(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのタンパク質配列において−Ｉ−Ｐ−Ｐ−および−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列を含んでなるタンパク質供給源からＩＰＰおよびＬＰＰを生成するための方法であって、ここで、タンパク質供給源において存在する−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列の少なくとも４０％がペプチドＩＰＰに変換され、タンパク質供給源において存在する−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列の少なくとも４０％がペプチドＬＰＰに変換され、プロリン特異的エンドプロテアーゼおよびアミノペプチダーゼの使用を含んでなり、
前記プロリン特異的エンドプロテアーゼおよび前記アミノペプチダーゼは、単一の工程において共にインキュベートされる、方法。
【請求項２】
乳タンパク質が使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質配列において存在する−Ｉ−Ｐ−Ｐ−または−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列は少なくとも５０％がペプチドＩＰＰまたはＬＰＰに変換される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
選択されたｐＨ条件下における沈殿による加水分解したタンパク質からのＩＰＰおよびＬＰＰを含む可溶性ペプチドの分離をさらに含んでなり、ｐＨを、前記加水分解したタンパク質の部分が、３．５〜６の間のｐＨで沈殿するｐＨに変更すること、および前記溶解したペプチドから前記沈殿した材料を分離することを含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
加水分解したタンパク質からの可溶性ペプチドの分離をさらに含んでなり、水混和性溶媒を加水分解したタンパク質に添加して加水分解したタンパク質の一部を沈殿させること、および前記溶解したペプチドから前記沈殿した材料を分離することを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質からＩＰＰおよびＬＰＰを生成するためのプロリン特異的エンドプロテアーゼおよびアミノペプチダーゼの使用であって、ここで、タンパク質供給源において存在する−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列の少なくとも４０％はペプチドＩＰＰに変換され、タンパク質供給源において存在する−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列の少なくとも４０％はペプチドＬＰＰに変換され、
前記プロリン特異的エンドプロテアーゼおよび前記アミノペプチダーゼは、単一の工程において共にインキュベートされる、使用。
【請求項７】
（ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のＩＰＰおよびＬＰＰを含んでなる組成物の生
成、ならびに
（ｂ）前記ＩＰＰおよびＬＰＰ含有組成物の食品、飲料製品または栄養補助食品への組み入れ、
を含んでなる、食品、飲料製品または栄養補助食品を調製するための方法。
【請求項８】
工程（ａ）において、乳タンパク質が使用される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
加水分解したタンパク質からペプチドを精製するための工程（ｃ）もまた含んでなり、加水分解したタンパク質は選択されたｐＨ条件下で沈殿することが可能であり、ｐＨを、前記加水分解したタンパク質が沈殿するｐＨに変更すること、および前記沈殿したタンパク質を前記ペプチドから分離することを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ｃ）は、工程（ａ）の後および工程（ｂ）の前に行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記食品、飲料製品または栄養補助食品は、マーガリン、スプレッド、バター、乳製品あるいは乳漿含有飲料の群から選択される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰの生成に関する。
【背景技術】
【０００２】
高血圧症は、ヒトにおいて比較的一般的な疾患であり、循環器系疾患、腎不全および脳卒中に対して有力な危険因子を示す。カルシウム遮断薬、β遮断薬、利尿剤、α遮断薬、中枢αアンタゴニスト、アンジオテンシンＩＩアンタゴニストおよびＡＣＥインヒビターのような多様な医薬製品の利用可能性は、高血圧症に対する根本的な生理学的機構が多面的であることを例示する。
【０００３】
高血圧症の生理学的機能のうち、特に、レニン−アンジオテンシン機構は、多くの科学的注目を集めている。この機構では、アンジオテンシンが肝臓より分泌され、ペプチダーゼのレニンによって切断されて、生物学的に不活性なデカペプチドのアンジオテンシンＩを産出する。アンジオテンシンＩが肺毛細管を通過する時、アンジオテンシン変換酵素（以後、ＡＣＥと称する）と呼ばれるもう１つのペプチダーゼは、アンジオテンシンＩの最後の２残基（Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）を取り出すことによって、アンジオテンシンＩに作用し、オクタペプチドのアンジオテンシンＩＩを形成させる。アンジオテンシンＩＩオクタペプチドは、強力な血管収縮活性を示し、従って、血圧を上昇する。より低いレベルのアンジオテンシンＩＩをもたらすＡＣＥ阻害は、血管収縮および、従って、高血圧を防止する。
【０００４】
アンジオテンシンＩを切断することのほかに、ＡＣＥはまた、ブラジキニン（血圧調節にも参加するノナペプチド）を加水分解することができる。後者の機構では、ＡＣＥ阻害は、血管拡張を促進し、血圧も降下するブラジキニンのレベルの増加をもたらす。従って、ＡＣＥを阻害することは、少なくとも２つの個別の機構を介する血圧降下効果をもたらす。
【０００５】
オクタペプチドのアンジオテンシンＩＩが副腎皮質によるアルドステロンの放出を刺激することもまた公知である。アルドステロンのための標的器官は、腎臓であって、ここで、アルドステロンは腎尿細管からのナトリウムの再吸収（ｒｅａｂｓｏｒｂｔｉｏｎ）の増加を促進する。また、この第３の機構を介して、ＡＣＥ阻害は血圧を減少するが、しかしこの場合、ナトリウム再吸収を低減することによってである。
【０００６】
その複数の生理学的効果のため、ＡＣＥのタンパク質分解活性を阻害することは、血圧を減弱する有効な方法である。この観察は、カプトプリルおよびエナラプリルのような多くの有効な薬学的血圧降下製品を生じている（オンデッチ，Ｍ．Ａ．（Ｏｎｄｅｔｔｉ，Ｍ．Ａ．）ら、１９７７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ，１９６，４４１−４４４）。
【０００７】
高血圧症は比較的一般的な疾患状態であるため、温和に有効な天然成分によって、現代のライフスタイルのこのような所望されない結果を妨げることは有利であり得る。具体的には、そのような製品は定期的に消費されるため、食品または飲料製品に組み入れることができる温和に有効な天然成分。あるいは、そのような温和に有効な天然成分は、栄養補助食品に組み入れられ得る。最近の数十年間の間に、発酵乳に存在する特定のペプチドがＡＣＥ阻害能を有し、高血圧症被験体における血圧減少を誘導することができることが発見されている。今日、多数のインビトロおよび少数の動物治験が、様々なタンパク質供給源から得られる異なるペプチドのＡＣＥ阻害効果を実証している。インビトロＡＣＥ阻害アッセイは、多くの異なるペプチド配列を示しているが、ＡＣＥ阻害ペプチドは、血中を循環して、インビボ効果を発揮する必要があることを重要視すべきである。効果的なＡＣＥ阻害ペプチドは、消化管タンパク質分解消化系による分解に耐性であるべきであり、腸壁を超える以後の輸送の間、無傷（ｉｎｔａｃｔ）を保持すべきであることに意味がある。
【０００８】
多様なＡＣＥ阻害ペプチドの構造−機能研究は、それらが、しばしば、それらのＣ末端配列でＰｒｏ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−ＰｒｏまたはＡｌａ−Ｈｙｐを所有することを示唆している（マルヤマ，Ｓ．（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｓ．）およびスズキ，Ｈ．（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．）、１９８２年；Ａｇｒｉｃ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，４６（５）：１３９３−１３９４）。この所見は、ＡＣＥが、プロリンに関与するペプチド結合を切断することができないペプチジルジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５．１）であるという事実によって、一部説明される。従って、Ｘａａ−Ｐｒｏ結合を切断することができないため、構造Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを有するトリペプチドから、ジペプチドＰｒｏ−Ｐｒｏを取り出すことができない。従って、比較的高い濃度で存在する場合、Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ構造を有するトリペプチドがＡＣＥ活性を阻害すると考えられる。ＡＣＥだけではなく、ほとんどすべてのタンパク質分解酵素は、Ｘａａ−ＰｒｏまたはＰｒｏ−Ｐｒｏ結合の切断において差異を有するため、ペプチドのカルボキシ末端部における（複数の）プロリン残基の存在は比較的プロテアーゼ耐性な分子を生じるという観念は、ほとんど自明である。同様に、プロリンの代わりにヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）を含有するペプチドも比較的プロテアーゼ耐性である。このことから、それらのカルボキシ末端部に１つもしくはそれ以上の（ヒドロキシ）プロリン残基を担持するペプチドは、消化管におけるタンパク質分解から免れるようであることが推察され得る。これらの結論は、我々が、特定のＡＣＥ阻害ペプチドの顕著なインビボ血圧降下効果を理解するのに役立つ：それらは、ＡＣＥ阻害の構造要件を満たすだけではなく、それらはまた、消化管タンパク質分解消化系による分解に耐性であり、腸壁を超える以後の輸送の間、無傷（ｉｎｔａｃｔ）を保持する。
【０００９】
強力なＡＣＥ阻害活性が、トリペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（特開平２−３６１２７号公報）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（ＥＰ０５８３０７４号明細書）およびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，７８：７７７−７８３１９９５年））について報告されている。最初に、すべてのＡＣＥ阻害ペプチドを、ＡＣＥ活性に対するそれらのインビトロ効果に基づいて特徴付けしたところ、比較的低いＩＣ５０値を生じるそれらの強力なＡＣＥ阻害効果のため、トリペプチドＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以後、ＩＰＰと称される）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以後、ＶＰＰと称される）およびＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（以後、ＬＰＰと称される）が際立っていた。後に、トリペプチドＶＰＰならびにＩＰＰの推定された抗高血圧効果を、高血圧自然発症ラットにおいて確認することができた（ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）ら、Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，７８：１２５３１２５７（１９９５年））。これらの実験では、阻害トリペプチドは乳酸菌発酵乳から由来した。乳発酵の間、所望のペプチドが、増殖中の乳酸菌より産生されるプロテイナーゼによって産生される。この発酵アプローチの欠点は、乳酸菌が排出される酵素のタイプおよび量を制御することが困難な生体であることである。従って、ＡＣＥ阻害ペプチドの産生は再現性がほとんどなく、酵素の最適な組を、要求されるペプチドの最大収量を確実にするように産生させることもまたありそうにない。また、要求される発酵時間は比較的長く、低い収量と組み合わせて、生体活性ペプチドの所望されないコスト構造を意味する。さらに、発酵製品は、特に、固形食物へ直接組み入れることにはあまり適さず、官能特性への制限が厳格である。そのような発酵乳製品は味が損なわれること、およびそのような発酵ブロスからのＡＣＥ阻害ペプチドの回収中に遭遇する多くのプロセシングの問題点については、米国特許第６，４２８，８１２号明細書に記載されている。これらの欠点にもかかわらず、発酵乳製品は、経口的に投与される血管抑制因子（ｖａｓｏｄｅｐｒｅｓｓｏｒ）として実践的アプリケーションに向けられている。ＡＣＥ阻害ペプチドは、錠剤または薬用ドロップのような濃縮された栄養補助食品の形態でのそれらの市場活動を可能にするために、電気透析、中空糸膜透析またはクロマトグラフィー方法後に発酵乳製品から濃縮されている。
【００１０】
発酵生成経路の上記の欠点については、特に、特許出願、国際公開第０１／６８１１５号パンフレットおよびＥＰ１２３１２７９号明細書において認められた。後者の出願には、純粋な酵素プロセスにより、ミルクカゼインからトリペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏが回収されることが記載されている。該出願は、ミルクカゼインを含有する材料をプロテイナーゼおよびペプチダーゼで消化することによって、中間ペプチドを介して、これらのトリペプチドを生成するための方法を請求している。これらの酵素インキュベーションのそれぞれは、１２時間もの長時間を要し、微生物混入の副産物に好都合な条件下で行われ得る。ペプチダーゼとのインキュベーションの前に、好ましくは、中間ペプチドが、精製され、中間ペプチドのさらなるクロマトグラフィー精製後、高い最終濃度のＡＣＥ阻害ペプチドのみを得ることができる。これらの多様な欠点から考えて、抗高血圧ペプチドの高いかつ再現性のある収量を伴う薄味の製品を作製するより簡単かつ微生物学的により信頼し得る酵素経路が明らかに必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ペプチドＩＰＰおよびＶＰＰが高収量で作製されるプロセスに関する。プロセスは、好ましくは、単一の酵素インキュベーション工程を含んでなる。本プロセスは、適切なアミノペプチダーゼとの組み合わせでのタンパク質分解酵素またはプロリンのカルボキシ末端で切断するプロテアーゼ、好ましくは、プロリン（ｐｒｏｆｉｎｅ）特異的エンドプロテアーゼもしくはプロリン特異的オリゴペプチダーゼ、より好ましくは、プロリン特異的エンドプロテアーゼの使用を含んでなる。好ましくは、プロリン特異的エンドプロテアーゼのようなプロリンの末端で切断するプロテアーゼ、ならびにアミノペプチダーゼ活性は、混入するエンドプロテアーゼ活性を何ら含まない。好ましくは、プロリン特異的エンドプロテアーゼのようなプロリンの末端で切断するプロテアーゼ、ならびにアミノペプチダーゼ活性は、混入するカルボキシペプチダーゼ活性を含まない。混入するエンドプロテアーゼ活性を含まないプロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは、１を超える、より好ましくは、１００を超えるＰｒｏｌ  Ｓｐｅｃ  ａｃｔ／Ｅｎｄｏ比を有する酵素調製物である。混入するエンドプロテアーゼ活性を含まないアミノペプチダーゼ活性は、好ましくは、少なくとも０．１、より好ましくは、少なくとも０．５、最も好ましくは、少なくとも１のＡＰ／Ｅｎｄｏ比を有する酵素調製物である。カルボキシルペプチダーゼ活性を含有しないプロリン類特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは、少なくとも１、より好ましくは、少なくとも１０のＰｒｏ  Ｓｐｅｃ  ａｃｔ／ＣＰＤ比を有する酵素調製物である。
【００１２】
カルボキシルペプチダーゼ活性を含有しないアミノペプチダーゼ活性は、好ましくは、少なくとも０．１、より好ましくは、少なくとも０．３のＡＰ／ＣＰＤを有する酵素調製物である。上記の比は、実施例９に記載のとおりに決定される。
【００１３】
タンパク質配列に存在する好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、またはなおより好ましくは、少なくとも６０％および最も好ましくは、少なくとも７０％の−Ｉ−Ｐ−Ｐ−配列は、ペプチドＩＰＰに変換される。タンパク質配列に存在する好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、またはなおより好ましくは、少なくとも６０％および最も好ましくは、少なくとも７０％の−Ｖ−Ｐ−Ｐ−配列は、ペプチドＶＰＰに変換される。タンパク質配列に存在する好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、またはなおより好ましくは、少なくとも６０％および最も好ましくは、少なくとも７０％の−Ｌ−Ｐ−Ｐ−配列は、ペプチドＬＰＰに変換される。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、好ましくは、ポリペプチドのような大きなタンパク質分子またはタンパク質自体を加水分解することが可能である。本発明に従うプロセスは、一般に、２４時間未満のインキュベーション時間を有し、好ましくは、インキュベーション時間は１０時間未満、より好ましくは、４時間未満である。インキュベーション温度は、一般に、３０℃より高い、好ましくは、４０℃より高い、より好ましくは、５０℃より高い。ＩＰＰおよびＶＰＰの生成の間、有利には、ＬＰＰも形成される。本発明の別の態様は、他の加水分解したタンパク質（好ましくは、非アスパラギン酸プロテアーゼ、より好ましくは、セリンプロテアーゼによって加水分解される）からＡＣＥ阻害ペプチドを精製するプロセスである。加水分解したタンパク質の部分は、選択されたｐＨ条件下で沈殿する。精製プロセスは、ｐＨを、ｐＨ、ここで、従って、加水分解したタンパク質が部分的に沈殿する、に変更し、沈殿したタンパク質を溶液中のＡＣＥ阻害ペプチドから分離することを含んでなる。さらなる実施態様ＡＣＥ阻害ペプチドの効率的かつ簡便な回収では、加水分解したタンパク質は、水溶性溶媒と混合され、大量のタンパク質を沈殿する。
【００１４】
本発明はさらに、健康の改善または疾患の防止および／または処置のためのニュートラシューティカル、好ましくは、医薬品の製造のため、あるいは高血圧（高血圧症）、心不全、前糖尿病もしくは糖尿病、肥満、耐糖能異常またはストレスの処置または防止のためのニュートラシューティカル、好ましくは、医薬品の製造のための、これらのペプチド組成物の使用に関する。
【００１５】
好ましくは、本ペプチド組成物は、栄養補助食品の形態で、ローション、ゲルもしくは乳液の形態での局所アプリケーションを含むパーソナルケアアプリケーションの形態で、または食物、飲料、飼料もしくはペットフード成分として使用される。
【００１６】
本発明は、さらに以下を開示する。
・乾燥物において１５〜３０％（ｗ／ｗ）、好ましくは、１８％（ｗ／ｗ）より高い、より好ましくは、２０％（ｗ／ｗ）より高いプロリン含量を有する酸性または溶媒沈殿プロセスによって得られる高血圧の処置に適するペプチド組成物、
・以下を含んでなるペプチド組成物
５〜２０ｍｇ／ｇ  ＶＰＰ（乾燥物およびタンパク質において）、５〜２０ｍｇ／ｇ  ＩＰＰ（乾燥物およびタンパク質において）ならびに場合により５〜２０ｍｇ／ｇ  ＬＰＰ（乾燥物およびタンパク質において）、ならびに
