(57)【要約】  本発明は、無血清培地中で霊長類の胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、及び培養物から網膜前駆細胞を得ることを含む、霊長類の網膜前駆細胞の製造方法を提供する。本発明は更に、胚性幹細胞から分化誘導された、単離された網膜前駆細胞を、接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養すること、及び培養物から視細胞前駆体を得ることを含む、視細胞前駆体の製造方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清培地中で霊長類の胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、及び培養物から網膜前駆細胞を得ることを含む、霊長類の網膜前駆細胞の製造方法。
【請求項２】
浮遊凝集体の培養の全期間にわたり、培養が無血清培地中で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
無血清培地がＮｏｄａｌシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤からなる群から選択される少なくともいずれかの阻害剤を含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
無血清培地がＮｏｄａｌシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤がＬｅｆｔｙ−Ａ又はＳＢ−４３１５４２である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
Ｗｎｔシグナル阻害剤がＤｋｋ１、ＣＫＩ−７又はＤ４４７６である、請求項３記載の方法。
【請求項７】
培養開始時における凝集体が、１つの凝集体あたり2〜50個の胚性幹細胞から構成される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
浮遊凝集体が少なくとも３日間培養される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
網膜前駆細胞が神経網膜前駆細胞又は網膜色素上皮前駆細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
浮遊凝集体の培養後に、培養された細胞を接着条件下で培養することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
無血清培地中で霊長類の胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、培養された細胞を接着条件下で更に培養すること、及び培養物から網膜色素上皮細胞を得ることを含む、霊長類の網膜色素上皮細胞の製造方法。
【請求項１２】
無血清培地中で霊長類の胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、培養された細胞を接着条件下で更に培養すること、及び培養物から視細胞又はその前駆体を得ることを含む、霊長類の視細胞又はその前駆体の製造方法。
【請求項１３】
接着条件下での培養がレチノイン酸及びタウリンからなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む培地中で行われる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
培地がレチノイン酸及びタウリンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
培養物中に視細胞前駆体が出現した以降の段階で、レチノイン酸及びタウリンからなる群から選択される少なくとも１つの因子が接着条件下での培養物中に添加される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
胚性幹細胞から分化誘導された、単離された網膜前駆細胞を、接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養すること、及び培養物から視細胞前駆体を得ることを含む、視細胞前駆体の製造方法。
【請求項１７】
ガンマセクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
胚性幹細胞から分化誘導された、単離された網膜前駆細胞を、接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養すること、及び培養物から錐体視細胞を得ることを含む、錐体視細胞の製造方法。
【請求項１９】
ガンマセクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
胚性幹細胞から分化誘導された、単離された網膜前駆細胞を、接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養すること、培養された細胞を、接着条件下、ＦＧＦ、ｓｈｈシグナル促進剤、レチノイン酸及びタウリンからなる群から選択される少なくともいずれかの因子の存在下で更に培養すること、及び培養物から桿体視細胞を得ることを含む、桿体視細胞の製造方法。
【請求項２１】
更なる培養がガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で行われる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ガンマセクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、請求項２１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜前駆細胞、視細胞前駆体、視細胞等の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢性黄斑変性症（age-related macular degeneration）、網膜色素変性症（retinitis pigmentosa）のような網膜変性疾患による失明に苦しむ患者の数が益々増加している。これらの疾患では視細胞の障害が失明の直接的な原因であるので、視細胞（又は視細胞前駆体）のインビトロでの産生が、これらの疾患の研究及びこれらの疾患の治療法の開発に大きく貢献し得る。
本発明者らも含め、多くのグループが、虹彩組織（非特許文献１、２）、毛様体組織（非特許文献３）、又は胚性幹（ＥＳ）細胞（非特許文献４−６）から、視細胞を創生することを試みている。組織幹細胞と比較して、ＥＳ細胞は、無限に増殖する能力を有しており、研究及び治療のために十分な数の細胞を産生することが可能であるので、優れている。近年の研究により、網膜前駆細胞をＥＳ細胞からインビトロで効率的に産生できることが立証されている。対照的に、ＥＳ細胞由来前駆細胞からの視細胞のインビトロでの創生は、細胞を発生中の網膜組織と共培養しない限り、非効率的なままである。例えば、本発明者らの以前の報告において（非特許文献６）、本発明者らは、Ｄｋｋ１、ＬｅｆｔｙＡ、血清及びアクチビン処理を組み合わせたエンブリオイドボディ様凝集体の無血清浮遊培養（ＳＦＥＢ）系（ＳＦＥＢ／ＤＬＦＡ）（非特許文献７）を用いた、マウスＥＳ細胞からの神経網膜前駆細胞の効率的な誘導（〜１６％）を示した。ＥＳ由来神経網膜前駆細胞は、胚性網膜組織と共培養すると、視細胞を産生することができる。しかしながら、共存させないような培養条件下で視細胞を産生する方法は確立されていない。特に、ヒトＥＳ細胞から視細胞を効率的に産生する規定された培養方法は移植治療への決定的限界を克服すると考えられ、該方法の開発が望まれている。
文献７において、本発明者らは、ソーティングせずに、外来性因子（Ｆｇｆ、タウリン、ｓｈｈ、及び／ＲＡ）のＳＦＥＢ／ＤＬＦＡ処理された細胞への効果を調べたが、ロドプシン＋視細胞分化に対する明らかにポジティブな効果を認めることはできなかった。また、マウスの胚性幹細胞からの網膜前駆細胞の誘導には、ＦＣＳの添加が必須であった。
【非特許文献１】Haruta, M. et al. Induction of photoreceptor-specific phenotypes in adult mammalian iris tissue. Nat. Neurosci. 4, 1163-1164 (2001).
【非特許文献２】Sun, G. et al. Retinal stem/progenitor properties of iris pigment epithelial cells. Dev. Biol. 289, 243-252 (2006).
【非特許文献３】Tropepe, V. et al. Retinal stem cells in the adult mammalian eye. Science 287, 2032-2036 (2000).
【非特許文献４】Zhao, X., Liu, J. & Ahmad, I.Differentiation of embryonic stem cells into retinal neurons. Biochem. Biophys. Res. Commun. 297, 177-184 (2002).
【非特許文献５】Hirano, M. et al. Generation of structures formed by lens and retinal cells differentiating from embryonic stem cells. Dev. Dyn. 228, 664-671 (2003).
【非特許文献６】Ikeda, H. et al. Generation of Rx+/Pax6+ neural retinal precursors from embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 11331-11336 (2005).
【非特許文献７】Watanabe, K. et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上記事情に鑑み、本発明は、哺乳動物（特にヒト）のＥＳ細胞から網膜前駆細胞や視細胞を効率的に産生する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、ガンマセクレターゼ阻害剤（ガンマセクレターゼ阻害薬）での処理により、ＦＡＣＳにより精製されたマウスＥＳ細胞由来網膜前駆細胞（Ｒｘ＋細胞）の凝集培養物中に、Ｃｒｘ＋視細胞前駆体が効率的に誘導されることを見出した。これらの細胞は、同時に錐体視細胞を高い頻度で産生したが、ロドプシン＋桿体視細胞の分化は、より効率的ではなかった。しかしながら、FGF、ｓｈｈ、タウリン及び／又はレチノイン酸でのさらなる処理により、ロドプシン＋細胞の頻度が有意に上昇した。
更に、霊長類（ヒト、サル）のＥＳ細胞から、効率的に網膜前駆細胞及び／又は視細胞を創生する方法についても検討した。フィーダー及び血清を含まず、Ｗｎｔ及びＮｏｄａｌ阻害剤を含む浮遊培養（ＳＦＥＢ／ＤＬ培養）によって、ＥＳ細胞からＲｘ陽性の網膜前駆細胞や特徴的な形態を有するＭｉｔｆ陽性の色素上皮細胞への分化が誘導された。これらの条件下ではＲｘ陽性網膜前駆細胞から視細胞への分化は稀にしか生じなかったが、レチノイン酸及びタウリンでさらに処理すると、ＥＳ細胞由来の前駆細胞からロドプシン陽性／リカバリン陽性の視細胞への分化が顕著に促進された。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。【０００５】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］無血清培地中で霊長類の胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、及び培養物から網膜前駆細胞を得ることを含む、霊長類の網膜前駆細胞の製造方法。
［２］浮遊凝集体の培養の全期間にわたり、培養が無血清培地中で行われる、［１］記載の方法。
［３］無血清培地がＮｏｄａｌシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤からなる群から選択される少なくともいずれかの阻害剤を含む、［１］又は［２］記載の方法。
［４］無血清培地がＮｏｄａｌシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤を含む、［３］記載の方法。
［５］Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤がＬｅｆｔｙ−Ａ又はＳＢ−４３１５４２である、［３］記載の方法。
［６］Ｗｎｔシグナル阻害剤がＤｋｋ１、ＣＫＩ−７又はＤ４４７６である、［３］記載の方法。
［７］培養開始時における凝集体が、１つの凝集体あたり2〜50個の胚性幹細胞から構成される、［１］記載の方法。
［８］浮遊凝集体が少なくとも３日間培養される、［１］記載の方法。
［９］網膜前駆細胞が神経網膜前駆細胞又は網膜色素上皮前駆細胞である、［１］記載の方法。
［１０］浮遊凝集体の培養後に、培養された細胞を接着条件下で培養することを更に含む、［１］記載の方法。
［１１］無血清培地中で霊長類の胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、培養された細胞を接着条件下で更に培養すること、及び培養物から網膜色素上皮細胞を得ることを含む、霊長類の網膜色素上皮細胞の製造方法。
［１２］無血清培地中で霊長類の胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、培養された細胞を接着条件下で更に培養すること、及び培養物から視細胞又はその前駆体を得ることを含む、霊長類の視細胞又はその前駆体の製造方法。
［１３］接着条件下での培養がレチノイン酸及びタウリンからなる群から選択される少なくとも１つの因子を含む培地中で行われる、［１２］記載の方法。
［１４］培地がレチノイン酸及びタウリンを含む、［１３］記載の方法。
［１５］培養物中に視細胞前駆体が出現した以降の段階で、レチノイン酸及びタウリンからなる群から選択される少なくとも１つの因子が接着条件下での培養物中に添加される、［１３］記載の方法。
［１６］胚性幹細胞から分化誘導された、単離された網膜前駆細胞を、接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養すること、及び培養物から視細胞前駆体を得ることを含む、視細胞前駆体の製造方法。
［１７］ガンマセクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、［１６］記載の方法。
［１８］胚性幹細胞から分化誘導された、単離された網膜前駆細胞を、接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養すること、及び培養物から錐体視細胞を得ることを含む、錐体視細胞の製造方法。
［１９］ガンマセクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、［１８］記載の方法。
［２０］胚性幹細胞から分化誘導された、単離された網膜前駆細胞を、接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養すること、培養された細胞を、接着条件下、ＦＧＦ、ｓｈｈシグナル促進剤、レチノイン酸及びタウリンからなる群から選択される少なくともいずれかの因子の存在下で更に培養すること、及び培養物から桿体視細胞を得ることを含む、桿体視細胞の製造方法。
［２１］更なる培養がガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で行われる、［２０］記載の方法。
