(57)【要約】  本発明は、（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリドを含む、経時的な安定性と復水調整時の溶解性に優れた凍結乾燥製剤を提供する。本発明は、１）（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド又はその薬理学的に許容され得る塩、２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤を含有する凍結乾燥製剤を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）下記式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩と、
２）pHを５〜８に調整するpH調整剤と、
３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤と、
【化１】
2008020584.tif 000016
を含有する凍結乾燥製剤。
【請求項２】
前記賦形剤が、前記凍結乾燥製剤において非晶質粉体として存在する、請求項１記載の凍結乾燥製剤。
【請求項３】
前記賦形剤が、スクロースである、請求項１又は２記載の凍結乾燥製剤。
【請求項４】
前記pH調整剤が、クエン酸又はその塩である、請求項１〜３の何れか１項記載の凍結乾燥製剤。
【請求項５】
前記pH調整剤の配合量が、式（１）で示される化合物１重量部に対して０．１〜３００重量部である、請求項１〜４の何れか１項記載の凍結乾燥製剤。
【請求項６】
シクロデキストリン類、グリシン及びポリエチレングリコールから選択される１種以上の安定化剤をさらに含む、請求項１〜５の何れか１項記載の凍結乾燥製剤。
【請求項７】
前記安定化剤の配合量が、式（１）で示される化合物１重量部に対して０．２〜５００重量部である、請求項６項記載の凍結乾燥製剤。
【請求項８】
抗酸化剤をさらに含む、請求項６又は７記載の凍結乾燥製剤。
【請求項９】
前記凍結乾燥製剤における製剤中の水分量が、２．０重量％以下である、請求項１〜８の何れか１項記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
前記凍結乾燥製剤が、注射用製剤である、請求項１〜９の何れか１項記載の凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
容器と、
請求項１〜１０の何れか１項記載の凍結乾燥製剤と、を含む物品であって、
前記凍結乾燥製剤が充填された前記容器のヘッドスペースが、窒素置換されている物品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍作用を有する１２員環マクロライド系化合物を含有する安定な凍結乾燥製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリドである、式（１）で表される１２員環マクロライド系化合物は、【０００３】
【化１】
2008020584.tif 000002
【０００４】
微生物発酵により見出された化合物を化学修飾して得られた化合物である（例えば、特許文献１参照）。この化合物は、in  vitroにおいて、低酸素状態でのVEGF  （Vascular  Endothelial  Growth  Factor：血管内皮細胞増殖因子）産生の抑制を介して、癌による血管新生を抑制し、in  vivoにおいて、固形腫瘍細胞の増殖を抑制する作用を有していることが知られている。【０００５】
上記式（１）で示される化合物を有効成分として、実際の医薬品として開発するには、各種の剤形として製剤化する必要がある。製剤化では、有効成分の性質に応じて、固体や液体などとして製剤化される。
【特許文献１】国際公開公報  ＷＯ０３／０９９８１３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明において、式（１）で示される化合物の製剤化を検討したところ、注射用製剤の製剤化においては、有効成分である式（１）で示される化合物が、溶液中での安定性が十分でなく、水性注射剤としての開発は難易度が高いということが判明した。一方で、式（１）で示される化合物は、結晶質の粉末状態では良好な安定性を有しているため、粉末充填製剤としての製剤化を検討したが、式（１）で示される化合物の結晶の溶解速度が遅いため、用時溶解して調剤するには長時間を要する等の問題点があることも判明した。【０００７】
上記事情に鑑み、本発明の目的は、経時的な安定性に優れ、且つ復水時の溶解性に優れた、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩を含む凍結乾燥製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記の点を解決すべく鋭意研究した結果、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩を、特定のpH調整剤と特定の賦形剤と共に凍結乾燥することにより、経時的な安定性に優れ、且つ復水時の溶解性に優れた凍結乾燥製剤が得られることを見出した。特に、凍結乾燥製剤において、非晶質粉体として存在する賦形剤を用いた場合、凍結乾燥製剤として安定化効果が大きい凍結乾燥製剤が得られることを見出した。また、pH調整剤として、特にクエン酸およびその塩を用いた場合、凍結乾燥製剤としての安定化効果が大きいことを見出した。さらにグリシン、シクロデキストリン類、ポリエチレングリコールを、前記製剤の安定化剤として加えると、より一層安定性が向上することを見出した。加えて、抗酸化剤の配合や容器としてのバイアル瓶のヘッドスペースの窒素置換が安定化に寄与することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００９】
即ち、以下に示す構成により、本発明の初期の目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明の第１の態様によれば、
１）下記式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩と、
