(57)【要約】  活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法、該製造方法により得られうる抽出物、該抽出物を含む飲食品、医薬、口腔用組成物、飼料、及び骨由来のオステオカルシン含有成育増強剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱処理した骨から溶媒抽出する工程を包含することを特徴とする活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法。
【請求項２】
加熱処理が湿式加熱処理である請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
抽出に用いる溶媒が酸性水溶液又はアルカリ性水溶液である請求項１記載の製造方法。
【請求項４】
加熱処理していない骨からアルカリ性水溶液で溶媒抽出する工程を包含することを特徴とする活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法。
【請求項５】
アルカリ性水溶液がｐＨ８〜１２のアルカリ水溶液である請求項３又は４記載の製造方法。
【請求項６】
アルカリ性水溶液が炭酸塩及び／又は重炭酸塩の水溶液である請求項３又は４記載の製造方法。
【請求項７】
活性型オステオカルシン含有抽出物の脱塩工程を包含する請求項１又は４記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１又は４記載の製造方法により製造される活性型オステオカルシン含有抽出物。
【請求項９】
請求項８記載の抽出物を含有することを特徴とする飲食品。
【請求項１０】
請求項８記載の抽出物を含有することを特徴とする医薬。
【請求項１１】
請求項８記載の抽出物を含有することを特徴とする口腔用組成物。
【請求項１２】
請求項８記載の抽出物を含有することを特徴とする飼料。
【請求項１３】
骨から採取された活性型オステオカルシンを有効成分とする成育増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法、該製造方法により得られうる抽出物、該抽出物を含む飲食品、医薬、口腔用組成物、飼料、及び骨由来のオステオカルシン含有成育増強剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
活性型オステオカルシンは、骨中Ｇｌａ残基含有タンパク質（ＢＧＰ）とも呼ばれ、骨形成細胞である骨芽細胞によって合成される細胞外マトリックスに存在する特徴的な非コラーゲン性タンパク質である。活性型オステオカルシンは骨の非コラーゲン性タンパク質の１０〜２０％を占めると言われている。【０００３】
ヒトのオステオカルシンは分子中に４９のアミノ酸を含有し、ビタミンＫ依存性の翻訳後修飾によって分子中のグルタミン酸残基がγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）残基に変換される。γ−カルボキシル化オステオカルシンは分子中に３残基のＧｌａ残基（１７、２１及び２４位）を含有している。また、骨芽細胞におけるオステオカルシンの生合成は活性型ビタミンＤにより増大する。γ−カルボキシル化オステオカルシンはＧｌａ残基を介してカルシウムと結合することができ、この作用によって骨の石灰化に関与していると言われていることから、活性型オステオカルシンと呼ばれている。オステオカルシン分子の一部は血中に分泌されることから、その血清中濃度は骨形成や骨代謝疾患の指標ともされている。【０００４】
ヒトにおいてミネラル摂取量が所要量を下回ることは健康を維持するうえで好ましくない。特にカルシウム不足は骨粗しょう症のような骨疾患のリスクを上昇させるのみならず、筋肉や神経組織の機能にも影響を及ぼすことが知られている。カルシウムをはじめとするミネラル吸収を促進するためにカルシウム結合能を有するＧｌａをミネラル吸収促進剤として利用することが検討されており、Ｇｌａを含有するオステオカルシンもその素材として使用できるといわれている（特許文献１）。【０００５】
生物由来の原料から活性型オステオカルシンを製造する方法についての報告は少ない。ニワトリの骨からオステオカルシン、オステオポンチンを選択的に可溶化する方法が報告されている（非特許文献１）。該文献に開示された方法は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む溶媒を用いる抽出方法である。【０００６】
骨からのオステオカルシンの抽出方法としては、上記のＥＤＴＡを含む溶媒を用いる方法の他に酸を用いる抽出方法が知られているが、その抽出効率は十分ではない（非特許文献２）。【０００７】
一方、畜産動物の骨は、そのエキスが熱水により抽出され、食品用スープや天然調味料の素材として利用されているが、エキスの抽出残渣には有効な利用方法がなく、再利用されているとしても肥料として利用されている程度であり、より有用な利用方法が望まれていた。【０００８】
【特許文献１】特開平６−７０７１９号公報
【非特許文献１】Ｃａｌｃｉｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．、第５５巻、第２３０−２３５頁（１９９４）
【非特許文献２】Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第１０７巻、第５１６−５４４頁（１９８４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、骨の有用な利用方法の開発が望まれていた。従来知られていた骨からのオステオカルシンの抽出方法は、原料として生の骨を使用し、ＥＤＴＡを含む溶媒、又は酸性溶媒を用いて抽出する方法であった。しかしながら、ＥＤＴＡは食品に利用する場合、その用途や使用量が制限されており、食品素材の製造においてＥＤＴＡの使用は適さない。たとえこの問題を回避するためにＥＤＴＡを除去する工程を加えたとしても、完全にＥＤＴＡを除去する事は困難であるうえ、ＥＤＴＡを除去する工程を加える事により製造原価が上昇する事となる。また、酸を用いる方法では、ＥＤＴＡを使用する方法に比べて十分な抽出効率を得ることが出来ない。加えて、原料として使用されている生の骨は、そのエキスが食品素材として既に有効に利用されていた。【００１０】
従って、本発明の目的は、骨より活性型オステオカルシンを効率よく抽出し、活性型オステオカルシンを多く含む、食品素材に適した抽出物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
熱水抽出処理などの加熱処理を施された骨に、オステオカルシンのような有用タンパク質が活性型で存在していることは、知られていなかった。本発明者らは、加熱処理した骨を用いて食品加工技術を駆使し、食品添加剤を用い種々の抽出処理を行ったところ、驚くべきことに、活性型のオステオカルシンが高濃度で、効率よく抽出でき、活性型オステオカルシンを豊富に含む安全性に優れた抽出物を製造できることを見出した。また加熱処理を行っていない生の骨からの抽出方法も確立し本発明を完成し、骨から採取した活性型オステオカルシンの用途を開発した。【００１２】
本発明の第一の発明は、加熱処理した骨から溶媒抽出する工程を包含することを特徴とする活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法に関する。第一の発明の態様において、加熱処理は湿式加熱処理であり、抽出に用いる溶媒は酸性水溶液又はアルカリ性水溶液である。加熱処理された骨としては、豚骨からスープを取った後に残る煮骨等が挙げられる。【００１３】
