(57)【要約】ウンデカプレニル二リン酸合成酵素に対して阻害活性を示すことにより、細菌によって引き起こされる感染症に対する薬剤として臨床できることが期待される化合物を提供する。ペニシリウム属に属し、ＦＫＩ−３３６８物質を産生する能力を有する微生物（ペニシリウム  エスピーＦＫＩ−３３６８）を培地に培養し、その培養物中にＦＫＩ−３３６８―１物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−３３６８―１物質物質を採取する。
2009035156.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
2009035156.tif 000014
（式中、Ｘは、水酸基、炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアミノ基）で表される化合物（以下、ＦＫＩ−３３６８物質という。）または製薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体。
【請求項２】
抗生物質活性を有することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ウンデカプレニル二リン酸合成酵素阻害活性を有することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｘがメチル基である請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｘがアミノ基である請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
ペニシリウム属に属し、ＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−３３６８物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−３３６８物質を採取することを特徴とする請求項１に記載の化合物の製造法。
【請求項７】
ペニシリウム属に属し、ＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する微生物。
【請求項８】
ペニシリウム属に属し、抗生物質活性を有するＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する微生物。
【請求項９】
ペニシリウム属に属し、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素阻害活性を有するＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する微生物。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とする抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規化合物（本願においてＦＫＩ−３３６８物質という。）、その製造法およびその用途に関する。特に本発明はイソプレノイド代謝阻害活性を有する前記化合物その製造法およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細菌感染症の予防および治療には各種ベータラクタム抗生物質、アミノ配糖体、マクロライド、グリコペプチド、キノロンなどが使われてきたが、最近これらの抗生物質に耐性を示す感染菌が増加しており、従来のタイプとは異なる抗生物質が渇望されている。
ウンデカプレニル二リン酸合成酵素は、ファルネシル２リン酸とイソプレニル２リン酸を基質としてウンデカプレニル二リン酸を生成する酵素である。これは細胞壁の合成などに関与する細菌類の生命維持に必須の酵素タンパク質であり、従って、本酵素を阻害する薬剤の発見は、上記の課題を解決し得ると考えられ、ＭＲＳＡやＶＲＥなどの多剤耐性菌による難治性の感染症の新しい治療剤として臨床できることが期待される。しかし、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素について抗生物質を開発するための標的としてストレプトコッカス属由来の遺伝子産物を提案した例はあるが（特表２００２−５２７０４９（ＷＯ００／２１５４４））、本酵素を阻害する抗菌剤は未だ実用化に至っていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、微生物のウンデカプレニル二リン酸合成酵素に対して阻害作用を有することにより、抗細菌剤として臨床的に使用できる新規化合物およびその製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、微生物の生産する代謝産物について種々研究を続けた結果、土壌より新たに分離されたＦＫＩ−３３６８菌株の培養物中に、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素阻害活性を有する物質が産生されることを見出した。次いで、該培養物中から本ウンデカプレニル二リン酸合成酵素を阻害する活性物質を分離、精製したところ、式（Ｉ）の一般式で表される化学構造を有する物質を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の新規化合物その製造法および用途に関する。
