部分、インターナルループ部分、第二ステム部分、ヘアピンループ部分から構成される。本アプタマーでは、一本鎖部分、第一ステム部分、インターナルループ部分、第二ステム部分、ヘアピンループ部分において、数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入及び／又は付加が許容され得る。例えば、本アプタマーでは、一本鎖部分に対する数個のヌクレオチドの挿入、第一ステム部分に対する数個のヌクレオチドの挿入、３’末端の一本鎖部分に対する数個のヌクレオチドの付加（例、配列番号５）が許容され得る。このようなアプタマーは、ＭＫのＣ−フラグメントよりもＮ−フラグメントにより強く結合する。【００３３】
第２のアプタマーは、配列番号２０で表されるヌクレオチド配列からなるアプタマー及びその変異体である。配列番号２０で表されるヌクレオチド配列からなるアプタマーは、ＭＦＯＬＤプログラムにより二次構造を予測すると図８に示されるような潜在的二次構造を有し、一本鎖部分、第一ステム部分、インターナルループ部分、第二ステム部分、ヘアピンループ部分から構成される。本アプタマーでは、一本鎖部分、第一ステム部分、インターナルループ部分、第二ステム部分、ヘアピンループ部分において、数個のヌクレオチドの置換、欠失、挿入及び／又は付加が許容され得る。例えば、本アプタマーでは、一本鎖部分、第一ステム部分及び／又は３’末端に対する数個のヌクレオチドの付加（例、配列番号４）が許容され得る。このようなアプタマーは、ＭＫのＮ−フラグメントに対してはほとんど親和性がなく、Ｃ−フラグメントと強く結合する。【００３４】
第３のアプタマーは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列からなるアプタマー又はその変異体であり得る。【００３５】
本発明のアプタマーは、ＭＫに対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ２）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Sproat et al., (1991) Nucle. Acid. Res. 19, 733-738; Cotton et al., (1991) Nucl. Acid. Res. 19, 2629-2635; Hobbs et al., (1973) Biochemistry 12, 5138-5145参照）。【００３６】
本発明のアプタマーはまた、ＭＫに対する結合性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６および／または８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換が挙げられる。また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。
改変はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、核酸、ヌクレオシド、Myristoyl、Lithocolic-oleyl、Docosanyl、Lauroyl、Stearoyl、Palmitoyl、Oleoyl、Linoleoyl、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照のこと。【００３７】
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により化学合成することができる。アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合および水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング結合など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換または削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。【００３８】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ellington et al., (1990) Nature, 346, 818-822; Tuerk et al., (1990) Science, 249, 505- 510）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用することで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。【００３９】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であり、そのことは標的物質の活性部位に結合することを意味しない。従って、ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは必ずしも標的物質の機能に作用するとは限らない。ＭＫはＮ末端とＣ末端のテイル部分にリジンリッチな部分が存在し、核酸が非特異的に結合すると考えられる。このテイル部分はヘパリンやコンドロイチン硫酸との結合において重要であるとは考えられていない。そのような環境の中でＭＫの活性を有効に阻害するアプタマーを作製することは容易ではない。実際、本発明では２３種類のアプタマーの細胞遊走阻害活性を調べ、５０％以上の活性を保持していたアプタマーはわずか４種類であった。【００４０】
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーは、最適化ＳＥＬＥＸを行うことで、更に高性能化することが可能である。最適化ＳＥＬＥＸとは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。【００４１】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる５０ヌクレオチド程度以下の長さまで短くする必要がある。
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、SELEXによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。【００４２】
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測することで、どのヌクレオチドを置換または欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうか既存のアッセイ系により確認することができる。【００４３】
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。新しい配列の長さは特に限定されるものではない。【００４４】
修飾に関しても配列と同様に高度に設計又は改変可能である。【００４５】
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。【００４６】
例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：【００４７】
【数１】
2008059877.tif 000002
【００４８】
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個又は１〜約１０個であり得る。〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。【００４９】
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質は、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミドまたはトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミドまたはダカルバジンなどのリースト剤、メトトレキセートまたはラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビンまたはフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフールまたはゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチンまたはビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセルまたはパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタルプロテアーゼ（MMP）、FactorXなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。【００５０】
本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は試薬（例、診断薬、検査薬（実験用試薬を含む））として使用され得る。例えば、本発明のアプタマー及び複合体は、細胞遊走の阻害剤、調節性Ｔ細胞の増殖促進剤、調節性Ｔ細胞の抑制機能促進剤、アポトーシス阻害抑制剤、細胞増殖阻害剤、細胞分化阻害剤、薬物送達剤、インビボイメージング用プローブ、ＭＫの血中濃度測定用プローブ、組織染色用プローブ、ＥＬＩＳＡ用プローブ、ＭＫの分離精製用リガンドとして使用され得る。【００５１】
本発明のアプタマー及び複合体はまた、自己免疫疾患（例、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、炎症性腸炎（クローン病など）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺疾患（バセドウ病など）、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、重症筋無力症（ＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病、乾癬、喘息、好中球機能異常）、癌（例、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、ニューログラストーマ、グリオブラストーマ、子宮癌、卵巣癌、ウィルムス腫瘍、前立腺癌）、術後癒着、子宮内膜症、移植時の拒絶反応、アレルギー、血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞などの種々の疾患の予防又は治療に使用され得る。特に、本発明のアプタマーは、ＭＫの細胞遊走活性を阻害することから、多発性硬化症、術後癒着、子宮内膜症、慢性関節リウマチ、血管狭窄の予防又は治療に有用である。【００５２】
