(57)【要約】  配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、肺癌由来の細胞を特異的に傷害し得ることを特徴とするポリペプチドを提供する。これにより、正常細胞には影響を与えることなく癌細胞を特異的に傷害する物質を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、肺癌由来の細胞を特異的に傷害し得ることを特徴とするポリペプチド：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または
（Ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列。
【請求項２】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項３】
（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド：
（Ａ）配列番号２に示される塩基配列；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列において１個もしくは数個のヌクレオチドが置換、付加もしくは欠失された、塩基配列；または
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る、塩基配列。
【請求項４】
請求の範囲第２項または第３項に記載のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とするベクター。
【請求項５】
請求の範囲第２項または第３項に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項６】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドと特異的に結合することを特徴とする抗体。
【請求項７】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを含んでいることを特徴とする肺癌を治療するための治療用組成物。
【請求項８】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを備えていることを特徴とする肺癌を治療するための治療用キット。
【請求項９】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを生体内に投与する工程を包含する肺癌を治療する方法。
【請求項１０】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを細胞とインキュベートする工程を包含することを特徴とする肺癌由来の細胞を検出するための検出方法。
【請求項１１】
インキュベートした後の上記細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の検出方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを備えていることを特徴とする肺癌由来の細胞を検出するための検出用キット。
【請求項１３】
細胞の生存率を測定するための試薬をさらに備えていることを特徴とする請求の範囲第１２項に記載の検出用キット。
【請求項１４】
請求の範囲第１項に記載のポリペプチドを含んでいることを特徴とする肺癌由来の細胞を検出するための検出用組成物。
【請求項１５】
癌細胞を傷害する因子をスクリーニングする方法であって、血清濃度が２％以下の培地にて癌細胞を培養する工程、および候補因子を癌細胞とともにインキュベートする工程を包含することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１６】
インキュベートした後の上記癌細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１７】
上記因子が抗体酵素であることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１８】
上記癌細胞が肺癌由来であることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１９】
上記培地がＣａＣｌ２を含んでいることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
請求の範囲第１５項に記載のスクリーニング方法によって得られたことを特徴とする癌細胞を傷害する因子。
【請求項２１】
請求の範囲第１５項に記載のスクリーニング方法によって得られた因子を含んでいることを特徴とする癌を治療するための治療用組成物。
【請求項２２】
請求の範囲第１５項に記載のスクリーニング方法によって得られた因子を備えていることを特徴とする癌を治療するための治療用キット。
【請求項２３】
請求の範囲第１５項に記載のスクリーニング方法によって得られた因子を生体内に投与する工程を包含することを特徴とする癌を治療する方法。
【請求項２４】
抗体酵素を含んでいることを特徴とする癌を治療するための治療用組成物。
【請求項２５】
抗体酵素を備えていることを特徴とする癌を治療するための治療用キット。
【請求項２６】
抗体酵素を生体内に投与する工程を包含することを特徴とする癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌に対する傷害性を有する新規ポリペプチドおよびそのスクリーニング方法、ならびにこれらの利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
一般に癌（腫瘍）の治療として、化学療法、外科療法、放射線療法、免疫療法などが行われている。化学療法は、抗癌剤を用いる治療法である。抗癌剤としては種々の物質が開発されており、ＤＮＡ合成阻害などの細胞代謝拮抗剤、チロシンキナーゼ阻害剤などの分子標的治療が行われている。しかし、従来の抗癌剤は、正常細胞と癌細胞との間の選択性が低く、薬剤の種類によっては、強い副作用を伴うこともある。そのため、さらなる好適な抗癌剤の開発が期待されている。【０００３】
抗体（免疫グロブリン）でありかつ酵素作用を示すタンパク質である抗体酵素は、抗体触媒、ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ａｂｚｙｍｅとも呼ばれている。特定の化学反応の中間体に特異的に結合するように作製された抗体酵素は、当該化学反応を触媒することができる。また、抗体酵素は天然においても存在しており、天然の抗体酵素は、生体内に存在する抗体からＬ鎖またはＨ鎖のみが分離して生成され特定の酵素活性を発揮する。【０００４】
天然の抗体酵素として、抗原を分解するものが知られている。現在、このような抗体酵素を利用した、医薬分野に応用する為の研究（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉに起因する胃疾患、関節リウマチ、ＨＩＶなどの治療に関する研究）が行われており、種々の医療分野における抗体酵素の利用が期待されている。【０００５】
また、さらなる天然の抗体酵素としては、ヒト免疫グロブリン軽鎖であるベンスジョーンズタンパク質が挙げられる。ベンスジョーンズタンパク質は、骨髄腫患者の尿中に存在するモノクローナル免疫グロブリンのＬ鎖の単量体または二量体であり、骨髄腫細胞で合成された過剰のＬ鎖が腎糸球体にて速やかにろ過されて尿中に出現したものである（特許文献１などを参照のこと）。
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開２００４−４１１４３号公報（公開日：平成１６年２月１２日）」
【発明の開示】
【０００６】
抗体酵素は癌細胞に対する傷害性を有しているかもしれない。特許文献１には、抗体酵素であるベンスジョーンズタンパク質が抗癌剤として用いることができるかもしれないことが示唆されている。しかし、公知の手法では、ベンスジョーンズタンパク質が抗癌作用を有しているか否かを知ることはできなかった。このために、現在までに、癌に対する傷害性を示す抗体酵素は得られていない。
【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、正常細胞には影響を与えることなく癌細胞を特異的に傷害する物質をスクリーニングする方法を提供し、新たな抗癌剤を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、独自の培地条件で培養した癌細胞を用いれば、癌細胞に対する傷害性を有している物質を効率よく検出し得ることを見出したことにより、抗癌作用を有する新規ポリペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明に係るポリペプチドは、（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有することを特徴としている：（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列；または、（Ｂ）配列番号１で示されるアミノ酸配列中の１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失された、アミノ酸配列。
