(57)【要約】  有効性が高く、かつ副作用の少ない肺疾患治療薬の提供。  ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む生体適合性ポリマーナノ粒子を含有する気管内投与用肺疾患治療薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む生体適合性ポリマーナノ粒子を含有する気管内投与用肺疾患治療薬。
【請求項２】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤が、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン又はその塩である請求項１記載の肺疾患治療薬。
【請求項３】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤が、ピタバスタチン又はその塩である請求項１記載の肺疾患治療薬。
【請求項４】
肺疾患が、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、急性呼吸促迫症侯群、気管支喘息、炎症性肺疾患、肺炎又は気管支炎である請求項１〜３のいずれか１項記載の肺疾患治療薬。
【請求項５】
生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、又はそれらのポリマーとポリエチレングリコールとのブロック共重合体である請求項１〜４のいずれか１項記載の肺疾患治療薬。
【請求項６】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む生体適合性ポリマーナノ粒子の、気管内投与用肺疾患治療薬製造のための使用。
【請求項７】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤が、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン又はその塩である請求項６記載の使用。
【請求項８】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤が、ピタバスタチン又はその塩である請求項６記載の使用。
【請求項９】
肺疾患が、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、急性呼吸促迫症侯群、気管支喘息、炎症性肺疾患、肺炎又は気管支炎である請求項６〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、又はそれらのポリマーとポリエチレングリコールとのブロック共重合体である請求項６〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む生体適合性ポリマーナノ粒子の有効量を気管内に投与することを特徴とする肺疾患治療方法。
【請求項１２】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤が、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン又はその塩である請求項１１記載の治療方法。
【請求項１３】
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤が、ピタバスタチン又はその塩である請求項１１記載の治療方法。
【請求項１４】
肺疾患が、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、急性呼吸促迫症侯群、気管支喘息、炎症性肺疾患、肺炎又は気管支炎である請求項１１記載の治療方法。
【請求項１５】
生体適合性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体、又はそれらのポリマーとポリエチレングリコールとのブロック共重合体である請求項１１記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺疾患に対して優れた改善作用を示す肺疾患治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
難治性肺疾患（慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、急性呼吸促迫症侯群（ＡＲＤＳ）、肺高血圧症等）は、ＱＯＬの悪化をもたらし予後も極めて悪い難治性疾患であり、肺高血圧症等の５年生存率は５０％以下である。最近、重症肺高血圧症に対するプロスタサイクリン持続静注法、ボセンタン、シルデナフィルなどが新しい治療法として使用されているが、その効果は不充分である。更に、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症等に対する治療法にも限界がある。したがって、重症肺疾患に対する根本的かつ低侵襲治療法の研究開発が期待されている。【０００３】
また、気管支喘息、ＣＯＰＤ、肺線維症（間質性肺炎）などの急性或いは慢性呼吸器疾患の多くは気道の炎症を伴った病態を呈する。
一般的な炎症の病態形成として，まず初期段階において遊離された走化性因子と呼ばれる情報伝達分子が好中球、好塩基球、好酸球、マクロファージ等の炎症性細胞の局所への遊走を促し、遊走した炎症性細胞が障害性の酵素やラジカルを遊離して組織を障害すると同時にサイトカイン等を放出することによってさらなる炎症性細胞の遊走及び活性化をもたらすことが知られている。このような炎症が気道で発症した場合、浸潤した炎症性細胞は気管支及び肺の組織を障害し、最終的には各疾患に特徴的な呼吸流量や酸素交換能の低下といった呼吸機能の障害を引き起こすことになる。【０００４】
