(57)【要約】  本発明は、培養ケラチノサイトにＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の少なくとも１種を作用させることにより炎症性サイトカインが誘導され、増殖が亢進されたことを特徴とする、炎症誘導と過剰増殖を伴う皮膚疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系及びその製造方法を提供する。
2008096868.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養ケラチノサイトにＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の少なくとも一方を作用させることにより炎症性サイトカインが誘導され、増殖が亢進されたことを特徴とする、炎症誘導と過剰増殖を伴う皮膚疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系。
【請求項２】
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の両方を作用させる、請求項１記載の皮膚疾患のｉｎ
ｖｉｔｒｏモデル系。
【請求項３】
前記過剰増殖皮膚疾患が乾癬である、請求項１又は２記載の皮膚疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系。
【請求項４】
前記Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が組換タンパク質である、請求項１〜３のいずれか１項記載の皮膚疾患モデル。
【請求項５】
炎症および過剰増殖を伴う皮膚疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系の作成方法であって、培養ケラチノサイトにＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の少なくとも一方を作用させることにより、炎症性サイトカインの発現と増殖を亢進させることを特徴とする、方法。
【請求項６】
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の両方を作用させる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記炎症性過剰増殖皮膚疾患が乾癬である、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
前記Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が組換タンパク質である、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症および過剰増殖を伴う皮膚疾患、例えば乾癬の病因・発症メカニズム、その治療に有効な方法の究明、並びに有効な薬剤のスクリーニングに利用できる皮膚疾患モデルを提供する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、最も一般的な皮膚疾患の１つである。西欧諸国での罹病率は約２％で、日本においても頻度は低いがその罹病率は増加しつつある（非特許文献１：Menter A et al., Lancet (1991) 338:231-234）。この疾患は表皮ケラチノサイトの過剰増殖および分化不全の結果として生じる赤色の肥厚した鱗状の表皮、さらにはＴ細胞、マクロファージ、好中球などの免疫細胞の顕著な浸潤を特徴とする。乾癬が致命的となることはまれで、病変は治療し易いものである。しかしながら、その症状は往々にして生涯にわたって再発することがあるので、患者のクオリティ・オブ・ライフにとっては今もなお深刻な課題であり続けている。【０００３】
近年、その病因に関して多大な研究がなされてきたにもかかわらず、乾癬をはじめとする炎症および過剰増殖を伴う皮膚性病変を発生させる分子学的および細胞学的機序の解明が依然として必要である（非特許文献２: Chamian F et al., Curr Opin Rheumatol (2004) 16:331-337）。乾癬等の炎症および過剰増殖を伴う皮膚疾患の病因の解明のため、適切な動物モデルの開発に多大な努力が費やされてきた。ＳＣＩＤマウスに移植した正常もしくは非病変性乾癬性皮膚組織に乾癬を有する患者から単離した活性化Ｔ細胞を注射するとその組織内において乾癬性病変が誘導されることで、乾癬の発症においてＴ細胞が果たす決定的な役割が実証されている（非特許文献３：Wrone-Smith T et al., J Clin Invest (1996) 98:1878-1887）。【０００４】
