(57)【要約】本発明は、検出対象である抗原が低分子抗原であっても、より簡便、効率的、安定性良くかつ高感度で検出し得る検出方法を提供することを目的としている。抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド；所定のタンパク質；リンカーペプチド：前記タンパク質と結合する活性を有し、前記タンパク質との結合の有無が検出可能であるパートナータンパク質；及び、前記抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド；をこの順又はこの順の逆の順で含んでなり、かつ、前記ＶＨ領域を含むポリペプチド及びＶＬ領域を含むポリペプチドの抗原に対する結合の有無により前記タンパク質と前記パートナータンパク質の結合の有無が生じる融合タンパク質を用いて、抗原の検出を行う。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド；所定のタンパク質；リンカーペプチド：前記タンパク質と結合する活性を有し、前記タンパク質との結合の有無が検出可能であるパートナータンパク質；及び、前記抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド；をこの順又はこの順の逆の順で含んでなり、かつ、前記ＶＨ領域を含むポリペプチド及びＶＬ領域を含むポリペプチドの抗原に対する結合の有無により前記タンパク質と前記パートナータンパク質の結合の有無が生じる融合タンパク質。
【請求項２】
所定のタンパク質とパートナータンパク質との組み合わせが、酵素タンパク質のＮ末端側フラグメントを含むタンパク質と前記酵素タンパク質のＣ末端側フラグメントを含むタンパク質との組み合わせであり、かつ、前記Ｎ末端側フラグメントを含むタンパク質と前記Ｃ末端側フラグメントを含むタンパク質との結合の有無を、前記酵素タンパク質の所定の酵素活性の変化により検出可能であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
酵素タンパク質が、βラクタマーゼであることを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
βラクタマーゼのＮ末端側フラグメントを含むタンパク質が、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、βラクタマーゼのＣ末端側フラグメントを含むタンパク質が、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
リンカーペプチドが、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒからなるアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項６】
所定のタンパク質；リンカーペプチド：パートナータンパク質の配列が、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
請求項７に記載のＤＮＡを有する組換えベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換細胞。
【請求項１０】
サンプル中の抗原を検出する方法であって、ＶＨ領域を含むポリペプチド及びＶＬ領域を含むポリペプチドが前記抗原に結合し得る請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質又は請求項９に記載の形質転換細胞をサンプルに接触させる工程、及び、前記融合タンパク質又は前記形質転換細胞が発現する融合タンパク質における所定のタンパク質とパートナータンパク質の結合を検出する工程を有することを特徴とする抗原の検出方法。
【請求項１１】
所定のタンパク質とパートナータンパク質が、互いに結合していない場合に比べて互いに結合すると所定のタンパク質及び／又はパートナータンパク質が発揮する所定の酵素活性が変化するタンパク質である請求項１〜６のいずれかに記載の融合タンパク質又は請求項９に記載の形質転換細胞；及び、前記酵素活性の変化を検出し得る発色基質又は発光基質；を備えたことを特徴とする抗原の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体酵素融合タンパク質、及び、該抗体酵素融合タンパク質を用いた抗原の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体を用いた免疫測定法として、酵素標識固相免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等が広く用いられている。しかし、抗原が低分子である場合は、第一に抗体の抗原結合部位（パラトープ）と抗原との界面積が小さくなるため、第二に抗原が小さすぎて感度の良いサンドイッチ法が適用できず競合法によって測定せざるを得ないため、ＥＬＩＳＡ法等は低分子抗原に対しては感度が低下するという問題があった。そのため、低分子抗原についても非競合的に高感度で測定し得る方法が開発されている。【０００３】
例えば、非特許文献１には、低分子である4-hydroxy-3-nitrophencetyl（ＮＰ）を高感度で検出する方法であって、ＮＰに結合するＢ１−８抗体のＶＨ領域ポリペプチド及び大腸菌βガラクトシダーゼのαフラグメントからなる融合タンパク質（ＶＨ領域ポリペプチドはαフラグメントのＮ末端側に結合）と、前記抗体のＶＬ領域ポリペプチド及び大腸菌βガラクトシダーゼのωフラグメントからなる融合タンパク質（ＶＬ領域ポリペプチドはωフラグメントのＮ末端側に結合）とを用いた方法が開示されている。この方法は、一方の融合タンパク質におけるＶＨ領域ポリペプチドと、他方の融合タンパク質におけるＶＬ領域ポリペプチドが、ＮＰ抗原を介して相互作用すると、両融合タンパク質におけるαフラグメントとωフラグメントが結合し、その結果生じるβガラクトシダーゼ活性の上昇（いわゆる活性相補）を検出することによって、ＮＰ抗原の検出を行う。この方法により、低分子抗原についても、従来のＥＬＩＳＡ法に比べて高感度で測定することが可能となった。また、この方法は、通常のＥＬＩＳＡ法とは異なり、結合しなかった標識２次抗体（非競合法）や標識抗原（競合法）などを洗浄する操作を要することなく測定し得る測定法（ホモジニアス法）であり、測定装置の自動化が容易で迅速な測定が可能という点で、通常のＥＬＩＳＡ法に比べてメリットがあった。しかし、この方法により高感度で測定するには、用いる両融合タンパク質の濃度設定をある程度正確に行う必要があるなど、検出の簡便性、効率性、安定性などに関して改善の余地があった。【０００４】
【非特許文献１】Anal. Chem., 74, 2500-2504 (2002)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記背景技術を改善したもので、検出対象である抗原が低分子抗原であっても、より簡便、効率的、安定性良くかつ高感度で検出し得る検出方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＶＨ領域ポリペプチドと酵素タンパク質の一部を含む融合タンパク質と、ＶＬ領域ポリペプチドと上記酵素タンパク質の残部を含む融合タンパク質をリンカーペプチドで結合することによって、非特許文献１の方法の不十分な点を顕著に改善し得ることを見いだした。すなわち、本発明者らは、イミダクロプリド（ＩＣＰ）を認識する抗体のＶＨ領域ポリペプチド、βラクタマーゼ（ＢＬＡ）の一部のポリペプチド、リンカーペプチド、前記ＢＬＡの別の一部のポリペプチド、及び、前記抗体のＶＬ領域ポリペプチドをこの順で含んでなる融合タンパク質を発現させた大腸菌と、非常に低濃度のＩＣＰ抗原とを接触させたところ、該大腸菌内のＢＬＡ活性がＩＣＰ抗原の濃度依存的に、かつ、リンカーペプチドを持たない分子に比べて著しく感度良く上昇することを見いだし、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち具体的には本発明は（１）抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド；所定のタンパク質；リンカーペプチド：前記タンパク質と結合する活性を有し、前記タンパク質との結合の有無が検出可能であるパートナータンパク質；及び、前記抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド；をこの順又はこの順の逆の順で含んでなり、かつ、前記ＶＨ領域を含むポリペプチド及びＶＬ領域を含むポリペプチドの抗原に対する結合の有無により前記タンパク質と前記パートナータンパク質の結合の有無が生じる融合タンパク質や、（２）所定のタンパク質とパートナータンパク質との組み合わせが、酵素タンパク質のＮ末端側フラグメントを含むタンパク質と前記酵素タンパク質のＣ末端側フラグメントを含むタンパク質との組み合わせであり、かつ、前記Ｎ末端側フラグメントを含むタンパク質と前記Ｃ末端側フラグメントを含むタンパク質との結合の有無を、前記酵素タンパク質の所定の酵素活性の変化により検出可能であることを特徴とする前記（１）に記載の融合タンパク質や、（３）酵素タンパク質が、βラクタマーゼであることを特徴とする前記（２）に記載の融合タンパク質や、（４）βラクタマーゼのＮ末端側フラグメントを含むタンパク質が、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、βラクタマーゼのＣ末端側フラグメントを含むタンパク質が、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする前記（３）に記載の融合タンパク質や、（５）リンカーペプチドが、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒからなるアミノ酸配列であることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれかに記載の融合タンパク質や、（６）所定のタンパク質；リンカーペプチド：パートナータンパク質の配列が、配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載の融合タンパク質や、（７）前記（１）〜（６）のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするＤＮＡや、（８）前記（７）に記載のＤＮＡを有する組換えベクターや、（９）前記（８）に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換細胞や、（１０）サンプル中の抗原を検出する方法であって、ＶＨ領域を含むポリペプチド及びＶＬ領域を含むポリペプチドが前記抗原に結合し得る前記（１）〜（６）のいずれかに記載の融合タンパク質又は前記（９）に記載の形質転換細胞をサンプルに接触させる工程、及び、前記融合タンパク質又は前記形質転換細胞が発現する融合タンパク質における所定のタンパク質とパートナータンパク質の結合を検出する工程を有することを特徴とする抗原の検出方法や、（１１）所定のタンパク質とパートナータンパク質が、互いに結合していない場合に比べて互いに結合すると所定のタンパク質及び／又はパートナータンパク質が発揮する所定の酵素活性が変化するタンパク質である前記（１）〜（６）のいずれかに記載の融合タンパク質又は前記（９）に記載の形質転換細胞；及び、前記酵素活性の変化を検出し得る発色基質又は発光基質；を備えたことを特徴とする抗原の検出用キットに関する。なお、本明細書中の配列は、５’側から３’側にかけて記載している。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ＶＨ領域ポリペプチド及びＶＬ領域ポリペプチドの抗原に対する結合の有無による本発明の融合タンパク質の構造変化の模式図を示す。
【図２】本発明の抗体−円順列変異体ＢＬＡ混成タンパク質発現ベクターのコンストラクト、及び、該ベクターの調製に用いたコンストラクトを示す図である。
【図３】抗体−リンカー欠如円順列変異体ＢＬＡ混成タンパク質発現ベクターのコンストラクトを示す図である。
【図４】抗体−リンカー欠如円順列変異体ＢＬＡ混成タンパク質発現ベクターの調製に用いたコンストラクト、及び、該コンストラクトの調製方法の概要を示す図である。
【図５】円順列変異体ＢＬＡ混成タンパク質発現ベクターのコンストラクトを示す図である。
【図６】ＩＣＰの存在下又は非存在下での大腸菌の生育を示す図である。
【図７】アンピシリン存在下若しくは非存在下、及び、ＩＣＰやＴＣＰの存在下又は非存在下でのＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株の生育を示す図である。
【図８】アンピシリン存在下若しくは非存在下、及び、ＩＣＰやＴＣＰの存在下又は非存在下でのＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／Ｃ４３株の生育を示す図である。
【図９】抗原（ＴＣＰ若しくはＩＣＰ）存在下又は非存在下で培養したＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株の菌体を用いたウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図１０】ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株から部分精製したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１１】精製抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）のＩＣＰ結合活性を示す図である。
【図１２】Nitrocefinを基質とした、精製抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）のＩＣＰ／ＴＣＰ添加による活性変化を示す図である。