このような知見から、炎症性呼吸器疾患の治療には抗炎症作用を有する薬剤が応用されており、すでに軽度〜中等度の気管支喘息では副腎皮質ステロイドが著効することが知られている（非特許文献１）。また副腎皮質ステロイドはＣＯＰＤの増悪を予防することも報告されているが、ＣＯＰＤの病態に対する効果は限定的であり（非特許文献２）、肺線維症においては副腎皮質ステロイドの有効性を積極的に支持する結果は今のところ得られていない（非特許文献３）。一方で、副腎皮質ステロイドは免疫機能を非特異的に抑制するばかりでなく、電解質異常、消化性潰瘍、筋疾患、行動異常、白内障、骨粗鬆症、骨壊死、及び発育阻害等さまざまな副作用を引き起こす可能性も知られている（非特許文献４）。【０００５】
また、気管支喘息の治療においては、吸入ステロイド剤を主流とする治療の浸透によって、発作による救急外来患者数、入院患者数は減少し、外来でのコントロール可能な患者が増えている。
その様な状況下においても、患者数は低下せず、また、依然として致死的発作による喘息死が存在することから、現在の吸入ステロイド剤を中心とする喘息治療剤の組合せ療法では、未だ十分な治療には至っておらず、高い効果を持ち、副作用の軽減された新しい治療剤の開発が望まれている。【０００６】
近年、強力なＬＤＬ−コレステロール低下作用を有し、高脂血症治療の第一選択肢として用いられているＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤に関するレトロスペクティブな臨床研究（疫学的研究）から、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の使用がＣＯＰＤ患者の生存率に寄与することが報告されている（非特許文献５、６）。一方で、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤には、ＬＤＬ−コレステロール低下作用とは独立した多面的作用（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ）の一つとして抗炎症作用を有するとの報告もあり、上記した炎症性肺疾患についてもその応用の可能性が示唆されている（非特許文献７）。【０００７】
しかしながら、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を経口投与した場合、吸収されたＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤は薬物トランスポーターの関与により、肝臓に特異的に集積するため、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を肺に集積させ、肺疾患への作用を発揮させるためには高用量の投与が必要となるが、特に高用量の投与の場合、横紋筋融解症等の重篤な副作用が懸念されている。
【非特許文献１】ＧＩＮＡ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ，２００６
【非特許文献２】ＧＯＬＤ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ，２００６
【非特許文献３】Ｗａｌｔｅｒ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ，Ｖｏｌ３，３３０−３３８，２００６
【非特許文献４】Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ，ＭｃＧｒａｗ  ｈｉｌｌ  ２００１
【非特許文献５】Ｓｏｙｓｅｔｈ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ，２９，２７９−２８３，２００７
【非特許文献６】Ｍａｎｃｉｎｉ  ＧＢＪ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ，４７，２５５４−２５６０，２００６
【非特許文献７】Ｈｏｔｈｅｒｓａｌｌ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｏｒａｘ  ６１，７２９−７３４，２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、有効性が高くかつ副作用の少ない優れた肺疾患治療薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を肺疾患治療薬に応用すべく種々検討したところ、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を生体適合性ポリマーナノ粒子に含有させて、肺疾患の主病変部である細気管支〜肺胞に直接投与することにより、低用量で優れた肺疾患治療効果が得られることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち、本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む生体適合性ポリマーナノ粒子を含有する気管内投与用肺疾患治療薬を提供するものである。