１．式（Ｉ）：
2009035156.tif 000003
（式中、Ｘは、水酸基、炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアミノ基）で表される化合物（以下、ＦＫＩ−３３６８物質という。）または製薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体。
２．抗生物質活性を有することを特徴とする前記１に記載の化合物。
３．ウンデカプレニル二リン酸合成酵素阻害活性を有することを特徴とする前記１に記載の化合物。
４．Ｘがメチル基である前記１〜３のいずれかに記載の化合物。
５．Ｘがアミノ基である前記１〜３のいずれかに記載の化合物。
６．ペニシリウム属に属し、ＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する微生物を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−３３６８物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−３３６８物質を採取することを特徴とする前記１に記載の化合物の製造法。
７．ペニシリウム属に属し、ＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する微生物。
８．ペニシリウム属に属し、抗生物質活性を有するＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する微生物。
９．ペニシリウム属に属し、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素阻害活性を有するＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する微生物。
１０．前記１〜３のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とする医薬組成物。
１１．前記１〜３のいずれかに記載の化合物を含有することを特徴とする抗菌剤。
本発明の化合物は、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素に対して阻害活性を示すことにより、細菌によって引き起こされる感染症に対する薬剤として臨床できることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１は、本発明によるＦＫＩ−３３６８−１物質の紫外部吸収スペクトル（Ｃ２Ｈ５ＯＨ中）を示したものである。
図２は、本発明によるＦＫＩ−３３６８−１物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示したものである。
図３は、本発明によるＦＫＩ−３３６８−１物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ３）を示したものである。
図４は、本発明によるＦＫＩ−３３６８−１物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ３）を示したものである。
図５は、本発明によるＦＫＩ−３３６８−２物質の紫外部吸収スペクトル（Ｃ２Ｈ５ＯＨ中）を示したものである。
図６は、本発明によるＦＫＩ−３３６８−２物質の赤外部吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を示したものである。
図７は、本発明によるＦＫＩ−３３６８−２物質のプロトン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ３）を示したものである。
図８は、本発明によるＦＫＩ−３３６８−２物質のカーボン核磁気共鳴スペクトル（ＣＤＣｌ３）を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
Ａ．ＦＫＩ−３３６８物質
本発明の新規化合物（ＦＫＩ−３３６８物質）は、下記の構造を有する。
2009035156.tif 000004
式中、Ｘは、水酸基、炭素数１〜３の置換されていてもよいアルキル基または置換されていてもよいアミノ基であり、炭素数１〜３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基が含まれる。また、その置換基は特に限定されないが、例えば、水酸基、ハロゲン、アルコキシ基、アミノ基等が含まれる。また、本発明はこれらの製薬学的に許容されるその塩もしくは誘導体も含む。ここで、塩は陰イオン残基と陽イオンの組み合わせ、陽イオン残基と陰イオンの組み合わせのいずれをも含み、陽イオンの例としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属その他の任意の金属陽イオン及びアンモニウムイオン等含窒素陽イオン等が挙げられ、陰イオンの例としては、ハロゲン、硫酸イオン、硝酸イオンその他の陰イオンが挙げられる。また、誘導体はエステルや製薬学的に慣用される保護基との反応生成物等を含む。
このような化合物の例としては、下記の化合物：
2009035156.tif 000005
及び
2009035156.tif 000006
