(57)【要約】機能が未知のＣＰＣ様Ｍｙｂ配列を有する遺伝子の機能を解析し、得られた知見に基づいて新規な変異植物体を提供する。  以下のいずれか１記載のタンパク質の機能を抑制する。（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質  上記タンパク質の機能を抑制することによって、野生型と比較して大きく成長できるといった特徴的な表現型が得られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれか１記載のタンパク質の機能を抑制した変異植物体。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（３）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１又は複数の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
【請求項２】
上記（１）〜（３）のいずれか１記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠損していることを特徴とする請求項１記載の変異植物体。
【請求項３】
双子葉植物であることを特徴とする請求項１記載の変異植物体。
【請求項４】
アブラナ科植物であることを特徴とする請求項１記載の変異植物体。
【請求項５】
対象とする植物における以下のいずれか１記載のタンパク質の機能を抑制する、変異植物体の製造方法。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（３）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１又は複数の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
【請求項６】
上記（１）〜（３）のいずれか１記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠損させることを特徴とする請求項５記載の変異植物体の製造方法。
【請求項７】
上記対象とする植物は双子葉植物であることを特徴とする請求項５記載の変異植物体の製造方法。
【請求項８】
上記対象とする植物はアブラナ科植物であることを特徴とする請求項５記載の変異植物体の製造方法。
【請求項９】
対象とする植物における以下のいずれか１記載のタンパク質の機能を抑制することを特徴とする、野生型と比較して、より大きな形態又はより早い開花時期を示す変異植物体の製造方法。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（３）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１又は複数の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
【請求項１０】
上記（１）〜（３）のいずれか１記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠損させることを特徴とする請求項９記載の変異植物体の製造方法。
【請求項１１】
上記対象とする植物は双子葉植物であることを特徴とする請求項９記載の変異植物体の製造方法。
【請求項１２】
上記対象とする植物はアブラナ科植物であることを特徴とする請求項９記載の変異植物体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特徴的な形態を示す変異植物体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、シロイヌナズナにおける根毛細胞分化に慣用するＲ３  ＭＹＢモチーフを有するタンパク質であるＣＡＰＲＩＣＥ（以下、ＣＰＣタンパク質）が開示されている。非特許文献２では、このＣＰＣタンパク質が非根毛細胞から根毛細胞に細胞間移行し、ホメオドメイン−ロイシンジッパー遺伝子（ＧＬＡＢＲＡ２）の発現を抑制していることが示された。
ＴＲＩＰＴＹＣＨＯＮ遺伝子（ＴＲＹ遺伝子）を含む４種類のＣＰＣ様Ｍｙｂ配列がシロイヌナズナゲノムから見いだされている。ＴＲＹ遺伝子欠損株においてトライコームのクラスターが観察されることから、ＴＲＹタンパク質はトライコーム形成を制御している。Ｋｉｒｉｋらは、これら４種類のＣＰＣ様Ｍｙｂ配列のうち既に２種（ＥＴＣ１及びＥＴＣ２と称される）を同定し、遺伝学的にこれらとＣＰＣ及びＴＲＹとの関係を解析している（非特許文献３及び非特許文献４）。Ｄａｖｉｄ  Ｍａｒｋｓのグループは、ＴＲＹ及びＡｔ１ｇ０１３８０（ＥＴＣ１）との関係を解析し、ＧＬ３がＴＲＹ遺伝子の発現を制御するがＥＴＣ１の発現を制御していないことを示した（非特許文献５）。
しかし、現在、その他のＣＰＣ様Ｍｙｂ配列からなる遺伝子に関する解析はなされておらず、当該遺伝子の機能は未知である。
【非特許文献１】Ｗａｄａ，Ｔ．，Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｔ．，Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，Ｋ．（１９９７）．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｍｙｂ  ｈｏｍｏｌｏｇ，ＣＰＣ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，１１１３−１１１６．
【非特許文献２】Ｗａｄａ，Ｔ．，Ｋｕｒａｔａ，Ｔ．，Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｒ．，Ｋｏｓｈｉｎｏ−Ｋｉｍｕｒａ，Ｙ．，Ｔａｃｈｉｂａｎａ，Ｔ．，Ｇｏｔｏ，Ｋ．，Ｍａｒｋｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｓｈｉｍｕｒａ，Ｙ．，ａｎｄ  Ｏｋａｄａ，Ｋ．（２００２）．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｒｏｏｔ  ｈａｉｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ＣＡＰＲＩＣＥ，ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒｏｏｔ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２９，５４０９−５４１９．
