(57)【要約】下記式で表される繰り返し単位からなるセルロース誘導体、該セルロース誘導体とリン脂質とを含んでなる組成物、それらの製造方法、ならびに該誘導体もしくは該組成物を含んでなる癒着防止材。2008096894.tif 000025  Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は−Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯＯＨ、−ＣＨ２−ＣＯＯＸ、または−ＣＨ２ＣＯ−ホスファチジルエタノールアミンであり、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属、−ＣＨ２−ＣＯＯＨと−ＣＨ２−ＣＯＯＸの置換度の合計が０．３〜２．０であり、−ＣＨ２ＣＯ−ホスファチジルエタノールアミンの置換度が０．００１〜０．０５である。
2008096894.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表される繰り返し単位からなるセルロース誘導体。
2008096894.tif 000019
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ独立に下記式（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）からなる群より選ばれるものであり、
−Ｈ                                      （ａ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＨ                        （ｂ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＸ                        （ｃ）
2008096894.tif 000020
式（ｃ）中、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属であり、
式（ｄ）中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、
（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計が０．３〜２．０であり、
（ｄ）の置換度が０．００１〜０．０５である。
【請求項２】
１重量％水溶液について動的粘弾性測定装置で角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃにて求められる複素弾性率が５０〜９００Ｎ／ｍ２である請求項１に記載のセルロース誘導体。
【請求項３】
Ｒ４およびＲ５が炭素数９〜１９のアルケニル基である請求項１または２に記載のセルロース誘導体。
【請求項４】
Ｒ４ＣＯ−および／またはＲ５ＣＯ−がオレオイル基である請求項３に記載のセルロース誘導体。
【請求項５】
Ｒ４ＣＯ−およびＲ５ＣＯ−がオレオイル基である請求項３に記載のセルロース誘導体。
【請求項６】
請求項１に記載のセルロース誘導体と、下記式で表されるリン脂質を含み、セルロース誘導体の繰り返し単位のモル当量とリン脂質のモル当量との比が１：０．０５〜１：１であるセルロース誘導体組成物。
2008096894.tif 000021
式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ８は−ＮＨ３＋または−Ｎ（ＣＨ３）３＋である。
【請求項７】
１重量％水溶液について動的粘弾性測定装置で角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃにて求められる複素弾性率が５０〜９００Ｎ／ｍ２である請求項６に記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項８】
Ｒ８が−ＮＨ３＋である請求項６に記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項９】
Ｒ８が−Ｎ（ＣＨ３）３＋である請求項６に記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項１０】
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７がすべて同一である請求項６から９のいずれかに記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項１１】
Ｒ６およびＲ７が炭素数９〜１９のアルケニル基である請求項６から９のいずれかに記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項１２】
Ｒ６ＣＯ−および／またはＲ７ＣＯ−がオレオイル基である請求項１１に記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項１３】
Ｒ６ＣＯ−およびＲ７ＣＯ−がオレオイル基である請求項１１に記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項１４】
Ｒ４およびＲ５が炭素数９〜１９のアルケニル基である請求項６から９のいずれかに記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項１５】
Ｒ４ＣＯ−および／またはＲ５ＣＯ−がオレオイル基である請求項１４に記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項１６】
Ｒ４ＣＯ−およびＲ５ＣＯ−がオレオイル基である請求項１４に記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項１７】
Ｒ４ＣＯ−、Ｒ５ＣＯ−、Ｒ６ＣＯ−、およびＲ７ＣＯ−がいずれもオレオイル基である請求項８に記載のセルロース誘導体組成物。
【請求項１８】
下記式で表される繰り返し単位からなり、分子量が５×１０３〜５×１０６のカルボキシメチルセルロースと、
2008096894.tif 000022
下記式で表されるホスファチジルエタノールアミンとを、
2008096894.tif 000023
カルボキシメチルセルロースのカルボキシル基１００当量に対し、ホスファチジルエタノールアミン０．１〜１００当量の割合にて、水および水と相溶する有機溶媒とからなり、水が２０〜７０容量％含まれる混合溶媒に溶解し、縮合剤の存在下で反応させる工程を含む、請求項１から５のいずれかに記載のセルロース誘導体の製造方法。
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ独立に、下記式（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）から選ばれるものであり、
−Ｈ                                （ａ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＨ                  （ｂ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＸ                  （ｃ）
式（ｃ）中、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属であり、
式（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計が０．３〜２．０であり、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に、炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基である。
【請求項１９】
反応工程の後に、カルボキシメチルセルロールの溶解度が３％未満で、水と相溶する沸点１００℃未満の有機溶媒を用いて精製する工程をさらに含む、請求項１８に記載の製造方法。
【請求項２０】
カルボキシメチルセルロールの溶解度が３％未満で、水と相溶する沸点１００℃未満の有機溶媒がエタノールである請求項１９に記載の製造方法。
【請求項２１】
反応工程に用いる水と相溶する有機溶媒が、テトラヒドロフラン、ジオキサン、およびジメチルスルホキシドからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項１８から２０のいずれかに記載の製造方法。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれかに記載の製造方法により得られたセルロース誘導体と、下記式で表されるリン脂質とを、水および水と相溶する有機溶媒を含む混合溶媒を用いて混合し、次いで溶媒を除く工程を含んでなる、請求項６から９、１７のいずれかに記載のセルロース誘導体組成物の製造方法。
2008096894.tif 000024
式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ８は−ＮＨ３＋または−Ｎ（ＣＨ３）３＋である。
【請求項２３】
溶媒を除く工程が、水による透析処理である請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
請求項１から５のいずれかに記載のセルロース誘導体を含んでなる癒着防止材。
【請求項２５】
請求項６から９、１７のいずれかに記載のセルロース誘導体組成物を含んでなる癒着防止材。
【請求項２６】
水１００重量部に対し、請求項１から５のいずれかに記載のセルロース誘導体を０．１〜１．５重量部含む、注入可能なハイドロゲル。
