(57)【要約】本発明により新規な配列を有するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸が提供される。本発明の核酸は、マイクロＲＮＡの発現または変異の検出、細胞の分離、標的配列を有する遺伝子の発現抑制、マイクロＲＮＡの機能の促進または抑制させる物質のスクリーニング、肥満細胞の異常に起因する疾患、間葉系幹細胞の増殖または分化の異常に起因する疾患、癌及び細胞の増殖異常や組織の過形成等が原因となっている疾患の診断や治療に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなる核酸。
【請求項２】
配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。
【請求項３】
配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸を含む核酸。
【請求項５】
配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸。
【請求項６】
配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。
【請求項７】
配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸を発現するベクター。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸の発現または変異を検出する方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸を発現する細胞を分離する方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項１７】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制させることを指標とする、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸またはベクターを導入した細胞。
【請求項２１】
配列番号が１、２、３、８、１４、２０、２２、２５、３２または３６のいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤。
【請求項２２】
配列番号が１３３７、１３３８、１３３９、１３５２、１３６３、１３７１、１３７３、１３７７、１３８６または１３９０のいずれかである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
【請求項２４】
請求項２１または２２に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤。
【請求項２５】
請求項２１または２２に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤。
【請求項２６】
請求項２１または２２に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２７】
請求項２１または２２に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤。
【請求項２８】
請求項２１または２２に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項２９】
配列番号が１、８、２１または３６のいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項３０】
配列番号が１３３７、１３５２、１３７２または１３９０のいずれかである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項３１】
請求項２９または３０に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項３２】
請求項２９または３０に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項３３】
請求項２９または３０に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項３４】
請求項２９または３０に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３５】
請求項２９または３０に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項３６】
請求項２９または３０に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３７】
配列番号が１である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤。
【請求項３８】
配列番号が１３３７である、請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤。
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖抑制剤。
【請求項４０】
配列番号が８、２１または３６のいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖抑制剤。
【請求項４１】
配列番号が１３５２、１３７２または１３９０のいずれかである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖抑制剤。
【請求項４２】
請求項３７または３８に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤。
【請求項４３】
請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
【請求項４４】
請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
【請求項４５】
請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項４６】
請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
【請求項４７】
請求項３７〜４２のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項４８】
配列番号が１、３、８、２０、２１、２２、３２または３６のいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項４９】
配列番号が１３３７、１３３９、１３５２、１３７１、１３７２、１３７３、１３８６または１３９０のいずれかである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項５０】
請求項４８または４９に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項５１】
請求項４８または４９に記載の核酸と、該核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項５２】
請求項４８または４９に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項５３】
請求項４８または４９に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５４】
請求項４８または４９に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
【請求項５５】
請求項４８または４９に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５６】
細胞の増殖異常に起因する疾患が癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎および自己免疫疾患からなる群から選ばれる疾患である請求項４８〜５５のいずれか１項に記載の診断薬、治療薬またはスクリーニング方法。
【請求項５７】
配列番号が１、３、８、２０、２１、２２、３２または３６のいずれかである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。
【請求項５８】
配列番号が１３３７、１３３９、１３５２、１３７１、１３７２、１３７３、１３８６または１３９０のいずれかである、請求項５〜７のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。
【請求項５９】
請求項５７または５８に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤。
【請求項６０】
請求項５７または５８に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
【請求項６１】
請求項５７または５８に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
【請求項６２】
請求項５７または５８に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤のスクリーニング方法。
【請求項６３】
請求項５７または５８に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
【請求項６４】
請求項５７または５８に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、新規核酸、ならびに、該核酸を発現または抑制させる方法、該核酸を含有する診断薬または治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】  核酸の１種であるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、蛋白質に翻訳されない約２２ヌクレオチドの小さな非コード一本鎖ＲＮＡであり、ヒトを含む生物に多数存在することが確認されている（非特許文献１、２）。
マイクロＲＮＡは、単一又はクラスター化されたマイクロＲＮＡ前駆体に転写される遺伝子から生成される。すなわち、まず、遺伝子から一次転写産物であるｐｒｉｍａｒｙ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）が転写され、次いで、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡから成熟型マイクロＲＮＡへの段階的プロセシングにおいて、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡから特徴的なヘアピン構造を有する約７０塩基のｐｒｅｃｕｒｓｏｒ−ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）が生成される。さらに、Ｄｉｃｅｒ介在によるプロセシングによりｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから成熟型マイクロＲＮＡが生成される（非特許文献３）。【０００３】  成熟型マイクロＲＮＡは、標的となるｍＲＮＡに相補的に結合してｍＲＮＡの翻訳を抑制する、あるいはｍＲＮＡを分解することにより、遺伝子発現の転写後制御に関与していると考えられている。２００６年５月現在、マイクロＲＮＡのデータベースｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）には、ヒトで４５５種、全生物種で３６８５種のマイクロＲＮＡが登録されている。ヒトを含む哺乳類で発現するマイクロＲＮＡの中で、その生理的機能に関してわかっているものは、血球系分化に関与するｍｉＲ−１８１（非特許文献４）やインシュリン分泌に関与するｍｉＲ−３７５（非特許文献５）など一部のみであり、多くはその生理的活性が未解明である。ただし、線虫やショウジョウバエを用いた研究からマイクロＲＮＡが生物の発生、分化に様々な重要な役割を果たしていることが明らかとなってきており、ヒト疾患との関係においても特に癌との関係を示唆する報告が出てきている（非特許文献６）。【０００４】  マイクロＲＮＡを同定する方法には、細胞から低分子ＲＮＡをクローニングする方法や、ゲノム配列情報からバイオインフォマティクスを用いる方法などがある。ｍｉＲＢａｓｅにマイクロＲＮＡとして登録されるためには、発現に関する情報と生合成及び構造に関する情報の両方が必要であり、ゲノム配列情報からの構造の予測だけではマイクロＲＮＡとして認められていない（非特許文献７）。【０００５】  肥満細胞は各種刺激により活性化され、脱顆粒を起こし、数多くの炎症性メディエーターを遊離、産生することが知られている（非特許文献８〜１０）。例えば肥満細胞に抗原が認識されると、脱顆粒によりヒスタミンやトリプターゼが速やかに放出されると共に、プロスタグランジンＤ２（ＰＧＤ２）、ロイコトリエン（ＬＴ）、血小板活性化因子（ＰＡＦ）などのケミカルメディエーター、およびマクロファージ炎症性蛋白質（ＭＩＰ）−１α等の各種のケモカインや顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）等の各種サイトカインが新たに合成され、放出されることが知られている。また、これまで好酸球が作ると考えられていた細胞障害性蛋白質である主要塩基性蛋白質（ｍａｊｏｒ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に関しても、ヒトの場合は肥満細胞が多量につくることが最近明らかになっている（非特許文献１１）。【０００６】  このように、肥満細胞は種々のアレルギー疾患の病態形成において主要な役割を演じていると考えられることから、肥満細胞の機能を制御することにより、アレルギー疾患の治療���可能であると考えられる。
しかしながら、げっ歯類肥満細胞とヒト肥満細胞では、薬剤への反応性が異なることが知られている（非特許文献９）。具体的には、炎症性メディエーター遊離抑制薬として使用されているクロモグリク酸ナトリウムは、ラット腹腔肥満細胞においてはＩｇＥ依存性の炎症性メディエーター遊離を顕著に抑制するが、ヒト肥満細胞に対する作用は強いものではない（非特許文献１２）。塩酸アゼラスチンは、高濃度においてはヒト培養肥満細胞からのヒスタミン、ＰＧＤ２、ＬＴの遊離、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＩＰ−１αの産生を抑制するが、いずれの活性も強いものではない。また、抗サイトカイン薬として使用されているトシル酸スプラタストは、ラット肥満細胞に対しては炎症性メディエーター遊離抑制作用を示すが、ヒト肥満細胞に対する作用はない（非特許文献１２）。【０００７】  また、ヒト肥満細胞とマウス肥満細胞で発現する遺伝子について比較された結果、各種刺激により発現する遺伝子が必ずしも一致しないことが知られている（非特許文献１３）。
マイクロＲＮＡについては、マウス骨髄由来肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡは報告されているが（非特許文献１４）、マイクロＲＮＡと肥満細胞の機能との関係は知られていない。ヒト肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡについては報告されておらず、上記のようなヒトとマウス間の種差を考慮すると、マウス肥満細胞のマイクロＲＮＡの発現情報をもとに、ヒト肥満細胞のマイクロＲＮＡの発現情報を予測することは困難である。【０００８】  間葉系幹細胞は、哺乳類の骨髄、脂肪組織、臍帯血等に存在し、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞等に分化する多能性の幹細胞として知られている。間葉系幹細胞は、その分化多能性の故に、骨、軟骨、腱、筋肉、脂肪、歯周組織など、多くの組織の再生医療のための移植材料として注目されている（非特許文献１５）。
間葉系幹細胞は、薬剤やサイトカイン等の添加によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の細胞へ分化させることができる。例えば、脂肪細胞へは１−メチル−３−イソブチルキサンチン、デキサメタゾン、インスリンおよびインドメタシンを作用させることにより、骨芽細胞へはデキサメタゾン、β−グリセロールフォスフェイト、およびアスコルビン酸を作用させることにより誘導できる（非特許文献１６）。しかし、これらの分化の過程における分子的なメカニズムに関しての詳細は不明である。遺伝子ノックアウトマウスや分化段階での遺伝子発現解析の結果から、脂肪細胞へはＰＰＡＲγおよびＣ／ＥＢＰファミリーが、骨芽細胞分化時にはＣｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２およびＯｓｔｅｒｉｘなどの遺伝子発現が関与していることが知られている（非特許文献１７）が、これらの遺伝子群のみで間葉系幹細胞からの分化メカニズムを説明することはできず、人為的に分化及び増殖を制御するには至っていない。また、間葉系幹細胞の分化及び増殖に作用するマイクロＲＮＡは知られていない。【０００９】  マイクロＲＮＡは様々な遺伝子の発現制御に関与することから、マイクロＲＮＡの異常はヒトの種々の疾患に関与していることが予想される。特に癌においては研究が進展しており、多くの癌においてマイクロＲＮＡの発現が正常組織と異なっていること、マイクロＲＮＡの発現プロファイル解析により癌の分類が可能であることなどが報告されている（非特許文献１８）。また、これまでに見出されたヒトのマイクロＲＮＡの約半数が、ヒト癌で知られている染色体異常あるいは染色体の脆弱部位に存在することも知られている（非特許文献１９）。今までに報告されている癌とマイクロＲＮＡの関係の例としては、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）で欠失が見られる染色体１３ｑ１４にｍｉＲ−１５ａ／ｍｉＲ−１６クラスターが含まれ、その欠失がＢ−ＣＬＬの原因の一つになっていると予測されていること（非特許文献２０）、肺癌ではマイクロＲＮＡの一つであるＬｅｔ−７の発現が低下しており、その標的の一つが癌原遺伝子として知られるＲａｓであること（非特許文献２１、２２）などがある。多くのマイクロＲＮＡは癌細胞で発現が低下しているが、逆に癌で遺伝子増幅や過剰発現が見られるマイクロＲＮＡもある。例えば、悪性リンパ腫で遺伝子増幅が見られる領域には６種のマイクロＲＮＡからなるクラスター（ｍｉＲ−１７−９２）が存在し、このｍｉＲＮＡクラスター遺伝子をヒトＢ細胞リンパ腫のモデルマウスに強制発現させるとリンパ腫の発生が促進されることが報告されている（非特許文献２３）。また以前から蛋白質をコードしない、ホジキンリンパ腫で過剰発現する癌遺伝子候補とされていたＢＩＣと呼ばれる遺伝子は、ｍｉＲ−１５５をコードしていることも明らかとなっている（非特許文献２４）。【００１０】  このように癌とマイクロＲＮＡの関係は近年多数報告されているが、その殆どは癌細胞での発現異常を示すものであり、マイクロＲＮＡの機能を示した研究は、Ｌｅｔ−７を肺癌細胞株に強制発現させることで癌細胞株の増殖を阻害したという報告（非特許文献２５）など、わずかしかない。体外からマイクロＲＮＡあるいはその前駆体、あるいはそのアンチセンスオ��ゴヌクレオチドを投与してマイクロＲＮＡの発現を増大あるいは減少させることで、動物モデルで癌の増殖を抑制させたという報告は現在のところ存在しない。
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３−８５８（２００１）
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ，１１３，６７３−６７６（２００３）
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５，５２２−５３１（２００４）
【非特許文献４】Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０３，８３−８６（２００４）
【非特許文献５】Ｎａｔｕｒｅ，４３２，２２６−２３０（２００４）
【非特許文献６】Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，６，２５９−２６９（２００６）
【非特許文献７】ＲＮＡ，９，２７７−２７９（２００３）
【非特許文献８】黒沢元博編，「肥満細胞の臨床」，先端医学社，ｐ１４２（２００１）；
【非特許文献９】黒沢元博編，「肥満細胞の臨床」，先端医学社，ｐ５５９（２００１）；
【非特許文献１０】Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２，１１５−１４０（２００２）
【非特許文献１１】Ｂｌｏｏｄ，９８，１１２７−１１３４（２００１）
【非特許文献１２】Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ，２８，１２２８−１２３６（１９９８）
【非特許文献１３】Ｂｌｏｏｄ，１００，３８６１−３８６８（２００２）
【非特許文献１４】Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，Ｒ７１（２００５）
【非特許文献１５】「遺伝子医学」、２０００年、４巻、ｐ．５８−６１
【非特許文献１６】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７（１９９９）
【非特許文献１７】「実験医学」、２００２年、２０巻、ｐ．２４５９−２４６４
【非特許文献１８】Ｎａｔｕｒｅ，４３５，８３９−８４３（２００５）
【非特許文献１９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，２９９９−３００４（２００４）
【非特許文献２０】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１５５２４−１５５２９（２００２）
【非特許文献２１】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４，３７５３−３７５６（２００４）
【非特許文献２２】Ｃｅｌｌ，１２０，６３５−６４７（２００５）
【非特許文献２３】Ｎａｔｕｒｅ，４３５，８２３−８３３（２００５）
【非特許文献２４】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２，３６２７−３６３２（２００５）
【非特許文献２５】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６４，３７５３−３７５６（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  ヒトの種々の臓器で発現しているマイクロＲＮＡを同定し、その機能を解析し、疾患との関係を解明することにより、新しい治療薬及び診断薬が開発されることが期待される。
肥満細胞で作用しているマイクロＲＮＡを見出すことは、肥満細胞の分化や脱顆粒、炎症性メディエーター産生、サイトカイン産生、ケモカイン産生等の機能解明につながり、肥満細胞の単離・培養・分化制御・脱顆粒制御・炎症性メディエーター産生制御・サイトカイン産生制御・ケモカイン産生制御法の開発およびそれらを利用した新しいアレルギー疾患等の治療法につながると期待できる。【００１２】  また、間葉系幹細胞で作用しているマイクロＲＮＡを見出すことは、間葉系幹細胞における分化及び増殖の機能解明につながり、間葉系幹細胞から特定の細胞への分化制御法の開発および分化制御を利用した新しい治療法につながると期待できる。
