(57)【要約】  脊髄ｄｏｒｓａｌ  ｈｏｒｎおよび小脳において、ＧＡＢＡニューロン前駆細胞の選択的マーカー６５Ｂ１３を同定し、該遺伝子によってコードされるタンパク質と結合する抗体を用いて、ＧＡＢＡニューロン前駆細胞を分離することに成功した。６５Ｂ１３は、脊髄ｄｏｒｓａｌ  ｈｏｒｎおよび小脳のＧＡＢＡ産生ニューロン前駆細胞を分離するためのマーカーとして有用であることが示された。同定されたマーカーを指標とすることにより、ＧＡＢＡニューロン前駆細胞を効率的に識別もしくは単離することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出する方法：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているポリヌクレオチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項１に記載の方法：
（ａ）被験細胞試料と請求項１で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドからなるプローブとを接触させる工程；および 
（ｂ）反応性の有無を検出する工程。
【請求項３】
工程（ａ）において、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を、プローブと接触させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
請求項１で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項１に記載の方法：
（ａ−１）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、請求項１で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーまたは請求項１で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて遺伝子増幅法を実施する工程；および
（ｂ−１）形成された増幅産物を検出する工程。
【請求項５】
工程（ａ−１）において、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を鋳型として用いる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、検出する工程の後に、検出物からGABA産生ニューロン前駆細胞を分離する工程を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
さらに、Corl1遺伝子、Pax2、Lim1/2遺伝子、Lbx1遺伝子およびCorl2遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現を指標として、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択される工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する方法：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項９】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させることによって該マーカータンパク質の該ｍＲＮＡを転写させて翻訳される該マーカータンパク質を検出する工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する方法：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項１０】
認識するタンパク質を検出する工程が、下記工程を含んでなる、請求項８または９に記載の方法：
（ｄ）被験細胞試料と請求項８または９で選択されるタンパク質と結合する抗体とを接触させる工程； および
（ｅ）反応性の有無を検出する工程。
【請求項１１】
検出する工程の後に、検出物からGABA産生ニューロン前駆細胞を分離する工程を含んでなる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項８で選択されるタンパク質以外のGABA産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質が、Corl1遺伝子、Pax2、Lim1/2遺伝子、Lbx1遺伝子およびCorl2遺伝子からなる群から選択される遺伝子でコードされるタンパク質である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
以下（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出することが可能なプローブ、プライマーまたはプライマーセットを含んでなるGABA産生ニューロン前駆細胞を検出するためのキット：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
さらに、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
さらに、小脳細胞または脊髄細胞を含む請求項１３または１４記載のキット。
【請求項１６】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するためのキット：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項１７】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパクに翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させたポリヌクレオチドを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するためのキット。
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項１８】
さらに、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子でコードされるタンパク質に結合する抗体との組合せを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための請求項１６または１７記載のキット。
【請求項１９】
さらに、小脳細胞または脊髄細胞を含む請求項１６〜１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２０】
識別の対象となる小脳細胞がプルキンエ細胞である、請求項１５または１９に記載のキット。
【請求項２１】
識別の対象となる脊髄細胞がdI4またはdILAである、請求項１５または１９に記載のキット。
【請求項２２】
下記工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法：
（Ｉ）GABA産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（ＩＩ）以下に記載のポリヌクレオチドの発現を検出する工程：
下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択される、ヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができる、GABA産生ニューロン前駆細胞のポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２３】
（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）でポリヌクレオチドの発現を検出した化合物を選択する工程、を更に含んでなる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
下記工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法：
（ＩＶ）GABA産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（Ｖ）以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項２５】
下記工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法：
（ＩＶ−１）GABA産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（Ｖ−１）以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させることによって該マーカータンパク質の該ｍＲＮＡを転写させて翻訳される該マーカータンパク質を検出する工程：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項２６】
（ＶＩ）工程（Ｖ）でタンパク質を検出した化合物を選択する工程、を更に含んでなる請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
GABA産生ニューロン前駆細胞集団の製造方法であって、
（ＶＩＩ）GABA産生ニューロン前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を用いて、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出または選択された細胞を増殖する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２８】
GABA産生ニューロン前駆細胞が、脊髄損傷治療用または小脳変性症治療用のGABA産生ニューロン前駆細胞である請求項２７の製造方法。
【請求項２９】
工程
（ＶＩＩ）GABA産生ニューロン前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法を用いて、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出された細胞を増殖する工程
で得られるGABA産生ニューロン前駆細胞集団。
【請求項３０】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットを含んでなるGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３１】
さらに、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドとの組合せを含む、小脳細胞または脊髄細胞を検出または選択するための請求項３０記載の試薬。
【請求項３２】
さらに、小脳細胞または脊髄細胞を含む請求項３０または３１記載の試薬。
【請求項３３】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項３４】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させたポリヌクレオチドを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項３５】
さらに、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子でコードされるタンパク質に結合する抗体との組合せを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための請求項３３または３４に記載の試薬。
【請求項３６】
さらに、小脳細胞または脊髄細胞を含む請求項３３〜３５のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項３７】
識別の対象となる小脳細胞がプルキンエ細胞である、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項３８】
識別の対象となる脊髄細胞がdI4またはdILAである、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項３９】
小脳変性症または脊髄損傷の再生医療に使用するためのGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４０】
GABA産生ニューロン前駆細胞が、脊髄または小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞である請求項３９記載のGABA産生ニューロン前駆細胞の検出または選択するためのポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項３９または４０記載のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドからなる、請求項３９または４０に記載の検出または選択するためのポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項３９または４０記載のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドからなる、請求項３９または４０に記載の検出または選択するためのポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の検出するためのポリヌクレオチドからなる、プローブ。
【請求項４４】
請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の検出用ポリヌクレオチドからなる、プライマー。
【請求項４５】
請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の二種以上の検出用ポリヌクレオチドからなる、プライマーセット。
【請求項４６】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する、小脳変性症または脊髄損傷の再生医療に使用するためのGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための抗体。：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項４７】
GABA産生ニューロン前駆細胞が、小脳細胞または脊髄細胞のGABA産生ニューロン前駆細胞である請求項４６記載の抗体。
【請求項４８】
配列番号：２、４、３８、４０、４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目、配列番号：３４若しくは３６で表されるアミノ酸配列の２０番目〜５１３番目、配列番号：４６若しくは４８で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４６０番目、または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４９０番目のアミノ酸配列の少なくとも連続した６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドと結合する抗体である、請求項４６または４７に記載の抗体。
【請求項４９】
抗体が、少なくとも６アミノ酸残基からなるポリペプチドと結合する抗体である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５０】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドによって検出または選択された、小脳変性症または脊髄損傷の再生医療に使用するためのGABA産生ニューロン前駆細胞：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５１】
GABA産生ニューロン前駆細胞が、脊髄または小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞である請求項５０記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
【請求項５２】
ポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項５０または５１記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
【請求項５３】
ポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項５０または５１記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
【請求項５４】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体によって検出または選択された、小脳変性症または脊髄損傷の再生医療に使用するためのGABA産生ニューロン前駆細胞。：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項５５】
GABA産生ニューロン前駆細胞が、小脳細胞または脊髄細胞のGABA産生ニューロン前駆細胞である請求項５４記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
【請求項５６】
抗体が、配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目のアミノ酸配列の少なくとも連続した６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドと結合する抗体である、請求項５４または５５に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
【請求項５７】
抗体が、少なくとも６アミノ酸残基からなるポリペプチドと結合する抗体である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
【請求項５８】
小脳変性症または脊髄損傷を治療する方法であって、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドによって検出または選択されたGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５９】
GABA産生ニューロン前駆細胞が、脊髄または小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞である請求項５８記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
【請求項６０】
ポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項５８または５９に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
【請求項６１】
ポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、請求項５８または５９に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
【請求項６２】
小脳変性症または脊髄損傷を治療する方法であって、以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体によって検出または選択されたGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
【請求項６３】
GABA産生ニューロン前駆細胞が、小脳細胞または脊髄細胞のGABA産生ニューロン前駆細胞である請求項６２記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
【請求項６４】
抗体が、配列番号：２、４、３８、４０、４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目、配列番号：３４若しくは３６で表されるアミノ酸配列の２０番目〜５１３番目、配列番号：４６若しくは４８で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４６０番目、または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４９０番目のアミノ酸配列の少なくとも連続した６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドと結合する抗体である、請求項６２または６３に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
【請求項６５】
抗体が、少なくとも６アミノ酸残基からなるポリペプチドと結合する抗体である、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、GABAニューロン前駆細胞マーカー遺伝子65B13の提供、並びに、GABAニューロン前駆細胞を識別するための該遺伝子の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳は非常に多様な神経細胞が複雑なネットワークを形成することで機能している。その破綻は各種神経疾患に繋がるが、治療法として移植再生治療が検討されつつある。この際まず大切なことは移植材料中の神経細胞の種類を正確に同定できることであり、また、安全性や治療効果の向上を考えれば、移植に必要な細胞種のみを分離できることが望ましい。【０００３】
小脳は、平衡、姿勢、随意運動の調節など、運動機能を円滑に遂行するために機能する。小脳腫瘍や慢性アルコール症による小脳虫部の変性、脊髄小脳変性症などにより、小脳機能が破綻すると、運動失調や平衡障害を示す。失われた神経細胞を補い、ネットワークが再構築されれば、機能回復が期待される。小脳には、プルキンエ細胞をはじめ、５種類ほどの神経細胞が存在し、それぞれが器官発生プログラムに従い正しくネットワークを形成することで、神経伝達を行っている。【０００４】
脊髄の背側にはdorsal hornと呼ばれる領域が存在する。末梢からの刺激を感知したdorsal root ganglionのニューロンは、そのシグナルをdorsal horn内の介在ニューロンに伝達し、さらに、そのシグナルが脳内へと伝達される。dorsal hornには興奮性のグルタミン酸ニューロンと抑制性のGABAニューロンが存在し、これらのバランスがシグナルの適正な伝達を制御している。GABAニューロンの不活性化は慢性的な痛みなどを招く。【０００５】
脊髄および小脳のGABAニューロンの発生については研究が進められており、その起源についてはほぼ理解されている。しかし、これらの前駆細胞を識別するマーカーはほとんど同定されておらず、また、細胞表面マーカーは同定されていないので、生きたままそれぞれの前駆細胞を分離する技術は開発されていない。【０００６】
65B13遺伝子は、分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞で一過性に発現することが知られている（特許文献１参照）ものの、GABAニューロンとの関連性については報告されていない。また、Corl1遺伝子の発現、またはCorl2遺伝子の発現を指標とすることにより、それぞれ、脊髄の介在ニューロンの種類、またはプルキンエ細胞を識別可能であることが報告されている（特許文献２、３参照）が、GABAニューロン前駆細胞を選択的に識別可能なマーカーはこれまでのところ知られていない。さらに、Ptf1aという転写因子は、GABA前駆細胞に発現すること自体は知られているが、転写因子であることから分離マーカーに有用な膜タンパク質は知られていない。（非特許文献1および非特許文献２）。【０００７】
【特許文献１】WO 2004/038018
【特許文献２】WO 2006/022243
【特許文献３】WO 2006/082826
【非特許文献１】Glasgow SM, Henke RM, Macdonald RJ, Wright CV, Johnson JE. Ptf1a determines GABAergic over glutamatergic neuronal cell fate in the spinal cord dorsal horn. Development. 2005 Dec;132(24):5461-9.