本発明の第二の発明は、加熱処理していない骨からアルカリ性水溶液で溶媒抽出する工程を包含することを特徴とする活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法に関する。
本発明の第一の発明、第二の発明の態様において、アルカリ性水溶液としてはｐＨ８〜１２のアルカリ水溶液、炭酸塩及び／又は重炭酸塩の水溶液を使用することができる。また、活性型オステオカルシン含有抽出物の脱塩工程を包含してもよい。【００１４】
本発明の第三の発明は、本発明の第一又は第二の発明の製造方法により製造される活性型オステオカルシン含有抽出物に関する。【００１５】
本発明の第四の発明は、本発明の第三の発明の抽出物を含有することを特徴とする飲食品に関する。第四の発明の飲食品としては、成育増強用、骨強化用及び／又は骨粗鬆症用の飲食品が例示される。第四の発明の飲食品においては、その容器、包装及び／又はパンフレットに成育増強、骨強化及び／又は骨粗鬆症予防若しくは治療に用いられる旨の表示が付されていても良い。【００１６】
なお、本発明により、活性型オステオカルシンを含有することを特徴とする成育増強用、骨強化用、及び／又は骨粗鬆症用の飲食品も提供される。【００１７】
また、飲食品の製造方法であって、本発明の第一又は第二の発明の製造方法により活性型オステオカルシン含有抽出物を製造する工程、並びに成育増強、骨強化及び／又は骨粗鬆症予防若しくは治療に用いられる旨の表示を行う工程を含む方法も、本発明により提供される。【００１８】
なお、成育増強用、骨強化用及び／又は骨粗鬆症予防若しくは治療用の飲食品の製造における第三の発明の抽出物の使用も本発明の一態様である。【００１９】
また、本発明により、第三の発明の抽出物を含むγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）補給剤が提供される。該γ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）補給剤としては、飲食品の形態で使用されるものが例示される。【００２０】
本発明の第五の発明は、本発明の第三の発明の抽出物を含有することを特徴とする医薬に関する。【００２１】
なお、本発明により、活性型オステオカルシンを含有することを特徴とする成育増強用、骨強化用、及び／又は骨書証症の予防若しくは治療用の医薬も提供される。【００２２】
また、成育増強方法、骨強化方法、又は骨粗鬆症の予防若しくは治療方法であって、本発明の第三の発明の抽出物を投与する工程を含む方法も、本発明により提供される。【００２３】
さらには、成育増強方法、骨強化方法、又は骨粗鬆症の予防若しくは治療方法であって、活性型オステオカルシンを投与する工程を含む方法も、本発明により提供される。【００２４】
本発明の第六の発明は、本発明の第三の発明の抽出物を含有することを特徴とする口腔用組成物に関する。【００２５】
本発明の第七の発明は、本発明の第三の発明の抽出物を含有することを特徴とする飼料に関する。【００２６】
本発明の第八の発明は、骨から採取された活性型オステオカルシンを有効成分とする成育増強剤に関する。【００２７】
また本発明により、本発明の第三の発明の抽出物及び／又は当該抽出物から精製された活性型オステオカルシンを有効成分として使用する化粧品も提供される。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、活性型オステオカルシンを豊富に含む抽出物の製造方法が提供される。該製造方法により、有用な利用方法が望まれていた骨のエキス抽出残渣を原料として利用する事ができる。また、該製造方法により、製造にＥＤＴＡを使用せずに飲食品に適した抽出物を製造する事ができる。更には、従来の製造方法に比べて製造原価を低減する事ができる。また、本発明により、活性型オステオカルシンを豊富に含む抽出物が提供される。該抽出物は、異味、異臭を有さず、脂肪成分が除去された水溶性の抽出物であり、様々な製品形態への適用が可能な飲食品に適した抽出物である。また、本発明により、該抽出物を含有する飲食品、医薬、口腔用組成物、及び飼料等が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明において原料として使用される骨は、活性型オステオカルシンを含むものであれば特に限定はないが、ウシ、ブタ、ニワトリ等の食肉用の動物や、その他の哺乳類、鳥類、魚類等の脊椎動物の骨が使用でき、ブタの骨が好適に使用できる。骨は、付着した肉を取り除いた骨（以下、生骨と記すことがある）を使用できる。【００３０】
また、本発明者らは、驚くべきことに、熱水処理や加圧熱水処理後の骨からも、活性型オステオカルシンを含む抽出物が製造できることを見出した。すなわち、本発明により、原料として加熱処理した骨を用いることを特徴とする活性型オステオカルシン含有抽出物が提供される。加熱処理した骨は生骨よりも余分な脂肪分が少なく、活性型オステオカルシンを抽出する原料として極めて好適である。本発明において原料として用いられる加熱処理した骨としては、加熱処理、例えば湿式加熱処理、例えば熱水処理、加圧熱水処理及び／又は加圧水蒸気処理を施された骨が例示される。このような加熱処理を施された骨としては、骨からエキスを抽出した残渣（以下、骨のエキス抽出残渣と記すことがある）が例示され、例えば生骨から水蒸気でエキスを抽出した残渣（以下、骨の水蒸気抽出残渣と記すことがある）や、生骨から熱水でエキスを抽出した後の残渣（以下、骨の熱水抽出残渣と記すことがある）が挙げられる。なお、本願明細書においては、骨のエキス抽出残渣のことを煮骨と記すことがある。本発明の原料として加熱処理した骨を用いる場合、加熱処理、例えば湿式加熱処理の温度としては、特に限定はないが、８０℃〜１５０℃、好適には８５℃〜１４０℃、より好適には１１０℃〜１３０℃が例示される。また、加熱処理、例えば湿式加熱処理の時間としては、特に限定はないが、１５分〜２４時間、好適には３０分〜１０時間、より好適には１〜８時間の条件で加熱処理された骨を使用することができる。なお、原料として使用される骨は、抽出効率を高める観点から、生骨又は加熱処理した骨、例えば煮骨を破砕又は粉砕したものが好適である。【００３１】
本発明の加熱処理された骨からの活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法においては、抽出溶媒に特に限定はないが、水性溶媒が抽出溶媒として好適に使用され、例えば、各種アルカリ性水溶液、水、塩酸水溶液、酢酸水溶液、燐酸水溶液、乳酸水溶液、クエン酸水溶液、ギ酸水溶液、アスコルビン酸水溶液が例示される。より好適にはアルカリ性水溶液が使用される。また、加熱処理をされていない骨からの活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法においては、後述のとおり、アルカリ性水溶液の使用が好適である。なお酸性溶媒、アルカリ性溶媒原料としては食品添加物の使用が好適である。【００３２】
本発明に使用されるアルカリ性水溶液としては、炭酸塩及び／又は重炭酸塩の水溶液、ホウ酸カリウム、ホウ酸ナトリウム等のホウ酸塩の水溶液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、並びに酢酸エタノールアミン緩衝液が例示される。【００３３】
