(57)【要約】  新規なマイコバクテリウム.アビウム（Mycobacterium avium、Ｍ.アビウム）検出用プライマー、及びこれを用いた簡便、迅速且つ精度の高いＭ.アビウムの検出方法を提供することを目的とし、「配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は該配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含有する、Ｍ.アビウム検出用プライマー並びにプローブ、該プライマ及び／又はプローブを用いるＭ.アビウムの検出方法」の発明である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。以下同じ。）の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものであり、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号６〜９及び配列番号２４〜２５から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１０〜１１及び配列番号２６から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１２〜１３及び配列番号２７から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１４〜２１及び配列番号２８〜３１から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号２２〜２３及び配列番号３２から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号３７で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号４３〜５４及び配列番号１０１〜１０６から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号３８で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号５５〜６６及び配列番号１０７〜１１２から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号３９で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号６７〜７４及び配列番号１１３〜１１６から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号４０で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号７５〜８２及び配列番号１１７〜１２０から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号４１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号８３〜９２及び配列番号１２０〜１２５から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号４２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号９３〜１００及び配列番号１２６〜１２９から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３０で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１３７〜１４４及び配列番号１８３〜１８６から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１４５〜１４８及び配列番号１８７〜１８８から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１４９〜１５８及び配列番号１８９〜１９３から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１５９〜１６４及び配列番号１９４〜１９６から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１６５〜１７０及び配列番号１９７〜１９９から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１７１〜１７４及び配列番号２００〜２０１から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３６で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１７５〜１８２及び配列番号２０２〜２０５から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列を含有するものである、
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー。
【請求項５】
配列番号１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号６〜９及び配列番号２４〜２５から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１０〜１１及び配列番号２６〜２７から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１２〜１３及び配列番号２７から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１４〜２１及び配列番号２８〜３１から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号２２〜２３及び配列番号３２から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号３７で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号４３〜５４及び配列番号１０１〜１０６から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号３８で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号５５〜６６及び配列番号１０７〜１１２から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号３９で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号６７〜７４及び配列番号１１３〜１１６から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号４０で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号７５〜８２及び配列番号１１７〜１２０から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号４１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号８３〜９２及び配列番号１２０〜１２５から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号４２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号９３〜１００及び配列番号１２６〜１２９から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３０で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１３７〜１４４及び配列番号１８３〜１８６から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１４５〜１４８及び配列番号１８７〜１８８から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１４９〜１５８及び配列番号１８９〜１９３から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１５９〜１６４及び配列番号１９４〜１９６から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１６５〜１７０及び配列番号１９７〜１９９から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１７１〜１７４及び配列番号２００〜２０１から選択される塩基配列を含有するものであり、
配列番号１３６で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号１７５〜１８２及び配列番号２０２〜２０５から選択される塩基配列を含有するものであり、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが、配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列を含有するものである、
請求項４に記載のプライマー。
【請求項６】
プライマーを構成するヌクレオチドの数が１０〜５０個である、請求項４に記載のプライマー。
【請求項７】
標識物質で標識化された、請求項４に記載のプライマー。
【請求項８】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項７に記載のプライマー。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・アビウム検出用プローブ。
【請求項１０】
標識物質で標識化された、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１１】
標識物質が放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質又はビオチンから選択されるものである、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１２】
５'末端がレポーター蛍光色素で標識化され、３'末端がクエンチャー色素で標識化された、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして用いることを特徴とするマイコバクテリウム・アビウムの検出方法。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出することを特徴とする、請求項１３に記載の検出方法。
【請求項１５】
更に、標識物質で標識された標識プローブを用いる、請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
下記工程を包含することを特徴とする、請求項１３に記載の検出方法、
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
（２）(１)で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて、マイコバクテリウム・アビウムの有無を判定する。
【請求項１７】
下記のいずれかの場合に、被検試料がマイコバクテリウム・アビウム陽性であると判定する、請求項１６記載の検出方法、
（１）電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、目的とする塩基対数のプライマー伸長産物の画分を確認し、目的とする塩基対数のプライマー伸長産物が確認された場合、
（２）電気泳動を行った後、得られた電気泳動画分について、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認された場合。
【請求項１８】
プライマーが標識物質で標識化されており、当該標識プライマーを用いて試料中の核酸を鋳型としたポリメラーゼ連鎖反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する、請求項１３に記載のマイコバクテリウム・アビウムの検出方法。
【請求項１９】
核酸増幅連鎖反応を行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長産物の標識を測定する、請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを標識物質で標識化したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出することを特徴とする、請求項１３に記載のマイコバクテリウム・アビウムの検出方法。
【請求項２１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして含んでなる、マイコバクテリウム・アビウム検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の増幅及びその検出系(system)を利用した、臨床検査におけるマイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium、以下、「Ｍ.アビウム」と記載する。）を検出、同定する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
非結核性抗酸菌（nontuberculous mycobacterium）は、マイコバクテリウム（Mycobacterium、以下、単にM.と略記する場合がある。）属に分類される抗酸性の性質を持つグラム陽性桿菌で、結核菌群及びMycobacterium leprae以外の抗酸菌の一種である。喀痰の抗酸菌塗抹検査で陽性となった症例の15〜20％は、その後の菌種同定検査で非結核性抗酸菌による感染症と診断されている。【０００３】
非結核性抗酸菌のうち、臨床上問題となる菌種としては、Ｍ.アビウム、Mycobacterium intracellulare （マイコバクテリウム・イントラセルラー、以下、「Ｍ.イントラセルラー」と記載する。」）、Mycobacterium kansasii（マイコバクテリウム・カンサシイ）、Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）、Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）、Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）、Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）、Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）、Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）、Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）等が知られている。【０００４】
その中でもよく見られるのが、Ｍ.アビウムとＭ.イントラセルラーである。Ｍ.アビウムとＭ.イントラセルラーは非常によく似ており、区別が付きにくかったことから、Ｍ.アビウムとＭ.イントラセルラーをあわせてMycobacterium avium complex （ＭＡＣ）と呼ばれる。非結核性抗酸菌症患者のおよそ70%はＭＡＣ感染症であり、次に多いのがM.kansasii症で、20%を占める。そして残る10%がその他の菌種による感染症である。【０００５】
非結核性抗酸菌は一般には毒力が弱く，健常人に対しては無害であるといわれている。しかし、まれにヒトに対して感染性を示す。中でもＭＡＣは、結核後遺症（肺感染症）を引き起こしたり、ＡＩＤＳなどの易感染患者に対して日和見感染を引き起こすことが知られている。そのため、非結核性抗酸菌を迅速且つ正確に検出することは治療上、特に重要である。【０００６】
また、非結核性抗酸菌症は近年増加傾向にあるため、結核菌と非結核性抗酸菌を短時間で鑑別する方法の開発が強く望まれている。更に、Ｍ.アビウム及びＭ.イントラセルラーを、核酸増幅法で検出・診断する方法が健康保険の適用となったことからも、その診断上の意義は大きい。【０００７】
また、非結核性抗酸菌は、多くが抗結核薬に対して抵抗性を示す。そのため、患者に抗酸菌感染症の疑いがある場合、結核症か非結核性抗酸菌症かを鑑別診断することが、治療方針を決定するために重要である。更に、非結核性抗酸菌による病気は、その菌の種類によって治療法が夫々異なるので、その菌種を決めることも非常に重要である。しかし、非結核性抗酸菌症には特異的な臨床症状がない。そのため、臨床的所見、病理組織学的所見から結核症と非結核性抗酸菌症を鑑別すること、更に非結核性抗酸菌の種類を特定することは極めて困難である。よって、結核症か非結核性抗酸菌症かの診断は、菌の同定によってなさなければならない。【０００８】
非結核性抗酸菌症の診断のために行う一般的な菌の同定法は、喀痰塗沫検査である。しかし、この検査では、その病原菌が「抗酸菌陽性」か否かということが判るだけで、その病原菌が結核菌か非結核性抗酸菌かということは鑑別できない。そこで、通常、喀痰塗末検査で陽性だった場合は、小川培地等の培地上で菌を分離培養することによって菌の培養検査を行い、結核菌か非結核性抗酸菌かを鑑別する。そして、さらに生化学的試験を行い、菌種の同定をする。しかしながら、一般にマイコバクテリウム属は発育が遅く、例えば、菌の分離培養だけで３〜４週間を要する。そして、菌種を同定するための各種生化学的試験の結果を得るまでに、更に２〜３週間を要する。そのため、従来の基本法である、以上のような塗抹検査や培養検査を行って結核症か否かの診断結果を得るという方法は、かなりの時間がかかる方法である。【０００９】
一方、近年、遺伝子レベルで菌を検出する技術が開発されてきた。例えばポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ）等の核酸増幅技術を利用した診断技術が、菌を検出するための有用な手段として検討されている。この方法は感度が高いので、試料中に数個の菌があれば、菌を検出できる。また、短時間（長くても４日）で検出できる（菌種を同定できる。）という利点がある。しかし、通常のＰＣＲ法では、菌数は判らない。また、生菌でも死菌でも区別なく検出してしまう。更に、試料に菌があれば、菌数の多少に関わらず陽性と判定される。そのため、ＰＣＲ法では患者の細菌に感染性があるか否かの診断が不確実になる。更にまた、ＰＣＲ法には、感度が高すぎるため、偽陽性の判定が出やすい等の問題点がある。【００１０】
ＰＣＲ法を利用したＭ.アビウムの検出方法としては、例えばMacSequevar遺伝子領域、Ｍ.アビウム 19キロダルトンタンパク質（ＭＡＶ１９ｋ）遺伝子領域、及びM.イントラセルラー リボソームタンパク質ｓ１遺伝子領域の二つ以上に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの多重プライマーセットを用いて、ＭＡＣ核酸を検出する方法（特許文献１）がある。しかしながら、この検出方法ではＭ.アビウムとＭ.イントラセルラーを判別することはできない。また、特許文献１は、Ｍ.アビウムのみを検出するプライマーMsqv-Avプローブ、及びＭ.アビウムの核酸に特異的なプライマーであるMAV19Kプライマーも開示している。しかし、これらのプローブ及びプライマーを用いた検出方法でも、Ｍ.アビウムの株によっては明確にＭ.アビウムであると同定できない場合も記載されている。すなわち、これらのプローブ及びプライマーのＭ.アビウム特異性は、とても満足のいくものではない。【００１１】
また、遺伝子挿入配列IS901の挿入部位を挟むＤＮＡ塩基配列を増幅するプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたプライマー伸長産物の鎖長によって、トリ結核菌（Ｍ.アビウム）かＭ.イントラセルラーかを判定する方法（特許文献２）も知られている。しかし、該プライマーを用いたＰＣＲでは、試料がトリ結核菌（Ｍ.アビウム）の場合でもＭ.イントラセルラーの場合でもプライマー伸長産物が得られるので、この判別方法はＭ.アビウムに特異的な方法とはいえない。また、プライマー伸長産物の鎖長によって両者を判別するという方法は、煩雑であるし、判定者によってその判定結果が異なる場合もあり得、確実な判定方法とはいえない。【００１２】
ＰＣＲ法以外に、鎖置換増幅法（ＳＤＡ法、Strand Displacement Amplification Method）を利用する検出方法もある。例えば、特開平10-4984号公報（特許文献３）には、マイコバクテリアのα抗原の一部分をコードするＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子の６３ヌクレオチドセグメントを標的とする方法が開示されている。この方法は、まずＭ.アビウムとＭ.イントラセルラーの、両方の菌が持つＢＣＧ８５−Ｂ遺伝子の標的配列を増幅するプライマーを用い、ＳＤＡ法で核酸増幅反応を行う。そして、その結果を基にＭＡＣを検出する方法である。すなわち、該方法に用いられるプライマーは、Ｍ.アビウムとＭ.イントラセルラーの両方を増幅させるプライマーである。しかし、この方法では当然のことながら、試料中にＭ.アビウムがある場合とＭ.イントラセルラーがある場合の両方の場合でプライマー伸長産物が得られる。そのため、この方法でＭＡＣを検出することはできるが、Ｍ.アビウムを特異的に検出することはできない。またＭＡＣを検出する際であっても、偽陽性が出現する場合がある。【００１３】
特開2001-103986号公報（特許文献４）には、ＭＡＣを検出するために用いられるプライマー、捕捉プローブ及び検出用プローブとして使用されるオリゴヌクレオチドが開示されている。しかしながら、該プライマーは、鳥型結核菌（Ｍ.アビウム）とＭ.イントラセルラーの両方の菌が持つｄｎａＪ遺伝子の４８ｂｐ標的配列を増幅する。すなわち、試料中にＭ.アビウムが存在する場合にも、Ｍ.イントラセルラーが存在する場合にも増幅反応が起こる。従って、該プライマーを用いてＳＤＡ法を行い、捕捉プローブ及び検出用プローブを用いてプライマー伸長産物を検出し、その結果に基づいてＭＡＣの検出を行うことはできる。しかし、Ｍ.イントラセルラーを検出せずに、Ｍ.アビウムを特異的に検出することはできない。【００１４】
その他、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法を利用し、Ｍ.アビウムの核酸を増幅する方法（特許文献５）等がある。しかし、ＬＡＭＰ法では、増幅されたＤＮＡの塩基配列を知ることができない、効率よく増幅できるＤＮＡの長さに制限がある、偽陽性が出現する、等の問題がある。【００１５】
また、Ｍ.アビウムには血清型４〜６、８〜１１および２１型、Ｍ.イントラセルラーには血清型７、１２〜２０、２５型という、複数の血清型が存在する。そのため、株間の共通配列を見いだすことが難しい。そのため、単一のプライマーセットによるＰＣＲだけで全ての血清型のＭ.アビウムを検出することが困難なのが現状である。【００１６】
以上のことから、Ｍ.アビウムを特異的に且つ迅速に検出する方法を確立することが望まれている現状にあった。【００１７】
【特許文献１】特開平11-69999号公報
【特許文献２】特許第3111213号公報
【特許文献３】特開平10-4984号公報
【特許文献４】特開2001-103986号公報
【特許文献５】特開2005-204582号公報
【非特許文献１】F.Poly et al., J. Bacteriology, 2004, 186(14), p.4781-4795
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、診断上の偽陽性を排除した新規なＭ.アビウム検出用プライマー、及びこれを用いた簡便、迅速且つ精度の高いＭ.アビウムの検出方法を提供することを目的とする。更に、複数の血清型のＭ.アビウムを、一回の測定で、特異的に且つ効率よく検出できる、新規なＭ.アビウム検出用プライマー、及びこれを用いた簡便、迅速且つ精度の高いＭ.アビウムの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は上記課題を解決する目的で成されたもので、以下の構成よりなる。
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。以下同じ。）の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・アビウム検出用プライマー。
（３）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する、マイコバクテリウム・アビウム検出用プローブ。
（４）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして用いることを特徴とするマイコバクテリウム・アビウムの検出方法。
（６）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つマイコバクテリウム・アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー又は／及びプローブとして含んでなる、マイコバクテリウム・アビウム検出用試薬キット。
【００２０】
本発明者は、現在までに決定されたＭ.アビウムとその他の生物の各種遺伝子について、各種間の各遺伝子配列の相同性の理論的検証と実験的検証を重ねた。その結果、マイクロアレイ法を用いた方法により得られたＭ.アビウム由来の塩基配列の断片の中に、Ｍ.アビウムの遺伝子配列に特異的にハイブリダイズし、Ｍ.アビウムの検出に有用な塩基配列が存在することを見出した。【００２１】
そこで、これらの知見をもとに更に鋭意研究の結果、Ｍ.アビウムに特異的なオリゴヌクレオチド（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６で表される塩基配列）を得、これらの塩基配列がＭ.アビウムの検出に有用であることを見出した。そして更にこれらの配列をもとにＭ.アビウム検出用プライマー及びプローブを開発し、これらを用いたＭ.アビウムの検出方法を確立するに到った。
【発明の効果】
【００２２】
本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたＭ.アビウムの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、Ｍ.アビウムの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法でＭ.アビウムの検出を行うことにより、従来のプライマー又は／及びプローブを用いたＰＣＲ法による診断方法に比較して、診断上の偽陽性が排除可能となり、より高精度に且つ正確に、しかも特異的にＭ.アビウムの検出及び診断を行うことができる。また、本発明の検出方法を用いることにより、Ｍ.アビウム菌体の定量も行うこともできる。【００２３】
また、本発明の配列番号１３０〜１３６で表される配列由来のもの、即ち、配列番号１３０〜２０５で表される配列を含有するプライマー又は／及びプローブを用いたＭ.アビウムの検出方法によれば、複数の血清型のＭ.アビウムを、一回の測定で、他のマイコバクテリウム属細菌と区別して、特異的に且つ効率よく検出することが可能となる。また、それにより検出操作が簡単になり、診断に要する時間も短縮されるという効果も得られる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例２で得られた、プライマー12Fw_1及びプライマー12Rv_1を用い、マイコバクテリウム属細菌由来のＤＮＡ試料及びEscherichia coli.由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲの結果をもとに得られた融解曲線解析の結果である。
【図２】実施例５で得られたリアルタイムＰＣＲ検出結果を示し、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットした検量線である。
【図３】実施例６で得られた、プライマー12Fw_1及びプライマー12Rv_1を用い、Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡ試料を鋳型として用いた、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲの結果をもとに得られた融解曲線解析の結果と、比較例１で得られた、プライマーMAV19K_F1s及びプライマーMAV19K_Rvsを用い、Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡ試料を鋳型として用いた、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲの結果をもとに得られた増幅曲線をまとめて示した図である。
【図４】実施例８で得られた、プライマーMac_12 Fw01及びプライマーMac_12 Rv01を用い、各種Ｍ.アビウム菌株由来のＤＮＡ試料、Ｍ.chimaea由来のＤＮＡ試料及びＭ.velatum由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲの結果をもとに得られた融解曲線解析の結果である。
【図５】実施例１０で得られた、プライマーMac_12Fw01及びプライマーMac_12Rv01を用い、マイコバクテリウム属細菌由来のＤＮＡ試料及びEscherichia coli.由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲの結果をもとに得られた融解曲線解析の結果である。
【図６】実施例１２で得られた、プライマーMac_12Fw01及びプライマーMac_12Rv01を用い、Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡ試料を鋳型として用いた、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲの結果をもとに得られた融解曲線解析の結果である。
