(57)【要約】  ヒアルロン酸を含む試料中のヒアルロン酸をヒアルロン酸結合性タンパク質と反応させ、試料中のヒアルロン酸に結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値を測定する工程を含む、ヒアルロン酸の分子量の測定方法。
2008018519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸を含む試料中のヒアルロン酸をヒアルロン酸結合性タンパク質と反応させ、試料中のヒアルロン酸に結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値を測定する工程を少なくとも含む、ヒアルロン酸の分子量の測定方法。
【請求項２】
下記の工程（１）〜（３）を少なくとも含む、請求項１に記載の測定方法。
(1)  試料中のヒアルロン酸濃度を測定する工程、
(2)  試料中のヒアルロン酸をヒアルロン酸結合性タンパク質と反応させ、試料中のヒアルロン酸に結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値を測定する工程、及び、
(3)  濃度及び分子量既知の標準ヒアルロン酸試料から得られたヒアルロン酸の分子量とヒアルロン酸に結合するヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値との関係と、上記工程（1）で得られた試料中のヒアルロン酸濃度と、上記工程(2)で得られた試料中のヒアルロン酸に結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値から試料中のヒアルロン酸の分子量を求める工程。
【請求項３】
上記工程(2)が下記工程（ｉ）〜（ｉｖ）により構成される、請求項２に記載の測定方法。
(i)  ヒアルロン酸結合性タンパク質を固相に固定する工程、
(ii)  固相に固定したヒアルロン酸結合性タンパク質に試料中のヒアルロン酸を反応させる工程、
(iii)  固相に固定したヒアルロン酸結合性タンパク質に結合したヒアルロン酸に、標識したヒアルロン酸結合性タンパク質をさらに反応させる工程、及び
(iv)  工程(iii)においてヒアルロン酸に結合した標識ヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値を測定する工程。
【請求項４】
工程(iii)において使用する標識したヒアルロン酸結合性タンパク質の標識物質が、ビオチン、アビジン、酵素、アイソトープ、蛍光色素、及び化学発光物質からなる群から選択される、請求項３に記載の測定方法。
【請求項５】
工程(iii)において使用する標識したヒアルロン酸結合性タンパク質の標識物質が、ビオチン又はアビジンである、請求項３又は４に記載の測定方法。
【請求項６】
工程(３)において使用する、濃度及び分子量既知の標準ヒアルロン酸試料から得られたヒアルロン酸の分子量とヒアルロン酸に結合するヒアルロン酸結合性タンパク質又はその量を反映する値の量との関係が、濃度及び分子量既知のヒアルロン酸標準液を試料として工程(2)を行うことにより得られた標準曲線で表されることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項７】
工程（３）において、工程（１）で得られた試料中のヒアルロン酸濃度は、試料を希釈するための指標として、又は、当該濃度における、標準ヒアルロン酸試料のヒアルロン酸に結合するヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値の算出に用いられることを特徴とする、請求項２〜６のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項８】
ヒアルロン酸にヒアルロン酸結合性タンパク質を反応させる際に、タンパク質変性剤、酸性多糖、及び界面活性剤から選択される添加剤を共存させ、その添加剤の量を調節することによりヒアルロン酸結合性タンパク質とヒアルロン酸とが結合する量を調整することを特徴とする、請求項３〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項９】
工程(iv)において測定するヒアルロン酸に結合したヒアルロン酸結合性タンパク質の量又はその量を反映する値を、工程(i)における固定するヒアルロン酸結合性タンパク質の量、あるいは工程(iii)における反応させるヒアルロン酸結合性タンパク質の量を変化させることにより調整することを特徴とする、請求項３〜８のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１０】
添加剤が、グアニジン塩酸である、請求項８に記載の測定方法。
【請求項１１】
固相化するヒアルロン酸結合性タンパク質の量が、固相化に使用するヒアルロン酸結合性タンパク質溶液の濃度として、3〜30000 ng/mLである、請求項３〜１０のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１２】
工程(iii)において反応させる標識ヒアルロン酸結合性タンパク質がビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質であり、ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質溶液の濃度が10〜30000 ng/mLである、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の測定方法。
【請求項１３】
ヒアルロン酸標準液及び／又は試料中のグアニジン塩酸の濃度が終濃度で0〜3.6 Mである、請求項１０に記載の測定方法。
【請求項１４】
ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質溶液中のグアニジン塩酸の濃度が終濃度で0〜1.6 Mである、請求項１０に記載の測定方法。
【請求項１５】
ヒアルロン酸結合性タンパク質を少なくとも含む、ヒアルロン酸の分子量の測定用のキット。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の測定方法を用いることを特徴とする、請求項１５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸の分子量の測定方法に関する。より詳細には、微量の試料中のヒアルロン酸の分子量を、多数の試料について短時間で測定することができるヒアルロン酸の分子量の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において用いる略号は下記の意味を有する。
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＳ−Ｃ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＨＡ−ＢＳＡ：ＨＡ−ＢＳＡコンジュゲート
ＨＡＢＰ：ＨＡ結合性タンパク質
ビオチン−ＨＡＢＰ：ビオチン標識ヒアルロン酸結合性タンパク質
ＨＲＰ−アビジン：ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
ＯＰＤ錠：Ｏ−フェニレンジアミン錠
ＡＢＴＳ錠：２，２'−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−０−スルホン酸）
ＴＭＢ（＋）：Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルベンチジン（＋）
ＴＭＢ ＢＬＵＥ：Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルベンチジンブルー
ＰＢＳ：食塩添加リン酸ナトリウム緩衝液
ＧＰＣ：ゲル浸透クロマトグラフィー
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＴＣＡ：トリクロロ酢酸
ＥＤＴＡ:エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ: Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid 
ＴＬＣＫ: Nα-p-Tosyl-lysine chloromethyl ketone 
ＴＰＣＫ: N-p-Tosyl-phenylalanine chloromethyl ketone【０００３】
ＨＡはＮ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸がβ１→４結合した２糖単位からなる自然界に存在する直鎖高分子多糖である。近年、ＨＡの分子量特異的な生理活性や、特定の分子量のＨＡの生体内における存在が疾患の存在を示唆し得ることなどが指摘されており、ＨＡの分子量の測定方法は医薬、医療などの分野において重要である。【０００４】
ＨＡの分子量測定は通常、極限粘度測定やＧＰＣを利用する方法により行われている。これらの方法は、ＨＡの分子量が大きくなるに従って同一濃度の水溶液の粘度が高くなること、分子量が大きいＨＡほど網目構造を有する担体中をより早く通過することをそれぞれ利用している。【０００５】
しかしながら、極限粘度測定を利用した測定方法では、測定を実施するためには約1mg以上のＨＡが必要である。また、汎用の自動装置を用いた場合でも、同時測定できる試料数は５前後であり、１回の測定毎に、粘度管の乾燥等の準備が必要となる。さらに、他の類似のグリコサミノグリカンも同様な粘度を示すため、これらが共存する場合にはＨＡに特異的な測定ができない。またその他の共存物質も溶液の粘度に影響を及ぼすため、原則的には精製した純品の水溶液等でなければ測定できない。【０００６】
またＧＰＣを利用した測定方法では、測定を実施するためには、約10μg以上のＨＡが必要である。また、測定系の安定化のために最短でも１時間が必要であり、分子量標準試料を含め各々の試料に対して独立した測定サイクルが必要となる。標準試料としては通常５種類前後を用い、原則的には分析バッチごとに測定が必要となる。さらに、１回の測定サイクルの所要時間は、最短で30分間であり、被験試料１つでも４時間以上、10試料では９時間以上が必要となる。また、この測定方法においてクロマトグラムを検出する汎用的な方法としては、紫外部吸収を利用する方法が現時点で最も高感度であるが、紫外部吸収を利用する場合、他の類似のグリコサミノグリカンも同様に検出される。従って、これらが共存する場合、ＨＡのクロマトグラムと重なり、ＨＡに特異的な測定ができない。同様に紫外部に吸収を持つような不純物が含まれる場合もＨＡのクロマトグラムに重なり、目的とする測定ができない。多くの生体試料の場合、タンパク質・核酸・二重結合を有する脂質などが共存する場合が殆どであるが、これらはいずれも紫外部に吸収を示し、試料中のＨＡを本方法により測定する場合は、これらの不純物を除去する前処理操作が必要となる。【０００７】
上記の通り、現在使用されているＨＡの分子量の測定方法は、少なくとも10μgから１mg程度の試料を必要とし、また時間がかかり、操作も煩雑であり、同時に測定できる試料数も限定される。【０００８】
一方、ＨＡに結合するタンパク質を利用したＨＡの測定方法は提案されているが（特許文献１及び２）、いずれも定量方法であり、直接分子量を測定する方法は知られていない。
【特許文献１】特公平６−４１９５２号公報
