(57)【要約】  本発明は、一本鎖ＤＮＡの切断及び一本鎖ＤＮＡの結合を触媒するための組成物の提供を目的とする。本発明は、Ｅｖｌタンパク質を含んでなる、一本鎖ＤＮＡの切断及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端の結合を行うための組成物を提供する。さらに、本発明は、Ｅｖｌタンパク質の他、さらにＲａｄ５１Ｂタンパク質、及び／又はＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質を含んでなる、一本鎖ＤＮＡの切断及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端の結合を行うための組成物を提供する。
2008108103.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるＥｖｌタンパク質を含んでなる、一本鎖ＤＮＡの切断及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端の結合を行うための組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するポリペプチド
【請求項２】
Ｍｇ２＋又はＣａ２＋をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｍｇ２＋の濃度が、０．５ｍＭ〜２．０ｍＭであることを特徴とする請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒａｄ５１Ｂタンパク質及びＡＴＰをさらに含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記Ｒａｄ５１Ｂに対する前記Ｅｖｌタンパク質のモル比が、１：０．５から１：４であることを特徴とする請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＡＴＰの濃度が、０．５ｍＭ〜２．０ｍＭであることを特徴とする請求項４又は５に記載の組成物。
【請求項７】
ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質をさらに含むことを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示される核酸を含む組換えベクターを含んでなる、一本鎖ＤＮＡの切断及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端の結合ための組成物。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１９で表されるヌクレオチド配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１９で表されるヌクレオチド配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、該核酸がコードするポリペプチドが、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有する核酸
【請求項９】
以下の（ａ）又は（ｂ）に示される核酸を含む組換えベクターを含んでなる、一本鎖ＤＮＡの切断及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端の結合ための組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれかに記載の組成物と一本鎖ＤＮＡを反応させて、一本鎖ＤＮＡマーカーを製造する方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により製造された一本鎖ＤＮＡマーカー。
【請求項１２】
アクラルビシン、デカリニウム、ＤＩＤＳ、β−ルブロマイシン及び３−ＡＴＡからなる化合物のグループから選択される１又は複数の化合物を含んでなる、Ｅｖｌタンパク質活性阻害用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一本鎖ＤＮＡを切断及び／又は連結するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学的な手法を駆使して行われる組換えＤＮＡ技術は、現在のバイオ産業の発展にはなくてはならない重要な技術である。例えば、近年、医療の分野において、その有効性が注目されているタンパク質製剤の開発及び製造においても、組換えＤＮＡ技術を用いずに需要に見合う製剤の供給を行うことは、ほぼ不可能に近く、この技術無くして現在の医療の発展を語ることはできないと言っても過言ではない。また、タンパク質製剤のみならず、研究開発に使用されるタンパク質試薬の開発のためにも、更なるＤＮＡ操作技術の進展が望まれている。【０００３】
ＤＮＡの組換え操作を行うにあたり、最も基本的な技術として、ＤＮＡの切断、フリーな末端の結合を挙げることができるが、このような操作の対象となるＤＮＡの多くは二重鎖ＤＮＡであった。これまでは、「タンパク質をコードし発現するツール」としてＤＮＡを利用することが多かったため、二重鎖ＤＮＡの操作技術の進捗に研究者らの興味が集中していたためと考えられる。しかしながら、現在は、生命工学の対象領域の拡大に伴い、一本鎖ＤＮＡの操作を行う機会も増えてきた。例えば、ＤＮＡチップなどを作成する場合には、所望の配列、長さを有する一本鎖ＤＮＡの調製が不可欠であり、一本鎖ＤＮＡを操作するための酵素などが重要になってくる。これまでに、一本鎖ＤＮＡを切断する方法は多数報告されているが、一本鎖ＤＮＡ同士を結合する方法は、Ｔ４  ＲＮＡ  リガーゼを用いる方法（特許文献１、非特許文献１）、古細菌由来の熱安定性リガーゼを用いる方法（特許文献２）、好熱性ファージＴＳ２１２６由来の熱安定性リガーゼをもちいる方法（特許文献３）など、数例が報告されているに過ぎない。
以上のような状況から、さらに利用可能な一本鎖ＤＮＡを操作し得る酵素又は組成物の開発が望まれている。【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１７１９８３号公報全文
【特許文献２】特開平６−６２８４７号公報全文
【特許文献３】米国特許公報第６，８１８，４２５号全文
【非特許文献１】Ｎｉｓｈｉｇａｋｉら，Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ  ４：１８７−９０，１９９８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、Ｅｖｌタンパク質が一本鎖ＤＮＡを切断し、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とを結合する活性を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。
よって、本発明は、一本鎖ＤＮＡを切断及び／又は結合するための組成物の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）に関する。
（１）本発明の第１の態様は、「 以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるＥｖｌタンパク質を含んでなる、一本鎖ＤＮＡの切断及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端の結合を行うための組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するポリペプチド」である。
（２）本発明の第２の態様は、「Ｍｇ２＋又はＣａ２＋をさらに含むことを特徴とする上記（１）に記載の組成物」である。
（３）本発明の第３の態様は、「前記Ｍｇ２＋の濃度が、０．５ｍＭ〜２．０ｍＭであることを特徴とする上記（２）に記載の組成物」である。
（４）本発明の第４の態様は、「Ｒａｄ５１Ｂタンパク質及びＡＴＰをさらに含むことを特徴とする上記（３）に記載の組成物」である。
（５）本発明の第５の態様は、「前記Ｒａｄ５１Ｂに対する前記Ｅｖｌタンパク質のモル比が、１：０．５から１：４であることを特徴とする上記（４）に記載の組成物」である。
（６）本発明の第６の態様は、「前記ＡＴＰの濃度が、０．５ｍＭ〜２．０ｍＭであることを特徴とする上記（４）又は（５）に記載の組成物」である。
（７）本発明の第７の態様は、「ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質をさらに含むことを特徴とする上記（１）乃至（３）のいずれかに記載の組成物」である。
（８）本発明の第８の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示される核酸を含む組換えベクターを含んでなる、一本鎖ＤＮＡの切断及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端の結合ための組成物。
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１９で表されるヌクレオチド配列からなる核酸、
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１９で表されるヌクレオチド配列からなる核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であって、該核酸がコードするポリペプチドが、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有する核酸」である。
（９）本発明の第９の態様は、「以下の（ａ）又は（ｂ）に示される核酸を含む組換えベクターを含んでなる、一本鎖ＤＮＡの切断及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端の結合ための組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする核酸
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するポリペプチドをコードする核酸」である。
（１０）本発明の第１０の態様は、「上記（１）乃至（９）のいずれかに記載の組成物と一本鎖ＤＮＡを反応させて、一本鎖ＤＮＡマーカーを製造する方法」である。
（１１）本発明の第１１の態様は、「上記（１０）に記載の方法により製造された一本鎖ＤＮＡマーカー」である。