が含まれる（以下、本願においては、それぞれをＦＫＩ−３３６８−１物質およびＦＫＩ−３３６８−２物質という。）。
これらの化合物は新規であり、抗生物質活性、より具体的にはウンデカプレニル二リン酸合成酵素に対して阻害活性作用を有する。
Ｂ．ＦＫＩ−３３６８物質の製造法
本発明はさらに、ペニシリウム属に属し、ＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する微生物（以下、「ＦＫＩ−３３６８物質生産菌」と称する。）を培地で培養し、培養液中にＦＫＩ−３３６８物質を蓄積せしめ、該培養物からＦＫＩ−３３６８物質を採取することを特徴とするＦＫＩ−３３６８物質の製造法を提供する。
前記ＦＫＩ−３３６８物質生産菌は、ペニシリウム属に属するが、例えば、本発明者らが分離したペニシリウム  エスピーＦＫＩ−３３６８菌株が、本発明において最も有効に使用される菌株の一例である。本菌株の菌学的性状を示すと次のとおりである。
Ｉ．形態的性質
本菌株は、ツァペック・イーストエキス寒天培地、２５％グリセリン・硝酸塩寒天培地、麦芽汁寒天培地、ポテト・デキストロース寒天培地などで良好に生育し、各種寒天培地で分生子の着生も良好であった。
ツァペック・イースト寒天培地に生育したコロニーを顕微鏡で観察すると、菌糸は無色で隔壁を有しており、分生子柄（５０〜２５０×１．０〜２．５μｍ）は気菌糸より直立して生じ、分岐することはなかった。分生子柄の先端にはペニシルスが形成される。ペニシルスは二輪生で、２〜４のフィアライドが群生して構成される。フィアライドはアンプル型で、大きさ６．５〜７．５×２．５〜３．５μｍであった。フィアライドの先端からフィアロ型分生子が形成され、時間の経過とともに連鎖状となる。分生子は、球形から亜球形、灰褐色、大きさ２．０〜２．５×２．０〜３．０μｍで、表面は粗面であった。
ＩＩ．各種培地上での培養性状
各種培地上で２５℃、７日間培養した場合の肉眼的観察結果を下記の表１に示す。
【表１】
2009035156.tif 000007
ＩＩＩ．生理学的諸性質
（１）最適生育条件：本菌株の最適生育条件は、ｐＨ４〜６、温度１５．４〜３６．０℃である。
（２）生育の範囲：本菌株の生育範囲は、ｐＨ２〜８、温度７．６〜３８．０℃である。
（３）好気性、嫌気性の区別：好気性
以上の形態的特徴、培養性状および生理的性状に基づき、既知菌種との比較を試みた結果、本菌株はペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）に属することが明らかとなった。従って、本菌株はペニシリウム  エスピー  ＦＫＩ−３３６８と命名し、平成１９年９月１９日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１つくばセンター中央第６）に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３６９）。
本発明の好ましい菌株として、ＦＫＩ−３３６８物質生産菌について説明したが、菌の一般的性状として菌学上の性状はきわめて変異し易く、一定したものではなく、自然的にあるいは通常行なわれる紫外線照射、Ｘ線照射または変異誘導体剤、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、エチルメタンスルホネートなどを用いる人工的変異手段により変異することは周知の事実であり、このような人工的変異株は勿論、自然変異株も含め、ペニシリウム属に属し、ＦＫＩ−３３６８物質を生産する能力を有する菌株は、すべて本発明に使用することができる。また、細胞融合、遺伝子操作などの細胞工学的に変異させた菌株もＦＫＩ−３３６８物質生産菌として包含される。
本発明のＦＫＩ−３３６８物質を製造するに当っては、先ずペニシリウム属に属するＦＫＩ−３３６８物質生産菌が、適当な培地に培養される。本菌株の培養においては、通常の真菌の培養方法が一般に適用される。培地としては微生物が同化し得る炭素源、消化し得る窒素源、さらに必要に応じて無機塩などを含有させた栄養培地が適宜用いられる。
上記の同化し得る炭素源としては、ブドウ糖、ショ糖、糖密、澱粉、デキストリン、セルロース、グリセリン、有機酸などが単独または組み合わせて用いられる。消化し得る窒素源としては、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、大豆粉、コーン・スティープ・リカー、綿実粕、カゼイン、大豆蛋白加水分解物、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸塩、アンモニウム塩などの無機窒素化合物が単独あるいは組み合わせて用いられる。
その他必要に応じてナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩などの無機塩、重金属塩類が添加される。さらに培地には、必要に応じて本菌の生育やＦＫＩ−３３６８物質の生産を促進する微量栄養素、発育促進物質、前駆物質を適当に添加してもよい。
培養は通常振とうまたは通気攪拌培養などの好気的条件下で行うのがよい。工業的には深部通気攪拌培養が好ましい。培地のｐＨは中性付近で培養を行うのが好ましい。培養温度は２０〜３７℃の範囲でも行い得るが、通常は２４〜３０℃、好ましくは２７℃付近に保つのがよい。培養時間は、通常１０〜１５日間培養を行うと、本発明のＦＫＩ−３３６８物質が生成蓄積されるので、好ましくは培養中の蓄積量が最大に達したときに培養を終了すればよい。
