(57)【要約】  ホスファターゼと特異的に反応し、かつ蛍光強度が十分に高く、かつレシオ測定が可能な程度に蛍光スペクトルまたは励起スペクトルが十分にシフトする化合物の提供を目的とする。本発明は、  一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体またはその塩である。2008108177.tif 000042前記式中、Ｒ1およびＲ2は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式2008108177.tif 000043（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）で表わされる基である。
2008108177.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体またはその塩。
【化１】
2008108177.tif 000037
前記式中、
Ｒ1およびＲ2は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式
【化２】
2008108177.tif 000038
（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）
で表わされる基である。
【請求項２】
一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体またはその塩の製造方法であって、
一般式（ＩＩ）で表わされる化合物をリン酸化、次いでＲ基の脱保護に付して、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を得る製造方法。
【化３】
2008108177.tif 000039
前記式（Ｉ）中、
Ｒ1およびＲ2は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式
【化４】
2008108177.tif 000040
（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）
で表わされる基であり、
前記式（ＩＩ）中、
Ｒ11およびＲ12は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式−（ＣＨ2）n−ＯＨで表わされる基（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）であり、
Ｒは、水酸基の保護基である。
【請求項３】
請求項１に記載のホスホクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブ。
【請求項４】
請求項３に記載の蛍光プローブを含むホスファターゼ測定試薬。
【請求項５】
ホスファターゼ活性を測定する方法であって、
前記方法が、
請求項４に記載のホスファターゼ測定試薬と試料とを混合し、
前記ホスファターゼ測定試薬中の一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量し、
前記ホスファターゼ測定試薬中の前記一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体およびその塩の量と、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量とから前記試料中のホスファターゼの量を定量することを含む方法。
【化５】
2008108177.tif 000041
前記式（ＩＩＩ）中、
Ｒ11およびＲ12は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式−（ＣＨ2）n−ＯＨで表わされる基（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）である。
【請求項６】
前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量が、蛍光強度の差を１以上の波長で測定することにより行われる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量が、
蛍光強度の差を２つの波長で測定し、それぞれの波長における蛍光強度の比を得、
前記比に基づき前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を算出することにより行われる請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量が、蛍光強度の差を１つの波長で測定し、前記波長における蛍光強度に基づき前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を算出することにより行われる請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ホスファターゼが、酸性ホスファターゼである請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホクマリン誘導体、前記ホスホクマリン誘導体の製造方法、ホスホクマリン誘導体を含む蛍光プローブおよびホスファターゼ測定試薬、ならびにホスファターゼ活性を測定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内では、様々な反応が起きている。この反応のひとつとして、タンパク質の可逆的なリン酸化および脱リン酸化が挙げられる。このリン酸化および／または脱リン酸化により、前記細胞内情報伝達、遺伝子発現、細胞周期、アポトーシス等の多くの過程は、制御されている。従って、生体内におけるタンパク質のリン酸化および／または脱リン酸化を即時に測定することは、生体内における前記細胞内情報伝達等の過程の進行を調べるのに非常に有用である。【０００３】
脱リン酸化に関与するホスファターゼは、生体内におけるタンパク質の脱リン酸化を測定するための標的の一つである。このホスファターゼを定量するために、従来から、蛍光性分子または蛍光タンパク質を用いる方法が知られている。【０００４】
前記蛍光性分子としては、例えば、以下の式で表わすものが知られている。しかしながら、このような蛍光性分子を用いる方法は、例えばホスファターゼと結合する前には蛍光を発しないが、結合した後に蛍光を発するという分子の性質を利用している。つまり、前記蛍光性分子は、一つの波長で蛍光性分子を励起させ、一つの波長で測定される、いわゆる一波長励起一波長測定型の分子である。このような蛍光性分子を用いる場合、一つの波長でのみ測定するため、実験誤差が大きいという問題点が知られている。
【化６】
2008108177.tif 000003
【０００５】
一方、前記蛍光タンパク質は、レシオ測定が可能であることが知られている。このレシオ測定を用いた方法は、蛍光プローブの蛍光スペクトルまたは励起スペクトルについて、異なる２波長における蛍光強度を測定し、その比を得る工程を含んでいる。このように蛍光強度の比を得るため、蛍光プローブ自体の濃度や励起光強度による影響をほとんど受けないという利点がある。この方法に用いるための蛍光プローブ用化合物が、報告されている（例えば、非特許文献１参照）。【０００６】
しかし、前記蛍光タンパク質では、実用化に十分な性能を有するレシオ変化や蛍光強度が小さく、その結果、実用化には充分な性能を有していない。【０００７】
このように、ホスファターゼを定量するのに必要な条件、すなわち、ホスファターゼに特異的に反応し、蛍光強度が十分に高く、かつレシオ測定が可能な程度に励起スペクトルまたは蛍光スペクトルが十分にシフトするという条件を満たすような化合物については見出されていなかった。
【非特許文献１】K. R. Gee, R. P. Haugland.ら、Analytical Biochemistry, １９９９年、第273巻,p 41-48.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は、ホスファターゼと特異的に反応し、かつ蛍光強度が十分に大きく、かつレシオ測定が可能な程度に蛍光スペクトルまたは励起スペクトルが十分にシフトする化合物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体またはその塩。
【化７】
2008108177.tif 000004
前記式中、
Ｒ1およびＲ2は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式
【化８】
2008108177.tif 000005
（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）
で表わされる基である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の化合物は、ホスファターゼに特異的に反応し、蛍光強度が高く、かつホスファターゼにより酵素反応を受けると蛍光スペクトルが十分にシフトするという性質を有する。従って、本発明の化合物を用いるホスファターゼ活性を測定する方法は、誤差が少なく、レシオ測定が利用可能であるという利点がある。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１ａ】図１ａは、実施例１で得られた化合物(PEHC）の励起スペクトルを示す。
【図１ｂ】図１ｂは、参考例１で得られた化合物(ＨＥＨＣ)の励起スペクトルを示す。
【図１ｃ】図１ｃは、実施例１で得られた化合物(PEHC）と参考例１で得られた化合物(ＨＥＨＣ)の蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを示す。
【図２ａ】図２ａは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）の励起スペクトルを示す。
【図２ｂ】図２ｂは、参考例２で得られた化合物（ＨＰＨＣ）の励起スペクトルを示す。
【図２ｃ】図２ｃは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）と参考例２で得られた化合物（ＨＰＨＣ）の蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを示す。
【図３ａ】図３ａは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）の励起スペクトルを示す。
【図３ｂ】図３ｂは、参考例３で得られた化合物（６−ＨＥＨＣ）の励起スペクトルを示す。
【図３ｃ】図３ｃは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）と参考例３で得られた化合物（６−ＨＥＨＣ）の蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを示す。