［２２］ガンマセクレターゼ阻害剤がＤＡＰＴである、［２１］記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明の方法を用いれば、網膜組織と共培養することなく、ＥＳ細胞から効率的に網膜前駆細胞や視細胞を創生することができる。特に本発明の方法は、規定された（defined）培養条件のもとで、霊長類ＥＳ細胞から網膜前駆細胞や視細胞を効率的に製造することができる点で優れている。
本発明は、ヒトＥＳ細胞をベースとした、網膜疾患に対する移植療法の開発を大いに促進し得る。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ガンマセクレターゼ阻害剤を用いた、ＦＡＣＳ精製したＥＳ由来神経網膜前駆細胞からの視細胞前駆体の効率的な創生。（ａ）ＦＡＣＳによるＲｘ＋網膜前駆細胞の濃縮のための手順を示す模式図。Ｄ、培養日数。（ｂ、ｃ）フローサイトメトリー解析。ＳＦＥＢ／ＤＬＦＡ処理された（９日目）（ｂ）、又はソートされた（ｃ）Ｒｘ−ＧＦＰ＋細胞を解析した。Ｒｘ−ＧＦＰ＋細胞の百分率を示す。（ｄ）ソートされたＲｘ−ＧＦＰ＋細胞または未分化（Ｄ０）細胞におけるＮｏｔｃｈシグナリングに関与する遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ解析。（ｅ）ソートされたＲｘ−ＧＦＰ＋細胞からの視細胞前駆体分化の手順を示す模式図。（ｆ）Ｒｘ−ＧＦＰ＋細胞をＤＡＰＴで処理し（または処理をせず）、更にＲｘ−ＧＦＰ−細胞を１０日目からＤＡＰＴで処理し、２０日目におけるＣｒｘ＋細胞の百分率を決定した。**、P < 0.01、***、P <0.001、Tukey’s test。（ｇ−ｉ）２０日目（ｇ、ｈ）及び１８日目（ｉ）における、ＤＡＰＴ処理したソートされたＲｘ−ＧＦＰ＋細胞の免疫組織学的解析。（ｇ、ｈ）Ｃｒｘ＋（赤）細胞が、ソートした細胞から効率的に創生した。ｇにおいて、核をＤＡＰＩ（青）で対比染色した。（ｉ）Ｃｒｘ＋（赤）細胞はＫｉ６７（緑）陰性だった。（ｊ、ｋ）ソートした細胞をＤＡＰＴで処理し（三角）又は処理せず（丸）、各分化日数におけるＫｉ６７＋（ｊ）およびＢｒｄＵ＋（ｋ）細胞の百分率を決定した。***、P < 0.001、Bonferroni test。（ｌ）いずれの分化日数においても、ＤＡＰＴ処理したＫｉ６７＋集団における活性カスパーゼ３＋細胞の百分率と、非処理のＫｉ６７＋集団における活性カスパーゼ３＋細胞の百分率との間に違いは見られなかった(ns、not significant、Bonferroni test)。スケールバー、ｇにおいては１００μｍ、ｈ及びｉにおいては２０μｍ。
【図２】ＥＳ由来の、ＤＡＰＴにより誘導された視細胞前駆体からのオプシン＋細胞の分化。（ａ）ＥＳ細胞からのオプシン＋錐体視細胞の分化の手順。ＦＡＣＳ精製されたＲｘ−ＧＦＰ＋細胞を１９日間、ＤＡＰＴとともに培養した。（ｂ、ｃ）マージされた赤／緑オプシン（赤）（ｂ）又は青オプシン（赤）（ｃ）の免疫染色及びノマルスキイメージ。スケールバー、２０μｍ。
【図３】FGF、タウリン、ｓｈｈ及びＲＡによるロドプシン＋視細胞分化の促進。（ａ）ＥＳ細胞からのロドプシン＋細胞の分化の手順。（ｂ）ソートしたＲｘ−ＧＦＰ＋細胞を、１６日目に表示された因子で処理し、２８日目におけるロドプシン＋細胞の百分率を決定した。*、P < 0.05、**、P < 0.01、vs. DAPT (+)（レーン２）、Dunnett’s test。（ｃ−ｅ）ＤＡＰＴ、ａFGF、ｂFGF、タウリン、ｓｈｈ及びＲＡで処理したソートした細胞の、２８日目における免疫染色。（ｃ）多くの細胞がロドプシン（赤）を発現した。（ｄ、ｅ）ロドプシン染色（赤）とノマルスキイメージ（ｄ）又はリカバリン染色（緑）とのマージされた視野。スケールバー、２０μｍ。
【図４】ガンマセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴは、視細胞前駆体の分化を促進する。Ｅ１７．５マウスの網膜を、組織培養下で２−４日間、１０μＭ  ＤＡＰＴにより処理し、又は処理しなかった。（ａ、ｂ）２日後、網膜をＣｒｘ（緑）及びＴＯＴＯ−３（青）について染色した。多くのＣｒｘ＋（緑）視細胞前駆体がＤＡＰＴで処理した網膜中に見出され（ａ）、一方、幾つかのＣｒｘ＋が非処理網膜中に見出された（ｂ）。ＧＣ、神経節細胞層（ganglion cell layer）；ＮＢＬ、神経芽細胞層（neuroblastic layer）；ＯＮＬ、外顆粒層（outer nuclear layer）。（ｃ）２又は４日間ＤＡＰＴで処理した又は処理しない網膜の、ＲＴ−ＰＣＲ解析。Ｈｅｓ１及びＨｅｓ５発現がＤＡＰＴ処理された網膜において減少していることが確認された。
【図５】ＤＡＰＴは、ＦＡＣＳ精製した網膜前駆細胞のＣｒｘ＋視細胞前駆体への分化を促進する。（ａ、ｂ）ＦＡＣＳ精製したＥＳ由来細胞の、Ｃｒｘ＋細胞への分化に対するＤＡＰＴ処理の効果。（ａ）試験のための培養スキーム。（ｂ）１０μＭ  ＤＡＰＴで処理された又は処理されていない細胞における、２０日目でのＣｒｘ＋細胞の百分率。（ｃ）１０日目からＤＡＰＴにより処理されたＦＡＣＳ精製細胞における、各分化日数でのＣｒｘ＋細胞の百分率(*、P < 0.05、***、P < 0.001、Tukey’s test)。
【図６】移植されたラット網膜において、ＥＳ由来網膜前駆細胞が生存しロドプシンを発現する。（ａ、ｂ）ＦＡＣＳ精製したＥＳ由来細胞（分化９日目）を蛍光色素（ＣＦＳＥ、(5-(6)-カルボキシフルオレセイン  ジアセテート  スクシンイミジルエステル、Molecular Probes)により１０分間標識し、ラットの目の網膜下の空間に移植した（Ｐ２１）。移植の２週間後、目を固定し、抗ロドプシン（赤）及び抗フルオレセイン（緑）抗体で染色した。核をＴＯＴＯ−３（青）で対比染色した。（ｂ）統合されたロドプシン＋細胞の、Ｚ軸に沿って再構成されえたイメージ。ＩＮＬ、内顆粒層（inner nuclear layer）；ＯＮＬ、外顆粒層（outer nuclear layer）；ＯＳ、外節（outer segment）；ＲＰＥ、網膜色素上皮（retinal pigment epithelium）。スケールバー、２０μｍ。
【図７】血清及びフィーダーを含まないで培養した場合の、サルＥＳ細胞からのＲＰＥ細胞の分化誘導。（ａ）網膜細胞の発生における多段階のコミットメント。各分化段階のマーカーを枠内に示した。（ｂ）ＳＦＥＢ処理したＥＳ細胞におけるＭｉｔｆ＋コロニーの割合。ＳＦＥＢ培養にＤｋｋ−１及びＬｅｆｔｙ−Ａを併用した場合が最も効率的にＭｉｔｆ＋コロニーの分化を誘導した。** P < 0.01、ＳＦＥＢ単独の場合との比較。（ｃ）ＳＦＥＢ／ＤＬ処理したサルＥＳ細胞は、Ｍｉｔｆ＋細胞へと分化する。（ｄ）サルＥＳ細胞からのＭｉｔｆ＋／Ｐａｘ６＋ＲＰＥ前駆細胞の産生。（ｅ）サルＥＳ細胞から分化した色素細胞の位相差像（４０日目）。（ｆ）ＳＦＥＢ／ＤＬ培養におけるサルＥＳ細胞由来のＲＰＥ細胞の高倍率画像。色素沈着した細胞が多角形の形状を示していることがわかる。（ｇ）ファロイジン染色によりＲＰＥ細胞の多角形の形状が示された。（ｈ）サルＥＳ細胞由来の色素細胞は、成熟したＲＰＥに特異的なタンパク質であるＲＰＥ−６５を発現している。（ｉ）タイトジャンクションの形成が、抗ＺＯ−１抗体を用いた免疫染色によって確認された。（ｊ）ＳＦＥＢ／ＤＬ培養におけるＲＰＥ分化の模式図。スケールバー、１００μｍ（ｃ，ｅ）、３０μｍ（ｄ）、２０μｍ（ｆ、ｇ、ｈ、ｉ)。
【図８】レチノイン酸、タウリン及びＮ２サプリメントは視細胞への分化を促進する。（ａ）Ｄｋｋ−１及びＬｅｆｔｙ−ＡはＳＦＥＢ培養におけるＲｘ＋コロニーの割合を増加させる。** P < 0.01、ＳＦＥＢ単独の場合との比較。（ｂ）ＳＦＥＢ／ＤＬ処理したＥＳ細胞でＲｘ＋細胞が効率的に誘導される。（ｃ）サルＥＳ細胞からのＲｘ＋／Ｐａｘ６＋神経網膜前駆細胞の産生。（ｄ）ＳＦＥＢ／ＤＬ処理はＣｒｘ＋コロニーの割合を増加させる。*** P < 0.01、ＳＦＥＢ単独の場合との比較。（ｅ）ＲＡ／Ｔ／Ｎ２処理はＣｒｘ＋細胞の割合を増加させる。** P < 0.01、ＳＦＥＢ／ＤＬ単独の場合との比較。（ｆ，ｇ）サルＥＳ細胞からのＣｒｘ＋視細胞前駆体の効率的な分化。（ｈ）ＳＦＥＢ／ＤＬ処理はロドプシン＋コロニーの割合を増加させる。 *** P < 0.01, ＳＦＥＢ単独の場合との比較。（ｉ）ＲＡ／Ｔ／Ｎ２処理はロドプシン＋細胞の割合を増加させる。*** P < 0.01、ＳＦＥＢ／ＤＬ単独の場合との比較。（ｊ、ｋ）サルＥＳ細胞からのロドプシン＋視細胞の効率的な分化。（ｌ）ロドプシン＋細胞はリカバリンを共発現する。（ｍ）ＳＦＥＢ／ＤＬ及びＲＡ／Ｔ／Ｎ２培養における視細胞分化の模式図。スケールバー、１００μｍ（ｂ、ｆ、ｊ、ｇ）、３０μｍ（ｃ、ｋ）、２０μｍ（ｌ）。
【図９】ヒトＥＳ細胞からのＲＰＥ細胞及び視細胞の産生。（ａ−ｉ）ヒトＥＳ細胞はＲＰＥ細胞へ効率よく分化する。（ａ）ＳＦＥＢ／ＤＬ処理したヒトＥＳ細胞は、Ｍｉｔｆ＋／Ｐａｘ６＋ＲＰＥ前駆細胞へ効率的に分化する。（ｂ）位相差顕微鏡で測定される、色素細胞のヒトＥＳ細胞からの効率的な産生。（ｃ）抗ＺＯ−１抗体を用いた免疫染色によりこれらの細胞の六角形の形状とタイトジャンクションが明らかとなる。（ｄ−ｉ）ヒトＥＳ細胞由来のＲＰＥ細胞の電子顕微鏡解析。（ｄ）ＳＦＥＢ／ＤＬ処理したヒトＥＳ細胞はＲＰＥに特徴的な特性を有する。ヒトＥＳ細胞由来の色素細胞は微絨毛（ｅ）、基底膜（ｆ）、メラニン顆粒（ｇ）、接着結合及びタイトジャンクション（ｈ、ｉ）を有していた。（ｊ−ｍ）ＳＦＥＢ／ＤＬ及びＲＡ／Ｔ／Ｎ２で処理したヒトＥＳ細胞からの視細胞の分化。（ｊ）ヒトＥＳ細胞はＲｘ＋／Ｐａｘ６＋神経網膜前駆細胞へと分化する。（ｋ−ｍ）ＳＦＥＢ／ＤＬ培養し、ＲＡ／Ｔ／Ｎ２処理したヒトＥＳ細胞からのＣｒｘ＋視細胞前駆体（ｋ）及びロドプシン＋視細胞（ｌ）の産生。（ｍ）ヒトＥＳ細胞由来のロドプシン＋細胞はリカバリンを共発現する。スケールバー、３０μｍ（ａ、ｊ、ｋ、ｌ）、５０μｍ（ｂ）、２μｍ（ｄ）、５００ｎｍ（ｅ、ｆ）、２００ｎｍ（ｇ、ｈ、ｉ）、２０μｍ（ｍ）。
【図１０】ＳＢ−４３１５４２（ＳＢ）又はＣＫＩ−７（ＣＫＩ）によるマウスＥＳ細胞の神経細胞（βＩＩチュブリン陽性細胞）への分化誘導を示す。薬剤濃度：μＭ。
【図１１】Ｄｋｋ−１及びＬｅｆｔｙ−Ａの併用（ＤＬ）、並びにＳＢ−４３１５４２とＣＫＩ−７の併用（ＳＣ）による、ヒトＥＳ細胞の網膜上皮細胞への分化誘導を示す。
【図１２】ラテックスビーズを貪食したＳＦＥＢ／ＤＬ誘導色素細胞。矢頭はラッテクスビーズを示す。
【図１３】ＳＦＥＢ／ＤＬ及びＲＡ／Ｔ／Ｎ２処理されたヒトＥＳ細胞における光伝達遺伝子の発現。ヒト成体網膜ｃＤＮＡ（BD Bioscience Clontech）を陽性対照として用いた。ＧＮＡＴ１：グアニンヌクレオチド結合タンパク質アルファ１、ＰＤＣ：フォスデュシン、ＰＤＥ：ホスホジエステラーゼ、ＣＮＧＡ１：サイクリンヌクレオチドゲーテドチャンネル  アルファ１、ＧＲＫ：ロドプシンキナーゼ、ＳＡＧ：Ｓ抗原、ＡＲＲ３：アレスチン３、ＲＤＨ：レチノールデヒドロゲナーゼ、ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、胚性幹細胞からの網膜前駆細胞、視細胞前駆体又は視細胞の改良された製造方法を提供する。以下、本発明の詳細を説明する。【０００９】
（１．胚性幹細胞）
「胚性幹細胞（ＥＳ細胞）」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。【００１０】
胚性幹細胞としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、モルモット、ハムスター等のげっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギが挙げられる。【００１１】
具体的には、本発明の方法で用いられる胚性幹細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞Ｉ」と省略）、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩ」と省略）、および胚性幹細胞Ｉ又はＩＩの胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩＩ」と省略）が挙げられる。【００１２】
より具体的には、胚性幹細胞Ｉとしては、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立された胚性幹細胞、始原生殖細胞から樹立されたＥＧ細胞、着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、あるいはその細胞を培養することによって得られる細胞などが挙げられる。【００１３】
胚性幹細胞Ｉは、着床以前の初期胚を、文献 (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)) に記載された方法に従って培養することにより調製することができる。【００１４】
胚性幹細胞ＩＩは、例えば、Wilmutら (Nature, 385, 810 (1997))、Cibelliら (Science, 280, 1256 (1998))、入谷明ら（蛋白質核酸酵素, 44, 892 (1999)）、Baguisiら (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999))、Wakayamaら (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999))、RideoutIIIら (Nature Genetics, 24, 109 (2000)) 等によって報告された方法を用いることにより、例えば以下のように作製することができる。【００１５】
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を開始した卵が得られる。【００１６】
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、核を提供する側の細胞を培養している培地を、５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、より好ましくは０．５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導することで初期化することができる。【００１７】
また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し、数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することができる。【００１８】
初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複数の方法が知られている。細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。【００１９】
同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。【００２０】
いったん発生を開始した卵が得られれば、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 (1995) 等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。【００２１】