【００１０】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴としている。また、本発明に係るポリヌクレオチドは、（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであってもよい：（Ａ）配列番号２に示される塩基配列；（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列中の１個もしくは数個のヌクレオチドが置換、付加もしくは欠失された、塩基配列；または、（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、塩基配列。
【００１１】
本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含んでいることを特徴としている。
【００１２】
本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００１３】
本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと特異的に結合することを特徴としている。
【００１４】
本発明に係る治療用組成物は、肺癌を治療するために上記ポリペプチドを含んでいることを特徴としている。
【００１５】
本発明に係る治療用キットは、肺癌を治療するために上記ポリペプチドを備えていることを特徴としている。
【００１６】
本発明に係る治療法は、肺癌を治療するために上記ポリペプチドを生体内に投与する工程を包含することを特徴としている。
【００１７】
本発明に係る検出方法は、肺癌由来の細胞を検出するために、上記ポリペプチドを細胞とインキュベートする工程を包含することを特徴としており、インキュベートした後の上記細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することが好ましい。
【００１８】
本発明に係る検出用キットは、肺癌由来の細胞を検出するために、上記ポリペプチドを備えていることを特徴としており、細胞の生存率を測定するための試薬をさらに備えていることが好ましい。
【００１９】
本発明に係る検出用組成物は、肺癌由来の細胞を検出するために、上記ポリペプチドを含んでいることを特徴としている。
【００２０】
本発明に係るスクリーニング方法は、癌細胞を傷害する因子をスクリーニングするために、血清濃度が２％以下の培地にて癌細胞を培養する工程、および候補因子を癌細胞とともにインキュベートする工程を包含することを特徴としている。本発明に係るスクリーニング方法は、インキュベートした後の上記癌細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含してもよい。
【００２１】
本発明に係るスクリーニング方法において、上記因子は抗体酵素であることが好ましく、上記癌細胞は肺癌由来であることが好ましい。
【００２２】
また、本発明に係るスクリーニング方法において、上記培地はＣａＣｌ２を含んでいることが好ましい。
【００２３】
本発明に係ることを特徴とする癌細胞を傷害する因子は、上記のスクリーニング方法によって得られたことを特徴としている。
【００２４】
本発明に係る治療用組成物は、癌を治療するために、上記スクリーニング方法によって得られた因子を含んでいることを特徴としている。
【００２５】
本発明に係る治療用キットは、癌を治療するために、上記スクリーニング方法によって得られた因子を備えていることを特徴としている。
【００２６】
本発明に係る治療法は、癌を治療するために、上記スクリーニング方法によって得られた因子を生体内に投与する工程を包含することを特徴としている。
【００２７】
本発明に係る治療用組成物は、癌を治療するために、抗体酵素を含んでいることを特徴としている。
【００２８】
本発明に係る治療用キットは、癌を治療するために、抗体酵素を備えていることを特徴としている。
【００２９】
本発明に係る治療法は、癌を治療するために、抗体酵素を生体内に投与する工程を包含することを特徴としている。
【００３０】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１（ａ）】多発性骨髄腫の患者の尿サンプルからｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにて分画したＢＪＰ（ＹＡＧ）のピークを示す図である。
【図１（ｂ）】多発性骨髄腫の患者の尿サンプルからｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにて分画したＢＪＰ（ＹＡＧ）の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。
【図２】多発性骨髄腫の患者から採取したＢＪＰ（ＹＡＧ）のアミダーゼ活性を示す図である。
【図３】培地の血清濃度を変化させたときの、Ａ５４９細胞の生存率を示す図である。
【図４】Ａ５４９細胞の形態を示す図であり、（ａ）は、ＢＪＰ（ＹＡＧ）を培地に添加した場合を示し、（ｂ）は、無添加の状態を示す。
【図５】培地の血清濃度を変化させた際の、ＢＪＰ（ＹＡＧ）のＡ５４９細胞への傷害性を示す図である。
【図６】ＢＪＰ（ＹＡＧ）を培地に添加した際のＡ５４９細胞の生存率を示す図である。
【図７】培地に添加するＣａＣｌ２濃度を変化させた際の、ＢＪＰ（ＹＡＧ）のＡ５４９細胞への傷害性を示す図である。
【図８】ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）のアミダーゼ活性を示す図である。
【図９】ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）を培地に添加した際のＡ５４９細胞の形態を示す図である。
【図１０】ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）を培地に添加した際のＡ５４９細胞の生存率を示す図である。
【図１１（ａ）】ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにて分画した組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）のピークを示す図である。
【図１１（ｂ）】ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにて分画した組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を示す図である。
【図１２】組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）のアミダーゼ活性を示す図である。
【図１３】組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）を添加した場合の種々の培養細胞の形態を示す図である。
【図１４】組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）を添加した際のＡ５４９細胞の生存率を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
〔１：ポリペプチド〕
１つの局面において、本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害し得るポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「肺癌由来の細胞」は、原発部位が肺である癌細胞が意図され、原発ガンおよび転移ガンの細胞ならびに生体から単離された細胞を含む。また、「肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性」は、他の細胞、例えば、肺以外を原発部位とする癌細胞や肺の正常細胞を傷害することなく肺癌由来の細胞のみを傷害する活性が意図される。【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。【００３４】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質もしくは細胞は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質もしくは細胞が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。【００３５】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいはその変異体が好ましい。【００３６】
本明細書中においてタンパク質またはポリペプチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、目的のポリペプチドが有する特定の活性を保持したポリペプチドが意図され、「配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体」は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドが意図される。なお、本明細書を読んだ当業者は、本発明に係るポリペプチドの変異体が肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するか否かを容易に決定することができる。【００３７】