【請求項２７】
水１００重量部に対し、請求項６から９、１７のいずれかに記載のセルロース誘導体組成物を０．１〜５．０重量部含む、注入可能なハイドロゲル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定構造のセルロース誘導体、特定構造のセルロース誘導体とリン脂質とを含んでなる組成物、およびそれらの製造方法、ならびに該誘導体もしくは該組成物を含んでなる癒着防止材に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織の癒着は、損傷を受けた臓器表面が再生する際に他の組織と結合することにより発生する。そのため、手術後の癒着を防止するため生体適合性の材料であるセルロースなどの多糖類を使用した種々の癒着防止材が提案されている。
例えば、カルボキシメチルセルロースの水溶液を用いた癒着防止材が提案されている（Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ．、１６９、１５４−１５９（１９９５））。しかし、この癒着防止材は体内での滞留性が低く、癒着防止効果を十分に発揮させることができない。そのため、多糖類を種々の方法で修飾したり、水不溶化させたりする試みがなされている。
例えば、ヒアルロン酸とカルボキシメチルセルロースとをカルボジイミドで修飾した癒着防止材が提案されている（国際公開ＷＯ９２／０００１０５号パンフレット、国際公開ＷＯ９２／０２０３４９号パンフレット）。また、セルロースの水素原子を特定の置換基で置換したセルロース誘導体を主成分とする癒着防止材が提案されている（特開平１−３０１６２４号公報）。さらに、ホスファチジルエタノールアミンで修飾したヒアルロン酸化合物からなる癒着防止材が提案されている（特開２００６−２９６９１６号公報）。
また、米国特許第５０６４８１７号明細書には、低分子量のカルボキシメチルセルロースとホスファチジルエタノールアミンとを水溶媒で反応させてホスホリパーゼＡ２阻害剤組成物を得る反応が記載されている。もっとも、後述する比較例５に示すとおり、この反応条件では目的とする化合物は生成していないことがわかっている。
国際公開ＷＯ２００１／０４６２６５号パンフレットには水相溶性有機溶媒を含む水溶液中において、ポリアニオン性多糖類を活性剤と反応させることを含んでなる水不溶性の生物適合性ゲルが記載され、ポリアニオン性多糖類としてカルボキシメチルセルロースが挙げられている。
しかし、いずれの提案も癒着防止効果、取扱い性、安全性についてさらなる検討の余地がある。上記したように、リン脂質のセルロースへの導入は示唆されているものの、癒着防止効果があり、取扱いのしやすいハイドロゲルについては何ら検討されていない。
また、特開平９−２９６００５号公報には、疎水性基からなる修飾基を多糖類に導入すると、多糖類をゲル化させることなく粘度の増大および生体内安定性の向上を図ることができることが記載されている。しかし、本発明の癒着防止効果を得るのに有用なセルロース誘導体やそれを含んでなる組成物については、記載も示唆もされていない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、医用材料として有用なセルロース誘導体もしくはそれを含んでなる組成物を提供することにある。特に、ハイドロゲルにした場合、適度な弾性率および粘弾性を有し、癒着防止材として有用なセルロース誘導体もしくはそれを含んでなる組成物を提供すること、特に体内での滞留性に優れたゲル状の癒着防止材を提供することにある。さらに、本発明の目的は、該セルロース誘導体もしくはそれを含んでなる組成物の製造方法を提供することにある。
本発明者らは、安全性に優れた材料でセルロースを修飾し、粘弾性を増大させ、生体内での滞留性を向上させ、適度な粘弾性を有し、癒着防止効果を向上させる組成について鋭意研究した。その結果、本発明者らは、カルボシキメチルセルロースの水素原子を生体由来物質であるホスファチジルエタノールアミンで一部側鎖を置換すると、適度な粘弾性を有し、癒着防止材として有用で、なおかつ注射器を通して注入可能なハイドロゲルを形成しうる新しいセルロース誘導体が得られることを見出した。本発明者らはさらに、該セルロース誘導体に特定量のリン脂質を共存させることによっても適度な粘弾性を有し、癒着防止材として有用なセルロース誘導体組成物が得られることを見出した。
すなわち、本発明は下記式で表される繰り返し単位からなるセルロース誘導体である。
2008096894.tif 000003
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ独立に下記式（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）からなる群より選ばれるものであり、
−Ｈ                                （ａ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＨ                  （ｂ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＸ                  （ｃ）
2008096894.tif 000004
式（ｃ）中、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属であり、
式（ｄ）中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、
（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計が０．３〜２．０であり、
（ｄ）の置換度が０．００１〜０．０５である。
ここで、本明細書における置換度とは、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の当量の合計を３とした場合の、それぞれの置換基の数をいう。
また、本発明は上記したセルロース誘導体と、下記式で表されるリン脂質を含み、セルロース誘導体の繰り返し単位のモル当量とリン脂質のモル当量との比が１：０．０５〜１：１であるセルロース誘導体組成物である。
2008096894.tif 000005
式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ８は−ＮＨ３＋または−Ｎ（ＣＨ３）３＋である。
また、本発明は下記式で表される繰り返し単位からなり、分子量が５×１０３〜５×１０６のカルボキシメチルセルロースと、
2008096894.tif 000006
下記式で表されるホスファチジルエタノールアミンとを、
2008096894.tif 000007
カルボキシメチルセルロースのカルボキシル基１００当量に対し、ホスファチジルエタノールアミン０．１〜１００当量の割合にて、水および水と相溶する有機溶媒とからなり、水が２０〜７０容量％含まれる混合溶媒に溶解し、縮合剤の存在下で反応させる工程を含む、本発明のセルロース誘導体の製造方法である。
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ独立に、下記式（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）から選ばれるものであり、
−Ｈ                            （ａ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＨ              （ｂ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＸ              （ｃ）
式（ｃ）中、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属であり、
式（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計が０．３〜２．０であり、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に、炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基である。
また、本発明は上記した製造方法により得られたセルロース誘導体と、下記式で表されるリン脂質とを、水および水と相溶する有機溶媒を含む混合溶媒を用いて混合し、次いで溶媒を除く工程を含んでなる、上記したセルロース誘導体組成物の製造方法である。
2008096894.tif 000008
式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ８は−ＮＨ３＋または−Ｎ（ＣＨ３）３＋である。
さらに、本発明は上記したセルロース誘導体またはセルロース誘導体組成物を含有する癒着防止材である。
さらに、本発明は水１００重量部に対し、上記したセルロース誘導体を０．１〜１．５重量部含む、注入可能なハイドロゲルである。
さらに、本発明は水１００重量部に対し、上記したセルロース誘導体組成物を０．１〜５．０重量部含む、注入可能なハイドロゲルである。
本発明のセルロース誘導体は、適度な弾性率および粘弾性を有するハイドロゲルを形成し、無色透明で、低濃度でもゲルを形成するのに十分な粘弾性を有し、注射器などの細管を有する器具を用いて注入することが可能である。本発明の製造方法によれば、かかるセルロース誘導体を効率的に製造することができる。
