(57)【要約】  （i）コレステロールエステル加水分解酵素等のコレステロール測定用酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を優先的に抑制する界面活性剤を含有する反応液中で、検体に該コレステロール測定用酵素を作用させ、該検体中のＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃを除去する工程、（ii）前記工程（i）後の反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬を添加し、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定する工程、及び、(iii)(ii)での測定値と、予め作成した検量線とから、該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程を含むｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程（i）、(ii)及び(iii)を含む、検体中の小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の定量方法。
（i）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃと略記する）、超低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＶＬＤＬ−Ｃと略記する）、カイロミクロン中のコレステロール（以下、ＣＭ−Ｃと略記する）及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＬｇＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）を含有する反応液中で、検体に該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素、又は、該コレステロールエステル加水分解酵素、該コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を作用させ、該検体中のＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃを除去する工程
（ii）前記工程（i）の界面活性剤Ａを含有する反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬を添加し、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定する工程
(iii)既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、前記(i)及び(ii)の工程を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と過酸化水素又は還元型補酵素に係る測定値とを関連づけ、該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程
【請求項２】
工程（i）の界面活性剤Ａを含有する反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬が、ｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）である請求項１記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
【化９】
2008050636.tif 000026
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる界面活性剤である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（ＩＩ）
【化１０】
2008050636.tif 000027
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる界面活性剤である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
工程(i)をアルブミン存在下で行う請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（ａ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、（ｂ）界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬、及び、過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
【請求項７】
（ａ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する第一試薬と、（ｂ）界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
【請求項８】
界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬が、ｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）である請求項６又は７記載のキット。
【請求項９】
界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）
【化１１】
2008050636.tif 000028
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる界面活性剤である請求項６〜８のいずれかに記載のキット。
【請求項１０】
界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（ＩＩ）
【化１２】
2008050636.tif 000029
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる界面活性剤である請求項６〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
少なくとも第一試薬にアルブミンを含有する請求項６〜１０のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
第三試薬として、既知濃度のｓｄＬＤＬを含有する標準品を含有する請求項６〜１１のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体中の小粒子低密度リポ蛋白（以下、ｓｄＬＤＬと略記する）中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の定量方法及び定量用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
血液中に存在するリポ蛋白は、その比重により高密度リポ蛋白（以下、ＨＤＬと略記する）、低密度リポ蛋白（以下、ＬＤＬと略記する）、超低密度リポ蛋白（以下、ＶＬＤＬと略記する）、及びカイロミクロン（以下、ＣＭと略記する）の４つに大きく分類されている。各リポ蛋白は構成する脂質組成も異なり、また各リポ蛋白を構成するアポ蛋白の種類の違いによって生体中での働きが大きく異なっている。また、ＶＬＤＬからＬＤＬへ代謝される過程において生成するリポ蛋白として、ＶＬＤＬとＬＤＬの中間の密度を有する中間密度リポ蛋白（以下、ＩＤＬと略記する）が存在するが、これも広義にはＬＤＬとして分類されている。【０００３】
臨床検査において、動脈硬化診断のスクリーニングマーカーとして、総コレステロール、総トリグリセリド、ＨＤＬ中コレステロール、ＬＤＬ中コレステロール、アポリポ蛋白ＡＩ、アポリポ蛋白Ｂなどが用いられている。なかでも、動脈硬化形成に強く関与するといわれているＬＤＬ中のコレステロールが頻繁に測定されるようになってきた。一方、ＬＤＬ中のコレステロールが高くないにも関わらず冠動脈硬化病変を有する者も多く認められる。この病態においては小型で高密度のＬＤＬ（当該ＬＤＬが、ｓｄＬＤＬと呼ばれている）が増加しており、ｓｄＬＤＬ−ＣはＬＤＬ−Ｃ以上に冠動脈疾患と関係するという報告もある［「アーテリオスクレローシス トロンボシス アンド ヴァスキュラー バイオロジー(Arteriosclerosis Thrombosis, and Vascular Biology)」，２００４年，第２４巻，ｐ．５５８−５６３参照］。【０００４】
ｓｄＬＤＬを測定する方法としては、電気泳動法、超遠心法、分画法などが知られている。電気泳動法は２〜１６％の非変性グラジエントゲルを用いて電気泳動、染色を行いＬＤＬの粒子サイズを測定する方法であるが、操作が煩雑であり汎用性に劣る。またこの方法ではＬＤＬの粒子サイズは測定できるが、ｓｄＬＤＬの定量はできない。また、イオン強度の差によりｓｄＬＤＬを混濁または溶解させ吸光度の差によりｓｄＬＤＬを測定する方法（特許文献１参照）がある。しかし、この方法では濁度を測定しているため、特異性や精度が不十分であり、更にこの方法ではｓｄＬＤＬ量を測定できるが、ｓｄＬＤＬ−Ｃを測定することは出来ない。【０００５】
ｓｄＬＤＬ−Ｃを定量する方法には、超遠心法、分画法などがある。超遠心法は超遠心分離機を用いて検体中のｓｄＬＤＬにあたる比重領域を分取し、該比重領域中のコレステロールを測定する方法であり、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量の標準法となり得る方法である。しかしながらこの方法は、高価な設備を必要とし、測定に非常に長時間を要し、手技に熟練を要する。【０００６】
分画法としては、第一工程でポリアニオンと２価の陽イオン又は１価の陽イオンとの組み合わせ、或いはポリエチレングリコールを用いて検体中のＨＤＬ及びｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白を凝集させ、遠心分離やフィルターろ過により凝集物を除去し、ＨＤＬ及びｓｄＬＤＬを分離し、第二工程で分離したＨＤＬ及びｓｄＬＤＬを含む試料からｓｄＬＤＬ−Ｃを定量する方法である（特許文献２参照）。この方法は、超遠心法と比較して操作が簡便化したものの、分画操作が必要であるため測定に時間を要する。【０００７】
界面活性剤の存在下で、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素を、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭからなる群より選ばれる一つ又は複数の特定のリポ蛋白に特異的に作用させ、測定すべきリポ蛋白中のコレステロールを測定する方法は多数報告されている。最近、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下に、検体にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をｓｄＬＤＬに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とするｓｄＬＤＬ−Ｃの定量法が報告された（特許文献３）。
【特許文献１】特開２００３−２８８８２号公報
【特許文献２】国際公開第２００４／０５３５００号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００７／０２６８２９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、簡便で、かつ、正確に、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを定量できる方法及びキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は以下の［１］〜［１２］に関する。
［１］  下記工程(i)、(ii)及び(iii)を含む、検体中の小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の定量方法。
（i）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＨＤＬ−Ｃと略記する）、超低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＶＬＤＬ−Ｃと略記する）、カイロミクロン中のコレステロール（以下、ＣＭ−Ｃと略記する）及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ＬｇＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）を含有する反応液中で、検体に該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素、又は、該コレステロールエステル加水分解酵素、該コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を作用させ、該検体中のＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃを除去する工程
（ii）前記工程（i）の界面活性剤Ａを含有する反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬を添加し、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定する工程