【図７】実施例１２で得られたリアルタイムＰＣＲ検出結果を示し、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットした検量線である。
【符号の説明】
【００２５】
図３において、各記号は、それぞれ以下の場合の結果を示す。
（１）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が105コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（２）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が104コピーで、新規候補配列１３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（３）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が103コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（４）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が102コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（５）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（６）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が0コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
【００２６】
図３において、(7)〜(12)はそれぞれ以下の場合を示す。
（７）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が105コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（８）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が104コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（９）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が103コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（１０）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が102コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（１１）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（１２）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が0コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明に於いて、Ｍ.アビウム遺伝子とは、Mycobacterium aviumの持つ全ゲノム配列における任意の塩基配列単位（領域）をいう。【００２８】
本発明に係るオリゴヌクレオチドとしては、配列表の、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列（但し、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。以下同じ。）の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる（以下、本発明のオリゴヌクレオチドと略記する場合がある。）。【００２９】
本発明に係る、配列番号１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは９８１塩基、配列番号２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは３２６塩基、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは５０３塩基、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは５８７塩基、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは６２２塩基、の大きさである。【００３０】
また、配列番号３７で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは１０２０塩基、配列番号３８で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは９５９塩基、配列番号３９で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは８９６塩基、配列番号４０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは７４４塩基、配列番号４１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは７９０塩基、配列番号４２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは５６９塩基、の大きさである。【００３１】
また、配列番号１３０で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは８３３塩基、配列番号１３１で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは９５５塩基、配列番号１３２で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは８１０塩基、配列番号１３３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは８７２塩基、配列番号１３４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは９３３塩基、配列番号１３５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは６３０塩基及び配列番号１３６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドは１０８５塩基、の大きさである。【００３２】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば、（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、更に好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００３３】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００３４】
好ましくは、配列番号１３０〜１３６から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１３０〜１３６から選択される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００３５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号１３０〜１３６から選択される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００３６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。【００３７】
好ましくは、配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するものが挙げられる。【００３８】
また、配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上を含有するオリゴヌクレオチド等が好ましい。【００３９】
配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００４０】
その好ましい具体例としては、配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００４１】
配列番号１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号６〜９及び配列番号２４〜２５から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００４２】
配列番号２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号１０〜１１及び配列番号２６から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００４３】
配列番号３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１２〜１３及び配列番号２７から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００４４】
配列番号４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１４〜２１及び配列番号２８〜３１から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００４５】
配列番号５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号２２〜２３及び配列番号３２から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００４６】
配列番号３７で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号４３〜５４及び配列番号１０１〜１０６から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００４７】
配列番号３８で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、配列番号５５〜６６及び配列番号１０７〜１１２から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００４８】
配列番号３９で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号６７〜７４及び配列番号１１３〜１１６から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００４９】
配列番号４０で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号７５〜８２及び配列番号１１７〜１２０から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５０】
配列番号４１で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号８３〜９２及び配列番号１２１〜１２５から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５１】
配列番号４２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号９３〜１００及び配列番号１２６〜１２９から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５２】
配列番号１３０で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１３７〜１４４及び配列番号１８３〜１８６ら選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５３】
配列番号１３１表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１４５〜１４８及び配列番号１８７〜１８８から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５４】
配列番号１３２で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１４９〜１５８及び配列番号１８９〜１９３から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５５】
配列番号１３３で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１５９〜１６４及び配列番号１９４〜１９６から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５６】
配列番号１３４で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１６５〜１７０及び配列番号１９７〜１９９から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５７】
配列番号１３５で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１７１〜１７４及び配列番号２００〜２０１から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５８】
配列番号１３６で表される塩基配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１７５〜１８２及び配列番号２０２〜２０５から選択される塩基配列を含有するものが挙げられる。【００５９】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００６０】
上記の、本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする塩基配列の一部若しくは全部を有するオリゴヌクレオチドとは、具体的には、本発明の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、ハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列の、一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。【００６１】
尚、ここでいう「ハイストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば「50%ホルムアミド中で42〜70℃で、好ましくは60〜70℃でハイブリダイゼーションを行い、その後0.2〜2×SSC、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）中、25〜70℃で洗浄する。」という条件である。【００６２】
また、「ストリンジェントな条件」とは、具体的には例えば「６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度のハイブリダイゼーション溶液中、50〜70℃の温度の条件下で16時間ハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で必要に応じて予備洗浄を行った後、１×ＳＳＣ又はこれと同等の塩濃度の溶液等で洗浄する。」という条件である。【００６３】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の、一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドとしては、例えば、
（１）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列と約70％以上、好ましくは約80％以上、より好ましくは約90％以上、更に好ましくは約95％以上の相同性を有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチド、又は
（２）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上、より好ましくは２０塩基以上を含有することを特徴とするオリゴヌクレオチド、
等が挙げられる。【００６４】
本発明に係る配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００６５】
好ましくは、配列番号１３０〜１３６から選択される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１３０〜配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００６６】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号１３０〜１３６から選択される塩基配列に対する、相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００６７】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する、相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００６８】
好ましくは、配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する、相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００６９】
また、配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列中の、連続する１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上を含有するオリゴヌクレオチドが好ましい。【００７０】
配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列の全部を含有するオリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００７１】
その好ましい具体例としては、配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【００７２】
本発明に係るＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとは、Ｍ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。そのハイストリンジェントな条件及びストリンジェントな条件は、上記したとおりである。【００７３】
尚、本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行なって得られた、ウリジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位置のＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであってもよい。また、一つ若しくは複数のヌクレオチドが欠失、挿入或いは置換されたオリゴヌクレオチドであってもよい。一つ若しくは複数のヌクレオチドがイノシン（I）のような修飾ヌクレオチドであってもよい。【００７４】
本発明のオリゴヌクレオチドを得る方法としては、特に限定されないが、例えば自体公知の化学合成法により調製する方法が挙げられる。この方法では、ベクター等を用いる遺伝子操作法によりオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを得る方法（クローン化法）に比べ、容易、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドを得ることが可能な方法である。【００７５】
例えば、ＤＮＡの合成に通常行われている、ＤＮＡシンセサイザーを用い、通常のホスホアミダイト法にてオリゴヌクレオチドを合成し、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを用いる常法により精製すれば、目的とする本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。【００７６】
また、オリゴヌクレオチドの合成を業者に委託して、業者から購入してもよい。【００７７】
本発明の目的を達成し得るオリゴヌクレオチドを探索（スクリーニング）する手段としては、FEMS Microbiology Letters 166: 63-70, 1998 あるいはSystematic and Applied Microbiology 24: 109-112, 2001などに示されているサブトラクション法、すなわち標的であるゲノムＤＮＡ由来ＤＮＡフラグメント群から、区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡ由来ＤＮＡフラグメント群と反応したものを除いて、候補配列を濃縮する方法がある。【００７８】
また、標的であるゲノムＤＮＡ及び区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡからの増幅産物のディファレンシャルディスプレイを作成するといったアプローチ、すなわち任意にプライムされたポリメラーゼ連鎖反応（ＡＰ−ＰＣＲ）を利用する方法が考えられる（特願平11-155589号公報）。【００７９】
更に、いわゆるマイクロアレイ法と呼ばれる方法を利用することによっても、本発明の目的を達成しうるオリゴヌクレオチドを探索することができるし、本発明のオリゴヌクレオチドを得ることができる。その方法の概略は以下の通りである。【００８０】
すなわち、例えばＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡのショットガン・クローンを作成し、得られたショットガン・クローンからＤＮＡを精製する。次いで、そのショットガン・クローン由来の精製ＤＮＡを、ＰＣＲ等により増幅させた後、スライドガラス上に配置させて、常法によりマイクロアレイを作成する。別に、標的であるＭ.アビウム由来のゲノムＤＮＡを蛍光標識（標識１）したＤＮＡフラグメント群を作成する。一方、区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡを蛍光標識（標識２）したＤＮＡフラグメント群を別途に作成する。そして、標識１及び標識２の各々を同一反応系で用いる競合ハイブリダイゼーション法を行い、マイクロアレイ上の精製ＤＮＡと、標識１及び標識２との反応性（結合性）を検定する。この検定により、標的であるＭ.アビウムのゲノムＤＮＡ由来フラグメント群（標識１）と、より特異的に反応する配列候補群を選定できる（例えば非特許文献１等の記載参照）。【００８１】
以上の方法により、目的の、Ｍ.アビウム遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選別することができる。以下にマイクロアレイ法を用いた、本発明のオリゴヌクレオチドの選定方法の一例について詳説する。【００８２】
（１）Ｍ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡの調製
まず、Ｍ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡを得る。例えば市販のＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡを入手してもよいし、常法によりＭ.アビウム菌株からＤＮＡを抽出・精製してもよい。また、業者にＭ.アビウム菌株からゲノムＤＮＡを抽出・精製を依頼し、それを入手してもよい。【００８３】
市販のＭ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡとしては、例えば、Ｍ.アビウム由来のgenomic DNA（Mycos Research社(米国)製）等がある。【００８４】
市販のＭ.アビウムの精製ＤＮＡは、そのまま使用してもよいが、市販のキット等を用いて通常の核酸増幅反応を行い、得られた増幅産物を用いてもよい。【００８５】
Ｍ.アビウム菌株から精製ゲノムＤＮＡを得るには、Ｍ.アビウム菌株を、常法（例えばオートクレーブ処理とガラスビーズ等を用いて菌体を粉砕処理する方法。）によって破砕処理した後、常法に従って、ＤＮＡの抽出、精製を行えばよい。【００８６】
（２）Whole Genome Shotgun Libraryの作製
Ｍ.アビウムのWhole Genome Shotgun Libraryの作製を行う方法の一例として、Venter et al., Science. 2001 Feb 16;291(5507):1304-1351 に記載のWhole Genome Shotgun法を改変した方法を、以下に説明する。【００８７】
まず、上記(1)で得られたＭ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡを、適当な緩衝液等で希釈した後、例えば終濃度20%のグリセロール存在下で、5kPa〜9kPaの圧力下で、ネビュライザーを用いて約1〜１５分間処理し、ＤＮＡの断片化処理を行う。この処理により、目的とする500〜1000bpのサイズの画分（ＤＮＡ断片）を効率よく回収する事ができる。得られた画分を市販の抽出カラムを利用して精製する。【００８８】
その後、常法に従い、得られた画分（ＤＮＡ断片。目的のＤＮＡ断片を含む。）を、ライゲーションによってベクターＤＮＡに組み込み、組み換えＤＮＡ（Ｍ.アビウムのWhole Genome Shotgun Library）を得る。【００８９】
そのために用いられるベクターＤＮＡとしては、後で形質転換する宿主細胞が大腸菌の場合には、例えば、pBS[例えばpBSII sk+ベクター(Stratagene社)]、pQE-TRIプラスミド (Qiagen社製)、pBluescript、pET、pGEM-3Z、pGEX等のベクターが挙げられる。用いるベクターの種類によっては、ライゲーションの前に、予めＤＮＡ断片を、ＤＮＡポリメラーゼで処理して、ＤＮＡ断片の末端を平滑化処理してもよい。【００９０】
次いで、得られた組み換えＤＮＡを用いて、適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を得る。【００９１】
そのために用いられる宿主細胞としては、例えば、大腸菌（Escherichia.coli）が挙げられ、好ましくはJM109、DH5α、TOP10等が挙げられる。この他、よりプラスミドやファージＤＮＡの導入効率の高い、Competent Cell（コンピテントセル）を用いても良い。例えば、E.coli JM109 Competent Cells（タカラバイオ社製）等が挙げられる。【００９２】
宿主細胞の形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法（Method in Enzymology, 68, 326-331,1979）等により行うことができる。また、市販のCompetent Cellを用いる場合には、その製品プロトコールに従って、形質転換を行えばよい。【００９３】
「目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組換えＤＮＡ」が導入された形質転換体を選別する方法として、例えば、形質転換のために用いたベクターの性質を利用する方法がある。例えば、アンピシリン耐性遺伝子を含有するベクターを用いた場合には、アンピシリンを含有する培地上で形質転換体を培養し、得られたクローンを選択することにより、目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組換えＤＮＡが導入された、形質転換体（Ｍ.アビウムのゲノムＤＮＡ由来のWhole Genome Shotgun clone Library）が容易に得られる。【００９４】
（３）マイクロアレイ作製
続いて、下記の方法でマイクロアレイを作製する。【００９５】
すなわち、上記(2)で得られた形質転換体のLibrary（Ｍ.アビウムのゲノムＤＮＡ由来のWhole Genome Shotgun clone Library）から常法に従いＤＮＡを精製する。精製したＤＮＡを鋳型として用い、適当なプライマー[市販のプライマーで良い。例えばM13 Primer M1(タカラバイオ社製)及びプライマーM13 Primer RV(タカラバイオ社製)等]を用い、常法に従ってＰＣＲを行った後、得られたＰＣＲ増幅産物を精製する。次いで常法に従って、精製したＰＣＲ増幅産物をマイクロアレイ用スライドガラス上にスポットする。これにUV照射（60mJ〜300mJ/cm2）を行ない、スライドガラス上にＰＣＲ増幅産物（ターゲットのＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡを含む）を固定して、マイクロアレイを作成する。【００９６】
尚、得られたマイクロアレイ上の、Ｍ.アビウム遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするＤＮＡフラグメントが含まれるスポットを選択するために、必要に応じコントロールサンプルを上記のマイクロアレイ上に並列させて固定化してもよい。【００９７】
