(57)【要約】  粘膜吸収性が極めて低いため従来は注射投与のみであったペプチド性薬物に対して経口、経鼻または経肺投与を可能とする粘膜吸収促進剤を提供するものであり、ペプチド性薬物をクロストリジウム属細菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）が産生するエンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）を、詳細にはＣ−ＣＰＥ又はＣ−ＣＰＥの１個ないし数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失の変異体のアミノ酸配列式を有する物質と共に作用させることにより、ペプチド性薬物の経腸、経肺および経鼻における粘膜吸収を向上させるものであり、本発明の粘膜投与用組成物は、小腸、肺や鼻などの粘膜においてヒト副甲状腺ホルモンｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトモチリン、ヒトグレリンなどのペプチド性薬物の吸収促進効果が顕著に認められ、また、従来の粘膜吸収促進物質とは異なり組織障害性がなく安全性に優れている。
2009005000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロストリジウム属細菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）が産生するエンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）アミノ酸配列式を有する物質からなるペプチド性薬物の粘膜吸収促進剤。
【請求項２】
エンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）アミノ酸配列式を有する物質が、Ｃ−ＣＰＥ又はＣ−ＣＰＥの１個ないし数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失の変異体である請求項１に記載のペプチド性薬物の粘膜吸収促進剤。
【請求項３】
当該Ｃ−ＣＰＥの変異体が、当該Ｃ−ＣＰＥのＮ末端から１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失した変異体である請求項２に記載の粘膜吸収促進剤。
【請求項４】
当該Ｃ−ＣＰＥの欠失体が、Ｃ−ＣＰＥのＮ末端１位から２１位までのアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失した変異体である請求項３に記載の粘膜吸収促進剤。
【請求項５】
当該Ｃ−ＣＰＥの欠失体が、Ｃ−ＣＰＥのＮ末端１位から１０位までのアミノ酸残基が欠失した変異体又はＣ−ＣＰＥのＮ末端１位から２１位までのアミノ酸残基が欠失した変異体である請求項４に記載の粘膜吸収促進剤。
【請求項６】
当該Ｃ−ＣＰＥのアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列である請求項１又は２に記載の粘膜吸収促進剤。
【請求項７】
当該Ｃ−ＣＰＥの塩基配列が、配列番号２に示す配列である請求項６に記載の粘膜吸収促進剤。
【請求項８】
当該該Ｃ−ＣＰＥの変異体のアミノ酸配列が、配列番号３又は４に示す配列である請求項５に記載の粘膜吸収促進剤。
【請求項９】
ペプチド性薬物と請求項１に記載の粘膜吸収促進剤を含有してなることを特徴とするペプチド性薬物の粘膜投与用組成物。
【請求項１０】
ペプチド性薬物が、ペプチドホルモンであることを特徴とする請求項９に記載のペプチド性薬物の粘膜投与用組成物。
【請求項１１】
ペプチドホルモンが、副甲状腺ホルモン及びその誘導体、グルカゴン様ペプチド−１、グレリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウムペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウムペプチド（ＣＮＰ）、インスリン、モチリン、レプチン、レジスチン、グルカゴン、リラキシン、ガラニン、ガストリン、アペリン、セレクチン、カルシトニン、アドレノメデュリン、アミリン、ヒューマニン、チモシン、エンドルフィン、エンドモルフィン、ノシスタチン、エンケファリン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＳ、ニューロメジンＵ、アンジオテンシン、エンドセリン、グアニリン、サリューシン、ウロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、ニューロフィジン、メラニン細胞刺激ホルモン、ウロコルチン、リポトロピン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メスタチン、プロラクチン放出ペプチド、ソマトスタチン、コルチスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サブスタンスＰ、ニューロキニン、エンドキニン、ニューロテンシン、ニューロメジンＮ、オベスタチン、オレキシンインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、メラニン凝集ホルモン、副腎刺激ホルモン放出ホルモン、エクセンジン−４、カタカルシン、コレシストキニン、コルチコトロピン、メラノトロピン、ニューロメジンＣ、コペプチン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ペプチドＹＹ、チロリベリン及びその誘導体のいずれかであることを特徴とする請求項１０に記載のペプチド性薬物の粘膜投与用組成物。
【請求項１２】
ペプチドホルモンが、ヒト副甲状腺ホルモン及びその誘導体ｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトグレリン又はヒトモチリンであることを特徴とする請求項１０に記載のペプチド性薬物の粘膜投与用組成物。
【請求項１３】
粘膜投与が、腸管上皮粘膜、鼻腔上皮粘膜、気道上皮粘膜、又は肺胞上皮粘膜経由のいずれかへの投与であることを特徴とする請求項９に記載のペプチド性薬物の粘膜投与用組成物。
【請求項１４】
粉末製剤、水性懸濁液剤又は油性懸濁液剤としての製剤形態にあることを特徴とする請求項９に記載のペプチド性薬物の粘膜投与用組成物。
【請求項１５】
請求項１又は２に記載の粘膜吸収促進剤を用いてペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法。
【請求項１６】
請求項１又は２に記載の粘膜吸収促進剤とペプチド性薬物を、同時に投与することを特徴とする請求項１５に記載のペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法。
【請求項１７】
請求項１又は２に記載の粘膜吸収促進剤とペプチド性薬物を、それぞれ時間差をおいて投与することを特徴とする請求項１５に記載のペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法。
【請求項１８】
ペプチド性薬物の投与前に請求項１又は２に記載の粘膜吸収促進剤を投与することを特徴とする請求項１５に記載のペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法。
【請求項１９】
ペプチド性薬物の投与の少なくとも２時間前までに請求項１又は２に記載の粘膜吸収促進剤を投与することを特徴とする請求項１５に記載のペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法。
【請求項２０】
ペプチド性薬物の投与の少なくとも４時間前までに請求項１又は２に記載の粘膜吸収促進剤を投与することを特徴とする請求項１５に記載のペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法。
【請求項２１】
粘膜吸収を腸管上皮粘膜、鼻腔上皮粘膜、気道上皮粘膜、又は肺胞上皮粘膜経由のいずれかで行うことを特徴とする請求項１５に記載のペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法。
【請求項２２】
ペプチド性薬物が、ヒト副甲状腺ホルモン及びその誘導体ｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトグレリン又はヒトモチリンであることを特徴とする請求項１５に記載のペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド性薬物の経腸吸収、経鼻吸収又は経肺吸収等の粘膜吸収を促進させる吸収促進剤、及びそれを用いたペプチド性薬物を含有する粘膜投与用組成物に関する。
更に詳細には、本発明は、粘膜吸収促進剤としてクロストリジウム属細菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）が産生するエンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）を、詳細にはＣ−ＣＰＥ又はＣ−ＣＰＥの１個ないし数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失の変異体を用いることにより、安全性に優れ、効率よくヒト甲状腺ホルモン：ｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトグレリン又はヒトモチリンなどの生理活性ペプチド性薬物の生体内吸収性を高めた粘膜投与用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンや副甲状腺ホルモン、グルカゴン様ペプチド：ＧＬＰ−１などの生理活性ペプチドは、分子量サイズが数キロダルトン（ｋＤａ）であり、加えて極性分子であるため、低分子化合物からなる薬物とは異なり、腸管粘膜上皮や鼻腔粘膜上皮、気道粘膜上皮などの粘膜細胞層を透過することができない。また、粘膜上皮細胞が分泌するプロテアーゼによって速やかに分解されてしまう。したがって、これらペプチド性薬物は経口投与では吸収されず、臨床上は筋肉投与、皮下投与又は静脈内投与などの注射による投与に限られているのが現実である。しかしながら、注射投与は患者に侵襲的な苦痛を与えるものであり、特に長期間の反復投与は精神的に負担を強いる。また、生理活性ペプチド投与の適応症としては、ＱＯＬ改善を目的とした疾患が多く、従って長期に亘っての継続的な投与を必要とし、患者が自分自身で在宅のまま行える投与形態の製剤が望まれている。【０００３】