・少なくともカルボキシ末端のプロリンを含有する１５〜５０％（ｗｔ乾燥物）ペプチドを含んでなり、少なくとも５ｍｇ／ｇ  ＶＰＰ（乾燥物およびタンパク質において）、少なくとも５ｍｇ／ｇ  ＩＰＰ（乾燥物およびタンパク質において）ならびに場合により少なくとも５ｍｇ／ｇ  ＬＰＰ（乾燥物およびタンパク質において）を含んでなるペプチド組成物。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼのｐＨ至適値のグラフ図を示す。
【図２】Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼのプロリン（ｐｒｏｆｉｌｅ）特異性を示す。
【図３】クロマトグラフィー精製されたＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーション後の無傷なオボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）および合成２７マーペプチドのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図４】合成基質Ｆ−ｐＮＡ、Ｑ−ｐＮＡおよびＶ−ｐＮＡに対するｐＨ６．０において試験した酵素調製物を含有する３つの市販のアミノペプチダーゼの相対活性を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１８】
有効なＡＣＥ阻害ペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端部で１もしくは２個のプロリン残基を組み入れるようである。同じ構造要件もまた、タンパク質分解に対して増加した耐性を伴うペプチドを与え、これによって、無傷なペプチドが最終的に血流にある可能性を増加する。それらのカルボキシ末端部で少なくとも単一、但し、好ましくは、複数個のプロリン残基を伴うペプチドを得るために、プロリン残基のカルボキシ末端側で切断することができるプロテアーゼの使用は、興味深い選択肢を付与する。いわゆるプロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）は、プロリン残基のカルボキシル側でペプチドを好適に切断する独特な可能性を有する。哺乳動物ならびに微生物供給源から単離されたすべての適切に特徴付けされたプロリン特異的プロテアーゼにおいて、酵素の活性部位から大きなペプチドを除外した独特なペプチダーゼドメインが単離されている。事実、これらの酵素は、約３０を超えるアミノ酸残基を含有するペプチドを分解することができず、そのため、これらの酵素は、現在、「プロリルオリゴペプチダーゼ」と称される（フロプ（Ｆｕｌｏｐ）ら：Ｃｅｌｌ、第９４巻、１６１−１７０、１９９８年７月２４日）。結果として、これらのプロリルオリゴペプチダーゼは、それらがそれらの加水分解作用を発揮し得る前に、他のエンドプロテアーゼによる広範な前加水分解を必要とする。しかし、国際公開第０２／４５５２３号パンフレットにおいて記載されるように、プロリルオリゴペプチダーゼとそのような別のエンドプロテアーゼとの組み合わせであっても、カルボキシ末端のプロリン残基を伴うペプチドの割合が有意に増強されたことを特徴とする加水分解物を生じる。このため、そのような加水分解物は、インビトロＡＣＥ阻害効果ならびに消化管タンパク質分解に対する改善された耐性を伴うペプチドの単離のための優れた出発点を形成する。これらの潜在的な利益にもかかわらず、本発明者らは、ＡＣＥ阻害ペプチドの回収のためのプロリン特異的プロテアーゼの使用だけでなく、ＩＰＰおよびＶＰＰの選択的な生産について明記した出願を知らない。
【００１９】
さらに、本発明は、プロリン特異的エンドプロテアーゼでタンパク質を５〜３８％のＤＨにまで加水分解することによって生成される可溶性ペプチドを含んでなる組成物を生成するためのプロセスに関する。本発明に従えば、多量のＩＰＰおよびＶＰＰを得るためのプロセスは、好ましくは、１０〜３８の間の加水分解の程度（ＤＨ）、より好ましくは、１５〜３５のＤＨ、最も好ましくは、２０〜３０のＤＨで得られ得る。本プロセスにおいて使用されるタンパク質は、好ましくは、乳タンパク質、より好ましくは、カゼインまたはカゼイン酸塩である。有利なことに、乳タンパク質は、それが本プロセスに使用される前は発酵しない。好ましくは、加水分解したタンパク質の不溶性部分を、選択されたｐＨ条件、好ましくは、酸性ｐＨ条件下、より好ましくは、３．５〜６の間のｐＨ、最も好ましくは、４〜５の間のｐＨで可溶性部分から分離し、可溶性ペプチドを含んでなる組成物を生じる。本発明の別の実施態様では、加水分解したタンパク質の不溶性部分の分離後、アミノペプチダーゼのみを添加する。
【００２０】
「ペプチド」または「オリゴペプチド」は、本明細書において、ペプチド結合を介して連結される少なくとも２アミノ酸の鎖として規定される。用語「ペプチド」および「オリゴペプチド」は、同義（共通認識される）とみなされ、各用語は、状況に応じて交換可能に使用することができる。「ポリペプチド」は、本明細書において、３０を超えるアミノ酸残基を含んでなる鎖として規定される。本明細書に記載のすべての（オリゴ）ペプチドおよびポリペプチドの式または配列は、定法に従い、アミノ末端からカルボキシ末端の方向で、左から右に記載される。本明細書において使用するアミノ酸の１文字コードは、当該分野において一般に公知であり、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）において見出すことができる。
【００２１】
ＩＵＭＢ由来のすべての酵素の分類および命名法についての国際的に認められたスキームは、プロテアーゼを含む。プロテアーゼＥＣ番号の更新されたＩＵＭＢテキストは、インターネットサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｑｍｗ／ａｃ．ｕｋ／ｉｕｂｍｂ／ｅｎｚｙｍｅ／ＥＣ３／４／１１／において見出すことができる。このシステムでは、酵素は、それらが単一の反応を触媒するという事実によって規定される。このことは、いくらかの異なるタンパク質が同じ酵素としてすべて記載され、１を超える反応を触媒するタンパク質が１を超える酵素として処置されるという重要な意味を有する。該システムにより、プロテアーゼはエンド−およびエキソプロテアーゼに分類される。エンドプロテアーゼは、内部のペプチド結合を加水分解するそれらの酵素であり、エキソプロテアーゼは、末端のα−アミノ基に隣接するペプチド結合（「アミノペプチダーゼ」）、または末端のカルボキシル基と最後から２番目のアミノ酸との間のペプチド結合（「カルボキシペプチダーゼ」）を加水分解する。エンドプロテアーゼは、触媒機構に基づいてサブサブクラスに分けられる。セリンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システインエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４）およびスレオニンエンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２５）のサブサブクラスが存在する。
【００２２】
アミノペプチダーゼはクラス３．４．１１である。サブ分類は、異なる２０アミノ酸が取り出される相対効率に基づく。狭いおよび広い特異性を伴うアミノペプチダーゼを識別することができる。アミノペプチダーゼは、タンパク質およびペプチド基質から単一のアミノ末端アミノ酸を連続的に取り出すことができる。狭い特異性を伴うアミノペプチダーゼは、基質ペプチドから解放されるＰ１位置におけるアミノ酸残基のタイプに対して強力な性能を示す。広い特異性のアミノペプチダーゼは、Ｎ末端またはＰ１位置（シェクター（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ）の命名法：シェクター，Ｉ．（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｉ．）およびベルガー，Ａ．（Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ．）、１９６７年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ２７：１５７−１６２に従う）における広範囲の異なるアミノ酸を放出することが可能である。カルボキシペプチダーゼは、タンパク質およびペプチド基質から単一のカルボキシ末端アミノ酸を連続的に取り出すことができる。エンドプロテアーゼの状況と同等に、カルボキシペプチダーゼは、触媒機構に基づいて、サブサブクラスに分類される。セリン型カルボキシペプチダーゼは、クラスＥＣ３．４．１６であり、メタロカルボキシペプチダーゼはクラスＥＣ３．４．１７であり、システイン型カルボキシペプチダーゼはクラスＥＣ３．４．１８である。プロテアーゼのためのＥＣリストの値は、多様なタイプのプロテアーゼ活性の標準的な用語を提供こと、および特に、それぞれのプロテアーゼに対する独特な識別番号および推奨される名称の割り当てにある。従って、ＥＣシステムの特定の長所は、クラス分類以外の用語体系の領域にある。
【００２３】
ＥＰ１２３１２７９号明細書には、純粋な酵素プロセスにより、ミルクカゼインからトリペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏが回収されることが記載されている。該出願は、ミルクカゼインを含有する材料をプロテイナーゼおよびペプチダーゼで消化し、配列Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを含有するがこの配列のＰｒｏ以外のＰｒｏを含有しないペプチドならびに配列Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを含有するがこの配列のＰｒｏ以外のＰｒｏを含有しないペプチドよりなる群から選択されるいわゆる「中間ペプチド」を介して、トリペプチドを生成するための方法を請求する。ＥＰ１２３１２７９号明細書の実施例において記載のように、方法は２工程プロセスに関与する。第１に、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏまたはＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏのいずれかを包含する中間ペプチドを生成する。このことは、カゼインを適切なプロテイナーゼでインキュベートすることによって行われる。実施例の１つに従って、３７℃において１２時間の期間。次いで、使用されるプロテイナーゼは、この第１の加水分解物を１００℃にまで３分間加熱することによって不活化し、元の状態に冷却した後、別の酵素調製物（事実上、エキソ型プロテアーゼ活性を伴う調製物）が添加される。３７℃でのこのような他の酵素調製物との別の１２時間のインキュベーション後、トリペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの存在が実証され得る。これらのＡＣＥ阻害ペプチドのより高い収量を得るために、ＥＰ１２３１２７９号明細書は、エキソ型プロテアーゼ活性への暴露の前に、中間ペプチドを精製および濃縮することをさらに示唆している。ＥＰ１２３１２７９号明細書はまた、中間ペプチドを得た後、および中間ペプチドを手順においてペプチダーゼと接触させる前に、例えば、５０００〜２００００ｒｐｍにおける３〜１０分間の遠心分離による非反応のタンパク質の取り出しのような多様な操作が、場合により実施され得ることを示唆している。このように、所望されるトリペプチドは、産業的にむしろ扱いにくい２工程酵素プロセスにおいて得られる。酵素インキュベーションのそれぞれは、ｐＨ４．５〜７．０、２５〜５０℃の温度で１２時間もの長い期間を要し得るため、微生物学的観点から許容され得ないこともまた明らかである。２５〜５０℃の低いインキュベーション温度と組み合わされたこれらの長期のインキュベーション時間は、タンパク質含有溶液の汚染を容易に生じ得る。
【００２４】
従って、本発明に従えば、ＩＰＰおよびＶＰＰは、中間産物の精製を伴わずに酵素的に生成される。ＥＰ１２３１２７９号明細書は、中間ペプチドがそれぞれＩｌｅ−Ｐｒｏ−ＰｒｏまたはＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ配列以外のＰｒｏを含有しない乳タンパク質をプロテイナーゼで消化する場合の中間ペプチドの形成について記載している。続いて、この中間ペプチドは別の酵素によってそれぞれＩＰＰまたはＶＰＰに変換される。高い収量を得るために、この中間ペプチドは、トリペプチドを変換する前にクロマトグラフィー精製される。本発明に従えば、中間ペプチドを精製することなく高い収量を得ることができる。
【００２５】
本発明のプロセスの好ましくは、少なくとも１０モル％、より好ましくは、少なくとも２０モル％、さらにより好ましくは、少なくとも３０モル％の可溶性ペプチドは、カルボキシ末端のプロリンを有する。特許出願、国際公開第０２／４５５２３号パンフレットには、このモル％を決定することができる仕方が記載されている。
【００２６】
本発明は、ニュートラシューティカル、好ましくは、医薬品としての使用のためのペプチド含有組成物に関する。本発明はまた、ニュートラシューティカル、好ましくは、医薬品としての本ペプチド含有組成物の使用、ニュートラシューティカル、好ましくは、医薬品の製造のための本ペプチド含有組成物の使用、健康の改善または疾患の防止および／もしくは処置のための本ペプチド含有組成物の使用、ニュートラシューティカル、好ましくは、医薬品の製造のための本ペプチド含有組成物の使用、高血圧症および心不全のような循環器系疾患の処置のための本ペプチド含有組成物の使用、前糖尿病または糖尿病の処置のための本ペプチド含有組成物の使用、肥満の処置または防止のための本ペプチド含有組成物の使用、血漿インスリンを増加するためまたは血漿インスリンに対する感受性を増加するための本ペプチド含有組成物の使用、血漿インスリンを増加するためまたは２型糖尿病もしくは前糖尿病の血漿インスリンの感受性を増加するための本ペプチド含有組成物の使用、２型糖尿病もしくは前糖尿病の血中における食後のグルコース濃度を降下させるための本ペプチド含有組成物の使用、２型糖尿病もしくは前糖尿病の血中における食後のインスリン分泌を増加させるための本ペプチド含有組成物の使用、本ペプチド含有組成物が栄養補助食品の形態である本ペプチド含有組成物の使用、ストレスの影響の治療的処置のための機能性食品の製造のための本ペプチド含有組成物の使用、局所アプリケーション、好ましくは、パーソナルケアアプリケーションにおける本ペプチド含有組成物の使用、ならびに飼料およびペットフードにおける本ペプチド含有組成物の使用に関する。
【００２７】
さらに、本発明は、１型および２型糖尿病の処置および前糖尿病、もしくは耐糖能異常（ＩＧＴ）を伴うそれらの個体における２型糖尿病の防止のための方法であって、そのような処置を必要とする被験体に本ペプチド含有組成物を投与することを含んでなる上記方法ならびに高血圧症もしくは心不全を患うヒトの処置またはその防止の方法であって、そのような処置を必要とする被験体に本ペプチド含有組成物を投与することを含んでなり、従って、血圧降下効果を示す上記方法に関する。ＡＣＥの阻害は、血管収縮の減少、血管拡張の増強、ナトリウムおよび水排泄の改善を生じ、次いで、末梢血管抵抗および血圧の減少ならびに局所血流量の改善をもたらす。従って、ペプチドを含んでなる本加水分解物は、高血圧症、心不全、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、末梢動脈閉塞症、アテローム性動脈硬化、腎症、腎機能不全、勃起障害、内皮機能障害、左室肥大、糖尿病性血管症、水分貯留、およびアルドステロン症を含むがこれらに限定されないＡＣＥ阻害の影響を受け得る疾患の防止および処置に特に有効である。組成物はまた、胃腸障害（下痢、過敏性腸症候群）、炎症、糖尿病、肥満、認知症、てんかん、老人性錯乱、およびメニエール病の防止および処置において有用であり得る。さらに、組成物は、認知機能および記憶（アルツハイマー病を含む）、飽満感を増強し、虚血障害を制限し、血管形成術のバイパス術後の動脈の再閉塞を防止し得る。
【００２８】
糖尿病は、これまでのところ治療方法のない広範に認められる慢性疾患である。糖尿病の発症率および有病率は指数的に増加しており、それは、先進国および発展途上国における最も一般的な代謝異常の１つである。糖尿病は、複数の原因に由来する複雑な疾患であり、インスリン分泌および／またはインスリン耐性の欠損に関連する炭水化物、タンパク質ならびに脂肪代謝の異常によって特徴付けられる。これは、非処置のまま放置すれば合併症をもたらす空腹時および食後血清グルコース濃度の上昇を生じる。この疾患には２つの主なカテゴリー、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｔ１ＤＭ）および非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、Ｔ２ＤＭ）が存在する。Ｔ１ＤＭ＝１型糖尿病。Ｔ２ＤＭ＝２型糖尿病。
【００２９】
Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭ糖尿病は、高血糖、高コレステロール血症および高脂血症に関連する。それぞれＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭにおける絶対的なインスリン欠損症およびインスリン非感受性は、肝臓、筋肉および脂肪組織によるグルコース利用の減少をもたらし、血中グルコースレベルの増加をもたらす。高血糖が管理されなければ、腎症、神経障害、網膜症、高血圧症、脳卒中、および心疾患を含む細小血管ならびに大血管症の危険率の増加による死亡率の増加および若年化に関連する。最近の証拠により、厳格な血糖コントロールがＴ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの両方におけるこれらの合併症の防止における主な要因であることが示された。従って、薬物または治療レジメンによる至適な血糖コントロールは、糖尿病の処置のための重要なアプローチである。
【００３０】
これらの測定が適切な血糖コントロールを維持することができない場合、Ｔ２ＤＭの治療は、最初に、食事および生活習慣の変更に関与し、患者は、経口血糖降下剤および／または外因性インスリンで処置される。Ｔ２ＤＭの処置のための現在の経口薬理学的薬剤の例として、インスリン分泌を強化するもの（スルホニル尿素系薬剤）、肝臓におけるインスリンの作用を改善するもの（ビグアナイド系薬剤）、インスリン抵抗性改善剤（チアゾリジンジオン類）およびグルコースの取り込みを阻害するために作用する薬剤（α−グルコシダーゼインヒビター類）が挙げられる。しかし、現在市販されている薬剤は、一般的に、膵細胞機能の進行的消失から生じる高血糖の進行的悪化による長期における適切な血糖コントロールを維持することができない。標的血糖レベルを維持し得ない患者の割合は経時的に顕著に減少し、付加的／代替的薬理学的薬剤の投与が必要とされる。さらに、薬物は、所望されない副作用を有し得、高い１次および２次失敗率に関連する。最終的に、血糖降下薬の使用は、血中グルコースレベルを制御するのに有効であり得るが、糖尿病のすべての合併症を防止するとは限らない。従って、すべてのタイプの糖尿病のための処置の現在の方法は、正常血糖の理想値および糖尿病合併症の防止を達成することができない。
【００３１】