例えば区別したい生物種由来のゲノムＤＮＡフラグメント［例えばrpsl(特許文献１)等のＭ.イントラセルラーのもつ配列のＤＮＡフラグメント、KATS2 sequence(特開平11-155589号公報)等のM.kansasiiに特異的な塩基配列のＤＮＡフラグメント、例えば大腸ＤＮＡ等のマイコバクテリウム属菌以外の菌由来のＤＮＡ］や、特異性を比較・評価するための指標となる公知のＤＮＡフラグメント［例えばMAV19K (特許文献１)等の、Ｍ.アビウムが持つ公知の塩基配列のＤＮＡフラグメント］を用い、上記のスライドガラス上のshotgunクローン由来ＰＣＲ産物と並列させて固定する。これをコントロールスポットとして用いることにより、Ｍ.アビウム遺伝子の塩基配列と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ断片のスポットを選択する、検定の精度を高める事ができる。【００９８】
（４）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
ｉ）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
例えばヘキシルアミノ-UTPを用いた間接標識法等の常法により、例えば上記(1)の方法で得られたＭ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡを標識物質で標識する。また、対照用ゲノム(例えばＭ.イントラセルラー等の非結核型抗酸菌、ウシ型結核菌等の結核菌等)ＤＮＡを、上記のＭ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡを標識する標識物質とは異なる標識物質で標識する。【００９９】
上記のＤＮＡの標識に用いられる標識物質としては、通常この分野で用いられる標識物質が挙げられるが、汎用されている標識物質としては、Cy3（アマシャムバイオサイエンス株式会社商品名）、Cy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社商品名）、Alexa555（インビトロジェン社商品名）、Alexa647（インビトロジェン社商品名）等が挙げられる。【０１００】
例えばDeRisi研究室（www.microarrays.org）が発表したプロトコールを改変した間接標識法で、標識物質としてCy3とCy5を用いた標識方法を例にとって説明する。この方法は、まず、酵素伸長反応を行い、アミノ基をもつαUTPを分子内に取り込ませたＤＮＡ鎖を作成する。そしてそのＤＮＡ鎖のアミノ基に蛍光色素（サクシニイミド体）を化学的に結合させて、ＤＮＡを標識するという方法である。【０１０１】
すなわち、まず、出発材料（Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡ及び対照用ゲノムＤＮＡ）を、常法に従い熱変性処理する[BioPrime DNA labeling system（インビトロジェン社製）等の市販キットを用いてもよい]。次いで、熱変性処理物に、DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTPの混合液、dTTP、Ha-dUTP、Klenow酵素を添加し、37℃で3時間程度の伸長反応を行う。得られた反応産物を限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機等を用いて完全に乾燥させる。次に、乾燥させた上記反応産物にNaHCO3 を加えて混合し、2〜3 分常温静置する。【０１０２】
別にCy3（またはCy5）をDMSO に溶かしたものを調製（Cy-dye Solution Cy3、Cy-dye Solution Cy5）する。このCy-dye Solution Cy3を対照用ゲノム由来ＤＮＡを用いて得られた上記反応産物に加える。また、Cy-dye Solution Cy5をＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡを用いて得られた上記反応産物に加える。それぞれの反応産物を40℃で60 分程度、遮光下にインキュベートする。さらに、それぞれの反応産物に4M NH2OHを加え、攪拌後に15 分程度、遮光下にインキュベートして、それぞれのゲノム由来ＤＮＡの標識産物を得る。その後、得られた標識産物を、限外ろ過カラムにのせ、14000rpm で4 分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機で完全に乾燥させる。【０１０３】
ｉｉ）標識産物の断片化工程
上記(4)i)で得られた乾燥状態の各ゲノム由来ＤＮＡの標識産物に対して、0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液を調製したものを加える。該溶液に乾燥状態のゲノム由来ＤＮＡの標識産物を懸濁混和させる。94℃で15 分間程度加熱処理し、100base〜300 base の、各ゲノム由来ＤＮＡの標識産物の、断片化生成物を得る（Cy3標識産物、Cy5標識産物）。【０１０４】
得られたCy3標識産物及びCy5標識産物の各々を限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分程度遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機等で完全に乾燥させる。【０１０５】
次いで、このマイクロチューブに、salmon sperm DNA（10mg/mL）、formamideを含有し、ArrayHyb Hybridization buffer（SIGMA社製）で全量を40〜50μlに調整した試薬溶液（後に使用するマイクロアレイのカバーガラスが24×55mm の大きさの場合の組成である）を加え、上記で得た乾燥物を同一の溶液中で懸濁混和後、95℃で5 分程度インキュベートし、Cy3Cy5標識産物混合溶液（Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡのCy5標識産物の断片化生成物とＭ.イントラセルラー由来ゲノムＤＮＡのCy3標識産物の断片化生成物の混合溶液）を調製する。続く(5)のマイクロアレイ・ハイブリダイゼーションに用いるまで70℃に保っておく。【０１０６】
（５）マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション（アレイ上でのDNA-DNA hybridization）
次に、Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun cloneのマイクロアレイに対して、常法によりCy3Cy5標識産物のハイブリダイゼーションを行う。【０１０７】
例えば、上記(3)の工程で得られた、Ｍ.アビウム由来ゲノムのWhole Genome Shotgun cloneのマイクロアレイ上に、上記(4)ii)で調製したCy3Cy5標識産物混合溶液をのせ、カバーガラスをかぶせる。これをハイブリカセットにセットした後、65℃で8 時間以上、遮光下に反応させて、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをカバーグラスごと2×SSC-0.1%SDS 溶液に室温で浸し、カバーグラスをはずす。1×SSC、0.03％SDS溶液（60℃）で10 分間洗浄、0.2×SSC 溶液（42℃）で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液（室温）で約10 分間洗浄後、800prm で約5 分間遠心を行って乾燥させる。【０１０８】
（６）蛍光強度の測定；シグナル検出から数量化まで
蛍光読み取りスキャナーを用いて、上記(5)で得られたマイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定する。この際、Cy3及びCy5の、２チャンネルでの蛍光強度を測定して、蛍光検出データを得る。蛍光シグナルの数量化を行うには、市販のＤＮＡチップ発現イメージ解析ソフトウェア等を用いればよい。そして、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行えば良い。【０１０９】
ハイブリダイゼーションに用いたCy5標識産物は、Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡを標識したＤＮＡフラグメント群であり、Cy3標識産物は対照用ゲノムＤＮＡを標識したＤＮＡフラグメント群である。そのため、マイクロアレイ上のあるスポットのCy3とCy5のそれぞれの蛍光強度を測定した結果、Cy3に対するCy5の蛍光強度比が高い場合には、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Cy5標識産物、すなわちＭ.アビウム由来のゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズしたということを示す。そして、そのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Ｍ.アビウムに対する特異性が高いと判断される。【０１１０】
他方、あるスポットのCy3とCy5のそれぞれの蛍光強度を測定した結果、Cy3に対するCy5の蛍光強度比が低い場合は、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Cy3標識産物、すなわち対照用ゲノムＤＮＡとの交叉反応が観察されたことを示す。この場合と、Cy3及びCy5の蛍光の強さが同程度だった場合と、Cy3及びCy5のどちらの蛍光も検出されなかった場合には、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Ｍ.アビウムに対する特異性が低いと判断される。【０１１１】
そこで、例えばマイクロアレイ上で検出されたCy3/Cy5の蛍光強度比（Ratio）を基に、例えば、散布図(スキャッタープロット)を作成する等して、結果を解析する。そして、Ｍ.アビウムに特異的な配列のスクリーニングを行う。【０１１２】
スクリーニングを行った候補の中から、Cy3/Cy5 Ratioの数値解析の結果、有意にＭ.アビウム特異的なシグナルが得られ（Cy5の蛍光強度が強い場合）たスポット（クローン）を選択する。【０１１３】
尚、マイクロアレイ上に上記したようなポジティブコントロール及びネガティブコントロールがスポットされている場合には、夫々のコントロールのCy3Cy5蛍光強度を測定する。そして、その蛍光強度の傾向をみれば、より正確に目的のスポットを選択できる。【０１１４】
例えば、スクリーニングを行った候補の中から、Cy3/Cy5 Ratioの数値解析の結果、有意にＭ.アビウムに特異的なシグナルが得られ（Cy5の蛍光強度が強い場合）、なおかつ上述のＭ.アビウムのポジティブコントロールのスポットに比べてRatioの数値が大きい（Cy5の蛍光強度が強い）スポット（クローン）を選択する。【０１１５】
次いで、通常この分野で用いられているシークエンサー等の機器を利用し、常法に従い、得られた候補クローンの塩基配列決定を行えばよい。【０１１６】
本発明に係るＭ.アビウム検出用プライマーとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するプライマーが挙げられる（以下、本発明のプライマーと記載する場合がある。）。【０１１７】
また、本発明のプライマーは、ＰＣＲ（リアルタイムＰＣＲを含む）等の核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション等の条件に合わせて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドの中から、解離温度（Ｔｍ値）などを考慮して、適当な領域の適当な長さを選択して設計すればよい。【０１１８】
好ましくはプライマー配列としての特異性を維持するために必要な塩基数と考えられている１０〜５０塩基、より好ましくは１０〜３５塩基、更に好ましくは１８〜２５塩基の長さを有しているオリゴヌクレオチドが挙げられる。【０１１９】
プライマーを設計するには、プライマー設計のために一般に用いられているソフトや、例えばプライマーデザイン用のWebツールPrimer3 (Whitehead Institute for Biomedical Research.)等を用いればよい。【０１２０】
本発明のプライマーに用いられる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、上記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明に於いて記載したものと同じである。【０１２１】
本発明のプライマーの具体例としては、例えば配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するものが挙げられる。【０１２２】
好ましいプライマーとしては、配列番号６〜２３、配列番号４３〜１００、及び配列番号１３７〜１８２から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、又は配列番号６〜２３、配列番号４３〜１００、及び配列番号１３７〜１８２から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが挙げられる。【０１２３】
より好ましいプライマーとしては、配列番号６、７、１０〜１７、２２、２３、５７〜７２、７５〜９４、１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するプライマー、又は配列番号６、７、１０〜１７，２２，２３、５７〜７２、７５〜９４、１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するプライマーが挙げられる。【０１２４】
更により好ましいプライマーとしては、配列番号６、７、１０〜１７、２２、２３、５９〜７２、７５〜７８、８１〜９４、１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するプライマー、又は配列番号６、７、１０〜１７、２２、２３、５９〜７２、７５〜７８、８１〜９４、１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するプライマーが挙げられる。【０１２５】
なお更により好ましいプライマーとしては、配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するプライマー、又は配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するプライマーが挙げられる。その中でも、配列番号１３７〜１８２から選択される塩基配列を含有するプライマー、又は配列番号１３７〜１８２から選択される塩基配列に対する相補配列を含有するプライマーが挙げられる。【０１２６】
尚、配列番号６〜９で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号１で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１２７】
配列番号１０〜１１で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号２で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１２８】
配列番号１２〜１３で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号３で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１２９】
配列番号１４〜２１で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号４で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１３０】
配列番号２２〜２３で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号５で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１３１】
配列番号４３〜５４で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号３７で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１３２】
配列番号５５〜６６で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号３８で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１３３】
配列番号６７〜７４で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号３９で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１３４】
配列番号７５〜８２で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号４０で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１３５】
配列番号８３〜９２で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号４１で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１３６】
配列番号９３〜１００で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号４２で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１３７】
配列番号１３７〜１４４で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号１３０で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１３８】
配列番号１４５〜１４８で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号１３１で表される塩基配列をもとに設計されたものである。
【０１３９】
配列番号１４９〜１５８で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号１３２で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１４０】
配列番号１５９〜１６４で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号１３３で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１４１】
配列番号１６５〜１７０で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号１３４で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１４２】
配列番号１７１〜１７４で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号１３５で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１４３】
配列番号１７５〜１８２で表される塩基配列を含有するプライマーは、配列番号１３６で表される塩基配列をもとに設計されたものである。【０１４４】
また、配列番号１で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号６〜９で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号６（003Fw_1）：８０４位〜８２３位、
配列番号７（003Rv_1）：７０７位〜７２５位、
配列番号８（003Fw_2）：２０位〜３７位、
配列番号９（003Rv_2）：１３６位〜１５３位。【０１４５】
配列番号２で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１０〜１１で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１０（007Fw_1）：３位〜２１位、
配列番号１１（007Rv_1）：１２２位〜１３９位。【０１４６】
配列番号３で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１２〜１３で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１２（11Fw_1）：４８１位〜５００位、
配列番号１３（11Rv_1）：３４６位〜３６６位。【０１４７】
配列番号４で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１４〜２１で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１４（12Fw_1）：１２位〜３２位、
配列番号１５（12Rv_1）：１４３位〜１６１位、
配列番号１６（12Fw_4）：１２６位〜１４５位、
配列番号１７（12Rv_4）：２８７位〜３０８位、
配列番号１８（12Fw_2）：４４８位〜４６５位、
配列番号１９（12Rv_2）：５５９位〜５７９位、
配列番号２０（12Fw_3）：２９３位〜３１２位、
配列番号２１（12Rv_3）：４５２位〜４７２位。【０１４８】
配列番号５で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号２２〜２３で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号２２（04Fw_1）：５７４位〜５９４位、
配列番号２３（04Rv_1）：３９７位〜４１７位。【０１４９】
配列番号３７で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号４３〜５４で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号４３（RE01Fw_01）：７６５位〜７８３位、
配列番号４４（RE01Rv_01）：８９１位〜９１０位、
配列番号４５（RE01FW_02）：８１３位〜８３０位、
配列番号４６（RE01Rv_02）：９６１位〜９７８位、
配列番号４７（RE01Fw_03）：２０４位〜２２１位、
配列番号４８（RE01Rv_03）：３８６位〜４０３位、
配列番号４９（RE01Fw_04）：６８位〜８７位、
配列番号５０（RE01Rv_04）：１９０位〜２０７位、
配列番号５１（RE01Fw_05）：３８６位〜４０３位、
配列番号５２（RE01Rv_05）：５１７位〜５３５位、
配列番号５３（RE01Fw_06）：６１５位〜６３５位、
配列番号５４（RE01Rv_06）：７３４位〜７５１位。【０１５０】
配列番号３８で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号５５〜６６で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号５５（RE04Fw_01）：２０６位〜２２４位、
配列番号５６（RE04Rv_01）：３６０位〜３７８位、
配列番号５７（RE04Fw_02）：３５位〜５２位、
配列番号５８（RE04Rv_02）：２０６位〜２２４位、
配列番号５９（RE04Fw_03）：６１１位〜６３０位、
配列番号６０（RE04Rv_03）：７４４位〜７６２位、
配列番号６１（RE04Fw_04）：５７０位〜５８９位、
配列番号６２（RE04Rv_04）：７２７位〜７４６位、
配列番号６３（RE04Fw_05）：４３５位〜４５３位、
配列番号６４（RE04Rv_05）：５７２位〜５９３位、
配列番号６５（RE04Fw_06）：７４８位〜７６７位、
配列番号６６（RE04Rv_06）：８９０位〜９０９位。【０１５１】
配列番号３９で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号６７〜７４で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号６７（RE10Fw_02）：７８３位〜８００位、
配列番号６８（RE10Rv_02）：８７９位〜８９６位、
配列番号６９（RE10Fw_03）：５９位〜７７位、
配列番号７０（RE10Rv_03）：２３９位〜２５７位、
配列番号７１（RE10Fw_04）：５９０位〜６０７位、
配列番号７２（RE10Rv_04）：７８９位〜８０９位、
配列番号７３（RE10Fw_05）：３７７位〜３９６位、
配列番号７４（RE10Rv_05）：５０１位〜５１８位。【０１５２】
配列番号４０で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号７５〜８２で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号７５（RE11Fw_01）：２６４位〜２８１位、
配列番号７６（RE11Rv_01）：３７９位〜３９７位、
配列番号７７（RE11Fw_02）：１０６位〜１２３位、
配列番号７８（RE11Rv_02）：２７８位〜２９６位、
配列番号７９（RE11Fv_03）：３７５位〜３９２位、
配列番号８０（RE11Rv_03）：５３１位〜５４８位、
配列番号８１（RE11Fw_04）：５２６位〜５４３位、
配列番号８２（RE11Rv_04）：７０９位〜７２６位。【０１５３】
配列番号４１で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号８３〜９２で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号８３（RE23Fw_01）：３４位〜５３位、
配列番号８４（RE23Rv_01）：１５７位〜１７６位、
配列番号８５（RE23Fw_02）：１５９位〜１７８位、
配列番号８６（RE23Rv_02）：３０５位〜３２２位、
配列番号８７（RE23Fw_03）：４６２位〜４８１位、
配列番号８８（RE23Rv_03）：５８４位〜６０３位、
配列番号８９（RE23Fw_04）：４３６位〜４５３位、
配列番号９０（RE23Rv_04）：５３５位〜５５２位、
配列番号９１（RE23FW_05）：２７９位〜２９８位、
配列番号９２（RE23Rv_05）：４０１位〜４１９位。【０１５４】
配列番号４２で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号９３〜１００で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号９３（RE24Fw_01）：３２８位〜３４７位、
配列番号９４（RE24Rv_01）：４１４位〜４３３位、
配列番号９５（RE24Fw_02）：１７８位〜１９６位、
配列番号９６（RE24Rv_02）：３２８位〜３４７位、
配列番号９７（RE24Fw_03）：１０３位〜１２０位、
配列番号９８（RE24Rv_03）：２７４位〜２９１位、
配列番号９９（RE24FW_04）：３８７位〜４０６位、
配列番号１００（RE24Rv_04）：５３７位〜５５５位。【０１５５】
配列番号１３０で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１３７〜１４４で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１３７（Mac_06Fw01）：８８位〜１０５位、
配列番号１３８（Mac_06Rv01）：２２３位〜２４１位、
配列番号１３９（Mac_06Fw02）：１５６位〜１７５位、
配列番号１４０（Mac_06Rv02）：３１２位〜３３１位、
配列番号１４１（Mac_06Fw03）：４６０位〜４７８位、
配列番号１４２（Mac_06Rv03）：６０４位〜６２３位、
配列番号１４３（Mac_06Fw04）：６０４位〜６２３位、
配列番号１４４（Mac_06Rv04）：７４３位〜７６０位、【０１５６】
配列番号１３１で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１４５〜１４８で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１４５（Mac_10Fw01）：９４位〜１１３位、
配列番号１４６（Mac_10Rv01）：２２８位〜２４５位、
配列番号１４７（Mac_10Fw02）：２８０位〜２９９位、
配列番号１４８（Mac_10Rv02）：４５３位〜４７２位、【０１５７】
配列番号１３２で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１４９〜１５８で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１４９（Mac_11Fw01）：７１位〜８８位、
配列番号１５０（Mac_11Rv01）：２２８位〜２４８位、
配列番号１５１（Mac_11Fw02）：４７７位〜４９６位、
配列番号１５２（Mac_11Rv02）：５９６位〜６１５位、
配列番号１５３（Mac_11Fw03）：５３６位〜５５４位、
配列番号１５４（Mac_11Rv03）：６１７位〜６３５位、
配列番号１５５（Mac_11Fw04）：５５８位〜５７５位、
配列番号１５６（Mac_11Rv04）：６７１位〜６８８位、
配列番号１５７（Mac_11Fw05）：２９９位〜３１６位、
配列番号１５８（Mac_11Rv05）：３９１位〜４１０位、【０１５８】
配列番号１３３で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１５９〜１６４で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１５９（Mac_12Fw01）：２７１位〜２９０位、
配列番号１６０（Mac_12Rv01）：４１６位〜４３３位、
配列番号１６１（Mac_12Fw02）：６０３位〜６２２位、
配列番号１６２（Mac_12Rv02）：７４７位〜７６５位、
