(57)【要約】  本発明の配列番号１〜７６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド、これらアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、活性化した血管内皮細胞への結合能または取込能を有するペプチド、あるいは前記ペプチドを部分配列として含有し、かつ、活性化した血管内皮細胞への結合能または取込能を有するペプチドは、新生血管内皮細胞に特異的に結合する新規なペプチドリガンドであり、このようなリガンドは、固形腫瘍などの血管新生を伴う疾患の治療、診断のために有効に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）いずれかのペプチド。
（Ａ）配列番号１〜７６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１〜７６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、かつ、活性化した血管内皮細胞への結合能または取込能を有するペプチド。
（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）のペプチドを部分配列として含有し、かつ、活性化した血管内皮細胞への結合能または取込能を有するペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチドが親水性高分子と結合していることを特徴とする、ペプチド結合体。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドを含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチドを用いて、新生血管に薬物を集積させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮細胞に親和性を有するペプチドに関する。特に、活性化した血管内皮細胞に対して特異的結合性を有するペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は、酸素をはじめとして種々の養分、細胞を全身の組織に運搬する重要な役目を持つことは周知のとおりである。血管新生は、新しい血管を形成する基礎的な過程であり、この過程は、個体発生、組織の成長、創傷治癒など多くの正常な生理的現象に不可欠である。また、血管新生はいくつかの病態発現においても重要であり、特に固形腫瘍の増殖および転移における役割は高い注目を集めている。腫瘍以外にも、関節炎、乾癬および糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症などの種々疾患との関わりが知られている。【０００３】
固形腫瘍において、癌細胞が自身の増殖に必要な酸素、栄養分等の供給を得るために、腫瘍組織内に新たな血管を形成する現象は広く知られており、この血管新生に必要な各種の血管新生促進因子が腫瘍細胞によって産生されていることが明らかになっている。このような血管新生を誘導する因子のひとつである血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する中和抗体を用いて腫瘍組織における血管新生を抑制する試みは、抗体医薬として実用化され、近年臨床での使用が開始されて期待通りの抗腫瘍効果を示すことが報告されている（非特許文献１）。【０００４】
腫瘍組織における新生血管をターゲットとした腫瘍の治療としては、上述のような血管内皮増殖因子を阻害する方法の他に、新生血管内皮細胞に特異的に薬物を送達し、この内皮細胞の障害または増殖抑制を引き起こす方法が考えられる。また新生内皮細胞の周囲の抗癌剤濃度を高めることで、癌細胞に作用する薬物濃度を高めて抗癌作用を得ることも期待できる。このようなアプローチにおいては、新生血管内皮細胞に特異的に結合するリガンドを得ることが重要なポイントとなる。この新生血管内皮細胞特異的リガンドとしては、新生血管内皮細胞において発現上昇が報告されているＶＥＧＦ受容体あるいはαｖインテグリンなどと結合するペプチドがいくつか報告されている（非特許文献２）が、in vivoにおいて十分な有効性が確認されているものは少なく、研究の初期段階にあるのが実状である。新生血管内皮細胞においては、上述のような分子以外にも発現が上昇している未知の分子が複数あると考えられ、このような未知の分子に対するリガンドを探索することで、さらに有効性の高いリガンドを取得できる期待がある。
【非特許文献１】ハーバート  ハーヴィッツ(Herbert Hurwitz)、他１４名、「転移性大腸癌に対するベバシズマブ＋イリノテカン、フルオロウラシル、ロイコボリン(Bevacizumab plus Irinotecan, Fluorouracil, and Leucovorin for Metastatic Colorectal Cancer)」、ニューイングランドジャーナルオブメディスン (New Engl J Med)、２００４年、第３５０巻、ページ２３３５〜２３４２
【非特許文献２】アラップ  ワディ(Arap Wadih)、他２名、「マウスモデルにおける腫瘍血管への選択的薬物送達による癌の治療(Cancer Treatment of Targeted Drug Delivery to Tumor Vasculature in a Mouse Model)」、サイエンス (Science)、１９９８年、第２７９巻、ページ３７７〜３８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、新生血管内皮細胞に特異的に結合する新規なペプチドリガンドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を克服するために、本発明者らは、腫瘍細胞株の培養上清を添加して培養した活性化ヒト血管内皮細胞、すなわち腫瘍新生血管内皮のモデル細胞に結合するが、腫瘍細胞株の培養上清を添加せずに培養したヒト血管内皮細胞、すなわち正常血管内皮のモデル細胞には結合しないペプチド配列を、ランダムライブラリーからスクリーニングする検討を行い、目的の性質を有するペプチドを取得した。【０００７】
すなわち、本発明は以下の構成を有する。
（１）（Ａ）、（Ｂ）または（Ｃ）のいずれかのペプチド。
（Ａ）配列番号１〜７６のいずれかで表されるアミノ酸配列からなるペプチド。
