(57)【要約】  新規なA型ボツリヌス毒素製剤を提供する。乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌に由来する高度精製A型ボツリヌス毒素を有効成分として含有する神経筋伝達阻害剤、および当該毒素を有効成分として含有する筋緊張亢進疾患治療剤。特に、本製剤は、従来知られているボツリヌス毒素製剤に比較して、速効性と、少ない拡散性を有しているため、安全域が広く、筋緊張亢進疾患における局所の筋緊張亢進を低下させる治療剤として使用するのに最適である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたHA陰性のA型ボツリヌス菌株に由来する高度精製A型ボツリヌス毒素を有効成分として含有する神経筋伝達阻害剤。
【請求項２】
当該高度精製A型ボツリヌス毒素の分子量が150kDaであることを特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
ボツリヌス毒素LL体、L体およびM体と比較して、速効性に優れ、かつ、拡散性が少ないという特徴を有する安全域の広い請求項１または２に記載の阻害剤。
【請求項４】
高度精製A型ボツリヌス毒素が、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌に由来するHA陰性のKyoto-F、Chiba-H、Y-8036、7I03-H、7I05-H、またはKZl828の菌株のいずれかから産生されることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項５】
ボツリヌス毒素安定化物質をさらに含むことを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項６】
ボツリヌス毒素安定化物質がヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたHA陰性のA型ボツリヌス菌株に由来する高度精製A型ボツリヌス毒素を有効成分として含有する筋緊張亢進疾患治療剤。
【請求項８】
当該高度精製A型ボツリヌス毒素の分子量が150kDaであることを特徴とする請求項７に記載の治療剤。
【請求項９】
ボツリヌス毒素LL体、L体およびM体と比較して、速効性に優れ、かつ、拡散性が少ないという特徴を有する安全域の広い請求項７または８に記載の治療剤。
【請求項１０】
高度精製A型ボツリヌス毒素が、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌に由来するHA陰性のKyoto-F、Chiba-H、Y-8036、7I03-H、7I05-H、またはKZl828の菌株のいずれかから産生されることを特徴とする請求項７から９のいずれかに記載の治療剤。
【請求項１１】
当該筋緊張亢進疾患が、局所の筋緊張亢進により惹起される疾患であり、当該疾患が、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、片頭痛などの頭痛、腰痛などの慢性的な疼痛、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニー、皺である請求項７から１０のいずれかに記載の治療剤。
【請求項１２】
ボツリヌス毒素安定化物質をさらに含むことを特徴とする請求項７から１１のいずれかに記載の治療剤。
【請求項１３】
ボツリヌス毒素安定化物質がヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項１２に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたHA陰性のA型ボツリヌス菌株より得られる150kDaのA型神経毒素を有効成分として含有する神経筋伝達阻害剤、及び当該神経毒素を有効成分として含有する筋緊張亢進疾患治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
嫌気性のグラム陽性菌であるクロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）が産生するボツリヌス毒素は地球上で最も致死性の高い神経毒素であり、これまでに血清型A、B、C、D、E、FおよびGの7種のボツリヌス菌由来の神経毒素とその特性が明らかにされている。これらはそれぞれ血清型に特異的な中和抗体で識別される。ボツリヌス毒素の血清型の違いにより、それらが影響する動物類、誘発される麻痺の重症度および持続期間等が異なる。ボツリヌス毒素の活性中心蛋白質の分子量は、既知のボツリヌス毒素血清型の7つすべてにおいて約150kDa神経毒素（NTX）である。【０００３】