(iii)既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、前記(i)及び(ii)の工程を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と過酸化水素又は還元型補酵素に係る測定値とを関連づけ、該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程
［２］  工程（i）の界面活性剤Ａを含有する反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬が、ｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）である［１］記載の方法。
［３］  界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）【００１０】
【化１】
2008050636.tif 000002
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる界面活性剤である［１］又は［２］記載の方法。
［４］  界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（ＩＩ）【００１１】
【化２】
2008050636.tif 000003
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる界面活性剤である［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］  工程(i)をアルブミン存在下で行う［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］  （ａ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、（ｂ）界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬、及び、過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
［７］  （ａ）コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による高密度リポ蛋白中のコレステロール、超低密度リポ蛋白中のコレステロール、カイロミクロン中のコレステロール及び大粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロール（以下、ｓｄＬＤＬ−Ｃと略記する）の反応を優先的に抑制する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ａと略記する）、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する第一試薬と、（ｂ）界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
［８］  界面活性剤Ａ共存下でｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を引き起こす試薬が、ｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素による反応の抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）である［６］又は［７］記載のキット。
［９］  界面活性剤Ａが、ポリオキシエチレンアルキルアミン、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体、一般式（Ｉ）【００１２】
【化３】
2008050636.tif 000004
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）からなる群より選ばれる界面活性剤である［６］〜［８］のいずれかに記載のキット。
［１０］  界面活性剤Ｂが、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル、一般式（ＩＩ）【００１３】
【化４】
2008050636.tif 000005
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミンからなる群より選ばれる界面活性剤である［６］〜［９］のいずれかに記載のキット。
［１１］  少なくとも第一試薬にアルブミンを含有する［６］〜［１０］のいずれかに記載のキット。
［１２］  第三試薬として、既知濃度のｓｄＬＤＬを含有する標準品を含有する［６］〜［１１］のいずれかに記載のキット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、簡便で、かつ、正確に、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを定量できる方法及びキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ及びＣＭ−Ｃとは、それぞれＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中の遊離型コレステロールとエステル型コレステロールを合わせたものを意味する。
本発明の測定方法において用いられる検体としては、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、血漿及び血清が好ましい。
本発明におけるコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素であれば特に限定はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ等も用いることができる。【００１６】
コレステロールエステル加水分解酵素としては、無修飾のコレステロールエステル加水分解酵素も、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素も使用することができる。また、コレステロールエステル加水分解酵素としては市販品を使用することもできる。
市販されているコレステロールエステル加水分解酵素としては、コレステロールエステラーゼ“Amano”２（ＣＨＥ２；天野エンザイム社製）、コレステロールエステラーゼ“Amano”３（ＣＨＥ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ“Amano”３（ＬＰＬ３；天野エンザイム社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１１；東洋紡績社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＬ−３１２；東洋紡績社製）、コレテロールエステラーゼ（ＣＯＥ−３０１；東洋紡績社製）、リポプロテインリパーゼ（ＬＰＢＰ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＥＢＰ−Ｍ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＥＮ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＰ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＰＭ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＰＡＰ；旭化成社製）、リパーゼ（ＬＩＰＳ；旭化成社製）、コレステロールエステラーゼ（ＣＨＥ−ＢＥ；キッコーマン社製）等が挙げられる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロールエステル加水分解酵素を組み合わせて用いることもできる。【００１７】
化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素において、コレステロールエステル加水分解酵素を修飾する基（化学修飾基）としては、例えばポリエチレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールを主成分とする基、ポリプロピレングリコールとポリエチレングリコールの共重合体を有する基、水溶性多糖類を含有する基、スルホプロピル基、スルホブチル基、ポリウレタン基、キレート機能を有する基等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを主成分とする基が好ましい。水溶性多糖類としては、例えばデキストラン、プルラン、可溶性デンプン等が挙げられる。【００１８】
コレステロールエステル加水分解酵素を化学的に修飾するための試薬（化学修飾剤）としては、上記の化学修飾基と、酵素のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基等と反応し得る官能基又は構造とを併せ持つ化合物等が挙げられる。酵素中のアミノ基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばカルボキシル基、活性エステル基（Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド基等）、酸無水物、酸塩化物、アルデヒド、エポキシド基、１，３−プロパンスルトン、１，４−ブタンスルトン等が挙げられる。酵素中のカルボキシル基と反応し得る官能基又は構造としては、例えばアミノ基等が挙げられる。酵素中のスルフヒドリル基と反応し得る基又は構造としては、例えばマレイミド基、ジスルフィド、α−ハロエステル（α−ヨードエステル等）等が挙げられる。【００１９】
化学修飾剤として、市販品を使用することもできる。市販されている化学修飾剤としては、ポリエチレングリコールを主成分とする基とＮ−ヒドロキシサクシンイミド基とを有するサンブライトＶＦＭ−４１０１、サンブライトＭＥ−０５０ＡＳ、サンブライトＤＥ−０３０ＡＳ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコールを主成分とする基と酸無水物構造とを有するサンブライトＡＫＭシリーズ（例えば、サンブライトＡＫＭ−１５１０等）、サンブライトＡＤＭシリーズ、サンブライトＡＣＭシリーズ（いずれも日本油脂社製）、ポリエチレングリコールを主成分とする基とエポキシド基とを有するＥＰＯＸ−３４００、Ｍ−ＥＰＯＸ−５０００（いずれもＳｈｅａｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）、キレート機能を有する基と酸無水物構造とを有するジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−ペンタ無水二酢酸（ＤＴＰＡ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ；同仁化学研究所社製）等が挙げられる。【００２０】
コレステロールエステル加水分解酵素の化学修飾は、例えば以下の方法で行うことができるが、本方法に限定されるものではない。まず、コレステロールエステル加水分解酵素をｐＨ８．０以上の緩衝液｛例えば２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液｝に溶解し、０〜５５℃で０．０１〜５００倍モル量の化学修飾剤を添加し、５分間〜５時間攪拌する。実際の酵素反応においては、化学的に修飾されたコレステロールエステル加水分解酵素として、この反応液そのもののみならず、必要に応じて限外濾過膜等により未反応の化学修飾剤等を除去したものも、使用することもできる。【００２１】
本反応の方法に用いられるコレステロールエステル加水分解酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬであることがより好ましい。
本発明におけるコレステロール酸化酵素としては、コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールオキシダーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールオキシダーゼ等も用いることができ、コレステロールオキシダーゼ“Amano”１（ＣＨＯＤ１；天野エンザイム社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＰＥＬ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＰＥＷＬ；キッコーマン社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＨＯ−ＣＥ；キッコーマン社製）コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ３２１；東洋紡績社製）、コレステロールオキシダーゼ（ＣＯＯ−３２２；東洋紡績社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。【００２２】
コレステロール酸化酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール酸化酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール酸化酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。【００２３】
