(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１または２で示されるウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸であって、該配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を有し、
前記システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）をエンコードする配列は、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）をエンコードする配列、または、Ｐｏｌ７１１エピトープをエンコードする配列の挿入によって中断されている、前記ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項２】
配列番号：３または４で示されるウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸であって、該配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を有し、
前記ベーシック・ドメイン（ＢＤ）をエンコードする配列は、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）をエンコードする配列、または、Ｐｏｌ７１１エピトープをエンコードする配列の挿入によって中断されている、前記ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項３】
配列番号：５で示されるウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸であって、該配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を有し、
前記システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）をエンコードする配列は、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）をエンコードする配列の挿入によって中断されており、
前記ベーシック・ドメイン（ＢＤ）をエンコードする配列は、Ｐｏｌ７１１エピトープをエンコードする配列の挿入によって中断されている、前記ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項４】
配列番号：６で示されるウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸であって、該配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域域を有し、
前記システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）をエンコードする配列は、Ｐｏｌ７１１エピトープをエンコードする配列の挿入によって中断されており、
前記ベーシック・ドメイン（ＢＤ）をエンコードする配列は、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）をエンコードする配列の挿入によって中断されている、前記ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項５】
配列番号：７で示されるウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸であって、該配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を有し、ＴａｔのＤＮＡ配列の、前記Ｃ末端領域をエンコードする配列と前記エクソンＩＩ領域との間に、合成イントロンの配列が挿入されている、前記ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項６】
前記ＴａｔのＤＮＡは、ＨＩＶ−１のサブタイプＣである、請求項１から請求項５までの何れか一項に記載のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項７】
配列番号：８に示されたＤＮＡ配列からなる核酸からなる合成イントロン。
【請求項８】
配列番号：１、２、３、４、５または６に示されるウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸であって、Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を有する前記核酸の前記Ｃ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に、配列番号：８に示される合成イントロンの配列が挿入されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項９】
前記ＴａｔのＤＮＡは、ＨＩＶ−１のサブタイプＣに由来する、請求項８に記載のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項１０】
配列番号：１、２、３、４、５、６または７に示されるウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸であって、該配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を有し、
ＴａｔのＤＮＡ配列の前記システイン・リッチ・ドメイン、前記ベーシック・ドメインまたは前記コア・ドメインをエンコードする配列への、ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープをエンコードする配列の挿入により、または、前記ＴａｔのＤＮＡ配列の前記Ｃ末端領域をエンコードする配列と前記エクソンＩＩ領域との間への、合成イントロンの配列の挿入により、前記ＴａｔのＤＮＡ配列が非毒性および免疫原性になる、前記ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項１１】
前記ＴａｔのＤＮＡは、ＨＩＶ−１のサブタイプＣに由来する、請求項１０に記載のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項１２】
前記ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープは、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）およびＨＩＶ−１  Ｐｏｌ７１１からなる群から選択される、請求項１０に記載のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項１３】
前記ＰＡＤＲＥは、破傷風トキソイドに由来し、そして前記Ｐｏｌ７１１は、ＨＩＶ−１ポリメラーゼに由来する、請求項１２に記載のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項１４】
前記ＴａｔのＤＮＡ配列は、前記ウイルスのＣＲＤ、ＢＤおよびコア・ドメインを含む前記Ｔａｔの重要なドメインの構造的中断の結果として、宿主にとって非毒性である、請求項１０に記載のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸。
【請求項１５】
配列番号：１、２、３、４、５、６または７に示される非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸であって、前記ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインあるいはこれらのドメインのいずれかの組み合わせをエンコードする配列に、ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープをエンコードする配列が挿入されることにより、または、前記ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域をエンコードする配列とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンの配列が挿入されることにより、前記ＴａｔのＤＮＡ配列が非毒性および免疫原性になる、前記ＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸を取得する方法であって、
ａ）前記ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインあるいはこれらのドメインのいずれかの組み合わせをエンコードする配列に、ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープをエンコードする配列を挿入する、または、前記ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域をエンコードする配列とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンの配列を挿入するためのプライマーを採用することによりオーバーラップＰＣＲ法を行う段階と、
ｂ）配列番号：１、２、３、４、５、６または７に示されるＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸を取得する段階、ここで、該ＴａｔのＤＮＡ配列は、前記ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインをエンコードする配列中に挿入されたＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープをエンコードする配列、または、前記ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域をエンコードする配列とエクソンＩＩ領域との間に挿入された合成イントロンの配列を含む、
を有する、前記方法。
【請求項１６】
前記プライマーは、配列番号：２３、２６、２７、２８、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４またはこれらのいずれかの組み合わせで示される配列から選択され、ここで、配列番号：２３、２７、３７、３９、４１および４３で示される配列からなる核酸はフォワードプライマーであり、そして、配列番号：２６、２８、３８、４０、４２および４４で示される配列からなる核酸はリバースプライマーである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＴａｔのＤＮＡは、ＨＩＶ−１のサブタイプＣに由来する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープは、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）およびＨＩＶ−１  Ｐｏｌ７１１からなる群から選ばれる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＰＡＤＲＥは、破傷風トキソイドに由来し、前記Ｐｏｌ７１１は、ＨＩＶ−１ポリメラーゼに由来する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
配列番号：１、２、３、４、５、６または７に示される非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸を有する発現ベクターであって、該配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を含み、
前記Ｔａｔの配列は、前記ＴａｔのＤＮＡ配列の前記システイン・リッチ・ドメイン、前記ベーシック・ドメインまたは前記コア・ドメインをエンコードする配列中に、ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープをエンコードする配列が挿入され、または、前記ＴａｔのＤＮＡ配列の前記Ｃ末端領域をエンコードする配列と前記エクソンＩＩ領域との間に合成イントロンの配列が挿入されることで遺伝子操作されており、
ＥＦ−１α、β−アクチン、ＥＧＲ１、ｅＩＦ４Ａ１、ＦｅｒＨ、ＦｅｒＬ、ＧＡＰＤＨ、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＨＳＰ７０、β−Ｋｉｎ、ＰＧＫ−１、ＲＯＳＡ、ユビキチンＢ、またはユビキチンＣ、もしくはこれらのいずれかの組み合わせを含むユビキタスな細胞性プロモーターを有する、前記発現ベクター。
【請求項２１】
前記ユビキタスな細胞性プロモーターが、ＥＦ−１αプロモーターである、請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
リン酸緩衝食塩水中の、配列番号：１、２、３、４、５、６または７に示される非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸を有するワクチンであって、前記ＴａｔのＤＮＡ配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を有し、
前記Ｔａｔの配列は、前記ＴａｔのＤＮＡ配列の前記システイン・リッチ・ドメイン、前記ベーシック・ドメインまたは前記コア・ドメインをエンコードする配列中に、ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープをエンコードする配列が挿入されることにより、または、前記ＴａｔのＤＮＡ配列の前記Ｃ末端領域をエンコードする配列と前記エクソンＩＩ領域との間に合成イントロンの配列が挿入されることにより、非毒性および免疫原性になる、前記ワクチン。
【請求項２３】
前記ＴａｔのＤＮＡは、ＨＩＶ−１のサブタイプＣに由来する、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
前記ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープは、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲ
Ｅ）およびＨＩＶ−１  Ｐｏｌ７１１からなる群から選ばれる、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２５】
前記ＰＡＤＲＥは、破傷風トキソイドに由来し、そして前記Ｐｏｌ７１１は、ＨＩＶ−１ポリメラーゼに由来する、請求項２４に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記ＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸は、ＣＲＤ、ＢＤおよびコア・ドメインを含むＴａｔの重要なドメインの構造的中断の結果として、宿主にとって非毒性である、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２７】
配列番号：１、２、３、４、５、６または７に示される非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸であって、該ＴａｔのＤＮＡ配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を有し、
前記ＴａｔのＤＮＡ配列の前記システイン・リッチ・ドメイン、前記ベーシック・ドメインまたは前記コア・ドメインをエンコードする配列への、ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープをエンコードする配列の挿入により、または、前記ＴａｔのＤＮＡ配列の前記Ｃ末端領域をエンコードする配列と前記エクソンＩＩ領域との間への、合成イントロンの配列の挿入により、前記ＴａｔのＤＮＡ配列が非毒性および免疫原性になる、前記ＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸を有するワクチンを取得する方法であって、
前記ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸を、リン酸緩衝食塩水に溶解させて、前記ワクチンを取得する行為を有する、前記方法。
【請求項２８】
リン酸緩衝食塩水中の、配列番号：１、２、３、４、５、６または７に示される非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列からなる核酸を有するワクチンを備えるキットであって、前記ＴａｔのＤＮＡ配列は、
Ｎ末端領域と、
システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、
コア・ドメインと、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、
Ｃ末端領域と、
をエンコードし、そして、
エクソンＩＩ領域を有し、
前記Ｔａｔの配列は、前記ＴａｔのＤＮＡ配列の前記システイン・リッチ・ドメイン、前記ベーシック・ドメインまたは前記コア・ドメインをエンコードする配列に、ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープをエンコードする配列が挿入されることにより、または、前記ＴａｔのＤＮＡ配列の前記Ｃ末端領域をエンコードする配列と前記エクソンＩＩ領域との間に合成イントロンの配列が挿入されることにより、非毒性および免疫原性になる、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非毒性免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列（ｎｏｎ  ｔｏｘｉｃ，  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｖｉｒａｌ  Ｔａｔ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に関する。ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン（Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｄｏｍａｉｎ）、ベーシック・ドメイン（Ｂａｓｉｃ  ｄｏｍａｉｎ）またはコア・ドメイン（Ｃｏｒｅ  ｄｏｍａｉｎ）にＴヘルパー・エピトープ（Ｔ−Ｈｅｌｐｅｒ  Ｅｐｉｔｏｐｅ）を挿入することによって、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になる。また、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）とエクソンＩＩ領域（Ｅｘｏｎ  ＩＩ  ｒｅｇｉｏｎ）との間に合成イントロン（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｉｎｔｒｏｎ）を挿入することによって、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になる。本発明は、また、伸長因子プロモーター・コンストラクト（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ）およびその方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）に関する。また、本発明は、非毒性免疫原性のＴａｔのＤＮＡ配列およびワクチンを得る方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）、ならびに、その方法（ｍｅｔｈｏｄ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔａｔワクチンに取り組んでいる主要な研究所の多くは、基本的なことに注意を払ってこなかった。（１）彼らは、ウイルス感染を制御するために、Ｔａｔはたんぱく質またはトキソイド（ｔｏｘｏｉｄ）としてではなく、ＤＮＡワクチンとして、免疫系に提示されなければならないという事実を見落としていた。（２）これらの研究者は、Ｔａｔを免疫優勢にする、Ｔａｔの免疫調節（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）の重要性を過小評価していた。（３）重要なことには、Ｔａｔを調節して（ｍｏｄｕｌａｔｅ）その有毒性（ｔｏｘｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を弱めるまたは軽減することの必要性を軽視して、ワクチンの中に天然の（ｎａｔｉｖｅ）Ｔａｔを用いる研究者もいた。Ｔａｔを弱毒化することの重要性に気付いていても、Ｔａｔの化学的修飾（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ）によりＴａｔ毒素（Ｔａｔ  ｔｏｘｏｉｄ）のより毒性の少ない形態（ｌｅｓｓ  ｔｏｘｉｃ  ｆｏｒｍ）に変換するという間違った方策をとる研究者もいた。Ｔａｔ毒素は、ワクチン接種（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ）においてＴａｔ毒素が誘導するであろう免疫反応の質において、天然のＴａｔ（ｎａｔｉｖｅ  Ｔａｔ）とは異なることが知られている。
【０００３】
ｅｎｖのような構造タンパク質（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）が伝統的に多数派を占めるＨＩＶワクチン設計：
