(57)【要約】【課題】本発明は、被検物質のヒドロキシラジカル消去活性を簡便且つ定量的に測定する方法及び装置を提供することを目的とする。【解決手段】本発明は、被検物質のヒドロキシラジカル消去能を測定する方法であって、複数の酸価数を取り得る遷移金属とビピリジンとの錯体を電解酸化して遷移金属元素の酸価数を増加させた酸化体を含む溶液にヒドロキシラジカルを加えて化学発光させる工程と、前記溶液に被検物質を加え、前記化学発光の消光強度を測定する工程と、を含む、方法を提供するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検物質のヒドロキシラジカル消去能を測定する方法であって、
複数の酸価数を取り得る遷移金属とビピリジンとの錯体を電解酸化して遷移金属元素の酸価数を増加させた酸化体を含む溶液に、ヒドロキシラジカルを加えて化学発光させる工程と、
前記溶液に被検物質を加え、前記化学発光の消光強度を測定する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記遷移金属が、ルテニウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒドロキシラジカルが、Ｆｅｎｔｏｎ反応により生成されたものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒドロキシラジカルが、酸化チタンと水を接触させ、紫外線を照射することによって生成されたものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒドロキシラジカルが、過酸化水素水に紫外線を照射することによって生成されたものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
被検物質のヒドロキシラジカル消去能を測定する装置であって、
ヒドロキシラジカル生成手段と、
複数の酸価数を取り得る遷移金属とビピリジンとの錯体を電解酸化する酸化手段と、
前記ヒドロキシラジカル生成手段により生成されたヒドロキシラジカルと、前記電解酸化された遷移金属と、前記被検物質とを接触させるための容器と、
前記容器における化学発光を検出する検出手段と、を備える装置。
【請求項７】
前記ヒドロキシラジカル生成手段が、Ｆｅ2+送入手段と過酸化水素送入手段とを備える、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記ヒドロキシラジカル生成手段が、酸化チタンと紫外線照射手段とを備える、請求項６に記載の装置。
【請求項９】
前記ヒドロキシラジカル生成手段が、過酸化水素送入手段と紫外線照射手段とを備える、請求項６に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検物質のヒドロキシラジカル消去能の測定方法及び測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性酸素種とは、三重項酸素分子よりも反応性が大きく、活性に富む酸素種のことをいい、主にスーパーオキシド（・Ｏ2-）、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、ヒドロキシラジカル（ＨＯ・）、一重項酸素（1Ｏ2）が挙げられる。それぞれの活性酸素種は、生成過程や生体に及ぼす影響に違いがあり、白血球で産生されて、免疫システムに深く関与しているものがある一方で、老化、脳卒中、白内障、心筋梗塞などの多くの疾患に関与しているものもあることが明らかになっている。また、スーパーオキシドや過酸化水素を分解する酵素は存在するが、ヒドロキシラジカルや一重項酸素を代謝する酵素はこれまでに見出されていない。【０００３】
活性酸素種の中でもヒドロキシラジカルは最も反応性が大きい攻撃種であり、生体内における障害作用も最も大きいと考えられる。ヒドロキシラジカルは、生体内において、以下の式に示されるＦｅｎｔｏｎ反応により生成される。【０００４】
【化１】
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上記の活性酸素種のうちスーパーオキシドとヒドロキシラジカルはラジカル種であり、一般に抗酸化剤とも呼ばれるラジカルスカベンジャーによって捕捉される。元来、好気性生物には防御システムとしてラジカルスカベンジャーのような抗酸化剤やラジカル生成阻害剤などが備わっている。しかし、酸化ストレスが何らかの理由で亢進し、防御システムの能力を超えた場合、様々な疾患が引き起こされる。そのため、疾患予防の目的で、ラジカルスカベンジャーを体外から投与する必要があり、かかるラジカルスカベンジャーのラジカル消去活性を測定する方法が必要とされる。【０００５】
