(57)【要約】本発明の心血管系組織培養用基材は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、前記発泡体は、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）の含有量が５０〜５４モル％、ε−カプロラクトンの含有量が５０〜４６モル％であるラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体からなり、前記補強材が前記発泡体によって被覆されたものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、
前記発泡体は、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）の含有量が５０〜５４モル％、ε−カプロラクトンの含有量が５０〜４６モル％であるラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体からなり、
前記補強材が前記発泡体によって被覆されたものであることを特徴とする心血管系組織培養用基材。
【請求項２】
生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、
前記発泡体は、厚みが０．２〜３．０ｍｍであり、
前記補強材が中心又は外面に位置し、内面は前記発泡体であることを特徴とする心血管系組織培養用基材。
【請求項３】
生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、
前記補強材は、生体吸収性材料でコーティングされた生体吸収性繊維からなり、
前記補強材が中心又は外面に位置し、内面は前記発泡体であることを特徴とする心血管系組織培養用基材。
【請求項４】
前記補強材は、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体でコーティングされたポリグリコール酸繊維からなることを特徴とする請求項３記載の心血管系組織培養用基材。
【請求項５】
生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、
前記補強材は、生体吸収性のマルチフィラメント糸に撚りをかけた撚糸からなり、
前記補強材が中心又は外面に位置し、内面は前記発泡体であることを特徴とする心血管系組織培養用基材。
【請求項６】
生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材及び生体吸収性材料からなる補強糸によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、
前記補強糸及び、補強材は前記発泡体の中心又は外面に位置し、内面は前記発泡体であることを特徴とする心血管系組織培養用基材。
【請求項７】
補強糸が、ポリ−Ｌ−ラクチド、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体及びグリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなることを特徴とする請求項６記載の心血管系組織培養用基材。
【請求項８】
補強糸がスパイラル状、リング状又はＸ字状で巻回されていることを特徴とする請求項６記載の心血管系組織培養用基材。
【請求項９】
請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の心血管系組織培養用基材に細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで播種し、更にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することを特徴とする基材表面が細胞で被われた移植用心血管系組織の製造方法。
【請求項１０】
請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の心血管系組織培養用基材に細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで播種し、更に培養することによって心血管系組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生することを特徴とする心血管系組織再生法。
【請求項１１】
請求項１、２、３、４、５、６、７又は８記載の心血管系組織培養用基材に内皮細胞、骨髄細胞、平滑筋細胞又は線維芽細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで播種し、更にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して得られることを特徴とする移植用心血管系組織。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を播種して移植することにより極めて高い効率で血管を再生することができる心血管系組織培養用基材、及び、これを用いた移植用心血管系組織の製造方法、心血管系組織再生法、移植用心血管系組織に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床において人工血管として最も使用されているのは、ゴアテックス等の非吸収性高分子を用いたものである。このような人工血管は、極めて血管に近い物性を発揮させることができ、短期的な血管の再建術には一定の成果をあげている。しかしながら、非吸収性高分子を用いた人工血管は、移植後長期にわたって異物が体内に残存することから、継続的に抗凝固剤等を投与しなければならないという問題があった。また、小児に使用した場合、成長に伴って改めて手術する必要が生じるという問題もあった。【０００３】
これに対して近年、いわゆる再生医療による組織再生方法が試みられている。再生医療とは、足場となる細胞培養基材に組織を構成する細胞を播種し、これを移植することによって、自己の組織を再生しようとする試みである。再生医療については、例えば皮膚（非特許文献１）や軟骨（非特許文献２）をはじめとする種々の組織について多くの研究例が報告されている。【０００４】
