(57)【要約】  新規アルコール脱水素酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。本発明の特徴は、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）より単離された新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び該ポリペプチドを生産する形質転換体である。本発明の別の特徴は、該ポリペプチド又は該形質転換体を利用して、カルボニル化合物を還元することによる光学活性アルコールの製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）のＤＮＡ：
（Ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ；
（Ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項２】
次の（１）〜（６）に示す理化学的性質を有するポリペプチド：
（１）作用：
ＮＡＤ+を補酵素としてアルコールを酸化して、ケトン又はアルデヒドを生成し、また、ＮＡＤＨを補酵素としてケトン又はアルデヒドを還元して、アルコールを生成する；
（２）基質特異性：
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とし、２−ブタノールのＲ体に比較してＳ体を優先的に酸化し、ケトン及びアルデヒドを還元反応の基質とし、アセトフェノンに作用し、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する；
（３）分子量：
還元ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動において約３９，０００の分子量を示す；
（４）ｐＨ安定性：
ｐＨの安定域は、ｐＨ５．５〜７．５の範囲である；
（５）至適温度：
作用至適温度は、４５℃〜７０℃である；
（６）阻害剤：
エチレンジアミン４酢酸、ｏ−フェナントロリン、塩化水銀、硫酸銅及び硫酸亜鉛で酵素活性が阻害されるが、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールには阻害されない。
【請求項３】
キャンディダ（Candida）属に属する微生物に由来する、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記微生物が、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）である請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチド、
（ｄ）請求項１に記載のＤＮＡがコードするポリペプチド。
【請求項６】
請求項２〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項７】
請求項１もしくは請求項６のいずれかに記載のＤＮＡを含むベクター
【請求項８】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡをさらに含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
還元型補酵素再生能を有するポリペプチドがグルコース脱水素酵素もしくはギ酸脱水素酵素である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１１】
前記宿主細胞が大腸菌である請求項１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項２〜５のいずれかに記載のポリペプチド、又は、請求項１０もしくは請求項１１に記載の形質転換体および／またはその処理物を、カルボニル基を有する化合物に作用させることを特徴とする、アルコールの製造方法。
【請求項１３】
前記カルボニル基を有する化合物が非対称ケトンであり、その産物が光学活性アルコールである、請求項１２に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１４】
前記非対称ケトンが、下記式（１）：
【化１】
2008066018.tif 000014
（式中、Ｒ1、Ｒ2は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換されていても良いアルコキシ基、置換されていても良いアルキル基、アミノ基、またはニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なっていてもよい。またＲ3は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、又は置換されていてもよいアルキル基を示す）で表される１−フェニルエタノン誘導体であり、その産物である光学活性アルコールが、下記式（２）：
【化２】
2008066018.tif 000015
（式中、 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は前記と同じ）で表される光学活性１−フェニルエタノール誘導体である、請求項１３に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１５】
Ｒ3が水素原子である、請求項１４に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１６】
前記非対称ケトンが、下記式（３）：
【化３】
2008066018.tif 000016
（式中、Ｒ4は置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアルケニル基もしくは置換されていても良いアルキニル基を示す）で表されるメチルケトン化合物であり、その産物である光学活性アルコールが、下記式（４）：
【化４】
2008066018.tif 000017
（式中、Ｒ4は前記と同じ）で表される光学活性１−置換−１−エタノール誘導体である、請求項１３に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１７】
Ｒ4がハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アミノ基、またはニトロ基で置換されていても良い炭素数１〜７のアルキル基である、請求項１６に記載のアルコールの製造方法。
【請求項１８】
Ｒ4がビニル基である、請求項１６に記載のアルコールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規アルコール脱水素酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−ブタノールのような２級アルコール化合物に作用するアルコール脱水素酵素は、カルボニル化合物の立体的還元反応による光学活性アルコール化合物の合成や、ラセミ体の２級アルコール化合物を立体選択的に酸化させ、光学活性２級アルコール化合物を合成する上で有用な酵素である。【０００３】
微生物が産生するアルコール脱水素酵素のうち、補酵素としてニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と略す）を要求し、かつ２−ブタノールを酸化するアルコール脱水素酵素については数多くの報告がある。しかし、２−ブタノールのＲ体に比較してＳ体を優先的に酸化するアルコール脱水素酵素で、かつその構造遺伝子（酵素をコードするＤＮＡ）が取得されているものは少ない。【０００４】
このようなアルコール脱水素酵素としては、ゴルドニア・エスピー（Gordonia sp.）ＴＹ−５株、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）ＩＦＯ１３９６株由来の酵素が知られている。【０００５】
上記酵素のうち、ゴルドニア・エスピー（Gordonia sp.）ＴＹ−５株由来の酵素であるＡＤＨ１は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動での分子量が約３５，０００の酵素であり、２−プロパノールの酸化時の至適温度は３０℃、至適ｐＨはｐＨ１０、であることを特徴とする。また、同株由来の酵素であるＡＤＨ３は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動での分子量が約５８，０００の酵素であり、２−プロパノールの酸化時の至適温度は６０℃、至適ｐＨはｐＨ１０、であることを特徴とする（特許文献１）。【０００６】
また、キャンディダ・パラプシロシス（Candida parapsilosis）ＩＦＯ１３９６株由来の酵素は、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動での分子量が４万の酵素であり、酵素の安定ｐＨ範囲はｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０、（Ｓ）−２−ブタノール酸化時の作用適温の範囲は２５℃〜５５℃、であることを特徴とする。また、本酵素は、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールで酵素活性が阻害されるが、エチレンジアミン４酢酸では阻害されない、という特徴を有する（特許文献２）。【０００７】
このように、２−ブタノールのＲ体に比較してＳ体を優先的に酸化し、かつその構造遺伝子が取得されたアルコール脱水素酵素は少なく、新たな酵素、その構造遺伝子の取得が望まれていた。該酵素の構造遺伝子を取得することができれば、遺伝子工学的手法を用いることにより該酵素を大量生産することができ、これにより該酵素を用いた有用化合物、例えば光学活性アルコールなど、を非常に効率的に製造できるプロセスをも確立することが可能となる。
【特許文献１】特開２００５−１０２５１１号公報
【特許文献２】特許第３５７４６８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規なアルコール脱水素酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の１又は複数の特徴を有する。
本発明の一つの特徴は、次の（１）から（６）に示す理化学的性質を有するポリペプチドである。【００１０】
（１）作用：
ＮＡＤ+を補酵素としてアルコールを酸化し、ケトン又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素としてケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。【００１１】
（２）基質特異性：
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。２−ブタノールのＲ体に比較してＳ体を優先的に酸化する。ケトン及びアルデヒドを還元反応の基質とする。アセトフェノンに作用し、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する。【００１２】
（３）分子量：
還元ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動において約３９，０００の分子量を示す。【００１３】
（４）ｐＨ安定性：
ｐＨの安定域は、ｐＨ５．５〜７．５の範囲である。【００１４】
（５）至適温度：
（Ｓ）−２−ブタノールの酸化反応の作用至適温度は、４５℃〜７０℃である。【００１５】
（６）阻害剤：
エチレンジアミン４酢酸、ｏ−フェナントロリン、塩化水銀、硫酸銅及び硫酸亜鉛で酵素活性が阻害されるが、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールには阻害されない。【００１６】
本発明の別の特徴は、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチドである。【００１７】
