(57)【要約】  本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）の感染を阻害する抗体を提供することを目的としている。上記目的を達成するために、本発明は、下記の（i）と（ii）とが連結したＣ型肝炎ウイルス（HCV）ゲノムから得られるＣ型肝炎ウイルス（HCV）粒子を抗原として認識し、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対して感染阻害活性を有する抗体を提供する。  （i）  （ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のJFH-1株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列、または（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のJ6CF株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列  （ii）  JFH-1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（i）と（ii）とが連結したＣ型肝炎ウイルス（HCV）ゲノムから得られるＣ型肝炎ウイルス（HCV）粒子を抗原として認識し、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対して感染阻害活性を有する抗体。
（i）  （ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のJFH-1株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列、または（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のJ6CF株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列
（ii）  JFH-1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域
【請求項２】
前記Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）ゲノムは、配列表の配列番号1または2に示される塩基配列からなる核酸（ただし、該核酸がRNAの場合は塩基配列中の塩基記号「T」は「U」に読み替えるものとする）である、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
抗体クラスがIgMである、請求項１または２記載の抗体。
【請求項４】
配列表の配列番号24に示されるアミノ酸配列の中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列を認識する、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５】
配列表の配列番号52に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、請求項４記載の抗体。
【請求項６】
配列表の配列番号54に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項４または５記載の抗体。
【請求項７】
受託番号がFERM BP-10982であるハイブリドーマ細胞株により産生される、請求項４〜６のいずれか一項記載の抗体。
【請求項８】
配列表の配列番号44または45に示されるアミノ酸配列の中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列を認識する、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項９】
受託番号がFERM BP-10980であるハイブリドーマ細胞株により産生される、請求項８記載の抗体。
【請求項１０】
配列表の配列番号36、45、46、47または48に示されるアミノ酸配列の中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列を認識する、請求項１〜３のいずれか一項記載の抗体。
【請求項１１】
受託番号がFERM BP-10981であるハイブリドーマ細胞株により産生される、請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の抗体を有効成分とする、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）の感染阻害剤。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の抗体を有効成分とする、医薬。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の抗体を有効成分とする、C型肝炎の治療薬または予防薬。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれか一項記載の抗体によってＣ型肝炎ウイルス（HCV）粒子を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対して感染阻害活性を有する抗体およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（HCV：Hepatitis C virus）は非A非B肝炎の主要な原因ウイルスとして発見同定された（非特許文献１）。さらに今日では高感度なHCVの検出方法が確立され、輸血による新たなHCV感染患者は激減した。しかしながら、日本におけるウイルス保有者は肝炎の症状を示していない、いわゆるウイルスキャリアーを含めると200万人以上、世界で1億7000万人以上と推定されている。それはHCV感染による肝炎の慢性化率が70〜80％と高いことや現在のところインターフェロン以外の有効な抗ウイルス剤がないことが大きな原因となっている。さらに、このC型慢性肝炎患者の半数程度は肝硬変、肝癌へと病態が確実に悪化していくことからもC型肝炎は予後の悪い深刻な感染症と言える。このことから、キャリアーの発症予防やウイルスの排除を目的とした抗ウイルス薬やワクチンの開発が望まれている。【０００３】
HCVのようにエンベロープを持ったウイルスが細胞に感染する際には、まず細胞表面の特異的なタンパク質（ウイルス受容体）に結合しなければならない。その後、ウイルス膜と細胞膜が融合してウイルス遺伝子を細胞内に注入する。HCVの治療・予防には細胞感染を阻止できる抗体の開発が必要であり、特にHCVが細胞表面のウイルス受容体に結合し進入するのを阻止できる抗体が重要である。【０００４】
HCVの細胞表面への結合は、HCVのエンベロープタンパク質が担っていると考えられることから、患者血清中のエンベロープタンパク質に対する抗体を検出する研究がなされた。C100抗体(NS4-NS-5抗体)またはコア抗体のすくなくとも一つが陽性の患者で、エンベロープタンパク質抗体が陽性の患者は10%程度である事が示された。さらに、エンベロープタンパク質抗体陽性患者31名中3名のみが自然に治癒することから、この3名には中和抗体が出現したと考えられた（非特許文献２）。中和抗体が出現したと考えられる患者は全体の1%にすぎず非常に少ない。【０００５】
それに対して、急性発症のＢ型肝炎では、Ｂ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質に対する抗体は100％でき、ウイルスが駆逐される。HIVの場合は高頻度にHIVのエンベロープタンパク質に対する抗体が検出される。HCVのエンベロープタンパク質抗体が患者の10％しか検出されないのは、HCVエンベロープタンパク質に対する抗体ができにくい仕組みが存在しているのかもしれないことが推測されている（非特許文献３）。【０００６】
一方、哺乳動物で発現させたHCVのE2タンパク質がヒト細胞表面に存在するCD81に特異的に結合することが示され（非特許文献４）、この実験系を用いて、C型肝炎患者からE2タンパク質とCD81との結合を阻害する（Neutralisation of binding, NOBと呼称する）活性を示す抗体の開発がなされている。【０００７】
代表的な例をあげれば、遺伝子型1aのＣ型慢性肝炎患者の骨髄リンパ球から抗体遺伝子ライブラリーを作製し、ファージディスプレイ法を用いて、NOB活性を示す抗体が作製されている（特許文献１）。さらに別の研究グループは、遺伝子型1bのC型肝炎患者の末梢B細胞からハイブリドーマを作製し、NOB活性を示す抗体が取られている（非特許文献５、特許文献２）。【０００８】
しかし、上記のHCV感染患者からモノクローナル抗体を取得する方法では、患者数さらにはHCV感染阻害抗体が存在する患者に限定されることなどから、感染阻害抗体のレパートリーを増やし、抗HCV剤として有用な抗体を見出すことが困難である。【０００９】
さらに、組換え型エンベロープタンパク質をマウスに投与し抗体を誘導する方法（特許文献３）、そのリンパ球とミエローマ細胞を融合させ抗体産生ハイブリドーマを作製し、エンベロープタンパク質に対する抗体の作製が試みられている（特許文献４、非特許文献６）。しかし、HCVの感染を阻害する抗体については示されていない。【００１０】
エンベロープタンパク質を動物に免疫して、HCVの感染を中和する抗体が作製されていない理由の一つとして、免疫に使用する組換え型エンベロープタンパク質がウイルス本来のエンベロープタンパク質と構造が異なることによることが示唆される。すでに組換え型エンベロープタンパク質は、アグリゲーションを起こしやすくネイティブな立体構造を保持することができないこと（非特許文献７）が示されている。【００１１】
また、NOB活性を示す抗体が必ずしも感染を阻害するものではない事も示されており（非特許文献８）、HCVの抗体による治療・予防の観点から、ウイルス感染を阻害することのできるエンベロープタンパク質に対する抗体を効果的に誘導する方法とウイルス感染を阻害する抗体を開発する必要がある。【００１２】
上記の背景にあって、近年、細胞培養系で感染性HCV粒子を作製する技術（特許文献５、特許文献６、特許文献７）が確立された。遺伝子組換え技術でエンベロープタンパク質を発現させ、それを抗原として使用する場合と比較して、このHCV粒子は感染性を示すことから、HCV抗原の立体構造が保たれていると考えられるため、HCVの感染を阻害するための抗体を作製する抗原として好適でありうる。
【特許文献１】特表2005-531286号公報
【特許文献２】特表2006-504645号公報
【特許文献３】特表平2004-500366号公報
【特許文献４】特表平6-505389号公報
【特許文献５】WO05080575A1
【特許文献６】WO06022422A1
【特許文献７】WO06096459A2
【非特許文献１】Chooら、Science、1989年、244巻、p.359-362
【非特許文献２】Matsuuraら、J. Virol.、1992年、66巻、p.1425-1431
【非特許文献３】斉藤ら、実験医学、1991年、9巻、p.2075-2080
【非特許文献４】Pileriら、Science、1998年、282巻、p.938-941
【非特許文献５】Hadlockら、J. Virol.、2000年、74巻、p.10407-10416
【非特許文献６】鈴木ら、最新医学、2003年、58巻、p.2017-2022
【非特許文献７】Op de Beeckら、J. Gen. Virol.、2001年、82巻、p.2589-2595
【非特許文献８】Burioniら、J. Virol.、2002年、76巻、p.11775-11779
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）の感染を阻害する抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明者らは、JFH-1株またはJ6CF株とJFH-1株のキメラウイルスのＣ型肝炎ウイルス（HCV）粒子を抗原としてマウスに投与し、HCV投与マウスの血清中のHCV感染阻害活性を測定したところ、HCV感染阻害活性を有することを見出した。【００１５】
さらにHCV粒子投与マウスから脾臓細胞を調製し、マウスミエローマ細胞株と融合させることにより、抗体産生ハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生する抗体のHCV感染阻害活性を評価し、HCV感染を阻害するモノクローナル抗体を取得したこと基づき本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下を包含する。【００１６】
[1]  下記の（i）と（ii）とが連結したＣ型肝炎ウイルス（HCV）ゲノムから得られるＣ型肝炎ウイルス（HCV）粒子を抗原として認識し、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）に対して感染阻害活性を有する抗体。
（i）  （ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のJFH-1株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列、または（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）のJ6CF株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列
（ii）  JFH-1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域【００１７】
[2]  上記Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）ゲノムは、配列表の配列番号1または2に示される塩基配列からなる核酸（ただし、該核酸がRNAの場合は塩基配列中の塩基記号「T」は「U」に読み替えるものとする）である、上記[1]に記載の抗体。【００１８】
[3]  抗体クラスがIgMである、上記[1]または[2]に記載の抗体。【００１９】
[4]  配列表の配列番号24に示されるアミノ酸配列の中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列を認識する、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の抗体。【００２０】
[5]  配列表の配列番号52に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、上記[4]に記載の抗体。【００２１】
[6]  配列表の配列番号54に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、上記[4]または[5]に記載の抗体。【００２２】
[7]  受託番号がFERM BP-10982であるハイブリドーマ細胞株により産生される、上記[4]〜[6]のいずれかに記載の抗体。【００２３】
[8]  配列表の配列番号44または45に示されるアミノ酸配列の中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列を認識する、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の抗体。【００２４】
[9]  受託番号がFERM BP-10980であるハイブリドーマ細胞株により産生される、上記[8]に記載の抗体。【００２５】
[10]  配列表の配列番号36、45、46、47または48に示されるアミノ酸配列の中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列を認識する、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の抗体。【００２６】
[11]  受託番号がFERM BP-10981であるハイブリドーマ細胞株により産生される、上記[10]に記載の抗体。【００２７】
[12]  上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）の感染阻害剤。【００２８】
[13]  上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、医薬。【００２９】
[14]  上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体を有効成分とする、C型肝炎の治療薬または予防薬。【００３０】
[15]  上記[1]〜[11]のいずれかに記載の抗体によってＣ型肝炎ウイルス（HCV）粒子を検出することを含む、Ｃ型肝炎ウイルス（HCV）の検出方法。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のHCV感染阻害活性を有する抗体およびその用途は、C型肝炎の治療または予防およびHCVの感染メカニズムを解明するための研究に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１Ａは、J6/JFH-1-HCV粒子投与マウス血清の遺伝子型2aのHCVに対する感染阻害活性を示す。図１Ｂは、J6/JFH-1-HCV粒子投与マウス血清の遺伝子型1bのHCVに対する感染阻害活性を示す。
【図２】図２は、JFH-1-HCV粒子投与マウス血清の遺伝子型2aのHCVに対する感染阻害活性を示す。
【図３】図３aは、J6/JFH-1-HCV粒子投与マウス血清のIgG画分のHCV感染阻害活性を示す。図３ｂは、J6/JFH-1-HCV粒子投与マウス血清のIgM画分のHCV感染阻害活性を示す。
【図４】図４は、J6/JFH-1-HCVに対するモノクローナル抗体のHCV感染阻害活性を示す。図４中、「P.C.」は抗体を加えなかった陽性対照、「N.C」は感染性HCV粒子を加えなかった陰性対照、「IgG」は対照抗体の結果を示す。
【図５】図５は、JFH-1-HCVに対するモノクローナル抗体のHCV感染阻害活性を示す。図５中、P.C.は抗体を加えなかった陽性対照、N.Cは感染性HCV粒子を加えなかった陰性対照の結果を示す。
