(57)【要約】  シクロデキストリンＣ７０錯体を含有する溶液と、リポソームを形成可能な脂質を含有する溶液とを１０〜４５℃で混合する。これにより、Ｃ７０フラーレンが本来有する物性を有し、安定に極性溶媒に溶解可能なＣ７０含有リポソームを製造することができる。これにより、本発明は、Ｃ７０フラーレンが本来有する物性を有し、安定に極性溶媒に溶解可能なＣ７０含有リポソームおよびその製造方法、並びにその利用を提供する。
2008096779.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ７０フラーレンを含有するリポソームの製造方法であって、
シクロデキストリンＣ７０錯体を含有する第１溶液と、リポソームを形成可能な脂質を含有する第２溶液とを１０〜４５℃で混合することを特徴とするＣ７０含有リポソームの製造方法。
【請求項２】
上記シクロデキストリンＣ７０錯体は、β−シクロデキストリンＣ７０錯体、γ−シクロデキストリンＣ７０錯体、δ−シクロデキストリンＣ７０錯体、およびε−シクロデキストリンＣ７０錯体、並びに、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、δ−シクロデキストリン、もしくはε−シクロデキストリンのモノ、ジ、またはトリメチル化体とＣ７０フラーレンとの錯体からなる群より選択される少なくとも１つのシクロデキストリンＣ７０錯体であることを特徴とする請求の範囲１に記載のＣ７０含有リポソームの製造方法。
【請求項３】
上記第２溶液は、下記式（１）〜（３）
【化１】
2008096779.tif 000008
で表される脂質からなる群より選択される少なくとも１つの脂質を含有することを特徴とする請求の範囲１に記載のＣ７０含有リポソームの製造方法。
【請求項４】
Ｃ７０フラーレンを含有するリポソームであることを特徴とするＣ７０含有リポソーム。
【請求項５】
上記リポソームは、下記式（１）〜（３）
【化２】
2008096779.tif 000009
で表される脂質からなる群より選択される少なくとも１つの脂質を含有することを特徴とする請求の範囲４に記載のＣ７０含有リポソーム。
【請求項６】
波長が３５０〜８００ｎｍの光の照射により、活性酸素を発生することを特徴とする請求の範囲４に記載のＣ７０フラーレン含有リポソーム。
【請求項７】
上記リポソームを構成する全脂質に対して、０．１〜２０モル％のＣ７０を含有することを特徴とする請求の範囲４に記載のＣ７０含有リポソーム。
【請求項８】
請求の範囲４〜７のいずれか１に記載のＣ７０含有リポソームを含有することを特徴とする組成物。
【請求項９】
光線力学的治療に用いられることを特徴とする請求の範囲８に記載の組成物。
【請求項１０】
上記光線力学的治療の治療対象が、癌細胞、加齢黄斑変性症、粥状動脈硬化病変、関節リウマチ病変、難治性疣贅、尋常性座瘡、およびパピロマーウイルスからなる群より選択されることを特徴とする請求の範囲９に記載の組成物。
【請求項１１】
上記加齢黄斑変性症が滲出型であることを特徴とする請求の範囲１０に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｃ７０含有リポソームの含有量が２〜２０モル％であることを特徴とする請求の範囲８に記載の組成物。
【請求項１３】
請求の範囲４〜７のいずれか１に記載のＣ７０含有リポソームを患部に投与する工程、および該患部に光照射する工程を包含することを特徴とする光線力学的治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラーレン類を含有するリポソームおよびその製造方法、並びにその利用に関するものであって、特に、Ｃ７０を含有するリポソームおよびその製造方法、並びにその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
フラーレン類は、炭素原子のみからなる閉殻構造を有する。そのため、フラーレン類は、特徴的な性質を有する。具体的には、（１）特異的にπ電子雲が非局在化している、（２）電子親和力が大きい、（３）イオン化エネルギーが比較的小さい、（４）電子受容能が高い、（５）可視光で光励起されるといった性質を挙げることができる。フラーレン類は、このような性質を有するため、半導体材料、超伝導材料、光電材料、医療材料、および化粧品材料等、多岐の産業分野への応用が期待されている。【０００３】
例えば、医療分野では、光線力学的治療（photodynamic therapy、以下「ＰＤＴ」ともいう）用途での利用が検討されている。ＰＤＴとは、癌等の治療に用いられる治療法であり、光感受性の物質に光を照射することにより、発生する活性酸素を用いて、癌細胞等を殺傷する治療法である。より具体的には、ＰＤＴでは、上記光感受性の物質を、患部に投与し、該患部に光を照射することによって、水や酸素の光化学反応により生成する一重項酸素やヒドロキシラジカル等の活性酸素を、該患部において発生させる。該活性酸素、またはそれから発生するラジカル種によって、上記患部の癌細胞の活動や増殖を阻害し、癌細胞を破壊させる。そして、最終的に、該癌細胞等の細胞を死滅させる。フラーレン類は、上述した特徴的な性質を有するゆえ、光の照射により一重項酸素等の活性酸素を効率よく発生する。そのため、ＰＤＴへの応用が期待されている。【０００４】
このように、フラーレン類は、ＰＤＴ等の医療材料を含め、多岐にわたる産業分野への応用が期待されている。フラーレン類を様々な用途で用いる場合、該フラーレン類を所望の溶媒に溶解させることが必要となることがしばしばある。例えば、ＰＤＴにおいてフラーレン類を用いる場合、該フラーレン類を水性溶媒に溶解させる必要がある。しかしながら、フラーレン類は、水を含む極性溶媒に対して不溶である。非特許文献１には、フラーレンをシクロデキストリン錯体とすることによって、水溶化できることが開示されているが、フラーレンのシクロデキストリン錯体は、非常に熱的に不安定で実用的ではない。そのため、フラーレン類は、上述したような様々な用途の可能性が期待されているものの、実際には、一定の制限下でしか使用できないという問題を抱えている。このような問題を解決すべく、フラーレン類を水性溶媒に溶解させるための技術開発が行われている。【０００５】
そのような技術として、例えば、特許文献１〜特許文献４、および非特許文献２に開示される技術を挙げることができる。特許文献１には、フラーレンを可溶化するためにフラーレンの炭素原子にヒドロキシル基を導入した各種フラロールが開示されている。特許文献２には、金属内包フラーレンまたはその塩の表面をスルホン基、ケトン基、アミノ基およびアルキル基からなる群より選ばれる官能基を有する多糖類で被覆することにより、フラーレン類を可溶化できることが開示されている。また、特許文献３には、フラーレンを、ポリマー鎖により被覆することにより該フラーレンを可溶化する方法が開示されている。より具体的には、第三級アミノ基および／または第二級アミノ基を側鎖に担持した反復単位を含有するポリマー鎖セグメントをコアとし、ポリ（エチレングリコール）鎖セグメントを構造物内に、フラーレンを封入することにより、該フラーレンを可溶化する方法が開示されている。さらに、特許文献４および非特許文献２には、Ｃ６０・シクロデキストリン錯体から、リポソーム内にＣ６０を移動（交換反応）させることにより、Ｃ６０含有リポソームが得られることが開示されている。より具体的には、Ｃ６０・シクロデキストリン錯体と、リポソーム溶液とを混合し、１〜７時間加熱撹拌することによりＣ６０をリポソーム内に移動させることができることが記載されている。また、特許文献４には、フラーレンと分散安定化剤を用いて、フラーレンの分散水性溶液を調製し、得られたフラーレンの分散水性溶液とカリックスアレーンとを混合処理し、カリックスアレーンとフラーレンとの錯体を調製することにより、フラーレンを可溶化できることが記載されている。【０００６】
ところで、ＰＤＴによる治療対象である癌組織には、正常組織に比べてより多くの水溶性高分子が集積される。また、一度癌組織に集積した水溶性高分子は、他の組織に集積した場合と比較して滞留時間が長い。したがって、ＰＤＴによる癌治療にフラーレンを用いる場合、該フラーレンを水性溶媒に溶解させることに加えて、高分子化することが必要となる。そこで、フラーレンを、ＰＤＴに用いるために、可溶化に加えて、高分子化させる技術も開発されている。例えば、特許文献５には、フラーレンを水溶性高分子によって化学修飾することにより、フラーレンを水性溶媒に可溶化できると共に、該可溶化したフラーレンを癌組織へ移行しやすくすることができることが開示されている。【０００７】
上述した技術以外にも、フラーレンを利用するための様々な技術がこれまでに開示されている（例えば、特許文献６〜９参照）。特許文献６には、カチオンキャリヤー系において診断化合物および治療化合物を安定化させる新規方法が開示されている。具体的には、特許文献６に記載の技術では、負の実効電荷を有するか、任意に変性されて負の実効電荷を有する、低分子量化合物をカチオンリポソーム内で安定化する。また、特許文献７には、抗酸化組成物および外用組成物が開示されており、具体的には、有機化合物により包接されたフラーレンを有効成分とする抗酸化組成物が開示されている。さらに、特許文献８には、フラーレンを可溶化する技術、すなわちフラーレンにより高い水溶性を付与する技術が開示されている。具体的には、特許文献８には、フラーレンが所定のブロックコポリマーよりなるポリマー鎖により被覆された微小粒子の複合体が開示されている。特許文献９には、電子受容性化合物と電子供与性化合物のそれぞれがホストゲスト錯体を形成している光電変換素子材料が開示されており、このような錯体として、具体的には、電子受容性化合物がフラーレンであり、カリックスアレーンをホストとする錯体が示されている。
【特許文献１】日本国公開特許公報「特開平７−０４８３０２号公報（公開日：平成７（１９９５）年２月２１日）」
【特許文献２】日本国公開特許公報「特開平８−１４３４７８号公報（公開日：平成８（１９９６）年６月４日）」
