(57)【要約】  本発明は、多種の細胞を含有する可能性のある試料に対して培地その他の培養条件を選択適用し、同適用と同時又はその前後に細胞肥大剤を加えて目的とする細胞を単離する方法である。これにより、自然環境中に生息する競争力の弱い未知の有用微生物を簡便かつ効率的に取得することが可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多種の細胞を含有する可能性のある試料に対して培地その他の培養条件を選択適用し、同適用と同時又はその前後に細胞肥大剤を加え、培養して目的とする細胞を単離する方法。
【請求項２】
前記培養条件を多種及び／又は反復的に選択適用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞肥大剤を多種及び／又は反復的に加える、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
相互に連結又は凝集した複数の細胞を切り離して一個の細胞を分離する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記培養後の細胞を顕微鏡で観察し、先端内径が１０〜１００μｍのキャピラリーで一個の細胞を吸引するか、その他の保持器で一個の細胞を保持する工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自然環境中に生息する多種・多様な未知の有用微生物を自然環境から簡便かつ効率的に単離して取得する方法に関する技術である。特に、本発明は、自然環境中に生息する競争力の弱くまた発見が困難な未知の有用微生物を取得し、或いは微生物分布を知ること等を目的とする方法に関する技術である。
【背景技術】
【０００２】
自然環境中には多種・多様な微生物が生息し、その中には人類にとって有用な物質を作ったり有害な物質を分解したりして大きな利益をもたらすものも多い。【０００３】
例えば、それらの一つが脱窒菌等の土壌微生物である。近年、窒素肥料の大量使用や輸入食料・飼料の増大等により、硝酸態窒素による水系汚染、温室効果ガスであるＮ２Ｏ（亜酸化窒素）の発生等の環境問題が深刻になっているが、この解決には脱窒菌が大きな役割を期待されている。すなわち、水田土壌には窒素肥料や生活廃水に由来するアンモニア（ＮＨ４＋）が存在し、一部はイネにより吸収されるが、残りは硝化菌の働きでまず硝酸イオン（ＮＯ３−）になり、最終的には脱窒菌により窒素酸化物でなく無害な窒素ガス（Ｎ２）に変換されて大気中に戻される。したがって、硝化菌や脱窒菌の連携した作用のおかげで水田土壌は畑土壌や草地土壌に比べて硝酸の溶脱やＮ２Ｏ等窒素酸化物の発生の少ない優良農地になっている。しかし現在、人工の培養条件下で脱窒能を示す微生物（脱窒菌）は多種知られているが、水田土壌で実際に機能している脱窒菌の種類に関する信頼できる同定結果は非常に少ない。【０００４】
このように、自然環境中の有用微生物を取得することは、環境上もまた産業上も有用である。しかしながら、有用微生物を単離して培養することの困難さ故、これら有用微生物の大部分はまだ利用されていないのが実情である。【０００５】
例えば、自然環境から有用微生物を得る為に、従来より希釈平板法が最も広く使われている（非特許文献１参照）。この方法は、自然環境中に生息する微生物を無菌水等に分散し、可能な限り一個の細胞ずつバラバラにし、次にこれを寒天平板上に均一に塗布して増殖させる。そして、一個の細胞から多数の細胞を増殖させて、利用可能なコロニーを形成させるという手法である。
【非特許文献１】Koch, R. (1882). Die Aetiologie derTuberculose. Berl Klin Wochenschr 19, 221-230.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、当該希釈平板法では、実際には一個の細胞には分散されず数個〜１００個の細胞が一つの塊を形成することが多く、その結果、一つのコロニー中には数十種類以上の細胞が混在することになる。コロニーが増殖するに伴い、その中で次第に競争に弱い微生物は死減して競争に強いもののみが生き残ることになる。その結果、ある一定の培地では、たとえ多数のコロニーが出現したとしても、同じ種類のものが多くなり、得られる微生物の種類数は非常に限定されたものとなる。すなわち、有用であるが競争に弱い微生物は得難いという欠点があった。【０００７】