本発明におけるコレステロール脱水素酵素としては、酸化型補酵素の存在下にコレステロールを酸化して還元型補酵素を生成する能力を有する酵素であれば特に制限はなく、例えば動物、植物又は微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼの他、遺伝子工学的な手法により製造されるコレステロールデヒドロゲナーゼ等も用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼ“Amano”５（ＣＨＤＨ５；天野エンザイム社製）等の市販品を用いることもできる。また、本発明においては、２種類以上のコレステロール脱水素酵素を組み合わせて用いることもできる。【００２４】
コレステロール脱水素酵素は、無修飾の酵素であっても、化学的に修飾された酵素であってもよい。化学的に修飾されたコレステロール脱水素酵素は、例えば前述の化学修飾剤を用いて、前述の化学修飾方法により作製することができる。
本反応の方法に用いられるコレステロール脱水素酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。【００２５】
コレステロール脱水素酵素を用いた定量において使用される酸化型補酵素としては、例えばＮＡＤ（Ｐ）＋、ｔｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）＋等が挙げられる。酸化型補酵素共存下でのコレステロール脱水素酵素とリポ蛋白中のコレステロールとの反応により生成する還元型補酵素としては、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、ｔｈｉｏ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ等が挙げられる。
本発明の方法に用いられる酸化型補酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であることが好ましく、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度であることがより好ましい。【００２６】
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法においては、還元型補酵素酸化酵素も用いることができる。ここで、還元型補酵素酸化酵素は、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素と共に用いられ、酸化型補酵素共存下でのコレステロール脱水素酵素とリポ蛋白中のコレステロールとの反応により生成した還元型補酵素を過酸化水素に変換する。還元型補酵素酸化酵素としては、例えばＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素等が挙げられる。還元型補酵素酸化酵素としては、市販品を使用することもできる。市販の還元型補酵素酸化酵素としては、ＮＡＤＨ  Ｏｘｉｄａｓｅ（コスモ・バイオ社製）等が挙げられる。【００２７】
本発明の方法に用いられる還元型補酵素酸化酵素の濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中で０．０１〜４００Ｕ／ｍＬの濃度であることが好ましく、０．０２〜２００Ｕ／ｍＬの濃度であることがより好ましい。
本発明において使用されるアルブミンとしては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とするアルブミンであれば特に限定はなく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト由来のアルブミン等が挙げられるが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましい。また、遺伝子工学的な手法により製造されたアルブミンも用いることができる。本発明においては、２種類以上のアルブミンを組み合わせて使用することもできる。本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量におけるアルブミンの濃度としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であれば特に制限はないが、反応液中の濃度が０．００１〜１０％であることが好ましく、０．０１〜５％がより好ましい。【００２８】
本発明における界面活性剤Ａは、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を抑制し、ＬｇＬＤＬ−Ｃの反応を行わせる性質を有する。具体的には、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を優先的に抑制する界面活性剤であり、工程(i)において、ｓｄＬＤＬ−Ｃ以外の、すなわちＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃの除去に使用される界面活性剤である。以下、ＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃを総称して、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールと表記する場合がある。【００２９】
界面活性剤Ａとしては、例えばポリオキシエチレンアルキルアミン（以下、ＰＯＥアルキルアミンと略記する）、アミンオキシド類、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ポリオキシエチレンベンジル−アルキル４級アンモニウム塩（以下、ＰＯＥベンジル−アルキル４級アンモニウム塩と略記する）、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド（以下、ＰＯＥ脂肪酸アミドと略記する）、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル硫酸エステル塩（以下、ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸エステル塩と略記する）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩（以下、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩と略記する）、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド硫酸エステル塩（以下、ＰＯＥ脂肪酸アミド硫酸エステル塩と略記する）、ポリオキシエチレンアルキルアミン硫酸エステル塩（以下、ＰＯＥアルキルアミン硫酸エステル塩と略記する）、Ｎ−アシルタウリン塩、Ｎ−アシルアミノ酸塩、エチレンジアミン−ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物（以下、エチレンジアミン−ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物と略記する）、ポリエチレングリコールを含まないポリプロピレングリコール誘導体（以下、ＰＰＧ誘導体と略記する）、一般式（Ｉ）【００３０】
【化５】
2008050636.tif 000006
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物と略記する）、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数９以下のアルキル）（以下、Ｃ９以下のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルと略記する）等が挙げられる。【００３１】
ＰＯＥアルキルアミン、アルキルベタイン、アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩、酸アミドアルキルベタイン、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩、ＰＯＥアルキルアミン硫酸エステル塩におけるアルキルとしては、炭素数１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。【００３２】
ＰＯＥアルキルアミンの市販品としては、パイオニンＤ−３１０４、パイオニンＤ−３１１０、パイオニンＤ−３１２０（以上、竹本油脂社製）、ナイミーンＬ−２０７（以上、日本油脂社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ Ｌ−２０５（以上、青木油脂社製）等が挙げられる。
アミンオキシド類としては、例えばアルキルアミンオキシド、ポリオキシエチレンアルキルアミンオキシド（以下、ＰＯＥアルキルアミンオキシドと略記する）等が挙げられる。アルキルアミンオキシド、ＰＯＥアルキルアミンオキシドにおけるアルキルとしては、例えば置換若しくは非置換の炭素数１〜３０のアルキル等が挙げられる。該アルキルとしては前記のアルキル等が挙げられる。該置換基としては、例えば水酸基等が挙げられる。アミンオキシド類の市販品としては、ユニセーフＡ−ＬＥ、ユニセーフＡ−ＬＭ、ユニセーフＡ−ＬＹ（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。【００３３】
アルキルベタインの市販品としては、ニッサンアノンＢＬ、ニッサンアノンＢＦ（以上、日本油脂社製）、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ（以上、花王社製）等が挙げられる。
アルキルアンモニオ−１−プロパンスルホン酸塩の市販品としては、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１２（以上、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）等が挙げられる。【００３４】
酸アミドアルキルベタインの市販品としては、アノンＢＤＦ−ＳＦ（日本油脂社製）等が挙げられる。
ＰＯＥベンジル−アルキル４級アンモニウム塩の市販品としては、ビスノールＳＫ（一方社社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ脂肪酸アミドの市販品としては、ナイミッドＭＴ−２１５（日本油脂社製）、ニッコールＴＡＭＤＳ１５（日光ケミカルズ社製）等が挙げられる。【００３５】
ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸エステル塩における多環フェニルとしては、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。ＰＯＥ多環フェニルエーテル硫酸エステル塩の市販品としては、ニューコール７０７−ＳＦ、ニューコール７０７−ＳＦＣ、ニューコール７０７−ＳＮ、ニューコール７２３−ＳＦ（以上、日本乳化剤社製）等が挙げられる。【００３６】
ＰＯＥアルキルフェニルエーテル硫酸エステル塩の市販品としては、ハイテノールＮ−０７、ハイテノールＮ−０８、ハイテノールＮ−１７（以上、第一工業薬品社製）等が挙げられる。
ＰＯＥ脂肪酸アミド硫酸エステル塩の市販品としては、サンアミドＣＦ−３、サンアミドＣＦ−１０（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。【００３７】
ＰＯＥアルキルアミン硫酸エステル塩の市販品としては、ミグノールＰＡ−３０（一方社社製）等が挙げられる。
Ｎ−アシルタウリン塩の市販品としては、ニッコールＣＭＴ−３０、ニッコールＰＭＴ（以上、日光ケミカルズ社製）、ダイヤポンＴペースト、ダイヤポンＴパウダー、ダイヤポンＫ、ダイヤポンＬＭ、ダイヤポンＫ−ＭＧ（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。【００３８】
Ｎ−アシルアミノ酸塩におけるアミノ酸としてはサルコシン、アラニン等が挙げられる。Ｎ−アシルアミノ酸塩の市販品としては、サルコシネートＬＮ−３０、サルコシネートＣＮ−３０、サルコシネートＬＫ−３０、アラニネートＬＮ−３０（以上、日光ケミカルズ社製）、フィレットＬ（日本油脂社製）等が挙げられる。
エチレンジアミン−ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物の市販品としては、アデカプルロニックＴＲ−７０１、アデカプルロニックＴＲ−７０２、アデカプルロニックＴＲ−７０４、アデカプルロニックＴＲ−９１３Ｒ（以上、旭電化社製）、ユニルーブ３２ＴＹ−６５ＢＩ（日本油脂社製）等が挙げられる。【００３９】
ポリエチレングリコールを含まないＰＰＧ誘導体としては、ポリプロピレングリコール（以下、ＰＰＧと略記する）、ポリオキシプロピレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＰアルキルエーテルと略記する）等が挙げられる。ＰＰＧとしては、例えば分子量１２００以下のＰＰＧが好ましい。分子量１２００以下のＰＰＧの市販品としては、ユニオールＤ−７００（日本油脂社製）、ニューポールＰＰ−４００（三洋化成社製）等が挙げられる。ＰＯＰアルキルエーテルの市販品としては、ユニルーブＭＢ−２（日本油脂社製）等が挙げられる。【００４０】
一般式（Ｉ）【００４１】
【化６】
2008050636.tif 000007
（式中、ａ、ｂ及びｃは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物の市販品としては、プルロニック２５Ｒ−１、プルロニック２５Ｒ−２（以上、旭電化社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ ＥＰ−０４８０、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＥＰ−０６７０、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＥＰ−１４６１（以上、青木油脂社製）等が挙げられる。【００４２】