また、本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む生体適合性ポリマーナノ粒子の、気管内投与用肺疾患治療薬製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は、気管内投与用肺疾患治療用のＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む生体適合性ポリマーナノ粒子を提供するものである。
また、本発明は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む生体適合性ポリマーナノ粒子の有効量を気管内に投与することを特徴とする肺疾患治療方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、例えば吸入等の簡便な操作により肺に直接投与することにより、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含有した生体適合性ポリマーナノ粒子が肺疾患の病変部に良好に移行し、かつ病変部における貯留性が高いことから、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の高血圧症の治療を目的とする経口投与と比較しても、低用量で有効性が高く、かつ副作用が少ない肺疾患治療薬が提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＬＰＳ誘発急性肺障害マウスにおける、ピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＬＧＡナノ粒子の気管内投与による気管支肺胞洗浄液中の細胞数に対する効果である。
【図２】モノクロタリン誘発重症肺高血圧ラットにおける、ピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＬＧＡナノ粒子の気管内投与における生存率である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の気管内投与用肺疾患治療薬は、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を含む生体適合性ポリマーナノ粒子を含有するものであり、有効成分はＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤である。
本発明で使用するＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤は、コレステロール合成阻害活性を有し、高脂血症治療剤として知られている所謂スタチン系化合物を全て包含するものである。それらのラクトン体及び開環体又はその塩のいずれも包含される。これらの化合物及びその塩の水和物や医薬品として許容される溶媒和物を包含する。【００１４】
好適なＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤としては、例えば、ロバスタチン（特開昭５７−１６３３７４号公報、米国特許第４２３１９３８号公報）、シンバスタチン（特開昭５６−１２２３７５号公報、米国特許第４４４４７８４号公報）、プラバスタチン（特開昭５７−２２４０号公報、米国特許第４３４６２２７号公報）、フルバスタチン（特表昭６０−５０００１５号公報、米国特許第４７３９０７３号公報）、アトルバスタチン（特開平３−５８９６７号公報、米国特許第４６８１８９３号公報、第５２７３９９５号公報）、ロスバスタチン（特開平５−１７８８４１号公報、米国特許５２６０４４０号公報）、ピタバスタチン（日本特許２５６９７４６号公報、米国特許第５１０２８８８号公報、米国特許第５８５６３３６号公報、欧州特許３０４０６３号公報）及びそれらの塩等が挙げられる。ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩等が挙げられる。【００１５】
更に最適なＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤としては、アトルバスタチン、ピタバスタチン又はそれらの塩が好ましく、特にピタバスタチン又はその塩が好ましい。塩としては、特にカルシウム塩、ナトリウム塩が好ましい。【００１６】
本発明の肺疾患治療薬におけるナノ粒子中のＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の含有量は、肺病変部への到達効率の点から、０．００１〜２０重量％、更に０．００５〜２０重量％、更に０．０１〜２０重量％、特に０．０５〜１５重量％が好ましい。ここでＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤は、ナノ粒子の内部及び表面に吸着されている場合を含む。【００１７】
ナノ粒子を形成する生体適合性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリアスパラギン酸、乳酸・グリコール酸共重合体、アスパラギン酸・乳酸・グリコール酸共重合体、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンのようなポリアルキレン、ポリプロピレン、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンテレフタレート、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル及びポリビニルエステルのようなポリビニル化合物、アクリル酸とメタクリル酸とのポリマー、セルロース及び他の多糖類、並びにペプチド又はタンパク質、あるいはそれらのコポリマー又は混合物が挙げられる。