そこで、本発明は、自然環境中に生息する競争力の弱い未知の有用微生物を簡便かつ効率的に単離して取得する手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、新規な細胞単離手法として、培養条件と細胞肥大剤とを組み合わせた単離法（細胞肥大法）を開発し、以下の本発明（１）〜（５）を完成させたものである。【０００９】
本発明（１）は、多種の細胞を含有する可能性のある試料に対して培地その他の培養条件を選択適用し、同適用と同時又はその前後に細胞肥大剤を加え、培養して目的とする細胞を単離する方法である。【００１０】
本発明（２）は、前記培養条件を多種及び／又は反復的に選択適用する、前記発明（１）の方法である。【００１１】
本発明（３）は、前記細胞肥大剤を多種及び／又は反復的に加える、前記発明（１）又は（２）の方法である。【００１２】
本発明（４）は、相互に連結又は凝集した複数の細胞を切り離して一個の細胞を分離する工程を含む、前記発明（１）〜（３）のいずれか一つの方法である。【００１３】
本発明（５）は、前記培養後の細胞を顕微鏡で観察し、先端内径が１０〜１００μｍのキャピラリーで一個の細胞を吸引するか、その他の保持器で一個の細胞を保持する工程を含む、前記発明（１）〜（４）のいずれか一つの方法である。【００１４】
ここで、本特許請求の範囲及び本明細書における各用語の定義を説明する。「細胞」とは、生物体を構成する形態上・機能上の構成単位であり、真核細胞、原核細胞及び古細菌（アルケア）のいずれをも含む。また、微生物、動物細胞、植物細胞のいずれをも包含する概念である。「試料」は、多種の細胞を含有する可能性があるものである限り限定されず、例えば、土壌、砂、底泥、動物組織及び組織内物質、植物組織、浮遊粉塵、河川水、海水、食品、化粧品、飼料、等を挙げることができる。「培養条件」とは、細胞の外的条件を制御して人工的に生活・発育・増殖させる操作若しくは手法に関する条件である限り特に限定されず、例えば、培地等の栄養条件、ｐＨ条件、温度条件、光条件を挙げることができる。「選択適用」とは、取得を希望する細胞を想定して、培養条件を適宜選択して適用することを意味する。「細胞肥大剤」とは、細胞分裂させずに細胞を肥大させる機能を有する薬剤である限り特に限定されず、例えば、抗生物質等の細胞分裂阻害剤を挙げることができる。培養条件に関する「多種及び／又は反復的に」とは、（１）複数種の培養条件を一回適用、（２）一種の培養条件を複数回に亘って適用、（３）複数種の培養条件を複数回に亘って適用｛一回につき一種の培養条件を複数回に亘って適用すること（各回の培養条件は相違）も含む｝、を意味する。細胞肥大剤に関する「多種及び／又は反復的に」とは、（１）複数種の細胞肥大剤を一回使用、（２）一種の細胞肥大剤を複数回に亘って使用、（３）複数種の細胞肥大剤を複数回に亘って使用｛一回につき一種の細胞肥大剤を複数回に亘って使用すること（各回の細胞肥大剤は相違）も含む｝、を意味する。「相互に連結・・した複数の細胞」とは、細胞壁又は細胞膜が相互に連結又は付着している細胞群を指し、「相互に・・凝集した複数の細胞」とは、複雑な形で絡み合った細胞叢を指す。「培地に適合」とは、当該培地から盛んに栄養を吸収して細胞が増殖することを指す。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によれば、細胞肥大剤の存在下で多種の細胞（例えば微生物）を所定培地で培養するので、所定の培養条件に適合した細胞は増殖し、細胞肥大剤に適合した細胞は細胞分裂をすることなくサイズは大きくなる。これに対し、前者に適合しない細胞は増殖せず、後者に適合しない細胞は相対的に小さいままである。このため、例えば、培養後に顕微鏡で観察し、サイズの大きい微生物を取得することにより、当該培養条件及び当該細胞肥大剤に適合する細胞を容易かつ効率的に取得することが可能となる。