(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質からなるプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子を植物体に過剰発現させる、バイオマス量及び/又は種子量を増産させる方法。
（a）配列番号５、７、３６、４２、４８及び５９〜６５からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号５、７、３６、４２、４８及び５９〜６５からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、プロテインホスファターゼ2C活性を有するタンパク質
（c）配列番号４、６、３５、４１及び４７からなる群から選ばれる１つの塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされプロテインホスファターゼ2C活性を有するタンパク質
【請求項２】
上記植物体は双子葉植物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
上記植物体はアブラナ科植物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
上記植物体はシロイヌナズナであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
上記植物体はアブラナであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
上記植物体は単子葉植物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
上記植物体はイネ科植物であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
上記植物体はイネであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
上記植物体はサトウキビであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質からなるプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子を過剰発現させた形質転換植物を準備する工程と、
（a）配列番号５、７、３６、４２、４８及び５９〜６５からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号５、７、３６、４２、４８及び５９〜６５からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列において１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、プロテインホスファターゼ2C活性を有するタンパク質
（c）配列番号４、６、３５、４１及び４７からなる群から選ばれる１つの塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされプロテインホスファターゼ2C活性を有するタンパク質
前記形質転換植物の後代植物のバイオマス量及び/又は種子量を測定し、当該バイオマス量及び/又は種子量が有意に向上した系統を選抜する工程とを含む、植物体の製造方法。
【請求項１１】
双子葉植物であることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１２】
アブラナ科植物であることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１３】
シロイヌナズナであることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１４】
アブラナであることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１５】
単子葉植物であることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１６】
イネ科植物であることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１７】
イネであることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【請求項１８】
サトウキビであることを特徴とする請求項１０記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の遺伝子を過剰発現させた植物体、及び所定の遺伝子を過剰発現させることによるバイオマス量及び/又は種子量を増産する方法、バイオマス量及び/又は種子量が増産した植物体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマス（biomass）とは、一般的には一定面積あたりに生息または存在する生物の総量を指し、特に植物を対象とした場合は、単位面積あたりの乾重量を意味する。バイオマスの単位は、質量又はエネルギー量で数値化する。バイオマスという表現は、「生物体量」、「生物量」も同義語であり、植物バイオマスの場合には「現存量（Standing crop）」の語が使われることもある。植物バイオマスは、大気中の二酸化炭素を太陽エネルギーを用いて固定して生成されるため、いわゆるカーボンニュートラルなエネルギーとして捕らえることができる。したがって、植物のバイオマスを増加させることは、地球環境保全、地球温暖化防止、温室効果ガス排出低減の効果がある。従って、植物バイオマスを増産させる技術は産業上の重要性が高い。【０００３】
一方、植物は、その一部の組織自体（種子、根、葉茎など）を目的として栽培されたり、油脂などの種々の物質生産を目的として栽培されたりする。例えば、植物が生産する油脂としては、大豆油、ごま油、オリーブ油、椰子油、米油、綿実油、ひまわり油、コーン油、べに花油、パーム油及び菜種油等が古来より知られており、家庭用途や工業用途に広く利用されている。また、植物が生産する油脂は、バイオディーゼル燃料やバイオプラスチックの原料としても使用され、石油代替エネルギーとして適用性が広がっている。【０００４】
特に、サトウキビなどのエネルギー作物は、バイオ燃料の原料となるため、植物自体の総量（植物バイオマス量）を増産させることが期待されている。このような状況において、植物バイオマス量を増産させるには、単位耕地面積あたりの生産性の向上が必要となる。ここで単位耕地面積あたりの栽培個体数が一定であると仮定すると、個体あたりのバイオマス量の向上が必要であることが判る。【０００５】
しかしながら、植物バイオマス量は、多数の遺伝子が関与すると考えられており（いわゆる量的形質の一種）、個別の遺伝子導入、遺伝子操作では効果的に増産できないと考えられている。一方、多数の遺伝子を望ましい状態で植物に導入することは非常に困難であり、また、導入できたとしても望ましい形質が確実に獲得できるわけではないといった問題があった。【０００６】
植物バイオマスを増産させる技術としては、例えば特許文献１〜７に開示されるような種々の遺伝子導入技術が知られていた。しかしながら、いずれの技術においてもバイオマス増産効果としては十分とは言えなかった。
【特許文献１】特表２００１−５０５４１０号
【特許文献２】特表２００１−５１９６５９号
【特許文献３】特表２００７−５３００６３号
【特許文献４】特開２００５−１３０７７０号
【特許文献５】特表２０００−５１５０２０号
【特許文献６】特表平９−５０３３８９号
【特許文献７】特開２００５−５２１１４号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、上述したような実情に鑑み、植物バイオマス量を大幅に向上させる新規な機能を有する遺伝子を探索し、植物バイオマス量を大幅に増産できる技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述した目的を達成するため、本発明者らが鋭意検討した結果、特徴的な共通配列を有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子を過剰発現させることで、植物バイオマス量を大幅に向上できるといった新規知見を見いだし、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明に係る植物体は、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子を過剰発現させたものである。【００１０】
また、本発明に係るバイオマス量を増産させる方法は、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子を過剰発現させる方法である。【００１１】
さらに、本発明に係る植物体の製造方法は、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子を過剰発現させた形質転換植物を準備する工程と、前記形質転換植物の後代植物のバイオマス量を測定し、当該バイオマス量が有意に向上した系統を選抜する工程とを含む方法である。【００１２】
本発明において、上記プロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子は、At1g03590-AtPP2C6-6、At1g16220、At1g79630、At5g01700、At3g02750、At5g36250、At5g26010、At4g32950、At3g16800、At3g05640、At5g27930-AtPP2C6-7、At2g20050及びAt3g06270からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子若しくは当該遺伝子に機能的に等価な遺伝子とすることができる。【００１３】
本発明において、上記プロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子が、以下の（a）〜（c）のいずれかのタンパク質をコードするものであることが好ましい。【００１４】
（a）配列番号５、７、３６、４２及び４８からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列を含むタンパク質
（b）配列番号５、７、３６、４２及び４８からなる群から選ばれる１つのアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、プロテインホスファターゼ2C活性を有するタンパク質
（c）配列番号４、６、３５、４１及び４７からなる群から選ばれる１つの塩基配列の相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下においてハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされプロテインホスファターゼ2C活性を有するタンパク質
また、本発明において、上記機能的に等価な遺伝子は、シロイヌナズナ以外の生物由来のプロテインホスファターゼ2C遺伝子を挙げることができる。シロイヌナズナ以外の生物としては、イネ（Oryza sativa）、ブラック・コットンウッド（Populus trichocarpa）、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）、アルファルファ（Medicago sativa）、ヒメツリカネゴケ（Physcomitrella patens）、アイスプラント（Mesembryanthemum crystallinum）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）、トウモロコシ（Zea mays）、アブラナ（Brassica rapa）、トマト（Solanum lycopersicum）、ミゾホオズキ（Mimulus guttatus）、単細胞紅藻類のCyanidioschyzon merolaeからなる群から選ばれる一種を挙げることができる。【００１５】
本発明において対象とする植物は、双子葉植物、例えばアブラナ科植物、アブラナ科植物の中でもシロイヌナズナやアブラナを挙げることができる。一方、本発明において対象とする植物は、単子葉植物、例えばイネ科植物、イネ科植物の中でもイネやサトウキビを挙げることができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明に係る植物体は、野生型と比較してバイオマス量及び/又は種子量が有意に向上したものとなる。また、本発明に係るバイオマス量及び/又は種子量を増産する方法は、対象とする植物の野生型と比較して大幅にバイオマス量及び/又は種子量を増産することができる。さらに、本発明に係る植物体の製造方法は、野生型と比較してバイオマス量及び/又は種子量が大幅に向上した植物体を製造することができる。したがって、本発明を適用することによって、例えば、植物自体を生産物としたときの生産性の向上を達成することができ、低コスト化を達成することができる。また、本発明を適用することによって、例えば、種子自体を生産物としたときの生産性や、種子に含まれる成分を生産物としたときの生産性の向上を達成することができ、低コスト化を達成することができる。【００１７】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-066460号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、At1g03590-AtPP2C6-6、At1g16220、At1g79630、At5g01700、At3g02750、At5g36250、At5g26010、At4g32950、At3g16800、At3g05640、At5g27930-AtPP2C6-7、At2g20050及びAt3g06270がコードするアミノ酸配列について、CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignmentプログラムを用いてアラインメント解析した結果を示す特性図である。
【図２】図２は、At1g03590-AtPP2C6-6、At1g16220、At1g79630、At5g01700、At3g02750、At5g36250、At5g26010、At4g32950、At3g16800、At3g05640及びAt5g27930-AtPP2C6-7がコードするアミノ酸配列について、CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignmentプログラムを用いてアラインメント解析した結果を示す特性図である。
【図３】図３は、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真である。
【図４】図４は、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部のバイオマス量を測定した結果を示す特性図である。野生型は、12個体の平均値、形質転換植物体は、5個体の平均値
【図５】図５は、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の種子量を測定した結果を示す特性図である。野生型は、12個体の平均値、形質転換植物体は、5個体の平均値
【図６】図６は、pBI-sGFP-R4R3にpST-Blue1ベクターのMultiple cloning siteを３個連結した植物発現用ベクターを導入した対象植物及びPP2C（protein phosphatase 2C）（At3g05640）のコーディング領域を導入した形質転換植物イネの地上部を撮影した写真である。
【図７】図７は、遺伝子導入していない対象イネ及びイネ由来PP2C（protein phosphatase 2C）（Os05g0358500）のコーディング領域を導入した形質転換イネの地上部を撮影した写真である。
【図８】図８は、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At5g27930）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真である。