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチド。【００１８】
本発明の別の特徴は、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡである。【００１９】
本発明の別の特徴は、以下の（Ａ）又は（Ｂ）のＤＮＡ、これを含むベクター、及びこのベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体である：
（Ａ）配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡ、
（Ｂ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｃ）配列表の配列番号２に示す塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｄ）配列表の配列番号２に示す塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。【００２０】
本発明の別の特徴は、本発明のポリペプチドまたは、本発明のＤＮＡを導入した形質転換体およびその処理物を、カルボニル基を有する化合物に作用させることを特徴とするアルコール、とりわけ光学活性アルコールの製造方法である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、新規アルコール脱水素酵素、その遺伝子、その遺伝子を含むベクター、そのベクターで形質転換された形質転換体、およびそれらを利用した光学活性アルコールの製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】組換えベクターｐＮＣＭ、ｐＮＣＭＧ及びｐＮＣＭＦＴの作製法および構造を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明について実施形態を用いて詳細に説明する。なお、本発明はこれらにより限定されるものではない。【００２４】
本発明のポリペプチドの理学的諸性質について
本発明において後述の方法により単離されたポリペプチドは、以下の（１）〜（６）の理化学的性質を有するポリペプチドである。【００２５】
（１）作用：
ＮＡＤ+を補酵素としてアルコールを酸化し、ケトン又はアルデヒドを生成する。また、ＮＡＤＨを補酵素としてケトン又はアルデヒドを還元し、アルコールを生成する。【００２６】
（２）基質特異性：
芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とする。２−ブタノールのＲ体に比較してＳ体を優先的に酸化する。ケトン及びアルデヒドを還元反応の基質とする。アセトフェノンに作用し、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する。【００２７】
（３）分子量：
還元ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動において約３９，０００の分子量を示す。【００２８】
（４）ｐＨ安定性：
ｐＨの安定域は、ｐＨ５．５〜７．５の範囲である。【００２９】
（５）至適温度：
作用至適温度は、４５℃〜７０℃である。【００３０】
（６）阻害剤：
エチレンジアミン４酢酸、ｏ−フェナントロリン、塩化水銀、硫酸銅、硫酸亜鉛で酵素活性が阻害される。【００３１】
以下に（１）〜（６）の理化学的諸性質について説明する。【００３２】
（１）作用について
本発明のポリペプチドは、ＮＡＤ+の存在下、２級アルコール化合物を酸化してケトン化合物に変換する能力を有する。また、本発明のポリペプチドは、１級アルコール化合物を酸化してアルデヒド化合物に変換する能力を有する。【００３３】
アルコール化合物を酸化する能力は、例えば、以下の方法で評価することができる。【００３４】
［アルコール化合物に対する酸化能力の評価方法］
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）にＮＡＤ+２．５ｍＭ、酸化活性を評価したいアルコール化合物５０ｍＭおよび本発明のポリペプチドを含む反応液を３０℃で反応させ、ＮＡＤＨ量の増加に伴う波長３４０ｎｍの吸光度の増加を測定することにより、酸化反応の進行を容易に評価することができる。吸光度が増加した場合、本発明のペプチドは評価対象のアルコール化合物を酸化する能力を有する、と判断することができる。なお、吸光度の増加速度が速いほど、評価対象のアルコール化合物に対する酸化能力が高いといえる。また、ポリペプチドの酸化能力は数値化することも可能であり、酸化活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの生成を触媒する酵素量とした。【００３５】
また、本発明のポリペプチドは、ＮＡＤＨの存在下、ケトン化合物もしくはアルデヒド化合物を還元してアルコール化合物に変換する能力を有する。【００３６】
ケトン化合物もしくはアルデヒド化合物を還元する能力は、例えば、以下の方法で評価することができる。【００３７】
［ケトン化合物もしくはアルデヒド化合物に対する還元能力の評価方法］
ジメチルスルホキシド０．３％（ｖ／ｖ）を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）にＮＡＤＨ０．２５ｍＭ、還元活性を評価したいケトン化合物もしくはアルデヒド化合物５０ｍＭおよび本発明のポリペプチドを含む反応液を３０℃で反応させ、ＮＡＤＨ量の減少に伴う波長３４０ｎｍの吸光度の減少を測定することにより、還元反応の進行を容易に評価することができる。吸光度が減少した場合、本発明のペプチドは評価対象のケトン化合物もしくはアルデヒド化合物を還元する能力を有する、と判断することができる。なお、吸光度の減少速度が速いほど、評価対象のケトン化合物もしくはアルデヒド化合物に対する還元能力が高いといえる。また、ポリペプチドの還元能力は数値化することも可能であり、還元活性１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨの消費を触媒する酵素量とした。【００３８】
（２）基質特異性について
本発明のポリペプチドは、芳香族置換を含む脂肪族アルコールを酸化反応の基質とすることができる。これは、上記の（１）作用で記載の［アルコール化合物に対する酸化能力の評価方法］に記載の方法で評価することができる。【００３９】
また、本発明のポリペプチドは、２−ブタノールのＲ体に比較してＳ体を優先的に酸化するが、これは（Ｒ）−２−ブタノールに対する酸化能力よりも（Ｓ）−２−ブタノールに対する酸化能力のほうが高いことを意味する。このことは、上記の（１）作用で記載の［アルコール化合物に対する酸化能力の評価方法］に記載の方法で、（Ｒ）−２−ブタノール、（Ｓ）−２−ブタノールに対する酸化能力をそれぞれ別々に評価することにより、容易に判断することができる。【００４０】
更に、本発明のポリペプチドは、ケトン及びアルデヒドを還元反応の基質とすることができる。これは、上記の（１）作用で記載の［ケトン化合物もしくはアルデヒド化合物に対する還元能力の評価方法］に記載の方法で評価することができる。【００４１】
本発明のポリペプチドは、アセトフェノンに作用し、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する能力を有する。これは、例えば以下のような方法で確認することができる。【００４２】
１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７）に、アセトフェノン、ＮＡＤＨ及び本発明のポリペプチドを加えて３０℃で攪拌して反応させる。反応後、酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出操作を行い、下記のガスクロマトグラフィー条件で分析することにより、１−フェニルエタノールの生成、その立体配置及び光学純度を確認することができる。【００４３】
［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（１）］
カラム：ＣＨＩＲＡＬＤＥＸ  Ｇ−ＰＮ（３０ｍ，０．２５ｍｍＩＤ）
（ＲＥＳＴＥＫ社製）  カラム温度：１００℃
注入口温度：１５０℃
検出器温度：１５０℃
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：Ｈｅ、１３０ｋＰａ
溶出時間： アセトフェノン（９．２分）
（Ｓ）−１−フェニルエタノール（１４．５分）
（Ｒ）−１−フェニルエタノール（１５．２分）【００４４】
（３）分子量について
本発明のポリペプチドの還元ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動における分子量は約３９，０００である。この還元ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を用いた分子量測定は、公知の方法、例えば「生物化学実験のてびき２  タンパク質の分離・分析法」（化学同人社刊行）に記載の方法、で実施できる。分子量標準蛋白質との移動度の差から、その分子量を算出することができる。【００４５】
（４）ｐＨ安定性について
本発明のポリペプチドのｐＨの安定域は、ｐＨ５．５〜７．５の範囲である。本安定ｐＨ域の測定は、例えば、以下のように実施できる。ｐＨの異なるブリットン−ロビンソン緩衝液中でポリペプチドを３０℃で３０分間処理後、前記の［アルコール化合物に対する酸化能力の評価方法］に記載の方法で（Ｓ）−２−ブタノールに対する酸化活性を測定する。処理後の残存活性値が、処理前の活性値の８０％以上の値を示すｐＨ域を安定ｐＨ域とした。【００４６】
（５）至適温度について
本発明のポリペプチドの酵素活性の作用至適温度は、４５℃〜７０℃である。本作用至適温度の測定は、例えば、以下のように実施できる。前記の［アルコール化合物に対する酸化能力の評価方法］に記載の方法において、測定温度を変化させて（Ｓ）−２−ブタノールに対する酸化活性を測定する。最も活性の高かった温度での酸化活性値を１００％として、各温度での活性値を相対活性で示した時、その相対活性値が６０％以上の値を示す温度域を作用至適温度とした。【００４７】
（６）阻害剤について
本発明のポリペプチドの酵素活性は、エチレンジアミン４酢酸、ｏ−フェナントロリン、塩化水銀、硫酸銅及び硫酸亜鉛で阻害されるが、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールには阻害されない。化合物がポリペプチドの酵素活性を阻害するかどうかは、例えば、以下のような方法で評価できる。１ｍＭ濃度の種々の化合物中でポリペプチドを３０℃で３０分間処理後、前記の［アルコール化合物に対する酸化能力の評価方法］に記載の方法で（Ｓ）−２−ブタノールに対する酸化活性を測定する。処理後の残存活性値が、処理前の活性値の３０％以下の値を示した場合には、処理に用いた化合物がポリペプチドの酵素活性を阻害する、と評価できる。また、処理後の残存活性値が、処理前の活性値の９０％以上の値を示した場合には、処理に用いた化合物はポリペプチドの酵素活性を阻害しない、と評価できる。【００４８】
本発明のポリペプチドの単離について
本発明のポリペプチドは、２−ブタノールのＲ体に比較してＳ体を優先的に酸化する能力を有するポリペプチドから選択しうる。もしくは、カルボニル基を有する化合物を還元してアルコールを生成する活性を有するポリペプチド、好ましくは非対称ケトンを不斉的に還元して光学活性アルコールを生成する活性を有するポリペプチド、もっとも好ましくはアセトフェノンを不斉的に還元して（Ｓ）−１−フェニルエタノールを生成する活性を有するポリペプチドから選択しうる。【００４９】