本発明に使用される炭酸塩としては、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸カルシウム、及び炭酸バリウムが例示され、重炭酸塩としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、及び炭酸水素カルシウムが例示される。【００３４】
本発明において使用される好適なアルカリ性水溶液のｐＨは、ｐＨ７超〜１４であり、より好適にはｐＨ８〜１３であり、更に好適にはｐＨ９〜ｐＨ１１である。また、アルカリ性水溶液中の塩濃度は、０．００１Ｍ以上が好適であり、より好適には０．１〜３Ｍであり、更に好適には０．２〜１Ｍである。本発明のアルカリ性水溶液を所望のｐＨに調整する方法に特に限定はないが、例えば、炭酸塩と重炭酸塩を任意の割合で配合することにより適宜調整することができる。【００３５】
また、本発明の活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法の別の態様として、加熱処理をされていない骨を原料とし、アルカリ性水溶液を抽出溶媒として使用する活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法が提供される。本発明者らは、アルカリ性水溶液を抽出溶媒として用いることによって、ＥＤＴＡを用いることなく、加熱処理をされていない骨より効率的に活性型オステオカルシンを抽出できることを見出した。ここで用いられるアルカリ性水溶液としては、前述のものを使用できる。また、原料として使用される骨は、食肉加工時に産生される種々の生骨が用いられる。【００３６】
本発明の製造方法において、骨から活性型オステオカルシンを抽出する際の抽出時間は、特に限定はないが、好ましくは１時間以上であり、より好ましくは６〜４８時間であり、更に好ましくは１２〜２４時間である。また、抽出温度は特に限定はないが、好ましくは０〜１３０℃の範囲であり、より好ましくは８０℃以下であり、更に好ましくは、４０℃以下である。【００３７】
本発明の製造方法の抽出溶媒にアルカリ性水溶液を用いる場合には、上記製造方法により得られた抽出物中のアルカリ成分を、酸により中和する工程を更に含む活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法も、本発明の抽出物の製造方法に包含される。抽出物を飲食品に用いる場合には、中和に用いる酸としては食品加工に認められるものであれば特に限定はないが、例えば、塩酸、硫酸、硝酸等の無機酸、アジピン酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸等の有機酸、また陽イオン交換樹脂、陽イオン交換繊維、陽イオン交換膜等の固体酸が使用可能である。そのうち、クエン酸が最も好適である。【００３８】
また本発明の製造方法の抽出溶媒に酸性水溶液を用いる場合には、上記製造方法により得られた抽出物中の酸成分を、アルカリ成分により中和する工程を更に含む活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法も、本発明の抽出物の製造方法に包含される。抽出物を飲食品に用いる場合には、中和に用いるアルカリ成分としては食品加工に認められるものであれば特に限定はないが、例えば、無機塩基（例えば、アルカリ土類金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属の炭酸塩；炭酸マグネシウム、炭酸バリウムなどのアルカリ土類金属の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属の炭酸水素塩；炭酸アンモニウム；アンモニアなど）を含むアルカリ性水溶液、有機塩基（例えば、酢酸ナトリウム、プロピオン酸カリウムなどのアルカリ金属の有機酸塩；ギ酸マグネシウム、酢酸マグネシウムなどのアルカリ土類金属の有機酸塩；アミン類；含窒素複素環化合物など）を含むアルカリ性水溶液、及び陰イオン交換樹脂を含むアルカリ性の懸濁液を用いることができ、そのうち、炭酸ナトリウム水溶液、又は陰イオン交換樹脂懸濁液を好適に用いることができる。【００３９】
また、上記製造方法によって得られた抽出物を更に脱塩する工程を含む活性型オステオカルシン含有抽出物の製造方法も、本発明の抽出物の製造方法に包含される。脱塩の工程では、抽出物から完全に塩を取り除く必要はなく、本発明の抽出物を飲食品等に用いるのに適した濃度まで塩を取り除けば良い。本発明に用いられる脱塩方法には特に限定はないが、限外濾過、電気透析、ゲル濾過、イオン交換樹脂を用いる事ができる。【００４０】
本発明の抽出物の製造方法によれば、活性型オステオカルシンを効率よく抽出することができる。なお、本発明の製造方法における活性型オステオカルシンの抽出効率については、原料として使用される骨の形態や骨中の活性型オステオカルシン含量により変動することから、特に限定されるものではないが、例えば豚の煮骨１ｇ（湿重量）当り８０μｇ以上の活性型オステオカルシンを得ることもできる。また、骨に強固に結合した活性型オステオカルシンは、これを摂取したとしても体内への吸収は期待できないが、本発明の製造方法によって得られる抽出物中の活性型オステオカルシンは、水に可溶で、しかも溶液中のミネラルとの結合が可能であるため、摂取によってカルシウムをはじめとするミネラルの吸収促進が期待できる。【００４１】
本発明において抽出物とは、抽出溶媒を用いて抽出操作を行う工程により得られる物質のことを言う。また該物質に更に濾過、遠心分離、濃縮、精密濾過、限外濾過、分子ふるい及び／又は中和等の処理を施して得られる物質も本発明の抽出物に包含される。また上記物質を公知の方法で分画することによって得られる画分や、分画操作を複数回繰り返すことによって得られる画分も、本発明の抽出物に包含される。上記の分画手段としては抽出、分別沈殿、カラムクロマトグラフィー等が挙げられる。さらには、上記物質に酵素処理を施したものも本発明の抽出物に包含される。当該酵素処理に用いる酵素としては、ペプシン、パンクレアチン、トリプシン、パパイン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等のプロテアーゼやペプチダーゼが例示される。【００４２】
本発明の抽出物は、活性型オステオカルシンを多く含む事を特徴とし、本発明により、例えば乾固物換算で０．０１重量％以上の活性型オステオカルシンを含む抽出物、より具体的には、乾固物換算で０．０３〜３．０重量％の活性型オステオカルシンを含む抽出物の提供が可能になる。また、この抽出物により活性型オステオカルシン高濃度含有物の調製が可能となる。なお、本発明の抽出物中には不活性型のオステオカルシンが含まれていても良い。また、コラーゲンやその他の骨由来タンパク質が含まれていても良い。【００４３】
本発明において、本発明の抽出物の形状は特に限定はないが、粉状、固形状、液状のいずれの形状であっても良い。粉状とする場合、スプレードライ法やフリーズドライ法など公知の方法を使用すればよく、特に限定はないが、例えば抽出溶媒で原料より活性型オステオカルシンを抽出することにより得られた抽出物を濃縮し、更にデキストリン、ショ糖脂肪酸エステル、乳糖等の賦形剤を添加し、乾燥、粉砕する事により、粉状の抽出物を得ることが出来る。また、当該抽出物を公知の方法で造粒して得た粒状の固形物を、本発明の抽出物として使用することもできる。造粒方法としては、特に限定はないが、転動造粒、攪拌造粒、流動層造粒、気流造粒、押出し造粒、圧縮成型造粒、解砕造粒、噴射造粒又は噴霧造粒等が例示される。また、液状の抽出物としては、前記抽出物の製造方法により得られた液体そのもの、その濃縮物や希釈物の他、前記の粉状の抽出物を液体、例えば水やアルコール等に溶解して液状としたものが例示される。【００４４】
