(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｈ鎖とＬ鎖を含む抗体を含む骨損失を治療するための医薬組成物であって、該Ｈ鎖は配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含み、該Ｌ鎖は配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含み、該抗体はＯＰＧＬがＯＤＡＲに結合することにより誘導される破骨細胞の分化を阻害する抗体である、骨損失を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
Ｈ鎖とＬ鎖を含む抗体を含む骨損失を治療するための医薬組成物であって、該Ｈ鎖は配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含む可変領域を含み、該Ｌ鎖は配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含む可変領域を含み、該抗体はＯＰＧＬがＯＤＡＲに結合することにより誘導される破骨細胞の分化を阻害する抗体である、骨損失を治療するための医薬組成物。
【請求項３】
患者の骨損失を伴う炎症性症状を治療する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
患者の骨損失を伴う自己免疫症状を治療する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
癌に関する骨損失を治療するための請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
癌が、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、食道癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、及び胃腸管の癌から選択される請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記抗体がＨ鎖とＬ鎖とを可撓性リンカーにより接続して一本鎖抗体を形成する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗体が一本鎖Ｆｖ抗体である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗体がＦａｂ抗体である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記抗体がＦａｂ’抗体である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗体が（Ｆａｂ’）２抗体である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
Ｈ鎖とＬ鎖を含む抗体を含む骨損失を治療するための医薬組成物であって、該Ｈ鎖は配列番号２の２０〜４６７アミノ酸残基で表されるアミノ酸配列を含み、該Ｌ鎖は配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含み、該抗体はＯＰＧＬがＯＤＡＲに結合することにより誘導される破骨細胞の分化を阻害する抗体であって、該骨損失は癌に関する骨損失である、骨損失を治療するための医薬組成物。
【請求項１３】
Ｈ鎖とＬ鎖を含む抗体を含む骨損失を治療するための医薬組成物であって、該Ｈ鎖は配列番号２の２０〜４６７アミノ酸残基で表されるアミノ酸配列に少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、該Ｌ鎖は配列番号４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含み、該抗体はＯＰＧＬがＯＤＡＲに結合することにより誘導される破骨細胞の分化を阻害する抗体であって、該骨損失は癌に関する骨損失である、骨損失を治療するための医薬組成物。
【請求項１４】
Ｈ鎖とＬ鎖を含む抗体を含む骨損失を治療するための医薬組成物であって、該Ｈ鎖は配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、該Ｌ鎖は配列番号１４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含む可変領域を含み、該抗体はＯＰＧＬがＯＤＡＲに結合することにより誘導される破骨細胞の分化を阻害する抗体であって、該骨損失は癌に関する骨損失である、骨損失を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
Ｈ鎖とＬ鎖を含む抗体を含む骨損失を治療するための医薬組成物であって、該Ｈ鎖は配列番号２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含み、該Ｌ鎖は配列番号４の２１〜２３５アミノ酸残基で表されるアミノ酸配列を含み、該抗体はＯＰＧＬがＯＤＡＲに結合することにより誘導される破骨細胞の分化を阻害する抗体であって、該骨損失は癌に関する骨損失である、骨損失を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
Ｈ鎖とＬ鎖を含む抗体を含む骨損失を治療するための医薬組成物であって、該Ｈ鎖は配列番号１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むアミノ酸配列を含む可変領域を含み、該Ｌ鎖は配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含む可変領域を含み、該抗体はＯＰＧＬがＯＤＡＲに結合することにより誘導される破骨細胞の分化を阻害する抗体であって、該骨損失は癌に関する骨損失である、骨損失を治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
癌が、乳癌、前立腺癌、甲状腺癌、腎臓癌、肺癌、食道癌、直腸癌、膀胱癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、及び胃腸管の癌から選択される請求項１２乃至１６のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年６月２６日に出願された米国仮出願番号６０／３０１，１７２の優先権を主張し、これを任意の目的のために参照してここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）に結合する抗体に関する。骨粗鬆症、関節炎による骨損失、ページェット病および骨減少症のような骨疾患を治療するための組成物および方法も記載する。
【背景技術】
【０００３】
骨組織は、体の支持を提供し、鉱物（カルシウムおよび燐を含む）、コラーゲン性および非コラーゲン性蛋白のマトリクス、および細胞を含む。生きている骨組織は、沈着と呼ばれる骨の形成と再吸収と呼ばれる骨の破壊との間の動的平衡を示す。骨中に見られる三種類の細胞である骨細胞、骨芽細胞および破骨細胞は、この平衡に含まれる。骨芽細胞は、骨組織の形成を促進するが、破骨細胞は再吸収に関わる。骨マトリクスおよび鉱物の再吸収、すなわち溶解は、骨形成と比べると迅速で効率的なプロセスであり、骨から多量の鉱物を放出することができる。破骨細胞は、骨組織の正常リモデリングの制御に関与し、ホルモンにより誘発される再吸収に関与している。例えば、細胞外液中のカルシウムイオン濃度の低下に応答する副甲状腺ホルモンの分泌により再吸収が刺激される。これに対し、再吸収の阻害は、カルシトニンの機能である。さらに、ビタミンＤの代謝産物は、骨の副甲状腺ホルモンおよびカルシトニンへの反応性を変える。
【０００４】
サイトカインのＴＮＦファミリーの一員であるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）は、ＮＦ−ｋＢの受容体活性化物質（ＲＡＮＫ：破骨細胞分化および活性化受容体すなわちＯＤＡＲとも呼ばれる）への結合により破骨細胞の形成を促進する。他方、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、ＯＰＧＬを隔離させ、ＯＰＧＬがＯＤＡＲと組合わされないようにすることにより、破骨細胞の形成を阻害する。すなわち、ＯＤＡＲと組み合わされたＯＰＧＬの量が、骨の沈着と再吸収との間の平衡と関連している。
【０００５】
骨格の成熟後、骨格中の骨の量は、骨の形成と骨の再吸収との均衡（または不均衡）を反映する。骨質量のピークは、骨格成熟後、４０年目前に迎える。４０年目と５０年目の間に、平衡が移動し、骨再吸収が主流となる。加齢に伴う骨質量の避け難い減少は男性よりも女性においてより早く開始し、一部の女性（主に、コーカサスおよびアジア系の女性）では閉経後に著しく加速される。
【０００６】
骨減少症は、通常、骨質量の正常水準を下回る減少に関わる症状である。そのような症状は、骨合成速度の低下または骨破壊速度の上昇あるいは両者から生じ得る。骨減少症の一般的形態は、閉経後および老人性骨粗鬆症とも呼ばれる原発性骨粗鬆症である。この形態の骨粗鬆症は、年と共に骨が全身性に損失する結果であり、しばしば、骨形成は正常速度であって骨再吸収が増加した結果である。合衆国の多くの白人女性は、症候性骨粗鬆症を発現する。４５歳以上の女性における股関節部、大腿部、首および転子間骨折の発病率と、骨粗鬆症との間に、直接の関係が存在する。高齢の女性は、５０歳から７０歳の間に症候性骨粗鬆症を発現し得る。骨粗鬆症は、ある場合において、ＯＰＧＬの上昇した水準または活性から生じ得る。すなわち、破骨細胞発生におけるＯＰＧＬの活性を制御することができる分子を有することが有用であろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
閉経後および老人性骨粗鬆症に貢献し得る幾つかの因子が確認された。これらは、カルシウムおよび他の鉱物の腸吸収低下に起因する不適切なカルシウム消費および加齢に伴うホルモン水準の変化を含む。ある治療は、プロセスを遅延させようとするホルモン療法または食事補足を含んでいた。より最近では、骨質量低下の予防および治療のために、ビホスホネートおよび選択的エストロゲン受容体修飾物質（ＳＥＲＭ）のような抗再吸収性剤が現れた。すなわち、特定の骨減少疾患の治療において、ＯＰＧＬの活性を制御することができる分子とこれらの治療を組み合わせることが有用であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２で示すアミノ酸配列またはその断片を含むＨ鎖および配列番号４で示すアミノ酸配列またはその断片を含むＬ鎖を含む抗体を提供する。
【０００９】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１３で示すアミノ酸配列またはその断片を含む可変領域を含むＨ鎖および配列番号１４で示すアミノ酸配列またはその断片を含む可変領域を含むＬ鎖を含む抗体を提供する。
【００１０】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２で示すアミノ酸配列またはその断片を含むＨ鎖、およびＬ鎖を含む抗体を提供する。
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１３で示すアミノ酸配列またはその断片を含む可変領域を含むＨ鎖およびＬ鎖を含む抗体を提供する。
【００１２】
ある実施形態において、本発明は、Ｈ鎖および配列番号４で示すアミノ酸配列またはその断片を含むＬ鎖を含む抗体を提供する。
【００１３】
ある実施形態において、本発明は、Ｈ鎖および配列番号１４で示すアミノ酸配列またはその断片を含む可変領域を含むＬ鎖を含む抗体を提供する。
【００１４】
ある実施形態において、本発明は、Ｈ鎖およびＬ鎖を含む抗体であって、（ａ）Ｈ鎖は第１の可変領域を含み、第１の可変領域は、配列番号１３で示すアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、（ｂ）Ｌ鎖は第２の可変領域を含み、第２の可変領域は、配列番号１４で示すアミノ酸配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、および（ｃ）前記抗体は、オステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）と相互反応する上記抗体を提供する。
【００１５】
ある実施形態において、第１の可変領域は、配列番号１３で示すアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、第２の可変領域は、配列番号１４で示すアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。
【００１６】
ある実施形態において、第１の可変領域は、配列番号１３で示すアミノ酸配列に少なくとも９９％の同一性を有する配列を含み、第２の可変領域は、配列番号１４で示すアミノ酸配列に少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。
【００１７】
ある実施形態において、本発明は、配列番号２で示すアミノ酸配列またはその断片を含むＨ鎖を提供する。ある実施形態において、本発明は、配列番号１３で示すアミノ酸配列またはその断片を含む可変領域および定常領域を含むＨ鎖を提供する。
【００１８】
ある実施形態において、本発明は、配列番号４で示すアミノ酸配列またはその断片を含むＬ鎖を提供する。ある実施形態において、本発明は、配列番号１４で示すアミノ酸配列またはその断片を含むＬ鎖を提供する。
【００１９】
本発明のある実施形態において、一本鎖抗体が提供される。本発明のある実施形態において、一本鎖Ｆｖ抗体が提供される。本発明のある実施形態において、Ｆａｂ抗体が提供される。本発明のある実施形態において、Ｆａｂ’抗体が提供される。本発明のある実施形態において、（Ｆａｂ’）２抗体が提供される。
【００２０】
ある実施形態において、本発明の抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。ある実施形態において、治療有効量のＯＰＧＬへの抗体を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００２１】
ある実施形態において、医薬組成物は、骨形態発生因子、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害因子、ＩＬ−１ｒａ、キネレト（Ｋｉｎｅｒｅｔ）（登録商標）、ＴＮＦα阻害因子、可溶性ＴＮＦα受容体、エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）、抗−ＴＮＦα抗体、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標）、Ｄ２Ｅ７抗体、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモン類似体、副甲状腺ホルモン関連蛋白、副甲状腺ホルモン関連蛋白類似体、プロスタグランジン、ビスホスホネート、アレンドロネート、フッ化物、カルシウム、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ＣＯＸ−２阻害因子、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（登録商標）、ビオックス（Ｖｉｏｘｘ）（登録商標）、免疫抑制薬、メトトレキセート、レフルノミド、セリンプロテアーゼ阻害因子、分泌性白血球プロテアーゼ阻害因子（ＳＬＰＩ）、ＩＬ−６阻害因子、ＩＬ−６への抗体、ＩＬ−８阻害因子、ＩＬ−８への抗体、ＩＬ−１８阻害因子、ＩＬ−１８結合性蛋白、ＩＬ−１８抗体、インターロイキン−１転化酵素（ＩＣＥ）調節因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ調節因子、ＰＡＦ拮抗薬、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＫＧＦ−関連分子、ＫＧＦ調節因子、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）調節因子、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）調節因子、グルココルチコイド受容体の調節因子、グルタメート受容体の調節因子、リポ多糖類（ＬＰＳ）水準の調節因子、ノルアドレナリン、ノルアドレナリン模倣体およびノルアドレナリン調節因子から選択される少なくとも一つの治療剤、およびＯＰＧＬへの抗体を含む。
【００２２】
本発明のある実施形態において、薬学的有効量の抗体を投与することを含んでなる、骨減少疾患を治療する方法が提供される。ある実施形態において、医薬組成物を投与することを含んでなる、骨減少疾患を治療する方法が提供される。
【００２３】
ある実施形態において、医薬組成物を投与することを含んでなる、患者における骨損失を伴う炎症性症状を治療する方法が提供される。
【００２４】
ある実施形態において、医薬組成物を投与することを含んでなる、患者における骨損失を伴う自己免疫症状を治療する方法が提供される。
【００２５】
ある実施形態において、本発明の医薬組成物を投与することを含んでなる、患者におけるリューマチ性関節炎を治療する方法が提供される。
【００２６】
ある実施形態において、サンプルを抗体に接触させることを含んでなる、生物学的サンプル中のＯＰＧＬの水準を検出する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】αＯＰＧＬ−１抗体Ｈ鎖をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２】αＯＰＧＬ−１抗体Ｈ鎖のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】αＯＰＧＬ−１抗体Ｌ鎖をコードするｃＤＮＡ配列（配列番号３）を示す。
【図４】αＯＰＧＬ−１抗体Ｌ鎖のアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図５】αＯＰＧＬ−１κＬ鎖発現プラスミドαＯＰＧＬ−１−κ／ｐＤＳＲａ１９の概略図を示す。
【図６】αＯＰＧＬ−１  ＩｇＧ２  Ｈ鎖発現プラスミドαＯＰＧＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲａ１９の概略図を示す。
【図７】ＯＰＧＬ被覆ＥＩＡプレートへのαＯＰＧＬ−１の投与量依存的結合を示す。
【図８】膜結合ＯＰＧＬへのαＯＰＧＬ−１の特異的結合を示す。
【図９】可溶性ＯＰＧＬによるＯＰＧＬ被覆ＥＩＡプレートへのαＯＰＧＬ−１の結合の阻害を示す。
【図１０】ＯＰＧＬ被覆ＥＩＡプレートへのαＯＰＧＬ−１の特異的結合を示す。
【図１１】αＯＰＧＬ−１による破骨細胞形成の投与量依存的阻害を示す。
【図１２】αＯＰＧＬ−１によるＯＰＧＬのＯＤＡＲへの結合の投与量依存的阻害を示す。
【図１３】カニクイザルにαＯＰＧＬ−１の一回投与量を投与した後の平均血清濃度時間プロフィールを示す。
【図１４】カニクイザルにαＯＰＧＬ−１の一回投与量を投与した後の血清Ｎ−Ｔｘ濃度の平均変化％を示す。
【図１５】カニクイザルにαＯＰＧＬ−１の一回投与量を投与した後の尿Ｎ−Ｔｘ濃度の平均変化％を示す。
【図１６】カニクイザルにαＯＰＧＬ−１の一回投与量を投与した後の抗体陽性および陰性血清濃度時間プロフィールを示す。
【図１７】αＯＰＧＬ−１抗体Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。
【図１８】αＯＰＧＬ−１抗体Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。
【図１９】αＯＰＧＬ−１の生産のための細胞培養プロセスを示す。
【図２０】カニクイザルにαＯＰＧＬ−１の一回投与量を投与した後の血清カルシウム変化％を示す。
【図２１】カニクイザルにαＯＰＧＬ−１の一回投与量を投与した後の血清アルカリホスファターゼ変化％を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ここで用いられる区分表題は系統化の目的のみのものであり、記載された対象に限定することを意図しない。本出願で引用された全ての引例は、ここにおいて任意の目的のために参考として組み込まれる。
【００２９】
定義
組換えＤＮＡ、オリグヌクレオチド合成並びに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔法、リポ移入）用の標準的技術を用いることができる。酵素的反応および精製技術を、製造者の仕様に従って、または当分野で一般的に行われるように、もしくはここで記載のように行うことができる。前記技術および手順は、通常、当分野で良く知られている従来法に従って、また、本明細書全体において引用および記載されている種々の一般的およびより具体的な引例に記載のように行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））が参照され、ここで任意の目的のために参考として取り込まれる。特定の定義が無い限り、分析化学、合成有機化学および医学および薬学的化学に関して利用される命名法およびその実験室的手順および技術は、当分野においてよく知られていると共に一般的に用いられるものである。化学的合成、化学的分析、薬学的調製、処方、および送達、および患者の治療用の標準的技術を用いてよい。
【００３０】
本開示に従って利用されるように、以下の用語は、特記しない限り、以下の意味を有すると解される：
ここで用いられる「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成起源またはそれらの組み合わせのポリヌクレオチドを意味し、その起源に依り、その「単離ポリヌクレオチド」は、（１）「単離ポリヌクレオチド」が天然に見られるポリヌクレオチドの全体または一部を伴わず、（２）天然には結合していないポリヌクレオチドに結合している、または（３）より大きな配列の一部として天然に存在しない。
【００３１】
ここで言及される「単離蛋白」という用語は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡによるコードされる、または合成起源またはそれらの組み合わせの蛋白を意味し、（１）正常では見つかる少なくとも一部の蛋白を含まない、（２）同じ源からの、例えば同じ種からの他の蛋白を本質的に含まない、（３）異なる種からの細胞により発現される、または（４）天然では存在しない。
【００３２】
「ポリペプチド」という用語は、ここで、天然蛋白または、天然配列の一または二以上のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を有する配列に言及する総称として用いられる。「ポリペプチド」という用語は、αＯＰＧＬ−１（以下に記載、配列番号２および配列番号４）または、αＯＰＧＬ−１の一または二以上のアミノ酸の欠失、付加および／または置換を有する配列も含む。ある実施形態によれば、本発明は、図２に示されるヒトＨ鎖イムノグロブリン分子（配列番号２）および図４に示されるヒトＬ鎖イムノグロブリン分子（配列番号４）またはそれらの断片または類似体を含む。
【００３３】
対象についてここで適用される「天然に存在する」という用語は、対象を天然に見つけることができるという事実を意味している。例えば、自然の供給源から単離し得る生物（ウイルスを含む）中に存在すると共に、実験室等においてヒトが意図的に修飾していないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００３４】
ここで用いられる「機能可能に結合」という用語は、意図する方式で機能する関係にある成分を意味する。例えば、コード化配列に「機能可能に結合」している制御配列は、制御配列に適合する条件下でコード化配列の発現が達成されるように結合されている。
【００３５】
ここで用いられる「制御配列」という用語は、それらが結合するコード化配列の発現および加工を達成し得るポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存して異なる。ある実施形態によれば、原核生物用の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列を含み得る。ある実施形態によれば、真核生物用の制御配列は、プロモーター、および転写終止配列を含み得る。ある実施形態において、「制御配列」はリーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。
【００３６】
ここで用いられる「ポリヌクレオチド」という用語は、長さが少なくとも１０塩基であるヌクレオチドのポリマー状態を意味する。ある実施形態において、塩基は、リボヌクテオチドまたはデオキシリボヌクテオチドあるいは、いずれかのタイプのヌクレオチドの修飾状態であり得る。この用語は、ＤＮＡの一本鎖または二本鎖状態を含む。