ケラチノサイトが乾癬の発症において重要な役割を担うというこの疾患の古典的な知見は、マウス表皮中での構成的に活性なＳＴＡＴ３の発現が乾癬様皮膚病変を誘導するとともに、乾癬の病原に結び付く数種の分子の発現を同時に亢進することが示されたことで再認識されることになった（非特許文献４：Sano S et al., Nat Med (2005) 11:43-49）。また最近、成体マウスにおけるJunBおよびcJunの表皮特異的欠失が乾癬様皮膚表現型をもたらすことが見出されている（非特許文献５：Zenz R et al., Nature (2005) 437:369-375）。このマウスでは、ヒト乾癬症例では往々にして観察されるが、動物モデルではめったに発症しない関節炎も観察された。そこでJunB/cJun欠失マウスモデルは、ヒト乾癬を最も高度に模倣すると考えられる。このようなマウスモデルは実験動物の飼育の他、被験物質の実験動物への投与や、皮膚観察、血液検査といった煩雑な作業を必要とし、また、そのための期間を要し、また動物愛護等の見地から見直しがせまられている。【０００５】
【非特許文献１】Lancet (1991) 338:231-234
【非特許文献２】Curr Opin Rheumatol (2004) 16:331-337
【非特許文献３】J Clin Invest (1996) 98:1878-1887
【非特許文献４】Nat Med (2005) 11:43-49
【非特許文献５】Nature (2005) 437:369-375
【非特許文献６】Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122
【非特許文献７】Trends Immunol (2003) 24:155-158
【非特許文献８】Nature (1987) 330:80-82
【非特許文献９】Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803
【非特許文献１０】Neurosci Lett (1998) 247:195-197
【非特許文献１１】Digestion (1995) 56:406-414
【非特許文献１２】J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653
【非特許文献１３】Am J Clin Pathol (1987) 87:681-699
【非特許文献１４】J Biol Chem (2001) 276:35818-35825
【非特許文献１５】J Invest Dermatol (1992). 99:299-305
【非特許文献１６】Hum Genet (2002) 111:310-313
【非特許文献１７】J Biol Chem (1992). 267:7499-7504
【非特許文献１８】J Immunol (1993) 150:2981-2991
【非特許文献１９】Biotechniques (1998) 24:954-958, 960, 962
【非特許文献２０】Hum Mol Genet (2001) 10:1793-1805
【非特許文献２１】Br J Dermatol (2003) 149:484-491
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、動物モデルを代替可能な、乾癬をはじめとする炎症および過剰増殖を伴う皮膚疾患モデルの提供にある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
JunB/cJunタンパク質を欠失させた後に最も早く発生する事象の１つとして、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の誘導がある。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、２０を超えるメンバーから構成されるＥＦ−ハンドカルシウム結合Ｓ１００タンパク質ファミリーに属する（非特許文献６：Marenholz I et al., Biochem Biophys Res Commun (2004) 322:1111-1122）。どちらのタンパク質も好中球、活性化単球、およびマクロファージによって分泌され、それらの細胞の化学走性分子として機能し、炎症性細胞の漸増に関する正のフィードバックループに関与する（非特許文献７：Roth J et al.,  Trends Immunol (2003) 24:155-158）。Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９陽性骨髄細胞は、炎症領域内に浸潤する最初の細胞である（非特許文献８：Odink K et al., Nature (1987) 330:80-82）。慢性関節リウマチ（非特許文献９：Liao H et al., Arthritis Rheum (2004） 50:3792-3803）、多発性硬化症（非特許文献１０：Bogumil T et al., Neurosci Lett (1998) 247:195-197）、クローン病（非特許文献１１：Lugering N, et al., Digestion (1995) 56:406-414）、および結合組織疾患（非特許文献１２：Kuruto R, et al., J Biochem (Tokyo) (1990) 108:650-653）を含む多数のヒト炎症性疾患で高いＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９血清レベルが観察されている。従って、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、炎症の誘導および伝播に重要な役割を担うと考えられている。【０００８】