これまで、高分子薬物の吸収改善のために、或いは消化管やその他の吸収部位におけるペプチド性薬物の粘膜透過性を一過性に上昇させるために、吸収促進剤の利用が試みられている。吸収促進剤としては、カプリン酸やオレイン酸などの脂肪酸、胆汁酸、ＥＤＴＡなどのキレート剤などが知られているが、いずれも粘膜上皮細胞に与える毒性が強く、長期投与には適していない。また、吸収部位や吸収促進剤自体の物性等により、その吸収促進効果が大きく異なるという問題点があった。
そのため、粘膜透過効率を高めることを目的とし、ペプチド性薬物の生体内吸収率を向上させると共に、且つ従来の吸収促進剤のような粘膜上皮組織に与える毒性がない、或いは非常に低く長期投与や反復投与も可能である吸収促進剤の開発を、細胞生物学的なアプローチによって行った。【０００４】
細胞生物学的なアプローチとしては、粘膜上皮細胞層は、隣接する細胞同士がタイトジャンクションと呼ばれる接着装置により、イオン分子も隔離する厳密なバリアを形成しているが、これまでに、このタイトジャンクション機能を制御して薬物を吸収させる試みが検討されている。例えば、タイトジャンクションを構成する主要タンパク質の一つであるオクルーディン（Occludin）の細胞外ループペプチドを作用させることで、４０ＫＤａまでのデキストランの透過を亢進させることができたと報告されている（非特許文献１）。
しかしながら、この報告はアフリカツメガエルの腎臓上皮細胞における実験結果に基づく報告であり、ヒト腸管粘膜上皮機能を反映させたCaco-2培養細胞層を用いた実験では、透過亢進作用は確認されていない（非特許文献２、３）。したがって、オクルーディン（Occludin）によるタイトジャンクションの開孔は推測されるが、生体内への吸収の促進に関しては一切明らかにされていない。【０００５】
一方、タイトジャンクションを構成する別な主要タンパク質にクローディン（Claudin）と呼ばれる膜タンパク質が同定されており、これまでに、ヒトにおいて２４種類のクローディン（Claudin）のファミリーが報告されている。
クローディン（Claudin）はオクルーディン（Occludin）と異なり組織ごとに発現する種類とパターンが異なり、腸管粘膜上皮や鼻腔粘膜上皮などの粘膜上皮ではクローディン−４（Claudin-4）が多く発現していることが知られている。そのため、オクルーディン（Occludin）とは異なり、組織特異的な薬物吸収送達システムの作用点として有望と考えられている。【０００６】
１９９９年に園田らの研究により、食中毒原因菌の一つであるウェルシュ菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の産生するエンテロトキシン（ＣＰＥ）がこのクローディン−４（Claudin-4）に特異的に作用し、タイトジャンクションを開孔させることが明らかにされた（非特許文献４）。
また、クローディン−４（Claudin-4）に対する結合には、ＣＰＥのＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）のみが関与していることも示された。また、ＣＰＥはクローディン−４（Claudin-4）に比べると結合活性が劣るものの、クローディンファミリーのクローディン−３、６、７、８、１４（Claudin-3, 6, 7, 8, 14）にも作用することも見出されている。【０００７】
近藤らは、このＣ−ＣＰＥが、分子量４ＫＤａ、１０ＫＤａ、２０ＫＤａ、４０ＫＤａのデキストランを用いて、粘膜吸収を高められるか否かを確認し、１０ＫＤａまでは、粘膜吸収効果があることを報告している（非特許文献５）。デキストランは高分子であるがその大きさが判明しており、分子構造がシンプルであること、また粘膜内および血中に存在するプロテアーゼ等からの分解を受け難く安定なことから、タイトジャンクション透過マーカーとして従来から使われているものである。試験に用いられた１０ＫＤａのデキストランは分子サイズが２．３ｎｍであるので、その大きさがタイトジャンクションの開孔の大きさと推測される。また、本文献には、既に吸収促進剤として、臨床使用されているカプリン酸が、Caco-2細胞評価系とラットの腸管組織において、それぞれ細胞毒性と組織障害性を有することに対し、Ｃ−ＣＰＥは、同様の吸収促進作用を示す投与量においても細胞毒性および組織障害性がほとんど認められず、安全性が高いことも記載されている。【０００８】
しかしながら、該文献では、Ｃ−ＣＰＥが、高分子であり且つ粘膜内及び血中で分解を受け難いデキストランを用いて、タイトジャンクションの開孔を試験し、その結果、透過できるであろう物質の分子サイズ或いは分子量を確認しているのに過ぎず、生体内の各部位において、同等の分子サイズ或いは分子量の物質が透過することを予想するものではない。生体内に投与された薬剤は、生体内の各部位で、特に粘膜上皮組織において多量に存在するプロテアーゼで容易に分解される。特にペプチド性薬物は、酵素による分解を受けやすく、生体内での安定性が、粘膜吸収を大きく左右する要因となる。また、ペプチド性薬物はその三次元構造が複雑であり、該文献において確認されたデキストリンと分子サイズ或いは分子量が同等の大きさのペプチド性薬物であっても、粘膜を透過することを予測できない。更に、透過しても、透過の前後において分解を受け、生体内にペプチド性薬物が吸収されるか否かは全く予測できるものではない。【０００９】
【非特許文献１】Wong V., Gumbiner BM., Journal of Cell Biology, Vol.136 pp.399-409 (1997)
【非特許文献２】Tavelin S., et al., Molecular Pharmacology, Vol.64 pp.1530-1540 (2003)
【非特許文献３】Kondoh M., et al., Yakugaku Zasshi Vol.127, No.4 pp.601-609 (2007)
【非特許文献４】Journal of Cell Biology, Vol.147, No.1 pp.195-204 (1999)
【非特許文献５】Kondoh M., et al., Molecular Pharmacology, Vol.67 pp.749-756, (2005)
【非特許文献６】Van Itallie CM., et al., Journal of Biological Chemistry, Vol.283, pp.268-274
【非特許文献７】Masuyama A., et al, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 314, pp.789-95 (2005)
【非特許文献８】Ebihara C., et al, Biochemical Pharmacology, 73, 824-30 (2007)
【非特許文献９】Harada M., et al, Biochemical Pharmacology, 73, pp.206-14 (2007)
【非特許文献１０】Takahashi A., et al, Biochemical Pharmacology, 75, pp.1639-48 (2008)
【００１０】
本発明者らは、粘膜上皮組織において多量に存在するプロテアーゼで容易に分解され、安定性が低く、かつ三次元構造が複雑なペプチド性薬物について、モデル実験系の選択やＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ−ＣＰＥの変異体とペプチド性薬物の投与濃度、その投与時期、また、吸収されたペプチド性薬物の検出方法などについて鋭意検討を行い、Ｃ−ＣＰＥを、詳細にはＣ−ＣＰＥ又はＣ−ＣＰＥの１個ないし数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失の変異体を、望ましい濃度でペプチド性薬物と共存在させることにより、当該ペプチド性薬物の粘膜透過促進効果が得られることを見出し、ペプチド性薬物の効率的な粘膜吸収方法として本発明を完成させるに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、粘膜上皮からの吸収がほとんど不可能なペプチド性薬物について、体内吸収率を著しく改善でき且つ粘膜上皮に損傷を与えることがない吸収促進剤を、細胞生物学的アプローチによって見出すと共に、ペプチド性薬物について経口投与や経鼻投与、または経肺投与により、粘膜吸収性を可能にする、粘膜投与用組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
かかる課題を解決するための本発明は、その基本的態様としてクロストリジウム属細菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）が産生するエンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）アミノ酸配列式を有する物質からなるペプチド性薬物の粘膜吸収促進剤である。
具体的には、エンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）アミノ酸配列式を有する物質がＣ−ＣＰＥ又はＣ−ＣＰＥの１個ないし数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失の変異体であるペプチド性薬物の粘膜吸収促進剤である。【００１３】
より具体的には、当該Ｃ−ＣＰＥは、そのアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列である粘膜吸収促進剤である。また、当該Ｃ−ＣＰＥは、その塩基配列が、配列番号２に示す配列である粘膜吸収促進剤である。【００１４】
更に、Ｃ−ＣＰＥの変異体が、当該Ｃ−ＣＰＥのＮ末端から１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失した変異体である粘膜吸収促進剤である。具体的には、当該Ｃ−ＣＰＥの欠失体が、Ｃ−ＣＰＥのＮ末端１位から２１位までのアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失した変異体である粘膜吸収促進剤である。【００１５】
更に当該Ｃ−ＣＰＥの欠失体が、Ｃ−ＣＰＥのＮ末端１位から１０位までのアミノ酸残基が欠失した変異体又はＣ−ＣＰＥのＮ末端１位から２１位までのアミノ酸残基が欠失した変異体である粘膜吸収促進剤である。
更に具体的には、当該該Ｃ−ＣＰＥの変異体のアミノ酸配列が、配列番号３又は４に示す配列である粘膜吸収促進剤である。【００１６】
また本発明は、別の態様としてかかる粘膜吸収促進剤を用いたペプチド性薬物についての粘膜吸収用組成物を提供し、具体的には、ペプチド性薬物と上記の粘膜吸収促進剤を含有してなることを特徴とする粘膜投与用組成物である。【００１７】