【非特許文献３】Ｋｉｒｉｋ，Ｖ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．，Ｈｕｅｌｓｋａｍｐ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎ，Ｊ．（２００４ｂ）．Ｔｈｅ  ＥＮＨＡＮＣＥＲ  ＯＦ  ＴＲＹ  ＡＮＤ  ＣＰＣ１  ｇｅｎｅ  ａｃｔｓ  ｒｅｄｕｎｄａｎｔｌｙ  ｗｉｔｈ  ＴＲＩＰＴＹＣＨＯＮ  ａｎｄ  ＣＡＰＲＩＣＥ  ｉｎ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ  ａｎｄ  ｒｏｏｔ  ｈａｉｒ  ｃｅｌｌ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２６８，５０６−５１３．
【非特許文献４】Ｋｉｒｉｋ，Ｖ．，Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．，Ｗｅｓｔｅｒ，Ｋ．，Ｓｃｈｉｅｆｅｌｂｅｉｎ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｈｕｌｓｋａｍｐ，Ｍ．（２００４ａ）．ＥＮＨＡＮＣＥＲ  ｏｆ  ＴＲＹ  ａｎｄ  ＣＰＣ  ２（ＥＴＣ２）ｒｅｖｅａｌｓ  ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ５５，３８９−３９８．
【非特許文献５】Ｅｓｃｈ，Ｊ．Ｊ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｈｉｌｌｅｓｔａｄ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ，Ｍ．Ｄ．（２００４）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＴＲＹ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｌｏｓｅｌｙ  ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｔ１ｇ０１３８０  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｒｉｃｈｏｍｅ  ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ４０，８６０−８６９．
【発明の開示】
【０００３】
そこで、本発明は、機能が未知のＣＰＣ様Ｍｙｂ配列を有する遺伝子の機能を解析し、得られた知見に基づいて新規な変異植物体を提供することを目的とし、また、当該変異植物体の製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、機能が未知のＣＰＣ様Ｍｙｂ配列を有する遺伝子の機能を解析した結果、当該遺伝子の欠損株が野生型と比較して特徴的な形態を示すことを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下を包含する。
（１）以下のいずれか１記載のタンパク質の機能を抑制した変異植物体。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１又は複数の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（２）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠損していることを特徴とする（１）記載の変異植物体。
（３）双子葉植物であることを特徴とする（１）記載の変異植物体。
（４）アブラナ科植物であることを特徴とする（１）記載の変異植物体。
（５）対象とする植物における以下のいずれか１記載のタンパク質の機能を抑制する、変異植物体の製造方法。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１又は複数の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（６）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠損させることを特徴とする（５）記載の変異植物体の製造方法。
（７）上記対象とする植物は双子葉植物であることを特徴とする（５）記載の変異植物体の製造方法。
（８）上記対象とする植物はアブラナ科植物であることを特徴とする（５）記載の変異植物体の製造方法。
（９）対象とする植物における以下のいずれか１記載のタンパク質の機能を抑制することを特徴とする、野生型と比較して、より大きな形態又はより早い開花時期を示す変異植物体の製造方法。
（ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（ｃ）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１又は複数の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（１０）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１記載のタンパク質をコードする遺伝子を欠損させることを特徴とする（９）記載の変異植物体の製造方法。
（１１）上記対象とする植物は双子葉植物であることを特徴とする（９）記載の変異植物体の製造方法。
（１２）上記対象とする植物はアブラナ科植物であることを特徴とする（９）記載の変異植物体の製造方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００６−２７８９８８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１−１は、ＣＰＬ３遺伝子とイネ由来オーソログとの関係を示す系統樹である。
図１−２は、ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３１８０、ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３２３０、ＣＰＣ、ＴＲＹ、ＥＴＣ１、ＥＴＣ２及びＣＰＬ３についてアミノ酸配列におけるアライメントを示す図である。
図２は、ＣＰＣタンパク質、ＥＴＣ１タンパク質、ＥＴＣ２タンパク質、ＴＲＹタンパク質及びＣＰＬ３タンパク質のアミノ酸配列におけるアライメント及び、各遺伝子を欠損する変異体におけるＴ−ＤＮＡ挿入位置を模式的に示す図である。
図３は、ＣＰＣ遺伝子、ＴＹＲ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子に対する二重変異体及び三重変異体について、根毛の数を計測した結果を示す特性図である。
図４は、ＣＰＣ遺伝子、ＴＹＲ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子に対する二重変異体及び三重変異体について、トライコーム数を計測した結果を示す特性図である。
図５は、ｃｐｌ３−１変異体、３５Ｓ：：ＣＰＬ３形質転換体、ＣＰＬ３：：ＣＰＬ３形質転換体及び野生型について、同じ成長段階における生重量を測定した結果を示す特性図である。