本発明のセルロース誘導体組成物も、水に溶解させると適度な弾性率および粘弾性を有するハイドロゲルを形成し、医療用のインジェクタブルゲルや癒着防止材として用いることができる。本発明のセルロース誘導体組成物は、生体由来物質のホスファチジルエタノールアミン類またホスファチジルコリン類を含有するので安全である。本発明のセルロース誘導体組成物は、ホスファチジルエタノールアミンで置換したセルロース誘導体に、遊離のホスファチジルエタノールアミン類またはホスファチジルコリン類を添加することで、適度な弾性率および粘弾性を有するハイドロゲルを形成することができる。本発明の製造方法によれば、かかるセルロース誘導体組成物を効率的に製造することができる。
本発明の癒着防止材は、体内での滞留性に優れ、癒着防止効果に優れる。また、本発明のゲル状の癒着防止材は、十分な柔軟性と粘弾性を有し、取扱い性に優れ、複雑な形状の部位にも適用でき、内視鏡を用いた手術にも適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、フィブロネクチンとハイドロゲル＋フィブロネクチンのドロップと、ペトリ皿全体にわたるフィブロネクチンの被覆を示す概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
＜セルロース誘導体＞
本発明は、下記式で表される繰り返し単位からなるセルロース誘導体である。
2008096894.tif 000009
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ独立に下記式（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）からなる群より選ばれるものであり、
−Ｈ                                      （ａ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＨ                        （ｂ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＸ                        （ｃ）
2008096894.tif 000010
（（ｄ）中の不斉炭素に関するの立体異性については特に限定されない。）
式（ｃ）中、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属であり、
式（ｄ）中、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、
（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計が０．３〜２．０であり、
（ｄ）の置換度が０．００１〜０．０５である。
かかるＸのアルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどが好ましく、アルカリ土類金属としては、マグネシウム、カルシウムなどが好ましい。
式（ｄ）中のＲ４およびＲ５は、いずれも炭素数９〜１９のアルケニル基であることが好ましい。なかでもＲ４ＣＯ−および／またはＲ５ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましく、特にＲ４ＣＯ−およびＲ５ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましい。
（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計は、０．３〜２．０、好ましくは０．５〜１．８、より好ましくは０．６〜１．５である。（ｂ）と（ｃ）の割合は特に限定されないが、水に対する溶解性の点から、（ｃ）が（ｂ）よりも多く存在するほうが好ましい。
（ｄ）の置換度は、０．００１〜０．０５、好ましくは０．００５〜０．０３である。（ｄ）の置換度をこの範囲に制御することにより、適度な粘弾性を有し、注射器などの細管を有する器具を用いて注入可能なゲルを得ることができる。（ｄ）の置換度は元素分析によるリンの定量分析によって求められる。リンの元素分析には、セルロース誘導体を適切な酸性の水溶液により加水分解後、遊離するリンイオンをリン−モリブデン法などの発色による吸光分析やＩＰＣなどの発光分析が利用できる。
また、本発明のセルロース誘導体の好ましい重量平均分子量は５×１０３〜５×１０６であり、より好ましくは５×１０４〜５×１０６、さらに好ましくは５×１０４〜１×１０６である。セルロース誘導体の重量平均分子量は、式（ｄ）で表される基の導入により増大するから、原料となるカルボキシメチルセルロースの分子量を適切に選択することによって目的の分子量を有するセルロース誘導体を得ることができる。
＜セルロース誘導体組成物＞
本発明は上記したセルロース誘導体と、下記式で表されるリン脂質を含み、セルロース誘導体の繰り返し単位のモル当量とリン脂質のモル当量との比が１：０．０５〜１：１であるセルロース誘導体組成物である。
2008096894.tif 000011
式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ８は−ＮＨ３＋または−Ｎ（ＣＨ３）３＋である。
かかる本発明のセルロース誘導体組成物の構成成分たるセルロース誘導体についても、上記した本発明のセルロース誘導体について好ましいと述べたものが好適に用いられる。
すなわち、Ｘのアルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどが好ましく、アルカリ土類金属としては、マグネシウム、カルシウムなどが好ましい。式（ｄ）中のＲ４およびＲ５は、いずれも炭素数９〜１９のアルケニル基であることが好ましく、なかでもＲ４ＣＯ−および／またはＲ５ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましく、特にＲ４ＣＯ−およびＲ５ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましい。
上記式で表されるリン脂質におけるＲ６およびＲ７としても、いずれも炭素数９〜１９のアルケニル基であることが好ましく、なかでもＲ６ＣＯ−および／またはＲ７ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましく、特にＲ６ＣＯ−およびＲ７ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましい。
また、Ｒ８としては−ＮＨ３＋が好ましい。
また、本発明のセルロース誘導体組成物としては、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７がすべて同一であるものが好ましく、その中でもＲ４ＣＯ−、Ｒ５ＣＯ−、Ｒ６ＣＯ−、およびＲ７ＣＯ−がいずれもオレオイル基であるものが好ましく、同時にＲ８が−ＮＨ３＋であるものが最も好ましい。
＜セルロース誘導体の製造方法＞
上記した本発明のセルロース誘導体は、下記式で表される繰り返し単位からなり、分子量が５×１０３〜５×１０６のカルボキシメチルセルロースと、
2008096894.tif 000012
下記式で表されるホスファチジルエタノールアミンとを、
2008096894.tif 000013
カルボキシメチルセルロースのカルボキシル基（すなわち（ｂ）＋（ｃ）の置換基の合計）１００当量に対し、ホスファチジルエタノールアミン０．１〜１００当量の割合にて、水および水と相溶する有機溶媒とからなり、水が２０〜７０容量％含まれる混合溶媒に溶解し、縮合剤の存在下で反応させる工程を含む方法により製造することができる。
ここで、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ独立に、下記式（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）から選ばれるものであり、
−Ｈ                              （ａ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＨ                （ｂ）
−ＣＨ２−ＣＯＯＸ                （ｃ）
式（ｃ）中、Ｘはアルカリ金属またはアルカリ土類金属であり、
式（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計が０．３〜２．０であり、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に、炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基である。
かかる原料としてのカルボキシメチルセルロースは、分子量が５×１０３〜５×１０６であるものが好ましく、より好ましくは５×１０４〜５×１０６、さらに好ましくは５×１０４〜１×１０６である。
かかる原料としてのカルボキシメチルセルロースは、例えばパルプを水酸化ナトリウム溶液で溶解し、モノクロロ酢酸またはそのナトリウム塩でエーテル化し、精製することにより製造することができる。
上記式（ｃ）におけるＸのアルカリ金属としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどが好ましく、アルカリ土類金属としては、マグネシウム、カルシウムなどが好ましい。
（ｂ）と（ｃ）の置換度の合計は、０．３〜２．０、好ましくは０．５〜１．８、より好ましくは０．６〜１．５である。（ｂ）と（ｃ）の割合は特に限定されないが、水に対する溶解性の点から、（ｃ）が（ｂ）よりも多く存在するほうが好ましい。