（１２）本発明の第１２の態様は、「アクラルビシン、デカリニウム、ＤＩＤＳ、β−ルブロマイシン及び３−ＡＴＡからなる化合物のグループから選択される１又は複数の化合物を含んでなる、Ｅｖｌタンパク質活性阻害用組成物」である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の方法によれば、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端を結合することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】Ｅｖｌタンパク質とＲａｄ５１Ｂタンパク質が結合することを示す結果である。（ａ）精製したＥｖｌタンパク質（０．５μｇ）とＲａｄ５１Ｂタンパク質（０．５μｇ）を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動を行い、クマジーブリリアントブルーで染色を行った。レーン１は、マーカーである。レーン２及び３は、各々、精製したＥｖｌ及びＲａｄ５１Ｂである。（ｂ）Ｅｖｌ−Ｒａｄ５１Ｂの相互作用を示す結果である。レーン１及び２は、Ｒａｄ５１Ｂの非存在下（レーン１）又は存在下（レーン２）にて、Ｅｖｌ結合ビーズとの結合実験を行った結果である。レーン３は、タンパク質を結合していないＡｆｆｉ−Ｇｅｌビーズを用いた、ネガティブコントロールの実験結果である。（ｃ）Ｅｖｌ−Ｒａｄ５１Ｂの相互作用を示す結果である。レーン１及び２は、Ｅｖｌの非存在下（レーン１）又は存在下（レーン２）にて、Ｒａｄ５１Ｂ結合ビーズとの結合実験を行った結果である。レーン３は、タンパク質を結合していないＡｆｆｉ−Ｇｅｌビーズを用いた、ネガティブコントロールの実験結果である。
【図２】精製したＥｖｌタンパク質をゲル濾過した結果を示す。Ｅｖｌタンパク質は、分子量約６００ｋＤａの位置に溶出された。
【図３】Ｅｖｌタンパク質のＤＮＡ結合性について調べた結果を示す。レーン１〜６及びレーン７〜１２は、各々、二重鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡに対する結合性を調べた結果である。レーン１及び７は、Ｅｖｌタンパク質を加えないネガティブコントロールの結果を示す。結合実験に用いたＥｖｌタンパク質の濃度は、０．２μＭ（レーン２及び８）、０．４μＭ（レーン３及び９）、０．８μＭ（レーン４及び１０）、１．６μＭ（レーン５及び１１）、３．２μＭ（レーン６及び１２）である。ｎｃはニック入りの環状二重鎖ＤＮＡ、ｓｃはスーパーコイル環状二重鎖ＤＮＡ、ｓｓは一本鎖ＤＮＡを意味する（他の図においても同様である）。
【図４】一本鎖ＤＮＡの切断、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性について調べた結果を示す。（ａ）環状一本鎖ＤＮＡに対するＥｖｌの活性を調べた結果である。レーン１及び２は、ΦＸ１７４環状一本鎖ＤＮＡを用いた場合で、レーン３及び４は、Ｍ１３ｍｐ１８環状一本鎖ＤＮＡを用いた結果を示す。また、レーン１及び３は、Ｅｖｌなしのコントロール実験の結果を、レーン２及び４が、Ｅｖｌタンパク質を用いた実験の結果を示す。（ｂ）二重鎖のスーパーコイルＤＮＡ及びニック入りＤＮＡに対するＥｖｌの活性を調べた結果である。ΦＸ１７４環状一本鎖ＤＮＡ（２０μＭ、レーン１〜３）又はΦＸ１７４スーパーコイル及びニック入り二重鎖ＤＮＡ（１０μＭ、レーン４〜６）を用いてＥｖｌ（４μＭ、レーン２及び５）及び大腸菌由来トポイソメラーゼＩ（５  ユニット、レーン３及び６）の影響を調べた。レーン１及び４は、Ｅｖｌタンパク質なしのコントロール実験の結果を示す。
【図５】Ｅｖｌタンパク質の活性に対するＭｇ２＋及び２価金属イオンの影響を示す。（ａ）Ｅｖｌタンパク質の活性に対するＭｇ２＋の影響を調べた結果である。Ｅｖｌタンパク質（４μＭ）のΦＸ１７４環状一本鎖ＤＮＡ（２０μＭ）に対するカテマー化反応を種々のＭｇ２＋濃度下において行わせた。レーン１は、Ｅｖｌタンパク質なしのコントロール実験の結果である。また、レーン２〜８は、各々、０ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．２５ｍＭ、１．５ｍＭ、１．７５ｍＭ、２．０ｍＭのＭｇ２＋存在下における実験結果を示す。（ｂ）Ｅｖｌタンパク質の活性に対する２価金属イオンの影響を調べた結果である。Ｅｖｌタンパク質（４μＭ）のΦＸ１７４環状一本鎖ＤＮＡ（２０μＭ）に対するカテマー化反応を種々の２価金属イオンの存在下で行わせた。レーン１は、金属イオンなしのコントロール実験の結果である。また、レーン２〜５は、図に示す金属イオンの１ｍＭ存在下における実験結果を示す。
【図６】Ｅｖｌタンパク質による反応生成物の熱安定性について調べた結果を示す。ΦＸ１７４環状一本鎖ＤＮＡ（２０μＭ）とＥｖｌタンパク質（４μＭ）を反応させた反応生成物を、１００℃、０分間（レーン２）、０．５分間（レーン３）、１分間（レーン４）、５分間（レーン５）及び１０分間（レーン６）インキュベートし、アガロースゲルで泳動した結果を示す。レーン１は、Ｅｖｌタンパク質なしのコントロール実験の結果を示す。
【図７】Ｅｖｌタンパク質による反応生成物を電子顕微鏡で観察した結果を示す。スケールバーは１００ｎｍである。
【図８】Ｅｖｌタンパク質の活性をＲａｄ５１Ｂタンパク質が促進することを示した結果である。（ａ）Ｅｖｌタンパク質の活性に対するＲａｄ５１Ｂタンパク質影響を調べた結果を示す。レーン１及び５は、Ｅｖｌ及びＲａｄ５１Ｂタンパク質なしのコントロール実験の結果である。レーン２及び６は、Ｅｖｌタンパク質非存在下において、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質を４μＭ用いて行った実験結果である。レーン３及び７は、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質非存在下において、Ｅｖｌタンパク質を４μＭ用いて行った実験結果である。レーン４及び８は、Ｅｖｌタンパク質を４μＭ、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質を４μＭ用いて行った実験の結果である。また、レーン１〜４はＡＴＰ存在下、レーン５〜８はＡＴＰ非存在下で行った実験の結果である。（ｂ）Ｅｖｌタンパク質の活性に対するＲａｄ５１タンパク質影響を調べた結果を示す。レーン１及び５は、Ｅｖｌ及びＲａｄ５１タンパク質なしのコントロール実験の結果である。レーン２及び６は、Ｅｖｌタンパク質非存在下において、Ｒａｄ５１タンパク質を４μＭ用いて行った実験結果である。レーン３及び７は、Ｒａｄ５１タンパク質非存在下において、Ｅｖｌタンパク質を４μＭ用いて行った実験結果である。レーン４及び８は、Ｅｖｌタンパク質を４μＭ、Ｒａｄ５１タンパク質を４μＭ用いて行った実験の結果である。また、レーン１〜４はＡＴＰ存在下、レーン５〜８はＡＴＰ非存在下で行った実験の結果である。
【図９】Ｅｖｌタンパク質のカテマー化活性に対するＲａｄ５１Ｂタンパク質による促進効果の濃度依存性について調べた結果を示す。Ｅｖｌタンパク質４μＭに対し、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質を０．５〜８μＭで混合し、活性を測定した。レーン１は、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質及びＥｖｌタンパク質の両方を添加しない場合、レーン８はＲａｄ５１Ｂタンパク質を８μＭ添加しＥｖｌタンパク質を添加しない場合のコントロール実験の結果である。レーン２〜７は、４μＭのＥｖｌ存在下において、各々、０μＭ、０．５μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ、４．０μＭ、８．０μＭのＲａｄ５１Ｂタンパク質を加えた場合の実験結果である。
【図１０】Ｅｖｌ（１−２２１）変異体の精製結果を示す。（ａ）Ｅｖｌ（１−２２１）変異体の精製工程を示す。（ｂ）精製の各工程のサンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマジーブリリアントブルーで染色した結果を示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２及び３は、各々、ＩＰＴＧ添加前及び添加後の全宿主細胞抽出液である。また、レーン４〜７は、各々、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース画分、ハイドロキシアパタイト素通し画分、トロンビン処理後の画分、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００のピーク画分である。
【図１１】Ｅｖｌ（２２２−４１８）変異体の精製結果を示す。（ａ）Ｅｖｌ（２２２−４１８）変異体の精製工程を示す。（ｂ）精製の各工程のサンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマジーブリリアントブルーで染色した結果を示す。レーン１は分子量マーカー、レーン２及び３は、各々、ＩＰＴＧ添加前及び添加後の全宿主細胞抽出液である。また、レーン４〜７は、各々、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース画分、ハイドロキシアパタイトのピーク画分、トロンビン処理後の画分、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００のピーク画分である。
【図１２】Ｅｖｌタンパク質のＥＶＨ２ドメインの活性について調べた結果である。（ａ）Ｅｖｌタンパク質のドメイン構造及び本実施例で使用した欠失変異体の模式図を示す。ＥＶＨ１、プロリンリッチ領域及びＥＶＨ２を図中に示す。（ｂ）Ｅｖｌ欠失変異体の活性を検討した結果を示す。レーン１〜４は、各々、タンパク質無し、Ｅｖｌタンパク質（４μＭ）存在下、Ｅｖｌ（１−２２１）変異体（４μＭ）存在下、Ｅｖｌ（２２２−４１８）変異体（４μＭ）存在下における活性を調べた結果である。（ｂ）Ｅｖｌ欠失変異体の活性に対するＲａｄ５１Ｂタンパク質の影響を検討した結果を示す。レーン１はタンパク質なし、レーン２はＲａｄ５１Ｂタンパク質のみを加えた結果である。レーン３及び４、５及び６、７及び８は、各々、Ｅｖｌタンパク質（４μＭ）、Ｅｖｌ（１−２２１）変異体（４μＭ）、Ｅｖｌ（２２２−４１８）変異体（４μＭ）を加え、レーン４、６及び８は、さらに、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質（４μＭ）を加えて実験を行った結果である。
【図１３】ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質及びＥｖｌタンパク質共存下における一本鎖ＤＮＡのカテマー化の促進効果に関する結果を示す。（ａ）ＴｏｐｏＩ（大腸菌由来）による一本鎖ＤＮＡのカテマー化の促進効果について示す。レーン１は、一本鎖ＤＮＡのみのネガティブコントロールの結果、レーン２は、１μＭのＥｖｌタンパク質を反応させたときの結果、レーン３は、５ＵのＴｏｐｏＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を反応させたときの結果、レーン４は、１μＭのＥｖｌタンパク質と０．０５ＵのＴｏｐｏＩの混在下で反応させたときの結果、レーン５は、１μＭのＥｖｌタンパク質と０．５ＵのＴｏｐｏＩの混在下で反応させたときの結果、レーン６は、１μＭのＥｖｌタンパク質と５ＵのＴｏｐｏＩの混在下で反応させたときの結果を、各々示す。（ｂ）ｈｓＴｏｐｏＩ（ヒト由来）による一本鎖ＤＮＡのカテマー化の促進効果について示す。レーン１は、一本鎖ＤＮＡのみのネガティブコントロールの結果、レーン２は、０．５μＭのＥｖｌタンパク質を反応させたときの結果、レーン３は、２．８ｎＭのｈｓＴｏｐｏＩ（ｈｕｍａｎ，Ｊｅｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を反応させたときの結果、レーン４は、０．５μＭのＥｖｌタンパク質と２．８ｎＭのｈｓＴｏｐｏＩの混在下で反応させたときの結果を、各々示す。
