(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１８Ｆによる送達分子の標識方法であって、
ａ）前記１８Ｆを、アルミニウム、ガリウム、インジウム、ルテチウム及びタリウムからなる群から選択される一種の金属と反応させて、金属−１８Ｆ錯体を形成するステップと、
ｂ）前記金属−１８Ｆ錯体を前記送達分子上のキレート部分に結合させて、１８Ｆ−標識送達分子を形成するステップと、を含み、
前記送達分子が、ＩＭＰ４６０（ＮＯＤＡ−ＧＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６１（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６２（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６５（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６６（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒｏ１）、ＩＭＰ４６７（Ｃ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６８（ＮＯＴＡ−ＮＨ−（ＣＨ２）７ＣＯ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２；配列番号２０）、ＩＭＰ４６９（Ｓ−ＮＥＴＡ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）及びＩＭＰ４７０（Ｚ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）からなる群から選択され、
前記キレート部分が、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、Ｃ−ＮＥＴＡ、Ｌ−ＮＥＴＡ及びＳ−ＮＥＴＡからなる群から選択される、方法。
【請求項２】
前記１８Ｆ−標識送達分子が、少なくとも４時間、血清中で安定である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属がアルミニウムである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記金属−１８Ｆ錯体は、マイクロ波照射又は加熱によりキレート部分に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
９５℃〜１１０℃の温度で水性媒質中で加熱することにより、前記金属−１８Ｆ錯体が前記キレート部分に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
有機溶媒が前記水性媒質に付加される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
１８Ｆによる送達分子の標識方法であって、
ａ）アルミニウム、ガリウム、インジウム、ルテチウム及びタリウムからなる群から選択される一種の金属を含有する送達分子を得るステップであり、前記金属が前記送達分子に結合したキレート部分に結合する、ステップと、
ｂ）前記１８Ｆを前記送達分子に加えるステップであり、前記１８Ｆが前記金属と結合して金属−１８Ｆ錯体を形成する、ステップと、を含み、
前記送達分子が、ＩＭＰ４６０（ＮＯＤＡ−ＧＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６１（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６２（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６５（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６６（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒｏ１）、ＩＭＰ４６７（Ｃ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）、ＩＭＰ４６８（ＮＯＴＡ−ＮＨ−（ＣＨ２）７ＣＯ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２；配列番号２０）、ＩＭＰ４６９（Ｓ−ＮＥＴＡ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）及びＩＭＰ４７０（Ｚ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）からなる群から選択され、
前記キレート部分が、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、Ｃ−ＮＥＴＡ、Ｌ−ＮＥＴＡ及びＳ−ＮＥＴＡからなる群から選択される、方法
【請求項８】
前記金属がアルミニウムである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アルミニウム、ガリウム、インジウム、ルテチウム及びタリウムからなる群から選択される一種の金属と１８Ｆとの錯体を含む、１８Ｆによって標識された分子であって、前記金属と前記１８Ｆとの錯体は、前記分子に結合するキレート部分に結合し、前記キレート部分は、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＣＮＥＴＡ、Ｚ−ＮＥＴＡ及びＳ−ＮＥＴＡからなる群から選択される、１８Ｆによって標識された分子。
【請求項１０】
被験者のＰＥＴ画像診断のための、請求項９に記載の１８Ｆによって標識された分子を含む、診断薬。
【請求項１１】
前記被験者が、固形癌（癌腫、肉種、黒色腫、神経膠腫、乳癌、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌）、造血器癌（白血病、リンパ腫、骨髄腫）、自己免疫疾患、神経変性疾患、アルツハイマー病、心疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、心臓壊死、血栓症、卒中、炎症、アテローム硬化症、関節リウマチ、紅斑性狼瘡、ＡＩＤＳ及び病原体感染からなる群から選択される疾患を有する、請求項１０に記載の診断薬。
【請求項１２】
前記１８Ｆによって標識された分子が受容体又は腫瘍を画像診断するために用いられる、請求項１０に記載の診断薬。
【請求項１３】
前記１８Ｆによって標識された分子が１８Ｆ−標識ボンベシン又は１８Ｆ−標識オクトレオチドであり、前記１８Ｆによって標識された分子が腫瘍を画像診断するために用いられる、請求項１０に記載の診断薬。
【請求項１４】
前記１８Ｆによって標識された分子が、抗体、その抗原結合断片又は抗体融合タンパク質を用いて、細胞、組織、又は器官を標的とする、請求項１０に記載の診断薬。
【請求項１５】
前記抗体、その抗原結合断片又は抗体融合タンパク質が、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、Ｂ７、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、ＰＳＭＡ、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＡＦＰ、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン・フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５及び癌遺伝子産物からなる群から選択される抗原に結合する、請求項１４に記載の診断薬。
【請求項１６】
１８Ｆ標識のためのキットであって、
ａ）金属−１８Ｆ錯体を形成するためのアルミニウム、ガリウム、インジウム、ルテチウム及びタリウムからなる群から選択される金属、
ｂ）ＩＭＰ４４９、ＩＭＰ４６０、ＩＭＰ４６１、ＩＭＰ４６２、ＩＭＰ４６５、ＩＭＰ４６６、ＩＭＰ４６７、ＩＭＰ４６８、ＩＭＰ４６９及びＩＭＰ４７０からなる群から選択される、金属−１８Ｆ錯体と結合するための１つ以上のキレート部分を含むターゲッティングペプチド、
ｃ）１８Ｆ、を包含するキット。
【請求項１７】
ｄ）放射線分解防護剤を更に包含する、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
ｅ）１つ以上の緩衝液を更に包含する、請求項１６又は１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許出願第６０／８８４，５２１号（２００７年１月１１日出願）の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下での利益を主張した米国特許出願第１１／９６０，２６２号（２００７年１２月１９日出願）の一部継続である米国特許出願第１２／１１２，２８９号（２００８年４月３０日出願）の一部継続である米国特許出願第１２／３４３，６５５号（２００８年１２月２４日出願）の一部継続である（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。
【０００２】
ある実施形態では、本発明は、in vivo画像診断に有用である１８Ｆでペプチドまたは他の分子を標識する簡単な方法に関する。好ましくは、１８Ｆは、タンパク質、ペプチドまたは他の分子と共有結合され得るキレート部分を介してアルミニウムまたは別の金属との共役体［錯体］として結合される。１８Ｆ標識ペプチド／分子の好ましい比放射能は、患者への投与の時点で、約５００〜１，０００、さらに好ましくは１，０００〜２，０００、さらに好ましくは１，０００〜５，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌである。１００〜１０，０００のＣｉ／ｍｍｏｌの範囲である比放射能も有用である。より高い比放射能がある画像診断用途のために選択されるが、しかし他の代替的実施形態では、ＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸）または別のキレート部分とのより低い比放射能の金属−１８Ｆ錯体は、例えば腎流量画像診断剤として、または血流量を画像診断するための心臓および脳画像診断剤のために有用であり得る。好ましくは、１８Ｆラベリングは、標識化ペプチド／分子から非標識化ペプチド／分子を分離するための精製ステップを必要とせずに成し遂げられる。さらに好ましくは、１８Ｆ標識ペプチドまたは他の分子は、in vivo条件下で、例えばヒト血清中で、少なくとも数時間、安定である。最も好ましい実施形態では、１８Ｆ標識分子は、１時間以下で、画像診断試験に適した形態で調製され得る。開示された方法を用いて、分子のラベリングは、５分という少ない時間で成し遂げられ得る。１８Ｆ標識分子は、例えばＰＥＴ画像診断技法に有用である。代替的実施形態では、ラベリング方法は、例えばＮＭＲ画像診断技法のために、１９Ｆのような他のフッ素同位体とともに用いられ得る。
【背景技術】
【０００３】
ポジトロン断層法（ＰＥＴ）は、非常に高い感受性（ｆｍｏｌｅｓ）、高解像度（４〜１０ｍｍ）、ならびに適切に定量され得る組織付着成長を伴う、診断医療における最も顕著な機能的画像モダリティの１つになってきた（Volkow et al., 1988, Am. J. Physiol. Imaging 3: 142）。［１８Ｆ］２−デオキシ−２−フルオロ−Ｄ−グルコース（［１８Ｆ］ＦＤＧ）は腫瘍学において最も広範に用いられる機能的画像診断剤である（Fletcher et al., 2008, J. Nucl. Med. 49: 480）が、しかし解剖学的画像診断法を補足し、増大するための、機能的画像診断のための他の標識化合物を開発するのに（Torigian et al., 2007, CA Cancer J. Clin. 57: 206）、特に、広く用いられているハイブリッドＰＥＴ／コンピューター断層撮影システムで、大変な利益がある。したがって、ポジトロン放射性核種を生物学的および医学的重要性を有する種々の分子と共役させる安易な方法を有する必要がある。
【０００４】
ペプチドまたはその他の小分子は、少数の例を挙げれば、ポジトロン放出体１８Ｆ、６４Ｃｕ、１１Ｃ、６６Ｇａ、６８Ｇａ、７６Ｂｒ、９４ｍＴｃ、８６Ｙおよび１２４Ｉで標識され得る。同位体の核から放出されるポジトロンは、用いられる同位体によって、異なるエネルギーで放出される。ポジトロンが電子と反応する場合、２つの５１１ｋｅＶ  γ線は反対方向で放出される。放出ポジトロンのエネルギーは、電子をたたくことにより対消滅される前にポジトロンが移動する平均距離を制御する。放出エネルギーが高いほど、電子との衝突前にポジトロンはさらに移動する。ＰＥＴ同位体に関する低放出エネルギーは、ＰＥＴカメラにより画像診断される２つの５１１ｋｅＶ  γ線を生じる前にポジトロンが標的部位から移動する距離を最小限にするために望ましい。ポジトロンを放出する多数の同位体は、それらの崩壊連鎖においてγ線、α粒子またはβ粒子のような他の放出も有する。任意の線量測定問題が最小限にされるよう、純ポジトロン放出体であるＰＥＴ同位体を有することが望ましい。
【０００５】
半減期は同位体をターゲッティング分子と結合し、生成物を分析し、患者にそれを注入し、生成物を局在化させ、非標的組織から除去した後、画像診断するのに十分に長くなければならないため、同位体の半減期も重要である。半減期が長すぎる場合、明瞭な画像のために十分なフォトンを得るには特定活性が十分高くなく、そして短すぎる場合、製造、商業的分布および体内分布のために必要とされる時間は十分ではあり得ない。１８Ｆ（β＋６３５ｋｅＶ  ９７％、ｔ1/2１１０分）は、その低ポジトロン放出エネルギー、副次的放出の欠如、ならびに適切な半減期のため、最も広範に用いられるＰＥＴ放出同位体の１つである。
【０００６】
１８Ｆは、高比放射能で産生される。同位体がターゲッティングのために分子と結合される場合、それは、通常は、放射能標識産物と比較して大モル過剰量でしばしば存在する何らかの非反応ターゲッティング剤により成し遂げられる。通常は、標識化産物および非標識化産物は、in vivoで同一標的に関して競合し、したがって冷ターゲッティング剤の存在はターゲッティング剤の有効な比放射能を低下させる。１８Ｆが、２−フルオロ−２−デオキシグルコース（ＦＤＧ）のような非常に高い取込みを有する分子と結合される場合には、有効な比放射能は重要とはみなされない。しかしながら、標識化ペプチドで受容体をターゲッティングし、または限定数の利用可能な結合部位を用いて免疫ＰＥＴプレターゲッティング試験を実施している場合、冷ターゲッティング剤は、過剰に存在するならば、放射能標識ターゲッティング剤の取込みを潜在的に遮断し得る。
【０００７】
慣用的には、１８Ｆは、それを炭素原子と結合することにより化合物と結合される（Miller et al., 2008, Angew Chem Int Ed 47: 8998-9033）が、しかし、ケイ素（Shirrmacher et al., 2007, Bioconj
Chem 18: 2085-89；Hohne et al.,
2008, Bioconj Chem 19: 1871-79）およびホウ素（Ting et al., 2008, Fluorine Chem 129: 349-58）との結合も報告されている。炭素との結合は、通常は、多段階合成、例えば１０分の半減期を有する同位体に関して問題がある多精製工程を包含する。ペプチドの１８Ｆ標識化のための一般的方法は、典型的には、低比放射能での試薬の標識化、試薬のＨＰＬＣ精製、そしてその後の当該ペプチドの共役を包含する。共役体は、標識化ペプチドの所望の比放射能を得るための共役後、しばしば、再精製される。
【０００８】
一例は、４−［１８Ｆ］フルオロベンズアルデヒドが先ず合成されて、精製され（Wilson et al., J. Labeled Compounds and Radiopharm. 1990; XXVIII:
1189-1199）、次いでペプチドと共役されるPoethko等（J. Nucl. Med. 2004; 45: 892-902）の標識化方法である。ペプチド共役体は、次に、共役を完了させるために用いられた過剰量のペプチドを除去するためにＨＰＬＣにより精製される。他の例としては、スクシニル［１８Ｆ］フルオロベンゾエート（ＳＦＢ）（例えば、Vaidyanathan et al., 1992, Int. J. Rad. Appl. Instrum. B 19: 275）、他のアシル化合物（Tada et al., 1989, Labeled Compd.
Radiopharm. XXVII: 1317；Wester et al.,
1996, Nucl. Med. Biol. 23: 365；Guhlke et al., 1994, Nucl. Med. Biol 21: 819）、またはクリック化学付加物（Li et al., 2007, Bioconjugate
Chem. 18: 1987）による標識化を包含する。これらの方法のための総合性および処方時間は１〜３時間の範囲であり、その大半は、in vivoターゲッティングのために必要とされる比放射能を得るための標識化ペプチドのＨＰＬＣ精製の時間である。１８Ｆが長い半減期を有したならば、多重反応および精製は問題ではなかった。しかしながら、２時間の半減期を有する場合、１８Ｆをペプチドと結合するのに要する操作の全てが有意の負担である。これらの方法は、標識化産物を産生するよう具体的に意図された設備の使用および／または専門熟練化学者の尽力を実施し且つ必要とするためには冗長でもある。それらはまた、臨床的環境で慣例的に用いられ得るキット処方を助成しない。
【０００９】
腫瘍または他の標的組織への標識化付加物の送達のための代替的一方法は、プレターゲッティングアプローチを包含している（例えば、米国特許第７，０５２，８７２号；第７，０７４，４０５号；第７，１３８，１０３号）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）。二重特異性抗体（ｂｓＭＡｂ）プレターゲッティング手法（例えば、McBride et al., 2006, J. Nucl. Med. 10: 1678-88）を用いる従来の研究は、１２４Ｉの使用に集中して、直接的放射能標識断片または１８Ｆ−ＦＤＧより、動物モデルにおける結腸癌異種移植片のより良好なターゲッティングを達成した。その技法は印象的な結果を示したが、しかし１２４Ｉは、主に、他の代替物と比較して、その高コスト（２０００ドル／用量投与より高い）および相対的に不十分な画像診断特性のため、この画像診断手法のための実用的候補ではない。他の抗体ベースのターゲッティング方法は、種々の理由のため、主として、腫瘍／バックグラウンド比が、許容可能レベルに達する前に６時間を超える時間を要するため、放射性ヨウ化産物に頼らなければならなかった。しかしながら、プレターゲッティング方法は、１時間以内に許容可能な画像診断条件を達成し得る（Hamacher et al., 1986, J. Nucl. Med. 27: 235；Iwata et al., 2000, Appl. Radiat. Isot. 52:
87）。
【００１０】
特殊な設備または高度熟練職員に関する要件を最小限にし、且つ高レベルの放射線へのオペレーターの曝露を低減しながら、検出および／または画像診断のための適切な比放射能およびin vivo安定性を有するターゲッティング構築物を生じる、タンパク質またはペプチドのようなターゲッティング部分の１８Ｆラベリングの迅速、簡単な方法に対する必要性が存在する。さらに好ましくは、プレターゲッティング技法に用いるための１８Ｆ標識化ターゲッティングペプチドの調製方法に対する必要性が存在する。このような新規の方法を実施するために必要とされる組成物を提供し得るプレパッケージ型キットに対するさらなる必要性も存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
フッ化物は事実上全ての他の元素と結合し、それらの結合のいくつかは相対的に安定している。金属結合リガンドを保有するペプチドは、安定的に、且つ非常に高い比放射能で、放射性金属を結合することが知られている。本発明で利用されるアプローチは、先ず１８Ｆを金属と結合し、次いで１８Ｆ金属錯体をペプチド上のリガンドでキレート化することであった。最初の問題は、どの金属を選択するかであった。ＩＩＩＡ族の金属（アルミニウム、ガリウム、インジウムおよびタリウム）は、第一の選択肢であった。ルテチウムも、有用であり得る。異なる金属は、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡならびに以下でさらに詳細に考察される他のキレート化基のような種々のキレート化剤と異なる親和性で結合するので、１８Ｆ−金属錯体をタンパク質、ペプチドまたは他の分子と結合するのに有用な金属結合リガンドも重要である。代替的には、金属または他の原子をペプチドと先ず結合し、次いで、１８Ｆを付加し得る。
【００１２】
フッ化アルミニウム錯体は、in vitroで安定であると報告されている（Martinez et al, Inorg. Chem.
1999; 38: 4765-4660；Antonny et al,
J. Biol. Chem. 1992; 267: 6710-6718）。フッ化アルミニウムは、骨に、ならびに歯のエナメル質に取り込まれるようになり、したがって、錯体はin vivoでも安定であり得る（Li,
Crit. Rev. Oral Biol. Med. 2003; 14: 100-114）。
【００１３】
送達分子と細胞または組織標的受容体との間のリガンド−受容体結合相互作用に影響を及ぼすことなく修飾され得る誘導体化可能基を含有する限り、事実上任意の送達分子を用いて画像診断目的のために１８Ｆを結合し得る、と当業者は理解する。下記の実施例は１８Ｆ標識ペプチド部分に関するが、しかし多数の他の種類の送達分子、例えばオリゴヌクレオチド、ホルモン、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、血管形成因子、抗血管形成因子、免疫調節物質、タンパク質、核酸、抗体、抗体断片、薬剤、インターロイキン、インターフェロン、オリゴ糖、多糖、脂質等が、画像診断目的のために１８Ｆ標識され、利用され得る。
【００１４】
同様に、画像診断され得る疾患または症状の種類は、疾患または症状に関連した細胞または組織をターゲッティングするための適切な送達分子の利用可能性によってのみ限定され得る。下記の実施例で例示されるように、多数のこのような送達分子が知られている。例えば、罹患組織または標的、例えば癌と結合する任意のタンパク質またはペプチドは、開示される方法により１８Ｆで標識され、検出および／または画像診断のために使用され得る。ある実施形態では、このようなタンパク質またはペプチドとしては、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と結合する抗体または抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。任意の既知のＴＡＡ結合抗体または断片は、記載される方法により１８Ｆで標識され、例えば、ＰＥＴスキャニングまたは他の既知の技法により、腫瘍の画像診断および／または検出のために用いられ得る。
【００１５】
下記のある実施例では、例示的１８Ｆ標識ペプチドは、二重特異性または多重特異性抗体または抗体断片を利用して、プレターゲッティング方法における標的化可能構築物として画像診断目的のために有用であり得る。この場合、抗体または断片は、疾患または症状に関連した標的、例えば腫瘍関連または自己免疫疾患関連抗原、あるいはウイルス、細菌、真菌または他の微生物のような病原性生物体により産生されるかまたは表示される抗原のための１つ以上の結合部位を含む。第二の結合部位は、具体的には、標的可能構築物と結合する。二重特異性または多重特異性抗体を用いてプレターゲッティングするための方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば米国特許第６，９６２，７０２号参照（この実施例の節は、参照により本明細書中で援用される））。同様に、標的化可能構築物と結合する抗体またはその断片、例えばＨＳＧ（ヒスタミンスクシニルグリシン）と結合する６７９モノクローナル抗体も、当該技術分野でよく知られている（同上）。一般的に、プレターゲッティング方法では、二重特異性または多重特異性抗体が先ず投与されて、細胞または組織標的抗原と結合される。非結合抗体を循環から取り除くための適切な長さの時間の後、例えば、１８Ｆ標識標的化可能構築物が患者に投与され、標的細胞または組織に限局される抗体と結合し、次いで、例えばＰＥＴスキャニングにより画像が得られる。
【００１６】
代替的例示的実施形態では、非ペプチド受容体ターゲッティング剤、例えば葉酸は、ＮＯＴＡまたは別のキレート部分と共役され、次いで、例えば、ＮＯＴＡと結合する１８Ｆ−金属錯体で標識され得る。このような非ペプチド受容体ターゲッティング剤としては、例えば、インテグリンαｖβ３受容体に対する非ペプチドアンタゴニストであるＴＡ１３８が挙げられ得る（Liu et al., 2003, Bioconj. Chem. 14: 1052-56）。ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、または１８Ｆ−金属錯体に関する別のキレート化剤と共役され得る当該技術分野で既知の同様の非ペプチドターゲッティング剤は、特許請求される方法で利用され得る。他の受容体ターゲッティング剤、例えばソマトスタチン受容体ターゲッティング剤Ｉｎ−ＤＴＰＡオクトレオチド（ＴＹＣＯ（登録商標））が、当該技術分野で知られている。以下で考察されるように、１８Ｆ−金属錯体は、潜在的に、ＤＴＰＡを用いてキレート化され、画像診断目的のために用いられ得る。ＮＯＤＡＧＡＴＯＣペプチドは、ソマトスタチン受容体ターゲッティングのためにＡｌ１８Ｆで標識され得る（Eisenwiener et al., Bioconj. Chem. 2002, 13(3): 530-41）。金属キレート化合物を用いた受容体ターゲッティング画像診断のための他の方法が当該技術分野で既知であり、特許請求される方法の実施に利用され得る（例えばAndre et al., 2002, J. Inorg. Biochem. 88: 1-6；Pearson et al., 1996, J. Med., Chem. 39:
1361-71参照）。
【００１７】
ＰＥＴスキャニングによる１８Ｆ画像診断のための画像診断技法および装置も、当該技術分野でよく知られており（例えば、米国特許第６，３５８，４８９号；第６，９５３，５６７号；Page et al., Nuclear Medicine And Biology, 21: 911-919, 1994；Choi et al., Cancer Research 55: 5323-5329,
1995；Zalutsky et al., J.
Nuclear Med., 33: 575-582, 1992参照）、任意のこのような既知のＰＥＴ画像診断技法および装置が利用され得る。
【００１８】
下記の実施例はＰＥＴ画像診断のための１８Ｆ−金属錯体の使用を実証するが、しかし、安定な金属−フッ化物錯体、例えば非放射性２７Ａｌおよび１９Ｆ錯体も、ＮＯＴＡまたは他のキレート剤と結合され、ＭＲＩ造影剤として用いるためにペプチドまたは他のターゲッティング剤に付着され得る、と当業者は理解する。［ＡｌＦ］−キレート剤錯体も、ＭＲＩ画像診断のためにポリマーに付着され得る。ＡｌＦ−キレート剤誘導体は、ＰＡＲＡＣＥＳＴ  ＭＲＩ画像診断剤として用いられ得る（Woessner et al. Magn. Reson. Med. 2005, 53: 790-99）。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
以下の図は、本発明の特定の実施形態を例証するために含まれており、特許請求される対象物の範囲に関して限定的であるよう意図されない。
【図１】ＴＦ２二重特異性抗体を用いた場合と用いない場合の、マウスにおける１１１Ｉｎおよび１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９の比較生体分布である。
【図２】マイクロＰＥＴ画像診断による腫瘍保有ヌードマウスにおける１８Ｆ標識化剤の生体分布である。（Ａ）［１８Ｆ］ＦＤＧ、（Ｂ）抗ＣＥＡかける抗ＨＳＧ  ｂｓＭＡｂでプレターゲッティングされたＡｌ［１８Ｆ］ＩＭＰ４４９、（Ｃ）Ａｌ［１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独（ｂｓＭＡｂでプレターゲッティングされない）を注射後に、各左わき腹に小さな皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を保有する３匹のヌードマウスの冠状薄片。注射用量パーセント／グラム（％ＩＤ／ｇ）として表される生体分布データを、画像診断期間の終結時に動物から取り出された組織に関して示す。略語：Ｂ、骨髄；Ｈ、心臓；Ｋ、腎臓；Ｔ、腫瘍。
【図３】上部脇腹に３５ｍｇのＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸癌異種移植片を保有するヌードマウスに投与されたプレターゲッティングＡｌ［１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の動的画像診断試験。上３つのパネルは、１２０分の画像診断期間に亘る６つの異なる５分間隔での腫瘍の周辺位置の中心にある身体の一領域の、採取されたそれぞれ冠状、矢状および横断切片を示す。各切片図の左側の最初の画像は、矢印で目立たせている十字線の交差点での腫瘍の位置を示す。画像診断期間中に、動物を部分的にその右側に傾けた。底部の２つのパネルは、肝臓および小腸における分布を目立たせるために冠状切片中のより前方の平面に焦点を当てた付加的な冠状および矢状切片を示すが、矢状図は身体のより中心部の横断図である。略語：Ｃｏｒ、冠状；ＦＡ、前腕；Ｈ、心臓；Ｋ、腎臓；Ｌｖ、肝臓；Ｓａｇ、矢状；Ｔｒ、横断；ＵＢ、膀胱。
【図４】テトラｔｅｒｔ−ブチルＣ−ＮＥＴＡ−スクシニルの合成。
【図５】テトラｔｅｒｔ−ブチルＣ−ＮＥＴＡ−スクシニルの詳細な合成。
【図６】ジ−ｔｅｒｔ−ブチルＮＯＴＡの合成。
【図７】テトラ−ｔｅｒｔ−ブチルＬ−ＮＥＴＡの合成。
【図８】Ｃ−ＮＥＴＡおよびＬ−ＮＥＴＡ間の構造の差。
【図９】Ｓ−ＮＥＴＡに関する合成スキーム。
【図１０】１８Ｆ標識ＩＭＰ４６８ボンベシン類似体によるin vivo組織分布。
【図１１】ＮＯＴＡ誘導体。（Ａ）ＩＭＰ４６７に関するＮＯＴＡリガンド、（Ｂ）ＮＯＴＡのイミノ二酢酸誘導体。
【図１２】ＮＯＴＡの例示的イミノ二酢酸誘導体。（Ａ）環窒素からの１つのイミノ二酢酸を有する。（Ｂ）窒素からの１つのイミノ二酢酸、ならびに炭素に結合された１つのイミノ二酢酸を有する。（Ｃ）炭素からの２つのイミノ二酢酸基を有する。
【図１３】ＡＲ４２Ｊ腫瘍保有マウス（ｎ＝５）における２時間ｐ.ｉ．での１８Ｆ−ＩＭＰ４６６および６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の生体分布の比較。対照として、別個の群のマウス（ｎ＝５）には過剰量の非標識化オクトレオチドを摂取させて、受容体特異性を実証した。
【図１４】頚部にｓ．ｃ．ＡＲ４２Ｊ腫瘍を有するマウスにおける２時間ｐ.ｉ．での１８Ｆ−ＩＭＰ４６６および６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６のＰＥＴ／ＣＴスキャンの対照薄片。腫瘍および腎臓中の蓄積が明瞭に可視化されている。
【図１５】漸増用量でのプレターゲッティング後の０．０１ｎｍｏｌ１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８の生体分布。値を、平均±標準偏差として示す（ｎ＝５）。
【図１６】皮下ＬＳ１７４ＴおよびＳＫ−ＲＣ５２腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８のｉ．ｖ．注射後１時間の６．０ｎｍｏｌ１２５Ｉ−ＴＦ２（０．３７ＭＢｑ）および０．２５ｎｍｏｌ６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（５ＭＢｑ）の生体分布。値を、平均±標準偏差として示す（ｎ＝５）。
【図１７】６．０ｎｍｏｌＴＦ２によるプレターゲッティング後、ｉ．ｖ．注射後１時間の５ＭＢｑＦＤＧおよび５ＭＢｑ６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ）の生体分布。値を、平均±標準偏差として示す（ｎ＝５）。
【図１８】５ＭＢｑ１８Ｆ−ＦＤＧを、そして１日後に、１６時間の間隔を置いて６．０ｎｍｏｌＴＦ２と５ＭＢｑ６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ）を摂取した、右後肢に皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍（０．１ｇ）（明色矢印）および左大腿筋に炎症（暗色矢印）を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスのＰＥＴ／ＣＴ画像。１８Ｆ−ＦＤＧおよび６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８注射後１時間に、動物を画像診断した。パネルは、ＦＤＧ−ＰＥＴスキャンの３Ｄボリュームレンダリング（Ａ）、腫瘍領域の横断面（Ｂ）、ならびにプレターゲッティングイムノＰＥＴスキャンの３Ｄボリュームレンダリング（Ｃ）、腫瘍領域の横断面（Ｄ）。
【図１９】１６時間前に６．０ｎｍｏｌＴＦ２を注射後１時間の０．２５ｎｍｏｌＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９（５ＭＢｑ）の生体分布、プレターゲッティングを伴わないＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の生体分布、またはＡｌ［１８Ｆ］の生体分布。値を、平均±標準偏差として示す（ｎ＝５）。
【図２０】１６時間間隔で６．０ｎｍｏｌＴＦ２および０．２５ｎｍｏｌＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９（５ＭＢｑ）を静脈内摂取した、右側（矢印）に皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍（０．１ｇ）を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの静的ＰＥＴ／ＣＴ画像診断試験。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の注射後１時間に、動物を画像診断した。パネルは、３Ｄボリュームレンダリング（Ａ）後面図、ならびに腫瘍領域の（Ｂ）冠状断面、（Ｃ）矢状断面を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書中の開示についての理解を促すために、以下の定義が提供される。明確に定義されない用語は、それらの平明な且つ通常の意味に従って用いられる。
【００２１】
本明細書中で用いる場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、1つまたは１つより多くの項目を意味し得る。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、「および」そして「または」は、接続語または離接語を意味するために用いられ得る。すなわち、両用語は、別記しない限り、「および／または」と等価であると理解されるべきである。
【００２３】
本明細書中で用いる場合、「約」は、ある数のプラスまたはマイナス１０％以内を意味する。例えば、「約１００」は、９０および１１０の間の任意の数を指す。
【００２４】
本明細書中で用いる場合、「ペプチド」は、２〜１００アミノ酸長、さらに好ましくは２〜１０、さらに好ましくは２〜６アミノ酸長の天然または非天然アミノ酸の任意の配列を指す。「アミノ酸」は、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物であり得る。
【００２５】
本明細書中で用いる場合、標識化分子の分画が出発混合物と比較して濃化されるよう、標識化分子が非標識化分子から部分的にまたは全体的に分離される場合、標識化分子は「精製される」。「精製」標識化分子は、ほぼ任意の比率、例えば約５：９５；１０：９０；１５：８５；２０：８０；２５：７５；３０：７０；４０：６０；５０：５０；６０：４０；７０：３０；７５：２５；８０：２０；８５：１５；９０：１０；９５：５；９７：３；９８：２；９９：１または１００：０（これらに限定されない）の比での標識化および非標識化分子の混合物を含み得る。
【００２６】
本明細書中で用いる場合、「病原体」という用語は、真菌、ウイルス、寄生生物および細菌（これらに限定されない）、例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、ヒト血清パルボ様ウイルス、サルウイルス４０、呼吸器合胞体ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、デング熱ウイルス、風疹ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネズミ白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、疣贅ウイルス、ブルータングウイルス、Ｂ群連鎖球菌、レジオネラ・ニューモフィラ、化膿連鎖球菌、大腸菌、ネイセリア・ゴノレア淋病菌、髄膜炎菌、肺炎球菌、Ｂ型インフルエンザ菌、梅毒トレポネーマ、ライム病スピロヘータ、緑膿菌、ライ菌、ウシ流産菌、結核菌および破傷風菌（これらに限定されない）を包含する。
【００２７】
本明細書中で用いる場合、「放射線分解防護剤」は、１８Ｆ標識錯体または分子に付加されて、放射線分解による１８Ｆ標識錯体または分子の分解速度を低減し得る任意の分子、化合物または組成物を指す。任意の既知の放射線分解防護剤（アスコルビン酸が挙げられるが、これに限定されない）が用いられ得る。
１８Ｆ標識技法の比較
【００２８】
１８Ｆで分子を標識化するための種々の技法が知られている。表１は、より一般的に報告されているフッ化手法のいくつかの特性を列挙する。炭素を介したペプチド標識化は、しばしば、通常は２−または３段階での、求核置換を介した補欠分子族との１８Ｆ結合を包含し、この場合、補欠分子族は、標識され、精製され、化合物に付着されて、次いで再び精製される。この一般的方法は、アミド結合、アルデヒドおよび「クリック化学」を介して補欠分子族を付着するために用いられてきた（Marik et al., 2006, Bioconjug Chem 17: 1017-21；Poethko et al., 2004, J Nucl Med 45: 892-902；Li et al., 2007, Bioconjug Chem 18: 989-93）。最も一般的なアミド結合形成試薬はＮ−スクシンイミジル４−１８Ｆ−フルオロベンゾエート（１８Ｆ−ＳＦＢ）であったが、しかし多数の他の基が試験されてきた（Marik et al., 2006）。いくつかの場合、例えば１８Ｆ標識化活性エステルアミド形成基が用いられる場合、カップリング反応中にペプチド上のある基を保護する必要があり、その後、それらは切り離される。この１８Ｆ−ＳＦＢ試薬の合成ならびにその後のペプチドとの共役は、多数の合成ステップを必要とし、約２〜３時間掛かる。
【００２９】
より簡単で、より効率的な１８Ｆ−ペプチド標識化方法がPoethko等（2004）により開発されたが、この場合、４-１８Ｆ−フルオロベンズアルデヒド試薬が、ドライダウン・ステップを含めて約７５〜９０分で、オキシム結合を介してペプチドと共役された。より新しい「クリック化学」法は、銅触媒の存在下で、ペプチド上の１８Ｆ標識分子をアセチレンまたはアジ化物で付着する（Li et al, 2007；Glaser and
Arstad, 2007, Bioconjug Chem 18: 989-93）。アジ化物およびアセチレン基間の反応はトリアゾール結合を形成し、これは非常に安定であり、そして保護基を必要とせずに非常に効率的にペプチド上に生じる。クリック化学は、ドライダウン・ステップを伴って約７５〜９０分で、良好な収率（〜５０％）で、１８Ｆ標識化ペプチドを産生する。
【表１】
0005608914.tif 000002
【００３０】
１８Ｆをケイ素と結合するさらに近年の方法は、同位体交換を用いて、１８Ｆを１９Ｆに置き換える（Shirrmacher et al., 2007）。室温で１０分間実施すると、この反応は、高比放射能を有する１８Ｆ−補欠分子アルデヒド基を生じる（２２５〜６８０ＧＢｑ／μｍｏｌ；６，１００〜１８，４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。１８Ｆ標識アルデヒドは、その後、ペプチドと協約され、ＨＰＬＣにより精製されて、精製標識化ペプチドが４０分以内（ドライダウンを含む）に収率〜５５％で得られる。これは、その後、標識化反応の前にペプチド中にケイ素を組み入れることにより、一段階法に修正された（Hohne et al, 2008）。しかしながら、１８Ｆ−ケイ素−ボンベシン誘導体を用いたマウスにおける生体分布試験は、長時間に亘って増大する骨取込みを示した（０．５時間での１．３５±０．４７％注入用量（ＩＤ）／ｇ対４．０時間での５．１４±２．７１％ＩＤ／ｇ）が、これは、非結合Ｆが骨中に局在することが知られているため（Hohne et al, 2008）、ペプチドからの１８Ｆの放出を示唆する。尿のＨＰＬＣ分析は、ボイド容量中の相当な量の１８Ｆ活性を示したが、これは、おそらく、ペプチドから放出される１８Ｆ−フッ化物陰イオンのためである。したがって、１８Ｆ−ケイ素標識分子は血清中で安定でない、ということが明らかになった。実質的肝胆道排出も報告されたが、これは１８Ｆ−ケイ素結合基質の親油性に起因すると考えられ、より親水性である将来的誘導体を必要とした。１８Ｆをホウ素に付着する方法も探究されてきた；しかしながら、最新方法は、低比放射能を有する共役体を生じる（Ting et al., 2008）。
【００３１】
抗体およびペプチドは、慣例的には放射性金属と、典型的には１５分で、且つ定量的収率で結合される（Meares et al., 1984, Acc Chem Res 17: 202-209；Scheinberg et al., 1982, Science 215: 1511-13）。ＰＥＴ画像診断のために、６４Ｃｕ、さらに近年では６８Ｇａが、キレート化合物を介してペプチドと結合されており、合理的に良好なＰＥＴ画像特性を示している（Heppler et al., 2000, Current Med Chem 7: 971-94）。フッ化物はほとんどの金属と結合するため、１８Ｆ−金属錯体が標的化分子上でキレート剤と結合され得るか否かを、われわれは確定しようと試みた（Tewson, 1989, Nucl Med Biol. 16: 533-51；Martin, 1996, Coordination Chem Rev 141:
23-32）。フッ化アルミニウムは相対的にin vivoで存在し得るため、Ａｌ１８Ｆ錯体の結合にわれわれは集中してきた（Li, 2003, Crit
Rev Oral Biol Med 14: 100-114；Antonny et al., 1992, J Biol Chem 267: 6710-18）。いくつかの場合にはＦ−ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）より良好な、癌を局在化するための高度感受性および特異性技法である二重特異性抗体（ｂｓＭＡｂ）プレターゲッティング系を用いた癌のin vivoターゲッティングのための１８Ｆ標識ペプチドを調製するためのこのアプローチの実現可能性を示した初期研究を、われわれは報告している（McBride et al. 2008, J Nucl Med (suppl) 49: 97P；Wagner, 2008, J Nucl Med 49: 23N-24N；Karacay et al., 2000, Bioconj Chem 11: 842-54；Sharkey et al., 2008, Cancer Res 68; 5282-90；Gold et al., 2008, Cancer Res 68: 4819-26；Sharkey et al., 2005, Nature Med 11: 1250-55；Sharkey et al., 2005, Clin Cancer Res 11:
7109s-7121s；McBride et al., 2006, J
Nucl Med 47: 1678-88；Sharkey et al.,
2008, Radiology 246: 497-508）。これらの研究は、Ａｌ１８Ｆ錯体が１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）と安定的に結合し得るが、しかし収率は低い、ということを明示した。
【００３２】
下記の実施例において、収率を約１０％から約８０％に増強して、ＰＥＴ画像診断のために有用なペプチドおよび他の分子の１８Ｆ標識化のための実行可能な方法を提供する新規の標識化条件およびいくつかの新規のＮＯＴＡ誘導体を調べた。
標的化可能構築物ペプチド
【００３３】
ある実施形態では、１８Ｆ標識部分は、ペプチドまたは他の標的化可能構築物を含み得る。１８Ｆ標識ペプチド（またはタンパク質）は、画像診断および／または検出のために、標的化細胞、組織、病原性生物体または他の標的と直接的に結合するよう選択され得る。他の実施形態では、１８Ｆ標識ペプチドは、例えば、標的化可能構築物ペプチドのための１つ以上の結合部位、ならびに疾患または症状に関連した標的抗原のための１つ以上の結合部位を有する二重特異性抗体を用いて、間接的に結合するよう選択され得る。二重特異性抗体は、例えば、抗体が最初に被験者に投与され得るプレターゲッティング技法に用いられ得る。抗体が標的抗原と結合するのに、ならびに非結合抗体が循環から除去されるのに十分な時間が与えられる。次いで、標的化可能構築物、例えば１８Ｆ標識ペプチドが被験者に投与され、二重特異性抗体と結合されて、罹患細胞または組織に局在化される。その後、ＰＥＴスキャニングまたは他の既知の技法により、１８Ｆ標識化標的化可能構築物の分布が確定され得る。
【００３４】
このような標的化可能構築物は多様な構造を有するものであり、高親和性で標的化可能構築物と結合する抗体または断片の利用可能性に関してだけでなく、プレターゲッティング法および二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）または多重特異性抗体内で用いられる場合、迅速in vivoクリアランスに関しても選択される。強力な免疫応答を引き出すには疎水性薬剤が最良であるが、一方、迅速in vivoクリアランスのためには親水性薬剤が好ましい。したがって、疎水性特質と親水性特質との平衡が確立される。これは、一部は、多数の有機部分の固有の疎水性を相殺するために親水性キレート化剤を用いることにより、成し遂げられ得る。さらにまた、逆の溶液特性を有する標的化可能構築物のサブユニット、例えばあるものは疎水性であり且つあるものは親水性であるアミノ酸を含有するペプチドが選択され得る。ペプチドのほかに、炭水化物も用いられ得る。
【００３５】
２個という少ないアミノ酸残基、好ましくは２〜１０個の残基を有するペプチドが用いられ得るし、他の部分、例えばキレート化剤と結合もされ得る。リンカーは、低分子量共役体であるべきであり、好ましくは、キレート化合物中の金属イオンを含めて、５０，０００ダルトン未満、有益には約２０，０００ダルトン未満、１０，０００ダルトンまたは５，０００ダルトン未満の分子量を有する。より通例的には、標的化可能構築物ペプチドは、例えばペプチドＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２（配列番号１）のように、４個以上の残基を有する（ここで、ＤＯＴＡは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン１，４，７，１０−四酢酸であり、ＨＳＧはヒスタミンスクシニルグリシル基である）。代替的には、ＤＯＴＡはＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸）、ＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）、ＮＥＴＡ（［２−（４，７−ビスカルボキシメチル［１，４，７］トリアザシクロノナン−１−イル−エチル）−２−カルボニルメチル−アミノ］酢酸）または他の既知のキレート化部分に取り替えられ得る。
【００３６】
標的化可能構築物は、in vivoでペプチドの安定性を増大するために、主鎖構造中に非天然アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸も含み得る。代替的実施形態では、他の主鎖構造、例えば非天然アミノ酸から構築されるものまたはペプトイドが用いられ得る。
【００３７】
標的化可能構築物として用いられるペプチドは、固相支持体ならびに反復的直交性脱保護およびカップリングの標準技法を用いて、自動ペプチド合成機で合成されるのが便利である。キレート共役のために後に用いられるべきであるペプチド中の遊離アミノ基は、標準保護基、例えばＢｏｃ基で遮断されるのが有益であるが、しかしＮ末端残基はアセチル化されて、血清安定性を増大し得る。このような保護基は、当業者によく知られている。Greene and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis, 1999 (John
Wiley and Sons, N.Y.)を参照されたい。ペプチドが二重特異性抗体系内で後に用いるために調製される場合、in vivoカルボキシペプチダーゼ活性を抑制するために、それらが樹脂から切断されて、対応するＣ末端アミドを生成するのが有益である。ペプチド合成方法の例は、下記の実施例で開示される。
【００３８】
免疫原のハプテンは、認識部分、例えば化学ハプテンを含む。化学ハプテン、好ましくはＨＳＧハプテンを用いて、抗体に対するリンカーの高特異性が示される。ＨＳＧハプテンに対して生じる抗体が知られており（例えば、６７９抗体）、適切な二重特異性抗体中に容易に組み入れられ得る（例えば米国特許第号６，９６２，７０２；第７，１３８，１０３号および第７，３００，６４４号（実施例の節に関して、参照により本明細書中で援用される）参照）。したがって、付着ハプテンを伴うリンカーの結合は、抗体または抗体断片に対して高度に特異的である。しかしながら、他のハプテンおよびそれらと結合する抗体は当該技術分野で既知であり、Ｉｎ−ＤＴＰＡおよび７３４抗体のように用いられ得る（例えば、米国特許出願公開番号２００５０００２９４５）。