配列番号１６３（Mac_12Fw03）：５８位〜７５位、
配列番号１６４（Mac_12Rv03）：１９８位〜２１６位、【０１５９】
配列番号１３４で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１６５〜１７０で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１６５（Mac_13Fw01）：１０８位〜１２６位、
配列番号１６６（Mac_13Rv01）：２８８位〜３０５位、
配列番号１６７（Mac_13Fw02）：３２１位〜３３９位、
配列番号１６８（Mac_13Rv02）：４５３位〜４７２位、
配列番号１６９（Mac_13Fw03）：５７６位〜５９５位、
配列番号１７０（Mac_13Rv03）：７２０位〜７３９位、【０１６０】
配列番号１３５で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１７１〜１７４で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１７１（Mac_15Fw01）：２３３位〜２５０位、
配列番号１７２（Mac_15Rv01）：３２６位〜３４６位、
配列番号１７３（Mac_15Fw02）：４４２位〜４６０位、
配列番号１７４（Mac_15Rv02）：５２７位〜５４６位、【０１６１】
配列番号１３６で表される塩基配列上の、プライマーとして設計した配列番号１７５〜１８２で表される塩基配列の存在位置は、夫々次の通りである。
配列番号１７５（Mac_16Fw02）：８４８位〜８６７位、
配列番号１７６（Mac_16Rv02）：９５２位〜９６９位、
配列番号１７７（Mac_16Fw03）：１３５位〜１５２位、
配列番号１７８（Mac_16Rv03）：２２２位〜２４０位、
配列番号１７９（Mac_16Fw05）：５４４位〜５６２位、
配列番号１８０（Mac_16Rv05）：６６９位〜６８８位、
配列番号１８１（Mac_16Fw07）：７０３位〜７２０位、
配列番号１８２（Mac_16Rv07）：７９２位〜８１２位、【０１６２】
尚、上記において、各配列番号の後の（  ）内に、本発明で命名したプライマーの名称を示す。【０１６３】
本発明のプライマーを得る方法は、上記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。【０１６４】
また、本発明のプライマーは、標識物質で標識されていてもよい。【０１６５】
本発明のプライマーを標識する方法としては、この分野で通常行われているオリゴヌクレオチドの標識方法が挙げられ、標識物質ごとに適宜方法を選択すればよい。【０１６６】
本発明のプライマーを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。【０１６７】
例えば、放射性同位体としては32P，33P，35S等、酵素としてはアルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等、蛍光物質としてはCyanine Dye系のCy3，Cy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）や、Alexa555、Alexa647（インビトロジェン社）フルオレセイン等、発光物質としてはAcridinium Esterを含む化学発光試薬等が挙げられる。【０１６８】
本発明のプライマーを放射性同位体により標識する方法としては、プライマーを合成する際に、放射性同位体で標識されたヌクレオチドを取り込ませることによって、プライマーを標識する方法や、プライマーを合成した後、放射性同位体で標識する方法等が挙げられる。具体的には、一般によく用いられているランダムプライマー法、ニックトランスレーション法、Ｔ４ポリヌクレオチド キナーゼによる5'−末端標識法、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いた3'−末端標識法、ＲＮＡラベリング法等が挙げられる。【０１６９】
本発明のプライマーを酵素で標識する方法としては、アルカリホスファターゼ，西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素分子を、標識するプライマーに直接共有結合させる等の、この分野に於ける常法である直接標識法が挙げられる。【０１７０】
本発明のプライマーを蛍光物質で標識する方法としては、例えばフルオレセイン標識したヌクレオチドをこの分野に於ける常法の標識手法によりプライマーに取り込ませる方法が挙げられる。また、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列中のオリゴヌクレオチドと置換する方法（例えば、Nucleic Acids Res.,1986年, 第14巻, p.6115参照）でもヌクレオチドを蛍光物質で標識することができる。その場合、５位にリンカーアームを有するウリジンを特開昭60-500717 号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリゴヌクレオチド鎖に蛍光物質を導入する方法もある。【０１７１】
本発明のプライマーを発光物質で標識する方法及びビオチンで標識する方法としては、通常この分野で行われているヌクレオチドを発光標識又はビオチン標識する常法が挙げられる。【０１７２】
本発明に係るＭ.アビウム検出用プローブとしては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）を含有するプローブが挙げられる（以下、本発明のプローブと記載する場合がある。）。【０１７３】
本発明のプローブは、ＰＣＲ(リアルタイムＰＣＲを含む)等の核酸増幅反応、核酸ハイブリダイゼーション等の条件に合わせて、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチド、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するオリゴヌクレオチドから、解離温度（Ｔｍ値）などを考慮して、適当な領域の適当な長さを選択して使用すればよい。但し、プローブに十分な特異性を持たせたいのならば、プローブ配列としての特異性を維持するために必要な塩基数を考慮して設計することが望ましい。【０１７４】
例えば、核酸ハイブリダイゼーション法（例えばサザン・ハイブリダイゼーション等）等に用いるプローブとしては、１０〜７００塩基、好ましくは１００〜６００塩基、更に好ましくは２００〜５００塩基の長さを有しているプローブが好ましい。【０１７５】
また、例えばリアルタイムＰＣＲ増幅法（例えばTaqManTM法、Molecular Beacon法等）等に用いるプローブとしては、１０〜５０塩基、好ましくは１５〜４０塩基、更に好ましくは２０〜３０塩基の長さを有しているものが挙げられる。【０１７６】
本発明のプローブに用いられる、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）の具体例は、上記の本発明のオリゴヌクレオチドの説明に於いて記載したものと同じである。【０１７７】
本発明のプローブの好ましい具体例としては、配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチド、又は配列番号６〜３２、配列番号４３〜１２９、及び配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【０１７８】
より好ましいプローブとしては、配列番号６、７、１０〜１７、２２〜２４、２６〜２９、３２、５７〜７２、７５〜９４、１０８〜１１５、１１７〜１２６、１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するプローブ、又は配列番号６、７、１０〜１７、２２〜２４、２６〜２９、３２、５７〜７２、７５〜９４、１０８〜１１５、１１７〜１２６、１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するプローブが挙げられる。【０１７９】
更に好ましいプローブとしては、配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列の一部若しくは全部を含有するプローブ、又は配列番号１３７〜２０５から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有するプローブが挙げられる。【０１８０】
尚、配列番号２４〜３２、配列番号１０１〜１２９、及び配列番号１８３〜２０５から選択される塩基配列又はこれらに対する相補配列は、本発明のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅されるオリゴヌクレオチドの塩基配列である。フォワードプライマーとリバースプライマーの組合せと、それを用いたＰＣＲにより増幅される塩基配列の配列番号を表１に併せて示す。例えば、配列番号２４で表される塩基配列は、配列番号６で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとし、配列番号７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして用いたＰＣＲにより増幅されるオリゴヌクレオチドの塩基配列であることを示す。【０１８１】
【表１】
2008075520.tif 000002
【０１８２】
本発明のプローブを得る方法は、上記の本発明のヌクレオチドを得る方法に於いて記載した通りである。【０１８３】
本発明のプローブは、標識物質で標識されていてもよい。【０１８４】
本発明のプローブを標識物質で標識するために用いられる標識物質としては、放射性同位体や酵素、蛍光物質、発光物質、ビオチンなど公知の標識物質であれば何れも用いることができる。【０１８５】
本発明のプローブを標識物質で標識するために用いられる、標識物質の具体例及び標識方法は、本発明のプライマーの標識方法の説明に於いて記載したとおりである。【０１８６】
また、後述するリアルタイムＰＣＲによる検出法に於いて用いられる標識プローブとしては、本発明のプローブを、リアルタイムＰＣＲ法において通常用いられている標識物質で標識したものが挙げられる。例えば、5'末端がレポーター蛍光物質［カルボキシフルオレセイン（FAM）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、テトラクロロフルオレセイン(TET)等］で標識され、3'末端がクエンチャー色素[例えばカルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）等の蛍光物質、Black Hole Quencher色素（BHQ），4-((4-(dimethylamino) phenyl)azo)benzoic acid (DABCYL)等の非蛍光物質]で標識された本発明のプローブが挙げられる。【０１８７】
後述するTaqManTMリアルタイムＰＣＲによる検出法においても、上記した標識プローブを用いることができる。【０１８８】
本発明に係るＭ.アビウムの検出に用いられる試料（被検試料）としては、喀痰，血液，咽頭粘液，胃液，気管支洗浄液，経気管支採取物，胸水などの穿刺液，尿，膿等の各種臨床検体が挙げられる。また、検体から単離、培養された培養菌体、これらより単離、精製された核酸、又は核酸増幅検出系等で増幅された核酸でもよい。【０１８９】
上記試料からＤＮＡを抽出・精製するには、検体からの抗酸菌（結核菌）ＤＮＡ抽出に用いられる常法に従って行えばよい。【０１９０】
まず、試料中の結核菌の細胞壁を破壊する必要がある。その方法としては、例えば菌体を試料とする場合には、例えばSDS等の界面活性剤や、グアニジンチオシアネート（GTC）等の蛋白変性剤で菌体を処理して結核菌の膜構造を破壊する方法、又は菌体をガラスビーズ等によって物理的に破砕する方法等が挙げられる。【０１９１】
喀痰を検体として用いる場合には、まず前処理として、米国疾病管理予防センター（Centers for Disease Control and Prevention、略称CDC）で推奨しているNALC （N-acetyl-L-cysteine） -NaOH法（Kent PT, Kubica GP, Pubric Health Mycobacteriology, A Guide for the Level III Laboratory, U.S.Department of Health and Human Services, Public Health Service, Center for Disease Control, Atlanta, U.S.A., 1985年, p.31-55）による検体の均質化を行うのが望ましい。【０１９２】
結核菌の細胞壁を破壊した後、この分野で一般的なＤＮＡの調製法（フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿法等  Rapid and simple method for purification of nucleic acids, J. Clin. Microbiol., 1990, Mar;28（3）, 495-503, Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J）、イソプロパノールを用いて沈殿する方法等によりＤＮＡの抽出及び精製を行えばよい。【０１９３】
ＤＮＡの抽出精製には、そのための様々なキットが市販されているので、それを用いてもよい。例えば（株）キアゲン製イオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic-tip等を用いてＤＮＡの抽出、精製を行えばよい。【０１９４】
検体から単離、培養された培養菌体を試料として用いる場合を例にとって示すと次のとおりである。【０１９５】
例えば小川培地上のコロニーを採取し、滅菌蒸留水に懸濁、遠心分離して菌体を集めた後、蒸留水に再懸濁する。次いで菌体の懸濁液をオートクレーブ処理した後、菌体の粉砕処理（ガラスビーズによる物理的破砕等）を行い、さらに遠心分離して上清を回収する。得られた上清から、上記した方法でＤＮＡを抽出・精製すればよい。【０１９６】
本発明に係るＭ.アビウムの検出方法としては、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）をプライマー又は／及びプローブとして用いる方法（本発明のプライマー又は／及びプローブを用いる方法）が挙げられる。【０１９７】
例えば、
（Ａ）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出する方法、
（Ｂ）本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして用いる方法、
等が挙げられる。以下に、夫々の方法について説明する。【０１９８】
（Ａ）本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物を検出する方法【０１９９】
（Ａ）の方法において、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて核酸増幅反応を行う方法としては、例えば、本発明のプライマーを用い、試料中の核酸を鋳型として用いてＤＮＡポリメラーゼ等による核酸増幅反応[例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（特開昭60-281号公報）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated Isothermal Amplification）法（Tsugunori Notomi et al., Nucleic Acid Res., 28, e63, 2000）、ICANTM（Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（臨床病理, 51(11), 1061-1067, 2003, Nov）、LCR(ligase chain reaction)法（特開平4-211399号）、SDA(strand displacement amplification)法（特開平8-19394号）]を行ってプライマー伸長させる方法が挙げられる。これによりＭ.アビウムの塩基配列の特定の領域の配列を増幅させることができるので、得られたプライマー伸長産物を測定することにより、Ｍ.アビウムを検出することができる。【０２００】
上記の核酸増幅反応を行う方法の中でも、ＰＣＲ法が最も一般的な方法として挙げられ、ＰＣＲ法の例としては、例えばリアルタイム増幅検出法（例えば米国特許第5210015号、米国特許第5538848号の記載参照）を用いることができる。また、リアルタイム増幅検出法による検出法の例として、例えばリアルタイムＰＣＲ検出法が挙げられる。【０２０１】
リアルタイムＰＣＲ検出法の例としては、TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第5538848号の記載参照）、MGB Eclipse Probe System法（例えば米国特許第5,801,155号の記載参照）、Molecular Beacons Probe Technology法（例えば米国特許第5925517号の記載参照）、LUX Fluorogenic Primer法（Invitrogen Corporation）、Quenching probe-ＰＣＲ（QP）法（例えば米国特許第6,492,121号の記載参照）等が挙げられる。【０２０２】
ＰＣＲ等の核酸増幅反応において用いられる本発明のプライマーの具体例は、上記したとおりである。【０２０３】
また、核酸増幅反応に用いられる、好ましいフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せとしては、上記表１で示される組合せが挙げられる。【０２０４】
その中でも好ましいフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せとしては、例えば下記表２に記載の組み合わせが挙げられる。【０２０５】
表２において、例えば番号１の組み合わせは、「フォワードプライマーが配列番号６で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドで、リバースプライマーが配列番号７で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドである組合せ。」を示す。【０２０６】
【表２】
2008075520.tif 000003
【０２０７】
上記プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲ等の核酸増幅反応に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常この分野で用いられているものを用いればよく、その条件、手法等は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、ＰＣＲ法の一般的なプロトコルに従って行えばよい。【０２０８】
核酸増幅反応で得られたプライマー伸長産物を検出する方法は、通常この分野で行われている常法で良く、限定されるものではない。【０２０９】
例えばインターカレーター法、TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（例えば米国特許第5538848号の記載参照）、MGB Eclipse Probe System法（例えば米国特許第5,801,155号の記載参照）、Molecular Beacons Probe Technology法（例えば米国特許第5925517号の記載参照）、LUX Fluorogenic Primer法（Invitrogen Corporation）、Quenching probe-ＰＣＲ（QP）法（例えば米国特許第6,492,121号の記載参照）、核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法等、様々な検出法が挙げられる。【０２１０】
これらのうち、一般によく用いられる方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。【０２１１】
（Ａ−１）インターカレーター法、
（Ａ−２）TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（TaqManTMプローブ法）、
(Ａ−３)核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法、
(Ａ−４)標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法。【０２１２】
以下に、夫々の方法について説明する。【０２１３】
（Ａ−１）インターカレーター法
公知のインターカレーターを利用してリアルタイムＰＣＲを行う、通常のインターカレーター法が利用できる。【０２１４】
例えば、本発明のプライマーと、インターカレーターを用い、通常のインターカレーター法を利用したリアルタイムＰＣＲを行う方法が挙げられる。【０２１５】
すなわち、インターカレーターは、二本鎖ＤＮＡに特異的に結合して蛍光を発する試薬であり、励起光を照射すると蛍光を発する。ＰＣＲ反応によって増幅を繰り返してＤＮＡが増えると、インターカレーターがそのＤＮＡに取り込まれるので、プライマー伸長産物の生成量に比例して、ＤＮＡに取り込まれていくため、インターカレーターに由来する蛍光強度を検出することにより、プライマー伸長産物の量を知ることができる。【０２１６】
但しインターカレーターは全ての二本鎖ＤＮＡに結合するので、得られた蛍光強度の測定結果を基に、必要に応じ、融解曲線を作成して、融解曲線解析を行う。すなわち、ＰＣＲ反応後にＰＣＲ反応液の温度を徐々に上げながら、インターカレーター由来の蛍光強度を測定する。最初はＰＣＲ増幅産物は二本鎖を形成しているので蛍光を発しているが、ＰＣＲ反応液の温度がある一定の温度に達すると一本鎖に解離するので、インターカレーター由来の蛍光は急激に低下する。この時の温度が融解温度（Ｔｍ値）であり、プライマー伸長産物の配列に固有の値である。融解曲線のピークが、目的とする特異産物のピークか、又は特異産物と非特異産物のピークかについては、このＴｍ値から判定することができる。【０２１７】
このインターカレーター法は、リアルタイムＰＣＲの後に電気泳動を行う必要がないので、臨床検査の分野等において、迅速に検出を行う必要がある場合には、有効な方法である。【０２１８】
本発明に用いられるインターカレーターとしては、通常この分野で用いられているインターカレーターであれば、何でも用いることができるが、例えばSYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)、エチジウムブロマイド、フルオレン等がある。【０２１９】
本発明に係る「インターカレーター法を利用したＭ.アビウムの検出方法」の例を説明すると、以下の通りである。【０２２０】
本発明のプライマーと、インターカレーター（例えばSYBRTM Green I）を用い、Ｍ.アビウムを検出すべき試料（被検試料）から精製した精製ＤＮＡ試料を鋳型として用いて、Taq DNA ポリメラーゼ等のポリメラーゼを用いたリアルタイムＰＣＲを行う。そして上記した温度を下げる方法で、プライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBRTM Green Iの蛍光強度を測定する。【０２２１】
次いで、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成する。これを用いて、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行い、ピークの検出を行い、単一のピークが得られた場合に、被検試料はＭ.アビウム陽性と判定される。【０２２２】
又は、精製ＤＮＡ試料溶液の希釈系列を調製し、各希釈系列毎に、上記と同様にリアルタイムＰＣＲを行う、【０２２３】
次いで、リアルタイムＰＣＲに於いて鋳型として用いた精製ＤＮＡ試料溶液の各希釈系列毎に、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成する。そして、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行い、検出ピークの解析を行う。各希釈系列に対する各プライマー伸長産物について、同一のＴｍ値のピークが検出された場合に、被検試料はＭ.アビウム陽性（すなわち、Ｍ.アビウム菌、又はその遺伝子が存在する。以下同じ。）と判定される。【０２２４】
また、対照として、Ｍ.アビウム以外のマイコバクテリウム属菌由来ＤＮＡを常法により抽出・精製し、これを鋳型として用いる以外は、上記と同様の方法にしてリアルタイムＰＣＲを行い、同様にSYBRTM Green Iの蛍光強度を測定し、融解曲線解析を行ってもよい。この場合は、試料中にＭ.アビウム由来の配列がないので、融解曲線解析でピークは出現しないはずである。Ｍ.アビウムの有無の判定をより確実にするためには、上記した対照実験を一緒に行うことが望ましい。【０２２５】
更に、インターカレーター法を利用した方法で得られた測定値をもとに、リアルタイムＰＣＲで行われる常法に従って、検量線を作成することもできるので、その検量線を用いて試料中にあるＭ.アビウムのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。【０２２６】
検量線の作成方法及びそれを用いたＭ.アビウムの定量方法は後記する。【０２２７】
本発明に係るインターカレーターを用いたリアルタイムＰＣＲ検出法によるＭ.アビウムの検出方法の一例として、上記した本発明の「プライマー12Fw_1」と「プライマー12Rv_1」を用いて、Ｍ.アビウムを検出する場合を例にとって説明すると、以下の通りである。【０２２８】
まず、公知の方法により、Ｍ.アビウムを検出すべき試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。【０２２９】
別に、ＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（12Fw_1）、及び配列番号１５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（12Rv_1）を合成する。【０２３０】
合成した12Fw_1をフォワードプライマーとして、12Rv_1をリバースプライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムＰＣＲを行う。【０２３１】
すなわち、プライマー12Fw_1と、プライマー12Rv_1を各50〜2000nM、インターカレーター［例えばSYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)］を原液の約５〜100000倍希釈、1.0〜4.0mM MgCl2、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%TritonX-100、夫々0.2mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位/mlのポリメラーゼ（例えばTaq DNA ポリメラーゼ）を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。該ＰＣＲ用反応液に、Ｍ.アビウムを検出すべき試料（被検試料）から精製した精製ＤＮＡ試料を加え、ＰＣＲ用試料とする。このＰＣＲ用試料を９６穴反応プレートのウェルに入れ、リアルタイムＰＣＲ検出装置等を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にプライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBRTM Green Iの蛍光強度を測定する。【０２３２】
次いで、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成する。これを用いて、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行い、ピークの検出を行い、単一のピークが得られた場合に、被検試料はＭ.アビウム陽性と判定される。【０２３３】
又は、精製ＤＮＡ試料溶液の希釈系列を調製し、各希釈系列毎に、上記と同様にリアルタイムＰＣＲを行う。次いで、リアルタイムＰＣＲに於いて鋳型として用いた精製ＤＮＡ試料溶液の各希釈系列毎に、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成する。そして、プライマー伸長産物の融解曲線解析を行い、検出ピークの解析を行う。【０２３４】
この場合のＭ.アビウムの検出方法としては、融解曲線解析で各希釈系列に対する各プライマー伸長産物について、同一のＴｍ値のピークが検出された場合に、被検試料はＭ.アビウム陽性と判定される。【０２３５】
また、対照として、Ｍ.アビウム以外のマイコバクテリウム属菌由来ＤＮＡを常法により抽出・精製し、これを鋳型として用いる以外は、上記と同様の方法にしてリアルタイムＰＣＲを行い、同様にSYBRTM Green Iの蛍光強度を測定し、融解曲線解析を行ってもよい。この場合は、試料中にＭ.アビウム由来の配列がないので、融解曲線解析でピークは出現しないはずである。Ｍ.アビウムの有無の判定をより確実にするためには、上記した対照実験を一緒に行うことが望ましい。【０２３６】
更に、検量線を作成することによって、試料中のＭ.アビウムのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を得ることができる。また、その数はＭ.アビウムの数に比例するので、試料（被検試料）中のＭ.アビウムの数も知ることができる。【０２３７】
（Ａ−２）TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法（TaqManTMプローブ法）
