(57)【要約】  優れたγセクレターゼ阻害効果を有し、かつ、Ａβの生成を特異的に阻害する新規な化合物を提供すること。  下記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。［式中、Ｒ1は炭素数１〜４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はフェニル基を示し；Ｒ2は１つ以上のフェニル基又はハロゲノフェニル基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し；Ｒ3は１つ以上の水酸基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し；Ｒ4は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、「*」はキラル中心を示す。］2009019815.tif 000018
2009019815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【化１】
2009019815.tif 000015
［式中、Ｒ1は炭素数１〜４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はフェニル基を示し；Ｒ2は１つ以上のフェニル基又はハロゲノフェニル基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し；Ｒ3は１つ以上の水酸基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し；Ｒ4は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、「*」はキラル中心を示す。］
【請求項２】
下記式（２）の構造を有する請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【化２】
2009019815.tif 000016
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は前記と同じ。］
【請求項３】
下記式（３）の構造を有する請求項１又は２記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【化３】
2009019815.tif 000017
［式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ。］
【請求項４】
下記から選ばれる化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
[５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン ベンジルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン ｎ−ブチルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン （Ｓ）−α−メチルベンジルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン ４−フルオロベンジルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン ベンジルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−フェニルグリシル−Ｌ−メチオニン ベンジルアミド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有する医薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有するγセクレターゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有するアミロイドタンパク質生成抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有するγセクレターゼが関与する疾病の予防・治療剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩の、γセクレターゼ阻害剤製造のための使用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩の、アミロイドタンパク質生成抑制剤製造のための使用。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩の、γセクレターゼが関与する疾病の予防・治療剤製造のための使用。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を適用することを特徴とするγセクレターゼの阻害方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を適用することを特徴とするアミロイドタンパク質生成の抑制方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを特徴とするγセクレターゼが関与する疾病の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミロイド前駆体タンパク質からアミロイドタンパク質を産生する分解酵素であるγセクレターゼを阻害する化合物、その薬学的に許容し得る塩及びこれらを含有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢化社会の進行と共にアルツハイマー型の認知症患者が増加し、社会的問題となっている。
アルツハイマー型の認知症の発症は、患者の脳に特徴的に診られる老人斑の主要構成成分であるアミロイドβタンパク質（以下、Ａβという）の産生亢進又は分解低下に続く凝集と蓄積という過程に深い関係があると考えられている。
このＡβは疎水性アミノ酸に富む４０個から４２個／４３個のアミノ酸からなり、その前駆体であるアミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＡＰＰという））から加水分解切断によって産生する。また、ＡＰＰにはアミノ酸６９５個からなるＡＰＰ（以下、ＡＰＰ６９５という）、アミノ酸７５１個からなるＡＰＰ（以下、ＡＰＰ７５１という）及びアミノ酸７７０個からなるＡＰＰ（以下、ＡＰＰ７７０という）の３種類が存在する。
ＡＰＰからＡβが産生する反応は２段階の反応であり、第１段階はβセクレターゼによる細胞外ドメインにおけるＮ末端側の切断、第２段階はγセクレターゼによる細胞膜貫通領域におけるＣ末端側の切断である。
従来の知見では、第２段階の切断点がＡβのＣ末端であるγ部位で生じていると考えられてきたが、最近の知見ではγ部位よりさらにアミノ酸残基５から１０個分下流（Ｃ末端方向）の細胞質寄りのε部位（ＡＰＰ７７０でいうＴｈｒ719−Ｌｅｕ720又はＬｅｕ720−Ｖａｌ721）で生じるとする報告がある。【０００３】
現在知られているγセクレターゼ阻害剤としては、その酵素が作用する基質ＡＰＰのγ部位に基づくペプチド模倣化合物であるＤＦＫ−１６７（非特許文献１）、既知阻害剤の中からスクリーニングされた化合物であるＬ−６８５，４５８（非特許文献２）、ＪＬＫ−６（非特許文献３）及びε部位に基づくペプチド模倣化合物（特許文献１）等が報告されている。【０００４】
しかし、ＤＦＫ−１６７はγ部位に対して設計された阻害剤であるため、設計目標や構造が、最近報告されたε部位での知見に基づき完成されたものとは全く異なり、阻害剤としての十分な効果が得られないという問題がある。
また、エイズ治療薬開発の過程で作成されたＬ−６８５，４５８及びα−キモトリプシン阻害剤であるＪＬＫ−６についても、本来ＡＰＰのＡβ産生をするγセクレターゼに対する特異的な阻害剤として開発された化合物ではないため、標的組織での有効性が充分ではなく、γセクレターゼの非特異的な活性抑制は癌化誘導などの重篤な副作用を誘導する可能性があるという問題がある。【０００５】
さらに、特許文献１には、ε部位に基づくペプチド模倣化合物として、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ型化合物が開示されているが、阻害剤としての効果が十分ではないという問題を抱えており、実施例中には、Ｔｈｒのヒドロキシル基がｔ−ブチルエーテル化されたままのＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ型化合物（１'ａ）が、開示されているが、当該化合物はいわば合成中間体にすぎず、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ型化合物として完成されたものではなかった。
そして、Ｔｈｒのヒドロキシル基が保護されていないＴｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ型化合物、当該化合物のγセクレターゼ阻害効果の特異性については、これまで知られていなかった。【０００６】
【特許文献１】ＷＯ０３／０９１２７８号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．， １９９８， ４１（１）， ６−９
【非特許文献２】Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０００， ３９（３０）， ８６９８−８７０４
【非特許文献３】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， １９７９， ２５４（１０）， ４０２７−４０３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、優れたγセクレターゼ阻害効果を有し、かつ、Ａβの生成を特異的に阻害する新規な化合物を提供することである。
本発明の更なる課題は、アルツハイマー病をはじめとする類縁疾患の有用な治療薬・治療方法等を提供することである。ここでいう類縁疾患とは、ダウン症をはじめとする、Ａβが直接・間接に病因として関与することが知られ又は可能性が疑われている疾患、及びＡβが神経病変中に認められる疾患をいう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、関連の研究知見に照らしつつ、ＡＰＰのε部位に着目して創意工夫を重ねた結果、ＡＰＰのε部位を含む４個のアミノ酸配列（Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ）と類似の化学構造を有し、酵素切断部位であるε部位のＴｈｒとＬｅｕとの間のペプチド結合を酵素に対し安定な結合に置き換えたペプチド類似化合物において、特定の構造をもつものが、飛躍的に効率よくγセクレターゼを阻害し、Ａβ産生を抑制することを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は下記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を提供するものである。【００１０】
【化１】
2009019815.tif 000003
【００１１】
［式中、Ｒ1は炭素数１〜４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はフェニル基を示し；Ｒ2は１つ以上のフェニル基又はハロゲノフェニル基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し；Ｒ3は１つ以上の水酸基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し；Ｒ4は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、「*」はキラル中心示す。］【００１２】
また、本発明は上記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有する医薬を提供するものである。【００１３】
また、本発明は上記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有するγセクレターゼ阻害剤を提供するものである。【００１４】
さらに、本発明は上記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有するアミロイドタンパク質生成抑制剤を提供するものである。【００１５】
さらに、本発明は上記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有するγセクレターゼが関与する疾病の予防・治療剤を提供するものである。【００１６】
さらに本発明は、上記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩の、γ−セクレターゼ阻害剤、アミロイドタンパク質生成抑制剤又はγ−セクレターゼが関与する疾病の予防・治療剤製造のための使用を提供するものである。
また、本発明は、上記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を適用することを特徴とする、γ−セクレターゼ阻害方法、アミロイドタンパク質生成抑制方法、又はγ−セクレターゼが関与する疾病の予防・治療方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の化合物及びその薬学的に許容し得る塩は、アルツハイマー病及びその類縁疾患、例えば、ダウン症をはじめとする、Ａβが直接・間接に病因として関与することが知られ又は可能性が疑われている疾患、及びＡβが神経病変中に認められる疾患の予防・治療に用いることができる。