キレート部分
【００３９】
いくつかの実施形態では、１８Ｆ標識分子は、金属イオンを結合し、さらにまた、迅速in vivoクリアランスを保証するのに役立つ１つ以上の親水性キレート部分を含み得る。キレート剤は、それらの特定の金属結合特性に関して選択され得るし。容易に取り替えられ得る。
【００４０】
特に有用な金属−キレート剤の組合せとしては、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘきしる類似体が挙げられる。大環状キレート剤、例えばＮＯＴＡ（１，４，７−トリアザ−シクロノナン−１，４，７−三酢酸）、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ（ｐ−ブロモアセトアミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸）およびＮＥＴＡも、１８Ｆ共役体のためのリガンドとして潜在的に用いられ得る種々の金属に関して有用である。
【００４１】
リガンドがハード塩基キレート化官能基、例えばカルボキシレートまたはアミン基を含むＤＴＰＡおよびＤＯＴＡ型キレート剤は、ハード酸陽イオン、特にＩＩａ族およびＩＩＩａ族金属陽イオンをキレート化するために最も有効である。このような金属キレート錯体は、環サイズを当該金属に合わせることにより非常に安定に作製され得る。他の環型キレート剤、例えば大環状ポリエステルは、核種を安定的に結合するために重要である。ポルフィリンキレート剤は、多数の金属錯体とともに用いられ得る。１つより多くの型のキレート剤が担体と共役されて、多数の金属イオンと結合し得る。キレート剤、例えば米国特許第５，７５３，２０６号に開示されたもの、特に、チオセミカルバゾニルグリオキシルシステイン（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）およびチオセミカルバジニル−アセチルシステイン（Ｔｓｃａ−Ｃｙｓ）キレート剤が有益に用いられて、ソフト塩基リガンドと堅く結合されるＴｃ、Ｒｅ、Ｂｉおよびその他の遷移金属、ランタニドおよびアクチニドのソフト酸陽イオンを結合する。１つより多い型のキレート剤をペプチドと連結することは有用であり得る。ジ−ＤＴＰＡハプテンに対する抗体が既知であり（米国特許第５，２５６，３９５号（Barbet等））、ターゲッティング抗体と容易に結合されて二重特異性抗体を形成するため、プレターゲッティング・プロトコールにおいて１８Ｆ錯体を結合するために、ペプチドを、ジＤＴＰＡキレート剤および別のキレート剤とともに用いることが出来る。このようなペプチドの一例は、Ａｃ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＤＴＰＡ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２（配列番号２）である。他のハード酸キレート剤、例えばＤＯＴＡ、ＴＥＴＡ等は、ＤＴＰＡおよび／またはＴｓｃｇ−Ｃｙｓ基の代わりにされ得るし、それらに特異的なＭＡｂは、抗ジ−ＤＴＰＡ  ＭＡｂを生成するために用いられるものと類似の技法を用いて産生され得る。
【００４２】
別の有用なキレート剤は、例えばChong等(J. Med. Chem., 2008, 51: 118-25；この記載内容は参照により本明細書中で援用される)に開示されたように、ＮＯＴＡ型部分を含み得る。Chong等は、１７７Ｌｕまたは２０５/２０６Ｂｉと錯体形成される場合、１４日までの間、血清中で安定性を示したＮＯＴＡ構造に基づいて、二官能性Ｃ−ＮＥＴＡリガンドの産生および使用を開示する。キレート剤は限定的ではなく、当該技術分野で既知であるかおよび／または以下の実施例で記載されるキレート剤のこれらのおよびその他の例が、本発明の実施において用いられ得る。
【００４３】
２つの異なるハード酸またはソフト酸キレート剤は、陽イオンの異なるサイズ、キレート環の形状、ならびに陽イオンの好ましい錯体イオン構造のため、例えば、異なるキレート環サイズで、標的化可能構築物中に組み入れられて、２つの異なるハード酸またはソフト酸陽イオンと優先的に結合し得る、と理解される。これは、一方または両方が１８Ｆに付着され得る２つの異なる金属を、プレターゲッティング二重特異性抗体による終局的捕捉のために標的化可能構築物中に組み入れさせる。
投与方法
【００４４】
種々の実施形態では、二重特異性抗体および標的化可能構築物が、正常または罹患組織および器官を画像診断するために用いられ得る（例えば、米国特許第６，１２６，９１６号；第６，０７７，４９９；第６，０１０，６８０号；第５，７７６，０９５号；第５，７７６，０９４号；第５，７７６，０９３号；第５，７７２，９８１号；第５，７５３，２０６号；第５，７４６，９９６号；第５，６９７，９０２号；第５，３２８，６７９号；第５，１２８，１１９号；第５，１０１，８２７号および第４，７３５，２１０号（各々、その実施例の節の参照により本明細書中で援用される参照）。
【００４５】
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および１８Ｆ標識標的化可能構築物は、標的化可能構築物の投与前のどこかの時点でｂｓＡｂ抗体を投与することにより実行され得る。試薬の用量および時機は当業者により容易に案出され得るし、用いられる試薬の具体的性質に依っている。ｂｓＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２誘導体が最初に投与される場合には、標的化可能構築物の投与前に２４〜７２時間（代替的には４８〜９６時間）の待機時間が適切である。ＩｇＧ−Ｆａｂ’  ｂｓＡｂ共役体が主要ターゲッティングベクターである場合には、標的化可能構築物の投与前のより長い待機期間が、３〜１０日の範囲で示され得る。罹患組織に対してｂｓＡｂが標的にするために十分な時間が経過した後、１８Ｆ標識標的化可能構築物が投与される。標的化可能構築物の投与後、画像診断が実施され得る。
【００４６】
ある実施形態は、特許出願番号６０／２２０，７８２に記載されているような少なくとも３つの異なる標的結合部位を有する多価標的結合タンパク質の使用に関する。多価標的結合タンパク質は、化学リンカーを介していくつかのＦａｂ様断片を架橋することにより作製されてきた。米国特許第５，２６２，５２４号；第５，０９１，５４２号およびLandsdorp et al. Euro. J. Immunol. 16: 679-83 (1986)を参照されたい。多価標的結合タンパク質は、いくつかの一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）を共有結合して単一ポリペプチドを形成することによっても作製されてきた（米国特許第５，８９２，０２０号参照）。基本的にｓｃＦｖ分子の集合体である多価標的結合タンパク質は、米国特許第６，０２５，１６５号および第５，８３７，２４２号に開示されている。３つのｓｃＦｖ分子を含む三価標的結合タンパク質は、Krott et al. Protein Engineering 10(4): 423-433 (1997)に記載されている。
【００４７】
代替的には、以下でさらに詳細に記載される「ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）」として知られている技法は、２つ以上の異なる抗体または抗体断片を含む錯体を含めた種々の多価錯体の簡単且つ再現可能な構築のために実証されてきた（例えば、米国特許出願第１１／３８９，３５８号（２００６年３月２４日出願）；１１／３９１，５８４号（２００６年３月２８日出願）；１１／４７８，０２１号（２００６年６月２９日出願）；１１／６３３，７２９号（２００６年１２月５日出願）；および１１／９２５，４０８号（２００７年１０月２６日出願）参照）（これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）。このような構築物は、本明細書中に記載される特許請求された方法および組成物の実施にも有用である。
【００４８】
二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および標的化可能構築物の用量投与の間に投与される除去剤が用いられ得る。新規の機械的作用を有する除去剤、すなわち、ｂｓＡｂの疾患標的腕（単数または複数）に対して標的化されるグリコシル化抗イディオタイプＦａｂ’断片が用いられ得る。一例では、抗ＣＥＡ（ＭＮ−１４Ａｂ）×抗ペプチドｂｓＡｂが投与され、その最大程度に疾患標的中に付着させる。残留ｂｓＡｂを循環から除去するために、ＷＩ２と呼ばれるＭＮ−１４に対する抗イディオタイプＡｂが、好ましくはグリコシル化Ｆａｂ’断片として投与される。除去剤は、多価的にｂｓＡｂと結合するが、一方、その添付のグリコシル残基は全錯体を肝臓に向け、ここで、迅速な代謝が起きる。次いで、１８Ｆ標識標的化可能構築物が被験者に投与される。ｂｓＡｂのＭＮ−１４アームに対するＷＩ２  Ａｂは高親和性を有し、そのクリアランス機序は、ＷＩ２−Ｆａｂが一価部分であるため、架橋を包含しないので、他の開示された機序とは異なる（Goodwin et al.同書中、参照）。しかしながら、キレート化剤に関する代替的方法および組成物が既知であり、任意のこのような既知の除去剤が用いられ得る。
処方物および投与
【００４９】
１８Ｆ標識分子は、１つ以上の薬学的に適した賦形剤、１つ以上の付加的成分またはこれらの何らかの組合せを含む組成物を得るよう処方されることもある。これらは、薬学的に有用な投与量を調製し、それにより放射能成分（すなわち、１８Ｆ標識分子）が１つ以上の薬学的に適した賦形剤と混合して併用される既知の方法により成し遂げられ得る。滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水は、薬学的に適した賦形剤の一例である。他の適切な賦形剤は、当業者に周知である。例えば、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,
5th Edition (Lea & Febiger 1990)およびGennaro (ed.), REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company
1990)ならびにそれらの改訂版を参照されたい。
【００５０】
本明細書中に記載される組成物の好ましい投与経路は、非経口注射である。注射は、静脈内、動脈内、リンパ内、くも膜下腔内または腔内（すなわち、非経口的に）であり得る。非経口投与では、組成物は、単位投与量注射可能形態で、例えば製薬上許容可能な賦形剤に関連して溶液、懸濁液または乳濁液で処方される。このような賦形剤は、本来、非毒性および非治療性である。このような賦形剤の例は、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液およびハンクス溶液である。非水性賦形剤、例えば不揮発性油およびオレイン酸エチルも用いられ得る。好ましい賦形剤は、生理食塩水中の５％デキストロースである。賦形剤は、少量の添加剤、例えば等張性および化学的安定性を増強する物質、例えば緩衝剤および防腐剤を含有し得る。他の投与方法、例えば経口投与も意図される。
【００５１】
１８Ｆ標識分子を含む処方組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入を介して、静脈内投与のために用いられ得る。注射用の組成物は、単位剤形で、例えばアンプル中に、または多用量容器中に、付加防腐剤とともに存在し得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態もとり得るし、処方剤、例えば懸濁剤、安定剤および／または分散剤を含有し得る。代替的には、組成物は、使用前に適切なビヒクル、例えば滅菌性の発熱物質を含有しない水を用いて構成するために、粉末形態であり得る。
【００５２】
組成物は、溶液中で投与され得る。溶液のｐＨは、ｐＨ５〜９．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５の範囲であるべきである。その処方物は、適切な製薬上許容可能な緩衝剤、例えばリン酸塩、ＴＲＩＳ（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌまたはクエン酸塩等を有する溶液で存在すべきである。緩衝剤濃度は、１〜１００ｍＭの範囲であるべきである。処方溶液は、５０〜１５０ｍＭの濃度で、塩、例えば塩化ナトリウムまたは塩化カリウムも含有し得る。有効量の安定剤、例えばグリセロール、アルブミン、グロブリン、洗剤、ゼラチン、プロタミンまたはプロタミンの塩も含まれ得る。組成物は、皮下に、静脈内に、筋肉内に、あるいは他の非経口経路により、哺乳類に投与され得る。さらに、投与は連続注入によるか、あるいは単回または多数回ボーラスによるものであり得る。
【００５３】
二重特異性抗体が投与される場合、例えばプレターゲッティング技法では、ヒトに関する投与抗体の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身症状および既往歴のような因子に依って変わる。典型的には、画像診断目的のために、単回静脈内注入として約１ｍｇ〜２００ｍｇの範囲である二重特異性抗体の投与量をレシピエントに提供することが望ましいが、しかし状況によっては、より低いまたはより高い投与量も投与され得る。典型的には、約１０ｍｇ／体表面積１ｍ２、あるいは典型的成人に関しては１７〜１８ｍｇの抗体の範囲である投与量をレシピエントに提供することが望ましいが、しかし、状況により、より低いまたはより高い投与量も投与され得る。画像診断目的のためにヒト被験者に投与され得る二重特異性抗体の投与量の例は、１〜２００ｍｇ、さらに好ましくは１〜７０ｍｇ、最も好ましくは１〜２０ｍｇであるが、しかしより高いかまたはより低い用量も用いられ得る。
【００５４】
概して、投与するための１８Ｆ標識の投与量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身症状および既往歴のような因子に依って変わる。好ましくは、飽和用量の１８Ｆ標識分子が患者に投与される。１８Ｆ標識分子の投与に関して、投与量は、ミリキュリーで測定され得る。Ｆ画像診断試験の典型的範囲は、５〜１０ｍＣｉである。
ペプチドの投与
【００５５】
特許請求される方法および／または組成物の種々の実施形態は、被験者に投与されるべき１つ以上の１８Ｆ標識ペプチドに関し得る。投与は、当該技術分野で既知の任意の経路、例えば、経口、鼻、頬、吸入、直腸、膣、局所、同所、皮内、皮下、筋内、腹腔内、動脈内、くも膜下腔内または静脈内注射（これらに限定されない）により起こり得る。例えば、１８Ｆ標識ペプチドがプレターゲッティング・プロトコールで投与される場合、ペプチドは、好ましくは静脈内投与される。
【００５６】
被験者に経口投与される非修飾化ペプチドは消化管中で分解され、配列および構造によって、腸管内層を通した不十分な吸収を示し得る。しかしながら、内因性プロテアーゼによる分解に対して低感受性にさせ、消化管を通してより吸収可能にさせるようペプチドを化学的に修飾するための方法は、よく知られている（例えば、Blondelle et al., 1995, Biophys. J. 69: 604-11；Ecker and Crooke, 1995, Biotechnology 13:
351-69；Goodman and Ro, 1995,
BURGER’S MEDICINAL CHEMISTRY
AND DRUG DISCOVERY, VOL. I, ed. Wollf, John Wiley & Sons；Goodman and Shao, 1996, Pure & Appl.
Chem. 68: 1303-08参照）。ペプチド類似体、例えばＤ−アミノ酸を含有するペプチド；ペプチドの構造を模倣する有機分子からなるペプチド模倣物；またはペプトイド、例えばビニル性ペプトイドのライブラリーの調製方法も記載されており、被験者への経口投与に適したペプチドベースの１８Ｆ標識分子を構築するために用いられ得る。
【００５７】
ある実施形態では、標準的ペプチド結合連結は、１つ以上の代替的連結基、例えばＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＯ−ＣＨ２、ＣＨＯＨ−ＣＨ２等に取り替えられ得る。ペプチド模倣物の調製方法は周知である（例えば、Hruby, 1982, Life Sci 31: 189-99；Holladay et al., 1983, Tetrahedron Lett. 24: 4401-04；Jennings-White et al., 1982, Tetrahedron
Lell. 23: 2533；Almquiest et
al., 1980, J. Med. Chem. 23: 1392-98；Hudson et al., 1979, Int. J. Pept. Res. 14: 177-185；Spatola et al., 1986, Life Sci 38: 1243-49；米国特許第５，１６９，８６２号；第５，５３９，０８５号；第５，５７６，４２３号；第５，０５１，４４８号；第５，５５９，１０３号）。ペプチド模倣物は、それらのペプチド類似体と比較して、in vivoでの増強された安定性および／または吸収を示し得る。
【００５８】
代替的には、ペプチドは、エキソペプチダーゼ活性を防止するために、Ｎ末端および／またはＣ末端キャッピングを用いて、経口送達により投与され得る。例えばＣ末端はアミドペプチドを用いてキャップ化され得るし、Ｎ末端はペプチドのアセチル化によりキャップ化され得る。ペプチドはさらにまた、例えば、環状アミド、ジスルフィド、エーテル、スルフィド等の形成により、エキソペプチダーゼを遮断するために環化され得る。
【００５９】
ペプチド安定化は、特に、エンドペプチダーゼが作用することが知られている位置で、天然Ｌ−アミノ酸の代わりにＤ−アミノ酸を置き換えることによっても起こり得る。エンドペプチダーゼ結合および切断配列は当該技術分野で既知であり、Ｄ−アミノ酸を組み入れているペプチドの作製および使用方法が記載されている（例えば、米国特許出願公開番号２００５００２５７０９（McBride等）、２００４年６月１４日出願。この実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）。ある実施形態では、ペプチドおよび／またはタンパク質は、プロテイナーゼ−および／またはペプチダーゼ阻害剤との同時処方により、経口投与され得る。
【００６０】
治療用ペプチドの経口送達のための他の方法は、Mehta
(“Oral delivery and
recombinant production of peptide hormones,” June 2004, BioPharm International)に開示されている。ペプチドは、腸管タンパク質分解活性を調整し、腸壁を通したペプチド輸送を増強する賦形剤を伴う腸溶性固体剤形で投与される。この技法を用いた無傷ペプチドの相対的生物学的利用能は、投与される量の１％〜１０％の範囲であった。インスリンは、コール酸ナトリウムおよびプロテアーゼ阻害剤とともに腸溶性マイクロカプセルを用いて、イヌにおいて首尾よく投与されている（Ziv et al., 1994, J. Bone Miner. Res. 18 (Suppl. 2): 792-94）。ペプチドの経口投与は、浸透増強剤としてのアシルカルニチンならびに腸溶コーティングを用いて実施されてきた（Eudragit L30D-55, Rohm Pharma Polymers、Mehta, 2004参照）。経口投与ペプチドに有用な賦形剤は、一般的に、腸溶性カプセルまたは錠剤内に包装され得るペプチドの溶解性または吸収を改善するために、洗剤または他の薬剤とともに腸プロテアーゼ／ペプチダーゼの１つ以上の阻害剤を含み得る（Mehta, 2004）。有機酸は、腸を酸性にするためにカプセル中に含まれ、そしてカプセルが一旦腸中で溶解すると腸プロテアーゼ活性を抑制し得る（Mehta, 2004）。ペプチドの経口送達のための別の代替物としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースの両親媒性オリゴマーとの共役、漸増吸収および酵素分解に対する耐性が挙げられる（Soltero and Ekwuribe, 2001, Pharm. Technol. 6: 110）。
抗体の産生方法
【００６１】
ペプチド主鎖に対するＡｂｓは、Ａｂ産生のための周知の方法により生成され得る。例えば、完全フロイントアジュバント中の免疫原、例えば（ペプチド）ｎ−ＫＬＨ（ここで、ＫＬＨはカギアナカサガイ・ヘモシアニンであり、ｎ＝１〜３０である）の注射と、その後の不完全フロイントアジュバント中に懸濁された同一免疫原の免疫適格動物への２回の注射の後、抗原の静脈内追加免疫３日後に脾臓細胞を採取した。次に、採取脾臓細胞をＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合され、その結果生じたクローンの培養上清は、直接結合ＥＬＩＳＡを用いて抗ペプチド反応性に関して分析される。生成Ａｂの特異性は、元の免疫原のペプチド断片を用いて分析され得る。これらの断片は、自動ペプチド合成機を用いて容易に調製され得る。Ａｂ産生のために、酵素欠損ハイブリドーマが単離されて、融合細胞株の選択を可能にする。この技法は、標的化可能構築物を含む１つ以上のキレート化合物、例えばＩｎ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡキレート化合物に対する抗体を産生するためにも用いられ得る。Ｉｎ（ＩＩＩ）−ジ−ＤＴＰＡに対するモノクローナルマウス抗体が知られている（Barbet ‘395、上記）。
【００６２】
例えば二重特異性抗体の構成成分として有用なターゲッティング抗体は、マーカー物質として種々の細胞表面または細胞内腫瘍関連抗原に特異的であり得る。これらのマーカーは、腫瘍により産生される物質であり得るし、あるいは細胞質、核中であれ、種々の細胞小器官または細胞成分構造中であれ、腫瘍部位に、腫瘍細胞表面にまたは腫瘍細胞内に蓄積する物質であり得る。このような腫瘍関連マーカーの中には、Herberman, “Immunodiagnosis
of Cancer”により、Fleisher ed., “The Clinical Biochemistry of Cancer”, page 347 (American Association of Clinical
Chemists, 1979)に、ならびに米国特許第４，１５０，１４９号；第４，３６１，５４４号および第４，４４４，７４４号（これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）に開示されたものも含まれる。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に関する最近の報告としては、Mizukami et al., （2005, Nature
Med. 11: 992-97）；Hatfield et
al., （2005, Curr. Cancer Drug
Targets 5: 229-48）；Vallbohmer et
al., （2005, J. Clin. Oncol.
23: 3536-44）；およびRen et al., （2005, Ann. Surg. 242: 55-63）が挙げられる（各々、同定されたＴＡＡに関して参照により本明細書中で援用される）。
【００６３】
腫瘍関連マーカーは、Herberman（上記）により多数の部類に分類されており、例としては、癌胎児性抗原、胎盤性抗原、発癌または腫瘍ウイルス関連抗原、組織関連抗原、器官関連抗原、異所性ホルモンおよび正常抗原、あるいはそれらの変異体が挙げられる。時折、腫瘍関連マーカーのサブユニット、例えば、米国特許第４，３６１，６４４号および第４，４４４，７４４号に開示されたような非腫瘍物質に対する交差反応性の大きな低減を示す抗体の産生を刺激するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）のβサブユニット、または癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のγ領域は、より高い腫瘍特異性を有する抗体を産生するために用いられるのが有益である。
【００６４】
別の当該マーカーは、膜貫通活性化因子およびＣＡＭＬ−インタラクター（ＴＡＣＩ）である（Yu et al. Nat. Immunol. 1: 252-256 (2000)参照）。要するに、ＴＡＣＩは、Ｂ細胞悪性疾患（例えばリンパ腫）に関するマーカーである。さらに、ＴＡＣＩおよびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は腫瘍壊死因子相同体−増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）により結合される、ということが知られている。ＡＰＲＩＬは、一次ＢおよびＴ細胞のin vitro増殖を刺激し、in vivoでのＢ細胞の蓄積のために脾臓重量を増大する。ＡＰＲＩＬは、受容体結合に関して、ＴＡＬＬ−１（ＢＬｙＳまたはＢＡＦＦとも呼ばれる）とも競合する。可溶性ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩは、ＡＰＲＩＬの結合を特異的に防止し、一次Ｂ細胞のＡＰＲＩＬ刺激性増殖を遮断する。ＢＣＭＡ−Ｆｃは、カギアナカサガイ・ヘモシアニンに対する抗体の産生およびマウスにおけるニューモバックスも抑制するが、これは、ＢＣＭＡおよび／またはＴＡＣＩを介したＡＰＲＩＬおよび／またはＴＡＬＬ−Ｉシグナル伝達が体液性免疫の生成に必要とされる、ということを示す。したがって、ＡＰＲＩＬ−ＴＡＬＬ−ＩおよびＢＣＭＡ−ＴＡＣＩは、ＢおよびＴ細胞機能の刺激に関与する２リガンド−２受容体経路を形成する。
【００６５】
種々の疾患または症状、例えば悪性疾患、心臓血管性疾患、感染性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患または神経学的疾患を画像診断するために用いる標的抗原の例としては、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＳＡｐ、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ−ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＡＦＰ、ＰＳＭＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ−６、Ｂ７、フィブロネクチンのＥＤ−Ｂ、Ｈ因子、ＦＨＬ−１、Ｆｌｔ−３、葉酸受容体、ＧＲＯＢ、ＨＭＧＢ−１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）、ＨＭ１．２４、インスリン様成長因子−１（ＩＬＧＦ−１）、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２５、ＩＰ−１０、ＭＡＧＥ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１Ａ、ＭＩＰ−１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５、ＰＡＭ４抗原、ＮＣＡ−９５、ＮＣＡ−９０、Ｉａ、ＨＭ１．２４、ＥＧＰ−１、ＥＧＰ−２、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、Ｌｅ（ｙ）、ＲＡＮＴＥＳ、Ｔ１０１、ＴＡＣ、Ｔｎ抗原、トムソン・フリーデンライヒ抗原、腫瘍壊死抗原、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ受容体（Ｒ１およびＲ２）、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｐ１ＧＦ、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５および癌遺伝子産物が挙げられ得る。
【００６６】
画像診断または検出がリンパ腫、白血病または自己免疫障害と関連する場合、標的化抗原は、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ６７、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ８０、ＣＤ１２６、ＣＤ１３８、ＣＤ１５４、Ｂ７、ＭＵＣ１、Ｉａ、Ｉｉ、ＨＭ１．２４、ＨＬＡ−ＤＲ、テネイシン、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、ＥＤ−Ｂフィブロネクチン、癌遺伝子、癌遺伝子産物、ＣＤ６６ａ−ｄ、壊死抗原、ＩＬ−２、Ｔ１０１、ＴＡＧ、ＩＬ−６、ＭＩＦ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（ＤＲ４）およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＤＲ５）からなる群から選択され得る。
【００６７】
免疫原に対する初期抗体産生後、抗体はシーケンシングされ、その後、組換え技法により調製され得る。ネズミ抗体および抗体断片のヒト化およびキメラ化は、当業者に周知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重および軽可変さからヒト可変ドメインにマウス相補性決定領域を移し、次いで、ネズミ対応物のフレームワーク領域においてヒト残基で置換することにより産生される。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体構成成分の使用は、ネズミ定常領域の免疫原性に関連した潜在的問題を未然に回避する。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングするための一般的技法は、例えば、Orlandi et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989)（この記載内容は参照により本明細書中で援用される）の出版物により記載されている。ヒト化ＭＡｂを産生するための技法は、例えば、Jones et al., Nature 321: 522 (1986)、Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988)、Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988)、Carter et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)、Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992)およびSinger et al., J. Immun. 150: 2844 (1993)（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）により記載されている。
【００６８】
代替的には、完全ヒト抗体は、トランスジェニック非ヒト動物から得られる（例えば、Mendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997)；米国特許第５，６３３，４２５号参照）。例えば、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスから回収され得る。マウス体液性免疫系は、内因性免疫グロブリン遺伝子を不活性化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト化される。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は、過剰に複雑にされて、ヒトゲノムのほぼ０．２％をともに占める多数の別個のセグメントを含む。トランスジェニックマウスが適切なレパートリーの抗体を産生し得ることを確証するために、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分がマウスゲノム中に導入されなければならない。これは、生殖系列配置でヒト重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座を含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成で開始する段階的プロセスで成し遂げられる。各挿入物は約１Ｍｂのサイズであるため、ＹＡＣ構築は、免疫グロブリン遺伝子座の重複断片の相同的組換えを要する。２つのＹＡＣ（重鎖遺伝子座を含有するものと、軽鎖遺伝子座を含有するもの）は、ＹＡＣ含有酵母スフェロブラストとマウス胚性幹細胞との融合によりマウス中に別々に導入される。胚性幹細胞クローンは、次に、マウス胚盤胞中に微量注入される。その結果生じるキメラ雄は、それらの生殖系列を介してＹＡＣを伝えるそれらの能力に関してスクリーニングされ、ネズミ抗体産生に欠陥があるマウスと交配される。２つのトランスジェニック系統（一方はヒト重鎖遺伝子座を含有し、他方はヒト軽鎖遺伝子座を含有する）の交配は、免疫化に応答してヒト抗体を産生する子孫を生じる。
【００６９】
非再配列化ヒト免疫グロブリン遺伝子も、微小細胞媒介性染色体移行（ＭＭＣＴ）によりマウス胚性幹細胞中に導入され得る（例えば、Tomizuka et al., Nature Genetics, 16: 133 (1997)参照）。この方法では、ヒト染色体を含有する微小細胞は、マウス胚性幹細胞と融合される。移行染色体は安定に保持され、成体キメラは適正な組織特異的発現を示す。
【００７０】
代替物として、抗体または抗体断片は、組合せ免疫グロブリンライブラリーから単離されたヒト抗体断片に由来し得る。例えば、Barbas et al., METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119
(1991)およびWinter et al., Ann.
Rev. Immunol. 12: 433 (1994)を参照されたい（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）。Ｂ細胞不死化によりモノクローナル抗体を生成することに伴う困難の多くは、ファージディスプレイを用いて、大腸菌中で抗体断片を工学処理し、発現することにより克服され得る。
【００７１】
類似の戦略を用いて、高親和性ｓｃＦｖを獲得し得る（例えば、Vaughn et al., Nat. Biotechnol., 14: 309-314 (1996)参照）。大きなレパートリーを有するｓｃＦｖライブラリーは、全ての既知のＶＨ、ＶカッパおよびＶ８０遺伝子ファミリーに対応するＰＣＲプライマーを用いて、非免疫化ヒトドナーからＶ遺伝子を単離することにより構築され得る。増幅後、ＶカッパおよびＶラムダプールは併合されて、１つのプールを形成する。これらの断片は、ファージミドベクターに結紮される。次いで、ｓｃＦｖリンカー（Ｇｌｙ４、Ｓｅｒ）３（配列番号２１）が、ＶＬ断片の上流のファージミドに結紮される。ＶＨおよびリンカー−ＶＬ断片は増幅され、ＪＨ領域上に集合される。その結果生じるＶＨ−リンカー−ＶＬ断片は、ファージミドベクターに結紮される。ファージミドライブラリーは、フィルターを用いて、上記のように、またはイムノチューブ（ＮＵＮＣ（登録商標）；ＭＡＸＩＳＯＲＰ（登録商標））を用いて、パニングされ得る。同様の結果は、免疫化ウサギのリンパ球または脾臓細胞から組合せ免疫グロブリンライブラリーを構築することにより、ならびにメタノール資化酵母中でｓｃＦｖ構築物を発現することにより、達成され得る（例えば、Ridder et al., Biotechnology, 13: 255-260 (1995)参照）。さらに、適切なｓｃＦｖの単離後、ＣＤＲ３突然変異誘発および鎖シャッフリングのような親和性成熟プロセスを介して、より高い結合親和性およびより遅い解離速度を有する抗体断片が得られる（例えば、Jackson et al., Br. J. Cancer, 78: 181-188 (1998)；Osbourn et al., Immunotechnology, 2: 181-196
(1996)参照）。
【００７２】
抗体断片の別の形態は、単一ＣＤＲをコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）は、当該抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得られる。このような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することより調製される（例えば、Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106
(1991);Courtenay-Luck, ”Genetic
Manipulation of Monoclonal Antibodies,” in MONOCLONAL ANTIBODIES: PTODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL
APPLICATION, Ritter et al.(eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press
1995)；およびWard et al., ”Genetic Manipulation and Expression of
Antibodies,” in MONOCLONAL
ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), pages 137-185
(Wiley-Liss, Inc. 1995)参照）。
【００７３】
キメラ抗体は、齧歯類抗体由来の可変ドメインおよび相補性決定領域を含有する組換えタンパク質であるが、一方、残りの抗体分子は、ヒト抗体に由来する。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体のネズミ相補性決定領域がネズミ免疫グロブリンの重および軽可変鎖から、ヒト定常領域配列に付着されたヒト可変ドメインに移された組換えタンパク質である。
【００７４】
キメラＡｂは、マウス軽可変および重可変ドメインをコードするｃＤＮＡ断片をヒト抗体からのＣドメインをコードする断片に結紮することにより構築される。Ｃドメインは抗原結合の一助とならないため、キメラ抗体は、元のマウスＡｂと同じ抗原特異性を保有するが、しかし配列がヒト抗体により近い。しかしながら、キメラＡｂは依然としていくつかのマウス配列を含有し、依然として免疫原性であり得る。ヒト化Ａｂは、抗原を認識するのに必要なマウスアミノ酸のみを含有する。この生成物は、マウス相補性決定領域からのアミノ酸をヒト抗体フレームワーク中に作り上げることにより構築される。
【００７５】
二重特異性抗体を産生するためのその他の近年の方法は、より一般的な免疫グロブリンアイソタイプより強力に架橋するよう、付加的システイン残基を有する工学処理組換えＡｂを包含する（例えば、FitzGerald et al., Protein Eng. 10: 1221-1225, 1997参照）。別のアプローチは、必要とされる二重特異性を有する２つ以上の異なる一本鎖抗体または抗体断片セグメントを連結する組換え融合タンパク質を工学処理することである（例えば、Coloma et al., Nature Biotech. 15: 159-163, 1997参照）。種々の二重特異性融合タンパク質は、分子工学処理を用いて産生され得る。一形態では、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば、１つの抗原のための単一結合部位を有するｓｃＦｖ、および第二の抗原のための単一結合部位を有するＦａｂ断片からなる。別の形態では、二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば、１つの抗原のための２つの結合部位を有するＩｇＧ、および第二の抗原のための２つの結合部位を有する２つのｓｃＦｖからなる。
【００７６】
ダイアボディとも呼ばれる機能的二重特異性一本鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）は、組換え法を用いて哺乳類細胞中で産生され得る（例えば、Mack et al., Proc. Natl. Acad. Sci.,92: 7021-7025, 1995参照）。
【００７７】
好ましい二重特異性抗体は、ＭＡｂ  Ｍｕ−９のＦｖ、ＭＡｂ６７９のＦｖまたはＭＡｂ  ＭＮ−１４のＦｖおよびＭＡｂ６７９のＦｖを組み入れるもの、ならびにそれらのヒト、キメラ化またはヒト化対応物である。ＭＮ−１４、ならびにそのキメラ化およびヒト化対応物は、米国特許第５，８７４，５４０号に開示されている。Ｍｕ配布９または６７９のＣＤＲのうちの１つ以上を組み入れる二重特異性抗体も好ましい。抗体は、クラスＩＩＩ抗ＣＥＡ抗体および６７９のＦｖを組み入れる融合タンパク質または二重特異性抗体でもあり得る。クラスＩＩＩ抗体、例えばクラスＩＩＩ抗ＣＥＡは、米国特許第４，８１８，７０９号で詳細に考察されている。
【００７８】
二重特異性抗体は、疾患状態または症状とかんれんすることが知られている標的高原に対する結合特異性を有する当該技術分野で既知の任意の抗体または断片を組み入れ得る、と当業者は理解する。このような既知の抗体としては、ｈＲ１（抗ＩＧＦ−１Ｒ、米国特許出願第６１／１４５，８９６号（２００９年１月２０日出願））、ｈＰＡＭ４（抗ＭＵＣ１、米国特許第７，２８２，５６７号）、ｈＡ２０（抗ＣＤ２０、米国特許第７，２５１，１６４号）、ｈＡ１９（抗ＣＤ１９、米国特許第７，１０９，３０４号）、ｈＩＭＭＵ３１（抗ＡＦＰ、米国特許第７，３００，６５５号）、ｈＬＬ１（抗ＣＤ７４、米国特許第７，３１２，３１８号）、ｈＬＬ２（抗ＣＤ２２、米国特許第号７，０７４，４０３）、ｈＭｕ９（抗ＣＳＡｐ、米国特許第７，３８７，７７３号）、ｈＬ２４３（抗ＨＬＡ−ＤＲ、米国特許出願第１１／３６８，２９６号）、ｈＭＮ−１４（抗ＣＥＡ、米国特許第６，６７６，９２４号）、ｈＭＮ−１５（抗ＣＥＡ、米国特許出願第１０／６７２，２７８号）、ｈＲＳ７（抗ＥＧＰ−１、米国特許第７，２３８，７８５号）およびｈＭＮ−３（抗ＣＥＡ、米国特許出願第１０／６７２，２７８号）（各引用特許または出願の実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。二次ＭＡｂも当該技術分野で既知の任意の抗ハプテン抗体から選択され得るし、例としては、ｈ６７９（米国特許第７，４２９，３８１号）および７３４（米国特許出願第１０／７７６，４７０号）（これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
有用な種々の他の抗体が、当該技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，６８６，０７２号；第５，８７４，５４０号；第６，１０７，０９０号；第６，１８３，７４４号；第６，３０６，３９３号；第６，６５３，１０４号；第６，７３０，３００号；第６，８９９，８６４号；第６，９２６，８９３号；第６，９２６，７０２号；第７，０７４，４０３号；第７，２３０，０８４号；第７，２３８，７８５号；第７，２３８，７８６号；第７，２５６，００４号；第７，２８２，５６７号；第７，３００，６５５号；第７，３１２，３１８号；ならびに米国特許出願公開番号２００４０１８５０５３；２００４０２０２６６６；２００５０２７１６７１；２００６０１９３８６５；２００６０２１０４７５；２００７００８７００１；（各々、参照により本明細書中で援用される））。このような既知の抗体は、種々の疾患状態または症状の検出および／または画像診断のために有用である（例えば、ｈＭＮ−１４またはＴＦ２  ｂｓＭＡｂ（ＣＥＡ発現癌腫）、ｈＡ２０  ｂｓＭａｂ（ＴＦ−４−リンパ腫）、ｈＰＡＭ４（ＴＦ−１０膵臓癌）、ＲＳ７  ｂｓＭＡｂ（肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌）、ｈＭＮ−１５またはｈＭＮ３  ｂｓＭＡｂ（炎症）、ヒトｇｐ１２０および／またはｇｐ４１  ｂｓＭＡｂ（ＨＩＶ）、抗血小板ｂｓＭａｂおよび抗トロンビンｂｓＭＡｂ（血餅画像診断）、抗ミオシンｂｓＭＡｂ（心臓壊死））。
【００８０】
有用な抗体は、広範な種々の既知の供給元から商業的に入手可能であり得る。例えば、種々の抗体分泌ハイブリドーマ系統は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ATCC, Manassas, VA）から入手可能である。腫瘍関連抗原（これらに限定されない）を含めた種々の疾患標的に対する多数の抗体は、ＡＴＣＣに寄託されており、および／または公表済みの可変領域配列を有し、特許請求された方法および組成物に用いるために利用可能である。例えば、米国特許第７，３１２，３１８号；第７，２８２，５６７号；第７，１５１，１６４号；第７，０７４，４０３号；第７，０６０，８０２号；第７，０５６，５０９号；第７，０４９，０６０号；第７，０４５，１３２号；第７，０４１，８０３号；第７，０４１，８０２号；第７，０４１，２９３号；第７，０３８，０１８号；第７，０３７，４９８号；第７，０１２，１３３号；第７，００１，５９８号；第６，９９８，４６８号；第６，９９４，９７６号；第６，９９４，８５２号；第６，９８９，２４１号；第６，９７４，８６３号；第６，９６５，０１８号；第６，９６４，８５４号；第６，９６２，９８１号；第６，９６２，８１３号；第６，９５６，１０７号；第６，９５１，９２４号；第６，９４９，２４４号；第６，９４６，１２９号；第６，９４３，０２０号；第６，９３９，５４７号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，６４５号；第６，９２１，５３３号；第６，９１９，４３３号；第６，９１９，０７８号；第６，９１６，４７５号；第６，９０５，６８１号；第６，８９９，８７９号；第６，８９３，６２５号；第６，８８７，４６８号；第６，８８７，４６６号；第６，８８４，５９４号；第６，８８１，４０５号；第６，８７８，８１２号；第６，８７５，５８０号；第６，８７２，５６８号；第６，８６７，００６号；第６，８６４，０６２号；第６，８６１，５１１号；第６，８６１，２２７号；第６，８６１，２２６号；第６，８３８，２８２号；第６，８３５，５４９号；第６，８３５，３７０号；第６，８２４，７８０号；第６，８２４，７７８号；第６，８１２，２０６号；第６，７９３，９２４号；第６，７８３，７５８号；第６，７７０，４５０号；第６，７６７，７１１号；第６，７６４，６８８号；第６，７６４，６８１号；第６，７６４，６７９号；第６，７４３，８９８号；第６，７３３，９８１号；第６，７３０，３０７号；第６，７２０，１５号；第６，７１６，９６６号；第６，７０９，６５３号；第６，６９３，１７６号；第６，６９２，９０８号；第６，６８９，６０７号；第６，６８９，３６２号；第６，６８９，３５５号；第６，６８２，７３７号；第６，６８２，７３６号；第６，６８２，７３４号；第６，６７３，３４４号；第６，６５３，１０４号；第６，６５２，８５２号；第６，６３５，４８２号；第６，６３０，１４４号；第６，６１０，８３３号；第６，６１０，２９４号；第６，６０５，４４１号；第６，６０５，２７９号；第６，５９６，８５２号；第６，５９２，８６８号；第６，５７６，７４５号；第６，５７２；８５６号；第６，５６６，０７６号；第６，５６２，６１８号；第６，５４５，１３０号；第６，５４４，７４９号；第６，５３４，０５８号；第６，５２８，６２５号；第６，５２８，２６９号；第６，５２１，２２７号；第６，５１８，４０４号；第６，５１１，６６５号；第６，４９１，９１５号；第６，４８８，９３０号；第６，４８２，５９８号；第６，４８２，４０８号；第６，４７９，２４７号；第６，４６８，５３１号；第６，４６８，５２９号；第６，４６５，１７３号；第６，４６１，８２３号；第６，４５８，３５６号；第６，４５５，０４４号；第６，４５５，０４０号；第６，４５１，３１０号；第６，４４４，２０６号；第６，４４１，１４３号；第６，４３２，４０４号；第６，４３２，４０２号；第６，４１９，９２８号；第６，４１３，７２６号；第６，４０６，６９４号；第６，４０３，７７０号；第６，４０３，０９１号；第６，３９５，２７６号；第６，３９５，２７４号；第６，３８７，３５０号；第６，３８３，７５９号；第６，３８３，４８４号；第６，３７６，６５４号；第６，３７２，２１５号；第６，３５９，１２６号；第６，３５５，４８１号；第６，３５５，４４４号；第６，３５５，２４５号；第６，３５５，２４４号；第６，３４６，２４６号；第６，３４４，１９８号；第６，３４０，５７１号；第６，３４０，４５９号；第６，３３１，１７５号；第６，３０６，３９３号；第６，２５４，８６８号；第６，１８７，２８７号；第６，１８３，７４４；第６，１２９，９１４号；第６，１２０，７６７号；第６，０９６，２８９号；第６，０７７，４９９号；第５，９２２，３０２号；第５，８７４，５４０号；第５，８１４，４４０号；第５，７９８，２２９号；第５，７８９，５５４号；第５，７７６，４５６号；第５，７３６，１１９号；第５，７１６，５９５号；第５，６７７，１３６号；第５，５８７，４５９号；第５，４４３，９５３号；第５，５２５，３３８号を参照されたい。これらは例に過ぎず、広範な種々のその他の抗体およびそれらのハイブリドーマが当該技術分野で既知である。ほとんどの任意の疾患関連抗原に対する抗体配列または抗体分泌ハイブリドーマは、当該選定疾患関連標的に対する抗体に関してＡＴＣ、ＮＣＢＩおよび／またはＵＳＰＴＯデータベースを簡単に検索することにより獲得され得る、と当業者は理解する。クローン化抗体の抗原結合ドメインは、当該技術分野で周知の標準技法を用いて、増幅され、切り出され、発現ベクターに結紮され、適応宿主細胞中に移されて、タンパク質産生のために用いられ得る。
【００８１】
候補抗ＨＩＶ抗体としては、Johansson
et al.(AIDS. 2006 Oct 3; 20(15): 1911-5)により記載された抗エンベロープ抗体、ならびにPolymun (Vienna, Austria)により記載され、販売され、米国特許第５，８３１，０３４号、米国特許第５，９１１，９８９号そしてVcelar et al., AIDS 2007; 21(16): 2161-2170およびJoos et al., Antimicrob. Agents Chemother.