5'末端を例えばFAM等の蛍光色素（レポーター）で、3'末端を例えばTAMRA等のクエンチャー色素で標識したプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法により、目的の微量なＤＮＡを高感度且つ定量的に検出する方法である（例えば米国特許第5,538,848号の記載参照）。【０２３８】
具体的には、本発明のプライマーと、本発明のプローブの5'末端がレポーター蛍光色素で標識され、3'末端がクエンチャー色素で標識された標識プローブを用いて、試料中の核酸を鋳型としてＰＣＲを行い、該標識プローブから遊離された標識物質の標識を検出する方法である。【０２３９】
TaqManTMリアルタイムＰＣＲ法の原理は以下の通りである。【０２４０】
この方法には、5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが使用される。該プローブは、通常の状態ではクエンチャー色素によってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光標識プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光標識プローブが5'端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングする方法であり、これにより、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができる。【０２４１】
本発明に係るTaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出法に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーには、本発明のプライマーが用いられる。好ましいプライマーとしては、上記したＰＣＲ法等の核酸増幅反応において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましい組合せも上記したとおりである。【０２４２】
本発明に係るTaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出法に用いられる5'末端を蛍光色素（レポーター）で、3'末端をクエンチャー色素で標識したプローブに用いられるプローブとしては、上記した本発明のプローブであればよい。実際には、選択したフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せでリアルタイムＰＣＲを行った場合に得られると予測されるプライマー伸長産物の塩基配列を含有するプローブ、又は更にその配列から設計される塩基配列を含有するプローブが用いられる。【０２４３】
例えば、プライマー12Fw_1とプライマー12Rv_1を用いてリアルタイムＰＣＲを行う場合に用いられるプローブは、そのリアルタイムＰＣＲで増幅されると予想される配列番号２８で表される塩基配列の一部又は全部を含有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。【０２４４】
５'末端を標識するレポーター蛍光物質としてはカルボキシフルオレセイン（FAM）、ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、テトラクロロフルオレセイン(TET)、Cy5、VIC等が挙げられるが、中でもFAMがよく用いられる。３'末端を標識するクエンチャー色素としては、カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）等の蛍光物質、Black Hole Quencher色素（例えばBHQ2），4-((4-(dimethylamino) phenyl)azo)benzoic acid (DABCYL)等の非蛍光物質が挙げられるが、中でもTAMRAがよく用いられる。【０２４５】
リアルタイムＰＣＲ検出法に用いられるその他のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、ＤＮＡポリメラーゼ等の試薬は、通常のリアルタイムＰＣＲで用いられているものを用いればよく、リアルタイムＰＣＲの手法は、本発明のプライマー及びプローブを用いる以外は、リアルタイムＰＣＲの一般的なプロトコルに従って行えばよい。【０２４６】
本発明に係るTaqManTMリアルタイムＰＣＲ検出法によるＭ.アビウムの検出方法の一例として、本発明のプライマー「12Fw_1」と「12Rv_1」を用いて、Ｍ.アビウムを検出する場合を例にとって説明すると、以下の通りである。【０２４７】
まず、公知の方法により、Ｍ.アビウムを検出すべき試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。【０２４８】
別に、ＤＮＡシンセサイザーを用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（12Fw_1）、及び配列番号１５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド（12Rv_1）を合成する。【０２４９】
また、12Fw_1及び12Rv_1をプライマーとして用いたＰＣＲで増幅されると予想される配列番号２８の塩基配列から、プローブとして利用するための配列を設計し、この塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成する。このオリゴヌクレオチドの5'末端にレポーター色素のFAMを、3'末端にレポーター消光体のTAMRAを常法により結合し、蛍光標識プローブを得る。【０２５０】
上記で調製した12Fw_1をフォワードプライマーとして、12Rv_1をリバースプライマーとして用い、例えば下記の通りリアルタイムＰＣＲを行う。【０２５１】
すなわち、各 0.1〜2μM、好ましくは各１μMのプライマー12Fw_1及びプライマー12Rv_1、100〜1000nMの蛍光標識プローブ、1.0〜4.0mM MgCl2、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%TritonX-100、夫々0.2mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、10〜80単位/mlのTaq DNA ポリメラーゼを含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。このＰＣＲ用反応液20μｌに精製ＤＮＡ試料1ngを加え、ＰＣＲ用試料を得る。このＰＣＲ用試料を９６穴反応プレートのウェルに入れ、リアルタイムＰＣＲ検出装置等を用いてリアルタイムＰＣＲを行う。反応は30〜50回サイクル繰り返し、１サイクル毎にレポーター色素の蛍光強度量を測定する。【０２５２】
この場合のＭ.アビウム検出方法としては、レポーター色素の蛍光が測定された場合に、被検試料はＭ.アビウム陽性と判定される。【０２５３】
また、リアルタイムＰＣＲ法では、検量線を作成することができるので、試料中のＭ.アビウムのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を得ることがでる。また、その数はＭ.アビウムの数に比例するので、試料（被検試料）中のＭ.アビウムの数も知ることができる。【０２５４】
検量線の作成方法は、リアルタイムＰＣＲ法において通常行われている常法に従えばよい。例えば、標準としてコピー数既知のＭ.アビウムのゲノムＤＮＡ試料を用い、希釈系列の濃度（コピー数）のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を調製する。次いで各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を用いて上記方法に従いリアルタイムＰＣＲを行い、レポーター色素の蛍光強度を測定する。各希釈系列のＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲの各サイクル数（ｘ軸）に対する、測定した蛍光強度の測定値(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成する。次いで、蛍光強度が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引く。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の増幅曲線が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とする。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。【０２５５】
先に記載した、インターカレーター法によるリアルタイムＰＣＲを行た場合も、得られた測定値を基に同様に検量線を作成することができる。例えば、ＰＣＲの各サイクル数（ｘ軸）に対するインターカレーター由来の蛍光強度の測定値（Rn、ｙ軸）をプロットした増幅曲線を作成する。次いで、上記と同じ方法でCt値を得、リアルタイムＰＣＲに用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のコピー数の対数値（x軸）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とすればよい。【０２５６】
試料中のＭ.アビウムのゲノムＤＮＡの数（コピー数）を定量するには、先ずＭ.アビウムを検出すべき試料中からＤＮＡを分離精製した後、得られたＤＮＡ試料についてリアルタイムＰＣＲを行い、同様に増幅曲線を作成する。検量線を作成したときのThと得られた増幅曲線が交差したCt値を得る。そのCt値を検量線に当てはめることにより、試料中のＭ.アビウムのゲノムＤＮＡ量（コピー数）を得ることができる。【０２５７】
（Ａ−３）核酸増幅反応を行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいて行う方法【０２５８】
この方法としては、例えば
「下記工程を包含することを特徴とする、Ｍ.アビウムの検出方法、
（i）配列番号１，配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）として用い、試料中の核酸を鋳型として核酸増幅反応を行う、
（ii）(i)で得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、その結果に基づいてＭ.アビウムの有無を判定する。」
が挙げられる。【０２５９】
電気泳動を行い、その結果に基づいて、Ｍ.アビウムの有無を判定する方法としては、例えば
（Ａ−３−１）目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長産物画分を確認することにより判定する方法、
（Ａ−３−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出する方法、
等が挙げられる。【０２６０】
核酸増幅反応の具体例は、上記したとおりである。【０２６１】
電気泳動法の条件、操作方法等は、この分野で通常行われている常法に従えばよい。【０２６２】
以下に、（Ａ−３−１）及び（Ａ−３−２）の方法について説明する。【０２６３】
（Ａ−３−１）目的とする大きさ（塩基対数）のプライマー伸長産物画分を確認することにより判定する方法【０２６４】
例えば、まず本発明のプライマーから、適当なフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを選択し、それを用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行う。次いで、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。予め、核酸増幅反応に用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せから、増幅されるであろうプライマー伸長産物の大きさ（塩基対数）を予測しておき、得られた電気泳動画分が予測された大きさのプライマー伸長産物に該当するか否かを、常法により確認すればよい。例えば、得られた電気泳動画分をエチジウムブロマイド等で染色して核酸種を視覚化するといった方法で、該画分を染色し、そのプライマー伸長産物の大きさを確認する等の方法が挙げられる。【０２６５】
（Ａ−３−１）の方法による具体的な判定方法としては、例えば上記の表１に記載されたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、そのプライマーの組合せで増幅されると予想される、表１に記載の配列番号で表される塩基配列のオリゴヌクレオチド、又はその塩基対数の大きさの画分が確認された場合に、被検試料はＭ.アビウム陽性と判定する方法が挙げられる。【０２６６】
（Ａ−３−１）の方法の具体例を、下記表３にまとめて示す。【０２６７】
すなわち、例えば表３における番号１の方法とは「フォワードプライマーとして配列番号６で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号７で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行い、１１９塩基対の画分又は配列番号２４で表される塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの画分が確認されたものを陽性と判定する方法。」である。【０２６８】
【表３】
2008075520.tif 000004
【０２６９】
以上の中でも番号１、３〜６、９、１７〜２４、２６〜３５、３９〜６１の方法が好ましい。
これらの中でも、番号３９〜６１の方法が、特に好ましい。【０２７０】
（Ａ−３−２）標識プローブを用いたハイブリダイゼーションにより検出する方法【０２７１】
例えば核酸増幅反応を行って得られたプライマー伸長産物について、電気泳動を行う。得られた電気泳動画分について、本発明のプローブを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行う。該標識プローブの標識を検出することによって、該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在が確認された場合に、その被検試料は、Ｍ.アビウム陽性と判定する方法が挙げられる。【０２７２】
用いられるプローブ及びプローブを標識する標識物質の具体例、並びにプローブの標識方法は、上記したとおりである。【０２７３】
その一例を示すと、次の通りである。すなわち、上記した表１に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。予め、ＰＣＲに用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組合せで増幅されると予測される、表１に記載の配列番号の塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブを調製しておく。電気泳動画分の該標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分の存在が確認された場合に、その被検試料はＭ.アビウム陽性と判定する方法、が挙げられる。【０２７４】
これらの方法の好ましい具体例を、下記表４にまとめて示す。【０２７５】
例えば、表４において、番号１の方法とは、「フォワードプライマーとして配列番号６で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを用い、リバースプライマーとして配列番号７で表される塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲを行った後、得られたプライマー伸長産物について電気泳動を行う。次いで、得られた画分について、配列番号２４で表される塩基配列の一部又は全部を含有する塩基配列を含有するオリゴヌクレオチドを標識物質で標識した標識プローブに対するハイブリダイゼーションを行い、該標識プローブの標識を検出することによって該標識プローブとハイブリダイズした画分が確認されたものを陽性と判定する方法。」である。【０２７６】
【表４】
2008075520.tif 000005
【０２７７】
以上の中でも、番号１、３〜６、９、１７〜２４、２６〜３５，３９〜６１の方法が好ましい。【０２７８】
これらの中でも、特に番号３９〜６１の方法が好ましい。【０２７９】
（Ａ−３）の方法による本発明のＭ.アビウムの検出方法の詳細を、例えば12Fw_1（配列番号１４）をフォワードプライマーとして用い、12Rv_1（配列番号１５）をリバースプライマーとして用いたＰＣＲ、及び電気泳動を行った後、目的とする塩基対数のプライマー伸長産物画分を確認する方法によって検出する場合（上記の（Ａ−３−１）の番号５の方法、表３参照）を例に挙げて説明すると、以下の通りである。【０２８０】
まず、公知の方法により、Ｍ.アビウムの有無を検出すべき試料（被検試料）中から精製ＤＮＡ試料を得る。【０２８１】
別に、ＤＮＡシンセサイザーを用いてホスホアミダイト法にて、12Fw_1（配列番号１４で表される配列からなるオリゴヌクレオチド）及び12Rv_1（配列番号１５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）を合成する。【０２８２】
各0.1〜2μM、好ましくは各１μMのプライマー12Fv_1及びプライマー12Rv_1、1.0〜4.0mM MgCl2、KCl、BSA、コール酸ナトリウム、0.005〜0.2%ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、夫々0.1〜0.6mM程度のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及び10〜80単位/mlのTaq DNA ポリメラーゼを含有する10mM Tris-HCl（pH8.9）緩衝液を調製し、ＰＣＲ用反応液とする。【０２８３】
ＰＣＲ用反応液に精製ＤＮＡ試料を添加したものをＰＣＲ用試料として用い、ＤＮＡサーマルサイクラーにて、20〜40回ＰＣＲを行う。得られたＰＣＲ後の反応液を、１.５％アガロースゲル電気泳動する。次いでエチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検出する。また、分子量マーカーも反応液と同時に泳動し、相対泳動度の比較により、検出されたＤＮＡ断片の長さを算出する。フォワードプライマーとして12Fw_1（配列番号１４で表される配列を持つ。）、及びリバースプライマーとして12Rv_1（配列番号１５で表される配列を持つ。）を用いたＰＣＲでは、Ｍ.アビウムの塩基配列中の150塩基対のＤＮＡ断片（配列番号２８で表される配列を持つ。）が複製されると予測される（表３参照）。そこで、150塩基対の大きさの蛍光バンドが確認された場合に、被検試料はＭ.アビウム陽性と判定すればよい。【０２８４】
また本発明は、核酸増幅工程において、ＲＮＡ転写産物を利用した検出法を適用する事ができる。例えば、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）法（特許第2650159号）、３ＳＲ（self-sustained sequence replication）法（特公平7-114718号）、ＴＡＳ（transcription based amplification system）法（特表平2-500565号：国際公開WO88/10315号）、ＴＭＡ（transcription mediated amplification）法（特開平11-46778号）などが挙げられる。中でも逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼの協奏的作用（逆転写酵素及びＲＮＡポリメラーゼが協奏的に作用するような条件下で反応させる。）を利用する一定温度核酸増幅法は、測定系を自動化する場合には適した方法である。【０２８５】
(Ａ−４)標識プライマーを用いた核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を測定する方法、【０２８６】
（Ａ−４）の方法としては、本発明のプライマーを上記した方法で標識した標識プライマーを用い、被検試料中の核酸を鋳型として用いてＰＣＲ等の核酸増幅反応を行い、得られたプライマー伸長産物の標識を検出・測定し、標識を検出できた場合には、その被検試料はＭ.アビウム陽性であると判定する方法が挙げられる。【０２８７】
この方法に用いられるフォワードプライマー及びリバースプライマーとしては、上記のＰＣＲ法において用いられるものが挙げられ、その好ましい具体例及び好ましい組合せも上記したとおりである。【０２８８】
上記方法の場合、核酸増幅反応を行ったのち、遊離の標識プライマーを除き、プライマー伸長産物の標識を測定し、標識を検出できた場合に、被検試料はＭ.アビウム陽性であると判定される。【０２８９】
遊離の標識プライマーを除く方法としては、核酸増幅反応反応を行って得られた反応物中のプライマー伸長産物を、核酸を沈殿させる常法（エタノール沈殿法、イソプロパノールを用いた沈殿法等）により沈殿させた後、沈殿しなかった遊離の標識プライマーを含有する上清を除去する方法等が挙げられる。【０２９０】
また、核酸増幅反応を行って得られた反応物を適当な条件下、ゲルクロマトグラフィーで処理して、プライマー伸長産物と遊離の標識プライマーを分離する方法、電気泳動法により分離する方法等も挙げられる。【０２９１】
（Ｂ）本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして用いる方法、【０２９２】
更に、本発明のＭ.アビウムの検出方法として、本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして用い、該標識プローブを試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせ、遊離の標識プローブを除いた後、ハイブリダイズした複合体の標識を検出する方法が挙げられる。【０２９３】
具体的には、例えば下記のような方法が挙げられる。【０２９４】
（Ｂ−１）本発明のオリゴヌクレオチドを固相担体に結合させたものを捕捉プローブとして用い、被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、試料中のＭ.アビウム由来の核酸を固相上に固定化させる検出法（例えば、特開昭62-265999号の記載参照）。この場合、本発明のオリゴヌクレオチドあるいは固相担体が、標識物質で標識されていてもよい。【０２９５】
（Ｂ−２）標識されていない(B-1)の捕捉プローブと、本発明のプローブを標識した標識プローブを用い、被検試料中の核酸とハイブリダイゼーションさせて、固相担体上に補足プローブとＭ.アビウム由来の核酸と標識プローブの複合体を形成させて、標識プローブの標識を測定するサンドイッチアッセイ（例えば、特開昭58-40099号の記載参照）を行う方法。【０２９６】
（Ｂ−３）ビオチンで標識した本発明のプローブを用い、試料中の核酸とハイブリダイゼーション後、試料中のＭ.アビウム由来の核酸をアビジン結合担体で捕捉する方法。【０２９７】
尚、本発明のＭ.アビウムの検出方法に用いられる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を阻害しないものを用いることができる。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。【０２９８】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲ等の核酸増幅反応やハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。【０２９９】
また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（エチジウムブロマイド、SYBRTM Greenなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などが用いられる。【０３００】
本発明に係るＭ.アビウム検出用試薬キットとしては、「配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマー（本発明のプライマー）又は／及びプローブ（本発明のプローブ）として含んでなるＭ.アビウム検出用試薬キット。」が挙げられる。【０３０１】
上記キットを構成する本発明のプライマー及び本発明のプローブの具体例は、上記した「本発明のプライマー」、「本発明のプローブ」についての説明に記載したとおりである。【０３０２】
本発明のプライマーは標識物質で標識されたものであってもよい。その標識物質の具体例は上記したとおりである。【０３０３】
本発明のプライマーを含んでなるキットには、フォワードプライマーとリバースプライマーの一組のプライマーを含む組成も含まれる。その例を下記表５にまとめて示す。【０３０４】
例えば、下記表５において、番号１のキットとは、「(a)配列番号６で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号６で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーと、(b)配列番号７で表される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号７で表される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマー、を構成試薬として含んでなるもの。」である。【０３０５】
【表５】
2008075520.tif 000006
【０３０６】
更に好ましいプライマー、及びその組み合わせは、上記した核酸増幅法の説明に記載したとおりである。【０３０７】
また、上記キットは、更に、本発明のオリゴヌクレオチドを標識物質で標識したものを標識プローブとして含んでいてもよい。【０３０８】
更に、「配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列の一部若しくは全部、又は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５及び配列番号１３６から選択される塩基配列に対する相補配列の一部若しくは全部を含有し、且つＭ.アビウム遺伝子の塩基配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（本発明のオリゴヌクレオチド）をプローブとして含んでなるＭ.アビウム検出用試薬キット。」が挙げられる。該プローブは標識物質で標識されたものであってもよい。【０３０９】
これらのキットを構成する構成試薬の好ましい態様及び具体例は上記したとおりである。【０３１０】
尚、本発明のＭ.アビウムの検出用試薬キットには、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害せず、ＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を阻害しないものが含まれていてもよい。また、その濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。【０３１１】
緩衝液の具体例を挙げると、例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等、通常のＰＣＲやハイブリダイゼーション反応を実施する場合に用いられている緩衝液は全て挙げられ、そのpHも特に限定されないが、通常5〜9の範囲が好ましい。【０３１２】
また、必要に応じて核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素など）、酵素に応じた基質（ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰなど）、また二本鎖インターカレーター（SYBRTM Green、エチジウムブロマイドなど）あるいはFAMやTAMRA等の標識検出物質などを含んでいてもよい。【０３１３】
以下に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。【０３１４】
尚、実施例で用いられる細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。
【実施例】
【０３１５】
実施例１．Ｍ.アビウムゲノム由来のクローンの選択１
（１）Ｍ.アビウム由来ＤＮＡ試料の調製
Mycos Research社（米国）より、高純度に精製されたMycobacterium avium TMC16741株由来のgenomic DNAを入手した。【０３１６】
入手したＭ.アビウム由来genomic DNA 試料1〜10ngを材料（鋳型）として用い、Genomiphi V2 DNA Amplification Kit（ＧＥ ヘルスケア バイオサイエンス社製）を使用して全ゲノム増幅反応を行い、100μg以上の増幅産物を得た。この増幅産物を、「Ｍ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡ」として、以下の実験に使用した。尚、得られたＭ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡは、吸光度測定レベルでの純度が良好であることを確認している。【０３１７】
また、このＭ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡを、最終400ng／μl（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製したものを、「Ｍ.アビウム由来ＤＮＡ試料」として用いた。【０３１８】
（２）Whole Genome Shotgun Libraryの作製
上記(1)で得られたＭ.アビウム由来ＤＮＡ試料24μgを材料として用い、以下の方法（Science. 2001 Feb 16;291(5507):1304-1351 Venter et al.に記載のWhole Genome Shotgun法を改変）で、Whole Genome Shotgun Libraryの作製を行った。【０３１９】