また本発明の化合物及びその薬学的に許容し得る塩は、Ａβの生成を特異的に阻害する作用を有しており、上記疾患の予防・治療の目的により、有効且つ安全に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明において、上記式（１）の化合物は少なくとも５個のキラル中心を含有し（式中、キラル中心を「*」で示す）、これらのキラル中心はＲ型、Ｓ型のいずれの立体もとり得るため、種々なエナンチオマー形、ジアステレオマー形として存在し得るが、このような化合物のラセミ混合物と個々のエナンチオマー及びジアステレオマー並びにそれらの混合物の両方としての全ての光学異性体及び全ての立体異性体は本発明の範囲に包含される。異性体としては、例えば、（２Ｒ，４Ｒ−体）、（２Ｒ，４Ｓ−体）、（２Ｓ，４Ｒ−体）、（２Ｓ，４Ｓ−体）等が挙げられるが、γセクレターゼを強く阻害し、Ａβ生成を特異的に抑制する点で、（２Ｒ，４Ｒ−体）が特に好ましい。【００１９】
本発明において、Ｒ1は、炭素数１〜４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はフェニル基を示し、炭素数１〜４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられる。Ｒ1としては、特にメチル基、イソプロピル基、フェニル基が好ましい。【００２０】
本発明において、Ｒ2は、１つ以上のフェニル基又はハロゲノフェニル基により置換されていても良い炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基としてはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられ、特にメチル基、エチル基、ｎ−ブチル基が好ましい。
また、１つ以上のフェニル基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基の好ましい例として、ベンジル基、１−フェニル−エチル基が挙げられる。
ハロゲノフェニル基におけるハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素等が挙げられ、フッ素が好ましい。ハロゲノフェニル基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基の好ましい例の１つとして、４−フルオロ−ベンジル基が挙げられる。【００２１】
本発明において、Ｒ3は１つ以上の水酸基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、具体的には１−ヒドロキシエチル基又はヒドロキシメチル基等が挙げられ、特に１−ヒドロキシエチル基が好ましい。【００２２】
本発明において、Ｒ4は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、具体的にはイソブチル基又はｓｅｃ−ブチル基等が挙げられ、特にイソブチル基が好ましい。【００２３】
本発明において、γセクレターゼを強く阻害し、Ａβ生成を特異的に抑制する点で、下記式（２）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩がより好ましい。【００２４】
【化２】
2009019815.tif 000004
【００２５】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は前記と同じ。］【００２６】
本発明において、γセクレターゼを強く阻害し、Ａβ生成を特異的に抑制する点で、下記式（３）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩がさらに好ましい。【００２７】
【化３】
2009019815.tif 000005
【００２８】
［式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じ。］【００２９】
本発明において、下記の化合物又はその薬学的に許容し得る塩が、特に好ましい。
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（ＴＬＶＭ−５）、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン ｎ−ブチルアミド（ＴＬＶＭ−７）、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン （Ｓ）−α−メチルベンジルアミド（ＴＬＶＭ−８）、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン ４−フルオロベンジルアミド（ＴＬＶＭ−９）、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン ベンジルアミド（ＴＬＶＭ−１０）、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−フェニルグリシル−Ｌ−メチオニン ベンジルアミド（ＴＬＶＭ−１１）。【００３０】
本発明において、薬学的に許容し得る塩としては、塩酸塩、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、メタンスルホン酸塩、リン酸塩、シュウ酸塩、安息香酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、臭素酸塩、沃素酸塩、コハク酸塩、グルタル酸塩等の酸付加塩、及びリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩等の金属塩が挙げられる。【００３１】
本発明において、「アミロイドタンパク質生成抑制剤」とは、γセクレターゼが基質とする種々のＩ型膜タンパク質のうち、Ａβの生成に対して抑制効果を有し且つ他の基質膜タンパク質（例えば、ヒトＡｌｃａｄｅｉｎ等）の生成に対しては抑制効果を有さない化合物を意味する。より具体的には、後述の方法（実施例１１）により求められる（ｉ）Ａβ分泌率が５０％以下且つ（ｉｉ）Ａｌｃａｄｅｉｎ分泌率が６０％以上であり、さらに（ｉ）／（ｉｉ）が０．８以下、より好ましくは０．４以下である化合物を意味する。【００３２】
本発明のペプチド模倣化合物は、ＡＰＰ分解物に関するこれまでの詳細な研究成果に照らし、酵素に対するε部位の安定化によりγセクレターゼ活性を阻害することが可能であるとの仮定のもとに、ε部位の構造と類似でありしかも酵素に対し安定化された化合物を作り出す試みから得られたものであり、孤発性アルツハイマー病のＡβ産生のみならず早期発症型家族性アルツハイマー病の遺伝変異を有するＡβ産生に対する抑制剤としても用いることができる。【００３３】
ＡＰＰのε部位付近と同様のアミノ酸配列を有し且つγセクレターゼによる切断部位を安定化させるように変更した種々のペプチド類似化合物で、γセクレターゼ阻害活性を有するものを、本発明の目的に使用することができる。例えば、ε部位付近のあるアミノ酸残基−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−を、Ｒについて類似の性質（疎水性／親水性、酸性／塩基性、イオウの有無、ヒドロキシル基の有無等）を有する他のアミノ酸残基で置換した形の化合物であってγセクレターゼ阻害活性を有するものが、そのような化合物の例である。例えば、Ｌｅｕに置換できるアミノ酸としてはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ等が、Ｔｈｒに置換できるアミノ酸としてはＳｅｒ等が、Ｍｅｔに置換できるアミノ酸としてはＡｌａ等が、Ｖａｌに置換できるアミノ酸としてはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、２−アミノブチリックアシッド等が、それぞれ挙げられる。【００３４】
本発明の化合物を合成するための素材および合成の各ステップにおいて用いる方法は、周知であるから、当業者は合成、単離、精製等を適宜行って目的とする化合物を適宜製造することができる。また、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞の自体公知の宿主を利用した遺伝子組み換え技術によって、本発明の化合物のポリペプチド部分を製造することも可能である。化学合成としては、例えば、後述の実施例に準じて行うことができるが、目的とする化合物が得られる限り、いかなる方法を用いてもよい。例えば、周知の方法であるＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）反応、ＤＭＳＯ酸化、アルカリ反応、酸性反応、エポキシ化反応、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、アルキル化反応、ケン化反応、加熱反応、脱炭酸反応、縮合反応、逆相高速液体クロマトグラフィー、アシル化反応、転移反応、異性化反応、メタセシス反応、付加反応、酸化反応、還元反応、ハロゲン化反応、ラジカル反応、カップリング反応、脱離反応、ニトロ化反応、スルホン化反応などを適宜組み合わせて行うことができる。好ましくは、本発明の化合物の構造要素部分を順次反応させ、効率と反応物純度の検定を適宜実施する方法をとる。【００３５】
本発明の化合物は、合成や精製を促進するための修飾、物理・化学的安定化を促進するための修飾、生体内の代謝に対する安定性と不安定性、条件付け等の活性化修飾、更には、脳血管関門通過を含む臓器搬送効率の亢進と低下をもたらす制御修飾を含むものであってよい。ここにいう制御修飾としては、Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇの１１個のアミノ酸よりなる配列を示す。Ｎ末端側にペプチド結合で連結された該制御配列を含むことにより、該化合物は、血液脳関門の通過が容易化され、脳内の目標部位によりよい効率で到達することが可能となる。【００３６】
本発明の化合物のその他の修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、交差架橋、環化、ジスルフィド結合、脱メチル化、交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメート形成、ホルミル化、ガンマーカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー化、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、脂質結合、硫酸化、セレノイル化、アルギニル化のようなトランスファーＲＮＡ媒介のタンパクへのアミノ酸の添加、ユビキチネーション、脱水縮合ならびにアルコキシカルボニル化等がある。【００３７】
更に、本発明の化合物の検出もしくは精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、構造の付加、変更、置換することは技術的に容易であり、これらの生成物も本発明の範囲に包含される。なお、修飾付加にはＦＬＡＧ−ｔａｇ、βガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片やＧＦＰ等の遺伝子工学手法による生成物も本発明の範囲に包含される。【００３８】
更に、必要に応じて、本発明の化合物に対する抗体を作製することができる。抗体は、本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物を選別し、これらを抗原として用いて精製することができる。抗原は当該化合物あるいはそれらの派生物でもよく、例えば４個以下のアミノ酸残基、好ましくは３個以下のアミノ酸残基、さらに好ましくは２個のアミノ酸残基で構成される。精製にはそれらの抗原を組み合わせて用いてもよい。抗原としては必ずしも本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物そのものでなくとも、ＡＰＰのε部位近傍の一次配列を立体構造上外部へ露出して有する化合物であればよい。これらの抗体は、当該部位に免疫学的に結合またはこれを認識する限り、種類及び量は特に限定されない。抗体の結合または認識の有無は、公知の抗原抗体反応によって決定される。
抗体の生産は、本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物を抗原として、アジュバントの存在または非存在下に、単独または担体に結合あるいは同居した状態で、該抗原に対して体液性応答および/または細胞性応答の免疫誘導を行うことによって実施される。あるいは培養条件下でリンパ球もしくはその前駆細胞を免疫刺激することによっても免疫誘導することができる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されず例えばセルロース、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、重合アミノ酸、アルブミンおよびそれらの混合物等が例示されるがこれに限らない。免疫される動物は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ等が好適に用いられる。ポリクローナル抗体は、自体公知の方法により血清として、また血清からの抗体回収法によって取得される。好ましい手段としては、免疫アフィニティークロマトグラフィー法が挙げられる。
