(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニクズクの種子抽出物の蒸留残渣のみを有効成分とする冷感剤。
【請求項２】
ニクズクの種子抽出物の蒸留残渣のみを有効成分とするＴＲＰＭ８活性化剤。
【請求項３】
請求項１に記載の冷感剤を含有する口腔用組成物。
【請求項４】
請求項２に記載のＴＲＰＭ８活性化剤を含有する口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、化粧料及び口腔用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニクズクやその加工処理物（例えばナツメグオイル等）は、古来より胃腸薬や頭痛薬、香辛料などに用いられている有用な化合物である。
【０００３】
一方、使用中や使用後における清涼感を付与することを目的として、化粧品、ヘアケア製品、トイレタリー製品、入浴剤、医薬品等の各種製品に、冷感物質がしばしば配合されており、斯様な冷感物質として、メントールが広く用いられている。
メントールによる冷感付与は、皮膚や粘膜組織中に存在する知覚神経終末にメントールが直接作用することにより生じると考えられており、この冷感付与に関するメカニズムの検討が進められてきた。
【０００４】
まず、ラットの感覚神経のうち、弱い冷却刺激に応答して内向きのイオン電流を生じるニューロンが、メントールに対しても同様の応答性を示すことが発見された（非特許文献１）。この発見により、メントールの刺激による冷感が内向きのイオン電流により引き起こされるものであることが明らかとなった。
【０００５】
そして、メントール及び冷刺激に応答性を示す受容体として、三叉神経ニューロンからＣＭＲ−１（ｃｏｌｄ  ａｎｄ  ｍｅｎｔｈｏｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が同定された（非特許文献２）。この受容体はＴＲＰＭ８と呼ばれており（非特許文献３）、ＴＲＰイオンチャネルファミリーに属する興奮性のイオンチャネルであるこの受容体が、前述のイオン電流を引き起こすと考えられる。
【０００６】
これらの報告によって、感覚神経に存在するＴＲＰＭ８にメントールが結合して内向き電流が発生することにより、メントールによる冷感が生じることが明らかとなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ＲＥＩＤ，Ｇ．＆ＦＬＯＮＴＡ，Ｍ．Ｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，３２４，ｐ１６４−１６８
【非特許文献２】ＭＣＫＥＭＹ，Ｄ．Ｄ．，ＮＥＵＨＡＵＳＳＥＲ，Ｗ．Ｍ．＆ＪＵＬＩＵＳ，Ｄ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１６，ｐ５２−５６
【非特許文献３】ＰＥＩＥＲ，Ａ．Ｍ．，ＭＯＱＲＩＣＨ，Ａ．，ＨＥＲＧＡＲＤＥＮ，Ａ．Ｃ．，ＲＥＥＶＥ，Ａ．Ｊ．，ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ，Ｄ．Ａ．，ＳＴＯＲＹ，Ｇ．Ｍ．，ＥＡＲＬＥＹ，Ｔ．Ｊ．，ＤＲＡＧＯＮＩ，Ｉ．，ＭＣＩＮＴＹＲＥ，Ｐ．，ＢＥＶＡＮ，Ｓ．＆ＰＡＴＡＰＯＵＴＩＡＮ，Ａ．（２００２），Ｃｅｌｌ，１０８，ｐ７０５−７１５
【非特許文献４】ＢＥＨＲＥＮＤＴ，Ｈ．−Ｊ．，ＧＥＲＭＡＮＮ，Ｔ．，ＧＩＬＬＥＮ，Ｃ．，ＨＡＴＴ，Ｈ．＆ＪＯＳＴＯＣＫ，Ｒ．（２００４），Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４１，ｐ７３７−７４５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、メントールは、多量に使用した場合に、皮膚や粘膜への刺激や特有の不快な刺激臭等が問題となるため、使用量が制限されることがある。
また、メントールの他に、リナロール、ゲラニオール、ヒドロキシシトロネラール等もＴＲＰＭ８を活性化することが知られているが（非特許文献４）、該非特許文献４に記載の化合物が示す清涼感は必ずしも充分なものではなかった。
【０００９】
本発明は、優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有する冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、化粧料及び口腔用組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ニクズク抽出物の蒸留残渣が、優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有することを見出し、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は、ニクズク抽出物の蒸留残渣を有効成分とする冷感剤を提供するものである。