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生は炎症細胞に制限されず、一部の上皮細胞、例えば活性化状態あるいは形質転換した状態で観察される（非特許文献１３：Brandtzaeg P et al., Am J Clin Pathol (1987) 87:681-699）。表皮中では、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は、創傷治癒（非特許文献１４：Thorey IS et al., J Biol Chem (2001) 276:35818-35825）および乾癬性病変（非特許文献１５：Madsen P et al., J Invest Dermatol (1992) 99:299-305）のような過剰増殖性ケラチノサイトにおいて発現亢進する。その遺伝子は乾癬感受性領域ＰＳＯＲＳ４内でコードされる（非特許文献１６：Semprini S et al., Hum Genet (2002) 111:310-313）。【０００９】
これらの知見にもかかわらず、上皮細胞中でＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が果たす生物学的機能は、炎症細胞への化学走性作用の可能性以外はほとんど知られていない（非特許文献１７：Lackmann M et al., J Biol Chem (1992) 267:7499-7504；非特許文献１８：Lackmann M et al J Immunol (1993) 150:2981-2991）。このため、本発明者は、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が表皮ケラチノサイトに直接作用するかどうかの解明を目指した。その結果、外因性Ｓ１００Ａ８／Ａ９は正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）を刺激して乾癬性病変において発現亢進される炎症性サイトカインを産生させ、さらにＳ１００Ａ８／Ａ９誘導性サイトカインがＮＨＫ中でのＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生および分泌を刺激することが解明された。さらに、Ｓ１００Ａ８／Ａ９自体がＮＨＥＫの増殖を増強することも見出された。これらの結果は、主要メディエーターとしてＳ１００Ａ８／Ａ９が関与するＮＨＥＫの増殖と炎症の正のフィードバック機構の存在、及びＳ１００Ａ８／Ａ９が乾癬の発生に重要な役割を担う可能性を示唆した。【００１０】
従って、本願は以下の発明を包含する：
（１）培養ケラチノサイトにＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の少なくとも一方を作用させることにより炎症性サイトカインが誘導され、増殖が亢進されたことを特徴とする、炎症誘導と過剰増殖を伴う皮膚疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系。
（２）Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の両方を作用させる、（１）の皮膚疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系。
（３）前記過剰増殖皮膚疾患が乾癬である、（１）又は（２）の皮膚疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系。
（４）前記Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が組換タンパク質である、（１）〜（３）のいずれかの皮膚疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系。
（５）炎症および過剰増殖を伴う皮膚疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系の作成方法であって、培養ケラチノサイトにＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の少なくとも一方を作用させることにより、炎症性サイトカインの発現と増殖を亢進させることを特徴とする、方法。
（６）Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の両方を作用させる、（５）の方法。
（７）前記過剰増殖皮膚疾患が乾癬である、（５）又は（６）の方法。
（８）前記Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が組換タンパク質である、（５）〜（７）のいずれかの方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の目的は、動物モデルを代替可能な炎症および過剰増殖を伴う皮膚疾患モデルの提供にある。この皮膚疾患モデルは、炎症及び／又は過剰増殖を伴う皮膚疾患、例えば乾癬の病因・発症メカニズム、その治療に有効な方法の究明、並びに有効な薬剤のスクリーニングに利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＮＨＥＫによるＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の産生および分泌を示す。