本発明の飲食品は、上記の抽出物を含有する。本発明の飲食品は活性型オステオカルシンを多く含むため、歯や骨の増強効果やカルシウム等のミネラル吸収促進に有用である。当該飲食品には、カルシウム等のミネラルを配合することもできる。当該飲食品としては、上記の効能を期待した機能性飲食品が例示され、例えば、歯や骨の増強作用や、カルシウム等のミネラル吸収促進による所望の効果の発現のために用いられるものである旨の表示を付した健康食品（特定保健用食品）とすることもできる。また、当該飲食品は、後述の本発明の医薬に感受性を示す各種疾患に対しての治療及び予防効果を得ることができる。また、上記の抽出物にコラーゲンやその他の骨由来タンパク質を多く含む場合、肌への美容効果に優れた飲食品となる。また、当該機能性飲食品は、歯や骨の増強効果やカルシウム等のミネラル吸収促進作用等に関するその他の成分を配合することもできる。このような成分としては特に限定されるものではないが、小腸上部でのカルシウムの能動輸送による吸収に関与するビタミンＤが例示される。【００４５】
本発明の飲食品の製造法に特に限定はない。例えば、本発明の抽出物の配合、調理、加工などは一般の飲食品のものに従えばよく、それらの製造法により製造することができ、得られた飲食品に本発明に係る前記抽出物が含有されていれば良い。また、本発明の抽出物そのものを飲食品としたものであっても良い。【００４６】
なお、本発明の飲食品において単に「含有」と言うときは、本発明の抽出物の含有、添加及び／又は希釈を意味する。ここで、「含有」とは飲食品中に本発明の抽出物が含まれるという態様を、「添加」とは飲食品の原料に、本発明の抽出物を添加するという態様を、「希釈」とは本発明の抽出物に、飲食品の原料を添加するという態様をいうものである。【００４７】
本発明の飲食品は、前記抽出物が含有されるものであれば特にその形状に限定はなく、タブレット状、顆粒状、カプセル状等の経口的に摂取可能な形状の飲食品も包含する。また、前記抽出物にグリセリン等を添加して健康食品とすることもできる。また、本願明細書において飲食品とは飲料をも包含するものであり、本発明の抽出物をそのまま、もしくは水や公知の飲料に含有させて、本発明の飲料とすることができる。また、本発明の飲食品としては、カルシウムを高含有することから、牛乳やヨーグルトなどの乳製品が例示される。【００４８】
飲食品中の本発明の抽出物の含有量は特に限定はなく、例えば飲食品中における本発明の抽出物の乾燥重量で、０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜８０重量％、更に好ましくは０．５〜５０重量％である。【００４９】
なお、本発明の抽出物は活性型オステオカルシンを高含有することから、本発明の別の態様として、本発明の抽出物を含有するγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）補給剤も提供される。当該剤はγ−カルボキシグルタミン酸を体内へ補給するために使用される剤であり、その好ましい態様は飲食品である。【００５０】
本発明の医薬は、上記の抽出物を含有する。本発明の医薬は活性型オステオカルシンを含むため、歯や骨の増強効果（例えば、骨密度や骨の強度の増強効果）やカルシウム等のミネラル吸収促進に有用である。また、体重増加等の成育増強効果を得ることができる。本発明の医薬に感受性を示す疾患としては、骨粗鬆症（例えば、慢性骨粗鬆症、閉経後のホルモンバランス異常により起こる骨粗鬆症、糖尿病やステロイド剤等の副作用に伴う続発性骨粗鬆症等）、骨折、再骨折、骨欠損、骨形成不全症、骨軟化症、骨ペーチェット病、硬直性脊髄炎、慢性関節リウマチ、変形性関節炎、変形性関節症、成長障害、歯周病、歯周疾患における歯周組織欠損、歯根・歯槽欠損が例示される。【００５１】
また、当該医薬は、歯や骨の増強効果やカルシウム等のミネラル吸収促進作用等に関するその他の成分を配合することもできる。【００５２】
本発明の医薬は、通常、前記抽出物を薬学的に許容できる液状または固体状の担体と配合することにより製造され、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。【００５３】
医薬用担体は、本発明の医薬の投与形態及び剤型に応じて選択することができる。固体組成物からなる経口剤とする場合は、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等とすることができ、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩などが担体として利用される。また経口剤の調製に当っては、更に結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、流動性促進剤、矯味剤、着色剤、香料などを配合することもできる。例えば、錠剤または丸剤とする場合は、所望によりショ糖、ゼラチン、ハイドロキシプロピルセルロースなどの糖衣または胃溶性もしくは腸溶性物質のフィルムで被覆しても良い。液体組成物からなる経口剤とする場合は、薬理学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などとすることができ、例えば、精製水、エタノールなどが担体として利用される。また、更に所望により湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、防腐剤などを添加しても良い。なお、本発明の抽出物は経口投与によっても十分な効果を発揮することから、その投与の簡便性の観点から経口投与用の医薬とするのが好適な形態である。【００５４】
一方、非経口剤とする場合は、常法に従い本発明の前記抽出物を希釈剤としての注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、落花生油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどに溶解ないし懸濁させ、必要に応じ、殺菌剤、安定剤、等張化剤、無痛化剤などを加えることにより調製することができる。また、固体組成物を製造し、使用前に無菌水または無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。【００５５】
外用剤としては、経皮投与用または経粘膜（口腔内、鼻腔内）投与用の、固体、半固体状または液状の製剤が含まれる。また、座剤なども含まれる。例えば、乳剤、ローション剤などの乳濁剤、外用チンキ剤、経粘膜投与用液剤などの液状製剤、油性軟膏、親水性軟膏などの軟膏剤、フィルム剤、テープ剤、パップ剤などの経皮投与用または経粘膜投与用の貼付剤などとすることができる。【００５６】
以上の各種製剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる製剤における抽出物の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、好ましくは後述の投与量範囲で当該抽出物を投与できるような量であれば特に限定されるものではない。本発明の製剤中の抽出物の含有量としては、乾燥重量で０．１〜１００重量％程度である。【００５７】