ＨＩＶワクチンの開発は、ｅｎｖ、ｇａｇおよび調節タンパク質（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｎｅｆのような免疫優勢の構造タンパク質を当てにしていた。確かに、ｅｎｖに対する抗体反応は、エントリレベルにおける感染率の抑制または軽減に重要な意味を持つ。最近の研究は、生体内の（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ウイルスの増殖抑制における、ｇａｇに対する細胞媒介性の（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）免疫反応の重要性を明らかにしている(Kiepiela et al., 2007;Novitsky et al., 2003;Novitsky et al., 2006)。一方、ｇａｇワクチンは防御免疫反応（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘導することができなかったという証拠もまた報告されている(Saini et al., 2007;Putkonen et al., 1998)。Ｔａｔとｇａｇの霊長類モデルにおける免疫反応を付き合わせて比較すると、ｇａｇではなくＴａｔに対する免疫反応が、ウイルス攻撃（ｖｉｒａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）からの防御をもたらした (Stittelaa et al., 2002)。ワクチンの設計において、Ｎｅｆのような抗原を含めることは、危険を伴う。なぜならば、Ｎｅｆは付属タンパク質であり（ｅｎｖ、ｇａｇ、Ｔａｔとは異なり、必須タンパク質ではない）、その存在は、ウイルスの生存にとって重要な意味を持たず、ウイルスは効果的にＮｅｆに対する耐性を獲得しうる。ｅｎｖワクチンは、自己移植の（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）ウイルス株からの防御を与えるけれども、抗原性変異（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、ワクチン設計にとって課題である(Osmanov et al., 1996)。さらに、ｅｎｖおよびその他の構造抗原（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）を用いた治験の大半は予防効果（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）をもたらしていない(Veljkovic et al., 2003;Kaiser, 2008;Bubnoff, 2007;Steinbrook, 2007)。
【０００４】
多成分ＨＩＶワクチンの必要性：
このような状況において、ＨＩＶワクチンの設計において、多重抗原（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）を含めること、および、個々の抗原のそれぞれを有効な免疫反応に最適化することが不可欠である。多重ウイルス抗原（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ）を組み込むことで、ウイルス感染に対するより広い免疫反応を誘導するために、多成分ワクチンを開発することの必要性がますます実感されている(Ho and Huang, 2002)。さまざまな研究所が提供している多数の研究は、ウイルスの構造タンパク質、ｇａｇおよびｐｏｌ、ならびに、ウイルスの調節タンパク質Ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖをワクチン開発の有力候補として認識している(Calarota et al., 1999;Evans et al., 1999;Putkonen et al., 1998)。これらのｅｎｖ以外の候補のうち、Ｔａｔは、様々な理由により、特別な地位を占めている。
【０００５】
ＨＩＶワクチンの開発におけるＴａｔの重要性：
まず第１に、ウイルスの感染性にとってのこのウイルス抗原（ｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）の機能的な重要性(Gallo, 1999;Jeang et al., 1999;Rubartelli et al., 1998;Rusnati and Presta, 2002)、および、Ｔａｔに対する免疫反応と疾患進行との間に逆相関関係があること(Allen et al., 2000;Re et al., 1995;Re et al., 2001;Reiss et al., 1990;Zagury et al., 1998b;van Baalen et al., 1997)が、Ｔａｔを重要な候補ワクチン（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）たらしめている。いくつかの研究によれば、Ｔａｔに対する体液性または細胞性の免疫反応が、疾患進行またはウイルス量（ｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ）に効果があるらしいと指摘されている。(Richardson et al., 2003;Re et al., 2001;Zagury et al., 1998b;van Baalen et al., 1997;Re et al., 1996;Rodman et al., 1992;Reiss et al., 1990;Wieland et al., 1990)。なお、そのような効果が見られなかったことを示す研究もある(Senkaali et al., 2008)。Ｔａｔは、ウイルスのライフサイクルにおける早い時期に発現させられ、そして、ウイルスの感染性および病原性にとって機能的に重要である(Jeang et al., 1999)。ウイルスの遺伝子発現を調節することに加えて、Ｔａｔは、宿主の様々な遺伝子の発現を調節する。さらに、Ｔａｔは細胞外に分泌され、細胞外のＴａｔは、ウイルスの潜伏に影響を与え、疾患進行に寄与する(Noonan and Albini, 2000)。ウイルスのライフサイクルにおいて早期に発現させられ、細胞外に分泌されることから、Ｔａｔに対する体液性免疫反応および細胞性免疫反応を誘導することは、重要な意味をもつ(Goldstein, 1996;Rusnati and Presta, 2002)。最後に、その多面的な生物学的機能（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）ゆえに、その生物学的機能への免疫成分の阻害作用を研究するための様々な機能分析がＴａｔに使用可能である。
【０００６】
Ｔａｔのシステイン・リッチ・ドメインおよびベーシック・ドメインによるＴａｔの重要な生物学的機能の調節：
ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質は、２つのエクソンによってコードされた１０１のアミノ酸残基からなる小さなポリペプチドである。多くの転写因子と同様に、Ｔａｔは構造的に柔軟性があり(Dyson and Wright, 2005)、結果として、その結晶構造をＸ線結晶学で決定することはできなかった。ＮＭＲ分光法によるＴａｔの構造予測は、Ｔａｔ中の明らかな２次構造の欠落を示唆している(Peloponese, Jr. et al., 2000;Gregoire et al., 2001;Shojania and O'neil, 2006)。アミノ酸分散（ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）の性質によって、Ｔａｔのエクソン−１の中に、５つの保存機能ドメイン（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ）が特定された(Jeang et al., 1999)。これらは、以下を含む。（１）１−２１残基からなるプロリンに富んだＮ末端領域（ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）はαヘリカル構造を前提とすると予想され、（２）２２−３７残基からなるシステイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）は分子内ジスルフィド結合を形成し、（３）３８−４８残基からなるコア・ドメインは第３のドメインを形成し、（４）ベーシック・ドメインは４９−５７残基からなり、そして、（５）５８−７２残基からなるＣ末端領域はグルタミンに富む。ＣＲＤとコア・ドメインは、ウイルスのプロモーター・トランス活性化を調節する活性化ドメインを一緒に構成する(Jeang et al., 1999)。加えて、ＣＲＤは、リンパ球走化性（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ）(Albini et al., 1998)および細胞アポトーシスの誘発を含むより多くの機能を調節する(Mishra et al., 2007)。アルギニンに富んだベーシック・ドメイン（ＢＤ）は、Ｔａｔのいくつかの重要な生物学的機能を調節する。これらの機能には、Ｔａｔの核局在化、細胞に出入りするときの細胞膜の貫通（ｃｒｏｓｓｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、ＨＩＶのＴＡＲのｍＲＮＡ中のウリジンに富んだバルジモチーフへの結合（ｕｒｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｂｕｌｇｅ  ｍｏｔｉｆ）、および、Ｔａｔの二量化のための機能が含まれる。
【０００７】
様々な分子戦略（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）を包含することによるワクチン性能の最適化：
異なる種類のワクチンの性能を向上させるために、幅広い分子戦略が採用されてきた。その方策（ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ）は、タンパク質の発現、転写産物の安定化、抗原処理および抗原提示、抗原輸送、免疫調節ファクターの同時投与（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、生来の免疫成分（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）のリクルート、ならびに、さらに多くを改善するための実に多彩な方策を含む。これらのすべてを検討することは、このセクションの範囲を超える。ｐａｎ抗原ＤＲエピトープ（ｐａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＤＲ  ｅｐｉｔｏｐｅ）（ＰＡＤＲＥ）、ユニバーサルなＨＬＡ−ＤＲ結合ペプチド（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＨＬＡ  ＤＲ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）(Alexander et al., 1994b)またはそのほかのＴヘルパー・エピトープを抗原の中に組み込んで、抗原特異的な（ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）免疫反応を強化することは、多くのグループによって広範囲に用いられた分子戦略の１つである(Alexander et al., 1998)。ペプチド抗原は免疫原性がより小さいことから、ＨＩＶ−１  ｅｎｖのワクチンを含めて(Belyakov et al., 1998)、ワクチンの免疫原性を強化するのに、ＰＡＤＲＥエピトープが幅広く用いられてきた (Beebe et al., 2007;Decroix et al., 2002;Fitzmaurice et al., 1996;Hsu et al., 1999;Olszewska et al., 2000)。いくつかの実施例はあるものの、Ｔヘルパー・エピトープのタンパク質ワクチンへの利用は、あまり一般的ではない (Greenstein et al., 1992;Rosa et al., 2004)。病原体に由来する糖鎖ワクチン（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）は、本来、免疫原性が非常に小さいので、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）をＰＡＤＲＥエピトープに接合することで免疫原性を示すようになる(Alexander et al., 2004;Belot et al., 2005)。粘膜ワクチンへのＰＡＤＲＥの利用が報告されている(Decroix et al., 2002;Belyakov et al., 1998)。Ｔヘルパー・エピトープと分子的に結合した癌特異的ペプチドまたは抗原を作り出すことによって、様々な種類の癌に対して、多くの努力が向けられてきた(Beebe et al., 2007;Mansour et al., 2007;Stevenson et al., 2004b;van Bergen et al., 2000)。ＨＩＶ−１を含む(Gorse et al., 2008;Newman et al., 2002)ウイルスの感染に対するＤＮＡワクチンの能力を増加させる目的で、ＤＮＡワクチンにＴヘルパー・エピトープを組み込むことがなされてきた(Hsu et al., 1999;Gao et al., 2004;Hung et al., 2007;Kim et al., 2007)。１００以上の異なる抗原がＰＡＤＲＥエピトープのキメラとして発現したとき、実験動物中で、高い抗体力価を有するポリクローナル抗血清が産生され、ヘルパーＴ（Ｔ−ｈｅｌｐ）の、様々な抗原への包括的で幅広い応用が示唆された(Chambers and Johnston, 2003)。ＰＡＤＲＥ・Ｔヘルパー・エピトープを介したヘルパーＴのリクルートもまた、寄生虫感染(Rosa et al., 2004)およびアルツハイマー病(Agadjanyan et al., 2005)または実験的自己免疫性脳炎(Uyttenhove et al., 2004)のような自己免疫疾患に対して報告されている。
【０００８】
既存のＴａｔワクチンの欠点：
その全てのメリットにもかかわらず、Ｔａｔワクチンの最初の試みは限られた範囲の成果しか得られず、候補ワクチンとしてのＴａｔの原理の通り、懸念事項があった。Ｔａｔワクチンが期待された成果をもたらさなかった第１の理由は、従来の方策がワクチン設計における基本を無視したことにある。Ｔａｔが予防ワクチンまたは治療ワクチンとして機能することを期待する前にいくつかの技術的課題に取り組むべきである。Ｔａｔワクチンの重大な欠点のいくつかは、３つのカテゴリーに大まかに分類することができ、簡単に述べると以下のようになる。（ａ）Ｔａｔに対する免疫反応の弱さ、（ｂ）Ｔａｔは毒素であり、免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）であるので、安全性に対する懸念があること、および、（ｃ）タンパク質としての抗原提示が限局的であることである。
【０００９】
（ａ）Ｔａｔは免疫優勢でない：
Ｔａｔは小さな核タンパク質であり、潜在的なＴヘルパー・エピトープ（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ）に乏しい。Ｔヘルパー・エピトープは、Ｔａｔ中に位置づけられている（ｍａｐｐｅｄ）けれども(Blazevic et al., 1993;Ramakrishna et al., 2004;Ranki et al., 1997;Silvera et al., 2002)、いくつかの証拠によれば、自然感染においては、これらのＴヘルパー・エピトープが十分に強くない可能性が示唆されている。血清反応が陽性である被験者の一部、（ＪＮＣＡＳＲ研究所からのデータでは）１０〜１５％だけが、アンチＴａｔ体液性免疫反応を示した(Krone et al., 1988;Reiss et al., 1990;Wieland et al., 1990)。これらの被験者のうち、少数の者だけがＩｇＧに対してアイソトープ・スイッチ（ｉｓｏｔｏｐｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を示した。これは、有効なヘルパーＴが不足していることを意味する(Venkatesh PK et al, manuscript in preparation)。同様に、自然感染において、Ｔａｔに対する細胞性免疫反応もまた十分ではないと見られている(Borrow et al., 1994;Goulder et al., 2001;Lieberman et al., 1997;Masemola et al., 2004;Lamhamedi-Cherradi et al., 1992)。霊長類(Putkonen et al., 1998;Belliard et al., 2005;Pauza et al., 2000)または人(Calarota et al., 1999;Hejdeman et al., 2004) における研究において、試験的な免疫付与では非常に強い免疫反応が見られなかったことからも、Ｔａｔの免疫優勢でないという性質は、Ｔａｔの固有特性に違いない。細胞外環境（ｅｘｔｒａ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｌｉｅｕ）において、十分な量のＴａｔが利用可能でないということもまた、自然感染においてＴａｔが免疫優勢でないという性質の一因でありうる。Ｔａｔは細胞外に分泌される（ｅＴａｔ）と考えられているけれども、この仮説を支持するデータは不十分であり、足りていない。
【００１０】
前述のことは、今までに候補ワクチンとなったこの抗原にとって、Ｔａｔによって誘導される免疫反応を強化する分子戦略が求められているということを示唆する。以前の試みの大半は、この重要な問題を無視し、免疫反応を強化する手段のないタンパク質、毒素またはＤＮＡとしてＴａｔを用いた。
【００１１】
（ｂ）Ｔａｔが毒素であることは、安全性に懸念を生じさせる：
細胞外ウイルス因子として、ｅＴａｔは、宿主の細胞および宿主の免疫系への多面発現効果（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ）を有し、ウイルスの発症および感染を増進すると考えられている。ｅＴａｔのこれらの特性のいくつかは、特に免疫力た低下した被験者において深刻な影響をもたらす(Huigen et al., 2004)。
ｉ．  潜伏ウイルス（Ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）の活性化：
ｅＴａｔは潜伏ウイルスを活性化しうる。このようにして、ウイルス感染の拡大に寄与する。
ｉｉ．  リンパ球のアポトーシス：
ｅＴａｔは、ウイルスに感染していないＴリンパ球(Li et al., 1995)、Ｂ細胞(Huang et al., 1997)および単球がアポトーシスするよう調整する。このようにして、ＨＩＶに感染した被験者における免疫抑制の機会を増加させる。Ｔａｔは、また、ＮＫ細胞の機能を抑制して、ＮＫ細胞機能不全をもたらす(Zocchi et al., 1998)。
ｉｉｉ．  コレセプターの上方調節（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）：
ＴａｔはコレセプターＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４の対象のＴ細胞への発現を上方調節する。このようにして、ウイルス感染の機会を増加させる(Huang et al., 1998)。同様にして、Ｔａｔは、幅広い範囲の宿主遺伝子の発現を制御して、宿主に深刻な影響をもたらす(Giacca, 2004)。
ｉｖ．  神経病因性：
ニューロンおよび星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ）のＴａｔへの直接的な曝露は、細胞死を増進し、高度の認知症を含む神経学的な影響（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を引き起こすことが知られている(Nath et al., 1998;Mishra et al., 2007)。
ｖ．  サイトカイン・ホメオスタシス（Ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を混乱させる（Ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ）：
Ｔａｔは様々な表現型（phenotype）の細胞のサイトカインおよび／またはケモカインの分泌を誘導しうる。それによって、活発に体内のサイトカイン・ホメオスタシスを混乱させる。それ故に、全体的な免疫抑制に寄与する(Lafrenie et al., 1997;Nath et al., 1999)。
ｖｉ．  免疫抑制：
Ｔａｔは、免疫抑制を引き起こす(Zagury et al., 1998a)マクロファージからの、またはＴＧＦ−βを介した、ＴＮＦ−αの分泌を活性化する(Reinhold et al., 1999)。Ｔａｔは、Ｔ細胞の増殖を直接的に抑制した可能性がある(Zagury et al., 1998a;Viscidi et al., 1989)。Ｔａｔの同時発現（Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は、ＩＬ−１０の活性化の仲介によって、ｅｎｖへの免疫反応を抑制した(Gupta et al., 2008)。それに対して、Ｔａｔの同時発現は、アジュバントの特性を明らかにするＨＩＶ−１のｇａｇおよびｅｎｖの免疫認識を拡大すると見られていた(Gavioli et al., 2008)。Ｔａｔは、免疫増強剤としても知られているけれども(Fanales-Belasio et al., 2002;Gavioli et al., 2004)、これらの相反するＴａｔの機能の間の絶妙なバランスを調節する条件は十分には理解されていない。
【００１２】
Ｔａｔワクチンの議論：
イタリアのＤｒ．バーバラ・エンソリー'（Ｄｒ．  Ｂａｒｂａｒａ  Ｅｎｓｏｌｉ）のグループによって展開された、Ｔａｔワクチンをめぐる最近の議論は、基本的に、これらのＴａｔの安全性に対する懸念(Cohen, 2007)、および、エイズワクチン・欧州フレームワーク計画をめぐる論争に関して繰り広げられた(ISIS Press Release 12/10/07) (http://www.i-sis.org.uk/ControversyAIDSvaccines.php)。このグループによって開発されたワクチンは、ヒトへの使用に関して潜在的な危険を有する機能性のＴａｔタンパク質からなる(Ensoli et al., 2006)。このＴａｔワクチン候補の安全性に対する質問に答えるのに用いられる方策はなかった。
【００１３】
