(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物に応じた細胞タンパク質の分解を定めるための方法であって、前記方法は、酵素ドナー（「ＥＤ」）としてのβ−ガラクトシダーゼの小断片および酵素アクセプター（「ＥＡ」）としての前記β−ガラクトシダーゼのより一層大きな断片を採用し、２つの断片は、活性な酵素を形成するために独立して複合化することによって特徴付けられ、前記方法はさらに、前記ＥＤと、前記細胞タンパク質または細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答する前記細胞タンパク質の代替物との融合タンパク質をコード化する遺伝子発現構築物が導入されている真核細胞を採用し、融合タンパク質は、細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答し、前記方法は次の
前記細胞において前記融合タンパク質を前記候補化合物の存在下に発現させること、
前記融合タンパク質を、前記ＥＡおよび検出可能な産物を形成する基質と結合させること、および
前記検出可能な産物を、前記細胞タンパク質の分解の指標として検出することであり、前記検出可能な産物のレベルにおける減少は、前記候補化合物に応じた前記細胞タンパク質の前記分解を示すこと
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞タンパク質はＩκＢである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記候補化合物は膜受容体のためのリガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＥＤはβ−ガラクトシダーゼの３７から９０個までのアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＥＤは、興味ある前記細胞タンパク質のための前記代替物の末端にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は候補化合物の存在下で増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記融合タンパク質は一時的に発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
候補化合物に応じた細胞タンパク質の核に対する転座を定めるための方法であって、前記方法は、酵素ドナー（「ＥＤ」）としてのβ−ガラクトシターゼの小断片および酵素アクセプター（「ＥＡ」）としての前記β−ガラクトシターゼのより一層大きな断片を含む酵素システムを採用し、２つの断片は、活性酵素を形成するために独立して複合化することによって特徴付けられ、前記方法はさらに、前記ＥＤと、前記細胞タンパク質または細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答する前記細胞タンパク質の代替物との融合タンパク質を含む遺伝子発現構築物が導入されている真核細胞を採用し、融合タンパク質は、細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答し、前記方法は次の
前記細胞において前記融合タンパク質を前記候補化合物の存在下に発現させること、
前記融合タンパク質を、前記ＥＡおよび検出可能な産物を形成する基質と結合させること、および
前記検出可能な産物を、前記細胞タンパク質の転座の指標として検出することであり、前記検出可能な産物のレベルにおける変化は、前記候補化合物に応じた前記細胞タンパク質の転座の指標であること
を含む、方法。
【請求項９】
前記ＥＤは前記細胞タンパク質のための前記代替物の末端にある、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＤは３７から９０個までのアミノ酸のものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記融合タンパク質は一時的に発現される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類宿主細胞において、
分解され、または核に輸送される細胞タンパク質または細胞環境に対して細胞タンパク質と実質同じように応答する前記細胞タンパク質の代替物と酵素ドナー（「ＥＤ」）が融合した融合タンパク質、
機能的に活性なβ−ガラクトシダーゼ酵素を形成するために前記融合タンパク質の前記ＥＤによって補完される能力を有する酵素アクセプター（「ＥＡ」）の存在下に、
生物学的に活性な前記融合タンパク質が分解され、または輸送されるかどうかを、前記融合タンパク質の酵素活性を測定することによって定めるためのシステムであって、前記システムは次の
（１）前記宿主細胞において機能する転写および翻訳の調節領域と、前記転写および翻訳の調節領域の調節下の複数クローニング部位（「ｍｃｓ」）に接合した前記ＥＤをコード化するＥＤ配列と、前記ＥＤ配列を有する読み枠において前記ｍｃｓへ挿入したとき、生物学的に活性なタンパク質、および前記ＥＡを補完する能力を有するＥＤを発現する遺伝子とを含むベクター、
（２）酵素アクセプタータンパク質、
（３）前記転写および翻訳の領域が機能しうる哺乳類宿主細胞、および
（４）加水分解に際して検出可能なシグナルを生成する前記β−ガラクトシターゼ酵素のための基質
を含む、システム。
【請求項１３】
前記転写および翻訳の領域は誘導可能である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記転写および翻訳の領域は構成的である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１５】
前記哺乳細胞はヒト細胞である、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１６】
前記ベクターは前記宿主細胞において一時的に発現される、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ベクターは前記宿主細胞中に組み込まれる、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１８】
前記宿主細胞はＥＡを発現する、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１９】
前記ｍｃｓは前記ＥＤ配列の３′末端で接合している、請求項１２に記載のシステム。
【請求項２０】
核に輸送される細胞タンパク質に接合したβ−ガラクトシターゼの小酵素ドナー（ＥＤ）断片の融合タンパク質を含む真核細胞であって、融合タンパク質は、活性なβ−ガラクトシダーゼ酵素を生成するために候補化合物の存在下にβ−ガラクトシダーゼ酵素の大酵素アクセプター（ＥＡ）断片と組み合わさり、前記酵素は検出可能な産物を生成するために基質に作用し、検出可能な産物のレベルにおける変化は前記真核細胞における前記細胞タンパク質の核に対する転座での変化を示す、細胞。
【請求項２１】
前記細胞は不死化細胞である、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
分解される細胞タンパク質に接合したβ−ガラクトシターゼの小酵素ドナー（ＥＤ）断片の融合タンパク質を含む細胞溶解物であって、融合タンパク質は、活性なβ−ガラクトシダーゼ酵素を生成するために候補化合物の存在下にβ−ガラクトシダーゼの大酵素アクセプター（ＥＡ）断片と組み合わさり、前記酵素は検出可能な産物を生成するために基質に作用し、検出可能な産物のレベルにおける変化は前記細胞溶解物における前記細胞タンパク質の分解での変化を示す、細胞溶解物。
【請求項２３】
ＩκＢに接合したβ−ガラクトシターゼの小酵素ドナー（ＥＤ）断片の融合タンパク質。
【請求項２４】
ＰＰＡＲγ１に接合したβ−ガラクトシターゼの小酵素ドナー（ＥＤ）断片の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、タンパク質の発現及びプロセッシングを細胞モニターに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムの説明及び他の種のものは、プロテオミクスにおける関心、すなわち、必然的に生じるタンパク質、及びそれらの細胞内外の相互作用、及び働きの研究ととも大幅に展開してきている。細胞におけるタンパク質の状況を決定する能力は、細胞内経路、タンパク質の異なる区画における細胞の動き、転写及び発現の調節、タンパク質含有量及びタンパク質修飾の調節などを理解する際に広範な機会を与える。これは、細胞がどのように機能するかへのより大きい洞察を与えるだけでなく、細胞がいつ異常が生じ又は病気となるのかの決定を可能とする。加えて、タンパク質プロフィール、タンパク質の修正，及びタンパク質の運搬における変化によって証明されるように、細胞機能上細胞の環境における変化の影響を人は決定することができる。
【０００３】
タンパク質―タンパク質相互作用を研究するために、特に宿主として酵母を使って種々の方法が使用されてきた。これは、2つのタンパク質が相互作用するか否かに関する情報を提供することができる一方、天然の細胞において何が起こるのかについての情報を与えない。宿主として酵母の使用は、相互作用を妨害する化合物についての情報を与えるかもしれないが、相互作用が生じる可能性がある哺乳類の野生の環境から実質的に異なる環境である。
【０００４】
他の技術は、ペプチド蛍光剤で標識したタンパク質、例えば、グリーン蛍光タンパク質を含み、そこでは、融合タンパク質の分解が、蛍光の損失によって起こることができる。これは、天然タンパク質の折り畳み、他のタンパク質へのその結合、分解の耐性、及びその全体の制御活性を妨害する可能性がある非常に大きいタグを要求するという点で多くの欠点を有する。
【０００５】
個々の応答における効き目及び違いの両方の薬の影響を研究する際に、それは、異なる応答において生じる個々の宿主における差異を理解するのに役立つであろう。病気の状態を理解する際に、細胞疾患状態の結果としてタンパク質活性における変化を比較することができることは有利である。1又はそれ以上のタンパク質における変化をモニターするための能力を提供することによって、治療上、診断上及び科学上の情報を展開させることができる。
【０００６】
関連する文献の簡単な説明
米国特許番号6,037,133号明細書は、IKB分解を測定するためにIKBと融合したグリーン蛍光タンパク質の使用を開示する。Li,など、J.Biol.Chem.,1999、274:21244-50．Douglas等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984、81:3983-7は、ATP-2及びlacZの融合タンパク質を開示する。WO92/03559は、プロテイナーゼを測定するためにβ―ガラクトシダーゼのβ―相補性を使用する融合タンパク質が記載されている。WO01/0214は、融合タンパク質としてβ―ガラクトシターゼのα―ペプチドを使用する構造相補性により評価されたタンパク質の折り畳み及び／又は溶解性が記載されている。WO01/60840は、タンパク質の折り畳み及び溶解性を測定するために酵素ドナーβ―ガラクトシターゼからなる融合タンパク質を含む融合タンパク質が記載されている。Homma等、Biochem.  Biophys.Res.Commun.、1995、215、452-8は、融合タンパク質の溶解性におけるβ―ガラクトシターゼのβ―断片の影響が記載されている。Abbas-Terki
等、Eur.J.Biochem.1999,266,517-23は、酵母における分子シャペロン熱―ショックタンパク質への生体内モデル基質としてのα相補性β―ガラクトシターゼが記載されている。Miller等、Gene,1984、29,247-50は、ヒトインスリンβ―鎖ペプチドを含む融合タンパク質用の定量的なβ―ガラクトシターゼα―相補性測定が記載されている。Thomas and Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sci.USA,