【特許文献２】特許第２６９８５６３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、微量の試料中のＨＡの分子量を、多数の試料について短時間で測定することができ、類似物質及びその他の物質が共存する試料であってもＨＡの分子量を測定することができるＨＡの分子量の測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ＨＡに結合するタンパク質（ＨＡ結合性タンパク質（ＨＡＢＰ））のＨＡに対する反応性が、ＨＡの分子量に比例して一定方向に変化し得ることを見出し、ＨＡの分子量測定に利用できることを確認し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち本発明は、ＨＡを含む試料中のＨＡをＨＡＢＰと反応させ、試料中のＨＡに結合したＨＡＢＰの量又はその量を反映する値を測定する工程を少なくとも含む、ＨＡの分子量の測定方法を提供する。
上記ＨＡＢＰのＨＡに対する反応性は、ＨＡの分子量に依存して一定方向に変化し、従ってＨＡの分子量によりＨＡに結合するＨＡＢＰの量が変化する。従って、ＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値を測定することにより、ＨＡの分子量を測定することができる。【００１２】
上記本発明測定方法は、例えば、
(1)  試料中のＨＡ濃度を測定する工程、
(2)  試料中のＨＡをＨＡＢＰと反応させ、試料中のＨＡに結合したＨＡＢＰの量又はその量を反映する値を測定する工程、及び
(3)  濃度及び分子量既知の標準ＨＡ試料から得られたＨＡの分子量とＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値との関係に基づいて、上記工程（1）で得られた試料中のヒアルロン酸濃度と、上記工程(2)で得られた試料中のＨＡに結合したＨＡＢＰの量又はその量を反映する値から試料中のＨＡの分子量を求める工程
により行うことができる。【００１３】
上記工程(2)は、例えば、
(i)  ＨＡＢＰを固相に固定する工程、
(ii)  固相に固定したＨＡＢＰに試料中のＨＡを反応させる工程、
(iii)  固相に固定したＨＡＢＰに結合したＨＡに、標識したＨＡＢＰをさらに反応させる工程、及び
(iv)  工程(iii)においてＨＡに結合した標識ＨＡＢＰの量又はその量を反映する値を測定する工程、から構成される工程が例示できる。【００１４】
上記工程(iii)において使用する標識したＨＡＢＰの標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、酵素、アイソトープ、蛍光色素、化学発光物質等が使用でき、ビオチン及びアビジンが好ましい。【００１５】
上記工程(3)において使用する、濃度及び分子量既知の標準ＨＡ試料から得られたＨＡの分子量とＨＡに結合するＨＡＢＰ又はその量を反映する値の量との関係は、例えば、濃度及び分子量既知のＨＡ標準液を試料として工程(2)を行い、標準曲線として得ることができる。【００１６】
上記工程（3）において、工程（1）で得られた試料中のＨＡ濃度は、試料を希釈するための指標として、又は、当該濃度における、標準ＨＡ試料のＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値の算出に用いることができる。【００１７】
上記標識ＨＡＢＰのＨＡに対する反応性、すなわちＨＡに結合する量は、ＨＡにＨＡＢＰを結合させる際に、タンパク質変性剤、酸性多糖、界面活性剤などの添加剤を存在させ、その量を調節することにより、ＨＡ分子量依存的な反応性変化という特性を維持しながら調整できる。また、工程(iv)において測定するＨＡに結合したＨＡＢＰの量又はその量を反映する値は、工程(i)において固定するＨＡＢＰの量、あるいは工程(iii)において反応させるＨＡＢＰの量を変化させることによっても、ＨＡ分子量依存的な反応性変化という特性を維持しながら調整できる。【００１８】
従って、工程(iv)において、例えば標識されたＨＡＢＰとそれに関連付けられた発色物質を使用して吸光度によりＨＡＢＰの量を測定する場合、適当な種類及び量の上記添加剤を使用すること及び／又は各工程で使用するＨＡＢＰの量を調整することにより、測定すべき吸光度を実際の測定に適した範囲となるように調整することができる。
上記添加剤としては、グアニジン塩酸、尿素などのタンパク質変性剤、ＣＳ−Ｃなどの酸性多糖類、ＳＤＳなどの界面活性剤などが使用できる。【００１９】
具体的には、固相化するＨＡＢＰの量は、固相化に使用するＨＡＢＰ溶液の濃度として、例えば、3 ng/mL以上、好ましくは10 ng/mL以上で、通常30000 ng/mL以下、好ましくは10000 ng/mL以下、より好ましくは1000 ng/mL以下であり、工程(iii)において反応させる標識ＨＡＢＰの量としては、標識物質としてビオチンを使用する場合、反応に使用するビオチン−ＨＡＢＰ溶液の濃度として、例えば10 ng/mL以上、好ましくは100 ng/mL以上、より好ましくは200 ng/mL以上で、通常30000 ng/mL以下、好ましくは3200 ng/mL以下である。添加剤については、グアニジン塩酸を使用する場合、上記ＨＡ標準液中及び／又は試料のグアニジン塩酸の濃度としては、終濃度で、例えば0〜3.6 Mであり、好ましくは0〜2.4 Mであり、ビオチン−ＨＡＢＰ溶液中のグアニジン塩酸の濃度としては、終濃度で、例えば0〜1.6 Mであり、好ましくは0〜1.2 M程度である。【００２０】
また本発明の別の形態として、ＨＡＢＰを含む、ＨＡの分子量の測定用のキットが提供される。本発明のキットは、上記本発明測定方法を実施するために使用することができる。
本発明キットは、ＨＡＢＰの他、上記添加剤、上記添加剤を含むバッファー、分子量既知のＨＡ標準試料などを含むものとしてもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、微量の試料中のＨＡの分子量を、多数の試料について短時間で測定することができるＨＡの分子量の測定方法が提供され、医療における診断、医薬の開発、その他の生化学的研究などにおいて極めて有用である。該方法によれば、従来のＨＡの分子量の測定方法よりも微量の試料中のＨＡの分子量を測定することができ、多数の試料について短時間で測定することができるので、医療における診断及び医薬の開発において特に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＨＡ試料の濃度測定における各種分子量のＨＡの反応曲線を示す図である。
【図２】緩衝液条件を変えてＨＡ試料濃度測定を実施した場合の各種分子量のＨＡの反応曲線を示す図である。
【図３】緩衝液条件を変えてＨＡ試料濃度測定を実施した場合の各種分子量のＨＡの反応曲線を示す図である。
【図４】発色物質を変えて標識ＨＡＢＰとの反応を行った結果を示す図である。
【図５】ビオチン−ＨＡＢＰの反応性に対するグアニジン塩酸の条件についての試験の結果を示す図である。
【図６】ビオチン−ＨＡＢＰの反応性に対する種々の添加剤の影響についての試験の結果を示す図である。
【図７】ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度の適当な範囲について試験するために行った試験の結果を示す図である。
【図８】ＨＡ標準溶液における添加剤使用についての試験の結果を示す図である。
【図９】ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液条件についての試験の結果を示す図である。
【図１０】ＨＡＢＰ固相化時のＨＡＢＰ濃度についての試験の結果を示す図である。
【図１１】ＨＡＢＰ固相化時のＨＡＢＰ濃度についての試験の結果を示す図である。
【図１２】各種条件の組合せについての試験の結果を示す図である。
【図１３】試料中のＨＡの濃度を測定するための、標準液の反応曲線（Ａ）及びそれから得られたＨＡの濃度を決定するための標準曲線（Ｂ）を示す図である。
【図１４】試料中のＨＡの分子量を測定するための、標準液の反応曲線（Ａ）及びそれから得られたＨＡの分子量を決定するための標準曲線（Ｂ）を示す図である。
【図１５】試料中のＨＡの濃度を測定するための、標準液の反応曲線（Ａ）及びそれから得られたＨＡの濃度を決定するための標準曲線（Ｂ）を近似式とともに示す図である。
【図１６】試料中のＨＡの分子量を測定するための標準液の反応曲線（Ａ）及びそれらを対数関数により表した近似式とともに示す図（Ｂ）である。
【図１７】試料中のＨＡの分子量を測定するための標準曲線を近似式とともに示す図である。
【図１８】測定工程(1)への前処理用試薬の影響がないことを確認する試験の結果を示す図である。
【図１９】測定工程(2)への前処理用試薬の影響がないことを確認する試験の結果を示す図である。
【図２０】測定工程(2)への前処理用試薬の影響がないことを確認する試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明のＨＡの分子量の測定方法は、ＨＡを含む試料中のＨＡをＨＡＢＰと反応させ、試料中のＨＡに結合したＨＡＢＰの量又はその量を反映する値を測定する工程を含むことを特徴とする。
上記工程において、ＨＡＢＰはＨＡに対する反応性がＨＡの分子量に依存して一定方向に変化し、従ってＨＡの分子量によりＨＡに結合するＨＡＢＰの量が変化する。これによりＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値を測定することによって、ＨＡの分子量を測定することができるものである。【００２４】
本発明の測定方法によれば、ＨＡを含む試料が他の物質、例えばタンパク質、核酸、脂質、その他の無機化合物などを含んでいてもそれらに影響されることなくＨＡの分子量を測定することができる。従ってＨＡを含む試料は、必ずしもＨＡについて精製されている必要はなく、生体試料などのＨＡ以外の物質を含む試料であってもそのまま本発明の測定方法に使用することができる。【００２５】
本発明の測定方法の測定対象となる被検体として具体的には、ＨＡ溶液、細胞培養液、器官培養液、体液、組織等が例示される。体液としては、血液、血清、血漿、尿、唾液、関節液、胸水、腹水、骨髄液、脊髄液、硝子体液等が例示され、組織としては軟骨、滑膜、皮膚、結腸などが例示されるが、細胞培養液、器官培養液、関節液、軟骨、滑膜、皮膚等が被検体として特に好ましい。【００２６】
本発明測定方法を、血清、尿、関節液、軟骨・滑膜・皮膚等の組織、培養細胞の培養液等の各種生体成分中に存在するＨＡの分子量の測定に適用する場合には、必要に応じて被検体に前処理を適用することができる。前処理方法としては、尿素、グアニジン塩酸、塩化ナトリウム等の塩による抽出、プロナーゼ、アクチナーゼ等のタンパク質分解酵素によるタンパク分解処理、ＴＣＡ等のタンパク質変性剤によるタンパク質の除去と中和、脱塩カラムあるいは透析等による脱塩、イオン交換カラム等によるイオン交換分離、エタノール沈殿、セチルピリジニウムクロリド(CPC)やセチルトリメチルアンモニウムブロミド(CETAB)等の4級アンモニウム塩による沈殿等の方法を単独で、あるいは組み合わせて使用することができる。これらの前処理については、適用する前処理によってＨＡ分子量が低下せず、かつ前処理後の溶媒組成が工程(1)および工程(2)の反応に影響を与えないことを、予備実験によって確認する必要がある。またこれらの条件を満足する方法であれば、前処理の方法は上記の方法に限定されるものではない。【００２７】
上記各種前処理方法のうち、プロテアーゼ処理による方法が、簡便性の点で好ましい。本方法は、更に詳細には下記1) 2) 4) あるいは 1) 2) 3) 4)で示される前処理工程を順次行なうことで実施することが出来る。
１）ＨＡ分子量が低下しない条件下で、プロテアーゼ処理による共存タンパク質を分解する工程。
２）ＨＡ分子量が低下しない条件下で、1) の処理液にタンパク質沈殿剤、変性剤、あるいは特異的阻害剤によりプロテアーゼを失活させる工程。
３）ＨＡ分子量が低下しない条件下で、2) の各試薬を中和あるいは除去する工程。
４）2) あるいは3) 液に対して、分子量測定工程１および工程2を実施するために必要な特定の成分を加える調整工程。【００２８】