Ｔａｔ毒素およびＴａｔの他の不活性形：
化学処理によって、Ｔａｔタンパク質を毒素として説明しようとする試みがなされた(Gringeri et al., 1998;Le Buanec and Bizzini, 2000)。Ｔａｔ毒素は安全であり、また、ヒト(Gringeri et al., 1998;Gringeri et al., 1999;Noonan et al., 2003;Moreau et al., 2004)および霊長類(Pauza et al., 2000;Richardson et al., 2002;Silvera et al., 2002)に適度な免疫反応を生じさせることが示された。いくつかの研究は、しばしば、Ｔａｔタンパク質に匹敵するほどのＴａｔ毒素の免疫原性を示したけれども、Ｔａｔ毒素が天然抗原と比べて質的に異なる免疫反応を引き起こす可能性があることを示す証拠も存在する(Tikhonov et al., 2003;Yang et al., 2003)。しかしながら、天然で、酸化されていない（ｎａｔｉｖｅ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ）Ｔａｔは、単球由来の樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）の成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）と、それらからの有効な抗原提示とを促進した。このことは、機能性のＴａｔが、弱毒化した形態（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ）よりも優れたワクチン候補となりうることを示唆した(Fanales-Belasio et al., 2002)。加えて、天然のＴａｔタンパク質は、抗原処理の増強につながる、免疫プロテアソーム（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）のサブユニット組成も調節した(Gavioli et al., 2004;Remoli et al., 2006)。トランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に不活性な突然変異体のＴａｔ（Ｔａｔ  ｍｕｔａｎｔｓ）について、マウス（ｍｉｃｅ）を用いた試験がなされた。しかし、この動物実験モデルを超える進展は報告されていない(Caselli et al., 1999;Mayol et al., 2007)。酸化されたＴａｔが、ワクチン接種にとって安全な形式であると提案されている(Cohen et al., 1999)。
【００１４】
（ｃ）タンパク質または毒素としてのＴａｔは、ＭＨＣクラスＩの区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に効率よくアクセスできない可能性がある：
実験的証拠は、体液中への分泌を示唆しているけれども、Ｔａｔの大部分は、細胞内タンパク質である(Chang et al., 1997)。さらに、Ｔａｔはウイルスの表面に曝露されていない。それゆえ、抗体も重要な役割を果たすけれども、Ｔａｔに対する細胞性免疫反応（Ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルスの拡大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を制限する支配的な要素である。霊長類の免疫付与（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）の研究 (Cafaro et al., 1999;Ensoli and Cafaro, 2000;Pauza et al., 2000;Richardson et al., 2002;Silvera et al., 2002;Tikhonov et al., 2003)またはヒトへの治験(Ensoli et al., 2006)において、以前の方策の大多数は、組み替えタンパク（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）または毒素として、Ｔａｔを用いてきた。これらの抗体は、有効な抗ウイルス細胞性免疫反応（ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を活性化させるＭＨＣ−Ｉ（ＭＨＣ−Ｉ）の区画（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に、タンパク質としてアクセスしにくそうであるＴａｔタンパク質は、ＭＨＣ−Ｉの区画に交差提示（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）されることが知られているけれども(Kim et al., 1997)、抗原提示の支配的な経路ではないように思われる。以前に報告された研究において、強い細胞性免疫反応が見られないことは、ＭＨＣ−Ｉの区画にとって、Ｔａｔをターゲットとすることが、ワクチン開発において重要であることを示す根拠となる。組み換え型のウイルスは、効果的に、コードされた抗原をＭＨＣ−Ｉ  経路（ＭＨＣ−Ｉ  ｐａｔｈｗａｙ）に取り込む。しかしながら、免疫介入は免疫反応に干渉しうる(de et al., 2008;Willis et al., 2006)。さらに、ウイルス・ベクターに対する事前の免疫反応は重大な問題であり、組み換えベクターが介在する抗原輸送（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）を制限する(Bangari and Mittal, 2006)。それゆえ、この種のワクチン接種は、ウイルス・ベクターと同種の強い免疫反応を活性化させることから、ＤＮＡワクチンは、抗原輸送にとって理想的な媒体である。しかしながら、ＤＮＡワクチンには、免疫付与の信頼性ある媒体として用いられる前に対処されるべきいくつかの技術的課題がある (Dean et al., 2005)。
【００１５】
この事業計画は、上記のＴａｔワクチンの重大な課題に対処するいくつかの潜在的に重要な分子免疫学的特徴を得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明の主要な目的は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、上記ＴａｔのＤＮＡ配列の上記システイン・リッチ・ドメイン、上記ベーシック・ドメインまたは上記コア・ドメインへの、Ｔヘルパー・エピトープの挿入により、上記Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、上記Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、上記Ｔａｔの上記Ｃ末端領域と上記エクソンＩＩ領域との間への、合成イントロンの挿入により、上記Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になる、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を取得することである。
本発明の他の目的は、イントロンの配列を取得することである。本発明のさらに他の目的は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を取得する方法を取得することである。本発明のさらに他の目的は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有する発現ベクターを取得することである。
本発明のさらに他の目的は、リン酸緩衝食塩水中の、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有するワクチンを取得することである。
本発明のさらに他の目的は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有するワクチンを取得する方法を取得することである。
本発明のさらに他の目的は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有するワクチンを備えるキットを取得することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）は、配列番号：１に示されたＰａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）、または、配列番号：２に示されたＰｏｌ７１１エピトープの挿入によって破壊されている（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）は、配列番号：３に示されたＰａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）、または、配列番号：４に示されたＰｏｌ７１１エピトープの挿入によって破壊されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）は、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）の挿入によって破壊されており、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）は、配列番号：５に示されたＰｏｌ７１１エピトープの挿入によって破壊されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）は、Ｐｏｌ７１１エピトープの挿入によって破壊されており、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）は、配列番号：６に示されたＰａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）の挿入によって破壊されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、配列番号：７に示されたＴａｔのＤＮＡ配列の、Ｃ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に、合成イントロンが挿入されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
本発明は、配列番号：８に示されたイントロン配列に関する。
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、配列番号：１、２、３、４、５および６からなる群から選択される配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に、配列番号：８の合成イントロンが挿入されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインへの、Ｔヘルパー・エピトープの挿入により、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間への合成イントロンの挿入により、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になる、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
本発明は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列であって、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインに、Ｔヘルパー・エピトープが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になる、ＴａｔのＤＮＡ配列を取得する方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）であって、完全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）のＴａｔのＤＮＡを増幅して、増幅されたＴａｔのＤＮＡのＣＲＤ、ＢＤまたはコア・ドメインにＴペルパー・エピトープが挿入されたＰＣＲ産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を取得し、必要に応じて、Ｔペルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソン２領域との間に合成イントロンが挿入されたＰＣＲ産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を取得する段階（ａ）と、哺乳類の発現カセット（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）またはプラスミド・ベクター（ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ）への段階（ａ）の挿入と一緒に、ＰＣＲ産物のクローンを作成する段階（ｂ）と、段階（ｂ）の発現カセットまたはプラスミド・ベクターを、発現に適した宿主に挿入して、ＴａｔのＤＮＡ配列を取得する段階（ｃ）と、を有する方法に関する。
本発明は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有する発現ベクターであって、ＥＦ−１α、β−アクチン、ＥＧＲ１、ｅＩＦ４Ａ１、ＦｅｒＨ、ＦｅｒＬ、ＧＡＰＤＨ、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＨＳＰ７０、β−Ｋｉｎ、ＰＧＫ−１、ＲＯＳＡ、ユビキチンＢ、ユビキチンＣなどのユビキタスな細胞性プロモーター（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）を有し、ＴａｔのＤＮＡ配列は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを含み、Ｔａｔの配列は、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインに、Ｔヘルパー・エピトープが挿入されることで遺伝子操作されており、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンが挿入されており、好ましくは、ユビキタスな細胞性プロモーターが、ＥＦ−１αプロモーター、または、ＥＦ−１αプロモーターの結合体である、発現ベクターに関する。
本発明は、配列番号：９、１０、１１、１２、１３または１４に示された伸長因子１α（ＥＦ−１α）細胞性プロモーターの遺伝子コンストラクトであって、本来の完全長のプロモーター配列のイントロン１の異なるフラグメントが欠失して（ｄｅｌｅｔｅｄ）得られた、遺伝子コンストラクトに関する。
本発明は、配列番号：９、１０、１１、１２、１３または１４に示された伸長因子１α（ＥＦ−１α）細胞性プロモーターの遺伝子コンストラクトであって、本来の完全長のプロモーター配列のイントロン１の異なるフラグメントが欠失して（ｄｅｌｅｔｅｄ）得られた遺伝子コンストラクトを取得する方法であって、制限消化（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を用いて、イントロン１の異なるフラグメントを欠失して（ｄｅｌｅｔｅ）、遺伝子コンストラクトを取得する段階を有する方法に関する。
本発明は、リン酸緩衝食塩水中の、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有するワクチンであって、ＴａｔのＤＮＡは、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、Ｔａｔの配列は、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインに、Ｔヘルパー・エピトープが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になるワクチンに関する。
本発明は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列であって、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインへの、Ｔヘルパー・エピトープの挿入により、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間への、合成イントロンの挿入により、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になる、ＴａｔのＤＮＡ配列を有するワクチンを取得する方法であって、ウイルスのＴａｔのＤＮＡを、リン酸緩衝食塩水に溶解させて、ワクチンを取得する段階を有する方法に関する。
本発明は、リン酸緩衝食塩水中の、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有するワクチンを備えるキットであって、ＴａｔのＤＮＡは、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、Ｔａｔの配列は、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインに、Ｔヘルパー・エピトープが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になるキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ｐＣＭＶ−ＴａｔＣＯ（完全長、天然のコドン、ＣＭＶ  プロモーター）ベクター・コンストラクトを示す。
【図２】ｐＥＦ−１α−Ｔａｔｗｔ（完全長、天然のコドン、ＥＦ−１αプロモーター）ベクター・コンストラクトを示す。
【図３】ｐＥＦ−１α−ＴａｔＣＯ（完全長、最適化された（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）コドン、ＥＦ−１αプロモーター）ベクター・コンストラクトを示す。
【図４】種々のＨＴＬコンストラクト、および、それぞれについて、トランス活性化アッセイを用いて得られた発現の結果を示す。
【図５】アポトーシス・アッセイの結果を示す。
【図６】用いられた遺伝子コンストラクトおよびプロモーターを、エリスポット・アッセイの結果とともに示す。
【図７Ａ】組み換えイントロンのＳＥＡＰアッセイの結果を示す。
【図７Ｂ】組み換えイントロンのＧＦＰ分析の結果を示す。
【図８Ａ】組み換えイントロンのエリスポット・アッセイの結果を示す。
【図８Ｂ】組み換えイントロンのリンパ増殖アッセイの結果を示す。
【図９】イントロンが操作されたＴａｔの、マウスにおけるウイルス量の結果を示す。
【図１０】遺伝子コンストラクトと、Ｔａｔ中のイントロンおよびＨＴＬが一緒に組み換えられて得られた結果を示す。
【図１１】ＥＦ−１αプロモーター欠失コンストラクトの概略図である。
【図１１Ａ】ＥＦ−１αプロモーター欠失コンストラクトおよび推定ＮＲＥ領域の同定を示す。
【図１２Ａ】ＥＦ−１αプロモーター変異体による遺伝子発現のＧＦＰ分析の結果を示す。
【図１２Ｂ】ＥＦ−１αプロモーター変異体による遺伝子発現のウエスタンブロット分析の結果を示す。
【図１３】ＥＦ−１αプロモーター欠失コンストラクトと、質の高い免疫反応の誘導の結果を示す。
【図１４】Ｔａｔの免疫付与、および、ＥＦ−１αプロモーター変異体コンストラクトによるウイルス量の制御を示す。
【図１５】細胞内のｐ２４のためのマウスの脾細胞の直接免疫蛍光法を示す。
【図１６Ａ】プラスミド・テンプレートを用いたＥｃｏＨＩＶのリアルタイムＰＣＲの標準化を示す。
【図１６Ｂ】プラスミド・テンプレートを用いたＧＡＰＤＨのリアルタイムＰＣＲの標準化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）は、配列番号：１に示されたＰａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）、または、配列番号：２に示されたＰｏｌ７１１エピトープの挿入によって破壊されている（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
【００２０】
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）は、配列番号：３に示されたＰａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）、または、配列番号：４に示されたＰｏｌ７１１エピトープの挿入によって破壊されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
【００２１】
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）は、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）の挿入によって破壊されており、
ベーシック・ドメイン（ＢＤ）は、配列番号：５に示されたＰｏｌ７１１エピトープの挿入によって破壊されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
【００２２】
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）は、Ｐｏｌ７１１エピトープの挿入によって破壊されており、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）は、配列番号：６に示されたＰａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）の挿入によって破壊されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
【００２３】
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、配列番号：７に示されたＴａｔのＤＮＡ配列の、Ｃ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に、合成イントロンが挿入されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