【図９】図９は、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At5g27930）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真である。
【図１０】図１０は、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g02750）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真である。
【図１１】図１１は、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g16800）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真である。
【図１２】図１２は、野生型及びイネ由来PP2C（protein phosphatase 2C）（Os05g0358500）のコーディング領域を導入した導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。【００２０】
本発明に係る植物体は、特徴的な共通配列を有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子を過剰発現させたものであり、野生型と比較してバイオマス量が有意に向上している。本発明に係る植物体としては、上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子を植物組織の全体に亘って過剰発現させたものであっても良いが、植物組織の少なくとも一部において過剰発現させたものであっても良い。ここで植物組織とは、葉、茎、種子、根及び花等の植物器官を含む意味である。【００２１】
ここで、過剰発現とは、植物体に導入された上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子が転写され、転写産物として確認できる発現量を意味する。【００２２】
プロテインホスファターゼ2C遺伝子
植物体内において過剰発現させるプロテインホスファターゼ2C遺伝子は、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする。なお、参考文献（TRENDS in Plant Science Vol.9 No.5 May 2004 Pages 236-243）の第237頁に挙げられたFigure1.topographic cladogramにおいてグループEとして分類された遺伝子群は、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子である。なお、参考文献によれば、シロイヌナズナにおいては、76個のプロテインホスファターゼ2C遺伝子が予測されており、これら遺伝子についてT-Coffeeソフトウェア（参考文献；Notredame, C. et al. 2000 T-Coffee: a novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. J. Mol. Biol. 302, 205-247）を用いて系統樹を作成した結果が参考文献のFigure 1として開示されている。この系統樹において、グループEに分類されたプロテインホスファターゼ2C遺伝子は、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2Cをコードしている。配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列は、上述した分類におけるグループＥに特徴的な配列であって、他のグループとの明確な区別基準となる配列である。【００２３】
上述した分類におけるグループＥには、シロイヌナズナ由来のAt1g03590-AtPP2C6-6、At1g16220、At1g79630、At5g01700、At3g02750、At5g36250、At5g26010、At4g32950、At3g16800、At3g05640、At5g27930-AtPP2C6-7、At2g20050及びAt3g06270で特定されるプロテインホスファターゼ2C遺伝子が含まれている。これらシロイヌナズナ由来のプロテインホスファターゼ2C遺伝子At1g03590-AtPP2C6-6、At1g16220、At1g79630、At5g01700、At3g02750、At5g36250、At5g26010、At4g32950、At3g16800、At3g05640、At5g27930-AtPP2C6-7、At2g20050及びAt3g06270がコードするアミノ酸配列について、CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignmentプログラム（国立遺伝学研究所のDDBJで使用できる（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html））を用いてアラインメント解析した結果を図１に示す（使用したアミノ酸配列置換行列表はデフォルト値のBLOSUMマトリックスを使用した）。図１に示すように、これらグループＥに分類されるプロテインホスファターゼ2C遺伝子は、I〜IIIと表記した領域において特徴的な共通配列を有することが判る。これらI〜IIIと表記した領域を、後述するイネ由来のプロテインホスファターゼ2C遺伝子とともにアライメント解析することで、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列を定義することができる。【００２４】
ここで、配列番号１に示すアミノ酸配列において、Xaaとして表記されたアミノ酸残基は任意のアミノ酸であり、如何なるアミノ酸に限定されるものではない。但し、配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１番目のアミノ酸残基は、ロイシン（三文字表記：Leu、一文字表記：L、以下同様）又はフェニルアラニン（Phe、F）であることが好ましい。配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から４番目のアミノ酸残基は、バリン（Val、V）、イソロイシン（Ile、I）又はメチオニン（Met、M）であることが好ましい。配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１６番目のアミノ酸残基は、セリン（Ser、S）又はアラニン（Ala、A）であることが好ましい。配列番号１に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１７番目のアミノ酸残基は、リジン（Lys、K）、アルギニン（Arg、R）、グルタミン（Gln、Q）又はアスパラギン（Asn、N）であることが好ましい。すなわち、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる共通配列としては、より具体的に (L/F)XG(V/I/M)FDGHGXXGXXX(S/A)(K/R/Q/N)XVであることが好ましい。このアミノ酸配列において、カッコ内の複数のアミノ酸は当該位置において取りうるアミノ酸残基のバリエーションを示している。また、下記アミノ酸配列において、Xは、当該位置において任意のアミノ酸残基を取りうることを意味している。【００２５】
また、この共通配列は、図１中の領域IのN末端側に３アミノ酸酸基：(D/E/N)XXを含む配列としてもよい。【００２６】
ここで配列番号２に示すアミノ酸配列において、Xaaとして表記されたアミノ酸残基は任意のアミノ酸であり、如何なるアミノ酸に限定されるものではない。但し、配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から５番目のアミノ酸残基は、グリシン（Gly、G）、アラニン（Ala、A）又はセリン（Ser、S）であることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から６番目のアミノ酸残基は、バリン（Val、V）、ロイシン（Leu、L）又はイソロイシン（Ile、I）であることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から９番目のアミノ酸残基は、イソロイシン（Ile、I）、バリン（Val、V）、フェニルアラニン（Phe、F）、メチオニン（Met、M）又はロイシン（Leu、L）であることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１２番目のアミノ酸残基は、グリシン（Gly、G）又はアラニン（Ala、A）であることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１５番目のアミノ酸残基は、ロイシン（Leu、L）、バリン（Val、V）又はイソロイシン（Ile、I）であることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１７番目のアミノ酸残基は、イソロイシン（Ile、I）、バリン（Val、V）又はメチオニン（Met、M）であることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１８番目のアミノ酸残基は、グリシン（Gly、G）又はアラニン（Ala、A）であることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から２２番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Asp、D）又はヒスチジン（His、H）であることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から２６番目のアミノ酸残基は、バリン（Val、V）又はイソロイシン（Ile、I）であることが好ましい。配列番号２に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から２７番目のアミノ酸残基は、ロイシン（Leu、L）、メチオニン（Met、M）又はイソロイシン（Ile、I）であることが好ましい。すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる共通配列としては、より具体的にSGXT(G/A/S)(V/L/I)XX(I/V/F/M/L)XX(G/A)XX(L/V/I)X(I/V/M)(A/G)NXG(D/H)SRA(V/I)(L/M/I)であることが好ましい。このアミノ酸配列において、カッコ内の複数のアミノ酸は当該位置において取りうるアミノ酸残基のバリエーションを示している。また、下記アミノ酸配列において、Xは、当該位置において任意のアミノ酸残基を取りうることを意味している。【００２７】
ここで配列番号３に示すアミノ酸配列において、Xaaとして表記されたアミノ酸残基は任意のアミノ酸であり、如何なるアミノ酸に限定されるものではない。但し、配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から４番目のアミノ酸残基は、メチオニン（Met、M）、バリン（Val、V）又はフェニルアラニン（Phe、F）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から５番目のアミノ酸残基は、セリン（Ser、S）、アラニン（Ala、A）又はトレオニン（Thr、T）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から７番目のアミノ酸残基は、アラニン（Ala、A）又はセリン（Ser、S）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から８番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン（Phe、F）、イソロイシン（Ile、I）又はバリン（Val、V）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１４番目のアミノ酸残基は、リシン（Lys、K）又はグルタミン酸（Glu、E）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１８番目のアミノ酸残基は、バリン（Val、V）又はロイシン（Leu、L）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１９番目のアミノ酸残基は、イソロイシン（Ile、I）又はバリン（Val、V）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から２３番目のアミノ酸残基は、グルタミン酸（Glu、E）、グルタミン（Gln、Q）又はアスパラギン酸（Asp、D）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から２４番目のアミノ酸残基は、イソロイシン（Ile、I）、バリン（Val、V）又はフェニルアラニン（Phe、F）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から２９番目のアミノ酸残基は、イソロイシン（Ile、I）、ロイシン（Leu、L）又はバリン（Val、V）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から３０番目のアミノ酸残基は、セリン（Ser、S）、トレオニン（Thr、T）又はアスパラギン（Asn、N）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から３３番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Asp、D）、アスパラギン（Asn、N）又はヒスチジン（His、H）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から３５番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン（Phe、F）又はチロシン（Tyr、Y）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から３６番目のアミノ酸残基は、ロイシン（Leu、L）、イソロイシン（Ile、I）、バリン（Val、V）、フェニルアラニン（Phe、F）又はメチオニン（Met、M）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から３７番目のアミノ酸残基は、バリン（Val、V）、ロイシン（Leu、L）又はイソロイシン（Ile、I）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から３８番目のアミノ酸残基は、ロイシン（Leu、L）又はバリン（Val、V）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から４０番目のアミノ酸残基は、トレオニン（Thr、T）又はセリン（Ser、S）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ��配列におけるＮ末端側から４３番目のアミノ酸残基は、バリン（Val、V）、イソロイシン（Ile、I）又はメチオニン（Met、M）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から４４番目のアミノ酸残基は、トリプトファン（Trp、W）又はフェニルアラニン（Phe、F）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から４５番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Asp、D）又はグルタミン酸（Glu、E）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から４７番目のアミノ酸残基は、ロイシン（Leu、L）、イソロイシン（Ile、I）又はメチオニン（Met、M）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から４８番目のアミノ酸残基は、セリン（Ser、S）、トレオニン（Thr、T）又はプロリン（Pro、P）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から４９番目のアミノ酸残基は、アスパラギン（Asn、N）又はセリン（Ser、S）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から５２番目のアミノ酸残基は、バリン（Val、V）又はアラニン（Ala、A）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から５５番目のアミノ酸残基は、ロイシン（Leu、L）、バリン（Val、V）、イソロイシン（Ile、I）又はメチオニン（Met、M）であることが好ましい。配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から５６番目のアミノ酸残基は、イソロイシン（Ile、I）又はバリン（Val、V）であることが好ましい。すなわち、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる共通配列としては、より具体的にGXA(M/V/F)(S/A/T)R(A/S)(F/I/V)GDXXX(K/E)XXG(V/L)(I/V)XXP(E/Q/D)(I/V/F)XXXX(I/L/V)(T/S)XX(D/N/H)X(F/Y)(L/I/V/F)(V/L/I)(L/V)A(T/S)DG(V/I/M)(W/F)(D/E)X(L/I/M)(S/T/P)(N/S)XX(V/A)XX(L/V/I/M)(I/V)であることが好ましい。このアミノ酸配列において、カッコ内の複数のアミノ酸は当該位置において取りうるアミノ酸残基のバリエーションを示している。また、下記アミノ酸配列において、Xは、当該位置において任意のアミノ酸残基を取りうることを意味している。【００２８】