これらの培養組成、培地の液性、培養温度、攪拌速度、通気量などの培養条件は使用する菌株の種類や外部の条件などに応じて好ましい結果が得られるように適宜調節、選択されることはいうまでもない。液体培養において、発泡があるときは、例えばシリコン油、植物油、界面活性剤などの消泡剤を適宜使用してもよい。
このようにして得られた培養物中に蓄積されたＦＫＩ−３３６８物質は、培養濾液または培養菌体中に含まれているので、培養濾液を必要に応じて濾過補助剤、例えばセライト、ハイフロースーパーセル等を加えて濾過するか、または遠心分離して培養濾液と菌体とに分離し、培養濾液と菌体との有機溶媒抽出物を濃縮したものの中からＦＫＩ−３３６８物質を採取するのが有利である。
また、培養濾液からＦＫＩ−３３６８物質を採取するには、先ず培養濾液を酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、クロロホルムなどの非親水性有機溶媒で抽出し、抽出液を減圧濃縮して粗製の物質、ＦＫＩ−３３６８物質が得られる。該粗製物質はさらに脂溶性物質の精製に通常用いられる公知の方法、例えばシリカゲル、アルミナなどの担体を用いるカラムクロマトグラフィーによりＦＫＩ−３３６８物質を分離、精製することができる。
菌体からＦＫＩ−３３６８物質を採取するには、菌体を含水アセトン、含水メタノール、含水エタノールなどの含水親水性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液を減圧濃縮し、その濃縮物を酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、クロロホルムなどの非親水性有機溶媒で抽出し、得られた抽出液は、前記の培養液から得た抽出液と合わせて分離精製するか、あるいは前記と同じ方法によってＦＫＩ−３３６８物質を分離、精製することができる。
Ｃ．ＦＫＩ−３３６８物質の用途
上記のように、本発明による新規物質ＦＫＩ−３３６８物質は抗生物質活性を有する化合物を含み、従って、抗生物質、医薬組成物、抗菌剤として使用できる。
【実施例】
【０００７】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれのみに限定されるものではない。
実施例１
５００ｍｌ容三角フラスコに、イーストエキストラクト０．２％、グルコース２．０％、ポリペプトン０．５％、ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ０．０５％、ＫＨ２ＰＯ４０．１％および寒天０．１％を含む培地（ｐＨ６．５に調整）１００ｍｌを仕込み、綿栓後、１２１℃で２０分の条件で高圧蒸気滅菌した。充分に冷却した後、寒天培地上に生育させたペニシリウム  エスピー（Ｐｅｎｉｓｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）ＦＫＩ−３３６８の胞子を無菌的に植菌し、２７℃で３日間振とう培養して種培養液を得た。
５００ｍｌ容三角フラスコに、イタリア米５０ｇと昆布茶粉末０．５ｇからなる培地（ｐＨ無調整）を仕込み、これを２０本作成した。綿栓後、１２１℃で２０分の条件で高圧蒸気滅菌し、充分に冷却した後、三角フラスコあたり上記種培養液２ｍｌを無菌的に移植し、２７℃で１５日間培養した。三角フラスコあたり１００ｍｌの５０％エタノール溶液を加え得られた抽出液を減圧ろ過してエタノール抽出液を得た。これを減圧濃縮した後、１リットルの水溶液とした後、これに等量の酢酸エチルを加えて抽出し、分液漏斗で水層と酢酸エチル層とに分別した。
得られた酢酸エチル層に無水硫酸ナトリウム５００ｇを加えて脱水した後、酢酸エチル層を減圧濃縮し、粗物質Ｉを３．３２ｇ得た。これを少量のクロロホルムに溶解し、クロロホルムで充填したシリカゲルカラム（ＭｅｒｃｋＡｒｔ．７７３４  内径３０ｍｍ、高さ３００ｍｍ）の上端に負荷し、クロロホルムでカラムを洗浄した後、クロロホルム−メタノール（９９：１）で溶出し、減圧濃縮により０．８１ｇの粗物質ＩＩを得た。
これを少量のヘキサンに溶解し、ヘキサンで充填したシリカゲルカラム（ＭｅｒｃｋＡｒｔ．７７３４  内径３０ｍｍ、高さ３００ｍｍ）の上端に負荷し、ヘキサンでカラムを洗浄した後、ヘキサン−酢酸エチル（６０：４０および５５：４５）で溶出し、減圧濃縮により０．２９ｇの粗物質ＩＩＩを得た。
この粗物質ＩＩＩを少量のエタノールに溶解し、続いて高速液体クロマトグラフイー（ＰＥＧＡＳＩＬ  ＯＤＳ、φ２０×２５０ｍｍ、センシュー科学製、日本）に注入し、０．０５％リン酸を含む６０％アセトニトリルを移動相として２１０ｎｍの吸収を検出しながら、７ｍｌ／分間の流速において、２５分および５０分に溶出するピークを集めた。これを減圧濃縮し、アセトニトリルを留去したのち酢酸エチルで抽出し、酢酸エチル層を分別し、脱水した後、減圧濃縮して、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素阻害物質ＦＫＩ−３３６８−Ｉ物質およびＦＫＩ−３３６８−ＩＩ物質の黄色粉末を６３．９ｍｇとＦＫＩ−３３６８−ＩＩ物質の黄色粉末を１．００ｍｇ得た。
（ＩＩ）ＦＫＩ−３３６８―１物質