（Ｂ）配列番号１〜７６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有し、かつ、活性化した血管内皮細胞への結合能または取込能を有するペプチド。
（Ｃ）前記（Ａ）または（Ｂ）のペプチドを部分配列として含有し、かつ、活性化した血管内皮細胞への結合能または取込能を有するペプチド。
（２）（１）に記載のペプチドをコードする核酸。
（３）（１）に記載のペプチドが親水性高分子と結合していることを特徴とする、ペプチド結合体。
（４）（１）に記載のペプチドを含有することを特徴とする医薬組成物。
（５）（１）に記載のペプチドを用いて、新生血管に薬物を集積させる方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のペプチドは、固形腫瘍などの病変組織に存在する新生血管に特異的に集積することが期待でき、この性質を用いて血管新生を伴う各種疾患の治療、診断に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各ファージクローンの活性化ＨＵＶＥＣおよび非活性化ＨＵＶＥＣへの結合性をＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示す図である。
【図２】クローン６の共焦点蛍光顕微鏡での観察結果を示す写真代用図面である。
【図３】蛍光標識ペプチド−ＢＳＡ複合体のＨＵＶＥＣおよびＨｅＬａ細胞への取り込みを共焦点レーザー顕微鏡で観察した写真代用図面である。
【図４】蛍光標識したマルチアームＰＥＧ−ペプチド複合体を担癌マウスに投与して２４時間後の腫瘍組織切片を免疫染色したのち蛍光顕微鏡で観察した写真代用図面である。
【図５】ドキソルビシンを内封したペプチド修飾リポソームをＨＵＶＥＣに作用させ、そのときの細胞内取り込み量をドキソルビシンで定量した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のペプチドは、配列番号１〜７６に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１〜７６のいずれかで表されるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、活性化した血管内皮細胞への結合能または取込能を有するペプチドである。【００１１】
ここで、置換、挿入または付加されるアミノ酸は、自然界での存在の有無に関わらずカルボキシル基とアミノ基を持つ分子であればよく、ヒドロキシル化、リン酸化、あるいはグリコシル化等の生体内で通常見られる翻訳後修飾をされたアミノ酸であっても良い。好ましくは、哺乳類細胞内に通常存在する天然アミノ酸およびその光学異性体からなるアミノ酸配列であり、例を挙げるとアルギニン(Arg)、リジン(Lys)、アスパラギン酸(Asp)、アスパラギン(Asn)、グルタミン酸(Glu)、グルタミン(Gln)、ヒスチジン(His)、プロリン(Pro)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、メチオニン(Met)、システイン(Cys)、フェニルアラニン(Phe)、ロイシン(Leu)、バリン(Val)、イソロイシン(Ile)などからなるアミノ酸配列である。【００１２】
置換、欠失、挿入または付加されるアミノ酸の数は、１〜７個であることが好ましく、１〜５個であることがさらに好ましく、１〜３個であることがさらに好ましい。置換、欠失または挿入により変異した配列において、配列番号１〜７６のいずれかで表されるもとのアミノ酸配列の４つ以上のアミノ酸の連続した並びが保存されていることが好ましく、６つ以上のアミノ酸の連続した並びが保存されていることがより好ましい。【００１３】
また、本発明は、上述のペプチド、すなわち配列番号１〜７６に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、または配列番号１〜７６のいずれかで表されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有し、かつ活性化した血管内皮細胞への結合能または取込能を有するペプチドを、部分アミノ酸配列として含有し、かつ活性化した血管内皮細胞への結合能または取込能を有するペプチドを含む。【００１４】
なお、本発明でいうペプチドとは、２つ以上のアミノ酸がアミド結合で連結された物質を広く意味しており、数十から数百あるいは数千のアミノ酸が連結したような通常タンパク質と呼ばれる物質を含む。【００１５】
本発明でいう血管内皮細胞とは、血管の内表面を構成する細胞であり、ヒト内皮細胞または他の哺乳動物内皮細胞の使用が好ましい。ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞あるいはヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）などが含まれるが、これらに限定されない。【００１６】
本発明でいう活性化した血管内皮細胞とは、血管新生を促進することが知られている種々の因子、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、アンジオポエチンなど、あるいはこれら因子の混合物の存在化で培養した内皮細胞をいう。あるいは、腫瘍細胞が産生する任意の因子の存在下で培養した内皮細胞をいう。腫瘍細胞が産生する因子の存在化で培養を行った内皮細胞、例えば腫瘍細胞の培養上清を培地に添加して培養した内皮細胞は、固形腫瘍組織で誘導される新生血管を構成する内皮細胞の性質を高く模倣しうることが期待でき、特に好ましく用いられる。ここで用いる腫瘍細胞としては、ヒトあるいは他の哺乳動物由来の各種臓器腫瘍細胞が広く用いられうる。例えば、肝臓癌由来のＨｕＨ−７細胞、乳癌由来のＭＣＦ−７細胞、卵巣癌由来のＯＶＣＡＲ−３細胞、カポシ肉腫由来のＫＳＩＭＭ細胞、大腸癌由来のＬＯＶＯ細胞、胃癌由来のＭＫＮ−４５細胞、前立腺癌由来のＤＵ１４５細胞、肺癌由来のＡ５４９細胞、脳腫瘍由来のＵ−８７ＭＧ細胞、皮膚癌由来のＳＫ−ＭＥＬ−５細胞、膀胱癌由来のＴ２４細胞、膵臓癌由来のＰＡＮＣ−１細胞、腎臓癌由来のＧＲＣ−１細胞などが挙げられる。【００１７】
これらの血管新生促進因子あるいは腫瘍細胞が産生する因子の存在化で内皮細胞を培養する時間は特に限定されないが、十分な作用を受けかつ細胞が過剰に増殖しない条件として２時間以上７２時間以内であることが好ましく、８時間以上４８時間以内であることがさらに好ましい。【００１８】