すべてのボツリヌス毒素はボツリヌス菌から産生される場合、関係する無毒蛋白質と結合した複合体の分子形態をとる。A型ボツリヌス毒素は、900kDa（LL毒素）、500kDa（L毒素）、または300kDa（M毒素）の分子形態として、ボツリヌス菌から産生される（図１）。これらボツリヌス毒素は、アルカリ条件下（pH7.2以上）でNTXとNTNHの部分（無毒非HAである蛋白質）が解離するため、この性質を利用することで、150kDaのNTX（神経毒素が活性を有する中心の蛋白質、S毒素とも呼ばれる。）のみを単離することができる。これら、LL毒素、L毒素、M毒素は、ボツリヌス毒素複合体、プロジェニター毒素などと呼ばれている。これらボツリヌス毒素は、小腸上部で吸収された場合には、リンパ管内で無毒蛋白質と神経毒素に解離する。解離した神経毒素は、その重鎖C末端側で神経終末の受容体に結合し、受容体を介して取り込まれる。その後、軽鎖のもつ亜鉛メタロエンドペプチダーゼ活性により神経シナプス前膜の蛋白質を特異的に切断し、カルシウム依存性のアセチルコリンの放出を阻害して、シナプスでの神経伝達を遮断する（非特許文献１）。【０００４】
ボツリヌス毒素は、ボツリヌス中毒においては全身の神経伝達を遮断してヒトを死に至らしめる毒素ではあるが、逆にその活性を積極的に利用して、有用な神経筋伝達阻害剤として利用されている。特に、異常な筋緊張性亢進を来たす疾患、例えばジストニアの患者の筋肉内に直接投与することによって、局所の筋緊張を緩和する治療薬として用いられている（非特許文献２）。例えば、A型ボツリヌス毒素複合体(Allergan Inc., BOTOX（登録商標）)は、眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣、頚部ジストニアの治療用、並びに眉間のしわの治療用としてアメリカ食品薬品局（FDA）によって承認されている。また、B型ボツリヌス毒素(Elan Pharmaceuticals, MYOBLOC（登録商標）)も頚部ジストニア治療用としてFDAによって承認されている。非A型ボツリヌス毒素は、A型ボツリヌス毒素と比較して、やや低い効力およびやや短い活性期間を有するといわれている。A型ボツリヌス毒素１回の筋肉内注射から症状の改善までの典型的な期間は平均して約3〜4ヶ月である。【０００５】
近年、ボツリヌス毒素の作用は、（１）神経筋接合部、（２）自律神経節、（３）神経節後の副交感神経末端、（４）神経節後の交感神経末端、（５）痛覚受容線維などの部位で確認されている。骨格筋の神経筋接合部では、ムスカリン性アセチルコリン作動性神経終末が主な作用部位である。自律神経節のうち、副交感神経節への直接作用は臨床作用と関連すると考えられている。また、末梢自律神経への作用には、ATP、VIP（vasoactive intestinal polypeptide）、substance Pの放出阻害やNO（nitric oxide）合成酵素の作用を阻害することが報告されている。また、ボツリヌス毒素が痛みの緩和に有用であることが知られるようになった。この作用において、ボツリヌス毒素は、グルタミン酸、substance P、CGRP（calcitonin gene-related peptide）の放出を阻害することが報告されている（非特許文献２）。このように、ボツリヌス毒素は様々な神経において、様々な神経伝達物質の放出を阻害する有用な神経筋伝達阻害剤である。【０００６】
現在、A型ボツリヌス毒素のような治療用ボツリヌス毒素製剤の生物学的力価は、マウスLD50単位によって通常表されている。１LD50は、マウスへの腹腔内投与に基づくLD50として定義されている。これは試験に供したマウスの半数が死亡する量であり、マウスの呼吸筋が弛緩される結果として、マウスが死亡するときの神経毒素の濃度または量から力価単位を定量している。現在市販されているA型ボツリヌス毒素複合体（Allergan Inc., BOTOX（登録商標）、100単位含有）のマウスにおける1LD50（つまり1単位）は、約50ピコグラム（pg）である。【０００７】
治療用ボツリヌス毒素製剤は、Allergan Inc. (米国)、Ipsen Limited (英国)、Elan Pharmaceuticals（アイルランド）から入手可能である。これら市販されている治療用ボツリヌス製剤は、関係する無毒蛋白質と結合した分子形態を取った神経毒素複合体（LL毒素）のみを精製した製剤である。近年では、2005年に無毒蛋白を含まないA型NTX製剤（Merz Pharma, Xeomin（登録商標）、ドイツ）が発売され、また米国でも同様な別製剤の臨床試験も実施されており、次世代製剤の開発も積極的に行われている。【０００８】
現在市販されているA型ボツリヌス毒素製剤、すなわち、Allergan Inc.のBOTOX（登録商標）とIpsen LimitedのDysport（登録商標）は、その毒素複合体の成分として、HA17、HA34、およびHA70のHaemagglutinin（HA）蛋白を持つ神経毒素複合体（LL毒素）である（HA陽性体）。【０００９】
一方、1990年に乳児ボツリヌス症の患者から単離されたタイプのボツリヌス毒素はA型ではあるものの、HA蛋白を含まないM毒素のみを産生する（HA陰性体）。HA蛋白を含まないボツリヌス毒素を産生するA型ボツリヌス菌は、1986年に日本で最初に乳児ボツリヌス症に関する患者から同定されている(非特許文献３)。この臨床分離株は、Kyoto-F、Chiba-H、Y-8036、7I03-H、7I05-HとKZl828である。他のボツリヌス毒素A〜Gと比較した場合、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌由来ボツリヌス毒素は、これらの毒素型分子とは異なる特異な神経毒素である。【００１０】