更に、本発明によれば、所定の培養条件及び細胞肥大剤との組み合わせにより、希釈平板法等の従来法で得たものと比較し、確実に一種類の細胞（例えば微生物）を容易かつ効率的に取得することが可能である。したがって、例えば、本発明で取得した細胞（例えば微生物）を培養した場合、完全に一種類であるが故に細胞（例えば微生物）の種間の競争が無く、競争に弱い種類の細胞（例えば微生物）も良く生育する。このように、希望する性質を有する新規細胞を取得したい場合、当該性質を反映した培養条件や細胞肥大剤を適宜選択することにより、当該希望する性質を有する新規な細胞（例えば有用微生物）を発見できる可能性が非常に高まるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、細胞として微生物を例にとり、本発明の最良形態を詳述する。尚、本発明の技術的範囲は本最良形態には何ら限定されず、例えば微生物以外の他の細胞（例えば動物細胞や植物細胞）に本発明に係る単離方法を適用した場合でも、本発明の技術的範囲に属することはいうまでもない。【００１７】
本法は、多種の微生物を含有する可能性のある試料に対して培地その他の培養条件を選択適用し、同適用と同時又はその前後に細胞肥大剤を加え、培養して目的とする微生物を単離する方法である。即ち、本法は、取得を希望する目的微生物との関係で、細胞肥大剤及び培養条件を決定することにより、確実に当該目的微生物を容易かつ効率的に取得することができる点を本質とする。【００１８】
本法を詳述すると、まず目的とする性質を持つ微生物を育成（生育）しやすい培地を作る。次に有用な微生物が生息している可能性のある試料（例えば土壌）を入手し、微生物の肥大作用を示す細胞肥大剤（例えば、細胞分裂を止める抗生物質等の細胞分裂阻害剤）と共にこの試料の少量を培地に入れて培養を開始する。一週間程度の後、細胞分裂阻害剤のため、この培地で生息可能な微生物は肥大して大きくなる。一方、この培地で育成不能な微生物の細胞は小さいままである。顕微鏡下で、大きい細胞の微生物のみをマイクロ・マニピュレーションにより可能な限り１個の細胞を１本の試験管に入れて培養し、増殖させると、目的とする性質を持つ微生物株を得ることが出来る。【００１９】
ここで、細胞肥大剤は、取得を希望する微生物との関係で当該細胞を肥大させる作用を有する限り特に限定されず、例えば、細胞分裂を止める抗生物質等の細胞分裂阻害剤を挙げることができる。また、細胞肥大剤は、取得を希望する微生物との関係では、濃度が高い場合には当該微生物の殺菌剤として機能し、濃度が低くなると当該微生物の分裂機能を損なわせる細胞肥大剤として機能する（後者が本発明にいう「細胞肥大剤」）。尚、当該細胞肥大剤を用いると、例えば、通常の大きさの３〜４倍程度の長さ又は大きさになる。そして、細胞肥大剤が存在しない別環境に配されると、細胞肥大剤の影響が無くなり、通常通りの細胞機能を発揮する（可逆的）。具体的には、既知化合物（抗生物質、農薬等）が使用可能であり、ナリジクス酸、ピペミド酸、ピロミド酸、Novobiocin、Moxifloxacin、シプロフロキサシン（ciprofloxacin）、ベノミル、チオファネートメチル、チアベンダゾール、フベリダゾール、カルベンダゾール、グリセオフルビン、ペンシクロンが例示される。例えば、ナリジクス酸は、グラム陰性菌、ピペミド酸とピロミド酸とNovobiocinはグラム陽性菌に有効である。また、Moxifloxacinは桿菌に有効である。また、複数の菌種に関して共通の性質を有することが判明している場合には、複数の細胞肥大剤を組み合わせて使用してもよい。例えば、実施例においては脱窒能を持つ菌（グラム陽性・陰性菌どちらにも存在）の取得を目的とし、これら両方をカバーするために３種の抗生物質を組み合わせて使用している。【００２０】
次に、使用する培地は、取得を希望する微生物に適合した培地を選択することが重要である。例えば、光合成を行う菌と行わない菌を取得する場合には、グルコース等のエネルギー源のない培地（即ち無機的な栄養素のみの培地）では光合成を行う菌のみが生育し、グルコースのようなエネルギー源を含む培地では光合成を行わない菌が生育する。尚、当業者であれば、どのような微生物の取得を希望するときにどのような培地を選択すればよいかは容易に判断可能である。参考までに、取得を希望する微生物と使用される培地との一例を表１に示す。【００２１】