従って、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの処置において好適な治療は本質的にインスリンおよび経口血糖降下薬の投与に基づくが、糖尿病の処置および防止のための最小限の副作用を伴う安全かつ効果的な栄養補助剤の必要性がある。多くの患者は、高用量の薬物に関連する副作用を最小限にし、付加的な臨床便益を得ることができる代替的治療に興味がある。糖尿病を伴う患者は、補助的処置として使用することができる温和な抗糖尿病効果を伴い、主な副作用を伴わない「天然物」とみなされる処置に特に興味がある。Ｔ２ＤＭは、インスリンの産生を担う膵臓細胞（ランゲルハンス島のβ細胞）に有意な損傷が生じるまで通常認識されない進行性かつ慢性の疾患である。従って、危険性のあるヒト、特に、Ｔ２ＤＭを発達する高い危険性にある高齢者におけるβ細胞の損傷、従って、明白なＴ２ＤＭへの進行を防止するために使用され得る栄養補助食品の開発に対する関心が高まっている。グルコースおよび脂質がβ細胞に対する損傷効果を発揮するため、膵臓β細胞の保護は、血中グルコースおよび／または脂質レベルを減少することによって達成することができる。血中グルコースレベルの減少は、異なる機構を介して、例えば、インスリン感受性を増強することおよび／または肝臓のグルコース産生を減少することによって、達成することができる。血中脂質レベルの減少はまた、異なる機構を介して、例えば、脂質酸化および／または脂質貯蔵を増強することによって、達成することができる。膵臓β細胞を保護するためのもう１つの可能なストラテジーは、酸化ストレスを減少することである。酸化ストレスはまた、インスリン分泌の以後の消失および明らかなＴ２ＤＭへの進行を伴うβ細胞損傷を生じる。
【００３２】
従って、Ｔ２ＤＭは、複数の器官部位において共存する欠損：筋肉および脂肪組織におけるインスリン作用に対する耐性、欠損性膵インスリン分泌、無制限な肝グルコース産生から生じる合併疾患である。それらの欠損は、しばしば、脂質異常および内皮機能障害に関連する。Ｔ２ＤＭにおいて複数の病態生理学的病巣がある場合、併用用法がその管理に対する魅力的なアプローチである。
【００３３】
本発明は、本発明のペプチド含有組成物を含んでなる新規のニュートラシューティカル組成物に関する。本発明のペプチド含有組成物を含んでなるニュートラシューティカル組成物はまた、糖尿病、もしくはＸ症候群のような耐糖能異常に関連する他の病態の処置または防止のための有効成分として加水分解されていないタンパク質および炭水化物を含んでなることができる。別の態様では、本発明は、前記処置または防止のための栄養補助剤、例えば、正常な代謝機能の維持に必須であるが、身体では合成されないビタミン類およびミネラル類を含んでなる総合ビタミン製剤への添加剤のような組成物の使用に関する。なお別の態様では、本発明は、１および２型糖尿病の両方の処置ならびに前糖尿病、または耐糖能異常（ＩＧＴ）または肥満を伴うそれらの個体におけるＴ２ＤＭの防止のための方法であって、そのような処置を必要とする被験体に、本発明のペプチド含有組成物ならびにタンパク質加水分解物もしくは加水分解されていないタンパク質および／または炭水化物を投与することを含んでなる、上記方法に関する。
【００３４】
本発明の組成物は、特に、Ｔ１ＤＭおよびＴ２ＤＭの両方の処置、ならびに前糖尿病、または耐糖能異常（ＩＧＴ）を伴うそれらの個体におけるＴ２ＤＭの防止を目的とする。
【００３５】
本ペプチド含有組成物は、２型糖尿病または前糖尿病について、好ましくは、食後グルコース濃度を降下するかまたは血中における食後インスリン分泌を増加するために使用することができることが見出されている。
【００３６】
ペプチドおよび場合により炭水化物を含んでなる組成物は、インスリン分泌を刺激し、脂肪組織、骨格筋および肝臓のようなインスリン感受性標的組織に対するグルコース処理を増加し、従って、糖尿病の処置における相乗効果を提供する。
【００３７】
一般的に、ストレス関連疾患、および身体に対するストレスのネガティブな効果は、多くのヒトに顕著な影響を与えることが認識されている。近年では、ストレスの影響、およびその多様な疾患および病態の発達に対する寄与については、医学的および科学的共同体においてより広範に受容されている。現在、これらの潜在的な問題を認知し、彼らの健康に対するストレスの可能なネガティブな影響を減少または防止することについて興味を示す消費者らが増加している。
【００３８】
本発明のさらなる目的は、身体がストレスの影響を処理することを助ける際の使用に適する食品、または食品に組み入れられ得る成分を提供することである。
【００３９】
さらなる目的は、身体がストレスのネガティブな影響を処理することを助けるような健康的便益を提供する本ペプチド含有組成物を含んでなる食品を提供することである。
【００４０】
本明細書において使用するニュートラシューティカルという用語は、アプリケーションの栄養および薬学的分野の両方における有用性を示す。従って、新規のニュートラシューティカル組成物は、食物および飲料への補助剤、およびカプセルもしくは錠剤のような固体剤、または溶液もしくは懸濁液のような液剤であり得る腸あるいは非経口的適用のための薬学的処方物あるいは医薬品としての用途が見出され得る。上記から明らかであるように、ニュートラシューティカル組成物という用語もまた、本ペプチド含有組成物および場合により炭水化物ならびに補助組成物、例えば、上記の有効成分を含んでなる栄養補助食品を含んでなる食物ならびに飲料を含んでなる。
【００４１】
本明細書において使用する栄養補助食品という用語は、食事を補助することを目的とした「食品成分」を含有する経口的に摂取される製品を示す。これらの製品における「食品成分」は、次のものを含み得る：ビタミン類、ミネラル類、ハーブ類または他の植物性薬品、アミノ酸、ならびに酵素、器官組織、腺、および代謝物のような物質。栄養補助食品はまた、抽出物または濃縮物であり得、錠剤、カプセル、ソフトゲル、ゲルキャップ、液体、または粉末のような多くの形態であってもよい。それらはまた、棒（但し、それらが存在する場合）のような他の形態でもあり得、栄養補助食品のラベル上の情報は、一般に、従来の食物としてまたは食べ物もしくは食事の１品目として製品を提示するものではない。
【００４２】
総合ビタミンおよびミネラル補給剤を、本発明のニュートラシューティカル組成物に添加して、いくつかの食事において損なわれている適切な量の必須栄養物を得てもよい。総合ビタミンおよびミネラル補給剤はまた、糖尿病において時々観察される生活習慣のパターンおよび一般的に不適切な食事による栄養物の消失および欠乏に対する疾患の防止ならびに保護に有用であり得る。さらに、酸化ストレスは、インスリン耐性の発達に関係している。活性酸素種は、インスリン受容体シグナル伝達カスケードを妨げることによって、インスリン刺激性グルコース取り込みを損傷し得る。α−トコフェロール（ビタミンＥ）、アスコルビン酸（ビタミンＣ）のような抗酸化剤による酸化ストレスの制御は、糖尿病の処置において価値があり得る。従って、総合ビタミン補給剤の摂取は、上記の原薬に加えられ、良好に均衡化された栄養物を維持し得る。
【００４３】
さらに、本ペプチド含有組成物とマグネシウム（Ｍｇ２＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）および／またはカリウム（Ｋ＋）のようなミネラル類との組み合わせは、健康の改善ならびに循環器系疾患および糖尿病を含むがこれらに限定されない疾患の防止および／または処置のために使用され得る。
【００４４】
本発明の好適な態様では、本発明のニュートラシューティカル組成物は、本ペプチド含有組成物を含有する。ＩＰＰおよびＶＰＰの両方とも、本発明に従う組成物において、それが投与されるべき被験体の体重１ｋｇあたり約０．００１ｇ〜体重１ｋｇあたり約１ｇの１日用量を提供するような用量で、適切に存在する。食物または飲料は、それぞれ、１サービングあたり約０．０５ｇ〜１サービングあたり約５０ｇのＩＰＰおよびＶＰＰを適切に含有する。ニュートラシューティカル組成物が薬学的処方物である場合、そのような処方物は、１用量単位、例えば、１カプセルもしくは錠剤あたり約０．００１ｇ〜約１ｇ、または液剤の１日用量あたり約０．０３５ｇ〜１日用量あたり約７０ｇの量で、それぞれ、ＩＰＰおよびＶＰＰを含有してもよい。本ペプチド含有組成物は、本発明に従う組成物において、それが投与されるべき被験体の体重１ｋｇあたり約０．０１ｇ〜体重１ｋｇあたり約３ｇの１日用量を提供するような量で、適切に存在する。食物または飲料は、１サービングあたり約０．１ｇ〜１サービングあたり約１００ｇのタンパク質加水分解物を適切に含有する。ニュートラシューティカル組成物が薬学的処方物である場合、そのような処方物は、１用量単位、例えば、１カプセルもしくは錠剤あたり約０．０１ｇ〜約５ｇ、または液剤の１日用量あたり約０．７ｇ〜１日用量あたり約２１０ｇの量で、ペプチド含有組成物を含有してもよい。
【００４５】
本発明のなお別の好適な態様では、組成物は、上記のような本ペプチド、および場合により、炭水化物を含んでなる。炭水化物は、本発明に従う組成物において、それが投与されるべき被験体の体重１ｋｇあたり約０．０１ｇ〜体重１ｋｇあたり約７ｇの１日用量を提供するような量で、適切に存在する。食物または飲料は、１サービングあたり約０．５ｇ〜１サービングあたり約２００ｇの炭水化物を適切に含有する。ニュートラシューティカル組成物が薬学的処方物である場合、そのような処方物は、１用量単位、例えば、１カプセルもしくは錠剤あたり約０．０５ｇ〜約１０ｇ、または液剤の１日用量あたり約０．７ｇ〜１日用量あたり約４９０ｇの量で、炭水化物を含有してもよい。
【００４６】
用量範囲（７０ｋｇのヒトについて）
ＶＰＰおよびＩＰＰ：０．００５〜７０ｇ／日（それぞれ）
タンパク質加水分解物：０．０７〜２１０ｇ／日
加水分解されていないタンパク質：０．０７〜２１０ｇ／日
炭水化物：０．１〜４９０ｇ／日
【００４７】
本発明の目的は、健康的便益を、それを消費する被験体に提供するために使用することができる食用材料を提供することである。なおさらなる目的は、単離された形態かまたは食品に組み入れられたかいずれかで、従来摂取され得るような食用材料を提供することである。
【００４８】
本発明のさらなる目的は、体重管理プログラムにおける使用に適する食品、または食品に組み入れられ得る成分を提供することである。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、例えば、ＡＣＥ阻害を介して循環器系の健康を維持することを助けるのに適する食品、または食品に組み入れられ得る成分を提供することである。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、許容可能な安定性および／または官能特性、特に、苦味がないまたは許容のレベルであるような良好な品位を有する食品、または食品に組み入れられ得る成分を提供することである。
【００５１】
さらなる目的は、肥満の防止／体重管理を援助することおよび／または循環器系の健康の維持を助けることのような健康的便益を提供する高濃度の成分を有する食品を提供することである。
【００５２】
意外なことに、１つもしくはそれ以上のこれらの目的は、消費時に健康的便益を提供する食品の調製のための本ペプチド含有組成物の使用により本発明に従って達成される。
【００５３】
第１の態様に従えば、本発明は、肥満の防止または体重管理のための機能性食品の製造のための本ペプチド含有組成物の使用を提供する。
【００５４】
第２の態様に従えば、本発明は、循環器系健康維持のための機能性食品の製造のための本ペプチド含有組成物の使用を提供する。
【００５５】
循環器系健康維持がアンジオテンシン変換（ＡＣＥ）酵素の阻害および／または血中グルコースレベルの管理を含んでなることは、本発明に従って特に好適である。
【００５６】
第３の態様に従えば、本発明は、健康的便益をその消費者に提供し（前記健康的便益は肥満の防止、体重管理および循環器系健康維持から選択される）、本ペプチド含有組成物を含んでなることが可能な機能性食品を提供する。
【００５７】
本発明に従うペプチド含有組成物のさらなる利点は、このペプチド含有組成物を、簡便に食品に組み入れ、その安定性および／または官能特性に許容できないほどに影響を及ぼすことなく、機能性食品を生成することができることである。
【００５８】
本発明に従う「健康的便益薬剤」は、摂取される場合、健康の局面にポジティブな影響を及ぼす健康的便益を提供するか、または良好な健康の局面を維持することを助ける材料であって、良好な健康のこれらの局面は、肥満の防止、体重管理および循環器系健康維持である。「健康的便益」とは、健康の局面にポジティブな影響を及ぼすかまたは健康の局面を維持することを助けることを意味する。
【００５９】
本発明に従う「機能性食品」は、食品の消費者の顕著な健康的便益が得られるように、本発明のペプチド含有組成物が有効量で成分として使用されるヒトでの消費に適する食品（錯誤回避のため飲料も含む）として規定される。
【００６０】
本明細書において使用する用語「含んでなる」は、この用語の後に記載される要素に限定するのではなく、機能的重要性が大きいまたは小さい指定されていない要素も包含する。換言すれば、列挙される工程、要素または選択肢については、そのすべてを取り上げる必要はない。語「含む」または「有する」が使用される場合、これらの用語は、上記で規定される「含んでなる」に等価であるとみなされる。
【００６１】
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットは、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）から入手可能なプロリン特異的プロテアーゼについて説明している。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の酵素は、好ましくは、プロリンのカルボキシ末端で切断するが、ヒドロキシプロリンのカルボキシ末端でも切断することができ、アラニンのカルボキシ末端であればより低い効率を伴う。国際公開第０２／４５５２４号パンフレットはまた、このＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の酵素と他の微生物または哺乳動物供給源由来の既知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間には、明確な相同性が存在しないことを教示している。既知のプロリルオリゴペプチダーゼとは対照的に、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素は酸性側のｐＨ至適値を有する。既知のプロリルオリゴペプチダーゼならびにＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の酵素はいわゆるセリンプロテアーゼであるが、本発明者らは、実施例１において、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素が、完全に異なるサブファミリーに属することを示している。分泌型Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素は、ほとんどのサイトゾル中のプロリルオリゴペプチダーゼが分類されているＳ９ファミリーではなく、セリンペプチダーゼのファミリーＳ２８のメンバーであると思われる（ローリングズ，Ｎ．Ｄ．（Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｎ．Ｄ．）およびバレット，Ａ．Ｊ．（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１２９８（１９９６年）１−３）。実施例２では、本発明者らは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的プロテアーゼのｐＨおよび温度至適値を示している。実施例３では、本発明者らは、本発明のプロセスにおいて使用されるようなＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物が、極めて狭い基質特異性を示すことを実証しており、これは、純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼに固有のエンド型プロテアーゼ活性以外の有意なエンド型プロテアーゼ活性は存在しないことを意味する。本発明者らはまた、本発明に従って使用される本発明者らのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物が、エキソ型プロテアーゼ、より特異的なアミノペプチダーゼ副活性を何ら含有しないことを実証している（実施例９を参照のこと）。本出願の実施例４では、本発明者らは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）酵素が、オリゴペプチダーゼではなく、副成分のエンドプロテアーゼの必要性を伴わずに無傷なタンパク質、大きなペプチドならびにより小さなペプチド分子を加水分解することが可能な真のエンドペプチダーゼであることを示している。この新たなおよび意外な所見により、カルボキシ末端のプロリン残基を伴うこれまでにない高含量のペプチドを伴う加水分解物を作製することができるほどに、副成分のエンドプロテアーゼの使用を除外することが可能である。さらに、副成分のエンドプロテアーゼの除外は、大量の基質タンパク質の効率的な取り出しを達成するのに好適である。結果として、極めて高いプロリン含量を特徴とする高度に濃縮されたＡＣＥ阻害ペプチド混合物が得られる。そのような新たな加水分解物が、異なるタンパク質性出発材料（それは植物由来であってもま���は動物由来であってもよい）から調製することができる。そのような出発材料の例には、乳清タンパク質、乳清β−ラクトグロブリン、乳清α−ラクトアルブミン、カゼイン、単離されたカゼイン画分、ゼラチン、魚または卵タンパク質、ポテトタンパク質、コムギおよびトウモロコシグルテン、ダイズおよびエンドウタンパク質、イネタンパク質ならびにルピナスタンパク質がある。高含量のプロリンならびにヒドロキシプロリンを伴うゼラチンのような基質から、カルボキシ末端のプロリンまたはヒドロキシプロリン残基のいずれかを伴うこれまでにない高含量のペプチドを伴う加水分解物を作製することができる。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素（既知のプロリルオリゴペプチダーゼのような）酵素は、Ｐｒｏ−ＰｒｏまたはＰｒｏ−Ｈｙｐ、Ｈｙｐ−ＰｒｏまたはＨｙｐ−Ｈｙｐ結合を切断することができないため、アプローチはまた、２、３もしくはなおそれ以上のカルボキシ末端のプロリンまたはヒドロキシプロリン残基を有するこれまでにない高含量のペプチドを含有する加水分解物を生じる。明らかに、タンパク質性出発材料の性質およびプロリン含量は、そのようなペプチドを作製する可能性に影響する。好適な基質は、カゼイン、ゼラチン、コムギおよびトウモロコシグルテン類のような６％を超えるプロリン（即ち、１００グラムのタンパク質あたり６グラムを超えるこのアミノ酸）を含有する基質である。そのようなカルボキシ末端のアミノ酸配列を担持するペプチドは、消化管におけるタンパク質分解活性に対して存続する十分な可能性を有することが予想できるという事実から考えて、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼとのインキュベーションによって作製される加水分解物は、既知の生物学的に活性なペプチドの単離ならびに新規の生物学的に活性なペプチドの単離のための優れた出発材料を提供する。ナトリウムは、高血圧症において役割を果たすことが公知であるため、ＡＣＥ阻害ペプチドの生成のための好適な基質は、これらのタンパク質のナトリウム塩ではなく、アンモニア、カルシウム、マグネシウムおよびカリウム塩である。
【００６２】
本発明に従うプロセスは、プロリン特異的エンド活性（それは、中性のｐＨ至適値を伴うプロリン特異的オリゴペプチダーゼであってもまたは酸性のｐＨ至適値を伴うプロリン特異的エンドプロテアーゼであってもよく、アミノペプチダーゼ活性と組み合わされる）の活性に帰着する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼのｐＨ至適値は、約４．３である。（図１を参照のこと）。この低いｐＨ至適値のため、ウシミルクカゼイン酸塩とＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼとをインキュベートすることは、自明ではない。ウシミルクカゼイン酸塩は、ｐＨが６．０未満に低下する場合、沈殿し、このｐＨ値で、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）酵素は限られた活性のみを有する。ここで、本発明者らは、このようなむしろ所望されない条件下であっても、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼとのインキュベーションは、いくらかのＡＣＥ阻害ペプチドを産出し得ることを示している。本発明に従えば、ＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰおよびＬＰＰは、カゼインにおいて理論的に存在する量の７０％に相当する収量で生成される。かなり意外なことに、ＡＣＥ阻害ペプチドＶＰＰは、アミノペプチダーゼ活性が存在しない場合、生成されない。この場合、ＶＰＰ前駆体のＶＶＶＰＰのみが、高い収量で生成される。本発明者らはまた、ここで、プロリン特異的プロテアーゼとの組み合わせでアミノペプチダーゼ活性が存在する場合、ほとんど１００％の収量でＶＰＰが生成されることを示している。これらの結果は、単純な１工程酵素プロセスにおいて、ならびに微生物の混入の可能性を最小限にする条件下でカゼイン酸とＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来エンドプロテアーゼおよびアミノペプチダーゼをインキュベートする時に得られる。
