(57)【要約】  同一の脾臓組織に由来する好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であって、アレルギー性サイトカインに対して異なる感受性を有する複数の細胞株に対する反応性に基づいて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングする。また、Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも１つの好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を用いて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングする。
2008059900.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一の脾臓組織に由来する好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であって、アレルギー性サイトカインに対して異なる感受性を有する複数の細胞株に対する反応性に基づいて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むアレルギー疾患関連分子のスクリーニング方法。
【請求項２】
前記複数の好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株が、Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも２つである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも１つの好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を用いて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むアレルギー疾患関連分子のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記細胞株と前記候補物質とを接触させる工程と、
前記接触後の前記細胞株の反応に基づいて候補物質を選別する工程と、
を含む請求項１又は請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記選別工程が、スクリーニングに用いられた複数の細胞株間で反応が異なる候補物質を選別するものである請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
競合用化合物の存在下で行われる請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記候補物質が、サイトカイン感受性調整機能を有する化合物のための候補物質である請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記選別が、細胞形態及び細胞活性上の変化、細胞内シグナル伝達に関与する分子の生化学的変化、及び、細胞の遺伝子制御上の変化の少なくともいずれか１つに基づいて行われる請求項１〜請求項４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）。
【請求項１０】
ＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）。
【請求項１１】
Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも２つで構成され、アレルギー疾患関連化合物をスクリーニングするために用いられる細胞セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アレルギー疾患関連分子をスクリーニングする方法及びこれに用いられる細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎、気管支喘息、食物アレルギーなどを発症する、いわゆるアレルギー疾患では、体内に入ったアレルゲンが、マスト細胞や好塩基球上のＩｇＥに結合して、これらの細胞から分泌されるヒスタミンなどにより、局所的炎症が誘導される。ＩｇＥ産生のためには、免疫グロブリンのクラススイッチに重要なＩＬ−４やＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカインを産生するＴ細胞機能分化が重要であるために、アレルギー体質はＴｈ２優位の状態と考えられている。また、マスト細胞や好塩基球などのエフェクター細胞の増殖や分化にもＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３などのＴｈ２サイトカインが重要な役割を果たしている。
このようにサイトカインが種々の反応に関与していることから、これらのサイトカインに対する感受性が異なれば、その結果生じる反応性にも大きな違いが生じる。またアレルギー性炎症を起こしている局所は、エフェクター細胞のサイトカインに対する感受性が上昇していると考えられている。【０００３】
一方、特定の細胞株を用いてアレルギーに関連した現象を分子レベルで解明しようとする試みが多くなされている。このような細胞株としては、肥満細胞の機能を維持し且つｃ−ＫＩＴの自己リン酸化を伴わない新規な肥満細胞株が知られている（特開２００４−２１５５８１号公報）。この細胞株ＮＣＬ−２細胞株は、腫瘍性の肥満細胞株ではないので、薬剤刺激に対して正常肥満細胞株に近い反応を示す可能性が高いと示唆されている。従って、この細胞株を用いることにより肥満細胞の増殖分化や機能の詳細な解析ができると記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記細胞株は、正常肥満細胞に近い細胞株として単独で見出された細胞株であるので、サイトカインに対する感受性の程度の位置づけが不明である。このため、慢性化状態のアレルギーに関与する物質を効率よくスクリーニングするには向かない場合がある。
従って、本発明の目的は、アレルギー疾患に関連した物質を効率よくスクリーニングすることができるスクリーニング方法及びこれに用いられる細胞株を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明のスクリーニング方法は、同一の脾臓組織に由来する好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であって、アレルギー性サイトカインに対して異なる感受性を有する複数の細胞株に対する反応性に基づいて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むアレルギー疾患関連分子のスクリーニング方法である。