このうち、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）及びこれらとポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのブロック共重合体がより好ましく、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）とポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのブロック共重合体（ＰＥＧ修飾ＰＬＧＡ：ｐｅｇ−ＰＬＧＡ）が特に好ましい。上記生体適合性ポリマーはＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を内包可能であり、当該薬物の効力を保持したまま長期間保存できる。更に、生体内の酵素による生体適合性ポリマーの分解により、肺において、数時間から数十時間単位のＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の徐放ができると考えられる。【００１８】
生体適合性ポリマーの分子量は５，０００〜２００，０００が好ましく、特に１５，０００〜２５，０００が好ましい。乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）における乳酸とグリコール酸との組成比（モル比）は１：９９〜９９：１であればよいが、乳酸１に対しグリコール酸０．３３３であることが好ましい。また、乳酸及びグリコール酸の含有量が２５重量％〜６５重量％の範囲内であるＰＬＧＡは、非晶質であり、かつアセトン等の有機溶媒に可溶であるから、好適に使用される。【００１９】
また、本発明に用いるナノ粒子の粒子径は、肺の病変部への到達効率及びＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の含有効率の点から、３０ｎｍ〜１０μｍ、特に１００ｎｍ〜５μｍであるのが好ましい。当該ナノ粒子の粒子径はコールターカウンター  Ｎ４  ＰＬＵＳ（ベックマン・コールター社製）によって測定できる。【００２０】
本発明に用いるナノ粒子は、例えば粉体工学会誌４２（１１）、７６５−７７２（２００５）、特開２００３−２７５２８１号公報、特開２００４−２６２８１０号公報、特開２００６−３２１７６３号公報等に記載の方法により製造することができる。【００２１】
水中エマルジョン溶媒拡散法による本発明ナノ粒子の製造例を以下に示す。
ＰＬＧＡをアセトン等の有機溶媒に溶解して、ポリマー溶液とし、これにＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤、又はその水溶液を混合する。これを攪拌下、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）水溶液、精製水等に滴下し、エマルジョン液を調製する。アセトン等の有機溶媒を留去して得られるＰＬＧＡナノ粒子懸濁液は、遠心分離法にてＰＬＧＡナノ粒子の沈殿を回収し、精製水中で再懸濁させ、ＰＬＧＡ表面に吸着できなかった余剰のＰＶＡを洗浄にて除去し、凍結乾燥し粉末化する。また、ＰＬＧＡナノ粒子懸濁液を直接凍結乾燥し、粉末化することもできる。【００２２】
本発明のナノ粒子には、高次構造を複合（コンポジット）化することが可能であり、コンポジット化されたナノ粒子も含まれる。コンポジット化は、上記の方法等で製造されたナノ粒子含有液に糖アルコールを添加し、均一に混合し、凍結乾燥することで製造することができる。糖アルコールとしては、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、エリスリトール、マルチトール、キシリトール等が挙げられる。糖アルコールの添加量は、ナノ粒子含有液全体に対して、０．００１〜１重量％、特に０．０１〜０．１重量％が好ましい。【００２３】
本発明のナノ粒子は、局方生理食塩水（ｐＨ＝６．０）、精製水（ｐＨ＝６．８）等の水性液に含有させて用いるのが好ましい。なお、この含有液には、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の分散剤を用いるのが好ましい。この含有液中のナノ粒子の濃度は粒子同士の凝集を防ぐ点から、０．１〜２０重量％、特に１〜１０重量％が好ましい。また分散剤の濃度はナノ粒子を効率よく分散させる点から、０．１〜２０重量％、特に１〜１０重量％が好ましい。【００２４】
本発明のナノ粒子の投与量は、疾患、症状により適宜選択されるが、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤として１日当り０．００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０１〜５０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜３０ｍｇである。更に好ましくは０．１〜１０ｍｇである。特に、ピタバスタチン又はその塩の場合、１日当り０．００１〜５０ｍｇ、更に０．０１〜３０ｍｇが好ましい。【００２５】
肺への投与は、吸入器、ネブライザー等を用いて行なうのが好ましい。投与回数は、多い場合は１日に１〜３回、少ない場合は２、３日、１週間程度に一度でも良い。【００２６】