【００２４】
本発明の他の実施形態において、ＴａｔのＤＮＡは、ヒトおよび霊長類のレトロウイルスの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）およびさらなる亜型（ｓｕｂ−ｓｕｂｔｙｐｅｓ）からなる群から選択される種々のウイルス型（ｄｉｖｅｒｓｅ  ｖｉｒａｌ  ｔｙｐｅｓ）に由来してよく、群は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ、ＨＩＶ−１のＭ、ＮおよびＯのグループ、ＨＩＶ−１のＡからＫまでのサブタイプ、ならびに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の様々な組み換え型を含んでよく、組み換え型は、孤立型組み換えウイルス（ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＵＲＦ）および組み換え流行株（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＣＲＦ）を含んでよい。
【００２５】
本発明は、配列番号：８に示されたイントロン配列に関する。
【００２６】
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、配列番号：１、２、３、４、５および６からなる群から選択される配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に、配列番号：８の合成イントロンが挿入されている、ウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
【００２７】
本発明の他の実施形態において、ＴａｔのＤＮＡは、ヒトおよび霊長類のレトロウイルスの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）およびさらなる亜型（ｓｕｂ−ｓｕｂｔｙｐｅｓ）からなる群から選択される種々のウイルス型（ｄｉｖｅｒｓｅ  ｖｉｒａｌ  ｔｙｐｅｓ）に由来してよく、群は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ、ＨＩＶ−１のＭ、ＮおよびＯのグループ、ＨＩＶ−１のＡからＫまでのサブタイプ、ならびに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の様々な組み換え型を含んでよく、組み換え型は、孤立型組み換えウイルス（ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＵＲＦ）および組み換え流行株（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＣＲＦ）を含んでよい。
【００２８】
本発明は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインへの、Ｔヘルパー・エピトープの挿入により、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間への、合成イントロンの挿入により、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になる、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列に関する。
【００２９】
本発明の他の実施形態において、ＴａｔのＤＮＡは、ヒトおよび霊長類のレトロウイルスの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）およびさらなる亜型（ｓｕｂ−ｓｕｂｔｙｐｅｓ）からなる群から選択される種々のウイルス型（ｄｉｖｅｒｓｅ  ｖｉｒａｌ  ｔｙｐｅｓ）に由来してよく、群は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ、ＨＩＶ−１のＭ、ＮおよびＯのグループ、ＨＩＶ−１のＡからＫまでのサブタイプ、ならびに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の様々な組み換え型を含んでよく、組み換え型は、孤立型組み換えウイルス（ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＵＲＦ）および組み換え流行株（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＣＲＦ）を含んでよい。
【００３０】
本発明のさらに他の実施形態において、Ｔヘルパー・エピトープは、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）およびその他のユニバーサルな（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）Ｔヘルパー・エピトープからなる群から選ばれてよく、ユニバーサルなＴヘルパー・エピトープは、ＨＩＶ−１  Ｐｏｌ７１１、様々な生物学的起源に由来するＴヘルパー・エピトープおよび人工的に合成したＴヘルパー・エピトープを含んでよく、生物学的起源に由来するＴヘルパー・エピトープおよび人工的に合成したＴヘルパー・エピトープは、毒素、免疫優勢抗原、熱ショック・タンパク質およびシャペロン・タンパク質、担体タンパク質（ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ならびにその他の多くのＴヘルパー・エピトープを含んでよく、毒素は、ボツリヌス神経毒素血清型Ａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ａ）、ジフテリア毒素、コレラ毒素および細菌性エンテロトキシン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ）を含んでよく、免疫優勢抗原は、ＨＩＶ抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、コア抗原およびその他の生物（ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の抗原を含み、ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ、ＲＴ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖを含んでよく、熱ショック・タンパク質およびシャペロン・タンパク質は、哺乳類、ならびに、ウイルス、細菌、ファージおよび寄生生物を含む微生物からの、熱ショック・タンパク質およびシャペロン・タンパク質を含んでよく、担体タンパク質は、キーホールリンペットシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｃｙａｎｉｎｅ）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、リボフラビン担体タンパク質（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および糖タンパク質Ｄ担体タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含んでよく、好ましくは、ＰＡＤＲＥおよびＰｏｌ７１１またはそれらの組み合わせであってよい。
【００３１】
本発明のさらに他の実施形態において、ＰＡＤＲＥは、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、ボツリヌス神経毒素血清型Ａ、ジフテリア毒素、コレラ毒素および細菌性エンテロトキシンからなる群に由来してよく、好ましくは破傷風トキソイドに由来してよく、Ｐｏｌ７１１は、ＨＩＶ−１ポリメラーゼ、ならびに、ｇａｇ、ＲＴ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖを含むＨＩＶ抗原からなる群に由来してよく、好ましくはＨＩＶ−１ポリメラーゼに由来してよい。
【００３２】
本発明のさらに他の実施形態において、遺伝子操作されたＴａｔのＤＮＡ配列は、ウイルスのＣＲＤ、ＢＤおよびコア・ドメインを含むＴａｔの重要なドメインの構造的破壊の結果として、宿主にとって非毒性であってよい。
【００３３】
本発明は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列であって、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインに、Ｔヘルパー・エピトープが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソン２領域との間に合成イントロンが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になる、ＴａｔのＤＮＡ配列を取得する方法（ｐｒｏｃｅｓｓ）であって、完全長（ｆｕｌｌ  ｌｅｎｇｔｈ）のＴａｔのＤＮＡを増幅して、増幅されたＴａｔのＤＮＡのＣＲＤ、ＢＤまたはコア・ドメインにＴペルパー・エピトープが挿入されたＰＣＲ産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を取得し、必要に応じて、Ｔペルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンが挿入されたＰＣＲ産物（ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を取得する段階（ａ）と、哺乳類の発現カセット（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）またはプラスミド・ベクター（ｐｌａｓｍｉｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ）への段階（ａ）の挿入と一緒に、ＰＣＲ産物のクローンを作成する段階（ｂ）と、段階（ｂ）の発現カセットまたはプラスミド・ベクターを、発現に適した宿主に挿入して、ＴａｔのＤＮＡ配列を取得する段階（ｃ）と、を有する方法に関する。
【００３４】
本発明の他の実施形態において、ＴａｔのＤＮＡは、ヒトおよび霊長類のレトロウイルスの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）およびさらなる亜型（ｓｕｂ−ｓｕｂｔｙｐｅｓ）からなる群から選択される種々のウイルス型（ｄｉｖｅｒｓｅ  ｖｉｒａｌ  ｔｙｐｅｓ）に由来してよく、群は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ、ＨＩＶ−１のＭ、ＮおよびＯのグループ、ＨＩＶ−１のＡからＫまでのサブタイプ、ならびに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の様々な組み換え型を含んでよく、組み換え型は、孤立型組み換えウイルス（ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＵＲＦ）および組み換え流行株（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＣＲＦ）を含んでよい。
【００３５】
本発明のさらに他の実施形態において、Ｔヘルパー・エピトープは、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）およびその他のユニバーサルなＴヘルパー・エピトープからなる群から選ばれてよく、ユニバーサルなＴヘルパー・エピトープは、ＨＩＶ−１  Ｐｏｌ７１１、様々な生物学的起源に由来するＴヘルパー・エピトープおよび人工的に合成したＴヘルパー・エピトープを含んでよく、生物学的起源に由来するＴヘルパー・エピトープおよび人工的に合成したＴヘルパー・エピトープは、毒素、免疫優勢抗原、熱ショック・タンパク質およびシャペロン・タンパク質、担体タンパク質（ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ならびにその他の多くのＴヘルパー・エピトープを含んでよく、毒素は、ボツリヌス神経毒素血清型Ａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ａ）、ジフテリア毒素、コレラ毒素および細菌性エンテロトキシン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ）を含んでよく、免疫優勢抗原は、ＨＩＶ抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、コア抗原およびその他の生物（ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の抗原を含み、ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ、ＲＴ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖを含んでよく、熱ショック・タンパク質およびシャペロン・タンパク質は、哺乳類、ならびに、ウイルス、細菌、ファージおよび寄生生物を含む微生物からの、熱ショック・タンパク質およびシャペロン・タンパク質を含んでよく、担体タンパク質は、キーホールリンペットシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｃｙａｎｉｎｅ）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、リボフラビン担体タンパク質（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および糖タンパク質Ｄ担体タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含んでよく、好ましくは、ＰＡＤＲＥおよびＰｏｌ７１１またはそれらの組み合わせであってよい。
【００３６】
本発明のさらに他の実施形態において、ＰＡＤＲＥは、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、ボツリヌス神経毒素血清型Ａ、ジフテリア毒素、コレラ毒素および細菌性エンテロトキシンからなる群に由来してよく、好ましくは破傷風トキソイドに由来してよく、Ｐｏｌ７１１は、ＨＩＶ−１ポリメラーゼ、ならびに、ｇａｇ、ＲＴ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖなどを含むＨＩＶ抗原からなる群に由来してよく、好ましくはＨＩＶ−１ポリメラーゼに由来してよい。
【００３７】
本発明は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有する発現ベクターであって、ＥＦ−１α、β−アクチン、ＥＧＲ１、ｅＩＦ４Ａ１、ＦｅｒＨ、ＦｅｒＬ、ＧＡＰＤＨ、ＧＲＰ７８、ＧＲＰ９４、ＨＳＰ７０、β−Ｋｉｎ、ＰＧＫ−１、ＲＯＳＡ、ユビキチンＢ、ユビキチンＣなどのユビキタスな細胞性プロモーター（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）を有し、ＴａｔのＤＮＡ配列は、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを含み、Ｔａｔの配列は、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインに、Ｔヘルパー・エピトープが挿入されることで遺伝子操作されており、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンが挿入されており、好ましくは、ユビキタスな細胞性プロモーターが、ＥＦ−１αプロモーター、または、ＥＦ−１αプロモーターの結合体である、発現ベクターに関する。
【００３８】
本発明は、配列番号：９、１０、１１、１２、１３または１４に示された伸長因子１α（ＥＦ−１α）細胞性プロモーターの遺伝子コンストラクトであって、本来の完全長のプロモーター配列のイントロン１の異なるフラグメントが欠失して（ｄｅｌｅｔｅｄ）得られた、遺伝子コンストラクトに関する。
【００３９】
本発明の他の実施形態において、細胞性プロモーターの遺伝子コンストラクトは、哺乳類の発現カセットに存在する非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を発現させてよい。
【００４０】
本発明は、配列番号：９、１０、１１、１２、１３または１４に示された伸長因子１α（ＥＦ−１α）細胞性プロモーターの遺伝子コンストラクトであって、本来の完全長のプロモーター配列のイントロン１の異なるフラグメントが欠失して（ｄｅｌｅｔｅｄ）得られた遺伝子コンストラクトを取得する方法であって、制限消化（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を用いて、イントロン１の異なるフラグメントを欠失して（ｄｅｌｅｔｅ）、遺伝子コンストラクトを取得する段階を有する方法に関する。
【００４１】
本発明の他の実施形態において、制限消化が、Ｍ１ｕＩ、ＥｃｏＲＩ、ＡｐａＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、Ｂｇ１ＩＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される部位を用いて実施されてよい。
【００４２】
本発明は、リン酸緩衝食塩水中の、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有するワクチンであって、ＴａｔのＤＮＡは、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、Ｔａｔの配列は、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインに、Ｔヘルパー・エピトープが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になるワクチンに関する。
【００４３】
本発明の他の実施形態において、ＴａｔのＤＮＡは、ヒトおよび霊長類のレトロウイルスの亜型（ｓｕｂｔｙｐｅｓ）およびさらなる亜型（ｓｕｂ−ｓｕｂｔｙｐｅｓ）からなる群から選択される種々のウイルス型（ｄｉｖｅｒｓｅ  ｖｉｒａｌ  ｔｙｐｅｓ）に由来してよく、群は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶ、ＨＩＶ−１のＭ、ＮおよびＯのグループ、ＨＩＶ−１のＡからＫまでのサブタイプ、ならびに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の様々な組み換え型を含んでよく、組み換え型は、孤立型組み換えウイルス（ｕｎｉｑｕｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＵＲＦ）および組み換え流行株（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍｓ）（ＣＲＦ）を含んでよい。
【００４４】
本発明のさらに他の実施形態において、Ｔヘルパー・エピトープは、Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）およびその他のユニバーサルな（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）Ｔヘルパー・エピトープからなる群から選ばれてよく、ユニバーサルなＴヘルパー・エピトープは、ＨＩＶ−１  Ｐｏｌ７１１、様々な生物学的起源に由来するＴヘルパー・エピトープおよび人工的に合成したＴヘルパー・エピトープを含んでよく、生物学的起源に由来するＴヘルパー・エピトープおよび人工的に合成したＴヘルパー・エピトープは、毒素、免疫優勢抗原、熱ショック・タンパク質およびシャペロン・タンパク質、担体タンパク質（ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ならびにその他の多くのＴヘルパー・エピトープを含んでよく、毒素は、ボツリヌス神経毒素血清型Ａ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  Ａ）、ジフテリア毒素、コレラ毒素および細菌性エンテロトキシン（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ）を含んでよく、免疫優勢抗原は、ＨＩＶ抗原、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、コア抗原およびその他の生物（ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の抗原を含み、ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ、ＲＴ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖを含んでよく、熱ショック・タンパク質およびシャペロン・タンパク質は、哺乳類、ならびに、ウイルス、細菌、ファージおよび寄生生物を含む微生物からの、熱ショック・タンパク質およびシャペロン・タンパク質を含んでよく、担体タンパク質は、キーホールリンペットシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｃｙａｎｉｎｅ）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、大腸菌マルトース結合タンパク質（Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、リボフラビン担体タンパク質（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）および糖タンパク質Ｄ担体タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を含んでよく、好ましくは、ＰＡＤＲＥおよびＰｏｌ７１１またはそれらの組み合わせであってよい。
【００４５】