【特許文献３】日本国公開特許公報「特開２００５−２２５７７２号公報（公開日：平成１７（２００５）年８月２５日）」
【特許文献４】日本国公開特許公報「特開２００６−６９８１２号公報（公開日：平成１８（２００６）年３月１６日）」
【特許文献５】日本国公開特許公報「特開平９−２３５２３５号公報（公開日：平成９（１９９７）年９月９日）」
【特許文献６】日本国公開特許公報「特開２００５−５３４７１８号公報（公開日：平成１７（２００５）年１１月１７日）」
【特許文献７】日本国公開特許公報「特開２００４−２５０６９０号公報（公開日：平成１６（２００４）年９月９日）」
【特許文献８】日本国公開特許公報「特開２００５−２２５７７２号公報（公開日：平成１７（２００５）年８月２５日）」
【特許文献９】日本国公開特許公報「特開２００４−０２２４２４号公報（公開日：平成１６（２００４）年１月２２日）」
【非特許文献１】K. Komatsu, K. Fujiwara, Y. Murata and T. Braun, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, 2963 (1999)
【非特許文献２】A. Ikeda, T. Sato, K. Kitamura, K. Nishiguchi, Y. Sasaki, J. Kikuchi, T. Ogawa, K. Yogo, T. Takeya, Org. Biomol. Chem., 3, 2907-2909 (2005)
【発明の開示】
【０００８】
このように、フラーレンの可溶化技術や、ＰＤＴ等の特定の用途に好適に利用できるようにフラーレンを修飾する技術の開発が進められている。しかしながら、特許文献１〜３に開示されるような方法では、フラーレンの表面が修飾されるため、フラーレンが本来有する特性が損なわれるという問題がある。
【０００９】
さらに、上述した技術では、多くの場合、フラーレン類として、最も安価に製造でき、安定性に優れるＣ６０フラーレンが用いられている。しかしながら、フラーレン類は、その炭素原子数によって、その物性が異なる。そのため、全てのフラーレンを同一の方法で可溶化できるわけではない。また、フラーレンの物性の相違に伴い、用途によって用いられるフラーレンが異なる。例えば、７０個の炭素原子からなるＣ７０フラーレンは、６０個の炭素原子からなるＣ６０フラーレンよりも、人体に害を及ぼしにくい可視光領域において光吸収率が高いため、高い光吸収率が求められる用途ではＣ７０を選択することが考えられる。
【００１０】
したがって、用途に応じて好適な物性を有するフラーレンを所望に選択して利用できるよう、各フラーレンについて、可溶化する技術を確立する必要がある。
【００１１】
本発明は、上記問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、Ｃ７０フラーレンが本来有する物性を有し、安定に極性溶媒に溶解可能なＣ７０含有リポソームおよびその製造方法、並びにその利用を提供することにある。
【００１２】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、シクロデキストリンＣ７０錯体を含有する溶液と、リポソームを形成可能な脂質を含有する溶液とを１０〜４５℃で混合するという単純な構成で、Ｃ７０含有リポソームを製造できることを独自に見出し、本発明を完成させるに至った。なお、フラーレンの水性化法を開示する特許文献４では、Ｃ６０フラーレンおよび分散安定化剤の分散水性溶液と、カリックスアレーンとを混合処理し、カリックスアレーンとＣ６０との錯体を調製することにより、Ｃ６０を水性化している。文献中には分散安定化剤として、シクロデキストリンおよびリポソームが例示されている。しかし、特許文献４に記載の技術において用いられているリポソームはあくまでも分散剤であり、特許文献４には、Ｃ７０フラーレンをリポソーム中に含有させることが、記載も示唆もされていない。また、特許文献６に記載の技術は、化合物を負の実効帯電を有する部分（負に帯電した部分）で変性することを特徴としており、ここで、「変性」は、「化合物をフラーレンなどのような負に帯電した部分内に取り込む」ことを含んでいる。このような技術は、フラーレンをリポソーム内に含有する本発明と大きく異なっている。有機化合物として特許文献７に例示されているものは、有機オリゴマー、有機ポリマー、シクロデキストリン、クラウンエーテルなどに過ぎない。また、特許文献７には、包接方法について具体的な開示がなされていない。また、特許文献７〜９には、リポソームを用いることもＣ７０フラーレンをリポソーム中に含有することも、記載も示唆もされていない。このように、本発明者らの創意工夫および試行錯誤の結果として完成された本発明が、従来技術から容易に導き得るものではなく、従来予測し得るものではないことを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。
【００１３】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１４】
〔１〕Ｃ７０フラーレンを含有するリポソームの製造方法であって、シクロデキストリンＣ７０錯体を含有する第１溶液と、リポソームを形成可能な脂質を含有する第２溶液とを１０〜４５℃で混合することを特徴とする製造方法。
【００１５】
〔２〕上記シクロデキストリンＣ７０錯体は、上記シクロデキストリンＣ７０錯体は、β−シクロデキストリンＣ７０錯体、γ−シクロデキストリンＣ７０錯体、δ−シクロデキストリンＣ７０錯体、およびε−シクロデキストリンＣ７０錯体、並びに、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、δ−シクロデキストリン、もしくはε−シクロデキストリンのモノ、ジ、またはトリメチル化体とＣ７０フラーレンとの錯体からなる群より選択される少なくとも１つのシクロデキストリンＣ７０錯体であることを特徴とする〔１〕に記載の製造方法。
【００１６】
〔３〕上記第２溶液は、下記式（１）〜（３）
【００１７】
【化１】
2008096779.tif 000003
【００１８】
で表される脂質からなる群より選択される少なくとも１つの脂質を含有することを特徴とする〔１〕に記載の製造方法。
【００１９】
〔４〕Ｃ７０フラーレンを含有するリポソームであることを特徴とするＣ７０含有リポソーム。
【００２０】
〔５〕上記リポソームは、下記式（１）〜（３）
【００２１】
【化２】
2008096779.tif 000004
【００２２】
で表される脂質からなる群より選択される少なくとも１つの脂質を含有することを特徴とする〔４〕に記載のＣ７０含有リポソーム。
【００２３】
〔６〕波長が３５０〜８００ｎｍの光の照射により、活性酸素を発生することを特徴とする〔４〕に記載のＣ７０含有リポソーム。
【００２４】
〔７〕上記リポソームを構成する全脂質に対して、０．１〜２０モル％のＣ７０フラーレンを含有することを特徴とする〔４〕に記載のＣ７０含有リポソーム。
【００２５】
〔８〕〔４〕〜〔７〕のいずれかに記載のＣ７０含有リポソームを含有することを特徴とする組成物。
【００２６】
〔９〕光線力学的治療に用いられることを特徴とする〔５〕に記載の組成物。
【００２７】
〔１０〕
上記光線力学的治療の治療対象が、癌細胞、加齢黄斑変性症、粥状動脈硬化病変、関節リウマチ病変、難治性疣贅、尋常性座瘡、およびパピロマーウイルスからなる群より選択されることを特徴とする〔９〕に記載の組成物。
【００２８】
〔１１〕
上記加齢黄斑変性症が滲出型であることを特徴とする〔１０〕に記載の組成物。
【００２９】
〔１２〕
Ｃ７０含有リポソームの含有量が２〜２０モル％であることを特徴とする〔８〕に記載の組成物。
【００３０】
〔１３〕
請求の範囲４〜７のいずれか１に記載のＣ７０含有リポソームを患部に投与する工程、および該患部に光照射する工程を包含することを特徴とする光線力学的治療法。
【００３１】
本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本発明の一実施形態にかかるＣ７０含有リポソームの構造を模式的に示す図である。
【図２】本発明の実施例にかかるＣ７０含有リポソームおよび従来技術のＣ６０含有リポソームのＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを示す図である。
【図３】（ａ）は一般的なプラスミドの構造を示す図であり、（ｂ）〜（ｄ）は本発明の実施例にかかるＣ７０含有リポソームのＤＮＡ切断能力を調べた結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例にかかるＣ７０含有リポソームおよび従来技術のＣ６０含有リポソームによる細胞殺傷能力を調べた結果を示す図である。
【図５】（ａ）は、本発明の実施例にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法により製造されたＣ７０含有リポソーム水溶液を示す図であり、（ｂ）は、参考例にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法により製造されたＣ７０含有リポソーム水溶液を示す図である。
【図６】図５の（ａ）および（ｂ）に示されたＣ７０含有リポソーム水溶液のＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本発明の一実施形態について、以下説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００３４】
＜Ｉ．Ｃ７０含有リポソーム＞
