(57)【要約】  本発明によれば、（１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または（２）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しており、かつ（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物、および該微生物などを用いたＬ−グルタミンの製造法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または（２）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しており、かつ（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物。
【請求項２】
コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
請求項１に記載の微生物、または以下の（１）〜（５）より選ばれる１つ以上の蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、該培養物中にＬ−グルタミンを生成、蓄積させ、該培養物中からＬ−グルタミンを採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミンの製造法。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（５）配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ（１）〜（４）のいずれかの蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
【請求項４】
コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、請求項３に記載のＬ−グルタミンの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ‐グルタミンを生成蓄積する能力を有するコリネバクテリウム属に属する微生物、および該微生物を用いたＬ‐グルタミンの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コリネバクテリウム・グルタミクムのgluABCDオペロンは、Ｌ‐グルタミン酸取り込みシステムの蛋白質群をコードすることが知られている（非特許文献１）。また、ブレビバクテリウム属に属する微生物の染色体上のgluABCDを破壊することによりＬ‐グルタミン酸の生産量が増大することは知られているが（特許文献１）、Ｌ‐グルタミンの生産量が増大することは知られていない。【０００３】
コリネバクテリウム・グルタミクムの染色体上で近接する３つのORF、すなわちNcgl2653、Ncgl2654、Ncgl2655それぞれを単独で欠失させた株は、Ｌ‐グルタミンを単一炭素源とした寒天培地上で生育できないが、それぞれの株のＬ‐グルタミン取り込み能は野生株の８０％保持されていること、およびNcgl2655を欠失した株は野生型株に比べ菌体内のＬ−グルタミン酸量が2倍に上昇するが、Ｌ−グルタミン量はわずかしか上昇しないことが知られている（非特許文献２）。
【特許文献１】特開2000-270872号
【非特許文献１】J.Bacteriol., 177, 1152-1158(1995)
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 281, 12300-12307 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、Ｌ‐グルタミンを生成、蓄積する能力を有する微生物、および該微生物を用いたＬ‐グルタミンの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の［１］〜［４］に関する。
［１］（１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または（２）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しており、かつ（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、または（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、の活性が低下または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物。
［２］コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、［１］に記載の微生物。
［３］［１］に記載の微生物、または以下の（１）〜（５）より選ばれる１つ以上の蛋白質の活性が低下、または喪失しているコリネバクテリウム属に属する微生物を培地に培養し、該培養物中にＬ−グルタミンを生成、蓄積させ、該培養物中からＬ−グルタミンを採取することを特徴とする、Ｌ−グルタミンの製造法。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（３）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（５）配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ（１）〜（４）のいずれかの蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
［４］コリネバクテリウム属に属する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクムである、［３］に記載のＬ‐グルタミンの製造法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、Ｌ‐グルタミンを効率的に生成、蓄積する能力を有するコリネバクテリウム属に属する微生物を得ることができ、また該微生物を用いてＬ‐グルタミンを効率的に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
１．本発明の微生物および本発明の方法で用いられる微生物の調製
本発明の微生物および本発明の方法で用いられる微生物は、以下の（１）または（２）記載の蛋白質
（１）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（２）配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％、最も好ましくは９９％の相同性を有し、かつ配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
の活性が低下または低下または喪失しており、かつ以下の（３）または（４）記載の蛋白質
（３）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（４）配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％、最も好ましくは９９％の相同性を有し、かつ配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
の活性が低下または喪失した微生物、および以下の（５）〜（９）より選ばれる１つ以上の蛋白質
（５）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（６）配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（７）配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（８）配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