【非特許文献２】Fuse T, Matsuo N, Sone M, Watanabe M, Bito H, Terashima T, Wright CV, Kawaguchi Y, Nakao K, Nabeshima Y. Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum. Neuron. 2005 Jul 21;47(2):201-13.）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述の状況に鑑みてなされたものであり、GABAニューロン前駆細胞を選択的に識別可能なマーカーの提供を課題とする。また、該マーカーを指標とするGABAニューロン前駆細胞を識別するための方法、並びに、該方法に用いるための試薬の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、脊髄dorsal hornおよび小脳において、GABAニューロン前駆細胞の選択的マーカー65B13を同定し、該遺伝子によってコードされるタンパク質と結合する抗体を用いて、GABAニューロン前駆細胞を分離することに成功した。即ち、65B13は、脊髄dorsal hornおよび小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞を分離するためのマーカーとして有用であることが示された。
本発明者によって同定されたマーカーを指標とすることにより、GABAニューロン前駆細胞を効率的に識別もしくは単離することが可能である。【００１０】
本発明は、GABAニューロン前駆細胞を選択的に識別可能なマーカー、該マーカーを指標とするGABAニューロン前駆細胞を識別するための方法、並びに、該方法に用いるための試薬に関し、より具体的には、以下を提供する。【００１１】
〔１〕  以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出する方法：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているポリヌクレオチド。
〔２〕  ポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、〔１〕に記載の方法：
（ａ）被験細胞試料と〔１〕で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドからなるプローブとを接触させる工程；および 
（ｂ）反応性の有無を検出する工程。
〔３〕  工程（ａ）において、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を、プローブと接触させる、〔２〕に記載の方法。
〔４〕  〔１〕で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程が、下記工程を含んでなる、〔１〕に記載の方法：
（ａ−１）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、〔１〕で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーまたは〔１〕で選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて遺伝子増幅法を実施する工程；および
（ｂ−１）形成された増幅産物を検出する工程。
〔５〕  工程（ａ−１）において、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を鋳型として用いる、〔４〕に記載の方法。
〔６〕  さらに、検出する工程の後に、検出物からGABA産生ニューロン前駆細胞を分離する工程を含んでなる、〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔７〕  さらに、Corl1遺伝子、Pax2、Lim1/2遺伝子、Lbx1遺伝子およびCorl2遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現を指標として、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択される工程を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８〕  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する方法：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔９〕  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させることによって該マーカータンパク質の該ｍＲＮＡを転写させて翻訳される該マーカータンパク質を検出する工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する方法：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔１０〕  認識するタンパク質を検出する工程が、下記工程を含んでなる、〔８〕または〔９〕に記載の方法：
（ｄ）被験細胞試料と〔８〕または〔９〕で選択されるタンパク質と結合する抗体とを接触させる工程； および
（ｅ）反応性の有無を検出する工程。
〔１１〕  検出する工程の後に、検出物からGABA産生ニューロン前駆細胞を分離する工程を含んでなる、〔８〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２〕  〔８〕で選択されるタンパク質以外のGABA産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質が、Corl1遺伝子、Pax2、Lim1/2遺伝子、Lbx1遺伝子およびCorl2遺伝子からなる群から選択される遺伝子でコードされるタンパク質である、〔８〕〜〔１１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３〕  以下（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出することが可能なプローブ、プライマーまたはプライマーセットを含んでなるGABA産生ニューロン前駆細胞を検出するためのキット：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１４〕  さらに、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための〔１３〕記載のキット。
〔１５〕  さらに、小脳細胞または脊髄細胞を含む〔１３〕または〔１４〕記載のキット。
〔１６〕  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するためのキット：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔１７〕  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパクに翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させたポリヌクレオチドを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するためのキット。
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔１８〕  さらに、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子でコードされるタンパク質に結合する抗体との組合せを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための〔１６〕または〔１７〕記載のキット。
〔１９〕  さらに、小脳細胞または脊髄細胞を含む〔１６〕〜〔１８〕のいずれか一項に記載のキット。
〔２０〕  識別の対象となる小脳細胞がプルキンエ細胞である、〔１５〕または〔１９〕に記載のキット。
〔２１〕  識別の対象となる脊髄細胞がdI4またはdILAである、〔１５〕または〔１９〕に記載のキット。
〔２２〕  下記工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法：
（Ｉ）GABA産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（ＩＩ）以下に記載のポリヌクレオチドの発現を検出する工程：
下記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択される、ヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができる、GABA産生ニューロン前駆細胞のポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔２３〕（ＩＩＩ）工程（ＩＩ）でポリヌクレオチドの発現を検出した化合物を選択する工程、を更に含んでなる〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕  下記工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法：
（ＩＶ）GABA産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（Ｖ）以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔２５〕  下記工程を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法：
（ＩＶ−１）GABA産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（Ｖ−１）以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させることによって該マーカータンパク質の該ｍＲＮＡを転写させて翻訳される該マーカータンパク質を検出する工程：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔２６〕  （ＶＩ）工程（Ｖ）でタンパク質を検出した化合物を選択する工程、を更に含んでなる〔２４〕または〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕  GABA産生ニューロン前駆細胞集団の製造方法であって、
（ＶＩＩ）GABA産生ニューロン前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出または選択された細胞を増殖する工程
を含んでなる、方法。
〔２８〕  GABA産生ニューロン前駆細胞が、脊髄損傷治療用または小脳変性症治療用のGABA産生ニューロン前駆細胞である〔２７〕の製造方法。
〔２９〕  工程
（ＶＩＩ）GABA産生ニューロン前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）〔１〕〜〔１２〕のいずれか一項に記載の方法を用いて、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出された細胞を増殖する工程
で得られるGABA産生ニューロン前駆細胞集団。
〔３０〕  以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットを含んでなるGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔３１〕  さらに、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドとの組合せを含む、小脳細胞または脊髄細胞を検出または選択するための〔３０〕記載の試薬。
〔３２〕  さらに、小脳細胞または脊髄細胞を含む〔３０〕または〔３１〕記載の試薬。
〔３３〕  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔３４〕  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質に翻訳されるｍＲＮＡを発現させるプロモーターの制御下にマーカータンパク質をコードするポリヌクレオチドを連結させたポリヌクレオチドを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔３５〕  さらに、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子でコードされるタンパク質に結合する抗体との組合せを含む、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための〔３３〕または〔３４〕に記載の試薬。
〔３６〕  さらに、小脳細胞または脊髄細胞を含む〔３３〕〜〔３５〕のいずれか一項に記載の試薬。
〔３７〕  識別の対象となる小脳細胞がプルキンエ細胞である、〔３３〕〜〔３６〕のいずれか一項に記載の試薬。
〔３８〕  識別の対象となる脊髄細胞がdI4またはdILAである、〔３３〕〜〔３６〕のいずれか一項に記載の試薬。
〔３９〕  小脳変性症または脊髄損傷の再生医療に使用するためのGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔４０〕  GABA産生ニューロン前駆細胞が、脊髄または小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞である〔３９〕記載のGABA産生ニューロン前駆細胞の検出または選択するためのポリヌクレオチド。
〔４１〕  〔３９〕または〔４０〕記載のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドからなる、〔３９〕または〔４０〕に記載の検出または選択するためのポリヌクレオチド。
〔４２〕  〔３９〕または〔４０〕記載のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドからなる、〔３９〕または〔４０〕に記載の検出または選択するためのポリヌクレオチド。
〔４３〕  〔３９〕〜〔４２〕のいずれか一項に記載の検出するためのポリヌクレオチドからなる、プローブ。
〔４４〕  〔３９〕〜〔４２〕のいずれか一項に記載の検出用ポリヌクレオチドからなる、プライマー。
〔４５〕  〔３９〕〜〔４２〕のいずれか一項に記載の二種以上の検出用ポリヌクレオチドからなる、プライマーセット。
〔４６〕  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する、小脳変性症または脊髄損傷の再生医療に使用するためのGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための抗体。：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔４７〕  GABA産生ニューロン前駆細胞が、小脳細胞または脊髄細胞のGABA産生ニューロン前駆細胞である〔４６〕記載の抗体。
〔４８〕  配列番号：２、４、３８、４０、４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目、配列番号：３４若しくは３６で表されるアミノ酸配列の２０番目〜５１３番目、配列番号：４６若しくは４８で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４６０番目、または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４９０番目のアミノ酸配列の少なくとも連続した６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドと結合する抗体である、〔４６〕または〔４７〕に記載の抗体。
〔４９〕  抗体が、少なくとも６アミノ酸残基からなるポリペプチドと結合する抗体である、〔４６〕〜〔４８〕のいずれか一項に記載の抗体。
〔５０〕  以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドによって検出または選択された、小脳変性症または脊髄損傷の再生医療に使用するためのGABA産生ニューロン前駆細胞：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔５１〕  GABA産生ニューロン前駆細胞が、脊髄または小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞である〔５０〕記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
〔５２〕  ポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、〔５０〕または〔５１〕記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
〔５３〕  ポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、〔５０〕または〔５１〕記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
