(57)【要約】安定性が高く、優れた抗菌性活性を有するペプチド又はその塩を提供する。以下の（１）又は（２）で表されるペプチド又はその塩；（１）下記一般式（I）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド(Pro Hyp Gly)n-｛(Lys X Gly)m-(Pro Hyp Gly)l-(Lys X Gly)p｝α-(Pro Hyp Gly)r    （I）（ここで、式（I）中、ｎは１〜６の整数であり、ｍは１〜４の整数であり、ｌは０〜７の整数であり、ｐは１〜４の整数であり、ｒは１〜６の整数であり、αは１〜６の整数である。Ｘは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＨｙｐから選択されるいずれかのアミノ酸残基であり、ｍ＋ｐ個のＸは、それぞれ同一又は異なっていてもよい。ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ＋ｒ＝４〜１５である。但し、ｌ＝０の時、ｍ＋ｐ≧２を満たし、α≧２のときｍ＝１、ｌ＝０、ｐ＝１を満たす。）（２）一般式（I）で表されるアミノ酸配列において、Lys、Gly及びX以外の１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ抗菌活性を有するペプチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）又は（２）で表されるペプチド又はその塩；
（１）下記一般式（I）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(Pro Hyp Gly)n-｛(Lys X Gly)m-(Pro Hyp Gly)l-(Lys X Gly)p｝α-(Pro Hyp Gly)r    （I）
（ここで、式（I）中、ｎは１〜６の整数であり、ｍは１〜４の整数であり、ｌは０〜７の整数であり、ｐは１〜４の整数であり、ｒは１〜６の整数であり、αは１〜６の整数である。
Ｘは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＨｙｐから選択されるいずれかのアミノ酸残基であり、
ｍ＋ｐ個のＸは、それぞれ同一又は異なっていてもよい。
ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ＋ｒ＝４〜１５である。
但し、ｌ＝０の時、ｍ＋ｐ≧２を満たし、
α≧２のときｍ＝１、ｌ＝０、ｐ＝１を満たす。）
（２）一般式（I）で表されるアミノ酸配列において、Lys、Gly及びX以外の１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ抗菌活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記（１）において、ｎは３〜６の整数であり、ｍは１〜４の整数であり、ｌは０〜７の整数であり、ｐは１〜４の整数であり、ｒは３〜６の整数であり、αは１であり、
ＸはＩｌｅ又はＬｅｕであり、
ｍ＋ｐ個のＸは、それぞれ同一又は異なっていてもよく、
ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ＋ｒ＝８〜１５であり、
ｌ＝０の時、ｍ＋ｐ≧２を満たす、
請求項１に記載のペプチド又はその塩。
【請求項３】
下記（1-1）又は（2-1）で表される請求項１に記載のペプチド又はその塩：
（1-1）以下の（i）〜（vi）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（i）(Pro Hyp Gly)3 -(Lys Ile Gly)3 -(Pro Hyp Gly)4(配列番号：１)
（ii）(Pro Hyp Gly)3 -Lys Ile Gly Pro Hyp Gly Lys Ile Gly-(Pro Hyp Gly)4(配列番
号：２)
（iii）(Pro Hyp Gly)4 -(Lys Ile Gly)2 -(Pro Hyp Gly)4(配列番号：３)
(iv)(Pro Hyp Gly)3-(Lys Hyp Gly Lys Leu Gly)2-(Pro Hyp Gly)3(配列番号：４)、
(v)(Pro Hyp Gly)2-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)3-(Pro Hyp Gly)2(配列番号：５)、
(vi)Pro Hyp Gly-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)4-Pro Hyp Gly (配列番号：６)
（2-1）前記アミノ酸配列（i）〜（vi）において１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、
若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、抗菌活性を有するペプチドならびにその塩。
【請求項４】
前記アミノ酸配列のアミノ末端の水素がアセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、１〜３残基のペプチドで置換された、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドならびにその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
前記アミノ酸配列のカルボキシ末端のカルボキシル基がアミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基、１〜３残基のペプチドで置換された、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドならびにその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
コラーゲン様の三重らせん構造を含む請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドならびにその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩を有効成分とする抗菌剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩、及び薬学的に許容される担体又は基材を含む、医薬製剤。
【請求項９】
細菌感染症又は敗血症の予防又は治療用である請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩が薬学的に許容される基材に担持されてなる医療用基材。  
【請求項１１】
前記薬学的に許容される基材が、アルギン酸ゲル、コラーゲンゲル、乳酸ポリマー及びセルロースからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１０に記載の医療用基材。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩を含有する化粧料。  
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩の有効量を、細菌感染症又は敗血症に罹患した患者に投与することを特徴とする、細菌感染症又は敗血症の治療方法。
【請求項１４】
請求項１０又は１１に記載の医療用基材を患部に適用することを特徴とする、細菌感染症の予防又は治療方法。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩の、抗菌剤を製造するための使用。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩の、細菌感染症又は敗血症の予防又は治療用の医薬製剤を製造するための使用。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩の、細菌感染予防又は治療用医療基材の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗菌活性を有する新規なペプチドならびにその生理学的に許容される塩に関する。さらに詳しくは、本発明は細菌類には毒性を示すが哺乳類細胞には毒性を示さず、細菌感染症の治療に有用なペプチドならびにその薬学的に許容される塩に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗生物質は細菌感染症の治療に主要な役割を果たしているが、ほとんどの場合耐性菌の出現によりその効力が失われる。そこで、抗生物質とは作用機序の異なる抗菌剤が求められている。そのような抗菌剤として、抗菌性ペプチドが挙げられる。特に、膜作動性の抗菌性ペプチドは、微生物の細胞膜・外膜に作用し、そのバリアー能を破壊することで殺菌作用を示すが、原理的に耐性菌が出現し難いことが特徴である。【０００３】