【表１】
2008139572.tif 000002
【００２２】
ここで、細胞肥大剤の存在下での培養後、一個の肥大した微生物を分離取得する前に、当該培養後の微生物を予備分別処理に付してもよい。当該操作により、一個の肥大微生物を分離取得する効率を大きく向上させることが可能となる。また、当該予備分別処理のみで、一個の微生物を分離取得することができる場合もある。ここで、予備分別処理は、特に限定されず、例えば、濾過処理等のサイズに基づく分別処理、遠心分離等の重さに基づく分別処理の他、フローサイトメトリー処理を挙げることができる。【００２３】
そして、当該培養の結果、肥大した一個の微生物を分離取得するに際しては、把持や吸引といった物理力で一個の微生物を保持可能な保持器を使用することが好適である。当該保持器の好適例としては、キャピラリーで一個の微生物を吸引可能なマイクロ・マニピュレーターを挙げることができる。ここで、当該キャピラリーは、ガラス製、鋼鉄製等であることが好適であり、かつ、内径が１０〜１００μｍであり、３０〜８０μｍであることが好適である。ここで、「内径」とは、先端内径を意味し、顕微鏡で確認可能である。ここで、図１は、マイクロ・マニピュレーター１を使用して肥大した一個の微生物を保持する様子を示した図である。図に示すように、マイクロ・マニピュレーター１のキャピラリーホルダー１ａは、本体部に固定されており（図示せず）、油圧でＸＹＺ方向にミクロン単位で移動可能に構成されている。また、当該キャピラリーホルダー１ａは、注射筒１ｂと連結している。そして、当該注射筒１ｂの操作により、キャピラリーホルダー１ａ内は減圧・加圧状態となり、これにより当該ホルダー内部に微生物が吸引・放出される。具体的な微生物取得法を説明すると、図に示すように、培養後の試料をスライドグラス２上に載せた後、顕微鏡３で覗きながら試料中の肥大した微生物を探す。この際、これまでの生きた微生物のみを染色しての微生物一個取得法と比較すると、微生物自体が巨大であるので発見することが容易である。そして、このような肥大した微生物を発見した後は、顕微鏡を覗きながらキャピラリーホルダー１ａをＸＹＺ方向に適宜操作し、キャピラリーホルダー１ａの先端部分にあるキャピラリー１ｃを当該肥大した微生物に接触させ、注射筒１ｂを図中の矢印方向に操作すると、当該微生物がキャピラリー１ｃ内に吸引される。【００２４】
尚、前述のように、微生物自体が肥大しているので発見は容易ではあるが、生きている微生物のみが染まる染色剤を組み合わせて使用すると、更に発見することが容易となる。当該染色剤は、生きている微生物のみが染まる染色剤である限り特に限定されず、通常の染色剤や蛍光染色剤が使用可能である。ここで、土壌のような固体中の微生物を得るためには、蛍光染色剤を用いることが特に好適である。ここで、染色剤の好適例としては、エステラーゼ基質蛍光染色剤｛ＣＦＤＡ−ＡＭ（5-carboxyfluorescein diacetate, acetoxymethyl ester）｝を挙げることができる。その他、使用可能な蛍光染色剤の例を表２に挙げる（Microbes and Environments vol.12, No.2 41-56, 1997より抜粋）。
【表２】
2008139572.tif 000003
【００２５】
また、液体中の微生物を得るに際しては、蛍光染色剤で無く通常の染色剤でも可能である。染色に用いられる色素（染色剤、染色薬）としては、特に限定されず、よく知られているものとしては、例えば、ビスマルクブラウン、カーミン、クマシーブルー、クリスタルバイオレット、エオシン、フクシン、ヘマトキシリン、ヨウ素、マラカイトグリーン、メチルグリーン、メチレンブルー、ニュートラルレッド、ナイルブルー、ナイルレッド、ローダミン、サフラニン、アリザリンレッドＳ、アルシアンブルー等を挙げることができる。これらは、それぞれ細胞や組織の異なった部分に反応・集中し、それらの性質の違いは特定の部位を明らかにする事に役立つ。【００２６】