図６は、ｃｐｌ３−１変異体、３５Ｓ：：ＣＰＬ３形質転換体、ＣＰＬ３：：ＣＰＬ３形質転換体及び野生型について、同じ成長段階における写真である。
図７は、ｃｐｌ３−１変異体、ＣＰＬ３：：ＣＰＬ３形質転換体及び野生型について、核内倍加を測定した結果を示す特性図である。
図８は、各変異体及び形質転換体について本葉数を測定した結果を示す特性図である。
図９は、各変異体及び形質転換体について抽台日数を測定した結果を示す特性図である。
図１０は、ｃｐｌ３−１変異体、ＣＰＬ３：：ＣＰＬ３形質転換体及び野生型について、葉及び胚軸における細胞の表現型を光学顕微鏡を用いて観察した結果を示す写真である。
図１１は、ＣＰＣ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子、ＴＲＹ遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子を３５Ｓプロモーターの制御下、又は自身のプロモーターの制御下に過剰発現する形質転換体における根毛の数を比較した結果を示す特性図である。
図１２は、ＣＰＣ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子、ＴＲＹ遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子を３５Ｓプロモーターの制御下、又は自身のプロモーターの制御下に過剰発現する形質転換体におけるトライコームの数を比較した結果を示す特性図である。
図１３は、ＣＰＣ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子、ＴＲＹ遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子のプロモーター制御下でＧＵＳタンパク質を発現する形質転換体を用いて、各遺伝子の発現パターンを検討した結果を示す写真である。
図１４は、ＣＰＣ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子、ＴＲＹ遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子についてＧＦＰ融合タンパク質を高発現する形質転換体を用いて、各遺伝子の発現パターンを検討した結果及びＲＴ−ＰＣＲ並びにＩｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎよって各遺伝子の発現パターンを検討した結果を示す特性図である。
図１５は、ｃｐｃ、ｔｒｙ、ｅｔｃ１、ｅｔｃ２及びｃｐｌ３変異植物体におけるＣＯ、ＦＴ、ＳＯＣ１及びＣＰＬ３の発現量を示すリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る変異植物体は、野生型の植物体における特定のタンパク質の機能を欠損させたものである。本発明に係る変異植物体は、野生型の植物体と比較して、大きく成長といった特徴がある。具体的に本発明に係る変異植物体は、野生型の植物体と同条件で同程度まで育成した時に重量を測定すると、野生型の植物体と比較して有意差をもって重いといった特徴がある。また本発明に係る変異植物体は、野生型の植物体と比較して、より速い開花時期を示すという特徴がある。
ここで、本明細書において、タンパク質の機能を欠損させるとは、当該タンパク質をコードする遺伝子をゲノムから欠損させること、当該タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害すること、及び当該タンパク質の活性を低下させることを含む意味である。
より詳細に、特定のタンパク質をコードする遺伝子を欠損させる方法としては、特に限定されないが、相同組換えを用いた方法やトランスポゾンを用いた方法を挙げることができる。また、当該遺伝子を欠損させる場合には、当該遺伝子の全長を欠損させても良いし、部分的に欠損させても良い。
また、特定のタンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害する方法としては、特に限定しないが、当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターを欠損させる方法、当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターを発現誘導型プロモーターに置換する方法、当該遺伝子の発現を制御しているプロモーターに突然変異を導入する方法、ＲＮＡ干渉を利用して当該遺伝子の転写産物を分解する方法、及びアンチセンスＲＮＡを利用して当該遺伝子の翻訳を阻害する方法を挙げることができる。
さらに、特定のタンパク質の活性を低下させる方法としては、当該タンパク質に特異的に結合して当該タンパク質の活性を抑制する機能を有する物質を作用させる方法を挙げることができる。当該物質としては、当該タンパク質の機能を阻害できる抗体や阻害物質を挙げあることができる。
本発明に係る変異植物体においては、シロイヌナズナにおいてＡｔ４ｇ０１０６０として登録された遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を欠損させる。具体的に、Ａｔ４ｇ０１０６０として登録された遺伝子は、本明細書中、ＣＰＣ様Ｍｙｂ配列を有するタンパク質として、ＣＰＬ３遺伝子と呼ばれる。ＣＰＬ３遺伝子の塩基配列を配列番号１に示し、ＣＰＬ３遺伝子によってコードされるＣＰＬ３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。
すなわち、本発明に係る変異植物体は、以下の（１）、（２）又は（３）のタンパク質の機能が欠損している。
（１）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなり、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
（３）配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドにおいて１又は複数の塩基が置換、欠失、付加又は挿入された塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされ、表皮細胞分化を制御する転写因子として機能するタンパク質
ここで、複数のアミノ酸とは、例えば２〜３３個のアミノ酸残基、好ましくは２〜１５個のアミノ酸残基、より好ましくは２〜５個のアミノ酸残基を意味する。また、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入する部位としては、配列番号２に示すアミノ酸配列において、３〜５番目の領域、２１〜３２番目の領域、及び７７番目以降の領域等を挙げることができる。これらの領域は、ＣＰＣ様Ｍｙｂ配列以外の領域であるため、１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加又は挿入されたとしてもＣＰＬ３タンパク質の機能に影響が少ないと考えられる。