【図２】組換Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９タンパク質の調製およびＮＨＥＫにそれらを添加したときの形態変化を示す。（A）組換Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の純度を示す。（B）S100A8/A9（各5μg/mL）によるＮＨＥＫの形態学的変化を示す。ＧＳＴをコントロールとして使用した。
【図３】ＲＴ−ＰＣＲによってアッセイしたＮＨＥＫにおいてＳ１００Ａ８／Ｓ９により発現の亢進された遺伝子を示す。転写産物の量は、未処理コントロールの数値に対する倍率として表示する。
【図４】サイトカインによるＮＨＥＫ中でのＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の産生および分泌の刺激を示す。細胞抽出物量のコントロールとしてチューブリンの発現量を示した。
【図５】Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９によるＮＨＥＫの増殖刺激を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
培養ケラチノサイト
培養ケラチノサイトは動物の表皮由来のケラチノサイトを適当な培地、例えばEpiLife (Cascade Biologies社、米国、オレゴン州ポートランド)中において培養されたものを用いることができる。細胞は、ヒトに限らず、マウス、ラット、ブタ等の表皮由来の細胞でも良いが、好ましくはヒト由来細胞を利用する。【００１４】
Ｓ１００Ａ８およびＡ９
Ｓ１００Ａ８およびＡ９のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列は例えば非特許文献１６に公開されている。本発明において使用できるＳ１００Ａ８およびＡ９は、通常ヒト由来の天然型、あるいは組み換えタンパク質であるが、活性を有すれば改変型、異種由来、もしくは非精製品を用いることができる。Ｓ１００Ａ８およびＡ９の組換タンパク質は、当業界周知の方法に従い、例えば単離したまたはＰＣＲにより合成したＳ１００Ａ８又はＡ９遺伝子（ｃＤＮＡ)を例えばプラスミド、ウィルス等に挿入して発現ベクターを調製し、これを宿主細胞、例えば微生物、動物細胞又は植物細胞等の培養細胞に導入し、発現させることにより、大量調製することが可能である。
Ｓ１００Ａ８およびＡ９はケラチノサイトと同種であることが好ましいが、異種であっても炎症性サイトカインを誘導し、ケラチノサイトを増殖可能であれば、使用することができる。Ｓ１００Ａ８および／またはＡ９は、水や培地、例えばケラチノサイトの培養に適当な培地、例えば上記EpiLife培地に溶解し、培養系に添加する。添加量は、一概には規定できないが１ｎｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ程度、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌ程度、より好ましくは１００ｎｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌ程度の濃度とする。Ｓ１００Ａ８および／またはＡ９の添加は、好ましくは塩化カルシウムの存在下で行う。Ｓ１００Ａ８および／またはＡ９の存在下での培養時間、培養温度といった培養条件は特に制限されることはなく、ケラチノサイトの過剰増殖に十分な時間とする。好ましくは３０〜３７℃で１〜１４時間、より好ましくは３４〜３７℃で２〜７時間、好ましくはＣＯ２５％の下で培養する。
炎症性サイトカインとしては、限定することなく、ＴＮＦ，ＣＸＣＬ１，ＣＸＣＬ２，ＣＸＣＬ３，ＩＬ８，ＩＬ６，ＩＬ１Ｆ９，ＩＬ１ＲＮなどが挙げられる。【００１５】
本発明に係る皮膚疾患モデルは炎症および過剰増殖を伴う皮膚疾患の発症、進行、治癒などのメカニズムの解明や、有効な疾患治療方法の探索、有効な治療薬のスクリーニングに利用できる。炎症および過剰増殖を伴う皮膚疾患とは、皮膚の炎症に加えて表皮上のケラチノサイトが異常に過剰増殖し、皮膚の肥厚化などが認められる状態をいう。乾癬、アトピー性皮膚疾患、脂漏性皮膚炎など、紅斑、落屑、苔癬化といった各種湿疹の症状に伴い表皮肥厚を呈するすべての疾患を含み、その典型的な症状は乾癬である。【００１６】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
材料および方法
細胞および材料
