(57)【要約】  ブタ浮腫病ワクチンを低コストかつ高効率に生産する技術を開発する。具体的にはブタ浮腫病の毒素タンパク質（Ｓｔｘ２ｅタンパク質）の遺伝子を植物細胞で効率良く発現させ、低コストにブタ浮腫病の植物ワクチンを生産する。植物由来の分泌シグナルペプチドがアミノ末端に付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質を、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'−非翻訳領域（ＡＤＨ５’ＵＴＲ）を用いて、レタス等の植物細胞で発現させる。
2009004842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'−非翻訳領域、及び該領域に発現可能に連結された、アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物。
【請求項２】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'−非翻訳領域が、タバコ由来である、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３】
前記分泌シグナルペプチドが、タバコ由来である、請求項１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記Ｓｔｘ２ｅタンパク質が、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のＢサブユニットである、請求項１〜３の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記Ｓｔｘ２ｅタンパク質は、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドが付加された、請求項１〜４の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
小胞体残留シグナルペプチドは、カルボキシル末端にＫＤＥＬ配列又はＨＤＥＬ配列を含む、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
液胞移行シグナルペプチドがタバコ由来である、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項８】
配列番号１２で表される塩基配列を有する、請求項１〜７の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項９】
配列番号２３、２４、７５、７７、７８、８６の何れかで表される塩基配列を有する、請求項５に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む組換えベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項１２】
形質転換体が形質転換植物細胞又は形質転換植物である、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
植物がレタス（Lactuca sativa）である、請求項１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の形質転換体から得られる種子。
【請求項１５】
請求項１１〜１３の何れか一項に記載の形質転換体を含む、ブタ浮腫病ワクチン。
【請求項１６】
請求項１５に記載のブタ浮腫病ワクチンをブタに投与することを特徴とする、ブタ浮腫病の防除方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブタ浮腫病ワクチンを生産するためのＤＮＡ構築物、該ＤＮＡ構築物により形質転換された形質転換体を含むブタ浮腫病ワクチン、及び該ブタ浮腫病ワクチンを用いてブタ浮腫病を防除する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ浮腫病は、Ｓｔｘ２ｅ毒素を有する大腸菌（浮腫病菌）が上部腸管内で急激に増殖し、毒素が血中に吸収されることにより発症する細菌病であり、離乳後１〜２週の子豚に高発生することが知られている。浮腫病菌の感染による致死率は、５０〜９０％と極めて高い。現在、浮腫病の防除には多種の抗生物質が用いられているが、耐性菌出現等の問題もあり、その使用は制限されている。
このような背景において、ブタ浮腫病を効率良く予防する方法を提供すべく、ブタ浮腫病ワクチンに関する研究が行われている。例えば、無毒化した浮腫病菌毒素タンパク質を使用してブタを免疫し、浮腫病菌の感染による致死を防いだ例が報告されている（非特許文献１）。ここでは、無毒化した浮腫病菌毒素タンパク質を組換え大腸菌を用いて生産させ、これをブタに接種している。しかしながら、組換え大腸菌による無毒化した浮腫病菌毒素タンパク質の生産量は十分ではなく、さらにこのようなワクチン接種はタンパク質の直接注射もしくは経鼻スプレーなどにより行う必要があり、人間の労力がかかるなど、ブタ浮腫病ワクチンの実用化の観点からは、低コスト化が図れないという問題があった。【０００３】
一方、近年トランスジェニック技術を用いて植物に有用な物質を生産させる研究も行われている。例えば、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）タンパク質のＢサブユニットをレタスに生産させた例が報告されている（非特許文献２）。この研究では、コドンを改変したＬＴタンパク質のＢサブユニットの遺伝子を、植物高発現プロモーターであるカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（CaMV35S）と、エンハンサーであるKozak配列を用いて、レタス内で発現させている。その結果、ＬＴタンパク質のＢサブユニットがレタスの総可溶性タンパク質の約２．０質量％蓄積したことが報告されている。しかしながら、この程度のタンパク質の蓄積量では、トランスジェニック植物を利用して細菌病の防除を効率的に行うには不十分であると考えられる。すなわち、目的タンパク質の遺伝子を高発現させ、植物細胞内で目的タンパク質を効率良く生産、蓄積させる必要がある。【０００４】
