(57)【要約】  食物などの試料中に含まれる可能性のあるアフラトキシンのすべてのタイプを検出・濃縮・精製すること、ならびにそれらの総量または個別の量を高感度に検出すること。アフラトキシンＢ２またはその誘導体をハプテン化合物に用い、各アフラトキシン類縁体間に対して同等の反応性を示すと同時に、有機溶媒に耐性の高い抗体を得て、当該抗体を用いた検出・濃縮・精製手段ならびに免疫学的検出手段を構築する。構築された検出手段は、高感度かつ定量性に優れている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフラトキシンＢ２又はその誘導体に由来する抗原を用いて得られる抗体またはそのフラグメントであって、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１のすべてに対して同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を有する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項２】
前記アフラトキシンＢ２の誘導体が以下の式（１）：
【化１】
2008059837.tif 000011
で表される構造を有する化合物である、請求項１に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項３】
前記アフラトキシンＢ２の誘導体に由来する抗原が、前記式（１）の化合物と高分子化合物との複合体である、請求項１または２に記載の抗体またはそのフラグメント。
【請求項４】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１から３までのいずれかに記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１から３までのいずれかに記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３である、請求項５に記載の抗体又はそのフラグメント。
【請求項７】
請求項５または６のいずれかに記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３１で国際寄託されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項１から６までのいずれかに記載の抗体又はそのフラグメントを用いる、アフラトキシンの免疫学的検出方法。
【請求項１０】
アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１からなる群より選択される１種またはそれ以上、あるいは総量を検出しうる請求項９に記載のアフラトキシンの免疫学的検出方法。
【請求項１１】
さらに、固相吸着剤を用いる、請求項９または１０に記載のアフラトキシンの免疫学的検出方法。
【請求項１２】
固相吸着剤およびそれに固定化した請求項１から６までのいずれかに記載の抗体又はそのフラグメントとを含む担体。
【請求項１３】
前記固相吸着剤が、セファロースである、請求項１２に記載の担体。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載の担体を含む、親和性カラム。
【請求項１５】
アフラトキシンを含む可能性のある試料を準備する工程；  請求項１４に記載の親和性カラム上に該試料を載せる工程；  および溶離剤をカラムに通して流出物を回収し、該アフラトキシンを該抗体又はそのフラグメントから溶離させて該流出物中に回収する工程とを含む、被検試料中のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法。
【請求項１６】
前記カラム上に試料を載せる工程において使用される溶剤が、濃度１（v/v）％以上２０（v/v）％以下のアセトニトリル、又は濃度１（v/v）％以上４０（v/v）％以下のメタノールである、請求項１５に記載のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法。
【請求項１７】
前記アフラトキシンが、Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１からなる群より選択される１種または２種以上である、請求項１５または１６に記載のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法。
【請求項１８】
アフラトキシン含有試料を、請求項１２または１３のいずれかに記載の担体上に保持された抗体又はそのフラグメントに捕捉させた後、溶出する、アフラトキシンを濃縮および／または精製する方法。
【請求項１９】
前記アフラトキシンが、Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１からなる群より選択される１種または２種以上である、請求項１８に記載のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法。
【請求項２０】
前記アフラトキシンが、Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１の総量である、請求項１５から１９のいずれかに記載のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフラトキシンに対する新規な性質を有する抗体またはそのフラグメントに関する。さらに本発明は、このような抗体またはそのフラグメントを用いた、アフラトキシンの捕捉用担体、親和性カラム、アフラトキシンの免疫学的検出方法、ならびに濃縮方法および精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カビが生産する天然毒アフラトキシンは発がん性毒素として知られ、ピーナッツ、ピーナッツバター等の加工品、とうもろこし、ハト麦、そば粉などの穀類及びその加工品、ナツメグ、白胡椒等の香辛料、ピスタチオナッツ等多くの食品から検出の可能性がある。アフラトキシン は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ 等の糸状菌が産生する２次代謝産物で、Ｂ1、Ｂ2、Ｇ1、Ｇ2およびその代謝物でアフラトキシンを摂取したウシの乳から見つかった水溶性のＭ１等の類縁体が知られており、それぞれ単離され、特徴づけがなされている。中でもアフラトキシン Ｂ1は、経口的に摂取された場合極めて高い発癌性を示すことが広く知られている。【０００３】
アフラトキシンＢ1以外のタイプのＢ２、Ｇ１、Ｇ２およびＭ１等の構造類似体アフラトキシンについても、動物種により多少の相違があり、Ｂ１ほど毒性は高くないとはいえ、種々の動物に発がん性および急性毒性が認められている。【０００４】
わが国では、食品衛生法により食品中のアフラトキシンＢ1濃度は１０ｐｐｂ以下に規制されているとともに、Ａ．ｆｌａｖｕｓやアフラトキシン Ｂ1が高頻度で検出されるピーナッツ、トウモロコシ、穀物類等で、汚染地域と考えられる国から輸入されるものについては、特に厳重な検査がなされている。検査においては、多数のサンプルを迅速に処理し、かつ微量のアフラトキシンを検出する必要があることから、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ＨＰＬＣ蛍光法、及び確認試験としてＬＣ/ＭＳ法が採用されている。【０００５】
これら化学的な分析法を使用する場合には、サンプルを粉砕後有機溶媒で抽出し、その抽出液を、濃縮精製する必要がある。濃縮精製手段には、通常液液分配やシリカゲルカラムクロマトグラフィー、フロリジルカラムクロマトグラフィーが用いられる。さらに、これらのクロマトグラフィーは濃縮精製効果が比較的低いことから、微量に汚染するアフラトキシンを検出するため、抗アフラトキシン抗体のアフラトキシンとの特異的結合能を利用した抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィーが用いられるようになった。しかし、既存の抗体カラムクロマトグラフィーは、使用されている抗体が有機溶媒に弱く、使用可能な有機溶媒が限られかつ低い濃度でしか使用できないという欠点があった。また、毒性の強いアフラトキシンB1に特異的な抗体は、多数開発され公表されているが、アフラトキシンＢ２、Ｇ1、Ｇ2、M１にも厳格に同等に反応するものはこれまで得られていなかった。アフラトキシンＢ２、Ｇ1、Ｇ2、M１についても発癌性を始めとする毒性があるため、最近の外国の規制では、アフラトキシンＢ１のみならず、すべてのアフラトキシンの個々の含有量及び総量を対象にしているところも多く、今後もこの傾向は増していくものと推定される。しかしながら、Ｂ１以外のタイプのアフラトキシンに対するモノクローナル抗体については、その必要性が高いにもかかわらず、研究は進んでいなかった。【０００６】
例としてあげると、これまで知られているアフラトキシンＢ１に対する抗体は、他のタイプのアフラトキシンに対する認識が弱いか、あるいは、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、およびＭ１のみを認識するモノクローナル抗体（例えば、Candlish J.E.ら, Letters in Appl.Microbiol. 1, 57 (1985); Ｇroopmanら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81, 7728 (1984),）、毒性の強い Ｂ１とＧ１のみを認識し、他のタイプを認識しないモノクローナル抗体（例えば、米国特許第４，８３５，１００号）などである。この他にも、Ｂ１をハプテンとし、Ｂ１に特異的な抗体として、Ｂ１あるいはＢ２に対する結合能と、Ｇ１に対する結合能とが桁違いに減少している場合（特開昭６３−２１９３９４）などがある。一方、全アフラトキシンの検出に有用なモノクローナル抗体として作成されている例（特開平４−３６０６９５）もあるが、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、およびＧ２の交差反応性は、IC50値の比較で、１／５から１/１０以上の開きがあり、実際のサンプルにおける検出用としては、各アフラトキシン類縁体間に対するばらつきが考えられる。【０００７】