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。【００５３】
経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。【００５４】
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）および色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。徐放の基材としては、例えば、リポソーム、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、PLGAなどが挙げられる。【００５５】
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与、経肺投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。更に注射液剤以外にも、吸入剤、軟膏剤も可能である。吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて従来より使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリンまたはその誘導体等を適宜配合することができる。
ここで界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール400、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート(商品名スパン８５)、ソルビタンモノオレエート(商品名スパン８０)、ソルビタンモノラウエート(商品名スパン２０)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油(商品名ＨＣＯ−６０)、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノラウレート(商品名ツイーン２０)、ポリオキシエチレン(２０)ソルビタンモノオレエート(商品名ツイーン８０)、天然資源由来のレシチン(商品名エピクロン)、オレイルポリオキシエチレン(２)エーテル(商品名ブリジ９２)、ステアリルポリオキシエチレン(２)エーテル(商品名ブリジ７２)、ラウリルポリオキシエチレン(４)エーテル(商品名ブリジ３０)、オレイルポリオキシエチレン(２)エーテル(商品名ゲナポル０−０２０)、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体(商品名シンペロニック)等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分と混合し製剤化し使用する。【００５６】
吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、上記本発明のアプタマー及び複合体を粉末または液状にして、吸入噴射剤および／または担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー及び複合体が粉末の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１,１,１,２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。【００５７】
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００mｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０mｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１mｇ／ｋｇであり得る。【００５８】
本発明はまた、本発明のアプタマー及び複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、ＭＫの精製、及びＭＫの検出、定量に有用であり得る。【００５９】
本発明のアプタマー及び複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー及び複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。【００６０】
本発明はまた、ＭＫの精製及び濃縮方法を提供する。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にＭＫを吸着させ、吸着したＭＫを溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのＭＫの吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、ＭＫを含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。ＭＫの溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、カリウム塩（例、ＮａＣｌ、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（例、Tween20、Triton、NP40）、グリセリンを含むものであり得る。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、ＭＫの吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリを含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。【００６１】
本発明はまた、ＭＫの検出及び定量方法を提供する。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）ＭＫを測定することを含み得る。ＭＫの検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法（例、ウエスタンブロット法における二次抗体の代わりとしての使用）、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるＭＫ量の測定、ＭＫが関連する疾患の診断に有用であり得る。【００６２】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。【００６３】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例１】
【００６４】
ミッドカインに特異的に結合する核酸の作製１
ミッドカインに特異的に結合する核酸はSELEX法を用いて作製した。SELEXはEllingtonらの方法（Ellington and Szostak, Nature 346, 818-822, 1990）及びTuerkらの方法（Tuerk and Gold, Science 249, 505-510, 1990）を改良して行った。標的物質であるヒトミッドカインはMurasugiらの方法（Murasugi and Tohma-Aiba, Protein Expression and Purification 27, 244-252, 2003）を参考にして、酵母を用いて作製した。以下、特記されていない場合、ミッドカインはヒトミッドカインを意味することとする。ミッドカインはアミノカップリングによってアガロース樹脂（NHS-activated Sepharose, Amersham Bioscience社製）に固定化した。アミノカップリングはAmersham Bioscience社の仕様書にそって行った。固定化量は、固定化前のミッドカイン溶液と固定化直後の上清をSDS-PAGEにより調べることで確認した。SDS-PAGEの結果、上清からはミッドカインのバンドは検出されず、使用したミッドカインのほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約175μgのミッドカインが約70μLの樹脂に固定化されたことになる。
最初のラウンドで用いたRNA（40N-RNA）は、化学合成によって得られたDNAをDuraScribeTM T7 Transcription Kit（Epicentre社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られたRNAはピリミジンヌクレオチドのリボースの2’位がフルオロ化されたものである。DNA鋳型として以下に示す40ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ94ヌクレオチドのDNAを用いた。DNA鋳型とプライマーは化学合成によって作製した（Operon社製）。【００６５】
DNA鋳型：5’-tcctcattcctgtcctcta-40N-ttcctcttctcctctccc-3’（配列番号71）
プライマーFwd：5’-taatacgactcactatagggagaggagaagaggaa-3’（配列番号72）
プライマーRev：5’-tcctcattcctgtcctcta-3’（配列番号73）
NはA, G, C又はTのいずれか一つを示す。プライマーFwdはT7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたRNAプールのバリエーションは理論上1014であった。【００６６】