腫瘍細胞が産生する任意の因子の存在化で培養を行う方法としては、腫瘍細胞単独で培養を行って培養上清を回収しこれを内皮細胞の培地に添加する方法、あるいは細胞は透過しないが各種蛋白、低分子などは透過しうるフィルターを用いて、一方に血管内皮細胞を他方に腫瘍細胞を入れて培養を行う方法などがある。活性化内皮細胞として一定の性質を有するものを再現性良く得るためには、腫瘍細胞単独で培養を行って培養上清を回収し、これを内皮細胞の培地に添加する方法が好ましい。【００１９】
本発明でいう血管内皮細胞への結合能を有するペプチドとは、血管内皮細胞の表面に存在する分子（細胞表面分子）と化学的もしくは物理的に相互作用することで該細胞表面上に留まることができるペプチドを意味し、血管内皮細胞結合性ペプチドともいう。ここでいう細胞表面分子としては、例えば、脂質、タンパク質、多糖類などが挙げられるが、これらに限定されるのではない。また、その相互作用は単一の細胞表面分子または複数の細胞表面分子のどちらであってもよい。【００２０】
本発明でいう血管内皮細胞への取込能を有するペプチドとは、ペプチドが該細胞と接触した後に細胞膜を通過して細胞内部へと侵入することができる性質をもつペプチドのことを意味する。通過の手段としては、例えば、エンドサイトーシスが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明においては、血管内皮細胞への取込能を有するペプチドも血管内皮細胞結合性ペプチドに含まれる。【００２１】
本発明のペプチドの血管内皮細胞への結合能または取込能は、例えば、共焦点レーザー顕微鏡観察、フローサイトメトリー、蛍光強度計などを用いて評価することができる。例えば、共焦点レーザー顕微鏡を用いた評価方法について以下に一例を記すが、これに限定されるものではない。まず、９６ウェルマイクロプレート（ガラスボトムプレート、Ｎｕｎｃ社Ｎｏ．１６４５８８）をあらかじめ１％酸性コラーゲン溶液１００μｌで１０分間処理し、ＰＢＳ１２０μｌで１回洗浄後、１×１０５個／ｍｌのＨＵＶＥＣ細胞１００μｌを播種して３７℃５％ＣＯ２条件下で２日間培養を行う。使用時に、細胞を１５０μｌの培地（２％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、増殖因子含有）で１回洗浄し、同じ培地５０μｌと、蛍光標識したペプチドまたは蛍光標識したペプチド−高分子複合体を培地で希釈してペプチド濃度２０μＭとした溶液５０μｌを添加して、３７℃５％ＣＯ２条件下で８時間培養を行う（細胞と反応時のペプチド濃度１０μＭ。）。反応後の細胞を共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社ＦＶ１０００）を用いて観察し、ペプチド由来の蛍光が細胞表面もしくは細胞内部に存在するかを調べることで血管内皮細胞への結合または取込能を評価できる。【００２２】
本発明のペプチドは、一般的な化学合成法により製造することが出来る。製造する方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が含まれる。かかるペプチド合成法には、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とが含まれる。本発明のペプチドの合成は、これらのいずれによることもできる。【００２３】
上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ（ジフェニルホスホリルアジド）法、ＤＣＣに１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド等を添加する方法、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサメチルホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、酢酸エチル等の溶媒またはこれらの溶媒の混合溶媒等を挙げることができる。【００２４】
上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸やペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステル等のアラルキルエステル等として保護することができる。また、側鎖に官能基を有するアミノ酸、例えばＴｙｒの水酸基は、必要に応じてアセチル基、ベンジル基、ベンジルオキシカルボニル基、第三級ブチル基等で保護されてもよい。更に、例えばＡｒｇのグアニジノ基は、ニトロ基、トシル基、２−メトキシベンゼンスルホニル基、メチレン−２−スルホニル基、ベンジルオキシカルボニル基、イソボルニルオキシカルボニル基、アダマンチルオキシカルボニル基等の適当な保護基により保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応も、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。【００２５】
また、本発明のペプチドは、遺伝子工学的手法を用いて常法により調製することもできる。このようにして得られる本発明のペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。【００２６】
また、本発明のペプチドは、他の物質と結合された状態で用いることもできる。結合は化学的でも物理的でもよく、本発明のペプチドと他の物質との間にリンカーを挟んでいてもよい。結合される他の物質としては、具体的には、高分子、脂質、糖、低分子化合物が挙げられ、その中でも血中滞留性の向上や高密度修飾によるクラスター効果を期待できる点などから親水性高分子が好ましい。ここでいう親水性高分子とは、化学的に合成された合成高分子や多糖類、核酸、タンパク質といった生体（天然）高分子が挙げられ、なかでも合成高分子、その中でもポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やポリビニルアルコール（ＰＶＡ）等がより好ましく用いられ、その中でも特に、ＰＥＧは血中滞留性が良いという点から好適に用いられる。【００２７】