Ｃ９以下のＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル等が挙げられる。Ｃ９以下のＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテルの市販品としては、ユニルーブ５０ＭＢ−２６、ユニルーブ５０ＭＢ−７２（以上、日本油脂社製）等が挙げられる。
本発明においては、界面活性剤Ａは１種のみならず、２種以上を組み合わせて用いても良い。【００４３】
本出願により、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ中のコレステロールの反応を抑制し、ＬｇＬＤＬ中のコレステロールの反応を行わせる作用を示す界面活性剤が存在することを開示された当業者は、上記に例示したもの以外でも、下記の判定により容易に本発明の界面活性剤Ａの具体例を把握し、選択することができる。該方法により選択される界面活性剤も本願発明の界面活性剤Ａに包含される。【００４４】
界面活性剤Ａの判定は、例えば以下に記載の方法で行うことができる。
１）リポ蛋白分画の分離
血清中のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ、ＬｇＬＤＬ、ｓｄＬＤＬの各分画を比重により分離精製する。具体的には、「新生化学実験講座４」（東京化学同人）に記載の超遠心法に従い、ヒト血清よりＨＤＬ（比重１．０６３以上）、ｓｄＬＤＬ（比重１．０４４〜１．０６３）、ＬｇＬＤＬ（比重１．００６〜１．０４４）、ＶＬＤＬ及びＣＭ（比重１．００６以下）の４つのリポ蛋白分画を分取する。
２）界面活性剤Ａの判定用試薬
例１
緩衝液、例えばＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステル加水分解酵素、例えばＬＰＬ３
コレステロール酸化酵素、例えばＣＨＯ−ＰＥＬ
過酸化水素測定試薬、例えばパーオキシダーゼ、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）及び４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）
検討すべき界面活性剤
例２
緩衝液、例えばＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステル加水分解酵素、例えばＬＰＬ３
コレステロール脱水素酵素、例えばＣＨＤＨ５
酸化型補酵素、例えばＮＡＤ
［必要に応じて、還元型補酵素測定試薬、例えば２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）］
検討すべき界面活性剤
例３
緩衝液、例えばＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）
コレステロールエステル加水分解酵素、例えばＬＰＬ３
コレステロール脱水素酵素、例えばＣＨＤＨ５
酸化型補酵素、例えばＮＡＤ
還元型補酵素酸化酵素、例えばＮＡＤＨ  ｏｘｉｄａｓｅ
過酸化水素測定試薬、例えばパーオキシダーゼ、ＥＭＳＥ及び４−ＡＡ
検討すべき界面活性剤
なお、上記各試薬には、必要に応じて、後述の水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等を含有させることもできる。
３）界面活性剤Ａ判定方法
各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ（２μＬ）添加し、次いで上記２）に記載した試薬（０．１５ｍＬ）を添加し反応を開始させ、３７℃で５分間加温し、反応液の吸光度が直線的に増加する時間、例えば反応５分後の反応液の吸光度変化（ΔＥリポ蛋白分画）を測定する。【００４５】
各リポ蛋白分画の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様の測定を行い、吸光度変化（ΔＥブランク）を算出し、各リポ蛋白分画における「反応吸光度１」を下記（式１）により算出する。【００４６】
【数１】
2008050636.tif 000008
各リポ蛋白分画について、日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、総コレステロール定量用キットであるデタミナーＣ  ＴＣ（協和メデックス社製）を用いて、同様にして、「反応吸光度２」を算出する。
ついで、各リポ蛋白分画の反応率を下記（式２）より算出する。【００４７】
【数２】
2008050636.tif 000009
ｓｄＬＤＬ分画における反応率が低く、ＬｇＬＤＬ分画における反応率が高い界面活性剤を選択し、好ましくは、ｓｄＬＤＬ分画における反応率が低く、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びＬｇＬＤＬ分画における反応率が高い界面活性剤を、界面活性剤Ａとして選択する。【００４８】
コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるＨＤＬ−Ｃ、ＶＬＤＬ−Ｃ、ＣＭ−Ｃ及びＬｇＬＤＬ−Ｃの反応に比較して、該コレステロールエステル加水分解酵素及び該コレステロール酸化酵素若しくは該コレステロール脱水素酵素−該酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を優先的に抑制するとは、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びＬｇＬＤＬの各分画中のコレステロールの反応率に対するｓｄＬＤＬ分画中のコレステロールの反応率が小さいことをいい、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びＬｇＬＤＬの各分画中のコレステロールの反応率に対するｓｄＬＤＬ分画中のコレステロールの反応率の割合が好ましくは５０％以下であり、より好ましくは２０％以下であり、特に好ましくは１０％以下である。【００４９】
なお、使用する酵素の種類及び濃度等の反応条件が異なると界面活性剤の反応性が異なる場合もあるが、設定した条件で検討対象の界面活性剤が本発明に界面活性剤Ａとして使用できるか否か判断できる。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法における界面活性剤Ａの濃度は、好ましくはｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白、即ち、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ及びＬｇＬＤＬ中のコレステロールを優先的に除去し得る濃度であり、反応液中での濃度が０．０００１〜１％であることが好ましく、０．０００５〜０．５％であることがより好ましい。【００５０】
本発明におけるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬は、検体とコレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素とを界面活性剤Ａの存在下に反応させて、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを除去した後の反応液中に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの、コレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素による反応を可能とする試薬である。具体的には、界面活性剤Ａの存在下での、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを除去するのに使用したコレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素若しくはコレステロール脱水素酵素−酸化型補酵素によるｓｄＬＤＬ−Ｃの反応抑制を解除する界面活性剤（以下、該界面活性剤を界面活性剤Ｂと略記する）及び界面活性剤Ａの存在下にｓｄＬＤＬ−Ｃとの反応を可能とする酵素などが挙げられる。【００５１】
本発明における界面活性剤Ｂとしては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテル（以下、ＰＯＥアルキルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルエーテル（該アルキルは炭素数１０以上のアルキル）（以下、Ｃ１０以上のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＥアルキルフェニルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＥ多環フェニルエーテルと略記する）、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレン多環フェニルエーテル（以下、ＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルと略記する）、一般式（ＩＩ）【００５２】
【化７】
2008050636.tif 000010
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレン縮合物（以下、ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物と略記する）、及び、ポリオキシエチレンポリオキシアルキレンアルキルアミン（以下ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアミンと略記する）等が挙げられる。【００５３】
ＰＯＥアルキルエーテルとしては、ＨＬＢが１５．０未満のＰＯＥアルキルエーテル（該アルキルは炭素数２０以下のアルキル）が好ましい。ＨＬＢが１５．０未満のＰＯＥアルキルエーテル（該アルキルは炭素数２０以下のアルキル）におけるアルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、イソデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘキシデシル、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。ＨＬＢが１５．０未満のＰＯＥアルキルエーテル（該アルキルは炭素数２０以下のアルキル）の市販品としてはモリノールＬ−８０（ＨＬＢ１３．１；炭素数１２）（モーリン化学社製）、エマルミンＮＬ−８０（ＨＬＢ１３．１；炭素数１２）、エマルミンＮＬ−９０（ＨＬＢ１３．６；炭素数１２）、エマルミンＮＬ−１００（ＨＬＢ１４．０；炭素数１２）、エマルミンＮＬ−１１０（ＨＬＢ１４．４；炭素数１２）（以上、三洋化成社製）、ノイゲンＴＤＳ−８０（ＨＬＢ１３．３；炭素数１３）、ノイゲンＴＤＳ−１２０（ＨＬＢ１４．８；炭素数１３）（以上、第一工業製薬社製）、ＥＭＡＬＥＸ１６１５（ＨＬＢ１３．０；炭素数１６）、ＥＭＡＬＥＸ１８２０（ＨＬＢ１４．０；炭素数１８）、ＥＭＡＬＥＸ  ＯＤ−１６（ＨＬＢ１２．０；炭素数２０）（以上、日本エマルジョン社製）等があげられる。【００５４】
Ｃ１０以上のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルとしては、ＨＬＢが１５．０未満かつアルキルの炭素数が１０以上２０以下であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１５．０未満かつアルキルの炭素数が１０以上２０以下であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、例えばデシル、イソデシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘキシデシル、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。ＨＬＢが１５．０未満かつアルキルの炭素数が１０以上２０以下であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の例えば、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ＨＬＢが１５．０未満かつアルキルの炭素数が１０以上２０以下であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルエーテルの市販品としては、例えばワンダサーフＩＤ−５０（ＨＬＢ１０．５；炭素数１０）、ワンダサーフＩＤ−７０（ＨＬＢ１２．１；炭素数１０）、ワンダサーフＩＤ−９０（ＨＬＢ１３．３；炭素数１０）、ワンダサーフＳ−８００（ＨＬＢ１２．３；炭素数１３）、ワンダサーフＳ−１０００（ＨＬＢ１３．２；炭素数１３）、ワンダサーフＳ−１４００（ＨＬＢ１４．４；炭素数１３）（以上、青木油脂社製）等が挙げられる。【００５５】
ＰＯＥアルキルフェニルエーテルとしては、ＨＬＢが１６．０未満であるＰＯＥアルキルフェニルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、炭素数１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥアルキルフェニルエーテルの市販品としてはノニオンＮＳ−２１０（ＨＬＢ１３．３）、ノニオンＮＳ−２１２（ＨＬＢ１４．１）、ノニオンＮＳ−２１５（ＨＬＢ１５．０）、ノニオンＨＳ−２１０（ＨＬＢ１３．６）（以上、日本油脂社製）、エマルゲン９１１（ＨＬＢ１３．７）、エマルゲン９１３（ＨＬＢ１４．５）（以上、花王社製）等が挙げられる。【００５６】