【００３７】
ここで用いられる「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在するもの、および天然産に存在するおよび／または天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合により一緒に結合されている修飾ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、通常、２００塩基以下の長さを有するポリヌクレオチド亜集団である。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０〜４０塩基である。オリゴヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、例えば、遺伝子突然変異体の構築に用いられる。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【００３８】
「天然に存在するヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾または置換された糖等を有するヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデート等のようなオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１４巻：９０８１頁（１９８６年）；Ｓｔｅｃら著、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１０６巻：６０７７頁（１９８４年）；Ｓｔｅｉｎら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１６巻：３２０９頁（１９８８年）；Ｚｏｎら著、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ第６巻：５３９頁（１９９１年）；Ｚｏｎら著、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、８７〜１０８頁（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９１年））；Ｓｔｅｃら著、米国特許第５，１５１，５１０号；第Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ第９０巻：５４３頁（１９９０年）が参照され、その開示が、ここで、任意の目的のために参考として取り込まれる。オリゴヌクレオチドは、検出用の標識を含むことができる。
【００３９】
関連するポリペプチドの同一性および類似性は、既知の方法により容易に計算することができる。そのような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８年）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３年）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ１、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４年）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７年）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１年）；およびＣａｒｉｌｌｏら著、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．第４８巻：１０７３頁（１９８８年）に記載されたものがあるが、これらに限定されない。
【００４０】
同一性を決めるための好ましい方法は、試験した配列間の最適一致を得るように設計されている。同一性を決めるための方法は、公に利用できるコンピュータープログラムに記載されている。二つの配列間の同一性を決めるための好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプログラムパッケージ、例えばＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．第１２巻：３８７頁（１９８４年）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））あるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら著、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら著、前掲書（１９９０年））から公に利用することができる。良く知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を決めるために用いることができる。
【００４１】
二つのアミノ酸配列を整列させるための特定の整列スキームにより、二つの配列の短い領域のみが一致することがあろう。この小さな整列領域は、二つの全長配列間に有意な関係が無くても、非常に高い配列同一性を有することができる。従って、ある実施形態において、選択された整列法（ＧＡＰプログラム）により、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接アミノ酸に及ぶ整列がもたらされる。
【００４２】
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を用いて、配列同一性％を決めるべき二つのポリペプチドを、それぞれのアミノ酸の一致（アルゴリズムにより決められる「一致領域」）が最適になるように整列させる。ある実施形態において、ギャップ・オープニング・ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）（３×平均ダイアゴナルとして計算される。「平均ダイアゴナル」は、用いられる比較マトリクスのダイアゴナルの平均である。「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリクスによる各完全アミノ酸一致に割り当てられた得点または数である）およびギャップ・エクステンション・ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）（通常、ギャップ・オープニング・ペナルティの１／１０倍）、並びにＰＡＭ２５０またはＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリクスが、アルゴリズムと組み合わされて用いられる。ある実施形態において、標準的比較マトリクス（ＰＡＭ２５０比較マトリクスについてはＤａｙｈｏｆｆら著、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５（３）（１９７８年）；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリクスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８９巻：１０９１５〜１０９１９頁（１９９２年）を参照されたい）もこのアルゴリズムにより用いられる。
【００４３】
ある実施形態において、ポリペプチド配列比較用のパラメーターは以下のものを含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第４８巻：４４３〜４５３頁（１９７０年）；
比較マトリクス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら著、前掲書（１９９２年）からのＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップ・ペナルティ：１２
ギャップ・レングス・ペナルティ：４
類似性の閾値：０
【００４４】
ＧＡＰプログラムは、前記パラメーターを用いて有用となり得る。ある実施形態において、前記パラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチドを比較（末端ギャップ用のペナルティ無しで）するためのデフォールトパラメーターである。
【００４５】
ここで用いられるように、２０個の慣用アミノ酸およびそれらの略号は、従来の慣例に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、Ｍａｓｓ．（１９９１年））が参照され、ここで任意の目的のために参考として取り込まれる。２０個の慣用アミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸のような非天然アミノ酸、および他の非慣用アミノ酸も、本発明のポリペプチド用の適切な成分となり得る。非慣用アミノ酸の例には：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプリン）がある。ここで用いられるポリペプチド表記において、標準的慣例および慣用によれば、左側方向はアミノ末端方向であり右側方向はカルボキシ末端方向である。
【００４６】
同様に、特記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’方向と呼ばれる。発生時期のＲＮＡ転写体の５’から３’への付加の方向は転写方向と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有しＲＮＡ転写体の５’から５’末端であるＤＮＡストランド上の配列領域は、「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有しＲＮＡ転写体の３’から３’末端であるＤＮＡストランド上の配列領域は、「下流配列」と呼ばれる。
【００４７】
保存的アミノ酸置換は、生物学的システムにおける合成よりも、化学的ペプチド合成により典型的に組み込まれる非天然産アミノ酸残基を含み得る。これらは、ペプチド模倣体および、アミノ酸部分の他の逆のまたは逆転した形態を含む。
【００４８】
天然に存在する残基は、側鎖共有特性に基づくクラスに分けることができる。
【００４９】
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖方向付けに影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００５０】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの一員を他のクラスからの一員に置換することを含み得る。そのような置換された残基は、非ヒト抗体と相同性のヒト抗体の領域中に、または分子の非相同性領域中に導入することができる。
【００５１】
ある実施形態においてそのような変化を起こす場合、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮することができる。各アミノ酸は、その疎水性および荷電特性を基準に、ヒドロパシー指数を割り与えられている。それらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【００５２】
生物学的機能相互作用を蛋白に与える際のアミノ酸ヒドロパシー指数の重要性が、当分野において理解されている。Ｋｙｔｅら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第１５７巻：１０５〜１３１頁（１９８２年）。あるアミノ酸は、同様のヒドロパシー指数または得点を有し同様の生物学的活性を維持している他のアミノ酸に置換できることが知られている。ある実施形態においてヒドロパシー指数に基づいて変更する際に、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある実施形態において、ヒドロパシー指数が±１以内であるものが含まれ、ある実施形態において、ヒドロパシー指数が±０．５以内であるものが含まれる。
【００５３】
類似アミノ酸の置換を、特に、この場合のように、それにより作られた生物学的機能性蛋白またはペプチドを免疫学的実施形態において用いることを意図する場合、親水性に基づいて効果的に行い得ることも当分野において理解されている。ある実施形態において、その隣接アミノ酸の親水性により支配される、蛋白の最も大きな局部的平均親水性は、その免疫原性および抗原性と、すなわち、蛋白の生物学的特性と関連している。
【００５４】
以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に割り与えられている。アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。ある実施形態において類似の親水性値に基づいて変更する場合、その親水性値が±２以内にあるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態においては、親水性値が±１以内にあるものが含まれ、ある実施形態においては、親水性値が±０．５以内にあるものが含まれる。親水性に基づき一次アミノ酸配列からのエピトープを特定することもできよう。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００５５】
アミノ酸置換の例を表１に示す。
【００５６】
【表１】
0005576903.tif 000002
【００５７】
当業者は、良く知られた技術を用いて、ここで示されるようなポリペプチドの適切な変異体を決めることができる。ある実施形態において、当業者は、活性に重要と考えられない標的領域により、活性を破壊することなく変化させることができる分子の適切な領域を特定することができる。ある実施形態において、類似のポリペプチド中に保存される分子の残基および部分を特定することができる。ある実施形態において、生物学的活性または構造に重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に悪影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に付すことができる。
【００５８】
さらに、当業者は、活性または構造に重要な、類似のポリペプチド中の残基を特定する構造−機能研究を行うことができる。そのような比較を考慮して、類似蛋白中の活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する蛋白中のアミノ酸残基の重要性を予想することができる。当業者は、そのような予想される重要なアミノ酸残基を化学的に類似のアミノ酸置換を選択することができる。
【００５９】
当業者は、類似のポリペプチド中のその構造に関する三次元構造およびアミノ酸配列を分析することもできる。そのような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造に関して、抗体のアミノ酸残基の整列を予想することができる。ある実施形態において、当業者は、蛋白の表面にあることが予想されるアミノ酸残基に過激な変化を起こさないように選択することができるが、これは、そのような残基が、他の分子との重要な相互作用に含まれ得るからである。さらに、当業者は、各所望のアミノ酸残基において一つのアミノ酸置換を含む試験変異体を発生させることができる。この変異体は、次に、当業者に知られている活性アッセイを用いてスクリーニングすることができる。そのような変異体は、適切な変異体に関する情報を集めるために用いることができる。例えば、特定のアミノ酸への変化により、破壊され望ましくない低下した不適切な活性が生じる場合、そのような変化を有する変異体を避けることができる。換言すると、そのような慣用実験から集められる情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独で避けられるまたは他の突然変異と組み合わされて避けられるアミノ酸を容易に決めることができる。
【００６０】
二次構造の予想のために、多くの化学的出版物を利用することができる。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７（４）巻：４２２〜４２７頁（１９９６年）、Ｃｈｏｕら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３（２）巻：２２２〜２４５頁（１９７４年）；Ｃｈｏｕら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１３（２）巻：２１１〜２２２頁（１９７４年）；Ｃｈｏｕら著、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４７巻：４５〜１４８頁（１９７８年）；Ｃｈｏｕら著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第４７巻：２５１〜２７６頁およびＣｈｏｕら著、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．第２６巻：３６７〜３８４頁（１９７９年）が参照される。さらに、二次構造の予想を補助するためにコンピュータープログラムが容易に利用される。二次構造を予想する一つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、配列同一性が３０％を超えるまたは類似性が４０％を超える二つのポリペプチドまたは蛋白は、類似の構造トポロジーを有することが多い。蛋白構造データベース（ＰＤＢ）の最近の成長は、ポリペプチドまたは蛋白構造中の折り重ねの潜在的数を含む、二次構造の向上した予想性を提供する。Ｈｏｌｍら著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．、２７（１）巻：２４４〜２４７頁（１９９９年）を参照のこと。所定のポリペプチドまたは蛋白中に限定数の折り重ねがあることおよび、一旦、構造の重要な数が決まると、構造予想が劇的により正確になることが示された（Ｂｒｅｎｎｅｒら著、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７（３）：３６９〜３７６頁（１９９７年））。
【００６１】
二次構造を予想するさらなる方法には、「Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ」（Ｊｏｎｅｓ、Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（３）：３７７〜８７頁（１９９７年）；Ｓｉｐｐｌら著、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４（１）：１５〜１９頁（１９９６年））、「Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」（Ｂｏｗｉｅら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５３巻：１６４〜１７０頁（１９９１年）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら著、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．、第１８３巻：１４６〜１５９頁（１９９０年）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８４（１３）：４３５５〜４３５８頁（１９８７））、および「ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ」（Ｈｏｌｍ、前掲書（１９９９年）、およびＢｒｅｎｎｅｒ、前掲書（１９９７年）参照）がある。
【００６２】
ある実施形態において、抗体変異体は、グリコシル化部位の数および／または型が親ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて変化したグリコシル化変異体を含む。ある実施形態において、蛋白変異体は、天然蛋白よりも多いまたは少ない数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒにより特徴付けられ、Ｘとしてあらわされるアミノ酸残基はプロリンを除く任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作るためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ−結合炭水化物鎖の付加のための潜在的新規部位を提供する。また、この配列を削除する置換は、存在するＮ−結合炭水化物鎖を除去する。また、一または二以上のＮ−結合グリコシル化部位（典型的には、天然に存在するもの）が削除され一または二以上の新規Ｎ−結合部位が作られるＮ−結合炭水化物鎖の再配列も提供される。さらなる好ましい抗体変異体は、一または二以上のシステイン残基が削除されているまたは親アミノ酸配列と比べて別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されているシステイン変異体を含む。システイン変異体は、不溶性封入体の単離後のように、抗体を再び折り重ねて生物学的活性立体配座にすべき場合に有用となり得る。システイン変異体は、通常、天然蛋白より少ないシステイン残基を有し、典型的に、不対システインから生じる相互作用を最少化するために偶数である。
【００６３】
ある実施形態によれば、アミノ酸置換は、（１）蛋白分解への感受性を低下させる、（２）酸化への感受性を低下させる、（３）蛋白複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および／または（５）そのようなポリペプチドに他の物理化学的または機能的特性を与えるまたは修飾する。ある実施形態によれば、天然に存在する配列（ある実施形態においては、分子間接触を形成する領域の外側のポリペプチドの部分）において、単一または複数のアミノ酸置換（ある実施形態においては、保存的アミノ酸置換）を設けることができる。ある実施形態において、保存的アミノ酸置換は、典型的には、親配列の構造特徴を実質的に変化させない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中に生じる螺旋を破壊または親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊する傾向があってはならない）。当分野で認識されているポリペプチド二次および三次構造の例が、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎおよびＪ．Ｔｏｏｚｅ編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９１年））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら著、Ｎａｔｕｒｅ第３５４巻：１０５頁（１９９１年）に記載されており、これらを参照してここに組み込まれる。
【００６４】
ここで用いられる「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するポリペプチドを意味する。ある実施形態において、断片は長さが少なくとも５〜４６７アミノ酸である。ある実施形態において、断片は長さが少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または４５０アミノ酸であると考えられる。
【００６５】
ペプチド類似体は、テンプレートペプチドと同様の特性を有する非ペプチド薬として薬学産業において一般的に用いられる。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模擬体」または「ペプチド模倣体」と呼ばれる。Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．第１５巻：２９頁（１９８６年）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ，３９２頁（１９８５年）；およびＥｖａｎｓら著、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．第３０巻：１２２９頁（１９８７年）が、ここで任意の目的のために参考として組み込まれる。そのような化合物は、コンピューター化分子モデリングの助けを借りて開発されることが多い。治療的に有用なペプチドに構造的に類似のペプチド模倣体を用いて、類似の治療または予防効果を得ることができる。通常、ペプチド模倣体は、ヒト抗体のような典型ポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似であるが、当分野でよく知られている方法により、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合により任意に置換される一または二以上のペプチド結合を有する。ある実施形態において、同じ型のＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）を有するコンセンサス配列の一または二以上のアミノ酸の系統的な置換を用いて、より安定なペプチドを発生させることができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変異体を含む制約ペプチドを、当分野で知られている方法（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第６１巻：３８７頁（１９９２年）、ここで任意の目的のために参考として取り込まれる）により、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド橋を形成することができる内部システイン残基を添加することにより、発生させることができる。