より具体的には、ペプチド性薬物が、好ましくはペプチドホルモンである上記の粘膜投与用組成物である。【００１８】
なかでも、本発明は、当該ペプチドホルモンが副甲状線ホルモン（ＰＴＨ）およびその誘導体、グルカゴン様ペプチド−１、グレリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウムペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウムペプチド（ＣＮＰ）、インスリン、モチリン、レプチン、レジスチン、グルカゴン、リラキシン、ガラニン、ガストリン、アペリン、セレクチン、カルシトニン、アドレノメデュリン、アミリン、ヒューマニン、チモシン、エンドルフィン、エンドモルフィン、ノシスタチン、エンケファリン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＳ、ニューロメジンＵ、アンジオテンシン、エンドセリン、グアニリン、サリューシン、ウロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、ニューロフィジン、メラニン細胞刺激ホルモン、ウロコルチン、リポトロピン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メスタチン、プロラクチン放出ペプチド、ソマトスタチン、コルチスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サブスタンスＰ、ニューロキニン、エンドキニン、ニューロテンシン、ニューロメジンＮ、オベスタチン、オレキシンインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、メラニン凝集ホルモン、副腎刺激ホルモン放出ホルモン、エクセンジン−４、カタカルシン、コレシストキニン、コルチコトロピン、メラノトロピン、ニューロメジンＣ、コペプチン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ペプチドＹＹ、チロリベリン及びその誘導体のいずれかである粘膜投与用組成物であり、より具体的にはペプチドホルモンが、ヒト副甲状腺ホルモン及びその誘導体ｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトグレリン又はヒトモチリンであることを特徴とする粘膜投与用組成物である。【００１９】
本発明にあっては、これらの組成物は、粘膜投与が腸管上皮粘膜、鼻腔上皮粘膜、気道上皮粘膜、又は肺胞上皮粘膜経由のいずれかへの投与であるペプチド性薬物の粘膜投与用組成物である。また、粉末製剤、水性懸濁液剤又は油性懸濁液剤としての製剤形態にある粘膜投与用組成物である。【００２０】
また本発明は、更に別の態様として、上記した粘膜吸収促進剤を用いてペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法を提供するものであり、より具体的には、かかる粘膜吸収促進剤とペプチド性薬物を、同時に投与すること、それぞれ時間差をおいて投与すること、更にはペプチド性薬物の投与前に粘膜吸収促進剤を投与すること、好ましくは、少なくともペプチド性薬物の投与２時間前までに粘膜吸収促進剤を投与することによるペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法である。
また、少なくともペプチド性薬物の投与４時間前までに粘膜吸収促進剤を投与することによるペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法である。【００２１】
本発明は、最も具体的には、粘膜吸収を腸管上皮粘膜、鼻腔上皮粘膜、気道上皮粘膜、又は肺胞上皮粘膜経由のいずれかで行うことを特徴とするペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法である。また、ペプチド性薬物がヒト副甲状腺ホルモン及びその誘導体ｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトグレリン又はヒトモチリンであることを特徴とするペプチド性薬物の生体内吸収性を促進させる方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、ペプチド性薬物を、クロストリジウム属細菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）が産生するエンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）と、詳細にはＣ−ＣＰＥ又はＣ−ＣＰＥの１個ないし数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失の変異体と共に作用させることにより、経腸、経肺および経鼻における粘膜吸収を促進させることが可能となった。また、ペプチド性薬物投与前に予めＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ−ＣＰＥの変異体を投与しておくことにより、ペプチド性薬物の吸収作用がより向上するものであり、本発明のＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ−ＣＰＥの変異体を含む粘膜投与用組成物は、患者への負担の少ない経口や経鼻および経肺投与へ使用することができる。【００２３】
より具体的には、本発明の方法により、生理活性を有する、天然、または非天然アミノ酸からなるペプチド性薬物、及び化学修飾されたペプチド性薬物を、高いバイオアベイラビリティーをもって、粘膜組織を介した非侵襲的な投与が可能となる。
したがって、本発明の粘膜投与用組成物は、小腸、肺や鼻などの粘膜においてｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトグレリンまたはヒトモチリンなどのペプチド性薬物の吸収促進効果が顕著に認められ、また、従来の粘膜吸収促進物質とは異なり組織障害性がなく安全性に優れている点で、極めて効果的にペプチド性薬物を生体に吸収させることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を皮下投与した時の血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度変化を示すグラフである。
【図２】ラットにヒトグレリンを静脈内投与した時の血漿中ヒトグレリン濃度変化を示すグラフである。
【図３】ラットにヒトモチリンを静脈内投与した時の血漿中ヒトモチリン濃度変化を示すグラフである。
【図４】ラット１匹当たり100μgのｈＰＴＨ（１−３４）を空腸内投与した際の血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度変化を示すグラフであって、◆を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）のみを投与した場合の濃度変化を示し、■を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）投与の４時間前にＣ−ＣＰＥを20 μg投与した場合の濃度変化を示す。
【図５】ラット１匹当たり200μgのｈＰＴＨ（１−３４）を経鼻投与した際の血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度変化を示すグラフであって、◆を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）のみを投与した場合の濃度変化を示し、■を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）投与の４時間前にＣ−ＣＰＥを4 μg投与した場合の濃度変化を示す。
【００２５】
【図６】ラット１匹当たり150μgのｈＰＴＨ（１−３４）を経肺投与した際の血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度変化を示すグラフであって、◆を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）のみを投与した場合の濃度変化を示し、■を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）投与の４時間前にＣ−ＣＰＥを4 μg投与した場合の濃度変化を示す。
【図７】ラット１匹あたり25μgのヒトグレリンを経肺投与した際の血漿中ヒトグレリン濃度変化を示すグラフであって、◆を結んで得られる線はヒトグレリンのみを投与した場合の濃度変化を示し、■を結んで得られる線はヒトグレリン投与の４時間前にＣ−ＣＰＥを５μg投与した場合の濃度変化を示す。
【図８】ラット１匹あたり25μgのヒトモチリンを経肺投与した際の血漿中ヒトモチリン濃度変化を示すグラフであって、◆を結んで得られる線はヒトグレリンのみを投与した場合の濃度変化を示し、■を結んで得られる線はヒトモチリン投与の４時間前にC-CPEを５μg投与した場合の濃度変化を示す。
【図９】ラット１匹あたり150μgのｈＰＴＨ（１−３４）を経肺投与した際の血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度変化を示すグラフであって、◆を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）のみを投与した場合の濃度変化を示し、■を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）投与の４時間前にＣ−ＣＰＥを4μg投与した場合の濃度変化を示す。▲を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）投与の２時間前にＣＰＥ０３を105μg投与した場合の濃度変化を示し、●を結んで得られる線はｈＰＴＨ（１−３４）投与の２時間前にＣＰＥ０４を20μg投与した場合の濃度変化を示す。
【図１０】ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を静脈内投与した時の血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で使用される吸収促進物質としてのＣ−ＣＰＥは、クロストリジウム属細菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）が産生するエンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）であり、このＣ−ＣＰＥのアミノ酸配列、及びそのＤＮＡ塩基配列を、それぞれ配列番号１、及び配列番号２に示した。なお、ＤＮＡ塩基配列は、本発明者により確認されている。