上記のプロテアーゼ処理による方法における各工程の組み合わせとしては、例えば、表３５に記載した各種組み合わせが使用できる。【００２９】
上記前処理工程の組み合わせにより最終的に得られる溶媒（ＨＡ以外の物質）の組成は、実施した処理条件により異なるが、以下に示す２つの条件を満たすことが予め確認されている限りにおいて特に限定されるものではない。
１．分子量測定の工程１においてＨＡ分子量に影響されず同一の反応性を示すこと。
２．分子量測定の工程２においてＨＡ分子量の増加とともに一定方向の反応性の変化を示すこと。【００３０】
上記前処理工程1) においては、例えば下記に示すような各種プロテアーゼが使用できる。
（１）菌体由来のプロテアーゼ
(例：Pronase E、Proteinase K (SIGMA社)、Actinase E、Actinase AF(科研製薬)、Dispase（ロシュダイアグノスティック社）)
（２）菌体由来のコラゲナーゼ
（例：Collagenase A, Collagenase P（ロシュダイアグノスティック社））
（３）脊椎動物由来のCystein Proteinase
（例：Papain）
（４）脊椎動物由来の Serine Proteinase
（例：Chimotrypsin, Trypsin）【００３１】
上記前処理工程2) においては、以下に示す各種試薬が沈殿剤／変性剤として使用できる。
ａ）ＴＣＡ、過塩素酸などの徐タンパク試薬
ｂ）pH2.0以下の酸性緩衝液
ｃ）グアニジン塩酸、尿素、硫酸アンモニウムなどのタンパク変性剤
本工程においては、必要に応じて、変性・沈殿したプロテアーゼを除去する操作を加えることができる。具体的には、以下に示す操作が利用できる。
ａ）遠心分離
ｂ）フィルターろ過【００３２】
同様に上記前処理工程2) においては、例えば以下に示す各種試薬が特異的阻害剤として使用できる。
ａ）キレート剤（例：EDTA, EGTA）
ｂ）還元剤（例：ヨード酢酸）
ｃ）Serin Protease阻害剤（例：TPCK、TLCK、大豆トリプシンインヒビター）
ｄ）市販プロテアーゼインヒビターカクテル【００３３】
上記前処理工程3) で中和処理を実施する場合は、以下に示す方法が利用できる。
１）Tris、Bis-Tris, MOPS等のGoodの緩衝液成分で作成した塩基性溶液
２）ホウ酸Na, リン酸Na糖の無機塩で作成した塩基性溶液【００３４】
上記前処理工程3) で除去処理を実施する場合は、以下に示す方法が利用できる。
１）脱塩用カラムを用いた脱塩
２）透析膜・透析カセット等を用いた透析
また、必要に応じて試料を濃縮するために、下記方法が使用できる。
１）遠心エバポレータ
２）凍結乾燥【００３５】
本発明の測定方法が適用できるＨＡの分子量は、ＨＡに対するＨＡＢＰの反応性がＨＡの分子量に依存して一定方向に変化する特性が維持される限り特に限定されないが、例えば３ｋＤａ以上、好ましくは１０ｋＤａ以上、より好ましくは２０ｋＤａ以上で、例えば３０００ｋＤａ以下、好ましくは１０００ｋＤａ以下の分子量範囲のＨＡに適用できる。【００３６】
従って、種々の由来の天然ＨＡ、それらをアルカリ処理、酵素処理などにより低分子化したＨＡなどが本発明の測定方法の測定対象となり得る。またＨＡの塩も本発明の測定方法の測定対象となり得る。【００３７】
本発明の測定方法に使用する「ＨＡＢＰ」とは、ＨＡに結合する性質を有するタンパク質を意味する。具体的には、ＨＡ結合性のプロテオグリカン（例えば、軟骨プロテオグリカン、軟骨プロテオグリカンのトリプシン消化物、軟骨プロテオグリカンのコンドロイチナーゼＡ、Ｂ、Ｃ消化物（特許第２７３２７１８号）など）、プロテオグリカンのコアタンパク質（例えば、軟骨プロテオグリカンのコアタンパク質など）、リンクプロテイン、ヒアルロネクチン、ＣＤ４４、これらのタンパク質のＨＡ結合部位を含む部分タンパク質、あるいは該部分タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質、ＨＡを認識する抗体 (特開平９−１２６００号公報)などが挙げられる。これらは天然物から分離精製したものであってもよく、遺伝子組換え技術により調製したものでもよい。特に軟骨プロテオグリカンのトリプシン消化物、さらにはウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物が好ましい。また、当該トリプシン消化物中の各成分を分離精製して使用することもできる。なお、ウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物については、「ＨＡバインディングプロテイン」（ウシ鼻軟骨のプロテオグリカンのトリプシン消化物であって、(1)AggrecanのＨＡ結合部位(ＨＡＢＲ)、(2)AggrecanのＨＡ結合部位(ＨＡＢＲ)にKS鎖含有ドメインが残存したもの、(3)リンクプロテインを含む混合物）として生化学工業株式会社から販売されており、好ましく使用できる。【００３８】
上記本発明の測定方法は、下記の工程、
(1)  試料中のＨＡ濃度を測定する工程、
(2)  試料中のＨＡをＨＡＢＰと反応させ、試料中のＨＡに結合したＨＡＢＰの量又はその量を反映する値を測定する工程、及び
(3)  濃度及び分子量既知の標準ＨＡ試料から得られたＨＡの分子量とＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値との関係と、上記工程（１）で得られた試料中のＨＡ濃度と、上記工程(2)で得られた試料中のＨＡに結合したＨＡＢＰの量又はその量を反映する値から試料中のＨＡの分子量を求める工程
により好ましく行うことができる。【００３９】
上記工程(1)は、ＨＡ分子量に依存しない定量測定によって試料中のＨＡ濃度を測定する工程である。本工程を実施する方法は、試料中のＨＡ濃度を測定し得る方法であれば特に限定されないが、例えば、カルバゾール硫酸法等の汎用的な比色法、ＨＡを特異的に分解する酵素とHPLCあるいはキャピラリー電気泳動を組み合わせた定量方法、ＨＡを固定化した固相とＨＡＢＰとを利用した競合的阻害法などが挙げられる。これらのうち、ＨＡを固定化した固相とＨＡＢＰとを利用した競合的阻害法が、多検体の同時測定が可能であること、測定感度がよいことから最も好ましい。【００４０】
ＨＡを固定化した固相とＨＡＢＰとを利用した競合的阻害法は、公知の方法により行うことができ、例えば特開昭６３−１５０６６９号公報、特開２０００−９７９４０号公報に記載された方法などにより行うことができる。使用するＨＡＢＰ、固相、標識などは下記に説明する工程(2)で使用されるものと同様のものを使用することができる。
ＨＡを固定化した固相とＨＡＢＰとを利用した競合的阻害法は、例えば以下のような具体的手順により行うことができるが、これに限定されるものではない。【００４１】
1)  ＢＳＡに共有結合させたＨＡをELISAプレートの各ウェルに固相化する。
2)  ＢＳＡを用いて各ウェルをブロッキングする。
3)  ＨＡ標準試料（特定の分子量１種のみ、濃度ポイントは６点前後）及び適時希釈した被検試料を各ウェルに添加する。
4)  被検試料にビオチン−ＨＡＢＰ溶液を添加し、所定時間反応させる。
5)  未反応ＨＡ及びビオチン−ＨＡＢＰを除去した後、ＨＲＰ−アビジン溶液を添加し、所定時間反応させる。
6)  発色基質溶液（例えばオルトフェニレンジアミン）を添加し、所定時間反応させる。
7)  停止液を添加し、マイクロプレート吸光度計を用いて所定の測定波長にて吸光度を測定する。
8)  標準試料について得られた吸光度から標準曲線を作成し、これと被検試料について得られた吸光度から被検試料中のＨＡ濃度を決定する。【００４２】
上記工程(2)は、ＨＡの分子量に依存して変化するＨＡＢＰのＨＡに対する反応性を、ＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値として測定する工程である。【００４３】
本工程において、ＨＡに結合するＨＡＢＰの量を測定する方法は上記本工程の目的が達成される限り限定されないが、ＨＡＢＰを固定化した固相と、任意の標識物質で標識したＨＡＢＰとを用いたサンドイッチ法で行うことが好ましく、例えば、
(i)  ＨＡＢＰを固相に固定する工程、
(ii)  固相に固定したＨＡＢＰに試料中のＨＡを反応させる工程、
(iii)  固相に固定したＨＡＢＰに結合したＨＡに、さらに標識したＨＡＢＰを反応させる工程、及び
(iv)  工程(iii)においてＨＡに結合した標識ＨＡＢＰの量又はその量を反映する値を測定する工程により行うことができる。【００４４】
上記サンドイッチ法によるＨＡＢＰの測定は公知の方法に従って行うことができ、例えば特公平６−４１９５２号公報に記載されたＨＡの測定方法におけるＨＡＢＰの測定を参照することができる。【００４５】
上記工程(i)において使用される固相は、ＨＡＢＰを固定できる水不溶性の固相であれば、形状、材料などは限定されないが、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミドなどの材料からなるプレート（例えばマイクロプレートのウェル）、チューブ、ビーズ、メンブレン、ゲル、ラテックスなどが挙げられる。ポリスチレン製のマイクロプレートのウェルを好ましく使用できる。【００４６】
これらの固相にＨＡＢＰを固定する方法としては、物理的吸着法、共有結合法、包括法等固定化酵素の調製法として一般的な方法（固定化酵素、1975年、講談社発行、第９〜75頁参照）を応用することができる。これらの中でも、物理的吸着法が、操作が簡便かつ頻用されていることから好ましい。【００４７】
物理的吸着法として具体的には、ＨＡＢＰをｐＨ６〜９程度の緩衝液(例えばリン酸緩衝液、ＰＢＳ、炭酸緩衝液等)に溶解して固相に加え、４℃で一晩静置して固着させる方法が挙げられ、好ましく使用することができる。【００４８】
なお、この後にブロッキング物質を固相に添加して、ＨＡＢＰが固着していない部分を被覆しておくことが好ましい。このようなブロッキング物質としては、ＢＳＡなどの血清アルブミン、カゼイン、スキムミルク、ゼラチン等が挙げられ、またブロッキング物質として市販されているものを使用することもできる。【００４９】
上記のような方法により、ＨＡＢＰが固定された固相を製造することができる。固相の製造は、試験毎に実施しても良く、あるいは保存可能な乾燥プレートを調製して用いることもできる。【００５０】
上記工程(ii)は、上記のようにして製造されたＨＡＢＰが固定された固相に上記のような測定対象となる被検体を接触させることにより行う。具体的には、被検体をＨＡＢＰが固定された固相に加え、例えば０〜４５℃、好ましくは約３７℃で、３０分〜１時間インキュベートすることにより行うことができる。【００５１】
反応後、固相の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。この洗浄は、固相に固着したＨＡＢＰ及びこれに結合したＨＡが遊離しない条件で行う。洗浄液としては、例えば、トゥイーン(Tween)系界面活性剤等の非イオン性界面活性剤を添加した緩衝液(例えばＰＢＳ、トリス塩酸緩衝液等)を用いることが好ましい。【００５２】
上記工程(iii)は、工程(ii)と同様の方法、反応条件により行うことができる。
上記工程(iii)において使用する標識したＨＡＢＰの標識物質としては、例えば、ビオチン、アビジン、酵素、アイソトープ、蛍光色素、化学発光物質等が使用でき、取り扱いやすさや標識対象物質の量が正確に反映されることなどから、ビオチン及びアビジンが好ましい。また、ＨＡＢＰの抗体を作製し、これを上記のような標識物質で標識し、これをＨＡＢＰと反応させることによりＨＡＢＰを検出することもできる。【００５３】
上記工程(iii)の反応後の固相についても、上記工程(ii)と同様に固相の表面を洗浄液で洗浄することが好ましい。【００５４】
