(57)【要約】【解決手段】  所定温度のヒータに接触させ、反応液の核酸増幅反応を促進するための反応液用容器であって、表面と裏面とを有し、前記いずれかの面もしくはその両面がヒータに対向した状態に保持されるように構成された基板と、この基板の面方向に互いに離間、独立して設けられ、それぞれに前記反応液を保持し液密に密閉されるウエルと、を有し、  前記ウエルは、前記基板に設けられた開口部と、この開口部の基板表面側および裏面側を閉塞する閉塞部材とからなり、少なくとも前記ヒータと接する側の面を閉塞する閉塞部材は厚さ１０〜３００μｍの伸縮性フィルム部分を有するものであることを特徴とする反応液用容器が提供される。【選択図】      図１０
2008146754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応液が収容された反応部を有する容器において、この反応液に所定の熱サイクルを与えてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）若しくはＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）等の熱サイクル反応を促進するための反応促進装置であって、
前記容器の反応部に対向するように配置され、前記容器に収容された反応液を所定熱サイクル時間内に高温側の目標温度、中温の目標温度、及び低温側の目標温度に温調して前記熱サイクルを与える熱サイクルヒータと、
前記熱サイクルヒータの温度を、高温側を前記高温側の目標温度より所定の温度差以上に乖離させ、および低温側を前記低温側の目標温度より所定の温度差以下に乖離させるように制御する温度制御部と
を有することを特徴とする反応促進装置。
【請求項２】
請求項１記載の反応促進装置において、
前記乖離温度が次式
Ｙ＝５，０００Ｘ３−９００Ｘ２＋５０Ｘ＋２．８・・・・・・・・・・（ａ）
Ｘ＝反応液の深さ（ｍｍ）×容器伝熱面の厚さ（ｍｍ）
（容器伝熱面とは、容器平板部で固体熱源と接する表面と反応液とに挟まれた膜状部分である）
で表される温度差以上となるよう制御することを特徴とする反応促進装置。
【請求項３】
請求項１記載の反応促進装置において、
前記熱サイクルヒータは、高温部、中温部、低温部を有し、
この熱サイクルヒータと前記容器との相対位置を変位させることによって、前記反応部に保持された反応液に所定の熱サイクルを与える駆動部を有するものであり、
この駆動部は、前記所定の熱サイクル時間に相関させて、前記容器と前記ヒータとの対向時間を制御するものである
ことを特徴とする反応促進装置。
【請求項４】
請求項３記載の反応促進装置において、
前記高温部、中温部、低温部は周方向に配置され、
前記駆動部は、前記容器と前記ヒータとの相対位置が回転円周方向に変位するように容器若しくはヒータを駆動するものである
ことを特徴とする反応促進装置。
【請求項５】
請求項４記載の反応促進装置において、
前記駆動部は、前記熱サイクルヒータと反応容器とを互いに接触させた状態で間欠的に相対変位させ、上記容器に収容された反応液が前記熱サイクルヒータの高温部、中温部、低温部にそれぞれ所定時間滞留させるものである
ことを特徴とする反応促進装置。
【請求項６】
請求項５記載の反応促進装置において、
前記制御部は、前記容器上の特定の部分が前記熱サイクルヒータの前記低温部に対向するまでの速度と、低温部から中温部に対向するまでの速度と、次いで中温部から出るまでの速度とを調整することで、少なくとも前記特定の部分に印加される低温と中温とに関する熱履歴を一定にすることを特徴とする反応促進装置。
【請求項７】
請求項４記載の反応促進装置において、
前記駆動部は、前記熱サイクルヒータと反応容器とを互いに接触させた状態で連続的に相対変位させることを特徴とする反応促進装置。
【請求項８】
請求項３記載の反応促進装置において、
前記高温部、中温部、低温部は直線方向に沿って配置され、
前記駆動部は、前記容器と前記ヒータとの相対位置が直線方向に変位するように容器若しくはヒータを駆動するものである
ことを特徴とする反応促進装置。
【請求項９】
請求項３記載の反応促進装置において、
前記制御部は、前記熱サイクルヒータと反応容器とを変位させる際、上記サイクルヒータを反応容器とを離間させ離間させた状態で変位させたあと、上記サイクルヒータと反応容器とを接触させるよう駆動することを特徴とする反応容器促進装置。
【請求項１０】
請求項１記載の反応促進装置において、この装置は、更に
前記反応進行の良否を、反応液の光学的変化で読み取るための、光学的検出装置を有するものであり、
前記容器は、複数の反応液の光学的干渉を防ぐために、少なくとも一部が遮光性材料で形成され、又は遮光着色されていることを特徴とする反応促進装置。
【請求項１１】
請求項１０記載の反応促進装置において、
前記容器には、当該容器を圧迫する部材として光学的に透明な圧迫部材が用いられ、この透明な圧迫部材を通して光学測定を行うことを特徴とする反応促進装置。
【請求項１２】
請求項１記載の反応促進装置において、
容器平板部を表面と裏面とから圧迫する装置を有し、
その圧迫装置構造の少なくとも片側は固体熱源であって
前記平板部の反応部の少なくとも片側は厚さ１０〜４００μｍのフィルム状伝熱面となっており、
前記固体熱源と前記フィルム状伝熱面とを対向させ前記圧迫装置にて接触させることで加熱し、前記反応部の内圧上昇によってフィルム状伝熱面が膨張することで、前記容器と前記熱源との安定的な接触を確保することを特徴とする反応促進装置。
【請求項１３】
請求項１記載の反応促進装置において、
前記容器は、平板部を有し、その平板部に凹部が設けられ、当該凹部に水溶液である反応液を入れた後に当該凹部をシールすることで反応液を密封して反応に必要な温度に対応する温度に設定した固体熱源と前記平板部とを接触させて熱反応である核酸増幅反応を行う反応容器であって、
前記凹部上端面に少なくとも一つの周状の段差を設け、この周状の段差部分と、シール部材下面を共に疎水性にすることで、安定的に核酸増幅反応を行うようにしたことを特徴とする反応促進装置。
【請求項１４】
請求項１記載の反応促進装置において、
反応部に反応液を加圧導入するために、
前記容器は、更に、開放端を有する液入れ用空隙を有し、前記反応部と容器内部において送液用溝状空隙で連結されており、
液入れ用空隙の開放端から反応液を入れたのち、送液用溝状空隙を通じて反応液を反応用空隙に送った後に、開放端を密封栓にて密封し、
反応中に前記密封栓が外れないよう密封栓に圧力を掛けた状態で反応が行われるように圧迫する機構を有する
ことを特徴とする反応促進装置。
【請求項１５】
請求項１４記載の反応促進装置において、
前記密封栓は、当該密封栓側面部の中位部から下位部にかけて空気溝を有するものである
ことを特徴とする反応促進装置。
【請求項１６】
請求項１４記載の反応促進装置において、
前記容器には、
前記反応部に連結された大気開放用溝状空隙と、
封止用液を流すための封止液が満たされる封止液用空隙と、
封止液用空隙と前記大気開放用溝状空隙及び前記液入れ用空隙とを連結する溝状空隙と
が設けられ、
前記液入れ用空隙から反応用空隙に反応液を送った後に、封止液が入った空隙から封止液を送ることにより反応用空隙の液入れ用空隙側の溝状空隙と、大気開放側の溝状空隙との両方に、封止液が入るように構成されている
ことを特徴とする反応促進装置。
【請求項１７】
請求項１６記載の反応促進装置において、
前記封止液は、シリコングリースを含むグリース状高粘度液、あるいはＵＶ硬化性樹脂若しくは熱硬化性樹脂から成るものである
ことを特徴とする反応促進装置。
【請求項１８】
請求項１記載の反応促進装置において、
平板部内の反応液を収容する部分が流路状をなし、反応液を流しながら核酸増幅を行うフロー型核酸増幅反応を行うための装置であって
反応液を送る速度を制御する為の送液制御装置を更に有する事を特徴とする反応促進装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学や酵素工学などの生物学的分野で用いられ、温度管理を必要とする生物学的反応を促進するための反応用容器およびそれを用いた反応促進装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
１９８３年にＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応）という画期的な遺伝子分析技術が発明され、それを用いることでヒトゲノム計画も完了した。しかしながら、遺伝子分析技術は、実用的速度と実用的安定性の面で未だ研究室のレベルにあり、これら実用的速度と実用的安定性を向上させて臨床や生産の現場に適用することが求められている。【０００３】
例えば、前述したＰＣＲ法は、目標とする特定のＤＮＡ領域を短時間で１０万倍以上に増幅することができる技術であるが、それでも数十分はかかり、臨床現場の「数分」というニーズには程遠い。実用的安定性という観点からも、核酸増幅を行うための加熱工程において、熱の伝達にばらつきがあるなどの原因で、時々増幅に失敗することもある。研究用分析であれば、失敗したらやり直せば良いが、実用を考えた場合には避けてはとおれない問題である。すなわち、しかしこの核酸増幅速度が遅いことと増幅安定性の欠如は、現場普及にとっては、大きな足かせになっている。【０００４】
まず、核酸増幅速度の問題について考える。【０００５】
例えば、一般に、このＰＣＲ法が医療の現場で利用できるためには、『救急診断分野で必要とされる３００ｂｐ（次項で説明）前後の核酸を安定的に５分以下で安定して増幅する技術』が要求される。核酸の増幅と同定が５分程度で安定して出来るようになると、緊急性を要する救急医療の現場では多くの人の生命を救うことが可能となるし、手術中に核酸による病理診断を行う事も可能となり、防疫現場では感染症の広がりを現場で防ぐことも可能となる。【０００６】
ここで、核酸による診断法は、「核酸増幅工程」と「増幅核酸の同定工程」とからなる。核酸増幅とは核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）を、熱サイクル反応か等温反応で数百万倍に増やす技術で、量を増すことで分析が可能となるという重要な技術である。分析対象の核酸は数個から数十万個の塩基のつながりであり、診断等に使うためには、その長い核酸の特徴的な一部を複製して核酸増幅する。複製する長さは、目的にもよるが１００〜３００塩基がつながった核酸（１００〜３００ｂｐという）を使うのが一般的である。【０００７】
従来技術の文献などを記述する前に、理解のため、核酸増幅の形態にポイントを置いた分類を図１に示した。【０００８】
この図に示すように、核酸増幅法１は、栄研化学のＬＡＭＰ法などの「等温増幅法」２と、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）やＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）などの高温熱乖離を伴う「熱サイクル増幅法」３とに分けられる。【０００９】
「等温増幅法」は、一定温度で酵素反応だけを行うものであり、理論上、現時点の技術よりも高速化を図ることは困難である。「熱サイクル増幅法」は、反応液に熱サイクルを与えて核酸増幅反応を促進するものであり、必要時間の大半が温度の上げ下げに費やされていることから、昇温や冷却の効率改善によって高速化できる余地が大きい。また、動作安定化という見地からは、いずれも熱反応であることから、熱源と反応容器との安定的接触が安定性の鍵となる。したがって、以下、熱サイクル増幅法について詳しく説明する。【００１０】
「熱サイクル増幅法」には、ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、その他の方法があるが、それらのうち、代表格であるＰＣＲ法について説明する。【００１１】
このＰＣＲ法では、複製開始点と複製終了点を決めるプライマーと鋳型ＤＮＡとＤＮＡ伸長酵素（ポリメラーゼ）の混合された反応液を用意し、５５℃前後の温度（以下「低温」という）でプライマーと鋳型ＤＮＡの２重螺旋を形成する。続いて７５℃前後の温度（「中間温度」という）でポリメラーゼにより開始点から終了点まで複製ＤＮＡが伸びて複製ＤＮＡを作る。更に９５℃前後（以下「高温」と記す）まで加熱して複製ＤＮＡの２重鎖を乖離し１本鎖ＤＮＡにする。この低温、中間温度、高温を１熱サイクルとして３０回程度繰り返すと、理論上２の３０乗近くの複製ＤＮＡを作ることができる。【００１２】
「熱サイクル増幅法」３はその実行形態に応じて「静止型」４と「フロー型」５とに区分される。フロー型とは反応容器内に保持した反応液を流路内で移動させることで異なる温度の熱領域を通過させて熱サイクルを与えるものである。反応液を容器内に流すことからフロー型と称される。一方、静止型とは、反応液ではなく反応容器を熱源に対して相対的に移動させることでその反応液に熱サイクルを与えるものである。反応容器中で反応液を移動させないことから静止型と称される。【００１３】
また、「静止型」４は更に、反応槽が大気に対して開放されているかどうかで「開放型」６と「密閉型」７とに分かれる。熱サイクル増幅法では９０℃以上で２本鎖ＤＮＡを熱で乖離させる工程があり、この時水分が蒸発し「開放型」では液濃度が変ってしまい安定性に致命的欠点がある。このことから「開放型」は現場実用性に問題があり、臨床診断分野では「密閉型」が最適であると思われる。【００１４】
上述したように、臨床応用には、高速化とその上での安定性が求められる。そこで高速化を中心に、既存技術を示したのが図２である。【００１５】
この図２は、核酸増幅の市販装置Ａ〜Ｆと、その加熱方式および速度を表にまとめたものである。また、装置Ａ〜Ｆの位置づけを熱源方式と反応時間で表したものを図３として示した。【００１６】
ＰＣＲ法は核酸増幅の世界標準とさえ言える技術であり、核酸増幅の歴史はＰＣＲ法の歴史と言っても過言ではない。代表的ＰＣＲ装置として、容器を「固体熱源」の上に置き熱源の温度を上下させる方式であるが、熱源自体の温度上下に一定の時間を要し高速化のネックとなっていた。例えばＡは、一般に高速機と称されているが、それでも１時間かかっている。【００１７】
一方、熱容量の小さい「気体熱源」を用いれば熱源自体の温度上下時間は事実上無視できることから、「気体熱源」によるＰＣＲ装置がその後高速化研究の中心となった。その結果同表の装置Ｂ〜Ｄが開発され、ＰＣＲの高速化が数十分台へと進んだ。更にＣ，Ｅなどで高速化は１０分近くまで進んだが、臨床診断市場が真に求める「５分」以下には到達せず、「高速性」と「安定性」の他に「安価」、「操作性」も求められ、単に熱源だけの改良では不十分で、熱源・容器・制御・酵素などＰＣＲに関する要素全ての総合的改良が必要な時代となった。【００１８】