2006; 50(5): 1773-9（これらはすべて、参照により本明細書中で援用される）にも記載されている抗ＨＩＶ抗体が挙げられる。
【００８２】
ある実施形態では、ｂｓＡｂ  Ｆ−１８標識標的化可能構築物は、米国特許第６，０９６，２８９号に記載されているように、術中、血管内、および／または内視鏡的腫瘍および病変検出、生検ならびに療法に用いられ得る。
抗体クローニングおよび構築のための一般的技法
【００８３】
キメラまたはヒト化抗体の産生といった種々の技法は、抗体クローニングおよび構築の手法を包含する。当該抗体に関する抗原結合Ｖκ（可変軽鎖）およびＶＨ（可変重鎖）配列は、種々の分子クローニング手法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥおよびｃＤＮＡライブラリースクリーニングにより獲得し得る。ネズミＭＡｂを発現する細胞からのＭＡｂのＶ遺伝子を、ＰＣＲ増幅によりクローン化し、シーケンシングし得る。それらの信憑性を確証するために、クローン化ＶＬおよびＶＨ遺伝子を、Orlandi et al.,
（Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 86: 3833 (1989)）により記載されたように、キメラＡｂとして細胞培養中で発現し得る。Ｖ遺伝子配列に基づいて、次いでヒト化ＭＡｂを、Leung et al. (Mol. Immunol., 32: 1413 (1995))により記載されたように設計し、構築し得る。
【００８４】
ｃＤＮＡは、一般的分子クローニング技法（Sambrook
et al., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2nd Ed (1989)）により、ネズミＭＡｂを産生する任意の既知のハイブリドーマ系統またはトランスフェクト化細胞系統から調製し得る。ＭＡｂに関するＶκ配列は、プライマーＶＫ１ＢＡＣＫおよびＶＫ１ＦＯＲ（Orlandi et al., 1989）、またはLeung et al. (BioTechniques, 15: 286 (1993))により記載された延長プライマー組を用いて増幅し得る。ＶＨ配列は、プライマー対ＶＨ１ＢＡＣＫ／ＶＨ１ＦＯＲ（Orlandi et al., 1989）、またはLeung et al. (Hybridoma, 13: 469 (1994))により記載されたネズミＩｇＧの定常領域とアニーリングするプライマーを用いて、増幅し得る。
【００８５】
１０μｌの一次鎖ｃＤＮＡ産物、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液［５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン］（Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT）、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２００ｎＭのプライマーおよび５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）を含有するＰＣＲ反応混合物は、３０サイクルのＰＣＲに付され得る。各ＰＣＲサイクルは、好ましくは、９４℃で１分の変性、５０℃Ｃで１．５分のアニーリング、および７２℃で１．５分の重合からなる。増幅ＶκおよびＶＨ断片は、２％アガロース（Bio-Rad, Richmond, CA）上で精製し得る。ヒト化Ｖ遺伝子は、Leung et al. (Mol. Immunol., 32: 1413 (1995))により記載されたように、長オリゴヌクレオチド鋳型合成およびＰＣＲ増幅の組合せにより構築し得る。
【００８６】
Ｖκに関するＰＣＲ産物は、Ｉｇプロモーター、シグナルペプチド配列、ならびにＶκＰＣＲ産物のフレーム内結紮を促進するのに便利な制限部位を含有するｐＢＲ３２７ベースのステージングベクターのようなステージングベクター中にサブクローニングし得る。ＶＨに関するＰＣＲ産物は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのＶＨｐＢＳのような類似のステージングベクター中にサブクローニングし得る。それぞれのＰＣＲ産物を含有する個々のクローンは、例えばSanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463 (1977))の方法によりシーケンシングし得る。
【００８７】
ＶκおよびＶＨ配列をプロモーターおよびシグナルペプチド配列とともに含有する発現カセットは、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として二重制限消化によりそれぞれＶＫｐＢＲおよびＶＨｐＢＳから切り出し得る。ＶκおよびＶＨ発現カセットを、適切な発現ベクター、例えばそれぞれｐＫｈおよびｐＧ１ｇに結紮し得る（Leung et al., Hybridoma, 13: 469 (1994))。発現ベクターを、適切な細胞、例えば骨髄腫Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（ATCC, VA）中に同時トランスフェクトし、コロニーを、ヒグロマイシン耐性に関して選択し、そして上清液を、ＥＬＩＳＡ検定により、キメラ、ヒト化またはヒトＭＡｂの産生に関してモニタリングし得る。代替的には、ＶκおよびＶＨ発現カセットを、修飾ステージングベクターＶＫκＢＲ２およびＶＨＰＢＳ２中に組み立てて、それぞれＸＢａＩ／ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片として切り出して、単一発現ベクター、例えばｐｄＨＬ２中にサブクローニングし得る（Gillies et al., J. Immunol. Methods 125: 191 (1989)に記載され、Losman et al., Cancer, 80: 2660 (1997)にも示されている）。有用である別のベクターは、ＧＳベクターである（Barnes et
al., Cytotechnology 32: 109-123 (2000)に記載）。他の適切な哺乳類発現系は、Werner et al., Arzneim.-Forsch./Drug Res. 48(II), Nr. 8, 870-880
(1998)に記載されている。
【００８８】
同時トランスフェクションおよびＥＬＩＳＡによる抗体分泌クローンに関する検定は、以下のように実行し得る。約１０μｇのＶＫｐＫｈ（軽鎖発現ベクター）および２０μｇのＶＨｐＧ１ｇ（重鎖発現ベクター）を、Co et al., J. Immunol., 148: 1149 (1992)に従って、電気穿孔（BioRad, Richmondm, CA）により、５×１０６ＳＰ２／０骨髄腫細胞のトランスフェクションのために用い得る。トランスフェクション後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、完全ＨＳＦＭ培地（Life Technologies, Inc., Grand Island, NY）中の９６ウエル微量滴定プレート中で増殖し得る。最終濃度５００単位／ｍｌヒグロマイシンでのヒグロマイシン選択培地（Calbiochem, San Diego, CA）の付加により、２日後に、選択プロセスを開始し得る。コロニーは、典型的には、電気穿孔後２〜３週目に出現する。次いで、さらなる分析のために培養を拡張し得る。キメラ、ヒト化またはヒト重鎖の分泌に関して陽性であるトランスフェクトーマクローンを、ＥＬＩＳＡ検定により同定し得る。
【００８９】
抗体は、以下のように、細胞培地から単離し得る。トランスフェクトーマ培養物を、無血清培地に適応させる。キメラ抗体の産生のために、細胞を、ＨＳＦＭを用いて、回転ボトル中の５００ｍｌ培養として増殖させる。培養物を遠心分離し、上清を０．２μ膜に通して濾過する。濾過培地を、１ｍｌ／分の流量でプロテインＡカラム（１×３ｃｍ）に通す。次に、樹脂を約１０カラム容積のＰＢＳで洗浄し、プロテインＡ結合抗体を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ３．５）を用いてカラムから溶離する。１．０ｍｌの分画を、３Ｍトリス（ｐＨ８．６）１０μｌを含入する試験管中に収集し、２８０／２６０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を確定した。ピーク分画をプールし、ＰＢＳに対して透析し、抗体を、例えばCentricon３０（Amicon,
Beverly, MA）を用いて濃縮する。抗体濃度をＥＬＩＳＡにより確定し、その濃度を、ＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍｌに調整する。アジ化ナトリウム０．０１％（ｗ／ｖ）を防腐剤として試料に付加すると好都合である。
【００９０】
代替的実施形態では、無血清培地中でのトランスフェクション、増殖および発現のために予め適応されている宿主細胞中に発現ベクターをトランスフェクトし得る。用いられ得る細胞系統の例としては、Ｓｐ／ＥＥＥ、Ｓｐ／ＥＳＦおよびＳｐ／ＥＳＦ−Ｘ細胞系統が挙げられる（例えば米国特許出願第１１／１８７，８６３号；第１１／２５３，６６６号；第１１／４８７，２１５号および第１１／８７７，７２８号参照（これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書中で援用される））。これらの例示的細胞系統は、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞系統を基礎にしており、突然変異体Ｂｃｌ−ＥＥＥ遺伝子でトランスフェクトされ、メトトレキセートに曝露されてトランスフェクト化遺伝子配列を増幅し、そしてタンパク質発現に関して無血清細胞系統に予め適応されたもの、例えばＳｐ２／０、Ｓｐ２／０誘導体、ＮＳＯ、ＹＢ２／０、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨｅｐＧ２、ＢＨＫ２１、Ｐ３Ｘ３Ａｇ８．６５３またはＢＳＣ−１が利用され得る。
二重特異性および多重特異性抗体
【００９１】
二重特異性抗体を当該技術分野で既知の技法により調製し、例えば抗ＣＥＡ腫瘍Ａｂおよび抗ペプチドＡｂをともに、ペプシンでそれらのそれぞれのＦ（ａｂ’）２断片に別々に消化する。抗ＣＥＡ−Ａｂ−Ｆ（ａｂ’）２をシステインで還元して、Ｆａｂ’モノマー単位を生成し、これをさらに架橋剤ビス（マレイミド）ヘキサンと反応させて、Ｆａｂ’−マレイミド部分を産生する。抗ペプチドＡｂ−Ｆ（ａｂ’）２をシステインで還元し、精製され、回収された抗ペプチドＦａｂ−ＳＨを抗ＣＥＡ−Ｆａｂ’−マレイミドと反応させて、Ｆａｂ’×Ｆａｂ’二重特異性Ａｂを生成する。代替的には、抗ペプチドＦａｂ’−ＳＨ断片を抗ＣＥＡ  Ｆ（ａｂ’）２とカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）×Ｆａｂ’構築物を生成するか、あるいは抗ＣＥＡ  ＩｇＧとカップリングさせて、ＩｇＧ×Ｆａｂ’二重特異性構築物を生成し得る。一実施形態では、抗ペプチドＦａｂ’チオール基を、過ヨウ素酸酸化されている抗ＣＥＡ  ＩｇＧ重鎖炭水化物に付着し、その後、市販のヒドラジド−マレイミド架橋剤との反応により活性化することにより、部位特異的方法で、ＩｇＧ×Ｆａｂ’構築物を調製し得る。既知の技法により、用いられる構成成分Ａｂをキメラ化またはヒト化し得る。二重特異性または多重特異性抗体は、前節に上記したように、治療用との任意の既知の抗体を組み入れ得る。
【００９２】
例えば米国特許出願公開番号２００５０００２９４５（２００４年２月１１日出願）（この実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）に開示されたように、二重特異性または多重特異性抗体を産生するための多数の方法が知られている。二重特異性抗体は、各々が異なる抗原部位を認識するモノクローナル抗体を産生する２つの異なるハイブリドーマの融合を包含するクアドローマ法により産生され得る（Milstein and Cuello, Nature, 1983; 305: 537-540）。
【００９３】
二重特異性抗体を産生するための別の方法は、ヘテロ二機能性架橋剤を用いて、２つの異なるモノクローナル抗体を化学的に結びつける（Staerz, et al. Nature. 1985; 314: 628-631；Perez, et al. Nature. 1985; 316: 354-356）。二重特異性抗体は、２つの親モノクローナル抗体の各々をそれぞれの半分子に低減し、これを次に混合して、再酸化させて、ハイブリッド構造を獲得することによっても産生され得る（Staerz and Bevan. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83: 1453-1457）。別の代替法は、適切なリンカーを用いて２または３つの別々に精製されたＦａｂ’断片を化学的に架橋することを包含する（例えば、欧州特許出願第０４５３０８２号参照）。
【００９４】
他の方法は、レトロウイルス由来シャトルベクターを介して、別個の選択可能なマーカーをそれぞれの親ハイブリドーマ中に遺伝子移入し、その後、これを融合することにより（DeMonte, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990, 87: 2941-2945）；あるいは異なる抗体の重鎖および軽鎖遺伝子を含有する発現プラスミドを用いたハイブリドーマ細胞系統のトランスフェクションにより、ハイブリッドハイブリドーマ生成の効率を改善することを包含する。
【００９５】
同族ＶＨおよびＶＬドメインは、適切な組成および長さのペプチドリンカー（通常、１２個より多いアミノ酸残基からなる）と連結されて、結合活性を有する一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を形成し得る。ｓｃＦｖの製造方法は、米国特許第４，９４６，７７８号および米国特許第５，１３２，４０５号（参照により本明細書中で援用される）に開示されている。１２個未満のアミノ酸残基へのペプチドリンカー長の低減は、同一鎖上でのＶＨおよびＶＬドメインの対合を防止し、他の鎖上でのＶＨおよびＶＬドメインと相補的ドメインとの対合を強いて、機能性多量体を形成する。３〜１２アミノ酸残基のリンカーと連結されるＶＨおよびＶＬドメインのポリペプチド鎖は、主に二量体（ダイアボディと呼ばれる）を形成する。０〜２個のアミノ酸残基のリンカーでは、三量体（トリアボディと呼ばれる）および四量体（テトラボディと呼ばれる）が選択されるが、しかしオリゴマー化の正確なパターンは、リンカー長のほかに、Ｖドメインの組成ならびに配向（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）に依っていると思われる。
【００９６】
多重特異性または二重特異性抗体を産生するためのこれらの技法は、当該技法の低収率、精製の必要性、低安定性または労働集約性に関して種々の難しさを示す。さらに近年、以下でさらに詳細に考察される「ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）」として知られている技法は、事実上任意の所望の抗体、抗体断片およびその他のエフェクター分子の組合せを産生するために利用されてきた（例えば、米国特許出願公開番号２００６０２２８３５７；２００６０２２８３００；２００７００８６９４２；２００７０１４０９６６および２００７０２６４２６５参照）（これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）。ＤＮＬ技法は、裸抗体部分としての、あるいは他のエフェクター分子、例えば免疫調節物質、酵素、化学療法剤、ケモカイン、サイトカイン、診断剤、治療剤、放射性核種、造影剤、抗血管新生剤、増殖因子、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ペプチド、毒素、プロアポトーシス剤またはそれらの組合せを組合せた単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体のアセンブリーを可能にする。二重特異性または多重特異性抗体を作製するための当該技術分野で既知の技法のいずれかが、本発明で特許請求される方法の実施に利用され得る。
ドック・アンド・ロック（ＤＮＬ）
【００９７】
好ましい実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体または他の構築物を、ドック・アンド・ロック技法を用いて産生し得る（例えば、米国特許出願第１１／３８９，３５８号；１１／３９１，５８４号；１１／４７８，０２１号；１１／６３３，７２９号および１１／９２５，４０８号参照）（これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）。ＤＮＬ法は、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）の調節（Ｒ）サブユニットとＡ−キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）のアンカードメイン（ＡＤ）との間に起こる特異的タンパク質／タンパク質相互作用を利用する（Baillie et al., FEBS Letters. 2005; 579: 3264；Wong and Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol.
2004; 5: 959）。二次メッセンジャーｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合により誘発される最良の試験されたシグナル伝達経路のうちの１つにおいて中心的役割を果たすＰＫＡは、１９６８年にウサギ骨格筋から最初に単離された（Walsh et al., J. Biol. Chem. 1968; 243: 3763）。ホロ酵素の構造は、Ｒサブユニットにより不活性形態で保持される２つの触媒性サブユニットからなる（Taylor, J. Biol. Chem. 1989; 264: 8443）。ＰＫＡのアイソザイムは２つの型のＲサブユニット（ＲＩおよびＲＩＩ）とともに見出され、各型は、αおよびβアイソフォームを有する（Scott, Pharmacol. Ther. 1991; 50: 123）。Ｒサブユニットは、安定二量体としてのみ単離されており、二量体化ドメインは最初の４４個のアミノ末端残基からなることが示されている（Newlon et al., Nat. Struct. Biol. 1999; 6: 222）。ｃＡＭＰとＲサブユニットとの結合は、広範囲のセリン／トレオニンキナーゼ活性に関する活性触媒性サブユニットの放出をもたらし、これは、ＡＫＡＰとのそのドッキングを介してＰＫＡを区画分けすることにより選定基質に向けられる（Scott et al., J. Biol. Chem. 1990; 265: 21561）。
【００９８】
微小管関連タンパク質−２である最初のＡＫＡＰが１９８４年に特性化されて以来（Lohmann et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 1984; 81: 6723）、種々の細胞成分部位、例えば形質膜、アクチン細胞骨格、核、ミトコンドリアおよび小胞体に局在する５０を超えるＡＫＡＰが、酵母からヒトまでの範囲の種において多様な構造で同定されてきた（Wong and Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004; 5: 959）。ＰＫＡに対するＡＫＡＰのＡＤは、１４〜１８残基の両親媒性らせんである（Carr et
al., J. Biol. Chem. 1991; 266: 14188）。ＡＤのアミノ酸配列は、個々のＡＫＡＰの間でかなり異なり、ＲＩＩ二量体に関して報告された結合親和性は２〜９０ｎＭの範囲である（Alto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 4445）。ＡＫＡＰは、二量体Ｒサブユニットのみと結合する。ヒトＲＩＩαに関しては、ＡＤは、２３アミノ末端残基により形成される疎水性表面と結合する（Colledge and Scott, Trends Cell Biol. 1999; 6: 216）。したがって、ヒトＲＩＩαの二量体化ドメインおよびＡＫＡＰ結合ドメインはともに、本明細書中でＤＤＤと呼ばれる同一のＮ末端４４アミノ酸配列内に位置する（Newlon et al., Nat. Struct. Biol. 1999; 6: 222；Newlon et al., EMBO J. 2001; 20: 1651）。
【００９９】
任意の２つの存在物（本明細書中で以後、ＡおよびＢと呼ぶ）を非共有結合複合体にドッキングし、これをさらに、戦略位置でのＤＤＤおよびＡＤの両方へのシステイン残基の導入により安定係留構造中にロックされてジスルフィド結合の形成を促すためのリンカーモジュールの優れた一対として、ヒトＲＩＩαのＤＤＤおよびＡＫＡＰのＡＤを利用するためのプラットフォーム技術をわれわれは開発してきた。「ドック・アンド・ロック」アプローチの一般的方法を、以下に示す。ＤＤＤ配列をＡの前駆体に連結して、以後ａと呼ばれる第一構成成分を生じることにより、存在物Ａを構築する。ＤＤＤ配列は二量体の自発的形成を実行するため、したがってＡはａ２からなる。ＡＤ配列をＢの前駆体に連結して、以後ｂと呼ばれる第二構成成分を生じることにより、存在物Ｂを構築する。ａ２中に含入されるＤＤＤの二量体モチーフは、ｂに含入されるＡＤ配列と結合するためのドッキング部位を作製し、したがって、ａ２およびｂの即時会合を促して、ａ２ｂで構成される二元性三量体複合体を形成する。この結合事象は、その後の反応で不可逆性にされて、ジスルフィド架橋を介して２つの存在物を共有的に固定し、これは、初期結合相互作用が、ＤＤＤおよびＡＤの両方の上に置かれた反応性チオール基を近接させて（Chimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001; 98: 8480）、部位特異的に結紮するはずであるため、有効局所濃度の原理に基づいて非常に効率的に起こる。リンカー、アダプターモジュールおよび前駆体の種々の組合せを用いて、異なる化学量論を有する広範な種々のＤＮＬ構築物、例えば二量体、三量体、四量体、五量体および六量体ＤＮＬ構築物（これらに限定されない）が産生され、用いられ得る（例えば、米国特許出願第１１／３８９，３５８号；１１／３９１，５８４号；１１／４７８，０２１号；１１／６３３，７２９号および１１／９２５，４０８号参照）（これらの各々の実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）。
【０１００】
２つの前駆体の官能基から離れてＤＤＤおよびＡＤを付着することにより、このような部位特異的結紮は、２つの前駆体の元の活性を保存することも予期される。このアプローチは、事実上モジュラーであり、そして潜在的に、広範囲の活性を有する広範囲の物質、例えばペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片およびその他のエフェクター部分を、部位特異的に且つ共有的に連結するために適用され得る。以下の実施例に記載されるＡＤおよびＤＤＤ共役エフェクターを構築する融合タンパク質法を用いて、実質的に任意のタンパク質またはペプチドがＤＮＬ構築物中に組み入れられ得る。しかしながら、当該技法は、非限定的であり、他の共役方法が利用され得る。
【０１０１】
融合タンパク質を製造するための種々の方法、例えば、当該融合タンパク質をコードする合成二本鎖核酸を産生するための核酸合成、ハイブリダイゼーションおよび／または増幅が知られている。このような二本鎖核酸は、標準分子生物学的技法により、融合タンパク質産生のために発現ベクター中に挿入され得る（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd Ed,
1989参照）。このような好ましい実施形態では、ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分は、エフェクタータンパク質またはペプチドのＮ末端またはＣ末端に付着され得る。しかしながら、エフェクター部分へのＡＤまたはＤＤＤ部分の付着の部位は、エフェクター部分の化学的性質ならびにその生理学的活性に関与するエフェクター部分の一部（単数または複数）によって変わり得る、と当業者は理解する。種々のエフェクター部分の部位特異的付着は、当該技術分野で既知の技法を用いて、例えば二価架橋試薬および／またはその他の化学的共役技法の使用により、実施され得る。
プレターゲッティング
【０１０２】
二重特異性または多重特異性抗体は、プレターゲッティング技法に利用され得る。プレターゲッティングは、最初は、骨髄のような正常組織に対する望ましくない毒性の一因となる直接ターゲッティング抗体の緩徐血中クリアランスを解決するために開発された多段階プロセスである。プレターゲッティングを用いて、放射性核種またはその他の治療剤が、血液から数分以内に除去される小送達分子（標的化可能構築物）に付着される。標的化可能構築物ならびに標的抗原に対する結合部位を有するプレターゲッティング二重特異性または多重特異性抗体が先ず投与され、遊離抗体が循環から除去されて、次に、標的化可能構築物が投与される。
【０１０３】
プレターゲッティング方法は、例えば、米国特許第４，８６３，７１３号（Goodwin等）；Goodwin et
al., J. Nucl. Med. 29:226, 1988; Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 28:1294, 1987;
Oehr et al., J. Nucl. Med. 29:728, 1988; Klibanov et al., J. Nucl. Med.
29:1951, 1988; Sinitsyn et al., J. Nucl. Med. 30:66, 1989; Kalofonos et al., J.
Nucl. Med. 31:1791, 1990; Schechter et al., Int. J. Cancer 48:167, 1991;
Paganelli et al., Cancer Res. 51:5960, 1991; Paganelli et al., Nucl. Med.
Commun. 12:211, 1991;米国特許第５，２５６，３９５号;
Stickney et al., Cancer Res. 51:6650, 1991; Yuan et al., Cancer Res. 51:3119,
1991;米国特許第６，０７７，４９９号;米国特許出願番号０９／５９７，５８０;米国特許出願番号１０／３６１，０２６;米国特許出願番号０９／３３７，７５６;米国特許出願番号０９／８２３，７４６;米国特許出願番号１０／１１６，１１６;米国特許出願番号０９／３８２，１８６；米国特許出願番号１０／１５０，６５４;米国特許第６，０９０，３８１号;米国特許第６，４７２，５１１号;米国特許出願番号１０／１１４，３１５;米国特許仮出願第６０／３８６，４１１号;米国特許仮出願第６０／３４５，６４１号;米国特許仮出願第６０／３３２８，８３５号;米国特許仮出願第６０／４２６，３７９号;米国特許出願番号０９／８２３，７４６;米国特許出願番号０９／３３７，７５６;米国特許仮出願第６０／３４２，１０３号;および米国特許第６，９６２，７０２号に開示されている（各々、参照により本明細書中で援用される）。
【０１０４】
被験者における疾患または症状を治療または診断するプレターゲッティング法は、（１）二重特異性抗体または抗体断片を被験者に投与すること；（２）任意に、クリアリング組成物を被験者に投与して、当該組成物に循環から抗体を除去させること；そして（３）１つ以上のキレート化されたまたは化学結合された治療剤または診断剤を含有する標的化可能構築物を被験者に投与することにより提供され得る。
アミノ酸置換
【０１０５】
ある実施形態では、開示される方法および組成物は、１つ以上の置換アミノ酸残基を有するタンパク質またはペプチドの産生および使用を包含し得る。例えば、ＤＮＬ構築物を作製するために用いられるＤＤＤおよび／またはＡＤ配列は、例えば、ＤＤＤ−ＡＤ結合親和性を増大するよう、さらに最適化され得る。ＤＤＤまたはＡＤ配列における潜在的配列変異は、以下の実施例で考察される。
【０１０６】
概して、アミノ酸置換は、典型的には、あるアミノ酸を相対的に類似の特性を有する別のアミノ酸に取り替えることを包含する（すなわち、保存的アミノ酸置換）、ということに当業者は気づくであろう。種々のアミノ酸の特性ならびにタンパク質の構造および機能に及ぼすアミノ酸置換の作用は、当該技術分野における広範な研究および知識の対象になってきた。
【０１０７】
例えば、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る（Kyte & Doolittle, 1982, J. Mol. Biol., 157: 105-132）。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特徴は、結果的に生じるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次に、当該タンパク質と他の分子との相互作用を限定する。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特徴に基づいて、ヒドロパシー指数を割り当てられており（Kyte & Doolittle, 1982）、これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−）３．５；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−）３．５；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。保存的置換を作製するに際して、そのヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の使用が好ましく、±１以内がさらに好ましく、±０．５以内がさらに好ましい。
【０１０８】
アミノ酸置換は、アミノ酸残基の親水性も考慮に入れ得る（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）。親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０）；グルタミン酸（＋）３．０；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±０．１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、類似の親水性を有する他のアミノ酸に置き換えるのが好ましい。
【０１０９】
他に考えられることとしては、アミノ酸側鎖のサイズが挙げられる。例えば、こじんまりした側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシンまたはセリンを、嵩高い側鎖を有するアミノ酸、例えばトリプトファンまたはチロシンに置き換えることは、一般的に好ましくない。タンパク質二次構造に及ぼす種々のアミノ酸残基の作用も、考慮される。経験的研究により、αらせん、βシートまたは逆ターン二次構造を取るタンパク質ドメインの傾向に及ぼす異なるアミノ酸の作用が確定されており、当該技術分野で既知である（例えば、Chou & Fasman, 1974, Biochemistry, 13: 222-245；1978, Ann. Rev. Biochem., 47: 251-276；1979, Biophys. J., 26: 367-384参照）。
【０１１０】
このような考察および広範な経験的研究に基づいて、保存的アミノ酸置換の表が構築されており、当該技術分野で知られている。例えば：アルギニンおよびリシン；グルタミンおよびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。代替的には：Ａｌａ（Ａ）Ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ；Ａｒｇ（Ｒ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ｌｙｓ；Ａｓｎ（Ｎ）ｈｉｓ、ａｓｐ、ｌｙｓ、ａｒｇ、ｇｌｎ；Ａｓｐ（Ｄ）ａｓｎ、ｇｌｕ；Ｃｙｓ（Ｃ）ａｌａ、ｓｅｒ；Ｇｌｎ（Ｑ）ｇｌｕ、ａｓｎ；Ｇｌｕ（Ｅ）ｇｌｎ、ａｓｐ；Ｇｌｙ（Ｇ）ａｌａ；Ｈｉｓ（Ｈ）ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ａｒｇ；Ｉｌｅ（Ｉ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｌｅｕ；Ｌｅｕ（Ｌ）ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、ｉｌｅ；Ｌｙｓ（Ｋ）ｇｌｎ、ａｓｎ、ａｒｇ；Ｍｅｔ（Ｍ）ｐｈｅ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；Ｐｈｅ（Ｆ）ｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ、ａｌａ、ｔｙｒ；Ｐｒｏ（Ｐ）ａｌａ；Ｓｅｒ（Ｓ）、ｔｈｒ；Ｔｈｒ（Ｔ）ｓｅｒ；Ｔｒｐ（Ｗ）ｐｈｅ、ｔｙｒ；Ｔｙｒ（Ｙ）ｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ、ｓｅｒ；Ｖａｌ（Ｖ）ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ｐｈｅ、ａｌａ。
【０１１１】
アミノ酸置換に関するその他の考察は、残基がタンパク質の内部に位置するか否か、または溶媒曝露されるか否かを包含する。内部残基に関して、保存的置換としては以下のものが挙げられる：ＡｓｐとＡｓｎ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＳｅｒとＡｌａ；ＡｌａとＧｌｙ；ＩｌｅとＶａｌ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＬｅｕとＭｅｔ；ＰｈｅとＴｙｒ；ＴｙｒとＴｒｐ（例えば、PROWLウエブサイト  Rockefeller.edu参照）。溶媒曝露残基に関して、保存的置換としては、以下のものが挙げられる：ＡｓｐとＡｓｎ；ＡｓｐとＧｌｕ；ＧｌｕとＧｌｎ；ＧｌｕとＡｌａ；ＧｌｙとＡｓｎ；ＡｌａとＰｒｏ；ＡｌａとＧｌｙ；ＡｌａとＳｅｒ；ＡｌａとＬｙｓ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＬｙｓとＡｒｇ；ＶａｌとＬｅｕ；ＬｅｕとＩｌｅ；ＩｌｅとＶａｌ；ＰｈｅとＴｙｒ（同上）。アミノ酸置換の選択を手助けするために、種々の行列、例えばＰＡＭ２５０スコア行列、Dayhoff行列、Grantham行列、McLachlan行列、Doolittle行列、Heniko行列、Miyata行列、Fitch行列、Jones行列、Rao行列、Levin行列およびRisler行列が構築されてきた（同上）。
【０１１２】
アミノ酸置換を確定するに際して、分子間または分子内結合の存在、例えば正荷電残基（例えば、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）と負荷電残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）との間のイオン結合（塩架橋）、あるいは隣接システイン残基間のジスルフィド結合の形成も考慮し得る。
【０１１３】
コード化タンパク質配列中の任意のアミノ酸を任意の他のアミノ酸に置換する方法はよく知られており、例えば、部位特異的突然変異誘発の技法による、またはアミノ酸置換をコードし、発現ベクター構築物にスプライスするオリゴヌクレオチドの合成およびアセンブリーによる、当業者にとっては慣例的実験の事柄である。
標識分子を用いた画像診断
【０１１４】
標識分子を用いた画像診断方法は当該技術分野で周知であり、任意のこのような既知の方法は、本明細書中に開示される１８Ｆ標識分子とともに用いられ得る。例えば、米国特許第６，２４１，９６４号；第６，３５８，４８９号；第６，９５３，５６７号；ならびに公開済み米国特許出願公開番号２００５０００３４０３；２００４００１８５５７；２００６０１４０９３６（各々の実施例の節は、参照により本明細書中で援用される）を参照されたい。Page et al., Nuclear Medicine And Biology, 21:911-919, 1994； Choi et al., Cancer Research 55:5323-5329,
1995; Zalutsky et al., J. Nuclear Med., 33:575-582, 1992; Woessner et. al.
Magn. Reson. Med. 2005, 53: 790-99も参照されたい。
【０１１５】
ある実施形態では、１８Ｆ標識分子は、例えば、米国特許第６，１２６，９１６号；第６，０７７，４９９号；第６，０１０，６８０号；第５，７７６，０９５号；第５，７７６，０９４号；第５，７７６，０９３号；第５，７７２，９８１号；第５，７５３，２０６号；第５，７４６，９９６号；第５，６９７，９０２号；第５，３２８，６７９号；第５，１２８，１１９号；第５，１０１，８２７号；および第４，７３５，２１０号（各々、参照により本明細書中で援用される）に記載された方法を用いて、正常または罹患組織および器官を画像診断するのに有用であり得る。付加的方法は、米国特許出願第０９／３３７，７５６号（１９９９年６月２２日出願）および米国特許出願第０９／８２３，７４６号（２００１年４月３日出願）に記載されている。このような画像診断は、適切なターゲッティング分子の直接的１８Ｆ標識により、あるいはGoldenberg et al. (2007, Update Cancer Ther. 2:19-31); Sharkey et
al. (2008, Radiology 246:497-507); Goldenberg et al. (2008, J. Nucl. Med.
49:158-63); Sharkey et al. (2007, Clin. Cancer Res. 13:5777s-5585s); McBride et
al. (2006, J. Nucl. Med. 47:1678-88); Goldenberg et al. (2006, J. Clin.
Oncol.24:823-85)に記載されたような、プレターゲッティング画像診断法により、実行され得る。米国特許公開番号２００５０００２９４５、２００４００１８５５７、２００３０１４８４０９および２００５００１４２０７（各々、参照により本明細書中で援用される）も参照されたい。
【０１１６】
標識化ペプチドまたはＭＡｂを用いた診断的画像法がよく知られている。例えば、免疫シンチグラフィーの技法では、リガンドまたは抗体はガンマ線放出放射性同位体で標識され、患者に導入される。ガンマカメラを用いて、ガンマ線放出放射性同位体の位置および分布を検出する。例えば、Srivastava (ed.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND
THERAPY (Plenum Press 1988)、Chase,
"Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S
PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition、Gennaro et al. (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990)、およびBrown, "Clinical Use of Monoclonal
Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto et al. (eds.)
