(57)【要約】  バソヒビンからなるリンパ管新生抑制剤、バソヒビンをコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなるリンパ管新生抑制剤、前記抑制剤を含有してなる、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物の製造のためのバソヒビンの使用、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物の製造のためのバソヒビンをコードするポリヌクレオチドの使用、ならびに前記抑制剤を投与する工程を含む、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療方法。本発明の抑制剤は、例えば、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療などに好適に用いられる【特許請求の範囲】
【請求項１】
バソヒビンからなるリンパ管新生抑制剤。
【請求項２】
バソヒビンをコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなるリンパ管新生抑制剤。
【請求項３】
バソヒビンが、配列番号２の７７位のＭｅｔから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列を含むものである、請求項１記載の抑制剤。
【請求項４】
バソヒビンをコードするポリヌクレオチドが、配列番号２の７７位のＭｅｔから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むものである、請求項２記載の抑制剤。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか記載の抑制剤を含有してなる、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物。
【請求項６】
リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、バソヒビンの使用。
【請求項７】
リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、バソヒビンをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項８】
請求項１〜４いずれか記載の抑制剤を投与する工程を含む、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リンパ管新生抑制剤に関する。さらに詳しくは、バソヒビンからなるリンパ管新生抑制剤、該抑制剤を含有したリンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物の製造のためのバソヒビンの使用、及び該抑制剤を投与する工程を含むリンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌細胞は、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：血管内皮増殖因子）を分泌して癌組織内に腫瘍血管新生を促すことで、酸素・栄養を得て増大することが分かっている。一方、癌細胞の中には、ＶＥＧＦ−Ｃを分泌するものも多い。ＶＥＧＦ−Ｃ又はＶＥＧＦ−Ｄは、既存のリンパ管内皮細胞に発現するＶＥＧＦＲ３に作用して、腫瘍周囲あるいは腫瘍内に拡大・増殖したリンパ管を新生する（以下、腫瘍リンパ管と定義する）。この腫瘍リンパ管新生によって、癌細胞がリンパ管内に侵入しやすくなり、癌細胞のリンパ節転移が生じる。最近、リンパ管に転移した癌細胞は、リンパ管新生や血管新生を誘導して、さらに遠隔転移を来すことも分かってきた。【０００３】
一方、ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦＲ３又はＶＥＧＦ−Ｄ／ＶＥＧＦＲ３の作用に着目して、ＶＥＧＦＲ３インヒビターを含む組成物を用いることにより、患者の角膜におけるリンパ管新生を抑制する手法が開示されている（特許文献１参照）。また、Ｎ−オキシドアントラニルアミド誘導体やシアノアントラニルアミド誘導体がＶＥＧＦＲキナーゼ阻害剤として卓越した効果を示すことから、リンパ管新生の効果的な阻害剤であると報告されている（特許文献２、３参照）。【０００４】
また、ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＥＧＦＲ３、ＶＥＧＦ−Ｄ／ＶＥＧＦＲ３以外のリンパ管新生関連分子として、Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ／Ｔｉｅ、ＰＤＧＦ−ＢＢ／ＰＤＧＦＲ−β、ＦＧＦ２／ＦＧＦＲ３、ＨＧＦ／Ｍｅｔ等が報告されているが、これらの関連分子に関するリンパ管新生抑制剤についての報告はない。
【特許文献１】特開２００５−５２５３５２号公報
【特許文献２】特開２００４−５３２２８１号公報
【特許文献３】特開２００４−５２８３７８号公報
【発明の要約】
【０００５】
本発明は、
〔１〕  バソヒビンからなるリンパ管新生抑制剤、
〔２〕  バソヒビンをコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなるリンパ管新生抑制剤、
〔３〕  前記〔１〕又は〔２〕記載の抑制剤を含有してなる、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物、
〔４〕  リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、バソヒビンの使用、
〔５〕  リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、バソヒビンをコードするポリヌクレオチドの使用、ならびに
〔６〕  前記〔１〕又は〔２〕記載の抑制剤を投与する工程を含む、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療方法
に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、ｂＦＧＦにより誘導されるリンパ管新生のバソヒビンによる抑制を示す。
【図２】図２は、ＶＥＧＦ−Ａにより誘導されるリンパ管新生のバソヒビンによる抑制を示す。
【図３】図３は、ＶＥＧＦ−Ｃにより誘導されるリンパ管新生のバソヒビンによる抑制を示す。
【図４】図４は、ＰＤＧＦ−ＢＢにより誘導されるリンパ管新生のバソヒビンによる抑制を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００７】
本発明は、ＶＥＧＦＲ３インヒビター以外の物質からなるリンパ管新生抑制剤、該抑制剤を含有するリンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物の製造のためのバソヒビンの使用、及び該抑制剤を投与する工程を含むリンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療方法に関する。
【０００８】
本発明の抑制剤により、リンパ管新生を抑制することが可能となる。
【０００９】
本発明者等はこれまで、バソヒビンが血管新生におけるネガティブフィードバック調節因子として作用することを明らかにした。しかし、バソヒビンのリンパ管における作用は不明であり、本発明者等が鋭意検討した結果、バソヒビンを用いてリンパ管新生を抑制することが可能であることを見出して本発明を完成した。