ペプチドと親水性高分子とを結合させる方法として、親水性高分子に導入した反応性基を利用して行う方法が挙げられる。導入される反応性基としては、ペプチド中に存在するＳＨ基、ＯＨ基、ＣＯＯＨ基、ＮＨ２基のいずれかと反応するものが好ましく、例えば、マレイミド基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、ジチオピリジン基、ＮＨ２基、ＣＯＯＨ基、ＯＨ基、ＳＨ基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般的に、ＰＥＧはペプチド中に存在する−ＮＨ２基、−ＣＯＯＨ基、−ＯＨ基、−ＳＨ基のような官能基と反応させるために適した反応性基を含むように機能化できることが知られており、例えば末端にマレイミド基を導入したＰＥＧ（例えば、日本油脂製マルチアームＰＥＧ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−２００ＭＡ）を用いると、ペプチドに存在する-ＳＨ基と反応させることでペプチド−ＰＥＧ修飾体を得ることが出来る。【００２８】
また、本発明のペプチドは、生物学的に活性な薬物と本発明のペプチド双方を含有した医薬組成物として用いることが出来る。医薬組成物内の本発明のペプチドと薬物はコンジュゲートを形成していることが好ましい。ここでいうコンジュゲートとは、２つ以上の物質が同時に動きうる状態を表し、その物質間が共有結合により結合しているもの、イオン結合により静電的に結合しているもの、また結合が存在しない場合であっても立体構造により他方がもう他方の動きを制限し共に動きうる状態にしたものも含まれる。例えば本発明のペプチドを表面に修飾したミセル、リポソーム、高分子などの微粒子の中に生物学的に活性な薬物が封入されているものなどもコンジュゲートを形成していることに含まれる。【００２９】
薬物の種類としては、細胞の増殖を抑制または促進する活性を有する各種の薬物の使用が考えられる。腫瘍新生血管をターゲットとした治療においては、抗癌剤として使用されているドキソルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、オキザリプラチン、５ＦＵ、ＣＰＴ−１１、マイトマイシンＣ、などの種々薬物が使用されうる。【００３０】
また、抗体などのタンパク薬、ｓｉＲＮＡ、アプタマーなど核酸医薬などのいわゆるバイオ医薬品も好ましく用いられる。薬物としてタンパク質を用いる場合には、本発明のペプチドとタンパク質のコンジュゲートとして、融合タンパク質を作成して用いることもできる。この場合、本発明のペプチドを結合させる位置は特に限定されないが、ペプチドがタンパク質の外側に提示されており、かつ融合させたタンパク質の活性、機能への影響が低いことが好ましく、望ましくはアミノ末端またはカルボキシル末端である。【００３１】
当発明のペプチドとの融合タンパク質を製造する場合は、一般的な化学合成法により行うことが出来る。例を示すと、本発明のペプチドと蛋白薬物を混合し縮合剤を添加して結合させる方法や、ペプチド合成装置（例えばApplied Biosystems Medel 433）を用いる方法である。また塩基配列情報に基づいて遺伝子工学的手法を用いて常法により製造することも出来る。例を挙げると、タンパク発現プロモーターを有する遺伝子発現ベクターに本発明のペプチドおよび融合させるタンパク質をコードする塩基配列を組み込み製造する方法である。【００３２】
本発明の医薬組成物としては、本発明のペプチドと薬物に加えて、薬学的に許容される添加剤からなる粉末形態、あるいは、水等の媒体および該媒体以外の薬学的に許容される基剤との混合物等からなる液状形態、さらには、薬学的に許容される基剤との組み合わせにより固形化または半固形化した形態等が挙げられる。前記基剤としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機物質が挙げられ、例えば賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、吸収促進剤等が挙げられる。【００３３】
本発明で得られたペプチドは、固形腫瘍などの病変組織に存在する新生血管に特異的に集積することが期待でき、この性質を用いて各種疾患の治療、診断に使用できる。例えば、新生血管を阻害すべき癌種としては、乳癌、皮膚癌、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、肝臓癌、脳腫瘍、食道癌、膀胱癌、子宮頸癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、黒色腫、リンパ腫、神経膠腫、子宮内膜腫、多剤耐性癌等が挙げられる。また、癌以外の疾患としては、慢性関節性リウマチ、乾癬、変形性関節症などの慢性炎症または加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、新生血管緑内障などの網膜症、などの疾患をあげることができるが、これらの疾患には限定されない。【００３４】
生物学的に活性な薬物と本発明のペプチド双方を含有した医薬組成物を、生体に投与することで、薬物を病変組織の新生血管に集積させることが可能となる。医薬組成物の投与方法は特に限定されないが、例えば注射による方法、経口投与、経肺投与、経鼻投与、点眼投与などがあげられる。注射による投与が好ましく、特に静脈あるいは動脈などの血管内への投与が、新生血管病変部位に効率よく薬物を到達させることができるために好ましい方法である。【００３５】
本発明の医薬組成物を生体に投与する際の投与量や投与回数は、前記ペプチドと組み合わせる薬物、投与形態、患者の年齢、体重、症状の重篤度によってによって適宜選択されうるが、通常成人男性１日あたり０．１μｇ〜１０ｇ、好ましくは１μｇ〜１０００ｍｇの範囲で投与されうる。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を詳細に説明するため実施例を挙げるが、本発明は実施例に限定されるものではない。【００３７】
実施例１  活性化血管内皮細胞結合ファージのスクリーニング
＜方法＞
１．腫瘍細胞培養上清の調製
ヒト肝癌細胞株ＨｕＨ−７を、５％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地７ｍｌに希釈し、２５ｃｍ２培養フラスコに入れて３７℃、５％ＣＯ２存在下で２４時間培養を行った。細胞密度は、約７０％コンフルエントの状態で培養を行った。培養液を回収し、１０００ｒｐｍ、５分間遠心して上清を回収した。回収した培養上清は使用時まで−３０℃で保存した。【００３８】
２．活性化正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の調製