1993. 90.7744-8 は、突然変異体率を測定するためのプラスミド含有EDが記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
システム、方法及び組成物は、その相互作用、状態、及び活性に関して興味のタンパク質の代理物として融合タンパク質を含有する酵素小断片を細胞内モニターするために提供される。システムは、（１）哺乳類細胞において機能的な転写制御領域を有する遺伝子構築物、検出可能な産物を生産するために基質へ作用する酵素アクセプター断片と配合したとき機能的な酵素ドナー断片をコード化する配列、ポリリンカー又は複数のクローニング部位、次いで、選択的にポリアデニル化コード化配列及び転写末端部位へ機能的に結合する酵素ドナーコード化核酸、（２）大酵素ドナー断片をコード化する大酵素ドナー断片又は発現構築物で、選択的に遺伝子構築物からなるベクターで使用するために特異的に修飾された細胞、（４）検出可能なシグナルを提供する機能的酵素(ホロ酵素)に対する基質、からなるシステムである。システムのサブ構成要素は、遺伝子構築物、表現修飾された細胞、及び表現修飾された細胞を使用する測定を含む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
構成成分は、全体として又は一部に興味のタンパク質を含む可能性がある代理タンパク質へ融合した酵素ドナーオリゴペプチドとしての小断片から成る融合タンパク質からなる。より大きい酵素断片、酵素アクセプターの存在下において、活性酵素は、興味のタンパク質の活性、発現レベル及び又は量の測定として決定することができる。測定は、基質が存在するか溶解物を使用することができる細胞に発現した酵素アクセプターを有することによって細胞内とすることができる。興味のタンパク質の分解、結合要件、転座、修飾を当該測定によって決定することができる。酵素断片は、並列に断片を保持する他の存在に無関係に活性酵素を形成するために結合能力を有する基質存在下において低い独立環境を提供し、酵素アクセプターの融合産物としての酵素ドナーへの結合を可能にすることによって特徴付けられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の詳細な説明
方法及び組成物、及び当該方法及び組成物を使用したシステムは、細胞の状況、例えば、興味のタンパク質の状態などを決定するために提供される。方法は、融合タンパク質を、細胞の状況と関連する興味のタンパク質と同等とみなして反映させて、細胞の状況の代理として融合タンパク質の状態を決定することを可能とする。この方法は、ED(又はPL)及びEAの複合体が、並列に断片を保持する他の実在物の不存在下、活性酵素を提供する場合、酵素ドナー（ED）又はプロラベル（PL）として言及される酵素小断片の使用、酵素アクセプターとして言及される融合タンパク質及びより大きい酵素断片の一部としての使用に依存する。サンプルにおける酵素活性は、EAと複合体を形成し、活性酵素を形成する際のEDの活性によって反映されるように細胞における細胞状況の代理として機能する。（１）融合タンパク質の発現又は（２）EAと複合体を形成する際又は複合体を形成したときのED(又はPL)の活性における変化により融合タンパク質を改変する結果を生じる状況は、細胞の変化の指標として測定することができる。小酵素断片はこの出願を通じてED又はPLという。
【００１０】
酵素及びそれらの断片は、多くの特性を有することが要求される。断片は、実質的に不活性であり、もしあっても少しであり、基質の存在下で存在する断片が唯一であるべきである。第２に、断片は互いに十分に親和性を有しており、他の結合、例えば、断片へ融合した構成要素などの不存在下、断片は活性酵素を提供するのに結合するであろう。これらの基準を満たす種々の酵素が知られており、追加の酵素は既知の技術に従って開発されることができる。これらの基準を満たす酵素は、β-ガラクトシターゼ（米国特許第4,708,929号参照）、リボヌクレア-ゼ  A(米国特許第4,378,428号)を含み、そこでは、より小さい断片は、アデノウイルスプロテアーゼ(米国特許第5,935,840号参照)などの小ペプチド補助因子を有するアミノ酸又はカルボキシル末端、又は酵素から生じることができる。上述の酵素の代わりに利用することが可能な他の酵素を同定するために、酵素遺伝子は、非対称的に切断し、小さい断片と大きい断片と特徴できることができ、同じ及び異なる細胞において発現させることができる。基質の存在下、両方の断片を生産する細胞は、基質の反応を触媒する一方、もしあっても個々の断片では少なくあるべきである。あるいは、人が個々に断片を発現でき、もし反応がないなら、酵素触媒反応が生じるかどうか見るために混合物を組み合わせることができる。興味の酵素は、約300kDa以下のものであり、一般に150kDa以下であり、小断片は、約125アミノ酸以下であり、一般に約100アミノ酸以下であり、好ましくは75アミノ酸以下である。酵素に依存して、ED(又はPL)は、１０アミノ酸と同じくらい小さく、通常少なくとも約25であり、より一般的には、少なくとも約35アミノ酸である。この基準を意識して、選別される断片は、適当な大きさの小断片を提供するのに選択することができる。
【００１１】
各酵素は、適当な基質を有するであろう。β-ガラクトシターゼは、β-ガラクトシル基でエーテル化されるフェノール基を有する蛍光剤を効率的に使用し、リボヌクレアーゼAは、核酸修飾された蛍光剤を使用し、５‘-O-アセチル  ２’-（テトラヒドロピラン-2-イル）ウリジン３‘-(4-メチルウンベリフェロン-７-イル)リン酸アンモニウムを使用し、アデノウイルスプロテアーゼは、−（L,I,M）−X-G-G/X-又はー（L,I,M）−X−G−X/G−などのオリゴペプチドを使用し(縦のラインは切断の位地を示す。)、P3（X）位置は、切断に重要でないと思われ(Anderson,C.W.,Virology,177;259(1990)；Webster等J.Gen.Virol.,70；3225(1989)、ペプチド基質は、例えば、蛍光剤共振エネルギートランスファーを使用して、切断部位の反対側の蛍光剤及び消光剤を有することによって、検出可能なシグナルを提供することができる。
【００１２】
β-ガラクトシターゼは、主要発明において使用されるペプチドの典型的なものであり、
複合体を非共有的に結合させて活性酵素を形成した際に、この酵素が、分類の実例として、異なる酵素を独立して考慮しなければならない状況を除いて、以後しばしば言及される2つのペプチドを有するための基準を明らかにするものである。
【００１３】
本方法は、どのような変化が生じた後でも、酵素活性が測定される場合、評価されるべき環境において、もしあれば、検出可能な基質の存在下酵素アクセプターとともに融合タンパク質を提供することからなる。生産される酵素産物の量は、EAへ結合する際のEDの活性へ関連する。酵素活性は、融合タンパク質の興味のタンパク質と複合体を形成する化合物への結合、融合タンパク質の分解、融合タンパク質の修飾、融合タンパク質の運搬などによって影響されるであろう。また、融合タンパク質の形成及び分解の割合の結果として、プロテアーゼ安定融合タンパク質及びタンパク質の発現レベルを有することによって、プロモータから生じる発現、転写、翻訳のレベルを測定することもできる。
【００１４】
本システムとそのサブコンポーネントは、発現、分解、転座、及び他の細胞成分との結合など細胞内活動の細胞モニター、通常、内部細胞モニターを提供する。この目的に向って、哺乳類細胞において機能的な転写調節領域と調節領域の転写調節下の酵素のEA断片と無関係に結合し活性酵素を形成することが可能な不活性ED酵素をコード化する配列とを有する発現構築物を含む哺乳類宿主細胞の中への遺伝子構築物の導入を可能とする成分が提供される。構築物に含まれるのは、タンパク質としてのEA断片、発現構築物、又は特に、細胞のゲノムへ組み込まれた細胞における細胞構築物である。したがって、機能的酵素に必要な2つの部分が、活性タンパク質として直接的にか細胞における発現によって間接的にかいずれかの第2断片を備える。このシステムに含まれるものは、酵素的触媒反応、例えば、加水分解によって検出可能な産物を遊離する酵素基質である。転写構築物が、機能的であり、融合タンパク質を生産する細胞も含まれる。
【００１５】
βガラクトシターゼ酵素及びその断片（米国特許番号第4,708,929号参照）は、多くの特性を有するように要求される。断片は、実質的に個別に不活性であり、基質存在下で1つの断片が存在するのみという背景でもしあっても少しである。第二に、断片は互いに十分な親和性を有し、例えば、断片へ融合した存在物によるなどの、他の結合の不存在下、断片が活性酵素を提供するのに結合するであろう。小断片（“ED”又は“PL”）は、それが融合した遺伝子の生物学的活動、生じた融合タンパク質の適格な折り畳み、酵素機能を含めた活動の活性部位の保持、他のタンパク質への結合機能、転座能力などを妨害しないであろう。EDは、一般に少なくとも約37、通常少なくとも約40アミノ酸で、かつ、一般的に約110を越えず、より一般的には、約90を越えないであろう。
【００１６】
基質は、蛍光産物、化学蛍光産物、電気化学的に検出可能な産物などを提供するかもしれない。β-ガラクトシターゼは、β―ガラクトシル基とエーテル化したフェノール基を有する蛍光剤、基質として効果的に使用する。沈殿可能な産物を生産する比色及び蛍光基質も転座をイメージするのに使用することもできる。
【００１７】
融合構築物を含む宿主細胞は、多くの用途を見出す。融合タンパク質は、宿主細胞においてED（又はPL）配列へ融合した遺伝子によって発現したタンパク質の安定性、タンパク質が宿主細胞において結合した程度、宿主細胞の特定の区画への融合タンパク質の転座、細胞の性質及び/又は細胞の環境において変化するための融合タンパク質の応答を決定するのに使用することができる。効果において、融合タンパク質は、通常のタンパク質の代理として機能する。いくつかの例において、ヒトが効果に関心を持った宿主細胞は、タンパク質を発現しないかもしれず、タンパク質は、宿主において1又はそれ以上の経路を有する可能性がある。宿主細胞において存在する融合タンパク質の量を知ることによって、融合タンパク質の宿主細胞への応答、その環境、推定により天然タンパク質を決定することができる。天然タンパク質の代理として融合タンパク質の量を測定することができるので、薬の影響又はタンパク質上の宿主細胞環境における変化を決定することができる。このようにして、タンパク質上、当該タンパク質が影響を及ぼす経路上、どのように薬物が他のタンパク質とのタンパク質相互作用へ影響を与えるかなどそれらの効果に対する薬物を選別することができる。加えて、分化、腫瘍形成、異常増殖、環境における物理変化など、興味のタンパク質の状況における影響を決定することができる。
【００１８】
本システムは、挿入される遺伝子が、天然のタンパク質の代理として使用するのに生物学的に活性である融合タンパク質を生じるかどうか、先ず最初に決定するのに使用することができる。融合タンパク質の活動は、天然タンパク質の発現が生じない宿主細胞、例えば、天然タンパク質の両方のコピーがノックアウトであり、アンチセンスRNAが、天然のタンパク質を阻害するが、融合タンパク質を阻害しない宿主細胞等、例えば、非コード化３‘領域又は、５’メチオニンコドンをふくみ、天然タンパク質に必要な転写因子を阻害する宿主細胞を使用することによって、決定することができ、そこでは、融合タンパク質が、もし酵素なら、異なる転写調節領域を有する場合、その天然の基質へ結合し、天然の酵素と合理的に均衡な速度でその反応を触媒するか、もし酵素でないなら、天然タンパク質が結合するタンパク質に適当な親和性を持って結合するなどを示す。
【００１９】