また、複数の塩基とは、上述した『複数のアミノ酸』に対応して、例えば６〜９９個の塩基、好ましくは６〜４５個の塩基、より好ましくは６〜１５個の塩基を意味する。１又は複数の塩基が置換、欠失、付加又は挿入する部位もまた、上述した『複数のアミノ酸』に対応して、配列番号１に示す塩基配列において、９〜１５番目の領域、６３〜９６番目の領域、及び２３１番目以降の領域等を挙げることができる。
また、本発明は、如何なる植物体にも適用することができる。すなわち、本発明は、野生型の植物体が上述したように定義されるタンパク質を有している限り如何なる植物体にも適用することができる。例えば、本発明は、特に双子葉植物が好ましく、中でもシロイヌナズナに代表されるアブラナ科植物に対して適用することが好ましい。
アブラナ科植物としては、ハクサイ（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、コマツナ（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｖａｒ．ｐｅｒｕｖｉｒｉｄｉｓ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ）、タカナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ  ｖａｒ．ｉｎｔｅｇｌｉｆｏｌｉａ）、ハゴロモカンラン（ケール）（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ａｃｅｐｈａｌａ）、ハボタン（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ａｃｅｐｈａｌａ）、カリフラワー（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、キャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ）、メキャベツ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｇｅｍｍｉｆｅｒａ）、コールラビ（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｇｏｎｇｙｌｏｄｅｓ）、ブロッコリー（Ｂ．ｏｌｅｒａｃｅａ  ｖａｒ．ｉｔａｌｉｃａ）、カブ（Ｂ．ｒａｐａ）、チンゲンサイ（Ｂ．ｒａｐａ  ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ノザワナ（Ｂ．ｒａｐａ  ｖａｒ．ｈａｋａｂｕｒａ）、ミズナ（Ｂ．ｒａｐａ  ｖａｒ．ｌａｎｃｉｎｉｆｏｌｉａ）及びアブラナ（Ｂ．ｒａｐａ  ｖａｒ．ｎｉｐｐｏ−ｏｌｅｉｆｅｒａ）等のアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）に属する植物を挙げることができる。また、アブラナ科植物としては、オランダガラシ（クレソン）（Ｎ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）等のオランダガラシ属（Ｎａｓｔｕｒｔｉｕｍ）に属する植物、コショウソウ（クレス）（Ｌ．ｓａｔｉｖｕｍ）等のコショウソウ属（Ｌｅｐｉｄｉｕｍ）に属する植物、ダイコン（Ｒ．ｓａｔｉｖｕｓ）及びハツカダイコン（Ｒ．ｓａｔｉｖｕｓ  ｖａｒ．ｒａｄｉｃｕｌａ）等のダイコン属（Ｒａｐｈａｎｕｓ）に属する植物、キバナスズシロ（ルッコラ）（Ｅ．ｖｅｓｉｓａｒｉａ）等のキバナスズシロ属（Ｅｒｕｃａ）に属する植物、ワサビ（Ｗ．ｊａｐｏｎｉｃａ）等のワサビ属（Ｗａｓａｂｉａ／Ｅｕｔｒｅｍａ）に属する植物、セイヨウワサビ（ホースラディッシュ）（Ａ．ｒｕｓｔｉｃａｎａ）等のセイヨウワサビ属（Ａｒｍｏｒａｃｉａ）に属する植物、アラセイトウ（ストック）（Ｍ．ｉｎｃａｎａ）等のアラセイトウ属（Ｍａｔｔｈｉｏｌａ）に属する植物、ナズナ（Ｃ．ｂｕｒｓａ−ｐａｓｔｏｒｉｓ）等のナズナ属（Ｃａｐｓｅｌｌａ）に属する植物、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）等のシロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に属する植物、オオアラセイトウ（ショカツサイ、ムラサキハナナ）（Ｏ．ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）等のオオアラセイトウ属（Ｏｒｙｃｈｏｐｈｒａｇｍｕｓ）に属する植物、並びにイヌガラシ属（Ｒｏｒｉｐｐａ）に属する植物を挙げることができる。
一方、本発明に係る変異植物体は、上述したような双子葉植物に限定されず、イネに代表される単子葉植物であってもよい。例えば、イネゲノムの配列データを格納したデータベースに対して、配列番号２に示すアミノ酸配列データをキーとして検索することによって、ＣＰＬ３遺伝子に相当する遺伝子をイネゲノムにおいて同定することができる。具体的には、ＣＰＬ３遺伝子のオーソログをイネゲノムデータベースから２つ同定することができた。これら２つのオーソログ遺伝子は、ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３１８０及びＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３２３０として登録され、共に第一染色体上に存在している。ＣＰＬ３遺伝子とＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３１８０との相同性はアミノ酸レベルで６３％であり、ＣＰＬ３遺伝子とＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３２３０との相同性はアミノ酸レベルで５９％であった。ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３１８０によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３に示し、ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３２３０によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に示す。