最近になって速度という面だけでは米国特許第６４７２１８６号（文献１）に示す様に高圧のヘリウムや炭酸ガスを用いる高速機が提案されている。しかし、高圧のヘリウムや炭酸ガスを利用することから救急診断分野での実用という面からは、安定性だけでなく簡便性と価格の面からも問題が多い。なお、同じく「気体熱源」を使う装置Ｂ（特許第３１３６１２９号公報：文献２）及び装置Ｄ（特表第２０００−５１１４３５号公報：文献３）は、いずれもガラス細管（キャピラリ）を用いて高速化を図ろうとしているが、５分以下には対応できていない。【００１９】
一方、固体熱源・フロー型の装置としての装置Ｅ（米国特許第６７８０６１７号：文献４）がある。この例はＰＣＲに必要な３温度に設定された固定熱源を用意し、チューブ状容器の反応液を複数のピストンで往復移動させるものである。このことで、上記反応液に熱サイクルを与えるものであるが、この方法は構造が複雑な上に、その構造上、速度の向上は期待できない。【００２０】
固体熱源・静止型は、固体熱源・フロー型と異なり、反応液を反応容器内で移動させるのではなく、反応容器と熱源との相対位置を移動させて反応液に熱サイクルを与えるものである。この形式の中で、装置Ｆ（特表第２００４−５０４８２８号公報：文献５）は、円盤周辺部の反応チャンバー下面に熱源を順次接触させることでＰＣＲを行うものである。ただし、この文献５においては、本発明が目指すような高速化については全く検討が行われていない。【００２１】
特開第２００６−１１５７４２号公報（文献６）は、微細溝を有するシリコンゴム板とガラス板を組み合わせて形成した流路に反応液を供給した後ＰＣＲに必要な温度に設定した３組の固定熱源の間を水平に往復させ、１組の熱源の間に容器が来た時に、両面から熱源で挟むことでＰＣＲを行う技術が開示されている。この技術においては、反応液が満たされる反応槽が大気に開放されているので、気化した水蒸気の流出を押さえることが出来ず、反応の安定性について問題がある。更に文献６によれば２００塩基の３０サイクル増幅に１０分を要しており、高速性についても市場ニーズに到達していない。【００２２】
以下に、上記で示した文献を示す。【００２３】
【特許文献１】米国特許第６，４７２，１８６号公報
【特許文献２】特許第３１３６１２９号公報
【特許文献３】特表第２００５−５１１４３５号公報
【特許文献４】米国特許第６，７８０，６１７号公報
【特許文献５】特表第２００４−５０４８２８号公報
【特許文献６】特開第２００６−１１５７４２号公報  以上説明したように、従来の装置は、いずれも臨床の現場等で実用的に核酸増幅を行うための条件、すなわち高速化と安定化の上で様々な課題があり、いずれも実用化には至っていない。
【００２４】
したがって、未だ、現場での利用に耐えうる反応促進を行える装置に対する要求が強い。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２５】
この発明は上述のような事情に鑑みてなされたものであり、その第１の主要な観点によれば、所定温度のヒータに接触させ、反応液の核酸増幅反応を促進するための反応液用容器であって、表面と裏面とを有し、前記いずれかの面もしくはその両面がヒータに対向した状態に保持されるように構成された基板と、この基板の面方向に互いに離間、独立して設けられ、それぞれに前記反応液を保持し液密に密閉されるウエルと、を有し、
前記ウエルは、前記基板に設けられた開口部と、この開口部の基板表面側および裏面側を閉塞する閉塞部材とからなり、少なくとも前記ヒータと接する側の面を閉塞する閉塞部材は厚さ４００μｍの伸縮性フィルム部分を有するものであることを特徴とする反応液用容器が提供される。【００２６】
このような構成によれば、反応液を収容するウエルの少なくともヒータと接する側の面を閉塞する閉塞部材は厚さ１０〜４００μｍの伸縮性フィルムであるから、前記ヒータの加熱により、密閉されたウエル内の空気が膨張することによって上記フィルムが伸長し、このフィルムがヒータに押し付けられることになる。このことによりウエル内への伝熱効率が高まるから、反応液の加熱および冷却速度を早くすることができる。これにより、反応液に与える熱サイクルを短縮することが可能になる。このことで、５分以下の熱サイクルの実現が可能になる。【００２７】
また、伸縮フィルムがヒータに密着することになるから、熱伝導における安定性が高まり、反応液の熱サイクルが失敗する可能性が低くなる。【００２８】
さらにこの方法は、基板上に存在するウエルの数が増えると更に実用的効果が大きくなり、単独のウエルに対する伝熱効率のアップだけでなく、多数のウエルに均一な熱を与える上での伝熱安定性についても顕著な効果がある。【００２９】
なお、１の実施形態によれば、前記フィルム部分は、オレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリウレタン樹脂、シリコン系樹脂、又はフッ素系樹脂である。【００３０】
別の１の実施形態によれば、また前記フィルム部分を含む閉塞部材は、前記基板に貼り付けられたフィルム状部材である。【００３１】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記基板は、前記ウエルを構成する前記開口部とフィルム部分を含む閉塞部材とが一体形成されてなる伸縮性樹脂材料と、この伸縮性樹脂材料に固定され、前記伸縮性材料の面方向への膨張を規制するリジット部材と材料とを有するものである。【００３２】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記ウエルは、反応時、内圧が大気圧より高くなるように構成されている。【００３３】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記核酸増幅反応は、等温核酸増幅反応である。【００３４】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）若しくはＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）を含む熱サイクル反応である。ここで、前記基板は、前記ヒータとの相対位置が変位するように保持されるものであり、それによりウエルに保持された反応液に熱サイクルが与えられるものであることが好ましい。さらにこの場合、前記基板は、前記ヒータとの相対位置が回転円周方向に変位するように保持されるものであり、前記ウエルは、前記基板の回転中心周りに形成されていることがさらに好ましい。【００３５】
また、前記基板は、前記ヒータとの相対位置が直線方向に変位するように保持されるものであり、前記ウエルは、直線方向に沿って互いに離間して形成されているものであってもよい。【００３６】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記ウエルは、さらに各ウエル間の光学的干渉を阻害するように構成されている。この場合、前記基板は少なくとも一部が遮光性材料で形成されるか遮光着色されていることが好ましい。前記基板の表面もしくは裏面のいずれか一方の面に金属反射膜を有するものであってもよい。【００３７】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記ウエルの開口部に反応液を入れた後、いずれか一方の閉塞部材を基板に張り付けることによりこのウエルの開口部を液密に密閉する構成であり、前記開口部内壁の上記一方の閉塞部材の近位部、前記閉塞部材の前記開口部に対向する面のいずれか一方もしくは両方が疎水性であることを特徴とする反応液用容器が提供される。【００３８】
この発明の第２の主要な側面によれば、所定温度に加熱されるヒータを具備し、反応液用容器に形成された独立ウエルに保持された反応液を加熱することで、この反応液の核酸増幅反応を促進するための反応促進装置であって、前記ウエルは、基板に設けられた開口部と、この開口部の基板表面側および裏面側を閉塞する閉塞部材とからなり、少なくとも前記ヒータと接する側の面を閉塞する閉塞部材は厚さ１０〜４００μｍの伸縮性フィルム部分を有するものであり、この反応促進装置は、前記ヒータを加熱することでウエル内を加熱し、これによる膨張により伸縮性フィルムをヒータに密着させるように制御されるものであることを特徴とする反応促進装置が提供される。【００３９】
この発明の第３の主要な側面によれば、所定温度に加熱されるヒータで、反応液用容器に形成された独立ウエルに保持された反応液を加熱することで、この反応液の核酸増幅反応を促進するための反応促進方法であって、前記ウエルは、基板に設けられた開口部と、この開口部の基板表面側および裏面側を閉塞する閉塞部材とからなり、少なくとも前記ヒータと接する側の面を閉塞する閉塞部材は厚さ１０〜４００μｍの伸縮性フィルム部分を有するものであり、この方法は、所定の温度以下で独立ウエル内に反応液を封入する工程と、前記ヒータを加熱することでウエル内を前記所定の温度以上に加熱し、これによる膨張により伸縮性フィルムをヒータに密着させるようにする工程とを有することを特徴とする反応促進方法が提供される。【００４０】
この発明の第４の側面によれば、反応容器を構成する基板には、液入れ用空隙と、この液入れ用空隙と前記各ウエルとを連結する複数の連結通路とが設けられ、この空隙に反応液が前記連結通路を通して前記ウエルに移送されるように構成されていることを特徴とする反応液用容器が提供される。【００４１】
この場合、前記複数の連結通路は、少なくともそのうちの１つが他の通路よりも浅く形成され、その浅い連結通路はウエルに反応液を移送する際に空気抜きとして利用されることが好ましい。【００４２】
また、前記基板には大気開放孔が形成され、この大気解放孔と前記ウエルとを連結する連結溝が形成されているものであってもよい。【００４３】
この液入れ用空隙や大気開放孔を密閉するための栓には、栓を挿入する際の容器内の空気を大気に逃がし、栓が完全に挿入された場合には密閉できるようにするための溝がシール面（側面部）の一部に形成されていることが好ましい。【００４４】
前記基板には、前記ウエルに連結された大気開放用溝状空隙と、封止用液を流すための封止液が満たされる封止液用空隙と、封止液用空隙と前記大気開放用溝状空隙及び前記液入れ用空隙とを連結する溝状空隙とが設けられ、前記液入れ用空隙から反応用空隙に反応液を送った後に、封止液が入った空隙から封止液を送ることにより反応用空隙の液入れ用空隙側の溝状空隙と、大気開放側の溝状空隙の両方に、封止液を入れるように構成されているものであってもよい。【００４５】
また、上記の場合、前記封止液は、シリコングリースを含むグリース状高粘度液、あるいはＵＶ硬化性樹脂若しくは熱硬化性樹脂であることが好ましい。【００４６】
さらに、上記反応液用容器において、前記ウエルは流路状であり、この流路状ウエルの一方が反応液を流し込む入り口となっており、他方が大気に開放されているか、大気圧より高く保持されており、前記反応液を流し込む入口から反応液を流しつづけることで反応時の前記ウエルの内圧が大気圧より高くするようになっていてもよい。【００４７】
また、前記反応は核酸増幅であり、核酸増幅に続いて電気泳導が行われるものであるものであってもよい。【００４８】
前記流路状のウエルには、RNAを逆転写させる温度に設定されるヒータに対向させられる部分と、引き続き逆転写酵素を熱により失活する温度に設定されたヒータに対向させられる部分と、その後に核酸増幅反応に対応する温度に設定されたヒータに対向させられる部分とを有するものであってもよい。【００４９】
この発明の第５の主要な側面によれば、反応液用容器を用いて反応液の反応を促進する反応促進装置であって、前記核酸増幅が終わった部分の流路状ウエルの終端とその手前の１ケ所の合わせて２ケ所に電気泳導の電圧を掛けられる電極が配設され、前記流路状ウエルの電極の間の部分と交差する新たな流路が配設され、この新たな流路の両端に開放端を設け、それぞれの開放端にも電気泳導の電圧を掛けられる電極を配置してなり、核酸増幅が進行し、流路の終端まで反応液が到着した時に、送液を停止し、前記の新たな流路の開放端から電気泳導用ゲルを流し、他の開放端にゲルが現れるまで送って停止し、次に、前記流路の終端とその手前の１ケ所の間に電圧を掛け、その後前記新たな流路に電圧を掛けるように構成されたことを特徴とする反応液用容器が提供される。【００５０】
１の実施形態によれば、前記基板を挟むペルチェ素子と透明部材とを有し、前記ペルチェ素子を熱サイクルによる核酸増幅反応に対応する温度に制御することで反応液の核酸増幅反応を促進するように構成され、前記光学測定装置は、上記透明部材を通して反応液に光を照射し、発生した光学的変化を測定するようになっている。【００５１】
この発明の第６の主要な側面によれば、平板部を有する容器の平板部に凹部を設け、凹部に水溶液である反応液を入れた後に凹部をシールすることで反応液を密封し反応に必要な温度に対応する温度に設定した固体熱源と平板部とを接触させて熱反応である核酸増幅反応を行う反応容器において、凹部上端面に少なくとも一つの周状の段差を設け、この周状の段差部分と、シール部材下面を共に疎水性にすることで、反応液の表面張力によりシール部への反応液の進入を防ぐことで安定的に核酸増幅反応を行うようにしたことを特徴とする反応容器が提供される。【００５２】
１の実施形態によれば、前記核酸増幅反応は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）若しくはＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）等の熱サイクルを要する核酸増幅反応である。この場合、核酸増幅反応が、エマルジョン状態で行う反応であるものが好ましい。【００５３】
他の１の実施形態によれば、前記核酸増幅反応は、ＬＡＭＰ法等の等温核酸増幅反応である。【００５４】