上記工程(iv)は、用いた標識により公知の方法に従って行うことができる。例えば、標識物質にビオチンを使用した場合には、アビジンを結合させた酵素（例えばペルオキシダーゼ等）を添加してビオチンとアビジンとを結合させ、次いでストレプトアビジン等を結合させた酵素の基質や発色基質等を加え、酵素反応による生成物の発色の度合いを吸光度の変化で測定する方法等を挙げることができる。また、蛍光物質や化学発光物質を使用する場合には、反応後の溶液の蛍光や発光を測定する方法等が挙げられる。【００５５】
より具体的には、標識物質としてビオチンを使用した場合には、上記工程(iii)の反応後の固相にＨＲＰ−アビジン溶液を加え、例えば37℃で１時間反応させた後洗浄し、Ｏ−フェニレンジアミン溶液を加え、例えば遮光して室温にて30分間反応させた後、反応溶液の吸光度を吸収波長492nm、対照波長630nmで測定することにより行うことができる。【００５６】
さらに、上記ＨＡＢＰのＨＡに対する反応性、すなわち上記工程(iii)において結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値は、工程(iii)の反応時に、タンパク質変性剤、酸性多糖、界面活性剤などの添加剤を存在させ、その量を調節することにより、ＨＡ分子量依存的に反応性が変化するという特性を維持しながら調整できる。
上記添加剤としては、グアニジン塩酸、尿素などのタンパク質変性剤、ＣＳ−Ｃなどの酸性多糖類、ＳＤＳなどの界面活性剤などが使用でき、グアニジン塩酸が特に好ましい。【００５７】
添加剤の量については、グアニジン塩酸の場合、良好なＨＡ分子量及び濃度依存的な反応性を得るという観点から、上記ＨＡ標準液及び／又は試料中のグアニジン塩酸の濃度としては、終濃度で、例えば0〜3.6 Mであり、好ましくは0〜2.4 Mであり、ビオチン−ＨＡＢＰ溶液中のグアニジン塩酸の濃度としては、終濃度で、例えば0〜1.6 Mであり、好ましくは0〜1.2 M程度であるが（後記実施例参照）、これらに限定されるものではない。【００５８】
また、工程(iv)において測定するＨＡに結合したＨＡＢＰの量又はその量を反映する値は、工程(i)において固定するＨＡＢＰの量、あるいは工程(iii)において反応させるＨＡＢＰの量を変化させることによっても、ＨＡ分子量依存的に反応性が変化するという特性を維持しながら調整できる。従って、これらの諸条件を適切に設定することにより、測定に適した反応性及び反応量を得ることが好ましい。また、目的とする分子量範囲において分子量が大きいほど反応性が高くなるように反応性を制御した方法を用いるのが好ましい。【００５９】
工程(i)において固定するＨＡＢＰの具体的な量としては、良好なＨＡ分子量及び濃度依存的な反応性を得るという観点から、固相化に使用するＨＡＢＰ溶液の濃度として、例えば、3 ng/mL以上、好ましくは10 ng/mL以上で、通常30000 ng/mL以下、好ましくは10000 ng/mL以下、より好ましくは1000 ng/mL以下であるが（後記実施例参照）、これらに限定されるものではない。【００６０】
工程(iii)において反応させる標識ＨＡＢＰの具体的な量としては、良好なＨＡ分子量及び濃度依存的な反応性を得るという観点から、標識物質としてビオチンを使用する場合、反応に使用するビオチン−ＨＡＢＰ溶液の濃度として、例えば10 ng/mL以上、好ましくは100 ng/mL以上、より好ましくは200 ng/mL以上で、通常30000 ng/mL以下、好ましくは3200 ng/mL以下であるが（後記実施例参照）、これらに限定されるものではない。【００６１】
上記工程(3)は、濃度及び分子量既知の標準ＨＡ試料から得られたＨＡの分子量とＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値との関係と、上記工程（1）で得られた試料中のＨＡ濃度と、上記工程(2)で得られた試料中のＨＡに結合したＨＡＢＰの量から試料中のＨＡの分子量を求める工程である。【００６２】
上記工程(3)において使用する、濃度及び分子量既知の標準ＨＡ試料から得られたＨＡの分子量とＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値との関係は、濃度及び分子量既知のＨＡ標準液を試料として工程(2)を行い、標準曲線として得ることができる。【００６３】
すなわち、濃度及び分子量既知の複数の標準ＨＡ試料を使用して工程(2)を行い、それぞれの試料による反応においてＨＡに結合した標識ＨＡＢＰの量を反映する値として、例えば、標識を利用して行われる発色反応で得られる反応液の吸光度を測定し、それらを各標準ＨＡ試料の分子量に対してプロットすることにより標準曲線を得る。そして得られた標準曲線に工程(2)の測定で被験試料について得られた値を当てはめることにより被験試料中のＨＡの分子量を決定する。【００６４】
標準ＨＡ試料について測定を行う際の濃度としては、工程(1)で測定した被検試料のＨＡ濃度を指標とし、被検試料そのままの濃度あるいは被検試料を適当に希釈して得られる濃度を使用して、工程(2)の測定と標準曲線作成のための測定を同一のＨＡ濃度で行い、工程(2)の測定で得られた値をそのまま標準曲線に当てはめることで求めることができる。この場合は、工程(1)と(2)を段階的に実施し、初めに被験試料のＨＡ濃度を求めておく必要がある。（後記実施例１６参照）。【００６５】
あるいは、標準試料及び被検試料の両方について同時に工程(1)及び(2)を行っても、被験試料のＨＡ濃度及び被験試料についてのＨＡに結合したＨＡＢＰ又はその量を反映する値が、各工程で標準試料について設定した測定条件下で測定可能であれば、工程(2)において求めた各分子量の標準試料の反応曲線を元に、任意の濃度の標準曲線を換算で求め、これを用いて被験試料のＨＡ分子量を求めることができる（後記実施例１７参照）。【００６６】
更に、工程(1)の試料中のＨＡの濃度の測定のための標準曲線と、ＨＡの分子量とＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値との関係を表す標準曲線の再現性が十分に保証されている場合は、これらを予め用意しておけば、被検試料のみについて工程(1)及び(2)を行い、得られた値を使用して工程(3)を行うことにより被検試料中のＨＡの分子量を決定でき、微量の被検試料から短時間で多数の被検試料についてＨＡの分子量を容易に決定することができる。【００６７】
標準曲線は、標準ＨＡ試料について得られた値から、分子量を、ＨＡに結合した標識ＨＡＢＰの量を反映する値、例えば吸光度あるいはその対数値、及び場合によりＨＡ濃度あるいはその対数値の一次、二次あるいはそれ以上の高次の関数として表し、試料について得られた吸光度あるいはその対数値などの値を該関数に当てはめることにより試料ＨＡの分子量を求めることができる。いずれの場合も標準曲線については、被検試料に予測されるＨＡ濃度、分子量に対応するように複数の標準曲線を用意しておくことにより、より迅速で正確な測定が可能となる。【００６８】
以上より、工程(2)及び(3)は、工程(3)で使用するＨＡの分子量とＨＡに結合するＨＡＢＰの量又はその量を反映する値との関係の取得を含めて、例えば、下記のような手順により行うことができる。
9)  ＨＡＢＰをELISAプレートの各ウェルに固相化する。
10)  ＢＳＡを用いて各ウェルをブロッキングする。
11)  標準試料（特定の分子量３種以上、濃度ポイントは同一１点のみ）及び被検試料をそれぞれ各ウェルに添加し、所定時間反応させる。
12)  ビオチン−ＨＡＢＰ溶液を添加し、所定時間反応させる。
13)  ＨＲＰ−アビジン溶液を添加し、所定時間反応させる。
14)  発色基質溶液（例えばオルトフェニレンジアミン）を添加し、所定時間反応させる。
15)  停止液を添加し、マイクロプレート吸光度計を用いて所定の測定波長にて吸光度を測定する。
16)  標準試料について得られた吸光度を使用し、分子量に対して吸光度をプロットすることにより標準曲線を作成し、これと被検試料について得られた吸光度から被検試料中の分子量を決定する。【００６９】
本発明はさらに、上記本発明のＨＡの分子量の測定方法に使用するための、ＨＡＢＰを含む、ＨＡの分子量の測定用のキットを提供する。
上記本発明のキットは、ＨＡＢＰの他、ＨＡＢＰのＨＡに対する反応性を調節するための添加剤、該添加剤を含む又は含まないバッファー、標準曲線作成用の分子量既知のＨＡ標準試料などを含むものとしてもよい。【００７０】
なお、本明細書中、特に断らない限り、「分子量」、「平均分子量」は「重量平均分子量」を意味する。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００７２】
材料
以下の実施例においては下記の材料を使用した。
ＥＬＩＳＡ用９６ウェルプレート（Maxisorp、ナルジェヌンク社製）
ＢＳＡ（オリエンタル酵母社製）
ＨＡ（アルツアンプル、鶏冠由来、生化学工業社製）
ＣＳ−Ｃ（サメ軟骨由来、生化学工業社製）
ＨＡ−ＢＳＡ（生化学工業社製）
ＨＡＢＰ（「ヒアルロン酸バインディングプロテイン」、生化学工業社製）
ビオチン−ＨＡＢＰ（生化学工業社製）
ＨＲＰ−アビジン（PIERCE社製）
ＯＰＤ錠（SIGMA社製）
ＡＢＴＳ錠（SIGMA社製）
ＯＰＤ(o-フェニレンジアミン)用緩衝液（特殊免疫研究所社製）
ＴＭＢ（＋）（DAKO社製）
ＴＭＢ ＢＬＵＥ（DAKO社製）
ＰＢＳ（塩化ナトリウム8g、塩化カリウム0.2g、リン酸水素二ナトリウム2.9g、リン酸二水素カリウム0.2gを精製水1Lに溶解して調製した。）
洗浄液（ＰＢＳ 1LにTween-20（和光純薬社製）0.5mL を添加し、攪拌溶解して調製した。）
ELISA基本緩衝液（洗浄液1LにＢＳＡ 10gを添加し、攪拌溶解した後、ポアサイズ0.2μmのろ過フィルターでろ過して調製した。）【００７３】
各種分子量のＨＡの調製
上記鶏冠由来ＨＡ（試料Ａとした）をアルカリ条件下（pH10.5）あるいはヒツジ睾丸ヒアルロニダーゼで処理して低分子化し、エタノール沈殿処理により精製し下記試料Ｂ〜Ｊを調製した。記載した各分子量は、後述する実施例１のＧＰＣ法により測定した値である。これらの試料を実施例２以降の試験に被験試料として使用した。
試料Ａ: 2289 kDa（以下「ＨＡ−２２８９」とも記載する）
試料Ｂ: 964 kDa（以下「ＨＡ−９６４」とも記載する）
試料Ｃ: 821 kDa（以下「ＨＡ−８２１」とも記載する）
試料Ｄ: 606 kDa（以下「ＨＡ−６０６」とも記載する）
試料Ｅ: 323 kDa（以下「ＨＡ−３２３」とも記載する）
試料Ｆ: 248 kDa（以下「ＨＡ−２４８」とも記載する）
試料Ｇ: 182 kDa（以下「ＨＡ−１８２」とも記載する）
試料Ｈ: 112 kDa（以下「ＨＡ−１１２」とも記載する）
試料Ｉ: 61 kDa（以下「ＨＡ−６１」とも記載する）
試料Ｊ: 22 kDa（以下「ＨＡ−２２」とも記載する）【００７４】
実施例１：ＧＰＣ法によるＨＡ分子量の測定
ＧＰＣ用ＨＡ標準品として鶏冠由来ＨＡを前述の方法によって低分子化し、エタノール沈殿によって精製し、９種の標準品(ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−１〜９）を得た。これらの分子量を公知の方法である光散乱法によって決定した。
上記９種のＧＰＣ用標準品、及び１０種の被検試料のそれぞれを、0.2M NaClを用いて約100μg/mLの濃度に調製し、下記条件で分析した。標準品の分子量をX軸に、溶出ピーク位置の溶出時間をY軸に、それぞれプロットして標準曲線を作成し、これを用いて被検試料の溶出ピーク位置からそれらのピーク分子量を算出した。【００７５】
・測定装置
カラムオーブン：CO-8025（東ソー社製）
ポンプ：PU-920（日本分光社製）
紫外部吸収検出器：UV-1575（日本分光社製）
カラム：TSK-GEL G-6000PWXL（東ソー社製）
・測定条件
溶媒：0.2M NaCl
温度：40℃