新生児ヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ；KURABO社、日本国大阪府）は、０．０３ｍＭの低濃度のカルシウム及びＨＫＧＳ増殖添加剤（Cascade Biologics社）を含有するEpiLife（商標）培地又はEpiLife（商標）-KG2培地（Cascade Biologies社、米国、オレゴン州ポートランド）中で培養した。ＨＫＧＳは、０．２ ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、５μｇ／ｍｌのインスリン、０．１８ μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、及び０．２％（v/v）のウシ下垂体抽出物を含有している。ケラチノサイトは継代し、実験には第２〜４継代目のものを使用した。ＤＮＡ合成を測定するため、トリチウムチミジン（1 μCi/mL；ARC社、米国、ミズーリ州、セントルイス）を細胞回収の１時間前に培養物に加えた。組換ヒトＥＧＦ、ＴＮＦ−α及びＩＬ−６はPEPROTECH EC社（英国、ロンドン）から購入した。組換ヒトＩＬ１Ｆ９、ＩＬ−８／ＣＸＣＬ８及びＣＸＣＬ１はR&D Systems社（米国、ミネソタ州、ミネアポリス）から購入した。【００１８】
組換タンパク質の調製
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のｃＤＮＡをＰＣＲにより増幅させ、ｐＧＥＸ６Ｐ１（GE Healthcare Bio-Sciences社、米国、ニュージャージー州、ピスカタウェイ: BamH1-Xho1部位）にクローニングした。ベクターのヌクレオチド配列をＤＮＡシーケンシングによって確認した。大腸菌（Escherichia coli）（BL21-Codon Plus - (DE3)-RIL; STRATAGENE社、米国、カリフォルニア州、ラ・ホーヤ）をこのベクター（ｐＧＥＸ６Ｐ１、ｐＧＥＸ６Ｐ１−Ｓ１００Ａ８及びｐＧＥＸ６Ｐ１−Ｓ１００Ａ９）により形質転換させた。組換ＧＳＴ融合タンパク質は、Sephadex 4Bカラム（GE Healthcare Bio-Sciences社）を使用し、グルタチオン-アガロース親和性クロマトグラフィーによって精製した。ＧＳＴは、PreScissionプロテアーゼ（GE Healthcare Bio-Sciences社）で切断することで遊離させ、Sephadex 4Bカラムを使用して最終調製物から取り出した。【００１９】
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析は一般的な条件下で実施した。使用した抗体は以下の通りとした：抗ヒトチューブリン抗体（Sigma社、米国、ミズーリ州、セントルイス）、ウサギ抗ヒトＳ１００Ａ８（Calgranulin A）抗体（FL-83；Santa Cruz Biotechnology社、米国、カリフォルニア州、サンタクルーズ）およびウサギ抗ヒトＳ１００Ａ９（Calgranulin B）抗体（H-90；Santa Cruz Biotechnology社）。シグナルは、ＨＲＰ（ホースラディシュペルオキシダーゼ）標識合抗マウス抗体および抗ウサギＩｇＧ抗体（Cell Signaling Technology社、米国、マサチューセッツ州、ビバリー）、次に化学発光系（ECL plus、GE Healthcare Bio-Sciences社）によって可視化させた。培養培地中に分泌されたＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９を確認するため、培地中のタンパク質をメタノールを用いて沈降させ、細胞抽出物と同量のバッファーに溶解した。相対量を直接比較できるよう、細胞抽出物および培養培地由来の調製物は等量ウェスタンブロット分析にかけた。【００２０】
ＤＮＡマイクロアレイ
EpiLife（商標）-KG2（Cascade Biologies社）中で培養した増殖期のＮＨＥＫを、２ ｍＭの塩化カルシウム、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９（各１０μｇ／ｍｌ）を含有又は非含有の同培地に置換し、３時間にわたり曝露させた。全ＲＮＡをISOGEN（Nippon Gene社、日本国東京都）を用いて抽出し、RNeasyスピンカラム（Qiagen社、米国、カリフォルニア州、バレンシア）を用いて精製した。抽出したＲＮＡサンプルの260nm/280nm光度比はいずれも２．０以上であった。これらのＲＮＡサンプルよりＣｙ３及びＣｙ５ラベル化したＲＮＡを調製し、ヒト全ゲノムオリゴマイクロアレイ（Agilent Technologies社）に対し製造業者の推奨プロトコールにしたがってハイブリダイズさせた。このアレイ上の各スポットの蛍光画像をMicroarray Scanner Bundle G2565BA（Agilent Technologies社）により取り込み、得られたＴＩＦＦ画像はFeature Extractionソフトウエア（Agilent Technologies社）によって数値化した。gIsFeatNonUnifOL、rIsFeatNonUnifOL、gIsBGNonUnifOL、およびrIsBGNonUnifOLのフラグが認められたスポットはその後の分析から除外した。【００２１】
リアルタイム定量ＰＣＲ