【００１０】
本発明は、リンパ管新生の抑制においてバソヒビンを用いることに大きな特徴を有し、本発明のリンパ管新生抑制剤としては、バソヒビンからなる抑制剤（態様１）とバソヒビンをコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなる抑制剤（態様２）が例示され、リンパ管新生を抑制する観点から使用される。バソヒビンは、腫瘍細胞や間質細胞、マクロファージなどから分泌される血管新生促進因子（ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−２等）により血管内皮細胞に発現し、内皮細胞自身にオートクライン的に作用して、血管新生を抑制する物質である。バソヒビンの有するこのような血管新生抑制に関した優れた効果を利用し、バソヒビン蛋白質あるいはバソヒビン遺伝子を体外より投与することにより、さらに強く血管新生を抑制することができる。一方、バソヒビンは、リンパ管においても同様に、リンパ管内皮細胞に作用してリンパ管新生を抑制すると考えられるので、体外よりバソヒビン蛋白質あるいはバソヒビン遺伝子を投与することにより、リンパ管新生を抑制することが可能であると推定される。
【００１１】
本発明におけるバソヒビン（Ｖａｓｏｈｉｂｉｎ）としては、バソヒビン１及びバソヒビン２が挙げられる。ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示されているようにバソヒビン１とバソヒビン２は、異なる染色体上に存在する別の遺伝子であるが、それらの遺伝子がコードする蛋白質のアミノ酸配列は５８％の相同性を有しており、共に血管新生に対する抑制活性を有する。バソヒビン１は配列番号１の３８６番目のＡから１４８０番目のＣで表される塩基配列からなるＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、及び配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドのことを、バソヒビン２は配列番号３の１番目のＡから１０６８番目のＧで表される塩基配列からなるＡＹ８３４２０２ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質、及び配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるＡＹ８３４２０２ポリペプチドのことをいう。
【００１２】
また、ＷＯ０７／０３７２４５に開示されているようにバソヒビン１の特定の配列、即ち、配列番号２の７７位のＭｅｔから３６５位のＶａｌまでのアミノ酸配列が、血管新生抑制活性がより高いことから、本発明におけるバソヒビンとしては、前記アミノ酸配列を含むもの、あるいは、前記アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含むものであることが好ましい。
【００１３】
本発明におけるポリヌクレオチドとしては、配列番号１に表される塩基配列からなるＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチド、配列番号３に表される塩基配列からなるＡＹ８３４２０２ポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチド又はそれらの相補鎖とストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチドが、例示される。
【００１４】
ここでいう「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの断片をプローブとして、当該分野において周知慣用な手法、例えば、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したメンブランを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Ｓａｌｉｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｉｔｒａｔｅ：１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）溶液を用い、６５℃でメンブランを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）などに記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、アデニン（Ａ）又はチミン（Ｔ）のみからなる配列は除外される。
【００１５】
本明細書において「ハイブリダイズしうるポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。そのようなポリヌクレオチドとして、具体的には、配列番号１で表されるＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドや配列番号３で表されるＡＹ８３４２０２ポリヌクレオチドと少なくとも６０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。なお、本明細書において、相同性は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０（１９９０））の開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、スコアで類似度が示される。
【００１６】
上記ポリヌクレオチドは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６に開示された方法に従って調製することができる。また、アミノ酸配列に基づいて、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドやＡＹ８３４２０２ポリペプチドをコードするＤＮＡを化学合成することによっても調製することができる。ＤＮＡの化学合成は、チオホスファイト法を利用した島津製作所社製のＤＮＡ合成機、フォスフォアミダイト法を利用したパーキン・エルマー社製のＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ３９２などを用いて行うことができる。
【００１７】
本発明におけるポリペプチドとしては、配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるＫＩＡＡ１０３６ポリペプチド、配列番号４に表されるアミノ酸配列からなるＡＹ８３４２０２ポリペプチド、前記アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入又は置換を有するポリペプチド、及びそれらの誘導体、ならびにそれらの塩が例示される。
【００１８】
本明細書中において、「ポリペプチドの誘導体」とは、例えば、ポリペプチドをアセチル化、パルミトイル化、ミリスチル化、アミド化、アクリル化、ダンシル化、ビオチン化、リン酸化、サクシニル化、アニリド化、ベンジルオキシカルボニル化、ホルミル化、ニトロ化、スルフォン化、アルデヒド化、環状化、グリコシル化、モノメチル化、ジメチル化、トリメチル化、グアニジル化、アミジン化、マレイル化、トリフルオロアセチル化、カルバミル化、トリニトロフェニル化、ニトロトロポニル化、ポリエチレングリコール化又はアセトアセチル化した誘導体等をいう。これらの中でもＮ末端のアセチル化、Ｃ末端のアミド化、Ｃ末端のメチル化は、末端からポリペプチドを分解するエキソペプチダーゼに対する抵抗性が付与され、また、グリコシル化またはポリエチレングリコール化によっても生体中における安定性が高くなることが期待されるので好ましい。