本システムの使用者は、興味の遺伝子を本システムに提供される遺伝子の構築物の中へ導入する。多数のクローニング部位を有することによって、遺伝子が操作され、正しい方向において及びED(又はPL)配列を有するリーディングフレームにおいて複数のクローニング部位へ挿入される。ED配列と興味の遺伝子との間に残存する複数のクローニング部位にヌクレオチドが存在する結果として、一般に、３コドンより多くないリンカー、好ましくは約２コドンより多くないであろう。示したように、提供されるベクターは、転写及び/又は翻訳末端配列、ポリアデニル化配列、又は、キレート化、アミノ基転位、プレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化などの機能をコード化する他の配列を含むことができる。一度、融合タンパク質構築物が完成されれば、その後構築物を宿主細胞の中へ導入することができる。宿主細胞は、EAを発現する構築物を有するか、又はそうでなければ、当該構築物は、ゲノム又は安定な発現物の中へ一時的発現又は組み込み用に加えることができる。あるいは、溶解物を調製し、必要に応じてEAを加えることができる。選択された基質は、細胞膜を透過することができ、その結果、基質は、細胞に比率を限定しない量で存在するであろう。あるいは、上述したように、溶解物を調整し、基質を溶解物へ加えることができる。
【００２０】
宿主細胞は、自然に興味のタンパク質を有することができるか、興味のタンパク質は発現構築物を使用して、発現構築物を宿主細胞へ加えて提供することができる。興味のタンパク質よりむしろ、興味のタンパク質が関係する経路含む発現構築物を使用して、異なるタンパク質を提供することができる。いくつかの例において、発現構築物は、特定のタンパク質の量を増加させるのに役立つことができる。
【００２１】
宿主細胞の必要な修飾が完成した後、人は、宿主細胞を使用することができる。例えば、どのような変化が起こって後でも、もしあれば、宿主細胞の環境において評価されるべきであり、人は、検出可能な基質の存在下、融合タンパク質とEAを接触させて、そこでは、酵素の活動が測定される。生産された酵素産物の量は、EAへ結合する際のEDの活性に関係する。酵素活性は、融合タンパク質の分解、興味のタンパク質と複合体を形成する化合物への融合タンパク質の結合、融合タンパク質の修飾、融合タンパク質の運搬など、に影響を受けるであろう。人は、また、プロモーターから生じる発現、転写及び翻訳の割合を、プロテアーゼ安定融合タンパク質を有し、融合タンパク質の発現レベル、その結果として融合タンパク質の形成及び分解割合を測定することによって、測定することもできる。
【００２２】
EDの活性における変化は、ユビキチン化による融合タンパク質の分解、プロテアーゼ分解、変性又は他のプロセスの結果とすることができる。あるいは、活性を興味のタンパク質と別のタンパク質との間の複合体形成の結果として修飾することができる。活性は、融合タンパク質の修飾のために修飾することもでき、修飾は、別のタンパク質との複合体を生じ、融合タンパク質の立体構造が変化し、EDなどの活性が変化する置換基が存在する可能性がある。細胞における融合タンパク質の区画への輸送は、細胞又は区画におけるEDの測定可能な活性の変化を生じさせることができる。加えて、ED活性へ影響を与える修飾は、経路の一部であり、ED活性における変化は経路における現象に関連することができる。融合タンパク質は、興味のタンパク質、興味のタンパク質の断片、興味のタンパク質を表現する異なるポリペプチドからなることができるか、又はいくつかの他のタンパク質又は他の活性を測定するための中間体とすることができ、天然タンパク質以外の他のものを使用したとき、断片又はタンパク質は、代理又は模倣として作用する。
【００２３】
細胞質におけるリボソームから別の区画、オルガネラ、又は部位、例えば、核、細胞膜、プロテオソーム、ミトコンドリア、リソソーム、ゴルジ体などへの細胞内におけるタンパク質運搬又は転座は、タンパク質の生化学的特性及び細胞の細胞経路に非常に重要とすることができる。タンパク質輸送に対して、人は、特定の部位へトランスロケートされるために知られたタンパク質から融合タンパク質のN末端でのリーダー配列を使用することができる。人は、融合タンパク質が細胞膜へ結合するために融合タンパク質の修飾を生じるコード化配列を使用することができ、そのような配列は、プレニル化、ミリストレイン化、ファルネシル化などを生ずる。融合タンパク質の部位に依存して、細胞内へEA及び基質を提供することによって、人は、融合タンパク質の存在を特定の部位で検出することができる。
【００２４】
主要な本発明によって使用される工程は、（１）本システムの一部として提供される遺伝子構築物の多数のクローニング部位へ興味の遺伝子を挿入することによって、融合タンパク質遺伝子及び発現構築物を調製し、（２）融合タンパク質を含む発現構築物をシステムによって提供されるか使用者によって選択された選択細胞宿主の中へ導入し、（３）あるいは、本システムに提供された宿主細胞の一部として以前にもし存在しないなら、EAをコード化する発現構築物も導入し、（４）発現及び細胞の生存を可能とする条件下トランスフォームされた細胞宿主をインキュベートし、（５）(i)内部基質を加えるか、(ii)細胞宿主を溶解し、EA及び基質を加え、（６）細胞環境の測定として、通常興味のタンパク質の状況の指標として、生産物の生産代謝回転率を測定する、ことからなる。無傷の細胞を使用するとき、検出可能な産物は、区画について、カメラ、マイクロスコープ、又は視覚検出用の他の装置を使用して、検出することができる。EA発現を提供するとき、人は、一般に高い活性プロモーターを使用し、存在する実質的にすべてのEDと複合体を形成するのに十分な量のEAが細胞内にあることを確実にし、それゆえ、EAプロモーターは、EDプロモーターの少なくとも約2倍活性があるべきである。EAを溶解物へ加えたとき、同じ考えが存在し、その結果、EDに対するEAのより過剰量、一般に少なくとも約2倍過剰量、しばしば、少なくとも約5倍過剰量が加えられ、当該過剰量は、20倍又はそれを越えるものとすることができる。
【００２５】
発現構築物、他の従来の巧みな工程の説明については、例えば,sambrook, Fritsch & Maniatis, “Molecular Cloning: A laboratory Manual,” Second Edition(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (herein "Sambrook et al., 1989"); "DNA Cloning : A Practical Approach," Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis"[B.D.Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation"[B.D.Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; "Animal Cell Culture"[R.I.Freshney, ed. (1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I.Freshney, ed. (1986)];B.Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984).を参照。
【００２６】
第一の主要な本発明の構成は、融合タンパク質及びその発現構築物である。EDは、C末端、N末端、又は末端間にあることができる。従って,融合タンパク質において１又はそれ以上のED配列が存在し、融合タンパク質当たりに存在するEDユニットの数を増加させて、融合タンパク質分子が存在を示す観察されたシグナルを増やすことができる。EDは、β-ガラクトシターゼ酵素のN末端又はC末端からもたらされることができる。
【００２７】
融合タンパク質におけるEDの特別の部位は、興味のタンパク質の天然の活性がかなり減少すること無しに、コード化配列にEDを含むための能力に依存するであろう。それゆえに、興味のタンパク質について、その構造、他の実在物への結合部位、ループ、β-シート及びα-へリックスに関する折り畳み形、ED活性が調節されるであろう方法、例えば,分解、別の実在物によるEAとの結合の立体傷害、立体構造又は電荷における変化により生ずる修飾など、どのくらい知られているかに依存して、EDは、最適な応答を提供するために位置付けられるであろう。分解について、EDがどのような部位で位置するかについて一般に問題ではなく、これは、興味のタンパク質が、その天然の立体構造、分解に対する感受性を維持し、EDが、EAを活性化する能力を維持するかぎり、立体構造の傷害に対する多くのケースにおいて事実であるようでもある。
【００２８】
細胞質ゾルにおいてリボソームから転座するために、興味のタンパク質の性質に依存して、当該転座を認識するリーダー配列を有することは望ましいであろう。人は、転写の方向へED配列の５‘末端でリーダー配列を提供することができ、それによって、ED配列を有するリーディングフレームとすることができる。ED配列からなる興味のタンパク質について、人は、ED配列を有するフレームを読み取る際に天然のリーダー配列を挿入するためのED配列の複数クローニング部位５’を提供することができる。あるいは、人は,遺伝子の構築物における望ましい転座と関連するリーダー配列を提供することができ、リーダー配列は、天然の配列ではないが、リーダー配列と同じ機能、例えば、膜、核,リソソーム、ミトコンドリア等への転座等を満足するであろう。
【００２９】
融合タンパク質をコード化する遺伝子は、発現構築物の一部であろう。遺伝子は、細胞宿主において機能する転写及び翻訳制御領域の下へ位置される。2,3の例において、制御領域は、興味のタンパク質をコード化する遺伝子の天然の制御領域とすることができ、融合タンパク質は、染色体外の又はエピソーム因子上にあるか、宿主細胞のゲノムの中へランダムに組み込まれる。天然のタンパク質が存在し、発現するそれらの細胞において、融合タンパク質は、発現のための転写因子用の天然タンパク質と競合するであろう。染色体外因子又はクロロソームのにおける遺伝子のその部位は、転写部位に関して変化する。したがって、大部分の例において、転写開始領域は、細胞宿主において機能するように選択されるべきであるが、天然の転写制御領域と著しく競合しないウイルス又は他の起源とすることができるか、又は、遺伝子が融合タンパク質の転写を著しく阻害しない興味のタンパク質用の遺伝子から異なる遺伝子に関連されることができる。
【００３０】
発現構築物の組み込みの位置は、もし宿主クロモソームの中へ組み込んだなら転写効率、それゆえ、融合タンパク質の発現に影響を与えるであろうと理解すべきである。人は、転写の高割合を有する細胞を選択することによって発現の効率を最適化することができ、又は、メトトレキサートの存在下で、発現構築物、例えば、DHFRを増幅及び共増幅させることができる。
【００３１】
使用することができる商業的に利用可能な転写制御領域が多量に存在し、特定の選別は、ベクターの機能、及びベクターが設計された興味の遺伝子にしたがって選択されるであろう。また、融合遺伝子構築物を宿主細胞へ導入する方法は、融合遺伝子構築物が融合遺伝子が使用される目的により変化するであろう。構築物の導入は、生体外及び生体内で行なうことができ、培地においてトランスフォームされた細胞がその後哺乳類宿主の中へ導入されるか、又はウイルス運搬構築物をウイルスが適当な型の細胞用にトロピックである哺乳類宿主の中へ導入することができる状況を含むであろう。転写制御領域は、本質的なものであるか誘導可能なものとすることができる。以前のケースにおいて、人は、宿主細胞において融合タンパク質の定常状態濃度を有することができる一方、後者の場合において、人は、定常状態に到達するまで、実質的に全くないもの(漏出の可能性を有する)から融合タンパク質の増加した量へ提供することができる。誘導可能な転写によって、人は、融合タンパク質が存在しない状態から融合タンパク質の定常状態濃度が存在する状態へ細胞を循環することができる。
【００３２】