２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤と、
３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤と、【００１０】
【化２】
2008020584.tif 000003
【００１１】
を含有する凍結乾燥製剤を提供する。ただし、pH調整剤がリン酸もしくはその塩である場合は、賦形剤がマンニトールである場合を除く。【００１２】
また、本発明の第２の態様によれば、
容器と、前述の本発明に係る凍結乾燥製剤と、を含む物品であって、前記凍結乾燥製剤が充填された前記容器のヘッドスペースが、窒素置換されている物品を提供する。【００１３】
なお、本発明で用いる用語「物品」とは、本発明に係る凍結乾燥製剤を含む容器をいい、容器の具体例としては、凍結乾燥製剤が充填されるバイアル瓶などを挙げることができる。また、本発明では、pH調整剤を水又は水性溶媒（たとえば、水とアルコールの混合物）に溶解させたものをpH調整液と呼ぶ場合がある。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリドを含む、経時的な安定性と復水時の溶解性に優れた凍結乾燥製剤が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。【００１６】
（式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩）
本発明で用いる式（１）で示される化合物（（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリド）は、国際公開公報  ＷＯ０３／０９９８１３号に記載された方法により合成することができ、そのまま使用してもよいし、その薬理学的に許容され得る塩として使用してもよい。【００１７】
【化３】
2008020584.tif 000004
【００１８】
本発明で用いる用語「薬理学的に許容され得る塩」とは、特に限定されないが、通常、酸との塩、例えば、塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、臭化水素酸塩、トルエンスルホン酸塩等が挙げられる。【００１９】
本発明に係る凍結乾燥製剤（以下、単に「本凍結乾燥製剤」という。）は、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩を活性成分として含有するものであり、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩の１バイアル中の含有量は、通常は０．１〜１００mg、好ましくは０．２〜７５mgであり、より好ましくは０．４〜５０mgであり、さらに好ましくは０．５〜３０mgである。【００２０】
（製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤）
本凍結乾燥製剤中のpHを調整するpH調整剤は、凍結乾燥に供する水溶液のpHを５〜８に調整するものであり、好ましくはpH５．４〜７．６、より好ましくは５．８〜７．２である。製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤は、医薬製剤において一般的に使用されているものであれば、特に限定されないが、例えば、クエン酸もしくはその塩（クエン酸ナトリウム等）、酒石酸もしくはその塩（酒石酸ナトリウム等）、リン酸もしくはその塩（リン酸２水素ナトリウム、リン酸１水素ナトリウム等）、炭酸もしくはその塩（炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等）、乳酸もしくはその塩（乳酸ナトリウム等）、酢酸もしくはその塩（酢酸ナトリウム等）、メグルミン、水酸化ナトリウム等を挙げることができる。好ましくは、クエン酸もしくはその塩（クエン酸ナトリウム等）、酒石酸もしくはその塩（酒石酸ナトリウム等）、リン酸もしくはその塩（リン酸２水素ナトリウム、リン酸１水素ナトリウム等）であり、より好ましくは、クエン酸もしくはその塩（クエン酸ナトリウム等）であり、いずれも水酸化ナトリウムや塩酸等の水溶液を用いて、製剤中のpHを５〜８に調整してもよい。なお、前述にように、pH調整剤における塩は、ナトリウム塩を例示したが、本発明で用いるpH調整剤はこれに限定されるものではなく、カリウム塩等をも含む。【００２１】
pH調整剤の配合量は、特に限定されないが、通常、式（１）で示される化合物１重量部に対して、０．１〜３００重量部であり、好ましくは０．２〜２００重量部であり、より好ましくは０．３〜１００重量部であり、さらに好ましくは０．３〜５０重量部である。【００２２】
（糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤）
本凍結乾燥製剤に用いられる賦形剤は、糖類及び糖アルコール類から選択される少なくとも１種類以上の賦形剤である。糖類としては、特に限定されないが、例えば、単糖類としては、グルコース、フルクトース等を、二糖類としては、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等を挙げることができる。糖アルコールとしては、例えば、マンニトール、エリスリトール、イノシトール、ソルビトール等を挙げることができる。【００２３】
糖類及び糖アルコールのうち、とりわけ、凍結乾燥製剤において非晶質粉体として存在する賦形剤が、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩の経時的な安定化効果が大きいため望ましい。具体的には、単糖類としては、グルコース、フルクトース等を、二糖類としては、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース等を、糖アルコールとしては、イノシトール、ソルビトール等を挙げることができ、好ましくはスクロースである。【００２４】
本凍結乾燥製剤において、賦形剤が糖類及び糖アルコールから選択される２種以上の賦形剤を含有する場合には、賦形剤の総重量に対して、凍結乾燥製剤において非晶質粉体として存在する賦形剤を、少なくとも４０重量％以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは６０％以上を含有させることが望ましい。【００２５】