一方、タバコ由来アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'−非翻訳領域（ＮｔＡＤＨ５’ＵＴＲ）の塩基配列は、シロイヌナズナやイネで機能するエンハンサーであることが知られている（特許文献１、非特許文献３）。しかしながら、このＮｔＡＤＨ５’ＵＴＲの塩基配列を用いて、細菌毒素タンパク質をコードする遺伝子を発現させた例は報告されていない。【０００５】
【非特許文献１】Makino et al., Microbial Pathogenesis, Volume 31,Number 1, July 2001, pp. 1-8(08)
【非特許文献２】Kim et al., Protein Expression and Purification, Volume 51, Number 1, Jan 2006, pp. 22-27(06)
【特許文献１】特開２００３−７９３７２号公報
【非特許文献３】Satoh et al., The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98,1-8
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、ブタ浮腫病ワクチンを低コストかつ高効率に生産する技術を開発することを課題とする。また、具体的にはブタ浮腫病の毒素タンパク質（Ｓｔｘ２ｅタンパク質）の遺伝子を植物細胞で効率良く発現させ、低コストでブタ浮腫病の植物ワクチンを生産することを課題とする。
【０００７】
本発明者らは、植物由来の分泌シグナルペプチドがアミノ末端に付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質を、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５'−非翻訳領域（ＡＤＨ５’ＵＴＲ）を用いて発現させることにより、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をレタス等の植物に効率良く生産させ、植物体に高濃度で蓄積させることができることを見い出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００８】
第一の発明は、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域、及び該領域に発現可能に連結された、アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物（以下、「本発明のＤＮＡ構築物」ともいう。）である。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域は、タバコ由来であることが好ましい。また、前記分泌シグナルペプチドは、タバコ由来であることが好ましい。また、前記Ｓｔｘ２ｅタンパク質は、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のＢサブユニットであることが好ましい。
【０００９】
また、前記Ｓｔｘ２ｅタンパク質のカルボキシル末端には、小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドが付加されていることも好ましく、小胞体残留シグナルペプチドは、カルボキシル末端にＫＤＥＬ配列又はＨＤＥＬ配列を含むことが好ましく、液胞移行シグナルペプチドは、タバコ由来であることが好ましい。
【００１０】
また、本発明のＤＮＡ構築物は、配列番号１２、２３、２４、７５、７７、７８、８６の何れかで表される塩基配列を有することが好ましい。
【００１１】
第二の発明は、本発明のＤＮＡ構築物を含む組換えベクター（以下、「本発明の組換えベクター」ともいう。）である。
【００１２】
第三の発明は、本発明の組換えベクターで形質転換された形質転換体（以下、「本発明の形質転換体」ともいう。）である。
本発明の形質転換体は、形質転換植物細胞又は形質転換植物であることが好ましい。また、前記植物は、レタスであることが好ましい。
【００１３】
第四の発明は、前記形質転換体植物細胞又は形質転換植物から得られる種子（以下、「本発明の種子」ともいう。）である。
【００１４】
第五の発明は、本発明の形質転換体を含むブタ浮腫病ワクチン（以下、「本発明のブタ浮腫病ワクチン」ともいう。）である。
【００１５】
第六の発明は、本発明のブタ浮腫病ワクチンをブタに投与することを特徴とする、ブタ浮腫病の防除方法（以下、「本発明のブタ浮腫病の防除方法」ともいう。）である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＧＦＰレポーター発現ベクターの構成を示す図である。図において、→は翻訳開始点を表し、▽は翻訳後に切断される部位を表す。
【図２】Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクターの構成を示す図である。図において、→は翻訳開始点を表し、▽は翻訳後に切断される部位を表す。
【図３】デザインしたmStx2eB 1-4の塩基配列をCLUSTALW（http://align.genome.jp/）で比較した図である。
【図４】ＰＣＲによるmStx2eBの合成の概念を示す図である。
【図５】PCR産物を1.5%アガロースゲル中で展開し、エチジウムブロマイドで染色後、UV照射にてDNAバンドを確認した結果を示す図である（写真）。
【図６】ダイレクトPCRした溶液を1.5%アガロースゲル中で展開し、エチジウムブロマイドで染色後、UV照射にてDNAバンドを確認した結果を示す図である（写真）。
【図７】Ｓｔｘ２ｅＡ発現ベクターの構成を示す図である。図において、→は翻訳開始点を表し、▽は翻訳後に切断される部位を表す。
【図８】レタスプロトプラストにおけるＧＦＰレポーターの発現の状態を示す図である（写真）。
【図９】各シグナルペプチドを付加したＳｔｘ２ｅＢ発現ベクターを用いた形質転換レタスプロトプラストにおけるＳｔｘ２ｅＢの蓄積量を示す図である（写真）。