〔５４〕  以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体によって検出または選択された、小脳変性症または脊髄損傷の再生医療に使用するためのGABA産生ニューロン前駆細胞。：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔５５〕  GABA産生ニューロン前駆細胞が、小脳細胞または脊髄細胞のGABA産生ニューロン前駆細胞である〔５４〕記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
〔５６〕  抗体が、配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目のアミノ酸配列の少なくとも連続した６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドと結合する抗体である、〔５４〕または〔５５〕に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
〔５７〕  抗体が、少なくとも６アミノ酸残基からなるポリペプチドと結合する抗体である、〔５４〕〜〔５６〕のいずれか一項に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞。
〔５８〕  小脳変性症または脊髄損傷を治療する方法であって、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドによって検出または選択されたGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法：
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔５９〕  GABA産生ニューロン前駆細胞が、脊髄または小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞である〔５８〕記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
〔６０〕  ポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、〔５８〕または〔５９〕に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
〔６１〕  ポリヌクレオチドが、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列の連続する少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである、〔５８〕または〔５９〕に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
〔６２〕  小脳変性症または脊髄損傷を治療する方法であって、以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体によって検出または選択されたGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。：
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質。
〔６３〕  GABA産生ニューロン前駆細胞が、小脳細胞または脊髄細胞のGABA産生ニューロン前駆細胞である〔６２〕記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
〔６４〕  抗体が、配列番号：２、４、３８、４０、４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目、配列番号：３４若しくは３６で表されるアミノ酸配列の２０番目〜５１３番目、配列番号：４６若しくは４８で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４６０番目、または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４９０番目のアミノ酸配列の少なくとも連続した６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドと結合する抗体である、〔６２〕または〔６３〕に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
〔６５〕  抗体が、少なくとも６アミノ酸残基からなるポリペプチドと結合する抗体である、〔６２〕〜〔６４〕のいずれか一項に記載のGABA産生ニューロン前駆細胞を移植する方法。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、65B13遺伝子の胎児期マウス神経系における発現パターンを示す写真である。Ａ：E12.5 sagittal切片、Ｂ：E12.5小脳原基、Ｃ：E12.5脊髄、Ｄ：E10.5脊髄、Ｅ：E12.5脊髄、Ｆ：E14.5脊髄。CB：小脳原基、SC：脊髄。
【図２】図２Ａは、脊髄背側領域の発生様式を示す図である。Ｂは各種ニューロンの識別マーカーを示す（Ｂ）。
【図３】図３は、E10.5マウス脊髄における65B13, Mash1, Pax2の発現の比較を示す写真である。
【図４】図４は、E12.5マウス脊髄における65B13, Corl1, Mash1の発現の比較を示す写真である。
【図５】図５は、E12.5マウス脊髄から分離した65B13陽性細胞がGABA産生dILAニューロンに分化することを示す図および写真である。Ａは抗65B13抗体を用いたフローサイトメトリーによる解析結果、Ｂは分離した65B13陽性細胞を２日間培養後にマーカー染色した写真である。
【図６】図６は、胎児期小脳原基における65B13, Corl2, Pax2の発現の比較を示す写真である。ＡはE12.5、ＢはE14.5の時の発現解析結果を示す。Ｂの左の写真は65B13、右の写真はPax2の発現を示す。
【図７】図７は、胎児期マウス小脳原基から65B13陽性細胞を分離できることを示す図である。ＡはE12.5、ＢはE.14.5の時の小脳および分離した65B13陽性細胞に関する結果を示す。
【図８】図８は、E12.5（Ａ）およびE14.5（Ｂ）マウス小脳原基から分離した65B13陽性細胞が、それぞれGABA産生プルキンエ細胞およびGABA産生ゴルジ細胞に分化することを示す写真である。
【図９】図９は、ES細胞由来in vitro分化誘導脊髄ニューロン集団から65B13陽性細胞を分離でき、それがGABA産生ニューロンに分化することを示す図および写真である。
【図１０】図１０は、GABA産生ニューロン前駆細胞を選択するために利用可能なDNA構築物の構造を模式的に表した図である。
【図１１】図１１は、65B13プロモーターにより外来遺伝子（Gsh1）をGABA産生ニューロン前駆細胞特異的に発現させられることを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明者によって、65B13遺伝子が脊髄dorsal hornおよび小脳GABAニューロン前駆細胞に選択的に発現していることが示された。
本発明は、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するためのポリヌクレオチドを提供する。【００１４】
本発明における65B13遺伝子の一例として、該遺伝子のオルタナティブアイソフォームである65B13-a及び65B13-bと名づけた２種の遺伝子が挙げられる。それぞれの塩基配列を配列番号：１または３に、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を配列番号：２または４に示す。65B13-aのコード領域は、配列番号:１の178番目のAから始まり、2278〜2280番目の終止コドンまで続き、700アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち178番目から228番目までの配列にコードされる17アミノ酸残基はシグナル配列、1717番目から1767番目までの配列にコードされる17アミノ酸残基は膜貫通領域であった。それに対し、65B13-bのコード領域は、配列番号:2の127番目のAから始まり、2277〜2079番目の終止コドンまで続き、650アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち127番目から178番目までの配列にコードされる17アミノ酸残基はシグナル配列、1516番目から1566番目までの配列にコードされる17アミノ酸残基は膜貫通領域である。また、配列番号：３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７及び４９で示される遺伝子も本発明における65B13遺伝子の一例として挙げることができる。それぞれの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８及び５０で示すことができる。アミノ酸配列のコード領域は、それぞれ配列番号:３３の668番目のAから始まり、2768〜2770番目の終止コドンまで続き、700アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち668番目から724番目までの配列にコードされる19個のアミノ酸残基はシグナル配列、725番目から2206番目までの配列にコードされる494個のアミノ酸残基は細胞外領域である。配列番号:３５の130番目のAから始まり、2230〜2232番目の終止コドンまで続き、700アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち130番目から186番目までの配列にコードされる19個のアミノ酸残基はシグナル配列、187番目から1668番目までの配列にコードされる494個のアミノ酸残基は細胞外領域である。配列番号:３７の199番目のAから始まり、2098〜2100番目の終止コドンまで続き、633アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち199番目から258番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、259番目から1728番目までの配列にコードされる490個のアミノ酸残基は細胞外領域である。配列番号:３９の199番目のAから始まり、2323〜2325番目の終止コドンまで続き、708アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち199番目から258番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、259番目から1728番目までの配列にコードされる490個のアミノ酸残基は細胞外領域である。配列番号:４１の199番目のAから始まり、2323〜2325番目の終止コドンまで続き、708アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち199番目から258番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、259番目から1728番目までの配列にコードされる490個のアミノ酸残基は細胞外領域である。配列番号:４３の15番目のAから始まり、1914〜1916番目の終止コドンまで続き、633アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち15番目から74番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、75番目から1544番��までの配列にコードされる490個のアミノ酸残基は細胞外領域である。配列番号:４５の199番目のAから始まり、1948〜1950番目の終止コドンまで続き、583アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち199番目から258番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、259番目から1578番目までの配列にコードされる440個のアミノ酸残基は細胞外領域である。配列番号:４７の15番目のAから始まり、1764〜1766番目の終止コドンまで続き、583アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち15番目から74番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、75番目から1394番目までの配列にコードされる440個のアミノ酸残基は細胞外領域である。配列番号:４９の196番目のAから始まり、2260〜2262番目の終止コドンまで続き、688アミノ酸からなる蛋白質をコードする。そして、そのうち196番目から255番目までの配列にコードされる20個のアミノ酸残基はシグナル配列、256番目から1665番目までの配列にコードされる470個のアミノ酸残基は細胞外領域である。その他、アクセッション番号XM_994164、AL136654、XM_512603、XR_012248、XM_541684またはXM_583222で示される配列も本発明における65B13遺伝子の一例として含まれる。【００１５】
本発明のポリヌクレオチドの好ましい態様としては、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができる、GABA産生ニューロン前駆細胞の検出または選択するためのポリヌクレオチドが挙げられる。
（ｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた塩基配列によってコードされたアミノ酸配列であって、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド； 
（ｉｉｉ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつGABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現しているタンパク質をコードするポリヌクレオチド【００１６】
本発明において「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸（DNA）またはリボ核酸（RNA）等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、DNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成DNA及びRNAを含む。また、天然以外の塩基、例えば、4-アセチルシチジン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウリジン、2’-O-メチルシチジン、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、2’-O-メチルプソイドウリジン、β-D-ガラクトシルキュェオシン、2’-O-メチルグアノシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデノシン、1-メチルアデノシン、1-メチルプソイドウリジン、1-メチルグアノシン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアノシン、2-メチルアデノシン、2-メチルグアノシン、3-メチルシチジン、5-メチルシチジン、N6-メチルアデノシン、7-メチルグアノシン、5-メチルアミノメチルウリジン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウリジン、β-D-マンノシルキュェオシン、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウリジン、5-メトキシカルボニルメチルウリジン、5-メトキシウリジン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン、N-((9-β-D-リボフラノシル-2-メチルチオプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)N-メチルカルバモイル)トレオニン、ウリジン-5-オキシ酢酸-メチルエステル、ウリジン-5オキシ酢酸、ワイブトキソシン、プソイドウリジン、キュェオシン、2-チオシチジン、5-メチル-2-チオウリジン、2-チオウリジン、4-チオウリジン、5-メチルウリジン、N-((9-β-D-リボフラノシルプリン-6-イル)カルバモイル)トレオニン、2’-O-メチル-5-メチルウリジン、2’-O-メチルウリジン、ワイブトシン、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウリジン等を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、65B13の公知の配列情報に基づいて化学合成により製造することができる。また、65B13遺伝子を発現する細胞よりハイブリダイゼーション法、PCR法等を利用して調製することも可能である。【００１８】