【００６６】
「抗体」または「抗体ペプチド」は、無傷抗体または特定の結合のために無傷抗体と競合するその結合性断片を意味する。ある実施形態において、結合性断片は、組換えＤＮＡ技術により生成される。ある実施形態において、結合性断片は、無傷抗体の酵素的または化学的分裂により生成される。結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および一本鎖抗体を含むが、これらに限定されない。
【００６７】
「Ｈ鎖」という用語は、ＯＰＧＬへの特異性を付与するための充分な可変領域配列を有するポリペプチドを含む。「Ｌ鎖」という用語は、ＯＰＧＬへの特異性を付与するための充分な可変領域配列を有するポリペプチドを含む。全長Ｈ鎖は、可変領域ＶＨおよび三つの定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。ＶＨ領域は、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３領域はカルボキシ末端にある。ここで用いられる「Ｈ鎖」という用語は、全長Ｈ鎖およびその断片を含む。全長Ｌ鎖は、可変領域ＶＬおよび定常領域ＣＬを含む。Ｈ鎖と同様に、Ｌ鎖の可変領域は、ポリペプチドのアミノ末端にある。ここで用いられる「Ｌ鎖」という用語は、全長Ｌ鎖およびその断片を含む。Ｆａｂ断片は、一つのＬ鎖および、一つのＨ鎖のＣＨ１および可変領域を含む。Ｆａｂ分子のＨ鎖は、もう一つのＨ鎖分子とのジスルフィド結合を形成することができない。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１領域とＣＨ２領域との間により多くの定常領域を含む一つのＨ鎖、および一つのＬ鎖を含み、それにより、二つのＨ鎖の間に鎖間ジスルフィド結合を形成してＦ（ａｂ’）２分子を形成することができる。Ｆｖ領域は、Ｈ鎖とＬ鎖の両方からの可変領域を含むが、定常領域は欠く。一本鎖抗体は、Ｈ鎖可変領域とＬ鎖可変領域とがフレキシブルリンカーにより接続されて一本のポリペプチド鎖を形成しそれが抗原結合領域を形成しているＦｖ分子である。一本鎖抗体は、ＷＯ８８／０１６４９および米国特許第４，９４６，７７８号および５，２６０，２０３号に詳細に説明されている。
【００６８】
ある実施形態において、「多特異的」または「多機能性」抗体以外の二価抗体は、典型的には、同一のその結合部位の各々を有すると解される。
【００６９】
過剰の抗体が対応受容体への受容体結合量を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％またはそれ以上（生体外競合結合アッセイで測定）減少させる場合、抗体は、リガンドの受容体への結合を実質的に阻害する。
【００７０】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるポリペプチド決定因子を含む。ある実施形態において、エピトープ決定因子は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスフホニルのような分子の化学的活性表面基を含み、ある実施形態において、特定の三次元構造特性および／または特定の荷電特性を有し得る。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。ある実施形態において、蛋白および／またはマクロ分子の複雑な混合物中のその標的抗原を選択的に認識する場合、抗体は特異的に抗原に結合すると言う。ある実施形態において、解離定数が１μＭ以下である場合、ある実施形態において、解離定数が１００ｎＭ以下である場合、およびある実施形態において、解離定数が１０ｎＭ以下である場合、抗体は特異的に抗原に結合すると言う。
【００７１】
「剤」という用語は、ここで、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的マクロ分子、または生物学的材料から得られる抽出物を示すために用いられる。
【００７２】
ここで用いられるように、「標識」または「標識された」という用語は、例えば、放射線標識アミノ酸の組み込み、または、マーカー付加されたアビジン（例えば、光学的または比色法により検出することができる酵素的活性または蛍光マーカーを含むストレプトアビジン）により検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの付与により、検出可能なマーカーを組み込むことを意味する。ある実施形態において、標識またはマーカーは治療的でもあり得る。ポリペプチドおよび糖蛋白を標識する種々の方法は当分野で知られており、用いることができる。ポリペプチドの標識の例には、以下の標識があるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１  Ｉｎ、１２５  Ｉ、１３１  Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素的標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体用の結合部位、金属結合領域、エピトープタグ）により認識される予め決められたポリペプチドエピトープ。ある実施形態において、種々の長さのスペーサーアームにより標識が付着されて、可能性ある立体障害が低下される。
【００７３】
ここで用いられる「生物学的サンプル」という用語は、生きている物体または以前は生きていた物体からの任意の量の物質を含むが、これらに限定されない。そのような生きている物体は、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギおよび他の動物を含むが、これらに限定されない。そのような物質は、血液、血清、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ節および皮膚を含むが、これらに限定されない。
【００７４】
「骨減少疾患」という用語は、骨粗鬆症、骨減少症、ページェット病、溶解性骨転移、歯周病、リューマチ性関節炎および、固定による骨損失を含むが、これらに限定されない。これらの骨疾患に加えて、特定の癌が、破骨細胞活性を増加させると共に、乳、前立腺および多発性骨髄腫のような骨再吸収を誘発させることが知られている。これらの癌は、骨中でＯＰＧＬを過剰発現させると共に、破骨細胞の数および活性を増加させる因子を生成することが知られている。
【００７５】
ここで用いられる「薬学的剤または薬」という用語は、患者に適切に投与された場合、所望の治療効果を誘発することができる化学的化合物または組成物を意味する。
【００７６】
ここで用いられる「調節因子」という用語は、分子の活性および機能を変化または変更する化合物である。例えば、調節因子は、調節因子の不存在下に観察される活性または機能の強さと比較して、分子のある活性または機能の強さを増加または低下させることができる。ある実施形態において、調節因子は、分子の少なくとも一つの活性または機能の強さを低下させる阻害因子である。分子の活性および機能の特定の例には、結合親和性、酵素的活性および信号伝達があるが、これらに限定されない。阻害因子の特定の例には、蛋白、ペプチド、抗体、ペプチボデイー、炭水化物または小さな有機分子があるが、これらに限定されない。ペプチボデイーは、例えば、ＷＯ０１／８３５２５に記載されている。
【００７７】
ここで用いられる「実質的に純粋」という用語は、目的の種が、優勢に存在する種である（すなわち、分子基準で、組成物中の他の個々の種よりも豊富である）ことを意味する。ある実施形態において、実質的に純粋な分画は、目的の種が、存在する全てのマクロ分子種の少なくとも約５０％（分子基準）をなす組成物である。ある実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全てのマクロ分子の約８０％、８５％、９０％、９５％または９９％以上を含む。ある実施形態において、目的の種は、組成物が実質的に単一のマクロ分子種からなる本質的均質性（従来の検出法により組成物中に汚染種を検出することができない）まで精製される。
【００７８】
患者という用語は、ヒトおよび動物対象を含む。
【００７９】
本出願において、単数の使用は特記しない限り複数を含む。本出願において、「または」の使用は特記しない限り「および／または」を意味する。さらに、「含む」という用語の使用は限定的でない。また、「要素」または「成分」のような用語は、一つの単位を含む要素および成分、および特記しない限り二つ以上のサブユニットを含む要素および成分の両方を含む。
【００８０】
サイトカインの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの一員であるオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）は、破骨細胞の形成に関与している。増加した破骨細胞活性は、閉経後骨粗鬆症、ページェット病、溶解性骨転移およびリューマチ性関節炎を含む多くの骨減少疾患に関わる。従って、ＯＰＧＬ活性の低下は、破骨細胞活性の低下につながり、骨減少疾患の重傷度を低下させ得る。本発明のある実施形態によれば、ＯＰＧＬへの抗体を、これらに限定はされないが前述の疾患を含む骨減少疾患を治療するために用いることができる。
【００８１】
本発明のある実施形態において、ヒトオステオプロテゲリンリガンド（ＯＰＧＬ）に対する完全ヒトモノクローナル抗体が提供される。ある実施形態において、Ｈ鎖イムノグロブリン分子とＬ鎖イムノグロブリン分子をコードするヌクレオチド配列およびそれらの分子を含むアミノ酸配列、特に、可変領域に相当する配列が提供される。ある実施形態において、相補性決定領域（ＣＤＲ）、特にＣＤＲ１からＣＤＲ３に対応する配列が提供される。ある実施形態によれば、そのようなイムノグルブリン分子およびモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞系も提供される。ある実施形態において、ヒトＯＰＧＬに対する精製ヒトモノクローナル抗体が提供される。
【００８２】
酵母人工染色体（ＹＡＣ）中にメガ塩基寸法のヒト遺伝子部位をクローン化しおよび再構築してそれらをマウス生殖細胞系に導入することができることにより、非常に大きなまたは粗くマップされた遺伝子座の機能性成分を解明するための、またヒト疾患の有用なモデルを発生させるための手段が提供される。さらに、そのような技術を利用してマウス遺伝子座をヒトの同等物で置換することにより、発育中のヒト遺伝子生成物の発現および制御、それらと他の系との連絡、および疾患の誘発および進行へのそれらの関与についてのユニークな洞察を得ることができる。
【００８３】
そのような方策の重要な実際の応用は、マウス液性免疫系の「ヒト型化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されているマウスへの、ヒトイムノグルブリン（Ｉｇ）座の導入は、抗体のプログラムされた発現および組み立ての基礎となる機構並びにそれらのＢ細胞発育における役割を研究する機会を提供する。さらに、そのような方策により、完全ヒト型モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の生成のための供給源を提供することができよう。ある実施形態において、完全ヒト型抗体は、マウスまたはマウス誘導Ｍａｂに固有の免疫原性およびアレルギー性反応を最少化し、すなわち、ある実施形態において、投与された抗体の効果および安全性を高めることが予測される。ある実施形態において、完全ヒト型抗体を、骨粗鬆症、炎症、自己免疫および癌のような慢性および再発性ヒト疾患の治療において用いることができ、これは、繰り返し抗体投与を含み得る。
【００８４】
マウスにマウス抗体の不存在下でヒト型抗体を生成させるような応用において、ヒトＩｇ座の大きな断片を用いて、マウス抗体生成を欠くマウス株を作成することができる。大きなヒトＩｇ断片は、大きな可変遺伝子多様性ならびに抗体生成および発現の適切な制御を保存していよう。抗体多様性および選択およびヒト蛋白への免疫学的寛容の欠損を活用することにより、これらのマウス株中の複製ヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む意図する抗原に対する高親和性抗体を有していよう。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトＭＡｂを生成および選択することができる。
【００８５】
ある実施形態において、ヒト可変領域と一緒に、ヒト以外の種からの定常領域を用いることができる。
【００８６】
天然に存在する抗体の構造
天然に存在する抗体の構造単位は、典型的に、四量体を含む。各々のそのようなテトラマーは、典型的に、二つの同一対のポリペプチド鎖を含み、各対は一つの全長Ｌ鎖（ある実施形態において、約２５ｋＤａ）と一つの全長Ｈ鎖（ある実施形態において、約５０ｋＤａから７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、典型的に抗原認識を担当する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を典型的に含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を担当し得る定常領域を典型的に規定する。ヒトＬ鎖は、典型的に、κおよびλＬ鎖とに分類される。Ｈ鎖は、典型的に、μ、δ、γ、αまたはεと分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体アイソタイプを定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む幾つかのサブクラスを有するが、これらに制限されない。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有するが、これらに限定されない。ＩｇＡは同様にＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むサブクラスに下位分割されるが、これらに限定されない。全長Ｌ鎖およびＨ鎖中では、典型的に、可変領域と定常領域が、約１２以上のアミノ酸からなる「Ｊ」領域により連結され、Ｈ鎖は、約１０以上のアミノ酸からなる「Ｄ」領域も含む。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  第７章（Ｐａｕｌ，Ｗ．編、第２版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい（全ての目的のために、その全体を参考のために取り入れる）。各Ｌ／Ｈ鎖対からなる可変領域は、典型的に、抗原結合部位を形成する。
【００８７】
可変領域は、相補性決定領域すなわちＣＤＲとも呼ばれる、三つの超可変領域により連結された比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般的構造を典型的に示す。各対の二つの鎖からのＣＤＲは、典型的に、このフレームワーク領域により典型的に配列されていて、これにより特定のエピトープへの結合が可能となり得る。Ｎ末端からＣ末端にかけて、Ｌ鎖可変領域とＨ鎖可変領域の両方が、典型的に、領域ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各領域へのアミノ酸の割り当ては、典型的に、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年および１９９１年））またはＣｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａら著、Ｎａｔｕｒｅ第３４２巻：８７８〜８８３頁（１９８９年）の定義に従う。
【００８８】
二重特異的または二重機能的抗体
二重特異的または二重機能的抗体は、典型的には、二つの異なるＨ／Ｌ鎖対と二つの異なる結合部位を有する人工的ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、限定はされないがハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む種々の方法により製造することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ＆  Ｌａｃｈｍａｎｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第７９巻：３１５〜３２１頁（１９９０年）、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら著、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４８巻：１５４７〜１５５３頁（１９９２年）を参照のこと。
【００８９】
抗体の調製
ある実施形態によれば、ＯＰＧＬに特異的に結合する特定の抗体が本発明に含まれる。ある実施形態において、全長ＯＰＧＬ、ＯＰＧＬの可溶性形態、またはその断片を用いて免疫化することにより抗体を製造することができる。ある実施形態において、本発明の抗体はポリクローナルまたはモノクローナル、および／または組換え抗体であってよい。ある実施形態において、本発明の抗体は、例えば、ヒト型抗体を生成することができるトランスジェニック動物の免疫化により調製されるヒト型抗体である（例えば、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ９３／１２２２７参照）。
【００９０】
ある実施形態において、αＯＰＧＬ−１のＬおよびＨ鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、同じまたは別の種からのフレームワーク領域（ＦＲ）に移設することができる。ある実施形態において、αＯＰＧＬ−１のＬおよびＨ鎖可変領域のＣＤＲを、コンセンサスヒトＦＲに移設することができる。コンセンサスヒトＦＲを作るために、ある実施形態において、幾つかのヒトＨ鎖またはＬ鎖アミノ酸配列からのＦＲが整列されてコンセンサスアミノ酸配列が同定される。ある実施形態において、αＯＰＧＬ−１のＨ鎖またはＬ鎖のＦＲが、異なるＨ鎖またはＬ鎖からのＦＲで置換される。ある実施形態において、αＯＰＧＬ−１のＨ鎖またはＬ鎖のＦＲ中の稀アミノ酸（ｒａｒｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）は置換されないが、ＦＲアミノ酸の残りは置換される。稀アミノ酸は、それらがＦＲ中で通常見つからない位置にある特定のアミノ酸である。ある実施形態において、αＯＰＧＬ−１からの移設可変領域を、αＯＰＧＬ−１の定常領域と異なる定常領域と一緒に用いることができる。ある実施形態において、移設可変領域は、一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。ＣＤＲ移設は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号、第５，６９３，７６２号、第５，６９３，７６１号、第５，５８５，０８９号および５，５３０，１０１号に記載されており、これらが任意の目的のために参考としてここで組み込まれる。
【００９１】
ある実施形態によれば、本発明の抗体は、挿入されたヒト型抗体生成ゲノムの実質部分を有するが内因性のネズミ抗体の生成が欠損したトランスジェニックマウスを利用することにより調製される。そのようなマウスは、ヒトイムノグルブリン分子および抗体を生成することができると共に、ネズミイムノグルブリン分子および抗体の生成は欠損している。この結果を達成するために利用される技術が、親出願および、ここで明細書中に開示されている参照文献に開示されている。ある実施形態において、ＰＣＴ公開出願番号ＷＯ９８／２４８９３に開示のもののような方法を用いることができ、これが任意の目的で参考のためにここで取り込まれる。Ｍｅｎｄｅｚら著、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ第１５巻：１４６〜１５６頁（１９９７年）も参照され、これが任意の目的で参考のためにここで取り込まれる。
【００９２】
ある実施形態によれば、ＯＰＧＬに特異的な完全ヒトモノクローナル抗体が以下のように生成される。ヒトイムノグルブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスが、意図する抗原で免疫される。抗体を発現するマウスからのリンパ細胞（例えば、Ｂ細胞）が得られる。そのように回収された細胞が骨髄型細胞系と融合されて不死ハイブリドーマ細胞系が調製され、そのようなハイブリドーマ細胞系は、意図する抗原に特異的な抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を特定するためにスクリーニングされ選択される。ある実施形態において、ＯＰＧＬに特異的な抗体を生産するハイブリドーマ細胞系の生成が提供される。
【００９３】
ある実施形態において、本発明の抗体は、ハイブリドーマ系ＡＭＧ６．１、ＡＭＧ６．４、ＡＭＧ６．５、ＡＭＧ７．１およびＡＭＧ７．２により生産される。ある実施形態において、本発明の抗体は、イブリドーマ系ＡＭＧ６．１、ＡＭＧ６．４およびＡＭＧ６．５により生産される。ある実施形態において、本発明の抗体は、約０．２３から０．２９ｎＭの間の解離定数（Ｋｄ）でＯＰＧＬに結合する。本発明のある実施形態において、この抗体は０．２３ｎＭ未満のＫｄでＯＰＧＬに結合する。
【００９４】
ある実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプである。本発明のある実施形態において、この抗体は、ヒトκＬ鎖およびヒトＩｇＧ２Ｈ鎖を含む。ある実施形態において、本発明の抗体を、哺乳動物細胞中での発現のためにクローニングした。ある実施形態において、抗体の可変領域は、ＩｇＧ２アイソタイプの定常領域以外の定常領域に連結される。
【００９５】
ある実施形態において、αＯＰＧＬ−１のＨおよびＬ鎖への保存的修飾（およびコード化ヌクレオチドへの対応する修飾）により、αＯＰＧＬ−１のものに類似の機能的および化学的特性を有するＯＰＧＬへの抗体が生成される。これに対して、αＯＰＧＬ−１の機能的および／または化学的特性の実質的修飾が、（ａ）例えば面状または螺旋状配座として置換の領域における分子バックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の荷電または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさ、の維持に対するそれらの効果が著しく異なるＨおよびＬ鎖のアミノ酸配列における置換を選択することにより達成することができる。
【００９６】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、天然アミノ酸残基を非天然残基で置換して、それによりその位置におけるアミノ酸残基の極性または電荷に殆どまたは全く影響が無いようにすることができる。さらに、ポリペプチド中の任意の天然残基を、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」について先に記載したように、アラニンで置換することもできる。
【００９７】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的）は、そのような置換が望まれるときに当業者が決めることができる。ある実施形態において、アミノ酸置換を用いて、αＯＰＧＬ−１の重要な残基を特定する、またはここに記載のＯＰＧＬへの抗体の親和性を増加または低下させることができる。
【００９８】