【００１９】
本明細書において、「塩」とは、ポリペプチド又はそれらの誘導体の薬理学的に許容される任意の塩（無機塩及び有機塩を含む）をいい、例えば、ポリペプチド又はそれらの誘導体のナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、アンモニウム塩、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、燐酸塩、有機酸塩（酢酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、プロピオン酸塩、蟻酸塩、安息香酸塩、ピクリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩等）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、燐酸塩が望ましい。
【００２０】
上記ポリペプチドは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示された方法に従って調製することができる。
【００２１】
また、上記ポリペプチドの誘導体は、当該分野で公知の方法により、作製され得る。また、上記ポリペプチドの塩も、当該分野で公知の任意の方法により、当業者によって容易に作製され得る。
【００２２】
態様１の抑制剤は、実質的に、前記バソヒビンにより構成されるが、態様２の抑制剤は前記バソヒビンをコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターにより構成される。
【００２３】
ベクターは、宿主細胞において自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、バソヒビンをコードする遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。本発明に用いられる好適なベクターとしては、後述するベクターが挙げられる。
【００２４】
上記ベクターは、公知の方法に準じて調製することができ、例えば、ＷＯ０２／０９０５４６、ＷＯ２００６／０７３０５２等に開示された方法に従って調製することができる。
【００２５】
本発明はまた、前記バソヒビンからなる抑制剤を含有してなる、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療用医薬組成物、即ち、治療剤を提供する。
【００２６】
本発明において、治療にリンパ管新生抑制作用を要する疾患としては、リンパ管新生を抑制することにより治療効果がみられる疾患であれば特に限定はないが、例えば、悪性腫瘍のリンパ節転移、リンパ管炎、リンパ節炎、リンパ管腫、母斑、肺リンパ脈管筋腫症、角膜移植、カボジ肉腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫等が例示される。特に、リンパ管炎、リンパ節炎、リンパ管腫、母斑、肺リンパ脈管筋腫症は、血管新生を抑制しても治療効果が認められないため、本発明の治療剤の適用が期待される。
【００２７】
本発明の治療剤としては、本発明の抑制剤を公知の医薬用担体と組み合わせて製剤化したものが挙げられる。また、本発明の治療剤としては、バソヒビンをバソヒビンと同じ用途に使用可能な他の成分、例えば公知のリンパ管新生を抑制する作用を有する成分、例えばＶＥＧＦＲ３インヒビターなどと配合することもできる。
【００２８】
本発明の治療剤の製造は、通常、本発明の抑制剤を薬学的に許容できる液状又は固体状の担体と配合することにより行われ、所望により溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等を加えて、錠剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、カプセル剤等の固形剤や、通常液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤とすることができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品や、その他、外用剤とすることもできる。なお、医薬用担体は、治療剤の投与形態及び製剤形態に応じて選択することができ、特に限定はない。
【００２９】
上記のような各種製剤形態での治療剤は、それぞれ公知の医薬用担体などを利用して、適宜、常法により製造することができる。また、かかる治療剤における本発明の抑制剤の含有量は、その投与形態、投与方法などを考慮し、本発明の所望の効果の発現が得られ得るような量であればよく、特に限定されるものではない。本発明の治療剤中の本発明の抑制剤の含有量としては通常１〜１００重量％程度である。
【００３０】
本発明の治療剤は、製剤形態に応じた適当な投与方法で投与される。投与方法も特に限定はなく、例えば内用、外用及び注射により投与することができる。本発明の治療剤を注射により投与する場合は、たとえば静脈内、筋肉内、皮下、皮内などに投与し得、外用により投与する場合は、たとえば、座剤等の外用剤として、その適する投与方法により投与すればよい。
【００３１】
本発明の治療剤の投与量は、その製剤形態、投与方法、使用目的及び当該治療剤の投与対象である患者の年齢、体重、症状によって適宜設定され一定ではない。また、投与は、所望の投与量範囲内において、１日内において単回で、又は数回に分けて行ってもよい。投与期間も任意である。
【００３２】
本発明はまた、被験体に、バソヒビンを投与することを含む、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療方法を提供する。
【００３３】
本明細書中において被験体とは、好ましくはリンパ管新生抑制作用を必要とするヒトであるが、ペット動物等であってもよい。
【００３４】
また、本明細書中において有効量とは、バソヒビンを上記被験体に投与した場合に、バソヒビンを投与していない被験体と比較して、リンパ管新生抑制作用を発揮するバソヒビンの量である。具体的な有効量としては、投与形態、投与方法、使用目的及び被験体の年齢、体重、症状等によって適宜設定され一定ではない。
【００３５】
本発明のリンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療方法においては、有効量のバソヒビンをそのまま上記被験体に投与してもよく、また、上記のような治療剤等の医薬として投与してもよい。また、投与方法にも限定はなく、例えば、上記の医薬と同様に、経口投与や注射等により投与すればよい。
【００３６】
本発明の治療方法によれば、前記の本発明の治療剤の対象となる疾患を治療することができ、例えば、リンパ管新生が原因因子となって起こる疾患の治療を行う効果が発揮され得る。
【００３７】
また、本発明のバソヒビンをコードするポリヌクレオチドを含有してなるベクターからなるリンパ管新生抑制剤は、リンパ管新生が原因因子となって起こる疾患を有する患者における遺伝子治療に使用することができる。
【００３８】
本発明のベクターからなる抑制剤の患者への導入方法としては、該抑制剤を直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法及びヒトからある種の細胞を取り出して体外でＤＮＡを該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある［日経サイエンス、４月号、２０−４５（１９９４）、月間薬事、３６、２３−４８（１９９４）、実験医学増刊、１２、１５（１９９４）］。本発明では、ｉｎ ｖｉｖｏ法が好ましい。