加えて、採取した試料にもよるが、そのままの状態では微生物同士が相互に連結していたり凝集している場合がある（土壌試料では経験上９０％程度はこの状態）。この場合、これら微生物叢から一個の微生物を切り離したりする必要がある。当該切り離しに際しては、ナイフ及び／又は針を用いると効率が良いことを見出した。【００２７】
そして、マイクロ・マニピュレーターで一個の微生物を取得した後は、所定の培地に接種し、所定期間（例えば１〜５週間）培養して増殖させる。このように、完全に一種類であるが故に、細胞（例えば微生物）の種間の競争が無く、競争に弱い種類の細胞（例えば微生物）を増殖させることが可能になる。【００２８】
次に、図２を参照しながら、本法における目的微生物の取得プロセスパターン例を挙げることとする。尚、ここでは、理解の容易上、試料中に存在する微生物が「菌Ａ」〜「菌Ｄ」の４種類であり、使用される培地が「培地イ」及び「培地ロ」の２種類であり、使用される細胞肥大剤が「細胞肥大剤α」及び「細胞肥大剤β」の２種類である、簡単なモデルを例にとり説明する。また、図中、培地に関する「○」は、対象となる菌の生育に適した培地であることを意味し、培地に関する「×」は、対象となる菌の生育に不適な培地であることを意味し、細胞肥大剤に関する「○」は、使用濃度においては対象となる菌に対して細胞肥大作用を示す薬剤であることを意味し、細胞肥大剤に関する「×」は、使用濃度においては対象となる菌に対して毒（殺菌剤）となる薬剤である（この場合は死滅又は弱体化）か、或いは対象となる菌に対して作用しない薬剤である（この場合は通常通り細胞分裂）ことを意味する。【００２９】
まず、図２中の例１は、使用する細胞肥大剤の種類を固定した状況で、複数種類の培地を連続的に適用することにより、最終的に菌Ｃを単離する例である。ここで、まず第一回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃに対して細胞肥大作用を示す細胞肥大剤αの存在下、菌Ａ〜菌Ｃの選択培地イが使用されている。この場合、菌Ａ〜菌Ｃは、当該培地の栄養で増殖・肥大する。他方、菌Ｄは、培地が不適合で栄養不足のため、増殖することなく死滅又は弱体化する。特に、細胞肥大剤αが毒として作用する場合には、菌Ｄは死滅する。このように、第一回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃが選択される。次に、第二回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃに対して細胞肥大作用を示す細胞肥大剤αの存在下、菌Ｃ〜菌Ｄの選択培地ロが使用されている。この場合、菌Ｃ〜菌Ｄは、当該培地の栄養で増殖し得るが、これらの内、菌Ｃは細胞肥大剤αに適合しているので肥大する一方、菌Ｄは細胞肥大剤αに適合していないので増殖するものの細胞は相対的に小さいままである（加えて、菌Ｄは、第一回培養において不適応培地に適用されていたので、休眠等して生存している菌が仮に存在していたとしても、当該菌数は減少しているか弱体化している）。このように、第二回培養においては、菌Ｃが選択される結果、菌Ｃのみを単離することが可能となる。【００３０】
ここで、例１においては、菌Ｃを確実に取得するため、各培養工程において細胞肥大剤を使用している。しかしながら、最終工程（例１では第二回培養）で細胞肥大剤を使用する限りは、理論上、その途中の培養工程の一部又はすべてにおいて細胞肥大剤を使用しなくともよい。例えば、例１の変更例として、例１の第一培養工程において、細胞肥大剤αを使用しない例を示す。このように、理論的には、第一培養工程で培地イにより菌Ａ〜菌Ｃが選択されるが、菌Ｄは休眠又は死滅する。またこれらの菌には肥大剤を適用しない。第二培養工程では、培地ロにより菌Ｃと菌Ｄが生育できるが、菌Ｄは既に死滅しているので菌Ｃのみが選択され、最終的に肥大剤αにより菌Ｃのみが肥大する。【００３１】