【図４ａ】図４ａは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＣＤ４５との反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図４ｂ】図４ｂは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＰＴＰ１Ｂとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図４ｃ】図４ｃは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＣＤ４５との反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図４ｄ】図４ｄは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＰＴＰ１Ｂとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図４ｅ】図４ｅは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＣＤ４５との反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図４ｆ】図４ｆは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＰＴＰ１Ｂとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図５ａ】図５ａは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＰＰ１との反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図５ｂ】図５ｂは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＰＰ２Ａ１との反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図５ｃ】図５ｃは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＰＰ１との反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図５ｄ】図５ｄは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＰＰ２Ａ１との反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図５ｅ】図５ｅは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＰＰ１との反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図５ｆ】図５ｆは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＰＰ２Ａ１との反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図６ａ】図６ａは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＣＤ４５とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図６ｂ】図６ｂは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＰＰ１とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図６ｃ】図６ｃは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＣＤ４５とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図６ｄ】図６ｄは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＰＰ１とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図６ｅ】図６ｅは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＣＤ４５とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図６ｆ】図６ｆは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＰＰ１とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図７ａ】図７ａは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＡＬＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図７ｂ】図７ｂは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＬＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図７ｃ】図７ｃは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＡＬＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図７ｄ】図７ｄは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＡＬＰとの反応の蛍光強度の経時変化を示す。
【図７ｅ】図７ｅは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＬＰとの反応の蛍光強度の経時変化を示す。
【図７ｆ】図７ｆは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＡＬＰとの反応の蛍光強度の経時変化を示す。
【図８ａ】図８ａは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＬＰとＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図８ｂ】図８ｂは、参考例２で得られた化合物（ＨＰＨＣ）とＡＬＰとＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図９ａ】図９ａは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＡＣＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図９ｂ】図９ｂは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＣＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図９ｃ】図９ｃは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＡＣＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図９ｄ】図９ｄは、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＡＣＰとの反応の蛍光強度の経時変化を示す。
【図９ｅ】図９ｅは、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＣＰとの反応の蛍光強度の経時変化を示す。
【図９ｆ】図９ｆは、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＡＣＰとの反応の蛍光強度の経時変化を示す。
【図１０】図１０は、参考例２で得られた化合物（ＨＰＨＣ）とＡＣＰとＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図１１ａ】図１１ａは、ＤｉＦＭＵＰとＡＬＰとの反応後の蛍光スペクトルを示す。
【図１１ｂ】図１１ｂは、ＤｉＦＭＵＰとＡＬＰとの反応後の励起スペクトルを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、前記のように、一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体またはその塩である。
【化９】
2008108177.tif 000006
前記式中、
Ｒ1およびＲ2は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式
【化１０】
2008108177.tif 000007
（前記式中、ｎは１〜４、好ましくは２〜３の整数である。）
で表わされる基である。【００１３】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体またはその塩の製造方法である。前記製造方法は、一般式（ＩＩＩ）で表わされる化合物をリン酸化、次いでＲ基の脱保護に付して、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を得ることを特徴とする。
【化１１】
2008108177.tif 000008
前記式（Ｉ）中、
Ｒ1およびＲ2は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式
【化１２】
2008108177.tif 000009
（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）
で表わされる基であり、
前記式（ＩＩ）中、
Ｒ11およびＲ12は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式−（ＣＨ2）n−ＯＨで表わされる基（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）であり、
Ｒは、水酸基の保護基である。【００１４】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブである。【００１５】
また、本発明は、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブを含むホスファターゼ測定試薬である。【００１６】
また、本発明は、ホスファターゼ活性を測定する方法であって、
前記方法は、
一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブを含むホスファターゼ測定試薬と試料とを混合し、
前記ホスファターゼ測定試薬中の一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量し、
前記ホスファターゼ測定試薬中の前記一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体およびその塩の量と、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量とから前記試料中のホスファターゼの量を定量することを含むことを特徴とする。
【化１３】
2008108177.tif 000010
前記式（ＩＩＩ）中、
Ｒ11およびＲ12は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式−（ＣＨ2）n−ＯＨで表わされる基（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）である。【００１７】
前記測定方法において、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を１以上の波長で測定することにより行われるのが好ましい。また、前記測定方法において、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を２つの波長で測定し、それぞれの波長における蛍光強度の比を得、前記比に基づき前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を算出することにより行われるのがさらに好ましい。または、前記測定方法において、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を１つの波長で測定し、前記波長における蛍光強度に基づき前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を算出することにより行われるのがさらに好ましい。【００１８】
前記測定方法において、前記ホスファターゼは、酸性ホスファターゼであるのが好ましい。【００１９】
本発明において、「保護基」とは、１級水酸基を保護する保護基を意味する。前記保護基としては、例えば、低級アルコキシで置換された低級アルキル（例えば、メトキシメチルなど）、アリールで置換された低級アルキル（例えば、ベンジルなど）、低級アルコキシ、ニトロ等で置換されたアリールで置換された低級アルキル（例えば、ｐ−メトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジルなど）、低級アルキルで置換されたシリル（例えば、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリルなど）等が挙げられる。前記保護基としては、低級アルコキシで置換された低級アルキルが好ましく、メトキシメチルがより好ましい。【００２０】
本発明において、「低級」は、特に指示がなければ、炭素原子１〜６個、好ましくは炭素原子１〜４個を意味する。【００２１】