【００３９】
ｉｎ ｖｉｖｏ法により投与する場合は、治療目的の疾患、標的臓器などに応じた適当な投与経路により投与される。例えば、病変の認められる組織に直接局所投与するか又は静脈、動脈、皮下、筋肉内、腹腔内、内視鏡的、エアロゾル的等により投与することも可能である。投与方法としては静脈内又は腹腔内投与が好ましい。また、病変の見られる組織の直接注射も好ましい。核磁気共鳴撮像又はコンピューター断層撮影等の当該技術分野で利用できる任意のものを使用して病変の見られる組織を撮影し、例えば、定位注射により本発明のベクターからなる抑制剤を投与することができる。
【００４０】
本発明のベクターからなる抑制剤を遺伝子治療用ベクターとして用いる場合、前記抑制剤の形態としては、上記の各投与形態にあった種々の製剤形態をとることができる。例えば、有効成分であるバソヒビンをコードするＤＮＡを含有する注射剤とした場合、当該注射剤は常法により調製することができる。遺伝子治療剤に用いる基剤としては、通常注射剤に用いる基剤であれば、特に制限されず、蒸留水、塩化ナトリウム、又は塩化ナトリウムと無機塩等との混合物の塩溶液、マンニトール、ラクトース、デキストラン、グルコース等の溶液、グリシン、アルギニン等のアミノ酸溶液、有機酸溶液又は塩溶液とグルコース溶液との混合溶液等が挙げられ得る。また、常法に従い、これらの基剤に浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、ゴマ油、ダイズ油等の植物油又はレシチン若しくは非イオン性界面活性剤等の界面活性剤等の助剤を用いて、溶液、懸濁液、分散液として注射剤を調製してもよい。これらの注射剤を粉末化、凍結乾燥等の操作により用事溶解用製剤とすることもできる。
【００４１】
前記製剤中のバソヒビンをコードするＤＮＡの含有量は、治療目的の疾患、投与部位、投与回数、所望治療期間、患者の年齢、体重等により異なり、適宜調整することができるが、通常患者（体重６０ｋｇとして）においては一般にバソヒビンをコードするＤＮＡの重量にして約０．０１〜２０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇである。
【００４２】
以下に、バソヒビンの作製方法および遺伝子治療用ベクターの作成方法等を具体的に記載する。
【００４３】
（１）バソヒビンの作製方法
バソヒビンは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）等に記載された方法等を用い、例えば、以下の方法により、バソヒビンの遺伝子を宿主細胞中で発現させ、作製することができる。
【００４４】
バソヒビンのタンパク質をコードする全長ＤＮＡを基にして、必要に応じて、該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該タンパク質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは該タンパク質の生産率を向上させるうえで有用である。該ＤＮＡ断片、又は全長ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡ（発現用プラスミド）を作製する。該発現用プラスミドを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、バソヒビンを生産する形質転換体を得ることができる。
【００４５】
宿主細胞としては、原核細胞、動物細胞、昆虫細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製が可能、又は染色体中への組込みが可能で、バソヒビンをコードする遺伝子の転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
【００４６】
（i）原核生物を宿主として用いる場合
バソヒビン蛋白質の発現ベクターは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、バソヒビンをコードする遺伝子、転写終結配列より構成されていることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【００４７】
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（ロシュダイアグノスティックス社製）、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＳＴＶ２８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９（宝酒造社製）、ｐＫＫ２３３-２（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＳＥ２８０、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ-１（プロメガ社製）、ｐＱＥ-８（キアゲン社製）、ｐＧＥＸ（ファルマシア社製）、ｐＥＴシステム（ノバジェン社製）、ｐＭＡＬ-ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８-１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＥＧ４００（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，２３９２（１９９０））、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ-５４０７）、ｐＴｒｓ３２(ＦＥＲＭ  ＢＰ-５４０８)、ｐＧＨＡ２(ＦＥＲＭ  ＢＰ-４００)、ｐＧＫＡ２(ＦＥＲＭ  Ｂ-６７９８)、ｐＰＡ１（特開昭６３-２３３７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３-２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）等を例示することができる。
【００４８】
プロモーターとしては、大腸菌等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
【００４９】
また、リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ-Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離、例えば、６〜１８塩基に調節したプラスミドを用いることが好ましい。バソヒビン遺伝子の発現において転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００５０】