一方、アフラトキシンＢ1に対するモノクローナル抗体を用いたアフラトキシンＢ１の定量方法が研究され（Hertzog P.J.ら、Carcinogenesis 3: pp.825-828 (1982))、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）等によってアフラトキシンＢ1の検出が実際に行われている。しかし、このような方法においても、抗体が有機溶媒に弱くかつ他の類縁体に対する反応性が低いことから、抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィー同様に抽出したサンプルを充分に希釈しなければならず、またアフラトキシン類縁体の含有比によっては正確に定量できない欠点があった。
【特許文献１】米国特許第４，８３５，１００号公報
【特許文献２】特開昭６３−２１９３９４
【特許文献３】特開平４−３６０６９５
【非特許文献１】Candlish J.E.ら, Letters in Appl.Microbiol. 1, 57 (1985)
【非特許文献２】Ｇroopmanら、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 81, 7728 (1984)
【非特許文献３】Hertzog P.J.ら、Carcinogenesis 3: pp.825-828 (1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、従来、アフラトキシンに対する抗体は、アフラトキシンが脂溶性でかつ4つの類縁体と1つの代謝物を測定する必要性があったにもかかわらず、有機溶媒に弱くかつ類縁体との反応性が同等でないという欠点があった。さらには、これらの抗体を利用した抗体アフィニティーカラムクロマトグラフィーは、同様に有機溶媒に弱くかつ全ての類縁体と代謝物を均等に濃縮精製することができなかった。また、さらには、これらの抗体を利用した免疫学的測定法は、抽出したサンプルを充分に希釈しなければならず、またアフラトキシン類縁体の含有比によっては正確に定量できない欠点があった。そのため、これらの一連の解決法が要望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、アフラトキシンＢ1、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１のすべてのタイプを同等に検出でき、かつ１０ｐｐｂ未満の極微量のアフラトキシンをも正確に検出するような検出方法を提供すべく鋭意研究を行った結果、アフラトキシンのすべてのタイプに同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を持つ抗体またはそのフラグメント、それを用いた検出方法等を見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち本発明の抗体またはそのフラグメントは、アフラトキシンＢ２又はその誘導体に由来する抗原を用いて得られる抗体またはそのフラグメントであって、アフラトキシンＢ1、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１のすべてに対して同等の結合能を有し、有機溶媒耐性を有する。【００１１】
本発明の１つの態様では、上記アフラトキシンＢ２の誘導体は、以下の式（１）：
【化１】
2008059837.tif 000002
で表される構造を有する化合物である。【００１２】
本発明の１つの態様では、上記アフラトキシンＢ２の誘導体に由来する抗原が、上記式（１）の化合物と高分子化合物との複合体である。【００１３】
上記抗体は、ポリクローナル抗体であり得る。【００１４】
上記抗体はモノクローナル抗体であり得る。【００１５】
上記モノクローナル抗体は、ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３である。【００１６】
本発明のハイブリドーマは、上記のいずれかのモノクローナル抗体を産生する。【００１７】
本発明のハイブリドーマは、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３１の下、２００７年１１月５日に独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国際寄託されているハイブリドーマであり得る。【００１８】
本発明のアフラトキシンの免疫学的検出方法は、上記のいずれかの抗体又はそのフラグメントを用いる。【００１９】
本発明のアフラトキシンの免疫学的検出方法は、上記のいずれかの抗体又はそのフラグメントを用い、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１のすべてを単独で、２種以上の組合せで、あるいは総量として検出しうる。【００２０】
本発明のアフラトキシンの免疫学的検出方法の１つの態様では、さらに、固相吸着剤を用いる。【００２１】
本発明の担体は、固相吸着剤およびそれに固定化した上記のいずれかの抗体又はそのフラグメントとを含む。【００２２】
上記固相吸着剤は、セファロースであり得る。【００２３】
本発明の親和性カラムは、上記のいずれかの担体を含む。【００２４】
本発明の被検試料中のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法においては、アフラトキシンを含む可能性のある試料を準備する工程；  上記の親和性カラム上に該試料を載せる工程；  および溶離剤をカラムに通して流出物を回収し、該アフラトキシンを該抗体又はそのフラグメントから溶離させて該流出物中に回収する工程とを含む。【００２５】
上記カラム上に試料を載せる工程において使用される溶剤は、濃度１（v/v）％以上２０（v/v）％以下のアセトニトリル、又は濃度１（v/v）％以上４０（v/v）％以下のメタノールであり得る。【００２６】
本発明のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法の別の態様においては、上記アフラトキシンが、Ｂ1、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１からなる群より選択される１種または２種以上である。【００２７】
本発明のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法において、アフラトキシン含有試料を、上記のいずれかの担体上に保持された抗体又はそのフラグメントに捕捉させた後、溶出する工程を含む。【００２８】
１つの態様において、本発明のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法では、上記アフラトキシンが、Ｂ1、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１からなる群より選択される１種または２種以上である。【００２９】
本発明のアフラトキシンを濃縮および／または精製する方法では、上記アフラトキシンは、Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１の総量としても得ることができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の抗体またはそのフラグメントは、アフラトキシンのすべてのタイプに同等の結合能を有し、かつ有機溶媒耐性を持つ。その為、この抗体またはそのフラグメントを利用したアフラトキシンの検出方法においては、アフラトキシンのすべてのタイプの総量または個別の量を同時に、かつ微量でも正確に検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】アフラトキシンＢ２−ＫＬＨ免疫マウス抗血清の間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるアフラトキシンＢ２に対する阻害曲線を示す。
【図２】抗体[ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３]を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるアフラトキシンに対する阻害曲線を示す。
【図３】メタノール存在下での抗体[ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３]を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるアフラトキシンＢ２に対する阻害曲線を示す。
【図４】アセトニトリル存在下での抗体[ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３]を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法におけるアフラトキシンＢ２に対する阻害曲線を示す。
【図５】抗体[ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３]を用いて調製したゲルを用いたアフィニティークロマトカラム（自社）と市販アフィニティークロマトカラムとの、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１およびＧ２を含む２０％アセトニトリル溶液を添加したときの回収率の比較を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
以下、本発明を詳細に説明する
本明細書において対象となる「アフラトキシン」とは、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１のいずれか１種を表すかまたは２以上のすべてを総称する。【００３３】