本発明においては、Ｃ−ＣＰＥ以外にも、Ｃ−ＣＰＥを１個ないし数個のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失を含める機能的同等類縁体である該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体も使用することができる。【００２７】
Ｃ−ＣＰＥの変異体に関しては、Ｃ−ＣＰＥの構造解析等のため複数の文献において作製されたことが報告され、そのうち一部については、ラットにおけるデキストランの腸管粘膜吸収作用がなかった、或いはＣ−ＣＰＥに比して減少したことが報告されている。そして、これらのＣ−ＣＰＥの変異体の中で、Ｃ−ＣＰＥを上回る粘膜吸収作用があるＣ−ＣＰＥ変異体は報告されておらず、更にペプチド性薬物の粘膜吸収促進作用については全く報告されていない。【００２８】
近藤らの文献（非特許文献８〜１０）によると、Claudinに対する結合中心を見つけるためにＣ−ＣＰＥのアミノ酸置換変異体を複数作製し、それらの変異体による蛍光標識したラットにおけるデキストランの腸管粘膜吸収作用を実験で調べているが、いずれも吸収作用がなかった、或いはＣ−ＣＰＥに比して減少した、又はＣ−ＣＰＥと同等であったことが報告されている。【００２９】
非特許文献７には、C-CPE220(CPE220-319)と称されるＮ末△36（Ｎ末端３６残基欠失）のＣ−ＣＰＥ変異体の作製例があるが、C-CPE220はラットにおけるデキストランの腸管粘膜吸収作用がなかったことが報告されている。【００３０】
非特許文献５には、Ｃ末端３０残基を欠損したC-CPE289(CPE184-289)及びＣ末端１６残基を欠損したC-CPE303(CPE184-303)の２種類のＣ末端を欠失させたＣ−ＣＰＥ変異体の作製例があるが、これらのＣ−ＣＰＥ変異体は、ラットにおけるデキストランの腸管粘膜吸収作用がなかったことが報告されている。【００３１】
非特許文献８には、３０６番目のTyr残基をAla残基に置換したY306A及び３０６番目のTyr残基をLys残基に置換したY306K（CPE184-319の点変異）の２種類のＣ−ＣＰＥ変異体が記載されているが、ラットにおける腸管粘膜吸収作用がなかったことが報告されている。また、３０６番目のTyr残基をPhe残基又はTrp残基に置換したY306F又はY306WのＣ−ＣＰＥ変異体が記載されているが、ラットにおけるデキストランの腸管粘膜吸収作用はＣ−ＣＰＥと同等である。【００３２】
非特許文献９には、３０６番目のTyr残基及び３１０番目のTyr残基及び３１２番目のTyr残基をそれぞれ同時にAla残基に置換した三重変異体であるY306A/Y310A/Y312Aの変異体が記載されているが、いずれもラットにおける腸管粘膜吸収作用がなく、それぞれの点変異体Y308AとY312A、及び二重変異体であるY308A/Y310A、Y308A/Y312A、Y310A/Y312Aはラットにおける腸管粘膜吸収作用が減少したと報告されている。【００３３】
非特許文献１０には、３１５番目のLeu残基をAla残基した変異体であるL315A及びY308A/L315AなどのL315Aを含む二重変異体が記載されているが、いずれの変異体もラットにおける腸管粘膜吸収作用がＣ−ＣＰＥに比べて著しく減少したことが報告されている。【００３４】
Ｎ末から１０のアミノ酸を欠失させた変異体（ＣＰＥ194-319）については、非特許文献６で作製が報告されている。ＣＰＥ194-319はＣ−ＣＰＥの蛋白質の構造結晶解析のため、Ｃ−ＣＰＥが凝集せずに安定な蛋白を得るために溶解度を高めることを意図して作製された変異体である。非特許文献６には、Ｎ末から１０のアミノ酸を欠失させた変異体（ＣＰＥ194-319）の水溶液中における溶解性と安定性、及びClaudin-4に対する結合活性についての記載はあるが、本発明の目的であるペプチド性薬物の粘膜吸収促進作用に関する記載は全くなく、その示唆すらない。
このように、Ｃ−ＣＰＥの変異体のいくつかの作製例は知られていたが、Ｎ末を欠失させた変異体について、Ｃ−ＣＰＥが有する吸収促進作用があることも、そしてさらに本発明のペプチド性薬物の粘膜吸収促進作用があることも、知られるものではなかった。【００３５】
本発明者らは、Ｃ−ＣＰＥの変異体についてそれらの推測される体内動態等から、複数作製の上、本発明のペプチド性薬物の粘膜吸収促進作用を有するＣ−ＣＰＥの変異体を見出した。
本発明で用いるＣ−ＣＰＥの変異体は、該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）欠損体および／または変換置換体である。本発明においては、該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）のＮ末欠損体が好ましく用いられる。特にＣ−ＣＰＥのＮ末端１位から２１位までのアミノ酸残基において、１もしくは数個のアミノ酸残基が欠失した変異体が好ましく用いられる。【００３６】
これらの変異体のうち、Ｃ−ＣＰＥのＮ末端１位から１０位までのアミノ酸残基が欠失した変異体（以下、ＣＰＥ０３という）は、欠損残基が「ERCVLTVPST」である変異体である。ＣＰＥ０３のアミノ酸配列を配列番号３に示した。なお、ＣＰＥ０３は、非特許文献６に記載されるＣＰＥ194-319と同じアミノ酸配列の変異体である。
また、Ｃ−ＣＰＥのＮ末端１位から２１位までのアミノ酸残基が欠失した変異体（以下、ＣＰＥ０４という）は、欠損残基が「ERCVLTVPSTDIEKEILDLAA」である変異体である。ＣＰＥ０４のアミノ酸配列を配列番号４に示した。【００３７】
本発明に用いるＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体である遺伝子産物は、クロストリジウム属細菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）由来、または同属細菌由来のホモロジーの高い毒素ファミリー、およびそれらのキメラ体由来のものであっても応用可能であり、同属細菌由来のホモロジーの高い毒素蛋白間のキメラ体であっても同種の効果が期待できる。
用いるＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体ペプチドは、クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の培養菌体から抽出するか、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌等の宿主で組換え蛋白質として調製可能である。
また、本発明に用いるＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体遺伝子産物は、部分的なアミノ酸残基置換等の化学修飾が可能である。【００３８】
本発明に用いるＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体は、クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）の培養菌体から抽出するか、遺伝子組換え技術を用いて大腸菌等の宿主で組換え蛋白質として調製可能である。また、Ｃ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体の精製を簡略化するために、ＨｉｓタグやＧＳＴタグなどの精製補助タグペプチドをＮ末に付加したものであっても使用は可能である。【００３９】
本発明において、粘膜透過性が亢進されるペプチド性薬物としては、種々のペプチド性薬物を挙げることができるが、特に、副甲状線ホルモンおよびその誘導体のほか、グルカゴン様ペプチド−１、グレリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウムペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウムペプチド（ＣＮＰ）、インスリン、モチリン、レプチン、レジスチン、グルカゴン、リラキシン、ガラニン、ガストリン、アペリン、セレクチン、カルシトニン、アドレノメデュリン、アミリン、ヒューマニン、チモシン、エンドルフィン、エンドモルフィン、ノシスタチン、エンケファリン、ニューロペプチドＹ、ニューロペプチドＳ、ニューロメジンＵ、アンジオテンシン、エンドセリン、グアニリン、サリューシン、ウロテンシン、オキシトシン、バソプレシン、ニューロフィジン、メラニン細胞刺激ホルモン、ウロコルチン、リポトロピン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、メスタチン、プロラクチン放出ペプチド、ソマトスタチン、コルチスタチン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、サブスタンスＰ、ニューロキニン、エンドキニン、ニューロテンシン、ニューロメジンＮ、オベスタチン、オレキシンインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、メラニン凝集ホルモン、副腎刺激ホルモン放出ホルモン、エクセンジン−４、カタカルシン、コレシストキニン、コルチコトロピン、メラノトロピン、ニューロメジンＣ、コペプチン、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ペプチドＹＹ、チロリベリン及びその誘導体、非天然アミノ酸や化学修飾を含むペプチド誘導体を含めて、Ｃ−ＣＰＥの添加による粘膜吸収促進作用が期待できる。なお、分子量約２万以下のサイズを有するペプチド性薬物であることが、より好ましい。【００４０】
本発明が提供する粘膜吸収性促進剤であるＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体は、ペプチド性薬物と併用することにより、ペプチド性薬物の生体内吸収性を向上させることができる。
このＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体とペプチド性薬物との併用時期については、ペプチド性薬物と同時投与であっても粘膜吸収促進作用が得られる。しかしながら、粘膜吸収性促進剤を予め投与し、タイトジャンクションが十分に開孔している状態で、ペプチド性薬物を投与することで、ペプチド性薬物が速やかに細胞間隙を透過でき、粘膜上皮細胞が分泌するプロテアーゼによる分解を受けやすい状態を短縮することにより、生体内の吸収がより一層高まり、効果的である。したがって、ペプチド性薬物の投与前に本発明の粘膜吸収性促進剤であるＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体を事前に投与しておくことがより好ましい。