また、本発明は、ニクズク抽出物の蒸留残渣を有効成分とするＴＲＰＭ８活性化剤を提供するものである。
更に、本発明は、ニクズク抽出物の蒸留残渣を含有する化粧料を提供するものである。
更に、本発明は、ニクズク抽出物の蒸留残渣を含有する口腔用組成物を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の冷感剤及びＴＲＰＭ８活性化剤は、優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有し、これを用いることによって良好な冷感を付与することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ニクズク抽出物の蒸留残渣を用いるものである。斯かるニクズクは、ニクズク科に属する植物であるＭｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ  Ｈｏｕｔｔ．を意味する。また、ニクズクとしては、その種子、メース、葉、果実などが使用され、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、種子、メースが好ましい。なお、ニクズク抽出物は、これら部位を単独で用いたものでもよく、２種以上組み合わせて用いたものでもよい。また、ニクズクをそのまま抽出したものでもよく、乾燥させた後に適当な大きさに切断・粉砕してから抽出したものでもよい。
【００１４】
また、上記ニクズク抽出物として、市販のものを用いてもよいが、常法に従いニクズクを抽出したものを用いてもよい。斯かる抽出は、上記ニクズクを室温又は加温下にて溶剤に含浸させる方法、ソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて行われる溶剤抽出法、炭酸ガス等を超臨界状態にして行う超臨界抽出法、圧搾して抽出物を得る圧搾法等を利用して行うことができる。また、水蒸気蒸留やマイクロ波水蒸気蒸留などを行った残渣から、再度溶媒等を用いて抽出を行ってもよい。
上記抽出法の中でも、蒸留残渣に用いる抽出物を得る場合は、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、超臨界抽出法が好ましい。なお、超臨界抽出法は、ニクズクに超臨界流体を接触させるものであり、具体的には、二酸化炭素等の物質を超臨界の状態（超臨界流体）とし、これを抽出可能な状態でニクズクに接触させて抽出する方法等が挙げられる。
【００１５】
また、上記抽出に抽出溶剤を用いる場合、その抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれを使用してもよい。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、シクロヘキサノール等のアルコール類；プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の鎖状又は環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；スクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類等の他、超臨界二酸化炭素、油脂、ワックス、オイル等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
これらの中でも、蒸留残渣に用いる抽出物を得る場合は、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、水と極性溶剤との混合液、極性溶剤、超臨界二酸化炭素が好ましく、水・アルコール類混合液、アルコール類、超臨界二酸化炭素がより好ましく、超臨界二酸化炭素が更に好ましい。