また、上記の「同等の機能」とは、対象となるタンパク質が、65B13タンパク質（例えば、配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列）と同等の生物学的特性を有していることを意味する。65B13タンパク質（例えば、配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列）が持つ生物学的特性としては、例えば、嗅覚神経回路パターン等が挙げられる。さらに、GABAニューロン前駆細胞に選択的に発現していることも機能（生物学的特性）といえる。
従って、対象となるタンパク質が本発明者らにより同定された配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と同等の生物学的特性を有しているか否かの判定は、当業者においては例えば、嗅覚神経回路パターンまたはGABAニューロン前駆細胞に選択的に発現していることを測定することにより行うことができる。【００１９】
また本発明のポリヌクレオチドには、配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能（好ましい機能としては、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現していることをいう。）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。該ポリペプチドには、65B13のアイソフォーム、アルタナティブアイソフォーム、アレリック変異体も含まれる。【００２０】
このようなポリヌクレオチドは、配列番号：１の1から2876番目の塩基、配列番号：３の1から2243番目で表される塩基配列、配列番号：３３の1番目から3123番目で表される塩基配列、配列番号：３５の1番目から3247番目で表される塩基配列、配列番号：３７の1番目から2153番目で表される塩基配列、配列番号：３９の1番目から2979番目で表される塩基配列、配列番号：４１の1番目から2973番目で表される塩基配列、配列番号：４３の1番目から1969番目で表される塩基配列、配列番号：４５の1番目から2003番目で表される塩基配列、配列番号：４７の1番目から1819番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の1番目から2959番目で表される塩基配列、好ましくは、配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ等の動物のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。cDNAライブラリーの作成方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989))を参照することができる。また、市販のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーを用いてもよい。【００２１】
より具体的に、cDNAライブラリーの作製においては、まず、本発明のポリヌクレオチドを発現する細胞、臓器、組織等からグアニジン超遠心法(Chirwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-9)、AGPC法(Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162: 156-9)等の公知の手法により全RNAを調製し、mRNA Purification Kit(Pharmacia)等を用いてmRNAを精製する。QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia)のような、直接mRNAを調製するためのキットを利用してもよい。次に得られたmRNAから逆転写酵素を用いてcDNAを合成する。AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業)のようなcDNA合成のためのキットも市販されている。その他の方法として、cDNAはPCRを利用した5’-RACE法(Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002; Belyavsky et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2919-32)により合成、及び増幅させてもよい。また、全長率の高いcDNAライブラリーを作製するために、オリゴキャップ法(Maruyama and Sugano (1994) Gene 138: 171-4; Suzuki (1997) Gene 200: 149-56)等の公知の手法を採用することもできる。上述のようにして得られたcDNAは、適当なベクター中に組み込む。【００２２】
本発明におけるハイブリダイゼーション条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分の洗浄を3回、最後に、1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行うことも考えられる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、本発明の65B13のアイソフォーム、アレリック変異体、及び対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。【００２３】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995);条件については特にSection2.10)等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに対して少なくとも50％以上、好ましくは70％、さらに好ましくは80％、より一層好ましくは90％(例えば、95％以上、さらには99％)の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、BLASTアルゴリズム(Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいたプログラムとして、アミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしてはBLASTX、ヌクレオチド配列についてはBLASTN(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)等が開発されており、本発明の配列に対して使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等を参照することができる。【００２４】
その他、遺伝子増幅技術(PCR)(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)により、65B13のアイソフォームやアレリック変異体等、65B13と類似した構造及び機能を有する遺伝子を、配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目で表される塩基配列、配列番号：３３の668番目から2770番目で表される塩基配列、配列番号：３５の130番目から2232番目で表される塩基配列、配列番号：３７の199番目から2100番目で表される塩基配列、配列番号：３９の199番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４１の15番目から2325番目で表される塩基配列、配列番号：４３の15番目から1916番目で表される塩基配列、配列番号：４５の199番目から1950番目で表される塩基配列、配列番号：４７の15番目から1766番目で表される塩基配列、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドを基にプライマーを設計し、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ等の動物のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。【００２５】
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463)等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することも可能である。【００２６】
本発明において「タンパク質」は、通常、ポリペプチドと表現することも可能である。本発明の「ポリペプチド」は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるペプチド重合体である。配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を好ましい例として挙げることができる。本発明のポリペプチドを構成するアミノ酸残基は天然に存在するものでも、また修飾されたものであっても良い。アミノ酸残基の修飾としては、アシル化、アセチル化、アミド化、アルギニル化、GPIアンカー形成、架橋、γ-カルボキシル化、環化、共有架橋の形成、グリコシル化、酸化、脂質または脂肪誘導体の共有結合化、シスチンの形成、ジスルフィド結合の形成、セレノイル化、脱メチル化、タンパク質の分解処理、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合化、ヒドロキシル化、ピログルタメートの形成、フラビンの共有結合化、プレニル化、ヘム部分の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、ホルミル化、ミリストイル化、メチル化、ユビキチン化、ヨウ素化、ラセミ化、ADP-リボシル化、硫酸化、リン酸化等が例示される。さらに、本発明のポリペプチドにはシグナルペプチド部分がついた前駆体、シグナルペプチド部分を欠く成熟タンパク質、及びその他のペプチド配列により修飾された融合タンパク質を含む。本発明のポリペプチドに付加するペプチド配列としては、インフルエンザ凝集素(HA)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、サブスタンスP、多重ヒスチジンタグ(6×His、10×His等)、プロテインC断片、マルトース結合タンパク質(MBP)、免疫グロブリン定常領域、α-チューブリン断片、β-ガラクトシダーゼ、B-タグ、c-myc断片、E-タグ(モノクローナルファージ上のエピトープ)、FLAG(Hopp et al. (1988) Bio/Technol. 6: 1204-10)、lckタグ、p18 HIV断片、HSV-タグ(ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質)、SV40T抗原断片、T7-タグ(T7 gene10タンパク質)、VSV-GP断片(Vesicular stomatitisウイルス糖タンパク質)等のタンパク質の精製を容易にする配列(例えば、pcDNA3.1/Myc−His(Invitrogen)のようなベクターを利用できる)、組換え技術によりタンパク質を生産する際に安定性を付与する配列等を選択することができる。【００２７】
本発明における「GABA産生ニューロン前駆細胞」としては、好ましくは脊髄または小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞を挙げることができるが、これらに制限されない。【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、GABA産生ニューロン前駆細胞の検出または選択ができればその鎖長は特に制限されず、所謂「オリゴヌクレオチド」も本発明のポリヌクレオチドに含まれる。一般的に本発明のポリヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドであり、好ましくは連続する少なくとも15塩基長の長さを有するポリヌクレオチドである。【００２９】
さらに本発明は、本発明のGABA産生ニューロン前駆細胞の検出または選択するためのポリヌクレオチドに相補的な、連続する少なくとも15塩基からなるヌクレオチド鎖も提供する。このような少なくとも連続した15塩基を含む塩基配列からなるポリヌクレオチドは、GABA産生ニューロン前駆細胞の発現を検出するためのプローブ、またはGABA産生ニューロン前駆細胞を検出するためのプライマーとして有用である。【００３０】
通常、プローブとして使用する場合には15〜100、好ましくは15〜35個の塩基より構成されていることが望ましく、またポリヌクレオチドは、適宜、放射性同位体または非放射性化合物などで標識して用いられる。プライマーとして使用する場合には、少なくとも15、好ましくは30個の塩基より構成されていることが望ましい。プライマーの場合には、3’末端側の領域を標的とする配列に対して相補的な配列に、5’末端側には制限酵素認識配列、タグ等を付加した形態に設計することができる。本発明のヌクレオチド鎖は、本発明のポリヌクレオチドに対してハイブリダイズすることができる。さらに、これらのプローブまたはプライマーを用いて、細胞内における本発明のポリヌクレオチドの変異を検出することができる。このような変異は、場合により本発明のポリペプチドの活性、または発現の異常を引き起こすものであることから、疾病の診断等に有用と考えられる。【００３１】
ここで「相補的な配列」とは、ヌクレオチド配列中の少なくとも15個の連続した塩基が鋳型に対して完全に対になっている場合のみならず、そのうちの少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは90％、さらに好ましくは95％以上(例えば、97％または99％)が対になっているものも含む。対になっているとは、鋳型となるポリヌクレオチドの塩基配列中のAに対しT(RNAの場合はU)、TまたはUに対しA、Cに対しG、そしてGに対しCが対応して鎖が形成されていることを意味する。そして相同性は、上述のハイブリダイズするポリヌクレオチドの場合と同様の方法で決定することができる。【００３２】
また本発明は、二種以上の本発明のGABA産生ニューロン前駆細胞の検出または選択するためのポリヌクレオチドからなるプライマーセットを提供する。【００３３】
本発明はまた、小脳変性症または脊髄損傷の再生医療に使用するための65B13遺伝子の翻訳産物と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の好ましい態様としては、例えば、以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための抗体を提供する。
（ｖ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
ここで、「配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列で表されるタンパク質と同等の機能」の好ましい機能としては、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現していることを意味する。
また、抗体の好ましい態様は、本発明のポリペプチドがGABA産生ニューロン前駆細胞の細胞外領域のポリペプチドであって、当該ポリペプチドと結合する抗体である。本発明に用いるポリペプチドの細胞外領域はプログラムPSORT（http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/）等を用いて調べることができる。具体的には、当該プログラムPSORTを用いた細胞外領域は、配列番号：２、４、３８、４０、４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目、配列番号：３４若しくは３６で表されるアミノ酸配列の２０番目〜５１３番目、配列番号：４６若しくは４８で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４６０番目、または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４９０番目のアミノ酸配列【００３４】
1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドで、元のポリペプチドと同じ生物学的活性が維持されることは公知である(Mark et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5662-6; Zoller and Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10: 6487-500; Wang et al. (1984) Science 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6409-13)。【００３５】