アフラトキシンＢ１は、以下の式
【化２】
2008059837.tif 000003
で表される化合物である。【００３４】
アフラトキシンＢ２は、以下の式
【化３】
2008059837.tif 000004
で表される化合物である。【００３５】
アフラトキシンＧ１は、以下の式
【化４】
2008059837.tif 000005
で表される化合物である。【００３６】
アフラトキシンG２は、以下の式
【化５】
2008059837.tif 000006
で表される化合物である。【００３７】
アフラトキシンM1は、以下の式
【化６】
2008059837.tif 000007
で表される化合物である。【００３８】
本明細書において用いられる、「同等の結合能を有する」または「同等に反応する」とは、Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１に対する反応性の違いが、ＩＣ50値（ng/ml）でＢ２に対する結合能を中心に±５０％以内であることを指す。【００３９】
本明細書において用いられる、「有機溶媒耐性」とは、被検試料を有機溶媒に溶解して親和性マトリックスと接触させる時点において、公知の各種有機溶媒に存在させても抗体またはそのフラグメントが変性を起さないことをいうが、特に、４０％メタノールあるいは２０％アセトニトリル中に少なくとも１時間存在させても、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１に対する反応性が変化しないことを指す。【００４０】
アフラトキシンに対する抗体を作製しようとする場合、タンパク質と結合可能な官能基を持ち、毒性も類縁体の中で最も高いアフラトキシンＢ１が一般的に免疫用のハプテン（免疫原）として用いられている。免疫原としてアフラトキシンＢ１誘導体を用いることにより、アフラトキシンＢ１に対し高い反応性を示し、かつアフラトキシンＢ１に特異性の高い抗体が作製できることは良く知られた事実である。【００４１】
一方、他の類縁体に対しても高い反応性を示す、すなわちアフラトキシンの少なくとも測定対象となる類縁体アフラトキシンＢ１、アフラトキシンＢ２、アフラトキシンＧ１、アフラトキシンＧ２、アフラトキシンＭ１と同等に反応する抗体は、参考例で示したように、免疫原としてアフラトキシンＢ１誘導体を用いた方法では得ることが出来なかった。この理由としては、アフラトキシンＢ１を免疫原とした場合、アフラトキシンＢ１のC-8,9間の二重結合の存在、すなわち、末端ジヒドロフラン環のC-8,9位のｓｐ2炭素によりこの部分が平面構造をとると同時に8位と9位の炭素間距離が短くなるため、8,9位にｓｐ３炭素を有するアフラトキシンＢ２と比較して立体的に障害が少なく、この平面ジヒドロフラン構造を強く認識するポケットを有した抗体ができやすく、この抗体とアフラトキシンＢ１とが結合した場合、その結合部位のポケットの最深部へ入り込み強固な結合を形成するため、アフラトキシンＢ１に強い認識力を持つのではないかと考えられた。一方、C-8,9位にｓｐ３炭素を有するアフラトキシンＢ２やＧ２については、テトラヒドロフラン環面に対し8,9位の上下方向に突き出た水素原子の存在によりアフラトキシンB1に比べより立体的に嵩高いために、このポケットの奥深くには入ることができず、その結果アフラトキシンＢ１に比較して格段に弱い認識力しか示さないものと推測された。また、アフラトキシンＭ1についても9a位に嵩高い水酸基が存在するため、アフラトキシンＢ２やＧ２と同様、このポケットに入り得ないのであろうと推測した。【００４２】
そこで、目的に見合う抗体を作製するためにハプテンのデザインを検討し、以下の理由でアフラトキシンＢ２をその候補に選択した。【００４３】
（１）  C-8,9間が単結合になっていて、アフラトキシンＢ1よりその近傍の構造が立体的に嵩高く、アフラトキシンＢ２を認識する抗体はアフラトキシンＢ１をも認識し得るものと考えられる。（２）アフラトキシンＧ１とアフラトキシンＧ２は、アフラトキシンＢ１とアフラトキシンＢ２と比較して、キャリアタンパク質との結合部位近傍で構造が違うのみなので、得られた抗体は両者の違いをそれ程認識しない抗体が含まれる可能性が高い。この仮説が正しければ、これらの抗体の中からモノクローナル抗体作製技術によって、アフラトキシンＢ１、アフラトキシンＢ２、アフラトキシンＧ１、アフラトキシンＧ２と等価に反応する抗体を選択することが可能と考えられる。（３）アフラトキシンＭ１については、免疫原にアフラトキシンＢ２を用いても反応性の高い抗体を得る可能性は上記アフラトキシンＧ１、アフラトキシンＧ２の場合より低いと想定される。しかし、アフラトキシンＢ２を免疫原とすることによって、アフラトキシンＭ１の水酸基が納まる空間を持つ抗体が産生される可能性は、アフラトキシンＢ１と比較して高いと考えられる。実際、アフラトキシンＢ１を免疫原とした場合に得られた抗体でも、全くアフラトキシンＭ１と反応しないわけではなく数十分の一程度の反応性を示すことが多い。そこで、アフラトキシンＢ２誘導体を免疫原とすることで、アフラトキシンＢ１誘導体を免疫原として用いるよりもアフラトキシンＭ１との反応性が高い抗体を得ることは可能と考えられる。【００４４】
これらの作業仮説を勘案し、アフラトキシンの各類縁体に同等に反応する抗体を作製するため、アフラトキシンＢ２をハプテンとして選択し、モノクローナル抗体作製技術により、目的の反応性を示す抗体の作製を目指すことにした。【００４５】
本発明に用いられるアフラトキシンＢ２またはその誘導体に由来する抗原は、アフラトキシンＢ２自体、アフラトキシンＢ２から公知の様々な方法を用いて誘導される化合物と、高分子化合物との複合体が好都合に使用され得る。【００４６】
ここで、アフラトキシンＢ２誘導体は、アフラトキシンＢ２に、特に高分子化合物との結合を容易にする為の公知の様々な反応基を導入した化合物を指す。本明細書でアフラトキシンＢ２誘導体というときには、下記の骨格を有し、
【化７】
2008059837.tif 000008
かつ、アフラトキシンＢ２の1位または１１位のカルボニル基に反応基を導入した化合物を指す。【００４７】
特に好ましいアフラトキシンＢ２誘導体は、式（１）で表される化合物であり、限定はされないが、例えばアフラトキシンＢ２の１位のケトン基を、Chu, F. S.,  Hsia, M-T. S., Sun. P., J. Assoc. Off. Anal. Chem. 60, 791 (1977)の記載に準じて、カルボキシメトキシイミノ誘導体に変換することにより得ることができる。【００４８】
上述のような製造方法によって得られた化合物を、必要に応じてシリカゲルクロマトグラフィー又は再結晶操作等を行うことにより、純度の高い、目的の化合物を得ることができる。【００４９】
次に、アフラトキシンＢ２誘導体と高分子化合物との複合体の作製は、限定はされないが、例えば以下のような方法を用いて、製造することができ、免疫用抗原として使用する。【００５０】
好ましい高分子化合物の例としては、スカシガイへモシアニン（ＫＬＨ）、卵白アルブミン（ＯＶＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）などがある。【００５１】
アフラトキシンＢ２誘導体と高分子化合物との結合は、例えば、誘導体中のカルボキシル基と高分子化合物とを活性化エステル法（Ａ．Ｅ．Ｋaru ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，42， 301−309（１９９４））、又は混合酸無水物法（Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒｅｔ ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，234， 1090‐1094（1954））等の公知の方法によって結合させることにより達成することができるが、特に限定はされない。【００５２】
さらに、上記と同様の方法により酵素等の標識物質をアフラトキシンＢ２誘導体に結合させたものを、免疫学的検出方法において使用することができる。標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質などがある。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［125I］、［131I］、［3H］、［14C］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（以下「ＨＲＰ」と言う）、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。【００５３】
本発明では、アフラトキシンＢ２誘導体と高分子化合物との複合体を抗原として用いることにより、アフラトキシンに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を得ることができる。【００５４】
ポリクローナル抗体の作製は、例えば、式（１）の化合物のようなアフラトキシンＢ２誘導体と高分子化合物との複合体を用いて、各種動物の抗体産生が可能な部位、例えば腹腔内注入、静脈注入、皮下注射などの投与方法によって投与することにより、行いうる。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバント、又は不完全フロイントアジュバントを投与することもできる。【００５５】
抗原の投与は、１回のみでも良いが、通常は２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。ポリクローナル抗体を作製する動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられる。【００５６】