本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、図１に示すようにＣ７０フラーレン（以下、単に「Ｃ７０」ともいう）を含有するリポソームである。本発明にかかるＣ７０含有リポソームでは、Ｃ７０は表面が修飾されることなく、リポソーム内に存在する。それゆえ、本発明によれば、Ｃ７０が本来有する物性を有した状態で、Ｃ７０を水性溶媒に可溶化させることができる。したがって、本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、水溶性のＣ７０を用いることが望まれる技術分野に広く用いることができる。なお、図１では、本発明にかかるＣ７０含有リポソームの一実施形態として、Ｃ７０がリポソーム膜中に埋め込まれているリポソームが記載されているが、本発明はこれに限定されない。すなわち、本明細書において、「Ｃ７０を含有するリポソーム」とは、Ｃ７０がリポソーム膜内部に閉じ込められている水相（内部水相）中に存在しているリポソーム、Ｃ７０がリポソーム膜中に埋め込まれているリポソーム、および一部のＣ７０が内部水相に存在し、残りのＣ７０がリポソーム膜中に埋め込まれているリポソームが意図される。また、本発明にかかるＣ７０含有リポソームにおいて、Ｃ７０は互いに相互作用することなく単独分子で存在してもいてもよいし、複数の分子が会合した状態で存在してもいてもよい。さらには、Ｃ７０の一部の分子のみが会合した状態で存在していてもよい。【００３５】
本明細書において、「水性溶媒」とは、水をベースとする溶媒が意図される。また、「リポソーム」とは、脂質二重膜からなるリポソーム膜により形成される構造物が意図される。上記脂質二重膜は、脂質分子からなる２分子膜であり、細胞膜と同じ構造を有する。上記脂質分子は、水を含む極性溶媒になじみやすい部分（親水部）と、油を含む非極性溶媒になじみやすい部分（疎水部）とを有する。上記脂質二重膜では、２分子の脂質分子が、疎水部が対向し、親水部が外側を向くように配置されている。【００３６】
本発明にかかるＣ７０含有リポソームにおけるリポソームの具体的な組成は、特に限定されるものではない。カチオン性脂質、アニオン性脂質、および中性脂質をどのように組み合わせたリポソームであってもよい。つまり、カチオン性脂質、アニオン性脂質、および中性脂質を全て含む必要はなく、特定の１種もしくは２種の脂質を含むものであってもよい。本発明では、上記リポソームの組成を変更することにより、Ｃ７０が有する性質を所望に利用可能なＣ７０含有リポソームとすることができる。【００３７】
例えば、Ｃ７０は、光の照射により活性酸素を発生する性質を有することが知られている。このＣ７０の性質が付与されたＣ７０含有リポソームとする場合、上記リポソームはカチオン性脂質を含有することが好ましく、カチオン性コレステロールを含有することがさらに好ましい。上記構成によれば、光照射により活性酸素を発生するとともに、該活性酸素によりリポソームが分解されることのない安定したＣ７０含有リポソームとすることができる。【００３８】
また、カチオン性脂質を含有させることにより、細胞透過性に優れるＣ７０含有リポソームとすることができる。このような活性酸素を発生し、細胞透過性に優れるＣ７０含有リポソームは、光線力学的治療（以下、「ＰＤＴ」ともいう）の用途に好適に用いることができる。なお、本明細書において、「活性酸素」とは、特に限定されないが、例えば、一重項酸素およびヒドロキシラジカルが意図される。【００３９】
また、Ｃ７０は活性酸素を消去する活性を有する。このＣ７０の性質が付与されたＣ７０含有リポソームとする場合、例えば、特開２００６−１２４３７８号公報等に記載されたリポソームを用いることが好ましい。上記構成によれば、水性溶媒中で、活性酸素を効率よく消去することが可能なＣ７０含有リポソームとすることができる。このようなＣ７０含有リポソームは、食品、医薬および化粧品等の分野に好適に用いることができる。【００４０】
以下、上記リポソームを構成する脂質についてより具体的に説明する。【００４１】
上記リポソームを構成する中性脂質としては、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン、並びにこれらを定法により水素添加したもの（例えば水素添加大豆レシチン等）および水酸化物等のリン脂質を挙げることができる。また、本発明には、下記式（１）【００４２】
【化３】
2008096779.tif 000005
【００４３】
で表される脂質を中性脂質として好適に用いることができる。【００４４】
上記リポソームを構成するアニオン性脂質として、例えば、ジミリストイルフォスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、卵黄、または大豆のような天然物質由来のホスファチジルグリセロール、完全水素添加ホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファジルグリセロール等の炭素数１０〜３０程度の飽和又は不飽和の直鎖状又は分枝状の脂肪酸残基を有するアニオン性リン脂質を挙げることができる。また、本発明には、下記式（３）【００４５】
【化４】
2008096779.tif 000006
【００４６】
で表される脂質をアニオン性脂質として好適に用いることができる。【００４７】
上記リポソームを構成するカチオン性脂質として、例えば、１、２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ、Ｎ−ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、３β［Ｎ−（Ｎ７，Ｎ’−ジメチルアミノ−エタン）−カルバモイル］コレステロール、ステアリルアミン、Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）ドデシル−Ｄ−グルタメートクロリド、Ｎ−［１−（２，３−オレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２、３−ジミリスチルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパンジオール（ＤＯＤＡＰ）等のカチオン性脂質を挙げることができる。さらに、ホスファチジン酸とアミノアルコールとのエステル、例えばジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）もしくはジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）とヒドロキシエチレンジアミンとのエステル等のカチオン性リン脂質を用いることもできる。また、本発明には、下記式（２）【００４８】
【化５】
2008096779.tif 000007
【００４９】
で表される脂質をカチオン性脂質として好適に用いることができる。上記カチオン性脂質によれば、５０ｎｍ〜２００ｎｍの平均粒径をもつＣ７０含有リポソームとすることができる。このような平均粒径をもつＣ７０含有リポソームは、ＥＰＲ（Enhanced permeability and retention）効果により癌細胞に選択的にターゲティングさせることができる。【００５０】
本発明にかかるＣ７０含有リポソームにおいて、カチオン性脂質を含有させる場合、その含有量は、全脂質量に対し９０モル％以下であることが好ましく、５０モル％以下であることがより好ましく、２０モル％以下であることがさらに好ましい。【００５１】
本発明において、上記リポソームは、上記例示したような脂質のうち、単一の脂質を含むものであってもよいし、複数の脂質を組み合わせて含むものであってもよい。また、複数の荷電脂質（アニオン性脂質またはカチオン性脂質）を組み合わせて含有する場合、負電荷の脂質同士または正電荷の脂質同士を組み合わせて含有することが好ましい。これにより、Ｃ７０含有リポソーム同士が結合し、凝集するのを低減することができる。また、中性脂質と荷電脂質とを組み合わせて含有する場合、中性脂質：荷電脂質（モル比）は、２００：１〜１：９であることが好ましく、１００：１〜１：１であることがより好ましく、４０：１〜５：１であることがさらに好ましい。【００５２】
複数の脂質を組み合わせて用いる実施形態について、より具体例を挙げて説明する。カチオン性脂質は、細胞透過性を有することが知られている。そのため、本発明にかかるＣ７０含有リポソームをＰＤＴ等の治療用途に用いる場合、カチオン性脂質を含有させることが好ましい。その一方で、カチオン性脂質は、一般的に毒性を有することが知られている。したがって、カチオン性脂質の含有量は、細胞透過性と毒性による副作用とを考慮して決定されるものである。このとき、カチオン性脂質の含有量は、中性脂質とカチオン性脂質とを組み合わせて用いることによって、調整することが好ましい。このように、中性脂質とカチオン性脂質とを組み合わせて用い、カチオン性脂質の含有量を上述した範囲内で適宜変更することにより、良好な細胞透過性を有し、かつ毒性による副作用が低減されたＣ７０含有リポソームを製造することができる。【００５３】
また、本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、糖脂質を含有していてもよい。上記糖脂質としては、例えば、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド硫酸エステル等のグリセロ脂質、ガラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド硫酸エステル、ラクトシルセラミド、ガングリオシドＧ７、ガングリオシドＧ６、ガングリオシドＧ４等のスフィンゴ糖脂質等を挙げることができる。【００５４】