【図６】図６Ａは、JF/M1-4モノクローナル抗体の、JFH1 E1（エンベロープタンパク質1）由来の配列を有するペプチドに対する結合強度を示す。図６Ｂは、JF/M1-4モノクローナル抗体のJFH1 E2（エンベロープタンパク質2）由来の配列を有する各ペプチドに対する結合強度を示す。図６Ａ中のペプチド番号53〜56ならびに６Ｂ中のペプチド番号111および112の棒グラフ（vehicle）は、ペプチドの代わりにPBSを添加して反応させた対照実験を示す。
【図７】図７Ａは、J6/1G11-25モノクローナル抗体のJ6 E1（エンベロープ蛋白質1）由来の配列を有するペプチドに対する結合強度を示す。図７Ｂは、J6/1G11-25モノクローナル抗体のJ6 E2（エンベロープ蛋白質2）由来の配列を有するペプチドに対する結合強度を示す。図７Ａ中のペプチド番号53〜56ならびに７Ｂ中のペプチド番号111および112の棒グラフ（vehicle）は、ペプチドの代わりにPBSを添加して反応させた対照実験を示す。
【図８】図８Ａは、J6/4D4-2モノクローナル抗体のJ6 E1（エンベロープ蛋白質1）由来の配列を有するペプチドに対する結合強度を示す。図８Ｂは、J6/4D4-2モノクローナル抗体のE2（J6エンベロープ蛋白質2）由来の配列を有するペプチドに対する結合強度を示す。図８Ａ中のペプチド番号53〜56ならびに８Ｂ中のペプチド番号111および112の棒グラフ（vehicle）は、ペプチドの代わりにPBSを添加して反応させた対照実験を示す。
【図９】図９は、JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖可変領域における相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク領域の構造と各アミノ酸配列を示す。このH鎖V領域には、N末端側からC末端側へ順番に、フレームワーク1（配列番号55）、CDR1（配列番号56）、フレームワーク2（配列番号57）、CDR2（配列番号58）、フレームワーク3（配列番号59）、CDR3（配列番号60）、フレームワーク4（Jセグメント、J領域、またはJ鎖とも呼ぶ）（配列番号61）の領域が含まれる。
【図１０】図１０は、JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖可変領域における相補性決定領域（CDR）およびフレームワーク配列の構造と各アミノ酸配列を示す。このL鎖V領域には、N末端側からC末端側へ順番に、フレームワーク1（配列番号62）、CDR1（配列番号63）、フレームワーク2（配列番号64）、CDR2（配列番号65）、フレームワーク3（配列番号66）、CDR3（配列番号67）、フレームワーク4（Jセグメント、J領域、またはJ鎖とも呼ぶ）（配列番号68）の領域が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明は、特定のHCVゲノムから産生された感染性のHCV粒子を抗原として用いて誘導されうる、HCV感染を阻害することができる抗体に関する。【００３４】
本発明は、当該分野の技術の範囲内にある分子生物学および免疫学の従来技術を用いて実施できる。このような技術は文献に十分に説明されている。たとえば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory (第3版, 2001)、Ed Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory（1988）を参照のこと。【００３５】
さらに、本明細書中に引用されている全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が本明細書に参考として、援用される。【００３６】
本明細書は、本願の優先権の主張の基礎となる特願2007−193413号に記載された内容を包含する。【００３７】
（１）感染性HCV粒子の作製
本発明において抗原として使用可能な感染性HCV粒子は、細胞培養系で生産することができる。この基本技術は、WO04104198A1、WO06022422A1、WO06096459A2、Wakita, T. et al., Nat. Med. 11:791-796,2005、Lindenbach, BD. et al., Science 309:623-626,2005およびPietschmann, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103:7408-7413, 2006に記載されている。【００３８】
本発明に係るHCV感染阻害活性を有する抗体の製造に用いる感染性HCV粒子を生成するのに利用できるHCVゲノムの例は、具体的には、遺伝子型2aのJFH-1株のウイルスゲノムRNAであって、5’側から3’側に順番に、5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列ならびに3’非翻訳領域からなるRNAでありうる。あるいはそのHCVゲノムは、2種類以上のHCV株のウイルスゲノムRNAからなり、5’側から3’側に順番に、JFH-1株以外のHCV株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、ならびにJFH-1株のNS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域からなるRNAであってもよい。あるいはそのHCVゲノムはまた、2種類以上のHCV株のウイルスゲノムRNAからなり、5’側から3’側に順番に、JFH-1株以外のHCV株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列ならびに、JFH-1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列、NS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域からなるRNAであってもよい。【００３９】
本発明において好ましい1つの態様のHCVゲノムの例は、5’側から3’側に順番に、遺伝子型2aのJFH-1株由来の全長ゲノム（例えば、配列番号1で示される塩基配列を有するもの）および遺伝子型2aのJ6CF株由来の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード領域、E1タンパク質コード領域、E2タンパク質コード領域、p7タンパク質コード領域、NS2タンパク質コード領域のN末端の16アミノ酸残基まで、JFH-1株のNS2タンパク質コード領域のN末端の17位のアミノ酸残基からC末端まで、NS3タンパク質コード領域、NS4Aタンパク質コード領域、NS4Bタンパク質コード領域、NS5Aタンパク質コード領域、NS5Bタンパク質コード領域および3’非翻訳領域からなるキメラゲノムである。この特に好ましい例は、配列番号2の塩基配列からなるJ6/JFH-1中にクローン化された核酸である。【００４０】
本発明の特に好ましい態様では、上記HCVゲノムは配列番号1または2で示される塩基配列からなる核酸であり、ただし該核酸がRNAの場合は塩基配列中の塩基記号「T」は「U」に読み替えるものとする。本発明の感染性HCV粒子の製造には、HCVゲノムRNAまたはHCVゲノムDNAを使用することができる。【００４１】
すなわち本発明は、5’側から3’側に順番に、（ａ）JFH-1株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列と、JFH-1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列およびNS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域が連結したHCVゲノム、または、5’側から3’側に順番に、（ｂ）HCVのJ6CF株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列と、JFH-1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列およびNS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域が連結したHCVゲノム、好ましくは、5’側から3’側に順番に、J6CF株の5’非翻訳領域、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列およびNS2タンパク質コード領域のN末端16アミノ酸残基までコードする配列と、JFH-1株のNS2タンパク質コード領域のN末端17アミノ酸残基からC末端までコードする配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列およびNS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域が連結したHCVゲノムから得られるHCV粒子を抗原とする、HCVの感染阻害活性を有する抗体である。【００４２】
本発明の抗体の感染阻害活性を評価する場合、上記（ａ）または（ｂ）のHCV粒子の他に、（ｃ）JFH-1株の5’非翻訳領域、遺伝子型1bのTH株(Wakita, T. et al., J. Biol. Chem., 269, 14205-14210, 1994、特開2004-179)のcoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列およびp7タンパク質コード配列と、JFH-1株のNS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列およびNS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域がこの順番で連結したHCVゲノム、好ましくはJFH-1株由来の5’非翻訳領域、TH株のcoreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質およびNS2タンパク質コード領域のN末端33アミノ酸残基までコードする配列と、JFH-1株のNS2タンパク質コード領域のN末端34アミノ酸残基からC末端までをコードする配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列およびNS5Bタンパク質コード配列および3’非翻訳領域がこの順番で連結したHCVゲノムから得られるHCV粒子も用いられる。【００４３】
上記の感染性HCV粒子は、上記（ａ）〜（ｃ）の完全長のHCVゲノムRNAのcDNAが転写プロモーターの下流にクローン化されたベクター（例えば、T7プロモーターの制御下にHCV ゲノムRNAがクローン化されたベクター）からRNAを合成し、このRNAを細胞に導入することで作製することができる。T7プロモーターの制御下にHCV cDNAをクローン化した核酸を鋳型として、in vitroでRNAを作製する方法は、MEGAscript T7 kit(Ambion社)などで合成することができる。RNAを導入する細胞はHCV粒子形成を許容する細胞で有れば良く、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞、293細胞等の培養細胞が挙げられるが、より好ましい例としてHuh7細胞等の肝由来培養細胞が挙げられ、さらに好適にはHuh7細胞、およびHuh7細胞の派生株であるHuh7.5細胞、Huh7.5.1細胞が挙げられる。また、Huh7細胞、HepG2細胞、IMY-N9細胞、HeLa細胞または293細胞にCD81遺伝子および/またはClaudin1遺伝子を発現させた細胞も挙げることができるが、中でもHuh7細胞またはHuh7細胞の派生株が好適に使用される。本発明において「派生株」とは、当該細胞から誘導された細胞株をいう。【００４４】
RNAを細胞に導入する方法として、公知の任意の方法を用いることができる。そのような方法としては、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法が挙げられるが、好適にはリポフェクション法およびエレクトロポレーション法が、さらに好適にはエレクトロポレーション法が挙げられる。【００４５】
細胞のウイルス粒子産生能は、培養液中に放出されたHCVウイルス粒子を構成する要素（例えば、coreタンパク質、E1タンパク質またはE2タンパク質）に対する抗体を用いて検出することもできる。また、培養液中のHCVウイルス粒子が含有するHCVゲノムRNAを、特異的プライマーを用いたRT-PCR法により増幅して検出することによって、HCVウイルス粒子の存在を間接的に検出することもできる。【００４６】
作製されたウイルスが感染能を有しているか否かは、HCV RNAを上記のような方法で導入した細胞を培養して得られた上清を、HCV許容性細胞（たとえばHuh7）に処理（添加）して、たとえば48時間後に細胞を抗core抗体で免疫染色して感染細胞数を数えるか、細胞の抽出物をSDS-ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ウエスタンブロットにて、core（コア）タンパク質を検出することで判断できる。【００４７】
（２）感染性HCV粒子の精製
上記（１）で得られた感染性HCV粒子を含むウイルス液は、遠心および／またはフィルターなどを用いて細胞および細胞の残渣が除去される。残渣が除去された溶液は、分画分子量100,000〜500,000の限外濾過膜を用いて10〜100倍程度に濃縮することもできる。残渣が除去されたHCVを含んだ溶液は、以下に記載するクロマトグラフィおよび密度勾配遠心を任意の順番に組み合わせて、あるいは単独で精製することができる。以下に代表的なクロマトグラフィや密度勾配遠心の方法について記載するが、それに限られるものではない。【００４８】
ゲル濾過クロマトグラフィは、好ましくはアリルデキストランとN, N'-メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマーをゲルマトリックスとするクロマトグラフィ担体で、さらに好ましくはSephacryl（登録商標） S-300、S-400およびS-500からなるクロマトグラフィを用いることにより、感染性HCV粒子の精製を行うことができる。【００４９】
イオン交換クロマトグラフィは、陰イオン交換樹脂として好ましくはQ-Sepharose（登録商標）など、および陽イオン交換樹脂として好ましくはSP Sepharose（登録商標）などを用いてHCV粒子の精製を行うことができる。【００５０】
アフィニティクロマトグラフィは、リガンドとして好ましくはヘパリン、硫酸化セルロファイン、レクチン、および様々な色素から選ばれる基質を結合させた樹脂を担体として用いて、HCV粒子の精製を行うことができる。さらに好ましくは、HiTrap Heparin HP（登録商標）、HiTrap Blue HP（登録商標）、HiTrap Benzamidine FF（登録商標）、硫酸化セルロファイン、ならびにLCA、ConA、RCA−120およびWGAが結合した担体を利用して、HCV粒子を精製することができる。最も好ましい手法は、硫酸化セルロファインを担体として利用してHCV粒子を精製することであり、精製前と精製後で溶液中の総タンパク質量とHCVのRNAコピー数の比率として30倍以上に精製することができる。【００５１】
密度勾配遠心による精製は、密度勾配を形成する溶質として好ましくは塩化セシウム、スクロース、ナイコデンツ（登録商標）ならびに、フィコール（登録商標）およびパーコール（登録商標）といった糖重合体を用いることができる。さらに好ましくは、スクロースを用いることができる。また、用いる溶媒として好ましくは水もしくは、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液、またはグリシン緩衝液といった緩衝液を用いることができる。密度勾配遠心による精製を行う際の遠心力は、好ましくは1×104〜1×109ｇであり、さらに好ましくは5×104〜1×107であり、最も好ましくは5×104〜5×105である。【００５２】
精製を行う際の温度は、好ましくは0〜40℃であり、さらに好ましくは0〜25℃であり、最も好ましくは0〜10℃である。【００５３】
密度勾配遠心とカラムクロマトグラフィを組み合わせて精製する場合、どのような順番にどのように組み合わせても良いが、好ましくは複数のカラムクロマトグラフィにより精製した後に密度勾配遠心を用いる組み合わせであり、更に好ましくは陰イオン交換カラムに次いでアフィニティクロマトグラフィを用いて得られたHCV粒子を含む画分を密度勾配遠心を用いて精製する組み合わせであり、最も好ましくはQ-Sepharose（登録商標）を用いたカラムにより得られたHCV粒子を含む画分を硫酸セルロファインを用いたカラムを用いて更に精製し、得られたHCV粒子を含む画分を密度勾配遠心により精製する組み合わせである。なおカラムクロマトグラフィおよび密度勾配遠心の工程の間に透析や限外濾過を用いることによりHCV粒子を含む溶液の溶質の置換および／またはHCV粒子の濃縮を行うことができる。【００５４】
（３）感染性HCV粒子の不活化
本発明の抗体は、HCV粒子を抗原とする。本発明の抗体の産生に関しては、当該HCV粒子の感染性の有無は抗原性において問題とならないが、不活化されたHCV粒子を使用することが好ましい。感染性HCV粒子を不活化する方法としては、ホルマリン，β−プロピオラクトン，グルタルジアルデヒド等の不活化剤を、例えば、ウイルス浮遊液に添加混合し、ウイルスと反応させることにより達成することができる（Appaiahgari et al., Vaccine, 22:3669-3675, 2004）。また、感染性HCV粒子を紫外線で照射することによりウイルスの感染性を失わせ、迅速に不活化する方法が挙げられる。紫外線照射は、ウイルスを構成するタンパク質などへの影響が少なく、ウイルスの不活化を行うことができる。不活化するための紫外線の線源としては一般に市販されている殺菌灯、特に15W殺菌灯を用いて行うことができるが、それに限るものではない。また、本発明においては、HCV粒子は上記に記載した方法により精製したものを用いているが、本不活化方法は精製・未精製などの状態により限られるものではない。好ましくは感染性HCV粒子を含む溶液を20 mW/cm2の紫外線で室温にて5分以上照射することにより、感染性HCV粒子を不活化することができる。【００５５】