遺伝的見地から、乳児ボツリヌス症由来ボツリヌス菌群の遺伝子機構は、他のすべてのボツリヌス毒素の血清型と異なっている。従来のA型ボツリヌス毒素に代表される多くのボツリヌス毒素は、複合体の成分として、Haemagglutinin（HA）タンパク質を持つ神経毒素複合体として見出されている。HA17、HA34、およびHA70などのHAタンパク質をコードする遺伝子は、A、B、C、DおよびG型ボツリヌス菌の神経毒素遺伝子群に含まれているが、乳児ボツリヌス症由来ボツリヌス菌群の遺伝子では完全に欠損している。また、乳児ボツリヌス症由来ボツリヌス菌群の遺伝子は、p47などの調節遺伝子を含んでいる（非特許文献４）。さらに、乳児ボツリヌス症由来ボツリヌス菌の産生するボツリヌス毒素のNTNHタンパク質の配列は、C型菌の無毒非HA蛋白質NTNH遺伝子とA型菌の無毒非HA蛋白質NTNH遺伝子の寄せ集め、すなわちモザイク型であることが示された（非特許文献５）。【００１１】
また、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌由来のボツリヌス毒素は、従来のHA蛋白質を含むA型ボツリヌス毒素と比較した場合に、精製したボツリヌス毒素の生化学的特性が著しく異なる。従来のA型ボツリヌス毒素はNTNH蛋白質、および少なくとも3個のHA蛋白質（HA17、HA34、およびHA70）を含むが、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌由来のボツリヌス毒素はNTNH蛋白質だけを含んでいて、HA蛋白質を欠く(非特許文献６)。神経毒素分子自体については、従来のA型ボツリヌス毒素の重鎖は93kDaであるが、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌由来のボツリヌス毒素では101kDaであり、分子量が異なる。また、異なるプロテアーゼ反応性を示す（非特許文献７）。これら2つのボツリヌス毒素アイソタイプのアミノ酸配列は、全体では、89.9%異なるが、特に重鎖領域で著しく異なっており、847のアミノ酸のうち109が異なる（13%の違い）。一方で、軽鎖は95.1％が異なると報告されている（非特許文献８）。【００１２】
一方、ボツリヌス毒素を繰り返し投与することにより、その有効性が減弱してくるという問題点が指摘されているが、この現象は毒素に対する抗体産生に依存していると考えられている。この原因の一つとしては、製剤中に含まれるHaemagglutinin（HA）に、抗体産生に関するアジュバンド作用があることが指摘されている（非特許文献９）。【００１３】
高度精製ボツリヌス毒素は、古くはTse CK., et al.らの文献（非特許文献１０）に報告があり、さらに、WO1996/11699（特許文献１）で、精製方法の記載例（p6, line 9-p7, line 2）や薬剤組成（p11, Table 2）に関する報告がなされている。
【特許文献１】WO1996/11699
【非特許文献１】Jankovic J. et al., Curr. Opin. Neurol., (7): p.358-366, 1994
【非特許文献２】梶龍兒ら、「ジストニアとボツリヌス治療」、診断と治療社、2005年
【非特許文献３】Sakaguchi G. et al., Int. J. Food Microbiol., 11: p.231-242, 1990
【非特許文献４】Kubota T. et al., FEMS Microbiology letters., 158: p.215-221, 1998
【非特許文献５】Kubota T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 224(3): p.843-848, 1996
【非特許文献６】Sakaguchi G. et al., Int. J. Food Microbiol. 11: p.231-242, 1990
【非特許文献７】Kozaki S. et al., Microbiol. Immunol. 39(10): p.767-774, 1995
【非特許文献８】Cordoba J. et al., System. Appl. Microbiol. 18: p.13-22, 1995
【非特許文献９】Arimitsu H. et al., Infect. Immun., 71(3): p.1599-1603, 2003
【非特許文献１０】Tse CK. et al., Eur. J. Biochem., 122(3): p.493-500, 1982
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