ただし、配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から２０番目のアミノ酸残基は、アラニン（Ala、A）、セリン（Ser、S）又はシステイン（Cys、C）であることがより好ましい。また、配列番号３に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から５０番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Asp、D）、グルタミン酸（Glu、E）、リシン（Lys、K）、グルタミン（Gln、Q）又はアスパラギン（Asn、N）であることがより好ましい。【００２９】
所定の位置において取りうるアミノ酸残基のバリエーションは以下の理由によるものである。参考文献(1)（「マッキー生化学」第3版  5章アミノ酸・ペプチド・タンパク質  5.1アミノ酸、監修：市川厚、監訳：福岡伸一、発行者：曽根良介、発行所：(株)化学同人、ISBN4-7598-0944 -9）でも記載されているように、アミノ酸は同様の性質（化学的性質や物理的大きさ）を持つ側鎖に従って分類される事がよく知られる。また、タンパク質の活性を保持したまま、所定のグループに分類されるアミノ酸残基間における分子進化上の置換が頻度高く起こることがよく知られる。この考えを基に、参考文献(2)： Henikoff S., Henikoff J.G., Amino-acid substitution matrices from protein blocks, Proc. Natl. Acad.  Sci.  USA, 89, 10915-10919 (1992)中の、Fig.2でアミノ酸残基の置換変異のスコアマトリックス（BLOSUM）が提唱され、広く使用されている。参考文献(2)では、側鎖の化学的性質が似たもの同士のアミノ酸置換は、タンパク質全体に与える構造や機能変化が少なくなると言う知見に基づくものである。上記参考文献(1)及び(2)によれば、マルチプルアラインメントで考慮するアミノ酸の側鎖のグループは、化学的性質や物理的大きさなどの指標を基にして考えることができる。これは、参考文献(2)に開示されたスコアマトリックス（BLOSUM）において、スコアの0以上の値を持つアミノ酸、好ましくは1以上の値を持つアミノ酸のグループとして示される。代表的なグループとしては、下記の８つが上げられる。その他の細かいグループ分けは、当該スコアの値の0以上同士のアミノ酸グループ、好ましくは1以上同士のアミノ酸グループ、さらに好ましくは2以上のアミノ酸グループであれば良い。【００３０】
１）脂肪族疎水性アミノ酸グループ（ILMVグループ）
このグループは、上記参考文献(1)で示された中性非極性アミノ酸のうち、脂肪属性の疎水性側鎖をもつアミノ酸のグループであり、V(Val、バリン)、L(Leu、ロイシン)、I(Ile、イソロイシン)及びM(Met、メチオニン)から構成される。参考文献(1)による中性非極性アミノ酸と分類されるもののうちFGACWPは以下理由で、この「脂肪族疎水性アミノ酸グループ」には含めない。G(Gly、グリシン)やA(Ala、アラニン)はメチル基以下の大きさで非極性の効果が弱いからである。C(Cys、システイン)はS-S結合に重要な役目を担う場合があり、また、酸素原子や窒素原子と水素結合を形成する特性があるからである。F(Phe、フェニルアラニン)やW(Trp、トリプトファン)は側鎖がとりわけ大きな分子量をもち、かつ、芳香族の効果が強いからである。P(Pro、プロリン)はイミノ酸効果が強く、ポリペプチドの主鎖の角度を固定してしまうからである。【００３１】
２）ヒドロキシメチレン基をもつグループ（STグループ）
このグループは、中性極性アミノ酸のうちヒドロキシメチレン基を側鎖に持つアミノ酸のグループであり、S(Ser、セリン)とT(Thr、スレオニン)から構成される。SとTの側鎖に存在する水酸基は、糖の結合部位であるため、あるポリペプチド（タンパク質）が特定の活性を持つために重要な部位である場合が多い。【００３２】
３）酸性アミノ酸（DEグループ）
このグループは、酸性であるカルボキシル基を側鎖に持つアミノ酸のグループであり、D(Asp、アスパラギン酸)とE(Glu、グルタミン酸)から構成される。【００３３】
４）塩基性アミノ酸（KRグループ）
このグループは、塩基性アミノ酸のグループであり、K(Lys、リジン)とR(Arg、アルギニン)から構成される。これらKとRは、pHの広い範囲で正に帯電し塩基性の性質をもつ。一方、塩基性アミノ酸に分類されるＨ(His、ヒスチジン)はpH7においてほとんどイオン化されないので、このグループには分類されない。【００３４】
５）メチレン基＝極性基（DHNグループ）
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてメチレン基が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持ち、N(Asn、アスパラギン、極性基はアミド基)、D(Asp、アスパラギン酸、極性基はカルボキシル基)とH(His、ヒスチジン、極性基はイミダゾール基)から成る。 
６）ジメチレン基＝極性基（EKQRグループ）
このグループは、全てα位の炭素元素に側鎖としてジメチレン基以上の直鎖炭化水素が結合しその先に極性基を有すると言う特徴を持つ。非極性基であるジメチレン基の物理的大きさが酷似している特徴を持つ。E(Glu、グルタミン酸、極性基はカルボキシル基)、K(Lys、リジン、極性基はアミノ基)、Q(Gln、グルタミン、極性基はアミド基)、R(Arg、アルギニン、極性基はイミノ基とアミノ基)から成る。【００３５】
７）芳香族（FYWグループ）
このグループには、側鎖にベンゼン核を持つ芳香族アミノ酸であり、芳香族特有の化学的性質を特徴とする。F(Phe、フェニルアラニン)、Y(Tyr、チロシン)、W(Trp、トリプトファン)から成る。【００３６】
８）環状＆極性（HYグループ）
このグループには、側鎖に環状構造を持つと同時に極性も持つアミノ酸で、H(H、ヒスチジン、環状構造と極性基は共にイミダゾール基)、Y(Tyr、チロシン、環状構造はベンゼン核で極性基は水酸基)から成る。【００３７】
以上のように、配列番号１〜３に示す所定のアミノ酸配列においては、Xaaとして示すアミノ酸残基を任意のアミノ酸としても良いが、Xaaとして示すアミノ酸残基を上記１）〜８）のグループ内でアミノ酸置換しても良いことが判る。すなわち、本発明において、植物体内で過剰発現させるプロテインホスファターゼ2C遺伝子は、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有する限り、如何なる植物由来のプロテインホスファターゼ2C遺伝子であってもよい。【００３８】
より具体的に、シロイヌナズナにおいて配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子としては、At1g03590-AtPP2C6-6、At1g16220、At1g79630、At5g01700、At3g02750、At5g36250、At5g26010、At4g32950、At3g16800、At3g05640、At5g27930-AtPP2C6-7、At2g20050及びAt3g06270が挙げられ、本発明ではこれら遺伝子群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を過剰発現させる。なかでも、本発明では、At1g03590-AtPP2C6-6、At1g16220、At1g79630、At5g01700、At3g02750、At5g36250、At5g26010、At4g32950、At3g16800、At3g05640及びAt5g27930-AtPP2C6-7からから選ばれる少なくとも１種の遺伝子を過剰発現させることが好ましい。特に本発明においては、At3g16800、At3g05640及びAt5g27930-AtPP2C6-7からから選ばれる少なくとも１種の遺伝子を過剰発現させることがより好ましく、At3g05640で特定される遺伝子を過剰発現させることが最も好ましい。【００３９】
なお、At1g03590-AtPP2C6-6、At1g16220、At1g79630、At5g01700、At3g02750、At5g36250、At5g26010、At4g32950、At3g16800、At3g05640及びAt5g27930-AtPP2C6-7がコードするアミノ酸配列について、CLUSTAL W (1.83) multiple sequence alignmentプログラム（国立遺伝学研究所のDDBJで使用できる（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html））を用いてアラインメント解析した結果を図２に示す（使用したアミノ酸配列置換行列表はデフォルト値のBLOSUMマトリックスを使用した）。【００４０】
すなわち、図２にはAt1g03590-AtPP2C6-6、At1g16220、At1g79630、At5g01700、At3g02750、At5g36250、At5g26010、At4g32950、At3g16800、At3g05640及びAt5g27930-AtPP2C6-7がコードするプロテインホスファターゼ2Cにおける３つの共通配列が示されている。図２におけるI〜IIIと表記した領域を、後述するイネ由来のプロテインホスファターゼ2C遺伝子のオーソログとともにアライメント解析することで、上述した配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列は、それぞれ配列番号５３〜５５に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列と言い換えることができる。【００４１】
配列番号５３に示す共通配列は、より具体的に(L/F)CG(V/I/M)FDGHGXXGXX(V/I)(S/A)(K/R)XVである。配列番号５４に示す共通配列は、より具体的にSGXT(G/A/S)(V/L)XX(I/V/F/L)XX(G/A)XX(L/V/I)X(I/V/M)(A/G)NXG(D/H)SRA(V/I)(L/M/I)である。配列番号５５に示す共通配列は、より具体的にGLA(M/V)(S/A)R(A/S)(F/L)GDXX(L/I/V)KX(Y/F/H)G(V/L)(I/V)XXP(E/Q/D)(I/V/F)XXXX(I/L/V)(T/S)XXDX(F/Y)(L/I/V/M)(V/L/I)LA(T/S)DG(V/I/M)WDX(L/I/M/V)(S/T)NX(E/D)(V/A)XX(L/V/I)(I/V)である。【００４２】
なお、これらアミノ酸配列において、カッコ内の複数のアミノ酸は当該位置において取りうるアミノ酸残基のバリエーションを示している。また、これらアミノ酸配列において、Xは、当該位置において任意のアミノ酸残基を取りうることを意味している。【００４３】
ただし、配列番号５４に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から９番目のアミノ酸残基は、イソロイシン（Ile、I）、バリン（Val、V）又はフェニルアラニン（Phe、F）であることがより好ましい。また、配列番号５４に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１１番目のアミノ酸残基は、グルタミン（Gln、Q）又はヒスチジン（His、H）であることがより好ましい。さらに配列番号５４に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３番目のアミノ酸残基は、リシン（Lys、K）、グルタミン酸（Glu、E）、セリン（Ser、S）、グルタミン（Gln、Q）、アスパラギン酸（Asp、D）又はアスパラギン（Asn、N）であることがより好ましい。【００４４】
ただし、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から７番目のアミノ酸残基は、アラニン（Ala、A）であることがより好ましい。また、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から８番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン（Phe、F）であることがより好ましい。さらに、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１１番目のアミノ酸残基は、フェニルアラニン（Phe、F）又はチロシン（Tyr、Y）であることがより好ましい。さらに、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１３番目のアミノ酸残基は、ロイシン（Leu、L）又はイソロイシン（Ile、I）であることがより好ましい。さらに、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から１５番目のアミノ酸残基は、アスパラギン酸（Asp、D）、セリン（Ser、S）又はグルタミン酸（Glu、E）であることがより好ましい。さらに、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から２０番目のアミノ酸残基は、セリン（Ser、S）、アラニン（Ala、A）又はシステイン（Cys、C）であることがより好ましい。さらに、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から２７番目のアミノ酸残基は、ヒスチジン（His、H）又はアルギニン（Arg、R）であることがより好ましい。さらに、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から３４番目のアミノ酸残基は、グルタミン（Gln、Q）、グルタミン酸（Glu、E）又はヒスチジン（His、H）であることがより好ましい。さらに、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から３６番目のアミノ酸残基は、ロイシン（Leu、L）、イソロイシン（Ile、I）又はバリン（Val、V）であることがより好ましい。さらに、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から４７番目のアミノ酸残基は、ロイシン（Leu、L）、イソロイシン（Ile、I）又はバリン（Val、V）であることがより好ましい。さらに、配列番号５５に示すアミノ酸配列におけるＮ末端側から５０番目のアミノ酸残基は、リシン（Lys、K）、グルタミン酸（Glu、E）、グルタミン（Gln、Q）、アスパラギン酸（Asp、D）又はアスパラギン（Asn、N）であることがより好ましい。【００４５】