モノクローナル抗体の生産は、上記の免疫誘導した動物から抗体活性を含む組織（例えば脾臓またはリンパ節）あるいは培養細胞を回収し、自体公知の永久増殖性細胞（例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することによって行われる。例えば、上記抗体産生細胞と永久増殖細胞とから作製されたハイブリドーマをクローン化し、本発明に係る新規な化合物を特異的に認識する抗体を産生しているハイブリドーマを選別し、該ハイブリドーマの培養液から抗体を回収する。実例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ． ａｎｄ   Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ．（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７）、トリオーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ（１９８３） ４：７２）、およびＥＢＶ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８５）：７７−９６）に記載されるような種々の技法がある。
上記抗体は、本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物の同定、検出、定量、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによる該化合物の調製と精製に用いることができる。上記抗体はヒト型抗体へと、自体公知の手法を用いて改変することができる。
具体的には、本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物、およびそれらに対する特異的抗体で本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物の活性を増加させる活性を持つものは、Ａβ生成阻害薬のスクリーニングに付される化合物の標準物として、またスクリーニング手段として有用である。【００３９】
本発明の化合物およびその誘導体あるいはその分解物に対する抗体を用いたアッセイ法としては、ラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、高速液体クロマトグラフィー、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイ等ならびにこれらの組み合わせが挙げられる。【００４０】
本発明の化合物は、アルツハイマー病およびその類縁疾患に対し、有効量を医薬上許容される担体に入れて若しくは単独で患者に投与して、Ａβ産生量を制御しそれにより、それらの疾患の予防、治療、及び症状の改善のため用いられる。本発明の化合物には、該化合物の脳組織への輸送効率を高める適切な製剤化を施してよい。ここで、アルツハイマーおよびその類縁疾患としては、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤーコブ病、プリオン障害、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、頭部外傷、発作、ダウン症候群、膵炎、封入体筋炎、他の末梢アミロイドーシス及び糖尿病等が挙げられる。【００４１】
本発明の化合物は、そのうち１種を単独で使用しても、あるいは複数を組み合わせて使用してもよい。更には、治療上有利となる他の化合物と併用してもよく、当該他の化合物の作用機作は本発明の化合物と同一であっても、また異なっていてもよい。本発明の化合物を含んでなる医薬品組成物の全身投与の好ましい形態は、注射であり、とりわけ静脈注射である。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆汁酸塩またはフクジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与である。さらに、腸溶処方またはカプセル処方等により、経口投与も可能である。これらの医薬品組成物の投与は局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の形態であってもよい。【００４２】
本発明のγセクレターゼ阻害剤の有効成分であるペプチド類似化合物を使用する際の投与量に厳格な制限はない。対象者や適用疾患等の様々な使用態様によって得られる効果が異なるため、適宜投与量を設定することが望ましいが、その好適な投与量は１日当たり０．０１〜１００ｇ、より好ましくは０．１〜１０ｇである。【００４３】
このような製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固体剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥剤等が挙げられる。これらの製剤は製剤上の常套手段により調製することができる。上記の医薬用無毒性担体としては、例えば、澱粉、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。【００４４】
また、本発明のγセクレターゼ阻害剤は、上記のような医薬品製剤として用いるだけでなく、飲食品等として用いることもできる。この場合には、本発明ペプチド類似化合物をそのまま、または種々の栄養成分を加えて、飲食品中に含有せしめればよい。この飲食品は、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤーコブ病、プリオン障害、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、頭部外傷、発作、ダウン症候群、膵炎、封入体筋炎、他の末梢アミロイドーシス及び糖尿病等の改善、予防等に有用な保健用食品又は食品素材として利用でき、これらの飲食品又はその容器には、前記の効果を有する旨の表示を付してもよい。具体的に本発明のγセクレターゼ阻害剤を飲食品に配合する場合は、飲食品として使用可能な添加剤を適宜使用し、慣用の手段を用いて食用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペースト等に成形してもよく、また種々の食品、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工品、パン、菓子、バター、粉乳、発酵飲食品に添加して使用したり、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料に添加して使用してもよい。なお、飲食品には動物の飼料も含まれる。【００４５】
さらに飲食品としては、有効成分であるペプチド類似化合物を含有する発酵乳、乳酸菌飲料、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液等の発酵乳製品が好適に用いられる。これら発酵乳飲食品の製造は定法に従って製造することができる。例えば発酵乳は、殺菌した乳培地に乳酸菌やビフィズス菌を接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで別途調製したシロップ溶液及びペプチド類似化合物を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品とすることができる。このようにして得られる発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。【００４６】
また、本発明のγセクレターゼ阻害剤は、ヒトを含むあらゆる哺乳動物に適用できる。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明の内容をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら制約されるものではない。【００４８】
実施例１  ［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｓ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（ＴＬＶＭ−４）の製造【００４９】
（工程１）
３−ベンジルオキシカルボニル−２，２−ジメチル−４Ｓ−（Ｎ−メトキシ−Ｎ−メチルカルバモイル）−５Ｒ−メチルオキサゾリジン（化合物１）
Ｎ−Ｃｂｚ−Ｌ−スレオニン（１２．７ｇ， ５０ｍｍｏｌ）、ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（５．９ｇ， ６０ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ塩酸塩（１１．５ｇ， ６０ｍｍｏｌ）をクロロホルム（３５０ｍｌ）に溶かし、トリエチルアミン（８．４ｍｌ， ６０ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ（７．７ｇ， ５０ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で６日間撹拌した。反応混合物に酢酸エチルを加え、１Ｎ−塩酸、水および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した。残留物（１２．４ｇ)をトルエン（２５０ｍｌ）に溶かし、２−メトキシプロペン（３５ｍｌ）とＰＰＴＳ(０．３９ｇ）を加え、８０℃で２時間撹拌した。トルエンを留去した後、残留物にクロロホルムを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝８：１から４：１)で精製し、標記化合物（１２．２ｇ，３６ｍｍｏｌ，８０％)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ:1.36 and 1.40(3H, 2d, J=6Hz) 1.60 and 1.68(3H, 2s) 1.62 and 1.71(3H, 2s) 3.02(3H, s) 3.24 and 3.26 (3H, 2s) 4.15 and 4.22(1H, 2m) 4.39 and 4.57(1H, 2d, J=7Hz) 4.92 and 5.12(1H, 2d, J=12Hz) 5.09 and 5.20(1H, 2d, J=12Hz) 7.28-7.38(5H, m).【００５０】
（工程２）
３−ベンジルオキシカルボニル−２，２−ジメチル−４Ｓ−（４−ペンテノイル）−５Ｒ−メチルオキサゾリジン（化合物２）
化合物１(１２．２ｇ， ３６ｍｍｏｌ)をＴＨＦ(１７０ｍｌ）に溶かし、氷浴中で３−ブテニルマグネシウムブロミド（０．５ｍｏｌ／ｌＴＨＦ溶液， １３０ｍｌ， ６５ｍｍｏｌ）を滴下し、氷浴中で０．５時間撹拌した後、室温で３日間撹拌した。反応混合物にクエン酸水溶液を加え、１０分間撹拌した後、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝９：１から６：１)で精製し、標記化合物（６．９ｇ， ２０．８ｍｍｏｌ， ７８％）および未反応の化合物１(３．１４ｇ， ９．３ｍｍｏｌ)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ:1.37 and 1.38(3H, 2d, J=5Hz) 1.56 and 1.68(3H, 2s) 1.57 and 1.62(3H, 2s) 2.05-2.85(4H, m) 3.96-4.15(2H, m) 4.88-5.17(2H, m) 4.98 and 5.12(1H, 2d, J=12Hz) 5.06 and 5.16(1H, 2d, J=12Hz) 5.60 and 5.80(1H, 2m) 7.28-7.38(5H, m).【００５１】
（工程３）
４−（３−ベンジルオキシカルボニル−２，２−ジメチル−５Ｒ−メチルオキサゾリジン−４Ｓ−イル）−４−オキソ酪酸（化合物３）
化合物２(６．９ｇ，２１ｍｍｏｌ)をトルエン（１０５ｍｌ）に溶かし、ｎＢｕ４ＮＢｒ(８４ｍｇ)、水（１０５ｍｌ）および酢酸（２１ｍｌ）を加えた。氷浴中で１０分間撹拌した後、ＫＭｎＯ４（１１．３ｇ， ７１．４ｍｍｏｌ）を加え、室温ではげしく５時間撹拌した。反応混合物にＮａＨＳＯ３を加えた後、氷浴中で飽和硫酸水素カリウム水溶液を加えｐＨを１から２に調整した。クロロホルムで抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝８：１からＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９７：３)で精製し、標記化合物（５．２ｇ， １４．９ｍｍｏｌ， ８３％)および未反応の化合物２(１．０２ｇ， ３．１ｍｍｏｌ)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ:1.38 and 1.41(3H, 2d, J=5Hz) 1.57 and 1.63(3H, 2s) 1.58 and 1.68(3H, 2s) 2.28-3.02(4H, m) 4.01-4.15(2H, m) 4.94 and 5.11(1H, 2d, J=12Hz) 5.10 and 5.16(1H, 2d, J=12Hz) 7.28-7.40(5H, m). 【００５２】
（工程４）
４−（３−ベンジルオキシカルボニル−２，２−ジメチル−５Ｒ−メチルオキサゾリジン−４Ｓ−イル）−４−オキソ酪酸 メチルエステル（化合物４）