【図１３】Fluorocillinを基質とした、精製抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）のＩＣＰ／ＴＣＰ添加による活性変化を示す図である。
【図１４】Fluorocillinを基質とした、精製抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（２１９））のＢＧＰ-Ｃ７ペプチド添加による活性変化を示す図である。
【図１５】Fluorocillinを基質とした、精製抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（２１９））の各種ＢＧＰペプチド／ＩＣＰ／ＴＣＰ添加による活性変化を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の融合タンパク質としては、抗体のＶＨ領域を含むポリペプチド；所定のタンパク質；リンカーペプチド：前記タンパク質と結合する活性を有し、前記タンパク質との結合の有無が検出可能であるパートナータンパク質；及び、前記抗体のＶＬ領域を含むポリペプチド；をこの順又はこの順の逆の順で含んでなり、かつ、前記ＶＨ領域を含むポリペプチド及びＶＬ領域を含むポリペプチドの抗原に対する結合の有無により前記タンパク質と前記パートナータンパク質の結合の有無が生じる融合タンパク質であれば特に制限されない。なお、ＶＨ領域を含むポリペプチド及びＶＬ領域を含むポリペプチドの抗原に対する結合の有無による本発明の融合タンパク質の構造変化の模式図を図１に示す。【００１０】
本発明の融合タンパク質に用いるＶＨ領域を含むポリペプチド（以下、「ＶＨ領域ポリペプチド」ともいう。）やＶＬ領域を含むポリペプチド（以下、「ＶＬ領域ポリペプチド」ともいう。）としては、所定の抗原に特異的に結合する抗体のＶＨ領域ポリペプチドやＶＬ領域ポリペプチドであり、かつ、本発明の融合タンパク質において用いた場合に、ＶＨ領域ポリペプチド及びＶＬ領域ポリペプチドの抗原に対する結合の有無により、所定のタンパク質とそのパートナータンパク質の結合の有無が生じるものであれば特に制限されず、例えば4-hydroxy-3-nitrophencetyl（ＮＰ）に結合するＢ１−８抗体のＶＨ領域ポリペプチド（アミノ酸配列：配列番号１；  塩基配列：配列番号２）やＶＬ領域ポリペプチド（アミノ酸配列：配列番号３；  塩基配列：配列番号４）、リゾチームに結合するＨｙＨＥＬ−１０のＶＨ領域ポリペプチドやＶＬ領域ポリペプチド（Nat. Biotechnol., 14, 1714-1718 (1996); J.Immunol. Methods, 224, 171-184 (1999)）、イミダクロプリド（ＩＣＰ）に結合する抗体（３３Ｃ３−１−１：ＦＥＲＭ  Ｐ−１７０９４で寄託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体：特開２０００−１９１６９８号公報）のＶＨ領域ポリペプチドやＶＬ領域ポリペプチド、オステオカルシンＣ末ペプチドに結合する抗体ＫＴＭ２１９のＶＨ領域ポリペプチドやＶＬ領域ポリペプチド（Anal. Chem. 79, 6197 (2007)）を好ましく例示することができる。
なお、本発明の融合タンパク質に用いるＶＨ領域ポリペプチドやＶＬ領域ポリペプチドとしては、ＶＨ領域からなるポリペプチドやＶＬ領域からなるポリペプチドを好ましく例示することができ、また、所定の抗原に特異的に結合する限り、ＶＨ領域の一部に変異や挿入、欠失を導入したポリペプチドやＶＬ領域の一部に変異や挿入、欠失を導入したポリペプチドも用いることができる。該変異、挿入、欠失としては特に制限されないが、好ましくは１０アミノ酸以下、より好ましくは５アミノ酸以下、さらに好ましくは３アミノ酸以下、さらにより好ましくは１アミノ酸以下の変異、挿入又は欠失である。【００１１】
本発明の融合タンパク質に用いるＶＨ領域ポリペプチドやＶＬ領域ポリペプチドの調製方法としては特に制限されず、配列公知の抗体から調製してもよいし、また、慣用のプロトコール（例えば特表２００６−５２３０８８号公報参照）を用いて、目的抗原に対する抗体を作製し、さらに、その抗体のＶＨ領域ポリペプチドやＶＬ領域ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をクローニングするなどして、本発明の融合タンパク質に用いるポリペプチドやそれをコードするＤＮＡ配列を入手し、該ＤＮＡ配列を適当な細胞で発現させるなどして調製してもよい。このような方法に従えば、検出対象とする所望の抗原に特異的に結合し得るＶＨ領域ポリペプチドやＶＬ領域ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を容易に入手することができる。例えば、前述の特表２００６−５２３０８８号公報には、ヒトＩＬ−８に特異的に結合する抗体や、そのＶＨ領域及びＶＬ領域の配列が記載されている。なお、調製したＶＨ領域ポリペプチドやＶＬ領域ポリペプチドが本発明の融合タンパク質に好適に用い得るかどうかは、後述の実施例記載のアッセイを行うことなどにより、容易に確認することができる。【００１２】
本発明の融合タンパク質に用いる所定のタンパク質やそのパートナータンパク質（以下、併せて「両タンパク質」ともいう。）としては、パートナータンパク質が前記タンパク質と結合する活性を有し、前記タンパク質との結合の有無が検出可能であり、かつ、本発明の融合タンパク質におけるＶＨ領域ポリペプチド及びＶＬ領域ポリペプチドの抗原に対する結合の有無により前記タンパク質と前記パートナータンパク質の結合の有無が生じるものであれば特に制限されないが、両タンパク質が結合すると、両タンパク質が結合していない場合に比べて、所定のタンパク質及び／又はパートナータンパク質が発揮する所定の酵素活性が変化（上昇、低下、発現又は消滅）する組み合わせ（特に、その酵素活性の変化を発色基質や蛍光基質で視覚的に検出できる組み合わせ）等の、両タンパク質の結合の有無を簡便に検出し得る組み合わせを好ましく例示することができ、中でも、酵素タンパク質の一部を含むタンパク質と、前記酵素タンパク質の残部を含むタンパク質であって、両タンパク質が結合するとその酵素の酵素活性が変化（特に上昇又は発現）する組み合わせをより好ましく例示することができ、特定の酵素のＮ末端側のフラグメントを含むタンパク質とＣ末端側のフラグメントを含むタンパク質であって、両タンパク質が結合するとその酵素の酵素活性が変化（特に上昇又は発現）する組み合わせをさらに好ましく例示することができ、大腸菌由来のβガラクトシダーゼのαフラグメントとそのωフラグメントの組み合わせや、大腸菌由来のβラクタマーゼ（ＢＬＡ）の２４位〜１７０位のアミノ酸配列からなるタンパク質（アミノ酸配列：配列番号５；  塩基配列：配列番号６）とその１６８位〜２８６位のアミノ酸配列からなるタンパク質（アミノ酸配列：配列番号７；  塩基配列：配列番号８）をよりさらに好ましく例示することができる。なお、上記本発明における所定のタンパク質とパートナータンパク質は便宜上名称を区別しているだけであり、例えば、上記ＢＬＡの２４位〜１７０位のアミノ酸配列からなるタンパク質を所定のタンパク質とし、そのＢＬＡの１６８位〜２８６位のアミノ酸配列からなるタンパク質をパートナータンパク質としてもよいし、上記ＢＬＡの１６８位〜２８６位のアミノ酸配列からなるタンパク質を所定のタンパク質とし、そのＢＬＡの２４位〜１７０位のアミノ酸配列からなるタンパク質をパートナータンパク質としてもよい。【００１３】
本発明における上記両タンパク質が、大腸菌由来のβガラクトシダーゼのαフラグメントとそのωフラグメントの組み合わせの場合は、これらの両フラグメントが結合すると、いわゆる活性相補が生じ、βガラクトシダーゼ活性が上昇する。βガラクトシダーゼ活性の上昇は、例えばGalacton-Plus（登録商標）（Applied Biosystems社製）等の化学発光基質を添加することにより、高感度で検出することができる。また、大腸菌由来のβラクタマーゼ（ＢＬＡ）の２４位〜１７０位のアミノ酸配列からなるタンパク質とその１６８位〜２８６位のアミノ酸配列からなるタンパク質の組み合わせの場合は、これらの両タンパク質が結合すると、βラクタマーゼ活性が上昇する。βラクタマーゼ活性の上昇は、例えばニトロセフィン等の発色基質を添加したり（Nature Biotechnol., 20, 619-622 (2002)）、Fluorocillin Green495/525 beta lactamase substrate (Invitrogen社製)等の蛍光基質を添加することにより、高感度で検出することができる。【００１４】
この他、本発明の両タンパク質として用い得ると考えられる組み合わせとして、ルシフェラーゼのＮ末端側フラグメントとそのＣ末端側フラグメントであって、両フラグメントが結合するとルシフェラーゼ活性が回復するもの（Anal. Chem., 75, 1584-1589 (2003)）や、Ｃｒｅ酵素の５９位までのフラグメントと６０位以降のフラグメントであって、両フラグメントが結合するとＣｒｅ活性が回復するもの（Nucleic Acids Research, 31, e131 (2003)）や、ジヒドロ葉酸レダクターゼのＮ末端側フラグメントとＣ末端側フラグメントであって、両フラグメントが結合するとジヒドロ葉酸レダクターゼ活性が回復するもの（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 12141-12146 (1998)）や、ＧＦＰのＮ末端側フラグメントとＣ末端側フラグメントを入れ替えて、Ｃ末端側フラグメントのＣ末端とＮ末端側フラグメントのＮ末端をインサーション配列（リンカー配列）で連結したＧＦＰの円順列変異体（circular permutant）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11241-11246 (1999)）等を例示することができる。【００１５】
本発明の融合タンパク質に用いる両タンパク質としては、上記以外にも、公知の任意の酵素タンパク質等を用いることができる。特定の酵素の２つのフラグメントであって、両フラグメントが結合していないときはその酵素活性を発現しないか又は酵素活性が弱く、両フラグメントが結合すると酵素活性が発現するか又は酵素活性が上昇する（活性相補する）フラグメントの組み合わせは、公知のprotein-fragment complementation assays (Nature Biotechnol., 20, 619-622 (2002)やUSP 7, 160, 691)により容易に作製することができ、また、活性相補する両フラグメントがリンカー配列で連結されたものである円順列変異体（circular permutant）についても、上述の文献（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 11241-11246 (1999)）等に基づいて容易に作製することができる。
なお、活性相補する両フラグメントは、一部に重複する配列を有していてもよい。【００１６】
本発明の融合タンパク質に用いるリンカーペプチドとしては、本発明に用いる所定のタンパク質とそのパートナータンパク質を該リンカーペプチドにて連結した場合に、前記タンパク質とそのパートナータンパク質の結合や、その結合の有無の検出を妨げない限り特に制限されないが、本発明の融合タンパク質を用いた目的抗原の検出をより高感度で行うためには、リンカーペプチドの長さを適宜調節することが好ましい。本発明に用いる所定のタンパク質とそのパートナータンパク質として、大腸菌由来のβラクタマーゼ（ＢＬＡ）の２４位〜１７０位のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｎ末端側フラグメント）とその１６８位〜２８６位のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｃ末端側フラグメント）の組み合わせを用いる場合は、そのリンカーペプチドとして、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ（ＤＫＳ）からなるアミノ酸配列（塩基配列：gacaagagc）を好適に例示することができる。リンカーペプチドの好ましいアミノ酸数は、リンカーペプチドのアミノ酸数を変化させた複数のサンプルについて、後述の実施例記載のアッセイを行うことなどにより、容易に調べることができる。【００１７】
本発明の融合タンパク質は、ＶＨ領域ポリペプチド及びＶＬ領域ポリペプチドの抗原に対する結合や、所定のタンパク質とそのパートナータンパク質の結合や、所定のタンパク質とそのパートナータンパク質の結合の検出を妨げない限り、抗体のＶＨ領域ポリペプチド；所定のタンパク質；リンカーペプチド：前記タンパク質と結合する活性を有し、前記タンパク質との結合の有無が検出可能であるパートナータンパク質；及び、前記抗体のＶＬ領域ポリペプチド；以外にも、Ｈｉｓ−Ｔａｇ等の精製用Ｔａｇ配列などのポリペプチドを含んでいることが、容易に精製し得る点で好ましい。【００１８】
本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡとしては、本発明の上記融合タンパク質をコードするＤＮＡである限り特に制限されず、前述のＶＨ領域ポリペプチド、所定のタンパク質、リンカーペプチド、パートナータンパク質、ＶＬ領域ポリペプチドのＤＮＡ配列を、慣用のプロトコールを用いて、この順で配置することにより構築することができる。本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡとして、具体的には、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６ベクターのＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ断片を好適に例示することができる。【００１９】