また、本凍結乾燥製剤中の糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤の量は、式（１）で示される化合物１重量部に対して、２〜１５００重量部であり、好ましくは４〜１０００重量部であり、より好ましくは６〜５００重量部、さらに好ましくは１０〜３００重量部である。【００２６】
本凍結乾燥製剤は、１）式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩、２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤の他に、さらに、シクロデキストリン類、グリシン及びポリエチレングリコールから選択される１種以上の安定化剤を、さらに含有する。【００２７】
本発明に用いる安定化剤のシクロデキストリン類は、特に限定されないが、例えば、α−シクロデキストリン，β−シクロデキストリン，γ−シクロデキストリン、部分メチル化β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンを挙げることができ、好ましくはβ−シクロデキストリン，γ−シクロデキストリン、部分メチル化β−シクロデキストリン、ジメチル−β−シクロデキストリン、グリコシル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンであり、より好ましくはβ−シクロデキストリン，ジメチル−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンであり、さらに好ましくはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。【００２８】
本発明に用いる安定化剤のポリエチレングリコールは、特定の分子量のものに限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３２５０、３３５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００等を挙げることができる。ポリエチレングリコールは、その分子量の大小にかかわらず、式（１）で示される化合物に対する極めて優れた安定化効果を有しているが、注射剤における使用例では、低分子量のポリエチレングリコールが多いこと及び凍結乾燥技術の特性として高分子量添加剤ほど凍結乾燥しやすいこと等を考慮に入れた場合、好ましくはポリエチレングリコール７００、８００、９００、１０００、８００、１０００等であり、より好ましくは、ポリエチレングリコール６００である。【００２９】
安定化剤の配合量は、特に限定されないが、通常、式（１）で示される化合物１重量部に対して、０．２〜５００重量部であり、好ましくは０．４〜４００重量部であり、より好ましくは０．６〜３００重量部であり、さらに好ましくは、１〜１００重量部である。【００３０】
本凍結乾燥製剤は、さらに抗酸化剤を含む。本発明では、１）式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩、２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤の他に、抗酸化剤を含有させた凍結乾燥製剤である。式（１）で示される化合物の酸化体が微量に生成する場合があるため、抗酸化剤の添加により、この酸化体の生成を抑制するものである。【００３１】
抗酸化剤としては、医薬製剤において通常使用されるものであれば、特に限定されないが、例えば、Ｌ−システイン塩酸塩、亜硝酸ナトリウム、アスコルビン酸、クエン酸、トコフェノール、酢酸トコフェノール、ジブチルヒドロキシトルエン、亜硫酸水素ナトリウム、アルファチオグリセリン、チオグリコール酸ナトリウム等を挙げることができる。【００３２】
本凍結乾燥製剤は、さらに、界面活性剤、浸透圧調整剤、防腐剤等を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリソルベート、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリエチレン硬化ヒマシ油、セスキオレイン酸ソルビタンなどを、浸透圧調整剤としては、ブドウ糖、キシリトール、ソルビトールなどを、防腐剤としては、安息香酸、アスコルビン酸などを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない。【００３３】
また、本凍結乾燥製剤は、１）式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩、２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される1種以上の賦形剤を含有し、さらに、シクロデキストリン類、グリシン及びポリエチレングリコールから選択される１種以上の安定化剤、抗酸化剤等を添加し、充填されたバイアル瓶のヘッドスペースが、窒素置換されている凍結乾燥製剤である。【００３４】
本凍結乾燥製剤は、凍結乾燥工程の乾燥時間及び乾燥温度を調節することにより、その製造初期水分量をコントロールすることが可能である。本凍結乾燥製剤の製造初期水分量は、通常２．０％以下であり、好ましくは１．７％以下、より好ましくは１．５％以下である。【００３５】
本凍結乾燥製剤は、製剤中における式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩の経時的な安定性及び復水時の溶解性に、極めて優れるという特性を有している。本凍結乾燥製剤は、１）式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩、２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤と共に凍結乾燥することにより、経時的な安定性に優れ、且つ復水時の溶解性に優れた凍結乾燥製剤を得られる。特に、当該凍結乾燥製剤において、非晶質粉体として存在する賦形剤を用いた場合、また、特にpH調整剤としてクエン酸およびその塩を用いた場合、安定化効果が大きいという特性も有する。さらに、シクロデキストリン類、グリシン、又はポリエチレングリコールを安定化剤として添加することにより、一層安定性が向上する。また、抗酸化剤の配合や、本凍結乾燥製剤を充填したバイアル瓶のヘッドスペースの窒素置換が、凍結乾燥製剤の安定性向上に寄与する。【００３６】