宿主細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の原核生物が挙げられ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属としてＥ．ｃｏｌｉのＸＬ１−Ｂｌｕｅ株、ＸＬ２−Ｂｌｕｅ株、ＤＨ１株、ＭＣ１０００株、ＫＹ３２７６株、Ｗ１４８５株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｎｏ．４９株、Ｗ３１１０株、ＮＹ４９株、ＢＬ２１（ＤＥ３）株、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）株及びＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株等が、Ｓｅｒｒａｔｉａ属として、Ｓ．ｆｉｃａｒｉａ株、Ｓ．ｆｏｎｔｉｃｏｌａ株、Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ株等が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属として、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ株、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ株等が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｂ．ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ株、Ｂ．Ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６８）株、Ｂ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６６）株等が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３０３２）株、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１４０６７）株、Ｃ．ｇｕｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８６９）株、Ｃ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１３８７０）株等が、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属として、Ｍ．ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ：１５３５４）株等が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属として、Ｓ．ｍｅｐｈｉｔｉｃａ株等が例示される。
【００５１】
発現用プラスミドの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１６，６１２７（１９８８））、リン酸カルシウム法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２））、プロトプラスト法〔特開昭６３−２４８３９４２、Ｇｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）〕に記載の方法等が挙げられる。
【００５２】
（ii）動物細胞を宿主として用いる場合
宿主として動物細胞を用いる場合、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡ１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＨＭ６（ロシュダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ（アマシャムバイオサイエンス社製）、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））、ｐＡＧＥ１０３（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（ｐＡＭｏＰＲＳＡ）（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３））、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０５）等を用いることができる。
【００５３】
プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいずれも用いることができ、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のＩＥ（Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、モロニー株マウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｌｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ）のロング・ターミナル・リピート・プロモーター（Ｌｏｎｇ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、レトロウイルスのプロモーター、ＨＳＰプロモーター、ＳＲαプロモーター及びメタロチオネインのプロモーター等を挙げることができる。また、ｈＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【００５４】
宿主に用いる動物細胞としては、ヒト由来株細胞のＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）、Ｎａｍａｌｗａ（バーキットリンパ腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１４３２）、ＨｅＬａ（子宮頚部癌細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、ＨＢＴ５６３７（白血病細胞、特開昭６３−２９９）、ＢＡＬＬ−１（白血病細胞）及びＨＣＴ−１５（大腸癌細胞）；マウス由来株細胞のＳｐ２／０−Ａｇ１４（マウス骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）及びＮＳＯ（マウス骨髄種細胞）；サル由来株細胞のＣＯＳ−１（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５０）及びＣＯＳ−７（アフリカミドリザル腎細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６５１）；ハムスター由来株細胞のＣＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−６１）及びＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）（シシリアンハムスター仔腎細胞、ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−１０）；ラット由来株細胞のＰＣ１２（副腎褐色細胞腫、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７２１）及びＹＢ２／０（ラット骨髄種細胞、ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１６６２）等を例示することができる。
【００５５】
発現用プラスミドの導入方法としては、宿主にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，（１９９０））、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３））が挙げられる。
【００５６】
（iii）昆虫細胞を宿主として用いる場合