また、上記水と極性溶剤との混合液を用いる場合、その極性溶剤の濃度は、好ましくは２５％（ｖ／ｖ）以上、より好ましくは３５％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは５０％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは７０％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは８０％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは９０％（ｖ／ｖ）以上であり、また、好ましくは９９．９％（ｖ／ｖ）以下である。具体的には、混合液中の極性溶剤の濃度は、好ましくは２５〜９９．９％（ｖ／ｖ）であり、より好ましくは３５〜９９．９％（ｖ／ｖ）であり、更に好ましくは５０〜９９．９％（ｖ／ｖ）であり、更に好ましくは７０〜９９．９％（ｖ／ｖ）であり、更に好ましくは８０〜９９．９％（ｖ／ｖ）であり、更に好ましくは９０〜９９．９％（ｖ／ｖ）である。
【００１６】
また、上記抽出溶剤の使用量は特に限定されないが、ニクズク１質量部に対して、通常１質量部以上、好ましくは３質量部以上、より好ましくは５質量部以上であり、また、通常５０質量部以下、好ましくは３０質量部以下、より好ましくは２５質量部以下、更に好ましくは１５質量部以下である。具体的には、抽出溶剤の使用量は、ニクズク１質量部に対して、好ましくは１〜５０質量部であり、より好ましくは３〜３０質量部であり、更に好ましくは５〜２５質量部である。
【００１７】
また、抽出温度は、通常３℃以上、好ましくは１０℃以上、より好ましくは２０℃以上であり、また、通常１００℃以下、好ましくは６０℃以下、より好ましくは４５℃以下である。具体的には、抽出温度は、好ましくは３〜１００℃であり、より好ましくは１０〜６０℃であり、更に好ましくは２０〜４５℃である。
【００１８】
また、抽出時間は、通常１時間以上であり、また、通常１４日間以下、好ましくは７日間以下、より好ましくは５日間以下である。具体的には、抽出時間は、好ましくは１時間〜１４日間であり、より好ましくは１時間〜７日間であり、更に好ましくは１時間〜５日間である。
また、抽出するときの圧力は、通常、常圧で行うが、高圧下で行うこともできる。
【００１９】
上記のようにして得られる抽出物の蒸留は、例えば、分子蒸留、水蒸気蒸留、マイクロ波蒸留等の公知の方法で行えばよく、蒸留の条件や段数、装置は特に限定されない。
また、斯かる蒸留操作は、常圧又は減圧下で行うことができるが、蒸留圧力は、好ましくは０．０５Ｐａ以上、より好ましくは０．１Ｐａ以上であり、また、好ましくは１０００Ｐａ以下、より好ましくは２００Ｐａ以下、更に好ましくは３０Ｐａ以下である。具体的には、好ましくは０．０５〜１０００Ｐａであり、より好ましくは０．１〜２００Ｐａであり、更に好ましくは０．１〜３０Ｐａである。
蒸留温度は、好ましくは３０℃以上、より好ましくは４５℃以上、更に好ましくは６０℃以上であり、また、好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１４０℃以下、更に好ましくは１３０℃以下である。具体的には、蒸留温度は、好ましくは３０〜１５０℃であり、より好ましくは４５〜１４０℃であり、更に好ましくは６０〜１３０℃である。
また、上記のようにして得られるニクズク抽出物の蒸留残渣を、更に１回以上（好ましくは１〜３回）蒸留して得られる残渣を蒸留残渣として用いてもよい。斯かる蒸留残渣を用いることによりＴＲＰＭ８活性化作用が向上する。
【００２０】
また、得られた蒸留残渣を希釈、濃縮、凍結乾燥等をした後、必要に応じて粉末やペースト状に調製して用いることもできる。
なお、上記蒸留残渣の希釈に用いる溶媒としては、アルコール、水、これらの混液が挙げられる。また、上記蒸留残渣の濃縮・精製手段としては、例えば蒸留残渣の濾過、活性炭処理、液−液分配等が挙げられる。
【００２１】
そして、後記実施例に示すように、ニクズク抽出物の蒸留残渣は、天然物由来であり、極めて簡便な操作で得ることができるものでありながら、優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有する。なお、本発明において、蒸留残渣とは、ニクズク抽出物を蒸留したときに蒸留されず残ったものをいう。
したがって、ニクズク抽出物の蒸留残渣は、冷感剤及びＴＲＰＭ８活性化剤（以下、冷感剤等とも称する）として、そのまま、或いは各種製剤担体や保存剤等とともに用いることができる。
【００２２】
次に、本発明の冷感剤及びＴＲＰＭ８活性化剤の態様について説明する。
冷感剤等は、それ自体がヒト又は動物用の医薬品、化粧料、飲食品、口腔用組成物、ペットフード、他の嗜好品（タバコ等）等であってもよく、また、これら医薬品等に添加する冷感を付与する素材であってもよい。
【００２３】
上記医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態は、経粘膜、経皮等の非経口投与と経口投与とに大別される。