【図１０】小胞体残留シグナルペプチドを付加したコドン改変Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクターを用いた形質転換レタスプロトプラストにおけるＳｔｘ２ｅＢの蓄積量を示す図である（写真）。
【図１１】小胞体残留シグナルペプチドを付加したコドン改変Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクターを用いた形質転換レタスプロトプラストにおけるＳｔｘ２ｅＢの蓄積量を示す図である（写真）。
【図１２】小胞体残留シグナルペプチドを付加したＳｔｘ２ｅＡ発現ベクターを用いた形質転換レタスプロトプラストにおけるＳｔｘ２ｅＡの蓄積量を示す図である（写真）。
【図１３】Stx2eB‐GST融合タンパク質のSDS-PAGE解析の結果を示す図である（写真）。Ｍ:マーカー、１:Stx2eB ８Ｍ尿素溶液、２：リフォールディングStx2eB‐GST溶液（注入サンプル）、３：非結合画分、４：洗浄１回目溶出画分、５：洗浄２回目溶出画分、６：溶出サンプル（結合画分）
【図１４】抗VT2抗体を用いたウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である（写真）。
【図１５】Stx2eB‐GST融合タンパク質マウス経鼻投与による抗体価測定の結果を示す図である。
【図１６】小胞体残留シグナルペプチドを付加したＳｔｘ２ｅＢ発現ベクターを用いた形質転換タバコBY2培養細胞におけるＳｔｘ２ｅＢの蓄積量を示す図である（写真）。
【図１７】デザインしたmStx2eB 5の塩基配列をCLUSTALW（http://align.genome.jp/）で比較した図である。
【図１８】小胞体残留シグナルペプチドを付加したコドン改変Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクターを用いた形質転換タバコBY2培養細胞におけるＳｔｘ２ｅＢの蓄積量を示す図である（写真）。
【図１９】小胞体残留シグナルペプチドを付加したコドン改変Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクターを用いた形質転換タバコBY2培養細胞におけるＳｔｘ２ｅＢの蓄積量を示す図である（写真）。
【図２０】浮腫病菌の強制投与０日目に採取した糞便中のStx特異的IgAの抗体価を示す図である。
【図２１】浮腫病菌の強制投与０日目に採取した血液中のStx特異的IgGの抗体価を示す図である。
【図２２】浮腫病菌の強制投与３日目に採取した糞便中の浮腫病数を示す図である。
【図２３】全期間の飼料要求率を示す図である。
【図２４】飼料要求率の推移を示す図である。
【図２５】子豚1頭当たりの平均臨床症状スコアの推移を示す図である。
【図２６】子豚１頭当たりの全期間の合計臨床症状スコアの平均を示す図である。
【図２７】浮腫病ワクチン無投与群の子豚と浮腫病ワクチン投与群の子豚の浮腫病菌投与１１日目の写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のＤＮＡ構築物は、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域、及び該領域に発現可能に連結されたアミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とする。【００１８】
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域とは、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の転写開始点から、翻訳開始点（ＡＴＧ、メチオニン）の前までの塩基配列を含む領域をいう。該領域は、翻訳量増大機能を有している。「翻訳量増大機能」とは、構造遺伝子にコードされた情報が、転写後、翻訳されてタンパク質が産生される際に、翻訳により産生されるタンパク質量を増大させる機能をいう。前記領域は、植物に由来すればよいが、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域としては、例えばタバコ（Nicotiana tabacum）由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域の塩基配列である、配列番号１で表される塩基配列からなる領域が特に好ましい。【００１９】
植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼを高発現している植物培養細胞のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子から単離することができる（特開２００３−７９３７２号公報参照）。また、タバコのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域等、その塩基配列が確定しているものについては、化学合成、又は該領域の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲなどにより合成することもできる。また、塩基配列が確定している前記領域の一部をプローブとして用いることにより、他の植物のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域を探索し、これを単離することもできる。【００２０】
また、配列番号１の塩基配列で表されるような前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域は、翻訳量増大機能を保持している限り、１又は数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有していてもよい。前記「数個」としては、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜３個である。
また、前記アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域と好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有し、かつ翻訳量増大機能を保持しているＤＮＡを使用してもよい。【００２１】