本発明の組換えベクターとしては、上記の本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含み、かつ本発明の融合タンパク質を発現することができる組換えベクターであれば特に制限されないが、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６ベクターを好適に例示することができる。
本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡを発現ベクターに適切にインテグレイトすることにより構築することができる。かかる発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製可能であるものや、あるいは宿主細胞の染色体中へ組込み可能であるものが好ましく、また、本発明の遺伝子を発現できる位置にプロモーター、エンハンサー、ターミネーター等の制御配列を含有しているものを好適に使用することができる。【００２０】
上記発現ベクターのうち、細菌用の発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒＰ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもロシュダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（ＧＥヘルスケア社製）、ｐＳＥ２８０（Invitrogen社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Promega社製）、ｐＱＥ−８（QIAGEN社製）、ｐＱＥ−３０（QIAGEN社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭58-110600）、ｐＫＹＰ２００〔Agrc. Biol. Chem., 48, 669 (1984)〕、ｐＬＳＡ１〔Agrc. Blo1. Chem., 53, 277 (1989)〕、ｐＧＥＬ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＵＣ１８〔Gene, 33, 103(1985)〕、ｐＵＣ１９〔Gene, 33, 103 (1985)〕、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＳＴＶ２９（タカラバイオ社製）、等を例示することができる。細菌用のプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。【００２１】
本発明の形質転換細胞としては、上記本発明の組換えベクターが導入され、かつ上記本発明の融合タンパク質を発現する形質転換細胞であれば特に制限されないが、本発明のＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６組変えベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３，ｐＬｙｓＳ）株に導入して得られるＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株を好適に例示することができる。上記形質転換細胞を作製する際の、宿主細胞への上記本発明の組換えベクターの導入方法としては、Ｄａｖｉｓら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞等を例示することができるが、ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株やＢＬ２１株等の大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌を好適に例示することができ、大腸菌を特に好ましく例示することができる。【００２２】
本発明の抗原の検出方法としては、サンプル中の抗原を検出する方法であって、ＶＨ領域ポリペプチド及びＶＬ領域ポリペプチドが前記抗原に結合し得る本発明の融合タンパク質又は本発明の形質転換細胞をサンプルに接触させる工程、及び、前記融合タンパク質又は前記形質転換細胞が発現する融合タンパク質における所定のタンパク質とパートナータンパク質の結合を検出する工程を有する方法であれば特に制限されず、また、抗原としては特に制限されないが、抗原が分子量１０００以下の低分子化合物等である場合に、特に本発明の抗原の検出方法のメリットを享受し得る。上記低分子化合物としては、イミダクロプリド等のネオニコチノイド系農薬、ポリ塩化ビフェニル、ビスフェノールＡ等の環境汚染物質、マイコトキシン等の毒性物質、オステオカルシンペプチド等の生体物質等を好適に例示することができる。本発明の抗原の検出方法は、これらの物質を抗原として検出し得るため、疾患の臨床診断、食品の毒性検査、環境分析等に有利に応用することができる。
なお、本発明の抗原の検出方法では、通常のＥＬＩＳＡ法とは異なり、本発明の融合タンパク質等とサンプルを接触した後の洗浄工程が不要であるため、抗原の検出を非常に簡便、迅速に行うことができる。【００２３】
上記の本発明の融合タンパク質又は形質転換細胞のサンプルへの接触は、例えば本発明の融合タンパク質又は形質転換細胞とサンプルとを適当な溶媒に懸濁又は溶解するなどして行うことができる。ただし、本発明の形質転換細胞をそのまま用いる場合は、形質転換細胞が発現する本発明の融合タンパク質と対象抗原とが接触し得る必要があるため、対象抗原が形質転換細胞内に取り込まれるか、又は、形質転換細胞が発現する本発明の融合タンパク質が細胞外へ分泌されることを確認して用いることが好ましい。一方、本発明の形質転換細胞を破砕して用いる場合は、この点を確認する必要は特にない。
なお、本発明の抗原の検出方法においては、用いる本発明の融合タンパク質の濃度や形質転換細胞の濃度を適宜調節することが、より高い検出感度を得る観点から好ましい。より高い検出感度が得られる上記濃度は、融合タンパク質や形質転換細胞の種類などにより異なるため一概にいうことはできないが、上記濃度を段階的に変えて実験を行うことにより容易に設定することができる。ただし、本発明の融合タンパク質はリンカーペプチドを有しているため、本発明の抗原の検出方法は、非特許文献１の方法に比べて、より高い検出感度をより安定的に得ることができる。【００２４】
また、上記所定のタンパク質とパートナータンパク質の結合の検出は、例えば前記タンパク質及び／又はパートナータンパク質が発揮する所定の酵素活性の変化（上昇、低下、発現又は消滅）、より好ましくは所定の酵素活性の上昇又は発現を検出することにより、簡便かつ高感度に行うことができる。上記所定の酵素活性の変化の検出は、例えば、反応系にその酵素の基質を含有させて、一定期間経過後の基質量の変化を検出することにより行うことができるが、より簡便かつ高感度に検出し得る観点から、酵素活性の変化を視覚的に検出し得る発色基質や蛍光基質などを用いることが好ましい。具体的には、所定のタンパク質とパートナータンパク質が、βガラクトシダーゼのαフラグメントとそのωフラグメントの組み合わせである場合は、Galacton-Plus（登録商標）（Applied Biosystems社製）等の化学発光基質を用いることにより、βガラクトシダーゼ活性の発現や上昇を発光や発光量の増加として検出することができ、βラクタマーゼ（ＢＬＡ）の２４位〜１７０位のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｎ末端側フラグメント）とその１６８位〜２８６位のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｃ末端側フラグメント）の組み合わせの場合は、ニトロセフィン等の発色基質や、CCF2/AM, Fluorocillin Green 495/525 beta lactamase substrate（Invitrogen社製）等の蛍光基質を用いることにより、βラクタマーゼ活性の発現や上昇を、発色又は発光や、発色量又は発光量の増加として検出することができる。発色や発光の有無、発色量や発光量は、レーザー顕微鏡等を用いることにより、高感度で検出することができる。【００２５】
また、本発明の抗原の検出方法において、本発明の形質転換細胞を用いる場合は、上記所定のタンパク質とパートナータンパク質の結合の検出を、該形質転換細胞の増殖速度の変化を調べることによってより安価に好適に行うこともできる。例えば、所定のタンパク質とパートナータンパク質が、βラクタマーゼ（ＢＬＡ）の２４位〜１７０位のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｎ末端側フラグメント）とその１６８位〜２８６位のアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｃ末端側フラグメント）の組み合わせの場合、βラクタマーゼが、その形質転換細胞の宿主細胞の増殖を妨げるアンピシリンを分解する活性を有していることを利用して、上記所定のタンパク質とパートナータンパク質の結合を、形質転換細胞の増殖速度の上昇により検出することができる。形質転換細胞の増殖を利用した増殖アッセイの具体的な方法として、後述の実施例４に記載されている方法を好適に例示することができる。【００２６】
本発明の検出用キットとしては、所定のタンパク質とパートナータンパク質が、互いに結合していない場合に比べて互いに結合すると所定のタンパク質及び／又はパートナータンパク質が発揮する所定の酵素活性が変化するタンパク質である本発明の融合タンパク質又は本発明の形質転換細胞、並びに、前記酵素活性の変化を検出し得る発色基質又は発光基質を備えている限り特に制限されないが、サンプルが固体である場合にそれを懸濁するために用いる適当な溶媒をさらに備えていてもよい。【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、後述の実施例の概要を述べると、実施例１から２にかけて、本発明の融合タンパク質を発現するベクターを作製し、実施例６において、その本発明の融合タンパク質を発現する形質転換体の増殖アッセイを行い、その比較実験として、実施例３において、上記の本発明の融合タンパク質の分割変異体（上記の本発明の融合タンパク質において、リンカーを欠いたもの）を発現するベクターを作製し、実施例７において、その分割変異体を発現する形質転換体の増殖アッセイを行い、別の比較実験の準備として、実施例４において、上記の本発明の融合タンパク質の抗体分子欠失変異体（上記の本発明の融合タンパク質において、その抗体分子を欠失したもの）を発現するベクターを作製した。また、実施例５、８、９は、上記の増殖アッセイの結果が、ｃｐＢＬＡの活性相補を反映したものであることを確認等する目的で行った。さらに、実施例１０、１１において、上記の本発明の融合タンパク質が、その分割変異体や、その抗体分子欠失変異体と比較して、抗原存在下でのＢＬＡ活性の上昇が著しいことを確認した。加えて、実施例１２においては、上記の本発明の融合タンパク質における抗体分子を別の抗体分子に置き換え、その融合タンパク質が、その抗体分子に結合する抗原存在下において、その抗原依存的にＢＬＡ活性が上昇することを確認することによって、本発明の融合タンパク質の汎用性を確認した。
【実施例１】
【００２８】
［円順列変異体βラクタマーゼ（ｃｐＢＬＡ）遺伝子の調製］
野生型βラクタマーゼ（野生型ＢＬＡ）のＤＮＡ配列を鋳型としたＰＣＲ法により、野生型ＢＬＡタンパク質の２４−１７０位のアミノ酸配列（配列番号５）をコードするＤＮＡ断片（配列番号６）と、１６８−２８６位のアミノ酸配列（配列番号７）をコードするＤＮＡ断片（配列番号８）を調製した。より詳細には以下のような方法で調製を行った。【００２９】
まず、上記ＰＣＲ法のプライマーとして、以下の４種類のプライマーを用意した。
ＢＬＡ２４ｒｅｖ（配列番号９：CATTGGGACAAGAGCCACCCAGAAACGCTGGTGAAA）
ＢＬＡ１７０ｆｏｒ（配列番号１０：GGCGATATCGGCTTCATTCAGCTCCGGTTC）
ＢＬＡ１６８ｒｅｖ（配列番号１１：GGCGATATCAATGAAGCCATACCAAAC）
ＢＬＡ２８６ｆｏｒ（配列番号１２：TGGGTGGCTCTTGTCCCAATGCTTAATCAGTGA）
ＢＬＡ２４ｒｅｖ及びＢＬＡ２８６ｆｏｒの５’末端にはリンカー配列（配列番号９及び１２の７〜１５番目の塩基配列）を配置し、ＢＬＡ１７０ｆｏｒ及びＢＬＡ１６８ｒｅｖの５’末端には作製したＤＮＡ断片を挿入するための制限酵素切断部位としてＥｃｏＲＶの認識配列（配列番号１０及び１１の４〜９番目の塩基配列）を配置した。
なお、これらの４種類のプライマーは、Guntasらの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 11224-11229 (2005)）にならい、ＢＬＡの活性部位近傍の１６８位と１７０位を新規末端とする遺伝子断片を最終的に得るべく設計を行った。上記２４−１７０位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の増幅には、ＢＬＡ２４ｒｅｖ及びＢＬＡ１７０ｆｏｒを用い、上記１６８−２８６位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の増幅には、ＢＬＡ１６８ｒｅｖ及びＢＬＡ２８６ｆｏｒを用いた。【００３０】