本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、Ｃ７０と脂質以外の成分を含有していてもよい。具体的には、例えば、膜安定化剤として作用するステロール類を含有していてもよい。上記ステロール類としては、例えば、コレステロール、ジヒドロコレステロール、コレステロールエステル、フィトステロール、シトステロール、スチグマステロール、カンペステロール、コレスタノール、またはラノステロール等が挙げられる。また、安定剤として、１−Ｏ−ステロールグルコシド，１−Ｏ−ステロールマルトシドまたは１−Ｏ−ステロールガラクトシドといったステロール誘導体を含有していてもよい。本発明にかかるＣ７０含有リポソームがステロール類を含有する場合、その含有量は、脂質全分子に対して０．０５〜７０モル％であることが好ましく、０．１〜６０モル％であることがより好ましく、０．５〜４０モル％であることがさらに好ましい。上記範囲内であれば、Ｃ７０含有リポソームの形成を阻害することなく、Ｃ７０含有リポソームを安定化させることができる。また、Ｃ７０含有リポソームがコレステロールを含有する場合、該コレステロールは、ポリアルキレンオキシド導入用のアンカーにもなり得る。ポリオキシアルキレン鎖の先端には、種々の機能性物質を共有結合により固定化することができる。【００５５】
また、本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、グリコール類を含有していてもよい。上記グリコール類としては、例えば、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、トリメチレングリコール、１，４-ブタンジオール等を挙げることができる。また、その含有量は、Ｃ７０含有リポソームの全脂質に対して０．０１〜２０モル％であることが好ましく、０．５〜１０モル％であることがより好ましい。上記構成によれば、Ｃ７０含有リポソーム内に、水溶性の物質を効率よく保持させることができる。また、本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、負荷電物質であるジセチルホスフェートといったリン酸ジアルキルエステルや、正電荷を与える化合物としてステアリルアミン等の脂肪族アミン等を含有していてもよい。【００５６】
さらに、本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、その粒子表面に、特定の機能を付与するための置換基を有していたり、特定の機能を付与するための分子が付加もしくは挿入されたりしていてもよい。上記置換基および分子としては、例えば、Ｃ７０含有リポソームを生体に投与した場合に、特定の臓器や組織にターゲティングさせるための置換基および分子、並びにＣ７０含有リポソームの安定性を向上させるための置換基および分子等を挙げることができる。より具体的には、Ｃ７０含有リポソームの安定性を向上させるための分子として、例えば、高分子鎖であるポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）基（ポリオキシアルキレン鎖）または類似の基を有するリン脂質または化合物を挙げることができる。ＰＡＯ基またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖をＣ７０含有リポソーム表面に付けることにより、Ｃ７０含有リポソームの安定性を向上させることができる。また、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＨであらわされるＰＥＧ基のオキシエチレン単位の長さと導入する割合を適宜変えることにより、その機能を調節することができる。ＰＥＧ基としては、オキシエチレン単位が１０〜３５００のＰＥＧ基であることが好ましく、オキシエチレン単位が１００〜２０００のＰＥＧであることがより好ましい。本発明にかかるＣ７０含有リポソームがＰＥＧを含有する場合、その含有量は、Ｃ７０含有リポソームの全脂質に対して０．１〜３０モル％であることが好ましく、１〜１５モル％であることがより好ましい。なお、Ｃ７０含有リポソームのＰＥＧ化には、従来公知のリポソームのＰＥＧ化技術を用いることができる。【００５７】
また、本発明にかかるＣ７０含有リポソームが−（ＡＯ）n−Ｙ（式中、ＡＯは炭素数２〜４のオキシアルキレン基を表し、ｎはオキシアルキレン基の平均付加モル数を表し、Ｙは、水素原子、アルキル基または機能性官能基を表す。）で表されるＰＡＯ基を有する場合、上記式中、ｎは、１〜２０００であることが好ましく、１０〜５００であることがより好ましく、２０〜２００であることがさらに好ましい。上記炭素数２〜４のオキシアルキレン基としては、例えばオキシエチレン基、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシ−１−エチルエチレン基、オキシ−１，２−ジメチルエチレン基等を挙げることができる。【００５８】
また、上記式のｎが２以上の場合、オキシアルキレン基は、同一のものであってもよいし、異なるものであってもよい。異なるものである場合、ランダム状に付加されても、ブロック状に付加されてもよい。また、ＰＡＯ基に親水性が付与される場合、オキシアルキレン基としてはエチレンオキシドが単独で付加されていることが好ましく、さらに、上記式のｎが１０以上であることがより好ましい。また種類の異なるアルキレンオキシドが付加される場合、エチレンオキシドが２０モル％以上付加されることが好ましく、５０モル％以上付加されることがより好ましい。ＰＡＯ基に親油性が付与される場合、エチレンオキシド以外のオキシアルキレン基の付加モル数が多いことが好ましい。例えば、ポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドとのブロック共重合物であることが好ましい。【００５９】
また、上記式のＹのアルキル基としては、炭素数１〜５の脂肪族炭化水素基（分岐していてもよい）を挙げることができる。上記「機能性官能基」とは、ＰＡＯ基の先端に糖、糖タンパク質、抗体、レクチン、細胞接着因子といった「機能性物質」を付加するための置換基が意図される。具体的には、例えば、アミノ基、オキシカルボニルイミダゾール基、Ｎ-ヒドロキシコハク酸イミド基といった反応性に富む置換基が挙げられる。先端に上記機能性物質が結合したＰＡＯ基が固定化されたＣ７０含有リポソームは、ＰＡＯ基の効果に加えて、上記機能性物質の機能、例えばがん組織指向性またはがん細胞認識性といった「認識素子」としての効果を有する。また、本発明にかかるＣ７０含有リポソームがＰＡＯ基を有するリン脂質または化合物を含有する場合、該リン脂質または化合物は、単一種であってもよいし、複数種の組み合わせであってもよい。また、その含有量は、Ｃ７０含有リポソームの全構成成分の０．００１〜５０モル％であることが好ましく、０．０１〜２５モル％であることがより好ましく、０．１〜１０モル％であることがさらに好ましい。また、Ｃ７０含有リポソームへのＰＡＯ基の導入は、従来公知の技術を用いて行うことができる。【００６０】
本発明にかかるＣ７０含有リポソームの大きさは、特に限定されるものではない。具体的には、Ｃ７０含有リポソームの用途に応じて、適した大きさに設計されうるものである。例えば、Ｃ７０含有リポソームを向腫瘍性治療薬として用い、ＥＰＲ効果により、がん組織へ選択的にＣ７０含有リポソームをターゲティングさせる場合、該Ｃ７０含有リポソームの平均粒径は、５０ｎｍ〜２００ｎｍであることが好ましく、６０ｎｍ〜２００ｎｍであることがより好ましく、特に７０ｎｍ〜１５０ｎｍであることがさらに好ましい。また、局所化学療法である動注化学療法に基づき、Ｃ７０含有リポソームを、がん病巣近傍の血管までカテーテルを通して直接適用する場合、Ｃ７０含有リポソームの平均粒径は、５００ｎｍ〜１.０μｍであることが好ましく、７００ｎｍ〜９００ｎｍであることがより好ましく、７５０ｎｍ〜８５０ｎｍであることがさらに好ましく、８００ｎｍ前後とすることが特に好ましい。上記平均粒径であれば、カテーテルから透過性が増した栄養動脈中に放出されても、がん組織に通じるその血管の壁孔から漏れずに、直接、標的のがん組織に、Ｃ７０含有リポソームを到達させることができる。【００６１】
本発明において、Ｃ７０含有リポソームに含有されるＣ７０の含有量は、特に限定されるものではない。Ｃ７０含有リポソームにおけるＣ７０の含有量は、後述のＣ７０含有リポソームの製造方法に記載するように、所望に変化させることができる。Ｃ７０の含有量を変更することで、Ｃ７０含有リポソームの性質を変化させることができる。より具体的に説明すると、Ｃ７０含有リポソーム中でＣ７０が会合している場合、Ｃ７０の含有量を変更することにより、Ｃ７０含有リポソーム中でのＣ７０の会合状態が変化する。そのため、単にＣ７０の含有量が変化したことによる性質の変化に加えて、会合状態の変化による性質の変化が期待される。したがって、Ｃ７０含有リポソームにおけるＣ７０の含有量は、該Ｃ７０含有リポソームの用途によって、適宜変更することが好ましい。例えば、Ｃ７０含有リポソームをＰＤＴ用途に用いる場合、該Ｃ７０含有リポソームは、全脂質に対して、０．１〜２０モル％のＣ７０を含有することが好ましく、０．５〜１５モル％のＣ７０を含有することがより好ましい。このような構成とすれば、Ｃ７０含有リポソーム１分子当たりの光照射による活性酸素発生量を増加させることができる。それゆえ、少量のＣ７０含有リポソームで、ＰＤＴの効果を得ることができる。【００６２】
本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、以上のような構成を備えているため、水性溶媒に対して可溶である。また、平均粒径、Ｃ７０の含有量、リポソームの組成、およびその他の成分の添加により、Ｃ７０含有リポソームの物性を所望に制御することができる。それゆえ、本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、その物性に応じて、様々な用途に用いることができる。具体的には、本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、一実施形態において、光照射により活性酸素を発生する性質を有する。このようなＣ７０含有リポソームは、光活性が高く、後述の実施例に示すように、波長が３５０〜７００ｎｍの光による励起によっても、多くの活性酸素を発生することができる。それゆえ、このようなＣ７０含有リポソームは、ＰＤＴ、殺菌、滅菌等の用途に好適に用いることができる。また、ＤＮＡを切断するための用途、例えば、研究用試薬としても用いることができる。なお、本明細書でいう「光活性」とは、光の照射により励起される活性が意図され、好ましくは、光の照射により活性酸素を生成する活性が意図される。また、本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、一実施形態として、活性酸素を消去する性質を有する。このようなＣ７０含有リポソームは、活性酸素の消去が必要とされる用途に幅広く用いることができる。【００６３】