ＮＨＥＫをＤＮＡマイクロアレイについて記載した条件と同様の条件下でＳ１００Ａ８／Ａ９に曝露させ、MagNA（商標） Pure mRNA抽出キットおよびMagNA Pure（商標）機器（Roche Diagnostics社、日本国、東京都）を用いてｍＲＮＡを抽出した。得られたｍＲＮＡは、SuperScript（商標） II（Invitrogen Corporation社、米国、カリフォルニア州、カールズバッド）を用いて逆転写させた。リアルタイム定量ＰＣＲは、製造業者の取扱説明書にしたがってLightCycler FastStart DNA master SYBR green Iキット（Roche Diagnostics社）を用いてLightCycler高速サーマルサイクラーシステム上で実施した。典型的な反応条件は、１０分間の活性化ステップ、それに続く９５℃で１５秒の変性、６０℃で１０秒のアニーリング、７２℃で１０秒の伸長からなるサイクル４０回であった。使用したプライマーは、下記の表１に示す。各プライマーの最終濃度は２０μｌの総反応容量中で０．２〜０．２５μＭとした。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）遺伝子を対照遺伝子として使用した。増幅させたフラグメントの特異性は融解曲線分析によって確認した。各遺伝子の発現レベルは、LightCycler分析用ソフトウエアを用いて定量分析した（非特許文献１９：Morrison TB et al., Biotechniques (1998)24:954-958, 960, 962）。目的のｍＲＮＡ量はＧＡＰＤＨ量で標準化し、最終的には未処理コントロールのｍＲＮＡの量に対する比率として表した。【００２２】
【表１】
2008096868.tif 000003
【００２３】
結果
ＮＨＥＫからの内因性Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の分泌
本発明者は、最初に、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が正常ヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ）によって産生および分泌されるかどうかについて試験した。ＮＨＥＫは、一般に１％のＨＫＧＳ（増殖添加剤；Cascade Biologics社製）を添加した基礎培地EpiLife中で培養させる。この条件下で、ＮＨＥＫは多量のＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９を産生し、それらを培地中に容易に分泌した（図１）。２４時間のインキュベーション後に分析すると、産生したＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の大部分が培地から回収された（１０ｍｌの培地中で約２０ｎｇのＳ１００Ａ９）。ＨＫＧＳは、これらのタンパク質の産生を用量依存式に誘導し、分泌させた。ＨＫＧＳは、０．２ｎｇ／ｍｌのEGF、５μｇ／ｍｌのインスリン、０．１８μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、及び０．２％（v/v）のウシ下垂体抽出物を含有している。ＥＧＦ単独でもＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生・分泌を増強することができた（図１）。チューブリンはコントロールとして試験した。【００２４】
ＮＨＥＫの遺伝子発現に外因性Ｓ１００Ａ８／Ａ９が及ぼす作用
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９は一般に、好中球および単球/マクロファージのための活性化因子および化学走性誘引物質として作用すると考えられている（非特許文献１７及び１８）。しかしながら、ヒト表皮ケラチノサイトがＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９を分泌すると、ケラチノサイト自体が必然的にこれらのタンパク質へ曝露させられる。そこでＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９が表皮ケラチノサイトに及ぼす可能性がある直接作用を調べるために、本発明者は、精製組み換えＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９タンパク質の混合物（Ｓ１００Ａ８／Ａ９）をＮＨＥＫ上に添加した。タンパク質調製物は、図２Ａに示すように十分に精製されていた。なお、これらのタンパク質は材料および方法の項に記載したとおりＧＳＴ融合タンパク質として産生させ、精製したものである。ゲルは、Coomassie Brilliant Blueを用いて染色した。矢印はＧＳＴの位置を示している。