このような再生医療を血管再生術に応用すべく本願発明者らは、生体吸収性高分子からなる発泡体に、芯材として生体吸収性高分子からなる補強材を組み込んだ心血管系組織培養用基材を開発した（特許文献１）。この心血管系組織培養用基材においては、発泡体が播種した細胞をしっかりと接着できる足場となり、かつ、補強材が移植後に血管が再生するまでの期間、血流に耐えて強度を保たせる役割を果したり、縫合に耐える補強材の役目も果たす。発泡体と補強材とが共に生体吸収性高分子からなることにより血管再生後には材料が吸収されることから抗凝固剤等の継続的な使用は不要となる。更に、再生された血管は自己組織であるため成長も期待できる。実際、該心血管系組織培養用基材は、臨床的にも極めて有意義であることが確認されつつある。しかしながら、実際の臨床応用のためには、より一層の血管再生効率を目指すべきことはいうまでもない。
【特許文献１】特開２００１−７８７５０号公報
【非特許文献１】ＭＬ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｌ．Ｆ．Ｈａｎｓｂｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｌ．Ｓｐｉｅｌｖｏｇｅｌ  ｅｔ．ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，１２：２４３−２４８，１９９１
【非特許文献２】Ｃ．Ａ．Ｖａｃａｎｔｉ，Ｒ．ｌａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ，８８：７５３−７５９，１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
心血管系組織培養用基材に細胞を播種したものを移植したとき、血管が再生するか否かは、播種した細胞が充分量結合しているとか、血管が再生するまでに狭窄が生じないとかにかかっている。通常、細胞は培養液等に懸濁した懸濁液の状態で播種を行うことから、高効率な播種のためには、細胞培養用基材には柔軟で吸水性が高いことが求められる。一方、狭窄が生じないためには、チューブ状体がつぶれにくい機械的強度を有すること、即ち、チューブ状体を圧縮したときに高い圧縮弾性率を発揮し、口径を維持することが求められる。このように、柔軟で吸水性が高いことと圧縮弾性率が高いこととはトレードオフの関係にあり、両立の難しい課題であった。
本発明は、細胞の播種効率とつぶれにくさとを両立して、細胞を播種して移植することにより極めて高い効率で血管を再生することができる心血管系組織培養用基材、及び、これを用いた移植用心血管系組織の製造方法、心血管系組織再生法、移植用心血管系組織を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明１は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、前記発泡体は、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）の含有量が５０〜５４モル％、ε−カプロラクトンの含有量が５０〜４６モル％であるラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体からなり、前記補強材が前記発泡体によって被覆されたものである心血管系組織培養用基材である。【０００７】
本発明２は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、前記発泡体は、厚みが０．２〜３．０ｍｍであり、前記補強材が中心又は外面に位置し、内面は前記発泡体である心血管系組織培養用基材である。【０００８】
本発明３は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、前記補強材は、生体吸収性材料でコーティングされた生体吸収性繊維からなり、前記補強材が中心又は外面に位置し、内面は前記発泡体である心血管系組織培養用基材である。【０００９】
本発明４は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、前記補強材は、生体吸収性のマルチフィラメント糸に撚りをかけた撚糸からなり、前記補強材が中心又は外面に位置し、内面は前記発泡体である心血管系組織培養用基材である。【００１０】
本発明５は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材及び生体吸収性材料からなる補強糸によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材であって、前記補強糸及び、補強材は前記発泡体の中心又は外面に位置し、内面は前記発泡体である心血管系組織培養用基材である。
以下に本発明を詳述する。【００１１】
本発明者らは、鋭意検討の結果、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したチューブ状の心血管系組織培養用基材において、発泡体の材料として特定の組成比のラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体を用いる方法（本発明１）、発泡体の厚さを特定の範囲とする方法（本発明２）、補強材の材料として生体吸収性材料でコーティングされた生体吸収性繊維を用いる方法（本発明３）、補強材として撚糸からなるものを用いる方法（本発明４）、及び、更に生体吸収性材料からなる補強糸により補強する方法（本発明５）により、細胞の播種効率とつぶれにくさとを両立して、細胞を播種して移植することにより極めて高い効率で血管を再生することができる心血管系組織培養用基材が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