化合物３(５．２ｇ， １５ｍｍｏｌ）をトルエン（２４０ｍｌ）に溶かし、ＭｅＯＨ(６０ｍｌ）およびトリメチルシリルジアゾメタン（１０％ ｈｅｘａｎｅ溶液， ２７ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応混合物に酢酸を滴下し、黄色の色が消えるのを確認した後、減圧下、溶媒を留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝８：１）で精製し、標記化合物（４．６ｇ， １２．７ｍｍｏｌ， ８５％）を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ:1.41 and 1.42(3H, 2d, J=6Hz) 1.57 and 1.63(3H, 2s) 1.58 and 1.68(3H, 2s) 2.20-3.00(4H, m) 3.64 and 3.70(3H, 2s) 3.97-4.18(2H, m) 4.94 and 5.10(1H, 2d, J=12Hz) 5.10 and 5.15(1H, 2d, J=12Hz) 7.26-7.38(5H, m).【００５３】
（工程５）
３−ベンジルオキシカルボニル−２，２−ジメチル−５Ｒ−メチル−４Ｓ−［５−オキソテトラヒドロフラン−２−イル］オキサゾリジン（化合物５）
化合物４（４．１３g， １１．４ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ(１２０ｍｌ）に溶かし、ＮａＢＨ４（８６０ｍｇ， ２３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応混合物を減圧下、溶媒を留去した後、水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した。得られた残留物をトルエン（１００ｍｌ）に溶かし、酢酸（３ｍｌ）を加え、還流下で４時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝３：１から２：１)で精製し、標記化合物（２．９９ｇ， ９．００ｍｍｏｌ， ７９％)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ:1.39(3H, d, J=6Hz) 1.53(3H, s) 1.59(3H, s) 1.95-2.23(2H, m) 2.42-2.57(2H, m) 3.98-4.16(2H, m) 4.79 and 5.06(1H, 2m) 5.15(2H, s) 7.28-7.40(5H, m).【００５４】
（工程６）
３−ベンジルオキシカルボニル−２，２−ジメチル−５Ｒ−メチル−４Ｓ−［４Ｒ−（２−メチル−２−プロペニル）−５−オキソテトラヒドロフラン−２Ｓ−イル］オキサゾリジン（化合物６）
アルゴン雰囲気下、化合物５(２．９９ｇ， ９．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ(５０ｍｌ）に溶かし、−７８℃で２０分間撹拌した後、ＬｉＨＭＤＳ（１．０Ｍ ＴＨＦ溶液， １２ｍｌ， １２ｍｍｏｌ）を加え、−７８℃で１時間撹拌した。反応系中に３−ブロモ−２−メチルプロペン（１．２ｍｌ， １２ｍｍｏｌ）をシリンジで滴下し、さらに−７８℃で２時間撹拌した。反応混合物にクエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝４：１から３：１)で精製し、標記化合物（２．２２ｇ， ５．７ｍｍｏｌ， ８３％)を得た。
1H-NMR (CDCl3)δ: 1.37(3H, d, J=6Hz) 1.55(3H, m) 1.60(3H, s) 1.69(3H, s) 1.95(1H, m) 2.09(1H, m) 2.30(1H, m) 2.53(1H, m) 2.65 and 2.79(1H, 2m) 3.90-4.13(2H, m) 4.68(1H, m) 4.81(1H, m) 5.11(1H, m) 5.15 and 5.18(2H, 2s) 7.30-7.40(5H, m).【００５５】
（工程７）
２Ｒ−ヒドロキシ−１Ｓ−［４Ｒ−（２−メチルプロピル）−５−オキソテトラヒドロフラン−２Ｓ−イル］プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物７）
化合物６(１．３０ｇ， ３．３６ｍｍｏｌ）をメタノール（１２０ｍｌ）および０．１Ｎ−塩酸（３０ｍｌ）に溶かし、撹拌しながら１０％パラジウム−炭素（０．９ｇ）を加えた。水素ガスを満たした風船を用い、反応系中を水素置換し、室温で終夜撹拌した。反応混合物をセライトパットでろ過し、ろ液を濃縮した。残留物を酢酸エチル（３００ｍｌ）に溶かし、水（９０ｍｌ）および炭酸水素ナトリウム（１．６８ｇ， ２０ｍｍｏｌ）を加え、氷浴中で１０分間撹拌した。反応系中にＢｏｃ２Ｏ(８００ｍｇ， ３．６７ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、氷浴中で６時間撹拌し、さらに室温で終夜撹拌した。反応混合物にクロロホルムを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝４：１から２：１)で精製し、標記化合物（０．６２ｇ， １．９７ｍｍｏｌ， ５９％ ２ｓｔｅｐｓ)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 0.90(3H, d, J=7Hz) 0.95(3H, d, J=6Hz) 1.22(3H, d, J=6Hz) 1.34(1H, m) 1.45(9H, s) 1.62-1.73(2H, m) 1.98(1H, m) 2.43(1H, m) 2.68(1H, m) 3.62(1H, m) 4.13(1H, m) 4.70(1H, m) 5.05(1H, d, J=9Hz, NH).【００５６】
（工程８）
２Ｒ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−１Ｓ−［４Ｒ−（２−メチルプロピル）−５−オキソテトラヒドロフラン−２Ｓ−イル］プロピル カルバミン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物８）
化合物７(０．６２ｇ， １．９７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ(１００ｍｌ）に溶かし、イミダゾール（２．７ｇ， ４０ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ(２４ｍｇ， ０．２ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチルジメチルクロロシラン（３．０ｇ， ２０ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で５時間撹拌した。反応混合物を室温にもどし、メタノールを加え０．５時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去した後、反応混合物にクロロホルムを加え、クエン酸水溶液および飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝８：１)で精製し、標記化合物（０．８１ｇ， １．８９ｍｍｏｌ， ９６％）を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 0.07(3H, s) 0.08(3H, s) 0.88(9H, s) 0.89(3H, d, J=6Hz) 0.94(3H, d, J=7Hz) 1.19(3H, d, J=6Hz) 1.31(1H, m) 1.43(9H, s) 1.61-1.71(2H, m) 1.96(1H, m) 2.31(1H, m) 2.65(1H, m) 3.60(1H, m) 3.90(1H, m) 4.63(1H, m) 4.66(1H, d, J=10Hz, NH).【００５７】
（工程９）
酢酸［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６Ｒ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−４Ｓ−ヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプチル］エステル（化合物９）
化合物８(０．８１ｇ， １．８９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ(１１ｍｌ）およびエタノール（１１ｍｌ）に溶かし、塩化カルシウム（４２０ｍｇ， ３．８ｍｍｏｌ）を加え、氷浴中で１５分間撹拌した後、ＮａＢＨ４（２９０ｍｇ， ７．６ｍｍｏｌ）を加え、氷浴中で３時間撹拌した。反応混合物を氷浴中で冷やしながら１Ｍ ＫＨＳＯ４水溶液を加え１５分間撹拌した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去し、ジオール体（０．８５ｇ)を得た。アルゴン雰囲気下、ジオール体（０．８５ｇ)を塩化メチレン（５０ｍｌ）に溶かし、氷浴中で１０分間撹拌した後、トリエチルアミン（２７３ｍｇ， ２．７ｍｍｏｌ）およびアセチルクロリド（２１２ｍｇ， ２．７ｍｍｏｌ）を加え、氷浴で３時間撹拌した。反応混合物にメタノール（１ｍｌ）を加え、１０分間撹拌した後、溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法(ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝８：１から６：１)で精製し、標記化合物（０．６６ｇ， １．３９ｍｍｏｌ， ７３％ ２ｓｔｅｐｓ）を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 0.11(3H, S) 0.12(3H, S) 0.87(3H, d, J=7Hz) 0.88(3H, d,J=7Hz) 0.89(9H, S) 1.12(1H, m) 1.18(3H, d, J=6Hz) 1.25(1H, m) 1.37(1H, m) 1.45(9H, s) 1.47(1H, m) 1.62(1H, m) 1.98(1H, m) 2.04(3H, S) 3.35(1H, m) 3.91(1H, m) 3.97-4.10(2H, m) 4.12(1H, m) 5.09(1H, d, J=10Hz, NH).【００５８】
（工程１０）
酢酸［４Ｓ，６Ｒ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプチル］エステル（化合物１０）
アルゴン雰囲気下、化合物９(０．６６ｇ， １．３９ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶かし、２，６−ルチジン（５００ｍｇ， ４．７ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（０．５３ｍｌ， ２．３ｍｍｏｌ）を加え、室温で３時間撹拌した。反応混合物に飽和食塩水を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝９：１)で精製し、標記化合物（０．５５ｇ， ０．９３ｍｍｏｌ， ６７％)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 0.07(3H, S) 0.08(3H, S) 0.08(3H, S) 0.10(3H, S) 0.87(3H, d, J=6Hz) 0.88(3H, d, J=6Hz) 0.89(9H, S) 0.89(9H, S) 1.05(1H, m) 1.16(3H, d, J=6Hz) 1.22 (1H, m) 1.37(1H, m) 1.44(9H, s) 1.54(1H, m) 1.61(1H, m) 1.81(1H, m) 2.04(3H, S) 3.42(1H, m) 3.89(1H, m) 3.90-4.00(2H, m) 4.90(1H, m) 4.81(1H, d, J=10Hz, NH).【００５９】
（工程１１）
１Ｓ−（１Ｒ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシエチル）−２Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−４Ｒ−ヒドロキシメチル−６−メチルヘプチル カルバミン酸 ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物１１）
化合物１０（０．１０ｇ， ０．１７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ(４ｍｌ）およびエタノール（４ｍｌ）に溶かし、塩化カルシウム（１１４ｍｇ， １．０ｍｍｏｌ）を加え、氷浴中で１５分間撹拌した後、ＮａＢＨ４（７８ｍｇ， ２．０ｍｍｏｌ）を加え、氷浴中で１時間、さらに室温で２４時間撹拌した。反応混合物を氷浴中で冷やしながら１Ｍ ＫＨＳＯ４水溶液を加え１５分間撹拌した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝８：１)で精製し、標記化合物（０．０９ｇ， ０．１６ｍｍｏｌ， ９７％）を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 0.06(3H, S) 0.07(3H, S) 0.08(3H, S) 0.09(3H, S) 0.88(3H, d, J=6Hz) 0.89(9H, s) 0.89(3H, d, J=6Hz) 0.90(9H, S) 1.04(1H, m) 1.15(1H, m) 1.18(3H, d, J=6Hz) 1.27(1H, m) 1.44(9H, s) 1.56-1.68(3H, m) 1.78(1H, m) 3.26(1H, m) 3.53-3.64(2H, m) 3.31-3.41(2H, m) 4.70(1H, d, J=10Hz,  NH).【００６０】