原料として好ましいカルボキシメチルセルロースの具体的な構造式は下記式で示す通りである。セルロース骨格におけるカルボキシメチル基の置換位置は、Ｃ−６位にあることが好ましい。
2008096894.tif 000014
本発明のセルロース誘導体の製造方法で用いられる上記式で表されるホスファチジルエタノールアミンにおいて、Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立に、炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基である。Ｒ４およびＲ５としては、いずれも炭素数９〜２７のアルケニル基であることが好ましく、なかでもＲ４ＣＯ−および／またはＲ５ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましく、特にＲ４ＣＯ−およびＲ５ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましい。
かかる原料としてのホスファチジルエタノールアミンは、動物組織から抽出したもの、または合成して製造したものどちらでも使用できる。ホスファチジルエタノールアミンとしては、例えばジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン、ジベヘノイルホスファチジルエタノールアミン、ジリグノセロイルホスファチジルエタノールアミン、ジセロトイルホスファチジルエタノールアミン、ジモンタノイルホスファチジルエタノールアミン、ラウロオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジネルボノイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルホスファチジルエタノールアミン、ジヒラゴノイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミンを挙げることができる。その中でも、合成する際に使用する有機溶媒への溶解性の面からジオレオイルホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
ホスファチジルエタノールアミンは生体由来の安全な物質であり、本発明のセルロース誘導体において、セルロース誘導体分子間の疎水性相互作用を高める結果、本発明のセルロース誘導体は、これらの疎水性相互作用によりハイドロゲルを形成するものと考えられる。
本発明のセルロース誘導体の原料たるカルボキシメチルセルロースとホスファチジルエタノールアミンは、カルボキシメチルセルロースのカルボキシル基１００当量に対し、ホスファチジルエタノールアミンを０．１〜１００当量、好ましくは０．２〜５０当量、より好ましくは０．３〜４０当量の割合で反応させる。０．１当量よりも少ないと生成されるセルロース誘導体がハイドロゲルを形成しない。また、１００当量より多いと生成されるセルロース誘導体の疎水性が高くなり、不溶物が発生しやすくなって好ましくない。カルボキシメチルセルロースとホスファチジルエタノールアミンとの縮合反応は、縮合に用いる触媒の反応性や反応条件によっては反応効率が悪くなることがあるため、ホスファチジルエタノールアミンは、目的とする置換度の計算値よりも過剰に用いることが好ましい。
カルボキシメチルセルロースとホスファチジルエタノールアミンとは、水および水と相溶する有機溶媒（Ａ）とからなり、水が２０〜７０容量％である混合溶媒に溶解させる。水の含有量が２０容量％よりも少ないとカルボキシルメチルセルロースが溶解しにくくなり、また７０容量％よりも多いとホスファチジルエタノールアミンが溶解しにくくなるため反応が進まない。水の含有量は、好ましくは３０〜６０容量％である。
水と相溶する有機溶媒（Ａ）としては、具体的にはテトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、モルフォリンなどの環状エーテル結合を有する有機溶媒、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドンなどのアミド結合を有する有機溶媒、ピリジン、ピペリジン、ピペラジンなどのアミン類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類を挙げることができる。これらの中でも環状エーテル類あるいはスルホキシド類が好ましく、なかでもテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルスルホキシドがより好ましい。
反応に用いる縮合剤としては、カルボキシル活性化剤や縮合剤（狭義）が好ましい。カルボキシル活性化剤としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、２，４，５−トリクロロフェノール、Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジンなどが挙げられる。縮合剤（狭義）としては１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドやその塩酸塩、ジイソプロピルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミドやＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドなどが挙げられる。これらの中でも、カルボキシル活性化剤としてＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、縮合剤（狭義）として１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩を用いるのが好ましい。
反応温度は、好ましくは０〜６０℃である。副生成物の産生を抑制するためには、反応を０〜１０℃で行うことがより好ましい。反応環境は弱酸性下が好ましい。さらに好ましくはｐＨ６〜７である。
＜セルロース誘導体の精製方法＞
本発明のセルロース誘導体の製造方法においては、得られたセルロース誘導体を、実質的にカルボキシメチルセルロースを溶解しないが水と相溶する有機溶媒（Ｂ）を用いてセルロース誘導体を精製する工程を加えてもよい。
ここで、実質的にカルボキシメチルセルロースを溶解しないとは、粉末状あるいは凍結乾燥状態で入手可能なカルボキシメチルセルロースナトリウム塩あるいはカルボキシメチルセルロース（ＣＯＯＨ型）に関して、水が存在しない条件下でカルボキシメチルセルロースの有機溶媒に対する溶解性を調べたとき、ほとんどが溶解しない有機溶媒をいう。具体的には溶解度が３％以下のものである。例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロピルアルコール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、ｔ−ブチルアルコールなどのアルコール類、エチレングリコール、１，２−プロピレングリコール、１，３−プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類、アセトンなどのケトン類、フェノールなどの芳香族アルコール類を挙げることができる。これらの中でも沸点１００℃未満のものが好ましく、より好ましくは沸点７３．８℃以下のものである。例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコールが挙げられるが、生体内で使用することを考慮するとエタノールが好ましい。
これらの群からなる有機溶媒（Ｂ）を用いて精製する場合、セルロース誘導体が水や有機溶媒（Ａ）の混合液中に存在する状態で有機溶媒（Ｂ）を加えて沈殿を形成し、セルロース誘導体を取り出す方法を用いてもよい。また、上記により得られた沈殿、あるいは乾燥状態にある粉末、あるいは凍結乾燥により得られたスポンジなどの成型体に、有機溶媒（Ｂ）を添加し、洗浄する方法を用いてもよい。これらの精製方法により、反応に用いた縮合剤やカルボキシル活性化剤などの触媒類、反応せずに系中に残った未反応のリン脂質などを取り除くことができる。有機溶媒（Ｂ）中に懸濁している目的物を得るには、遠心分離、ろ過などの方法が利用される。また、ソックスレー抽出も、有機溶媒（Ｂ）による洗浄を行うために利用することができる。
＜セルロース誘導体組成物の製造方法＞
本発明のセルロース誘導体組成物は、上記した製造方法により得られたセルロース誘導体と、下記式で表されるリン脂質とを、水および水と相溶する有機溶媒を含む混合溶媒を用いて混合し、次いで溶媒を除く工程を含んでなる方法により製造することができる。
2008096894.tif 000015
式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基であり、Ｒ８は−ＮＨ３＋または−Ｎ（ＣＨ３）３＋である。
すなわち、この工程で用いられるリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン類またはホスファチジルコリン類である。式中、Ｒ６およびＲ７はそれぞれ独立に、炭素数９〜２７のアルキル基またはアルケニル基である、Ｒ６およびＲ７は、いずれも炭素数９〜１９のアルケニル基であることが好ましく、なかでもＲ６ＣＯ−および／またはＲ７ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましく、特にＲ６ＣＯ−およびＲ７ＣＯ−がオレオイル基であるものが好ましい。