（９）配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらに好ましくは９８％、最も好ましくは９９％の相同性を有し、かつ配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質
の活性が低下または喪失した微生物をあげることができる。【０００８】
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST[Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]やFASTA[Methods Enzymol., 183, 63 (1990)]を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている［J. Mol. Biol., 215, 403(1990)］。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばScore＝100、wordlength＝12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばscore＝50、wordlength＝3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。【０００９】
上記した配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１〜３のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、配列番号４で表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質、または配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有し、かつ配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質と実質的に同一の活性を有する蛋白質を発現するコリネバクテリウム属に属する微生物は、以下の方法により特定することができる。【００１０】
すなわち、公知のDNAデータベースの検索またはコリネバクテリウム属に属する微生物の染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションもしくはPCR法などで分析することにより配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有する蛋白質を発現する微生物を特定した後、J. Bacteriol., 177, 1152-1158(1995)またはJ. Biol. Chem., 281, 12300-12307(2006) 記載の方法に準じて、該蛋白質の活性を喪失したコリネバクテリウム属に属する微生物を取得し、該文献記載の配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性が喪失した微生物と同一の性質を有していることを確認することにより、上記微生物であることを特定することができる。【００１１】
また本発明の微生物および本発明の方法で用いられる微生物は、配列番号１〜４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性が低下または喪失している既存の微生物が有している、該蛋白質をコードする変異型遺伝子を、ファージを用いた形質導入によって１つの微生物に集積する方法［J.H.Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1972)］、UV照射、変異剤などで微生物を変異処理した後、上記した蛋白質の活性が低下または喪失した菌株を選択する方法、アンチセンス法等の蛋白質の発現を抑制する方法、または微生物の染色体DNA上の上記した蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列に、塩基の欠失、置換または付加を導入する方法などにより取得することができる。【００１２】
塩基の欠失、置換または付加を導入する領域としては、上記した蛋白質の活性を低下または喪失させることのできる領域であれば限定されず、上記した蛋白質をコードする遺伝子のORFおよび該遺伝子のプロモーターなどの転写調節領域やシャイン・ダルガノ配列などの翻訳調節領域をあげることができ、好ましくは上記した蛋白質をコードする遺伝子のORFをあげることができる。【００１３】
転写調節領域としては、染色体DNA上における転写領域の５’末端より上流側５０塩基からなるDNAをあげることができ、好ましくは−１０および−３５領域に相当する領域をあげることができる。
翻訳調節領域としては、染色体DNA上における翻訳領域の５’末端より上流側３０塩基からなるDNAをあげることができ、好ましくは上流側１０塩基からなるDNAをあげることができる。【００１４】
ORFへの塩基の欠失、置換または付加の導入は、蛋白質の活性を低下または喪失させる塩基の欠失、置換または付加であれば、塩基の種類および数に制限はないが、塩基の欠失としては、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、さらに好ましくは１００塩基以上、特に好ましくは２００塩基以上の転写領域の一部、最も好ましくは転写領域全部の欠失をあげることができる。塩基の置換としては、転写領域の５’末端から１５０番目以内の塩基、好ましくは１００番目以内の塩基、より好ましくは５０番目の塩基、特に好ましくは３０番目の塩基、最も好ましくは２０番目以内の塩基を置換してナンセンスコドンを導入する置換をあげることができる。塩基の付加としては、転写領域の５’末端から１５０番目以内の塩基、好ましくは１００番目以内の塩基、より好ましくは５０番目の塩基、特に好ましくは３０番目の塩基、最も好ましくは２０番目以内の塩基の直後に、５０塩基以上、好ましくは１００塩基以上、より好ましくは２００塩基以上、さらに好ましくは５００塩基以上、特に好ましくは１ｋｂ以上のDNA断片を付加することをあげることができ、特に好ましくはクロラムフェニコール耐性遺伝子およびカナマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子の挿入をあげることができる。【００１５】
蛋白質の活性が低下しているとは、（１）該蛋白質をコードするDNAの転写物（mRNA）量をノーザン解析もしくはRT-PCRで定量し、変異が導入されていない遺伝子のmRNA量と比較する、または（２）微生物の該蛋白質の生産量をSDS-PAGEもしくは抗体を用いたアッセイにより定量し、変異が導入されていない遺伝子にコードされている蛋白質の生産量と比較したとき、その量が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％以下に低下していることをいう。【００１６】
また、配列番号１〜３で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質のいずれかの活性が低下しているとは、微生物をJ. Biol. Chem. 281, 12300-12307(2006)に記載の方法でＬ−グルタミンを単一の炭素源として寒天培地上で培養したときに、一定時間後のコロニーの直径が野生型株と比較して８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％以下に低下していることを、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の活性が低下しているとは、微生物のＬ−グルタミン酸取り込み活性をJ. Bacteriol. 177, 1152-1158(1995)に記載の方法で野生型株と比較したときに、その活性が８０％以下、好ましくは５０％以下、より好ましくは３０％以下、さらに好ましくは１０％以下に低下していることをいう。【００１７】