ポリペプチドを構成するアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。【００３８】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。【００３９】
好ましい変異体は、保存性または非保存性アミノ酸置換、欠失、または付加を有する。これらは、本発明に係るポリペプチドの肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を変化させない。【００４０】
このように、本実施形態に係るポリペプチドは、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドであって、（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、（２）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、であることが好ましい。【００４１】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。【００４２】
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖およびイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。【００４３】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。【００４４】
他の局面において、本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドの生産方法を提供する。【００４５】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。【００４６】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが組換え発現系において用いられることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能な宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られるポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。【００４７】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。【００４８】
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。【００４９】
本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターが無細胞タンパク質合成系において用いられることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットが用いられ得る。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。【００５０】
無細胞タンパク質合成系は細胞内ｍＲＮＡやクローニングされたｃＤＮＡにコードされているさまざまなタンパク質の同定等に広く用いられる手法であり、無細胞タンパク質合成系（無細胞タンパク質合成法、無細胞タンパク質翻訳系とも呼ぶ）に用いられるのが無細胞タンパク質合成液である。【００５１】
無細胞タンパク質合成系としては、コムギ胚芽抽出液を用いる系、ウサギ網状赤血球抽出液を用いる系、大腸菌Ｓ３０抽出液を用いる系、および植物の脱液胞化プロトプラストから得られる細胞成分抽出液が挙げられる。一般的には、真核生物由来遺伝子の翻訳には真核細胞の系、すなわち、コムギ胚芽抽出液を用いる系またはウサギ網状赤血球抽出液を用いる系のいずれかが選択されるが、翻訳される遺伝子の由来（原核生物／真核生物）や、合成後のタンパク質の使用目的を考慮して、上記合成系から選択されればよい。【００５２】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することが好ましい。本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、後述する抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明に係るポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。【００５３】
さらに他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。【００５４】
本発明に係るポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。【００５５】
このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、当該ポリペプチドのアミノ酸配列、または当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。つまり、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【００５６】
〔２：ポリヌクレオチド〕
１つの局面において、本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。【００５７】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。【００５８】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。特定のポリペプチドのアミノ酸配列が得られた場合、当業者は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を容易に設計することができる。【００５９】
他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドあるいはその変異体である。【００６０】
本明細書中においてポリヌクレオチドに関して用いられる場合、用語「変異体」は、特定のポリペプチドの活性と同じ活性を保持しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図され、「配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドの変異体」は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。すなわち、本明細書中で使用される場合、ポリヌクレオチドの観点における変異体は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、
・配列番号２に示される塩基配列において、１または数個の塩基が置換、欠失または付加されている塩基配列からなるポリヌクレオチド；あるいは
・配列番号２に示される塩基配列の相補配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド
であり得る。【００６１】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、または、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化学合成されてもよい。【００６３】
本発明に係るポリヌクレオチドはまた、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。【００６４】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０ｎｔより長いポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）は、本明細書中においてより詳細に考察されるような検出用プローブとしても有用である。【００６６】
以上のように、本発明に係るポリヌクレオチドは、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下のいずれかであることが好ましい：（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失されたアミノ酸配列からなるポリペプチドでありかつ肺癌由来の細胞を特異的に傷害し得ることを特徴とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；（２）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；（３）配列番号２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド；あるいは、（４）配列番号２に示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が置換、欠失もしくは付加された塩基配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。【００６７】