血清中の本発明の抗原に対する抗体価の測定は、液相法（例えば、標識化した本発明の抗原と抗血清とを反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定する方法）、或いは固相法（例えば、９６穴プレートの各ウェル内壁面に本発明の抗原を固着させておき、ここに血清を適当に希釈した溶液を添加し、抗体を抗原に結合させた後、ウェル中の溶液を洗浄することで夾雑物を除去し、ウェル内壁面に結合した抗体量を測定する方法）によりなされる。【００５７】
本発明のポリクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離精製法に従って行われる。これは、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥなど）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などが含まれ、単独であるいは適宜組み合わせて行い得る。【００５８】
モノクローナル抗体自体の製造も、通常の方法に従って調製できる。（例えば、Current Protocol in Molecular Biology、Chapter 11.12〜11.13（2000））。具体的には、前記複合体を常法に従ってウサギ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ等の非ヒト動物に免疫し、得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞をスクリーニングし、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを培養することにより得ることができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley and Sons. Section 11.4 〜11.11 ）。【００５９】
このようにして得られたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを一定の条件下にて培養し、抗体価を測定しながら、所望の性質を有する抗体をスクリーニングする。【００６０】
モノクローナル抗体の分離精製は、ポリクローナル抗体と同様に、免疫グロブリンの分離精製法に従って行われる。すなわち、例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥなど）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法などが含まれ、単独であるいは適宜組み合わせて行い得る。【００６１】
また、前記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、特に限定されないが、下記のような常法に従って調製されうる。【００６２】
抗原をアジュバントと等量混合した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に投与する。その後、定期的に追加免疫する。採取血液の血清中の抗体力価が高くなったマウスの脾臓を摘出し、無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で、組織片等を取り除いた後に新しい培地中に移し、脾臓細胞を完全に培地中に浮遊させる。細胞を洗浄後、マウスのミエローマ細胞と混合する。細胞を沈殿させ上清を取り除いたあと、攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）などを用いて細胞融合を行う。細胞融合後、ＨＡＴ培地中などで懸濁し、適度な条件下にて培養する。培養液中の抗体の活性をＥＬＩＳＡで調べ、目的とする抗体を産生しているウェルの細胞について、限界希釈法によりハイブリドーマのクローニングを行う。クローニングにより、アフラトキシンに対する抗体を産生している安定なハイブリドーマ株を得る。【００６３】
本発明のハイブリドーマは、培地（例えば、１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭ）を用いて培養し、その培養液の遠心上清をモノクローナル抗体溶液とすることができる。また、本ハイブリドーマを由来する動物の腹腔に注入することにより、腹水を生成させ、得られた腹水をモノクローナル抗体溶液とすることができる。これらの抗体溶液は、さらに精製・濃縮することができる。【００６４】
本発明の用語で、抗体の「フラグメント」とは、抗原を認識する部位を含む抗体の断片を指す。【００６５】
また、本発明においては、アフラトキシンに特異的に結合する抗体を含むことにより、アフラトキシンを簡便に検出することができ、検出手段としてのキットおよび後述するアフラトキシンの検出方法に好適に使用することができる。前記キットは、さらに、検出法に応じて、標識された二次抗体もしくは標識されたアフラトキシンのハプテン化合物、緩衝液、検出試薬および／またはアフラトキシンの標準溶液等を含む。好ましいキットは、ＥＬＩＳＡ法や金コロイドを用いた検出法に用いられうるものであり、直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法を用いる場合、固相化されたアフラトキシンに対する抗体、抗体を保持する担体、酵素標識された抗原および検出試薬などを含む。【００６６】
さらに、本発明は、前記抗体または検出手段を用いることを特徴とするアフラトキシンの検出方法に関する。検出方法としては、通常の抗原−抗体反応を利用する方法であれば特に制限されず、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光もしくは発光検出法、凝集法、イムノブロット法、イムノクロマト法等(Meth. Enzymol., 92, 147-523 (1983), Antibodies Vol. II IRL Press Oxford (1989))が挙げられる。標識の手段としては、酵素、金コロイド、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質などがある。放射性同位元素としては、特に限定されるものではないが、例えば［125I］、［131I］、［3H］、［14C］などが好ましい。酵素としては、特に限定されるものではないが、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが挙げられる。蛍光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばフルオレスカミン、フルオレセインイソチオシアネートなどが挙げられる。発光物質としては、特に限定されるものではないが、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが挙げられる。これらのうち、特に感度や簡便性等の点から、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素を用いるＥＬＩＳＡ、あるいは金コロイドを用いたイムノクロマトが好ましい。【００６７】
代表的なＥＬＩＳＡによる検出法は、間接競合阻害ＥＬＩＳＡまたは直接競合阻害ＥＬＩＳＡなどが挙げられる。例えば以下に述べるような本発明のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡによってアフラトキシンの検出を行うことができる。【００６８】
（１）本発明のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を、担体に固相化する。用いる担体は、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗体を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗体の濃度は、通常０．０１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。【００６９】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗体が吸着していない固相表面部分を、抗体と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本住友製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。【００７０】
（３）各種濃度のアフラトキシンを含む試料に、アフラトキシンのハプテン化合物と酵素を結合させた酵素結合ハプテンを加えた混合物を調製する。酵素結合ハプテンの調製は、アフラトキシンのハプテン化合物を酵素に結合する方法であれば特に制限なく、いかなる方法で行ってもよい。【００７１】
（４）工程（３）の混合物を工程（２）で得られた抗体固相化担体と反応させる。アフラトキシンと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化担体との複合体が生成する。反応は例えば、約２５℃で約１時間行う。アフラトキシンは、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することができる。前記有機溶媒としては、アフラトキシンを溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、アセトニトリルなどがあげられ、含有量は、アセトニトリルの場合は１％（ｖ／ｖ）以上２０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上４０％（v/v）以下、好ましくは１％（ｖ／ｖ）以上３０％（v/v）以下の濃度の溶剤が使用できる。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。固相化抗体−酵素結合ハプテン複合体の量を検出することにより、予め作成した検量線から試料中のアフラトキシンの量を決定する。【００７２】