このようなポリペプチドは、当該活性を有する微生物などの生物から単離することができる。該酵素は、例えば、以下の方法で微生物より見出すことができる。微生物を適当な培地で培養し、集菌後、緩衝液中、グルコースなどの栄養存在下でアセトフェノンを反応させる。反応後、溶剤などで抽出を行い、前記の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（１）］記載の条件で分析することにより、１−フェニルエタノールの生成を確認すればよい。【００５０】
微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。培養は、例えば、温度２５℃から３７℃、ｐＨ４〜８で振とうもしくは通気することで行い得る。【００５１】
本発明のポリペプチドの起源となる微生物からの該ポリペプチドの単離は、公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、以下のように実施できる。まず、当該微生物を適当な培地で培養し、培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集める。得られた菌体を、超音波破砕機、あるいは、グラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得る。そして、熱処理、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法を単独で、または組み合わせて用いることにより、該無細胞抽出液から本発明のポリペプチドを単離する。【００５２】
本発明のポリペプチドの起源は限定されるものではないが、好ましくはキャンディダ（Candida）属に属する微生物である。好ましくは、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、より好ましくはキャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）ＩＦＯ１９７７株が挙げられる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部  生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ：〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）より入手することができる。【００５３】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列について
本発明のポリペプチドとしては、以下の（ａ）〜（ｃ）のポリペプチドを挙げることができる。【００５４】
（ａ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列において、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加したアミノ酸配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチド、
（ｃ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を持つアミノ酸配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチド。【００５５】
（ａ）〜（ｃ）のそれぞれについて、以下に詳説する。【００５６】
（ａ）のポリペプチドについて
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列としては、配列表の配列番号２に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列、を挙げることができる。【００５７】
（ｂ）のポリペプチドについて
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、アセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有する限りは、上記ポリペプチドに包含される。【００５８】
配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列において、アミノ酸が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避けるのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、アミノ酸配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間でアミノ酸が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号１に示したアミノ酸配列と、公知の微生物由来のアルコール脱水素酵素のアミノ酸配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。【００５９】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変されたアミノ酸配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。【００６０】
また、置換の場合には、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸（同族アミノ酸）であることが好ましい。ここでは、以下に挙げる各群の同一群内のアミノ酸を同族アミノ酸とする。【００６１】
（第１群：中性非極性アミノ酸）Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Cys, Pro, Phe 
（第２群：中性極性アミノ酸）Ser, Thr, Gln, Asn, Trp, Tyr
（第３群：酸性アミノ酸）Glu, Asp
（第４群：塩基性アミノ酸）His, Lys, Arg【００６２】
上記で記載の「複数個のアミノ酸」とは、例えば、５０個、好ましくは３０個、より好ましくは１５個、さらに好ましくは１０個、５個、４個、３個、または２個以下のアミノ酸、を意味する。【００６３】
（ｃ）のポリペプチドについて
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチドが、アセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有する場合は、これも本発明のポリペプチドに含まれる。配列表の配列番号１のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチドは本発明のポリペプチドに含まれるが、その配列同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が更に好ましく、９９％以上がより最も好ましい。【００６４】
アミノ酸配列の配列同一性は、配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列と評価したいアミノ酸配列とを比較し、両方の配列でアミノ酸が一致した位置の数を比較総アミノ酸数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。【００６５】
アセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有する限り、配列番号１に記載のアミノ酸配列に、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのようなタグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また、アセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有する限り、ペプチド断片であってもよい。【００６６】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチドが、アセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有する場合は、これも本発明のポリペプチドに含まれる。【００６７】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡのクローニングについて
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で該酵素を発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。該酵素が取得できれば、該酵素の起源となる生物より、当業者であれば公知の方法で、このようなＤＮＡを取得できる。例えば、以下に示した方法で取得できる。【００６８】
なお、本明細書において後述する、ＤＮＡクローニング、ベクターの調製及び形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）等の成書に記載されている方法により実施することができる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％（ｗ／ｖ）を意味する。【００６９】
まず、先の「本発明のポリペプチドの単離について」で記載した方法で単離された本発明のポリペプチドについて、適当なエンドペプチダーゼを用いて消化し、生じたペプチド断片を逆相ＨＰＬＣにより分取する。そして、例えば、ＡＢＩ４９２型プロテインシークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）により、これらのペプチド断片のアミノ酸配列の一部または全部を決定する。【００７０】
このようにして得られたアミノ酸配列情報をもとにして、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅するためのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）プライマーを合成する。次に、通常のＤＮＡ単離法、例えば、Ｖｉｓｓｅｒ等の方法（Appl. Microbiol. Biotechnol., 53, 415 (2000)）により、該ポリペプチドの起源となる微生物の染色体ＤＮＡを調製する。この染色体ＤＮＡを鋳型として、先述のＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。塩基配列の決定は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）等を用いて行うことができる。【００７１】
該ポリペプチドをコードするＤＮＡの一部の塩基配列が明らかになれば、例えば、インバース（Ｉｎｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）によりその全体の配列を決定することができる。【００７２】
このようにして得られる本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとして、例えば、配列表の配列番号２に示す塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。【００７３】
以下に、配列番号２に示す塩基配列について説明する。【００７４】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの配列について
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとして、例えば、
配列表の配列番号２に示した塩基配列からなるＤＮＡ、
配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列を含むＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
配列表の配列番号２に示した塩基配列と８５％以上の配列同一性を示し、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は、