（工程１２）
４Ｓ，６Ｒ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタン酸（化合物１２）
化合物１１（０．３６ｇ， ０．６６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍｌ）と四塩化炭素（４ｍｌ）に溶かし、水（６ｍｌ）および過ヨウ素酸ナトリウム（０．５５ｇ， ２．５６ｍｍｏｌ）を加え、室温で５分間撹拌した後、塩化ルテニウム・ｎＨ２Ｏ(２０ｍｇ）を加え、さらに室温で３時間はげしく撹拌した。反応混合物に水とクロロホルムを加え、有機層を分離した後、セライトパットでろ過し、ろ液を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去し、標記化合物（０．３７ｇ）を得た。そのまま次の反応に使用した。【００６１】
（工程１３）
４Ｓ，６Ｒ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタン酸１Ｓ−ヒドロキシメチル−２−メチルプロピルアミド（化合物１３）
化合物１２（０．３７ｇ)とＬ−バリノール（８３ｍｇ， ０．８０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ(３０ｍｌ）に溶かし、氷浴中で１０分間撹拌した後、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ， １３０ｍｇ， ０．８３０ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１０３ｍｇ， ０．８０ｍｍｏｌ）を加え、氷浴中で１時間さらに室温で終夜撹拌した。反応混合物に酢酸エチルを加え、硫酸水素カリウム水溶液、水および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で順に洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９８：２）で精製を行い、標記化合物（０．３９ｇ， ０．６０ｍｍｏｌ， ９１％ ２ｓｔｅｐｓ）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.05(3H, s) 0.06(3H, s) 0.08(3H, s) 0.10(3H, s) 0.89(9H, s) 0.89(9H, s) 0.89(3H, d, J=6Hz) 0.90(3H, d, J=6Hz) 0.93(3H, d, J=7Hz) 0.95(3H, d, J=7Hz) 1.07(1H, m) 1.18(3H, d, J= 6Hz) 1.40(9H, s) 1.54(1H, m) 1.72(1H, m) 1.76(1H, m) 1.98(1H, m) 2.40(1H, m) 3.41(1H, m) 3.42(1H, m) 3.64(1H, m) 3.72(1H, m) 3.78-3.88(2H, m) 4.72(1H, d, J=10Hz, NH) 6.45(1H, m, NH).【００６２】
（工程１４）
［４Ｓ，６Ｒ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリン（化合物１４）
化合物１３（０．３９ｇ， ０．６０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．２ｍｌ）と四塩化炭素（３．２ｍｌ）に溶かし、水（４．８ｍｌ）および過ヨウ素酸ナトリウム（４９６ｍｇ， ２．３２ｍｍｏｌ）を加え、室温で５分間撹拌した後、塩化ルテニウム・ｎＨ２Ｏ(４ｍｇ)を加え、さらに室温で３時間はげしく撹拌した。反応混合物に水とクロロホルムを加え、有機層を分離した後、セライトパットでろ過し、ろ液を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去し、標記化合物（０．３３ｇ， ８３％)を得た。そのまま次の反応に使用した。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.03(3H, s) 0.05(3H, s) 0.08(3H, s) 0.11(3H, s) 0.81(3H, d, J=6Hz) 0.84(3H, d, J=6Hz) 0.85(9H, s) 0.86(3H, d, J=7Hz) 0.87(9H, s) 0.88(3H, d, J=7Hz) 1.05(1H, m) 1.13(3H, d, J= 6Hz) 1.38(9H, s) 1.40-1.56(2H, m) 1.67-1.80(2H, m) 2.23(1H, m) 2.40(1H, m) 3.56(1H, m) 3.72-3.82(2H, m) 4.51(1H, m) 4.94(1H, d, J=10Hz,NH) 7.33(1H, d, J=7Hz, NH).【００６３】
（工程１５）
［４Ｓ，６Ｒ−ビス（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ）−５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（化合物１５）
アルゴン雰囲気下、化合物１４(０．１８ｇ， ０．２７ｍｍｏｌ）とＨ−Ｍｅｔ−ＮＨＢｎをＴＨＦに(４ｍｌ）溶かし、撹拌しながら４−(４，６−ジメトキシ−１，３，５，−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ−ＭＭ ｎＨ２Ｏ，１２５ｍｇ）を加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物に酢酸エチルを加え、硫酸水素カリウム水溶液および飽和食塩水で順に洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９８：２)で精製を行い、標記化合物（０．１４ｇ， ０．１５ｍｍｏｌ， ６７％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.06(3H, s) 0.07(3H, s) 0.08(3H, s) 0.10(3H, s) 0.84(3H, d, J=7Hz) 0.88(3H, d, J=7Hz) 0.89(9H, s) 0.89(9H, s) 0.90(3H, d, J=7Hz) 0.94(3H, d, J=7Hz) 1.07(1H, m) 1.18(3H, d, J=6Hz) 1.43(9H, s) 1.48(1H, m) 1.63(1H, m) 1.69-1.82(2H, m) 1.94(1H, m) 2.05-2.11(2H, m) 2.06(3H, s) 2.40(1H, m) 2.44-2.59(2H, m) 3.44(1H, m) 3.78(1H, m) 3.90(1H, m) 4.05(1H, m) 4.37-4.48(2H, m) 4.58(1H, m) 4.70(1H, d, J=10Hz, NH) 6.46(1H, br d, J=7Hz, NH) 6.64(1H, br d, J=8Hz, NH) 6.86(1H, m, NH) 7.20-7.35(5H, m).【００６４】
（工程１６）
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｓ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（ＴＬＶＭ−４）
化合物１５(０．１５ｇ， ０．１７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ(３ｍｌ）に溶かし、酢酸（８０ｍｇ）を加えた後、テトラブチルアンモニウムフルオリド・ｎＨ２Ｏ(ＴＢＡＦ， ０．４７ｇ)を加え、室温で８日間撹拌した。反応混合物にクロロホルムを加え、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９７：３)で精製を行い、標記化合物（０．０６ｇ， ０．０９２ｍｍｏｌ， ８１％）を得た。
1H-NMR (CDCl3-CD3OD) δ: 0.86(3H, d, J=7Hz) 0.89(3H, d, J=7Hz) 0.90(3H, d, J=7Hz) 0.92(3H, d, J=7Hz) 1.15(3H, d, J=6Hz) 1.21(1H, m) 1.44(9H, s) 1.46(1H, m) 1.53-1.64(2H, m) 1.66(1H, m) 1.94(1H, m) 2.00-2.15(2H, m) 2.07(3H, s) 2.42-2.50 (2H, m) 2.60(1H, m) 3.38(1H, m) 3.77(1H, m) 4.02(1H, m) 4.10(1H, m) 4.37(1H, d, J=15Hz) 4.42(1H, d, J=15Hz) 4.50(1H, m) 7.20-7.37(5H, m).【００６５】
実施例２
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（ＴＬＶＭ−５）の製造【００６６】
（工程１）
１Ｓ−［４Ｒ−（２−メチルプロピル）−５−オキソテトラヒドロフラン−２Ｓ−イル］−２Ｒ−トリエチルシリルオキシ-プロピル カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物１６）
化合物１０の合成と同様の方法で化合物７(２．００ｇ， ６．３ｍｍｏｌ）とトリエチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（２．６４ｇ， １０ｍｍｏｌ）から標記化合物（１．７３ｇ， ４．０ｍｍｏｌ， ８５％)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 0.56-0.65(6H, m) 0.89(3H, d, J=6Hz) 0.92-1.00(9H, m) 0.96(3H, d, J=6Hz) 1.20(3H, d, J=6Hz) 1.33(1H, m) 1.44(9H, s) 1.64-1.73(2H, m) 1.96(1H, m) 1.96(1H, m) 2.30(1H, m) 2.65(1H, m) 3.61(1H, m) 3.92(1H, m) 4.66(1H, m) 4.74(1H, d, J=10Hz, NH).【００６７】
（工程２）
酢酸［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｓ−ヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）−６Ｒ−トリエチルシリルオキシヘプチル］エステル(化合物１７）
化合物９の合成と同様の方法で化合物１６（１．７３ｇ， ４．０ｍｍｏｌ）から標記化合物（１．７３ｇ， ３．６ｍｍｏｌ， ９１％ ２ｓｔｅｐｓ)を得た。
1H-NMR(CDCl3) δ: 0.65(2H × 3, q, J=8Hz) 0.89(3H, d, J=7Hz) 0.89(3H, d, J=7Hz) 0.98(3H × 3, t, J=8Hz) 1.14(1H, m) 1.21(3H, d, J=6Hz) 1.27(1H, m) 1.38(1H, m) 1.47(9H, s) 1.50(1H, m) 1.65(1H, m) 1.98(1H, m) 2.05(3H, s) 3.36(1H, m) 3.42(1H, br s, OH) 3.97(1H, m) 4.00-4.14(2H, m) 4.18(1H, m) 5.15(1H, d, J=10Hz, NH).【００６８】
（工程３）
酢酸［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２Ｒ−（２−メチルプロピル）−４−オキソ−６Ｒ−トリエチルシリルオキシヘプチル］エステル（化合物１８）
化合物１７(１．７３ｇ， ３．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２０ｍｌ）に溶かし、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬（ＤＭＰ， １．７ｇ， ４．０ｍｍｏｌ）を加えた後、水を飽和させた塩化メチレン（２ｍｌ）をゆっくり加え、室温で３時間撹拌した。反応混合物にチオ硫酸ナトリウム水溶液を加えクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝９：１)で精製し、標記化合物（１．４４ｇ，３．０ｍｍｏｌ，８４％）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ: 0.58(2H × 3, q, J=8Hz) 0.86(3H, d, J=7Hz) 0.91(3H, d, J=7Hz) 0.93(3H × 3, t, J=8Hz) 1.11(1H, m) 1.13(3H, d, J=6Hz) 1.18(1H, m) 1.46(9H, s) 1.58(1H, m) 2.02(3H, s) 2.36(1H, m) 2.41(1H, dd, J=18,6Hz) 2.74(1H, dd, J=18,6Hz) 3.92(1H, dd, J=11,6Hz) 4.03(1H, dd, J=11,5Hz) 4.12(1H, dd, J=9,3Hz) 4.36(1H, dq, J=6,3Hz) 5.37(1H, d, J=9Hz, NH).【００６９】
（工程４）
酢酸［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−６Ｒ−ヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）−４−オキソヘプチル］エステル(化合物１９）