ミッドカインが固定化された樹脂にRNAプールを加え、30分室温で保持した。30分後、ミッドカインに結合しないRNAを取り除くために、溶液Aで樹脂を洗浄した。ここで溶液Aは145mM塩化ナトリウム、5.4mM塩化カリウム、1.8mM塩化カルシウム、0.8mM塩化マグネシウム、20mMトリス（pH7.6）の混合溶液である。ミッドカインに結合したRNAは、溶出液を加えて95℃で10分間加熱することで回収した。溶出液として7M尿素、3mM EDTA、100mMトリスの混合溶液をpH6.6に調製したものを用いた。回収されたRNAはRT-PCRで増幅し、DuraScribeTM T7 Transcription Kitで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を1ラウンドとし、同様の作業を7ラウンド行った。SELEX終了後、PCR産物をpGEM-T Easyベクター（Promega社製）にクローニングし、大腸菌株DH5α（Toyobo社製）にトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、DNAシーケンサー（ABI PRISM 3100、ABI社製）で48クローンの塩基配列を決定した。
SELEXを7ラウンド行った後に配列を調べたところ、配列に収束が見られた。配列番号1で表される配列は20配列存在し、2塩基置換体が1配列存在した。配列番号2で表される配列は2配列存在した。配列番号3〜5で表される配列は1配列存在した。配列番号1〜5で表されるRNAの二次構造をMFOLDプログラム（M. Zuker, Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415, 2003）を用いて予測した。その結果、配列番号2, 3, 4で表されるRNAによく似た形状のインターナルループ−ステム−ヘアピンループ構造が見られた（図1〜5）。ヘアピンループは全て8ヌクレオチドからできており、配列番号4に対して2と3は1塩基置換体であった。ステムに関しては、配列番号２は２塩基対、配列番号３と４は３塩基対で構成されていた。【００６７】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。なお、ヌクレオチドにおける括弧は、その2’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子を示す（以下同様）。
配列番号1：
gggagaggagaagaggaaau(F)agu(F)u(F)aagggu(F)gaau(F)u(F)u(F)gc(F)gaaagc(F)u(F)au(F)u(F)u(F)u(F)agu(F)c(F)gc(F)agu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga
配列番号2：
gggagaggagaagaggaaggac(F)u(F)aagu(F)aagagaac(F)ac(F)c(F)ggaau(F)gaagggac(F)u(F)u(F)ac(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga
配列番号3：
gggagaggagaagaggaaagc(F)c(F)u(F)u(F)c(F)u(F)ac(F)c(F)gaaagu(F)gggaaagc(F)ac(F)ac(F)au(F)aaau(F)c(F)u(F)ggu(F)agaggac(F)aggaau(F)gaga
配列番号4：
gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gaga
配列番号5：
gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)aggaau(F)gaga【００６８】
ヘアピンループの配列
配列番号2     -ggaaugaa-
配列番号3     -ggaaagca-
配列番号4     -ggaaagaa-
【実施例２】
【００６９】
ミッドカインに特異的に結合する核酸の作製２
ミッドカインに結合するがミッドカインのファミリータンパク質であるプレイオトロフィンには結合しないアプタマーを作製するために、プレイオトロフィンを用いたプレサブトラクションを含むSELEXを行った。まず、ミッドカインと同様に、プレイオトロフィンをアミノカップリングによりアガロース樹脂に固定化した。次に、RNAプールをプレイオトロフィンの結合した樹脂に加え、室温で30分保持した。その後、上清のみを回収した。この上清には理論上プレイオトロフィンに結合するRNAは含まれていないことになる。この上清をミッドカインが結合した樹脂に加え、実施例1と同様にSELEXを行った。プレイオトロフィンはMurasugiらの方法（Murasugi, Kido, Kumai, and Asami, Biosci. Biotech.Biochem. 67 (10), 2288-2290, 2003）により酵母で発現させたものを用いた。DNA鋳型とプライマーは実施例1で用いたものと同じものを用いた。
7ラウンド終了後48クローンの配列を確認したところ配列に収束が見られた。その中に、実施例1で得られた配列番号3と同じ配列が10配列、その1塩基置換体が1配列存在した。また、配列番号2と同じ配列が6配列、その1塩基置換体が2配列存在した。更に、配列番号5と同じ配列が1配列存在した。
【実施例３】
【００７０】
ミッドカインに特異的に結合する核酸の作製３
ミッドカインをアミノカップリングにより固定化すると、アミノカップリングされる場所によっては、重要な部位がつぶれてしまう可能性がある。そこで、担体への固定化を伴わないニトロセルロース膜を用いたフィルター結合SELEXを行った。タンパク質はニトロセルロース膜に結合しやすいが核酸は結合し難いという性質を利用して、標的タンパク質に結合する核酸と結合しない核酸を分離するというものである。RNAプールとミッドカインを混合し、30分間室温で保持した後に、ニトロセルロース膜を用いてろ過する。ニトロセルロース膜を溶液Aで十分に洗浄した後に、そのニトロセルロース膜を溶出液Bに浸して90℃で5分間加熱する。その後は実施例1と同様に、RNAをエタノール沈殿法により回収し、RT-PCRで増幅し、転写して次のラウンドのRNAプールとする。DNA鋳型とプライマーは実施例1と同じものを用いた。また、溶出液Bとは50%フェノールと6M尿素の混合液である。
6ラウンド終了後48クローンの配列を確認したが十分な収束が得られなかった。そこで、更に3ラウンドSELEXを行い、9ラウンド終了後に48クローンの配列を確認したところ十分な収束が見られた。その配列の中に、配列番号2と同じ配列のものが21配列、その1塩基置換体が4配列存在した。また、配列番号4と同じ配列のものが10配列存在した。新しい配列は3配列見つかったが、そのいずれも収束していなかった。
【実施例４】
【００７１】
表面プラズモン共鳴法による結合活性の評価
配列番号1〜5で表されるRNAのミッドカインに対する結合活性を表面プラズモン共鳴法により調べた。測定にはBIAcore社製のBIAcore2000を用いた。センサーチップにはストレプトアビジンが固定化されているSAチップを用いた。これに、5’末端にビオチンが結合している16ヌクレオチドのPoly dTを1000RU程度結合させた。リガンドとなるRNAは、3’末端に16ヌクレオチドのPoly Aを付加し、dTとAの結合によりSAチップに固定化した。固定化量は約1000RUとした。アナライト用のミッドカインは0.5μMに調製したものを70μLインジェクトした。BIAcoreのランニングバッファーには溶液Aを用いた。測定の結果、配列番号1〜5で表されるRNAの全てがミッドカインに結合することがわかった（図6）。ネガティブコントロールとして40ヌクレオチドのランダム配列を含む40N-RNAを固定化して同様の測定を行った。その結果、40N-RNAもミッドカインに対して親和性があることがわかった。その程度は、配列番号1〜5で表されるRNAの親和性と同程度で高いものあった。ミッドカインはリジン等の塩基性アミノ酸を多く含むため、負電荷を帯びている核酸と非特異的に結合することが予想される。
そこで、BIAcoreのランニングバッファーに、溶液Aの塩化ナトリウムの濃度を500mMにした、高塩濃度のバッファー（溶液B）を用いて測定を行った。高塩濃度のバッファーを用いることで、イオン結合性の非特異吸着が低減できることが予想された。測定の結果、40N-RNAはミッドカインにほとんど結合しないことがわかった。一方、配列番号2〜5で表されるRNAは40N-RNAよりも優位にミッドカインと結合した（図7）。高塩濃度下で結合していることは、その結合が疎水結合である可能性が高い。これは、これらのRNAがリジン部分に非特異的に結合しているのではなく、特異的にミッドカインを認識していることを示唆している。
次に、ミッドカインをCM4センサーチップにアミノカップリングにより固定化し、アナライトとして配列番号4又は5で表されるRNAをインジェクションすることで、RNAとミッドカインの親和性を確認する実験を行った。ミッドカインの固定化はBIAcore社の仕様書に従って、N-hydroxysuccinimide（NHS, 11mg/L）及びN-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochroride（EDC, 75mg/L）を用いて行った。ミッドカインはHBS-EPバッファー（BIAcore社製）で希釈し20μg/mLの濃度で使用した。ブロッキングには1M ethanolamine hydrochloride（pH8.5）を用いた。一つのセンサーチップのフローセル2にＭＫ（１?５９、ＭＫ?Ｎ、ペプチド研究所社製）、フローセル3にＭＫ（６０?１２１、ＭＫ?Ｃ、ペプチド研究所社製）、フローセル4にミッドカインの全長（ＭＫ?ＮＣ）を固定化した。フローセル1はコントロール用のセルとして用いた。このように一つのセンサーチップに3種類のミッドカイン及びミッドカインフラグメントを固定化することで、3種類のリガンドに対する親和性を1度に測定することができる。測定の結果、配列番号4で表されるRNAはミッドカインの全長（以下、MK-NCと記載）及びミッドカインのＣ−ドメイン（以下、MK-Cと記載）には結合するが、ミッドカインのＮ−ドメイン（以下、MK-Nと記載）には結合しないことがわかった（表1）。一方、配列番号5で表されるRNAはMK-NC、MK-N、MK-Cのいずれにも結合したが、MK-CよりMK-Nとの親和性がより高かった。【００７２】
【表１】
2008059877.tif 000003
【００７３】