【図１４】アクラルビシンよるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性への影響を示す。（ａ）アクラルビシンによるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性の阻害効果。レーン１は、一本鎖ＤＮＡのみのネガティブコントロールの結果、レーン２は、４μＭのＥｖｌタンパク質を反応させたときの結果、レーン３は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１μＭのアクラルビシンを反応させたときの結果、レーン４は、４μＭのＥｖｌタンパク質と５μＭのアクラルビシンを反応させたときの結果、レーン５は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１０μＭのアクラルビシンを反応させたときの結果、レーン６は、４μＭのＥｖｌタンパク質と２０μＭのアクラルビシンを反応させたときの結果、レーン７は、２０μＭのアクラルビシンを反応させたときの結果を、各々示す。（ｂ）アクラルビシンによるＥｖｌタンパク質のＤＮＡ結合活性への影響。反応させたＥｖｌタンパク質を０．３μＭにした以外は（ａ）と同様である。
【図１５】デカリニウムよるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性への影響を示す。（ａ）デカリニウムによるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性の阻害効果。レーン１は、一本鎖ＤＮＡのみのネガティブコントロールの結果、レーン２は、４μＭのＥｖｌタンパク質を反応させたときの結果、レーン３は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１μＭのデカリニウムを反応させたときの結果、レーン４は、４μＭのＥｖｌタンパク質と５μＭのデカリニウムを反応させたときの結果、レーン５は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１０μＭのデカリニウムを反応させたときの結果、レーン６は、４μＭのＥｖｌタンパク質と２０μＭのデカリニウムを反応させたときの結果、レーン７は、２０μＭのアクラルビシンを反応させたときの結果を、各々示す。（ｂ）デカリニウムによるＥｖｌタンパク質のＤＮＡ結合活性への影響。反応させたＥｖｌタンパク質を０．３μＭにした以外は（ａ）と同様である。
【図１６】ＤＩＤＳよるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性への影響を示す。（ａ）ＤＩＤＳによるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性の阻害効果。レーン１は、一本鎖ＤＮＡのみのネガティブコントロールの結果、レーン２は、４μＭのＥｖｌタンパク質を反応させたときの結果、レーン３は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１μＭのＤＩＤＳを反応させたときの結果、レーン４は、４μＭのＥｖｌタンパク質と５μＭのＤＩＤＳを反応させたときの結果、レーン５は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１０μＭのＤＩＤＳを反応させたときの結果、レーン６は、４μＭのＥｖｌタンパク質と２０μＭのＤＩＤＳを反応させたときの結果、レーン７は、２０μＭのＤＩＤＳを反応させたときの結果を、各々示す。（ｂ）ＤＩＤＳによるＥｖｌタンパク質のＤＮＡ結合活性への影響。反応させたＥｖｌタンパク質を０．３μＭにした以外は（ａ）と同様である。
【図１７】β−ルブロマイシンよるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性への影響を示す。（ａ）β−ルブロマイシンによるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性の阻害効果。レーン１は、一本鎖ＤＮＡのみのネガティブコントロールの結果、レーン２は、４μＭのＥｖｌタンパク質を反応させたときの結果、レーン３は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１μＭのβ−ルブロマイシンを反応させたときの結果、レーン４は、４μＭのＥｖｌタンパク質と５μＭのβ−ルブロマイシンを反応させたときの結果、レーン５は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１０μＭのβ−ルブロマイシンを反応させたときの結果、レーン６は、４μＭのＥｖｌタンパク質と２０μＭのβ−ルブロマイシンを反応させたときの結果、レーン７は、２０μＭのβ−ルブロマイシンを反応させたときの結果を、各々示す。（ｂ）β−ルブロマイシンによるＥｖｌタンパク質のＤＮＡ結合活性への影響。反応させたＥｖｌタンパク質を０．３μＭにした以外は（ａ）と同様である。
【図１８】３−ＡＴＡよるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性への影響を示す。（ａ）３−ＡＴＡによるＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性の阻害効果。レーン１は、一本鎖ＤＮＡのみのネガティブコントロールの結果、レーン２は、４μＭのＥｖｌタンパク質を反応させたときの結果、レーン３は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１μＭの３−ＡＴＡを反応させたときの結果、レーン４は、４μＭのＥｖｌタンパク質と５μＭの３−ＡＴＡを反応させたときの結果、レーン５は、４μＭのＥｖｌタンパク質と１０μＭの３−ＡＴＡを反応させたときの結果、レーン６は、４μＭのＥｖｌタンパク質と２０μＭの３−ＡＴＡを反応させたときの結果、レーン７は、２０μＭの３−ＡＴＡを反応させたときの結果を、各々示す。（ｂ）３−ＡＴＡによるＥｖｌタンパク質のＤＮＡ結合活性への影響。反応させたＥｖｌタンパク質を０．３μＭにした以外は（ａ）と同様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の第１の実施態様は、「 以下の（ａ）又は（ｂ）に示されるＥｖｌタンパク質を含んでなる、一本鎖ＤＮＡの切断及び／又は、一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端の結合を行うための組成物。
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、又は配列番号２０で表されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を持つアミノ酸配列からなり、かつ、一本鎖ＤＮＡ切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するポリペプチド」である。
ここで「Ｅｖｌタンパク質」とは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するタンパク質である。
なお、本明細書中において、特に断らない限り、「ポリペプチド」と「タンパク質」は同じ意味で用いるものとする。【００１０】
あるいは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質とは、配列番号２、４、６、８、１０又は１２で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するタンパク質である。
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、単離した天然のポリペプチドに存在していてもよく、また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものでもよい。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行うことで実施することができる。【００１１】
また、本発明の実施において使用されるタンパク質のＣ末端は、通常カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）又はカルボキシレート（−ＣＯＯ−）であるが、当該カルボキシル基は、アミド（−ＣＯＮＨ２）やエステル（−ＣＯＯＲ）等に化学修飾されていてもよい。ここで、エステル中のＲとしては、Ｃ１−６アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル）、Ｃ３−８シクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル）、Ｃ１−６アリール基（例えば、フェニル、α−ナフチル）、フェニル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、ベンジル、フェネチル）、α−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基（例えば、α−ナフチルメチル）等が挙げられる。その他、経口用エステルとして汎用されているピバロイルオキシメチルエステルとすることも可能である。本発明のＥｖｌタンパク質がＣ末端以外にもそのポリペプチド鎖中にカルボキシル基を有する場合には、当該カルボキシル基がアミド化又はエステル化されているものも本発明のタンパク質に含まれる。このエステルとしては上記の各エステルが挙げられる。同様に、本発明のタンパク質のＮ末端は、通常アミノ基（−ＮＨ２）であるが、当該アミノ基は、ホルミル基、アセチル基等のＣ１−６アシル基等で化学修飾されていてもよい。その他、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したものや、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な官能基（例えば、ホルミル基、アセチル等）で化学修飾されているものや糖鎖の結合しているものも本発明のタンパク質に含まれる。【００１２】