また、上記ＰＣＲ法の鋳型として、野生型ＢＬＡ遺伝子をコードするベクターpET20b（＋）（メルク社製）を用い、酵素としてＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。具体的には、５０ｐｍｏｌずつの２種類のプライマー、１０ｎｇ  ｐＥＴ２０ｂ（＋）、０．２ｍＭ（反応溶液の最終濃度）ｄＮＴＰｓ、１０μｌ  Ｅｘ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５ｕｎｉｔ  Ｅｘ−Ｔａｑ  １μｌを混合して１００μｌの反応溶液とし、９４℃、５分間の後に、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間からなるサイクルを２５サイクル繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。このＰＣＲにより、野生型ＢＬＡタンパク質の２４−１７０位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片と、１６８−２８６位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を調製した。次いで、これらの２種類のＤＮＡ断片をＴＡＥ緩衝液を含む１％アガロースゲルで電気泳動した後、目的のバンドを含むゲルを切り出し、Wizard（登録商標） SV Gel and PCR Clean-Up System（プロメガ社製）を用いて精製した。【００３１】
得られた２種類のＤＮＡ断片を用いたoverlap extension  ＰＣＲによって、本来のＮ末端（２４位のアミノ酸）とＣ末端（２８６位のアミノ酸）を、ＤＫＳリンカー配列（アミノ酸配列：Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ；  塩基配列：gacaagagc）を介して結合し、１６８位と１７０位がそれぞれ新たなＮ末端及びＣ末端であるＰＣＲ断片（円順列変異体遺伝子）を調製した（図２の左上のコンストラクト；ｃｐＢＬＡ）。より詳細には、以下のような方法で調製を行った。
約１００ｎｇずつの２種類のＰＣＲ産物（野生型ＢＬＡタンパク質の２４−１７０位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片と、１６８−２８６位のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片）、０．２ｍＭ（反応溶液の最終濃度）ｄＮＴＰｓ、１０μｌ  Ｅｘ−Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ、５ｕｎｉｔ  Ｅｘ−Ｔａｑを混合して１００μｌの反応溶液とし、９４℃、５分間の後に９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分間からなるサイクルを１０サイクル繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。このようにして作製した目的のＢＬＡ円順列変異体遺伝子をｃｐＢＬＡ（アミノ酸配列：配列番号１３；  塩基配列：配列番号１４）と命名した。【００３２】
この後、ｃｐＢＬＡのＤＮＡのみを増幅するため、さきほど得られた反応溶液に２種類のプライマー（ＢＬＡ１６８ｒｅｖ及びＢＬＡ１７０ｆｏｒ）を５０ｐｍｏｌずつ、２．５ｕｎｉｔＥｘ−Ｔａｑを加え、９４℃で５分間の後に、９４℃で３０秒間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間からなるサイクルを２５サイクル繰り返した後、７２℃で１０分間反応させた。得られた反応溶液をアガロースゲルにて電気泳動し、目的サイズのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。さらに、その目的サイズのバンド部分のゲルを切り出し精製した。【００３３】
精製して得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）に組み込み、その塩基配列を確認した。より詳細な手順については以下に述べる。
ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  Ｖｅｃｔｏｒを使ったキットであって、Ｔａｑポリメラーゼで増幅した３’−ｄＡ突出末端を持つＰＣＲ産物をクローニング、シーケンスするのに適したＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Invitrogen社製）を使用した。１μｌのｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  Ｖｅｃｔｏｒに対し、等モル量の上記精製ＤＮＡ断片を加え、さらにSalt Solutionを１μｌ加えて室温で３０分間放置した。このligation mixtureを氷上で溶かした大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株（Tetr, Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA, lac, The, [F’, proAB, laclqZΔM15, Tn10(Tetr), Tn5(Kanr), Amy）に加え氷上で３０分間放置した後、４２℃で４５秒ヒートショックを与え、２００μｌのＳＯＣ培地（１Ｌあたり２０ｇ  bacto tryptone、５ｇ  bacto yeast extract、０．５ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｍｌ  ５Ｎ  ＮａＯＨ、２０ｍｌ  １Ｍ  グルコース、１０ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２、１０ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４）を加え３７℃で３０分間キュアリングして形質転換し、予め１０μｌの０．４Ｍ  ＩＰＴＧと２００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを撒いておいた１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコースを含むＬＢ寒天培地プレート（１Ｌあたり１０ｇ  bacto tryptone、 ５ｇ bactoyeastextract、５ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｍｌ  ５Ｎ  ＮａＯＨ、１５ｇ  ａｇａｒ）にて３７℃で一晩培養した。翌日、白いコロニー、青いコロニー各数個のうち白いコロニーを竹串でつつき、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ）とＴ３、Ｔ７の２本のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行なった。そのＰＣＲ産物をアガロースゲルにて泳動し、目的の大きさのバンドが確認できたコロニーのみを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む滅菌ＬＢ液体培地（１Ｌあたり１０ｇ  bacto tryptone、 ５ｇ bactoyeastextract、 ５ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｍｌ  ５Ｎ  ＮａＯＨ）に植菌して、３７℃で一晩培養した。培養して得られた菌体から、Wizard（登録商標） plus SV Minipreps（プロメガ社製）を用いてプラスミドを抽出し、ＡＢＩ３１００ＤＮＡシーケンサーを用いて、ＢＬＡ円順列変異体遺伝子（ｃｐＢＬＡ）の配列を確認した。このｃｐＢＬＡを有する上記プラスミドを、ｃｐＢＬＡ／ＴＯＰＯと命名した。
【実施例２】
【００３４】
［抗体−円順列変異体ＢＬＡ混成タンパク質発現ベクターの作製］
ネオニコチノイド系農薬イミダクロプリド（ＩＣＰ）を認識する抗体（３３Ｃ３−１−１：ＦＥＲＭＰ−１７０９４で寄託されたハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体：特開２０００−１９１６９８号公報）の可変領域をファージミドベクターpIT2（Nature Biotechnol., 18, 989-994 (2000)）に組込み，これを用いて常法に従い一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）提示ファージを調製しその抗原結合能を確認した（ｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＩＴ２）。このｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＩＴ２から、該抗体遺伝子をタンパク質大量発現用プラスミドベクターに移し替え、ｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＥＴ２６を作製した。より詳細には以下のような方法で調製を行った。【００３５】
ｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＩＴ２中の抗体遺伝子を、目的タンパクをペリプラズムに分泌させ発現させることができ、かつカナマイシン耐性を示すプラスミドｐＥＴ２６ｂ（＋）（メルク社製）に組み込んだ。ｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＩＴ２と、ｐＥＴ２６ｂ（＋）１μｇに対し、１０ｕｎｉｔ  ＮｃｏＩ（New England Biolabs社製）、１０ｕｎｉｔ  ＮｏｔＩ（New England Biolabs社製）、５μｌ  １０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ３（New England Biolabs社製）、５μｌの０．１％  ＢＳＡ（New England Biolabs社製）に滅菌水を加えて５０μｌにし、３７℃で１６時間制限酵素処理した。この制限酵素処理物をアガロースゲル電気泳動を行い切り出し精製したｓｃＦｖ（ＩＣＰ）遺伝子断片３μｌと、同様の制限酵素処理後に切り出し精製したベクター２μｌと、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡社製）５μｌを加え、１６℃で３０分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応により得られた反応液のうち５μｌを用いて、１００μｌの大腸菌ＴＯＰ１０株（F-mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZΔM15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara,leu)7697galU, galK, rpsL(StrR)endA1, nupG）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地プレートにて３７℃で一晩培養した。翌日、コロニー数個を竹串でつつき、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ社製）とＴ７ promoterとＴ７ terminatorの２本のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物をアガロースゲルにて泳動し、目的の大きさのバンドが確認できたコロニーのみを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地４ｍｌに植菌し、３７℃で一晩培養した。培養して得られた菌体からｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＥＴ２６を抽出した。【００３６】
ｃｐＢＬＡをコードするＤＮＡ断片を組み込むための制限酵素サイトとして、ＤｒａＩサイトをｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＥＴ２６中のリンカー領域にクイックチェンジ（ストラタジーン社製：登録商標）を用いたＰＣＲにより導入した（図２の右上のコンストラクト）。このＤｒａＩサイトで切断することによりｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＥＴ２６は平滑末端を持つリニアＤＮＡとなり、ＥｃｏＲＶ処理により同じく平滑末端を生じるｃｐＢＬＡ断片を組み込むことができる。ＤｒａＩサイトを導入するＰＣＲは以下のように行った。
１５ｐｍｏｌずつの後述の２種類のプライマー、１ｎｇ  ｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＥＴ２６、０．２ｍＭ（反応溶液の最終濃度）ｄＮＴＰｓ、２．５ｕｎｉｔ  PfuUltraHigh-Fidelity DNA Polymerase（ストラタジーン社製）、５μｌ  １０×PfuUltra reaction Buffer（ストラタジーン社製）を混合して５０μｌの反応溶液とし、９５℃、１分間の後に、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で１５分間からなるサイクルを１８サイクル繰り返した。用いたプライマーの配列は以下のとおりである。Ｄｒａ１ｒｅｖ（配列番号１５：GGTGGAGGCGGTTCAGGCTTTAAAGGCAGTGGCGGTGGCGGG）Ｄｒａ１ｆｏｒ（配列番号１６：CCCGCCACCGCCACTGCCTTTAAAGCCTGAACCGCCTCCACC）
（配列番号１５及び１６の１９〜２４番目の塩基配列はそれぞれＤｒａＩ切断部位である）【００３７】
上記ＰＣＲにより得られた反応液に１μｌ  ＤｐｎＩを加え、３７℃で１時間処理してメチル化された鋳型ＤＮＡを分解し、５μｌを用いて、１００μｌの大腸菌ＴＯＰ１０株を形質転換した。これを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地にて３７℃で一晩培養し、翌日生成したコロニー数個を竹串でつついて５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地４ｍｌに植菌し、３７℃で一晩培養した。培養して得られた菌体からプラスミドを抽出した後、ＡＢＩ３１００ＤＮＡシーケンサーを用いて配列を決定し、所定の位置ＤｒａＩサイトが導入されていることを確認した。【００３８】