ここで、アミノ酸の置換とは、配列中のアミノ酸残基の一つ以上が、異なる種類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。このような置換により本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を改変する場合、タンパク質の機能を保持することが必要な場合には、保存的な置換を行うことが好ましい。保存的な置換とは、置換前のアミノ酸と似た性質のアミノ酸をコードするように配列を変化させることである。アミノ酸の性質は、例えば、非極性アミノ酸(Ala, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val)、非荷電性アミノ酸(Asn, Cys, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr)、酸性アミノ酸(Asp, Glu)、塩基性アミノ酸(Arg, His, Lys)、中性アミノ酸(Ala, Asn, Cys, Gln, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)、脂肪族アミノ酸(Ala, Gly)、分枝アミノ酸(Ile, Leu, Val)、ヒドロキシアミノ酸(Ser, Thr)、アミド型アミノ酸(Gln, Asn)、含硫アミノ酸(Cys, Met)、芳香族アミノ酸(His, Phe, Trp, Tyr)、複素環式アミノ酸(His, Trp)、イミノ酸(Pro, 4Hyp)等に分類することができる。中でも、Ala、Val、Leu及びIleの間、Ser及びThrの間、Asp及びGluの間、Asn及びGlnの間、Lys及びArgの間、Phe及びTyrの間の置換は、タンパク質の性質を保持する置換として好ましい。変異されるアミノ酸の数及び部位は特に制限されず、該ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸が65B13の抗原性を有していれば良い。【００３６】
このような配列番号:２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection8.1-8.5)、Hashimoto-Goto et al. (1995) Gene 152: 271-5、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kramer and Fritz (1987) Method. Enzymol. 154: 350-67、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。【００３７】
また上記本発明のタンパク質には、配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質も含まれる。
なお、「配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列で表されるタンパク質と同等の機能」の好ましい機能としては、GABA産生ニューロン前駆細胞に選択的に発現していることを意味する。【００３８】
本発明におけるハイブリダイゼーション条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer(Amersham Life Science)を用いた方法として、68℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分の洗浄を3回、最後に、1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分の洗浄を2回行うことも考えられる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution (CLONTECH)中、55℃で30分以上プレハイブリダイゼーションを行い、標識プローブを添加し、37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度を上げることにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブの長さ、反応時間等の諸条件を加味し、65B13のアイソフォーム、アレリック変異体、及び対応する他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。【００３９】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』(Cold Spring Harbor Press (1989);特にSection9.47-9.58) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997);特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995);条件については特にSection2.10)等を参照することができる。ハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：２、４、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８または５０で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対して少なくとも50％以上、好ましくは70％、さらに好ましくは80％、より一層好ましくは90％(例えば、95％以上、さらには99％)の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。このような同一性は、BLASTアルゴリズム(Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいたプログラムとして、アミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしてはBLASTX、ヌクレオチド配列についてはBLASTN(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)等が開発されており、本発明の配列に対して使用することができる。具体的な解析方法については、例えば、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.等を参照することができる。【００４０】
その他、遺伝子増幅技術(PCR)(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 6.1-6.4)により、65B13のアイソフォームやアレリック変異体等、65B13と類似した構造及び機能を有する遺伝子を、配列番号：１の178から2280番目の塩基、配列番号：３の127から2079番目の塩基、配列番号：３３の668番目から2770番目の塩基、配列番号：３５の130番目から2232番目の塩基、配列番号：３７の199番目から2100番目の塩基、配列番号：３９の199番目から2325番目の塩基、配列番号：４１の15番目から2325番目の塩基、配列番号：４３の15番目から1916番目の塩基、配列番号：４５の199番目から1950番目の塩基、配列番号：４７の15番目から1766番目の塩基、若しくは配列番号：４９の196番目から2262番目に記載のヌクレオチド配列等を基にプライマーを設計し、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ニワトリ、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ等の動物のcDNAライブラリー及びゲノムライブラリーから得ることができる。【００４１】
また本発明の抗体にはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体(scFV)(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol.113, Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag (1994) pp.269-315)、ヒト化抗体、多特異性抗体(LeDoussal et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt. 78: 118-32; Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 537-9; Zimmermann (1986) Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; Van Dijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9)、並びに、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fc、Fv等の抗体断片が含まれる。さらに、本発明の抗体は必要に応じ、PEG等により修飾されていてもよい。その他、本発明の抗体は、β-ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、GST、緑色蛍光タンパク質(GFP)等との融合タンパク質として製造され得、二次抗体を用いずに検出できるようにしてもよい。また、ビオチン等により抗体を標識することによりアビジン、ストレプトアビジン等を用いて抗体の回収を行い得るように改変されていてもよい。【００４２】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチド若しくはその断片、またはそれらを発現する細胞を感作抗原として製造することができる。また、本発明のポリペプチド若しくはその断片のうち短いものは、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、卵白アルブミン等のキャリアに結合して免疫原として用いてもよい。また、本発明のポリペプチドまたはその断片と共に、アルミニウムアジュバント、完全(または不完全)フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント等の公知のアジュバントを抗原に対する免疫応答を強化するために用いてもよい。【００４３】
ポリクローナル抗体は、例えば、本発明のポリペプチドまたはその断片を所望によりアジュバントと共に哺乳動物に免疫し、免疫した動物より血清を得る。ここで用いる哺乳動物は、特に限定されないが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的である。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物が挙げられる。動物の免疫化は、感作抗原をPhosphate-Buffered Saline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射して行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生は、血清中の所望の抗体レベルを慣用の方法により測定することにより確認することができる。最終的に、血清そのものをポリクローナル抗体として用いても良いし、さらに精製して用いてもよい。具体的な方法として、例えば、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987) Section 11.12-11.13)を参照することができる。【００４４】
モノクローナル抗体を産生するためには、まず、上述のようにして免疫化した動物より脾臓を摘出し、該脾臓より免疫細胞を分離し、適当なミエローマ細胞とポリエチレングリコール(PEG)等を用いて融合してハイブリドーマを作成する。細胞の融合は、Milsteinの方法(Galfre and Milstein (1981) Methods Enzymol. 73: 3-46)に準じて行うことができる。ここで、適当なミエローマ細胞として特に、融合細胞を薬剤により選択することを可能にする細胞が挙げられる。このようなミエローマを用いた場合、融合されたハイブリドーマは、融合された細胞以外は死滅するヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液(HAT培養液)で培養して選択する。次に、作成されたハイブリドーマの中から、本発明のポリペプチドまたはその断片に対して結合する抗体を産生するクローンを選択する。その後、選択したクローンをマウス等の腹腔内に移植し、腹水を回収してモノクローナル抗体を得る。また、具体的な方法として、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987) Section 11.4-11.11)を参照することもできる。【００４５】
ハイブリドーマは、その他、最初にEBウイルスに感染させたヒトリンパ球をin vitroで免疫原を用いて感作し、感作リンパ球をヒト由来のミエローマ細胞(U266等)と融合し、ヒト抗体を産生するハイブリドーマを得る方法(特開昭63-17688号公報)によっても得ることができる。また、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物を感作して製造した抗体産生細胞を用いても、ヒト抗体を得ることができる(WO92/03918; WO93/02227; WO94/02602; WO94/25585; WO96/33735; WO96/34096; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146-56等)。ハイブリドーマを用いない例としては、抗体を産生するリンパ球等の免疫細胞に癌遺伝子を導入して不死化する方法が挙げられる。【００４６】
また、遺伝子組換え技術により抗体を製造することもできる(Borrebaeck and Larrick (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers LTD., UK参照)。そのためには、まず、抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞(感作リンパ球等)からクローニングする。得られた遺伝子を適当なベクターに組み込み、宿主に該ベクターを導入し、宿主を培養することにより抗体を産生させる。このような組換え型の抗体も本発明の抗体に含まれる。代表的な組換え型の抗体として、非ヒト抗体由来可変領域及びヒト抗体由来定常領域とからなるキメラ抗体、並びに非ヒト抗体由来相補性決定領域(CDR)、及び、ヒト抗体由来フレームワーク領域(FR)及び定常領域とからなるヒト化抗体が挙げられる(Jones et al. (1986) Nature 321: 522-5; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323-9; Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-6; Methods Enzymol. 203: 99-121 (1991))。【００４７】
抗体断片は、上述のポリクローナルまたはモノクローナル抗体をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することにより製造し得る。または、抗体断片をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である(Co et al., (1994) J. Immunol. 152: 2968-76; Better and Horwitz (1989) Methods Enzymol. 178: 476-96; Pluckthun and Skerra (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Lamoyi (1986) Methods Enzymol. 121: 652-63; Rousseaux et al. (1986) 121: 663-9; Bird and Walker (1991) Trends Biotechnol. 9: 132-7参照)。【００４８】
多特異性抗体には、二特異性抗体(BsAb)、ダイアボディ(Db)等が含まれる。多特異性抗体は、(1)異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカーにより化学的にカップリングする方法(Paulus (1985) Behring Inst. Mill. 78: 118-32)、(2)異なるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを融合する方法(Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 537-9)、(3)異なるモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子(4種のDNA)によりマウス骨髄腫細胞等の真核細胞発現系をトランスフェクションした後、二特異性の一価部分を単離する方法(Zimmermann (1986) Rev. Physio. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; Van Dijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9)等により作製することができる。一方、Dbは遺伝子融合により構築され得る二価の2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーの抗体断片であり、公知の手法により作製することができる(Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8; EP404097; WO93/11161参照)。【００４９】
抗体及び抗体断片の回収及び精製は、プロテインA及びGを用いて行う他、公知のタンパク質精製技術によっても行い得る(Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))。例えば、本発明の抗体の精製にプロテインAを利用する場合、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等のプロテインAカラムが公知であり、使用可能である。得られた抗体の濃度は、その吸光度を測定することにより、または酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)等により決定することができる。【００５０】