ボツリヌス毒素は、筋緊張亢進疾患患者の筋肉を弛緩させて治療効果を発揮する薬剤として知られているが、その反面、その作用が適応部位以外に作用した場合には、逆にその作用が毒性に転じてしまう薬物である。したがって、痙縮、全身性の付随運動（脳性麻痺に限られる）において筋緊張を正常に戻す薬剤として、安全性が高く、局所にとどまり、効果を早く発現する毒素製剤が社会的に求められている。また、ボツリヌス毒素を繰り返し投与することにより、その有効性が減弱してくるという問題点が指摘されており、この現象は毒素に対する抗体産生に依存していると考えられている。この原因の一つとしては、製剤中に含まれるHaemagglutinin（HA）に、抗体産生に関するアジュバンド作用があることが指摘されている。したがって、抗体産生を誘導せず、繰り返し投与しても効果が減弱しない治療剤が求められている。既にボツリヌス毒素のLL毒素を主な有効成分とするボツリヌス製剤が販売されているが、効果や副作用の観点から、これより優れた製品の開発が待たれている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ボツリヌス毒素製剤の力価単位としては、マウスLD50が用いられてきたことから、ボツリヌス毒素の効力は、マウスLD50の定量でしか比較することができなかった。「力価」とは目的とする望ましい効力を数値化したものを意味するが、マウスLD50は、一定期間内において試験に供したマウスの半数が死亡する量を算出する方法であり、マウスの呼吸筋が弛緩麻痺される結果としてマウスが死亡するときの毒素の濃度または量から力価単位を定量する方法であり、毒素の持つ「致死活性」を一定時間内で判断する方法である。この場合、一定時間内で生じる効果発現にかかる時間や副作用の観点から、ボツリヌス毒素のもつ特性の差を確認することは不可能である。このように、市販されているボツリヌス毒素製剤より優れた製品かどうかを見極める方法自体が存在しなかった。【００１６】
今回の発明に先立ち、本発明者らはまず、試験系の構築を行った。すなわち、一定期間内におけるマウスLD50の評価を行うのではなく、マウスLD50を経時的に観察することで、ボツリヌス神経毒素の力価の速効性を比較する方法を開発した。【００１７】
また、現在市販されているボツリヌス毒素製剤が目的とする効果は、治療対象とする筋肉の弛緩作用であるため、ボツリヌス毒素本来の量はLD50でなく、到底致死に至らない程度の筋弛緩作用を定量的に評価することが望ましい。すなわち、ボツリヌス毒素の効力は、毒素のある用量がある筋に弛緩作用をもたらす程度を意味することが望ましい。本発明者らは筋電計を用いることで、臨床での筋肉に対する効果を時間的に評価することできる試験系、すなわち、複合筋活動電位（CMAP）を測定するCMAP試験系を構築した。【００１８】
これらの系を用いることで、ボツリヌス毒素のより好ましい分子形態や由来する菌株を選定することが可能となった。【００１９】
さらに本発明者らは、既存のボツリヌス製剤より優れている薬剤を見出すために、ボツリヌス毒素の中でも最も致死活性が高いA型の亜種の産生するボツリヌス毒素に着目した。これは、1990年に乳児ボツリヌス症の患者から単離されたタイプのA型ボツリヌス毒素であり、HA蛋白を含まないM毒素のみを産生する。【００２０】
今回本発明者らは、従来知られているLL毒素製剤と、乳児ボツリヌス症原因のボツリヌス菌に由来する高度精製ボツリヌス毒素のNTXを、上記の経時的マウスLD50試験とCMAP試験系を用いて比較することによって、乳児ボツリヌス症原因のボツリヌス菌に由来する高度精製ボツリヌス毒素NTXが、LL毒素よりも速効性を持ち、少ない拡散性を有していることを発見した。そのため、乳児ボツリヌス症原因のボツリヌス菌に由来する高度精製ボツリヌス毒素NTXは、優れた神経筋伝達阻害活性を有していること（神経筋伝達阻害剤）から、筋緊張亢進疾患の治療剤として使用するのに最適であることを見出した。乳児ボツリヌス症由来菌から得られた高度精製ボツリヌス毒素は、速効性を有していることから、障害部位でより速い作用発現を期待できる。また、障害部位以外の筋への毒素の波及（拡散）を避ける為のより安全な製剤として、使用することができるという優位性を持つ。さらに、乳児ボツリヌス症の患者から単離されたA型ボツリヌス菌の一部は、HA蛋白を含まないM毒素のみを産生するため、神経毒素NTXのみを精製する際には、抗体産生を増徴させるHAを全く含まず、HAを除去するための精製工程を省略することができるという優位性を持つ。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の乳児ボツリヌス症原因菌より分離されたHA陰性のボツリヌス菌に由来する高度精製ボツリヌス毒素（NTX）は、M毒素やLL毒素よりも速効性に優れた神経筋伝達阻害作用を有する。また、ボツリヌス毒素を投与した筋肉から離れた筋肉における神経筋伝達阻害は、すなわち、副作用を意味しているのであるが、LL毒素＞M毒素＞NTXであり、NTXが最も拡散性が少なく、副作用の少ない製剤であることを意味している。【００２２】
このように、乳児ボツリヌス症原因菌由来のNTXは、筋緊張亢進疾患への治療に供する場合、緊張を緩和させる目的筋肉においては「速効性」を有するが、目的筋肉以外の筋肉においては「拡散しにくい」性質を有するために緊張を緩和させないという、神経筋伝達阻害剤としては最も好ましい特徴を有する。これは、乳児ボツリヌス症原因菌由来のNTX特有のアミノ酸配列とその構造に起因すると推測される。従来より筋緊張亢進疾患の治療に用いられてきたBOTOXのようないわゆるLL毒素製剤に比べて、本発明のNTX製剤は、投与して効果発現するまでの時間が速いため、患者は「効果発現するまでの数日を短縮できる」という点において、大きなメリットを有する。また、緊張している筋肉が、ヒトが直立したり、歩行したりする際に使用するような大きな足の筋肉であった場合には、300単位を超えるような大量の毒素投与が必要とされるが、この場合、目的筋肉以外の筋肉が弛緩してしまうと、逆に、患者は日常生活に支障をきたしてしまう恐れがある。適切な解毒剤のないボツリヌス毒素の場合、乳児ボツリヌス症原因菌由来のNTXの「拡散しにくい」という特徴は「副作用のリスクが少ない」という点においても非常に大きなメリットである。【００２３】