本凍結乾燥製剤は、たとえば、以下の方法により、製造することができる。具体的には、１）式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩、２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤、さらに必要に応じて、安定化剤、抗酸化剤等を、水又は適当な水性溶媒（たとえば、水とアルコールの混合物）に溶かした溶液を、所望によりメンブレンフィルタなどを用いて濾過滅菌を行う。次いで、無菌溶液をバイアル瓶、トレーなどに分注し、通常の凍結乾燥をすることによって固体粉末状としたものが好ましい。【００３７】
前述のように製造された本凍結乾燥製剤においては、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩の経時的な分解が抑制され、安定性と復水時の溶解性に優れた特性を有する。【００３８】
前述の溶液を調製する場合、公知の方法にしたがって、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩、賦形剤及びpH調整剤を、水又は水性溶媒（たとえば、水とアルコールの混合物）に溶解すればよい（溶解させた溶液を、以下「水性溶液」という）。溶解させる順序は、成分の種類には特に依存することなく、任意に溶解させることができるが、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩は、低pH領域で溶解性に優れるため、pH調整剤を用いて、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩の分解が抑制される低pH（５〜７）の調整液を調製し、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩を溶解した後、所定のpHに調整することが望ましい。また、式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩が水溶液中で分解するのを防ぐために、製造中の溶液温度を低温に保って製造してもよい。水性液中の式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩の濃度は、通常、０．１mg/mL〜１０mg/mLであり、好ましくは０．５mg/mL〜５mg/mLであり、より好ましくは０．５mg/mL〜２mg/mLである。【００３９】
また、水性溶液中の賦形剤の濃度は、通常、１０mg/mL〜２００mg/mLであり、好ましくは２０mg/mL〜１７５mg/mLであり、より好ましくは３０mg/mL〜１５０mg/mLである。【００４０】
また、凍結乾燥に供する水性溶液のpHは５〜８であり、好ましくはｐＨ５．４〜７．６、より好ましくは５．８〜７．２である。前述のpH調整剤を適宜添加することにより、所望のpHに調整可能である。【００４１】
このように調製された水性溶液を、好ましくは共晶点及びガラス転移点以下で予備凍結した後、乾燥庫内を真空に保持しながら、棚温を徐々に１次乾燥温度まで昇温し、同温度で１次乾燥を実行する。１次乾燥終了後、さらに棚温を２次乾燥温度に到達するまで昇温し、同温度で２次乾燥を行う。【００４２】
具体的な凍結乾燥製剤の製造方法として、１）式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩、２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤、さらに必要に応じて、安定化剤、抗酸化剤等とを含有する水性溶液を、滅菌後、所定量をバイアル瓶に分注する。約−６０℃〜−２０℃の条件で予備凍結を行い、次いで、約−２０℃〜２０℃で減圧下に１次乾燥を行い、約１０〜４０℃で減圧下に二次乾燥して凍結乾燥する。そして、必要に応じて、バイアル瓶のヘッドスペースを窒素ガスで置換し、打栓して凍結乾燥製剤を得る。なお、予備凍結時には、賦形剤の結晶化が起こらないように、共晶点及びガラス転移点以上の温度にならないような低温に維持する必要がある。共晶点及びガラス転移点は賦形剤を構成する成分の混合割合により異なるが、通常、糖類及び糖アルコールを含む場合、例えば、スクロース及び／又は乳糖を含む場合は、予備凍結の温度条件は、通常、−４０℃以下の温度で実行することが好ましい。【００４３】
このようにして得られる本凍結乾燥製剤は、賦形剤が非晶質粉体として存在するため、長期間に渡る経時的安定性を保つことができる。【００４４】
また、本凍結乾燥製剤は、良好な復水性を有する。即ち、任意の適当な溶液（再溶解液）の添加によって極めて容易に再溶解し、凍結乾燥前の溶液を再構築することができる。かかる再溶解液としては、用時注射用蒸留水、生理食塩水、その他一般的輸液（たとえば、ブドウ糖、アミノ酸輸液など）が挙げられる。【００４５】
本凍結乾燥製剤を再溶解させた溶液は、静脈注射剤、皮下注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの注射剤又は点眼剤として、非経口投与することができる。この注射用蒸留水、生理的食塩液、又は輸液で溶解した液は十分に安定である。復水・希釈時における式（１）で示される化合物又はその薬理学的に許容され得る塩の濃度は、通常、０．００１mg/mL〜１０mg/mLであり、好ましくは、０．００５mg/mL〜５mg/mLである。
【実施例】
【００４６】
以下に示す本発明の実施例及び対照例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであり、本発明は以下の実施例等に制限されるものではない。当業者は、以下に示す実施例に様々な変更を加えて本発明を実施することができ、かかる変更は本願特許請求の範囲に包含される。【００４７】