流速：0.5mL/min.
検出条件：波長215nmでの紫外吸収【００７６】
試験は２回行い（試験１及び２）、９種のＧＰＣ用標準品及び試料Ｂ、Ｈ、Ｊについては試験１及び２で測定を行い、試料Ａ、Ｅ〜Ｇ、Ｉについては試験１で測定を行い、試料Ｃ及びＤについては試験２で測定を行った。各試験において、ＧＰＣ用分子量標準品はすべてn=3で、各被検試料はすべてn=2で測定した。結果を表１に示す。【００７７】
【表１】
2008018519.tif 000003
【００７８】
表１中、標準品について示した分子量は光散乱法により測定した分子量である。
本実施例における測定所要時間は、試験１では47時間、試験２では37時間であった。このように、既存の方法のひとつであるＧＰＣ法では１サイクルで１試料しか分析できないため、長時間が必要となる。また、40μg以上（100μg/mL溶液が400μL）のＨＡ量が必要である。【００７９】
実施例２：ＨＰＬＣ法によるＨＡ濃度の定量
実施例１においてＧＰＣ法で分子量を測定した試料Ａ〜Ｊについて、以下に記載したＨＰＬＣ法によってＨＡ濃度を定量測定した。
・標準品
ＨＡ不飽和２糖標準品（生化学工業社製）を精製水に溶解し、波長232nmでの紫外部吸収を校正された分光光度計（U-530DS；日本分光社製）により測定し、同物質の分子吸光係数5.7に基づき濃度を決定し、校正された電子天秤（AT-250；メトラー社製）を用いて正確に希釈して濃度2μg/mLのＨＰＬＣ定量用標準液を作成した。
・測定装置
ポンプ：PU-2080（日本分光社製）
グラジエントユニット：（日本分光社製）
オートサンプラー：AS-2050（日本分光社製）
加熱反応槽：DB-5（島村計器社製）
蛍光検出器：FP-2059（日本分光社製）
カラム：YMC-GEL PA120-S05（ワイエムシー社製）
・測定条件
溶媒：0 〜 200mM Na2SO4グラジエント
温度：室温
流速：0.5 mL/min.
標識温度：145℃
検出条件：励起波長346nm、吸収波長410nm【００８０】
ＨＡ濃度測定方法
被検試料を採取し、ヒアルロニダーゼSD（生化学工業社製）を終濃度 100mUとなるように加え、酢酸Na緩衝液を終濃度25mUとなるように加え、３７℃で２時間反応させ、ＨＡ不飽和２糖に完全に分解した。得られた被検試料の消化液及びＨＡ不飽和２糖標準液をHPLCを用いて上記条件で分析した。標準液のピーク面積値と被検試料消化液の面積値との比を元に、被検試料である各種分子量のＨＡ濃度を算出した。
結果を表２に示す。【００８１】
【表２】
2008018519.tif 000004
【００８２】
実施例３：試料のＨＡ濃度測定（工程(1)）
実施例１でＧＰＣ法により分子量を測定し、実施例２でＨＰＬＣ法によりＨＡ濃度を測定した試料Ｂ(ＨＡ-964)、Ｅ(ＨＡ-323)、Ｈ(ＨＡ-112)及びＪ(ＨＡ-22)を、濃度0、6.25、12.5、25、50、100、200、400 ng/mLに調製し、下記の手順による競合ELISA法によりＨＡ定量試験を行った。
ＨＡ−ＢＳＡを濃度100μg/mLでＰＢＳに溶解し、これを96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ加え、４℃で一晩静置して固相化した。その後、各ウェルをＰＢＳ 300μLで３回洗浄し、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を200μLずつ加え、室温で２時間静置してブロッキングした後、各ウェルを洗浄液300μLで３回洗浄した。この各ウェルに、前述のELISA基本緩衝液で調製した各試料ＨＡの希釈系列あるいはＨＡ不含液を50μLずつ加え、次いで、ELISA基本緩衝液で調製したビオチン−ＨＡＢＰ溶液を50μLずつ加え、37℃で１時間反応させた後、各ウェルを洗浄液300μLで３回洗浄した。この各ウェルに、ELISA基本緩衝液で希釈したＨＲＰ−アビジン溶液を100μLずつ加え、37℃で１時間反応させた後、各ウェルを洗浄液300μLで５回洗浄した。この各ウェルに、ＯＰＤ用緩衝液で濃度0.25mg/mLに調製したＯＰＤ溶液を100μLずつ加え、遮光して室温にて30分間反応させた後、1M HCl溶液を100μL加え、ELISAプレート吸光度計（SK-603、生化学工業社製）を用いて吸収波長492nm、対照波長630nmにて吸光度を測定した。測定結果を表３に、結果をプロットしたグラフを図１に示す。【００８３】
【表３】
2008018519.tif 000005
【００８４】
上記結果から明らかなように、本実施例で記載したような競合ELISA法を使用すれば、少なくとも分子量20kＤａから960kＤａ程度のＨＡについて分子量の影響を受けずに簡便にＨＡを定量できることが明らかとなった。【００８５】
実施例４
実施例３と同様の方法でＨＡ定量試験を行った。但し、ビオチン−ＨＡＢＰの溶解液を0.4Mおよび1.2Mグアニジン塩酸を含むELISA基本緩衝液とした。測定結果を表４および表５に、結果をプロットしたグラフを図２および図３に、それぞれ示す。【００８６】
【表４】
2008018519.tif 000006
【００８７】
【表５】
2008018519.tif 000007
【００８８】
実施例３及び４の結果から明らかなように、工程(1)に競合ELISA法を適用する場合、緩衝液条件等は各種分子量のＨＡの定量測定に影響を与えず、種々の条件で実施し得るものである。すなわち、後述する工程(2)における反応性を変化させ得る添加剤について測定感度・測定精度・安定性・操作性などの点において最適な条件を適時選択し、同一の条件を使用して工程(1)を行っても測定結果に影響がないことが確認された。従って、工程(1)および(2)において同一の緩衝液を使用するなど、本発明の測定方法の条件をより簡略化でき、またより簡略な本発明の測定キットを構築することができる。【００８９】
実施例５：ＨＡに結合する標識されたＨＡＢＰの測定（工程(2)）
下記のような手順によりＨＡに結合する標識されたＨＡＢＰの測定を行った。
本実施例では、固相に固定するＨＡＢＰの量、反応時の緩衝条件、添加剤の条件を検討するため、固相に固定するＨＡＢＰの量を変化させ、またＨＡ標準液及びビオチン−ＨＡＢＰを溶解する緩衝液に関して、下記５通りのELISA緩衝液を用いた。
1)  ELISA基本緩衝液
2)  ELISA基本緩衝液に1M NaClを添加
3)  ELISA基本緩衝液に３M NaClを添加
4)  ELISA基本緩衝液に0.4M グアニジン塩酸を添加
5)  ELISA基本緩衝液に1.2M グアニジン塩酸を添加【００９０】
ＨＡＢＰを濃度300及び3000ng/mLでＰＢＳに溶解し、これを96ウェルプレートの各ウェルに100μLずつ加え、４℃で一晩静置して固相化した。その後、各ウェルをＰＢＳ 300μLで３回洗浄し、１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を200μLずつ加え、室温で２時間静置してブロッキングした後、各ウェルを洗浄液300μLで３回洗浄した。この各ウェルに、前述の各ELISA緩衝液で調製した試料Ｊ(ＨＡ−２２)あるいは試料Ｂ(ＨＡ−９６４)の1000ng/mL溶液あるいはＨＡ不含液を100μLずつ加え、37℃で１時間反応させた後、各ウェルを洗浄液300μLで３回洗浄した。この各ウェルに、前述の各ELISA緩衝液で調製したビオチン−ＨＡＢＰの200及び800ng/mL溶液を100μLずつ加え、37℃で１時間反応させた後、各ウェルを洗浄液300μLで３回洗浄した。この各ウェルに、ELISA基本緩衝液で調製したＨＲＰ−アビジンの500ng/mL溶液を100μLずつ加え、37℃で１時間反応させた後、各ウェルを洗浄液300μLで５回洗浄した。この各ウェルに、ＯＰＤ用緩衝液で濃度0.25mg/mL に調製したＯＰＤ溶液を100μLずつ加え、遮光して室温にて30分間反応させた後、1M HCl溶液を100μL加え、ELISAプレート吸光度計（SK-603、生化学工業社製）を用いて吸収波長492nm、対照波長630nm にて吸光度を測定した。結果を表６及び７に示す。【００９１】
【表６】
2008018519.tif 000008
【００９２】
【表７】
2008018519.tif 000009
【００９３】
上記結果から、固相化したＨＡＢＰと液相のビオチン−ＨＡＢＰとでＨＡを挟み込んで検出するサンドイッチ法を行った場合、ＨＡの分子量によりビオチン−ＨＡＢＰとの反応性は一様ではないこと、固相化するＨＡＢＰあるいはビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度及び各ステップにおいて用いる緩衝液の組成によって、ＨＡ分子量に依存する反応性の差異の程度（以下、ＨＡ分子量依存性と表記する）を調整可能であることが明らかとなった。【００９４】
実施例６：ビオチン−ＨＡＢＰの反応性に対する添加剤条件についての試験１
ビオチン−ＨＡＢＰの反応性に対する添加剤条件について試験するため、試料Ｂ(ＨＡ−９６４)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用し、下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。結果を表８及び９に示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：300及び3000 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ
・ＨＡ標準品を溶解した緩衝液：ELISA基本緩衝液
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200及び800 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度：0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2及び1.4 M
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：500 ng/mL
・発色液：0.25 mg/mL ＯＰＤ【００９５】
【表８】
2008018519.tif 000010
【００９６】
【表９】
2008018519.tif 000011
【００９７】
上記の結果から、例えばビオチン−ＨＡＢＰを溶解する緩衝液にグアニジン塩酸を加え、この濃度を変化させることによって、ＨＡ分子量依存性を調節可能であることが判明した。【００９８】
実施例７：発色強度の調整についての試験
発色物質による発色強度の調整について試験するため、試料Ｂ(ＨＡ−９６４)を使用し、下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。結果を図４に示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：300 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ
・ＨＡ標準品を溶解した緩衝液：ELISA基本緩衝液
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200及び800 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度： 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2及び1.4 M
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：500ng/mL
・発色液：0.25mg/mL ＯＰＤ、0.5mg/mL
ＯＰＤ及びＴＭＢ(+)（試薬量として100μl）【００９９】