＜ＩＩ．Ｃ７０含有リポソームを含有する組成物＞
また、本発明は、一実施形態として、上述した本発明にかかるＣ７０含有リポソームを含有する組成物を提供する。本発明にかかる組成物は、上述したＣ７０含有リポソームを含んでいればよく、その他の具体的な構成は特に限定されるものではない。例えば、Ｃ７０含有リポソームが水性溶媒に溶解した溶液は、本発明にかかる組成物に含まれる。また、本発明にかかる溶液の用途も、特に限定されるものではない。以下、本発明にかかる組成物の一実施形態として、薬学的組成物、殺菌用組成物および化粧品用組成物について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６４】
（Ａ）薬学的組成物
本実施形態にかかる組成物は、光照射、好ましくは、波長が３５０〜８００ｎｍの光照射、より好ましくは、波長が３５０〜７００ｎｍの光照射により、活性酸素を発生するＣ７０含有リポソームを含有する。具体的には、Ｃ７０がカチオン性脂質を含有するリポソームによって包含されたＣ７０含有リポソームであることが好ましい。上記カチオン性脂質としては、例えば、上記例示したカチオン性脂質を含有させることができるが、中でも、上記式（２）で表される脂質を含有させることが好ましい。また、その含有量は、全脂質量の１〜５０モル％であることが好ましく、１０モル％であることがより好ましい。【００６５】
さらに、本実施形態では、上記リポソームは、カチオン性脂質に加えて、中性脂質を含有することが好ましい。該中性脂質についても、例えば、上記例示した中性脂質を含有させることができるが、中でも、上記式（１）で表される脂質を含有させることが好ましい。その含有量は、全脂質量の５０〜９９モル％であることが好ましく、９０モル％であることがより好ましい。つまり、本実施形態にかかる組成物に含有されるＣ７０含有リポソームの好ましい一実施形態として、全脂質量に対して、上記式（２）で表される脂質を１０モル％、上記式（１）で表される脂質を９０モル％含有するＣ７０含有リポソームを挙げることができる。【００６６】
本実施形態にかかる組成物において、上記Ｃ７０含有リポソームの含有量は、特に限定されるものではないが、２〜２０モル％であることが好ましく、５〜１５モル％であることがより好ましい。また、本実施形態にかかる組成物では、上記Ｃ７０含有リポソーム以外に、薬学的に許容される成分を含有していてもよい。そのような成分としては、例えば、生理学的に許容される各種の緩衝剤、ＥＤＴＡ Ｎａ２−Ｃａ、ＥＤＴＡ Ｎａ２等といったエデト酸系のキレート化剤、薬理的活性物質（例えば血管拡張剤、凝固抑制剤等）、さらには浸透圧調節剤、安定化剤、抗酸化剤（例えばα‐トコフェロール、アスコルビン酸）、粘度調節剤、保存剤等を挙げることができる。上記浸透圧調節剤としては、例えば、生理食塩水（０．９％食塩水）を挙げることができる。また、ｐＨ緩衝剤としては、アミン系緩衝剤および炭酸塩系緩衝剤が挙げられる。【００６７】
本実施形態にかかる組成物は、ＰＤＴ用として用いることができる。その場合、本実施形態にかかる組成物を投与する方法は特に限定されるものではなく、例えば、治療すべき患部に対して皮下注射、静脈注射、外科的手段等によって投与することができる。また、本実施形態にかかる組成物をＰＤＴに用いる場合、該組成部を投与後、患部を一定時間、光に曝露しない環境に置いたのちに、該患部に対して一定時間の光を照射する。この際、光の波長は特に限定されるものではないが、３５０〜８００ｎｍであることが好ましく、３５０〜７００ｎｍであることがより好ましい。このような波長の光によれば、患部に効率よく光を照射することができる。また、光を照射する方法は特に限定されるものではなく、例えば、人工拡散光源、レーザー等各種の光源を用いて光を照射することができる。好ましい光源としては、より具体的には、ハロゲン灯、キセノン灯、メタルハライド灯等を挙げることができる。中でも、可視光に強い放射強度スペクトルを持つ光源としてメタルハライド灯を用いることが好ましい。また、光源としてＬＥＤや有機ＥＬ素子等の発光素子を用いることもできる。【００６８】
また、本実施形態にかかる組成物をＰＤＴに用いる場合、その治療対象は特に限定されるものではない。例えば、癌細胞、加齢黄斑変性症、粥状動脈硬化病変、関節リウマチ病変、難治性疣贅、尋常性座瘡、およびパピロマーウイルスに対する治療に用いることができる。中でも、癌細胞、および加齢黄斑変性症の治療に好適に用いることができる。上記癌細胞の種類は特に限定されず、各種の癌細胞に対して用いることができる。また、加齢黄斑変性症は、色を識別する細胞を持つ網膜の黄斑と呼ばれる部分が加齢に伴い変化する疾患であるが、本実施形態にかかる組成物は、加齢黄斑変性症の中でも、脈絡新生血管を伴う「滲出型」の加齢黄斑変性症の治療に好適に用いることができる。【００６９】
（Ｂ）殺菌用組成物
本実施形態にかかる組成物は、光照射、好ましくは、波長３５０〜８００ｎｍの光照射、より好ましくは波長３５０〜７００ｎｍの光照射により、活性酸素を発生するＣ７０含有リポソームを含有する。その含有量は、特に限定されず、光照射によりＣ７０含有リポソームが発生する活性酸素により微生物等を死滅させることができる程度の量であればよい。また、本実施形態にかかる組成物の具体的な使用方法は、特に限定されるものではないが、例えば、本実施形態にかかる組成物を微生物が存在する部分に散布し、散布した領域を自然太陽光に曝すか、もしくは人工光源によって一定時間光照射する。人工光源によって照射する場合は、紫外光をフィルター等でカットした光を照射することが好ましい。【００７０】
また、本実施形態にかかる組成物を用いて殺菌を行う場合、殺菌対象となる微生物は特に限定されない。例えば、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ菌等の細菌に対する殺菌あるいは抗菌に用いることができる。また、クラドスポリウム（クロカビ）、アルペルギウス等のカビの除去あるいは発生防止に用いることも可能である。【００７１】
（Ｃ）化粧品用組成物
本実施形態にかかる組成物は、活性酸素を消去することが可能なＣ７０含有リポソームを含有する。本実施形態にかかる組成物は、該Ｃ７０含有リポソームに共に、他の化粧品の配合成分を含有することが好ましい。上記他の化粧品の配合成分としては、例えば、ゲル化剤、紫外線吸収剤、抗菌剤、ｐＨ調整剤、動植物由来及び微生物由来の抽出物、ビタミン類、アミノ酸類、核酸関連物質、ホルモン、酵素、血行促進剤、皮膚収斂剤、および抗脂漏剤等を挙げることができる。【００７２】
上記ゲル化剤としては、例えば、Ｎ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸、α，γ−ジ−ｎ−ブチルアミン等のアミノ酸誘導体、デキストリンパルミチン酸エステル、デキストリンステアリン酸エステル、デキストリン２−エチルヘキ酸パルミチン酸エステル等のデキストリン脂肪酸エステル、ショ糖パルミチン酸エステル、ショ糖ステアリン酸エステル等のショ糖脂肪酸エステル、モノベンジリデンソルビトール、ジベンジリデンソルビトール等のソルビトールのベンジリデン誘導体、ジメチルベンジルドデシルアンモニウムモンモリロナイトクレー、ジメチルジオクタデシルアンモニウムモンモリロナイトクレー等の有機変性粘土鉱物等を挙げることができる。【００７３】
上記紫外線吸収剤としては、たとえｂ、パラメトキシケイ皮酸−２−エチルヘキシル、パラメトキシケイ皮酸イソプロピル、パラメトキシハイドロ皮酸ジエタノールアミン塩、ジパラメトキシケイ皮酸−モノ−２−エチルヘキサン酸グリセリル、メトキシケイ皮酸オクチル、ジイソプロピルケイ皮酸メチル等のケイ皮酸系紫外線吸収剤；２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−硫酸、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−硫酸ナトリウム、２，４−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，２′−ジヒドロキシベンゾフェノン、２，２′、４，４′−テトラヒドロキシベンゾフェノン、２−ヒドロキシ−４−ｎ−オクトキシベンゾフェノン等のベンゾフェノン系紫外線吸収剤；パラアミノ安息香酸、パラアミノ安息香酸エチル、パラアミノ安息香酸ブチル、パラジメチルアミノ安息香酸−２−エチルヘキシル、パラアミノ安息香酸グリセリル、パラアミノ安息香酸アミル等の安息香酸系紫外線吸収剤；サリチル酸−２−エチルヘキシル、サリチル酸トリエタノールアミン、サリチル酸ホモメンチル、サリチル酸ジプロピレングリコール、サリチル酸メチル、サリチル酸エチレングリコール、サリチル酸フェニル、サリチル酸アミル、サリチル酸ベンジル、サリチル酸イソプロピルベンジル、サリチル酸カリウム等のサリチル酸系紫外線吸収剤；４−ｔ−ブチル−４′−メトキシジベンゾイルメタン、４−イソプロピルジベンゾイルメタン、４−メトキシベンゾイルメタン、4-t-butiru−４′−ヒドロキシジベンゾイルメタン等のジベンゾイルメタン系紫外線吸収剤；メチル−Ｏ−アミノベンゾエート、２−フェニル−ベンズイミダゾール−５−硫酸、２−フェニル−５−メチルベンゾキサゾール、３−（４−メチルベンジリデン）カンフル、２−エチルヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリレート、２−エチル−２−シアノ−３，３′−ジフェニルアクリレート、２−（２′ヒドロキシ−５−メチルフェニル）ベンゾトリアゾール、アントラニル酸メンチル等のアントラニル酸系紫外線吸収剤；ウロカニン酸エチル等のウロカニン酸紫外線吸収剤；酸化チタン、酸化ジルコニウム、酸化セリウム等を挙げることができる。【００７４】