ある実施形態において、本発明の抗体を、ハイブリドーマ細胞系以外の細胞系において発現させることができる。ある実施形態において、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために、特定の抗体をコードする配列を用いることができる。ある実施形態によれば、形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドのウイルス（またはウイルスベクター）中への包装および宿主細胞へのウイルス（またはベクター）の導入または、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，９１２，０４０号、第４，７４０，４６１号および４，９５９，４５５号（これら特許を、任意の目的で参考のためにここで組み込む）に例示されるような当分野で知られている形質移入手順を含む、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための任意の既知の方法により行うことができる。ある実施形態において、用いられる形質転換手順は、形質転換すべき宿主に依存し得る。哺乳動物細胞中に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は、当分野で良く知られており、限定はされないが、デキストラン媒介形質移入、燐酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介形質移入、プロトプラスト融解、電気穿孔、リポソーム内へのポリヌクレオチドの封入、および核内へのＤＮＡの直接顕微注入がある。
【００９９】
発現用の宿主として利用できる哺乳動物細胞系は当分野で良く知られており、限定はされないが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手される多くの不死化した細胞系があり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）および多くの他の細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、どの細胞系が高い発現水準を有し、構成的ＯＰＧＬ結合特性を有する抗体を生成するかを決めることにより、細胞系を選択することができる。
【０１００】
ある実施形態によれば、本発明の抗体は、生物学的サンプル中にＯＰＧＬを検出するのに有用である。ある実施形態において、これにより、蛋白を生成する細胞または組織を特定することができる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに結合すると共に他の結合性化合物との相互作用を阻害する抗体は、破骨細胞の分化および骨の再吸収の調節において治療的に用いることができる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、ＯＰＧＬのＯＤＡＲへの結合を阻害することができ、それにより、信号導入カスケードの阻害およびＮＦ−ｋＢ媒介転写活性化の損失が生じ得る。例えば、ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いてＮＦ−ｋＢ媒介転写活性化を測定するアッセイは、当業者に知られている。
【０１０１】
ある実施形態において、治療有効量のＯＰＧＬに対する抗体を投与することを含んでなる骨疾患を治療する方法が提供される。ある実施形態において、治療有効量のＯＰＧＬに対する抗体および他の治療薬を投与することを含んでなる骨疾患を治療する方法が提供される。あるそのような態様において、さらなる治療薬は治療有効量で投与される。ある実施形態において、骨疾患は、正味骨損失を特徴とする疾患であり、骨減少症および骨溶解が挙げられるがこれらに限定されない。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体による治療を用いて骨再吸収速度を抑制する。従って、ある実施形態において、再吸収速度が正常を超える場合に骨再吸収速度を低下させる、または、骨形成の正常より低い水準を補うために骨再吸収を正常水準より低くするための治療を行うことができる。ある実施形態において、抗体を、ＯＰＧの不存在または存在下におけるＯＰＧＬへの結合について試験することができ、ＯＰＧＬ媒介破骨細胞発生および／または骨再吸収を阻害するその性能について試験することができる。
【０１０２】
ある実施形態に従って治療することができる症状には以下のものがあるが、これらに限定されない：
骨粗鬆症、例えば、原発性骨粗鬆症、内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群および先端巨大症が挙げられるがこれらに限定されない）、骨粗鬆症の遺伝性および先天性型（骨形成不全症、ホモシスチン尿症、メンケズ症候群、ライリー−ダイ症候群が挙げられるがこれらに限定されない）、および端部の不動化による骨粗鬆症（これらに限定されない）；
成人および若年者における骨のページェット病（変性性骨炎）；
骨髄炎、すなわち、骨損失につながる、骨における感染性病変；
高カルシウム血症、例えば、充実性腫瘍（乳、肺および腎臓を含むがこれらに限定されない）および血液悪性病変（多発性骨髄腫、リンパ腫および白血病を含むがこれらに限定されない）から生じる高カルシウム血症、特発性高カルシウム血症、および甲状腺機能亢進症および腎機能障害に関わる高カルシウム血症（これらに限定されない）；
骨減少症、例えば、手術に続く骨減少症、ステロイド投与により誘発される骨減少症、小腸および大腸の疾患に関わる骨減少症、および慢性肝臓および腎臓疾患に関わる骨減少症（これらに限定されない）；
骨壊死、すなわち、骨細胞死であって、外傷に関わる骨壊死、ゴーシェ病に関わる骨壊死、鎌状赤血球貧血に関わる骨壊死、全身性エリテマトーデスに関わる骨壊死、リューマチ性関節炎に関わる骨壊死、歯周病に関わる骨壊死、骨溶解性転移に関わる骨壊死、および他の症状に関わる骨壊死（これらに限定されない）；および
リューマチ性関節炎に関わる軟骨の損失および関節侵食。
【０１０３】
ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体を、骨疾患の治療のために、単独で使用するまたは、少なくとも一種のさらなる治療剤と共に使用することができる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体を、治療有効量のさらなる治療剤と組み合わせて用いる。ＯＰＧＬに対する抗体と共に投与することができる治療剤の例には、ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１２と表される骨形態発生因子；形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）およびＴＧＦ−βファミリー構成員；インターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害因子、例えば、ＩＬ−１ｒａおよびその誘導体およびキネレト（Ｋｉｎｅｒｅｔ）（登録商標）（これらに限定されない）；ＴＮＦα阻害因子、例えば、可溶性ＴＮＦα受容体、エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）、抗−ＴＮＦα抗体、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標）およびＤ２Ｅ７抗体（これらに限定されない）；副甲状腺ホルモンおよびその類似体；副甲状腺関連蛋白およびその類似体；Ｅ系列プロスタグランジン；ビスホスホネート（アレンドロネート等）；骨向上性鉱物、例えばフッ化物およびカルシウム；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えば、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（登録商標）およびビオックス（Ｖｉｏｘｘ）（登録商標）のようなＣＯＸ−２阻害因子（これらに限定されない）；免疫抑制薬、例えばメトトレキセートまたはレフルノミド；セリンプロテアーゼ阻害因子、例えば、分泌性白血球プロテアーゼ阻害因子（ＳＬＰＩ）（これらに限定されない）；ＩＬ−６阻害因子（限定はされないがＩＬ−６への抗体を含む）；ＩＬ−８阻害因子（限定はされないがＩＬ−８への抗体を含む）；ＩＬ−１８阻害因子（限定はされないがＩＬ−１８結合蛋白およびＩＬ−１８抗体を含む）；インターロイキン−１転化酵素（ＩＣＥ）調節因子；線維芽細胞成長因子ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０およびＦＧＦ調節因子；ＰＡＦ拮抗薬；ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＫＧＦ−関連分子、およびＫＧＦ調節因子；マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）調節因子；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）調節因子、例えば、誘発性ＮＯＳの調節因子（これらに限定されない）；グルココルチコイド受容体の調節因子；グルタメート受容体の調節因子；リポ多糖類（ＬＰＳ）水準の調節因子；およびノルアドレナリン並びにその調節因子および模倣体があるが、これらに限定されない。
【０１０４】
ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体が特定の治療剤と共に用いられて、骨損失を伴う種々の炎症性症状、自己免疫症状または他の症状が治療される。ある実施形態において、症状および治療の所望水準の観点から、二種、三種またはそれ以上の治療剤を投与することができる。ある実施形態において、同じ製剤中に含ませることにより治療剤を一緒に提供することができる。ある実施形態において、同じ製剤中に含ませることにより治療剤およびＯＰＧＬへの抗体を一緒に提供することができる。ある実施形態において、処理キット中に含ませることにより治療剤を一緒に提供することができる。ある実施形態において、処理キット中に含ませることにより治療剤およびＯＰＧＬに対する抗体を一緒に提供することができる。ある実施形態において、そのような治療剤を別々に提供することができる。ある実施形態において、遺伝子治療により投与された場合、蛋白剤および／またはＯＰＧＬに対する抗体をコードする遺伝子を同じベクター中に含ませることができる。ある実施形態において、蛋白剤および／またはＯＰＧＬに対する抗体をコードする遺伝子を同じプロモーター領域の制御下に置くことができる。ある実施形態において、蛋白剤および／またはＯＰＧＬに対する抗体をコードする遺伝子を別々のベクター中に存在させることができる。
【０１０５】
ある実施形態において、本発明は、ＯＰＧＬに対する抗体および少なくとも一つのインターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害因子を含む治療薬、およびそのような治療薬を用いる治療方法を提供する。ある実施形態において、この治療薬はＯＰＧＬに対する抗体およびＩＬ−１阻害因子および、少なくとも一つのここに記載のさらなる分子を含む。ある実施形態において、治療法は、ＩＬ−１阻害因子および／またはＴＮＦ−α阻害因子をＯＰＧＬに対する抗体と組み合わせて用いる。ある実施形態において、ＩＬ−１阻害因子および／またはＴＮＦ−α阻害因子と組み合わされたＯＰＧＬに対する抗体を、喘息、リューマチ性関節炎および多発性硬化症のような症状の治療に用いることができる。
【０１０６】
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、抗炎症性サイトカインである。ある例において、ＩＬ−１は、多くの疾患および医学的症状における媒介物である。ある例において、ＩＬ−１は、マクロファージ／単核細胞直系の細胞により製造される。ある実施形態において、ＩＬ−１は二つの状態：ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）とＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）として生成される。
【０１０７】
自然発生的または実験的疾患または医学的症状が、体液または組織中のＩＬ−１の高くなった水準を伴う場合、および／または、体から得た細胞または組織が培地中のＩＬ−１の水準を高くする場合、疾患または医学的症状は「インターロイキン−１媒介疾患」と考えられる。ある実施形態において、そのようなインターロイキン−１媒介疾患は、以下のさらなる二つの条件によっても理解される：（１）疾患または医学的症状に関わる病的所見を、ＩＬ−１の投与またはＩＬ−１の発現の上方制御により、動物中で実験的に模倣することができる；および（２）疾患または医学的症状の実験的動物モデルにおいて誘発される病因を、ＩＬ−１の作用を阻害する剤で処理することにより阻害または壊すことができる。ある実施形態において、ＩＬ−１媒介疾患において、前記条件の一つまたは二つ以上が見られる。ある実施形態において、ＩＬ−１媒介疾患において、三つの全ての条件が見られる。
【０１０８】
急性および慢性インターロイキン−１（ＩＬ−１）媒介疾患には以下のものがあるが、これらに限定されない：急性膵臓炎；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、またはルー・ゲーリック病）；アルツハイマー病；悪液質／食欲不振、例えば、ＡＩＤＳ誘発悪液質（これに限定されない）；喘息および他の肺疾患；アテローム性硬化症；自己免疫脈管炎；慢性疲労症候群；クロストリジウム関連疾患、例えば、クロストリジウム関連下痢（これに限定されない）；冠動脈症状および適応症、例えば、鬱血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば、敗血症関連）および冠動脈バイパスグラフト（これらに限定されない）；癌、例えば、白血病、限定はさらないが多発性骨髄白血病および骨髄形成（例えば、ＡＭＬおよびＣＭＬ）および腫瘍転移（これらに限定されない）；糖尿病（限定はされないが、インスリン依存性糖尿病）；子宮内膜症；熱；線維筋痛症；糸球体腎炎；対宿主性移植片病および／または移植拒絶反応；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；関節の炎症症状、例えば、変形性関節炎、乾癬性関節炎およびリューマチ性関節炎（これらに限定されない）；炎症性眼疾患、例えば、角膜移植に関わる疾患（これらに限定されない）；虚血、例えば、脳虚血（限定はされないが、例えば各々が神経退化につながり得る外傷、癲癇、出血またはショックの結果としての脳損傷を含む）（これらに限定されない）；川崎病；学習障害；肺疾患（限定はされないが、急性呼吸促迫症候群すなわちＡＲＤＡを含む）；多発性硬化症；筋障害（例えば、筋蛋白代謝、限定はされないが敗血症における筋蛋白代謝）；神経毒性（限定はされないが、ＨＩＶにより誘発させる症状を含む）；骨粗鬆症；疼痛、限定はされないが癌関連疼痛を含む；パーキンソン病；歯周病；早期分娩；乾癬；再灌流障害；敗血症ショック；放射線療法からの副作用；側頭下顎関節疾患；睡眠障害；ブドウ膜炎；および、例えば筋挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染または他の疾患過程から生じる炎症性症状。
【０１０９】
ある実施形態において、ＩＬ−１阻害因子は、任意数の機構から生じ得るＩＬ−１への細胞性受容体の活性化を特異的に防止することができる任意の蛋白または分子であり得る。機構の例には、ＩＬ−１生成の下方制御、遊離ＩＬ−１の結合、その受容体に結合するＩＬ−１の妨害、ＩＬ−１受容体複合体の形成（すなわち、ＩＬ−１受容体とＩＬ−１受容体付属蛋白との組み合わせ）の妨害、およびその受容体への結合後に信号発信するＩＬ−１の調節の妨害があるが、これらに限定されない。
【０１１０】
特定のインターロイキン−１阻害因子には、ＩＬ−１受容体拮抗薬、例えば限定はされないがキネレト（Ｋｉｎｅｒｅｔ）（登録商標）、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−１ｒａ変異体およびＩＬ−１ｒａ誘導体（集合的に「ＩＬ−１ｒａ蛋白」と称する）、抗ＩＬ−１受容体モノクローナル抗体（例えば、ここで任意の目的のために参考として取り込まれるＥＰ６２３６７４を参照されたい）；ＩＬ−１結合蛋白、例えば、限定はされないが可溶性ＩＬ−１受容体（例えば米国特許第５，４９２，８８８号、米国特許第５，４８８，０３２号、米国特許第５，４６４，９３７号、米国特許第５，３１９，０７１号および米国特許第５，１８０，８１２号が参照され、ここで任意の目的のために参考として取り込まれる）を含む；抗ＩＬ−１モノクローナル抗体（例えばＷＯ９５０１９９７、ＷＯ９４０２６２７、ＷＯ９００６３７１、米国特許第４，９３５，３４３号、ＥＰ３６４７７８、ＥＰ２６７６１１およびＥＰ２２００６３が参照され、ここで任意の目的のために参考として取り込まれる）；ＩＬ−１受容体付属蛋白およびそれに対する抗体（例えばＷＯ９６／２３０６７およびＷＯ９９／３７７７３が参照され、ここで任意の目的のために参考として取り込まれる）；ＩＬ−１β生成および分泌を阻害するために用いることができる、インターロイキン−１β転化酵素（ＩＣＥ）またはカスパセ（ｃａｓｐａｓｅ）Ｉ（例えばＷＯ９９／４６２４８、ＷＯ９９／４７５４５およびＷＯ９９／４７１５４が参照され、ここで任意の目的のために参考として取り込まれる）；インターロイキン−１βプロテアーゼ阻害因子；およびＩＬ−１の生体内合成または細胞外放出を妨害する他の化合物および蛋白があるが、これらに限定されない。
【０１１１】
ＩＬ−１阻害因子の例が、例えば、米国特許第５，７４７，４４４号；第第５，３５９，０３２号；第第５，６０８，０３５号；第第５，８４３，９０５号；第第５，３５９，０３２号；第第５，８６６，５７６号；第第５，８６９，６６０号；第第５，８６９，３１５号；第第５，８７２，０９５号；第第５，９５５，４８０号；第第５，９６５，６５４号；第国際（ＷＯ）特許出願第９８／２１９５７号、第９６／０９３２３号、第９１／１７１８４号、第９６／４０９０７号、第９８／３２７３３号、第９８／４２３２５号、第９８／４４９４０号、第９８／４７８９２号、第９８／５６３７７号、第９９／０３８３７号、第９９／０６４２６号、第９９／０６０４２号、第９１／１７２４９号、第９８／３２７３３号、第９８／１７６６１号、第９７／０８１７４号、第９５／３４３２６号、第９９／３６４２６号、第９９／３６４１５号；第欧州（ＥＰ）特許出願第５３４９７８号および第８９４７９５；および仏国特許出願第ＦＲ２７６５１４号に開示されている。前記参考文献の全ての開示が、ここで任意の目的で参考として取り込まれる。
【０１１２】
インターロイキン−１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ｒａ）は、インターロイキン−１の天然阻害因子として作用すると共に、ＩＬ−１αおよびＩＬ−１βを含むＩＬ−１ファミリーの構成員であるヒト蛋白である。ＩＬ−１ｒａおよびその変異体および誘導体を含む特定の受容体拮抗薬、並びにそれらを製造および使用する方法が、米国特許第５，０７５，２２２号；第ＷＯ９１／０８２８５；ＷＯ９１／１７１８４；ＡＵ９１７３６３６；ＷＯ９２／１６２２１；ＷＯ９３／２１９４６；ＷＯ９４／０６４５７；ＷＯ９４／２１２７５；ＦＲ２７０６７７２；ＷＯ９４／２１２３５；ＤＥ４２１９６２６、ＷＯ９４／２０５１７；ＷＯ９６／２２７９３；ＷＯ９７／２８８２８；およびＷＯ９９／３６５４１に記載されており、これらがここで任意の目的で参考として取り込まれる。ある実施形態において、ＬＩ−１受容体拮抗薬をグリコシル化することができる。ある実施形態において、ＩＬ−１受容体拮抗薬はグリコシル化しなくてよい。
【０１１３】
ＩＬ−１ｒａおよびその変異体の三つの形態が、米国特許第５，０７５，２２２号（’２２２特許）に記載されている。最初の形態は’２２２特許において「ＩＬ−１ｉ」と呼ばれ、ｐＨ７．６のＴｒｉｓ緩衝液中の約５２ｍＭのＮａＣｌでＭｏｎｏ  Ｑ  ＦＰＬＣカラムから溶離される、等電点約４．８のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の２２ｋＤから２３ｋＤ分子として特徴付けられる。第２の形態であるＩＬ−１ｒａβは、４８ｍＭ  ＮａＣｌでＭｏｎｏ  Ｑカラムから溶離される、２２ｋＤから２３ｋＤ分子として特徴付けられる。ＩＬ−１ｒａαおよびＩＬ−１ｒａβの両方がグリコシル化される。第３の形態であるＩＬ−１ｒａｘは、４８ｍＭ  ＮａＣｌでＭｏｎｏ  Ｑカラムから溶離されグリコシル化されていない、２０ｋＤ分子として特徴付けられる。’２２２特許は、阻害因子をコードする遺伝子を単離し、適切なベクター中でこれらの遺伝子をクローニングし、これらの遺伝子を特定の細胞型中に形質転換および形質移入し、これらの遺伝子を発現させて阻害因子を生成するための特定の方法も記載している。
【０１１４】
ある実施形態において、ＩＬ−１ｒａのアミノ酸配列中で、欠失、挿入および／または置換（個々にまたは集合的に「変異体」と呼ばれる）が成される。ある実施形態において、ＩＬ−１ｒａ変異体は生物学的に活性である（例えば、ＩＬ−１を阻害する性能を有する）。
【０１１５】
ある実施形態において、本発明は、ＯＰＧＬに対する抗体および少なくとも一つのＴＮＦα阻害因子を含む治療薬、およびそのような治療薬を用いる治療方法に関する。ある実施形態において、治療薬は、ＯＰＧＬに対する抗体およびＴＮＦα阻害因子並びにここに記載の少なくとも一つのさらなる分子を含む。
【０１１６】
ある疾患および医学的症状はＴＮＦにより媒介され、炎症性症状と類別される。ここで用いられる「ＴＮＦ媒介疾患」という用語は、体液または組織中のＴＮＦの高くなった水準を伴うおよび／または体から得られる細胞または組織が培地中のＴＮＦ水準を高くする疾患または医学的症状を含むが、これらに制限されない。ある実施形態において、（１）疾患または医学的症状に関わる病的所見を、ＴＮＦの投与またはＴＮＦの発現の上方制御により、動物中で実験的に模倣することができる、および／または（２）疾患または医学的症状の実験的動物モデルにおいて誘発される病因を、ＴＮＦの作用を阻害する医剤で処理することにより阻害または壊すことができる場合、疾患はＴＮＦ−媒介疾患である。
【０１１７】
特定の急性および慢性ＴＮＦ媒介疾患には、悪液質および食欲不振；癌、例えば、白血病（これに限定されない）；慢性疲労症候群；冠動脈症状および／または適応症、例えば、鬱血性心不全、冠動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば、限定はされないが敗血症関連症状を含む）および冠動脈バイパスグラフト（これらに限定されない）；抑鬱；糖尿病、例えば、若年発症１型糖尿病、真性糖尿病およびインスリン抵抗性（限定はされないが、肥満関連インスリン抵抗性を含む）（これらに限定されない）；子宮内膜症、子宮内膜炎および関連症状；線維筋痛症および無痛覚症；対宿主性移植片病；痛覚過敏；炎症性腸疾患、例えば、クローン病およびクロストリジウム・ジフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連下痢（これらに限定されない）；虚血、例えば、脳虚血（限定はされないが、例えば外傷、癲癇、出血および／または脳卒中の結果としての脳損傷を含む）（これらに限定されない）；肺疾患、例えば成人呼吸促迫症候群、喘息および肺線維症（これらに限定されない）；多発性硬化症；神経炎症性疾患；眼疾患および症状、例えば、角膜移植、眼球退行変性およびブドウ膜炎（これらに限定されない）；疼痛、限定はされないが癌関連疼痛を含む；膵臓炎；歯周病；毛孔性紅色ひこう疹（ＰＲＰ）；前立腺炎、例えばバクテリア性および非バクテリア性前立腺炎、および関連症状；乾癬および関連症状；肺線維症；再灌流障害；リューマチ性疾患、限定はされないが、リューマチ性関節炎、変性性関節炎、若年性関節炎（限定はされないが、若年性リューマチ性関節炎を含む）、セロネガティブ多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群および反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸疾患に基づく関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば、川崎病）、脳脈管炎、ライム病、ブドウ球菌誘発（「敗血症」）関節炎、シェーグレン症候群、リューマチ熱、多発性軟骨炎およびリューマチ性多発性筋痛および巨細胞性動脈炎を含む；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；全身性エリテマドーデス（ＳＬＥ）；側頭下顎関節疾患；甲状腺炎；および、例えば筋挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染（例えば、ＨＩＶ、クロストリジウム・ジフィシルおよび関連種）または他の疾患過程から生じる組織移植および／または炎症疾患；があるが、これらに限定されない。
【０１１８】