前記領域が目的とする翻訳量増大機能を有するか否かについては、例えばタバコ培養細胞においてＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）遺伝子又はルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子としたトランジェントアッセイ、染色体に組み込ませた形質転換細胞であのアッセイ等により確認することができる。【００２２】
前記植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域には、アミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡが、発現可能に連結されている。ここで、「発現可能」とは、本発明のＤＮＡ構築物が適切なプロモーターを含むベクターに挿入され、該ベクターが適切な宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞内で前記Ｓｔｘ２ｅタンパク質が生産されることをいう。また、「連結」とは、２つのＤＮＡが直接結合している場合も、他の塩基配列を介して結合している場合も含む概念である。【００２３】
Ｓｔｘ２ｅタンパク質は、浮腫病菌の毒素タンパク質であり、毒性本体である１つのＡサブユニットと腸管粘膜への侵入へ関与する５つのＢサブユニットからなる。Ａサブユニットは、配列番号２のアミノ酸配列で表され、Ｂサブユニットは、配列番号３のアミノ酸配列で表される。
本発明のＤＮＡ構築物に含まれるＳｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡは、Ａサブユニット及びＢサブユニットの両方を含むＳｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡであってもよいし、Ａサブユニットのみ又はＢサブユニットのみをコードするＤＮＡであってもよい。ただし、ＡサブユニットをコードするＤＮＡを含む場合には、生産されるＡサブユニットが無毒化されるように、ＤＮＡの塩基配列を改変して用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡ構築物においては、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡは、ＢサブユニットのみをコードするＤＮＡであることが好ましい。【００２４】
本発明のＤＮＡ構築物においてコードされるＳｔｘ２ｅタンパク質は、ブタに投与して免疫応答を引き起こすことができる限り、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２及び／又は配列番号３）における１個又は数個のアミノ酸が、置換、欠失、挿入又は付加されていてもよい。前記「数個」としては、例えば、Ａサブユニットにおいて、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜２０個、より好ましくは２〜１０個であり、Ｂサブユニットにおいて、好ましくは２〜１０個、さらに好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個である。
また、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２及び／又は配列番号３）と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有し、かつブタに投与して免疫応答を引き起こすことができるタンパク質であってもよい。【００２５】
Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば配列番号４及び／又は配列番号５の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的手法により容易に得ることができる。具体的には、Ｓｔｘ２ｅタンパク質を生産する浮腫病菌より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから上記塩基配列に基づいて作製したプローブを用いて所望のクローンを選択することにより、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。また、上記塩基配列を基にした化学合成、上記塩基配列の５’及び３’末端の塩基配列をプライマーとし、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲなどにより合成することもできる。【００２６】
また、本発明のＤＮＡ構築物の作製に用いることができる、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列は、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、Ｓｔｘ２ｅタンパク質の翻訳量が増大するように、Ｓｔｘ２ｅタンパク質を構成するアミノ酸残基を示すコドンを適宜改変することも好ましい。
コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (2004)の方法を参考にすることができる（実施例に詳述する。）。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
例えば、配列番号５で表される塩基配列をコドン改変した塩基配列としては、配列番号６〜９、７９で表される塩基配列が挙げられる。本発明のＤＮＡ構築物の作製においては、配列番号６、８、９、７９で表される塩基配列を有するＤＮＡを用いることが好ましい。【００２７】
また、配列番号４及び／又は配列番号５〜９の何れかの塩基配列を有するＤＮＡを有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを使用してもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い二つのＤＮＡどうし、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の同一性を有する２つのＤＮＡがハイブリダイズするが、それより同一性の低い２つのＤＮＡがハイブリダイズしない条件が挙げられる。例えば２×ＳＳＣ（３３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  クエン酸）、４２℃が挙げられる。【００２８】