なお、本明細書においては、便宜上本発明１〜５として記載しているが、これらは単独で実施してもよく、併用してもかまわない。【００１２】
本発明の心血管系組織培養用基材は、生体吸収性材料からなる発泡体を生体吸収性材料からなる補強材によって強化したものである。このような構成によることにより、上記発泡体が播種した細胞がしっかりと接着できる足場となり、かつ、上記補強材が移植後に血管が再生するまでの期間、血流に耐えて強度を保たせる役割を果たす。また、発泡体と補強材とが共に生体吸収性高分子からなることにより血管再生後には材料が吸収されることから抗凝固剤等の継続的な使用は不要となる。更に、再生された血管は自己組織であるため成長も期待できる。
なお、本明細書において心血管系組織とは、血管、心臓弁、心膜等が挙げられる。【００１３】
上記発泡体の孔径は、播種した細胞が適当に接着し増殖することができるとともに、心血管系組織として移植した際にほとんど血液漏れしない程度であることが必要であり、具体的には好ましい下限は５μｍ、好ましい上限は１００μｍである。５μｍ未満であると、播種した細胞が発泡体の孔内に侵入できずに充分な播種効率が得られないことがあり、１００μｍを超えると、移植したときに血液漏れを起こすことがある。より好ましい下限は１０μｍ、より好ましい上限は５０μｍである。
なお、上記微細小孔の平均孔径は、例えば、水銀圧入法や画像解析法等の従来公知の方法により測定することができる。【００１４】
上記発泡体は、親水化処理が施されていてもよい。親水化処理を施すことにより、細胞懸濁液と接触させたときに速やかにこれを吸収することができ、細胞をより効率よく均一に播種することができる。
上記親水化処理としては特に限定されず、例えば、プラズマ処理、グロー放電処理、コロナ放電処理、オゾン処理、表面グラフト処理又は紫外線照射処理等が挙げられる。なかでも、人工血管用基材の外観を変化させることなく吸水率を飛躍的に向上できることからプラズマ処理が好適である。【００１５】
上記補強材としては、上記発泡体より高強度であるものであれば特に限定されず、例えば、繊維状体、不織布状体又はフィルム状体等が挙げられる。なかでも、生体吸収性材料からなる繊維を編織成した横編地、縦編地、組紐、織地等の繊維状体が好適である。【００１６】
本発明の心血管系組織培養用基材において、上記発泡体と補強材とは一体になっていることが好ましい。
上記発泡体と補強材との位置関係は、上記補強材が本発明の心血管系組織培養用基材であるチューブ状体の中心又は外面に位置し、かつ、チューブ状体の内面は上記発泡体である。このような構造により、上記補強材が強度を保たせる役割を充分に発揮することができ、また、血管の内側から再生を進めて早期の血管再生を行うことができる。【００１７】
本発明の心血管系組織培養用基材であるチューブ状体の内径及び長さは目的とする血管に合わせて選択すればよい。
本発明の心血管系組織培養用基材の厚みの好ましい下限は５０μｍ、好ましい上限は５ｍｍである。５０μｍ未満であると、血流に耐え得る充分な強度得られなかったり、縫合が困難になったりすることがあり、５ｍｍを超えると、吸収にかかる期間が徒に長くなり、狭窄の原因となることがある。【００１８】
上記発泡体、補強材及び補強糸を構成する生体吸収性材料としては、例えば、ポリグリコール酸、ポリラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）、ポリカプロラクトン、グリコール酸−ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体、ポリ（ｐ−ジオキサノン）等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。これらのなかから、各発明ごとに選択する。【００１９】
本発明１の心血管系組織培養用基材においては、上記発泡体は、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）の含有量が５０〜５４モル％、ε−カプロラクトンの含有量が５０〜４６モル％であるラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体からなる。このような組成比のラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体を用いることにより、充分量の細胞播種数を確保できる柔軟性、吸水性と、狭窄が生じないチューブ状体を圧縮したときの高い圧縮弾性率とを両立することができる。ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）の含有量が５０モル％未満であると（ε−カプロラクトンの含有量が５０モル％を超えると）、チューブ状体を圧縮するときの圧縮弾性率が低く狭窄を起こしやすいことがあり、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）の含有量が５４モル％を超えると（ε−カプロラクトンの含有量が４６モル％未満であると）、柔軟性に欠け吸水率が低くなり、充分量の細胞を播種できない。
なお、本明細書において上記ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体の組成比は、１種の共重合体のみを用いて該共重合体における各成分の組成比が上記範囲を満たすものであってもよく、組成比の異なる複数の種類の共重合体を併用して該複数の種類の共重合体全体としての各成分の組成比が上記範囲を満たすものであってもよい。【００２０】
本発明１の心血管系組織培養用基材においては、上記補強材は、ポリグリコール酸、ポリラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）、ポリカプロラクトン、グリコール酸−ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体及びポリ（ｐ−ジオキサノン）からなる群から選択される少なくとも１種からなる。【００２１】