別の１の実施形態によれば、前記容器は、反応用空隙で逆転写反応を行い、続いて逆転写酵素を失活させる温度に加熱して逆転写酵素を失活させ、核酸増幅を行う事を特徴とするものである。【００５５】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記容器は、容器が回転中心を有し、反応用空隙がある平板部が円周上にあって、前記回転中心に対する半径方向及び周方向に亘って互いに隔離・独立して設けられた複数の反応用空隙がある事を特徴とするものである。【００５６】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記容器は、容器が回転中心を有し、反応用空隙がある平板部が円周状にあって、円周状平板部の全面に反応用空隙が配置されている事を特徴とするものである。【００５７】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記容器は、容器平板部の反応用空隙の少なくとも片側が１０〜４００μｍのフィルム状であることを特徴とするものである。【００５８】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記容器は、容器平板部を遮光性材料で作るか、反応用空隙の周囲の壁面を金属膜でコーテイングするかいずれかの方法で隣接する反応用空隙の光の影響から遮断することを特徴とするものである。【００５９】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記容器は、容器平板部の反応用空隙に入射した光を反射させる金属膜を有することを特徴とするものである。【００６０】
この発明の第７の主要な側面によれば、前記反応容器を用いる熱サイクル反応を行う装置において、反応容器を回転させる機構と熱サイクル反応に対応した、複数の固体熱源が存在し、前記固体熱源を、熱サイクル反応に対応した、複数の温度に調節する制御装置が存在し、少なくとも片側が前記熱源であるブロックで容器平板部を両側から押さえる機構を有し、前記回転機構と容器平板部を両側から押さえる前記機構とを制御して、平板部を熱サイクルに必要な温度に調節した前記熱源に順次接触されることを繰り返すことで、容器平板部内の反応用空隙内の反応液を、熱反応に必要な温度に、また熱反応に必要な時間にコントロールして目的の熱サイクルを伴う核酸増幅を行うことを特徴とする核酸増幅装置が提供される。【００６１】
１の実施形態によれば、前記核酸増幅装置は、前記固定熱源のいくつかを、次式
Ｙ＝５，０００Ｘ３−９００Ｘ２＋５０Ｘ＋２．８・・・・・・・・・・（ａ）
Ｙ＝最低過剰設定温度  Ｘ＝反応液の深さ（ｍｍ）×容器伝熱面の厚さ（ｍｍ）。【００６２】
（容器伝熱面とは、容器平板部で固体熱源と接する表面と反応液とに挟まれた膜状部分である。）
で表される温度差以上に、昇温時には昇温目標温度より高温側に、あるいは冷却時には冷却目標温度より低温側に、過剰設定温度だけ過剰に設定制御することを特徴とするものである。【００６３】
他の１の実施形態によれば、前記核酸増幅装置は、更に反応用空隙の光学的変化を測定する光学測定機構を有するものである。【００６４】
別の１の実施形態によれば、前記核酸増幅装置は、記載の平板部を両側から押さえるブロックにおいて、前記ブロックは固体熱源と透明部材であって、前記生物化学的反応は核酸増幅反応であって反応液に光を照射する発光部と、発生した光学的変化を測定する受光部からなる光学測定装置が存在し、上記透明部材を通して光学測定を行うことを特徴とするものである。【００６５】
この発明の第８の主要な側面によれば、前記容器と、生物化学的反応用酵素が入った反応液とを含む生物化学反応用キットが提供される。【００６６】
この発明の第９の主要な側面によれば、容器に収容された反応液に所定の熱サイクルを与えてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）若しくはＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）等の熱サイクル反応を促進するための反応 促進装置であって、前記容器に対向するように配置され、前記容器に収容された反応液を所定熱サイクル時間内に高温側の目標温度と低温側の目標温度に温調して前記熱サイクルを与える熱サイクルヒータと、前記熱サイクルヒータの温度を、前記所定のサイクル時間に相関させて、高温側を、前記高温側の目標温度より所定の温度差以上に乖離させ、および低温側を、前記低温側の目標温度より所定の温度差以下に乖離させるように制御する温度制御部とを有し、前記乖離温度が次式
Ｙ＝５，０００Ｘ３−９００Ｘ２＋５０Ｘ＋２．８・・・・・・・・・・（ａ）
Ｙ＝最低過剰設定温度  Ｘ＝反応液の深さ（ｍｍ）×容器伝熱面の厚さ（ｍｍ）。【００６７】
（容器伝熱面とは、容器平板部で固体熱源と接する表面と反応液とに挟まれた膜状部分である。）
で表される温度差以上となるよう制御することを特徴とする反応促進装置が提供される。【００６８】
１の実施形態によれば、前記反応促進装置は、容器平板部を表面と裏面から圧迫する装置を有し、その圧迫装置構造の少なくとも片側は固体熱源であって前記平板部の反応用空隙の少なくとも片側は厚さ１０〜４００μｍのフィルム状伝熱面となっており、固体熱源と前記フィルム状伝熱面とを対向させ前記圧迫装置にて接触させることで加熱し、反応用空隙の内圧上昇により膨張したフィルム状伝熱面と前記熱源との密着が安定的に推移するよう圧迫装置を制御する機構を有することを特徴とするものである。【００６９】
他の１の実施形態によれば、前記反応促進装置は、高速反応部に反応液を加圧導入する為、前記容器には、さらに開放端を有する液入れ用空隙を有し、反応用空隙と容器内部において送液用溝状空隙で連結されており、液入れ用空隙の開放端から反応液を入れたのち、送液用溝状空隙を通じて反応液を反応用空隙に送った後に、開放端を密封栓にて密封し、前記密封栓が外れないよう密封栓に圧力を掛けた状態で反応が行われるように圧迫する機構を有することを特徴とするものである。【００７０】
別の１の実施形態によれば、前記反応促進装置は、前記固体熱源の少なくとも一つが、ホットスタートＰＣＲや、逆転写酵素の失活を可能とする９０℃以上に設定される熱源を少なくとも一つ有する事を特徴とするものである。【００７１】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記反応促進装置は、前記反応進行の良否を、反応液の光学的変化で読み取るための、光学的検出装置を、更に有することを特徴とするものである。【００７２】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記反応促進装置は、核酸増幅反応を行った後に、反応進行の適否を判定するための引き続き電気泳導で核酸増幅産物を分離するための電気泳導用電源装置を更に有することを特徴とするものである。【００７３】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記反応促進装置は、平板部内の反応液を収容する部分が流路状をなし、反応液を流しながら核酸増幅を行うフロー型核酸増幅反応を行うための装置であって反応液を送る速度を制御する為の送液制御装置を更に有する事を特徴とするものである。【００７４】
この発明の第１０の主要な側面によれば、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）若しくはＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）等の熱サイクルを伴う核酸増幅反応を行う反応促進方法であって熱サイクルの所定温度に対応した特定の温度に設定された複数の固体熱源があって反応液を収容する反応用空隙が存在する平板部を有し、反応用空隙の少なくとも１方の平板部の表面は、伝熱面となっている容器を用い、反応液を前記容器の反応用空隙に入れる工程と、熱サイクルの所定温度に対応した前記固体熱源に順次サイクル数だけ繰り返し接触させる工程とを有する反応において、前記特定の温度が、昇温時には目標温度より高温側に、冷却時には目標温度より低温側に次式
Ｙ＝５，０００Ｘ３−９００Ｘ２＋５０Ｘ＋２．８・・・・・・・・・・（ａ）
Ｙ＝最低過剰設定温度  Ｘ＝反応液の深さ（ｍｍ）×容器伝熱面の厚さ（ｍｍ）。【００７５】
（容器伝熱面とは、容器平板部で固体熱源と接する表面と反応液とに挟まれた膜状部分である。）
で表される温度差以上に、過剰設定されている熱源が存在することを特徴とする熱サイクル反応の促進方法が提供される。【００７６】
１の実施形態によれば、前記方法は、反応の高速性を担保する
為、ＴａｋａｒａのＺ−Ｔａｑや東洋紡のＫＯＤ−Ｄａｓｈなどの１００塩基／秒以上のポリメラーゼを使用することを特徴とするものである。【００７７】
他の１の実施形態によれば、前記方法は、核酸の種類増幅対象がＲＮＡの場合、増幅可能なＤＮＡに変換する為の逆転写温度に設定された固定熱源に接触させる工程と、引き続き逆転写酵素を失活させる温度に設定された固定熱源に接触させる工程とその後に熱サイクル用に温度設定された固定熱源に順次接触させる工程とを有することを特徴とするものである。【００７８】
別の１の実施形態によれば、前記方法は、核酸増幅の進行状態を確認する為に、前記熱サイクルの進行に伴い複数の光学的測定を行い、核酸増幅の進行状態を確認する工程を有することを特徴とするものである。【００７９】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記方法は、核酸増幅が間違いなく行われたことを確認する為に、前記核酸増幅反応後に、反応液の温度を徐々に上げながら前記反応液の光学的変化を読み取ることで核酸増幅産物を同定する工程を有することを特徴とするものである。【００８０】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記方法は、前記核酸増幅反応後に、電気泳導を行うことを特徴とするものである。【００８１】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記方法は、前記核酸増幅反応がエマルジョンＰＣＲ反応であることを特徴とするものである。【００８２】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記反応容器は、前記伝熱面が、厚さ１０〜４００μｍのフィルム状となっているものである。【００８３】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記反応容器は、反応用空隙との光学的干渉を避ける為、遮光性材料から成る、若しくは前記反応用空隙の内壁を黒色或いは金属皮膜により遮光されているものであり、前記反応用空隙が周囲の反応用空隙と光学的に干渉しないことを特徴とするものである。【００８４】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記反応容器は、前記光学的感度アップのために、前記平板部の何れか片側に金属反射膜を設置し、励起光の経路長を往復２倍とすることを特徴とするものである。【００８５】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記反応容器は、前記反応用空隙部分が、反応液の深さ（ｍｍ）×容器伝熱面の厚さ（ｍｍ）が０．００１〜０．２となるように設計されていることを特徴とするものである。【００８６】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記反応容器は、容器の平板部にあらかじめ凹部を形成するか、容器平板部に貫通穴を開けておきその片方の開口部をフィルムで封をする方法かで形成した凹部に反応液を滴下充填した後、１０〜４００μｍのフィルムで密閉することで、他から独立した複数の閉鎖係反応空隙を形成することを特徴とするものである。この場合、前記反応容器は、前記凹部の外周壁面に少なくとも一つの周状の段差が設けられており、その段差部分が疎水性である事が好ましい。【００８７】
またこの場合、前記反応容器は、回転中心を有し、前記他から独立した２０〜２００個の閉鎖係反応空隙が、円周状に容器平板部全体に分布している事が好ましい。【００８８】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記反応容器は、前記平板部がさらに、開放端を有する液入れ用空隙を有し、前記反応用空隙と容器内部において送液用溝状空隙で連結させており、この液入れ用空隙に反応液を入れたのち、送液用溝状空隙を通じて反応液を反応用空隙に送ることを特徴とするものである。この場合、前記反応用空隙からは、更に大気解放用溝状空隙がでており大気開放口に繋がっており、前記容器にはさらに、封止用空隙を有し、容器の内部において前記の送液用溝状空隙と大気解放用溝状空隙に繋がっており、前記液入れ用空隙から送液用溝状空隙を通じて反応液を反応用空隙に送った後に封止用空隙から封止液を送って、前記送液用溝状空隙と大気解放用溝状空隙を封止する事が好ましい。またこの場合、前記封止液は、シリコングリースを含むグリース状高粘度液、あるいはＵＶ硬化性樹脂若しくは熱硬化性樹脂であることが好ましい。【００８９】
この発明の第１０の主要な側面によれば、前記反応促進装置に使用するキットであって、ポリメラーゼあるいはリガーゼを含む反応液を収容する平板部を有する容器を含むキットが提供される。【００９０】
この発明の第１１の主要な側面によれば、反応液が収容された反応部を有する容器において、この反応液に所定の熱サイクルを与えてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）若しくはＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）等の熱サイクル反応を促進するための反応促進装置であって、前記容器の反応部に対向するように配置され、前記容器に収容された反応液を所定熱サイクル時間内に高温側の目標温度、中温の目標温度、及び低温側の目標温度に温調して前記熱サイクルを与える熱サイクルヒータと、前記熱サイクルヒータの温度を、高温側を前記高温側の目標温度より所定の温度差以上に乖離させ、および低温側を前記低温側の目標温度より所定の温度差以下に乖離させるように制御する温度制御部とを有することを特徴とする反応促進装置が提供される。【００９１】
また、１の実施形態によれば、前記乖離温度が次式
Ｙ＝５，０００Ｘ３−９００Ｘ２＋５０Ｘ＋２．８・・・・・・・・・・（ａ）
Ｘ＝反応液の深さ（ｍｍ）×容器伝熱面の厚さ（ｍｍ）
（容器伝熱面とは、容器平板部で固体熱源と接する表面と反応液とに挟まれた膜状部分である）
で表される温度差以上となるよう制御することを特徴とする反応促進装置が提供される。【００９２】
別の１の実施形態によれば、前記熱サイクルヒータは、高温部、中温部、低温部を有し、この熱サイクルヒータと前記容器との相対位置を変位させることによって、前記反応部に保持された反応液に所定の熱サイクルを与える駆動部を有するものであり、この駆動部は、前記所定の熱サイクル時間に相関させて、前記容器と前記ヒータとの対向時間を制御するものである。【００９３】