次いで、ＤｒａＩサイトが導入されたｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＥＴ２６をＤｒａＩにて開裂したｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＥＴ２６に、ＥｃｏＲＶ処理したｃｐＢＬＡ断片を組み込み、抗体−円順列変異体酵素発現ベクターＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６（図２の中央下のコンストラクト）を作製した。より詳細な手順については以下に述べる。
１μｇ  ｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＥＴ２６に２０ｕｎｉｔ  ＤｒａＩ（New England Biolabs, NEB社製）、１０ｕｎｉｔ  Alkaline Phosphatase，Calf Intestinal（NEB社製）、１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ４（NEB社製）に滅菌水を加えて５０μｌにし、３７℃で１６時間制限酵素処理した。ベクターのセルフライゲーションを防ぐため、制限酵素処理と同時にアルカリフォスファターゼにて末端の脱リン酸化も行った。また、ｃｐＢＬＡ断片が組み込まれたｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター１μｇ、２０ｕｎｉｔ  ＥｃｏＲＶ（NEB社製）、１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ３、５μｌの０．１％  ＢＳＡに滅菌水を加えて５０μｌにし、３７℃で１６時間制限酵素処理した。この制限酵素処理物をアガロースゲル電気泳動を行い切り出し精製したｓｃＦｖ（ＩＣＰ）／ｐＥＴ２６ベクター３μｌと、同様の制限酵素処理後に切り出し精製したｃｐＢＬＡ断片３μｌと、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ６μｌを加え、１６℃で３０分ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応により得られた反応液のうち５μｌを用いて１００μｌの大腸菌ＴＯＰ１０株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ寒天培地プレートにて３７℃で一晩培養した。翌日、コロニー数個を竹串でつつき、ＴａｑポリメラーゼとＴ７プロモーターとＢＬＡ１７０ｆｏｒの２本のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行った。そのＰＣＲ産物をアガロースゲルにて泳動し、目的の大きさのバンドが確認できたコロニーのみを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ液体培地４ｍｌに植菌し、３７℃で一晩培養した。培養して得られた菌体からＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６（抗体−円順列変異体ＢＬＡ混成タンパク質発現ベクター）を抽出した。
【実施例３】
【００３９】
［抗体−分割・円順列変異体ＢＬＡ混成タンパク質発現ベクターの作製］
本発明の融合タンパク質におけるリンカーペプチドの意義を調べるため、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ中のリンカーペプチドをコードする配列に代えて、stopコドン及びＲＢＳをコードする配列を有する、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６（抗体−分割・円順列変異体ＢＬＡ混成タンパク質発現ベクター）を作製した。該ベクターのコンストラクトを図３に示す。このＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６は、図３に示すように、ＶＨ−ＢＬＡｃ（ＶＨ領域ポリペプチドと、野生型ＢＬＡタンパク質の１６８−２８６位のアミノ酸配列との融合タンパク質）と、ＢＬＡｎ−ＶＬ（ＶＬ領域ポリペプチドと、野生型ＢＬＡタンパク質の２４−１７０位のアミノ酸配列との融合タンパク質）を発現するベクターである。ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６の作製は、図４に示すような概要にしたがって、以下のような方法で行なった。【００４０】
まず、図４に示すようなコンストラクトのｐＢＲ３２２を用意した。このｐＢＲ３２２に対して、ＢＬＡｓｉｇＢａｃｋ（配列番号１７：TCACCATCACTAAGAAGGAGATATCATATGAGTATTCAACATTTCC）（５’末端から１〜１８番目のヌクレオチドがＢＬＡＨｉｓＦｏｒとのオーバーラップ領域）及びＢＬＡｄｒａＦｏｒ（配列番号１８：CGGCGACCGAGTTGCTCTTG）の２種類のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子から、シグナル配列を経て、ＢＬＡ前半部に存在するＤｒａＩサイトまでを増幅してその断片（ＢＬＡ−ＤｒａＩ断片）を得た。また、ｐＢＲ３２２に対して、ＢＬＡｂｓａＢａｃｋ（配列番号１９：ATGGAGGCGGATAAAGTTGC）及びＢＬＡＨｉｓＦｏｒ（配列番号２０：CCTTCTTAGTGATGGTGATGATGATGCCAATGCTTAATCAGTGAGGC）（５’末端から１〜１８番目のヌクレオチドがＢＬＡｓｉｇＢａｃｋとのオーバーラップ領域）の２種類のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｐＢＲ３２２のＢＬＡ後半部に存在するＢｓａＩサイトからＢＬＡタンパク質の２９６位までを増幅してその断片（ＢＬＡ−ＢｓａＩ断片）を得た。なお、ＢＬＡＨｉｓＦｏｒの５’末端にはＨｉｓ ｔａｇ をコードする配列の相補鎖が含まれており、これによってＶＨ−ＢＬＡｃのＣ末端に、精製のためのＨｉｓ ｔａｇが付加される。ＢＬＡ−ＤｒａＩ断片やＢＬＡ−ＢｓａＩ断片を増幅するＰＣＲは以下のように行った。【００４１】
５０ｐｍｏｌずつの２種類のプライマー（ＢＬＡ−ＤｒａＩ断片増幅用として、ＢＬＡｓｉｇＢａｃｋ及びＢＬＡｄｒａＦｏｒ；ＢＬＡ−ＢｓａＩ断片増幅用としてＢＬＡｂｓａＢａｃｋ及びＢＬＡＨｉｓＦｏｒ）、１０ｎｇ  ｐＢＲ３２２、０．２ｍＭ（反応溶液の最終濃度）のｄＮＴＰｓ、１０μｌ  １０´Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、５ｕｎｉｔ  Ｅｘ−Ｔａｑを混合して１００μｌの反応溶液とし、９５℃、５分間の後に、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなるサイクルを２５サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応させた。これらのＰＣＲにより得られたＢＬＡ−ＤｒａＩ断片やＢＬＡ−ＢｓａＩ断片を、ＴＡＥ緩衝液を含む１．５％アガロースゲルでそれぞれ電気泳動した後、目的のバンドを含むゲルを切り出し精製した。【００４２】
次に、精製したＢＬＡ−ＤｒａＩ断片及びＢＬＡ−ＢｓａＩ断片について、オーバーラップ・エクステンションＰＣＲを行なうことによって、ＢＬＡ−ＤｒａＩ断片とＢＬＡ−ＢｓａＩ断片とを結合させた（図４の中央のコンストラクト参照）。オーバーラップ・エクステンションＰＣＲは具体的に以下のような方法で行なった。
精製したＢＬＡ−ＤｒａＩ断片（約１００ｎｇ）及びＢＬＡ−ＢｓａＩ断片（約１００ｎｇ）、０．２ｍＭ（反応溶液の最終濃度）のｄＮＴＰｓ、１０mｌ  １０´Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、５ｕｎｉｔ  Ｅｘ−Ｔａｑを混合して１００mｌの反応溶液とし、９５℃、５分の後に９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間からなるサイクルを１５サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応させて反応液を得た。次いで、目的ＤＮＡ断片をさらに増やすため、得られた反応溶液に、ＢＬＡｂｓａＢａｃｋプライマー（５０ｐｍｏｌ）、ＢＬＡｄｒａＦｏｒプライマー（５０ｐｍｏｌ）、２．５ｕｎｉｔ  Ｅｘ−Ｔａｑを添加し、９５℃で５分間の後に、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間からなるサイクルを２５サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応させて反応液を得た。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動し、目的サイズのＤＮＡ断片が増幅されていることを確認した。次いで、目的サイズ近辺のゲルを切り出し、目的サイズのＤＮＡ断片を精製した。【００４３】
精製して得られたＤＮＡ断片をｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Invitrogen社製）に組み込み、その塩基配列を確認した。より詳細な手順については以下に述べる。
ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  Ｖｅｃｔｏｒを使ったキットであって、Ｔａｑポリメラーゼで増幅した３’−ｄＡ突出末端を持つＰＣＲ産物をクローニング、シーケンスするのに適したＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Invitrogen社製）を使用した。１μｌのｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  Ｖｅｃｔｏｒに対し、等モル量の上記精製ＤＮＡ断片を加え、さらにSalt Solutionを１μｌ加えて室温で３０分間放置した。このligation mixtureを氷上で溶かした大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ株（Tetr,Δ(mcrA)183, Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, endA1, supE44, thi-1, recA1, gyrA96, relA, lac, The, [F’, proAB, laclqZΔM15, Tn10(Tetr), Tn5(Kanr), Amy）に加え氷上で３０分間放置した後、４２℃で４５秒ヒートショックを与え、２００μｌのＳＯＣ培地（１Ｌあたり２０ｇ  bacto tryptone、５ｇ  bacto yeast extract、０．５ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｍｌ  ５Ｎ  ＮａＯＨ、２０ｍｌ  １Ｍ  グルコース、１０ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＣｌ２、１０ｍｌ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４）を加え３７℃で３０分間キュアリングして形質転換し、予め１０μｌの０．４Ｍ  ＩＰＴＧと２００μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  Ｘ−ｇａｌを撒いておいた１００μｇ／ｍｌアンピシリン、１％グルコースを含むＬＢ寒天培地プレート（１Ｌあたり１０ｇ  bacto tryptone、 ５ｇ bacto yeast extract、５ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｍｌ  ５Ｎ  ＮａＯＨ、１５ｇ  ａｇａｒ）にて３７℃で一晩培養した。翌日、白いコロニー、青いコロニー各数個のうち白いコロニーを竹串でつつき、Ｔａｑポリメラーゼ（タカラバイオ）とＴ３、Ｔ７の２本のプライマーを用いてコロニーＰＣＲを行なった。そのＰＣＲ産物をアガロースゲルにて泳動し、目的の大きさのバンドが確認できたコロニーのみを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む滅菌ＬＢ液体培地（１Ｌあたり１０ｇ  bacto tryptone、 ５ｇ bacto yeast extract、５ｇ  ＮａＣｌ、０．２ｍｌ  ５Ｎ  ＮａＯＨ）に植菌して、３７℃で一晩培養した。培養して得られた菌体からプラスミドを抽出し、ＡＢＩ３１００ＤＮＡシーケンサーを用いて、前述の精製ＤＮＡ断片の配列を決定し、その配列が、分割・円順列変異体ＢＬＡ（ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ）（図４の中央のコンストラクト参照）であることを確認した。このｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡを有する上記プラスミドを、ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ／ＴＯＰＯと命名した。【００４４】
１μｇのｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ／ＴＯＰＯに対し、１０ｕｎｉｔのＤｒａＩ、５μｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ２を添加し、さらにｍｉｌｌｉＱ水を添加して５０μｌに調整し、この溶液を３７℃で６時間処理後、５ｕｎｉｔのＢｓａＩを添加し、これを５０℃で一晩静置して制限酵素処理を行った。１μｇのｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ／ＴＯＰＯに代えて、１μｇのＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６を用いて、同様に、ＤｒａＩ及びＢｓａＩで制限酵素処理を行なった。制限酵素処理して得られたそれぞれの溶液をアガロースゲルにて泳動して精製したＤＮＡ溶液各５μｌにＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ  ｖｅｒ．２（東洋紡社製）をそれぞれ１０μｌ添加し、１６℃で３０分間ライゲーション反応を行った。このライゲーション反応により得られた反応液のうち５μｌを用いて、１００μｌの大腸菌ＴＯＰ１０株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地プレートにて３７℃で一晩培養した。翌日、シングルコロニーを４ｍｌのＬＢＫにてさらに一晩培養後、得られた菌体からプラスミドを抽出し、そのプラスミドのＤＮＡ配列を確認した。ＤＮＡ配列を確認した複数のプラスミドの中から、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６におけるＢｓａＩサイト・ＤｒａＩサイト間の配列が、ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡにおけるＢｓａＩサイト・ＤｒａＩサイト間の配列に置換されたプラスミド（図４）を見いだし、このプラスミドをＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６と命名した（図３）。
【実施例４】
【００４５】
［円順列変異体ＢＬＡタンパク質発現ベクターの作製］
本発明の融合タンパク質の１つであるＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６のコントロールとして、抗体遺伝子を持たない、ｃｐＢＬＡのみの発現ベクター（円順列変異体ＢＬＡタンパク質発現ベクター：ｃｐＢＬＡ／ｐＥＴ２６）（図５）を作製した。より詳細には以下のような方法で作製を行った。【００４６】
実施例１で作製したｃｐＢＬＡ／ＴＯＰＯを鋳型とするＰＣＲによって、末端にＮｃｏＩサイトとＸｈｏＩサイトが付加されたｃｐＢＬＡ遺伝子を増幅し、ｐＥＴ２６ｂ（＋）に組み込んだ。このＰＣＲは以下のように行なった。
５０ｐｍｏｌのＢＬＡ１６８Ｎｃｏｒｅｖ（配列番号２１：CATGCCATGGGCAATGAAGCCATACCAAAC）（５’末端から５〜１０番目のヌクレオチドがＮｃｏＩサイト）、５０ｐｍｏｌのＢＬＡ１７０Ｘｈｏｆｏｒ（配列番号２２：CCGCTCGAGGGCTTCATTCAGCTCCGGTTC）（５’末端から４〜９番目のヌクレオチドがＸｈｏサイト）、１０ｎｇのＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ＴＯＰＯ（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬをｐＣＲ４−ＴＯＰＯに組み込んだプラスミド）、０．２ｍＭ（反応溶液の最終濃度）のｄＮＴＰｓ、１０μｌの１０´Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、５ｕｎｉｔのＥｘ−ｔａｑを混合して１００mｌの反応溶液とし、９４℃で５分間の後に、９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなるサイクルを２５サイクル繰り返した後、７２℃で１０分間反応させて反応液を得た。得られた反応液をアガロースゲル電気泳動して精製を行った後、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩにて制限酵素処理した。この制限酵素処理した溶液をアガロースゲル電気泳動し、精製を行った。精製したＤＮＡ断片を、同じくＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ処理並びに精製を行ったｐＥＴ２６ｂ（＋）に組み込んで、ｃｐＢＬＡ／ｐＥＴ２６とした（図５）。
【実施例５】
【００４７】
［ＩＣＰの大腸菌に対する毒性の確認］
まず、後述の実施例６の増殖アッセイの前提として、ＩＣＰが大腸菌に対して毒性あるいは増殖促進活性がないことを調べるため、高濃度のＩＣＰを含む培地中での野生型ＢＬ２１（DE3,pLysS）株の増殖を以下の方法により調べた。
ＢＬ２１（DE3,pLysS）株を、３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地プレートにおいて３０℃にて一晩培養して生成したコロニーを竹串でつつき、３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地４ｍｌに植菌し、２７℃で一晩培養した。この前培養液４０μｌを、３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１００ｎｇ／ｍｌのＩＣＰを含むＬＢ液体培地４ｍｌに植菌し、２７℃で一晩培養しながら、Mini photo518R（タイテック社製）にて６６０ｎｍにおける濁度の経時変化を測定した。また、ＩＣＰを含まないこと以外は同じＬＢ液体培地を用いて、同様に濁度の経時変化を測定した。その結果を図６に示す。図６から分かるように、大腸菌ＢＬ２１（DE3,pLysS）株は、ＩＣＰの有無に関わらずほぼ同様の増殖曲線を示した。したがって、ＩＣＰの大腸菌に対する毒性および増殖促進活性はないと考えられる。
【実施例６】
【００４８】
［ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ発現株を用いた増殖アッセイ］
ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（抗体酵素混成タンパク質）の発現株が、目的抗原の有無の検出に用い得るかどうかを調べるために、この抗体酵素混成タンパク質の目的抗原であるＩＣＰ、およびＩＣＰの類似体でＩＣＰより交差反応性が低いことが確認されているチアクロプリド（ＴＣＰ）を用いて、目的抗原が抗体酵素混成タンパク質に結合した場合に発揮されるＢＬＡ活性の基質となり得るアンピシリンを用いた増殖アッセイを行った。より詳細には以下のような方法で行った。【００４９】
まず、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（抗体酵素混成タンパク質）の発現株の作製を行った。
０．５μｇ  ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６を用いて１００μｌのＢＬ２１（DE3, pLysS）株（F-, ompT, hsdSB, (rB-, mB-), dcm, gal, λ(DE3), pLysS, Cmr）を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地プレートにて３０℃で一晩培養することにより、抗体酵素混成タンパク質発現株（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株）を作製した。一晩培養した上記ＬＢ寒天培地プレートに生じたコロニーを竹串でつつき、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地４ｍｌに植菌し、２７℃で一晩培養した。この前培養液４μｌを、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、０又は１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、０−１０ｎｇ／ｍｌのＩＣＰ又はＴＣＰを含むＬＢ液体培地４ｍｌに植菌し、２７℃で３３時間培養しながら、Mini photo 518Rにて６６０ｎｍにおける濁度の経時変化を測定した。その結果を図７に示す。【００５０】
図７から分かるように、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地において、測定開始後２４時間前後から５−１０ｎｇ／ｍｌで，また３０時間前後から１ｎｇ／ｍｌという低濃度でＩＣＰ濃度依存的な増殖が確認された。これに対し、ＴＣＰは同濃度のＩＣＰを添加した場合よりも遅れて３０時間前後から増殖がみられ、１０ｎｇ／ｍｌＴＣＰを添加した場合に、１ｎｇ／ｍｌ  ＩＣＰを添加した場合と同程度の有意な増殖がみられた。一方、アンピシリンを含まない培地においては、アンピシリン含有培地よりも早く、抗原の種類、濃度によらずほぼ同様の増殖が見られた（図７）。なお、日本の農作物における含有農薬の基準値は２０−５０００ｎｇ／ｍｌであり(http://m5.ws001.squarestart.ne.jp/zaidan/agrdtl.php?a_inq=8800)、今回の結果は、本発明の誘導タンパク質が対象抗原に対して十分な感度を有しているといえる。
【実施例７】
【００５１】
［ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ発現株等を用いた増殖アッセイ］
上記実施例６のアッセイにおいて、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６に代えて、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６を用い、また、ＢＬ２１（DE3,pLysS）株に代えて、毒性の高いタンパク質の過剰発現に適している大腸菌Ｃ４３（DE3）株（Lucigen社製）を用いて、該株での発現を試みた。具体的には、０．５μｇのＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６を用いて、Ｃ４３（DE3）株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地プレートにて３０℃で一晩培養することにより、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ発現株（ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／Ｃ４３株）を作製した。一晩培養した上記ＬＢ寒天培地プレートに生じたコロニーを竹串でつつき、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン含むＬＢ（ＬＢＣ）液体培地４ｍｌに植菌し、２７℃で一晩培養した。この前培養液１０μｌを、１ｍＭのＩＰＴＧ、０又は１０μｇ／ｍｌのアンピシリン、１０ｎｇ／ｍｌのＩＣＰ又はＴＣＰを含むＬＢＫＣ液体培地１ｍｌに植菌し、２７℃で４５時間培養した後の６６０ｎｍにおける濁度をMini photo 518Rにて測定した。その結果を図８に示す。図８から分かるように、アンピシリン非添加時には、増殖の差は見られなかったものの、実施例６の場合より低い１０μｇ／ｍｌのアンピシリン添加時に、ようやくＩＣＰ依存的な増殖が確認された。しかし，１００μｇ／ｍｌのアンピシリン添加時，および１０ｎｇ／ｍｌ未満のＩＣＰあるいはＴＣＰ添加時には有意な増殖を確認することが出来なかった。更にＢＬ２１（DE3,pLysS）株を用いた場合には増殖が見られなかったことから，ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬではＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬに比べ低い抗原依存的酵素活性しか得られず，その結果低い抗原検出感度しか得られないものと考えられた。【００５２】
なお、同様の増殖アッセイを、ｃｐＢＬＡ発現株（ｃｐＢＬＡ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株やｃｐＢＬＡ／ｐＥＴ２６／Ｃ４３株）を用いて行なったところ、いずれのｃｐＢＬＡ発現株においても、抗原依存的な増殖は見られず、アンピシリン非添加時には、抗原の有無にかかわらず増殖し、アンピシリン添加時にはすべてのサンプルにおいて増殖しなかった。
【実施例８】
【００５３】
［Western blottingによる抗体酵素混成タンパク質発現の確認］
実施例６の増殖アッセイでは、培地中の抗原の有無や違いによって、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（抗体酵素混成タンパク質）の発現量が変化したことにより増殖速度の違いが生じた可能性を否定することはできないため、抗ＢＬＡ抗体を用いたWestern blottingにより、抗体酵素混成タンパク質発現株中の抗体酵素混成タンパク質の発現量の確認を行った。より詳細には以下のような方法で行った。【００５４】
抗体酵素混成タンパク質発現株（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株）を５０μｇ／ｍｌカナマイシンと３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地４ｍｌに植菌し、２７℃で一晩培養した。この前培養液４μｌを、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、１０  ｎｇ／ｍｌのＩＣＰ又はＴＣＰを含むＬＢ液体培地４ｍｌに植菌し、２７℃で一晩培養した。また、ＩＣＰ、ＴＣＰのいずれも含まないこと以外は同一の方法で一晩培養した。これらの培養によりＯＤ６６０が０．６程度にまで上昇した培養液１００μｌを１５０００ｒｐｍにて５分間遠心して菌体を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲル中のタンパク質のバンドをニトロセルロース膜（バイオラッド社製）に転写した後、このニトロセルロース膜をイムノブロック（大日本住友製薬社製）にて４℃で一晩静置してブロッキングを行った。このニトロセルロース膜を、ＰＢＳ−Ｔ（１０ｍＭ  リン酸、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．２、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）にて５分間の洗浄することを３回繰り返した後、１／５０００希釈したウサギ抗ＢＬＡポリクローナル抗体（Chemicon社製）を含む５％イムノブロック溶液にて室温で１時間反応させた。反応後のニトロセルロース膜を、ＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後、１／５０００希釈したHRP-Goat anti Rabbit  １ｇを含む５％イムノブロック溶液に浸して室温で１時間反応させた。反応後のニトロセルロース膜をＰＢＳ−Ｔにて３回洗浄した後、そのＨＲＰ活性をSuperSignal WestPico Chemiluminescent Substrate（Pierce社製）にて検出した。その結果を図９に示す。レーン１はＩＣＰ存在下で培養した菌体サンプルを、レーン２はＴＣＰ存在下で培養した菌体サンプルを、レーン３はＩＣＰ、ＴＣＰのいずれの抗原（Ａｇ）も含まない培地で培養した菌体サンプルを表す。【００５５】