「低級アルキル基」および低級アルコキシ基の「低級アルキル」部分としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等のような直鎖状もしくは分岐鎖状の炭素数１〜６のアルカンの残基を意味する。低級アルキル基および低級アルキル部分の好ましい例としては、炭素数１〜５のアルキルが挙げられる。好ましい炭素数１〜５のアルキルとしては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第三級ブチル、ペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。【００２２】
「アリール」としては、炭素数６〜１２のもの、例えば、フェニル、ナフチルなどを意味する。【００２３】
前記一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体の塩は、前記一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体の、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩などの無機塩基との塩、及びトリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンアミンなどの有機アミン塩、及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸塩、及びギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸などの有機カルボン酸塩、及びメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸付加塩、及びアルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸などの塩基性又は酸性アミノ酸といった塩基との塩又は酸付加塩が挙げられる。【００２４】
本発明の化合物およびその塩は、溶媒和物の形をとることもありうるが、これも本発明の範囲に含まれる。溶媒和物としては、好ましくは、水和物及びエタノール和物が挙げられる。【００２５】
前記一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩は、一般式（Ｉ）中、ｎが２または３であるのが好ましい。【００２６】
前記一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩は、一般式（Ｉ）中、
Ｒ1が式
【化１４】
2008108177.tif 000011
（ｎは２または３である）で表わされ、Ｒ2が水素原子であるのがさらに好ましい。【００２７】
また、前記一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩は、一般式（Ｉ）中、
Ｒ1が水素原子であり、
Ｒ2が式
【化１５】
2008108177.tif 000012
（ｎは２である）で表わされるのがさらに好ましい。【００２８】
具体的には、前記一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩は、７−ヒドロキシ−８−(２−ホスホエチル)−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン、７−ヒドロキシ−８−(２−ホスホプロピル)−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン、および７−ヒドロキシ−６−(２−ホスホエチル)−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピランがより好ましい。【００２９】
次に、本発明の式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体またはその塩を製造するための製造方法について、例を挙げて説明する。このような製造方法により、従来にはない化学構造を有する、本発明のホスホクマリン誘導体の製造が可能になった。なお、本発明の式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体は、以下の方法以外の方法で製造されてもよい。【００３０】
本発明の式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体の製造方法の一例を説明する。その製造方法は、式（ＩＩ）で表わされる化合物をリン酸化、次いでＲ基の脱保護に付して、式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を得る工程を含む（スキーム１参照）。
【化１６】
2008108177.tif 000013
【００３１】
前記式（Ｉ）中、
Ｒ1およびＲ2は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式
【化１７】
2008108177.tif 000014
（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）
で表わされる基であり、
前記式（ＩＩ）中、
Ｒ11およびＲ12は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式−（ＣＨ2）n−ＯＨで表わされる基（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）であり、
Ｒは、水酸基の保護基である。【００３２】
前記製造方法のリン酸化は、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物に、リン酸化剤を不活性ガス（例えばアルゴン、窒素等）雰囲気下に、溶媒中で反応させることにより行うことができる。【００３３】
前記製造方法の脱保護は、前記リン酸化後、酸、トリメチルシリルブロミド等を不活性ガス（例えばアルゴン、窒素等）雰囲気下に、溶媒中で行うことができる。または、前記脱保護は、前記リン酸化後、反応後処理中に溶媒中で行われてもよい。これは、分子内にリン酸基を含有するためそのリン酸基が酸としても機能するため、酸等の添加が不要なためである。【００３４】
前記製造方法のリン酸化および脱保護において、反応溶媒は限定されないが、例えば、ＣＨ2Ｃｌ2、クロロホルム、ＣＣｌ4等の塩素で置換された炭化水素類、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、エチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール、エタノール等のアルコール類等が挙げられる。前記リン酸化における前記溶媒としては、エーテル類から選択されるのが好ましく、テトラヒドロフランがさらに好ましい。また、前記製造方法のリン酸化の後、リン酸化で用いた反応溶媒を除去して、別の反応溶媒を用いてもよい。前記脱保護における前記溶媒としては、エーテル類およびアルコール類等から選択されるのが好ましく、テトラヒドロフランおよびメタノールがさらに好ましい。【００３５】
前記製造方法のリン酸化および脱保護において、反応温度は限定されないが、例えば−１０℃〜５０℃である。前記リン酸化における反応温度は、好ましくは−１０℃〜１０℃である。前記脱保護における反応温度は、好ましくは４０℃〜５０℃である。【００３６】
前記製造方法のリン酸化および脱保護において、反応時間は限定されないが、例えば３０分〜３時間である。前記リン酸化における反応時間は、好ましくは９０分〜２時間である。前記脱保護における反応時間は、好ましくは６０分〜２時間である。【００３７】
前記製造方法のリン酸化において、式（ＩＩ）で表される化合物に対し使用されるリン酸化剤のモル比（式（ＩＩ）で表される化合物：リン酸化剤）は、例えば１：１０〜２０、好ましくは１：５〜６である。また、前記製造方法の脱保護において、式（ＩＩ）で表される化合物に対し使用される脱保護試薬のモル比（式（ＩＩ）で表される化合物：脱保護試薬）は、例えば１：大過剰、好ましくは１：１０〜２０、より好ましくは１：５〜６である。【００３８】
前記製造方法において、前記式（ＩＩ）で表される化合物は、市販で入手してもよいし、公知文献を参照して自家製造してもよい。【００３９】
また、前記式（ＩＩ）で表わされる化合物は、以下の製造方法により、得ることができる。例えば、以下のスキーム２に示す方法により、得ることができる。スキーム２中、Ｒ11が式−（ＣＨ2）n−ＯＨで表わされる基（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）であり、Ｒ12が水素原子であり、Ｒが水酸基の保護基である式（ＩＩ）で表わされる化合物は、式（ＸＩＶ）で表わされる化合物に相当する。また、Ｒ11が水素原子であり、Ｒ12が式−（ＣＨ2）n−ＯＨで表わされる基（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）であり、Ｒが水酸基の保護基である式（ＩＩ）で表わされる化合物は、式（ＸＸＩＶ）で表わされる化合物に相当する。
【化１８】
2008108177.tif 000015
【００４０】
前記式中、Ｒは水酸基の保護基であり、ｎは１〜４の整数である。【００４１】
スキーム２に示す製造方法により、クマリン（Ｘ）をアリル化して式（ＸＩ）で表わされる化合物を得、前記式（ＸＩ）で表わされる化合物をクライゼン転位を起こさせ、式（ＸＩＩ）で表わされる化合物と、式（ＸＸＩＩ）で表わされる化合物との混合物を得、これらの化合物のそれぞれについて、７位水酸基をＲ基で保護して式（ＸＩＩＩ）で表わされる化合物と、式（ＸＸＩＩＩ）で表わされる化合物とをそれぞれ得、アリル基から−（ＣＨ２）n−ＯＨ基へ変換して、式（ＸＩＶ）で表わされる化合物と、式（ＸＸＩＶ）で表わされる化合物をそれぞれ得る。【００４２】
本発明の一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩は、蛍光プローブとして有用である。前記一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩は、それ自体で強い蛍光を発する性質を有している。さらに、前記一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩は、ホスファターゼの基質となり、脱リン酸化され、一般式（ＩＩＩ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩となることを、本発明者らは新たに見出した。さらに、この式（ＩＩＩ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩は、式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩と比較し、励起スペクトルがレッドシフトすることも見出した。このような知見に基づき、本発明者らは、式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を用いて、ホスファターゼの量をレシオ測定により定量する方法を完成した。なお、前記一般式（Ｉ）で表わされるクマリン誘導体またはその塩は、蛍光強度が十分に高いため、一波長励起一波長測定によるホスファターゼの定量方法にも用いることが可能である。
【化１９】
2008108177.tif 000016
【００４３】
前記式（Ｉ）中、
Ｒ1およびＲ2は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式
【化２０】
2008108177.tif 000017
（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）
で表わされる基であり、
前記式（ＩＩＩ）中、
Ｒ11およびＲ12は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式−（ＣＨ2）n−ＯＨで表わされる基（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）である。【００４４】
さらに、前記一般式（ＩＩＩ）で表わされるクマリン誘導体も、強い蛍光を発する性質を有しており、ｐＨが変化するにつれ、１点を中心にして増減する性質を有している。従って、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩は、ホスファターゼの基質であり、かつ蛍光強度が十分に高く、レシオ測定が可能な程度に蛍光スペクトルまたは励起スペクトルが十分にシフトする化合物である。【００４５】