上記抗菌剤としては、例えば、安息香酸、安息香酸ナトリウム、サリチル酸、石炭酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、パラオキシ安息香酸エステル、パラクロルメタクレゾール、ヘキサクロロフェン、塩化ベンザルコニウム、塩化クロルヘキシジン、トリクロロカルバニリド、感光素、ビス（２−ピリジルチオ−１−オキシド）亜鉛、ペンタジオール、アイチュリン、サーファクチン、ポリグリシン、エタノール、フェのキシエタノール、イソプロピルフェノール等を挙げることができる。【００７５】
上記ｐＨ調整剤としては、例えば、乳酸、クエン酸、グリコール酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム等、清涼剤としては、Ｌ−メントール、カンフル等を挙げることができる。【００７６】
上記動植物由来及び微生物由来の抽出物としては、例えば、ブタ、ウシ等の血液抽出液、血清除蛋白抽出物、脾臓抽出物、トリの卵成分、鶏冠抽出物、魚肉抽出部、イカスミ、キチン、キトサン、貝殻抽出物、貝肉抽出物、ローヤルゼリー、シルクプロテイン及びその分解物又はそれらの誘導体、ヘモグロビン又はその分解物、牛乳、カゼイン及びその誘導体又はそれらの分解物、ラクトフェリン又はその分解物、コラーゲン及びその誘導体又はそれらの加水分解物、エラスチン及びその誘導体又はそれらの加水分解物、ケラチン及びその誘導体又はそれらの分解物等、哺乳類、鳥類、魚類、軟体動物類、甲殻類、貝類、昆虫類等の動物由来抽出物；酵母代謝物、醗酵代謝産物、酵母抽出物、乳酸菌抽出物、ビフィズス菌抽出物等の微生物由来の抽出物、グラブリジン、グラブレン、リクイリチン、イソリクイリチン及びこれらを含有するカンゾウ抽出物、胎盤抽出物、カロチノイド類及びこれらを含有する動植物抽出物、ネオアガロビオース、アガロースオリゴサッカライド、アスパラガス抽出物、イブキトラノオ抽出物、エンドウ豆抽出物、エイジツ抽出物、オウゴン抽出物、オノニス抽出物、海藻抽出物、キイチゴ抽出物、クジン抽出物、ケイケットウ抽出物、ゴカヒ抽出物、リノール酸を含有する植物油、サイシン抽出物、サンザシ抽出物、サンペンズ抽出物、シラユリ抽出物、シャクヤク抽出物、センプクカ抽出物、ソウハクヒ抽出物、大豆抽出物、茶抽出物、トウキ抽出物、糖蜜抽出物、ビャクレン抽出物、ブナノキ抽出物、ブドウ種子抽出物、フローデマニータ抽出物、ホップ抽出物、マイカイカ抽出物、モッカ抽出物、ユキノシタ抽出物、ヨクイニン抽出物及び羅漢果抽出物、アスパラガス、アカネ、アカブドウ、アカメガシワ、アケビ、アサ、アサガオ、アズキ、アセンヤク、アマチャ、アマチャヅル、イタドリ、イチジク、イチョウ、イランイラン、ウツボグサ、ウメ、ウワウルシ、ウンシュウミカン、エゾウコギ、エビスグサ、エンジュ、エンドウ、オオバコ、オクラ、オグルマ、オニグルミ、オミナエシ、オランダイチゴ、カキ、カキドウシ、カシュウ、カシュー、カノコソウ、カラスウリ、カリン、ガラナ、キキョウ、キク、キササゲ、ギシギシ、ギムネマ・シルベスタ、キンミズヒキ、グアバ、クコ、クズ、クスノキ、クリ、ケイケットウ、ゲッケイジュ、ケイヒ、ゴショイチゴ、コショウ、コーヒー、ゴマノハグサ、コロンボ、サザンカ、サンショウ、サフラン、サクラ、ザクロ、サンズコン、サンペンズ、シオン、ショウブ、スイカ、ステビア、スモモ、セイヨウキズタ、セイヨウナシ、セイヨウノコギリソウ、セイヨウネズ、セイヨウワサビ、セキショウ、セリ、セネガ、センナ、ダイオウ、ダイダイ、タマリンド、タラノキ、タンポポ、チコリ、チョウジ、チョウセンゴミシ、チョレイ、ツキミソウ、ツボクサ、ツユクサ、ツルナ、テウチグルミ、トウガン、トチュウ、トロロアオイ、ナズナ、ナツミカン、ナンテン、ニガキ、ノゴギリソウ、パイナップル、ハイビスカス、パパイヤ、バジル、ハス、ハダカムギ、ヒオウギ、ピーナツ、ヒキオコシ、ヒシ、ピスタチオ、ヒバ、ヒメマツタケ、ビャクシ、ビワ、フキタンポポ、フシノキ、フジバカマ、ブルーベリー、ボウフウ、ホオズキ、ホオノキ、ボケ、マイカイ、マオウ、マンゴー、マンネンタケ、ミシマサイコ、ミソハギ、ミツバ、ミモザ、メリロート、メロン、モクレン、モモルディカ・グロスベノリィ、モロヘイヤ、モヤシ、ヤクチ、ヤクモソウ、ガグルマソウ、ヤシ、ヤシャジツ、ヤドリギ、ヤナギタデ、ヤマゴボウ、ヤマモモ、ユズリハ、ヨモギ、ライムギ、ラン、リュウガン、リンゴ、レイシ、レンギョウ等を挙げることができる。【００７７】
上記ビタミン類としては、例えば、リノレン酸及びその誘導体等のビタミンＦ類；フィトナジオン、メナキノン、メナジオン、メナジオール等のビタミンＫ類；エリオシトリン、ヘスペリジン等のビタミンＰ類；その他、ビオチン、カルチニン、フェルラ酸等を挙げることができる。【００７８】
上記アミノ酸類としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、シスチン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、プロリン、ヒドロキシプロリン、オルチニン、シトルリン、テアニン等のアミノ酸及びそれらの誘導体並びにそれらの塩、あるいはピロリドンカルボン酸等のアミノ酸誘導体またはその誘導体等が挙げられる。【００７９】
上記核酸関連物質としては、例えば、デオキシリボ核酸及びその塩、アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン一リン酸から選ばれるアデニル酸誘導体及びそれらの塩、リボ核酸及びその塩、サイクリックＡＭＰ、サイクリックＧＭＰ、フラビンアデニンヌクレオチド、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、キサンチン及びそれらの誘導体であるカフェイン、デオフィリン並びにそれらの塩等が挙げられる。【００８０】
上記ホルモンとしては、例えば、エストラジオール、エテニルエストラジオール等が挙げられる。さらに、上記酵素としては、例えば、リパーゼ、パパイン等が挙げられる。【００８１】
上記血行促進剤としては、例えば、ノニル酸ワレニルアミド、カプサイシン、ジンゲロン、カンタリスチンキ、イクタモール、α−ボルネオール、イノシトールヘキサニコチネート、シクランデレート、シンナリジン、トラゾリン、アセチルコリン、バラパミル、セファランチン、γ−オリザノール等が挙げられる。また、上記皮膚収斂剤としては、例えば、タンニン酸等が挙げられ、上記抗脂漏剤としては、例えば、イオウ、チアントロール等が挙げられる。【００８２】
また、本実施形態にかかる組成物の形状は特に限定されるものではなく、粉末状、バルク状、ペースト状、溶液状、分散液状、膜状、あるいはゲル状等でありうる。【００８３】
＜ＩＩＩ．Ｃ７０含有リポソームの製造方法＞
本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法は、上述した本発明にかかるＣ７０含有リポソームを製造するために、好適に用いることができるものである。以下、本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法の一実施形態について説明するが、それに先立ち、本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法を発明するに至った経緯について説明する。【００８４】
特許文献４および非特許文献２には、Ｃ６０フラーレン（以下、単に「Ｃ６０」ともいう）のシクロデキストリン錯体を含有する溶液と、リポソームを形成可能な脂質を含有する溶液とを、７０〜８０℃程度で、数時間加熱撹拌してＣ６０含有リポソームを製造する方法が開示されている。Ｃ６０は、Ｃ７０よりも自己会合しにくいという性質を有する。逆に言えば、Ｃ７０は、Ｃ６０よりも自己会合しやすい。フラーレンは、自己会合するとリポソームに取り込まれにくくなると考えられる。したがって、特許文献４および非特許文献２に開示されるような方法では、Ｃ７０をリポソームに取り込ませることは困難であることが予想される。また、従来、Ｃ７０含有リポソームが製造された例はなかった。このような状況下で、本発明者らは、後述の参考例に示すように、特許文献４および非特許文献２に順ずる方法でＣ７０含有リポソームの製造を試みた。その結果、Ｃ７０含有リポソームは製造できたが、リポソームへのＣ７０の取り込み効率が悪い、粒子径が大きくなるといった問題があることが明らかとなった。そこで、本発明者らは、鋭意検討し、Ｃ７０のシクロデキストリン錯体を含有する第１溶液と、リポソームを形成可能な脂質を含有する第２溶液とを１０〜４５℃で混合することにより、上記問題点が解消されたＣ７０含有リポソームを、１分以内という実に短時間で製造できることを独自に見出し、本発明を完成させたのである。【００８５】
すなわち、本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法は、シクロデキストリンＣ７０錯体を含有する第１溶液と、リポソームを形成可能な脂質を含有する第２溶液とを１０〜４５℃で混合する工程（以下、「混合工程」ともいう）を含んでいればよく、その他の構成、使用器具、使用装置等は特に限定されるものではない。例えば、本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法は、一実施形態として、上記混合工程の後、Ｃ７０含有リポソームの表面に、特定の機能を付与するための置換基を導入したり、特定の機能を付与するための脂質を挿入したりするといったＣ７０含有リポソームを修飾する工程（以下、「修飾工程」ともいう）を含んでいてもよい。より具体的には、上記修飾工程は、上述の＜Ｉ．Ｃ７０含有リポソーム＞で説明した構造を有するＣ７０含有リポソームを製造するために必要となる操作工程を包含するものである。本明細書において、「Ｃ７０含有リポソームの修飾」とは、Ｃ７０含有リポソームを化学的または物理的に改変することが意図される。また、上記修飾工程は、上記混合工程の後に行うことに限定されるものではなく、上記混合工程の前に行ってもよいし、上記混合工程と同時に行ってもよい。【００８６】