さらに、癌細胞の増殖または抑制を引き起こすマイクロＲＮＡを見出すことは、発癌のメカニズムの理解に役立つのみならず、ヒトの癌の診断薬や治療薬の開発、さらにはそれらを利用した癌の新しい診断法や治療法につながることが期待される。さらに癌以外の疾患に関しても、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患など細胞の異常増殖、組織の過形成等が原因となっている疾患の診断薬・治療薬やそれらを利用した診断法・治療法の開発に貢献することが期待される。【００１３】  本発明の目的は、マイクロＲＮＡ群を取得し、肥満細胞の単離・培養・分化制御・脱顆粒制御・炎症性メディエーター産生制御・サイトカイン産生制御・ケモカイン産生制御、及びアレルギー疾患の診断・治療、間葉系幹細胞の分化及び増殖の制御、癌細胞の分化や増殖の制御、癌等の疾患の診断・治療に有用な核酸及び、それらの利用法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】  本発明は以下の（１）〜（６４）に関する。
（１）配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなる核酸。
（２）配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。
（３）配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の核酸を含む核酸。
（５）配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸。
（６）配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。
（７）配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
（８）（１）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸。
（９）（１）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸。
（１０）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸を発現するベクター。
（１１）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とする、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸の発現または変異を検出する方法。
（１２）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とする、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質のスクリーニング方法。
（１３）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とする、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸を発現する細胞を分離する方法。
（１４）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸を用いることを特徴とする、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する方法。
（１５）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（１６）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（１７）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
（１８）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（１９）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制させることを指標とする、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
（２０）（１）〜（１０）のいずれか１項に記載の核酸またはベクターを導入した細胞。
（２１）配列番号が１、２、３、８、１４、２０、２２、２５、３２または３６のいずれかである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤。
（２２）配列番号が１３３７、１３３８、１３３９、１３５２、１３６３、１３７１、１３７３、１３７７、１３８６または１３９０のいずれかである、（５）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤。
（２３）（２１）または（２２）に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒抑制剤。
（２４）（２１）または（２２）に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤。
（２５）（２１）または（２２）に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤。
（２６）（２１）または（２２）に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法。
（２７）（２１）または（２２）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤。
（２８）（２１）または（２２）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤のスクリーニング方法。
（２９）配列番号が１、８、２１または３６のいずれかである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（３０）配列番号が１３３７、１３５２、１３７２または１３９０のいずれかである、（５）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（３１）（２９）または（３０）に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（３２）（２９）または（３０）に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（３３）（２９）または（３０）に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（３４）（２９）または（３０）に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
（３５）（２９）または（３０）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（３６）（２９）または（３０）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
（３７）配列番号が１である、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤。
（３８）配列番号が１３３７である、（５）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤。
（３９）（３７）または（３８）に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖抑制剤。
（４０）配列番号が８、２１または３６のいずれかである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖抑制剤。
（４１）配列番号が１３５２、１３７２または１３９０のいずれかである、（５）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖抑制剤。
（４２）（３７）または（３８）に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤。
（４３）（３７）〜（４２）のいずれか１項に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
（４４）（３７）〜（４２）のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
（４５）（３７）〜（４２）のいずれか１項に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤のスクリーニング方法。
（４６）（３７）〜（４２）のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤。
（４７）（３７）〜（４２）のいずれか１項に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤のスクリーニング方法。
（４８）配列番号が１、３、８、２０、２１、２２、３２または３６のいずれかである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（４９）配列番号が１３３７、１３３９、１３５２、１３７１、１３７２、１３７３、１３８６または１３９０のいずれかである、（５）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（５０）（４８）または（４９）に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（５１）（４８）または（４９）に記載の核酸と、該核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（５２）（４８）または（４９）に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（５３）（４８）または（４９）に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
（５４）（４８）または（４９）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬。
（５５）（４８）または（４９）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬のスクリーニング方法。
（５６）細胞の増殖異常に起因する疾患が癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎および自己免疫疾患からなる群から選ばれる疾患である（４８）〜（５５）のいずれか１項に記載の診断薬、治療薬またはスクリーニング方法。
（５７）配列番号が１、３、８、２０、２１、２２、３２または３６のいずれかである、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。
（５８）配列番号が１３３７、１３３９、１３５２、１３７１、１３７２、１３７３、１３８６または１３９０のいずれかである、（５）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤。
（５９）（５７）または（５８）に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖促進剤。
（６０）（５７）または（５８）に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
（６１）（５７）または（５８）に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
（６２）（５７）または（５８）に記載の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させることを指標とする、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤のスクリーニング方法。
（６３）（５７）または（５８）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質を有効成分として含有する、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤。
（６４）（５７）または（５８）に記載の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進させることを指標とする、細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】  本発明により、新規核酸、該核酸を発現するベクター、該核酸の発現及び変異を検出する方法、該核酸を制御する物質のスクリーニング方法、該核酸を発現する細胞の分離方法、該核酸の標的遺伝子の発現制御方法、該核酸もしくは該核酸を制御する物質を有効成分として含有する診断薬または医薬、該核酸の標的遺伝子の発現制御物質を含有する診断薬または医薬、並びに肥満細胞または間葉系幹細胞等の異常に起因する疾患や癌等の疾患の診断薬または治療薬、細胞の分化や増殖の制御剤などを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１１９４の配列番号１５８０で表される塩基配列の２次構造を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  本発明における核酸としては、以下の核酸があげられる。該核酸は、マイクロＲＮＡまたはその誘導体、マイクロＲＮＡ前駆体またはその誘導体、および二本鎖核酸（以下、本発明の核酸ともいう）であることが好ましい。
（１）配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなる核酸。
（２）配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。
（３）配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の核酸を含む核酸。
（５）配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸。
（６）配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸。
（７）配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸。
（８）（１）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸。
（９）（１）〜（７）のいずれか１項に記載の核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸。【００１８】  本発明においてマイクロＲＮＡとは、細胞に由来する一本鎖ＲＮＡであり、かつ、該配列を含む周辺ゲノム配列がヘアピン構造を形成し得る配列を有しており、ヘアピンのいずれか片鎖から切り出され得るＲＮＡをいう。マイクロＲＮＡの長さとしては、１５〜２８塩基が好ましく、１６〜２８塩基がより好ましく、１６〜２６塩基がさらに好ましく、１６〜２４塩基が特に好ましい。マイクロＲＮＡは、その標的となるｍＲＮＡに相補的に結合してｍＲＮＡの分解あるいは翻訳を抑制し、遺伝子発現の転写後制御を行う。本発明のマイクロＲＮＡとしては、配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなる核酸、配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸をあげることができる。また、配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸をあげることができる。また本発明のマイクロＲＮＡとして、これらの核酸を含む核酸をあげることができる。【００１９】  本発明においてマイクロＲＮＡ前駆体とは、マイクロＲＮＡを含む約５０〜約２００塩基長、好ましくは約７０〜約１００塩基長の核酸であり、かつ、ヘアピン構造を形成し得る核酸である。マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ前駆体からＤｉｃｅｒと呼ばれる蛋白質によるプロセシングを経て生成される。本発明のマイクロＲＮＡ前駆体としては、配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸、配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸、配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸があげられる。なおマイクロＲＮＡ前駆体は、マイクロＲＮＡの配列を含んでおり、該マイクロＲＮＡがマイクロＲＮＡ前駆体からプロセシングを経て生成されれば、前駆体としての機能を有するため、配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の相同性を有している核酸であれば、マイクロＲＮＡ前駆体としての機能を有するものと考えられる。【００２０】  表１−１〜１−４０に、マイクロＲＮＡとして具体的に挙げられる配列番号１〜１３３６で表される塩基配列と、その前駆体として挙げられるマイクロＲＮＡ前駆体の塩基配列の関係を示す。
［表１−１］
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【００２１】［表１−２］
2008084319.tif 000004
【００２２】［表１−３］
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【００２３】［表１−４］
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【００２４】［表１−５］
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【００２５】［表１−６］
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【００２６】［表１−７］
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【００２７】［表１−８］
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【００２８】［表１−９］
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【００２９】［表１−１０］
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【００３０】［表１−１１］
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【００３１】［表１−１２］
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【００３２】［表１−１３］
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【００３３】［表１−１４］
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【００３４】［表１−１５］
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【００３５】［表１−１６］
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【００３６】［表１−１７］
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【００３７】［表１−１８］
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【００３８】［表１−１９］
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【００３９】［表１−２０］
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【００４０】［表１−２１］
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【００４１】［表１−２２］
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【００４２】［表１−２３］
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【００４３】［表１−２４］
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【００４４】［表１−２５］
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【００４５】［表１−２６］
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【００４６】［表１−２７］
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【００４７】［表１−２８］
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【００４８】［表１−２９］
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【００４９】［表１−３０］
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【００５０】［表１−３１］
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【００５１】［表１−３２］
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【００５２】［表１−３３］
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【００５３】［表１−３４］
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【００５４】［表１−３５］
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【００５５】［表１−３６］
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【００５６】［表１−３７］
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【００５７】［表１−３８］
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【００５８】［表１−３９］
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【００５９】［表１−４０］
2008084319.tif 000042
【００６０】  また本発明の核酸として、上記にあげられた核酸に対して相補的な塩基配列からなる核酸、上記にあげられた核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とからなる二本鎖核酸をあげることができる。