ファージライブラリースクリーニングに用いる正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）は、あらかじめ２％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、増殖因子含有）中で１ｘ１０４／ｍｌ、１ｍｌ／ウェルの密度で１２ウェルプレートに播種し、４８時間培養を行った。ＰＢＳで３回洗浄し、一方のウェルには上記で調製したＨｕＨ−７肝癌細胞培養上清０．５ｍｌおよびＥＢＭ−２培地（増殖因子不含）０．５ｍｌを、他方のウェルには５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地０．５ｍｌおよびＥＢＭ−２培地（増殖因子不含）０．５ｍｌを添加して、２４時間培養を行った。ＨｕＨ−７肝癌細胞培養上清を添加して培養した細胞を「ＨｕＨ−７上清培養ＨＵＶＥＣ」、ＤＭＥＭ培地を添加して培養した細胞を「ＤＭＥＭ培養ＨＵＶＥＣ」として以下のスクリーニングに使用した。【００３９】
３．ファージライブラリーからのスクリーニング
ファージペプチドライブラリーとしては、１５ｍｅｒまたは１２ｍｅｒのランダムアミノ酸配列をファージｐIII蛋白の融合蛋白として呈示するＭ１３系ファージライブラリーを使用した。上記２で調製したＤＭＥＭ培養ＨＵＶＥＣをＰＢＳで３回洗浄し、１．２ｘ１０１０ＴＵ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ）のファージを含む０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／リン酸生理緩衝液（ＰＢＳ）１ｍｌを添加して室温で３０分間反応を行った。反応液（結合しなかったファージ）を回収し、今度は上記２で調製したＨｕＨ−７上清培養ＨＵＶＥＣ（あらかじめＰＢＳで３回洗浄）に添加して、室温で３０分間反応を行った。反応後の細胞はＰＢＳで３回洗浄後、０．５ｍｌの酸性の溶離液（０．１％ＢＳＡを含有する０．１Ｍグリシン塩酸ｐＨ２．４）を添加して１分間反応を行い、結合したファージを解離させた。溶離液を回収し１２００ｒｐｍ５分間遠心を行って上清を回収し、１２５μｌの１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）を添加して中和した。この溶液を、ＤＭＥＭ培養ＨＵＶＥＣ（あらかじめＰＢＳで３回洗浄）に添加し、室温で３０分間反応後上清を回収することで、ＨｕＨ−７上清培養ＨＵＶＥＣに選択的に結合するファージを得た。【００４０】
得られたファージ溶液を対数増殖期の大腸菌に感染し、培養を行うことでファージの増幅を行った。培養液中に産生されたファージをＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する２０％ＰＥＧ８０００）添加により沈殿させて遠心回収することで、ファージの精製を行った。【００４１】
上述の一連の操作によるＨｕＨ−７上清培養ＨＵＶＥＣ結合性ファージの単離および大腸菌感染による増幅を１サイクルとして、計３サイクルのスクリーニングを行った。３サイクル後のファージ回収液を、ＬＢ−ａｇａｒプレートにまき、３７℃終夜培養後に得られたコロニー（シングルクローン）から数十個をランダムに選んで個別に培養し、上清のファージを上述のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿法で精製することで、精製ファージクローンを得た。【００４２】
４．Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法によるファージクローンの細胞結合性の解析
ＨＵＶＥＣを２％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ−２培地中９６ウェルプラスチックプレートに３ｘ１０４／ｍｌの密度で０．１ｍｌ播種し、３７℃で２４時間培養し、１５０μｌＰＢＳで洗浄後、活性化ＨＵＶＥＣ調製ウェルにはＨｕＨ−７肝癌細胞培養上清０．０５ｍｌおよびＥＢＭ−２培地（増殖因子不含）０．０５ｍｌを、非活性化ＨＵＶＥＣ調製ウェルには５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地０．０５ｍｌおよびＥＢＭ−２培地（増殖因子不含）０．０５ｍｌを添加して３７℃で２４時間培養を行った。細胞をＰＢＳで洗浄後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５０倍に希釈したファージクローンを添加し、室温で３０分間反応を行った。反応後の細胞を１５０μｌのＰＢＳで３回洗浄し、０．５％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ５０μｌを添加して室温で３０分間固定化反応を行った。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗Ｍ１３ファージ抗体（アマシャム社）５０μｌを添加し、室温で６０分間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、ＨＲＰ酵素基質（０．２μｌ／ｍｌ過酸化水素水および０．０８ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジンを含む酢酸クエン酸緩衝液ｐＨ４．５）１００μｌを添加し、室温で３〜５分間反応させた後、１Ｎ硫酸５０μｌを添加して反応を停止させた。マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ（対象波長５９５ｎｍ）の吸光度を測定した
＜結果＞
各ファージクローンの吸光度測定結果を図１に示す。吸光度が大きいほど、ＨＵＶＥＣへの結合性が高いことを示す。５０クローンのうちの半数以上のクローンが、非活性化ＨＵＶＥＣ（図中、ＤＭＥＭ培地添加）に対する結合と比較して、活性化ＨＵＶＥＣ（図中、ＨｕＨ−７培養上清添加）への結合性が高いことが認められた。【００４３】
５．ファージクローンの配列解析
実施例１−１〜４のスクリーニングを数回繰り返して実施し活性化ＨＵＶＥＣへの高い結合性が認められた計６８種のクローンを選択し、大腸菌に感染増幅させた後に、ファージｐIII蛋白のランダムペプチド配列を含む領域の塩基配列を解析することで、呈示するペプチド配列を決定した。【００４４】
＜結果＞
配列番号１〜１４および２２〜７５に示す計６８種類のペプチド配列が得られた（表１）。【００４５】
【表１−１】
2008084652.tif 000002
【００４６】
【表１−２】
2008084652.tif 000003
【００４７】
【表１−３】
2008084652.tif 000004
【００４８】
実施例２  共焦点蛍光顕微鏡によるＨＵＶＥＣへのファージ結合の確認
＜方法＞