本発明に係るポリヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列またはベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。【００６８】
なお、本発明に係るベクターは、周知の遺伝子組換え技術により、本発明に係るポリヌクレオチドを所定のベクターに挿入することにより作製することができる。上記ベクターとしては、これに限定されるものではないが、後述する組換え発現ベクターの他に、クローニングベクターを用いることができる。【００６９】
本発明に係るポリヌクレオチドの生産方法も特に限定されるものではない。例えば、配列番号２に示す塩基配列等に基づいて、ＤＮＡシンセサイザーにより合成してもよい。当業者は、２００塩基以下のポリヌクレオチドであれば、ＤＮＡシンセサイザーによって合成し得ることを容易に理解する。また、当業者は、２００塩基以下のポリヌクレオチドどおしを周知の方法を用いて連結し得るので、２００塩基以上のポリヌクレオチドを容易に取得し得る。ポリヌクレオチドは、取得されたポリヌクレオチドを鋳型としてＰＣＲ等により増幅することで大量に生産することができる。また、取得した上記ポリヌクレオチドを含むベクターを用いて大腸菌等を形質転換して、増幅したポリヌクレオチドを回収することによっても大量に生産することができる。【００７０】
このように、本発明に係るポリヌクレオチドの生産方法は、少なくとも、当該ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。つまり、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【００７１】
〔３：ベクター〕
本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、周知の遺伝子組換え技術により、本発明に係るポリヌクレオチドを所定のベクターに挿入することにより作製することができる。上記ベクターとしては、組換え発現ベクターの他にクローニングベクターが挙げられるが、これらに限定されない。【００７２】
〔４：形質転換体〕
本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体を提供する。本明細書中で使用される場合、「形質転換体」は、細胞、組織または器官だけでなく、生物個体を含む。【００７３】
形質転換体の作製方法（生産方法）としては、特に限定されないが、例えば、組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。また、形質転換の対象となる生物としても、特に限定されないが、各種微生物、植物および動物が挙げられる。【００７４】
遺伝子が導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行なうことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行なう。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行なうことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。【００７５】
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換体がいったん得られれば、当該生物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された生物体、もしくは、当該生物体と同一の性質を有する当該生物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。【００７６】
このように、本発明に係る形質転換体は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていればよいといえる。すなわち、組換え発現ベクター以外の手段によって生成された形質転換体も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。【００７７】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている形質転換体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および生物種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換体も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。【００７８】
〔５：抗体〕
本発明は、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと特異的に結合し得るものであればよく、当該ポリペプチドに対するポリクローナル抗体等でもよいが、当該ポリペプチドに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。モノクローナル抗体は、性質が均一で供給しやすい、ハイブリドーマとして半永久的に保存ができるなどの利点を有する。【００７９】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体および抗イディオタイプ抗体が挙げられるがこれらに限定されない。なお、「抗体」は、種々の公知の方法に従えば作製され得る。【００８０】
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントが、種々の公知の方法に従って使用され得ることは、当業者には明白である。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生され得る。あるいは、本発明に係るポリペプチドに結合するフラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または化学合成によって産生され得る。【００８１】
このように、本実施形態に係る抗体は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合するフラグメント（例えば、ＦａｂフラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよく、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。【００８２】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドと特異的に結合する抗体およびその利用を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、抗体作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の範囲に属することに留意しなければならない。【００８３】
〔６：癌を治療するための方法、組成物およびキット〕
本発明はさらに、肺癌を治療するための方法、組成物およびキットを提供する。本発明に係る治療用組成物は、本発明に係るポリペプチドを含んでいることを特徴としており、本発明に係る治療用キットは、本発明に係るポリペプチドを備えていることを特徴としている。なお、本明細書中で使用される場合、用語「治療」は、症状を軽減または排除することが意図され、予防的（発症前）または治療的（発症後）に行われ得るもののいずれもが包含される。【００８４】
本明細書中で使用される場合、「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であることが意図される。また、本明細書中で使用される場合、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であることが意図される。【００８５】
一般に、組成物は「二種以上の成分が全体として均質に存在し、一物質として把握されるもの」が意図され、主成分としての物質Ａ単独を含有する組成物、主成分としての物質Ａと物質Ｂとを含有する単一の組成物であり得る。これらの組成物は、物質Ａおよび物質Ｂ以外に他の成分（例えば、薬学的に受容可能なキャリア）を含有してもよい。本発明に係る組成物は、物質Ａとして上述した本発明に係るポリペプチドを含有していることを特徴としているので、本発明に係るポリペプチドを含有する組成物を他の組成物と併用する場合は、これらを全体として一組成物として認識し得ないが、この場合は、後述する「キット」の範疇に入り得、組成物としてではなくキットとして提供され得ることを当業者は容易に理解する。【００８６】
本発明に係る治療用組成物としての医薬品は、上記ポリペプチドを含んでおり、かつ、経口投与または非経口投与が都合よく行われるものであればどのような剤形のものであってもよい。本発明に係る医薬品の剤形としては、例えば注射液、輸液、用液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、外用液剤等の液体製剤；散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、腸溶剤、トローチ等の固形製剤；内湿布剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤、軟膏剤、ローション剤、坐剤等が挙げられる。また、本発明においては、症状に応じて、上記剤形の医薬品をそれぞれ単独で、または組み合わせて用いることができる。【００８７】