宿主として昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＦＡＳＴＢａｃ１（インビトロジェン社製）等が、感染用ウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するバキュロウイルス（Ｖａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＭＮＰＶ）Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡ等が挙げられる。昆虫細胞の形質転換の方法は、例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載の方法が用いられる。
【００５７】
昆虫細胞培養液に目的遺伝子を含む発現ベクター及び昆虫細胞への感染用のバキュロウイルスＤＮＡを添加し、組換えにより作製された目的遺伝子を発現するウイルスが昆虫細胞に感染することによりバソヒビンを発現することができる。
【００５８】
宿主に用いる昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ヨトウガ）由来株細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（イラクサキンウワバ）由来株細胞等が挙げられ、具体的には、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来細胞としては、Ｓｆ９（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１７１１、卵巣細胞）、Ｓｆ２１（卵巣細胞）等が、Ｔ．ｎｉ由来細胞株としては、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（卵細胞、インビトロジェン社製）等が例示される。
【００５９】
発現用プラスミドの導入方法としては、宿主に導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等を挙げることができる。リポフェクション法では、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ試薬（インビトロジェン社）を用いることができる。また、動物細胞と同様に、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））等も用いることができる。
【００６０】
（iv）形質転換体の培養方法
バソヒビンをコードするＤＮＡを組み込んだ発現用プラスミドを保有する形質転換体が、大腸菌、動物細胞等の細胞の場合、各種宿主に適した通常の培養方法に従って培養し、該タンパク質を産生・蓄積させ、形質転換体又は培養液より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を作製することができる。形質転換体が、動物個体又は植物個体の場合、各種宿主に適した通常の生育方法に従って飼育又は栽培し、該タンパク質を産生・蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該タンパク質を回収することにより、該タンパク質を作製することができる。
【００６１】
宿主が動物個体の場合、例えば、バソヒビンをコードする遺伝子を保有する非ヒトトランスジェニック動物を飼育し、該プラスミドのコードするバソヒビンを該動物中に産生・蓄積させ、該動物個体中から該タンパク質を回収することにより、バソヒビンを作製することができる。動物個体中の産生・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク、唾液、卵等を挙げることができる。
【００６２】
宿主が大腸菌等の原核生物である場合、例えば、バソヒビンをコードする遺伝子を保有する形質転換体を培地中で培養し、該プラスミドのコードするバソヒビンを培養液に産生・蓄積させ、該培養液から該タンパク質を回収することにより、バソヒビンを作製することができる。
【００６３】
バソヒビンの形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
【００６４】
得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００６５】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。
【００６６】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
【００６７】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。
【００６８】
形質転換体が大腸菌等の原核生物である場合、かかる培地としては、例えば、バクトトリプトン、イーストエクストラクト及び塩化ナトリウムを含むＹＴ培地が好ましい。
【００６９】
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７０】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
【００７１】
バソヒビン作製用形質転換体が動物細胞である場合、該細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７））、ＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））、Ｄ−ＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０））又はこれら培地に牛胎児血清（ＦＣＳ）等を添加した培地等が用いられる。
【００７２】
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％  ＣＯ２存在下等の条件で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００７３】
形質転換体が昆虫細胞である場合、培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（ＪＲＨバイオサイエンシーズ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  ＩｎｓｅｃｔＭｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））等を用いることができる。
【００７４】
（ｖ）作製方法
バソヒビンは、形質転換体を培養し、培養液からバソヒビンを単離・精製することにより作製することができる。バソヒビンの単離・精製方法は、当該分野において周知慣用の常法により行うことができ、例えば、酵素の単離・精製方法やＳａｎｄｌｅｒらの糖転移酵素の精製方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８）を用いることができる。
【００７５】
バソヒビンが溶解性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記のように形質転換体を培養した培養液を、例えば、遠心分離等の方法で細胞又は菌体と培地に分離する。バソヒビンが宿主細胞内に存在する場合、採取した細胞又は菌体をＳＴＥ溶液等の適当な緩衝液で洗浄した後、超音波、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等で細胞又は菌体を破砕し、遠心分離やろ過により無細胞溶液として得ることができる。