アナライトとしてRNAの代わりにヘパリン（Heparin, Sodium Salt, Porcine Intestinal Mucosa, Low Molecular Weight, Mw: 5000, Calbiochem社製）、コンドロイチン硫酸E（From Squid cartilage, 生化学工業社製）、コンドロイチン硫酸C（From Shark cartilage, Mw: 40,000-80,000, 生化学工業社製）、tRNA（Sigma社製）を用いて同様の実験を行った。その結果、これら全てのアナライトがMK-Nとの親和性が低く、MK-Cと主に結合していることがわかった（表1）。
以上より、配列番号4で表されるRNAはヘパリンなどと同様にミッドカインのＣドメインに結合することがわかった。一方、配列番号5で表されるRNAはＣドメインと親和性は低く、よりＮドメインと強く結合することがわかった。これは配列番号4と5で表されるRNAがミッドカインの異なる部位に結合していることを示している。ミッドカインはＣドメインにヘパリン結合部位である活性部位を持つことが知られている（Muramatsu H et al., Biochem Biophys Res Commun. 1994 Sep 15;203(2):1131-9., 106.; Iwasaki W et al., EMBO J. 1997 Dec 1;16(23):6936-46.）。【００７４】
配列番号5で表されるRNAがミッドカインのファミリータンパク質であるプレイオトロフィンに対して結合活性を有しているかどうか、上述同様に表面プラズモン共鳴法により調べた。RNAをSAセンサーチップに固定化し、0.5μMのプレイオトロフィンをインジェクトした。非特異吸着を低減させるために、プレイオトロフィン溶液に0.4mg/mLのtRNAを加えた。測定の結果、配列番号5で表されるRNAはプレイオトロフィンに対して結合活性を有していたが、その程度はミッドカインに対するものより低いことがわかった。また、リガンドに40N-RNAを用いて同様の測定を行った。ミッドカイン及びプレイオトロフィンはともに40N-RNAに結合したが、その程度は配列番号5で表されるRNAに対するものより低かった。また、40N-RNAはプレイオトロフィンよりミッドカインに対してより高い親和性を示した。以上より、プレイオトロフィンはミッドカイン同様に核酸と結合しやすい性質を有していることがわかった。また、配列番号5で表されるRNAはプレイオトロフィンよりミッドカインに対してより高い親和性を有していることがわかった。【００７５】
次に、配列番号4と5で表されるRNAが他のタンパク質に対して親和性を有しているかどうか調べた。タンパク質として、ヒトIgG1（Calbiochem社製）およびヒトアルブミン（Sigma社製）を用いた。SAセンサーチップを用い、上述同様の方法でRNAを固定化し、アナライトとしてタンパク質をインジェクトした。その結果、配列番号4および５で表されるRNAに対して、ヒトIgG1及びヒトアルブミンは全く結合しなかった。以上より、配列番号4および5で表されるRNAは、血中に多量に存在するヒトアルブミンやヒトIgGとは結合しないことがわかった。【００７６】
配列番号２〜７、３１、３２、３６、４０、４０−１および４０−２で表されるRNAとMKの結合活性を測定した。上述と同様に、MKをCM4センサーチップに固定化して測定した。その結果、そのどれもがMKに対して親和性を有していることがわかった。
【実施例５】
【００７７】
細胞遊走阻害実験によるRNAアプタマーの評価
ミッドカインは骨芽細胞前駆細胞の細胞浸潤作用を有することが知られている（Qi et al., J. Biol. Chem. 276 (19), 15868-15875, 2001）。そこで、作製したRNAアプタマーがミッドカインの細胞遊走活性を阻害するかどうか、ラットの骨芽細胞前駆細胞であるUMR106細胞（ATCC No. CRL1661）を用いて調べた。ケモタキセル（膜孔径8μm、クラボウ社製）の膜外面に1.5μMのミッドカイン30μLを塗布し、膜外面にミッドカインを固定化した。RNAアプタマー100nMを含む500μLの培地（0.3%ウシ血清アルブミン添加、Dulbecco's Modified Eagle's medium）を添加した24穴カルチャープレートに、ミッドカインを固定化したケモタキセルを設置した。ケモタキセルチェンバー内層にはUMR106細胞を1x106 cells/mLの濃度で200μL入れ、37℃で4時間培養した。ケモタキセルチェンバー内層に残存した細胞を除去し、ミッドカイン塗布面に浸潤し接着した細胞をメタノールで固定した。ケモタキセルチェンバーを1%クリスタルバイオレット水溶液に30分間浸して細胞を染色した。ケモタキセルチェンバーを蒸留水で洗浄、乾燥した後、200μLの1%SDSと1%tritonX100の混合液で色素を抽出した。抽出液の150μLを96穴マイクロプレートに移し、590nmの吸光度を測定した。
測定の結果、配列番号1、2、4、5で表されるRNAは顕著な細胞遊走阻害活性を有していることがわかった。その結果を表2に示す。配列番号5で表されるアプタマーは最も高い阻害活性を示し、14回測定した平均値は76%であった。また、ネガティブコントロールとして用いた40N-RNAはほとんど阻害活性を示さなかった。【００７８】
【表２】
2008059877.tif 000004
【００７９】
次に、配列番号4及び5で表されるアプタマーが、プレイオトロフィンに対して細胞遊走阻害活性を有しているかどうか調べた。実験はミッドカインの代わりにプレイオトロフィンを用いた以外は全て上述と同様の方法で行った。実験の結果、これらのアプタマーはプレイオトロフィンに対して顕著な阻害活性を示さないことがわかった（表2）。【００８０】
次にヘパリン、コンドロイチン硫酸E、コンドロイチン硫酸Cが、ミッドカイン及びプレイオトロフィンの細胞遊走活性を阻害するかどうか調べた。実験はアプタマーをヘパリン、コンドロイチン硫酸E又はコンドロイチン硫酸Cに置換した以外は全て上述と同様に行った。ヘパリンはナカライテスク社製のものを用いた。コンドロイチン硫酸EとCは実施例4で用いたものと同じものを用いた。ヘパリンとコンドロイチン硫酸Eの濃度は0.1、1、10、100μg/mLとした。実験の結果、ヘパリンは0.1μg/mLでミッドカイン及びプレイオトロフィンの細胞遊走活性を阻害した。また、1μg/mLの濃度でミッドカイン及びプレイオトロフィンの細胞遊走活性を80%以上阻害した。一方、コンドロイチン硫酸Eは10μg/mLの濃度でミッドカインを49%、プレイオトロフィンを69%阻害した。コンドロイチン硫酸Cは分子量を40,000と仮定して500nM（20μg/mL）で実験を行った。その結果、配列番号4で表されるアプタマー（500nM）の阻害活性を100とすると、コンドロイチン硫酸Cの阻害活性は44であった。【００８１】
以上より、配列番号１、２、４、５で表されるアプタマーは、ミッドカインに特異的に結合してその細胞遊走活性を阻害することがわかった。40N-RNAは静電的にミッドカインに非特異吸着するが、細胞遊走活性は阻害しなかった。これはSELEXにより得られてきたRNAが非特異吸着によるものではなく、細胞遊走活性と関係する重要な部位に結合していることを示している。ヘパリンとコンドロイチン硫酸Eはミッドカインとプレイオトロフィンを区別することなく同等に細胞遊走活性を阻害した。一方、配列番号4及び5で表されるアプタマーはミッドカインの活性のみを阻害した。ミッドカインとプレイオトロフィンのホモロジーは50%であり、特にヘパリン結合部位は高度に保存されているので、アプタマーの特異性の高さが理解できる。
【実施例６】
【００８２】
配列番号4で表されるアプタマーの小型化及び安定化
配列番号4で表されるアプタマーは77ヌクレオチドの長さであり、ピリミジンヌクレオチドのリボースの2'位がフルオロ化されている。化学合成を可能にし、毒性の低減及び血中安定性の向上を図るために、このアプタマーの小型化及び安定化を行った。小型化及び安定化作業はMFOLDプログラムによって予想される二次構造をもとにして行い、その活性は細胞遊走阻害実験により評価した。細胞遊走阻害実験におけるRNAの濃度は100nM又は500nMとした。細胞の状態により実験結果に多少の誤差が生じるため、各測定に以前に測定済みのサンプルをポジティブコントロールとして含めた。RNAの濃度が500nMの場合の阻害活性を表3（表3-1および3-2）に示す。阻害活性は、改変体間の活性の違いが明確に示されるように、配列番号4で表されるアプタマーの活性を100とした相対値で表した。配列番号4で表されるアプタマーの阻害活性%（アプタマーを加えないときに移動した細胞の数を100として、アプタマーを加えたときに移動した細胞の数を表したものを100から引いた値）は500nMのとき73%だった。これは4回の測定の平均値である。また、100nMのときの阻害活性%の6回の測定の平均値は63%だった。【００８３】
【表３−１】
2008059877.tif 000005
【００８４】
【表３−２】
2008059877.tif 000006
【００８５】
以下に改変体の改変部分（配列番号6〜29）を説明する。
配列番号6：配列番号4で表されるRNAを基にして、3'末端側の一本鎖部分を10ヌクレオチド削ったもの。
gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)a
配列番号7：配列番号4で表されるRNAを基にして、5'末端側の一本鎖部分を14ヌクレオチド削り、転写のためにGを一つ付加したもの。
gggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga
配列番号8：配列番号4で表されるRNAを基にして、末端側のステム中の4塩基対を削ったもの。
gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agc(F)aggaau(F)gagga
配列番号9：配列番号4で表されるRNAを基にして、インターナルループの8ヌクレオチド及びその反対側のCGGを削ったもの。
gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gc(F)c(F)ggaaagaaggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga
配列番号10：配列番号4で表されるRNAを基にして、ループ部分をGAAAテトラループにしたもの。
gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)gaaaggc(F)ggu(F)gu(F)gu(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga【００８６】