粘膜吸収性促進剤の事前投与については、粘膜吸収性促進剤であるＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体によるタイトジャンクションの開孔作用が発揮される時間を考慮し、ペプチド性薬物投与１５分前から２４時間前程度の範囲が望ましい。本発明者等の検討によれば、ペプチド性薬物の投与前少なくとも２時間前までにＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体を事前に投与することにより、顕著な吸収促進作用が得られることが判明した。【００４１】
ペプチド性薬物との併用におけるＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体の投与方法としては、Ｃ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体の直接投与以外に、種々の投与形態が挙げられる。例えば、ペプチド性薬物を内包するコア錠を腸溶解性ポリマーで被覆したカプセル剤の外層部分にＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体或いはそれらの誘導体を抱合した形態とすることもできる。
さらに溶解時間を遅らせて崩壊させるように設計した腸溶解性ポリマーから成る内膜に囲まれた内核部分に目的とするペプチド薬物を封入した経口製剤カプセルを用いる場合、初めに外殻ポリマーが溶解してＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体が放出され腸管粘膜上皮組織のタイトジャンクションを開孔させ、その後、内膜ポリマーが崩壊し封入されていたペプチド薬物が放出され、開孔したタイトジャンクションを経由して、効率良く生体内吸収をさせることができる。【００４２】
Ｃ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体とペプチドを同時投与する場合には、両者を単に物理的に混合するだけでも良い。また、化学修飾により両者を架橋結合させてもよく、さらにはアミノ酸一次配列上でＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体のＮ末端或いはＣ末端のいずれかに、投与すべきペプチド性薬物を直接接続した形式で生合成させたものを投与しても良い。
一次配列上での接続においては両者を直接接続しても良く、またはトリプシンなどの血中または粘膜上皮に局在しているプロテアーゼにより認識され切断されるリンカー配列を挟んで連結しても良い。【００４３】
本発明が提供する粘膜投与用組成物、粘膜吸収促進剤の形態或いはペプチド性薬物の形態は、種々の態様を採用することが可能であり、それぞれ治療目的に応じた製剤設計により調製することが可能である。具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤等が挙げられる。粘膜投与用組成物としては、粉末製剤、水性懸濁液剤又は油性懸濁液剤としての製剤形態が投与には特に適している。【００４４】
本発明の粘膜投与用組成物が投与され、効率的な生体内吸収を生じる投与部位としての粘膜の種類としては、Caco-2細胞の実験系が反映される小腸粘膜上皮組織のほか、クローディン−４（Claudin-4）が多く発現している粘膜上皮組織であれば同様に効果が期待でき、鼻腔粘膜や気道粘膜、肺粘膜、膣粘膜、眼粘膜、口腔粘膜、及び直腸粘膜などの上皮組織が挙げられる。また、ＣＰＥはクローディン−４（Claudin-4）に比べると結合活性が劣るものの、クローディンファミリーのクローディン−３、６、７、８、１４（Claudin-3, 6, 7, 8, 14）にも作用することが知られており、これらのクローディンファミリーが発現している組織においても同様の効果が期待できる。【００４５】
用いるＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体の投与量は、併用するペプチド性薬物の投与量、粘膜吸収させるべき投与部位等によって異なり一概に限定されず、粘膜上皮細胞層におけるタイトジャンクションを開孔するのに十分な量のＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体を投与すればよい。具体的には、１回の投与量が０．１μｇから１００μｇの範囲が好ましい。【００４６】
以上の本発明により、ペプチド性薬物をクロストリジウム属細菌クロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）が産生するエンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体と共に作用させることにより、経腸、経肺および経鼻における粘膜吸収を促進させることが可能となった。したがって、本発明が提供する粘膜投与用組成物は、小腸、肺や鼻などの粘膜において、ｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトグレリンまたはヒトモチリンなどのペプチド性薬物の生体内吸収性を高めるものであり、その吸収促進効果が顕著に認められ、従来の粘膜吸収促進物質とは異なり組織障害性がなく安全性にも優れ、極めて効果的にペプチド性薬物を生体に吸収させることが可能となる。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例、比較例等により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。【００４８】
実施例１：Ｃ−ＣＰＥ調製
ウェルシュ菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）ＮＣＴＣ８２３９株（Health Protection Agency, The National Collection of Type Cultures、ロンドン, UK）よりエンテロトキシンＣ末断片（１８４−３１９残基目）をクローニングし、Hisタグ融合蛋白質発現プラスミドpET16b (Novagen Inc., Madison, WI, USA)に組み込んだ発現プラスミドpETH10PER（J. Cell Biol. Vol.136, 1239-47）を大腸菌BL21株に形質導入し、アンピシリン（Ampicillin）を添加したＬＢ培地で培養した。
IPTG添加によりHisタグ融合蛋白質を誘導発現させた後、遠心分離により集菌し、菌体を超音波処理により破砕した。15,000 rpmの遠心分離を１５分間行い、上清を回収しＮｉ−キレートカラムに添加した。
200 mMイミダゾールを含む10 mM Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄後、400 mMイミダゾールを含む10 mM Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．０）でHisタグ融合蛋白質を溶出させた。得られた溶出液はゲル濾過カラムを用いてPBS緩衝液（ｐＨ７．４）に置換し、粘膜吸収促進活性の評価用試料とした。【００４９】
実施例２：Ｃ−ＣＰＥ変異体の調製
Ｃ−ＣＰＥのＮ末端10残基を欠失させた△10aa C-CPE(ＣＰＥ０３)、及びＮ末端21残基を欠失させた△21aa C-CPE(ＣＰＥ０４)を大腸菌内で発現させるための発現プラスミドpCPE03、及びpCPE04をpETH10PERの当該アミノ酸残基をコードするDNA塩基配列を削除することにより作製した。これらの発現プラスミドをそれぞれ大腸菌BL21株に形質導入し、Ampicillinを添加したLB培地で培養した。IPTG添加によりHisタグ融合蛋白質を誘導発現させた後で遠心分離により集菌し、菌体を超音波処理により破砕した。15,000 rpmの遠心分離を１５分間行い、上清を回収しNi-キレートカラムに添加した。200 mMイミダゾールを含む10 mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)で洗浄後、400 mMイミダゾールを含む10 mM Tris-HCl緩衝液（ｐＨ８．０）でHisタグ融合蛋白質を溶出させた。得られた溶出液はゲル濾過カラムを用いてPBS緩衝液（ｐＨ７．４）に置換し、ＣＰＥ０３とＣＰＥ０４を粘膜吸収促進活性の評価用試料として得た。【００５０】
比較例１：ラットを用いた皮下投与によるｈＰＴＨ（１−３４）の薬物動態実験
ヒト副甲状腺ホルモンｈＰＴＨ（１−３４）溶液をラットに皮下投与し、血漿中濃度を測定した。
皮下投与は、予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いて実施した。試験系として、５−６週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に５匹を実験に供した。ｈＰＴＨ（１−３４）を０．１％BSA含有生理食塩水に溶解して10μg/mLの溶液を調製し、この溶液を1 mL/kgの投与容量で、背部皮下に注射筒および２６Ｇの注射針（ともにテルモ社製）を用いて投与した。投与前、および投与後５、１５、３０、４５、６０、９０及び１２０分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。
採取した血液には直ちに１／１００容量のＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ溶液を添加後、遠心して血漿を分離した。血漿にはただちに１／１０容量の5,000 IU/mLアプロチニン溶液を添加、混合し、測定に供するまで−８０℃で保管した。
ｈＰＴＨ（１−３４）の血漿中濃度測定は、抗ｈＰＴＨ抗体を用いたラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法により実施した。すなわち、血漿試料に抗ｈＰＴＨ抗体を加えたのち、［125I−Tyr34］ｈＰＴＨ（１−３４）を加えて競合反応させた。これに二次抗体を加えて抗ｈＰＴＨ抗体に結合したｈＰＴＨ（１−３４）を沈殿させ、上清分離後に沈殿画分中の放射能をγ−カウンター（パッカード社製）で測定した。得られた血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度推移を図１に示した。【００５１】