化合物１８(０．２５ｇ，０．５３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ(４ｍｌ）に溶かし、水（１ｍｌ）および酢酸（４ｍｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を注意深く加え、気体の発生がおさまった後、クロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去し、標記化合物（０．２４ｇ)を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ: 0.87(3H, d, J=6Hz) 0.91(3H, d, J=6Hz) 1.10(1H, m) 1.21(3H, d, J=7Hz) 1.22(1H, m) 1.45(9H, s) 1.59(1H, m) 2.03(3H, s) 2.38(1H, m) 2.50(1H, dd, J=18,5Hz) 2.65(1H, dd, J=18,8Hz) 3.87(1H, dd, J=11,6Hz) 4.14(1H, dd, J=11,4Hz) 4.19(1H, br d, J=9Hz) 4.30(1H, m) 5.41(1H, d, J=9Hz, NH).【００７０】
（工程５）
酢酸２Ｒ−［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２，２−ジメチル−６Ｒ−メチル−１，３−ジオキサン−４Ｒ−イル］メチル−４−メチルペンチル エステル（化合物２０）
化合物１９(０．２４ｇ)をＴＨＦ(５ｍｌ）に溶かし、氷浴中で１０分間撹拌した後、ＮａＢＨ(ＯＡｃ）３（３１８ｍｇ， １．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ(３ｍｌ）と酢酸（０．３ｍｌ）の懸濁液を加え、氷浴で１時間、室温で３時間撹拌した。反応混合物に酢酸カリウム水溶液を加え、１０分間撹拌した後、飽和食塩水を加えクロロホルムで抽出した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した。残留物をトルエン（３０ｍｌ）に溶かし、２−メトキシプロペン（１．２ｍｌ）とＰＰＴＳ(３０ｍｇ）を加え、７０℃で３時間撹拌した。トルエンを留去した後、残留物にクロロホルムを加え、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧下、溶媒を留去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフ法（ｈｅｘａｎｅ：ＡｃＯＥｔ＝９：１から６：１）で精製し、標記化合物（０．０９ｇ， ０．２２ｍｍｏｌ， ４２％ ３ｓｔｅｐｓ）と５員環状の保護体（０．０８ｇ）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ: 0.86(3H, d, J=7Hz) 0.88(3H, d, J=7Hz) 1.09(3H, d, J=6Hz) 1.11(1H, m) 1.15(1H, m) 1.32(3H, s) 1.44(9H, s) 1.56(3H, s) 1.56(1H, m) 1.60-1.73(2H, m) 1.91(1H, m) 2.05(3H, s) 3.35(1H, ddd, J=10,7,3Hz) 3.57(1H, ddd, J=10,8,5Hz) 3.94-4.04 (2H,m) 4.08(1H, m) 4.65(1H, d, J=10Hz, NH).【００７１】
（工程６）
［２，２−ジメチル−４Ｒ−（２Ｒ−ヒドロキシメチル−４−メチルペンチル）−６Ｒ−メチル−１，３−ジオキサン−５Ｓ−イル］カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（化合物２１）
化合物１１の合成と同様の方法で化合物２０(０．１２ｇ，０．３０ｍｍｏｌ）から標記化合物（０．１２ｇ）を得た。そのまま次の反応に使用した。【００７２】
（工程７）
２Ｒ−［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２，２−ジメチル−６Ｒ−メチル−１，３−ジオキサン−４Ｒ−イル］メチル−４−メチル吉草酸（化合物２２）
化合物１２の合成と同様の方法で化合物２１(０．４３ｇ）から標記化合物（０．３８ｇ，１．０ｍｍｏｌ，９５％ ２ｓｔｅｐｓ）を得た。
1H-NMR(CDCl3)δ: 0.89(3H, d, J=6Hz) 0.90(3H, d, J=6Hz) 1.09(3H, d, J=6Hz) 1.25(1H, m) 1.30(3H, s) 1.43(9H, s) 1.46(3H, s) 1.55-1.65(2H, m) 1.77(1H, m) 1.96(1H, m) 2.52(1H, m) 3.35(1H, m) 4.08(1H, m) 4.80(1H, d, J=10Hz, NH).【００７３】
（工程８）
２Ｒ−［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２，２−ジメチル−６Ｒ−メチル−１，３−ジオキサン−４Ｒ−イル］メチル−４−メチルペンタノイル−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（化合物２３）
化合物１５の合成と同様の方法で化合物２２(０．１１ｇ， ０．２９ｍｍｏｌ）とＨ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨＢｎから標記化合物（０．１０ｇ， ０．１４ｍｍｏｌ， ４８％)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.85(3H, d, J=7Hz) 0.86(3H, d, J=7Hz) 0.91(3H, d, J=7Hz) 0.93(3H, d, J=7Hz) 1.09(3H, d, J=7Hz) 1.21(1H, m) 1.32(3H, s) 1.44(9H, s) 1.46(3H, s) 1.58(1H, m) 1.73-1.90(2H, m) 1.92-2.17(4H, m) 2.05(3H, s) 2.39(1H, m) 2.41-2.59(2H, m) 3.34(1H, m) 3.56(1H, m) 4.05(1H, m) 4.18(1H, m) 4.42(1H, d, J=6Hz) 4.43(1H, d, J=6Hz) 4.55(1H, m) 4.61(1H, d,J=7Hz, NH) 6.28(1H, m, NH) 6.78(1H, m, NH) 6.84(1H, m, NH) 7.20-7.34(5H, m).【００７４】
（工程９）
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（ＴＬＶＭ−５）
化合物２３(０．１０ｇ， ０．１４ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶かし、ＰＰＴＳ(２０ｍｇ)を加えた後、４０℃で２４時間撹拌した。減圧下、メタノールを留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフ法（ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９８：２)で精製し、標記化合物（０．０７ｇ， ０．１０７ｍｍｏｌ， ７７％)を得た。
1H-NMR (CDCl3-CD3OD) δ: 0.87(3H, d, J=6Hz) 0.91(3H, d, J=7Hz) 0.91(3H, d, J=6Hz) 0.93(3H, d, J=7Hz) 1.15(3H, d, J=6Hz) 1.24(1H, m) 1.45(9H, s) 1.46-1.61(2H, m) 1.66-1.81(2H, m) 1.94(1H, m) 2.03-2.16(2H, m) 2.08(3H, s) 2.44-2.55(3H, m) 3.28(1H, m) 3.64(1H, m) 4.11(1H, d, J=7Hz) 4.23(1H, m) 4.32-4.43(2H, m) 4.50(1H, m) 7.22-7.35(5H, m).【００７５】
実施例３
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンｎ−ブチルアミド（ＴＬＶＭ−７）の製造【００７６】
（工程１）
２Ｒ−［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２，２−ジメチル−６Ｒ−メチル−１，３−ジオキサン−４Ｒ−イル］メチル−４−メチルペンタノイル−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンｎ−ブチルアミド（化合物２４）
化合物１５の合成と同様の方法で化合物２２(０．０８ｇ， ０．２１ｍｍｏｌ）とＨ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ−ｎ−Ｐｒから標記化合物（０．１７ｇ）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88(3H, d, J=7Hz) 0.90(3H, d, J=7Hz) 0.91(3H, t, J=6Hz) 0.96(3H, d, J=7Hz) 1.01(3H, d, J=7Hz) 1.09(3H, d, J=6Hz) 1.20(1H, m) 1.31(2H, m) 1.33(3H, s) 1.34(3H, s) 1.44(9H, s) 1.46(2H, m) 1.62(1H, m) 1.75-1.89(2H, m) 1.90-2.14(4H, m) 2.09(3H, s) 2.26(1H, m) 2.43-2.61(2H, m) 3.22(2H, m) 3.35(1H, m) 3.57(1H, m) 4.05(1H, m) 4.17(1H, m) 4.40(1H, m) 4.72(1H, d, J=10Hz, NH) 6.25(1H, br d, J=9Hz, NH) 6.77(1H, br d, J=9Hz, NH) 7.25(1H, br d,J=10Hz, NH).【００７７】
（工程２）
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニンｎ−ブチルアミド（ＴＬＶＭ−７）
ＴＬＶＭ−５の合成と同様の方法で化合物２４(０．１６ｇ)から標記化合物（０．０７ｇ， ０．１１ｍｍｏｌ， ５４％ ２ｓｔｅｐｓ)を得た。
1H-NMR (CDCl3-CD3OD) δ: 0.88(3H, d, J=6Hz) 0.91(3H, d, J=7Hz) 0.92(3H, t, J=7Hz) 0.92(3H, d, J=7Hz) 0.93(3H, d, J=7Hz) 1.18(3H, d, J=6Hz) 1.29(1H, m) 1.34(2H, m) 1.40-1.61(3H, m) 1.44(9H, s) 1.77-1.86(2H, m) 1.97(1H, m) 2.02-2.13(2H, m) 2.09(3H, s) 2.31(1H, m) 2.43-2.59(3H, m) 3.12-3.35(3H, m) 3.75(1H, m) 4.20(1H, m) 4.32(1H, m) 4.60(1H, m) 5.34(1H, d, J=8Hz, NH) 6.70(1H, m, NH) 6.92(1H, m, NH) 7.92(1H, m, NH).【００７８】
実施例４
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン（Ｓ）−α−メチルベンジルアミド（ＴＬＶＭ−８）の製造【００７９】
（工程１）
２Ｒ−［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２，２−ジメチル−６Ｒ−メチル−１，３−ジオキサン−４Ｒ−イル］メチル−４−メチルペンタノイル−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン（Ｓ）−α−メチルベンジルアミド（化合物２５）
化合物１５の合成と同様の方法で化合物２２(０．０７ｇ， ０．１９ｍｍｏｌ）とＨ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ−（Ｓ）−ＣＨ(Ｍｅ)Ｐｈから標記化合物（０．１２ｇ)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.88(3H, d, J=6Hz) 0.90(3H,d, J=7Hz) 0.92(3H, d, J=6Hz) 0.96(3H, d, J=7Hz) 1.09(3H, d, J=7Hz) 1.26(1H, m) 1.33(3H, d, J=7Hz) 1.44(9H, s) 1.45(3H, s) 1.48(3H, s) 1.59(1H, m) 1.79(1H, m) 1.83-2.22(4H, m) 2.01(3H, s) 2.26-2.60(4H, m) 3.36(1H, m) 3.57(1H, m) 4.06(1H, m) 4.21(1H, m) 4.56(1H, m) 4.72(1H, d, J=10Hz, NH) 5.07(1H, m) 6.23(1H, m, NH) 6.69(1H, m, NH) 6.76(1H, m, NH) 7.21-7.36(5H, m).【００８０】
（工程２）
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン（Ｓ）−α−メチルベンジルアミド（ＴＬＶＭ−８）