構築物を導入するためのベクターは弱力化したか又は欠陥をもつウイルス、例えば、限定されないが、ヘルペス単一ウイルス（HSV）、乳頭腫ウイルス、EBウイルス（EBV）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、等を含む。完全に又は殆ど完全にウイルス遺伝子を欠く適当にパッケージされた検出可能なウイルスが好ましい。検出可能なウイルスは細胞の中へ導入した後は、感染性がない。特に特定の細胞型に対してトロピックな検出可能なウイルスベクターの使用は、宿主の特異的な、特定の領域における細胞の投与を、ベクターが他の細胞へ感染する可能性の不安なしに、可能とする。それゆえ、特定の座は、ベクターと特異的に標的とすることができる。特定のウイルスベクターは、検出可能なヘルペスウイルス１(HSV１)ベクター(Kaplitt et al.,1991, Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330; 弱められたアデノウイルスベクター、Stratford-Perricaudet等によって説明されたベクターを含む(1992,J.Clin.Invest.90:626-630 a defective adeno-assoxited virus vector(Samulski et al., 1987, J.Virol. 61:3096-3101; Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828)。あるいは、ウイルスは、発現に本質的な転写因子からなる細胞の特定の型に限定されないウイルスの複製に必要な遺伝子の発現用プロモーターを含むことができる。この構築物は、当該転写因子を有する細胞をモニターするためのものであろう。
【００３３】
ベクターは、生体外及び生体内でリポフェクチンによって導入することができる。過去10年間の間、生体外におけるカプセル封入用リポソーム、及び核酸のトランスフェクションの使用が増加している。リソソーム仲介トランスフェクションに遭遇する困難性と危険を限定するために設計された合成陽イオンリピッドを、生体内トランスフェクション用のリポソームとして調整するのに使用することができる(Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A),
84:7413-7417 ; see Mackey, et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
85:8027-8031)。陽イオンリピッドの使用は、マイナスに荷電した核酸のカプセル封入を促進することができ、マイナスに荷電した細胞膜との融合を促進することもできる(Felgner and Ringold, 1989, Science, 337:387-388).生体内における神経系へのリポフェクションが最近達成された(Holt,et.al., 1990 , Neuron, 4:203-214)。生体内における神経系の中へ外因性遺伝子を導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実行上の利点を有する。リピッドは、ターゲッティングの目的用に他の分子へ化学的に結合することモ可能である（Mackey, et al., 1988, supra参照）。標的ペプチド又は非ペプチド分子を化学的にリポソームへ結合することができる。
【００３４】
生体外及び生体内においてベクターを剥き出しのDNAプラスミドとして、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポーション、又は他の知られた試薬を使用して導入することも可能である。あるいは、融合タンパク質をコード化する遺伝子を含むベクターは、DNAベクタートランスポーターを経由して導入することができる（例えば,Wu et al., 1992, J.Biol. Chem., 267:963-967; Wu and Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:14621-14624; Hartmut et al., Canadian Patent Application No. 2,012,311, Filed March 15, 1990）。
【００３５】
従来既知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション(リソソーム融合)、遺伝子銃の使用、ウイルスベクターの使用、DNAベクタートランスポーターなどによって生体外において所望の宿主細胞の中へベクターを導入する。
【００３６】
融合タンパク質発現構築物の生体内における導入に関係する利点は、細胞の状態に通常関連する因子が存在する天然の環境における融合タンパク質の発現を有することがである。例えば、もし人が、薬が興味のタンパク質に関連する細胞型にどのように作用するか知ることに関心があるなら、生体内で薬をテストすることによって、天然の状態下で興味のタンパク質の応答を決定することができる。欠点は、人は、通常発現のレベルを制御できないということであり、発現の効率と、環境に対する潜在的な応答に関して異なる多くの細胞に渡って平均レベルを見つけることであろうということである。
【００３７】
融合タンパク質遺伝子挿入物を含む発現ベクターは、４つの一般的方法、すなわち、(a)所望のプラスミドDNA又は特異的ｍRNAのPCR増幅、(b)核酸加水分解、(c)マーカー遺伝子機能の存在又は不存在、及び(d)挿入した配列の発現、によって同定することができる。最初の方法において、核酸を、放射性核酸を組み込むか、エチジウムブロマイドで染色させたPCR増幅によって、増幅産物の検出を提供することができる。第二の方法において、発現ベクターに挿入した融合タンパク質遺伝子の存在を、融合タンパク質遺伝子に相同な配列からなるプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションによって検出することができる。第三の方法において、リコンビナントベクター/宿主系を、ベクターにおける外来遺伝子の挿入によって引き起こされたあるマーカー遺伝子機能(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける占有体形成等)の存在又は不存在に基づいて、同定し、選別することができる。第四の方法において、組み換え発現ベクターは、組み換え発現ベクターによって発現した融合タンパク質遺伝子産物の活性を測定することによって同定することができる。
【００３８】
短い期間の間、活性なプロモーター、例えば,初期遺伝子用のウイルスプロモーター，例えば、ヒトサイトメガロウイルス(ｈCMV)介在初期プロモーターなどを使用することができる。他のウイルスプロモーターは、強力なプロモーターに限定されないが、サイトメガロウイルスプロモーター（CMV）、SR．アルファ（Takebe et al., Moke. Cell. Biol. 8:466(1988)）、SV40プロモーター、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、チミジンキナーゼ（TK）、β―グロビン等を含む。あるいは、誘導可能なプロモーターを使用することができる。
【００３９】
多くのプロモーターは、種々の状況で、種々の目的用に、種々の宿主に対して使用が見出された。多くのプロモーターは、今日商業的に利用可能である。融合タンパク質の発現は、当該技術において既知のいずれのプロモーター/エンハンサー因子によって制御することができるが、これらの制御因子は、宿主又は発現用に選別された宿主細胞において機能しなければならない。融合遺伝子を制御するのに使用することができるプロモーターは、限定されないが、SV40初期プロモーター領域(Benoist and Chambon, 1981, Nature, 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3’長末端繰り返しを含むプロモーター（Yamamoto, et al., 1980, Cell, 22: 787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 78: 1441-1445）, メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature, 296:39-42）、及び以下の、組織特異性を有し、トランスジェニック動物において利用することができる動物転写制御領域、すなわち、膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift et al., 1984, Cell, 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology, 7: 425-515); 膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan，1985，Nature，315:115-122)、リンパ細胞において活性な免疫グロブリン制御領域(Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature, 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell \. Biol., 7: 1436-1444)、睾丸、胸、リンパ及びマスト細胞において活性なマウス哺乳類腫瘍ウイルス制御領域細胞（Leder et al., 1986, Cell, 45: 486-495）,肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域(Pinkert et al., 1987, Genes and Devel., 1:268-276)，肝臓において活性なα―フェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science, 235: 53-58)、肝臓において活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域(Mogram et al., 1985 Nature, 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell, 46: 89-94)、脳の希突起膠細胞において活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域(Readhead et al., 1987; Cell, 48: 703-712)、骨筋肉において活性なミオシン軽鎖―2遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature, 314:283-286）、前立腺細胞において活性な前立腺特異的抗原制御領域(米国特許明細書第6、197，293号及び第6，136，792号)、及び視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason et al., 1986, Science, 234: 1372-1378）を含む。あるいは、融合タンパク質遺伝子の発現は、融合可能なプロモーター、例えば，重金属へ曝すことによって誘導されるメタロチオネインプロモーターの制御下とすることができる。ある脳細胞へトランスフェクトさせた遺伝子の制御に対して、グルココルチコイドは、血管脳関門を通過することができるので、グルココルチコイド誘導プロモーターを使用することができる。あるいは、視床下部及びエストロゲンへ反応する他の領域において活性なエストロゲン誘導可能なプロモーターを使用することができる。加えて、tet誘導可能なプロモーターを使用することができる。転写を外因性の薬剤によって終了させることが可能な他のプロモーターが利用される。本発明は、薬理剤によって誘導可能な又は有限なプロモーターであり、膜、生体内における神���細胞、血管脳関門を通過することができ、転写に影響を与えるいすれかのプロモーターの使用に関する。
【００４０】
例えば、次のタンパク質をコード化するDNAを含むベクターが、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託されている。MD:因子VIII（ｐSP64−VIII、ATCC No. 39812）；581アミノ酸を欠く因子VIIIアナログ、“LA”(pDGR-2、ATCC No. 53100); t-PA 及びそのアナログ（共に係属中の米国出願明細書No.882,051）;VWF(pMT2-VMF,ATCC No. 67122)； EPO(pRK1-4, ATCC No. 39940; pdBPVMMTneo 342-12(BPV-Type vector) ATCC No. 37224) ;及びGM-CSF（ｐCSF-1，ATCC No. 39754）。