【００６３】
タンパク質を含有する水溶液は、特に、５．０を超えるｐＨ値および５０℃もしくはそれ以下の温度で何時間も保持される場合、微生物感染を高度に受け易い。具体的には、そのような長期のインキュベーション工程中に産生され得、その後の加熱工程後も存続するようであり、食品用加工処理を潜在的に脅かす微生物毒素である。ＥＰ１２３１２７９号明細書に記載の条件とは異なり、本発明に従うプロセスは、好ましくは、５０℃を超えるインキュベーション温度を使用する。酵素インキュベーションが２４時間未満、好ましくは、８時間未満、より好ましくは、４時間未満の期間行われる１工程の酵素プロセスとの組み合わせで、本発明に従うプロセスは、改善された微生物学的安定性の利点を付与する。
【００６４】
ウシミルクカゼインには、β−カゼインおよびκ−カゼインを含む異なる多くのタンパク質が組み入れられる。既知のアミノ酸配列に従えば、β−カゼインは、ＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。κ−カゼインはＩＰＰのみを包含する。実施例５では、本発明者らは、カゼイン酸カリウムとＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼとをインキュベートすると、高い収量で既知のＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰならびにＬＰＰが作製されることを示している。高い温度条件との組み合わせで本酵素−基質比を使用すると、ＩＰＰおよびＬＰＰの削除は３時間のインキュベーション期間内に完了する。かなり意外なことに、有意な量のトリペプチドＶＰＰの同時生成は実証することができない。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素が有意なアミノペプチダーゼ活性を含有しないという事実（実施例９を参照のこと）は、形成されるＩＰＰが、κ−カゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）に存在する−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−配列から放出されることを強く示唆する。おそらく、ＩＰＰのペプチド結合のカルボキシ末端側は、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼの主要活性によって切断される一方、前方のＡｌａ−Ｉｌｅ結合の切断は、そのＡｌａ特異的副活性によって達成される。
【００６５】
従って、本発明では、先行技術のプロセスにおけるよりも生じる水溶性ペプチドの数が少ない。これらの水溶性ペプチドのうち、ＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰが大量に存在する。このことは、しばしばそれほど活性ではない他の多くの化合物を伴わない高濃度のＩＰＰおよびＬＰＰ化合物が必要とされる場合、特に重要である。
【００６６】
本プロセスに従えば、タンパク質において存在する−Ａ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−、−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−または−Ａ−Ｖ−Ｐ−Ｐ−配列の好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、最も好ましくは、少なくとも４０％は、それぞれ、ＩＰＰ、ＬＰＰまたはＶＰＰに変換される。さらに、本プロセスに従えば、タンパク質において存在する−Ｐ−Ｌ−Ｐ−Ｐ−または−Ｐ−Ｉ−Ｐ−Ｐ−または−Ｐ−Ｖ−Ｐ−Ｐ−配列の好ましくは、少なくとも２０％、より好ましくは、少なくとも３０％、なおより好ましくは、少なくとも４０％、最も好ましくは、少なくとも５０％は、それぞれ、ＬＰＰまたはＩＰＰまたはＶＰＰに変換される。
【００６７】
上記には、好ましくは、−Ａ−または−Ｐ−残基が、−Ｉ−Ｐ−Ｐ、−Ｖ−Ｐ−Ｐまたは−Ｌ−Ｐ−Ｐ配列（より前方）のタンパク質Ｎ末端側のアミノ酸配列に存在することが記載されている。
【００６８】
本発明に従えば、−Ａ−または−Ｐ−残基と−Ｉ−、−Ｖ−または−Ｌ−残基との間には、好ましくは、０〜５アミノ酸残基が存在し得る。加水分解時、タンパク質は、プロリン特異的プロテアーゼにより−Ａ−または−Ｐ−残基のＣ末端ならびに−Ｐ−Ｐ−配列のＣ末端で切断される。続いて、−Ｉ−Ｐ−Ｐ、−Ｖ−Ｐ−Ｐまたは−Ｌ−Ｐ−Ｐ配列より前方のアミノ酸が、アミノペプチダーゼによって１つずつ取り出される。アミノペプチダーゼはＩ−Ｐ、Ｖ−ＰまたはＬ−Ｐペプチド結合を切断することができないため、Ｉ−Ｐ−Ｐ、Ｖ−Ｐ−ＰまたはＬ−Ｐ−Ｐ配列は無傷（ｉｎｔａｃｔ）のままである。例えば、２アミノ酸−Ｖ−Ｖ−が、カゼインのアミノ酸配列において−Ｐ−と−Ｖ−Ｐ−Ｐ−との間に存在する場合、最初に、配列は、プロリン特異的エンドプロテアーゼによって−Ｐ−および−Ｐ−Ｐ−より後方で切断され、続いて、２個のバリン（Ｖ）残基がアミノペプチダーゼによって取り出され、ＶＰＰを生じる。
【００６９】
実施例６では、本発明者らは、新規かつ意外な精製工程による５倍の精製効果を例示している。このプロセスでは、加水分解物を、５５℃、ｐＨ６．０での短い酵素インキュベーション中に形成させ、続いて、８０℃を超える温度に加熱して、すべての混入している微生物を死滅させ、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドペプチダーゼを不活化させる。続いて、加水分解物を緩除に酸性化し、４．５または少なくとも５．０未満へｐＨ降下を実現する。それが酵素の至適条件を示すためにＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドペプチダーゼを不活化するために使用することができないこのｐＨ値では、より小さなペプチドのみが溶液に残るように、カゼイン酸由来のすべての大きなペプチドが沈殿する。好ましくは、酸性化された混合物を低温で数時間保持し、できるだけ多くのタンパク質および非ＡＣＥ阻害ペプチドを沈殿させる。沈殿したカゼイン酸を、デカンテーションまたはろ過工程または低速（即ち、５０００ｒｐｍ未満）遠心分離により容易に取り出すことができる場合、水相は、存在するタンパク質の量に対して高い割合の生物活性ペプチドを含有する。ケルダール（Ｋｊｅｌｄａｈｌ）のデータに従えば、８０〜７０％のカゼイン酸タンパク質が、ＡＣＥ阻害ペプチドの４〜５倍精製を黙示する低速遠心分離工程によって取り出される。場合により、精製は、以後の限外ろ過工程によってさらに改善することができる。本発明者らはまた、この精製原理が、カゼイン以外のタンパク質性材料から得られる生物学的に活性なペプチドを得るために有利に適用され得ることを発見した。また、適切な微生物によって発酵されるタンパク質を、本プロセスに従って分離および精製することもできる。基質が沈殿し、酵素がなお活性である値に近いｐＨ値で酵素および基質をインキュベートすることにより、この精製工程が可能になる。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリルエンドプロテアーゼの低いｐＨ至適値のため、ｐＨ１．５〜６．５の間の範囲の基質沈殿を考慮することができる。それらの特定の沈殿挙動を考慮すると、ｐＨ３．５を超えてのグルテン沈殿、ｐＨ３．５を超えておよびｐＨ６．０未満での乳清タンパク質沈殿、ｐＨ３．５を超えておよびｐＨ５．０未満での卵白沈殿は、加水分解したタンパク質が沈殿する条件の例であり、沈殿したタンパク質は、加水分解したタンパク質またはペプチドから分離することができる。加水分解物の可溶性画分もまた、加水分解物という表現に含まれる。この酸可溶性加水分解物は、本発明に従うタンパク質の加水分解によって、続いて、可溶性の加水分解された部分を可溶性ペプチドから分離することができるように酸性条件を修正することによって、形成される。この分離は、例えば、不溶性部分の沈降または遠心分離によって行うことができる。グルテン加水分解物では、酸性分離条件は、好ましくは、ｐＨ＝４であり、乳清加水分解物では、酸性条件は、好ましくは、ｐＨ＝４．５であり、カゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）加水分解物では、酸性条件は、好ましくは、ｐＨ＝４．５であり、卵白では、酸性条件は、好ましくは、ｐＨ＝５．０である。一般に、分離のための好適な酸性条件はｐＨ＝４．５である。
【００７０】
加水分解物とは、タンパク質の加水分解によって形成される産物（または簡潔なタンパク質加水分解物もしくは加水分解したタンパク質）、可溶性ペプチド含有組成物（または可溶性ペプチドを含んでなる組成物）としてもまた本明細書に記載のタンパク質加水分解物の可溶性画分である酸可溶性加水分解物、あるいはタンパク質加水分解物と酸可溶性加水分解物との混合物を意味する。
【００７１】
ニュートラシューティカルアプリケーションならびに食物および飲料アプリケーションでは、本発明の加水分解物が有利に使用される。タンパク質加水分解物、酸−溶解性加水分解物ならびにそれらの混合物は、ニュートラシューティカルアプリケーション、食物アプリケーションまたは飲料において使用することができる。存在する高含量の活性なペプチドのため、好ましくは、酸可溶性加水分解物は、ニュートラシューティカルアプリケーション、食物アプリケーションまたは飲料において使用される。チーズ作製プロセスにおいてもカゼインカードを乳清タンパク質から分離するために同じ原理が使用されるが、チーズ作製プロセスでは、アスパラギン酸エンドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２３）のみが利用される。この酵素クラスには、キモシンのような周知のチーズ作製酵素および哺乳動物ペプシンのような多様なペプシンならびにアスペルギロペプシンおよびムコールペプシンのような多様な微生物ペプシンが組み入れられる。本出願では、チーズ作製プロセスにおけるカードは、加水分解物ではないと規定される。さらに、上記で規定されるように、非アスパラギン酸エンドプロテアーゼによって生成される加水分解物のための本発明に従う精製プロセスは公知ではない。
【００７２】
チーズ作製プロセスまたはカード／乳清分離プロセスは、本発明の精製プロセスには含まれないことから、本精製プロセスは可溶性ペプチドを得るために指向されるが、但し、このプロセスは、チーズ作製プロセスの一部でもまたはカード／乳清分離プロセスでもない。
【００７３】
チーズ作製のプロセスを伴うこの精製工程の外面的類似にもかかわらず、それは完全に異なる。チーズ作製では、カード形成は、酵素工程（「レンネット処理」）または酸性化工程のいずれかにより開始される。しかし、レンネット処理プロセスは、酸性化に依存せずに進行する一方、酸性化によるチーズカード凝固は、酵素に依存せずに進行する。
【００７４】
代替的精製方法では、ＡＣＥ阻害ペプチドは、エタノール、アセトン、プロパノール−１、プロパノール−２、メタノールまたはそれらの混合物のような水混和性溶媒を使用して簡便かつ効率的に取り出される。このアプローチでは、より大きなタンパク質が沈殿し、小さなＡＣＥ阻害ペプチドが溶液に残留するように、タンパク質加水分解物は、好ましくは、選択されたｐＨ条件下で３０〜６０％（ｖ／ｖ）の水混和性溶媒と注意深く混合される。
【００７５】
酸性化または溶媒添加工程のいずれかの間に形成される沈殿物を取り出すためのデカンテーション、ろ過もしくは低速遠心分離後、生物学的に活性なペプチドを含有する上清を回収することができる。場合により、さらなるろ過工程、続く、噴霧乾燥工程と組み合わされる以後のエバポレーションは、高い生物活性および良好な水溶解度を伴う食品用ペーストまたは粉末を得るための経済的な経路を生じる。本発明の実施態様の１つに従えば、これらの可溶性ペプチドを、アミノペプチダーゼで加水分解して、ＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰ含有加水分解物を生成させることができる。アミノペプチダーゼと組み合わされたプロリン特異的プロテアーゼによるカゼイン酸の消化時に、ＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰに富む高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドを伴う白色および無色の粉末が得られる。得られる調製物は、極めて高いプロリン含量を有する。プロリンは最も疎水性のアミノ酸の１つであるため、この調製物の極めて高いプロリン含量は予想外である。
【００７６】
実施例７では、本発明者らは、少なくとも３つの異なる市販の酵素調製物が、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的プロテアーゼによって形成される前駆体ペプチドをＡＣＥ阻害トリペプチドに転換するために必要なアミノペプチダーゼ活性を含有することを実証している。実施例８では、本発明者らは、実際に、プロリン特異的プロテアーゼとこれらの市販の酵素調製物との組み合わせが、単一の酵素インキュベーション工程で高収量のＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを作製することができることを証明している。実施例６に記載の酸性沈殿との組み合わせで、ＡＣＥ阻害ペプチドの高度に濃縮された混合物が得られる。正しいトリペプチド濃度に適切に希釈される場合、ＡＣＥ阻害特性を伴うすべての種類の食物および飲料を与えるのに適切な優れた嗜好性を伴う汎用出発材料が得られる。必要であれば、生物活性成分の濃度を、ペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰの極めて高い疎水性特徴を利用する以後の精製によって、さらに増加させることができる。好適な精製方法として、ナノろ過、例えば、ブタノールによる抽出、続いて、エバポレーション／沈殿または得られる酸性化加水分解物と活性炭のようなバインダもしくはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＸＡＤレンジ（Ｒｏｈｍ）由来のクロマトグラフィー樹脂とを接触させることが挙げられる。また、Ｐｈａｒｍａｃｉａより供給されるようなブチルセファロース樹脂を使用することもできる。そのような材料からのＡＣＥ阻害ペプチドの脱着は、メタノール／エタノール混合物のような有機溶媒またはプロパノールによって行うことができる。さらに、ＣＯ２またはＮ２Ｏを使用する超臨界抽出を使用して、高度に精製された生物活性ペプチドを得ることができる。実施例９では、本発明者らは、本発明に従って使用される本発明者らのＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物が、有意なレベルの混入するエンドプロテアーゼならびにアミノ−およびカルボキシペプチダーゼ活性を含まないことを実証している。ＥＰ１２３１２７９号明細書に記載のすべてのポジティブに同定されるプロテイナーゼサンプルは、異なるタンパク質分解活性を示す異なる酵素の複雑な混合物である。使用されるこれらのプロテイナーゼサンプルには、有意な量のプロリン特異的プロテアーゼが組み入れられていないため、当業者は、ＥＰ１２３１２７９号明細書に記載のプロセスが、非特異的エンド型プロテアーゼ活性と適切なカルボキシペプチダーゼおよび／またはアミノペプチダーゼ活性との組み合わせに帰着することを理解するであろう。本発明のプロセスは、そのような非特異的エンド型プロテアーゼ活性またはカルボキシペプチダーゼ活性に依存しない。本発明に従えば、極めて狭い基質特異性を伴う単一のプロリン特異的エンドプロテアーゼが、アミノペプチダーゼとの組み合わせで使用される。何らカルボキシペプチダーゼ活性が存在しないことは、最終加水分解物が減少したレベルの遊離アミノ酸を有することを黙示する。そのような低いレベルの遊離アミノ酸は、プロセシング工程中または低温殺菌もしくは滅菌プロセス中のメイラード（Ｍａｉｌｌａｒｄ）反応において容易に発生するブロスの不用な味（ｏｆｆ−ｔａｓｔｅ）を最小限にするために好���である。また、本発明に従うプロセスにおいて使用されるプロリン特異的タンパク質分解活性は、ＥＰ１２３１２７９号明細書に記載の複雑なプロテイナーゼサンプルには存在しない。この活性が非組換えアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株に本質的に存在しないという見解の実験的証明は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットおよび本出願の実施例９に見出すことができる。
【００７７】
さらなる（例えば、クロマトグラフィー）精製工程の前または後のいずれかにおいて得られるＡＣＥ阻害ペプチドは、定期的に広範に消費される食品への組み入れのために使用され得る。そのような製品の例には、マーガリン、スプレッド、バターもしくはヨーグルトのような多様な乳製品または乳汁もしくは乳清含有飲料、好ましくは、ヨーグルトおよび乳汁のようなヨーグルトもしくは乳汁に基づく製品がある。また、果汁飲料またはダイズ飲料のような他の飲料では、本発明の加水分解物を使用することができる。もう１つの選択肢は、フルーツバー、プロテインバー、エナジーバー、穀物に基づく製品、例えば、朝食シリアルのような健康製品における加水分解物の使用である。好ましくは、食物または飲料製品または栄養補助食品は、マーガリン、スプレッド、バター、乳製品または乳清含有飲料、好ましくは、ヨーグルトもしくは乳汁のようなヨーグルトまたは乳汁に基づく製品から選択され、ここで、前記食物または飲料製品または栄養補助食品は、上記で示したような該量のタンパク質加水分解物または該量のＩＰＰを含んでなる。
【００７８】
ヒトの高血圧症を軽減するための使用のための上記で考察したような食物または飲料製品または栄養補助食品が特に好適である。食物または飲料または栄養補助食品の好適なサービングサイズは、例えば、１サービングあたり５〜３５０グラム、例えば、５〜１５０グラムである。好ましくは、１日あたりのサービング数は、１〜１０、例えば、２〜５である。
【００７９】
そのような組成物は、典型的にヒトに投与されるが、それらはまた、高血圧症を軽減するために、動物、好ましくは、哺乳動物に投与してもよい。さらに、得られる生成物のＡＣＥインヒビターは高濃度であるため、これらの生成物は、ピル、錠剤あるいは高度に濃縮された溶液もしくはペーストまたは粉末の形態での栄養補助食品への組み入れに極めて有用である。ＡＣＥ阻害ペプチドの継続放出を確実にする徐放性栄養補助食品は特に興味深い。本発明に従うＡＣＥ阻害ペプチドは、例えば、丸剤、錠剤、顆粒剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）またはカプセル剤中の乾燥粉末として処方してもよい。あるいは、本発明に従う酵素は、例えば、シロップまたはカプセル中の液体として処方してもよい。多様な処方物において使用され、かつ本発明に従う酵素を含有する組成物はまた、生理学的に許容可能なキャリア、アジュバント、賦形剤、安定剤、緩衝液および希釈剤よりなる群の少なくとも１つの化合物を組み入れてもよく、該用語は、包装、送達、吸収、安定化、またはアジュバントの場合には、酵素の生理学的効果を増強することを援助する物質を示すためにそれらの常識的な意味で使用される。粉体化された形態の本発明に従う酵素との組み合わせで使用することができる多様な化合物に関する関連性のある背景は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」、第２版、第１、２および３巻、ＩＳＢＮ０−８２４７−８０４４−２  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．において見出すことができる。乾燥粉末として処方される本発明のＡＣＥ阻害ペプチドは、かなり長期間貯蔵することができるが、例えば、アルミニウムブリスターのような適切な包装を選択することによって、水分または湿り空気との接触を回避するべきである。比較的新しい経口アプリケーション形態は、多様なタイプのゼラチンカプセルまたはゼラチンを基剤とする錠剤の使用である。