本発明２の心血管系組織培養用基材においては、上記発泡体は、厚みの下限が０．２ｍｍ、上限が３．０ｍｍである。このような厚みの発泡体を用いることにより、充分量の細胞播種数を確保できる柔軟性、吸水性と、狭窄が生じないチューブ状体を圧縮したときの高い圧縮弾性率とを両立することができる。０．２ｍｍ未満であると、チューブ状体を圧縮するときの圧縮弾性率が低く狭窄を起こしやすいことがあり、３．０ｍｍを超えると、柔軟性に欠け吸水率が低くなり、充分量の細胞を播種できない。【００２２】
本発明２の心血管系組織培養用基材において上記発泡体の厚みを調整する方法としては特に限定されず、例えば、後述する製造方法にて本願発明の心血管系組織培養用基材を製造する際に、上記発泡体を形成する生体吸収性材料の溶液の濃度や量を調整する方法等が挙げられる。【００２３】
本発明２の心血管系組織培養用基材においては、上記発泡体及び補強材は、ポリグリコール酸、ポリラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）、ポリカプロラクトン、グリコール酸−ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体及びポリ（ｐ−ジオキサノン）からなる群から選択される少なくとも１種からなる。【００２４】
本発明３の心血管系組織培養用基材においては、上記補強材は、生体吸収性材料でコーティングされた生体吸収性繊維からなる。このような生体吸収性材料でコーティングされた生体吸収性繊維を用いることにより、充分量の細胞播種数を確保できる柔軟性、吸水性と、狭窄が生じないチューブ状体を圧縮したときの高い圧縮弾性率とを両立することができる。
上記生体吸収性材料でコーティングされた生体吸収性繊維としては特に限定されないが、例えば、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体でコーティングされたポリグリコール酸繊維が好適である。【００２５】
上記コーティングの方法としては特に限定されず、例えば、ポリグリコール酸繊維をラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体の溶液中に浸漬して引き上げた後乾燥させてから補強材を形成する方法、ポリグリコール酸繊維を用いて補強材を形成した後、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体の溶液中に浸漬して引き上げてから乾燥させる方法等が挙げられる。【００２６】
本発明３の心血管系組織培養用基材においては、上記発泡体は、ポリグリコール酸、ポリラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）、ポリカプロラクトン、グリコール酸−ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体及びポリ（ｐ−ジオキサノン）からなる群から選択される少なくとも１種からなる。【００２７】
本発明４の心血管系組織培養用基材においては、上記補強材は、生体吸収性のマルチフィラメント糸に撚りをかけた撚糸からなる。このような撚糸を用いることにより、充分量の細胞播種数を確保できる柔軟性、吸水性と、狭窄が生じないチューブ状体を圧縮したときの高い圧縮弾性率とを両立することができる。【００２８】
上記撚糸の撚りとしては、Ｓ撚り３５０Ｔ／ｍ以上、Ｚ撚り２２０Ｔ／ｍ以上であることが好ましい。これらの範囲外であると、充分な効果が得られないことがある。【００２９】
本発明４の心血管系組織培養用基材においては、上記発泡体及び補強材は、ポリグリコール酸、ポリラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）、ポリカプロラクトン、グリコール酸−ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）共重合体、グリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体及びポリ（ｐ−ジオキサノン）からなる群から選択される少なくとも１種からなる。【００３０】
本発明５の心血管系組織培養用基材においては、上記発泡体と補強材とからなる複合体を生体吸収性材料からなる補強糸によって更に強化している。補強糸により強化することにより、細胞の播種効率とつぶれにくさとを両立して、細胞を播種して移植することにより極めて高い効率で血管を再生することができる。上記補強糸は、発泡体の中心に位置しても、最外面に位置してもよい。【００３１】
上記補強糸は、スパイラル状、リング状又はＸ字状で上記発泡体と補強材とからなる複合体に巻回されていることが好ましい。このような態様にて補強糸が配置されることにより、得られる心血管系組織培養用基材がよりつぶれにくくなる。【００３２】
本発明５の心血管系組織培養用基材においては、上記補強糸は、ポリ−Ｌ−ラクチド、ラクチド（Ｄ、Ｌ、ＤＬ体）−ε−カプロラクトン共重合体及びグリコール酸−ε−カプロラクトン共重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなることが好ましい。【００３３】
本発明５の心血管系組織培養用基材に用いる補強糸の太さとしては特に限定されないが、断面直径の好ましい下限は０．１ｍｍ、好ましい上限は１ｍｍである。０．１ｍｍ未満であると、充分な補強効果が得られないことがあり、移植したときに周りからの圧迫に対し口径を保持できずに狭窄・閉塞につながる恐れがある。１ｍｍを超えると、硬化してしまうことある。補強糸の太さについては、１−０（断面直径が０．４〜０．５ｍｍ）、２−０（断面直径が０．３５〜０．４ｍｍ）、３−０（断面直径が０．２５〜０．３ｍｍ）等、ＵＳＰ縫合糸規格に従って表すこともできる。【００３４】
本発明５の心血管系組織培養用基材に用いる補強糸としては、モノフィラメント糸が好適である。モノフィラメント糸を用いることにより、より高い補強効果を発揮することができる。【００３５】