まず、終濃度20%のグリセロール存在下で、Ｍ.アビウム由来ＤＮＡ試料を5kPa〜9kPaの圧力下、ネビュライザー（インビトロジェン社製）を用いて、約10分間処理して、Ｍ.アビウム由来ＤＮＡ試料を断片化した。この処理によりで、目的とする500〜1000bpのサイズの画分（ＤＮＡ断片）を効率よく回収する事ができた。得られた画分を(株)キアゲン製の抽出カラムを利用して精製した。【０３２０】
次に、タカラバイオ社製のDNA Blunting Kitを用い、T4 DNA Polymeraseの5'→3'polymerase活性と3'→5'exonuclease活性を利用して、得られたＤＮＡ断片の末端を平滑化した。このＤＮＡ断片と、平滑末端処理済みpBSII sk+ベクター(Stratagene社)とでライゲーション反応を行い、ＤＮＡ断片をpBSII sk+ベクター（ampｒ）に組み込んだ組み換えＤＮＡを作製した。【０３２１】
タカラバイオ社製E. coli JM109 Competent Cellsを用い、その製品プロトコールに従って、上記で得られた組み換えＤＮＡを用いてE. coli JM109 Competent Cellsの形質転換を行った。得られた形質転換体を100μg/mlのアンピシリン、0.2 mM IPTG、40μg/ml X-Galを含むLB-寒天培地で培養した。白色コロニーをピックアップし、「目的のＤＮＡ断片を組み込んだ組み換えＤＮＡ」が導入された、形質転換体のLibrary（Ｍ.アビウム由来ゲノムのWhole Genome Shotgun clone Library）を得た。【０３２２】
（３）マイクロアレイ作製
上記(2)で得られた形質転換体のlibrary（Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun clone Library）を用い、下記の方法でＰＣＲを行って、スライドガラス上に固定するプローブ材料を調製した。【０３２３】
まず、各１μMのプライマーM13 Primer M1(タカラバイオ社製)及びプライマーM13 Primer RV(タカラバイオ社製)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% Triton X-100（トリトンX-100、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社商品名）、夫々0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP及びTaq DNA ポリメラーゼ（(株)ニッポン・ジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl緩衝液（pH8.9）を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０３２４】
上記(2)で得られた形質転換体（Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun clone ）のそれぞれから、常法に従いＤＮＡを精製した。この精製したＤＮＡ（テンプレートとなる）をＰＣＲ用反応液20μlに懸濁添加したものを調製し、ＰＣＲ用試料とした。このＰＣＲ試料を用い、MJ Research社のＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）を使用して、下記の反応条件で30サイクル ＰＣＲを行った。【０３２５】
ＰＣＲ反応条件：
熱変性： ９４℃、０．５分
アニーリング：５５℃、１分
重合反応： ７５℃、０．５分。【０３２６】
得られたＰＣＲ増幅産物を精製後、固定化Buffer（終濃度3x SSC）と混合した。【０３２７】
スポットされるＰＣＲ増幅産物の終濃度が300ng/μLとなるように調整し、装置内の湿度を55%に設定したタイピング用装置（GTMAS Stamp II; 日本レーザ電子社製）を使用し、スライドガラス（CMT GAPS-II; Corning社製）上に、上記で得られたＰＣＲ産物をスポットした（スポット径150-250μm）。スポットが終了したスライドガラスをUVクロスリンカー（UV Stratalinker1800; Stratagene社製）に移し、150mJ/cm2のUV照射を行なって、ＰＣＲ増幅産物（目的のＤＮＡ）をスライドガラス上に固定化し、マイクロアレイ（Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun clone Libraryを材料としたマイクロアレイ、合計1600クローン）を作製した。【０３２８】
（４）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
ｉ）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
BioPrime DNA labeling system（インビトロジェン社製）を利用し、標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識を行った。【０３２９】
まず、上記(1)で得られたＭ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡ 2μgに、製品中のrandom primer solution 20μLを混合した後、熱変性（９５℃、5分間）処理を行い、サンプル溶液を得た。別に、Ｍ.イントラセルラー（ATCC 13950）から常法によりゲノムＤＮＡを抽出・精製し（対照用ゲノムＤＮＡ）、同様に処理を行い、サンプル溶液を得た。【０３３０】
次いで、得られたサンプル溶液夫々に、0.1M DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP（各5ｍM）の混合液 2μl、2.5ｍM dTTP 0.8μl、5ｍM Ha-dUTP 1.6μl、Klenow酵素(40U/μL) 1μlを添加し、total volume=50μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、37℃で3時間の伸長反応を行った。マイクロコンYM-30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5ml チューブにセットし、上記で得られた反応産物をカラムにのせ、14,000rpm で4 分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。【０３３１】
乾燥させた上記反応産物に50ｍM NaHCO3 を10μl 加え混合し、2〜3 分常温で静置した（以下、「反応産物溶液」と称する。）。【０３３２】
別に、１mg のCy5（アマシャムバイオサイエンス株式会社）またはCy3（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を105μl のDMSO に溶かしたものを調製した（Cy-dye Solution Cy3、Cy-dye Solution Cy5）。このCy-dye Solution Cy5 10μl をＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡを用いて得られた上記反応産物溶液に加え、同様に40℃で60 分インキュベート（遮光）した。また、Cy-dye Solution Cy3 10μl を対照用ゲノムＤＮＡ(Ｍ.イントラセルラー由来)を用いて得られた上記反応産物溶液に加え、40℃で60 分インキュベート（遮光）した。【０３３３】
さらに、インキュベート後の、夫々の上記反応産物溶液に、4M NH2OH（使う直前に作成する）を10μl 加え、攪拌後、15 分インキュベート（遮光）を行い、夫々の標識産物、すなわちＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡをCy5で標識した標識産物、及びＭ.イントラセルラー由来ゲノムＤＮＡをCy3で標識した標識産物を得た。【０３３４】
マイクロコンYM-30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5ml チューブにセットし、上記で得られた各ゲノムＤＮＡの標識産物をカラムにのせ、14,000rpmで４分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。【０３３５】
iｉ）標識産物の断片化工程
上記(4) i)で得られた乾燥状態の各ゲノムＤＮＡの標識産物に対して、終濃度が0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液40μLを調製したものを加え、懸濁混和させた。次いで94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base の、各ゲノムＤＮＡの標識産物の、断片化生成物を得た。【０３３６】
なお、BcaBEST DNA Polymerase（タカラバイオ社製）及びrBst DNA Polymerase（EPICENTRE社製）を用いてラベル化効率（base／dye）を調べた結果、Cy3標識の実験結果では、Ｍ.イントラセルラー由来の対照用ゲノムを材料とした標識産物（ＤＮＡフラグメント）の約２８塩基にdye １分子が取り込まれていることを確認している。また、Cy5標識の実験結果では、Ｍ.アビウム由来ゲノムを材料とした標識産物（ＤＮＡフラグメント）ＤＮＡの約３６塩基にdye １分子が取り込まれていることを確認している。【０３３７】
得られたCy5標識産物溶液及びCy3標識産物溶液の各々をマイクロコンYM-10（ミリポア社製）の限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分遠心した後、濃縮液を同一のマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。次いで、このマイクロチューブに以下の試薬を加え、懸濁混和させ、標識産物の乾燥物を溶解させた。以上の操作により、Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡCy5標識産物の断片化生成物と、Ｍ.イントラセルラー由来の対照用ゲノムＤＮＡCy3標識産物の断片化生成物との、Cy3Cy5標識産物混合溶液が得られた。【０３３８】
ArrayHyb Hybridization buffer（SIGMA社製）；40μL
salmon sperm DNA（10mg/mL）            ；0.5μL
formamide                              ；5μL
Total 40〜50μL
得られたCy3Cy5標識産物混合溶液を95℃で5 分インキュベートし、ハイブリダイゼーションまで70℃に保っておいた。【０３３９】
（５）マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション
上記(3)の工程で得られた、Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun clone Libraryのマイクロアレイ上に、上記(4)ii)で調製したCy3Cy5標識産物混合溶液を全てのせ、気泡が入らないようにカバーガラスをかぶせた。これをハイブリカセットにセットし、タッパーに蒸留水で湿らせたキムタオルをひいたものの上にのせて密閉し、遮光下に65℃で8 時間以上反応させてハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、マイクロアレイをカバーグラスごと2×SSC-0.1%SDS 溶液に室温で浸し、溶液中でマイクロアレイを静かに揺らしてカバーグラスをはずした。次いで1×SSC、0.03％SDS溶液（60℃）で10 分間洗浄、 0.2×SSC 溶液（42℃）で10 分間洗浄、0.05×SSC溶液（室温）で10 分間洗浄した後、新しい乾いたラックにマイクロアレイをすばやく移し、すぐに800prm で5 分間遠心を行って乾燥させた。【０３４０】
（６）蛍光強度の測定：シグナル検出から数量化まで
蛍光読み取りスキャナー GenePix 4000B(Axon Instruments Inc.製)を用いて、上記(5)で得られた、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定した。この際、Cy3標識産物とCy5標識産物の競合ハイブリダイゼーションの結果を解析するため、２チャンネル、すなわち2ch(Cy3、Cy5)での蛍光を検出した。【０３４１】
蛍光シグナル（蛍光検出データ）の数量化は日立ソフト社製のDNASISTM-Array（ＤＮＡチップ発現イメージ解析ソフトウェア）を用い、ソフトの操作手順に従って、スポット自動認識、バックグラウンド計算、蛍光強度比の正規化を行った。また、信頼性限界ラインを定め、それ以下の領域のデータは扱わないようにして、正規化され信頼性のある蛍光強度（比）を求めた。【０３４２】
さらに、マイクロアレイ上で検出されたCy3/Cy5の蛍光強度比（Ratio）を基に、常法に従い、散布図(スキャッタープロット)解析を行った。【０３４３】
すなわち、あるマイクロアレイ上のスポットのCy3に対するCy5の蛍光強度比が高い場合には、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Cy5標識産物、即ちＭ.アビウム由来のゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズしたことを示す。他方、あるスポットのCy3に対するCy5の蛍光強度比が低い場合は、そのスポットのＤＮＡ断片は、Ｍ.アビウム由来のゲノムＤＮＡに対する特異性が低く、Cy3標識産物、すなわちＭ.イントラセルラー由来の対照用ゲノムＤＮＡとの交叉反応が観察された（Ｍ.イントラセルラー由来の対照用ゲノムＤＮＡとハイブリダイズした）ことを示す。【０３４４】
この方法で、マイクロアレイの全てのスポットの蛍光強度比を算出した。そして、蛍光強度が高く、且つCy3に対するCy5の蛍光強度比が高いスポットを選択した。【０３４５】
その結果、Ｍ.アビウム由来のゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズした２４クローンを、候補クローンとして選択した。【０３４６】
（７）候補クローンの塩基配列決定
次に、上記(6)で選択された候補２４クローンについて、下記の方法で塩基配列決定を行った。【０３４７】
すなわち、Big Dye Terminatorキット（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、製品プロトコールに従い以下の手順でシークエンス解析を行った。【０３４８】
候補ＤＮＡ（候補クローン）      ；2μL(100ng)
M13 Primer M1              ；1μL(5pmol)
premix                     ；8μL
上記の混合物に、総volume=20μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、MJ Research社のＤＮＡサーマルサイクラー（DNA Engine PTC200）を使用して、下記の反応条件で30サイクルのＰＣＲを行った。
96℃ 2 min → (96℃ 10sec→50℃ 5sec→60℃ 4min)×25 →4℃【０３４９】
得られたＰＣＲ産物をQIAGEN社製ゲルろ過カラムで精製後、MJ Research社製のシークエンサー（BaseStation）を用い、機器付属の手順書に従い候補クローンの塩基配列すべてのシークエンス（塩基配列）解読を完了した。【０３５０】
得られた結果をデータベース（NCBI BLAST及びCHEMICAL ABSTRACT）で検索した結果、データベース上では候補の２４クローンの塩基配列は、未登録の新規な配列であることが推定できた。【０３５１】
実施例２．候補クローン１３のＭ.アビウム特異性評価
（１）本発明のプライマーの合成
まず、上記した実施例１で決定された候補の２４クローンのうち、候補クローン１３のシークエンス（塩基配列）の解析結果に基づき、その候補配列１３から、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてＰＣＲに用いるためのプライマー配列、すなわち「5'−AAGGCTCATGGCTACCAAGTC−3'」（配列番号１４。以下、12Fw_1と呼ぶ）、及び「5'−TGGCCGAGTTCGTGATTCT−3'」（配列番号１５。以下、12Rv_1と呼ぶ）を設計した。【０３５２】
尚、シークエンスの解析結果から得られた、候補クローン１３の塩基配列は、配列番号４で表されるものである。また、そのクローンＩＤ番号をR11_2dと付番した（発明者が命名した。以下同じ）。【０３５３】
次に、ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、設計したオリゴヌクレオチドを合成した。合成はＡＢＩ社マニュアルに従った。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液を５５℃で一夜加熱することにより実施した。【０３５４】
次いでファルマシア社製ＦＰＬＣを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、合成オリゴヌクレオチドを精製した。この合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。【０３５５】
（２）ＤＮＡ試料の調製
以下に示す各細菌のＤＮＡ試料を、それぞれ下記の方法で調製した。【０３５６】
ａ：Escherichia coli （E. coli、大腸菌）（ATCC11775）
ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）（TMC102[H37Rv]）
ｃ：Mycobacterium kansasii（Ｍ.カンサシ）（ATCC12478）
ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）（ATCC927）
ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）（ATCC25275）
ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）（ATCC19981）
ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）（ATCC14470）
ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）（ATCC35799）
ｉ：Ｍ.アビウム（TNC16741）
ｊ：Ｍ.イントラセルラー（マイコバクテリウム・イントラセルラー）（ATCC13950）
ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）（ATCC15754）
ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）（ATCC19250）
ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）（ATCC19530）
ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）（ATCC15755）
ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）（ATCC23292）
ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）（ATCC6841）
ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）（ATCC35752）
ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）（ATCC19977）
ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）（ATCC14467）【０３５７】
まず、Mycobacterium tuberculosisとＭ.アビウムは、Mycos Research, LLCから精製ゲノムＤＮＡを入手し、それを精製ＤＮＡとして用いた。【０３５８】
それ以外の細菌については、American Type Culture Collection （ATCC）から菌株を入手し、下記の方法でＤＮＡを抽出・精製した。細菌はいずれも臨床分離株であり、培養後、コロニーの形状や従来の各種生化学的試験などによって菌種がすでに鑑別されているものである。【０３５９】
すなわち、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌については、まず、小川培地上のコロニーを精製水に懸濁し、オートクレーブ処理（１２０℃・２気圧、２０分）した。次いで菌体を粉砕処理（直径2mmガラスビーズによる物理的破砕）した後、遠心分離し、上清を得た。得られた上清から、(株)キアゲン製のイオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic-tipを用いてＤＮＡの抽出、精製を行った。【０３６０】
また、大腸菌については、大腸菌のＤＮＡ抽出方法の常法に従い、ＤＮＡを抽出、精製した。【０３６１】
得られたそれぞれの精製ＤＮＡを、最終１ng／μl（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、ＤＮＡ試料とした。【０３６２】
（３）リアルタイムＰＣＲ
上記(1)で設計、合成した12Fw_1をフォワードプライマーとして、12Rv_1をリバースプライマーとして用い、下記の通りＰＣＲを行った。【０３６３】
ｉ）ＰＣＲ用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマー12Fw_1及び12Rv_1を各300nM、SYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)を原液の30倍希釈（最終濃度は原液の30000倍希釈）、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX-100、それぞれ0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０３６４】
ｉｉ）リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲにおける増幅ターゲットとなる鋳型ＤＮＡとして、上記(2)で調製した各マイコバクテリウム属細菌由来又は大腸菌由来のＤＮＡ試料を用い、以下の通り、インターカレーション法によるリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光の定量モニタリングを行った。【０３６５】
まず、上記(3)i)で調製したＰＣＲ用反応液20μlに、上記(2)で調製したＤＮＡ試料１μL（１ng）を添加し、ＰＣＲ用試料とした。【０３６６】
そのＰＣＲ用試料を、９６ 穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、TaqManTM ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（ABI 7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。すなわち、９５℃ で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃ で１分間の反応を４０サイクル繰り返し、プライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBRTM Green Iの蛍光強度を測定した。【０３６７】
尚、フォワードプライマー12_Fw1、及びリバースプライマー12_Rv1を用いた上記のリアルタイムＰＣＲにより、鋳型として用いたＤＮＡ試料中に候補クローン１３の塩基配列が存在すれば、Ｍ.アビウムゲノムＤＮＡ中に存在する候補クローン１３の塩基配列中の、配列番号２８で表される配列（１５０塩基対）のＤＮＡ断片が複製され、蛍光が検出されると予測される。【０３６８】
（４）融解曲線解析
各ＤＮＡ試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。【０３６９】
（５）結果
各ＤＮＡ試料について得られた融解曲線解析の結果を１つのグラフにまとめて、図１に示す。【０３７０】
図１の結果から明らかな如く、本発明のプライマー12_Fw1、及びプライマー12_Rv1を用いて、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、Ｍ.アビウム由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光が確認でき（図１：M.avium）、陽性と判定できた。【０３７１】
これに対し、図１から明らかな如く、Ｍ.アビウム以外のマイコバクテリウム属細菌や他の属の細菌である大腸菌由来のＤＮＡを鋳型として用いて、同じプライマーの組合せを用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行った場合には、該当する蛍光が確認できず（図１：other species）、すべて陰性と判定できた。【０３７２】
更に、図１から明らかな如く、Ｍ.アビウム由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた場合の融解曲線解析の結果、単一の明瞭なピークが得られたことから、行った検出法は、Ｍ.アビウムに極めて特異性の高い、検出方法であることが判る。【０３７３】
以上のことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲに用いることにより、Ｍ.アビウムを特異的に検出することが出来ることが判る。また、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、細菌を単離する必要がなく、臨床材料をそのまま検出に用いることが可能であるため、従来の細菌を培養してから検出する方法では培養に数週間かかっていたＭ.アビウムの検出を、長くても１日以内に終わらせることができることが判る。【０３７４】
実施例３．その他の候補クローンのＭ.アビウム特異性評価１
（１）本発明のプライマーの合成
実施例１で決定された候補の２４クローンのうち、候補クローン０８のシークエンス（塩基配列）の解析結果に基づき、その候補配列０８から、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてＰＣＲに用いるためのプライマー配列、すなわち「5'−cattgtgcgctgcttatgac−3'」（配列番号６。以下、003Fw_1と呼ぶ）及び「5'−gaagtgaatcggccttgct−3'」（配列番号７。以下、003Rv_1と呼ぶ）を設計した。【０３７５】
尚、シークエンスの解析結果から得られた、候補クローン０８の塩基配列は、配列番号１で示されるものである。また、そのクローンＩＤ番号をR07_12qと付番した。【０３７６】
次いで、実施例２(1)と同じ機器を用い、同様の方法で、設計したリゴヌクレオチドを合成・精製した。この合成オリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして用いた。【０３７７】
同様の方法で、他の候補クローンの塩基配列をもとに、下記のプライマーを設計した。【０３７８】
(i)候補配列０９（配列番号２、クローンＩＤ番号 R07_7a）をもとに、「5'−tgcaggtcgtgtagtcctc−3'」（配列番号１０、以下、「007Fw_1」と呼ぶ）及び「5'−aaggtcgagttgcgcttg−3'」（配列番号１１、以下、「007Rv_1」と呼ぶ）を設計した。【０３７９】
(ii)候補配列１２（配列番号３、クローンＩＤ番号 R11_12b）をもとに、「5'−accagttgatgttgccttcc−3'」（配列番号１２、以下、「11Fw_1」と呼ぶ）及び「5'−tctcgatcttcaccgtcagtt−3'」（配列番号１３、以下、「11Rv_1」と呼ぶ）を設計した。【０３８０】
(iii)候補配列１３（配列番号４、クローンＩＤ番号 R11_2d）をもとに、「5'−acctcaacccaggctacaga−3'」（配列番号１６、以下、「12Fw_4」と呼ぶ）及び「5'−gaataagggaaagtgcatacga−3'」（配列番号１７、以下、「12Rv_4」と呼ぶ）を設計した。【０３８１】
(iv)候補配列２２（配列番号５、クローンＩＤ番号 R16_6h）をもとに、「5'−agggcgaacaaaacgatctac−3'」（配列番号２２、以下、「04Fw_1」と呼ぶ）及び「5'−cccaaaacaacttctgcctct−3'」（配列番号２３、以下、「04Rv_1」と呼ぶ）を設計した。【０３８２】
次いで、実施例２(1)と同様の方法で、設計した各オリゴヌクレオチドを合成・精製した。この合成オリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして用いた。【０３８３】
（２）ＤＮＡ試料の調製
実施例２(2)で用いたのと同じ細菌を用い、実施例２(2)と同様の方法で、ＤＮＡ試料を調製した。【０３８４】
（３）リアルタイムＰＣＲ
上記（１）で設計、合成したプライマーを、下記表６の組み合わせで用いる以外は、実施例２(3)と同様の方法で、リアルタイムＰＣＲを行った。【０３８５】
【表６】
2008075520.tif 000007
【０３８６】
（４）融解曲線解析
実施例２(4)と同様の方法で、各ＤＮＡ試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。【０３８７】
（５）結果