抗体の抗原結合活性は、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、ELISA等により測定することができる。ELISA法による測定の場合、本発明の抗体をプレート等の担体に固相化し、次いで本発明のポリペプチドを添加した後、目的とする抗体を含む試料を添加する。ここで、抗体を含む試料としては、抗体産性細胞の培養上清、精製抗体等が考えられる。続いて、本発明の抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートのインキュベーションを行う。その後、プレートを洗浄し、二次抗体に付加された標識を検出する。即ち、二次抗体がアルカリフォスファターゼで標識されている場合には、p-ニトロフェニルリン酸等の酵素基質を添加して吸光度を測定することで、抗原結合活性を測定することができる。また、抗体の活性評価に、BIAcore(Pharmacia)等の市販の系を使用することもできる。【００５１】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドまたはその断片を認識または検出することができる。また、本発明のポリペプチドまたはその断片を認識することから、当該ポリペプチドまたはその断片が発現している細胞等を認識または検出することができる。さらに、本発明のポリペプチドまたはその断片の精製に使用することができる。また、本発明のポリペプチドまたはその断片が発現している細胞等の精製に使用することができる。【００５２】
本発明の抗体は、好ましくは、配列番号：２、４、３８、４０、４２若しくは４４で表されるアミノ酸配列の２１番目〜５１０番目、配列番号：３４若しくは３６で表されるアミノ酸配列の２０番目〜５１３番目、配列番号：４６若しくは４８で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４６０番目、または配列番号：５０で表されるアミノ酸配列の２１番目〜４９０番目のアミノ酸配列の少なくとも連続した６アミノ酸残基または全部からなるポリペプチドと結合する抗体であり、より好ましくは、少なくとも６アミノ酸残基からなるポリペプチドと結合する抗体である。【００５３】
また本発明は、上記の本発明のポリヌクレオチドの発現を検出することを特徴とする、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する方法に関する。
本発明の方法の好ましい態様としては、本発明の前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出する工程を含む方法である。【００５４】
本発明の上記方法において、「ポリヌクレオチドの発現を検出する工程」は、具体的には下記工程を含むことが好ましい。
（ａ）被験細胞試料と、前記本発明の方法で選択されるポリヌクレオチド、その相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドからなるプローブとを接触させる工程；および
（ｂ）反応性の有無を検出する工程【００５５】
また、本方法の好ましい態様においてはまず、被験細胞試料と、本発明のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドからなるプローブとを接触させる。例えば、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を、プローブと接触させることができる。
本方法においては次いで、反応性の有無を検出する。ここで反応性が有るとは、通常、接触させたポリヌクレオチドが対象となる配列とハイブリダイズした（反応した）状態をいう。【００５６】
本発明の上記方法における工程には、例えば以下の工程が含まれていてもよい。
（ａ−１）被験細胞試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチドからなるプライマーまたは本発明のポリヌクレオチドからなるプライマーセットを用いて遺伝子増幅法を実施する工程；および
（ｂ−１）形成された増幅産物を検出する工程【００５７】
上記工程における「遺伝子増幅法」としては公知の方法を用いることができるが、例えば、PCR法等を用いることができる。さらに該増幅法により形成された増幅産物の検出も、公知の方法を用いて行うことができる。
また、前記工程（ａ−１）は、例えば、被験細胞試料から調製されたmRNAまたはそのmRNAから転写された相補的DNA（cDNA）を鋳型として用いてもよい。
前記検出する工程の後に、検出物からGABA産生ニューロン前駆細胞を分離する工程が含まれていてもよい。【００５８】
本発明の65B13遺伝子によってコードされるタンパク質は、膜タンパク質であることから、該タンパク質を指標とすることにより、GABA産生ニューロン前駆細胞を生きたまま単離（分離）することが可能である。【００５９】
さらに本発明の方法は、上述の工程に加えて、Corl1遺伝子、Pax2、Lim1/2遺伝子、Lbx1遺伝子およびCorl2遺伝子からなる群から選択される遺伝子の発現を指標として、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択される工程を含むものであってもよい。【００６０】
本発明の方法の好ましい態様としては、前記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程を含む方法が挙げられる。【００６１】
タンパク質を検出する工程は、具体的には、以下の工程が挙げられる。
（ｄ）被験細胞試料と上記GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する工程によって選択されるタンパク質と結合する抗体とを接触させる工程
（ｅ）反応性の有無を検出する工程【００６２】
本発明の抗体とGABA産生ニューロン前駆細胞を含むことが予測される細胞試料とを接触させ、反応性の有無を検出することで本発明のタンパク質を検出することができる。細胞との接触前に、抗体を適当な担体に固定化して用いることも可能である。または、細胞と抗体とを接触させ、結合させた後、抗体のアフィニティーによる精製を行うことで、該抗体と結合した細胞を選択的に回収することもできる。例えば、本発明の抗体がビオチンと結合されている場合には、アビジンやストレプトアビジンを結合したプレートやカラムに対して添加することにより精製を行うことができる。
前記検出する工程の後に、検出物からGABA産生ニューロン前駆細胞を分離する工程が含まれていてもよい。本発明におけるGABA産生ニューロン前駆細胞の分離は、抗65B13抗体を用いたフローサイトメトリーにより効率的に行なうことができる。【００６３】
その他、65B13に対するプロモーター（修飾されたプロモーターを含む）を利用してGABA産生ニューロン前駆細胞を選択することもできる(例えば、特開2002-51775号公報参照)。例えば、後述する65B13の発現領域解析により得られたプロモーター部分に対し、GFP等の検出可能なマーカーをコードする遺伝子を連結した構築物を含むベクターを細胞に対してトランスフェクションすることができる。また該構築物は、65B13に対する発現制御配列（プロモーター、エンハンサー等を含む）の制御下に、65B13遺伝子がマーカー遺伝子の上流もしくは下流に連結された構造を有していてもよい。その他、65B13遺伝子座へマーカーをコードする遺伝子をノックインすることができる。該構築物の好ましい態様としては、例えば、図１０において2〜4に模式的に記載された構造の構築物を例示することができる。いずれの場合にも、GABA産生ニューロン前駆細胞特異的にマーカー遺伝子の発現が検出されることとなり、特異的な細胞の選択が可能となる。【００６４】
ここで使用する細胞試料は好ましくは、in vitroで分化誘導されたGABA産生ニューロンを含む培養培地である。in vitroにおけるGABA産生ニューロンの分化誘導は、公知のES細胞等を出発材料として、公知の方法により行うことができる。通常、GABA産生ニューロンは、脳のGABA産生ニューロン領域から得た組織を神経組織由来の支持細胞層と共培養することにより分化させることができる。本発明のGABA産生ニューロン前駆細胞の選択に用いる細胞試料は、如何なる方法により分離または培養された細胞群であってもよい。【００６５】
また、本発明の抗体またはポリペプチドを固定する担体としては、細胞に対して無害なものである必要がある。例えば、合成または天然の有機高分子化合物、ガラスビーズ、シリカゲル、アルミナ、活性炭等の無機材料、及びこれらの表面に多糖類、合成高分子等をコーティングしたものが考えられる。担体の形状には特に制限はなく、膜状、繊維状、顆粒状、中空糸状、不織布状、多孔形状、ハニカム形状等が挙げられ、その厚さ、表面積、太さ、長さ、形状、大きさを種々変えることにより接触面積を制御することができる。【００６６】
本発明の方法によって選択されるタンパク質以外のGABA産生ニューロン前駆細胞マーカータンパク質としては、例えば、Corl1遺伝子、Pax2、Lim1/2遺伝子、Lbx1遺伝子およびCorl2遺伝子からなる群から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質を挙げることができる。【００６７】
本発明の方法における65B13遺伝子の転写産物の検出は、本発明のポリヌクレオチドと細胞試料由来の核酸抽出物とを接触させ、核酸抽出物中において該ポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸を検出することにより、実施することができる。【００６８】
65B13遺伝子の転写産物を検出するために、ポリヌクレオチドプローブは、好ましくは放射性同位体または非放射性化合物で標識されたものである。例えば、標識するための放射性同位体としては、35S、3H等を挙げることができる。放射標識したポリヌクレオチドプローブを用いた場合、エマルションオートラジオグラフィーにより銀粒子を検出することによりマーカーと結合するRNAを検出することができる。また、ポリヌクレオチドプローブの標識のため慣用の非放射性同位体としては、ビオチン、ジゴキシゲニン等が公知である。ビオチン標識マーカーの検出は、例えば、蛍光、または、アルカリ性ホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を標識したアビジンを用いて行うことができる。一方、ジゴキシゲニン標識マーカーの検出には、蛍光、または、アルカリ性ホスファターゼ若しくは西洋ワサビペルオキシダーゼ等の酵素を標識した抗ジゴキシゲニン抗体を使用することができる。酵素標識を使用する場合には、酵素の基質と共にインキュベートし、安定な色素をマーカー位置に沈着させることで検出を行う。【００６９】
65B13遺伝子の転写産物を検出するために、ポリヌクレオチドプライマーを用いた場合には、65B13遺伝子の転写産物は、例えば、RT-PCRなどの手法により、該ポリヌクレオチドプライマーとハイブリダイズする核酸を増幅することによって検出することができる。【００７０】
本発明の方法における65B13遺伝子の翻訳産物の検出は、上記した抗体と細胞試料由来のタンパク質抽出物とを接触させ、該抗体と結合するタンパク質を検出することにより、実施することができる。抗体の抗原結合活性の測定方法については、上述したように、吸光度測定、蛍光抗体法、酵素免疫測定法（EIA）、放射免疫測定法（RIA）、ELISA法等により測定することができる。【００７１】
本発明の方法においては、65B13遺伝子の転写産物または翻訳産物に加えて、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出することにより、より高精度に識別を行うことが可能であり、このような方法も本発明に含まれる。【００７２】
また本発明は、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するためのキットを提供する。本発明のキットには、例えば、上述の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出することが可能なプローブ、プライマーまたはプライマーセットを含めることができる。さらに、緩衝液等を適宜含めることができる。また、キットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくことも可能である。
本発明のキットには、さらにLbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドが含まれていてもよい。
本発明のキットには、さらに小脳細胞または脊髄細胞が含まれていてもよい。【００７３】
本発明のGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するためのキットの他の態様としては、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体を含むキットが挙げられる。
該キットにはさらに、Lbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子でコードされるタンパク質に結合する抗体との組合せが含まれていてもよい。
さらに小脳細胞または脊髄細胞が含まれていてもよい。【００７４】
また本発明の方法またはキットにより識別の対象となるのは、小脳細胞の場合は、好ましくはプルキンエ細胞であり、脊髄細胞の場合は、好ましくはdI4またはdILAである。【００７５】
また本発明のポリヌクレオチドの発現を指標とすることにより、GABA産生ニューロン前駆細胞の分化誘導に有効な物質をスクリーニングすることが可能である。
本発明は、GABA産生ニューロン前駆細胞分化誘導に有効な物質のスクリーニング方法を提供する。本方法によりスクリーニングされる化合物は、GABA産生ニューロン前駆細胞分化誘導する機能を示すことから、GABA産生ニューロンにおける何等かの欠陥が病因となっている疾病の治療のための候補化合物となることが期待され有用である。本スクリーニング方法によって取得される化合物の治療対象となる疾患としては、例えば脊髄小脳変性症を挙げることができる。【００７６】
本発明の上記スクリーニング方法の好ましい態様としては、以下の工程を含んでなる方法を挙げることができる。
（Ｉ）GABA産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（ＩＩ）前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択される、ヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができる、GABA産生ニューロン前駆細胞のポリヌクレオチドの発現を検出する工程【００７７】
ここで、「被験物質」とはどのような化合物であってもよいが、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、合成ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)抽出液、細胞(微生物、植物細胞、動物細胞)培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。【００７８】
また、65B13は、分化誘導したGABA産生ニューロン前駆細胞において特異的な発現を示すため、GABA産生ニューロン前駆細胞への分化誘導試薬のスクリーニングにおいて利用することも可能である。すなわち、被検試料の存在下で、GABA産生ニューロン前駆細胞へ分化する能力のある細胞からGABA産生ニューロン前駆細胞への分化を誘導し、分化を誘導した細胞における65B13の発現を検出することにより、該被験試料にGABA産生ニューロン前駆細胞の分化を誘導する能力があるか否かを決定することができる。従って、本発明は下記（ｆ）〜（ｈ）の工程を含む、65B13の発現を指標とするGABA産生ニューロン前駆細胞分化誘導試薬の候補化合物のスクリーニング方法を提供する。
（ｆ）被検試料の存在下で、GABA産生ニューロン前駆細胞へ分化する能力のある細胞からGABA産生ニューロン前駆細胞への分化を誘導する工程、
（ｇ）分化を誘導した細胞における65B13遺伝子の転写産物または翻訳産物を検出する工程、
（ｈ）被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該転写産物または翻訳産物の量を増大させる化合物を選択する工程。【００７９】
ここで「GABA産生ニューロン前駆細胞へ分化する能力のある細胞」としては、好ましくは多分化能を有するES細胞等、GABA産生ニューロン前駆細胞へと分化誘導され得る細胞を含む細胞試料である。【００８０】
本発明の65B13遺伝子の転写産物または翻訳産物の検出は、上記のように、65B13遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドや65B13遺伝子の翻訳産物に結合する抗体を用いて検出することができる。【００８１】
本発明において細胞の分化や増殖は、被験物質と接触させない場合における細胞の状態と比較することにより検出することができる。細胞の分化や増殖は、顕微鏡下において形態学的な観察を行うこと、または、細胞の分化に伴って産生される物質を検出、定量することにより、評価することができる。【００８２】