一例として、At3g05640で特定される遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号４に示し、At3g05640で特定される遺伝子によりコードされるプロテインホスファターゼ2Cのアミノ酸配列を配列番号５に示す。また、At5g27930で特定される遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号３５に示し、At5g27930で特定される遺伝子によりコードされるプロテインホスファターゼ2Cのアミノ酸配列を配列番号３６に示す。さらに、At3g02750で特定される遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号４１に示し、At3g02750で特定される遺伝子によりコードされるプロテインホスファターゼ2Cのアミノ酸配列を配列番号４２に示す。さらにまた、At3g16800で特定される遺伝子におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号４７に示し、At3g16800で特定される遺伝子によりコードされるプロテインホスファターゼ2Cのアミノ酸配列を配列番号４８に示す。【００４６】
また、本発明においては、上記で列挙した遺伝子と機能的に等価な遺伝子を過剰発現させても良い。ここで機能的に等価な遺伝子とは、例えばシロイヌナズナ以外の生物由来であって配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列（好ましくは配列番号５３〜５５に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列。以下同様）をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子を含む意味である。また、機能的に等価な遺伝子とは、プロテインホスファターゼ2C活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。プロテインホスファターゼ2C活性とは、Mg2+又はMn2+依存型のセリン/スレオニンホスファターゼ（Ser/Thrホスファターゼ）活性を意味する。従って、ある遺伝子がプロテインホスファターゼ2C活性を有するタンパク質をコードするか否かは、当該遺伝子の産物がMg2+又はMn2+存在下においてセリン/スレオニンホスファターゼ活性を有するか否かを検討すればよい。セリン/スレオニンホスファターゼ活性を測定する手法は、従来公知の手法を適宜使用することができる。例えば、市販の活性測定キットProFluor（登録商標）Ser/Thr Phosphatase Assay（Promega社製）を使用することができる。【００４７】
ここで、シロイヌナズナ以外の生物としては、何ら限定されないが、例えばイネを挙げることができる。すなわち、機能的に等価な遺伝子としては、イネにおけるOs05g0358500遺伝子を挙げることができる。Os05g0358500遺伝子のコーディング領域の塩基配列を配列番号６に示し、当該遺伝子によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号７に示す。また、イネ由来の遺伝子であって、上記機能的に等価な遺伝子としては、Os11g0109000（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号８及び９に示す）、Os12g0108600（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１０及び１１に示す）、Os02g0471500（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１２及び１３に示す）、Os04g0321800（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１４及び１５に示す）、Os11g0417400（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１６及び１７に示す）、Os07g0566200（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号１８及び１９に示す）、Os08g0500300（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２０及び２１に示す）、Os02g0224100（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２２及び２３に示す）及びOs02g0281000（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号５６及び５７に示す）を挙げることができる。【００４８】
さらに、シロイヌナズナ及びイネ以外の植物由来であって、上記機能的に等価な遺伝子としては、ブラック・コットンウッド（Populus trichocarpa）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号A9P973、A9PFS0及びA9P7U4）を挙げることができ、ヨーロッパブドウ（Vitis vinifera）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号A7PRZ8、A7Q8H4、A7PV59、A5C3B0、A5BF43、A7QFG6、A7P4H7、A5C0C9、A5AP53、A7QQF9及びA5BDP5）を挙げることができ、タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号Q2HW33及びQ4L0F8）を挙げることができ、アルファルファ（Medicago sativa）由来の遺伝子（GenBank データベース アクセッション番号AY651248）を挙げることができ、ヒメツリカネゴケ（Physcomitrella patens）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号A9SE70、A9SE69及びA9RFU1）を挙げることができ、アイスプラント（Mesembryanthemum crystallinum）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号2511453C）を挙げることができ、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）由来の遺伝子（UniProt データベース アクセッション番号A8HQG8）を挙げることができ、トウモロコシ（Zea mays）由来の遺伝子（GenBank データベース アクセッション番号BT024031、BT017414及びBT024134）を挙げることができ、アブラナ（Brassica rapa）由来の遺伝子（GenBank データベース アクセッション番号AC189312及びAC189579）を挙げることができ、トマト（Solanum lycopersicum）由来の遺伝子（GenBank データベース アクセッション番号AP009550、AP009302及びAP009278）を挙げることができ、ミゾホオズキ（Mimulus guttatus）由来の遺伝子（GenBank データベース アクセッション番号AC182571）を挙げることができ、単細胞紅藻類の（Cyanidioschyzon merolae）由来の遺伝子（GenBank データベース アクセッション番号AP006489）を挙げることができる。【００４９】
これらに代表されるシロイヌナズナ以外の植物における、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2Cをコードする遺伝子は、上記で列挙したシロイヌナズナ由来のプロテインホスファターゼ2C遺伝子の塩基配列やプロテインホスファターゼ2Cのアミノ酸配列に基づいて、GenBank等の公知のデータベースから容易に検索・同定することができる。【００５０】
なお、本発明においては過剰発現させるプロテインホスファターゼ2C遺伝子としては、上述したような配列番号４〜２３、３５、３６、４１、４２、４７及び４８に示した塩基配列及びアミノ酸配列からなるプロテインホスファターゼ2C遺伝子に限定されるものではない。すなわち、プロテインホスファターゼ2C遺伝子としては、配列番号４〜２３の奇数番号に示したアミノ酸配列又は配列番号３６、４２若しくは４８に示したアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸配列が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を含み、且つ、プロテインホスファターゼ2C活性を有するものであっても良い。ここで、複数個のアミノ酸としては、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１個から５個、特に好ましくは１個から３個を意味する。なお、アミノ酸の欠失、置換若しくは付加は、上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子をコードする塩基配列を、当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。塩基配列に変異を導入するには、Kunkel法またはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができ、例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばMutant-KやMutant-G（何れも商品名、TAKARA Bio社製））等を用いて、あるいはLA PCR in vitro Mutagenesisシリーズキット（商品名、TAKARA Bio社製）を用いて変異が導入される。また、変異導入方法としては、EMS（エチルメタンスルホン酸）、5-ブロモウラシル、2-アミノプリン、ヒドロキシルアミン、N-メチル-N’-ニトロ-Nニトロソグアニジン、その他の発ガン性化合物に代表されるような化学的変異剤を使用する方法でも良いし、X線、アルファ線、ベータ線、ガンマ線、イオンビームに代表されるような放射線処理や紫外線処理による方法でも良い。【００５１】
また、過剰発現させるプロテインホスファターゼ2C遺伝子としては、配列番号４〜２３に示した塩基配列及びアミノ酸配列からなるプロテインホスファターゼ2C遺伝子の相同遺伝子であってもよい。ここで、相同遺伝子とは、一般的に、共通の祖先遺伝子から進化分岐した遺伝子を意味しており、２種類の種の相同遺伝子（オルソログ（ortholog)）及び同一種内で重複分岐により生じた相同遺伝子（パラログ(paralog)）を含む意味である。換言すると、上述した「機能的に等価な遺伝子」にはオルソログやパラログといった相同遺伝子を含む意味である。但し、上述した「機能的に等価な遺伝子」には、共通遺伝子から進化せず、単に類似した機能を有する遺伝子も含まれている。【００５２】
配列番号４〜２３、３５、３６、４１、４２、４７及び４８に示した塩基配列及びアミノ酸配列からなるプロテインホスファターゼ2C遺伝子に類似する遺伝子としては、これらアミノ酸配列に対する類似度(Similarity)が例えば７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上であるアミノ酸配列を有し、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2C活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。ここで、類似度の値は、BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）プログラムを実装したコンピュータプログラム及び遺伝子配列情報を格納したデータベースを用いてデフォルトの設定で求められる値を意味する。【００５３】
また、配列番号４〜２３、３５、３６、４１、４２、４７及び４８に示した塩基配列及びアミノ酸配列からなるプロテインホスファターゼ2C遺伝子に類似する遺伝子は、植物ゲノム情報が明らかとなっていない場合には、対象となる植物からゲノムを抽出するか或いは対象となる植物のcDNAライブラリーを構築し、配列番号４〜２３の偶数番号に示した塩基配列又は配列番号３５、４１、４７若しくは５３に示した塩基配列からなるプロテインホスファターゼ2C遺伝子の少なくとも一部に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするゲノム領域或いはcDNAを単離することで同定することができる。ここで、ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ハイブリダイゼーションは、J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory(1989)に記載されている方法等、従来公知の方法で行うことができる。
【００５４】
本発明に係る植物体は、上述したような配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するプロテインホスファターゼ2C遺伝子を過剰発現させることによって、バイオマス量及び/又は種子量が野生型と比較して有意に向上したものとなる。このプロテインホスファターゼ2C遺伝子を過剰発現させる手法としては、対象とする植物体における内因性のプロテインホスファターゼ2C遺伝子のプロモーターを改変する手法、過剰発現を可能とするプロモーターの制御下に外因性のプロテインホスファターゼ2C遺伝子を配置した発現ベクターを導入する手法、あるいはこれら両手法を同時におこなう手法をあげることができる。【００５５】
一例としては、過剰発現を可能とするプロモーターの制御下に上述したプロテインホスファターゼ2C遺伝子を配置した発現ベクターを対象の植物に導入する手法が好ましい。【００５６】
発現ベクター
発現ベクターは、過剰発現を可能とするプロモーターと、上述したプロテインホスファターゼ2C遺伝子とを含むように構築する。発現ベクターの母体となるベクターとしては、従来公知の種々のベクターを用いることができる。例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミド等を用いることができ、導入される植物細胞や導入方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、pBluescript、pBluescriptSK、ｐＢＩ系のベクター等を挙げることができる。特に、植物体へのベクターの導入法がアグロバクテリウムを用いる方法である場合には、ｐＢＩ系のバイナリーベクターを用いることが好ましい。ｐＢＩ系のバイナリーベクターとしては、具体的には、例えば、ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１等を挙げることができる。【００５７】
プロモーターは、植物体内でプロテインホスファターゼ2C遺伝子を過剰発現させることが可能なプロモーターであれば特に限定されるものではなく、公知のプロモーターを好適に用いることができる。かかるプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ）、各種アクチン遺伝子プロモーター、各種ユビキチン遺伝子プロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、タバコのＰＲ１ａ遺伝子プロモーター、トマトのリブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小サブユニット遺伝子プロモーター、ナピン遺伝子プロモーター、オレオシン遺伝子プロモーター等を挙げることができる。この中でも、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、アクチン遺伝子プロモーター又はユビキチン遺伝子プロモーターをより好ましく用いることができる。上記各プロモーターを用いれば、植物細胞内に導入されたときに任意の遺伝子を強く発現させることが可能となる。【００５８】