配列表の配列番号２に示した塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
を挙げることができる。【００７５】
ここで、「配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」とは、配列表の配列番号２に示した塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして、ストリンジェントな条件下にコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡで、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを意味する。【００７６】
ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で０．５倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。【００７７】
以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。【００７８】
上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号２に示されるＤＮＡと、配列同一性が７０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のＤＮＡをあげることができ、コードされるポリペプチドが、アセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有する限り、上記ＤＮＡに包含される。【００７９】
ここで、「配列同一性（％）」とは、対比される２つのＤＮＡを最適に整列させ、核酸塩基(例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ)が両方の配列で一致した位置の数を比較塩基総数で除し、そして、この結果に１００を乗じた数値で表される。【００８０】
配列同一性は、例えば、以下の配列分析用ツールを用いて算出し得る：GCG Wisconsin Package（Program Manual for The Wisconsin Package, Version8, 1994年9月, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Medison, Wisconsin, USA 53711; Rice, P. (1996) Program Manual for EGCG Package, Peter Rice, The Sanger Centre, Hinxton Hall, Cambridge, CB10 1RQ, England）、及び、the ExPASy World Wide Web分子生物学用サーバー（Geneva University Hospital and University of Geneva, Geneva, Switzerland）。【００８１】
ここで、「配列表の配列番号２に示した塩基配列と８５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが、アセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードする場合は、これも本発明のＤＮＡに含まれる。配列表の配列番号２の核酸配列と８５％以上の配列同一性を有するＤＮＡは本発明のＤＮＡに含まれるが、その配列同一性は９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９８％以上が更に好ましく、９９％以上がより最も好ましい。【００８２】
塩基配列の配列同一性は、配列表の配列番号２に示した塩基配列と評価したい塩基配列とを比較し、両方の配列で塩基が一致した位置の数を比較総塩基数で除して、さらに１００を乗じた値で表される。【００８３】
ここで、「配列表の配列番号２に示した塩基配列において、１もしくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び／または付加した塩基配列からなり、かつアセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ」とは、Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley and Sons, Inc., 1989）等に記載の公知の方法に準じて調製することができ、アセトフェノンに作用して、Ｓ体の１−フェニルエタノールへ還元する活性を有するポリペプチドをコードする限りは、上記ＤＮＡに包含される。【００８４】
配列表の配列番号２に示した塩基配列において、塩基が置換、挿入、欠失及び／または付加される場所は特に制限されないが、高度保存領域を避け、フレームシフトが生じないようにするのが好ましい。ここで、高度保存領域とは、由来の異なる複数の酵素について、塩基配列を最適に整列させて比較した場合に、複数の配列間で塩基が一致している位置を表す。高度保存領域は、配列番号２に示した塩基配列と、公知の微生物由来のアルコール脱水素酵素遺伝子の塩基配列とを、ＧＥＮＥＴＹＸ等のツールを用いて比較することにより確認することができる。【００８５】
置換、挿入、欠失及び／又は付加により改変された塩基配列としては、１種類のタイプ（例えば置換）の改変のみを含むものであっても良いし、２種以上の改変（例えば、置換と挿入）を含んでいても良い。【００８６】
上記で記載の「複数個の塩基」とは、例えば、１５０個、好ましくは１００個、より好ましくは５０個、さらに好ましくは２０個、１０個、５個、４個、３個、または２個以下の塩基、を意味する。【００８７】
宿主−ベクター系及び形質転換体について
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入することにより、ポリペプチド発現ベクターが作成できる。また、このポリペプチド発現ベクターで宿主生物を形質転換して得られる形質転換体を培養することにより、本発明のポリペプチドを発現させることができる。更に、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体中に導入する方法なども利用できる。【００８８】
上記で用いる発現ベクターとしては、適当な宿主生物内で当該ＤＮＡがコードするポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。【００８９】
このようなベクターは、例えば大腸菌の場合では、通常、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ｐＬプロモーター等の制御因子を含み、本発明のＤＮＡと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、ｐＵＣＮ１８（実施例５参照）、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣＮＴ（ＷＯ９４／０３６１３公報）などが挙げられる。【００９０】
本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばエンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有する塩基配列をいう。【００９１】
本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントと遺伝子が、宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類が、宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００９２】
各種生物において利用可能なベクター、プロモーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」などに詳細に記述されている。【００９３】
各ポリペプチドを発現させるために用いる宿主生物は、各ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターにより形質転換され、導入したＤＮＡがコードするポリペプチドを発現することができる生物であれば、特に制限はされない。利用可能な微生物としては、例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、バチルス(Bacillus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属、ストレプトコッカス(Streptococcus)属、及びラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系の開発されている細菌、ロドコッカス(Rhodococcus)属及びストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター系の開発されている放線菌、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、クライベロマイセス(Kluyveromyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ピキア(Pichia)属、及びキャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発されている酵母、ノイロスポラ(Neurospora)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、セファロスポリウム(Cephalosporium)属、及びトリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の開発されているカビ、などが挙げられる。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature, 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。これらのうち、導入及び発現効率から細菌が好ましく、大腸菌が特に好ましい。【００９４】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含むポリペプチド発現ベクターは、公知の方法により宿主微生物に導入できる。例えば、ポリペプチド発現ベクターとして前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に配列番号２に示すＤＮＡを導入した本発明のベクターであるプラスミドｐＮＣＭ（実施例５参照）を、宿主微生物として大腸菌を用いる場合は、市販のＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）などを用いて、そのプロトコールに従って操作することにより、当該ベクターを宿主細胞に導入した形質転換体、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）（実施例８参照）、が得られる。【００９５】