また、ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３１８０及びＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３２３０について、ＴＲＹ遺伝子、ＣＰＣ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子及びＥＴＣ２遺伝子との相同性を計算した。ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３１８０は、ＣＰＣに対してアミノ酸レベルで６１％、ＥＴＣ２に対してアミノ酸レベルで５４％、ＥＴＣ１に対してアミノ酸レベルで５３％、ＴＲＹに対してアミノ酸レベルで５１％のホモロジーを示した。ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３２３０は、ＥＴＣ２に対してアミノ酸レベルで５６％、ＣＰＣに対してアミノ酸レベルで５４％、ＥＴＣ１に対してアミノ酸レベルで４９％、ＴＲＹに対してアミノ酸レベルで４４％のホモロジーを示した。これらの結果を系統樹として図１−１に示す。なお、図１−２には、ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３１８０、ＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３２３０、ＣＰＣ、ＴＲＹ、ＥＴＣ１、ＥＴＣ２及びＣＰＬ３についてアミノ酸配列でアライメントをとった結果も示している。
このように、イネゲノムにおいて見いだされたＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３１８０及びＬＯＣ＿Ｏｓ０１ｇ４３２３０は、ＣＰＣ様Ｍｙｂ配列を含むタンパク質のなかでＣＰＬ３と最も相同性が高く、シロイヌナズナにおけるＣＰＬ３遺伝子と同等の機能を有する蓋然性が高いと判断できる。
以上のように定義した本発明に係る変異植物体は、野生型の植物体と比較して大きく成長するといった特徴がある。従って、本発明によれば、変異導入対象の植物体が食用であるような場合には大型化による生産量の向上を期待することができる。また、本発明によれば、変異導入対象の植物体内部で物質を生産する様な場合には、当該有用物質の生産性を向上させることができる。ここで、物質としては、野生型の植物体が本来的に産生する物質であってもよいし、野生型の植物体を形質転換することによって産生されるような物質であってもよい。
また本発明に係る変異植物体は、野生型の植物体と比較してより開花時期が早いという特徴を有する。したがって、果実や種子の形成を促進できるため、通常年一回しか収穫できない作物を複数回収穫可能であるという利点を有する。またこのような本発明の変異植物体の性質により、作物の収穫までにかかる時間やコストの削減が可能である。
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
（実験例１）  ＣＰＬ３遺伝子を欠損した変異植物体のスクリーニング
本実施例では、野生型の植物体としてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ  ｅｃｏｔｙｐｅ  Ｃｏｌ−０（以下、野生型シロイヌナズナと称する）を使用した。本実施例では、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｔ−ＤＮＡ群のなかから、配列番号１に示す塩基配列を含む遺伝子に変異が導入されたｃｐｌ３−１変異体をスクリーニングした。
また、本例では、ＳＡＬＫ  Ｔ−ＤＮＡ群のなかから、ＴＲＹ遺伝子に変異が導入されたｔｒｙ−２９７６０変異体、ＥＴＣ１遺伝子に変異が導入されたｅｔｃ１−１変異体及びＥＴＣ２遺伝子に変異が導入されたｅｔｃ２−４０３９０変異体を単離した。また、Ｋｕｒａｔａ，ＴらＣｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡＰＲＩＣＥ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒｏｏｔ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２，５３８７−５３９８（２００５）に開示された、ＣＰＣ遺伝子に変異が導入されたｃｐｃ−２変異体を準備した。得られた変異体におけるＴ−ＤＮＡ挿入部位を図２に示す。
（実験例２）  形質転換植物の作製
本実施例では、ＣＰＣ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子、ＴＲＹ遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子を３５Ｓプロモーターの制御下に恒常的に発現する形質転換体、これら遺伝子とＧＦＰ遺伝子とを連結してＧＦＰ融合タンパク質を高発現する形質転換体及びこれら遺伝子のプロモーター配列とＧＵＳ遺伝子とを連結してＧＵＳタンパク質を発現する形質転換体を作製した。
本例で使用したプライマーの名前、塩基配列及び配列番号の一覧を表１に示した。
【表１】
2008044800.tif 000002
2008044800.tif 000003
各遺伝子を３５Ｓプロモーターの制御下に恒常的に発現する形質転換体を得るため、以下の構築物を作製した。すなわち、まず、ＴＷ１１６９及びＴＷ１１７０を用いてＥＴＣ１遺伝子を含む０．７ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。また、ＴＷ１１６５及びＴＷ１１６６を用いてＥＴＣ２遺伝子を含む１．４ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。さらに、ＴＷ１１６７及びＴＷ１１６８を用いてＣＰＬ３遺伝子を含む０．８ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。さらにまた、ＲＴ９１及びＲＴ９２を用いてＴＲＹ遺伝子を含む１．４ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。次に、得られた各ＰＣＲ断片を、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にそれぞれサブクローンした。作製されたプラスミドをそれぞれｐＢＳ−ＥＴＣ１、ｐＢＳ−ＥＴＣ２、ｐＢＳ−ＣＰＬ３及びｐＢＳ−ＴＲＹとした。
次に、ｐＢＳ−ＥＴＣ１、ｐＢＳ−ＥＴＣ２及びｐＢＳ−ＣＰＬ３をＡｃｃ６５Ｉ及びＳａｌＩで処理して得られた断片を、ｐＣＨＦ３バイナリベクター（Ｊａｒｖｉｓ，ＰらＡｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｍｕｔａｎｔｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｔｉｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｐｏｒｔ  ａｐｐａｒａｔｕｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，１００−１０３（１９９８））のＡｃｃ６５Ｉ及びＳａｌＩサイトに挿入し、３５Ｓ：：ＥＴＣ１、３５Ｓ：：ＥＴＣ２及び３５Ｓ：：ＣＰＬ３コンストラクトを作製した。また、ｐＢＳ−ＴＲＹに対しては、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで処理する以外は同様にして３５Ｓ：：ＴＲＹコンストラクトを作製した。