実施例２と同様に、本発明のプライマーを用いて、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、表６記載のどのプライマーの組み合わせを用いた場合でも、Ｍ.アビウム由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いてリアルタイムＰＣＲを行った場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光が確認でき、陽性と判定できた。【０３８８】
これに対し、Ｍ.アビウム以外のマイコバクテリウム属細菌や他の属の細菌である大腸菌由来のＤＮＡを鋳型として用いて、表２記載のどの同じプライマーの組合せを用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行った場合にも、該当する蛍光が確認できず、すべて陰性と判定できた。【０３８９】
更に、Ｍ.アビウム由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた場合の融解曲線解析の結果、実施例２の場合と同様、単一の明瞭なピークが得られたことから、行った検出法は、Ｍ.アビウムに極めて特異性の高い、検出方法であることが分かる。【０３９０】
以上のことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲに用いることにより、Ｍ.アビウムを特異的に検出することが出来ることが判った。また、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、細菌を単離する必要がなく、臨床材料をそのまま検出に用いることが可能であるため、従来の細菌を培養してから検出する方法では培養に数週間かかっていたＭ.アビウムの検出を、長くても１日以内に終わらせることができる。【０３９１】
実施例４．その他の候補クローンのＭ.アビウム特異性評価２
（１）本発明のプライマーの合成
実施例１で決定された候補の２４クローンのうち、候補クローン１０のシークエンス（塩基配列）の解析結果に基づき、その候補配列１０から、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いてＰＣＲ増幅検出のためのプライマー配列、すなわち「5'−caccggccaatccctaac−3'」（配列番号６７。以下、RE10Fw_02と呼ぶ）及び「5'−agcgcgatgcgtagttcc−3'」（配列番号６８。以下、RE10Rv_02と呼ぶ）を設計した。【０３９２】
尚、シークエンスの解析結果から得られた、候補クローン１０の塩基配列は、配列番号３９で示されるものである。【０３９３】
次いで、実施例２(1)と同じ機器を用い、同様の方法で、設計したリゴヌクレオチドを合成・精製した。この合成オリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして用いた。【０３９４】
同様の方法で、他の候補クローンの塩基配列をもとに、プライマーを設計した。【０３９５】
各候補配列の名称（番号）、その候補配列の塩基配列の配列番号、その候補配列をもとに設計したプライマーの名称（発明者が命名した。以下同じ。）及びその塩基配列の配列番号、続いて行うＰＣＲにおいて用いたフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを表７に併せて示す。また、各候補配列のクローンID番号を、候補配列の名称の下に、（  ）内に示す。【０３９６】
【表７】
2008075520.tif 000008
【０３９７】
次いで、実施例２(1)と同様の方法で、設計した各オリゴヌクレオチドを合成・精製した。この合成オリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして用いた。【０３９８】
（２）ＤＮＡ試料の調製
実施例２(2)で用いたのと同じ細菌を用い、同様の方法で、ＤＮＡ試料を調製した。【０３９９】
（３）リアルタイムＰＣＲ
上記（１）で調製したプライマーを、上記表７の組み合わせで用いる以外は、実施例２(3)と同様の方法で、リアルタイムＰＣＲを行った。【０４００】
（４）融解曲線解析
実施例２(4)と同様の方法で、各ＤＮＡ試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。【０４０１】
（５）結果
実施例２と同様に、本発明のプライマーを用いて、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、表７記載のどのプライマーの組み合わせを用いた場合でも、Ｍ.アビウム由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いてリアルタイムＰＣＲを行った場合、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認でき、陽性と判定できた。【０４０２】
特に、下記表８のプライマーの組み合わせを用いたリアルタイムＰＣＲが、Ｍ.アビウムに対する特異性が高いという結果が得られた。【０４０３】
【表８】
2008075520.tif 000009
【０４０４】
尚、Ｍ.アビウム 104（Kathleen L.Horan, et al., J. Clin. Microbiol., vol.44, No.3, pp.783-789、2006）の全ゲノム配列が、2006年12月12日に大学共同利用機関法人 情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所 日本ＤＮＡデータバンクのDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のWeb上で公開された。【０４０５】
そこで、実施例４で用いたプライマー及び実施例４で得られた伸長産物の塩基配列を、このMycobacterium avium 104の全ゲノム配列と比較したところ、特に下記表９に記載したプライマー対の伸長産物に、Ｍ.アビウム 104の全ゲノム配列とマッチングしている部位があることが判った。このことから、本発明に係る候補配列をターゲットとして利用すれば、Ｍ.アビウム種の広範な検出を行えることが示唆された。【０４０６】
【表９】
2008075520.tif 000010
【０４０７】
以上のことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲに用いることにより、Ｍ.アビウムを特異的に検出することが出来ることが判った。また、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、細菌を単離する必要がなく、臨床材料をそのまま検出に用いることが可能であるため、従来の細菌を培養してから検出する方法では培養に数週間かかっていたＭ.アビウムの検出を、長くても１日以内に終わらせることができる。【０４０８】
実施例５．最小検出感度試験１
リアルタイム検出法を利用し、候補配列１３をターゲットとした場合の検出感度の検定を行った。【０４０９】
（１）本発明のプライマーの合成
実施例２（1）と同じ機器を用い、同様の操作で12Fw_1、及び12Rv_1のオリゴヌクレオチドを合成した。これをプライマーとして用いた。【０４１０】
（２）ＤＮＡ試料の調製
Mycos Research社（米国）より、高純度に精製されたＭ.アビウム由来のgenomic DNAを入手した。これを10mM Tris-HCl緩衝液に溶解し、吸光度を測定して試料中のＤＮＡ量を測定した。得られたＤＮＡ量を、濃度既知のＭ.アビウムのゲノムＤＮＡを試料として同様に吸光度を測定して得られた測定値と比較することにより、試料中のゲノムＤＮＡ量（ゲノムコピー数）を決定した。【０４１１】
次いで10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9を用いてＤＮＡ試料を105, 104, 103, 102, 10, 5, 2.5コピー/μLの希釈系列に希釈したものを調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。【０４１２】
（３）リアルタイムＰＣＲ
ｉ）ＰＣＲ用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマー12_Fw1及びプライマー12_Rv1を各300nM、SYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)を原液の30倍希釈（最終濃度は原液の30000倍希釈）、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX-100、各0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０４１３】
ｉｉ）リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲにおける増幅ターゲットとなる鋳型ＤＮＡとして、上記(2)で調製したＭ.アビウム由来のＰＣＲ用ＤＮＡ試料を用い、以下の通り、インターカレーション法によるリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光の定量モニタリングを行った。【０４１４】
まず、上記(3)i)で調製したＰＣＲ用反応液２０μＬに、上記(2)で調製したＰＣＲ用ＤＮＡ試料１μＬ（１ng）を添加し、ＰＣＲ用試料とした。【０４１５】
そのＰＣＲ用試料を、９６ 穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、TaqManTM  ＰＣＲ 専用サーマルサイクラー・検出器（ABI 7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製） を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。すなわち、９５℃ で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃ で１分間の反応を４０サイクル繰り返し、プライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBRTM Green Iの蛍光強度を測定した。【０４１６】
尚、蛍光強度は、測定に供した９６穴反応プレート１プレート毎に、測定に用いたサーマルサイクラーの、相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。【０４１７】
（４）結果
得られた実験データから、リアルタイムＰＣＲ法において行われている常法に従って、検量線を作成した。【０４１８】
すなわち、各濃度のＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、ＰＣＲのサイクル数（ｘ軸）に対するSYBRTM Green Iの蛍光強度(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成した。次いで、蛍光強度が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引いた。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の蛍光強度が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とした。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とした。得られた検量線を図２に示す。【０４１９】
ｙ＝−３．１７３ｘ＋３３．００
Ｒ２＝０.９９６【０４２０】
以上の結果、まずリアルタイムＰＣＲで蛍光が検出されたことから、本発明に係るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、リアルタイムＰＣＲを行えば、Ｍ.アビウムが検出できることが判った。【０４２１】
また、検量線が作成できたことより、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法によれば、Ｍ.アビウムの定量が可能であることが判った。更に、図２より、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法では、Ｍ.アビウムのゲノムＤＮＡが初期量として２．５コピー存在する条件でもＭ.アビウムの検出が可能である事がわかる。【０４２２】
更に、リアルタイムＰＣＲ法を利用した場合では、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングするので、鋳型ＤＮＡの初期量を正確に定量することができ、Ｍ.アビウムの検出に有効である。【０４２３】
実施例６．
リアルタイムＰＣＲ検出法を利用し、新規候補配列１３（候補クローン１３の塩基配列、配列番号４で表される塩基配列からなる。）をターゲットとした場合のＭ.アビウムの検出を行った。【０４２４】
（１）本発明のＭ.アビウム検出用プライマーの合成
実施例２(1)と同じ機器を用い、同様の操作で12Fw_1（配列番号１４）、及び12Rv_1（配列番号１５）のオリゴヌクレオチドを合成・精製した。【０４２５】
（２）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
実施例２(2)でＭ.アビウム菌体から調製したＤＮＡ試料を用いた。まず、該ＤＮＡ試料について、吸光度を測定して試料中のＤＮＡ量を測定した。得られたＤＮＡ量を、濃度既知のＭ.アビウムのゲノムＤＮＡを試料として同様に吸光度を測定して得られた測定値と量と比較することにより、試料中のゲノムＤＮＡ量（ゲノムコピー数）を決定した。10８コピー／μlのゲノムＤＮＡが得られた。【０４２６】
次いで10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9を用いてＤＮＡ試料を105, 104, 103, 102, 10, 0コピー/μLの希釈系列に希釈したものを調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。【０４２７】
（３）リアルタイムＰＣＲ
ｉ）ＰＣＲ用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマー12_Fw1及びプライマー12_Rv1を各300nM、SYBR Green I (Molecular Probe社)を原液の30倍希釈（x0.3 concentrate、最終濃度は原液の30000倍希釈）、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、それぞれ0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０４２８】
ｉｉ）リアルタイムＰＣＲ
上記(3)ｉ）で得られたＰＣＲ用反応液２０μlに、上記(2)で調製したＰＣＲ用ＤＮＡ試料１μLを添加し、ＰＣＲ用試料とした。【０４２９】
このＰＣＲ用試料を、９６ 穴反応プレート（ マイクロアンプ・オプチカル・９６ ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、ＴａｑＭａｎＴＭ  ＰＣＲ 専用サーマルサイクラー・検出器（ABI7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製） を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。すなわち、95℃ で10分間保温の後、95℃で15秒間、60℃ で１分間の反応を40サイクル繰り返し、プライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBR Green Iの蛍光強度を測定した。【０４３０】
尚、蛍光強度は、測定に供した９６穴１プレート毎に、測定に用いたサーマルサイクラーの、反応プレート相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。【０４３１】
得られた実験データから、リアルタイムＰＣＲ法において行われている常法に従い、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、実施例５(4)と同様の方法で、ＰＣＲのサイクル数（ｘ軸）に対するレポーター色素の発光強度(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成した。【０４３２】
結果を図３に実線で示す。【０４３３】
図３において、(1)〜(6)はそれぞれ以下の場合を示す。【０４３４】
（１）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が105コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（２）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が104コピーで、新規候補配列１３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（３）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が103コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（４）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が102コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（５）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（６）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が0コピーで、新規候補配列1３をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。【０４３５】
比較例１．
公知のプライマー配列を使用し、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとした場合のＭ.アビウムの検出を行った。【０４３６】
（１）公知のＭ.アビウム検出用プライマーの調製
特開平１１−６９９９９号（特許文献１、EP0887425）に開示された公知のＭ.アビウム検出用プライマーMAV19K_F1（配列「5'−cggctgttcgagtggcaacaagtc−3'」、配列番号３５）をもとに、プライマー配列「5'−ctgttcgagtggcaacaagtc−3'」（以下、MAV19K_F1sと呼ぶ。配列番号３３）を設計し、MAV19K_R1（配列「5'−ccgtcgatgatgaccttggtccc−3'」、配列番号３６）をもとに「5'−gtcgatgatgaccttggtcc−3'」（以下、MAV19K_R1sと呼ぶ。配列番号３４）を設計した。【０４３７】
ここで、特開平１１−６９９９９号に開示された公知のＭ.アビウム検出用プライマーであるMAV19K_F1及びMAV19K_R1を以下のＰＣＲにそのまま用いなかったのは、下記の理由による。【０４３８】
すなわち、リアルタイムＰＣＲに使用するプライマーは、あまり長い塩基配列のものは好ましくない。しかし、特開平１１−６９９９９号の出願された当時は、リアルタイムＰＣＲの技術が確立されていなかったことにもよるが、特開平１１−６９９９９号に開示されたプライマーMAV19K_F1及びMAV19K_R1は、リアルタイムＰＣＲに使用するには少し長めで、また、その塩基配列から、このままリアルタイムＰＣＲに使用した場合、プライマー同士がアニールしてプライマーダイマーを形成し、その結果、ＰＣＲ増幅効率の低下を引き起こす等の問題が生じる可能性が高いと考えられた。【０４３９】
そこで、リアルタイムＰＣＲに使用するのに都合のよい長さのプライマーを得るため、本発明者は、特開平１１−６９９９９号に開示されたプライマーMAV19K_F1の塩基配列の5'側の３つの塩基「cgg」を削除した配列であるMAV19K_F1s、及びMAV19K_R1の5'側の２つの塩基「cc」を削除した配列であるMAV19K_R1sを設計した。【０４４０】
実施例２(1)と同じ機器を用い、同様の操作で、設計したMAV19K_F1s（配列番号３３）及びMAV19K_R1s（配列番号３４）のオリゴヌクレオチドを合成・精製した。【０４４１】
（２）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の調製
実施例６で調製したものと同じものを用いた。【０４４２】
（３）リアルタイムＰＣＲ
上記(1)で調製したMAV19K_F1sをフォワードプライマーとして、MAV19K_R1sをリバースプライマーとして用る以外は、実施例６(3)と同様の方法で、リアルタイムＰＣＲを行った。【０４４３】
得られた実験データから、リアルタイムＰＣＲ法において行われている常法に従い、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、実施例５(4)と同様の方法で、ＰＣＲのサイクル数（ｘ軸）に対するレポーター色素の発光強度(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成した。【０４４４】
結果を図３に波線で示す。【０４４５】
図３において、(7)〜(12)はそれぞれ以下の場合を示す。【０４４６】
（７）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が105コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（８）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が104コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（９）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が103コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（１０）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が102コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（１１）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が10コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。
（１２）ＰＣＲ用ＤＮＡ試料中の初期ＤＮＡの濃度が0コピーで、Ｍ.アビウムの１９キロダルトンタンパク質遺伝子領域をターゲットとしてリアルタイムＰＣＲを行った場合。【０４４７】
（４）結果
以上の結果より、本発明のプライマー12Fw_1と12Rv_1を用い、新規候補配列1３をターゲットとしてＭ.アビウムの検出を行った場合（実施例６）と、特開平11-69999号に開示された公知のプライマーを用い、公知のＭ.アビウムの持つ配列をターゲットとした場合（比較例１）で、リアルタイムＰＣＲによるＭ.アビウム検出法を比較した。【０４４８】
図３の結果から明らかなごとく、いずれのＤＮＡ試料（105, 104, 103, 102, 10, 0コピー/μLの希釈系列）を対象とした場合においても、実施例６で得られた増幅曲線の立ち上がりが、比較例１で得られた増幅曲線の立ち上がりと比較して４サイクル程度早いことがわかる。このことから、実施例６の方法は、比較例１の方法と比較して約10〜20倍程度増幅効率の高い検出法であることが考察できる。【０４４９】
以上のことから、本発明のプライマーを用い、本発明の新規候補配列１３をターゲットとした検出方法の方が、公知の特開平11-69999号に記載されたプライマーを用い、公知の配列をターゲットとした場合に比較して、明らかに核酸増幅効率の優れている検出法であることが明らかである。【０４５０】
実施例７．Ｍ.アビウムゲノム由来のクローンの選択２
（１）Ｍ.アビウム由来ＤＮＡ試料の調製
まず、Ｍ.アビウムの基準株であるMycobacterium avium IID 585 （日本細菌学会より分譲された。国立大学法人 東京大学 医科学研究所 感染症国際センター 病原微生物資源室由来）を精製水に懸濁し、オートクレーブ処理（１２０℃・２気圧、２０分）した。次いで、菌体を粉砕処理（直径2mmガラスビーズによる物理的破砕）した後、遠心分離し、上清を得た。得られた上清から、(株)キアゲン製のイオン交換樹脂タイプ ＤＮＡ抽出精製キットGenomic-tipを用いてＤＮＡの抽出、精製を行い、Ｍ.アビウム（Mycobacterium avium IID 585）由来の精製ゲノムＤＮＡを得た。【０４５１】
得られたＭ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡを、最終400ng／μl（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、それを「Ｍ.アビウム由来ＤＮＡ試料」として用いた。【０４５２】
（２）Whole Genome Shotgun Libraryの作製とマイクロアレイの作製
上記(1)で得られたＭ.アビウム由来ＤＮＡ試料24μgを材料として用い、上記実施例１(2)〜(3)と同じ試薬を用い、同様の方法で、Whole Genome Shotgum Libraryの作製、マイクロアレイ（Ｍ.アビウム由来ゲノムのWhole Genome Shotgun clone libraryのマイクロアレイ、合計1000クローン）を作製した。【０４５３】
（３）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
ｉ）標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識
BioPrime DNA labeling system（インビトロジェン社製）を利用し、標的ゲノムＤＮＡの蛍光色素標識を行った。【０４５４】
まず、上記(1)で得られたＭ.アビウム由来精製ゲノムＤＮＡ 2μgに、製品中のrandom primer solution 20μLを混合した後、熱変性（９５℃、5分間）処理を行い、サンプル溶液を得た。別に、Ｍ.イントラセルラー（ATCC 13950）から常法によりゲノムＤＮＡを抽出・精製し（対照用ゲノムＤＮＡ）、同様に処理を行い、サンプル溶液を得た。【０４５５】
次いで、得られたサンプル溶液夫々に、0.1M DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP（各5ｍM）の混合液 2μl、2.5ｍM dTTP 0.8μl、5ｍM Ha-dUTP 1.6μl、Klenow酵素(40U/μL) 1μlを添加し、total volume=50μLとなるように脱イオン化滅菌水を加え、37℃で3時間の伸長反応を行った。マイクロコンYM-30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5ml チューブにセットし、上記で得られた反応産物をカラムにのせ、14,000rpm で4 分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。【０４５６】
乾燥させた上記反応産物に50ｍM NaHCO3 を10μl 加え混合し、2〜3 分常温で静置した（以下、「反応産物溶液」と称する。）。【０４５７】
別に、１mg のAlexa647（インビトロジェン社製）またはAlexa555（インビトロジェン社製）を105μl のDMSO に溶かしたものを調製した（dye Solution Alexa647、 dye Solution Alexa555）。この、dye Solution Alexa647 10μl をＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡを用いて得られた上記反応産物溶液に加え、40℃で60 分インキュベート（遮光）を行った。また、dye Solution Alexa555 10μl を対照用ゲノムＤＮＡ(Ｍ.イントラセルラー由来)を用いて得られた上記反応産物溶液に加え、同様に40℃で60 分インキュベート（遮光）した。【０４５８】
さらに、インキュベート後の、夫々の上記反応産物溶液に、4M NH2OH（使う直前に作成する）を10μl 加え、攪拌後、15 分インキュベート（遮光）を行い、夫々の標識産物、すなわちＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡをAlexa647で標識した標識産物、及びＭ.イントラセルラー由来ゲノムＤＮＡをAlexa555で標識した標識産物を得た。【０４５９】
マイクロコンYM-30（ミリポア社製）の限外ろ過カラムを付属の1.5ml チューブにセットし、上記で得られた各ゲノムＤＮＡの標識産物をカラムにのせ、14,000rpmで４分遠心した後、濃縮液をマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。【０４６０】
ｉｉ）標識産物の断片化工程
上記(3) i)で得られた乾燥状態の各ゲノムＤＮＡの標識産物に対して、終濃度が0.04M Tris-acetate(pH8.1)、0.1M 酢酸カリウム、0.03M酢酸マグネシウム四水和物の組成の溶液40μLを調製したものを加え、懸濁混和させた。次いで94℃で15 分間加熱処理し、100base〜300 base の、各ゲノムＤＮＡの標識産物の、断片化生成物を得た。【０４６１】
なお、間接標識法を利用してラベル化効率（base／dye）を調べた結果、Alexa647に関しては、約100〜200塩基にdye１分子が取り込まれることを確認している。また、Alexa555に関しては、約150塩基にdye １分子が取り込まれることを確認している。【０４６２】
得られたAlexa647標識産物溶液及びAlexa555標識産物溶液の各々をマイクロコンYM-10（ミリポア社製）の限外ろ過カラムにのせ14000rpm で4 分遠心した後、濃縮液を同一のマイクロチューブに回収して、真空乾燥遠心機(CentriVap concentrator; LABCONCO社製)で完全に乾燥させた。次いで、このマイクロチューブに以下の試薬を加え、懸濁混和させ、標識産物の乾燥物を溶解させた。以上の操作により、Ｍ.アビウム由来ゲノムＤＮＡ Alexa647標識産物の断片化生成物と、Ｍ.イントラセルラー由来の対照用ゲノムＤＮＡ Alexa555標識産物の断片化生成物との、Alexa555Alexa647標識産物混合溶液が得られた。【０４６３】