また、本発明のポリペプチド及び後述する還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両ポリペプチドを、同一菌体内で発現させた形質転換体も育種することができる。すなわち、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを、同一のベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる他、これら２種類のＤＮＡを不和合性グループの異なる２種のベクターにそれぞれ組み込み、それらを同一の宿主細胞に導入することによっても得られ得る。このようにして得られる形質転換体としては、例えば、配列番号２に示すＤＮＡ、及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドであるグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ、の両ＤＮＡを前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクターであるｐＮＣＭＧ（実施例６参照）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）（実施例８参照）などが挙げられる。また、配列番号２に示すＤＮＡ、及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドであるギ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、の両ＤＮＡを前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクターであるｐＮＣＭＦＴ（実施例７参照）を、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した形質転換体であるＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１(ｐＮＣＭＦＴ)（実施例８参照）なども挙げられる。【００９６】
ポリペプチドもしくは形質転換体を用いたアルコールもしくはアルデヒドの製造方法
［  反応条件  ］
本発明のポリペプチドもしくは本発明のポリペプチドを発現させた形質転換体を用いて、カルボニル基を有する化合物を還元してアルコールもしくはアルデヒドを製造する場合、以下のように実施され得る。但し、以下の方法に限定されるわけではない。【００９７】
適当な溶媒、例えば１００ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ６．５）など、中にカルボニル化合物である基質、例えばアセトフェノン、を加え、ＮＡＤＨやＮＡＤ+等の補酵素、及び該形質転換体の培養物及び／またはその処理物などを添加し、ｐＨ調整下、攪拌して反応させる。【００９８】
ここで、処理物とは、例えば、粗抽出液、培養菌体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物体、菌体破砕物、またはそれらの固定化物等で、該ポリペプチドの酵素触媒活性が残存している物を意味する。【００９９】
この反応は５〜８０℃、好ましくは１０〜６０℃、より好ましくは２０〜４０℃の温度で行われ、反応中反応液のｐＨは３〜１０、好ましくは４〜９、より好ましくは５〜８に維持する。反応はバッチ式あるいは連続方式で行われ得る。バッチ方式の場合は、反応基質は０．０１〜１００％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜７０％、より好ましくは０．５〜５０％の仕込み濃度で添加されうる。また、反応の途中で新たに基質を追加添加しても良い。【０１００】
また、反応には水系溶媒を用いてもよいし、水系の溶媒と有機系の溶媒とを混合して用いてもよい。有機系溶媒としては、例えば、トルエン、酢酸エチル、酢酸ｎ−ブチル、ヘキサン、イソプロパノール、ジイソプロピルエーテル、メタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド等が挙げられる。【０１０１】
ここで形質転換体の処理物等とは、例えば、粗酵素液、培養菌体、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、あるいはそれらの磨砕物、これらの混合物などを意味する。更にそれらは、ポリペプチド自体あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いられ得る。また、本反応を行う際に、本発明のポリペプチド及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドの両者を生産する形質転換体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）（実施例８参照）やＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＦＴ）（実施例８参照）など、を用いれば、補酵素の使用量を大幅に減らすことが可能となる。還元型補酵素再生能を有するポリペプチドについて、次に詳説する。【０１０２】
［還元型補酵素再生能を有するポリペプチド］
本発明のポリペプチドの生産能を有する形質転換体を用いて、カルボニル化合物を還元してアルコール化合物を合成する場合、補酵素としてＮＡＤＨが必要となる。上記のように、反応系にＮＡＤＨを必要な量だけ添加しても実施しうる。しかし、酸化された該補酵素（ＮＡＤ+）を還元型ＮＡＤＨに変換する能力（以後還元型補酵素再生能力と呼ぶ）を有する酵素をその基質と共に、つまり補酵素再生系を本発明のポリペプチドと組み合わせて反応を行うことにより、高価な補酵素の使用量を大幅に削減することができる。還元型補酵素再生能力を有する酵素としては、ヒドロゲナーゼ、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素及びグルコース脱水素酵素等を用いることができる。好適には、グルコース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素が用いられる。【０１０３】
このような反応は、補酵素再生系を不斉還元反応系内に添加することによっても行われ得るが、本発明の酵素をコードするＤＮＡ及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの両者により形質転換された形質転換体を触媒とした場合は、還元型補酵素再生能を有する酵素を別に調製し反応系内に添加しなくても、効率的に反応を行うことができる。このような形質転換体は、先述の「宿主−ベクター系及び形質転換体について」で記載した方法により得られる。例えば、配列番号２に示すＤＮＡ、及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドであるグルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ、の両ＤＮＡを前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクターであるｐＮＣＭＧ（実施例６参照）を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）（実施例８参照）などが挙げられる。また、配列番号２に示すＤＮＡ、及び還元型補酵素再生能を有するポリペプチドであるギ酸脱水素酵素をコードするＤＮＡ、の両ＤＮＡを前記の発現ベクターｐＵＣＮ１８に導入した組換えベクターであるｐＮＣＭＦＴ（実施例７参照）を、Ｅ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）に導入した形質転換体であるＥ． ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１(ｐＮＣＭＦＴ)（実施例８参照）なども挙げられる。【０１０４】
［カルボニル基を有する化合物及び生成するアルコールについて］
本発明のポリペプチドもしくは本発明のポリペプチドを発現させた形質転換体を用いて、カルボニル基を有する化合物を還元してアルコールもしくはアルデヒドを製造する場合、その基質となるカルボニル化合物についての制限はない。カルボニル基を有する化合物が非対称ケトンである場合、その産物が有用な光学活性アルコールとなるため、非常に有益な反応となる。【０１０５】
カルボニル基を有する化合物が、非対称ケトンである下記式（１）：【０１０６】
【化５】
2008066018.tif 000002
【０１０７】
（式中、Ｒ1、Ｒ2は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、置換されていても良いアルコキシ基、置換されていても良いアルキル基、アミノ基、またはニトロ基を示し、それぞれ同一でも異なっていてもよい。またＲ3は水素原子、ハロゲン原子、水酸基、又は置換されていてもよいアルキル基を示す）で表される１−フェニルエタノン誘導体である場合は、その産物は下記式（２）：【０１０８】
【化６】
2008066018.tif 000003
【０１０９】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は前記と同じ）で表される光学活性１−フェニルエタノール誘導体となる。【０１１０】
Ｒ1、Ｒ2としては、置換されていても良いアルコキシ基、置換されていても良いアルキル基の場合、その置換されていても良い基としては、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基またはニトロ基、などが挙げられる。【０１１１】
Ｒ3は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、又は置換されていてもよいアルキル基を示すが、好ましくは水素原子である。【０１１２】
上記で言うハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、などである。【０１１３】
カルボニル基を有する化合物が、非対称ケトンである下記式（３）：【０１１４】
【化７】
2008066018.tif 000004
【０１１５】
（式中、Ｒ4は置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアルケニル基もしくは置換されていても良いアルキニル基を示す）で表されるメチルケトン化合物である場合は、その産物は下記式（４）：【０１１６】
【化８】
2008066018.tif 000005
【０１１７】
（式中、Ｒ4は前記と同じ）で表される光学活性１−置換−１−エタノール誘導体となる。【０１１８】
Ｒ4は置換されていても良いアルキル基、置換されていても良いアルケニル基もしくは置換されていても良いアルキニル基を示す。好ましくは、ハロゲン原子、水酸基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、アミノ基、またはニトロ基で置換されていても良い炭素数１〜７のアルキル基である。また、置換基がアルコキシ基の場合は、炭素数１〜５のアルコキシ基が好ましい。また、置換基がアルコキシカルボニル基の場合は、炭素数１〜５のアルコキシカルボニル基が好ましく、例えば、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などが挙げられる。【０１１９】
また、Ｒ4がビニル基である場合も好ましい。【０１２０】
［アルコールの単離精製方法］
反応後の反応液からのアルコールまたはアルデヒド化合物の採取方法は特に限定されないが、反応液から直接、あるいは菌体等を分離後、酢酸エチル、トルエン、ｔ−ブチルメチルエーテル、ヘキサン、塩化メチレン等の溶剤で抽出し、脱水後、蒸留、再結晶あるいはシリカゲルカラムクロマトグラフィー等により精製すれば、高純度のアルコール化合物が容易に得られる。
【実施例】
【０１２１】
以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組み換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：
Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。【０１２２】
（実施例１）ポリペプチドの精製
以下の方法に従って、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）ＩＦＯ  １９７７株より、アセトフェノンを不斉的に還元し、（Ｓ）−フェニルエタノールを生成する活性を有するポリペプチドを分離し、単一に精製した。特に断りのない限り、精製操作は４℃で行った。また、アセトフェノンに対する還元活性は、前述の［ケトン化合物もしくはアルデヒド化合物に対する還元能力の評価方法］に記載の方法で実施した。【０１２３】