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルとしては、ＨＬＢが１６．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、炭素数１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の例えば、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ＨＬＢが１６．０未満のＰＯＥ・ＰＯＡアルキルフェニルエーテルの市販品としては、アクロネセスＫＰ−１８９Ｒ、ディスパノールＬＳ−１００（以上、日本油脂社製）、エマルゲンＬ−４０（花王社製）等が挙げられる。【００５７】
ＰＯＥ多環フェニルエーテルとしては、ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ多環フェニルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとしては、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ多環フェニルエーテルの市販品としては、エマルゲンＡ−６０（ＨＬＢ１２．８）（花王社製）、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ−９（ＨＬＢ１１．４）、ＢＬＡＵＮＯＮ  ＤＳＰ−１２．５（ＨＬＢ１２．８）（以上、青木油脂社製）、ニューコール２６０７（ＨＬＢ１１．８）（日本乳化剤社製）等が挙げられる。【００５８】
ＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルとしては、ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルが好ましい。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルにおける多環フェニルとしては、基内に１つの芳香環を有する基（置換基）が２つ以上置換したフェニル基、基内に２つ以上の芳香環を有する基（置換基）が１つまたは複数置換したフェニル基等が挙げられる。基内に１つの芳香環を有する基としては、例えばベンジル、１−（フェニル）エチル等が挙げられる。基内に２つ以上の芳香環を有する基としては、例えばナフチル等が挙げられる。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の例えば、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ＨＬＢが１３．０未満であるＰＯＥ・ＰＯＡ多環フェニルエーテルの市販品としてはニューコール７０７Ｆ（ＨＬＢ１２．４）（以上、日本乳化剤社製）等が挙げられる。【００５９】
一般式（ＩＩ）【００６０】
【化８】
2008050636.tif 000011
（式中、ｄ、ｅ及びｆは同一又は異なって、１〜２００の整数を表す）で表されるＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物としては、ＰＯＰの分子量が１２００以上かつＰＯＥ含量が６０％以下であるＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物が好ましい。ＰＯＰの分子量が１２００以上かつＰＯＥ含量が６０％以下であるＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物の市販品としてはプロノン２０４（ＰＯＰの分子量：２０００；ＰＯＥ含量：４０％）（日本油脂社製）、ニューポールＰＥ−６２（ＰＯＰの分子量：１７５０；ＰＯＥ含量：２０％）、ニューポールＰＥ−６４（ＰＯＰの分子量：１７５０；ＰＯＥ含量：４０％）、ニューポールＰＥ−７１（ＰＯＰの分子量：２０５０；ＰＯＥ含量：１０％）、ニューポールＰＥ−７５（ＰＯＰの分子量：２０５０；ＰＯＥ含量：５０％）（以上、三洋化成社製）、プルロニックＰ−８４（ＰＯＰの分子量：２２５０；ＰＯＥ含量：４０％）、プルロニックＰ−８５（ＰＯＰの分子量：２２５０；ＰＯＥ含量：５０％）、プルロニックＰ−１０３（ＰＯＰの分子量：３２５０；ＰＯＥ含量：３０％）（以上、旭電化社製）等が挙げられる。【００６１】
ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアミンにおけるアルキルとしては、炭素数１〜３０の、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル、ヘネイコシル、ドコシル（ベヘニル）、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンシル等が挙げられる。ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアミンにおけるポリオキシアルキレンとしては、ポリオキシエチレン以外の例えば、ポリオキシプロピレン、ポリオキシブチレン等が挙げられる。ＰＯＥ・ＰＯＡアルキルアミンの市販品としてはＢＬＡＵＮＯＮ  ＬＰＥ１００７（青木油脂社製）、アルキル（Ｃ１６）アミンＥＯ２０ＰＯ１０（日本油脂社製）等が挙げられる。【００６２】
本発明においては、界面活性剤Ｂを１種のみならず、２種以上を組み合わせて用いても良い。
なお、当業者は、本発明の実施例２に示した方法等により、ｓｄＬＤＬ分画の反応率を高める界面活性剤を、界面活性剤Ｂとして適宜把握・選択することができる。使用する酵素の種類及び濃度等の反応条件が異なると界面活性剤の反応性が異なる場合もあるが、設定した条件で検討対象の界面活性剤が本発明に界面活性剤Ｂとして使用できるか否か判断することができる。【００６３】
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法における界面活性剤Ｂの濃度は、ｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする濃度であり、反応液中での濃度が０．００１〜５％であることが好ましく、０．０１〜０．５％であることがより好ましい。
界面活性剤Ａの存在下にｓｄＬＤＬ−Ｃとの反応を可能とする酵素としては、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素又はコレステロール脱水素酵素等が挙げられるが、コレステロールエステル加水分解酵素が好ましい。コレステロールエステル加水分解酵素を界面活性剤Ｂの代わりに用いる場合、該コレステロールエステル加水分解酵素としては、工程(i)で使用されるコレステロールエステル加水分解酵素と同種のコレステロールエステル加水分解酵素であっても異種のコレステロールエステル加水分解酵素であってもよい。同種のコレステロールエステル加水分解酵素を用いる場合には、工程（ii）において、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする量のコレステロールエステル加水分解酵素を添加すればよい。また、異種のコレステロールエステル加水分解酵素を用いる場合には、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とするコレステロールエステル加水分解酵素であれば特に制限はない。【００６４】
また、工程（ii）において、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬としては、酵素と界面活性剤の組み合わせを用いることもできる。該組み合わせは、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白を除去した後の反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする組み合わせであれば特に制限はない。該組み合わせを構成する酵素及び界面活性剤は、単独で、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする必要はなく、組み合わされて使用されることにより、残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とすればよい。【００６５】
ＨＬＢとは、親水性−親油性均衡値を意味する。本発明に用いられる界面活性剤、例えばＰＯＥ多環フェニルエーテルのＨＬＢは、界面活性剤ハンドブック（吉田  時行ら著  工業図書株式会社）や新界面活性剤（堀口  博著  三共出版株式会社）に記載の方法で算出することが可能である。また、該ＨＬＢとしては、各種界面活性剤の製造メーカーのカタログやパンフレットに記載されているＨＬＢ値を利用することも可能である。
（ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量方法）
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量方法は、下記工程(i)〜(iii)を含む方法である。
（i）界面活性剤Ａを含有する反応液中で、検体にコレステロールエステル加水分解酵素及びコレステロール酸化酵素、或いは、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素及び酸化型補酵素を作用させ、該検体中のｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを除去する工程
（ii）前記工程（i）後の反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬を添加し、過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定する工程
（iii）既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、前記（i）及び（ii）の工程を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と過酸化水素又は還元型補酵素濃度に係る測定値とを関連づけ、該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定する工程
また、工程(iii)を行うことなく、工程(i)及び工程(ii)を行うことにより、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの検出方法とすることもできる。【００６６】
工程(i)における検体中のｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの除去方法としては、例えば、該コレステロールから変換された過酸化水素、又は、該コレステロールより生成させた還元型補酵素を除去する方法が挙げられる。該除去方法としては、該コレステロールより過酸化水素を生成させ、次いで該過酸化水素を除去する方法が好ましい。【００６７】
過酸化水素の除去は、例えば過酸化水素除去試薬を用いることにより行うことができる。過酸化水素除去方法としては、過酸化水素にカタラーゼを作用させるか、又は、過酸化水素に、過酸化活性物質と、酸化カップリング発色反応に使用される２つの酸化カップリング色原体の一方との組み合わせを作用させる方法が好ましい。
還元型補酵素の除去は、例えば還元型補酵素に還元型補酵素酸化酵素を作用させ、生成する過酸化水素を過酸化水素除去試薬を用いることにより除去することにより行うことができる。【００６８】
過酸化水素除去試薬としては、ｓｄＬＤＬ−Ｃ以外のリポ蛋白のコレステロールから生成する過酸化水素を、ｓｄＬＤＬ−Ｃから生成する過酸化水素の測定に影響を及ぼさない物質に変換する試薬であれば特に制限はないが、例えばカタラーゼを含有する試薬、過酸化活性物質と酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方とを含有する試薬等が挙げられる。過酸化活性物質としては、例えばパーオキシダーゼ等が挙げられる。酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方とは、具体的には、後述の「酸化カップリング発色型色原体」におけるカプラー、又は、アニリン類若しくはフェノール類が例示される。本明細書において、「もう片方の酸化カップリング型色原体」なる用語は、「酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方」なる用語と対で使用され、例えば、前者がカップラーを意味する場合は、後者はフェノール類又はアニリン類を示し、前者がフェノール類又はアニリン類を意味する場合は、後者は、カップラーを示す。【００６９】
過酸化水素除試薬として、カタラ−ゼを含有する試薬を用いる場合、カタラーゼの濃度としては、０．００１〜５０００ｋＵ/Ｌが好ましく、０．０１〜１０００ｋＵ/Ｌがより好ましい。また、本発明の工程(i)において、過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合は、工程（ii）においてカタラーゼ阻害剤を共存させることが好ましい。カタラーゼ阻害剤としては、アジ化ナトリウム、Ｈ2Ｓ、ＨＣＮ、ＮＨ2ＯＨ、３−アミノ−１，２，４−トリアゾール等が挙げられ、使用する濃度としてはカタラーゼ活性を阻害し、工程（ii）で生成する過酸化水素の測定に影響を及ぼさない濃度であれば特に限定はされないが、好ましくは０．５〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ、より好ましくは１〜３０ｍｍｏｌ／Ｌである。【００７０】