本発明において、配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸とは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなる核酸と少なくとも９０％以上、好ましくは９１％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９３％以上、特に好ましくは９４％以上、最も好ましくは９５％以上である核酸であることを意味する。また本発明において、配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上の同一性を有する塩基配列からなる核酸とは、ＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８３，６３（１９９０）〕等の解析ソフトを用いて計算したときに、配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列からなる核酸と少なくとも８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９２％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９６％以上である核酸であることを意味する。【００６１】  本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸としては、例えば配列番号１〜２８５１のいずれかで表される塩基配列を有する核酸またはその一部の断片をプローブとして、２０ｘＳＳＣ  ７．５ｍＬ、１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）０．６ｍＬ、１０％ＳＤＳ  ２１ｍＬ、５０ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ０．６ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ  ｓｏｎｉｃａｔｅｄ  ｓａｌｍｏｎ  ｓｐｅｒｍ  ＤＮＡ  ０．３ｍＬから成るＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒに、γ−３２Ｐ−ＡＴＰで標識したプローブＲＮＡを加え、５０℃で一晩反応させた後、５０℃で１０分間、５ｘＳＳＣ／５％ＳＤＳ液で洗浄し、更に５０℃で１０分間、１ｘＳＳＣ／１％ＳＤＳ液で洗浄し、その後メンブレンを取り出し、Ｘ線フィルムに感光させることにより同定できる核酸をあげることができる。【００６２】  本発明において、核酸とはヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡが混合した重合体、および、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体をあげることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよく、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。マイクロＲＮＡまたはその誘導体、マイクロＲＮＡ前駆体またはその誘導体も本発明の核酸に含まれる。【００６３】  本発明において、ヌクレオチド類似体とは、ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、あるいは細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子であればいかなる分子でもよく、���然に存在する分子でも非天然の分子でもよく、例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等があげられる。【００６４】  糖部修飾ヌクレオチド類似体とは、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、２’−Ｏ−メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−［２−（グアニジウム）エチル］リボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）（ＢＮＡ）、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）、およびエチレン架橋構造型人工核酸（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（ＥＮＡ）［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，ｅ１７５（２００４）］があげられ、さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，３２，６２４（１９９９）］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３，４６５３（２００１）］、およびペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，６９００（２０００）］等をあげることができる。【００６５】  リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体とは、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、Ｎ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等をあげることができる［細胞工学，１６，１４６３−１４７３（１９９７）、ＲＮＡｉ法とアンチセンス法，講談社（２００５）］。【００６６】  本発明において核酸誘導体とは、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよく、例えば、５’−ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６−ＦＡＭ付加誘導体、およびビオチン付加誘導体等をあげることができる。【００６７】  別の核酸の誘導体として、例えば、糖の修飾体としては、２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、２’−Ｏ−メチルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、２’−Ｏ−メトキシエチルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体��２’−Ｏ−［２−（グアニジウム）エチル］リボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、２’−Ｏ−フルオロリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができ、リン酸基の修飾体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスフォロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる［細胞工学，１６，１４６３−１４７３（１９９７）、ＲＮＡｉ法とアンチセンス法，講談社（２００５）］。【００６８】  本発明において、マイクロＲＮＡ誘導体とは、当該マイクロＲＮＡと同等の機能を有するリボヌクレオチド以外の分子を含む重合体であればいかなるものでもよく、例えば、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡが混合した重合体、および、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体をあげることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよく、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。【００６９】  マイクロＲＮＡ前駆体の誘導体とは、当該マイクロＲＮＡ前駆体と同等の機能を有するリボヌクレオチド以外の分子を含む重合体であればいかなるものでもよく、例えば、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡが混合した重合体、および、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体をあげることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよく、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。【００７０】  本発明の核酸を製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成法を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成法を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法、ＣＥＭ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，３２８７（２００７）］等をあげることができ、例えば、ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはＤＮＡを鋳型として典型的なファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写法をあげることができる。【００７１】  本発明の核酸を用いて、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の発現を検出する方法としては、検体中の核酸を検出できる方法であればいかなる方法でもよく、例えば、（１）ノーザンハイブリダイゼーション、（２）ドットブロットハイブリダイゼーション、（３）ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（４）定量的ＰＣＲ、（５）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、（６）マイクロアレイ、（７）リボヌクレアーゼ保護アッセイ等の方法があげられる。【００７２】  本発明の核酸を用いて、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の変異を検出する方法としては、検体中の核酸の塩基配列の変異を検出できる方法であれば、いかなる方法でもよく、例えば、非変異型塩基配列を有する核酸と変異型塩基配���を有する核酸とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法や、あるいは、検体由来の塩基配列を直接配列決定して変異の有無を検出する方法等をあげることができる。【００７３】  本発明の核酸を用いて、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を発現する細胞を分離する方法としては、種々の細胞の混合物より、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を発現する細胞を分離できる方法であればいかなる方法でもよく、例えば、本発明の核酸の塩基配列と相補的な配列を有する核酸に蛍光標識したプローブを細胞に導入し、該プローブとハイブリダイゼーションさせ、標識プローブとハイブリダイゼーションした細胞のみを、ソーティング機能を有したフローサイトメーターで分離する方法等をあげることができる。【００７４】  本発明の核酸を発現するベクターとは、細胞内もしくは試験管内で転写されることにより本発明の核酸が生合成されるように設計されたベクターをいい、細胞内もしくは試験管内で本発明の核酸を転写することができるプロモーターを有していればいかなるベクターでもよい。具体的には、ｐｃＤＮＡ６．２−ＧＷ／ｍｉＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＳＩＮｓｉ−ｈＨ１  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）、ｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。【００７５】  本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸の標的塩基配列を有する遺伝子（以下、標的遺伝子という）の発現を抑制する方法としては、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸を用いて、標的塩基配列を有するｍＲＮＡの発現を抑制する活性を利用して、標的遺伝子の発現を抑制する方法であれば、いかなる方法でもよい。なお、ここで、発現を抑制するとは、ｍＲＮＡの翻訳を抑制する場合、およびｍＲＮＡを切断あるいは分解することによって、結果としてｍＲＮＡから翻訳される蛋白質の量を減少させる場合も含む。【００７６】  標的塩基配列とは、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸によって認識される数塩基からなる核酸の塩基配列をいう。該塩基配列を有するｍＲＮＡの翻訳は本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸により抑制される。マイクロＲＮＡの５’末端側２〜８番目の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するｍＲＮＡは、該マイクロＲＮＡによって翻訳が抑制される［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，Ｒ４５８−Ｒ４６０（２００５）］ので、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸の５’末端側２〜８番目と相補的な塩基配列を該マイクロＲＮＡなどの核酸の標的塩基配列としてあげることができる。例えば、マイクロＲＮＡの５’末端側２−８番目の塩基配列に対して相補的な標的配列を用意し、ヒトｍＲＮＡの３’ＵＴＲ塩基配列群に対して、完全一致配列を含有するｍＲＮＡを、文字列探索などの方法で選抜することで決定することができる。ヒトｍＲＮＡの３’ＵＴＲ塩基配列群は、「ＵＣＳＣ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  Ｇａｔｅｗａｙ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）」より取得できるゲノム配列および遺伝子位置情報を用いて作製することができる。配列番号１〜１３３６で表されるマイクロＲＮＡの標的塩基配列を有した遺伝子の具体的な例としては、米国国立バイオテクノロジー情報センターＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＥｎｔｒｅＧｅｎｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ／）で使われている名前（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  ＳｙｍｂｏｌとＧｅｎｅ  ＩＤ）で表記された表２−１〜２−３５に記載の遺伝子をあげることができる。遺伝子名は、ＥｎｔｒｅＧｅｎｅデータベースの２００６年３月時点での名前を使用した。
［表２−１］
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【００７７】［表２−２］
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【００７８】［表２−３］
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【００７９】［表２−４］
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【００８０】［表２−５］
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【００８１】［表２−６］
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【００８２】［表２−７］
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【００８３】［表２−８］
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【００８４】［表２−１０］
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【００８５】［表２−１１］
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【００８６】［表２−１２］
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【００８７】［表２−１３］
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【００８８】［表２−１４］
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【００８９】［表２−１５］
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【００９０】［表２−１６］
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【００９１】［表２−１７］
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【００９２】［表２−１８］
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【００９３】［表２−１９］
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【００９４】［表２−２０］
2008084319.tif 000080
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【００９５】［表２−２１］
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【００９６】［表２−２２］
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2008084319.tif 000086
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【００９７】［表２−２３］
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【００９８】［表２−２４］
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【００９９】［表２−２５］
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【０１００】［表２−２６］
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【０１０１】［表２−２７］
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【０１０２】［表２−２８］
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【０１０３】［表２−２９］
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【０１０４】［表２−３０］
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【０１０５】［表２−３１］
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【０１０６】［表２−３２］
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【０１０７】［表２−３３］
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【０１０８】［表２−３４］
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【０１０９】［表２−３５］
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【０１１０】  本発明の核酸を用いた、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質をスクリーニングする方法としては、本発明の核酸を用いて、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質をスクリーニングする方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸を発現するベクターを細胞に導入し、それらの標的遺伝子の発現を抑制する物質、もしくはそれらの標的遺伝子の発現を促進する物質をスクリーニングする方法があげられる。【０１１１】  標的遺伝子の発現を抑制する物質としては、標的遺伝子のｍＲＮＡの発現を抑制する物質であればいかなる物質であってもよいが、核酸が好ましく、標的遺伝子に対するｓｉＲＮＡがさらに好ましい。標的遺伝子の発現を促進する物質としては、標的遺伝子のｍＲＮＡの発現を促進する物質であればいかなる物質であってもよいが、核酸が好ましく、標的遺伝子の発現を抑制するマイクロＲＮＡに対するｓｉＲＮＡがさらに好ましい。【０１１２】  本発明の核酸またはベクターを導入した細胞とは、本発明の核酸またはベクターを体外において導入した細胞であればいかなる細胞であってもよい。具体的には、肥満細胞および肥満細胞の前駆細胞、または、間葉系幹細胞および間葉系幹細胞が分化してできた細胞、例えば皮膚、肺、小腸、鼻、扁桃、眼瞼結膜、血管壁、骨髄等の組織に存在する細胞、または、骨髄、脂肪組織、臍帯血、子宮内膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、および歯胚等の組織に存在する細胞であり、例えば、骨芽細胞、脂肪細胞、および筋肉細胞等をあげることができる。【０１１３】  本発明において肥満細胞とは、各種刺激により活性化され、脱顆粒を起こし、数多くの炎症性メディエーターを遊離、産生する細胞で、種々のアレルギー疾患の病態形成にも関与する細胞をいう。
本発明において間葉系幹細胞とは、骨髄、脂肪組織、臍帯血、子宮内膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、および歯胚等の間葉系組織に存在し、少なくとも骨芽細胞、脂肪細胞、および筋肉細胞等の間葉系細胞への分化能を有する細胞をいう。【０１１４】  本発明の核酸を有効成分とする医薬は、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断または治療に用いることができる。肥満細胞の異常としては、脱顆粒の異常があげられるため、本発明の核酸は、肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤として用いることもできる。また、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質や、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質もまた、肥満細胞の異常に起因する疾患の診断または治療に用いることができる。これらの物質は肥満細胞の脱顆粒促進剤または脱顆粒抑制剤として用いることもできる。【０１１５】  肥満細胞の異常に起因する疾患としては、具体的には、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、及びアレルギー疾患等をあげることができる。