現在、ＨＯ・の測定方法としては電子スピン共鳴（ＥＳＲ）を用いる方法と、ｐ−ニトロソジメチルアニリン、メチオナールを用いる化学的方法がある。しかし、化学的方法は、ＨＯ・に対して特異性が低いため、一般にはＥＳＲを用いる方法が利用されている。ＥＳＲを用いる方法にはトラップ剤としてＰＢＮ（α−4−phenyl−N−t−butyl nitrone）、ＤＭＰＯ（5,5−dimethyl−1−pyrroline−N−oxide）等が用いられるが、ＤＭＰＯは安定性が低く、一度水に溶解したものは保存できないので、その日のうちに使用しなければならないなどの問題があり、手順も煩雑であって簡便な方法とは言い難い。また、ＥＳＲは、ラジカルスカベンジャーの強さを比較することができるが、相対強度を測定しているため、正確な順位付けが困難な場合もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、被検物質のヒドロキシラジカル消去活性を簡便且つ定量的に測定する方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、複数の酸価数を取り得る遷移金属とビピリジンとの錯体を電解酸化して遷移金属元素の酸価数を増加させ、この酸化体と脂環式三級アミン又はインドール化合物とを接触させると化学発光を生じることを既に見出しているが（例えば、特許第２５８８８６６号公報を参照）、今回、当該酸化体とヒドロキシラジカルを接触させることによっても、同様に化学発光が生じることを見出した。さらに、酸化体とヒドロキシラジカルとを接触させ発光状態を維持した溶液中に、ヒドロキシラジカル消去能を有する被検物質を添加すると、ヒドロキシラジカル消去活性に比例して当該発光が減衰することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
即ち、本発明は
〔１〕被検物質のヒドロキシラジカル消去能を測定する方法であって、複数の酸価数を取り得る遷移金属とビピリジンとの錯体を電解酸化して遷移金属元素の酸価数を増加させた酸化体を含む溶液に、ヒドロキシラジカルを加えて化学発光させる工程と、前記溶液に被検物質を加え、前記化学発光の消光強度を測定する工程と、を含む方法；
〔２〕前記遷移金属が、ルテニウムである、上記〔１〕に記載の方法；
〔３〕前記ヒドロキシラジカルが、Ｆｅｎｔｏｎ反応により生成されたものである、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記ヒドロキシラジカルが、酸化チタンと水を接触させ、紫外線を照射することによって生成されたものである、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔５〕前記ヒドロキシラジカルが、過酸化水素水に紫外線を照射することによって生成されたものである、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔６〕被検物質のヒドロキシラジカル消去能を測定する装置であって、ヒドロキシラジカル生成手段と、複数の酸価数を取り得る遷移金属とビピリジンとの錯体を電解酸化する酸化手段と、前記ヒドロキシラジカル生成手段により生成されたヒドロキシラジカルと、前記電解酸化された遷移金属と、前記被検物質とを接触させるための容器と、前記容器における化学発光を検出する検出手段と、を備える装置；
〔７〕前記ヒドロキシラジカル生成手段が、Ｆｅ2+送入手段と過酸化水素送入手段とを備える、上記〔６〕に記載の装置；
〔８〕前記ヒドロキシラジカル生成手段が、酸化チタンと紫外線照射手段とを備える、上記〔６〕に記載の装置；及び
〔９〕前記ヒドロキシラジカル生成手段が、過酸化水素送入手段と紫外線照射手段とを備える、上記〔６〕に記載の装置、に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、複数の酸価数を取り得る遷移金属とビピリジンとの錯体を電解酸化して遷移金属元素の酸価数を増加させた酸化体を含む溶液に、ヒドロキシラジカルを加えて化学発光させておき、当該溶液に被検物質を添加して消光強度を測定するという簡易な方法で、被検物質のヒドロキシラジカル消去活性を定量的に測定することができる。【００１０】