(Chapman & Hall 1993)を参照されたい。５１１ｋｅＶのエネルギーを有するようなポジトロン放出核種（ＰＥＴ同位体）、例えば１８Ｆ、６８Ｇａ、６４Ｃｕおよび１２４Ｉの使用も好ましい。このような放射性核種は、周知のＰＥＴスキャニング技法により画像処理され得る。
【０１１７】
好ましい実施形態では、１８Ｆ標識ペプチド、タンパク質および／または抗体は、癌の画像診断のために有用である。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉種および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のさらに特定の例は下記で言及されるが、例としては以下のものが挙げられる：扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平上皮細胞癌）、肺癌、例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌腫、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含めた胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌腫、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌腫、陰茎癌腫および頭頸部癌。「癌」という用語は、原発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、被検者の身体において、元の悪性腫瘍部位または腫瘍部位以外に細胞がまだ移動していないもの）および続発性の悪性細胞または腫瘍（例えば、転移、つまり悪性細胞または腫瘍細胞が元の腫瘍部位と異なる第二の部位へ移動することから生じるもの）を包含する。
【０１１８】
癌または悪性腫瘍のその他の例としては、小児急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌腫、成人（原発性）肝細胞癌、成人（原発性）肝臓癌、成人急性リンパ球性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人ホジキンリンパ腫、成人リンパ球性白血病、成人非ホジキンリンパ腫、成人原発性肝臓癌、成人軟部組織肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂・尿管癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状細胞腫、大脳星状細胞腫、子宮頸癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝臓癌、小児急性リンパ芽球性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児頭蓋外胚細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部および視覚路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体およびテント上原発性神経外胚葉性腫瘍、小児原発性肝臓癌、小児横紋筋肉腫、小児軟部組織肉腫、小児視覚路および視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌膵島細胞癌腫、子宮内膜癌、上衣腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、膵外分泌癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外生殖細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、胃腸管腫瘍、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性腫瘍、ヘアリー細胞白血病、頭頸部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高ガンマグロブリン血症、下咽頭癌、腸癌、眼内黒色腫、膵島細胞癌腫、島細胞膵臓癌、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、口唇・口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ球増殖性障害、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜在性原発性扁平上皮頸癌、転移性原発性扁平上皮頸癌、転移性扁平上皮頸癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、骨髄球性白血病、骨髄増殖性障害、鼻腔・副鼻腔癌、上咽頭癌、神経細胞芽腫、妊娠中非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜在性原発性転移性扁平上皮頸癌、口咽頭癌、骨肉腫／悪性線維性肉腫、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、骨肉腫／骨悪性線維性組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在性腫瘍、膵臓癌、異常タンパク血症、紫斑病、上皮小体癌、陰茎癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓細胞癌、腎盂・尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、サルコイドーシス肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮頸癌、胃癌、テント上原発性神経外胚葉性および松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺腫、甲状腺癌、腎盂・尿管移行細胞癌、移行性腎盂・尿管癌、絨毛性腫瘍、尿管・腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚路および視床下部神経膠腫、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、ならびに上記器官系に存在する新生物以外のその他の任意の高増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１９】
本明細書中で記載され、特許請求される方法および組成物を用いて、悪性または前悪性症状を検出するかまたは診断し得る。このような使用は、腫瘍または癌への進行前であることが分かるかまたは疑われる症状、特に、過形成、化生または最も特定的には異形成からなる非腫瘍性の細胞増殖が生じた場合に示される（このような異常な増殖症状の検討のためには、Robbins and Angell, Basic Pathology, 2d Ed., W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp.68‐79 (1976)を参照）。
【０１２０】
異形成は癌の前兆である場合が多く、主として上皮に見出される。異形成は、非腫瘍性細胞増殖の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構造的配向の喪失を伴う。異形成は、慢性的な刺激または炎症が存在する部位に生じるのが特徴である。検出され得る異形成障害としては、無汗性外胚様異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、大脳異形成、子宮頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、骨端半肢異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性繊維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、繊維筋性異形成、骨繊維性異形成、開花性骨異形成、遺伝性腎網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、発汗減少症性外胚葉異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成、モンディーニ異形成、単骨性繊維性骨異形成、粘膜上皮異形成、多発性骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎異形成（opthalmomandibulomelic dysplasia）、根尖端セメント質異形成、多骨性繊維性骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、眼中隔異形成、脊椎骨端異形成および心室橈骨異形成が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
検出され得るさらなる前腫瘍性障害としては、良性の異常増殖性障害（例えば、良性腫瘍、繊維嚢胞性症状、組織肥大、小腸ポリープ、結腸ポリープおよび食道異形成）、白板症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎および日光角化症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
さらなる高増殖性の疾患、障害および／または症状としては、悪性腫瘍および関連障害、例えば、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤血白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに固形腫瘍、例えば繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎臓細胞癌腫、ヘパトーマ、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス癌腫、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経細胞芽腫および網膜芽細胞腫のような肉腫および癌腫（これらに限定されない）の進行および／または転移が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
検出され、診断され、および／または画像処理され得る上記の例示的症状は、限定的でない。抗体、抗体断片またはターゲッティングペプチドは広範な種々の症状、例えば自己免疫疾患、心臓血管性疾患、神経変性疾患、代謝性疾患、癌、感染性疾患および高増殖性疾患に関して既知である、ということに当業者は気づくであろう。本明細書中に記載される方法により１８Ｆ標識分子、例えばタンパク質またはペプチドが調製され、利用され得る任意のこのような症状は、本明細書中に記載されるように画像処理され、診断されおよび／または検出され得る。
キット
【０１２４】
種々の実施形態は、１８Ｆ  ＰＥＴ画像診断により患者における罹患組織を検出し、診断し、および／または画像処理するのに適した構成成分を含有するキットに関する。例示的キットは、本明細書中に記載されるようなプレターゲッティング方法に有用な抗体、断片または融合タンパク質、例えば二重特異性抗体を含有し得る。他の構成成分は、このような二重特異性抗体とともに用いるための標的化可能構築物を包含し得る。好ましくは、標的化可能構築物は、Ａｌ１８Ｆ錯体または１８Ｆと異なる金属との錯体を付着するために用いられ得るキレート基と前共役される。しかしながら、代替的実施形態では、キレート剤は、Ａｌ１８Ｆキレート化部分と標的化可能構築物あるいはその他のターゲッティングペプチド、タンパク質または他の分子との共役の前に、Ａｌ１８Ｆ錯体と付着するために、別々に含まれ得る、ということが意図される。以下の実施例に記載されるある好ましい実施形態は、プレターゲッティング法において二重特異性抗体および１８Ｆ標識標的化可能構築物を利用するが、しかし、他の実施形態では、本明細書中に開示され、特許請求される１８Ｆ標識化方法は、非抗体ターゲッティングタンパク質、ペプチドまたは他の分子とともに利用され得る、と当業者は理解する。
【０１２５】
当該キットは、新たに調製されるＡｌ１８Ｆまたは１８Ｆ−金属を標的化可能構築物または他のターゲッティング分子に付着するために、および／または、任意に、非標識ターゲッティング分子、非組み入れ１８Ｆおよび混合物の他の構成成分からＦ標識化ターゲッティング分子を部分的にまたは完全に精製するために有用である付加的試薬およびその他の構成成分を含有し得る。しかしながら、ある好ましい実施形態では、標識化構築物の組み入れおよび標識化の効率、ならびに特異的放射能は、本明細書中に記載されるように調製された非精製１８Ｆ標識ターゲッティング分子がＰＥＴ画像診断のために利用され得るのに十分高い、と当業者は理解する。最も好ましい実施形態では、キットは、商業的供給元から入手され得る新たに調製される１８Ｆ以外に、ＰＥＴ画像診断のための１８Ｆ標識タンパク質、ペプチドまたは他の分子を調製し、使用するのに必要とされるすべての構成成分を含有し得る。
【０１２６】
投与のための構成成分を含有する組成物が、経口送達によるような消化管を介した送達のために処方されない場合、何らかの他の経路を介してキット構成成分を送達し得るデバイスが含まれ得る。非経口送達のような用途のためのデバイスの一型は、被験者の身体中に組成物を注射するために用いられる注射器である。吸入用具も、ある用途のために用いられ得る。
【０１２７】
キット構成成分は、一緒に包装され得るし、あるいは２つ以上の容器中に分離され得る。いくつかの実施形態では、容器は、再構成に適している組成物の滅菌凍結乾燥処方物を含有するバイアルであり得る。キットは、他の試薬の再構成および／または希釈に適した１つ以上の緩衝剤も含有し得る。用いられ得る他の容器としては、ポーチ、トレイ、箱、チューブ等が挙げられるが、これらに限定されない。キット構成成分は、容器内に包装され、滅菌保持され得る。含まれ得る別の構成成分は、その使用のためのキットを用いるヒトへの使用説明書である。
【実施例】
【０１２８】
実施例１．ペプチドＩＭＰ２７２の１８Ｆ標識化
【０１２９】
調製し、１８Ｆ標識した最初のペプチドは、ＩＭＰ２７２であった：
ＤＴＰＡ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋１５１２
【０１３０】
酢酸塩緩衝溶液−酢酸  １．５０９ｇを〜１６０ｍＬの水中に希釈し、１Ｍ  ＮａＯＨを付加してｐＨを調整し、次いで、２５０ｍＬに希釈して、ｐＨ４．０３の０．１Ｍ溶液を作製した。
【０１３１】
酢酸アルミニウム緩衝溶液−脱イオン水４２．６ｍＬ中にＡｌＣｌ３・六水和物０．１０２８ｇを溶解することにより、アルミニウムの溶液を調製した。アルミニウム溶液のアリコート４ｍＬを、０．１ＭのＮａＯＡｃ溶液（ｐＨ４）１６ｍＬと混合して、２ｍＭのＡｌストック溶液を得た。
【０１３２】
ＩＭＰ２７２酢酸塩緩衝溶液−０．１Ｍ酢酸塩緩衝溶液（ｐＨ４）３６４μＬ中にペプチド  ０．００１１ｇ（７．２８×１０−７ｍｏｌ  ＩＭＰ２７２）を溶解して、ペプチドの２ｍＭストック溶液を得た。
【０１３３】
ＩＭＰ２７２のＦ−１８標識化−アルミニウムストック溶液のアリコート３μＬをＲＥＡＣＴＩ−ＶＩＡＬ（商標）中に入れて、１８Ｆ  ５０μＬ（投与する場合）およびＩＭＰ２７２溶液３μＬと混合した。溶液を、１１０℃で１５分間、加熱ブロック中で加熱し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣトレース（示されていない）は、遊離１８Ｆ９３％、ペプチドとの結合７％を示した。さらに１０μＬのＩＭＰ２７２を反応物に付加して、それを再び加熱し、逆相ＨＰＬＣ（示されていない）により分析した。ＨＰＬＣトレースは、空隙容量の１８Ｆ８％、およびペプチドに付着された放射能を有するもの９２％を示した。残りのペプチド溶液を、室温で１時間までの間、ＰＢＳ  １５０μＬとともにインキュベートした後、逆相ＨＰＬＣにより検査した。ＨＰＬＣ（示されていない）は、ペプチドと結合していない１８Ｆ  ５８％およびペプチドに依然として付着しているもの４２％を示した。データは、１８Ｆ−Ａｌ−ＤＴＰＡ錯体が、リン酸塩と混合されると、不安定になることがある、ということを示す。
【０１３４】
逆相ＨＰＬＣ−以下の条件下で、逆相ＨＰＬＣ分析を実行した：
カラム：    ＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＸＴＥＲＲＡ（商標）ＭＳ  Ｃ１８５μｍ、
４．６×２５０ｍｍ
流量：      １ｍＬ／分
勾配緩衝液：緩衝液Ｃ：脱イオン水中0.1％ＮＨ４ＯＡｃ；
緩衝液Ｄ：９０％アセトニトリル、１０％水および0.1％ＮＨ４ＯＡｃ
勾配：      １００％緩衝液Ｃ〜１００％緩衝液Ｄ。
３０分間に亘って線形勾配を使用。
実行時間：  ３０分。
【０１３５】
サイズ排除ＨＰＬＣ−以下の条件下で、サイズ排除ＨＰＬＣを実行した：
カラム：    ＢＩＯＲＡＤ（登録商標）ＢＩＯ−ＳＩＬ（商標）
ＳＥＣ２５０，３００×７．８ｍｍ、
勾配：      均一濃度
溶離緩衝液：０．２Ｍリン酸塩、ｐＨ６．８
流量：      １ｍＬ／分
実行時間：  ３０分。
【０１３６】
１８Ｆの放出をモニタリングするためにＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ（登録商標）６１０Ｔｒを用いて、全ての放射測定トレースを得た。表２〜４は、データを表で示したものである。
【表２】
0005608914.tif 000003
【表３】
0005608914.tif 000004
【表４】
0005608914.tif 000005
【０１３７】
１ｃｃ（３０ｍｇ）のＷＡＴＥＲＳ（登録商標）ＨＬＢカラム（Part# 186001879）上に標識化ペプチド溶液を適用し、水３００μＬで洗浄して、非結合Ｆ−１８を除去した。２×１００μＬのＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）でカラムを洗浄することにより、ペプチドを溶離した。精製ペプチドを水中で２５℃でインキュベートし、逆相ＨＰＬＣ（示されていない）により分析した。ＨＰＬＣ分析は、１８Ｆ標識ＩＭＰ２７２が水中で安定でない、ということを示した。水中で４０分インキュベート後、約１７％の１８Ｆがペプチドから放出されたが、一方、８３％は保持された（示されていない）。
実施例２．１８Ｆ  ＩＭＰ２７２の免疫活性
【０１３８】
ペプチド（１６μＬの２ｍＭ  ＩＭＰ、４８μｇ）を１８Ｆで標識し、サイズ排除ＨＰＬＣにより抗体結合に関して分析した。サイズ排除ＨＰＬＣは、ペプチドがｈＭＮ−１４×６７９を結合するが、しかし無関係な二重特異性抗体ｈＭＮ−１４×７３４と結合しない（示されていない）、ということを示した。
実施例３．他の金属を用いたＩＭＰ２７２１８Ｆ標識化
【０１３９】
金属ストック溶液（６×１０−９ｍｏｌ）のアリコート３μＬまでを、ポリプロピレン製円錐バイアル中に入れて、１８Ｆ  ７５μＬ（投与する場合）と混合し、室温で２分までの間インキュベートして、次に、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の２ｍＭ（４×１０−８ｍｏｌ）ＩＭＰ２７２溶液２０μＬと混合した。溶液を、１００℃で１５分、加熱ブロック中で加熱し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。ＩＭＰ２７２を、インジウム（２４％）、ガリウム（３６％）、ジルコニウム（１５％）、ルテチウム（３７％）およびイットリウム（２％）で標識した（示されていない）。これらの結果は、１８Ｆ金属標識技法が、アルミニウムリガンドに限定されないが、しかし同様に他の金属も利用され得る、ということを実証する。異なる金属リガンドを用いて、Ｆ−１８−金属共役体の結合を最適化するために、異なるキレート化部分が利用され得る。
実施例４．Ａｌ−１８Ｆ結合に関して他のペプチドをスクリーニングするために用いられる標準１８Ｆペプチド標識化条件
【０１４０】
２ｍＭアルミニウムストック溶液のアリコート３μＬを、ポリプロピレン製円錐バイアル中に入れて、１８Ｆ  ５０μＬ（投与する場合）と混合し、室温で２分までの間インキュベートして、次に、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の２ｍＭのペプチド溶液１６〜２０μＬと混合した。溶液を、１００℃で１５分、加熱ブロック中で加熱し、逆相ＨＰＬＣにより分析した（ＰＨＥＮＯＭＥＮＥＸ（商標）、ＧＥＭＩＮＩ（登録商標）、５μ、Ｃ−１８、１１０Ａ、２５０×４．６ｍｍＨＰＬＣカラム）。
試験したペプチド
【０１４１】
ＩＭＰ  ２７２：      ＤＴＰＡ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２    ＭＨ＋  １５１２  
【０１４２】
ＩＭＰ  ２８８    ＤＯＴＡ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２    ＭＨ＋  １４５３
【０１４３】
ＩＭＰ  ３２６    ＤＴＰＡ−ＩＴＣ−ＮＨ−ＮＨ−Ｐｈｅ−ＣＯ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２                  ＭＨ＋  １４７７
【０１４４】
ＩＭＰ  ３２９    デフェロキサミン−ＮＨ−ＣＳ−ＮＨ−ＮＨ−Ｐｈ−ＣＯ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２      ＭＨ＋  １８０４
【０１４５】
ＩＭＰ  ３３１    ＮＴＡ−ｉＡｓｐ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２    ＭＨ＋  １２４０
【０１４６】
ＩＭＰ  ３３２      ＥＤＴＡＤｐｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｓｙ（ＨＳＧ）−ＮＨ２    ＭＨ＋  １３２７  
【０１４７】
ＩＭＰ  ３３３    ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２      ＭＨ＋  １８４５  
【０１４８】
ＩＭＰ  ３３４    （  Ｈ２Ｏ３Ｐ）２−Ｃ（ＯＨ）−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｇｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２    ＭＨ＋  １１９２
【０１４９】
ＩＭＰ  ３３７  Ａｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２      ＭＨ＋    １２９１
【０１５０】
ＩＭＰ  ３３８  Ａｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２      ＭＨ＋    １１２６
【０１５１】
ＩＭＰ  ３４５  ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ３Ｈ２）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４５９
【０１５２】
ＩＭＰ  ３４９  ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｃｙｓ（（Ｈ２Ｏ３Ｐ）２−ＣＨ−ＣＨ２−Ｓ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２    ＭＨ＋  １５８３
【０１５３】
ＩＭＰ  ３６１    ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（ＢｒＣＨ２ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４９８
【０１５４】
ＩＭＰ  ３６６    ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｐｈ−Ｓ−ＣＨ２ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５２８
【０１５５】
ＩＭＰ  ３６８  Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １２９２  
【０１５６】
ＩＭＰ  ３６９  Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ（２−Ｂｒ−Ｐｈｅ−）−ＣＨ２−ＣＯ−  Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５１７
【０１５７】
ＩＭＰ  ３７０  Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ（２−Ｏ２Ｎ−Ｐｈｅ−）−ＣＨ２−ＣＯ−  Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４８４
【０１５８】
ＩＭＰ  ３７１  ＤＴＰＡ−ＮＨ−ＣＨ（２−Ｏ２Ｎ−Ｐｈｅ−）−ＣＨ２−ＣＯ−  Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４８４
【０１５９】
ＩＭＰ  ３７２  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｓｅｒ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４６５
【０１６０】
ＩＭＰ  ３７３  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｓｙｍ−ＤＴＰＡ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １７５３
【０１６１】
ＩＭＰ  ３７４  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｃｌ−ＣＨ２ＣＯ−Ｃｙｓ（Ｅｔ）−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５８５
【０１６２】
ＩＭＰ  ３７５  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−Ｂｒ−Ｐｈｅ−ＣＨＮＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １６０３
【０１６３】
ＩＭＰ  ３７６  ＤＴＰＡ−Ｃｙｓ（ＨＯ３Ｓ−Ｓ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５５８
【０１６４】
ＩＭＰ  ３７９  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−Ｈ２Ｎ−Ｐｈｅ−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４９７
【０１６５】
ＩＭＰ  ３８２  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｈ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １３７８
【０１６６】
ＩＭＰ  ３８３  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｇｌａ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５０７
【０１６７】
ＩＭＰ  ３８４  ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−ＨＯ−Ｐｈｅ−ＣＨＮＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５４１  
【０１６８】
ＩＭＰ  ３８５    ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｄｐｒ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４６４
【０１６９】
ＩＭＰ  ３８６    ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−ピリジル−ＣＨ２−ＣＨＮＨ２−ＣＯ−）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １５２６  
【０１７０】
ＩＭＰ  ３８７    ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（Ｄ−９−アントリルアラニン）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １６２５
【０１７１】
ＩＭＰ  ３８９    ＤＴＰＡ−Ｄｐｒ（２−カルボキシピペリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １４９０
【０１７２】
ＩＭＰ  ４２２
【化１】
0005608914.tif 000006
【０１７３】
ＩＭＰ  ４２６
【化２】
0005608914.tif 000007
【０１７４】
ＩＭＰ  ４２８
【化３】
0005608914.tif 000008
【０１７５】
ＩＭＰ  ４４９    ＮＯＴＡ−ＩＴＣ  ベンジル−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２    ＭＨ＋  １４５９  
【０１７６】
ＩＭＰ  ４６０  ＮＯＤＡ−ＧＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋  １３６６
【０１７７】
代替的実施形態における、ＮＯＴＡ型リガンドに関する立体配置。ＮＯＴＡ部分はＤまたはＬパラ−ニトロフェニルアラニンから作製され、イミノ二酢酸部分はジアミノプロピオン酸（ＤまたはＬであり得る）から生じる。さらに、エチレン架橋の位置をジアミノプロピオン酸で切り替えて、リガンド上の基の異なる立体配置を得た。これらの修飾は全て、その後形成される錯体の結合動態および安定性に影響を及ぼし得る。代替的には、ＮＯＤＡ−Ｇａペプチドを、例えば６８Ｇａまたは１８Ｆで標識し得る。
【０１７８】
ある実施形態では、代替的キレート部分を用いて、金属−１８Ｆ錯体と結合し得る。いくつかの例示的潜在的キレート部分は、ＮＥＴＡの構造に基づいている。上記のように、種々の金属と錯体形成される場合、ＮＥＴＡリガンドは血清安定性改善を示し得る、とChong等（2007）は報告している。キレート剤設計は、さらにまた、金属−１８Ｆに対するペプチドの結合親和性を増大するよう最適化され得る。
ペプチド標識化スクリーニング試験の結果
【０１７９】
ＤＴＰＡ誘導体のほとんどが、ＩＭＰ２７２の標識化に匹敵する標識化を示した。但し、ＩＭＰ３４９は、システイン側鎖上にビスリン酸基を保有し、非常に不十分に標識される。ＤＯＴＡリガンドは、Ａｌ１８Ｆを結合しなかった。ＩＭＰ３２６のＩＴＣ  ＤＴＰＡリガンドは、ＤＴＰＡと同様、Ａｌ１８Ｆを結合しなかった。ＩＭＰ３３１のＮＴＡリガンドはＡｌ１８Ｆを結合しなかった。ＩＭＰ３３２のＥＤＴＡリガンドはＡｌ１８Ｆを結合したが、しかしＤＴＰＡを同様に結合することはなかった。対称的ＤＴＰＡリガンドはＡｌ１８Ｆを結合しなかった。試験したホスホン酸およびリン酸基は、試験条件下では良好にＡｌ１８Ｆを結合しなかった。
【０１８０】
スクリーニングは、ＤＴＰＡの近くに付着された基がＡｌ１８Ｆ−ＤＴＰＡ複合体の安定性に影響を及ぼし得る、ということを示さなかった。スクリーニングは、ＩＭＰ３７５が、ＩＭＰ２７２より良好に標識されるし、有意により安定である複合体を形成する、ということを示した。ＩＭＰ３７５は良好に標識され、水中で安定であり、２５℃で５時間後に９５．４％が結合されたままであることを示した（図示せず）。in vivo使用のためには、高血清安定性を有するペプチドが好ましい。ペプチド標識化スクリーニング試験は、Ａｌ１８Ｆの結合を検査するだけであった。Ａｌ１８Ｆで良好に標識されなかったペプチドのいくつかは、１８Ｆと結合している別の金属で良好に標識され得る。
ペプチド合成
【０１８１】
Ｆｍｏｃ戦略を用いて固相ペプチド合成により、ペプチドを合成した。示差脱保護化を可能にするために、Ｆｍｏｃ／Ａｌｏｃ保護基を用いることにより、二アミノ酸の側鎖に基を付加した。Dangles等（J. Org. Chem.
1987, 52: 4984-4993）の方法によりＡｌｏｃ基を除去したが、但し、用いた酢酸に、ペペリジンを１：１の比で付加した。McBride等（米国特許出願公開番号ＵＳ２００５／０００２９４５  Ａ１、出願番号１０／７７６，４７０）（この実施例の節は参照により本明細書中で援用される）に記載されたように、非対称的テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを作製した。
【０１８２】
トリ−ｔ−ブチルＤＯＴＡ、対象的テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡ、ＩＴＣ−ブチルＤＴＰＡ、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡおよびＴＡＣＮは、MACROCYCLICS（登録商標）（Dallas,
TX）から入手した。ＤｉＢｏｃＴＡＣＮ、ＮＯＤＡ−ＧＡ（ｔＢｕ）３およびＮＯ２ＡｔＢｕは、CheMatech（Dijon, France）から購入した。Ａｌｏｃ／ＦｍｏｃリシンおよびＤａｐ（ジアミノプロピオン酸誘導体（Ｄｐｒも））は、CREOSALUS（登録商標）（Louisville,
KY）BACHEM（登録商標）（Torrance, CA）から入手した。Sieberアミド樹脂は、NOVABIOCHEM（登録商標）（San
Diego, CA）から入手した。残りのＦｍｏｃアミノ酸は、CREOSALUS（登録商標）、BACHEM（登録商標）、PEPTECH（登録商標）（Burlington,
MA）、EMD BIOSCIENCES（登録商標）（San Diego, CA）、CHEM IMPEX（登録商標）（Wood Dale, IL）またはNOVABIOCHEM（登録商標）から入手した。塩化アルミニウム・六水和物は、SIGMA-ALDRICH（登録商標）（Milwaukee, WI）から購入した。残りの溶媒および試薬は、FISHER SCIENTIFIC（登録商標）（Pittsburgh, PA）またはSigma-Aldrich Corp（登録商標）（Milwaukee, WI）から購入した。１８Ｆは、IBA MOLECULAR（登録商標）（Somerset, NJ）により供給された。
【０１８３】
ＩＭＰ２７２を、記載どおりに合成した（米国特許出願公開番号２００４０２４１１５８  Ａ１、出願番号１０／７６８，７０７）（この実施例の節は参照により本明細書中で援用される）。ＩＭＰ２８８を、記載どおりに作製した（McBride et al., J. Nucl. Med. 2006, 47: 1678-1688）。
【０１８４】
ＩＭＰ３２６  Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（ＯＢｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨおよび４−（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＮＨ−）Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈをこの順序で用いて、Sieberアミド樹脂上にヒドラジンペプチド（ＩＭＰ３１９）を作製した。ジオキサン水酸化ナトリウム溶液中の４−ヒドラジノ安息香酸にＢｏｃ二炭酸塩を付加することにより、４−（Ｂｏｃ−ＮＨ−ＮＨ−）Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈを作製した。
【０１８５】
Ｂｏｃ−ヒドラジドの付加後、側鎖Ａｌｏｃ基を除去し、トリチル−ＨＳＧ−ＯＨ基をリシンの側鎖に付加した。次いで、ペプチドをＴＦＡを用いて樹脂から切断し、ＨＰＬＣにより精製して、所望のヒドラジンビス−ＨＳＧペプチドＩＭＰ３１９（ＭＨ＋１２０１）を得た。次に、ヒドラジンペプチド（０．０９１４ｇ）を、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．２）３ｍＬ中のＩＴＣ−ベンジルＤＴＰＡ  ０．０６５０ｇと混合した。１Ｍ  ＮａＯＨで溶液のｐＨを調整して、ｐＨをｐＨ８．２に保持した。ペプチドおよびＩＴＣ−ベンジルＤＴＰＡ間の反応完了後、ペプチド共役体をＨＰＬＣにより精製した。
【０１８６】
ＩＭＰ３２９  メシル酸デフェロキサミン（１．５９×１０−３ｍｏｌ）１．０４２２ｇを、１：１  メタノール／水  １０ｍＬ中のチオカルボニルジイミダゾール０．２８３５ｇ（１．５９×１０−３ｍｏｌ）と混合することにより、イソチオシアン酸デフェロキサミドを調製した。トリエチルアミン  ０．２３ｍＬを付加し、２．５時間後に逆相ＨＰＬＣにより反応物を精製して、イソチオシアン酸デフェロキサミン  ＭＮａ＋６２５を得た。
【０１８７】
ヒドラジンペプチド、ＩＭＰ３１９（０．０５３３ｇ、４．４×１０−５ｍｏｌ、ＭＨ＋１２０１）を、リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．１中のイソチオシアン酸デフェロキサミン  ０．０２９１ｇと２時間混合して、次に、ＨＰＬＣにより精製して、所望の生成物ＭＨ＋１８０４を得た。
【０１８８】
ＩＭＰ３３１  以下のアミノ酸を、以下の順序でSieberアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ）に付着した：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨをリシンの側鎖に付加した。Ｆｍｏｃを除去し、次に、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ａｓｐ−ＯＢｕｔをその順序で付加した（樹脂０．５ｇ）。Ｆｍｏｃを除去し、Ａｓｐの窒素を、３．４ｍＬのＮＭＰ中で、３ｍＬのｔ−ブチルブロモアセテートおよび３．６ｍＬのジイソプロピルエチルアミンを用いて一晩アルキル化した。ＴＦＡを用いて樹脂からペプチドを切断して、逆相ＨＰＬＣにより精製して、所望のペプチドＭＨ＋１２４０を得た。
【０１８９】
ＩＭＰ３３２  ３ｇのSieberアミド樹脂（０．５８ｍｍｏｌ／ｇ）上に、当該ペプチドを作製した。以下のアミノ酸を、以下の順序で樹脂に付加した：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ。樹脂を、その後の合成のために、部分に分割した。１ｇの樹脂を除去し、Ｆｍｏｃ基をジアミノプロピオン酸から除去した。ペプチドを、３ｍＬのｔ−ブチルブロモアセテート、３．６ｍＬのジイソプロピルエチルアミンおよび３．４ｍＬのＮＭＰを用いて一晩アルキル化した。次に、側鎖Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基を付加した。次いで、樹脂からペプチドを切断して、ＨＰＬＣにより精製して、生成物ＭＨ＋１３２７を得た。
【０１９０】
ＩＭＰ３３３  ＩＭＰ３３２を作製するために用いたものと同じ樹脂  １ｇを用いて、当該ペプチドを作製した。ＤＴＰＡテトラ−ｔ−ブチルエステル（米国特許公開番号２００５０００２９４５）を、Ｄｐｒ基のアミンの両方に付加した。次いでＡｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加した。次に、ペプチドを切断し、ＨＰＬＣにより精製して、所望の生成物ＭＨ＋１８４５を得た。
【０１９１】
ＩＭＰ３３４  以下の順序で付加した以下のアミノ酸を用いて、１ｇのRinkアミド樹脂（０．７ｍｍｏｌ／ｇ）上に当該ペプチドを作製した：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｇｌｕ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ。Ａｌｏｃ基を除去し、トリチル−ＨＳＧ−ＯＨを付加した。ペプチドを、ＴＦＡを用いて樹脂から切断した。粗製ペプチドを、エーテルからの沈殿により収集し、乾燥した。過ヨウ素酸ナトリウム  ０．３３ｇを水１５ｍＬ中に溶解した。粗製ペプチドを０．５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．６  １ｍＬ、水３ｍＬおよび過ヨウ素酸溶液１ｍＬ中に溶解した。増分１ｍＬで、さらに３ｍＬの過ヨウ素酸を２時間までの間付加した。次に、混合物を逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、アルデヒドＩＭＰ２８９  ＨＣＯ−ＣＯ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｇｌｕ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２ＭＨ＋９５９を得た。アレンドロネート（０．０２９５ｇ、CALBIOCHEM（登録商標））を１５０μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４中に溶解した。ペプチド  ＩＭＰ２８９（０．０５００ｇ）を、水中の１３％イソプロパノール  １００μＬ中に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムを付加し、混合物をＨＰＬＣにより精製して、所望の生成物ＭＨ＋１１９２を得た。
【０１９２】
ＩＭＰ３３７およびＩＭＰ３３８  以下の順序で付加した以下のアミノ酸を用いて、Sieberアミド樹脂上に当該ペプチドを作製した：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨおよびＡｃ２Ｏ。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基をリシンの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣにより精製して、所望の生成物：ＩＭＰ３３７ＭＨ＋１２９１およびＩＭＰ３３８ＭＨ＋１１２６を得た。
【０１９３】
ＩＭＰ３４５  以下の順序で付加した以下のアミノ酸を用いて、Sieberアミド樹脂上に当該ペプチドを作製した：Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｓｅｒ（ＰＯ（ＯＢｚｌ）ＯＨ）−ＯＨおよびテトラ−ブチルＤＴＰＡ。Ａｌｏｃ基を除去し、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ基をリシンの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣにより精製して、所望の生成物：ＩＭＰ３４５ＭＨ＋１４５９を得た。
【０１９４】
ＩＭＰ３４９  以下の順序で付加した以下のアミノ酸を用いて、Sieberアミド樹脂上に該ペプチドＩＭＰ３４７ＤＴＰＡ−Ｄ−Ｃｙｓ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２を作製した：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ。Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨおよびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを付加した。ペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣにより精製して、所望の生成物：ＩＭＰ３４７ＭＨ＋１３９５を得た。ペプチドＩＭＰ３４７、０．０４４６ｇ（３．２×１０−５ｍｏｌ）を３ｍＬの水中の０．４６０５ｇ（２．４×１０−３ｍｏｌ）のエテニリデンビス（ホスホン酸）と混合して（Degenhardt et al., J. Org. Chem. 1986, 51: 3488-3490）、溶液を１Ｍ  ＮａＯＨを滴下することによりｐＨ６．５に調整した。反応物を一晩撹拌し、過剰量のエテニリデンビス（ホスホン酸）の付加により、反応溶液をｐＨ１．４９に調整した。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで、ＨＰＬＣにより精製して、所望のペプチドＩＭＰ３４９ＭＨ＋１５８３を得た。
【０１９５】
ＩＭＰ３６１  以下の順序で付加した以下のアミノ酸を用いて、Sieberアミド樹脂上に該ペプチドを作製した：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ。Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｄａｐ（Ａｌｏｃ）−ＯＨおよびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを付加した。Ｄａｐの側鎖上のＡｌｏｃを除去し、ブロモアセチルをブロモ酢酸無水物とともに付加した。粗生成物をＨＰＬＣにより精製して、所望のペプチドＩＭＰ３６１（ＭＨ＋１４９８）を得た。
【０１９６】
ＩＭＰ３６６  ＩＭＰ３６１と同一方法により、最後にフェニルチオ酢酸を付加して、当該ペプチドを作製した。粗生成物をＨＰＬＣにより精製して、生成物ＩＭＰ３６６ＭＨ＋１５２８を得た。
【０１９７】
ＩＭＰ３６８  ＩＭＰ３４９に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、システイン残基は付加せず、対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡ（MACROCYCLICS（登録商標））を非対称ＤＴＰＡの代わりに用いて、精製後に所望の生成物ＩＭＰ３６８ＭＨ＋１２９２を得た。
【０１９８】
ＩＭＰ３６９  ＩＭＰ３４９に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ブロモフェニル）プロピオン酸をＤ−Ｃｙｓの代わりに付加し、対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡをＤＴＰＡテトラ−ｔ−ブチルエステルの非対称バージョンの代わりに付加した。粗製ペプチドを精製して、所望の生成物ＭＨ＋１５１７を得た。
【０１９９】
ＩＭＰ３７０  ＩＭＰ３６９に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸をブロモの代わりに用いた。ＨＰＬＣによる精製後に、所望の生成物ＭＨ＋１４８４を得た。
【０２００】
ＩＭＰ３７１  ＩＭＰ３７０に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、非対称テトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを対称バージョンの代わりに用いた。ＨＰＬＣによる精製後に、所望の生成物ＭＨ＋１４８４を得た。
【０２０１】
ＩＭＰ３７２  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨを用いてＳｅｒをＤａｐ側鎖に付着させた。Ｆｍｏｃを除去し、ペプチドを樹脂から切断して、精製し、所望の生成物ＭＨ＋１４６５を得た。
【０２０２】
ＩＭＰ３７３  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、対称テトラ−ｔ−ブチルエステルＤＴＰＡを用いてＳｙｍ−ＤＴＰＡをＤａｐ側鎖に付着させた。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１７５３を得た。
【０２０３】
ＩＭＰ３７４  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｓ−エチルシステインをＤａｐ側鎖に付加し、その後、無水クロロ酢酸を解してクロロアセチル（システイン窒素上）を付加した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１５８５を得た。
【０２０４】
ＩＭＰ３７５  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｒ−３−アミノ−３−（２−ブロモフェニル）プロピオン酸をＤａｐ側鎖に付加し、その後、Ｆｍｏｃ基を切断した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１６０３を得た。
【０２０５】
ＩＭＰ３７６  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、２番目のアラニンの後にＦｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨを付加し、その後、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（ＳＯ３Ｈ）およびテトラ−ｔ−ブチルＤＴＰＡを付加した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１５５８を得た。
【０２０６】
ＩＭＰ３７９  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｂｏｃ−２−Ａｂｚ−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１４９７を得た。
【０２０７】
ＩＭＰ３８２  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、ＡｌｏｃをＤａｐの側鎖から除去した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１３７８を得た。
【０２０８】
ＩＭＰ３８３  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｇｌａ（ＯＢｕｔ）２−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋−ＣＯ２１５０７を得た。
【０２０９】
ＩＭＰ３８４  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｂｏｃ−Ｓ−３−アミノ−３−（２−ヒドロキシフェニル）プロピオン酸をＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１５４１を得た。
【０２１０】
ＩＭＰ３８５  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｄｐｒ(Ｆｍｏｃ)−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１４６４を得た。
【０２１１】
ＩＭＰ３８６  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｂｏｃ−Ｄ−２−ピリジルアラニン−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１５２６を得た。
【０２１２】