さらに、これは、HAを含有しないため、抗体産生を誘導しにくく、繰り返し投与しても効果の減弱が少ないので、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、片頭痛などの頭痛、腰痛などの慢性的な疼痛、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニー、皺などの筋緊張亢進に起因する疾患の治療剤として特に有用である。また、ボツリヌス毒素は痛みの緩和にも有用であるため、筋疾患に関連しない各種中枢神経性・末梢神経性の疼痛や術後痛などにも有用であろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ボツリヌス毒素蛋白複合体の分子形態を表す模式図。
【００２５】
【図２】マウスを用いた経時的LD50試験によるNTX毒素の作用発現時間を示すグラフ。
【００２６】
【図３】マウスを用いた経時的LD50試験によるM毒素の作用発現時間を示すグラフ。
【００２７】
【図４】マウスを用いた経時的LD50試験によるプロジェニター毒素の作用発現時間を示すグラフ。
【００２８】
【図５】ボツリヌス毒素の投与部位とCMAP測定部位を示す。
【００２９】
【図６】各種ボツリヌス毒素を投与した左後肢筋におけるCMAP結果を示すグラフ。横軸は投与後日数（day）を、縦軸はCMAP振幅（×10-1mA）を示す。
【００３０】
【図７】各種ボツリヌス毒素投与部位と反対側である右後肢筋におけるCMAP結果を示すグラフ。横軸は投与後日数（day）を、縦軸はCMAP振幅（×10-1mA）を示す。
【００３１】
【図８】投与後1日の左後肢CMAP振幅の回帰直線を示すグラフ。
【００３２】
【図９】投与後4日の右後肢CMAP振幅の回帰直線を示すグラフ。
【００３３】
【図１０】各毒素のCMAP-ED50、CMAP-SD50、Therapeutic windowの比較を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明の乳児ボツリヌス症原因菌に由来する高度精製A型ボツリヌス毒素治療剤は、乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたHA陰性のA型ボツリヌス菌株より得られるM毒素から無毒蛋白であるNTNHを分離した高度精製A型ボツリヌス毒素、すなわち、NTXを有効成分とする。NTXは、LL毒素やM毒素と比較して、投与後速やかに治療効果を発揮するので、本発明の治療剤はより速効性に優れた治療剤として使用できる。また、HA陰性の乳児ボツリヌス症の原因菌として分離された高度精製A型ボツリヌス毒素は、HA陽性のA型ボツリヌス毒素より得られる高度精製A型ボツリヌス毒素よりも少ない拡散性を有しているため、安全域が広い優れた神経筋伝達阻害剤であり、筋緊張亢進疾患における局所の筋緊張亢進を低下させる治療剤として使用するのに最適である。【００３５】
乳児ボツリヌス症の患者から単離されたタイプのボツリヌス毒素はA型ではあるものの、HA蛋白を含まないM毒素のみを産生する。HA蛋白を含まないボツリヌス毒素を産生するA型ボツリヌス菌は、Kyoto-F、Chiba-H、Y-8036、7I03-H、7I05-HとKZl828から選択される。【００３６】
本発明の治療剤は、好ましくは、乳児ボツリヌス症原因菌に由来する高度精製A型ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質を含んでなる医薬組成物である。【００３７】
ボツリヌス毒素安定化物質は、上記の組成物が保存される条件において、ボツリヌス神経毒素を安定化することができ、かつボツリヌス毒素の筋緊張疾患治療効果の速効性を損なわないものであればよい。ボツリヌス毒素安定化物質の例としては、ヒト血清アルブミンが挙げられる。【００３８】
本発明における好ましい医薬組成物は、乳児ボツリヌス症原因菌に由来する高度精製A型ボツリヌス毒素をヒト血清アルブミンと混合する工程により製造することができる。従って、本発明は、（１）ボツリヌス毒素を精製する工程、（２）ボツリヌス毒素をヒト血清アルブミンと混合する工程を含んでなる、ボツリヌス毒素を含んでなる医薬組成物を製造する方法も提供する。【００３９】
高度精製A型ボツリヌス毒素は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、疎水クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて精製することができる。具体的にはボツリヌス菌の培養上清から、M毒素を例えば硫安塩析、プロタミン処理等の方法により濃縮する。M毒素をpH7以上の条件にすることで、神経毒素と無毒蛋白質に分離する。その後、例えば陽イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製し、毒素活性のある分画を集めて、更にゲルろ過で精製するなどの方法があげられる。毒素活性は、例えばマウス腹腔内注射法（マウス腹腔内に投与してLD50から毒素活性を求める方法）により測定し、マウス1LD50を1単位とする。【００４０】