ある実施形態において、ＴＮＦ阻害因子は、ＴＮＦ生成の下方制御または阻害、遊離ＴＮＦの結合、その受容体に結合するＴＮＦの妨害、およびその受容体への結合後に信号発信するＴＮＦの調節の妨害の少なくとも一つにより作用することができる。「ＴＮＦ阻害因子」という用語は、可溶化ＴＮＦ受容体、例えば、限定はされないが可溶性腫瘍壊死因子受容体Ｉ型（ｓＴＮＦ−ＲＩ；ｐ５５受容体とも呼ばれる）、可溶性腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型（ｐ７５受容体とも呼ばれる）およびエンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）がある；ＴＮＦに対する抗体、例えば、限定はされないレミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標）およびＤ２Ｅ７（例えば、米国特許第６，０９０，３８２号および６，２５８，５６２号を参照）がある；ＴＮＦ受容体への抗体；ｓＴＮＦ−ＲＩ（例えば、ＷＯ９８／２４４６３を参照）、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、アバカイン（Ａｖａｋｉｎｅ）（登録商標）；ＴＮＦ−α転化酵素（ＴＡＣＥ）の阻害剤；およびＴＮＦ活性化に影響を与える他の分子；を含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
ＴＮＦ−α阻害因子に例が、例えば、欧州特許出願ＥＰ３０８  ３７８；ＥＰ４２２  ３３９；ＥＰ３９３  ４３８；ＥＰ３９８  ３２７；ＥＰ４１２  ４８６；ＥＰ４１８  ０１４；ＥＰ４１７  ５６３；ＥＰ４３３  ９００；ＥＰ４６４  ５３３；ＥＰ５１２  ５２８；ＥＰ５２６  ９０５；ＥＰ５６８  ９２８；ＥＰ６０７  ７７６（ＴＮＦ−αの阻害のためのレフルノミドの使用を記載）；ＥＰ６６３  ２１０；ＥＰ５４２  ７９５；ＥＰ８１８  ４３９；ＥＰ６６４  １２８；ＥＰ５４２  ７９５；ＥＰ７４１  ７０７；ＥＰ８７４  ８１９；ＥＰ８８２  ７１４；ＥＰ８８０  ９７０；ＥＰ６４８  ７８３；ＥＰ７３１  ７９１；ＥＰ８９５  ９８８；ＥＰ５５０  ３７６；ＥＰ８８２  ７１４；ＥＰ８５３  ０８３；ＥＰ５５０  ３７６；ＥＰ９４３  ６１６；ＥＰ９３９  １２１；ＥＰ６１４  ９８４；ＥＰ８５３  ０８３；米国特許第５，１３６，０２１号；第５，９２９，１１７号；第５，９４８，６３８号；第５，８０７，８６２号；第５，６９５，９５３号；第５，８３４，４３５号；第５，８１７，８２２号；第５，８３０，７４２号；第５，８３４，４３５号；第５，８５１，５５６号；第５，８５３，９７７号；第５，３５９，０３７号；第５，５１２，５４４号；第５，６９５，９５３号；第５，８１１，２６１号；第５，６３３，１４５号；第５，８６３，９２６号；第５，８６６，６１６号；第５，６４１，６７３号；第５，８６９，６７７号；第５，８６９，５１１号；第５，８７２，１４６号；第５，８５４，００３号；第５，８５６，１６１号；第５，８７７，２２２号；第５，８７７，２００号；第５，８７７，１５１号；第５，８８６，０１０号；第５，８６９，６６０号；第５，８５９，２０７号；第５，８９１，８８３号；第５，８７７，１８０号；第５，９５５，４８０号；第５，９５５，４７６号；第５，９５５，４３５号；第５，９９４，３５１号；第５，９９０，１１９号；第５，９５２，３２０号；第５，９６２，４８１号；第国際特許出願ＷＯ９０／１３５７５、ＷＯ９１／０３５５３、ＷＯ９２／０１００２、ＷＯ９２／１３０９５、ＷＯ９２／１６２２１、ＷＯ９３／０７８６３、ＷＯ９３／２１９４６、ＷＯ９３／１９７７７、ＷＯ９５／３４３２６、ＷＯ９６／２８５４６、ＷＯ９８／２７２９８、ＷＯ９８／３０５４１、ＷＯ９６／３８１５０、ＷＯ９６／３８１５０、ＷＯ９７／１８２０７、ＷＯ９７／１５５６１、ＷＯ９７／１２９０２、ＷＯ９６／２５８６１、ＷＯ９６／１２７３５、ＷＯ９６／１１２０９、ＷＯ９８／３９３２６、ＷＯ９８／３９３１６、ＷＯ９８／３８８５９、ＷＯ９８／３９３１５、ＷＯ９８／４２６５９、ＷＯ９８／３９３２９、ＷＯ９８／４３９５９、ＷＯ９８／４５２６８、ＷＯ９８／４７８６３、ＷＯ９６／３３１７２、ＷＯ９６／２０９２６、ＷＯ９７／３７９７４、ＷＯ９７／３７９７３、ＷＯ９７／４７５９９、ＷＯ９６／３５７１１、ＷＯ９８／５１６６５、ＷＯ９８／４３９４６、ＷＯ９５／０４０４５、ＷＯ９８／５６３７７、ＷＯ９７／１２２４４、ＷＯ９９／００３６４、ＷＯ９９／００３６３、ＷＯ９８／５７９３６、ＷＯ９９／０１４４９、ＷＯ９９／０１１３９、ＷＯ９８／５６７８８、ＷＯ９８／５６７５６、Ｗ��９８／５３８４２、ＷＯ９８／５２９４８、ＷＯ９８／５２９３７、ＷＯ９９／０２５１０、ＷＯ９７／４３２５０、ＷＯ９９／０６４１０、ＷＯ９９／０６０４２、ＷＯ９９／０９０２２、ＷＯ９９／０８６８８、ＷＯ９９／０７６７９、ＷＯ９９／０９９６５、ＷＯ９９／０７７０４、ＷＯ９９／０６０４１、ＷＯ９９／３７８１８、ＷＯ９９／３７６２５、ＷＯ９７／１１６６８、ＷＯ９９／５０２３８、ＷＯ９９／４７６７２、ＷＯ９９／４８４９１；日本国特許出願第１０１４７５３１号、第１０２３１２８５号、第１０２５９１４０号および第１０１３０１４９号、第１０３１６５７０号、第１１００１４８１号および第１２７，８００号／１９９１；独国出願第１９７３１５２１号；および英国出願第２２１８１０１号、第２３２６８８１号、第２２４６５６９号に記載されている。前記参考文献の全ての開示を、ここで、任意の目的のために参考として取り込む。
【０１２０】
ＥＰ３９３  ４３８およびＥＰ４２２  ３３９は、集合的に「ｓＴＮＦ  Ｒｓ」と呼ばれる、可溶性ＴＮＦ受容体Ｉ型（ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉまたは３０ｋＤａ  ＴＮＦ阻害因子としても知られている）および可溶性ＴＮＦ受容体ＩＩ型（ｓＴＮＦ  Ｒ−ＩＩまたは４０ｋＤａ  ＴＮＦ阻害因子としても知られている）のアミノ酸および核酸配列を記載している。ＥＰ３９３  ４３８およびＥＰ４２２  ３３９は、ｓＴＮＦ  Ｒ−ＩおよびｓＴＮＦ  Ｒ−ＩＩの修飾形態も記載しており、例えば、限定はされないが断片、機能性誘導体および変異体が含まれる。さらに、ＥＰ３９３  ４３８およびＥＰ４２２  ３３９は、阻害因子をコードする遺伝子を単離し、適切なベクター内に遺伝子をクローニングし、特定の細胞型内に遺伝子を形質転換または形質移入し、および遺伝子を発現して阻害剤を生成するための方法を記載している。
【０１２１】
ｓＴＮＦ  Ｒ−ＩおよびｓＴＮＦ  Ｒ−ＩＩは、神経成長因子受容体（ＮＧＦ）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ラットＴ細胞抗原ＭＲＣ  ＯＸ４０、ｆａｓ抗原、およびＣＤ２７およびＣＤ３０抗原（Ｓｍｉｔｈら著（１９９０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４８巻：１０１９〜１０２３頁）を含む、受容体の神経成長因子／ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの構成員である。その群の細胞表面受容体の保存された特徴は、システインに富む細胞外リガンド結合領域であり、これは、充分に保存された位置において４個から６個のシステイン残基を含む約４０個のアミノ酸からなる４つの繰り返しモチーフに分割することができる（Ｓｍｉｔｈら著（１９９０年）、前掲書）。
【０１２２】
ＥＰ３９３  ４３８は、全長組換え４０ｋＤａ  ＴＮＦ阻害蛋白の切頭形態である４０ｋＤａ  ＴＮＦ阻害因子Δ５１および４０ｋＤａ  ＴＮＦ阻害因子Δ５３を教示している。Δ５１およびΔ５３は、成熟蛋白のカルボキシル末端から削除された、それぞれ５１または５３個のアミノ酸を有する。
【０１２３】
公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／０１５５５は、４番目の領域（ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉのアミノ酸残基Ｔｈｒ１２７−Ａｓｎ１６１およびｓＴＮＦ  Ｒ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１４１−Ｔｈｒ１７９）；３番目の領域の一部（ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｎ１１１−Ｃｙｓ１２６およびｓＴＮＦ  Ｒ−ＩＩのアミノ酸残基Ｐｒｏ１２３−Ｌｙｓ１４０）を含まず、任意に、１番目の領域の一部（ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉのアミノ酸残基Ａｓｐ１−Ｃｙｓ１９およびｓＴＮＦ  Ｒ−ＩＩのアミノ酸残基Ｌｅｕ１−Ｃｙｓ３２）を含まないｓＴＮＦ  Ｒ−ＩおよびｓＴＮＦ  Ｒ−ＩＩの切頭形態を記載している。ある実施形態において、切頭ｓＴＮＦ  Ｒは、式：Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２およびＲ４−［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］−Ｒ５で示される蛋白を含む。これらの蛋白は、それぞれｓＴＮＦ  Ｒ−ＩおよびｓＴＮＦ  Ｒ−ＩＩの切頭形態である。
【０１２４】
ここで用いられる「Ｒ１−［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］−Ｒ２」は、［Ｃｙｓ１９−Ｃｙｓ１０３］がｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉの残基１９から１０３である一または二以上の蛋白を表し、その配列はＷＯ９８／０１５５５の図１に示され、ここでＲ１はＣｙｓ１９のメチオニル化または非メチオニル化アミン基を表すかまたはＣｙｓ１８からＡｓｐ１から選択される一または二以上のアミノ末端アミノ酸残基を表し、Ｒ２はＣｙｓ１０３のカルボキシ基を表すかまたはＰｈｅ１０４からＬｅｕ１１０から選択される一または二以上のカルボキシ末端アミノ酸残基を表す。
【０１２５】
本発明の切頭ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉの例には、限定はされないが、ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉ  ２．６Ｄ／Ｃ１０５、ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉ  ２．６Ｄ／Ｃ１０６、ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉ  ２．６Ｄ／Ｎ１０５、ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉ  ２．３Ｄ／ｄ８、ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉ  ２．３Ｄ／ｄ１８、ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉ  ２．３Ｄ／ｄ１５であってメチオニル化されたまはたメチオニル化されていないもの、その変異体および誘導体が含まれる。切頭ｓＴＮＦ  Ｒ−Ｉのある例が、例えば、公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９８／０１５５５に記載されている。
【０１２６】
ここで用いられる「Ｒ３−［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］−Ｒ４」は、［Ｃｙｓ３２−Ｃｙｓ１１５］がｓＴＮＦ  Ｒ−ＩＩの残基Ｃｙｓ３２からＣｙｓ１１５である一または二以上の蛋白を表し、その配列はＷＯ９８／０１５５５の図８に示され、ここでＲ３はＣｙｓ３２のメチオニル化または非メチオニル化アミン基を表すかまたはＣｙｓ３１からＬｅｕ１から選択される一または二以上のアミノ末端アミノ酸残基を表し、Ｒ４はＣｙｓ１１５のカルボキシ基を表すかまたはＡｌａ１１６からＡｒｇ１２２から選択される一または二以上のカルボキシ末端アミノ酸残基を表す。
【０１２７】
ある実施形態において、本発明は、ＯＰＧＬに対する抗体および少なくとも一つのセリンプロテアーゼ阻害因子を含む治療薬、およびそのような治療薬を用いる治療方法に関する。ある実施形態において、治療薬は、ＯＰＧＬに対する抗体およびセリンプロテアーゼ阻害因子並びにここに記載の少なくとも一つのさらなる分子を含む。
【０１２８】
内因性プロテアーゼは、もはや必要でないまたは有用でない侵入生物、抗原−抗体複合体および特定の組織蛋白を分解させ得る。感染性剤は、さらなるプロテアーゼを生物中に導入することができる。プロテアーゼ阻害因子は、内因性と侵入性の両方のプロテアーゼを制御することができる。
【０１２９】
ある実施形態において、天然に存在するプロテアーゼ阻害因子は、その反応を局所的および一時的に制限することにより内因性プロテアーゼを制御するのに役立つ。ある実施形態において、プロテアーゼ阻害因子は、感染性剤により体内に導入されたプロテアーゼを阻害する。ある例において、限定はされないが気道の蛋白分解攻撃および感染を含む蛋白分解攻撃および感染を特に起こし易い組織は、プロテアーゼ阻害因子を多く含む。
【０１３０】
プロテアーゼ阻害因子は、ヒト血漿蛋白の約１０％を含む。少なくとも８つの阻害因子がこの供給源から単離され、文献において特徴付けられている。これらは、限定はされないが、α２−マクロブロブリン（α２Ｍ）、α１−プロテアーゼ阻害因子（α１ＰＩ）、α１−アンチキモトリプシン（α１Ａｃｈｙ）、α１−アンチコラーゲナーゼ（α１ＡＣ）およびαトリプシン間阻害因子（Ｉ−α−Ｉ）を含む。
【０１３１】
ある例において、プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害因子バランスの妨害によりプロテアーゼ媒介組織破壊を起こすことができ、これは、限定はされないが、気腫、関節炎、糸球体腎炎、歯周病、筋ジストロフィ、腫瘍浸潤、および種々の他の病因性症状を含む。例えば敗血症または急性白血病のような重症の病因性過程である状況において、存在する遊離プロテアーゼの量は、分泌性細胞からの酵素の放出故に増加することができる。
【０１３２】
さらに、ある例において、生物の低下した制御阻害因子性能も、プロテアーゼ／プロテアーゼ阻害因子バランスを変化させ得る。そのような低下した制御阻害因子性能の非限定的例として、肺気腫の進行に関係するα１−プロテアーゼ阻害因子欠損がある。
【０１３３】
ある例において、プロテアーゼを制御するための手段を講ずることができず、そのような異常な状態が存在する場合、生物への過酷な損傷が起こり得る。従って、プロテアーゼを制御するために生物に投与することができるプロテアーゼ阻害因子を探した。
【０１３４】
白血球エラスターゼ、トリプシン、カテプシンＧおよび膵臓エラスターゼは、セリンプロテアーゼとして知られているプロテアーゼのクラスの非限定的例である。
【０１３５】
ある実施形態において、白血球エラスターゼは、細胞外に放出された場合、結合組織および他の価値のある蛋白を分解する。正常に機能している生物はある量の結合組織および他の蛋白を分解するが、白血球エラスターゼの過剰量の存在は、限定はされないが気腫およびリューマチ性関節炎を含む種々の病原性状態を伴い得る。ある実施形態において、正常を超える量で存在する場合に白血球エラスターゼの効果を打ち消すために、白血球エラスターゼに特異的なプロテアーゼ阻害因子を探した。そのようなプロテアーゼ阻害因子は、薬学的に有用であるように純粋な状態で充分な量で単離または調製することができるなら、有用であり得る。
【０１３６】
特定の白血球エラスターゼ阻害因子が、例えば、Ｓｃｈｉｅｓｓｌｅｒら著、「Ａｃｉｄ−Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｃｏｕｓ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｎｅｕｃｌｅａｒ  Ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ、Ｈａｖｅｍａｎｎら（著）、Ｕｒｂａｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇ、Ｉｎｃ．（１９７８年）、およびＴｒａｖｉｓおよびＳａｌｖｅｓｅｎ著、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第５２巻：６５５〜７０９頁（１９８３年）に記載されている。
【０１３７】
ある実施形態において、トリプシンは、限定はされないが膵臓炎を含む種々の急性症状中に、膵臓組織のような特定の軟質器官組織の分解を引き起こす。トリプシン阻害因子は、薬学的に有用となるように純粋状態で充分な量で単離および調製することができれば、有用であり得る。
【０１３８】
カテプシンＧは、白血球中に存在するもう一つのプロテアーゼである。ある実施形態において、カテプシンＧは、補体経路の蛋白を含む、種々の蛋白を生体外で分解することができる。膵臓エラスターゼは、膵臓炎で役割を果たすもう一つのプロテアーゼである。すなわち、これらのプロテアーゼ用の阻害因子も、薬学的価値がある。
【０１３９】
ある実施形態において、セリンプロテアーゼの異なる阻害因子の基質特異性および選択性は、僅かなアミノ酸残基の変化から生じると考えられる。したがって、比較的少ないアミノ酸の変化により異なるプロテアーゼを阻害することになるクラスのセリンプロテアーゼ阻害因子を考えることができる。ある実施形態において、このクラスの構成員は、全てのセリンプロテアーゼを阻害する。
【０１４０】
セリンプロテアーゼ阻害因子の例は、分泌性白血球プロテアーゼ阻害因子（ＳＬＰＩ）およびその断片および類似体である。セリンプロテアーゼ阻害因子の例には、抗白血球プロテアーゼ（ＡＬＰ）、粘液性プロテアーゼ阻害因子（ＭＰＩ）、ヒト精液血漿阻害因子（ＨＵＳＩ−Ｉ）、気管支粘膜阻害因子（ＢＭＩ）および子宮頸部粘膜阻害因子（ＣＵＳＩ）もあるが、これらに限定されない。ある実施形態において、セリンプロテアーゼ阻害因子は、ＬＰＳ調節因子でもあり得る。例えば、Ｊｉｎら著（１９９７年）、Ｃｅｌｌ第８８（３）巻：４１７〜２６頁を参照されたい。ある実施形態において、これらの分子は、選択的に軟骨に導かれるために、骨損失に至る症状において用いるのに好適である。
【０１４１】
セリンプロテアーゼ阻害因子の例が、例えば、米国特許第４，７６０，１３０号；第米国特許第５，９００，４００号および米国特許第５，６３３，２２７号に記載されており、これらを任意の目的のために参照してここに組み込まれる。前記参考文献に開示の分子、およびその任意の変異体または類似体は、集合的に「セリンプロテアーゼ阻害因子」と呼ばれる。
【０１４２】
ＩＬ−１８は、インターフェロン−γを誘発することが発見され先にインターフェロンガンマ誘発因子（ＩＧＩＦ）と命名された前炎症性サイトカインである。ある実施形態において、ＩＬ−１はＩＬ−１８生成を上方制御することが示され、ＩＬ−１８は多くの前炎症性サイトカインの生成を誘発し、ＩＬ−６およびＭＭＰ−１を誘発する。例えば、Ｄｉｎａｒｅｌｌｏら著（１９９８年）、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌ．第６３巻：６５８〜６４頁を参照されたい。ある実施形態において、カスパーゼＩは、ＩＬ−１８生成にも重要である。実験は、ＴＮＦ−αがＩＬ−１８の生成を制御すること、およびＴＮＦ−αおよび１Ｌ−１８の同時阻害が肝毒性を保護することも示している。例えば、Ｆａｇｇｉｏｎｉら著（２０００年）、ＰＮＡＳ第９７巻：２３６７〜７２頁も参照されたい。
【０１４３】
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１系様の受容体系により生体内で作用する。ＩＬ−１８は、付属蛋白（１Ｌ−１８ＲＡｃＰ）と相互作用する細胞表面受容体（１Ｌ−１８Ｒ）と相互作用する。ＩＬ−１８媒介信号発信は、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＲおよびＩＬ−１８ＲＡｃＰの複合体の形成時に進行する。ＩＬ−１８用の天然阻害因子はＩＬ−１８ｂｐである。ある実施形態において、ＩＬ−１８ｂｐは、ＩＬ−１８分子に結合しＩＬ−１８Ｒとの相互作用を妨げることにより「デコイ受容体」として作用する。
【０１４４】
ある実施形態において、本発明は、ＯＰＧＬに対する抗体および少なくとも一つのＩＬ−１８阻害因子を含む治療薬、およびそのような治療薬を用いる治療方法に関する。ある実施形態において、この治療薬は、ＯＰＧＬに対する抗体およびＩＬ−１８阻害因子並びにここに記載の少なくとも一つのさらなる分子を含む。特定の実施形態により治療することができる症状の例には、炎症、自己免疫疾患、ＩＬ−１媒介疾患およびＴＮＦ媒介疾患があるが、これらに限定されない。特定の態様に従ってＯＰＧＬに対する抗体および少なくとも一つのＩＬ−１８阻害因子で処理することができる症状の例には、限定はされないが関節炎があり、例えば、リューマチ性関節炎；全身性エリテマドーテス（ＳＬＥ）；対宿主性移植片病（ＧｖＨＤ）；肝炎；敗血症；およびこれらの疾患に伴う骨および軟骨の損失が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
ＩＬ−１８阻害因子の例には、ＩＬ−１８に結合する抗体；ＩＬ−１８Ｒに結合する抗体；ＩＬ−１８ＲＡｃＰに結合する抗体；ＩＬ−１８ｂｐ；ＩＬ−１８Ｒ断片（例えば、ＩＬ−１８受容体の可溶化細胞外領域）；ＩＬ−１８に結合すると共にＩＬ−１８Ｒとのその相互作用を低下または防止するペプチド；ＩＬ−１８Ｒに結合すると共にＩＬ−１８またはＩＬ−１８ＲＡｃＰとのその相互作用を低下または防止するペプチド；ＩＬ−１８ＲＡｃＰに結合すると共にＩＬ−１８Ｒとのその相互作用を低下または防止するペプチド；およびＩＬ−１８の生成または１Ｌ−１８、１Ｌ−１８Ｒおよび１Ｌ−１８ＲＡｃＰのいずれかの間の相互作用を低下または防止する小さい分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
特定のＩＬ−１８阻害因子が、例えば、１９９４年７月１４日に発行された米国特許第５，９１２，３２４号；第１９９９年１２月８日に発行されたＥＰ０  ９６２  ５３１；１９９４年１１月１５日に発行されたＥＰ７１２  ９３１；１９９４年７月１４日に発行された米国特許第５，９１４，２５３号；第１９９７年７月１０日に発行されたＷＯ９７／２４４４１；２０００年５月９日に発行された米国特許第６，０６０，２８３号；第１９９６年１２月２６日に発行されたＥＰ８５０  ９５２；１９９８年９月１６日に発行されたＥＰ８６４  ５８５；１９９８年９月２４日に発行されたＷＯ９８／４１２３２；２０００年４月２５日に発行された米国特許第６，０５４，４８７号；第１９９７年８月１４日に発行されたＷＯ９９／０９０６３；１９９７年１１月３日に発行されたＷＯ９９／２２７６０；１９９８年１月２３日に発行されたＷＯ９９／３７７７２；１９９８年３月２０日に発行されたＷＯ９９／３７７７３；２０００年１月２６日に発行されたＥＰ０  ９７４  ６００；２０００年３月９日に発行されたＷＯ００／１２５５５；１９９７年１０月３１日に発行された日本国特許出願ＪＰ１１１，３９９／９４；１９９８年２月８日に公開されたイスラエル特許出願ＩＬ  １２１５５４Ａ０に記載されており、これらを任意の目的のために参考としてここに取り込む。
【０１４７】
ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体を、炎症用の少なくとも一つの治療剤と共に用いることができる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体を、免疫疾患用の少なくとも一つの治療剤と共に用いることができる。炎症疾患および免疫疾患用の治療剤の例には、限定はされないが、コルチコステロイド、例えばプレドニソロン（これに限定されない）；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、例えばシクロオキシゲナーゼ１型（ＣＯＸ−１）およびシクロオキシゲナーゼ２型（ＣＯＸ−２）阻害因子（これらに限定されない）；疾患修飾抗リューマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、例えばメトトレキセート、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、シクロスポリン、金化合物（例えば、オーラノフィン、オーロチオマレートおよびオーロチオグルコース）およびレフルノミド（これらに限定されない）；ＩＶ型ホスホジエステラーゼ阻害因子、例えば、ロリプラム（Ｒｏｌｉｐｒａｍ）およびペントキシフィリン（Ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）（これらに限定されない）；タクロリムス（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）（ＦＫ−５０６）；シロリムス（Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）（ラパマイシン）；マイコフェノール酸；５−リポキシゲナーゼ阻害因子、例えばジロイトン（Ｚｉｌｅｕｔｏｎ）（これらに限定されない）；インターロイキン−６（ＩＬ−６）の調節因子；３８ｋＤａ有糸分裂促進物質活性化蛋白キナーゼ（ｐ３８−ＭＡＰＫ）の小分子調節因子；限定はされないがｊｎｋ、ＩＫＫ、ＮＦ−κＢ、ＺＡＰ７０およびｌｃｋのような炎症経路に含まれる細胞内分子の小分子調節因子がある。炎症用の治療剤の特定の例が、例えば、Ｃ．Ａ．ＤｉｎａｒｅｌｌｏおよびＬ．Ｌ．Ｍｏｌｄａｗｅｒ著Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ａ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ第３版（２００１年），Ａｍｇｅｎ  Ｉｎｃ．Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡに記載されている。炎症および自己免疫疾患用の治療剤の特定の例としては、限定はされないが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）調節因子；ＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌの調節因子（ＯＸ４０の可溶性形態を含む）；４−１ＢＢ／４−１ＢＢリガンドの調節因子（４−１ＢＢの可溶性形態を含む）；Ｂ細胞−Ｔ細胞共刺激経路の調節因子、例えば限定はされないが受容体リガンド対ＣＤ２８／Ｂ７、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ／Ｂ７ＲＰ１およびＡＧＰ−３／ＴＡＣＩ／ＢＡＦＦＲ（ＡＧＰ−３がＴＡＣＩおよびＢＡＦＦＲ受容体の両方に結合する）の調節因子がある。Ｂ細胞−Ｔ細胞共刺激経路の調節因子の特定の例は、限定はされないが、ＣＤ２８、Ｂ７．１およびＢ７．２の阻害因子（Ｂ７．１またはＢ７．２の可溶性形態およびＣＴＬＡ４の可溶性形態を含み、それらの両方を融合して異種ペプチドまたは蛋白を形成することができ、これが、可溶性または循環半減期を増加させることにより、分解を低下または防止および／または半減期を増加させ、毒性を低下させ、免疫原性を低下させ、または治療性蛋白の生物学的活性を増加させる）；ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの阻害因子（異種ペプチドまたは蛋白に融合し得るＣＤ���０の可溶性形態を含む）；ＩＣＯＳおよびＢ７ＲＰ１の阻害因子（異種ペプチドまたは蛋白に融合し得るＩＣＯＳの可溶性形態を含む）；およびＡＧＰ−３、ＴＡＣＩおよびＢＡＦＦＲの阻害因子（ＴＡＣＩおよびＢＡＦＦＲの可溶性形態を含む）；を含む。ＩＣＯＳ、Ｂ７ＲＰ１およびそれらの阻害因子は、例えば、ＷＯ００／４６２４０に記載されている。ＡＧＰ−３、ＴＡＣＩおよびＢＡＦＦＲおよびそれらの阻害因子は、例えば、ＷＯ００／４７７４０、ＷＯ０１／８５８７２、ＷＯ０２／１５２７３、ＷＯ９８／３９３６１およびＢｕｌｏｗおよびＢｒａｍ著（１９９７年）Ｓｃｉｅｎｃｅ第２７８巻：１３８〜１４０頁に記載されている。
【０１４８】
ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体が、限定はされないが悪性または転移性腫瘍により引き起こされる骨の骨溶解性破壊から生じる骨損失を含む骨損失を治療するために用いられる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、癌に関する骨損失を治療するために用いることができる。癌の例としては、乳、前立腺、甲状腺、腎臓、肺、食道、直腸、膀胱、子宮頸部、卵巣および肝臓癌、並びに胃腸管の癌があるが、これらに限定されない。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、例えば、ある血液学的悪性疾患、例えば限定はされないがホジキン病を含む多発性骨髄腫およびリンパ腫に関する骨損失を治療するために用いることができる。
【０１４９】
ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は単独で投与される。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、限定はされないが少なくとも一つの他の癌治療剤を含む少なくとも一つの他の治療剤と一緒に投与される。癌治療には、例えば、放射線療法および化学療法があるが、これらに限定されない。ある実施形態において、化学療法は、以下の剤の一種または二種以上で治療することを含み得る：アントラサイクリン、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシルおよび、当分野で知られている他の薬剤。ある実施形態において、癌治療剤は、黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）拮抗薬である。ある実施形態において、ＬＨＲＨ拮抗薬はペプチド拮抗薬である。
【０１５０】
ある実施形態において、ＬＨＲＨ拮抗薬は、ペプチド：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−４−Ｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｎ−Ｍｅ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ｉＰｒ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（配列番号２０）を含み、ここでＮａｌは３−（２−ナフチル）アラニニル；４−Ｃｌ−Ｐｈｅは（４’−クロロフェニル）アラニニル；Ｐａｌは３−（３’−ピリジル）アラニニル；およびＬｙｓ（ｉＰｒ）はＮ−エプシロン−２−プロピル−リシニルである。
【０１５１】
ある実施形態において、ＬＨＲＨ拮抗薬はＬＨＲＨ拮抗薬デカペプチドである。デカペプチドの特定の例が、例えば、米国特許第５，８４３，９０１号に記載されており、これを任意の目的のために参照してここに組み込まれる。
【０１５２】
ある実施形態による治療性抗体の例としては、限定はされないが、マウス、マウス−ヒトキメラ、ＣＤＲ−接枝、ヒト化および完全ヒト抗体、および限定はされないが抗体ライブラリーをスクリーニングすることにより選択される抗体を含む合成抗体がある。抗体の例には、細胞表面蛋白Ｈｅｒ２、ＣＤＣ２０、ＣＤＣ３３、ムチン様糖蛋白および、腫瘍細胞上に存在する上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合すると共にこれらの蛋白を示す腫瘍細胞上に細胞増殖抑制性および／または細胞毒性効果を任意に誘発する抗体があるが、これらに限定されない。抗体の例は、乳癌および他の形態の癌を治療するために用いることができるＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）（ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、およびＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ）、および非ホジキンリンパ腫および他の形態の癌を治療するために用いることができるＬＹＭＰＨＯＣＩＤＥ（登録商標）（ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）も含み。抗体の特定の例は、ＥＲＢＩＴＵＸ（登録商標）（ＩＭＣ−Ｃ２２５）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（ヨウ素１３１  ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）およびＣａｍｐａｔｈも含む。
【０１５３】
ある実施形態において、癌治療剤は、限定はされないがＴＮＦ−関連ポリペプチドＴＲＡＩＬを含む、腫瘍細胞中でアポトーシスを選択的に誘発するポリペプチドである。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、少なくとも、癌治療剤での治療の前、同時および後のいずれかに投与することができる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、転移性癌の骨損失の開始を防止または軽減するために予防的に投与することができる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、転移による骨損失の存在する症状の治療のために投与することができる。
【０１５４】
ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体は、多発性骨髄腫に関わる骨損失を防止および／または治療するため、および／またはその病気そのものを防止および／または治療するため用いることができる。多発性骨髄腫は、著しい罹患率および／または死亡率に到り得るＢ細胞誘導腫瘍である。ある実施形態において、多発性骨髄腫の臨床的症状発現は限局性骨損失であり、これは、局所領域における増加した破骨細胞活性化に起因し得る。多くの骨髄腫患者は、放射線医学的分析により見ることができる骨病巣を呈し、骨格痛を被る。ある例において、骨髄腫の患者は、突発的にまたは外傷により起こり得る、含まれる骨の病的骨折を起こし易い。ある実施形態において、骨髄腫中に生じる骨格病巣は、骨折を起こすのみならず、変形および時には特に椎骨特記における神経圧迫も起こす。ある実施形態において、血清カルシウムの病的増加（高カルシウム血症）が起こり、病気治療中に著しい問題を引き起こし得る。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体を、骨再吸収およびカルシウム放出を低下または阻害するために患者に投与することができ、これが骨折および脊椎変形の危険性を低下させることができる。
【０１５５】
ある実施形態において、骨髄腫細胞は骨破壊に直接関与せず、その代わりに、破骨細胞の分化および活性化につながる細胞外信号を発する。ある実施形態において、破骨細胞は、特に活性化したとき、高水準のサイトカインＩＬ−６を生成する。ＩＬ−６は、Ｂ細胞成長因子であり、ネズミおよびヒトの両方の骨髄腫細胞の生体外での成長に貢献する。骨髄腫細胞は、直接または間接的にＯＰＧＬを生成することができ、これが、骨髄空間に埋められている骨髄腫細胞を包囲する限局性骨溶解を引き起こし得る。ある実施形態において、骨髄腫細胞に隣接する正常破骨細胞がここではＩＬ−６を生成し、これが、腫瘍細胞の限局性拡張を引き起こし得る。骨髄腫細胞はクローン様に拡張し、不適切な骨再吸収により形成される骨空間を占めることができる。
【０１５６】
げっ歯類へのＯＰＧの投与が、破骨細胞集団の迅速な死を誘発することが観察された。（例えば、Ｌａｃｅｙら著、（２０００年）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．第１５７巻：４３５〜４４８頁を参照のこと）。破骨細胞の数の減少が、これらの細胞による増加したＩＬ−６生成の効果を阻害することがあり、従って、海綿質中での骨髄腫細胞の成長および生き残りに影響を与えることができる。すなわち、ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体の骨髄腫患者への投与が、骨の過剰再吸収を阻害するのみならず、腫瘍そのものの拡張および生き残りに影響を与えることができる。
【０１５７】
Ｂ細胞は、ＯＰＧＬ、ＯＤＡＲへの受容体を発現する。骨髄腫細胞もＯＤＡＲを発現し、さらに、ＯＰＧＬを生成することができる。ある実施形態において、同じ細胞集合におけるＯＰＧＬとＯＤＡＲの両方の発現が、骨髄腫細胞の生き残りに影響を与えるオートクリン刺激を生むことができる。すなわち、ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体の投与が、腫瘍細胞生き残りを減少させ、それにより骨髄腫患者において見られる腫瘍負荷を減少または除去することができる。
【０１５８】
ある実施形態において、本発明は、治療有効量のＯＰＧＬに対する抗体を、医薬適合性の希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと一緒に含む医薬組成物を提供する。
【０１５９】
ある実施形態において、本発明は、治療有効量のＯＰＧＬに対する抗体および治療有効量の少なくとも一つのさらなる治療剤を、医薬適合性の希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントと一緒に含む医薬組成物を提供する。ある実施形態において、少なくとも一つのさらなる治療剤は、ＢＭＰ−１からＢＭＰ−１２と表される骨形態発生因子；形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）およびＴＧＦ−β科構成員；インターロイキン−１（ＩＬ−１）阻害因子、例えばＬＩ−１ａおよびその誘導体およびキネレト（Ｋｉｎｅｒｅｔ）（登録商標）（これらに限定されない）；ＴＮＦα阻害因子、例えば可溶性ＴＮＦα受容体、エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）、抗ＴＮＦα抗体、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標）およびＤ２Ｅ７抗体（これらに限定されない）；副甲状腺ホルモンおよびその類似体、副甲状腺関連蛋白およびその類似体；Ｅ系列プロスタグランジン；ビスホスホネート（例えば、アレンドロネートおよびその他）；フッ化物およびカルシウムのような骨強化鉱物；非ステロイド抗炎症性薬（ＮＳＡＩＤ）、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（登録商標）およびビオツクス（Ｖｉｏｘｘ）（登録商標）のようなＣＯＸ−２阻害因子；免疫抑制剤、例えばメトトレキセートおよびレフルノミド；セリンプロテアーゼ阻害因子、例えば、分泌性白血球プロテアーゼ阻害因子（ＳＬＰＩ）；ＩＬ−６阻害因子（例えば、ＩＬ−６への抗体）；ＩＬ−８阻害因子（例えば、ＩＬ−８への抗体）；ＩＬ−１８阻害因子（例えば、ＩＬ−１８結合蛋白またはＩＬ−１８抗体）；インターロイキン−１転化酵素（ＩＣＥ）調節因子；線維芽細胞成長因子ＦＧＦ−１からＦＧＦ−１０およびＦＧＦ調節因子；ＰＡＦ拮抗薬；ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ＫＧＦ−関連分子、またはＫＧＦ調節因子；マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）調節因子；一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）調節因子、例えば、誘発性ＮＯＳの調節因子；グルココルチコイド受容体の調節因子；グルタメート受容体の調節因子；リポ多糖類（ＬＰＳ）水準の調節因子；およびノルアドレナリン並びにその調節因子および模倣体から選択される。
【０１６０】
ある実施形態において、許容できる製剤材料は、好ましくは、用いられる投与量および濃度においてレシピエントに非毒性である。
【０１６１】
ある実施形態において、医薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透性、粘度、透明さ、色、等張性、香り、無菌性、安定性、溶解または放出速度、吸着性および透過性を修飾、維持または保存するための製剤材料を含み得る。ある実施形態において、適切な製剤材料は、限定はさらないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン）；抗菌物質；抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝物質（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、燐酸塩または有機酸）；バルキング剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−ｓｈクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；蛋白（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリン）；着色剤、着香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、ベンズアルコニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン；トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル）；安定性向上剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；張度向上剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは、塩化ナトリウムまたはカリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的アジュバントを含む。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０年））。
【０１６２】
ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体および／または治療性分子を、当分野において知られている半減期延長性ビヒクルに結合される。そのようなビヒクルは、限定はされないが、Ｆｃ領域、ポリエチレングリコールおよびデキストランを含む。そのようなビヒクルは、例えば、米国出願番号０９／４２８，０８２および公開ＰＣＴ出願ＷＯ９９／２５０４４に記載されており、これらを任意の目的のために参照してここに組み込まれる。
【０１６３】
ある実施形態において、最適医薬組成物は、例えば意図する投与経路、送達方式および所望の投与量に依存して当業者により決められる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：前掲書を参照されたい。ある実施形態において、そのような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、生体内放出速度および生体内クリアランス速度に影響を与えることができる。
【０１６４】
ある実施形態において、医薬組成物中の主なビヒクルまたはキャリアは、性質が水性または非水性である。例えば、ある実施形態において、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用水、生理食塩溶液または人工脳脊髄液であってよく、非経口投与のための組成物において一般的な他の材料を補足して良い。ある実施形態において、中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水が、さらなるビヒクルの例である。ある実施形態において、医薬組成物は、ｐＨ約７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液またはｐＨ約４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、さらに、ソルビトールまたは適切なその代替物を含んでよい。ある実施形態において、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液としての任意の製剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：前掲書）と混合することにより、ＯＰＧＬに対する抗体を含み、少なくとも一つのさらなる治療剤を含むまたは含まない組成物を、貯蔵用に調製することができる。さらに、ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体を含み、少なくとも一つのさらなる治療剤を含むまたは含まない組成物を、スクロースのような適切な賦形剤を用いて凍結乾燥体として調製することができる。
【０１６５】
ある実施形態において、本発明の医薬組成物を、非経口送達のために選択することができる。ある実施形態において、この組成物を、吸入または経口のような消化管を通る送達用に選択することができる。そのような医薬適合性の組成物の調製は、当分野の技術範囲内である。
【０１６６】
ある実施形態において、製剤成分は、投与部位に許容できる濃度で存在する。ある実施形態において、組成物を生理的ｐＨまたは僅かに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持するために緩衝液が用いられる。
【０１６７】
ある実施形態において、非経口投与を考える場合、治療組成物は、医薬適合性のビヒクル中に所望のＯＰＧＬに対する抗体を含み、さらなる治療剤を含むまたは含まない、発熱因子を含まず非経口的に許容できる水溶液の状態であり得る。ある実施形態において、非経口注入用のビヒクルは滅菌蒸留水であり、その中で、ＯＰＧＬに対する抗体が、少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないで、適切に保存された滅菌等張溶液として形成される。ある実施形態において、製剤は、その後にデポー注射により送達することができる生成物の管理された放出または少しずつの放出を提供し得る、注射性マイクロ球、生物学的腐食性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームのような剤と所望の分子の組成物を含むことができる。ある実施形態において、ヒアルロン酸も用いることができ、循環する持続を促進する効果を有することができる。ある実施形態において、所望の分子を導入するために移植可能な薬剤送達装置を用いることができる。
【０１６８】
ある実施形態において、医薬組成物を吸入用に調製することができる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体を、少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないで、吸入用の乾燥粉末として調製することができる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体を、少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないで、推進剤を用いてエアロゾル送達用に調製することができる。ある実施形態において、溶液を霧状にすることができる。肺投与が、さらに、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５に記載されており、これは化学的に修飾した蛋白の肺送達を記載している。
【０１６９】
ある実施形態において、製剤を経口的に投与することが考えられる。ある実施形態において、このように投与されるＯＰＧＬに対する抗体を、少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないで、錠剤およびカプセルのような固体投与型の配合において通常用いられるキャリアを用いてまたは用いないで製剤にすることができる。ある実施形態において、生物学的利用性が最大となり前全身性分解が最少となる胃腸管の地点で組成物の活性部分を放出するようにカプセルを設計することができる。ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体および／または任意のさらなる治療剤の吸収を容易にするように、少なくとも一つのさらなる剤を含ませることができる。ある実施形態において、希釈剤、着香剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤およびバインダーを用いることもできる。
【０１７０】
ある実施形態において、医薬組成物は、少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないで、有効量のＯＰＧＬに対する抗体を、錠剤の製造に適している非毒性賦形剤を含む混合物中に含むことができる。ある実施形態において、錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクル中に溶解することにより、溶液を単位投与形態で調製することができる。ある実施形態において、適切な賦形剤は、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸または重炭酸ナトリウム、ラクトースまたは燐酸カルシウムのような不活性希釈剤；デンプン、ゼラチンまたはアカシアのような結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクのような潤滑剤を含む。
【０１７１】