本発明により、脳機能改善薬をはじめとするヒドロキシラジカル関連疾患の予防又は治療剤の研究開発過程において、被検物質のヒドロキシラジカル消去能を迅速に評価することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明に係るヒドロキシラジカル消去能測定方法に用いられる遷移金属としては、ルテニウム（Ｒｕ）、クロム（Ｃｒ）、コバルト（Ｃｏ）、ロジウム（Ｒｈ）、インジウム（Ｉｎ）、オスミウム（Ｏｓ）などが挙げられる。特にルテニウム又はクロムが好ましい。【００１２】
これらの遷移金属とビピリジンとの錯体は、複数の酸価数を取り得る。電解酸化により、酸価数を増加させると、ヒドロキシラジカルによって還元され、励起状態を経て基底状態に戻る際、発光するものと考えられる。【００１３】
例えば、ルテニウムとビピリジンとの錯体には、下記式（Ｉ）に示す２価の錯体（トリス（２，２−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体）と、下記式（ＩＩ）に示す３価の錯体があり、２価の錯体を電解酸化することによって３価の錯体を得ることができる。【００１４】
【化２】
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式（ＩＩ）に示す３価の錯体は、下記式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に示すように、ヒドロキシラジカルによって還元され、励起状態の２価の錯体（以下、「*」で表す。）を経て基底状態の２価の錯体になるときに発光するものと考えられる。【００１５】
【化３】
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このように発光のためには、励起状態の錯体を生成することが重要であるが、励起状態の錯体を生成するのは、これまでに本発明者らが見出した脂環式三級アミン、インドール化合物、ヒドロキシラジカル等の限られた物質である。本発明に係る方法では、溶液中に、ヒドロキシラジカル以外に励起状態の錯体を生成する物質が存在しないため、他の物質の影響を受けることなく、ヒドロキシラジカルによる発光及びヒドロキシラジカル消去による消光のみを測定することができる。【００１６】
遷移金属元素の酸価数を増加させた酸化体を含む溶液に加えるヒドロキシラジカルを生成する方法は特に限定されないが、Ｆｅｎｔｏｎ反応や酸化チタンを用いる方法、紫外線照射による方法等、公知の方法やそれに準ずる方法を用いることができる。【００１７】
Ｆｅｎｔｏｎ反応は、下記式（Ｖ）に示される反応であり、過酸化水素とＦｅ2+からヒドロキシラジカルが生成される。【００１８】
【化４】
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Ｆｅｎｔｏｎ反応を用いる場合は、塩化鉄（ＩＩ）四水和物を水に溶解し、過酸化水素水溶液と反応させる。ここで、溶媒としてリン酸緩衝液等を用いると、緩衝液と塩化第一鉄とが接触して鉄が析出するため、溶媒は蒸留水として何も溶解しないことが好ましい。また、過酸化水素に対して、Ｆｅ2+が過剰に存在すると、下記式（ＶＩ）で表される反応が生じる可能性がある。この反応が生じると、ルテニウム錯体が発光しなくなるため、Ｆｅｎｔｏｎ反応においては、Ｆｅ2+と過酸化水素のモル濃度を約１：１とし、Ｆｅ2+が残存しないようにすることが好ましい。【００１９】
【化５】
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また、Ｆｅｎｔｏｎ反応で消費されずに残存したＦｅ2+によってルテニウムが消光されることも防ぐため、溶液中のルテニウムの濃度は十分に高くすることが好ましい。【００２０】
一方、酸化チタンを用いる場合は、酸化チタンと水を接触させ、これに紫外線を照射することによって、ヒドロキシラジカルを生成することができる。酸価チタンの表面に紫外線を照射すると、下記式（ＶＩＩ）に示すように、価電子帯の電子が励起され、価電子帯に正孔が生じる（式中、ｈ+は正孔を示す）。この正孔は、式（ＶＩＩＩ）に示すように、表面にある吸着水を酸化し、ヒドロキシラジカルを生じると考えられている。【００２１】
【化６】
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【００２２】
また、過酸化水素水に紫外線を照射することによっても、下記式（ＩＸ）に示す反応によって、ヒドロキシラジカルを生成することができる。
【化７】
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【００２３】