ＴＬＶＭ−５の合成と同様の方法で化合物２５(０．１２ｇ）から標記化合物（０．０８ｇ， ０．１２ｍｍｏｌ， ６３％ ２ｓｔｅｐｓ)を得た。
1H-NMR (CDCl3-CD3OD) δ: 0.88(3H, d, J=6Hz) 0.92(3H, d, J=7Hz) 0.92(3H, d, J=7Hz) 0.94(3H, d, J=7Hz) 1.15(3H, d, J=6Hz) 1.27(1H, m) 1.44(9H, s) 1.46(3H, d, J=7Hz) 1.47-1.58(2H, m) 1.72-1.81(2H, m) 1.88(1H, m) 1.96-2.06(2H, m) 2.02(3H, s) 2.24(1H, m) 2.31-2.44(3H, m) 2.50(1H, m) 3.28(1H, m) 3.68(1H, m) 4.18(1H, d, J=7Hz) 4.26(1H, m) 4.49(1H, m) 4.52(1H, m) 5.42(1H, m, NH) 7.05(1H, m, NH) 7.55(1H, m, NH) 7.83(1H, m, NH).【００８１】
実施例５
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン ４−フルオロベンジルアミド（ＴＬＶＭ−９）の製造【００８２】
（工程１）
２Ｒ−［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２，２−ジメチル−６Ｒ−メチル−１，３−ジオキサン−４Ｒ−イル］メチル−4−メチルペンタノイル−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン ４−フルオロベンジルアミド（化合物２６）
化合物１５の合成と同様の方法で化合物２２(０．０８ｇ， ０．２１ｍｍｏｌ）とＨ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−ＮＨ−ｐ−Ｆ−Ｂｎから標記化合物（０．１６ｇ)を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.85(3H, d, J=6Hz) 0.87(3H, d, J=6Hz) 0.92(3H, d, J=7Hz) 0.94(3H, d, J=7Hz) 1.09(3H, d, J=7Hz) 1.18(1H, m) 1.33(3H, s) 1.34(3H, s) 1.44(9H, s) 1.58(1H, m) 1.79(1H, m) 1.84(1H, m) 1.98(1H, m) 2.04-2.17(3H, m) 2.07(3H, s) 2.39(1H, m) 2.44-2.63(2H, m) 3.35(1H, m) 3.57(1H, m) 4.07(1H, m) 4.12(1H, m) 4.31-4.45(2H, m) 4.60(1H, m) 4.73(1H, d, J=10Hz, NH) 6.20(1H, m, NH) 6.75(1H, m, NH) 6.83(1H, m, NH) 6.95-7.03(2H, m) 7.20-7.28(2H, m).【００８３】
（工程２）
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン４−フルオロベンジルアミド（ＴＬＶＭ−９）
ＴＬＶＭ−５の合成と同様の方法で化合物２６(０．１６ｇ）から標記化合物（０．０９ｇ， ０．１３ｍｍｏｌ， ６４％ ２ｓｔｅｐｓ）を得た。
1H-NMR (CDCl3-CD3OD) δ: 0.87(3H, d, J=6Hz) 0.90(3H, d, J=7Hz) 0.91(3H, d, J=7Hz) 0.91(3H, d, J=7Hz) 1.16(3H, d, J=6Hz) 1.26(1H, m) 1.45(9H,s) 1.47-1.58(2H, m) 1.68-1.81(2H, m) 1.93(1H, m) 2.05-2.24(2H, m) 2.08(3H, s) 2.43-2.52(3H, m) 3.22(1H, m) 3.64(1H, m) 4.12(1H, d, J=7Hz) 4.26(1H, m) 4.33(1H, d, J=15Hz) 4.38(1H, d, J=15Hz) 4.50(1H, dd, J=8,6Hz) 5.52(1H, m, NH) 6.97-7.04(2H, m) 7.20(1H, m, NH) 7.21-7.36(2H, m) 7.73(1H, m, NH) 7.83(1H, m, NH).【００８４】
実施例６
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（ＴＬＶＭ−１０）の製造【００８５】
（工程１）
２Ｒ−［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２，２−ジメチル−６Ｒ−メチル−１，３−ジオキサン−４Ｒ−イル］メチル−４−メチルペンタノイル−Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン ベンジルアミド（化合物２７）
化合物１５の合成と同様の方法で化合物２２（０．０４ｇ， ０．１１ｍｍｏｌ）とＨ−Ａｌａ−Ｍｅｔ−ＮＨ−Ｂｎから標記化合物（０．０４ｇ， ０．０６ｍｍｏｌ， ５５％）を得た。
1H-NMR (CDCl3) δ: 0.85(3H, d, J=7Hz) 0.86(3H, d, J=6Hz) 1.09(3H, d, J=7Hz) 1.16(1H, m) 1.31(3H, s) 1.32(3H, s) 1.36(3H, d, J=7Hz) 1.44(9H, s) 1.57(1H, m) 1.74(1H, m) 1.86(1H, m) 1.98(1H, m) 2.03(1H,m) 2.05(3H, s) 2.12(1H, m) 2.33(1H, m) 2.43-2.58(2H, m) 3.33(1H, m) 3.56(1H, m) 4.08(1H, m) 4.34(1H, m) 4.42(2H, m) 4.59(1H, m) 4.82(1H, d, J=10Hz,  NH) 6.28(1H, m, NH) 6.88(1H, m, NH) 7.00(1H, m, NH) 7.17-7.34(5H, m).【００８６】
（工程２）
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン ベンジルアミド（ＴＬＶＭ−１０）
ＴＬＶＭ−５の合成と同様の方法で化合物２７(０．０４ｇ）から標記化合物（０．０１ｇ， ０．０１６ｍｍｏｌ， ２７％）を得た。
1H-NMR (CDCl3-CD3OD) δ: 0.91(3H, d, J=6Hz) 0.95(3H, d, J=6Hz) 1.18(3H, d, J=6Hz) 1.33(1H, m) 1.46(9H, s) 1.48(3H, d, J=7Hz) 1.55-1.83(3H, m) 1.99(1H,m) 2.06(3H, s) 2.07(1H, m) 2.10(1H, m) 2.29(1H, m) 2.46-2.53(2H, m) 3.38(1H, m) 3.52(1H, m) 4.19(1H, m) 4.34-4.46(2H, m) 4.47-4.62(2H, m) 7.21-7.38(5H, m).【００８７】
実施例７
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−フェニルグリシル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（ＴＬＶＭ−１１）の製造【００８８】
（工程１）
２Ｒ−［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−２，２−ジメチル−６Ｒ−メチル−１，３−ジオキサン−４Ｒ−イル］メチル−４−メチルペンタノイル−Ｌ−フェニルグリシル−Ｌ−メチオニン ベンジルアミド（化合物２８）
化合物１５の合成と同様の方法で化合物２２(０．１３ｇ， ０．３５ｍｍｏｌ）とＨ−Ｐｈｇ−Ｍｅｔ−ＮＨ−Ｂｎから標記化合物（０．１２ｇ， ０．１７ｍｍｏｌ， ７９％)を得た。
1H-NMR (CDCl3-CD3OD) δ: 0.89(3H, d, J=7Hz) 0.92(3H, d, J=7Hz) 1.14(3H, d, J=6Hz) 1.24(1H, m) 1.34(3H, s) 1.42(3H, s) 1.43(9H, s) 1.48-1.62(2H, m) 1.65-1.80(2H, m) 1.98(1H, m) 2.07(3H, s) 2.14(1H, m) 2.40-2.55(3H, m) 3.22(1H, m) 3.60(1H, m) 4.05(1H, m) 4.26-4.37(3H, m) 4.53(1H, m) 7.05-7.25(10H, m).【００８９】
（工程２）
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−フェニルグリシル−Ｌ−メチオニンベンジルアミド（ＴＬＶＭ−１１）
ＴＬＶＭ−５の合成と同様の方法で化合物２８(０．１２ｇ， ０．１７ｍｍｏｌ）から標記化合物（０．０６ｇ， ０．０９ｍｍｏｌ， ５１％)を得た。
1H-NMR (CDCl3-CD3OD) δ: 0.88(3H, d, J=6Hz) 0.92(3H, d, J=6Hz) 1.14(3H, d, J=6Hz) 1.23(1H, m) 1.44(9H, s) 1.47-1.62(2H, m) 1.64-1.76(2H, m) 1.97(1H, m) 2.07(3H, s) 2.16(1H, m) 2.44-2.55(3H, m) 3.22(1H, m) 3.60(1H, m) 4.21(1H, m) 4.27-4.40(3H, m) 4.57(1H, m) 7.16-7.40(10H, m).【００９０】
実施例８  γセクレターゼ阻害作用の検討（Ｉ）
（１）試験方法
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ社）にＡＰＰ Ｃ９９ ｐｃＤＮＡ３．１（そのコード領域の塩基配列を配列番号１に示す）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、 ２００３、 ２７８、 ４９４４８−４９４５８）を導入しＡＰＰ−Ｃ９９（ＡＰＰからＡβが生成される２段階反応の第１段階において、αもしくはβセクレターゼによって切除されるポリペプチド部分を予め欠いたＡＰＰ人工断片）を安定的に発現していることが確認されている細胞株（Ｃ９９細胞）を用いて、４種類の被験物質（ＴＬＶＭ−５、７、８、９）のγセクレターゼ阻害作用についてｉｎ ｖｉｔｒｏにて検討した。
本試験において、Ｃ９９細胞の培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）５００ｍＬに、ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社）５５ｍｌ、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）５．５ｍｌ及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）５．５ｍｌを添加したものを用いた。
Ｃ９９細胞を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地に懸濁し、１ｍｌ（５×１０４ｃｅｌｌｓ）／ｗｅｌｌずつ２４ウェルコラーゲンプレート（秋田住友ベーク社）に添加して３日間培養した後、ウェル内の培地を除去し、培地１ｍｌ／ｗｅｌｌでウェル内を洗浄した。培地を除去後、新しい培地０．４ｍｌ／ｗｅｌｌを添加した。被験物質及び陽性対照物質に曝露して２４時間インキュベートし、培養上清を採取した。陽性対照物質としてはＬ−６８５，４５８（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社）及び特許文献１（ＷＯ０３／０９１２７８号公報）の実施例１に開示されているＢｏｃ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ（以下、ＬＶＭＬ−１という）を用いた。曝露濃度は、すべての被験物質及び陽性対照物質について０．３、１、３及び１０μｍｏｌ／Ｌの４濃度を設定した。培地上清中のＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）の濃度をＨｕｍａｎ Ａｍｙｌｏｉｄβ（１−４０）（Ｎ）測定キット（Ｌ）−ＩＢＬ及びＨｕｍａｎ Ａｍｙｌｏｉｄβ（１−４２）（Ｎ）測定キット（Ｌ）−ＩＢＬ（免疫生物研究所）を用いて測定した。Ｃ９９細胞を播種する前の培地に元々含有されているＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）濃度を差し引いて、それぞれの分泌量を算出した。また、陰性対照（５％ＤＭＳＯ含有培地、終濃度で１％ＤＭＳＯとなる）のＡβ分泌率を１００％として、被験物質及び陽性対照の各濃度におけるＡβ分泌率を算出した。【００９１】
（２）結果
表１〜３に示すように、ＴＬＶＭ−５、７、８及び９は陽性対照物質であるＬ−６８５，４５８及びＬＶＭＬ−１よりも格段に強いγセクレターゼ阻害作用を示した。
また、特許文献１（ＷＯ０３／０９１２７８）の実施例６には、Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ型化合物（１’ａ）のＡβ４０産生に対する阻害率（曝露濃度１０μＭ）が７３％であったことが示されている。一方、表１に示す通り、ＴＬＶＭ−５、７、８及び９のＡβ４０の分泌率（曝露濃度１０μＭ）は３％以下（阻害率として９７％以上）であり、さらにはより低い濃度域（曝露濃度０．３μＭ）においても分泌率２４％以下（阻害率として７６％以上）の活性を保持しており、本発明の化合物が従来化合物と比較して極めて優れたγセクレターゼ阻害作用を奏することが確認された。【００９２】