また、プロモーターとしては、植物における部位特異的に過剰発現させる機能を有するものを使用することもできる。このようなプロモーターとしては、従来公知の如何なるプロモーターを使用することができる。このようなプロモーターを使用して、上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子を部位特異的に過剰発現させることによって、過剰発現した植物器官を野生型と比較して増大させることができる。【００５９】
なお、発現ベクターは、プロモーター及び上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子に加えて、さらに他のＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当該他のＤＮＡセグメントは特に限定されるものではないが、ターミネーター、選別マーカー、エンハンサー、翻訳効率を高めるための塩基配列等を挙げることができる。また、上記組換え発現ベクターは、さらにＴ−ＤＮＡ領域を有していてもよい。Ｔ−ＤＮＡ領域は特にアグロバクテリウムを用いて上記組換え発現ベクターを植物体に導入する場合に遺伝子導入の効率を高めることができる。【００６０】
転写ターミネーターは転写終結部位としての機能を有していれば特に限定されるものではなく、公知のものであってもよい。例えば、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終結領域（Ｎｏｓターミネーター）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓの転写終結領域（ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター）等を好ましく用いることができる。この中でもＮｏｓターミネーターをより好ましく用いることできる。上記組換えベクターにおいては、転写ターミネーターを適当な位置に配置することにより、植物細胞に導入された後に、不必要に長い転写物を合成し、強力なプロモーターがプラスミドのコピー数を減少させるといった現象の発生を防止することができる。【００６１】
形質転換体選別マーカーとしては、例えば薬剤耐性遺伝子を用いることができる。かかる薬剤耐性遺伝子の具体的な一例としては、例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール等に対する薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。これにより、上記抗生物質を含む培地中で生育する植物体を選択することによって、形質転換された植物体を容易に選別することができる。【００６２】
翻訳効率を高めるための塩基配列としては、例えばタバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を挙げることができる。このｏｍｅｇａ配列をプロモーターの非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に配置させることによって、上記融合遺伝子の翻訳効率を高めることができる。このように、上記組換え発現ベクターには、その目的に応じて、さまざまなＤＮＡセグメントを含ませることができる。【００６３】
組換え発現ベクターの構築方法についても特に限定されるものではなく、適宜選択された母体となるベクターに、上記プロモーター、上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子、および転写抑制転換ポリヌクレオチド、並びに必要に応じて上記他のＤＮＡセグメントを所定の順序となるように導入すればよい。例えば、上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子とプロモーターと（必要に応じて転写ターミネーター等）とを連結して発現カセットを構築し、これをベクターに導入すればよい。発現カセットの構築では、例えば、各ＤＮＡセグメントの切断部位を互いに相補的な突出末端としておき、ライゲーション酵素で反応させることで、当該ＤＮＡセグメントの順序を規定することが可能となる。なお、発現カセットにターミネーターが含まれる場合には、上流から、プロモーター、上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子、ターミネーターの順となっていればよい。また、発現ベクターを構築するための試薬類、すなわち制限酵素やライゲーション酵素等の種類についても特に限定されるものではなく、市販のものを適宜選択して用いればよい。【００６４】
また、上記発現ベクターの増殖方法（生産方法）も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いることができる。一般的には大腸菌をホストとして当該大腸菌内で増殖させればよい。このとき、ベクターの種類に応じて、好ましい大腸菌の種類を選択してもよい。【００６５】
形質転換
上述した発現ベクターは、一般的な形質転換方法によって対象の植物内に導入される。発現ベクターを植物細胞に導入する方法（形質転換方法）は特に限定されるものではなく、植物細胞に応じた適切な従来公知の方法を用いることができる。具体的には、例えば、アグロバクテリウムを用いる方法や直接植物細胞に導入する方法を用いることができる。アグロバクテリウムを用いる方法としては、例えば、Bechtold, E., Ellis, J. and Pelletier, G. (1993) In Planta  Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis plants. C.R. Acad. Sci. Paris Sci. Vie, 316, 1194-1199. あるいは、Zyprian E, Kado Cl, Agrobacterium-mediated plant transformation by novel mini-T vectors in conjunction with a high-copy vir region helper plasmid. Plant Molecular Biology, 1990, 15(2), 245-256.に記載された方法を用いることができる。【００６６】
発現ベクターを直接植物細胞に導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法（電気穿孔法）、ポリエチレングリコール法、パーティクルガン法、プロトプラスト融合法、リン酸カルシウム法等を用いることができる。【００６７】
また、DNAを直接植物細胞に導入する方法を採るなら、対象とする遺伝子の発現に必要な転写ユニット、例えばプロモーターや転写ターミネーターと、対象とする遺伝子を含んだDNAであれば十分であり、ベクター機能が必須ではない。さらに、転写ユニットを有さない対象とする遺伝子のタンパク質コード領域のみを含むDNAであっても、宿主の転写ユニット内にインテグレートし、対象となる遺伝子を発現することができればよい。【００６８】
上記発現ベクターや、発現ベクターを含まず対象となる遺伝子を含んだ発現カセットが導入される植物細胞としては、例えば、花、葉、根等の植物器官における各組織の細胞、カルス、懸濁培養細胞等を挙げることができる。ここで、発現ベクターは、生産しようとする種類の植物体に合わせて適切なものを適宜構築してもよいが、汎用的な発現ベクターを予め構築しておき、それを植物細胞に導入してもよい。【００６９】
発現ベクターの導入対象となる植物、換言するとバイオマス増産対象の植物としては、特に限定されない。すなわち、上述したプロテインホスファターゼ2C遺伝子を過剰発現させることによって、あらゆる植物体についてバイオマス増産効果を期待することができる。対象となる植物としては、例えば、双子葉植物、単子葉植物、例えばアブラナ科、イネ科、ナス科、マメ科、ヤナギ科等に属する植物（下記参照）が挙げられるが、これらの植物に限定されるものではない。【００７０】
アブラナ科：シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ（Brassica rapa、Brassica napus、Brassica campestris）、キャベツ(Brassica oleracea var. capitata)、ハクサイ（Brassica rapa var. pekinensis）、チンゲンサイ（Brassica rapa var. chinensis）、カブ（Brassica rapa var. rapa）、ノザワナ（Brassica rapa var. hakabura）、ミズナ（Brassica rapa var. lancinifolia）、コマツナ（Brassica rapa var. peruviridis）、パクチョイ（Brassica rapa var. chinensis）、ダイコン（Raphanus sativus）、ワサビ（Wasabia japonica）など。【００７１】
ナス科：タバコ（Nicotiana tabacum）、ナス(Solanum melongena)、ジャガイモ（Solaneum tuberosum）、トマト（Lycopersicon lycopersicum）、トウガラシ（Capsicum annuum）、ペチュニア（Petunia）など。【００７２】
マメ科：ダイズ(Glycine max)、エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、フジ（Wisteria floribunda）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ミヤコグサ（Lotus corniculatus var. japonicus）、インゲンマメ（Phaseolus vulgaris）、アズキ（Vigna angularis）、アカシア（Acacia）など。【００７３】
キク科：キク（Chrysanthemum morifolium）、ヒマワリ（Helianthus annuus）など。【００７４】
ヤシ科：アブラヤシ（Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、ココヤシ（Cocos nucifera）、ナツメヤシ（Phoenix dactylifera）、ロウヤシ（Copernicia）など。【００７５】
ウルシ科：ハゼノキ（Rhus succedanea）、カシューナットノキ（Anacardium occidentale）、ウルシ（Toxicodendron vernicifluum）、マンゴー（Mangifera indica）、ピスタチオ（Pistacia vera）など。【００７６】
ウリ科：カボチャ（Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo）、キュウリ（Cucumis sativus）、カラスウリ（Trichosanthes cucumeroides）、ヒョウタン（Lagenaria siceraria var. gourda）など。【００７７】
バラ科：アーモンド（Amygdalus communis）、バラ（Rosa）、イチゴ（Fragaria）、サクラ（Prunus）、リンゴ（Malus pumila var. domestica）など。【００７８】
ナデシコ科：カーネーション（Dianthus caryophyllus）など。【００７９】
ヤナギ科：ポプラ(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula) など。【００８０】
イネ科：トウモロコシ(Zea mays)、イネ(Oryza sativa)、オオムギ（Hordeum vulgare）、コムギ（Triticum aestivum）、タケ（Phyllostachys）、サトウキビ（Saccharum officinarum）、ネピアグラス（Pennisetum pupureum）、エリアンサス（Erianthus ravenae）、ミスキャンタス（ススキ）（Miscanthus virgatum）、ソルガム（Sorghum）スイッチグラス（Panicum）など。【００８１】
ユリ科：チューリップ（Tulipa）、ユリ（Lilium）など。【００８２】
なかでも、サトウキビやトウモロコシ、ナタネ、ヒマワリ等のバイオ燃料の原料となりうるエネルギー作物を対象とすることが好ましい。エネルギー作物のバイオマスを増産することによって、バイオエタノール、バイオディーゼル、バイオメタノール、バイオDME、バイオGTL(BTL)及びバイオブタノール等のバイオ燃料の低コスト化を実現できるからである。【００８３】
また、上述したように、本発明で使用可能なプロテインホスファターゼ2C遺伝子は、種々の植物から単離して使用することができるが、バイオマス増産対象の植物の種類に応じて、適宜選択して用いることができる。すなわち、バイオマス増産対象の植物が単子葉植物である場合には、プロテインホスファターゼ2C遺伝子として単子葉植物から単離したものを過剰発現させることが好ましい。特に、バイオマス増産対象の植物がイネである場合には、イネ由来のプロテインホスファターゼ2C遺伝子（配列番号６）を過剰発現させることが好ましい。【００８４】
なお、本発明においては、バイオマス増産対象の植物が単子葉植物であったとしても、双子葉植物由来のプロテインホスファターゼ2C遺伝子を過剰発現させても良い。すなわち、例えば、シロイヌナズナ由来のプロテインホスファターゼ2C遺伝子（配列番号４）は、双子葉植物に限らず、広く単子葉植物に分類される植物に過剰発現するように導入されてもよい。【００８５】
その他の工程、その他の方法
上述した形質転換処理後、植物体のなかから適切な形質転換体を選抜する選抜工程を、従来公知の方法で行うことができる。選抜の方法は特に限定されるものではなく、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を基準として選抜してもよいし、形質転換体を育成した後に、植物体そのもの、または任意の器官や組織の重量を測定して野生型と比較して有意に増産しているものを選抜してもよい。【００８６】
また、形質転換処理で得られた形質転換植物から定法に従って後代植物を得ることができる。上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子を過剰発現するといった形質を保持した後代植物を、そのバイオマス量を基準として選抜することによって、上記形質を有することでバイオマス量が増産された安定的な植物系統を作出することができる。なお、形質転換植物やその子孫から、植物細胞や種子、果実、株、カルス、塊茎、切穂、塊等の繁殖材料を得て、これらを基に上記形質を有することでバイオマス量が増産された安定的な植物系統を量産することも可能である。【００８７】
なお、本発明における植物体とは、成育した植物個体、植物細胞、植物組織、カルス、種子の少なくとも何れかが含まれる。つまり、本発明では、最終的に植物個体まで成育させることができる状態のものであれば、全て植物体とみなす。また、上記植物細胞には、種々の形態の植物細胞が含まれる。かかる植物細胞としては、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片等が含まれる。これらの植物細胞を増殖・分化させることにより植物体を得ることができる。なお、植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて、従来公知の方法を用いて行うことができる。【００８８】
以上説明したように、本発明によれば、上述したプロテインホスファターゼ2C遺伝子を過剰発現させることで、野生型の植物体と比較して、個体あたりのバイオマス量及び/又は種子量が有意に増産した植物体を提供することができる。ここで、バイオマス量が有意に増産するとは、野生型と比較して一個体あたりの総重量が統計的に有意に大となっていることを意味する。このとき、植物体の一部の組織が特異的に大となり、他の組織が野生型と同等であったとしても、植物体全体についての総重量が大であればバイオマス量が増産したと判断する。また、種子量が有意に増産するとは、野生型と比較して、一個体から採取される種子の総量及び/又は総数が統計的に有意に大となっていることを意味する。すなわち、種子一粒あたりの大きさが向上している場合、種子一粒あたりの大きさが同等で種子数が向上している場合又は種子一粒あたりの大きさが向上し、且つ種子数が向上している場合の如何なる場合でもよい。【００８９】