上記医薬品においては、目的に応じて、医薬の製剤技術分野において通常使用し得る公知の添加剤を添加することができる。このような添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、安定化剤等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。より具体的には、上記医薬品が固形製剤の場合には、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニットなどの賦形剤；澱粉、アルギン酸ソーダなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤；ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤；脂肪酸エステルなどの界面活性剤；グリセリンなどの可塑剤などの添加剤を製剤中に含有させることができる。【００８８】
また、上記医薬品が液体製剤の場合には、例えば、水、ショ糖、ソルビット、果糖などの糖類；ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類；ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類；ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤などの添加剤を製剤中に含有させることができる。また、液体製剤の場合、上記医薬品は有効成分である上記ポリペプチドを用時溶解させる形態の製剤であってもよい。【００８９】
上記医薬品の投与経路は特に限定されるものではなく、経口投与または非経口投与のいずれでもよい。服用の容易性の点から経口投与が可能であることが好ましい。また、上記医薬品の投与量は、投与経路、剤形、患者の症状の重篤度、年齢もしくは体重などによって適宜設定されるものであり特に限定されるものではない。【００９０】
本発明が治療用組成物ではなく治療用キットとして提供される場合は、その構成物の一つとして本発明に係るポリペプチドを備えていればよく、当該ポリペプチドの使用方法は、本発明に係る治療用組成物におけるポリペプチドの使用方法に準ずる。他の構成物の使用方法については、その目的に応じて適宜選択されればよい。【００９１】
本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは該材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、ここで、組成物の形態は上述したような形態であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、物質Ａおよび物質Ｂを同一の容器に混合して備えても別々の容器に備えてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、癌（好ましくは肺癌）の治療に適用するために必要な器具をあわせて備えてもよい。【００９２】
上述したように、本発明に係るポリペプチドは、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有している。従って、上記ポリペプチドを生体内に取り込ませることにより、当該生体内の肺癌細胞または肺癌由来の細胞を特異的に傷害することができ、その結果、肺癌細胞または肺癌由来の細胞の増殖を抑えるか、または減少させることができる。また、本発明に係る肺癌を治療するための方法は、上記ポリペプチドを生体内に投与する工程を包含している。本発明に係るポリペプチドは、正常な細胞を傷害することなく肺癌由来の細胞を特異的に傷害し得るので、上記方法を用いれば、肺癌由来の細胞を傷害して肺癌を治療することができる。【００９３】
〔７：肺癌由来の細胞を検出するための方法、組成物およびキット〕
本発明はさらに、肺癌由来の細胞を検出するための方法を提供する。本発明に係る肺癌由来の細胞を検出する方法は、本発明に係るポリペプチドを細胞とインキュベートする工程を包含していることを特徴としている。【００９４】
上述したように、本発明に係るポリペプチドは、肺癌由来の細胞を特異的に傷害する活性を有している。よって、本発明に係るポリペプチドとともにインキュベートされることにより細胞が傷害された場合は、当該細胞が肺癌由来の細胞であると判別し得る。一実施形態において、本発明に係る方法は、インキュベートした後の細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することが好ましい。【００９５】
細胞は、培養細胞として提供されても、生物学的サンプルとして提供されてもよい。本明細書中において使用される場合、「生物学的サンプル」は、供給源としての生物材料（例えば、個体、体液、細胞株、組織培養物もしくは組織切片）から得られる、任意の調製物が意図される。生物学的サンプルとしては、体液（例えば、血液、唾液、歯垢、血清、血漿、尿、滑液、および随液）および組織供給源が挙げられる。好ましい生物学的サンプルは、被験体サンプルである。好ましい被験体サンプルは、被験体から得た病変部であり得、哺乳動物から組織を得るための方法は、当該分野で周知であり、例えば、穿刺による生検、内視鏡又は気管支鏡を用いた組織採取が挙げられるが、これらに限定されない。【００９６】
一つの局面において、本発明に係る方法において、細胞の生存状態を評価する工程は、細胞の形態変化を観察することによって行われ得る。肺癌由来の細胞は上記ポリペプチドとインキュベートされることにより萎縮／縮小するので、細胞の形態変化を観察することにより、肺癌由来の細胞であるか否かを判定することができる。【００９７】
また、他の局面において、本発明に係る方法において、細胞の生存状態を評価する工程は、細胞の生存率を測定することによって行われ得る。上記ポリペプチドとインキュベートした細胞の生存率を測定することによって、肺癌由来の細胞であるか否かを判定することができる。また、上記ポリペプチドとインキュベートした細胞と、上記ポリペプチドを添加せずにインキュベートした細胞（コントロール）とを比較すれば、当該細胞が肺癌由来であるか否かをより容易に判定することができる。すなわち、本発明に係る方法において、細胞の生存状態を評価する工程は、上記ポリペプチドとインキュベートした細胞の生存率と、上記ポリペプチドを添加せずにインキュベートした細胞の生存率とを比較することによって行われることがなお好ましい。【００９８】
細胞の生存率の測定には、細胞数を計数しても、ＭＴＴ法等の周知の比色法等を用いてもよい。ＭＴＴ法では、細胞に黄色のテトラゾリウム塩であるＭＴＴ（３，［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ）を添加し、生存している細胞のミトコンドリア酵素によってＭＴＴが紫色のホルマザンに変換された量を吸光度に基づいて測定することにより、細胞の生存率を測定することができる。【００９９】
本発明はさらに、肺癌由来の細胞を検出するための組成物およびキットを提供する。本発明に係る肺癌由来の細胞を検出するための組成物は、本発明に係るポリペプチドを含んでいればよく、本発明に係る肺癌由来の細胞を検出するためのキットは、本発明に係るポリペプチドを備えていればよい。【０１００】
本発明に係る組成物およびキットは、本発明に係るポリペプチドを有しているので、肺癌由来の細胞を検出するために使用することができる。また、本発明に係る肺癌由来の細胞を検出するためのキットは、細胞の生存率の測定に用いる試薬を備えていることが好ましい。上記試薬としては、細胞の生存率を測定するのに用いることができる試薬であればよく、上述のＭＴＴ法関連試薬が挙げられるが、これに限られない。【０１０１】
〔８：癌細胞を傷害する因子のスクリーニング方法〕
１つの局面において、本発明は、癌細胞を傷害する因子をスクリーニングする方法を提供する。本発明に係るスクリーニング方法は、血清濃度が２％以下の培地にて癌細胞を培養する工程、および候補因子を癌細胞とインキュベートする工程を包含する特徴としている。インキュベート中の培地の血清濃度もまた２％以下であることが好ましい。【０１０２】
上記癌細胞としては、ＨｅｐＧ２（肝臓癌由来の細胞）、ＤＬＤ−１（大腸癌由来の細胞）、ＡＣＨＮ（腎臓癌由来の細胞）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌由来の細胞）、および、Ａ５４９（肺癌由来の細胞）の癌細胞株が挙げられるが、これらに限定されず、標的とする癌細胞の種類に応じて適宜選択されればよい。なお、コントロール実験を行う場合は、正常細胞（例えば、ＬＬＣ−ＰＫ１（正常な腎臓の上皮細胞）、Ｌ−５（正常な肺の上皮細胞）など）を用いることができるが、これらに限られない。【０１０３】
培養温度および培養時間については、用いる細胞に応じて適宜設定されればよい。また、本発明者らは。独自の観点に基づいて、癌細胞を傷害する効果を首尾よく検出するためには、培地中の血清濃度が重要であることを見出した。よって、本発明に係るスクリーニング方法においては、培地中の血清濃度を適宜変更することが好ましい。なお、血清中の夾雑物による影響を考慮すべき場合は、血清濃度は低いことが好ましい。【０１０４】