（微生物の培養）
２Ｌ容坂口フラスコに、肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム３ｇ、アデカノールＬＧ−１０９（日本油脂製）０．１ｇ（いずれも１Ｌ当たり）の組成からなる液体培地（ｐＨ７）４００ｍｌを調製し、１２０℃で２０分間蒸気殺菌をおこなった。この培地に、予め同培地にて前培養しておいたキャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）ＩＦＯ  １９７７株の培養液を４ｍｌ接種し、３０℃で６０時間振盪しながら培養を行った。【０１２４】
（無細胞抽出液の調製）
上記の培養液から遠心分離により菌体を集め、０．８％塩化ナトリウム水溶液を用いて菌体を洗浄した。この菌体を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、ＳＯＮＩＦＩＥＲ２５０型超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製）を用いて破砕した後、遠心分離にて菌体残渣を除き、無細胞抽出液を得た。【０１２５】
（熱処理）
上記で得た無細胞抽出液を、６０℃で３０分間処理した後、遠心分離にて不溶画分を除き、熱処理した無細胞抽出液を得た。【０１２６】
（ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
上記で得た熱処理した無細胞抽出液を、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で予め平衡化したＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（９５ｍｌ）に供し、不必要な画分を吸着させた。【０１２７】
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーに吸着しなかった活性画分に終濃度０．９２Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解後、遠心分離により沈殿を除去した。これを０．９２Ｍの硫酸アンモニウム及び５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で予め平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（６０ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。０．６６Ｍの硫酸アンモニウムを含む同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（０．６６Ｍから０．２６Ｍまで）により活性画分を溶出させた。活性画分を集め、５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）にて１夜透析を行った。【０１２８】
（Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィー）
Ｐｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬカラムクロマトグラフィーにより得られた活性画分に終濃度０．９２Ｍとなるよう硫酸アンモニウムを溶解し、０．９２Ｍの硫酸アンモニウム及び５ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で予め平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（東ソー株式会社製）カラム（２３ｍｌ）に供し、活性画分を吸着させた。同一緩衝液でカラムを洗浄した後、硫酸アンモニウムのリニアグラジエント（０．９２Ｍから０Ｍまで）により活性画分を溶出させ、電気泳動的に単一なポリペプチドの精製標品を得た。【０１２９】
今後、本ポリペプチドをＲＭＡと呼ぶこととした。【０１３０】
（実施例２）ＲＭＡの理化学的性質
前記のようにして得られたＲＭＡの理化学的性質について検討した。なお各活性の測定は、前記の［アルコール化合物に対する酸化能力の評価方法］に記載の方法により実施した。【０１３１】
［基質特異性］
（Ｓ）−２−ブタノールの酸化活性を１００％とした場合の、各基質に対する酸化活性を相対活性として算出し、表１にまとめた。なお、活性測定条件下での各基質の濃度は、表１に記載の濃度でそれぞれ測定した。【０１３２】
【表１】
2008066018.tif 000006
【０１３３】
［至適温度］
標準反応条件のうち温度だけを変化させて（Ｓ）−２−ブタノールの酸化活性を測定した。最も活性が高かった６０℃での酸化活性を１００％とした場合の、各温度での酸化活性を相対活性として算出し、表２にまとめた。相対活性値が６０％以上の値を示す温度域は、４５℃〜７０℃であった。【０１３４】
【表２】
2008066018.tif 000007
【０１３５】
［安定温度範囲］
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）中、ＲＭＡを３０℃〜７０℃で１０分間処理した。その後、（Ｓ）−２−ブタノールに対する酸化活性を測定した。３０℃での酸化活性を１００％とした場合の、各温度での酸化活性を相対活性として算出し、表３にまとめた。【０１３６】
【表３】
2008066018.tif 000008
【０１３７】
［至適ｐＨ］
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７〜ｐＨ９）、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６〜ｐＨ８）及び５０ｍＭグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜ｐＨ１０．５）を用いて、反応のｐＨを変化させて（Ｓ）−２−ブタノールに対する酸化活性を測定した。最も活性が高かったリン酸カリウム緩衝液ｐＨ９での酸化活性を１００％とした場合の、各緩衝液、及びｐＨでの酸化活性を相対活性として算出し、表４にまとめた。相対活性値が６０％以上の値を示すｐＨ域は、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．５であった。【０１３８】
【表４】
2008066018.tif 000009
【０１３９】
［安定ｐＨ範囲］
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０〜ｐＨ９．０）及び５０ｍＭブリットン−ロビンソン緩衝液（ｐＨ５．０〜ｐＨ１２．０）中、ＲＭＡを３０℃で３０分間処理した。その後、（Ｓ）−２−ブタノールに対する酸化活性を測定した。処理前の活性値を１００％とした場合の、各処理後での酸化活性を相対活性として算出し、表５にまとめた。相対活性値が８０％以上の値を示すｐＨ域は、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５であった。【０１４０】
【表５】
2008066018.tif 000010
【０１４１】
［阻害剤］
ＲＭＡを表６記載の各種試薬の存在下、３０℃で３０分間処理した。なお、処理時の各試薬濃度は表６に記載した。その後、前記の［アルコール化合物に対する酸化能力の評価方法］に記載の方法により、（Ｓ）−２−ブタノールに対する酸化活性を測定した。未処理の活性値を１００％とした場合の、各処理後での酸化活性を相対活性として算出し、表６にまとめた。ＲＭＡは、エチレンジアミン４酢酸、ｏ−フェナントロリン、塩化水銀、硫酸銅、硫酸亜鉛で阻害されたが、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトールには阻害されない。【０１４２】
【表６】
2008066018.tif 000011
【０１４３】
［分子量］
ＲＭＡの還元ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動における分子量は、分子量標準蛋白質との移動度の差から、約３９，０００と算出された。【０１４４】
（実施例３）  ＲＭＡのカルボニル還元活性の基質特異性
０．３％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシドを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に、基質となるカルボニル化合物を終濃度１．５ｍＭ、補酵素ＮＡＤＨを終濃度０．２５ｍＭとなるようそれぞれ溶解した。これに、実施例１で調製した精製ＲＭＡを適当量添加し、３０℃で３分間反応を行った。当該反応液の波長３４０ｎｍにおける吸光度の減少速度から、各カルボニル化合物に対する還元活性を算出し、これをアセトフェノンに対する活性を１００％とした場合の相対値で表し、表７に示した。表７から明らかなように、ＲＭＡは広範なカルボニル化合物に対して還元活性を示した。【０１４５】
【表７】
2008066018.tif 000012
【０１４６】
（実施例４）ＲＭＡをコードするＤＮＡの取得
（ＰＣＲプライマーの作製）
実施例１で得られた精製ＲＭＡを８Ｍ尿素存在下で変性した後、アクロモバクター由来のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬工業株式会社製）で消化し、得られたペプチド断片のアミノ酸配列をＡＢＩ４９２型プロテインシーケンサー（パーキンエルマー社製）により決定した。このアミノ酸配列から予想されるＤＮＡ配列に基づき、ＲＭＡをコードする遺伝子の一部をＰＣＲにより増幅するためのプライマー１：５'−ＧＧＴＧＡＴＴＧＧＴＴＹＧＧＴＴＴＲＧＧ−３'（配列表の配列番号３）、および、プライマー２：５'−ＳＷＡＧＣＡＣＣＹＡＡＡＣＣＡＡＣＴＧＧ−３'（配列表の配列番号４）を合成した。【０１４７】
（ＰＣＲによる遺伝子の増幅）
実施例１と同様に培養したキャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）ＩＦＯ  １９７７株の菌体からＧｅｎとるくんTM（タカラバイオ社製）を用い、取り扱い説明書に従って染色体ＤＮＡを抽出した。次に、上記で調製したＤＮＡプライマー１および２を用い、得られた染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。このＤＮＡ断片を、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０ｘｌ  ジェネティックアナライザ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてダイレクトシーケンスを行い、その塩基配列を解析した。その結果判明した塩基配列を、配列表の配列番号５に示した。【０１４８】
（ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ法による目的遺伝子の全長配列の決定）
上記で調製したキャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）ＩＦＯ  １９７７株の染色体ＤＮＡを、制限酵素ＢｇｌＩ又はＭｕｎＩ又はＸｂａＩで完全消化し、得られたＤＮＡ断片の混合物をＴ４リガーゼにより分子内環化させた。これを鋳型として用い、インバースＰＣＲ法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988)）により、上述の配列番号５に示す塩基配列を含むＲＭＡ遺伝子の全塩基配列を決定した。その結果を配列表の配列番号２に示した。インバースＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとしてＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。また、配列番号２に示した塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列番号１に示した。【０１４９】