図９から分かるように、抗原の種類を問わず、すべてのサンプルにおいて５８ｋＤ付近にほぼ同量のタンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）の発現が確認された（図９）。したがって、抗原（特にＩＣＰ）添加による増殖速度の上昇は、抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）の発現量の増加によるものではなく、抗原結合による抗体酵素混成タンパク質の構造安定化がもたらす酵素活性上昇によるものと考えられる。
【実施例９】
【００５６】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥやWestern blottingによる抗体酵素混成タンパク質発現の確認］
抗体酵素混成タンパク質発現株（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株）において、抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）が実際に発現されているかを確認するために、抗体酵素混成タンパク質発現株からの抗体酵素混成タンパク質の部分精製を行った。より詳細には以下のような方法で行った。【００５７】
抗体酵素混成タンパク質発現株（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株）を５０μｇ／ｍｌカナマイシンと３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地４ｍｌに植菌し、２７℃で一晩培養した。この培養液を５０μｇ／ｍｌカナマイシン、３７μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地（ＬＢＫＣ液体培地）２５０ｍｌに植菌し、Ｏ．Ｄ６００が約０．６に達したとき１Ｍ  ＩＰＴＧを２５０μｌ加えて発現を誘導後、２７℃でさらに１６時間培養した。その後、培養液を４℃条件下６０００ｇで１０分間遠心して回収した上清に１０７．５ｇの硫酸アンモニウムを加え４℃で一晩静置し、可溶性タンパク質を沈殿させた。この溶液を４℃条件下１００００ｇで２０分間遠心して上清を廃棄し、沈殿を１０ｍｌ  ＴＡＬＯＮ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  リン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）にて懸濁した。これに２００μｌのＴＡＬＯＮ金属アフィニティーカラム（クロンテック社製）を加え、説明書に従いバッチ／重力方式カラム精製法によりタンパク質を精製した。タンパク質の溶出にはＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  リン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用いた。この濃縮タンパク質を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果を図１０に示す。【００５８】
図１０から分かるように、レーン５の５８ｋＤ付近において、目的タンパク質である抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）の分子量に相当するバンドを確認した。【００５９】
また、ＢＬ２１（DE3,pLysS）株を、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６、ｃｐＢＬＡ／ｐＥＴ２６のそれぞれのベクターにて形質転換して得られたＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株、ｃｐＢＬＡ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株を、前述のＬＢＫＣ液体培地４ｍｌにそれぞれ植菌し、２７℃で一晩培養した。この培養液をＬＢＫＣ液体培地２５０ｍｌに植菌し、Ｏ．Ｄ６００が約０．６に達したとき１Ｍ  ＩＰＴＧを２５０μｌ加えて発現を誘導後、２７℃でさらに１６時間培養した。その後、培養液を４℃条件下６０００ｇで１０分間遠心して回収した上清に１０７．５ｇの硫酸アンモニウムを加え４℃で一晩静置し、可溶性タンパク質を沈殿させた。この溶液を４℃条件下１００００ｇで２０分間遠心して上清を廃棄し、沈殿を１０ｍｌ  ＴＡＬＯＮ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  リン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）にて懸濁した。これに２００μｌのＴＡＬＯＮ金属アフィニティーカラム（クロンテック社製）を加え、説明書に従いバッチ／重力方式カラム精製法によりタンパク質を精製した。タンパク質の溶出にはＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  リン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を用いた。この濃縮タンパク質溶液１０μｌを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった後、上記実施例８と同様の方法でWestern blottingを行なった結果、目的タンパク質の理論値付近の位置にそれぞれバンドを確認することができた。すなわち、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株については、５８ｋＤ付近にＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬと考えられるバンドが確認され、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株については、２８ｋＤ付近にＶＨ−ＢＬＡｃ、３１ｋＤ付近にＢＬＡｎ−ＶＬと考えられるバンドが確認され、ｃｐＢＬＡ／ｐＥＴ２６／ＢＬ２１株については、３０ｋＤ付近にｃｐＢＬＡと考えられるバンドが確認された。
【実施例１０】
【００６０】
［抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）等の抗原結合能の確認］
抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）が実際に抗原（ＩＣＰ）に結合する能力を有しているかどうか確認するために、以下のＥＬＩＳＡ実験を行った。
１０μｇ／ｍｌのＩＣＰ−ＢＳＡ又はＢＳＡを含むＰＢＳ溶液をＦａｌｃｏｎ３９１２マイクロプレートに１００μｌずつ分注し、４℃で１６時間静置した。マイクロプレートから溶液を廃棄した後、そこに２５％イムノブロックを含むＰＢＳを２００μｌ加え、室温で２時間置いてブロッキングを行った。次いで、マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、上記実施例９で得られた５０μｇ／ｍｌの精製抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）と５％イムノブロックを含むＰＢＳを１００μｌ加え室温で、９０分間静置した。ここまでの操作で固相化された抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）を検出するために、マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔ洗浄後、５％イムノブロックを含むＰＢＳで１／２０００に希釈したHRP標識PentaHis（QIAGEN社製、東京）を加え室温で１時間静置した。その後マイクロプレートをＰＢＳ−Ｔで三回洗浄した後、あらかじめ調製した酵素反応溶液（５０ｍｌ  ＥＬＩＳＡ  ｂｕｆｆｅｒ、ＴＭＢＺ（ｉｎ  ＤＭＳＯ）５００μｌ、Ｈ２Ｏ２  １０μｌ）を各ｗｅｌｌへ１００μｌずつ添加して反応を開始した。暗所で５分間反応させた後、３．２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を５０μｌずつ添加して反応を止め、プレートリーダーで吸光度を測定した（４５０ｎｍ）。【００６１】
また、上記のＥＬＩＳＡ実験の方法において、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬに代えて、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（ＶＨ−ＢＬＡｃ及びＢＬＡｎ−ＶＬ）又はｃｐＢＬＡを用いて、同様のＥＬＩＳＡ実験を行い、同様に吸光度を測定したその結果を図１１に示す。図１１から分かるように、ｃｐＢＬＡの場合と比較すると、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬのいずれの場合も、有意なＩＣＰ−ＢＳＡ特異的な結合が確認されたが、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬの場合はＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬの場合と比較しても顕著なＩＣＰ−ＢＳＡ特異的結合能が認められた。なお、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬにおいてはＶＨ−ＢＬＡｃとＢＬＡｎ−ＶＬの両方にＨｉｓ  ｔａｇが存在することを考慮すると、ＶＨ−ｓｐｌｉｔ・ｃｐＢＬＡ−ＶＬと比較したＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬのシグナルの高さは、図１１に示されている以上のものがある。また、ｃｐＢＬＡにおいては、ＩＣＰ（抗原）の有無にかかわらず、同程度の低いシグナルを示していることから、ＢＬＡのコンフォメーションが崩れ、非特異に結合している可能性がある。
【実施例１１】
【００６２】
［抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）の抗原結合による活性変化］
抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ）が抗原に結合することによって、実際に酵素活性の変化（上昇）が生じているかどうか確認するために、発色基質Nitrocefin（Calbiochem社製）又は蛍光基質Fluorocillin (Invitrogen社製)、及び、実施例９で濃縮したＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬを用いて以下の実験を行った。【００６３】
まず、実施例９で濃縮したＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬタンパク質溶液  ５μｌ、１０μｇ／ｍｌのＩＣＰ又はＴＣＰ  ５μｌ、及び、１ｍＭ  Nitrocefinを含むＰＢＳ  ９０μｌを混合し、室温で１８時間暗所に静置した。その後、その反応液について４９０ｎｍの吸光度を測定することによって、βラクタマーゼの活性の変化を調べた。また、ＩＣＰやＴＣＰに代えてＰＢＳを用いた場合（図１２中の「ＰＢＳ」の項目）や、ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬタンパク質溶液を添加しなかった場合（図１２中の「Nitrocefin」の項目）についても同様に４９０ｎｍの吸光度を測定した。その結果を図１２に示す。図１２から分かるように、ＩＣＰを添加したサンプルにおいて、これを加えなかったサンプル（「ＴＣＰ」、「ＰＢＳ」、「Nitrocefin」）と比較して有意なシグナル上昇が観察された。すなわち、ＩＣＰ依存的なβラクタマーゼ活性の上昇が認められた。また、ＴＣＰを添加したサンプルにおいても、ＩＣＰ、ＴＣＰのいずれも添加しなかったサンプル（「ＰＢＳ」）に比較してわずかながら有意な信号増加が観察された（ｎ＝２）。これにより、抗原添加により混成タンパク質の酵素活性が活性化されたと考えられる。【００６４】
次に、発色基質Nitrocefinに代えて蛍光基質Fluorocillinを用いて同様の実験を行なった。具体的には、実施例９で濃縮したＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬタンパク質溶液  ５μｌ、１０μｇ／ｍｌのＩＣＰ又はＴＣＰ  ５μｌを混合し、４℃にて３０分間インキュベーションした後に、１０μＭ  Fluorocillinを含むＰＢＳ  ９０μｌを添加し、室温で３０分間反応を行なった後に、マイクロプレートリーダーGenios Pro（TECAN社製）を用いて、４８５ｎｍで励起し、５３５ｎｍの蛍光を測定した。ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬタンパク質溶液を添加しなかった場合の測定値をバックグラウンドとして引いた値を図１３に示す。図１３から分かるように、ＩＣＰを添加したサンプルにおいて、これを加えなかったサンプル（「ＴＣＰ」、「ＰＢＳ」）と比較して有意なシグナル上昇が観察された。すなわち、ＩＣＰ依存的なβラクタマーゼ活性の上昇が認められた。