【００８０】
高血圧症を克服するための天然のＡＣＥ阻害ペプチドの関連性を考慮すると、本新規かつ経済効果のある経路は、温和な血圧降下性の食物またはなお獣医学製品の魅力的な出発点を付与する。本経路はまた、意外なほど簡単な精製工程を含むため、血圧降下性濃縮栄養補助食品の可能性もまた拡大する。
【００８１】
本発明に従うプロセスは、任意のプロリン特異的オリゴ−またはエンドプロテアーゼを使用して達成することができる。本発明に従うまたは本発明に従って使用されるプロリン特異的オリゴペプチダーゼとは、ＥＣ３．４．２１．２６に属する酵素を意味する。本発明に従うかまたは本発明に従って使用されるプロリン特異的エンドプロテアーゼとは、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットの請求項１〜５、１１および１３に記載のポリペプチドを意味する。従って、このプロリン特異的エンドプロテアーゼは、以下よりなる群から選択されるプロリン特異的エンド型プロテアーゼ活性を有するポリペプチドである：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜５２６またはそのフラグメントと少なくとも４０％アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）低いストリンジェンシー条件で、（ｉ）少なくとも８０％もしくは９０％同一な６０を超える、好ましくは１００を超えるヌクレオチド、より好ましくは少なくとも９０％同一な２００を超えるヌクレオチドである配列番号１の核酸配列またはそのフラグメント、あるいは（ｉｉ）配列番号１の核酸配列に相補的な核酸配列、とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド。配列番号１および配列番号２は国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに示される通りである。好ましくは、ポリペプチドは単離された形態である。
【００８２】
本発明に従って使用される好適なポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５２６と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、およびさらに最も好ましくは少なくとも約９７％同一性を有するアミノ酸配列を有するかまたは配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる。
【００８３】
好ましくは、ポリペプチドは、低いストリンジェンシー条件、より好ましくは中等度のストリンジェンシー条件、および最も好ましくは高いストリンジェンシー条件下、（ｉ）配列番号１の核酸配列もしくはそのフラグメント、または（ｉｉ）配列番号１の核酸配列に相補的な核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。
【００８４】
用語「ハイブリダイズすることが可能」は、本発明の標的ポリヌクレオチドが、プローブとして使用される核酸（例えば、配列番号１のヌクレオチド配列、もしくはそのフラグメント、または配列番号１の相補物）と、バックグランドよりも有意に高いレベルでハイブリダイズすることができることを意味する。本発明はまた、本発明のプロリン特異的エンドプロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれに相補的であるヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、ＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを含むＤＮＡであってもよい。好ましくは、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡおよび最も好ましくは、ゲノムＤＮＡ配列である。典型的に、本発明のポリヌクレオチドは、選択的条件下で、コーディング配列または配列番号１のコーディング配列の相補物にハイブリダイズすることが可能であるヌクレオチドの連続配列を含んでなる。そのようなヌクレオチドは、当該分野において周知の方法に従って合成することができる。
【００８５】
本発明のポリヌクレオチドは、コーディング配列または配列番号１のコーディング配列の相補物に、バックグランドよりも有意に高いレベルでハイブリダイズすることができる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーに存在する他のｃＤＮＡのため、バックグランドのハイブリダイゼーションが生じ得る。本発明のポリヌクレオチドとコーディング配列または配列番号１のコーディング配列の相補物との間の相互作用によって作製されるシグナルレベルは、典型的に、他のポリヌクレオチドと配列番号１のコーディング配列との間の相互作用の少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも２０倍、より好ましくは少なくとも５０倍、およびさらにより好ましくは少なくとも１００倍の強度である。相互作用の強度は、例えば、プローブを、例えば、３２Ｐで放射性標識することによって、測定することができる。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的に、低いストリンジェンシー（０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約４０°Ｃ）、中等度のストリンジェンシー（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０°Ｃ）または高いストリンジェンシー（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウムおよび０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約６０°Ｃ）の条件を使用して、達成することができる。
【００８６】
ＵＷＧＣＧパッケージは、（例えば、そのデフォルト設定値に対して使用される）同一性を算出するために使用することができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する。
【００８７】
ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴ  Ｎアルゴリズムを使用して、配列同一性を算出するかまたは（例えば、それらのデフォルト設定値に対する等価もしくは対応する配列を同定するような）配列を列挙することができる。
【００８８】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公的に入手することができる。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードと共に整列される場合、いくつかのポジティブ評価された閾値スコアＴに一致または満たすかのいずれかである問い合わせ配列における長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコアリング配列対（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｉｒ）（ＨＳＰ）を第１に同定することに関与する。Ｔは隣接ワードスコア閾値と称される。これらの初期の隣接ワードのヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出すための検索を初期化するためのシードとして作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向において拡張される。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下する場合；１つもしくはそれ以上のネガティブスコアリング残基アラインメントの累積により累積スコアが０もしくはそれ以下となる場合；またはいずれかの配列の末端に到達する場合、各方向におけるワードヒットの拡張は停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプラグラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を使用する。
【００８９】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの測定は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の示度を提供する最小の全確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、配列は、第１の配列と第２の配列との比較における最小全確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、もう１つの配列に類似であるとみなされる。
【００９０】
アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の株は食品用として位置付けられており、これらの微生物由来の酵素は、思いも寄らない食品用供給源を形成することが公知である。別の好適な実施態様に従えば、非分泌型のいわゆるサイトゾル酵素以外の酵素は、その産生細胞によって分泌される。この方法では、酵素は、高価な精製工程を伴わずに、本質的に純粋な状態で細胞ブロスから回収することができる。好ましくは、酵素は、一般的なｐＨおよび温度条件下でその基質に対して高い親和性を有する。
【００９１】
材料および方法
食用のカゼイン酸ナトリウムおよびカリウムスプレー（８８％）は、ＤＭＶ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、蘭国から入手した。合成発色ペプチドは、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂ．Ｖ．、蘭国またはＢａｃｈｅｍ、瑞国のいずれかから入手した。Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  １０００Ｌ  Ｂａｔｃｈ  ＨＰＮ００２１８は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（丁国）から、Ｓｕｍｉｚｙｍｅ  ＦＰはＳｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ（日本）から、およびＣｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰ  Ｃｈ．：４１２３はＡＢ酵素（英国）から入手した。
【００９２】
Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼ
アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼの過剰発現は、国際公開第０２／４５５２４号パンフレットに記載の通りに達成させた。酵素の活性は、３７℃で、クエン酸／リン酸二ナトリウム緩衝液ｐＨ４．６中合成ペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡに対して試験した。反応産物は、分光光度法により４０５ｎＭでモニターした。単位は、これらの試験条件下で１分間あたり１μｍｏｌのｐ−ニトロアニリドを遊離する酵素の量として規定される。
【００９３】
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来エンドプロテアーゼのクロマトグラフィー精製
過剰産生Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株から得られる培養ブロスを、プロテアーゼのクロマトグラフィー精製に使用して、任意の混入するエンド−およびエキソ型プロテアーゼ活性を取り出した。そのために、最初に、発酵ブロスを遠心分離して、多量の真菌塊を取り出し、次いで、上清を、ポアサイズを減少しながら多くのフィルターを通過させ、すべての細胞フラグメントを取り出した。最終的に、得られた限外ろ過物を、２０ミリモル／リットルの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．１中に１０倍希釈し、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム上に適用した。タンパク質を、２０ミリモル／リットルの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．１における０〜０．４モル／リットルＮａＣｌの勾配で溶出させた。Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，２０９−２１２（１９９５年）に記載のプロトコルに従って（但し、若干改変したアッセイ条件下で）、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡの切断に対して活性を示すピーク画分を回収し、プールした。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの酸性のｐＨ至適値を考慮して、酵素アッセイを、ｐＨ４．６、クエン酸／二リン酸緩衝液中、３７℃において行った。活性画分のプール、続く、濃縮により、最終的に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上においてただ単一のバンドおよびＨＰ−ＳＥＣ上において１つのピークを示す調製物が得られた。さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる分析によって、得られる酵素調製物の純度を確認した。
【００９４】
加水分解の程度
多様なタンパク質分解混合物とのインキュベーション中に得られる加水分解の程度（ＤＨ）を、迅速ＯＰＡ試験を使用してモニターした（ニールセン，Ｐ．Ｍ．（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．）；ピーターセン，Ｄ．（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｄ．）；ダンマン，Ｃ．（Ｄａｍｂｍａｎｎ，Ｃ．）、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１年、６６，６４２−６４６）。
【００９５】
ケルダール窒素
全ケルダール窒素を、フローインジェクション分析によって測定した。ＴＫＮ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ５０００−０４０、ＳＯＦＩＡソフトウェアを伴うＰｅｎｔｉｕｍ４コンピュータ、およびＴｅｃａｔｏｒ  ５０２７  Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒを具備したＴｅｃａｔｏｒ  ＦＩＡＳＴＡＲ  ５０００  Ｆｌｏｗ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、タンパク質含有溶液から遊離したアンモニアを、５９０ｎｍで定量した。方法のダイナミックレンジに対応するサンプル量（０．５〜２０ｍｇ  Ｎ／ｌ）を、３０分間、２００℃、続いて、９０分間、３６０℃の消化プログラムに供された９５〜９７％硫酸およびＫｊｅｌｔａｂを伴う消化チューブに配置する。ＦＩＡＳＴＡＲ５０００システムにおける注入後、窒素ピークを測定し、これから測定されるタンパク質の量を推察することができる。
【００９６】
アミノ酸分析
タンパク質性材料の正確に秤量したサンプルを、希酸に溶解し、沈殿物を、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機における遠心分離によって分離した。Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国）の操作マニュアルに記載のＰｉｃｏＴａｇ法に従って、澄明な上清に対してアミノ酸分析を行った。そのために、液体から適切なサンプルを得、次いで、乾燥し、気相酸加水分解に供し、フェニルイソチオシアネートを使用して誘導体化した。存在する多様な誘導体化されたアミノ酸を、ＨＰＬＣ法を使用して定量化し、合計して、秤量したサンプルにおける全レベルの遊離アミノ酸を算出した。アミノ酸ＣｙｓおよびＴｒｐは、この分析において得られるデータに含まれない。
【００９７】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
Ｐ４０００ポンプ（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ（登録商標）、Ｂｒｅｄａ、蘭国）に結合されたイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏｑｕｅｓｔ（登録商標）、Ｂｒｅｄａ、蘭国）を使用するＨＰＬＣを、本発明の酵素混合物によって生成される酵素タンパク質加水分解物中のこれらのトリペプチドＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰのうちの目的のペプチドの定量化に使用した。溶出のためのＭｉｌｌｉＱウォーター中０．１％ギ酸（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、米国；溶液Ａ）およびアセトニトリル中０．１％ギ酸（溶液Ｂ）の勾配と組み合わせたＩｎｅｒｔｓｉｌ  ３ＯＤＳ３、３ｍｍ、１５０＊２．１ｍｍ（Ｖａｒｉａｎ  Ｂｅｌｇｉｕｍ、白国）カラムを使用して、形成されるペプチドを分離した。勾配は、１００％の溶液Ａで開始し、ここで、５分間保持し、１０分間、５％Ｂまで直線的に増加させ、続いて、３０分間、４５％の溶液Ｂまで直線的に増加させ、直ちに初期条件に移行し、ここで、安定化のため１５分間保持した。使用した注入容積は５０マイクロリットルであり、流速は１分間あたり２００マイクロリットルであり、カラム温度は５５℃に維持した。注入したサンプルのタンパク質濃度は、約５０マイクログラム／ミリリットルであった。
【００９８】
約３０％の至適衝突エネルギーを使用する目的のペプチドに専用のＭＳ／ＭＳを使用することによって、個々のペプチドに関する詳細な情報を得た。ＭＳ／ＭＳモードにおいて観察される最も豊富なフラグメントイオンを使用することによる外部校正を使用して、個々のペプチドの定量化を実施した。
【００９９】
トリペプチドＬＰＰ（Ｍ＝３２５．２）を使用して、ＭＳモードにおける至適感受性およびＭＳ／ＭＳモードにおける至適フラグメント化のために同調し、５ｍｇ／ｍｌの一定の輸注を実施し、ＭＳモードではプロトン化分子が、およびＭＳ／ＭＳモードでは約３０％の至適衝突エネルギーが生じ、ＢおよびＹ系列イオンが生成させた。
【０１００】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの前に、酵素タンパク質加水分解物を、周囲温度および１３０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離し、０．２２μｍフィルターを介してろ過し、上清をＭｉｌｌｉＱウォーターで１：１００に希釈した。
【０１０１】