本発明の心血管系組織培養用基材を製造する方法としては特に限定されないが、例えば、予め調製した上記補強材を型枠に設置し、該型枠中に上記発泡体を形成する生体吸収性材料の溶液を流し込んでから凍結した後、凍結乾燥する方法（凍結乾燥法）、予め調製した上記補強材に水溶性物質と上記発泡体を形成する生体吸収性材料との混合溶液を付着させ乾燥した後、該水溶性物質を水洗によって洗い流す方法（溶出法）等が挙げられる。凍結乾燥法においては、凍結温度やポリマーの濃度等によって種々の孔径を有する発泡体が調製することができる。溶出法においては、水溶性物質の粒子を調整することにより発泡体の孔径を制御することができる。【００３６】
次に、本願発明の心血管系組織培養用基材に細胞を播種する方法について説明する。
播種する細胞としては、心血管系組織ではほぼ共通の細胞種を用いる。即ち、内皮細胞、骨髄細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞であり、通常は、これらの２種又は３種の混合培養細胞又は骨髄中の単核球成分を播種して組織構築を行う。
なお、本願発明の心血管系組織培養用基材は、細胞を播種することなく移植することも可能である。【００３７】
使用する細胞の培養条件、播種方法を以下に示す。下記Ａ〜Ｃは混合培養細胞を使う場合の心臓弁、心膜、血管作製の際の細胞採取、培養、播種方法を例示したものであり、Ｄは骨髄単核球成分を使う場合の方法を例示したものである。
Ａ．細胞単離、細胞培養、細胞数増大
完全清潔下に採取した血管組織を細胞培養液に浸漬し、クリーンベンチ内でリン酸化生食を用いて洗浄する。次に、ペトリディッシュ上で外科メスを用いて単純なｅｘｐｌａｎｔ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅに準じて組織の裁断を行う。約１〜２ｍｍ２大の細組織片を均等にディッシュ上に分配し、約２０分後、組織がディッシュ下面に強固に接着した後に培養液を加える。培養液は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％牛胎児血清と１％の抗生物質溶液（Ｌ−グルタミン２９．２ｍｇ／ｍＬ、ペニシリンＧ  １０００ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン硫酸塩１０，０００μｇ／ｍＬ）を補填したものを使用する。血管壁細胞は、通常５〜７日後には細胞が組織からディッシュ上に移動し始め、更に１週間後には混合細胞コロニーが組織片の周囲に形成される。その２〜３週後に混合細胞はディッシュ上でコンフルエントの状態を形成する。この状態になったら直ちに０．２５％トリプシンにて細胞を回収して継代培養を行う。継代培養は、例えば７５ｃｍ２の培養フラスコ上で行うが、概ねこのフラスコがコンフルエントになると約二百万個の細胞を得たことになる。５％ＣＯ２、２１％Ｏ２の環境下で継体培養を続け、通常は１０×１０６個程度の細胞数を得るまで培養を続ける。培養液は４〜５日ごとに交換するが、予備実験の結果では細胞の倍化時間は約４８時間である。なお、経過中の細胞数の算定はトリパンブルーによる古典的な染色法に従って行う。【００３８】
Ｂ．細胞隔離、内皮細胞純化
混合細胞がコンフルエントに達し、ある程度の細胞数が得られた段階で、以下の手順に従い、ＦＡＣＳを用いて混合細胞から内皮細胞を選別分離する。即ち、例えばバイオメディカルテクノロジー社のＤｉｌ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ＬＤＬ（蛍光色素マーカー）（以下Ｄｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ）を混合細胞培養液中に１μｇ／ｍＬの濃度で添加し、２４時間のインキュベーションを行う。このマーカーは内皮細胞、マクロファージに特有なスキャベンジャー経路を通過して細胞内に取り込まれる。２４時間後にトリプシン処理を行い、混合細胞浮遊液を作成し、セルソーター（ＦＡＣＳ  ｍａｃｈｉｎｅ：べクチンディケンソン社製）を使用してソートする。細胞は、その大きさと蛍光発光に基づいてＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ陽性と陰性に選別される。分離後これらを別々に培養し、内皮細胞が二百万個になるまで継続する。【００３９】
Ｃ．組織構築
組織を構築する第１段階は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞播種である。具体的には、本発明の心血管系組織培養用基材に約１００万個／ｃｍ２のＤｉｌ−Ａｃ−ＬＤＬ陰性の線維芽細胞を播種する。線維芽細胞播種直後３０〜６０分間は培養皿上でクリーンベンチ内に放置し、その後約５０ｍＬの培養液を添加する。培養液は基本的に毎日交換し、７日後、外科的移植の一日前に内皮細胞の細胞浮遊液（約二百万個）を更に播種し、この作業で単一層の内皮細胞化を図る。【００４０】
Ｄ．単核球の採取と播種
単核球の採取方法としては、まず、手術日当日に全身麻酔により鎮静・鎮痛が得られた後、手術時の清潔野と同等の清潔操作により腸棘より骨髄穿刺針を用い、抗凝固のためのヘパリン入りのシリンジに骨髄を採取する。得られた骨髄から骨片成分、脂肪成分、凝血成分を取り除くために、骨髄をまずクリーンベンチ内にてフィルターにかけた後、勾配液（例えば、商品名「Ｆｉｃｏｌｌ」：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の上部に静かに注入し、遠心を行う。その後、血漿成分を別に清潔下に分別し、また単核球層を分離する。単核球層の細胞塊のみを得るために更に遠心し、単核球の細胞塊を得る。
得られた細胞塊を、播種する心血管系組織培養用基材の大きさに合わせ、適宜分別してある自己血清にて希釈、攪拌し、用手的に心血管系組織培養用基材に播種する。
細胞播種後の心血管系組織培養用基材は、骨髄単核球細胞を温存するために、移植直前まで自己血清に浸した状態で、３７℃、５％二酸化炭素、１００％湿度のインキュベータ内に保存しておく。【００４１】