微生物の染色体DNAの遺伝子に塩基の欠失、置換または付加を導入する方法としては、相同組換えを利用した方法をあげることができる。一般的な相同組換えを利用した方法としては、塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子を、塩基の欠失等を導入したい宿主細胞内では自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドDNAと連結して作製できる相同組換え用プラスミドを用いる方法をあげることができる。【００１８】
塩基の欠失、置換または付加が導入された変異遺伝子の取得方法としては、変異を導入したい微生物の染色体DNAを鋳型とし、予め塩基の欠失、置換または付加などの変異を導入した合成DNAをプライマーとして目的遺伝子をPCRにより増幅して、塩基の欠失、置換または付加が導入された遺伝子を取得する方法や、変異を導入したい微生物の染色体DNAを鋳型とし、欠失させたい領域を挟む２つの領域をPCRにより増幅し、得られた増幅断片を連結することにより、塩基の欠失した遺伝子断片を取得する方法などをあげることができる。【００１９】
相同組換えを利用した方法としては、i）該相同組換え用プラスミドを常法により微生物細胞に導入した後、薬剤耐性を指標にして相同組換えによって染色体DNA上に該相同組換え用プラスミドが組込まれた形質転換株を選択し、ii）得られた形質転換株を該薬剤を含有しない培地で数時間〜１日培養した後、該薬剤含有寒天培地、および該薬剤非含有寒天培地に塗布し、iii）前者の培地で生育せず、後者の培地で生育できる株を選択する、ことで染色体DNA上において２回目の相同組換えが生じた株を取得する方法をあげることができる。染色体DNA上の欠失等を導入した遺伝子が存在する領域の塩基配列を決定することで、染色体DNA上の目的遺伝子に塩基の欠失、置換または付加が導入されたことを確認することができる。【００２０】
微生物の細胞内で自立複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドとして、薬剤耐性遺伝子および枯草菌のレバンシュークラーゼ遺伝子sacB[Mol. Microbiol., 6, 1195(1992)] を有するプラスミドを用いて、レバンシュークラーゼが宿主細胞に有害な物質を生産することを利用した選択法 [J.Bacteriol., 174, 5462(1992)]を利用して上記２回目の相同組換えが生じた株を取得することもできる。【００２１】
相同組換え用プラスミドを微生物の細胞に導入する方法としては、微生物の細胞へDNAを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、電気穿孔法[Appl. Microbiol. Biotech., 52,541(1999)] やプロトプラスト法[J. Bacteriol., 159,306(1984)]等をあげることができる。
微生物細胞としては、好ましくコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができ、野生株であってもよいし、該野生株からＬ‐グルタミンを効率よく生成するように育種された育種株でもよい。【００２２】
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、Corynebacterium acetoacidophilum、Corynebacterium acetoglutamicum、Corynebacteirum callunae、Corynebacterium glutamicum、Corynebacterium lactofermentum、Corynebacterium herculis、Corynebacterium lilium、Corynebacterium melassecola、Corynebacterium thermoaminogenes、Corynebacterium efficiens等をあげることができる。具体的には、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870、Corynebacterium acetoglutamicumATCC 15806、Corynebacterium callunae ATCC 15991、Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032、Corynebacterium glutamicum ATCC 13060、Corynebacterium glutamicum ATCC 13826、Corynebacteriumglutamicum ATCC 14020、Corynebacterium glutamicum ATCC 13869、Corynebacterium herculis ATCC 13868、Corynebacterium liliumATCC 15990、Corynebacterium melassecola ATCC 17965、Corynebacterium thermoaminogenes ATCC 9244、ATCC 9245、ATCC 9246およびATCC9277等をあげることができ、好ましくはCorynebacteriumglutamicum ATCC 13032、Corynebacterium glutamicum ATCC 13060、Corynebacterium glutamicum ATCC 13826、Corynebacterium glutamicum ATCC 14020、Corynebacterium glutamicum ATCC 13869等をあげることができる。【００２３】
育種株としては、Ｌ−グルタミンの生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除した微生物や、野生型株に比べＬ−グルタミンアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択して得られる微生物などをあげることができる。
Ｌ−グルタミンの生合成を制御する機構の少なくとも１つを緩和または解除した微生物としては、例えばアデニリル化によりグルタミンシンテターゼの制御を行なうグルタミンシンテターゼ・アデニリルトランスフェラーゼの活性が低下したコリネ型細菌［FEMS Microbiology Letters, 201, 91 (2001)、特開2002-300887号］、アデニリル化を受けるグルタミンシンテターゼの４０５番目のアミノ酸が置換したコリネ型細菌［FEMS Microbiology Letters, 201, 91 (2001)、特開2003-164297号］、およびＰIIタンパク質の活性が低下したコリネ型細菌［FEMS Microbiology Letters, 173, 303 (1999)、特開2002-300887号］をあげることができる。野生型株に比べＬ−グルタミンアナログに対する耐性度が高い細胞株を選択して得られる微生物としては、例えばアザセリン耐性を付与したコリネ型細菌［特開昭55-148094号］、６−ジアゾ−５−オキソ−ノルロイシン耐性を付与したコリネ型細菌［特開平3-232497号］などが知られている。【００２４】
以上の方法により、上記した蛋白質の活性が低下、または喪失したコリネバクテリウム属に属する微生物を調製することができる。
２．本発明のＬ‐グルタミンの製造法
上記１の方法で調製することができる微生物を培地に培養し、培養物中にＬ−グルタミンを生成、蓄積させ、該培養物からＬ−グルタミンを採取することにより、Ｌ‐グルタミンを製造することができる。【００２５】
本発明の製造法で用いられる培地は、炭素源、窒素源、無機塩など本発明の微生物の増殖、およびＬ−グルタミンの生合成に必要な栄養素を含む限り、合成培地、天然培地のいずれでもよい。