本発明の医薬の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該医薬の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。一般には、製剤中に含有される前記抽出物量を乾燥重量で表した場合の投与量で、例えば成人１日当り０．１μｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重、好適には１μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重、さらに好適には１０μｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重である。もちろん投与量は、種々の条件によって変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、または数回に分けて行っても良い。投与期間も任意である。また、本発明の医薬はそのまま経口投与する他、任意の飲食品に添加して日常的に摂取させることもできる。【００５８】
本発明の口腔用組成物は、上記の抽出物を含有することを特徴とする。本発明の口腔組成物は活性型オステオカルシンを含むため、歯の石灰化の促進が期待できる。本発明の口腔組成物は、液状、ペースト状、軟膏、又は粉体とすることができ、フロスなどの繊維担体に被覆、あるいは配合することができ、歯みがき、液体歯みがき、ガム、マウスウォッシュ、マウススプレイ、歯ブラシ、デンタルフロス、又は歯間清掃具などの形態であっても良い。本発明における口腔組成物中の本発明の抽出物の含有量は特に限定はなく、例えば口腔組成物中における本発明の抽出物の乾燥重量で、０．１〜１００重量％、好ましくは０．５〜８０重量％、更に好ましくは１〜５０重量％である。【００５９】
本発明の飼料は、上記の抽出物を含有することを特徴とする。本発明の飼料は活性型オステオカルシンを含むため、本発明の飼料を家畜、実験動物、家禽、魚類、ペット動物などに給餌することにより、これらの生物の成長を促進させたり、骨を強化させたりすることができる。さらに、本発明の飼料によれば、本発明に使用されるオステオカルシンの生理作用に基づき、前記の本発明の医薬と同様の効果の発現が期待できる。【００６０】
本発明の飼料が給餌される生物としては、特に本発明を限定するものではないが、例えばウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマなどの家畜、マウス、ラット、モルモット、ウサギなどの実験動物、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ダチョウなどの家禽、マダイ、イシダイ、ヒラメ、カレイ、ブリ、ハマチ、ヒラマサ、マグロ、シマアジ、アユ、サケ・マス類、トラフグ、ウナギ、ドジョウ、ナマズ等の魚類、クルマエビ、ブラックタイガー、タイショウエビ、ガザミ等の甲殻類等、アワビ、サザエ、ホタテ貝、カキ等の貝類、イヌ、ネコ等のペット動物が挙げられる。【００６１】
本発明に使用される飼料は、前記抽出物量を乾燥重量で表した場合の給餌量で、通常、対象生物１日当たり０．０００１ｍｇ〜２０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重給餌される。もちろん給餌量は、種々の条件によっても変動するので、上記給餌量より少ない量で十分な場合もあるし、あるいは範囲を超えて必要な場合もある。給餌は、例えば、本発明の抽出物を対象生物に供する人工配合飼料の原料中に添加、混合しておくか、人工配合飼料の粉末原料と混合した後、その他の原料にさらに添加、混合することで行うことができる。【００６２】
前記の人工配合飼料の原料としては、魚粉、カゼイン、ミートミール、イカミールなどの動物性原料、大豆粕、小麦粉、デンプン、コーングルテンミール、飼料用酵母などの植物性原料、タラ肝油、イカ肝油、などの動物性油脂、大豆油、菜種油等の植物性油脂、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸、抗酸化剤等が例示される。前記飼料原料を混合して製造された人工配合飼料に本発明の有効成分を配合して本発明の飼料としてもよい。【００６３】
本発明の抽出物の飼料中の含有量は特に限定されるものではなく、飼料１００重量％中、０．０００１重量％以上、好ましくは０．００１〜１００重量％、より好ましくは０．０１〜１００重量％である。すなわち、本発明の有効成分を単独で飼料とすることもできる。【００６４】
また、魚類用の人工配合飼料とする場合には、魚類への病原微生物感染を防止するという観点から、本発明の抽出物に加えて抗ウイルス作用を持つ組成物を人工飼料に配合してもよい。抗ウイルス作用を持つ組成物としては、シクロペンテノン誘導体を含む組成物、例えばＤＨＣＰ（４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１オン）を豊富に含む昆布処理物が例示される。【００６５】
なお、本発明の飼料は、飲料として対象生物に給餌しても良い。飲料として給餌する場合の本発明の有効成分の濃度は特に限定はなく、目的に応じて使用すれば良いが、０．０００１〜１ｗ／ｗ％の割合が適当である。【００６６】
本発明の成育増強剤は、骨から採取された活性型オステオカルシンを有効成分とすることを特徴とする。本発明の成育増強剤は動物、例えばヒト、家畜、養殖魚等の成育を促進する作用を有する。この本発明の成育増強剤の作用により、例えば、動物の体長や体重を増加させる効果が期待できる。成育増強剤は前記の有効成分を含有させる他は常法に従い製造すればよく、当該増強剤を含有する食品も本発明の態様である。当該食品は「成育増強作用を有する食品」、「成育増強用の食品」として、例えば成育増強作用を有することや成育増強用であること等を表示して使用することができる。【００６７】
本発明により得られる活性型オステオカルシンは、ラットへの経口投与において２０００ｍｇ／ｋｇを単回投与しても死亡例は認められない。【００６８】
本発明により、活性型オステオカルシンの効率の良い抽出方法が提供され、当該抽出物を有効成分とする安全性の高い医薬、及び飲食品用添加物が提供される。【００６９】
本発明の抽出物は活性型オステオカルシンだけでなく原料の骨由来のコラーゲンを主成分とするタンパク質群を豊富に含んでおり、骨の健康をはじめ、美容に役に立つ健康食品として、機能性食品素材としても大量生産が可能であり、市場への供給が可能である。【００７０】
例えば、ブタの肉部分を採った後の豚骨部分からは、エキスが抽出され、ラーメンのスープなどとして商品化されている。日本の畜産県の代表である鹿児島県では年間７万トン程度の豚骨が生産され、エキスが抽出された残渣、すなわち煮骨も大量に産生されている。活性型オステオカルシンは骨に強固に結合しているため、これまで機能性食品素材として利用されることはなかったが、本発明者らは骨形成に必須なタンパク質、活性型オステオカルシンの抽出を種々検討し、本発明者らが保有する食品加工技術を用いることにより、例えば３０ｋｇのブタ煮骨粉砕物から２．１ｇの活性型オステオカルシンを含有する７００ｇの抽出物を製造することが可能になった。【００７１】