過酸化水素除去試薬として、過酸化活性物質と酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方とを用いる場合、過酸化活性物質としてはパーオキシダーゼ等が挙げられる。パーオキシダ−ゼの濃度は０．０１〜５００ｋＵ／Ｌが好ましく、１〜１００ｋＵ／Ｌがより好ましい。酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方の濃度としては、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。【００７１】
尚、本発明において、工程(i)におけるｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールの除去とは、該コレステロールから生成した過酸化水素又は還元型補酵素を、他の物質に変換して消去することにとどまらない。例えば、過酸化水素と還元型補酵素の分別測定が可能な場合、該コレステロールから生成した過酸化水素又は還元型補酵素を他の物質に変換する必要はない。例えば工程(i)でｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールから還元型補酵素を生成させ、工程(ii)でｓｄＬＤＬ中のコレステロールから過酸化水素を生成させる場合、工程(i)で生成した還元型補酵素を他の物質に変換する必要はない。更に、本発明は、工程(i)で生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、得られた測定値を基に、工程（ii）で生成した過酸化水素又は還元型補酵素を算出することにより、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを定量することも包含する。【００７２】
ここで、過酸化水素の測定は、例えば過酸化水素電極や後述の過酸化水素測定試薬を用いて行うことができるが、過酸化水素に過酸化活性物質と酸化発色型色原体とを作用させて色素を生成させ、該色素の吸光度を測定することにより行われる方法が好ましい。
還元型補酵素の測定は、例えば還元型補酵素の吸収極大付近の波長での吸光度測定や、後述の還元型補酵素測定試薬を用いた測定により行うことができる。【００７３】
過酸化水素測定用試薬は、生成した過酸化水素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光等が挙げられるが、色素が好ましい。検出可能な物質が色素の場合には、過酸化水素測定用試薬は、酸化発色型色原体及びパーオキシダーゼ等の過酸化活性物質を含有する。酸化発色型色原体としては、例えば後述の酸化発色型色原体が挙げられる。検出可能な物質が光の場合には、過酸化水素測定用試薬は、化学発光物質を含有する。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。【００７４】
過酸化水素測定用試薬として、酸化発色型色原体及び過酸化活性物質を含有する試薬を用いる場合には、過酸化水素は、過酸化活性物質の存在下に酸化発色型色原体と反応して色素を生成し、生成した色素を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。また、化学発光物質を含有する過酸化水素測定用試薬を用いる場合には、過酸化水素は、化学発光物質と反応して光を生じ、生じた光を測定することにより、過酸化水素を測定することができる。【００７５】
酸化発色型色原体としては、例えばロイコ型色原体、酸化カップリング発色型色原体等が挙げられる。
ロイコ型色原体は、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、単独で色素へ変換される物質である。具体的には、１０−Ｎ−カルボキシメチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＣＣＡＰ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩（ＤＡ−６４）、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル〕アミン（ＢＣＭＡ）等が挙げられる。【００７６】
酸化カップリング発色型色原体は、過酸化水素及び過酸化活性物質の存在下、２つの化合物が酸化的カップリングして色素を生成する物質である。
２つの化合物の組み合わせとしては、カプラーとアニリン類との組み合わせ、カプラーとフェノール類との組み合わせ等が挙げられる。
カプラーとしては、例えば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラジン等が挙げられる。【００７７】
アニリン類としては、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−フルオロ−３，５−ジメトキシアニリン（Ｆ−ＤＡＯＳ）等が挙げられる。【００７８】
フェノール類としては、フェノール、４−クロロフェノール、３−メチルフェノール、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安息香酸（ＨＴＩＢ）等が挙げられる。
還元型補酵素測定試薬は、生成した還元型補酵素を検出可能な物質へ変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素等が挙げられる。検出可能な物質が色素の場合には、還元型補酵素測定試薬は、還元発色型色原体を含有する。還元発色型色原体としては、例えば３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム ブロミド（ＭＴＴ）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−１）、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノナトリウム塩（ＷＳＴ−３）等が挙げられる。【００７９】
過酸化水素の測定において、過酸化活性物質としては、例えばパーオキシダーゼ等が挙げられる。過酸化活性物質の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、過酸化活性物質としてパーオキシダーゼを用いる場合は、１〜１００ｋＵ／Ｌが好ましい。また、酸化発色型色原体の濃度は、測定に適した濃度であれば特に制限はないが、０．０１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。【００８０】
本発明において、ｓｄＬＤＬ−Ｃの測定は水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられるが、緩衝液が好ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
グッドの緩衝剤としては、例えば２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、３−モルホリノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸〔（Ｈ）ＥＰＰＳ〕、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。緩衝液の濃度は測定に適した濃度であれば特に制限はされないが、０．００１〜２．０ｍｏｌ／Ｌが好ましく、０．００５〜１．０ｍｏｌ／Ｌがより好ましい。【００８１】
試料中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定するために使用する検量線は、例えば、既知濃度のｓｄＬＤＬ−Ｃを含有する標準検体を用いて、本発明の工程(i)及び工程(ii)を行い過酸化水素または還元型補酵素を生成させ、生成した過酸化水素又は還元型補酵素を測定し、その測定値と使用したｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度から作成することができる。
本発明の工程(i)及び工程(ii)は、例えば、１０〜５０℃で、好ましくは、２０〜４０℃で、１〜３０分間、好ましくは２〜１５分間行う。
（ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット）
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットは、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量方法に使用され得る。ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットの形態としては、本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量方法を可能とする形態であれば特に制限はなく、２試薬系、３試薬系等のいずれの形態であってもよいが、２試薬系が好ましい。【００８２】
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットとしては、例えば以下のキットが挙げられる。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。【００８３】
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定試薬を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。【００８４】
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール脱水素酵素、酸化型補酵素、還元型補酵素酸化酵素及び過酸化水素除去試薬素を含有する第一試薬と、ｓｄＬＤＬ−Ｃの反応を引き起こす試薬及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂ及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。【００８５】
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素及びコレステロール脱水素酵素を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂを含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素及び還元型補酵素測定試薬を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂを含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。【００８６】
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素及び過酸化水素除去試薬を含有する第一試薬と、界面活性剤Ｂ及び過酸化水素測定試薬を含有する第二試薬とを含有することを特徴とする、ｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キット。
第一試薬及び第二試薬からなる２試薬系のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおいては、コレステロールエステル加水分解酵素は第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。コレステロール酸化酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。コレステロール脱水素酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。【００８７】
界面活性剤Ａは、第一試薬に含有されることが好ましい。
酸化型補酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。還元型補酵素酸化酵素は、第一試薬に含有されるが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。
過酸化水素除去試薬は、第一試薬に含有されることが好ましい。過酸化水素除去試薬としてカタラーゼを用いる場合、カタラーゼは第一試薬に含有されることが好ましく、カタラーゼ阻害剤は、第二試薬に含有されることが好ましい。過酸化水素除去試薬としてパーオキシダーゼと酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせを用いる場合、該組み合わせは第一試薬に含有されることが好ましい。【００８８】
界面活性剤Ｂは、第二試薬に含有されることが好ましい。前述のように、界面活性剤Ｂの代わりに、ｓｄＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを除去した後の反応液に残存するｓｄＬＤＬ−Ｃの定量を可能とする酵素や、酵素と界面活性剤の組み合わせを用いることもできる。
過酸化水素測定試薬として、パーオキシダーゼと２つの酸化カップリング型色原体とを含有する試薬を用いる場合には、２つの酸化カップリング型色原体はそれぞれ別々の試薬に含有されることが好ましい。パーオキシダーゼは、第一、第二試薬のいずれか一方又は両方に含有される。尚、過酸化水素除去試薬として、パーオキシダーゼと酸化カップリング型発色反応に使用される２つの酸化カップリング型色原体の一方との組み合わせを用いる場合、当該組み合わせと共に、もう一方のカップリング型色原体とを組み合わせて過酸化水素測定試薬とすることができる。尚、該もう一方のカップリング型色原体は第二試薬に含有される。【００８９】