この様な抗菌性ペプチドは天然にも数多く存在し、例えば、蜂の産生するMelittinが挙げられる。しかしながら、Meilittinは、細菌膜と同時に哺乳類細胞にも作用する。一方、アフリカツメガエルが分泌するMagainin 2は、細菌膜を選択的に破壊し、先天的な生体防御作用を担うと考えられている（例えば、非特許文献１）。MelittinやMagainin 2は、Lys残基やArg残基を含む塩基性ペプチドであり、α-ヘリックスを形成して、抗菌作用を示すことが報告されている。さらに、同様の作用を示す抗菌性ペプチドとして、カイコ由来のCecropin A、ヒト、昆虫、植物由来のDefensin等があり、静電相互作用と疎水性相互作用が細菌膜選択性に重要であることが報告されている（非特許文献２）。また、例えば、特許文献１には、抗菌剤、抗菌性医薬、点眼薬の用途に使用できるヒト角膜および結膜分泌アポ蛋白質由来の抗菌性ペプチド、これをコードするポリヌクレオチドが開示されている。【０００４】
人工的に製造された抗菌性ぺプチドとしては、例えば、特許文献２には、CAP11をベースにした新規なペプチド、これを有効成分とする抗菌剤、ならびに細胞に対するLPSの結合阻害剤、細菌感染治療剤やエンドトキシンショック抑制剤等の医薬が報告されている。特許文献３には、親水性アミノ酸残基の繰返し−疎水性アミノ酸部−塩基性アミノ酸部−ブリッジ部−塩基性アミノ酸部−疎水性アミノ酸部で表される抗菌性ペプチドが報告されている。特許文献４には、ペプチドの末端ではない２ヶ所に塩基性アミノ酸残基が２個以上連続している部位を含む、アミノ酸残基が７〜３０個の抗菌性ペプチドが報告されている。特許文献５には、リゾチームをトリプシンで分解して得られる平均分子量が２〜６ｋＤａの範囲にあるペプチド類を有効成分とする抗菌性ペプチド組成物が報告されている。特許文献６には、ウシラクトフェリンの加水分解物から分画された抗菌性ペプチドが報告されている。ヒト由来のものとしては、ヒト由来のタンパク質の中に存在する抗菌活性を有するタンパク質またはペプチドが知られている（例えば特許文献７を参照）。また、特許文献８には、ヒト由来で、LPS結合活性、抗菌活性およびLPS中和活性が非常に高いペプチドが報告されている。【０００５】
これらの抗菌性ペプチドは、細菌膜と結合し、α-ヘリックスを形成したペプチドが細菌膜内でチャンネル様の構造をとって膜に細孔を形成することが提案されているが、α-ヘリックスを形成するペプチドは一般に熱や塩濃度などの外的環境に影響されやすく不安定であるという問題点があった。【０００６】
一方、本発明者らはコラーゲンのアミノ酸配列に基づいて、安定な三重らせん構造を形成するペプチドを報告している（例えば、非特許文献３、特許文献９）。本発明者らは、この様な知見をもとに、安定性の高い抗菌性ペプチドを作製できると考えた。
【特許文献１】特開2005-318829
【特許文献２】特開2006-45214
【特許文献３】特開2005-120050
【特許文献４】特開2004-175727
【特許文献５】特開2003-267805
【特許文献６】特開2000-319300
【特許文献７】特開2000-217579
【特許文献８】特開平11-335396
【特許文献９】特開2003-321500
【非特許文献１】薬学雑誌、Vol.117(5),253-264、1997
【非特許文献２】Nature, 415, 389-395, 2002
【非特許文献３】Biopolymers, 79(3),163-172,2005
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかるに本発明は、安定性が高く、優れた抗菌活性を有する新規なペプチドならびにその生理学的に許容される塩を提供すること、さらには、細菌感染症などの治療に有用なペプチド並びにその薬学的に許容される塩を提供することを主な目的とする。さらに、本発明は、当該ペプチド又はその塩を利用した、抗菌剤、医薬製剤、医療用基材、化粧料、細菌感染粧又は敗血症の予防又は治療方法をも提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、鋭意検討を行ったところ、上記課題を解決し得る特定のアミノ酸配列を有するペプチドを見出した。すなわち、下記一般式(I)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドであれば、安定なコラーゲン様の三重らせん構造を形成することができ、熱や塩濃度等の影響を受けにくく、優れた抗菌活性が発揮され得ることを見出した。本発明は、このような知見に基づいてさらに研究を重ねた結果得られたものである。【０００９】
本発明は、以下の抗菌活性を有するペプチド又はその塩、これらを有効成分とする抗菌剤、医薬製剤、医療用基材、化粧料、細菌感染症又は敗血症の予防又は治療方法を提供するものである。
項１．以下の（１）又は（２）で表されるペプチド又はその塩；
（１）下記一般式（I）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(Pro Hyp Gly)n-｛(Lys X Gly)m-(Pro Hyp Gly)l-(Lys X Gly)p｝α-(Pro Hyp Gly)r （I）
（ここで、式（I）中、ｎは１〜６の整数であり、ｍは１〜４の整数であり、ｌは０〜７の整数であり、ｐは１〜４の整数であり、ｒは１〜６の整数であり、αは１〜６の整数である。
Ｘは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＨｙｐから選択されるいずれかのアミノ酸残基であり、
ｍ＋ｐ個のＸは、それぞれ同一又は異なっていてもよい。
ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ＋ｒ＝４〜１５である。
但し、ｌ＝０の時、ｍ＋ｐ≧２を満たし、
α≧２のときｍ＝１、ｌ＝０、ｐ＝１を満たす。）
（２）一般式（I）で表されるアミノ酸配列において、Lys、Gly及びX以外の１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ抗菌活性を有するペプチド。
項２．前記（１）において、ｎは３〜６の整数であり、ｍは１〜４の整数であり、ｌは０〜７の整数であり、ｐは１〜４の整数であり、ｒは３〜６の整数であり、αは１であり、
ＸはＩｌｅ又はＬｅｕであり、
ｍ＋ｐ個のＸは、それぞれ同一又は異なっていてもよく、
ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ＋ｒ＝８〜１５であり、
ｌ＝０の時、ｍ＋ｐ≧２を満たす、項１に記載のペプチド又はその塩。
項３．下記（1-1）又は（2-1）で表される項１に記載のペプチド又はその塩：
（1-1）以下の（i）〜（vi）のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（i）(Pro Hyp Gly)3 -(Lys Ile Gly)3 -(Pro Hyp Gly)4(配列番号：１)
（ii）(Pro Hyp Gly)3 -Lys Ile Gly Pro Hyp Gly Lys Ile Gly-(Pro Hyp Gly)4(配列番号：２)
（iii）(Pro Hyp Gly)4 -(Lys Ile Gly)2 -(Pro Hyp Gly)4(配列番号：３)
(iv)(Pro Hyp Gly)3-(Lys Hyp Gly Lys Leu Gly)2-(Pro Hyp Gly)3 (配列番号：４)、
(v)(Pro Hyp Gly)2-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)3-(Pro Hyp Gly)2(配列番号：５)、
(vi)Pro Hyp Gly-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)4-Pro Hyp Gly (配列番号：６)