配列番号11：配列番号4で表されるRNAを基にして、末端側のステム中の3カ所のG-U塩基対をG-C塩基対に変えたもの。
gggagaggagaagaggaac(F)gu(F)gc(F)u(F)c(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga
配列番号12：配列番号8で表されるRNAを基にして、末端側のステム中の3カ所のG-U塩基対をG-C塩基対に変え、3'末端側の一本鎖部分を11ヌクレオチド削ったもの。
gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agc(F)
配列番号13：配列番号12で表されるRNAを基にして、5'末端側の一本鎖部分の11ヌクレオチドを削り、転写のためにGGGを付加したもの。
gggagaggaac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agc(F)
配列番号14：配列番号12で表されるRNAを基にして、末端側のステム中の一つのG-C及び一つのC-G塩基対を削ったもの。
gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)agc(F)
配列番号15：配列番号12で表されるRNAを基にして、ループ部分のA36及びA37を削ったもの。
gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agc(F)【００８７】
配列番号16：配列番号12で表されるRNAを基にして、インターナルループ部分のA23を削ったもの。
gggagaggagaagaggaac(F)gc(F)u(F)gc(F)ac(F)gagggu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)gc(F)agc(F)
配列番号17：配列番号13で表されるRNAを基にして、末端側のステム中の一つのG-Cと一つのC-G塩基対を削ったもの。
gggagaggaac(F)gc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)agc(F)
配列番号18：配列番号17で表されるRNAを基にして、5'末端の一本鎖部分を11ヌクレオチド削り、転写のためにGGを付加したもの。
gggc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)agc(F)
配列番号19：配列番号17で表されるRNAを基にして、末端側のステム部分の一つのC-G塩基対を削ったもの。
gggagaggaac(F)gu(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)ac(F)【００８８】
配列番号20：配列番号17で表されるRNAを基にして、末端側のステム部分の一つのC-Gと一つのU-A塩基対を削ったもの。
gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号20-1：配列番号20で表されるRNAの一本鎖部分を全てOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号20-2：配列番号20で表されるRNAの一つ目のステム部分をOMe修飾したもの。
gggagaggaac(F)g(M)a(M)c(F)g(M)aggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)
配列番号20-3：配列番号20で表されるRNAの二つ目のステム部分をOMe修飾したもの。
gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)ag(M)c(F)c(F)ggaaagaag(M)g(M)c(F)ggc(F)gu(F)c(F) 
配列番号20-4：配列番号20で表されるRNAのループ部分のGをOMe修飾したもの。
gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)g(M)g(M)aaag(M)aaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F) 【００８９】
配列番号20-5：配列番号20-1で表されるRNAのバルジ部分のAをOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号20-6：配列番号20-1で表されるRNAのバルジ部分のGをOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)gag(M)g(M)ag(M)u(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号20-7：配列番号20-1で表されるRNAのループ部分のAをOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
【００９０】
配列番号20-8：配列番号20-5で表されるRNAのループ部分のAをOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号20-9：配列番号20-5で表されるRNAの一つ目のステムをOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)
配列番号20-10：配列番号20-5で表されるRNAの一部をOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)gac(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)g(M)g(M)c(F)gu(F)c(F)
配列番号20-11：配列番号20-5で表されるRNAの一部をOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaaggc(F)g(M)g(M)c(F)g(M)u(F)c(F)
配列番号20-12：配列番号20-5で表されるRNAの一部をOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)g(M)aaggc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)
配列番号20-13：配列番号20-5で表されるRNAの一部をOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)c(F)g(M)a(M)c(F)ga(M)gga(M)gu(F)a(M)gc(F)c(F)gga(M)aa(M)gaag(M)gc(F)ggc(F)g(M)u(F)c(F)【００９１】
配列番号21：配列番号17で表されるRNAを基にして、ループ側のステム部分の一つのG-C塩基対を削ったもの。
gggagaggaac(F)gc(F)u(F)ac(F)gaggagu(F)agc(F)ggaaagaagc(F)ggc(F)gu(F)agc(F)
配列番号22：配列番号20で表されるRNAを基にして、5'末端の一本鎖部分を11ヌクレオチド削り、転写のためにGを二つ加えたもの。
gggac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)【００９２】
配列番号23：配列番号20で表されるRNAを基にして、ループ部分をGAAAテトラループにしたもの。
gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)gaaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号24：配列番号20で表されるRNAを基にして、ループ部分をUUCGテトラループにしたもの。
gggagaggaac(F)gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)u(F)u(F)c(F)gggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号25：配列番号20で表されるRNAを基にして、インターナルループ部分を配列番号2で表されるアプタマーのインターナルループに入れ替えたもの。
gggagaggaac(F)gac(F)gagaac(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号26：配列番号20で表されるRNAを基にして、インターナルループのG18を削ったもの。
gggagaggaac(F)gac(F)gagagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号27：配列番号20で表されるRNAを基にして、インターナルループのA19を削ったもの。
gggagaggaac(F)gac(F)gagggu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)
配列番号28：配列番号22で表されるRNAの5’末端のGを二つ取り除き、二番目の塩基対A-UをG-Cにしたもの。
ggc(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gc(F)c(F)
配列番号29：配列番号22で表されるRNAの5’末端のGを二つ取り除いたもの。
gac(F)gaggagu(F)agc(F)c(F)ggaaagaaggc(F)ggc(F)gu(F)c(F)【００９３】
また、配列番号4で表されるアプタマーのマウスミッドカインに対する細胞遊走阻害活性を調べた。実験方法はヒトミッドカインに対する上述の実験と同様である。実験の結果、本アプタマーの阻害活性%は50%であった。これは、本アプタマーのヒトミッドカインに対する阻害活性を100とした場合に57程度であり、ヒトミッドカインに対する阻害活性と比較して明らかに活性が落ちていた。よって、本アプタマーはよりヒトミッドカインに対して阻害活性が高いアプタマーであることがわかった。【００９４】