胚性幹細胞ＩＩＩは、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。胚性幹細胞ＩＩＩの作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、網膜細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。また、網膜前駆細胞や、視細胞前駆体の分化マーカー（例えばＲｘ）をコードする遺伝子に標識遺伝子（例えばＧＦＰ等の蛍光タンパク質）をインフレームにノックインすることにより、特定の分化段階に達しその分化マーカーを発現する細胞を、標識遺伝子の発現により識別することが可能となる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 (1995) 等に記載の方法を用い、行なうことができる。【００２２】
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製することができる。【００２３】
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) やCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム (Genome Systems製)やUniversal GenomeWalkerTM Kits (CLONTECH製)などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。【００２４】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 (1995)等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができ、また、選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。【００２５】
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。【００２６】
また、胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2 及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。【００２７】
また本明細書においては、皮膚細胞等の体細胞に、ＥＳ細胞の万能性や高い増殖性を維持するために重要な複数の特定の遺伝子を導入することにより得られる誘導多能性幹細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれ得る（Cell, 126, 1-14, 2006； Cell, 131, 1-12, 2007; Science,318, no.5858, 1917-1920； Nat Biotechnol. 2008  Jan;26(1):101-106. Epub 2007 Nov 30.; Nature, 451,141-146, 2008．Epub 2007 Dec 23.;その他）。更に、ＥＳ細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ＥＳ細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれ得る。【００２８】
胚性幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、胚性幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、KnockoutTM Serum Replacement（ＫＳＲ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。【００２９】
（２．網膜前駆細胞の製造）
本発明は胚性幹細胞から網膜前駆細胞を製造する方法を提供する。本発明の網膜前駆細胞の製造方法は、血清を含む又は含まない培地中で胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養すること、及び培養物から網膜前駆細胞を得ることを含む。胚性幹細胞からの網膜前駆細胞の製造は、例えば、Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005)に記載された方法に準じて行うことが可能である。しかし、胚性幹細胞が由来する動物の種類や、目的とする網膜前駆細胞の種類に応じて、培養条件を適宜改変することができる。以下、詳細に説明する。【００３０】
網膜前駆細胞とは、網膜〔神経網膜（内膜）、網膜色素上皮（ＲＰＥ、外層）〕に存在する細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。網膜前駆細胞としては、神経網膜前駆細胞及び網膜色素上皮前駆細胞が挙げられる。【００３１】
得られた細胞が網膜前駆細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、網膜前駆細胞マーカーの発現により確認できる。網膜前駆細胞マーカーとしては、例えば、Ｐａｘ６（神経網膜前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞）、Ｒｘ（神経網膜前駆細胞）、Ｍｉｔｆ（網膜色素上皮前駆細胞）が挙げられる。【００３２】
胚性幹細胞を「浮遊凝集体として培養する」とは、集合し塊を形成した胚性幹細胞群を、培養培地中において、細胞培養器に対し非接着性の条件下で培養することをいう。以下、このような培養を、必要に応じて浮遊培養と省略する。【００３３】
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、浮遊凝集体の形成をより容易にするため、並びに／あるいは、効率的な分化誘導のために、フィーダー細胞の非存在下で培養を行うのが好ましい。【００３４】
浮遊培養で用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。【００３５】
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、培地としては無血清培地又は血清を含む培地が用いられる。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。血清は、任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来する血清を使用できる。血清が由来する哺乳動物は、胚性幹細胞が由来する哺乳動物（上述）と同様である。【００３６】
浮遊培養で血清を含む培地を用いる場合、血清の濃度は、網膜前駆細胞を効率的に分化誘導し得る濃度である限り限定されないが、例えば０．５〜３０％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１．０〜２０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約３〜１０％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは約５％（ｖ／ｖ）であり得る。【００３７】
マウス等のげっ歯類の胚性幹細胞から網膜前駆細胞を製造する場合には、血清は必須の因子である。血清を添加しない場合、胚性幹細胞からの網膜前駆細胞の効率的な分化を誘導することが出来ない。胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む培地に血清を添加する時期は、網膜前駆細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から３〜７日以内である。血清は浮遊培養開始時に既に培地に添加されていてもよい。【００３８】
一方、ヒトやサル等の霊長類の胚性幹細胞から網膜前駆細胞を製造する場合には、血清は必須の因子ではなく、浮遊培養の全期間にわたり無血清培地中で培養を行うことにより、効率的に霊長類の網膜前駆細胞を誘導することが出来る。製造される網膜前駆細胞を移植医療等に用いる場合、血清へのウイルス等の混入のリスクを考慮し、無血清培地が好ましく用いられる。【００３９】
浮遊培養で用いられる無血清培地は、例えば、血清代替物を含有するものであり得る。血清代替物は、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、knockout Serum Replacement（ＫＳＲ）、Chemically-defined Lipid concentrated（Gibco社製）、Glutamax（Gibco社製）が挙げられる。【００４０】
また、浮遊培養で用いられる培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、添加物（Ｎ２サプリメント等）等を含有できる。例えば、２−メルカプトエタノールは、胚性幹細胞の培養に適する濃度で使用される限り限定されないが、例えば約０．０５〜１．０ｍＭ、好ましくは約０．１〜０．５ｍＭ、より好ましくは約０．２ｍＭの濃度で使用できる。【００４１】
浮遊培養に用いられる培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避するという観点からは、かかる培地として、市販のKSRを適量（例えば、１-20％）添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はｄＭＥＭ、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム）や、この無血清培地に更に胎仔ウシ血清を適量（例えば１-20％）添加した血清含有培地を使用できる。【００４２】
網膜前駆細胞への分化効率を向上・安定化させるため、浮遊培養に用いる培地は、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤からなる群から選択されるいずれかの阻害剤を含むことが好ましい。また、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤の併用により、さらに著しい効果が期待できる。【００４３】
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤は、Ｎｏｄａｌにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ−Ａ、Ｌｅｆｔｙ−Ｂ、Ｌｅｆｔｙ−１、Ｌｅｆｔｙ−２、可溶型Ｎｏｄａｌ受容体、Ｎｏｄａｌ抗体、Ｎｏｄａｌ受容体阻害剤、ＳＢ−４３１２４２が挙げられる。【００４４】
ＳＢ−４３１２４２は、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７を選択的に阻害する公知の化合物であり、以下の構造を有する。【００４５】
【化１】
2008087917.tif 000002
【００４６】
浮遊培養に用いられるＮｏｄａｌシグナル阻害剤の濃度は、浮遊凝集体の網膜前駆細胞への分化促進、あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＬｅｆｔｙ−Ａについては約０．１〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．５〜５０μｇ／ｍｌであり得る。また、ＳＢ−４３１２４２については、かかる濃度は約０．０１〜１００μＭ、好ましくは０．１〜１０μＭであり得る。【００４７】
Ｗｎｔシグナル阻害剤は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル阻害剤としては、例えば、Ｄｋｋ１、Cerberus蛋白、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔ蛋白、ＣＫＩ−７（Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロ−イソキノリン−８−スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４−{４−（２，３−ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン−６−イル）−５−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミイダゾール−２−イル}ベンズアミド）が挙げられる。【００４８】
ＣＫＩ−７及びＤ４４７６は、カゼインキナーゼ１を選択的に阻害する公知の化合物である。【００４９】
浮遊培養に用いられるＷｎｔシグナル阻害剤の濃度は、浮遊凝集体の網膜前駆細胞への分化促進、あるいは上記有用性を達成可能であるような濃度であり得る。かかる濃度は、例えばＤｋｋ１については約０．０５〜２０μｇ／ｍｌ、好ましくは約０．１〜１０μｇ／ｍｌであり得る。また、ＣＫＩ−７については、かかる濃度は約０．１〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭであり得る。Ｄ４４７６については、かかる濃度は約０．１〜１００μＭ、好ましくは１〜１０μＭであり得る。【００５０】
本発明において、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤とＷｎｔシグナル阻害剤とを併用する場合、その好ましい組み合わせとしては、Ｌｅｆｔｙ−ＡとＤｋｋ１；ＳＢ−４３１２４２とＣＫＩ−７；ＳＢ−４３１２４２とＤ４４７６等を挙げることができるが、これらに限定されない。【００５１】
Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤は、胚性幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養数日後（例えば、培養１０日以内の時期）に培地に添加してもよい。好ましくは、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤は、培養５日以内の時期に培地に添加される。【００５２】
特に、浮遊細胞を無血清培地中で行う場合には、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及びＷｎｔシグナル阻害剤からなる群から選択される少なくともいずれか（好ましくは両方）の阻害剤を含むことが好ましい。これらの阻害剤の添加により、浮遊培養の全期間にわたり無血清培地を用いた場合であっても、霊長類の胚性幹細胞から網膜前駆細胞を効率的に製造することが可能となる。【００５３】
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及び／又はＷｎｔシグナル阻害剤の非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。【００５４】
網膜前駆細胞への分化を促進する目的で、浮遊培養に用いる培地中にアクチビン（例えばアクチビンＡ）を添加してもよい。浮遊培養に用いられるアクチビンの濃度は、網膜前駆細胞をより効率的に産生できる濃度であり得る。かかる濃度は、例えば約１〜１００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１０〜１０００ｎｇ／ｍｌであり得る。【００５５】
胚性幹細胞の浮遊凝集体を含む培地にアクチビンを添加する時期は、網膜前駆細胞への分化を可能とする限り特に限定されないが、例えば、浮遊培養開始から７日以内（例えば、３〜７日後）である。【００５６】
なお、胚性幹細胞の浮遊培養は、アクチビンの非存在下で行うことも勿論可能である。また、浮遊培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。【００５７】
１つの好ましい態様において、胚性幹細胞から網膜前駆細胞への分化を特に効率よく行うために、浮遊培養が、血清、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤及びアクチビンを含む培地中で行われる。この方法は、特にマウス等のげっ歯類の胚性幹細胞から網膜前駆細胞を製造する場合に好適である。【００５８】