また、精製工程の後は、ボツリヌス毒素をヒト血清アルブミンと混合する工程を含む限り、特に限定されず、例えばボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質を溶媒に溶解後、無菌ろ過し、アンプル、バイアル等に充填して本発明の組成物を製造することができる。また、ボツリヌス毒素を予めボツリヌス毒素安定化物質を溶解した溶媒に溶解後、無菌ろ過しアンプル等に充填することもできる。溶媒は、注射用蒸留水、生理食塩水、0.01M〜0.1Mのリン酸緩衝液等を用いることができ、必要に応じて、エタノール、グリセリン等を混合することもできる。【００４１】
更に、ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質を溶媒に溶解後、無菌ろ過し、バイアル等に充填後、凍結乾燥して発明の組成物を製造することもでき、また、ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素安定化物質を混合後、バイアル等に無菌充填して本発明の医薬組成物を製造することもできる。【００４２】
具体的には、精製したボツリヌス毒素に、ボツリヌス毒素安定化物質、好ましくはヒト血清アルブミン、更に好ましくはヒトでの安全性が確保された治療用ヒト血清アルブミンを、最終濃度が0.1〜5mg/mL、好ましくは0.5〜2mg/mLになるように加え、冷蔵保存、冷凍保存あるいは凍結乾燥することが挙げられる。【００４３】
本発明の治療剤には、必要に応じさらに、マンニトール、グルコース、乳糖等の糖類、食塩、リン酸ナトリウム等の添加剤を混合することができる。溶解状態での本発明にかかる医薬組成物のpHは、通常3〜8であり、好ましくは4〜7であり、より好ましくは5〜7である。【００４４】
本発明の治療剤において、ボツリヌス毒素は、本発明の使用目的において有効な量が含まれていればよい。また、ボツリヌス毒素安定化物質が含まれる場合には、ボツリヌス毒素安定化物質は、ボツリヌス神経毒素を安定化するのに十分な量含まれていればよい。【００４５】
本発明の治療剤は、従来知られているボツリヌス毒素製剤に比較して、速効性と、少ない拡散性を有しているため、安全域が広く、筋緊張亢進疾患における局所の筋緊張亢進を低下させる治療剤として使用するのに最適であるが、ここでいう局所の筋緊張亢進を低下させる治療の対象疾患は、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、片頭痛などの頭痛、腰痛などの慢性的な疼痛、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニー、皺である。筋膜痛症候群は、急性の筋肉障害や筋肉の反復性の過負荷（使いすぎ）により、筋肉内に硬いしこり状の緊張帯ができ、強い痛みを感じる疾患であり、脳卒中後、あるいは、小児性脳性麻痺、パーキンソン病若しくは多発性硬化症の発症に伴い、手や足の筋緊張が過度に亢進することが知られている。さらに、首および肩の筋肉緊張が異常に亢進することによって慢性的な片頭痛などの頭痛を生じ、また、筋肉疲労や持続的な姿勢の悪さにより筋肉緊張が異常に亢進し、結果的に、腰痛、頚痛あるいは背中痛などの慢性的な疼痛や肩こりが誘発されることも知られている。【００４６】
本発明の治療剤により治療される筋緊張亢進疾患は、速やかな筋緊張亢進の抑制を必要とする疾患、すなわち速効型治療剤による治療を必要とする疾患であることが好ましい。このような筋緊張亢進疾患としては、有効用量が決まるまで投与量を調節しながら投与する筋緊張亢進疾患、累積的に効果を積み重ねて治療を行う全身性の筋緊張亢進疾患が挙げられる。全身性の筋緊張亢進疾患の例としては、全身性ジストニア・全身性痙縮、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、パーキンソン病や多発性硬化症が挙げられる。【００４７】
本発明の治療剤は、治療に有効な量投与される。ヒトに投与する場合、その投与形態は好ましくは局所的投与、更に好ましくは筋肉内注射である。また、それらの投与タイミングや投与量も、特に限定されず、症状の程度等により異なる。投与量は症状の程度、年齢、性別、体重、投与部位および形態等に応じて異なるが、例えば成人ならば0.01〜900単位を、好ましくは5〜300単位を、1回筋肉内注射する。ここで1単位とは、マウスに腹腔内投与した時に半数のマウスが死亡する毒素の量（1LD50）である。患者に対する総用量は、約0.01〜900単位の範囲である。【００４８】
注射後、すべての患者において、全身的または局所的副作用は無く、治療対象となる筋肉以外での大きな局所的緊張低下は見られないことと、治療対象筋肉の機能改善が見られることを筋電計などにより確認しながら治療を行う。【００４９】
本発明は、また、乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたHA陰性のA型ボツリヌス菌株に由来する高度精製A型ボツリヌス毒素治療剤を、筋緊張亢進疾患における局所の筋緊張亢進を低下させる治療剤として使用することを特徴とする治療方法を提供する。高度精製ボツリヌス毒素、筋緊張亢進疾患、投与方法、製造方法等については上記に説明した通りである。