本発明によれば、植物体のバイオマス量及び/又は種子量が増産するため、植物体全体を生産目的とした場合及び植物体の一部の組織（例えば種子など）やその含有成分を生産目的とした場合のいずれにおいても生産性の向上を達成することができる。例えば、植物種子に含まれる油脂を生産目的とした場合、作付け面積あたりで回収できる油脂量を大幅に向上させることができる。ここで油脂としては、特に限定されず、例えば、大豆油、ごま油、オリーブ油、椰子油、米油、綿実油、ひまわり油、コーン油、べに花油及び菜種油等の植物由来の油脂を例示することができる。また、製造した油脂は、家庭用途や工業用途に広く利用することができ、更にはバイオディーゼル燃料の原料としても使用することができる。すなわち、本発明によれば上記プロテインホスファターゼ2C遺伝子を過剰発現する植物体を利用することによって、上述した家庭用途又は工業用途の油脂や、バイオディーゼル燃料等を低コストに製造することができる。
【実施例】
【００９０】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００９１】
〔実施例１〕
PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）を導入した形質転換体（シロイヌナズナ）の作製
1．材料および方法
1−1．実験材料
実験材料にはシロイヌナズナ変異体（Activation-tag T-DNA lines: Weigel T-DNS lines、計20072系統）の種子を用いた。なお、種子はNottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC) より購入した。実験材料として使用した種子についてはWeigel, D. et al., 2000, Plant Physiol. 122, 1003-1013を参考とすることができる。【００９２】
1−2．方法
1−2−1．塩耐性変異体の選抜
Weigel T-DNA linesの種子を、NaCl 125 mMあるいは150 mMを含む改変MS寒天（1%）培地〔B5培地のビタミン、ショ糖10 g/l、寒天（細菌培地用；和光純薬工業社製）8 g/L〕に無菌播種し、22℃、30〜100μmol/m2/secの照明下（16時間明期/8時間暗期のサイクル）で培養した。播種後2〜4週間後、塩耐性変異体候補を選抜した。なお、MS培地はMurashige, T. et al., 1962,  Physiol. Plant. 15, 473-497を参照する。また、B5培地についてはGamborg, O.L. et al. , 1968, Experimental Cell Research 50, 151-158を参照する。【００９３】
1−2−2．DNA調製
選抜した耐塩性シロイヌナズナ系統のゲノムへのT-DNA挿入部位を、TAIL-PCR法により決定した。まず、栽培したシロイヌナズナから幼葉を採取し、液体窒素凍結下で粉砕した。QIAGEN社製DNA調製キット（ DNeasy  Plant Mini Kit）を用いてキット添付の標準プロトコルに従ってDNAを調製した。【００９４】
1−2−3．TAIL-PCR法及びT-DNA挿入部位の推定
Weigel T-DNA linesで用いられているアクティベーションタギング用ベクター（pSKI015 : GenBank accession No.AF187951）の左のT-DNA配列（T-DNA left border）付近に3種類の特異的プライマーTL1、TL2及びTL3を設定し、任意プライマーP1を用いて、以下のPCR反応液及び反応条件下でTAIL-PCR（島本功、佐々木卓治監修, 新版, 植物のPCR実験プロトコール, 2000, 83-89pp, 秀潤社, 東京 ; Liu, Y.G. and Whttier, R.F., 1995, Genomics 25, 674-681 ; Liu, Y.G. et al., Plant J., 8, 457-463, 1995）を行い、T-DNAに隣接するゲノムDNAを増幅した。【００９５】
プライマーTL1、TL2、TL3及びP1の具体的な配列は以下の通りである。【００９６】
TL1: 5'-TGC TTT CGC CAT TAA ATA GCG ACG G-3‘（配列番号２４）
TL2: 5'-CGC TGC GGA CAT CTA CAT TTT TG-3‘（配列番号２５）
TL3: 5'-TCC CGG ACA TGA AGC CAT TTA C-3'（配列番号２６）
P1: 5'-NGT CGA SWG ANA WGA A-3‘（配列番号２７）
なお、配列番号２５において、nは、a、g、c又はtを表し(存在位置：1及び11)、またsは、g又はcを表し(存在位置：7)、さらにwは、a又はtを表す(存在位置：8及び13)。【００９７】
１回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表１及び表２に示す。【００９８】
【表１】
0005403628.tif 000002
【００９９】
【表２】
0005403628.tif 000003
【０１００】
２回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表３及び表４に示す。【０１０１】
【表３】
0005403628.tif 000004
【０１０２】
【表４】
0005403628.tif 000005
【０１０３】
３回目のPCR反応液組成及び反応条件をそれぞれ表５及び表６に示す。【０１０４】
【表５】
0005403628.tif 000006
【０１０５】
【表６】
0005403628.tif 000007
【０１０６】
次いで、2回目と3回目の反応産物をアガロースゲルで電気泳動した後、増幅の有無と反応産物の特異性を確認した。また、3回目の増幅産物は、特異的プライマーTL3を用いて、直接BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Ver.3.1（アプライドバイオシステム社製）でシーケンス反応を行い、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer（アプライドバイオシステム社製）によって塩基配列の決定を行った。その結果、498bpの配列情報が得られた（配列番号２８）。【０１０７】
この得られた配列をThe Arabidopsis Information Resource（TAIR：http://www.arabidopsis.org/）のBLASTにより検索したところ、挿入部位はシロイヌナズナ３番染色体の遺伝子〔AGI（The Arabidopsis Genome Initiative gene code）コード：At3g05630〕と判明した。【０１０８】
1−2−4．活性化されている遺伝子の予測
アクティベートされている遺伝子を、1−2−3．により判明したT-DNA挿入部位（At3g05630）近傍10Kb以内に存在する推定Open reading frame(ORF)遺伝子の配列から予測した。【０１０９】
1−2−5．予測した遺伝子の取得
1−2−4．でアクティベート（活性化）されていると予測したPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORF領域を含む断片を増幅するために、TAIR（http://www.arabidopsis.org/home.html）で公開されている配列情報を基にPCR用プライマー5640PF1及び5640PR1を設計・合成した。なおこれらプライマーの末端には、発現ベクターへ導入するときに必要となる制限酵素サイト（Bsr G IまたはSal I）を付加するように設計した。【０１１０】
5640PF1（配列番号２９）：
5'-ACG CGT CGA CAT GGG ACA TTT CTC TTC CAT GTT CAA CGG-3'
5640PR1（配列番号３０）：
5'-TGT ACA TGT ACA CTA TAG AGA TGG CGA CGA CGA TGA AGA ATG G-3'
1−2−2．記載の方法に従って、野生型シロイヌナズナ、Col-0エコタイプから鋳型DNAを調製した。酵素としてPhusion High-Fidelity DNA Polymerase（NEW ENGLAND BioLabs：NEB社製）、プライマーとして、上記5640PF1および5640PR1を用いた。PCRの反応液組成、および反応条件をそれぞれ表７及び８に示す。【０１１１】
【表７】
0005403628.tif 000008
【０１１２】
【表８】
0005403628.tif 000009
【０１１３】
PCR増幅産物を、2％アガロースゲル（TAEバッファー）で電気泳動し、エチジウムブロマイドにより断片を染色した。目的断片を含むゲルをメスで切り出し、 GFX PCR DNA and GEL Band Purification Kit （Amersham社製）を用いて目的のDNA断片を溶出・精製した。得られたDNA断片に、A-Ａddition Kit（QIAGEN社製）を用いてにアデニンを付加した。アデニンを付加した増幅DNAを、TOPO TA Cloning Kit（Invitrogen社製）を用いて、TA-Cloning用pCR2.1ベクターにライゲーション後、キット添付のコンピテントセル（E.coli  TOP 10）に形質転換した。形質転換後、50μl/mlのカナマイシンを添加したLB培地で培養し、形質転換体を選抜した。出現したコロニーを50μl/mlのカナマイシンを添加したLB培地で液体培養し、得られた菌体からQIAGEN 社製Plasmid Mini Kitを用いてプラスミドDNA を調製した。得られたPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片をクローニングしたベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。【０１１４】
1−2−6．植物発現用ベクターの作製
タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を含む植物発現用ベクターpBI121に、PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片を挿入したコンストラクトの作製を行った。【０１１５】
まず、1−2−5．でPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片をクローニングしたpCR2.1ベクターを、制限酵素SalI及びBsrGI で処理した。【０１１６】
次に、同様にｏｍｅｇａ配列を含むpBI121を制限酵素SalI及びBsrGI で処理した。これら制限酵素消化産物について0.8％アガロースゲル電気泳動を行い、GFX PCR DNA and GEL Band Purification Kit（Amersham）を用いて、ゲルより約2700bpのPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片及びｏｍｅｇａ配列を含むpBI121を、それぞれ分取・精製した。【０１１７】
ｏｍｅｇａ配列を含むpBI121の断片をベクターとしてPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片を導入するため、ベクター：インサート比が1：10になるように混合し、等量のTaKaRa Ligation kit ver.2（タカラバイオ社製）を用いて16℃で一晩ライゲーション反応を行った。【０１１８】
反応液の全量を100μlのコンピテントセル（E.coli strain DH5α，TOYOBO社製）に添加し、キット添付のプロトコルに従って形質転換を行った。50μg/mlのカナマイシンを含むLB寒天培地に塗布し一晩培養し、出現したコロニーを50μg/mlのカナマイシンを添加したLB培地で液体培養し、得られた菌体からPlasmid Mini Kit（QIAGEN社製）を用いてプラスミドDNAを調製した。【０１１９】
得られたPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片をサブクローニングした発現ベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。【０１２０】
1−2−7．アグロバクテリウム法を用いたシロイヌナズナへの遺伝子導入
1−2−6．で作製した植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法（Plant Molecular Biology Mannal, Second Edition , B. G. Stanton and A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、Cloughらにより記載された浸潤法（Steven J. Clough and Andrew F. Bent, 1998, The Plant Journal 16, 735-743）により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入した。【０１２１】
カナマイシン含有培地で形質転換体を選抜し、自家受粉によりT1世代の植物を作製し、T2種子を得た。【０１２２】
1−2−8．形質転換体の表現形の確認
1−2−7．で作製したT2種子を無菌播種し、バーミキュライト混合土を入れた直径50mmのポットに移植した。比較対象として非組換えシロイヌナズナを移植した。これを22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜45μmol m-2 s-1で栽培し移植後合計１1週間栽培した。栽培後、地上部の植物体を紙袋に入れ、22℃、湿度60%の条件で2週間乾燥させた後に、全バイオマス量及び種子量を電子天秤で秤量した。【０１２３】
1−3．結果
上記1−2−8．の結果として、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真を図３に示す。また、結果として、地上部の全バイオマス量及び種子量を測定した結果を図４及び図５に示す。【０１２４】
図３、図４及び図５から、PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体では、地上部の全バイオマス量が野生型と比較して大幅（約1.9〜2.1倍）に、また種子量も野生型と比較して大幅（約1.7〜1.8倍）に向上していることが明らかとなった。【０１２５】
〔実施例２〕
PP2C（protein phosphatase 2C）cDNA（At3g05640）を導入した形質転換体（イネ）の作製
2．材料および方法
2−1．実験材料
実験材料には、１．で作製したPP2C遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片を導入した形質転換体シロイヌナズナとイネ（Oryza sativa L. ssp. japonica (cv. Nipponbare)）を用いた。【０１２６】
2−2．方法
2−2−1．PP2C（protein phosphatase 2C）cDNA（At3g05640）の取得
１．で作製したPP2C遺伝子（At3g05640）のORFを含む断片を導入した形質転換体シロイヌナズナを4週齢となるまで育成し、その地上部からトータルRNAを単離し、TaqMan Reverse Transcription Reagents（アプライドバイオシステム社製）を用いてRT−PCRを行いcDNAを作製した。【０１２７】
PP2C（At3g05640）のコーディング領域の塩基配列（配列番号４）に基づいて設計した下記のプライマーを用いて、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ社製) によりPCRを行い、その増幅断片をpCR-Blunt II-TOPOベクター（Invitrogen社製）にTA−クローニングした。【０１２８】
AP041-F：5’-AGGATCCATGGGACATTTCTCTTCCATGT-3’（配列番号３１）
AP041-R：5’-AGAGCTCCTATAGAGATGGCGACGACG-3'（配列番号３２）
2−2−2．植物発現用ベクターの作製