ＩＭＰ３８７  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−９−アントリルアラニン−ＯＨをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１６２５を得た。
【０２１３】
ＩＭＰ３８９  ＩＭＰ３６１に関して記載したとおりに当該ペプチドを作製したが、但し、ビス−Ｂｏｃ−ピペラジン−２−カルボキシレートをＤａｐの側鎖に付加した。ペプチドを樹脂から切断し、精製して、所望の生成物ＭＨ＋１６６４を得た。
実施例５．１８Ｆ標識ペプチドを調製し、分離するための代替的方法
【０２１４】
ある実施形態では、加熱を用いて、Ａｌ１８Ｆ錯体をＮＯＴＡキレート基に付着させた。代替的には、ＩＴＣベンジルＮＯＴＡ（MACROCYCLICS（登録商標））をＡｌＦで標識し、次いで、標識後に、他の感熱性分子、例えばタンパク質と共役させた。高特異活性が必要な場合、ＩＴＣベンジルＮＯＴＡ錯体を冷却リガンドから切り離して精製し得る。
【０２１５】
Ａｌ３＋をペプチド［ＩＭＰ−４４９］に付加し、そのＨＰＬＣプロフィールを非錯化ＮＯＴＡペプチドおよびＡｌ１８Ｆペプチドと比較した。ＩＭＰ４４９に関しては、ＡｌペプチドおよびＡｌ１８Ｆペプチドは、事実上、ＨＰＬＣによる同一保持時間（ｔＲ）を有し、非標識化ペプチドに関するｔＲより１分未満長かった。３ｍＬ／分の流量を用いて、PHENOMENEX（商標）ONYX（登録商標）モノリシックＣ−１８  １００×４．５ｍｍカラムで、ペプチドを精製した。緩衝液Ａは、水中０．１％ＴＦＡであり、緩衝液Ｂは９０％ＣＨ３ＣＮ、１０％水および０．１％ＴＦＡであった。線形勾配は、１５分間に亘って、１００％緩衝液Ａから７５：２５Ａ／Ｂに進行した。Ａｌ錯体はＡｌ１８Ｆ錯体と同時溶離するため、Ａｌ３＋および１８Ｆの量は比放射能を確定する。
【０２１６】
以下の実施例６に従ってＩＭＰ４４９を調製し、以下のように標識した。３２５μＬまでの水中の１５ｍＣｉの１８Ｆを含入する２．０ｍＬFISHER（登録商標）微量遠心バイアル（０２−６８１−３７４）中に、１８Ｆを入れた。０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中の２ｍＭ  ＡｌＣｌ３  ３μＬを１８Ｆ溶液に付加し、次いで渦巻き撹拌した。約４分後、０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中の０．０５Ｍ  ＩＭＰ４４９  １０μＬを付加した。試料を再び渦巻き撹拌して、１０２℃加熱ブロック中で１７分間加熱した。次に、反応物を手短に冷却し、バイアル内容物を取り出して、上記と同様にＨＰＬＣにより精製した。
【０２１７】
別個に、溶離条件をWATERS（登録商標）ALLIANCE（商標）分析系で確定し、標識化ペプチドを７．５〜８．５分で溶離した。分析的ＨＰＬＣは、標識化ペプチドが［ＡｌＦ］ＩＭＰ４４９（ＵＶ２２０ｎｍ）を含有し、非錯化ペプチドを含有せず、比放射能増大を生じる、ということを示した。
【０２１８】
ペプチドを水中に希釈し、次いで、WATERS（登録商標）OASIS PLUS HLB（商標）抽出カラムを通過させた。標識化ペプチドを、３ｍＬの１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離した。溶離液のＨＰＬＣ分析は、カラムが標識化ペプチドを効率的に捕捉し、これが、アセトニトリルおよびＴＦＡをペプチドから洗い落とさせる、ということを確証した。ＨＰＬＣは、１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ溶離液が、希釈後の注入に適した溶媒中に遊離１８Ｆを有さない所望の生成物を含有する、ということも示した。標識収率は、ＨＰＬＣ精製後、５〜２０％であった。ＨＰＬＣ精製ペプチドの比放射能を、約５００〜１３００Ｃａ／ｍｍｏｌの範囲であると概算した（示されていない）。その後、この誘導体による放射能標識収率を、反応容積を３分の１低減することにより、４４％に、２〜４倍改善し得る、ということを見出した。
実施例６．血清安定性１８Ｆ標識ペプチドＩＭＰ４４９の産生および使用
【０２１９】
以下のアミノ酸を以下の順序で樹脂に付加することにより、Sieberアミド樹脂上に該ペプチドＩＭＰ４４８  Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２  ＭＨ＋１００９を作製した：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨ。Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨを付加して、最後にＦｍｏｃ切断して、所望のペプチドを得る。次に、ペプチドを樹脂から切断し、ＨＰＬＣにより精製して、ＩＭＰ４４８を産生し、これを次にＩＴＣ−ベンジルＮＯＴＡとカップリングさせた。ペプチドＩＭＰ４４８、０．０７５７ｇ（７．５×１０−５ｍｏｌ）を０．０５０９ｇ（９．０９×１０−５ｍｏｌ）ＩＴＣベンジルＮＯＴＡと混合して、１ｍＬの水に溶解した。次いで、無水炭酸カリウム（０．２１７１ｇ）を徐々に撹拌ペプチド／ＮＯＴＡ溶液に付加した。全炭酸塩の付加後、反応溶液はｐＨ１０．６となった。反応物を室温で一晩撹拌した。１４時間後、反応物を１Ｍ  ＨＣｌで注意深くクエンチして、ＨＰＬＣにより精製して、４８ｍｇのＩＭＰ４４９を得た。
ＩＭＰ４４９の１８Ｆ標識化
【０２２０】
ペプチドＩＭＰ４４９（０．００２ｇ,１．３７×１０−６ｍｏｌ）を、６８６μＬ（２ｍＭペプチド溶液）の０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０２中に溶解した。ｐＨ４酢酸塩緩衝液中のＡｌの２ｍＭ溶液  ３μＬを、１．３ｍＣｉの１８Ｆ  １５μＬと混合した。次にその溶液を２０μＬの２ｍＭ  ＩＭＰ４４９と混合し、１０５℃で１５分間加熱した。逆相ＨＰＬＣ分析は、放射能の３５％（ｔＲ〜１０分）がペプチドに付着され、放射能の６５％がカラムのボイド容量で溶離される（３．１分、示されていない）ということを示したが、このことは、放射能の大部分がペプチドと関連しなかったことを示す。粗製標識化混合物（５μＬ）を、プール化ヒト血清と混合し、３７℃でインキュベートした。１５分後にアリコートを取り出し、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣは、放射能の９．８％が依然としてペプチドに付着されている（３５％から下降）、ということを示した。１時間後に別のアリコートを取り出し、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣは、放射能の７．６％が依然としてペプチドに付着されている（３５％から下降）ことを示したが、これは、１５分トレースと本質的に同一であった（データは示されていない）。
高線量１８Ｆ標識化
【０２２１】
精製ＩＭＰ４４９を用いたさらなる試験は、１８Ｆ標識ペプチドが、ヒト血清中で、３７℃で少なくとも１時間、高度に安定であり（９１％、示されていない）、ヒト血清中で、３７℃で少なくとも４時間、部分的に安定である（７６％、示されていない）、ということを実証した。安定化剤としてのアスコルビン酸の存在下でＩＭＰ４４９を調製する、さらなる試験を実施した。それらの試験（示されていない）において、金属−１８Ｆ−ペプチド錯体は、３７℃で４時間後の血清中で検出可能な分解を示さなかった。１８Ｆ標識ペプチドの注入の３０分後のマウス尿は、ペプチドと結合された１８Ｆを含有することが判明した（示されていない）。これらの結果は、本明細書中に開示される１８Ｆ標識ペプチドが、１８Ｆ画像診断試験のために用いられるのに十分な安定性を、適切なin vivo条件下で示す、ということを実証する。
【０２２２】
アスコルビン酸の非存在下での試験のために、４００μＬまでの水中の２１ｍＣｉまでの１８Ｆを、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中の２ｍＭ  ＡｌＣｌ３  ９μＬと混合した。ペプチド  ＩＭＰ４４９、  ６０μＬ（０．０１Ｍ、０．５ＮａＯＨ中６×１０−７ｍｏｌ、ｐＨ４．１３）を付加し、溶液を、１５分間、１１０℃に加熱した。次いで、１ｃｃ  WATERS（登録商標）HLBカラムの樽形容器中に反応溶液を入れて、水で溶離して非結合１８Ｆを除去した後、１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏを入れて１８Ｆ標識ペプチドを溶離することにより、粗製標識化ペプチドを精製した。粗製反応溶液をカラムに通して廃液バイアルに入れ、カラムを３かける１ｍＬ分画の水で洗浄した（１８．９７ｍＣｉ）。次に、ＨＬＢカラムを新しいバイアルの上に載せて、２×２００μＬの１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離して、標識化ペプチドを収集した（１．８３ｍＣｉ）。溶離が全て完了した後、カラムは０．１ｍＣｉの活性を保持した。精製１８Ｆ標識ペプチドのアリコート（２０μＬ）を、２００μＬのプール化ヒト血清と混合して、３７℃で加熱した。アリコートを、（上記と同様に）逆相ＨＰＬＣにより分析した。結果は、ヒト血清中の、３７℃で、ゼロ時点、１時間（９１％標識化ペプチド）、２時間（７７％標識化ペプチド）および４時間（７６％標識化ペプチド）のインキュベーションでの、Ｆ標識化精製ＩＭＰ４４９の相対的安定性を示した（図示せず）。１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９は、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー中に時折用いられるＴＦＡ溶液中で安定である、ということも観察された。本明細書中に記載される例示的１８Ｆ標識分子に関して観察されたＴＦＡ中での安定性とヒト血清中での安定性との間に一般的相関が存在すると思われる。これらの結果は、本明細書中に開示される方法に従って産生される１８Ｆ標識ペプチドが、例えば標識化細胞または組織を検出するためのＰＥＴスキャニングを用いて、in vivo標識化および画像診断試験のために上首尾に用いられるのに十分な安定性を示す、ということを実証する。最後に、ＩＭＰ４４９ペプチドは、放射線分解に感受性であるチオ尿素結合を含有するため、いくつかの生成物がＲＰ−ＨＰＬＣにより観察される。しかしながら、アスコルビン酸が反応混合物に付加される場合、生成される副生成物は顕著に低減される。
質量分光分析
【０２２３】
形成される錯体の性質を確定するのを手助けするために、ＨＰＬＣにより、そして質量分光分析により、錯体が分析されるよう、ペプチドのＡｌおよびＡｌ１９Ｆ錯体を調製した。類似の条件下で検査した場合に１８Ｆ錯体に匹敵する保持時間を有する２つのＡｌ１９Ｆ錯体を形成した。［Ａｌ１９Ｆ］ＩＭＰ４４９  ＭＨ＋１５０２．６５８８（Ｃ６６Ｈ９３Ｎ１９Ｏ１７Ｓ１Ａｌ１Ｆ１理論値１５０２．６５８９）の質量は、Ａｌ１９ＦがＮＯＴＡカルボキシル基のうちの２つと結合し、第三のカルボキシルが依然としてプロトン化される錯体と一致する。アルミニウムは、ＮＯＴＡを結合して、３個の窒素および３個のカルボキシルと結合されたヘキサデンテートを形成することが知られている（Andre et al., 2002, J Inorg Biochem 88: 1-6）。したがって、Ａｌ１９Ｆ錯体はフッ化物イオンで満たされたアルミニウムの６つの結合部位を有するＮＯＴＡと結合するペンタデンテートを有する、と思われる。
実施例７．ＳＣＩＤマウスにおける１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９のin vivo体内分布
【０２２４】
上記と同様に、１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９を調製した。OASIS（登録商標）HLBカラム（WATERS（登録商標）, Milford, MA）で、当該物質を精製した。非結合物質を水で洗い落として、カラムに結合した標識化ペプチドを１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ混合物で溶離した。逆相Ｃ１８ＨＰＬＣにより、両分画を分析した。精製ペプチドは、逆相ＨＰＬＣカラムでいくつかのピークとして溶離した（示されていない）。OASIS（登録商標）カラムから収集した非結合分画は、Ｃ１８カラムからの不十分な回収（７％）を示した（図示されず）。
【０２２５】
「非結合」分画および精製［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９を、ＳＵ−ＤＨＬ６リンパ腫細胞を予め皮下注射されたＳＣＩＤマウスに注射した。マウスのうちの２〜３匹だけが、可視的腫瘍を有した。体内分布データは、「非結合」１８Ｆ分画と精製［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９との間に有意差を示した。データを、以下の表５〜７に示す。この試験では、標識化ペプチドの前にプレターゲッティング二重特異性抗体を動物に投与しなかった、ということに留意されたい。これらの結果は、in vivoでの標識化ペプチド対遊離１８Ｆの分布を実証する。
【０２２６】
非共役１８Ｆは、in vivoでの骨組織への高レベルの分布を示す。注射２０分後の取込みは、予測どおり、主に骨（脊椎）中で約１２〜１５％注射用量／ｇ（ＩＤ／ｇ）で、その後、腎臓で、約４％ＩＤ／ｇで観察された。骨組織への１８Ｆ標識の局在化は、ターゲッティングペプチドとの共役により実質的に低減された。ＩＭＰ４４９と結合されると、骨中の取込みは注射後２０分で〜１％ＩＤ／ｇ、１時間で０．３％に低減され、腎臓取込みは２０分で１１％、１時間で３．３％ＩＤ／ｇである。ペプチド単独の腎臓取込みはプレターゲッティング［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９ペプチドと同様であった（以下の実施例参照）が、これは、その取込みが１８時間前にｂｓＭＡｂを投与された動物の結果というよりむしろペプチドの一関数であった、ということを示唆する。非結合１８Ｆと比較して、１８Ｆ標識ペプチドでは、脊椎および大腿骨において相対的に低い非特異的取込みが観察された。
【表５】
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【表６】
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【表７】
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【０２２７】
これらの結果は、１８Ｆ標識ペプチドが標識化および画像診断試験を実施するのに十分なin vivo安定性を示した、ということを実証する。
実施例８．プレターゲッティングによる１８Ｆ画像診断のためのＤＮＬ構築物の調製
【０２２８】
種々の形態で、事実上任意の抗体またはその断片または他のエフェクター部分を含む二量体、三量体、四量体、六量体等を作製するために、ＤＮＬ技法が用いられ得る。ある好ましい実施形態に関して、ＩｇＧ抗体またはＦａｂ抗体断片は、ＤＤＤまたはＡＤ配列を含有する融合タンパク質として産生し得る。二重特異性抗体は、第一抗体のＦａｂ−ＤＤＤ融合タンパク質を第二抗体のＦａｂ−ＡＤ融合タンパク質と組合せることにより形成さし得る。代替的には、ＩｇＧ−ＡＤ融合タンパク質をＦａｂ−ＤＤＤ融合タンパク質と組合せる構築物を作製し得る。１８Ｆ検出の目的のために、画像診断されるべき標的組織、例えば腫瘍と関連した抗原のための結合部位を含有する抗体または断片は、金属−１８Ｆが付着され得るＩＭＰ４４９のような標的化可能構築物上のハプテンを結合する第二の抗体または断片と組合され得る。二重特異性抗体（ＤＮＬ構築物）を被験者に投与し、循環抗体を血液から除去して、標的組織に局在させ、１８Ｆ標識標的化可能構築物を付加して、画像診断のために抗体と結合させる。
【０２２９】
各々のＦａｂまたはＩｇＧ融合タンパク質に関して、独立したトランスジェニック細胞系統を開発し得る。一旦産生されると、所望により、または細胞培養上清液中に保持される場合、モジュールを精製し得る。産生後、任意のＤＤＤ２−融合タンパク質モジュールを任意のＡＤ−融合タンパク質モジュールと組合せて、二重特異性ＤＮＬ構築物を生成し得る。異なる型の構築物に関しては、異なるＡＤまたはＤＤＤ配列を利用し得る。
ＤＤＤ１：    ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ  （配列番号３）
ＤＤＤ２：    ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ  （配列番号４）
ＡＤ１：    ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ  （配列番号５）
ＡＤ２：    ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ  （配列番号６）
【０２３０】
プラスミドベクターｐｄＨＬ２は、多数の抗体および抗体関連構築物を産生するために用いられてきた（Gillies et al., J Immunol Methods (1989), 125: 191-202；Losman et al., Cancer (Phila)(1997), 80:
2660-6参照）。２シストロン性哺乳類発現ベクターは、ＩｇＧの重鎖および軽鎖の合成を指図する。ベクター配列は多数の異なるＩｇＧ−ｐｄＨＬ２構築物に関して大部分は同一であり、差は可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）配列に存在するだけである。当業者に既知の分子生物学ツールを用いて、これらのＩｇＧ発現ベクターをＦａｂ−ＤＤＤまたはＦａｂ−ＡＤ発現ベクターに転換し得る。Ｆａｂ−ＤＤＤ発現ベクターを生成するために、重鎖のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに関するコード配列を、ヒンジの最初の４つの残基、１４残基Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーおよびヒトＲＩＩαの最初の４４残基に置き換える（ＤＤＤ１と呼ばれる）。Ｆａｂ−ＡＤ発現ベクターを生成するために、ＩｇＧのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに関する配列を、ヒンジの最初の４つの残基、１５残基Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーおよびＡＫＡＰ−ＩＳと呼ばれる１７残基合成ＡＤに置き換え（ＡＤ１と呼ばれる）、これは、バイオインフォーマティクスおよびペプチドアレイ技法を用いて生成され、非常に高親和性（０．４ｎＭ）でＲＩＩαを結合することが示された。Alto, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003), 100: 4445-50も参照されたい。
【０２３１】
以下で説明するようなＦａｂ−ＤＤＤ１またはＦａｂ−ＡＤ１発現ベクターへのＩｇＧ−ｐｄＨＬ２ベクターの転換を促すよう、２つのシャトルベクターを設計した。
ＣＨ１の調製
【０２３２】
鋳型としてｐｄＨＬ２プラスミドベクターを用いたＰＣＲにより、ＣＨ１ドメインを増幅した。左ＰＣＲプライマーはＣＨ１ドメインの上流（５’）末端およびＳａｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＨ１コード配列の５’である）で構成された。右プライマーは、ヒンジの最初の４残基（ＰＫＳＣ）と、その後の４つのグリシンおよびセリンをコードする配列と、ＢａｍＨＩ制限部位を含む最後の２つのコドン（ＧＳ）とで構成された。４１０ｂｐＰＣＲ増幅体をｐＧｅｍＴ  ＰＣＲクローニングベクター（Promega, Inc.）中にクローン化し、クローンを、Ｔ７（５’）配向の挿入物に関してスクリーニングした。
（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１（（配列番号２２として開示された（Ｇ４Ｓ）２）の構築
【０２３３】
ＢａｍＨＩ制限部位を含む最初の２つのコドンを伴い、リンカーペプチドの１１残基が先行するＤＤＤ１のアミノ酸配列をコードするために、二重鎖オリゴヌクレオチド（（Ｇ４Ｓ）２ＤＤＤ１（配列番号２２として開示された（Ｇ４Ｓ）２）と呼ばれる）が、Sigma Genosys（Haverhill, UK）により合成された。停止コドンおよびＥａｇＩ制限部位を、３’末端に付する。コード化ポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ  （配列番号７）
【０２３４】
それぞれの３’末端上の３０塩基対で重複するＲＩＩＡ１−４４トップおよびＲＩＩＡ１−４４ボトムと呼ばれる２つのオリゴヌクレオチドを合成し（Sigma Genosys）、１７４ｂｐＤＤＤ１配列の中央の１５４塩基対を含むよう組合せた。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔａｑポリメラーゼを用いてプライマー伸長反応に付した。プライマー伸長後、二重鎖をＰＣＲにより増幅した。増幅体をｐＧｅｍＴ中にクローン化し、Ｔ７（５’）配向での挿入物に関してスクリーニングした。
（Ｇ４Ｓ）２ＡＤ１（（配列番号２２として開示された（Ｇ４Ｓ）２）の構築
【０２３５】
ＢａｍＨＩ制限部位を含む最初の２つのコドンを伴い、リンカーペプチドの１１残基が先行するＡＤ１のアミノ酸配列をコードするために、二重鎖オリゴヌクレオチド（（Ｇ４Ｓ）２ＡＤ１（配列番号２２として開示された（Ｇ４Ｓ）２）と呼ばれる）が合成された（Sigma Genosys）。停止コドンおよびＥａｇＩ制限部位を、３’末端に付する。コード化ポリペプチド配列を以下に示す。
ＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ  （配列番号８）
【０２３６】
ＡＫＡＰ−ＩＳトップおよびＡＫＡＰ−ＩＳボトムと呼ばれる上記ペプチド配列をコードする２つの相補的重複オリゴヌクレオチドを合成し、アニーリングした。二重鎖をＰＣＲにより増幅した。増幅体をｐＧｅｍＴベクター中にクローン化し、Ｔ７（５’）配向での挿入物に関してスクリーニングした。
ＤＤＤ１とＣＨ１との結紮
【０２３７】
ＤＤＤ１配列をコードする１９０ｂｐ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素でｐＧｅｍＴから切り出して、次に、ＣＨ１−ｐＧｅｍＴ中の同一部位に結紮して、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
ＡＤ１とＣＨ１との結紮
【０２３８】
ＡＤ１配列を含有する１１０ｂｐ断片をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限酵素でｐＧｅｍＴから切り出して、次に、ＣＨ１−ｐＧｅｍＴ中の同一部位に結紮して、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴを生成した。
ｐｄＨＬ２ベースのベクター中へのＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のクローニング
【０２３９】
このモジュール設計を用いて、ＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１をｐｄＨＬ２ベクター中の任意のＩｇＧ構築物中に組み入れ得る。ｐｄＨＬ２からＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ制限断片（ＣＨ１−ＣＨ３）を除去し、それを、それぞれのｐＧｅｍＴシャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＤＤＤ１またはＣＨ１−ＡＤ１のＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片と取り替えることにより、全重鎖定常ドメインを、上記構築物のうちの１つと置き換える。
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２の構築
【０２４０】
ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基からなるフレキシブルＧｌｙ／Ｓｅｒペプチドスペーサーを介してＦｄのＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に結合されるＡＤ１を有するｈ６７９Ｆａｂの産生のための発現ベクターである。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩでＣＨ１−ＡＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＡＤ１断片とＳａｃＩＩ／ＥａｇＩ断片を取り替えることにより、ｈ６７９の可変ドメインを含有するｐｄＨＬ２ベースのベクターをｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ１−ｐｄＨＬ２に転換した。
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２の構築
【０２４１】
Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、ＤＤＤ１がフレキシブルペプチドスペーサーを介してＣＨ１のカルボキシル末端でｈＭＮ−１４Ｆａｂに連結される融合タンパク質Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の２つのコピーを含む安定二量体の産生のための発現ベクターである。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、ＣＨ１−ＣＨ３ドメインを除去し、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩでＣＨ１−ＤＤＤ１−ＳＶ３シャトルベクターから切り出したＣＨ１−ＤＤＤ１断片を挿入することにより、ｈＭＮ−１４ＩｇＧを産生するために用いられてきたプラスミドベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２を、Ｃ−ＤＤＤ１−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２に転換した。
【０２４２】
同一技法は、広範な種々の既知の抗体、例えばｈＬＬ１、ｈＬＬ２、ｈＰＡＭ４、ｈＲ１、ｈＲＳ７、ｈＭＮ−１４、ｈＭＮ−１５、ｈＡ１９、ｈＡ２０等のＦａｂ発現のためのプラスミドを産生するために利用されてきた。一般的に、抗体可変領域コード配列はｐｄＨＬ２発現ベクター中に存在し、発現ベクターを、上記のようにＡＤ−またはＤＤＤ−融合タンパク質の産生のために転換した。このような抗体のいずれかのＦａｂ断片を含むＡＤ−およびＤＤＤ−融合タンパク質を、２つのＤＤＤ−融合タンパク質／１つのＡＤ−融合タンパク質を類似の割合で、組合せて、第一の抗体の２つのＦａｂ断片および第二の抗体の１つのＦａｂ断片を含む三量体ＤＮＬ構築物を生成し得る。
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２
【０２４３】
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してｈＭＮ−１４のＦｄのカルボキシル末端に付されたＤＤＤ２の二量体化およびドッキングドメインを保有するＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の産生のための発現ベクターである。分泌される融合タンパク質は、ＤＤＤ２ドメインの非共有的相互作用により一緒に保持されるｈＭＮ−１４Ｆａｂの２つの同一コピーからなる。
【０２４４】
発現ベクターを以下のように工学処理した。リンカーペプチドの一部に関するコード配列（ＧＧＧＧＳＧＧＧＣＧ、配列番号９）およびＤＤＤ２の残基１〜１３を含む２つの重複相補的オリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔ４ＰＮＫでリン酸化して、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化されるＤＮＡとの結紮に適合性である５’および３’末端上にオーバーハングを生じた。
【０２４５】
二重鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで消化して調製したシャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ１−ｐＧｅｍＴと結紮して、シャトルベクターＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴを生成した。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩを用いてＣＨ１−ＤＤＤ２−ｐＧｅｍＴから５０７ｂｐ断片を切り出して、ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩで消化して調製したＩｇＧ発現ベクターｈＭＮ１４（Ｉ）−ｐｄＨＬ２と結紮した。最終発現構築物をＣ−ＤＤＤ２−Ｆｄ−ｈＭＮ−１４−ｐｄＨＬ２と命名した。多数の異なるヒト化抗体のＦａｂ断片のＤＤＤ２−融合タンパク質を生成するために、類似の技法が利用されている。
Ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２
【０２４６】
ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２を、Ｂとして、（Ａとしての）Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４と対合するよう設計した。ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２は、１４アミノ酸残基Ｇｌｙ／Ｓｅｒペプチドリンカーを介してＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付されたＡＤ２のアンカードメイン配列を保有するｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２の産生のための発現ベクターである。ＡＤ２は、ＡＤ１アンカードメイン配列に先行する１つのシステイン残基および後のもう１つのシステイン残基を有する。
【０２４７】
発現ベクターを、以下のように工学処理した。ＡＤ２のコード配列ならびにリンカー配列の一部を含む２つの重複相補的オリゴヌクレオチド（ＡＤ２トップおよびＡＤ２ボトム）を合成した。オリゴヌクレオチドをアニーリングし、Ｔ４ＰＮＫでリン酸化して、それぞれ制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＰｓｅＩで消化されるＤＮＡとの結紮に適合性である５’および３’末端上にオーバーハングを生じた。
【０２４８】
二重鎖ＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＰｓｅＩで消化して調製したシャトルベクターＣＨ１−ＡＤ１−ｐＧｅｍＴと結紮して、シャトルベクターＣＨ１−ＡＤ２−ｐＧｅｍＴを生成した。ＳａｃＩＩおよびＥａｇＩ制限酵素を用いてシャトルベクターからＣＨ１およびＡＤ２コード配列を含有する４２９塩基対断片を切り出して、同一酵素で消化して調製したｈ６７９−ｐｄＨＬ２と結紮した。最終発現構築物は、ｈ６７９−Ｆｄ−ＡＤ２−ｐｄＨＬ２である。
ＴＦ２の生成
【０２４９】
Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４をｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２と反応させることにより、ＴＦ２と呼ばれる三量体ＤＮＬ構築物を得た。ＴＦ２のパイロットバッチを、９０％を超える収率で、以下のように生成した。タンパク質Ｌ−精製Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４（２００ｍｇ）を、１．４：１のモル比で、ｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ２（６０ｍｇ）と混合した。総タンパク質濃度は、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中に１．５ｍｇ／ｍｌであった。その後のステップは、ＴＣＥＰ還元、ＨＩＣクロマトグラフィー、ＤＭＳＯ酸化およびＩＭＰ２９１アフィニティークロマトグラフィーを包含した。ＴＣＥＰの付加前に、ＳＥ−ＨＰＬＣはａ２ｂ形成の如何なる証拠も示さなかった。５ｍＭのＴＣＥＰの付加は、二元構造に関して予期される１５７ｋＤａタンパク質と一致するａ２ｂ複合体の形成を迅速に生じた。ＩＭＰ２９１アフィニティークロマトグラフィーにより、ＴＦ２をほぼ均質に精製した（示されていない）。ＩＭＰ２９１は、６７９Ｆａｂが結合するＨＳＧハプテンを含有する合成ペプチドである（Rossi et al., 2005, Clin Cancer Res 11: 7122s-29s）。ＩＭＰ２９１非結合分画のＳＥ−ＨＰＬＣ分析は、生成物からのａ４、ａ２および遊離κ鎖の除去を実証した（示されていない）。
【０２５０】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＴＦ２の大多数が、ＩｇＧのものに近い相対移動度を有する大型の共有結合構造として存在する、ということを実証した（示されていない）。付加的帯域は、ジスルフィド形成が実験条件化では不完全である、ということを示唆する（示されていない）。還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＴＦ２の成分ポリペプチドを表す帯域のみが明らかである場合、非還元ゲル中で明白な任意の付加的帯域は生成物関連性である（示されていない）、ということを示す。しかしながら、４つのポリペプチドの各々の相対移動度は、近すぎて分割されない。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析（示されていない）は１５６，４３４Ｄａの単一ピークを明示したが、これは、ＴＦ２の算定質量（１５７，３１９Ｄａ）の９９．５％以内である。
【０２５１】
ＢＩＡＣＯＲＥ検定により、ＴＦ２の機能性を確定した。ＴＦ２、Ｃ−ＤＤＤ１−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ１（非共有結合ａ２ｂ複合体の対照試料として用いられる）またはＣ−ＤＤＤ２−ｈＭＮ−１４＋ｈ６７９−ＡＤ２（非還元ａ２およびｂ構成成分の対照試料として用いられる）を１μｇ／ｍｌ（総タンパク質）に希釈し、ＨＳＧで固定されたセンサーチップ上を通した。ＴＦ２に関する応答は２つの対照試料の応答の約２倍であったが、これは、対照試料中のｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤ構成成分のみがセンサーチップと結合し、その上に残存する、ということを示す。ｈＭＮ−１４に関する抗イディオタイプ抗体であるＷＩ２  ＩｇＧのその後の注射は、付加的シグナル応答により示されるようなｈ６７９−Ｆａｂ−ＡＤと緊密に関連するＤＤＤ−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４構成成分をＴＦ２のみが有する、ということを実証した。センサーチップ上に固定されたＴＦ２とのＷＩ２の結合に起因する応答単位のさらなる増大は、各々がＣ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＭＮ−１４の１つのサブユニットを一助とする２つの完全機能的結合部位に対応する。これは、ＷＩ２の２つのＦａｂ断片を結合するＴＦ２の能力により確証された。
ＴＦ１０二重特異性抗体の産生
【０２５２】
同様のプロトコールを用いて、Ｃ−ＤＤＤ２−Ｆａｂ−ｈＰＡＭ４の２つのコピーおよびＣ−ＡＤ２−Ｆａｂ−６７９の１つのコピーを含む三量体ＴＦ１０ＤＮＬを生成した。ＴＦ１０中の癌標的抗体構成成分は、放射能標識ＭＡｂとして詳細に研究されているｈＰＡＭ４（ヒト化抗膵臓癌ムチンＭＡｂ）に由来する（例えば、Gold et al., Clin. Cancer Res. 13: 7380-7387, 2007）。ハプテン結合構成成分は、上記のｈ６７９（ヒト化抗ヒスタミニル−スクシニル−グリシン（ＨＳＧ）ＭＡｂ）に由来する。上記のような（抗ＣＥＡ）２×抗ＨＳＧｂｓＡｂ  ＴＦ２の産生に関して開示された方法を用いて、ＴＦ１０二重特異性（［ｈＰＡＭ４］２×ｈ６７９）抗体を産生した。ＴＦ１０構築物は、２つのヒト化ＰＡＭ４  Ｆａｂおよび１つのヒト化６７９Ｆａｂを保有する。
【０２５３】
２つの融合タンパク質（ｈＰＡＭ４−ＤＤＤおよびｈ６７９−ＡＤ２）を、安定的にトランスフェクトされた骨髄腫細胞中で独立して発現させた。組織培養上清液を組合せて、２倍モル余分量のｈＰＡＭ４−ＤＤＤを生じた。反応混合物を、１ｍＭ還元グルタチオンを用いた低刺激性還元条件下で室温で２４時間、インキュベートした。還元後、２ｍＭ酸化グルタチオンを用いた低刺激性酸化により、ＤＮＬ反応を完了した。ｈ６７９  Ｆａｂと高特異性で結合するＩＭＰ２９１−アフィゲル樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、ＴＦ１０を単離した。
【０２５４】
十分な組織組織学および血球結合パネルが、ｈＰＡＭ４  ＩｇＧに関して、ならびに臨床試験に入っている抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ  ｂｓＭＡｂに関して、既に検査されている。ｈＰＡＭ４結合を、３分の１の検体で膀胱および胃との極弱い結合に制限し（結合はin vivoで観察されなかった）、正常組織との結合は抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ  ｂｓＭＡｂに起因すると考えられた。さらに、Ｈ１およびＨ２ヒスタミン受容体を保有する細胞系統に対するin vitro試験は、ＩＭＰ２８８ジ−ＨＳＧペプチドに伴うアンタゴニストまたはアゴニスト活性を示さなかったし、２つの異なる種における動物試験は、画像診断のために用いられるより２０，０００倍高い用量で、ヒスタミン構成成分に関連したペプチドの薬理学的活性を示さなかった。したがって、ＨＳＧ−ヒスタミン誘導体は、薬理学的活性を有さない。
実施例９．ＤＮＬに関する配列変異体
【０２５５】
ある種の好ましい実施形態では、サイトカイン−ＭＡｂ  ＤＮＬ複合体中に組み入れられるＡＤおよびＤＤＤ配列は、以下に示すようなＡＤ２およびＤＤＤ２のアミノ酸配列を含む：
ＤＤＤ２
ＣＧＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号４）
ＡＤ２
ＣＧＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡＧＣ（配列番号６）
【０２５６】
しかしながら、代替的実施形態では、ＡＤおよび／またはＤＤＤ部分の配列変異体は、ＤＮＬ複合体の構築において利用され得る。ＡＤおよびＤＤＤドメインの構造−機能関係は、研究の対象となってきた（例えば、Burns-Hamuro et al., 2005, Protein Sci 14:2982-92; Carr et al.,
2001, J Biol Chem 276:17332-38; Alto et al., 2003, Proc Natl Acad Sci USA
100:4445-50; Hundsrucker et al., 2006, Biochem J 396:297-306; Stokka et al.,
2006, Biochem J 400:493-99; Gold et al., 2006, Mol Cell 24:383-95; Kinderman et
al., 2006, Mol Cell 24:397-408参照。これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）
【０２５７】
例えば、Kinderman等(2006)は、ＡＤＤ−ＤＤＤ結合相互作用の結晶構造を検査して、ヒトＤＤＤ配列は、以下の配列３で下線を付された、二量体系性またはＡＫＡＰ結合に重要である多数の保存的アミノ酸残基を含有する、と結論づけた（Kinderman et al., 2006（参照により本明細書中で援用される）の図１参照）。ＤＤＤ配列の配列変異体を設計するに際しては、望ましくは、下線を付した残基のいずれかの変更を回避するが、一方、二量体化およびＡＫＡＰ結合に余り重要でない残基に関しては保存的アミノ酸置換が成され得る、と当業者は理解する。
プロテインキナーゼＡからのヒトＤＤＤ配列
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３）
【０２５８】
Alto等(2003)は、０．４ｎＭのＤＤＤに関する結合定数を有する、ＡＫＡＰ−ＩＳ（配列番号５）と呼ばれるＲＩＩ選択的ＡＤ配列を設計するために、種々のＡＫＡＰタンパク質のＡＤ配列の生物情報学分析を実施した。ＰＫＡと結合するＡＫＡＰのペプチドアンタゴニストとして、ＡＫＡＰ−ＩＳ配列を設計した。置換がＤＤＤとの結合を低減する傾向があるＡＫＡＰ−ＩＳ配列中の残基には、配列５中に下線を付す。ＡＤ配列の配列変異体を設計するに際しては、望ましくは、下線を付した残基のいずれかの変更を回避するが、一方、ＤＤＤ結合に余り重要でない残基に関しては保存的アミノ酸置換が成され得る、と当業者は理解する。
ＡＫＡＰ−ＩＳ配列
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号５）
【０２５９】
Gold (2006)は、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列（配列番号１０）を開発するために結晶学およびペプチドスクリーニングを利用して、ＲＩアイソフォームと比較して５オーダー高い大きさのＲＩＩアイソフォームに関する選択性を示した。下線残基は、ＲＩＩαのＤＤＤ部分との結合を増大するアミノ酸置換の位置をＡＫＡＰ−ＩＳ配列と比して示す。この配列において、Ｎ末端Ｑ残基を残基番号４として番号付けし、Ｃ末端Ａ残基は残基番号２０である。置換がＲＩＩαに関する親和性に影響を及ぼすようにされた残基は、残基８、１１、１５、１６、１８、１９および２０であった（Gold et al., 2006)。ある代替的実施形態では、ＤＮＬ構築物を調製するために、ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ配列をＡＫＡＰ−ＩＳの代わりに置換し得るよう意図される。ＡＫＡＰ−ＩＳ  ＡＤ配列の代わりに置き換え得る他の代替的配列を、配列番号１１〜１３で示す。ＡＫＡＰ−ＩＳ配列に関する置換に下線を付す。配列番号６で示されるＡＤ２配列を用いる場合、ＡＤ部分は、配列番号６で示されるように、付加的Ｎ末端残基システインおよびグリシン、ならびにＣ末端残基グリシンおよびシステインも包含し得る、と予測される。
ＳｕｐｅｒＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＹＡＩＨＱＡ（配列番号１０）
代替的ＡＫＡＰ配列
ＱＩＥＹＫＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号１１）
ＱＩＥＹＨＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号１２）
ＱＩＥＹＶＡＫＱＩＶＤＨＡＩＨＱＡ（配列番号１３）
【０２６０】
Stokka等(2006)も、配列番号１４〜１６で示されるＰＫＡと結合するＡＫＡＰのペプチド競合物を開発した。ペプチドアンタゴニストを、Ｈｔ３１（配列番号１４）、ＲＩＡＤ（配列番号１５）およびＰＶ−３８（配列番号１６）と名づけた。Ｈｔ−３１ペプチドはＰＫＡのＲＩＩアイソフォームに対するより大きな親和性を示したが、一方、ＲＩＡＤおよびＰＶ−３８はＲＩに対するより高い親和性を示した。
Ｈｔ３１
ＤＬＩＥＥＡＡＳＲＩＶＤＡＶＩＥＱＶＫＡＡＧＡＹ（配列番号１４）
ＲＩＡＤ
ＬＥＱＹＡＮＱＬＡＤＱＩＩＫＥＡＴＥ（配列番号１５）
ＰＶ−３８
ＦＥＥＬＡＷＫＩＡＫＭＩＷＳＤＶＦＱＱＣ（配列番号１６）
【０２６１】
Hundsrucker等(2006)は、ＲＩＩ形態のＰＫＡのＤＤＤとの０．４ｎＭという低い結合定数を有する、ＰＫＡに結合するＡＫＡＰに対するさらに他のペプチド競合物を開発した。種々のＡＫＡＰアンタゴニストペプチドの配列は、Hundsrucker等の表１に提示されている（参照により本明細書中で援用される）。異なるＡＫＡＰタンパク質のＡＤドメイン間に高度に保存された残基を、ＡＫＡＰ  ＩＳ配列（配列番号５）に関して下線を付して、以下に示す。残基は、Alto等(2003)により観察されたものと同一であるが、Ｃ末端アラニン残基の付加を伴う（Hundsrucker等(2006)の図４参照。参照により本明細書中で援用される）。ＲＩＩ  ＤＤＤ配列に対する特に高い親和性を有するペプチドアンタゴニストの配列を、配列番号１７〜１９で示す。
ＡＫＡＰ−ＩＳ
ＱＩＥＹＬＡＫＱＩＶＤＮＡＩＱＱＡ（配列番号５）
ＡＫＡＰ７δ−ｗｔ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号１７）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０４Ｔ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＴＳＫＲＬＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号１８）
ＡＫＡＰ７δ−Ｌ３０８Ｄ−ｐｅｐ
ＰＥＤＡＥＬＶＲＬＳＫＲＤＶＥＮＡＶＬＫＡＶＱＱＹ（配列番号１９）
【０２６２】
Carr等(2001)は、ヒトおよび非ヒトタンパク質からの異なるＡＫＡＰ結合ＤＤＤ配列間の配列相同性の程度を調べ、異なるＤＤＤ部分間で最も高度に保存されていると思われるＤＤＤ配列中の残基を同定した。これらを、配列番号３のヒトＰＫＡ  ＲＩＩアルファ  ＤＤＤ配列に関して下線を付して以下に示す。特に保存された残基を、さらに、イタリック体で示す。残基は、Kinderman等(2006)によりＡＫＡＰタンパク質との結合のために重要であることが示唆されたものと重複するが、それらと同一ではない。ＤＤＤの配列変異体を設計するに際して、最も保存された残基（イタリック体）の変更を回避することが最も好ましく、保存残基（下線付き）の変更を回避することも好ましいが、一方、保存的アミノ酸置換は、下線を付されていないしイタリック体で記されてもいない残基に関して考慮され得る、と当業者は理解する。
ＳＨＩＱＩＰＰＧＬＴＥＬＬＱＧＹＴＶＥＶＬＲＱＱＰＰＤＬＶＥＦＡＶＥＹＦＴＲＬＲＥＡＲＡ（配列番号３）
実施例１０．プレターゲッティング抗体および１８Ｆ標識ペプチドを用いたin vivo試験
【０２６３】
１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９を、以下のように調製した。０．５ｍＬまでの５４．７ｍＣｉの１８Ｆを、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４巻漿液中の２ｍＭ  Ａｌ  ３μＬと混合した。３分後、０．５Ｍ、ｐＨ４  ＮａＯＡｃ緩衝液中の０．０５Ｍ  ＩＭＰ４４９  １０μＬを付加し、反応物を９６℃加熱ブロック中で１５分間加熱した。反応内容物を注射器で取り出した。次いで、粗製標識ペプチドを、Ｃ１８カラム上でＨＰＬＣにより精製した。流量は３ｍＬ／分であった。緩衝液Ａは水中０．１％ＴＦＡであり、緩衝液Ｂは、０．１％ＴＦＡを含有する水中９０％アセトニトリルであった。勾配は、１５分間に亘って、１００％緩衝液Ａから７５：２５Ａ／Ｂに進行した。最初に溶離した標識化ペプチドと非標識化ペプチドとの間に、保持時間（ｔＲ）の約１分の差があった。ＨＰＬＣ溶離液を、０．５分（ｍＬ）分画中に収集した。標識化ペプチドは、用いたカラムによって、６〜９分のｔＲを有した。当該分画を水中で２倍に希釈し、１ｃｃ  WATERS（登録商標）ＨＬＢカラムの樽形容器に溶液を入れることにより、ＨＰＬＣ精製ペプチド試料をさらに処理した。カートリッジを３×１ｍＬの水で溶離して、アセトニトリルおよびＴＦＡを除去し、その後、１：１のＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで１８Ｆ標識ペプチドを溶離した。精製［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９が、分析用ＨＰＬＣ  Ｃ１８カラム上に単一ピークとして溶離した（示されていない）。
【０２６４】
４つの緩徐増殖性ｓｃＣａＰａｎ１異種移植片を保有するTaconicヌードマウスを、in vivo試験のために用いた。マウスのうちの３匹には、ＴＦ１０（１６２μｇ）を、その１８時間後に［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９を注射した。ＴＦ１０は腫瘍画像診断試験に用いるためのヒト化二重特異性抗体であって、ＰＡＭ−４限定腫瘍抗原と二価結合し、ＨＳＧと一価結合する（例えば、Gold et al., 2007, J. Clin. Oncol. 25(18S): 4564参照）。１匹のマウスに、ペプチド単独を注射した。ペプチド注射の１時間後に、マウス全てを剖検した。組織を直ちに計数した。動物＃２は、大腿骨で高計数を示した。大腿骨を新しいバイアル中に移して、古い空のバイアルとともに再計数した。再計数は、当該計数が当該組織上に存在することを示した。この大腿骨を破断したが、それには筋肉の大きな破片が付着していた。平均分布の比較は、腫瘍ターゲッティング二重特異性抗体の存在下では、任意の正常組織中よりも腫瘍中に実質的により高レベルに局在する１８Ｆ標識ペプチドを示した。
【０２６５】
組織取込みは、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独を投与した動物において、またはプレターゲッティング設定において、同様であった（表８）。１時間目のヒト膵臓癌異種移植片ＣａＰａｎ１中の取込みは、プレターゲッティング動物においては、ペプチド単独と比較して５倍に増大された（４．６±０．９％ＩＤ／ｇ対０．８９％ＩＤ／ｇ）。例外的な腫瘍／非腫瘍比が、この時点で達成された（例えば、腫瘍／血液および肝臓比は、それぞれ２３．４±２．０および２３．５±２．８）。
【表８】
0005608914.tif 000012
実施例１１．プレターゲッティング抗体を用いた１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９対［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の体内分布の比較
【０２６６】
本試験の目的は、二重特異性抗体ＴＦ２でプレターゲッティング後のｓｃＬＳ１７４Ｔ異種試食片を保有するヌードマウスにおける１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９および［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の体内分布を比較することであった。ＴＦ２抗体は、ドック・アンド・ロック法により作製されたものであり、ＣＥＡ腫瘍抗原およびＨＳＧハプテンのための結合部位を含有する（例えば、Sharkey et al., Radiology 2008, 246: 497-507；Rossi et al., PNAS USA 2006, 103: 6841-46参照）。一度に存在するマウスの数が不十分であったため、２つの異なる週の間に試験を実施した。