本発明の核酸を有効成分とする医薬は、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断または治療に用いることができる。また、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質や、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質もまた、間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断または治療に用いることができる。【０１１６】  間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患としては、具体的には、癌、骨形成不全症、軟骨形成不全症、糖尿病等をあげることができる。
本発明の核酸を有効成分とする医薬は、細胞の増殖などの異常や、組織の過形成等が原因となっている疾患の診断または治療に用いることができる。また本発明の核酸は、細胞の増殖抑制剤もしくは増殖促進剤として用いることもできる。また、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体などの核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質や、本発明のマイクロＲＮＡなどの核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する物質もまた、細胞の増殖などの異常や、組織の過形成等が原因となっている疾患の診断または治療に用いることができる。これらの物質は細胞の増殖抑制剤もしくは増殖促進剤として用いることもできる。ここで細胞の増殖の異常とは、生体内における通常の増殖速度ではない速度で細胞が増殖している状態をいう。【０１１７】  細胞の増殖異常や組織の過形成等が原因となっている疾患としては、具体的には、癌、動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができる。
以下、本発明の核酸がマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体である場合を例として、本発明を詳細に説明する。
１．肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体の同定
（１−１）肥満細胞の取得、培養
ヒト肥満細胞は、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、例えば、ヒトの肺、皮膚、胎児肝臓などから公知の方法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６９，１５３（１９９４）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８，８６１（１９８７）；Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０７，３２２（２００１）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２４０，１０１（２０００）］により調製することができる。また、公知の方法［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７，３４３，（１９９６）；Ｂｌｏｏｄ，９１，１８７（１９９８）；Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０６，１４１（２０００）；Ｂｌｏｏｄ，９７，１０１６（２００１）；Ｂｌｏｏｄ，９８，１１２７（２００１）；Ｂｌｏｏｄ，１００，３８６１（２００２）；Ｂｌｏｏｄ，９７，２０４５（２００１）］に従って、ヒトの臍帯血、末梢血、骨髄、肺あるいは皮膚から調製した単核球を、幹細胞因子（以下、ＳＣＦともいう）の存在下で培養し、肥満細胞に分化させることにより、調製することができる。【０１１８】  また、ヒト肥満細胞から樹立した細胞株を用いることもできる。ヒト肥満細胞株としては、ヒト肥満細胞の性質をよく保持していることが知られているＬＡＤ２［Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２７，６７１（２００３）；Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２７，６７７（２００３）］等があげられる。
（１−２）低分子ＲＮＡと配列情報の取得
上記の各種方法で取得した肥満細胞から全ＲＮＡを抽出し、該ＲＮＡを用いて肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡを含有する低分子ＲＮＡを以下のようにして取得することができる。【０１１９】  低分子ＲＮＡの取得法としては、具体的には、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５，１８８−２００（２０００）に記載の方法に準じて、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子ＲＮＡの分離及び切り出し、５’末端脱リン酸化、３’−アダプターライゲーション、リン酸化、５’−アダプターライゲーション、逆転写、ＰＣＲ増幅、コンカテマー化、ベクターへのライゲーションを順次経て、低分子ＲＮＡをクローニングし、そのクローンの塩基配列を決定する方法等があげられる。あるいは、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５８−８６２（２００１）に記載の方法に準じて、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子ＲＮＡの分離及び切り出し、５’−アデニル化３’−アダプターライゲーション、５’−アダプターライゲーション、逆転写、ＰＣＲ増幅、コンカテマー化、ベクターへのライゲーションを順次経て、低分子ＲＮＡをクローニングし、そのクローンの塩基配列を決定する方法等があげられる。【０１２０】  あるいは、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４，１７６５−１７７１（２００６）に記載の方法により、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子ＲＮＡの分離及び切り出し、５’末端脱リン酸化、３’−アダプターライゲーション、リン酸化、５’−アダプターライゲーション、逆転写、ＰＣＲ増幅、マイクロビーズベクターへのライゲーションを順次経て、低分子ＲＮＡをクローニングし、そのマイクロビーズの塩基配列を読み取ることで塩基配列を決定することにより低分子ＲＮＡを取得することもできる。【０１２１】  また、ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて低分子ＲＮＡを取得することもできる。
（１−３）マイクロＲＮＡの同定
取得した低分子ＲＮＡ配列がマイクロＲＮＡであるかは、ＲＮＡ，９，２７７−２７９（２００３）に記載の基準に従うか否かで判定できる。例えば、上記方法で取得して塩基配列を決定した低分子ＲＮＡの場合、以下のようにしておこなうことができる。【０１２２】  すなわち、取得した低分子ＲＮＡ塩基配列に対応するＤＮＡ配列を５’末端側および３’末端側にそれぞれ５０ｎｔ程度伸ばした周辺ゲノム配列情報を取得し、そのゲノム配列から転写されることが予測されるＲＮＡの２次構造を予測する。その結果、ヘアピン構造を有し、且つ該低分子ＲＮＡの塩基配列がヘアピン構造の片鎖に位置する場合、該低分子ＲＮＡはマイクロＲＮＡであると判定できる。ゲノム配列は一般に公開されており、例えば、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）から入手可能である。また、２次構造予測も様々なプログラムが公開されており、例えば、ＲＮＡｆｏｌｄ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，３４２９−３４３１（２００３）］やＭｆｏｌｄ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，３４０６−３４１５（２００３）］等を用いることができる。また、既存のマイクロＲＮＡ配列はｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）というデータベースに登録されており、ここに記載の配列と同一か否かで、既存のマイクロＲＮＡと同一か否かを判定することができる。【０１２３】  このようにして同定した、肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡとして、例えば、配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列を有する核酸をあげることができる。
また、同定したマイクロＲＮＡに対応するゲノム配列と、他の生物のゲノム配列とを比較し、配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有する核酸を、その生物におけるマイクロＲＮＡとして同定することができる。
（１−４）マイクロＲＮＡ前駆体の同定
上記（１−３）で同定したマイクロＲＮＡの塩基配列をもとに、マイクロＲＮＡをコードする配列を含む配列をマイクロＲＮＡ前駆体をコードする配列として同定することができる。本発明の肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡ前駆体としては、例えば、配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列を有する核酸等をあげることができる。【０１２４】  更に、同定したマイクロＲＮＡ前駆体に対応するゲノム配列と、他生物のゲノム配列とを比較し、配列番号１３３７〜２８５１のいずれかで表される塩基配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上の同一性を有する塩基配列を有する核酸を、その生物におけるマイクロＲＮＡ前駆体として同定することができる。
２．核酸の合成
上記１．のようにして一旦、肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体が同定された後は、その塩基配列に基づいてリボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡだけでなく、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡも合成することができる。例えば、上記１．で同定したＲＮＡの塩基配列をもとに、ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。ＲＮＡの塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列は、ＲＮＡの配列に含まれるＵ（ウラシル）をＴ（チミン）に読み替えることで一義的に決定できる。また、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体や、ヌクレオチド類似体を含む重合体も同様にして合成することができる。【０１２５】  本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を合成する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成法を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等にて製造することができる。公知の化学合成法を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスフォロチオエート法、ホスホトリエステル法、ＣＥＭ法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５，３２８７（２００７）］等をあげることができ、例えば、ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはＤＮＡを鋳型として典型的なファージＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写法をあげることができる。
３．マイクロＲＮＡおよび該マイクロＲＮＡ前駆体の機能を検出する方法
マイクロＲＮＡは、ヘアピン構造を有するマイクロＲＮＡ前駆体が、細胞質内でＲＮａｓｅＩＩＩ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅの一種であるＤｉｃｅｒと呼ばれる蛋白質によるプロセシングを経て生成され、標的塩基配列を有するｍＲＮＡの翻訳を抑制する。従って、当該機能を有しているか否かで得られた核酸がマイクロＲＮＡであるか否かを検出することができる。【０１２６】  例えば、ＲＮＡがＲＮａｓｅＩＩＩ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅによりプロセシングされるか否かでマイクロＲＮＡ前駆体としての機能を有するかを測定することができる。具体的には、機能を検出したいＲＮＡをＲＮａｓｅＩＩＩ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅと反応させ、反応産物を電気泳動した際、マイクロＲＮＡ前駆体としての機能を有していれば、プロセシングを受けた２０−２５塩基長程度のバンドが検出されることを利用して、該機能を有するかを測定することができる。ＲＮａｓｅＩＩＩ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅは、マイクロＲＮＡ前駆体をプロセシングする活性を有するものであれば特に限定されないが、Ｄｉｃｅｒ蛋白質を用いることが好ましい。具体的には、ｓｉ−ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩＴＭ（タカラバイオ社製）、Ｃｏｌｄ  Ｓｈｏｃｋ−ＤＩＣＥＲ（タカラバイオ社製）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｄｉｃｅｒ  Ｅｎｚｙｍｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  Ｄｉｃｅｒ  ＲＮＡｉ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｘ−ｔｒｅｍｅ  ＧＥＮＥ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｉｃｅｒ  Ｋｉｔ（ロシュ・アプライド・サイエンス社製）などを用いることができ、添付された説明書の反応条件に従うことで測定できる。【０１２７】  マイクロＲＮＡの機能を検出する方法としては、標的塩基配列を有するｍＲＮＡの翻訳を抑制するか否かで該機能を有するかを測定する方法をあげることができる。
マイクロＲＮＡは、その標的塩基配列を３’末端側ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ（３’ＵＴＲ）に含むｍＲＮＡの翻訳を抑制することが知られている［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１５，Ｒ４５８−Ｒ４６０（２００５）］。そこで、測定しようとするＲＮＡに対する標的塩基配列を、適当なレポーター遺伝子発現ベクターの３’ＵＴＲに挿入したＤＮＡを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に該ＲＮＡを発現させた時に、レポーター遺伝子の発現を測定することで、マイクロＲＮＡの機能を有しているか否かを検出することができる。【０１２８】  レポーター遺伝子発現ベクターは、レポーター遺伝子の上流にプロモーターを有しており、宿主細胞においてレポーター遺伝子が発現できるものであればいかなるものでもよい。レポーター遺伝子としては、あらゆるレポーター遺伝子を使用することが可能であるが、例えば、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、エクオリン遺伝子、グリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子およびＤｓＲｅｄ蛍光遺伝子などが利用できる。こうした性質を有するレポーター遺伝子発現ベクターとして、例えば、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐｓｉＣＨＥＣＫ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＧＬ４（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＲＮＡｉ−ＧＬ（タカラバイオ社製）、ｐＣＭＶ−ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）等をあげることができる。またＲＮＡは、後述の６．に記載した方法で発現させることができる。【０１２９】  マイクロＲＮＡの機能は、具体的には以下のようにして検出することができる。まず宿主細胞をマルチウェルプレート等に培養し、標的塩基配列を有したレポーター遺伝子発現ベクターとＲＮＡを発現させる。その後、レポーター活性を測定し、該ＲＮＡを発現させない場合と比較して、該ＲＮＡを発現させた場合にレポーター活性が低下することを検出することで、マイクロＲＮＡの機能を検出することができる。
４．本発明の核酸を用いたマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の発現を検出する方法
以下に、本発明の核酸を用いて、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の発現を検出する方法について説明する。【０１３０】  マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の発現を検出する方法としては、例えば、（１）ノーザンハイブリダイゼーション、（２）ドットブロットハイブリダイゼーション、（３）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、（４）定量的ＰＣＲ、（５）デファレンシャル・ハイブリダイゼーション、（６）マイクロアレイ、（７）リボヌクレアーゼ保護アッセイ等の方法があげられる。【０１３１】  ノーザンブロット法とは、検体由来ＲＮＡをゲル電気泳動で分離後、ナイロンフィルター等の支持体に転写し、本発明の核酸の塩基配列をもとに適宜標識をしたプローブを作製し、ハイブリダイゼーションおよび洗浄をおこなうことで、本発明の核酸に特異的に結合したバンドを検出する方法であり、具体的には、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，８５３−８５８（２００１）に記載の方法等に従って行うことができる。【０１３２】  標識プローブは、例えば、ニック・トランスレーション、ランダム・プライミングまたは５’末端のリン酸化等の方法により放射性同位体、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基、化学発光基等を、本発明の核酸の塩基配列と相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡ、あるいはＬＮＡ等に取り込ませることで調製できる。標識プローブの結合量はマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の発現量を反映することから、結合した標識プローブの量を定量することでマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の発現量を定量することができる。電気泳動、メンブレンへの移行、プローブの調製、ハイブリダイゼーション、核酸の検出については、モレキュラー・クローニング第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＵＳＡ（２００１）に記載の方法により行うことができる。【０１３３】  ドットブロットハイブリダイゼーションは、組織や細胞から抽出した核酸をメンブラン上に点状にスポットして固定し、プローブとハイブリダイゼーションを行い、プローブと特異的にハイブリダイズする核酸を検出する方法である。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものを用いることができる。核酸の調製、スポット、ハイブリダイゼーション、検出については、モレキュラー・クローニング第３版に記載の方法により行なうことができる。【０１３４】 ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、生体から取得した組織のパラフィンまたはクリオスタット切片、あるいは固定化した細胞を検体として用い、標識したプローブとハイブリダイゼーションならびに洗浄の工程を行い、顕微鏡観察により、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の組織や細胞内での分布や局在を調べる方法である［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２５４，４１９（１９９５）］。プローブとしてはノーザンハイブリダイゼーションと同様のものを用いることができる。具体的には、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄ  ３，２７（２００６）に記載の方法に従って、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等を検出することができる。【０１３５】  定量的ＰＣＲでは、検体由来ＲＮＡから、逆転写��プライマーと逆転写酵素を用いて合成したｃＤＮＡ（以後、該ｃＤＮＡを検体由来ｃＤＮＡともいう）を測定に用いる。ｃＤＮＡ合成に供する逆転写用プライマーとして、ランダムプライマーあるいは特異的ＲＴプライマー等を用いることができる。特異的ＲＴプライマーとは、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等、およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列に相補する配列を有するプライマーをいう。【０１３６】  例えば、検体由来ｃＤＮＡを合成後、これを鋳型とし、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体およびその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列、あるいは逆転写用プライマーに対応する塩基配列から設計した鋳型特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｃＤＮＡの断片を増幅させ、ある一定量に達するまでのサイクル数から検体由来ＲＮＡに含まれるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体の量を検出する。鋳型特異的なプライマーとしては、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体およびその周辺ゲノム配列に対応する適当な領域を選択し、その領域の塩基配列の５’端２０〜４０塩基の配列からなるＤＮＡまたはＬＮＡ、および３’端２０〜４０塩基と相補的な配列からなるＤＮＡまたはＬＮＡの組を用いることができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，ｅ４３（２００４）に記載の方法等に準じて行うことができる。【０１３７】  または、ｃＤＮＡ合成に供する逆転写用プライマーとして、ステム・ループ構造を有した特異的ＲＴプライマーを用いることもできる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３，ｅ１７９（２００５）に記載の方法に従い、あるいは、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行うことができる。