本発明により安全性の高い活性型オステオカルシン高含有抽出物の提供が初めて可能になった。オステオカルシンは、骨芽細胞により産生されるたんぱく質であり、活性型のみがカルシウムを骨に蓄積する機能がある。本発明の抽出物には、この活性型オステオカルシンが含まれるため、骨分解と骨形成のバランスを骨形成に向かわせるのに有用である。また本発明の態様として異味、異臭を有さず、脂肪成分も除去された水溶性の抽出物が提供され、当該活性型オステオカルシン高含有抽出物は、様々な製品形態への適用が可能である。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明について実施例をもって詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００７３】
実施例１  豚骨からの活性型オステオカルシンの抽出における溶媒の検討（１）
以下に記す方法で各抽出溶媒の調製を行った。０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）：炭酸ナトリウム（ナカライテスク社）０．２７５ｇ、炭酸水素ナトリウム（ナカライテスク社）０．６２ｇを蒸留水で溶解し５０ｍＬとした。１Ｍ塩酸：塩酸（ナカライテスク社）４．３ｍＬに蒸留水４５．７ｍＬの蒸留水を加えて混合した。１Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ６．７）：燐酸水素２ナトリウム（ナカライテスク社）７．１ｇを蒸留水に溶解し５０ｍＬとしたものと、燐酸２水素１カリウム（ナカライテスク社）６．８ｇを蒸留水に溶解し５０ｍＬとしたものを混合し、ｐＨ６．７に調整した。次に、生豚骨からエキスを加圧熱水抽出した残渣（煮骨）をミキサーで粉砕したもの３ｇ（湿重量）に対して、各溶液１０ｍＬを添加し、攪拌しながら４℃で２４時間抽出を行った。抽出液と残渣を分離した後、抽出液を中和し、透析（ＳＰＥＣＴＲＵＭ社製、分画分子量３５００）により脱塩を行った。次に、透析内液中の活性型オステオカルシン量をＥＬＩＳＡ法（タカラバイオ社製）により測定した。その結果を表１に示す。表１に示す如く、炭酸緩衝液で特に活性型オステオカルシンの抽出効率が高いことが示された。【００７４】
【表１】
2008108395.tif 000002
【００７５】
実施例２  豚骨からの活性型オステオカルシンの抽出における原料の検討
生の豚骨を熱水（９０℃）で３０分間加熱後、加熱抽出液１を得て、さらに取り出した豚骨は粗粉砕を行った。さらに、粗粉砕した豚骨を再度熱水（９０℃）で３０分間加熱し、加熱抽出液２と熱水処理豚骨を得た。続いて、生の豚骨を加圧下熱水（１２０℃）で５時間加熱し、加熱抽出液３と加圧熱水処理豚骨を得た。次に、原料の骨として熱水処理豚骨２０ｇ（湿重量）、又は加圧熱水処理豚骨をミキサーで粉砕したもの２０ｇ（湿重量）を用いる点、及び抽出溶媒として０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）６０ｍＬを用いる点以外は実施例１と同様の方法で抽出物を製造し、該抽出物中の活性型オステオカルシン量を測定した。その結果を表２に示す。表２に示す如く、熱水処理豚骨、加圧熱水処理豚骨から炭酸緩衝液中に活性型オステオカルシンが抽出されることが示された。なお加熱抽出液１〜３からは活性型オステオカルシンはほとんど検出されなかった。【００７６】
【表２】
2008108395.tif 000003
【００７７】
実施例３  豚骨からの活性型オステオカルシンの抽出における抽出溶媒の塩濃度検討
以下に示す方法で、種々の濃度の炭酸緩衝液を調製した。１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）：炭酸ナトリウム１．３７５ｇ、炭酸水素ナトリウム３．１ｇを蒸留水で溶解し５０ｍＬとした。これを蒸留水で希釈して０．０５〜０．５Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を調製した。次に、実施例１と同様の方法で、炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）の濃度と活性型オステオカルシンの抽出効率の関係を検討した。その結果を表３に示す。表３に示す如く、いずれの濃度においても活性型オステオカルシンを抽出することができたが、０．１〜１Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で特に活性型オステオカルシンの抽出効率が高いことが示された。【００７８】
【表３】
2008108395.tif 000004
【００７９】
実施例４  豚骨からの活性型オステオカルシンの抽出における抽出温度の検討
抽出溶媒に０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を用い、抽出温度が４℃と３０℃である点以外は実施例１と同様の方法で、０．２Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を用いた活性型オステオカルシンの抽出における抽出温度を検討した。その結果を表４に示す。表４に示す如く、３０℃での抽出の方がより活性型オステオカルシンの抽出効率が高いことが示された。【００８０】
【表４】
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【００８１】
実施例５  豚骨からの活性型オステオカルシンの抽出における抽出溶媒のｐＨの検討
以下に示す方法で、炭酸塩水溶液、及び重炭酸塩水溶液を調製した。０．５Ｍ重炭酸塩水溶液（ｐＨ８．０）：炭酸水素ナトリウム２．１ｇを蒸留水で溶解し５０ｍＬとした。０．５Ｍ炭酸塩水溶液（ｐＨ１２．０）：炭酸ナトリウム２．６５ｇを蒸留水で溶解し５０ｍＬとした。次に、実施例１と同様の方法で、０．５Ｍ炭酸塩水溶液、０．５Ｍ重炭酸塩水溶液を用いた活性型オステオカルシンの抽出における抽出溶媒のｐＨを検討した。その結果を表５に示す。表５に示す如く、ｐＨ８〜１２の範囲の炭酸塩及び／又は重炭酸塩の水溶液で活性型オステオカルシンが効率良く抽出できることが示された。【００８２】
【表５】
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【００８３】
実施例６  豚骨からの活性型オステオカルシンの抽出における溶媒の検討（２）
蒸留水、０．５Ｍ酢酸、２６．２％乳酸、０．２５Ｍ及び０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）、０．５Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）、又は０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ１２．０）を抽出溶媒として用いる点以外は実施例２と同様の方法で加圧熱水処理豚骨をミキサーで粉砕したものから抽出物を製造し、種々の抽出溶媒を用いた場合の活性型オステオカルシンの抽出効率について評価した。その結果を表６に示す。表６に示す如く、蒸留水や０．５Ｍ酢酸、２６．２％乳酸に比べて、０．２５Ｍ及び０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）、０．５Ｍ重炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）、０．５Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ１２．０）が活性型オステオカルシンの抽出効率が高いことが示された。【００８４】