炭素源としては、使用する微生物の資化できる炭素源であればいずれでもよく、例えばグルコース、糖蜜、フラクトース、シュークロース、マルトース、でんぷん加水分解物等の糖類、エタノール、グリセロールのようなアルコール類、酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸類などをあげることができる。【００２６】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、尿素、アミン等の窒素化合物、ならびに肉エキス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー、ペプトン、大豆加水分解物等の窒素含有有機物を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一水素カリウム、リン酸第二水素カリウム、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、炭酸カルシウム等を用いることができる。【００２７】
その他、必要に応じて、ビオチン、チアミン、ニコチンアミド、ニコチン酸等の微量栄養源を加えることができる。これら微量栄養源は、肉エキス、コーン・スティープ・リカー、カザミノ酸等の培地添加物で代用することもできる。  さらに必要に応じて本発明の微生物が生育に要求する物質（例えばアミノ酸要求性の微生物であれば要求アミノ酸）を添加することができる。【００２８】
培養は、振とう培養や深部通気攪拌培養のような好気的条件で行う。培養温度は20〜50℃、好ましくは20〜42℃、より好ましくは28〜38℃である。培地のｐＨは５〜１１の範囲で、好ましくは６〜９の中性付近の範囲に維持して培養を行う。培地のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、ｐＨ緩衝液などを用いて行う。【００２９】
培養時間は、5時間〜６日間、好ましくは16時間〜3日間である。
培養物中に蓄積したＬ−グルタミンは、通常の精製方法によって採取することができる。例えばＬ−グルタミンは、培養後、遠心分離などで菌体や固形物を除いたあと、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、濃縮、結晶分別等の公知の方法を併用することによって採取することができる。【００３０】
以下に本願発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
本発明の微生物の造成
（１）染色体DNA相同組換え用ベクターpdXの作製
まず、TAクローニング法［Molecular cloning, a laboratory manual, Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)、以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す］により、染色体組換え用断片をプラスミドpESB30にクローニングした。【００３２】
プラスミドpESB30は、カナマイシン耐性遺伝子を有するベクターpHSG299  （タカラバイオ社製）［Gene, 61, 63 (1987)］のPstI切断部位に、Bacillus subtilis由来のレバンシュークラーゼ遺伝子sacBを含む2.6kbのPstI DNA断片［Mol. Microbiol., 6, 1195 (1992)］を連結したプラスミドである。
使用したコリネバクテリウム・グルタミクムの野生株ATCC13032株の染色体DNAは、斉藤らの方法[Biochim.Biophys.Acta,72,619(1963)]により調製した。【００３３】
pESB30をBamHIで切断後、アガロースゲル電気泳動し、アガロースゲルより、GENECLEAN  Kit（BIO 101社製）を用いて約5.3kbのDNA断片を回収した。
該5.3kbのDNA断片の両末端をDNA  Blunting  Kit（タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従って、平滑化した。該平滑化断片をフェノール・クロロホルム抽出及びエタノール沈殿により濃縮した後、Takara Ex Taq（タカラバイオ社製）および添付のバッファーを用いてdTTP存在下で７０℃、２時間反応させ、３´末端にチミン１塩基が付加したDNA断片pESB30-Tを調製した。【００３４】
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032株の染色体DNAを鋳型として用い、配列番号６および７で表される塩基配列を有する合成DNAまたは配列番号８および９で表される塩基配列を有する合成DNAをそれぞれプライマーセットとして、Pyrobest DNA polymerase（タカラバイオ社製）と添付のバッファーを用いて２種類のPCRを各々行った。
各々のPCRにより得られた約0.7kbおよび約1.0kbの増幅産物を、各々Qiaquick PCR Purification Kit（Qiagen社製）を用いて精製した。【００３５】
さらに、両精製物を鋳型として、配列番号６および９で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーとし、Pyrobest DNA Polymeraseおよび添付のバッファーを用いてPCR反応を行い、配列番号５の塩基番号261から3389で表される塩基配列のうち、塩基番号1001から2389を欠失した約1.7kbのDNA断片を取得した。
得られた約1.7kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN  Kitを用いて抽出、精製した。【００３６】
上記で得られた精製DNA断片を、ライゲーションキットver.1（タカラバイオ社製）を用い、pESB30―T断片と結合させた。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して３０℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。【００３７】
該プラスミドを制限酵素切断法で解析し、該プラスミドがpESB30に、配列番号５の塩基番号261から3389で表される塩基配列のうち、塩基番号1001から2389を欠失した約1.7kbのDNA断片がpESB30に挿入されている構造であることを確認した。該プラスミドをpdXと命名した。
（２）染色体DNA相同組換え用ベクターpdHの作製
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032株の染色体DNA上の配列番号５の塩基番号1390から4424で表される塩基配列のうち、塩基番号2391から3424で表される領域を欠失させるためのプラスミドを（１）と同様の方法で作製した。【００３８】
（１）で調製したATCC 13032株の染色体DNAを鋳型として、配列番号１０および１１で表される塩基配列を有する合成DNAまたは配列番号１２および１３で表される塩基配列を有する合成DNAをそれぞれプライマーセットとして、Pyrobest DNA polymeraseと添付のバッファーを用いて２種類のPCRを各々行った。得られた約1.0kbpの増幅産物を、各々Qiaquick PCR Purification Kitを用いて精製した。【００３９】
さらに、両精製物を鋳型として、配列番号１０および１３で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーとしてPyrobest DNA polymeraseおよび添付のバッファーを用いてPCR反応を行い、配列番号５の塩基番号1390から4424で表される塩基配列のうち、塩基番号2391から3424で表される領域を欠失した約2.0kbpのDNA断片を取得した。
得られた約2.0kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。【００４０】
上記で得られた精製DNA断片を、ライゲーションキットver.1を用い、（１）で作製したpESB30―T断片と結合させた。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して３０℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。【００４１】