また、前記医薬品の剤型は特に限定されない。非経口投与用の医薬品の剤型としては、例えば、液剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、パップ剤、エアゾール剤、ローション剤、ファンデーション等の皮膚外用剤の他、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
一方、経口投与用の医薬品の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、丸剤、糖衣錠、内服液、懸濁液、シロップ剤等が挙げられる。
また、前記医薬品は、消炎鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、抗生物質等の他の薬効成分を含んでいてもよい。なお、これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２４】
また、前記化粧料、飲食品、口腔用組成物の形態は特に限定されない。
化粧料は、例えば、皮膚外用剤（虫除けスプレー等）、洗浄剤、化粧水、乳液、スキンクリーム、ファンデーション、口紅、頭皮用化粧料、毛髪化粧料（シャンプー、ヘアトニック等）、入浴剤等とすることができる。また、化粧料は、蒸留残渣の他に、油剤、セラミド類、擬似セラミド類、ステロール類、保湿剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、美白剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤等を含んでいてもよい。なお、これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。
また、飲食品としては、例えば、キャンディ、ガム、タブレット、カプセル、飲料水等が挙げられる。
また、口腔用組成物としては、例えば、歯磨剤、洗口液、歯肉マッサージクリーム等が挙げられる。
【００２５】
また、蒸留残渣の含有量は特に限定されないが、経口投与のための医薬品、飲食品、口腔用組成物又はペットフードである場合は、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、好ましくは０．１ｐｐｍ以上、より好ましくは１ｐｐｍ以上、更に好ましくは１０ｐｐｍ以上、更に好ましくは５０ｐｐｍ以上であり、また、好ましくは１００００ｐｐｍ以下、より好ましくは５０００ｐｐｍ以下、更に好ましくは２５００ｐｐｍ以下、更に好ましくは１０００ｐｐｍ以下である。具体的には、上記のような場合の蒸留残渣の含有量は、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、好ましくは０．１〜１００００ｐｐｍであり、より好ましくは１〜１００００ｐｐｍであり、更に好ましくは１０〜５０００ｐｐｍであり、更に好ましくは５０〜２５００ｐｐｍである。
【００２６】
また、非経口投与のための医薬品、化粧料又は他の嗜好品である場合、蒸留残渣の含有量は、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上であり、また、好ましくは１０質量％以下である。具体的には、上記のような場合の蒸留残渣の含有量は、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、好ましくは０．００１〜１０質量％であり、より好ましくは０．０１〜１０質量％である。
【００２７】
上述した実施形態に関し、本発明は更に以下の冷感剤等を開示する。
【００２８】
＜１＞ニクズク抽出物の蒸留残渣を有効成分とする冷感剤。
【００２９】
＜２＞ニクズク抽出物の蒸留残渣を有効成分とするＴＲＰＭ８活性化剤。
＜３＞ニクズク抽出物の蒸留残渣を含有する化粧料。
＜４＞ニクズク抽出物の蒸留残渣を含有する口腔用組成物。
＜５＞ニクズク抽出物が、超臨界抽出法で抽出したニクズク抽出物である上記＜１＞〜＜４＞のいずれかの冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、化粧料又は口腔用組成物。
＜６＞ニクズク抽出物が、好ましくは水と極性溶剤との混合液、極性溶剤及び超臨界二酸化炭素から選ばれる溶剤を用いて抽出されたもの、より好ましくは水・アルコール類混合液、アルコール類及び超臨界二酸化炭素から選ばれる溶剤を用いて抽出されたもの、更に好ましくは超臨界二酸化炭素を用いて抽出されたものである上記＜１＞〜＜５＞のいずれかの冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、化粧料又は口腔用組成物。