従って、本発明の一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブは、ホスファターゼ測定試薬として用いることができる。このホスファターゼ測定試薬は、例えば、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩それ自体、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩の溶液等が挙げられる。前記溶液の場合、溶媒としては、生理食塩水、緩衝液等の水性溶媒、またはエタノール、アセトン、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の水混和性有機溶媒と、前記水性溶媒との混合物などを用いることができる。また、前記蛍光プローブおよび前記ホスファターゼ測定試薬は、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩が含まれること以外は限定されず、例えば、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、金属捕捉剤、界面活性剤、酸化防止剤等をさらに含んでもよい。【００４６】
なお、前記式（Ｉ）で表わされる化合物と、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物との変換は、以下のようなメカニズムによると推測している。
例えば、
Ｒ1が式
【化２１】
2008108177.tif 000018
（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）
で表わされる基であり、Ｒ2が水素原子である式（Ｉ）のホスホクマリン誘導体に対応する式（Ｉ−１）で表わされるホスホクマリン誘導体について説明する。【００４７】
式（Ｉ−１）で表わされるホスホクマリン誘導体は、７位水酸基の近傍にリン酸基が存在する。そのため、リン酸基と水酸基が相互作用し、７位水酸基はプロトン化されている。この式（Ｉ−１）で表わされるホスホクマリン誘導体が、一旦ホスファターゼにより脱リン酸化されると、７位水酸基と相互作用する官能基が存在しなくなり、７位水酸基は脱プロトン化され、式（ＩＩＩ−１）で表わされるクマリン誘導体に変換される。そして、この式（ＩＩＩ−１）で表わされるクマリン誘導体またはその塩は、式（Ｉ−１）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩と比較し、励起スペクトルがレッドシフトするのである。なお、このメカニズムにおいて、クマリンの７位水酸基の近傍にアニオン性残基が存在すると、クマリンのｐＫａが増大し、前記水酸基のプロトン化が起こりやすくなるという知見は、本発明者らが初めて見出している（スキーム３参照）。
【化２２】
2008108177.tif 000019
【００４８】
従って、本発明は、アニオン性残基を基質とする酵素についても、応用が可能である。具体的には、式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩のＲ1またはＲ2を、末端にアニオン性残基を有する基に変更した誘導体を選ぶ。そのような誘導体は、スキーム３の式（Ｉ−１）で表わされる化合物のように、クマリンの６位Ｒ1または８位のＲ2中のアニオン性残基とクマリンの７位水酸基とが相互作用し、７位水酸基がプロトン化されることが考えられる。そして、このような誘導体に酵素を作用させ、前記アニオン性残基を脱離させると、スキーム３の式（ＩＩＩ−１）で表わされる化合物のように、クマリンの７位水酸基が脱プロトン化され、その結果、クマリンの励起スペクトルがレッドシフトすると考えられる。このような応用は、ＡＴＰ加水分解酵素、スルファターゼ等の酵素について、応用が考えられる。【００４９】
本発明のホスファターゼ活性を測定する方法は、前記のように、
一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブを含むホスファターゼ測定試薬と試料とを混合し、
前記ホスファターゼ測定試薬中の一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量し、
前記ホスファターゼ測定試薬中の前記一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体およびその塩の量と、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量とから前記試料中のホスファターゼの量を定量することを含むのを特徴とする。
【化２３】
2008108177.tif 000020
前記式（ＩＩＩ）中、
Ｒ11およびＲ12は、いずれか一方が水素原子であり、いずれか他方が式−（ＣＨ2）n−ＯＨで表わされる基（前記式中、ｎは１〜４の整数である。）である。【００５０】
前記測定方法において、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブを含むホスファターゼ測定試薬と試料とを混合する工程は、例えば、一般式（Ｉ）で表わされるホスホクマリン誘導体またはその塩を含む蛍光プローブを含むホスファターゼ測定試薬を、細胞、組織等の試料を含む緩衝液中に添加することにより行うことができる。次に、前記ホスファターゼ測定試薬の一般式（Ｉ）で表されるホスホクマリン誘導体およびその塩由来の一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を定量する工程は、例えば、前記試料の蛍光スペクトルを測定することにより行うことができる。具体的には、前記測定方法において、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を１以上の波長で測定することにより行われるのが好ましい。また、前記測定方法において、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を２つの波長で測定し、それぞれの波長における蛍光強度の比を得、前記比に基づき前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を算出することにより行われるのがより好ましい。また、前記測定方法において、前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量の定量は、蛍光強度の差を１つの波長で測定し、前記波長における蛍光強度に基づき前記一般式（ＩＩＩ）で表されるクマリン誘導体またはその塩の量を算出することにより行われるのがより好ましい。前記ホスファターゼは、酸性ホスファターゼであるのが好ましい。【００５１】
以下に本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、以下の実施例により限定されない。
種々のスペクトルは、以下の機器を用いて測定した。
励起スペクトル、蛍光スペクトル：株式会社日立製作所製、F-4500 fluorescence Spectrophotometer
NMR：日本電子株式会社製、JNM-EX270、JEOL JNM-Al400
質量スペクトル : EI, CI：株式会社島津製作所製 GCMS-QP2000
ESI：日本ウォーターズ株式会社製、LCT-Premier XE【００５２】
本明細書の記載において、以下の略語を使用する。
Ａｒ：  アルゴン
ＤＭＦ：  ジメチルホルムアミド
ＨＲＭＳ：  高分解能質量分析
ＴＨＦ：  テトラヒドロフラン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＴＭＳＢｒ：トリメチルシリルブロミド
【実施例１】
【００５３】
７−ヒドロキシ−８−（２−ホスホエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン  （ＰＥＨＣ）の製造
（１）７−アリルオキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピランの製造
【化２４】
2008108177.tif 000021
７−ヒドロキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（１．０ｇ）とＫ2ＣＯ3（１．２ｇ）を無水アセトン（３０ｍｌ）に懸濁させ、アルゴン雰囲気下２時間還流した。反応終了後、反応液を冷却し、Ｋ2ＣＯ3を濾別した。ろ液からアセトンを留去した後、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、標題化合物（白色固体、収率９６％）を得た。【００５４】
1H NMR (CDCl3, 270 MHz)：δ 4.61(d, 2H, J=5.1 Hz, f), 5.34(dd, 1H, Jcis=10.5 Hz および Jgem =1.5Hz, h), 5.44 (dd, 1H, Jtrans = 17.5 Hz および Jgem =1.5 Hz, i), 6.01(m, 1H, g), 6.25(d, 1H, J=9.7 Hz, e), 6.83(s, 1H, a), 6.85(d, 1H, J=8.6 Hz, b), 7.36(d, 1H, J=8.6 Hz, c), 7.63(d, 1H, J=9.7 Hz, d)；
13C NMR (CDCl3, 67.8 MHz)：δ = 69.3, 101.7, 112.6, 113.0, 113.1, 118.5, 128.6, 132.0, 143.2, 155.7, 161.0, 161.6；
MS (CI) : m/z = 203 (M + 1)；計算値: 202.06；
元素分析：C12H10O3について実測値: C, 71.17; H ,4.98, 計算値 C, 71.28; H, 4.98; O, 23.74。【００５５】
（２）７−ヒドロキシ−８−アリル−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピランの製造
【化２５】
2008108177.tif 000022
７−アリルオキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（１．０ｇ）をＮ，Ｎ−ジエチルアニリン（１０ｍｌ）に懸濁させ、アルゴン雰囲気下３時間、２２０℃で還流加熱した。反応終了後、反応液を冷却し、ｎ−ヘキサン（１０ｍｌ）を加え、生じた固体を濾取し、冷ｎ−ヘキサンで得られた固体をよく洗浄した。前記固体を真空乾燥後、酢酸エチルから再結晶して標題化合物（クリーム色、固体、収率：５０％）を得た。【００５６】
1H NMR (CDCl3, 270 MHz)δ：3.67(d, 2H, J=5.9 Hz, a), 5.14−5.24(m, 2H, h, i), 5.89(s, 1H, f), 6.01(m, 1H, g), 6.25(d, 1H, J=9.5 Hz, e), 6.81(d, 1H, J=8.4 Hz, b), 7.26(d, 1H, J=8.4 Hz, c), 7.63(d, 1H, J=9.5 Hz, d)：
13C NMR (CDCl3, 67.8 MHz)δ：26.2, 110.7, 111.1, 112.0, 112.34, 114.8, 126.9, 135.0, 144.6, 152.9, 158.56, 160.1；
MS (CI) : m/z = 203 (M + 1) 計算値: 202.06；
元素分析：C12H10O3について実測値 : C, 71.14; H , 5.03。計算値：C, 71.28; H, 4.98; O, 23.74。【００５７】
（３）７−メトキシメトキシ−８−アリル−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピランの製造
【化２６】
2008108177.tif 000023
７−ヒドロキシ−８−アリル−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（３００ｍｇ）を無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶かした。その溶液へジイソプロピルエチルアミン（３８４ｍｇ）を加え、その後、メトキシメチルクロライド（２３９ｍｇ）をゆっくりと滴下して氷浴中、Ａｒ雰囲気下で３時間攪拌した。反応終了後、反応液をジエチルエーテルで希釈し、有機層をクエン酸飽和水溶液、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液、Ｍｉｌｉ−Ｑでそれぞれ３回ずつ洗浄した。得られた有機層を、ブラインで洗浄した後、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。前記有機層から溶媒を留去し、標題化合物（白色、固体、収率９３％）を得た。【００５８】