本発明のＥｖｌタンパク質中の部分アミノ酸配列を含むペプチド（部分ペプチドともいう）も、当該部分ペプチドが一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するものであれば、本発明の組成物に含まれてもよい。そのような部分ペプチドとしては、配列番号２０で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド」とは、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するポリペプチドである。【００１３】
あるいは、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号２０で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するポリペプチドである。
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、単離した天然のポリペプチドに存在していてもよく、また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものでもよい。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行うことにより実施することができる。【００１４】
Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチドは、天然のソースから取得しても、あるいは、組換体として取得してもよい。組換体を取得するためには、Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチドを発現するために組換えベクターが必要となる。また、該組換えベクターは、
本発明の組成物中に含まれてもよい。本組換えベクターには、Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチドをコードする核酸が発現可能に挿入されている。ここで、「発現可能」とは、所望のアミノ酸配列を有するＥｖｌタンパク質又は部分ペプチドが発現されるように、これらをコードする核酸が読み枠を併せて発現用のベクター中に挿入されている状態であって、その他必要な構成要素、例えば、プロモーター、選択マーカーなどが機能するように、当該ベクター中に構築されている状態のことである。
ここで、「Ｅｖｌタンパク質をコードする核酸」とは、配列番号１、３、５、７、９又は１１で表される塩基配列からなる核酸のみならず、配列番号１、３、５、７、９又は１１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するポリペプチドをコードする核酸も含まれる。
配列番号１、３、５、７、９又は１１で表わされる塩基配列を含有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号１、３、５、７、９又は１１で表わされる塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有する核酸等が挙げられる。【００１５】
ここで、「Ｅｖｌタンパク質の部分ペプチドをコードする核酸」とは、配列番号１９で表される塩基配列からなる核酸のみならず、配列番号１９で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、一本鎖ＤＮＡを切断し、及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を有するポリペプチドをコードする核酸も含まれる。
配列番号１９で表わされる塩基配列を含有する核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、配列番号１９で表わされる塩基配列と好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のポリヌクレオチド配列相同性を有する塩基配列を含有する核酸等が挙げられる。【００１６】
ここで、ストリンジェントな条件とは、当業者によって容易に決定されるハイブリダイゼーションのための条件のことで、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的諸条件のことである。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点よりやや低い温度条件下において、再アニールする核酸の能力に依存する。
具体的には、例えば、低ストリンジェントな条件として、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄段階において、３７℃〜４２℃の温度条件下、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中で洗浄することなどが上げられる。また、高ストリンジェントな条件として、例えば、洗浄段階において、６５℃、５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄することなどが挙げられる。ストリンジェントな条件をより高くすることにより、相同性の高いポリヌクレオチドを得ることができる。【００１７】
Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチドをコードする核酸は、ヒト、ラット、マウス、ヒツジなどの哺乳類を含む、真核生物の細胞から、定法に従い取得することができる。あるいは、すでに公知となっているＥｖｌタンパク質の核酸配列情報をデータベースなどから取得し、その配列情報に基づいて、所望の生物種由来のＥｖｌ遺伝子を得ることも可能である。Ｅｖｌ遺伝子のクローニングは当該技術分野における通常の知識に基づいて行うことができる。該遺伝子は、該遺伝子を発現している細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製し、定法のスクリーニング方法により取得することができる。あるいは、該遺伝子が発現している細胞からＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、該遺伝子配列に基づいてＰＣＲ用プライマーを調製してｃＤＮＡを増幅させることにより該ｃＤＮＡを取得してもよい。【００１８】
Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチドをコードする核酸を組み込んだ組換えベクターは、適切なベクターに当該核酸を連結することにより得ることができる。組換えベクターは、クローニング用に供される場合、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されない。また、Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチドを発現するためのベクターとしては、宿主中で複製可能なものであって、該タンパク質をコードするＤＮＡ断片を発現させることができるプロモーターなどを使用することができる。【００１９】
使用可能なベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＣＢＤ−Ｃ、ｐＥＴ１５ｂ等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、ＹＩｐ３０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。さらに、レトロウイルス、ワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルス、トガウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。【００２０】
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであれば特に限定されない。
例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター等が挙げられる。
宿主が大腸菌である場合には、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーター等が、宿主が枯草菌である場合には、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等が挙げられる。
宿主が酵母である場合には、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。
宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。【００２１】
本発明の組換えベクターにはＥｖｌタンパク質又はその一部をコードする核酸配列、プロモーター配列以外にも、選択マーカー、ターミネーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、ＳＶ４０複製起点（ＳＶ４０ｏｒｉ）などを連結することができる。
選択マーカーとしては、限定はしないが、ハイグロマイシン耐性マーカー（Ｈｙｇｒ）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（ｄｈｆｒ）、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ，Ｇ４１８）などが利用可能である。
また、組換えタンパク質の単離・精製を容易にするなどの目的で、発現させるタンパク質又はその一部のＮ末端側、Ｃ末端側等に、精製用のタグ配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴなどを融合させることもできる。
宿主が大腸菌である場合にはアルカリホスファターゼシグナル、ＯｍｐＡシグナルなどが利用可能であり、宿主が枯草菌である場合にはα−アミラーゼシグナル配列、ズブチリスシグナル配列などが利用可能であり、宿主が酵母である場合には、α因子シグナル配列、インベルターゼシグナル配列などが利用可能であり、宿主が動物細胞である場合には、例えば、インシュリンシグナル配列、α−インターフェロンシグナル配列などが利用可能である。【００２２】
上述のベクターへのＥｖｌタンパク質をコードするＤＮＡ又はその一部の挿入は、クローニングされたＤＮＡをそのまま、又は所望により制限酵素で消化して、リンカーを付加し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに組み込むことにより行うことができる。連結するＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡ又はＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。連結するＤＮＡは、当該ＤＮＡ中にコードされている本発明のポリペプチドが宿主細胞中で発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。【００２３】
Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチドを発現するために、これらをコードする核酸を挿入した発現ベクターを、適当な宿主細胞に形質転換する必要がある。形質転換を行うための宿主としては、Ｅｖｌタンパク質を発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエシェリシア属、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）等のリゾビウム属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）等の酵母、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、あるいはＳｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞が挙げられる。【００２４】
大腸菌への組換えベクターの導入方法としては、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が利用可能である。酵母への組換えベクターの導入方法としては、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が利用可能である。動物細胞又は動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、カチオン性脂質による方法等が挙げられる。【００２５】
Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチドは、形質転換体を培養し、該タンパク質又はその部分ペプチドを発現させ、形質転換体の培養物から該タンパク質又はその部分ペプチドを単離することにより製造することができる。「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主とした形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。【００２６】
培養は、宿主細胞に適した条件下で行う。例えば、大腸菌を培養する際の培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地等が好ましい。所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。大腸菌の場合、培養は通常約１５〜３７℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。宿主が枯草菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加えることもできる。【００２７】
酵母を培養するための培地としては、ＳＤ培地、ＹＰＤ培地があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、ウシ血清を含むグレース昆虫培地等が挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。  【００２８】
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％のウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。上記培養物からＥｖｌタンパク質又はその部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行うことができる。【００２９】
Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／又は凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過によりＥｖｌタンパク質又はその部分ペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にＥｖｌタンパク質又はその部分ペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。このようにして得られた培養上清又は抽出液中に含まれるＥｖｌタンパク質又はその部分ペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。【００３０】
Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは、これらの発現ベクターを含んでなる組成物は、一本鎖ＤＮＡを切断、及び／又は一本鎖ＤＮＡの５’末端及び３’末端を結合させるために使用することができる。本組成物には、Ｅｖｌタンパク質又はその部分ペプチド、あるいは、これらの発現ベクターなどの他に、一本鎖ＤＮＡの切断、結合反応に必要な物質であれば、いかなるものも含まれる。例えば、Ｍｇ２＋などの金属イオンやＡＴＰなどのほか、ｐＨを一定に保つためのバッファーなどの補助物質も含まれる。【００３１】
本発明のさらなる実施態様には、上述の有効成分及び補助物質等の他、さらに、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質又はＲａｄ５１Ｂタンパク質の発現ベクターをさらに含んだ組成物も含まれる。
ここで「Ｒａｄ５１Ｂタンパク質」とは、配列番号１４、１６又は１８で表されるアミノ酸配列と同一又は実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号１４、１６又は１８で表わされるアミノ酸配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，最も好ましくは約９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ＡＴＰａｓｅ活性及び相同組換えに特異的なＤＮＡ構造であるホリデー（Ｈｏｌｌｉｄａｙ）構造に結合する活性を有するタンパク質である。【００３２】
あるいは、配列番号１４、１６又は１８で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質とは、配列番号１４、１６又は１８で表わされるアミノ酸配列中の１又は数個（好ましくは、１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＡＴＰａｓｅ活性及び相同組換えに特異的なＤＮＡ構造であるホリデー（Ｈｏｌｌｉｄａｙ）構造に結合する活性を有するタンパク質である。
上記アミノ酸の欠失、付加及び置換は、単離した天然のポリペプチドに存在していてもよく、また、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって新たに導入したものでもよい。例えば、特定のアミノ酸残基の置換は、市販のキット（例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社）、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社））等を使用し、Ｇｕｐｐｅｄｄｕｐｌｅｘ法やＫｕｎｋｅｌ法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法により塩基の置換を行実施することができる。【００３３】
Ｒａｄ５１Ｂタンパク質は天然の環境から取得しても、又は組換え体を発現させることで取得してもよい。Ｒａｄ５１Ｂタンパク質の組換体を発現させる場合には、上述のＥｖｌタンパク質を発現させる方法に準じて、発現用のベクター及び、発現に必要な構成要素を選択することができ、また、組換体の取得についても、上述のＥｖｌタンパク質の組換体を取得する方法に準じて実施することができる。【００３４】
また、本発明の実施態様には、Ｅｖｌタンパク質又はＥｖｌタンパク質の発現ベクターの他に、さらに、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質又はＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質の発現ベクターを含んだ組成物も含まれる。ここで、「ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型」とは、一般に、「ＴｏｐｏＩ」などとも称されるが、その慣用名に拘泥されるものではなく、その活性として、環状（二重鎖）ＤＮＡの片方の鎖に切れ目を導入し、他方の鎖を通過させたのち、切れ目を再結合する結果、ＤＮＡの超らせんを解消する活性を持つ酵素の全てを含むものである。従って、本発明における「ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型」には、原核生物及び真核生物のいずれに由来するものも含まれ、また、ＤＮＡ超らせんの正又は負のいずれか一方を解消するもの、ＤＮＡ超らせんの正及び負の両方を解消するもののいずれも含まれる。ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質は、天然の環境から取得しても、又は組換え体を発現させることで取得してもよく、あるいは、市販品を購入してもよい。ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質の組換え体を発現させる場合には、上述のＥｖｌタンパク質を発現させる方法に準じて、発現用のベクター及び、発現に必要な構成要素を選択することができ、また、組換え体の取得についても、上述のＥｖｌタンパク質の組換え体を取得する方法に準じて実施することができる。【００３５】
さらに、本発明の実施態様には、Ｅｖｌ活性を阻害する組成物が含まれる。Ｅｖｌタンパク質は、一本鎖ＤＮＡを切断及び／又は結合する活性を有するが、この活性は、Ｅｖｌ活性を阻害する組成物により、適時、抑制調節することで、より望ましい形態を持つ一本鎖ＤＮＡの形成を達成することができる。Ｅｖｌ活性を阻害する組成物の有効成分として含まれる化合物は、アクラルビシン（Ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、デカリニウム（Ｄｅｑｕａｌｉｎｉｕｍ）、ＤＩＤＳ（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ）、β−ルブロマイシン（β−Ｒｕｂｒｏｍｙｃｉｎ）及び／又は３−ＡＴＡ（３−ａｍｉｎｏ−９−ｔｈｉｏ（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ）である。これらの化合物は塩の形態でＥｖｌ活性を阻害する組成物に含まれてもよい。【００３６】
本発明の組成物は、有効成分である化合物、タンパク質、ＤＮＡ等の他、ｐＨを調整するためのバッファー、イオン強度を調整するための塩、プロテアーゼインヒビター、など、通常、試薬等として提供する場合に必要とされる添加物質をさらに含んでもよい。これの添加物質は、本発明の組成物の用途に応じて、当業者であれば、適宜選択及び使用することが可能である。【００３７】