本発明の心血管系組織培養用基材に細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで播種し、更にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する基材表面が細胞で被われた移植用心血管系組織の製造方法もまた、本発明の１つである。
本発明の心血管系組織培養用基材に細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで播種し、更に培養することによって心血管系組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生する心血管系組織再生法もまた、本発明の１つである。
本発明の心血管系組織培養用基材に細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで播種し、更にｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養して得られる内皮細胞化された移植用心血管系組織もまた、本発明の１つである。【００４２】
本発明の移植用心血管系組織は、細胞の播種効率とつぶれにくさとを両立した本発明の心血管系組織培養用基材を用いていることにより、移植することにより極めて高い効率で血管を再生することができる。
本発明の移植用心血管系組織を移植する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、抗血栓薬、抗凝固薬、抗血小板薬、糖質コルチコイド薬（ステロイド薬）、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を併用することにより、より高い効果を得ることができる。なかでも、糖質コルチコイド薬（ステロイド薬）は極めて高い効果が得られる。【００４３】
上記抗血栓薬としては特に限定されず、例えば、アスピリン等が挙げられる。
上記抗凝固薬としては特に限定されず、例えば、ヘパリン、ワルファリン、アセノクマロール、フェニンジオン等が挙げられる。
上記抗血小板薬としては特に限定されず、例えば、シロスタゾール、アスピリン、チクロピジン等が挙げられる。
上記糖質コルチコイド薬（ステロイド薬）としては特に限定されず、例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、コルチゾール等が挙げられる。
上記非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）としては特に限定されず、例えば、アスピリン、ジクロフェナク、インドメタシン、イブプロフェン、ナプロキセン、等が挙げられる。【００４４】
上記糖質コルチコイド薬（ステロイド薬）等を併用する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。例えば、糖質コルチコイド薬（ステロイド薬）を併用する場合には、本発明の移植用心血管系組織を移植した後、一定期間、糖質コルチコイド薬（ステロイド薬）を経口投与することが考えられる。
【発明の効果】
【００４５】
本発明によれば、細胞を播種して移植することにより極めて高い効率で血管を再生することができる心血管系組織培養用基材、及び、これを用いた移植用心血管系組織の製造方法、心血管系組織再生法、移植用心血管系組織を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。【００４７】
（実験例１）
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）とＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比７５：２５）とを１００：０、９０：１０、８０：２０及び７０：３０の割合で混合することにより、Ｌ−ラクチド：ε−カプロラクトン（モル比）が５０：５０、５２．５：４７．５、５５：４５及び５７．５：４２．５であるＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体を調製し、この４重量％ジオキサン溶液を調製した。
外径１２ｍｍのテフロン（登録商標）製の棒に１４０デニールのポリグリコール酸糸にて筒状に編成した平編地を装着し、これを前記のＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体溶液中に浸漬し、−８０℃で凍結した後、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥した。次いで、これを反転させながらテフロン（登録商標）製の棒から外し、再度テフロン（登録商標）製の棒に装着した後、前記と同様の操作を行って、グリコール酸編地で補強されたサンドイッチ構造のチューブ状の心血管系組織培養用基材を得た。なお、発泡層(スポンジ層)の厚さは両面で計約１．３ｍｍであった。【００４８】
得られた心血管系組織培養用基材について、以下の方法にて評価を行った。
結果を表１に示した。【００４９】
（１）圧縮弾性試験
得られたチューブ状の心血管系組織培養用基材について、直径を１／２になるまで圧縮するときに必要な強度を求めた。この値が大きければ、狭窄に対し、高い口径維持力を有することを意味する。【００５０】
（２）引張試験
得られたチューブ状の心血管系組織培養用基材について、外径方向に引張ったときの最大点強力を求めた。この値が大きいことは、拍動に対する強さが強いことをあらわす。【００５１】
（３）吸水試験
得られたチューブ状の心血管系組織培養用基材を１ｃｍの大きさにカットしたものをサンプルとして、その重量を測定した。サンプルを生理食塩水中に浸漬し、指で１５回押して、サンプル中の気泡を押出した。軽く水を切った後、吸水後の重量を測定した。吸水前後のサンプルの重量から吸水率を算出した。この値が大きいことは、細胞懸濁液の吸収量が多いことを示す。【００５２】
【表１】
2008088042.tif 000002
【００５３】
（実験例２）