かかるリン脂質は、動物組織から抽出したもの、または合成して製造したものどちらでも使用できる。ホスファチジルエタノールアミンとしては、例えばジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドイルホスファチジルエタノールアミン、ジベヘノイルホスファチジルエタノールアミン、ジリグノセロイルホスファチジルエタノールアミン、ジセロトイルホスファチジルエタノールアミン、ジモンタノイルホスファチジルエタノールアミン、ラウロオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ミリストオレオイルホスファチジルエタノールアミン、パルミトオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジネルボノイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレノイルホスファチジルエタノールアミン、ジヒラゴノイルホスファチジルエタノールアミン、ジアラキドノイルホスファチジルエタノールアミン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルエタノールアミンを挙げることができる。
ホスファチジルコリンとしては、例えばジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジアラキドイルホスファチジルコリン、ジベヘノイルホスファチジルコリン、ジリグノセロイルホスファチジルコリン、ジセロトイルホスファチジルコリン、ジモンタノイルホスファチジルコリン、ラウロオレオイルホスファチジルコリン、ミリストオレオイルホスファチジルコリン、パルミトオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジネルボノイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジリノレノイルホスファチジルコリン、ジヒラゴノイルホスファチジルコリン、ジアラキドノイルホスファチジルコリン、ジドコサヘキサエノイルホスファチジルコリンを挙げることができる。
これらの中でも特に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリンが好ましい。
かかるセルロース誘導体とリン脂質との混合は、水および水と相溶する有機溶媒（Ａ）の混合溶媒中で混合する。このとき、水の含有量が２０〜７０容量％である混合溶媒、好ましくは水の含有量が３０〜６０容量％である混合溶媒が用いられる。
有機溶媒（Ａ）として、具体的には前述した有機溶媒が利用できる。それらの中で好ましくは環状エーテル類あるいはスルホキシド類であり、なかでもテトラヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルスルホキシドがより好ましい。
本発明のセルロース誘導体組成物においては、セルロース誘導体にリン脂質を混合することにより、得られる組成物の粘弾性、および水を加えて得られるそのハイドロゲルの粘弾性を高めることができる。このとき、セルロース誘導体とリン脂質との混合比は、セルロース誘導体の繰り返し単位モル当量と、リン脂質のモル当量比が１：０．０５〜１：１であるが、好ましくは、１：０．１〜１：０．８、より好ましくは、１：０．１５〜１：０．６である。リン脂質のモル当量比が０．０５よりも低いと粘弾性の改善効果が得られず、また１を超えてもリン脂質が過剰に存在するだけで、粘弾性の改善効果は観察されにくい。
セルロース誘導体にリン脂質を混合する際の条件として、温度は０〜３０℃がよく、好ましくは１０〜２５℃である。また、溶媒中のポリマーおよびリン脂質の含量は特に制限されないが、合計で３重量％以下が好ましい。
セルロース誘導体にリン脂質を混合した後、有機溶媒（Ａ）を除去する工程を経て、目的とする組成物を得る。有機溶媒（Ａ）を取り除く方法としては特に制限はなく、減圧濃縮、凍結乾燥、水中での透析により有機溶媒を除く方法、噴霧乾燥、エレクトロスプレーデポジション、風乾、溶解性の低い溶媒を添加して目的物を沈殿させる方法などが利用できるが、これらの中では水中での透析により有機溶媒を除く方法が好ましく、得られた透析物を凍結乾燥により乾燥する方法が好ましい。透析膜には特に制限はないが、市販のヴィスキングチューブ（再生セルロース膜）が好ましく利用できる。
＜セルロース誘導体のハイドロゲル＞
本発明の癒着防止材は、本発明のセルロース誘導体を含有するハイドロゲルであり、水１００重量部に対し、本発明のセルロース誘導体を０．１〜５．０重量部、好ましくは０．２〜２．０重量部、さらに好ましくは０．３〜１．０重量部含むハイドロゲルである。
これらのハイドロゲルは、ゲルの入った容器を傾けても流れ落ちない程度の粘弾性を有するものが好ましく、スパテルなどの金属へらで触ると容易に変形することが可能で、患部に塗布することが容易な状態であり、また注射器など細管を有する器具で注入することが可能である。
かかるゲルの好ましい複素弾性率としては、水中におけるポリマー濃度が１重量％、温度３７℃の条件で、動的粘弾性測定装置を用い、角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃで測定したときに５０〜９００Ｎ／ｍ２であるものが好ましく、１００〜７００Ｎ／ｍ２であるものがさらに好ましい。この範囲が注入型のゲルとして最も取扱いやすいからである。
また本発明のハイドロゲルは無色透明であり、製造の過程でごみなどの異物が混入した場合、これを検知することが可能であり、工業生産する上でのメリットを有する。
またハイドロゲル中に含まれる水以外の他の成分としては、触媒として用いた縮合剤類、縮合剤が所定の化学反応を経由することで生成するウレアなどの副産物類、カルボキシル活性化剤、未反応のホスファチジルエタノールアミン類、反応の各段階で混入する可能性のある異物、ｐＨの調整に用いたイオン類などが考えられるが、これらの成分は、上記の有機溶媒（Ｂ）を用いた精製あるいは洗浄によって取り除かれており、いずれの化合物も、生体内に入れたときに異物反応として認識されない程度の低いレベルに抑えてあることが好ましい。
＜セルロース誘導体組成物のハイドロゲル＞
本発明のセルロース誘導体組成物はハイドロゲルを形成することができる。このとき、水１００重量部に対し、セルロース誘導体組成物を０．１〜５．０重量部、好ましくは０．２〜２．０重量部、さらに好ましくは０．３〜１．０重量部含むことにより、適度な粘弾性を有するハイドロゲルを得ることができる。
これらのハイドロゲルは、ハイドロゲルの入った容器を傾けても流れ落ちない程度の粘弾性を有するものが好ましく、スパテルなどの金属へらで触ると容易に変形することが可能で、患部に塗布することが容易な状態である。また注射器など細管を有する器具で注入することが可能である。
かかるゲルの好ましい複素弾性率としては、水中におけるポリマー濃度が１重量％、温度３７℃の条件で、動的粘弾性測定装置を用い、角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃで測定したときに５０〜９００Ｎ／ｍ２であるものが好ましく、１００〜７００Ｎ／ｍ２であるものがさらに好ましい。この範囲が注入型のゲルとして最も取扱いやすいからである。
ハイドロゲルに含まれる水、セルロース誘導体、およびリン脂質以外の成分としては、触媒として用いた縮合剤類、縮合剤が所定の化学反応を経由することで生成するウレアなどの副産物類、カルボキシル活性化剤、反応の各段階で混入する可能性のある異物、ｐＨの調整に用いたイオン類などが考えられる。いずれの化合物も、生体内に入れたときに異物反応として認識されない程度の低いレベルに抑えてあることが好ましい。
＜用途＞
本発明のセルロース誘導体、セルロース誘導体組成物、およびそれらのハイドロゲルの用途としては、医用材料を含めた医療用途、ヘアケア製品や肌の保湿剤などの日用品用途、化粧品用途などへの使用が可能である。本ゲルは注射器を通して注入可能であることから、その中でも特に低侵襲医療用途に用いることが可能であり、再生医療のための細胞の担体、成長因子などの液性因子を保持・徐放する担体、医薬品として利用できる低分子化合物を保持・徐放する担体、癒着防止材やシーラントなどの医用材料として、特に注入型の癒着防止材として好ましく利用できる。
【実施例】
【０００６】
以下の実施例により本発明の詳細をより具体的に説明する。しかし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（１）実施例に使用した材料は以下の通りである。
（ｉ）ＣＭＣＮａ：カルボキシメチルセルロースナトリウム（日本製紙ケミカル（株）製、置換度０．６９）、
（ｉｉ）テトラヒドロフラン（和光純薬工業（株）製）、
（ｉｉｉ）０．１Ｍ  ＨＣｌ（和光純薬工業（株）製）、
（ｉｖ）０．１Ｍ  ＮａＯＨ（和光純薬工業（株）製）、
（ｖ）ＥＤＣ：１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−ｃａｒｂｏｄｉ−ｉｍｉｄｅ・ＨＣｌ（（株）大阪合成有機化学研究所製）、
（ｖｉ）ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ：１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ（（株）大阪合成有機化学研究所製）、
（ｖｉｉ）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ−８１８１、日本油脂（株）製）、
（ｖｉｉｉ）Ｌ−α−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ−２０２０、日本油脂（株）製）、
（ｉｘ）Ｌ−α−ジオレオイルホスファチジルコリン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−８１８１、日本油脂（株）製）、