1H NMR (CDCl3, 270 MHz)δ：3.49(s, 3H, g), 3.63(d, 2H, J=5.9 Hz, a), 4.98−5.28(m, 2H, i,j), 5.28(s, 2H, f), 5.97(m, 1H, h), 6.26(d, 1H, J=9.2 Hz, e), 7.06(d, 1H, J=8.4 Hz, b), 7.29(d, 1H, J=8.4 Hz, c), 7.63(d, 1H, J=9.2Hz, d)：
13C NMR (CDCl3, 67.8 MHz) δ： 27.1, 56.4, 94.2, 110.4, 113.5, 113.5, 115.3, 116.8, 126.50, 134.9, 143.6, 152.9, 157.7，161.0：
MS (CI) : m/z = 247 (M + 1) 計算値: 246.09
元素分析： C14H14O4 について実測値： C, 68.22; H , 5.39、計算値：C, 68.28; H, 5.73; O, 25.99。【００５９】
（４）７−メトキシメトキシ−８−（２−オキソエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピランの製造
【化２７】
2008108177.tif 000024
７−メトキシメトキシ−８−アリル−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（１．０ｇ）を無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶かし、その溶液にＯｓＯ4水液（５０ｍｇ／３ｍｌ）を滴下して加えた。前記混合物を、Ａｒ雰囲気下、室温で１時間攪拌した。その後前記混合物にＮａＩＯ4（５．５ｇ）を３度に分けて加え、１２時間攪拌した。反応終了後、ＴＨＦを留去し、Ｍｉｌｉ−Ｑを加え、ＣＨ2Ｃｌ2で２回抽出した。得られた有機層をブラインで洗浄した後、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。前記有機層から溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、標題化合物（白色、固体、収率６５％）を得た。【００６０】
1H NMR (CDCl3, 270 MHz) δ 3.45(s, 3H, g), 4.02(s, 2H, a), 5.26(s, 2H, f), 6.28(d, 1H, J=9.2 Hz, e), 7.11(d, 1H, J=8.4 Hz, b), 7.40(d, 1H, J=8.4 Hz, c), 7.66(d, 1H, J=9.2Hz, d), 9.78(s, 1H, h)：
13C NMR (CDCl3, 67.8 MHz) δ： 38.1, 56.5, 94.4, 110.0, 110.3, 113.5, 113.7, 127.9, 143.5, 153.1, 158.2, 160.4, 197.5：
MS (CI) : m/z = 249 (M + 1) 計算値: 248.07：
元素分析： C13H12O5 について実測値 : C, 62.80; H , 4.73、計算値：C, 62.90; H, 4.87; O, 32.23。【００６１】
（５）７−メトキシメトキシ−８−（２−ヒドロキシエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピランの製造
【化２８】
2008108177.tif 000025
７−メトキシメトキシ−８−（２−オキソエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（１００ｍｇ）のＴＨＦ溶液を、氷浴中、Ａｒ雰囲気下、ＮａＢＨ4（２０ｍｇ）の無水ＴＨＦ懸濁液にゆっくりと滴下した後、１時間攪拌した。その後、前記混合物に飽和クエン酸水溶液（５ｍｌ）を加えて反応を終了させた。前記混合物からＴＨＦを留去した後、残渣にＭｉｌｉ−Ｑを加え、ＣＨ2Ｃｌ2で２回抽出した。得られた有機層を、ブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。前記有機層から溶媒を留去し、残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、標題化合物（白色、固体、収率７５％）を得た。【００６２】
1H NMR (CDCl3, 270 MHz) δ 3.19(t, 2H, J=6.8 Hz, a), 3.50(s, 3H, g), 3.88(t, 2H, J=6.8 Hz, h), 5.30(s, 2H, f), 6.28(d, 1H, J=9.2 Hz, e), 7.08(d, 1H, J=8.4 Hz, b), 7.32(d, 1H, J=8.4 Hz, c), 7.64(d, 1H, J=9.2Hz, d)：
HRMS (C13H14O5) ; 実測値 250.0845
C13H14O5について計算値： 250.0841【００６３】
（６）７−ヒドロキシ−８−（２−ホスホエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン  （ＰＥＨＣ）の製造
【化２９】
2008108177.tif 000026
【００６４】
氷浴中Ａｒ雰囲気下、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）にＰＯＣｌ3（３０７ｍｇ）、トリエチルアミン（４０５ｍｇ）を加えた。そこに７−ヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（１００ｍｇ）のＴＨＦ溶液をゆっくりと滴下し、その後、混合物を２時間攪拌した。その後、１Ｎ  ＮａＨＣＯ3水溶液（１０ｍｌ）を前記混合物へ加え、１時間攪拌した。得られた白懸濁液をろ過し、ろ液から溶媒を留去した。得られたオイルにＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を加え、４０℃で２時間攪拌した。その後ＭｅＯＨを留去した後、逆層ＨＰＬＣを用いて得られた残渣を精製し、標題の化合物（薄黄色、固体、収率２０％）を得た。なお、ＨＰＬＣの際にＴＥＡＡ（トリエチルアミン−酢酸）緩衝液を用いたため、標題化合物はトリエチルアミンとの塩として得られた。【００６５】
1H NMR (D2O, 270 MHz) δ：1.12(t, 9H, J=7.6 Hz, h), 2.89(t, 2H, J=6.8 Hz, a), 3.03(q, 6H, J=7.3Hz, g), 3.86(q, 2H, J=7.0 Hz, h), 5.30(s, 2H, f), 6.05(d, 1H, J=9.2 Hz, e), 6.69(d, 1H, J=8.4 Hz, b), 7.15(d, 1H, J=8.4 Hz, c), 7.69(d, 1H, J=9.2Hz, d)：
13C NMR (CD3OD, 67.8 MHz) δ： 9.2, 25.6, 47.5, 64.5, 111.8, 113.1, 113.1, 113.9, 128.3, 146.3, 155.2, 161.3, 163.5：
MS (FAB+) : m/z = 388.2 (M + 1)、計算値: 387.14：
元素分析：C17H26NO7Pについて実測値 : C,52.43; H , 6.77; N,3.65、
計算値：C, 52.71; H, 6.77; N, 3.62; O, 28.91; P, 8.00。【００６６】
［参考例１］
７−ヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン  （ＨＥＨＣ）の製造
【化３０】
2008108177.tif 000027
７−メトキシメトキシ−８−（２−ヒドロキシエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（５０ｍｇ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）中溶液に、ＴＭＳＢｒ（１２２ｍｇ）をゆっくりと滴下し、得られた混合物を２．５時間攪拌した。その後、前記混合物から溶媒を留去し、得られた残渣を逆層ＨＰＬＣを用いて精製し、標題化合物（白色、固体、収率２４％）を得た。【００６７】
1H NMR (CD3OD, 270 MHz) δ 3.09(t, 2H, J=7.3 Hz, a), 3.74(t, 2H, J=7.3 Hz, f), 6.17(d, 1H, J=9.2 Hz, e), 6.81(d, 1H, J=8.4 Hz, b), 7.32(d, 1H, J=8.4 Hz, c), 7.83(d, 1H, J=9.2Hz, d)：
13C NMR (CD3OD, 67.8 MHz) δ：27.3, 61.7, 111.8, 113.2, 113.6, 113.7, 128.2, 146.4, 155.1, 161.1, 163.7：
HRMS (C11H10O4) ; 実測値 206.0576、計算値: 206.0579
【実施例２】
【００６８】
７−ヒドロキシ−８−（２−ホスホプロピル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン  （ＰＰＨＣ）の製造
（１）７−メトキシメトキシ−８−（２−ヒドロキシプロピル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピランの製造
【化３１】
2008108177.tif 000028
【００６９】
７−メトキシメトキシ−８−アリル−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（１．０ｇ）の無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に、氷浴中、Ａｒ雰囲気下でＢＨ3・ＴＨＦをゆっくりと滴下し、室温に戻した後、その混合物を１時間攪拌した。再び氷浴中に戻し、その混合物に２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液（２ｍｌ）を加え、０℃で３０分攪拌した。次に前記混合物に３０％Ｈ2Ｏ2水溶液（１．７ｍｌ）を加え、０℃で２時間攪拌した。前記混合物からＴＨＦを留去し、得られた残渣をジエチルエーテルで希釈した。得られた有機層をＭｉｌｉ−Ｑで２回洗浄し、ブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。得られた有機層から溶媒を留去した後、得られたオイルをカラムクロマトグラフィーによって精製し、標題化合物（白色、固体、４２％）を得た。【００７０】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ：1.89(q, 2H, J=6.8 Hz, h), 2.99(t, 2H, J=7.1 Hz, a), 3.50(s, 3H, g), 3.65(t, 2H, J=6.4 Hz, i), 5.30(s, 2H, f), 6.28(d, 1H, J=9.4 Hz, e), 7.08(d, 1H, J=8.8 Hz, b), 7.30(d, 1H, J=8.8 Hz, c), 7.64(d, 1H, J=9.4Hz, d)：
HRMS (C14H16O5,CI+) ;実測値 265.1074，計算値: 264.0998【００７１】
（２）７−ヒドロキシ−８−（２−ホスホプロピル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン  （ＰＰＨＣ）の製造
【化３２】
2008108177.tif 000029
【００７２】
氷浴中Ａｒ雰囲気下、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）にＰＯＣｌ3（１５０ｍｇ）およびトリエチルアミン（２７５μｌ）を加えた。その混合物へ７−ヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシプロピル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（５０ｍｇ）のＴＨＦ溶液をゆっくりと滴下し、その混合物を２時間攪拌した。次いでその混合物に１Ｎ  ＮａＨＣＯ3水溶液（２ｍｌ）を加え、その後、その混合物を１時間攪拌した。得られた白懸濁液をろ過し、ろ液から溶媒を留去した。得られたオイルにＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を加え、混合物を４０℃で２時間攪拌した。前記混合物からＭｅＯＨを留去した後、得られた残渣を逆層ＨＰＬＣを用いて精製し、標題化合物（薄黄色、固体、収率３０％）を得た。なお、ＨＰＬＣの際にＴＥＡＡ（トリエチルアミン−酢酸）緩衝液を用いたため、化合物はトリエチルアミンとの塩として得られた。【００７３】