（１）分子式：Ｃ３０Ｈ３１ＮＯ１０（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ５６４．１８５４（Ｍ−Ｈ）が観察された）（計算値５６５．１９４８）。
（２）分子量：５３８（ＦＡＢマススペクトルよりｍ／ｚ５６１（Ｍ＋Ｎａ）＋が観察された）。
（３）比旋光度：［α］Ｄ２４＋１７°（ｃ＝１．０、エタノール）。
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図１に示すとおりであり、２３９ｎｍ（ε＝１８７００）と２８１ｎｍ（ε＝２６６００）、４２７ｎｍ（ε＝７８７０）に特徴的な吸収極大を示す。
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図２に示す通りであり、λｍａｘＫＢｒｃｍ−１：３４０１，２９６０，２９１５，１６２７，１５８７に特徴的な吸収帯を有する。
（６）溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに可溶、水に不溶。
（７）塩基性、酸性、中性の区別：中性。
（８）物質の色、形状：黄色粉末状物質。
（９）プロトン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、６００ＭＨｚ）は図３に示すとおりであり、化学シフト（ｐｐｍ）は、表２に示すとおりである。
【表２】
2009035156.tif 000008
（１０）カーボン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したカーボン磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、１５０ＭＨｚ）は図４に示す通りであり、化学シフト（ｐｐｍ）は、表２に示す通りである。
以上、ＦＫＩ−３３６８−１物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ＦＫＩ−３３６８−１物質は下記式（ＩＩ）で表される化学構造であることが決定された。
2009035156.tif 000009
（ＩＩＩ）ＦＫＩ−３３６８−２物質
（１）分子式：Ｃ３１Ｈ３２Ｏ１０（高分解能ＦＡＢマススペクトルでｍ／ｚ５６３．１９００（Ｍ−Ｈ）−が観察された）（計算値５６３．１９１７）。
（２）分子量：５５２（ＦＡＢマススペクトルよりｍ／ｚ５７５（Ｍ＋Ｎａ）＋が観察された）。
（３）比旋光度：［α］Ｄ２４＋１３°（ｃ＝１．０、エタノール）。
（４）紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した紫外部吸収スペクトルは図５に示すとおりであり、２３８ｎｍ（ε＝２０１００）と２８２ｎｍ（ε＝３５８００）、４２３ｎｍ（ε＝８０８０）に特徴的な吸収極大を示す。
（５）赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法で測定した赤外部吸収スペクトルは図６に示す通りであり、λｍａｘＫＢｒｃｍ−１：３４３８，２９５８，２９２５，１７３３，１６２５，１５９６
に特徴的な吸収帯を有する。
（６）溶剤に対する溶解性：メタノール、エタノール、アセトニトリル、酢酸エチル、クロロホルム、ジメチルスルホキシドに可溶、水に不溶。
（７）塩基性、酸性、中性の区別：中性。
（８）物質の色、形状：黄色粉末状物質。
（９）プロトン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したプロトン核磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、６００ＭＨｚ）は図７に示すとおりであり、化学シフト（ｐｐｍ）は、表３に示すとおりである。
【表３】
2009035156.tif 000010
（１０）カーボン核磁気共鳴スペクトル：バリアン社製、核磁気共鳴スペクトロメータを用いて測定したカーボン磁気共鳴スペクトル（重メタノール中で測定、１５０ＭＨｚ）は図８に示す通りであり、化学シフト（ｐｐｍ）は、表３に示す通りである。
以上、ＦＫＩ−３３６８−２物質の各種理化学的性状やスペクトルデータを詳細に検討した結果、ＦＫＩ−３３６８−２物質は下記式（ＩＩＩ）で表される化学構造であることが決定された。
2009035156.tif 000011
上記したように、ＦＫＩ−３３６８−１物質、およびＦＫＩ−３３６８−２物質の各種理化学的性状について詳述したが、このような性質に一致する化合物はこれまでに全く報告されておらず、ＦＫＩ−３３６８−１物質、およびＦＫＩ−３３６８−２物質は新規物質であると決定した。
実施例２
次に、本発明のＦＫＩ−３３６８−１物質の生物学的性状について以下に述べる。
（１）黄色ブドウ球菌由来ウンデカプレニル二リン酸合成酵素に対する阻害作用
ウンデカプレニル二リン酸合成酵素活性は、ＬＩらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．８巻、７１２〜７１５頁、２００３年）を一部改変して行った。酵素源としては、黄色ブドウ球菌由来ウンデカプレニル二リン酸合成酵素遺伝子をＰＣＲで増幅し、Ｔ７ファージ由来プロモーターにより大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株においてＩｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを１ｍＭとなるように添加して黄色ブドウ球菌由来ウンデカプレニル二リン酸合成酵素を誘導発現させることにより得られた形質転換大腸菌由来の無細胞抽出液を用いた。