さらに別の１の実施形態によれば、前記高温部、中温部、低温部は周方向に配置され、前記駆動部は、前記容器と前記ヒータとの相対位置が回転円周方向に変位するように容器若しくはヒータを駆動するものである。【００９４】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記駆動部は、前記熱サイクルヒータと反応容器とを互いに接触させた状態で間欠的に相対変位させ、上記容器に収容された反応液が前記熱サイクルヒータの高温部、中温部、低温部にそれぞれ所定時間滞留するようにするものである。【００９５】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記制御部は、前記容器上の複数の反応部が相対的に移動して前記低温部に対向するまでの速度と、低温部から中温部に移動するまでの速度と中温部から出るまでの速度とを調整することで、少なくとも前記反応部に印加される低温と中温とに関する熱履歴を一定にするものである。【００９６】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記駆動部は、前記熱サイクルヒータと反応容器とを互いに接触させた状態で連続的に相対変位させるものである。【００９７】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記高温部、中温部、低温部は直線方向に沿って配置され、前記駆動部は、前記容器と前記ヒータとの相対位置が直線方向に変位するように容器若しくはヒータを駆動するものである。【００９８】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記制御部は、前記熱サイクルヒータと反応容器とを変位させる際、上記サイクルヒータを反応容器とを離間させ離間させた状態で変位させたあと、上記サイクルヒータと反応容器とを接触させるよう駆動するものである。【００９９】
さらなる別の１の実施形態によれば、この装置は、更に、前記反応進行の良否を、反応液の光学的変化で読み取るための、光学的検出装置を有するものであり、前記容器は、複数の反応液の光学的干渉を防ぐために、少なくとも一部が遮光性材料で形成され、又は遮光着色されているものである。【０１００】
さらなる別の１の実施形態によれば、請求項１０記載の反応促進装置において、
前記容器には、当該容器を圧迫する部材として光学的に透明な圧迫部材が用いられ、この透明な圧迫部材を通して光学測定を行うことを特徴とする反応促進装置。【０１０１】
さらなる別の１の実施形態によれば、容器平板部を表面と裏面とから圧迫する装置を有し、その圧迫装置構造の少なくとも片側は固体熱源であって、前記平板部の反応部の少なくとも片側は厚さ１０〜４００μｍのフィルム状伝熱面となっており、前記固体熱源と前記フィルム状伝熱面とを対向させ前記圧迫装置にて接触させることで加熱し、前記反応部の内圧上昇によってフィルム状伝熱面が膨張することで、前記容器と前記熱源との安定的な接触を確保することを特徴とする反応促進装置が提供される。【０１０２】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記容器は、平板部を有し、その平板部に凹部が設けられ、当該凹部に水溶液である反応液を入れた後に当該凹部をシールすることで反応液を密封して反応に必要な温度に対応する温度に設定した固体熱源と前記平板部とを接触させて熱反応である核酸増幅反応を行う反応容器であって、前記凹部上端面に少なくとも一つの周状の段差を設け、この周状の段差部分と、シール部材下面を共に疎水性にすることで、安定的に核酸増幅反応を行うようにするものである。【０１０３】
さらなる別の１の実施形態によれば、反応部に反応液を加圧導入するために、前記容器は、更に、開放端を有する液入れ用空隙を有し、前記反応部と容器内部において送液用溝状空隙で連結されており、液入れ用空隙の開放端から反応液を入れたのち、送液用溝状空隙を通じて反応液を反応用空隙に送った後に、開放端を密封栓にて密封し、反応中に前記密封栓が外れないよう密封栓に圧力を掛けた状態で反応が行われるように圧迫する機構を有するものである。【０１０４】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記密封栓は、当該密封栓側面部の中位部から下位部にかけて空気溝を有するものである。【０１０５】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記容器には、前記反応部に連結された大気開放用溝状空隙と、封止用液を流すための封止液が満たされる封止液用空隙と、封止液用空隙と前記大気開放用溝状空隙及び前記液入れ用空隙とを連結する溝状空隙とが設けられ、前記液入れ用空隙から反応用空隙に反応液を送った後に、封止液が入った空隙から封止液を送ることにより反応用空隙の液入れ用空隙側の溝状空隙と、大気開放側の溝状空隙との両方に、封止液が入るように構成されているものである。【０１０６】
さらなる別の１の実施形態によれば、前記封止液は、シリコングリースを含むグリース状高粘度液、あるいはＵＶ硬化性樹脂若しくは熱硬化性樹脂から成るものである。【０１０７】
さらなる別の１の実施形態によれば、平板部内の反応液を収容する部分が流路状をなし、反応液を流しながら核酸増幅を行うフロー型核酸増幅反応を行うための装置であって、反応液を送る速度を制御する為の送液制御装置を更に有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０８】
以下、この発明の一実施形態を図面を参照して説明する。【０１０９】
前述したように、市場で求められる５分以下の高速核酸増幅を行うためには、熱源の種類・容器の形状・装置の制御・使用する酵素などＰＣＲに関する要素全てを総合的に改良することが必要である。
（本発明で改良した基本的技術事項）
そこで、まずＰＣＲを例に、高速かつ安定に実施するために必要な技術的要件を以下に列挙すると、以下のようになる。【０１１０】
ａ．熱源の温度を上下するのに要する時間を限りなく短縮する…高速化
ｂ．熱源の温度上下と反応液の温度の上下との遅れを限りなく短縮する…高速化
ｂ−１．熱源と反応容器の接触を確保する…安定化
ｂ−２．容器表面から反応液への熱伝導を確保するため容器表面層の厚さを薄くし、反応液内の熱伝導を確保するため、液の厚さを薄くする…高速化
ｂ−３．反応液内の熱伝導を加速するための制御…高速化
（固体熱源・静止型の採用）
項目ａに関して、本発明は、固体熱源・静止型を採用し、各温度に対応した設定温度の異なる複数の固体熱源を用意し、反応容器を相対的に移動させることで反応液に対して熱サイクルを与えることにした。これにより、熱源自身の昇温や冷却の時間は見かけ上ゼロとなり、反応容器内の反応液への伝熱に要する時間のみが、反応液の温度上下に必要な時間となる。【０１１１】
図４は、この発明の第１の実施形態の反応促進装置の全体概略を示した側面図である。【０１１２】
図４中、参照符号１０で示すのが固体熱源、１１で示すのが反応容器である。反応容器１１は、図６に示すように、上方から見た場合、円盤形状のものであり、図に１２で示す部分が反応液が満たされる反応槽となっている。また、前記固体熱源１０は図７に示す様にこの反応容器１１の形状に対応するように扇形状に形成された、それぞれ低温、中間温度、および高温に設定される異なる３つのブロック１０ａ〜１０ｃからなり、これに対して前記反応容器１１を回転させることで、反応槽１２内の反応液に熱サイクルを与えるように構成されている。【０１１３】
図４に戻ると、前記固体熱源１０は、上側の熱源１０'と下側の熱源１０"とで前記反応容器１１を挟むように配置されている。上側の熱源１０'は上蓋１３に設けられた上側フレーム１４にスプリング１５及び放熱ブロック１６を介して保持されており、下側の熱源１０"は、本体側１７のフレーム１８上に同じくスプリング１９と放熱ブロック２０を介して保持されている。この熱源１０は、制御の容易さや正確さからペルチェ素子がこの実施形態では採用されている。【０１１４】
上蓋１３と本体１７とはヒンジ部材２１で接続され、図５に示すように、このヒンジ部材２１によって上蓋１３は本体１７に対して開閉可能になっており、上蓋１３を開けることで、前記反応容器１１を解放できるようになっている。一方、図４に示す様に、前記本体フレーム１８には、反応容器１１を回転駆動するための主モータ２２が回転軸２２ａを上方に延出した状態で保持されており、上記回転軸２２ａの上端には上記反応容器１１を保持するための保持テーブル２３が設けられている。この保持テーブル２３上に反応容器１１を位置決めした状態で設置し、上蓋１３を閉めることで、上記上側および下側の放熱ブロック１０'、１０"で反応容器１１の周縁部を挟むことができるようになっている。【０１１５】
また、反応容器１１の中央部分は、前記保持テーブル２３と、上蓋フレーム１４に設けられた上側保持ブロック２４とによって把持されるようになっている。この上側保持ブロック２４は、容器中心部を押さえるための第一の面２４ａと、この面よりも高く形成され後で説明する密閉栓を抑えるための第二の面２４ｂとを有する。この保持ブロック２４は、上記上側フレーム１４にスプリング２６を介して保持され、上記反応容器１１を上記保持テーブル２３に対して弾性的に押し付けることができるように構成されている。【０１１６】
また、この装置は、上記本体フレーム１８上に、反応した反応液の反応を測定するための蛍光測定装置２７を備える。この蛍光測定装置２７は、反応容器１１内の反応液に励起蛍光を照射しその反射光を測定することで反応液に生じた反応を検出するものである。この蛍光測定装置２７は、移動テーブル２８上に保持され、上記反応容器の半径方向に位置決め駆動可能となっている。【０１１７】
また、この装置は、上記本体１７内に、ヒータ温度制御部２９と、回転モータ制御部３０と、蛍光測定装置制御部３１と、電源３２とを備える。【０１１８】
以下、この装置の詳しい構成をその動作と共に説明する。
（反応容器）
先ず、図６及び図８〜図１０を参照して上記反応容器１１について詳しく説明する。【０１１９】
図６に示すように、この反応容器１１には、周方向１２０度に亘る範囲に互いに約２５度離間して設けられた４つの反応槽１２が設けられている。各反応槽１２に対応する反応容器の中心部側には、前記各反応槽１２に反応液を送るための送液孔３３が設けられている。この反応槽１２と送液孔３３は、送液通路３４と大気解放通路３５とで接続されている。【０１２０】
図８Ａ、８Ｂは、上記反応槽１２のうちの１つと、それに対応する部位の断面を示すものである。この反応容器１１は、ポリカーボネート製の本体基板３７と、この基板３７の上部面に積層された同じくポリカーボネート製の閉塞板３８、および下面に貼付された厚さ２００μｍの伸縮性フィルム部材３９とからなる。上記反応槽１２および送液孔３３は、前記本体基板３７を貫通するように形成され、上記送液通路３４は本体基板３７の裏面側に上記深さ１００μｍの溝として、大気解放通路３５は上面側に深さ１００μｍの溝としてそれぞれ形成されている。そして、前記上面および下面をそれぞれ閉塞板３８と伸縮性フィルム３９で覆われることで、それぞれ反応槽１２、送液孔３３として区画されるようになっている。一方、上記送液孔３３を構成する部分の上面は、上方に突出する突起部３３ａとして構成され、その突出した部分３３ａに上記大気解放通路３５が連通するようになっている。このような構成になっているのは、図に４０で示す密閉栓により反応容器１１内部の空気を抜きながら反応液を送液孔３３から送液通路３４を通して反応槽１２に送りつつ、上記反応槽１２内の空気を大気解放通路３５を通して抜くためである。【０１２１】
次に、送液、空気抜き、密閉の流れを図９Ａ〜Ｃを参照して説明する。【０１２２】
まず、図９Ａに示す様に、送液孔３３に反応液を入れた状態で反応容器１１を本体側の保持テーブル２３上に設置する。このとき、密閉栓４０は、先端を送液孔３３内に挿入し、密閉栓４０の空気抜き通路４０ａにより、前記容器１１の大気連通孔が大気に解放された状態で供給される。このとき、上蓋１３は、図５に示す様に解放されており、上記反応容器１１を本体側に設置することができる。【０１２３】
次に、上蓋１３を閉じると、図９Ｂに示すように、密閉栓４０が上側保持ブロック２４により反応容器１１の送液孔３３内に圧入されていく。この状態を拡大して示すのが図８Ｂである。送液孔３３内に供給された反応液が送液通路３４を通って反応槽１２に移動し、この反応槽１２内に反応液が満たされていく（矢印（Ｉ））。この時、上部閉塞板３８と基板３７との間に形成された大気解放通路３５を通って反応空隙の空気が前記送液孔３３内に導出され（矢印（ＩＩ)）、前記密閉栓４０の空気抜き通路４０ａを通して大気中へと逃がされていく（矢印（ＩＩＩ））。【０１２４】
図９Ｃに示すように、上蓋１３が完全に閉められると、前記保持ブロック２４に設けられたスプリング２６の復元力によって密閉栓４０が更に下げられ、前記密閉栓４０の空気逃し溝４０ａも送液孔３３内に埋没し、それ以降は空気は逃げなくなる。そして、更に密閉栓４０が完全に押込まれることで、送液通路３４及び反応槽１２内は適度な加圧状態、すなわち大気圧よりも加圧された状態となる。【０１２５】
また、このとき、前記保持ブロック２４の第二の面２４ｂでこの密閉栓４０を押さえ、第一の面２４ａで反応容器１１の上面が押し付けられることになるから、この反応容器１１は上記密閉栓４０を含め完全に把持された状態になる。このことで、この反応容器１１を回転駆動できると共にこの回転中に密閉栓４０が抜けてしまうことが防止される。【０１２６】
このように反応槽１２内に反応液が満たされかつこの反応槽１２内が加圧されることで、この発明では、上記反応槽１２内の反応液の加熱効率を向上する。この原理を示したのが図１０である。【０１２７】
この反応容器１１の第一の工夫は、上記反応槽１２の部分を上下の熱源１０'、１０"で挟んで伝熱効率を高めた点である。特に、この反応槽１２を閉塞する上下面の両方あるいはいずれかが薄肉になっており、その薄肉の部材をそれぞれ伝熱面とするものである。この実施形態では、上下に固体熱源１０'、１０"が設けられ、これらで反応容器１１を圧迫する構成となっているが、固体熱源は両側でも片側であっても良く、要は熱源は反応液が接触伝熱面に対向して接触していれば良い。この例では、伝熱面は反応液が溜まる下面側に設定されているが、この伝熱面を構成する部材が薄いことを要する。薄すぎれば反応中に破損する危険があるので最低１０μｍの厚さは必要である。４００μｍより厚くなれば熱伝導効率が落ちて高速化が期待できなくなる。したがって、この伝熱面の厚さは１０μｍ〜４００μｍ、好ましくは５０μｍ〜３００μｍ、最も好ましくは１５０μｍ程度である。また、反応液への伝熱を考えると、伝熱面積あたりの液の熱容量を大きくしないために、反応槽１２内の反応液の液深さは１ｍｍ以下が好ましく５００μｍ程度が好適である。【０１２８】