以下の実施例記載の添加物は、日本薬局方ＩＶ、医薬品添加物規格２００５（薬添規）、日本薬局方外医薬品規格（局外規）２００５、USP/NF  XXIII等の公定書に適合したもの、又は試薬を使用した。  【００４８】
製造例１（pH調整剤の種類、糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤の種類、並びにその量の検討）
（参考例１及び実施例１〜６）
参考例１と、本発明の実施例１〜６の凍結乾燥製剤は、式（１）で示される化合物に配合する、製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤、及び糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤の種類、並びに添加量を変化させて、以下の方法により製造した。
注射用蒸留水に、所定量のクエン酸１水和物若しくはリン酸を溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いて、pHを調整しながら、マンニトール、スクロース又はラクトースの所定量の賦形剤を溶解して、糖類又は糖アルコールを含有する５０mM又は１００mMのpH調整液（pH６）５０mLを調製した。
次に、これらの溶液６mLに６mgの式（１）で示される化合物を溶解（１mg/mL）した後、フィルターろ過（0.22μmフィルター）した溶液を１ｍＬずつバイアルに小分けして凍結乾燥した。凍結乾燥したバイアルはそのヘッドスペースを窒素置換してゴム栓で打栓した後、アルミキャップで巻き締め、参考例１と実施例１〜６（表１）として、本凍結乾燥製剤を得た。なお、１バイアルに充填された製剤中のpH調整剤の量は、リン酸４．９mg（参考例１、実施例１、２）又はクエン酸１水和物１０．５mg（実施例３〜５）が５０mMに相当し、クエン酸１水和物２１．０mg（実施例６）が１００mMに相当した。【００４９】
なお、対照例として、対照例１及び２を製造した。対照例１は、式（１）で示される化合物を１mgを秤取して、その粉体のままバイアルに充填し、そのヘッドスペースを窒素置換してゴム栓で打栓した後、アルミキャップで巻き締めた粉末充填製剤した。対照例２は、マンニトール、スクロース又はラクトースの所定量の賦形剤を添加することなく、それ以外は実施例３〜５と同様の方法で製造した、式（１）で示される化合物と製剤中のpHを約６に調整するpH調整剤とを含む凍結乾燥製剤である。【００５０】
また、製造した製剤の物性値の評価を行った。評価項目は、製造直後の復水時の物性及び、４０℃相対湿度７５％下で２週間保存後の式（１）で示される化合物由来の不純物増加量であった。
製造直後の復水時の物性の評価は、１バイアル中に充填された凍結乾燥製剤に、１ｍｌの注射用蒸留水及び生理食塩水を添加して復水し、杉森C法にて、復水性を評価した。杉森C法とは、製薬工場  ｐ574、Vol.6  No.6.1986記載の方法であって、用時溶解注射剤の復水性を評価する一手法である。【００５１】
同時に、復水した製剤の溶液ｐHの評価を行なった。
４０℃相対湿度７５％下で２週間保存後の不純物増加量の評価は、製造直後の製剤中の不純物量と４０℃相対湿度７５％下で２週間保存した製剤の不純物量を、各々、高速液体クロマトグラフィーにて評価を行い、製造直後の製剤中の不純物量と比較して増加した量（％）として示した。代表的なHPLC条件を下記に示した。【００５２】
カラム：L-column  ODS  (4.6  x  150mm,  5um、（財）化学物質評価研究機構)
カラム温度：40℃
検出器：UV/PDA(検出波長  241nm)
移動相Ａ：アセトニトリル/精製水/リン酸二水素カリウム/過塩素酸ナトリウム（500mL/4500mL/1.0g/35g）
移動相Ｂ：アセトニトリル/精製水/過塩素酸ナトリウム（4500mL/500mL/35g）
流速：1mL/min
サンプル溶解液：20%アセトニトリル
サンプルクーラー：5℃
注入量：10uL(0.2mg/mL)
グラジエントプログラム：B28%(0min)−B28%(15min)−B100%(20min)−B28%(25.01min)−B28%(33min)【００５３】
なお、不純物増加量としては、不純物の総量の増加量（％）と式（１）で示される化合物の分解による主不純物Ａの増加量の両者で示した。主不純物Ａは、式（２）で示される２化合物のうちいずれか１種又はその両者の混合物と推定されている。【００５４】
【化４】
2008020584.tif 000005
式（２） 
【００５５】
参考例１及び実施例２〜６の凍結乾燥製剤処方及び物性を表１に示す。【００５６】
【表１】
2008020584.tif 000006
【００５７】
製造例２（非晶質粉体として存在する糖類の種類の検討）
（実施例７〜８）
本発明の実施例７〜８の凍結乾燥製剤は、式（１）で示される化合物に配合する、糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤として、凍結乾燥製剤において非晶質粉体として存在する糖類の種類を変化させて、以下の方法により製造した。
注射用蒸留水に、所定量のクエン酸１水和物を溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いて、pHを調整しながら、スクロース、トレハロース、又はマルトースの所定量の賦形剤を溶解して、糖類を含有する５０mMのpH調整液（pH６）５０mLを調製した。次に、これらの溶液６mLに６mgの式（１）で示される化合物を溶解（１mg/mL）した後、フィルターろ過（0.22μmフィルター）した溶液を１ｍＬずつバイアルに小分けして凍結乾燥した。凍結乾燥したバイアルはそのヘッドスペースを窒素置換してゴム栓で打栓した後、アルミキャップで巻き締め、実施例４、７、８(表２)として、本凍結乾燥製剤を得た。なお、１バイアルに充填された製剤中のpH調整剤の量は、クエン酸１水和物１０．５mg（実施例４、７、８）であり、スクロース、トレハロース、又はマルトースの賦形剤の量は、１００mgであった。
また、製造した製剤の物性値は、製造例１記載の方法により、同様の評価を行った。実施例４、７、８の凍結乾燥製剤処方及び物性値を、表２に示す。【００５８】
【表２】
2008020584.tif 000007
【００５９】