また、本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法は、一実施形態として、Ｃ７０含有リポソームを精製する工程（以下、「精製工程」ともいう）を含んでいてもよい。上記混合工程では、Ｃ７０含有リポソームを含む水溶液が製造される。上記精製工程では、上記水溶液からＣ７０含有リポソームのみを単離したり、その単離したＣ７０含有リポソームを他の溶媒に溶解したり、上記水溶液中の不純物（析出物や沈殿物）を除去したりすることができる。【００８７】
以下、上記混合工程について、より詳細に説明する。【００８８】
上記混合工程では、上記第１溶液と第２溶液とを１０〜４５℃で混合する。混合方法は、特に限定されるものではなく、上記第１溶液と第２溶液とは混ざり合って、均一な溶液となればよい。【００８９】
上記第１溶液は、少なくともシクロデキストリンＣ７０錯体を含有する水溶液であればよく、その他の成分が含有されていてもよい。上記シクロデキストリンＣ７０錯体は、水性溶媒に可溶であるが、熱的に安定性に乏しいという欠点があり、産業上の利用性が少ないとされる。本発明者らは、シクロデキストリンＣ７０錯体のこの不安定性を逆に利用して、安定性に優れ、実用的なＣ７０含有リポソームを製造することに成功したのである。上記シクロデキストリンＣ７０錯体の製造方法は、特に限定されるものではないが、例えば、非特許文献１に開示される方法に製造することができる。また、シクロデキストリンＣ７０錯体を構成するシクロデキストリンは、特に限定されるものではない。例えば、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、δ−シクロデキストリン、ε−シクロデキストリン、およびそれらのメチル化されたシクロデキストリンを挙げることができる。すなわち、本発明におけるシクロデキストリンＣ７０錯体は、β−シクロデキストリンＣ７０錯体、γ−シクロデキストリンＣ７０錯体、δ−シクロデキストリンＣ７０錯体、およびε−シクロデキストリンＣ７０錯体、並びに、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、δ−シクロデキストリン、もしくはε−シクロデキストリンのモノ、ジ、またはトリメチル化体とＣ７０フラーレンとの錯体からなる群より選択されるシクロデキストリンＣ７０錯体である。中でも、γ−シクロデキストリンＣ７０錯体を用いることが好ましい。また、上記例示したシクロデキストリンＣ７０錯体は、単独で用いてもよいし、複数を組み合わせて用いてもよい。選択するシクロデキストリンＣ７０錯体の種類および／または組み合わせを変更することにより、物性の異なるＣ７０含有リポソームを製造することができる。【００９０】
上記第２溶液は、リポソームを形成可能な脂質を含有する水溶液であればよく、その他の構成は特に限定されない。すなわち、リポソームを形成可能な脂質以外の成分が含まれていてもよい。このような成分としては、例えば、得られるＣ７０含有リポソームを修飾するための成分を挙げることができる。具体的には、例えば、上述の＜Ｉ．Ｃ７０含有リポソーム＞に例示した成分を含有させることができる。このような成分を含有させることにより、得られるＣ７０含有リポソームに特定の機能を付与することができる。【００９１】
上記脂質は、カチオン性脂質、アニオン性脂質、および中性脂質のいずれであってもよく、これらを組み合わせて用いてもよい。つまり、上記＜Ｉ．Ｃ７０含有リポソーム＞で例示したような脂質を適宜組み合わせて用いることができる。上記第２溶液の脂質の組成を変更することにより、得られるＣ７０含有リポソームの物性を所望に制御することができる。例えば、上記第２溶液にカチオン性脂質を含有させることにより、Ｃ７０含有リポソームの細胞への取り込み効率（細胞透過性）を向上させることができる。さらに、Ｃ７０含有リポソームに光を照射したときに、リポソームを損傷することなく、Ｃ７０から発生する活性酸素をＣ７０含有リポソーム外へ放出することができる。また、上述の式（１）および（２）で表される脂質を含むリポソームを用いれば、平均粒径がＥＰＲ効果により癌細胞に効率よくターゲティング可能なＣ７０含有リポソームを製造することができる。【００９２】
上記第２溶液中において、上記脂質は、リポソームを形成していてもよいし、上記混合工程において、リポソームが形成されてもよい。【００９３】
また、上記第１溶液中のシクロデキストリンＣ７０錯体濃度および第２溶液中のリポソーム濃度は、特に限定されるものではなく、それぞれ、調製が可能な濃度範囲であればよい。また、上記第１溶液と第２溶液とを混合する比率も特に限定されるものではなく、製造するＣ７０含有リポソームにおけるＣ７０の含有量が所望のものとなるように、適宜設定すればよい。つまり、本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法では、混合するシクロデキストリンＣ７０錯体と脂質とのモル比を調整することにより、Ｃ７０含有リポソームにおけるＣ７０の含有量を所望に制御することができる。本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法では、交換反応はほぼ完全に起こる。そのため、例えば、シクロデキストリンＣ７０錯体１モルに対して、脂質が１０モルとなるように、上記第１溶液と第２溶液とを混合すると、脂質の１０モル％のＣ７０を含有するＣ７０含有リポソームを製造することができる。Ｃ７０含有リポソームに含有されるＣ７０の含有量が変化すると、該Ｃ７０含有リポソーム中におけるＣ７０の会合状態が変化する。それゆえ、本発明にかかるＣ７０含有リポソームによれば、物性、例えば光特性が所望に制御されたＣ７０含有リポソームを製造することができる。【００９４】
以上のように、本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法は上述の構成を備えているため、上記第１溶液と第２溶液とを混合して直ちに（具体的には１分以内に）、Ｃ７０含有リポソームが形成される。それゆえ、生産効率よく、Ｃ７０含有リポソームを製造することができる。また、上記構成によれば、加熱等の処理が不要であるため、設備の制限を受けることなく、低コストにＣ７０含有リポソームを製造することができる。さらに、上記構成によれば、リポソームの組成やＣ７０の含有量を所望に変更することが可能であるため、活性酸素に対して安定性に優れるＣ７０含有リポソームや、活性酸素を効率よく消去するＣ７０含有リポソームや、ＥＰＲ効果により癌細胞へのターゲティングが可能なＣ７０含有リポソーム等、所望の物性をもつＣ７０含有リポソームを製造することができる。【００９５】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【００９６】
本発明について、実施例、および図２〜図６に基づいて、より具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正および改変を行うことができる。【００９７】
〔製造例１：γ−シクロデキストリンＣ７０錯体の製造〕
５．０ｍｇのＣ７０を、８倍モル等量のγ−シクロデキストリン（６１ｍｇ）と共に、高速振動条件で２０分間処理した。これにより得られた混合物を、１．５ｍｌの水で処理し、赤褐色の水溶液を得た。該赤褐色の水溶液を５倍希釈して、ＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを測定した。その吸収スペクトルは、シクロヘキサンに溶解したＣ７０とほぼ同じであった。上記水溶液の原液を、２×１０４Ｍとなるように希釈した。なお、濃度計算では、上記水溶液の３８１ｎｍにおける分子吸光係数ε３８１＝３．８０×１０４ｃｍ２ｇ−１を用いた。【００９８】
〔実施例１：Ｃ７０含有リポソームの製造〕
製造例１で製造したγ−シクロデキストリンＣ７０錯体を用いて、Ｃ７０含有リポソームを製造した。具体的には、まず、製造例１で製造した、０．２０ｍＭ γ−シクロデキストリンＣ７０錯体溶液（１ｍｌ）に、２．０ｍＭ脂質溶液（上記式（１）で表される脂質：９０モル％、上記式（２）で表される脂質：１０モル％）を、室温（２５℃）で加え、混合し、Ｃ７０含有リポソーム水溶液を得た。【００９９】
なお、γ−シクロデキストリンＣ７０錯体溶液中のγ−シクロデキストリン濃度およびＣ７０濃度、並びに脂質濃度は、それぞれ、ＮＭＲスペクトルの積算強度を用いて評価した。その結果、γ−シクロデキストリン濃度は１．９ｍＭ、Ｃ７０濃度は０．１ｍＭ、脂質濃度は１．０ｍＭであった。つまり、γ−シクロデキストリン：Ｃ７０：脂質（モル比）は、１．９：０．１：１．０であった。【０１００】
γ−シクロデキストリンＣ７０錯体が、Ｃ７０含有リポソームに変化したことは、ＵＳ−ｖｉｓ吸収スペクトルの変化により確認した。また、得られたＣ７０含有リポソームにおけるＣ７０濃度は、γ−シクロデキストリンＣ７０錯体溶液の初期濃度と同じであった。つまり、γ−シクロデキストリンＣ７０錯体中のＣ７０は、全てリポソーム中に移動することが分かった。したがって、本実施例で製造されたＣ７０含有リポソームは、脂質の１０モル％のＣ７０を含有していた。【０１０１】
こうして得られたＣ７０含有リポソーム水溶液を用いて、Ｃ７０含有リポソームのＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルを測定し、Ｃ６０含有リポソームのＵＶ−ｖｉｓ吸収スペクトルと比較した。なお、Ｃ６０含有リポソームは、非特許文献２に記載された方法で製造した。【０１０２】