本発明のさらに他の実施形態において、ＰＡＤＲＥは、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ）、ボツリヌス神経毒素血清型Ａ、ジフテリア毒素、コレラ毒素および細菌性エンテロトキシンからなる群に由来してよく、好ましくは破傷風トキソイドに由来し、Ｐｏｌ７１１は、ＨＩＶ−１ポリメラーゼ、ならびに、ｇａｇ、ＲＴ、インテグラーゼ、ｅｎｖ、ｎｅｆ、ＴａｔおよびＲｅｖを含むＨＩＶ抗原からなる群に由来してよく、好ましくはＨＩＶ−１ポリメラーゼに由来してよい。
【００４６】
本発明のさらに他の実施形態において、遺伝子操作されたＴａｔのＤＮＡ配列は、ウイルスのＣＲＤ、ＢＤおよびコア・ドメインを含むＴａｔの重要なドメインの構造的破壊の結果として、宿主にとって非毒性であってよい。
【００４７】
本発明は、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列であって、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインへの、Ｔヘルパー・エピトープの挿入により、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間への、合成イントロンの挿入により、Ｔａｔの配列が非毒性および免疫原性になる、ＴａｔのＤＮＡ配列を有するワクチンを取得する方法であって、ウイルスのＴａｔのＤＮＡを、リン酸緩衝食塩水に溶解させて、ワクチンを取得する段階を有する方法に関する。
【００４８】
本発明は、リン酸緩衝食塩水中の、非毒性および免疫原性のウイルスのＴａｔのＤＮＡ配列を有するワクチンを備えるキットであって、ＴａｔのＤＮＡは、Ｎ末端領域と、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）と、コア・ドメインと、ベーシック・ドメイン（ＢＤ）と、Ｃ末端領域と、エクソンＩＩ領域とを有し、Ｔａｔの配列は、ＴａｔのＤＮＡ配列のシステイン・リッチ・ドメイン、ベーシック・ドメインまたはコア・ドメインに、Ｔヘルパー・エピトープが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になり、必要に応じて、Ｔヘルパー・エピトープの挿入に加えて、ＴａｔのＤＮＡ配列のＣ末端領域とエクソンＩＩ領域との間に合成イントロンが挿入されることにより、非毒性および免疫原性になるキットに関する。
【００４９】
これらの特徴のいくつかは、この分野における初めての方策である。この方策の最も重要な要素は、Ｔヘルパー・エピトープを挿入して、Ｔａｔのシステイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）および／またはベーシック・ドメイン（ＢＤ）を破壊することである。この操作によって、２つの独立した利点が生じることが期待される。第一に、Ｔａｔの生物学的機能の多くを破壊するＴヘルパー・エピトープの挿入によって、Ｔａｔの構造的完全性が混乱させられ（ｐｅｒｔｕｒｂｅｄ）、それ故に、ワクチン接種がより安全になる。しかしながら、Ｔａｔ中の既知のＢ細胞およびＣＴＬエピトープ（ｋｎｏｗｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ＣＴＬ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  Ｔａｔ）を破壊することに注意が払われていないので、この操作が、天然のＴａｔに対する自然免疫反応（ｎａｔｕｒａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を減少させる可能性は高くない。第２に、ユニバーサルなエピトープのＣＲＤおよび／またはＤＢへの遺伝子操作は、抗原特異的免疫応答の質および量を増強させる、付加的でより強力なヘルパーＴをリクルートする（ｒｅｃｒｕｉｔ）ことが期待される。それ故、この方策は、２つの異なる、重要な目的を同時に達成することが期待される。
【００５０】
この方策の特異性は、既存の種類のＴａｔワクチン候補よりも２つの重要な点で優れた、新規なＴａｔワクチンの創出にある。この方策による新規なＴａｔワクチンは、優れた免疫特性を有し、天然のＴａｔワクチンまたはＴａｔ毒素と比較して、毒性に乏しい。
【００５１】
ＴａｔのＤＮＡ配列の安全性：
標準的な分子技術（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を用いて、２つのユニバーサルなＴヘルパー・エピトープの１つが、Ｔａｔのシステイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）および／またはベーシック・ドメイン（ＢＤ）に挿入された。ＣＲＤは、Ｔａｔのトランス活性化、ケモカイン誘導およびアポトーシス特性を調節し、ＢＤは、核局在化、ＲＮＡ結合、膜輸送および他の多くの機能に関与する。それゆえ、ヘルパーＴ（Ｔ−ｈｅｌｐｅｒｓ）の接合によるこれらのドメインの破壊は、Ｔａｔの有害な機能を弱め、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投薬に対する安全性を向上させることが期待される。
ＴａｔのＤＮＡ配列の免疫原性：
重要なことに、Ｔヘルパー・エピトープのＣＲＤおよびＢＤへの遺伝子操作は、Ｔａｔの非免疫原性に対する質問に答える、Ｔａｔへの特異的免疫応答を増強させることも期待される。Ｔヘルパー・エピトープは、Ｔａｔ中の既知にＢ細胞およびＣＴＬエピトープ（ｋｎｏｗｎ  Ｂ−  ａｎｄ  ＣＴＬ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｉｎ  Ｔａｔ）が破壊されないような方法で遺伝子操作される。
付加的な免疫調節特性：
Ｔａｔのコドン最適化を行い、合成イントロンの翻訳および遺伝子操作を行って、Ｔａｔの自然発現（ｎａｔｕｒａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）および免疫付与（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）における補助アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔｓ）を模倣する。
Ｔａｔ誘発モデル（Ｔａｔ−ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｍｏｄｅｌｓ）：
増強された抗Ｔａｔ免疫反応（ａｎｔｉ−Ｔａｔ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）の有意性を評価する目的で、２つの新規で独立なｉｎ  ｖｉｖｏでの誘発モデルが用いられるであろう。自己腫瘍モデル（安定してＴａｔを発現しているマウスの腫瘍細胞株の確立または拒絶）およびキメラウイルス誘発モデル（マウスにおけるＥｃｏＨＩＶ−１ウイルスの増殖）である。増強された免疫反応は、必ずしも、防御免疫反応でなくてもよい。それゆえ、以下で述べるように、２つの異なる実験モデルにおいて、Ｔａｔワクチンの防御特性が試験された。
【００５２】
（Ａ）ＥｃｏＨＩＶ誘発モデル：
Ｄａｖｉｄ  Ｊ  Ｖｏｌｋｓｙのグループは、ウイルスの複製、調節（ｃｏｎｔｒｏｌ）を病原性（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）研究する目的で、通常飼育のマウスのＨＩＶ−１感染モデルを作成した。マウスの中でのウイルスの増殖を可能にする目的で、限られたレベルではあるけれども、ＨＩＶ／ＮＬ４−３ウイルス株のｇｐ１２０のコード領域が、齧歯動物のみに感染するレトロウイルスである、エコトロピック・マウス白血病ウイルスからのｇｐ８０のコード領域に置き換えられた(Potash et al., 2005)。結果そして生じたキメラウイルスＥｃｏＨＩＶは、人間のリンパ球ではない、ネズミ科の動物に生産的に感染する。脾臓リンパ細胞、腹腔マクロファージおよび脳におけるウイルスの検知によって示されるとおり、免疫の正常な成体のマウス（Ａｄｕｌｔ，  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｍｉｃｅ）は、ＥｃｏＨＩＶの単回接種による感染の影響を敏速に受けやすかった。動物中で生産されたウイルスは、培養の継代によって示されるとおり、感染性であり、ＨＩＶ−１のＧａｇおよびＴａｔに対する抗体の誘導（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）によって示されるとおり、免疫原性であった。ＥｃｏＨＩＶ誘発モデルは、霊長類モデルにとって、特に資源の乏しい環境においてワクチン効力を評価するための、費用効率がよく、シンプルな代替手段を提供する。この事前準備されたモデル（ｐｒｅ−ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｍｏｄｅｌ）は、本発明のＤＮＡワクチンの効力を評価するのに用いられた。マウスへの免疫付与およびウイルス量の評価は、ＪＮＣＡＳＲ研究所において標準化された。ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス増殖のモニタリングを簡素化する目的で、ＥｃｏＨＩＶにＧＦＰが遺伝子操作で組み込まれ、ＥｃｏＨＩＶ−ＧＦＰを作り出した。ＧＦＰの遺伝子操作は、脾細胞上でのＲＴ−ＰＣＲ法ではなく、共焦点顕微鏡法を用いて、異なる組織におけるウイルス負荷（ｂｕｒｄｅｎ）を直接分析することを可能にした。ウイルス負荷（ｂｕｒｄｅｎ）／量（ｌｏａｄ）を用いて、ワクチンの効力を測定することができる。
【００５３】
（Ｂ）腫瘍誘発モデル：
ＤＮＡワクチン接種は、強い抗腫瘍免疫反応を誘導することが示されてきた。ＴａｔのＤＮＡワクチンによって生じる免疫反応の質を明らかにする目的で、同質遺伝子的な（ｓｙｎｇｅｎｉｃ）腫瘍誘発モデルが用いられた(Holden et al., 1975;Mocellin, 2005;Stevenson et al., 2004a;Rice et al., 2002;Hedley et al., 1998)。つまり、安定にＴａｔを発現させている同質遺伝子的な腫瘍細胞を用いて、免疫付与を受けたマウス（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ）に対する免疫性のテストが実施された。例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに対してＥＬ４細胞を用いて実施された。対照群のマウスと比較して、潜在的な（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）抗Ｔａｔ細胞性免疫反応が腫瘍成長を拒絶することが期待される。
安定にトランスフェクトされた細胞株（Ｓｔａｂｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）：
ＥＦ−１プロモーターの支配下でＴａｔＣＯを発現させた哺乳類発現ベクターが、Ｐ８１５（Ｈ−２ｄのＢＡＬＢ／ｃ）とＥＬ４（Ｈ−２ｂのＣ５７ＢＬ）という２つの同質遺伝子的な細胞株に導入され、Ｇ４１８薬剤選択マーカーを用いて選択された。ウエスタンブロット分析によって、安定に導入された細胞におけるＴａｔの発現が確認された。
マウスにおける腫瘍の確立：
親のＥＬ−４細胞（１０６）またはＴａｔが発現されているＥＬ−４（ＥＬ４−ＴａｔＣＯ）が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹部の後部（ｈｉｎｄ  ｆｌａｎｋｓ）に皮内注射された腫瘍の成長が観察された。親細胞とＴａｔが発現されている細胞との両方が、効果的に腫瘍を誘導した。したがって、これらの細胞を、ＴａｔＤＮＡワクチンの効力の評価に用いることができた。
【００５４】
安全性および機能的統合性を確保する目的で、ワクチン候補は、ヒト治験（ｈｕｍａｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ）を実施する前に、動物モデルおよび細胞モデルを用いて評価されなければならない。
【００５５】
このワクチン接種の方策には、その後にＤＮＡのブースト（ＤＮＡ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ）が続く、ＤＮＡプライミング（ＤＮＡ  ｐｒｉｍｉｎｇ）が含まれる。多少補完的な、別のワクチン接種の方策は、その後にタンパク質のブーストが続くＤＮＡプライミング、その後にＤＮＡのブーストが続くタンパク質のプライミング、または、その後にタンパク質のブーストが続くタンパク質のプライミングであってもよい。免疫付与スキームのこれらの代替手段によって生じた免疫反応の質および特性は、防御（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）に大きな影響を与える。本明細書に記載されるように遺伝子操作されたＴヘルパー・エピトープを有する組み換えＴａｔタンパク質を用いて、これらの代替方策が使用された。これらの全ての免疫付与スキームに共通するテーマは、修飾Ｔａｔ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔａｔ）の利用である。
【００５６】
ＨＩＶ−１  ｅｎｖワクチンによって達成されたある程度の成功は、多成分ＨＩＶワクチンの有力候補（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ）の役目を果たす可能性がある代替ウイルス抗原の探索を促進した。ウイルスの調節タンパク質であるＴａｔには、そのような有力な候補抗原の１つとして、いくつかの利点がある。他のグループによって以前になされた、Ｔａｔワクチンを用いたいくつかの試みは、以下の理由で、ある程度の成功にとどまっている。（１）報告されたリポートの大半は、Ｔａｔの非免疫原性を無視した。（２）これらの出版物の大半は、Ｔａｔをタンパク質または毒素として用いた。しかし、その形態では、Ｔａｔは、ウイルスの制御に重要な意味をもつＭＨＣクラスＩの経路にアクセスすることができなかった。（３）これらのレポートの多くは、Ｔａｔの毒素作用を緩和する分子戦略を採用しなかった。Ｔａｔワクチンの技術的な限界を克服するユニークな分子戦略を提案する。
【００５７】
本戦略の最も革新的な特徴は、Ｔａｔのシステイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）および／またはベーシック・ドメイン（ＢＤ）に、ユニバーサルなＴペルパー・エピトープを組み込む（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）ことである。この分子操作により、２つの異なる目的が達成されることが期待される。Ｔヘルパー・エピトープは効果的にヘルパーＴをリクルートし、Ｔａｔに対する免疫反応を増強し、その結果、この免疫原性に乏しい抗原を、免疫原性の強い抗原に変化させる。加えて、重要なことには、Ｔａｔの重要な生物学的機能は、これら２つのドメインの構造的完全性に依存しているので、よく構成された（ｗｅｌｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）ＣＲＤおよびＢＤにＴヘルパー・エピトープを挿入することで、それらを破壊することは、Ｔａｔを宿主にとって非毒性にする、または、宿主に対するＴａｔの毒性を弱める。
【００５８】
さらに、合成イントロンをＴａｔに組み込むことにより、分子プロモーターの最適化、ウイルス転写産物の安定化、転写産物の転座の強化などのＴａｔに対する免疫反応を増強させる付加的な分子戦略を提案する。以前の方策の大半とは異なり、本発明は、Ｔａｔを、組み換えタンパク質としてではなく、ＤＮＡ発現ベクターとして発現させるＤＮＡベクターから発現させられたＴａｔは、ＭＨＣクラス１の経路に効果的に提示され、その結果、効果的なウイルス制御に必要である細胞性免疫反応を生じさせることが期待される。一般に、これらの方策のいくつかは、他の非免疫優勢抗原にも関連し、ＤＮＡワクチンの分野の広範囲に影響を与える。
【００５９】
本発明は、以下の実施例を用いて、さらに詳しく述べられる。しかしながら、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００６０】
（実施例１）
Ｔａｔのシステイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）に接合されたＰＡＤＲＥエピトープを有する、コドン最適化されたＴａｔの挿入配列。
0005576859.tif 000002
【００６１】
分裂のないＤＮＡ配列（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｂｒｅａｋｕｐ）：（ＰＡＤＲＥエピトープには下線が引かれる。）：配列番号１で示される。
ATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTGGAGCCCTGGAACCACCCTGGCAGCCAGCCCAAGACCGCCTGCAACAACTGCTACTGCAAGCACTGCGCCAAGTTTGTCGCTGCCTGGACGCTGAAGGCTGCTGCCAGCTACCACTGCCTGGTGTGCTTCCAGACCAAGGGCCTGGGCATCAGCTACGGCCGGAAGAAGCGGCGCCAGCGCCGGAGCGCTCCTCCAAGCAGCGAGGACCACCAAAATCTTATATCAAAGCAGCCCCTGCCTAGGACCCAGGGCGACCCCACAGGCAGCGAGGAGAGCAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAGAGACAGACCCCTTCGACTGA
分裂のないタンパク質配列（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｂｒｅａｋｕｐ）：（ＰＡＤＲＥエピトープには下線が引かれる。）。
MEPVDPNLEPWNHPGSQPKTACNNCYCKHCAKFVAAWTLKAAASYHCLVCFQTKGLGISYGRKKRRQRRSAPPSSEDHQNLISKQPLPRTQGDPTGSEESKKKVESKTETDPFD
【００６２】
（実施例２）
Ｔａｔのシステイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）に接合されたＰｏｌ７１１エピトープを有する、コドン最適化されたＴａｔの挿入配列。
0005576859.tif 000003
【００６３】
分裂のないＤＮＡ配列：（Ｐｏｌ７１１エピトープには下線が引かれる。）：配列番号２で示される。
ATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTGGAGCCCTGGAACCACCCTGGCAGCCAGCCCAAGACCGCCTGCAACAACTGCTACTGCAAGCACTGCGAGAAGGTGTACCTCGCATGGGTGCCTGCCCACAAGGGCATTGGCAGCTACCACTGCCTGGTGTGCTTCCAGACCAAGGGCCTGGGCATCAGCTACGGCCGGAAGAAGCGGCGCCAGCGCCGGAGCGCTCCTCCAAGCAGCGAGGACCACCAAAATCTTATATCAAAGCAGCCCCTGCCTAGGACCCAGGGCGACCCCACAGGCAGCGAGGAGAGCAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAGAGACAGACCCCTTCGACTAG
分裂のないタンパク質配列：（Ｐｏｌ７１１エピトープには下線が引かれる。）。
MEPVDPNLEPWNHPGSQPKTACNNCYCKHCEKVYLAWVPAHKGIGSYHCLVCFQTKGLGISYGRKKRRQRRSAPPSSEDHQNLISKQPLPRTQGDPTGSEESKKKVESKTETDPFD
【００６４】
（実施例３）
Ｔａｔのベーシック・ドメイン（ＢＤ）に接合されたＰＡＤＲＥエピトープを有する、コドン最適化されたＴａｔの挿入配列。
0005576859.tif 000004
【００６５】
分裂のないＤＮＡ配列：（ＰＡＤＲＥエピトープには下線が引かれる。）：配列番号３で示される。
ATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTGGAGCCCTGGAACCACCCTGGCAGCCAGCCCAAGACCGCCTGCAACAACTGCTACTGCAAGCACTGCAGCTACCACTGCCTGGTGTGCTTCCAGACCAAGGGCCTGGGCATCAGCTACGGCCGGAAGAAGGCCAAGTTTGTCGCTGCCTGGACGCTGAAGGCTGCTGCCCGGCGCCAGCGCCGGAGCGCTCCTCCAAGCAGCGAGGACCACCAAAATCTTATATCAAAGCAGCCCCTGCCTAGGACCCAGGGCGACCCCACAGGCAGCGAGGAGAGCAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAGAGACAGACCCCTTCGACTAG
【００６６】
分裂のないタンパク質配列：（ＰＡＤＲＥエピトープには下線が引かれる。）。
MEPVDPNLEPWNHPGSQPKTACNNCYCKHCSYHCLVCFQTKGLGISYGRKKAKFVAAWTLKAAARRQRRSAPPSSEDHQNLISKQPLPRTQGDPTGSEESKKKVESKTETDPFD
【００６７】
（実施例４）
Ｔａｔのベーシック・ドメイン（ＢＤ）に接合されたＰｏｌ７１１エピトープを有する、コドン最適化されたＴａｔの挿入配列。
0005576859.tif 000005
【００６８】
分裂のないＤＮＡ配列：（Ｐｏｌ７１１エピトープには下線が引かれる。）：配列番号４で示される。
ATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTGGAGCCCTGGAACCACCCTGGCAGCCAGCCCAAGACCGCCTGCAACAACTGCTACTGCAAGCACTGCAGCTACCACTGCCTGGTGTGCTTCCAGACCAAGGGCCTGGGCATCAGCTACGGCCGGAAGAAGGAGAAGGTGTACCTCGCATGGGTGCCTGCCCACAAGGGCATTGGCCGGCGCCAGCGCCGGAGCGCTCCTCCAAGCAGCGAGGACCACCAAAATCTTATATCAAAGCAGCCCCTGCCTAGGACCCAGGGCGACCCCACAGGCAGCGAGGAGAGCAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAGAGACAGACCCCTTCGACTGA
【００６９】
分裂のないタンパク質配列：（Ｐｏｌ７１１エピトープには下線が引かれる。）。
MEPVDPNLEPWNHPGSQPKTACNNCYCKHCSYHCLVCFQTKGLGISYGRKKEKVYLAWVPAHKGIGRRQRRSAPPSSEDHQNLISKQPLPRTQGDPTGSEESKKKVESKTETDPFD
【００７０】
（実施例５）
システイン・リッチ・ドメイン中のＰＡＤＲＥエピトープと、Ｔａｔのベーシック・ドメインに接合されたＰｏｌ７１１エピトープとを有する、コドン最適化されたＴａｔの挿入配列。
0005576859.tif 000006
【００７１】
分裂のないＤＮＡ配列：（それぞれのエピトープには下線が引かれる。）：配列番号５で示される。
ATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTGGAGCCCTGGAACCACCCTGGCAGCCAGCCCAAGACCGCCTGCAACAACTGCTACTGCAAGCACTGCGCCAAGTTTGTCGCTGCCTGGACGCTGAAGGCTGCTGCCAGCTACCACTGCCTGGTGTGCTTCCAGACCAAGGGCCTGGGCATCAGCTACGGCCGGAAGAAGGAGAAGGTGTACCTCGCATGGGTGCCTGCCCACAAGGGCATTGGCCGGCGCCAGCGCCGGAGCGCTCCTCCAAGCAGCGAGGACCACCAAAATCTTATATCAAAGCAGCCCCTGCCTAGGACCCAGGGCGACCCCACAGGCAGCGAGGAGAGCAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAGAGACAGACCCCTTCGACTGA
【００７２】
分裂のないタンパク質配列：（それぞれのエピトープには下線が引かれる。）。
MEPVDPNLEPWNHPGSQPKTACNNCYCKHCAKFVAAWTLKAAASYHCLVCFQTKGLGISYGRKKEKVYLAWVPAHKGIGRRQRRSAPPSSEDHQNLISKQPLPRTQGDPTGSEESKKKVESKTETDPFD
【００７３】
（実施例６）
システイン・リッチ・ドメイン中のＰｏｌ７１１エピトープと、Ｔａｔのベーシック・ドメインに接合されたＰＡＤＲＥエピトープとを有する、コドン最適化されたＴａｔの挿入配列。
0005576859.tif 000007
【００７４】
分裂のないＤＮＡ配列：（それぞれのエピトープには下線が引かれる。）：配列番号６で示される。
ATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTGGAGCCCTGGAACCACCCTGGCAGCCAGCCCAAGACCGCCTGCAACAACTGCTACTGCAAGCACTGCGAGAAGGTGTACCTCGCATGGGTGCCTGCCCACAAGGGCATTGGCAGCTACCACTGCCTGGTGTGCTTCCAGACCAGGGCCTGGGCATCAGCTACGGCCGGAAGAAGGCCAAGTTTGTCGCTGCCTGGACGCTGAAGGCTGCTGCCCGGCGCCAGCGCCGGAGCGCTCCTCCAAGCAGCGAGGACCACCAAAATCTTATATCAAAGCAGCCCCTGCCTAGGACCCAGGGCGACCCCACAGGCAGCGAGGAGAGCAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAGAGACAGACCCCTTCGACTGA
【００７５】
分裂のないタンパク質配列：（それぞれのエピトープには下線が引かれる。）。
MEPVDPNLEPWNHPGSQPKTACNNCYCKHCEKVYLAWVPAHKGIGSYHCLVCFQTKGLGISYGRKKAKFVAAWTLKAAARRQRRSAPPSSEDHQNLISKQPLPRTQGDPTGSEESKKKVESKTETDPFD
【００７６】
（実施例７）
合成イントロンを有する、コドン最適化されたＴａｔの挿入配列。
0005576859.tif 000008
【００７７】
分裂のないＤＮＡ配列：（合成イントロンには下線が引かれる。）：配列番号７で示される。
ATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTGGAGCCCTGGAACCACCCTGGCAGCCAGCCCAAGACCGCCTGCAACAACTGCTACTGCAAGCACTGCAGCTACCACTGCCTGGTGTGCTTCCAGACCAAGGGCCTGGGCATCAGCTACGGCCGGAAGAAGCGGCGCCAGCGCCGGAGCGCTCCTCCAAGCAGCGAGGACCACCAAAATCTTATATCAAAGCAGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGCCCCTGCCTAGGACCCAGGGCGACCCCACAGGCAGCGAGGAGAGCAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAGAGACAGACCCCTTCGACTGA
【００７８】
分裂のないタンパク質配列：
MEPVDPNLEPWNHPGSQPKTACNNCYCKHCSYHCLVCFQTKGLGISYGRKKRRQRRSAPPSSEDHQNLISKQPLPRTQGDPTGSEESKKKVESKTETDPFD
【００７９】
（実施例８）
合成イントロンの挿入配列：配列番号８で示される。
GTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGCGGTGATGCCTTTGAGGGTGGCCGCGTCCATCTGGTCAGAAAAGACAATCTTTTTGTTGTCAAGCTTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG
【００８０】
（実施例９）
ＡｐａＩ−ＳａｃＩ欠失コンストラクトのＤＮＡ配列（イントロンには下線が引かれる。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ酵素部位は太字で強調される。）：配列番号９で示される。
0005576859.tif 000009
【００８１】
（実施例１０）
ＳａｃＩＩ欠失コンストラクトのＤＮＡ配列（イントロンには下線が引かれる。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ酵素部位は太字で強調される。）：配列番号１０で示される。
0005576859.tif 000010
【００８２】
（実施例１１）
Ｂｇ１ＩＩ−ＸｈｏＩ欠失コンストラクトのＤＮＡ配列（イントロンには下線が引かれる。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ酵素部位は太字で強調される。）：配列番号１１で示される。
0005576859.tif 000011
【００８３】
（実施例１２）
ＰｓｔＩ欠失コンストラクトのＤＮＡ配列（イントロンには下線が引かれる。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ酵素部位は太字で強調される。）：配列番号１２で示される。
0005576859.tif 000012
【００８４】
（実施例１３）
ＰｓｔＩ−ＳａｃＩＩ欠失コンストラクトのＤＮＡ配列（イントロンには下線が引かれる。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ酵素部位は太字で強調される。）：配列番号１３で示される。
0005576859.tif 000013
【００８５】
（実施例１４）
ＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ欠失コンストラクトのＤＮＡ配列（イントロンには下線が引かれる。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ酵素部位は太字で強調される。）：配列番号１４で示される。
0005576859.tif 000014
【００８６】
（実施例１５）
伸長因子−１αプロモーターのＤＮＡ配列（完全長）（イントロンには下線が引かれる。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ酵素部位は太字で強調される。）：配列番号１５で示される。
0005576859.tif 000015
【００８７】
（実施例１６）
発現ベクターの生成。
ＨＩＶ−１サブタイプＣの野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）Ｔａｔおよびコドン最適化された（ｃｏｄｏｎ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）発現ベクター。
以前に、ＪＮＣＡＳＲ研究所から、完全長の野生型のサブタイプＣのＴａｔベクターのクローニングが報告された(Siddappa et al., 2007)。ＨＩＶ−１サブタイプＣ共通配列の第一エクソン（ｆｉｒｓｔ  ｅｘｏｎ）、ｐＤＶ２−ＴａｔＣＯ、に対応する、コドン最適化されたＨＩＶ−１のＴａｔ遺伝子もまた、以前に報告されている(Ramakrishna et al., 2004)。しかしながら、このベクターは、エクソンＩＩが欠落していた（ｌａｃｋｅｄ）。オーバーラップＰＣＲ法を用いて、エクソンＩＩのサブタイプＣ共通配列の３０ａａを、ｐＤＶ２−ＴａｔＣＯに付加することにより、完全長のＴａｔ発現ベクターが組み立てられた（ａｓｓｅｍｂｌｅｄ）。全てのコドンが哺乳類発現に最適化されていた。エクソンＩは、順方向プライマーＮ１１３(5'-TAGAATTCGCCGCCGCCATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTA-3')および逆方向プライマーＮ４５８(5'GTCGCCCTGGGTCCTAGGCAGGGGCTGCTTTGATATAAGATTTT-3')を用いて、増幅された。逆方向プライマーは、エクソンＩとの２０ｂｐのオーバーラップ、および、エクソンＩＩとの２４ｂｐのオーバーラップを含むように作られていた。プラスミドｐＤＶ２−ＴａｔＣＯ（ＴａｔのエクソンＩのみを含む。）が増幅のテンプレートとして用いられた。増幅条件は、以下の通りであった。９４℃で１分間、５４℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で３サイクルと、９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で１２サイクルであった。単位複製配列は、市販キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ゲル精製された（ｇｅｌ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ）。第二エクソンのコドン最適された共通配列は、８７塩基の単一のプライマー（Ｎ４５６）(5'-CCCCTGCCTAGGACCCAGGGCGACCCCACAGGCAGCGAGGAGAGCAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAGAGACAGACCCCTTCGAC-3')として合成された。１００ｂｐ以下のエクソンＩＩの単位複製配列は、ノン・テンプレーテッドＰＣＲ法（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ＰＣＲ）において、Ｎ４５６プライマーと、Ｎ４５７プライマー(5'-AGAGTCTAGACTAGTCGAAGGGGTCTGTCTCTGTCTT-3')とを用いて得られた。ＰＣＲの増幅条件としては、９４℃で１分間、５４℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で３サイクルと、９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で１２サイクルという条件を用いた。エクソンＩおよびエクソンＩＩの単位複製配列はゲル精製され、それぞれ、ＥｃｏＲｌおよびＸｂａｌの酵素部位（ｅｎｚｙｍｅｓ  ｓｉｔｅｓ）を含むＮ１１３およびＮ４５７のプライマーを用いて、オーバーラップＰＣＲ法が実施された。３５０ｂｐの最終生成物がゲル精製され、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）上のＣＭＶプロモーターの下流の、ＥｃｏＲＩ部位およびＸｂａｌ部位の間で一方向性にクローン化され（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｃｌｏｎｅｄ）（図１）、最適化されたコドンを有する完全長のＴａｔを含むｐＣＭＶ−ＴａｔＣＯが生成された。
【００８８】
（実施例１７）
発現ベクターの生成
ＴａｔＣＯへのイントロンの遺伝子操作：
ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ  （＃  ６０３１−１，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に由来する２３０ｂｐの合成イントロンを増幅させる目的で、オーバーラップＰＣＲ法が採用され、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）上のコドン最適化されたＴａｔの２つのエクソンの間で、上記イントロンがクローン化された（図５）最初、イントロンはＴａｔのエクソンＩに付加され、その後、エクソンＩＩに付加された。このようにして、エクソンの間に遺伝子操作されたイントロンを有する完全長のＴａｔを作成した。合成イントロンの複製は、１００ｎｇのプラスミドｐＩＲＥＳｐｕｒｏ（＃６０３１−１，  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が反応のテンプレートとして供給される条件で、一対のプライマー、Ｎ５２１(5'-GACCACCAAAATCTTATATCAAAGCAGGTGAGTACTCCCTCTC-3')およびＮ５２２(5'-TCGCCCGGGTCCTAGGCAGGGGCTGTGGAGAGAAAGGC-3')を用いて実行された。増幅条件は、以下の通りであった。９４℃で１分間、４２℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で３サイクルと、９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で１２サイクルであった。３００ｂｐ以下の単位複製配列がゲル精製され、ＰＣＲの次のラウンドのメガ・プライマー（ｍｅｇａ−ｐｒｉｍｅｒ）として用いられた。上記のＰＣＲの次のラウンドにおいて、プラスミドｐＣＭＶ−ＴａｔＣＯがテンプレートとして供給された。増幅の最初の３サイクルは、プライマーがない状態で実行された。増幅条件は、以下の通りであった。９４℃で１分間、４２℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で３サイクルと、９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で１２サイクルであった。３回目のサイクルの後、数秒、サイクラー（ｃｙｃｌｅｒ）が停止させられ、それぞれ順方向プライマーおよび逆方向プライマーである、Ｎ１１３(5'-TAGAATTCGCCGCCGCCATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTA-3')およびＮ５２２(5'-TCGCCCGGGTCCTAGGCAGGGGCTGTGGAGAGAAAGGC-3')からなるプライマー混合物が試験管に添加された。このＰＣＲにより、４８０ｂｐのフラグメントの増幅が得られた。第一エクソンおよび合成イントロンを含む生成物がゲル溶出され（ｇｅｌ  ｅｌｕｔｅｄ）、上述のようにして得られたＴａｔの第二エクソン単位複製配列と混合された。３回目のサイクルの後、サイクラーが停止させられ、それぞれ制限酵素部位ＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌを含むＮ１１３(5'-TAGAATTCGCCGCCGCCATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTA-3')およびＮ４５７(5'-AGAGTCTAGACTAGTCGAAGGGGTCTGTCTCTGTCTT-3')からなるプライマー混合物が試験管に添加され、増幅がさらに１５サイクル続けられた。エクソンＩ−合成イントロン−エクソンＩＩからなる５６０ｂｐの単位複製配列がゲル溶出され、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）骨格上（ｂａｃｋｂｏｎｅ）で、ＣＭＶまたはＥＦ−１αプロモーターの支配下で、２つの異なるベクターに一方向性にクローン化されて、ｐＣＭＶ−ＴａｔｉｎｔコンストラクトおよびｐＥＦ−１α  Ｔａｔｉｎｔコンストラクトが得られた。
【００８９】
（実施例１８）
発現ベクターの生成。
Ｔヘルパー・エピトープ  ＨＴＬのＴａｔＣＯへの接合：
ＨＴＬエピトープのＴａｔＣＯコンストラクトへの接合に、オーバーラップＰＣＲ法が用いられた。これを目的として、もともと破傷風毒素中で確認された「ＰＡＤＲＥ」エピトープ（Ｐａｎ  ＤＲヘルパーＴ細胞エピトープ、AKFVAAWTLKAAA)と、ＨＩＶ−１  ＲＴポリメラーゼに由来するＰｏｌ７１１エピトープ(EKVYLAWVPAHKGIG)という、２つの異なるエピトープが用いられた。ＰＡＤＲＥエピトープは、付加的な修飾（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を被りやすく、最も一般的なＨＬＡ−ＤＲ分子と高親和性で結合する(Alexander et al., 2000;Alexander et al., 1994b)。Ｐｏｌ７１１エピトープは、いくつかのネズミ科のクラスＩＩ分子と同様、多くの異なるＨＬＡ−ＤＲと結合することが報告されている(Wilson C et al., 2001)。ＨＴＬエピトープは、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ、Ｃ３０残基とＳ３１残基の間）および／またはベーシック・ドメイン（ＢＤ、Ｋ５２残基とＫ５３残基の間）の個々の位置または両方の位置に組み込まれた（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。
【００９０】
【表１】
0005576859.tif 000016
表１は、ＨＴＬエピトープのＴａｔへの接合に用いられるプライマーを示す。上下に一対のプライマーは、それぞれ、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを示す。逆方向プライマーは、リバース・コンプリメント（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）として提示される。アスタリスクは、２つの隣接するドメインの接合を示す。制限酵素は下線を引いて強調されている。
【００９１】
増幅条件は、以下の通りであった。生成物「Ａ」と生成物「Ｂ」を産出したＰＣＲの最初のラウンドの間の増幅条件は、９４℃で１分間、４２℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で３サイクルと、９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で１２サイクルであった。生成物「Ｃ」を産出したＰＣＲの第二ラウンドの増幅条件は、９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で１５サイクルであった。生成物「Ｃ」は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）骨格上（ｂａｃｋｂｏｎｅ）のＣＭＶまたはＥＦ−１αプロモーターの下流で、ＥｃｏＲＩ部位とＸｂａＩ部位との間に一方向にクローン化された。
【００９２】
（実施例１９）
発現ベクターの生成。
完全長のＥＦ−１αプロモーターのクローニング：
Ｄｒ．  Ｓｈｉｇｅｋａｚｕ  Ｎａｇａｔａから贈られた(Mizushima and Nagata, 1990)、１．２ｋｂのＥＦ−１α遺伝子の上流要素（ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を含むベクターｐＥＦ−ＢＯＳがもたらされた。Ｔａｔベクターの上流のＥＦ−１αプロモーターは、２つの連続する段階において得られた（図１２Ａ、図１２Ｂ、ｐ１００）。第一段階において、プロモーターのより大きなフラグメント（８００ｂｐのフラグメント）が、Ｔａｔの上流で、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのＡｆｌＩＩ酵素制限部位とＥｃｏＲＩ酵素制限部位との間に、方向性を持って移動された（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ）。第二段階において、ＥＦ−１αプロモーターの５'側の４００ｂｐのリマインダー（ｒｅｍｉｎｄｅｒ）がそれぞれ制限酵素部位ＭｌｕＩおよびＡｆｌＩＩを含む、順方向プライマーＮ５７０(5'-ATAGACGCGTGTGAGGCTCAGGTCGCCGTCAGTGGGC-3')および逆方向プライマーＮ５７３(5'-GGGCTTAAGCGCAAGGCGTCG-3')を用いて増幅された。増幅条件は、以下の通りであった。９４℃で１分間、４８℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で３サイクルと、９４℃で１分間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で１２サイクルであった。増幅のテンプレートとして、１００ｎｇのｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドが用いられた。４００ｂｐ以下のフラグメントが、ＭｌｕＩ部位およびＡｆｌＩＩ部位の間で一方向性にクローン化され、その結果、もともとＣＭＶプロモーターがあった位置に、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）骨格上で、完全長のＥＦ−１αプロモーターが組み立てられた（図２）。