【０２６７】
１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９：  ＩＭＰ２８８を標識するために用いたものと同様の手法を用いて１１１Ｉｎ標識を実施したが、但し、比放射能は低かった。ＩＴＬＣおよびＣ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣは、３０％までの非結合を示した（示されていない）。標識化ペプチドを、ＨＬＢカラム上で精製した（１ｍＬ、３０ｍｇ）。精製物質の分析も、飽和塩化ナトリウム中で展開されたＩＴＬＣにより３３％非結合を示した（示されていない）。ＲＰ−ＨＰＬＣは、精製の前および後に多数のピークを示した（示されていない）。精製後のＳＥ−ＨＰＬＣは、２０倍モル余分量のＴＦ２と混合した場合、高ＭＷへの４７％の活性シフトを示した（示されていない）。
【０２６８】
［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９：上記と同様に標識化を実施したが、但し、Kim等（Applied
Radiation and Isotopes 61, 2004, 1241-46）により記載されたように、標識前にＱＭＡカートリッジ上で１８Ｆを精製した。要するに、SEP-PAK（登録商標）LIGHT
WATERS（登録商標）ACCELL（商標）Plus QMAカートリッジを調製し、０．４ＭのＫＨＣＯ３１０ｍＬで洗い流して、次に、脱イオン水１０ｍＬで洗浄した。水２ｍＬ中の１８Ｆ（４２ｍＣｉ）をＱＭＡカートリッジ上に載せた。カートリッジを脱イオン水１０ｍＬで溶離して、不純物を除去した。次いで、カラムを２００μＬ分画中の０．４Ｍ  ＫＨＣＯ３１ｍＬで溶離した。分画番号２は、大部分の放射能３３ｍＣｉを含有した。次に、１８Ｆ溶液のｐＨを氷酢酸１０μＬで調整した。次いで、分画＃２からの１８Ｆを、０．１Ｍ、ｐＨ４、ＮａＯＡｃ緩衝液中の２ｍＭのＡｌ  ３μＬと混合した。次に試料を、０．５Ｍ、ｐＨ４、ＮａＯＡｃ緩衝液中の０．０５ＭのＩＭＰ４４９  １０μＬと混合し、反応溶液を９４℃で１５分間加熱した。［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。当該生成物を含有する分画をＨＬＢカラムに通して、緩衝液を交換した。試料充填後、カラムを水で洗浄した。生成物を、４００μＬの１：１  ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏで溶離した。生成物のＲＰ−ＨＰＬＣは、ショルダーを有する１つの主ピークを示した（図示せず）。収率が低かったため、比放射能は低かったので、さらにペプチドを注射すると、ｂｓＭＡｂ：ペプチドの比は１０：１でなくて６．９：１となった。
結果
【０２６９】
Ｉｎ−１１１によるＩＭＰ４４９の標識は、多数の生成物を生じた。おそらくは、いくつかは、二核性複合体の可能性があった。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９は、高腎臓取込みおよび高血中濃度を示した。しかしながら、多種としてさえ、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ４４９は、ＴＦ２でプレターゲッティングされた場合、腫瘍への局在化を示した（図１）。
【０２７０】
図１は、マウスにおける１１１Ｉｎおよび１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９の比較体内分布を示す。両標識種は、二重特異性ＴＦ２抗体の存在下で、腫瘍組織への同様に高レベルの局在化を示した。１１１Ｉｎ標識種は、ＴＦ２抗体の存在下または非存在下で、１８Ｆ標識種より高い腎臓中濃度を示した。データを、以下の表９〜１２に要約する。
【表９】
0005608914.tif 000013
【表１０】
0005608914.tif 000014
【表１１】
0005608914.tif 000015
【表１２】
0005608914.tif 000016
【０２７１】
この試験は、本明細書中に記載される簡単で再現可能な方法および組成物が、種々の疾患状態のin vivo画像診断に用いるのに適した１８Ｆ標識ターゲッティングペプチドを産生する、ということを示す。上記の二重特異性抗体は限定されないが、しかし、広範な種々の疾患または病原体標的抗原に対する任意の既知の抗体を含み得る、と当業者は理解する。当該方法は、二重特異性抗体によるプレターゲッティングにも限定されない。他の実施形態では、画像診断されるべき標的細胞、組織または生物体と直接結合する分子または複合体は、本明細書中に開示される方法を用いて１８Ｆで標識され、ＰＥＴ画像診断のために被験者に投与される（以下の実施例参照）。
【０２７２】
ＩＭＰ４４９により例示されるＡｌ１８Ｆ標識ペプチドは、ＰＥＴスキャニングのような既知の画像診断プロトコールに利用されるのに、in vivo条件下で、十分に安定である。さらに、特許請求される方法は、適切な画像診断手法を実施させるために十分な１８Ｆの崩壊時間内である１時間の調製時間内に、いつでも注射可能である。最後に、記載され、特許請求される方法は、画像診断試験のための１８Ｆ標識化合物の既知の調製方法と比較して、オペレーターが放射性同位体に曝露されるのを最小限にする。
実施例１２．１８Ｆ標識化キット
【０２７３】
８．０ｍｇのＩＭＰ４４９を０．１５４９ｇのアスコルビン酸と混合することにより、１８Ｆ標識化キットを作製した。２つの試薬を１０．５ｍＬの水中に溶解し、溶液を１０個のバイアル中の１．０ｍＬアリコート中に分配した。ｐＨは調整しなかった。溶液を凍結し、凍結乾燥し、真空下で密封した。凍結乾燥バイアルを再水和し、ＩＭＰ４４９ペプチドとともに試験に用いた。
実施例１３．Ｆ標識ペプチドを用いるin
vivo画像診断および１８Ｆ［ＦＤＧ］法との比較
【０２７４】
二重特異性抗体によるプレターゲッティングおよび標識化ターゲッティングペプチドを用いるin vivo画像診断技法を用いて、相対的に小さいサイズの腫瘍を首尾よく検出した。
【０２７５】
文献の手法に従って、WATERS（登録商標）ACCELL（商標）Plus QMA LIGHTカートリッジ上で１８Ｆを精製したが、この場合、カートリッジを、０．４ＭのＫＨＣＯ３１０ｍＬで洗浄して、その後、脱イオン水１０ｍＬで洗浄した。水２ｍＬ中の１８Ｆをカートリッジに通して、次に、水１０ｍＬで洗浄した。次いで、５×２００μＬアリコート中で０．４Ｍ  ＫＨＣＯ３１ｍＬを用いて、カートリッジから１８Ｆを溶離した。放射能の大部分を、第二分画中で溶離した。第二分画中の放射能を、ｐＨ４酢酸緩衝液中の２ｍＭのＡｌ３＋  ３μＬと混合した。次に、Ａｌ１８Ｆ溶液をアスコルビン酸ＩＭＰ４４９標識バイアルに注入して、１０５℃で１５分間過熱した。反応溶液を冷却し、脱イオン水０．８ｍＬと混合した。反応内容物をWATERS（登録商標）OASIS（登録商標）１ｃｃＨＬＢカラム上に載せて、廃液バイアル中に溶離した。カラムを３×１ｍＬ脱衣温水で洗浄した。カラムを、アスコルビン酸を含有する処方物バイアルに移した。カラムを、２×２００μＬの１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで洗浄して、標識化ペプチドを溶離した。
【０２７６】
組換えヒト化三Ｆａｂ  ｂｓＭＡｂ、ＴＦ２を、上記のように調製した。ＴＦ２は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）と二価結合し、合成ハプテンＨＳＧ（ヒスタミン−スクシニル−グリシン）と一価結合する。ｂｓＭＡｂは、サイズ排除ＨＰＬＣ法を用いて、ＣＥＡおよび二価ＨＳＧ  ＮＯＴＡ−ペプチドＩＭＰ４４９に対して＞９５％免疫反応性であった（示されていない）。
体内分布およびマイクロＰＥＴ画像診断
【０２７７】
６週齢ＮＣｒ  ｎｕ−ｍ雌ヌードマウスに、ヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ATCC, Manassas, VA）を皮下移植した。腫瘍が視覚的に確立されると、プレターゲッティング動物に１６２μｇ（〜１ｎｍｏｌｅ／０．１ｍＬ）のＴＦ２またはＴＦ１０（対照非ターゲッティング三Ｆａｂ  ｂｓＭＡｂ）を静脈内注射し、次いで、１６〜１８時間後、〜０．１ｎｍｏｌｅの［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９（８４μＣｉ、３．１１ＭＢｑ／０．１ｍＬ）を静脈内注射した。付加アルミニウムの１００％回収により、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の濃度を確定した。他の非プレターゲッティング対照動物には、１８Ｆ単独（１５０μＣｉ、５．５ＭＢｑ）、Ａｌ１８Ｆ錯体単独（１５０μＣｉ、５．５５ＭＢｑ）、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９ペプチド単独（８４μＣｉ、３．１１ＭＢｑ）または［１８Ｆ］ＦＤＧ（１５０μＣｉ、５．５５ＭＢｑ）を投与した。１８Ｆおよび［１８Ｆ］ＦＤＧは、IBA Molecular (Somerset, NJ)から、使用当日に入手した。［１８Ｆ］ＦＤＧを摂取している動物を一晩絶食させたが、水は自由に摂らせた。
【０２７８】
放射性トレーサー注射後１．５時間目に、動物を麻酔し、心臓内放血させて、剖検した。組織を計量し、それぞれの生成物のおのおのから調製した標準希釈液と一緒に計数した。１８Ｆの短い物理半減期のため、各動物からの組織の各群間に、標準を差し挟んだ。注入用量％／グラム（％ＩＤ／ｇ）を得るために、計数／ｇを総注入放射能を割った値として、組織中の取込みを表す。
【０２７９】
２つの型の画像診断試験を実施した。１組では、小さなＬＳ１７４Ｔ皮下腫瘍を保有する３匹のヌードマウスに、プレターゲッティング［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独（）（ともに１３５μＣｉ、５ＭＢｑ；０．１ｎｍｏｌ）、または［１８Ｆ］ＦＤＧ（１３５μＣｉ、５ＭＢｑ）を投与した。静脈内放射性トレーサー注射後２時間目に、Ｏ２／Ｎ２Ｏおよびイソフルラン（２％）の混合物で動物を麻酔し、スキャン中は温保持した。マウスを、仰臥位で、INVEON（登録商標）動物ＰＥＴスキャナー（Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN）の走査床上に載せた。このスキャナーは、１．５ｍｍの固有空間分解能を有する。１５分［１８Ｆ］ＦＤＧまたは３０分（［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９）に関して、放出スキャンを得た。以下のパラメーター：マトリックス２５６×２５６×１５９、ピクセルサイズ０．４３×０．４３×０．８ｍｍおよび０．５ｍｍのＭＡＰ priorで、順序集合期待値最大化３Ｄ／最大事後確率（ＯＳＥＭ３Ｄ／ＭＡＰ）アルゴリズムを用いるINVEON（登録商標）Acquisition
Workplaceソフトウエア（ＩＡＷ、バージョン１．２）を用いて、スキャンを再構成した。
【０２８０】
ピクセル飽和が身体の任意の領域（膀胱以外）で起きるまで強度を調整し、バックグラウンド調整せずに、腫瘍のほぼ中心に位置する平面における代表的冠状横断切片（０．８ｍｍ厚）を示した。
【０２８１】
別個の動的画像診断試験において、１６時間前にＴＦ２  ｂｓＭＡｂを投与された単一ＬＳ１７４Ｔ保有ヌードマウスを、Ｏ２／Ｎ２Ｏおよびイソフルラン（２％）の混合物で麻酔し、カメラ床上に仰臥位で載せて、次に、２１９μＣｉ（８．１  ＭＢｑ）［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９（０．１６ｎｍｏｌ）を静脈内注射した。１２０分の期間に亘って、データ獲得を直ちに開始した。各々５分の２４フレームで、データをヒストグラムで表した。上記と同一パラメーターでＯＳＥＭ３Ｄ／ＭＡＰを用いて、スキャンを再構成した。２４画像時間フレームの各々を調べた。提示のために、５、１５、３０、６０、９０および１２０分で終わる時間フレーム（すなわち、５分画像は時間ゼロから５分までの期間に関するものである）を、各断面切片（冠状、矢状および横断）に関して表示した。腫瘍を含有する切片に関して、ピクセル飽和が最初に腫瘍で起こるまで、各間隔で、画像強度を調整した。必要な場合は経時的に画像強度を増大して、腫瘍内のピクセル飽和を保持した。同一間隔で採取した腫瘍を含有しない冠状および矢状断面切片を、腫瘍を含有する横断切片と同一強度に調整した。バックグラウンド放射能は調整しなかった。
結果
【０２８２】
１８Ｆ単独および［Ａｌ１８Ｆ］錯体は全ての組織において同様の取込みを有したが、しかし錯体がＩＭＰ４４９とキレート形成された場合、かなりの差が見出された（表１３）。最も顕著な差は、骨における取込みに見出されたが、この場合、非キレート化１８Ｆは、肩甲骨においては６０倍〜ほぼ１００倍高く、脊椎では〜２００倍高かった。１８Ｆは、または金属−フッ化物錯体でさえ、骨中で増大することが知られているため、この分布が予期される（Franke et al. 1972, Radiobiol. Radiother. (Berlin) 13: 533）。より高い取込みは、腫瘍及び腸管中でも、ならびに筋肉及び血中でも観察された。キレート化［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９は、腎臓以外の全ての組織において有意に低い取込みを示したが、これは、排尿により身体から効率的に除去されるキレート錯体の能力を例示する。ＴＦ２抗ＣＥＡ  ｂｓＭＡｂを用いた［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９のプレターゲッティングは、腫瘍への取込みを変えて、それを、１．５時間での注射用量／ｇで、０．２０±０．０５から６．０１±１．７２に増大したが、一方、正常組織中の取込みは［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独と同様であった。腫瘍／非腫瘍比は、血液、肝臓、肺および腎臓ではそれぞれ１４６±６３、５９±２４、３８±１５および２．０±１．０であり、他の腫瘍／組織比はこの時点で＞１００：１であった。１８Ｆ単独および［Ａｌ１８Ｆ］単独はともにキレート化［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９より高い腫瘍中取込みを示し、それぞれ６．７±２．７および１１．０±４．６対５．１±１．５の腫瘍／血液比を生じたが、しかし、腫瘍取込みおよび腫瘍／血液比はプレターゲッティングにより有意に増大した（全てのＰ値＜０．００１）。
【０２８３】
高グルコース消費および代謝活性を示す組織を標的にする、最も一般的に用いられる腫瘍画像診断剤である［１８Ｆ］ＦＤＧに対する体内分布も比較した。その取込みは、腎臓以外の全ての正常組織において、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９よりかなり高かった。腫瘍取込みは、プレターゲッティング［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９および［１８Ｆ］ＦＤＧの両方に関して同様であったが、しかし、ほとんどの正常組織中での［１８Ｆ］ＦＤＧのより高い増大のため、［１８Ｆ］ＦＤＧに関する腫瘍／非腫瘍比は、プレターゲッティング動物の場合より有意に低かった（全てのＰ値＜０．００１）。
【表１３】
0005608914.tif 000017
【０２８４】
［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独またはＴＦ２でプレターゲッティングした［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９、ならびに［１８Ｆ］ＦＤＧの体内分布をさらに分析するために、数匹の動物を画像診断した。放射能を注射後２．０時間目に開始した統計的画像は、腎臓中でほとんど専ら取込みを示す従来の組織分布データを裏付けた（図２）。２１ｍｇ腫瘍はプレターゲッティング動物において容易に可視化されたが、一方、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９単独を投与された動物は腫瘍を局在化できず、腎臓取込みのみを示した。骨増大の証拠は観察されず、これは、Ａｌ１８ＦがＩＭＰ４４９にしっかり結合された、ということを示唆する。これは、１２０分に亘って５分間隔で、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４４９の分布を監視する動的画像診断試験を受けた別のプレターゲッティング動物において確証された（図３）。冠状および矢状薄片は、最初の５分間の、主に心臓、腎臓および多少の肝臓取込みを示したが、しかし心臓および肝臓活性は次の１０分間は実質的に低減したが、一方、腎臓は試験全体を通して依然として顕著であった。全１２０分スキャン全体に亘って、腸管または骨中に放射能の証拠は認められなかった。３５ｍｇ  ＬＳ１７４Ｔ腫瘍中の取込みは、１５分で先ず観察され、３０分までに、シグナルは非常に明白にバックグラウンドから減少し、全１２０分のスキャニング中、強い腫瘍放射能が顕著であった。
【０２８５】
比較した場合、［１８Ｆ］ＦＤＧを投与された動物からの静止画像は、前に観察された骨、心筋および脳における放射能の予測パターンを示し（McBride et al., 2006, J. Nucl. Med. 47: 1678；Sharkey et al., 2008, Radiology 246: 497）、身体中のバックグラウンド放射能はかなり高かった（図２）。静止画像診断試験の終わりに剖検された３匹の動物で測定した組織取込みは、全組織において非常に高い組織１８Ｆ放射能を確証した。［１８Ｆ］ＦＤＧの腫瘍取込みはこの動物においては、プレターゲッティング動物より高かったが、一方、腫瘍／血液比はプレターゲッティングにより好都合であり、そして身体中の残留放射能が低いほど、腫瘍可視化はプレターゲッティングにより増強された。
【０２８６】
これらの試験は、生体分子（この場合は、プレターゲッティング画像診断に用いられるハプテン−ペプチド）がアルミニウム−フッ化物錯体を簡単に形成し、これは次に適切なキレート化合物により結合され、ハプテン−ペプチドに組み入れられることにより、１８Ｆで迅速に標識され得る（総調製時間６０分）、ということを実証する。これは、キレート部分に付着され、その後、精製され得る任意の分子と［Ａｌ１８Ｆ］−キレート化合物を簡単にカップリングすることにより、より一般的になされ得る。好ましい実施形態では、標識の組み入れパーセンテージおよび標識化合物の比放射能は、標識化分子の精製が必要でないほど十分である。キレート剤と既に結合されたＡｌと１８Ｆを結合することも出来た（データは示されていない）。
【０２８７】
これは、アルミニウム接合体を介して１８Ｆを種々の化合物と結合する直接的で、安易な且つ迅速な方法を記載する最初の報告である。このような生成物、例えば［Ａｌ１８Ｆ］の安定性は、１８Ｆを当該分子と連結するために用いられるキレート化合物の特性に依っている。キレート化合物は、金属組み入れとその後の安定性を最適化するために正しい立体配置で選択され得る。［Ａｌ１８Ｆ］ペプチドは、ＮＯＴＡベースのキレート化合物により結合される場合、in vitroおよびin vivoで安定であった。収率は、慣用的１８Ｆ標識化手法で見出される範囲内であった。これらの結果は、広範な種々の標的化分子にキレート化される金属１８Ｆを用いるＰＥＴ画像診断の実現可能性、をさらに実証する。
実施例１４．Ａｌ−１８Ｆを用いたＩＭＰ４６０の調製および標識化
【０２８８】
ＩＭＰ３６１に関して上記した方法と同様に、ＩＭＰ４６０ＮＯＤＡ−Ｇａ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２を合成した。ＮＯＤＡ−Ｇａリガンドは、CHEMATECH（登録商標）から購入し、他のアミノ酸と同様にペプチド合成機上に載せた。以下の順序で：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨおよびＮＯＤＡ−ＧＡ（ｔＢｕ）３を付加したアミノ酸および他の作用物質を用いて、Sieberアミド樹脂上でペプチドを合成した。次いで、ペプチドを切断し、ＨＰＬＣにより精製して、当該生成物を得た。ＨＲＭＳ  Ｃ６１Ｈ９２Ｎ１８Ｏ１８  ＭＨ＋理論値１３６５．６９０９；実測値１３６５．６９１２。
ＩＭＰ４６０の放射能標識
【０２８９】
ＩＭＰ４６０（０．００２０ｇ）を、７３２μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中に溶解した。１８Ｆを上記と同様に精製し、氷酢酸で中和し、Ａｌ溶液と混合した。次に、ペプチド溶液２０μＬを付加し、溶液を２５分間９９℃に加熱した。次いで、粗生成物をWATERS（登録商標）ＨＬＢカラムで精製した。［Ａｌ１８Ｆ］標識ペプチドは、１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏカラム溶離液中に存在した。０．１％ＴＦＡ緩衝液中の逆相ＨＰＬＣとレースは、標識化ペプチドに関する予測位置にきれいな単一ＨＰＬＣピークを示した（示されていない）。
実施例１５．ＩＭＰ４６１およびＩＭＰ４６２ＮＯＴＡ共役ペプチドの合成および標識
【０２９０】
最も簡単な考え得るＮＯＴＡリガンド（ペプチド合成に関して保護される）を調製し、ＩＭＰ４６１およびＩＭＰ４６２をプレターゲッティングするために２つのペプチド中に組み入れた。
ジ−ｔ−ブチル−ＮＯＴＡの合成（図６）
【０２９１】
ＮＯ２ＡｔＢｕ（０．５０１ｇ、１．４×１０−３ｍｏｌ）を、無水アセトニトリル  ５ｍＬ中に溶解した。ベンジル−２−ブロモアセテート（０．２２２ｍＬ、１．４×１０−３ｍｏｌ）を溶液に付加し、その後、０．３８７ｇの無水Ｋ２ＣＯ３を付加した。反応物を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を濾過し、濃縮して、０．６０５ｇ（収率８６％）のベンジルエステル共役体を得た。次に、粗生成物をイソプロパノール  ５０ｍＬ中に溶解し、０．２ｇの１０％Ｐｄ／Ｃと混合し（Ａｒ下）、５０ｐｓｉのＨ２下に３日間放置した。次に、生成物を濾過し、真空下で濃縮して、０．４６２ｇの所望の生成物ＥＳＭＳ  ＭＨ−４１５を得た。
ＩＭＰ４６１の合成
【０２９２】
以下の順序で：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨおよびＢｉｓ−ｔ−ブチルＮＯＴＡ−ＯＨを付加したアミノ酸および他の作用物質を用いてSieberアミド樹脂上で、ペプチドを合成した。次いで、ペプチドを切断し、ＨＰＬＣにより精製して、生成物ＩＭＰ４６１  ＥＳＭＳ  ＭＨ＋１２９４（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）を得た。
ＩＭＰ４６２の合成
【０２９３】
以下の順序で：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを除去し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（Ｂｕｔ）−ＯＨおよびＢｉｓ−ｔ−ブチルＮＯＴＡ−ＯＨを付加したアミノ酸および他の作用物質を用いてSieberアミド樹脂上で、ペプチドを合成した。次いで、ペプチドを切断し、ＨＰＬＣにより精製して、生成物ＩＭＰ４６２  ＥＳＭＳ  ＭＨ＋１３３８（ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）を得た。ＮＯＴＡエステルを、ペプチド合成機上のペプチドに付加した。
ペプチド（ＩＭＰ４６１＆ＩＭＰ４６２）の１８Ｆ標識
【０２９４】
ペプチドを、０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．１３）中に溶解して、０．０５Ｍペプチド溶液を作製し、これを、必要になるまで冷凍庫中に保存した。Ｆ−１８を水２ｍＬ中に入れて、０．４ＭのＫＨＣＯ３５ｍＬで、その後、水５ｍＬで予め洗浄したSEP-PAK（登録商標）LIGHT
WATERS（登録商標）ACCELL（商標）Plus QMAカートリッジ上に捕捉した。カラムを脱イオン水５ｍＬで洗浄して、望ましくない夾雑物を１８Ｆから除去した。次いで、０．４Ｍ  ＫＨＣＯ３の２００μＬアリコートでカラムから１８Ｆを溶離し、放射能の大半は第二アリコート中に存在した。放射能の付加前にバイアルに氷酢酸１０μＬを付加することにより、アリコート中の重炭酸塩を〜ｐＨ４に中和した。精製１８Ｆ溶液の１００μＬアリコートを取り出して、０．１Ｍ、ｐＨ４、ＮａＯＡｃ中の２ｍＭのＡｌ  ３μＬと混合した。ペプチド１０μＬ（０．０５Ｍ）を付加し、溶液を〜１００℃で１５分間加熱した。粗反応混合物を脱イオン水７００μＬで希釈し、ＨＬＢカラム上に載せて、次いで、液体をカラムを通して廃液バイアル中に抜き取った。反応バイアルをさらなる１ｍＬの脱イオン水ですすぎ、ＨＬＢカラムに通して清掃した（真空下）。ＨＬＢカラムを脱イオン水のさらなる２×１ｍＬ部分で洗浄した。カラムを空バイアルに移して、２×１００μＬの１：１  ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏで溶離して、精製１８Ｆ標識ペプチドを得た。
実施例１６．ＩＭＰ４６７の調製および１８Ｆ標識
合成
ＩＭＰ４６７  Ｃ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２、分子量１５２８．７
【０２９５】
図４に従って、テトラｔｅｒｔ−ブチルＣ−ＮＥＴＡ−スクシニルを生成した。ｔｅｒｔ−ブチル｛４−［２−ビス−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）メチル−３−（４−ニトロフェニル）プロピル］−７−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル［１，４，７］トリアザノナン−１−イル｝を、Chong等(J. Med. Chem.
2008, 51: 118-125)に記載されたように調製した。さらに広範な合成スキームを、図５に示す。SUNFIRE（登録商標）ＰｒｅｐＣ１８逆相カラム（３０×１５０ｍｍ、５μｍ）を装備したWATERS（登録商標）ＰｒｅｐＬＣ４０００系を用いて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、リガンド３を精製した。４５ｍＬ／分の流量で、５０分に亘って、１００％Ａ（０．１％ＴＦＡ）〜１００％Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％水、０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いてクロマトグラフィー分離を達成し、吸光度を２２０ｎｍで検出した。
【０２９６】
以下の順序で、以下のアミノ酸：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを樹脂に付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加し、Ａｌｏｃを切断し、ｔｅｒｔ−ブチル｛４−［ビス−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）メチルアミノ］−３−（４−スクシニルアミノフェニル）プロピル］−７−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル［１，４，７］トリアザノナン−１−イル｝アセテート３を付加することにより、Sieberアミド樹脂上に、ペプチドＩＭＰ４６７Ｃ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２、ＭＨ＋１５２７．８７を作製した。次いで、ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、６．３ｍｇのＩＭＰ４６７を得た。約３０．６ｍｇの生成物（分子量１０３４．８４、保持時間８．４７０）も得た（ＴＦＡアミド）。
【０２９７】
Ｃ１８カラムを用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、粗製ペプチドを精製した。４５ｍＬ／分の流量で、８０分に亘って、１００％Ａ（０．１％ＴＦＡ）〜８０％Ａ：２０％Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％水、０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いてクロマトグラフィー分離を達成し、吸光度を２２０ｎｍで検出した。
放射能標識
【０２９８】
０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中に、ＩＭＰ４６７の２ｍＭ溶液を調製した。１８Ｆ（１３９ｍＣｉ）を注射器中の２ｍＬ中に入れた。WATERS（登録商標）ACCELL（商標）Plus SEP-PAK（登録商標）LIGHT ＱＭＡカートリッジを通して放射能を溶離し、水５ｍＬで洗浄して、任意の金属イオン夾雑物を除去した。次いで、以下の分画中の０．４Ｍ  ＫＨＣＯ３  １ｍＬで１８Ｆを溶離した： 
【表１４】
0005608914.tif 000018
【０２９９】
段落０３０５に従って、ＨＬＢ  ＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、標識ＩＭＰ４６７を精製した。ＲＰ−ＨＰＬＣは、２つのピーク溶離（示されていない）を示したが、これは、Ａｌ１８Ｆ  ＩＭＰ４６７のジアステレオマーであると考えられる。この仮説を支持すると、ＩＭＰ４６７を３７℃でインキュベートした場合、２つのＨＬＢピーク間の何らかの相互転換が存在すると思われた（示されていない）。以下で考察するようなプレターゲッティング技法においては、Ａｌ１８Ｆ−キレート剤複合体は抗体結合のためのハプテン部位の一部ではないため、ジアステレオマーの存在は罹患組織に対する１８Ｆ標識ペプチドの標的化に影響を及ぼすとは思われない。
放射能標識ペプチドの収率の比較
【０３００】
in vivo安定性を保持しながら標識収率を改善するための試みにおいて、プレターゲッティングペプチドの３つの新規のＮＯＴＡ誘導体を合成した（ＩＭＰ４６０、ＩＭＰ４６１およびＩＭＰ４６７）。これらのうち、ＩＭＰ４６７は他のペプチドの標識収率のほぼ２倍であった（表１５）。表１５における標識化試験の全てを、同一モル数のペプチドおよびアルミニウムを用いて実施した。表１５に示した結果は、各ペプチドに関する例示的標識化実験を表す。
【０３０１】
表１５のデータを生成するために、３μＬの２ｍＭ  Ａｌ３＋ストック溶液を６０μＬの１８Ｆ（４４ＭＢｑ）に付加し、その後、０．５ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．１）中の０．０５Ｍペプチド溶液  １０μＬを付加した。４つの反応混合物を処方し、１０３℃加熱ブロック中に１９分間入れた。段落０３０５に記載されるようにＨＬＢカラムにより反応混合物を精製して、放射化学反応収率を確定した。
【０３０２】
単に４０ｎｍｏｌ（ＩＭＰ４４９の１３分の１未満まで）だけを１．３ＧＢｑ（３５ｍＣｉ）の１８Ｆに関して用いた場合、ＩＭＰ４６７の１８Ｆ標識収率は〜７０％であったが、これは、このリガンドがＡｌ１８Ｆ錯体に対する改善された結合特性を有する、ということを示す。リガンド結合の動力学を増強することにより、ＩＭＰ４４９（５２０ｎｍｏｌ、収率４４％）に比して、より少ないモルのＩＭＰ４６７（４０ｎｍｏｌ）を用いながら、収率を実質的に改善した（平均収率６５〜７５％）。
【表１５】
0005608914.tif 000019
実施例１７．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍保有ヌードマウスにおける１８Ｆ標識ＩＭＰ４６７によるプレターゲッティング体内分布
【０３０３】
段落０３２８に記載されるものと同一方法で調製された１８Ｆ標識ＩＭＰ４６７を、ＬＳ１７４腫瘍保有ヌードマウスへの注射のために希釈した。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６７を調製し、ヌードマウスに注射して、これを１．５時間後に剖検した。表１６および１７は、ペプチド単独（表１７）と比較して、ＴＦ２プレターゲッティング・プロトコールを用いて（表１６）１８Ｆ標識ＩＭＰ４６７の体内分布を比較する。表１７に示すように、ペプチドは、ＩＭＰ４４９と同様に、血液および身体から迅速に除去される。１８ＦまたはＡｌ１８Ｆと比較して低い骨中の取込みは、Ａｌ１８Ｆキレート化合物の安定性ならびにプレターゲッティングに対するその適合性を例証する。ＩＭＰ４４９に関する場合、ＴＦ２二重特異性抗体を用いることならびに標識化ＩＭＰ４６７の分布をプレターゲッティングすることは、主に腫瘍および腎臓に限定され、骨または他の正常組織への分布は非常に少なかった。１８Ｆ標識ＩＭＰ４６７を用いた画像診断試験を、以下で報告する。データは、ＡｌＦ−１８  ＩＭＰ４６７がin vivoで安定であり、当該ペプチドは腫瘍表面の抗体を標的にした、ということを示す。
【表１６】
0005608914.tif 000020
【表１７】
0005608914.tif 000021
実施例１８．ＩＭＰ４６７標識化の収率および安定性に影響を及ぼす因子
ペプチド濃度
【０３０４】
収率に及ぼす種々のペプチド濃度の作用を調べるために、ペプチドとのＡｌ１８Ｆの結合の量を、一定量のＡｌ３＋（６ｎｍｏｌ）で、しかし付加するペプチドの量を変えて、一定容積中で確定した。３μＬの２ｍＭ  Ａｌ３＋ストック溶液を４０μＬの１８Ｆ（２４ＭＢｑ）に付加し、その後、０．１ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．１）中の２ｍＭ  ＩＭＰ４６７  ５、１０、１５または２０μＬ、ならびに水１５、１０、５または０μＬをそれぞれ付加した。反応溶液を１５分間９９℃に加熱し、次いで、上記のようにＨＬＢカラムにより精製して、単離放射化学物質収率を確定した。標識化ペプチドＩＭＰ４６７の収率は、以下のようにペプチドの漸減濃度に伴って低減した：４０ｎｍｏｌペプチド（収率８２％）；３０ｎｍｏｌ（収率７９％）；２０ｎｍｏｌ（収率７５％）；１０ｎｍｏｌ（収率４９％）。したがって、２０〜４０ｎｍｏｌの間のペプチドの量の変更は、ＩＭＰ４６７に関する収率にほとんど影響を及ぼさなかった。しかしながら、収率低減は、標識混合物中１０ｎｍｏｌペプチドで出発して観察された。
アルミニウム濃度
【０３０５】
漸増量のＡｌ３＋（ｐＨ４酢酸塩緩衝液中の２ｍＭ  ０、５、１０、１５、２０μＬ。総容積を一定に保持する）の存在下でＩＭＰ４６７を標識した場合、それぞれ３．５％、８０％、７７％、７８％および７４％の収率を達成した。これらの結果は、（ａ）Ａｌ３＋の非存在下でのこのペプチドとの１８Ｆの非特異的結合が最小であり、（ｂ）最大１８Ｆ結合を可能にするには１０ｎｍｏｌのＡｌ３＋で十分であり、ならびに（ｃ）それより多量のＡｌ３＋は結合を実質的に低減せず、このことはこのペプチド濃度で十分なキレート化能力が存在したことを示す、ということを示した。
Ａｌ１８Ｆ  ＩＭＰ４６７放射能標識の動力学
【０３０６】
３μＬの２ｍＭ  Ａｌ３＋ストック溶液を４０μＬの１８Ｆと混合し、その後、０．１ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．１）中の２ｍＭ  ＩＭＰ４６７  ２０μＬを付加した。４つの反応混合物を処方し、１０７℃加熱ブロック中に５、１０、１５および３０分間入れた。粗生成物を、Waters Oasis（登録商標）ＨＬＢ  １ｃｃ（３０ｍｇ）Flangelessカートリッジで、各々、精製した。要するに、水２００μＬを反応溶液に付加し、これを次にピペットで取り出して、ＨＬＢカラムに適用した。反応溶液をカラムに通した。反応容器を水１ｍＬですすぎ、これを次にカラムに移して、カラムに通した。カラムを１：１  ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏの２×２００μＬ部分で溶離して、生成物を、ｐＨ６に調製し、予め凍結乾燥したアスコルビン酸１５ｍｇを含入する３ｍＬバイアル中に単離した。反応容器中に残留した、ＨＬＢカラム上に、水洗浄液中に、そして１：１  ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ中に残存する放射能を測定することにより、収率を確定した。１：１  ＥｔＯＨ：Ｈ２Ｏ分画中の放射能の量を、他の分画からの総放射能で割ることにより、単離放射化学物質収率を得た。次に、ＲＰ−ＨＰＬＣにより放射能標識ペプチドを分析したが、これは、非結合１８Ｆが全ての場合に除去されることを示した。
【０３０７】
動力学的試験は、結合が１０７℃で５分以内に完了し（５分、６８％；１０分、６１％；１５分、７１％；および３０分、７５％）、３０分もの長い反応時間で単離収率が中等度に増大するに過ぎない、ということを示した。
【０３０８】
５０℃で実施したＩＭＰ４６７の放射能標識反応は、低温では結合は達成されない、ということを示した。
ＩＭＰ４６７の高線量放射能標識
【０３０９】
５μＬの２ｍＭ  Ａｌ３＋ストック溶液を５０μＬの１８Ｆ（１．３ＧＢｑ、３５ｍＣｉ）と混合し、その後、０．１ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．１）中の２ｍＭ  ＩＭＰ４６７  ２０μＬを付加した。反応溶液を１５分間１０４℃に加熱し、次いで、上記のようにＨＬＢカラム（〜１０分）上で精製して、１７ＧＢｑ／μｍｏｌ（４６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の比放射能で、放射化学物質収率６９％で、０．６８ＧＢｑ（１８．４ｍＣｉ）の精製ペプチドを単離した。反応時間は１５分、精製時間は１２分であった。反応は、１．３ＧＢｑ（３５ｍＣｉ）１８Ｆ精製の１０分後に開始され、したがって、１８Ｆの単離から精製最終物質までの総時間は３７分で、減衰を補正せずに収率５２％を得た。
ヒト血清安定性試験
【０３１０】
ＨＬＢ精製ペプチドのアリコート（〜３０μＬ）を２００μＬのヒト血清（予め凍結）で希釈し、３７℃  ＨＰＬＣ試料小室中に入れた。アリコートを種々の時点で取り出して、ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ分析は、３７℃で少なくとも５時間の血清中の１８Ｆ標識ペプチドの非常に高い安定性を示した（示されていない）。血清中で５時間インキュベーション後の１８Ｆ標識ペプチドの検出可能な分解は認められなかった（示されていない）。
【０３１１】
ＩＭＰ４６１およびＩＭＰ４６２リガンドはアルミニウムを結合するために利用可能な２つのカルボキシル基を有し、一方、ＩＭＰ４６７中のＮＯＴＡリガンドは４つのカルボキシル基を有した。血清安定性試験は、ＩＭＰ４６７に関する複合体がin vivo使用を反復する条件下で血清中で安定である、ということを示した。さらに、標識化ＩＭＰ４６７に関するin vivo体内分布試験は、１８Ｆ−Ａｌ標識ペプチドが実際のin vivo条件下で安定である、ということを示した。
【０３１２】
ＨＰＬＣ精製を必要とせずに、少なくとも１７ＧＢｑ／μｍｏｌの比放射能で、ペプチド上のＮＯＴＡリガンドと結合され得るＡｌ１８Ｆ錯体を形成することにより、ペプチドはＦで迅速に（３０分）且つ高収率で標識され得る。Ａｌ１８Ｆ  ＮＯＴＡ−ペプチドは、血清中で、ならびにin vivoで安定である。ＮＯＴＡリガンドの修飾は収率および比放射能の改善をもたらし得るが、一方、Ａｌ１８Ｆ−ＮＯＴＡ複合体のin vivo安定性を依然として保持し、そして親水性リンカーへの付着はペプチドの腎クリアランスを手助けする。さらに、この方法は、１８Ｆでペプチドを標識するために一般的に用いられるドライダウン工程を回避する。以下の実施例に示すように、この新規の１８Ｆ標識方法は、広範囲のターゲッティングペプチドの標識に適用可能である。
実施例１９．ＩＭＰ４７０の合成および標識
【０３１３】
ＩＭＰ４６７に関する結果により、Ｃ−ＮＥＴＡのより容易に利用可能な二機能性バージョンの評価が促された（図８）。テトラｔｅｒｔ−ブチルＬ−ＮＥＴＡ７への合成経路は（図７に図示）は、ＴＦＡを用いた１のＢｏｃ脱保護で開始し、その後、ｔ−ブチルブロモアセテートで２を二重アルキル化して、アルコール３を得る。３とＰＰｈ３／ＮＢＳとの反応により、臭化物４が生じる。ＣＨ３ＣＮ中の二置換ＴＡＣＮ５を、Ｋ２ＣＯ３を用いて４とカップリングすることにより、大環状物質６を得た。ほぼ定量的収率で、Ｐｄ／Ｃ上での水素添加を用いた２−Ｃｌ−Ｚ脱保護により、ｔｅｒｔ−ブチル保護化Ｌ−ＮＥＴＡ７が得られる。
【０３１４】
７におけるこの遊離アミンは、さらにイソチオシアネート、マレイミド、ブロモアセチルまたはスクシニルに転化されて、それを、腫瘍ターゲッティングペプチドまたは抗体または種々の他の潜在的ターゲッティング部分との共役に適した基にする。
ＩＭＰ４７０  Ｌ−ＮＥＴＡ−スクシニル−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２      ＭＨ＋１４９４．６８
【０３１５】
以下の順序で、以下のアミノ酸：Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを樹脂に付加し、Ａｌｏｃを切断し、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｂｕｔ）−ＯＨ、Ａｌｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｔｒｔ−ＨＳＧ−ＯＨを付加することにより、Sieberアミド樹脂上に、ペプチドＩＭＰ４７０を作製した。Ａｌｏｃの除去後に得られた遊離アミンを無水コハク酸と反応させて、Ｎ末端にカルボン酸基を生成したが、これは、ＤＭＦにおいてＤＩＣを用いて活性化され、その後、ｔｅｒｔ−ブチル保護化Ｌ−ＮＥＴＡ７と結合される。次いで、ペプチドを樹脂から切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、１６．４ｍｇのＩＭＰ４７０を得た。Ｌ−ＮＥＴＡを有さず、保持時間９．００１分を有するペプチドに対応する分子量１０３７．１５の生成物も得た。
【０３１６】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のために、１ｍＬ／分の流量で３０分間に亘って、１００％Ａ（０．１％ＴＦＡ）〜１００％Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％水、０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を用いて、PHENOMENEX（登録商標）GEMINI（商標）Ｃ１８逆相カラム（４．６×２５０ｍｍ）を装備したWATERS（登録商標）２６９５ＨＰＬＣ系。吸光度を２２０ｎｍで検出した。PERKIN ELMER（登録商標）６１０ＴＲ流動液体シンチレーション分析器により、放射能を測定した。
【０３１７】
ＩＭＰ４７０の２ｍＭ溶液を調製するために、２．５ｍｇ（１．６７μｍｏｌ）のＩＭＰ（Ｆ．Ｗ．１４９４．６８）ＧＧ２３−１１６−１３を０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０２）  ８３６μＬ中に溶解した。
【０３１８】
１８Ｆ標識のために、２ｍＭ  ＡｌＣｌ３溶液  ３μＬに、４０μＬのＦ−１８溶液（１．７３６ｍＣｉの１８Ｆ）を、その後、２０μＬ（４０ｎｍｏｌ）の２ｍＭ  ＩＭＰ４７０溶液を付加して、１５分間１０１℃に加熱した。逆相ＨＰＬＣ分析は、カラムのボイド容量で溶離された（２．７０分）放射能の２６．１０％（保持時間８．９０分）および４７．２９％（保持時間９．３０分）で２つの放射能標識ペプチドピークを示した（図示せず）。
【表１８】
0005608914.tif 000022
【０３１９】
１ｃｃ  WATERS（登録商標）ＨＬＢカラム中に反応溶液を移して、水で溶離して、非結合１８Ｆを除去し、その後、１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで１８Ｆ−標識ペプチドを溶離することにより、粗製標識ペプチドを精製した。粗反応溶液をＨＬＢカラムに通して５ｍＬバイアルに入れて、３×１ｍＬ分画の水で洗浄した（３６５μＣｉ）。次いで、ＨＬＢカラムを新しい３ｍＬバイアル上に載せて、２×２００μＬの１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離して、標識化ペプチド（７９０μＣｉ）を収集した。反応容器は１１．９３μＣｉの放射能を保持したが、一方、カラムは３．２μＣｉの放射能を保持した。収集された７９０μＣｉは、標識化ペプチドの６５．８３％が回収されたことを表す。
【０３２０】
ＨＬＢ精製１８Ｆ標識ペプチドのアリコートを、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。２つの生成物を検出した−８．９０分、４４．９３％；９．２０分、５５．０７％（１８Ｆはボイド容量中に検出されなかった）。
【表１９】
0005608914.tif 000023
３７℃での１８Ｆ標識ＩＭＰ４７０の血清安定性：
【０３２１】
ＨＬＢカラム精製１８Ｆ標識ペプチド  ６０μＬをヒト血清  １００μＬと混合し、全ＲＰ−ＨＰＬＣ分析中は試料を３７℃で保持した。
【表２０】
0005608914.tif 000024
【表２１】
0005608914.tif 000025
【表２２】
0005608914.tif 000026
【表２３】
0005608914.tif 000027
【０３２２】
要するに、大環状ＮＯＴＡおよび隣接ビス（カルボキシメチル）アミンを有する二機能性リガンドＬ−ＮＥＴＡと連結されるＨＳＧ含有ペプチド（ＩＭＰ４７０）は、Ａｌ１８Ｆで首尾よく標識された。４０ｎｍｏｌのＩＭＰ４７０を用いた１８Ｆ組み入れは６５．８３％であり、ＨＬＢカラム精製ペプチドは、３７℃で４時間、ヒト血清中で安定であった。同様の標識条件下で、４０ｎｍｏｌのＩＭＰ４６７に関する放射化学物質収率は７５．３４％であった。
実施例２０．ＩＭＰ４６９の合成
【０３２３】
図９に示した合成スキームを用いて、Ｓ−ＮＥＴＡ共役ターゲッティングペプチドＩＭＰ４６９を調製した。合成経路は、ｔ−ブチルブロモアセテートで１を二重アルキル化して開始し、アルコール２を得る。２とＰＰｈ３／ＮＢＳとの反応により、臭化物３が生じる。ＣＨ３ＣＮ中の二置換ＴＡＣＮ４を、ＤＩＥＡを用いて３とカップリングすることにより、大環状物質５を得た。ほぼ定量的収率で、Ｐｄ／Ｃ上での水素添加を用いたベンジル脱保護により、ｔｅｒｔ−ブチル保護化Ｓ−ＮＥＴＡ６が得られる。
（ｔ−ＢｕＯ−ＣＯ−ＣＨ２）２−Ｓｅｒ−ＯＢｚｌ：
【０３２４】
０℃のＤＭＦ（１００ｍＬ）中のＨ−Ｓｅｒ−ＯＢｚｌ・ＨＣｌ  ４．７９４５ｇ（２０．７０）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（５０ｍＬ）およびｔｅｒｔ−ブチルブロモアセテート（９ｍＬ、９０．９０ｍｍｏｌ）を２時間に亘って滴下した。その結果生じた混合物を、０℃で２時間、室温で４日間、撹拌した。溶媒を蒸発させて、粗製物をＥｔＯＡｃ中に溶解した。ＥｔＯＡｃ抽出物をＡＢＣ（ｐＨ５．３）、ＮａＨＣＯ３溶液、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濾過し、濾液を真空濃縮して、８．９６２ｇの黄色油を得た。
（ｔ−ＢｕＯ−ＣＯ−ＣＨ２）２−β−ブロモ−Ａｌａ−ＯＢｚｌ：
【０３２５】
０℃の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の（ｔ−ＢｕＯ−ＣＯ−ＣＨ２）−Ｓｅｒ−ＯＢｚｌ  ６．４９３ｇ（１５．３３）の溶液に、トリフェニルホスフィン（４．０３１９ｇ、１５．３７ｍｍｏｌ）およびＮ−ブロモスクシンイミド（２．７６９４ｇ、１５．５６ｍｍｏｌ）を１時間に亘って少量ずつ付加した。反応混合物を、０℃で３０分、室温で３時間、撹拌した。溶媒を蒸発させて、褐色油を、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、２３０〜４００メッシュ）により精製し、ヘキサン中の１０％ＥｔＯＡｃで溶離して、４．７７８ｇの褐色油を得た。
（ｔ−ＢｕＯ−ＣＯ−ＣＨ２）２−Ａｌａ（ＮＯＴＡ）−ＯＢｚｌ：
【０３２６】
ＣＨ３ＣＮ（３ｍＬ）中のＮＯ２ＡｔＢｕ  ８５．８ｇ（０．２４０ｍｍｏｌ）の溶液に、１００μＬのジイソプロピルエチルアミンおよび１５４ｍｇ（０．３１７ｍｍｏｌ）の（ｔ−ＢｕＯ−ＣＯ−ＣＨ２）２−β−ブロモ−Ａｌａ−ＯＢｚｌを付加し、その結果生じた溶液を室温で撹拌した。３１時間後、溶媒を蒸発させて、粗製物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、６７．８ｍｇの所望の生成物を得た。
（ｔ−ＢｕＯ−ＣＯ−ＣＨ２）２−Ａｌａ（ＮＯＴＡ）：
【０３２７】
２−プロパノール（５０ｍＬ）中の（ｔ−ＢｕＯ−ＣＯ−ＣＨ２）−Ａｌａ（ＮＯＴＡ）−ＯＢｚｌ  １６７．９ｇ（０．２２０ｍｍｏｌ）の溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ触媒（１４６．８ｍｇ）を付加した。その結果生じた溶液を、室温で５時間、Parr水素添加装置中で５０ｐｓｉでＨ２（ｇ）と掻き混ぜることにより、水素化分解に付した。反応混合物をセライトに通して濾過し、濾液を濃縮して、暗褐色油（１１５．４ｍｇ）を得た。
実施例２１．代替的ＮＯＴＡ誘導体キレート化部分
【０３２８】
ＩＭＰ４６７は、Chong等（2002, J Med Chem 45: 3458-64; 2008a, J Med
Chem 51: 118-25; 2008b, J Med Chem 51: 2208-15）に開示されたものと同様のＮＯＴＡ誘導体キレート化部分を含有し、これは、窒素から出たイミノ二酢酸基を有する（図１１Ａ）。ＩＭＰ４６７は、上記で検査した他のペプチドと比較して、Ａｌ１８Ｆに関する結合動力学の改善を示すと思われるため、付加的ＮＯＴＡ誘導体を合成し、それらのＡｌ１８Ｆ結合特性に関して調べた。多数のイミノ二酢酸基または代替的位置におけるイミノ二酢酸基の存在を調べた（図１１Ｂ）。誘導体の例を図１２に示す：窒素から出た１つのイミノ二酢酸基を含有するもの（図１２Ａ）；２つのイミノ二酢酸基（窒素から出たものと、炭素に付着したもの）（図１２Ｂ）；ならびに炭素から出た２つのイミノ二酢酸基（図１２Ｃ）。基が炭素から出る場合、ＤまたはＬ型のアミノ酸を用いて、基を互いに対してｓｙｎまたはａｎｔｉにするよう調整し得る。さらに、ペプチドにＮＯＴＡを付着するために用いられるカルボキシル基は、当該技術分野で既知の他の連結剤に取替えられ得る。リンカーは、図示されるように窒素を介して付着され得る（図１１Ｂ）、あるいはＩＭＰ４４９のようなＮＯＴＡ上の炭素原子を介して付着され得る。他の結合増強基（イミノ二酢酸以外）をリガンドに付着して、金属−フッ化物錯体の結合を改善し、あるいはフッ化物とリガンド中に既に存在する金属との結合を増強し得る。リガンドに対する他の金属結合増強基のいくつかの例は、Kimura等（1987, J. Chem.