また、この発明では、熱伝導効率を高めるために、上記伝熱面を伸縮性フィルム３９で構成し、処理中に反応槽１２を大気圧よりも高圧にすることによってこのフィルム３９を熱源１０"側に膨張させてこの熱源１０との密着性を高めるように構成されている。この点について以下にさらに詳しく説明する。
（接触安定性の確保）
すなわち、ＰＣＲの高速化を達成する為には、３０サイクルにも及ぶ移動中に、固体熱源１０と容器１１の反応槽１２部分との確実な接触を維持することが必須である。そのため、本技術のように、固体熱源１０と反応容器１１とによる反応では、その接触の安定性が重要なファクターとなる。【０１２９】
通常このためには容器１１と固体熱源１０とを圧接する。しかし容器１１と固体熱源１０とがいずれも固体同士である為に、表面のわずかな凹凸が邪魔してわずかな隙間が発生する。そこには非常に熱伝導率の低い空気が介在することになり、両者の熱伝達の安定性を大きく阻害する。即ち３０サイクル以上にも渡り、多数の反応槽が同一の熱履歴を経るためには、通常の平面の圧接だけで両者を完全に密着させることは殆ど期待できない。この接触確保が、本法のように固体熱源と固体容器を用いる生物化学的反応には決定的に重要な技術となる。【０１３０】
更に診断用途では、結果の確実さを保証する為に、検査目的物が無ければ検出されない（ネガテイブコントロール）と、検査目的物が無くても検査が問題なく進んだことを知る為の（ポジテイブコントロール）とを同時に検査することが良く行われる。すなわち１検体の１項目を検査する場合でも、１項目３検査になる。また、検体を一度に多数検査したいと言うニーズも大きい。そこで平板部に多数の反応空隙を配置した場合、これらの反応部の伝熱面自体が多少の凹凸を産みこの凹凸が競合して接触する反応部と接触しない反応部が事実上発生する。【０１３１】
これに対して、この発明では、反応槽１２内部の圧力を高くし、閉塞部材を伸縮性フィルム３９とすることによって、このフィルム３９を内部圧力によって外側方向に膨張させることで、多数の反応槽のフィルム３９を固体熱源１０に対して安定的に接触させることが出来るようにした。この発明の予備検討の段階では、前記伸縮性フィルム３９としてフッ素樹脂フィルム、厚さ０．５ｍｍと０．１ｍｍのポリカーボネートフィルムの３種を用い、熱サイクル条件は一定にして実験を行った。その結果０．５ｍｍのポリカーボネートフィルムを使った場合には、８つの反応槽１２のうち、３つでは反応が進まなかったが、フッ素樹脂フィルムと０．１ｍｍのポリカーボネートフィルムとにおいてはすべての反応槽１２において良好な反応が確認できた。【０１３２】
以上のことから、容器１１に形成された多数の反応槽１２と固体熱源１０とを、全ての反応槽１２において均一で安定な接触を達成し核酸増幅反応を安定的に行うには、反応空隙の伝熱面が薄いか柔らかい伸縮性をもつフィルム状閉塞部材（この実施形態では伸縮性フィルム３９）によって提供され、反応槽１２内圧が少なくとも反応時には大気圧より高くなるという条件を達成することによって、反応の安定性を確保できることが分かったのである。【０１３３】
すなわち、通常、容器基板１１自体は硬くかつ平面度にも問題があるので、そこに存在する多数の反応槽１２の容器閉塞部材（伸縮フィルム３９）が膨らんで、全ての反応槽１２が接触できるように互いの接触力を閉塞フィルム３９の変形量で自動的に固体熱源１０に沿わせるという効果がある。【０１３４】
この実施形態では、容器１１の基板３７に別素材の伸縮性フィルム３９を接着したものとなっているが、これに限定されるものではない。基板３７と同素材であっても、その厚さを薄くすることによって伸縮性を持たせた閉塞部材であってもよい。なお、伸縮性フィルムは、オレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリウレタン樹脂、シリコン系樹脂、又はフッ素系樹脂などから選択でき、中でも柔らかさと強度の観点から、フッ素系樹脂が最も好ましい。【０１３５】
伸縮性フィルム３９を備える反応容器１１の製造法は次のように種々の方法がある。例えば、この実施形態のように反応槽１２を有する容器基板１１に伸縮性フィルム３９を貼り付ける方法がある。また、容器基板３７そのものを、薄くなると伸縮性が期待できる材料で成形し、一体成型により前記伸縮性フィルム３９を形成してしまう方法がある。【０１３６】
また、この実施形態では反応槽１２内を大気圧よりも高くすることで前記伸縮性フィルムと固体熱源との接触を確保しているが、反応槽１２内を高圧する方法もこの実施形態のものに限定されるものではない。すなわち、この実施形態では、密閉栓４０と送液通路３４を用いることでこれを達成したが、これに限定されるものではない。送液通路等を持たない容器１１であって独立した反応槽を持つものであって、常温・常圧で反応液を入れた後に、個々の反応槽を単純に表面閉塞部材で密封することによっても達成できる。なぜなら核酸増幅反応はすべて常温より高く反応空隙の液や気体が熱せられ膨張して固定熱源との接触を確保できるからである。【０１３７】
本発明者はこれを更に確実にするため次のような方法も行った。すなわち、容器１１に反応液を入れる時に容器の下面を減圧することで下面の閉塞フィルム３９を下側に突出させ、反応液を入れて上面側の閉塞部材を接着した後に減圧を停止したのである。この方法で作った反応容器１１は、反応に供する前から反応槽１２の内圧は大気圧を超えていることになるので、熱反応においては更に確実な反応の安定化が行えた。
（熱源温度制御の工夫）
この実施形態では、上記反応容器１１の形状等に関する改良に加えて、熱源温度の制御方法における改良も行っているので、この装置の動作を説明前にその原理について説明しておく。【０１３８】
従来の特許や文献においても容器底面の厚さや反応液の深さに言及している例は多い。しかしながら単にその厚さや深さに頼るだけでは熱サイクルの高速化には限界がある。そこで本発明者らは、伝熱の根本に立ち返り、熱源と被加熱部材との温度差に着目して高速化の検討を行った。【０１３９】
すなわち、従来の技術は、いずれも熱源の設定温度は反応液の加熱目的温度丁度か近傍に設定して加熱を行っていたが、本発明では、昇温時には目標温度より高温側に所定温度だけ乖離させて熱源温度を設定し、冷却時には目標温度より低温側に所定温度乖離させて設定することで、反応液に熱サイクルを与える時間が大幅に短縮される事を見出した。【０１４０】
これを模式化して示したのが、図１１である。【０１４１】
すなわち、熱サイクル時間が短くなると、低温側熱源１０ａと高温側熱源１０ｃとの熱エネルギー格差を大きくしないと、高速な昇温および降温を行えない。この図では、反応液高温側目標温度ＴＨ０に対して高温側熱源１０ｃの設定温度ＴＨ１を所定の乖離温度分δｔｈだけ高くし、反応液低温側目標温度ＴＬ０に対して低温側熱源１０ａの設定温度ＴＬ１を所定の乖離温度分δｔｌだけ低くしている。そして、熱サイクル時間に連動させて前記容器１１を１回転させることで、図に４３で示すような温度推移を実現しているものである。【０１４２】
この乖離温度δｔｈ、δｔｌをどのように設定するか、すなわち、臨床分野で望まれている５分以下での核酸増幅が可能となる乖離温度の設定を、伝熱に関する数値計算で解析した。【０１４３】
その結果得られた、容器伝熱面の厚さ×反応液深さと必要な最低過剰設定温度との関係を図１２に示した。そして得られた結果に対し、３０サイクル５分という結果に対する近似式を作成し以下の結果を得た。【０１４４】
Ｙ＝５，０００Ｘ３−９００Ｘ２＋５０Ｘ＋２．８・・・・・・・・・・（ａ）
Ｙ＝最低過剰設定温度  Ｘ＝反応液の深さ（ｍｍ）×容器伝熱面の厚さ（ｍｍ）。【０１４５】
容器伝熱面とは、容器平板部で固体熱源と接する表面と反応液とに挟まれた膜状部分である。【０１４６】
この式は、以下のようにして求められる。【０１４７】
〔前提〕
Ｔｉ℃の熱源に、Ｔｏ℃で単位面積１ｃｍ２の、厚さＬｐｃｍの樹脂膜を介して、厚さＬｌｃｍのＰＣＲ反応液があると仮定する。単位ｃｍ２あたりの通過熱量Ｑは一般に次の式で示される。【０１４８】
Ｑ＝λ／Ｌｐ  ＊（Ｔｉ−Ｔｏ）  
ここで、移動熱量Ｑ：ｃａｌ／ｓｅｃ
熱伝導率λ：ｃａｌ／ｃｍ・ｓｅｃ・℃
樹脂膜厚Ｌｐ：ｃｍ
反応液（水、液体）の熱伝導率は、ＰＣやＡＢＳ樹脂の熱伝導率の数倍あり、かつ液は流動性があって薄膜状であることから、樹脂壁を通じて伝わった熱は、そのまま液の昇温に使われると仮定する。微小時間δｔ秒に通過する熱量をδＱ１ｃａｌとする。【０１４９】
δＱ１＝λ／Ｌｐ  ＊（Ｔｉ−Ｔｏ）  ＊δｔ
水の比熱と比重を１として昇温は、ｄＴ１＝ｄＱ１／Ｌｌ
δＱ２＝λ／Ｌｐ  ＊（Ｔｉ−Ｔｏ＋ｄＴ１）δｔ
伝熱を数値計算で行うには
δＱｎ＝λ／Ｌｐ  ×（Ｔｉ−（Ｔｏ−ΣｄＴ１〜ｎ））×δｔ・・（ｂ）
δＴｎ＝δＱｎ／Ｌｌ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・（ｃ）
この（ｂ）（ｃ）式を用いた数値計算結果に、機械のアイドルタイムを加味し、３０サイクルに必要な時間と（反応液の深さ×容器伝熱面の厚さ）の関係から所要過剰設定温度のグラフを得て図１２に示した。（λは樹脂の中でも比較的熱伝導率が高いシリコン樹脂の０．００１ｃａｌ／ｃｍ・ｓｅｃ・℃を使用）図４の５分の計算結果を黒丸で示し、近似式の計算結果を白丸で示した。【０１５０】
以上のことから項目ｂ−３の熱伝導を加速する制御としては、ミリメータで表示した液深さに伝熱面の閉塞部材厚さを掛けた値をＸとし、熱サイクル時間に応じて、（ａ）式に代入して得られた温度以上に、熱源の温度を乖離させる高速の反応が可能となる。ここでＸの値に制限は無いが、０．００１〜０．２が好ましい。更にこのましくは０．０１〜０．１５が好ましい。【０１５１】
具体的な設定の例を述べる。通常のＰＣＲでは高温：９５℃、低温：５５℃、中間温度：７５℃程度が必要である。この場合、上記（ａ）式の値以上という意味で、熱サイクル時間に応じて３〜３０℃程度の乖離温度に設定する。ここで乖離設定温度差δｔｈ、δｔｌを１５℃とした例ではＴＨ１：１１０℃、ＴＬ１：４０℃、ＴＭ１：７５℃に設定し、それぞれの固定熱源１０ａ〜１０ｃに順次接触させるというサイクルを３０〜４０回繰り返す。各熱源１０ａ〜１０ｃへの移動に必要な時間は０．６秒程度なので３００ｂｐ程度の場合、各熱源上での停止時間はＴＨ：０ｓｅｃ、ＴＬ：０．５ｓｅｃ、ＴＭ：３ｓｅｃ程度である。これで概ね２分半程度で増幅が完了する。このように臨床救急分野でも十分な速さが達成される。【０１５２】
（各温度熱源への移動速度）
また、本発明者らは、各温度熱源への移動速度に関しても工夫を重ねている。図４０は、その工夫が必要となることを示す模式図である。【０１５３】
この図においても、上述したように、低温側固定熱源１０ａ〜高温側固定熱源１０ｃが円周方向に沿って配置されており、上記円形の反応容器１１がこれらの固定熱源１０ａ〜１０ｃに接触して回転するようになっている。このような構成においては、容器１１が固体熱源の高温側固定熱源１０ｃから低温側固定熱源１０ａ、低温側固定熱源１０ａから中温側固定熱源１０ｂ、中温側固定熱源１０ｂから高温側固定熱源１０ｃへと移動する際に、当該反応容器１１が回転することによって容器１１が移動前の熱源で得た熱が移動先の固体熱源１０ａ〜１０ｃに影響を与え、さらには容器１１の温度の均一性にも影響を与えることになる。【０１５４】
具体的には、例えば、矢印Ｉで示すように、高温側固定熱源１０ｃで熱せられた容器１１の部分が低温側固定熱源１０ａに差し掛かる場合、容器１１の熱が急速に低温側固定熱源１０ａに吸収され低温側固定熱源１０ａの温度が低下する。そして、さらに矢印ＩＩで示すように、当該容器１１の部分が低温側固定熱源１０ａの先端部に到達するときには、当初の高温で熱せられた温度よりも低下した状態となる。その結果、容器１１が有していた熱による低温側固定熱源１０ａ先端部の温度上昇は、低温側固定熱源１０ａ手前部の温度上昇より小さくなり、図４０のように低温側固定熱源１０ａ先端部（４３℃）と手前部（４６℃）との間で温度差が発生し、それに伴い、容器の反応ウエルが受ける冷却速度にも差が発生することになる。【０１５５】
すなわち、熱源自体は温度制御されているため、この温度差は時間とともに解消するが、動的な熱移動を利用する超高速ＰＣＲ装置では、このわずかな熱源温度差に起因して、複数ウエルの反応結果にも差が生じる恐れがある。この現象は接触回転式超高速ＰＣＲ特有の問題であり、各反応ウエルにおけるＰＣＲ反応などの安定性確保のために回避すべき重要な問題である。【０１５６】
この熱源の温度差に関して、通常の熱サイクルＰＣＲ装置では、各熱源温度は目標温度に設定されており、且つ長時間設定温度の熱源に接触させておくことで、いずれの反応ウエルも多少の時間差はあっても同じ温度になるので問題にならない。【０１５７】
しかしながら、本実施形態に係る超高速ＰＣＲでは、高速に温度を上下するために熱源設定温度は目標温度より過剰に加熱あるいは冷却されるような温度（乖離温度）に設定し、動的な熱移動を利用する方式であるために、熱源上に停止させておく時間を延長すると反応ウエルの温度は目標温度を超えて、熱源設定温度（目標温度＋乖離温度）まで変化してしまう恐れがある。【０１５８】
この例として、各熱源への移動時間を０．８秒と一定にして、低温側固定熱源１０ａと高温側固定熱源１０ｃとに乖離温度を設定した実験例を図４１Ａ及び４１Ｂに示す。図４１Ａは、各熱源の温度設定と、各熱源への移動時間を示したものである。この図に示すように、各熱源間の移動速度（時間）が一定のため、低温側固定熱源１０ａ及び高温側固定熱源１０ｃは、ともに、動的な熱移動の影響を受けてしまう。そのため、図４１Ｂに示すように、このような構成による温度制御の結果を示したグラフでは、回転方向手前側と先端側とで低温ボトム（５０℃以上）と高温ピーク（９０℃以上）に温度差が生じている。【０１５９】
なお、このグラフに示す線（ＩＩＩ）と（ＩＶ）は、それぞれ、容器１１が特定の固定熱源に停止した場合に、回転方向手前側に位置する反応槽１２（ＩＩＩ）と回転方向先端側に位置する反応槽１２（ＩＶ）の温度プロファイル（縦軸に温度、横軸に経過時間）を示したものである。【０１６０】
そこで、この問題点を解決するために、本発明者らは以下のような工夫をとっている。即ち、動的熱移動を考慮して、各ウエルが低温側固定熱源１０ａに接触する時間を変えれば容器１１の各部分（反応槽１２）が受ける熱量を同じにすることができるという考えである。【０１６１】
容器１１が定速で移動し一旦停止し定速で次の熱源に移動する限り、各反応槽１２は同じ容器１１上に配置されているため、同じ時間だけ熱源に接触することになる。そのため、熱源に動的温度差があれば各反応槽１２の受ける熱は熱源の動的温度差の影響を避けられない。【０１６２】
従って、本発明者らは、同じ容器１１上にありながら各反応槽１２が特定の熱源に接触する時間を変えるために、その熱源に容器１１の特定の部分が入ってくる速度と出て行く速度を変えることとした。【０１６３】