【００９３】
（実施例２０）
発現ベクターの生成。
ＥＦ−１αプロモーターの構築：
ＣＭＶ−ＴａｔＣＯプラスミド中のＣＭＶプロモーターを置き換えることで、ＥＦ−１α  ＴａｔＣＯプラスミドが得られた（ｐ２１５．１）。プロモーターの移動には、制限酵素Ｍ１ｕＩ  およびＥｃｏＲＩが用いられた。
以前に、ＪＮＣＡＳＲ研究所から、完全長の野生型サブタイプＣのＴａｔベクター（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ  ｓｕｂｔｙｐｅ  Ｃ  Ｔａｔ  ｖｅｃｔｏｒ）のクローニングが報告されている(Siddappa et al., 2007)。ＨＩＶ−１サブタイプＣ共通配列の第一エクソンに関連する、コドン最適化されたＨＩＶ−１のＴａｔ遺伝子ｐＤＶ２−ＴａｔＣＯの構造もまた、以前に報告されている(Ramakrishna et al., 2004)。しかしながら、このベクターはエクソンＩＩが欠落している。オーバーラップＰＣＲ法を用いて、エクソンＩＩのサブタイプＣ共通配列の３０ａａがｐＤＶ２−ＴａｔＣＯに付加されることにより、完全長のＴａｔ発現ベクターが組み立てられた。全てのコドンが哺乳類発現に最適化されていた。エクソンＩは、順方向プライマーＮ１１３(5'-TAGAATTCGCCGCCGCCATGGAGCCAGTAGATCCTAACCTA-3')および逆方向プライマーＮ４５８(5'GTCGCCCTGGGTCCTAGGCAGGGGCTGCTTTGATATAAGATTTT-3')を用いて増幅された。逆方向プライマーは、エクソンＩと２０ｂｐオーバーラップし、エクソンＩＩと２４ｂｐオーバーラップするように作られた。増幅のテンプレートとして、ｐＤＶ２−ＴａｔＣＯプラスミド（ＴａｔのエクソンＩのみを含む。）が提供された。増幅条件は、以下の通りであった。９４℃で１分間、５４℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で３サイクルと、９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で１２サイクルであった。単位複製配列は、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてゲル精製された。第二エクソンのコドン最適化された共通配列が、８７塩基の単一のプライマー（Ｎ４５６）(5'-CCCCTGCCTAGGACCCAGGGCGACCCCACAGGCAGCGAGGAGAGCAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAGAGACAGACCCCTTCGAC-3')として合成された。１００ｂｐ以下のエクソンＩＩの単位複製配列は、ノン・テンプレーテッドＰＣＲ法（ｎｏｎ−ｔｅｍｐｌａｔｅｄ  ＰＣＲ）において、Ｎ４５６プライマーと、Ｎ４５７プライマー(5'-AGAGTCTAGACTAGTCGAAGGGGTCTGTCTCTGTCTT-3')とを用いて得られた。ＰＣＲの増幅条件としては、９４℃で１分間、５４℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で３サイクルと、９４℃で１分間、６０℃で３０秒間、７２℃で１分間という条件で１２サイクルという条件を用いた。エクソンＩおよびエクソンＩＩの単位複製配列はゲル精製され、それぞれ、ＥｃｏＲｌおよびＸｂａｌの酵素部位を含むＮ１１３およびＮ４５７のプライマーを用いて、オーバーラップＰＣＲ法が実施された。３５０ｂｐの最終生成物がゲル精製され、最適化されたコドンを有する完全長のＴａｔを含むｐＥＦ−１α−ＴａｔＣＯを生成する、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）上のＥＦ−１αプロモーターの下流の、ＥｃｏＲＩ部位およびＸｂａｌ部位の間で一方向性にクローン化された（図３）。
【００９４】
（実施例２１）
発現ベクターの生成。
ＥＦ−１αプロモーターの欠失変異体の構築：
一方でプロモーターの全長を縮小する目的で、他方で推定「負の調節要素（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」（ＮＲＥ）または他のシスに働く調節要素（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）の抑制的な役割を評価する目的で、ＥＦ−１αイントロンＩの欠失解析が行われた。第一イントロンの内部に欠失変異体を生成する目的で、ＮｒｕＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を用いて、ＥＦ−１αプロモーターの全体が、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）からのｐＵＣ１９ベクターに移植された。図１４、ｐ１０２に概略的示すとおり、第一イントロンにおける一連の欠失変異体を生成する目的で、多様な制限酵素が、単一でもしくは組み合わせて用いられた。その後、ＭｌｕＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位を用いて、ＥＦ−１αプロモーター欠失変異体のそれぞれが、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に戻された。このようにして、ＣＭＶ−ＴａｔＣＯ中の元の（ｏｒｉｇｉｎａｌ）ＣＭＶプロモーターを置き換え、ＴａｔＣＯが変異ＥＦ−１αプロモーターの支配下に置いた。制限酵素が欠失に用いられた後、コンストラクトが標識化された（ｌａｂｅｌｅｄ）。コンストラクトは、ＡｐａＩ−ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ−ＳａｃＩＩおよびＳａｃＩＩ−ＥｃｏＲＩ（Ｉｎｔ−ｌｅｓｓ）のように標識化された。最終的なコンストラクトは、イントロンを完全に欠いている。
【００９５】
（実施例２２）
Ｔヘルパー・エピトープのＴａｔへの組み込みは、Ｔａｔの免疫付与の安全性を高める。
Ｔａｔの毒素作用の原因の大半は、Ｔａｔのシステイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）またはベーシック・ドメイン（ＢＤ）である可能性がある。Ｔａｔのタンパク質構造および機能を混乱させて、Ｔａｔの免疫付与の安全性を高める目的で、Ｔヘルパー・エピトープ（ＨＴＬエピトープ）が、これらのドメインの一方または両方に挿入された。このため、２つの異なるＨＴＬエピトープが用いられた。第一のＨＴＬエピトープは、破傷風トキソイドに由来する、天然でない（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ）Ｐａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープであるＰＡＤＲＥ(Alexander et al., 2000; Alexander et al., 1994a)であった。第二の他のエピトープは、ＨＩＶ−１ポリメラーゼに由来するＰｏｌ７１１エピトープ(van der Burg et al., 1999)であった。これらのエピトープは、両方とも、マウスのＭＨＣクラスＩＩ分子（ｍｏｕｓｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に対して非常に高い結合親和性を有し、いくつかのヒトのＭＨＣにも結合する。ＨＴＬエピトープは、ＣＲＤおよび／またはＢＤの個々の位置または両方の位置に組み込まれた。
トランス活性化アッセイ：
Ｔａｔの免疫原性を増強し、毒性を緩和する目的で、２つの強力でユニバーサルなＴヘルパー・エピトープ（ＨＴＬエピトープ）がこのタンパク質に導入された。エピトープの１つは、破傷風トキソイドに由来する、天然でないＰａｎ  ＨＬＡ−ＤＲ結合エピトープであるＰＡＤＲＥであった(Alexander et al., 2000; Alexander et al., 1994a)。他のエピトープは、ＨＩＶ−１ポリメラーゼに由来するＰｏｌ７１１エピトープ(van der Burg et al., 1999)であった。これらのエピトープは、両方とも、マウスのＭＨＣクラスＩＩ分子（ｍｏｕｓｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に対して非常に高い結合親和性を有し、いくつかのヒトのＭＨＣにも結合する。ＨＴＬエピトープは、システイン・リッチ・ドメイン（ＣＲＤ）および／またはベーシック・ドメイン（ＢＤ）の個々の位置または両方の位置に組み込まれた（図４、左図）。上述の通り、ＨＴＬのＴａｔへの組み込みにより、２つの異なる目的が達成されることが期待される。１つは、Ｔａｔを免疫原性にするための効果的なヘルパーＴ細胞のリクルートであり、２つめは、Ｔａｔの毒素作用を無効にして（ａｂｒｏｇａｔｅ）、安全性を向上させることである。これらの２つのドメインはＴａｔの機能の統制において重要な役割を果たしているので、ＣＲＤおよび／またはＢＤを破壊することは、Ｔａｔの生物学的機能のいくつかを無効にする。ＨＴＬを組み込む間に、Ｔａｔの既知のＢ−エピトープまたはＣＴＬエピトープを破壊しないように、予防措置がとられる。ヒトとネズミ科の動物のクラスＩＩ分子の間で交差反応性結合（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を有するエピトープを用いることで、標準マウス・モデルにおける評価が可能になった(Alexander et al., 2002; Lopez-Diaz et al., 2003)。マウスへの免疫付与による予備試験の結果は、ＴａｔのＣＤにＰＡＤＲＥ  ＨＴＬが組み込まれたＴａｔコンストラクトからの免疫反応が非常に増強されることを示した（実験データは記載していない。）。ＣＲＤまたはＢＤのどちらかの領域が破壊されることで、Ｔａｔのトランス活性化活性が、大いに無効化された。この実験において、デュアル・レポーター・ベクター（ｄｕａｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｖｅｃｔｏｒ）（ウイルス・プロモーターの支配化で、分泌型アルカリホスファターゼ−ＳＥＡＰおよび緑色蛍光タンパク質−ＧＦＰという２つの異なる遺伝子を発現する。）であるＧＦＰ−ＳＥＡＰレポーター・ベクターが、Ｔａｔ発現ベクターの１つと一緒に、ＨＥＫ２９３細胞に導入された。損傷を受けていないＣＲＤおよびＢＤを有する３つの異なるＴａｔ発現ベクター（図４右上図の野生型、コドン最適化およびイントロンが組み込まれたＴａｔタンパク質（ｉｎｔｒｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ））は、トランス活性化が活性であり、ＧＦＰまたはＳＥＡＰの発現を可能にするＨＩＶ−１  ＬＴＲからの遺伝子発現が上方制御されていた（ｕｐ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ）。対照的に、ＣＲＤおよび／またはＢＤが破壊された６つのＴａｔ発現ベクターは、すべて、ウイルス・プロモーターからのレポーター遺伝子の発現をトランス活性化する（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｅ）ことができなかった（図４、右下図）。この結果は、これらのドメインの何れかが破壊されているＴａｔタンパク質は、免疫付与にとって安全であることを示唆した。
【００９６】
（実施例２３）
Ｔヘルパー・エピトープのＴａｔへの組み込みは、Ｔａｔの免疫付与への安全性を高める。−アポトーシス・アッセイ：
細胞がＴａｔに曝露されると、ウイルスタンパク質は、アポトーシスを誘導することによって、細胞死を引き起こす。ＣＲＤおよびＢＤは細胞のアポトーシスにおいて重要な役割を果たしている。これらの領域の一方が破壊されれば、操作されたＴａｔ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔａｔ）は細胞を殺す能力を失うはずである。ＢＤまたはＣＲＤが破壊されたＴａｔベクターを用いて、この仮説が検証された。Ｔａｔのドメイン破壊がＴａｔのアポトーシス機能を無効化することを調べる目的で、損傷を受けていない領域（野生型またはコドン最適化されたＴａｔ）を有するＴａｔベクター、または、ＨＴＬによってＣＲＤおよびＢＤの両方が破壊されたＴａｔベクターに、ＴＨＰ−１細胞が一過性にトランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）から２４時間後、ヨウ化プロピジウムを含む緩衝剤中で、細胞がアネキシンＶ−ＦＩＴＣで染色され、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたフローサイトメトリーによって分析された。野生型（ｗｔ）およびコドン最適化された（ｃｏ）ＴａｔのＤＮＡでは、それぞれ、４８％と５１％の細胞が陽性であり、非常に高いレベルのアポトーシスが誘導された。一方、ドメインが破壊されたＴａｔ（倍増ＨＴＬ（ｄｏｕｂｌｅ  ＨＴＬ））では、対照群のモック（空のベクター（ｅｍｐｔｙ  ｖｅｃｔｏｒ））と区別できないくらい低いレベルのアポトーシスが誘導された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値が比較された時（右図にグラフで示す。）、損傷を受けていないＴａｔコンストラクトと、ドメインが破壊されたＴａｔとの間の差異は明確になった。このことは、ドメインの破壊がこのウイルスのトランス活性化因子の大規模な減衰を引き起こし、それを免疫付与、遺伝子、タンパク質またはその他の形態に対して安全なものにしたことを示唆する（図５）。
【００９７】
（実施例２４）
Ｔヘルパー・エピトープをＴａｔに組み込むことは、Ｔａｔを免疫学的に優れたものにする：
異なるＴａｔ発現ＤＮＡベクター（Ｔａｔ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｖｅｃｔｏｒｓ）を用いて、複数のマウス群（１グループ当たり５匹）が免疫された。免疫付与は、筋肉注射で、標準プロトコル（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）によりなされ、免疫付与当たり（ｐｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）１００μｇのＤＮＡが接種された。１回のプライマーの免疫付与（ｐｒｉｍｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）に続いて、３回のブースターの免疫付与（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｓ）が実施された。最後のブースターの免疫付与から３ヵ月後に、脾細胞が採取された。サイトカイン・インターフェロンγ（ＩＮＦγ、Ｔｈ−１を代表するサイトカイン、望ましい免疫反応）またはインターロイキン−４（ＩＬ−４、Ｔｈ−２型のサイトカイン、あまり望ましくない）に対するエリスポット・アッセイが実施された。図６に示されるデータによれば、ＢＤ中ではなくＣＲＤ中にＰＡＤＲＥが組み込まれたＴａｔは、野生型（Ｗｔ）のＴａｔ抗原と比較して、ＩＦＮγへの反応が大きく増強されることが示されている。ＣＭＶまたはＥＦ−１αプロモーターのいずれかによってドライブされた（ｄｒｉｖｅｎ）Ｔａｔ発現は、基本的に、同一パターンの免疫反応を示す。ＨＩＶ−１  ＲＴ  ＨＴＬの挿入は、免疫反応を強化しない。ＰＡＤＲＥエピトープによって引き起こされる免疫反応は、より望ましいＴｈ−１型（ＩＦＮγ）であり、認識できるＩＬ−４の反応は観察されなかった。要約すれば、ＰＡＤＲＥエピトープのＴａｔのＣＲＤへの組み込みは、最も望ましいＴｈ−１型の免疫反応だけを引き起こす。このベクター・コンストラクトは、Ｔａｔ抗原のさらなる開発のための後の実験においても用いられるであろう（図６）。上述のデータは、実際に可能であることを示す実験（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｔｈｅ−ｃｏｎｃｅｐｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）としての役目を果たし、ＰＡＤＲＥが組み込まれたＴａｔ抗原が高い免疫原性を有し、非毒性であることの実験的証拠を提供する。
【００９８】
（実施例２５）
イントロンが組み込まれたＴａｔは、高次の（ｈｉｇｈｅｒ  ｏｒｄｅｒ）遺伝子発現を誘導する：
細胞質ＲＮＡの安定性および遺伝子発現を強化する目的で、プライマー伸長法を用いて、ｐＩＲＥＳ−ｐｕｒｏ  （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、＃  ６０３１−１）からの小さな（２３０ｂｐ）合成イントロンが、Ｔａｔの２つのエクソンの間に導入された。イントロンを含むＴａｔ遺伝は、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）の骨格上で、ＣＭＶおよびＥＦ−１αプロモーターの両方の下流に配された。レポーター・アッセイを用いて、Ｔａｔｉｎｔのトランス活性化能が、Ｔａｔｗｔ（野生型）およびＴａｔＣＯ（コドン最適化）と比較された。短く言えば、ＣＭＶまたはＥＦ−１αプロモーターによってドライブされたＴａｔｉｎｔ、ＴａｔｗｔおよびＴａｔＣＯのコンストラクトが、デュアル・レポーター・プラスミド（ｄｕａｌ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｐｌａｓｍｉｄ）であるＨＩＶ−ＬＴＲ−ＳＥＡＰ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰと一緒に、ＨＥＫ２９３細胞に同時遺伝子導入された（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）。トランスフェクションに引き続いて、２４時間ごとに遺伝子発現が観察された。全ての分析時点において、また、両方のプロモーターにおいて、Ｔａｔｉｎｔは、ＴａｔｗｔまたはＴａｔＣＯと比較して、非常に高いレベルのレポーター遺伝子を産出した。このことは、期待されたとおり、イントロンの存在によって、遺伝子発現が確かに向上したことを示唆する（図７Ａ、図７Ｂ）。
【００９９】
（実施例２６）
イントロンが組み込まれたＴａｔは高次の免疫反応を誘導する：
重要なことに、イントロンが挿入された（ドメインが破壊されていない）Ｔａｔも、高められた免疫反応を誘導し、ＨＴＬが組み込まれたＴａｔと同様の効果を奏する（図８Ａ、図８Ｂ）。追加実験において、イントロンを有するＴａｔと、イントロンを有しないＴａｔの免疫付与が比較された。イントロンを有するＴａｔは、非常に多くの数のサイトカイン・リンパ球（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を産出（図８Ａ）と、より強度のリンパ球増殖（図８Ｂ）とを誘導し、免疫原性を与えることに成功したことを示唆している。両方のプロモーター（図８Ａ、図８Ｂを参照。）ならびに２つの異なるマウス株ＢＡＬＢ／ｃ  ａｎｄおよびＣ５７ＢＬ／６の下でも同様に、Ｔａｔｉｎｔの優れた性能が明らかにされた。
【０１００】
（実施例２７）
イントロンが組み込まれたＴａｔは、マウス中のウイルス量を制御する：
１プライム−３ブースト養生法（ｒｅｇｉｍｅｎ）を用いて、免疫付与を受けたマウスが、ＥｃｏＨＩＶウイルスを攻撃接種された（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。ＥｃｏＨＩＶは、本来のエンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）が、エコトロピック・マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のエンペロープであるｇｐ８０のエンベロープによって置き換えられたキメラＨＩＶ−１である。ＭＬＶは、齧歯類のみに感染するレトロウイルスである (Potash et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102:3760-3765, 2005)。ＥｃｏＨＩＶは、方法は制限されるものの、標準となったマウス（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｍｉｃｅ）中で増殖することができ、それ故、ウイルスの増殖、制御および発症に関する研究にとって強力なツールを提供する。最後のブースターから２週間後に、免疫付与を受けたマウスが、ＥｃｏＨＩＶウイルスを攻撃接種され、リアルタイムＰＣＲを用いて、ウイルス量が測定された。対照群となる親ベクター（ｐｖ）と比較して、Ｔａｔを用いて免疫されたマウスは、非常に低いウイルス量を維持した（図９）。イントロンを有するＴａｔは、通常のＴａｔ（ｒｅｇｕｌａｒ  Ｔａｔ）より広い範囲にわたって、ウイルス量を制御した。データは、イントロンの遺伝子操作により、より高いレベルの免疫反応が引き起こされること、および、マウスモデルにおいてウイルスを制御できることの証拠を提供する。
【０１０１】
（実施例２８）
一緒に組み込まれたイントロンおよびＨＴＬを有するＤＮＡベクターは安全である：
新規なＴａｔベクターは、第一エクソンと第二エクソンとの間に、イントロンを含む。ＣＲＤの中間にＨＴＬが挿入された上述のベクターとは異なり、ＣＲＤの両端（ｅｘｔｒｅｍｅ  ｅｎｄｓ）に、ＰＡＤＲＥ  ＨＴＬエピトープが挿入された。ＪＮＣＡＳＲ研究所における最近の研究は、インドでの臨床上のコホート（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｈｏｒｔｓ）において、免疫優勢のＢ細胞エピトープをＣＲＤの内部に位置づけた（ｍａｐｐｅｄ）。それは、前のベクター（ｏｌｄｅｒ  ｖｅｃｔｏｒｓ）中へのＨＴＬの挿入（アミノ酸残基３０と３１との間）は、このエピトープを破壊したことを意味する。この問題を避ける目的で、Ｂ細胞エピトープが損傷を受けていないままにして、ＣＲＤのＮ末端側の端部（Ｃ２２  Ｔａｔ）、または、ＣＲＤのＣ末端側の端部（Ｃ３７  Ｔａｔ）にＨＴＬ（赤色の箱）を挿入することで、２つの新しいＴａｔベクターを開発した。ＨＴＬがコア・ドメイン（ＣＤ）に挿入された付加的なＴａｔベクターも産出された。ドメインを操作したその他のＴａｔではなく、損傷を受けていない野生型（ｗｔ）のＴａｔだけが、ウイルス・プロモーターを活性化することができ、ＨＥＫ２９３中のＧＦＰの発現を誘導することができた。ＲＦＰ発現は、トランスフェクション効率が良好であったことを裏付ける。ウエスタンブロット分析（下図）は細胞中の全てのタンパク質の発現を裏付ける。総合すれば、これらのデータは、新たに操作されたベクター中のＴａｔが免疫付与の目的において安全であることを証明している（図１０）。