Soc., Chem. Commun. 1712-14;1986, Pure & Appl. Chem. 58(11), 1461-66; 1990,
Inorg. Chem. 29, 4991-96; 1987, J. Am. Chem. Soc. 109, 5528-29; 1984, Inorg.
Chem. 23, 4181-88; 1989, Pure & Appl. Chem. 61(5), 823-8）により発表されている。
実施例２２.アルミニウムとともに予備インキュベートされたペプチドへの１８Ｆの付加による標識化
【０３２９】
アルミニウムと錯体形成した大環状ＮＯＴＡに連結されたＨＳＧ含有ペプチド（ＩＭＰ４６５、ＮＯＴＡ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２）を、Ｆ−１８で首尾よく標識した。４０ｎｍｏｌのＩＭＰ４６５を用いた１８Ｆ組み入れは、１３．２０％であった。中間体ペプチドＩＭＰ４６１を、上記と同様に作製した。次いで、２５．７ｍｇのＩＭＰ４６１を２ｍＬの脱イオン水中に溶解し、これに、１０．２ｍｇのＡｌＣｌ３・３Ｈ２Ｏを付加して、その結果生じた溶液を１時間１００℃に加熱した。粗反応混合物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、１９．６ｍｇのＩＭＰ４６５を得た。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を、上記と同様に実施した。
【０３３０】
ＩＭＰ４６５の２ｍＭ溶液を調製するために、１．５ｍｇ（１．１４μｍｏｌ）のＩＭＰ４６５（Ｆ．Ｗ．１３１８．４４）ＧＧ２３−０２６−８を０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．１８）  ５６９μＬ中に溶解した。
【０３３１】
１８Ｆ標識のために、５０μＬの１８Ｆ溶液［０．７０２ｍＣｉの１８Ｆ］および２０μＬ（４０ｎｍｏｌ）の２ｍＭ  ＩＭＰ４６５溶液を１７分間１０１℃に加熱した。逆相ＨＰＬＣ分析は、１５．３８％（ＲＴ約８．６０分）の放射能がペプチドに付着され、８４．６２％の放射能がカラムのボイド容量で溶離された（２．６０分）、ということを示す。
【表２４】
0005608914.tif 000028
【０３３２】
１ｃｃ  WATERS（登録商標）ＨＬＢカラム中に反応溶液を移して、水で溶離して、非結合１８Ｆを除去し、その後、１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで１８Ｆ−標識ペプチドを溶離することにより、粗製標識ペプチド（３７７μＣｉ）を精製した。粗反応溶液をＨＬＢカラムに通して５ｍＬバイアルに入れて、３×１ｍＬ分画の水で洗浄した（２８４μＣｉ）。次いで、ＨＬＢカラムを新しい３ｍＬバイアル上に載せて、２×２００μＬの１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離して、標識化ペプチド（４４．４μＣｉ、標識ペプチドの１３．２％）を収集した。反応容器は４．５４μＣｉの放射能を保持したが、一方、全ての溶離を実施した後、カラムは３．３９μＣｉの放射能を保持した。
【０３３３】
別個の実験において、１８Ｆ標識ペプチドの収率％は、付加ペプチド料を買えることにより改善し得た。この実験では、反応は全て、同量の１８Ｆを有する総容量６３μＬ中で実施した。ＩＭＰ４６５に関して観察された収率％は、１０ｎｍｏｌペプチドで０．２７％、２０ｎｍｏｌペプチドで１．８％および４０ｎｍｏｌペプチドで４９％であった。
【０３３４】
ＩＭＰ４６７は、１８Ｆへの曝露前にペプチドをアルミニウムとともに予備インキュベートした場合、ＩＭＰ４６１より高い収率を示した。ＩＭＰ４６７を室温でアルミニウムとともにインキュベートし、次いで、凍結し、凍結乾燥した。予備インキュベーションのために付加されるアルミニウムの量を変えた。
【表２５】
0005608914.tif 000029
【０３３５】
収率は、ＩＭＰ４６７がＡｌ１８Ｆ錯体の付加により標識される場合に得られるものに匹敵する。したがって、キレート化部分に既に結合されたアルミニウムを有するペプチドへの１８Ｆの付加による１８Ｆ標識化は、キレート化部分への付加前に１８Ｆとともに金属を予備インキュベートすることへの実現可能な代替的アプローチである。
実施例２３．ＩＭＰ４６８ボンベシンペプチドの合成および標識
【０３３６】
上記のように、１８Ｆ標識化標的部分は抗体または抗体断片に限定されないが、しかしむしろ、１８Ｆ  ＰＥＴにより画像診断され得る疾患状態または他の症状に関連した、またはその診断に用いられる細胞標的と特異的にまたは選択的に結合する任意の分子を含み得る。ボンベシンは、ニューロメジンＢおよびガストリン放出ペプチドと相同である１４アミノ酸ペプチド、ならびに肺癌および胃癌そして神経芽細胞腫のような癌に関する腫瘍マーカーである。ＩＭＰ４６８（ＮＯＴＡ−ＮＨ−（ＣＨ２）７ＣＯ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ２；配列番号２０）をボンベシン類似体として合成し、１８Ｆで標識して、ガストリン放出ペプチド受容体を標的にした。
【０３３７】
文献（Prasanphanich et
al., 2007, PNAS USA 104: 12463-467）で報告された合成スキームの変形を用いて、Sieberアミド樹脂上でのＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成により、ペプチドを合成した。合成は、樹脂上でのペプチド合成中にペプチドにビス−ｔ−ブチルＮＯＴＡリガンドを付加する、という点で異なった。これに対して、Prasanphanichの２００７年の報告は、ペプチドを先ず作製し、次いで、水溶液中で非保護化ＮＯＴＡと共役する、と記述した。
【０３３８】
ＩＭＰ４６８（０．０１３９ｇ、１．０２×１０−５ｍｏｌ）を、０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．１３）緩衝液  ２０３μＬ中に溶解した。ペプチドは溶解したが、しかし放置するとゲルを形成したので、したがって、ペプチドゲルを０．５Ｍ、ｐＨ４．１３のＮａＯＡｃ緩衝液６０９μＬおよびエタノール４０６μＬで希釈して、ペプチドの８．３５×１０−３Ｍ溶液を生じた。１８ＦをＱＭＡカートリッジ上で精製し、２００μＬ分画中の０．４Ｍ  ＫＨＣＯ３で溶離した。１８Ｆ重炭酸塩分画の各々を、氷酢酸１０μＬで中和した。精製１８Ｆ、４０μＬ、１．１３ｍＣｉを、０．１Ｍ  ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の２ｍＭ  ＡｌＣｌ３  ３μＬと混合した。ＩＭＰ４６８（５９．２μＬ、４．９４×１０−７ｍｏｌ）をＡｌ１８Ｆ溶液に付加し、１０８℃加熱ブロック中に１５分間入れた。粗生成物を水で希釈し、WATERS（登録商標）３０ｍｇ、１ｃｃ注射器外筒、ＨＬＢカラムに載せた。溶液を、真空下に置いたクリンプシールバイアル中に溶離した。反応バイアルを水１ｍＬですすぎ、これをＨＬＢカラムに付加した。次に、カラムを３×１ｍＬの水ですすいだ。カラムを空バイアルに移して、２×２００μＬの１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離して、精製１８Ｆ標識ペプチドを収率３４％で得た。
【表２６】
0005608914.tif 000030
総面積:                 21465.5
CPM
平均バックグラウンド:      59.0 CPM
非割当面積:        -16179.1
CPM
【０３３９】
過剰量の冷ペプチドを［Ａｌ１８Ｆ］標識ペプチドから分離することにより、比放射能を増大するためのin vivoターゲッティング試験ためにＨＰＬＣにより、標識化ペプチドを精製し得る。
【０３４０】
受容体結合競合試験のために、冷［Ａｌ１９Ｆ］標識ペプチドも調製した。０．０２Ｍ  ＡｌＣｌ３溶液（６０４μＬ、１．２０８×１０−５ｍｏｌ、０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中）を、０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中の０．１Ｍ  ＮａＦ（１．３０×１０−５ｍｏｌ）１３０μＬと混合した。Ａｌ１９Ｆ溶液を室温で１２分間インキュベートし、次いで、０．０１６５ｇ、１．２１×１０−５ｍｏｌのＩＭＰ４６８に付加した。溶液を、１０３℃加熱ブロック中で１６分間加熱した。粗生成物の分析的ＨＰＬＣは、一方が１３．８分で０．００３４ｇ（Ａｌ−ＩＭＰ４６８  ＭＨ＋１３９１）、もう一方が１４．８分で０．００６０ｇ（［Ａｌ１９Ｆ］ＩＭＰ４６８  ＭＨ＋１４１１）である（データは示さず）２つの主要生成物を示した。
実施例２４．１８Ｆ標識ボンベシンを用いた腫瘍の画像診断
【０３４１】
ＮＯＴＡ共役ボンベシン誘導体（ＩＭＰ４６８）を、上記のように調製した。Prasanphanich等（PNAS 104:
12462-12467, 2007）が実行したように、ＰＣ−３細胞と結合することから放射能標識化ボンベシンを遮断するその能力の試験を、われわれは開始した。われわれの初期の実験は、ＩＭＰ４６８がＰＣ−３細胞と結合することからボンベシンを特異的に遮断し得るか否かを確定することであった。ＩＭＰ３３３を非特異的対照として用いた。この実験では、３×１０６のＰＣ−３細胞を、一定量（〜５０，０００ｃｐｍ）の１２５Ｉ−ボンベシン（Perkin-Elmer）に曝露して、これに、漸増量のＩＭＰ４６８またはＩＭＰ３３３を付加した。５６〜０．４４ｎＭの範囲を、われわれの抑制濃度として用いた。
【０３４２】
結果は、Ｉ−ＢＢＮのＩＭＰ４６８との結合を遮断し得るが、しかし対照ペプチド（ＩＭＰ３３３）との結合は遮断し得ないことを示した（データ示さず）が、これは、ＩＭＰ４６８の特異性を実証している。Prasanphanichは３．２ｎＭでの彼等のペプチドに関するＩＣ５０を示したが、これは、ＩＭＰ４６８（２１．５ｎＭ）に関してわれわれが見出したものより約７倍低い。
【０３４３】
市販のＢＢＮペプチドを用いて、この実験を反復した。ＰＣ−３細胞との結合から１２５Ｉ−ＢＢＮを遮断するために、２５０〜２ｎＭの範囲に抑制ペプチドの量を増大した。ＩＭＰ４６８およびＢＢＮ陽性対照に関して非常によく似たＩＣ５０値を観察し、ＩＣ５０値は、以前に報告されたもの（３．２ｎＭ）より高い（３５．９ｎＭ）が、しかしＢＢＮ対照が達成したもの（２４．４ｎＭ）に近かった。
【０３４４】
in vivoターゲッティングを調べるために、ｓｃＰＣ３前立腺癌異種移植片保有ヌード雄マウスで、Ａｌ１８Ｆ  ＩＭＰ４６８の分布（単独対ボンベシンで遮断）を調べた。放射能標識のために、塩化アルミニウム（１０μＬ、２ｍＭ）、５１．９ｍＣｉの１８Ｆ（ＱＭＡカートリッジから）、酢酸および６０μＬのＩＭＰ４６８（エタノール／ＮａＯＡｃ中８．４５ｍＭ）を、１５分間１００℃で加熱した。反応混合物を逆相ＨＰＬＣ上で精製し、分画を０．２５分毎に収集した。分画４０および４１（３．５６、１．９１  ｍｃｉ）をプールし、溶媒交換のためにＨＬＢカラムに適用した。生成物を８００μＬ（）中で溶離し、９１０μＣｉがカラム上に残存した。飽和ＮａＣｌ中に展開されたＩＴＬＣは、０．１％非結合放射能を示した。
【０３４５】
６匹の腫瘍保有マウスの一群に、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８（１６７μＣｉ、〜９×１０−１０ｍｏｌ）を注射して、１．５時間後に剖検した。別の群の６匹のマウスには、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８投与の１８分前に、１００μｇ（６．２×１０−８ｍｏｌ）のボンベシンを静注した。第二の群も、注射の１．５時間後に剖検した。データは、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８による腫瘍の特異的標的化を示す（図１０）。［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８の１８分前にボンベシンが投与された場合、ペプチドの腫瘍取込みは低減される（図１０）。体内分布データは、少なくとも１．５時間の間の［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８のin vivo安定性を示す。ペプチド単独群中の動物＃１は、おそらくは夾雑物のために、わずかに高い脊椎および筋肉取込みを示した。ボンベシン遮断群中の動物＃２は、その群の他のマウスと比較して、いくつかの組織においてより高いペプチド取込みを示した。
【表２７】
0005608914.tif 000031
【０３４６】
おそらくは大型腫瘍中のより高い受容体発現のため、大きい腫瘍ほど、［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８のより高い取込みを示した。
【表２８】
0005608914.tif 000032
【０３４７】
上記の体内分布データは、Prasanphanich等により６８Ｇａで標識された同一ペプチドに関して報告されたものと同一範囲である［Ａｌ１８Ｆ］ＩＭＰ４６８腫瘍標的化を示した。結果は、抗体のほかにターゲッティング分子を用いて腫瘍中で上方調節される受容体を標的化するために、１８Ｆペプチド標識化方法がin vivoで用いられ得る、ということを実証する。この場合、ＩＭＰ４６８標的化は、天然リガンド−受容体相互作用を利用した。腫瘍標的化は、Ｐ＝０．００１３のＰ値で有意であった。多数のこのようなリガンド−受容体対が知られており、任意のこのような標的化相互作用は、本明細書中に記載される方法を用いて、１８Ｆ画像診断のための基礎を形成し得る。
実施例２５．ソマトスタチン類似体ＩＭＰ４６６の合成および標識化
【０３４８】
ソマトスタチンは、ソマトスタチン受容体タンパク質の分布を画像診断するために有用であるもう１つの非抗体標的化ペプチドである。ソマトスタチン類似体である１２３Ｉ標識オクトレオチドが、ソマトスタチン受容体発現腫瘍の画像診断のために用いられてきた（例えばKvols et al., 1993, Radiology 187: 129-33；Leitha et al., 1993, J Nucl Med 34: 1397-1402）。しかしながら、１２３Ｉは、それが高価で、物理的半減期が短く、且つ放射能標識化合物を調製するのが難しいため、画像診断のために広範に用いられてきたわけではない。本明細書中に記載される１８Ｆ標識化方法は、ソマトスタチン受容体発現腫瘍の画像診断のために選択され得る。
ＩＭＰ４６６  ＮＯＴＡ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒｏｌ  ＭＨ＋１３０５
【０３４９】
上記実施例に記載したように、標準Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成により、ＮＯＴＡ共役誘導体ソマトスタチン類似体オクトレオチド（ＩＭＰ４６６）を作製して、線状ペプチドを生成した。Ｃ末端Ｔｈｒｏｌ残基は、トレオニノールである。ＤＭＳＯで一晩処理することにより、ペプチドを環化した。
【０３５０】
ペプチド  ０．００７３ｇ、５．５９×１０−６ｍｏｌを、０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）緩衝液  １１１．９μＬ中に溶解して、ＩＭＰ４６６の０．０５Ｍ溶液を作製した。溶液は時間が経つとゲルを形成したので、したがって、さらに０．５ＭのＮａＯＡｃ緩衝液を付加することにより、０．０１２５Ｍに希釈した。
【０３５１】
１８ＦをＱＭＡカートリッジ上で精製し、０．４Ｍ  ＫＨＣＯ３中の１８Ｆ  ２００μＬを得た。重炭酸塩溶液を、氷酢酸１０μＬで中和した。中和１８Ｆ溶離物の４０μＬアリコートを２ｍＭ  ＡｌＣｌ３  ３μＬと混合し、その後、０．０１２５Ｍ  ＩＭＰ４６６溶液  ４０μＬを付加した。混合物を１０５℃で１７分間加熱した。次いで、反応溶液をカラム上に載せて、水（３ｍＬ）で非結合１８Ｆを洗い落とし、次いで、２×２００μＬの１：１  ＥｔＯＨ／水で放射能標識ペプチドを溶離することにより、反応物をWATERS  １ｃｃ（３０ｍｇ）ＨＬＢカラム上で精製した。ＨＬＢ精製後の放射能標識ペプチドの収率は、３４．６％であった。放射能標識ペプチドは２つの放射測定ピークを含有し、非標識化ＩＭＰ４６６保持時間に近いＨＰＬＣ保持時間を有した（示されていない）。
【０３５２】
in vitro競合検定のために、冷Ａｌ１９Ｆペプチドも調製した。放射能標識ＨＰＬＣおよび冷却Ａｌ１９Ｆペプチドはともに、２つのＡｌ１９Ｆ産物が形成されることを示した。これらはおそらくはジアステレオマーである。
【０３５３】
０．０２Ｍ  ＡｌＣｌ３（０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中７．１３×１０−６ｍｏｌ）３５６μＬを、０．５Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中の０．１Ｍ  ＮａＦ（７．１３×１０−６ｍｏｌ）７１．３μＬと混合することにより、冷Ａｌ１９Ｆ溶液を調製した。次いで、Ａｌ１９Ｆ溶液をペプチドＩＭＰ４６６、０．００９３ｇ（７．１３×１０−６ｍｏｌ）と混合し、１０３℃で１７分間加熱した。反応物は、ＨＰＬＣにより３つの主要ピークを生じた（１つは短い保持時間ピーク（１３．５分）、２つは長い保持時間ピーク（１４．８分および１４．９分））（示されていない）。ＩＭＰ４６６の保持時間は１４．７分であった。Ｃ１８逆相ＨＰＬＣにより、反応混合物を精製した。短い方の保持時間（１３．５分）物質は、ペプチド＋アルミニウムＭＨ＋１３２９に対応した。
【０３５４】
長い方の保持時間物質１４．８および１４．９分（０．００３７ｇ）は、ＭＨ＋１３４９を有するＡｌ１９Ｆペプチドに対応した。２つのＡｌ１８Ｆ物質が放射測定とレースで形成されるが、これは、冷ペプチドに関する２つのＡｌ１９Ｆ物質と対応する。
【表２９】
0005608914.tif 000033
実施例２６．Ｆ−およびＧａ−標識ＩＭＰ４６６による神経内分泌腫瘍の画像診断
【０３５５】
１８Ｆ対Ｇａ標識ソマトスタチン類似体ペプチドを用いて、そしてソマトスタチン受容体発現腫瘍に対して直接標的化して得られたＰＥＴ画像を比較するために、試験を実施した。
方法
【０３５６】
１８Ｆ標識化  −  上記の実施例に記載したようにＩＭＰ４６６を合成し、１８Ｆ標識したが、但し、ＩＭＰ４６６ペプチドの量を変えた（１００〜５００μｇ）。１８Ｆ標識ＩＭＰ４６６の分布を、６８Ｇａ標識ＩＭＰ４６６と比較した。
【０３５７】
６８Ｇａ標識化  −  ０．１Ｍ超高純度ＨＣｌ（J.T.
Baker, Deventer, The Netherlands）を用いて、ＴｉＯ２ベースの１，１１０  ＭＢｑ６８Ｇｅ／６８Ｇａ発生器（Cyclotron Co. Ltd., Obninsk, Russia）から溶離された６８ＧａＣｌ３で、ＩＭＰ４６６を標識した。５つの１ｍＬ分画を収集し、第二分画のアリコートをペプチド標識のために用いた。ＩＭＰ４６６を、１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０中に溶解した。４容量の６８Ｇａ溶離液（１２０〜２４０ＭＢｑ）を付加し、混合物を９５℃で２０分間加熱した。次いで、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを付加して最終濃度を５ｍＭにして、非組み入れ６８Ｇａ３＋を錯化した。６８Ｇａ標識ＩＭＰ４６６をOasisＨＬＢカートリッジ上で精製し、５０％エタノールで溶離した。
【０３５８】
ＨＰＬＣ分析  −  Agilent 1200システム（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）でのＲＰ−ＨＰＬＣにより、放射能標識ＩＭＰ４６６ペプチドを分析した。以下の緩衝液系を用いて、２ｍＬ／分の流量でＣ１８カラム（Onyx monolithic, 4.6×100 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA）を用いた：緩衝液Ａ：水中０．１％ｖ／ｖＴＦＡ；緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％ｖ／ｖＴＦＡ。勾配：０〜５分、９７％緩衝液Ａ、５〜３５分、８０％緩衝液Ｂ〜７５％緩衝液Ａ。直列型ＮａＩ放射線検出器（Raytest GmbH, Straubenhardt, Germany）を用いて、溶離液の放射能を監視した。Gina-starソフトウエア（バージョン２．１８、Raytest GmbH, Straubenhardt, Germany）を用いて、溶離プロフィールを分析した。
【０３５９】
オクタノル−水分配係数（ｌｏｇＰオクト／水）−放射能標識ペプチドの親油性を確定するために、約５０，０００ｄｐｍの放射能標識ペプチドを０．５ｍＬのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈した。等容量のオクタ乗るを付加して、二位相系を得た。この系を２分間渦巻き撹拌後、遠心分離（１００×ｇ、５分）により２つの層を分離した。３つの１００μＬ試料を各層から採取して、ウエル型ガンマ計数器（Wallac Wizard 3””, Perkin-Elmer,
Waltham, MA）で放射能を測定した。
【０３６０】
安定性−１０μＬの１８Ｆ標識ＩＭＰ４６６を、新鮮収集ヒト血清５００μＬ中でインキュベートし、３７℃で４時間インキュベートした。アセトニトリルを付加し、混合物を撹拌した後、１０００×ｇで５分間遠心分離して、血清タンパク質を沈殿させた。上清を、上記と同様にＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。
【０３６１】
細胞培養−４５００ｍｇ／ＬのＤグルコース、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Gibco Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA）中で、ＡＲ４２Ｊラット膵臓腫瘍細胞株を培養した。細胞を、５％ＣＯ２を有する加湿大気中で３７℃で培養した。
【０３６２】
ＩＣ５０確定−６ウエルプレート中のＤＭＥＭ培地、４５００ｍｇ／ＬのＤグルコース、１０％ウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン中で増殖させたＡＲ４２Ｊ細胞で、ＩＭＰ４６６の５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を確定した。結合緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝ＲＰＭＩ）中で、３７℃で１０分間、細胞をインキュベートして、非標識化ＩＭＰ４６６を、０．０１〜１０ｎｍｏｌの範囲の最終濃度で、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−オクトレオテート（５０，０００ｄｐｍ／２ｍｌ）と一緒に付加した。インターナライゼーションを防止するために、細胞を氷上で４時間インキュベートした。細胞を結合緩衝液で２回洗浄し、細胞を綿栓で採取して、細胞関連放射能をγ計数器で確定した。
【０３６３】
体内分布試験−雄ヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週）の右脇腹に、１０７細胞／ｍＬのＡＲ４２Ｊ細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍細胞接種の約２週間後、腫瘍が直径５〜８ｍｍになったら、３７０ｋＢｑの１８Ｆまたは６８Ｇａ標識ＩＭＰ４６６を静脈内投与した（ｎ＝５）。別個の群（ｎ＝５）に、１，０００倍モル過剰量の非標識化ＩＭＰ４６６を注射した。３匹のマウスの１群には、非キレート化［Ａｌ１８Ｆ］を注射した。注射後（ｐ．ｉ．）２時間で、ＣＯ２／Ｏ２窒息により、全マウスを殺した。当該器官を収集し、計量し、ガンマ計数器で計数した。組織１グラム当たりの注射用量のパーセンテージ（％ＩＤ／ｇ）を、各組織に関して算定した。動物実験は、地方動物福祉委員会により承認され、国の法令に従って実施された。
【０３６４】
ＰＥＴ／ＣＴ画像診断−ｓ．ｃ．ＡＲ４２Ｊ腫瘍を有するマウスに、１０ＭＢｑのＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６または６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６を静脈内注射した。ペプチド注射の１および２時間後に、１．５ｍｍの固有空間分解能を有するInveon動物ＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Siemens
Preclinical Solutions, Knoxville, TN）でマウスを走査した（Visser et al., JNM, 2009）。動物を、スキャナ中に仰臥位に入れた。ＰＥＴ放出スキャンを１５分に亘って獲得し、その後、解剖学的参照のためにＣＴスキャンを得た（空間分解能１１３μｍ、８０ｋＶ、５００μＡ）。以下のパラメーター：マトリックス２５６×２５６×１５９、ピクセルサイズ０．４３×０．４３×０．８ｍｍおよび０．５ｍｍのＭＡＰ priorで、順序集合期待値最大化３Ｄ／最大事後確率（ＯＳＥＭ３Ｄ／ＭＡＰ）アルゴリズムを用いるINVEON Acquisition Workplaceソフトウエア  バージョン１．２（Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN）を用いて、スキャンを再構成した。
【０３６５】
統計学的分析−平均値は全て、±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）で示される。GraphPad InStatソフトウエア（バージョン４．００、GraphPad Software）を用いた、ウエルチの補正された対応のないｔ検定または分散分析を用いて、統計学的分析を実施した。有意のレベルは、ｐ＜０．０５に設定した。
結果
【０３６６】
緩衝液の作用−ＩＭＰ４６６の標識効率に及ぼす緩衝液の作用を調べた。ＩＭＰ４６６を、クエン酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）または４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液中に、１０ｍｇ／ｍＬ（７．７ｍＭ）で溶解した。全緩衝液のモル数は１Ｍで、ｐＨは４．１であった。２００μｇ（１５３ｎｍｏｌ）のＩＭＰ４６６に、１００μＬのＡｌ−Ｆ−１８（ｐＨ４）を付加し、１００℃で１５分間インキュベートした。放射能標識収率および比放射能を、ＲＰ−ＨＲＬＣで確定した。酢酸ナトリウム、ＭＥＳまたはＨＥＰＥＳを用いた場合、放射能標識収率は、それぞれ４９％、４４％および４６％であった。クエン酸ナトリウムの存在下で、標識化は観察されなかった（＜１％）。標識化反応を酢酸ナトリウム緩衝液中で実行した場合、調製物の比放射能は１０，０００ＧＢｑ／ｍｍｏｌであったが、一方、ＭＥＳおよびＨＥＰＥＳ緩衝液中では、それぞれ２０，５００および１６，５００ＧＢｑ／ｍｍｏｌの比放射能を得た。
【０３６７】
ＡｌＣｌ３濃度の作用−酢酸ナトリウム中のＡｌＣｌ３の３つのストック溶液（ｐＨ４．１）を調製した：０．２、２．０および２０ｍＭ。これらの溶液から、３μＬを２００μＬの１８Ｆに付加して、［Ａｌ１８Ｆ］を形成した。これらの試料に、１５３ｎｍｏｌのペプチドを付加し、１００℃で１５分間インキュベートした。最終濃度６ｎｍｏｌでのＡｌＣｌ３のインキュベーション後の放射能標識収率は、４９％であった。０．６ｎｍｏｌのＡｌＣｌ３および６０ｎｍｏｌのＡｌＣｌ３を用いたインキュベーションは、放射能収率の強度の低減（それぞれ１０％および６％）を生じた。
【０３６８】
ペプチド量の作用−標識効率に及ぼすペプチド量の作用を調べた。ＩＭＰ４６６を、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．１）中に、７．７ｍＭ（１０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶解し、３８、１５３または３６３ｎｍｏｌのＩＭＰ４６６を２００μＬ［Ａｌ１８Ｆ］（５８１〜６０３ＭＢｑ）に付加した。放射能標識収率は、ペプチド量増大に伴って増大した。３８ｎｍｏｌでは、放射能標識収率は４〜８％の範囲であり、１５３ｎｍｏｌでは、収率は４２〜４９％に増大し、最高濃度では、放射能標識収率は４８〜５２％であった。
【０３６９】
オクタノール−水分配係数−１８Ｆおよび６８Ｇａ標識ＩＭＰ４６６の親油性を確定するために、オクタノール−水分配係数を確定した。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６に関するｌｏｇＰオクタノール／水値は、−２．４４±０．１２であり、６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の値はマイナス３．７９±０．０７であったが、これは、１８Ｆ標識ＩＭＰ４６６がわずかに低親水性であったことを示す。
【０３７０】
安定性−１８Ｆ標識ＩＭＰ４６６は、ヒト血清中で３７℃で４時間インキュベート後に１８Ｆの放出を示さなかったが、これは、Ａｌ１８Ｆ−ＮＯＴＡ複合体の優れた安定性を示す。
【０３７１】
体内分布試験−Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６および６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の両方の体内分布を、注射後２時間に，ｓ．ｃ．ＡＲ４２Ｊ腫瘍を有するヌードＢＡＬＢ／ｃマウスで試験した（図１３）。Ａｌ１８Ｆを、対照として含めた。１８Ｆ−ＩＭＰ４６６の腫瘍標的化は高く、注射後２時間で２８．３±５．７％ＩＤ／ｇで蓄積される。過剰量の非標識化ＩＭＰ４６６の存在下での取り込みは８．６±０．７％ＩＤ／ｇであったが、これは、腫瘍取込みが受容体媒介性であったことを示す。血中レベルは非常に低く（０．１０±０．０７％ＩＤ／ｇ、注射後２時間）、２９９±８８という腫瘍対血液比を生じる。器官における取込みは低く、副腎、膵臓および胃のような受容体発現器官においては特異的取込みを示す。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６の骨取込みは非キレート化Ａｌ１８Ｆの取込みと比較して取るに足りない（それぞれ注射後２時間で、０．３３±０．０７対３６．９±５．０％ＩＤ／ｇ）が、これは、１８Ｆ標識ＮＯＴＡ−ペプチドの良好なin vivo安定性を示す。
【０３７２】
Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６の体内分布を、６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の分布と比較した（図１３）。６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の腫瘍取込み（２９．２±０．５％ＩＤ／ｇ、注射後２時間）は、ＡｌＦ−ＩＭＰ４６６の取込みと類似した（ｐ＜０．００１）。６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の肺取込みは、１８Ｆ−ＩＭＰ４６６より２倍高かった（それぞれ、４．０±０．９％ＩＤ／ｇ対１．９±０．４％ＩＤ／ｇ）。さらに、６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６の腎臓保持は、Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６よりわずかに高かった（それぞれ、１６．２±２．８６％ＩＤ／ｇ体９．９６±１．２７％ＩＤ／ｇ）。
【０３７３】
融合ＰＥＴおよびＣＴスキャンを、図１４に示す。ＰＥＴスキャンは、体内分布データを裏付けた。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４６６および６８Ｇａ−ＩＭＰ４６６はともに、腫瘍における高い取込み、ならびに腎臓における保持を示した。腎臓中の放射能は、主に腎臓皮質中に限局された。さらにまた、骨取込みは観察されなかったため、Ａｌ１８Ｆは、ＮＯＴＡキレート剤により安定的にキレート化されることを立証した。
【０３７４】
図１４は、ソマトスタチン（オクトレオチド）の１８Ｆ標識類似体の分布が６８Ｇａ標識ソマトスタチン類似体の分布を模倣する、ということを明らかに示す。神経内分泌性腫瘍を有するヒト被験者における６８Ｇａ標識オクトレオチドＰＥＴ画像診断は、感度９７％、特異性９２％および精度９６％で、慣用的ソマトスタチン受容体シンチグラフィーおよび診断用ＣＴと比較して有意に高い検出率を有することが示されているため、これらの結果は有意である（例えば、Gabriel et al., 2007, J Nucl Med 48: 508-18）。６８Ｇａ標識オクトレオチドによるＰＥＴ画像診断は、１１１Ｉｎ標識オクトレオチドを用いたＳＰＥＣＴ分析より優れていると、ならびに小さな髄膜種でさえその検出に対して高感受性であると報告されている（Henze et al., 2001, J Nucl Med 42: 1053-56）。１８Ｆと比較して６８Ｇａのエネルギーの方が高いため、１８ＦベースのＰＥＴ画像診断は６８ＧａベースのＰＥＴ画像診断より良好な空間分解能を示す、と予期される。これは、１８Ｆ標識ＩＭＰ４６６（図１４、左）対６８Ｇａ標識ＩＭＰ４６６（図１４、右）で得られる腎臓画像を比較することにより、図１４に例示する。６８Ｇａで得られるＰＥＴ画像は、１８Ｆで得られる画像より拡散した縁およびより低い分解能を示す。これらの結果は、本明細書中に記載される方法および組成物を用いて調製される１８Ｆ標識標的化部分で得られる優れた画像を実証し、非抗体標的化ペプチドに関して記載された１８Ｆ標識化技法の有用性を確証する。
実施例２７．プレターゲッティングを用いた６８Ｇａおよび１８Ｆ  ＰＥＴ画像診断の比較
【０３７５】
上記のように調製される二重特異性ＴＦ２抗体でプレターゲッティングされた６８Ｇａ−または１８Ｆ標識ペプチドを用いて得られるＰＥＴ画像を、われわれは比較した。６８Ｇａ（ｔ1/2＝６８分）および１８Ｆ（ｔ1/2＝１１０分）の半減期は、時間内に腫瘍におけるその最大増大に達するため、放射能標識ペプチドの薬物動態と一致する。さらに、６８Ｇａは６８Ｇｅ／６８Ｇａ発生器から容易に入手可能であり、一方、１８Ｆは最も一般的に用いられ、ＰＥＴで広範に利用可能な放射性核種である。
方法
【０３７６】
ｓ．ｃ．ＣＥＡ発現ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有するマウスに、ＴＦ（６．０ｎｍｏｌ；０．９４ｍｇ）、および５ＭＢｑの６８Ｇａ標識ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ）または１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９（０．２５ｎｍｏｌ）を、二重特異性抗体と放射能標識ペプチドの注射の間に１６時間の間隔で静脈内投与した。放射能標識ペプチドの注射の１または２時間後に、ＰＥＴ／ＣＴ画像を獲得し、放射能標識ペプチドの体内分布を確定した。ＬＳ１７４Ｔ腫瘍中の取込みを，ｓ．ｃ．ＣＥＡ陰性ＳＫ−ＲＣ５２腫瘍中の取込みと比較した。プレターゲッティングイムノＰＥＴ画像診断を、ｓ．ｃ．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍および体側に炎症大腿筋を有するマウスにおいて、１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴ画像診断と比較した。
【０３７７】
プレターゲッティング−上記のようなＤＮＬ法により、二重特異性ＴＦ２抗体を作製した。ＴＦ２は、ｈ６７９抗体からの１つのＨＳＧ結合Ｆａｂと、ｈＭＮ−１４抗体からの２つのＣＥＡ結合Ｆａｂ断片を含む三価二重特異性抗体である。固定ＬＳ１７４Ｔ細胞に関するLindmo検定（Lindmo et
al., 1984, J Immunol Methods 72: 77-89）で確定されたＣＥＡとの結合のためのＴＦ２の免疫反応性分画は、８５％であった。上記のように、ＤＯＴＡ共役、ＨＳＧ含有ペプチドＩＭＰ２８８を合成し、精製した。上記のように合成されたＩＭＰ４４９ペプチドは、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）キレート部分を含有して、１８Ｆによる標識化を促す。抗体構成成分のためのトレーサーとして、ヨードゲン法（Fraker and Speck, 1978, Biochem Biophys Res Comm 80: 849-57）により、ＴＦ２を１２５Ｉ（Perkin Elmer, Waltham, MA）で、５８ＭＢｑ／ｎｍｏｌの比放射能に標識した。ＰＤ−１０カラム（GE Healthcare
Bio-sciences AB, Uppsala, Sweden）上で、ＰＢＳ、０．５％ｗ／ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma Chemicals, St. Louis, MO, USA）で反応混合物を溶離することにより、１２５Ｉ標識ＴＦ２を精製した。
【０３７８】
ＩＭＰ２８８の標識−厳密な無金属条件下で、３２ＭＢｑ／ｎｍｏｌの比放射能で、体内分布試験のために１１１Ｉｎ（Covidient, Petten, The Netherlands）でＩＭＰ２８８を標識した。無金属バイアル中の０．２５Ｍ酢酸アンモニウム（ＮＨ４Ａｃ）緩衝液、ｐＨ５．６中に溶解した１２μｇのＩＭＰ２８８に１１  ＭＢｑ１１１Ｉｎを付加した後、混合物を加熱ブロック中で９５℃で２０分間インキュベートした。その後、１０μＬの５０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を付加して、遊離１１１Ｉｎを錯化した。０．１Ｍ超高純度ＨＣｌを用いて、ＴｉＯ２ベースの１，１１０  ＭＢｑ６８Ｇｅ／６８Ｇａ発生器（Cyclotron Co. Ltd., Obninsk, Russia）から溶離された６８Ｇａで、ＩＭＰ２８８を標識した。５つの１ｍＬ分画を収集し、第二分画をペプチド標識のために用いた。１容量の１．０Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．０を、３．４ｎｍｏｌ  ＩＭＰ２８８に付加した。４容量の６８Ｇａ溶離液（３８０ＭＢｑ）を付加し、混合物を９５℃で２０分間加熱した。次いで、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを付加して最終濃度を５ｍＭにして、非キレート化６８Ｇａ３＋を錯化した。６８Ｇａ標識ＩＭＰ２８８を１ｍＬ  OasisＨＬＢカートリッジ（Waters,
Milford, MA）上で精製した。カートリッジを水で洗浄後、ペプチドを２５％エタノールで溶離した。６８ＧａでＩＭＰ２８８を標識するための手順を４５分以内に実施し、調製物はin vivo使用のために準備が出来た。