その例を図４２Ａ及び４２Ｂを参照して説明する。【０１６４】
この例では、低温側固定熱源１０ａ〜高温側固定熱源１０ｃの温度設定及びその熱源での容器１１の停止時間、熱源間での移動時を図４２Ａの表に示すように、設定した。すなわち、まず、高温側の目標反応温度を９０℃以上に設定するために高温側固定熱源１０ｃの温度は１１０℃と目標温度よりも２０℃乖離させて設定している。また、この高温側固定熱源１０ｃでの停止時間を０．７秒、中温側固定熱源１０ｂからこの高温側固定熱源１０ｃへ移動してくる移動時間を０．８秒と設定している。【０１６５】
また、低温側の目標反応温度を５０℃に設定するためにこの低温側固定熱源１０ａの温度は４３℃と目標温度よりも７℃低く乖離させて設定している。また、この低温側固定熱源１０ａでの停止時間を２．８０秒、高温側固定熱源１０ｃからこの低温側固定熱源１０ａへ移動してくる移動時間を１．０秒と設定している。【０１６６】
一方、中温側固定熱源１０ｂについては、温度乖離は設けず、停止時間は２．９０秒、低温側固定熱源１０ａからこの中温側固定熱源１０ｂへの移動時間は０．９０秒と設定している。【０１６７】
すなわち、中温側固定熱源１０ｂから高温側固定熱源１０ｃへの移動時間が０．８秒であるのに対して、高温側固定熱源１０ｃから低温側固定熱源１０ａへの移動には０．２秒長く１．０秒に設定し、低温側固定熱源１０ａから中温側固定熱源１０ｂへの移動にも０．１秒長く０．９秒かけて移動するように移動速度を変化させた。これにより、この実施形態では、上記のような温度差を解消若しくは最小にするように工夫している。【０１６８】
図４２Ｂは、このような構成による温度制御の結果を示したグラフである。【０１６９】
このグラフに示す線（Ｖ）と（ＶＩ）は、それぞれ、容器１１が特定の固定熱源に停止した場合に、回転方向手前側に位置する反応槽１２（Ｖ）と回転方向先端側に位置する反応槽１２（ＶＩ）の温度プロファイル（縦軸に温度、横軸に経過時間）を示したものである。【０１７０】
このグラフに示すように、低温側では乖離温度を７℃に設定しているにも関わらず、２つの反応槽１２は共に５０℃という同じボトム温度を達成している。また、中温においても、２つの反応槽１２の温度は共に７５℃に制御されている。一方、高温側においては、目標温度９０度以上に対して、２つの反応槽１２間で温度差が生じているが、高温は２本鎖のＤＮＡを熱で乖離させる反応であって、９０℃以上であれば温度に差があっても反応上問題にならない。この実施形態では、このことを利用し、低温と中温が共に設定温度になる移動時間を設定したものである。【０１７１】
すなわち、一般的に、各熱源に温度差があることに着目して移動速度を変えるとしても、同じ容器上の反応槽なのでひとつの熱源に対して移動時間を変更しても、その変更は他の部分も同様になる。すなわち１つ目と２つ目の熱源での動的熱移動はそれぞれの影響を考慮して速度調節で解消することはできるが、３つ目も同様に影響を回避するという設定はできない。しかし、ＰＣＲに必要な３温度のうち、低温と中温は一定の温度である必要があるが、高温は２本鎖のＤＮＡを熱で乖離させる反応であって、９０℃以上であれば温度に差があっても問題ないのである。【０１７２】
なお、熱源の動的温度変化があっても、各反応ウエルの熱履歴を同等にする方法は、容器を定速で連続回転するという方法によって達成されても良い。【０１７３】
（酵素速度）
以上が核酸増幅を高速化するための、本発明の骨子であるが、他にも留意すべきことがある。特に明記したいのは上記中間温度にて塩基伸長が起こるのであるが、熱サイクルが高速に設定された場合、使用するポリメラーゼの塩基伸長能力が十分でないと目的の増幅が行われない場合がある。ＰＣＲで汎用的に使われているＴａｑは、５０塩基／秒程度の能力であって５分以下の高速ＰＣＲでは不十分な場合がある。そこでＴａｋａｒａのＺ−Ｔａｑや東洋紡のＫＯＤ−Ｄａｓｈなどの１００塩基／秒以上のポリメラーゼを使用することが好ましい。【０１７４】
（蛍光測定装置）
次に、前記蛍光測定装置２７の構成について説明する。【０１７５】
図１３は、蛍光測定装置２７と測定対象である反応槽１２との関係を模式化して示すものである。この蛍光測定装置２７は、励起光発生部４５と、反射部４６と、光電子倍増管部４７とからなる。励起光発生部４５は、内部にＬＥＤによる励起光源４８が上向きに設置され、発生した励起光を励起光フィルター４９を通して上にある反応容器１１の反応液に照射する。反射部４６は、反応液から発せられた蛍光をミラー５０で光電子倍増管部４７に向けて反射し、蛍光フィルター５１で必要な波長光のみに絞る。光電子増倍管部４７は、このようにして反射部４６によって導かれた蛍光を測定する。【０１７６】
この蛍光測定装置２７は、上記反応容器１１の半径方向に沿って移動する移動テーブル２８によって保持されており、非計測時は反応容器外に位置し、蛍光測定時のみ反応槽１２に対抗する位置に移動して計測を行う。図１４に示す様に、この蛍光測定装置２７及び移動テーブル２８は、低温側固定熱源１０ａと、中間温度固定熱源１０ｂとの間に設けられた隙間５２に対応するように配置され、反応槽１２がこの隙間に来るタイミングに同期して各反応槽１２の測定を実行するようになっている。【０１７７】
蛍光の測定は、一定温度における蛍光の時間的変化を見ることで、いわゆるリアルタイムＰＣＲを行う事もできるし、核酸増幅後のゆっくりした昇温で蛍光が消えていく温度（乖離温度）をみれば、増幅された核酸が何か同定できる。【０１７８】
なお、蛍光測定には貫通型と反射型があるが、測定感度も向上するのでこの実施形態のような反射型が好ましい。この実施形態では、反射効率を高めるため、反応槽１２の内側面も金属反射膜５４をつけているが、反応容器基板３７や上側閉塞板３９を遮光性材料で形成してもよい。一方、下面側のフィルム３８は、一部もしくは全体が透光性となっている。【０１７９】
（装置の操作と制御）
次に、この装置の操作と動作について説明する。【０１８０】
図１５は、この装置の制御系統を示すためのブロック図である。【０１８１】
すでに説明した構成要素については同じ符号を付してその説明を省略する。このブロック図で示された各構成のうち、メイン制御部５５、情報表示部５６、入力部５７及び記憶部５８は、実質的にはコンピュータで構成されて、図４に示した装置の前面パネル５４下に組み込まれている。【０１８２】
情報表示部５６は具体的には液晶パネルであり、入力部５７はこの液晶パネルに設けられたタッチセンサもしくはキー入力部である。メイン制御部５５は、ＣＰＵやＲＡＭで構成される演算装置であり、メインプログラム５９と、温度乖離演算部６０と、回転駆動モード演算部６１と、リアルタイムＰＣＲ計測処理部６２とを有する。メインプログラム５９は、制御に必要な情報入力要求をオペレータに示し、オペレータから入力された情報は、ハードディスク等からなる記憶部５８に格納される。すなわち、この記憶部５８は、運転モード６３、熱サイクル時間６４、熱サイクル回数６５、反応液の温調目標温度６６、ＰＣＲリアルタイム測定結果６７を格納する。【０１８３】
メイン制御部５５には、前記ヒータ温度制御部２９、回転モータ制御部３０及び蛍光計測制御部３１が接続されている。また、各熱源１０ａ〜１０ｃに設けられたセンサ６８ａ〜６８ｅも前記メイン制御部に接続されており、前記メイン制御部５５はセンサからの検出値に基づいて各構成要素にフィードバック制御をかけるようになっている。
（動作フロー）
以下、この装置の動作をフローチャート等にしたがって説明する。なお、図中の符号Ｓ１〜Ｓ１７は、以下のステップＳ１〜Ｓ１７に対応する。【０１８４】
図１６は、操作手順を示す動作フローチャ−トである。【０１８５】
まず、電源を入れると（ステップＳ１）、操作設定処理工程において、運転モードを設定する（ステップＳ２）。この装置は、運転モードを選ぶことで、ＰＣＲ反応だけを選択する他に、逆転写反応をするかどうか、ホットスタートをするかどうか、熱乖離測定を行うかどうかを選択できるようになっている。ただし、リアルタイム蛍光測定は常に行うようになっている。【０１８６】
この操作設定処理（ステップＳ２）では、反応モードの他に、熱サイクル時間、熱サイクル回数及び反応液温調目標温度等を設定する。これらの設定入力は、前記情報表示部５６及び入力部パネル５７を通して対話的に行われ、すべての情報は、前記メイン制御部６５によって記憶部５８に格納される（図１５参照）。【０１８７】
操作設定処理が終了したならば、この装置は、前記温度乖離演算部６０によって必要な乖離温度が演算され、また、前記回転駆動モード演算部６１によって各温度熱源への移動速度や各熱源上での停止時間などの適切な回転モードが演算・設定される。【０１８８】
これにより、設定完了すると（ステップＳ５）、動作が開始され、前記ヒータ温度制御部２９を通して上記熱源１０ａ〜１０ｃが昇温駆動される。熱源１０ａ〜１０ｃが所定の温度になり準備完了状態になったら、上蓋１３をあけ、反応容器１１を挿入して蓋を閉めた後に前記入力部パネル５７からスタートを指定する。その後は選択されたモードに従い、下記に説明するように必要な反応処理が順次行われる。【０１８９】
まず、１方向連続運転か（ステップＳ８）が判断される。１方向連続運転を選択した場合には、ＰＣＲ反応処理のみが実行される。【０１９０】
一方向連続以外の場合には、次に逆転写処理有りかが判断され（ステップＳ９）、逆転写処理有の場合には、ＰＣＲサイクルの前に、逆転写処理が実行される（ステップＳ１０）。この処理においては、まず、低温側熱源１０ａを逆転写の温度に設定し所定時間保持する。その後、高温側熱源１０ｃにて高温処理され逆転写酵素を失活させる。【０１９１】
次に、この装置にてホットスタートＰＣＲを行う場合は、高温処理有りかが判断され（ステップＳ１１）、ＰＣＲサイクルの前に高温側熱源１０ｃにて所定時間保持（高温処理：ステップＳ１２）された後に、ＰＣＲサイクル（ステップＳ１３以下）に移行する。【０１９２】
次に、ステップＳ１３のＰＣＲ処理が実行される。このＰＣＲ処理を示したのが、図１７に示すフローチャートである。この図１７の各ステップ（Ｓ１８〜Ｓ２４）を順次実行することで、上記温度乖離演算部６０で計算された高温側熱源温度ＴＨ１、低温側熱源温度ＴＬ１、中間熱源温度ＴＭ、および前記回転駆動モード演算部６１で決定された各熱源位置での時間時間を、設定されたサイクル繰り返すことができると共に、各反応槽１２が低温側熱源１０ａと中間熱源１０ｂとの間の隙間５２を移動する間に、蛍光測定装置２７で反応液の蛍光測定を行うことができる。【０１９３】
この測定値は、前記記憶部に順次蓄積されていく。なお、例えばネットワークを通して他のコンピュータにリアルタイムに転送することも可能である。【０１９４】
なお、この工程でリアルタイムで蛍光測定をせず、ＰＣＲ処理のみを行うようにしても良い。この場合には、後のステップＳ１６で熱乖離測定処理を実行しても良い。図１９は、この熱乖離計測処理を示すフローチャートである。【０１９５】
この工程が開始すると（ステップＳ３０）、まずＰＣＲの終了を低温側熱源１０ａの位置で止め低温側熱源１０ａおよび中間温度熱源１０ｂが共に熱乖離開始温度になるまで所定時間待ち、その後３０秒保持する（ステップＳ３１）。その後両熱源を設定された昇温速度で昇温して行き、所定の秒数毎に低温側熱源と中間温度熱源の間を移動し移動中に蛍光測定する（ステップＳ３２〜Ｓ３５）。【０１９６】
なお、この装置は、上記の実施形態で説明した形状の反応容器以外の反応容器にも適応可能である。【０１９７】
例えば、図６、図８Ａ，図８Ｂで示した容器では、反応槽内を周辺の大気よりも高圧にしつつ密閉するために送液孔と密閉栓をそれぞれ１つずつ用いたが、例えば、図２０、図２１Ａ，図２１Ｂに示すように送液孔３３と空気抜き孔７０をそれぞれ独立させて設け、それぞれに密閉栓４０，７１を挿入するようにしてもよい。このような構成によれば、より確実な動作を得ることができ、また、２つの密閉栓４０，７１を用いることで、内圧コントロールの自由度が上がる。【０１９８】
図８Ｂの栓４０の側面部の一部には溝４０ａが切られている。送液孔に反応液を入れ、栓４０を挿入し押し下げていくと、栓４０の底から溝４０ａまでの部分は送液孔壁３３とでシールされているため、反応液は押し下げに伴い送液孔から反応槽１２に送られていく。【０１９９】
送液に伴う内圧の高まりを回避するため、反応槽１２内の空気を、空気抜き溝３５から、送液穴３３上部の３３ａを経由して溝４０ａを通じて空気を外部に逃がす。その後も栓４０の押し下げを続けると、やがて溝４０ａは溝３５からの通気孔３３ａを塞いでしまい、栓４０を最下まで押し下げることにより、送液の完了と一定の内圧を加えることができる。【０２００】
なお、図２１Ｂは、送液と内圧コントロールを別の栓で行うことで溝４０ａの設計に自由度が増す例である。【０２０１】
また、図２２、図２３Ａ，図２３Ｂに示すように、図６のものに加えて送液通路３４と大気解放通路３５に封止剤を導入するための封止剤導入用孔７２を設けてもよい。このような構成によれば、この封止剤導入用孔７２に密閉栓７５を押し込むことで、封止剤導入用孔７２内の封止剤を通路７３，７４を介して送液通路３４と大気解放通路３５に充填することができる。この封止剤は所定の条件で硬化するような材料である。これにより、上記反応槽１２の独立性および密閉性をさらに高めることができる。【０２０２】
また、上記図６、図２０、図２１の反応容器１１では、上記反応槽１２の上面および下面を予め閉塞しておき、送液孔３３から送液通路３４を通して反応液を満たすようにしていたがこれに限定されるものではない。たとえば、送液孔３３を用いず、上記反応槽１２に直接反応液を充填するようにしても良い。図２４の例は、８つの反応槽１２が互いに離間した状態で独立的に設けられている例である。この場合、例えば、上面閉塞板３８は例えば柔軟性のあるシートであり、このシートを本体基板３７の上面に添付することにより、反応液が満たされた各反応槽１２を一括的に閉塞することが可能になる。【０２０３】
また、このような反応槽１２が、図２５に示すように全周に亘って設けられているものであってもよい。この場合、超多検体の検査などに応用が可能となる。図２５のような反応容器１１の場合、１方向に連続的に回転させることで各反応槽１２内の反応液に熱サイクルを与えることができる。このようにして容器１１を１方向のみに連続的に回転させると、各反応空隙の熱サイクルは最初の１サイクルだけは、高温から始まるもの、低温から始まるもの、中間温度から始まるものという３種類になるが、ＰＣＲプライマーを適切に選択すればこの違いは問題にならないことから、一度に超多検体を処理することが出来る。この図２５の反応容器に適合する熱源配置の別の例を図２６に例示した。すなわち、熱源１０ａ〜１０ｃの面積比は任意であり、上記実施形態のように１２０度間隔とすることもできるが、この図に示すように、各熱源の面積を温度滞留時間比（たとえば高温側熱源：低温側熱源：中間温度熱源＝１：１：４程度）としておけば多検体でも３０サイクル３分程度でＰＣＲが行える。【０２０４】