アルブミンは、第一試薬に含有されることが好ましいが、第一及び第二試薬両方に含有されてもよい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットとしては、例えば以下の態様のキットが挙げられるがこれらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
キット１
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、カタラーゼ
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット２
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット３
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット４
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット５
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット６
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット７
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット８
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット９
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット１０
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット１１
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット１２
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ
キット１３
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬
キット１４
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット１５
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬、アルブミン
キット１６
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン、もう一方の酸化カップリング型色原体
キット１７
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン
キット１８
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン
キット１９
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素測定試薬、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン
キット２０
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、カタラーゼ、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、カタラーゼ阻害剤、過酸化水素測定試薬、アルブミン
キット２１
第一試薬
界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、パーオキシダーゼ、酸化カップリング型色原体の一方、アルブミン
第二試薬
界面活性剤Ｂ、アルブミン、もう一方の酸化カップリング型色原体
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットに用いられる、界面活性剤Ａ、コレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素、酸化型補酵素、コレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素、過酸化水素除去試薬、界面活性剤Ｂ、アルブミン、過酸化水素測定試薬としては、それぞれ、前述のものが挙げられる。【００９０】
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットには、必要に応じて、水性媒体、安定化剤、防腐剤、影響物質消去剤、反応促進剤等が含有されてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シュークロース、塩化カルシウム等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、バイオエ−ス、抗生物質等が挙げられる。影響物質消去剤としては、例えばアスコルビン酸の影響を消去するためのアスコルビン酸オキシダーゼ等が挙げられる。反応促進剤としては、例えばコリパーゼ等の酵素、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の塩類等が挙げられる。【００９１】
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットは、凍結乾燥された状態でも、水性媒体に溶解された状態でもよい。凍結乾燥された状態の試薬を用いて検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを定量する場合には、当該試薬は水性媒体に溶解して使用される。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおけるコレステロールエステル加水分解酵素、コレステロール酸化酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。【００９２】
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおけるコレステロール脱水素酵素、還元型補酵素酸化酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜２０００Ｕ／ｍＬとなる含量が好ましく、０．００５〜１０００Ｕ／ｍＬとなる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおける酸化型補酵素の含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０１〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量が好ましく、０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌとなる含量がより好ましい。【００９３】
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおける界面活性剤Ａの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０００１〜１％となる含量が好ましく、０．０００５〜０．５％となる含量がより好ましい。
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおける界面活性剤Ｂの含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．００１〜５％となる含量が好ましく、０．０１〜０．５％となる含量がより好ましい。【００９４】
本発明のｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットにおけるアルブミン含量としては、水性媒体で溶解された状態での濃度が０．０００１〜１０％であることが好ましく、０．００１〜５％がより好ましい。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例および参考例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。【００９５】
ＭＯＰＳ（同仁化学研究所社製）、ＥＭＳＥ（ダイトーケミックス社製）、硫酸ナトリウム（関東化学社製）、４−アミノアンチピリン（埼京化成社製）、パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）、ＣＨＯ−ＰＥＬ（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）、ＣＨＯ−ＣＥ（コレステロール酸化酵素；キッコーマン社製）、ＣＯＯ−３２２（コレステロール酸化酵素；東洋紡績社製）、ＬＰＬ３（コレステロールエステル加水分解酵素；天野エンザイム社製）、ＬＰ（コレステロールエステル加水分解酵素；旭化成社製）、ＬＩＰＳ（コレステロールエステル加水分解酵素；旭化成社製）、ＬＰＡＰ（コレステロールエステル加水分解酵素；旭化成社製）、パーオキシダーゼ（東洋紡績社製）、ＢＳＡ（Ｐｒｏｌｉａｎｔ社製）。【００９６】
パイオニンＤ−３１１０（竹本油脂社製）、パイオニンＤ−３１２０（竹本油脂社製）、ナイミーンＬ−２０７（日本油脂社製）、ユニセーフＡＬ−Ｅ（日本油脂社製）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ  ３−１０（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）、ニッサンアノンＢＬ（日本油脂社製）、アノンＢＤＦ−ＳＦ（日本油脂社製）、ビスノールＳＫ（一方社社製）、ナイミッドＭＴ−２１５（日本油脂社製）、ニューコール７０７−ＳＦ（日本乳化剤社製）、ニューコール７２３−ＳＦ（日本乳化剤社製）、ハイテノールＮ−１７（第一工業薬品社製）、サンアミドＣＦ−１０（日本油脂社製）、ミグノールＰＡ−３０（一方社社製）、ニッコールＣＭＴ−３０（日光ケミカルズ社製）、サルコシネートＬＮ−３０（日光ケミカルズ社製）、アデカプルロニックＴＲ−７０４（旭電化社製）、ユニオールＤ−７００（日本油脂社製）、プルロニック２５Ｒ−２（旭電化社製）、ユニルーブ５０ＭＢ−２６（日本油脂社製）。【００９７】
ノイゲンＴＤＳ−８０（第一工業薬品社製）、ノイゲンＴＤＳ−１２０（第一工業薬品社製）、ＥＭＡＬＥＸ  ＯＤ−１６（日本エマルジョン社製）、ワンダサーフＳ−８００（青木油脂社製）、ワンダサーフＳ−１４００（青木油脂社製）、ノニオンＮＳ−２１０（日本油脂社製）、ノニオンＮＳ−２１５（日本油脂社製）、ニューコール２６０７（日本乳化剤社製）、エマルゲンＡ−６０（花王社製）、ＢＬＡＵＮＯＮＤＳＰ−１２．５（青木油脂社製）、ニューポールＰＥ−６４（三洋化成社製）、ＢＬＡＵＮＯＮＬＰＥ１００７（青木油脂社製）。
【実施例１】
【００９８】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットを調製した。第１表に示す界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを用いたキットを実施例１(1)〜１(34)のキットとした。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）                        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                                ２  ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
ＬＰＬ３                                      １００  ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ                                １  ｋＵ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              １０ ｋＵ／Ｌ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）                        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
界面活性剤Ｂ（以下、「界Ｂ」と略記する）【００９９】
【表１−１】
2008050636.tif 000012
【０１００】
【表１−２】
2008050636.tif 000013
【０１０１】
【表１−３】
2008050636.tif 000014
【実施例２】
【０１０２】
「新生化学実験講座４」（東京化学同人）に記載の超遠心法に従い、ヒト血清よりＨＤＬ（比重 １．０６３以上）、ｓｄＬＤＬ（比重１．０４４〜１．０６３）、ＬｇＬＤＬ（比重 １．００６〜１．０４４）、ＶＬＤＬ及びＣＭ（比重 １．００６以下）の４つのリポ蛋白分画をそれぞれ分取し、実施例１のキットを用いて、各リポ蛋白分画中コレステロールの反応率を算出した。
（１）各リポ蛋白分画中コレステロールと実施例１のキットとの反応による各リポ蛋白分画における「反応吸光度」の算出
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、以下の操作により「反応吸光度」を算出した。【０１０３】