前記細胞株は、Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも２つであることが好ましい。【０００６】
また、本発明の第二のスクリーニング方法では、特に上記Ｒ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞の特徴を利用すれば、これらの細胞株のうちの１つ以上を使用すればよく、即ち、本発明の第二のスクリーニング方法では、Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも１つの好塩基球ないしマスト細胞様細胞株を用いて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むアレルギー疾患関連分子のスクリーニング方法である。【０００７】
また、本発明の上記スクリーニング方法では、前記細胞株と前記候補物質とを接触させる工程と、接触後の前記細胞株の反応に基づいて候補物質を選別する工程と、を含むものであってもよい。ここで前記選別工程は、スクリーニングに用いられた複数の細胞株間で反応が異なる候補物質を選別することを含んでもよい。
また本発明のスクリーニング方法は、競合用化合物の存在下で行われるものであってもよい。【０００８】
本発明の細胞セットは、Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも２つで構成されたアレルギー疾患関連化合物をスクリーニングするために用いられる細胞セットである。【０００９】
本発明は、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングするために、同一の脾臓組織に由来する好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であって、アレルギー性サイトカインに対して異なる感受性を有する複数の細胞株を用いるものである。このような複数の細胞株はもともと同一の組織に由来するものであるため、細胞株間の遺伝的特徴の違いは他の組織由来の細胞株と比較して少ない上に、このような少ない遺伝的特徴が、サイトカインに対する感受性の違いを生じていると考えられる。このため、これらの複数の細胞株に対して異なる反応性を示す候補物質は、アレルギー性サイトカインに対する感受性の違いに対応した細胞株の相違点を認識している可能性が高い。この結果、このような細胞株を用いることによって、アレルギー性サイトカインの感受性に関与し得る候補物質を効率よくスクリーニングできる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、アレルギー疾患に関連した化合物を効率よくスクリーニングすることができるスクリーニング方法及びこれに用いられる細胞株を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】（Ａ）は本発明の実施例にかかるＲ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞の１０容量％ＲＣＧＦ含有培地に対する増殖反応を示すグラフ、（Ｂ）は０．１容量％ＲＣＧＦ含有培地に対する増殖反応を示すグラフ、（Ｃ）は０容量％ＲＣＧＦ含有培地に対する増殖反応を示すグラフである。
【図２】本発明の実施例にかかるＲ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞の各種濃度のＲＣＧＦ含有培地に対する増殖反応を示すグラフである。
【図３】本発明の実施例にかかるＲ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞の各種濃度のＩＬ−３含有培地に対する増殖反応を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例にかかるＲ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞の各種濃度のＩＬ−４含有培地に対する増殖反応を示すグラフである。
【図５】本発明の実施例にかかるＲ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞の各種濃度のＩＬ−３＋ＩＬ−４含有培地に対する増殖反応を示すグラフである。フである。
【図６】本発明の実施例にかかる各細胞株のＰＭＡに対する増殖反応を示すグラフである。
【図７】本発明の実施例にかかる各細胞株のＬＹ２９４００２に対する増殖反応を示すグラフである。
【図８】本発明の実施例にかかる各細胞株のＲｏｔｔｌｅｒｉｎに対する増殖反応を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のスクリーニング方法は、同一の脾臓組織に由来する好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であって、アレルギー性サイトカインに対して異なる感受性を有する複数の細胞株に対する反応性に基づいて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むアレルギー疾患関連分子のスクリーニング方法である。【００１３】
本細胞株は、好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であるので、アレルギー疾患関連物資に対する感受性を有するものである。ここで「好塩基球様ないしマスト細胞様である」とは、光学又は電子顕微鏡観察による形態観察や、細胞表面抗原によって判断することができる。例えば、好塩基球様の形態としては、顆粒密度の低い嚢胞状構造やトルイジンブルー（ＴＢ）染色では染まらない点を挙げることができ、一方、マスト細胞様の形態としては、ｃ−ｋｉｔ、ＦｃεＲＩαが共に陽性という細胞表面分子の特徴を挙げることができる。【００１４】
このような細胞株としては、具体的には、脾臓細胞を卵白アルブミン（ＯＶＡ抗原）ペプチドで長期間にわたり培養中に出現してきた好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株、更には、ＤＯ１１．１０トランスジェニックマウスの脾臓細胞からＯＶＡ抗原を用いて誘導した好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を挙げることができる。本好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を得るため、ＯＶＡ抗原ペプチドの３２３番目−３３９番目のアミノ酸残基を用いることができる。【００１５】
本発明における上記細胞株としては、Ｒ細胞（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８、２００５年９月１日付で受託）、Ｎ６２．５細胞（同特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９、２００６年１１月１６日付で受託）及びＲＣＣＭ細胞（同特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０、２００６年１１月１６日付で受託）を挙げることができる。【００１６】