また、別の好ましい態様において、胚性幹細胞から網膜前駆細胞への分化を特に効率よく行うために、浮遊培養が、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤及びＷｎｔ阻害剤を含む無血清培地中で行われる。この方法は、特にヒトやサル等の霊長類の胚性幹細胞から網膜前駆細胞を製造する場合に好適であり、この方法を用いることにより、マウスの胚性幹細胞については困難であった無血清培地中での網膜前駆細胞への誘導が、ヒト等の霊長類の胚性幹細胞について可能となる。【００５９】
浮遊培養で用いられる培養器は、細胞の浮遊培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。【００６０】
胚性幹細胞を浮遊培養する場合、培養器は細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）されていないものを使用できる。【００６１】
培養開始時においては、維持培養された胚性幹細胞を分散処理し、これを培養容器中に再度播種する。胚性幹細胞の由来する動物の種類によっては、このときの分散処理の程度により、網膜前駆細胞の製造効率が大きく影響を受ける。マウス等のげっ歯類の場合には、維持培養された胚性幹細胞をシングルセルにまで強力に分散した場合も、或いは１つの凝集体あたり５０細胞を超えるような大きな凝集体となるまで弱く分散した場合も、高い効率で網膜前駆細胞を誘導することが出来る。一方、霊長類の場合には、凝集体が、１つの凝集体あたり好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは５〜１０個の胚性幹細胞から構成されるように調製される。胚性幹細胞をシングルセルにまで分散すると、細胞の生存率が低下してしまい、網膜前駆細胞の誘導効率が低下してしまう。また、１つの凝集体あたりの胚性幹細胞の数が５０個を越えると、網膜前駆細胞の誘導効率が低下し得る。【００６２】
培養開始時の胚性幹細胞の濃度は、胚性幹細胞の浮遊凝集体をより効率的に形成させるように適宜設定できる。培養開始時の胚性幹細胞の濃度は、胚性幹細胞の浮遊凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば、約１×１０３〜約５×１０６細胞／ｍｌ、好ましくは約３×１０４〜約１×１０５細胞／ｍｌ（凝集塊の濃度として約１×１０３〜約１×１０５／ｍｌ、好ましくは約３×１０３〜約２×１０４／ｍｌ）であり得る。【００６３】
浮遊培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１〜１０％、好ましくは約５％である。【００６４】
浮遊培養の期間は、網膜前駆細胞をより効率的に産生できる長さであり得る。かかる期間の長さは、例えば約３日間以上、好ましくは約３〜４０日間、より好ましくは約５〜２５日間であり得る。特に、霊長類の胚性幹細胞から網膜前駆細胞を効率よく誘導する場合には、浮遊培養の期間は１５日間以上（例えば約１６〜２５日間）が好ましい。【００６５】
浮遊培養後、凝集体をそのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、次いで細胞を接着条件下でさらに培養してもよい（以下、必要に応じて接着培養と省略）。なお、接着培養では、細胞接着性の培養器、例えば、細胞外マトリックス等（例えば、ポリＤリジン、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリＬリジン、ポリエチレンイミン、ポリオルニチン、マトリゲル等）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。また、接着培養における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は、浮遊培養における条件と同様に適宜設定することができる。接着培養に用いられる培地は、Ｎｏｄａｌシグナル阻害剤、Ｗｎｔシグナル阻害剤及びアクチビンを含まなくてもよいことを除き、浮遊培養に用いられる培地と同様に適宜選択することができる。【００６６】
接着培養の期間は、網膜前駆細胞をより効率的に産生できる長さであり得る。かかる期間の長さは、例えば約３日間以上、好ましくは約３〜７０日間、より好ましくは約５〜４０日間であり得る。【００６７】
培養終了後、培養物から網膜前駆細胞が単離され得る。この単離は上述の網膜前駆細胞のマーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。あるいは、胚性幹細胞として、網膜前駆細胞のマーカー（例えばＲｘ）をコードする遺伝子に標識遺伝子（例えばＧＦＰ等の蛍光タンパク質）がインフレームにノックインされた細胞を用い、その標識遺伝子の発現を指標に、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。【００６８】
本発明の方法により得られる培養物中には高頻度（含有量）に網膜前駆細胞が含まれる。本発明の方法により得られる細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは１０〜５０％の頻度（コロニー頻度）でＲｘ陽性（神経網膜前駆細胞のマーカー）である。このＲｘ陽性細胞のほとんど（例えば９０％以上）が、神経網膜前駆細胞のプロファイルと一致してＰａｘ６陽性である。【００６９】
また、本発明の方法により得られる細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは１０〜６０％の頻度（コロニー頻度）でＭｉｔｆ陽性（網膜色素上皮前駆細胞のマーカー）である。このＭｉｔｆ陽性細胞のほとんど（例えば９０％以上）が、胚の網膜色素上皮のプロファイルと一致してＰａｘ６陽性である。【００７０】
本発明の方法によれば、培養の全期間にわたり、培養を無血清培地中で行うことにより、霊長類の網膜前駆細胞を高い効率で製造することが可能となる。【００７１】
（３．網膜色素上皮細胞の製造）
本発明は網膜色素上皮細胞を製造する方法を提供する。上述の網膜前駆細胞の製造方法と同様に、血清を含む又は含まない培地中で胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養し、培養された細胞を接着条件下で更に培養し、培養物から網膜色素上皮細胞を得ることにより、網膜色素上皮細胞を製造することができる。【００７２】
網膜色素上皮細胞は、網膜色素上皮を構成する上皮細胞である。得られた細胞が網膜色素上皮細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、網膜色素上皮細胞マーカーの発現により確認できる。網膜色素上皮細胞マーカーとしては、例えば、ＲＰＥ−６５が挙げられる。その他、細胞の形態（細胞内のメラニン色素沈着、多角形で扁平状の細胞形態、多角形のアクチン束の形成等）を指標に、光学顕微鏡を用いて、得られた細胞が網膜色素上皮細胞であるか否かを判断することができる。【００７３】
網膜色素上皮細胞の製造における、浮遊培養及び接着培養の条件は、接着培養の期間の長さを除き、網膜前駆細胞の製造におけるものと同一である。網膜色素上皮細胞の製造における、接着培養の期間は、網膜色素上皮細胞をより効率的に産生できる長さであり得る。かかる期間の長さは、例えば約１０日間以上、好ましくは約２０〜１２０日間、より好ましくは約３０〜１００日間であり得る。この長期の接着培養により、上記２の方法で製造された網膜前駆細胞（網膜色素上皮前駆細胞）から網膜色素上皮細胞への分化が更に誘導される。【００７４】
接着培養の終了後、培養物から網膜色素上皮細胞が単離され得る。この単離は上述の網膜色素上皮細胞のマーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。【００７５】
本発明の方法により得られる培養物中には高頻度（含有量）で網膜色素上皮細胞が含まれる。本発明の方法により得られる細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは１０〜６０％の頻度（コロニー頻度）でＲＰＥ−６５陽性（網膜色素上皮細胞のマーカー）である。この細胞は、扁平な多角形の形態を示すこと、端部の微絨毛と基底膜を伴い二極化していること、メラニン顆粒が存在すること、タイトジャンクション及び接着結合が存在すること等の典型的な成熟網膜色素上皮の特徴を有する。【００７６】
本発明の方法によれば、培養の全期間にわたり、培養が無血清培地中で行うことにより、霊長類の網膜色素上皮細胞を高い効率で製造することができる。【００７７】
（４．視細胞又はその前駆体の製造）
本発明は視細胞又は前駆体を製造する方法を提供する。上述の網膜前駆細胞の製造方法と同様に、血清を含む又は含まない培地中で胚性幹細胞を浮遊凝集体として培養し、培養された細胞を接着条件下で更に培養し、培養物から視細胞又はその前駆体を得ることにより、視細胞又はその前駆体を製造することができる。【００７８】
視細胞前駆体は、視細胞への分化が決定付けられている前駆細胞である。得られた細胞が視細胞前駆体であるか否かは、自体公知の方法、例えば、視細胞前駆体マーカーの発現により確認できる。視細胞前駆体マーカーとしては、例えば、Ｃｒｘが挙げられる。【００７９】
視細胞には桿体視細胞及び錐体視細胞が含まれる。得られた細胞が視細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、視細胞マーカーの発現により確認できる。視細胞マーカーとしては、例えば、ロドプシン（桿体視細胞）、赤／緑オプシン（錐体視細胞）、青オプシン（錐体視細胞）、リカバリン（桿体視細胞、錐体視細胞）等が挙げられる。【００８０】
視細胞又はその前駆体の製造における、浮遊培養及び接着培養の条件は、接着培養の期間を除き、網膜前駆細胞の製造（上記２）におけるものと同一である。視細胞又はその前駆体の製造における、接着培養の期間は、視細胞又はその前駆体をより効率的に産生できる長さであり得る。かかる期間の長さは、例えば約１０日以上、好ましくは１５日〜３００日間である。特に霊長類の視細胞又はその前駆細胞の製造における培養期間はげっ歯類の場合と比較してより長期（約３０日間以上、好ましくは約４０〜３００日間、より好ましくは約５０〜２００日間）であり得る。この接着培養により、上記方法で製造された網膜前駆細胞（神経網膜前駆細胞）からの視細胞前駆体及び視細胞への分化が更に誘導される。【００８１】
視細胞又はその前駆体への分化を促進するため、視細胞又はその前駆体の製造における、接着培養は、ＦＧＦ（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ等）、ｓｈｈシグナル促進剤、レチノイン酸及びタウリンからなる群から選択される少なくとも１つ（例えば２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つ、最も好ましくは５つ）の因子を含む培地中で行われることが好ましい。特に、霊長類の視細胞又はその前駆体の製造においては、レチノイン酸及び／又はタウリンを含む培地中で接着培養が行われることが好ましい。また、これらの因子の複数を併用することにより、さらに著しい効果が期待できる。【００８２】
接着培養に用いられるＦＧＦの濃度は、視細胞又はその前駆体への分化を促進し得る限り限定されないが、かかる濃度は、例えば約０．１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５〜２００ｎｇ／ｍｌである。【００８３】
Ｓｈｈシグナル促進剤は、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル促進剤としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニストが挙げられるが、なかでも、Ｓｈｈが好ましい。【００８４】
接着培養に用いられるＳｈｈシグナル促進剤の濃度は、視細胞又はその前駆体への分化を促進し得る限り限定されない。かかる濃度は、例えば約０．１〜１０００ｎＭ、好ましくは約０．３〜１００ｎＭ、より好ましくは約１〜５０ｎＭであり得る。【００８５】
接着培養に用いられるレチノイン酸の濃度は、視細胞又はその前駆体への分化を促進し得る限り限定されない。かかる濃度は、例えば約１〜１００００ｎＭ、好ましくは約１０〜２０００ｎＭ、より好ましくは約１００〜１０００ｎＭであり得る。【００８６】
接着培養に用いられるタウリンの濃度は、視細胞又はその前駆体への分化を促進し得る限り限定されない。かかる濃度は、例えば約５〜２０００μＭ、より好ましくは約１０〜１０００μＭであり得る。【００８７】
上述の因子は、接着培養の開始時に既に培地に添加されていてもよいが、培養物中に視細胞前駆体が出現した以降の段階（例えば接着培養開始後３日以降、好ましくは７日以降）に培養物中に添加されることが好ましい。これにより、視細胞前駆体から視細胞への分化が効率よく促進される。【００８８】
視細胞又はその前駆体への分化を促進するため、視細胞又はその前駆体の製造における、接着培養は、添加物（Ｎ２サプリメント等）を含む培地中で行われることが好ましい。培地中の添加物の濃度は、当業者において通常用いられる濃度範囲内で、適宜設定することができる。【００８９】
なお、接着培養は、上記因子の非存在下で行うことも勿論可能である。また、接着培養の途中に、この培養条件を切り替えることも可能である。【００９０】
接着培養の終了後、培養物から視細胞又はその前駆体が単離され得る。この単離は上述の視細胞又はその前駆体のマーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。あるいは、胚性幹細胞として、視細胞又はその前駆体のマーカーをコードする遺伝子に標識遺伝子（例えばＧＦＰ等の蛍光タンパク質）がインフレームにノックインされた細胞を用い、その標識遺伝子の発現を指標に、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。【００９１】
本発明の方法により得られる培養物には高頻度（含有量）で視細胞又はその前駆体が含まれる。本発明の方法により得られる細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは１０〜４０％の頻度（コロニー頻度）でＣｒｘ陽性（視細胞前駆体のマーカー）である。また、本発明の方法により得られる視細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは１０〜４０％の頻度（コロニー頻度）でロドプシン陽性（視細胞のマーカー）である。これらのロドプシン陽性細胞は、リカバリン陽性であり得る。【００９２】
本発明の方法によれば、培養の全期間にわたり、培養を無血清培地中で行うことにより、霊長類の視細胞又はその前駆体を高い効率で製造することが可能となる。【００９３】
（５．視細胞前駆体又は錐体視細胞の製造）
本発明は、胚性幹細胞から分化誘導された、単離された網膜前駆細胞を、接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養すること、及び培養物から視細胞前駆体又は錐体視細胞を得ることを含む、視細胞前駆体又は錐体視細胞の製造方法を提供する。ガンマセクレターゼ阻害剤は、網膜前駆細胞からの視細胞前駆体への分化を誘導し、同時に視細胞前駆体から錐体視細胞への分化を強力に促進する。重要なことに、ガンマセクレターゼ阻害剤は、視細胞前駆細胞から桿体視細胞への分化を誘導しない。従って、本方法を用いれば、桿体視細胞の混入を最小限に抑制しながら、錐体視細胞を選択的に製造することが可能となる。【００９４】
胚性幹細胞から分化誘導された網膜前駆細胞としては、例えば上記１に記載された方法や、Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005)に記載された方法により、インビトロで胚性幹細胞から分化誘導された網膜前駆細胞（特に、神経網膜前駆細胞）を用いることができる。【００９５】