（2-1）前記アミノ酸配列（i）〜（vi）において１〜３個のアミノ酸が置換、欠失、
若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、抗菌活性を有するペプチドならびにその塩。
項４．前記アミノ酸配列のアミノ末端の水素がアセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、１〜３残基のペプチドで置換された、項１〜４のいずれかに記載のペプチドならびにその薬学的に許容される塩。
項５．前記アミノ酸配列のカルボキシ末端のカルボキシル基がアミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基、１〜３残基のペプチドで置換された、項１〜４のいずれかに記載のペプチドならびにその薬学的に許容される塩。
項６．コラーゲン様の三重らせん構造を含む項１〜５のいずれかに記載のペプチドならびにその薬学的に許容される塩。
項７．項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩を有効成分とする抗菌剤。
項８．項１〜７のいずれかに記載のペプチド又はその塩、及び薬学的に許容される担体又は基材を含む、医薬製剤。
項９．細菌感染症又は敗血症の予防又は治療用である項８に記載の医薬製剤。
項１０．項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩が薬学的に許容される基材に担持されてなる医療用基材。  
項１１．前記薬学的に許容される基材が、アルギン酸ゲル、コラーゲンゲル、乳酸ポリマー及びセルロースからなる群より選択される少なくとも一種である、項１０に記載の医療用基材。
項１２．請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩を含有する化粧料。  
項１３．項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩の有効量を、細菌感染症又は敗血症に罹患した患者に投与することを特徴とする、細菌感染症又は敗血症の治療方法。
項１４．項１０又は１１に記載の医療用基材を患部に適用することを特徴とする、細菌感染症の予防又は治療方法。
項１５．項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩の、抗菌剤を製造するための使用。
項１６．項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩の、細菌感染症又は敗血症の予防又は治療用の医薬製剤を製造するための使用。
項１７．項１〜６のいずれかに記載のペプチド又はその塩の、細菌感染予防又は治療用医療基材の製造のための使用。
項１８．
細菌感染症又は敗血症の治療用である、以下の（１）又は（２）で表されるペプチド又はその塩；
以下の（１）又は（２）で表されるペプチド又はその塩；
（１）下記一般式（I）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(Pro Hyp Gly)n-｛(Lys X Gly)m-(Pro Hyp Gly)l-(Lys X Gly)p｝α-(Pro Hyp Gly)r    （I）
（ここで、式（I）中、ｎは１〜６の整数であり、ｍは１〜４の整数であり、ｌは０〜７の整数であり、ｐは１〜４の整数であり、ｒは１〜６の整数であり、αは１〜６の整数である。
Ｘは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＨｙｐから選択されるいずれかのアミノ酸残基であり、
ｍ＋ｐ個のＸは、それぞれ同一又は異なっていてもよい。
ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ＋ｒ＝４〜１５である。
但し、ｌ＝０の時、ｍ＋ｐ≧２を満たし、
α≧２のときｍ＝１、ｌ＝０、ｐ＝１を満たす。）
（２）一般式（I）で表されるアミノ酸配列において、Lys、Gly及びX以外の１〜３個のアミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ抗菌活性を有するペプチド。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のペプチドによれば、安定な三重らせん構造を形成する抗菌性ペプチドを提供することができる。また、本発明のペプチドは、熱、塩濃度等の外的要因の影響を受けにくく、安定して優れた抗菌活性を発揮することができることから、医薬製剤として調製し、細菌感染症、敗血症等の予防又は治療に好適に使用することができる。【００１１】
さらに、本発明のポリペプチドを医療用基材に結合させて使用することもできる。例えば、人工コラーゲンゲル等に本発明のペプチドを結合させ、これを原料として製造された人工皮膚は、移植部分の細菌感染を予防することができる。【００１２】
加えて、本発明のペプチドは、ヒトに対して低刺激性であり、安定した抗菌性を保持し得ることから、化粧料に抗菌剤（又は防腐剤）として配合することもできる。化粧料に配合される従来の抗菌剤や防腐剤には、臭いの気になるものもあった。しかしながら、本発明のポリペプチドは臭い等の問題もなく、化粧料に配合される抗菌剤として好適に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１〜６、ならびに比較例１〜３のペプチドの抗菌性評価の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明においては各種アミノ酸残基を次の略号で記述する。【００１５】
Ala ：Ｌ−アラニン残基
Arg ：Ｌ−アルギニン残基
Asn ：Ｌ−アスパラギン残基
Asp ：Ｌ−アスパラギン酸残基
Cys ：Ｌ−システイン残基
Gln ：Ｌ−グルタミン残基
Glu ：Ｌ−グルタミン酸残基
Gly ：グリシン残基
His ：Ｌ−ヒスチジン残基
Hyp ：Ｌ−ヒドロキシプロリン残基
Ile ：Ｌ−イソロイシン残基
Leu ：Ｌ−ロイシン残基
Lys ：Ｌ−リジン残基
Met ：Ｌ−メチオニン残基
Phe ：Ｌ−フェニルアラニン残基
Pro ：Ｌ−プロリン残基
Ser ：Ｌ−セリン残基
Thr ：Ｌ−トレオニン残基
Trp ：Ｌ−トリプトファン残基
Tyr ：Ｌ−チロシン残基
Val ：Ｌ−バリン残基
また、本明細書においては、常法に従ってペプチドのアミノ酸配列を、そのＮ末端のアミノ酸残基が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸残基が右側に位置するように記述する。【００１６】
［抗菌活性を有するペプチド及びその塩］
本発明の抗菌活性を有するペプチドとしては、以下の（１）又は（２）で表されるペプチドが挙げられる。
（１）下記一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(Pro Hyp Gly)n-｛(Lys X Gly)m-(Pro Hyp Gly)l-(Lys X Gly)p｝α-(Pro Hyp Gly)r    （I）
式（Ｉ）中、例えば(Lys X Gly)mは、構成単位(Lys X Gly)がｍ個連結していることを
示すものである。【００１７】
ここで、式（Ｉ）中、ｎ、ｍ、ｌ、ｐ、ｒ、α及びＸは、以下の通りである。
ｎは１〜６の整数、好ましくは１〜５の整数、より好ましくは１〜４の整数である。
ｍは１〜４の整数、好ましくは１〜３の整数、より好ましくは１〜２の整数である。
ｌは０〜７の整数、好ましくは０〜５の整数、より好ましくは０〜３の整数である。
ｐは１〜４の整数、好ましくは１〜３の整数、より好ましくは１〜２の整数である。
ｒは１〜６の整数、好ましくは１〜５の整数、より好ましくは１〜４の整数である。
αは１〜６の整数、好ましくは１〜５の整数、より好ましくは１〜４の整数である。【００１８】
Ｘは、同一又は異なって、Ile、Leu及びHypから選択されるいずれか少なくとも1種である。【００１９】