比較例２：ラットを用いた腸管内投与によるｈＰＴＨ（１−３４）の薬物動態実験
腸管内投与もまた、予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用い、In situ loop法により空腸内に投与した。試験系として、７週齢の雄性Wister系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に６匹を実験に供した。空腸の総胆管開口部の下とそこより約5 cm下部を縫合糸で緩く縛り、作製したループの両端にハサミで切れ込みを入れた。切り込みからPBS(pH6.5)の50 mLを注入して腸管内を洗浄した後、下端を結紮した。ｈＰＴＨ（１−３４）をPBS(pH6.5)に溶解して0.5 mg/mLの溶液を調製し、この溶液を0.2 mL/ratの投与容量で、ループ上部より注射筒および１８Ｇの注射針（ともにテルモ社製）を用いて投与し、上端を結紮して腸管を腹腔内に収めた。投与前、および投与後１５、３０、４５、６０及び１２０分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。採取した血液を比較例１と同様に処理して血漿を分離し、血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度をＲＩＡ法により測定した。【００５２】
比較例３：ラットを用いた経鼻投与によるｈＰＴＨ（１−３４）の薬物動態実験
経鼻投与もまた、予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用いて実施した。試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に３匹を実験に供した。ｈＰＴＨ（１−３４）をPBS(pH6.5)に溶解して10 mg/mLの溶液を調製し、この溶液をラットの両鼻腔内に各10μL、計20μLを投与した。投与前、および投与後１５、３０、４５、６０及び１２０分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。採取した血液を比較例１と同様に処理して血漿を分離し、血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度をＲＩＡ法により測定した。【００５３】
比較例４：ラットを用いた経肺投与によるｈＰＴＨ（１−３４）の薬物動態実験
経肺投与もまた、予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用い、気管内に直接投与した。試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に６匹を実験に供した。投与に先立ちラットの気管にポリエチレンチューブ（ＰＥ−２４０、クレイ・アダムス社製）を挿入した。ｈＰＴＨ（１−３４）をPBS(pH6.5)に溶解して10 mg/mLの溶液を調製し、この溶液15μLを、気管内液体噴霧装置（MicroSprayer：Penn Century社製）を用いて気管のポリエチレンチューブ内に投与した。投与前、および投与後１５、３０、４５、６０及び１２０分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。採取した血液を比較例１と同様に処理して血漿を分離し、血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度をＲＩＡ法により測定した。【００５４】
これらの試験によって得られた血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度推移から、薬物速度論的パラメータとして最高血漿中濃度（Ｃmax）及び血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。Cmaxは実測値より、ＡＵＣは台形法にて求めた。この値より生物学的利用率（バイオアベイラビリティー：ＢＡ）を以下の数式により算出した。
ＢＡ（％）＝（AUC／Dose）／（AUC(sc)／Dose(sc)）
AUC：空腸内、経鼻及び経肺投与後のAUC（ng・分/mL）
Dose：空腸内、経鼻及び経肺投与における投与量（μg/kg）
AUC(sc)：皮下投与後のAUC（ng・分/mL）
Dose(sc)：皮下投与における投与量（μg/kg）【００５５】
その結果を表１に示す。なお、これらの値は各群３〜６匹のラットから得られた値の平均値である。【００５６】
表１：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を皮下、空腸内、経鼻あるいは経肺投与した時の薬物速度論的パラメータ【００５７】
【表１】
2009005000.tif 000003
【００５８】
表１中に示した結果から判明するように、ｈＰＴＨ（１−３４）溶液を10 μg/kgの用量で皮下投与したときのＡＵＣは49.6 ng・分／mLであった。またｈＰＴＨ（１−３４）溶液を100μｇ／ratの用量で空腸内投与したときのＡＵＣは32.3 ng・分／mLであり、200μｇ／ratの用量で経鼻投与したときのＡＵＣは43.9 ng・分／mLであり、150μｇ／ratの用量で経肺投与したときのＡＵＣは1534.1 ng・分／mLであった。したがって、空腸内、経鼻あるいは経肺投与した時のｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡはそれぞれ１．８％、１．１％及び６１．３％と算出された。【００５９】
比較例５：ラットを用いた静脈内投与によるヒトグレリンの薬物動態実験
ヒトグレリン（hGhrelin）溶液をラットに静脈内投与し、血漿中濃度を測定した。
静脈内投与は、予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いて実施した。試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に５匹を実験に供した。ヒトグレリンを５％マンニトール溶液に溶解して20μg/mLの溶液を調製し、この溶液を0.5 mL/kgの投与容量で、尾静脈に注射筒および２６Ｇの注射針（ともにテルモ社製）を用いて投与した。投与前、および投与１、３、５、１０、２０、３０、６０及び９０分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。
採取した血液には直ちに１／１００容量のＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ溶液及び１／５０容量の4-(2-Aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride（ＡＥＢＳＦ）溶液を添加後、遠心して血漿を分離した。血漿にはただちに１／１０容量の１Ｎ塩酸を添加、混合し、測定に供するまで−８０℃で保管した。
ヒトグレリンの血漿中濃度測定は、抗グレリン抗体を用いたＲＩＡ法により実施した。すなわち、血漿試料に抗グレリン抗体を加えたのち、［125I−Tyr29］ヒトグレリンを加えて競合反応させた。これに二次抗体を加えて抗グレリン抗体に結合したヒトグレリンを沈殿させ、上清分離後に沈殿画分中の放射能をγ−カウンター（パーキンエルマー社製）で測定した。得られた血漿中ヒトグレリン濃度推移を図２に示した。
得られた血漿中ヒトグレリン濃度推移から、薬物速度論的パラメータとして血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法により算出した。Ｃ０は外挿により、ＡＵＣは台形法にて求めた。ヒトグレリン溶液を10 μg/kgの用量で静脈内投与したときのＣ０は40.69 ng／mL、ＡＵＣは206.0 ng・分／mLであった。【００６０】
比較例６：ラットを用いた経肺投与によるヒトグレリンの薬物動態実験
予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用い、気管内に直接投与した。試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に６匹を実験に供した。投与に先立ちラットの気管にポリエチレンチューブ（ＰＥ−２４０、クレイ・アダムス社製）を挿入した。ヒトグレリンをPBS(pH6.5)に溶解して1 mg/mLの溶液を調製し、この溶液25μLを、気管内液体噴霧装置（MicroSprayer：Penn Century社製）を用いて気管のポリエチレンチューブ内に投与した。投与前、および投与5, 10, 20, 30及び60分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。採取した血液を比較例５と同様に処理して血漿を分離し、血漿中ヒトグレリン濃度をＲＩＡ法により測定した。【００６１】
比較例７：ラットを用いた静脈内投与によるヒトモチリンの薬物動態実験
ヒトモチリン（hMotilin）溶液をラットに静脈内投与し、血漿中濃度を測定した。
静脈内投与は、予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いて実施した。試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に５匹を実験に供した。ヒトモチリンを５％マンニトール溶液に溶解して100 μg/mLの溶液を調製し、この溶液を1 mL/kgの投与容量で、尾静脈に注射筒および２６Ｇの注射針（ともにテルモ社製）を用いて投与した。投与前、および投与１、３、５、１０、２０、３０、６０及び８０分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。
採取した血液には直ちに１／１００容量のＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ溶液を添加後、遠心して血漿を分離した。血漿にはただちに１／１０容量の5,000 IU/mLアプロチニン溶液を添加、混合し、測定に供するまで−８０℃で保管した。
ヒトモチリンの血漿中濃度測定は、抗ヒトモチリン抗体を用いたＲＩＡ法により実施した。すなわち、血漿試料に抗ヒトモチリン抗体を加えたのち、125Ｉ−ヒトモチリンを加えて競合反応させた。これに二次抗体を加えて抗ヒトモチリン抗体に結合したヒトモチリンを沈殿させ、上清分離後に沈殿画分中の放射能をγ−カウンター（パーキンエルマー社製）で測定した。得られた血漿中ヒトモチリン濃度推移を図３に示した。