1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 1.31(t, 9H, J=7.3 Hz, i), 1.93(m, 2H, f), 2.92(t, 2H, J=7.8 Hz, a), 3.20(q, 6H, J=7.3Hz, h), 3.96(q, 2H, J=6.6 Hz, g), 6.17(d, 1H, J=9.6 Hz, e), 6.80(d, 1H, J=8.6 Hz, b), 7.31(d, 1H, J=8.6 Hz, c), 7.83(d, 1H, J=9.6Hz, d)：
13C NMR (CD3OD,100.4MHz) δ 9.1, 20.4,31.3, 47.5, 66.9, 111.9, 113.3, 113.7, 117.0, 128.0, 146.6, 155.0, 161.0, 163.9：
HRMS (C12H12O7P,ESI-) ;実測値 299.0317 ; 計算値: 299.0321；
元素分析 : C18H28NO7P
について実測値 : C, 53.68; H , 6.91; N,3.60, 計算値：C, 53.86; H, 7.03; N, 3.49; O, 27.90; P, 7.72。【００７４】
［参考例２］
７−ヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシプロピル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（ＨＰＨＣ）の製造
【化３３】
2008108177.tif 000030
【００７５】
７−メトキシメトキシ−８−（２−ヒドロキシプロピル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（５０ｍｇ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）溶液に、ＴＭＳＢｒ（１００μｌ）をゆっくりと滴下し、その混合物を２．５時間攪拌した。その混合物から溶媒を留去し、得られた残渣をカラムクマトグラフィーを用いて精製して標題化合物（白色、固体、収率２４％）を得た。【００７６】
1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 1.83(q, 2H, J=6.8 Hz, f), 2.88(t, 2H, J=7.8 Hz, a), 3.61(t, 2H, J=6.8 Hz, f), 6.17(d, 1H, J=9.6 Hz, e), 7.08(d, 1H, J=8.6 Hz, b), 7.31(d, 1H, J=8.6 Hz, c), 7.84(d, 1H, J=9.6Hz, d)：
13C NMR (CD3OD,100.4MHz) δ：20.0, 32.8, 62.9,111.8, 113.3, 113.6, 117.0, 127.9,146.6, 154.9, 160.8, 164.0：
HRMS (C12H13O4,ESI+) ; C12H12O4について実測値 221.0828 ; 計算値 221.0814。
【実施例３】
【００７７】
７−ヒドロキシ−６−（２−ホスホエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン  （６−ＰＥＨＣ）の製造
（１）7-メトキシメトキシ-6-アリル-2-オキソ-2H-1-ベンゾピランの製造
【化３４】
2008108177.tif 000031
【００７８】
７−アリルオキシ−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（５．５ｇ）をＮ，Ｎ−ジエチルアニリン（５５ｍｌ）中に懸濁させ、アルゴン雰囲気下３時間２２０℃で還流加熱した。その混合物を冷却した後、ｎ−ヘキサン（５０ｍｌ）を加え、生じた固体を濾取した。その固体を冷ｎ−ヘキサンでよく洗浄した。得られた固体を真空乾燥後、酢酸エチルから再結晶して結晶を分離した。その後、ろ液を留去し、クリーム色の固体を得た。【００７９】
その固体（１．６５ｇ）の無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）溶液にジイソプロピルエチルアミン（２．５ｍｌ）を加え、さらにメトキシメチルクロライド（１．０ｍｌ）をゆっくりと滴下した後、氷浴中、Ａｒ雰囲気下で３時間攪拌した。その後、混合液をジエチルエーテルで希釈し、有機層をクエン酸飽和水溶液、２Ｎ  ＮａＯＨ水溶液、Ｍｉｌｉ−Ｑでそれぞれ３回ずつ洗浄した。得られた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した後、溶媒を留去し、標題化合物（白色、固体、収率９％）を得た。【００８０】
1H NMR (CDCl3, 270 MHz) δ：  3.41(d, 2H, J=6.5 Hz, e), 3.48(s, 3H, i), 5.03−5.11(m, 2H, g), 5.26(s, 2H, h), 5.97(m, 1H, f), 6.26(d, 1H, J=9.5 Hz, d), 7.05(s, 1H, a), 7.23(s, 1H, b), 7.61(d, 1H, J=9.5Hz, c)：
HRMS (C14H14O4, EI+) ; 実測値 246.0886, 計算値: 246.0892。【００８１】
（２）７−メトキシメトキシ−６−（２−オキソエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピランの製造
【化３５】
2008108177.tif 000032
【００８２】
７−メトキシメトキシ−６−アリル−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（４００ｍｇ）の無水ＴＨＦ（２０ｍｌ）溶液に、ＯｓＯ4水溶液（２０ｍｇ／３ｍｌ）を滴下し、その後、Ａｒ雰囲気下、室温で１時間攪拌した。その混合液にＮａＩＯ4（２．２ｇ）を３度に分けて加え、その後、１２時間攪拌した。前記混合物からＴＨＦを留去し、得られた残渣にＭｉｌｉ−Ｑを加え、ＣＨ2Ｃｌ2で２回抽出した。得られた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥し、溶媒を留去した。得られた残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、標題化合物（白色、固体、収率４６％）を得た。【００８３】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ： 3.45(s, 3H, h), 3.75(s, 2H, e), 5.25(s, 2H, g), 6.27(d, 1H, J=9.5 Hz, d), 7.10(s, 1H, a), 7.28(s, 1H, b), 7.62(d, 1H, J=9.5Hz, c), 9.75(s, 1H, f)：
HRMS (C14H14O4, EI+) ; 実測値 248.0680、計算値：248.0685。【００８４】
（３）７−メトキシメトキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピランの製造
【化３６】
2008108177.tif 000033
【００８５】
７−メトキシメトキシ−６−（２−オキソエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（１５０ｍｇ）のＴＨＦ溶液を、氷浴中Ａｒ雰囲気下、ＮａＢＨ4（２８ｍｇ）の無水ＴＨＦ懸濁液にゆっくりと滴下し、その後、１時間攪拌した。前記混合物に飽和クエン酸水溶液（５ｍｌ）を加えて、反応を終了させた。その後、混合物からＴＨＦを留去した。得られた残渣にＭｉｌｉ−Ｑを加え、ＣＨ2Ｃｌ2で２回抽出した。得られた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥した。前記有機層から溶媒を留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製して標題化合物（白色、固体、収率３０％）を得た。【００８６】
1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ： 2.97(t, 2H, J=6.3 Hz, e),  3.52(s, 3H, h), 3.90(t, 2H, J=6.3 Hz, f), 5.30(s, 2H, g), 6.27(d, 1H, J=9.5 Hz, d), 7.10(s, 1H, a), 7.28(s, 1H, b), 7.62(d, 1H, J=9.5Hz, c)：
MS (ESI+) : m/z = 251.1 (M + 1)、計算値：250.0841。【００８７】
（４）７−ヒドロキシ−６−（２−ホスホエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン  （６−ＰＥＨＣ）の製造
【化３７】
2008108177.tif 000034
【００８８】
氷浴中Ａｒ雰囲気下、無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）にＰＯＣｌ3（４６ｍｇ）およびトリエチルアミン（８３μｌ）を加えた。そこに７−ヒドロキシ−８−（２−ヒドロキシプロピル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（１５ｍｇ）のＴＨＦ溶液をゆっくりと滴下し、その後２時間攪拌した。前記混合物に１Ｎ  ＮａＨＣＯ3水溶液（２ｍｌ）を加え、その後１時間攪拌した。得られた白懸濁液をろ過し、ろ液から溶媒を留去した。得られたオイルにＭｅＯＨ（１０ｍｌ）を加え、４０℃で２時間攪拌した。前記混合物からＭｅＯＨを留去した後、得られた残渣を逆層ＨＰＬＣを用いて精製して標題化合物（薄黄色、固体、収率２０％）を得た。なお、ＨＰＬＣの際にＴＥＡＡ（トリエチルアミン−酢酸）緩衝液を用いたため、化合物はトリエチルアミンとの塩として得られた。【００８９】
1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ： 1.29(t, 9H, J=7.6 Hz, h), 2.98(t, 2H, J=6.8 Hz, e), 3.15(q, 6H, J=7.6Hz, g), 4.09(q, 2H, J=6.8 Hz, f), 6.16(d, 1H, J=9.5 Hz, d), 6.70(s, 1H, a), 7.46(s, 1H, b), 7.84(d, 1H, J=9.5Hz, c)：
13C NMR (CD3OD, 100.4MHz) δ： 9.1, 32.2, 47.5, 65.2, 102.8, 112.1, 112.9, 125.0, 131.4,146.3, 155.8, 161.3, 163.9：
HRMS (C11H10O7P, ESI-) ; 実測値 285.0156、計算値：287.1447.【００９０】
［参考例３］
７−ヒドロキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン  （６−ＨＥＨＣ）の製造
【化３８】
2008108177.tif 000035
【００９１】
７−メトキシメトキシ−６−（２−ヒドロキシエチル）−２−オキソ−２Ｈ−１−ベンゾピラン（１７ｍｇ）の無水ＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）溶液に、ＴＭＳＢｒ（３０μｇ）をゆっくりと滴下し、その後２．５時間攪拌した。その混合物から溶媒を留去し、得られた残渣をカラムクロマトグラフィーを用いて精製して標題化合物（白色、固体、収率３５％）を得た。【００９２】
1H NMR (CD3OD, 400 MHz) δ： 2.86(t, 2H, J=6.8 Hz, e), 3.76(t, 2H, J=6.8 Hz, f), 6.15(d, 1H, J=9.5 Hz, d), 6.71(s, 1H, a), 7.36(s, 1H, b), 7.82(d, 1H, J=9.5Hz, c)：
13C NMR (CD3OD, 100.4MHz) δ： 34.3, 62.4, 102.9, 112.2, 112.9, 125.3, 131.2, 146.2, 155.8, 161.4, 163.9.