また、一般式（I）に含まれるｍ＋ｐ個のＸは、それぞれ同一又は異なっていてもよい。すなわち、ｍ及びｐがそれぞれ２以上である場合、（Lys X Gly）の繰り返し単位のなかでＸが同一又は異なっていてもよい。具体的には、(Lys X Gly)mで示される構成単位が、繰り返し単位(Lys Ile Gly)のみによって構成されるアミノ酸配列、繰り返し単位(Lys Lue Gly)のみによって構成されるアミノ酸配列、繰り返し単位(Lys Hyp Gly)のみによって構成されるアミノ酸配列、又はこれらの繰り返し単位を任意の順で組み合わせたアミノ酸配列によって構成されるアミノ酸配列であることを示す。本発明の一般式（Ｉ）において、ＸはIle又はHypであることが好ましい。【００２０】
上記一般式（I）において、ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ＋ｒ＝４〜１５、好ましくは４〜１３、より好ましくは４〜１２である。但し、ｌ＝０の時、ｍ＋ｐ≧２を満たし、α≧２のときは、ｍ＝１、ｌ＝０、且つｎ＝１を満たす。【００２１】
さらに、上記一般式（I）によって提供されるペプチドのアミノ酸配列は、抗菌活性の観点から、以下の態様が好ましい例として挙げられる。【００２２】
ｌが０のとき、ｎは１〜６；ｍは１〜４、好ましくは１〜３；ｐは１〜４、好ましくは１〜３；ｒは１〜６；α＝１である。【００２３】
ｌが１のとき、ｎは１〜６；ｍは１〜４、好ましくは１〜３；ｐは１〜４、好ましくは１〜３；ｒは１〜６；α＝１である。【００２４】
ｌが２のとき、ｎは１〜６；ｍは１〜４、好ましくは１〜３；ｐは１〜４、好ましくは１〜３；ｒは１〜６；α＝１である。【００２５】
ｌが３のとき、ｎは１〜６；ｍは１〜４、好ましくは１〜３；ｐは１〜４、好ましくは１〜３；ｒは１〜６；α＝１である。【００２６】
また、α≧２のとき、ｌは０；ｎは１〜６、好ましくは１〜４；ｍは１；ｐは１；ｒは１〜６、好ましくは１〜４である。【００２７】
また、ｌが０のとき、ｎは３〜６；ｍは１〜４；ｌは０〜７；ｐは１〜４；ｒは３〜６；α＝１であり；ＸはＩｌｅ又はＬｅｕであり；ｍ＋ｐ個のＸは、それぞれ同一又は異なっていてもよく；ｎ＋ｍ＋ｌ＋ｐ＋ｒ＝８〜１５であり；ｍ＋ｐ≧２を満たす。【００２８】
上記一般式(I)で表されるペプチドを構成するアミノ酸数は、本発明の効果を奏する限り特に限定されないが、通常１２〜６０、好ましくは１５〜４０、より好ましくは２０〜３５である。【００２９】
さらに、上記一般式（I）で表されるペプチドとしては、具体的には、例えば下記（i）〜（vi）（配列番号１〜６）で表されるアミノ酸配列を有するものが挙げられる。
(i)(Pro Hyp Gly)3 -(Lys Ile Gly)3 -(Pro Hyp Gly)4(配列番号：１)
(ii)(Pro Hyp Gly)3 -Lys Ile Gly Pro Hyp Gly Lys Ile Gly-(Pro Hyp Gly)4(配列番号：２)
(iii)(Pro Hyp Gly)4 -(Lys Ile Gly)2 -(Pro Hyp Gly)4(配列番号：３)
(iv)(Pro Hyp Gly)3-(Lys Hyp Gly Lys Leu Gly)2-(Pro Hyp Gly)3(配列番号：４)
(v)(Pro Hyp Gly)2-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)3-(Pro Hyp Gly)2(配列番号：５)
(vi)Pro Hyp Gly-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)4-Pro Hyp Gly (配列番号：６)
（２）本発明には、さらに、一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列において、１又は数個の任意のアミノ酸残基が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ抗菌活性を有するペプチドも含まれる。【００３０】
上記（２）のペプチドにおいて、置換、欠失若しくは付加されるアミノ酸残基の数については、改変されたペプチドが抗菌活性を有している限り特に限定されない。【００３１】
例えば、アミノ酸残基の付加の場合であれば、当該付加されるアミノ酸残基の数としては、１〜３個、好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個である。【００３２】
また、アミノ酸残基の欠失の場合であれば、当該欠失されるアミノ酸残基の数としては、１〜３個、好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個である。【００３３】
さらに、アミノ酸残基の置換の場合であれば、当該置換されるアミノ酸残基の数としては、１〜３個、好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個である。【００３４】
また、上記（２）のペプチドにおいて、置換、欠失若しくは付加されるアミノ酸残基の位置は、改変されたペプチドが抗菌活性を有している限り、特に限定されない。ただし、アミノ酸の置換、欠失若しくは付加を行う場合は、前記一般式（Ｉ）においてLys、Gly及びX以外のアミノ酸残基について行うことが好ましい。【００３５】
更に、上記（２）のペプチドにおいて、置換若しくは付加されるアミノ酸の種類については、改変されたペプチドが抗菌活性を有することを限度として、特に制限されない。付加されるアミノ酸の種類については、改変されたペプチドが抗菌活性を有している限りにおいて、天然アミノ酸、非天然アミノ酸の別を問わず、任意のアミノ酸を選択することができる。但し、置換については、各アミノ酸残基は側鎖官能基の性質に基づく相同性置換であることが望ましい。アミノ酸の置換の場合、例えば、ProはHypに、LeuはIle又はValにそれぞれ置換可能であり、その逆の置換も可能である。【００３６】
本発明のペプチドは、アミノ末端の水素がアセチル基、メトキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基、１〜３残基のペプチド等で置換されたものでも良い。また、C末端のカルボキシル基がアミド基、メチルエステル基、ブチルエステル基、１〜３残基のペプチド等で置換されたものでも良い。ここで、カルボキシル基が前記置換基で置換されている場合とは、それぞれ、カルボキシル基の-OHが、アミノ基、メトキシ基、ブトキシ基で置換されていることを指す。また、カルボキシル基がペプチドで置換されている場合とは、カルボキシル基と結合されるペプチド間で脱水縮合がおこり、ペプチド結合を形成することを指す。【００３７】
上記（１）又は（２）に示される本発明のペプチドは、薬学的に許容される塩を形成していても良く、その塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマール酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。【００３８】
このような本発明のペプチドは、コラーゲン様三重らせん構造を有することを１つの特徴とするものである。コラーゲン様三重らせん構造とは、コラーゲン分子に見られる特徴的な構造であり、ロープ状の超らせん構造を示す。コラーゲンには、プロリン、ヒドロキシプロリンとグリシンが特に多く含まれ、グリシンは３残基ごとに存在する。このような特徴が安定な三重らせん構造の形成に重要であるとされている。本発明においては、この様な構造が本発明のペプチドの安定性を高める役割があると考えられる。【００３９】
本発明のペプチドは、通常のペプチド合成方法によって得ることができ、例えば固相合成法または液相合成法によって調製されるが、固相合成法が操作上簡便である。固相合成法は、例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座２  タンパク質の化学(下)」(昭和６２年５月２０日  株式会社東京化学同人発行)、第６４１−６９４頁に記載の方法を参考に実施することができる。【００４０】