この結果、実施例６で比較検討した各条件における最大吸光度は、ＨＲＰ−アビジン使用濃度及び発色基質の種類と濃度を変化させることで調整可能であることが確認された。【０１００】
実施例８：ビオチン−ＨＡＢＰの反応性に対する添加剤条件についての試験２
ビオチン−ＨＡＢＰの反応性に対する添加剤条件について試験するため、試料Ｂ(ＨＡ−９６４)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用し、下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表１０に、結果を図５に示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：300及び3000 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ
・ＨＡ標準品を溶解した緩衝液：ELISA基本緩衝液
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度： 0、0.4、0.8、及び 1.2 M
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：500ng/mL
・発色液：0.25mg/mL ＯＰＤ、0.5mg/mL
ＯＰＤ及びＴＭＢ（＋）（試薬量として100μl）【０１０１】
【表１０】
2008018519.tif 000012
【０１０２】
この結果、グアニジン塩酸濃度が高くなるに従って分子量依存性が顕著になる結果が得られ、実施例６で得られた傾向と一致した。本実施例のように、実施例６で見い出したビオチン標識ＨＡＢＰ溶解液に添加するグアニジン塩酸濃度の調節と、実施例７で実施した発色条件の最適化を組み合わせることにより、最大吸光度0.5〜3.0の実用的な範囲で、様々な分子量依存性を示す反応系を構築可能であることが判明した。【０１０３】
なお、実施例９以降においても、本実施例の場合と同様に必要に応じて予め実施例７と同様も発色強度検討を実施し、ＨＲＰ−アビジンの使用濃度及び発色基質の種類と濃度について適切な条件を選択した上で、各試験を実施した。【０１０４】
実施例９：ビオチン−ＨＡＢＰの反応性に対する添加剤条件についての試験３
ビオチン−ＨＡＢＰの反応性に対する添加剤条件について試験するため、試料Ｂ(ＨＡ−９６４)、Ｅ(ＨＡ−323)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用し、下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表１１に、結果を図６に示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：300 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ
・ＨＡ標準品を溶解した緩衝液：ELISA基本緩衝液
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へ加えた添加剤の種類及び濃度
1) 尿素： 2.67M、5.33M及び8.0M
2) ＣＳ−Ｃ： 0.2mg/mL、1.0mg/mL及び10mg/mL
3) ＳＤＳ： 0.025%、0.05%及び0.1%
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：500ng/mL
・発色液：0.25mg/mL ＯＰＤ、0.5mg/mL ＯＰＤ及びＴＭＢ（＋）（試薬量として100μl）【０１０５】
【表１１】
2008018519.tif 000013
【０１０６】
この結果、ビオチン−ＨＡＢＰ溶解液への添加剤としては、グアニジン塩酸以外にも、尿素、ＳＤＳ、ＣＳ−Ｃなどが利用可能であることが判明した。【０１０７】
実施例１０：ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度についての試験
ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度の適当な範囲について試験するため、試料Ｂ(ＨＡ-964)、Ｅ(ＨＡ−３２３)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用し、下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表１２に、結果を図７に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表１３にそれぞれ示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：300 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ
・ＨＡ標準品を溶解した緩衝液：ELISA基本緩衝液
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200、400、800、1600及び3200 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度： 0.4、0.8及び1.2 M
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：100及び500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度：
1) ＡＢＴＳ：0.4 mg/mL
2) ＯＰＤ：0.2、0.25、及び 0.5 mg/mL
3) ＴＭＢ−ＢＬＵＥ（試薬量として100μl）【０１０８】
【表１２】
2008018519.tif 000014
【０１０９】
【表１３】
2008018519.tif 000015
【０１１０】
この結果から、ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度としては、少なくとも200から3200ng/mLの範囲が適用可能であることが示された。また、特にビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度が比較的高濃度である場合には、ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度が高くなるに従って、分子量依存性は減ずる結果が得られた。本実施例から、ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度によっても分子量依存性を調節可能であることが判明した。【０１１１】
実施例１１：ＨＡ標準溶液における添加剤使用についての試験
ＨＡ標準溶液においてグアニジン塩酸を使用した場合の影響について試験するため、試料Ｂ(ＨＡ−９６４)、Ｅ(ＨＡ−３２３)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用し、下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表１４に、結果を図８に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表１５にそれぞれ示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：30、300、3000 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ
・ＨＡ標準品溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度： 0、0.8、1.2、1.6及び2.4 M
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加： なし
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：100及び500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度：
1) ＯＰＤ：0.25、0.32及び0.5 mg/mL
２) ＴＭＢ（＋）（試薬量として100μl）【０１１２】
【表１４】
2008018519.tif 000016
【０１１３】
【表１５】
2008018519.tif 000017
【０１１４】
特にＨＡＢＰ固相化濃度が飽和となる300ng/mLよりも低い範囲で、標準液及び被検試料溶解液へ添加したグアニジン塩酸濃度が高くなるほど分子量依存性は顕著になる結果が得られた。本実施例から、標準液及び被検試料を溶解する緩衝液へのグアニジン塩酸濃度によっても分子量依存性を調節可能であることが判明した。【０１１５】
実施例１２：ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液条件についての試験
ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液条件について試験するため、試料Ｂ(ＨＡ−９６４)、Ｅ(ＨＡ−３２３)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用し、下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表１６に、結果を図９に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表１７にそれぞれ示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：300 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ、3M NaCl−ＰＢＳ及び3.6M NaCl−ＰＢＳ
・ＨＡ標準品を溶解した緩衝液：ELISA基本緩衝液
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度： 0.4、0.8及び1.2 M
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：500ng/mL
・    発色液の濃度と使用濃度：
１）ＯＰＤ：0.25mg/mL
２）ＯＰＤ：0.5mg/mL及びＴＭＢ（＋）（試薬量として100μl）【０１１６】
【表１６】
2008018519.tif 000018
【０１１７】
【表１７】
2008018519.tif 000019
【０１１８】
これらの結果から、ＨＡＢＰをプレートに固相化する際に使用する緩衝液は、特定の条件に限定されるものではなく、少なくとも本実施例で示した緩衝液条件はすべて適用可能であることが示された。【０１１９】
実施例１３：ＨＡＢＰ固相化時のＨＡＢＰ濃度についての試験１
ＨＡＢＰ固相化時のＨＡＢＰ濃度について試験するため、試料Ｂ(ＨＡ−９６４)、Ｅ(ＨＡ−３２３)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用し、下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表１８に、結果を図１０に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表１９にそれぞれ示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：10、30、100、300、1000、3000、10000、30000 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ
・ＨＡ標準品を溶解した緩衝液：ELISA基本緩衝液
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度： 0.4及び1.2 M