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）について２％、４％、６％、８％の４種類の濃度のジオキサン溶液を調製した。
外径１０ｍｍのテフロン（登録商標）製の棒に実施例１と同じ構成の筒状編地を装着し、これを前記のＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体溶液中に浸漬し、以後、実験例１と同じ条件、操作によりグリコール酸編地で補強されたサンドイッチ構造のチューブ状の心血管系組織培養用基材を得た。
得られた心血管系組織培養用基材の発泡体部分のみの一部を採取して測定したところ、その厚さはそれぞれ０．５５ｍｍ（２％濃度）、０．９０ｍｍ（４％濃度）、１．３０ｍｍ（６％濃度）及び２．１０ｍｍ（８％濃度）であった。
得られた心血管系組織培養用基材について、実験例１と同様の方法にて評価を行った。
結果を表２に示した。【００５４】
【表２】
2008088042.tif 000003
【００５５】
（実験例３）
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液、及び、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比７５：２５）の４重量％ジオキサン溶液を調製した。これらの溶液中に１４０デニールのポリグリコール酸繊維を浸漬し、ゆっくりと取り出した後乾燥して、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体でコーティングされたポリグリコール酸繊維を得た。得られたコーティングされたポリグリコール酸繊維を用いて実施例１と同じ編組織の筒状編地を編成し、補強材を得た。
これを実験例１と同じテフロン（登録商標）製の棒を装着し、以後、実験例１と同じ条件、操作によりコーティングされたポリグリコール酸編地で編成された補強材を有する０．９ｍｍの厚さの発泡層を有するサンドイッチ構造のチューブ状の心血管系組織培養用基材を得た。
コントロールとして、コーティングされていないポリグリコール酸繊維を用いて補強材を調製し、同様の方法により心血管系組織培養用基材を得た。
得られた心血管系組織培養用基材について、実験例１と同様の方法にて評価を行った。
結果を表３に示した。【００５６】
【表３】
2008088042.tif 000004
【００５７】
（実験例４）
１４０デニールのポリグリコール酸からなるマルチフィラメント糸（３５ｄ／１６フィラメント）を１本ずつＳ撚をかけた後、４本を束ねて合糸し、更にＺ撚りをかけて構成する撚糸において、低撚（単糸のＳ撚り１２０Ｔ／ｍ、合糸のＺ撚り７５Ｔ／ｍ）、中撚（単糸のＳ撚り６００Ｔ／ｍ、合糸のＺ撚り３７５Ｔ／ｍ）及び高撚（単糸のＳ撚り１２００Ｔ／ｍ、合糸のＺ撚り７５０Ｔ／ｍ）の３種類の撚糸を得た。
この撚糸をそれぞれ実施例１と同じ編組織の筒状編地に編成し、実験例１と同じテフロン（登録商標）製の棒の装着し、以後、実験例１と同じ条件、操作により、Ｌ−ラクチド−ε―カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液に浸漬し、０．９ｍｍの厚さの発泡層を有するサンドイッチ構造のチューブ状の心血管系組織培養用基材を得た。
得られた心血管系組織培養用基材について、実験例１と同様の方法にて評価を行った。
結果を表４に示した。【００５８】
【表４】
2008088042.tif 000005
【００５９】
（実験例５）
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液を調製した。
外径１０ｍｍのテフロン（登録商標）製の棒に１４０デニールのポリグリコール酸糸にて筒状に編成した平編地を装着し、これを前記のＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体溶液中に浸漬し、−８０℃で凍結した後、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥した。次いで、これを反転させながらテフロン（登録商標）製の棒から外し、再度、テフロン（登録商標）棒に装着した後、その表面に、Ｌ−ラクチド−ε―カプロラクトン共重合体のモノフィラメント糸（太さ１−０及び３−０の２種類）を３ｍｍ及び５ｍｍのピッチでスパイラル状に巻きつけた。これを前記のＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）４重量％ジオキサン溶液に３０秒間浸漬した後、−８０℃で凍結した後、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥して０．９ｍｍの厚さの発泡層を有するサンドイッチ構造の心血管系組織培養用基材を得た。
コントロールとして、モノフィラメント糸を巻き付けなかった以外は同様の方法により心血管系組織培養用基材を得た。
得られた心血管系組織培養用基材について、実験例１と同様の方法にて評価を行った。
結果を表５に示した。【００６０】
【表５】
2008088042.tif 000006
【００６１】
また、得られた心血管系組織培養用基材のうち３−０糸／３ｍｍピッチのものについて、イヌへの埋入実験を行った。
即ち、イヌ（ビーグル、体重約１０ｋｇ）７頭について、大腿骨骨頭、腸骨骨頭から、骨髄穿刺針を用いてヘパリン入りのシリンジに骨髄を採取した。得られた骨髄から骨片成分、脂肪成分、凝血成分を取り除くために、骨髄をまずクリーンベンチ内にてフィルターにかけた後、勾配液（商品名「Ｆｉｃｏｌｌ」：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の上部に静かに注入し、遠心を行った。その後、血漿成分を別に清潔下に分別し、また単核球層を分離した。単核球層の細胞塊のみを得るために更に遠心し、単核球の細胞塊を得た。得られた細胞塊を３ｃｍの長さに切断した心血管系組織培養用基材に播種した後、同一のイヌの下大静脈に移植した。
移植後２ヶ月経過後においても、７頭全て経過は順調であった。【００６２】