別の検体由来ｃＤＮＡ合成法として、検体由来ＲＮＡに対してｐｏｌｙＡポリメラーゼによりｐｏｌｙＡ配列を付加し、オリゴｄＴ配列を含む塩基配列を逆転写用プライマーとして用いることにより、逆転写反応を行うこともできる。具体的には、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（キアゲン社製）やＱｕａｎｔｉＭｉｒ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて行うことができる。【０１３８】  また、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を少なくとも１つ以上含む塩基配列に対応するＤＮＡあるいはＬＮＡを固定化させたフィルターあるいはスライドガラスやシリコンなどの基盤に対して、検体由来ｃＤＮＡをハイブリダイゼーションし、洗浄を行うことにより、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の量の変動を検出することができる。このようなハイブリダイゼーションに基づく方法には、ディファレンシャルハイブリダイゼーション［Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，７，３１４（１９９１）］やマイクロアレイ［Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，６，６３９（１９９６）］を用いる方法があげられる。いずれの方法もフィルターあるいは基盤上にＵ６  ＲＮＡに対応する塩基配列などの内部対照を固定化することで、対照検体と標的検体の間でのマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の量の違いを正確に検出することができる。また対照検体と標的検体由来のＲＮＡをもとにそれぞれ異なる標識のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの混合物）を用いて標識ｃＤＮＡ合成を行い、１枚のフィルターあるいは１枚の基盤に２つの標識ｃＤＮＡを同時にハイブリダイズさせることで、正確なマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の定量を行うことができる。更に、対照検体および／または標的検体由来のＲＮＡを直接標識してハイブリダイズさせることで、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の定量を行うこともできる。例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０１，９７４０−９７４４（２００４）やＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，ｅ１８８（２００４）等に記載のマイクロアレイを用いてマイクロＲＮＡ等を検出することができる。具体的には、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ  Ｂｉｏａｒｒａｙ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いてマイクロＲＮＡ等を検出または定量することができる。【０１３９】  リボヌクレアーゼ保護アッセイでは、まず本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体あるいはその周辺ゲノム配列に対応する塩基配列の３’端にＴ７プロモーター、ＳＰ６プロモーターなどのプロモーター配列を結合し、標識したＮＴＰ（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰの混合物）およびＲＮＡポリメラーゼを用いたイン・ビトロの転写系により、標識したアンチセンスＲＮＡを合成する。該標識アンチセンスＲＮＡを、検体由来ＲＮＡと結合させて、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成させた後、１本鎖ＲＮＡのみを分解するリボヌクレアーゼＡで消化する。該消化物をゲル電気泳動し、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成することにより消化から保護されたＲＮＡ断片を、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体として検出または定量する。具体的には、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用いてマイクロＲＮＡ等を検出または定量することができる。
５．本発明の核酸を用いてマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の変異を検出する方法
以下に本発明の核酸を用いて、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の変異を検出する方法について説明する。【０１４０】  マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の変異を検出する方法として、正常型のマイクロＲＮＡと変異型のマイクロＲＮＡ、および正常型のマイクロＲＮＡ前駆体と変異型のマイクロＲＮＡ前駆体とのハイブリダイズにより形成されるヘテロ二本鎖を検出する方法を用いることができる。
ヘテロ二本鎖を検出する方法としては、（１）ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるヘテロ二本鎖検出法［Ｔｒｅｎｄｓ  ｇｅｎｅｔ．，７，５（１９９１）］、（２）一本鎖コンフォメーション多型解析法［Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１６，３２５−３３２（１９９３）］、（３）ミスマッチの化学的切断法（ＣＣＭ，ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）［Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９６），Ｔｏｍ  Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｒｅｗ  Ｐ．Ｒｅａｄ，ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ］、（４）ミスマッチの酵素的切断法［Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，９，１０３−１０４（１９９６）］、（５）変性ゲル電気泳動法［Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，２８８，１０３−１１２（１９９３）］等の方法があげられる。【０１４１】  ポリアクリルアミドゲル電気泳動法によるヘテロ二本鎖検出法は、例えば、以下のようにして行う。まず、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに対し、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の塩基配列を含むゲノムの塩基配列を基に設計したプライマーにより、２００ｂｐよりも小さい断片として増幅する。ヘテロ二本鎖が形成された場合は、変異を持たないホモ二本鎖よりも移動度が遅く、それらは余分なバンドとして検出することができる。特製のゲル（Ｈｙｄｒｏ−ｌｉｎｋ，ＭＤＥなど）を用いたほうが分離度はよい。２００ｂｐよりも示さい断片の検索ならば、挿入、欠失、ほとんどの１塩基置換を検出することができる。ヘテロ二本鎖解析は、次に述べる一本鎖コンフォメーション解析と組み合わせた１枚のゲルで行うことが望ましい。【０１４２】  一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ解析；ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎａｌｙｓｉｓ）では、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートにして、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーを用いて、２００ｂｐよりも小さい断片として増幅したＤＮＡを、変性後に、未変性ポリアクリルアミドゲル中で泳動する。ＤＮＡ増幅を行う際にプライマーを同位体あるいは蛍光色素で標識するか、または未標識の増幅産物を銀染色することにより、増幅したＤＮＡをバンドとして検出することができる。野生型のパターンとの相違を明らかにするために、コントロールの検体も同時に泳動すると、変異を持った断片を移動度の違いから検出できる。【０１４３】  ミスマッチ化学的切断法（ＣＣＭ法）では、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したＤＮＡ断片を、本発明の核酸に同位体あるいは蛍光標識をとり込ませた標識核酸とハイブリダイズさせ、四酸化オスミウムで処理することでミスマッチしている場所のＤＮＡの一方の鎖を切断させ変異を検出することができる。ＣＣＭは最も感度の高い検出法の１つであり、キロベースの長さの検体にも適応できる。【０１４４】  上記、四酸化オスミウムの代わりにＴ４ファージリゾルベースとエンドヌクレアーゼＶＩＩのような細胞内でミスマッチの修復に関与する酵素とＲＮａｓｅＡと組み合わせることで、酵素的にミスマッチを切断することもできる。
変性ゲル電気泳動法（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＤＧＧＥ法）では、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡをテンプレートに、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の塩基配列を含むゲノムの塩基配列に基づき設計したプライマーで増幅したＤＮＡ断片を化学的変性剤の濃度勾配や温度勾配を有するゲルを用いて電気泳動する。増幅したＤＮＡ断片はゲル内を二本鎖に変性する位置まで移動し、変性後は移動しなくなる。変異がある場合とない場合では増幅したＤＮＡのゲル内での移動が異なることから、変異の存在を検出できる。検出感度を上げるにはそれぞれのプライマーにポリ（Ｇ：Ｃ）端末を付けるとよい。【０１４５】  また、検体由来ＤＮＡあるいは検体由来ｃＤＮＡの塩基配列を直接的に決定し、解析することにより、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の変異を検出することもできる。
６．本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を発現させる方法
本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸は、該核酸をコードする発現ベクターを用いることにより発現させることができる。【０１４６】  発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能もしくは染色体中への組込みが可能で、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているプラスミド、ウィルスベクター等が好ましく用いられる。プロモーターとしては、宿主細胞中で発現できるものであれば、いかなるものでもよく、例えば、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）系プロモーターやＵ６  ＲＮＡやＨ１  ＲＮＡの転写系であるＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）系プロモーター等をあげることができる。ｐｏｌ  ＩＩ系プロモーターとしては例えば、サイトメガロウィルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター等をあげることができる。それらを用いた発現ベクターとして、例えば、ｐＣＤＮＡ６．２−ＧＷ／ｍｉＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ４．１−ＣＭＶ（Ａｍｂｉｏｎ社製）等を例示することができる。ｐｏｌ  ＩＩＩ系プロモーターとしてはＵ６  ＲＮＡやＨ１  ＲＮＡあるいはｔＲＮＡのプロモーターをあげることができる。それらを用いた発現ベクターとして、例えば、ｐＳＩＮｓｉ−ｈＨ１  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）、ｐＳＩＮｓｉ−ｈＵ６  ＤＮＡ（タカラバイオ社製）、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。また試験管内でマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等を発現させる場合には、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーターもしくはＳＰ６プロモーターを有する発現ベクターが好ましく用いられる。これらを有するベクターとして、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等をあげることができる。【０１４７】  プラスミドを用いる場合、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の塩基配列あるいは、その塩基配列を含むゲノムの塩基配列をもとに、ヘアピン部分を含むＤＮＡ断片を調製し、プラスミドのプロモーター下流に挿入して組換えプラスミドを造成した後、該プラスミドを、該プラスミドに適合した宿主細胞に導入するか、試験管内でＲＮＡポリメラーゼやヌクレオチドなどと混合することにより、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を発現させることができる。【０１４８】  ウィルスベクターを用いる場合、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の塩基配列を含む遺伝子をウィルスベクター内のプロモーター下流に挿入して組換えウィルスベクターを造成し、該ベクターをパッケージング細胞に導入して組換えウィルスを生産して、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の遺伝子を発現させることもできる。【０１４９】  パッケージング細胞は、ウィルスのパッケジーングに必要な蛋白質をコードする遺伝子のいずれかを欠損している組換えウィルスベクターの、該欠損する蛋白質を補給できる細胞であればいずれの細胞もよく、例えばヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞、マウス繊維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３由来の細胞などを用いることができる。パッケージング細胞で補給する蛋白質としては、レトロウィルスベクターの場合はマウスレトロウイルス由来のｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖなどの蛋白質が、レンチウィルスベクターの場合はＨＩＶウィルス由来のｇａｇ，ｐｏｌ，ｅｎｖ，ｖｐｒ，ｖｐｕ，ｖｉｆ，ｔａｔ，ｒｅｖ，ｎｅｆなどの蛋白質、アデノウィルスベクターの場合はアデノウィルス由来のＥ１Ａ，Ｅ１Ｂなどの蛋白質、また、アデノ随伴ウィルスベクターの場合はＲｅｐ（ｐ５，ｐ１９，ｐ４０），Ｖｐ（Ｃａｐ）などの蛋白質を用いることができる。【０１５０】  発現ベクターを用いる以外にも、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を、ベクターを用いずに直接細胞に導入することもできる。本手法に用いる核酸はＤＮＡやＲＮＡ、あるいはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、Ｐｒｅ−ｍｉＲＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｍｂｉｏｎ社製）やｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｍｉｍｉｃｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いることができる。
７．本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の発現または機能を促進或いは抑制または促進する方法
本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸は、アンチセンス技術［バイオサイエンスとインダストリー，５０，３２２（１９９２）、化学，４６，６８１（１９９１）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，３５８（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，８７（１９９２）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１５２（１９９２）、細胞工学，１６，１４６３（１９９７）］、トリプル・ヘリックス技術［Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１３２（１９９２）］、リボザイム技術［Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２７４（１９９９）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２３，２５７（１９９９）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，４，Ｄ４９７（１９９９）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，６，Ｒ３３（１９９９）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６，５２３７（１９９８）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，４３８（１９９８）］、デコイＤＮＡ法［Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５６，５６３（１９９８）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８２，１０２３（１９９８）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，５，４２９（１９９７）、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ−Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５４，２５８３（１９９６）］、あるいはｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を用いて、その発現または機能を抑制することができる。【０１５１】  アンチセンスとは、ある標的核酸の塩基配列に相補的な塩基配列を有する核酸を塩基配列特異的にハイブリダイゼーションさせ、該標的核酸の発現または機能を抑制できるものをいう。アンチセンスに用いる核酸はＤＮＡやＲＮＡまたはヌクレオチド類似体の他、これらのキメラ分子、あるいは該核酸の誘導体も用いることができる。具体的には、Ｎａｔｕｒｅ４３２，２２６（２００４）等に記載の方法に従うことでアンチセンスを作製し、発現または機能を抑制することができる。具体的には、Ａｎｔｉ−ｍｉＲＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ａｍｂｉｏｎ社製）やｍｉＲＩＤＩＡＮ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＧＥヘルスケア社製）を用いることにより本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の発現または機能を抑制することができる。【０１５２】  ｓｉＲＮＡとは、ある標的核酸の塩基配列を含む短い二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、該標的核酸の発現または機能を抑制できるものをいう。ｓｉＲＮＡの配列は、標的とする塩基配列から文献［Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１３，３１９１（１９９９）］の条件に基づいて適宜設計することができる。選択した１７〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列および相補的な配列それぞれの３’端にＴＴを付加した配列を有する２本のＲＮＡを核酸合成機により合成し、アニーリングすることに��りｓｉＲＮＡを作製できる。また、ｐＳｉｌｅｎｃｅｒ  １．０−Ｕ６（Ａｍｂｉｏｎ社製）、ｐＳＵＰＥＲ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ社）等のｓｉＲＮＡ発現用ベクターに上記の選択した１７〜３０塩基、好ましくは１８〜２５塩基、より好ましくは１９〜２３塩基の配列に相当するＤＮＡを挿入することにより、該遺伝子の発現または機能を抑制できるｓｉＲＮＡを発現するベクターを作製することができる。【０１５３】  肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体に特異的なアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを用いて、肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体の発現または機能の抑制を行うことができる。すなわち、該マイクロＲＮＡに特異的なアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを投与することにより該マイクロＲＮＡの発現または機能を抑制し、肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞におけるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体の作用を制御することができる。【０１５４】  具体的な一例をあげると、配列番号が１、２、３、８、１４、２０、２２、２５、３２または３６のいずれかで表されるマイクロＲＮＡもしくは配列番号が１３３７、１３３８、１３３９、１３５２、１３６３、１３７１、１３７３、１３７７、１３８６または１３９０のいずれかで表されるマイクロＲＮＡ前駆体に特異的なアンチセンスまたはｓｉＲＮＡは肥満細胞の脱顆粒抑制剤として用いることができる。また、配列番号が１、８、２１または３６で表されるマイクロＲＮＡもしくは配列番号が１３３７、１３５２、１３７２または１３９０のいずれかで表されるマイクロＲＮＡ前駆体に特異的なアンチセンスまたはｓｉＲＮＡは間葉系幹細胞の増殖抑制剤または増殖促進剤として用いることができる。さらに、配列番号が１、３、８、２０、２１、２２、３２または３６のいずれかで表されるマイクロＲＮＡもしくは配列番号が１３３７、１３３９、１３５２、１３７１、１３７２、１３７３、１３８６または１３９０のいずれかで表されるマイクロＲＮＡ前駆体に特異的なアンチセンスまたはｓｉＲＮＡは細胞増殖促進剤として用いることができる。【０１５５】  また、肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体の発現異常による患者の場合、該マイクロＲＮＡやその前駆体に特異的なアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを患者に投与することにより、肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞の機能を制御し、上記発現異常により発症する疾患の治療をすることができる。すなわち、該マイクロＲＮＡまたはその前駆体に特異的なアンチセンスまたはｓｉＲＮＡは、肥満細胞、間葉系幹細胞の異常に起因する疾患または細胞の増殖異常に起因する疾患の治療剤として有用である。【０１５６】  該マイクロＲＮＡまたはその前駆体に特異的なアンチセンスまたはｓｉＲＮＡを上記治療剤として使用する場合は、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡを単独、あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、下記１１．に記載した常法に従って医薬製剤とし、投与することができる。