（４）動物への免疫
本発明の抗体は、HCV粒子を動物に投与することで免疫反応により誘導させて得ることができる。免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどハイブリドーマを作製することが可能な脾細胞を産生できる非ヒト動物（例えば、非ヒト哺乳動物）であれば、いかなるものでもよいが、本発明においては好ましくはマウスであり、マウスを用いる例を以下に示す。【００５６】
通常4〜10週令のマウスに、上記（１）〜（３）の工程で得られたHCV粒子を抗原として免疫するが、場合によっては、精製工程を変更・省略、ウイルスの不活化を省略してもよい。免疫は通常皮下または腹腔内に、アジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジュバントとしては、フロインドの完全アジュバント、フロインドの不完全アジュバント、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチン、Titer Max Gold（Vaxel社）またはGERBUアジュバント（GERBU Biotechnik社）などがあげられるがこれに限定されるものではない。最終免疫はアジュバントを使用せず、静脈内または腹腔内に投与し、HCV粒子の最終投与後3 〜10 日目、好適には4日目に、免疫したマウスより公知の方法（Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）に準じて血清中よりポリクローナル抗体が得られる。なお、免疫した動物が本発明の抗体を産生しているかどうかについては、最終免疫の前に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、抗原として用いたHCVの感染阻害活性を測定することで調べることができる。【００５７】
本発明に係る抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、好ましくはモノクローナル抗体である。本発明に係る抗体はまた、任意の生物由来の抗体、好ましくは哺乳動物由来の抗体、より好ましくはヒト抗体であってもよい。本発明に係る抗体は、キメラ抗体（例えば、ヒト抗体と他の哺乳動物由来の抗体とのキメラ抗体）であってもよい。特に好適なキメラ抗体としては、例えば、マウス抗体の超可変部位の配列をヒト抗体に移植したヒト化抗体（ヒト型化抗体）等が挙げられる。本発明に係る抗体は、例えば、ヒト抗体のフレームワーク領域と他の哺乳動物由来抗体の超可変領域とを含む重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を有するキメラ抗体であってもよい。【００５８】
（５）モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の作製
本発明の抗体の中でも、特にモノクローナル抗体を作製する場合、免疫した動物の脾臓を摘出し、脾細胞と骨髄腫細胞を融合させたハイブリドーマ細胞を作製する方法が用いられる。細胞融合に使用する骨髄腫細胞としては、マウス由来の株化細胞である、8-アザグアニン耐性マウス（BALB/c由来）骨髄腫細胞株P3-X63Ag8-U1(P3-U1)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、P3-X63-Ag8653(653)、P3-X63-Ag8(X63)、P3/NS1/1-Ag4-1(NS1)など、in vitroで増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。これらの細胞株は理化学研究所バイオリソースセンター、ATCC（American Type Culture Collection）またはECACC（European Collection of Cell Cultures）から入手可能であり、培養および継代については公知の方法（Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, 1988、Selected Methods in Cellular Immunology W.H. Freeman and Company, 1980）に従い培養する。【００５９】
上記で得られた脾細胞と骨髄腫細胞とを洗浄した後、骨髄腫細胞1に対し脾細胞を1〜10の割合で混合し、ポリエチレングリコールを加え、細胞を融合させる。ポリエチレングリコールは細胞を融合する能力があり、細胞毒性の少ないものがよく、ポリエチレングリコール−1500(PEG-1500)などが好適に使用できる。融合後、細胞を培地に懸濁させ洗浄する。細胞の洗浄には骨髄腫細胞の培養に使用した培地、例をあげれば、ダルベッコの改変MEN培地またはRPMI-1640培地などを用いる。融合細胞の培養培地としては、目的の融合細胞のみを選択的に得られるように、HAT培地（骨髄腫細胞の培養に使用した培地たとえばダルベッコ改変MEN培地に2-メルカプトエタノール（5×10-5M）、ペニシリン（100単位/ｍｌ）、ストレプトマイシン(100μg/ml)および牛胎児血清(FCS)（インビトロジェン社製、10%）を加えた培地）にヒポキサンチン（10-4M）、チミジン（1.5×10-5M）およびアミノプテリン（4×10-7M）を加えた培地）を用いる。【００６０】
培養後、培養上清の一部をとり、HCV感染試験によりHCVの感染を阻害する抗体を産生する細胞を選択する。あるいは、酵素免疫測定法により、HCV蛋白質に反応する抗体を産生する細胞を選択することもできる。ついで、限界希釈法またはメチルセルロース培地中でのコロニー形成法によりクローニングを行い、HCV蛋白質に反応する抗体およびHCV感染阻害活性を持つ抗体を産生することが認められたものがモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択される。【００６１】
（６）HCV感染阻害活性を有する抗HCVモノクローナル抗体の選択
HCV感染阻害活性を有する抗HCVモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択は、以下の例および後述の実施例に述べる感染性HCV粒子を用いたHCV感染阻害活性の測定法により行うことができる。【００６２】
まず、感染性HCV粒子（作製方法については上記に示した）と抗体サンプルとを混合し、37℃にて1時間反応させる。前日に96穴プレートに5 x 103個/ウェルで培養したHuh7細胞に上記サンプル50μlを加え、37℃にて、2.5時間培養する。培養後、サンプルを除去し、PBSにて細胞を洗浄後、新鮮培地を加え培養を続ける。48時間後、培養上清を除去し、PBSで1回洗浄後ISOGEN(ニッポンジーン社)を100μl加え、細胞からRNAを調製し、RNAを定量後、HCVゲノムRNA量の測定を行う。HCV RNAの定量的RT-PCRによる検出は、Takeuchiらの方法（Takeuchi T. et al., Gastroenterology, 116：636-642,1999）に従いHCV RNAの5'非翻訳領域のRNAを検出することにより行う。【００６３】
またHCV感染阻害活性を評価する別の方法として次の方法がある。まず、抗体サンプルと感染性HCV粒子とを混合し37℃で1時間反応させる。次に、前日に96ウェルプレートに1×104 個/ウェルで培養したHuh-7細胞に、上記サンプル50μlを加え、37℃にて、2.5時間培養する。培養後、サンプルを除去し、PBSにて細胞を洗浄後、新鮮培地を加え培養を続ける。72時間後、培養上清を取り除いた後に、氷冷したメタノール中にプレートを入れ細胞を固定する。その後、メタノールを風乾により除き、0.3% Triton（登録商標）-X 100（GEヘルスケア社）を含んだブロックエース（登録商標）（大日本製薬社）で細胞の可溶化処置する。そして、clone 2H9抗HCV-core抗体（Nat Med. (2005) 11:p791-6.参照）およびgoat anti-mouse IgG-Alexa488（モレキュラープローブ社）を用いてHCV感染細胞を蛍光顕微鏡（IX-70；オリンパス社製）下で計数し、HCVの感染が阻害されたウェルのサンプルを陽性クローンとすることにより、目的のハイブリドーマを選択することができる。上記の通り選択されるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、本発明の抗体の好ましい態様のひとつである。【００６４】
なお、本発明の抗体を産生するハイブリドーマは、上記の通り選択されるハイブリドーマであれば特に限定されるものではないが、受託番号FERM BP-10980、受託番号FERM BP-10981のハイブリドーマ細胞株、受託番号FERM BP-10982のハイブリドーマ株がより好ましい。ハイブリドーマ細胞株J6/1G11-25（受託番号：FERM BP-10980；2007年7月19日に寄託された受託番号：FERM P-21318（受領番号：FERM AP-21318）から国際寄託に移管）、J6/4D4-2（受託番号：FERM BP-10981；2007年7月19日に寄託された受託番号：FERM P-21319（受領番号：FERM AP-21319）から国際寄託に移管）、JF/M1-4（受託番号：FERM BP-10982；2007年7月19日に寄託された受託番号：FERM P-21320（受領番号：FERM AP-21320）から国際寄託に移管）は、2007年7月19日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1  中央第6）に寄託されている。これらのハイブリドーマ細胞株はダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）にピルビン酸ナトリウム  1mM、2-メルカプトエタノール  55μM、ウシ胎仔血清  10％を添加した培地で37℃で好適に培養できる。【００６５】
上記方法により選択されたハイブリドーマ細胞株が産生する本発明の抗体のエピトープを解析するためには、HCVのタンパク質を用いたエンザイムイムノアッセイ（EIA）、ウエスタンブロッティングまたはドットブロッティングなどを使用することができる。なお、抗HCVモノクローナル抗体の一次スクリーニングとして本エピトープ解析をすることで、特定のHCVタンパク質を標的とした抗HCVモノクローナル抗体を効率よくスクリーニングすることができる。【００６６】
本発明に係るより好適なHCV感染阻害活性を有する抗体は、HCV（特にJFH-1株のHCV）のE2タンパク質中のアミノ酸配列WLTPKCLVHYPYRLWHYPC（配列番号24）、またはWLTPKCLVHYPYRLWHYPC（配列番号24）中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列を、エピトープとして認識する抗体であることが好ましい。WLTPKCLVHYPYRLWHYPC中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列としては、LVHYPYRLWH（配列番号18）、WLTPKCLVHY（配列番号19）、PKCLVHYPYR（配列番号20）、YPYRLWHYPC（配列番号21）が好ましく、LVHYPYRLWH（配列番号18）がより好ましい。また、HCVのE2タンパク質のアミノ酸配列である、NFTIFKIRMY（配列番号22）またはIFKIRMYVCG（配列番号23）を認識する抗体についても本発明に係るより好適なHCV感染阻害活性を有する抗体として挙げられる。なお、本願明細書において、例えば「E1タンパク質の1〜162アミノ酸」とは、E1タンパク質のアミノ酸配列中のアミノ酸残基1番から162番までの領域を意味する。またタンパク質や核酸の一領域を示す類似の表現も同様に理解されるものとする。【００６７】
このような本発明に係る抗体の好適な実施形態としては、配列番号52に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する抗体が挙げられる。また本発明に係る抗体の好適な実施形態として、配列番号54に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体も挙げられる。配列番号52に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号54に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域との両方を有する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）が、より好ましい。このようなモノクローナル抗体の一例を、後述の実施例においてJF/M1-4モノクローナル抗体として記載する。配列番号52に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号54に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体もまた、任意の生物由来の抗体、好ましくは哺乳動物由来の抗体、より好ましくはヒト抗体であってよいし、キメラ抗体であってもよい。キメラ抗体としては、任意の生物（例えば、遺伝子操作が容易なマウスなど）由来の重鎖および／または軽鎖可変部位、またはそれらの相補性決定領域（超可変部位）を、該抗体を投与すべき生物（例えばヒト）由来の抗体（好ましくはモノクローナル抗体）の同等部位に移植したものを用いることができる。特に好適なキメラ抗体としては、例えばマウス抗体の超可変部位（相補性決定領域（CDR）とも呼ばれる）の配列をヒト抗体の当該部位に移植したヒト化抗体（ヒト型化抗体）等が挙げられる。【００６８】
本発明に係る抗体はまた、H鎖V領域（重鎖可変領域）中の相補性決定領域（CDR）として、JF/M1-4モノクローナル抗体由来である配列番号56、58、60に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、およびCDR3を有するものでありうる。また本発明に係る抗体は、L鎖V領域（軽鎖可変領域）中の相補性決定領域（CDR）として、JF/M1-4モノクローナル抗体由来である配列番号63、65、67に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、およびCDR3を有するものでありうる。さらに好ましい実施形態では、本発明に係る抗体は、H鎖V領域（重鎖可変領域）中の相補性決定領域（CDR）として、配列番号56、58、60に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、およびCDR3を有し、かつL鎖V領域（軽鎖可変領域）中の相補性決定領域（CDR）として、配列番号63、65、67に示されるアミノ酸配列をそれぞれ有するCDR1、CDR2、およびCDR3を有するものが挙げられる。このような抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域中に任意のフレームワーク1〜4領域を有しうるが、マウス以外の生物由来の任意の抗体クラスのフレームワーク1〜4領域（例えば、ヒト由来のフレームワーク1〜4領域）を有していてもよい。JF/M1-4モノクローナル抗体由来のH鎖V領域のCDR1〜3および／またはL鎖V領域のCDR1〜3を有するこれらの抗体は、遺伝子型2aのHCV粒子に対して感染阻害活性を示す。【００６９】
別の実施形態では、本発明に係るより好適なHCV感染阻害活性を有する抗体は、HCV（特に、J6CF株のHCV）のE2タンパク質中のアミノ酸配列のNVTNPEDMPRPYCW（配列番号44）またはNYTIFKIRMYVGG（配列番号45）の中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列を、エピトープとして認識する抗体であることが好ましい。NVTNPEDMPRPYCW（配列番号44）またはNYTIFKIRMYVGG（配列番号45）中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列としては、NVTNPEDMRP（配列番号29）、NPEDMRPYCW（配列番号30）、NYTIFKIRMY（配列番号31）、IFKIRMYVGG（配列番号32）が挙げられる。【００７０】
さらに別の実施形態では、本発明に係るより好適なHCV感染阻害活性を有する抗体は、HCV（特に、J6CF株のHCV）のE1タンパク質中のアミノ酸配列FIVSPQHHWFVQDCNC（配列番号46）、MAWDMMMNWS（配列番号36）、E2タンパク質中のアミノ酸配列LIDYPYRLWHYPC（配列番号47）、NPEDMRPYCWHYPPRQ（配列番号48）またはNYTIFKIRMYVGG（配列番号45）の中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体であることが好ましい。例えば、それらアミノ酸配列FIVSPQHHWFVQDCNC（配列番号46）、MAWDMMMNWS（配列番号36）、E2タンパク質中のアミノ酸配列LIDYPYRLWHYPC（配列番号47）、NPEDMRPYCWHYPPRQ（配列番号48）またはNYTIFKIRMYVGG（配列番号45）の中の少なくとも10個の連続するアミノ酸配列としては、例えば、E1由来のエピトープについては、FIVSPQHHWF（配列番号33）、SPQHHWFVQD（配列番号34）およびHHWFVQDCNC（配列番号35）、MAWDMMMNWS（配列番号36）などが挙げられるが、E2由来のエピトープについてはLIDYPYRLWH（配列番号37）、YPYRLWHYPC（配列番号38）、DMRPYCWHYP（配列番号39）、NPEDMRPYCW（配列番号40）、PYCWHYPPRQ（配列番号41）などが挙げられる。【００７１】