【実施例】
【００５０】
本発明を下記実施例により更に詳しく説明するが、本発明はこれに限られるものではない。
《実施例１：ボツリヌスA型神経毒素の精製》
使用するボツリヌス菌としては、乳児ボツリヌス症の患者から分離されたタイプのA型ボツリヌス毒菌であるChiba-H株を用い、Sakaguchi G., Biochemical aspects of botulism: Purification and oral toxicities of Clostridium botulinum progenitor toxins, 21-34, Lewis GE., 1981, Academic Press, New Yorkに記載された方法に従って、ボツリヌスA型M毒素を精製した。【００５１】
また、ボツリヌスM毒素を10mMリン酸緩衝液（pH7.5）に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したDEAEセファロースカラムに吸着させ、同緩衝液の0〜0.3M NaCl濃度勾配で溶出し、神経毒素と無毒蛋白質に分離した。得られた高度精製神経毒素（NTX）はYM-10メンブラン（アミコン社製）で1mg/mLまで濃縮し、50mMリン酸緩衝液（pH7.5）に対して透析した後、使用時まで-80℃に保存した。【００５２】
《実施例２：マウスを用いた経時的LD50試験による各種ボツリヌス毒素の作用発現時間の比較》
ボツリヌス毒素は、実施例１において調製したボツリヌスA型M毒素および、NTXを使用し、LL毒素はAllergan Inc.製BOTOX（登録商標）を使用した。各毒素を検体希釈Bufferにより2.662, 2.420, 2.200, 2.000, 1.818, 1.653, 1.503LD50/mLとなるように希釈液を作製した。（7用量、インターバル×1.1希釈）各希釈群20匹ずつマウスに0.5mL腹腔内投与を行い、投与後4日間、毎日その生死を観察した。結果を図２〜図４に示す。【００５３】
この結果、致死に要する時間は、NTX＞M毒素＞LL毒素であり、NTXが最も早く効果発現を示し、少ない日数でマウスを多く死亡させることが明らかとなった。【００５４】
《実施例３：各種神経毒素のCMAP比較》
ボツリヌス毒素は、実施例１において調製したボツリヌスA型M毒素および、NTXを使用し、LL毒素はAllergan Inc.製BOTOX（登録商標）を使用した。各毒素の単位数は、マウスに腹腔内投与したときの1LD50を1単位とし、マウス3LD50/0.1mLとなるように、0.5％血清アルブミンを含む無菌生理食塩水で調製した。両毒素0.1mLを、各ラット（SD系）の左後肢の腓腹筋に注射し、後肢における複合筋活動電位（CMAP）の変化を測定した。後肢のCMAPは、ラットの脊椎根をクリップ電極で挟んで電気刺激を行い、左右の後肢筋について記録電極を用いてCMAPを記録した。ボツリヌス毒素の投与部位およびCMAP測定部位を図５に示す。なお、筋電計は、ニコレー・バイキングクエストシリーズ（ニコレー・バイオメディカル社製）を使用し、結果を解析ソフトにより数値化した。各毒素の左後肢筋のCMAP結果を図６に、右後肢筋のCMAP結果を図７に示す。【００５５】
ボツリヌス毒素を投与した左の後肢筋のCMAP結果では、筋弛緩の速さの順は、NTX＞M毒素＝LL毒素であり、NTXが最も早く効果発現を持つことが明らかとなった。さらに、神経毒素を投与したのと反対側である右の後肢筋、すなわち、投与していない部位のCMAP結果によると、筋弛緩の速さおよび拡散の強さの順は、LL毒素＞M毒素＞NTXであり、NTXは拡散性が最も少ないことが明らかとなった。【００５６】
《実施例４：HA陽性のA型ボツリヌス毒素からのNTX精製》
使用するボツリヌス菌はHA陽性のA型ボツリヌス株である62A株を用い、実施例１同様に、Sakaguchi G., Biochemical aspects of botulism: Purification and oral toxicities of Clostridium botulinum progenitor toxins, 21-34, Lewis GE., 1981, Academic Press, New Yorkに記載された方法に従って、毒素の培養、精製を行った。さらに、M毒素から、NTXを精製し、これを62A NTXとした。【００５７】
《実施例５：各種神経毒素のTherapeutic Window比較》
ボツリヌス毒素は、実施例１において調製したボツリヌスA型NTX、および実施例４において調製した62A NTXを使用し、LL毒素はAllergan Inc.製BOTOX（登録商標）を使用した。0.5%血清アルブミンを含む無菌生理食塩水により、各毒素を136.0, 68.0, 34.0, 17.0,4.0, 2.0, 1.0, 0.50LD50/mLとなるように希釈液を作製した。希釈毒素0.1mLを各ラット（SD系）の左後肢の腓腹筋に注射し、投与後1日に左後肢、投与後4日に右後肢のCMAPを測定した。左後肢のCMAP振幅が投与後1日に投与前の50%低下する毒素活性量をCMAP-ED50と定義し、右後肢のCMAP振幅が投与後4日に与前の50%低下する毒素活性量をCMAP-SD50と定義した。また、CMAP-SD50をCMAP-ED50で除した値をTherapeutic windowと定義した。投与後1日の左後肢CMAP振幅の回帰直線を図８に、投与後4日の右後肢CMAP振幅の回帰直線を図９に、各毒素のCMAP-ED50、CMAP-SD50、Therapeutic windowの比較を図１０に示す。【００５８】