HRMS (C11H11O4, ESI+) ;実測値 207.0661、計算値：206.0579。【００９３】
［本発明の化合物の蛍光スペクトルと励起スペクトルの測定］
実施例１〜３、参考例１〜３で得た化合物について、蛍光スペクトルおよび励起スペクトルをそれぞれ測定した。各例で得た化合物の１０ｍＭ ＤＭＳＯ（和光純薬株式会社製、生化学用）溶液を調製し、その溶液を各ｐＨの１００ｍＭ Ｎａ−Ｈ3ＰＯ4緩衝液で１μＭまで希釈した。その希釈液の蛍光スペクトル（Ｅｘ＝３８０ｎｍ）および励起スペクトル（Ｅｍ＝４７０ｎｍ）をスリット幅５．０ｎｍ／５．０ｎｍ、ホトマル電圧４００Ｖ、レスポンス２．０秒の条件下で測定した。実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）の励起スペクトルを図１ａに、参考例１で得られた化合物(ＨＥＨＣ)の励起スペクトルを図１ｂに、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）と参考例１で得られた化合物(ＨＥＨＣ)の蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを図１ｃに示す。【００９４】
同様の条件下で、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）の励起スペクトルを図２ａに、参考例２で得られた化合物（ＨＰＨＣ）の励起スペクトルを図２ｂに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）と参考例２で得られた化合物（ＨＰＨＣ）の蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを図２ｃに示す。実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）の励起スペクトルを図３ａに、参考例３で得られた化合物（６−ＨＥＨＣ）の励起スペクトルを図３ｂに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）と参考例３で得られた化合物（６−ＨＥＨＣ）の蛍光スペクトルのｐＨプロファイルを図３ｃに示す。【００９５】
図１ａと図１ｂ、図２ａと図２ｂ、図３ａと図３ｂをそれぞれ比較すると、実施例１〜３で得られた化合物は、ホスファターゼによって脱リン酸化を受け、参考例１〜３で得られた化合物に変換されると、励起スペクトルがシフトすることが確認できた。また、図１ｃ、図２ｃおよび図３ｃから理解できるように、実施例１〜３で得られた化合物は、ホスファターゼによって脱リン酸化を受け、参考例１〜３で得られた化合物に変換されると、ｐＫａがシフトすることが確認できた。従って、本発明のホスホクマリン誘導体またはその塩は、脱リン酸化を受けると励起スペクトルがシフトし、ホスファターゼの量を測定するためのレシオ検出が可能であることが確認された。【００９６】
［本発明の化合物の酵素反応］
実施例１〜３で得られた化合物について、種々のホスファターゼとの反応を測定した。
（測定条件）
蛍光スペクトルEx = 380nm : 励起スペクトル  Em = 470nm
経時測定  Ex = 380nm：Em = 470nm
スリット幅＝5.0 nm/ 5.0 nm :ホトマル電圧 400 V : レスポンス 2.0 秒
（酵素反応プロトコル）
反応緩衝液
チロシンホスファターゼ(CD45とPTP1B）: 50 mM HEPES (pH7.4), 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.05% NP-40
セリン／スレオニンホスファターゼ(PP1）: 25 mM イミダゾール(pH 7.4), 0.1 mg/ml BSA, 1 mM DTT, 50 mM NaCl
セリン／スレオニンホスファターゼ（PP2A1）、アルカリホスファターゼ(ALP)、酸ホスファターゼ(ACP): 100 mM HEPES (pH7.4), 1mM EDTA, 1mM DTT
（基質混合物）
基質混合物は、前記反応緩衝液（１００μＭ）中に溶解した、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）を用いた。【００９７】
（手順）
１．  分光計を３０℃に温める。
２．  酵素ストック溶液を反応緩衝液で希釈する。
３．  基質（５０μｌ：最終濃度１０μＭ）をキュベットに加える。
４．  反応緩衝液をキュベットに４４０μｌ加える。
５．  キュベットをパラフィルムでふたをして振盪。
６．  蛍光測定を行う（酵素反応前）。
７．  希釈した酵素溶液をキュベットに１０μｌ入れる。
８．  キュベットをパラフィルムでふたをして振盪。
９．  蛍光測定を行う（酵素反応後）。【００９８】
（１）チロシンホスファターゼ（ＣＤ４５とＰＴＰ１Ｂ）との反応
実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＣＤ４５との反応後の蛍光スペクトルを図４ａに、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＰＴＰ１Ｂとの反応後の蛍光スペクトルを図４ｂに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＣＤ４５との反応後の蛍光スペクトルを図４ｃに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＰＴＰ１Ｂとの反応後の蛍光スペクトルを図４ｄに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＣＤ４５との反応後の蛍光スペクトルを図４ｅに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＰＴＰ１Ｂとの反応後の蛍光スペクトルを図４ｆに示す。図４ａ〜４ｆから、いずれの場合の励起スペクトルに大きな変化が無いことが理解できる。すなわち実施例１〜３で得た化合物はチロシンホスファターゼの基質とならないことが確認できた。【００９９】
（２）セリン／スレオニンホスファターゼ（ＰＰ１とＰＰ２Ａ１）との反応
実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＰＰ１との反応後の蛍光スペクトルを図５ａに、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＰＰ２Ａ１との反応後の蛍光スペクトルを図５ｂに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＰＰ１との反応後の蛍光スペクトルを図５ｃに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＰＰ２Ａ１との反応後の蛍光スペクトルを図５ｄに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＰＰ１との反応後の蛍光スペクトルを図５ｅに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＰＰ２Ａ１との反応後の蛍光スペクトルを図５ｆに示す。図５ａ〜５ｆから、いずれの場合の励起スペクトルに大きな変化が無いことが理解できる。すなわち実施例１〜３で得た化合物はセリン／スレオニンホスファターゼの基質とならないことが確認できた。【０１００】
前記手順９の後、それぞれの反応液にＤｉＦＭＵＰ（反応液中のその濃度が１０μＭになるように）を加えて蛍光スペクトルを測定した。ＤｉＦＭＵＰ（モレキュラープローブ社製）は、ホスファターゼにより脱リン酸化されると４５０ｎｍ付近の蛍光が増大する。【０１０１】
実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＣＤ４５とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを図６ａに、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＰＰ１とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを図６ｂに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＣＤ４５とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを図６ｃに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＰＰ１とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを図６ｄに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＣＤ４５とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを図６ｅに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＰＰ１とＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを図６ｆに示した。図６ａ〜６ｆから、いずれの場合にもＤｉＦＭＵＰを加えた後、励起スペクトルは４５０ｎｍ付近で蛍光が著しく増大した。従って、各ホスファターゼの活性は存在するにもかかわらず、実施例１〜３で得た化合物はチロシンホスファターゼおよびセリン／スレオニンホスファターゼの基質とならないことが確認できた。【０１０２】
（３）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）との反応