本発明に係るヒドロキシラジカル消去能測定方法では、上記遷移金属とビピリジンとの錯体の酸化体に、このようにして生成されたヒドロキシラジカルを添加して発光させた溶液中に、被検物質を添加する。被検物質にヒドロキシラジカル消去活性があると、上記式（ＩＩＩ）におけるヒドロキシラジカルが減少し、励起状態の錯体も減少するため、化学発光が減衰する。従って、消光強度を測定することにより、ヒドロキシラジカル消去活性を定量的に知ることができる。【００２４】
次に、本発明に係るヒドロキシラジカル消去能測定装置について説明する。図１に本発明のヒドロキシラジカル消去能測定装置の一例として装置１を示す。装置１では、電解酸化装置３２（酸価手段）によって電解酸化された遷移金属とビピリジンとの錯体と、ヒドロキシラジカル生成手段１０によって生成されたヒドロキシラジカルとが反応容器４０内で反応して発光する。反応容器４０には、検出手段が備えられており、この検出手段によって発光が検出される。安定に発光が継続している状態で、反応容器４０に、サンプルインジェクタ２２によって被検物質を注入すると、被検物質がヒドロキシラジカル消去活性を有する場合、発光が減衰するので、検出手段によって消光強度を測定することにより、被検物質のヒドロキシラジカル消去能を定量的に測定することができる。【００２５】
装置１において、ヒドロキシラジカル生成手段１０は、ヒドロキシラジカルを生成できる限りどのような構成であってもよいが、図１では、Ｆｅｎｔｏｎ反応を利用する構成となっている。塩化鉄（ＩＩ）四水和物の水溶液をリザーバ１２に、過酸化水素水溶液をリザーバ１４に用意し、それぞれポンプＰ３、Ｐ４により送液する。流路が合流する位置で両者が混合されるとヒドロキシラジカルが生じ、容器４０に流入する。上述のように、塩化第一鉄が過剰に存在すると、鉄が析出したり、発光を阻害する可能性があるため、塩化鉄（ＩＩ）四水和物の水溶液と過酸化水素の水溶液の濃度、ポンプＰ３及びＰ４による送液速度を調節し、流路が合流する位置において、Ｆｅ2+と過酸化水素のモル濃度が約１：１となるようにすることが好ましい。また、生じたヒドロキシラジカルは反応性が高いため、流路が合流した後の容器４０までの流路は可能な限り短くすることが望ましい。【００２６】
一方、遷移金属とビピリジンとの錯体はリザーバ３０に用意し、ポンプＰ２により送液する。ダンパーＤ２を介して安定化直流電源３４を備える電解酸化装置３２に流入し、連続的に電解酸化される。こうして遷移金属元素の酸価数を増加させた酸化体が生成され、これが容器４０に流入する。尚、電解酸化により得られるビピリジン錯体の酸化体は、含水溶媒中で不安定なので、電解酸化装置３２から容器４０までの流路もできるだけ短くすることが望ましい。【００２７】
リザーバ２０には、移動相として蒸留水を用意し、ポンプＰ１によりダンパーＤ１及びサンプルインジェクタ２２を介して容器４０に送液する。検出手段によって安定な発光が測定される状態で、サンプルインジェクタ２２を作動させ、被検物質を添加する。被検物質にヒドロキシラジカル消去活性があれば、消光強度が増加する。検出手段により検出された発光、消光強度は、レコーダ４２によって記録される。【００２８】
尚、ダンパーＤ１及びＤ２は、ポンプＰ１及びＰ２の脈動を吸収して、滑らかに連続的に後段に送液するためのものであり、例えば、それぞれ長い細管（例えば２０ｍ程度）とすることができる。【００２９】
図２に、ヒドロキシラジカル生成手段１０の別の例として、酸化チタンを用いる場合の構成を示す。リザーバ１６には蒸留水を用意し、ポンプＰ５により送液する。らせん状の流路１８には酸化チタンが充填されており、らせんの中央には紫外線ランプ１９が配置されている。紫外線ランプ１９を点灯させることにより、上述の反応でヒドロキシラジカルが生成され、容器４０に流入する。【００３０】
図３に、ヒドロキシラジカル生成手段１０の別の例として、過酸化水素に紫外線を照射する場合の構成を示す。リザーバ１６に過酸化水素水を用意し、ポンプ５により送液する。紫外線ランプ１９を点灯させることにより、ヒドロキシラジカルが生成され、容器４０に流入する。
【実施例１】
【００３１】
図１に示した装置１を用いて、以下に記載する方法で、エダラボン、尿酸、及びアスコルビン酸のヒドロキシラジカル消去能を測定した。【００３２】
まず、塩化鉄（ＩＩ）四水和物を蒸留水に溶解し１．０ｍＭとしてリザーバ１２に用意し、ポンプＰ３（島津製作所社製ＬＣ−６Ａ）を用いて毎分１ｍＬで送液した。一方、過酸化水素も蒸留水に溶解し１．０ｍＭとしてリザーバ１４に用意し、ポンプＰ４（ｕｎｉｆｌｏｗｓ社製Ｕｆ−４００４Ｐ）により毎分１ｍＬで送液した。これにより、流路の合流地点でＦｅｎｔｏｎ反応が起こり、生成されたヒドロキシラジカルが容器４０に流入する。【００３３】