本発明に係るスクリーニング方法を用いる対象が抗体酵素である場合は、ＣａＣｌ２を添加することにより、抗体酵素の癌細胞に対する傷害性をより顕著に観察することができるので、培地中にＣａＣｌ２が含まれていることが好ましく、最終濃度０．２５〜０．７５ＭのＣａＣｌ２が含まれていることがより好ましい。【０１０５】
一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、インキュベートした後の細胞の生存状態を評価する工程をさらに包含することが好ましい。【０１０６】
一つの局面において、本発明に係るスクリーニング方法において、細胞の生存状態を評価する工程は、細胞の形態変化を観察することによって行われ得る。癌細胞は傷害されることにより萎縮／縮小するので、候補因子とインキュベートした細胞の形態変化を観察することにより、候補因子が癌細胞を傷害するか否かを判定することができる。【０１０７】
他の局面において、本発明に係るスクリーニング方法において、細胞の生存状態を評価する工程は、細胞の生存率を測定することによって行われ得る。候補因子とインキュベートした細胞の生存率を測定することによって、候補因子が癌細胞を傷害するか否かを判定することができる。細胞の生存率の測定には、細胞数を計数しても、ＭＴＴ法等の周知の比色法等を用いてもよい。また、本発明に係るスクリーニング方法において、候補因子とインキュベートした特定の癌細胞の生存率と、候補因子とインキュベートした当該癌細胞とは別の細胞の生存率とを比較する工程をさらに包含する。これにより、特定の癌細胞を特異的に傷害する因子を得ることができる。【０１０８】
本発明はさらに、上記スクリーニング方法によって得られた因子を用いた、癌を治療するための方法、組成物およびキットを提供する。上記スクリーニング方法によって得られた因子は、本発明に係るポリペプチドと同様の特性を有しているので、本明細書を読んだ当業者は、当該因子が上述した治療法、治療用組成物および治療用キットに適用され得ることを、容易に理解する。【０１０９】
以下、実施例および比較例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。尚、本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。【０１１０】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【０１１１】
〔実施例１：ＢＪＰ（ＹＡＧ）の精製〕
本発明に係るポリペプチド（ベンスジョーンズタンパク質：ＢＪＰ（ＹＡＧ））を、多発性骨髄腫患者の尿から精製した。具体的には、最終濃度０．４５ＭとなるようにＮａＣｌを添加した多発性骨髄腫患者の尿を、静置した後にろ過して、沈殿を回収した。回収した沈殿を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）＋１Ｍ硫酸アンモニウムによって平衡化したブチルセルロファインカラム（商品名ブチルセルロファイン、生化学工業）にアプライし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）を用いて溶出した。この溶出液に７０％飽和硫酸アンモニウムを添加して塩析した。沈殿を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーで溶解し、セファデックスＧ−７５（ＧＥヘルスケア）のカラムを用いて、ＢＪＰ（ＹＡＧ）の二量体と単量体との混合液を精製した。この混合液を、ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（ＧＥヘルスケア）にアプライし、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出することにより、ＢＪＰ（ＹＡＧ）の二量体（Ａ）と単量体（Ｂ）とを分離した（図１（ａ）および図１（ｂ））。【０１１２】
図１（ａ）は、ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムからのタンパク質の溶出を示す図である。示すように、２つのピーク（ＡおよびＢ）が得られた。それぞれのピークに対応する溶出画分ＡおよびＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）によって染色した（図１（ｂ））。示すように、画分Ａのタンパク質の見かけの分子量は約５１．０ｋＤａ、画分Ｂのタンパク質の見かけの分子量は約２５．０ｋＤａであった。【０１１３】
〔実施例２：ＢＪＰ（ＹＡＧ）のアミダーゼ活性の測定〕
ＢＪＰ（ＹＡＧ）が抗体酵素としての機能を有しているかを確認するために、ＢＪＰ（ＹＡＧ）のアミダーゼ活性を測定した。【０１１４】
アミダーゼ活性の測定を、クロモザイムトライ（Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ  ＴＲＹ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。クロモザイムトライとは、ｚ−ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。クロモザイムトライを加えた試料がアミダーゼ活性を有する場合、当該クロモザイムトライは分解され、ｐＮＡ（パラニトロアニリド；ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）が生成する。従って、ｐＮＡの生成量を測定することにより、試料のアミダーゼ活性を測定することができる。本実施例において、ｐＮＡの生成量は、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定することにより測定した。【０１１５】
実施例１で得られた画分Ａおよび画分Ｂの各々２００ｍｌに、最終濃度１００ｍＭのクロモザイムトライを添加し、３７℃で１８時間インキュベートした。また、コントロールとして、ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムでの溶出溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に、最終濃度１００ｍＭのクロモザイムトライを添加し、３７℃で１８時間インキュベートした。その後、各試料の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（図７）。【０１１６】
図７は、波長４０５ｎｍにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。示すように、画分Ａは、高い吸光度を示した。すなわち、ＢＪＰ（ＹＡＧ）の二量体（Ａ）が単量体（Ｂ）よりも抗体酵素としての活性が高いことが示された。【０１１７】
〔実施例３：ＢＪＰ（ＹＡＧ）の癌細胞に対する傷害性の観察〕
ＨｅｐＧ２（肝臓癌由来の細胞）、ＤＬＤ−１（大腸癌由来の細胞）、ＡＣＨＮ（腎臓癌由来の細胞）、Ｈｅｌａ（子宮頸癌由来の細胞）およびＡ５４９（肺癌由来の細胞）の癌細胞株と、ＬＬＣ−ＰＫ１（正常な腎臓の上皮細胞）およびＬ−５（正常な肺の上皮細胞）の正常細胞株にＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を添加した後の細胞を観察することにより、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の効果を調べたが、通常の血清濃度（１０％）で細胞を培養した場合は、いずれの細胞においても何ら変化がなかった（示さず）。これにより、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体が癌細胞に対する傷害性を有していないと考えられた。【０１１８】
しかし、本発明者らは独自の観点に基づき、血清中に含まれる夾雑物がＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の効果が妨げたと考え、培地中の夾雑物がない系において癌に対するＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の効果を調べることにした。ただし、ＨｅｐＧ２、ＤＬＤ−１、ＡＣＨＮ、Ｈｅｌａ、ＬＬＣ−ＰＫ１およびＬ−５については、無血清培地を用いて培養し得るが、Ａ５４９は無血清培地では生存し得ないので、通常濃度（１０％）の血清をどれだけ低減させてもＡ５４９の生育に影響が出ないのかを予め検討した（図３）。【０１１９】
種々の濃度の牛血清を含有する培地を用いてＡ５４９を２４時間培養した。図３は、１０％牛血清含有培地にてＡ５４９を培養した後の細胞数に対する、各濃度の牛血清含有培地にてＡ５４９を培養した後の細胞数の比率を示すグラフである。示すように、血清濃度が０％〜０．７５％の培地を用いた場合は、Ａ５４９が死滅したが、１％以上の血清濃度であればＡ５４９の生育に何ら影響を与えないことがわかった。【０１２０】
次いで、サブコンフルエントな状態になるまで無血清培地を用いて培養したＨｅｐＧ２、ＤＬＤ−１、ＡＣＨＮ、Ｈｅｌａ、ＬＬＣ−ＰＫ１およびＬ−５、ならびに１％の牛血清を加えた培地を用いて培養したＡ５４９に、最終濃度１μＭのＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体および最終濃度０．７５ＭのＣａＣｌ２を添加し、１８時間インキュベートした後の細胞を観察した（図４）。その結果、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体をＡ５４９に添加した場合、細胞が縮小／萎縮していた（図４の（ａ））。しかし、何も添加しなかったコントロール（図４の（ｂ））および他の細胞株（示さず）では形態変化が認められなかった。このことより、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体がＡ５４９を特異的に傷害することがわかった。【０１２１】