各リポ蛋白分画を検体とし反応セルへ（２μＬ）添加し、次いでそれぞれ実施例１のキットの第一試薬（０．１５ｍＬ）を添加し反応（第一反応）を開始させ、３７℃で５分間加温し、反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ１）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定した。次いで、この反応液にそれぞれ実施例１(1)〜１(34)のキットの第二試薬（０．０５ｍＬ）を添加しさらに３７℃で５分間加温して反応（第二反応）を行い、第二反応５分後の反応液の吸光度（Ｅ２）を主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍで測定し、Ｅ２からＥ１を差し引いて、吸光度変化（ΔＥ’リポ蛋白分画）を算出した。また、各リポ蛋白分画の代わりに生理食塩水を検体として用いて、同様の測定を行い、吸光度変化（ΔＥ’ブランク）を算出した。最後に、下記（式３）により、各リポ蛋白分画における「反応吸光度３」を算出した。【０１０４】
【数３】
2008050636.tif 000015
（２）各リポ蛋白分画中コレステロールの反応率の算出
日立７１７０Ｓ形自動分析装置を用いて、総コレステロール定量用キットであるデタミナーＣ  ＴＣ（協和メデックス社製）を実施例１のキットの代わりに用いる以外は（１）の場合と同様の方法で、「反応吸光度４」を算出し、以下の（式４）にて、実施例１(1)〜１(34)のそれぞれのキットにおける各リポ蛋白分画中コレステロールの反応率（％）を算出した。尚、デタミナーＣ  ＴＣを用いた測定において算出した「反応吸光度４」は、対象とするリポ蛋白中のコレステロールが全て反応した際の「反応吸光度」を意味する。【０１０５】
【数４】
2008050636.tif 000016
実施例１(1)〜１(34)の各キットにおける各リポ蛋白分画中コレステロールの反応率について、反応率が０〜１０％を「−」、１０〜２０％を「±」、２０〜５０％を「＋」、５０〜８０％を「＋＋」、８０〜１００％を「＋＋＋」と表しまとめたものを第２表に示す。
【０１０６】
【表２】
2008050636.tif 000017
第２表に示すごとく、実施例１(1)〜１(34)に示すキットがｓｄＬＤＬ−Ｃの定量に使用され得ることがわかる。
【実施例３】
【０１０７】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットを調製した。第３表に示す界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを用いたキットを実施例３(35)〜３(44)のキットとした。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）                        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                                ２  ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
ＬＰＬ３                                      １００  ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ                                １  ｋＵ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              １０  ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）                        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
界面活性剤Ｂ（以下、「界Ｂ」と略記する）
【０１０８】
【表３−１】
2008050636.tif 000018
【０１０９】
【表３−２】
2008050636.tif 000019
【実施例４】
【０１１０】
実施例３(35)〜３(47)のキットを用いて、実施例２の（１）記載の測定方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、ヒト血清２４検体それぞれにおける反応吸光度を測定した。
次に、該血清を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該検体中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。実施例３(35)〜３(47)のキットを用いた測定における測定値と、超遠心法による測定値との相関係数を第４表に記す。
【０１１１】
【表４】
2008050636.tif 000020
第４表に示すごとく、実施例３(35)〜３(47)のキットによる測定結果は、超遠心法での測定結果と良好な相関を示した。【０１１２】
また、第一試薬にＢＳＡを含有する実施例３(42)と３(43)のキットを用いた測定と、実施例３(35)と３(37)のキットを用いた測定との比較から、第一試薬にＢＳＡを含有するキットを用いることにより、第一試薬にＢＳＡを含有しないキットを用いた場合に比較して、超遠心法との間の相関がより良好となることが判った。
【実施例５】
【０１１３】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットを調製した。第５表に示す界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを用いたキットを実施例５(48)〜５(57)のキットとした。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）                        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                                ２  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              １０  ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ                                        ３  ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
コレステロールエステル加水分解酵素（以下、「ＣＨＥＲ」と略記する）
コレステロール酸化酵素（以下、「ＣＨＯＤ」と略記する）
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）                        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
ＢＬＡＵＮＯＮ  ＬＰＥ−１００７              １  ｇ／Ｌ
ワンダサーフＳ−８００                        ０．３  ｇ／Ｌ【０１１４】
【表５】
2008050636.tif 000021
【実施例６】
【０１１５】
実施例３(43)、及び、実施例５(48)〜５(57)のキットを用いて、実施例２の（１）記載の方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、ヒト血清２５検体それぞれにおける反応吸光度を測定した。
次に、該血清を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該検体中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。実施例３(43)、及び、実施例５(48)〜５(57)のキットを用いた測定における測定値と、超遠心法による測定値との相関係数を第６表に記す。【０１１６】
【表６】
2008050636.tif 000022
第６表に示すごとく、実施例３(43)及び実施例５(48)〜５(57)のキットを用いた測定結果と、超遠心法で得られた測定結果とは、良好な相関を示した。
【実施例７】
【０１１７】
以下の第一試薬及び第二試薬からなるｓｄＬＤＬ−Ｃ定量用キットを調製した。第７表に示す界面活性剤Ａ及び界面活性剤Ｂを用いたキットを実施例７(58)〜７(67)のキットとした。
第一試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）                        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
ＥＭＳＥ                                      ０．３  ｇ／Ｌ
硫酸ナトリウム                                ２  ｇ／Ｌ
界面活性剤Ａ（以下、「界Ａ」と略記する）
ＬＰＬ３                                      １００  ｋＵ／Ｌ
ＣＨＯ−ＰＥＬ                                １  ｋＵ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              １０  ｋＵ／Ｌ
ＢＳＡ
第二試薬
ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）                        ２０  ｍｍｏｌ／Ｌ
４−アミノアンチピリン                        ０．３  ｇ／Ｌ
パーオキシダーゼ                              ２０  ｋＵ／Ｌ
界面活性剤Ｂ（以下、「界Ｂ」と略記する）【０１１８】
【表７】
2008050636.tif 000023
【実施例８】
【０１１９】
実施例３(36)及び実施例７(58)〜５(67)のキットを用いて、実施例２の（１）記載の方法と同様にしてヒト血清２１検体それぞれにおける反応吸光度を測定した。
次に、該血清を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該血清中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ  ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。各実施例及び比較例のキットを用いた測定における測定値と、超遠心法による測定値との相関係数を第８表に記す。【０１２０】
【表８】
2008050636.tif 000024
第８表に示すごとく、実施例３(36)及び実施例７(58)〜７(67)のキットを用いた測定結果と、超遠心法で得られた測定結果とは、良好な相関を示した。
【実施例９】
【０１２１】
検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量
超遠心法並びに本発明の実施例３(36)及び実施例３(44)のキットを用いて、ヒト新鮮血清２検体について、各検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃを以下の方法により定量した。
（１）超遠心法を用いたヒト血清検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量
該ヒト血清２検体を用いてJournal of Lipid Research vol.44, p.2193-2201(2003) 記載の超遠心法にて該血清中のｓｄＬＤＬを遠心分離し、得られたｓｄＬＤＬ分画中のコレステロール量をデタミナーＬ  ＴＣＩＩ（協和メデックス社製）を用いて測定した。
（２）検量線の作成
超遠心法による測定より、ｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度が４３．１ｍｇ／ｄＬであることが判明している血清標準液を検量線作成用サンプルとした。実施例２の（１）記載の測定方法と同様にして日立７１７０Ｓ自動分析装置により、実施例３(36)及び実施例３(44)のキットにより、検量線作成用サンプル検体の反応吸光度を測定し、該反応吸光度と検量線作成用サンプル中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度との関係からそれぞれのキットの検量線を作成した。
（３）ヒト血清２検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃの定量
検量線作成用サンプルの代わりにヒト血清２検体を用いて、上記（２）と同様の方法により、該２検体各々について反応を行い、反応後の反応液の吸光度と上記（２）で作成した検量線とから、それぞれのキットについて各検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を決定した。【０１２２】
該２検体について、上記（１）における超遠心法により決定した該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度と、上記（３）における実施例３(36)及び実施例３(44)のキットを用いた測定により決定した該検体中のｓｄＬＤＬ−Ｃ濃度を第９表に示す。【０１２３】
【表９】
2008050636.tif 000025
第９表は、本発明のキットを用いて、本発明の方法によりヒト血清中のｓｄＬＤＬ−Ｃが正確に定量できることを示す。
【産業上の利用可能性】
【０１２４】
本発明により、動脈硬化などの冠動脈疾患の診断に有用な小粒子低密度リポ蛋白中のコレステロールの定量方法及び定量用キットが提供される。
【国際調査報告】
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