表３で示されるように、77ヌクレオチドであった配列番号4で表されるアプタマーは、31ヌクレオチドまで、大きく活性を落とすことなく小型化することができた（配列番号28、29）。得られた本アプタマーのヘアピンループ部分は必ずしもGGAAAGAAである必要はなく、GAAAやUUCGテトラループでも活性を保持していた（配列番号23、24）。インターナルループ部分は配列番号2で表されるアプタマーのインターナルループ部分に入れ替えても活性を保持していた（配列番号25）。また、A19を削っても活性を保持していたが、G18を削ると活性が極端に低下した（配列番号26、27）。一方、ループ側のステムのC-G塩基対を削除すると、二次構造が大きく変わり、阻害活性がなくなることがわかった（配列番号21）。以上より、配列番号20で表される42ヌクレオチドのアプタマー（図8）は、基本構造が大きく変化しなければ、一部のヌクレオチドを別のヌクレオチドで置換したり削除したりしても活性を保持していることがわかった。
【実施例７】
【００９５】
配列番号5で表されるアプタマーの小型化及び安定化
配列番号5で表されるアプタマーは77ヌクレオチドの長さであり、ピリミジンヌクレオチドのリボースの2'位がフルオロ化されている。化学合成を可能にし、毒性の低減及び血中安定性の向上を図るために、このアプタマーの小型化及び安定化を行った。小型化及び安定化作業はMFOLDプログラムによって予想される二次構造をもとにして行い、その活性を細胞遊走阻害実験により評価した。細胞遊走阻害実験におけるRNAの濃度は100nM又は500nMとした。細胞の状態により実験結果に多少の誤差が生じるため、各測定に以前に測定済みのサンプルをポジティブコントロールとして含めた。RNAの濃度が100nMの場合の阻害活性を表4-1に示す。阻害活性は、改変体間の活性の違いが明確に示されるように、配列番号5で表されるアプタマーの活性を100とした相対値で表した。配列番号5で表されるアプタマーの阻害活性%（アプタマーを加えないときに移動した細胞の数を100として、アプタマーを加えたときに移動した細胞の数を表したものを100から引いた値）は100nMのとき76%だった。これは14回の測定の平均値である。また、RNAの濃度を500nMにして同様な実験を行った。その結果を表4-2（表4-2-1、表4-2-2）に示す。活性は配列番号40で表されるアプタマーの活性を100とした相対値で表した。配列番号40で表されるアプタマーの阻害活性%は82%であった。これは4回の測定の平均値である。【００９６】
【表４−１】
2008059877.tif 000007
【００９７】
【表４−２−１】
2008059877.tif 000008
【００９８】
【表４−２−２】
2008059877.tif 000009
【００９９】
以下に改変体の改変部分（配列番号30〜70）を説明する。
配列番号30：配列番号5で表されるRNAの5'末端側の一本鎖部分を6ヌクレオチド削り、転写用にGを一つ付加したもの。
ggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)aggaau(F)gagga
配列番号31：配列番号5で表されるRNAの3'末端側の一本鎖部分を10ヌクレオチド削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)a
配列番号32：配列番号5で表されるRNAの3'末端側の一本鎖部分を20ヌクレオチド削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aag
配列番号33：配列番号5で表されるRNAの5'末端側の一本鎖部分を6ヌクレオチド、3'末端側の一本鎖部分を10ヌクレオチド削ったもの。
ggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aagau(F)agaggac(F)a【０１００】
配列番号34：配列番号5で表されるRNAの5'末端側の一本鎖部分を12ヌクレオチド、3'末端側の一本鎖部分を20ヌクレオチド削ったもの。
ggaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aag
配列番号35：配列番号32で表されるRNAの3'末端側の一本鎖部分を6ヌクレオチド削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)ag
配列番号36：配列番号32で表されるRNAの末端側のステムを2塩基対削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag
配列番号36-1：配列番号36で表されるRNAの5'末端側の一本鎖部分を全てOMe修飾にしたもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)g(M)a(M)a(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag
配列番号37：配列番号32で表されるRNAの末端側のステムを4塩基対削ったもの。
gggagaggagaagaggaagc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)agu(F)au(F)aag
配列番号38：配列番号32で表されるRNAの5'末端側の一本鎖部分をpoly Uにしたもの。ここでUはリボースの2'位がフルオロ化されているものである。
gggu(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)u(F)gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)agu(F)au(F)aag【０１０１】
配列番号39：配列番号36で表されるRNAの3'末端側の一本鎖部分を6ヌクレオチド、末端側のステムの1塩基対を削ったもの。
gggagaggagaagaggaaggc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)c(F)ag
配列番号40：配列番号36で表されるRNAの3'末端側の一本鎖部分を8ヌクレオチド削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)
配列番号40-1：配列番号40で表されるRNAの5'末端に、C12のリンカーを挟んで分子量2000のポリエチレングリコールを付加し、3'末端にidTを付加したもの。
PEG2000-C12-gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)-idT
配列番号40-2：配列番号40で表されるRNAの5’末端の一本鎖部分のGを全てOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)ag(M)ag(M)g(M)ag(M)aag(M)ag(M)g(M)aagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)
配列番号40-3：配列番号40で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のAを全てOMe修飾したもの。
ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)
配列番号41：配列番号36で表されるRNAの5'末端側の一本鎖部分のG5を削ったもの。
gggaaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag
配列番号42：配列番号36で表されるRNAの5'末端側の一本鎖部分のA11を削ったもの。
gggagaggagagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag【０１０２】
配列番号43：配列番号36で表されるRNAの5'末端側の一本鎖部分のA17を削ったもの。
gggagaggagaagaggagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag
配列番号44：配列番号40で表されるRNAの末端側のステムの1塩基対を削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)u(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)aac(F)
配列番号45：配列番号40で表されるRNAの末端側のステムの2塩基対を削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号45-1：配列番号45で表されるRNAの5'末端に、C12のリンカーを挟んで分子量2000のポリエチレングリコールを付加し、3'末端にidTを付加したもの。
PEG2000-C12-ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)-idT
配列番号45-2：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のA及びループ部分のGを全てOMe修飾したもの。
ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)agggg(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号45-3：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のA及びインターナルループ部分のAとGを全てOMe修飾したもの。
ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)a(M)g(M)gggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)g(M)g(M)gu(F)gc(F)ac(F)
配列番号45-4：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のA及び末端側のステム部分のAとGを全てOMe修飾したもの。
ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)
配列番号45-4-1：配列番号45-4で表されるRNAのループ部分のGを全てOMe修飾したもの。
ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)
配列番号45-4-1-1：配列番号45-4-1で表されるRNAのC24をRNAヌクレオチドにしたもの。
ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)caggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)【０１０３】
配列番号46：配列番号40で表されるRNAの末端側のステムのA-U塩基対をG-C塩基対に変えたもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gc(F)gc(F)gc(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggc(F)gc(F)gu(F)ac(F)
配列番号47：配列番号40で表されるRNAのループのU32削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)
配列番号48：配列番号40で表されるRNAのループのG34削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)gu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)
配列番号49：配列番号40で表されるRNAのループのU36削ったもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)gggu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)
配列番号50：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のG4及びG10を削ったもの。
gggaaggaaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)【０１０４】
配列番号51：配列番号36で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のG5及びA11を削ったもの。
gggaaggagagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag
配列番号52：配列番号36で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のG1及びG5を削ったもの。
ggaaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag
配列番号53：配列番号36で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のG5及びG10を削ったもの。
gggaaggaaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)agu(F)au(F)aag
配列番号54：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のGを全てF修飾、Aを全てOMe修飾したもの。
g(F)g(F)g(F)a(M)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)g(F)a(M)a(M)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号55：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のA11及びA12を削ったもの。
gggagaggaggaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)【０１０５】
配列番号56：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のG13及びA14を削ったもの。
gggagaggagaaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号57：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のG15及びG16を削ったもの。
gggagaggagaagaaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号58：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のA17及びA18を削ったもの。
gggagaggagaagagggu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号59：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分を18ヌクレオチド削り、転写のためにGを二つ付加したもの。
gggu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号60：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分をGGGAAGGAにしたもの。
gggaaggagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)【０１０６】
配列番号61：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のG5、G10、A11、A12、G13、A14を削ったもの。
gggaaggaggaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号61-1：配列番号61で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のGをDNAヌクレオチド、AをOMe修飾し、ループ部分のGをOMe修飾したもの。
g(H)g(H)g(H)a(M)a(M)g(H)g(H)a(M)g(H)g(H)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号61-2：配列番号61で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のG及びA、ループ部分のGをOMe修飾したもの。
g(M)g(M)g(M)a(M)a(M)g(M)g(M)a(M)g(M)g(M)a(M)a(M)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号61-3：配列番号61で表されるRNAの一部にOMeとFの修飾を加えたもの。
g(F)g(F)g(F)a(M)a(M)g(F)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)g(F)g(M)g(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)g(F)g(F)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)
配列番号61-4：配列番号61で表されるRNAの一部にOMeの修飾を加えたもの。
ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)【０１０７】
配列番号61-5：配列番号61-5で表されるRNAの5’末端に枝分かれした40kDaのポリエチレングリコール鎖、3’末端にidTを付加したもの。
PEG40k-ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)-idT
配列番号61-6：配列番号61-5で表されるRNAの両末端に30kDaのポリエチレングリコール鎖を付加したもの。
PEG30k-ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)-PEG30k
配列番号61-7：配列番号61で表されるRNAの一部にOMe修飾を加えたもの。
ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)g(M)g(M)gu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)
配列番号61-8: 配列番号61で表されるRNAの一部にOMe修飾を加えたもの。
ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)g(M)gg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)
配列番号61-9：配列番号61で表されるRNAの一部にOMe修飾を加え、5'末端に2kDaのポリエチレングリコールを付加したもの。
PEG2000-ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)gg(M)g(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)ggg(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)【０１０８】
配列番号62：配列番号45で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のG13、A14、G15、G16、A17、A18を削ったもの。
gggagaggagaagu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号63：配列番号45で表されるRNAのA25とG26をCにしてインターナルループをステムにしたもの。
gggagaggagaagaggaagu(F)gc(F)ac(F)c(F)c(F)gggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)
配列番号64：配列番号61で表されるRNAの5'末端側のステムのU-Aを削ったもの。
gggaaggaggaaggc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)c(F)