このような反応容器の反応槽１２の部分を拡大して示したのが図２７である。【０２０５】
多検体用容器の場合、各反応槽１２は比較的小さくなるので反応液を入れたあとで表面の閉塞部材３８を貼る時に、反応液が容器基板３７上面に一部こぼれて接着が巧く行かないことが考えられる。本発明者らは、この対策に苦慮し種々の方法を試した結果、図２７に示した様に反応空隙の上面周囲に高さ約０．１ｍｍの段差７７を設け、そこを疎水処理することでこの問題を解決した。表面閉塞部材のフィルム３８下面（図に３８ａで示す部分）にも疎水処理を行う事が好ましい。段差部７７があって更にそこが疎水性だとフィルム３８（３９）で反応液を押し付けた時に反応槽１２の外周に空気がリング状に残って接着面に反応液が侵入するのを防ぐことができる。これによりフィルム貼り付けの失敗を無くす事ができる。【０２０６】
この液漏れ防止対策は、極めて重要なことで、実用面では、図２５に示すような全周独立反応空隙に液を入れてから表面閉塞部材を貼る独立式容器には必須である。その場合、一度に６０もの反応空隙に反応液を入れることになるが、各独立空隙は互いに近く、わずかの漏れでも結果の信頼を失うことになるからである。検査の対象は結果が命に係ることや、漏れた液に接触した場合命の危険に遭遇する場合もあるからである。【０２０７】
なお、図２４や図２５に示した多検体反応タイプの容器を用いて蛍光測定を行う場合には、上記蛍光装置を各反応槽に対向させる必要がある。この場合の蛍光測定装置２７の制御を示したのが図１８のフローチャートである。すなわち、この図に示すように、ステップＳ２５〜Ｓ２９で、蛍光測定ヘッドを反応容器１１の半径方向に往復動させ、順次外周側の反応槽１２と内側の反応槽１２とに順次対向させて蛍光測定を行うことができる。【０２０８】
（第２の実施形態）
次に、この発明の第２の実施形態を図２８〜図３０を参照して説明する。【０２０９】
図２８Ａは、この第２の実施形態にかかる装置の平面図、図２８Ｂは正面図、図２９は動作フロー図、図３０は、この装置で用いる矩形平板形状の反応容器１１'である。【０２１０】
すなわち、上記第１の実施形態では、円板形状の反応容器を用いこれを回転させることで反応および計測を行っていたが、この第２の実施形態の装置は、図３０の反応容器を回転させず、一方向に移動させることで前記第１の実施形態の装置と同様の動作をさせるものである。【０２１１】
原理や動作は全て第１の実施形態と同じであるが、固定熱源１０ａ〜１０ｃが円周上ではなく、直線上に並んでいる点で第１の実施形態と異なる物である。【０２１２】
蛍光測定装置２７も第１の実施形態と同じ機構のものが熱源部１０ａと１０ｂとの間に設置されている。熱源１０ａ〜１０ｃの隣には、容器保持部７８が設けられており、前記矩形平板状反応容器１１'を保持してガイドに沿って図に矢印７９で示すように往復することでＰＣＲ反応を行うようになっている。なお、容器保持部７８は、図示しない溝に前記反応１１'容器を差し込み、容器ストッパーでこれを固定することで、移動中の反応容器１１の脱落を防ぐように構成されている。【０２１３】
この装置によるＰＣＲ反応処理手順・制御方法は図２９のフローチャートに示すものであるが、上記容器が直線的に移動する以外は、前記第１の実施形態と同じであるので、その説明はあえて省略する。【０２１４】
（第３の実施形態）
次にこの発明の第３の実施形態について図３１〜３６を参照して説明する。【０２１５】
図３１は装置７９を示す側面図、図３２はこの装置で使用する反応容器８１、及び図３２はこの反応容器に対応する熱源８０を示す平面図である。【０２１６】
前記第１、第２の実施形態は、反応容器８１を熱源８０に対して移動させることで反応液に熱サイクルを与えるものであったが、この実施形態においては反応容器と熱源の位置関係を一定に保ったまま、反応容器に設けた流路内で反応液を移動させることでこの反応液に熱サイクルを与えるものである。【０２１７】
すなわち、図３２Ｂに示すように、前記流路容器は厚さ２．５１ｍｍの矩形の平板であり、厚さ２．５ｍｍのポリカーボネート成形品本体部に厚さ１０μｍのポリカーボネートフィルムを貼り付けて構成されている。容器の一端部には反応液を入れたシリンジを挿入する液入り口９３が設けられ、この液入り口９３から導出された流路溝が、反応容器８１の他端部に設けられたＰＣＲ液着観察窓９６まで延びている。この流路溝は、幅２００μｍ深さ５０μｍの流路溝であり、前述したポリカーボネートフィルムで上端開口を閉塞されることで反応液の流路として区画・構成される。【０２１８】
反応液は、この流路溝に上記液入り口９３からＰＣＲ液着観察溝９６に向かって流されることで、ＰＣＲ反応および観察の一連の工程がなされるようになっている。ここで、流路は、図３２のように容器内を幅方向に蛇腹形に往復するように形成され、これによって、３つの領域、すなわち、逆転写領域９９、酵素失活領域１００、ＰＣＲ領域１０１を構成するようになっている。【０２１９】
前記ＰＣＲ液着観察溝９６が設けられた反応容器８１の他端部には、電気泳導を行うための泳導液入口９７と泳導液着観察口９８とが互いに離間して設けられ、これらは上記とは別の流路溝で繋がれている。また、図に示すように、上記２つの流路溝は泳導液着観察口９８の近くで交差した状態で繋がっている。さらに、反応容器８１の他端部には、液着観察口９４、９５が設けられている。液着観察口９４、９５は、流路内の液がどこまで到達したかを目視するためのもので、流路内での液溜りとなっている。また、流路容器端面には電極ａ〜ｄが設けられており、この電極は容器一側部に露出している。各電極ａ〜ｄはそれぞれ液着観察口ａ９４、泳導液着観察口９８、ＰＣＲ液着観察窓９６、泳導液入口９７まで容器８１内で配線され、液と接触する構造となっている。【０２２０】
以下の動作説明では、説明簡略化のために、窓Ａ＝液入り口９３、窓Ｂ＝液着観察口ａ９４、窓Ｃ＝液着観察口ｂ９５、窓Ｄ＝ＰＣＲ液着観察窓９６、窓Ｅ＝泳導液着観察口９８、窓Ｆ＝泳導液入口９７として記述する。【０２２１】
一方、図３２Ｃは、上記反応容器８１を加熱するための熱源８０である。この熱源８０は、流路容器８１の真下に配置され、上記反応容器の各部位に対応して、逆転写用８９、酵素失活用９０、ＰＣＲ高温用９１、ＰＣＲ低温用９２の各熱源部を有するものである。各熱源部８９〜９２の温度は、温度コントローラーにより、それぞれの反応に対応した温度に制御される。【０２２２】
この装置は、図３１に示すように、前記熱源８０の上に反応容器８１を設置し、おさえ蓋８２と熱源８０とを容器ロック８３によって互いに圧接する方向に駆動する構造となっている。反応液を入れたシリンジ８４をシリンジ支持ブロック８５にセットし、おさえ蓋８２に開いた穴から流路容器８１のシリンジ挿入口に差込み、シリンジに付属しているピストン部８６をピストン押し下げブロック８７により押し下げることで、容器内に送液するように構成されている。ピストン押し下げブロック８７は、１軸移動テーブル８８に付属の図示されていないステッピングモーターにより上下させられる。送液速度、言い換えるとステッピングモーターの速度は制御部内のマイコンによりコントロールされる。【０２２３】
電気泳導については、泳導熱源部で所要の電圧を発生させ、流路容器の電極Ａ〜ｄに対応する位置の、図示していない装置側電極が熱源部横にあって、おさえ蓋８２をロックした時に容器と装置側電極が接触して通電する構造となっている。【０２２４】
電気泳導の結果を見るための蛍光検出機構は、実施例の機械には組み込まれておらず、蛍光測定部の穴に、ビー・エー・エス社のＵＳＢ４０００スペクトロメータと光源に接続した反射光測定プローブを挿入して外部計測する。装置は、これ以外に、全体を制御する制御部や操作部ほかをもって構成されている。【０２２５】
図３３〜図３５は、この装置の動作を示すフローチャートである。【０２２６】
図３３は、メインのＰＣＲ反応処理を示すフローチャートである。【０２２７】
まず、この装置で反応容器におけるＰＣＲ反応などを開始する場合、上記のように反応容器をセットし、おさえ蓋８２をロックした後、反応液が入ったシリンジ８４をセットしスタートボタンを押す。すると、反応液が窓Ａに到達するまでは、ピストン押し下げブロック８７が高速で降下する。窓Ａへの到着は予め実験で確定させた送液時間により操作部のマイコンが判断する。その後ピストン押し下げブロック８７は所定の送液速度が得られるように低速で降下を続ける。液が窓Ｄに到達したであろう時間が経過したら送液を停止しブザーで反応終了を知らせる。【０２２８】
次いで、図３４に示すように、流路容器８１を取り出し、電気泳導用アガロースゲルを窓Ｅに見えるまで窓Ｆから注入し、再び流路装置にセットする。この時、反応液がこれ以上移動しないようにシリンジは外したままとする。図３５に示すように、次に電気泳導スタートボタンを押すと、窓Ｃから窓Ｄに向かって１次電気泳導電圧を掛けて一定時間後に停止する。続いて窓Ｅから窓Ｆに向かって２次泳導電圧を印加開始する。その後設定された２次電圧印加時間が経過したら全ての処理を停止させる。【０２２９】
（第４の実施形態）
次にこの発明の第４の実施形態について説明する。【０２３０】
前記第１、第２の実施形態は反応容器を移動させ、第３の実施形態では反応液を移動させることで反応液に所定の熱サイクルを与えるように構成されていたが、この第４の実施形態の装置は、容器も反応液のどちらも移動させない構成となっている。【０２３１】
図３６は装置側面図、図３７は装置上面図、図３８は装置正面図である。【０２３２】
図３６において、１１０で示すのが反応容器である。反応容器１１０は、図２７に示すような形状であり、独立型の反応槽１２が一以上形成されている。このような形状の反応容器１１０が上下を逆にした状態で熱源１１１の上に設置されるようになっている。【０２３３】
この装置において、反応は固定容器１１０に封入された反応液に所定の熱を与えて行い、ＰＣＲ法の場合、反応の進行は蛍光装置で確認し、ＬＡＭＰ法の場合は目視で白濁しているかどうかで判断できるように構成されている。【０２３４】
加熱も冷却も、熱源１１１はペルチェ素子１つだけで行う。熱源１１１の上に容器１１０を置き、図３７に示すように、励起光照射光軸１０２を妨げないように貫通穴が開き穴の周囲を反射用金属膜で遮光した硬質ガラス製ガラス加圧部材１０４をかぶせ、装置構造左断面図にあるロック機構１０６で、熱源１１１と固定容器１１０を圧接するように固定する構造となっている。蛍光測定部１０４は、図１３の構造と上下が逆で移動テーブルの代わりに図３７に示したヒンジ構造１０５でベースに取り付けられている。反応容器１１０をガラス透明部材で固定した後に、ヒンジ１０５を利用して手で上から降ろしてガラス透明部材の上に位置させる。装置は、これ以外に、全体を制御する制御部１０７や操作部１０８ほかをもって構成されている。【０２３５】
図３９は、動作フローを示すフローチャートである。【０２３６】
この図に示すように、基本的に、反応条件などを設定し、反応液を入れた固定容器をセットし蛍光測定部をかぶせた後、スタートボタンを押すと自動的に反応が行われるようになっている。【０２３７】
ＬＡＭＰ法の場合は所定の温度に対応する温度で所定時間保持するだけで、その後白濁の有無で反応結果を判定する。ＰＣＲ法の場合は、高温→低温→中間温度という温度に対応する熱源により所定の温度で所定の時間保持するというサイクルを所定の回数繰り返す。各サイクルのＬ温終了時点で蛍光測定を行って反応の進行を判定する。【０２３８】
以上、第１〜第４の実施形態について説明したが、次に、実施例として、反応容器の寸法、使用した反応液等について、記載する。
（円板装置用反応容器）
「円板装置用反応容器」は、第１の実施形態で用いた反応容器である。【０２３９】
いずれも直径が１２０ｍｍ厚さ０．６ｍｍのポリカーボネート製の射出成形による円板であって、中央部には回転軸を合わせる円形の穴が開いている。【０２４０】
以下、便宜上、形状の異なる「円板装置用反応容器」を、それぞれ、「８ウエル容器」、「全周容器」、「ａ容器、ｂ容器、ｃ容器」と称する。【０２４１】
〔８ウエル容器〕は、図２４に示す容器のことであり、全体が透明な平板で、外周の120度の扇形の範囲に円周状に４つずつ、２列で合わせて８個の円形の凹部を有する。それぞれの凹部は、底の厚さが０．２ｍｍであって、上端面には深さ０．１ｍｍの円周状段差を２段儲け、反射用金属膜でコーテイングしたうえで段差部分を疎水処理した。【０２４２】
各凹部に反応液を入れた後に、厚さ１００μｍのフッ素樹脂フィルムを接着して反応に供する。【０２４３】
〔全周容器〕は、図２５に示す容器のことであり、６０個の凹部が容器全周に渡って配置されていることと、各凹部の遮光を確実なものにするために素材の色が黒色であることを除けば８ウエル容器と同様である。【０２４４】
「ａ容器、ｂ容器、ｃ容器」は、８ウエル容器と同じ透明ポリカーボネート樹脂製の基板とフッ素樹脂フィルムを基本構成としている。いずれも反応用空隙の他にそれに対応した送液空隙を有し、送液時の空気逃しとその後の反応用空隙回りの細溝部の密閉方式の違いで、図６に示すものが「ａ容器」，図２０に示すものが「ｂ容器」，図２２に示すものが「ｃ容器」となっている。ａ，ｂ，ｃの反応用空隙が８ウエル容器と異なる点は、凹部上端面の段差が無いことと疎水処理ではなく親水処理がされていることである。
【０２４５】
各空隙を繋ぐ溝は深さ５０μｍ幅２００μｍで全て親水処理が行われている。反応用空隙以外の空隙はいずれも基板面より円筒状に立ち上がりゴム製の密閉栓を押し下げて密閉する構造とした。【０２４６】
下側に貼付された伸縮性フィルムは、１００μｍのフッ素樹脂フィルム、上側に添付された上側閉塞基盤は１ｍｍ厚のポリカーボネート製基板である。
（平板容器）
「平板容器」は、第２の実施形態で用いた図３０に示す反応容器である。【０２４７】
平板容器は、まず正方形で厚さ０．６ｍｍの平板に、底の厚さが０．２ｍｍの円形の４つの凹部があって、上端面には深さ０．１ｍｍの円周状段差を２段設けたものを、硬度９０度の黒色ウレタン樹脂で真空下で注型成形した。表面を反射用金属膜でコーテイングしたうえで凹部全体を疎水処理した。各凹部に反応液を入れた後に、厚さ１ｍｍの透明ポリカーボネート樹脂平板を接着した上で黒色ウレタン側を伝熱面に、透明ポリカーボネート側を蛍光測定側として反応に供した。【０２４８】
（流路容器）
「流路容器」は、第３の実施形態で用いた図３２に示す反応容器である。【０２４９】
流路容器は厚さ約２．５ｍｍの矩形の平板である。【０２５０】