【００７６】
バソヒビンの分離・精製に用いる緩衝液には界面活性剤が適量含まれていてもよく、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等を含んでいてもよい。
【００７７】
得られた粗精製物に含まれる目的タンパク質の分離・精製方法は自体公知の各種分離・精製方法を組み合わせて行うことができる。これらの公知の方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、透析法、有機溶媒による沈殿法、限外濾過法、ゲル濾過、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロースクロマトグラフィー、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学社製）等のリジンを用いた陰イオンクロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のリジンを用いた陽イオンクロマトグラフィー、ブチルセファロース等の疎水性クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー法、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法や等電点電気泳動法等の各種電気泳動法等が例示される。アフィニティークロマトグラフィーは、バソヒビンに対する抗体を用いることによっても行うことができる。
【００７８】
バソヒビンが不溶性ポリペプチドとして産生・蓄積される場合、上記同様に細胞又は菌体を分離し、適当な方法により破砕後、該ポリペプチドを含む分画を回収する。回収した試料は、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）やＮ−ラウロイルサルコシンナトリウム（サルコシル）等の界面活性剤等の可溶化剤で可溶化する。該可溶化液は、可溶化剤を含まないか殆ど含まれない濃度にまで希釈又は透析し、該ポリペプチドを正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の分離・精製方法により精製標品を得ることができる。
【００７９】
また、バソヒビンを他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる（山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５））。融合タンパク質に使用する付加タンパク質としてはプロテインＡ、ＦＬＡＧ等が例示される（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，４，１２８８（１９９０）、特開平５−３３６９６３、特開平６−８２３０２１）。プロテインＡを使用する場合、バソヒビンとプロテインＡの融合タンパク質を生産し、イムノグロブリンＧを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。ＦＬＡＧペプチドを使用する場合、バソヒビンとＦＬＡＧの融合タンパク質を生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてアフィニティークロマトグラフィーを行うことにより精製することができる。
【００８０】
上記の形質転換体により作製する方法以外には、バソヒビンは、公知の方法に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いても生産することができる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１０，１６６−１６８（１９９１））。
【００８１】
また、バソヒビンは、そのアミノ酸配列を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法や市販されているペプチド合成機器、例えば、ＡＰＥＸ３９６（アドバンストケムテック社製）、４３３Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）、ＰＳ３（プロテインテクノロジーズ社製）、９０５０（パーセプティブ社製）、ＰＳＳＭ−８（島津製作所製）等のペプチド合成機器により化学合成することができる。
【００８２】
（２）遺伝子治療用ベクターの作製方法
遺伝子治療用ベクターの作製方法、細胞における発現方法等は上記「バソヒビンの作製方法」に記載の発現ベクターと同様である。
【００８３】
発現ベクターは安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サル等）に対して投与することができる。遺伝子治療に用いる際には、ヒトを含む哺乳動物の細胞内で蛋白質を発現でき、かつ、安全性の高いＤＮＡ若しくはＲＮＡウイルスベクター又はプラスミドベクターを用いるのが好ましい。遺伝子治療に好ましいウイルスベクターとしては，アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等が挙げられる。遺伝子治療に好ましいプラスミドとしては、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，１０８，１９３−２００（１９９１））、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）等が挙げられる。
【００８４】
なお、バソヒビンをコードするＤＮＡにシグナル配列を付加することにより、分泌蛋白質となり、局所投与する必要は必ずしもなく、細胞内で産生、分泌された蛋白質が遠く離れた標的臓器に作用し、リンパ管新生抑制作用を生ずる。従って、病理組織以外の正常組織内又は正常細胞内への投与も可能である。なお、ヒトに投与する場合は静脈内投与又は筋肉内投与が好ましい。
【実施例】
【００８５】
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。なお、遺伝子操作的手法として、特に断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されている方法を用いた。【００８６】
バソヒビン蛋白質の作製例１
バソヒビン蛋白質はバキュロウイルス／昆虫細胞発現系により産生させ精製した。バソヒビン１のＫＩＡＡ１０３６（配列番号２の１位から３６５位のアミノ酸からなる領域）のＣ末端に３ｘＦＬＡＧ配列を付加したものをコードするｃＤＮＡを、昆虫細胞発現用ベクターであるｐＦＡＳＴＢａｃ１（インビトロジェン社）に挿入し、昆虫細胞発現用プラスミドｐＦＡＳＴＢａｃ１０３６を構築した。昆虫細胞での発現にはＢａｃ−Ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（インビトロジェン社）を使用し、操作なども付属のマニュアルに従った。すなわち、構築したｐＦＡＳＴＢａｃ１０３６プラスミドをＤＨ１０Ｂａｃ  Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、組換えＢａｃｍｉｄＤＮＡを得た。次にこのＢａｃｍｉｄＤＮＡをＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ試薬（インビトロジェン社）によってＳｆ９細胞に遺伝子導入し、組換えバキュロウイルスを得た。このウイルス溶液０．５ｍＬを１．５×１０６個／ｍＬの濃度の５０ｍＬのＳｆ９細胞に感染させる割合で使用した。