本発明に係る抗体を選択するためには、より具体的には、HCVのタンパク質を担体に固定（固相化）し、次にサンプル抗体を加え、抗体/抗原複合体を形成するのに十分な時間および条件下で反応させればよい。ついで、かくして生成した複合体をシグナルとなる酵素、色素もしくはラジオアイソトープを結合させたサンプル抗体を認識する抗体（2次抗体）と接触させ、第2の混合物を生成させる。第2の混合物を抗体/抗原複合体を形成するのに十分な時間および条件下で反応させる。HCVタンパク質を認識する抗体の存在を酵素、色素もしくはラジオアイソトープのシグナルで検出することにより検出する。【００７２】
担体に固相化するHCVのタンパク質として、HCV粒子そのものを用いても良いし、HCVゲノム中の、coreタンパク質コード配列、E1タンパク質コード配列、E2タンパク質コード配列、p7タンパク質コード配列、NS2タンパク質コード配列、NS3タンパク質コード配列、NS4Aタンパク質コード配列、NS4Bタンパク質コード配列、NS5Aタンパク質コード配列またはNS5Bタンパク質コード配列からなるcDNAを用いて大腸菌、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞等で発現させたそれらがコードするタンパク質を用いてもよく、さらには該タンパク質を化学合成して用いてもよい。固相化に使用するタンパク質のアミノ酸長は限定されるものではないが、3アミノ酸以上、好ましくは8アミノ酸以上であればよい。【００７３】
JFH-1株またはJ6CF株のエンベロープタンパク質であるE1タンパク質およびE2タンパク質を哺乳動物細胞で発現させる例を下記に示す。JFH-1株またはJ6CF株のE1タンパク質は、JFH-1全長タンパク質のアミノ酸配列（NCBI Protein アクセッション番号BAB32872）の開始メチオニンを1番とした場合に、192番のアミノ酸で始まり、383番のアミノ酸で終わる。このE1タンパク質の353番のアミノ酸から383番のアミノ酸までが膜貫通ドメイン（C末端疎水性ドメインとも呼称する）と考えられている（Cocquerel, L. et al., J. Virol. 74:3623-3633, 2000）。【００７４】
JFH-1株またはJ6CF株のE2タンパク質は、上記アミノ酸配列の384番のアミノ酸で始まり、750番のアミノ酸で終わる。このE2タンパク質の722番のアミノ酸から750番のアミノ酸までが膜貫通ドメインと考えられている（Cocquerel, L. et al., J. Virol. 74:3623-3633, 2000）。【００７５】
哺乳動物細胞でタンパク質を培養上清中に分泌発現させる場合、該タンパク質がシグナルペプチドを持ち、膜貫通ドメインを持たないことが必要である。【００７６】
従って、E1またはE2タンパク質の膜貫通ドメインを含まないタンパク質は、それぞれ、上記の192番のアミノ酸から352番のアミノ酸、および384番のアミノ酸から721番のアミノ酸からなるが、質的に等価であればアミノ酸のずれは問題ない。本発明では、JFH-1株においてはE1タンパク質の192番のアミノ酸から352番のアミノ酸内、E2タンパク質の384番のアミノ酸から720番のアミノ酸内の配列、好ましくは384番のアミノ酸から714番のアミノ酸内の配列、J6CF株においてはE1タンパク質の192番のアミノ酸から352番のアミノ酸内、E2タンパク質の384番のアミノ酸から720番のアミノ酸内の配列であれば、膜貫通ドメインを含まないタンパク質として使用できる。これらのアミノ酸番号を他の配列に適用する場合は、上記JFH-1全長タンパク質のアミノ酸配列とのアラインメントにおいて対応するアミノ酸残基の番号で指定すればよい。【００７７】
E1およびE2タンパク質の膜貫通ドメインを含まないタンパク質をコードする核酸は、GenBankに記載されたJFH-1の核酸配列に基づいて、JFH-1のcDNAを鋳型としてPCRにより合成するか全合成することにより作製することができる。【００７８】
JFH-1以外のHCV株の対応するE1およびE2タンパク質の領域は、そのHCV株の配列を置換や欠失を考慮しながらJFH-1の配列と比較し配列間で一致する配列が最大となるように整列（アラインメント）させることにより容易に決定され得る。この解析は遺伝子情報処理ソフトウエア（例えば、GENETYX；ソフトウエア開発株式会社）を用いて行うことができる。【００７９】
E1およびE2タンパク質の膜貫通ドメインを含まないタンパク質を哺乳動物細胞で分泌発現させる場合、該タンパク質コードする核酸を、シグナルペプチドをコードする核酸の下流にコドンのフレームが合った状態（イン・フレーム）で連結し、さらにその3’末端に停止コドンを付加して発現ベクターに挿入する。シグナルペプチドは、分泌タンパク質のN末端に存在する15〜30アミノ酸残基の主として疎水性アミノ酸からなり、タンパク質の細胞膜通過機構に関与している。【００８０】
哺乳動物細胞でのタンパク質の分泌発現のために利用できるシグナルペプチドは、分泌タンパク質のものであればよい。シグナルペプチドを持つベクターとして、マウスGM-CSFのシグナルペプチド配列を持つベクター（特開昭63-276490）、IgG κ鎖のシグナルペプチド配列を持つベクターpSecTag/FRT/V5-His（インビトロジェン社）、プレプロトリプシンのシグナルペプチド配列を持つベクターp3xFLAG-CMV13(シグマ社)、IL-2のシグナルペプチド配列を持つベクターpFUSE-Fc2（インビボジェン社）およびIgMのシグナルペプチド配列を持つベクターpTriEx-7（ノバジェン社）などが上げられる。【００８１】
タンパク質を発現させる際に、目的タンパク質と標識となるタンパク質との融合タンパク質として発現させ、標識となるタンパク質に対する抗体や特異的に結合する分子で融合タンパク質の検出や精製を行うことができる。このような標識となるタンパク質をタグ（Tag）とも呼称する。標識となるタンパク質としては、限定されるものではないが、FLAGペプチド（flagペプチドFlagペプチドとも呼称する）、3x FLAGペプチド（3x FLAGペプチド、3x Flagペプチド、3x flagペプチドとも呼称する）、HAペプチド, 3x HAペプチド、mycペプチド、6x Hisペプチド、GSTポリペプチド、MBPポリペプチド、PDZドメインポリペプチド、アルカリフォスファターゼ、イムノグロブリン、アビジンなどが挙げられる。これらのペプチドまたはポリペプチドは通常、目的のタンパク質のN末端またはC末端に融合されるが、場合によっては目的のタンパク質内に挿入することもできる。また、プレプロトリプシンシグナルペプチドと3x FLAGペプチドの融合ポリペプチドを持つベクターはp3xFLAG-CMV-9としてシグマ社より入手できる。【００８２】
（７）モノクローナル抗体の調製
上記（６）により選択されたハイブリドーマを無血清培地、たとえばHybridoma-SFM（インビトロジェン社）に馴化させ、無血清培地にて培養した上清をモノクローナル抗体サンプルとすることができる。培養には、フラスコ、シャーレ、スピナーカルチャーボトル、ローラーボトルあるいは高密度培養フラスコCELLine（ベクトンデッキンソン社）を使用することができる。【００８３】
動物でモノクローナル抗体を調製する場合は、プリスタン処理（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、2週間飼育する）した8〜10週令のマウス、ヌードマウスまたはSCIDマウスに、上記で得られた抗HCVモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞2×107〜5×106細胞/匹を腹腔内に注射する。10〜21日間でハイブリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、モノクローナル抗体サンプルとすることができる。得られた抗体サンプルを遠心し、細胞やその破砕物を除去し、40〜50% 飽和硫酸アンモニウムによる塩析、カプリル酸沈殿法、DEAE- セファロースカラム、プロテインA-カラム、プロテインG-カラム、HiTrap IgM Purification HP-カラム（GEヘルスケア社）、mannan binding protein-カラム（ピアス社）あるいはゲル濾過カラムなどを単独または組み合わせて用いて、IgGまたはIgM画分を回収し、精製モノクローナル抗体が得られる。精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピングキット（ピアス社）などを用いて行うことができる。なお、上記（４）〜（７）により得られる本発明のHCV感染阻害活性を有する抗体のクラスとしては特に限定されるものではないが、本発明においてはIgGまたはIgMであることが好ましく、とりわけIgMの抗体がより好ましく得られる。【００８４】
（８）ヒト型抗HCVモノクローナル抗体の作製
ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報）。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する。【００８５】
CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Sato, K., et al., Cancer Res. 53:851-856, 1993）。【００８６】
本発明のHCV感染阻害活性を有するヒト型抗HCVモノクローナル抗体を作製する場合、一例としては、まず、抗HCVモノクローナル抗体のH鎖V領域（VH）およびL鎖V領域（VL）をコードするcDNAを以下のようにして取得する。抗HCVモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ等よりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAを、ファージあるいはプラスミドなどのベクターに挿入し、cDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のC領域部分あるいはV領域部分をプローブとして用い、VHをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミド、およびVLをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とする抗体のVHおよびVLの全塩基配列を決定し、塩基配列よりVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定する。【００８７】
また別の方法として、PCRを用いてVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングすることも可能である。前述のように調製したハイブリドーマのcDNAを鋳型として、それぞれの遺伝子に保存されたアミノ酸配列に基づいて設計した複数のプライマーを用いて増幅し、そのcDNA断片をクローニングベクターにクローン化してVHおよびVLをコードするcDNAを得ることができる。【００８８】
ヒト抗体のH鎖C領域（CH）およびL鎖C領域（CL）をコードする遺伝子の上流に、上記抗HCV抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを挿入することで、ヒト型抗HCVモノクローナル抗体をコードするcDNAを構築することができる。CHでは、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4を、CLでは、Cκ、Cλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、C領域を修飾してもよい。【００８９】
発現用ベクターとしては、哺乳動物の場合は、哺乳動物で発現可能なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’末端の下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。使用できるプロモーターとしては、ヒトサイトメガロウィルス、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40（SV40）等のウィルスプロモーター／エンハンサー、あるいはエロンゲーションファクター1α（EF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を挙げることができる。【００９０】
大腸菌の場合、大腸菌で発現可能なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばlaczプロモーター、araBプロモーター、Trpプロモーター、T7プロモーターなどを挙げることができる。【００９１】
昆虫細胞の場合は、昆虫細胞で発現可能なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’末端の下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。使用できるプロモーターとしては、ポリヘドリンプロモーター、バキュロウイルスOpNMPV由来の極初期OpIE2プロモーターなどを挙げることができる。【００９２】
本発明に係る、配列番号52に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号54に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する抗体も、上記のヒト型モノクローナル抗体の作製方法と同様の方法で作製することができる。【００９３】
（９）HCV感染阻害剤としての利用
本発明のHCV感染阻害活性を有する抗体をHCV感染阻害剤として用いる場合、HCVの感染メカニズムを解明するための研究ツールとして利用される他、医薬（例えば、医薬組成物）として好ましく使用され、より好ましくはC型肝炎の治療または予防薬として使用される。C型肝炎の治療または予防薬として使用される場合、臓器移植によるドナー臓器からのHCVの感染予防にも使用される。さらに既存の抗ウイルス剤、例えば、インターフェロン、リバビリンなどとの併用で使用されうる。【００９４】
本発明のHCV感染阻害活性を有する抗体は、任意のC型肝炎に対して有効であり得るが、例えば慢性肝炎または劇症肝炎に対して有効であり、また遺伝子型2aまたは1bのHCVによって引き起こされるC型肝炎に対して特に有効である。【００９５】
本発明のC型肝炎の治療または予防薬を患者に投与する場合、有効成分である本発明の抗体の有効投与量は、一回につき体重1kgあたり0.001mg〜1000mgの範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり0.01〜100000mg/bodyの投与量を選ぶことができるが、これらの投与量に制限されるものではない。また、上記投与時期としては、疾患の臨床症状が生ずる前後を問わず投与することができる。【００９６】
本発明のＣ型肝炎の治療または予防薬は、常法にしたがって製剤化され（Remington’s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark Publishing Company,Easton,米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。【００９７】
上記医薬的に許容される担体や添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。【００９８】
実際の添加物は、本発明のC型肝炎の治療または予防薬の剤形に応じて上記の中から単独でまたは適宜組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、注射用製剤として使用する場合、精製された抗HCV抗体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween20、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトール、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。【００９９】
（１０）HCV検出のための抗体の利用
本発明の抗体はHCV検出のための診断用組成物にも応用できる。【０１００】
例えば、本発明抗体を固相化した担体もしくはプレートとHCV抗原を含有するかもしれない試験サンプルとを接触させ混合物を生成させる。この混合物を抗体/抗原複合体を形成するのに十分な時間および条件下で反応させる。ついで、かくして生成した複合体をシグナルとなる酵素、色素もしくはラジオアイソトープを結合させたHCV抗原を認識する抗体と接触させ、第2の混合物を生成させる。第2の混合物を抗体/抗原複合体を形成するのに十分な時間および条件下で反応させる。HCV抗原の存在を酵素、色素もしくはラジオアイソトープのシグナルで検出することにより検出する。【０１０１】
別の方法として、HCV抗原を含有するかもしれない試験サンプルをニトロセルロース膜またはPVDF膜などタンパク質を固相化できる膜にスポットすることで、試験サンプルに含まれるタンパク質を固相化する。次に、この膜を5％スキムミルクあるいは1％BSA溶液に浸すことにより、膜をブロッキングする。膜を洗浄後、酵素、色素もしくはラジオアイソトープを結合させた本発明抗体溶液に浸し、膜に固相化された抗原と本発明抗体とが複合体を形成するのに十分な時間および条件下で反応させる。ついで、膜を洗浄後、膜に固相化されたHCV抗原の存在を酵素、色素もしくはラジオアイソトープのシグナルで検出することにより検出する。【０１０２】
（１１）抗HCV抗体の検出のための利用
本発明の別の利用方法として、本発明の抗体と同じエピトープを認識する抗HCV抗体を検出することができる。HCV抗原に対する本発明の抗体と試験抗体との競合プローブとして用いることができる。たとえば、HCV抗原をプレートや膜に固相化し、ついで酵素、色素もしくはラジオアイソトープを結合させた本発明抗体と試験抗体を加え、HCV抗原と抗体が複合体を形成するのに十分な時間および条件下で反応させる。酵素、色素もしくはラジオアイソトープのシグナルの固相への結合の減少を測定することにより、試験抗体が本発明抗体と同じエピトープか否かを検出できる。
【実施例】
【０１０３】