該プラスミドを制限酵素切断法で解析し、該プラスミドがpESB30に、配列番号５の塩基番号1390から4424で表される塩基配列のうち、塩基番号2391から3424で表される領域を欠失した約2.0kbpのDNA断片がpESB30に挿入されている構造であることを確認した。該プラスミドをpdHと命名した。
（３）染色体DNA相同組換え用ベクターpdpGの作製
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032株の染色体DNA上の配列番号５の塩基番号2977から6882で表される塩基配列のうち、塩基番号3627から5882で表される領域を欠失させるためのプラスミドを（１）と同様の方法で作製した。【００４２】
（１）で調製したATCC 13032株の染色体DNAを鋳型として、配列番号１４および１５で表される塩基配列を有する合成DNAまたは配列番号１６および１７で表される塩基配列を有する合成DNAをそれぞれプライマーセットとして、Pyrobest DNA Polymeraseと添付のバッファーを用いて２種類のPCRを各々行った。得られた約0.7kbおよび約1.0kbpの増幅産物を、各々Qiaquick PCR Purification Kitを用いて精製した。【００４３】
さらに、両精製物を鋳型として、配列番号１４および１７で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーとしてPyrobest DNA Polymeraseおよび添付のバッファーを用いてPCR反応を行い、配列番号５の塩基番号2977から6882で表される塩基配列のうち、塩基番号3627から5882で表される領域を欠失した約1.7kbpのDNA断片を取得した。
得られた約1.7kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。【００４４】
上記で得られた精製DNA断片を、ライゲーションキットver.1を用い、（１）で作製したpESB30―T断片と結合させた。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して３０℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。【００４５】
該プラスミドを制限酵素切断法で解析し、該プラスミドがpESB30に、配列番号５の塩基番号2977から6882で表される塩基配列のうち、塩基番号3627から5882で表される領域を欠失した約1.7kbのDNA断片がpESB30に挿入されている構造であることを確認した。該プラスミドをpdpGと命名した。
（４）染色体DNA相同組換え用ベクターpDGADの作製
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032株の染色体DNA上の配列番号１８で表される塩基配列のうち、塩基番号1001から4489で表される領域を欠失させるためのプラスミドを（１）と同様の方法で作製した。【００４６】
（１）で調製したATCC 13032株の染色体DNAを鋳型として、配列番号１９および２０で表される塩基配列を有する合成DNAまたは配列番号２１および２２で表される塩基配列を有する合成DNAをそれぞれプライマーセットとして、Pyrobest DNA Polymeraseと添付のバッファーを用いて２種類のPCRを各々行った。得られた各々約1.0kbpの増幅産物をQiaquick PCR Purification Kitを用いて精製した。【００４７】
さらに、両精製物を鋳型として、配列番号１９および２２で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーとしてPyrobest DNA Polymeraseおよび添付のバッファーを用いてPCR反応を行い、配列番号１８で表される塩基配列のうち、塩基番号1001〜4489を欠失した約2.0kbpのDNA断片を取得した。
得られた約2.0kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。【００４８】
上記で得られた精製DNA断片を、ライゲーションキットver.1を用い、（１）で作製したpESB30―T断片と結合させた。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して３０℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。【００４９】
該プラスミドを制限酵素切断法で解析し、該プラスミドがpESB30に、配列番号１８で表される塩基配列のうち塩基番号1001〜4489が欠失した約2.0kbのDNA断片がpESB30に挿入されている構造であることを確認した。該プラスミドをpDGADと命名した。
（５）染色体DNA相同組換え用ベクターpDGBの作製
コリネバクテリウム・グルタミクムGLA2株の染色体DNA上の配列番号１８の塩基番号1847から2734で表される塩基配列を欠失させるためのプラスミドを（１）と同様の方法で作製した。【００５０】
（１）で調製したATCC 13032株の染色体DNAを鋳型として、配列番号２３および２４で表される塩基配列を有する合成DNAまたは配列番号２５および２６で表される塩基配列を有する合成DNAをそれぞれプライマーセットとして、Pyrobest DNA Polymeraseと添付のバッファーを用いて２種類のPCRを各々行った。得られた各々約1.0kbの増幅産物をQiaquick PCR Purification Kitを用いて精製した。【００５１】
さらに、両精製物を鋳型として、配列番号２３および２６で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーとしてPyrobest DNA Polymeraseおよび添付のバッファーを用いてPCR反応を行い、配列番号１８で表される塩基配列のうち、塩基番号1847〜2734を欠失した約2.0kbのDNA断片を取得した。
得られた約2.0kbのDNA断片をアガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。【００５２】
上記で得られた精製DNA断片を、ライゲーションキットver.1を用い、（１）で作製したpESB30―T断片と結合させた。
得られた結合産物を用い、常法に従って大腸菌DH5αを形質転換した。該形質転換体を、20μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布後、３０℃で一晩培養した。
生育した形質転換体を20μg/mlのカナマイシンを含むLB液体培地に植菌して３０℃で一晩培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを抽出した。【００５３】
該プラスミドを制限酵素切断法で解析し、該プラスミドがpESB30に、配列番号１８の塩基番号847から3735で表される塩基配列のうち塩基番号1847から2734が欠失した約2.0kbのDNA断片がpESB30に挿入されている構造であることを確認した。該プラスミドをpDGBと命名した。
（６）Ｌ−グルタミン生産菌GLA2への染色体欠失変異導入
プラスミドpdXが、コリネ型細菌内では自立複製できないことを利用し、以下の方法で、pdX中の組換え用DNA断片が、実験例で作製したＬ−グルタミン生産株であるコリネバクテリウム・グルタミクムGLA2株（GLA2の作製方法については後述する）の染色体DNA中に相同組換えにより組み込まれた株を選択した。【００５４】
pdXを用い、レストらの方法[Appl.Microbiol.Biotech.,52,541(1999)]に従って電気穿孔法にてGLA2株を形質転換し、該形質転換体をカナマイシン25μg/mlを含むBY寒天培地［ブイヨン２０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Lに含みｐＨ７．０に調整した培地］に塗布後、３０℃、一晩培養した。