実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＡＬＰとの反応後の蛍光スペクトルを図７ａに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＬＰとの反応後の蛍光スペクトルを図７ｂに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＡＬＰとの反応後の蛍光スペクトルを図７ｃに、示す。また、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＡＬＰとの反応の蛍光強度の経時変化を図７ｄに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＬＰとの反応の蛍光強度の経時変化を図７ｅに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＡＬＰとの反応の蛍光強度の経時変化を図７ｆに示す。図７ａ〜７ｃから、実施例１〜３で得た化合物の励起スペクトル変化が確認できた。また、図７ｄ〜７ｆから、それぞれの化合物の蛍光強度が経時的に変化し、酵素反応が起きていることが確認できた。ただし、スペクトルの変化量が小さいことから、酵素の活性が低下していることが推測できる。【０１０３】
前記手順９の後、反応液にＤｉＦＭＵＰ（反応液中のその濃度が１０μＭになるように）を加えて蛍光スペクトルを測定した。ＤｉＦＭＵＰ（モレキュラープローブ社製）は、ホスファターゼにより脱リン酸化されると４５０ｎｍ付近の蛍光が増大する。【０１０４】
実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＬＰとＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを図８ａに、参考例２で得られた化合物（ＨＰＨＣ）とＡＬＰとＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを図８ｂに示した。図８ａおよび図８ｂから、いずれの場合にもＤｉＦＭＵＰを加えた後、励起スペクトルはほとんど変化せず、ＡＬＰの活性は存在しないことが確認できた。従って、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）がＡＬＰによる酵素反応を受け生成した物（参考例２で得た化合物）は、アルカリホスファターゼを阻害することが確認できた。【０１０５】
（４）酸ホスファターゼ（ＡＣＰ）との反応
実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＡＣＰとの反応後の蛍光スペクトルを図９ａに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＣＰとの反応後の蛍光スペクトルを図９ｂに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＡＣＰとの反応後の蛍光スペクトルを図９ｃに、示す。また、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）とＡＣＰとの反応の蛍光強度の経時変化を図９ｄに、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）とＡＣＰとの反応の蛍光強度の経時変化を図９ｅに、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）とＡＣＰとの反応の蛍光強度の経時変化を図９ｆに示す。図９ａ〜９ｃから、実施例１〜３で得た化合物が、酵素反応を受けると、３３０ｎｍ付近の蛍光スペクトルが減少し、３８０ｎｍ付近の蛍光スペクトルが増大することが確認できた。また、図９ｄ〜９ｆから、それぞれの化合物の蛍光強度が経時的に変化し、酵素反応が起きていることが確認できた。なかでも実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）について、蛍光強度の変化割合が大きく、従って実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）が酸ホスファターゼに認識されやすいことが確認できた。【０１０６】
前記手順９の後、反応液にＤｉＦＭＵＰ（反応液中のその濃度が１０μＭになるように）を加えて蛍光スペクトルを測定した。ＤｉＦＭＵＰ（モレキュラープローブ社製）は、ホスファターゼにより脱リン酸化されると４５０ｎｍ付近の蛍光が増大する。【０１０７】
参考例２で得られた化合物（ＨＰＨＣ）とＡＣＰとＤｉＦＭＵＰとの反応後の蛍光スペクトルを図１０に示した。図１０から、ＤｉＦＭＵＰを加えた後、励起スペクトルは４５０ｎｍ付近で蛍光が著しく増大した。従って、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）がＡＣＰによる酵素反応を受け生成した物（参考例２で得た化合物）は、酸ホスファターゼを阻害しないことが確認できた。【０１０８】
［ＤｉＦＭＵＰとアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）との反応］
本発明の化合物の代わりにＤｉＦＭＵＰを用いた以外は、前記本発明の化合物の酵素反応と同様にして、ＤｉＦＭＵＰとＡＬＰとの反応を測定した。ＤｉＦＭＵＰとＡＬＰとの反応後の蛍光スペクトルを図１１ａに、ＤｉＦＭＵＰとＡＬＰとの反応後の励起スペクトルを図１１ｂに示す。図１１ａおよび図１１ｂから、ＡＬＰにより反応後、ＤｉＦＭＵＰの蛍光スペクトルおよび励起スペクトルの強度が増大することが確認できた。しかし、ＡＬＰと反応前のＤｉＦＭＵＰの蛍光スペクトルおよび励起スペクトルは、蛍光スペクトルおよび励起スペクトルの強度が非常に小さい。従って、ＤｉＦＭＵＰは、ＡＬＰと反応前後において、蛍光スペクトルまたは励起スペクトルのシフトを有さず、すなわち、等蛍光点を有さないことが確認できた。従って、ＤｉＦＭＵＰは、２波長以上におけるレシオ測定は不可能であることが確認できた。【０１０９】
［本発明の化合物について酸フォスファターゼ（ＡＣＰ）の動力学的パラメータ］
（測定条件）
蛍光スペクトルEx = 380nm : 励起スペクトル  Em = 470nm
経時測定  Ex = 380nm：Em = 470nm
スリット幅＝5.0 nm/ 5.0 nm :ホトマル電圧 400 V : レスポンス 2.0 秒
（酵素反応プロトコル）
反応緩衝液
100 mM HEPES (pH7.4), 1mM EDTA, 1mM DTT
（基質混合物）
基質混合物は、前記反応緩衝液（１００μＭ）中に溶解した、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）、実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）を用いた。
実施例１〜３で得られた化合物について、酸フォスファターゼの動力学的パラメータを測定した。参考例として、ＤｉＦＭＵＰについても、同様に測定した。【０１１０】
（手順）
１．  分光計を３０℃に温める。
２．  酵素ストック溶液を反応緩衝液で希釈する。
３．  基質（５０μｌ：最終濃度１０μＭ）を石英キュベットに加える。
４．  反応緩衝液をキュベットに４４０μｌ加える。
５．  キュベットをパラフィルムでふたをして振盪。
６．  蛍光測定を行う（酵素反応前）。
７．  希釈した酵素溶液をキュベットに１０μｌ入れる。
８．  キュベットをパラフィルムでふたをして振盪。
９．  蛍光測定を行う（酵素反応後）。【０１１１】
ＫmおよびＶMAXのような動力学的パラメータは、前記化合物の濃度に対する反応初速度をプロットし、そのプロットをミハエリス−メンテン式に当てはめることにより、算出した。当初反応速度は、１ｍＭのＤＴＴと１ｍＭのＥＤＴＡを含む１００ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中で化合物の３８０ｎｍでの吸光度と蛍光強度（λex＝３８０ｎｍ、λem＝４７０ｎｍ）で測定することにより算出した。【０１１２】
【表１】
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【０１１３】
前記表１に示すように、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）および実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）は、高いＶmax／Ｋm値を示し、この値はＤｉＦＭＵＰについて得られた値と同等であることが確認できた。また、実施例１で得られた化合物（ＰＥＨＣ）、実施例２で得られた化合物（ＰＰＨＣ）および実施例３で得られた化合物（６−ＰＥＨＣ）のＶmax／Ｋm値から、ＰＰＨＣは反応速度からＤｉＦＭＵＰと同等の速度で切断されることが確認できた。前記のように、ＰＰＨＣはＡＣＰを除く種々のホスファターゼとは反応しないことを考慮すると、ＰＰＨＣはＡＣＰを特異的に検出するための優れた基質であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明のホスホクマリン誘導体は、ホスファターゼ検出試薬にも適用できる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図６ｅ】
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【図６ｆ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図７ｅ】
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【図７ｆ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図９ｅ】
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【図９ｆ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【国際調査報告】
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