さらなる医薬組成物は、当業者に良く知られており、少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないで、ＯＰＧＬに対する抗体を持続性または制御された送達製剤中に含む組成物を含む。ある実施形態において、種々の他の持続性または制御下の送達手段、例えば、リポソームキャリア、生物学的腐食性ミクロ粒子または多孔質ビーズおよび蓄積注射剤を調製する技術も当業者に知られている。例えば、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９が参照され、これは、医薬組成物の送達のための多孔質ポリマーミクロ粒子の制御下の放出を記載している。ある実施形態において、持続性放出製剤は、造形粒子、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの状態の半透過性ポリマーマトリクスを含むことができる。持続性放出マトリクスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．３，７７３，９１９およびＥＰ０５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチルＬ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら著，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ第２２巻：５４７〜５５６頁（１９８３年））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら著、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．第１５巻：１６７〜２７７頁（１９８１年）およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．第１２巻：９８〜１０５頁（１９８２年））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら著、前掲書）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を含むことができる。ある実施形態において、持続放出組成物は、当分野で知られている任意の幾つかの方法により調製することができるリポソームも含むことができる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８２巻：３６８８〜３６９２頁（１９８５年）；ＥＰ０３６，６７６；ＥＰ０８８，０４６およびＥＰ１４３，９４９を参照されたい。
【０１７２】
生体内投与用に用いられる医薬組成物は、典型的には無菌である。ある実施形態において、これは、滅菌濾過膜を通す濾過により達成することができる。ある実施形態において、組成物を凍結乾燥する場合、この方法を用いる滅菌を凍結乾燥および再構築の前または後に行うことができる。ある実施形態において、非経口投与用の組成物を、凍結乾燥状態または溶液中に貯蔵することができる。ある実施形態において、非経口組成物は、通常、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液袋または皮下注射針により突き通すことができるストッパーを有するバイアル中に配される。
【０１７３】
ある実施形態において、医薬組成物が一旦調製されると、これを、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体としてまたは脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に貯蔵することができる。ある実施形態において、そのような製剤は、直ぐに使用できる状態または、投与前に再構築される状態（例えば、凍結乾燥された状態）で貯蔵することができる。
【０１７４】
ある実施形態において、本発明は、一回投与単位を製造するためのキットに関する。ある実施形態において、このキットは、各々が、乾燥蛋白を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含むことができる。本発明のある実施形態において、単数室および複数室予備充填注射器（例えば、液体注射器および溶解注射器）を含むキットが含まれる。
【０１７５】
ある実施形態において、少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないで、ＯＰＧＬに対する抗体を含む治療的に用いられる医薬組成物の有効量は、例えば、治療方法および対象に依存する。当業者は、特定の態様に従う治療用の適切な投与量は、部分的には、送達される分子、ＯＰＧＬに対する抗体が少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないで使用される指示、投与経路、および患者の大きさ（体重、体表面積または器官寸法）および／または症状（年齢および全身状態）に依存して変化すると理解する。ある実施形態において、臨床家は投与量を調節し投与経路を変更して最適治療効果を得ることができる。ある実施形態において、典型的投与量は、前述の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲で変化することができる。ある実施形態において、投与量は０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇで変化し得る。
【０１７６】
ある実施形態において、投与回数は、用いられる組成物中のＯＰＧＬに対する抗体および／または任意のさらなる治療剤の薬物動態学的パラメーターを考慮する。ある実施形態において、臨床家は、所望の効果を達成する投与量に到るまで組成物を投与する。ある実施形態において、組成物は、従って、時間を置いて一回投与としてまたは二回以上の投与として（同量の所望の分子を含むまたは含まなくてもよい）、あるいは移植装置またはカテーテルを介する連続輸液として投与することができる。適切な投与量をさらに精製することは、当業者が通常方法で行い、当業者が一般的に行う作業範囲である。ある実施形態において、適切な投与量は、適切な投与量−応答データを用いることにより突き止めることができる。
【０１７７】
ある実施形態において、医薬組成物の投与経路は、既知の方法、例えば、経口投与、また、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼球内、動脈内、門脈内または病変内経路による注射；または維持放出システムまたは移植装置に従う。ある実施形態において、組成物は、ボーラス注射によりまたは輸液により連続的に、あるいは移植装置により投与することができる。
【０１７８】
ある実施形態において、この組成物は、そこに所望の分子が吸収または封入されている薄膜、スポンジまたは別の適切な材料の移植により局所的に投与することができる。ある実施形態において、移植装置を用いる場合、その装置は、適切な組織または器官に移植することができ、所望の分子の送達は拡散、遅延放出ボーラスまたは連続的投与であり得る。
【０１７９】
ある実施形態において、少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないで、ＯＰＧＬに対する抗体を含む医薬組成物を生体外で用いることが望ましい。そのような例において、患者から除去された細胞、組織および／または器官を、少なくとも一つのさらなる治療剤を用いてまたは用いないでＯＰＧＬに対する抗体を含む医薬組成物に晒し、その後、細胞、組織および／または器官を続いて患者に移植して戻す。
【０１８０】
ある実施形態において、ＯＰＧＬに対する抗体および／または任意の治療剤は、ポリペプチドを発現し分泌するためにここに記載されたような方法を用いて遺伝子加工された特定の細胞を移植することにより送達することができる。ある実施形態において、そのような細胞は動物またはヒト細胞であって良く、自己由来、異種または遠異種であって良い。ある実施形態において、細胞は不朽化することができる。ある実施形態において、免疫学的反応の変化を低下させるために、細胞を封入して周囲組織の侵入を避けることができる。ある実施形態において、封入材料は典型的には、蛋白の放出は許すが、患者の免疫系によるまたは周囲細胞からの他の有害因子による細胞の破壊は防止する、生物適合性で半透過性のポリマー封入体または薄膜である。
【０１８１】
行った実験および達成された結果を含む以下の実施例は、説明の目的のみに提供され、本発明の制限を意図するものではない。
【実施例１】
【０１８２】
αＯＰＧＬ−１  Ｈ鎖およびＬ鎖のクローニング
全長ヒトＯＰＧＬ  ｃＤＮＡを発現するＣＨＯ細胞を用いて、ヒトイムノグルブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを免疫する。免疫されたマウスからのリンパ説をネズミ骨髄腫細胞に融合させてハイブリドーマを発生させる。ハイブリドーマ系統からの上澄みを、ヒトＯＰＧＬと反応する抗体についてＥＬＩＳＡアッセイにおいて試験する。抗ＯＰＧＬ発現ハイブリドーマ系統ＡＭＧ６．５、ＡＭＧ６．４およびＡＭＧ６．１は、ＯＰＧＬに対する高い親和性を有する抗体を発現することがわかり（Ｋｄがそれぞれ０．２８ｎＭ、０．２９ｎＭおよび０．２３ｎＭ）、ＡＭＧ６．５をクローニングのために選択する。ＡＭＧ６．５およびＡＭＧ６．４からのＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡクローンは同一であり、ＡＭＧ６．５を用いて、αＯＰＧＬ−１  Ｌ鎖ｃＤＮＡをクローン化し、ＡＭＧ６．４を用いて、αＯＰＧＬ−１  Ｈ鎖ｃＤＮＡをクローン化する。
【０１８３】
αＯＰＧＬ−１  Ｌ鎖のクローニング
ＡＭＧ６．５全ＲＮＡ調製される第１のストランドｃＤＮＡから、ＰＣＲ増幅方法を用いて、αＯＰＧＬ−１κＬ鎖可変領域を得る。第１のストランドｃＤＮＡは、拡張５’−アダプタ（５’−ＧＧＣＣＧＧＡＴＡＧＧＣＣＴＣＡＣＮＮＮＮＮＮＴ−３’（配列番号１５）を有するランダムプライマーおよび材料を用い、Ｇｉｂｃｏ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（登録商標）Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（カタログ番号１８０８９−０１１）により提供される方法を使用して、ＡＭＧ６．５全ＲＮＡから調製する。ＰＣＲには以下のオリゴヌクレオチドを用いる：
５’κＲＡＣＥプライマー：
５’−ＧＡＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＣＴ  Ｇ−３’（配列番号５）
３’κＲＡＣＥプライマー：
５’−ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＧＧ−３’（配列番号６）
【０１８４】
増幅されたＤＮＡを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、得られるプラスミドを配列する。κ鎖コンセンサス配列を用いて、全長αＯＰＧＬ−１κ鎖のＰＣＲ増幅用のプライマーを設計する。５’αＯＰＧＬ−１κプライマーは、クローニング用のＸｂａｌ部位（ＴＣＴＡＧＡ）および「ＣＣＡＣＣ」Ｋｏｚａｋ配列を、開始Ｍｅｔコドンの前に組み込む。３’αＯＰＧＬ−１κプライマーは、クローニング用の停止コドンに続いてＳａｌＩ部位（ＧＴＣＧＡＣ）を組み込む。
【０１８５】
【化１】
0005576903.tif 000003
【０１８６】
【化２】
0005576903.tif 000004
【０１８７】
全長αＯＰＧＬ−１κ鎖ｃＤＮＡクローンを、５’および３’αＯＰＧＬ−１κプライマーを用いるＰＣＲ増幅により、前述のようにして、ＡＭＧ６．５第１ストランドｃＤＮＡを用いて得た。ＰＣＲ反応は、αＯＰＧＬ−１κ鎖（図４、配列番号４）の２３５アミノ酸残基（２０アミノ酸κ鎖信号配列を含む）をコードする７３８ｂｐ断片を生じさせる。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（カタログ番号２８１０４）を用いる精製に続いて、この断片を用いてκＬ鎖発現ベクターを構築する。
【０１８８】
先に作成した７３８ｂｐ全長κ断片をＸｂａｌおよびＳａｌＩで切断し、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｃａｔ．ｎｏ．Ａ７１００）を用いて精製し、ｐＤＳＲα１９中にクローニングしてプラスミドαＯＰＧＬ−１κ／ｐＤＳＲα１９を作成する（図５）。ｐＤＳＲα１９は、先に記載した（ＷＯ９０／１４３６３を参照：これを任意の目的のために参照してここに組み込まれる（例えば、図１２を参照））。簡単説明すると、ｐＤＳＲα１９を作るために、ｐＤＳＲα２を以下のようにして修飾する。ＦＳＨ  ｐｏｌｙＡを約１４００塩基対短縮して８８５塩基対を得ると、Ｎｄｅｌ部位が末端となる。ジヒドロフォレートリダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターは５’末端から約１キロ塩基短縮された、２０９塩基対を含む。ＤＨＦＲポリＡ配列からの約５５０塩基対ＢｇＩＩＩ断片を削除する。
【０１８９】
αＯＰＧＬ−１κＬ鎖発現クローンを配列決定して、ＡＭＧ６．５ハイブリドーマ中で同定される同じペプチドをコードしたことを確認する。最終発現ベクターαＯＰＧＬ−１κ／ｐＤＳＲα１９は５４７６ｂｐであり、表２に示す７つの機能性領域を含む。
【０１９０】
【表２】
0005576903.tif 000005
【０１９１】
このベクターの環状プラスミドマップを図５に示す。
【０１９２】
αＯＰＧＬ−１  Ｈ鎖のクローニング
αＯＰＧＬ−１  ＩｇＧ２  Ｈ鎖を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号Ｋ１８０２−１）を用いて作成したＡＭＧ６．４ハイブリドーマ二本鎖ｃＤＮＡからクローニングする。ＡＭＧ６．４Ｈ鎖ｃＤＮＡの増幅は、ヒト生殖細胞系ＩｇＧ２  Ｈ鎖定常領域即位的プライマー（図示せず）およびＲＡＣＥプライマーおよび他の材料ならびにＭａｒａｔｈｏｎ（登録商標）ｃＤＮＡ増幅キットで提供される方法を用いて行われるｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）技術の５’および３’迅速増幅により達成される。
【０１９３】
５’ＩｇＧ２  ＲＡＣＥプライマー
５’−ＧＧＣ  ＡＣＧ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＡＧ−３’（配列番号９）
３’−ＩｇＧ２  ＲＡＣＥプライマー
５’−ＣＣＴ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＴＣＴ−３’（配列番号１０）
【０１９４】
６００ｂｐ５’ＲＡＣＥ生成物および１２００ｂｐ３’ＲＡＣＥ生成物を、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列決定する。この配列情報を用いて、全長配列のクローニング用のαＯＰＧＬ−１  Ｈ鎖特異的プライマーを設計する。Ｈ鎖５’プライマー（５’αＯＰＧＬ−１  ＩｇＧ２プライマー）は、センスストランドに向けられ、元の開始部位の前にＨｉｎｄＩＩＩ部位およびコンセンサスＫｏｚａｋ配列を有する。Ｈ鎖３’プライマー（３’αＯＰＧＬ−１  ＩｇＧ２プライマー）は、Ｈ鎖ＩｇＧ２配列の最後のアミノ酸の後にＳａｌＩ部位および停止コドンを含むアンチセンスプライマーである。
【０１９５】
【化３】
0005576903.tif 000006
【０１９６】
【化４】
0005576903.tif 000007
【０１９７】
前述の２本鎖ｃＤＮＡを用いて、５’−および３’−αＯＰＧＬ−１  ＩｇＧ２プライマーを用いるＰＣＲ増幅により全長Ｈ鎖ｃＤＮＡを作成する。ＰＣＲは、αＯＰＧＬ−１  ＩｇＧ２  Ｈ鎖蛋白の４６７アミノ酸残基（１９アミノ酸ＩｇＧ信号配列を含む）をコードする１４３３ｂｐ断片を生成する（図２、配列番号２）。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８１０４）を用いる精製に続いて、この断片を用いて、以下のようにＨ鎖発現ベクターを構築する。
【０１９８】
前述のように作成した全長ＩｇＧ２重断片をコードするＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌＩで切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号２８７０４）を用いて精製し、この断片をｐＤＳＲα１９中にクローニングする。得られる発現プラスミドを、αＯＰＧＬ−１ＩｇＧ２／ｐＤＳＲα１９と命名する（図６）。全てのベクター成分は、αＯＰＧＬ−１ＩｇＧ２Ｈ鎖ｃＤＮＡが、Ｘｂａｌ部位とＳａｌＩ部位との間のαＯＰＧＬ−１κＬ鎖ｃＤＮＡに取って代わる以外は、前述のαＯＰＧＬ−１−κ／ｐＤＳＲα１９ベクターと同じである。αＯＰＧＬ−１ＩｇＧ２Ｈ鎖発現クローンを配列決定して、ＡＭＧ６．４ハイブリドーマにおいて同定される同じポリペプチドをコードしたことを確認する。
【実施例２】
【０１９９】
ＣＨＯ細胞中でのαＯＰＧＬ−１発現
αＯＰＧＬ−１抗体の安定発現を、ジヒドロフォレートリダクターゼ欠損（ＤＨＦＲ−）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ  ＡＭ−１／Ｄ、米国特許第６，２１０，９２４号）中へのαＯＰＧＬ−１−κ／ｐＤＳＲα１９およびαＯＰＧＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲα１９プラスミドの共形質移入およびその後の個々のクローンの単離および試験により達成する。
【０２００】
形質移入の前の日（０日目）に、１００ｍｍ組織培養皿に、ＣＨＯｄ−培地（ＤＭＥＭ−高グルコース、１０％胎児ウシ血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１×ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ））（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））および１％ｈｔサプリメント（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））中で成長した１．５×１０６ＡＭ−１／Ｄ細胞を乗せる。１日目に、血清非含有ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））４００μｌを１２×７５ｍｍポリプロピレン管に入れる。Ｔｒａｎｓ  ＩＴ（登録商標）−ＬＴ１試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の２４μｌを、培地に滴下し、混合物を室温で１０分間インキュベートする。次に、合計１５μｇの線状化されたプラスミドＤＮＡ（７．５μｇのαＯＰＧＬ−１−κ／ｐＤＳＲα１９および７．５μｇのαＯＰＧＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲα１９、Ｐｖｕ１で消化）を混合物に滴下し、室温で１０分間インキュベートする。
【０２０１】
ＣＨＯｄ−培地を細胞から除去し、これをダルベッコ燐酸緩衝食塩水（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））１０ｍｌで洗う。ＨＴ、Ｌ−ｇｌｕ、ＮＥＡＡおよびピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））を補足した血清非含有ＭＥＭ培地６ｍｌを細胞に追加する。ＤＮＡ／ＬＴ１複合体をプレートに滴下し、これを前後に穏やかに揺らしてＤＮＡを細胞上に均一に分布させる。組織培養インキュベーター中で６時間後、培地を新しいＣＨＯｄ−培地に置き換える。４８時間後、細胞を、ＣＨＯ選択培地（ＤＭＥＭ高グルコース、１０％透析胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％可欠アミノ酸および１×ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））中の１０個の１００ｍｍ培養皿に分ける。培地を、コロニーが現れるまで、週に二回交換する。
【０２０２】
１０日から１４日後、コロニーを、１×トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標））中に浸した５ｍｍクローニングディスク（Ｌａｂｃｏｒｅ（登録商標））を用いてほじり、２４ウエル組織培養プレート中でＣＨＯ選択培地で培養する。細胞がコンフルエントになると、血清非含有培地（ＣＨＯ選択培地−ＦＢＳ）を添加し、次に４８時間後に集める。これらの条件に付した培地を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いてウエスタンブロットにより抗体発現について分析して、αＯＰＧＬ−１  Ｈ鎖を検出し、ヤギ抗ヒトκ鎖抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）およびその後のＨＲＰ−共役ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、αＯＰＧＬ−１  Ｌ鎖を検出する。最も高度に発現するクローンを拡張させ、液体窒素中に貯蔵する。
【実施例３】
【０２０３】
αＯＰＧＬ−１の生成
細胞系１２５Ｑの調製および形成
αＯＰＧＬ−１を生成するＣＨＯ細胞を、血清非含有条件下に９６ウエルプレート中で２回限界希釈することによりクローニングする。クローンを、種々の懸濁容器中での生成および成長特性に基づいて選択する。ＥＩＡを行って、最高水準のαＯＰＧＬ−１を生成するクローンを選択する。次に、倍加時間および密度を含む成長特性を、１００ｍｌ、２５０ｍｌ、５００ｍｌ、１Ｌ、および３Ｌのスピナフラスコ中、および３ＬのＡｐｌｉｋｏｎ生物反応容器中でクローンを成長させることにより測定する。培地中で最高密度を達成する倍加時間が最も速いクローンを選択し、Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  １２５Ｑとする。クローンが拡張して、約１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬで３６０個のアンプルを凍結するのに充分な細胞を作成し、細胞を低温保存用の血清非含有培地（１０ｍｌ／Ｌ可欠アミノ酸および１０ｍｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＬＴＩ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を付加した９０％  ＶＭ−Ｓｏｙ  Ｂａｔｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（詳細は表３を参照）、および１０％ジメチルスルホキシド（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ））中に再懸濁し凍結する。アンプルを、接触制限装置中に貯蔵し、液体窒素デューア瓶中の液体窒素に漬ける。
【０２０４】
寸法の小さなスピナおよび寸法の大きな生物反応容器における成長および生産に基づき、αＯＰＧＬ−１の製造用の細胞系としてＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅ１２５Ｑを選択する。
【０２０５】
細胞培養
αＯＰＧＬ−１−κ／ｐＤＳＲα１９およびαＯＰＧＬ−１−ＩｇＧ２／ｐＤＳＲα１９からαＯＰＧＬ−１を発現するＣＨＯ細胞のクローン系であるＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅ１２５Ｑ中で発現することによりαＯＰＧＬ−１を生産する。αＯＰＧＬ−１用の細胞培養プロセスを図１９に示す。各生産ランについて、Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ１２５Ｑのバイアルからの細胞を、先ず、１２５ｍｌエルレンマイエルシェーカー中で１０ｍｌ／Ｌ非必須アミノ酸と１０ｍｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＬＴＩ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＶＭ−Ｓｏｙ  Ｓｕｐｐ）を補足したＶＭ−Ｓｏｙ  Ｂａｔｃｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（組成については表３を参照）５０ｍｌ中で１００ｒｐｍで５日間成長させる。次に、培地全体を用いて５００ｍｌスピナフラスコ中のＶＭ−Ｓｏｙ  Ｓｕｐｐに接種して３×１０５バイアル細胞／ｍｌ（３Ｅ５  ｖｃ／ｍｌ）とし、７０ｒｐｍで３日から４日間回転させつつ成長させる。次に、５００ｍｌスピナフラスコからの培地全体を用いて、３Ｌスピナフラスコ中のＶＭ−Ｓｏｙ  Ｓｕｐｐに接種して３Ｅ５  ｖｃ／ｍｌとし、７０ｒｐｍで３日から４日間回転させつつ成長させる。
【０２０６】