ＨＵＶＥＣを２％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ−２培地中９６ウェルガラスボトムプレート（あらかじめコラーゲン溶液を添加、洗浄してコーティングを行ったプレート）に３ｘ１０４／ｍｌの密度で０．１ｍｌ播種し、３７℃で２４時間培養し、１５０μｌＰＢＳ洗浄後、活性化ＨＵＶＥＣ調製ウェルにはＨｕＨ−７肝癌細胞培養上清０．０５ｍｌおよびＥＢＭ−２培地（増殖因子不含）０．０５ｍｌを、非活性化ＨＵＶＥＣ調製ウェルには５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地０．０５ｍｌおよびＥＢＭ−２培地（増殖因子不含）０．０５ｍｌを添加して３７℃で２４時間培養を行った。使用する細胞をＰＢＳで洗浄後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈したファージクローン（ファージ数約２ｘ１０９ＴＵ／ｍｌ）を添加し、室温で３０分間反応を行った。反応後の細胞を１５０μｌのＰＢＳで３回洗浄後、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ１００μｌを添加して３７℃で１０分間固定化反応を行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ１００μｌを添加して室温３０分間反応させ、さらにＰＢＳで３回洗浄後、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μｌを添加して１０分間ブロッキング反応を行った。ＰＢＳで３回洗浄後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１０００倍希釈した抗Ｍ１３ファージ抗体（アマシャム社、マウスモノクローナル抗体）１００μｌ、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２０００倍希釈したフルオレセイン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ザイメッド社）１００μｌ、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで１０００倍希釈したＡｌｅｘａ４８８標識抗フルオレセイン抗体（モレキュラープローブ社）５０μｌを、順次室温でそれぞれ３０分間、３０分間、１５分間反応させた。各反応後は、細胞を１５０μｌＰＢＳで３回洗浄した。最終反応後の細胞を共焦点レーザー蛍光顕微鏡（オリンパスＦＶ１０００）で観察し、活性化ＨＵＶＥＣ、非活性化ＨＵＶＥＣそれぞれに結合したファージに由来する輝点の数を比較することで、細胞結合性を評価した。【００４９】
＜結果＞
活性化ＨＵＶＥＣ、非活性化ＨＵＶＥＣに結合したファージを蛍光標識抗体で染色し、共焦点蛍光顕微鏡で観察することにより、各ファージクローンのそれぞれの細胞への結合性をスコアリングした結果を表２に示す。また代表的な結果として、クローン６の共焦点蛍光顕微鏡写真を図２に示す。多くのクローンにおいて、活性化ＨＵＶＥＣに特異的な結合が観察された。【００５０】
【表２】
2008084652.tif 000005
【００５１】
実施例３  ペプチドの合成と高分子複合体の調製
実施例１で決定した塩基配列を持つペプチドを、Ｆｍｏｃ固相合成法により化学合成した。細胞への結合取込評価の指標となるよう、各ペプチドのアミノ末端には蛍光色素フルオレセインを結合した。また、各ペプチドのカルボキシル末端には、下記の高分子複合体を作製するための官能基としてチオール基を導入する目的でシステイン残基を付加した配列で合成した。【００５２】
各ペプチドは、薬物キャリアとしての細胞への結合取込機能を評価するため、以下の（１）、（２）の方法により、蛍光標識ペプチド−高分子複合体を作製した。【００５３】
（１）ペプチド−マルチアームＰＥＧ複合体の作製
１分子あたり４個のマレイミド基を有するＰＥＧ（日本油脂製マルチアームＰＥＧ、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ−２００ＭＡ）を２ｍＭの濃度でＤＭＳＯに溶解し、この溶液２０μｌと等量（２０μｌ）の１０ｍＭフルオレセイン標識ペプチドＤＭＳＯ溶液を混合して、室温で２時間反応させた。ＰＢＳ６０μｌを添加して総量を１００μｌに希釈した後、あらかじめ５００μｌのＰＢＳで３回洗浄して平衡化したスピンカラム（バイオラッド社マイクロバイオスピンカラム３０）を用いて脱塩処理し、未結合のペプチドを分離除去し、ペプチド−マルチアームＰＥＧ複合体を得た。【００５４】
（２）ペプチド−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）複合体の作製
２０ｍｇのＢＳＡを１ｍｌの５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液に溶解して、０．３ｍＭ溶液を作製した。この溶液全量（１ｍｌ）に、ＰＥＧ鎖スペーサーを有する２価性架橋試薬であるＮＨＳ−ＰＥＯ１２−マレイミド（ピアス社製カタログＮｏ．２２１１２）の２５０ｍＭ溶液２０μｌ（最終濃度５ｍＭ）を加えて室温で１時間反応させた。反応後の溶液１００μｌを、あらかじめ５００μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３回線乗して平衡化したスピンカラム（バイオラッド社マイクロバイオスピンカラム３０）を用いて脱塩処理し、未反応の架橋試薬を分離除去した。脱塩後の溶液５０μｌを等量の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）と混合して希釈し、得られた溶液１００μｌに、フルオレセイン標識ペプチドＤＭＳＯ溶液１０μｌを添加して室温で１時間反応させた。反応後の溶液全量を、あらかじめ５００μｌのＰＢＳで３回洗浄して平衡化したスピンカラム（バイオラッド社マイクロバイオスピンカラム３０）を用いて脱塩処理することで、未結合のペプチドを分離除去し、ペプチド−ＢＳＡ複合体溶液を得た。【００５５】
実施例４  蛍光標識ペプチド−ＰＥＧ複合体の内皮細胞への取込（定量解析）
＜方法＞