一方、遷移金属とビピリジンとの錯体として、Ｒｕ（ｂｐｙ）3Ｃｌ2を用いた。Ｈ2ＳＯ4を含む１．０ｍＭのＲｕ（ｂｐｙ）3Ｃｌ2をリザーバ３０に用意し、ポンプＰ２（ｕｎｉｆｌｏｗｓ社製Ｕｆ−４００４Ｐ）により、ダンパーＤ２（ｕｎｉｆｌｏｗｓ社製ＰＵＬＳＥ  ＤＵＭＰＥＲ  ＰＤ０２３５Ｐ）を介して、毎分０．２ｍＬで送液し、電解酸化装置３２（ＨＯＫＵＴＯ  ＤＥＮＫＯ社製ＨＡ−１５１）で定流電界酸化した。検出器は、電解化学発光検出器（ＪＡＳＣＯ社製ＣＬ−２０２７ｐｌｕｓ）を用いた。【００３４】
リザーバ２０には移動相として蒸留水を用意し、ポンプＰ１（ＪＡＳＣＯ社製８８０−ＰＵ）により、ダンパーＤ１としてカラム（ＳＥＩＳＨＩＮ社）を使用し、毎分０．５ｍＬで送液した。安定した発光が検出されたところで、被検物質を、それぞれ１０μｇをサンプルインジェクタ２２によって注入した。【００３５】
消光強度の測定結果を図４に示す。フリーラジカル消去による脳保護剤として知られるエダラボン、尿酸、アスコルビン酸について、ヒドロキシラジカル消去活性が認められた。活性の強さは、尿酸、エダラボン、アスコルビン酸の順であった。
【実施例２】
【００３６】
図１に示す装置１において、ヒドロキシラジカル生成手段を図３に示した構成とし、以下に記載する方法で、Ｌ−トリプトファンのヒドロキシラジカル消去能を測定した。【００３７】
まず、０．１ｍＭの過酸化水素水をリザーバ１６に用意し、ポンプＰ５（島津製作所社製ＬＣ−６Ａ）を用いて毎分０．２ｍＬで送液した。ＵＶランプ１９を点灯させておくことにより、過酸化水素水がらせん状の流路１８を通過する際に生成するヒドロキシラジカルを、容器４０に流入させた。【００３８】
一方、遷移金属とビピリジンとの錯体としては、Ｒｕ（ｂｐｙ）3Ｃｌ2を用いた。０．１ｍＭのＲｕ（ｂｐｙ）3Ｃｌ2と５ｍＭのＨ2ＳＯ4を含む溶液をリザーバ３０に用意し、ポンプＰ２（ｕｎｉｆｌｏｗｓ社製Ｕｆ−４００４Ｐ）により、ダンパーＤ２（ｕｎｉｆｌｏｗｓ社製ＰＵＬＳＥ  ＤＵＭＰＥＲ  ＰＤ０２３５Ｐ）を介して、毎分０．４ｍＬで送液した。電解酸化装置３２（ＨＯＫＵＴＯ  ＤＥＮＫＯ社製ＨＡ−１５１）で定流電界酸化した。検出器４２は、電解化学発光検出器（ＪＡＳＣＯ社製ＣＬ−２０２７ｐｌｕｓ）を用いた。【００３９】
リザーバ２０には移動相として蒸留水を用意し、ポンプＰ１（ＪＡＳＣＯ社製８８０−ＰＵ）により、ダンパーＤ１としてカラム（ＳＥＩＳＨＩＮ社）を使用し、毎分０．３ｍＬで送液した。検出器４２により安定した発光が検出されたところで、被検物質として、０μＭ、１５μＭ、６０μＭ、１５０μＭ、３００μＭ、６００μＭ、及び１０００μＭのＬ−トリプトファンをサンプルインジェクタ６２によってそれぞれ５μＬずつ３回注入した。【００４０】
結果を図５に示す。過酸化水素水に紫外線を照射してヒドロキシラジカルを発生させるシステムによっても、ヒドロキシラジカル消去能を定量的に測定できることが確認された。また、Ｌ−トリプトファンのヒドロキシラジカル消去能は、所定の濃度までは濃度に依存し、ある濃度を超えると飽和することが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の被検物質のヒドロキシラジカル消去能測定装置の一例であり、Ｆｅｎｔｏｎ反応によってヒドロキシラジカルを発生させる装置を示す概略図である。
【図２】本発明のヒドロキシラジカル消去能測定装置における酸化チタンを用いたヒドロキシラジカル生成手段を示す概略図である。
【図３】本発明のヒドロキシラジカル消去能測定装置における過酸化水素水に紫外線を照射するヒドロキシラジカル生成手段を示す概略図である。
【図４】図１に示される装置により、被検物質のヒドロキシラジカル消去能を測定した結果である。
【図５】図１に示される装置において、図３に示されるヒドロキシラジカル生成手段を使用して、Ｌ−トリプトファンのヒドロキシラジカル消去能を測定した結果である。
【符号の説明】
【００４２】
１０…ヒドロキシラジカル生成手段、１２、１４、１６、２０、３０…リザーバ、１８…流路、１９…ランプ、２２…サンプルインジェクタ、３２…電解酸化装置、３４…安定化直流電源、４０…容器、４２…レコーダ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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