次に、３Ｌスピナフラスコからの培地を、フェノールレッドを含まないＶＭ−Ｓｏｙ  Ｓｕｐｐ中３Ｅ５ｖｃ／ｍｌにて二つの３Ｌスピナフラスコに分け、同じ条件下で成長させる。次に、これらのスピナフラスコ培地を用いて、フェノールレッドを含まないＶＭ−Ｓｏｙ  Ｓｕｐｐ中３Ｅ５ｖｃ／ｍｌにて四つさらなるスピナフラスコを接種し、同じ条件下に成長させる。四つの３Ｌスピナフラスコからの培地４Ｌを用いて、２０Ｌ生物反応器中でフェノールレッドを含まないＶＭ−Ｓｏｙ  Ｓｕｐｐの１０Ｌを接種し、生物反応器をフェッド−バッチモードで７日から１０日間運転する。フェッド−バッチモードにおいて、濃厚培地成分を含む栄養供給物（「供給物」、以下の表３に示す）を添加して細胞成長および生存能を維持する。
【０２０７】
次に、２０Ｌ生物反応器からの培地全体を用いて、１５０Ｌ生物反応器中でフェノールレッドを含まないＶＭ−Ｓｏｙ  Ｓｕｐｐの７０Ｌを接種し、生物反応器をフェッド−バッチモードで９日から１０日間運転する。最後に、１５０Ｌ生物反応器からの培地全体を用いて、２０００Ｌ生物反応器中で（サプリメントまたはフェノールレッドを含まない）ＶＭ−Ｓｏｙ約８８０Ｌを接種し、生物反応器をフェッド−バッチモードで運転する。フェッド−バッチモードの間の供給速度は、培地中のグルコース水準が各生物反応器について０．６ｇ／Ｌであるように決められる。細胞密度およびグルコース濃度を毎日測定し、それに従って供給速度を調節する。
【０２０８】
２０００Ｌ生物反応器中での生産を約２週間続け、その間に、その細胞によりαＯＰＧＬ−１が構成的に生産され、細胞培地中に分泌する。
【０２０９】
生成反応器を、設定ｐＨ、設定温度および設定溶解酸素水準に制御し、ｐＨは７．０とし、二酸化炭素ガスおよび炭酸ナトリウムの添加により制御され、溶解酸素は１２０ｍｍＨｇであり、空気、窒素および酸素ガス流により制御される。プロセス全体を通して細胞を３７℃に維持する。全てのガスを、孔寸法０．２２μｍ以下の薄膜フィルターを通す。
【０２１０】
生産の最後に、細胞ブロスをディスクスタック遠心分離器に入れ、培養上澄みを細胞から分離する。遠心分離物を、Ｃｕｎｏ  ９０ＳＰ深フィルターおよび続いて０．２μｍ  Ｐｏｓｉｄｙｎｅフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏ．）により、さらに清澄化する。清澄化条件に付した培地を、次に、５０ｋＤ  ＮＭＷＬ薄膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  ５０）を用いる接線フロー限外濾過（ＵＦ）により濃縮する。培養上清を１５倍から３０倍に濃縮する。得られた濃縮培養上清（ＣＣＭ）を、次に、精製によりまたは、後日の精製のための凍結により加工する。生産プロセスを図１９に要約する。
【０２１１】
細胞培養培地
全細胞培養プロセスを通して用いるための細胞培養培地は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ／Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１：１）に基づき、補足水準のアミノ酸、さらなる栄養および塩、大豆加水分解物および組換えヒトインスリン（Ｎｕｃｅｌｌｉｎ（登録商標）Ｚｎ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）を含む。成分を表３に列挙する。この培地をＶＭ−Ｓｏｙと呼ぶ。培地溶液を、使用前に０．２μｍ孔寸法の薄膜フィルターを通して濾過する。
【０２１２】
【表３】
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0005576903.tif 000009
【０２１３】
精製プロセス
ＣＨＯ細胞中に発現されたαＯＰＧＬ−１は、細胞外培地中に分泌される。一連の工程を用いて純粋な物質を生産することができる。このプロセスは、疎水性電荷誘導、カチオン交換、および低ｐＨ工程およびバイアルフィルターを用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いる。これらの手順を以下に記載する。
【０２１４】
Ａ．疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）
このクロマトグラフィー工程は、大部分の宿主細胞蛋白およびＤＮＡを除去する。濃縮培養上清（ＣＣＭ）を、Ｃｕｎｏ  ３０ＳＰフィルター、次にＣｕｎｏ  ＶＲ０７荷電セルロース系フィルターを通して濾過し、次に、ＭＥＰＨｙｐｅｒＣｅｌ樹脂上に乗せる。負荷後、カラムを、平衡緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．２）で洗う。抗体を、低ｐＨ緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０）を用いて樹脂から溶離する。カラムから溶離されると、生産物を、カラム溶出液の２８０ｎｍでの吸収に基づいて集める。
【０２１５】
Ｂ．ウイルス不活化
ＭＥＰプールを、ｐＨ３．７まで滴定し、約６０分間保持して汚染の可能性あるレトロウイルスを不活化する。保持工程に続いて、ｐＨを約６．０に調節する。
【０２１６】
Ｃ．ウイルス濾過
ｐＨ調節したプールを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＮＦＲフィルターまたは同等物を通して濾過する。抗体がフィルターを通過し、汚染可能性ウイルス５０ｎｍより大は維持される。
【０２１７】
Ｄ．カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
抗体を、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）または同等物を用いるカチオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製する。カチオン交換クロマトグラフィー工程は、さらなるＣＨＯ細胞蛋白、ＤＮＡ、低分子量蛋白、およびαＯＰＧＬ−１の凝集形状を除去する。ウイルス濾過プールを、カチオン交換樹脂上に負荷する。負荷後、カラムを平衡緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＭＥＳ  ｐＨ６．２）で洗う。次に、抗体を、塩が増加するリニアグラジエント（２０ｍＭ  ＮａＭＥＳ  ｐＨ６．２、０Ｍ  ＮａＣｌ〜２０ｍＭ  ＮａＭＥＳ  ｐＨ６．２、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で溶離する。カラムから溶離すると、カラム溶出液の２８０ｎｍでの吸収に基づき生産物を集める。
【０２１８】
Ｅ．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
抗体は、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０Ｓ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ）または同等物を用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーによりさらに精製される。疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、仕上げ工程として用いられ、さらなるＣＨＯ細胞蛋白、ＤＮＡ、低分子量蛋白および、αＯＰＧＬ−１の凝集形を除去する。カチオン交換プールを条件付けしてから、１５℃から２５℃で硫酸アンモニウムを添加して１０５ｍＳ／ｃｍを超える導電性にすることによりカラムに負荷する。負荷後、カラムを平衡緩衝液（１Ｍ  燐酸カリウム  ｐＨ８）で洗う。次に、抗体を、塩濃度が減少するリニアグラジエント（１Ｍ燐酸カリウム、０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８〜０Ｍ燐酸カリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８）で溶離する。カラムから溶離すると、カラム溶出液の２８０ｎｍでの吸収に基づき生成物を集める。
【０２１９】
Ｆ．濃縮およびダイアフィルトレーション
ＨＩＣカラムプールを濃縮し、５０ｋＤ  ＮＭＷＬ薄膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｂｉｏｍａｘ  ５０）を用いて接線フロー限外濾過により製剤緩衝液中にダイアフィルトレーションする。製剤緩衝席は、１０ｍＭ酢酸塩、５％ソルビトール、ｐＨ５．２およびαＯＰＧＬ−１を３０ｍｇ／ｍＬで含む。
【０２２０】
最終的濾過および貯蔵
精製されたバルクを、０．２２μｍ  ＰＶＤＦフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通し、サンプルを得、固定冷凍器において約−３０℃で貯蔵する。
【実施例４】
【０２２１】
αＯＰＧＬ−１の結合特異性
実施例１および２に記載のように二つの発現ベクターを形質移入したＣＨＯ細胞中において生産された抗体を、以下の実施例４、５および６において用いることができる。
【０２２２】
ラット、マウスおよびカニクイザル、並びにヒトにおいて、ヒトＯＰＧがＯＰＧＬに結合し中和する。αＯＰＧＬ−１はヒトＯＰＧＬに高い親和性で結合するが、ネズミＯＰＧＬにはあまり結合しない（表４）。
【０２２３】
【表４】
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【０２２４】
さらに、ヒトＯＰＧは、ＯＰＧＬ（Ｌａｃｅｙら著、１９９８年）にＤＮＡおよびアミノ酸配列相同性を示すＴＮＦファミリーの関連構成員である腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）（Ｔｒｕｎｅｈら著、２０００年）に弱い結合を示すことが報告された。しかしながら、ＯＰＧは、ＴＮＦα、ＴＮＦβまたはＣＤ４０リガンドのような他のＴＮＦ−関連蛋白に、検出可能に結合しない。
【０２２５】
αＯＰＧＬ−１は、ＥＩＡプレート上のＯＰＧＬに特異的に結合する（図７）。組換え可溶性ＯＰＧＬ（２μｇ／ｍｌ）を、室温で９６ウエルＥＩＡプレート上に１６時間から２４時間被覆する。ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックした後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ中に希釈された種々の濃度のαＯＰＧＬ−１（約２ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ）をウエルに添加し、プレートを室温で約２時間インキュベートする。結合した抗体を、ＴＭＢ−Ｈ２０２（テトラメチルベンジジンと過酸化水素）基質カクテルを用いてヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）−ＨＲＰで検出する。吸収を、４５０ｎｍおよび６５０ｎｍで読む。
【０２２６】
αＯＰＧＬ−１は、形質移入した細胞の表面に発現されているＯＰＧＬに特異的に結合する（図８）。ＦＡＣＳ緩衛液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０１％アジ化ナトリウム）中に希釈されたαＯＰＧＬ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）を、種々の濃度のＯＰＧＬ、ＴＮＦａ、ＴＮＦｂ、ＴＲＡＩＬまたはＣＤ４０リガンド（約０．１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ）で予備インキュベートし、次に、細胞表面上に膜結合ＯＰＧＬを安定に発現しているＣＨＯ細胞であるＣＨＯ  ＲＥＮ２１８−９細胞の約２００，０００個に添加する。２℃から８℃で１時間後、非結合抗体を、遠心分離および洗浄により除去する。次に、この細胞を、ＦＩＴＣ−標識Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃｙ断片特異的）と２℃から８℃で３０分間インキュベートする。遠心分離および洗浄後、フローサイトメトリーを用いて細胞表面蛍光を測定する。図８は、ＣＨＯ  ＲＥＮ２１８〜９細胞へのαＯＰＧＬ−１の結合が特異的で、可溶性ＯＰＧＬの添加により競合的に低下されるが、ＴＮＦａ、ＴＮＦｂ、ＴＲＡＩＬまたはＣＤ４０リガンドの添加によっては低下しないことを示している。
【０２２７】
競合実験において、ＥＩＡプレート上のＯＰＧＬへのαＯＰＧＬ−１の結合は、外因性ＯＰＧＬの添加により阻害される（図９）が、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＴＲＡＩＬまたはＣＤ４０リガンドの添加によっては阻害されない（図１０）。この手順は、ＯＰＧＬ被覆プレートに添加する前に一定濃度のαＯＰＧＬ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）を種々の濃度の可溶性ＯＰＧＬまたは他のリガンド（各々について約１ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌ）と予備インキュベートする以外は、ＥＩＡプレート上のＯＰＧＬにαＯＰＧＬ−１を結合させるために前述したものと実質的に同じ方法で行う。
【実施例５】
【０２２８】
αＯＰＧＬ−１中和活性
破骨細胞形成の阻害
ＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−７１、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）は、Ａｂｅｌｓｏｎネズミ白血病ウイルス誘発腫瘍から誘導されたネズミマクロファージ細胞系である。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＯＰＧＬの存在下に、破骨細胞様細胞に分化する。ＯＰＧＬの存在下におけるＲＡＷ細胞からの培養中の破骨細胞の生成についての基本的アッセイが、Ｓｉｍｏｎｅｔら著（１９９７年）Ｃｅｌｌ第８９巻、３０９頁およびＬａｃｅｙら著（１９９８年）Ｃｅｌｌ第９３巻、１６５頁に詳細に記載されており、これを任意の目的のために参照してここに組み込まれる。
【０２２９】
ＲＡＷ細胞をリガンドにより刺激して破骨細胞様細胞に分化させる。分化は、破骨細胞の特性であるＴＲＡＰ活性により測定することができる。すなわち、破骨細胞発生へのαＯＰＧＬ−１の効果を測定することができる。
【０２３０】
ＲＡＷ細胞を、細胞培養培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、０．２９２ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−Ｇｌｕｔ、１００単位／ｍｌ  ペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌ  硫酸ストレプトマイシン）中、一定量のＯＰＧＬ−１（４０ｎｇ／ｍｌ）および種々の量のαＯＰＧＬ−１（６．３ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌ）の存在下に、４日間インキュベートする。４日の最後に、細胞を、透過性化および酸性化により、酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性について染色し、続いて、パラニトロフェニルホスフェートで５分間処理する。簡単に説明すると、培地を細胞から吸引除去し、クエン酸塩緩衝液（４１０ｍｌ  ０．１Ｍクエン酸、０．１Ｍクエン酸塩５９０ｍｌ、三ナトリウム塩、１ｍＬ  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）１００μｌを各ウエルに添加し、プレートを室温で３分から５分間インキュベートする。次に、ＲＮＰＰ１００μｌを添加（酸ホスファターゼ試薬（Ｓｉｇｍａ  １０４〜１００）１５７．８ｍｇ、酒石酸塩溶液（Ｓｉｇｍａカタログ番号３８７〜３）７．２ｍｌ、およびクエン酸塩緩衝液２２．８ｍｌ）し、プレートを室温で３分から５分間インキュベートする。反応を、０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液５０μｌの添加により終了させる。
【０２３１】
ＴＲＡＰは、パラニトロフェニルホスフェートをパラニトロフェノールに転換し、これは、４０５ｎｍで光学濃度を測定することにより定量化することができる。ＴＲＡＰ活性は、破骨細胞発生の代理マーカーであり、従って、４０５ｎｍでの光学濃度に関連する。光学濃度対αＯＰＧＬ−１濃度のプロットを図１１に示す。このアッセイにおいてαＯＰＧＬ−１が破骨細胞形成を阻害することを示す。
【０２３２】
ＯＰＧＬの受容体への結合の阻害
αＯＰＧＬ−１の性能を、ＯＰＧリガンドの、その同族受容体である、破骨細胞分化および活性化受容体（ＯＤＡＲ、ＲＮＡＫとしても知られている）への結合を阻害する性能により示す。このアッセイは、均質時間分解蛍光共鳴（ＨＴＲＦ）を用いて、ユーロピウム結合オステオプロテゲリンリガンド（Ｅｕ−ＯＰＧＬ）へのαＯＰＧＬ−１の結合を検出する。αＯＰＧＬ−１が、ＯＤＡＲへのＥｕ−ＯＰＧＬの結合を阻害すると、蛍光出力は減少し、存在するαＯＰＧＬ−１の量は、蛍光量と逆相関する。
【０２３３】
ＯＰＧＬを、３３７ｎｍの光で励起させると、６２０ｎｍで発光するユーロピウムで標識する。ＯＤＡＲをＦＬＡＧおよびＦｃに融合し、Ｆｃ−ＯＤＡＲ−ＦＬＡＧ融合蛋白を、６２０ｎｍの光で励起させると、６６５ｎｍ光を発する蛍光体であるアロフィコシアニン（ＡＰＣ）に結合した抗ＦＬＡＧ抗体で標識する。従って、Ｅｕ標識ＯＰＧリガンドがＦｃ−ＯＤＡＲ−ＦＬＡＧ／抗−ＦＬＡＧ−ＡＰＣ複合体に結合した場合、３３７ｎｍの光で励起したとき、３次複合体が６６５ｎｍ光を発する。
【０２３４】
０．０５μｇ／ｍｌのＥｕ−ＯＰＧＬを、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  ＮａＮ３、０．１％ＢＳＡ、および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）中の種々の濃度（０．１ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍｌ）のαＯＰＧＬ−１と共に、室温で約１時間、予備インキュベートする（予備インキュベーション混合物）。Ｆｃ−ＯＤＡＲ−ＦＬＡＧ（１μｇ／ｍｌ）と抗−ＦＬＡＧ−ＡＰＣ（２．５μｇ／ｍｌ）の混合物もアッセイ緩衝液中に調製し、室温で１時間インキュベートする（蛍光色素混合物）。次に、等体積の予備インキュベーション混合物および蛍光色素混合物を組み合わせ、室温で３時間インキュベートする。蛍光を、３３７ｎｍの励起波長および６６５ｎｍの発光波長を用いてＰａｃｋａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＴＲＦマイクロプレート分析器上でプレートを読むことにより測定する。
【０２３５】
αＯＰＧＬ−１をＥｕ−ＯＰＧリガンドと予備インキュベートし、次にＦｃ−ＯＤＡＲ−ＦＬＡＧ／抗−ＦＬＡＧ−ＡＰＣと混合したとき、６６５ｎｍでの蛍光強度が、図１２に示すように、投与量依存的に低下する。これは、αＯＰＧＬ１６２がＯＤＡＲへのＯＰＧＬの結合を効果的に阻害し得ることを示している。
【実施例６】
【０２３６】
カニクイザルにおける薬物動態
４．５歳以下で２ｋｇから４ｋｇの６匹の雄および６匹の雌のカニクイザルを、四つの投与群に割り当てる。第１群は３匹の雄と３匹の雌からなる。第２、第３および第４群は、各々、１匹の雄と１匹の雌からなる。第１群の動物は、１ｍｇ／ｋｇ  αＯＰＧＬ−１の単一ＳＣ投与量を投与し、第２、第３および第４群の動物は、それぞれ０．１、１．０または１０．０ｍｇ／ｋｇ  αＯＰＧＬ−１の単一ＩＶ投与量を投与する。
【０２３７】
動物に、形質移入したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞から発現したαＯＰＧＬ−１を投与する。αＯＰＧＬ−１水準の決定、抗体の分析、および骨代謝回転マーカー血清Ｎ−テロペプチド（血清Ｎ−Ｔｘ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）および血清カルシウム（血清Ｃａ）の分析のために血清サンプルを採取する。Ｎ−テロペプチド（尿Ｎ−Ｔｘ）およびクレアチニンの分析のために尿も採取する。
【０２３８】
ＩＶ投与後の血清濃度−時間プロフィールを、三相分布により特徴付ける（図１３）。最初に、迅速分布相があり、次に濃度依存的に見えるかなり遅いプラトー相がある。第三観測相は、迅速排除相である。
【０２３９】
サルにおけるαＯＰＧＬ−１の薬物動態を調べるために、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（ｖ１．５）を用いる完全血清濃度−時間プロフィールの非区分分析、および１００００ｎｇ／ｍｌを越える試験品投与後１４日までのデータをＳＡＡＭＩＩ（ｖ１．１．２）を用いて指数分析を用いる。全てのＩＶ投与からの分布の初期体積は、血漿体積と同様に平均２８．９ｍｌ／ｋｇである。分布の定常状態体積（ＶＳＳ）は、全てのＩＶ投与において平均３９ｍｌ／ｋｇである。指数分析は、αＯＰＧＬ−１が、６．０２時間の平均分布半減期（ｔ１／２α）、０．１ｍｇ／ｋｇの投与量での８６．９時間から１０．０ｍｇ／ｋｇの投与量で最大値４４４時間に、投与量と共に増加する半減期（ｔ１／２β）を有する、拡張した二次相を有することを示す。終末排除半減期（ｔ１／２ｚ）は、全てのＩＶ投与群を通じて非区分の平均３１時間を推定した。αＯＰＧＬ−１のクリアランスは、非線形であると分かり、動物は、０．１ｍｇ／ｋｇ（０．４０１ｍｌ／時間／ｋｇ）を投与したものより３．３倍低い平均クリアランス（０．１２０ｍｌ／時間／ｋｇ）を有する１０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与を受ける。
【０２４０】
皮下投与後、吸収は低く、１３２時間において平均ピーク濃度（Ｃｍａｘ）は１１，６００ｎｇ／ｍｌである。ＳＣ投与後の曝露範囲に高い可変性があり、その結果、平均クリアランスが０．３８７±０．２８１ｍｌ／時間／ｋｇとなり、２０２±８０．１時間の滞留時間を示す。平均生物学的利用率は８９％である。
【０２４１】
前記データを表５に要約する。
【０２４２】
【表５】
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【０２４３】
αＯＰＧＬ−１は、投与後２４時間以内に血清Ｎ−Ｔｘ水準の迅速増加を引き起こす（図１４）。最大効果の平均時間は、ＩＶ投与量が０．１から１０ｍｇ／ｋｇに増えるのにしたがい投与後１２時間から７日の間に生じることが観察され、１．０ｍｇ／ｋｇのＳＣ投与を受ける動物においては１２時間から１１日の間に生じることが観察される。最大効果は、０．１ｍｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇの投与範囲にわたって、投与量と共に約８０から９１％に増加する。しかしながら、より高い投与量においては、さらなる抑制が観察されず最大阻害率が９１％である。血清Ｎ−Ｔｘの平均水準は、０．１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶの投与後２８日までに、および１ｍｇ／ｋｇ  ＳＣの投与後７０日までにベースラインに戻る。尿Ｎ−Ｔｘは、１０５日目の検査により全ての群がベースラインに戻ることを除いて血清Ｎ−Ｔｘと同様の傾向を示す（図１５）。
【０２４４】
投与量に従う血清Ｃａの抑制は、１０．０ｍｇ／ｋｇのＩＶ投与後平均７日で、ベースラインを３１．６％下回る平均最下点に増加する。全ての他の投与群は、血清Ｃａがベースライン平均から平均２６．４％未満低下する。１７日目までに、処理した動物中の全ての血清Ｃａ水準は、それらのベースライン平均の１０％以内に戻る（図２０）。
【０２４５】
骨再吸収および形成は密切に関連しているので、骨形成マーカー（ＡＬＰ）の変化が観察され、ＡＬＰ水準は、形成マーカーＮ−Ｔｘの場合よりも、かなりゆっくり低下し、したがってより長時間抑制される（図２１）。αＯＰＧＬ−１の投与に続いて骨形成マーカー（ＡＬＰ）の前に骨再吸収マーカーが減少することは、αＯＰＧＬ−１が骨抗再吸収性剤であることを確認している。
【０２４６】
動物の大部分（１２匹中の９匹）がαＯＰＧＬ−１への抗体を発現する。αＯＰＧＬ−１への抗体の発生率は、投与量または経路依存的ではない。投与群が抗体陰性および陽性動物の両方を有さないと、０．１ｍｇ／ｋｇを超えるαＯＰＧＬ−１薬物動態への、αＯＰＧＬ−１に対する抗体の効果を評価することができない。０．１ｍｇ／ｋｇ  ＩＶでは、αＯＰＧＬ−１の大部分が、抗体発生前に除去され、従って、αＯＰＧＬ−１処理への影響が観察されない（図１６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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