９６ウェルマイクロプレート（ガラスボトムプレート、Ｎｕｎｃ社Ｎｏ．１６４５８８）をあらかじめ１％酸性コラーゲン溶液１００μｌで１０分間処理し、ＰＢＳ１２０μｌで１回洗浄後、１ｘ１０５個／ｍｌのＨＵＶＥＣ細胞１００μｌを播種して３７℃５％ＣＯ２条件下で２日間培養を行った。使用時に、細胞を１５０μｌの培地（２％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、増殖因子含有）で１回洗浄し、同じ培地５０μｌと、実施例３（１）で調製したペプチド−マルチアームＰＥＧ複合体（配列番号１２、１３、１６（配列番号１４の部分配列）、７７）を培地で希釈してペプチド濃度２０μＭとした溶液５０μｌを順次添加して、３７℃５％ＣＯ２条件下で８時間培養を行った。（細胞と反応時のペプチド濃度１０μＭ。）培養後の細胞をＨＢＳＳ（＋）緩衝液１５０μｌで３回洗浄して未結合のペプチド−マルチアームＰＥＧ複合体を除去した後、１％ＳＤＳを含有するＨＢＳＳ（＋）１００μｌを加えて細胞に結合または取り込まれたペプチドを抽出した。抽出液を別の９６ウェルマイクロプレート（黒色プレート）に写し、蛍光光度計を用いて励起波長４９０ｎｍ、検出波長５３０ｎｍでの蛍光を測定した。添加したそれぞれのペプチド−マルチアームＰＥＧ複合体の蛍光強度を１００％として、細胞から回収された蛍光量から細胞へのペプチド取込量（％）を計算した。【００５６】
＜結果＞
各ペプチド−マルチアームＰＥＧ複合体の回収率を表３に示す。ネガティブコントロールであるランダム配列ペプチド（配列番号７７）と比較して、本発明の３種のペプチド（配列番号１２、１３、１６）はいずれも高い回収率を示した。【００５７】
【表３】
2008084652.tif 000006
【００５８】
実施例５  蛍光標識したペプチド−ＢＳＡ複合体の内皮細胞への取込（定量解析）
＜方法＞
９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社Ｎｏ．３５９５）に１ｘ１０５個／ｍｌのＨＵＶＥＣ細胞１００μｌを播種し、３７℃５％ＣＯ２条件下で２日間培養を行った。使用時に、細胞を１５０μｌの培地（２％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、増殖因子含有）で１回洗浄し、同じ培地５０μｌと、実施例３（２）で調製したペプチド−ＢＳＡ複合体（配列番号１２、１３、１６、７７）を培地で希釈してペプチド濃度２０μＭとした溶液５０μｌを順次添加して、３７℃５％ＣＯ２条件下で８時間培養を行った（細胞と反応時のペプチド濃度１０μＭ。）。反応後の細胞に結合または取り込まれたペプチド−ＢＳＡ複合体の回収および蛍光定量を、実施例３と同じ方法で行った。【００５９】
＜結果＞
各ペプチド−ＢＳＡ複合体の回収率を表４に示す。ネガティブコントロールのランダム配列ペプチド（配列番号７７）と比較して、本発明の３種のペプチド（配列番号１２、１３、１６）はいずれも高い回収率を示した。【００６０】
【表４】
2008084652.tif 000007
【００６１】
実施例６  蛍光標識したペプチド−ＢＳＡ複合体の内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびＨｅＬａ細胞への取込（画像解析）
＜方法＞
９６ウェルマイクロプレート（ガラスボトムプレート、Ｎｕｎｃ社Ｎｏ．１６４５８８）をあらかじめ１％酸性コラーゲン溶液１００μｌで１０分間処理し、ＰＢＳ１２０μｌで１回洗浄後、１ｘ１０５個／ｍｌのＨＵＶＥＣ細胞１００μｌを播種して３７℃５％ＣＯ２条件下で２日間培養を行った。使用時に、細胞を１５０μｌの培地（２％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、増殖因子含有）で１回洗浄し、同じ培地５０μｌと、実施例３（２）で調製したペプチド−ＢＳＡ複合体（配列番号１２、１３、１６、７７）を培地で希釈してペプチド濃度２０μＭとした溶液５０μｌを順次添加して、３７℃５％ＣＯ２条件下で８時間培養を行った（細胞と反応時のペプチド濃度１０μＭ。）。反応後の細胞を、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社ＦＶ１０００）を用いて観察した。【００６２】
＜結果＞
各ペプチド−ＢＳＡ複合体を反応させた細胞の共焦点レーザー顕微鏡画像を図３に示す。ＨＵＶＥＣ細胞については、本発明の３種のペプチド（配列番号１２，１３，１６）はいずれも細胞内に明るい輝点が多数観察され、細胞内にペプチドが取り込まれていることが示された。ネガティブコントロールのランダム配列ペプチド（配列番号７７）は、細胞内のペプチドは全く観察されなかった。【００６３】
一方、内皮細胞以外の比較細胞として用いたＨｅＬａの場合には、配列番号１２，１３，１６で表される本発明のペプチドとともに、ＨＵＶＥＣへの取り込みと比較してごく少量のペプチドしか細胞内に観察されず、取り込みが内皮細胞特異的であることが示された。【００６４】
実施例７  蛍光標識したペプチド−マルチアームＰＥＧ複合体の内皮細胞への取込（画像解析スコアリング）
＜方法＞
９６ウェルマイクロプレート（ガラスボトムプレート、Ｎｕｎｃ社Ｎｏ．１６４５８８）をあらかじめ１％酸性コラーゲン溶液１００μｌで１０分間処理し、ＰＢＳ１２０μｌで１回洗浄後、１ｘ１０５個／ｍｌのＨＵＶＥＣ細胞１００μｌを播種して３７℃５％ＣＯ２条件下で２日間培養を行った。使用時に、細胞を１５０μｌの培地（２％ウシ胎児血清を含むＥＢＭ−２培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、増殖因子含有）で１回洗浄し、同じ培地５０μｌと、実施例３（１）で調製したマルチアームＰＥＧ−ペプチド複合体（配列番号１２のペプチドとその部分ペプチド（配列番号１７、１８、１９）、配列番号１３のペプチドとその部分ペプチド（配列番号１５、２０、２１）、ランダム配列ペプチド（配列番号７７））を培地で希釈してペプチド濃度３２μＭとした溶液５０μｌを順次添加して、３７℃５％ＣＯ２条件下で８時間培養を行った（細胞と反応時のペプチド濃度１６μＭ。）。反応後の細胞を、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス社ＦＶ１０００）を用いて観察した。細胞内に認められるペプチド由来の蛍光輝点の量を以下の通りスコアリングした。【００６５】
スコア０：  細胞内の蛍光輝点は認められない
スコア１：  細胞内に、かすかな蛍光輝点が認められる
スコア２：  細胞内に、スコア１よりも明瞭な蛍光輝点が認められる
スコア３：  細胞内に、スコア２よりもさらに明るい蛍光輝点が多数見られる。【００６６】
＜結果＞