生育した該形質転換体のうちの１株から斉藤らの方法[Biochim.Biophys.Acta,72、619(1993)]により染色体DNAを調製し、得られた染色体DNAの構造をサザンハイブリダイゼーション［モレキュラー・クローニング第３版］により調べた結果、pdXがCampbellタイプの相同組み換えにより染色体に組み込まれていることが確かめられた。【００５５】
該形質転換体（１回組み換え体）をSUC寒天培地[ショ糖１００g、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地]上に塗布後、３０℃で１日間培養を行い、ショ糖耐性株を得た。
SUC寒天培地で生育した１回組換え体から、斉藤らの方法により染色体DNAを調製した。得られた染色体DNAを鋳型として、配列番号６および９で表される塩基配列を有する合成DNAをプライマーとして、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ社製）と添付のバッファーを用いてPCRを行った。得られたPCR増幅断片の塩基配列を常法により決定し、GLA2株の染色体DNA上の配列番号５の塩基番号261から3389で表される塩基配列のうち、塩基番号1001から2389を欠失したDNA断片に置換されているGLA2X株を取得した。同様の方法でpdHを用いて配列番号５の塩基番号1390から4424で表される塩基配列のうち、塩基番号2391から3424で表される領域を欠失したDNA断片に置換されているGLA2H株を取得した。さらに同様の方法でpdpGを用いて配列番号５の塩基番号2977から6882で表される塩基配列のうち、塩基番号3627から5882で表される領域を欠失したDNA断片に置換されているGLA2PG株を取得した。【００５６】
プラスミドpDGAD、pDGBを用いて上記と同様の方法でコリネバクテリウム・グルタミクムGLA2へ染色体欠失変異を導入した。pDGADを用いて取得した染色体上の配列番号１８で表される塩基配列のうち塩基番号1001から4489を欠失した株をGLA2GAD株、pDGBを用いて取得した塩基番号1847から2734を欠失した株をGLA2GB株と命名した。また同様に、pDGBを用いて、上記で得られたGLA2H株に染色体欠失変異を導入した。取得したGLA2H株の染色体上の配列番号１８で表される塩基配列のうち塩基番号1001から4489を欠失した株を、GLA2HGB株と命名した。
【実施例２】
【００５７】
本発明の微生物を用いたＬ−グルタミンの製造
実施例１で得たGLA2X株、GLA2H株、GLA2PG株、GLA2GAD株、GLA2GB株、GLA2HGB株、およびこれらの親株であるGLA2株をそれぞれ種培地〔グルコース５０ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、尿素５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物５００ｍｇ、硫酸鉄７水和物５０ｍｇ、チアミン塩酸塩５００μｇ、ビオチン２０μｇを水1Ｌに含み、ｐＨ７．２に調整後、炭酸カルシウムを３０ｇ加えた培地〕8ｍｌの入った試験管に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１６時間培養し、種培養液を得た。【００５８】
該種培養液３ｍｌを、それぞれ、本培養培地〔グルコース５０ｇ、硫酸アンモニウム２０ｇ、リン酸二水素カリウム０．５ｇ、リン酸水素二カリウム０．５ｇ、尿素２ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ、硫酸鉄７水和物２ｍｇ、硫酸マンガン５水和物２．５ｍｇ、チアミン塩酸塩１ｍｇ、ビオチン１００μｇ、炭酸カルシウム３０ｇを水１Ｌに含む。滅菌後に硫酸でｐＨ７．０に調整した培地〕３０ｍｌの入ったバッフル付き２５０ｍｌ三角フラスコに接種し、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１６時間培養した。【００５９】
遠心分離により培養液から菌体を除去し、上清中のＬ−グルタミンの蓄積量を高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により定量した。
結果を表１に示す。【００６０】
【表１】
2008026698.tif 000002
【００６１】
表１から明らかなように、本発明の微生物および本発明の方法で用いられる微生物であるGLA2X株、GLA2H株、GLA2PG株、GLA2GAD株、GLA2GB、GLA2HGB株では、Ｌ‐グルタミンの生産効率が親株GLA2株に比べ向上した。
［実験例］Ｌ‐グルタミン生産菌GLA2株の造成
（１）遺伝子置換用プラスミドpCglnA2の作製
配列番号２７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸がリジンに置換（Glu64Lys）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAを、PCRを用いる部位特異的変異法［モレキュラー・クローニング第３版］を用いて次のようにして取得した。【００６２】
まず、実施例１（１）と同様の方法で調製したコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13031株の染色体DNAを鋳型として、Pyrobest DNAポリメラーゼ、添付のバッファーおよび後述のプライマーを用いてPCRを行った。PCRに用いたプライマーは、EP 1108790に記載されているコリネバクテリウム・グルタミクム由来のグルタミンシンテターゼ２をコードするDNAの塩基配列情報に基づき、配列番号２８で表されるグルタミンシンテターゼ２をコードする領域中で、配列番号２７で表されるグルタミンシンテターゼ２の有するアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸をコードする領域（配列番号２８で表される塩基配列の５’末端から１９０〜１９２番目の領域、ｇａａ）を含む２１塩基からなる領域（配列番号２８で表される塩基配列の５’末端から１８０〜２００番目の塩基配列、および配列番号２９で表される塩基配列の５’末端から６８０〜７００番目の塩基配列）において、配列番号３１で表される該グルタミン酸をコードする領域を、リジンをコードするコドン（ａａａ）に置換した塩基配列からなるDNA断片、およびその相補配列である配列番号３２で表される２１塩基の塩基配列を有するDNA断片を常法に従い合成した。【００６３】
また、配列番号２９で表される塩基配列の５’末端から１６７〜１８６番目の塩基配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したDNA断片を合成し、その塩基配列を配列番号３０に示した。
配列番号２９で表される塩基配列の５’末端から１１８５〜１２０４番目の塩基配列の相補配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したDNA断片を合成し、その塩基配列を配列番号３３に示した。【００６４】
配列番号３０で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号３２で表される塩基配列を有するDNA断片、または配列番号３１で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号３３で表される塩基配列を有するDNA断片をそれぞれプライマーセットとして、得られた染色体DNAを鋳型として、Pyrobest DNAポリメラーゼと添付のバッファーを用いて２種類のPCRを各々行った。【００６５】