これらの細胞は、上記ＯＶＡ抗原存在下での長期培養中の培養脾臓細胞からＴ細胞を除去することで単離し、次いで、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞株の培養上清（R cell growth factor：ＲＣＧＦ）を様々な濃度で使用しながら、さらに長期継代することで得られた。このＲＣＧＦは、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞株を、抗Ｔ細胞受容体抗体を架橋することによって刺激して得られた培養上清である。
従ってこれらの細胞株は、サイトカインに対する細胞の持つ感受性を除いては、同一か極めて類似の性質を有する細胞である。このため、アレルギー性炎症局所で予想される異なったサイトカイン環境で、好塩基球やマスト細胞の増殖を制御する分子のスクリーニングに適していると考えられる。【００１７】
Ｒ細胞及びＮ６２．５細胞の維持条件としては、ＯＶＡ抗原ペプチド刺激Ｔ細胞との共培養を挙げることができる。
共培養に用いられるＴ細胞は、表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ８−のヘルパーＴ細胞であればよい。このＴ細胞の起源としては、哺乳類、特に齧歯類を挙げることができ、好ましくはマウス、特に好ましくは、Ｒ細胞及びＮ６２．５細胞と同一の遺伝的系統を有するマウスである。この共培養に用いられるＴ細胞は、上記条件のものであればいずれのものであってもよいが、Ｒ細胞及びＮ６２．５細胞を確立するために使用した親細胞であり、ＤＯ１１．１０のＴＣＲトランスジェニックマウスの脾臓細胞中のＴ細胞（以下、同系Ｔ細胞という）であることが特に好ましい。
共培養中でのＯＶＡ抗原ペプチドの濃度は、１００ｎＭ〜１０００ｎＭとすることができ、２５０〜１０００ｎＭであることが好ましい。【００１８】
またＲ細胞及びＮ６２．５細胞の成育は、ＤＯ１１．１０ Ｔ細胞株の培養上清を含む培地又はＩＬ−３を含む培地を用いて、このような培地による刺激を受けながら培養することによって維持することができる。好ましくは、これらの細胞の特徴的な活性を良好に維持するには、これらの細胞の成育を、ＤＯ１１．１０細胞株の培養上清を含む培地によって維持することが好ましい。更に、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）に対する刺激を付与しながらヘルパーＴ細胞を培養することによって得られた培養上清を含む培地を用いても、同様にＲ細胞及びＮ６２．５細胞を維持及び増殖させることができる。
ＯＶＡ抗原ペプチド刺激Ｔ細胞の培養上清又はＴＣＲ刺激Ｔ細胞の培養上清は、細胞用培養液中に含有してあればよく、細胞の状態に応じて適宜変更することができるが、好ましくは、０．０１容量％〜１０容量％、特に好ましくは、Ｎ６２．５細胞の場合には１０容量％とすることができ、Ｒ細胞の場合には２．５容量％とすることができる。
また、ＯＶＡ抗原ペプチド刺激Ｔ細胞の培養上清の代わりにＩＬ−３含有培地を用いる場合、培養液中に含まれるＩＬ−３は、Ｒ細胞及びＮ６２．５細胞の状態に応じて適宜設定可能である。【００１９】
ＲＣＣＭ細胞は、上記のような培養上清や増殖因子に依存せずに培養することができるので、細胞培養に用いられる通常の培地を用いればよい。
各種細胞の通常の培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）や、ＲＰＭＩ１６４０などを挙げることができる。これらの培養液に対しては、通常、血清、各種ビタミン、各種抗生物質等、通常の細胞培養に適用可能な各種添加剤を添加してもよい。【００２０】
本発明にかかる複数の細胞株は、アレルギー性サイトカインに対して異なる感受性を示す細胞株である。
ここでいうアレルギー性サイトカインには、Ｔｈ２サイトカインが含まれる。Ｔｈ２サイトカインとしては、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などを挙げることができる。本発明にかかる細胞株は、これらのアレルギー性サイトカインの種類や、濃度に対して、異なる反応性を示すものである。【００２１】
ここでいう反応性とは、外部からの刺激に対して、細胞の持つ形質を変化させる能力を指す。このような細胞の形質の変化には、細胞の形態、増殖速度、生存率及び特定の細胞性因子の産生などの細胞形態及び細胞活性上の変化と細胞内シグナル伝達に関与する分子の生化学的変化、更には遺伝子発現や遺伝子調節のような遺伝子制御上の変化が挙げられる。これらの細胞の状態の変化のうち、少なくとも１つの変化を、反応性の指標にすることができる。【００２２】
本発明にかかる細胞株のうち、ＲＣＣＭ細胞は、上記アレルギー性サイトカインに対して依存性が極めて低く、その存在有無に拘わらず増殖が可能であることがわかっている。ＲＣＣＭ細胞の細胞表面には、ＦＣεＲＩα、ｃ−ｋｉｔ、ＣｌａｓｓＩなどが存在していることが確認されている。
Ｒ細胞は、上記アレルギー性サイトカインに対して中程度の依存性を示す細胞株である。このため、アレルギー性サイトカイン非存在下の培養系では生存することができないが、ごくわずかな濃度でアレルギー性サイトカインが存在すれば、増殖することが確認されている。Ｒ細胞は、複数のサイトカインに対して高い感受性を有しており、中でもＴｈ２型サイトカインを中心とするＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５などのインターロイキンに対して増殖能を示し、このうち、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１３、特にＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−９に対して高い増殖能を示す。例えばＩＬ−３の場合、約５ｎｇ／ｍｌの濃度であればＲ細胞を維持することができる。ただし、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＧＭ−ＣＦＳやＩＦＮ−γに対しては感受性を示さない。Ｒ細胞の細胞表面には、ＦＣεＲＩα、ｃ−ｋｉｔ、ＣｌａｓｓＩなどが存在していることが確認されている。【００２３】
Ｎ６２．５細胞は、上記アレルギー性サイトカインに対して高程度の依存性を示す細胞株である。このため、アレルギー性サイトカイン非存在下では生存できず、Ｒ細胞が増殖可能な濃度よりも多い高濃度であれば増殖することが確認されている。例えば、ＩＬ−３の場合、約２０ｎｇ／ｍｌの濃度であればＮ６２．５細胞を維持することができる。Ｎ６２．５細胞の細胞表面には、ＦＣεＲＩα、ｃ−ｋｉｔ、ＣｌａｓｓＩなどが存在していることが確認されている。【００２４】