【００４１】
多くの商業的な哺乳類ベクターは、異なる性質、異なるプロモーター、msc，及び選択遺伝子で利用できる。PYACneo（Replicon）、pAdvantage、pSI（SV40ｐ）、ｐTarget、ｐGineo（Promega）、Vitality hrGFP(Stratagene)、ｐCMS-EGFP-１、pEGFP-N1(BD Biosciences),pVITROms（Invivogen）、pRK-5GFP（Fikosawa）及びpCruz22（Santa Cruz）(supplier)。
【００４２】
ベクターは、プロモーターの転写及び翻訳制御下融合遺伝子、プロモーター/エンハンサー領域、あるいは、複製コンピテントであるべき複製開始領域、上述したような抗生物質耐性などの選別用マーカーを含み、PCR開始部位、EAの構成成分又は誘導可能な発現を提供する発現構築物などの追加の特性を含むことができる。上述したように、宿主において融合タンパク質の発現に対して多くの異なる方法を提供する利用可能な多くのベクターが存在する。
【００４３】
宿主細胞は、融合タンパク質の発現用の必要な転写因子、及び決定目的の他の成分を提供するように選別されるであろう。宿主細胞は、シミュレートされる環境と類似する環境を提供するように選択されるであろう。いくつかのケースにおいて、主要細胞を、培地内で維持されたもの及び親株から直接的に得られるものの両方を使用することができるが、通常、腫瘍形成又は非腫瘍形成の細胞株を使用するであろう。細胞株は、所望の環境を提供し、比較が、患者からの主要な細胞を使用することが利用できない研究間の直接的な比較を可能とすることができる。以前に示したように、宿主細胞を修飾し、興味のタンパク質が関連する経路と関連させることによって、興味のタンパク質に影響を与えるタンパク質を発現させることができる。いくつかの例において、特定のタンパク質、例えば、レセプターなどを欠く宿主細胞が選択されるので、レセプターに対する発現構築物を導入することによって、特定のタンパク質の発現を制御することができる。これら遺伝子の修飾は、融合タンパク質を発現する構築物の導入に付随して、又はその後に行なうことができる。遺伝子の修飾は、一時的又は実質的に永続的なもととすることができ、発現の所望のレベル及び発現の制御を提供するように細胞が選択されるべきである。
【００４４】
主要なシステムは、家庭内の動物細胞、ネズミ、ウシ、犬、ネコ、ブタ、ウサギなど、より好ましくは、モンキー、サル、ヒトなどの霊長類の細胞を含む。確立された細胞株は、形質転換された細胞株を含め、宿主として適当である。通常二倍体細胞、主要組織及び主要な外植体の培地から生体外において誘導された細胞株は(造血幹細胞などの相対的に未分化細胞を含め)、適当であろう。胚細胞を、及び幹細胞、例えば、造血幹細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞などを使用することができる。候補細胞は、選択遺伝子が著しく作用する限り、選択遺伝子において遺伝子型的に不完全なもので必要はない。宿主細胞は、哺乳類細胞株を確立するであろう。ベクターDNAの染色体DNAの中への安定な組み込みのために、及び組み込まれたベクターDNAの次の増幅のために、従来技術によって両方とも、CHO細胞(Chinese Hamster Ovary)は好都合である。あるいは、ベクターDNAは、ウシ乳頭腫ウイルスゲノム(Lusky et al., 1984, Cell 36: 391-401)の全て又は一部を含むことができ、安定なエピソーム因子としてC127マウス細胞などの細胞株において実行することができる。他の使用可能な哺乳類細胞株は、Hela、COS-1モンキー細胞、Bow細胞、マウスl-929細胞、マウス乳腺腫瘍細胞、などの黒色腫細胞株、Swiss、Balb-c又はNIHマウスから引き出された３T3株、BHK又はHAKハムスター細胞株などを含む。
【００４５】
細胞株は、特異的遺伝子、例えば，タンパク質などの発現を促進するか又は弱めるEAコード化遺伝子を導入して、特異的遺伝子をノックアウトすることによって修飾することができる。修飾は、アンチセンスDNA又はRNAiを導入する場合において、一時的とすることができ、また、遺伝子を削除し、標的タンパク質のアンチセンスｍRNAをコード化する遺伝子を導入し、優勢劣性遺伝子などを加えることによって永久的なものとすることができる。研究動物は、株が自然に変態を生じ、生じた遺伝的に修飾した宿主を有する胎児又は他の細胞の遺伝的修飾を繁殖又は使用した結果物である種々の株を使用することができる。ノックアウトマウスは、文献に広範に記載されている。本発明の目的のために、無傷の宿主、無傷の宿主からの組織、又は無傷の宿主からの細胞を使用することができる。ノックアウト及びノックインマウスの開発の説明は、Nozawa, et al., Blood, 2001 98: 525-32; Kotani, et al., Biochem. J., 2001, 357: 827-34; Zhou, et al., Int. J. Radiat. Biol., 2001, 77: 763-72; and Chang, et al., Mol. Cell. Endocrinol.,2001, 180 :39-46 及びここで引用した参照文献であり、遺伝的に修飾されたマウスに関する多量の刊行物のみを提供する。加えて、ハイブリドーマを使用し、所望の遺伝子を有する最初の細胞は、最初の細胞からの染色体が安定に維持される条件下、不死化細胞と融合されるハイブリッドーマを使用することができる。遺伝子は、転写因子、興味のタンパク質、例えば、非ヒト宿主細胞におけるヒトタンパク質とすることができ、また、タンパク質の向上した発現を提供する。
【００４６】
全ての細胞タンパク質、特に内部細胞タンパク質の状況は、融合タンパク質が興味のタンパク質の代理として利用することができる限度において本発明によって決定することができる。なぜなら、すべてのタンパク質は、幾分の修飾、例えば、分解を受けるからである。タンパク質の性質は、例えば、位置、量、他のタンパク質との複合体形成、例えば、リン酸化反応又は脱リン酸化反応等の修飾などの状態によって意図される。測定の条件下、生物学的に活性な融合タンパク質のED活性を変化させるいずれの修飾も検出に適用させることができる。これらの修飾は、1又はそれ以上のタンパク質との複合体形成、例えば、アセチル基、リン酸基、メチル基、硫酸塩、脂肪酸エステル、アルコキシル化などの基を除去又は追加する化学修飾、区間において活性の違いを検出することができる転座などを含む。大部分に対して、興味のタンパク質は、感染性の病気、遺伝子欠陥、突然変異体、薬剤への応答、腫瘍形成、炎症反応など、健康機能に関するであろう。したがって、融合タンパク質のEDの活性における変化は、診断における生理学的機能及び哺乳類宿主の治療に関係し、新生物、分化、ストレスなどの細胞の状態を指標することができる。
【００４７】
分解は、追加の測定による他の修飾から容易に区別することができる。融合タンパク質のEAとの活性を知るために、融合タンパク質を解離するための抗体又は他の結合化合物を使用し、融合タンパク質の数を決定し、融合タンパク質を単離することができる。溶解物に存在する全融合タンパク質からの活性と、観察された活性との間の違いは、融合タンパク質の分解以外の相互作用の指標である。観察されるシグナルが、分解以外の現象に関係するように、細胞内で細胞サイクル中の融合タンパク質の量を把握しなければならない。全細胞量は、上述した溶解物、及び測定での結果を比較用に使用するためにグラフ化した修飾の存在不存在における融合タンパク質の異なる量で観察されるシグナルを使用して決定することができる。
【００４８】
細胞における構築物の存在又は細胞の区画は、カメラ、例えば、CCDカメラ、マイクロスコープ、又は検出可能なシグナルの全細胞にわたり、又は一つの区画に関してのみ組み込みを可能とする他の装置を使用して、無傷の細胞を視覚可能な分析を使用して決定することができる。反対に、例えば、サイトソルと比較して核における検出可能なシグナルの濃度を容易に検出することができる。FACS装置は、酵素反応が、予め設定した時間行なわれることを可能にし、急冷し、細胞を分析する場合、FACS装置は、無傷の細胞からシグナルを組み込むのに使用することができる。
【００４９】
隠れたタンパク質もそれらが細胞内である間決定することができる。ゴルジ体からの表面膜への移送前に、多くの工程を生じ、細胞における当該分子の数、及びそれらが他のタンパク質、例えば、ドッキングタンパク質と結合するかどうかを決定することができる。
【００５０】
転写の効率は、測定の間重要な修飾を受けず、安定な融合タンパク質を使用することによって決定することもできる。安定なタンパク質、例えば、プリオン、a-アミロイド、コラーゲン、ケラチン又はエラスチンモチーフ等の合成ポリペプチドを使用するか、タンパク質分解の環境の中へ分泌を提供することによって、興味の調節領域からの発現率を決定することができる。天然及び構築した発現系が両方とも活性である一方、融合タンパク質が発現系の有効性を指標する適当な調節領域で構築物を導入することができる。この例において、人は、調節領域の転写活性上で、例えば,環境、ゲノムなど変化の影響に興味があるであろう。その後、人は、細胞表面への結合現象の結果として、シグナルの形質導入上の薬剤の影響、細胞内阻害剤の影響、第一の経路に伴う第二の経路の影響を評価することができる。
【００５１】
興味のタンパク質カテゴリー、転写因子、阻害剤、調節因子、酵素，膜タンパク質、構造タンパク質、それらのいずれかと複合しているタンパク質は、興味のものである。特異的タンパク質は、アミド切断ペプチドターゼ、例えば，ガスパーゼ、トロンビン，プラスミノーゲン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、カテプシン、ジペプチジル  ペプチターゼ、前立腺特異的抗原，エラスターゼ、コラゲナーゼ、エクソペプチダーゼ、エンドペプチターゼ、アミノペプチターゼ、メタロプロテイナーゼ、セリン/スレオニンプロテアーゼ及びチロシンプロテアーゼの両方を含め、ハイドロラーゼ、例えば、アセチルコリンエステラーゼ、サッカライダーゼ、リパーゼ、アシラーゼ、ATPシクロハイドロラーゼ、セレブロシダーゼ、ATPアーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、ホスファターゼ、ホスホジエステラーゼ、ヌクレアーゼ、エンド及びエクソヌクレアーゼ、シトクロームタンパク質などオキシドリダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、例えば、NAD依存デヒドロゲナーゼ、キサンチンでヒドロゲナーゼ、ジヒドロロテート  デヒドロゲナーゼ、アルデヒド及びアルコール  デヒドロゲナーゼ、アロマターゼ、レダクターゼ、例えば、アルドース  レダクターゼ、HMG-CoAレダクターゼ、トリパノチオ.ンレダクターゼなど、及び他のオキシドレダクターゼ、例えば、ペルオキシターゼ、例えば、ミエロペルオキシターゼ、グルタチオンペルオキシターゼなど、おきシターゼ、例えば、モノアミノオキシターゼ、ミエロペルオキシターゼ、及びこの分類内の他の酵素、例えば、NOシンターゼ、チオレドキシン  レダクターゼ、ドーパミン  β―ヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、nox-1オキシゲナーゼなど、及び他の分類の他の酵素、例えば，トランスアミナーゼ、GABAトランスアミナーゼ、シンターゼ、β―ケトアシルキャリアータンパク質シンターゼ、チミジル酸シンターゼ、シンテターゼ、アミノ酸ｔRNAシンテターゼ、トランスフェラーゼ、エノーループルビルトランスフェラーゼ、グリシンアミド  リボヌクレオチド  トランスフォーミラーゼ、COX-1及びー2、アデノシンデアミナーゼによって増幅された加水分解酵素などの酵素を含む。
【００５２】
例えば，チロシンキナーゼ、MAPキナーゼ、サイクリン依存キナーゼ、GTPキナーゼ、ser／thr  キナーゼ、Chk１及び２などのキナーゼは非常に重要である。
【００５３】
α１−アンチトリプシン、アンチトロンビン、シクロフィリン阻害剤、プロテオソーム阻害剤などの酵素阻害剤も興味深い。
【００５４】