各々のPCRにより得られた、約０．５ｋｂの増幅産物（配列番号２９で表される塩基配列の５’末端から第１６７〜７００番目の塩基配列に対応するDNA断片、および第６８０番目から１２０４番目に対応するDNA断片）をアガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号３０で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号３３で表される塩基配列を有するDNA断片をプライマーとして用いてPCRを行った。このPCRにより、配列番号２７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸をコードするコドン（ｇａａ）がリジンをコードするコドン（ａａａ）に置換された約１．０ｋｂのDNA断片を取得した。得られた約１．０ｋｂのDNA断片をBamHI処理し、アガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。【００６６】
該DNA断片をプラスミドpESB30に挿入した。
具体的にはpESB30をBamHＩで切断後、アルカリフォスファターゼ処理を行ない、アガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kitを用いてpESB30のBamHI処理断片を抽出、精製した。このpESB30断片と、上記で得られたBamHI処理した約１．０ｋｂのDNA断片を混合し、ライゲーションキットver.1を用い、リガーゼ反応を行った。【００６７】
得られた反応産物を用い、常法［モレキュラー・クローニング第３版］に従ってEscherichia coli DH5α（東洋紡社製）を形質転換した。
該菌株を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地［バクトトリプトン（ディフコ社製）１０ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、塩化ナトリウム  １０ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１６ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．０に調整された培地］上で培養し、形質転換株を選択した。該形質転換株を２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むLB培地で終夜培養し、得られた培養液からアルカリSDS法によりプラスミドを調製した。【００６８】
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pESB30に上記で得られた約１．０ｋｂのDNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpCglnA2と命名した。
（２）遺伝子発現用プラスミドpGlnA2の造成
配列番号２７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸がリジンに置換（Glu64Lys）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAを、（１）と同様の方法で取得した。【００６９】
コリネバクテリウム・グルタミクムの野生型株ATCC13032の染色体DNAにおいて、グルタミンシンテターゼ２をコードする塩基配列の５’末端側の上流に位置する塩基配列（配列番号２９で表される塩基配列の５’末端から１〜２０番目の塩基配列）にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したDNA断片、および３’末端側に位置する塩基配列(配列番号２９で表される塩基配列の５’末端から第１８２５〜１８４４番目の塩基配列）の相補配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したDNA断片を合成し、その塩基配列をそれぞれ配列番号３４、配列番号３５に示した。【００７０】
配列番号３４で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号３２で表される塩基配列を有するDNA断片、または配列番号３１で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号３５で表される塩基配列を有するDNA断片をそれぞれプライマーセットとして、ATCC13032株の染色体DNAを鋳型として、Pyrobest DNAポリメラーゼと添付のバッファーを用いて２種類のPCRを各々行った。【００７１】
各々のPCRにより得られた、約０．７ｋｂの増幅産物（配列番号２９で表される塩基配列の５’末端から第１〜７００番目の塩基配列に対応するDNA断片）、および約１．１ｋｂの増幅産物（配列番号２９で表される塩基配列の５’末端から第６８０〜１８４４番目の塩基配列に対応するDNA断片）を、各々アガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。【００７２】
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号３４で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号３５で表される塩基配列を有するDNA断片をプライマーとして用いてPCRを行った。このPCRにより、グルタミンシンテターゼ２の５’末端側の上流に存在するプロモーター配列と、配列番号２８において、配列番号２７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から第６４番目のグルタミン酸をコードするコドン（ｇａａ）がリジンをコードするコドン（ａａａ）に置換された塩基配列を含む約１．９ｋｂのDNA断片を取得した。この約１．９ｋｂのDNA断片をBamHIで処理し、アガロースゲル電気泳動した後、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。【００７３】
pCS299P（国際公開第00/63388号パンフレット）をBamHIで切断後、アルカリフォスファターゼ処理を行ない、アガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kitを用いてpCS299P断片を抽出、精製した。
このpCS299P断片に上記で得られたBamHI処理した約１．９ｋｂのDNA断片を（１）と同様の方法でクローン化した。【００７４】
制限酵素切断解析を行い、該プラスミドは、pCS299Pに上記で得られた約１．９ｋｂのDNA断片が挿入された構造を有するプラスミドであることを確認した。このプラスミドをpGlnA2と命名した。
（３）遺伝子置換用プラスミドpCltsAの作製
配列番号３６で表されるリゾチーム感受性に関わるポリペプチドのアミノ酸配列のＮ末端から第８０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換（Gly80Asp）されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNAを、（１）と同様の方法で取得した。同変異の導入によりリゾチーム感受性が付与されることが報告されている［BMC Biotechnol., 9, 1 (2001)］。【００７５】
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032の染色体DNAにおけるLtsAをコードするDNAの周辺領域を示す、配列番号３８で表される塩基配列の５’末端から１〜２０番目の塩基配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したDNA断片、および配列番号３８で表される塩基配列の５’末端から９８１〜１０００番目の塩基配列の相補配列にBamHI認識配列を含むタグ配列を付加したDNA断片を合成し、その塩基配列をそれぞれ配列番号３９、配列番号４２に示した。配列番号３７で表されるLtsAをコードする領域中で、配列番号３６で現されるLtsAの有するアミノ酸配列のＮ末端から第８０番目のグリシンをコードするコドン（配列番号３８で表される塩基配列の５’末端から２３８〜２４０番目の塩基配列、ｇｇｔ）を含む２１塩基からなる領域（配列番号３７で表される塩基配列の５’末端から２２９〜２４９番目の塩基配列、および配列番号３８で表される塩基配列の５’末端から４９１〜５１１番目の塩基配列）において、該グリシンをコードするコドンをアスパラギン酸をコードするコドン（ｇａｔ）に置換した、配列番号４１で表される塩基配列からなるDNA断片、および該塩基配列の相補配列である配列番号４０で表される２１塩基の塩基配列を有するDNA断片を常法に従い合成した。【００７６】