このように、Ｒ細胞とＮ６２．５細胞とは、共にアレルギー性サイトカインに対して依存性を示すが、その依存の程度が異なることが確認されている。このようにこれらの３細胞間の比較において、高依存性のＮ６２．５細胞では、アレルギー性サイトカインが高濃度にないと反応しないという正常状態のモデル系として使用することができ、一方、中依存性のＲ細胞は、低濃度のアレルギー性サイトカインに対しても反応性を示すことから所謂アレルギー状態のモデル系として使用することができる。これに対してアレルギー性サイトカインに極低依存性のＲＣＣＭ細胞はアレルギー性サイトカインが低濃度でも増殖可能な細胞株であり、慢性アレルギーのモデル系として使用することができる。【００２５】
本発明のスクリーニング方法は、上記複数の細胞株に対する反応性に基づいて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むものである。これにより、スクリーニングに用いられた複数の細胞間での反応性の違いから、アレルギー疾患関連物質を効率よくスクリーニングすることができる。
また、本発明の第二のスクリーニング方法は、本発明にかかるＲ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞の上記特性を利用し、この中から少なくとも１つを用いて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むものであってもよい。【００２６】
本発明の上記スクリーニング方法では、具体的には、本発明の細胞株と候補物質とを接触させる工程と、接触後の細胞株の反応に基づいて候補物質を選別する工程とを含むことが好ましい。【００２７】
候補物質は、好塩基球ないしマスト細胞様細胞を増殖させることが既知の物質又は好塩基球ないしマスト細胞様細胞を増殖させる原因因子として未同定の物質を選別するための候補物質とすることができる。
このような候補物質としては、天然及び合成の低分子化合物、高分子化合物を挙げることができ、また、既知又は未知のサイトカインなどを含み得る種々の細胞培養上清なども、候補物質としてもよい。この場合、好塩基球ないしマスト細胞様細胞を増殖させる物質を含んだ細胞培養上清をスクリーニングすることができる。これらの候補物質は、種々の濃度で培地に添加することができ、好ましくは複数の濃度段階で培地に添加することができる。
候補物質と細胞株との接触は、本発明に係る複数の細胞株を単独で培養する培養系に候補物質をそれぞれ添加すればよい。【００２８】
また上記第一及び第二のスクリーニング方法は、細胞株の培養系に競合用化合物の存在下で行うものであってもよい。競合用化合物を用いることによって、候補物質の中から、競合用化合物との接触に起因した反応を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
競合用化合物には、候補物質と同様に、天然及び合成の低分子化合物、高分子化合物、細胞培養上清などを挙げることができる。競合用化合物の培地への添加量は、種々の任意の濃度とすることができる。【００２９】
競合用化合物は、使用される細胞株に対する反応性が既知のアレルギー疾患関連物質の化合物であり、例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−９などのサイトカインなどを挙げることができる。また上述したようなＲＣＧＦを競合用化合物として用いてもよい。これらのサイトカイン及びＲＣＧＦは本発明の細胞株に対する増殖活性を有することが確認されているので、これらの化合物を同一の系に存在させることにより、増殖抑制活性を有する物質をスクリーニングすることができる。【００３０】
なお、スクリーニングに用いられる培地には、通常の増殖用培地を用いることできるが、候補物質の特性をより的確に判定するために、完全合成培地、血清を含まない培地などを用いてもよい。【００３１】
スクリーニングに適用される培養温度及び湿度などの培養条件は、一般的なマスト細胞又は好塩基球系細胞株に対して用いられる培養条件をそのまま適用することができる。また、培養工程の前に細胞株に対して前培養を行ってもよい。
培養期間は、細胞株の種類や状態によって異なるが、一般に、２日〜７日、好ましくは３〜５日とすることができる。【００３２】
候補物質のスクリーニングは、上記細胞株の反応性の変化に基づいて行われる。例えば、一の細胞株が他の細胞株の成育状態と異なる状態となった場合には、培養系に含まれる候補物質が、アレルギー疾患関連物質である可能性があると判定することができる。【００３３】
前記選別工程は、候補物質との接触後の細胞株の反応に基づいて行われることが好ましい。このような細胞株の反応としては、以下の述べるような細胞の反応性の指標の少なくとも１つであればよい。例えば細胞の形態、増殖速度、生存率及び特定の細胞性因子の産生などの細胞形態及び細胞活性上の変化と、細胞内シグナル伝達に関与する分子の生化学的変化、更には遺伝子発現や遺伝子調節のような遺伝子制御上の変化を挙げることができる。細胞の変化のうち細胞の形態の変化としては、顆粒の状態や大きさの変化などを挙げることができ、細胞活性上の変化としては、特定の因子の産生量の変化などを挙げることができる。生化学的変化としては、細胞内シグナル伝達に関与する分子のリン酸化や脱リン酸化、ユビキチン化等があり、また、遺伝子制御上の変化としては、特定の遺伝子の発現の有無や、特定遺伝子の発現量の変化などを挙げることができる。【００３４】
例えば、細胞の増殖に基づいてスクリーニングを行うことができる。これにより、細胞を増殖させる候補物質を確実に且つ簡便にスクリーニングを行うことができるため、アッセイの利便性の観点から、好ましい。細胞株の増殖の速度は、通常、この目的のために用いられている各種の手段をそのまま適用することができ、例えば、目視又は顕微鏡による血球計算盤等を用いた細胞数の計測、放射性同位元素（例えば、３Ｈ−チミジン）の取り込み量などを挙げることができる。【００３５】
また本スクリーニング方法は、好塩基球ないしマスト細胞様細胞の増殖に関与する遺伝子の発現に基づいて、候補物質をスクリーニングするものであってもよい。この場合には、本スクリーニング方法は、本発明の細胞株と候補物質とを接触させる工程と、接触により誘導された遺伝子発現を検出する工程とを更に含む。誘導された遺伝子発現の検出には、処理効率の観点から、例えばマイクロアレイなどを用いることができる。【００３６】
特に、複数の細胞株を用いた場合には、スクリーニングに用いられた複数の細胞株間で反応が異なる候補物質を選別する。候補物質の存在によって、アレルギー性サイトカインに対して異なる感受性を有する複数の細胞株に対する反応に基づいてアレルギー関連物質のスクリーニングを行うので、一方の細胞株に対する反応と他方の細胞株に対する反応との違いから、アレルギー疾患関連物質を効率よくスクリーニングすることができる。【００３７】