感染後９６時間培養し、遠心によって細胞を回収した。ＦＬＡＧ付加バソヒビン蛋白質の昆虫細胞による発現確認は、このＳｆ９細胞の抽出液とＨＲＰ標識した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（シグマ社）を利用したウェスタンブロットによって行った。初めに、細胞を５ｍＬのりん酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて１回洗浄した後、５ｍＬのＬｙｓｉｓ  溶液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ａｍｉｄｉｎｏｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈａｎｓｕｌｕｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｒｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、０．１％ＮＰ−４０を含む、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）にて懸濁後、ＭＩＣＲＯＣＯＮ（ＨＥＡＲＴ  ＳＹＳＴＥＭＳ社製）にて超音波処理を氷冷しながら１５秒間４回行った後、１４，５００ｘｇにて２０分間遠心し、上清に等量のＬｙｓｉｓ溶液を加えたものをライセート溶液とした。ウェスタンブロットは０．５μＬをＬａｅｍｌｉの方法にしたがって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（テフコ社）に電気的に転写した後、５％スキムミルクを含んだＴＢＳ中にてブロッキングし、ＨＲＰ標識した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体と反応させた。０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んだＴＢＳ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）にて１０分間３回洗浄後、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ試薬（アマシャム  ファルマシア社）によって化学発光させ、それをＨｙｐｅｒｆｉｌｍＥＣＬフィルム（アマシャム  ファルマシア社）に感光させることによって検出した。ＦＬＡＧ付加バソヒビン蛋白質の精製はライセート溶液を０．１％ＮＰ−４０を含むＴＢＳにて平衡化した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２アフィニティゲルカラム（Ｓｉｇｍａ社）に添加後、同溶液にて洗浄を行い、溶出液（０．１％ＮＰ−４０を含むＧｌｙ−ＨＣｌ，ｐＨ３．５）（１ｍＬ／画分）にて溶出し、ただちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０にて中和（溶出液１ｍＬに対し、２０μＬ）することによって行った。各画分のウェスタンブロットあるいはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＢｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）による染色により��５０ｋＤａの単一バンドが確認された。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＰＶＤＦメンブレン（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）への転写後、このバンドを溶出し、アミノ酸シークエンサーを用いてこのポリペプチドのＮ末端部分のアミノ酸配列を解析したところ、配列番号２の第２位から第１０位までのアミノ酸配列と一致したことから、この蛋白がバソヒビン蛋白質であることが確認された。【００８７】
試験例１
得られたバソヒビンがリンパ管新生抑制能を有するかをＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：５７０４−５７１１，（２００３）及びＦＡＳＡＢ  Ｊ．１８：３００−３１０，（２００４）に記載の方法に従い、マウスの角膜マイクロポケット・アッセイにより検討した。【００８８】
０．３μｇのハイドロン試薬（ＩＦＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に８０ｎｇあるいは１２．５ｎｇのＦＧＦ−２タンパク質（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２、ｂＦＧＦ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１６０ｎｇのＶＥＧＦ−Ａタンパク質（Ｓｉｇｍａ社）、１６０ｎｇのＶＥＧＦ−Ｃタンパク質（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社）、又は８０ｎｇのＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を混合し、さらに前記で得られた５ｎｇのバソヒビンを加え、ＢＡＬＢ／Ｃ雄マウスの角膜に移植した。７日後、眼球を摘出し４％パラホルムアルデヒド／ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で４℃終夜反応にて固定化を行った。ＴＢＳ−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）で５分間の洗浄を３回行い、２％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで４℃１時間ブロッキング反応を行った。ＬＹＶＥ１抗体によるリンパ管の染色は、３００倍希釈の抗マウスＬＹＶＥ１抗体（慶応大学  医学部  尾池雄一先生よりの譲渡）で４℃終夜反応後、ＴＢＳ−Ｔにて２０分間の洗浄を４回行い、二次抗体として５００倍希釈のＡｎｔｉ−Ｒａｔ  ＩｇＧ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）と４℃で６時間反応させ、ＴＢＳ−Ｔで２０分間の洗浄を４回行った。こうして作製した染色標本を蛍光顕微鏡で撮影し、ＬＹＶＥ１染色の画像を画像解析ソフトＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）ｉｍａｇｅによって定量分析を行った。結果を図１〜４に示す。【００８９】
図１〜４より、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されるリンパ管新生がバソヒビンの存在下では有意に抑制されることが分かった。【００９０】
本発明のバソヒビンを含有する治療剤は、例えば、リンパ管新生抑制作用を要する疾患の治療などに好適に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列表の配列番号１は、ＫＩＡＡ１０３６ポリヌクレオチドである。
配列表の配列番号２は、ＫＩＡＡ１０３６ポリペプチドである。
配列表の配列番号３は、ＡＹ８３４２０２ポリヌクレオチドである。
配列表の配列番号４は、ＡＹ８３４２０２ポリペプチドである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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