以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのものであり、本発明の技術的範囲を制限するものではない。【０１０４】
［実施例１］JFH-1-HCV粒子、J6/JFH-1-HCV粒子およびTH/JFH-1-HCV粒子の作製
劇症肝炎の患者から分離したＣ型肝炎ウイルス（HCV）JFH-1株（遺伝子型2a）のゲノムRNA全領域を逆転写して得たcDNA（ゲノムcDNA）をpUC19プラスミドのT7 RNAプロモーター配列の下流にクローニングしたプラスミドDNAであるpJFH-1は、Wakita, T. et al., Nat. Med., 11 (2005) p.791-796および国際公開WO 2004/104198に記載されたようにして作製した。なおpJFH-1中に挿入されているJFH-1株由来ゲノムcDNAの塩基配列は、配列番号1に示す通りである。このpJFH-1を、EcoRIで消化後、さらにBclIで部分消化し、EcoRI部位から最初のBclI部位までの断片（約2840 bp）を切除したプラスミドDNA断片を調製し、それを精製した。【０１０５】
一方、HCV J6CF株由来ゲノムcDNA（GenBank アクセッション番号AF177036、Yanagi, M., et al., Virology 262: 250-263 (1999)）をpUC19プラスミドのT7 RNAプロモーター配列の下流にクローニングしたpJ6CFは、国際公開WO 2006/022422に記載されたようにして作製した。このpJ6CFをEcoRIとBclIで部分消化し、得られた約2840 bpの断片を精製し、それを上記のEcoRI-BclIを切除したpJFH-1断片に連結して、プラスミドDNA pJ6/JFH-1を作製した。このpJ6/JFH-1中にクローン化されたDNA（配列番号2）は、J6CF株ゲノムcDNAの5’非翻訳領域、core、E1、E2、およびp7タンパク質をコードする配列およびNS2タンパク質のN末端から16位のアミノ酸残基までの領域をコードする配列に、JFH-1株ゲノムcDNAのNS2タンパク質の17位のアミノ酸残基からC末端までの領域をコードする配列、NS3、NS4A、NS4B、NS5AおよびNS5Bタンパク質を順にコードする配列および3’非翻訳領域を連結させたキメラウイルスゲノムcDNAである。【０１０６】
次に、プラスミドDNA pTH/JFH-1を以下の通りに作製した。まず、上記pJFH-1中のゲノムcDNAを鋳型として、それにPhusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMプライマー JFH-1-A（配列番号4：TGTAAAACGACGGCCAGT）およびJFH-1-B（配列番号5：（GGTTTAGGATTCGTGCTCATGGTGCACGGTCTACGAGACC）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。そこにPhusion DNAポリメラーゼ（FINNZYMES社）を0.5μl加えてPCR反応を行うことにより、JFH-1株の5’非翻訳領域に加えて、プライマーJFH-1-Bに含めたHCV TH株coreタンパク質コード配列の一部分（N末端側の16アミノ酸残基まで）を含むDNA断片の増幅を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.1と称した。次いで、HCV TH株由来ゲノムcDNAを含むプラスミドpTH（Wakita et al., J.Biol.Chem., 269： 14205-14210, (1994)およびMoradpour et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 246： 920-924 (1998)）を鋳型として、それにPhusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMプライマー TH-C（配列番号6：GGTCTCGTAGACCGTGCACCATGAGCACGAATCCTAAACC）およびTH-D（配列番号7：AGATAGCACAACCACCACAGGAGCTTGGCGAGGAATGCCT）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。そこにPhusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてPCR反応を行うことにより、TH株のcoreタンパク質コード配列の大部分〜NS2タンパク質コード配列の一部分までの配列に加えて、プライマーTH-Cに含めたJFH-1株の5’非翻訳領域の一部分およびプライマーYH-Dに含めたJFH-1株のNS2タンパク質コード配列の一部分を含むDNA断片の増幅を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.2と称した。さらに上記pJFH-1を鋳型として、それにPhusion High-Fidelity DNA Polymeraseキット（FINNZYMES社）に添付されていた10×緩衝液を10μl、2mM dNTP混合液を4μl、10μMプライマー JFH-1-E（配列番号8：AGGCATTCCTCGCCAAGCTCCTGTGGTGGTTGTGCTATCT）およびJFH-1-F（配列番号9：CAGCTACCGAGGGGTTAAGC）をそれぞれ1μl加え、最終的に脱イオン水を加え全量を49.5μlとした。そこにPhusion DNA Polymerase（FINNZYMES社）を0.5μl加えてPCR反応を行うことにより、JFH-1株のNS2、NS3タンパク質コード配列の一部分に加え、プライマーJFH-1-Eに含めたTH株のNS2タンパク質コード配列の一部分を含むDNA断片の増幅を行った。PCR反応は、98℃ 10秒、55℃ 15秒、72℃ 30秒からなる工程を1サイクルとして30サイクルの条件で行った。得られたPCR産物をPCR産物no.3と称した。【０１０７】
以上の通り調製したPCR産物no.1、no.2、no.3と、上記のプライマーJFH-1-A（配列番号4）およびJFH-1-E（配列番号8）とを用いてPCRを行うことにより、JFH-1株の5’非翻訳領域、TH株のcoreタンパク質コード配列からNS2タンパク質コード配列の一部分まで、JFH-1株のNS2タンパク質コード配列の一部分からNS3タンパク質コード配列の一部分までが連結された断片を得た（PCR産物no.4）。【０１０８】
次に、pJFH-1およびPCR産物no.4をそれぞれEcoR I、SpeIで制限酵素処理し、それらをライゲーションして、プラスミドDNA pTH/JFH-1を得た。pTH/JFH-1中にクローン化されたこのキメラウイルスゲノムcDNAの塩基配列を配列番号3に示す。【０１０９】
作製したpJFH-1、pJ6/JFH-1およびpTH/JFH-1を、Xba Iで切断した後、フェノールクロロホルム抽出、エタノール沈殿を行った。この切断したプラスミドを鋳型として、MEGAscript T7キット(Ambion社)を用いてRNAを合成した（WO 2006/022422を参照されたい）。こうして合成された各HCV RNAを以下の細胞導入に用いた。【０１１０】
3×106個のHuh-7細胞と5μgの各HCV RNAをCytomix溶液（120mM KCl, 0.15 mM CaCl2, 10 mM K2HPO4/KH2PO4, 25 mM Hepes, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 20 mM ATP, 50 mMグルタチオン 400μl）に懸濁し、4 mmキュベットに移した後、Gene Pulser（BioRad社）を用いて260 V、950μFで、Huh-7細胞へのHCV RNAのエレクトロポレーションを行った。その後、HCV RNA導入細胞を10 cm2ディッシュに播種し、継代培養を行った。継代時に、HCV抗原ELISAテストキット(オーソ社)を用いて培養上清中に含まれるHCV coreタンパク質を定量し、HCV粒子産生の確認を行った。coreタンパク質の量が多くHCV粒子産生の活性が高い培養上清を選択し、ウイルスストックとして保存した。【０１１１】
10% FCS-DMEM培地(1% MEM 非必須アミノ酸溶液(Invitrogen社), 10 mM HEPES-Tris(pH 7.3), 1 mM ピルビン酸ナトリウム)で培養した10 cmディッシュ中のHuh-7細胞に、上記で得たJFH-1およびJ6/JFH-1ウイルスストック(4 x 104 ffu/ml)を各々100μl程度加え、Huh-7細胞にHCVウイルスを感染させた。【０１１２】
適宜、細胞がコンフルエントにならないように継代し、225 cm2フラスコの1個から、4個へ、12個へと拡大培養を行った。次いでそのうちの225 cm2フラスコ 8個より細胞を剥がし、セルスタックTM 5段2個(コーニング社)に播種し、培地は650 ml/個となるように添加した。残り4個のフラスコから得た細胞を12個のフラスコに播種することにより、効率よくウイルス産生が続けられた。【０１１３】
継代翌日に培地を捨て、2% FCS-DMEM培地 (1% MEM 非必須アミノ酸溶液(invitrogen社), 10 mM HEPES-Tris(pH 7.3), 1 mM ピルビン酸ナトリウム) 650 mlを加えた。培地交換3日後に培地を回収し、0.45 μmフィルターを通した後、ディープフリーザーで保存した。また、培養上清回収後のセルスタックに2% FCS-DMEM培地 (1% MEM 非必須アミノ酸溶液, 10 mM HEPES-Tris(pH 7.3), 1 mM ピルビン酸ナトリウム) 650 mlを加え、培養を続けた。培地交換2日後に同様の作業を行ない、培養上清を回収した。さらに、同様の作業をもう1回繰り返した。ここで回収した培養上清を、後述の実施例で使用した。【０１１４】
以上により、上記pJFH-1、pJ6/JFH-1およびpTH/JFH-1から合成したRNAを導入した細胞の培養上清には、感染性のあるHCVウイルス粒子が産生されることが示された。【０１１５】
［実施例2］JFH-1、J6/JFH-1およびTH/JFH-1 HCV粒子の精製
実施例１で産生させたウイルス粒子は、以下4段階の工程を用いて精製した。【０１１６】
１）濃縮
Pellicon 2 Mini Ultrafiltration Module PLCMK V 0.1 m2 （Millipore社：300kDaカットオフ  カタログ番号P2C300V01、以下pellicon 2 miniと呼ぶ）を利用して、上記実施例で得たHCV粒子を含む培養上清を30〜50倍程度に濃縮した。0.45 μmフィルターで濾過した後に-80℃で保存した。【０１１７】
２）密度勾配超遠心
Ultra-clear 25×89mm遠心管（ベックマンコールター社：カタログ番号344058）に、冷却した60%ショ糖を含むTNE緩衝液(10 mM Tris-HCl(pH 7.4), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA)を3 ml加え、20%ショ糖を含むTNE緩衝液を7ml重層した。さらに、20%ショ糖を含むTNE緩衝液の上に、サンプルを25 ml重層した。SW-28（ベックマンコールター社）を用いて、28,000回転で4時間、4℃で超遠心を行った。【０１１８】
チューブの底面に25G注射針(テルモ社)を用いて穿孔を開け、2.5 ml、3 ml、4.5 ml、25 mlの順に画分を得た。【０１１９】
３）ヘパリンカラム精製
5 ml HiTrap Heparin HPカラムを20 mM リン酸緩衝液(pH 7)で平衡化した。希釈した上記画分（6本分以下）を5 ml/min以下の流速でHiTrap Heparinにアプライした。20 mM リン酸緩衝液(pH 7)を50 ml流し、カラムを洗浄した。500 mM NaClを含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7)を25 ml流し、溶出画分を得た。さらに3.8 M NaClを含む20 mM リン酸緩衝液(pH 7)を50 ml流し、カラムを洗浄した後に、20 mM リン酸緩衝液(pH 7)で平衡化しカラムを保存した。【０１２０】
４）濃縮および緩衝液置換
溶出画分をAmicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units(ミリポア社)およびTNE 緩衝液を用いてバッファー置換を行うとともに濃縮を行った。こうして得た濃縮液を、後述の免疫工程において感染性ウイルス粒子を含むウイルス液として使用した。【０１２１】
［実施例３］ウイルスの不活化
上記実施例２の工程１）〜４）で得た濃縮C型肝炎ウイルスを、紫外線照射にて不活化した。紫外線の線源としては東芝社製GL-15を使用した。精製した、感染力価1 x 106 ffu/mlのC型肝炎ウイルス粒子（JFH-1株）含有溶液をシリコンコーティングされたポリエチレン製エッペンチューブ（アシスト社製）に入れ、紫外線の照射強度が20mW/cm2となるような距離に置き、5分間UV-Cを照射した。【０１２２】
処置後、C型肝炎ウイルス粒子をダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中に50倍、250倍、1250倍、6250倍、31250倍、156250倍、781250倍で段階希釈した。【０１２３】
前日に、96ウェル ポリ-L-リジンコーティングプレート（コーニング社製；Corning 96 Well Clear Flat Bottom Poly-L-Lysine Coated Microplate）にHuh-7細胞を1 x 104 細胞/ウェルで播種しておき、そこに段階希釈した上記ウイルス粒子を播種して37℃で72時間培養をおこなった。【０１２４】
培養上清を取り除いた後に、氷冷したメタノール中にプレートを浸し、細胞を固定した。その後、メタノールを風乾により除去し、0.3% Triton(登録商標)-X100（GEヘルスケア社）を含んだブロックエース（登録商標）（大日本製薬社）で細胞の可溶化処置をした。クローン2H9 抗HCV-core抗体（Wakita, T. et al., Nat. Med. 11:791-796,2005）およびヤギ抗-マウスIgG-Alexa488（モレキュラープローブ社）を用いて、C型肝炎ウイルス感染細胞を検出し、蛍光顕微鏡（オリンパス社製IX-70）下で計数した。紫外線処置後のC型肝炎ウイルスの感染力価が検出限界以下であることが確認された。後述の実施例におけるマウスへの投与には、このように感染性が完全消失したことが示されたHCV粒子を使用した。【０１２５】
［実施例４］不活化HCV粒子を用いたマウスの免疫
まず、アジュバントの調製を行った。実施例３に示したのと同様にして不活化したJ6/JFH-1-HCV粒子（HCV coreタンパク質 1.4μg相当量、HCV総タンパク質10 μg相当量）を含んだ溶液100μlに等量のフロインドの完全アジュバント(Difco社)を加え、エマルジョンを形成させた。エマルジョンの形成はビーカーに適量の水を準備しておき、混合液を水面に1滴落として液が分散しないことにより確認した。Balb/cマウス（7週齢、雌）をエーテル麻酔し、上記のように調製した不活化J6/JFH-1-HCV粒子を含むエマルジョンを腹腔内投与することにより免疫した。【０１２６】
2週間後、J6/JFH-1-HCV粒子（HCV core 1.4 μg相当量、HCV総タンパク質10 μg相当量）を含んだ溶液100μlに等量のフロインドの不完全アジュバント(Difco社)を加え、エマルジョンを形成させ、同様に腹腔内投与してさらに免疫した。さらに3週間後、同様に腹腔内投与して免疫した。【０１２７】
また、実施例３で不活化したJFH-1-HCV粒子を用いて上記記載の免疫スケジュールで同様にしてマウスを免疫した。【０１２８】
［実施例５］不活化HCV粒子で免疫したマウス由来の血清におけるHCV感染阻害活性の測定
実施例４で免疫したマウスのうち、遺伝子型2aの構造タンパク質をもつ不活化HCV粒子（J6/JFH-1-HCV粒子およびJFH-1-HCV粒子）で免疫したマウスから部分採血した血清について、HCV感染阻害活性を測定した。【０１２９】
Huh7細胞を96ウェルプレートに5x103 細胞/ウェルで播種し、一晩培養した。上記実施例２の１）の工程で得た濃縮J6/JFH-1-HCVウイルス液にそれぞれ血清とヘパリン(10 単位/mL)を加え、37℃で1時間インキュベーションした。血清は培地（10% FCS(invitrogen社),1% MEM 非必須アミノ酸溶液(invitrogen社), 10 mM HEPES-Tris(pH 7.3), 1 mM ピルビン酸ナトリウムを含むDMEM）にて20倍および100倍希釈して用いた。培地を捨てた後、ウイルス液を50μl/ウェルで加えて、37℃で3時間インキュベーションした。培地を捨てた後、PBSで1回洗浄し、100μl/ウェルの培地を加えて37℃で48時間インキュベーションした。培地を捨てた後、PBSで1回洗浄し、100μl/ウェルのIsogen（和光純薬）を加えて添付書に従い全RNAを抽出した。全RNAを定量的RT-PCRにより定量し、全RNA 1μgあたりのRNAのコピー数を決定した。【０１３０】
さらに、遺伝子型2aの構造タンパク質をもつJ6/JFH-1-HCV粒子で免疫したマウス由来の血清が、遺伝子型1bの構造タンパク質をもつHCVに対して感染阻害活性を有するかどうかを以下のように検討した。そのため、実施例１および２で作製した、遺伝子型1bのTH株の構造タンパク質をもつキメラHCV粒子（TH/JFH-1-HCV）および遺伝子型2aの構造タンパク質をもつキメラJ6/JFH-1-HCV粒子を、感染因子としてそれぞれ使用して、上記と同様の方法により血清の感染阻害活性を測定した。対照実験は、HCV粒子を投与する前に採血した正常マウス血清を用いること以外は同様にして行った。【０１３１】