本発明のその他の実施態様において、本発明の組成物を用いた一本鎖ＤＮＡ分子量マーカーの作製方法、及び作製された一本鎖ＤＮＡ分子量マーカーが提供される。本発明による一本鎖ＤＮＡ分子量マーカーは、分子量が既知の一本鎖ＤＮＡから該分子量の整数倍の分子量を持つ一本鎖ＤＮＡを作製することによって調製されるものである。従って、本発明の分子量マーカーは、出発物質として使用した一本鎖ＤＮＡ及び／又は該分子量の整数倍の分子量を持つ一本鎖ＤＮＡの混合物として提供される。さらに、該混合物の分子量マーカーをアガロース電気泳動などによって分離し、各分子量に対応する一本鎖ＤＮＡを切り出して生成を行うと、特定の分子量を持つ一本鎖ＤＮＡとして、提供することも可能である。本発明の一本鎖分子量マーカーの作製方法においては、一本鎖ＤＮＡであればいかなるものも使用できるが、好ましくは、環状一本鎖ＤＮＡである。
前述のように、本発明のＥｖｌタンパク質を含んでなる組成物を用いれば、一本鎖ＤＮＡを切断し、再度結合させることができるため、種々の長さ（又は分子量）を含んだ一本鎖ＤＮＡを作製することができる。例えば、本発明の実施例を参照して説明すると、図１４〜図１８のａに示すように、ΦＸ１７４環状一本鎖ＤＮＡ（５３６８塩基）に対して本発明のＥｖｌタンパク質を含んでなる組成物を作用させると、５３６８×ｎ塩基（ｎは１以上の整数）の分子量マーカーを作製することができる（図１４〜図１８のａのゲルの写真の右横に楕円で一本鎖ＤＮＡを模式的に示している。楕円１個が５３６８塩基の一本鎖ＤＮＡの位置を、楕円２個が５３６８×２塩基の一本鎖ＤＮＡの位置を、楕円３個が５３６８×３塩基の一本鎖ＤＮＡの位置を、各々、示している）。同様に、異なる分子量の一本鎖ＤＮＡ、例えば、Ｍ１３ｍｐ１８（７２５０塩基）を用いれば７２５０×ｎ（ｎは１以上の整数）の分子量マーカーを作製することができる（図４を参照のこと）。
作製した一本鎖ＤＮＡ分子量マーカーを用いれば、ヘルパーファージなどによって一本鎖ＤＮＡを抽出した際、取り出したＤＮＡの分子量を調べることができる。
なお、本発明の組成物により作製した一本鎖ＤＮＡマーカーはエタノール沈殿などを経た後、凍結乾燥を行った場合でも、分子量の変化が生じないことから、安定な一本鎖ＤＮＡ分子量マーカーとして使用することができる。【００３８】
以下に実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
１．ヒトＥｖｌタンパク質の精製
Ｅｖｌタンパク質（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＦ２１７０９）ＤＮＡ断片をＰＣＲ法によりヒトｃＤＮＡプール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から単離し（例えば、配列番号１）、ｐＥＴ１５ｂベクターのＮｄｅＩサイトにクローニングした（Ｎｏｖａｇｅｎ社）。このコンストラクトにおいて、Ｈｉｓタグ配列を単離した遺伝子のＮ末端側に融合させた。Ｅｖｌタンパク質はＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ−ＲＰ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて発現させ、６×Ｈｉｓタグを除去するステップを含む４ステップにより精製を行った。まず、Ｅｖｌタンパク質を発現している細胞をＡバッファー（２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、７００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール）に懸濁し、超音波破砕器を用いて細胞を破砕した。得られた細胞破砕液を３０，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、得られた上清と８ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（ＱＩＡＧＥＮ社）を穏やかに混合し、４℃で１時間バッチ法によりＨｉｓタグ融合Ｅｖｌタンパク質（Ｈｉｓ−Ｅｖｌ）を結合させた。【００４０】
Ｅｖｌ−結合ビーズを８０ｍｌのＢバッファー（２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、７００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、３０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール）で洗浄し、次に、８０ｍｌのＣバッファー（２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、７００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、６０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール）で洗浄し、再度、８０ｍｌのＢバッファーで洗浄した後、得られたＥｖｌ−結合ビーズをエコノカラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）に充填した。充填したＥｖｌ−結合ビーズを、３００ｍｌのＤバッファー（２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、３０ｍＭ  イミダゾール、１０％  グリセロール）で洗浄し、３０〜３００ｍＭ  イミダゾールの直線的濃度勾配によりＨｉｓ−Ｅｖｌを溶出した。【００４１】
Ｈｉs−Ｅｖｌを含む画分に、等量のＦバッファー（１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％  グリセロール）を加え、さらに１０ｍｌのハイドロキシアパタイト（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）と４℃で１時間バッチ法により穏やかに混合した。その後、レジンを８０ｍｌのＧバッファー（２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％  グリセロール）で洗浄し、エコノカラムに充填した。充填したレジンを３００ｍｌのＨバッファー（１０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、２２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％  グリセロール）で洗浄後、２２５〜１０００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０〜３００ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）の直線的濃度勾配によりＨｉｓ−Ｅｖｌを溶出した。
得られたＨｉｓ−Ｅｖｌ、１ｍｇあたり５ユニットのＴｈｒｏｍｂｉｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加し、４ＬのＪバッファー（２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％  グリセロール）に対し、４℃で透析を行った。【００４２】
Ｈｉｓタグを除去した後、Ｅｖｌタンパク質は、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ）クロマトグラフィーを用いて精製を行った。精製後、Ｅｖｌタンパク質をＫバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトメタノール、３０％  グリセロール）又は、Ｌバッファー（２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、７００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、３０％  グリセロール）に対して透析し、−２０℃で保存した。精製したＥｖｌタンパク質の濃度は、ブラッド・フォード法により、ＢＳＡをスタンダードとして測定した。図１ａは精製したＥｖｌタンパク質の１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果である。【００４３】
２．Ｅｖｌ−又はＲａｄ５１Ｂ−結合ビーズを用いたプルダウンアッセイ
Ｒａｄ５１Ｂタンパク質はすでに報告されている方法に従って精製を行った（Ｙｏｋｏｙａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２７６７−２７７２，２００３）。
Ｅｖｌタンパク質及びＲａｄ５１Ｂタンパク質を説明書に従いＡｆｆｉ−ｇｅｌ  １０ビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に結合させた。残存しているエステル残基を最終濃度１００ｍＭになるようにエタノールアミン（ｐＨ８．０）を添加し、４℃で一晩インキュベートした。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０−Ｅｖｌビーズを５００μｌの洗浄バッファー１（２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、３０％  グリセロール、７００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０５％  トリトン  Ｘ−１００）で、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０−Ｒａｄ５１Ｂビーズを洗浄バッファー２（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．３）、３０％  グリセロール、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１％  トリトン  Ｘ−１００、２ｍＭ  硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で３回洗浄した後、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０−タンパク質を５０％懸濁液となるように調製し、４℃で保存した。【００４４】