例えば、候補物質に、アレルギー性サイトカインに対して高依存性のＮ６２．５細胞と中依存性のＲ細胞に対してはそれぞれの増殖速度に影響せず、アレルギー性サイトカインに低依存性のＲＣＣＭ細胞に対してのみ増殖を抑制する化合物があれば、この化合物を慢性アレルギー疾患に特に関連し得る物質として選別することができる。またこの慢性アレルギー疾患に特に関連し得る物質として選別された化合物が、ＩＬ−３を競合用化合物として存在する培養系を用いた同様のスクリーニングにおいて、ＲＣＣＭ細胞の増殖抑制活性を示さない場合には、この化合物をＩＬ−３分子に関連しうる物質として更に選別することができる。
細胞株の組み合わせについては、目的とする候補物質のスクリーニングに応じて適宜選択すればよい。【００３８】
このようにサイトカイン感受性に基づいてスクリーニングされる物質は、サイトカイン感受性を調整する機能を有する可能性がある。従って、本発明のスクリーニング方法のスクリーニング対象となる候補物質は、サイトカイン感受性調整機能を有する化合物のための候補物質であることが好ましい。【００３９】
スクリーニング可能なアレルギー疾患としては、アレルゲンの生体内への侵入に惹起されたＴ細胞の活性化によってアレルギー性サイトカインが放出し、アレルギー反応のエフェクター細胞（マスト細胞、好塩基球など）の増殖や炎症メディエータの放出が引き起こされると考えられているものであればよく、アトピー性皮膚炎、気管支喘息等を挙げることができ、慢性化（難治化）の疾患を特に挙げることができる。
【実施例】
【００４０】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。【００４１】
［実施例１］
細胞株の作製
１０週齢のメスＤＯ１１．１０トランスジェニックマウス（米国ワシントン大学、Ken Murphy教授より供与）から脾臓を摘出し、この脾臓細胞を、ＲＰＭＩ培地（１０容量％ＦＣＳ、ペニシリンＧカリウム１００Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ添加：以下、単に１０％血清含有培地という）にＯＶＡ抗原ペプチド（ニワトリＯＶＡ（ｃＯＶＡ）３２３−３３９ ペプチド：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ：配列番号１）を１０００ｎＭ又は２５０ｍＭの最終濃度となるように添加した培養条件下で培養した。
得られた培養物から、ＯＶＡ抗原ペプチド反応性を示すＴ細胞を得た。このＴ細胞を抗ＣＤ３抗体によって２４時間３７℃で刺激しながら培養して、培養上清（Ｒ細胞増殖因子含有液：ＲＣＧＦ）を得た。以下、ＲＣＧＦを培養に用いる際には、２日間培養して得たＲＣＧＦを２５容量（ｖ／ｖ）％の濃度で新規培地と混合して使用した。【００４２】
また、得られた培養物に、抗Ｔｈｙ１．２抗体（Pharmingen社製）と補体（ウサギ血清、Pel-Freeze社製）をそれぞれ１μｇ／ｍｌ及び最終１０容量％の濃度で１×１０７個／１００μｌの細胞に対して添加して、約３０分間反応させ、Ｔ細胞を除去し、様々な濃度の上記ＲＣＧＦを添加しながら培養を継続して、本発明にかかる細胞株を得た。
その結果、Ｎ６２．５細胞は１０ｖ／ｖ％のＲＣＧＦ含有培地で、Ｒ細胞は、２．５ｖ／ｖ％のＲＣＧＦ含有培地で維持・増殖可能であった。それに対してＲＣＣＭ細胞は全くＲＣＧＦを含まない培地で維持できた。
その後、それぞれの細胞株は希釈法に従った培養を３週間にわたって行いクローン化した。Ｒ細胞は、２５容量％のＲＣＧＦを含有する１０容量％血清含有ＲＰＭＩ培地（又は５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含有するＲ細胞用培地）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で培養し、維持した。Ｒ細胞は、培養環境からＲＣＧＦ及びＴ細胞を除去すると、死滅した。【００４３】
［実施例２］
細胞株の特徴解析
上記のようにして得られたＲ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）、ＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）に対して各種抗体を用いた表面抗原解析を行った。
蛍光色素（ＦＩＴＣ）結合抗体として、抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（e-Bio社製）、抗マウスＦｃεＲＩ抗体（e-Bio社製）、抗マウスＢ２２０抗体（e-Bio社製）、抗マウスＣＤ３抗体（e-Bio社製）、抗マウスＦｃγＲII／III抗体（Pharmingen社製）、抗ＣｌａｓｓＩ抗体（Pharmingen社製）、抗マウスＤＸ５抗体（e-Bio社製）、抗ＣｌａｓｓII抗体（Pharmingen社製）を使用し、それぞれ約５〜１０μｇをＲ細胞１×１０６／１００μｌ対して氷上で３０分間反応させた。抗体の結合状態は、ＦＡＣＳを用いて解析した。
その結果を表１に示す。【００４４】
【表１】
2008059900.tif 000003
【００４５】
また光学顕微鏡及び電子顕微鏡を用いて各種細胞株の形態観察を行った。
その結果、ヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）では、Ｒ細胞の細胞質はピンクに染色された。細胞質内には多数の顆粒が詰まっているが、その一部は空胞状顆粒構造を示した。一方、トルイジンブルー染色（ＴＢ染色）では、マスト細胞と異なり染色されなかった。また電子顕微鏡像では、細胞質に多数の嚢胞状構造をもち、その内部には、好塩基球と同様に粒状構造物を含んでいた。また、粒状構造物はやや大型であるが、マスト細胞に見られるような指紋状・渦巻状構造は認められなかった。細胞質内に多数の顆粒が詰まっているが、一部は空胞に抜けており（空胞状顆粒構造）、高密度の粒状構造を有するマスト細胞とは異なっていた。
これらのことから、Ｒ細胞は好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であることが示された。Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞も同様の形態を示していた。【００４６】
［実施例３］
各種細胞のＲＣＧＦに対する感受性実験
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１．５×１０４個／ウェルの播種密度で、実施例１で得られたＲ細胞、Ｎ６２．５細胞又はＲＣＣＭ細胞を配置し、ＲＣＧＦの含量を変えた培地を用いてＲＣＧＦに対する感受性を確認した。
ＲＣＧＦの濃度を１０ｖ／ｖ％、０．１ｖ／ｖ％、０ｖ／ｖ％とし、１０容量％血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。その後、最終濃度が０．５μＣｉ／ｍｌとなるように３Ｈ−チミジンを培養液中に加え、更に１２時間培養し、その間の３Ｈの取り込み量を測定した。反応後３Ｈ−チミジンの取り込み量をMicroBeta TRILUX（ＷＡＬＬＡＣ社製）を用いて測定した。結果を図１に示す。図１（Ａ）〜（Ｃ）では、黒菱形はＲＣＣＭ細胞、黒四角はＲ細胞、黒三角はＮ６２．５細胞をそれぞれ表す。【００４７】