前記Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のアミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加されるように、植物由来の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡと連結される。ここで「付加」とは、前記分泌シグナルペプチドがＳｔｘ２ｅタンパク質のアミノ末端に、直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。また、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡがＡサブユニット及びＢサブユニットの両方を含むＳｔｘ２ｅタンパク質をコードする場合において、Ａサブユニット及びＢサブユニットを融合タンパク質として発現させる場合には、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡは、融合タンパク質のアミノ末端に前記分泌シグナルペプチドが付加されるように、前記分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡと連結されていればよく、Ａサブユニット及びＢサブユニットを別々に発現させる場合には、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡは、Ａサブユニット及びＢサブユニットの両方のアミノ末端に前記分泌シグナルペプチドが付加されるように、前記分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡと連結されていればよい。
分泌シグナルペプチドは、好ましくはナス科（Solanaceae）、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科(Asteraceae)に属する植物、さらに好ましくはタバコ属（Nicotiana）、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、アキノノゲシ属(Lactuca)等に属する植物、より好ましくはタバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、レタス(Lactuca sativa)等に由来する。
また、好ましくはタバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼ（β-D-gulucan exohydrolase）、タバコの38kDa ペルオキシダーゼ(GenBank Accession D42064)に由来する。
前記分泌シグナルペプチドとしては、例えば、タバコのβ−Ｄグルカンエキソヒドロラーゼに由来する、配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有しているものが挙げられる。また、該分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号１１で表される。【００２９】
前記分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、種々の植物から探索、単離することもできるし、前記配列番号１１の塩基配列に基づいてプローブを作製し、種々の植物のｃＤＮＡから得ることもできるし、同塩基配列に基づいて、化学合成やＰＣＲ等の手法により得ることもできる。【００３０】
本発明のＤＮＡ構築物としては、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ、及び配列番号５〜９の何れかの塩基配列からなるＤＮＡが連結したＤＮＡ構築物が好ましく挙げられる。このような本発明のＤＮＡ構築物としては、例えば配列番号１２の塩基配列を有するＤＮＡ構築物が挙げられる。【００３１】
さらに、前記Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡは、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のカルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドが付加されるように、小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡと連結されることが好ましい。ここで「付加」とは、前記小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドが、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のカルボキシル末端に直接結合している場合も、他のペプチドを介して結合している場合も含む概念である。また、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡがＡサブユニット及びＢサブユニットの両方を含むＳｔｘ２ｅタンパク質をコードする場合において、Ａサブユニット及びＢサブユニットを融合タンパク質として発現させる場合には、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡは、融合タンパク質のカルボキシル末端に前記分泌シグナルペプチドが付加されるように、前記小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡと連結されていればよく、Ａサブユニット及びＢサブユニットを別々に発現させる場合には、Ｓｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡは、前記小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドが、Ａサブユニット及びＢサブユニットの少なくとも一つのカルボキシル末端に付加されるように、前記小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡと連結されていればよい。【００３２】