上記形質転換大腸菌は氷冷した緩衝液Ａ（１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、プロテアーゼインヒビターカクテルタブレットミニ）に懸濁し、フレンチプレスを用いて１，０００ｋｇ／ｃｍ２の圧力で菌体を破砕した。これを１８，８００  ｘ  ｇで４℃、１０分間遠心し、得られた上清を１００，０００  ｘ  ｇ、４℃、９０分間超遠心した。得られた上清を１０．０ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度となるように前記の緩衝液Ａで調製し、無細胞抽出液とした。
ウンデカプレニル二リン酸合成酵素活性の測定は、緩衝液Ｂ（１００ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ  塩化カリウム、０．５ｍＭ  塩化マグネシウム、０．５μＭ  ファルネシル二リン酸、３．５μＭ  イソペンテニル二リン酸、５０ｍＭ  ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）中でＦＫＩ−３３６８物質を加え全量９０μＬとして、９６穴マイクロプレートの各穴に入れた。酵素溶液（６２μｇ／ｍｌ）１０μＬを加え全量を１００μＬとして、３７℃で２０分間反応させた後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡを１０μＬ添加し反応を停止させた。遊離したリン酸を定量するために、各穴に緩衝液Ｃ（０．５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、１．５ｍＭ  イノシン、５０μＭ  ＡｍｐｌｅｘＴＭＲｅｄ、０．０２Ｕ  ヌクレオチドフォスフォリラーゼ、１Ｕ  ペルオキシダーゼ、０．４Ｕキサンチンオキシダーゼ）１００μＬを加え室温で４０分間反応させた後、励起波長５４４ｎｍ、測定波長５９０ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。
ファルネシル２リン酸添加と非添加の反応液で得られた蛍光強度（Ｆ．Ｉ．）を次の式に当てはめ阻害％を算出した。
2009035156.tif 000012
その算出結果、ＦＫＩ−３３６８物質のウンデカプレニル二リン酸合成酵素活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）は、ＦＫＩ−３３６８−１物質で４．０μＭ、ＦＫＩ−３３６８−２物質で１０．０μＭと測定された。以上に詳しく述べたように、本発明のＦＫＩ−３３６８物質はウンデカプレニル二リン酸合成酵素に対して阻害活性を示すことから、抗細菌剤として有用であると期待される。
実施例３
本発明のＦＫＩ−３３６８−Ｉ物質の各種微生物に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定は、以下の方法で行った。ＦＫＩ−３３６８−Ｉ物質のエタノール溶液を１０００μｇ／ｍｌの濃度より２倍希釈し、１４段階（１０００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、１２５μｇ／ｍｌ、６２．５μｇ／ｍｌ、３１．３μｇ／ｍｌ、１５．６μｇ／ｍｌ、７．８μｇ／ｍｌ、３．９μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、０．２４μｇ／ｍｌ、０．１２μｇ／ｍｌ）の希釈液を調製した。各希釈液を丸型シャーレ（９０φ×２０ｍｍ、ＩＷＡＫＩ社製）に１ｍｌずつ分注後、感受性ディスク用培地−Ｎ（細菌用、日水製薬社製）またはサブロー・ブドウ糖寒天培地（酵母、かび用  日本製薬社製）を９ｍｌ加えて混合し、平板とした。被検菌はミューラーヒントン培地（細菌、日水製薬製）又は、ポテトデキストロース寒天培地（酵母、かび、日水製薬製）で前培養した。試験当日、得られた菌液を、ミューラーヒントン培地またはポテトデキストロース培地を用いて希釈し、その１白金耳を平板培地に画線塗沫した。この画線塗沫した平板培地を３７℃、１８時間（細菌）または２７℃４０時間（酵母、かび）培養した後、ＭＩＣを判定した。
結果を表４に示す。
【表４】
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これより本願ＦＫＩ−３３６８−Ｉ物質が優れた抗菌活性を有することが明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
以上のとおり、ペニシリウム属に属するＦＫＩ−３３６８を生産する能力を有する微生物を培地に培養して、その培養物中からＦＫＩ−３３６８物質を採取することにより、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素に対する阻害活性物質が得られ、該物質は多剤耐性菌などによる難治性の細菌感染症に対する抗細菌剤としての効果が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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