（実験例６）
グリコール酸−ε―カプロラクトン共重合体（モル比；７５／２５）のモノフィラメント糸（太さ１−０）を、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液に浸漬し、ゆっくりと取り出した後乾燥して、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体でコーティングされたグリコール酸−ε―カプロラクトン共重合体のモノフィラメント糸を得た。【００６３】
外径１０ｍｍのテフロン（登録商標）製の棒に１４０デニールのポリグリコール酸糸にて筒状に編成した平編地を装着し、これをＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体溶液中に浸漬し、−８０℃で凍結した後、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥した。次いで、これを反転させながらテフロン（登録商標）製の棒から外し、再度、テフロン（登録商標）棒に装着した。
次いで、その表面に、得られたＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体でコーティングされたグリコール酸−ε―カプロラクトン共重合体のモノフィラメント糸を３ｍｍのピッチでスパイラル状に巻きつけた。これをＬ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）４重量％ジオキサン溶液に３０秒間浸漬した後、−８０℃で凍結した後、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥して０．９ｍｍの厚さの発泡層を有するサンドイッチ構造の心血管系組織培養用基材を得た。【００６４】
得られた心血管系組織培養用基材においては、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体でコーティングされたグリコール酸−ε―カプロラクトン共重合体のモノフィラメント糸を用いたことにより、モノフィラメント糸に対する発泡層の接着性が高くなり、モノフィラメント糸が発泡層から外れにくくなった。【００６５】
（実験例７）
Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液を調製した。
外径１０ｍｍのテフロン（登録商標）製の棒に１４０デニールのポリグリコール酸糸にて筒状に編成した平編地を装着し、これを前記Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体溶液中に浸漬し、−８０℃で凍結した後、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥した。次いで、これを反転させながらテフロン（登録商標）製の棒から外し、再度、テフロン（登録商標）棒に装着した後、前記Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体溶液中に浸漬し、−８０℃で凍結した後、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥した。その表面に、Ｌ−ラクチド−ε―カプロラクトン共重合体のモノフィラメント糸（太さ１−０）を３ｍｍピッチでスパイラル状に巻きつけた。これを前記Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）４重量％ジオキサン溶液に３０秒間浸漬した後、−８０℃で凍結した後、−４０℃〜４０℃で１２時間凍結乾燥して０．９ｍｍの厚さの発泡層を有する３層構造の心血管系組織培養用基材を得た。
得られた心血管系組織培養用基材においては、３層構造としたことにより補強材がより強固に安定して保持された。【００６６】
（参考例）
１４０デニールのポリグリコール酸からなるマルチフィラメント糸（３５ｄ／１６フィラメント）を１本ずつＳ撚をかけた後、４本を束ねて合糸し、更にＺ撚りをかけて構成する撚糸において、低撚（単糸のＳ撚り１２０Ｔ／ｍ、合糸のＺ撚り７５Ｔ／ｍ）の撚糸を得た。
得られた低撚の撚糸を、実施例１と同じ編組織の筒状編地に編成し、実験例１と同じテフロン（登録商標）製の棒に装着し、以後、実験例１と同じ条件、操作により、Ｌ−ラクチド−ε―カプロラクトン共重合体（モル比５０：５０）の４重量％ジオキサン溶液に浸漬し、０．９ｍｍの厚さの発泡層を有するサンドイッチ構造のチューブ状の心血管系組織培養用基材を得た。【００６７】
イヌ（ビーグル、体重約１０ｋｇ）の大腿骨骨頭、腸骨骨頭から、骨髄穿刺針を用いてヘパリン入りのシリンジに骨髄を採取した。得られた骨髄から骨片成分、脂肪成分、凝血成分を取り除くために、骨髄をまずクリーンベンチ内にてフィルターにかけた後、勾配液（商品名「Ｆｉｃｏｌｌ」：Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）の上部に静かに注入し、遠心を行った。その後、血漿成分を別に清潔下に分別し、また単核球層を分離した。単核球層の細胞塊のみを得るために更に遠心し、単核球の細胞塊を得た。得られた細胞塊を３ｃｍの長さに切断した心血管系組織培養用基材に播種した後、同一のイヌの下大静脈に移植し、糖質コルチコイド薬（ステロイド薬）であるプレドニゾロン０．５ｍｇ／ｋｇを術後１ヶ月間餌に混ぜ投与した群と、投与しない群とを作製した（両群とも３頭ずつ）。
その結果、プレドニゾロンを投与した群では、白血球の上昇を抑制し、炎症反応を抑えることができた。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明によれば、細胞を播種して移植することにより極めて高い効率で血管を再生することができる心血管系組織培養用基材、及び、これを用いた移植用心血管系組織の製造方法、心血管系組織再生法、移植用心血管系組織を提供することができる。
【国際調査報告】
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