pIG121-Hm（Ohat, S. et al., 1990, Plant Cell Physiol. 31, 805-813）のGUS（β-Glucuronidase）部分を、トウゴマ由来カタラーゼのイントロン断片を持つsGFP(S65T)と置換し、植物発現用ベクターpBIsGFPを作製した。さらにMultiSite Gateway Three -Fragement Vector Construction Kit （Invitrogen社製）に含まれるpDEST R4-R3の組換えサイト（attR4とattR3）を含む配列を挿入したデスティネーションベクター（Destination Vector）pBI-sGFP-R4R3を作製した。【０１２９】
トウモロコシ由来ユビキチン遺伝子のプロモーター（配列番号３３：Christensen, A.H. and Quail, P.H., Transgenic Research 1996, 5, 213-218）、2−2−1．で取得したPP2C cDNA（At3g05640）及びAgrobacterium tumefaciens Tiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子（NOS）のターミネーター（配列番号３４：pIG121-Hmより取得）をMultiSite Gateway Three -Fragement Vector Construction Kit （Invitrogen社製）に含まれる各々のドナークローン（pDONR P4-P1R, pDONR 221, DONR P2R-P3）にBP反応によりクローニングし、エントリークローン(Entry Clone)を作製した。【０１３０】
作製した各々のエントリークローンとデスティネーションベクターpBI-sGFP-R4R3とをLR反応により、トウモロコシ由来ユビキチン遺伝子のプロモーター、PP2C cDNA（At3g05640）及びノパリン合成酵素遺伝子（NOS）のターミネーターを順に持つ植物発現用ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。【０１３１】
2−2−3．アグロバクテリウム法を用いたイネへの遺伝子導入
2−2−2．で作製した植物発現用ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）EHA101株に導入し、次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、イネ（Oryza sativa L. ssp. japonica (cv. Nipponbare)）に導入した。詳細な実験条件は特許第3141084号に記載された方法に準じて行った。【０１３２】
そしてハイグロマイシン含有培地で生育する形質転換イネを選抜し、T1世代幼植物（約12cm）を無菌的に作製した。【０１３３】
2−2−4．形質転換体の表現形の確認
2−2−3．で作製したT1世代の植物を、くみあい肥鉄培土2号（JAあいち経済連）を入れた直径約10cmのポットに移植、馴化後、同じ培土を入れた1/5000アールのワグネルポットに移植した。これを30℃、16時間明期8時間暗期、光強度約100μmol m-2 s-1で栽培した。【０１３４】
対象には、デスティネーションベクター（Destination Vector）pBI-sGFP-R4R3に、pST-Blue1ベクター（Novagen社製）のMultiple cloning siteを３個連結した植物発現用ベクターを導入したT1世代の植物を、同様に栽培した。【０１３５】
2−3．結果
上記2−2−4．の結果として、対象及びPP2C（protein phosphatase 2C）（At3g05640）のコーディング領域を導入した形質転換植物イネを撮影した写真を図６に示す。図６から、PP2C（protein phosphatase 2C）（At3g05640）のコーディング領域を導入した形質転換イネでは、地上部の全バイオマス量が対象と比較して向上していた。以上の結果から、シロイヌナズナ由来のPP2C遺伝子を、シロイヌナズナ以外の植物において高発現させることで、当該植物のバイオマス量を増産できることが明らかとなった。【０１３６】
〔実施例３〕
PP2C（protein phosphatase 2C）cDNA（Os05g0358500）を導入した形質転換体（イネ）の作製
3．材料および方法
3−1．実験材料
実験材料には、イネ（Oryza sativa L. ssp. japonica (cv. Nipponbare)）を用いた。【０１３７】
3−2．方法
3−2−1．イネPP2C（protein phosphatase 2C）cDNA（Os05g0358500）の取得
本実施例では、実施例１及び２にて使用したPP2C（protein phosphatase 2C）（At3g05640）のイネにおける相同遺伝子（PP2C遺伝子（Os05g0358500））を使用した。イネPP2C（Os05g0358500）のコーディング領域の塩基配列（配列番号６）に基づいて、全配列を化学合成した。化学合成した全配列断片は、MultiSite Gateway Three -Fragement Vector Construction Kit （Invitrogen社製）のドナークローンであるpDONR 221にクローニングした。【０１３８】
3−2−2．植物発現用ベクターの作製
トウモロコシ由来ユビキチン遺伝子のプロモーター（配列番号３３：Christensen, A.H. and Quail, P.H., Transgenic Research 1996, 5, 213-218）及びAgrobacterium tumefaciens Tiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子（NOS）のターミネーター（配列番号３４：pIG121-Hmより取得）をMultiSite Gateway Three -Fragement Vector Construction Kit （Invitrogen社製）に含まれる各々のドナークローン（pDONR P4-P1R, DONR P2R-P3）にBP反応によりクローニングし、エントリークローン(Entry Clone)を作製した。【０１３９】
3−2−1．で作製したイネPP2C（Os05g0358500）のcDNA配列をクローニングしたpDONR 221、上記で作製したトウモロコシ由来ユビキチン遺伝子のプロモーターの配列をクローニングしたpDONR P4-P1R 、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）のターミネーター配列をクローニングしたDONR P2R-P3及び2−2−2．で作製したデスティネーションベクターpBI-sGFP-R4R3とをLR反応により、トウモロコシ由来ユビキチン遺伝子のプロモーター、イネPP2C cDNA（Os05g0358500）、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）のターミネーターを順に持つ植物発現用ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。【０１４０】
3−2−3．アグロバクテリウム法を用いたイネへの遺伝子導入
2−2−2．で作製した植物発現用ベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）EHA101株に導入し、次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、イネ（Oryza sativa L. ssp. japonica (cv. Nipponbare)）に導入した。詳細な実験条件は特許第3141084号に記載された方法に準じて行った。【０１４１】
そしてハイグロマイシン含有培地で生育する形質転換イネを選抜し、T1世代幼植物（約12cm）を無菌的に作製した。【０１４２】
3−2−4．形質転換体の表現形の確認
3−2−3．で作製したT1世代の植物を、くみあい肥鉄培土2号（JAあいち経済連）を入れた直径約10cmのポットに移植、馴化後、同じ培土を入れた1/5000アールのワグネルポットに移植した。これを30℃、16時間明期8時間暗期、光強度約100μmol m-2 s-1で栽培した。【０１４３】
対象には、形質転換体移植時に、生育ステージを揃えた遺伝子導入していないイネを用い、同様に栽培した。【０１４４】
3−3．結果
上記3−2−4．の結果として、対象及びイネ由来PP2C（protein phosphatase 2C）（Os05g0358500）のコーディング領域を導入した形質転換イネを撮影した写真を図７に示す。図７から、イネ由来のPP2C（protein phosphatase 2C）（Os05g0358500）のコーディング領域を導入した形質転換イネでは、地上部の全バイオマス量が対象と比較して向上していた。以上の結果から、イネ由来のPP2C遺伝子をイネにおいて高発現させることで、イネのバイオマス量を増産できることが明らかとなった。【０１４５】
〔実施例４〕
PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At5g27930）を導入した形質転換体（シロイヌナズナ）の作製
4．材料および方法
4−1．実験材料
実験材料には、野生型シロイヌナズナは、エコタイプCol-0を用いた。【０１４６】
4−2．方法
4−2−1．シロイヌナズナPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At5g27930）の取得
本実施例では、実施例１及び２にて使用したPP2C（protein phosphatase 2C）（At3g05640）とは異なる、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At5g27930）を使用した。シロイヌナズナにおけるPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At5g27930）のORF領域を含む断片を増幅するために、TAIR（http://www.arabidopsis.org/home.html）で公開されている配列情報を基にPCR用プライマーAP042-F5及びAP042-Rを設計・合成した。また、その増幅断片をIn-Fusionクローニングシステム（Clontech社製）を用いて、ベクターにクローニングする時に必要なベクター側の配列、制限酵素サイト（Bsr G IまたはSal I）を付加するように設計したPCR用プライマーSalI-AP042-F2及びAP042-BsrGI-R2も合成した。PP2C遺伝子（At5g27930）におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号３５に示し、PP2C遺伝子（At5g27930）によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号３６に示した。【０１４７】
AP042-F5：5'-ATGGGACATTTCTCATCGATGTTC-3'（配列番号３７）
AP042-R：5'-TTACTTTAAAATCGTCATGGCATGATG-3'（配列番号３８）
SalI-AP042-F2：5'-AATTACTATTTACAATTACAGTCGACATGGGACATTTCTCATCGATGTTCAATGGA-3'（配列番号３９）
AP042-BsrGI-R2：5'-AGCCGGGCGGCCGCTTTACTTGTACATTACTTTAAAATCGTCATGGCATGATGATGTTG-3'（配列番号４０）
1−2−2．記載の方法に従って、野生型シロイヌナズナ、Col-0エコタイプから鋳型DNAを調製し、上記のプライマーAP042-F5及びAP042-Rを用いて、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ社製)によりPCRを行い、PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At5g27930）のORFを含む断片を取得した。【０１４８】
4−2−2．植物発現用ベクターの作製
タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を含む植物発現用ベクターpBI121に、PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At5g27930）のORFを含む断片を挿入したコンストラクトの作製を行った。【０１４９】
4−2−1．で取得したPP2C遺伝子（At5g27930）を含む断片をIn-Fusionクローニングシステム（Clontech社製）を用いてベクターにクローニングし、コンストラクトの作製を行った。得られたPP2C遺伝子（At5g27930）を含む断片をサブクローニングした発現ベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。【０１５０】
4−2−3．アグロバクテリウム法を用いたシロイヌナズナへの遺伝子導入
4−2−2．で作製した植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法（Plant Molecular Biology Mannal, Second Edition , B. G. Stanton A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、Cloughらにより記載された浸潤法（1998, The Plant Journal 16：735-743）により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入し、自家受粉によりT1種子を得た。【０１５１】
4−2−4．形質転換体の表現形の確認
4−2−3．で得られたT1種子をカナマイシン含有培地に無菌播種し、T1世代の植物を作製した。カナマイシン含有培地で選抜した幼植物体は、バーミキュライト混合土を入れた直径50mmのポットに移植した。対象には、非組換えシロイヌナズナを移植した。これを22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜45μmol m-2 s-1で栽培した。【０１５２】
4−3．結果
上記4−2−4．の結果として、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At5g27930）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真を図８及び図９に示す。図８及び図９から、PP2C遺伝子（At5g27930）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体では、地上部の全バイオマス量が野生型と比較して向上していた。以上の結果から、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子を高発現させることで、植物のバイオマス量を増産できることが明らかとなった。【０１５３】
〔実施例５〕
PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g02750）を導入した形質転換体（シロイヌナズナ）の作製
5．材料および方法
5−1．実験材料
実験材料には、野生型シロイヌナズナは、エコタイプCol-0を用いた。【０１５４】
5−2．方法
5−2−1．シロイヌナズナPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g02750）の取得
本実施例では、実施例１及び２にて使用したPP2C（protein phosphatase 2C）（At3g05640）とは異なる、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g02750）を使用した。PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g02750）のORF領域を含む断片を増幅するために、TAIR（http://www.arabidopsis.org/home.html）で公開されている配列情報を基にPCR用プライマーAP036-F4及びAP036-Rを設計・合成した。また、その増幅断片をIn-Fusionクローニングシステム（Clontech社製）を用いて、ベクターにクローニングする時に必要なベクター側の配列、制限酵素サイト（Bsr G IまたはSal I）を付加するように設計したPCR用プライマーSalI-AP036-F2及びAP036-BsrGI-R2も設計・合成した。PP2C遺伝子（At3g02750）におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号４１に示し、PP2C遺伝子（At3g02750）によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４２に示した。【０１５５】