一方、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の発現または機能を促進する物質としては、該マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、それらと標的塩基配列が同様であるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、およびこれらをコードする発現ベクターの他、マイクロＲＮＡ前駆体のプロセシングに関与するＤｉｃｅｒ等の因子があげられる。マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等をコードする発現ベクターは、前記６．であげられた方法により作成することができる。【０１５７】  肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、これらと標的塩基配列が同様であるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、およびこれらをコードする発現ベクターを用いて、肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体の発現または機能の促進を行うことができる。すなわち、これらを投与することにより該マイクロＲＮＡの発現または機能を促進し、肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞におけるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体の作用を制御することができる。【０１５８】  具体的な一例をあげると、配列番号が１、２、３、８、１４、２０、２２、２５、３２または３６のいずれかで表されるマイクロＲＮＡもしくは配列番号が１３３７、１３３８、１３３９、１３５２、１３６３、１３７１、１３７３、１３７７、１３８６または１３９０のいずれかで表されるマイクロＲＮＡ前駆体、これらと標的塩基配列が同様であるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、およびこれらをコードする発現ベクターは肥満細胞の脱顆粒促進剤として用いることができる。また、配列番号が１、８、２１または３６のいずれかで表されるマイクロＲＮＡもしくは配列番号が１３３７、１３５２、１３７２または１３９０のいずれかで表されるマイクロＲＮＡ前駆体、これらと標的塩基配列が同様であるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、およびこれらをコードする発現ベクターは間葉系幹細胞の増殖促進剤または増殖抑制剤として用いることができる。さらに、配列番号が１、３、８、２０、２１、２２、３２または３６のいずれかで表されるマイクロＲＮＡもしくは配列番号が１３３７、１３３９、１３５２、１３７１、１３７２、１３７３、１３８６または１３９０のいずれかで表されるマイクロＲＮＡ前駆体、これらと標的塩基配列が同様であるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、およびこれらをコードする発現ベクターは細胞の増殖抑制剤として用いることができる。【０１５９】  肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞で発現するマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体の発現異常による患者の場合、該マイクロＲＮＡやその前駆体、これらをコードする発現ベクター、これらと標的塩基配列が同様であるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、およびこれらをコードする発現ベクターを患者に投与することにより、肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞の機能を制御し、上記発現異常により発症する疾患の治療をすることができる。すなわち、該マイクロＲＮＡまたはその前駆体、これらをコードする発現ベクター、これらと標的塩基配列が同様であるマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、およびこれらをコードする発現ベクターは、肥満細胞、間葉系幹細胞の異常に起因する疾患または細胞の増殖異常に起因する疾患の治療剤として有用である。【０１６０】  該マイクロＲＮＡまたはその前駆体、およびこれらをコードする発現ベクターを上記治療剤として使用する場合は、該マイクロＲＮＡまたはその前駆体、およびこれらをコードする発現ベクターを単独、あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクターなどの適当なベクターを用い、下記１１．に記載した常法に従って医薬製剤とし、投与することができる。
８．本発明のマイクロＲＮＡ等の核酸の標的遺伝子の発現を抑制または促進する方法
本発明のマイクロＲＮＡ等の核酸の標的遺伝子の発現を抑制する方法としては、標的遺伝子の発現を抑制する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を発現させもしくは投与し、細胞内のマイクロＲＮＡの量を増加させることにより、標的配列を有するｍＲＮＡの発現を抑制し、標的遺伝子の発現を抑制する方法をあげることができる。なお、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を発現させるには、上記６．で記載した方法により行なうことができる。【０１６１】  本発明のマイクロＲＮＡ等の核酸の標的遺伝子の発現を促進する方法としては、標的遺伝子の発現を促進する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸に対するアンチセンスやｓｉＲＮＡを発現させもしくは投与することにより、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の発現または機能を抑制し、その標的遺伝子の発現を促進する方法をあげることができる。アンチセンスやｓｉＲＮＡは、上記７．で記載した方法により作製することができる。【０１６２】  配列番号１〜１３３６のいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの標的遺伝子としては、例えば、それぞれ前述の表２で示される遺伝子群を例示することができる。
９．本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を用いて細胞を分離する方法
生体内から取り出した各種細胞から、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を発現する細胞を分離する方法としては、該マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸を蛍光標識したプローブを細胞に導入し、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸とハイブリダイゼーションさせ、標識プローブとハイブリダイゼーションした細胞のみを、ソーティング機能を有したフローサイトメーターで分離することにより、行うことができる。【０１６３】  蛍光標識プローブとしては、ハイブリダイゼーションした時に特異的な蛍光を発するものであれば、いかなるものでもよく、例えば、モレキュラービーコン［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１４７９，１７８（１９９８）］やＦＲＥＴ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３，２６３（２００６）］等があげられる。
モレキュラービーコンは、一方の末端に蛍光官能基を共有結合により導入し、もう一方の末端に蛍光消光を引き起こすダブシル基等を導入した核酸で、通常の水溶液中ではヘアピン構造をとるように塩基配列が設計されている。両末端に導入した蛍光官能基と蛍光消光団は互いに隣接するためプローブ単独では蛍光が観測されないが、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸とハイブリダイゼーションすると蛍光官能基と蛍光消光団が引き離され、強い蛍光が観測できる。【０１６４】  ＦＲＥＴとは、２種以上の蛍光官能基間の分子励起エネルギー移動現象である。具体的にはエネルギー供与体を末端に導入した核酸プローブとエネルギー受容体を末端に導入した核酸プローブの２種を用意する。２つのプローブの塩基配列は、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸とハイブリダイゼーションした後に導入した２つの蛍光官能基が近接するように設計すると、プローブ単独では供与体の発光のみが観測されるが、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸とプローブがハイブリダイゼーションを引き起こすと、２つのプローブが近接するため、供与体のエネルギーが受容体に移動し、受容体に基づく発光が主として観測できる。【０１６５】  ソーティング機能を有したフローサイトメーターによる細胞の分離の方式としては、水電荷方式、セルキャプチャー方式などがあげられる（フローサイトメーター自由自在、ｐ１４−２３、秀潤社、１９９９年）。どちらの方法も細胞の蛍光測定を行い、蛍光強度を電気信号に変換することにより蛍光強度を定量し、その量に応じて細胞を分離することができる。具体的には、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａセルソーター（ベクトン・ディッキンソン社製）やＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡ  ＨｙＰｅｒＳｏｒｔ（ベックマン・コールター社製）などを用いて蛍光を測定し、細胞を分離することができる。
１０．本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の発現または機能を促進或いは抑制させる物質をスクリーニングする方法
本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を用いて、該マイクロＲＮＡやその前駆体の発現または機能を促進或いは抑制させる物質をスクリーニングすることができる。例えば、本発明のマイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体の塩基配列から、スクリーニングの標的とする塩基配列を選択して、該塩基配列を有する核酸を発現する細胞を利用して、選択したマイクロＲＮＡまたはその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質をスクリーニングすることができる。【０１６６】  スクリーニングに用いる、マイクロＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ前駆体の塩基配列を有する核酸を発現する細胞としては、肥満細胞、間葉系幹細胞または癌細胞のほか、上記６で記載したように、該塩基配列を有する核酸を発現するベクターを動物細胞や酵母などの宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞や、該塩基配列を有する核酸をベクターを用いずに直接導入した細胞等を用いることもできる。【０１６７】  具体的なスクリーニング方法としては、（ａ）スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡまたはその前駆体の発現量の変化を指標にする方法の他、マイクロＲＮＡは標的配列を有するｍＲＮＡの翻訳を抑制するため、（ｂ）スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡまたはその前駆体の標的配列を有するｍＲＮＡの発現量の変化を指標にする方法があげることができる。
（ａ）スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡまたはその前駆体の発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
該塩基配列を有する核酸を発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の発現量の変化を指標に、マイクロＲＮＡやその前駆体の発現を促進または抑制させる物質を得る。核酸の発現量は、上記４．で記載した方法により検出することができる。
（ｂ）スクリーニングの標的とするマイクロＲＮＡまたはその前駆体の標的配列を有するｍＲＮＡの発現量の変化を指標にするスクリーニング方法
該塩基配列を有する核酸を発現する細胞に対し、試験物質を接触させ、選択した核酸の標的配列を有するｍＲＮＡ発現量の変化を指標に、マイクロＲＮＡやその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質を得る。または、本発明の塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡに対する標的配列を、適当なレポーター遺伝子発現ベクターの３’ＵＴＲに挿入したＤＮＡを作製して、発現ベクターに適合した宿主細胞に導入し、その細胞に試験物質を接触させ、レポーター遺伝子の発現量の変化を指標に、マイクロＲＮＡやその前駆体の発現または機能を促進または抑制させる物質を得る。【０１６８】  標的配列の選択は、上記に記載した方法により行なうことができ、配列番号１〜１３３６でいずれかで表される塩基配列からなるマイクロＲＮＡの標的遺伝子としては、例えば、それぞれ前述の表２で示される遺伝子群を例示することができる。
１１．本発明の核酸等を含有する診断薬および治療薬
本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸、および、それらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸は、その標的遺伝子や本発明の核酸の発現を制御することにより、肥満細胞、間葉系幹細胞の異常等に起因する疾患、または細胞の増殖異常に起因する疾患の治療薬として利用することができる。また本発明の核酸は、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の定量または変異の検出により、肥満細胞、間葉系幹細胞の異常等に起因する疾患、または細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬として利用することができる。【０１６９】  肥満細胞の異常としては、肥満細胞の分化や脱顆粒、炎症性メディエーター産生、サイトカイン産生、ケモカイン産生等の異常が挙げられ、それに起因する疾患として、アトピー性皮膚炎、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性疾患等をあげることができる。間葉系幹細胞の異常としては、増殖または分化の異常等があげられ、それに起因する疾患として、癌、骨形成不全症、軟骨形成不全症、糖尿病等をあげることができる。細胞の増殖異常に起因する疾患としては、癌及び、細胞の異常増殖や組織の過形成等が原因となっている動脈硬化、慢性関節リウマチ、前立腺肥大症、経皮的経血管的冠動脈形成術後の血管再狭窄、肺線維症、糸球体腎炎、自己免疫疾患等をあげることができる。【０１７０】  治療薬や診断薬としての具体的な一例をあげると、配列番号が１〜１３３６のいずれかで表されるマイクロＲＮＡもしくは配列番号が１３３７〜２８５１のいずれかで表されるマイクロＲＮＡ前駆体、並びにそれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸は肥満細胞の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬として用いることができる。また、配列番号が１、８、２１または３６のいずれかで表されるマイクロＲＮＡもしくは配列番号が１３３７、１３５２、１３７２または１３９０のいずれかで表されるマイクロＲＮＡ前駆体、並びにそれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸は間葉系幹細胞の増殖および／または分化の異常に起因する疾患の診断薬または治療薬として用いることができる。さらに、配列番号が１、３、８、２０、２１、２２、３２または３６のいずれかで表されるマイクロＲＮＡもしくは配列番号が１３３７、１３３９、１３５２、１３７１、１３７２、１３７３、１３８６または１３９０のいずれかで表されるマイクロＲＮＡ前駆体、並びにそれらの塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸は細胞の増殖異常に起因する疾患の診断薬または治療薬として用いることができる。【０１７１】  本発明の核酸を含有する診断薬は、目的の診断法に応じて、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸の定量あるいは変異の検出を行うために必要な試薬、例えば緩衝剤、塩、反応用酵素、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸と結合する標識された蛋白、および検出用発色剤等を含んでもよい。
本発明の核酸または、その塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸を有効成分として含有する医薬は、単独で投与することもできるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として投与するのが望ましい。【０１７２】  投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。【０１７３】  経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。【０１７４】  カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。【０１７５】  非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。
注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。また、噴霧剤は受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ有効成分を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。【０１７６】  担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。本発明の核酸、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。【０１７７】  また、本発明の核酸または、その塩基配列と相補的な塩基配列を有する核酸を有効成分として含有する治療薬は、それらの核酸を発現するベクターと核酸治療薬に用いる基剤とを調合することにより製造することもできる［Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，８，４２（１９９４）］。
核酸治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であればどのようなものでもよく、蒸留水、塩化ナトリウム又は塩化ナトリウムと無機塩との混合物等の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等があげられる。また常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチンもしくは界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を、粉末化、凍結乾燥等の操作により用時溶解用製剤として調製することもできる。本発明の治療剤は、治療の直前に液体の場合はそのままで、固体の場合は必要により滅菌処理をした上記の基剤に溶解して治療に使用することができる。【０１７８】  本発明の核酸をコードするベクターは、上記６．で作製した組換えウィルスベクターをあげることができ、より具体的には、レトロウィルスベクター及びレンチウィルスベクター等をあげることができる。
例えば、本発明の核酸をコードするベクターを、アデノウィルス・ヘキソン蛋白質に特異的なポリリジン−コンジュゲート抗体と組み合わせてコンプレックスを作製し、得られたコンプレックスをアデノウィルスベクターに結合させることにより、ウィルスベクターを調製することができる。該ウィルスベクターは安定に目的の細胞に到達し、エンドソームによる細胞内に取り込まれ、細胞内で分解され核酸を効率的に発現させることができる。【０１７９】  また、（−）鎖ＲＮＡウィルスであるセンダイウィルスをベースにしたウィルスベクターも開発されており（ＷＯ９７／１６５３８、ＷＯ９７／１６５３９）、当該センダイウィルスを用いて、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸を組み込んだセンダイウィルスを作製することができる。