本発明の医薬は、肺、例えば細気管支〜肺胞に直接投与することにより、肺の病変部に到達し、長時間にわたってＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を放出するので、低用量で安全に肺疾患の治療ができる。対象となる肺疾患としては、肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患、肺線維症、急性呼吸促迫症侯群、気管支喘息、炎症性肺疾患、肺炎、気管支炎等が挙げられるが、肺高血圧症の治療に特に有用である。
また、副腎皮質ステロイドを肺疾患の治療に用いる場合、本発明の治療薬と併用することによりその用量を減らすことが可能となり、ステロイドの副作用の軽減にも繋がる。
【実施例】
【００２７】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。【００２８】
実施例１
ピタバスタチンのカルシウム塩を封入したＰＬＧＡナノ粒子の調製方法
ＰＬＧＡナノ粒子へのピタバスタチンのカルシウム塩（ピタバスタチン・カルシウム）（日本特許２５６９７４６号公報、米国特許第５１０２８８８号公報、米国特許第５８５６３３６号公報、欧州特許３０４０６３号公報）の封入は、既に報告されている精製水中におけるエマルジョン溶媒拡散法を参考に調製した（粉体工学会誌、４２、７６５−７７２（２００５））。【００２９】
乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ、分子量２０，０００、乳酸／グリコール酸比：７５／２５）（１ｇ）とピタバスタチン・カルシウム（０．０２５ｇ）を、アセトン（４０ｍＬ）に溶解し、そこにエタノール（２０ｍＬ）を加え、ポリマー溶液とした。このポリマー溶液を、攪拌機を用いて４００ｒｐｍで攪拌したＰＶＡ水溶液（ＰＶＡ（０．５ｇ）を含有する水溶液（１００ｍＬ））中に滴下し、エマルジョン化した。減圧下、４０℃で１時間攪拌し有機溶媒を留去後、メンブレンフィルターを用いて濾過後、濾過液を凍結乾燥し、目的のＰＬＧＡナノ粒子を粉末として得た。
ＰＬＧＡナノ粒子には、ピタバスタチン・カルシウムが１．３重量％包含されていた。
なお、コントロールのピタバスタチン・カルシウムを封入していないＰＬＧＡナノ粒子は、ピタバスタチン・カルシウムを加えずに上記の方法と同様に調製した。【００３０】
実施例２
ピタバスタチンのカルシウム塩を封入したＰＥＧ修飾ＰＬＧＡナノ粒子の調製方法
ＰＥＧ修飾ＰＬＧＡ（ｐｅｇ−ＰＬＧＡ）（２ｇ）、ピタバスタチン・カルシウム（０．１ｇ）をアセトン（２０ｍＬ）に溶解し、エタノール（１０ｍＬ）を加え、ポリマー溶液を作った。
この溶液を４０℃で４００ｒｐｍの速さで攪拌している精製水（５０ｍＬ）中に滴下した。
減圧下、４０℃にて２時間をかけて有機溶媒を留去後、得られた懸濁液を、塊状になったナノ粒子を除く為に、ポアーサイズが３２μｍのメンブレンフィルターを用いて濾過した。
濾過液をそのまま下記の試験例２に用いた。本ナノ粒子含有液には、ピタバスタチン・カルシウムが０．０９９８重量％包含されている。【００３１】
試験例１
ＬＰＳ誘発急性肺傷害モデルにおける、ピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＬＧＡナノ粒子の気管内投与による炎症性細胞に対する効果
試験方法：
日本チャールスリバーより購入した雄性ＢＡＬＢ／ｃマウス（使用時８週齢）を室温２１±２℃、湿度５０±２０％、明期７：００−１９：００に設定した飼育室において餌及び水が自由摂取出来る条件で予備飼育した後に用いた。
マウスをＬＰＳ（リポポリサッカライド）非吸入曝露群（Ｃｏｎｔｒｏｌ（−）；ｎ＝７）、ピタバスタチン・カルシウムを封入していないＰＬＧＡナノ粒子を投与後、ＬＰＳ吸入曝露した群（Ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）；ｎ＝１４）、ピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＬＧＡナノ粒子を投与後、ＬＰＳ吸入曝露した群（Ｐｉｔａｖａ；ｎ＝１３）の３群に分け、実験を行なった。【００３２】
ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔したマウスの頸部を切開して気道を露出させ、ピバスタチン・カルシウムを封入していないＰＬＧＡナノ粒子及びピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＬＧＡナノ粒子のそれぞれを、目視下に生理食塩液に懸濁し、それぞれの懸濁液５０μＬを、２００μＬの空気と共に２７Ｇの注射針を用いて気管内に投与した。投与後頸部を縫合し、麻酔から覚醒したマウスは順次飼育ケージに戻した。
投与量はＰＬＧＡナノ粒子の重量で１５μｇ／ｂｏｄｙ（ピタバスタチン・カルシウムの含有量：０．２μｇ／ｂｏｄｙ）とした。
なお、ナノ粒子の投与液は用時に生理食塩液に懸濁して超音波ホモジナイザーで３０秒間ソニケーションしたものを用いた。【００３３】
気管内投与の２４時間後、マウスを内寸２６ｃｍ×２６ｃｍ×１０ｃｍ（Ｗ×Ｄ×Ｈ）のアクリル製ケージに移し、そのケージに超音波ネブライザー（オムロン）で霧化した３０μｇ／ｍＬのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）を送気することによって吸入曝露を行った。吸入曝露は３０分間継続して行い、マウスは曝露終了後に再度飼育ケージに戻した。