細胞の分化は、被検試料の非存在下における65B13遺伝子発現のレベルと比較することにより判定することができる。すなわち、被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、65B13遺伝子の転写産物または翻訳産物の量を増大させる場合、該被験試料は神経細胞の分化を誘導する能力を有すると判定できる。ここで「増大」とは、例えば、２倍、好ましくは５倍、より好ましくは１０倍以上をいう。【００８３】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様においては、さらに工程（ＩＩ）でポリヌクレオチドの発現を検出した化合物を選択する工程を含む方法である。【００８４】
また本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、例えば下記工程を含んでなる方法が挙げられる。即ち、
（ＩＶ）GABA産生ニューロン前駆細胞に分化し得る細胞と、被験化合物とを接触させる工程；および
（Ｖ）前記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質を検出する工程：
上記方法の好ましい態様としては、さらに、（ＶＩ）工程（Ｖ）でタンパク質を検出した化合物を選択する工程を含む方法である。【００８５】
ここで、当該タンパク質の発現を検出する方法（手段）としては、65B13に対するプロモーター（修飾されたプロモーターを含む）を利用することもできる。例えば、65B13の発現領域解析により得られたプロモーター部分に対し、例えばGFP（green fluorescent protein）等の検出可能なマーカーをコードする遺伝子を連結した構築物を含むベクターを細胞に対してトランスフェクションすることができる。その他、65B13遺伝子座へマーカーをコードする遺伝子をノックインすることができる。どちらの場合にも、GABA産生ニューロン前駆細胞特異的にマーカー遺伝子の発現が検出されることとなり、タンパク質の発現を検出することが可能となる。当該タンパク質の発現を検出する方法（手段）は、当該タンパク質の発現が検出されることから、当該タンパク質をコードする遺伝子を検出する方法（手段）にもなり得る。【００８６】
この場合、「プロモーター部分にマーカーをコードする遺伝子を連結」とは、当該マーカーをコードする遺伝子が発現可能な状態になるように当該遺伝子を繋げることをいい、プロモーターに当該遺伝子が直接結合した状態の他、プロモーターから離れた状態でも当該プロモーターの制御下にある状態のものも含む。さらに、65B13に対するプロモーターは、65B13領域を発現させるものであれば、65B13の発現領域解析により得られたプロモーター部分を他のプロモーターに置換することもできる。【００８７】
また本発明はGABA産生ニューロン細胞集団の製造方法を提供する。該方法としては、例えば、
（ＶＩＩ）GABA産生ニューロン前駆細胞を含み得る細胞集団を取得する工程；
（ＶＩＩＩ）本発明のGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択する方法を用いて、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出する工程；および
（ＩＸ）工程（ＶＩＩＩ）で検出または選択された細胞を増殖する工程
を含んでなる、方法が挙げられる。【００８８】
前記製造方法によって得られるGABA産生ニューロン前駆細胞は、例えば、脊髄損傷治療用または小脳変性治療のためのGABA産生ニューロン前駆細胞である。【００８９】
また前記製造方法によって得られるGABA産生ニューロン前駆細胞もまた、本発明に含まれる。本発明の上記方法によって製造される細胞は、好ましくは、生きた細胞であるという特徴を有する。【００９０】
本発明によって獲得された細胞は、GABA産生ニューロン前駆細胞であることから、雑多な細胞集団または外来遺伝子を導入して生成されるGABA産生ニューロンと比べて、安全性、生存率、ネットワーク形成能の面で変性疾患の移植治療等に好ましいものである。さらに、本方法により得られた本発明の細胞(群)は、前駆細胞であることから、in vitroにおいて培地等の条件を選択することにより適当な段階まで分化させることも可能であり、種々の神経移植治療の材料としても好ましいものである。本発明の方法により得られたニューロン前駆細胞の移植では、1×103〜1×106個、さらに好ましくは5〜6×104個のニューロンを移植する。第１の方法としては、細胞の懸濁液を脳に移植する定位脳固定術(stereotaxic surgery)が挙げられる。また、ミクロ手術(microsurgery) により細胞を移植しても良い。ニューロン組織の移植方法については、Backlund等(Backlund et al. (1985) J. Neurosurg. 62: 169-73)、Lindvall等(Lindvall et al. (1987) Ann. Neurol. 22: 457-68)、Madrazo等(Madrazo et al. (1987) New Engl. J. Med. 316: 831-4)の方法を参照することができる。【００９１】
さらに、本発明の細胞は、GABA産生ニューロン前駆細胞特異的遺伝子及び前駆細胞からGABA産生ニューロンへの各成熟段階に特異的な遺伝子の単離、変性疾患治療のターゲット探索、GABA産生ニューロンの成熟過程の解明、並びに成熟を指標としたスクリーニング等にも利用することができる。【００９２】
また本発明は、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬を提供する。本発明の試薬による細胞種の識別の対象となる小脳細胞としては、代表的にはプルキンエ細胞が挙げられ、脊髄細胞としては、代表的にはdI4またはdILAが挙げられる。【００９３】
本発明において「細胞の種類を識別する」とは、対象となる細胞が特定の種類の細胞であると識別する場合のみならず、対象となる細胞が特定の種類の細胞ではないと識別する場合も含まれる。例えば、対象となる小脳細胞において65B13遺伝子が実質的に発現していれば、該小脳細胞は「プルキンエ細胞の可能性がある」と識別することができ、また、「プルキンエ細胞ではない」と識別することもできる。一方、対象となる脊髄細胞において65B13遺伝子が実質的に発現していなければ、該脊髄神経細胞は「dI4またはdILAの可能性がある」と識別することができ、また、「dI4またはdILAではない」と識別することもできる。【００９４】
本発明の試薬の一態様としては、例えば、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドまたはその相補配列にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドの発現を検出可能なプローブ、プライマー、プライマーセットを含んでなるGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬が挙げられる。【００９５】
また本発明は、小脳細胞または脊髄細胞を検出または選択するための試薬を提供する。当該試薬には、前記GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬に、さらに他の公知のマーカーを適宜組み合わせて用いることができ、これにより、詳細に細胞の種類の識別を行うことが可能となる。従って、本発明の好ましい態様においては、上記GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬にLbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子の転写産物にハイブリダイズするポリヌクレオチドとの組合せを含む、小脳細胞または脊髄細胞を検出または選択するための試薬を提供する。【００９６】
これら上記のマーカー遺伝子の配列は以下に示すように公知である。
マウスLbx1の塩基配列を配列番号：５、アミノ酸配列を配列番号：６に、ヒトLbx1の塩基配列を配列番号：７、アミノ酸配列を配列番号：８に示す。
マウスPax2の塩基配列を配列番号：９、アミノ酸配列を配列番号：１０に、ヒトPax2の塩基配列を配列番号：１１、アミノ酸配列を配列番号：１２に示す。
マウスLim1の塩基配列を配列番号：１３、アミノ酸配列を配列番号：１４に、ヒトLim1の塩基配列を配列番号：１５、アミノ酸配列を配列番号：１６に示す。
マウスLim2の塩基配列を配列番号：１７、アミノ酸配列を配列番号：１８に、ヒトLim2の塩基配列を配列番号：１９、アミノ酸配列を配列番号：２０に、ラットLim2の塩基配列を配列番号：２１、アミノ酸配列を配列番号：２２に示す。
マウスCorl1の塩基配列を配列番号：２３に、アミノ酸配列を配列番号：２４に、ヒトCorl1の塩基配列を配列番号：２５、アミノ酸配列を配列番号：２６に、ラットCorl1の塩基配列を配列番号：２７に、アミノ酸配列を配列番号：２８に示す。
マウスCorl2の塩基配列を配列番号：２９に、アミノ酸配列を配列番号：３０に、ヒトCorl2の塩基配列を配列番号：３１、アミノ酸配列を配列番号：３２に示す。
また前記試薬には、さらに小脳細胞または脊髄細胞を含めることができる。【００９７】
さらに本発明のGABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬の他の態様として、例えば前記（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質と結合する抗体を含んでなる、GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬が挙げられる。【００９８】
前記GABA産生ニューロン前駆細胞を検出または選択するための試薬には、さらにLbx1、Pax2、Lim1/2、Corl1およびCorl2遺伝子からなる群より選択される１または複数の遺伝子でコードされるタンパク質に結合する抗体との組合せが含まれていてもよい。
また前記試薬には、さらに、小脳細胞または脊髄細胞が含まれていてもよい。
前記試薬による識別可能な細胞は、小脳細胞の場合はプルキンエ細胞、脊髄細胞の場合はdI4またはdILAを挙げることができる。【００９９】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１００】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。【０１０１】
[実施例１]65B13の胎児期脊髄における発現解析と65B13陽性細胞の分離
65B13（Neph3）は、胎児脳内において幾つかの領域に選択的に発現している（図１；WO 2004/038018；Minaki Y, Mizuhara E, Morimoto K, Nakatani T, Sakamoto Y, Inoue Y, Satoh K, Imai T, Takai Y, Ono Y. Migrating postmitotic neural precursor cells in the ventricular zone extend apical processes and form adherens junctions near the ventricle in the developing spinal cord. Neurosci Res. 2005, 52(3):250-62.）。中脳ではドーパミンニューロン前駆細胞に発現することが明らかになっているが（WO 2004/038018）、それ以外の領域における65B13発現細胞種については同定されていない。そこで、脊髄および小脳原基の65B13発現細胞の同定を試みた。【０１０２】
まずは、脊髄における65B13の発現を詳細に解析した。方法はWO 2004/038018に記載の方法にしたがって行った。E10.5マウス脊髄では、65B13 mRNAは背側の非常に狭い領域に限局して発現していた（図１Ｄ）。E12.5では、背側のより広い範囲に発現が認められ（図１Ｅ）、そのパターンはE14.5まで維持されていた（図１Ｆ）（Minaki Y, Mizuhara E, Morimoto K, Nakatani T, Sakamoto Y, Inoue Y, Satoh K, Imai T, Takai Y, Ono Y. Migrating postmitotic neural precursor cells in the ventricular zone extend apical processes and form adherens junctions near the ventricle in the developing spinal cord. Neurosci Res. 2005, 52(3):250-62.）。【０１０３】
脊髄では発生初期（E10.5-11.5）には６種類のニューロンが、後期（E12-13.5）には２種類のニューロンが発生することが知られている（図２; Caspary T, Anderson KV. Patterning cell types in the dorsal spinal cord: what the mouse mutants say. Nat Rev Neurosci. 2003, 4(4):289-97.; Helms AW, Johnson JE. Specification of dorsal spinal cord interneurons. Curr Opin Neurobiol. 2003, 13(1):42-9.; Matise M. A dorsal elaboration in the spinal cord. Neuron. 2002, 34(4):491-3.）。これらのうち４種類（dI4, dI5, dILA, dILB）がdorsal hornを形成し、知覚や痛みなどの末梢からのシグナルを中枢に伝達する。これらdorsal hornニューロンのうち、２種類（dI4, dILA ）はGABA産生抑制性ニューロンであり、残りの２種類（dI5, dILB）はグルタミン酸産生興奮性ニューロンである（図２）。【０１０４】
発生初期の脊髄背側ニューロンは背―腹方向に並んだ6つのドメインからそれぞれ産生される。65B13陽性細胞の種類を同定するために、以下のプロトコールにより、65B13（タンパクレベル）の発現を各種ニューロンマーカーと比較した。【０１０５】
マウス10.5日胚を摘出し4% PFA/PBS(-)で4℃、2時間固定したのち、20% ショ糖/PBS(-)で4℃、一晩置換し、OCTで包埋した。厚さ12μmの切片を作製し、スライドガラスに貼り付けた後、室温で30分乾燥させ、PBS(-)で再び湿潤させた。その後、ブロッキング（ブロックエース）を室温、30分間行い、一次抗体を室温、1時間反応させた後、さらに4℃、一晩反応させた。0.1% Tween-20/PBS(-)で、室温、15分間の洗浄を3回行った。次に蛍光標識した２次抗体を室温、1時間反応させ、同様に洗浄を行った後、PBS(-)によって室温、10分間洗浄し、封入した。一次抗体は、以下のものを使用した。65B13: WO 2004/038018およびMinaki Y, Mizuhara E, Morimoto K, Nakatani T, Sakamoto Y, Inoue Y, Satoh K, Imai T, Takai Y, Ono Y. Migrating postmitotic neural precursor cells in the ventricular zone extend apical processes and form adherens junctions near the ventricle in the developing spinal cord. Neurosci Res. 2005, 52(3):250-62.に記載、Pax2: Zymedより購入、Mash1: BD PharMingenより購入。【０１０６】
その結果、65B13はdI4領域に選択的に発現することが明らかになった（図３）。また、65B13は未分化な前駆細胞の存在するventrivular zone（VZ）内にのみ発現することから（図１）、E10.5脊髄における65B13陽性細胞はdI4の前駆細胞であることが明らかになった。【０１０７】
次に発生後期（E12.5）における65B13陽性細胞の同定を同様の方法で試みた。Corl1抗体はWO 2006/022243およびMizuhara E, Nakatani T, Minaki Y, Sakamoto Y, Ono Y. Corl1, a novel neuronal lineage-specific transcriptional corepressor for the homeodomain transcription factor Lbx1. J Biol Chem. 2005, 280(5):3645-55.に記載のものを使用した。【０１０８】
E12.5では、65B13は脊髄背側領域のVZ内に広く発現していた（図１）。背―腹方向での発現領域は、dILAおよびdILBの前駆細胞選択的なMash1発現領域、およびこれらのニューロンに発現するCorl1（Mizuhara E, Nakatani T, Minaki Y, Sakamoto Y, Ono Y. Corl1, a novel neuronal lineage-specific transcriptional corepressor for the homeodomain transcription factor Lbx1. J Biol Chem. 2005, 280(5):3645-55.）の発現領域と一致していた（図４Ａ）。したがって、65B13はdILAとdILBの前駆細胞の両方、またはいずれかに選択的に発現していることが明らかになった。この時期の脊髄背側では、初期とは異なり、２種類のニューロンが同一領域内で発生するので、発現場所により細胞種を同定することは出来ない。そこで、以下のプロトコールにより、65B13陽性細胞を分離し、培養することで、細胞種の同定を試みた。【０１０９】