興味の他のタンパク質は、Src,Ras,Neu,Erb,Fos,Kit,Jun,Myb,Abl,Bcl,などのオンコジーンである。サイトカイン、例えば，インタフェロン、α―γインターロイキン、１−１９及びインテグリン、付着因子、TNF、レセプター、ホルモン、コロニー刺激因子、成長因子、例えば、表皮成長因子、繊維芽細胞成長因子など、骨形態形成タンパク質、発育タンパク質、例えば，Hoxタンパク質など、ホメオボックスへ結合する他のタンパク質又は調節タンパク質、例えば、ヘッジホッグタンパク質、ベースメント膜タンパク質、熱ショックタンパク質、Krupple及びKrinngle  構造シェペロンを含むタンパク質、例えば、カルモジュリン、カルシニュリン(calcineurin)などのカルシウム結合タンパク質、膜チャンネル、トランスポータータンパク質なども興味のタンパク質である。
【００５５】
興味のものは、例えば、サイクリン、サイクリン依存キナーゼ、ｐ５３、RBなどの増殖に関係するタンパク質である。
【００５６】
例えば、β―アミロイド、TNF、プリオン、APP、トランスポーター、例えば、ドーパミントランスポーター、レセプター、例えば、NMDAレセプター、AMDAレセプター、ドーパミンレセプター、チャネルなどを含め神経系タンパク質など。
【００５７】
タンパク質の別の分類は、膜レセプター、特に細胞膜レセプター、及び当該レセプターに関連するタンパク質、例えば、Gタンパク質、Gタンパク質複合レセプター、インスリンレセプター、成長因子レセプター、EPOレセプター、T細胞レセプター、免疫グロブリン、CD4、CD8などである。興味の他の細胞膜タンパク質は、主要又はマイナー組織適合性複合タンパク質、接着タンパク質、チャネルなどを含む。
【００５８】
タンパク質の別の分類は、転写因子、及びそれらの阻害剤、又は調節タンパク質、例えば，Adr Ace, Amt, AP, Atf, Att, Baf, Brn, Btf, C Ebp, Cjun, Cets, CREB, CF, Chop, DP, E2F, Elk, Gata, Hnf, IiiA-H, Irf, Ny Y, Otf, NfeB, Nf-At, Oct-1, Pea, Pit, PU, S, SP, Stat, Tef, TFIII, TFIIII, Ubf, and Usf, 等であり、一方阻害剤は、Erk，IeB、LIF, Smad, RANTES, Tdg, 等、転写因子合成、活性化、又は阻害を誘導する毛糸に関係する他のタンパク質を含む。
【００５９】
タンパク質の他の分類は、PPARタンパク質などのホルモン核レセプターである。
【００６０】
いくつかの例において、ハウスキーピングタンパク質、例えば、トリカルボキシル酸サイクル、クレブス回路、グリコーゲン合成などに伴うタンパク質は、興味深い。
【００６１】
種々の経路が、異なるタンパク質に関係する興味深いものであろう。それゆえ、経路は、表面膜タンパク質レセプターへ結合したリガンドの結果としての単一の形質導入、気孔形成、及びトランスポート、プロテオソーム、ペルオキシソーム、細胞成分の多段合成、スピンドル形成、チューブリン会合、例えば、毒素、薬剤など摂取された化合物のプロセッシング等を含む。
【００６２】
主要構築物を含む細胞は、興味の経路に関連するタンパク質、興味のタンパク質の生産の薬剤又は薬剤候補の存在下など環境における変化の影響、発現調節における変化、タンパク質の発現を阻害する効果、細胞経路及びその周辺を阻害する経路、レセプターによるシグナルの形質導入の影響、形成及び分解などの割合に関連するタンパク質の発現レベルなどを同定するのに使用することができる。転写を誘導する特異的経路に興味がある場合、遺伝子構築物は、興味の遺伝子に関係する興味の調節領域を有するであろう。
【００６３】
環境における変化は、化学試薬、例えば、薬剤、抗生物質、酵素阻害剤、レセプターリガンド、などの存在、温度、大気、ｐHなどの物理的環境における変化、例えば、栄養素の添加又は除去、非水溶性溶媒などの添加など培地媒体の変化を含む。
【００６４】
生産物が蛍光性であるβ―ガラクトシターゼ、β―ガラクトシターゼ用の基質の数が知られている。共通の基質は、β―Dグルコピラノシル  フェノール、フルオレセインなど、モノ及びジー置換、o―ニトロフェニルーβ―D‐ガラクトシターゼ、β―メチルベリフェリル(methylumbelliferyl)ーβ-D-ガラクトシド、X-ゲル、リゾルフィンーβ―D―ガラクトシターゼ、商業的に利用可能なオキセタン、例えば，Galacto‐Light Plus(登録商標)キット(ケミルミネッセンス)、及びクロロフェノールレッドなどである。ジーβ―D―ガラクトピラノシリルフルオレセイン、及びクロロフェノールレッドβ―D-ガラクトピラノサイドを細胞マーカーとして使用することができる。
【００６５】
記載すべき最も簡単な手順は、培養における細胞の使用、溶解物の分析である。この場合、細胞が培地において成長する。必要に応じて、融合タンパク質及び他の構築物をゲノムの中へ組み込まれた細胞へ存在させることができ、DNAを細胞へ機能的な翻訳用に導入する種々の方法によって一次的に加えることもできる。細胞は培地又は生体内とすることができる。これらの方法は、前述したように、十分に文献において例示されている。例えば，抗生物質耐性、検出可能なシグナルの開発物など構築物からなる細胞の選択用の融合タンパク質を有するマーカーを使用することによって、融合タンパク質からなる培地において細胞を構築物が存在しない細胞から分離することができる。一度、融合タンパク質が発現すると、細胞の環境は、所望により改変することができる。候補の成分、レセプター用リガンド、表面膜、又は核などへのリガンドを加え、これらの二つを組み合わせて使用することができる。培養媒体における変化を作ることができ、他の細胞を因子の分泌用に又はトランスフォームされた細胞に結合するために加えることができ、ウイルスなども加えることができる。環境に対して、異なる時間間隔で、影響を記録し、培養の部分標本を採取するための十分か時間が与えられるれば、細胞をEA、酵素基質，及び読まれた産物からのシグナルからなる溶解混合物で溶解することができる。その後、溶解物が、融合タンパク質の異なる量で混合し、融合タンパク質の量が決定されるスタンダードを使用することによって、この結果を、融合タンパク質が存在しテ要る量と関連させることができる。その後、シグナルが溶解物における活性融合タンパク質の量と関連するグラフを有するであろう。
【００６６】
細胞が生存可能な宿主にある場合、通常、宿主からの細胞又は組織が収穫され溶解することができるので、培養に使用される方法は同様であろう。構築物を有する細胞の選別は、構築物の一部として抗生物質耐性を有することによって達成することができ、その結果、構築物を欠く細胞によるサンプルの希釈を避けるために抗生物質を使用して選別することができる。
【００６７】
EA及び基質を細胞へ提供することによって、EDの異なる分配を可能とする転写又は他の現象の場合、EDの分配を微視的に決定することができる。転座が、細胞質ソルから核へ生じる場合、核及び細胞質ソルからシグナルを独立して測定することができ、1つ又は両方の測定は必要な情報を提供する。
【００６８】
細胞がEA及び存在する基質を有し、蛍光活性細胞ソーターを使用して活性なEDが存在するレベルを決定することができる。シグナルの限界レベルを提供することによって、限界レベルを超えた細胞の数をカウントすることができ、細胞におけるEDの量の分配パターンを得ることができる。バルク特性として又は個々の細胞で蛍光を測定する他の方法は、例えば、共集光レーザスキャニングサイトメトリーなど既知である。
【００６９】
便宜上、システムは、測定の主要な構成要素のすべて又はいくつかを含むことが可能なキットとして提供する。例えば,キットはベクターの一部、例えば、通常弱めらたプラスミド、ウイルス、などの発現構築物を含み、前記発現構築物は、マーカー、組み込み用タンパク質をコード化する遺伝子、複製開始部位などを含むことができる。発現構築物に加えて、キットは、EA又は同等物、例えばEA用の発現構築物、β―ガラクトシターゼ用の基質、を含み、加えて、一又はそれ以上の細胞株、又は主要細胞、ED存在量に関連する対応のグラフ、緩衝液などを含む。いくつかの例において、細胞は、所望の環境、例えば、興味の経路に伴うタンパク質の発現の高いレベル、表面膜レセプター、GPCR,核レセプター、例えば、ステロイドレセプター、転写因子などを提供するのに設計することができ、又は変異させることができ、それによって、融合タンパク質の天然タンパク質の発現に影響する発現のレベルを減少させる。人は、発現のレベルを向上させることに関心がある。
【００７０】
示したように、主要な方法は、多くの状況において大きな効果に対して使用することができる。なぜなら、EDは、融合タンパク質として興味のタンパク質がEDと機能するのに十分小さく、EDがEAと複合し、機能的酵素を提供することを可能とするからである。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、説明を意図するものであり、本発明を限定するものではない。
【００７２】
試験
IKB-ED融合タンパク質の生産
IKB及びEDをコード化するｃDNA(図1)をPfuDNAポリメラーゼで増幅した（Stratagene,CA）。IKBα及びIKB  Mをフォワードプライマー：５‘CCGAAGCTTATGTTCCAGGCGGCCGAG-３’（SEQ  ID  NO:１）及びリバースプライマー５‘-ATAGGATCCTAACGTCAGACGCTGGCC−３’(SEQ  ID  NO:２)を使用して増幅した。これらのプライマーは、PCR産物の５‘末端でHindIIIを、３’末端でBamHIを組み込んだ。また、IKBの停止コドンを、EDを有するオープンリーディングフレームを提供するために除去した。ｐCMV-IKB及びｐCMV-IKBM（CLONETECH,  CA）をPCR鋳型として使用した。IKB  Mは、アミノ酸残基３２及び３６でのセリンのアラニンへの変異を含む。これら2つの部位は、IKBのホスホリル化へ重要であり、変異は、IKBの分解に対する耐性を生じさせる(Brown、Gerstbergger,Carlson,Franzoso, Science,1995 Mar 10; 267(5203): 1485-8)。他方、EDをフォワードプライマー：５‘-ATAGGATCCATGAGCTCCAATTCACTGGCCG-３’｛SEQ  ID  NO:3｝及びリバースプライマー５‘ATAAGAATGCGGCCGGCCTATTCGCCATTCAGGCTGCGC-３’｛SEQ  ID  NO:４｝。フォワードプライマーは、Bam  HI部位EDへ組み込み、リバースプライマーNotI部位をEDへ停止コドンと共に組み込んだ。増幅を92℃で1分間DNAを変性させ、52℃で1分間アニ-ルし、その後、72℃で2分間伸長し、その後全部で29回繰り返すPCRプログラムを使用した。増幅したPCR産物はBam  HI部位でライゲートし、生じた融合構築物をHind  III及びNotIの部位で哺乳類発現ベクターpCMVの中へサブクローン化し、構築物設計pCMV-IKB−EDを生じた。ｐCMVベクターは、IKBαがPCMV−IKB−ED融合構築物によって置換されるPCMV-IKBα（CLONTECH、CA）由来とした。ｐCMV-ED構築物は、分子生物学法のスタンダードに従って(Maniatis et al)、EDPCR産物をBam  HI部位及びNot  I部位へ挿入することによって得ることができた。
【００７３】
ED融合タンパク質の細胞培養における発現
Hela細胞は、10％胎児ウシ血清及び2mMグルタミン（GIBCO、CA）で補完したDMEM媒体（GIBCO、CA）において培養しつづけた。一時的感染のために、細胞を実験前1日６ウエルプレートに播種した。各ウエルに対して、3μlのFugene  ６を100μlの無血清培地へ希釈し、その後、プラスミドDNA1μgを加えた。ウエルへの滴下を加える前に、混合物を室温で15分間インキュベートした。プレートをその後、測定まで37℃でインキュベートした。
【００７４】