図１に示されるように、Ｒ細胞（黒四角）及びＮ６２．５細胞（黒三角）はＲＣＧＦの濃度に依存して増殖し（図１（Ａ）及び（Ｂ）参照）、ＲＣＧＦの非存在下では増殖しない（図１（Ｃ）参照）ＲＣＧＦ依存性の細胞であることが示された。このうちＮ６２．５細胞は、ＲＣＧＦの濃度が低くなるとこれに伴って増殖速度が低下し、この点でＲ細胞とは反応性が異なる細胞であることが示された（図１（Ｂ）参照）。
一方、ＲＣＣＭ細胞（黒菱形）は、ＲＣＧＦの有無に拘わらず増殖する非依存性の細胞であることが確認された。
従って、この３つの細胞株は同一の脾臓組織由来にも拘わらずＲＣＧＦに対する反応性が異なる細胞株であることが確認された。【００４８】
［実施例４］
各種細胞のサイトカイン感受性実験
９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１．５×１０４個／ウェルの播種密度で、実施例１で得られたＲ細胞、Ｎ６２．５細胞又はＲＣＣＭ細胞を配置し、ＲＣＧＦ（図２）及び各種サイトカイン（図３：ＩＬ−３、図４：ＩＬ−４、図５：ＩＬ−３＋ＩＬ−４））に対する感受性を確認した。
各種リコンビナントサイトカイン（ＩＬ−３［PeproTech社製］、ＩＬ−４［PeproTech社製］）をそれぞれ含有する培地を各ウェルに添加して、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４８時間培養した。なおＲＣＧＦの濃度は、８０容量％含有培地からの１／２段階的希釈とし、サイトカインの量は、単独の場合、４０ｎｇ／ｍｌからの１／２段階的希釈、ＩＬ−３及びＩＬ−４の組み合わせの場合、それぞれ２０ｎｇ／ｍｌからの１／２段階的希釈とした。その後、最終濃度が０．５μＣｉ／ｍｌとなるように３Ｈ−チミジンを培養液中に加え、更に１２時間培養し、その間の３Ｈの取り込み量を測定した。結果を図２〜図５に示す。図２〜図５において黒菱形はＲＣＣＭ細胞、黒四角はＲ細胞、黒三角はＮ６２．５細胞をそれぞれ表す。【００４９】
図２〜５に示されるように、本実施例にかかる３つの細胞株は、それぞれＲＣＧＦに対する感受性と同様に、ＩＬ−３（図３参照）、ＩＬ−４（図４参照）、ＩＬ−３＋ＩＬ−４（図５参照）に対する感受性がそれぞれ異なっていた。特にＮ６２．５細胞はＩＬ−４では感受性を示さない一方でＩＬ−３に対しては増殖活性を示し、Ｒ細胞との反応性の違いは明白であった。一方で、ＲＣＣＭ細胞は、いずれの場合においても増殖能に違いはなく、常に増殖可能な状態であることが示唆された。【００５０】
このように、本実施例にかかる３つの細胞株は、ＲＣＧＦのみならず、ＩＬ−３やＩＬ−４といったアレルギー性サイトカインに対しても異なる性質を示した。従って、これらの３つの細胞株を用いることによって、細胞株間の各種サイトカインに対する反応性の違いに対応した細胞内分子や遺伝子発現に関与する物質のスクリーニングに使用できることは明らかであった。【００５１】
［実施例５］
実施例４と同様に、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１．５×１０４個／ウェルの播種密度で、実施例１で得られたＲ細胞、Ｎ６２．５細胞又はＲＣＣＭ細胞を配置した。各ウェルには、フォルボール１２−ミリステート１３アセテート（ＰＭＡ）を、１０ｎｇ／ｍｌからの１／２段階希釈で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４８時間培養した。その後、最終濃度が０．５μＣｉ／ｍｌとなるように３Ｈ−チミジンを培養液中に加え、更に１２時間培養し、その間の３Ｈの取り込み量を測定した。結果を図６に示す。図６において黒菱形はＲＣＣＭ細胞、黒四角はＲ細胞、黒三角はＮ６２．５細胞をそれぞれ表す。【００５２】
図６に示されるように、ＲＣＣＭ細胞は、Ｎ６２．５細胞及びＲ細胞と異なり、低濃度のＰＭＡによって増殖が抑制された。このことは、ＰＭＡが、慢性アレルギー疾患関連物質としての機能を有することを示唆している。
このように、ＲＣＣＭ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲ細胞の３つの細胞株を用いることによって、これらの細胞株の増殖能に対する反応性の違いから、アレルギー疾患関連物質、例えばＰＭＡのように増殖抑制物質のスクリーニングにも適用することができる。【００５３】
［実施例６］
実施例４と同様に、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに１．５×１０４個／ウェルの播種密度で、実施例１で得られたＲ細胞、Ｎ６２．５細胞、ＲＣＣＭ細胞と、好塩基球系細胞株であるＰ１８５細胞とをそれぞれ配置した。各ウェルには、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２（SuperArray社  Cat No. FA-002）及びＰＫＣ阻害剤であるＲｏｔｔｌｅｒｉｎ（CALBIOCHEM Cat. No. 557370）を、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌからの１／２段階希釈で添加し、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で４８時間培養した。その後、最終濃度が０．５μＣｉ／ｍｌとなるように３Ｈ−チミジンを培養液中に加え、更に１２時間培養し、その間の３Ｈの取り込み量を測定した。結果を図７に示す。図７及び図８において黒四角はＲ細胞、黒三角はＮ６２．５細胞、黒菱形はＲＣＣＭ細胞、黒丸はＰ１８５をそれぞれ示す。図７は、ＬＹ２９４００２に対する各細胞の反応を示すグラフ、図８は、Rottlerinに対する各細胞の反応を示すグラフである。【００５４】
図７に示されるように、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＬＹ２９４００２に対して、ＲＣＣＭ細胞は、他の２株よりも低濃度で増殖が抑制され、Ｒ細胞及びＮ６２．５細胞はほぼ同様の反応性を示した。このことは、ＬＹ２９４００２が慢性アレルギー疾患の関連物質であることを示唆している。
これに対して、図８に示されるように、ＰＫＣ阻害剤であるＲｏｔｔｌｅｒｉｎに対しては、好塩基球系細胞株Ｐ８１５に対する増殖抑制よりも急激に、本発明にかかる３細胞株の増殖が抑制されるものの、ＲＣＣＭ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲ細胞はいずれも、同様の反応性を示していた。
このように、増殖関連物質としての阻害剤であっても、アレルギー疾患に対する反応性に違いがあり、本発明にかかる細胞株を組み合わせて用いることによって、アレルギー関連物質を更に分類することができる。【００５５】