その結果、J6/JFH-1-HCV粒子で免疫して62日目のマウスから得られた血清については、20倍希釈で、対照実験（100％）と比較してJ6/JFH-1-HCVの感染量が15％に減少したことから、遺伝子型2aの構造タンパク質をもつHCV粒子に対する感染阻害活性が認められた（図１Ａ）。さらに本血清では、20倍希釈で、対照実験（100％）と比較してTH/JFH-1-HCVの感染量が34％に減少したことから、遺伝子型1bの構造タンパク質をもつHCV粒子に対する感染阻害活性が認められた（図１Ｂ）。この結果は、遺伝子型2aのHCVで免疫して誘導される抗体中には、遺伝子型2aのHCVの感染を阻害する抗体だけではなく、遺伝子型1bのHCVの感染を阻害する抗体も存在することを示している。【０１３２】
また、JFH-1-HCV粒子で免疫して42日目の2匹のマウスの血清においても、100倍希釈でさえ、対照実験で用いたHCV粒子投与前血清（100％）と比較して、遺伝子型2aのJFH-1-HCVの感染量が減少したことから、感染阻害活性が認められた（図２）。【０１３３】
次に、J6/JFH-1-HCV粒子を投与したマウスの血清およびHCV粒子投与前の正常マウス血清200μlをそれぞれ1mlのプロテインGセファロースカラム（GEヘルスケア社）にかけて、洗浄後、0.1Mグリシン緩衝液（pH3.0）にて1ml/画分で溶出した。溶出されたタンパク質のピーク画分をIgG画分とし、IgG画分と非吸着画分（IgM画分）とに分けて精製画分として取得し、それぞれのHCV感染阻害活性を上記と同様にして以下のように測定した。【０１３４】
上記測定で用いた血清の代わりに、HCV粒子投与マウス血清より得られた精製IgGを100 μg/mlもしくは10 μg/ml、または正常マウス血清より得られた精製IgGを100 μg/mlの濃度で用いた。またHCV粒子（ウイルス液）を107コピー/mlとなるようにIgG等と混合し、1時間室温で静置した。次いで、前日に24ウェルプレートに4 x 104個/ウェルとなるように播き培養しておいたHuh-7細胞の培地を捨て、そこに上記のウイルス粒子とIgG抗体の混合液を200μl/ウェルで加えた。その細胞を3時間37℃でインキュベートし、ウイルス粒子を含んだ溶液を捨て、PBSでウェルを一回洗浄した。新しい培地を加えて2日間培養し、培地を捨て、PBSで一回洗浄し、Trizol試薬（インビトロジェン社）を用いて細胞からRNAを抽出した。抽出したRNAに含まれるHCV RNAのコピー数を測定した。RNAコピー数の測定方法はTakeuchiらの方法（Gastroenterology.(1999) 116:p636-42.）に準じて行った。【０１３５】
次に、プロテインGセファロース非結合画分（IgM画分）についても同様に感染阻害活性を測定した。陽性対照として、J6/JFH-1-HCV粒子投与マウス血清（未精製）を用いた。J6/JFH-1-HCV粒子投与マウス血清中のタンパク質含量とIgM画分中のタンパク質含量を測定し、両サンプルのタンパク質の添加量が同一になるようにして実験を行い、感染阻害活性を測定した。具体的には、J6/JFH-1-HCV粒子投与マウス血清は5%量で、HCV粒子は107コピー/mlとなるように混合した。一方、IgM画分は上記5％マウス血清と同量のタンパク質を含む量で、HCV粒子は107コピー/mlとなるように混合した。これらの混合液を1時間室温で静置した。前日に24 ウェルプレートに4 x 104 個/ウェルとなるように播き培養しておいたHuh-7細胞の培地を捨て、そこに上記のウイルス粒子と血清／IgMの混合液を200μl/ウェルで加えた。その細胞を3時間37℃でインキュベートし、ウイルス粒子を含んだ溶液を捨て、PBSでウェルを一回洗浄した。新しい培地を加え2日間培養し、培地を捨て、PBSで一回洗浄し、Trizol試薬（インビトロジェン社）を用いて細胞からRNAを抽出した。抽出したRNAに含まれるHCV RNAのコピー数を測定した。RNAコピー数の測定方法はTakeuchiらの方法（Gastroenterology.(1999) 116:p636-42.）に準じて行った。【０１３６】
以上の結果、図３に示すように、J6/JFH-1-HCV粒子投与マウス血清由来のIgM画分について、HCV感染阻害活性が認められた。【０１３７】
［実施例６］ハイブリドーマの作製
マウス骨髄腫細胞株SP2/0（ECACCより入手）を5×10-5Mの2-メルカプトエタノール、100単位/ｍｌのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、および10%の牛胎児血清(FCS、インビトロジェン社製）を含有するダルベッコ改変MEM培地(インビトロジェン社)にて培養し、対数増殖期のSP2/0細胞を得た。その細胞を、血清を含まないダルベッコ改変MEMにて3回洗浄した。【０１３８】
次に実施例４のHCV粒子（JFH-1粒子およびJ6/JFH-1粒子）を投与したマウスより脾細胞を調製し、血清を含まないダルベッコ改変MEMにて3回洗浄した。SP2/0細胞とマウス脾細胞とを1:5の比率になるように50mlの遠心チューブに入れ、1,000回転で10分間遠心した。上清を完全に吸引して取り除き、チューブの底を指でタッピングし、ペレットをほぐした。細胞に37℃にて温めておいた50%ポリエチレングリコール-1500溶液（ロシュ社）を1分間かけて1ml加え、37℃にて、1分間反応を続けた。次に1mlの血清不含ダルベッコ改変MEMを1分間かけて徐々に加え、再度1mlの血清不含ダルベッコ改変MEMを1分間かけて徐々に加えた。最後に7mlの血清不含ダルベッコ改変MEMを3分間かけて加えることにより、エチレングリコール溶液を希釈した。希釈液中のこの細胞を1,000回転で10分間遠心し、そこに50mlのHT培地（5×10-5Mの2-メルカプトエタノール、100単位/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンおよび10%のFCS、10-4Mのヒポキサンチンおよび1.5×10-5Mのチミジンを含有するダルベッコ改変MEM培地）を加え、細胞ペレットをピペッティングによりほぐした。細胞を75cm2のフラスコ2本に移して、37℃、5%CO2インキュベーターで一晩培養した。【０１３９】
細胞を1,000回転で10分間遠心して回収した。細胞ペレットをタッピングしてほぐし、10mlのダルベッコ改変MEMに懸濁した。この細胞懸濁液を90mlのメチルセルロースHAT選択培地（Stem Cell Technology社）に加え、良く混合して、10cmのディッシュに10mlずつ加え、37℃、5%CO2インキュベーターで培養した。【０１４０】
10〜14日間培養し、単一の細胞から増殖したと考えられるハイブリドーマのコロニーをピペットチップで吸い上げ、それを10%のハイブリドーマ増殖因子（Bio Veris社）を含むHT培地を200μlずつ加えた96ウェルプレートの各ウェルに入れ、培養した。【０１４１】
［実施例７］HCV感染阻害抗体産生ハイブリドーマのスクリーニング
実施例６で作製されたハイブリドーマが十分に増殖した時点で、培養上清を回収し、以下の通りスクリーニングを行った。【０１４２】
スクリーニングは、E1タンパク質およびE2タンパク質をプレートに固定し、ハイブリドーマ上清中の抗体がプレートに固定したそれらタンパク質に結合するかどうかをEIAにて評価すること、およびハイブリドーマ上清中の抗体がHCV感染を阻害することができるかどうかを評価することによって行った。【０１４３】
１）J6CF株由来のE1およびE2タンパク質の作製
J6CF株のE1タンパク質およびE2タンパク質は以下に示すようにして調製した。遺伝子型2aのJ6CF株由来ゲノムcDNA（GenBankアクセッション番号AF177036）を鋳型として、J6CF全長タンパク質配列（J6CF株ゲノム配列にコードされる一つながりのタンパク質配列；GenBankアクセッション番号AF177036にも記載のアミノ酸配列）のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合に192番目から352番目までに相当する、膜貫通領域を含まないE1タンパク質をコードする遺伝子を、Advantage GC2 PCRキット（タカラバイオ社）、ならびにJ6E1dTM-s（配列番号10：CACAAGCTTGCCGAAGTGAAGAACATCAGT）およびJ6E1dTM-as（配列番号11：GCTCTAGATTAATGAGCCCCGCTAATGATGTC）を用いてPCR法で増幅した。増幅したDNA断片をpCR-TOPO（インビトロジェン）中にクローニングし、3つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンをpTOPO-J6E1dTMと名付けた。【０１４４】
pTOPO-J6E1dTMをHindIIIとXbaIで消化し約500bpのDNA断片（E1断片）を含むゲルを切り出した。GeneElute(SIGMA)を用いて、DNA断片をそのゲルから精製した。同様に、p3xFLAG-CMV-9（SIGMA）をHindIIIおよびXbaIで消化後、1％アガロースゲルにて電気泳動し、約6,400bpの断片を含むゲルを切り出し、GeneElute(SIGMA)を用いてDNA断片をゲルから精製した。それぞれの精製したDNA断片をT4リガーゼ(タカラバイオ社)を用いて連結させ、J6CFのE1断片を組み込んだ動物細胞発現ベクターCMV-3xFLAGJ6E1dTMを得た。【０１４５】
次に、J6CF全長タンパク質配列のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合に384番目から720番目までに相当する、膜貫通領域を含まないE2タンパク質をコードする遺伝子を、Advantage GC2 PCRキット（タカラバイオ社）、ならびにJ6E2dTM-s（配列番号12：CACAAGCTTCGCACCCATACTGTTGGGG）およびJ6E2dTM-as（配列番号13：GCTCTAGATTACCATCGGACGATGTATTTTGT）を用いてPCR法で増幅した。増幅したDNA断片をpCR-TOPO（インビトロジェン）中にクローニングし、3つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンをpTOPO-J6E2dTMと名付けた。【０１４６】
次にp3xFLAG-CMV-9（SIGMA）をHindIIIとXbaIで消化して得たDNAと、pTOPO-J6E2dTMをHindIIIとXbaIで切り出した約1,000bpのDNA断片とを、T4 DNAリガーゼにて連結し環状化した。このベクターをCMV-3xFLAGJ6E2dTMと名付けた。【０１４７】
これらのCMV-3xFLAGJ6E1dTMおよびCMV-3xFLAGJ6E2dTMを、以下のようにしてサル腎臓由来COS1細胞（理研細胞銀行から受託番号RCB0143に基づき入手）に導入しタンパク質を発現させた。【０１４８】
COS1細胞は10%ウシ胎児血清（Invitrogen社）、100U/ml ペニシリン、100μg/ml 硫酸ストレプトマイシンを含有するダルベッコMEM（D-MEM:vitrogen社）にて培養した。COS1細胞を遺伝子導入前日に2倍のスプリットレシオで、150cm2培養フラスコ（コーニングコースター）に播き、37℃、5％CO2インキュベーターで一晩培養した。【０１４９】
一方、D-MEM培地(Invitorogen)に終濃度がそれぞれ400μg/ml、100μMとなるようにDEAEデキストラン（Pharmacia）とクロロキン（SIGMA）を加え、さらに本溶液13ml当たり0.1μg/μlの濃度で上記発現ベクター（CMV-3xFLAGJ6E1dTMまたはCMV-3xFLAGJ6E2dTM）を50μg加えて培養した。次に、培養したCOS1細胞の上清を吸引除去後、10mlのPBS(-)(ニッスイ)を添加して細胞を1回洗浄した。PBS(-)を吸引除去後、DEAEデキストラン-DNA混合液を13ml/150 cm2フラスコで加え、37℃、5％CO2存在下で4時間インキュベートした。【０１５０】
4時間後、DEAEデキストラン-DNA混合液を吸引除去し、10mlのPBSで1回洗浄し、CHO-SFM培地(Invitorogen)を50ml/フラスコにて加え、37℃、5％CO2存在下で培養した。4日後、培養上清を50mlの遠心管（コーニングコースター）に回収した。回収した上清は6,000rpm（HITACHI RPR9-2ローター使用）、30分、4℃で遠心後、0.2μmの濾過フィルター(Whatman社)を用いて濾過した。【０１５１】
培養上清は、抗FLAG M2アガロース（SIGMA）を用いて以下のように精製した。500mlの培養上清に対し、1mlの抗FLAG M2アガロースを添加し、スピナーボトルで撹拌しながら、4℃（低温室）で2時間反応させた。2時間後、上清と抗FLAG M2アガロースの混合液をエコノカラム(BIO-RAD)に移し、素通り画分を回収した。次に、10mlのTBS(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.4)で2回洗浄した。0.1Mグリシン-HCl(pH3.5)にて1ml/画分ずつ6画分溶出した。溶出後、直ちに1M Tris-HCl(pH9.5)を添加し、中性に戻した。各画分の20μlを還元下にてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーにて染色した。その結果、J6CF株由来のE1タンパク質またはE2タンパク質が精製されていることを確認した。【０１５２】
２）JFH-1株由来のE1およびE2タンパク質の作製
JFH-1株のE1およびE2タンパク質は以下に示すようにして調製した。遺伝子型2aのJFH-1株由来ゲノムcDNAを鋳型として、全長タンパク質配列（JFH-1株ゲノム配列にコードされる一つながりのタンパク質配列；GenBankアクセッション番号AB047639にも記載のアミノ酸配列、Kato, T. et al., Gastroenterology, 125(2003) p1808-1817）のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合に192番目から352番目までに相当する、E1タンパク質をコードする遺伝子を、Advantage GC2 PCRキット（タカラバイオ社）、ならびにJFHE1dTM-s（配列番号14：CACAAGCTTGCCCAGGTGAAGAATACCAGT）およびJFHE1dTM-as（配列番号15：GCTCTAGATTAGTGAGCCCCGCTAACGATGTC）を用いてPCR法で増幅した。こうして増幅した断片をpCR-TOPO中にクローニングした。3つのクローンについて塩基配列の解析を行い、正しい塩基配列のインサートを有するクローンをpTOPO-JFHE1dTMと名付けた。【０１５３】
pTOPO-JFHE1dTMをHindIIIとXbaIで消化し、約500bpのDNA断片（E1断片）を含むゲルを切り出した。GeneElute(SIGMA)を用いて、DNA断片をゲルから精製した。同様に、p3xFLAG-CMV-9（SIGMA）をHindIIIおよびXbaIで消化後、1％アガロースゲルにて電気泳動し、約6,400bpの断片を含むゲルを切り出し、GeneElute(SIGMA)を用いて、DNA断片をゲルから精製した。それぞれの精製したDNA断片をT4リガーゼ(タカラバイオ社)にて連結させ、JFH-1株のE1断片を組み込んだ動物細胞発現ベクターCMV-3xFLAGJFHE1dTMを得た。【０１５４】
次に、JFH-1株全長タンパク質配列のN末端の開始メチオニンを1番目とした場合に384番目から714番目までに相当する、膜貫通領域を含まないE2タンパク質をコードする遺伝子を、Advantage GC2 PCRキット（タカラバイオ社）、ならびにJFE2dTM-s（配列番号16：CACAAGCTTGGCACCACCACCGTTGGAG）およびJFE2dTM-as（配列番号17：GCTCTAGATTATGTGATAGCAGGTGAGAGGCC）を用いてPCR法で増幅した。増幅したDNA断片をpCR-TOPO（インビトロジェン）中にクローニングし、3つのクローンについて塩基配列の解析を行った。正しい塩基配列のインサートを有するクローンをpTOPO-JFHE2dTMと名付けた。【０１５５】
pTOPO-JFHE2dTMをHindIIIとXbaIで消化し約1,000bpのE2断片を含むゲルを切り出した。GeneElute(SIGMA)を用いて、DNA断片をゲルから精製した。同様に、p3xFLAG-CMV-9 vector（SIGMA）をHindIIIおよびXbaIで消化後、1％アガロースゲルにて電気泳動し、約6,400bpの断片を含むゲルを切り出した。GeneElute(SIGMA)を用いて、DNA断片をゲルから精製した。それぞれの精製したDNA断片をT4リガーゼ(タカラバイオ社)にて連結させ、JFH-1のE2断片が組み込まれた動物細胞発現ベクターCMV-3xFLAGJFHE2dTMを得た。【０１５６】
これらのCMV-3xFLAGJFHE1dTMおよびCMV-3xFLAGJFHE2dTMを、以下のようにしてサル腎臓由来COS1細胞（理研細胞銀行から受託番号RCB0143に基づき入手）に導入しタンパク質を発現させた。【０１５７】
COS1細胞は10%ウシ胎児血清（Invitrogen社）、100U/ml ペニシリン、100μg/ml 硫酸ストレプトマイシンを含有するダルベッコMEM（D-MEM:vitrogen社）にて培養した。COS1細胞を遺伝子導入前日に2倍のスプリットレシオで、150cm2培養フラスコ（コーニングコースター）に播き、37℃、5％CO2インキュベーターで一晩培養した。【０１５８】
一方、D-MEM培地(Invitorogen)に終濃度がそれぞれ400μg/ml、100μMとなるようにDEAEデキストラン（Pharmacia）とクロロキン（SIGMA）を加え、さらに本溶液13ml当たり0.1μg/μlの濃度の上記発現ベクター（CMV-3xFLAGJFHE1dTMまたはCMV-3xFLAGJFHE2dTM）を50μg加えて培養した。次に、培養したCOS1細胞の上清を吸引除去後、10mlのPBS(-)(ニッスイ)を添加して細胞を1回洗浄した。PBS(-)を吸引除去後、DEAEデキストラン-DNA混合液を13ml/150 cm2フラスコで加え、37℃、5％CO2存在下で4時間インキュベートした。【０１５９】
4時間後、DEAEデキストラン-DNA混合液を吸引除去し、10mlのPBSで1回洗浄し、CHO-SFM培地(Invitorogen)を50ml/フラスコにて加え、37℃、5％CO2存在下で培養した。4日後、培養上清を50mlの遠心管（コーニングコースター）に回収した。回収した上清は6,000rpm（HITACHI RPR9-2ローター使用）、30分、4℃で遠心後、0.2μmの濾過フィルター(Whatman社)を用いて濾過した。【０１６０】