さらに、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の癌傷害活性が血清濃度依存的に観察されたことを裏付けるために、また、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体が癌傷害活性を示す至適血清濃度を検討するために、種々の濃度の血清を含有する培地を用いて培養したＡ５４９にＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を添加し、インキュベートした後の細胞生存率を、ＷＳＴ法を用いて測定した（図５）。示すように、血清濃度が２％を超えるとＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の細胞への傷害性が認められず、１〜２％の血清濃度において、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体が効率よく作用することがわかった。なお、ＷＳＴ法とは、ＭＴＴ法を改良した方法であり、テトラゾリウム塩として、ＭＴＴの代わりにＷＳＴ（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ、商品名ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ−８、Ｄｏｊｉｎ）を用いる方法である。【０１２２】
さらに、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を添加した後の細胞生存率を、ＷＳＴ法を用いて測定した。具体的には、以下の手順に従った。まず、９６穴マイクロプレートの各ウェルに播種したＡ５４９（５×１０４ｃｅｌｌｓ）を、１６時間培養した。引き続き、最終濃度０．７５ＭのＣａＣｌ２とともに、最終濃度１、２、３または４μＭのＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を培地に添加した後に、３７℃で２４時間培養した。次いで、培地にＷＳＴを添加した後に、細胞をさらに４時間インキュベートした。インキュベートした後の培地について、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（図６）。示すように、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体は、濃度依存的にＡ５４９に対する傷害性を示した。【０１２３】
〔実施例４：ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の癌細胞傷害性に対するＣａＣｌ２の影響〕
ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の癌細胞傷害性を検討する際に、本発明者らの独自の観点に基づいて最終濃度０．７５ＭのＣａＣｌ２をＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体と同時に添加していたが、次いで、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の癌細胞傷害性に対するＣａＣｌ２の影響の有無を確認した。具体的には、１％血清を含有する培地を用いて培養したＡ５４９に対し、最終濃度０ｍＭ〜２ｍＭのＣａＣｌ２、および最終濃度０μＭ〜４μＭのＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を添加し、さらにインキュベートした後にＷＳＴ法により細胞生存率を測定した（図７）。示すように、最終濃度０．７５ｍＭのＣａＣｌ２を加えたとき、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体による癌細胞傷害性は最大であった。しかし、ＣａＣｌ２の最終濃度が２ｍＭを超える場合は、ＣａＣｌ２自体が細胞を傷害した。このように、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体が癌細胞傷害性を示すためには、適切な濃度のＣａＣｌ２が必要であることがわかった。【０１２４】
〔実施例５：抗体酵素としての活性と癌細胞を傷害する活性との相関性〕
ジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）は、セリンプロテアーゼなどの特異的拮抗剤であり、活性中心のセリン残基に結合することにより酵素を失活させる。すなわち、ＤＦＰ結合型のＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体は抗体酵素としての酵素活性を失っていることが期待される。そこで、ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を作製した。具体的には、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体に過剰量のジイソプロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）を加え、５分間静置した。その後、静置した溶液を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌによって透析して、ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を得た。【０１２５】
作製したＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体（１００ｍｌ）に、最終濃度１００ｍＭのクロモザイムトライを加えて反応させた後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（図８）。示すように、ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体は酵素活性を失っていた。【０１２６】
次いで、ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の癌細胞傷害性を確認した。１％血清含有培地中にてサブコンフルエントな状態になるまで培養したＡ５４９に、最終濃度１ｍＭのＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）を、最終濃度０．７５ＭのＣａＣｌ２とともに添加し、さらに１８時間インキュベートした後の細胞の形態を観察した（図９）。示すように、ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体は、Ａ５４９を傷害する活性を失っていた。【０１２７】
ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体が癌細胞傷害活性を失っていたことを検証するために、ＤＦＰ結合型ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を添加した後の細胞生存率を、ＷＳＴ法を用いて測定した。具体的には、以下の手順に従った。まず、９６穴マイクロプレートの各ウェルに播種したＡ５４９（５×１０４ｃｅｌｌｓ）を、１６時間培養した。引き続き、最終濃度０．７５ＭのＣａＣｌ２とともに、最終濃度１、２、３または４μＭのＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を培地に添加した後に、３７℃で２４時間培養した。次いで、培地にＷＳＴを添加した後に、細胞をさらに４時間インキュベートした。インキュベートした後の培地について、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（図１０）。示すように、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体は、Ａ５４９を傷害する活性を失っていた。【０１２８】
このように、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体の有する酵素活性および癌細胞傷害性のいずれもが、ＤＦＰにより失われた。すなわち、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体は、セリンプロテアーゼであると考えられるとともに、抗体酵素としての活性と癌細胞を傷害する活性とが相関すると考えられる。【０１２９】
〔実施例６：組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）の作製〕
ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体溶液に約１／５０量のリシルエンドペプチダーゼ、トリプシンまたはプロテアーゼＶ８を添加した後、３７℃で２４時間インキュベートし、溶液をＨＰＬＣ逆相カラム（Ｃ１８、Ｂｒｏｗｎ  Ｌｅｅ）により分画した。各画分をアミノ酸シークエンサー（型番４９２ＴＨ、Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により解析し、ＢＪＰ（ＹＡＧ）の可変部位および定常部のアミノ酸配列を得た（配列番号１）。さらに得られた、ＢＪＰ（ＹＡＧ）をコードする塩基配列（配列番号２）の両端に制限酵素部位(ＮｃｏＩ、ＸｈｏＩ)を付加した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドを、Ｃ末端にＨｉｓタグ配列を有するｐＥＴ２０ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ）のマルチクローニングサイトに挿入した。得られたプラスミドを用いて形質転換した大腸菌を用いて組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）を発現させた。組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）を発現した大腸菌から得た抽出液を、Ｎｉ−ａｇａｒｏｓｅカラム（商品名Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ、Ｑｉａｇｅｎ）にアプライし、酸性の緩衝液を用いてカラムを洗浄した後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ溶液を加えて中性にした溶出液を用いて、Ｎｉ−ａｇａｒｏｓｅカラムから組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）を溶出した。この溶出液をｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムを用いて分画し、組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）の二量体と単量体とに分離した。【０１３０】
図１１（ａ）は、ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムからのタンパク質の溶出を示す図である。実施例１（図１）と同様に、２つのピーク（ＡおよびＢ）が得られた。また、それぞれのピークに対応する溶出画分ＡおよびＢのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）によって染色した（図１１（ｂ））。示すように、画分Ａのタンパク質の見かけの分子量は約５１．０ｋＤａ、画分Ｂのタンパク質の見かけの分子量は約２５．０ｋＤａであった。【０１３１】
〔実施例７：組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）のアミダーゼ活性の測定〕
組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）が抗体酵素としての機能を有しているかを確認するために、実施例２と同様に、組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）のアミダーゼ活性を測定した。【０１３２】
実施例６で得られた画分Ａおよび画分Ｂの各々２００ｍｌに、最終濃度１００ｍＭのクロモザイムトライを添加し、３７℃で１８時間インキュベートした。また、コントロールとして、ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムでの溶出溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）＋０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）に、最終濃度１００ｍＭのクロモザイムトライを添加し、３７℃で１８時間インキュベートした。その後、各試料の波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（図１２）。【０１３３】
図１２は、波長４０５ｎｍにおける吸光度の測定結果を示すグラフである。示すように、画分Ａは、高い吸光度を示した。すなわち、組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）は、多発性骨髄腫の患者から採取したＢＪＰ（ＹＡＧ）と同様に抗体酵素としての活性を有していることがわかった。【０１３４】
〔実施例８：組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）の癌細胞に対する傷害性の観察〕
実施例３と同様に、組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）の癌細胞に対する傷害性を観察した。具体的には、サブコンフルエントな状態になるまで無血清培地を用いて培養したＬＬＣ−ＰＫ１およびＬ−５、ならびに１％の牛血清を加えた培地を用いて培養したＡ５４９に、最終濃度１μＭの組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体および最終濃度０．７５ＭのＣａＣｌ２を添加し、１８時間インキュベートした後の細胞を観察した（図１３）。その結果、組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を正常細胞であるＬ−５（図１３の（ａ））およびＬＬＣ−ＰＫ１（図１３の（ｂ））に添加しても細胞の形態変化が認められなかったが、組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体をＡ５４９に添加した場合は、細胞が縮小／萎縮していた（図１３の（ｃ））。このことより、組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体もまた、多発性骨髄腫の患者から採取したＢＪＰ（ＹＡＧ）と同様にＡ５４９を特異的に傷害することがわかった。【０１３５】
さらに、組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を添加した後の細胞生存率を、ＷＳＴ法を用いて測定した。具体的には、以下の手順に従った。まず、９６穴マイクロプレートの各ウェルに播種したＡ５４９（５×１０４ｃｅｌｌｓ）を、１６時間培養した。引き続き、最終濃度０．７５ＭのＣａＣｌ２とともに、最終濃度１、２、３または４μＭの組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体を培地に添加した後に、３７℃で２４時間培養した。次いで、培地にＷＳＴを添加した後に、細胞をさらに４時間インキュベートした。インキュベートした後の培地について、波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定した（図１４）。示すように、組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体は、多発性骨髄腫の患者から採取したＢＪＰ（ＹＡＧ）と同様に、濃度依存的にＡ５４９に対する傷害性を示した。【０１３６】
以上のように、多発性骨髄腫の患者から採取したＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体および組換え体ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体は、肺癌由来の細胞であるＡ５４９にのみ傷害性を示した。このことから、ＢＪＰ（ＹＡＧ）二量体は肺癌治療に有効な抗癌剤として利用することができると考えられる。また、上記傷害性がＡ５４９に特異的なものであり、正常細胞および他の癌細胞に対しては何ら影響を示さないことから、副作用が少ない抗癌剤として有用であると考えられる。【０１３７】
本発明を用いれば、癌細胞を特異的に傷害することができる治療薬および治療方法を提供することができる。【０１３８】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内で、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１３９】
本発明に係るポリペプチドは、標的細胞に特異的かつ効果的に作用するので、本発明を用いれば、副作用の少ない癌治療のための治療薬を提供することができる。このように、本発明は、医学分野および製薬分野において非常に有用である。
【図１（ａ）】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１（ａ）】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１（ｂ）】
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【図４】
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【図９】
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【図１１（ｂ）】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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