次に、例２は、使用する培地を固定した状況で、複数種類の細胞肥大剤を連続的に適用することにより、最終的に菌Ｃを単離する例である。ここで、まず第一回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃに適合した培地イの存在下、菌Ａ〜菌Ｃに対して肥大作用を示す細胞肥大剤αが使用されている。この場合、菌Ａ〜菌Ｃは、当該培地の栄養で肥大する。他方、菌Ｄは、培地が不適合で栄養不足のため、肥大することなく死滅又は弱体化する。特に、細胞肥大剤αが毒として作用する場合には、菌Ｄは死滅する。次に、第二回培養においては、菌Ａ〜菌Ｃに適合した培地イの存在下、菌Ｃ〜菌Ｄに対して肥大作用を示す細胞肥大剤βが使用されている。この場合、菌Ａ〜菌Ｃは、当該培地の栄養で増殖し得るが、これらの内、菌Ａと菌Ｂは、（１）当該細胞肥大剤βが毒として作用する菌については、死滅又は弱体化し、（２）当該細胞肥大剤βが毒として作用しない菌については、肥大することなく細胞分裂を行う（即ち、相対的に小さいまま）。そのため、残る菌Ｃのみが、当該培地で更に肥大する結果、菌Ｃのみを単離することが可能となる。【００３２】
次に、例３は、使用する培地と細胞肥大剤とを絞込み、より少ない回数（本例では一回）で菌Ｃを単離する例である。ここで、培地としては、菌Ａ〜菌Ｃの選択培地イを採用する。他方、細胞肥大剤としては、菌Ｃ〜菌Ｄに対して肥大作用を示す細胞肥大剤βを採用する。このように、まず、選択培地イを採用した場合、菌Ａ〜菌Ｃは、当該培地の栄養で増殖し得る。他方、菌Ｄは、培地が不適合で栄養不足のため、増殖することなく死滅又は弱体化する。更に、細胞肥大剤βを採用した場合、菌Ｃ〜菌Ｄは肥大可能であるが、前述のように、菌Ｄは、培地が不適合で栄養不足のために増殖することなく死滅又は弱体化しているので、菌Ｃのみが、当該培地で肥大する。その結果、菌Ｃのみを単離することが可能となる。【００３３】
次に、本法を用いての応用例を説明する。まず、本法は、バイオレメディエーションに有用である。バイオレメディエーションとは、微生物等の働きを利用して汚染物質を分解・無害化することによって、土壌・地下水等の環境汚染の浄化・修復を図る技術である。この汚染物質の分解・無害化に係る微生物の発見を効率的に行うことができる。更に、これら方法は、新薬を生み出す素となる微生物の発見にも有用である。特に、放線菌は医薬品の素として重要な多くの有用物質を作ることが知られている。したがって、新種の放線菌を探すことは重要である。そこで、放線菌のみを生育させる培地に放線菌が含まれている土壌等を入れて、分裂阻害剤を入れて微生物を生育させると放線菌のみが肥大する。ここから一個の放線菌の細胞を本法で得て培養すると、未知のものも含めて高い効率で多種の放線菌を入手することができる。
【実施例】
【００３４】
水田土壌中の脱窒菌は、過剰施肥による地下水の硝酸態窒素汚染を抑えたり、温室効果が非常に高いＮ２Ｏ窒素酸化物の発生を抑えたりすると考えられている。今まで実験室レベルでは脱窒作用を示す菌の種類は多数存在することが知られているが、水田土壌中で実際に脱窒作用を示していることが判明した菌の種類は、非常に少なかった。これは、従来の方法では競争に強い菌しか培養できなかったためと、実際の水田土壌中で脱窒作用を示している菌を同定できなかったからである。
我々は００３３に示すような方法で、水田土壌の微生物叢から従来脱窒作用があると考えられていなかった菌に脱窒作用があることを発見した。今後、本技術を用いれば、水田土壌からさらに多くの新しい脱窒作用のある菌（脱窒菌）を発見できるであろう。【００３５】
活発に脱窒が起こる水田土壌の室内モデルとして、１０mLのバイアルびんに１０mL弱の土壌（東京大学田無農場水田土壌）、脱窒菌の選択的基質（コハク酸ナトリウム約５ｇ／L）と硝酸ナトリウム（約５ｇ／L）を入れ、気相をアルゴン−アセチレンで完全にガス置換し、３０度Cで嫌気的に培養した。２４時間培養後、再び基質(コハク酸ナトリウム)、硝酸ナトリウムをいずれも最終濃度が約５ｇ／Lとなるように添加すると同時に、３種の細胞肥大剤｛ナリジクス酸（８０μｇ／g土壌)、ピペミド酸(４０μｇ／g土壌)、ピロミド酸（４０μｇ／g土壌）｝を添加し、更に３０度Cで嫌気的に２４時間培養した。この培養物に蛍光染色剤｛ＣＦＤＡ−ＡＭ（最終濃度５０μＭ）｝を添加し、蛍光顕微鏡（青色励起。青色光をあてる）で確認した｛図３（ｂ）｝。併せて、比較例として、細胞肥大剤を添加せずに、蛍光染色剤を添加し、顕微鏡で確認した｛図３（ａ）｝。その結果、図３（ａ）では試料中に円形又は楕円形の微生物細胞のみが見られたが、図３(ｂ）では細長くて大きい細胞も見られるようになった｛矢印で表記｝。