結合アッセイを行う場合には、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０−タンパク質懸濁液（３０ μｌ）を１０μｇのＥｖｌ又はＲａｄ５１Ｂタンパク質と室温にて１５０分間インキュベートした。Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０−Ｅｖｌビーズは、１００μｌのバッファー１（２０ｍＭ  リン酸カリウム（ｐＨ８．５）、３０％  グリセロール、７００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．３％  トリトン  Ｘ−１００）で４回洗浄した。また、Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ  １０−Ｒａｄ５１Ｂビーズは、１００μｌのバッファー２（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．３）、３０％  グリセロール、９０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  硫酸アンモニウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３５％  トリトン  Ｘ−１００）で４回洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル処理バッファー（２×）と洗浄後のビーズを直接混合し、１００℃で２分間熱処理を行い、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、タンパク質をクマジーブリリアントブルーで染色した。【００４５】
図１ｂに示すように、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質はＥｖｌ−結合ビーズによってプルダウンされた。また、Ｅｖｌ−タンパク質はＲａｄ５１Ｂ結合ビーズによってプルダウンされた（図１ｃ）。
これらの結果から、Ｅｖｌタンパク質がＲａｄ５１Ｂと直接結合することが明らかとなった。Ｅｖｌ結合ビーズがプルダウンアッセイにおいて使用される場合、Ｒａｄ５１ＢはＥｖｌ結合ビーズと１：１のストイキオメトリーで結合した（図１ｂ）。一方、大量のＥｖｌタンパク質がＲａｄ５１Ｂ結合ビーズと共に沈降した（図１ｃ）。従って、Ｅｖｌタンパク質同士が重合し複合体を形成していることが考えられる。ゲル濾過分析により、Ｅｖｌタンパク質が約６００ｋＤａの画分に溶出され、Ｅｖｌタンパク質が約１３マーのマルチマーを形成していることが示された（図２）。【００４６】
３．ＤＮＡ結合アッセイ
次に、Ｅｖｌタンパク質とＤＮＡへの結合性について検討した。
ΦＸ１７４環状一本鎖ＤＮＡ（４０μＭ）又はΦＸ１７４スーパーコイル二重鎖ＤＮＡ（１０μＭ）を１０μｌの反応溶液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で混合し、３７℃で１５分間反応させた。反応生成物は、１×ＴＡＥ（４０ｍＭ  トリス−酢酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）バッファーを用いて０．８％アガロースゲル電気泳動（３Ｖ／ｃｍ、３時間）にて解析を行った。ＤＮＡのバンドはエチジウムブロマイドで染色した（図３）。アッセイの結果、Ｅｖｌタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ及びスーパーコイル二重鎖ＤＮＡと効率的に結合することが分かった（図３）【００４７】
４．一本鎖ＤＮＡのカテマー化アッセイ
ΦＸ１７４又はＭ１３ｍｐ１８環状一本鎖ＤＮＡ（２０μＭ）を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中、３７℃でインキュベートした。その後、サンプルを０．２％  ＳＤＳ、１．３ｍｇ／ｍｌ  プロテイネースＫにより除タンパク処理を行った。得られた産物を０．９％  アガロースゲル電気泳動で分離し、ＤＮＡのバンドをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色した。
Ｅｖｌタンパク質を作用させたＤＮＡのうち、環状一本鎖ＤＮＡはマルチマーを形成したのに対し（図４ａ、レーン２、４及び図４ｂ、レーン２）、スーパーコイル二重鎖ＤＮＡには特に変化は見られなかった（図４ｂ、レーン５）。Ｅｖｌタンパク質は、スーパーコイル二重鎖ＤＮＡのトポロジーの変化を誘導しなかったことから、Ｅｖｌタンパク質の活性はトポイソメラーゼＩのような活性（図４ｂ、レーン６）とは異なるものであると考えられる。【００４８】
次に、Ｅｖｌタンパク質の活性に対する金属イオンの要求性を調べたところ、Ｍｇ２＋を強く要求することが示された（図５ａ）。Ｍｇ２＋非存在下においても、Ｅｖｌタンパク質のカテマー化活性は認められるが、Ｍｇ２＋により活性が促進される。Ｍｇ２＋の至適濃度に関しては、反応条件（その他の成分、例えば、グリセロール濃度、塩濃度）にも左右されるが、例えば、０．１ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは、０．５ｍＭ〜１５ｍＭ、より好ましくは、０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、さらにより好ましくは、０．５ｍＭ〜２ｍＭ程度である。また、Ｍｇ２＋以外の金属イオンについては、Ｃａ２＋でも同様の効果が示された（図５ｂ）。Ｍｎ２＋では、本実験条件では、巨大なＤＮＡ複合体様の生成物が形成され、また、Ｚｎ２＋では、Ｍｇ２＋程の促進活性は認められなかった（図５ｂ）。
また、形成された一本鎖ＤＮＡのマルチマーは、１００℃で１０分間処理しても解消されなかったことから（図６）、これらのマルチマーは、リング上に連結した環状一本鎖ＤＮＡのカテマーであることが示唆される。
次に、環状一本鎖ＤＮＡがＥｖｌタンパク質の作用により、カテマー化されている状態を視覚的に捉えるために、電子顕微鏡により生成産物の観察を行った。【００４９】
５．電子顕微鏡観察
Ｅｖｌタンパク質によって形成された一本鎖ＤＮＡカテマーを、フェノール／クロロホルム法により抽出し、その後エタノール沈殿により回収を行った。次いで、一本鎖ＤＮＡカテマーをＡＴＰ非存在下にてＲｅｃＡタンパク質（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）でコートし、炭素メッキした銅製グリッド上、２％ウラニルアセテートで染色した。染色したサンプルは、タングステンによるロータリーシャドー法により視覚化し、ＪＥＯＬ  ＪＥＭ２０００ＦＸ電子顕微鏡で観察を行った。
図７に示されるように、２又は３の一本鎖ＤＮＡ分子を含む環状一本鎖ＤＮＡカテマーが観察された。【００５０】
以上、一本鎖ＤＮＡのカテマー化のアッセイ及び電子顕微鏡による観察の結果から、Ｅｖｌタンパク質は環状一本鎖ＤＮＡを切断し、その後、５’末端と３’末端とを結合させることで、カテマーを形成していると考えられる。従って、Ｅｖｌタンパク質は、一本鎖ＤＮＡを切断する活性及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端とを結合する活性を有すると結論づけることができる。
なお、直鎖状一本鎖ＤＮＡでもカテマー化を引き起こす結果が得られている。【００５１】
６．Ｒａｄ５１Ｂの影響
次に、Ｅｖｌタンパク質による一本鎖ＤＮＡのカテマー化が、Ｒａｄ５１Ｂによって影響を受けるかどうか検討した。図８ａに示すように、Ｅｖｌタンパク質によるＤＮＡのカテマー化は、ＡＴＰの存在下において、Ｒａｄ５１Ｂによって顕著に促進されることが分かった（レーン４）。これに対し、Ｒａｄ５１Ｂ依存性の促進は、ＡＴＰ非存在下ではそれ程顕著ではなかった（図８ａ、レーン８）。従って、ＡＴＰ結合Ｒａｄ５１Ｂタンパク質が、Ｅｖｌタンパク質によるＤＮＡのカテマー化を促進していることが示唆される。Ｒａｄ５１ＢによるＥｖｌタンパク質活性の促進効果は、Ｒａｄ５１Ｂの添加する濃度依存的に上昇するが、４μＭのＥｖｌタンパク質に対し、１μＭ以上のＲａｄ５１Ｂを加えてもそれ以上の促進効果は見られなかった（図９）
一方、Ｒａｄ５１Ｂと配列類似性を示すＲａｄ５１タンパク質は、ＡＴＰの有無に関わらずＥｖｌタンパク質によるＤＮＡのカテマー化を阻害した（図８ｂ）。これらの結果から、Ｅｖｌ及びＲａｄ５１Ｂタンパク質間に特異的な機能的相互作用により、Ｅｖｌタンパク質の活性が促進されていることが示唆される。【００５２】
７．Ｅｖｌタンパク質のＥＶＨ２ドメイン
Ｅｖｌタンパク質による一本鎖ＤＮＡカテマー化の原因となる機能ドメインを同定するために、１−２２１及び２２２−４１８のアミノ酸残基を含む２つのＥｖｌ断片、Ｅｖｌ（１−２２１）及びＥｖｌ（２２２−４１８）を精製した。Ｅｖｌ（１−２２１）及びＥｖｌ（２２２−４１８）の精製は、Ｅｖｌタンパク質の全長を精製したときに使用したプロトコールに準じて行った。
定法に従い、Ｅｖｌ（１−２２１）及びＥｖｌ（２２２−４１８）を発現するためのコンストラクトを作成後、各々、大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に形質転換し、タンパク質を発現させた。Ｅｖｌ（１−２２１）については、細胞抽出物を回収した後、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に通し、得られたピーク画分をハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）と混合した。遠心分離後、ハイドロキシアパタイトと結合しなかった上清を回収し、トロンビン処理によりＨｉｓタグを除去し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムクロマトグラフィーにより、Ｅｖｌ（１−２２１）とタグを分離した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムクロマトグラフィーにより得られたＥｖｌ（１−２２１）を実験に使用した（図１０）。また、Ｅｖｌ（２２２−４１８）については、細胞抽出物を回収した後、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に通し、得られたピーク画分をハイドロキシアパタイト（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に通し、ピーク画分を回収した。回収したＥｖｌ（２２２−４１８）は、トロンビン処理によりＨｉｓタグを除去し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）カラムクロマトグラフィーにより、Ｅｖｌ（２２２−４１８）とタグを分離した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムクロマトグラフィーにより得られたＥｖｌ（２２２−４１８）を実験に使用した（図１１）。【００５３】
Ｅｖｌ（１−２２１）変異体は、ＥＶＨ１及びプロリンリッチドメインを含み、Ｅｖｌ（２２２−４１８）変異体はＥＶＨ２ドメインを含む（図１２ａ）。図１２ｂに示されるように、Ｅｖｌ（２２２−４１８）変異体はｓｓＤＮＡカテマー化活性を示すが（レーン４）、Ｅｖｌ（１−２２１）変異体はｓｓＤＮＡカテマー化活性を示さなかった（レーン３）。また、Ｅｖｌ（２２２−４１８）変異体の活性は、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質により促進されたが（図１２ｃ、レーン８）、Ｅｖｌ（１−２２１）変異体については、Ｒａｄ５１Ｂタンパク質を添加しても活性が検出されることはなかった（図１２ｃ、レーン６）。