本発明によれば、ＲＣＣＭ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲ細胞の３つの細胞株を用いることによって、これらの細胞株の増殖能に対する反応性の違いから、アレルギー疾患関連物質、例えばＰＭＡのように増殖抑制物質のスクリーニングにも適用することができる。【００５６】
なお、本実施例では、３Ｈ−チミジンの取込量に基づく増殖速度に基づいてアレルギー疾患関連物質のスクリーニングを行ったが、これに限定されない。
例えば、候補物質と接触させた前後の各種細胞の遺伝子発現のパターンを、サブトラクション法などを用いて確認する。このとき、各細胞の一部又は全遺伝子をマイクロアレイなどに固定させ、蛍光検出薬等を用いて接触後の遺伝子の発現パターンを確認する。これにより、遺伝子発現の有無に基づいて候補物質をスクリーニングすることができる。【００５７】
本実施例で示されるように、本発明にかかるＲ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞は、アレルギー性サイトカインに対する反応性が異なるので、アレルギー疾患関連物質のスクリーニングのための効果的なパネルとして使用することができる。
従って、本発明によればアレルギー疾患関連物質のスクリーニングを効率よく行うことができる。
【図１】
2008059900.tif 000004
【図２】
2008059900.tif 000005
【図３】
2008059900.tif 000006
【図４】
2008059900.tif 000007
【図５】
2008059900.tif 000008
【図６】
2008059900.tif 000009
【図７】
2008059900.tif 000010
【図８】
2008059900.tif 000011
【配列表】
2008059900000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年9月10日(2008.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同一のＤＯ１１．１０  Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニックマウス脾臓組織細胞を、抗原ペプチド存在下で培養して誘導した好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であって、アレルギー性サイトカインに対して異なる感受性を有する複数の細胞株に対する反応性に基づいて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むアレルギー疾患関連分子のスクリーニング方法。
【請求項２】
Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも２つの好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株に対する反応性に基づいて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むアレルギー疾患関連分子のスクリーニング方法。
【請求項３】
Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも１つの好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を用いて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むアレルギー疾患関連分子のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記細胞株と前記候補物質とを接触させる工程と、
前記接触後の前記細胞株の反応に基づいて候補物質を選別する工程と、
を含む請求項２又は請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記選別工程が、スクリーニングに用いられた複数の細胞株間で反応が異なる候補物質を選別するものである請求項４記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
競合用化合物の存在下で行われる請求項２〜請求項４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記候補物質が、サイトカイン感受性調整機能を有する化合物のための候補物質である請求項２〜請求項４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記選別が、細胞形態及び細胞活性上の変化、細胞内シグナル伝達に関与する分子の生化学的変化、及び、細胞の遺伝子制御上の変化の少なくともいずれか１つに基づいて行われる請求項２〜請求項４のいずれか１項記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）。
【請求項１０】
ＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）。
【請求項１１】
Ｒ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８）、Ｎ６２．５細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９）及びＲＣＣＭ細胞（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０）からなる群より選択された少なくとも２つで構成され、アレルギー疾患関連化合物をスクリーニングするために用いられる細胞セット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
［図４］本発明の実施例にかかるＲ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞の各種濃度のＩＬ−４含有培地に対する増殖反応を示すグラフである。
［図５］本発明の実施例にかかるＲ細胞、Ｎ６２．５細胞及びＲＣＣＭ細胞の各種濃度のＩＬ−３＋ＩＬ−４含有培地に対する増殖反応を示すグラフである。
［図６］本発明の実施例にかかる各細胞株のＰＭＡに対する増殖反応を示すグラフである。
［図７］本発明の実施例にかかる各細胞株のＬＹ２９４００２に対する増殖反応を示すグラフである。
［図８］本発明の実施例にかかる各細胞株のＲｏｔｔｌｅｒｉｎに対する増殖反応を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
［００１２］
本発明のスクリーニング方法は、同一の脾臓組織に由来する好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であって、アレルギー性サイトカインに対して異なる感受性を有する複数の細胞株に対する反応性に基づいて、候補物質からアレルギー疾患関連物質をスクリーニングすることを含むアレルギー疾患関連分子のスクリーニング方法である。