製造例３（安定化剤の種類、ポリエチレングリコールの種類（分子量）及び添加量の検討）
（実施例９〜１６）
本発明の実施例９〜１６の凍結乾燥製剤は、１）式（１）で示される化合物、２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤（クエン酸１水和物を使用）、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤（スクロースを使用）を含む凍結乾燥製剤に、配合する安定化剤として、その種類及び添加量を変化させて、以下の方法により製造した。
注射用蒸留水に、所定量のクエン酸1水和物を溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いて、pHを調整しながら、一定量のスクロースと安定化剤を溶解して、スクロースと安定化剤を含有する５０mMのpH調整液（pH６）５０mLを調製した。
次に、これらの溶液６mLに６mgの式（１）で示される化合物を溶解（１mg/mL）した後、フィルターろ過（0.22μmフィルター）した溶液を１mLずつバイアルに小分けして凍結乾燥した。凍結乾燥したバイアルはそのヘッドスペースを窒素置換してゴム栓で打栓した後、アルミキャップで巻き締め、実施例９〜１１（表３）、実施例１２〜１４（表４）及び実施例１５〜１６（表５）として、本凍結乾燥製剤を得た。【００６０】
なお、１バイアルに充填された製剤中のpH調整剤の量は、クエン酸１水和物１０．５mg（実施例９〜１６）であり、スクロースの賦形剤の量は、１００mgであった。安定化剤は、実施例９〜１１では、各々、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、グリシン、ポリエチレングリコール４０００を１バイアルの凍結乾燥製剤中に１０mgを含有させた。実施例１２〜１４では、安定化剤としてポリエチレングリコールの種類（分子量）を変化させ、各々、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール４０００を１バイアルの凍結乾燥製剤中に１０mgを含有させた。実施例１５、１３、１６では、安定化剤としてポリエチレングリコール６００の添加量を変化させ、１バイアルの凍結乾燥製剤中に、各々、５mg、１０mg、２０mgを含有させた。【００６１】
また、製造した製剤の物性値は、製造例１記載の方法により、同様の評価を行った。実施例９〜１１、実施例１２〜１４、実施例１５〜１６の凍結乾燥製剤処方及び物性値を、各々、表３、表４及び表５に示す。【００６２】
【表３】
2008020584.tif 000008
【００６３】
【表４】
2008020584.tif 000009
【００６４】
【表５】
2008020584.tif 000010
【００６５】
製造例４
（pH調整剤添加による製剤中のpHの検討）
（実施例１７〜２１）
本発明の実施例１７〜２１の凍結乾燥製剤は、配合するpH調整剤により、製剤中のpHを変化させて、以下の方法により製造した。
注射用蒸留水に、所定量のクエン酸１水和物を溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いて、pHを調整しながら、一定量のスクロースとポリエチレングリコール６００（安定化剤）を溶解して、スクロースと安定化剤を含有する５０mMの種々のpH調整剤（pH５．５、５．７、５．９、６．１、６．３）を５０mL調製した。次に、これらの溶液６mLに６mgの式（１）で示される化合物を溶解（１mg/mL）した後、フィルターろ過（0.22μmフィルター）した溶液を１mLずつバイアルに小分けして凍結乾燥した。凍結乾燥したバイアルはそのヘッドスペースを窒素置換してゴム栓で打栓した後、アルミキャップで巻き締め、実施例１７〜２１（表６）として、本凍結乾燥製剤を得た。なお、１バイアルに充填された製剤中のpH調整剤の量は、クエン酸１水和物１０．５mg（実施例１８〜２２）であり、スクロースの賦形剤の量は１００mgであり、安定化剤のポリエチレングリコール６００の量は２０mgであった。また、製造した製剤の物性値は、製造例１記載の方法により、同様の評価を行った。【００６６】
実施例１７〜２１の凍結乾燥製剤処方及び物性値を、表６に示す。【００６７】
【表６】
2008020584.tif 000011
【００６８】
また、pH調整剤添加による製剤中のpHが、式（１）で示される化合物の溶解度に及ぼす影響の検討を行なった。
注射用蒸留水に、０．５２５gのクエン酸１水和物を溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いて、pHを調整しながら、５gのスクロースと１gポリエチレングリコール６００（安定化剤）を溶解して、スクロースと安定化剤を含有する５０mMの種々のpH調整液（pH５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６）を５０mL調製した。調製したpH調整液３mLを約９mgの式（１）で示される化合物を秤取した５mLのバイアルに投入し、スターラー攪拌しながら５℃で１時間保存した。その後、この溶液（懸濁液を含む）をフィルターろ過（0.22μmフィルター）し、初期流出液１mLを廃棄した後に得られた溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて式（１）で示される化合物の濃度を測定し、式（１）で示される化合物の溶解度とした。また、その溶液のpHも同時に測定した。その結果を、表７に示した。【００６９】
【表７】
2008020584.tif 000012
【００７０】
製造例５（バイアル瓶のヘッドスペースの窒素置換の検討）
（実施例２２〜２３）
本発明の実施例２２〜２３の凍結乾燥製剤は、バイアル瓶のヘッドスペースの窒素置換の有無を変化させて、以下の方法により製造した。
約１４０mLの注射用蒸留水にクエン酸１水和物を２．１g溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを５．６に調整した。この溶液を２〜１０℃に冷却しながら、２０gのスクロース、４gのポリエチレングリコール６００、２００mgの式（１）で示される化合物を溶解した。この溶液を水酸化ナトリウム溶液にてpH６．１に調整した後、注射用蒸留水にて全量を２００mLとした。次に、これらの溶液をフィルターろ過（0.22μmフィルター）し、その溶液を１mLずつバイアルに小分けして凍結乾燥した。