小胞体残留シグナルペプチドとしてはＫＤＥＬ配列（配列番号１３）、ＨＤＥＬ配列（配列番号１４）、ＫＤＥＦ配列（配列番号１５）又はＨＤＥＦ配列（配列番号１６）を含む小胞体残留シグナルペプチドが挙げられる。例えば、ＨＤＥＬ配列を含む小胞体残留シグナルペプチドとしては配列番号１７のアミノ酸配列で表される小胞体残留シグナルペプチド等が好ましく用いられる。なお、この小胞体残留シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号１８で表される。【００３３】
液胞移行シグナルペプチドとしては、好ましくはナス科（Solanaceae）科、アブラナ科（Brassicaceae）、キク科（Asteraceae）に属する植物、さらに好ましくはタバコ（Nicotiana）属、シロイヌナズナ属（Arabidopsis）、セイヨウワサビ属（Armoracia）等に属する植物、より好ましくはタバコ（Nicotiana tabacum）、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、セイヨウワサビ(Armoracia rusticana)等に由来する。また、好ましくは、キチナーゼに由来する。タバコキチナーゼ由来の液胞移行シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１９で表される。また、タバコキチナーゼ由来の液胞移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号２０で表される。
また、好ましくは、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイムに由来する。セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイム由来の液胞移行シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２１で表される。また、セイヨウワサビペルオキシダーゼC1a アイソザイム由来の液胞移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列は、例えば配列番号２２で表される。【００３４】
本発明のＤＮＡ構築物としては、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１１の塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号５〜９の何れかの塩基配列からなるＤＮＡ、並びに配列番号１８又は配列番号２０の塩基配列からなるＤＮＡが連結した、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域、及びアミノ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが、カルボキシル末端に小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドが付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡからなるＤＮＡ構築物が好ましく挙げられる。小胞体残留シグナルペプチドが付加された本発明のＤＮＡ構築物としては、例えば配列番号２３、７５、７７、７８、８６の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ構築物が挙げられる。液胞移行シグナルペプチドが付加された本発明のＤＮＡ構築物としては、例えば配列番号２４で表されるＤＮＡ構築物が挙げられる。【００３５】
本発明のＤＮＡ構築物は、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、植物由来のアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の５’−非翻訳領域、植物由来の分泌シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、及びＳｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡ、任意で小胞体残留シグナルペプチド又は液胞移行シグナルペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡを、それぞれ、適当な制限酵素により切断し、適当なリガーゼで連結することにより行うことができる。【００３６】
本発明の組換えベクターは、本発明のＤＮＡ構築物を含むことを特徴とする。本発明の組換えベクターは、Ｎ末端に植物由来の分泌シグナルペプチドが付加されたＳｔｘ２ｅタンパク質をコードするＤＮＡが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されていればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。プラスミドＤＮＡは、大腸菌やアグロバクテリウムからアルカリ抽出法（Birnboim, H. C. & Doly, J. (1979) Nucleic acid Res 7: 1513）又はその変法等により調製することができる。また、市販のプラスミドとして、例えばｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＩＧ１２１Ｈｍ等を用いることもできる。ウィルスＤＮＡとしては、例えばpTB2(Donson et al., 1991)等を用いることができる（Donson J., Kerney CM., Hilf ME., Dawson WO. Systemic expression of a bacterial gene by a tobacco mosaic virus-based vector. Proc. Natl. Acad. Sci.(1991) 88: 7204-7208を参照。）【００３７】