【表１】
2009019815.tif 000006
【００９３】
【表２】
2009019815.tif 000007
【００９４】
【表３】
2009019815.tif 000008
【００９５】
実施例９  γセクレターゼ阻害作用の検討（ＩＩ）
（１）試験方法
実施例８において、γセクレターゼ活性に対する強い阻害活性が認められたＴＬＶＭ−５、７、８、９については低濃度での追加実験をした（曝露濃度：被験物質については０．０３、０．１及び０．３μｍｏｌ／Ｌの３濃度、陽性対照については、０．１、０．３、１及び３μｍｏｌ／Ｌの４濃度を設定）。
また、Ａβ分泌を５０％阻害するときの被験物質濃度（ＩＣ５０）を挟む２濃度のＡβ分泌率を用い、次の式よりＩＣ５０を算出した。【００９６】
ＩＣ５０ ＝ １０[LOG(A/B)*(50-C)/(D-C)+LOG(B)]
Ａ：５０％阻害を挟む２点の高濃度側の被験物質濃度
Ｂ：５０％阻害を挟む２点の低濃度側の被験物質濃度
Ｃ：Ｂでの分泌率（％）
Ｄ：Ａでの分泌率（％）【００９７】
（２）結果
表４〜６に示すように、ＴＬＶＭ−５、７、８及び９は低濃度域（０．０３〜０．３μｍｏｌ／Ｌ）においても優れたγセクレターゼ阻害作用を示した。
被験物質（ＴＬＶＭ−５、７、８及び９）のＡβ（１−４０）及びＡβ（１−４２）に対するＩＣ５０はそれぞれ０．０３３〜０．０８９μｍｏｌ／Ｌ（陽性対照：１．８μｍｏｌ／Ｌ）、０．１１〜０．２９μｍｏｌ／Ｌ（陽性対照：１．７μｍｏｌ／Ｌ）であり、陽性対照と比較して格段に強い効果を奏した。【００９８】
【表４】
2009019815.tif 000009
【００９９】
【表５】
2009019815.tif 000010
【０１００】
【表６】
2009019815.tif 000011
【０１０１】
実施例１０  細胞毒性の測定
（１）試験方法
以下に示す方法を用いて、４種類の被験物質（ＴＬＶＭ−５、７、８、９）のＣ９９細胞に対する細胞毒性を測定した。
本試験において、Ｃ９９細胞の培地としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）５００ｍｌに、ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社）５５ｍｌ、ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ社）５．５ｍｌ及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社）５．５ｍｌを添加したものを用いた。
Ｃ９９細胞を０．７５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように培地に懸濁し、１００μＬ（０．７５×１０４ｃｅｌｌｓ）／ｗｅｌｌずつ９６ウェルコラーゲンプレート（秋田住友ベーク社）に添加して２日間培養した後、ウェル内の培地５０μＬ／ｗｅｌｌを除去し、新しい培地３０μＬ／ｗｅｌｌを添加した。被験物質２０μＬ／ｗｅｌｌ（最終濃度は、０．３、１、３、１０、３０及び１００μｍｏｌ／Ｌ）に２４時間曝露したのち、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所）を用いて細胞生存率を測定した。【０１０２】
（２）結果
表７に示すように、３０μｍｏｌ／Ｌ以上の濃度において細胞生存率を低下させる被験物質が散見されたが、本発明の実施例で用いられた曝露濃度（１０μｍｏｌ／Ｌ以下）ではいずれの阻害剤についても細胞生存率の低下は認められなかったことから、本実施例において認められたγセクレターゼ活性阻害作用は、被験物質の細胞毒性に起因するものではないと判断された。【０１０３】
【表７】
2009019815.tif 000012
【０１０４】
実施例１１  基質特異性の検討
（１）試験方法
γセクレターゼの基質としてＡＰＰと脳神経細胞で共局在化することが知られているヒトＡｌｃａｄｅｉｎ（以下、Ａｌｃという）を構成するファミリーのうち、細胞外の一回目の切断サイトおよびγセクレターゼによる切断サイトが決定しているＡｌｃαの人工断片（以下、Ａｌｃα Ｃ１５０という）を用いて、本発明のγセクレターゼ阻害剤の基質特異性を検討した。Ａｌｃαの一回切断コンストラクトから生成するβ−ＡｌｃαはＡβの測定に用いるｓＥＬＩＳＡ法では定量できないため、ＡｌｃαおよびＣ９９の一回切断コンストラクトのＮ末端側にＦＬＡＧ−タグを付けたタンパクを細胞に発現させて、培地中に分泌したＦＬＡＧ−Ａβ様ペプチドを抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降法で回収し、同抗体を用いたウェスタンブロット法で検出した。具体的な方法を以下に示す。
１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（和光純薬工業株式会社）６ｍｌで培養したＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ社）（１×１０７ｃｅｌｌｓ／１０ｃｍ ｄｉｓｈ）にＦＬＡＧ ＡＰＰ Ｃ９９ ｐｃＤＮＡ３．１（そのコード領域の塩基配列を配列番号２に示す）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００３、２７８、４９４４８−４９４５８（ｐｃＤＮＡ３−ＡＰＰＣ９９より作製））またはＦＬＡＧ Ａｌｃα Ｃ１５０ ｐｃＤＮＡ３．１（そのコード領域の塩基配列を配列番号３に示す）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、 ２００４、 ２７９、 ２４３４３−２４３５４（ｐｃＤＮＡ３ＡｌｃαΔＥと同一））をリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて試薬プロトコールに従い導入し、各０．２又は２μｍｏｌ／Ｌになるように各阻害剤及び陽性対照物質（γ−Ｓｅｃｒｅｔａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＩＸ（ＤＡＰＴ））（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｎｔａｃｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ社）を加えた。陰性対照は同用量のＤＭＳＯ（和光純薬工業株式会社）を加えた。２４時間後、培養上清を回収しビーズ（１００μＬの５０％（ｖ／ｖ）プロテイン−Ｇセファロース（ＧＥヘルスケア社））でサンプルを予備精製した後、１５μＬの５０％（ｖ／ｖ）抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２ビーズ（ＳＩＧＭＡ社）を加えて、４℃にて１時間インキュベートした。遠心分離しビーズを回収し、バッファー（１０ｍＭ トリス−塩酸［ｐＨ８．０］、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ｎ−オクチルグルコシド、０．０２５％ アジ化ナトリウム）で３回洗浄し、培地中のＡβおよびβ−Ａｌｃαを回収した。１５％ トリス−トリシン ゲル（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９８７， １６６（２）， ３６８−３７９）にてＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、転写した。メンブレンはＰＢＳ中で５分間煮沸した後、抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ社）を加えてインキュベートし、ウェスタンブロッティング検出試薬ＥＣＬ（ＧＥヘルスケア社）にて検出を行った。このシグナルをＶｅｒｓａ−ｄｏｃ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社）で定量し、タンパク質分泌率を算出した（陰性対照のタンパク質分泌率を１００％とする）。【０１０５】
（２）結果
表８、９に示したように、ＴＬＶＭ−５、７、８、９及び１１については０．２μｍｏｌ／Ｌ、ＴＬＶＭ−１０については２μｍｏｌ／Ｌの濃度で、細胞に作用させた場合、Ａｌｃα−Ｃ１５０のγ切断を阻害せず、ＡＰＰ−Ｃ９９の切断を特異的に阻害した。
特定の濃度域での阻害効果に特異性が認められたことから、アルツハイマー病の有用な治療薬になると考えられた。【０１０６】
【表８】
2009019815.tif 000013
【０１０７】
【表９】
2009019815.tif 000014
【配列表】
2009019815000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年11月20日(2008.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【化１】
2009019815.tif 000019
［式中、Ｒ１は炭素数１〜４の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基又はフェニル基を示し；Ｒ２は１つ以上のフェニル基又はハロゲノフェニル基により置換されていてもよい炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し；Ｒ３は１つ以上の水酸基を有する炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し；Ｒ４は炭素数１〜４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示し、「＊」はキラル中心を示す。］
【請求項２】
下記式（２）の構造を有する請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【化２】
2009019815.tif 000020
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は前記と同じ。］
【請求項３】
下記式（３）の構造を有する請求項１又は２記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
【化３】
2009019815.tif 000021
［式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じ。］
【請求項４】
下記から選ばれる化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン  ベンジルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン  ｎ−ブチルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン  （Ｓ）−α−メチルベンジルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−バリル−Ｌ−メチオニン  ４−フルオロベンジルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−アラニル−Ｌ−メチオニン  ベンジルアミド、
［５Ｓ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−４Ｒ，６Ｒ−ジヒドロキシ−２Ｒ−（２−メチルプロピル）ヘプタノイル］−Ｌ−フェニルグリシル−Ｌ−メチオニン  ベンジルアミド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有する医薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有するγセクレターゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有するアミロイドタンパク質生成抑制剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を含有するγセクレターゼが関与する疾病の予防・治療剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩の、γセクレターゼ阻害剤製造のための使用。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩の、アミロイドタンパク質生成抑制剤製造のための使用。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩の、γセクレターゼが関与する疾病の予防・治療剤製造のための使用。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を適用することを特徴とするγセクレターゼの阻害方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を適用することを特徴とするアミロイドタンパク質生成の抑制方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを特徴とするγセクレターゼが関与する疾病の予防・治療方法。
【国際調査報告】
2009019815.tif 000022
2009019815.tif 000023
2009019815.tif 000024
2009019815.tif 000025
2009019815.tif 000026
2009019815.tif 000027