【０３７９】
ＩＭＰ４４９の標識−上記のように１８ＦでＩＭＰ４４９を標識した。５５５〜７４０ＭＢｑ１８Ｆ（B.V. Cyclotron VU, Amsterdam, The Netherlands）を、０．４Ｍ  ＫＨＣＯ３でＱＭＡカートリッジから溶離した。０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４中の２ｍＭ  ＡｌＣｌ３  ３μＬを含入するバイアル中に、４つの２００μＬ分画を収集した。最高放射能を有する分画を用いた。Ａｌ１８Ｆ放射能を、ペプチド（２３０μｇ）およびアスコルビン酸（１０ｍｇ）を含入するバイアルに付加した。混合物を、１００℃で１５分間インキュベートした。３０分で９７％Ａ〜１００％Ｂの線形勾配（緩衝液Ａ：水中０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ；流量３ｍＬ／分）で溶離されるPhenomenex OnyxモノリシックＣ１８カラム（Torrance,
CA, USA）上でのＲＰ−ＨＰＬＣにより、反応混合物を精製した。１容量の水を付加後、１ｍＬ  OasisＨＬＢカートリッジ上でペプチドを精製した。水で洗浄後、放射能標識ペプチドを５０％エタノールで溶離した。１８Ｆ−ＩＭＰ４４９を６０分以内に調製した。調製物はin vivo使用のために準備が出来た。
【０３８０】
放射能標識調製物の品質管理−移動相として０．１Ｍクエン酸塩緩衝液、ｐＨ６．０を用いて、シリカゲル・ストリップ（Pall Life Sciences, Ann Arbor, MI）上での即時の薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）を用いて、放射化学純度を確定した。移動相として０．１５Ｍ  ＮＨ４Ａｃ、ｐＨ５．５：ＭｅＯＨの１：１ｖ／ｖ溶液を用いて、ＩＴＬＣ−ＳＧにより、放射能標識ペプチドのコロイド含量を確定した。ＲＰ  Ｃ１８カラム（ALLTIMA, ５μｍ、４．６×２５０ｍｍ、Alltech,
Deerfield, IL, USA）上でのＲＰ−ＨＰＬＣ（Agilent
１１００シリーズ、Agilent
Technologies, Palo Alto, CA）により、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８、６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８および１８Ｆ−ＩＭＰ４４９を分析した。カラムを、１．０ｍｌ／分の流量で、９７％Ａおよび３％〜１００％Ｂの線形勾配（緩衝液Ａ：水中０．１％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）で、１５分間に亘って、カラムを溶離した。試験で用いた１２５Ｉ−ＴＦ２、１１１Ｉｎ−および６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８、ならびにＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９調製物の放射化学純度は、常に９５％を超えた。
【０３８１】
動物実験−体重２０〜２５グラムの雄ヌードＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）で、実験を実施した。マウスに、１×１０６個のＬＳ１７４Ｔ細胞（ＣＥＡ発現ヒト結腸癌腫細胞株（American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA））の懸濁液０．２ｍＬを皮下注射した。腫瘍が約０．１〜０．３ｇの大きさになった時点（腫瘍接種後１０〜１４日目）で、試験を開始した。
【０３８２】
ＴＦ２およびＩＭＰ２８８注射間の間隔は１６時間であったが、それは、循環から非結合ＴＦ２を除去するのに十分な期間であったからである。いくつかの試験では、１２５Ｉ−ＴＦ２（０．４ＭＢｑ）を、非標識化ＴＦ２と同時注射した。ＩＭＰ２８８を、１１１Ｉｎまたは６８Ｇａで標識した。ＩＭＰ４４９を、１８Ｆで標識した。マウスに、ＴＦ２およびＩＭＰ２８８を静脈内投与した（０．２ｍＬ）。６８Ｇａ標識ペプチドの注射の１時間後、ならびに１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の注射の２時間後、ＣＯ２／Ｏ２によりマウスを安楽死させて、心臓穿刺により血液を採取し、組織を切り出した。
【０３８３】
１．５ｍｍの固有空間分解能を有するInveon動物ＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Siemens Preclinical Solutions,
Knoxville, TN）で、ＰＥＴ画像を獲得した（１６）。動物を仰臥位で、スキャナー中に入れた。解剖学的参照のためにＣＴスキャンを先行して、１５分間、ＰＥＴ放出スキャンを獲得した（空間分解能１１３μｍ、８０ｋＶ、５００μＡ、曝露時間３００ミリ秒）。以下のパラメーター：マトリックス２５６×２５６×１５９、ピクセルサイズ０．４３×０．４３×０．８ｍｍおよび０．５ｍｍのＭＡＰ prior  βで、３Ｄ順序集合期待値最大化／最大事後確率（ＯＳＥＭ３Ｄ／ＭＡＰ）アルゴリズムを用いるINVEON Acquisition Workplaceソフトウエア（バージョン１．２、Siemens Preclinical Solutions, Knoxville, TN, USA）を用いて、スキャンを再構成した。
【０３８４】
画像診断後、当該腫瘍および器官を切断し、計量し、１２５Ｉ、１１１Ｉｎ、６８Ｇａまたは１８Ｆに関して適切なエネルギーウィンドウを有するガンマ計数器で計数した。注射用量パーセンテージ／組織１グラム（％ＩＤ／ｇ）を算定した。
【０３８５】
統計学的分析−GraphPad InStatソフトウエア（バージョン４．００、GraphPad Software）を用いた、非パラメーター両側マン・ホイットニー検定を用いて、統計学的分析を実施した。有意のレベルは、ｐ＜０．０５に設定した。
結果
【０３８６】
１時間以内に、プレターゲッティングイムノＰＥＴは腫瘍中のＧａ−ＩＭＰ２８８の高く且つ特異的な標的化を生じた（１０．７±３．６％ＩＤ／ｇ）が、正常組織中（例えば、腫瘍／血液  ６９．９±３２．３）、ＣＥＡ陰性腫瘍（０．３５±０．３５％ＩＤ／ｇ）および炎症筋肉（０．７２±０．２０％ＩＤ／ｇ）中で非常に低い取込みを示した。ＴＦ２でプレターゲッティングされていない腫瘍も、低い６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８取込みを有した（０．２０±０．０３％ＩＤ／ｇ）。［１８Ｆ］ＦＤＧは腫瘍中で効率的に増大した（７．４２±０．２０％ＩＤ／ｇ）が、しかし炎症筋肉中（４．０７±１．１３％ＩＤ／ｇ）および多数の正常組織においても増大し、したがって、プレターゲッティング６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８は、良好な特異性および感受性を提供した。ＴＦ２によるプレターゲッティング後に６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８または１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９を投与したマウスの対応するＰＥＴ／ＣＴ画像は、皮下ＬＳ１７４Ｔ腫瘍中の放射能標識ペプチドの効率的標的化を明らかに示したが、一方、炎症筋肉は可視化されなかった。これに対して、［１８Ｆ］ＦＤＧに関しては、腫瘍ならびに炎症は明白に描写された。
【０３８７】
用量最適化−固定０．０１ｎｍｏｌ（１５ｎｇ）用量のＩＭＰ２８８の腫瘍標的化に及ぼすＴＦ２  ｂｓＭＡｂ用量の作用を確定した。５匹のマウスの群に、微量の１２５Ｉ（０．４ＭＢｑ）で標識された０．１０、０．２５、０．５０または１．０ｎｍｏｌのＴＦ２（それぞれ、１６、４０、８０または１６０μｇ）を静脈内注射した。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８（０．０１ｎｍｏｌ、０．４ＭＢｑ）の注射の１時間後に、放射能標識の体内分布を確定した。
【０３８８】
ＴＦ２は、血液および正常組織から迅速に出て行った。注射の１８時間後、血中濃度は、試験した全てのＴＦ２用量で、０．４５％ＩＤ／ｇ未満であった。腫瘍におけるＴＦ２の標的化は、注射後２時間で３．５％ＩＤ／ｇで、ＴＦ２用量とは無関係であった（データは示されていない）。１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８取込みの結果を、図１５に要約する。全ＴＦ２用量で、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８は腫瘍中に有効に蓄積した。高ＴＦ２用量では、腫瘍における１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８の取込み増強が観察された：１．０ｎｍｏｌＴＦ２用量では、ＩＭＰ２８８の最大標的化に到達した（２６．２±３．８％ＩＤ／ｇ）。したがって、０．０１ｎｍｏｌペプチド用量では、最高腫瘍標的化および標的対血液比が、１．０ｎｍｏｌの最高ＴＦ２用量で到達された（ＴＦ２：ＩＭＰ２８８モル比＝１００：１）。正常組織の間で、腎臓は、ＴＦ２用量の影響を受けなかった。他の正常組織は全て、非常に低い取込みを示して、試験した全てのＴＦ２用量で５０：１を超える極端に高い腫瘍対非腫瘍比を生じた。
【０３８９】
注射後１時間でＰＥＴ画像診断が実施される場合、５〜１０ＭＢｑの６８Ｇａの最小放射能がマウス当たりで注射される必要があるため、６８Ｇａ標識ＩＭＰ２８８を用いたＰＥＴ画像診断のためには、より高いペプチド用量を要する。６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８調製物の比放射能は、注射時点で５０〜１２５ＭＢｑ／ｎｍｏｌであった。したがって、ＰＥＴ画像診断のためには、少なくとも０．１〜０．２５ｎｍｏｌのＩＭＰ２８８が投与されなければならなかった。同一ＴＦ２：ＩＭＰ２８８モル比を、０．１ｎｍｏｌのＩＭＰ２８８用量で試験した。１．０、２．５、５．０または１０．０ｎｍｏｌのＴＦ２（１６０、４００、８００または１６００μｇ）を注射することにより、ＬＳ１７４Ｔ腫瘍をプレターゲッティングした。低ペプチド用量での結果と対比して、腫瘍中の１１１Ｉｎ−ＩＭＰ２８８取込みはＴＦ２用量の影響を受けなかった（試験した全用量で１５％ＩＤ／ｇ、データは示されていない）。％ＩＤ／ｇに換算した腫瘍におけるＴＦ２標的化は、用量が高いほど低減した（それぞれ、１．０ｎｍｏｌおよび１０．０ｎｍｏｌの注射用量で、３．２１±０．６１％ＩＤ／ｇ対１．１６±０．２７％ＩＤ／ｇ）。腎臓取込みも、ｂｓＭＡｂ用量とは無関係であった（２％ＩＤ／ｇ）。これらのデータに基づいて、腫瘍に対する０．１〜０．２５ｎｍｏｌのＩＭＰ２８８の標的化に関して、６．０ｎｍｏｌというｂｓＭＡｂ用量を、われわれは選択した。
【０３９０】
ＰＥＴ画像診断−ＣＥＡ発現腫瘍を画像処理するためのＴＦ２および６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８によるプレターゲッティングイムノＰＥＴ画像診断の有効性を実証するために、皮下腫瘍を５匹のマウスにおいて誘導した。右脇腹に、ｓ．ｃ．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を誘導し、一方、同時に、同一マウスにおいて、１×１０６個のＳＫ−ＲＣ５２細胞を左脇腹に接種して、ＣＥＡ陰性腫瘍を誘導した。１４日後、腫瘍が０．１〜０．２ｇのサイズになったら、マウスを、６．０ｎｍｏｌの１２５Ｉ−ＴＦ２で静脈内にプレターゲッティングした。１６時間後、マウスに５ＭＢｑの６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ、比放射能２０ＭＢｑ／ｎｍｏｌ）を投与した。３匹のマウスの別個の群には、同量の６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８単独を投与し、ＴＦ２でプレターゲッティングしなかった。６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の注射の１時間後に、マウスのＰＥＴ／ＣＴスキャンを獲得した。
【０３９１】
マウスにおける１２５Ｉ−ＴＦ２および６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の体内分布を、図１６に示す。さらにまた、ｂｓＭＡｂ（２．１７±０．５０％ＩＤ／ｇ）およびペプチド（１０．７±３．６％ＩＤ／ｇ）の高取込みが腫瘍において観察されたが、正常組織においては取込みは非常に低かった（腫瘍対血液比：６４±２２）。ＣＥＡ陰性腫瘍ＳＫ−ＲＣ５２における６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の標的化は、非常に低かった（０．３５±０．３５％ＩＤ／ｇ）。同様に、ＴＦ２でプレターゲッティングされなかった腫瘍は、６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の低取込みを有した（０．２０±０．０３％ＩＤ／ｇ）が、これは、ＣＥＡ発現ＬＳ１７４Ｔ腫瘍におけるＩＭＰ２８８の特異的蓄積を示す。
【０３９２】
６８Ｇａ標識ペプチドの注射の１時間後に得られたＰＥＴ画像において、ＴＦ２でプレターゲッティングされたＣＥＡ発現腫瘍における６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の特異的取込みが明瞭に可視化された（示されていない）。最大強度の５０％閾値を用いて、対象領域（ＲＯＩ）を抜き出すことにより、腫瘍における取込みを定量的に評価した。腹部の領域を、バックグラウンド領域として用いた。ＴＦ２および６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８を投与されたマウスの画像における腫瘍対バックグラウンド比は、３８．２であった。
【０３９３】
次に、［１８Ｆ］ＦＤＧによるプレターゲッティングイムノＰＥＴを、われわれは調べた。５匹のマウスの２つの群において、ｓ．ｃ．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を右後足に誘導し、左大腿筋中の炎症病巣を５０μＬのテルペンチンの筋肉内注射により誘導した（１８）。テルペンチン注射の３日後に、マウスの１群に、６．０ｎｍｏｌのＴＦ２を投与し、１６時間後、５ＭＢｑの６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８（０．２５ｎｍｏｌ）を投与した。他の群には、［１８Ｆ］ＦＤＧ（５ＭＢｑ）を投与した。注射前の１０時間の間はマウスを絶食させて、麻酔して、注射後１時間の安楽死まで、３７℃で温保持した。
【０３９４】
炎症筋肉中の６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の取込みは非常に低かったが、一方、同一動物における腫瘍中の取込みは高かった（０．７２±０．２０％ＩＤ／ｇ対８．７３±１．６０％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０５、図１７）。炎症筋肉中の取込みは、肺、肝臓および脾臓中の取込みと同一範囲であった（それぞれ、０．５０±０．１４％ＩＤ／ｇ、０．７２±０．０７％ＩＤ／ｇ、０．４４±０．１０％ＩＤ／ｇ）。これらのマウスにおける６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８の腫瘍対血液比は６９．９±３２．３であった；炎症筋肉対血液比は５．９±２．９であった；腫瘍対炎症筋肉比は１２．５±２．１であった。マウスの他の群では、１８Ｆ−ＦＤＧは腫瘍中で効率的に増大した（７．４２±０．２０％ＩＤ／ｇ、腫瘍対血液比６．２４±１．５、図４）。１８Ｆ−ＦＤＧも、炎症筋肉中に実質的に蓄積し（４．０７±１．１３％ＩＤ／ｇ）、炎症筋肉対血液比は３．４±０．５、腫瘍対炎症筋肉比は１．９７±０．７１であった。ＴＦ２によるプレターゲッティング後のＧａ−ＩＭＰ２８８を投与されたマウスの対応するＰＥＴ／ＣＴ画像は、腫瘍中の放射能標識ペプチドの効率的増大を明白に示したが、一方、炎症筋肉は可視化されなかった（図１８）。これに対して、１８Ｆ−ＦＤＧを投与されたマウスの画像に関して、腫瘍、ならびに炎症が可視的であった（図１８）。６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８を投与されたマウスでは、腫瘍対炎症組織比は５．４であった；腫瘍対バックグラウンド比は４８であった；炎症筋肉対バックグラウンド比は８．９であった。［１８Ｆ］ＦＤＧ取込みは０．８３の腫瘍対炎症筋肉比を有した；腫瘍対バックグラウンド比は２．４であった；炎症筋肉対バックグラウンド比は２．９であった。
【０３９５】
Ａｌ１８Ｆ標識ＩＭＰ４４９を用いて、プレターゲッティングイムノＰＥＴ画像診断法を試験した。５匹のマウスに、６．０ｎｍｏｌのＴＦ２を投与し、１６時間後、５ＭＢｑのＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９（０．２５ｎｍｏｌ）を投与した。別の３匹には、５ＭＢｑのＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９を投与し、ＴＦ２の前投与はしなかったが、一方、２匹の対照マウスには、［Ａｌ１８Ｆ］（３ＭＢｑ）を注射した。この実験の結果を、図１９に要約する。ＴＦ２でプレターゲッティングされた腫瘍におけるＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の取込みは高かった（１０．６±１．７％ＩＤ／ｇ）が、一方、それは非プレターゲッティングマウスでは非常に低かった（０．４５±０．３８％ＩＤ／ｇ）。［Ａｌ１８Ｆ］は骨中に蓄積した（５０．９±１１．４％ＩＤ／ｇ）が、一方、骨における放射能標識ＩＭＰ４４９ペプチドの取込みは非常に低かった（０．５４±０．２％ＩＤ／ｇ）が、これは、Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９がin vivoで安定であったことを示す。ｓ．ｃ．ＬＳ１７４Ｔ腫瘍を有するＴＦ２プレターゲッティングマウスにおけるＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の体内分布は、Ｇａ−ＩＭＰ２８８の分布と高度に類似した。
【０３９６】
ＡｌＦ−ＩＭＰ４４９を用いたプレターゲッティングイムノＰＥＴのＰＥＴ画像は、６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８を用いたものと同一の腫瘍における強度を示すが、しかし１８Ｆ画像の分解能は６８Ｇａ画像より優れていた（図２０）。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９シグナルの腫瘍対バックグラウンド比は６６であった。
結論
【０３９７】
本試験は、抗ＣＥＡ×抗ＨＳＧ二重特異性抗体ＴＦ２を６８Ｇａ−または１８Ｆ−標識ジ−ＨＳＧ−ＤＯＴＡ−ペプチドと組合せて用いたプレターゲッティングイムノＰＥＴは、ＣＥＡ発現腫瘍のＰＥＴ画像診断のための迅速且つ特異的技法である、ということを示した。
【０３９８】
ＴＦ２を６８Ｇａ−ＩＭＰ２８８またはＡｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９と組合せて用いるプレターゲッティングイムノＰＥＴは、２回の静脈内投与を包含する。１６時間というｂｓＭＡｂと放射能標識ペプチドの融合間の間隔を用いた。１６時間後、ＴＦ２のほとんどが血液から除去されて（血中濃度＜１％ＩＤ／ｇ）、循環中のＴＦ２とＩＭＰ２８８の複合体形成を防止する。
【０３９９】
これらの試験のために、６８ＧａでＩＭＰ２８８を標識する手順を最適化して、一工程標識化技法を生じた。Ｃ１８／ＨＬＢカートリッジは、９５℃で１５０Ｇｂｑ／ｎｍｏｌを超える比放射能でペプチドが標識される場合に形成される６８Ｇａコロイドを除去するために必要とされる、ということをわれわれは見出した。調製物が小パーセンテージのコロイドを含有し、静脈内投与される場合、６８Ｇａコロイドは単核食細胞系（肝臓、脾臓および骨髄）の組織中に蓄積し、画像の質を悪くする。６８Ｇａ標識ペプチドは、Ｃ１８−カートリッジ上で迅速に精製され得る。投与のための放射能標識および精製は、４５分以内に成し遂げられ得る。
【０４００】
６８Ｇａの半減期は、プレターゲッティング系におけるＩＭＰ２８８ペプチドの動力学と一致する：腫瘍の最大増大は、１時間以内に到達される。６８Ｇａを、６８Ｇｅ／６８Ｇａ発生器から１日２回溶離して、オンサイト・サイクロトロンの必要性を回避する。しかしながら、６８Ｇａにより放出されるポジトロンの高エネルギー（１．９ＭｅＶ）は、獲得画像の空間分解能を３ｍｍに限定するが、一方、マイクロＰＥＴ系の固有分解能は１．５ｍｍという低さである。
【０４０１】
ＰＥＴにおいて最も広範に用いられる放射性核種である１８Ｆは、プレターゲッティングＰＥＴ画像診断のためのより好ましい半減期を有する（ｔ1/2＝１１０分）。ＮＯＴＡ共役ペプチドＩＭＰ４４９を、上記のように１８Ｆで標識した。６８Ｇａによる標識化と同様に、それは一工程手順である。５０％という高い標識化収率を得た。Ａｌ１８Ｆ−ＩＭＰ４４９の体内分布は６８Ｇａ標識ＩＭＰ２８８と高度に類似したが、これは、この標識方法では、１８Ｆは残留核種である、ということを示唆する。
【０４０２】
ＦＤＧ−ＰＥＴと対比して、プレターゲッティング放射免疫検出は腫瘍特異的画像診断様式である。再発性結腸直腸癌病変の検出におけるＦＤＧ−ＰＥＴに対する高感受性および特異性が患者において報告されている（Huebner et al., 2000, J Nucl Med 41: 11277-89）が、しかし、炎症に伴って観察されたこうれべるノ標識化により示されるように、ＦＤＧ−ＰＥＴ画像は、悪性疾患を良性病変と区別するに際して診断的ジレンマを生じ得る。これに対して、ＴＦ２６８Ｇａ−または１８Ｆ−標識ペプチドによるプレターゲッティングイムノＰＥＴを用いた高い腫瘍対バックグラウンド比ならびにＣＥＡ陽性腫瘍の明瞭な可視化は、癌および他の症状の臨床的画像診断に関して記載された方法の使用を支持する。転移を検出すること、ならびにＣＥＡ陽性腫瘍を他の病変と区別することのほかに、プレターゲッティングイムノＰＥＴは、プレターゲッティング放射免疫療法の前に腫瘍および正常組織への放射線量送達を概算するためにも用いられ得る。ＴＦ２がヒト化抗体である場合、それは低免疫原性を有し、多数の画像診断または治療サイクルのための道を開く。
実施例２８．葉酸ＮＯＴＡ共役体の合成
【０４０３】
葉酸を、上記のように活性化して（Wang et
al. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 56-62）、Ｂｏｃ−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２と共役する。クロマトグラフィーにより、共役体を精製する。次いで、ＴＦＡで処理して、Ｂｏｃ基を除去する。次に、アミノ葉酸塩誘導体を、炭酸塩緩衝液中でｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡ（大環状物質）と混合する。次いで、生成物を、ＨＰＬＣにより精製する。葉酸塩−ＮＯＴＡ誘導体を、前記実施例に記載したようにＡｌ１８Ｆで標識して、次に、ＨＰＬＣ精製する。１８Ｆ標識葉酸塩を、被験者に静脈内注射して、例えば癌または炎症性疾患における葉酸塩受容体の分布を画像化するために首尾よく用いる（例えば、Ke et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 56: 1143-60, 2004参照）。
実施例２９．ヒトにおけるプレターゲッティングＰＥＴ画像診断
【０４０４】
再発性腫瘍を有する疑いのある患者（対表面積１．７ｍ２）に、１７ｍｇの二重特異性モノクローナル抗体（ｂｓＭａｂ）を注射する。ｂｓＭａｂを標的に局在させて、血中から除去する。ｂｓＭａの９９％が血液から除去された場合、１８Ｆ標識ペプチド（５．７×１０−９ｍｏｌに５〜１０ｍＣｉ）を注射する。ＰＥＴ画像診断は、微小転移性腫瘍の存在を示す。
実施例３０．１８Ｆ標識による血管新生受容体の画像診断
【０４０５】
標識化Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドは、αｖβ３インテグリンが関与する、例えば、虚血性組織における、血管新生の画像診断のために用いられてきた（Jeong et al., J. Nucl. Med. 2008, Apr. 15 epub）。Jeong et al. (2008)に従って、ＲＧＤをＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡと共役させる。標識化反応を完了させるために過剰量のペプチドを用いて、アルミニウムストック溶液を１８Ｆおよび誘導体化ＲＧＤペプチドと混合し、１１０℃で１５分間加熱することにより、上記のように［Ａｌ１８Ｆ］をＮＯＴＡ誘導体化ＲＧＤペプチドに付着する。１８Ｆ標識ＲＧＤペプチドを、Jeong et al.(2008)に開示されたように、in vivo体内分布およびＰＥＴ画像診断のために用いる。ＲＧＤ−ＮＯＴＡの［Ａｌ１８Ｆ］共役体を虚血性組織中に取り上げて、血管新生のＰＥＴ画像診断を提供する。
実施例３１．腎流量画像診断のための１８Ｆ標識ＮＯＴＡの使用
【０４０６】
アルミニウムストック溶液（ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ４）中の０．０５Ｍ、２０μＬ）を、ＱＭＡ精製１８Ｆ  ２００μＬと混合する。次に、［Ａｌ１８Ｆ］溶液を、５００μＬの０．２Ｍ  ＮＯＴＡ（ｐＨ４）と混合し、１５分間加熱する。次いで、注射用に、試料をＰＢＳ  ５ｍＬ中に希釈する。腎流量画像診断を上首尾で実行するために、１８Ｆ標識ＮＯＴＡを直接用いる。
実施例３２．炭水化物標識化
【０４０７】
ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡをヒドラジンと反応させ、次いで、ＨＰＬＣによりリガンドを精製することにより、ＮＯＴＡチオセミカルバジド誘導体を調製する。前記実施例に記載したように［Ａｌ１８Ｆ］を調製し、［Ａｌ１８Ｆ］をＮＯＴＡチオセミカルバジドに付加して、１５分間加熱する。任意に、［Ａｌ１８Ｆ］ＮＯＴＡチオセミカルバジド複合体を、ＨＰＬＣにより精製する。［Ａｌ１８Ｆ］ＮＯＴＡチオセミカルバジドを、既知の方法により酸化炭水化物と共役させる。ＰＥＴスキャニングを用いた画像診断試験のために、１８Ｆ標識炭水化物を上首尾に用いる。
実施例３３．脂質標識化
【０４０８】
アルデヒドを含む脂質を、実施例３２の［Ａｌ１８Ｆ］ＮＯＴＡチオセミカルバジドと共役させて、１８Ｆ標識脂質を、ＰＥＴスキャニングを用いた上首尾の画像診断試験のために用いる。
【０４０９】
代替的実施形態では、アミノ基を含む脂質を、ｐ−ＳＣＮ−Ｂｎ−ＮＯＴＡと反応させる。ＮＯＴＡ標識脂質を、上記の実施例に記載したように［Ａｌ１８Ｆ］と反応させる。１８Ｆ標識脂質を、ＰＥＴスキャニングを用いた上首尾の画像診断試験のために用いる。
実施例３４．アプタマー標識化
【０４１０】
アルデヒドを含むアプタマーを、実施例３２の［Ａｌ１８Ｆ］ＮＯＴＡチオセミカルバジドと共役させる。１８Ｆ標識アプタマーを被験者に投与し、ＰＥＴスキャニングを用いた上首尾の画像診断試験のために用いる。
実施例３５．Ｆ−１８標識化に及ぼす有機溶媒の作用
【０４１１】
アルミニウムに対するＮＥＴＡおよびＮＯＴＡのようなキレート部分の親和性は、１８Ｆに対するアルミニウムの親和性より非常に高い。他の対イオンの存在が、正荷電アルミニウムおよび負荷電フッ化物イオンを互いから遮蔽し、したがってイオン結合の強度を低減する傾向があるため、１８Ｆに対するＡｌの親和性は、溶液のイオン強度のような因子により影響を及ぼされる。したがって、低イオン強度媒質は、Ａｌおよび１８Ｆの有効な結合を増大するはずである。おそらくは、媒質の親水性を低減するための、媒質への有機溶媒の付加は、イオン結合の強度も増大し得る、と考えられた。
【０４１２】
１８Ｆ反応物にエタノールを付加する初期試験は、放射能標識ペプチドの収率を増大することが判明した。ＩＭＰ４６１を、実施例１５に従って調製した。
【表３０】
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【０４１３】
予備的結果は、反応混合物へのエタノールの付加が１８Ｆ標識ペプチドの収率を非常に倍増する、ということを示した。表３０は、ＩＭＰ４６１のキレート部分への［Ａｌ１８Ｆ］の組み入れを促進するために、加熱の代わりにマイクロ波照射を用い得る、ということも示す。６０秒のマイクロ波放射（＃３）は、５分間１０１℃に加熱することよりわずかに低く（１８％）有効であると思われた。
【０４１４】
ペプチドの１９Ｆ標識化に及ぼす付加的溶媒の作用を調べた。各々の場合、反応体の濃度は同一であり、溶媒のみが変化した。反応条件は、２５μＬのＮａ１９Ｆ＋２０μＬのＡｌＣｌ３＋２０μＬのＩＭＰ−４６１＋６０μＬの溶媒を混合し、その後、１０１℃で５分間加熱することを包含した。表３１は、溶媒の存在が［Ａｌ１９Ｆ］ＩＭＰ−４６１（ＩＭＰ４７３）の収率をかなり改善する、ということを示す。
【表３１】
0005608914.tif 000035
【０４１５】
ＲＰ−ＨＰＬＣ分析：PHENOMENEX（登録商標）GEMINI（商標）Ｃ１８逆相カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、１１０Å）を装備したWATERS（登録商標）２６９５ＨＰＬＣ系、１ｍＬ／分の流量で、５分で１００％Ａ（０．１％ＴＦＡ）〜９０％Ａ、１６分で９０％Ａ〜２０％Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％水、０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を使用。WATERS（登録商標）ＰＤＡ２９９６検出器を用いて、吸光度を２２０ｎｍで検出した（実行時間：２０分）。
実施例３６．重炭酸塩による１８Ｆの溶離
【０４１６】
１８Ｆ（１０．４３ｍＣｉ）を、注射器中２ｍＬ中に入れた。溶液をSEP-PAK（登録商標）LIGHT,
WATERS（登録商標）ACCELL（商標）Plus QMAカートリッジに通した。次に、カラムを５ｍＬの脱イオン水で洗浄した。１８Ｆを、以下に示すような分画中の０．４ＭのＫＨＣＯ３で溶離した。
【表３２】
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【０４１７】
ＩＭＰ−４６１の１８Ｆ標識化に及ぼす付加的溶媒（ＣＨ３ＣＮ）の量の作用を、調べた。各々の場合、反応体の濃度は同一であり、溶媒のみが変化した。反応条件は、１０μＬのＡｌＣｌ３＋２０μＬの１８Ｆ＋２０μＬのＩＭＰ−４６１＋ＣＨ３ＣＮを混合し、その後、１０１℃で５分間加熱することを包含した。表３２は、初期改善後、標識化効率が過剰量の溶媒の存在下で低減する、ということを示す。
表３３．種々の量のＣＨ３ＣＮを用いたＩＭＰ４６１の１８Ｆ標識化
【表３３】
0005608914.tif 000037
＊  水性洗浄液は標識化ペプチドを含有する。ＲＣＹ＝ＨＬＢ精製後の放射化学収率
実施例３７．ＩＭＰ４６１の高線量放射能標識化
【０４１８】
１８Ｆ（１６３ｍＣｉ）を、注射器中２ｍＬ中に入れた。溶液をSEP-PAK（登録商標）LIGHT,
WATERS（登録商標）ACCELL（商標）Plus QMAカートリッジに通した。次に、カラムを５ｍＬの脱イオン水で洗浄した。１８Ｆを、表３３に示すような分画中の０．４ＭのＫＨＣＯ３で溶離した。
表３４．高線量標識化
【表３４】
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【０４１９】
塩化アルミニウム溶液（１０μＬ、２ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中２ｍＭ）を、表３３からのバイアル番号３に付加した。ペプチド（２０μＬ、２ｍＭ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４）中２ｍＭ）をバイアルに付加し、その後、１７０μＬのＣＨ３ＣＮを付加した。溶液を１０３℃で１０分間加熱し、６ｍＬの水で希釈した。溶液を１０ｍＬ注射器中に引き入れて、タンデム配列された２つのWATERS（登録商標）ＨＬＢ Plusカートリッジ上に注入した。カートリッジを８ｍＬの水で洗浄した。次に、放射能標識ペプチドＡｌ１８Ｆ  ＩＭＰ４６１を１０ｍＬの１：１  ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏで溶離した。３０．３ｍＣｉ、収率６３．５％、比放射能７５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ。
【０４２０】
標識化ペプチドは、ＨＰＬＣにより、非結合１８Ｆを含有しなかった。総反応および精製時間は、２０分であった。
実施例３８．１９Ｆ標識ペプチドの調製
【０４２１】
２７Ａｌおよび／または１９Ｆを含有する物質は、ＮＭＲ画像診断のようなある種の用途に有用である。［Ａｌ１９Ｆ］標識化合物を調製するための改良型方法を開発した。ＩＭＰ４６１を実施例１５に記載したように調製し、１９Ｆで標識した。ＩＭＰ４６１をＡｌＣｌ３＋ＮａＦと反応させて、３ｔの生成物を形成した（示されていない）。しかしながら、ＩＭＰ４６１をＡｌＦ３・３Ｈ２Ｏと反応させることにより、より高い収率の［Ａｌ１９Ｆ］ＩＭＰ４６１を得た。
【０４２２】
ＩＭＰ４７３の合成：（［Ａｌ１９Ｆ］ＩＭＰ４６１）  ２ｍＬのＮａＯＡｃ（２ｍＭ、ｐＨ４．１８）溶液中の（１４．１ｍｇ、１０．９０μｍｏｌ）ＩＭＰ４６１に、（４．５１ｍｇ、３２．６８μｍｏｌ）ＡｌＦ３・３Ｈ２Ｏおよび５００μＬのエタノールを付加した。１ＮのＮａＯＨ  ３μＬを用いて、溶液のｐＨを４．４６に調整し、沸騰水浴中で３０分間加熱した。粗反応混合物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製して、４．８ｍｇ（３２．９％）のＩＭＰ４７３を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ＭＨ＋理論値：１３３７．６３４１；実測値：１３３７．６３３２
【０４２３】
PHENOMENEX（登録商標）GEMINI（商標）Ｃ１８逆相カラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ、１１０Å）を装備したWATERS（登録商標）２６９５ＨＰＬＣ系、１ｍＬ／分の流量で、２０分で１００％Ａ（０．１％ＴＦＡ）〜２０％Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％水、０．１％ＴＦＡ）の線形勾配を使用。WATERS（登録商標）ＰＤＡ２９９６検出器を用いて、吸光度を２２０ｎｍで検出した。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ上で２つの近接溶離ピークを観察下が、これは、他の［Ａｌ１８Ｆ］標識ペプチドに関して観察されたようなジアステレオマーの存在を示す。
【０４２４】
これらの結果は、１８Ｆ標識化に関して上記したように、金属−１９Ｆ錯体を形成し、金属−１９Ｆをキレート部分と結合することにより、１９Ｆ標識分子を調製し得る、ということを実証する。当該実施例は、プレターゲッティング検出、診断および／または画像診断に有用な標的化ペプチドが当該方法を用いて調製され得る、ということを示す。
実施例３９．Ａｌ１８ＦまたはＡｌ１９Ｆを用いた他の補欠分子族標識方法
【０４２５】
ある実施形態では、感熱性である分子に関する補欠分子族標識方法を用いて、フッ化アルミニウム標識方法を実施し得る。補欠分子族共役を、感熱性分子に関して低い温度で実行し得る。
【０４２６】
補欠分子族ＮＯＴＡを上記のように１８Ｆまたは１９Ｆで標識し、次いで、それを標的分子に付着する。一非限定例では、これを、標的分子上のアミノ−オキシ化合物にその後付着されるアルデヒドＮＯＴＡを用いて実施する。代替的には、アミノ−オキシマレイミドをアルデヒドと反応させて、次に、マレイミドを標的分子上のシステインに付着する（Toyokuni et al., 2003, Bioconj Chem 14: 1253）。
【０４２７】
別の代替的方法では、ＡｌＦ−キレート剤複合体を、クリック化学により標的分子に付着する。リガンドを先ず、上記のようにＡｌ１８ＦまたはＡｌ１９Ｆで標識する。次に、ＡｌＦ−キレート剤を、下記のようにクリック化学により標的分子と共役させる。例えば、アルキンＮＯＴＡを、Marik and Stucliffe (2006, Tetrahedron Lett 47: 6681)に従って標識し、アジド含有標的化剤と共役させる。
【化４】
0005608914.tif 000039
【０４２８】
別の代替的実施形態では、アジドはキレート剤部分上にあり、アルキンは標的化剤上にある（Glaser and Arstad, 2007, Bioconj Chem 18: 989）。
【化５】
0005608914.tif 000040
【図１】
0005608914.tif 000041
【図２】
0005608914.tif 000042
【図３】
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【図４】
0005608914.tif 000044
【図５】
0005608914.tif 000045
【図６】
0005608914.tif 000046
【図７】
0005608914.tif 000047
【図８】
0005608914.tif 000048
【図９】
0005608914.tif 000049
【図１０】
0005608914.tif 000050
【図１１】
0005608914.tif 000051
【図１２】
0005608914.tif 000052
【図１３】
0005608914.tif 000053
【図１４】
0005608914.tif 000054
【図１５】
0005608914.tif 000055
【図１６】
0005608914.tif 000056
【図１７】
0005608914.tif 000057
【図１８Ａ】
0005608914.tif 000058
【図１８Ｂ】
0005608914.tif 000059
【図１８Ｃ】
0005608914.tif 000060
【図１８Ｄ】
0005608914.tif 000061
【図１９】
0005608914.tif 000062
【図２０（Ａ）】
0005608914.tif 000063
【図２０（Ｂ）】
0005608914.tif 000064
【図２０（Ｃ）】
0005608914.tif 000065
【配列表】
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