＜７＞混合液の濃度が、好ましくは２５％（ｖ／ｖ）以上、より好ましくは３５％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは５０％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは７０％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは８０％（ｖ／ｖ）以上、更に好ましくは９０％（ｖ／ｖ）以上であり、また、好ましくは９９．９％（ｖ／ｖ）以下である上記＜６＞の冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、化粧料又は口腔用組成物。
＜８＞蒸留残渣が、好ましくは０．０５Ｐａ以上、より好ましくは０．１Ｐａ以上、また、好ましくは１０００Ｐａ以下、より好ましくは２００Ｐａ以下、更に好ましくは３０Ｐａ以下の圧力下でニクズク抽出物を蒸留して得た残渣である上記＜１＞〜＜７＞のいずれかの冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、化粧料又は口腔用組成物。
＜９＞蒸留残渣が、好ましくは３０℃以上、より好ましくは４５℃以上、更に好ましくは６０℃以上、また、好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１４０℃以下、更に好ましくは１３０℃以下の温度でニクズク抽出物を蒸留した残渣である上記＜１＞〜＜８＞のいずれかの冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、化粧料又は口腔用組成物。
＜１０＞蒸留残渣が、ニクズク抽出物の蒸留残渣を、更に１回以上蒸留して得られる残渣である上記＜１＞〜＜９＞のいずれかの冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、化粧料又は口腔用組成物。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３１】
実施例１  超臨界二酸化炭素抽出物をクーゲル蒸留（単蒸留）した残渣
ニクズク科ニクズク（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ  Ｈｏｕｔｔ．）の種子の超臨界二酸化炭素抽出物（ＰＴ  ＭＩＴＲＡ  ＡＹＵ  ＡＤＩＰＲＡＴＡＭＡ社より購入）１５．６ｇを、２段階のクーゲル蒸留によって成分分離を行った。１段階目は、減圧度０．８ｍｍＨｇ、温度８０℃で行い、留分（１）５．２３ｇ、蒸留残渣（１）７．９１ｇを得た（ロス２．４６ｇ）。２段階目は、減圧度０．００６ｍｍＨｇ、温度１２０℃で行い、蒸留残渣（１）より、留分（２）２．３９ｇ、蒸留残渣（２）５．１９ｇを得た（ロス０．３３ｇ）。
【００３２】
実施例２  ＥｔＯＨ抽出物をクーゲル蒸留（単蒸留）した残渣
破砕したニクズク科ニクズク（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ  Ｈｏｕｔｔ．）の種子１６０ｇに、９９．５ｖｏｌ％エタノールを１．６Ｌ添加し、室温で３日間浸漬して抽出した後、濾過し粗抽出液を調製した。続いて、この粗抽出液をエバポレータで濃縮し、ＥｔＯＨ抽出物１９．４９ｇを得、このＥｔＯＨ抽出物７．５９ｇについて、２段階のクーゲル蒸留によって成分分離を行った。１段階目は、減圧度０．８ｍｍＨｇ、温度８０℃で行い、留分（３）０．０９ｇ、蒸留残渣（３）７．０５ｇを得た（ロス０．４５ｇ）。２段階目は、減圧度０．０１ｍｍＨｇ、温度１３０℃で行い、蒸留残渣（３）より、留分（４）１．３１ｇ、蒸留残渣（４）５．６２ｇを得た（ロス０．１２ｇ）。
【００３３】
実施例３  超臨界二酸化炭素抽出物を分留及び分子蒸留した残渣
ニクズク科ニクズク（Ｍｙｒｉｓｔｉｃａ  ｆｒａｇｒａｎｓ  Ｈｏｕｔｔ．）の種子の超臨界二酸化炭素抽出物（ＰＴ  ＭＩＴＲＡ  ＡＹＵ  ＡＤＩＰＲＡＴＡＭＡ社より購入）２３４ｋｇを、減圧度１．５ｍｍＨｇ、温度８０℃の条件で分留し、留分（５）７６．５ｋｇ、蒸留残渣（５）１５１．５ｋｇを得た（ロス６ｋｇ）。続いて、蒸留残渣（５）１３２．６ｋｇについて、３段階の分子蒸留によって成分分離を行った。１段階目は、減圧度０．３７５ｍｍＨｇ、温度６０℃で行い、上記蒸留残渣（５）より、留分（６）２７．５ｋｇを得た。２段階目は、減圧度０．０００７５ｍｍＨｇ、温度８０℃で行い、上記１段階目の蒸留残渣より、留分（７）２９．３ｋｇを得た。３段階目は、減圧度０．０００７５ｍｍＨｇ、温度１２０℃で行い、上記２段階目の蒸留残渣より、留分（８）１６．９ｋｇ、蒸留残渣（６）５５．３ｋｇを得た（３段階のロス３．６ｋｇ）。
【００３４】
試験例１