その結果、図２に示すように、Ｃ７０含有リポソームは、Ｃ６０含有リポソームよりも全ての波長領域で高い吸光度を示した。特に、波長３５０ｎｍ〜７００ｎｍの領域において、高い吸光度を示した。【０１０３】
〔実施例２：Ｃ７０含有リポソームのＤＮＡ切断効果〕
実施例１で製造したＣ７０含有リポソームによるＤＮＡ切断効果を、ＤＮＡとして、ＣｏｌＥ１スーパーコイルプラスミドを用いて調べた。プラスミドは、図３の（ａ）に示すように、全く切断されていないスーパーコイルを形成した状態（図３の（ａ）中のＦｏｒｍＩ）、切断によりスーパーコイル構造が解けた環状の状態（図３の（ａ）中のＦｏｒｍＩＩ）、および、さらに切断され、直鎖状となった状態（図３の（ａ）中のＦｏｒｍＩＩＩ）をとる。本実施例では、Ｃ７０含有リポソームにより、ＦｏｒｍＩのＣｏｌＥ１プラスミドが切断され、ＦｏｒｍＩＩまたはＦｏｒｍＩＩＩとなる割合を調べた。【０１０４】
実験では、ＣｏｌＥ１スーパーコイルプラスミド（ＦｏｒｍＩ、反応液中の濃度１．３ｍｇ／ｌ）に、（１）何も添加しない、（２）光のみを照射する、（３）Ｃ６０含有リポソーム（反応液中の濃度３０μＭ）のみを添加する、（４）Ｃ６０含有リポソーム（反応液中の濃度３０μＭ）を添加して光を照射する、（５）Ｃ７０含有リポソーム（反応液中の濃度３０μＭ）のみを添加する、または（６）Ｃ７０含有リポソーム（反応液中の濃度３０μＭ）を添加して光を照射することによって、ＦｏｒｍＩＩまたはＦｏｒｍＩＩＩに切断された割合（切断率）を評価した。光照射は、５００Ｗキセノンランプ（ＵＩ−５０２Ｑ；Ushio, Inc）を用いて、１０ｃｍの距離から、好気条件、２５℃で、３時間行った。また、上記切断率の評価は、次の方法で行った。上記の処理後の試料に１０％ ＳＤＳおよびサンプルバッファー（和光純薬）を順に加え、０．９アガロースゲルを用いて電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（１００００倍希釈；Molecular Probes Inc.）で染色し、ＵＶトランスイルミネーターで観察した画像の画像解析により上記切断率を算出した。【０１０５】
その結果、図３の（ｂ）に示すように、（１）何も添加しなった場合、ＣｏｌＥ１スーパーコイルプラスミドは全く切断されなかった。また、（２）光のみを照射した場合、（３）Ｃ６０含有リポソームのみを添加した場合、（５）Ｃ７０含有リポソームのみを添加した場合にも、ＣｏｌＥ１スーパーコイルプラスミドはほとんど切断されなかった。一方、（４）Ｃ６０含有リポソームを添加して光を照射した場合、および（６）Ｃ７０含有リポソームを添加して光を照射した場合には、ＣｏｌＥ１スーパーコイルプラスミドは切断された。その程度は、（６）Ｃ７０含有リポソームを添加して光を照射した場合のほうがはるかに高く、（６）Ｃ７０含有リポソームを添加して光を照射した場合には９０％以上が切断されたのに対して、（４）Ｃ６０含有リポソームを添加して光を照射した場合には、２６％と、約１／４程度のＤＮＡしか切断されなかった。【０１０６】
また、Ｃ７０含有リポソームによるＤＮＡの光切断と、Ｃ６０含有リポソームによるＤＮＡの光切断とを、光照射開始後、経時的に比較した。その結果、図３の（ｃ）に示すように、Ｃ７０含有リポソームでは、約２時間で９０％以上のＤＮＡが切断されるのに対して、Ｃ６０含有リポソームでは、３時間経過しても、約３０％のＤＮＡしか切断されなかった。さらに、Ｃ７０含有リポソームによるＤＮＡの光切断の切断レベルを調べた。その結果、図３の（ｄ）に示すように、光照射時間が長くなるにつれて、ＦｏｒｍＩＩＩまで切断されるＤＮＡの割合が増加した。【０１０７】
以上の結果、Ｃ７０含有リポソームは、Ｃ６０含有リポソームよりも、ＤＮＡの光切断能力が遥かに高いことが分かった。【０１０８】
〔実施例３：Ｃ７０含有リポソームのＨｅＬａ細胞への光線力学活性〕
実施例１で製造したＣ７０含有リポソームのＨｅＬａ細胞に対する光線力学活性を評価した。また、実験では、Ｃ６０含有リポソームについても同様の評価を行い、両者の比較も併せて行った。【０１０９】
実験は、以下の方法により行った。まず、培養したＨｅＬａ細胞を３５ｍｍディッシュに撒き、３７℃−５％ ＣＯ２条件下で、８０％コンフルエントに達するまでインキュベートした。そこに、（１）Ｃ７０含有リポソーム溶液、（２）Ｃ６０含有リポソーム、または（３）リポソーム溶液を、脂質濃度５０μＭとなるように添加し、２４時間インキュベートした。その後、取り込まれていないリポソームを取り除くため、培地を吸引除去し、３７℃に温めておいたPhosphate Buffer Saline （ＰＢＳ） １ｍｌで洗浄を３回行った。さらに、３７℃に温めておいた培地２ｍｌを添加し、光照射サンプルとした。その後、３５℃のインキュベーターに移し、４００〜８００ｎｍの波長領域で３０分間光照射した。光照射後のディッシュの培地を除き、Annexin V-Propidium Iodide溶液 １００μｌをカバーグラス上に添加した。暗所で１５分間静置後、１×ＰＢＳで洗浄（５００μｌ×１回）した。さらに、蛍光剤溶液 １００μｌをカバーグラス上に添加し、暗所で１５分間静置後、１×ＰＢＳで洗浄（５００μｌ×１回）した。染色した細胞面を挟むようにカバーグラスをスライドグラスに被せたものを観察サンプルとし、顕微鏡下で観察した。その結果を図４に示す。図４の上段のパネルは位相差像を示すものである。該位相差像では、全細胞を観察することができる。一方、図４の下段のパネルは、ヨウ化プロピジウムで染色した細胞を蛍光顕微鏡下で観察した像を示す図である。該像では、死細胞を観察することができる。つまり、図４の上段のパネルの像と下段のパネルの像とを比較することにより、全細胞のうち、どの程度の細胞が死細胞であるかを評価することができる。【０１１０】
図４に示すように、（３）リポソーム溶液で処理した場合（図４中、コントロールと記載）、ほとんど死細胞は観察されなかった。また、（２）Ｃ６０含有リポソームで処理した場合、死細胞は観察されたが、全細胞に占める死細胞の割合は、５％と非常に低かった。一方、（１）Ｃ７０含有リポソーム溶液で処理した場合、多くの死細胞が観察され、全細胞に占める死細胞の割合は、ほぼ１００％であり、（２）Ｃ６０含有リポソームで処理した場合よりも遥かに高かった。【０１１１】
以上の結果、Ｃ７０含有リポソームは、Ｃ６０含有リポソームよりも、細胞を死滅させる能力（細胞殺傷能力）が遥かに高いことが分かった。【０１１２】
〔参考例１〕
γ−シクロデキストリンＣ７０錯体溶液に脂質溶液を加えた後、８０℃で２時間、加熱撹拌したことを除いて、実施例１と同様の方法で、Ｃ７０含有リポソーム水溶液を製造した。【０１１３】
その結果、図５の（ａ）に示すように、実施例１のＣ７０含有リポソーム水溶液では沈殿物（析出物）が見られなかったのに対して、図５の（ｂ）に示すように、本参考例のＣ７０含有リポソーム水溶液では、沈殿物（析出物）がサンプル瓶の壁面に付着していた。【０１１４】
さらに、実施例１のＣ７０含有リポソーム水溶液および本参考例のＣ７０含有リポソーム水溶液を用いて、ＵＶ−ｖｉｓ吸光スペクトルを測定した。その結果を図６に示す。図６中、実線は室温で調製されたＣ７０含有リポソーム水溶液（実施例１のＣ７０含有リポソーム水溶液）の吸収スペクトルを、破線は８０℃で２時間、加熱撹拌して調製されたＣ７０含有リポソーム水溶液（本参考例のＣ７０含有リポソーム水溶液）の吸収スペクトルである。【０１１５】
図６に示すように、本参考例のＣ７０含有リポソーム水溶液では、８００ｎｍに０．０１０の散乱による吸光度の上昇が見られた。これは、Ｃ７０含有リポソーム同士が融合し、大きなＣ７０含有リポソームに成長していることを示している。つまり、本参考例の方法で製造されたＣ７０含有リポソームは、実施例１の方法で製造されたＣ７０含有リポソームと比較して、平均粒子径が大きいことが分かった。また、本参考例のＣ７０含有リポソーム水溶液では、Ｃ７０由来の吸収ピークがブロードニングしていた。これは、Ｃ７０同士の会合が進んでいることを示している。つまり、本参考例の方法では、Ｃ７０が沈殿しやすい状態にあることが分かった。さらに、本参考例のＣ７０含有リポソーム水溶液では、２２０ｎｍおよび２４５ｎｍのピークの吸光度が減少していた。これは、Ｃ７０の沈殿（析出）によって、系内のＣ７０濃度、換言すれば、Ｃ７０含有リポソームに取り込まれたＣ７０量が低下していることを示している。つまり、本参考例の方法で製造されたＣ７０含有リポソームは、光活性が低いことが分かった。【０１１６】
なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。【０１１７】
以上のように、本発明にかかるＣ７０含有リポソームは、Ｃ７０フラーレンがリポソームに包含された状態にある。それゆえ、Ｃ７０フラーレンが本来有する物性を有する状態で、安定に極性溶媒に対してＣ７０フラーレンを可溶化することができるという効果を奏する。また、本発明にかかるＣ７０含有リポソームの製造方法によれば、シクロデキストリンＣ７０錯体を含有する第１溶液と、リポソームを形成可能な脂質を含有する第２溶液とを１０〜４５℃で混合するという単純な工程でＣ７０含有リポソームを製造できる。それゆえ、特別な設備を必要とすることなく、短時間で極性溶媒に対して可溶なＣ７０含有リポソームを製造できるという効果を奏する。【０１１８】
発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明は、Ｃ７０をリポソームに包含させるため、機能を損なうことなく、Ｃ７０を水性溶媒に対して可溶化することができる。それゆえ、ＰＤＴ薬、殺菌剤、化粧品等の用途に用いることができるだけではなく、水溶性のＣ７０を用いる医薬化学分野、材料化学分野、電気化学分野等に幅広く利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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