（ｘ）Ｌ−α−ジラウロイルホスファチジルコリン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−２０２０、日本油脂（株）製）、
（ｘｉ）Ｌ−α−ジミリストイルホスファチジルコリン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−４０４０、日本油脂（株）製）、
（ｘｉｉ）Ｌ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−６０６０、日本油脂（株）製）、
（ｘｉｉｉ）Ｌ−α−ジステアリルホスファチジルコリン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＣ−８０８０、日本油脂（株）製）、
（ｘｉｖ）フィブロネクチン（日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）、
（ｘｖ）ニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）、
（ｘｖｉ）マウスＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎより分譲）、
（ｘｖｉｉ）ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（ｘｖｉｉｉ）ＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（ｘｉｘ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（ｘｘ）ＦＢＳ（ＨＹＣＬＯＮＥ社製）、
（ｘｘｉ）トリプシン−ＥＤＴＡ：０．２５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、
（ｘｘｉｉ）メタノール（和光純薬工業（株）製）。
（ｘｘｉｉｉ）消毒用エタノール（和光純薬工業（株）製）、
（ｘｘｉｖ）ペントバルビタールナトリウム（ネンブタール注射液、大日本住友製薬製）、
（ｘｘｖ）イソジン消毒液（明治製菓（株）製）、
（ｘｘｖｉ）注射用蒸留水（大塚製薬（株）製）。
（２）セルロース誘導体中のリン脂質含量の測定
セルロース誘導体中のリン脂質の割合は、バナドモリブデン酸吸光光度法による全リン含量の分析により求めた。
（３）ハイドロゲルの複素弾性率の測定
ハイドロゲルの複素弾性率は、動的粘弾性測定装置であるＲｈｅｏｍｅｔｅｒ  ＲＦＩＩＩ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を使用し、３７℃、角速度１０ｒａｄ／ｓｅｃで測定した。複素弾性率とは弾性体の応力とひずみの比を表す定数のことである。
［実施例１］
＜セルロース誘導体＞
平均分子量２３０万のＣＭＣＮａ２００ｍｇを水４０ｍｌに溶解し、さらにテトラヒドロフラン４０ｍｌを加えた。この溶液にＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン１６９．７ｍｇ（０．０００２２８ｍｏｌ）（ＣＭＣＮａのカルボキシル基１００当量に対し４０当量）、ＥＤＣ４８ｍｇ（０．０００２５１ｍｏｌ）、ＨＯＢｔ・Ｈ２Ｏ３８．４ｍｇ（０．０００２５１ｍｏｌ）を１０ｍｌのテトラヒドロフラン／水＝１／１に溶解して反応系に添加した後、終夜攪拌を行った。攪拌後、テトラヒドロフランを除去し、水をある程度蒸発させたところで、エタノール中に加え、沈殿させた。ろ過により、エタノールを除き、再度、エタノールにて洗浄し、ろ物を真空乾燥することでセルロース誘導体を得、そのリン脂質含量を測定した。反応前のカルボキシメチルセルロースナトリウムの置換度は０．６９であり、すべてのカルボキシメチル基はナトリウム化されていると仮定し、リン脂質含量を用いて計算により、式（ｄ）の置換度を求めた。式（ｄ）の置換度は０．００７であった。
＜セルロース誘導体組成物＞
上記で得られたセルロース誘導体１００ｍｇ（０．４５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのテトラヒドロフラン／水＝１／１に溶解し、セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル当量の比が、１：０．０６２になるようにＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン２０．６ｍｇ（０．０２８ｍｍｏｌ）を添加し、２０時間攪拌した。攪拌後、透析により精製を行い、さらに凍結乾燥してセルロース誘導体組成物を得た。
＜セルロース誘導体ハイドロゲル＞
凍結乾燥したセルロース誘導体１０ｍｇをイオン交換水９９０ｍｇに溶解し、濃度１重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲル無色透明で、容器を傾けても流動することはなく、スパテルなどの金属へらを簡単に挿入することができ、２５Ｇの注射針を通して容易に押し出せることが可能であった。また、得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定したところ、１８８．２Ｎ／ｍ２であった。
＜セルロース誘導体組成物ハイドロゲル＞
凍結乾燥したセルロース誘導体組成物１０ｍｇをイオン交換水９９０ｍｇに溶解し、濃度１重量％のハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定したところ１８８．３Ｎ／ｍ２であった。
［実施例２］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル当量の比が、１：０．１３になるようにＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン４３．８ｍｇ（０．０５９ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例１と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、２８７．３Ｎ／ｍ２であった。
［実施例３］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル当量の比が、１：０．２６になるようにＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン８９．６ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例１と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、２９１．９Ｎ／ｍ２であった。
［実施例４］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル当量の比が、１：０．４０になるようにＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン１３５．６ｍｇ（０．１８ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例１と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、３０８．９Ｎ／ｍ２であった。
［実施例５］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンのモル当量の比が、１：０．６９になるようにＬ−α−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン２３１ｍｇ（０．３１ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例１と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、２９４．２Ｎ／ｍ２であった。
［実施例６］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジオレオイルホスファチジルコリンのモル当量の比が、１：０．２６になるように実施例１で使用したセルロース誘導体３０ｍｇ（０．１４ｍｍｏｌ）にＬ−α−ジオレオイルホスファチジルコリン２８．６ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例１と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、１７４．９Ｎ／ｍ２であった。
［実施例７］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジラウロイルホスファチジルコリンのモル当量の比が、１：０．２７になるようにＬ−α−ジラウロイルホスファチジルコリン２２．５ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例６と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、２４９．１Ｎ／ｍ２であった。
［実施例８］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジミリストイルホスファチジルコリンのモル当量の比が、１：０．２７になるようにＬ−α−ジミリストイルホスファチジルコリン２４．６ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例６と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、３９８．４Ｎ／ｍ２であった。