得られた血漿中ヒトモチリン濃度推移から、薬物速度論的パラメータとして血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を台形法により算出した。Ｃ０は外挿により、ＡＵＣは台形法にて求めた。ヒトモチリン溶液を100 μg/kgの用量で静脈内投与したときのＣ０は1797 ng／mL、ＡＵＣは3598 ng・分／mLであった。【００６２】
比較例８：ラットを用いた経肺投与によるヒトモチリンの薬物動態実験
予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用い、気管内に直接投与した。試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に３匹を実験に供した。投与に先立ちラットの気管にポリエチレンチューブ（ＰＥ−２４０、クレイ・アダムス社製）を挿入した。ヒトモチリンをPBS(pH6.5)に溶解して1 mg/mLの溶液を調製し、この溶液25μLを、気管内液体噴霧装置（MicroSprayer：Penn Century社製）を用いて気管のポリエチレンチューブ内に投与した。投与前、および投与5, 10, 20, 30及び60分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。採取した血液を比較例７と同様に処理して血漿を分離し、血漿中ヒトモチリン濃度をＲＩＡ法により測定した。【００６３】
実施例３：ラット腸管内投与におけるＣ−ＣＰＥによるｈＰＴＨ（１−３４）の吸収促進効果
試験系として、７週齢の雄性Wister系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に６匹を実験に供した。比較例２と同様に空腸内にループを作製した後、Ｃ−ＣＰＥの0.1 mg/mL溶液を0.2 mL/ratの容量でループ上部より投与した。Ｃ−ＣＰＥ投与４時間後に、ｈＰＴＨ（１−３４）の0.5 mg/mL溶液を0.2 mL/ratの投与容量でループ内に投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その結果を図４に示した。また、薬物速度論的パラメータを下記表２に示した。【００６４】
表２：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を空腸内投与した時の薬物速度論的パラメータ（Ｃ−ＣＰＥの吸収促進効果）【００６５】
【表２】
2009005000.tif 000004
【００６６】
表２中に示した結果から判明するように、Ｃ−ＣＰＥをｈＰＴＨ（１−３４）の４時間前に空腸内投与したときのｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡは１１．３％であった。ｈＰＴＨ（１−３４）単独投与時のＢＡが１．８％であったのに対して、驚くべきことに、Ｃ−ＣＰＥを前投与したときのＢＡは、単独投与のときと比べて６．３倍と顕著に上昇した。【００６７】
実施例４：ラット経鼻投与におけるＣ−ＣＰＥによるｈＰＴＨ（１−３４）の吸収促進効果
試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に３匹を実験に供した。Ｃ−ＣＰＥの0.2 mg/mL溶液をラットの両鼻腔内に各10μL、計20μLを投与した。Ｃ−ＣＰＥ投与４時間後に、ｈＰＴＨ（１−３４）の10 mg/mL溶液を両鼻腔内に各10μL、計20μL投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その結果を図５に示した。また、薬物速度論的パラメータを下記表３に示した。【００６８】
表３：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を経鼻投与した時の薬物速度論的パラメータ（Ｃ−ＣＰＥの吸収促進効果）【００６９】
【表３】
2009005000.tif 000005
【００７０】
表３中に示した結果から判明するように、Ｃ−ＣＰＥをｈＰＴＨ（１−３４）の４時間前に経鼻投与したときのｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡは５．９％であり、単独投与のときに対して５．４倍であった。すなわち、ｈＰＴＨ（１−３４）経鼻投与においても、Ｃ−ＣＰＥの前投与によって顕著にＢＡが上昇した。【００７１】
実施例５：ラット経肺投与におけるＣ−ＣＰＥによるｈＰＴＨ（１−３４）の吸収促進効果
試験系として、７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に６匹を実験に供した。比較例４と同様に気管にポリエチレンチューブを挿入した後、Ｃ−ＣＰＥの0.2 mg/mL溶液を20 μL/ratの容量でMicroSprayer（Penn-Century, Inc.製）を用いて投与した。Ｃ−ＣＰＥ投与４時間後に、ｈＰＴＨ（１−３４）の10 mg/mL溶液を15 μL/ratの容量で気管内に投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その結果を図６に示した。また、薬物速度論的パラメータを下記表４に示した。【００７２】
表４：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を経肺投与した時の薬物速度論的パラメータ（Ｃ−ＣＰＥの吸収促進効果）【００７３】
【表４】
2009005000.tif 000006
【００７４】
表４中に示した結果から判明するように、Ｃ−ＣＰＥをｈＰＴＨ（１−３４）の４時間前に経肺投与したときのｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡは１４５．１％であり、単独投与のときに対して２．４倍であった。すなわち、ｈＰＴＨ（１−３４）経肺投与においても、Ｃ−ＣＰＥの前投与によって顕著にＢＡが上昇した。【００７５】
実施例６：ラット経肺投与におけるＣ−ＣＰＥによるヒトグレリンの吸収促進効果
予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用い、気管内に直接投与した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に６匹を実験に供した。比較例６と同様に気管にポリエチレンチューブを挿入した後、Ｃ−ＣＰＥの0.2 mg/mL溶液を25 μL/ratの容量でMicroSprayer（Penn-Century, Inc.製）を用いて投与した。Ｃ−ＣＰＥ投与４時間後に、ヒトグレリンの1 mg/mL溶液を25 μL/ratの容量で気管内に投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その結果を図７に示した。
比較例６及び実施例６の試験によって得られた血漿中ヒトグレリン濃度推移から、薬物速度論的パラメータとして最高血漿中濃度（Ｃmax）及び血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。Cmaxは実測値より、ＡＵＣは台形法にて求めた。この値より生物学的利用率（バイオアベイラビリティー：ＢＡ）を以下の数式により算出した。
ＢＡ（％） = （AUC／Dose）／（AUC(iv)／Dose(iv)）
ＡＵＣ：経肺投与後のＡＵＣ（ng・分/mL）
Dose：経肺投与における投与量（μg/kg）
ＡＵＣ(iv)：静脈内投与後のＡＵＣ（ng・分/mL）
Dose(iv)：静脈内投与における投与量（μg/kg）
その結果を表５に示す。【００７６】
表５：ラットにヒトグレリンを経肺投与した時の薬物速度論的パラメータ（Ｃ−ＣＰＥの吸収促進効果）【００７７】
【表５】
2009005000.tif 000007
【００７８】
表５中に示した結果から判明するように、Ｃ−ＣＰＥをヒトグレリンの４時間前に経肺投与したときのヒトグレリンのＢＡは６．１％であり、単独投与のときに対して３．８倍であった。すなわち、ヒトグレリン経肺投与においても、Ｃ−ＣＰＥの前投与によって顕著にＢＡが上昇した。【００７９】
実施例７：ラット経肺投与におけるＣ−ＣＰＥによるヒトモチリンの吸収促進効果
予め大腿動脈にポリエチレンチューブを挿入したラットを用い、気管内に直接投与した。試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に３匹を実験に供した。比較例８と同様に気管にポリエチレンチューブを挿入した後、Ｃ−ＣＰＥの0.2 mg/mL溶液を25 μL/ratの容量でMicroSprayer（Penn-Century, Inc.製）を用いて投与した。Ｃ−ＣＰＥ投与４時間後に、ヒトモチリンの1 mg/mL溶液を25 μL/ratの容量で気管内に投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その結果を図８に示した。また、薬物速度論的パラメータを下記表６に示した。【００８０】
表６：ラットにヒトモチリンを経肺投与した時の薬物速度論的パラメータ（Ｃ−ＣＰＥの吸収促進効果）【００８１】
【表６】
2009005000.tif 000008
【００８２】
表６中に示した結果から判明するように、Ｃ−ＣＰＥをヒトモチリンの４時間前に経肺投与したときのヒトモチリンのＢＡは４．５％であり、単独投与のときに対して４．１倍であった。すなわち、ヒトモチリン経肺投与においても、Ｃ−ＣＰＥの前投与によって顕著にＢＡが上昇した。【００８３】
実施例８：ラット経肺投与におけるＣ−ＣＰＥ変異体によるｈＰＴＨ（１−３４）の吸収促進効果
試験系として、７週齢の雄性SD系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に５−６匹を実験に供した。比較例４と同様に気管にポリエチレンチューブを挿入した後、Ｃ−ＣＰＥの変異体である配列番号３に示すアミノ酸配列式を有するＣＰＥ０３、及び配列番号４に示すアミノ酸配列式を有するＣＰＥ０４のそれぞれ4.2及び0.8 mg/mL溶液を25 μL/ratの容量でMicroSprayer（Penn-Century, Inc.製）を用いて投与した。ＣＰＥ０３、ＣＰＥ０４投与２時間後に、ｈＰＴＨ（１−３４）の10 mg/mL溶液を15 μL/ratの容量で気管内に投与し、血漿中濃度をＲＩＡ法にて測定した。その結果を図９に示した。また、薬物速度論的パラメータを下記表７に示した。【００８４】
表７：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を経肺投与した時の薬物速度論的パラメータ（ＣＰＥ０３及びＣＰＥ０４の吸収促進効果）【００８５】
【表７】
2009005000.tif 000009
【００８６】