本方法に用いられる網膜前駆細胞は単離されていることが必要である。単離されていない網膜前駆細胞を用いた場合には、視細胞前駆体、錐体視細胞への分化を促進するガンマセクレターゼ阻害剤の効果が減弱されてしまう。【００９６】
本明細書において「単離された」とは、目的とする細胞の純度（割合）を、処理しない場合と比較して増加させるような操作がなされていることを意味する。単離された細胞の純度（全細胞における目的とする細胞の割合）は、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば１００％）である。【００９７】
網膜前駆細胞の単離は、上述の網膜前駆細胞のマーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。あるいは、胚性幹細胞として、網膜前駆細胞のマーカー（例えばＲｘ）をコードする遺伝子に標識遺伝子（例えばＧＦＰ等の蛍光タンパク質）がインフレームにノックインされた細胞を用い、その標識遺伝子の発現を指標に、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。【００９８】
次に、単離された網膜前駆細胞が、接着条件下で、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養される。この接着培養においては、単離された網膜前駆細胞を遠心分離等により再凝集し、網膜前駆細胞の凝集体を播種することが好ましい。接着培養の条件は、ガンマセクレターゼ阻害剤を培地に添加することを除き、上記１と同一である。【００９９】
ガンマセクレターゼ阻害剤としては、例えば、Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン  ｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を挙げることが出来る。【０１００】
接着培養に用いられるガンマセクレターゼ阻害剤の濃度は、網膜前駆細胞から視細胞前駆体又は錐体視細胞への分化を促進し得る濃度であり得る。かかる濃度は、例えば約０．１〜１０００μＭ、好ましくは約１〜１００μＭ、より好ましくは約３０〜５０μＭであり得る。【０１０１】
ガンマセクレターゼ阻害剤は、接着培養の開始時に既に培地に添加されていてもよいが、接着培養開始から数日後（例えば、培養１０日以内の時期）に培養物中に添加されることが好ましい。好ましくは、ガンマセクレターゼ阻害剤は、培養５日以内、より好ましくは２日以内の時期に培地に添加される。【０１０２】
ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下での接着培養の期間は、視細胞前駆体又は錐体視細胞をより効率的に産生できる長さであり得る。かかる期間の長さは、例えば約３日間以上、好ましくは約５〜１００日間、より好ましくは約１０〜５０日間であり得る。【０１０３】
得られた細胞が視細胞前駆体であるか否かは、自体公知の方法、例えば、視細胞前駆体マーカーの発現により確認できる。視細胞前駆体マーカーとしては、例えば、Ｃｒｘが挙げられる。【０１０４】
得られた細胞が錐体視細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、錐体視細胞マーカーの発現により確認できる。視細胞マーカーとしては、例えば、赤／緑オプシン（錐体視細胞）、青オプシン（錐体視細胞）、リカバリン（桿体視細胞、錐体視細胞）等が挙げられる。【０１０５】
接着培養の終了後、培養物から視細胞前駆体又は錐体視細胞が単離され得る。この単離は上述の視細胞前駆体又は錐体視細胞のマーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。【０１０６】
本発明の方法により得られる培養物には高頻度（含有量）で視細胞前駆体又はその錐体視細胞が含まれる。本発明の方法により得られる細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは１０〜３０％の頻度（コロニー頻度）でＣｒｘ陽性（視細胞前駆体のマーカー）である。また、本発明の方法により得られる細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは１０〜３０％の頻度（コロニー頻度）でオプシン（赤／緑オプシン、又は青オプシン）陽性（視細胞のマーカー）である。【０１０７】
（６．桿体視細胞の製造）
本発明は、胚性幹細胞から分化誘導された単離された網膜前駆細胞を、接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養すること、培養された細胞を、接着条件下、ＦＧＦ、ｓｈｈシグナル促進剤、レチノイン酸及びタウリンからなる群から選択される少なくともいずれかの因子の存在下で更に培養すること、及び培養物から桿体視細胞を得ることを含む、桿体視細胞の製造方法を提供する。上記５で述べたように、ガンマセクレターゼ阻害剤の添加によっては、桿体視細胞への分化は促進されない。しかしながら、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下での培養後に、培養された細胞を上記因子で処理することにより、桿体視細胞への分化を促進することができる。【０１０８】
接着条件下、ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程までは、上記５と同様に行うことができる。この工程で得られる細胞が、接着条件下、ＦＧＦ（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ等）、ｓｈｈシグナル促進剤、レチノイン酸及びタウリンからなる群から選択される少なくとも１つ（例えば２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つ、最も好ましくは５つ）の因子を含む培地中で更に培養される。これらの因子の複数を併用することにより、さらに著しい効果が期待できる。【０１０９】
培養に用いられるＦＧＦ、ｓｈｈシグナル促進剤、レチノイン酸及びタウリンの種類や濃度、並びに接着条件は、上記４と同様である。【０１１０】
これらの因子を加えた後の接着培養の期間は、桿体視細胞をより効率的に産生できる長さであり得る。かかる期間の長さは、例えば約５日間以上、好ましくは約８〜５０日間であり得る。【０１１１】
また、この更なる培養においては、上記因子に加えてＤＡＰＴ等のガンマセクレターゼ阻害剤が培地に添加されていてもよい。ガンマセクレターゼ阻害剤の添加により、桿体視細胞の分化が促進し得る。【０１１２】
この場合のガンマセクレターゼ阻害剤の濃度は、桿体視細胞の分化を促進し得る濃度であり得る。かかる濃度は、例えば約０．１〜１０００μＭ、好ましくは約１〜１００μＭ、より好ましくは約３０〜５０μＭであり得る。【０１１３】
桿体視細胞への分化を促進するため、この更なる培養は、添加物（Ｎ２サプリメント等）を含む培地中で行われることが好ましい。培地中の添加物の濃度は、当業者において通常用いられる濃度範囲内で、適宜設定することができる。【０１１４】
得られた細胞が桿体視細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、桿体視細胞マーカーの発現により確認できる。桿体視細胞マーカーとしては、例えば、ロドプシン、リカバリン等が挙げられる。【０１１５】
接着培養の終了後、培養物から桿体視細胞が単離され得る。この単離は上述の視細胞前駆体又は桿体視細胞のマーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。【０１１６】
本発明の方法により得られる培養物には高頻度（含有量）で桿体視細胞が含まれる。本発明の方法により得られる細胞は、高頻度、例えば５％以上、好ましくは１０〜３０％の頻度（コロニー頻度）でロドプシン陽性である。そしてこのロドプシン陽性細胞は、リカバリンを共発現している。【０１１７】
（７．細胞培養物、及び医薬としての使用）
本発明はまた、本発明の方法により得られる細胞培養物を提供する。本発明の細胞培養物は、例えば、胚性幹細胞の浮遊凝集体、浮遊凝集体を分散処理した細胞、分散処理細胞の培養により得られる細胞などであり得る。また、本発明は、かかる細胞培養物より被検体に投与し得る程度に単離・精製された均質な細胞、例えば、網膜前駆細胞（神経網膜前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞）、視細胞前駆体、視細胞（錐体視細胞、桿体視細胞）を提供する。【０１１８】
本発明の方法により得られた細胞は、加齢性黄斑変性症、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、及び網膜剥離のような網膜疾患の治療薬、又はその他の原因による網膜細胞損傷状態において当該細胞を補充するためなどに用いることができる。【０１１９】
また、本発明の方法により得られた細胞を、網膜疾患の治療薬として用いる場合、当該細胞の純度を高めた後に被検体に移植することが好ましい。【０１２０】
細胞の純度を高める方法は、公知となっている細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、例えば、フローサイトメーターを用いる方法（例えば、Antibodies- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)、Int. Immunol., 10, 275 (1998)参照）、パニング法（例えば、Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)、Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1996)、J. Immunol., 141, 2797 (1988)参照）、ショ糖濃度の密度差を利用する細胞分画法（例えば、組織培養の技術（第三版），朝倉書店（１９９６）参照）が挙げられる。【０１２１】
また、移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、体細胞の核を核移植した胚性幹細胞、又は染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を用いることで当該問題を克服できる。【０１２２】
また、体細胞の核を核移植した胚性幹細胞を用いて分化誘導することで、体細胞を提供した個体の細胞、例えば視細胞を得ることができる。このような個体の細胞は、その細胞自身が移植医療として有効のみならず、既存の薬物がその個体に有効か否かを判断する診断材料としても有用である。【０１２３】
胚性幹細胞から分化誘導された細胞、例えば視細胞は、自体公知の方法により、患者の疾患部位に移植できる（例えば、Arch Ophthalmol. 122, 1159-1165 (2004)参照）。【０１２４】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０１２５】
〔実施例１〕
方法
細胞培養
マウスＥＳ細胞維持及びＳＦＥＢ条件での分化の方法については以前に既述した（参考文献Ａ７、２０）。ＳＦＥＢ／ＤＬＦＡ法のため、Ｄｋｋ１（R & D Systems、１００ｎｇ／ｍｌ、０−５日の間）、ＬｅｆｔｙＡ（R & D Systems、５００ｎｇ／ｍｌ、０−５日の間）、５％  ＦＣＳ（JRH Biosciences、３−５日の間）、及びＡｃｔｉｖｉｎ−Ａ（R & D Systems、１０ｎｇ／ｍｌ、４−５日の間）が、分化用培地（Ｇ−ＭＥＭ、５％  ＫＳＲ、０．１ｍＭ  非必須アミノ酸、１ｍＭ  ピルビン酸、及び０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）（参考文献Ａ６）に添加された。
ＦＡＣＳのため（下記参照）、９日目まで、分化用培地中、懸濁培養下で細胞凝集体をインキュベートした。ＦＡＣＳ後、１−２ｘ１０４個のソートされた細胞を１０％ＦＣＳを含む分化用培地中に再懸濁し、再凝集ペレットを作るため８００ｇにて１０分間遠心した。３７℃にて１時間の培養後、ｃｍ２あたり３−５個の再凝集ペレットを、ポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／ファイブロネクチンでコートされた培養スライド上に、１０％ＦＣＳが添加された分化用培地と共に再度播種した。１０日目に、培養培地を、ＦＣＳを含まず、ガンマセクレターゼ阻害剤Ｎ−［Ｎ−（３，５−ジフルオロフェンアセチル）−Ｌ−アラニル］−Ｓ−フェニルグリシン  ｔ−ブチルエステル（ＤＡＰＴ、１０μＭ、Calbiochem）を含むか又は含まない分化用培地に変えた。
視細胞分化のため、１６日目に、培地を図３ａに示した因子を含む網膜培養培地（６６％  Ｅ−ＭＥＭ−ＨＥＰＥＳ（Sigma M7278）、３３％  ＨＢＳＳ（Gibco 24020-117）、１％  Ｎ２を添加したＦＣＳ、５．７５ｍｇ／ｍｌ  グルコース、２００μＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（Gibco））に変えた。ａＦＧＦ（R & D Systems）及びｂＦＧＦ（R & D Systems）は分化１６−２４日の間添加し、タウリン（Sigma）、ｓｈｈ（R & D Systems）、及びＲＡ（Sigma）は分化１６−２８日の間添加した。培地は２日おきに交換した。
ＢｒｄＵの取り込みは、固定前２４時間、５μｇ／ｍｌ  ＢｒｄＵを含む培地中で細胞を培養することにより調べられた。【０１２６】
ＦＡＣＳ試験
９日目に、ＳＦＥＢ／ＤＬＦＡ処理されたＥＳ細胞凝集体をトリプシン（０．２５％、Invitrogen）及びＤＮａｓｅＩ（１０μｇ／ｍｌ、Sigma）でシングルセルに分散した。中和後、以前既述したように（参考文献Ａ７、２１）細胞を０．１％ＢＳＡ及び５μｇ／ｍｌプロピジウムイオダイド（ＰＩ、Sigma）を含むＨＢＳＳ中に再懸濁し、セルストレーナー（BD）を通した。細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（BD Biosciences）でカウント及びソートし、データをＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェア（BD Biosciences）で解析した。死細胞を前方及び側方散乱のゲーティング並びにＰＩ染色で排除した。Ｒｘ−ＧＦＰ蛍光を有する細胞（バンドパスフィルター：ＦＩＴＣ、５３０ｎｍ）をソートし、更に培養した。【０１２７】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＴ−ＰＣＲ解析を以前既述したように実施した（参考文献Ａ７、２０）。使用したプライマーは以下の通り：
Notch1（参考文献Ａ２２）
forward: 5’-TGCCTGTGCACACCATTCTGC-3’（配列番号：１）
reverse: 5’-CAATCAGAGATGTTGGAATGC-3’（配列番号：２）
Notch2（参考文献Ａ２２）
forward: 5’-ATGCACCATGACATCGTTCG-3’（配列番号：３）
reverse: 5’-GATAGAGTCACTGAGCTCTCG-3’（配列番号：４）
Notch3（参考文献Ａ２２）
forward: 5’-TTGGTCTGCTCAATCCTGTAGC-3’（配列番号：５）
reverse: 5’-TGGCATTGGTAGCAGTTGCTG-3’（配列番号：６）
Notch4 （参考文献Ａ２２）
forward: 5’-AAGCGACACGTACGAGTCTGG-3’（配列番号：７）
reverse: 5’-ATAGTTGCCAGCTACTTGTGG-3’（配列番号：８）