【表６】
2008108395.tif 000007
【００８５】
実施例７  豚骨からの活性型オステオカルシンの抽出における溶媒の検討（３）
１Ｍ塩酸、０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５及びｐＨ１０．５）、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）、０．５Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ９．１）、０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）、又は０．５Ｍ酢酸エタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）を抽出溶媒として用いる点以外は実施例６と同様の方法で、活性型オステオカルシンの抽出効率について評価した。その結果を表７に示す。表７に示す如く、１Ｍ塩酸に比べて、０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５及びｐＨ１０．５）、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）、０．５Ｍホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ９．１）、０．５Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．１）、０．５Ｍ酢酸エタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．６）が活性型オステオカルシンの抽出効率が高いことが示された。【００８６】
【表７】
2008108395.tif 000008
【００８７】
実施例８
生豚骨からエキスを加圧熱水抽出した残渣（煮骨）をミキサーで粉砕したもの３０ｋｇ（湿重量）に対して、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）１５０Ｌを添加し、攪拌しながら室温にて２２時間抽出を行った。抽出液と残渣を分離した後、セラミック膜ろ過、珪藻土ろ過、無菌ろ過、限外ろ過、無菌ろ過を順次行い、無菌ろ過液３６Ｌを得た。次にこのろ液を凍結乾燥し、活性型オステオカルシンを１．７ｇ含有する凍結乾燥物４１０ｇを調製した。【００８８】
実施例９
緑茶葉１０ｇ、ビタミンＣ０．２ｇ及びイオン交換水１０００ｍＬを用い、常法に従って緑茶を調製した。本発明品１は、実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を、製品１００ｍＬ当りの活性型オステオカルシン量が３０ｍｇとなるように添加した。対照は、無添加のものとした。本発明品１は対象と同様の風味を示し、動物臭等は感じられなかった。【００８９】
実施例１０
普通牛乳の均質牛乳（水分８８．６ｗ／ｖ％、タンパク質２．８ｗ／ｖ％、脂肪３．５ｗ／ｖ％、乳糖４．５ｗ／ｖ％、灰分０．８ｗ／ｖ％）を用い、本発明品２は、実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を、製品１００ｍＬ当り活性型オステオカルシン量が３０ｍｇとなるように添加した。対照は、無添加のものを用いた。本発明品２は対象と同様の風味を示し、動物臭の増加は感じられなかった。【００９０】
実施例１１
常法に従い、大豆から豆乳を作り、凝固剤で凝固させ、通常のもめんごしの豆腐を調製した。本発明品３は、豆乳中に実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を、製品１００ｇ当りの活性型オステオカルシン量が４０ｍｇとなるように添加した。対照は無添加のものを用いた。本発明品３は対象と同様の風味を示し、動物臭等は感じられなかった。【００９１】
実施例１２
菓子類として、オレンジゼリーを試作した。オレンジゼリーは、カラギーナン９ｇをグラニュー糖１８０ｇと混合し、水８００ｍＬを加え、混合、加熱溶解する。これに、温州みかん濃縮果汁１０ｇ、クエン酸２ｇ、クエン酸ソーダ１．５ｇ、オレンジアロマ２ｇ、香料１ｇを加えて調製した。本発明品４は、それぞれ実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を、製品１００ｇ当りの活性型オステオカルシン量が２０ｍｇとなるように添加した。対照は、無添加のものを用いた。本発明品４は対象と同様の風味を示し、動物臭等は感じられなかった。【００９２】
実施例１３
練り製品として、ソーセージを試作した。ソーセージは、豚肉２ｋｇ、豚脂肪７００ｇを５ｍｍ目で肉ひきし、コショウ７ｇ、セージ３ｇ、メース１ｇを混合し、カッティングした後、径２ｃｍの豚腸を用いケーシングした。これを１５分間蒸煮してソーセージを得た。ソーセージにはカッティング前に、本発明品５は、実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を、製品１００ｇ当りの活性型オステオカルシン量が５０ｍｇとなるように添加した。対照は、無添加のものを用いた。本発明品５は対象と同様の風味を示し、動物臭の増加は感じられなかった。【００９３】
実施例１４
下記表８の配合で打錠機を用い、打錠時の圧力３０００ｋｇ／ｃｍ２で常法に従い、実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を含む錠剤（２００ｍｇ／錠）を作製した。【００９４】
【表８】
2008108395.tif 000009
【００９５】
実施例１５
下記表９の配合で実施例８に準じて調製した凍結乾燥物を含む歯磨き組成物を作製した。【００９６】
【表９】
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【００９７】
実施例１６
下記表１０の配合で実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を含むチューインガム組成物を作製した。【００９８】
【表１０】
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【００９９】
実施例１７
生豚骨からエキスを加圧熱水抽出した残渣（煮骨）をミキサーで粉砕したもの３０ｋｇ（湿重量）に対して、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）９０Ｌを添加し、攪拌しながら室温にて２４時間抽出を行った。抽出液と残渣を分離して得られた抽出液を０．５Ｍクエン酸水溶液で中和した後、限外ろ過を行い、ろ過液１３．３Ｌを得た。次に、このろ過液を凍結乾燥し、活性型オステオカルシンを２．１ｇ含有する凍結乾燥物７００ｇを調製した。【０１００】
実施例１８
実施例１７で調製した凍結乾燥物を０．０５％（ｗ／ｗ）混合した餌を孵化後６週目の鶏（雌）５０羽に与えて飼育した。また、対照として１００羽に凍結乾燥物を含まない餌を与えて飼育した。飼育９週間目に鶏の体重を測定した結果、対照群の体重は１１８５．３±１１４．７ｇ、凍結乾燥物投与群では１２６０．２±１０１．７ｇであり、本発明の抽出物による顕著な鶏の成育増強作用が認められた。【０１０１】
実施例１９