（５）担体に結合した標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、吸光度を検出することによって検量線からアフラトキシンの量を算出することができる。標識酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素と、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンまたはｏ−フェニレンジアミンを含む発色基質溶液を使用することができる。通常、発色基質溶液を加えて室温で約１０分程度反応させた後、硫酸を加えることにより酵素反応を停止させる。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を検出する。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度を検出する。なお、バックグランド値を補正するため、６３０ｎｍの吸光度も同時に検出することが望ましい。【００７３】
標識酵素としてアルカリホスファターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、ＮａＯＨ溶液を加えて酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を検出する方法があげられる。【００７４】
アフラトキシンを添加しない反応溶液の吸光度に対して、アフラトキシンを添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃度のアフラトキシンを添加した反応液の阻害率により予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のアフラトキシンの濃度を算出することができる。【００７５】
別の態様としてアフラトキシンの検出は以下のような手順により間接競合阻害ＥＬＩＳＡによって行うことができる。
（１）抗原を担体に固相化する。
用いる担体は、通常のＥＬＩＳＡに用いる担体であれば特に制限されないが、９６穴、４８穴、１９２穴等のマイクロタイタープレートが好ましい。固相化は、例えば、固相化用抗原を含む緩衝液を担体上に載せ、インキュベーションすればよい。緩衝液中の抗原の濃度は、通常０.０１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ程度である。緩衝液としては、検出手段に応じて公知のものを使用することができる。【００７６】
（２）担体の固相表面へのタンパク質の非特異的吸着を防止するため、固相化用抗原が吸着していない固相表面部分を、抗原と無関係なタンパク質等によりブロッキングする。ブロッキング剤としては、ＢＳＡもしくはスキムミルク溶液、または市販のブロックエース（大日本住友製薬社製）等を使用することができる。ブロッキングは、前記ブロッキング剤を担体に添加し、例えば、約４℃で一晩インキュベーションした後、洗浄液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に制限はないが、前記（１）と同じ緩衝液を使用することができる。【００７７】
（３）前記（１）および（２）で処理された固相表面にアフラトキシンを含む試料および本発明のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体溶液を加え、該抗体を前記固相化抗原およびアフラトキシンに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体およびアフラトキシンに対する抗体複合体を生成させる。反応は、通常室温、１時間程度で行うことができる。アフラトキシンは、水に不溶性であるため、反応溶液中には各種有機溶媒を含有することが必要である。前記有機溶媒としては、アフラトキシンを溶解させ、かつ抗原−抗体反応を阻害しない範囲で有機溶媒およびその含有量を選択すればよい。具体的には、メタノール、アセトニトリルなどがあげられ、含有量は、アセトニトリルの場合は１％（ｖ／ｖ）以上２０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上４０％（v/v）以下、好ましくは、１％（ｖ／ｖ）以上３０％（ｖ／ｖ）以下の濃度の溶媒が使用できる。【００７８】
（４）固相化抗原−抗体複合体の量は、酵素標識した二次抗体（例えば、マウス抗体を認識する抗体）を添加して検出することができる。例えばアフラトキシンに対する抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる場合、酵素標識（例えば、ペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等）した抗マウス−ヤギ抗体を用いて、担体に結合したアフラトキシンに対する抗体と反応させるのが望ましい。反応は、前記（３）と同様の条件下で行えばよい。反応後、緩衝液で洗浄する。【００７９】
（５）担体に結合した二次抗体の標識酵素と反応する発色基質溶液を加え、二次抗体に結合させた酵素に反応する発色基質溶液を前述の直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法と同様に加え、吸光度を検出することによりあらかじめ作成した検量線からアフラトキシンの量を算出することができる。【００８０】
前記本発明の検出方法においては、検出対象物に応じた前処理をして試料とした後、直接競合阻害ＥＬＩＳＡの工程または間接競合阻害ＥＬＩＳＡに供することができる。ほとんどの食品の場合、アフラトキシンが抽出できる全ての方法を用いることができる。抽出物は、メタノールあるいはアセトニトリルに転溶させて緩衝液で希釈後、検出試料にする。簡便法として、メタノールであるいはアセトニトリルで抽出し緩衝液で希釈したものをそのまま試料とすることも可能である。【００８１】
さらに、本発明の抗体またはそのフラグメントを担持した親和性カラムを用いてアフラトキシンの検出を行うこともできる。【００８２】
本発明においては、アフラトキシンのすべてのタイプに結合し、かつ耐有機溶媒性を有する抗体を含むことにより、被検試料中に含まれるアフラトキシンの個別の量および総量を、固相吸着剤を用いて検出、濃縮および／または精製することができる。このような方法は、特に限定されないが、例えば以下に説明するような方法が用いられ得る。【００８３】
精製された本発明の抗体又はそのフラグメントを用いて、例えば、ファーマシア・ファイン・ケミカルズに記載された以下の方法によって親和性マトリックス材料（担体）をつくることができる。抗体としては、ポリクローナル抗体もモノクローナル抗体およびそれらのフラグメントも使用することができるが、特にモノクローナル抗体を好適に用いることができる。この場合、十分量のモノクローナル抗体を、ＮａＨＣＯ3 とＮａＣｌとを含む結合緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、この抗体溶液を、例えば予めＨＣｌ中で一夜インキュベートした、臭化シアンによって活性化されたセファロース−４Ｂ（シグマ社）に加える。セファロースと抗体溶液とを反応させた後、この固相吸着材料を、例えば１．０Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８．５）で適度な時間インキュベートすることによって、抗体が結合されたゲルの未結合部位をブロックする。固相吸着材料上に固定化されたモノクローナル抗体によって親和性マトリックスが形成され、これをアフラトキシンの検出用に用いることができる。【００８４】
好ましい固相吸着材料は活性化されたセファロース４Ｂゲルであるが、これに限定されない。他の様々な材料を固相材料として用いることができる。例えば他のアガロースゲル組成物、デキストラン、ガラス板を包含する炭素及びケイ素粒状製剤を挙げることができる。同様に、モノクローナル抗体をそれぞれの化学組成物上に固定化する方法もこの分野において公知であり、種々記載されている。【００８５】
本発明における液体試料中のアフラトキシンを検出、単離、濃縮および／または精製する方法には、次の工程を含む親和性クロマトグラフィー法が例示されるが、これに限定されない。まず、本発明のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固相吸着材料上に固定化された、均一な親和性マトリックスに、被検試料中のアフラトキシンが結合され保持されるように、被検試料と親和性マトリックスとを接触させる。この際、被検試料を溶解した溶剤としてはアセトニトリルまたはメタノールなどがあるが、これらに限定されない。アセトニトリルの場合は１％（ｖ／ｖ）以上２０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は１％（ｖ／ｖ）以上４０％（v/v）以下、好ましくは１％（ｖ／ｖ）以上３０％（v/v）以下の濃度の溶剤が使用できる。次に、本発明のポリクローナル抗体、モノクローナル抗体またはそのフラグメントからアフラトキシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックスに加える。この溶離剤は、アセトニトリルまたはメタノールなどであるが、これらに限定されない。次に、このような親和性マトリックスからの回収された流出物中にアフラトキシンが存在するかどうか、どのタイプがどれだけ含まれるかを、例えばＨＰＬＣなどを用いて同定することができる。【００８６】