表７中に示した結果から判明するように、ＣＰＥ０３及びＣＰＥ０４をｈＰＴＨ（１−３４）の２時間前に経肺投与したときのｈＰＴＨ（１−３４）の皮下投与に対するＢＡはそれぞれ１３８．８％及び１４９．７％であり、単独投与のときに対してそれぞれ２．３及び２．４倍であった。すなわち、Ｃ−ＣＰＥの変異体の前投与によっても、ｈＰＴＨ（１−３４）経肺投与のＢＡが顕著に上昇した。【００８７】
比較例９：ラットを用いた静脈内投与によるｈＰＴＨ（１−３４）の薬物動態実験
ｈＰＴＨ（１−３４）溶液をラットに静脈内投与し、血漿中濃度を測定した。
静脈内投与は、予め大腿動脈にポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０、クレイ・アダムス社製）を挿入したラットを用いて実施した。試験系として、６−７週齢の雄性ＳＤ系ラット（日本チャールズ・リバー社製）１群に３匹を実験に供した。ｈＰＴＨ（１−３４）を０．１％BSA含有生理食塩水に溶解して10μg/mLの溶液を調製し、この溶液を1 mL/kgの投与容量で、頚静脈に注射筒および２６Ｇの注射針（ともにテルモ社製）を用いて投与した。投与前、および投与後１、５、１５、３０、９０、１２０、１８０及び２４０分後に大腿動脈に挿入したポリエチレンチューブより血液を採取した。
採取した血液には直ちに１／１００容量のＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ溶液を添加後、遠心して血漿を分離した。血漿にはただちに１／１０容量の5,000 IU/mLアプロチニン溶液を添加、混合し、測定に供するまで−８０℃で保管した。
ｈＰＴＨ（１−３４）の血漿中濃度測定は、抗ｈＰＴＨ抗体を用いたＲＩＡ法により実施した。すなわち、血漿試料に抗ｈＰＴＨ抗体を加えたのち、［125I−Tyr34］ｈＰＴＨ（１−３４）を加えて競合反応させた。これに二次抗体を加えて抗ｈＰＴＨ抗体に結合したｈＰＴＨ（１−３４）を沈殿させ、上清分離後に沈殿画分中の放射能をγ−カウンター（パッカード社製）で測定した。得られた血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度推移を図１０に示した。【００８８】
実施例２〜４及び比較例９の試験によって得られた血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度推移から、薬物速度論的パラメータとして最高血漿中濃度（Ｃmax）及び血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を算出した。Cmaxは実測値より、ＡＵＣは台形法にて求めた。この値より生物学的利用率（バイオアベイラビリティー：ＢＡ（iv））を、以下の数式により算出した。
ＢＡ(iv)（％）＝（AUC／Dose）／（AUC(iv)／Dose(iv)）
AUC：空腸内、経鼻及び経肺投与後のAUC（ng・分/mL）
Dose：空腸内、経鼻及び経肺投与における投与量（μg/kg）
AUC(iv)：静脈内投与後のAUC（ng・分/mL）
Dose(iv)：静脈内投与における投与量（μg/kg）
その結果を表８に示す。【００８９】
表８：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を静脈内、空腸内、経鼻あるいは経肺投与した時の薬物速度論的パラメータ【００９０】
【表８】
2009005000.tif 000010
【００９１】
表８中に示した結果から判明するように、ｈＰＴＨ（１−３４）溶液を10 μg/kgの用量で静脈内投与したときのＡＵＣ(iv)は208.6 ng・分／mLであった。またｈＰＴＨ（１−３４）溶液を100μｇ／ratの用量で空腸内投与したときのＡＵＣは32.3 ng・分／mLであり、200μｇ／ratの用量で経鼻投与したときのＡＵＣは43.9 ng・分／mLであり、150μｇ／ratの用量で経肺投与したときのＡＵＣは1534.1 ng・分／mLであった。
したがって、空腸内あるいは経鼻投与した時のｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡ(iv)はそれぞれ０．４％、０．３％及び１４．６％と算出された。【００９２】
また、比較例９の試験結果に基づき、実施例３〜５、実施例８、比較例９の試験によって得られた血漿中ｈＰＴＨ（１−３４）濃度推移から、薬物速度論的パラメータとして最高血漿中濃度（Ｃmax）及び血漿中濃度曲線下面積（ＡＵＣ）を算出し、この値より生物学的利用率（バイオアベイラビリティー：ＢＡ（iv））を算出した。その結果を、表９から表１２に示す。【００９３】
表９：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を空腸内投与した時の薬物速度論的パラメータ（Ｃ−ＣＰＥの吸収促進効果）【００９４】
【表９】
2009005000.tif 000011
【００９５】
表９中に示した結果から判明するように、Ｃ−ＣＰＥをｈＰＴＨ（１−３４）の４時間前に空腸内投与したときのｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡ（ｉｖ）は２．７％であった。ｈＰＴＨ（１−３４）単独投与時のＢＡ（ｉｖ）が０．４％であったのに対して、驚くべきことに、Ｃ−ＣＰＥを前投与したときのＢＡ（ｉｖ）は、単独投与のときと比べて６．９倍と顕著に上昇した。【００９６】
表１０：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を経鼻投与した時の薬物速度論的パラメータ（Ｃ−ＣＰＥの吸収促進効果）【００９７】
【表１０】
2009005000.tif 000012
【００９８】
表１０中に示した結果から判明するように、Ｃ−ＣＰＥをｈＰＴＨ（１−３４）の４時間前に経鼻投与したときのｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡ（ｉｖ）は１．４％であり、単独投与のときに対して４．６倍であった。すなわち、ｈＰＴＨ（１−３４）経鼻投与においても、Ｃ−ＣＰＥの前投与によって顕著にＢＡ（ｉｖ）が上昇した。【００９９】
表１１：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を経肺投与した時の薬物速度論的パラメータ（Ｃ−ＣＰＥの吸収促進効果）【０１００】
【表１１】
2009005000.tif 000013
【０１０１】
表１１中に示した結果から判明するように、Ｃ−ＣＰＥをｈＰＴＨ（１−３４）の４時間前に経肺投与したときのｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡ（ｉｖ）は３４．５％であり、単独投与のときに対して２．４倍であった。すなわち、ｈＰＴＨ（１−３４）経肺投与においても、Ｃ−ＣＰＥの前投与によって顕著にＢＡ（ｉｖ）が上昇した。【０１０２】
表１２：ラットにｈＰＴＨ（１−３４）を経肺投与した時の薬物速度論的パラメータ（ＣＰＥ０３及びＣＰＥ０４の吸収促進効果）【０１０３】
【表１２】
2009005000.tif 000014
【０１０４】
表１２中に示した結果から判明するように、ＣＰＥ０３及びＣＰＥ０４をｈＰＴＨ（１−３４）の２時間前に経肺投与したときのｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡ（ｉｖ）は３３．０％及び３５．６％であり、単独投与のときに対して２．３及び２．４倍であった。すなわち、Ｃ−ＣＰＥの変異体の前投与においても、ｈＰＴＨ（１−３４）経肺投与のＢＡ（ｉｖ）が顕著に上昇した。【０１０５】
表９から表１２中に示した結果から判明するように、Ｃ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体をｈＰＴＨ（１−３４）の２乃至４時間前に前投与したときのｈＰＴＨ（１−３４）のＢＡ及びＢＡ（ｉｖ）はいずれも、ｈＰＴＨ（１−３４）単独投与のときに対して顕著に上昇し、Ｃ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体の投与により、粘膜吸収が促進されたことが判る。最も生物学的利用率が高い静脈注射の場合に比べて、空腸内、肺内及び鼻腔内のいずれの粘膜に対しての投与においても、生物学的利用率が上昇しており、本発明による粘膜吸収促進剤及び粘膜投与用組成物が、注射剤による投与に限定されていたペプチド性薬物の投与方法を粘膜への投与に変更できる方法を提供できることが判る。【０１０６】
以上の実施例から、腸管上皮粘膜、鼻腔上皮粘膜、気道上皮粘膜、又は肺胞上皮粘膜経由の粘膜吸収促進剤としてＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体を投与した場合、ヒト副甲状腺ホルモンｈＰＴＨ（１−３４）、ヒトグレリン又はヒトモチリンなどのペプチド性薬物の吸収が促進されたことが判る。これらの実施例は、いずれもin situでの実験であり、体内動態、つまりはペプチド性薬物が体内の各種プロテアーゼによる分解を受ける状態にあっての実施例であり、それにも係わらず、吸収が著しく促進されたことが判る。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明により、粘膜吸収性が極めて低いため従来は注射投与のみであったペプチド性薬物を、経口、経鼻または経肺投与を可能とする粘膜吸収促進剤が提供される。
具体的には、ペプチド性薬物をクロストリジウム属細菌であるクロストリジウム  パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）が産生するエンテロトキシン（ＣＰＥ）のＣ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）と、詳細にはＣ−ＣＰＥ又はＣ−ＣＰＥの１個ないし数個のアミノ酸残基の置換又は欠失の変異体と共に作用させることにより、経腸、経肺および経鼻における粘膜吸収を促進させることに成功した。また、ペプチド性薬物投与前に予めＣ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体を作用させておくことによりペプチド性薬物の吸収作用が向上することも見出した。Ｃ−ＣＰＥ又は該Ｃ末断片（Ｃ−ＣＰＥ）の変異体を含む粘膜投与用組成物は患者への負担の少ない経口、経鼻および経肺投与への応用が期待できる点で、産業上の利用性は多大なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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