ArrayHyb Hybridization buffer（SIGMA社製）；40μL
salmon sperm DNA（10mg/mL）              ；0.5μL
formamide                                ；5μL
Total 40〜50μL【０４６４】
得られたAlexa555Alexa647標識産物混合溶液を95℃で5 分インキュベートし、ハイブリダイゼーションまで70℃に保っておいた。【０４６５】
（４）マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション
上記(3)の工程で得られたAlexa555Alexa647標識産物混合溶液を用いる以外は、上記実施例１(5)と同様の方法で、上記（２）で得られたＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun clone libraryのマイクロアレイに対する、Alexa555標識産物とAlexa647標識産物の競合ハイブリダイゼーションを行った。【０４６６】
（５）蛍光強度の測定：シグナル検出から数量化まで
蛍光読み取りスキャナー GenePix 4000B(Axon Instruments Inc.製)を用いて、上記(4)で得られた、マイクロアレイ・ハイブリダイゼーション処理したマイクロアレイ上の蛍光強度を測定した。この際、Alexa555標識産物とAlexa647標識産物の競合ハイブリダイゼーションの結果を解析するため、２チャンネル、すなわち2ch(Alexa555、Alexa647)での蛍光を検出した。【０４６７】
また、上記実施例１(6)と同様の装置を用い、得られた蛍光シグナル（蛍光検出データ）の数量化を行った。【０４６８】
さらに、マイクロアレイ上で検出されたAlexa555/ Alexa647の蛍光強度比（Ratio）を基に、常法に従い、散布図(スキャッタープロット)解析を行った。【０４６９】
この場合は、すなわち、あるマイクロアレイ上のスポットのAlexa555に対するAlexa647の蛍光強度比が高い場合には、そのスポットのＤＮＡ断片（ＰＣＲ産物）は、Alexa647標識産物、即ちＭ.アビウム由来のゲノムＤＮＡとより強くハイブリダイズしたことを示す。他方、あるスポットのAlexa555に対するAlexa647の蛍光強度比が低い場合は、そのスポットのＤＮＡ断片は、Ｍ.アビウム由来のゲノムＤＮＡに対する特異性が低く、Alexa555標識産物、すなわちＭ.イントラセルラー由来の対照用ゲノムＤＮＡとの交叉反応が観察された（Ｍ.イントラセルラー由来の対照用ゲノムＤＮＡとハイブリダイズした）ことを示す。【０４７０】
この方法で、マイクロアレイの全てのスポットの蛍光強度比を算出した。そして、蛍光強度が高く、且つAlexa555に対するAlexa647の蛍光強度比が高いスポットを選択した。【０４７１】
（６）その他のＭ.アビウム株（strain）を用いた二次検出
下記表１０に記載のＭ.アビウム菌株各種（日本細菌学会より分譲された）を用い、上記(1)と同様の方法で、各菌株から「Ｍ.アビウム由来ＤＮＡ試料」を調製した。【０４７２】
【表１０】
2008075520.tif 000011
【０４７３】
次いで、上記(3)i)〜ii)と同様の方法で、各Ｍ.アビウム菌株由来ゲノムＤＮＡをAlexa647で標識した標識産物を得、その断片化産物を得た。【０４７４】
また、上記(3)i)〜ii)と同様の方法で、Ｍ.イントラセルラー由来ゲノムＤＮＡをAlexa555で標識した標識産物を得、その断片化産物を得た。【０４７５】
それから、上記(3)i)〜ii)と同様の方法で、各Ｍ.アビウム菌株由来ゲノムＤＮＡ Alexa647標識産物の断片化生成物と、Ｍ.イントラセルラー由来の対照用ゲノム Alexa555標識産物の断片化生成物の、Alexa555Alexa647標識産物混合溶液を得た。【０４７６】
得られた各Alexa555Alexa647標識産物混合溶液を用い、実施例７（２）で得られたＭ.アビウム由来ゲノムのWhole Genome Shotgun cloneのマイクロアレイに対する、Alexa647標識産物とAlexa555標識産物の競合ハイブリダイゼーション、及び蛍光強度の測定を、上記(4)〜(5)と同様の方法で行った。【０４７７】
さらに、上記(5)と同様の方法で、マイクロアレイ上で検出されたAlexa555/ Alexa647の蛍光強度比（Ratio）を基に、常法に従い、散布図(スキャッタープロット)解析を行った。【０４７８】
得られた解析結果に基づいて、上記(5)と同様の方法で、マイクロアレイの全てのスポットの蛍光強度比を算出し、蛍光強度が高く、且つAlexa555に対するAlexa647の蛍光強度比が高いスポットを選択した。【０４７９】
（７）候補クローンの選択
以上の結果を基に、コンセンサス配列としての候補を選択する上での一つの目安として、上記(６)の検出で、これらのＭ.アビウム菌株とハイブリダイズし、且つ上記(５)の検出で、Ｍ.イントラセルラーとはハイブリダイズしなかったスポットをＭ.アビウム由来ゲノムＤＮＡのWhole Genome Shotgun cloneのマイクロアレイ上から選択した。その結果、７つのスポット（候補クローン）が選択された。【０４８０】
（８）候補クローンの塩基配列決定
次に、上記(7)で選択された候補７クローンについて、実施例１（７）と同様の方法でシークエンス解析を行い、それぞれのクローンの塩基配列決定を行った。【０４８１】
決定された各候補クローンの候補配列の名称、クローンID番号、クローンの大きさ（塩基数）および塩基配列の配列番号を下記表１１にまとめて示す。【０４８２】
【表１１】
2008075520.tif 000012
【０４８３】
実施例８．候補配列ＤのＭ.アビウム株間保存性評価１
（１）本発明のプライマーの合成
実施例７(8)で決定された候補クローンのうち、候補クローンＤのシークエンス（塩基配列）の各解析結果に基づき、その候補配列Ｄから、プライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いて、ＰＣＲに用いるためのプライマー配列、すなわち「5'−AGTGGGCAACAATCCAAGAG−3'」（配列番号１５９、以下、「Mac_12 Fw01」と呼ぶ。）、及び「5'−CCCGACACAACGAGGTTT−3'」（配列番号１６０，以下、「Mac_12 Rv01」と呼ぶ。）を設計した。【０４８４】
次に、ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、設計したオリゴヌクレオチドを合成した。合成手法はＡＢＩ社マニュアルに従った。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はオリゴヌクレオチドのアンモニア水溶液を５５℃で一夜加熱することにより実施した。【０４８５】
次いでファルマシア社製ＦＰＬＣを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、合成オリゴヌクレオチドを精製した。この合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。【０４８６】
（２）Ｍ.アビウム菌株由来ＤＮＡ試料の調製
実施例２(2)のマイコバクテリウム属細菌の調製方法に従って、上記表１０に記載のＭ.アビウム菌株を処理し、ＤＮＡの抽出、精製を行った。得られたそれぞれの精製ＤＮＡを、最終１ng／μl（10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9）になるように調製し、各Ｍ.アビウム菌株由来のＤＮＡ試料とした。【０４８７】
（３）リアルタイムＰＣＲ
上記(1)で設計、合成したMac_12Fw01をフォワードプライマーとして、Mac_12Rv01をリバースプライマーとして用い、下記の通りＰＣＲを行った。【０４８８】
ｉ）ＰＣＲ用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマーMac_12Fw01及びMac_12Rv01を各300nM、SYBRTM Green I (Molecular Probe社商品名)を原液の30倍希釈（最終濃度は原液の30000倍希釈）、1.5mM MgCl2 、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1% TritonX-100、dATP、それぞれ0.2mMのdCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０４８９】
ｉｉ）リアルタイムＰＣＲ
ＰＣＲにおける増幅ターゲットとなる鋳型ＤＮＡとして、上記(2)で調製した各Ｍ.アビウム菌株由来のＤＮＡ試料を用い、以下の通り、インターカレーション法によるリアルタイムＰＣＲを行い、蛍光の定量モニタリングを行った。【０４９０】
まず、上記(3)ｉ)で調製したＰＣＲ用反応液20μlに、上記(2)で調製したＤＮＡ試料１μL（１ng）を添加し、ＰＣＲ用試料とした。【０４９１】
該ＰＣＲ用試料を、９６ 穴反応プレート（マイクロアンプ・オプチカル・９６ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、TaqManTM ＰＣＲ専用サーマルサイクラー・検出器（ABI 7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製）を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。すなわち、９５℃ で１０分間保温の後、９５℃で１５秒間、６０℃ で１分間の反応を４０サイクル繰り返し、プライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBRTM Green Iの蛍光強度を測定した。【０４９２】
尚、フォワードプライマーMac_12Fw01とリバースプライマーMac_12Rv01を用いた上記のリアルタイムＰＣＲにより、鋳型として用いた各Ｍ.アビウム株のゲノムＤＮＡ中に候補クローンＤの塩基配列が存在すれば、候補クローンＤの塩基配列中の、配列番号１９４で表される配列（１９３塩基）のＤＮＡ断片が複製され、蛍光が検出されると予測される。【０４９３】
（４）融解曲線解析
各ＤＮＡ試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。【０４９４】
（５）結果
各ＤＮＡ試料について得られた融解曲線解析の結果を１つのグラフにまとめて、図４に示す。【０４９５】
図４の結果から明らかな如く、本発明のプライマーMac_12Fw01及びプライマーMac_12Rv01を用い、１０種類のＭ.アビウム株から得られたＤＮＡ試料それぞれを鋳型として用いてリアルタイムＰＣＲを行い、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、いずれの場合でも、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認できた（図４：Ｍ.avium）。しかも、得られたシグナルのピークはいずれも単一ピークであった。更にピークの位置は、ほぼ重っていた。【０４９６】
別に、上記(1)〜(4)と同様の方法で、Ｍ.アビウム以外のマイコバクテリウム属菌（Ｍ. chimaera及びＭ.velatum）から得られたＤＮＡ試料を鋳型として用い、同じプライマーを用いてＰＣＲを行った。この場合には、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認できなかった（図４：other species）。【０４９７】
以上のことから、本発明のプライマーMac_12Fw01及びプライマーMac_12Rv01を用いてＰＣＲを行えば、上記１０種類のＭ.アビウム株の何れかが存在していればその検出が可能であり、しかもＭ.アビウム属に特異的な検出が行えることが判る。そして、このことからターゲットとした候補配列Ｄは、Ｍ.アビウムのコンセンサス配列である可能性が高いことも示唆された。【０４９８】
実施例９．その他の候補クローンのＭ.アビウム株間における塩基配列の保存性評価
実施例７(8)で決定された候補クローンＡ〜Ｇのシークエンス（塩基配列）の解析結果に基づき、その各候補クローンの候補配列Ａ〜Ｇ、プライマープライマーデザイン用のWebツールPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)を用いて、ＰＣＲ増幅検出のためのプライマー配列をそれぞれ設計した。【０４９９】
候補配列の名称及びその候補配列の塩基配列の配列番号、その候補配列をもとに設計したプライマーの名称（発明者が命名）及びその塩基配列、更にこの後行うＰＣＲで用いた、フォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせを、表１２にまとめて示す。【０５００】
【表１２】
2008075520.tif 000013
【０５０１】
次いで、実施例８(1)と同様の方法で設計した各オリゴヌクレオチドを合成、精製した。この合成オリゴヌクレオチドを本発明のプライマーとして用い、表１２記載のフォワードプライマーとリバースプライマーの組み合わせで、実施例８(2)〜(4)と同様の方法で、ＤＮＡ試料の調製、リアルタイムＰＣＲ、融解曲線解析を行った。【０５０２】
その結果、いずれのプライマーの組み合わせを用いてリアルタイムＰＣＲを行った場合も実施例８の図４と同様の融解曲線が得られた。すなわち、表１２記載のプライマーの組み合わせを用い、１０種類のＭ.アビウム株から得られたＤＮＡ試料それぞれを鋳型として用いてリアルタイムＰＣＲを行った。SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った。その結果、いずれの場合でも、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認できた。得られたシグナルのピークはいずれも単一ピークであった。しかもピークの位置は、ほぼ重っていた。
【０５０３】
また、実施例８と同様に、Ｍ.アビウム以外のマイコバクテリウム属菌（Ｍ. chimaera及びＭ.velatum）から得られたＤＮＡ試料を鋳型として用い、同じプライマーを用いてＰＣＲを行った。この場合には、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認できなかった。【０５０４】
以上のことから、表１２に記載された本発明のプライマーを用いてＰＣＲを行えば、上記１０種類のＭ.アビウム株の何れかが存在していればその検出が可能であり、しかもＭ.アビウム属に特異的な検出が行えることが判る。【０５０５】
すなわち、本発明のプライマーを用いれば、複数の血液型のＭ.アビウムを、一回の測定で、他のマイコバクテリウム属細菌と区別して、検出することが出来ることが判る。【０５０６】
そして、このことからターゲットとした候補配列Ａ〜Ｇは、いずれもＭ.アビウムのコンセンサス配列である可能性が高いことも示唆された。【０５０７】
実施例１０．候補クローンＤのＭ.アビウム特異性評価
（１）プライマーの合成
実施例８(1)と同じ機器を用い、同様の操作で、Mac_12Fw01、及びMac_12Rv01のオリゴヌクレオチドを合成、精製した。【０５０８】
（２）ＤＮＡ試料の調製
以下に示す、実施例２で用いたのと同じ細菌を用い、実施例２(2)と同様の方法で調製したＤＮＡ試料を得た。【０５０９】
ａ：Escherichia coli （E. coli、大腸菌）（ATCC11775）
ｂ：Mycobacterium tuberculosis（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ヒト型結核菌）（TMC102[H37Rv]）
ｃ：Mycobacterium kansasii（Ｍ.カンサシ）（ATCC12478）
ｄ：Mycobacterium marinum（マイコバクテリウム・マリナム）（ATCC927）
ｅ：Mycobacterium simiae（マイコバクテリウム・シミアエ）（ATCC25275）
ｆ：Mycobacterium scrofulaceum（マイコバクテリウム・スクロフラセウム）（ATCC19981）
ｇ：Mycobacterium gordonae（マイコバクテリウム・ゴルドネア）（ATCC14470）
ｈ：Mycobacterium szulgai（マイコバクテリウム・スズルガイ）（ATCC35799）
ｉ：Ｍ.アビウム（IIID 585）
ｊ：Ｍ.イントラセルラー（マイコバクテリウム・イントラセルラー）（ATCC13950）
ｋ：Mycobacterium gastri（マイコバクテリウム・ガストリ）（ATCC15754）
ｌ：Mycobacterium xenopi（マイコバクテリウム・ゼノピ）（ATCC19250）
ｍ：Mycobacterium nonchromogenicum（マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム）（ATCC19530）
ｎ：Mycobacterium terrae（マイコバクテリウム・テレ）（ATCC15755）
ｏ：Mycobacterium triviale（マイコバクテリウム・トリビアレ）（ATCC23292）
ｐ：Mycobacterium fortuitum（マイコバクテリウム・フォーチュイタム）（ATCC6841）
ｑ：Mycobacterium chelonei（マイコバクテリウム・セロネイ）（ATCC35752）
ｒ：Mycobacterium abscessus（マイコバクテリウム・アプセッサス）（ATCC19977）
ｓ：Mycobacterium peregrinum（マイコバクテリウム・ペレグリナム）（ATCC14467）【０５１０】
（３）リアルタイムＰＣＲ
上記(1)で設計、合成したプライマーMac_12Fw01、及びMac_12Rv01を用いる以外は、実施例２(3)と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行った。【０５１１】
（４）融解曲線解析
実施例２(4)と同様の方法で、各ＤＮＡ試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。【０５１２】
（５）結果
各ＤＮＡ試料について得られた融解曲線解析の結果を１つのグラフにまとめて、図５に示す。【０５１３】
図５の結果から明らかな如く、本発明のプライマーMac_12Fw01、及びMac_12Rv01を用いて、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、Ｍ.アビウム由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いてリアルタイムＰＣＲを行った場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認でき（図５：M.avium）、陽性と判定できた。【０５１４】
これに対し、図５から明らかな如く、Ｍ.アビウム以外のマイコバクテリウム属細菌や他の属の細菌である大腸菌由来のＤＮＡを鋳型として用いて、同じプライマーの組合せを用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行った場合には、該当する蛍光シグナルが確認できず（図５：other species）、すべて陰性と判定できた。【０５１５】
更に、図５から明らかな如く、Ｍ.アビウム由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた場合の融解曲線解析の結果、単一の明瞭なピークが得られたことから、行った検出法は、Ｍ.アビウムに極めて特異性の高い、検出方法であることが判る。【０５１６】
以上のことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲに用いることにより、Ｍ.アビウムを特異的に検出することが出来ることが判る。また、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、細菌を単離する必要がなく、臨床材料をそのまま検出に用いることが可能であるため、従来の細菌を培養してから検出する方法では培養に数週間かかっていたＭ.アビウムの検出を、長くても１日以内に終わらせることができることが判る。【０５１７】
実施例１１．その他の候補クローンのＭ.アビウム特異性評価２
（１）本発明のプライマーの合成
実施例８(1)と同じ機器を用い、同様の操作で、上記表１２に記載された、Mac_12Fw01及びMac_12Rv01以外のオリゴヌクレオチドを合成、精製した。【０５１８】
この合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた。【０５１９】
（２）ＤＮＡ試料の調製
実施例10で用いたのと同じ細菌を用い、実施例２(2)と同様の方法で、ＤＮＡ試料を調製した。【０５２０】
（３）リアルタイムＰＣＲ
上記（１）で設計、合成したプライマーを、上記表１２の組み合わせで用いる以外は、実施例２(3)と同様の方法で、リアルタイムＰＣＲを行った。【０５２１】
（４）融解曲線解析
実施例２(4)と同様の方法で、各ＤＮＡ試料に対して各々増幅されてきた産物について、横軸をプライマー伸長産物（２本鎖ＤＮＡ）の解離温度、縦軸に蛍光強度の１次微分（変化量）をとった融解曲線を作成し、ピークの検出を行った。【０５２２】
（５）結果
実施例10の結果と同様、本発明のプライマーを用いて、SYBR Green I存在下で増幅された核酸の融解曲線解析を行った結果、表１２記載のどのプライマーの組み合わせを用いた場合でも、Ｍ.アビウム由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いてリアルタイムＰＣＲを行った場合のみに、核酸増幅の結果生じる蛍光シグナルが確認でき、陽性と判定できた。【０５２３】
これに対し、Ｍ.アビウム以外のマイコバクテリウム属細菌や他の属の細菌である大腸菌由来のＤＮＡを鋳型として用いて、表１２記載のどの同じプライマーの組合せを用いて同様にリアルタイムＰＣＲを行った場合にも、該当する蛍光シグナルが確認できず、すべて陰性と判定できた。【０５２４】
更に、Ｍ.アビウム由来のＤＮＡ試料を鋳型として用いた場合の融解曲線解析の結果、実施例10の場合と同様、単一の明瞭なピークが得られたことから、行った検出法は、Ｍ.アビウムに極めて特異性の高い、検出方法であることが分かる。【０５２５】
以上のことから、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲに用いることにより、Ｍ.アビウムを特異的に検出することが出来ることが判った。また、ＰＣＲなどの核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、細菌を単離する必要がなく、臨床材料をそのまま検出に用いることが可能であるため、従来の細菌を培養してから検出する方法では培養に数週間かかっていたＭ.アビウムの検出を、長くても１日以内に終わらせることができる。【０５２６】
実施例１２．最小検出感度試験２
リアルタイムＰＣＲ検出法を利用し、候補配列Ｄをターゲットとした場合の検出感度の検定を行った。【０５２７】
（１）本発明のＭ.アビウム検出用プライマーの調製
実施例２(1)と同じ機器を用い、同様の操作でMac_12Fw01、及びMac_12Rv01のオリゴヌクレオチドを合成・精製した。これをプライマーとして用いた。【０５２８】
（２）ＤＮＡ試料の調製
実施例7(1)で、Ｍ.アビウム（Mycobacterium avium IID 585）から調製したＤＮＡ試料を用いた。【０５２９】
該ＤＮＡ試料の吸光度を測定して試料中のＤＮＡ量を測定した。得られたＤＮＡ量を、濃度既知のＭ.アビウムのゲノムＤＮＡを試料として同様に吸光度を測定して得られた測定値と量と比較することにより、試料中のゲノムＤＮＡ量（ゲノムコピー数）を決定した。10８コピー／μlのゲノムＤＮＡが得られた。【０５３０】
次いで10mM Tris-HCl緩衝液、pH8.9を用いてＤＮＡ試料を105, 104, 103, 102, 10, 5コピー/μLの希釈系列に希釈したものを調製し、ＰＣＲ用ＤＮＡ試料とした。【０５３１】
（３）リアルタイムＰＣＲ
ｉ）ＰＣＲ用反応液の調製
上記(1)で得られたプライマーMac_12Fw1及びプライマーMac_12Rv1を各300nM、SYBR Green I (Molecular Probe社)を原液の30倍希釈（最終濃度は原液の30000倍希釈）、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1% コール酸ナトリウム、0.1%TritonX-100、それぞれ0.2mM のdATP、dCTP、dGTP、dTTP、及びTaq DNA ポリメラーゼ（ニッポンジーン製）40単位/ml を含有する10mM Tris-HCl(pH8.9)を調製し、ＰＣＲ用反応液とした。【０５３２】
ｉｉ）リアルタイムＰＣＲ
上記(3)i)で調製したＰＣＲ用反応液２０μlに、上記(2)で調製したＰＣＲ用ＤＮＡ試料１μLを添加したものを、ＰＣＲ用試料とした。【０５３３】
このＰＣＲ用試料を、９６ 穴反応プレート（ マイクロアンプ・オプチカル・９６ ウェル・リアクション・プレート、アプライドバイオシステムズジャパン社製）のウェルに入れ、ＴａｑＭａｎＴＭ  ＰＣＲ 専用サーマルサイクラー・検出器（ABI7500、アプライドバイオシステムズジャパン社製） を用いてリアルタイムＰＣＲを行った。すなわち、95℃ で10分間保温の後、95℃で15秒間、60℃ で１分間の反応を40サイクル繰り返し、プライマー伸長産物の増幅量と相関してインターカレーションするSYBR Green Iの蛍光強度を測定した。【０５３４】
尚、蛍光強度は、測定に供した９６穴反応プレート１プレート毎に、測定に用いたサーマルサイクラーの、相対的な蛍光強度比を数値化する機能を用いて求めた。【０５３５】
（４）結果
得られた実験データから、リアルタイムＰＣＲ法において行われている常法に従って、各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料毎に、実施例5(4)と同様の方法で、ＰＣＲのサイクル数（ｘ軸）に対するレポーター色素の発光量(Rn、ｙ軸)をプロットした増幅曲線を作成した。得られた検量線を図６に示す。【０５３６】
次いで、得られた増幅曲線から、下記の方法によって、検量線を作成した。【０５３７】
すなわち、得られた増幅曲線（図６）の、蛍光強度が指数関数的に増幅しているRn部を選択し、Threshold line（Th）を引いた。Thと各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料の蛍光強度が交差した点をThreshold cycle（Ct）値とした。次いで用いた各ＰＣＲ用ＤＮＡ試料のゲノムのコピー数（x軸、対数値）に対するCt値（y軸）をプロットし、各Ctに対して得られた近似曲線を検量線とした。得られた検量線を図７に示す。【０５３８】
ｙ＝−３．２７２ｘ＋３４．００
Ｒ２＝０.９９４【０５３９】
以上の結果、まずリアルタイムＰＣＲで蛍光が検出されたことから、本発明に係るオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、リアルタイムＰＣＲを行えば、Ｍ.アビウムが検出できることが判った。【０５４０】
また、検量線が作成できたことより、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法によれば、Ｍ.アビウムの定量が可能であることが判った。更に、図＊より、本発明のプライマー及びプローブを用いたリアルタイムＰＣＲ法では、Ｍ.アビウムのゲノムＤＮＡが初期量として５コピー存在する条件でもＭ.アビウムの検出が可能である事がわかる。【０５４１】
また、本法によるＰＣＲの増幅効率は、計算上１０２.２％となり、高い反応性を確認できた。【０５４２】
更に、上記表１２に記載された他のプライマーの組み合わせを用いて同様に実験を行った結果、ほぼ同等の成績を得ることが出来た。以上のことから、候補配列Ａ〜Ｇを標的としてリアルタイムＰＣＲを行うことにより、Ｍ.アビウム株の検出及び定量を行うことが出来ることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０５４３】
本発明のプライマー又は／及びプローブを用いたＭ.アビウムの検出方法によれば、従来の菌の培養検査等により菌種を同定する方法と比較して、はるかに迅速且つ高精度に、Ｍ.アビウムの検出を行うことができる。また、本発明の検出方法でＭ.アビウムの検出を行うことにより、従来のプライマー又は／及びプローブを用いたＰＣＲ法による診断方法に比較して、診断上の偽陽性が排除可能となり、より高精度にＭ.アビウムの検出及び診断を行うことができる。更に、本発明の検出方法を用いることにより、Ｍ.アビウム菌体の定量も行うこともできるという効果を奏する。
更に、本発明の検出方法によれば、複数の血清型のＭ.アビウムを、一回の測定で検出することが出来、迅速且つ簡便なＭ.アビウムの検出、診断が可能となるという効果を奏する。
【図１】
2008075520.tif 000014
【図２】
2008075520.tif 000015
【図３】
2008075520.tif 000016
【図４】
2008075520.tif 000017
【図５】
2008075520.tif 000018
【図６】
2008075520.tif 000019
【図７】
2008075520.tif 000020
【配列表】
2008075520000001.app
【国際調査報告】
2008075520.tif 000021
2008075520.tif 000022
2008075520.tif 000023
2008075520.tif 000024
2008075520.tif 000025
2008075520.tif 000026
2008075520.tif 000027