本発明における液体試料中のアフラトキシンを濃縮・精製する方法には、本発明のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体あるいはそのフラグメントを固定化した親和性マトリックス材料を用いた以下の方法が例示されるが、これに限定されない。まず、本発明のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体またはそのフラグメントが固相吸着材料上に固定化された、均一な親和性マトリックスに、被検試料中のアフラトキシンが結合され保持されるように、被検試料と親和性マトリックスとを接触させる。次に、夾雑物を洗浄除去する。そして、本発明のポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体またはそのフラグメントからアフラトキシンを放出させるための溶離剤を親和性マトリックスに加える。このようにして、液体試料中のアフラトキシンを、免疫学的に夾雑物の少ない状態で、元の試料中の濃度の数千から数万倍もの高倍率に濃縮できる。これにより、試料中に極微量しか存在しないアフラトキシンでも、抗体を利用しない他の濃縮方法と比較して、はるかに高倍率に濃縮することができ、しかも定量を妨害する夾雑物等の含量の少ない濃縮液を得ることができる。被検試料を溶解して親和性マトリックスと接触させるのに用いる溶剤は、アセトニトリルまたはメタノールなどであるが、これらに限定されない。アセトニトリルの場合は、１％（ｖ／ｖ）以上２０％（ｖ／ｖ）以下であり、メタノールの場合は、１％（ｖ／ｖ）以上４０％（v/v）以下、好ましくは１（ｖ／ｖ）以上３０％（v/v）以下の濃度のものが使用できる。【００８７】
本発明のアフラトキシンに対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の重要な特徴は、アフラトキシンＢ２抗原に対するだけでなく、Ｂ１、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１のいずれに対しても同等の高い結合能（親和性）を有することである。さらに、通常の既存の抗アフラトキシンＢ１モノクローナル抗体と比較して優れた有機溶媒耐性を有する。従って、被検試料を溶解して親和性マトリックスと接触させるのに用いる溶剤には、比較的高い濃度の有機溶媒を用いることができる。【００８８】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例１】
【００８９】
（１）  式（1）の化合物（アフラトキシンハプテン）の合成
アフラトキシンＢ２（和光純薬）  ８．２ｍｇ（２６．１μｍｏｌ) をピリジン：メタノール：水（１：４：１）溶液 6.3mlに溶解し、アミノオキシ酢酸ヘミ塩酸塩 １０．３ｍｇ  （９３．９μｍｏｌ) を加え、２時間加熱還流した。これを濃縮し、残渣をシリカゲルカラム（クロロホルム：メタノール=９：１）で精製し、白色粉末のアフラトキシンＢ２ハプテン９．１ｍｇ(収率９０％）を得た。【００９０】
得られたＢ２ハプテンのＴＬＣ（和光純薬製シリカゲル７０F２５４プレート；  展開溶媒は、クロロホルム：メタノール=９：１）でのRf値は、アフラトキシンＢ２が０．７０であったのに対してハプテンは０．５４だった。
【実施例２】
【００９１】
（免疫原の調製）
免疫原としてスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）と実施例１で得られた式（１）で示されるハプテンとの複合体を、活性エステル法を用いて作製した。【００９２】
実施例１で製造したアフラトキシンＢ２ハプテン３．３ｍｇ、N-ヒドロキシスクシンイミド２．２ｍｇ、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩３．７ｍｇをジメチルスルホキシド０．５ｍｌに溶解し、この溶液を室温、暗所で１．５時間撹拌し、アフラトキシンＢ２ハプテン溶液とした。別途、０．１Mホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌにＫＬＨ １０ｍｇを加え、これにアフラトキシンＢ２ハプテン溶液 ２４８μｌを徐々に滴下し、室温、暗所で１．５時間撹拌した。反応終了後、４℃で２日間、生理的リン酸緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸緩衝液）に対して透析した後、−４０℃で貯蔵した。同様にアフラトキシンハプテンとＢＳＡとの複合体を作製した。このようにして得られたアフラトキシンハプテンとＫＬＨとの複合体を免疫原として使用した。
【実施例３】
【００９３】
（モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製）
実施例２で調製した免疫原を２ｍｇ／ｍＬとなるように生理的リン酸緩衝液に溶解し、これに等量の完全アジュバント（商品名：フロイント完全アジュバント；ＦＣＡ）を等量混合しエマルジョン化し、その１００μＬを６〜７週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント（商品名：フロイント不完全アジュバント；ＦＩＣＡ）を等量混合した０．５ｍｇ／ｍＬの免疫原１００μＬを２週間毎に追加免疫した。４回の免疫後、眼底から採血し、血清中の抗体力価が十分に上がっていることを間接ＥＬＩＳＡにて確認した。【００９４】
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるアフラトキシンの検出
（１）実施例２で得られたアフラトキシンハプテンとＢＳＡとの複合体を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液を用いて１μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μL／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、０．４％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液を３００μL／ウェル分注し、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。【００９５】
（２）メタノールに溶解したアフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１それぞれの標準溶液０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、および１００００ｎｇ／ｍｌを、０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液にそれぞれ１％添加し、アフラトキシンの濃度が０．０、１．０、２．５、５．０、１０、２５、５０、および１００ｎｇ／ｍｌになるよう調製した。各アフラトキシンの希釈溶液を（１）で作製したアフラトキシンハプテンとBSAとの複合体固相化プレートに５０μＬ／ウェルずつ分注した。先に得られた抗血清を、０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液で２０，０００倍希釈したものをさらに５０μl／ウェルずつ添加して、２５℃で１時間静置しアフラトキシンの競合阻害反応をさせた。【００９６】
（３）HRP（西洋ワサビペルオキシダーゼ）と抗マウスIgG ヒツジ抗体の複合体（ICN
社）を、０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液で４０００倍に希釈して２次抗体希釈液とした。【００９７】
（４）  （２）で反応させたウェルを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄したあと、上記の２次抗体希釈液を１００μL／ウェル分注して、２５℃  １時間静置して反応させた。【００９８】
（５）上記の（４）で反応させた後のウェルを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液で３回洗浄し、TMB基質溶液（100μg／mLの3,3’,5,5’-テトラメチルベンチジンおよび0.006％過酸化水素を添加した0.1Ｎ 酢酸ナトリウム溶液（pH5.5））100μＬをウェルに加え、２５℃で１０分間インキュベーションした後、１Ｎ硫酸１００μLをウェルに加えて発色反応を止め、４５０nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで検出した。この実施例におけるアフラトキシンＢ２についての結果を図１に示す。【００９９】
モノクローナル抗体の確認
マウスの血中の抗体価が十分に高くなったマウスを用いて、最終免疫（１０μｇ／マウス）した。その３日後に当該マウスから脾臓を摘出し細胞融合に供した。【０１００】
摘出した脾臓を無血清ＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）中で余分な組織片を切除したあと、脾臓から完全に細胞を取り出し、培地中に浮遊させた。浮遊している大きな組織片を沈降させるために５分間静置、細胞浮遊液を遠沈管に集め、１５００ｒｐｍで遠心し、上清を吸引除去して、新しい無血清ＤＭＥＭを添加して細胞を浮遊させた。この操作を２回繰り返した。【０１０１】
あらかじめ培養してあったミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）を回収し、遠沈、上清除去、無血清ＤＭＥＭ培地で再浮遊を２回繰り返した。【０１０２】
それぞれの細胞数を計数して脾臓細胞とミエローマ細胞との比率が１０：１〜７．５：１になるように混合し、１５００ｒｐｍで５分間遠心して，上清を吸引除去した。【０１０３】
遠沈管を激しく攪拌しながら５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）溶液２ｍＬを約６０秒かけて添加した。次いで約１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭを攪拌しながら３〜４分かけて添加した。【０１０４】
遠沈管を１０００ｒｐｍ，５分で遠心して上清を完全に吸引除去し、脾臓細胞が２．５×１０６個／ｍＬになるようにＨＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、１０％牛胎児血清入ＤＭＥＭ培地）に浮遊させ、９６穴培養プレートに１００μＬ／ウェル分注し、３７℃、８％炭酸ガス、加湿条件下で培養を開始した。【０１０５】
翌日に約４０μＬ／ウェルのＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリン、１０％牛胎児血清入ＤＭＥＭ培地）を添加し、ミエローマ細胞が死滅し、ハイブリドーマ細胞のコロニーが形成されるまで観察を続け、以後は細胞の状態を見ながらＨＴ培地を添加した。【０１０６】