ED活性を検出するために、感染後24時間、培地を除去し、細胞を200μlの溶解緩衝液液（0.5％  CHAPS,  10mMリン酸カリウム、10mM塩化ナトリウム、pH6.9）で溶解した。その後、細胞溶解物30μlをEA試薬（EAコア緩衝液における0.18mg/ml  EA及び0.5％胎児ウシ血清（100mM  PIPES,400mM  NaCl, 10mM
EGTA, 0.005 % Tween, 150 mM NaOH, 10 mM Mg アセテート、  14.6mM  NaN3,  pH69））10μlが加えられる384ウエルプレートの中へ感染させた。30分間室温でインキュベーションした後、15μlのケミルミネッセンス物質（EAコア緩衝液における４％のGalacton  Star（登録商標）及び20％のEmerald（登録商標）（Tropix））を加えた。シグナルを、ウエル当たり1秒間の組み込み時間でLumicount（Packard）又はFluoroskan(Labsystem)上で解読した。
【００７５】
図２において、3つの構築物をHeLa細胞の中へ感染させ、それらは、それぞれ、pCMV-ED、pCMV-IKB-ED、及びｐCMV−IKB  M-EDである。非感染細胞もネガティブ対照例として使用した。EDを融合タンパク質として発現させたとき、ED活性は、容易に検出することができ、融合タンパク質はかなり安定であることを示す。しかしながら、EDを単独で溶解させず発現させたとき、ED活性は、基礎レベルまで落ち、溶解されていないEDは、非常に不安定なペプチドであり、細胞内において迅速に分解することを示した。
【００７６】
HeLa細胞におけるTNFα-誘導IKB-ED分解
Hela細胞を、感染前24時間24個のウエルプレートへ播種した。0.2５μgのDNAをFugene 6（Roche）を使用して製造者のプロトコールに従って各ウエルの中へ感染させた。感染後24時間、細胞をTNFα(Sigma)の処理へ種々の高度で30分間さらした。その後、培地を除去し、細胞を90μlの細胞溶解緩衝液において溶解した。30μlの細胞溶解物を、10μl EA試薬が加えられた384個のウエルプレートへ移した。測定を3回繰り返して行なった。15μlのケミルミネッセンス物質の添加前に、プレートを室温で30分間インキュベートした。物質添加後、プレートを30分間判読した。未処理の細胞を100％活性化へ標準化した。図3に示すように、TNFαはED活性を用量依存的に減少させることができ、このことは、野生型IKBの分解を示す。対照的に、突然変異体型は、予想されたように、TNFα処理による用量依存的なED活性の減少を示さなかった。この結果は、融合タグとしてのEDは、IKB生物学的機能を変化させず、生体内でIKB分解をモニターすることが出来ることを証明した。加えて、IKB-ED分解は、上流のコンポーネント活性化に特異的に関連した。IKB-ED分解は、標識されていないIKBと同様に32及び36残基でIKBホスホリル化に依存した。
【００７７】
Hela細胞におけるIL-1-誘導IKB-ED分解
細胞のIL-1活性が誘導されたIKBの分解を通じてNE-KB経路活性を生じた。細胞におけるED標識したIｋBが、IL-１経路活性をモニターできることを確認するために、HeLa細胞を上述したように24ウエルプレートにおいて同様に、ｐCMV- IKB -EDまたはｐCMV−IKB M-Edで一時的に感染させた。細胞をその後、IL-1（Sigma）で種々の濃度で30分間処理し、その後、ED活性を測定した。図４に示したように、IKB-ED活性は、用量依存的にIL-１処理で減少する一方、IKB、IKB M-EDの突然変異型はIL-1誘導分解に対して耐性であった。この結果は、HeLa細胞において発現したIKB−EDは、内因性神経芽細胞IL-1レセプター活性をモニターするのに使用することできることを証明した。
【００７８】
神経芽細胞腫細胞株SK-N-DHにおけるGｑ-結合GPCR活性
Gq結合GPCRレセプター活性がNF-KB経路活性を生じることが報告された。IKB-ED融合タンパク質がGPCR活性をモニターするための機能的マーカーとして使用することができることを証明するために、神経芽細胞腫細胞株SK-N-SHを使用した。この細胞株は内生的にM3レセプターを発現することを報告した。このレセプターは、Gαq結合する。カルバコールは、M3レセプターを活性化するための非選択的アゴニストとして知られる。SK-N−SH細胞（ATCC）を10％胎児ウシ血清及び２ｍMグルタミンで補完したMEM培地(Gibco)において培養した。細胞を、実験一日前に24ウエルプレートの中へ播種した。その後、ウエル当たり0.25μgDNAを細胞をFugene６と感染させるのに使用した。感染24時間後、細胞をカルバコールで、20分間37℃で処理した。その後、細胞を溶解し、ED活性を上述したように測定した。図５に示すように、M3活性を誘導するカルバコールをIKB-EDの分解によって指示し、減少したRLUリーディングを生じた。未処理の細胞を100％活性へ標準化した。カルバコールの30μM処理において、ED活性の50％のみを保持した。RLUの減少は、IKB−ED融合タンパク質の誘導された分解を指示した。これに対して、IKB M-EDは、活性における劇的な減少を示さなかった。ED活性の９２％以上は、IKB M-ED発現細胞において30μMカルバコール処理後も維持された。この結果は、IKB標識EDは、GPCR活性をモニターすることにも使用することが出来ることを証明した。
【００７９】
M1活性はIKB−PL 分解を導く
ヒトM1ムスカリンレセプターを安定的に発現するCHO-K1細胞は、Euroscreen（Belgium）から得られた。細胞を10％胎児ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン及び400μg/mlG418を含むF-12培地で成長させた。細胞を感染1日前、24ウエルプレート上に播種した。製造者の指示にしたがって、PCMV-IKB-PLをFugene６を使用してCHOM１細胞の中へ一時的に感染させた。感染24時間後、培地を取り替え、細胞を異なる濃度の範囲で30分間カルバコールで処理した。培地を誘発後取り除き、補填的測定をケミルミネッセント読み出しで行なった。(図１４)
【００８０】
MC４活性はIKB-PL分解を導く
ヒトMC4メラノコルチン４レセプターを安定的に発現するCHO−K1細胞は、Euroscreenから得た。細胞を10％胎児ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン及び400μg/ml  G418を含むF-12培地で成長させた。細胞を感染1日前、6ウエルプレート上に播種した。製造者の指示にしたがって、PCMV-IKB-PLをFugene６を使用してCHO  MC4細胞の中へ一時的に感染させた。感染24時間後、培地を取り替え、細胞を指示した濃度で30分間NDP-α-MSHで処理した。培地を誘発後取り除き、補填的測定をケミルミネッセント読み出しで行なった。(図１５)
【００８１】
CCR３活性はIKB-PL分解を導く
ヒトケモキンCCR3レセプターを安定的に発現するCHO−K1細胞は、Euroscreenから得た。細胞を10％胎児ウシ血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、5μg/mlピューロマイシン、100μg/mlヒグロマイシン、及び400μg/ml  G418を含むF-12培地で成長させた。細胞を感染1日前、6ウエルプレート上に播種した。製造者の指示にしたがって、PCMV-IKB-PLをFugene６を使用してCHO  MC4細胞の中へ一時的に感染させた。感染24時間後、培地を取り替え、細胞を指示した濃度で30分間エオタキシンで処理した。培地を誘発後取り除き、補填的測定をケミルミネッセント読み出しで行なった。(図１６)
【００８２】
EGFR活性はIKB-PL分解を導く
IKB-PLを安定的に発現するHela細胞を使用した。細胞がEGFに対して応答していることを確かめるために、細胞可視可測定を行なった。HeLa-IKB細胞を0.5％FBSを有するDMEMへウエル当たり5000細胞の密度を有する96ウエルプレートに播種し、ｒHEGFの連続的な投与を行なった。72時間後、細胞可視測定を細胞タイター-Glo  ルミネッセンス  細胞可視測定キット（Promega）を使用して行なった。結果は、可視できる細胞数が、用量依存的にEGF誘発へ応答することができることを示した(図１７)。
【００８３】
Hela細胞のEGFへの応答ををテストするために、IKB-PLを発現するHela細胞をウエル当たり8000個の密度を有する96-ウエルプレートにおいて0.5％FBSを含むDMEM培地において播種した。37℃で５％CO２下インキュベートした後、細胞をシクロヘキシミド(10μg/ml)で30分間予め処理し、その後rhEGFの連続投与に2時間曝した。IKB−PL分解をDiscoveRx 酵素断片相補性（EFC）測定を使用して検出した。結果は、用量依存的なEGF誘発へのIKB分解を証明した(図１８)。
【００８４】
Basal Conditions pcDNA3.1-PL-PPAR構築物の下、PL(PL-PPAR)で標識した各レセプターの分解は、クローニング手順を2回行なって得られた。1回目において、ED配列(55-mer)をpcDNA3.1/zeo ベクター（Invitorogen）のNheI及びKpnI部位へ挿入した。ヒト胎盤ｃDNAライブラリーのPCR増幅によってPPARg１を得て、クローニング2回目において,ベクターのKpnI及びNotI部位の中へ挿入した。
【００８５】
要約すれば、pcDNA3.1/zeo  ベクターDNA(図6)が、最初にNheI及びKpnI制限酵素を使用して消化され、その後、大断片をゲル精製し、ED含有プラスミド（ｐCMV-IKB-ED）からPCRによって得られたED  DNA配列へライゲートされる。PCRによって得られたED  DNA断片は、ゲル精製され、同じ酵素で消化され、精製されたpcDNA3.1/zeo-NheI-KpnI断片へライゲートされる。生じたpcDNA3.1-PL構築物は、pcDNA3.1-PL-PPARγ１をさらに生産するのに使用する。
【００８６】
PPARγ１コード化領域のPCR増幅を、200μMの5’及び3’プライマー、５‘プライマー：AGACGGTACC ATGACCATGG TTGACACAGA GATG;(配列識別番号５)３’プライマー：GTCCTCTAGA TGTTCCTGAA CATGATCCGC CGGCGCAGA(配列識別番号６)、1μLnoヒト胎盤ｃDNAライブラリー（Clontech）白金タグDNAポリメラーゼ  ハイ  ファイデリティ（High Fidelity）(Invitrogen)を製造者の推奨にしたがって使用して100μLの反応混合液中で実施した。1.5kb  PCR産物をQIAEX  IIゲル抽出キット（Qiagen）を使用してゲル精製し、KpnI及びNotI制限エンドヌクレアーゼで消化用に使用した。より早く得られたpcDNA3.1-PL構築物を同じ制限酵素(KpnI及びNotI)で消化し、ゲル精製し、T４DNAリガーゼを使用して（Statagene）PPAR  KpnI/NotI遺伝子断片へライゲートした。ライゲ-ション混合物をDH5αコンピタント細胞をトランスフォームするのに使用し、得られたコロニーを制限酵素分析によってマップ化した。選択したクローンにおいてEDPPATｇ１挿入物の存在をＤＮＡシークエンシングによって確かめた。
【００８７】
ＰＬ−ＰＰＡＲ融合タンパク質の一時的感染及び検出
pcDNA3.1-PL-PPAR構築物を使用して、6ウエルプレートにおいて播種したHEK293細胞へ一時的に感染させた。Fugene６を遺伝子移送系として使用した。感染を製造者の指示に従って実施した。1μgのプラスミドDNA及び３μlのFugene６試薬を共に混合し、HEK293細胞の70％密集単一層上へ適用した。感染24時間後、細胞をPBSで洗浄し、その後、穏やかな界面活性剤を含有する溶解物緩衝液(480μl)において溶解した（CHAPS）。全細胞溶解物をEFC(ED及びEAの酵素断片相補部分)活性又はウエスタンブロティング用に調べた。全細胞溶解物30μLを384ウエルプレートに三重に置床した。EA試薬10μlをウエルへ加えた。室温で1時間インキュベーション後、15μLnoケミルミネッセンス物質を加え、βガラクトシターゼ相補活性をケミルミネッセントリーダーを使用して1時間以内に測定した(Packard)。EFC活性ネガティブ対照例を、対照ウエルにおけるEA試薬を置換するのに加えたEA希釈緩衝液の添加のものか、又は非感染細胞の細胞溶解物のいずれかであった。