本発明のペプチドの固相合成法による調製は、例えば、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの反応溶媒に不溶性である重合体に目的とするペプチドのＣ末端に対応するアミノ酸をそれが有するα−ＣＯＯＨ基を介して結合させ、次いで該アミノ酸に目的とするペプチドのＮ末端の方向に向かって、対応するアミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸またはペプチド断片が有するα−ＣＯＯＨ基以外のα−アミノ基などの官能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と、該結合したアミノ酸またはペプチド断片におけるα−アミノ基などのペプチド結合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作とを順次繰り返すことによってペプチド鎖を伸長させ、目的とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成し、次いで該ペプチド鎖を重合体から脱離させ、かつ保護されている官能基から保護基を除去することにより目的とするペプチドを得、次いでこれを精製することによって実施される。【００４１】
ここで、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保護基の除去は、トリフルオロ酢酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制する観点から好ましい。また、得られたペプチドの精製は逆相液体クロマトグラフィ−やゲルパーミエイションクロマトグラフィーで行うのが効果的である。【００４２】
また、本発明のペプチドの塩は、通常の塩生成反応を利用することにより調製される。【００４３】
上記（１）又は（２）で表されるペプチドは、優れた抗菌活性を有する。本発明において抗菌活性を有するペプチドとは、細菌および／または真菌に対する制菌作用又は殺菌作用を有するペプチドであることを意味する。本発明のペプチド（又はその塩）の抗菌活性の測定は、通常以下の方法により行われる。DPPG(dipalmitoylphosphatidylglycerol)を主構成脂質とするリポソームからの内包する蛍光色素（carboxyfluorescein）の漏出量（Biochim Biophys Acta, 1070, 259-264, 1991）を測定して行われる。具体的な測定方法の例として、以下の方法が挙げられる。【００４４】
＜細菌膜モデルリポソームの作製＞
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG：シグマP9789）0.7 mgを含む塩化
メチレン／メタノール混合溶液を褐色ガラスバイアルに入れ、窒素ガスを吹き込むことにより、バイアルの内壁に脂質膜を形成させる。カルボキシフルオレセイン（CF：シグマC7153）を20 mMの濃度で含む、1 mM EDTA/TBS溶液1 mLをガラスバイアルに加え、ボルテクスミキサーで脂質膜がバイアルの内壁から剥離するまで良く攪拌する。次に、60℃で20分間超音波処理を行った。さらに、PD10カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）で3-5 mLの分画を分取して、リポソーム溶液とする。【００４５】
＜哺乳類膜モデルリポソームの作製＞
超音波処理を室温で行う以外は上記と同様の操作で、ホスファチジルコリン（PC：シグマP2772 Type XI-E）からなるリポソームを得る。【００４６】
＜抗菌性評価＞
得られたDPPGリポソーム、PCリポソームのそれぞれをPBSで10倍希釈した溶液200 μLに対して、抗菌活性を評価する対象となるペプチドを最終濃度が0.25〜0.005 mMに成るように加え、１５分間室温で静置する。その後、12,000 rpmで5分間遠心して得られた上清中のCFの量を、励起波長485 nm、蛍光波長535 nmで測定する。ペプチド溶液の代わりにPBSを加えた場合の蛍光を0％、最終濃度0.1%のTriton X-100を加えた場合の蛍光を100％として、各ペプチドによるCF漏出量を計算する。【００４７】
上記試験においてPBSを加えた場合の蛍光を0％、最終濃度0.1%のTriton X-100を加えた場合の蛍光を100％とした場合に、CF漏出による蛍光が３％以上、好ましくは５％以上、より好ましくは10％以上のものを、本発明において抗菌活性を有するペプチドという。【００４８】
また、黄色ブドウ球菌などに対する抗菌活性（参考文献：Nature, 443, 867-869, 2006）の測定方法に基づいて抗菌活性を評価することも可能である。上記リポソームからの蛍光色素（carboxyfluorescein）の漏出量による測定方法と、黄色ブドウ球菌などに対する抗菌活性の測定方法の少なくともいずれか一方、好ましくは両方によって抗菌活性が確認されたものを本発明のペプチドとする。【００４９】
本発明の限定的な解釈を望むものではないが、本発明のペプチド（又はその塩）は、細菌の膜の構造に選択的に作用し、細菌の膜構造を破壊することによって抗菌活性を発揮するものであると考えられることから、幅広い種の細菌に対して有効に作用することができるものである。本発明のペプチドが優れた抗菌作用を示す細菌としては、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌等、特に限定されず、例えば、黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、緑膿菌、大腸菌等に対して優れた抗菌作用を発揮するものである。【００５０】
さらに、本発明のペプチド又はその塩は、上記一般細菌のみならず、真菌に対しても有効に作用し得るものである。【００５１】
このように、本発明のポリペプチド又はその塩は、幅広い細菌及び真菌に対して優れた抗菌活性を有することから、当該ペプチド又は塩を１種単独又は２種以上を組み合わせて、抗菌剤又は抗真菌剤として使用することができる。また、本発明のポリペプチド又はその塩の抗菌作用（抗菌活性）に基づいて、医薬製剤として感染症の予防等を目的として使用することもできる。さらには、本発明のペプチド又はその塩を、防腐等を目的として医薬製剤、医療用基材、化粧料、食品、医薬部外品等の添加対象物に配合して使用することもできる。以下、それぞれの使用形態に応じて詳述する。【００５２】
［感染症の予防等を目的とする使用形態］
本発明のペプチド又はその塩は、上記抗菌活性に基づいて、医薬分野において有用な効果を奏し得る。本発明のペプチド又はその塩は、黄色ブドウ球菌、緑膿菌等の細菌及び真菌に対して優れた抗菌活性を有することから、本発明のペプチド又はその塩と薬学的に許容される基材又は担体と混合し、医薬製剤として調製し、使用することができる。医薬製剤として本発明のペプチド又はその塩を使用する場合、当該ペプチド又は塩を１種単独又は２種以上を組み合わせて使用することもできる。【００５３】
当該医薬製剤は、上記抗菌活性に基づく使用用途、即ち、感染症、敗血症等の予防又は治療に有用である。また、本発明のペプチド又はその塩は、真菌に対しても優れた抗菌活性を有することから、抗真菌剤として白癬（足白癬（いわゆる水虫）、爪白癬、手白癬等）、カンジダ症等の治療を目的する医薬製剤の形態に調製して使用することもできる。【００５４】
当該医薬製剤に使用される基材又は担体については、薬学的に許容されることを限度として特に制限されず、医薬の製剤化のために配合されている成分を広く使用することができる。また、当該医薬製剤には、上記成分の他に、添加剤や薬理活性成分を含んでいても良い。【００５５】
当該医薬製剤の剤型としては、適用形態に応じて適宜設定されるが、一例として、錠剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形製剤；及び液剤、乳剤、懸濁剤等の液状製剤；軟膏、クリーム等の半固形製剤が挙げられる。また、当該医薬製剤は、本発明のペプチド又はその塩をリポソ−ム化して製剤化したものであってもよい。【００５６】
当該医薬製剤の投与形態については、例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、経口投与等の全身的投与；関節内投与等の局所投与等が挙げられ、用途や剤型等に応じて適宜設定することができる。また、疾患部位に塗布や散布により本発明のペプチドを、外用剤として直接投与する経皮投与の形態なども挙げられる。【００５７】
また、全身に投与する場合にはペプチドを５％ブドウ糖液や生理食塩水などの薬学的に許容し得る溶液に溶解させて得られる溶液が好ましい。該溶液は薬理学的に許容される種々の添加剤を含んでいてもよい。さらにペプチド類をカプセル化またはリポソ−ム化することも可能である。局所投与する場合にも、５％ブドウ糖液や生理食塩水などの溶液や通常用いられる軟膏基剤やクリーム基材に混合することもできる。【００５８】