ニュートラシューティカル製品
本発明に従うニュートラシューティカル製品は、いずれの食物タイプであってもよい。それらは、適切な量の風味付け、糖、果実、ミネラル類、ビタミン類、安定剤、増粘剤などの食品に加えて、一般の食物成分を含んでなり得る。
【０１０２】
好ましくは、ニュートラシューティカル製品は、５０〜２００ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｋ＋および／または１５〜６０ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｃａ２＋および／または６〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｍｇ２＋、より好ましくは、１００〜１５０ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｋ＋および／または３０〜５０ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｃａ２＋および／または１０〜２５ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｍｇ２＋ならびに最も好ましくは、１１０〜１３５ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｋ＋および／または３５〜４５ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｃａ２＋および／または１３〜２０ｍｍｏｌ／ｋｇ  Ｍｇ２＋を含んでなる。これらのカチオンは、本発明に従うニュートラシューティカル製品に組み入れられる場合、さらに血圧を降下させる便益効果を有する。
【０１０３】
有利なことに、ニュートラシューティカル製品は、１つもしくはそれ以上のＢ群ビタミンを含んでなる。
【０１０４】
Ｂ群ビタミンの葉酸は、ホモシステイン、ヒト食事中のアミノ酸の代謝に参加することが公知である。長年の間、高ホモシステインレベルは、循環器系疾患の高い発症率と相関関係を有している。ホモシステインを降下することは、循環器系疾患の危険率を減少し得ると考えられる。
【０１０５】
ビタミンＢ６およびＢ１２は、プリンおよびチアミンの生合成を妨害し、メチオニンを産生するためのホモシステインメチル化のプロセスおよびいくらかの成長プロセスにおいてメチル基の合成に参加することが公知である。ビタミンＢ６（塩酸ピリドキシン）は、既知のビタミン補給剤である。ビタミンＢ１２（シアノバラミン（ｃｙａｎｏｂａｌａｍｉｎ））は、神経系の健康に寄与し、赤血球の産生に関与する。それはまた、食品補助製品中のビタミンとしても公知である。
【０１０６】
循環器系疾患危険率の減少に対するそれらの組み合わされたポジティブな効果のため、本発明に従う製品は、ビタミンＢ６およびビタミンＢ１２ならびに葉酸を含んでなることが好適である。
【０１０７】
ニュートラシューティカル製品中のＢ群ビタミンの量は、次に示すこれらのＢ群ビタミンの１日量に基づいて当業者によって算出され得る：葉酸：２００〜８００μｇ／日、好ましくは、２００〜４００μｇ／日、ビタミンＢ６：０．２〜２ｍｇ／日、好ましくは、０５〜１ｍｇ／日およびビタミンＢ１２：０．５〜４μｇ／日、好ましくは、１〜２μｇ／日。
【０１０８】
好ましくは、ニュートラシューティカル製品は、３〜２５ｗｔ％ステロール、より好適には、７〜１５ｗｔ％ステロールを含んでなる。ステロールの組み入れの利点は、それがヒト血中におけるＬＤＬ−コレステロールのレベルの減少を引き起こし、循環器系の危険率の減少を生じることである。
【０１０９】
ステロールを参考にする場合、これは、飽和スタノール類およびステロール／スタノールのエステル化誘導体またはこれらの任意の混合物を含む。
【０１１０】
本出願では、ステロールエステルを参考にする場合、これはまた、それらの飽和誘導体、スタノールエステル、ならびにステロール−およびスタノールエステルの組み合わせを含む。
【０１１１】
植物ステロール類または野菜ステロール類としても公知であるステロール類またはフィトステロール類は、３つの群、４−デスメチルステロール類、４−モノメチルステロール類および４，４’−ジメチルステロール類に分類することができる。油において、それらは、主に、有利のステロール類および脂肪酸のステロールエステルとして存在するが、ステロールグルコシド類およびアシル化ステロールグルコシド類もまた存在する。３種の主なフィトステロール類、即ち、β−シトステロール、スチグマステロールおよびカンペステロールが存在する。意図される成分の概略図は、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｎ  Ｓｔｅｒｏｌｓ  ｏｆ  Ｅｄｉｂｌｅ  Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ  Ｏｉｌｓ」、Ｓ．Ｐ．コッハル（Ｓ．Ｐ．Ｋｏｃｈｈａｒ）、Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２２：１６１−１８８頁に掲載のとおりである。
【０１１２】
シトスタノール、カンペスタノールおよびエルゴスタノールならびにそれらの誘導体のようなそれぞれの５α−飽和誘導体も本明細書においてスタノール類と称される。好ましくは、（場合によりエステル化）ステロールまたはスタノールは、β−シトステロール、β−シトスタノール、カンペステロール、カンペスタノール、スチグマステロール、ブラシカステロール、ブラシカスタノールまたはそれらの混合物の脂肪酸エステルを含んでなる群から選択される。
【０１１３】
ステロール類またはスタノール類は、場合により、脂肪酸により少なくとも部分的にエステル化される。好ましくは、ステロール類またはスタノール類は、１つもしくはそれ以上のＣ２−２２脂肪酸でエステル化される。本発明の目的のために、Ｃ２−２２脂肪酸という用語は、Ｃ２−２２主鎖および少なくとも１つの酸基を含んでなる任意の分子を指す。本発明に関して好適ではないが、Ｃ２−２２主鎖は部分的に置換されていてもよくまたは側鎖が存在していてもよい。しかし、好ましくは、Ｃ２−２２脂肪酸は、末端基として１もしくは２個の酸基を含んでなる直鎖分子である。これらが天然油中に存在する場合、直鎖状Ｃ８−２２脂肪酸が最も好適である。任意のそのような脂肪酸の適切な例には、酢酸、プロピオン酸、酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸がある。他の適切な酸は、例えば、クエン酸、乳酸、シュウ酸およびマレイン酸である。ミリスチン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、セトレイン酸、エルカ酸、エライジン酸、リノール酸およびリノレン酸が最も好適である。
【０１１４】
所望であれば、脂肪酸の混合物をステロール類またはスタノール類のエステル化のために使用してもよい。例えば、脂肪酸の供給源として天然に存在する脂肪または油を使用することおよびエステル交換反応を介してエステル化を行うことも可能である。
【０１１５】
循環器系の健康を増進することに起用する上記のニュートラシューティカル成分、Ｋ＋、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋、Ｂ群ビタミン（葉酸、Ｂ６、Ｂ１２）ならびにステロール類は、本明細書において、集合的に心臓健康成分と称される。
【０１１６】
実施例１
Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）から得られる酵素は新規のクラスのプロリン特異的酵素を提示する。
国際公開第０２／４５５２４号パンフレットにおいて提供されるＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼのコーディング配列全体から、５２６アミノ酸のタンパク質配列を決定することができる。酵素の新規性は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ，ＰＩＲおよびｔｒＥＭＢＬのようなデータベースのＢＬＡＳＴ検索によって確認した。意外なことに、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）の酵素と既知のプロリルオリゴペプチダーゼとの間に明確な相同性を検出することができなかった。しかし、アミノ酸配列をより緊密に調べたところ、Ｐｒｏ−Ｘカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．２）、ジペプチジルアミノペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．２）、および胸腺特異的セリンプロテアーゼに対して低いが有意な相同性を示した。これらのすべての酵素は、セリンペプチダーゼのｃｌａｎＳＣのファミリーＳ２８に割り当てられている（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｅｎｚｙｍｅｓ；バレット  Ａ．Ｊ．（Ｂａｒｒｅｔｔ  Ａ．Ｊ．）、ローリングズ  Ｎ．Ｄ．（Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．）；ウォエスナー  Ｊ．Ｆ．（Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  Ｊ．Ｆ．）編；Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ、英国、１９９８年、３６９−４１５）。また、活性部位セリンの周りのＧｘＳＹｘＧの立体配置は、これらの酵素とＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来エンドプロテアーゼとの間で保存される。さらに、ファミリーＳ２８のメンバーは、酸性のｐＨ至適値を有し、プロリン残基のカルボキシ末端側で切断するための特異性を有し、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼと同様のシグナル配列およびプロペプチドで合成される。また、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）酵素のサイズは、ファミリーＳ２８のメンバーのサイズに類似する。従って、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）プロリン特異的エンドプロテアーゼは、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）から得られる酵素を含むほとんどのサイトゾルプロリルオリゴペプチダーゼが分類されているＳ９ファミリーではなく、セリンプロテアーゼのファミリーＳ２８のメンバーであるようである。これらの構造的および生理学的特徴に基づいて、本発明者らは、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）の酵素がセリンプロテアーゼのＳ９ファミリーではなく、Ｓ２８に属すると結論した。Ｓ９ファミリーに属するプロリルオリゴペプチダーゼ由来のＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来酵素を区別するさらなる特徴は、後者のファミリーに属するサイトゾルプロリルエンドプロテアーゼとは異なり、新たに同定されたＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）の酵素は増殖培地に分泌されるという事実である。これは、下等真核生物由来のファミリーＳ２８のメンバーの単離および特徴付けに関する最初の報告である。
【０１１７】
実施例２
Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）から得られるプロリン特異的エンドプロテアーゼのｐＨおよび温度至適値。
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼのｐＨ至適値を確立するために、異なるｐＨ値を伴う緩衝液を調製した。ｐＨ４．０−４．５−４．８−５．０−５．５および６．０の緩衝液は、０．０５ｍｏｌ／ｌ酢酸Ｎａおよび０．０２Ｍ  ＣａＣｌ２を使用して作製し；ｐＨ７．０および８．０の緩衝液は、０．０２Ｍ  ＣａＣｌ２を含有する０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を使用して作製した。ｐＨ値は、それぞれ、酢酸およびＨＣｌを使用して調整した。発色合成ペプチドＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡを基質として使用した。緩衝溶液、基質溶液およびプロリルエンドプロテアーゼプレ希釈液（０．１Ｕ／ｍＬの活性）を、水浴中で正確に３７．０°Ｃにまで加熱した。混合後、反応物を、分光光度的に４０５ｎｍ、３７．０℃で３．５分間追跡し、０．５分間毎に測定した。図１に示す結果から、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが約４のｐＨ至適値を有することが明らかである。
【０１１８】
また、プロリルエンドプロテアーゼの温度至適値を確立した。そのために、基質としてＣａｓｅｉｎｅ  Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ａｌｍｅｒｅ、蘭国、バージョン３）を使用し、精製された酵素調製物を、ｐＨ５．０で０．０２ｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ２を含有する０．１ｍｏｌ／ｌ酢酸Ｎａにおいて、２時間、異なる温度でインキュベートし、５７４ｎｍで測定することによって酵素活性を定量した。得られる結果に従えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼは約５０℃の温度至適値を有する。
【０１１９】
実施例３
Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼの特異性
複数コピーの発現カセット（国際公開第０２／４５５２４号パンフレットを参照のこと）を含有するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）株から得られる粗ならびにクロマトグラフィー精製した酵素サンプルを、発色ペプチド基質のコレクションに対して試験し、コードされるエンドプロテアーゼの特異性を確立した。酵素のエンド型プロテアーゼ活性を、ＡＡＸｐＮＡ基質に対して試験した。「ｐＮＡ」（ｐ−ニトロアニリド）基質は、Ｘ−ｐＮＡペプチド結合が切断される場合、色の変化を生じる；「Ｘ」は、異なる天然のアミノ酸残基を表す。
【０１２０】
ＡＡＸ−ｐＮＡ基質のストック溶液（１５０ｍｍｏｌ／ｌ）を、２０ＣａＣｌ２を含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４．０において１００×希釈した。４０℃、ＴＥＣＡＮ  Ｇｅｎｉｏｓ  ＭＴＰ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｓａｌｚｂｕｒｇ，Ｖｉｅｎｎａ）における４０５ｎｍでの１０分間の動力学測定により、光学密度の増加が記録され、これから、エクセル（Ｅｘｃｅｌ）におけるデータ処理を介して、図２に示される図が得られた。結果から、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来エンドプロテアーゼがプロリルペプチド結合に高度に特異的であり、アラニル結合に対する副活性を伴うことが明らかである。粗およびクロマトグラフィー精製した調製物は類似の活性プロファイルを示した。
【０１２１】
アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼまたは非プロリン特異的エンドプロテアーゼによるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来エンドプロテアーゼへの混入は、極めて僅かであることが示され得る（実施例９を参照のこと）。
【０１２２】
実施例４
Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼは、大きなタンパク質ならびに小さなペプチドを加水分解することができ、従って、真のエンドプロテアーゼである。
特定の構造的特徴のため、Ｓ９ファミリーに属するプロリルオリゴペプチダーゼは３０アミノ酸を超えるペプチドを消化することができない。この制限は、できるだけ迅速かつ効率的に異なるタンパク質を加水分解することが意図される酵素に明らかに不利である。Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼが基質分子のサイズに関して同じ制限を示すかどうかを調べるために、本発明者らは、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来のクロマトグラフィー精製したプロリルエンドペプチダーゼを、小さな合成ペプチドおよび大きなオボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）分子と共にインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、形成された加水分解産物を分析した。
【０１２３】
使用した合成ペプチドは、２７マーの配列ＮＨ２−ＦＲＡＳＤＮＤＲＶＩＤＰＧＫＶＥＴＬＴＩＲＲＬＨＩＰＲ−ＣＯＯＨであり、Ｐｅｐｓｃａｎ  ｃｏｍｐａｎｙ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ、蘭国）より贈与された。そのアミノ酸配列から示されるように、このペプチドは、２プロリン残基を含有し、１つはペプチドの中央にあり、１つはカルボキシ末端部にある。
【０１２４】
無傷なオボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）分子（ＰｉｅｒｃｅＩｍｊｅｃｔ、２０ｍｇの凍結乾燥材料を含有するバイアル）は、４２７５０Ｄａの分子量を伴う３８５アミノ酸よりなる。この分子は、１４プロリン残基を含有し、このうち１つは分子の究極的Ｃ末端に位置し、プロリン特異的エンドプロテアーゼによって切断することができない。
【０１２５】
オボアルブミンおよびオリゴペプチドを、個別に、５０°Ｃで、精製されたＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼと共にインキュベートした。いくらかの時間間隔で、サンプルを採取し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分析した。
【０１２６】
４．５単位／ｍｌの活性を伴うクロマトグラフィー精製されたＡ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ４で１００倍希釈した。オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）を、１ｍｇ／ｍｌの濃度（２２μＭ）で酢酸緩衝液ｐＨ４に溶解した。２７マーを同じ緩衝液に溶解し、０．４８ｍｇ／ｍｌの濃度（１５２μＭ）に到達させた。オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）および２７マー溶液のモル濃度は、両溶液が切断可能なプロリン残基において同じモル濃度を含有するような方法で、選択した。オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）は１３個の潜在的プロリン切断部位を含有する一方、２７マーペプチドは２個しか有さない。両基質溶液のうち、０．５ｍｌを、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）サーモミキサー中、５０°Ｃで１０μｌ（０．４５ミリＵ）の酵素溶液と共にインキュベートした。いくらかの時間間隔で、１０μｌサンプルをインキュベーション混合物から抜き取り、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまで２０°Ｃで保持した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色のために使用されるすべての材料は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。サンプルは、製造者の指示に従い、ＳＤＳ緩衝液を使用して調製し、製造者の指示に従い、ＭＥＳ−ＳＤＳ緩衝液システムを使用して１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。染色は、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｃｏｌｌｏｄｉａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ２５０）を使用して実施した。