【０１０２】
（実施例２９）
ウイルス関連のアッセイ（ＶＩＲＵＳ  ＲＥＬＡＴＥＤ  ＡＳＳＡＹＳ）
ＥｃｏＨＩＶウイルス・ストック（ｖｉｒａｌ  ｓｔｏｃｋｓ）の準備：
ＣａＣｌ２法(Jordan et al., 1996)を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に、Ｄｒ．  Ｄａｖｉｄ  Ｊ  Ｖｏｌｓｋｙから贈られた(Potash et al., 2005)ＥｃｏＨＩＶプラスミドの１０μｇがトランスフェクトされた。トランスフェクトの４８時間後に、上澄みが採取された。上澄み室温で１，５００ｒｐｍで１０分間回転させられた後、０．４５μｍのメンブレン・フィルターを通してろ過され、使用されるまで−８０℃で凍結保存された。上澄み中のｐ２４の濃度は、市販のＥＬＩＳＡキット（＃ＮＥＫ０５０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｉｎｃ社製）を用いて定量化された。高速遠心分離を用いて（ＳＳ３４ローター、５０，０００Ｇで３時間）ウイルスのペレットを得て、一度洗浄して、生理食塩水中（ｓａｌｉｎｅ）に再懸濁させた。マウスへの感染を確定する目的で、尾静脈を介してウイルスが注射されたとき、１００ｎｇのｐ２４が用いられた(Potash et al., 2005)。免疫付与に続く、ウイルス誘発実験を目的として、腹腔内経路を介して５μｇのウイルスが投与された(Saini et al., 2007)。
【０１０３】
（実施例３０）
免疫学的アッセイ
ＤＮＡ免疫付与：
キアゲン社製のＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａキットの型番１２３８１（＃１２３８１、Ｑｉａｇｅｎ社製、ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  ｋｉｔ）を用いて、製造会社の指示通りに、免疫付与品質のプラスミドＤＮＡが準備された。ｅｎｄｏｆｒｅｅ  ＰＢＳ（Ｍａｎｕｋｉｒｔｉ社製、エンドトキシン＜０．０６  ＥＵ）中に、ＤＮＡを再懸濁させ、標準ＬＡＬアッセイ（ＱＣＬ−１０００，  Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ社製）を用いて、エンドトキシン量を分析し、推奨制限値以内（＜０．１  ＥＵ／  μｇ  ＤＮＡ）であることを確認した。１００μｇのＤＮＡが生後８−１２週のマウスの前脛骨筋に注射された。それぞれの免疫付与は、１グループ当たり４または５匹のマウスで構成された。免疫付与のスケジュールには、１回のプライマーの免疫付与に続いて、１回または３回のブースターの免疫付与が含まれた。動物は、インドの動物実験のスーパービジョンの目的を審議する委員会（ＣＰＣＳＥＡ）およびＪＮＣＡＳＲの倫理的動物実験の制度を審議する委員会（ＩＡＥＣ）の勧告を順守する施設内で格納および飼育された。
【０１０４】
（実施例３１）
免疫学的アッセイ
リンパ増殖アッセイ：
ＤＮＡ抗原刺激を受けた（ＤＮＡ  ｐｒｉｍｅｄ）マウスが頸椎脱臼により屠殺され、２ｍｌの完全培地を含む直径６０ｍｍの無菌の皿の中に、脾臓が無菌で収集された。脾細胞を培地中に放出する目的で、２ｍｌの使い捨て注射器のハブ（ｈｕｂ）を用いて、穏やかな圧力を加えることで、臓器を押しつぶした。１０％ＦＢＳが補充された５ｍｌのＲＰＭＩ培地を含む、１５ｍｌのスクリューキャップ・チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）の中に細胞が収集された。重力によって、細胞の破片（ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）を、２分間落ち着かせた。細胞を含む上層が、未使用のチューブの中に注意深く移された。トリパンブルー色素排除試験法を用いて、生存能力のある細胞の数が数えられた。脾臓１つあたり、大体５０〜１００×１０６個の細胞が回収された。脾細胞は、平底でウェルを９６個有するマイクロプレートのウェル中で、トリプリケート（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）にて培養された。１つのウェル当たり２×１０５個の細胞が培養された。細胞は、マイトジェン、抗原またはペプチドのプールの存在下で４日間、活性化された。いくつかの実験において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのペプチド活性化が妨げられ、細胞が、直接、免疫機能に特徴付けられた。以前に報告されたように(Ramakrishna et al., 2004)、細胞活性化の目的で、ペプチド間の１０残基のオーバーラップを有し、ＴａｔのエクソンＩを補う（ｓｐａｎｎｉｎｇ）、６回重複する２０ｍｅｒのペプチドのプールが、２μｇ／ｍｌの濃度で用いられた。細胞増殖の陽性対照として、コンカナバリンＡが最終濃度５μｇ／ｍｌで用いられた。培養後、ウェル中へのトリチウム（［３Ｈ］）チミジンの添加により（１０μＣｉ／ｍｌ）、細胞増殖の程度が測定された標識を組み込む目的で、培養物が、３７℃でさらに４時間培養された。セル・ハーベスター（ノルウェーのＳｋａｔｒｏｎ社製）を用いて、プレートを採取した。フィルターが乾燥され、β−シンチレーションカウンターを用いて（Ｗａｌｌａｃ社製、１４０９）、放射能の総数が測定された。
【０１０５】
（実施例３２）
免疫学的アッセイ
エリスポット・アッセイ：
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の前に、Ｔｈ１サイトカインＩＮＦγ（マウスＩＮＦγ  エリスポット、ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）およびＴｈ２サイトカインＩＬ−４（マウスＩＬ−４  エリスポット、ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）に対して、エリスポット・アッセイが実施された。手短に言えば、抗体溶液を４℃で一晩培養することで、ＩＮＦγに特異的な捕捉抗体（ＩＦＮγ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（５μｇ／ｍｌ）がＰＶＤＦに支持された９６ウェルのプレートに吸着された。プレートは、室温で２時間、完全培地でブロックされ、準備された脾細胞（０．２×１０６細胞）がそれぞれのウェルに添加された。抗原、ペプチド・プールまたは適切なマイトジェンが、ラベル付きのウェル（ｌａｂｅｌｅｄ  ｗｅｌｌｓ）に適切な濃度で添加され、最終的な体積が２００μｌである培地中で、２４時間、細胞が培養された。プレートを反転させて、細胞がデカンテーションされた（ｄｅｃａｎｔｅｄ）。それぞれのウェルに、２００μｌの滅菌蒸留水が添加され、プレートが４℃で５分間培養され、細胞を浸透溶解させた（ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ  ｌｙｓｅ）。１×ＰＢＳを用いてウェルを３度洗浄して（１回の洗浄当たり２００μｌ）細胞の断片（Ｃｅｌｌ  ｄｅｂｒｉｓ）が除去され、ビオチン化抗ＩＮＦγ抗体（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ＩＦＮγ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ）（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、ウェルが２時間培養された。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む１×ＰＢＳを用いてウェルを３度洗浄して、ＨＲＰが接合したアビジン（ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｖｉｄｉｎ）（０．２５μｇ／ｍｌ）を用いて、ウェルが１時間培養された。スポットは、３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質溶液（＃５５１９５１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）の基質を用いて、室温で２０分間プレートを培養して展開された。細胞刺激の陽性対照として、ホルボールミリスチン酸アセテート（１μｇ／ｍｌ）とイオノマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）との組み合わせが用いられた。ＫＳエリスポット・システム（ドイツのＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、スポットを数えた。
【０１０６】
（実施例３３）
細胞性プロモーターの最適化：
ヒトサイトメガロウイルスの主要極初期遺伝子（ＣＭＶ）のプロモーター／エンハンサーは、既知の最も強力なプロモーターの１つである。このプロモーターは、高機能の細胞株であり、様々な系の組織（ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｏｒｉｇｉｎ）であるので、遺伝子治療への適用において、最も頻繁に使われている。それにもかかわらず、他のウイルス調整要素からの発現と同様、ＣＭＶプロモーターからの発現は、いくつかの生理学的状況において、インターフェロン媒介の経路または未解明の機構のいずれかを介して、下方制御される。そのウイルスの起源および遺伝子発現の不一致があるので、改善された発現特性を有する選択的プロモーターの探索が必要とされる。
【０１０７】
伸長因子−１α（ＥＦ−１α）遺伝子のプロモーター要素が、ＣＭＶプロモーターと同等の効果を示すことが示された。２、３のケースにおいては、ＣＭＶプロモーターより優れた効果を示す場合すらあった。ＣＭＶプロモーターと同様、ＥＦ−１αプロモーターからの遺伝子発現は、ユビキタス（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ）である。重要なことに、ＣＭＶプロモーターと異なり、ＥＦ−１αプロモーターはＩＦＮ媒介性経路またはＣｐＧメチル化経路を介した遺伝子制御が起こりにくい。このプロモーターは、遺伝子治療への適用において用いられているけれども、逆説的ではあるが、１つの出版物を除けば、遺伝子による免疫法に関してＥＦ−１αプロモーターの潜在力（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は評価されていない。
【０１０８】
この目的を念頭において、ＥＦ−１αプロモーターを含むＤＮＡ発現ベクターが構築され、その効果がＣＭＶプロモーターの効果と比較された。この分析の目的は、２要素からなる。一方においては、ＥＦ−１αプロモーターの重要な調整要素を詳しく説明することであり、他方においては、Ｔ細胞、単球および筋芽細胞のような免疫学的に重要な細胞株の効果を評価することである。以前の出版物は、ヒーラ細胞中のＥＦ−１αプロモーターのイントロンにおける負の調整要素（ＮＲＥ）を報告した。免疫学的に関連のある細胞における同様の分析を実施することは重要であり、本研究を通して達成されるであろう。
【０１０９】
ＥＦ−１αプロモーター変異プロモーター（ＥＦ−１α  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖａｒｉａｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）の生成：  一方で、イントロンＩ中の異なるフラグメントを欠失させて、細胞性プロモーター（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の長さを減少させる目的で、また、他方で、ＮＲＥの機能を検査する目的で、制限酵素での消化（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）が用いられた（図１１および図１１Ａを参照。）。全ての細胞性プロモーター変異体（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖａｒｉａｎｔｓ）がＨＩＶ−１  Ｔａｔの上流にクローン化され、ウイルス抗原を発現しているＣＭＶプロモーターと比較された。
【０１１０】
ＥＦ−１α変異プロモーター（ＥＦ−１α  ｖａｒｉａｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）は、レポーター遺伝子を効果的に発現させる：
ＨＥＫ２９３細胞に、リポーター・ベクター（ＨＩＶプロモーターの支配化で、ＳＥＡＰおよびＧＦＰの両方を発現している。）と、Ｔａｔをドライブする（ｄｒｉｖｉｎｇ）ＥＦ−１αプロモーターまたはＣＭＶプロモーターのベクターの１つとがトランスフェクトされた。すべてのベクターがＴａｔを発現させ（図１２Ａ、図１２Ｂ）、また、ＧＦＰ（図１２Ａ）もしくはＳＥＡＰの発現も誘導した。それらは、ＨＬＭ−１細胞からウイルスを効果的に救う。イントロンを完全に欠いたＥＦ−１αプロモーターは、非機能的だった（ｎｏｎ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）。トランスフェクション効率の対照群として、ＲFＰ発現が用いられた（図１２Ａ、図１２Ｂ）。
【０１１１】
（実施例３４）
ＥＦ−１α変異プロモーターによってドライブされたＴａｔは、高品質の免疫反応を誘導する：
左側に示されるような一連のＥＦ−１αプロモーターのＣＭＶプロモーターの支配下におけるＴａｔ  ＤＮＡベクターによって、Ｃ５７ＢＬ／６マウスが免疫された。ラインダイアグラムに示されたスケジュールに従って、マウス（１グループ当たり４または５匹）が、１００μｇのプラスミドＤＮＡを用いて免疫された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞刺激を行うことなく、脾細胞上で、エリスポット反応が実施された。それぞれのアッセイは、完全長のウイルス抗原を有するＴａｔペプチドのプールを用いて培養された、０．２×１０６個の脾細胞で構成された。その結果、細胞性プロモーターのコンストラクトのいくつかは、ＣＭＶプロモーターに匹敵する効率で機能することが示された。上記の免疫付与は、主として、より望ましいＴＨ−１型（ＩＦＮγ）を誘導した（図１３）。
【０１１２】
（実施例３５）
ＥＦ−１α変異プロモーターによるＴａｔの免疫付与は、ウイルス量を効果的に制御する：
図示された投与計画（ｒｅｇｉｍｅｎ）に続いて、図１４に示される４つのＴａｔ発現ベクターのうちの１つを用いてマウスが免疫された。２つの異なるマウス株が用いられた。最後のブースターの２週間後、免疫付与を受けたマウスが、ＥｃｏＨＩＶウイルスを攻撃接種され、リアルタイムＰＣＲ法を用いてウイルス量が測定された。免疫付与を受けた全てのマウスにおいて、親ベクターを用いて免疫された対照群と比較して、有意に低いレベルにウイルス量が制御された。ＥＦ−１αプロモーターのＡｐａＩ−ＳａｃＩＩ変異プロモーターは最もよい効果を示し、両方のマウス株において、ＣＭＶプロモーターと同様に効果的なレベルにまで、ウイルスを制御したこれらのデータは、ＡｐａＩ−ＳａｃＩＩ変異プロモーターおよびＳａｃＩＩ変異プロモーターが、遺伝子による免疫法への大きな可能性を有することを示す。これらのプロモーターは、オリジナルのＥＦ−１αプロモーターより効果的であり、ＣＭＶウイルス・プロモーターの不利益とも関係がない可能性がある（図１４）。
【０１１３】
（実施例３６）
ワクチン効力−ＥｃｏＨＩＶによるマウスの感染の定性分析：
本発明のＴａｔワクチン・コンストラクトの有効性を検証する目的で、ＥｃｏＨＩＶが攻撃接種されたモデルが用いられた。ＥｃｏＨＩＶプラスミドがＤｒ．Ｄａｖｉｄ  Ｊ．  Ｖｏｌｓｋｙからの親切な贈り物として得られた。２つの異なるマウス株であるＢＡＬＢ／ｃとＣ５７ＢＬ／６におけるＥｃｏＨＩＶによる感染は、基本的に彼らの論文において概説されたプロトコルに従って(Potash et al., 2005)、統一された。手短に言えば、ＥｃｏＨＩＶプラスミドがトランスフェクトされた２９３個のＴ細胞が、産生細胞株としての役割を果たし、ウイルス・ストックを得た。高速遠心分離を用いて、無細胞のウイルス・ストックが準備された。０．１μｇのｐ２４  ＥｃｏＨＩＶの静脈注射（ｉ．  ｖ．  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（尾静脈）によって、ＢＡＬＢ／ｃまたはＣ５７ＢＬ／６のマウスが接種された。感染またはモック感染（ｍｏｃｋ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の６週間後に、マウスが安楽死させられ、分析のために脾細胞が収集された。上述した補体介在分解法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用いて、脾細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを枯渇させられた。ＣＤ８＋枯渇脾細胞（ＣＤ８＋  −ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ）は、固定化され、透過処理され、細胞内ｐ２４（ｉｎｔｒａ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐ２４）に対して染色され、説明されているように共焦点顕微鏡法によって分析された。細胞内ｐ２４に対する蛍光免疫染色は、感染したマウスにおける、いくつかの明るく染色された細胞の存在を明らかにした。明るく染色された細胞の存在は、有効で、漸進的な（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ）ウイルス複製を確定する（図１５）。
【０１１４】
リアルタイムＰＣＲ法におけるウイルス量の測定：
ＥｃｏＨＩＶウイルス攻撃接種実験のために、上述のとおり（Saini et al., 2007）、無細胞のウイルスの腹腔内注射によって、マウスが、５μｇのＥｃｏＨＩＶ／ＮＬ４−３のｐ２４に感染させられた。攻撃接種の１週間後、マウスが頸椎脱臼によって安楽死させられ、脾臓および腹腔マクロファージが収集された。市販のカラム（＃Ｇ１０Ｎ０、Ｓｉｇｍａ社製）を用いて、脾臓からＤＮＡが分離され、リアルタイムＰＣＲ法を用いてプロウイルス量（ｐｒｏｖｉｒａｌ  ｌｏａｄ）が測定された。
【０１１５】
ＥｃｏＨＩＶおよびＧＡＰＤＨに対するリアルタイムＰＣＲ法の統一化：
プラスミド・スタンダード（ｐｌａｓｍｉｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を用いて、ＥｃｏＨＩＶおよびグリセルアルデヒドリン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）に対するリアルタイムＰＣＲ法（図１６Ａ、図１６Ｂ）が統一された。プロウイルス量を正規化する（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）目的で、ＧＡＰＤＨ増幅が内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として用いられた。ウイルス量のＰＣＲに用いられたプライマーＮ９０９(5'-GGCCAAACCCCGTTCTG-3')およびＮ９１０(5'-ACTTAACAGGTTTGGGCTTGGA-3')は、ＥｃｏＨＩＶのｇｐ８０上に配され、７１１６と７１７２との間の５６ｂｐのフラグメントを増幅した(Potash et al., 2005)。増幅条件は、以下の通りであった。９４℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間という条件で４０サイクルであった。ＧＡＰＤＨ増幅には、プライマーＮ１０４０(5'-GAGCTGAACGGGAAGCTCACT-3')およびＮ１０４１(5'-CACGTCAGATCCACGACGGACACATTG -3')が用いられた。反応条件は、９４℃で１分間、６６℃で３０秒間、７２℃で３０秒間という条件で４０サイクルであった。得られた単位複製配列の長さは、１２０ｂｐであった。これらの２対のプライマーに対する最適アニーリング温度は、グラジエントＰＣＲ（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ＰＣＲ）（ＭｙＣｙｌｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて、確認された。市販のキット（＃６２３４５、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）とＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  ６０００（オーストラリアのＣｏｒｂｅｔｔ  ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とを用いて、リアルタイムＰＣＲが実施された。データは、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  １．７．２８  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析された（図１６Ａ、図１６Ｂ）。
【０１１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図７Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１Ａ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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