まず、E12.5マウス脊髄領域を切り出し、細胞分散バッファー（Invitrogen）を用いて分散させた後、固定・透過処理せずに、抗65B13モノクローナル抗体（精製抗体1/100 希釈ずつ、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/SDIA分化培地（Kawasaki et. al. (2000) Neuron 28(1): 31-40））で4℃、20分間染色した。その後、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/PBSで4℃、3分間の洗浄を3回行い、PE標識抗ハムスターIgG抗体（Jackson、10μg/ml、1% ウシ胎児血清、1 mM EDTA/ SDIA分化培地）で4℃、30分間染色し、同様に洗浄した。染色後、セルソーターにより65B13発現細胞を分離した。分離した細胞をpoly-L-ornithine（Sigma、0.002% in PBS）、laminin（Invitrogen、5μg/ml in PBS）、fibronectin（Sigma、5μg/ml in PBS）コートしたスライドガラス上に播き、Knockout Serum Replacement (Gibco, 5%)、N2（Invitrogen、1x）、B27（Invitrogen、1x）、アスコルビン酸（Sigma、200μM）BDNF（Invitrogen、20 ng/ml）/ SDIA分化培地中で、37℃、2日間培養した。培養した細胞を2% PFA/PBSで4℃、20分間固定し、PBSで4℃、10分間の洗浄を2回行った。その後、0.3% Triton X-100/PBSで室温、30分間の透過処理を行い、10% normal donkey serum/ブロックエースで室温、20分間のブロッキングを行った。続いて、一次抗体（10% normal donkey serum、2.5% ブロックエース、0.1% Triton X-100/PBS）、で、室温、1時間反応させ、引き続き、4℃、一晩反応させた。翌日、0.1% Triton X-100/PBSで、室温、10分間の洗浄を3回行った後、蛍光標識した二次抗体（いずれもJackson、10μg/ml、10% normal donkey serum、2.5%ブロックエース、0.1% Triton X-100/PBS）で室温、30分間反応させた。その後、同様に洗浄し、PBSで室温、5分間洗浄し、封入して観察した。一次抗体は、以下のものを使用した。Lim1/2: Developmental Studies Hybridoma Bankより購入、HuC/D: molecular probeより購入、Gad65: BD PharMingenより購入。Lmx1b抗体は以下の方法で作製した。まず免疫に必要な抗原であるLmx1bの271-306 アミノ酸にあたる領域とGSTの融合タンパク質発現ベクターを構築した。このベクターをE.coli(JM109株)に導入した後、IPTGによって発現誘導し、グルタチオンビーズを用いて融合タンパク質を回収した。融合タンパク質をウサギに数回免疫した後に採血し、その血清から免疫に用いたGST-Lmx1b抗原によるaffinity精製を行うことによって、抗Lmx1bポリクローナル抗体を得た。核染色はSYTOX Green（molecular probe）を用いて行った。【０１１０】
その結果、まず、抗65B13抗体を用いることで、脊髄背側65B13発現細胞を生きたまま分離することが可能であることが示された（図５Ａ）。そして、脊髄背側65B13発現細胞は２日間の培養により、ほぼ全てがHuC/D陽性のニューロンに分化し、そのほとんどがLim1/2陽性、Gad1陽性のGABA産生dILAニューロンであることが明らかになった（図５Ｂ）。したがって、E12.5脊髄では、65B13はdILAの前駆細胞に選択的に発現していることが明らかになった。すなわち、胎児期脊髄では、65B13はdorsal hornのGABAニューロン前駆細胞（dI4およびdILA）に特異的に発現していることが明らかになり、抗65B13抗体を用いることで、これらの前駆細胞を分離することが可能であることが示された。【０１１１】
[実施例２]65B13の小脳原基における発現解析と65B13陽性細胞の分離
小脳はグルタミン酸産生顆粒細胞と、プルキンエ細胞、ゴルジ細胞、星状細胞、籠細胞などのGABA産生ニューロンにより構成される（Wang VY, Zoghbi HY. Genetic regulation of cerebellar development. Nat Rev Neurosci. 2001, 2(7):484-91.）。顆粒細胞はE12.5-14.5にかけてのrhombic lip領域から発生することが知られている（Wang VY, Zoghbi HY. Genetic regulation of cerebellar development. Nat Rev Neurosci. 2001, 2(7):484-91.）。一方、GABA産生ニューロンの発生については明らかでない部分が多いものの、最近の知見から、E11.5-E13.5のrhombomere1背側領域（小脳原基領域）からプルキンエ細胞が産生されると考えられている（Chizhikov VV, Lindgren AG, Currle DS, Rose MF, Monuki ES, Millen KJ. The roof plate regulates cerebellar cell-type specification and proliferation. Development. 2006, 133(15):2793-804.）。ゴルジ細胞については詳細な報告はないが、同様の領域から発生後期（E13.5-15.5）に産生されると考えられ、一方、星状細胞と籠細胞は生後に白質内の前駆細胞から発生すると考えられている（Zhang L, Goldman JE. Generation of cerebellar interneurons from dividing progenitors in white matter. Neuron. 1996, 16(1):47-54.）。【０１１２】
小脳原基における65B13発現細胞を同定するために、実施例１と同様の方法で、各種マーカーとの発現領域の比較を行った。Corl2抗体は、WO 2006/082826に記載のものを使用した。【０１１３】
その結果、E12.5小脳原基領域では、65B13は、Corl2陽性プルキンエ細胞発生領域のVZに選択的に発現することが明らかになった（図６Ａ）。一方、E14.5では、同一の65B13陽性領域からPax2陽性のゴルジ細胞と思われるニューロン（Maricich SM, Herrup K. Pax-2 expression defines a subset of GABAergic interneurons and their precursors in the developing murine cerebellum. J Neurobiol. 1999, 41(2):281-94.）が出現し始めることも明らかになった（図６Ｂ）。【０１１４】
そこで、65B13陽性細胞がプルキンエ細胞およびゴルジ細胞の前駆細胞であることを確認するために、65B13陽性細胞の分離および培養実験を行った。
E12.5およびE14.5小脳原基領域を切り出し、実施例１と同様の方法で、セルソーターを用いて65B13陽性細胞を検出・分離した。その結果、いずれの発生時期の小脳原基領域からも65B13陽性細胞を生きたまま分離することが可能であることが示された（図７）。そして、２日間の培養により、これらの細胞のほとんどがニューロンに分化し、E12.5の65B13陽性細胞のほとんどはCorl2陽性のプルキンエ細胞に（図８Ａ）、そしてE14.5の65B13陽性細胞のほとんどはPax2陽性のゴルジ細胞様ニューロンに（図８Ｂ）分化することが確認された。したがって、胎児期小脳では、65B13は、プルキンエ細胞およびゴルジ細胞の前駆細胞に選択的に発現し、抗65B13抗体を用いることで、これらの前駆細胞を分離可能であることが明らかになった。すなわち、65B13は脊髄dorsal hornおよび小脳のGABA産生ニューロン前駆細胞を分離するためのマーカーとして有用であることが示された。【０１１５】
[実施例３]ES細胞由来脊髄dorsal horn GABAニューロン前駆細胞の分離
次に、65B13をマーカーに用いることで、in vitroで分化誘導したGABAニューロン前駆細胞を分離可能であるか調べるために、以下のプロトコールにより、ES細胞より分化誘導した脊髄神経細胞（Wichterle H, Lieberam I, Porter JA, Jessell TM. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 2002, 110(3):385-97.）の分離を試みた。【０１１６】
Glasgow Minimum Essential Medium（Invitrog）に、5% ウシ胎児血、2 mM L-glutamine（Invitrogen）、0.1 mM Non-essential amino acid（Invitrogen）、1 mM sodium pyruvate（sigma）、0.1 mM 2-mercaptoethanol（sigma）、100 U/ml penicillin（Invitrogen）、100μg/ml streptomycin（Invitrogen）を添加した培地10 mlを10 cm dishに入れ、1.5 x 106個の細胞を播き、37℃、二酸化炭素5％、湿度95％の条件で、２日間培養した。その後、形成された細胞塊（EB）を上記培地中に回収し、2μM retinoic acid（sigma）を添加し、さらに4日間培養した。その後、実施例１と同様の方法で細胞を分散、抗65B13抗体で染色し、セルソーターで分離した。【０１１７】
その結果、ES細胞から分化誘導した脊髄細胞集団中に65B13陽性細胞が検出されたことから、ES細胞由来脊髄背側ニューロン前駆細胞も、胎児脊髄細胞と同様に65B13を発現することが明らかになった（図９Ａ）。また、分離した細胞の約50％がHuC/D陽性のニューロンに分化し、そのうち約70％がPax2陽性のGABAニューロンに分化することも確認された（図９Ｂ）。したがって、65B13は、胎児のみならず、ES細胞由来GABAニューロン前駆細胞の分離に有用なマーカーであることが示された。【０１１８】
[実施例４]65B13プロモーターを用いた外来遺伝子のGABA産生ニューロン前駆細胞特異的発現
次に、65B13プロモーターを用いることで、外来遺伝子をGABA産生ニューロン前駆細胞特異的に発現させることが可能であるかを調べるために、以下のプロトコールで、トランスジェニックマウスを作製し、外来遺伝子の発現を解析した。【０１１９】
まず、ウシgrowth hormoneポリA付加配列（配列番号：５５；Invitrogen pcDNA3.1+ベクターより）を増幅し、pSP73（プロメガ）のHindIII/XhoI部位に挿入し、pSP73-polyAを構築した。次に、配列番号：５６と５７の合成DNAをアニーリングしたものをpSP73-polyAのAsp718I/BamHI部位に挿入し、pSP73-polyA IIを構築した。65B13の翻訳開始コドンより上流約3.2ｋｂのマウスゲノム断片（配列番号：５８）をpSP73-polyA IIのClaI/Asp718I部位に挿入し、pN3を構築した。最後に、外来遺伝子としてマウスGsh1 cDNA（配列番号：５９）をpN3のAsp718I/SalI部位に挿入し、pN3-Gsh1を構築した。ClaIで直鎖化したpN3-Gsh1を、Gordonらの方法に従って(Gordon JW, Scangos GA, Plotkin DJ, Barbosa JA, Ruddle FH.Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Dec;77(12):7380-4.)、マウス受精卵前核にインジェクションし、仮親に移植した。胎生12.5日に胎児を取り出し、実施例1の方法で、小脳原器におけるNeph3およびGsh1の発現を解析した。抗Gsh1抗体は以下の方法で作製した。まず免疫に必要な抗原であるGsh1の1-72 アミノ酸にあたる領域とGSTの融合タンパク質発現ベクターを構築した。このベクターをE.coli(JM109株)に導入した後、IPTGによって発現誘導し、グルタチオンビーズを用いて融合タンパク質を回収した。回収した融合タンパク質をラットに免疫したのち、リンパ球細胞を取り出してミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１と細胞融合させ、抗Gsh1抗体産生ハイブリドーマを得た（ハイブリドーマ作製はコージンバイオに外注）。【０１２０】
その結果、野生型の小脳ではGsh1は65B13陽性GABA産生ニューロン前駆細胞のうち腹側のごく一部の集団にのみ発現するのに対し、トランスジェニックマウスでは65B13陽性領域の全域でかつ特異的にGsh1の発現が認められた（図１１）。このことから、65B13プロモーターを用いることで、GABA産生ニューロン前駆細胞特異的に外来遺伝子を発現させることができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２１】
本発明では、脊髄dorsal hornおよび小脳GABAニューロン前駆細胞選択的マーカー65B13を同定し、これに対する抗体を用いて、GABAニューロン前駆細胞の分離に成功した。この技術は、GABAニューロン前駆細胞を生きた状態のまま提供することが出来、また変性疾患などの移植治療のための材料調製や、特異的遺伝子の探索、GABAニューロンをターゲットにした創薬などに有用であると期待される。
本発明者によって同定されたマーカー遺伝子は、膜タンパク質をコードすることから、該マーカーを指標とすることにより、GABAニューロン前駆細胞を検出・選択し、GABAニューロン前駆細胞を生きた状態のまま単離（分離）することが可能である。
本発明のマーカーを利用した、GABAニューロン前駆細胞の取得方法により、高純度のGABAニューロンが得られることから、例えば、脊髄GABAニューロンであれば痛みに対する創薬などに、小脳GABAニューロンであれば小脳変性症に対する創薬などに適用することが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
配列番号：３３  Mouse 65B13  NM_172898   extracellular: 20-513 a.a.
配列番号：３５  Mouse 65B13  BC052773   extracellular: 20-513 a.a.
配列番号：３７  Human 65B13  NM_032123   extracellular: 21-510 a.a.
配列番号：３９  Human 65B13  NM_199180   extracellular: 21-510 a.a.
配列番号：４１  Human 65B13  AY358742   extracellular: 21-510 a.a.
配列番号：４３  Human 65B13  AY305301   extracellular: 21-510 a.a.
配列番号：４５  Human 65B13  NM_199179   extracellular: 21-460 a.a.
配列番号：４７  Human 65B13  AY305302   extracellular: 21-460 a.a.
配列番号：４９  Human 65B13  BC064925   extracellular: 21-490 a.a.
配列番号：５１  Chimpanzee 65B13 (predicted)  XM_512603   extracellular: 21-445 a.a.
配列番号：５３  Cattle 65B13 (predicted)  XM_583222   extracellular: 44-607 a.a.
【図１】
2008096817.tif 000002
【図２】
2008096817.tif 000003
【図３】
2008096817.tif 000004
【図４】
2008096817.tif 000005
【図５】
2008096817.tif 000006
【図６】
2008096817.tif 000007
【図７】
2008096817.tif 000008
【図８】
2008096817.tif 000009
【図９】
2008096817.tif 000010
【図１０】
2008096817.tif 000011
【図１１】
2008096817.tif 000012
【配列表】
2008096817000001.app
【国際調査報告】
2008096817.tif 000013
2008096817.tif 000014
2008096817.tif 000015
2008096817.tif 000016
2008096817.tif 000017
2008096817.tif 000018
2008096817.tif 000019