AP036-F4：5'-ATGGGGTCCTGTTTATCTGCAG-3'（配列番号４３）
AP036-R：5'-TCACTTTCCAGGCACAAATCTTG-3'（配列番号４４）
SalI-AP036-F2：5'-AATTACTATTTACAATTACAGTCGACATGGGGTCCTGTTTATCTGCAGAGAGCAGG-3'（配列番号４５）
AP036-BsrGI-R2：5'-AGCCGGGCGGCCGCTTTACTTGTACATCACTTTCCAGGCACAAATCTTGGTAAGTT-3'（配列番号４６）
1−2−2．記載の方法に従って、野生型シロイヌナズナ、Col-0エコタイプから鋳型DNAを調製し、上記のプライマーを用いて、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ社製) によりPCRを行い、PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g02750）のORFを含む断片を取得した。【０１５６】
5−2−2．植物発現用ベクターの作製
タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を含む植物発現用ベクターpBI121に、PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g02750）のORFを含む断片を挿入したコンストラクトの作製を行った。【０１５７】
5−2−1．で取得したPP2C遺伝子（At3g02750）を含む断片をIn-Fusionクローニングシステム（Clontech社製）を用いてベクターにクローニングし、コンストラクトの作製を行った。得られたPP2C遺伝子（At3g02750）を含む断片をサブクローニングした発現ベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。【０１５８】
5−2−3．アグロバクテリウム法を用いたシロイヌナズナへの遺伝子導入
5−2−2．で作製した植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法（Plant Molecular Biology Mannal, Second Edition , B. G. Stanton A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、Cloughらにより記載された浸潤法（1998, The Plant Journal 16：735-743）により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入し、自家受粉によりT1種子を得た。【０１５９】
5−2−４．形質転換体の表現形の確認
5−2−3．で得られたT1種子をカナマイシン含有培地に無菌播種し、T1世代の植物を作製した。カナマイシン含有培地で選抜した幼植物体は、バーミキュライト混合土を入れた直径50mmのポットに移植した。対象には、非組換えシロイヌナズナを移植した。これを22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜45μmol m-2 s-1で栽培した。【０１６０】
5−3．結果
上記5−2−4．の結果として、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g02750）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真を図１０に示す。図１０から、PP2C遺伝子（At3g02750）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体では、地上部の全バイオマス量が野生型と比較して向上していた。以上の結果から、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子を高発現させることで、植物のバイオマス量を増産できることが明らかとなった。【０１６１】
〔実施例６〕
PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g16800）を導入した形質転換体（シロイヌナズナ）の作製
6．材料および方法
6−1．実験材料
実験材料には、野生型シロイヌナズナは、エコタイプCol-0を用いた。【０１６２】
6−2．方法
6−2−1．シロイヌナズナPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g16800）の取得
本実施例では、実施例１及び２にて使用したPP2C（protein phosphatase 2C）（At3g05640）とは異なる、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g16800）を使用した。PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g16800）のORF領域を含む断片を増幅するために、TAIR（http://www.arabidopsis.org/home.html）で公開されている配列情報を基にPCR用プライマーAP040-F4及びAP040-Rを設計・合成した。また、その増幅断片をIn-Fusionクローニングシステム（Clontech社製）を用いて、ベクターにクローニングする時に必要なベクター側の配列、制限酵素サイト（Bsr G IまたはSal I）を付加するように設計したPCR用プライマーSalI-AP040-F2及びAP040-BsrGI-R2も設計・合成した。PP2C遺伝子（At3g16800）におけるコーディング領域の塩基配列を配列番号４７に示し、PP2C遺伝子（At3g16800）によりコードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４８に示した。【０１６３】
AP040-F4：5'-ATGGTGCTTTTACCAGCGTTTTTG-3'（配列番号４９）
AP040-R：5'-CTAAGAAGGACGAAAGAAGAGAC-3'（配列番号５０）
SalI-AP040-F2：5'-AATTACTATTTACAATTACAGTCGACATGGTGCTTTTACCAGCGTTTTTGGACGGATTAG-3'（配列番号５１）
AP040-BsrGI-R2：5'-AGCCGGGCGGCCGCTTTACTTGTACACTAAGAAGGACGAAAGAAGAGACAGAGAAC-3'（配列番号５２）
1−2−2．記載の方法に従って、野生型シロイヌナズナ、Col-0エコタイプから鋳型DNAを調製し、上記のプライマーを用いて、PrimeSTAR HS DNA Polymerase (タカラバイオ社製) によりPCRを行い、PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g16800）のORFを含む断片を取得した。【０１６４】
6−2−2．植物発現用ベクターの作製
タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を含む植物発現用ベクターpBI121に、PP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g16800）のORFを含む断片を挿入したコンストラクトの作製を行った。【０１６５】
6−2−1．で取得したPP2C遺伝子（At3g16800）を含む断片をIn-Fusionクローニングシステム（Clontech社製）を用いてベクターにクローニングし、コンストラクトの作製を行った。得られたPP2C遺伝子（At3g16800）を含む断片をサブクローニングした発現ベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。【０１６６】
6−2−3．アグロバクテリウム法を用いたシロイヌナズナへの遺伝子導入
6−2−2．で作製した植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法（Plant Molecular Biology Mannal, Second Edition , B. G. Stanton A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、Cloughらにより記載された浸潤法（1998, The Plant Journal 16：735-743）により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入し、自家受粉によりT1種子を得た。【０１６７】
6−2−４．形質転換体の表現形の確認
6−2−3．で得られたT1種子をカナマイシン含有培地に無菌播種し、T1世代の植物を作製した。カナマイシン含有培地で選抜した幼植物体は、バーミキュライト混合土を入れた直径50mmのポットに移植した。対象には、非組換えシロイヌナズナを移植した。これを22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜45μmol m-2 s-1で栽培した。【０１６８】
6−3．結果
上記6−2−4．の結果として、野生型及びPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子（At3g16800）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真を図１１に示す。図１１から、PP2C遺伝子（At3g16800）のORFを含む断片を導入した形質転換植物体では、地上部の全バイオマス量が野生型と比較して向上していた。以上の結果から、配列番号１〜３に示すアミノ酸配列からなる３つの共通配列をN末端側からこの順で有するPP2C（protein phosphatase 2C）遺伝子を高発現させることで、植物のバイオマス量を増産できることが明らかとなった。【０１６９】
〔実施例７〕
PP2C（protein phosphatase 2C）cDNA（Os05g0358500）を導入した形質転換体（シロイヌナズナ）の作製
7．材料および方法
7−1．実験材料
実験材料には、野生型シロイヌナズナは、エコタイプCol-0を用いた。【０１７０】
7−2．方法
7−2−1．イネPP2C（protein phosphatase 2C）cDNA（Os05g0358500）の取得
本実施例では、実施例１及び２にて使用したPP2C（protein phosphatase 2C）（At3g05640）のイネにおける相同遺伝子（PP2C遺伝子（Os05g0358500））を使用した。イネPP2C（Os05g0358500）のコーディング領域の塩基配列（配列番号６）に基づいて、全配列を化学合成した。化学合成した全配列断片は、MultiSite Gateway Three -Fragement Vector Construction Kit （Invitrogen社製）のドナークローンであるpDONR 221にクローニングした。【０１７１】
7−2−2．植物発現用ベクターの作製
タバコモザイクウイルス由来のｏｍｅｇａ配列を含むカリフラワーモザイクウイルス由来35S（CaMV35S Ω）プロモーター（配列番号５８）Agrobacterium tumefaciens Tiプラスミド由来のノパリン合成酵素遺伝子（NOS）のターミネーター（配列番号３４：pIG121-Hmより取得）をMultiSite Gateway Three -Fragement Vector Construction Kit （Invitrogen社製）に含まれる各々のドナークローン（pDONR P4-P1R, DONR P2R-P3）にBP反応によりクローニングし、エントリークローン(Entry Clone)を作製した。【０１７２】
7−2−1．で作製したイネPP2C（Os05g0358500）のcDNA配列をクローニングしたpDONR 221、上記で作製したCaMV35S Ωプロモーターの配列をクローニングしたpDONR P4-P1R 、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）のターミネーター配列をクローニングしたDONR P2R-P3及び2−2−2．で作製したデスティネーションベクターpBI-sGFP-R4R3とをLR反応により、CaMV35S Ωプロモーター、イネPP2C cDNA（Os05g0358500）、ノパリン合成酵素遺伝子（NOS）のターミネーターを順に持つ植物発現用ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列決定および配列解析を行った。【０１７３】
7−2−3．アグロバクテリウム法を用いたシロイヌナズナへの遺伝子導入
7−2−2．で作製した植物発現用ベクターをエレクトロポレーション法（Plant Molecular Biology Mannal, Second Edition , B. G. Stanton A. S. Robbert, Kluwer Acdemic Publishers 1994）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）C58C1株に導入した。次いで植物発現用ベクターが導入されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスを、Cloughらにより記載された浸潤法（1998, The Plant Journal 16：735-743）により、野生型シロイヌナズナ エコタイプCol-0に導入し、自家受粉によりT1種子を得た。【０１７４】
7−2−4．形質転換体の表現形の確認
7−2−3．で得られたT1種子をカナマイシン含有培地に無菌播種し、T1世代の植物を作製した。カナマイシン含有培地で選抜した幼植物体は、バーミキュライト混合土を入れた直径50mmのポットに移植した。対象には、非組換えシロイヌナズナを移植した。これを22℃、16時間明期8時間暗期、光強度約30〜45μmol m-2 s-1で栽培した。【０１７５】
7−3．結果
上記7−2−4．の結果として、野生型及びイネ由来PP2C（protein phosphatase 2C）（Os05g0358500）のコーディング領域を導入した形質転換植物体の地上部を撮影した写真を図１２に示す。図１２から、イネ由来PP2C（protein phosphatase 2C）（Os05g0358500）のコーディング領域を導入した形質転換植物体では、地上部の全バイオマス量が野生型と比較して向上していた。以上の結果から、イネ由来のPP2C遺伝子をシロイヌナズナにおいて高発現させることで、シロイヌナズナのバイオマス量を増産できることが明らかとなった。【０１７６】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１−１】
0005403628.tif 000010
【図１−２】
0005403628.tif 000011
【図１−３】
0005403628.tif 000012
【図２−１】
0005403628.tif 000013
【図２−２】
0005403628.tif 000014
【図２−３】
0005403628.tif 000015
【図３】
0005403628.tif 000016
【図４】
0005403628.tif 000017
【図５】
0005403628.tif 000018
【図６】
0005403628.tif 000019
【図７】
0005403628.tif 000020
【図８】
0005403628.tif 000021
【図９】
0005403628.tif 000022
【図１０】
0005403628.tif 000023
【図１１】
0005403628.tif 000024
【図１２】
0005403628.tif 000025
【配列表】
0005403628000001.app