各遺伝子とＧＦＰ遺伝子とを連結してＧＦＰ融合タンパク質を高発現する形質転換体を得るため、以下のコンストラクトを作製した。すなわち、ＲＴ６７及びＲＴ６８を用いてＥＴＣ１遺伝子を含む２．３ｋｂのＰＣＲ断片を増幅し、これをＳａｌＩ及びＳｍａＩで制限酵素処理した。また、ＲＴ６９及びＲＴ７０を用いて、ＥＴＣ２遺伝子を含む４．０ｋｂのＰＣＲ断片を増幅し、これをＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶを用いて消化した。さらに、ＲＴ７１及びＲＴ７２を用いて３．０ｋｂのＰＣＲ断片を増幅し、これをＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶで制限酵素処理した。さらにまた、ＲＴ８９及びＲＴ９０を用いて４．０ｋｂのＰＣＲ断片を増幅し、これをＳａｌＩ及びＳｍａＩで制限酵素処理した。得られた断片をｐＢＳ−２ｘＧＦＰ（Ｋｕｒａｔａ，ＴらＣｅｌｌ−ｔｏ−ｃｅｌｌ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡＰＲＩＣＥ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｒｏｏｔ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３２，５３８７−５３９８（２００５））のＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶサイトにそれぞれ挿入し、ｐＢＳ−ＥＴＣ１：２ｘＧＦＰ、ｐＢＳ−ＥＴＣ２：２ｘＧＦＰ、ｐＢＳ−ＣＰＬ３：２ｘＧＦＰ及びｐＢＳ−ＴＲＹ：２ｘＧＦＰを作製した。
次に、ｐＢＳ−ＥＴＣ１：２ｘＧＦＰをＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理して得られた断片をｐＪＨＡ２１２Ｋバイナリベクター（Ｙｏｏ，Ｓ．ＹらＴｈｅ  ３５Ｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｕｓｅｄ  ｉｎ  ａ  ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  ａ  ｐｌａｎｔ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅ．Ｐｌａｎｔａ  ２２１，５２３−５３０（２００５））のＳａｌＩ及びＸｂａＩサイトに挿入した。また、ｐＢＳ−ＥＴＣ２：２ｘＧＦＰをＳａｌＩ及びＳａｃＩＩで処理して得られた断片をｐＪＨＡ２１２ＫバイナリベクターのＳａｌＩ及びＳｍａＩサイトに挿入した。さらに、ｐＢＳ−ＣＰＬ３：２ｘＧＦＰ及びｐＢＳ−ＴＲＹ：２ｘＧＦＰをそれぞれＳａｌＩ及びＳａｃＩで処理して得られた断片をｐＪＨＡ２１２ＫバイナリベクターのＳａｌＩ及びＳａｃＩサイトに挿入した。
各遺伝子のプロモーター配列とＧＵＳ遺伝子とを連結してＧＵＳタンパク質を発現する形質転換体を得るため、以下の構築物を作製した。すなわち、ＲＴ４６及びＲＴ４７を用いてＥＴＣ１遺伝子のプロモーター領域を含む１．９ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。また、ＲＴ４８及びＲＴ４９を用いてＥＴＣ２遺伝子のプロモーター領域を含む３．０ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。さらに、ＲＴ５０及びＲＴ５１を用いてＣＰＬ３遺伝子のプロモーター領域を含む２．４ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。さらにまた、ＲＴ８８及びＲＴ８９を用いてＴＲＹ遺伝子のプロモーター領域を含む３．０ｋｂのＰＣＲ断片を増幅した。得られた増幅断片をそれぞれＮｏｔＩ及びＡｃｃＩで処理した後、ｐＢＳにサブクローンした。作製されたプラスミドをそれぞれｐＢＳ−ＥＴＣ１、ｐＢＳ−ＥＴＣ２、ｐＢＳ−ＣＰＬ３及びｐＢＳ−ＴＲＹとした。
次に、ｐＢＳ−ＥＴＣ１及びｐＢＳ−ＣＰＬ３をＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで処理して得られた断片をｐＢＩ１０１バイナリベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ，ＵＳＡ）のＳａｌＩ及びＢａｍＨＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをＥＴＣ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳ及びＣＰＬ３ｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳとした。また、ｐＢＳ−ＥＴＣ２及びｐＢＳ−ＴＲＹをＳａｌＩ及びＸｂａＩで処理して得られた断片をｐＢＩ１０１バイナリベクターのＳａｌＩ及びＸｂａＩサイトに挿入した。得られたプラスミドをＥＴＣ２ｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳ及びＴＲＹｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳとした。
以上のようにして得られた３５Ｓ：：ＥＴＣ１、３５Ｓ：：ＥＴＣ２、３５Ｓ：：ＣＰＬ３、ＥＴＣ１：：ＥＴＣ１：２ｘＧＦＰ、ＥＴＣ２：：ＥＴＣ２：２ｘＧＦＰ、ＣＰＬ３：：ＣＰＬ３：２ｘＧＦＰ、ＴＲＹ：：ＴＲＹ：２ｘＧＦＰ、ＥＴＣ１ｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳ、ＣＰＬ３ｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳ、ＥＴＣ２ｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳ及びＴＲＹｐｒｏｍｏｔｅｒ：：ＧＵＳを用いて、Ｋｕｒａｔａ，ＴらＴｈｅ  ＹＯＲＥ−ＹＯＲＥ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ３６，５５−６６（２００３）に開示された方法に従って形質転換した。
【実施例１】
【０００６】
ＣＰＬ３遺伝子を欠損する変異体における表現型