本発明の核酸やこれをコードするベクターは、非ウィルス核酸移入法によっても移入することができる。例えば、リン酸カルシウム共沈法［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６−４６７（１９７３）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０９，１４１４−１４２２（１９８０）］、マイクロインジェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，５３９９−５４０３（１９８０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，７３８０−７３８４（１９８０）；Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１（１９８１）；Ｎａｔｕｒｅ，２９４，９２−９４（１９８１）］、リポソームを介した膜融合−介在移入法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３−７４１７（１９８７）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，９５０８−９５１４（１９８９）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１２１２６−１２１２９（１９８９）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，２６７−２７５，（１９９２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，１２８５−１２８８（１９９０）；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８３，２００７−２０１１（１９９２）］あるいは直接ＤＮＡ取り込みおよび受容体−媒介ＤＮＡ移入法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８（１９９０）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，１４３３８−１４３４２（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３６５５−３６５９（１９９１）；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１６９８５−１６９８７（１９８９）；ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１１，４７４−４８５（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，３４１０−３４１４（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，４２５５−４２５９（１９９１）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，４０３３−４０３７（１９９０）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，８８５０−８８５４（１９９１）；Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１４７−１５４（１９９１）］等により移入することができる。【０１８０】  リポソームを介した膜融合−介在移入法は、リポソーム調製物を目的とする組織に直接投与することにより、本発明の核酸やこれをコードするベクターを当該組織の局所に取り込み、および発現させることができる［Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，３９９（１９９２）］。ＤＮＡを病巣に直接ターゲッティングするには、直接ＤＮＡ取り込み技術が好ましい。
受容体−媒介ＤＮＡ移入は、例えば、ポリリジンを介して、蛋白質リガンドにＤＮＡ（通常、共有的に閉環したスーパーコイル化プラスミドの形態をとる）を結合することによって行う方法をあげることができる。リガンドは、目的細胞または組織の細胞表面上の対応するリガンド受容体の存在に基づいて選択する。当該リガンド−ＤＮＡコンジュゲートは、所望により、血管に直接注射することができ、受容体結合およびＤＮＡ−蛋白質コンプレックスの内在化が起こる標的組織に指向し得る。ＤＮＡの細胞内破壊を防止するために、アデノウィルスを同時感染させて、エンドソーム機能を崩壊させることもできる。
１２．肥満細胞の活性化の程度を測定する方法
ある核酸が肥満細胞に対し、活性化抑制、脱顆粒抑制、炎症性メディエーター産生抑制、サイトカイン産生抑制およびケモカイン産生抑制のうちの少なくとも１つの作用を有していることは、例えば、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸、更には該マイクロＲＮＡの標的遺伝子に対するアンチセンスやｓｉＲＮＡなどを肥満細胞に導入し、ＩｇＥを添加して培養した後、抗ＩｇＥ抗体の添加等によりヒト肥満細胞を活性化し、放出された（ｉ）脱顆粒の指標となるヒスタミンやβ−ヘキソサミニダーゼ、（ｉｉ）ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、ＰＧＤ２等の炎症性メディエーター、（ｉｉｉ）ＴＮＦ−αやＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカイン、（ｉｖ）ＩＬ−８、Ｉ−３０９、ＭＩＰ−１α等のケモカイン等を測定し、何も導入しなかった場合と比較することにより確認できる。このように肥満細胞の活性化は脱顆粒だけでなく、ＴＮＦ−αやＧＭ−ＣＳＦ等のサイトカイン産生、ＩＬ−８、Ｉ−３０９、ＭＩＰ−１α等のケモカイン産生、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４、ＬＴＥ４、ＰＧＤ２等の炎症メディエーター産生等を測定することによっても調べることができる［Ｂｌｏｏｄ，１００，３８６１（２００２）］。【０１８１】  また本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸、更には該マイクロＲＮＡの標的遺伝子に対するアンチセンスやｓｉＲＮＡなどがアポトーシスの誘導作用を有していることは、これらを肥満細胞に導入し、クロマチンＤＮＡの断片化の測定やＴＵＮＥＬ法等による測定を行うことにより検出できる。
１３．間葉系幹細胞の増殖および骨芽細胞への分化および評価方法
間葉系幹細胞は、安全かつ効率的に取得される方法であれば特に限定されないが、ヒト骨髄から取得する方法としては、例えばＳ．Ｅ．Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｏｎｅ，１３，８１（１９９２）に記載の方法があげられる。【０１８２】  胸骨または腸骨において、骨髄穿刺を行う場所の皮膚を消毒し、特に骨膜下を十分に局所麻酔する。骨髄穿刺針の内筒を抜き、５，０００ｕｎｉｔｓのヘパリンを入れた１０ｍｌ注射器を装着して必要量、平均的には１０ｍｌ〜２０ｍｌの骨髄液を吸引する。骨髄穿刺針を取り外し、１０分間程度圧迫止血する。取得した骨髄液を１，０００×ｇで遠心分離して骨髄細胞を回収した後、該骨髄細胞をリン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）で洗浄する。遠心分離・洗浄を２回繰り返した後、骨髄細胞を１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むα−ＭＥＭ（α−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＥＭ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭＥＭ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）等の細胞培養用培地に浮遊させることにより骨髄細胞液を得る。骨髄細胞液から間葉系幹細胞を単離する方法としては、骨髄細胞液中に混在する他の細胞、例えば血球系細胞、造血幹細胞、血管幹細胞、線維芽細胞等を除去することができる方法であれば特に限定されないが、例えばＭ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７（１９９９）に記載の方法があげられる。骨髄細胞液を密度１．０７３ｇ／ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌに重層した後、１，１００×ｇで３０分間遠心分離し、界面の細胞を間葉系幹細胞として単離することができる。また、骨髄細胞液に１０倍濃度のＰＢＳを加えて９／１０に希釈したＰｅｒｃｏｌｌを同容量加えて混合した後に、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、密度１．０７５〜１．０６０の画分の細胞を間葉系幹細胞として単離することもできる。【０１８３】  また、ヒトの骨髄に由来する間葉系幹細胞は、Ｃａｍｂｒｅｘ社、タカラバイオ社より購入することもできる。
ヒト臍帯から間葉系幹細胞を取得する方法としては、例えばＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，２１，１０５−１１０（２００３）に記載された方法があげられる。臍帯静脈の両端にカニューレを挿入し、適当な緩衝液、例えば、ＥＢＳＳ（Ｅａｒｌｅ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で洗浄する。蛋白質分解酵素、例えば、０．１％コラゲナーゼを含む１９９培地に抗生物質を添加して血管に注入し、４〜４０℃、好ましくは３７℃で、１〜６０分間インキュベートする。血管をＥＢＳＳで洗浄し、臍帯を軽くマッサージした後、内皮細胞および内皮下層細胞の懸濁液を回収する。該懸濁液を６００×ｇで１０分間遠心分離し、得られた細胞を、例えば、低濃度のグルコースを含むＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ−ＬＧ、Ｇｉｂｃｏ）に、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳを加えた培地に懸濁する。細胞密度を、１０２〜１０６個／ｃｍ２として培養フラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養する。培地を１〜７日毎に交換し、１〜３週間培養を継続することにより、間葉系幹細胞を取得することができる。【０１８４】  子宮内膜から間葉系幹細胞を取得する方法としては、例えば、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１６３，２２５９−２２６９（２００３）に記載の方法があげられる。外科手術により摘出されたヒト子宮内膜組織を細切し、細胞を培養可能な培地、好ましくはα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等に１〜２０％の動物由来の血清、好ましくは５〜１０％のＦＢＳを加えた培地で培養する。培地にはペニシリンやストレプトマイシン等の抗生物質を加えても良い。さらに、細胞の分離を良くするために、３型コラゲナーゼ等のコラーゲン分解酵素およびデオキシリボヌクレアーゼＩ等のＤＮＡ分解酵素を培地に添加し、２０〜４０℃、好ましくは３７℃の条件で、１０分間〜５時間、好ましくは１時間、緩やかに振盪する。個々の子宮内膜腺を顕微鏡で観察しながら分離し、適当な培養容器、例えば２４−ウェル培養皿を用いて３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養することにより、間葉系幹細胞を取得することができる。【０１８５】  歯、歯胚、歯周辺組織から間葉系幹細胞を取得する方法としては、例えばＬａｎｃｅｔ，３６４，１４９−１５５（２００４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１３６２５−１３６３０（２０００）に記載の方法があげられる。ヒトの歯としては、乳歯、または切歯、犬歯、小臼歯、大臼歯等の永久歯のいずれでも良い。例えば、抜歯した第三大臼歯（親知らず）の歯根の表面から歯周靭帯（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｌｉｇａｍｅｎｔ）を慎重に分離し、コラゲナーゼ、トリプシン、プロナーゼ、エラスターゼ、ディスパーゼ、ヒアルロニダーゼ等の蛋白分解酵素を用いて、３７℃で１時間消化反応を行う。ストレイナー、メッシュ、フィルター等を用いて、組織残渣を除くことにより間葉系幹細胞を取得することができる。また、抜歯した第三大臼歯の表面をＰＢＳ等で洗浄した後、セメント質とエナメル質の結合部を切断して髄質を露出させ、歯冠および歯根から歯髄組織を慎重に分離し、上記と同様の方法で蛋白分解酵素処理した後、組織残渣を除くことにより間葉系幹細胞を取得することもできる。【０１８６】  また、上記以外の間葉系幹細胞の単離方法として、間葉系幹細胞に発現する表面抗原、間葉系幹細胞特異的な遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーを持つレポーターベクターを用いて間葉系幹細胞を単離する方法があげられる。具体的には、ＡＣ１３３抗原を用いて幹細胞を単離する方法（ＵＳ６４６８７９４）、Ｓｏｘ遺伝子（ＵＳ２００２／０１３５５３９）、Ｎｅｓｔｉｎ遺伝子またはＭｕｓａｓｈｉ遺伝子（特開２００２−０３４５８０）のプロモーターおよびエンハンサーを持つレポーターベクターを用いて間葉系幹細胞を単離する方法等があげられる。【０１８７】  また、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２の細胞外排出能を指標にしたＦＡＣＳ分画法を用いてサイドポピュレーション（ｓｉｄｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（ＳＰ）中に幹細胞を濃縮させる方法［Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８３，１７９７−８０６（１９９６）］により幹細胞を分離することもできる。また、ＳＨ２陽性，ＳＨ４陽性，ＣＤ２９陽性，ＣＤ４４陽性，ＣＤ７１陽性，ＣＤ９０陽性，ＣＤ１０６陽性，ＣＤ１２０ａ陽性，ＣＤ１２４陽性，ＣＤ１４陰性，ＣＤ３４陰性，およびＣＤ４５陰性の細胞を間葉系幹細胞として、セルソーターや磁気ビーズを用いて分離する方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１４３−１４７（１９９９）］を用いることもできる。【０１８８】  間葉系幹細胞の培養に用いる培地としては、例えば「組織培養の技術基礎編  第三版」朝倉書店（１９９６）等に記載された細胞培養用培地があげられるが、ウシやヒト等の血清を１〜２０％添加したα−ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＭ等の細胞培養用培地が好ましく用いられる。培養条件は、細胞が培養可能な条件であればいかなる条件でもよいが、培養温度は３３〜３７℃が好ましく、５〜１０％のＣＯ２ガスで満たしたインキュベーターで培養することが好ましい。また間葉系幹細胞は、通常の組織培養用のプラスチック製培養皿に接着させて増殖させることが好ましい。細胞が培養皿一面に増殖する頃、培地を除去して、トリプシンＥＤＴＡ溶液を加えることで細胞を浮遊させる。浮遊させた細胞は、ＰＢＳまたは細胞培養用の培地で洗浄後、細胞培養用の培地で２倍から２０倍に希釈して新しい培養皿に播種することで、さらに継代培養することができる。【０１８９】  ある核酸が間葉系幹細胞の増殖を制御しているかは、例えば、本発明のマイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸、更には該マイクロＲＮＡの標的遺伝子に対するアンチセンスやｓｉＲＮＡ等を間葉系幹細胞に導入し、細胞増殖の程度を陰性対照と比較することにより確認できる。細胞増殖の程度を測定する方法は後述の１４．で記載した方法により行うことができる。【０１９０】  間葉系幹細胞から骨芽細胞へのへの分化過程における影響を調べる方法としては、例えば以下のようにして確認する方法があげられる。具体的には、間葉系幹細胞から骨芽細胞へ分化を誘導する条件下で、本発明の核酸、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体、更には該マイクロＲＮＡの標的遺伝子に対するアンチセンスやｓｉＲＮ��等を間葉系幹細胞に導入し、培養する。骨芽細胞への分化が進むに伴い発現が上昇する遺伝子または蛋白質を解析し、陰性対照と比較する。【０１９１】  間葉系幹細胞から骨芽細胞へ分化誘導させる方法としては、間葉系幹細胞から骨芽細胞へ分化誘導させることができる方法であればいかなる方法でもよいが、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，４３−１４７（１９９９）に記載の方法があげられる。具体的には、間葉系幹細胞を培養器に播種した後、デキサメサゾン、アスコルビン酸−２リン酸、およびβ−グリセロフォスフェートを含む細胞培養用培地中で１〜４週間培養を続けることにより、間葉系幹細胞を骨芽細胞へ分化させることができる。【０１９２】  骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇する遺伝子の定量的な解析法としては、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ノーザンブロット解析、ドットブロットハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロアレイによる解析等があげられる。
骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇する蛋白質の定量的な解析法としては、該蛋白質に特異的に反応する抗体を用いたウェスタンブロット解析、免疫組織染色、ＥＬＩＳＡ等があげられる。【０１９３】  骨芽細胞への分化に伴い発現が上昇する遺伝子または蛋白質としては、Ｉ型コラーゲン、オステオカルシン、オステオネクチン、オステオポンチン、ボーンシアロプロテイン（ｂｏｎｅ  ｓｉａｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｒｕｎｘ２（ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ２）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）等があげられる。
また、骨芽細胞への分化程度を評価する方法としては、該骨芽細胞中のＡＬＰ酵素活性を利用して細胞を染色すること、あるいは、ＡＬＰ酵素活性を測定する方法があげられる。該細胞染色のより具体的な方法は、骨芽細胞中のＡＬＰ酵素により加水分解された基質のリン酸エステルのアルコール部分をジアゾニウム塩でカップリングし、アゾ色素で酵素活性部位に沈殿させる方法があげられる。基質としては、例えばナフトールＡＳ−ＭＸリン酸を、アゾ色素としては、例えばファーストバイオレット青をあげることができる。これらが含まれているキット、例えばｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｓｉｇｍａ社製）等を用いてもよい。また、ＡＬＰ酵素活性の測定キットとして、例えばアルカリ性ホスファＢ−テストワコー（和光純薬株式会社製）等を用いてもよい。【０１９４】  更に、骨芽細胞が産生した石灰化成分を検出することによっても骨芽細胞への分化を確認することもできる。石灰化成分を検出する方法としては、フォンコッサ（ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ）染色、アリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ）染色等の染色法があげられる。
フォンコッサ染色とは、硝酸銀を用いて石灰化成分であるリン酸カルシウムを検出する方法である。具体的には、パラフィン等で固定した細胞に対し１〜５％の硝酸銀水溶液を反応させ光に当て、黒く呈色したリン酸カルシウムが存在する部分を定量、例えば該呈色面積を計測することにより骨芽細胞への分化程度を評価することができる。【０１９５】  アリザリンレッド染色とは、アリザリン赤Ｓがカルシウムに対して特異的な結合を示しレーキを形成することを利用した方法である。具体的には、パラフィン等で固定した細胞に対し０．０１〜５％アリザリン赤Ｓ溶液を反応させる、赤紫色〜橙赤色に呈色した部分を定量、例えば該呈色面積を計測することにより骨芽細胞への分化程度を評価することができる。
１４．癌細胞や他の細胞の増殖を測定する方法
細胞増殖の測定法としては、細胞数や細胞増殖速度を反映する指標を測定できる方法であれば特に限定されない。生細胞数測定、ＤＮＡ合成速度測定、総蛋白質量測定などを用いることができる。【０１９６】  生細胞数を評価する方法としては、細胞中のＡＴＰ量を測定する方法があげられる。細胞中のＡＴＰ量は培養下の細胞数と比例関係にあることが知られている（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１６０，８１−８８（１９９３））。細胞中のＡＴＰ量測定のより具体的な方法は、ＭＴＴ法、ＸＴＴ法などが拳げられる（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，６５，５５−６３（１９８３））。また、ＡＴＰ依存性酵素ルシフェラーゼによるルシフェリン基質の発光にてＡＴＰ量を測定する方法もあげられる。細胞中のＡＴＰ量の測定キットとして、例えばＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−ＧｌｏＲＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等を用いてもよい。
１５．癌細胞や他の細胞の細胞死の程度を測定する方法
細胞死の程度を測定する方法としては、死細胞をＰｒｏｐｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ等の色素で染色する方法や、細胞死に伴い細胞外に漏出した酵素の活性を測定する方法等を用いることができる。後者については、例えば細胞外に漏出したアデニル酸キナーゼの酵素活性を測定する方法が利用できる。より具体的には、ＴｏｘｉＬｉｇｈｔ（Ｒ）Ｎｏｎ−Ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ＢｉｏＡｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製）等を用いてもよい。【０１９７】  また、細胞死の中でも特に癌との関係で重要なアポトーシス（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）に限定してその程度を測定することもできる。細胞のアポトーシスを評価する方法としては、ＤＮＡの断片化の程度を測定する方法や、細胞膜の構成脂質の変化を測定する方法、アポトーシスに伴って誘導される細胞中のプロテアーゼであるカスパーゼ３／７活性を測定する方法があげられる。細胞中のカスパーゼ３／７活性測定のより具体的な方法は、カスパーゼ３／７活性により遊離されたルシフェリン基質を、ルシフェラーゼ酵素反応によるルシフェリン発光にて測定する方法があげられる。細胞中のカスパーゼ３／７活性の測定キットとして、例えばＣａｓｐａｓｅ−ＧｌｏＲ３／７  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等を用いてもよい。【０１９８】  以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
【実施例１】
【０１９９】ヒト肥満細胞で発現するマイクロＲＮＡの抽出
（１）ＲＮＡ抽出