スコアリングの結果を表５に示す。配列番号１２のペプチド由来の部分ペプチド（配列番号１７，１８，１９）は、もとの配列番号１２のペプチドよりも弱いながらもいずれも細胞内の蛍光が認められ、細胞内への取り込みが確認された。配列番号１３のペプチド由来の部分ペプチド（配列番号１５、２０、２１）もいずれも細胞内の蛍光が認められ、細胞内への取り込みが確認された。特に配列番号１３のペプチドの１２ｍｅｒペプチドの５−１２アミノ酸残基に相当するペプチド（配列番号１５）は、配列番号１３のペプチドと同等の蛍光が認められた。【００６７】
一方、ネガティブコントロールのランダム配列ペプチド（配列番号７７）は、細胞内の蛍光は全く観察されなかった。【００６８】
【表５】
2008084652.tif 000008
【００６９】
実施例８  蛍光標識したペプチド−マルチアームＰＥＧ複合体の腫瘍への集積評価
＜方法＞
８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（雄）（日本ＳＬＣより購入）に、ＰＢＳに懸濁したマウス大腸癌細胞（ｃｏｌｏｎ２６細胞）を１．５×１０６個／匹で皮下移植した。１ヵ月後、腫瘍直径が約１．５ｃｍになった状態で、実施例３（１）で調製したマルチアームＰＥＧ−ペプチド（配列番号１２および１３）複合体のＰＢＳ懸濁液２００ｕＬを尾静脈投与した。投与２４時間後、マウスを安楽死させ、腫瘍塊を摘出した。摘出した腫瘍隗はＯＣＴコンパウンド（サクラファインテック社）を用いて包埋し凍結ブロックを作製した。この凍結ブロックからクリオスタット（ブライト社製）を用いて腫瘍組織の凍結切片を作製した。得られた組織切片は冷風で１時間風乾した。この組織切片をＰＢＳで洗浄しＯＣＴコンパウンドを除去した後、アセトンに５分間浸漬することで固定処理を行った。固定処理後、１０％牛胎児血清を含むＰＢＳを室温で３０分間作用させることでブロッキング処理を行った。ここにペプチドに修飾されている蛍光色素フルオレセインに対する抗体（ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ／Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）と血管内皮細胞に発現していることが知られている表面抗原ＣＤ３１に対する抗体（Ｂｉｏｔｉｎａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＣＤ３１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を１００倍の希釈率で作用させ室温で２時間インキュベーションすることで１次抗体反応を行った。反応終了後、ＰＢＳで洗浄を行い、続いてそれぞれの１次抗体に対する蛍光標識抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔＩｇＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社と、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を作用させることで２次抗体反応を行った。２次抗体反応終了後、ＰＢＳで十分に洗浄を行いカバーガラスにて封入し、蛍光顕微鏡（ＩＸ−７０、オリンパス社製）を用いて観察を行いペプチドの腫瘍組織への集積を評価した。【００７０】
＜結果＞
蛍光顕微鏡による観察像を図４に示す。観察の結果、腫瘍組織内にペプチドに由来する蛍光が観察され、静脈内投与した蛍光標識ペプチド−ＰＥＧ複合体が腫瘍部に集積することが示された。また、ペプチド由来の蛍光の位置とＣＤ３１で染色される位置が一致したことより、蛍光標識したペプチド−マルチアームＰＥＧ複合体は腫瘍組織内の血管部位に局在していることが示された。【００７１】
実施例９  ドキソルビシンを内封したペプチド修飾リポソームの調製
＜方法＞
水素化大豆ホスファチジルコリン（１０ｍｇ）、コレステロール（３．４ｍｇ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００（３．５ｍｇ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール５０００−マレイミド（３．１ｍｇ）をクロロフォルムに溶解させ、エバポレータを用いてフラスコ内で溶媒を除去し薄膜を形成させた。このものに、２５０ｍMアンモニウム硫酸水溶液１．７ｍＬを添加し、６５℃で過熱した。得られたベシクルを、ポアサイズ１．０μｍ、０．４μｍ、０．２μｍの多孔膜を順次用いてエクストルーダーで整粒した。調製した粒径約２００ｎｍのリポソームに、リモートローディング法によりドキソルビシンを封入した。カラムにより未封入ドキソルビシンを除いた後、マレイミドに対して１/５量にあたるペプチド（配列番号１２、１３、７６（配列番号７の部分配列）、７８）をそれぞれ添加し、各種ペプチドが導入されたリポソームを調製した。未反応のマレイミドは、３倍量の２-メルカプトエタノール添加し不活化した。【００７２】
実施例１０  ドキソルビシンを内封したペプチド修飾リポソームのＨＵＶＥＣへの取り込み（定量解析）
＜方法＞
２４ウェルプレートで培養した５０−６０%コンフルエントの正常ヒト臍帯静脈内皮細胞について、培地を交換後、培地の半量のドキソルビシン内封ペプチド修飾リポソーム分散液を添加した。６時間後リン酸緩衝液で洗浄後、トリプシン処理し、遠心操作で細胞を回収した。細胞ペレットに１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を５０μＬ添加し、細胞及びドキソルビシン内封ペプチドリポソームを溶解させた後、０．７５ＭＨＣｌを１０％加えたイソプロパノールを３５０μＬ添加し、一晩−２０℃で静置した。遠心操作後上澄みをＯＤＳカラムで分析し細胞に取り込まれたドキソルビシンを定量した。
＜結果＞
結果を図５に示す。配列番号１２、１３、７６を導入したリポソームでは、ランダム配列（配列番号７８）のペプチドを導入したリポソームおよびペプチドを導入していないリポソームと比較して、ドキソルビシンの取り込み量が顕著に上昇した。特に、配列番号１３を導入したリポソームでのドキソルビシン取り込み量は、配列番号１２、７６を導入した場合よりも高く、ペプチド導入していないものの約３倍であった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明のペプチドは、固形腫瘍などの病変組織に存在する新生血管に特異的に集積することが期待でき、この性質を用いて血管新生を伴う各種疾患の治療、診断に使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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