生豚骨からエキスを加圧熱水抽出した残渣（煮骨）をミキサーで粉砕したもの６００ｋｇ（湿重量）に対して、０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）３０００Ｌを添加し、攪拌しながら室温にて２２時間抽出を行った。抽出液と残渣を分離した後、セラミック膜ろ過、珪藻土ろ過、無菌ろ過、限外ろ過、無菌ろ過を順次行い、無菌ろ過液７００Ｌを得た。得られた無菌ろ過液をエバポール濃縮し、液量を８５Ｌとした。この濃縮物にデキストリン（松谷化学社：パインデックス＃１）を固形分の８割量添加した後、スプレイドライにより、飼料添加用オステオカルシン含有組成物を調製した。【０１０２】
実施例２０
オステオカルシン含有抽出物の酵素処理物を以下の方法で調製した。実施例８に準じて製造した凍結乾燥物１０ｇを５０ｍＬのイオン交換水に溶解し、ｐＨ６．８下でパンクレアチン０．２５ｇ（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ社製）を加えて３７℃、１時間反応しオステオカルシン含有抽出物の酵素処理物を得た。また、実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を含まずに同様の反応を行ったものをコントロール処理物とした。
次に、以下の方法でオステオカルシン含有抽出物の酵素処理物の腸からのカルシウム吸収性の向上作用を評価した。【０１０３】
９週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラット（５匹）を一晩絶食した後、小腸を摘出し回腸と盲腸の接合部（回盲部）から十二指腸側に３ｃｍずつ腸を切断して１匹から６〜８個の標本を得た。各標本は丁寧に反転させた後、両端を縫合して反転腸サックを作製した。
次に、それぞれの各反転腸サック内に漿膜側緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｄ−グルコース，１．２５ｍＭ  ＣａＣｌ２・２水和物，ｐＨ７．６）を０．３ｍＬ注入し、３７℃に保温したオステオカルシン含有抽出物の酵素処理物もしくはコントロール処理物を粘膜側緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，４ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  Ｄ−グルコース，１０ｍＭ  ＣａＣｌ２・２水和物，ｐＨ７．６）で２０倍希釈した液の中でインキュベートした。インキュベート１５分後に、サック内に挿入したカニューレからサックの内液をサンプリングしてカルシウム濃度をカルシウムＥテストワコー（和光純薬社製）で測定し、カルシウム吸収量を算出した。その結果を表１１に示す。【０１０４】
【表１１】
2008108395.tif 000012
【０１０５】
表１１に示す通り、反転腸サックモデルにおいてオステオカルシン含有抽出物の酵素処理物がカルシウムの吸収量を高めることが示された。【０１０６】
実施例２１
４週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラットを馴化後、オステオカルシン含有抽出物投与群（ｎ＝５）とコントロール群（ｎ＝５）に分け、オステオカルシン含有抽出物投与群には実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を２．５重量％含む標準食（ＣＥ−２、日本クレア社製）を給餌した。一方、コントロール群には標準食を給餌した。それぞれの群のラットより、投与１０日目に採血を行い、血液中のカルシウム濃度をカルシウムＥテストワコーで測定した。その結果を表１２に示す。【０１０７】
【表１２】
2008108395.tif 000013
【０１０８】
表１２に示す通り、オステオカルシン含有抽出物投与群の方がコントロール群に比べて血中カルシウム濃度が高いことが示された。【０１０９】
実施例２２
８週齢のＷｉｓｔａｒ系雌ラットを卵巣摘出手術群（ｎ＝１３）と偽手術群（ｎ＝６）に分け、卵巣摘出術と偽手術をそれぞれ施した。卵巣摘出手術群については、低カルシウム食（カルシウム含量０．１％、日本クレア社製）にて２週間馴化後、実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を２．５重量％含む低カルシウム食（カルシウム含量０．１％）を８週間給餌したオステオカルシン含有抽出物投与群（ｎ＝７）と、馴化に続けて低カルシウム食を８週間給餌したコントロール群（ｎ＝６）の２群に更に区分けした。偽手術群については、偽手術後１０週間低カルシウム食を与えた。なお、それぞれの群のラットより、手術後１０週目に採血を行った。【０１１０】
続いて、ラットを麻酔下で脱血致死させた後、大腿骨を摘出して骨幹端部の骨密度を評価した。骨密度は、ｐＱＣＴ法（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｂｏｎｅ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、３８５−４０５頁、１９９９年）により遠位成長板より３ｍｍの部位で測定した。その結果を表１３に示す。【０１１１】
【表１３】
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【０１１２】
表１３に示す通り、オステオカルシン含有抽出物による大腿骨骨幹端部における骨密度の上昇作用が示された。【０１１３】
また、手術後１０週目に採血した血液中のカルシウム濃度を測定した。その結果を表１４に示す。【０１１４】
【表１４】
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【０１１５】
表１４に示す通り、オステオカルシン含有抽出物投与群の方がコントロール群に比べて血中カルシウム濃度が高いことが示された。【０１１６】
実施例２３
４週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラットを低カルシウム食（カルシウム含量０．１％）にて馴化後、オステオカルシン含有抽出物投与群（ｎ＝５）とコントロール群（ｎ＝５）に分け、オステオカルシン含有抽出物投与群には実施例８に準じて製造した凍結乾燥物を２．５重量％含む低カルシウム食（カルシウム含量０．１％）を給餌した。一方、コントロール群には低カルシウム食（カルシウム含量０．１％）を給餌した。投与１８日目にラットを麻酔下で脱血致死させた後、大腿骨を摘出して骨幹部の骨密度を評価した。骨密度は、ｐＱＣＴ法により遠位成長板より１２ｍｍの部位で測定した。その結果を表１５に示す。【０１１７】
【表１５】
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【０１１８】
表１５に示す通り、オステオカルシン含有抽出物投与群の方がコントロール群に比べて大腿骨骨幹部における骨密度が高く、皮質骨の厚さおよび三点曲げ強度が亢進していることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明により、医薬や飲食品への配合に適した活性型オステオカルシン含有抽出物を安価に製造する事ができる。また、食品加工廃棄物より高付加価値な製品を製造する事ができる。
【国際調査報告】
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