（実験例１）で単離したｅｔｃ１−１変異体、ｅｔｃ２−４０３９０変異体及びｃｐ１３−１変異体のホモ接合体をＦ２世代においてＰＣＲを用いて同定することで、ＣＰＣ遺伝子、ＴＲＹ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子に対する二重変異体及び三重変異体を同定した。各遺伝子の変異体、得られた二重変異体及び三重変異体について、根毛の数を計測した結果を図３に示す。
図３から判るように、ｃｐｌ３−１変異体においては、根毛の数が僅かに減少していた。また、ＣＰＣ遺伝子及びＴＲＹ遺伝子に対する二重変異株、ＣＰＣ遺伝子及びＥＴＣ１遺伝子に対する二重変異株、並びにＴＲＹ遺伝子、ＣＰＬ３遺伝子及びＣＰＣ遺伝子に対する三重変異株においては、根毛の数が大幅に減少しているか、根毛が殆ど計測されなかった。
各遺伝子の変異体、得られた二重変異体及び三重変異体について、トライコームの数を計測した結果を図４に示す。図４から判るように、ｃｐｌ３−１変異体においては、ｃｐｃ−２変異体と同様に野生型と比較してトライコーム数が増加していた。また、ＴＲＹ遺伝子、ＣＰＣ遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子に対する三重変異体においては、更にトライコーム数が増加していた。さらに、ＴＲＹ遺伝子、ＣＰＣ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子に対する四重変異体においては、更に多くのトライコームが形成され葉の主面全体がトライコームで覆われていた。
また、（実験例１）で単離したｃｐｌ３−１変異体、及び（実験例２）で作製した形質転換体について成長を観測した。
各植物について同じ成長段階における生重量を測定した結果を図５に示し、各植物の同時期における写真を図６に示す。図５及び６から分かるように、ＣＰＬ３遺伝子を欠損する変異体は野生型と比較して大きく成長している。これに対して、ＣＰＬ３遺伝子を過剰に発現する形質転換体は、野生型と比較して３０％程度の成長であった。なお、結果を図示しないが、ＣＰＣ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子及びＴＲＹ遺伝子を欠損する各変異体においては、野生型と同等の成長しか示さなかった。
また、これら各植物について倍数性を検証した結果を図７に示す。なお、倍数性は、播種から２週間経過後の各植物について、Ｐｌｏｉｄｙ  Ａｎａｌｔｚｅｒ  ＰＡ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｐａｒｔｅｃ）を使用して製造元マニュアルに従って測定した。図７から分かるように、ＣＰＬ３遺伝子を欠損する変異体においては、１６Ｃのピークが著しく上昇している。この結果から、ＣＰＬ３遺伝子を欠損する変異体は、核内倍化が向上することにより細胞のサイズ向上といった表現型を示していることが示唆された。
さらに、各植物について本葉数を測定した結果を図８に示し、各植物の抽台日数を測定した結果を図９に示す。図８及び９から分かるように、ＣＰＬ３遺伝子を欠損する変異体は、野生型及びその他の変異体ならびに形質転換体と比較して早咲きであった。
さらに、各植物について、葉及び胚軸における細胞の表現型を光学顕微鏡を用いて観察した。その結果を図１０に示す。図１０から分かるように、ＣＰＬ３遺伝子を欠損する変異体においては、野生型及びＣＰＬ３遺伝子を過剰発現する形質転換体と比較して、葉の表皮細胞が大きく、且つ胚軸が長いといった特徴を示した。また、各植物について、葉のサイズ、上皮細胞数を計測した結果を表２に示す。
【表２】
2008044800.tif 000004
なお、上皮細胞数の測定に際しては、播種から２週間経過した後、第３葉を採取し、抱水クロラール（重量）：グリセロール（容量）：水（容量）を８：２：１で含む洗浄液で洗浄し、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  ｐｌａｎ２（Ｃａｒｌ  Ｚｗｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて可視化した。表２の数値は、５枚の葉について計測した平均を示している。
図１０及び表２に示した結果より、ＣＰＬ３遺伝子を欠損した変異体においては、野生型と比較して細胞数の増加は見られないものの野生型と比較して大きく成長していることから、野生型と比較して個々の細胞における成長が促進されていることが明らかとなった。
【実施例２】
【０００７】
本実施例では、（実験例２）で作製した形質転換体を用いて、ＣＰＣ遺伝子、ＥＴＣ１遺伝子、ＥＴＣ２遺伝子、ＴＲＹ遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子を３５Ｓプロモーターの制御下、又は自身のプロモーターの制御下に過剰発現する形質転換体における根毛の数を比較した。結果を図１１に示す。図１１に示すように、３５Ｓプロモーターの制御下に恒常的に発現する全ての形質転換体において、野生型と比較して根毛の数が増加した。しかし、３５Ｓプロモーターの制御下にＣＰＬ３遺伝子を発現する形質転換体においては、他の形質転換体と比較して根毛の数が増加がやや緩やかであった。さらに、ＥＴＣ１プロモーターの制御下にＥＴＣ１遺伝子を過剰発現する形質転換体においては、自身のプロモーターの制御下に過剰発現する他の形質転換体及び野生型と比較して根毛の数が増加した。
また、同様にして各形質転換体におけるトライコームの数を測定した結果を図１２に示す。図１２に示すように、ＥＴＣ２プロモーターの制御下にＥＴＣ２遺伝子を過剰発現する形質転換体を除いて全ての形質転換体において、トライコームが完全に欠失していた。ＥＴＣ２プロモーターの制御下にＥＴＣ２遺伝子を過剰発現する形質転換体も、野生型と比較するとトライコーム数が大幅に減少していた。
【実施例３】
【０００８】
本実施例では、（実験例２）で作製した、各遺伝子のプロモーター制御下でＧＵＳタンパク質を発現する形質転換体を用いて、各遺伝子の発現パターンを検討した。その結果を図１３に示す。また、（実験例２）で作製した、各遺伝子についてＧＦＰ融合タンパク質を高発現する形質転換体を用いて、各遺伝子産物の発現パターンを検討した。結果を図１４に示す。また、図１４には、ＲＴ−ＰＣＲ及びＩｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎによって各遺伝子の発現パターンを検討した結果も示す。
図１３及び１４に示すように、ＣＰＣ遺伝子、ＴＲＹ遺伝子およびＥＴＣ１遺伝子の産物は、若い葉のトライコーム及び根表皮における非根毛細胞（Ｈａｉｒｌｅｓｓ  Ｃｅｌｌ）に特異的に蓄積していた。また、ＥＴＣ２遺伝子及びＣＰＬ３遺伝子の産物は、葉における向軸側及び背軸側の気孔孔辺細胞を含む表皮細胞に特異的に蓄積しており、根及びトライコームには蓄積していなかった。特に、ＥＴＣ２遺伝子よりもＣＰＬ３遺伝子は、葉、子葉、胚軸及び葉柄における気孔孔辺細胞に限定的に発現していた。
【実施例４】