【００８８】
ウエスタンブロティングを使用したPL−PPAR融合タンパク質の特性
PL-PPARの発現は、全細胞溶解物又は免疫沈澱物をウエスタンブロティングすることによっても確認した。沈殿用に１μgの抗PPAR抗体（Santa Cruz：sc-７１９６）をタンパク質A−セファロースビーズ上でPBS緩衝液中で一晩中４℃で固定化した。ビーズをPBS緩衝液で２回洗浄し、室温で１時間細胞溶解物でインキュベートした。その後、ビーズを４回PBS緩衝液で洗浄し、LDSサンプル緩衝液中で１００℃で５分間沸騰させた。その後、１５μlの全細胞溶解物又は免疫沈澱物を、NuPage  ４-１２％ビスートリス  プレキャスト  ポリアクリルアミドゲルにかけ、ニトロセルロース膜上にブロットした。その後、膜を、抗体でPPARγへ精査し、その後、二次抗体がアルカリ性フォスファターゼへ結合した。内因性PPARγ(５１ｋDA)及び組み換え発現したPL−PPARγ(５８ｋDA)に対応するバンドは、アルカリ性フォスファターゼの発色性基質を使用して可視化した。
【００８９】
一時的発現PL-PPARのプロテオソーム分解
一時的発現PL-PPARタンパク質のプロテオソーム分解を、NIH3T３、ECV304、及びHela細胞において検出した。細胞をpcDNA３.１-PL-PPARで感染させて、感染２４時間後、培地を取り除き、細胞を担体（DMSO）又はMG132(プロテオソーム阻害剤)のいずれかで処理した。感染を上述したように、６ウエルプレートで実施した。細胞をPBS緩衝液で洗浄し、CHAPS(穏やかな界面活性剤)を含有する溶解物緩衝液４８０μlに溶解し、三回ED−EA相補性用にテストした。細胞溶解物の３０μlを３８４ウエルプレートのウエルへ設置した。その後、EA溶液１０μLを加え、相補性の反応を１時間、室温で行なった。ケミルミネッセント物質１５μL(０.４mM  Galacton-Star(Applied  Biosystems,Bedford,MA)及び２mg.ml  Emerald  II基質(Applied Biosystems, Bedford, MA)をウエルへ加え、ケミルミネッセントシグナルをケミルミネッセントリーダーを使用して判読した(Packard LumiCount, Packard Biosystems)(図１０A,１０B及び１０C)。
【００９０】
PL−PPARγのMG132用量依存的な増加
PL-PPAR発現レベルを増加した濃度のMG132の存在下でテストした(図１１)。実験を、MG132の表示された濃度を使用する以外、上述したように行った。
【００９１】
PL-PPARγ１の基礎的な分解
PPARγ１タンパク質の分解がいくつかの文献において立証されているが、当方は、それら実験においてPLタグの付着が分解を誘因したかどうか調べた。(文献として、例えば、Floyd et al., 2002 J.Biol.Chem., 277, 4062-8; Waite,et al., 2001 icid, 276, 7062-8; Hauser, et al., 2000 icid, 275, 18257-33; Dennis, et al., 2001 Front. Biosci., 6, D954-9 and Wijayayatne and McDonnell 2001 J. Biol. Chem., 276, 35684-92.)。当方は、長く残存したタンパク質EDへ融合したGFPタンパク質をテストした（GFP-PL）。PL-PPARと異なり、GFP−PLは、いずれの分解も示さず(図１２)、PL-PPAR分解は、PPARタンパク質の特異的性質であった。
【００９２】
哺乳細胞の核におけるPLで標識した核レセプター(PL-PPAR)の検出
PL−PPAR構築物及び感染を上述したように行なった。その後細胞を使用し、細胞内のPL-PPARタンパク質の局在を検出した。
【００９３】
NIH３T３又はECV304細胞においてpcDNA３.１−PL-PPAR構築物の感染２４時間後、PL-PPARタンパク質の核局在を検出し、その後、担体対照例としてDMSO又は１０μMのCTZ（Ciglitazone）−PPARγ選択性アゴニストのいずれかで２時間処理した。感染を上述したように６ウエルプレートで実施した。細胞をPBS緩衝液で洗浄し、３.７％ホルムアルデヒド/PBS溶液で２０分間固定し、その後、０.１％Tween-２０で浸透させた。細胞をさらに、５００μlのEA試薬で１時間室温でインキュベーションした。EA試薬を除去した後、X-Gal染色溶液（Invitrogen）を加え、プレートを３７℃で５％CO2で２時間インキュベートした。像を可視化して、Zeiss  HBO100  マイクロスコープを使用して捕獲した(図１３A及び１３B)。
【００９４】
修飾した細胞を多くの目的に使用することができる。細胞を、細胞がマイクロタイタープレートに播種でき、候補の化合物で処理し、37℃で30分間シンキュベートし,その後溶解するNｆ−βB経路活性を測定するのに使用することができる。EA及び基質の添加後、発生したシグナルは、NF-βB経路で候補の化合物との影響を示すであろう。シグナル減少は、候補の化合物が経路を刺激することを示すであろう。候補の化合物は、レセプター-リガンド相互作用が自然にNF-βB経路活性を導くレセプター-リガンド相互作用におけるそれらの影響をスクリーニングすることができる。レセプターは、細胞におけるIβB-ED融合タンパク質とともに発現することができるか、又はI βB融合タンパク質構築物レセプターを発現する細胞において発現することができる。細胞を、リガンドを添加する前に候補の化合物で処理する。I βB−ED分解の阻害は、レセプター活性の阻害を示す。レセプターは、それらGCPR、すなわち、GTPアーゼと複合したレセプター、オーファンレセプター、又はNF-βB経路へ結合したいずれかのレセプターを含むことができる。プロトコールは、NF-βB経路へ関連する遺伝子をスクリーニングする際に使用することができる。ｃDNA発現ライブラリーを、IβB−EDを発現する細胞の中へ感染させて、IβB−ED分解におけるいかなる変化も決定することができる。分解のレベルにおける変化は、遺伝子がNF-βB経路へ影響することを示す。この方法において、遺伝子機能、医薬標的検証，及び新規医薬標的を決定するために測定することができる。加えて、IKKキナーゼ、又はユビキチン経路活性又は阻害を分析することができる。
【００９５】
サイクリン-ED融合タンパク質用の遺伝子を調整し、細胞を構築物で感染させることによって、細胞成長におけるインディケータとしてサイクリン変化、サイクリン上の候補化合物例えば、異常な成長、例えば、がん細胞などを制御する化合物の影響をモニターすることができる。EDは、p53へ融合させることができ、融合タンパク質のレベルを、細胞アポトーシス、p53遺伝子修飾、細胞におけるｐ53蓄積又は減少で観察した。
【００９６】
環境における変化において核に転座した因子を有することによって、タンパク質の核への運搬を決定することができる。このようにして、そのような転座の活性及び阻害を測定することができる。また、タンパク質が、大きい会合と関係して、融合体、例えば、プロテオソーム、スプライセオソームなどを生産する場合、ED融合タンパク質の活性の減少は、ED融合タンパク質の活性における減少によってモニターすることができる。
【００９７】
主要な発明が、細胞の機能、細胞の機能上の試薬の影響、細胞におけるターゲットの同定、細胞成分間の相互作用の同定を調査するため、また、医薬候補、細胞状態の変化の影響、例えば、細胞経路上での分化、腫瘍形成、有糸分裂、減数分裂などをスクリーニングするための力強いツールを提供することは上述の結果から明白である。この方法は、利用可能な成分を使用する率直的なものである。このシステムは、使用者が、興味の所望の遺伝子を予め設計したベクターの中へ導入することができ、ED(又はPL)を有するリーディングフレームにおいて遺伝子を有することができる場合、好都合な形で提供される。融合タンパク質を容易に調整され、分解が伴われる場合、ED(又はPL)はいずれかの末端で結合することができる。融合タンパク質が生物学的に活性であり、消極的又は積極的な背景において天然の遺伝子の代理として役立つことができる。加えて、融合タンパク質に対して構築物と相互作用するように特異的に修飾される細胞を提供することができ、制御された転写、例えば，融合タンパク質の活性に影響する誘導、発現、過剰発現などを提供する。主要な発明に対する他の用途も、医薬に対する間接的な応答、処理に対する応答、細胞における変化等をモニターする際にもまた利用することができる。
【００９８】
全ての刊行物及びこの明細書で引用した特許出願を、あたかも各刊行物又は特許出願が参照によって組み込まれるように具体的に個別に閉めされるように、ここで参照により組み込む。
【００９９】
前述の発明は、明確に理解されることを目的に、説明及び実施例によっていくつか詳細に記載されてきたが、本願発明の技術に鑑み、与えられた特許請求の範囲の要旨又は範囲を逸脱することなしに、いくつかの変更及び修正を行なうことが可能であることは、当業者にとって容易に明白である。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、酵素ドナーアミノ酸配列及び核酸配列をである。
【図２】図２は、融合していないか又は融合している細胞のED活性の図である。
【図３】図３は、HeLa細胞におけるTNF誘導されたIkB−ED分解の図である。
【図４】図４は、HeLa細胞におけるIL-1誘導IKB−ED分解の図を示す。
【図５】図５は、SK-N-SH細胞におけるカルバコール誘導IKB-ED分解の図を示す。
【図６】図６は、pcDNA３．１/zeoベクターの図である。
【図７】図７は、pcDNA3.1-PL-PPAR  DNA構築物の地図である。
【図８】図８は、PL−PPAR  DNA構築物の量に比例することを示す酵素断片相補性(β―ガラクトシターゼED及びEA相補性)活性読み出しの棒グラフである。
【図９】図９は、HEK-293細胞で一時的に発現したPL-PPARの全細胞溶解物及び免疫沈降のウエスタンブロットを示す。矢印は、PL-PPAR構築物を示す。
【図１０】図１０は、MG132プロテオソーム阻害剤(20μM)の存在下、PL-PPARγ１の増加した量を示す棒グラフである。１０A．NIH3T3細胞；１０B.ECV304細胞；及び１０C.Hela細胞；PL-PPARのプロテオソームの分解のレベルを示す。
【図１１】図１１は、プロテオソーム阻害剤の存在下のPL−PPARの量の増加に依存した投与量を示す図である。
【図１２】図１２A及び図１２Bは、融合タンパク質IKB-PL及びGFP(グリーン蛍光タンパク質)-PL-12Aの存続期間におけるプロテオソーム阻害剤の影響を示す棒グラフである。ECV40細胞は、IKB−PL、１２Bで一時的に感染させた。NIH３T3細胞は、GFP-PLで一時的に感染させた。MG１３２濃度は、２０μMであった。
【図１３】図１３は、CTZの存在下において主に核に集中したPL-PPARタンパク質の細胞拡散を示す。１３A  NIH3T3細胞及び１３B.  ECV304細胞。
【図１４】図１４は、カルバコールで刺激したCHO−K1細胞におけるIKB-PL分解を引き起こすクローン化されたM１レセプターの活性を示す。
【図１５】図１５は、CHO−K1細胞におけるIkB−PL分解を引き起こすクローン化されたメラノコルチン４（MC4）レセプターの活性を示す。
【図１６】図１６は、エオタキシンによってCHO−K1細胞におけるIKB-PL分解を引き起こすケモカインレセプターCCR３の活性を示す。
【図１７】図１７は、HeLa細胞における細胞の実行可能性の測定としてのEGFR活性を示す。
【図１８】図１８は、HeLa細胞におけるIKB-PL分解を引き起こすEGFによるEGFレセプターの活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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