【実施例１２】
【００６５】
［抗ペプチド抗体酵素混成タンパク質を用いたペプチドの検出例］
本発明の融合タンパク質（抗体酵素混成タンパク質）を用いた抗原検出システムの汎用性を確かめるため、上記のＦｖとは異なる抗体Ｆｖを有する抗体酵素混成タンパク質を用いた検出系を構築し、同様の抗原依存的酵素活性変化が見られるかどうか検証した。すなわち、実施例３で作製したＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６におけるＶＨおよびＶＬ遺伝子を、抗オステオカルシンＣ末ペプチド抗体ＫＴＭ２１９（Anal. Chem. 79, 6197 (2007)）由来のものに置き換えた抗体酵素混成タンパク質を用いて、抗原ペプチドの検出実験を行なった。この実験は具体的には以下のような方法で行なった。【００６６】
まずＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６のＶＬ遺伝子の交換、および３‘側に存在する不要なＸｈｏＩサイトの除去のため、ＫＴＭ２１９のＶＬ遺伝子を以下のプライマーを用いて増幅した。５０ｐｍｏｌのＭＫｂａｃｋ２Ａ（配列番号２３：GCGCAAGCTCAGTCGACGGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA）（５’末端から１２〜１７番目のヌクレオチドがＳａｌＩサイト）、５０ｐｍｏｌのＶｋＮｏｔＦｏｒ（配列番号２４：ATGGTGCTCGACTGCGGCCGCCCGTTTTAT）、１０ｎｇのｐＫＳＴ２（ＫＴＭ２１９；Anal. Chem. 79, 6197 (2007)）、０．２ｍＭ（反応溶液の最終濃度）のｄＮＴＰｓ、１０μｌの１０´Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、５ｕｎｉｔのＥｘ−Ｔａｑを混合して１００mｌの反応溶液とし、９４℃で５分間の後に、９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなるサイクルを２５サイクル繰り返した後、７２℃で１０分間反応させて反応液を得た。更に得られた反応液をアガロースゲル電気泳動により精製した。次に同様にして５０ｐｍｏｌのＮｏｔｄＸｂａｃｋ（配列番号２５：GCAGTCGAGCACCATCACCACCACCAC）、５０ｐｍｏｌのｐＥＴＤｒａ３Ｆｏｒ（配列番号２６：TGAGTGTTGTTCCAGTTTGG）、１０ｎｇのＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６を用いてｐＥＴ２６のＮｏｔＩ−ＤｒａＩＩＩ領域を含む断片を増幅し、得られた反応液を同様に精製した。【００６７】
精製して得られたこれらのＤＮＡ断片、および、プライマーとしてＭＫｂａｃｋ２ＡとｐＥＴＤｒａ３Ｆｏｒを用いて、実施例１と同様にオーバーラップ・エクステンションＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を精製した後、該ＰＣＲ産物を制限酵素ＳａｌＩおよびＤｒａIIＩで処理して精製し、ＳａｌＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を得た。このＳａｌＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を、同じくＳａｌＩおよびＤｒａＩＩＩ処理並びに精製を行なったＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６に組み込み、該プラスミドをＶＨ（ＩＣＰ）−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（２１９）／ｐＥＴ２６とした。このプラスミドの配列を確認後、同様にしてプライマーＭ１３ＲＶ（配列番号２７：CAGGAAACAGCTATGAC）およびＪＨ１（配列番号２８：ACTGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC）、およびテンプレートとしてｐＫＳＴ２（ＫＴＭ２１９）を用いてＫＴＭ２１９ＶＨ遺伝子をＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物をＮｃｏＩ及びＸｈｏＩにて制限酵素処理して精製し、ＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。このＮｃｏＩ−ＸｈｏＩ断片を、同じくＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ処理並びに精製を行ったＶＨ（ＩＣＰ）−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（２１９）／ｐＥＴ２６に組み込み、該プラスミドをＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６（２１９）とした。【００６８】
［不溶性タンパク質の発現と精製、およびリフォールディング］
ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６（２１９）でＢＬ２１（DE3, pLysS）株を形質転換し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地プレートにて３０℃で一晩培養し、抗体酵素混成タンパク質発現株（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ／ｐＥＴ２６（２１９）／ＢＬ２１株）を作製した。コロニーを竹串でつつき、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンと３７μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ液体培地（ＬＢＣＫ培地）４ｍｌに植菌し、３７℃で一晩培養した。この前培養液２５０μｌをＬＢＣＫ培地２５０ｍｌに植菌して３７℃で培養し、ＯＤ６００が０．６に達した時点で終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加して３７℃で更に一晩培養した。その後、培養液を４℃条件下６０００ｇで１０分間遠心して回収し、２５ｍｌのＴＡＬＯＮ  Ｂｕｆｆｅｒに懸濁、氷上での超音波処理により菌体を破砕し、２．５μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（Novagen社製）および終濃度１ｍＭのＭｇＣｌ２を加え氷上３０分反応させてＤＮＡを分解した後、６０００ｇ１０分間遠心して上清をとり除いた。その後残ったペレットに２５ｍｌの１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１ｍＭ ＥＤＴＡを加えボルテックスし、６０００ｇ１０分遠心する操作を３回繰り返して不溶性画分を洗浄した。【００６９】
洗浄した沈殿（不溶性画分）を１０ｍｌ  ６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）を含むＴＡＬＯＮ  Ｂｕｆｆｅｒにて懸濁した。この懸濁液に２００μｌのＴＡＬＯＮ金属アフィニティーカラム（メルク社製）を加え、説明書に従った変性条件でのバッチ／重力方式カラム精製法によりタンパク質を精製した。タンパク質の溶出にはＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ  イミダゾール、５０ｍＭ  リン酸、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ，ｐＨ７．０）を用いた。【００７０】
溶出液中のタンパク質量をＵＶで定量し、溶出液のうち１５０μｌ（約３２０μｇのタンパク質を含む）を分取し、終濃度１０ｍＭの２メルカプトエタノールと同１ｍＭ ＥＤＴＡを加え、３０℃で３０分間おいたのち、Slide-A-Lyzer透析カセット(MW 10ｋcutoff, Pierce 社製)に移した。透析は、J. Immunol. Methods 219, 119 (1998)記載の透析外液（後述の透析外液１〜５）ならびに方法に従って、５００ｍＬの透析外液に対して４℃で２４時間ずつ計５回行い、最後に、４℃、１５ｋｒｐｍにて１０ｍｉｎ遠心して最終的に約１．７ｍｌの可溶化サンプルを得た。この可溶化サンプルには、３．７μＭの抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（２１９））が含まれていた。
透析外液１：５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，３Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；
透析外液２：５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，２Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；
透析外液３：５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，１Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１８０μＭ  ＧＳＳＧ，４００ｍＭ  Ｌ-アルギニン，ｐＨ８．０；
透析外液４：５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，０．５Ｍ  ＧｄｎＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；
透析外液５：５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；【００７１】
［抗体酵素混成タンパク質の活性測定］
上記により調製した抗体酵素混成タンパク質（ＶＨ−ｃｐＢＬＡ−ＶＬ（２１９））を用い、Fluorocillinを用いて活性測定を行った。５０μｌのＰＢＳ中に終濃度０−２０００ｎｇ／ｍｌの抗原ペプチドＢＧＰ−Ｃ７、および終濃度３００ｎＭの抗体酵素混成タンパク質を混合し、黒色マイクロプレートウェルに分注した。これに５０μＬ ＰＢＳ中の２μＭ Fluorocillinを加えて２８℃で６０分反応させ、反応液の蛍光強度（４８５ｎｍの励起光照射による５３５ｎｍの蛍光強度）を測定した。なおこの際、抗体酵素混成タンパク質を加えない対照実験を行い、これらのウェルの蛍光強度をバックグラウンドとして減算した。この結果、図１４に示すようにＢＧＰ−Ｃ７濃度依存的に有意な蛍光強度の増加がみられた。なお、本実験の測定は３連で行なった。図１４中の黒丸は測定値の平均値を表し、エラーバーは１ＳＤを示す。【００７２】
また、抗原としてＢＧＰ−Ｃ７以外のもの（ＢＧＰ-Ｃ８，ＢＧＰ−Ｃ１０，ＩＣＰ，ＴＣＰ各終濃度１μｇ/ｍｌ）を用いて、同様の実験を行った。その結果を図１５に示す。図１５の結果から分かるように、ＫＴＭ２１９を用いたオープンサンドイッチＥＬＩＳＡで検出が可能なＢＧＰ−Ｃ８、ＢＧＰ−Ｃ１０（Anal. Chem. 79, 6197 (2007)）では信号強度が増大したのに対し、特異的に認識されないＩＣＰ、ＴＣＰではＰＢＳと同じ信号強度しか得られなかった。なお、本実験の測定も３連で行なった。図１５中のグラフの値は測定値の平均値を表し、エラーバーは１ＳＤを示す。【００７３】
以上の実験結果より、本発明の融合タンパク質（抗体酵素混成タンパク質）を用いた抗原検出システムの汎用性と、目的抗原に対する特異性が示された。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明によれば、検出対象である抗原が低分子抗原であっても、より簡便、効率的、安定性良くかつ高感度で検出することができる。また、本発明の抗原の検出方法は、通常のＥＬＩＳＡ法とは異なり、結合しなかった標識２次抗体（非競合法）や標識抗原（競合法）などを洗浄する操作を要することなく測定し得る測定法（ホモジニアス法）であり、測定装置の自動化が容易で（操作が簡便で熟練を要さずに）迅速な測定が可能という点で、通常のＥＬＩＳＡ法に比べて非常に大きなメリットがある。そのため、本発明は、臨床診断、食品検査、環境分析等における免疫測定系にきわめて有用に用いることができる。
【図１】
2009016839.tif 000002
【図２】
2009016839.tif 000003
【図３】
2009016839.tif 000004
【図４】
2009016839.tif 000005
【図５】
2009016839.tif 000006
【図６】
2009016839.tif 000007
【図７】
2009016839.tif 000008
【図８】
2009016839.tif 000009
【図９】
2009016839.tif 000010
【図１０】
2009016839.tif 000011
【図１１】
2009016839.tif 000012
【図１２】
2009016839.tif 000013
【図１３】
2009016839.tif 000014
【図１４】
2009016839.tif 000015
【図１５】
2009016839.tif 000016
【配列表】
2009016839000001.app
【国際調査報告】
2009016839.tif 000017
2009016839.tif 000018
2009016839.tif 000019
2009016839.tif 000020