培養開始から１０日後に培養液を採取し、間接競合阻害法でアフラトキシンに対する抗体を産生しているウェルをスクリーニングし、９６ウェル、４８ウェル、２４ウェルと順次培養スケールを上げた。【０１０７】
２４ウェルの段階で限界希釈法によるクローニングを行ない、アフラトキシンに対するＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株を得た。得られたハイブリドーマについては、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１１２６の下に独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国内寄託した。また、受領番号ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９３１の下、２００７年１１月５日に独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに国際寄託した。【０１０８】
ここで、ハイブリドーマのスクリーニングは、アフラトキシンＢ１，Ｂ２，Ｇ１，Ｇ２との反応性が1ｐｐｂを下回りかつほぼ等価であることを指標に行った。また、濃度を変えたアセトニトリルおよびメタノール存在下でのアフラトキシンＢ１との反応性が、可能な限り高いものを選択することを指標にスクリーニングを行うことで、ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３抗体産生細胞以外にも複数の同様な反応特性を示す抗体産生細胞を選択することができた。
【実施例４】
【０１０９】
（モノクローナル抗体の作製）
実施例３で得られたＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３抗体産生ハイブリドーマ株を１０％牛胎児血清入りＤＭＥＭで培養し、約２×１０６個の細胞をＢＡＬＢ／ｃ  メスＲｅｔｉｒｅ  マウスの腹腔内に注射し、腹水液を採取した。得られた腹水はプロテインＧ  カラムによりＩｇＧ精製を行った。得られたモノクローナル抗体はサブクラスがＩｇＧ1、Ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎがλ鎖であった。【０１１０】
一方、ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３抗体産生細胞を、１０％牛胎児血清添加ダルベッコＭＥＭ培地を用いて、37℃、5％炭酸ガス存在下で培養し、コンフルエントに増殖させた。これを、１５００ｒｐｍで遠心分離することによって培養上清を得た。培養上清は０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液で50倍に希釈して間接競合阻害法に用いた。
【実施例５】
【０１１１】
間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によるアフラトキシンの検出
（１）実施例２で得られたアフラトキシンハプテンとＢＳＡとの複合体を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μL／ウェルずつ分注し、４℃で一晩放置することにより固相化した。次に液を吸引除去後、０．４％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液を３００μL／ウェル分注し、４℃で一晩静置することによりブロッキングを行った後、ブロッキング液を吸引除去した。【０１１２】
（２）メタノールに溶解したアフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１それぞれの標準溶液０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、および１０００ng／mlを、０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液にそれぞれ１％添加し、アフラトキシンの濃度が０．０、０．１、０．２５、０．５０、１．０、２．５、５．０、及び１０．０ng／mlになるよう調製した。  各アフラトキシンの希釈溶液を（１）で作製したアフラトキシンハプテンとBSAとの複合体固相化プレートに５０μL／ウェルずつ分注した。さらに実施例４で得られたモノクローナル抗体ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３ 産生細胞培養液を、０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液で５０倍希釈したものを５０μl／ウェルずつ添加して、２５℃で１時間静置しアフラトキシンの競合阻害反応をさせた。【０１１３】
以降は実施例３と同様の操作を行った。【０１１４】
モノクローナル抗体ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３溶液についての間接競合阻害法によるアフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１のそれぞれの標準阻害曲線を図２に示す。モノクローナル抗体ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３溶液を用いた間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、すべてのタイプのアフラトキシンに対してＩＣ５０値がＢ１：０．２６、Ｂ２：０．３４、Ｇ１：０．３４、Ｇ２：０．３４、Ｍ１：０．４ であることから、Ｂ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１の反応性の違いがＩＣ50値でＢ２を中心に±５０％以内にあり、同等の検出感度を表すことがわかった。【０１１５】
実施例３で得られた他のハイブリドーマから得られたモノクローナル抗体についても同様の実験を行った。その結果、例えば、モノクローナル抗体ＡＦＢ２-２-５Ｅ１０-１溶液からは、すべてのタイプのアフラトキシンに対してＩＣ５０値がＢ１：０．３３、Ｂ２：０．４４、Ｇ１：０．４３、Ｇ２：０．５７、Ｍ１：０．５５およびＡＦＢ２-３-４Ｅ４-１溶液からはＢ１：０．３、Ｂ２：０．４４、Ｇ１：０．４３、Ｇ２：０．５３、Ｍ１：０．５８となった。【０１１６】
これらの値は、本発明の抗体が、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、およびＭ１のすべてに対して優れた結合能を有することを示している。これまでに存在するアフラトキシンに対するモノクローナル抗体では、Ｂ１をハプテンとして誘起したものがあるが、いずれも他のタイプのアフラトキシンへの結合能との比較において、本明細書でいう「同等の結合能を有する」ものではない。例えば、特開昭６３−２１９３９４では、Ｂ１をハプテンとし、Ｂ１に特異的な抗体の取得を意図しており、それ故にＢ１あるいはＢ２に対する結合能と比較して、Ｇ１に対する結合能は、桁違いに減少している。例えば表１でAF-1と称される抗体では、結合能の違いが一番少ないが、それでも、Ｂ１またはＢ２に対して、Ｇ１に対する結合能は、１/１０程度である。一方、全アフラトキシンの検出に有用なモノクローナル抗体として作成されている例もあるが、例えば、特開平４−３６０６９５に示される例では、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、およびＧ２の交差反応性は、ＩＣ５０値の比較で、それぞれ、０．４４ｎｇ／ｍｌ、２．１ｎｇ／ｍｌ、２．４ｎｇ／ｍｌ、５．２ｎｇ／ｍｌなどとなっている。【０１１７】
以上の結果から、本発明のアフラトキシンハプテン化合物を用いて得られるモノクローナル抗体を使用する間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、すべてのタイプのアフラトキシンの総量分析および各アフラトキシン類縁体間の分析が高感度で可能となることがわかる。
【実施例６】
【０１１８】
抗体のメタノール耐性
モノクローナル抗体  ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３のメタノール耐性を調べた。０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％メタノール水溶液を調製し、それぞれのメタノール水溶液に、０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液を１９：１の割合で混合し、さらに各メタノール濃度の水溶液にアフラトキシンＢ２標準液０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００および１０００ng／ml溶液をそれぞれ１％添加してアフラトキシンＢ２濃度０、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．５、５．０、および１０．０ｎｇ／ｍｌとなるよう調製した。実施例３の（１）で作製したアフラトキシンハプテンとBSAとの複合体固相化プレートに各メタノール濃度、各アフラトキシンＢ２濃度の溶液を５０μl／ウェル添加した。【０１１９】
一方、モノクローナル抗体  ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３の産生細胞培養液を、０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液で２．５倍に希釈し、さらに0％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％メタノール溶液に  それぞれ１９：１の割合で添加して抗体希釈液とした。【０１２０】