図１０に示されるように、CMAP-ED50は各毒素ともにほぼ同じ値を示すが、CMAP-SD50はNTXと62A NTXの比が1.8、NTXとBOTOXの比が1.45となり、NTXは非投与側へ影響を与えるのに最も毒素活性量が必要であり、拡散性が最も低いことが明らかとなった。また各毒素のTherapeutic windowを比較すると、NTXは62A NTX、BOTOXと比較して、約2倍広い値となり治療に最も適していると言える。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明の乳児ボツリヌス症原因菌に由来する高度精製A型ボツリヌス毒素治療剤は、乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたHA陰性のA型ボツリヌス菌株より得られるM毒素から無毒蛋白であるNTNHを分離した高度精製A型ボツリヌス毒素、すなわち、NTXを有効成分とする。NTXは、LL毒素やM毒素と比較して、投与後速やかに治療効果を発揮するので、本発明の治療剤はより速効性に優れた治療剤として使用できる。また、HA陰性の乳児ボツリヌス症の原因菌として分離された高度精製A型ボツリヌス毒素は、HA陽性のA型ボツリヌス毒素より得られる高度精製A型ボツリヌス毒素よりも少ない拡散性を有しているため、安全域が広く、筋緊張亢進疾患における局所の筋緊張亢進を低下させる治療剤として使用するのに最適である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月27日(2008.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたＨＡ非産生性のＡ型ボツリヌス菌株に由来し、かつＮＴＮＨを含有しない、分子量１５０ｋＤａの高度精製Ａ型ボツリヌス毒素を有効成分として含有する神経筋伝達阻害剤。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
ボツリヌス毒素ＬＬ体、Ｌ体およびＭ体と比較して、速効性に優れ、かつ、拡散性が少ないという特徴を有する安全域の広い請求項１に記載の阻害剤。
【請求項４】
高度精製Ａ型ボツリヌス毒素が、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌に由来するＨＡ非産生性のＫｙｏｔｏ−Ｆ、Ｃｈｉｂａ−Ｈ、Ｙ−８０３６、７Ｉ０３−Ｈ、７Ｉ０５−Ｈ、またはＫＺ１８２８の菌株のいずれかから産生されることを特徴とする請求項１または３に記載の阻害剤。
【請求項５】
ボツリヌス毒素安定化物質をさらに含むことを特徴とする請求項１、３または４のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項６】
ボツリヌス毒素安定化物質がヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
乳児ボツリヌス症の原因菌として分離されたＨＡ非産生性のＡ型ボツリヌス菌株に由来し、かつＮＴＮＨを含有しない、分子量１５０ｋＤａの高度精製Ａ型ボツリヌス毒素を有効成分として含有する筋緊張亢進疾患治療剤。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
ボツリヌス毒素ＬＬ体、Ｌ体およびＭ体と比較して、速効性に優れ、かつ、拡散性が少ないという特徴を有する安全域の広い請求項７に記載の治療剤。
【請求項１０】
高度精製Ａ型ボツリヌス毒素が、乳児ボツリヌス症原因ボツリヌス菌に由来するＨＡ非産生性のＫｙｏｔｏ−Ｆ、Ｃｈｉｂａ−Ｈ、Ｙ−８０３６、７Ｉ０３−Ｈ、７Ｉ０５−Ｈ、またはＫＺ１８２８の菌株のいずれかから産生されることを特徴とする請求項７または９に記載の治療剤。
【請求項１１】
当該筋緊張亢進疾患が、局所の筋緊張亢進により惹起される疾患であり、当該疾患が、斜視、眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、痙性斜頚、脳卒中後の麻痺、小児脳性麻痺、痙性発声障害、片頭痛などの頭痛、腰痛などの慢性的な疼痛、肩こり、パーキンソン病や多発性硬化症などの発症時に起こる筋弛緩不全、筋膜痛症候群、咀嚼筋攣縮、慢性裂肛、尿失禁、歯ぎしり、顔面ミオキミア、チック、局所性ジストニー、皺である請求項７、９または１０のいずれかに記載の治療剤。
【請求項１２】
ボツリヌス毒素安定化物質をさらに含むことを特徴とする請求項７、または９から１１のいずれかに記載の治療剤。
【請求項１３】
ボツリヌス毒素安定化物質がヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項１２に記載の治療剤。
【国際調査報告】
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