（実施例５）組換えベクターｐＮＣＭの構築
プライマー３：５'−ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＴＴＣＣＡＴＣＴＡＣＴＣＡＡＴＡＣ−３'（配列表の配列番号６）、プライマー４：５'−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＧＧＡＴＧＧＡＡＡＡＣＡＡＣＴＣＴＡＣＣ−３'（配列表の配列番号７）を用い、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）ＩＦＯ  １９７７株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。その結果、配列表の配列番号２に示す塩基配列からなる遺伝子の開始コドン部分にＮｄｅＩ認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後にＥｃｏＲＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを得た。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラ−ゼとして、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。【０１５０】
上記のＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、プラスミドｐＵＣＮ１８（ＰＣＲ法によりｐＵＣ１８（タカラバイオ社製、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｌ０９１３６）の１８５番目のＴをＡに改変してＮｄｅＩサイトを破壊し、更に４７１−４７２番目のＧＣをＴＧに改変することにより新たにＮｄｅＩサイトを導入したプラスミド）のｌａｃプロモーターの下流のＮｄｅＩ認識部位とＥｃｏＲＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＣＭを構築した。ｐＮＣＭの作製法および構造を図１に示す。【０１５１】
（実施例６）  グルコース脱水素酵素遺伝子をさらに含む組換えベクターｐＮＣＭＧの構築
プライマー５：５'−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡＧ−３'（配列表の配列番号８）と、プライマー６：５'−ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＣＣＧＣＧＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧ−３'（配列表の配列番号９）を用い、プラスミドｐＧＤＫ１（Eur. J. Biochem., 186, 389 (1989)に記載の方法で当業者が取得及び調製可能）を鋳型としてＰＣＲを行い、バシラス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＡＭ１０３０株由来のグルコース脱水素酵素（以後、ＧＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＥｃｏＲＩ認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳａｌＩ認識部位が付加された、二本鎖ＤＮＡを取得した。【０１５２】
得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化し、実施例５記載のプラスミドｐＮＣＭのＲＭＡ遺伝子の下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｌＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＣＭＧを構築した。ｐＮＣＭＧの作製法および構造を図１に示す。【０１５３】
（実施例７）  ギ酸脱水素酵素遺伝子をさらに含む組換えベクターｐＮＣＭＦＴの構築
プライマー７：５'−ＡＣＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＧＣＧＡＡＡ−３'（配列表の配列番号１０）、プライマー８：５'−ＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＴＣＴＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣ−３'（配列表の配列番号１１）、プライマー９：５'−ＴＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＴＣＧＡＡＣＡＣ−３'（配列表の配列番号１２）プライマー１０：５'−ＧＴＧＴＴＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＡ−３'（配列表の配列番号１３）を用い、プラスミドｐＦＴ００２（国際公開公報2003/031626号パンフレットに記載の方法で当業者が取得及び調製可能）を鋳型としてＰＣＲを行った。プライマー７と９の組合せ、及び、プライマー８と１０の組合せで、それぞれ約０．３ｋｂｐ、０．９ｋｂｐの二本鎖ＤＮＡが得られた。次に、これらの二本鎖ＤＮＡを混合したものを鋳型として、プライマー７と８の組合せでＰＣＲを行った。その結果、国際公開公報2003/031626号パンフレットの配列表配列番号３に示す塩基配列の３５４番目のＧをＡに改変した、チオバシラス・エスピー（Thiobacillus sp.）のギ酸脱水素酵素（以後、ＦＤＨと呼ぶ）遺伝子の開始コドンから５塩基上流に大腸菌のリボゾーム結合配列が、さらにその直前にＥｃｏＲＩ認識部位が付加され、かつ、終止コドンの直後にＳａｃＩ認識部位が付加された二本鎖ＤＮＡを取得した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＳａｃＩで消化し、実施例５記載のプラスミドｐＮＣＭのＲＭＡ遺伝子の下流のＥｃｏＲＩ認識部位とＳａｃＩ認識部位の間に挿入し、組換えベクターｐＮＣＭＦＴを構築した。ｐＮＣＭＦＴの作製法および構造を図１に示す。【０１５４】
（実施例８）形質転換体の作製
実施例５で構築した組換えベクターｐＮＣＭを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を得た。【０１５５】
また同様に、実施例６で構築した組換えベクターｐＮＣＭＧを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）を得た。【０１５６】
さらに、実施例７で構築した組換えベクターｐＮＣＭＦＴを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１コンピテントセル（タカラバイオ社製）を形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＦＴ）を得た。【０１５７】
（実施例９）  形質転換体におけるＤＮＡの発現
実施例８で得た３種の形質転換体、および、ベクタープラスミドｐＵＣＮ１８を含む形質転換体であるＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＵＣＮ１８）（比較例）のそれぞれを、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（トリプトン１．６％、イーストエキス１．０％、ＮａＣｌ０．５％、ｐＨ７．０）５ｍｌに接種し、３７℃で２４時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、５ｍｌの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）に懸濁した。これを、ＵＨ−５０型超音波ホモゲナイザー（ＳＭＴ社製）を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液のＲＭＡによるアセトフェノン還元活性、ＧＤＨ活性およびＦＤＨ活性を測定した。【０１５８】
アセトフェノンに対する還元活性は、前述の［ケトン化合物もしくはアルデヒド化合物に対する還元能力の評価方法］に記載の方法で実施した。ＧＤＨ活性は、１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、グルコース０．１Ｍ、補酵素ＮＡＤ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して２５℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。ＦＤＨ活性は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に、ギ酸０．５Ｍ、補酵素ＮＡＤ２ｍＭ、および粗酵素液を添加して３０℃で１分間反応を行い、波長３４０ｎｍにおける吸光度の増加速度より算出した。この反応条件において、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤをＮＡＤＨに還元する酵素活性を１Ｕと定義した。【０１５９】
ＲＭＡ、ＧＤＨおよびＦＤＨを比活性として表８にまとめた。表８に示すように実施例８で得られた３種の形質転換体のいずれにおいても、アセトフェノン還元活性を有し、ＲＭＡの発現が認められた。また、ＧＤＨ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）では、ＧＤＨの発現が、ＦＤＨ遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＦＴ）では、ＦＤＨの発現が、それぞれ認められた。【０１６０】
【表８】
2008066018.tif 000013
【０１６１】
（実施例１０）  形質転換体 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を用いた（Ｓ）−フェニルエタノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を実施例９と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ"Ａｍａｎｏ"II、天野エンザイム社製）７００Ｕ、グルコース１７ｇ、ＮＡＤ+３ｍｇ、アセトフェノン１０ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを除去後、減圧下で有機溶媒を留去することにより、（Ｓ）−フェニルエタノール９．８ｇを得た。先に記載の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（１）］で測定したところ、その光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１６２】
（実施例１１）  形質転換体 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）を用いた（Ｓ）−フェニルエタノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）を実施例９と同様に培養することで培養液を取得した。培養液１００ｍｌにグルコース１７ｇ、ＮＡＤ+３ｍｇ、アセトフェノン１０ｇを添加し、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを除去後、減圧下で有機溶媒を留去することにより、（Ｓ）−フェニルエタノール９．９ｇを得た。先に記載の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（１）］で測定したところ、その光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１６３】