［００１３］
本細胞株は、好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株であるので、アレルギー疾患関連物資に対する感受性を有するものである。ここで「好塩基球様ないしマスト細胞様である」とは、光学又は電子顕微鏡観察による形態観察や、細胞表面抗原によって判断することができる。例えば、好塩基球様の形態としては、顆粒密度の低い嚢胞状構造やトルイジンブルー（ＴＢ）染色では染まらない点を挙げることができ、一方、マスト細胞様の形態としては、ｃ−ｋｉｔ、ＦｃεＲＩαが共に陽性という細胞表面分子の特徴を挙げることができる。
［００１４］
このような細胞株としては、具体的には、脾臓細胞を卵白アルブミン（ＯＶＡ抗原）ペプチドで長期間にわたり培養中に出現してきた好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株、更には、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスの脾臓細胞からＯＶＡ抗原を用いて誘導した好塩基球様ないしマスト細胞様細胞株を挙げることができる。本好塩基球様ないしマスト細胞様細胞
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
株を得るため、ＯＶＡ抗原ペプチドの３２３番目−３３９番目のアミノ酸残基を用いることができる。
［００１５］
本発明における上記細胞株としては、Ｒ細胞（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６  独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１８、２００５年９月１日付で受託）、Ｎ６２．５細胞（同特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９１９、２００６年１１月１６日付で受託）及びＲＣＣＭ細胞（同特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０９２０、２００６年１１月１６日付で受託）を挙げることができる。
［００１６］
これらの細胞は、上記ＯＶＡ抗原存在下での長期培養中の培養脾臓細胞からＴ細胞を除去することで単離し、次いで、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞株の培養上清（Ｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＲＣＧＦ）を様々な濃度で使用しながら、さらに長期継代することで得られた。このＲＣＧＦは、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞株を、抗Ｔ細胞受容体抗体を架橋することによって刺激して得られた培養上清である。
従ってこれらの細胞株は、サイトカインに対する細胞の持つ感受性を除いては、同一か極めて類似の性質を有する細胞である。このため、アレルギー性炎症局所で予想される異なったサイトカイン環境で、好塩基球やマスト細胞の増殖を制御する分子のスクリーニングに適していると考えられる。
［００１７］
Ｒ細胞及びＮ６２．５細胞の維持条件としては、ＯＶＡ抗原ペプチド刺激Ｔ細胞との共培養を挙げることができる。
共培養に用いられるＴ細胞は、表面マーカーＣＤ４＋ＣＤ８−のヘルパーＴ細胞であればよい。このＴ細胞の起源としては、哺乳類、特に齧歯類を挙げることができ、好ましくはマウス、特に好ましくは、Ｒ細胞及びＮ６２．５細胞と同一の遺伝的系統を有するマウスである。この共培養に用いられるＴ細胞は、上記条件のものであればいずれのものであってもよいが、Ｒ細胞及びＮ６２．５細胞を確立するために使用した親細胞であり、ＤＯ１１．１０  ＴＣＲトランスジェニックマウスの脾臓細胞中のＴ細胞（以下、同系Ｔ細胞という）であることが特に好ましい。
共培養中でのＯＶＡ抗原ペプチドの濃度は、１００ｎＭ〜１０００ｎＭとすることができ、２５０〜１０００ｎＭであることが好ましい。
［００１８］
またＲ細胞及びＮ６２．５細胞の成育は、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞株の培養上清を含む培
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
またこの慢性アレルギー疾患に特に関連し得る物質として選別された化合物が、ＩＬ−３を競合用化合物として存在する培養系を用いた同様のスクリーニングにおいて、ＲＣＣＭ細胞の増殖抑制活性を示さない場合には、この化合物をＩＬ−３分子に関連しうる物質として更に選別することができる。
細胞株の組み合わせについては、目的とする候補物質のスクリーニングに応じて適宜選択すればよい。
［００３８］
このようにサイトカイン感受性に基づいてスクリーニングされる物質は、サイトカイン感受性を調整する機能を有する可能性がある。従って、本発明のスクリーニング方法のスクリーニング対象となる候補物質は、サイトカイン感受性調整機能を有する化合物のための候補物質であることが好ましい。
［００３９］
スクリーニング可能なアレルギー疾患としては、アレルゲンの生体内へ侵入に惹起されたＴ細胞の活性化によってアレルギー性サイトカインが放出し、アレルギー反応のエフェクター細胞（マスト細胞、好塩基球など）の増殖や炎症メディエータの放出が引き起こされると考えられているものであればよく、アトピー性皮膚炎、気管支喘息等を挙げることができ、慢性化（難治化）の疾患を特に挙げることができる。
実施例
［００４０］
以下に本発明の実施例についで説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。
［００４１］
実施例１
細胞株の作製
１０週齢のメスＤＯ１１．１０  ＴＣＲトランスジェニックマウス（米国ワシントン大学、Ｋｅｎ  Ｍｕｒｐｈｙ教授より供与）から脾臓を摘出し、この脾臓細胞を、ＲＰＭＩ培地（１０容量％ＦＣＳ、ペニシリンＧカリウム１００Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ添加：以下、単に１０％血清含有培地という）にＯＶＡ抗原ペプチド（ニワトリＯＶＡ（ｃＯＶＡ）３２３−３３９ペプチド：ＩＳＱＡＶＨＡＡＨＡＥＩＮＥＡＧＲ：配列番号１）を１０００ｎＭ又は２５０ｍＭの最終濃度となるように添加した培養条件下で培養した。
得られた培養物から、ＯＶＡ抗原ペプチド反応性を示すＴ細胞を得た。このＴ細胞を抗ＣＤ３抗体によって２４時間３７℃で刺激しながら培養して、培養上清（Ｒ細胞増殖
【国際調査報告】
2008059900.tif 000012
2008059900.tif 000013
2008059900.tif 000014
2008059900.tif 000015