【０１２７】
図３に認められ得るように、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎｅ）は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来酵素によって、インキュベーションの最初の４．７５時間において約３５〜３６ｋＤの個別のバンドに切断される（レーン３）。インキュベーション期間を延長すると、多様な分子量のより小さな産物へのさらなる分解が生じる（レーン７）。
【０１２８】
２７マーペプチドもまた分解され、レーン２と比較して、レーン４、６および８におけるより微弱なバンドによって判定される。産物の極めて小さな分子量のシフト（レーン９および８を比較すること）は、ペプチドのカルボキシ末端でのアルギニン残基の切断によるためである可能性が最も高い。差異は約２００Ｄであり（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ２０００システムの上のＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ３．３ｄソフトウェアを使用して測定される）、アルギニンは１７４のＭＷを有する。この小さな分子量のシフトは、恐らく、ペプチドの分解の第１の工程である。
【０１２９】
産物のさらなる崩壊は、ＳＤＳゲル上のバンドの強度の減少のみによって、認めることができる。約１０００のＭＷを伴う成分のゲル染色はクマシー・ブリリアント・ブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌａｎｔ  Ｂｌｕｅ）では可能ではないため、さらなる産物の崩壊は認められない。この実験から、Ｓ９ファミリーに属する既知のプロリルオリゴペプチダーゼとは異なり、Ａ．ｎｉｇｅｒ（Ａ．ニガー）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼは、極めてより大きなタンパク質よりも小型のペプチドの方を特に選考して切断するわけではないと結論付けることができる。従って、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素は、真のエンドプロテアーゼ、および異なるタイプのタンパク質を加水分解する好適な酵素を表す。この所見は、以下の実施例において例示されるように酵素の意外な使用をもたらす。
【０１３０】
実施例５
カゼイン酸カリウムとＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼとをインキュベートすると、ＩＰＰおよびＬＰＰが迅速に産出されるが、ＶＰＰは産出されない。
この実験では、本発明者らは、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）から得られるプロリン特異的プロテアーゼが真のエンドプロテアーゼであるという実施例４においてなされた観察を利用する。Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来の過剰産生されるおよび本質的に純粋なプロリン特異的エンドプロテアーゼを、カゼイン酸カリウムと共にインキュベートし、ＡＣＥ阻害ペプチドＩＰＰ、ＶＰＰならびにＬＰＰの遊離について試験した。このインキュベーションでは、プロリン特異的エンドプロテアーゼ以外の酵素は使用しなかった。実施例９において実証されるように、使用したプロリン特異的エンドプロテアーゼは、エンドプロテアーゼ、アミノペプチダーゼまたはカルボキシペプチダーゼ混入が認められない。できるだけ多くのＡＣＥ阻害ペプチドの摂取の結果としてのナトリウム取り込みを制限するために、このインキュベーションでは、カゼイン酸カリウムを基質として使用した。
【０１３１】
カゼイン酸を、１０％（ｗ／ｗ）タンパク質の濃度で、６５℃の水に懸濁し、その後、リン酸を使用して、ｐＨを６．０（２０℃で測定）に調整した。次いで、懸濁液の温度を５５℃にし、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼを４単位／タンパク質のグラムの濃度で添加した（単位規定のための材料および方法のセクションを参照のこと）。連続撹拌下、この混合物を２４時間インキュベートした。この期間の間、さらなるｐＨ調整は行わなかった。サンプルを、インキュベーションの１、２、３、４、８および２４時間後に採取した。各サンプルの酵素活性を、９０℃への５分間のサンプルの即時的加熱によって終結させた。冷却後、リン酸を使用して、各サンプルのｐＨを迅速に４．５に降下させ、その後、懸濁液を、５分間、３０００ｒｐｍで、Ｈｅｒｅａｕｓ卓上遠心機において遠心分離した。完全に澄明な上清を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に使用し、上清中のペプチドＶＰＰ、ＩＰＰ、ＬＰＰ、ＶＶＶＰＰおよびＶＶＶＰＰＦを定量した（材料および方法のセクションを参照のこと）。
【０１３２】
ウシミルクカゼインは、β−カゼインおよびκ−カゼインを含む異なる多くのタンパク質を組み入れている。既知のアミノ酸配列に従えば、β−カゼインは、ＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを包含する。β−カゼインにおいて、ＩＰＰは、配列−Ｐ７１−Ｑ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−に含有され、ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−に含有され、ＬＰＰは配列−Ｐ１５０−Ｌ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−に含有される。酸性沈殿したカゼイン酸調製物において、β−カゼイン濃度の５０％未満のモル濃度で存在するκ−カゼインは、ＩＰＰのみを包含する。κ−カゼインでは、ＩＰＰは、配列−Ａ１０７−Ｉ１０８−Ｐ１０９−Ｐ１１０−に含有される。カゼインの他のタンパク質構成成分は、ＩＰＰ、ＶＰＰまたはＬＰＰのいずれも含有しない。
【０１３３】
表１および２は、ＬＣ／ＭＳ実験において決定し、インキュベーション混合物に添加された１グラムのカゼイン酸カリウムあたりで算出した、酸性化および遠心分離した上清に存在するペプチドの濃度を示す。表１に示されるように、ＩＰＰは、１時間のインキュベーション後にその最大濃度に到達する。それ以外では、ＩＰＰ濃度は、それよりさらに増加しない。ペンタペプチドＶＶＶＰＰの形成は、ＩＰＰの作製と同じ動力学を示す。理論的に予想されるように、ＶＶＶＰＰのモル収量は、ＬＰＰペプチドのモル収量に類似する。ＬＰＰおよびＶＶＶＰＰの両方の収量は、理論的に可能なもののほぼ６０％に到達する。ＬＰＰの最大濃度が３時間のインキュベーション後のみに到達されるという事実は、β−カゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）分子の特定の部分の切断が、おそらく、若干より困難であることを示唆する。ＶＶＶＰＰとは対照的に、ヘキサペプチドＶＶＶＰＰＦは全く形成されない。この観察から、プロリン特異的エンドプロテアーゼは効率的に−Ｐ−Ｆ−結合を切断し、それによってＶＶＶＰＰが生じることが示唆される。トリペプチドＩＰＰは即時に形成されるが、そのモル収量は、ＶＶＶＰＰまたはＬＰＰのいずれの最大モル収量の約３分の１を超えない。ＩＰＰトリペプチドは、κ−カゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）におけるようにβ−カゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）においても両方に含有されるため、この結果は予想外である。この観察の妥当な説明は、プロリン特異的プロテアーゼはＩＰＰを生じることができるが、但し、カゼイン酸のκ−カゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）部分のみからであるということである。κ−カゼイン（ｃａｓｅｉｎｅ）の関連するアミノ酸配列を考慮すると、このことは、−Ａ１０７−Ｉ１０８−ペプチド結合が酵素のアラニン特異的活性によって切断されることを示唆する。この仮定に従えば、プロリン特異的エンドプロテアーゼによるβ−カゼイン消化は、Ｑ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６を生じるが、Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６は生じない。遊離するＩＰＰの量は、κ−カゼインに存在する量の約４０％に到達するが、β＋κカゼインに理論的に存在するＩＰＰの約１０％を超えない。ＩＰＰの放出のためのこの切断機構はまた、ＶＰＰがその前駆体分子ＶＶＶＰＰから形成され得ない理由を説明する：要求されるエンド型プロテアーゼ活性は、使用されるＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素調製物内に単純に存在するわけではない。
【０１３４】
【表１】
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【０１３５】
【表２】
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【０１３６】
実施例６
酸性カゼイン沈殿工程の組み入れは、５倍濃度のＡＣＥ阻害ペプチドを示す酸可溶性プロリンリッチペプチド画分を生じる
実施例５において、本発明者らは、１０％（ｗ／ｗ）タンパク質の濃度のカゼイン酸カリウムを、ｐＨ６．０でＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来プロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーションに供する仕方について説明した。多様なインキュベーション期間後、サンプルを加熱して、さらなる酵素活性を停止し、その後、ｐＨを４．５に降下させ、カゼイン溶解度を最小限にした。不溶性カゼイン分子を低速遠心分離によって取り出した。表１および２では、本発明者らは、１０％タンパク質の出発濃度に基づいて算出されたＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を提供した。しかし、酸性化および以後の遠心分離工程の結果として、添加した大きな割合のタンパク質が取り出されている。酸性化された上清のこれらの減少したタンパク質含量を定量するために、窒素（ケルダール）分析を行った。後者のデータに従えば、多様な上清が以下のタンパク質レベルを含有することが見出された。
【０１３７】
【表３】
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【０１３８】
本発明者らは、これらのデータを考慮して、但し、今回は、それらの実際のタンパク質含量を使用して、それぞれの上清に存在するＡＣＥ阻害ペプチドの濃度を再計算した。これらの再計算されたデータを表４に示す。
【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
表２および４に提示されたデータの比較は、明らかに、単純な酸性化工程、続いて、産業的に可能なデカンテーション、ろ過または低速遠心分離工程は、上清に存在するタンパク質の１グラムあたりで算出する場合、特定のＡＣＥ阻害ペプチドの濃度の５倍増加を生じることを示す。濃度におけるこの５倍増加は、使用する酸性沈殿手順の任意の最適化を伴わずに、得られた。これらの増強されたレベルのＡＣＥ阻害ペプチドを含有するこの酸可溶性画分のアミノ酸組成の印象を得るために、存在するペプチドを酸加水分解し、次いで、Ｗａｔｅｒｓ（材料および方法のセクションを参照のこと）に従って、アミノ酸分析に供した。得られる結果に従って、本発明に従う酸可溶性タンパク質画分は、この画分に存在するペプチドのモルに基づいてほぼ２４％および重量に基づいて２１％のプロリン含量を有する！プロリンは最も疎水性のアミノ酸の１つとして公知であるため、この観察は、全く意外なことであり、そのため、酸可溶性画分において増強されたプロリンレベルを見出すことは予想外である。事実、高量のプロリンを含有するこの酸性化工程において得られるペプチド画分は新規である。例えば、最もプロリンリッチタンパク質として公知のゼラチンは、１４．４％（ｗ／ｗ）のヒドロキシプロリンに加えて、僅か１６．５％（ｗ／ｗ）のプロリンしか含有しない。
【０１４１】
実施例７
異なる市販の酵素調製物のアミノペプチダーゼ活性
β−カゼインにおいて、ＩＰＰは、配列−Ｐ７１−Ｑ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−に含有され、ＶＰＰは配列−Ｐ８１−Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−に含有され、ＬＰＰは配列−Ｐ１５０−Ｌ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−に含有される。カゼインの他のタンパク質構成成分のうち、κ−カゼインのみは、ＩＰＰ含有配列を組み入れる。プロリン特異的エンドプロテアーゼの特異性から、β−カゼインとＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来酵素とのインキュベート時に、ペプチドＱ７２−Ｎ７３−Ｉ７４−Ｐ７５−Ｐ７６−、Ｖ８２−Ｖ８３−Ｖ８４−Ｐ８５−Ｐ８６−およびＬ１５１−Ｐ１５２−Ｐ１５３−が形成されることが推察され得る。ＬＰＰとは対照的に、形成される２つのペンタペプチドは、低いＡＣＥ阻害活性のみを示す。例えば、ＥＰ０５８３０７４号明細書は、８７３マイクロモル／ｌのＶＶＶＰＰに対するＩＣ５０値を報告する一方、短縮型ＶＰＰ分子は、９マイクロ／ｌのＩＣ５０値を有する。そのため、カゼイン加水分解物の十分なＡＣＥ阻害能を作製するために、プロリン特異的エンドプロテアーゼとのインキュベーション時に形成されるペンタペプチドＶＶＶＰＰおよびＱＮＩＰＰは、それぞれ、トリペプチドＶＰＰおよびＩＰＰに転換されるべきであることが明らかである。アミノペプチダーゼは、ペプチドのＮ末端側からアミノ酸を連続的に取り出すことができるため、ＶＰＰ配列より前方の２個のバリン（「Ｖ」）残基ならびにＩＰＰ配列より前方にあるグルタミン（「Ｑ」）およびアスパラギン（「Ｎ」）残基を効率的に遊離することができるアミノペプチダーゼ酵素活性が要求される。ＸＰＰトリペプチドに存在するＸ−ＰおよびＰ−Ｐペプチド結合は、酵素切断に耐性であることが公知であるため、そのようなアミノペプチダーゼ活性は、２つのペンタペプチドを所望されるＶＰＰおよびＩＰＰトリペプチドに転換するようである。
【０１４２】
３種の市販の酵素調製物、即ち：Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ  １０００Ｌ  Ｂａｔｃｈ  ＨＰＮ００２１８（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、Ｓｕｍｉｚｙｍｅ  ＦＰ（Ｓｈｉｎ  Ｎｉｈｏｎ）およびＣｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰ  Ｃｈ．：４１２３（ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅｓ）を、それらのアミノペプチダーゼ活性について試験した。ＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅおよびＳｕｍｉｚｙｍｅ  ＦＰは、両方とも、特定されていないエンド型プロテアーゼおよびカルボキシペプチダーゼ活性の他に、いくらかのアミノペプチダーゼ酵素活性を含有する複雑な酵素調製物であることが公知である。Ｃｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来の比較的純粋な、クローニングおよび過剰発現されたロイシンアミノペプチダーゼ活性を表す。
【０１４３】
これら３種の市販の調製物に存在するアミノペプチダーゼ活性を、発色基質Ｆ−ｐＮＡ（対照）、Ｑ−ｐＮＡおよびＶ−ｐＮＡを使用して試験した。そのために、ＤＭＳＯ中１５０ｍＭ  Ｘ−ｐＮＡのストック溶液を、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ６において１００×希釈した。マイクロタイタープレートにウェルあたり２００μｌの緩衝化基質溶液を充填し、Ｍａｇｅｌｌａｎ  ４ソフトウェアによって制御されるＴｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ  ＭＴＰリーダーにおいて、４０℃でプレインキュベートした。５０μｌの適切な酵素溶液（使用前に、Ｓｕｍｉｚｙｍｅ  ＦＰ粉末を、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ６に、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した）を添加することによって、反応を開始した。黄色のｐＮＡの遊離を、４０５ｎｍで１０分間、追跡した。ソフトウェアはＯＤ／ｍｉｎを算出する。多様な基質に対する各酵素調製物の活性を、Ｆ−ｐＮＡに対するそれらの活性について標準化した。得られたデータを図４に示す。明らかに、３種のすべての酵素調製物は、Ｆ−ｐＮＡに対して最も高い活性を示すが、しかし、Ｑ−ｐＮＡおよびＶ−ｐＮＡもまたこれらの酵素に対して基質を形成する。アミノペプチダーゼの活性が、プロリン特異的プロテアーゼによって形成されるペプチドＱＮＩＰＰおよびＶＶＶＰＰをそれぞれＩＰＰおよびＶＰＰに変換するため、これらの結果は、プロリン特異的プロテアーゼと組み合わされる場合、市販の調製物のそれぞれ１つが、所望されるＡＣＥ阻害トリペプチドＩＰＰ、ＶＰＰならびにＬＰＰを形成することが可能であるべきであることを示す。この仮定を、実施例８に記載の実験において試験した。
【０１４４】
実施例８
カゼイン酸と異なるアミノペプチダーゼ酵素調製物を伴うＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的エンドプロテアーゼとをインキュベートすることにより、高収量のＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰを生じる。
ＥＰ１２３１２７９号明細書に記載のＩＰＰおよびＶＰＰに対する酵素経路は、２工程プロセスを必要とする。カゼインを適切なプロテイナーゼとインキュベートする第１の工程の間、より大きな中間ペプチドが形成され、そのうちのいくらかは、ＩＰＰまたはＶＰＰのいずれかを包含する。ＥＰ１２３１２７９号明細書に記載の実施例の１つに従えば、このプロテイナーゼとのインキュベーションは、３７℃で１２時間の期間、行われる。次いで、使用されるプロテイナーゼは、この第１の加水分解物を１００℃にまで３分間加熱することによって不活化し、元の状態に冷却した後、別の酵素調製物（事実上、エキソ型プロテアーゼ活性を伴う調製物）が添加される。エキソ型プロテアーゼ活性とのこのインキュベーションは、第２の工程を形成する。３７℃でのこのような第２の酵素調製物との別の１２時間のインキュベーション後、トリペプチドＶａｌ−Ｐｒｏ−ＰｒｏおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの存在が実証され得る。これらのＡＣＥ阻害ペプチドのより高い収量を得るために、ＥＰ１２３１２７９号明細書は、エキソ型プロテアーゼ活性への暴露の前に、中間ペプチドを精製および濃縮することをさらに示唆している。ＥＰ１２３１２７９号明細書はまた、中間ペプチドを得た後、および中間ペプチドを手順においてペプチダーゼと接触させる前に、例えば、５０００〜２００００ｒｐｍにおける３〜１０分間の遠心分離による非反応のタンパク質の取り出しのような多様な操作が、場合により実施され得ることを示唆している。このように、所望されるトリペプチドは、産業的にむしろ扱いにくい２工程酵素プロセスにおいて得られる。酵素インキュベーションのそれぞれは、ｐＨ４．５〜７．０、２５〜５０℃の温度で１２時間もの長い期間を要し得るため、微生物学的観点から許容され得ない。