凍結乾燥したバイアルは、そのヘッドスペースを窒素置換する処理を施したものと通常の空気で置き換える処理を施したものを２種類に分け、ゴム栓で打栓した後、アルミキャップで巻き締め、各々、実施例２２及び実施例２３（表８）として、本凍結乾燥製剤を得た。なお、１バイアルに充填された製剤中のpH調整剤の量は、クエン酸１水和物１０．５mgであり、スクロースの賦形剤の量は１００mgであり、安定化剤のポリエチレングリコール６００の量は２０mgであった。【００７１】
また、製造した製剤の物性値の評価を行った。評価項目は、製造直後の初期水分の含量及び、４０℃相対湿度７５％下で２週間保存後の不純物増加量であった。初期水分の含量は、日本薬局方ＩＶ記載のカールフィッシャー水分計（三菱化学株式会社）を用いて評価を行った。【００７２】
実施例２２〜２３の凍結乾燥製剤処方及び物性値を、表８に示す。【００７３】
【表８】
2008020584.tif 000013
【００７４】
製造例６（抗酸化剤の添加の検討）
（実施例２４〜２７）
本発明の実施例２４〜２７の凍結乾燥製剤は、抗酸化剤の添加量を変化させて、以下の方法により製造した。
１）式（１）で示される化合物１mg、２）製剤中のpHを６．１に調整するpH調整剤１０．５mg（５０mMのクエン酸１水和物を使用）、３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤１００mg（スクロースを使用）、及び４）安定化剤２０mg（ポリエチレングリコール６００）からなる処方に、抗酸化剤を添加し、式（１）で示される化合物の安定性に与える影響について検討を行った。なお、抗酸化剤としてはＬ−システイン塩酸塩１水和物を用い、製剤中の添加量は、０mg（添加せず）、０．０１mg、０．０５mg、０．１０mgの４水準とした。
即ち、注射用蒸留水に、０．５２５gのクエン酸１水和物を溶解し、水酸化ナトリウム溶液を用いて、pHを調整しながら、さらに５gのスクロースと１gのポリエチレングリコール６００及び各々所定量（０g、０．００５g、０．００２５g、０．０００５g）のＬ−システィン塩酸塩１水和物を溶解して、スクロース、ポリエチレングリコール６００、Ｌ−システィン塩酸塩１水和物を含有する５０mMのpH調整液（pH６．１）５０mLを調製した。次に、これらの溶液６mLに６mgの式（１）で示される化合物を溶解（１mg/mL）した後、フィルターろ過（0.22μmフィルター）した溶液を１mLずつバイアルに小分けして凍結乾燥した。凍結乾燥したバイアルはそのヘッドスペースを窒素置換してゴム栓で打栓した後、アルミキャップで巻き締め、実施例２５〜２８（表９）として、本凍結乾燥製剤を得た。【００７５】
また、製造した製剤の物性値の評価を行った。評価項目は、４０℃相対湿度７５％下で２週間保存後の不純物増加量である。なお、不純物増加量としては、製造直後の初期の不純物の総量との増加量（％）と式（１）で示される化合物の酸化分解による酸化体の量に比して、増加した不純物の総量と式（１）で示される化合物の酸化分解による増加した酸化体の量の両者で示した。【００７６】
実施例２４〜２７の凍結乾燥製剤処方及び物性値を、表９に示す。【００７７】
【表９】
2008020584.tif 000014
【００７８】
製造例７（凍結乾燥製剤の水分量の検討）
凍結乾燥製剤中の水分量が、式（１）で示される化合物の安定性に与える影響について検討した。まず、実施例２０で窒素置換して製造したバイアル（pH６．２３）を開封し、調湿下で重量変化をモニタリングしながら吸湿させた後、それぞれの水分値をカールフィッシャー水分計にて測定し、各々の製剤の製造初期水分量（％）とした（０．４８％、０．６６％、１．２０％、１．６４％、２．１９％の５水準）。これらについて、再びゴム栓を打栓し巻き締めして、各初期水分量を有する試料とした。これらの試料について、４０℃相対湿度７５％下で２週間保存し、不純物の増加量の評価を行った。
凍結乾燥製剤処方及び物性値を、表１０に示す。【００７９】
【表１０】
2008020584.tif 000015
【００８０】
製造初期水分値が１．５％を超えると分解が加速する傾向が認められた。【００８１】
発明の効果
本発明によれば、式（１）で示される化合物を含む、経時的な安定性に優れ、且つ復水時の溶解性に優れた凍結乾燥製剤を製造することが可能である。
１．pH調整剤及び糖類、糖アルコール等の賦形剤と、式（１）で示される化合物を含む凍結乾燥製剤の安定性及び復水性に及ぼす効果（製造例１、製造例２）
表１に示した製造例１で対照例とした製剤において、粉末充填製剤（対照例１）では、結晶である式（１）で示される化合物は安定ではあるが、復水性が著しく悪く溶解しなかった。また、対照例２の式（１）で示される化合物と製剤中のpHを６に調整するpH調整剤とを含む凍結乾燥製剤凍結乾燥製剤においては、注射剤に供するに十分な復水性は得られたが、主分解物である不純物Ａ及び不純物の総量の増加が認められた。
一方、本発明の製造例１の実施例１〜６に係る製剤は、１）式（１）で示される化合物、２）製剤中のpHを６に調整するpH調整剤、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤を含む凍結乾燥製剤であり、マンニトール以外の賦形剤を配合することにより、対照例２に比べて主分解物である不純物Ａ及び不純物の総量の増加が抑制され、安定性の向上が認められ、復水性も良好であった。
その安定化効果は、マンニトールを配合した製剤（参考例１、実施例３）を除き、非晶質粉体として存在する糖類（賦形剤）で著しく優れており、特にスクロースを賦形剤として使用した場合に最も優れていた（実施例４）。また、pH調整剤としては、クエン酸１水和物（１０．５mg：実施例５、２１．０mg：実施例６）を用いた場合、特に高い分解抑制効果があり、特に主分解物である不純物Ａの生成が著しく抑制された。
また、表２に示した本発明の製造例２の実施例７〜８に係る製剤は、スクロースと同様に凍結乾燥製剤において非晶質粉体として存在する糖類であるトレハロース、マルトースを各々配合した凍結乾燥製剤であるが、いずれも、実施例４と同様に主分解物である不純物Ａ及び不純物の総量の増加が抑制され、安定性が向上した。