Hes1 （参考文献Ａ２２）
forward: 5’-TCTACACCAGCAACAGTGG-3’（配列番号：９）
reverse: 5’-TCAAACATCTTTGGCATCAC-3’（配列番号：１０）
Hes5 （参考文献Ａ２２）
forward: 5’-AAGTGACTTCTGCGAAGTTCC-3’（配列番号：１１）
reverse: 5’-AAGGCCATGTGGACCTTGAGG-3’ （配列番号：１２）
Hey1 （参考文献Ａ２３）
forward: 5’-TCGAGAAGCGCCGACGAGACCGA-3’ （配列番号：１３）
reverse: 5’-CAGCAGAGGGTGTGCGATGTGTGGGT-3’ （配列番号：１４）
gnat1
forward: 5’-GAGCTTAACATGCGACGTGA-3’ （配列番号：１５）
reverse: 5’-GCTGCTGTAGGTCCAAGAGG-3’ （配列番号：１６）
pde6b
forward: 5’-CATGAATGGCAAAGATGTCG-3’ （配列番号：１７）
reverse: 5’-GTGTTCGTGGGCCTGAGTAT-3’ （配列番号：１８）
pde6c
forward: 5’-GAGGTCCTTGCTGTGGTCAT-3’ （配列番号：１９）
reverse: 5’-CCTTGTGAAACTGTCGCTCA-3’ （配列番号：２０）
cnga1
forward: 5’-GAGCAAGGCCGATGATAAAA-3’ （配列番号：２１）
reverse: 5’-TCACTAGCAGCCCTTGTTCC-3’ （配列番号：２２）
sag
forward: 5’-GTCCTCACCCAACTCCAAGA-3’ （配列番号：２３）
reverse: 5’-GTTGTTGGTCACGGTCACAG-3’ （配列番号：２４）
arr3
forward: 5’-GTCCTTGTTGACCCCGAGTA-3’ （配列番号：２５）
reverse: 5’-CTGCACTTTCCGTACAACCA-3’ （配列番号：２６）
Grk1
forward: 5’-CTGCATCAGAGACGCATTGT-3’ （配列番号：２７）
reverse: 5’-TCTCCAACAGCTGCTCACAG-3’ （配列番号：２８）
pdc
forward: 5’-CACACAGGACCCAAAGGAGT-3’ （配列番号：２９）
reverse: 5’-TCTGCTCCTTCTCGATGGTT-3’ （配列番号：３０）
rdh12
forward: 5’-GGCCAATCTGCTCTTCACTC-3’ （配列番号：３１）
reverse: 5’-TGAAAAGGCTCTGGTCTTCG-3’ （配列番号：３２）
rbp3
forward: 5’-TTCCCTCCCCAGAAGTCTTT-3’ （配列番号：３３）
reverse: 5’-GGATGGCTACGCTCTTCTTG-3’ （配列番号：３４）
rp1h
forward: 5’-CGAAGCCTTTCTGCAGTACC-3’ （配列番号：３５）
reverse: 5’-AGGGAATCAGTCTGGGGTCT-3’ （配列番号：３６）
rpgrip1
forward: 5’-CAGACTACCGACAGCGATGA -3’ （配列番号：３７）
reverse: 5’-TTGGTTTCCTCAGGGACATC -3’ （配列番号：３８）【０１２８】
免疫組織染色及び統計学的解析
免疫組織染色を以前既述したように行った（参考文献Ａ２０、２４）。本試験において用いられた一次抗体は以下の通り：
抗Crx (ラット/ポリクローナル/1:200, 参考文献Ａ６)、
抗Ki67 (マウス/モノクローナル/1:200/BD)、
抗BrdU (マウス/モノクローナル/1:50/BD)、
抗活性カスパーゼ-3 (ウサギ/モノクローナル/1:500/BD)、
抗赤/緑オプシン (ウサギ/ポリクローナル/1:1000/Chemicon)、
抗青オプシン (ウサギ/ポリクローナル/1:500/Chemicon)、
抗ロドプシン (RetP1; マウス/モノクローナル/1:1000/SIGMA)及び
抗リカバリン (ウサギ/ポリクローナル/1:5000/Chemicon)。
各抗体の免疫反応性は、同一の条件下で、陽性コントロールとして適切な網膜組織を免疫染色することにより確認した。全細胞数は、TOTO-3又はDAPI (Molecular Probes)により染色された核をカウントすることにより決定した。陽性細胞の数は、共焦点(Leica)又はApoTome (Zeiss)顕微鏡により作成した光学切片イメージ中でカウントした。
統計学的解析のため、各試験において少なくとも２５００個の細胞について検討し、各試験を少なくとも３回行った。全ての統計学的解析は、GraphPad InStat version 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)を用いて行った。統計学的有意差は、図１ｆの試験については一元配置分散分析 (ANOVA)それに続くTukey’s testにより、図３ｂの試験についてはone-way ANOVAそれに続くDunnett’s多重比較検定により、図１ｊ−ｌの試験については、two-way ANOVAそれに続くBonferroni検定により、決定した。５％を下回る危険率を有意と判断した。【０１２９】
結果
本研究において、本発明者らは、網膜前駆細胞の視細胞系列への分化を促進する誘導条件を検索した。神経網膜前駆細胞は、眼野（eye field）の特定のために必須なＲｘを発現している（参考文献Ａ８、９）。ＧＦＰがＲｘローカスにノックインされたマウスレポーターＥＳ株(W.T. and Y.S)を用いて、本発明者らは、まず、Ｒｘ＋網膜前駆細胞が濃縮された細胞集団を精製した（図１ａ−ｃ）。ＥＳ細胞をＳＦＥＢ／ＤＬＦＡ条件下で９日間培養し、シングルセルにまで分離し、ＦＡＣＳでソートした（図１ａ）。本発明者らの以前の報告（参考文献Ａ６）と一致して、９日目において、ＳＦＥＢ／ＤＬＦＡ処理されたＥＳ細胞の１５％がＲｘ−ＧＦＰ＋であった（図１ｂ）。シングルソート後、９０％を上回る細胞がＧＦＰ＋であった（図１ｃ）。以前の報告（参考文献Ａ６）と一致して、免疫染色により、ソートされた細胞のほとんどがＲｘ＋で、それらのうちの多くがＰａｘ６＋であることが示された（データ示さず）。【０１３０】
本発明者らは、次に、ソートされた細胞がインビトロにおいて視細胞に分化するかどうか試験した。ソート後、本発明者らは遠心分離により再凝集ペレットをつくり、ペレット状の細胞をポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／ファイブロネクチン−コートしたディッシュ上に再度播いた（図１ｅ）。分化用培地中での１１日間の培養後（即ち、分化２０日目）、比較的小さな細胞集団（７．８±２．６％）が、視細胞系列の運命決定因子である（参考文献Ａ１０、１１）Ｃｒｘについて陽性となった（図１ｆ、レーン１）。このことは２つの事実を示す。第１に、精製されたＲｘ＋細胞は、視細胞前駆体へ分化する能力を有する。第２に、これらのＲｘ＋細胞は、「効率的な」視細胞分化のためには、この培養物中にはない何らかの促進シグナルを要する。【０１３１】
このことを考慮し、本発明者らは、この工程におけるガンマセクレターゼ阻害による効果について検討した。本発明者らが組織培養を用いて平行して行った研究において、胚性網膜組織をガンマセクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（１０μＭ、参考文献Ａ１５及び１６参照）で処理することにより、Ｃｒｘ＋視細胞前駆体の割合が大いに増加し、分化抑制因子Ｈｅｓ１及びＨｅｓ５の発現が抑制されることが認められた（図４）。ＲＴ−ＰＣＲ解析により、精製Ｒｘ＋細胞がＮｏｔｃｈ（Ｎｏｔｃｈ１−４）、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５及びＨｅｙ１を発現していることが示され（図１ｄ）、Ｎｏｔｃｈシグナリングの構成因子が精製されたＥＳ由来Ｒｘ＋細胞中に存在することが示された。本発明者らは、これらの細胞をＤＡＰＴで処理することにより、これらの細胞に対するＮｏｔｃｈ阻害の効果を調べた。ＦＡＣＳにより細胞を精製し、再凝集ペレットとして播種した後、１０μＭ  ＤＡＰＴを含む、又は含まない分化用培地中で、ＥＳ由来神経網膜前駆細胞を培養した（図５a）。ＤＡＰＴ処理により、Ｃｒｘ＋細胞凝集体の頻度が有意に上昇し、ＤＡＰＴ処理は１０−２０日にしたときに最も効果的であった（図５ｂ及び図１ｅ）。細胞レベルでは、これらの条件下で、２０日目において、精製したＲｘ−ＧＦＰ＋細胞の２２．４±２．９％が、Ｃｒｘ＋視細胞前駆体に分化した（図１ｆ、レーン２、図１ｇ、ｈ）。ＦＡＣＳソートしていないＥＳ細胞由来神経網膜前駆細胞をＤＡＰＴ処理した場合には、明確なＣｒｘ＋視細胞前駆細胞への分化の促進は認められなかった。対照的に、Ｒｘ−ＧＦＰ−細胞はＣｒｘを発現しなかった（図１ｆ、レーン３）。これらの結果は、ガンマセクレターゼ阻害剤が、ＦＡＣＳ精製した網膜前駆細胞のＣｒｘ＋視細胞前駆体へのインビトロでの分化を促進することを示す。従って、ＥＳ由来網膜前駆細胞からの視細胞前駆体の効率的な創生が、胚性網膜組織との共培養をすることなく達成された。【０１３２】
視細胞前駆体は、細胞周期を脱した直後にＣｒｘを発現する。これと一致して、ＥＳ由来Ｃｒｘ＋細胞は、有糸分裂マーカーＫｉ６７が陰性であり（図１ｉ）、これらの細胞は有糸分裂後であることが示された。本発明者らは、次に、分化１１−２０日の間の精製Ｒｘ＋細胞における、Ｋｉ６７発現（図１ｊ）及びＢｒｄＵ取り込み（２４時間）（図１ｋ）に対するＤＡＰＴの効果を解析した。１４日目（処理４日後）及びその後、ＤＡＰＴ処理細胞中のＫｉ６７＋細胞の集団は、非処理の細胞よりも小さかった（図１ｊ）。同様に、１４−２０日において、非処理対照と比較してより少ないＢｒｄＵ＋細胞が、ＤＡＰＴ処理された細胞中に認められた。これらのデータは、ＤＡＰＴ処理が、精製された神経網膜前駆細胞中の有糸分裂細胞の数を減少させることを示す。本発明者らは、ＤＡＰＴによる有糸分裂細胞の減少が、アポトーシスが増強されたこと（これにより有糸分裂細胞が除かれる）によるものであるのか、あるいは有糸分裂後の段階へ分化する細胞の数が増加したことによるものであるかについて検討した。１１−２０日の間、Ｋｉ６７＋有糸分裂細胞のほとんどは活性なカスパーゼ３（アポトーシス細胞のマーカー）（参考文献Ａ１７）陽性ではなかった。更に、活性なカスパーゼ陽性な細胞の集団は、ＤＡＰＴ処理された集団と非処理集団との間で有意な違いを示さなかった（１１、１２、１４、１６、１８及び２０日目において、それぞれ、０．１７±０．０４％、０．１３±０．０４％、０．１０±０．０７％、０．１０±０．０１％、０．１３±０．０２％及び０．１０±０．１５％）（図１ｌ）。逆に、ＤＡＰＴで処理した細胞は、分化１６日目にＣｒｘを発現し始め、１６−２０日の間、Ｃｒｘ＋細胞の割合は徐々に上昇した（図５ｃ）。これらの観察結果は、ガンマセクレターゼ阻害剤は、ＥＳ由来有糸分裂網膜前駆細胞を、有糸分裂後の視細胞前駆体への分化へ向かわせることを示唆する。【０１３３】
次に、本発明者らは、ＤＡＰＴを用いて効率的に創生されたＣｒｘ＋視細胞前駆体が、視色素（visual pigments）を含む視細胞へ更に分化するかどうかについて検討した。精製されたＥＳ由来Ｒｘ＋細胞を、１０日目からＤＡＰＴを含む分化用培地中で培養し、次に１６日目（Ｃｒｘ発現が始まる頃、図２ａ）にその培地を網膜分化用培地（参考文献Ａ６）に切り替えた。２８日目に、免疫染色の結果、１１．５±２．０％及び１０．７±１．６％のＥＳ由来細胞が、それぞれ、赤／緑オプシン及び青オプシン（これらは、色覚のために欠くことのできない錐体特異的色素タンパク質である）を発現していることが示された（図２ｂ、ｃ）。反対に、より少ない細胞（５．５±０．５％）が、桿体型視色素であるロドプシンを発現した（図３ｂ、レーン２）。これらの知見から、これらの条件下において、ＥＳ由来Ｃｒｘ＋視細胞前駆体が、オプシン＋錐体型視細胞に効率的に分化し、ロドプシン＋細胞へは、効率的には分化しないことが示唆された。【０１３４】
網膜変性疾患については、桿体視細胞のインビトロ創生が特に価値がある。なぜなら、ヒトの視細胞の９５％が桿体型であり、網膜色素変性症の患者においてこの細胞が主に喪失するからである。桿体分化のために条件を最適化するため、本発明者らは次に、胚性（又は新生）網膜前駆細胞からの桿体の創生にポジティブな効果を有すると報告されている（参考文献Ａ１８）幾つかの可溶性因子を試験した。ＦＡＣＳ精製及びＤＡＰＴ処理の後、各因子を、まず、それぞれ網膜培養培地に加えた（図３ａ）。これらのうち、酸性FGF（５０ｎｇ／ｍｌ）、塩基性FGF（１０ｎｇ／ｍｌ）、タウリン（１ｍＭ）、ｓｈｈ（３ｎＭ）及びレチノイン酸（ＲＡ、５００ｎＭ）が、桿体分化を促進した（図３ｂ、レーン３−７；処理期間は方法の項に記載）。特に、これらの因子を組み合わせると、多くの数の細胞（全細胞の１７．２±１．８％）がロドプシンを発現した（図３ｂ、レーン８、図３ｃ、ｄ）。これらのロドプシン＋細胞は、視細胞マーカーであるリカバリン（recoverin）（参考文献Ａ１９）を共発現していた（図３ｅ）。これらの知見から、FGF、タウリン、ｓｈｈ、及びＲＡによる組み合わせ処理が、ＥＳ由来で、ＤＡＰＴにより誘導された視細胞前駆体のロドプシン＋／リカバリン＋桿体視細胞への分化を強力に促進することが示された。ロドプシン＋細胞とは対照的に、ＦＧＦ、タウリン、ｓｈｈ及び／又はＲＡ処理（個別に又は組み合わせて）により、赤／緑オプシン＋細胞の割合も、青オプシン＋細胞の割合も上昇せず、上述の因子に対する反応は、錐体細胞と桿体細胞との間で異なることが示唆された。従って、定まった可溶性因子による段階的処理を用いることにより、インビトロで、ＥＳ細胞から、錐体及び桿体視細胞を、効率的且つ選択的に創生することができる。【０１３５】
本発明者らのものも含め、以前の報告（参考文献Ａ４−６）は、ＥＳ由来前駆細胞からの桿体視細胞の創生は、発生過程の網膜組織と共培養しない限り、頻度が低いことを立証している。本発明者らの報告において（参考文献Ａ６）、本発明者らは、ソーティングせずに、外来性因子（FGF、タウリン、ｓｈｈ、及び／ＲＡ）のＳＦＥＢ／ＤＬＦＡ処理された細胞への効果を調べたが、ソーティング及びＤＡＰＴ処理後の細胞に対してはこれらの因子が明らかな効果を有する（図３ｂ）のとは対照的に、ロドプシン＋視細胞分化に対する明らかにポジティブな効果を認めることはできなかった。【０１３６】
本研究における1つの重要な知見は、ＦＡＣＳ精製したＲｘ＋細胞は、かなりの期間にわたり有糸分裂性であるということである（図１ｊ、ｋ）。これは、さらなる研究のために精製された神経網膜前駆細胞を使用する前に、その細胞の数を増やし得る可能性を生じさせる。このことは、将来的な移植研究や、視細胞の分化や生存を促進する因子のスクリーニングにおいて、この系の大きなアドバンテージとなるであろう。【０１３７】
最後に、今回の研究は、ＥＳ細胞を難治性の網膜疾患の治療のための再生医療に適用するための実質的な実験的基礎を提供する。将来の重要な目標は、網膜（又は視細胞）前駆体を、網膜変性モデル動物の網膜中に移植することにより、視力をレスキューすることである。予備的な試験において、ラットの網膜下への移植の２週間後に、ソートされたＲｘ−ＧＦＰ＋細胞は網膜中で生存し、ロドプシンを発現し、外顆粒層内に統合された（図６ａ、ｂ）。【０１３８】
〔実施例２〕
方法
未分化サルＥＳ細胞の管理