先に記した各濃度のアフラトキシンＢ２溶液を分注したプレートに、メタノール濃度の同じウェルへ抗体希釈液を５０μl／ウェルずつ添加して、２５℃で１時間静置して反応させた。以後は実施例３の（３）、（４）、（５）に示す通り反応を行い反応液中メタノール濃度それぞれにおける阻害曲線を求めた。【０１２１】
その結果を図３に示す。アフラトキシン抗体ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３は、３８％メタノール中でも、阻害曲線が乱れず、メタノールに対し高い耐性を有していた。食物中に存在しているアフラトキシンを抽出する際、メタノールは一般的に使用される非常に優れた溶媒であり、メタノールに対し高い耐性を有することはアフラトキシン検出用の抗体としてＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３は極めて有用であることを示している。
【実施例７】
【０１２２】
抗体のアセトニトリル耐性
モノクローナル抗体  ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３のアセトニトリル耐性を調べた。０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％アセトニトリル水溶液を調製し、各アセトニトリル濃度の水溶液にアフラトキシンＢ２標準液０、１０、２５、５０、１００、２５０、５００および１０００ng／ml溶液をそれぞれ１％添加してアフラトキシンＢ２濃度０、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．５、５．０、および１０．０ng／mlとなるよう調製した。実施例３の（１）で作製したアフラトキシンハプテンとBSAとの複合体固相化プレートに各アセトニトリル濃度、各アフラトキシンＢ２濃度の溶液を５０μl／ウェル添加した。
一方、モノクローナル抗体  ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３の産生細胞培養液を０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液で５０倍に希釈し、先のプレートの各ウェルに５０μl／ウェル分注した。２５℃で１時間静置して反応させ、以後は実施例３の（３）、（４）、（５）に示す通り反応を行い反応液中アセトニトリル濃度０％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％における阻害曲線を求めた。【０１２３】
その結果を図４に示す。アフラトキシン抗体ＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３は、２０％アセトニトリル中でも、阻害曲線が乱れず、アセトニトリルに対し高い耐性を有していた。食物中に存在するアフラトキシンを抽出する際、アセトニトリルは一般的に使用される非常に優れた溶媒であり、アセトニトリルに対し高い耐性を有することはアフラトキシン検出用の抗体としてＡＦＢ２−３−７Ｆ３−３は極めて有用であることを示している。
【実施例８】
【０１２４】
ゲルの調製
ＮＨＳ活性化セファロース４ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス）１ｍＬを、１ｍＭ 冷塩酸１０ｍｌで３回洗浄した。ここに、実施例４で得られた抗体（０．５ｍｇ／ｍｌ  、０．２％ＢＳＡおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含みｐH７．０に調節した１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液にて希釈した抗体溶液） １０ｍｌを入れ、室温で４時間撹拌後、モノエタノールアミン緩衝溶液、酢酸ナトリウム緩衝溶液、モノエタノールアミン緩衝溶液の順に１０ｍｌで３回ずつ洗浄した。これに、モノエタノールアミン緩衝溶液１０ｍｌを加え、室温で３時間撹拌し、酢酸ナトリウム緩衝溶液、モノエタノールアミン緩衝溶液、酢酸ナトリウム緩衝溶液、リン酸緩衝液の順に１０ｍｌで３回ずつ洗浄した。
【実施例９】
【０１２５】
アフラトキシン用アフィニティーカラムの調製
実施例８で調製したゲル０．２ｍＬをエンプティーカラムにつめ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液３ｍｌで２回ずつ洗浄した。
【実施例１０】
【０１２６】
アフラトキシン用アフィニティーカラムによる添加回収実験
このカラムに、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２のすべてのタイプについて、各々５ng、１０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、および２００ｎｇ含む２％アセトニトリル溶液６種類を調整し、その各１０ｍｌを添加した。次にこのカラムをさらに１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液３ｍｌにて２回、水３ｍｌにて２回ずつ洗浄し、１００％アセトニトリル１ｍｌにて３回溶出した。【０１２７】
次に、得られた溶出液をＨＰＬＣで分析し、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２のそれぞれのタイプの溶出量を測定した。ＨＰＬＣの条件は、以下の通りである。すなわち、カラムは、ＯＤＳカラム（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）、移動相：アセトニトリルーメタノール-０．２Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．０）−水（１：３：０．５：５．５）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度４０℃、検出器：蛍光検出器（励起波長  ３６０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）、注入量：１００μｌ、フォトケミカルリアクター（Aura Industries Inc.）をカラム−検出器間に設置した。【０１２８】
回収率（％）は、表１に示すとおりである。
【表１】
2008059837.tif 000009
表１から、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２のすべてのタイプについて、５ｎｇから１００ｎｇまで、ほぼ確実に回収できていることがわかった。
【実施例１１】
【０１２９】
実施例１０において調製した、本発明のモノクローナル抗体を用いたアフィニティーカラムと市販されているアフラトキシン用アフィニティーカラムを用いて、比較実験を行った。実施例１０で調製したこのカラム、および市販カラムＡ、Ｂ、Ｃに、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２のそれぞれのタイプについて５０ｎｇを含む２０％アセトニトリル溶液各１０ｍｌのアフラトキシン標準品を添加した。次にこのカラムをさらに１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液３ｍｌにて２回、水３ｍｌにて２回ずつ洗浄し、１００％アセトニトリル１ｍｌにて３回溶出した。図５は、それぞれのカラムにおけるアフラトキシンのタイプＢ１、Ｂ２、Ｇ１およびＧ２の回収率を示している。【０１３０】
図５から分るように、市販のカラムでは各アフラトキシン類縁体間に回収率の差が認められるのに対し、本発明のモノクローナル抗体を固定化したアフィニティーカラムを用いると、類縁体間で回収率に殆ど差が認められず、アフラトキシン類縁体の全てを濃縮・精製するための理想的な性質を有している。さらに、本発明のモノクローナル抗体を固定化したアフィニティーカラムにおいては、２０％アセトニトリルといった、高い有機溶媒含有率を有する溶剤をも使用することができる。【０１３１】
以上より、本発明で得られたモノクローナル抗体ならびにその抗体を用いたアフラトキシン類を濃縮・精製することができるアフィニティーカラムを用いることで、高感度のアフラトキシン類の定量が可能になるばかりでなく、アフラトキシン類縁体個々の含有量や、アフラトキシン類縁体の総量の定量も可能になる。【０１３２】
（参考例）
アフラトキシンＢ１について、アフラトキシンＢ２についての実施例１で示した方法によりアフラトキシンＢ１ハプテンを得た。このハプテン化合物を用いて実施例２で示した方法により免疫原を調製し、実施例３に示した方法によりマウスを免疫した。同様に家兎についても免疫した。実施例２で調製した免疫原を０．４ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに溶解し、これに等量の完全アジュバント（商品名：フロイント完全アジュバント；ＦＣＡ）を混合しエマルジョン化し、その２ｍＬを２．５ｋｇ〜３．０ｋｇのメスの家兎（日本白色種）に皮内投与した。これと同様の手順で、不完全アジュバント（商品名：フロイント不完全アジュバント；ＦＩＣＡ）を等量混合した免疫原を２週間毎に４回追加免疫した。最終免疫後、１週間後に全採血し、血清中の抗体力価が十分に上がっていることを間接ＥＬＩＳＡにて確認した。血清中の抗体力価を間接競合ＥＬＩＳＡ法にて確認した。結果を表２に示した。
【表２】
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表２の結果から、アフラトキシンＢ１誘導体をハプテンとして用いて得られた免疫原により動物を免疫した結果、得られた抗血清はマウスにおいても家兎においてもアフラトキシンＢ１に対して特に高い結合活性が得られ、アフラトキシンＧ１に対してはそれに次ぎ、アフラトキシンＧ２やＭ１には低い結合活性しか認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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