（実施例１２）  形質転換体 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＦＴ）を用いた（Ｓ）−フェニルエタノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＦＴ）を実施例９と同様に培養することで培養液を取得した。培養液１００ｍｌにギ酸ナトリウム２．８ｇ、ＮＡＤ+３ｍｇ、アセトフェノン１０ｇを添加し、５Ｎのギ酸水溶液を滴下することによりｐＨ６．０に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを除去後、減圧下で有機溶媒を留去することにより、（Ｓ）−フェニルエタノール９．８ｇを得た。先に記載の［ガスクロマトグラフィーによる分析条件（１）］で測定したところ、その光学純度は９９．９％ｅ．ｅ．以上であった。【０１６４】
（実施例１３）  形質転換体 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を用いた（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭ）を実施例９と同様に培養後、超音波ホモゲナイザーによる菌体破砕を実施し、無細胞抽出液１００ｍｌを得た。この無細胞抽出液１００ｍｌに、グルコース脱水素酵素（商品名：ＧＬＵＣＤＨ"Ａｍａｎｏ"II、天野エンザイム社製）２０００Ｕ、グルコース１８．４ｇ、ＮＡＤ+１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。これにメチルビニルケトン１．０５ｇを加え、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ５．５に調整しながら、３０℃で攪拌を続けた。更に、メチルビニルケトン１．０５ｇを１５分おきに５回添加した（メチルビニルケトンの総添加量は６．３ｇ）。１９時間の反応ののち、反応液を２００ｍｌの塩化メチレンで５回抽出し、得られた有機層をあわせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過によって硫酸ナトリウムを除去し、常圧下有機溶媒を留去したのち、常圧で蒸留し、４．５ｇの（Ｓ）−３−ブテン−２−オールを得た（沸点９６℃）。このものの光学純度は、９９．６％ｅ．ｅ．であった。なお、（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの生成量は、下記のガスクロマトグラフィー条件で分析することにより決定した。【０１６５】
［ガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：ＧＬサイエンス株式会社製  ＩｎｅｒｔＣａｐ５（３０ｍ×０．２５ｍｍ）
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：ヘリウム
カラム温度：３５℃
また、生成した３−ブテン−２−オールの光学純度は、ジニトロベンゾイル化後、ＨＰＬＣ分析することにより測定した。３−ブテン−２−オールのジニトロベンゾイル化は、反応液から３−ブテン−２−オールを塩化メチレンで抽出後、トリエチルアミン及び３，５−ジニトロ塩化ベンゾイルを３−ブテン−２−オールの１．２等量添加後、室温で２時間攪拌することにより行なった。１規定塩酸で洗浄後、分取用薄層クロマトグラフィーにより精製取得し、これをエタノールに溶解後、下記の高速液体クロマトグラフィー条件で分析した。【０１６６】
［高速液体クロマトグラフィー分析条件］
カラム：ダイセル化学工業株式会社製  Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ
（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール＝７／３
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：２４５ｎｍ
溶出時間：Ｓ体  １７．２分、Ｒ体  １１．０分【０１６７】
（実施例１４）  形質転換体 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）を用いた（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）を実施例９と同様に培養することで培養液を取得した。培養液１００ｍｌに、グルコース７．１ｇ、ＮＡＤ+１０ｍｇ、５ｇのエマルゲン８１０（花王製）を添加し、３０℃で１０分間攪拌した。これにメチルビニルケトン２．６３ｇを加え、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ５．５に調整しながら、３０℃で攪拌を続けた。３時間の反応ののち、反応液を２００ｍｌの塩化メチレンで５回抽出し、得られた有機層をあわせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過によって硫酸ナトリウムを除去し、常圧下有機溶媒を留去したのち、常圧で蒸留し、２．５４ｇの（Ｓ）−３−ブテン−２−オールを得た。このものの光学純度は、９９．２％ｅ．ｅ．であった。なお、（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの生成量及び光学純度は、実施例１３に記載の方法により行なった。【０１６８】
（実施例１５）  形質転換体 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＦＴ）を用いた（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＦＴ）を実施例９と同様に培養することで培養液を取得した。培養液１００ｍｌにギ酸ナトリウム１．９４ｇ、ＮＡＤ+１０ｍｇを添加し、３０℃で攪拌した。これにメチルビニルケトン０．５２５ｇを加え、５Ｎのギ酸水溶液を滴下することによりｐＨ５．５に調整しながら、３０℃で攪拌を続けた。更に、メチルビニルケトン０．５２５ｇを３０分おきに７回添加した（メチルビニルケトンの総添加量は４．２ｇ）。１９時間の反応ののち、反応液を２００ｍｌの塩化メチレンで５回抽出し、得られた有機層をあわせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過によって硫酸ナトリウムを除去し、常圧下有機溶媒を留去したのち、常圧で蒸留し、３．９４ｇの（Ｓ）−３−ブテン−２−オールを得た。このものの光学純度は、９６．３％ｅ．ｅ．であった。なお、（Ｓ）−３−ブテン−２−オールの生成量及び光学純度は、実施例１３に記載の方法により行なった。【０１６９】
（実施例１６）  形質転換体 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）を用いた（Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−ペンタノールの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＧ）を実施例９と同様に培養することで培養液を取得した。培養液５０ｍｌに、グルコース２１．２ｇ、ＮＡＤ+２．５ｍｇ及び２−オキソ−５−ペンタノール１０．０ｇを加えて、５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を滴下することによりｐＨ６．５に調整しながら３０℃で攪拌を続けた。４５時間の反応ののち、反応液から遠心分離により菌体を除去した。その溶液を酢酸エチル２００ｍｌで３回抽出し、得られた有機層をあわせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過によって硫酸ナトリウムを除去し、常圧下有機溶媒を留去したのち、溶媒を留去することにより、８．６８ｇの（Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−ペンタノールを得た。このものの光学純度は、９９．２％ｅ．ｅ．であった。なお、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−５−ペンタノールの生成量は下記のガスクロマトグラフィー条件（ａ）で、また、光学純度は下記のガスクロマトグラフィー条件（ｂ）で分析することにより決定した。【０１７０】
［ガスクロマトグラフィー分析条件（ａ）］
カラム：ＧＬサイエンス株式会社製  ＩｎｅｒｔＣａｐ５（３０ｍ×０．２５ｍｍ）
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：ヘリウム
カラム温度：８０℃【０１７１】
［ガスクロマトグラフィー分析条件（ｂ）］
カラム：ＧＬサイエンス株式会社製  ＩｎｅｒｔＣａｐ  ＣＨＩＲＡＭＩ
Ｘ（３０ｍ×０．２５ｍｍ）
検出：ＦＩＤ
キャリアーガス：ヘリウム
カラム温度：９０℃
溶出時間：Ｓ体  １７．２分、Ｒ体  １８．３分【０１７２】
（実施例１７）  形質転換体 Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＦＴ）を用いた（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸メチルの製造
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１（ｐＮＣＭＦＴ）を実施例９と同様に培養することで培養液を取得した。培養液１００ｍｌにギ酸ナトリウム２．８ｇ、ＮＡＤ+３ｍｇ、アセト酢酸メチル１０ｇを添加し、５Ｎのギ酸水溶液を滴下することによりｐＨ６．０に調整しながら、３０℃で２０時間攪拌した。反応終了後、反応液をトルエンで抽出し、得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウムを除去後、減圧下で有機溶媒を留去することにより、（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸メチル９．７ｇを得た。このものの光学純度は、９９％ｅ．ｅ．以上であった。なお、（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸メチルの生成量は、下記のガスクロマトグラフィー条件で分析し算出した。【０１７３】
［ガスクロマトグラフィー分析条件］
カラム：ＴＣ−ＷＡＸ（１５ｍ×０．２５ｍｍ）（ＧＬサイエンス社製）
検出：ＦＩＤ
カラム温度：８５℃
注入温度：２００℃
検出温度：２００℃
キャリアーガス：ヘリウム（７０ｋＰａ）
スプリット比：１００／１
溶出時間：アセト酢酸メチル  ２．９分、３−ヒドロキシ酪酸メチル  ３．８分【０１７４】
また、生成した（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸メチルの光学純度は、ジニトロベンゾイル化後、下記の高速液体クロマトグラフィー条件で分析することにより測定した。３−ヒドロキシブタン酸メチルのジニトロベンゾイル化は、反応液から３−ヒドロキシブタン酸メチルを酢酸エチルで抽出後、ピリジン及び３，５−ジニトロ塩化ベンゾイルを３−ヒドロキシ酪酸メチルの１．２当量添加後、室温で２時間攪拌することにより行なった。１規定塩酸で洗浄後、分取用薄層クロマトグラフィーにより精製取得し、これをエタノールに溶解後、下記ＨＰＬＣ条件で分析した。【０１７５】
［高速液体クロマトグラフィー分析条件］
カラム：Ｃｈｉｒａｌｐａｋ  ＡＤ−Ｈ（ダイセル化学社製）
検出波長：２３０ｎｍ
カラム温度：２０℃
溶離液：ｎ−ヘキサン／エタノール＝３／７
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
溶出時間：Ｓ体  ２１．７分、Ｒ体  ２９．８分
【図１】
2008066018.tif 000018
【配列表】
2008066018000001.app
【国際調査報告】
2008066018.tif 000019
2008066018.tif 000020
2008066018.tif 000021
2008066018.tif 000022