培養上清は、抗FLAG M2アガロース（SIGMA）を用いて以下のように精製した。500mlの培養上清に対し、抗FLAG M2アガロースを添加し、スピナーボトルで撹拌しながら、4℃（低温室）で2時間反応させた。2時間後、上清と抗FLAG M2アガロース混合液をエコノカラム(BIO-RAD)に移し、素通り画分を回収した。次に、10mlのTBS(50mM Tris-HCl、150mM NaCl、pH7.4)で2回洗浄した。0.1Mグリシン-HCl(pH3.5)にて1ml/画分ずつ6画分溶出した。溶出後、直ちに1M Tris-HCl(pH9.5)を添加し、中性に戻した。各画分の20μlを還元下にてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーにて染色した。JFH-1株由来のE1タンパク質またはE2タンパク質が精製されていることを確認した。【０１６１】
３）E1およびE2タンパク質の固相化プレートの作製
J6CF株由来のE1およびE2タンパク質がそれぞれ1μg/mlとなるようにPBSで希釈した。このE1とE2の混合タンパク質溶液をイムノプレート（NUNC社）の各ウェルに50μl加え、4℃にて一晩静置し、タンパク質をプレートに固定した。タンパク質溶液を除き、各ウェルに150μlのブロックエース（大日本製薬）を加え室温で4時間ブロッキングした。【０１６２】
JFH-1株由来のE1およびE2タンパク質についても2つのタンパク質がそれぞれ1μg/mlとなるようにPBSで希釈した。このE1とE2の混合タンパク質溶液をイムノプレート（NUNC社）の各ウェルに50μl加え、4℃にて一晩静置し、タンパク質をプレートに固定した。タンパク質溶液を除去し、各ウェルに150μlのブロックエース（大日本製薬）を加え室温で4時間ブロッキングした。【０１６３】
これらのプレートを、後述のハイブリドーマの培養上清中の抗HCV抗体のスクリーニングに使用した。【０１６４】
４）J6/JFH-1-HCV粒子を抗原として作製したハイブリドーマの上清のスクリーニング
上記３）で作製したJ6CF株由来のE1およびE2タンパク質が固定されたプレートを0.1%Tween20(SIGMA)を含むPBSで4回洗浄し、実施例６で得られた各ハイブリドーマ上清サンプルを各ウェルに50μl加え、室温で1時間、プレートミキサーにて振とうさせながら反応させた。反応後、0.1%Tween20(SIGMA)を含むPBSで4回洗浄した後、各ウェルに、0.1%Tween20を含むPBSで5,000倍に希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(Amersham Biosciences)を50μl加え、室温で1時間、振とうさせながら反応させた。反応後、0.1%Tween20(SIGMA)を含むPBSで4回洗浄し、ペルオキシダーゼ発色キット（住友ベークライト）を用いて発色させ、マルチスキャン（タイターテック社）にて450nmでの吸光度を測定し、陽性クローンを選抜した。【０１６５】
次に、陽性クローンの培養上清について、J6/JFH-1-HCV粒子を感染因子として用いて、HCV感染阻害活性について評価した。具体的には、感染力価1 x 106 ffu/mlのJ6/JFH1-HCV粒子含有溶液とハイブリドーマ上清を等量混合し、37℃にて1時間培養した。その後、前日にHuh-7細胞を1 x 104 細胞/ウェルで播種しておいた96ウェルポリ-L-リジンコーティングプレート（コーニング社製・Corning 96 Well Clear Flat Bottom Poly-Ｌ-Lysine Coated Microplate）に、J6/JFH-1-HCV粒子とハイブリドーマ培養上清の混合サンプルを加えて、37℃で72時間培養を行った。【０１６６】
サンプルを取り除いた後に、氷冷したメタノール中にプレートを浸し、細胞を固定した。その後、メタノールを風乾により除去し、0.3% Triton(登録商標)-X100（GEヘルスケア社）を含んだブロックエース（登録商標）（大日本製薬社）で細胞の可溶化処置をした。クローン2H9抗HCV-core抗体（Wakita, T. et al., Nat. Med. 11:791-796,2005）およびヤギ抗マウスIgG-Alexa488（モレキュラープローブ社）を用いて、C型肝炎ウイルス感染細胞を蛍光顕微鏡（IX-70；オリンパス社製）下で計数した。感染細胞の少ないサンプルを、HCV感染阻害活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株として2種類選別した。これらの細胞株を限界希釈法にてクローン化して、J6/1G11-25（受託番号：FERM BP-10980）およびJ6/4D4-2（受託番号：FERM BP-10981）を得た。【０１６７】
５）JFH-1-HCV粒子を抗原として作製したハイブリドーマの上清のスクリーニング
上記３）で作製したJFH-1株由来のE1およびE2タンパク質が固定されたプレートを0.1%Tween20(SIGMA)を含むPBSで4回洗浄し、実施例６で得られた各ハイブリドーマ上清サンプルを各ウェルに50μl加え、室温で1時間、プレートミキサーにて振とうさせながら反応させた。反応後、0.1%Tween20(SIGMA)を含むPBSで4回洗浄し、各ウェルに0.1%Tween20を含むPBSで5,000倍に希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(Amersham Biosciences)を50μl加え、室温で1時間、振とうさせながら反応させた。反応後、0.1%Tween20(SIGMA)を含むPBSで4回洗浄し、ペルオキシダーゼ発色キット（住友ベークライト）を用いて発色させ、マルチスキャン（タイターテック社）にて450nmでの吸光度を測定した。陽性クローンから、JFH-1株のE1および/またはE2タンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株として4種類選別した。次に、陽性クローンの培養上清について、J6/JFH-1-HCV粒子を感染因子として用いて、４）と同様にしてHCV感染阻害活性について評価した。その結果、陽性クローンJF/M1-4（受託番号：FERM BP-10982）を得た。陽性クローンJF/M1-4は、JFH-1株のE1および/またはE2タンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生し、かつJ6/JFH-1-HCVの感染を阻害する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株である。【０１６８】
［実施例８］HCV感染阻害モノクローナル抗体の解析
実施例７で選抜された3つのハイブリドーマ細胞株J6/1G11-25（受託番号：FERM BP-10980）、J6/4D4-2（受託番号：FERM BP-10981）、JF/M1-4（受託番号：FERM BP-10982）は、2007年7月19日付で、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1  中央第6）に寄託されている。【０１６９】
これらのハイブリドーマ細胞株から産生されるHCV感染阻害モノクローナル抗体の特性解析は、以下の通り行った。【０１７０】
１）抗体のサブクラス
マウス抗体のサブクラスの解析については、陽性クローンの培養上清をImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit(ピアス社)を用いて行った。各クローンのアイソタイプの解析の結果、すべてのクローンはH鎖がμ、L鎖がκであることが判明したことからIgMであることが示された。【０１７１】
２）分子量
ハイブリドーマを無血清培地にて培養し、その培養上清を50％硫酸アンモニウムで塩析し、PBSにて透析した。その後、還元条件下にてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、クマシーブリリアントブルーで染色し、各抗体のH鎖およびL鎖の分子量を見積もった。その結果、全てのクローンの抗体の分子量はH鎖が70kDa、L鎖が23kDaであった。【０１７２】
３）各モノクローナル抗体のHCV感染阻害活性の評価
各ハイブリドーマ細胞株の培養上清からモノクローナル抗体を精製した。この抗体精製は無血清培地であるHybridoma-SFMにて馴化させ培養したハイブリドーマの上清を50%硫安沈殿させ、PBSにて透析することにより行った。得られた精製抗体サンプルの濃度は、マウス精製IgMκ（シグマ社）をスタンダードとしてSDS-PAGEを行いクマシー染色により算出した。【０１７３】
そのように調製した各ハイブリドーマ細胞株由来の精製モノクローナル抗体のHCV感染阻害活性の評価は、上記と同様に、感染性HCV粒子と共に細胞に添加してインキュベートし、感染細胞中のHCV RNAの濃度を測定し、細胞中のHCV RNA量を解析することにより行った。細胞中のHCV RNAは感染性HCV粒子により複製されるので、モノクローナル抗体により感染が抑制される場合には、細胞中のHCV RNA量は減少するはずである。【０１７４】
具体的には、各精製モノクローナル抗体が10 μg/ml、感染性HCV粒子（J6/JFH-1-HCV粒子）が107 コピー/mlとなるように混合し、1時間室温で静置した。前日に24ウェルプレートに4 x 104個/ウェルとなるように播き培養しておいたHuh-7細胞の培地を捨て、そこにJ6/JFH-1-HCV粒子と精製モノクローナル抗体の混合液を200μl/ウェルで加えた。その細胞を3時間37℃でインキュベートし、ウイルス粒子を含んだ溶液を捨て、PBSでウェルを一回洗浄した。新しい培地を加え2日間培養し、培地を捨て、PBSで一回洗浄し、Trizol試薬（インビトロジェン社）を用いてRNAを抽出した。抽出したRNAに含まれるHCV RNAのコピー数を測定した。RNAコピー数の測定方法はTakeuchiらの方法（Gastroenterology.(1999) 116:p636-42.）に準じて行った。【０１７５】
ハイブリドーマ細胞株J6/1G11-25、J6/4D4-2、JF/M1-4由来の精製モノクローナル抗体（それぞれ、J6/1G11-25モノクローナル抗体、J6/4D4-2モノクローナル抗体、JF/M1-4モノクローナル抗体と呼ぶ）、および対照抗体（ヒトIgG）についてのJ6/JFH-1-HCV感染阻害活性の評価結果を図４に示した。また、ハイブリドーマ細胞株JF/M1-4由来の精製モノクローナル抗体および対照抗体についてのJ6/JFH-1-HCV感染阻害活性の評価結果は図５に示した。図４および５に見られる通り、対照抗体以外のいずれの抗体もHCVに対して感染阻害活性を有していた。【０１７６】
［実施例９］JF/M1-4モノクローナル抗体のエピトープ解析
JFH-1株のE1タンパク質の1〜162アミノ酸（配列番号25）、JFH-1株のE2タンパク質の1〜337アミノ酸（配列番号26）について、10個の連続するアミノ酸をN末端から3アミノ酸ずつずらして設計したアミノ酸配列からなるペプチド群を合成した。各ペプチドのN末端はビオチン化し、C末端はグリシンアミドとした（ＪＰＴ社に合成委託）。【０１７７】
合成したペプチドをDMSOに溶解し、PBSに0.01nmol/μlとなるように溶解した。このペプチド溶液をストレプトアビジンコーティングプレート（Nunc社）の各ウェルに50μl加え、室温で1時間反応させた。次に、ペプチド溶液を捨てて、ブロッキングワン（ナカライテスク）を200μl/ウェル加え、室温で5時間置いた。ブロッキンングワン溶液を捨てて、0.05% Tween20含有PBS（pH7.2）150μl/ウェルで4回洗浄し、0.05% Tween20 含有PBS（pH7.2）で1μg/mlに希釈したJF/M1-4モノクローナル抗体を50μl/ウェル加え、室温にて1時間反応させた。次に、抗体溶液を捨て、0.05% Tween20 含有PBS（pH7.2）150μl/ウェルで5回洗浄し、5000倍に0.05% Tween20含有PBSで希釈したHRP化抗マウスIgGヤギ抗体（GEヘルスケア）を50μl/ウェル加え、室温にて1時間反応させた。反応後、抗体溶液を捨て、0.05% Tween20 含有PBS（pH7.2）150μl/ウェルで5回洗浄した。洗浄後、HPR発色キット（住友ベークライト）にて、ペプチドに結合した抗体を検出した。【０１７８】
この検出によりOD450nmで測定された抗体レベルで示される、JFH-1のE1タンパク質由来のペプチド群（ペプチド番号1〜52）に対するJF/M1-4モノクローナル抗体の結合強度を図６Ａに、JFH-1のE2タンパク質由来のペプチド群（ペプチド番号1〜110）に対するJF/M1-4モノクローナル抗体の結合強度を図６Ｂに示す。OD450nmでの測定値（図６ＡおよびＢの縦軸の値）が高い場合には、そのペプチドに対するJF/M1-4モノクローナル抗体の結合強度が強く、すなわちその抗体が当該ペプチドを認識することが示される。【０１７９】
その結果、JF/M1-4モノクローナル抗体はJFH-1株のE1由来のペプチドをいずれも認識せず（図６Ａ）、JFH-1株のE2由来のペプチドのいくつかを認識した（図６Ｂ）。特に強いエピトープはLVHYPYRLWH（配列番号18；図６Ｂ中のペプチド番号77）であり、このペプチドとオーバーラップしているWLTPKCLVHY（配列番号19；図６Ｂ中のペプチド番号75）、PKCLVHYPYR（配列番号20；図６Ｂ中のペプチド番号76）およびYPYRLWHYPC（配列番号21；図６Ｂ中のペプチド番号78）は弱いエピトープであった。また、NFTIFKIRMY（配列番号22；図６Ｂ中のペプチド番号82）およびIFKIRMYVCG（配列番号23；図６Ｂ中のペプチド番号83）も弱いエピトープとして同定された。【０１８０】
以上からJF/M1-4モノクローナル抗体は、強いエピトープを含むJFH-1株のE2タンパク質中のWLTPKCLVHYPYRLWHYPC（配列番号24）をエピトープとして認識できる抗体であることが示された。【０１８１】
［実施例１０］J6/JFH-1-HCV粒子に対するJ6/1G11-25モノクローナル抗体およびJ6/4D4-2モノクローナル抗体のエピトープ解析
J6CF株のE1タンパク質の1〜162アミノ酸（配列番号27）、J6CF株のE2タンパク質の1〜337アミノ酸（配列番号28）について、10個の連続するアミノ酸をN末端から3アミノ酸ずつずらして設計したアミノ酸配列からなるペプチド群を合成した。各ペプチドのN末端はビオチン化し、C末端はグリシンアミドとした（JPT社に合成委託）。【０１８２】
合成したペプチドをDMSOに溶解し、ＰＢＳに0.01nmol/μlとなるように溶解した。このペプチド溶液をストレプトアビジンコーティングプレート（Nunc社）の各ウェルに50μl加え、室温で1時間反応させた。次に、ペプチド溶液を捨て、ブロッキングワン（ナカライテスク）を200μl/ウェル加え、室温で5時間置いた。ブロッキンングワン溶液を捨て、0.05% Tween20含有PBS（pH7.2）150μl/ウェルで4回洗浄し、0.05% Tween20 含有PBS（pH7.2）で1μg/mlに希釈したJ6/1G11-25モノクローナル抗体またはJ6/4D4-2を50μl/ウェル加え、室温にて1時間反応させた。次に、抗体溶液を捨て、0.05% Tween20 含有PBS（pH7.2）150μl/ウェルで5回洗浄し、5000倍に0.05% Tween20含有PBSで希釈したHRP化抗マウスIgGヤギ抗体（GEヘルスケア）を50μl/ウェル加え、室温にて1時間反応させた。反応後、抗体溶液を捨て、0.05% Tween20 含有PBS（pH7.2）150μl/ウェルで5回洗浄し、引き続き、HPR発色キット（住友ベークライト）でペプチドに結合した抗体を分光光度計（OD450nm）で検出した。【０１８３】
図７Ａは、J6CF株のE1タンパク質由来のペプチド群（ペプチド番号1〜52）に対するJ6/1G11-25モノクローナル抗体の結合強度を、図７Ｂは、J6CF株のE2タンパク質由来のペプチド群（ペプチド番号1〜110）に対するJ6/1G11-25モノクローナル抗体の結合強度を示している。このOD450nmでの測定値（図７ＡおよびＢの縦軸の値）が高い場合には、そのペプチドに対するJ6/1G11-25モノクローナル抗体の結合強度が強く、その抗体が当該ペプチドを特異的に認識することを意味している。【０１８４】
その結果、J6/1G11-25モノクローナル抗体は、J6CF株のE1由来のペプチドを認識せず（図７Ａ）、J6CF株のE2由来のペプチドを認識した（図７Ｂ）。J6/1G11-25モノクローナル抗体が認識したペプチドは、NVTNPEDMRP（配列番号29；図７Ｂ中のペプチド番号32）およびこのペプチドとオーバーラップしているNPEDMRPYCW（配列番号30；図７Ｂ中のペプチド番号33）、ならびにNYTIFKIRMY（配列番号31；図７Ｂ中のペプチド番号82）およびこのペプチドとオーバーラップしているIFKIRMYVGG（配列番号32；図７Ｂ中のペプチド番号83）であった。【０１８５】
一方、図８Ａは、J6CF株のE1タンパク質由来のペプチド群（ペプチド番号1〜52）に対するJ6/4D4-2モノクローナル抗体の結合強度を、図８Ｂは、J6CF株のE2タンパク質由来のペプチド群（ペプチド番号1〜110）に対するJ6/4D4-2モノクローナル抗体の結合強度を示している。このOD450nmでの測定値（図８ＡおよびＢの縦軸の値）が高い場合には、そのペプチドに対するJ6/4D4-2モノクローナル抗体の結合強度が強く、その抗体が当該ペプチドを特異的に認識することを意味している。【０１８６】
その結果、図８に示されるように、J6/4D4-2モノクローナル抗体は、J6CF株のE1由来のペプチドおよびJ6CF株のE2由来のペプチドのいくつかを認識した。E1由来の強いエピトープは、FIVSPQHHWF（配列番号33；図８Ａ中のペプチド番号34）であり、このペプチドとオーバーラップしているSPQHHWFVQD（配列番号34；図８Ａ中のペプチド番号35）およびHHWFVQDCNC（配列番号35；図８Ａ中のペプチド番号36）は弱いエピトープであった。また、別の強いエピトープはMAWDMMMNWS（配列番号36；図８Ａ中のペプチド番号43）であった。【０１８７】