クエン酸１水和物等の製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤、糖類、糖アルコール等の賦形剤、とりわけ非晶質粉体として存在する糖類が、式（１）で示される化合物を含む凍結乾燥製剤の安定性及び復水性を向上させることは、明らかである。【００８２】
２．さらに、安定化剤を添加した凍結乾燥製剤の安定性及び復水性に及ぼす効果（製造例３）
本発明の製造例３の実施例９〜１６に係る製剤は、１）式（１）で示される化合物、２）製剤中のpHを５〜８に調整するpH調整剤（クエン酸1水和物を使用）、及び３）糖類及び糖アルコールから選択される１種以上の賦形剤（スクロースを使用）を含む凍結乾燥製剤に、配合する安定化剤として、その種類及び添加量を変化させた製剤であった。
表３に示すように、安定化剤として、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（実施例９）、グリシン（実施例１０）、ポリエチレングリコール（実施例１１）等の添加において、安定化効果が確認された。特にポリエチレングリコール４０００（分子量３３５０）の添加（実施例１１）により、主分解物である不純物Ａの生成の著しい抑制が認められ、復水性も良好であった。また、安定化効果が最も優れていたポリエチレングリコールに関して、その種類（分子量４００、６００、４０００）と安定化効果の関係について検討した（実施例１２〜１４）。その結果、いずれの分子量のポリエチレングリコールの添加においても、式（１）で示される化合物の分解を抑制した（表４）。特にポリエチレングリコール６００は、安定化効果が優れていた。
さらに、ポリエチレングリコール６００に関して、その添加量と安定化効果の関係について検討したが、表５に示すように、ポリエチレングリコール６００（分子量６００）が、添加量依存的に式（１）で示される化合物の分解を抑制し、特に主分解物である不純物Ａの生成抑制が認められた。
本凍結乾燥製剤中の安定化剤の添加により、特に、ポリエチレングリコール等の添加により、添加量依存的に凍結乾燥製剤の安定性を向上させ、かつ良好な復水性を確保できることが判明した。【００８３】
３．pH調整剤添加による製剤中のpHによる、式（１）で示される化合物の安定性（製造例４）及び溶解性に及ぼす効果
本発明の製造例４の実施例１７〜２１に係る製剤は、表６に示すように、式（１）で示される化合物を含有する凍結乾燥製剤中のpHを、pH調整剤のクエン酸１水和物を用いて、各々、pH５．５、５．７、５．９、６．１、６．３に調整した製剤であった。pH５．５以上においては、pHが高くなるほど、式（１）で示される化合物の分解が抑制され安定化が認められた。
また、pH調整剤添加による製剤中のpHが、式（１）で示される化合物の溶解度に及ぼす影響の検討を行なった。その結果、表８に示すように、pH５．７９〜７．０４において、低いpH領域では溶解度が高いが、高いpH領域では溶解度が著しく低下した。式（１）で示される化合物のpKaは約７．９であり、pH８付近までの溶解度減少は著しく、注射剤として使用できるpH領域は溶解度の面からも制限を受けるため、十分な溶解度を確保する必要がある。
本凍結乾燥製剤中のpH調整剤による製剤中のpH（５〜８）が、式（１）で示される化合物の安定性及び溶解性に影響を及ぼすため、安定性及び溶解性のバランスにより製剤中のpHを調整することにより、凍結乾燥製剤の安定性を向上させ、かつ良好な復水性を確保できることが判明した。【００８４】
４．バイアル瓶のヘッドスペースの窒素置換の有無による、式（１）で示される化合物の安定性に与える効果（製造例５）
式（１）で示される化合物の凍結乾燥製剤に関して、バイアル瓶のヘッドスペースの窒素置換の有無が、製剤中の式（１）で示される化合物の安定性に与える影響について検討した。その結果、表８に示すように、製造初期の水分値がほぼ同一であっても、窒素置換をした場合（実施例２２）は、窒素置換をしなかった場合（実施例２３）と比べて、著しく分解が抑制された。
本凍結乾燥製剤を充填したバイアル瓶のヘッドスペースの窒素置換を行うことにより、凍結乾燥製剤の安定性を向上させ、かつ良好な復水性を確保できることが判明した。【００８５】
５．抗酸化剤の添加による、式（１）で示される化合物の安定性に与える効果（製造例６）
表９に示すように、安定化剤を配合した、式（１）で示される化合物の凍結乾燥製剤には、製造直後の時点で酸化体が生成しており、それが安定性試験中に増加することが認められた。特にポリエチレングリコールを含有する系では、製造初期の酸化体量の増加及びそれに伴う不純物の総量の増加が認められた（実施例２４）。一方、抗酸化剤としてＬ−システイン塩酸塩１水和物を添加した系では、微量の添加により、酸化体量の増加及びそれに伴う不純物の総量の増加が抑制された（実施例２５〜２７）。
本凍結乾燥製剤は、特に、安定化剤を配合した場合には、抗酸化剤の微量の添加により、凍結乾燥製剤の安定性を向上できることが判明した。【００８６】
６．凍結乾燥製剤中の水分量による、式（１）で示される化合物の安定性に与える影響
表１０に示す結果から、本凍結乾燥製剤は、凍結乾燥製剤中の水分量が多くなるほど、式（１）で示される化合物の安定性を低下するため、特に、製剤中の水分量を少なくとも２．０重量％以下に保つことが必要であり、好ましくは１．５重量％以下とすることにより、凍結乾燥製剤の安定性の向上を図ることができることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８７】
本発明によれば、（８Ｅ，１２Ｅ，１４Ｅ）−７−（（４−シクロヘプチルピペラジン−１−イル）カルボニル）オキシ−３，６，１６，２１−テトラヒドロキシ−６，１０，１２，１６，２０−ペンタメチル−１８，１９−エポキシトリコサ−８，１２，１４−トリエン−１１−オリドを含む、経時的な安定性と復水時の溶解性に優れた凍結乾燥製剤が提供される。
【国際調査報告】
2008020584.tif 000017
2008020584.tif 000018
2008020584.tif 000019
2008020584.tif 000020