配列番号65：配列番号61で表されるRNAのインターナルループ内のA19及びG20をCにしたもの。
gggaaggaggaagu(F)gc(F)ac(F)c(F)c(F)gggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)ac(F)【０１０９】
配列番号66：配列番号61で表されるRNAの一部にOMe修飾を加え、さらにGにF修飾を加えたもの。
g(F)g(F)a(M)a(M)g(F)g(F)a(M)g(F)g(F)a(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)a(M)gg(M)g(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)g(F)g(F)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)
配列番号67：配列番号66で表されるRNAの修飾を変えたもの。
gga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)
配列番号68：配列番号61で表されるRNAの一部にOMe修飾を加え、U28をA(M)にしたもの。
ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)u(F)g(M)g(M)a(M)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)
配列番号69：配列番号61で表されるRNAの一部にOMe修飾を加え、U25をA(M)にしたもの。
ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)u(F)a(M)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)
配列番号70：配列番号61で表されるRNAの一部にOMe修飾を加え、U24をA(M)にしたもの。
ggga(M)a(M)gga(M)gga(M)a(M)g(M)u(F)g(M)c(F)a(M)c(F)aggg(M)g(M)a(M)u(F)g(M)g(M)u(F)g(M)u(F)c(F)gggu(F)g(M)c(F)a(M)c(F)【０１１０】
ここで、n(M)はリボースの2'位をOMe 修飾したもの、n(F)はリボースの2’位をF修飾したもの、n(H)はデオキシリボース、PEG2000は2000Daのポリエチレングリコール、PEG40kは枝分かれした40kDaのポリエチレングリコール、PEG30kは30kDaのポリエチレングリコール、C12はC12リンカー、idTはinverted dTである。【０１１１】
配列番号5で表されるアプタマー及びその改変体のプレイオトロフィンに対する細胞遊走阻害実験を行った。実験方法はミッドカインの代わりにプレイオトロフィンを用いた以外は上述と同様である。アプタマーの濃度は100nMとし、配列番号5で表されるアプタマーのミッドカインに対する阻害活性を100とした。実験の結果、プレイオトロフィンに対する阻害活性は13であった（表4-1）。これは6回の測定の平均値である。また、改変体に関してもプレイオトロフィンに対する顕著な阻害活性は確認されなかった。【０１１２】
配列番号35で表されるアプタマーのマウスミッドカインに対する細胞遊走阻害活性を調べた。実験はヒトミッドカインを用いた上述の実験方法と同様である。実験の結果、本アプタマーの阻害活性%は84%であった。よって、本アプタマーはヒトミッドカインに対する阻害活性と同等の活性をマウスミッドカインに対して有していることがわかった。【０１１３】
アプタマーの代わりに、ミッドカインに特異的に結合するとは考え難い、tRNA（Sigma社製）、Thrombin-S、HIV-Sを用いて上述同様のヒトミッドカインに対する細胞遊走阻害実験を行った。ここで、Thrombin-Sはt'ggttggtgtggttgg'taaaaaaaaaaaaaaaa（配列番号74）、HIV-Sはg'tggtgggtgggtggg't（配列番号75）のDNAアプタマーである。'はホスホロチオエート結合を示す。ホスホロチオエート結合はヌクレアーゼ耐性を向上させるために加えた。これらのRNAは500nMで使用された。配列番号45で表されるアプタマーのヒトミッドカインに対する阻害活性を100とした場合、tRNAは28、Thrombin-Sは0、HIV-Sは48であった。よって、本研究で作製されたアプタマーはミッドカインの細胞遊走活性と関係する重要な部位に特異的に結合していることが示唆された。【０１１４】
77ヌクレオチドであった配列番号5で表されるアプタマーは、39ヌクレオチドまで、活性を落とすことなく小型化することができた（配列番号61）。5'末端の一本鎖部分は完全に削除することはできず、この一本鎖部分がアプタマーの立体構造形成に関与していることが推測される。また、この一本鎖部分のGはF修飾されたヌクレオチドでもよいが、OMe修飾のヌクレオチドの場合は活性が低下することがわかった（配列番号40-2、54、61-2）。一方、AはOMe修飾のヌクレオチドでも活性は変わらない（配列番号40-3）。5'末端側のステムは一部A-U塩基対をG-C塩基対に変えてもそれほど活性に影響を与えなかった（配列番号46）。このステム部分のA及びGをOMe修飾されたヌクレオチドにしても活性は保たれていた（配列番号45-4）。インターナルループ部分は、ヌクレオチド置換によりG-Cステム構造にしても活性は変わらなかったが（配列番号63）、一本鎖部分を短くすると活性が低下した（配列番号59）。インターナルループのG及びAはOMe修飾ヌクレオチドに置換すると活性が低下した（配列番号45-3）。ループ部分は1ヌクレオチド欠損させると活性が低下した（配列番号47〜49）。ループ部分のGはOMe修飾ヌクレオチドにしても活性を保持していた（配列番号45-2）。
以上より、得られた本アプタマーは一部塩基置換したり修飾を変えても活性に影響がないことがわかった。また、ミッドカインに特異的に結合して細胞遊走活性を阻害することがわかった。一方、ファミリータンパク質であるプレイオトロフィンにも結合するが顕著な細胞遊走阻害活性を有していないことがわかった。
【実施例８】
【０１１５】
術後臓器癒着マウスモデルによるアプタマーの臓器癒着防止効果
正常マウスの腹部を開腹、腹膜にメス等で傷を入れた後、内臓を乾燥、その後開腹部を縫合した後、５日以内に臓器の癒着が観察できる（Am J Obstet Gynecol 179, 438-443, 1998)。術後臓器癒着を起こさせる本方法を用いてミッドカインノックアウトマウスを処置すると、術後臓器癒着がおこらないことが報告されている（Biochemical and Biophysical Research Communication, 317, 108-113, 2004）。そこで術後臓器癒着マウスモデルを用いて配列番号76で示されるアプタマーの術後臓器癒着に対する防止効果を検討した。麻酔下において、8週令のC57BL/6マウス（メス）の腹部を開腹後、脱脂綿にて腹膜をぬぐった。その後ハサミにて約2 cmの裂傷を5箇所腹膜に入れた。脱脂綿にて10分間止血した後、縫い針と糸を用いて縫合した。覚醒後、配列番号76で示されるアプタマーを 1 mg/25 mL/kgの投与量で腹腔内投与した。対照群には１ mM MgCl2を含む生理食塩水を25 mL/kgの投与量で同様に腹腔内投与した。投与は1日一回とし、術後0日目、1日目、2日目の計3回実施した後、3日目に麻酔下にて開腹、傷創部への臓器の癒着の程度を下記の評価基準にて評価した。
0: 癒着無し
1: 癒着あり、弱い癒着 (mild)
2: 癒着あり、中程度の癒着 (moderate)
3: 癒着あり、癒着部臓器を引っ張ってもはがれない強度の癒着 (severe)
結果は一群9〜10匹の癒着程度のスコアの平均値と標準誤差で示した(表５)。その結果、生理食塩水投与群では全てスコア3であったのに対し、配列番号76で示されるアプタマー投与群の平均スコアは2.4を示した。配列番号76で示されるアプタマー投与群は生理食塩水投与群と比較して統計学的な有意差（ｐ＜５％）が認められた。統計学的処理はMann-Whitney U検定を用いた。以上の結果より、配列番号76で示されるアプタマーは、術後臓器癒着防止活性を有することが明らかとなった。
なお、配列番号76で示されるアプタマーは以下で示される。
配列番号76：配列番号40で表されるRNAの5'末端の一本鎖部分のAを全てOMe修飾し、さらに5'末端に炭素数１２の飽和炭化水素鎖（C12）リンカーをはさんでコレステロール（Chol）を、3'末端にinverted dT（idT）を付加したもの。
Chol-C12-ggga(M)ga(M)gga(M)ga(M)a(M)ga(M)gga(M)a(M)gu(F)gu(F)gc(F)ac(F)aggggu(F)u(F)ggu(F)gu(F)c(F)gggu(F)gc(F)au(F)ac(F)-idT【０１１６】
【表５】
2008059877.tif 000010
【０１１７】
本出願は、日本で出願された特願２００６−３０８４８２（出願日：２００６年１１月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１Ａ】
2008059877.tif 000011
【図１Ｂ】
2008059877.tif 000012
【図２Ａ】
2008059877.tif 000013
【図２Ｂ】
2008059877.tif 000014
【図３Ａ】
2008059877.tif 000015
【図３Ｂ】
2008059877.tif 000016
【図４】
2008059877.tif 000017
【図５】
2008059877.tif 000018
【図６】
2008059877.tif 000019
【図７】
2008059877.tif 000020
【図８】
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【図９】
2008059877.tif 000022
【配列表】
2008059877000001.app
【国際調査報告】
2008059877.tif 000023
2008059877.tif 000024
2008059877.tif 000025
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