E2由来の強いエピトープは、LIDYPYRLWH（配列番号37；図８Ｂ中のペプチド番号77）およびこのペプチドとオーバーラップしているYPYRLWHYPC（配列番号38；図８Ｂ中のペプチド番号78）ならびにDMRPYCWHYP（配列番号39；図８Ｂ中のペプチド番号34）であり、これとオーバーラップしている NPEDMRPYCW（配列番号40；図８Ｂ中のペプチド番号33）およびPYCWHYPPRQ （配列番号41；図８Ｂ中のペプチド番号35）は弱いエピトープであった。【０１８８】
また、比較的強いエピトープは、NYTIFKIRMY（配列番号31；図８Ｂ中のペプチド番号82）であり、これとオーバーラップしているIFKIRMYVGG（配列番号32；図８Ｂ中のペプチド番号83）は弱いエピトープであった。【０１８９】
さらに、STRPPLGSWF（配列番号42；図８Ｂ中のペプチド番号54）およびGSWFGCTWMN（配列番号43；図８Ｂ中のペプチド番号56）は弱いエピトープとして同定された。【０１９０】
以上より、J6/1G11-25モノクローナル抗体は、J6CF株のE2タンパク質中のアミノ酸配列NVTNPEDMPRPYCW（配列番号44）およびNYTIFKIRMYVGG（配列番号45）をエピトープとして認識する抗体であることが明らかとなった。【０１９１】
また、J6/4D4-2モノクローナル抗体は、J6CF株のE1タンパク質中のアミノ酸配列FIVSPQHHWFVQDCNC（配列番号46）およびMAWDMMMNWS（配列番号36）をエピトープとして認識するとともに、J6CF株のE2タンパク質中のアミノ酸配列LIDYPYRLWHYPC（配列番号47）、NPEDMRPYCWHYPPRQ（配列番号48）およびNYTIFKIRMYVGG（配列番号45）についてもエピトープとして認識する抗体であることが明らかとなった。【０１９２】
［実施例１１］JF/M1-4モノクローナル抗体のV領域をコードするDNAのクローン化
HCV粒子に対するJF/M1-4マウスモノクローナル抗体の可変領域をコードするDNAを次の様にしてクローン化した。【０１９３】
１）全RNAの調製
PureLink Micro-to-Midi（Invitrogen社）を用いて、添付マニュアルに記載されている方法に従って、ハイブリドーマ細胞株JF/M1-4から全RNAを調製した。すなわち、2×108個のハイブリドーマ株JF/M1-4の細胞を2.4mlのRNALysis溶液に懸濁させ、18ゲージ注射針付きシリンジを数回通してホモジナイズした。ホモジネートを遠心し、得られたこの上清に同量の70%エタノールを加え、RNAスピンカートリッジにアプライした。カートリッジに洗浄液を加え良く洗浄し、RNAaseフリー水でRNAを溶出させた。【０１９４】
２）一本鎖cDNAの合成
μ型H鎖およびκ型L鎖特異的プライマーを用いて、上記１）で調製した全RNAから以下のようにして一本鎖cDNAを合成した。【０１９５】
i) JF/M1-4モノクローナル抗体のμ型H鎖をコードするcDNAの合成
5μgのRNAにμ型H鎖特異的プライマーmCHm-as（配列番号49：5’-AGGCTTACTAGTAGCTGGAATGGGCACATGCAGATC-3’）を50pmol加えてアニーリングさせ、これに0.1M DTTを5μl、20mM dNTPs溶液を1.25μl、SuperScriptIIに添付の5x RT Bufferを10μl加え、さらに最終容量が49μlとなるように蒸留水（DW）を加えた。【０１９６】
次に、逆転写酵素SuperScriptII（Invitrogen社）を1μl加え、42℃で30分、50℃で30分反応させたものを、次のステップのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に直接使用した。【０１９７】
ii) JF/M1-4モノクローナル抗体のκ型L鎖をコードするcDNAの合成
5μgのRNAにκ型L鎖特異的プライマーmCK1-as（配列番号50：5’-CATGTCTAGAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTG-3’）を50pmol加えてアニーリングさせ、これに0.1M DTTを5μl、20mM dNTPs溶液を1.25μl、SuperScriptIIに添付の5x RT Bufferを10μl加え、さらに最終容量が49μlとなるように蒸留水（DW）を加えた。次に、逆転写酵素SuperScriptII（Invitrogen社）を1μl加え、42℃で30分、50℃で30分反応させたものを、次のステップのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）に直接使用した。【０１９８】
３）JF/M1-4モノクローナル抗体の抗体可変領域をコードする遺伝子のPCR法による増幅
PCRは、GeneAmp(R) PCR System 9700（Applied Biosystems社）で、Advantage GC2 DNA polymerase キット（TAKARA社）を使用して行った。【０１９９】
i) マウスH鎖V領域をコードするcDNAの増幅
PCRのためのプライマーセットとしては、Novagen社のMouse Ig-Primer Set(69831-3)を使用し、添付マニュアルの条件に従ってPCRを行った。【０２００】
具体的には、キット添付のMuIgVH5'-AからMuIgVH5'-Fまでのプライマー（マウスH鎖のリーダー配列とハイブリダイズする）とMuIgMVH3'-1プライマー（マウスμ型H鎖C領域とハイブリダイズする）とを使用してPCRを行った。【０２０１】
上記で調製したμ型H鎖をコードする一本鎖cDNA合成の反応混合物5μlに、キット添付の5x PCR Bufferを10μl、GC Meltを10μl、2.5mM dNTPs溶液を4μl、Advantage GC2 DNA polymerase mix（TAKARA社）を1.25ユニット、10pmol/μlのMuIgVH5'プライマーを1μl、5pmol/μlのMuIgMVH3'-1プライマーを1μl加え、さらに最終容量が50μlとなるように蒸留水（DW）を加えた。このPCR溶液50μlを94℃にて4分間インキュベートした後、94℃にて1分間、50℃（MuIgVH5'-Aおよび-Bの場合)または60℃（MuIgVH5'-C〜-Fの場合）にて1分間、72℃にて2分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを40回反復した後、反応混合物をさらに72℃にて6分間インキュベートした。【０２０２】
ii) マウスL鎖V領域をコードする遺伝子の増幅
PCRのためのプライマーセットとしては、Novagen社のMouse Ig-Primer Set(69831-3)を使用し、添付マニュアルの条件に従ってPCRを行った。【０２０３】
具体的には、キット添付のMuIgκVL5'-AからMuIgκVL5'-Fまでのプライマー（マウスκ型L鎖のリーダー配列とハイブリダイズする）とMuIgκVL3'-1プライマー（マウスκ型L鎖C領域とハイブリダイズする）とを使用してPCRを行った。【０２０４】
上記で調製したκ型L鎖をコードする一本鎖cDNA合成の反応混合物5μlに、キット添付の5x PCR Bufferを10μl、GC Meltを10μl、2.5mM dNTPs溶液を4μl、Advantage GC2 DNA polymerase mix（TAKARA社）を1.25ユニット、10pmol/μlのMuIgκVL 5'プライマーを1μl、5pmol/μlのMuIgκVL3'-1プライマーを1μl加え、さらに最終容量が50μlとなるように蒸留水（DW）を加えた。このPCR溶液50μlを94℃にて4分間インキュベートした後、94℃にて1分間、50℃(MuIgκVL5'-AおよびBの場合)または60℃（MuIgκVL5'-C〜-Fの場合）にて1分間、72℃にて2分間、この順序で加熱した。この温度サイクルを40回反復した後、反応混合物をさらに72℃にて6分間インキュベートした。【０２０５】
４）PCR生成物の精製およびプラスミドベクターへのクローン化
上記のようにしてPCR法で増幅した各DNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離した。約450bp長のDNA断片をGeneElute（Sigma社）にて精製した。DNA断片のクローン化には、TOPO TA Cloning  キット（Invitrogen社）を用いた。キット添付のpCR-TOPOベクターとDNA断片および添付の塩溶液を加え、室温に5分間置いた後の反応溶液の一部を大腸菌Mach1（Invitrogen社）のコンピテントセルに加えた。この大腸菌コンピテントセルを氷上に30分間置き、引き続き42℃で30秒間加熱下後、再び氷上に1分間置き、SOC培地（室温）を加え、37℃で1時間培養した後に寒天培地に播き、37℃で一晩培養した。この形質転換体からプラスミドDNAを調製し、クローン化したDNAの塩基配列を常法により決定した。【０２０６】
５）JF/M1-4マウスモノクローナル抗体のV領域をコードするcDNAの核酸配列解析
上記４）で塩基配列を決定し、プラスミド中にクローン化したDNA（JF/M1-4マウスモノクローナル抗体のH鎖V領域およびL鎖V領域をそれぞれコードするcDNA）について、以下の通り解析を行った。【０２０７】
i) マウスH鎖V領域をコードするcDNAの核酸配列解析
多数のクローン中のH鎖V領域の核酸配列は、マウスH鎖リーダー配列の領域を除いて同一であることが判明した。このことは、調べた複数のクローンが、マウスH鎖リーダー配列をコードする各種プライマーの混合物を利用したPCRによって得られた独立の単離物に由来することを示している。また、その核酸配列から推定されるコード化アミノ酸配列をデータベースで検索することにより、JF/M1-4マウスモノクローナル抗体のH鎖V領域のフレームワーク1からJ領域（フレームワーク4）までの各領域の配列を推定した（配列番号55〜61）。得られた核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ配列表の配列番号51および52に示した。さらに、本アミノ酸配列から推定されるCDR1からCDR3を図９に示した。JF/M1-4マウスモノクローナル抗体によるエピトープ（WLTPKCLVHYPYRLWHYPC（配列番号24）または10個以上の連続するアミノ酸残基を含むその一部）の認識には、抗体のそのH鎖V領域（核酸配列：配列番号51、アミノ酸配列：配列番号52）が役割を果たしていることが明らかとなった。【０２０８】
ii) マウスＬ鎖V領域をコードするcDNAの核酸配列解析
多数のクローン中のL鎖V領域の核酸配列は、マウスL鎖リーダー配列の領域を除いて同一であることが判明した。このことは、調べた複数のクローンが、マウスL鎖リーダー配列をコードする各種プライマーの混合物を利用したPCRによって得られた独立の単離物に由来することを示している。また、その核酸配列から推定されるコード化アミノ酸配列をデータベースにて検索することにより、JF/M1-4マウスモノクローナル抗体のL鎖V領域のフレームワーク1からJ領域（フレームワーク4）までの各領域の配列を推定した（配列番号62〜68）。得られた核酸配列とアミノ酸配列は、それぞれ配列番号53および54に示した。さらに、本アミノ酸配列から推定されるCDR1からCDR3を図１０に示した。JF/M1-4マウスモノクローナル抗体によるエピトープ（WLTPKCLVHYPYRLWHYPC（配列番号24）または10個以上の連続するアミノ酸残基を含むその一部）の認識には、抗体のそのL鎖V領域（核酸配列：配列番号53、アミノ酸配列：配列番号54）が役割を果たしていることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０２０９】
本発明のHCV感染阻害活性を有する抗体は、HCV感染の治療および予防用の医薬として使用することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０２１０】
配列番号1  pJFH-1中にクローン化されたHCVゲノムcDNAを示す。【０２１１】
配列番号2  pJ6/JFH-1中にクローン化されたキメラHCVゲノムcDNAの配列を示す。【０２１２】
配列番号3  pTH/JFH-1中にクローン化されたHCVゲノムcDNAの配列を示す。【０２１３】
配列番号4  プライマー（JFH-1-A）の配列を示す。【０２１４】
配列番号5  プライマー（JFH-1-B）の配列を示す。【０２１５】
配列番号6  プライマー（TH-C）の配列を示す。【０２１６】
配列番号7  プライマー（TH-D）の配列を示す。【０２１７】
配列番号8  プライマー（JFH-1-E）の配列を示す。【０２１８】
配列番号9  プライマー（JFH-1-Ｆ）の配列を示す。【０２１９】
配列番号10  プライマー（J6E1dTM-s）の配列を示す。【０２２０】
配列番号11  プライマー（J6E1dTM-as）の配列を示す。【０２２１】
配列番号12  プライマー（J6E2dTM-s）の配列を示す。【０２２２】
配列番号13  プライマー（J6E2dTM-as）の配列を示す。【０２２３】
配列番号14  プライマー（JFHE1dTM-s）の配列を示す。【０２２４】
配列番号15  プライマー（JFHE1dTM-as）の配列を示す。【０２２５】
配列番号16  プライマー（JFHE2dTM-s）の配列を示す。【０２２６】
配列番号17  プライマー（JFHE2dTM-as）の配列を示す。【０２２７】
配列番号18〜24  合成ペプチドの配列を示す。【０２２８】
配列番号25  JFH-1株のE1タンパク質の1〜162アミノ酸の配列を示す。【０２２９】
配列番号26  JFH-1株のE2タンパク質の1〜337アミノ酸の配列を示す。【０２３０】
配列番号27  J6CF株のE1タンパク質の1〜162アミノ酸の配列を示す。【０２３１】
配列番号28  J6CF株のE2タンパク質の1〜337アミノ酸の配列を示す。【０２３２】
配列番号29〜48  合成ペプチドの配列を示す。【０２３３】
配列番号49  プライマー（mCHm-as）の配列を示す。【０２３４】
配列番号50  プライマー（mCK1-as）の配列を示す。【０２３５】
配列番号51  JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖V領域（重鎖可変領域）をコードする遺伝子の塩基配列を示す。【０２３６】
配列番号52  JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖V領域（重鎖可変領域）のアミノ酸配列を示す。【０２３７】
配列番号53  JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖V領域（軽鎖可変領域）をコードする遺伝子の塩基配列を示す。【０２３８】
配列番号54  JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖V領域（軽鎖可変領域）のアミノ酸配列を示す。【０２３９】
配列番号55  JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖V領域中のフレームワーク1のアミノ酸配列を示す。【０２４０】
配列番号56  JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖V領域中のCDR1のアミノ酸配列を示す。【０２４１】
配列番号57  JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖V領域中のフレームワーク2のアミノ酸配列を示す。【０２４２】
配列番号58  JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖V領域中のCDR2のアミノ酸配列を示す。【０２４３】
配列番号59  JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖V領域中のフレームワーク3のアミノ酸配列を示す。【０２４４】
配列番号60  JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖V領域中のCDR3のアミノ酸配列を示す。【０２４５】
配列番号61  JF/M1-4モノクローナル抗体のH鎖V領域中のフレームワーク4（Jセグメント）のアミノ酸配列を示す。【０２４６】
配列番号62  JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖V領域中のフレームワーク1のアミノ酸配列を示す。【０２４７】
配列番号63  JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖V領域中のCDR1のアミノ酸配列を示す。【０２４８】
配列番号64  JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖V領域中のフレームワーク2のアミノ酸配列を示す。【０２４９】
配列番号65  JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖V領域中のCDR2のアミノ酸配列を示す。【０２５０】
配列番号66  JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖V領域中のフレームワーク3のアミノ酸配列を示す。【０２５１】
配列番号67  JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖V領域中のCDR3のアミノ酸配列を示す。【０２５２】
配列番号68  JF/M1-4モノクローナル抗体のL鎖V領域中のフレームワーク4（Jセグメント）のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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