カニクイザルＥＳ細胞の２つの別個の細胞系（ＣＭＫ６及びＣＭＫ９）を以前に記載されたようにして維持した（参考文献Ｂ２６、２８、２９）。要約すれば、未分化のＥＳ細胞をマイトマイシンＣ処理したマウス胚線維芽細胞（ＳＴＯ細胞）のフィーダー層上で維持した。ＳＴＯ細胞は、１０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ(Wako, Osaka, Japan)で２時間インキュベートしてゼラチンコートしたディッシュに撒いた。未分化のサルＥＳ細胞を、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール(Sigma)、０．１ｍＭ非必須アミノ酸(Sigma)、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Sigma)、２０％ノックアウト血清リプレースメント（knockout serum replacement）(KSR; Lot.1139720及び1219101, GIBCO)、１，０００単位／ｍｌ白血病抑制因子(ESGRO; Chemicon, Temecula, CA)及び４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２(Sigma, St. Louis, MO)中でインキュベートした。ＥＳ細胞を０．２５％トリプシン(GIBCO)（１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２０％ＫＳＲを加えたＰＢＳ中）を用いて３日毎に継代した。本研究に用いたサルＥＳ細胞系は高い核／細胞質比を示す各細胞とともにきっちり詰め込まれたコロニーを形成した。これらの細胞は、Ｏｃｔ−３／４（参考文献Ｂ３０）及びＮａｎｏｇ（参考文献Ｂ３１、３２）等の未分化ＥＳ細胞のマーカーを発現したが、１年以上培養を続けてもネスチン、βＩＩＩ−チューブリン及び微小管関連タンパク質−２（ａ＋ｂ）等の汎神経マーカーを発現しなかった。従って、これらのＥＳ細胞は本発明者らの培養では未分化のままであった。【０１３９】
サルＥＳ細胞の網膜細胞への分化
ＥＳのコロニーを０．２５％トリプシン（１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２０％ＫＳＲ含有ＰＢＳ中）で部分的に解離し凝集体（塊１つあたり５〜１０細胞）にした。このＥＳ細胞の凝集体が大きすぎる（例えば１つの凝集塊あたり細胞５０個を超える場合）と神経誘導の効率が低くなったことは注目すべきことである。シングルセルにまで分散したＥＳ細胞を使用すると、細胞の生存率が低下してしまい、効率的に網膜細胞を誘導できなかった。ＥＳ凝集体をゼラチンコートしたディッシュ上で３０分間インキュベーションすることによってＳＴＯフィーダーを取り除いた。１ｍｌあたり６．７×１０３凝集体の密度でＥＳ凝集体を、ＥＳ分化用培地を用いて細菌グレードのディッシュに播種した。分化用培地の組成は以下の通り。［Ｇ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）、１０％ＫＳＲ, Ｌｏｔ．１１３９７２０及び１２１９１０１、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸塩及び０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール］。組換えＤｋｋ−１タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＬｅｆｔｙ−Ａタンパク質（５００ｎｇ／ｍｌ；R&D Systems, Minneapolis, MN)を１８日間の浮遊培養の間分化用培地に添加した。その後、自然に形成したＥＳ細胞の凝集物をまとめてｃｍ２あたり２０〜１５の凝集物という密度で、ポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／ファイブロネクチンコートされた８ウェルの培養スライドに再度撒いた。
視細胞を産生するには、ＳＦＥＢ／ＤＬ処理した分化した細胞をさらにＲＡ／Ｔ／Ｎ２培地（ＧＭＥＭ＋５％ＫＳＲ＋Ｎ２サプリメント(GIBCO)＋レチノイン酸（１μＭ，Sigma）＋タウリン（１００μＭ，Sigma）＋ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ））で少なくとも３０日間さらにインキュベートした。【０１４０】
未分化ヒトＥＳ細胞の管理
ヒトＥＳ細胞はN. NakatsujiとH. Suemori (Kyoto University)から供与され、日本政府のヒトＥＳ細胞ガイドラインに従って使用した。これらの別個のヒトＥＳ細胞系（ｋｈＥＳ−１、ｋｈＥＳ−２、及びｋｈＥＳ−３）は以前に記載された（参考文献Ｂ３３）ようにして維持した。要約すれば、未分化のヒトＥＳ細胞をマイトマイシンＣで処理したマウス胚線維芽細胞(Oriental Yeast, Tokyo, Japan)のフィーダー層上で維持した。ヒトＥＳ細胞を０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０％ＫＳＲ（Lot.1219101）及び４ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞増殖因子（Upstate Biotechnology）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２中、２％ＣＯ２及び９８％空気の加湿雰囲気下、３７℃で維持した。ＥＳ細胞を０．２５％トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ(GIBCO)（１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２０％ＫＳＲ含有ＰＢＳ中）を用いて３〜４日毎に継代した。このヒトＥＳ細胞系は、未分化ＥＳ細胞のマーカーであるＯｃｔ−３／４及びＮａｎｏｇを発現した。これらのヒトＥＳ細胞は、ネスチン、βＩＩＩ−チューブリン及び微小管関連タンパク質−２（ａ＋ｂ）等の汎神経マーカーに免疫陰性であり、これは本発明者らの培養で未分化のままのヒトＥＳ細胞に一致した。【０１４１】
ヒトＥＳ細胞の網膜細胞への分化
ＥＳのコロニーを０．２５％トリプシン及び０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶ（１ｍＭ  ＣａＣｌ２及び２０％ＫＳＲ(Lot. 1219101)含有ＰＢＳ中）で処理し、ついで穏やかにほぐすことによって部分的に解離し凝集体（塊１つあたり５〜１０細胞）にした。２０％ＫＳＲ含有ＥＳ分化用培地［Ｇ−ＭＥＭ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭピルビン酸塩及び０．１ｍM  ２−メルカプトエタノール］中、１ｍｌあたり６．７×１０３ＥＳ凝集体の密度で、ＥＳ凝集体を、ゼラチンコートしたディッシュ上で１日培養した。浮遊培養で１日後、浮遊しているＥＳ凝集物を細菌グレードのディッシュ上で２０％ＫＳＲ含有ＥＳ分化用培地で４日間、次いで１５％ＫＳＲ含有ＥＳ分化用培地で８日間、そしてその後１０％ＫＳＲ含有ＥＳ分化用培地で６日間インキュベートした。浮遊培養している２０日間、Ｄｋｋ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）及びＬｅｆｔｙ−Ａ（５００ｎｇ／ｍｌ)を分化用培地に添加した。ＥＳ細胞凝集物をまとめてｃｍ２あたり１０〜２０の凝集物という密度で、ポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／ファイブロネクチンコートされた培養スライド上に再度撒いた。接着培養では、１０％ＫＳＲ含有ＥＳ分化用培地中で細胞をインキュベートした。
視細胞を産生するには、ＳＦＥＢ／ＤＬ処理したＥＳ細胞をＲＡ／Ｔ／Ｎ２培地（ＧＭＥＭ＋５％ＫＳＲ＋レチノイン酸（１μＭ）＋タウリン（１００μＭ）＋Ｎ２サプリメント＋ペニシリン（１００単位／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ））で少なくとも３０日間インキュベートした。培地は一日おきに交換した。分化効率は細胞系によって様々であったが、３つの個別のヒトＥＳ細胞（ｋｈＥＳ１、ｋｈＥＳ２及びｋｈＥＳ３）において、この方法で網膜細胞への分化が誘導されることが確認された。【０１４２】
免疫細胞化学
細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、以前に記載した（参考文献Ｂ９、３３、３４）ようにして免疫標識した。
一次抗体及びその使用希釈濃度は以下の通りである：
マウス抗βＩＩＩチューブリン(1:500, Sigma)
ラット抗Ｃｒｘ(1:200)（参考文献Ｂ９）
マウス抗微小管関連タンパク質−２（ａ+ｂ）(1:500, Sigma)
マウス抗Ｍｉｔｆ(1:30, abcam)
ウサギ抗Ｎａｎｏｇ(1:1000, ReproCELL)
ウサギ抗ネスチン(1:1000, Covance)
マウス抗Ｏｃｔ３／４(1:200, BD pharmingen)
ウサギ抗Ｐａｘ６(1:600, Covance)
マウス抗Ｐａｘ６(1:200, DSHB)
抗ＰＫＣ(sigma)
ウサギ抗リカバリン(1:3000, chemicon)
マウス抗ロドプシン(RET-P1, 1:2000, Sigma)
ラビット抗ＲＰＥ６５(1:1000)
ウサギ抗Ｒｘ(1: 200)（参考文献Ｂ９）
ラビット抗ＺＯ−１(1:100, Zymed)
二次抗体は以下のものを用いた：
それぞれＣｙ３又はＦＩＴＣとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体、抗ウサギＩｇＧ抗体、抗ラットＩｇＧ抗体(1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)Ｆ−アクチンはＡｌｅｘａ４８８をコンジュゲートしたファロイジン(Molecular Probes)で染色した。細胞核は４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール(ＤＡＰＩ、１μｇ／ｍｌ、Molecular Probes) 又はＴＯＴＯ−３(Molecular Probes)で対比染色した。標識化された細胞をレーザー走査共焦点顕微鏡(Leica) 及びアポトーム(Zeiss)で画像化した。【０１４３】
電子顕微鏡解析
細胞を２％グルタルアルデヒド／０．１Ｍ  ＰＢで１０分間固定し、１％酸化オスミウム（０．１Ｍ  ＰＢ、ｐＨ７．３）で後固定し、エタノール系列（５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９．５％及び１００％）で処理することにより脱水し、そしてエポキシ樹脂に包埋した。これらのサンプルから、ウルトラミクロトームで超薄切片を切り出し酢酸ウランとクエン酸鉛で染色し、次いで電子顕微鏡で画像化した。【０１４４】
ＲＴ−ＰＣＲ
実施例１と同様に、以下のヒト遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲ解析により調べた。使用したプライマーは以下の通り：
transducin alpha1
(Guanine nucleotide-binding protein alpha 1 subunit (GNAT1))
forward: 5’-CATCGAGACGCAGTTCTCCT-3’ （配列番号：３９）
reverse: 5’-AGTAGCGGTGGTTGCAGATG-3’ （配列番号：４０）
phosducin (PDC)
forward: 5’-TCAAAGGAACGAGTCAGCAG-3’ （配列番号：４１）
reverse: 5’-CTGCTGCAAGGCATGTTAAA-3’ （配列番号：４２）
phosphodiesterase 6b (PDE6b)
forward: 5’-CAGTGATGAACACCGACACC-3’ （配列番号：４３）
reverse: 5’-ATTTGACCAGGTCCAGTTCG-3’ （配列番号：４４）
PDE6c
forward: 5’-CTGAGGTGGCCTCTAGGTTG-3’ （配列番号：４５）
reverse: 5’-GCTGGTGTGATGAAGCCTTAG-3’ （配列番号：４６）
cGMP-gated channel alpha1 (CNGA1)
forward: 5’-GATCCCTCGGGAAACACATA-3’ （配列番号：４７）
reverse: 5’-CGAGAGAACCGTAACAACCTGG-3’ （配列番号：４８）
rhodopsin kinase (GRK1)
forward: 5’-GGACTGGTTCCTGGACTTCA-3’ （配列番号：４９）
reverse: 5’-AAGCCAGGGTTCTCCTCATT-3’ （配列番号：５０）
arrestin (S-antigen, SAG)
forward: 5’-GGTGTTGTCCTGGTTGATCC-3’ （配列番号：５１）
reverse: 5’-TCAGCGTCTTGGTCAAAGTG-3’ （配列番号：５２）
arrestin3 (ARR3)
forward: 5’-GGTGTTGTCCTGGTTGATCC-3’ （配列番号：５３）
reverse: 5’-GTCACAGAACAGGGCAGGTT-3’ （配列番号：５４）
retinol dehydrogenase 12 (RDH12)
forward: 5’-CTTCTCCCCCTTTGTCAAGA-3’ （配列番号：５５）
reverse: 5’-CTTTAGGGTTGGCCTTCTCC-3’ （配列番号：５６）
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)
forward: 5’-GCCTCTAGGTTGCTGGATGT-3’ （配列番号：５７）
reverse: 5’-GCTGGTGTGATGAAGCCTTAG-3’ （配列番号：５８）【０１４５】
統計的分析
値は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表示した。統計的分析のために、各実験について１００〜２００のコロニーを調べ、各実験を少なくとも３回実施した。統計的分析は全て、GraphPad InStat version 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)を用いて行った。図７ｂの実験に対しては、統計的有意差は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）それに続くダネット検定によって行った。図８ａ、ｄ、ｅ、ｈ及びｉから得られたデータは対応のないｔ検定によって評価した。確立値５％未満を有意差ありと判断した。【０１４６】
結果
まず、ＳＦＥＢ（serum-free floating culture of embryoid body-like aggregates）法を改良し、マウスＥＳ細胞と同様の方法でサルＥＳ細胞から網膜前駆細胞が産生されるかどうかを調べた（参考文献Ｂ９、１１）。サルＥＳ細胞を解離して、５〜１０細胞の小塊とし、ペトリ皿に播種し、分化用培地で浮遊培養した（「方法」の項参照）。これらの条件下で、サルＥＳ細胞は胚葉体様の凝集体を形成した。１８日目で、これらの凝集体をポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／ファイブロネクチンをコートしたスライド上に置いた。脊椎動物では、眼胞は神経網膜（内層）及び網膜色素上皮（ＲＰＥ、外層）へと進化する。神経網膜前駆細胞がＲｘを発現する（参考文献Ｂ８、１２、１３）一方で、予定（presumptive）ＲＰＥはＭｉｔｆを発現する（参考文献Ｂ９、１４−１６）（図７ａ）。従って、ＳＦＥＢ処理したＥＳ細胞がこれら２つのマーカーを発現したかどうかを調べた。ＳＦＥＢ培養４０日目でほんの少しのコロニーがＭｉｔｆ陽性であったことが免疫染色からわかった（〜１０％、図７ｂ）。マウスＥＳ細胞からＭｉｔｆ＋細胞の形成を効率的に誘導する培養条件を同定するために、ＳＦＥＢ培養しているＭｉｔｆ＋コロニーの数における可溶性因子の影響を調べた。ＷｎｔアンタゴニストであるＤｋｋ−１、及びｎｏｄａｌアンタゴニストであるＬｅｆｔｙ−Ａは両方ともマウスＥＳ細胞からのＲｘ＋網膜前駆細胞への分化を促進する（参考文献Ｂ９）。Ｄｋｋ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＬｅｆｔｙ−Ａ（５００ｎｇ／ｍｌ）で処理すると、Ｍｉｔｆ＋コロニーが、それぞれ、３５．３±４．４％、及び５０．８±５．０％に増加した（図７ｂ）。Ｄｋｋ−１及びＬｅｆｔｙ−Ａを両方添加して１６日間培養すると（以後、ＳＦＥＢ／ＤＬ培養と称する）、Ｌｅｆｔｙ−Ａ単独投与の場合の結果を超えるわずかな向上が見られた（全コロニーの５４．６±４．２％、図７ｂ、ｃ）。ＳＦＥＢ／ＤＬ培養することによって誘導されたＭｉｔｆ＋細胞はＰａｘ６（９０％、図７ｄ）を共発現していた。この結果は、胚のＲＰＥのインビボマーカーのプロファイルと一致している（参考文献Ｂ９、１４−１６）。【０１４７】