配列番号３９で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号４０で表される塩基配列を有するDNA断片、または配列番号４１で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号４２で表される塩基配列を有するDNA断片をそれぞれプライマーセットとして用い、ATCC13032株の染色体DNAを鋳型として、Pyrobest DNAポリメラーゼと添付のバッファーを用いて２種類のPCRを各々行った。【００７７】
各々のPCRにより得られた、約０．５ｋｂの増幅産物（配列番号３８で表される塩基配列の５’末端から１〜５１１番目の塩基配列に対応するDNA断片、および配列番号３８で表される塩基配列の５’末端から４９１〜１０００番目の塩基配列に対応するDNA断片）を、各々アガロースゲル電気泳動し、GENECLEAN Kitを用いて抽出、精製した。
さらに、両精製物を鋳型とし、配列番号３９で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号４２で表される塩基配列を有するDNA断片をプライマーとして用いてPCRを行った。このPCRにより、配列番号３６で表されるＬｔｓＡが有するアミノ酸配列のＮ末端から第８０番目のグリシンをコードする領域（ｇｇｔ）がアスパラギン酸をコードするコドン（ｇａｔ）に置換された約１．０ｋｂのDNA断片を取得した。この約１．０ｋｂのDNA断片をBamHIで処理し（１）と同様の方法でpESB30にクローン化し、このプラスミドをpCltsAと命名した。
（４）Ｌ−グルタミン生産菌GLA2の造成
上記（１）で作製したプラスミドpCglnA2を用い、遺伝子置換法によってコリネバクテリウム・グルタミクム  ATCC13032の染色体DNAにおいてグルタミンシンテターゼ２をコードする遺伝子に配列番号２７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸をリジンに置換する変異（Glu64Lys）を導入した。【００７８】
遺伝子置換法によるATCC13032の染色体DNAにおいてグルタミンシンテターゼ２をコードする遺伝子への変異の導入は、次に示すような２回の組換え操作によって行った。まず、上記で作製したプラスミドpCglnA2がコリネ型細菌内では自律複製できないことを利用して、以下の方法で、このプラスミドがコリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032の染色体DNA中に相同組換えで組み込まれた株を選択した。【００７９】
具体的には、該プラスミドを用い、レストらの方法［Appl. Microbiol. Biotech., 52,541 (1999)］に従って電気穿孔法にてATCC13032株を形質転換し、カナマイシン耐性株を選択した。選択したカナマイシン耐性株のうちの１株から得た染色体の構造をサザンハイブリダイゼーション（モレキュラー・クローニング第３版）により調べた結果、プラスミドがCampbellタイプの相同組換えにより染色体に組み込まれていることが確かめられた。このような株では、野生型および変異型のグルタミンシンテターゼ２遺伝子が染色体上に近接して存在しており、その間で２回目の相同組換えが起こりやすくなっている。【００８０】
該形質転換株（１回組換え体）をSUC寒天培地〔ショ糖１００ｇ、肉エキス７ｇ、ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ、バクトアガー（ディフコ社製）１８ｇを水１Ｌに含みｐＨ７．２に調整した培地〕上に塗布し、３０℃で１日間培養して、生育するコロニーを選択した。sacB遺伝子が存在する株は、ショ糖を自殺基質に転換するので、この培地では生育できない［J. Bacteriol., 174, 5462 (1991)］。これに対し、染色体上に近接して存在する野生型と変異型のグルタミンシンテターゼ２遺伝子間での２回目の相同組み換えによりsacB遺伝子が欠失した株では、自殺基質はできずこの培地で生育することができる。この２回目の相同組み換えの際には、野生型遺伝子もしくは変異型遺伝子のいずれかが、sacBとともに欠失する。このとき野生型がsacBとともに欠失した株では、変異型への遺伝子置換が起こったことになる。【００８１】
このようにして得られた２回組換え体の染色体DNAを、斉藤らの方法により調製し、該染色体DNAを鋳型とし、配列番号３０で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号３３で表される塩基配列を有するDNA断片をプライマーとして、Pyrobest DNAポリメラーゼと添付のバッファーを用いてPCRを行った。これらのPCR産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体の染色体DNA上のグルタミンシンテターゼ２遺伝子が野生型であるか変異型であるかを判定した。その結果、染色体DNAにおいてグルタミンシンテターゼ２をコードする遺伝子に、配列番号２７で表されるアミノ酸配列のＮ末端から６４番目のグルタミン酸をリジンに置換する変異（Glu64Lys）を有する２回組換え体であるGS2株を取得した。【００８２】
GS2株にさらに、上記と同様の方法でpCltsAを用いて染色体DNA上のLtsA遺伝子に、配列番号３６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のグリシンをアスパラギン酸に置換する変異（Gly80Asp）を導入し、GLA2株を取得した。宿主にGS2株を用い、置換用のプラスミドにpCltsAを用いる以外は上記と同じ操作を行い、得られた２回組換え体の染色体DNAを、斉藤らの方法により調製し、該染色体DNAを鋳型とし、配列番号３９で表される塩基配列を有するDNA断片と配列番号４２で表される塩基配列を有するDNA断片をプライマーとして、Pyrobest DNAポリメラーゼと添付のバッファーを用いてPCRを行った。これらのPCR産物の塩基配列を常法により決定し、２回組み換え体の染色体DNA上のLtsA遺伝子が野生型であるか変異型であるかを判定した。その結果、染色体DNAにおいてLtsAをコードする遺伝子に、配列番号３６で表されるアミノ酸配列のＮ末端から８０番目のグリシンをアスパラギン酸に置換する変異（Gly80Asp）を有する２回組換え体であるGLA2株を取得した。
【配列表フリーテキスト】
【００８３】
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３３−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３４−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号３９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号４２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明により、Ｌ‐グルタミンを効率的に生成、蓄積する能力を有するコリネバクテリウム属に属する微生物を得ることができ、また該微生物を用いてＬ‐グルタミンを効率的に製造することができる。
【配列表】
2008026698000001.app
【国際調査報告】
2008026698.tif 000003
2008026698.tif 000004
2008026698.tif 000005
2008026698.tif 000006
2008026698.tif 000007