【０００９】
本実施例では、実施例１と同様にして同定したｃｐｃ、ｔｒｙ、ｅｔｃ１、ｅｔｃ２及びｃｐｌ３ノックアウト変異体、並びに実験例２と同様にして作製したＣＰＬ３過剰発現植物体の開花時期及び葉数を調査した。
これらの各変異植物体の開花時期、及び各開花時期における葉数を調査した結果を表３に示す。なお、データは１実験当たり少なくとも１０個体の植物の平均±ＳＤを示す。
【表３】
2008044800.tif 000005
2008044800.tif 000006
表３に示されるように、ｃｐｌ３ノックアウト変異植物体は野生型よりも早く開花し（２８．９±０．５対３７．６±０．５日）、葉数はより少なかった（８．２±０．３対１７．４±０．６）。他方、ｃｐｃ、ｔｒｙ、ｅｔｃ１及びｅｔｃ２変異植物体は、野生型と有意差はなかった（表３）。３５Ｓ：ＣＰＬ３トランスジェニック植物は野生型よりわずかに遅く開花し（４１．１±１．１対３７．６±０．５）、葉数はより多かった（２８．５±１．７対１７．４±０．６）。
さらに、開花に対するＣＰＬ３遺伝子の効果を明確にするために、花成（開花）の制御において中心的な役割を果たすことがわかっているＦＬＯＷＥＲＩＮＧ  ＬＯＣＵＳ  Ｔ（ＦＴ）、ＳＵＰＲＥＳＳＯＲ  ＯＦ  ＯＶＥＲＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＯＦ  ＣＯ  １（ＳＯＣ１）及びＣＯＮＳＴＡＮＳ（ＣＯ）（Ｂａｇｎａｌｌ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ  ７１，７５，１９９３；Ｌｅｅら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４，２３６６−２３７６，２０００；Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆら，Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２２９，５７−６６，１９９１）の発現を、ＣＰＬ３発現を改変した植物系統においてリアルタイムＰＣＲを用いて調査した。
リアルタイムＰＣＲは以下のように実施した。全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。オンカラムＤＮアーゼＩ消化は、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋに記載されるプロトコールに従ってＲＮＡ精製の間に行った。第一鎖のｃＤＮＡを、２０μＬ反応混合液中、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  ｒｅｇｅｎｔ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、１μｇの全ＲＮＡから合成した。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を用いてＣｈｒｏｍｏ４  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実施した。ＰＣＲ増幅は、９５℃３０秒の変性ステップ、その後の９５℃で５秒、６０℃で３０秒の、ＣＰＬ３については４５サイクル、ＣＯ、ＦＴ、ＳＯＣ１及びＡＣＴ２については４０サイクルとした。ｍＲＮＡの相対レベルは、ｉＱ５ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって計算し、ＡＣＴ２  ｍＲＮＡの濃度に標準化した。
ｃｐｌ３ノックアウト変異体におけるＦＴ及びＳＯＣ１の発現は、葉の発育の間、長日（ＬＤ）条件下で、野生型と比較してより高かった。２１日齢の葉において、ｃｐｌ３ノックアウト変異体におけるＦＴの発現は、野生型よりも、約７．５倍高く、ＳＯＣ１の発現は３．２倍高かった（図１５Ａ及び１５Ｂ）。ｃｐｌ３ノックアウト変異体におけるＣＯの発現は野生型と有意差はなかった（図１５Ｃ）。これらの結果は、ＦＴ及びＳＯＣ１発現を抑制することによる開花調節にＣＰＬ３が関与していることを示す。
【産業上の利用可能性】
【００１０】
本発明によれば、野生型と比較して、より大きな形態又はより早い開花時期を示す新規な変異植物体及びその製造方法を提供することができる。本発明に係る変異植物体によれば、野生型と比較して大きな形態を示すため、例えば、植物体から抽出される物質の生産性を向上させることができる。また本発明に係る変異植物体によれば、野生型と比較してより早い開花時期を示すため、果実や種子の形成を促進でき、例えば通常年一回しか収穫できない作物が複数回収穫可能である。またこのような本発明の変異植物体の性質により、作物の収穫までにかかる時間やコストの削減が可能である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
2008044800.tif 000007
2008044800.tif 000008
2008044800.tif 000009
2008044800.tif 000010
2008044800.tif 000011
2008044800.tif 000012
2008044800.tif 000013
2008044800.tif 000014
2008044800.tif 000015
2008044800.tif 000016
2008044800.tif 000017
2008044800.tif 000018
【図１−１】
2008044800.tif 000019
【図１−２】
2008044800.tif 000020
【図２】
2008044800.tif 000021
【図３】
2008044800.tif 000022
【図４】
2008044800.tif 000023
【図５】
2008044800.tif 000024
【図６】
2008044800.tif 000025
【図７】
2008044800.tif 000026
【図８】
2008044800.tif 000027
【図９】
2008044800.tif 000028
【図１０】
2008044800.tif 000029
【図１１】
2008044800.tif 000030
【図１２】
2008044800.tif 000031
【図１３】
2008044800.tif 000032
【図１４】
2008044800.tif 000033
【図１５】
2008044800.tif 000034
【国際調査報告】
2008044800.tif 000035
2008044800.tif 000036
2008044800.tif 000037
2008044800.tif 000038
2008044800.tif 000039
2008044800.tif 000040
2008044800.tif 000041
2008044800.tif 000042