本発明者はまた、Ｓ１００Ａ８／Ａ９が細胞の形態学的変化をもたらすことを見出した。つまり、細胞は辺縁がより平滑になり、細胞間接着を消失した（図２Ｂ）。この作用は、同一条件下で調製したＧＳＴではこのような作用が全く示されなかったので、調製物中の夾雑物ではなくＳ１００Ａ８／Ａ９によって誘導されたと考えられる。この所見により、本発明者は41,765個の遺伝子を網羅するＤＮＡマイクロアレイによってＮＨＫの遺伝子発現プロファイルにおける可能性のある変化について分析し、その結果、３時間にわたるＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９への細胞の曝露によって１９個の遺伝子発現が亢進された（＞２．０倍）ことを見出した（表２）。発現亢進された遺伝子群には、ＩＬ−８/ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＣＬ２０、ＩＬ−６、ＳＰＲＲ及びＴＮＦα並びにその関連タンパク質が含まれる。特に注目すべきなのは、発現亢進された遺伝子の大多数が乾癬性表皮中で発現していることが知られる遺伝子と共通することであり、その大部分が炎症性サイトカインであることである（非特許文献２０：Bowcock AM et al., Hum Mol Genet (2001) 10:1793-1805）。これら遺伝子の発現亢進を確認するために、本発明者は、３時間にわたりＳ１００Ａ８／Ａ９に曝露したＮＨＥＫのＲＴ−ＰＣＲを実施した（図３）。各遺伝子のｍＲＮＡレベルは、Ｓ１００Ａ８／Ａ９の用量および遺伝子の種類に依存して上昇した。試験した遺伝子のアップレギュレーションの程度は、２倍（ＴＮＦα）から９倍（ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８）程度で、ＤＮＡマイクロアレイの結果にほぼ一致した。【００２５】
【表２】
2008096868.tif 000004
【００２６】
ＮＨＥＫにおけるＳ１００Ａ８／Ａ９誘導性サイトカインにより増強されたＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生・分泌
本発明者は次に、Ｓ１００Ａ８／Ａ９誘導性サイトカインがＮＨＫ中のＳ１００Ａ８および／またはＳ１００Ａ９の産生に影響を及ぼすかどうかについて試験した。ＮＨＫを、ＨＫＧＳを含有しないが、サイトカインを添加したEpiLife基礎培地中で２４時間インキュベートした。分泌された全タンパク質の分画を大まかに算定できるよう、細胞抽出物および培養培地由来の同量の全タンパク質調製物をウェスタンブロット分析にかけた。図４に示すように、試験した全Ｓ１００Ａ８／Ａ９誘導性サイトカイン、即ちＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８／ＩＬ−８、ＩＬ−１ Ｆ９、ＩＬ−６、及びＴＮＦαは、用量依存式にＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９の産生および素早い分泌を促した。インターフェロンγもまた似たような作用を示した。なお、コントロールとして、Ｓ１００Ａ８やＳ１００Ａ９の代わりにチューブリンを作用させたものも試験した。これらの試験結果は、Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９ならびにＳ１００Ａ８／Ａ９によって誘導されたサイトカインが、ＮＨＫ中での産生および分泌に関して正のフィードバックループの構成員であることを示唆している。ＴＮＦα及びインターフェロンγの組み合わせはＮＨＫ中のＳ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９のｍＲＮＡレベルを効率的に増強することが報告されている（非特許文献２１：Mork G et al., Br J Dermatol (2003) 149:484-491）。【００２７】
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ８／Ａ９によるＮＨＥＫの増殖刺激
Ｓ１００Ａ８およびＳ１００Ａ９がＮＨＫの増殖に及ぼす作用を試験するため、ＮＨＫ細胞を、ＨＫＧＳを含有していないがＳ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９または両タンパク質の混合物の添加されたEpiLife基礎培地中で２４時間インキュベートした。細胞回収の１時間前に培地へ3Ｈ−チミジン（１μCi/mL）を添加し、不溶性分画中の放射能を測定した。ＧＳＴをコントロールとして使用した。図５に示すように、Ｓ１００Ａ８はＮＨＫの増殖を顕著に増強したが、Ｓ１００Ａ９は増強しなかった。両タンパク質の混合物は、Ｓ１００Ａ８単独の作用と比べ、ＮＨＥＫの増殖を一層強く増強した。Ｓ１００Ａ８／Ａ９の最適濃度は約100 ｎｇ／ｍｌであり、これより濃度を高くすると増殖増強は低下した。機能が明確に解明されていないＳ１００Ａ８/A９誘導性サイトカインの１つであるＩＬ−１ Ｆ９もＮＨＫの増殖を刺激した。
【図３】
2008096868.tif 000005
【図５】
2008096868.tif 000006
【図１】
2008096868.tif 000007
【図２】
2008096868.tif 000008
【図４】
2008096868.tif 000009
【配列表】
2008096868000001.app
【国際調査報告】
2008096868.tif 000010
2008096868.tif 000011
2008096868.tif 000012
2008096868.tif 000013
2008096868.tif 000014