流路パターンは図３２Ｂに示すようなもので、全体は幅２００μｍ深さ５０μｍである。しかし液着観察窓口２とＰＣＲ流路をつなぐ流路の１０ｍｍの部分は深さ幅共に１０μｍに強く絞り、またＰＣＲ部分も深さ幅共に５０μｍとなっている。これは本実施例では、流路出口に圧力をかけることはせず、液の流動背圧で流路内を加圧するための形状である。この溝形状を有する２．５ｍｍの成形品を透明ポリカーボネート樹脂で射出成形した。この時、銅製の配線用部品を金型にインサート成形して、射出成形と同時に必要な配線部分を形成した。更に流路溝側に厚さ１０μｍのポリカーボネートフィルムを貼り付けて反応に供した。【０２５１】
（固定容器）
固定容器は、第４の実施形態で用いた反応容器である。【０２５２】
まず正方形で厚さ０．６ｍｍの平板の中心に、底の厚さが０．２ｍｍの円形の凹部が１つあり、上端面には深さ０．１ｍｍの円周状段差を２段設けたものを透明ポリカーボネート樹脂で射出成形した。表面を反射用金属膜でコーテイングしたうえで凹部全体を疎水処理した。凹部に反応液を入れた後に、厚さ１００μｍのフッ素樹脂フィルムを接着して反応に供した。【０２５３】
以上述べてきた容器と熱源の安定接触に関する一連の説明は、容器基板にある反応部が熱源と安定的な接触を得るために、反応部が基板よりフレキシブル性をもって突出するという観点で述べてきた。しかし同じ着眼点ながら、容器のクッション性に注目しないで他の方法を持って全く同じ成果をえることが可能なのでそれについて述べる。【０２５４】
容器基板から反応部が突出することが無いとしても、熱源自体がクッション性をもてば反応部を膨らませなくても同様の効果が得られる。そこで発明者らは、前記固体熱源の表面を、耐熱エラストマーで覆い、容器として８穴のポリカーボネート製基板を用い、伸縮性フィルムの代わりに伸縮性の無い０．３ｍｍの金属板で反応ウエルを封止した状態でPCRを行った。その結果８ウエル共に安定な核酸増幅が達成されたことから熱源のクッション性を確保する事が反応の安定に資することが証明された。熱源を覆うエラストマーとしては耐熱性の観点からフッ素ゴムやシリコンゴムが好適である。【０２５５】
また固体熱源がクッションを有することから、金属基板をそのものをへこませた容器を作成し、フィルムで表面を覆う場合などは、フィルム側だけでなく、金属性の容器の底も熱源に接触させることで更に良好な伝熱を実現することもできる。
【実施例】
【０２５６】
（反応液）
反応に供する反応液の配合は表１に示した６種類を用いた。【０２５７】
【表１】
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【０２５８】
反応に必要な目的温度と実際に熱源に設定する温度とは乖離があるので、以下の実験例では、反応目的温度（熱源設定温度）と表記する。例えば９５℃で反応したい時に熱源を１１０℃に設定して反応を行った場合、９５℃（１１０℃）と表記することになる。【０２５９】
〔実験１〕
反応液１を８ウエル容器に入れ、円板装置（第１の実施形態）でＰＣＲ反応を行った。高温熱源９５℃（１１８℃）に０．５秒、低温熱源５５℃（３６℃）に０．５秒の２温度ＰＣＲ３０サイクルを行った。反応時間は容器回転時間を含め全体で１分６秒であった。光電子増倍管によるリアルタイム蛍光検出の８ウエル平均出力電圧は、熱サイクル前が２．９５ｍＶ、反応後は３．４２ｍＶで核酸増幅が正常に行われていたことが確認できた。【０２６０】
〔実験２〕
反応液３を８ウエル容器に入れ、円板装置で逆転写から検出までの一貫ＰＣＲ反応を行った。中温熱源３７℃（３７℃）に２分置いて逆転写反応を行う。次に高温熱源９５℃（1００℃）で３０秒保持し逆転写酵素を失活させた。低温熱源５５℃（３６℃）に０．５秒、中温熱源７２℃（７７℃）に３秒、高温熱源９５℃（１１８℃）に０．５秒、の３温度ＰＣＲ３０サイクルを行った。反応時間は容器回転時間を含め全体で５分２５秒であった。核酸増幅ＰＣＲ単独では２分５４秒であった。光電子増倍管によるリアルタイム蛍光検出の８ウエル平均出力電圧は、熱サイクル前が３．１１ｍＶ、反応後は３．６８ｍＶで核酸増幅が正常に行われていたことが確認できた。【０２６１】
〔実験３〕
反応液２を８ウエル容器に入れ、円板装置でＰＣＲ反応を行い引き続いて融解曲線を書いて増幅物の同定を行った。高温熱源９５℃（１１８℃）で０．５秒、低温熱源５５℃（５０℃）で３．５秒、中温熱源７２℃（７７℃）で１．５秒の３温度ＰＣＲ３０サイクルを行った。ここで低温熱源時間を延ばし目標温度と熱源実温との乖離を減らす設定にしたのは、熱乖離に移行する際の熱源温度の変更幅を減らして正確な熱管理を行う為である。
２重螺旋核酸の融解曲線分析をおこなう為、ＰＣＲ最後のサイクルに措ける熱源の設定は通常と異なる。ＰＣＲ２９サイクル低温処理後に低温熱源は５５℃設定に変更する。３０サイクル最後の高温処理後に高温熱源は９５℃設定に変える。その結果、３０サイクル終了後の高温熱源は９８℃だったので、そのまま高温熱源上で１秒熱乖離を行い、低温熱源は５４℃だったのでそのまま３０秒保持した後、低温熱源を０．２℃／秒で昇温させ、２秒に１回ずつ蛍光測定を行った。得られた蛍光の８ウエルの平均値を微分グラフ化したところ８８．１℃に下向きピークが読み取れた。これは増幅した２５０ｂｐのＤＮＡ乖離温度８８．２℃とほぼ同等なので、目的の増幅が行われた事が確認できた。【０２６２】
〔実験４〕
また、各温度熱源への移動速度を変化させた場合のＤＮＡ増幅も行った。中温熱源から高温熱源への移動を０．８秒、高温熱源から低温熱源への移動を１．０秒、低温熱源から中温熱源への移動を０．９秒かけて移動するように移動速度を変えて反応を行った。この反応によっても、手前と先のウエルが全く同等のＤＮＡ増幅をしていることを電気泳動によって確認した。【０２６３】
〔実験５〕
反応液５を８ウエル容器に入れ、エマルジョンＰＣＲ反応を行った。高温熱源９５℃（１１８℃）で０．５秒、低温熱源５５℃（３６℃）に０．５秒、中温熱源７２℃（７７℃）に０．５秒の３０サイクルを行い、反応後にエマルジョンからＤＮＡ抽出を行い、電気泳導を行ったところ目的の核酸増幅ができていることが確認された。【０２６４】
〔実験６〕
反応液２をａ容器の送液空隙に入れ、送液・密封後にＰＣＲ反応を行った。反応液１５μｌを送液空隙に入れ、送液空隙用密封栓を下まで押し下げ、そのまま円板装置にセットし次の条件でＰＣＲ反応を行った。高温熱源９５℃（１１８℃）で０．５秒、低温熱源５５℃（３６℃）に０．５秒、中温熱源７２℃（７７℃）に１．５秒の３０サイクルを行った。光電子増倍管による反応前後の電圧が０．５２ｍＶ増加したことから目的の増幅が確認された。【０２６５】
〔実験７〕
反応液２をｂ容器の送液空隙に入れ、送液・密封後にＰＣＲ反応を行った。反応液１５μｌを送液空隙に入れ、送液空隙用密封栓を下まで押し下げ、続いて大気開放空隙用密封栓も下まで押し下げ、そのまま円板装置にセットし次の条件でＰＣＲ反応を行った。高温熱源９５℃（１１８℃）で０．５秒、低温熱源５５℃（３６℃）で０．５秒、中温熱源７２℃（７７℃）で１．５秒の３０サイクルを行った。光電子増倍管による反応前後の電圧が０．５１ｍＶ増加したことから目的の増幅が確認された。【０２６６】
〔実験８〕
反応液２をｂ容器の送液空隙に入れ、送液・密封後にＰＣＲ反応を行った。反応液１５μｌを送液空隙に入れ、送液空隙用密封栓を下まで押し下げ、続いて大気開放空隙用密封栓も下まで押し下げた。続いて封止空隙にシリコングリースを入れて、密封空隙用密封栓を下まで押し下げて、そのまま円板装置にセットし次の条件でＰＣＲ反応を行った。高温熱源９５℃（１１８℃）で０．５秒、低温熱源５５℃（３６℃）で０．５秒、中温熱源７２℃（７７℃）で１．５秒の３０サイクルを行った。光電子増倍管による反応前後の電圧が０．４７ｍＶ増加したことから目的の増幅が確認された。【０２６７】
〔実験９〕
反応液１を全周容器に入れ、円板装置でＰＣＲ反応を行った。１方向連続モードで高温熱源９５℃（１１８℃）、低温熱源５５℃（３６℃）、中温熱源７２℃（７７℃）とし、１サイクル３．３秒の３０サイクルを行った。反応時間は全体で１分３９秒であった。６０の反応空隙の光電子増倍管による反応前後の電圧増は、平均０．３３ｍＶで標準偏差０．０３ｍＶであり、全ての反応空隙で良好な核酸増幅が行われたことが確認された。【０２６８】
〔実験１０〕
反応液２を平板容器に入れ、平板装置（第２の実施形態）でＰＣＲ反応を行った。高温熱源９５℃（１０２℃）で２秒、低温熱源５５℃（４３℃）で２秒、中温熱源７２℃（７６℃）で２秒の３０サイクルを行った。反応時間は全体で３分５９秒であった。光電子増倍管による反応前後の電圧が０．５４ｍＶ増加したことから目的の増幅が確認された。【０２６９】
〔実験１１〕
流路装置（第３の実施形態）で反応液４を用い逆転写から電気泳導までの反応を行った。流路装置に流路容器をセットし、専用シリンジに反応液４を入れて流路容器の液入り口に差し込んでスタートさせた。反応時の送液速度は０．０１２μｌ／秒である。逆転写熱源３７℃（３７℃）で逆転写反応を行う。計算上２分の通過時間である。次の逆転写酵素失活熱源は９５℃（1００℃）で、計算上３０秒の通過時間である。ＰＣＲ部は低温熱源を５５℃（５１℃）、高温熱源９５℃（９９℃）として３０サイクルで４分程度の通過時間を要する。６分４０秒後に流路容器を取り出し、泳導液入り口から電気泳導用アガロースゲルを注入し泳導側着液観察口まで送った。その後流路装置に再セットし電気泳導スタートボタンを押して電気泳導を行った。この間蛍光測定部に挿入した反射光測定プローブとスペクトロメータによってＧ３ＰＤＨ領域の２０８ｂｐのバンドと同時に生成したプライマーダイマーが分離していく状態が観察できた。【０２７０】
〔実験１２〕
反応液６を固定容器（第４の実施形態）に入れ、密封後にＬＡＭＰ反応を行った。６５℃で１時間保持した後、目視によって白濁が確認されたことから、目的の反応が安定的に進んだ事を示している。
（キット）
ＭＲＳＡ（メシチリン耐性ぶどう球菌）検出用として次の構成のキットを作成した。【０２７１】
ユーザーは円板装置を使い、ユーザーが調達可能なポリメラーゼとバッファーを使用してリアルタイムＰＣＲを行う。
８ウエル容器  ５枚
プライマーＭＩＸ  ２０ｍｌ（Ｆプライマー  配列：ＡＡＣＴＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＡＴＧＡＧＴ、Ｒプライマー配列：ＣＣＡＧＣＡＴＴＡＣＣＴＧＴＡＡＴＣＴＣＧ）
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】図１は、核酸増幅法の分類を示す図である。
【図２】図２は、代表的な既存の高速装置を説明するための説明図である。
【図３】図３は、従来装置の熱源別・ＰＣＲ時間を説明するための説明図である。
【図４】図４は、この発明の第１の実施形態の装置を示す概略構成図である。
【図５】図５は、この発明の第１の実施形態の装置を示す概略構成図である。
【図６】図６は、この発明の第１の実施形態の反応容器を示す概略構成図である。
【図７】図７は、この発明の第１の実施形態の熱源の配置を示す概略構成図である。
【図８】図８Ａ、８Ｂは、この発明の第１の実施形態の反応槽を示す概略構成図である。
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、この発明の第１の実施形態の反応容器設置工程を示す概略構成図である。
【図１０】図１０は、この発明の第１の実施形態の反応槽を拡大して示す概略構成図である。
【図１１】図１１は、この発明の第１の実施形態の原理を説明するための模式図である。
【図１２】図１２は、この発明の第１の実施形態の熱乖離式を説明するための説明図である。
【図１３】図１３は、この発明の第１の実施形態の蛍光測定装置を示す概略構成図である。
【図１４】図１４は、この発明の第１の実施形態の蛍光測定装置の配置を示す概略構成図である。
【図１５】図１５は、この発明の第１の実施形態の制御を説明するためのブロック構成図である。
【図１６】図１６は、この発明の第１の実施形態の動作を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、この発明の第１の実施形態の動作を示すフローチャートである。
【図１８】図１８は、この発明の第１の実施形態の動作を示すフローチャートである。
【図１９】図１９は、この発明の第１の実施形態の動作を示すフローチャートである。
【図２０】図２０は、この発明の他の実施形態の反応容器を示す平面図である。
【図２１】図２１Ａ、２１Ｂは、他の実施形態の反応槽を示す概略構成図である。
【図２２】図２２は、この発明の他の実施形態の反応容器を示す平面図である。
【図２３】図２３Ａ、２３Ｂは、他の実施形態の反応槽を示す概略構成図である。
【図２４】図２４は、この発明の他の実施形態の反応容器を示す平面図である。
【図２５】図２５は、この発明の他の実施形態の反応容器を示す平面図である。
【図２６】図２６は、この発明の他の実施形態の熱源配置を示す概略構成図である。
【図２７】図２７は、この発明の他の実施形態の反応槽を拡大して示す断面図。
【図２８】図２８Ａ，Ｂは、この発明の第２の実施形態の装置を示す平面図および正面図である。
【図２９】図２９は、この発明の第２の実施形態の装置を示す正面図である。
【図３０】図３０は、この発明の第２の実施形態で用いる反応容器を示す概略構成図である。
【図３１】図３１は、この発明の第３の実施形態の装置を示す側面図である。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｃは、この発明の第３の実施形態で用いる反応容器を示す概略構成図である。
【図３３】図３３は、この発明の第３の実施形態の動作を示すフローチャートである。
【図３４】図３４は、この発明の第３の実施形態の動作を示すフローチャートである。
【図３５】図３５は、この発明の第３の実施形態の動作を示すフローチャートである。
【図３６】図３６は、この発明の第４の実施形態の装置を示す側面図である。
【図３７】図３７は、この発明の第４の実施形態の装置を示す平面図である。
【図３８】図３８は、この発明の第４の実施形態の装置を示す正面図である。
【図３９】図３９は、この発明の第４の実施形態の動作を示すフローチャートである。
【図４０】図４０は、熱源に発生する温度差を示す図である。
【図４１】図４１は、各温度熱源の温度設定、及びその構成によって各反応槽が受ける温度を説明する図である。
【図４２】図４２は、改善した各温度熱源の温度設定、及びその構成によって各反応槽が受ける温度を説明する図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【国際調査報告】
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