ＬＡＤ２は最近樹立されたヒト肥満細胞株で、ヒト肥満細胞の性質をよく保持していることが知られている［Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２７，６７１（２００３）；Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．，２７，６７７（２００３）］。そこで、ＬＡＤ２からマイクロＲＮＡの抽出をおこなった。ＬＡＤ２は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９２−１８８１，ＵＳＡ）より入手し、１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦを含むＳｔｅｍ  Ｐｒｏ−３４培地（インビトロジェン社製）で３７℃の５％ＣＯ２濃度のインキュベーター中で培養した。
（２）低分子ＲＮＡのクローニング
上記（１）で取得したＬＡＤ２由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２００μｇを用いて、Ｌａｕらの方法［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５８−８６２，（２００１）］に従い、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子ＲＮＡの切り出し、５’−アデニル化３’−アダプターライゲーション、５’−アダプターライゲーション、逆転写、ＰＣＲ増幅、コンカテマー化、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターへのライゲーションを順次進め、低分子ＲＮＡのクローニングを行なった。次に、クローニングした低分子ＲＮＡの塩基配列を決定した。なお５’−アデニル化３’−アダプターは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のｍｉＲＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｌｉｎｋｅｒを用いた。【０２００】  また、上記方法とは別に、上記（１）で取得したＬＡＤ２由来ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ２００μｇを用いて、Ｍｉｎｅｎｏらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３４，１７６５−１７７１，（２００６）］に従い、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動による低分子ＲＮＡの分離及び切り出し、５’末端脱リン酸化、３’−アダプターライゲーション、リン酸化、５’−アダプターライゲーション、逆転写、ＰＣＲ増幅、マイクロビーズベクターへのライゲーションを順次経て、低分子ＲＮＡをクローニングし、そのマイクロビーズの塩基配列を読み取ることでも塩基配列を決定した。
【実施例２】
【０２０１】マイクロＲＮＡの同定
実施例１で得られた低分子ＲＮＡについて、まず、既知マイクロＲＮＡデータベースであるｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏｒｎａ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）と比較して塩基配列が一致しなかったものを選抜した。それらの塩基配列に対応するＤＮＡ配列を５’側および３’側にそれぞれ５０ｎｔ程度伸ばした周辺ゲノム配列をＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）から取得し、そのゲノム配列から転写されることが予測されるＲＮＡの２次構造をＲＮＡｆｏｌｄを用いて予測した。その結果、１３３６種がヘアピン構造の片鎖に位置する新規マイクロＲＮＡであることが判明した。その塩基配列および、これらのマイクロＲＮＡを含むマイクロＲＮＡ前駆体の塩基配列を表１に示す。それぞれの塩基配列を有するマイクロＲＮＡにつき、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１から２３４４という名前を付与した（表１）。一つのマイクロＲＮＡが異なる位置のゲノム配列に由来するヘアピン構造を取り得る場合はその全てを記載した。【０２０２】  ２次構造の一例として、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１１９４のヘアピン構造を図１に示す。
【実施例３】
【０２０３】マイクロＲＮＡの機能の検出
実施例２で得られたマイクロＲＮＡについて、その前駆体がＤｉｃｅｒ蛋白質でプロセシングを受けるか否かを調べることにより、マイクロＲＮＡとしての機能を有するか否かを調べることができる。
実施例２で得られたマイクロＲＮＡのうち、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１１９４で示されるマイクロＲＮＡの機能の検出は以下のようにして行うことができる。まず、配列番号１５８０で表される塩基配列を有する一本鎖ＲＮＡを合成し、Ｘ−ｔｒｅｍｅ  ＧＥＮＥ  ｓｉＲＮＡ  Ｄｉｃｅｒ  Ｋｉｔ（ロシュ・アプライド・サイエンス社製）に添付のＤｉｃｅｒ  Ｅｎｚｙｍｅと反応させる。次に、反応産物を１５％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、２０−２５塩基の大きさのバンドを検出できることでマイクロＲＮＡとしての機能を有していることを検出できる。
【実施例４】
【０２０４】マイクロＲＮＡを強制発現したヒト肥満細胞の脱顆粒に及ぼす作用
実施例２で得られたマイクロＲＮＡの前駆体を、ヒト肥満細胞株であるＬＡＤ２に導入して脱顆粒を誘導し、該マイクロＲＮＡ前駆体の影響を調べた。
ＬＡＤ２は１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦを含むＳｔｅｍ  Ｐｒｏ−３４培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で培養した。
ＬＡＤ２を６穴プレートに１穴あたり約５ｘ１０５個になるように播種し、マイクロＲＮＡ前駆体をリポフェクション法、具体的には、Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ社製）を用いて、終濃度が３０ｎＭとなるよう導入した。マイクロＲＮＡ（以下、ｍｉＲＮＡともいう）の前駆体は、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１，１００２，１００３，１００８，１０１４，１０２０，１０２１，１０２２，１０２５，１０３２，１０３６のＰｒｅ−ｍｉＲＴＭｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ＭｏｌｅｃｕｌｅｓとしてＡｍｂｉｏｎ社で合成されたものを用いた。これは化学合成された二本鎖の核酸分子で、それぞれ配列番号１、２、３、８、１４、２０、２１、２２、２５、３２、３６で表される塩基配列からなる核酸が、ｍｉＲＮＡが活性を有する要因となるＲＩＳＣに類似した複合体に取り込まれて、ｍｉＲＮＡと同様の機能を有するようにデザインされている。また、配列番号１のヒトゲノム配列に対応する配列について、配列番号１より５’側の１塩基と３’側から４塩基を欠失した配列（配列番号２８５２）からなる核酸を用意し、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１＿２のＰｒｅ−ｍｉＲＴＭｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓとして、Ａｍｂｉｏｎ社で合成したものも用いた。陰性対照としては、Ｐｒｅ−ｍｉＲＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃２（以下、ｍｉＲ−ｎｅｇａｃｏｎ＃２と称す）（Ａｍｂｉｏｎ社製）を用い、同様にＬＡＤ２に導入した。リポフェクションは、製品に添付された方法に従った。【０２０５】  リポフェクション法によりマイクロＲＮＡ前駆体を導入した２日後に、１μｇ／ｍＬのヒトミエローマＩｇＥ（コスモバイオ社製）を添加して３７℃の５％ＣＯ２濃度のインキュベーター中で一晩培養した。翌日、遠心分離により培地を除き、タイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）緩衝液（１２６．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、４．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、１．０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．６ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５．６ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｄ−グルコース、０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）で洗浄した後、タイロード緩衝液を３．９ｍＬ添加して細胞を懸濁し、９６ウェル・プレートに１ウェルあたり１００μＬずつ分注した。次いで、最終濃度１０μｇ／ｍＬとなるようウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体（ダコ社製）を加え、３７℃の５％ＣＯ２濃度のインキュベーター中で２０分間インキュベートし、脱顆粒を誘導した。遠心により上清を回収し、上清中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性を測定することにより、脱顆粒の程度を測定した。β−ヘキソサミニダーゼ活性は、回収した上清５０μＬに、４０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した４ｍｍｏｌ／Ｌ  ｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−グルコサミニド（シグマ社製）を５０μＬを加え、３７℃で１時間インキュベート後、０．２ｍｏｌ／Ｌグリシン（ｐＨ１０．７）を１００μＬ加えたサンプルの４０５ｎｍにおける吸光度をプレートリーダー１４２０ＡＲＶＯｓｘ（パーキンエルマー社製）を用いることにより測定した。また、ウサギ抗ヒトＩｇＥ抗体の代わりに最���濃度１％のトリトンＸ−１００を添加して同様の実験を行うことにより、ＬＡＤ２中の全β−ヘキソサミニダーゼ活性を測定した。脱顆粒の割合を、全β−ヘキソサミニダーゼ活性に対する上清中のβ−ヘキソサミニダーゼ活性の割合（％）で算出し、それぞれについて対照区（Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｅｒのみ）の脱顆粒の割合を１．０とした時の脱顆粒相対活性を計算した。その結果を表３に示した。
［表３］
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【０２０６】  その結果、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１，１００１＿２，１００２，１００３，１００８，１０１４，１０２０，１０２２，１０２５，１０３２，１０３６導入により、ＩｇＥ受容体刺激によるＬＡＤ２の脱顆粒が促進されることが明らかになった。
【実施例５】
【０２０７】マイクロＲＮＡを強制発現させた間葉系幹細胞の増殖活性、骨芽細胞分化、生細胞率
実施例２で得られたマイクロＲＮＡの前駆体をヒト間葉系幹細胞（以下、ｈＭＳＣともいう）に導入し、増殖および骨芽細胞分化に及ぼすマイクロＲＮＡ前駆体の影響を調べた。
ヒト間葉系幹細胞はＣａｍｂｒｅｘ社より入手し、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を含むＩＭＤＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で３７℃の５％ＣＯ２濃度のインキュベーター中で培養した。ｈＭＳＣを２４穴プレートに１穴あたり約６．２ｘ１０３個になるように播種し、２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地で一晩培養した。１日後、マイクロＲＮＡ前駆体をリポフェクション法、具体的には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、終濃度が２０ｎＭとなるようにｈＭＳＣに導入した。マイクロＲＮＡの前駆体は、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１，１００１＿２，１００２，１００３，１００８，１０１４，１０２０，１０２１，１０２２，１０２５，１０３２，１０３６のＰｒｅ−ｍｉＲＴＭｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ＭｏｌｅｃｕｌｅｓとしてＡｍｂｉｏｎ社で合成されたものを用いた。リポフェクションは、製品に添付された方法に従った。【０２０８】  リポフェクション法によりマイクロＲＮＡ前駆体を導入した翌日、培地を骨芽分化誘導培地（２０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭ培地中に、０．１μｍｏｌ／Ｌ  デキサメサゾン、５０μｍｏｌ／Ｌ  アスコルビン酸−２リン酸（Ｓｉｇｍａ社製）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  β−グリセロフォスフィト（Ｓｉｇｍａ社製））へ交換し、３日に一度の頻度で、骨芽分化誘導培地を交換して培養を続けた。
培養開始から２週間後に、細胞の形態を位相差顕微鏡（ニコン社製）下で観察し、更にアルカリフォスファターゼ染色を行って、骨芽細胞を検出した。具体的にはまず、細胞をリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）ともいう）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で１回洗浄し、固定液（１０％フォルマリン／ＰＢＳ）で５分間固定した。蒸留水で洗浄した後、暗所でＮａｐｈｔｈｏｌ  ＡＳ−ＭＸリン酸（Ｓｉｇｍａ社製）とＦａｓｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｂ溶液との混合溶液（Ｓｉｇｍａ社製）と３０分間反応させ、アルカリフォスファターゼ反応をおこなった。更に蒸留水で洗浄し、位相差顕微鏡下で赤く染まっている骨芽細胞を観察し、デジタルカメラ（ニコン社製）で撮影した。【０２０９】  その結果、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００８，１０２１，１０３６のＰｒｅ−ｍｉＲＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓを導入したｈＭＳＣは、マイクロＲＮＡ前駆体非導入ｈＭＳＣと比べて、細胞数が少なく、アルカリフォスファターゼ染色された陽性細胞の数も少ないことが見出された。マイクロＲＮＡ前駆体は細胞中でマイクロＲＮＡに変換されるので、これらの前駆体に由来するマイクロＲＮＡは、ｈＭＳＣに対して、増殖を抑制する活性および骨芽細胞への分化を抑制する活性を有することが明らかになった。また逆に、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１，１００１＿２のＰｒｅ−ｍｉＲＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓを導入したｈＭＳＣは、マイクロＲＮＡ前駆体非導入ｈＭＳＣと比べて、アルカリフォスファターゼ染色された陽性細胞の数が多いことが見出された。このことから、これらの前駆体に由来するマイクロＲＮＡは、ｈＭＳＣに対して、骨芽細胞への分化を促進する活性を有することが明らかになった。【０２１０】  また、リポフェクション法によりマイクロＲＮＡ前駆体を導入した４日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて生細胞率を測定した。その結果を表４に示す。表４に示したように、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１導入により通常よりも生細胞率が増加したことが認められた。
［表４］
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【実施例６】
【０２１１】マイクロＲＮＡを強制発現させた大腸癌由来細胞株における生細胞率、アポトーシス活性
実施例２で得られたマイクロＲＮＡの前駆体を大腸癌由来細胞株に導入し、生細胞率、アポトーシス活性に及ぼすマイクロＲＮＡ前駆体の影響を調べた。
ＤＬＤ−１ヒト大腸癌由来細胞株（以下、ＤＬＤ−１ともいう）はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（以下、ＡＴＣＣと称す）より入手した（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２１）。ＤＬＤ−１は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で３７℃の５％ＣＯ２濃度のインキュベーター中で培養した。【０２１２】  ＤＬＤ−１を９６穴プレートに１穴あたり約２５００細胞数になるように播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で一晩培養した。１日後、マイクロＲＮＡ前駆体をリポフェクション法、具体的には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、終濃度が５ｎＭ或いは２５ｎＭとなるようＤＬＤ−１に導入した。マイクロＲＮＡの前駆体は、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１，１００１＿２，１００２，１００３，１００８，１０１４，１０２０，１０２１，１０２２，１０２５，１０３２，１０３６のＰｒｅ−ｍｉＲＴＭｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ＭｏｌｅｃｕｌｅｓとしてＡｍｂｉｏｎ社で合成したものを用いた。また、ｍｉＲ−ｎｅｇａｃｏｎ＃２（Ａｍｂｉｏｎ社製）もＤＬＤ−１に導入し、陰性対照とした。リポフェクションは、製品に添付された方法に従った。【０２１３】  リポフェクション法によりマイクロＲＮＡ前駆体を導入した３日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて生細胞率を測定した。対照区（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のみ）のＤＬＤ−１の生細胞率を１．０としてそれぞれの相対生細胞率を計算した。その結果、表５に示したように、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１，１００１＿２，１０３２，１０３６導入により４０％以上の生細胞率の減少が認められた。
［表５］
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【０２１４】  またリポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した２日後に、Ｃａｓｐａｓｅ−ＧｌｏＲ  ３／７  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて製品に添付された方法に従いカスパーゼ３／７活性を測定した。対照区（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のみ）のＤＬＤ−１のカスパーゼ３／７活性値を１．０としてそれぞれの相対カスパーゼ３／７活性値を計算した。その結果を表６に示す。表６に示したように、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１，１００１＿２，１０３６導入により５０％以上のカスパーゼ３／７活性の増加が認められた。
［表６］
2008084319.tif 000125
【実施例７】
【０２１５】マイクロＲＮＡを強制発現させた卵巣癌由来細胞株における生細胞率
実施例２で得られたマイクロＲＮＡの前駆体を卵巣癌由来細胞株に導入し、生細胞率に及ぼすマイクロＲＮＡ前駆体の影響を調べた。
Ａ２７８０ヒト卵巣癌由来細胞株（Ｎａｔｕｒｅ，２９５，１１６−１１９，（１９８２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，９９４−９９６，（１９８４）；Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１１，２８５−２９８（１９８４）；以下，Ａ２７８０と称す）は５％ＦＢＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）で３７℃の５％ＣＯ２濃度のインキュベーター中で培養した。【０２１６】  Ａ２７８０を９６穴プレートに１穴あたり約２５００細胞数になるように播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で一晩培養した。１日後、マイクロＲＮＡ前駆体をリポフェクション法、具体的には、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、終濃度が５ｎＭ或いは２５ｎＭとなるようＡ２７８０に導入した。マイクロＲＮＡの前駆体は、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００１，１００１＿２，１００２，１００３，１００８，１０１４，１０２０，１０２１，１０２２，１０２５，１０３２，１０３６のＰｒｅ−ｍｉＲＴＭ  ｍｉＲＮＡ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ＭｏｌｅｃｕｌｅｓとしてＡｍｂｉｏｎ社で合成したものを用いた。また、ｍｉＲ−ｎｅｇａｃｏｎ＃２（Ａｍｂｉｏｎ社製）もＡ２７８０に導入し、陰性対照とした。【０２１７】  リポフェクション法により該マイクロＲＮＡ前駆体を導入した３日後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて生細胞率を測定した。対照区（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００のみ）のＡ２７８０の生細胞率を１．０としてそれぞれの相対生細胞率を計算した。その結果を表７に示す。表７に示したように、ＫＨＫ＿ｍｉＲ＿１００３，１００８，１０２０，１０２１，１０２２，１０３２，１０３６導入により４０％以上の生細胞率の減少が認められた。
［表７］
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【産業上の利用可能性】
【０２１８】  本発明により、新規な配列を有する、マイクロＲＮＡやマイクロＲＮＡ前駆体等の核酸が提供される。本発明の核酸により、マイクロＲＮＡの発現または変異の検出、細胞の分離、標的配列遺伝子の発現抑制、マイクロＲＮＡの機能の促進または抑制させる物質のスクリーニング、肥満細胞の異常に起因する疾患、間葉系幹細胞の増殖または分化の異常に起因する疾患、癌及び細胞の増殖異常や組織の過形成等が原因となっている疾患の診断や治療をすることができる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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