本発明の医薬製剤を、例えば静注する場合の投与量は、患者の性別や年齢、症状、投与形態、期待される効果等に基づいて、適宜設定することができる。当該医薬製剤の１日当たりの投与量の一例として、本発明のペプチド又はその塩の投与量に換算して、通常０．１μｇ／ｋｇ〜３ｇ／ｋｇ(成人)であり、好ましくは１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ(成人)、より好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ(成人)が挙げられる。【００５９】
また、本発明の医薬製剤を外用剤の形態で用いる場合は、患部の大きさや症状に応じて適量を塗布すればよいが、例えば、１〜１０ｃｍ２の患部にペプチドに換算して０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは０．１μｇ〜１０ｍｇとなるように適用すればよい。【００６０】
加えて、本発明は、上記ペプチド又はその塩の有効量を患者に投与することを特徴とする、細菌感染症、敗血症、白癬（足白癬（いわゆる水虫）、爪白癬、手白癬等）、カンジダ症等の予防又は治療方法をも提供し得るものである。当該治療方法における本発明のペプチド又はその塩の有効量及び投与方法は、上記投与量、投与方法に基づいて適宜設定することができる。【００６１】
さらに、本発明は、本発明のペプチド又はその塩を、薬学的に許容される基材に担持させた医療用基材をも提供し得る。本発明に使用され得る基材としては、例えばアルギン酸ゲル、コラーゲンゲル、乳酸ポリマー、セルロースなどの生分解性基材が好ましい。このような基材に、本発明のペプチド又はその塩を物理的または化学的に結合させることによって担持させることができる。ここで、コラーゲンゲルとしては、人工的に製造されたものであってもよく、ウシ、ブタ等の動物から得られる天然由来のものであってもよいが、動物由来の病原体感染を防止する意味で、人工コラーゲンを用いることが好ましい。【００６２】
また、本発明のポリペプチド又はその塩を、生分解性基材と混合し、医療用基材を形成することもできる。例えば、人工コラーゲンゲルに本発明のペプチドを結合させ、人工皮膚の材料として使用することもできる。【００６３】
本発明は、このような医療用基材を、患部に適用することを特徴とする細菌感染症の予防又は治療方法をも提供するものである。例えば、本発明のペプチド又はその塩が担持された（又は混合された）人工皮膚を用いて創面や、分層皮膚移植、全層皮膚移植等による移植部分を覆い、細菌感染を予防することができる。当該医療用基材を用いた細菌感染症の予防又は治療方法においては、医療用基材の形態に応じて適宜適用方法を選択することができる。【００６４】
医療用基材に担持又は混合される本発明のペプチド又はその塩の使用量は、上記抗菌活性に基づいて適宜設定することができ、特に限定されないが、例えば医療用基材の乾燥重量あたり０．０１〜１０重量％、好ましくは０．０５〜５重量％程度、より好ましくは０．１〜２重量％である。
［防腐を目的として添加対象物に配合する使用形態］
本発明のペプチド又はその塩は、幅広い抗菌活性を有することから、防腐を目的として医薬製剤、化粧料、医療用基材、食品、医薬部外品等の添加対象物に配合することができる。【００６５】
前記添加対象物が医薬製剤である場合、本発明のペプチド又はその塩が添加される製剤の形態は特に限定されないが、例えば、固形製剤、液状製剤、半固形製剤が挙げられる。【００６６】
また、前記添加対象物が化粧料である場合、その化粧料の形態は、特に制限されないが、例えば、クレンジング剤、皮膚洗浄料、マッサージ剤、軟膏、クリーム、ローション、オイル、パック、洗顔料、化粧水、乳液、ゼリー等が挙げられる。【００６７】
従来、抗菌剤や防腐剤としてパラベン等が汎用されてきたが、使用の際に臭いが気になる等の問題があった。本発明のペプチドを抗菌剤（又は防腐剤）として配合した場合は、この様な臭いもない。また、本発明のペプチドは、熱、塩濃度等の影響を受けにくく、化粧料中においても長期間にわたって安定した抗菌活性を保持することができる。従って、本発明のペプチド又はその塩を従来の抗菌剤や防腐剤に代えて使用することができる。【００６８】
さらに、前記添加対象物が医療用基材である場合、本発明のペプチド又はその塩を、アルギン酸ゲル、人工コラーゲンゲル、乳酸ポリマー、セルロースなどの生分解性基材に結合させるか、これらの生分解性基材に混合して用いることができる。【００６９】
本発明のペプチド又はその塩を、防腐等を目的として上記添加対象物に配合する場合の配合量としては、ペプチドに換算して、添加対象物中0.01〜10重量％、好ましくは0.05〜5重量％、より好ましくは0.1〜2重量％が挙げられる。このとき本発明のペプチド又はその塩を、１種単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。本発明のペプチド又はその塩を従来公知の方法に従って、上記添加対象物に配合することができる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］
(Pro Hyp Gly)3 -(Lys Ile Gly)3 -(Pro Hyp Gly)4(配列番号：１)で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを、ペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。すなわち、４−(Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン)−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65 mmol/g（樹脂）の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕０．１ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。【００７１】
結合反応において、アミノ酸として、アプライド・バイオシステムズ社（米国）製のＮα−９−  （フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−プロリン〔Fmocプロリン〕、Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｎε−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン〔Ｆｍｏｃリジン〕、Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｌ−イソロイシン〔Ｆｍｏｃイソロイシン〕、Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−グリシン〔Ｆｍｏｃグリシン〕、ＢＡＣＨＥＭ社（ドイツ）製Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−Ｏ−ブトキシカルボニル−Ｌ−ヒドロキシプロリン〔Fmocヒドロキシプロリン〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。【００７２】
得られたペプチド樹脂を、5％の水を含むトリフルオロ酢酸10 mlで3時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物をPD10カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをHPLC〔GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製AKTA explorer10XTシステム、カラム：ミリポアウオーターズ株式会社製ノバパックC18 3.9 mmφ×150 mm、移動相：トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒（アセトニトリル濃度を３０分間で５容量%から５０容量%に直線的に変化させた）、流速1.0 ml/min〕に付したところ、12.96 minに単一のピ−クが示された。【００７３】
得られたペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（GPC;GEヘルスケアバイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Supedex peptide 10/30GL、流速：0.5 mL/min、溶離液：150 mMのNaClを含む10mM phosphate buffer(pH7.4)）に供したところ、溶出体積10.18 mLに主ピークと9 mL付近に副ピークが認められた。また、得られたペプチドの円二色性スペクトル（CD）を測定したところ、223 nmに正のコットン効果、199 nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を含むことが確認された。【００７４】
［実施例２及び３］
(Pro Hyp Gly)3 -Lys Ile Gly Pro Hyp Gly Lys Ile Gly-(Pro Hyp Gly)4(配列番号：２)で示されるアミノ酸配列をからなるペプチド（実施例２）、(Pro Hyp Gly)4 -(Lys Ile Gly)2-(Pro Hyp Gly)4(配列番号：３)で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（実施例３）を、ペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。【００７５】
すなわち、実施例２では、４−（Ｎα−９−（フルオレニルメトキシカルボニル）−グリシン）−オキシメチル−フェノキシ−メチル基を0.65 mmol/g（樹脂）の割合で含むス
チレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、ＨＭＰグリシン〕の代わりに、４−（２’、４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル）−アミノメチル）−フェノキシアセトアミド−エチル基を0.62 mmol/g（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、Fmocアミドレジン〕を用いる以外は実施例１と同様にして合成、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離、精製を行った。実施例３についても実施例１と同様の方法に従ってペプチドを調製した。【００７６】
HPLCにおいて、実施例２では11.73 minに単一のピ−クが示された。また、実施例
３では12.19 minに単一のピ−クが示された。【００７７】
GPCにおいて、実施例２では10.22 mLに主ピークと8.81 mLに副ピークが認められた。また、実施例３では10.16 mLに主ピークと8.74 mLに副ピークが認められた。【００７８】
CDにおいて、実施例２では225 nmに正のコットン効果、199 nmに負のコットン効果が観測された。実施例３では225 nmに正のコットン効果、199 nmに負のコットン効果が観測された。この結果より、実施例２及び３のペプチドが、３重らせん構造を含むことが確認された。【００７９】
［比較例１及び２］
(Pro Hyp Gly)4 -Lys Ile Gly-(Pro Hyp Gly)5(配列番号：７)で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（比較例１）を実施例１と同様の方法で合成し、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離、精製を行った。【００８０】
得られた比較例１のペプチドは、HPLCにおいて11.03 minと11.44 minにピ−クが示された。また、GPCにおいて10.61 mLに主ピークと9.07 mLに副ピークが認められた。さらに、CDにおいて224 nmに正のコットン効果、199 nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を含むことが確認された。【００８１】
(Pro Hyp Gly)10（配列番号：８）で示されるアミノ酸配列をからなるペプチド（比較例２）を、（株）ペプチド研究所から購入した。【００８２】
GPCにおいて、8.81 mLに主ピークと10.14 mLに副ピークが認められた。CDにおいて、225 nmに正のコットン効果、197 nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を含むことが確認された。【００８３】
［試験例１］
＜細菌膜モデルリポソームの作製＞
ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（DPPG：シグマP9789）0.7 mgを含む塩化
メチレン／メタノール混合溶液を褐色ガラスバイアルに入れ、窒素ガスを吹き込むことにより、バイアルの内壁に脂質膜を形成させた。カルボキシフルオレセイン（CF：シグマC7153）を20 mMの濃度で含む、1 mM EDTA/TBS溶液1 mLをガラスバイアルに加え、ボルテクスミキサーで脂質膜がバイアルの内壁から剥離するまで良く攪拌した。次に、60℃で20分間超音波処理を行った。さらに、PD10カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）で3〜5 mL（好ましくは3〜4 mL）の分画を分取して、リポソーム溶液とした。【００８４】
＜哺乳類膜モデルリポソームの作製＞
超音波処理を室温で行う以外は上記と同様の操作で、ホスファチジルコリン（PC：シグマP2772 Type XI-E）からなるリポソームを得た。【００８５】
＜抗菌性評価＞
得られたDPPGリポソーム、PCリポソームのそれぞれをPBSで10倍希釈した溶液200 μLに対して、実施例１〜３、比較例１及び２のペプチドを最終濃度が0.25〜0.005 mMに成るように加え、１５分間室温で静置した。その後、12,000 rpmで5分間遠心して得られた上清中のCFの量を、励起波長485 nm、蛍光波長535 nmで測定した。ペプチド溶液の代わりにPBSを加えた場合の蛍光を0％、最終濃度0.1%のTriton X-100を加えた場合の蛍光を100％として、各ペプチドによるCF漏出量を計算した。【００８６】
細菌膜モデルのDPPGリポソームに対して、実施例１のペプチドは、50 μMで20 ％、実施例２のペプチドは、125 μMで11 ％、実施例３では25 μMで3 %のＣＦ漏出を示した。哺乳類細胞膜モデルのPCリポソームに対してはいずれの濃度でもCF漏出は認められず、細菌選択的な抗菌活性を発現することが示された（図１を参照）。【００８７】
これに対して、比較例１、２のペプチドでは、いずれのリポソームに対しても全ての濃度範囲で全くCF漏出は認められなかった。【００８８】
［実施例４］
(Pro Hyp Gly)3-(Lys Hyp Gly Lys Leu Gly)2-(Pro Hyp Gly)3(配列番号：４)で示されるアミノ酸配列からなり、カルボキシ末端のカルボキシル基がアミド基で置換されたペプチド、すなわち(Pro Hyp Gly)3-(Lys Hyp Gly Lys Leu Gly)2-(Pro Hyp Gly)3-NH2をペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により合成した。【００８９】
すなわち、４−(２’、４’−ジメトキシフェニル−フルオレニルメトキシカルボニル)−アミノメチル)−フェノキシアセトアミド−エチル基を０．６２ミリモル／ｇ(樹脂)の割合で含むスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成モル比：９９対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ社製、Ｆｍｏｃアミドレジン〕０．１ミリモルを用い、目的とするペプチドのカルボキシル末端からアミノ末端に向かって順次対応するアミノ酸を結合させた。結合反応において、アミノ酸として、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９− (フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−プロリン〔Ｆｍｏｃプロリン〕、Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｎε−ブトキシカルボニル−Ｌ−リジン〔Ｆｍｏｃリジン〕、Ｎα−９− (フルオレニルメトキシカルボニル)−Ｌ−ロイシン〔Ｆｍｏｃロイシン〕、Ｎα−９− (フルオレニルメトキシカルボニル)−グリシン〔Ｆｍｏｃグリシン〕、独国BACHEM社製Ｎα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−O−ブトキシカルボニル−Ｌ−ヒドロキシプロリン〔Ｆｍｏｃヒドロキシプロリン〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。【００９０】