細胞肥大剤、蛍光染色剤を加えた試料から、蛍光顕微鏡下で肥大細胞をマイクロ・マニピュレーターにより、１３０株(「株」は遺伝的に均一な微生物集団)を分離した。これをＬＢ液体培地で１週間培養したところ、８２株が生育・増殖した。増殖が見られたものを、Giltay液体培地で１週間培養し、ガス発生と培地の変色により脱窒作用の有無を検定し、５０株に脱窒作用があると判定した。脱窒作用が認められた５０株中の８株について増殖し、これについて、細菌の１６SrDNA塩基配列に基づいて系統解析を行った。【００３６】
系統解析の結果、次の５種類の細菌であることが判明した。Stenotrophomonas sp.（２株）、Ochrobactrum anthropi（１株）、 Burkholderia cepacia.（２株）、 Pseudomonas putida.（２株）、Pseudomonas sp.（１株）。このうち前２種、即ちStenotrophomonas sp.、Ochrobactrum anthropi.は従来脱窒作用を持たないと思われていたが、脱窒作用を持つことが新たに分かった。Burkholderia cepacia.以下の３種については、従来、実験室で培養した株に脱窒作用は認められていたが、本発明の方法の適用により具体的な水田土壌の試料から容易にその脱窒作用が確認できた。【００３７】
上記実施例を一例として、本技術は微生物を用いる、土壌のバイオレメディエーション、石油のバイオ脱硫、医薬品製造など広い分野の産業に応用可能で、有用微生物の単離、培養、利用に極めて有用な手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、マイクロ・マニピュレーターを使用して肥大した一個の微生物を保持する様子を示した図である。
【図２】図２は、本法における目的微生物の取得プロセスパターン例である。ここでは菌Cを得る為に、培地の種類と細胞肥大剤の種類をそれぞれ変えて組み合わせた３つの例を提示している
【図３】図３は、実施例における、土壌中の微生物に対する細胞肥大剤の効果を示した図（写真）である｛図３（ａ）は添加前、図３（ｂ）は添加後｝。
【符号の説明】
【００３９】
１：マイクロ・マニピュレーター
１ａ：キャピラリーホルダー
１ｂ：注射筒
１ｃ：キャピラリー
２：スライドグラス
３：顕微鏡の対物レンズ
【図１】
2008139572.tif 000004
【図２】
2008139572.tif 000005
【図３】
2008139572.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月8日(2008.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多種の細胞を含有する可能性のある試料に対して培地その他の培養条件を選択適用し、同適用と同時又はその前後に細胞肥大剤を加え、培養して目的とする細胞を肥大細胞として単離した後に更に培養する方法であって、前記肥大細胞に対してエステラーゼ基質蛍光染色剤を適用する方法。
【請求項２】
前記培養条件を多種及び／又は反復的に選択適用する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細胞肥大剤を多種及び／又は反復的に加える、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
相互に連結又は凝集した複数の細胞を切り離して一個の細胞を分離する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記培養後の細胞を顕微鏡で観察し、先端内径が１０〜１００μｍのキャピラリーで一個の細胞を吸引するか、その他の保持器で一個の細胞を保持する工程を含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【国際調査報告】
2008139572.tif 000007
2008139572.tif 000008