［実施例９］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリンのモル当量の比が、１：０．２７になるようにＬ−α−ジパルミトイルホスファチジルコリン２６．７ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例６と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、２４４．８Ｎ／ｍ２であった。
［実施例１０］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジステアロイルホスファチジルコリンのモル当量の比が、１：０．２７になるようにＬ−α−ジステアロイルホスファチジルコリン２８．８ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例６と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、２６１．２Ｎ／ｍ２であった。
［実施例１１］
セルロース誘導体中の繰り返し単位のモル当量とＬ−α−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミンのモル当量の比が、１：０．２７になるようにＬ−α−ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン２０．９ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）を添加する以外は実施例６と同様の操作を行い、セルロース誘導体組成物を得た後、ハイドロゲルを調製した。得られたハイドロゲルの複素弾性率を測定した結果、２１２．７Ｎ／ｍ２であった。
［実施例１２］
＜マウスＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞の調製＞
マウスＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞を１０％ＦＢＳおよび１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓを含むＤＭＥＭ中にて５％ＣＯ２存在下で培養した。インビトロにおけるハイドロゲルへの細胞接着および浸潤の評価では、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡでマウスＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞を組織培養用のペトリ皿から分離し、９００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離を行った。上清を除去し、１０％ＦＢＳおよび１％Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓを含むＤＭＥＭに懸濁し、０．４×１０５個／ｍｌの細胞懸濁液を調製した。
＜セルロース誘導体組成物ハイドロゲルへの細胞接着および浸潤の評価＞
手術後の癒着は、損傷を受けた臓器表面が再生する際に、他の組織と結合することにより発生するため、その防止方法の１つとして損傷組織への細胞浸潤を抑制することが考えられる。そこで、Ｓｎｏｗらの方法に一部改変を加えた方法を用いて、セルロース誘導体組成物ハイドロゲルへの細胞接着および浸潤を評価した［Ｓｎｏｗ  ＤＭ，ｅｍｍｏｎ  Ｖ，Ｃａｒｒｉｎｏ  ＤＡ，Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｊ．：Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ；１０９（１）：１１１−３０．１９９０］。すなわち、メタノール６ｍｌに５ｃｍ２のニトロセルロースを溶解させ、この溶液０．５ｍｌで組織培養用の直径６０ｍｍのペトリ皿を被覆したのち、２時間風乾した。実施例１のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルをニトロセルロースで被覆したペトリ皿にドロップしたのち、６時間風乾した。次に、３０μｇ／ｍｌフィブロネクチン３ｍｌでペトリ皿を被覆したのち、ＰＢＳでペトリ皿を洗浄した（図１）。最後に、０．４×１０５個／ｍｌのマウスＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞懸濁液５ｍｌをペトリ皿全体に播種した（２×１０５個／ペトリ皿）。位相差顕微鏡を用いて、７日間ハイドロゲルドロップへの細胞接着および浸潤を観察した。その結果、ドロップしたセルロース誘導体組成物ハイドロゲルへの細胞接着および浸潤は認められなかった。
［実施例１３］
実施例１のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルの代わりに実施例２のハイドロゲルを用いること以外、実施例１２と同様の操作を行い、ハイドロゲルへの細胞接着および浸潤を評価した。その結果は実施例１２と概ね同一であった。
［実施例１４］
実施例１のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルの代わりに実施例３のハイドロゲルを用いること以外、実施例１２と同様の操作を行い、ハイドロゲルへの細胞接着および浸潤を評価した。その結果は実施例１２と概ね同一であった。
［実施例１５］
実施例１のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルの代わりに実施例５のハイドロゲルを用いること以外、実施例１２と同様の操作を行い、ハイドロゲルへの細胞接着および浸潤を評価した。その結果は実施例１２と概ね同一であった。
［比較例１］
実施例１のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルの代わりに３０μｇ／ｍｌフィブロネクチンを用いること以外、実施例１２と同様の操作を行い、フィブロネクチンへの細胞接着および浸潤を評価した。細胞はフィブロネクチン全体に広がっていることが観察された。
その結果、７日目まで、比較例１ではマウスＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞が接着および浸潤していたのに比べ、実施例１２、１３、１４、および１５ではマウスＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞の本発明のハイドロゲルへの接着および浸潤はほとんど観察されず、細胞はハイドロゲルが被覆されていないフィブロネクチンの領域に選択的に接着していた。
以上より、実施例１２、１３、１４、および１５で評価したハイドロゲルには細胞接着および浸潤を抑制する効果があることが確認された。
［実施例１６］
＜腹腔内癒着試験＞
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）系ラット（日本チャールスリバー）１０匹（７週齢、雄）を使用し、Ｂｕｃｋｅｎｍａｉｅｒ  ＣＣ  ３ｒｄらの方法に従って腹腔内癒着モデルを作製した［Ｂｕｃｋｅｎｍａｉｅｒ  ＣＣ  ３ｒｄ，Ｐｕｓａｔｅｒｉ  ＡＥ，Ｈａｒｒｉｓ  ＲＡ，Ｈｅｔｚ  ＳＰ：Ａｍ  Ｓｕｒｇ．６５（３）：２７４−８２，１９９９］。すなわち、ラットをペントバルビタールナトリウムの腹腔内投与麻酔下で背位に固定し、腹部を剃毛した後、消毒用エタノールで消毒した。さらにイソジン消毒液で手術領域を消毒した後、腹部正中線に沿って３〜４ｃｍ切開して盲腸を露出させた。露出させた盲腸の一定の面積（１〜２ｃｍ２）について、滅菌ガーゼを用いて点状出血が生じるまで擦過した。盲腸を元に戻し、さらに相対する腹壁に欠損（８ｍｍ×１．６ｍｍ）を作製した。その後、腹壁の欠損部位に実施例１のセルロース誘導体ハイドロゲル（１ｍｌ）を塗布し、切開部の筋層は連続縫合した後、皮膚は４〜５針縫合した。創傷部をイソジン消毒液で消毒した後、ケージに戻した。モデル作製４週間後に動物をペントバルビタールナトリウム麻酔下で開腹し、腹腔内癒着の程度を肉眼的に観察し、以下に示す基準に従ってスコア化した。セルロース誘導体ハイドロゲルを塗布しないものをコントロールとした。
（スコア分類）
スコア０：癒着が認められない状態
スコア１：軽度の牽引で切れる程度の弱い癒着がある状態
スコア２：軽度の牽引に耐えられる中程度の癒着がある状態
スコア３：かなりしっかりとした癒着がある状態
有意差については、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの方法で検定した。
その結果、コントロールでは４週間後において腹壁と盲腸間に強固な癒着形成が認められた。一方、実施例１のハイドロゲルを塗布した群では、４週間後において腹壁と盲腸間の癒着の程度はコントロールと比較して有意に低かった。具体的には、コントロールが２．３±１．２（平均値±標準偏差）であるのに対し、実施例１のハイドロゲルを塗布した群では、０．８±１．２（平均値±標準偏差）で、統計学的に有意な差が認められた（Ｐ＜０．０１４、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ’ｓテスト）。