上記蒸留残渣（１）、（２）、（４）及び（６）、上記留分（１）及び（２）、ＰＴ  ＭＩＴＲＡ  ＡＹＵ  ＡＤＩＰＲＡＴＡＭＡ社より購入した超臨界二酸化炭素抽出物、実施例２で調製したＥｔＯＨ抽出物をそれぞれ試験サンプルとし、以下の手順に従いＴＲＰＭ８活性化作用におけるＥＣ50値を測定した。
（１）ヒトＴＲＰＭ８安定発現株の作製
ヒトＴＲＰＭ８安定発現ＨＥＫ２９３細胞株を作製するため、ヒトＴＲＰＭ８遺伝子のクローニングを行った。全長ヒトＴＲＰＭ８遺伝子は、ヒト前立腺組織全ＲＮＡ（ＣＯＳＭＯＢＩＯ社製）より、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅した。
得られたＰＣＲ産物をエントリーベクターｐＥＮＴＲ−Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）へクローニングした後、ｐＣＤＮＡ３．２−Ｖ５／ＤＥＳＴ（インビトロジェン社製）へサブクローニングし、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）によりＨＥＫ２９３細胞へ形質導入した。形質導入された細胞を、４５０μｇ／ｍＬのＧ−４１８（プロメガ社）を含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させて選抜した。ＨＥＫ２９３細胞は内在性のＴＲＰＭ８を発現しないため、ＴＲＰＭ８形質導入株に対するコントロールとして使用できる。
（２）カルシウムイメージング
ＨＥＫ２９３細胞へ形質導入したＴＲＰＭ８活性の測定は、蛍光カルシウムイメージング法により行った。
まず、培養したＴＲＰＭ８発現細胞をポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ウェルプレート（ＢＤファルコン社製）へ播種（３０，０００細胞／ウェル）し、３７℃で一晩インキュベートした後、培養液を除去し、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ液（同仁化学社製；カルシウムキットＩＩ）を添加し、３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。その後、９６ウェル穴プレートを蛍光プレートリーダー（ＦＤＳＳ３０００；浜松ホトニクス社製）にセットし、装置庫内温度を３２℃とした状態で、励起波長４８０ｎｍで励起したときのＦｌｕｏ４による蛍光イメージを、ＣＣＤカメラを用いて検出波長５２０ｎｍにより捕捉した。
測定は１秒毎に計４分間行い、測定開始１５秒後に、ＦＤＳＳ３０００内蔵の分注器から試験サンプル（下記表１に示す各化合物をそれぞれリンガー液に溶解させたもの）を添加し、蛍光強度の変化によりＴＲＰＭ８の活性を評価した。
【００３５】
（３）ＴＲＰＭ８活性化の評価
ＴＲＰＭ８活性は、試験サンプルによる自家蛍光の影響を排除するため、下記の式で自家蛍光分を差し引いた。
自家蛍光を差し引いた蛍光強度（Ｆsub）
＝（各時点のＴＲＰＭ８発現細胞の蛍光強度）−｛（各時点ＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度）−（測定開始時のＨＥＫ２９３細胞の蛍光強度）｝
また、各サンプルによるＴＲＰＭ８活性化作用は、試験サンプル添加後の蛍光強度比のピークを用いて評価した。下記の式を用いて蛍光強度比を算出した。
蛍光強度比＝各時点のＦsub／測定開始時のＦsub
各処理群あたり２ウェルで評価を行い、その平均値を用いた。
【００３６】
（４）ＴＲＰＭ８活性化作用の評価結果
各試験サンプルのＴＲＰＭ８活性化作用を、終濃度０．１ｐｐｍから３０ｐｐｍの範囲で評価し、最小二乗法によりヒルの式に近似した容量依存曲線を求めた。この曲線から算出した各試験サンプルのＴＲＰＭ８活性化作用におけるＥＣ50値を以下に示す。
【００３７】
【表１】
0005608793.tif 000002
【００３８】
留分（１）及び留分（２）は終濃度３０ｐｐｍにおいてもＴＲＰＭ８活性化作用を有していなかった。
【００３９】
前記表１に示すように、実施例で得られた蒸留残渣は優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有する。
【要約】
【課題】優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有する冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、化粧料及び口腔用組成物を提供すること。
【解決手段】ニクズク抽出物の蒸留残渣を有効成分とする冷感剤。
【選択図】なし