得られたペプチド樹脂を、５％の水を含むトリフルオロ酢酸１０ｍｌで３時間処理した。得られた溶液をジエチルエーテルに加えて生じる沈殿をさらに数回ジエチルエーテルで洗浄して、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離を行った。粗生成物をＰＤ１０カラム(GEヘルスケアバイオサイエンス)で精製してペプチドを得た。得られた精製ペプチドをHPLC〔GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ１０ＸＴシステム、カラム：ミリポアウオーターズ株式会社製ノバパックＣ１８  ３．９ｍｍφ×１５０ｍｍ、移動相：トリフルオロ酢酸を０．０５容量％含有するアセトニトリルと水の混合溶媒(アセトニトリル濃度を３０分間で５容量％から５０容量％に直線的に変化させた)、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ〕に付したところ、10.7 minに単一のピ−クが示された。【００９１】
得られたペプチドをゲルパーミエーションクロマトグラフィー（GPC; GEヘルスケアバイオサイエンス（株）製、AKTApurifierシステム、カラム：Supedex peptide 10/30 GL、流速：0.5mL/min、溶離液：150mMのNaClを含む10mM phosphate buffer（pH 7.4））に供したところ、溶出体積10.1mLに主ピークと7.5mL付近に副ピークが認められた。また、得られたペプチドの円二色性スペクトル(CD)を測定したところ、223nmに正のコットン効果、200nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を含むことが確認された。【００９２】
［実施例５及び６］
(Pro Hyp Gly)2-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)3-(Pro Hyp Gly)2(配列番号：５) で示されるアミノ酸配列からなり、カルボキシ末端のカルボキシル基がアミド基で置換されたペプチド、すなわち(Pro Hyp Gly)2-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)3-(Pro Hyp Gly)2-NH2 （実施例５）、
Pro Hyp Gly-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)4-Pro Hyp Gly (配列番号：６)で示されるアミノ酸配列からなり、カルボキシ末端のカルボキシル基がアミド基で置換されたペプチド、すなわちPro Hyp Gly-(Lys Leu Gly Lys Hyp Gly)4-Pro Hyp Gly-NH2（実施例６）をペプチド自動合成装置を用いて固相合成法により実施例４と同様にして合成し、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離、精製を行った。【００９３】
HPLCにおいて、実施例５では10.2 minに単一のピ−クが、実施例６では10.1 minに単一のピ−クが示された。GPCにおいて、実施例５では10.1 mLに主ピークと7.5 mLに副ピークが、実施例６では10.1 mLに主ピークと7.5 mLに副ピークが認められた。また、CDにおいて、実施例５では222 nmに正のコットン効果、198 nmに負のコットン効果が、実施例６では220 nmに正のコットン効果、197 nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を含むことが確認された。【００９４】
［比較例３］
(Pro Hyp Gly)3-Arg Leu Gly Pro Hyp Gly Arg Leu Gly-(Pro Hyp Gly)4(配列番号：９)で示されるアミノ酸配列からなり、カルボキシ末端のカルボキシル基がアミド基で置換されたペプチド、すなわち(Pro Hyp Gly)3-Arg Leu Gly Pro Hyp Gly Arg Leu Gly-(Pro Hyp Gly)4-NH2（比較例３）を実施例１と同様の方法で合成、ペプチドの脱保護と樹脂からの脱離、精製を行った。ただし、合成ステップにおいて、米国アプライド・バイオシステムズ社製のＮα−９−(フルオレニルメトキシカルボニル)−ＮＧ−(２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルフォニル)−Ｌ−アルギニン〔Ｆｍｏｃアルギニン〕を、各結合ステップについてそれぞれ１ミリモルずつ用いた。【００９５】
HPLCにおいて12.2 minにピ−クが示された。GPCにおいて10.6 mLに主ピークと7.5 mLに副ピークが認められた。また、CDにおいて222 nmに正のコットン効果、199 nmに負のコットン効果が観測され、３重らせん構造を含むことが確認された。【００９６】
実施例４、５、６及び比較例３のペプチドについて、上記試験例１に示される方法に従って抗菌活性を評価した。【００９７】
細菌膜モデルのDPPGリポソームに対して、実施例４のペプチドは、18 μMで10％、実施例５のペプチドは、3.5 μMで17％、実施例６では7 μMで18％のCF漏出を示した。哺乳類細胞膜モデルのPCリポソームに対してはいずれの濃度でもCF漏出は認められず、細菌選択的な抗菌活性を発現することが示された（図１を参照）。【００９８】
これに対して、比較例３のペプチドでは、いずれのリポソームに対しても全ての濃度範囲で全くCF漏出は認められなかった。【００９９】
以上の結果から明らかなように、本発明により提供される新規なペプチドは、細菌の細胞膜に対する選択的な抗菌活性を示し、細菌感染症などの治療や雑菌の繁殖抑制等に有用である。【０１００】
［処方例］
本発明のペプチド又はその塩を用いた化粧料の処方例を以下に示すが、本発明はこれに限定されない。
処方例１．
下記成分を混合し、保湿液を得た。
人工コラーゲン水溶液（０．３％）        ９９．５部
配列番号１のペプチド１％水溶液          ０．５部
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明のペプチドは、熱、塩濃度等の外的要因の影響を受けにくく、安定して優れた抗菌活性を発揮することができることから、医薬製剤として調製し、細菌感染症、敗血症等の予防又は治療に使用することができる。【０１０２】
また、本発明のポリペプチドを医療用基材に結合させて使用することもできる。例えば、人工コラーゲンゲル等に本発明のペプチドを結合させ、これを原料として製造された人工皮膚は、移植部分の細菌感染を予防することができる。【０１０３】
さらに、本発明のペプチドは、ヒトに対して低刺激性であり、安定した抗菌性を保持し得ることから、化粧料に抗菌剤として配合することもできる。化粧料に配合される従来の抗菌剤には、臭いの気になるものもあった。しかしながら、本発明のポリペプチドは臭い等の問題もなく、化粧料に配合される抗菌剤として好適に使用され得る。
【配列表フリーテキスト】
【０１０４】
配列番号１は、実施例１において得られる人工ペプチドである。
配列番号２は、実施例２において得られる人工ペプチドである。
配列番号３は、実施例３において得られる人工ペプチドである。
配列番号４は、実施例４において得られる人工ペプチドである。
配列番号５は、実施例５において得られる人工ペプチドである。
配列番号６は、実施例６において得られる人工ペプチドである。
配列番号７は、比較例１において得られる人工ペプチドである。
配列番号８は、比較例２の人工ペプチドである。
配列番号９は、比較例３において得られる人工ペプチドである。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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