ＬＰＳの吸入曝露開始から４時間後にペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／１０ｍＬ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔したマウスの腹部大動脈を切断して放血・致死させた。その後頸部を切開して気管支に外径１．２ｍｍのポリエチレンチューブ（ＳＰ５５，夏目製作所）を固定し、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を注入・回収する操作を３回繰り返すことで気管支肺胞洗浄を行った。回収した気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）は１０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、集めた遊走細胞は２００μＬのＰＢＳに再懸濁して、総細胞数及び好中球数を多項目自動血球分析装置（ＸＴ−２０００ｉ，Ｓｙｓｍｅｘ）を用いてカウントした。【００３４】
実験結果：
得られた結果は、Ｃｏｎｔｒｏｌ（＋）群に対する百分率で表し、その平均値±標準誤差を、表１及び図１に示した。【００３５】
【表１】
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【００３６】
ピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＬＧＡナノ粒子の気道内投与によって、炎症性細胞の遊走が有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。炎症性細胞の遊走抑制は、単なるＰＬＧＡナノ粒子の効果ではなく、ピタバスタチン・カルシウムを封入したナノ粒子の効果であることが確認された。
また、原体のピタバスタチン・カルシウムの３用量（０．２μｇ／ｂｏｄｙ、２μｇ／ｂｏｄｙ、及び２０μｇ／ｂｏｄｙ）を用い、それぞれを生理食塩水（５０μＬ）に溶解し、上記と同様に実験を行ったが、どの用量においても炎症性細胞の遊走抑制作用は見られなかった（ピタバスタチン・カルシウム非投与群：ｎ＝８；ピタバスタチン・カルシウム投与群（それぞれの用量において）：ｎ＝８）。
今回の試験から、ピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＬＧＡナノ粒子の肺への局所投与によって、ＬＰＳで惹起された炎症性反応が抑制され、また、そのピタバスタチン・カルシウムの用量は、原体そのものを投与する場合に比べ、極めて低用量で炎症性反応が抑制された。このことから、炎症を伴う各種肺疾患の治療にピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＬＧＡナノ粒子が有用であることが示された。【００３７】
試験例２
ピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＬＧＡナノ粒子の気管内投与による肺高血圧症治療実験
試験方法：
雄性ＳＤラット（７週齢：２５０−３００ｇ）にモノクロタリン（ＭＣＴ）を皮下注射（６０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）し、ＭＣＴ誘発肺高血圧症ラットを作製した（ＭＣＴ投与の３週間後に重症肺高血圧症が確立する。）。
ラットを２群、すなわち、（１）第１群（ピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＥＧ修飾ＰＬＧＡナノ粒子を投与した群（ナノ粒子投与群；ｎ＝２６））、（２）第２群（コントロールとしてＰＢＳを投与した群（コントロール群；ｎ＝４１））に分けた。
ＭＣＴ投与後、２１日目に、前頸部を切開し、第１群にはピタバスタチン・カルシウム封入ＰＥＧ修飾ＰＬＧＡナノ粒子含有液（上記実施例２にて製造）（１００μＬ）を、第２群にはＰＢＳ（１００μＬ）をそれぞれ１００μＬの空気と共に気管内に投与した。ピタバスタチン・カルシウムを封入したＰＥＧ修飾ＰＬＧＡナノ粒子に含まれるピタバスタチン・カルシウムの量は１００μｇ／ｂｏｄｙであった。
ナノ粒子投与後１４日間、ラットの生存の確認を行なった。【００３８】
試験結果：
表２及び図２に示した様に、コントロール群では１４日後に生存率が３７％まで低下した。しかしながら、ナノ粒子投与群では、１４日後の生存率が６９％であり、コントロール群と比較して有意な生存率の改善が確認された（ｐ＜０．０１）。【００３９】
【表２】
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【００４０】
今回の結果は、肺高血圧症の治療において、ピタバスタチン・カルシウムの投与量が１００μｇの極めて低い用量を一回投与したものである。このことから、ピタバスタチン・カルシムを封入ＰＬＧＡナノ粒子の気管内投与が非常に有用であることが明かになった。
ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤の経口投与による高脂血症の治療の場合は、用量が多いもので、アトルバスタチンのカルシウム塩の１０〜８０ｍｇ／日、少ないもので、ピタバスタチンのカルシウム塩の１〜４ｍｇ／日である。試験例１及び２から、これらに比べても、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤を封入した生体適合性ポリマーナノ粒子の気管内投与の場合は、低用量のＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ阻害剤で肺疾患の抑制に効果を示すことが確認された。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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