さらに、癒着が認められた場合、盲腸にゼムクリップを縫合糸にて縫い付け、それをＭｅｔｒｉｃ  Ｇａｕｇｅｓ（ＥＷ−９３９５３−０５、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ社製）で引っ張り、盲腸が腹壁からはがれるの最大強度（グラム）を測定し、その値を癒着の強度として評価した。癒着がない場合、０グラムとして扱った。有意差については、Ｗｅｌｃｈ’ｓ  ｔ検定を用いた。こうして実施例１のセルロース誘導体ハイドロゲルが癒着の程度や強度に及ぼす効果を評価した。その結果、コントロールが３３８．７±２７８．４グラム（平均値±標準偏差）であるのに対し、実施例１のセルロース誘導体ハイドロゲルを塗布した群では、１０８．１±１８８．７グラム（平均値±標準偏差）で、統計学的に有意な差が認められた（Ｐ＜０．０４４、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔテスト）
以上より、実施例１のセルロース誘導体ハイドロゲルは、癒着を防止できることを確認した。
［実施例１７］
ラットを８匹用い、実施例１のセルロース誘導体ハイドロゲルの代わりに実施例１のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルを用いること以外、実施例１６と同様の操作を行い、それが癒着の程度や強度に及ぼす効果を評価した。その結果、癒着のスコア、強度はそれぞれ、０．１±０．４、１８±５２グラム（平均値±標準偏差）であった。
［実施例１８］
ラットを９匹用い、実施例１のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルの代わりに実施例２のハイドロゲルを用いること以外、実施例１７と同様の操作を行い、ハイドロゲルの癒着の程度、強度に対する効果を評価した。その結果、癒着のスコア、強度はそれぞれ、０．２±０．７、５０±１４９グラム（平均値±標準偏差）であった。
［実施例１９］
ラットを８匹用い、実施例１のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルの代わりに実施例３のハイドロゲルを用いること以外、実施例１７と同様の操作を行い、ハイドロゲルの癒着の程度、強度に対する効果を評価した。その結果、癒着のスコア、強度はそれぞれ、０．０±０．０、０±０グラム（平均値±標準偏差）であり、完全に癒着が抑えられていた。
［実施例２０］
ラットを９匹用い、実施例１のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルの代わりに実施例５のハイドロゲルを用いること以外、実施例１７と同様の操作を行い、ハイドロゲルの癒着の程度、強度に対する効果を評価した。その結果、癒着のスコア、強度はそれぞれ、０．６±１．１、８９±１８０グラム（平均値±標準偏差）であった。
［比較例２］
コントロールとして、ハイドロゲルを塗布せずに、実施例１７と同様の操作を行い、癒着の程度、強度を評価した。その結果、癒着のスコア、強度はそれぞれ、２．０±１．３、３９７±３１３グラム（平均値±標準偏差）であった。
以上、４週間後において、比較例２で強固な癒着が発生していたのと比較して、実施例１７、１８、１９、および２０では癒着の程度、強度が有意に抑制されていた。
以上より、実施例１、２、３、および５で得られた本発明のセルロース誘導体組成物ハイドロゲルには、生体内において癒着を強力に抑制する効果があることが確認され、手術後の癒着を効果的に防止することができることが示された。
以下表１に実施例１７〜２０および比較例２の結果をまとめる。
【表１】
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［実施例２１］
実施例１のセルロース誘導体ハイドロゲルの濃度および塗布量を変えて用いること以外は、実施例１６、１７と同様の操作を行い、ハイドロゲルの癒着の程度、強度に対する効果を評価した。各群９例のラットを用いた。結果を表２に示す。
【表２】
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塗布量を一定（１ｍｌ）にした場合、癒着の程度、強度は、０．５重量％以上で対照群と比較して有意に低かった。また、濃度を一定（１重量％）にした場合、０．２５ｍｌでも対照群と比較して癒着の程度、強度は有意に低かった。したがって、これらの塗布量、濃度であれば、生体内で所期の効果を発現することが確認された。
［実施例２２］
ＣＭＣＮａに分子量９７万のものを用いた以外は実施例１と同様に調製したセルロース誘導体（置換度０．００１、「ＣＭＣ−ＰＥ」と表記）を塩化ナトリウム水溶液に溶解させてゲル化したものの粘度（Ｅｔａ（Ｐ）、１０ｒａｄ／ｓｅｃでの値）を測定した。結果を表３に示す。ポリマーの濃度は１重量％であり、「ＣＭＣ−Ｎａ」は原料に用いた分子量９７万のカルボキシメチルセルロースナトリウム塩を表し、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）を表す。
【表３】
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このように、本発明のセルロース誘導体ハイドロゲルは、少量の塩化ナトリウムを共存させることで、驚くべきことにその粘度が急激に増大することがわかった。この特性を利用することにより、例えば本発明のハイドロゲルを注射する際には塩化ナトリウムを加えずに粘度の低い状態とすることで注射を容易にするが、投与した局所では生体組織に触れて塩化ナトリウム濃度が上昇することにより粘度が増大し、例えば癒着防止剤などの所期の機能を発揮しやすくする、といった使用法が可能になる。
［比較例３］
本発明者らは、本発明のセルロース誘導体ハイドロゲルやセルロース誘導体組成物ハイドロゲルに限らず、他の多糖類を一級のアミノ基を有する疎水基により修飾することによる粘弾性の増大効果を検討した。例えば、ヒアルロン酸をロイシンメチルエステル、チロシンエチルエステル、フェニルアラニンメチルエステル、ビタミンＫ５、カルバコール（塩化カルバミルコリン）、エチルアミン、ニコチンアミドを用いて多糖類のカルボキシル基を修飾して作成したハイドロゲルでは粘弾性の向上はほとんど認められなかったのに対し、エチルウレアで修飾したものには明らかな粘弾性の向上が認められた。したがって、多糖類を疎水基で修飾することにより、そのハイドロゲルの粘弾性の向上が認められる場合はあるが、具体的にどのような組み合わせのときに粘弾性の向上が認められるかについて予測することは困難であることがわかる。
［比較例４］
さらに、多糖類を疎水基で修飾することで得られるハイドロゲルの粘弾性と、それを用いたときの癒着防止効果との関連も検討した。平均分子量２３０万のＣＭＣＮａを用い、ホスファチジルエタノールアミンの代わりにオレイルアミンをＣＭＣＮａのカルボキシル基１００当量に対し４０当量用いた以外は実施例１に記載の方法でＣＭＣ−オレイルアミン誘導体を調製した。この誘導体の複素弾性率は、８７．４Ｎ／ｍ２であった。
本発明者らは、カルボキシメチルセルロースをアルキルアミン、具体的にはオレイルアミンで修飾することによっても、高粘弾性のセルロース誘導体のハイドロゲルが得られることを見出している。しかし、それを実施例１２に記載のハイドロゲルへの細胞接着および浸潤の評価を行ったところ、ＣＭＣ−アルキルアミンハイドロゲルの細胞接着および浸潤を抑制する効果は低く、ハイドロゲルの高い粘弾性が必ずしも良好な癒着防止効果に結びつかないことがわかった。
［比較例５］
ＣＭＣＮａ（日本製紙ケミカル（株）製、Ｆ１５ＭＨＣ、置換度０．７７）を用い、リン脂質には、ジラウルロイルホスファチジルエタノールアミン（ＣＯＡＴＳＯＭＥ  ＭＥ−２０２０、日本油脂（株）製）を用いた。その他の試薬は、実施例１に記載のものと同じものを用いた。
１ｇのＣＭＣＮａを５０ｍｌの水に溶解し、この溶液に、ジラウルロイルホスファチジルエタノールアミン２００ｍｇを添加し、室温で１時間攪拌した。この溶液にＥＤＣを５００ｍｇ添加し、一晩、室温で攪拌した。得られた溶液を脱イオン水で透析し、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥体を、ポリマー濃度が１重量％となるよう水と混合し、粘弾性を測定した。
その結果、反応前のＣＭＣＮａの複素弾性率が０．４Ｎ／ｍ２であったのに対し、得られた凍結乾燥品の複素弾性率が０．４Ｎ／ｍ２であり、反応の前後でポリマー溶液の物性に変化は見られなかった。得られたセルロース誘導体と水との混合物は、容器を傾けると流れ落ちる流体のままであり、ゲルの性状は示さなかった。
【産業上の利用可能性】
【０００７】
本発明のセルロース誘導体組成物は、医療用ハイドロゲル、とりわけインジェクタブルな癒着防止材として有用である。癒着防止材は、脊椎、関節、腱、神経などに対する手術時に、損傷を受けた生体組織表面が癒着するのを防止するために用いることができる。さらに具体的には、脊椎手術の場合、例えば本発明の癒着防止材を硬膜と神経根周囲を隔離するために塗布することで癒着を防止することができる。
癒着が起きた場合、除痛、可動領域の確保を目的として癒着剥離を行う必要がある。本発明の癒着防止材を塗布することにより、癒着を防止することができ、再手術を回避し、医療経済性の向上、さらには患者の生活の質を高めることが可能となる。
また、婦人科手術では、開腹術又は腹腔鏡による子宮筋腫摘出術時などに用いることができる。手術後の創傷部位に本発明の癒着防止材を塗布することにより、癒着を防止することができる。
本発明の癒着防止材は体内での優れた滞留性を有し、癒着防止材として有用である。とくに癒着防止材がゲルの場合は、複雑な形状の部位にも適用でき、内視鏡を用いた手術に容易に適用可能である。
【図１】
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【国際調査報告】
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