従って、ＥＶＨ２ドメインは、Ｅｖｌタンパク質のｓｓＤＮＡカテマー化活性に必要であると考えられる。【００５４】
８．ＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質及びＥｖｌタンパク質共存下における一本鎖ＤＮＡのカテマー化の促進効果
反応液１０ μｌ（２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１  ｍＭ  ＤＴＴ、１００ μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に、ΦＸ１７４一本鎖ＤＮＡを２０ μＭ、Ｅｖｌを４μＭ、及び各濃度又はユニット数のＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質（大腸菌由来又はヒト由来）を加え、３７℃で１時間反応させた。その後サンプルを０．２％  ＳＤＳ、１．３ｍｇ／ｍｌ  プロテイネースＫにより除タンパク処理を行った。得られた産物を０．９％  アガロースゲル電気泳動で分離し、ＤＮＡバンドをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で染色した（図１３）。
この結果、一本鎖ＤＮＡのカテマー化は、大腸菌由来（図１３ａ、レーン４〜５）又はヒト由来（図１３ｂ、レーン４）のＤＮＡトポイソメラーゼＩ型タンパク質の共存下において、促進されることが明らかとなった。【００５５】
９．Ｅｖｌタンパク質による一本鎖ＤＮＡカテネーション活性に影響を与える低分子化合物の探索
Ｅｖｌタンパク質による一本鎖ＤＮＡカテネーション活性を適時調節するために使用可能な低分子化合物の探索を行ったところ、アクラルビシン、デカリニウム、ＤＩＤＳ、β−ルブロマイシン及び３−ＡＴＡの各化合物を見出した。
上記各化合物による阻害活性は、以下のようにして検出した。
カテネーション活性への影響については（図１４〜図１８のａ）、反応液１０ μｌ（２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１  ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に各化合物を終濃度１、５、１０、２０μＭ、ΦＸ１７４一本鎖ＤＮＡを２０μＭ、Ｅｖｌタンパク質を４μＭになるように加え、３７℃で１時間反応させた。反応後、ＰＫ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．２％  ＳＤＳ、１．３ｍｇ／ｍｌ  プロテイネースＫ）、２μｌを加え、３７℃で１５分間反応させた。反応物を、０．８  ％のＨＧＴアガロースゲルで電気泳動し、ＳＹＢＲ  ＧｏｌｄによってＤＮＡを検出した。
また、一本鎖ＤＮＡ結合活性に関するゲルシフト法については（図１４〜図１８のｂ）、  反応液２０ μｌ（２０  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１  ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中に各化合物を終濃度１、５、１０、２０μＭ、ΦＸ１７４一本鎖ＤＮＡを２０μＭ、Ｅｖｌタンパク質を０．３μＭになるように加え、３７℃で１５分間反応させた。これを０．８  ％  ＨＧＴ  アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで検出した。【００５６】
９−１．アクラビシン（Ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）
アクラルビシンは、心臓毒性を大幅に低減させたアントラサイクリン系抗腫瘍剤である。トポイソメラーゼＩ／ＩＩの触媒活性阻害剤でもある。また、２０Ｓプロテアソームのキモトリプシン様活性を抑制することにより、ユビキチン化タンパク質の分解も阻害する。大動脈平滑筋細胞におけるＩＬ−１β誘導性ｉＮＯＳ産生を阻害することも知られている。臨床の場では抗腫瘍性抗生物質として（製品名：Ａｃｌａｃｉｎｏｎ）試用され、癌細胞のＤＮＡに結合して核酸合成、ＲＮＡ合成を強く阻害することで、胃癌、肺癌、乳癌、悪性リンパ腫、急性白血病の自覚的ならびに他覚的症状の寛解及び改善を行う目的で使用されている。今回、アクラルビシンが、Ｅｖｌタンパク質による一本鎖ＤＮＡのカテネーション活性を阻害することを見出した（図１４ａ）。また、アクラルビシンの及ぼすＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合活性への影響を、ゲルシフトアッセイ法を用いて調べた（図１４ｂ）。その結果、アクラルビシンは、Ｅｖｌタンパク質による環状一本鎖ＤＮＡへの結合活性を変化させないことがわかった。以上の解析から、アクラルビシンは、Ｅｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合活性を阻害することなく、一本鎖ＤＮＡカテネーション活性を阻害することが明らかになった。【００５７】
９−２．デカリニウム（Ｄｅｑｕａｌｉｎｉｕｍ）
デカリニウム（塩化デカリニウム）は、抗腫瘍及びＰＫＣ阻害薬である。ＵＶを照射すると、デカリニウムは、ＰＫＣα又はＰＫＣβに共有結合し、これらを不可逆的に阻害する。アパミン感受性低伝達性Ｃａ２＋活性化Ｋ＋チャネルに対する強力かつ選択的な非ペプチドブロッカーであり、神経伝達を遮断する。また、癌細胞のミトコンドリア内に選択的に蓄積し、エネルギー産生を阻害する。臨床の場では製品名ノードマリントローチとして使用されている。この薬剤は細菌のタンパク質に作用し口やのどの細菌を殺すことから、咽頭炎、扁桃炎、口内炎、抜歯創を含む口腔創傷の感染予防に用いられている。今回、デカリニウムが、Ｅｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性を阻害することを見出した（図１５ａ）。また、デカリニウムの及ぼすＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合活性への影響を、ゲルシフトアッセイ法を用いて調べた（図１５ｂ）。その結果、デカリニウムによりＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合様式が変化することがわかった。以上の解析から、デカリニウムは、Ｅｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合様式を変化させ、Ｅｖｌタンパク質の環状一本鎖ＤＮＡのカテネーション活性を阻害すると考えられる。【００５８】
９−３．ＤＩＤＳ（Ｄｉｓｏｄｉｕｍ  Ｓａｌｔ）
ＤＩＤＳは、神経芽腫細胞におけるＣｌ−取り込みを阻害するアニオン輸送阻害剤であり、抗潰瘍作用を示す。また、小胞体へのＡＴＰ輸送を阻害することも知られている。今回、ＤＩＤＳがＥｖｌタンパク質による一本鎖ＤＮＡカテネーション活性を阻害することを見出した（図１６ａ）。また、ＤＩＤＳの及ぼすＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合活性への影響を、ゲルシフトアッセイ法を用いて調べた（図１６ｂ）。その結果、ＤＩＤＳはＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合活性を阻害することがわかった。以上の解析から、ＤＩＤＳは、Ｅｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合活性を阻害することで、Ｅｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性を阻害すると考えられる。【００５９】
９−４．β−ルブロマイシン
β−ルブロマイシンは、ＨＩＶ−Ｉ逆転写酵素の阻害剤である。また、テロメラーゼの阻害剤としても知られている。今回、β−ルブロマイシンがＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性を阻害することを見出した（図１７ａ）。また、β−ルブロマイシンの及ぼすＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合活性への影響を、ゲルシフトアッセイ法を用いて調べた（図１７ｂ）。その結果、β−ルブロマイシンによりＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡへの結合様式が変化することがわかった。以上の解析から、β−ルブロマイシンは、Ｅｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合様式を変化させ、Ｅｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性を阻害すると考えられる。【００６０】
９−５．３−ＡＴＡ（３−ａｍｉｎｏ−９−ｔｈｉｏ（１０Ｈ）−ａｃｒｉｄｏｎｅ）
３−ＡＴＡは、ＣＤＫ４の阻害剤である。また、ｐ−１６変異腫瘍の増殖抑制を行うこともわかっている。今回、３−ＡＴＡがＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡカテネーション活性を阻害することを見出した（図１８ａ）。また、３−ＡＴＡの及ぼすＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合活性への影響を、ゲルシフトアッセイ法を用いて調べた（図１８ｂ）。その結果、３−ＡＴＡはＥｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合活性に変化を及ぼさないことがわかった。以上の解析から、３−ＡＴＡは、Ｅｖｌタンパク質の一本鎖ＤＮＡ結合活性を阻害することなく、Ｅｖｌの単鎖ＤＮＡカテネーション活性を阻害することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の組成物は、一本鎖ＤＮＡの切断する活性及び一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を結合する活性を併せ持つため、一本鎖ＤＮＡを遺伝子工学的に操作する上で、効果的なツールとして役立ち得る。また、本発明の組成物を用いると、一本鎖ＤＮＡの分子量マーカーなどを提供する事も可能であるため、本発明の組成物は、生物・医学分野における研究開発の発展に大いに貢献することが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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