【０１４５】
本実施例において、本発明者らは、多様なＡＣＥ阻害ペプチドの形成に対するＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）由来のプロリン特異的プロテアーゼとアミノペプチダーゼ活性とを単一のインキュベーション工程において組み合わせることの効果について調べている。そのために、５０グラムのカゼイン酸ナトリウムを７０℃５０６グラムの水に溶解することによって、カゼイン酸溶液を調製し、８１グラムのタンパク質／ｌを含有する溶液を得た。この溶液を５０℃まで冷却し、その後、リン酸を使用して、ｐＨを６．０（２０℃で測定）まで降下させ、その後、多様な酵素の組み合わせを添加した。すべてのサンプル（それぞれ１０ｍｌ）にプロリン特異的プロテアーゼを添加して、１グラムのタンパク質あたり４単位の濃度（単位規定についての材料および方法のセクションを参照のと）に到達させた。サンプルＡ１は、このプロリン特異的プロテアーゼのみを含有した。サンプルＢ１は、プロリン特異的プロテアーゼ＋５グラムの水に希釈した１１４０ｍｇの濃Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ液を含有する３８マイクロリットルの溶液を含有した。サンプルＢ２では、プロリン特異的プロテアーゼを８マイクロリットルのこのＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ溶液と組み合わせた。サンプルＣ１では、プロリン特異的プロテアーゼを１００マイクロリットルのＣｏｒｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰ液と組み合わせた。サンプルＣ２では、プロリン特異的プロテアーゼを、Ｃｏｒｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰ液の１０倍希釈サンプルの１０マイクロリットルと組み合わせた。５つのサンプルすべてにおいて、インキュベーションを、６時間、５０℃で進行させた。酵素反応は、混合物を５分間、９０℃まで加熱することによって終結させた。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心機における１０分間の遠心分離後に得られる澄明な上清を回収し、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析まで凍結保存した。ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析後に得られるデータを表５に示す。
【０１４６】
先に実証したように、サンプルＡ１（プロリン特異的プロテアーゼだけが存在する）のインキュベーション条件は、ＬＰＰならびにＶＶＶＰＰを効率的に作製するが、有意な量のＶＰＰは作製しない。ペプチドＶＶＶＰＰＦが存在しない場合、プロリン特異的プロテアーゼが、適用される条件下でプロリン残基のカルボキシ末端を効率的に切断することが例示される。サンプルＡ１では、ＩＰＰの収量は、ＶＶＶＰＰの収量の約３分の１である。しかし、プロリン特異的プロテアーゼと、Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ（サンプルＢ１およびＢ２）またはＣｏｒｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰ（サンプルＣ１）のいずれか一方とを組み合わせると、ＩＰＰ収量に対して明確な刺激効果を及ぼす。おそらく、アミノペプチダーゼ活性の濃度は、プロリン特異的プロテアーゼによって形成されるすべてのＱＮＩＰＰを変換するのに不適切であったため、サンプルＣ２（低濃度のＣｏｒｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰを伴う）では、ＩＰＰの収量は増加しなかった。１グラムのカゼインは、理論的に６．９ｍｇ（２１．１マイクロモル）のＩＰＰ（β−カゼイン＋κ−カゼイン由来）を産出することができるため、サンプルＢ１およびＣ１に存在するＩＰＰレベルは、それぞれ、入手可能な最大収量のそれぞれ７０％および５５％を表す。本発明者らの予想に従って、増加しているアミノペプチダーゼ活性は、ＶＶＶＰＰ濃度の降下およびＶＰＰ濃度の増加を生じる。少量の中間ペプチドＶＶＰＰがサンプルＢ２およびＣ２において検出可能であるという事実は、これらのサンプルにおいて、アミノペプチダーゼ活性が、プロリン特異的プロテアーゼによって形成されるＶＶＶＰＰをＶＰＰに十分に変換するのには不適切であることを示す。１グラムのカゼインは、理論的にサンプルＢ１、Ｂ２およびＣ１において４．５８ｍｇ（１４．７マイクロモル）のＶＰＰを産出することができるため、最大のＶＰＰ収量が達成される。
【０１４７】
結論として、本実験は、プロリン特異的プロテアーゼと適切なアミノペプチダーゼ活性との組み合わせは、単一の酵素インキュベーション工程および５０℃もしくはそれ以上の温度で、高濃度のＡＣＥ阻害ペプチドを効率的に作製することができることを明らかに実証する。
【０１４８】
【表５】
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【０１４９】
実施例９
ＡＣＥ阻害ペプチドの生成において所望するおよび混入している酵素活性の定量
本発明に従えば、ＡＣＥ阻害ペプチドは、簡単な１工程プロセスにおいて、プロリン特異的エンドプロテアーゼ＋アミノペプチダーゼとのインキュベーションによって、カゼイン基質から選択的にＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰを回収することにより得ることができる。これらの可溶化されたＡＣＥ阻害ペプチドの以後の富化は、酸性化または水混和性有機溶媒を添加することによって、残留するより大きな分子量のタンパク質を沈殿させることによって達成される。この選択的回収プロセス中の任意の混入するエンドプロテアーゼまたはカルボキシペプチダーゼの存在は、最終的なトリペプチド混合物の品質にネガティブに影響する。例えば、非プロリンまたは非アラニン特異的エンドプロテアーゼの存在は、さらなる非生物活性ペプチドの可溶化をもたらし、これによって、最終濃縮物におけるＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰの相対濃度が希釈される。さらに、例えば、カルボキシペプチダーゼのような混入するエキソプロテアーゼの存在は、増加したレベルの遊離アミノ酸を有するＡＣＥ阻害ペプチドを生じる。これらの余剰遊離アミノ酸はまた、ＩＰＰ、ＬＰＰおよびＶＰＰの相対濃度を希釈し、さらに、メイラード（Ｍａｉｌｌａｒｄ）反応の増加の結果としてブロスの不用な味（ｏｆｆ−ｔａｓｔｅ）を付与する。これらのすべての所望されない副反応を最小限にするために、本質的に純粋なプロリン特異的プロテアーゼと本質的に純粋なアミノペプチダーゼとの組み合わせが好適である。使用されるインキュベーション条件下で混入するエンドプロテアーゼならびに混入するカルボキシペプチダーゼの活性が最小限であるかまたは好ましくは存在しない本質的に純粋な。以下の試験手順は、そのような混入するエンド−およびカルボキシペプチダーゼ活性を定量するために考案した。
【０１５０】
試験手順のための基礎は、多様な選択的発色ペプチドのコレクションによって形成される。プロリン特異的オリゴ−およびエンドプロテアーゼのみが、ペプチドＺ−ＡＡＡＰ−ｐＮＡからｐＮＡを放出することができるため、この特定のペプチドを使用して、所望されるプロリン特異的エンド型プロテアーゼ活性を定量した。多くのエンドプロテアーゼはペプチドＺ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡおよびＺ−ＡＡＡＲ−ｐＮＡからｐＮＡを放出することができるため、これらの２つのペプチドを使用して、混入する非プロリン特異的エンド型プロテアーゼ活性を定量した。ペプチドＱＮＩＰＰおよびＶＶＶＰＰのそれぞれＩＰＰおよびＶＰＰの変換は、効率的にＧｌｎおよびＶａｌ残基を取り出すアミノペプチダーゼを必要とするため、ペプチドＱ−ｐＮＡおよびＶ−ｐＮＡを使用して、所望されるアミノペプチダーゼ活性を定量した。多くのカルボキシペプチダーゼは、ペプチドからＰｈｅおよびＡｒｇ残基を遊離することができるため、これらの残基を含有するペプチドを選択して、混入するカルボキシペプチダーゼ活性を定量した。しかし、カルボキシペプチダーゼ活性を測定するための適切な発色基は利用可能でないため、合成ペプチドＺ−ＡＦおよびＺ−ＡＲを使用する代替的方法は開発されていない。代替的方法は下記に提供する。使用されるすべての合成ペプチドにおいて、「Ｚ」は、ベンジルオキシカルボニルを表し、「ｐＮＡ」は発色パラ−ニトロアニリドを表す。すべての発色ペプチドは、Ｐｅｐｓｃａｎ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ、蘭国）から入手した。ペプチドＺ−ＡＦおよびＺ−ＡＲは、Ｂａｃｈｅｍ（瑞国）から購入した。すべてのインキュベーションは４０℃で行った。希釈した酵素調製物を商業製品の濃度に対して再計算した。
【０１５１】
アミノペプチダーゼ活性の測定
１００％ＤＭＳＯ中１５０ｍｍｏｌ／ｌのＶ−ｐＮＡおよびＱ−ｐＮＡのストック溶液を、０．１Ｍ  ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ６において８０倍希釈して、Ｖ−ｐＮＡおよびＱ−ｐＮＡを１：１比で含有する３．７５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｖ−ｐＮＡ＋Ｑ−ｐＮＡ基質溶液を作製した。このアミノペプチダーゼ基質溶液の２００μｌアリコートを、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）の個別のウェルにピペッティングした。ＭＴＰを、Ｍａｇｅｌｌａｎ４ソフトウェア下で稼動するＴｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ  ＭＴＰ（Ｓａｌｚｂｕｒｇ，Ｖｉｅｎｎａ）において、４０℃でプレインキュベートした。５０μｌの適切な酵素溶液を添加することによって反応を開始し、３ｍＭの基質濃度でインキュベーションを行った。典型的に、１：５０希釈の液体酵素サンプルＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ、Ｃｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰおよびプロリン特異的エンドプロテアーゼを使用した。乾燥Ｓｕｍｉｚｙｍｅ  ＦＰ製品の１％溶液を使用した。
【０１５２】
４０５ｎｍにおいてＴｅｃａｎ  Ｇｅｎｉｏｓ  ＭＴＰにより測定され、アミノ酸−ｐＮＡ結合の結果として発達する黄色を、少なくとも２０回の動力学サイクル（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｙｃｌｅ）（約１０分間）について追跡した。ソフトウェアにより、ＯＤ４０５／ｍｉｎとして得られるデータが得られた。
【０１５３】
プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性の測定
この測定は、アミノペプチダーゼアッセイと本質的に同様に行ったが、この場合、Ｚ−ＡＡＡＰ−ｐＮＡを唯一の基質として、３ｍｍｏｌ／ｌの最終濃度で測定した。懸濁液を、ｐＨ６の緩衝液において５０〜５５℃に加熱することによって、この基質を可溶化し、室温で澄明な溶液を生じた。測定は４０℃で行った。
【０１５４】
典型的に、１：５０希釈の液体酵素サンプルＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅおよびＣｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰを使用した。Ｓｕｍｉｚｙｍｅ  ＦＰを１％溶液で使用した。プロリン特異的エンドプロテアーゼは、典型的に、１：５０００希釈で使用した。
【０１５５】
ソフトウェアにより、ＯＤ４０５／ｍｉｎとしてデータが得られた。
【０１５６】
混入する非プロリン特異的エンドプロテアーゼ活性の測定
この測定もまた、アミノペプチダーゼアッセイについての記載と本質的に同様に行ったが、この試験では、１：１比および３ｍｍｏｌ／ｌの最終濃度でＺ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡおよびＺ−ＡＡＡＲ−ｐＮＡを基質として使用した。基質Ｚ−ＡＡＡＦ−ｐＮＡは、使用したｐＨ６．０の試験条件下で溶けにくくなるが、スブチリシンとの試験的インキュベーションでは、ｐＮＡ放出に付随的に伴って基質の迅速な可溶化を生じた。測定は４０℃で行った。しかし、この乏しい溶解度を補償するために、動力学サイクル（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｙｃｌｅ）間において振盪するようにＭＴＰリーダーをプログラムした。
【０１５７】
さらに、ソフトウェアにより、ＯＤ４０５／ｍｉｎとしてデータが得られた。
【０１５８】
混入するカルボキシペプチダーゼ活性の測定
カルボキシペプチダーゼ活性を測定するための感受性の発色ペプチドは利用可能でないため、カルボキシペプチダーゼＣを定量するためのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒプロトコルに基づく方法を使用した。
【０１５９】
Ｚ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒのエタノール中の２つの１５０ｍｍｏｌ／ｌストック溶液を、０．１ｍｏｌ／ｌ  ＢｉｓＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ６において８０倍希釈し、１：１比でＺ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒを含有する３．７５ｍｍｏｌ／ｌ  Ｚ−Ａ−Ｆ＋Ｚ−Ａ−Ｒ基質溶液を作製した。次いで、２００μｌの基質溶液をエッペンドルフバイアルにピペッティングし、４０℃でプレインキュベートした。反応は、５０μｌの適切な酵素希釈液を添加することによって開始した。典型的に、ＦｌａｖｏｕｒｚｙｍｅおよびＣｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰおよびプロリン特異的エンドプロテアーゼの１：５０希釈を使用した。Ｓｕｍｉｚｙｍ  ＦＰでは１％溶液を使用した。５分後、２５０μｌのニンヒドリン試薬を添加することによって、反応を停止した。ニンヒドリン試薬は、４００ｍｇニンヒドリン（Ｍｅｒｃｋ）および１５ｍｌ  ＤＭＳＯに溶解した６０ｍｇヒドリンダンチンから作製し、これに、５ｍｌの４．０ｍｏｌ／ｌ酢酸リチウム緩衝液ｐＨ５．２を添加した。４．０ｍｏｌ／ｌ酢酸リチウム緩衝液は、ＬｉＯＨ（Ｓｉｇｍａ）を溶解し、その後、氷酢酸（Ｍｅｒｃｋ）を使用して、溶液のｐＨをｐＨ５．２に調整することによって作製した。
【０１６０】
反応を停止した後、各サンプルを１５分間、９５℃で加熱して、色の形成を容易にし、その後、純粋なエタノールで１０倍希釈した。形成した色を、５７８ｎｍでＵｖｉｋｏｎ分光光度計において測定した。活性サンプルと同じ様式でブランクを作製したが、ニンヒドリン試薬および酵素添加は逆の順序で行った。カルボキシペプチダーゼ活性によって作製される遊離アミノ酸の量を定量するために、アミノ酸Ｌ−フェニルアラニンを使用して、検量線を作成した。０．１８７５、０．３７５、０．７５、１．５および３．０ｍｍｏｌ／ｌのＬ−フェニルアラニン（Ｓｉｇｍａ）を含有する緩衝液ｐＨ６における溶液を、サンプル、即ちバイアル中２５０μｌと同じ様式で処置した。得られたＯＤ５７８値から、エクセル（Ｅｘｃｅｌ）において曲線を構築した。Ｚ−Ａ−ＦおよびＺ−Ａ−Ｒ基質を含有するサンプルに存在する遊離アミノ酸の濃度を、この曲線を使用して算出した。得られた値から、試験した酵素の量あたり１分間のマイクロモルで、カルボキシペプチダーゼ活性を算出した。
【０１６１】
活性比の算出
本発明に従うプロセスのための多様な酵素調製物の適合を確立するために、関連する酵素活性の指数を算出した。ＭＴＰリーダーに基づくアッセイでは、酵素活性を、経時的なｐＮＡ放出、即ち？ＯＤ４０５／ｍｉｎとして特徴付けた。ＭＴＰリーダーによって得られる酵素活性の指数を、同一量の酵素に対して得られる？ＯＤ／ｍｉｎ値を単純に除することによって算出した。
【０１６２】
しかし、カルボキシペプチダーゼアッセイの場合、ＭＴＰ−ｐＮＡに基づくアッセイによって生じる？ＯＤ／ｍｉｎと直接比較することができないＯＤが生じる。ここで、測定したＯＤを、最初に、１分間あたりに放出されたμｍｏｌアミノ酸（μｍｏｌ／ｍｉｎ）に変換した。次いで、放出されたｐＮＡの？ＯＤ／ｍｉｎを、μｍｏｌ／ｍｉｎに変換した。そのために、ＭＴＰリーダーにおいて検量線を作成したが、ここでは、純粋なｐＮＡ（Ｓｉｇｍａ）の希釈、ウェルあたり０．２５、０．１２５、０．０６２５、０．０３１２および０．０１５ｍｍｏｌ／ｌおよび２５０μｌを測定した。得られたデータから、エクセル（Ｅｘｃｅｌ）において検量線を構築した。この検量線から、ｐＮＡに基づく測定値を、ニンヒドリンに基づく測定値と比較し得るように、？ＯＤ／ｍｉｎをμｍｏｌ／ｍｉｎに変換した。
【０１６３】
上記の試験において作成されたデータに基づいて、使用した多様な酵素調製物を、所望のプロリン特異的およびアミノペプチダーゼ活性ならびに混入するエンドプロテアーゼおよびカルボキシペプチダーゼ活性について特徴付けした。さらに、５０℃で６時間のインキュベーション期間後のＡＣＥ阻害ペプチドの至適放出を生じる、実施例８において使用し、１グラムのカゼインあたり４単位のプロリン特異的エンドプロテアーゼおよび１３０マイクロリットルのＣｏｒｏｌａｓｅ  ＬＡＰの混合物よりなる酵素の組み合わせＣ１を、この方法で特徴付けした。提供される各酵素調製物に存在するプロリン特異的オリゴ−またはエンド型プロテアーゼ活性に関するデータを、表６のカラム「Ｐｒｏｌ  Ｓｐｅｃ活性」に示す。所望されるアミノペプチダーゼ活性（ＡＰ／Ｐｒｏｌ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔ）ならびに混入するカルボキシペプチダーゼ（ＣＰＤ／Ｐｒｏｌ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔ）およびエンド型プロテアーゼ活性（Ｅｎｄｏ／Ｐｒｏｌ  Ｓｐｅｃ  Ａｃｔ）に関するデータを、存在するプロリン特異的活性に対して示す。各調製物において存在する混入するカルボキシペプチダーゼ活性に対する所望されるアミノペプチダーゼ活性を（ＡＰ／ＣＰＤ）として示す。
【０１６４】
試験した市販の酵素調製物のうち、任意の有意なプロリン特異的オリゴ−またはエンド型プロテアーゼ活性を含有するものはないことは明らかである。さらに、試験したすべての市販の酵素調製物は、混入するカルボキシペプチダーゼおよびエンド型プロテアーゼ活性を含有する。高収量のＡＣＥ阻害ＩＰＰ、ＶＰＰおよびＬＰＰペプチドを生じる酵素の組み合わせＣ１は、その極めて低レベルの混入するカルボキシペプチダーゼおよびエンド型プロテアーゼ活性のため、卓越している。
【０１６５】
【表６】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図３】
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