サルＥＳ細胞のＳＦＥＢ／ＤＬ培養において、４０日目で色素沈着した細胞が光学顕微鏡下に認められた（図７ｅ）。この後、これらの細胞はさらに色素沈着がすすみ、扁平状の様相を呈する多角形の形態を示した（図７ｆ）。ファロイジンを用いたＦアクチン染色により、これらの色素沈着細胞中に、ＲＰＥに特徴的な多角形のアクチン束（参考文献Ｂ１７）が形成されているのがわかった（図７ｇ）。９０日目では、色素沈着細胞は、成熟したＲＰＥのマーカーとなるＲＰＥ−６５を発現し（図７ｈ）、タイトジャンクションのマーカーとなるＺＯ−１を発現した（図７ｉ）。これらの結果から、本発明者らは、サルＥＳ細胞由来の色素細胞は成熟ＲＰＥの典型的な特徴を有している、と結論づけている。【０１４８】
次いで、ＳＦＥＢ／ＤＬ条件下でのサルＥＳ細胞からの神経網膜前駆細胞の産生について調べた。培養３０日目で、ＳＦＥＢ／ＤＬ処理したコロニーでは４２．５±５．４％がＲｘを発現していた。一方ＳＦＥＢ処理したコロニーでは１７．５±３．１％がＲｘに免疫陽性であった（図８ａ、ｂ）。ＳＦＥＢ／ＤＬ培養したＲｘ＋細胞のほとんどはＰａｘ６＋であった（図８ｃ）。このことは神経網膜前駆細胞のマーカープロファイルに一致している。誘導されたＲｘ+細胞は、しばしば、Ｍｉｔｆ＋細胞クラスターに極めて近接して見られた。同様の観察が誘導したマウスＥＳ細胞についても見られた（参考文献Ｂ９）。ＳＦＥＢ／ＤＬ処理により霊長類のＥＳ細胞が網膜前駆細胞の特徴を有する細胞へと分化誘導される。【０１４９】
続いて、サルＥＳ細胞の視細胞へのインビトロでの分化を調べた。胎児では、網膜の発生過程で、視細胞前駆体はＣｒｘを発現している（参考文献Ｂ１８、１９）。ＳＦＥＢ培養９０日後では、わずか６．７±３．１％のコロニーしかＣｒｘを発現していなかった（図８ｄ）。対照的に、ＳＦＥＢ／ＤＬ処理した場合には、より多くのＣｒｘ＋コロニーが得られた（２４．２±３．８％、図８ｄ）。レチノイン酸とタウリンは視細胞の分化を促進するので（参考文献Ｂ２０−２３）、これらのＳＦＥＢ／ＤＬ培養においてもこれらの因子が視細胞の産生を増強するのか調べた。９０日目及びそれ以降、ＳＦＥＢ／ＤＬ処理したＥＳ細胞をＲＡ（１μＭ）、タウリン（１００μＭ）及びＮ２サプリメントを含む培地（ＲＡ／Ｔ／Ｎ２培地）中でインキュベートした。１３０日目で、ＳＦＥＢ／ＤＬ＋ＲＡ／Ｔ／Ｎ２サプリメント中、２８．５±３．６％のコロニーがＣｒｘ陽性であった。厳密に言えば、Ｃｒｘ＋コロニー中の７１．０±５．４％の細胞が１３０日までにＣｒｘを発現したのに対し、ＲＡ／Ｔ／Ｎ２サプリメントがない場合には４３．２±６．３％がＣｒｘ＋であった（図８ｅ、ｆ、ｇ）。Ｃｒｘ+発現のこのような強い誘導は他のＥＳ細胞の分化系では未だ報告されていない。【０１５０】
サルＥＳ細胞が成熟した視細胞へと分化し得るのかどうかを調べるために、ＳＦＥＢ／ＤＬ培養において、視細胞のマーカーであるロドプシンの発現を調べた。ＳＦＥＢ／ＤＬ培養１３０日目では、ロドプシン陽性の細胞はこれらの培養中に明らかに存在していたが、ＳＦＥＢ培養の場合には稀にしか観察されなかった（図８ｈ）。ＲＡ／Ｔ／Ｎ２処理によりＳＦＥＢ／ＤＬ処理培養におけるロドプシン＋細胞の割合が顕著に増加した（図８ｉ、ｊ、ｋ）。これらのロドプシン＋細胞は、視細胞及び錐体双極細胞のマーカーであるリカバリンを共発現した（参考文献Ｂ２４、図８ｌ）。視細胞に加えて、これらの培養条件で、他の網膜ニューロン（ＰＫＣ＋双極細胞、ＨＰＣ＋／Ｐａｘ６＋アマクリン細胞、およびグルタミンシンターゼ＋ミューラー細胞も観察された（データ示さず）。２つの別個のＥＳ細胞系（ＣＭＫ６、ＣＭＫ９；通常のカリオタイプ）についても同様の結果が得られた（データ示さず）。これらの結果からＳＦＥＢ／ＤＬ＋ＲＡ／Ｔ／Ｎ２処理はサルＥＳ細胞から効率的に視細胞を産生させると結論付ける。【０１５１】
最後に、ヒトＥＳ細胞が網膜細胞へと分化し得るのか調べた。処理条件を幾つかの観点から改変することによって、ヒトＥＳ細胞のＳＦＥＢ／ＤＬ培養を最適化した（「方法」の項参照）。サルＥＳ細胞培養で確立した方法（図７ｊ、２ｍ）と同様にして、ヒトＥＳ細胞を細胞塊（１塊あたり５〜１０個の細胞）にまで解離し、ＷｎｔアンタゴニストであるＤｋｋ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）及びｎｏｄａｌアンタゴニストＬｅｆｔｙ−Ａ（５００ｎｇ／ｍｌ）を浮遊培養の最初の２０日間適用した。次に、ＥＳ細胞の凝集体をポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／ファイブロネクチンでコートしたスライドに再播種した。これらの条件下で、７３．８±５．５％のコロニーがネスチン陽性であった。このことはＳＦＥＢ／ＤＬ処理が、サル細胞と同様のやり方でヒトＥＳ細胞の神経分化を誘導するということと矛盾しない。【０１５２】
ＲＰＥ細胞の分化についても調べた。５０日目でＭｉｔｆ＋／Ｐａｘ６コロニーが豊富に生じていた（コロニーの３０．６±４．７％、図９ａ）。これらＳＦＥＢ／ＤＬ処理したヒトＥＳ培養では、６０日目で、扁平で六角形の形態を示す色素細胞が多く存在した（図９ｂ）。抗ＺＯ−１抗体を用いた免疫染色から、ヒトＥＳ細胞由来の色素細胞が１２０日目までにタイトジャンクションを形成することが明らかになった（図９ｃ）。ＳＦＥＢ／ＤＬによって誘導される色素沈着細胞がＲＰＥの構造的特徴を有しているかどうかを確認するために、これらの細胞の電子顕微鏡写真を調べた。ＥＳ由来の色素沈着細胞は端部の微絨毛と基底膜を伴い、二極化した（図９ｄ、ｅ、ｆ）。メラニン顆粒は、細胞質内、大部分は細胞の上端部と真ん中ぐらいの位置に多く存在していたが、底部の細胞質には含まれなかった（図９ｄ）。これらは、成熟したヒトＲＰＥの特徴である（参考文献Ｂ２５）。成熟度の異なるメラニン顆粒がこれらＥＳ細胞由来の色素沈着細胞に存在していた（図９ｇ）。タイトジャンクション及び接着結合が存在するということが電子顕微鏡によって確認された（図９ｈ、ｉ）。貪食はＲＰＥの重要な機能であり、視細胞機能の維持に必要である。そこで、本発明者らはラテックスビーズ貪食アッセイを行い、ヒトＥＳ由来の色素沈着細胞の貪食活性を決定した。電子顕微鏡により、ラテックスビーズを取り込んだ、ＳＦＥＢ／ＤＬによって誘導された色素沈着細胞が示された（図１２）。これらの知見より、ヒトＥＳ細胞はＳＦＥＢ／ＤＬ培養により典型的なＲＰＥの特徴を有する細胞へと分化する、と結論づける。【０１５３】
次に、続いてＳＦＥＢ／ＤＬ＋ＲＡ／Ｔ／Ｎ２処理することにより視細胞へと分化しうるのかを調べた。ＳＦＥＢ／ＤＬ培養したヒトＥＳ細胞からＲｘ＋／Ｐａｘ６＋神経網膜前駆細胞が産生されるか調べた。５０日目でコロニーの１３．１±２．３％がＲｘ＋／Ｐａｘ６＋であった（図９ｊ）。すなわち、ＳＦＥＢ／ＤＬ処理はヒトＥＳ細胞の神経網膜前駆細胞への分化を促進する。ＳＦＥＢ／ＤＬ処理によって誘導される網膜前駆細胞が視細胞へと分化するのかどうかを調べる為に、１２０日目で、ＲＡ／Ｔ／Ｎ２で処理した。９０日目でＣｒｘ＋の視細胞前駆細胞が観察され、１７０日目には前記の視細胞前駆体が全コロニー数の２０．０±３．５％であった（図９ｋ）。ロドプシン＋の杆体視細胞が１３０日までに存在し、２００日にはコロニーの１４．３％±４．２がロドプシン陽性であった（図９ｌ）。これらのロドプシン＋細胞はリカバリンを共発現していた（図９ｍ）。Red/green opsin+（全コロニーの21.4 ± 4.0% ) あるいはblue opsin+の錐体視細胞（全コロニーの23.9 ± 3.7% ）も観察された。更に、本発明者らはＲＴ−ＰＣＲ解析を行い、杆体及び／又は錐体における光伝達に責を負う遺伝子の発現を調べた。ＳＦＥＢ／ＤＬ及びＲＡ／Ｔ／Ｎ２処理された細胞は、トランスデュシン−アルファ（杆体）、フォスデュシン（杆体及び錐体）、ホスホジエステラーゼ（６ｂ：杆体、６ｃ：錐体）、サイクリンヌクレオチドゲーテドチャンネル（ａ１：杆体）、ロドプシンキナーゼ（ｇｒｋ−１：杆体）、アレスチンＳ抗原（杆体）アレスチン３（錐体）及びレチノールデヒドロゲナーゼ（杆体及び錐体）を１４０〜２００日目に発現していた（図１３）。これらの結果は、ヒトＥＳ細胞由来視細胞は光反応のための機能的構成要素を有することを示唆する。ヒトＥＳ細胞をＳＦＥＢ／ＤＬで処理すると効率的に網膜前駆細胞を産生し、網膜前駆細胞は、ＲＡ／Ｔ／Ｎ２培養条件で視細胞へと分化する、と結論付けられた。【０１５４】
マウスフィーダー細胞上で培養したヒトＥＳ細胞は、免疫原性のある非ヒトシアル酸をその表面に発現する（参考文献Ｂ２７）。これらの異種因子が移植後、免疫系による拒絶を引き起こすかもしれない。従って、他の動物由来の物質が混入することなく、ヒトＥＳ細胞から分化した細胞を作り出すことが、これらの移植ストラテジーの臨床への応用には不可欠である。以前の研究では、網膜前駆細胞をウシ胎児血清の存在下に誘導した（参考文献Ｂ９）。さらに、Ｌａｍｂａらはマトリゲル（マウス肉腫由来の材料で完全にキャラクタライズされておらず、異種成分が混入しているかもしれない（参考文献Ｂ１０））を用いてヒトＥＳ細胞から網膜前駆細胞を作り出している。定義づけられた培養（合成培地による培養）で視細胞への分化を報告した例はない。この点で、本明細書で延べた網膜細胞を産生する方法は、以前の報告とは決定的に異なる。この培養技術はヒトＥＳ細胞に基づく網膜細胞を相当量得ることができ、はっきりとわかっている物質のみを用いる。【０１５５】
これらのＥＳ細胞由来の網膜細胞の総合的機能解析及び移植研究には次のような２つの問題点がある。（１）純粋な視細胞、ＲＰＥ細胞あるいは前駆細胞の選別システム、（２）生じた成熟網膜細胞の長期間の培養。しかしながら、実施例１がＦＡＣＳによって純化されるマウスＥＳ細胞由来のＲｘ＋細胞における視細胞分化をガンマセクレターゼ阻害剤が劇的に促進するということ示したので、これらの問題は将来的には解決されるであろう。Ｒａｄｔｋｅらは、神経網膜組織及びＲＰＥ組織両方の移植が網膜色素変性症の患者の視覚を改善するということを立証した（参考文献Ｂ４）。つまり、ヒトＥＳ細胞由来の視細胞とＲＰＥ細胞とを組み合わせて移植することにより、より効果的な治療ストラテジーとなり得る。移植治療の効果と安全性は最も重要とされるところなので、該当動物モデルでこれらのアプローチを十分に調べることが必須である。本明細書で提示する培養システムは、サル及びヒトの両方のＥＳ細胞に効果的であるので、該システムはサルＥＳ細胞由来の視細胞及びＲＰＥ細胞を用いたサルの同種移植実験に役立つに違いない。さらに、この分化システムと得られるヒトＥＳ細胞由来細胞は、付加的な治療薬の開発やヒト中枢神経系（特に眼）の発生の理解の改善の促進に貢献するかもしれない。【０１５６】
〔実施例３〕
マウスＥＳ細胞をＳＢ−４３１５４２（０．１〜１０μＭ）及び／又はＣＫＩ−７（１〜１００μＭ）の存在下でＳＦＥＢ条件での培養に付した。培養開始５日後、細胞を回収し、新鮮な分化用培地中に再懸濁し、再凝集ペレットを作るため８００ｇにて１０分間遠心した。３７℃にて１時間の培養後、ｃｍ２あたり３−５個の再凝集ペレットを、ポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／ファイブロネクチンでコートされた培養スライド上に、分化用培地と共に再度播種した。５日間培養後、細胞を固定し、抗βＩＩチュブリン抗体で染色し、βＩＩチュブリン陽性細胞数の割合を顕微鏡下で計測した。その他の実験条件は実施例１と同様であった。【０１５７】
その結果、ＳＢ−４３１５４２又はＣＫＩ−７の添加により、βＩＩチュブリン陽性細胞数が増加した（図１０）。このことは、ＳＢ−４３１５４２及びＣＫＩ−７が、それぞれ単独でＥＳ細胞からの神経細胞分化を増強し得ることを示す。更に、ＳＢ−４３１５４２（５μＭ）及びＣＫＩ−７（３μＭ）の両方を培地に添加すると、ほとんど（９３．０±１．９％）の細胞がβＩＩチュブリン陽性になった。このことは、ＳＢ−４３１５４２とＣＫＩ−７との併用により、ＥＳ細胞からの神経細胞分化が相乗的に亢進される可能性を示唆する。【０１５８】
〔実施例４〕
マウスＥＳ細胞をＳＢ−４３１５４２（５μＭ）及びＣＫＩ−７（３μＭ）；又はＳＢ−４３１５４２（５μＭ）及びＤ４４７６（３μＭ）の存在下でＳＦＥＢ条件での培養に付した。培養開始から３日後に、培地を５％ＦＣＳを含む新鮮な分化用培地に交換した。培養開始から４〜５日後にかけてＡｃｔｉｖｉｎ−Ａ（R & D Systems、１０ｎｇ／ｍｌ）を培地に添加した。培養開始５日後、細胞を回収し、新鮮な分化用培地中に再懸濁し、再凝集ペレットを作るため８００ｇにて１０分間遠心した。３７℃にて１時間の培養後、ｃｍ２あたり３−５個の再凝集ペレットを、ポリ−Ｄ−リジン／ラミニン／ファイブロネクチンでコートされた培養スライド上に、分化用培地と共に再度播種した。３日間培養後、実施例１と同様に免疫組織染色及びＦＡＣＳによりＲｘ／Ｐａｘ６陽性細胞数を計測した。その他の実験条件は実施例１と同様であった。【０１５９】
免疫組織染色の結果、ＳＢ−４３１５４２及びＣＫＩ−７を用いた場合にも、ＤＬＦＡと同様にＲｘ＋Ｐａｘ６＋細胞が出現した。このことは、Ｌｅｆｔｙ−Ａ及びＤｋｋ１に代えてＳＢ−４３１５４２及びＣＫＩ−７を用いてもＥＳ細胞から網膜前駆細胞が誘導されることが示された。また、ＦＡＣＳ解析の結果、ＳＢ−４３１５４２及びＣＫＩ−７；又はＳＢ−４３１５４２及びＤ４４７６を用いてＥＳ細胞を培養した場合、それぞれ０．８３％及び０．７％の細胞がＲｘ陽性であった。この結果から、ＳＢ−４３１５４２とＣＫＩ−７の併用、又はＳＢ−４３１５４２とＤ４４７６の併用によってもＥＳ細胞から網膜前駆細胞への分化が誘導されることが示された。【０１６０】
〔実施例５〕
Ｌｅｆｔｙ−Ａ及びＤｋｋ１に代えて、ＳＢ−４３１５４２（５μＭ）及びＣＫＩ−７（３μＭ）を用い、実施例２と同様にして、ヒトＥＳ細胞のＲＰＥ細胞への分化について検討した。その結果、Ｌｅｆｔｙ−Ａ及びＤｋｋ１を用いた場合と同様に、培養開始から６０日後に、色素陽性コロニーが出現した（図１１）。この結果から、ＳＢ−４３１５４２とＣＫＩ−７の併用によってもヒトＥＳ細胞からのＲＰＥ細胞への分化が誘導されることが示された。【０１６１】
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【産業上の利用可能性】
【０１６３】
本発明の方法を用いれば、網膜組織と共培養することなく、ＥＳ細胞から効率的に網膜前駆細胞や視細胞を創生することができる。特に本発明の方法は、規定された（defined）培養条件のもとで、霊長類ＥＳ細胞から網膜前駆細胞や視細胞を効率的に製造することができる点で優れている。
本発明は、ヒトＥＳ細胞をベースとした、網膜疾患に対する移植療法の開発を大いに促進し得る。
本出願は、日本で出願された特願2007-009617（出願日：2007年1月18日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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