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度：
1) ＯＰＤ：0.25及び0.5 mg/mL
2) ＴＭＢ（＋）及びＴＭＢ ＢＬＵＥ（試薬量として100μl）【０１２０】
【表１８】
2008018519.tif 000020
【０１２１】
【表１９】
2008018519.tif 000021
【０１２２】
これらの結果から、ＨＡＢＰ固相化濃度としては、少なくとも10から30,000ng/mLの範囲が適用可能であることが示された。また、ＨＡＢＰ固相化濃度が飽和に達する300ng/mLよりも低い範囲では、ＨＡＢＰ濃度が低くなるほど分子量依存性は顕著となる結果が得られた。本実施例より、ＨＡＢＰの固相化濃度によっても分子量依存性を調節可能であることが判明した。【０１２３】
実施例１４：ＨＡＢＰ固相化時のＨＡＢＰ濃度についての試験２
ＨＡＢＰ固相化時のＨＡＢＰ濃度について試験するため、試料Ｂ(ＨＡ−９６４)、Ｅ(ＨＡ−３２３)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用し、下記の条件で、その他は実施例１３と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表２０に、結果を図１１に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表２１にそれぞれ示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：30、60、120、240 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度： 0.4及び0.8 M
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度：
１）ＯＰＤ：0.25及び0.5 mg/mL【０１２４】
【表２０】
2008018519.tif 000022
【０１２５】
【表２１】
2008018519.tif 000023
【０１２６】
実施例１３と一致する結果が得られた。【０１２７】
実施例１５：条件の組合せについての試験
上記実施例で検討した各種の条件の組合せにより分子量依存性の程度を調整できるかを試験するため、試料Ｂ(ＨＡ−９６４)、Ｅ(ＨＡ−３２３)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用し、下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。反応条件を表２２に、結果を図１２に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表２３にそれぞれ示す。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：100 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ
・ＨＡ標準品溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度： 0、0.8及び1.6 M
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加： 0、0.4及び0.8 M
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度：
１）ＯＰＤ：0.25、0.32及び0.5 mg/mL【０１２８】
【表２２】
2008018519.tif 000024
【０１２９】
【表２３】
2008018519.tif 000025
【０１３０】
本実施例から明らかなように、本発明の測定方法の工程(2)における分子量依存性の程度は、複数の条件の組合せを最適化することで自在に調節できる。実際には、測定方法の条件を設定し、測定キットを構築する上で、測定感度・測定精度・安定性・操作性等を考慮し、最適な形態となる条件を適時選択することができる。【０１３１】
実施例１６：検体についての測定１
以下に被検試料の分子量の測定の具体例を示す。
被検試料としては、実施例１において分子量を測定した３種のＨＡ、試料Ｄ(ＨＡ−６０６)、Ｇ(ＨＡ−１８２)、Ｉ(ＨＡ−６１)を、ダルベッコ改変イーグル培地に添加した試料を用いた。工程(1)の標準試料としては試料Ｊ(ＨＡ−２２)そのものを使用した。工程(2)の標準試料としては試料Ｂ(ＨＡ−９６４)、Ｅ(ＨＡ−３２３)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用した。
これらの試料をそれぞれ適宜希釈し、まず実施例３に記載した方法に従って工程(1)を実施した。吸光度測定の結果を、標準試料については下記表２４に、それらを濃度値とともに対数に換算した値を表２５に、被検試料については表２６に示す。【０１３２】
【表２４】
2008018519.tif 000026
【０１３３】
【表２５】
2008018519.tif 000027
【０１３４】
【表２６】
2008018519.tif 000028
【０１３５】
標準液での吸光度データ(図１３Ａ)を元に図１３Ｂに示した検量線を作成し、これを利用して試料中のＨＡ濃度を求めた。結果は表２６に示す。
この結果に基づき、各被検試料を400ng/mLの濃度に希釈し、実施例１５の条件Ｅを適用して、工程(2)を実施した。得られた吸光度の結果を下記表２８に示す。また各濃度の標準試料について同様に操作を行った。得られた吸光度の結果を下記表２７に示す。これらの値から得られた各標準試料についての反応曲線を図１４Ａに示す。またこれらの結果のうち400ng/mLの濃度で得られた結果から得られた標準曲線を図１４Ｂに示す。
400ng/mLの濃度の各試料の吸光度値と図１４Ｂの標準曲線から、各被検試料のＨＡの分子量を求めた（工程(3)）。結果を表２８に示す。【０１３６】
【表２７】
2008018519.tif 000029
【０１３７】
【表２８】
2008018519.tif 000030
【０１３８】
実施例１７：検体についての測定２
以下に被検試料の分子量の測定の別の具体例を示す。
被検試料としては、実施例１において分子量を測定した３種のＨＡ、試料Ｄ(ＨＡ−６０６)、Ｆ(ＨＡ−２４８)、Ｉ(ＨＡ−６１)を、ダルベッコ改変イーグル培地に添加した試料を用いた。工程(1)の標準試料としては試料Ｊ(ＨＡ−２２)そのものを使用した。工程(2)の標準試料としては試料Ｂ(ＨＡ−９６４)、Ｅ(ＨＡ−３２３)、Ｈ(ＨＡ−１１２)及びＪ(ＨＡ−２２)を使用した。【０１３９】
これらの試料をそれぞれ適宜希釈し、実施例３に記載した方法に従って工程(1)を実施するとともに、これと並行して実施例１４の条件Ａを適用して、工程(2)を実施した。
工程(1)について、標準試料の吸光度測定の結果を下記表２９に、それらの対数に換算した値を濃度を対数に換算した値とともに表３０に、被検試料の吸光度測定の結果を表３１に示す。【０１４０】
【表２９】
2008018519.tif 000031
【０１４１】
【表３０】
2008018519.tif 000032
【０１４２】
【表３１】
2008018519.tif 000033
【０１４３】
標準液での吸光度データを元に作成した検量線を図１５Ａに、吸光度及び濃度を対数値で表した前記検量線の近似式を図１５Ｂに示す。これを利用して試料中のＨＡ濃度を求めた。結果は表３１に合わせて示す。
また、工程(2)で得られた標準試料の吸光度の結果を下記表３２に、これら値から得られた各標準試料についてのＨＡ濃度に対する吸光度を示す反応曲線を図１６Ａに、被検試料の吸光度の結果を表３４に示す。【０１４４】
最後に、工程(1)および工程(2)で得られた結果を元に、工程(3)である分子量算出を実施した。まず、工程(2)で得られた各々のＨＡ分子量標準試料の反応曲線について対数関数により近似した式を図１６Ｂに示す。これらの近似式のxに、工程(1)で求めた各被験試料のＨＡ濃度を代入することにより、各被験試料のＨＡ濃度での各分子量標準試料の吸光度値を計算により求めることができる。この操作により求めた値を表３３に示す。【０１４５】
さらに、各被験試料のＨＡ濃度で求めた表３３の吸光度値をx軸に、ＨＡ分子量をy軸にプロットし、得られた曲線の近似式を求めることにより、各被験試料のＨＡ濃度での分子量測定用検量線を作成することができる。これにより得られた各濃度おける分子量測定用検量線の近似式を図１７に示す。これらの近似式中、各被験試料の濃度に対応する式のxに、工程(2)で求めた当該被験試料の吸光度値を代入することにより、当該被験試料のＨＡ分子量を求めることができる。これにより得られた分子量を表３４に示す。
本実施例のように、工程(1)および(2)を、工程(1)の結果に基づいて工程(2)の反応条件等を選択する等の操作を行うことなく独立して実施した場合でも、被験試料について各工程で得られた吸光度値が各々の測定範囲内であれば、被験試料のＨＡ分子量を求めることができる。【０１４６】
【表３２】
2008018519.tif 000034
【０１４７】
【表３３】
2008018519.tif 000035
【０１４８】
【表３４】
2008018519.tif 000036
【０１４９】
【表３５】
2008018519.tif 000037
【０１５０】
実施例１８：前処理工程２）と３）を行った際のプロテアーゼ失活効果の確認
アクチナーゼAFを、濃度2%あるいは6% となるように0.135M NaCl−10mM Tris.HCl(pH8.0) に溶解し、被験試料液とした。この溶液の一部を分取し、10分間煮沸して失活させ、対照液Aとした。また、アクチナーゼを含まない緩衝液を対照液Bとした。
各液を氷冷後、予め氷冷しておいた40%、12%、あるいは4％ＴＣＡ溶液を1/4容量添加して混合して氷上に15分間保持した後、各液を2等分し、一方はそのまま氷上に維持し、もう一方は小型冷却遠心機を用いて４℃で5分間、10000r.p.m.で遠心分離し、上清を採取した。
各液に対して予め氷冷しておいた 2M Tris溶液を添加し、pH8.0に調整した。尚、pH8.0 に調整する為に要する2M Trisの容量は、事前検討により決定した。
中和後の各液を 20μL採取し、試験開始時のアクチナーゼ濃度2%の試料については精製水 180μL を、アクチナーゼ濃度 6%の試料については精製水580μL を、それぞれ添加して希釈して氷上に保持し、残存プロテアーゼ活性測定の被験試料とした。
プロテアーゼ活性測定の標準品として、アクチナーゼAF粉末を精製水に溶解して６％溶液を調整し、これを用いて12.5−500μg/mLの希釈系列を作成し、標準液とした。
上記の被験試料および標準液を50μLずつ採取し、1.25%カゼインナトリウム（和光純薬）溶液を250μL添加し、55℃で30分間反応させた後、110mM ＴＣＡ250μLを添加してタンパク質を沈殿させ、10000×gで10分間遠心分離して上清60μLを採取した。この溶液に500mM 炭酸Na溶液を 150μL添加し、更に4倍希釈したフェノール試薬（和光純薬）を30μL添加し、攪拌混合後、37℃で30分間反応させた後、波長630nmの吸光度を測定した。
標準液の濃度と吸光度から検量線を作成し、これを用いて被験試料中の残存プロテアーゼ活性を、標準アクチナーゼAFの濃度当量として算出して評価した。
その結果を表３６に示した。アクチナーゼ濃度 2%溶液、6%溶液ともに、TCA処理を終濃度8%および2.4%で実施し、沈殿を遠心分離除去後に上清を中和する方法を実施した場合、残存プロテアーゼ活性をほぼ完全に失活できることが確認できた。【０１５１】
【表３６】
2008018519.tif 000038
【０１５２】
実施例１９：前処理工程２）と３）を実施した場合のＨＡ分子量の保持率の評価
試料用緩衝液として0.135M NaCl−10mM Tris.HCl(pH8.0) を調製し、これに、3種の分子量のＨＡ（実施例１、表１のＨＡ−ＭＷＳＴＤ−１、２、および３）を終濃度5μg/mLとなるように添加し、これを被験試料とした。
各被験試料を6mLずつ3本に分注し氷冷後、予め氷冷しておいた３種濃度のＴＣＡ溶液（A：40%、B：12%、C：4%）を1.5mL添加して混合して氷上に15分間保持した後、冷却遠心機を用いて４℃で5分間、3000r.p.m.で遠心分離し、上清9.6mLを採取した。
上記各液に対して、氷冷した 2M Tris溶液を、Aについては2.50ｍL、Bについては0.75mL、Cについては0.27mL添加してpH8.0に調整した。続いて氷冷した精製水を、Aについては非添加、Bについては1.75mL、Cについては2.24mL添加して、最終容量を揃えた。これらの液を9.6mL採取し、PD-10カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて脱塩後、遠心エバポレーターで加温せずに濃縮乾固し、0.2M NaCl 380μL を加えて再溶解した。
この溶液について、実施例1と同様の方法でGPC分析を実施してＨＡ分子量を測定し、上記の前処理実施後のＨＡ分子量と未処理のＨＡの分子量とを比較して、前処理工程でのＨＡ分子量保持率を評価した。
その結果を表３７に示した。ＴＣＡを終濃度8%で処理した場合、ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−１（分子量：2310kDa）、ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−２（分子量：1410kDa）、ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−０３（分子量：993kDa）の各試料について、ピーク分子量で評価した保持率はそれぞれ100%、96%、103％であった。ＴＣＡを終濃度2.4%で処理した場合、ＨＡ分子量  ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−１、同−２、同−３の各試料について、ピーク分子量で評価した保持率はそれぞれ101%、99%、102％であった。ＴＣＡを終濃度0.8%で処理した場合、ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−１、同−２、同−３の各試料について、ピーク分子量で評価した保持率はそれぞれ97%、95%、104％であった。【０１５３】
【表３７】
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【０１５４】
実施例２０：前処理工程１）、２）、３）を実施した場合のＨＡ分子量の保持率の評価
試料用緩衝液として0.135M NaCl−10mM Tris.HCl(pH8.0) を調製し、これにアクチナーゼAFを溶解して、濃度6%溶液（A）および2%溶液（B）を調製した。また、アクチナーゼを含まない試料用緩衝液（C）を用意した。上記各液に、3種の分子量のＨＡ（実施例１、表１のＨＡ−ＭＷＳＴＤ−１、２、および３）を終濃度5μg/mLとなるように添加し、これを被験試料とした。
各被験試料を37℃湯浴中で24時間処理した後、6mLを採取して氷冷後、予め氷冷しておいた40%ＴＣＡ溶液を1.5mL添加して混合し、氷上に15分間保持した後、冷却遠心機を用いて４℃で5分間、3000r.p.m.で遠心分離し、上清9.6mLを採取した。
上記各液に対して、氷冷した 2M Tris溶液を2.65ｍL添加してpH8.0に調整した。調製後の各液を PD-10カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて脱塩後、遠心エバポレーターで加温せずに濃縮乾固し、0.2M NaCl 380μL を加えて再溶解した。
この溶液について、実施例1と同様の方法でGPC分析を実施してＨＡ分子量を測定し、上記の前処理実施後のＨＡ分子量と未処理のＨＡの分子量とを比較して、前処理工程でのＨＡ分子量保持率を評価した。
その結果を表３８に示した。アクチナーゼ濃度2%で37℃・24時間処理した場合の保持率は、ピーク分子量で評価した場合、ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−１（分子量：2310kDa）、ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−２（分子量：1410kDa）、ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−３（分子量：993kDa）の各試料について、それぞれ89%、91%、96％であった。アクチナーゼ濃度6%で42℃・24時間処理した場合の保持率は、ピーク分子量で評価した場合ＨＡ−ＭＷＳＴＤ−１、同−２、同−３の各試料について、それぞれ74%、80%、89％であった。【０１５５】
【表３８】
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【０１５６】
実施例２１：前処理工程２）、３）、４）実施後の溶媒組成が、測定工程(1)に及ぼす影響の確認
3種濃度のＴＣＡ溶液、2M Tris溶液、ELISA用補正液、D.W. を、表３９の比率で混合し、模擬前処理液A、B、Cを調製した。この処理液を用いて、4種の分子量のＨＡ（実施例１、表１の試料-B、E、H、J）について、濃度800、400、200、100、50、25、12.5ng/mLの希釈列を作成した。これを、実施例3と同様の方法で測定工程(1)を実施した。
測定結果を表４０に、結果をプロットしたグラフを図１８に、それぞれに示した。模擬処理液A、B、Cいずれを用いた場合も、ＨＡの分子量によらず同一の反応性を示すことが確認された。このことから、被験試料溶液に前処理工程で添加したプロテアーゼ失活用試薬および中和試薬が含まれたままの状態でも、標準品の溶媒を被験試料の溶媒と同一組成に合わせて使用すれば、測定工程(1)が実施可能であることが確認された。【０１５７】
【表３９】
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【０１５８】
【表４０】
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【０１５９】
実施例２２：前処理工程２）、３）、４）実施後の溶媒組成が、測定工程(2)に及ぼす影響の確認
実施例２１で調製した模擬前処理液A、B、Cを用いて、4種の分子量のＨＡ（実施例１、表１の試料-B、E、H、J）について、濃度1000、300、100、30ng/mLの希釈列を作成した。これを下記の条件で、その他は実施例５と同様に反応及び測定を行った。
・ＨＡＢＰ固相化濃度：30、100 ng/mL
・ＨＡＢＰ固相化時の緩衝液：ＰＢＳ
・ＨＡＢＰ固相化プレート：3種ブロッキング試薬を用いて乾燥プレートを作成して使用。
・ＨＡ標準品を溶解した緩衝液：ELISA基本緩衝液
・ビオチン−ＨＡＢＰの使用濃度：200 ng/mL
・ビオチン−ＨＡＢＰ溶液へのグアニジン塩酸の添加濃度： 0.4及び0.8 M
・ＨＲＰ−アビジンの使用濃度：500 ng/mL
・発色液の種類と使用濃度：ＯＰＤ：0.5 mg/mL
ＨＡＢＰ固相化濃度30ng/mLでの反応条件を表４１に、結果を図１９に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表４２にそれぞれ示す。また、ＨＡＢＰ固相化濃度100ng/mLでの反応条件を表４３に、結果を図２０に、結果から計算した各試料で得られた吸光度間の比を表４４にそれぞれ示す。
模擬処理液Ａ、Ｂ、Ｃいずれを用いた場合も、ＨＡの分子量に比例した反応強度を示すことが確認された。このことから、被験試料溶液に前処理工程で添加したプロテアーゼ失活用試薬および中和試薬が含まれたままの状態でも、標準品の溶媒を被験試料の溶媒と同一組成に合わせて使用すれば、測定工程(2)が実施可能であることが確認された。【０１６０】
【表４１】
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【０１６１】
【表４２】
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【０１６２】
【表４３】
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【０１６３】
【表４４】
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【０１６４】
実施例２３：実施例１８〜２２の結果から確定した条件を適用した場合の、各種生体試料中ＨＡ濃度の測定結果（HPLC法）
10mM Tris.HCl(pH8.0) にアクチナーゼAFを溶解して、2%溶液を調製し、これをブタ軟骨種組織試料４00mgに４mL添加し、これを被験試料1とした。
同様に10mM Tris.HCl(pH8.0) にアクチナーゼAFを溶解して、10%溶液を調製し、これをヒト滑膜細胞株培養上清4mLに1mL添加し、これを被験試料２とした。
各被験試料を37℃湯浴中で24時間処理した後、3mLを採取して氷冷後、予め氷冷しておいた40%ＴＣＡ溶液を0.75mL添加して混合し、氷上に15分間保持した後、冷却遠心機を用いて４℃で5分間、3000r.p.m.で遠心分離し、上清4.8mLを採取した。
上記各液に対して、氷冷した 2M Tris溶液を1.33ｍL添加してpH8.0に調整した。調製後の各液を PD-10カラム（GEヘルスケアバイオサイエンス）を用いて脱塩後、遠心エバポレーターで加温せずに濃縮乾固し、0.2M NaCl を加えて再溶解した。
この溶液について、実施例２と同様の方法でHPLC分析を実施してＨＡ濃度を測定した。
その結果を表４５に示した。【０１６５】
【表４５】
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【０１６６】
実施例２４：実施例１８〜２２の結果から確定した条件を適用した場合の、各種生体試料中ＨＡ分子量の測定結果（GPC法）
実施例２３で得た、脱塩濃縮後の再溶解液について、実施例１と同様の方法でGPC分析を実施してＨＡ分子量を測定した。
その結果を表４５に示した。【０１６７】
実施例２５：実施例１８〜２２の結果から確定した条件を適用した場合の、各種生体試料中ＨＡ濃度の測定結果（ELISA法（測定工程（１））
実施例２３で得た、各検体の2M Tris中和液を 30μL採取し、これに実施例２１に示したELISA用補正液を48.3μL添加し、被験試料溶液を作成した。ＨＡ濃度標準品は実施例２１と同様の方法で調製した。
上記の標準液および被験試料溶液を、実施例１６と同様の方法で測定し、ＨＡ濃度を測定した。
その結果を表４５に示した。本方法での測定値と、実施例２３で得られたHPLC法での値との間で、良好な一致が得られた。【０１６８】
実施例２６：実施例１８〜２２の結果から確定した条件を適用した場合の、各種生体試料中ＨＡ分子量の測定結果（ELISA法（測定工程（２）、（３）））
実施例２５で作成した各被験試料溶液について、実施例２５での結果を元に、実施例２１で作成した模擬前処理液Aを用いて希釈し、ＨＡ濃度を100ng/mLにあわせ、これを被験試料とした。ＨＡ分子量標準品は実施例２１と同様の方法で調製した。
上記の標準液および被験試料を、実施例１６と同様の方法で測定し、ＨＡ分子量を算出した。
その結果を表４５に示した。本方法での測定値と、実施例２４で得られたGPC法での値との間で、良好な一致が得られた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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