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター（Odell et al．1985 Nature 313：810）、イネのアクチンプロモーター（Zhang et al．1991 Plant Cell 3：1155）、トウモロコシのユビキチンプロモーター（Cornejo et al．1993 Plant Mol．Biol．23：567）等が好ましく用いられる。また、ベクター内で用いられるターミネーターも、同様にベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、ノパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター、カリフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター等が好ましく用いられる。【００３８】
本発明の組換えベクターは、例えば以下のようにして作製することができる。
まず、本発明のＤＮＡ構築物を適当な制限酵素で切断又はＰＣＲによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入する。【００３９】
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターで形質転換されていることを特徴とする。形質転換に用いられる宿主細胞は真核細胞及び原核細胞の何れでもよい。
真核細胞としては、植物細胞が好ましく用いられ、中でもキク（Asteraceae）科、ナス科、アブラナ科、アカザ科に属する植物の細胞が好ましく用いられる。さらに、アキノノゲシ（Lactuca）属に属する植物の細胞、中でもレタス（Lactuca sativa）細胞が好ましく用いられる。宿主細胞としてレタス細胞を用いる場合は、ベクターは、カリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター等を用いることができる。
原核細胞としては、大腸菌（Escherichia coli）、アグロバクテリウム（Agrobacterium tumefaciens）等が用いられる。【００４０】
本発明の形質転換体は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、本発明のベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、アクロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、エレクトロポーレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci. tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki）などの方法を用いることが可能である。
本発明のベクターを宿主細胞に導入した後、選択マーカーの表現型によって本発明の形質転換体を選抜することができる。また、選抜した形質転換体を培養することにより前記Ｓｔｘ２ｅタンパク質を生産することができる。培養に用いる培地及び条件は、形質転換体の種に応じて適宜選択することができる。
また、宿主細胞が植物細胞の場合には、選抜した植物細胞を常法に従って培養することにより、植物体を再生することができ、植物細胞内又は植物細胞の細胞膜外に前記Ｓｔｘ２ｅタンパク質を蓄積させることができる。例えば、植物細胞の種類により異なるが、ジャガイモであればVisserら（Theor．Appl．Genet 78：594（1989））の方法が挙げられ、タバコであればNagataとTakebe（Planta 99：12（1971））の方法が挙げられる。【００４１】
レタスの場合は0.1 mg /ｌのNAA(ナフタレン酢酸)、0.05 mg/ｌのBA(ベンジルアデニン)および0.5 g/ｌのpolyvinylpyrrolidoneを含むMS培地でシュートの再生が可能であり、再生したシュートを0.5 g/lのpolyvinylpyrrolidoneを含む1/2 MS培地で培養することで発根が可能である。【００４２】
また、本発明の種子は、上記のようにして再生した植物体から種子を採取することにより得ることができる。本発明の種子は適当な方法で播種し栽培することにより、Ｓｔｘ２ｅタンパク質を生産する植物体とすることができ、このような植物体も、本発明の形質転換体に含まれる。【００４３】
本発明のブタ浮腫病ワクチンは、本発明の形質転換体を含むことを特徴とする。本発明のブタ浮腫病ワクチンは、Ｓｔｘ２ｅタンパク質を含む本発明の形質転換体の全部を含んでいても、一部を含んでいてもよい。また、形質転換体をそのまま用いることもでき、乾燥、粉砕するなどして用いることもできる。また、本発明のブタ浮腫病ワクチンには、Ｓｔｘ２ｅタンパク質の免疫原性を高めるアジュバントを配合することもできる。一般的には、安全性を考慮して水酸化アルミニウムなどがアジュバントとして用いられる。一方、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のＢサブユニットは、それ自体がアジュバント活性を示すため、本発明のＤＮＡ構築物がＢサブユニットをコードするＤＮＡを含む場合には、さらにアジュバントを配合しなくても、高い免疫原性が得られる。【００４４】
本発明のブタ浮腫病の防除方法は、本発明のブタ浮腫病ワクチンをブタに投与することを特徴とする。本発明のブタ浮腫病ワクチンによる免疫は、浮腫病の発生率が高い子豚に対して行うことが好ましい。免疫の方法としては、本発明のブタ浮腫病ワクチンを母豚に投与して、母豚が産生した抗体を、乳汁により子豚に与える方法、本発明ブタ浮腫病ワクチンを子豚に投与し、子豚を直接免疫する方法等が挙げられる。
本発明のブタ浮腫病ワクチンをブタに投与する方法としては、ブタの飼料に本発明のブタ浮腫病ワクチンを混合してブタに与える方法、ブタに点鼻する方法などが挙げられる。この場合の投与量は、Stx2eタンパク質の質量として、１日当たり好ましくは４ｍｇ以上、さらに好ましくは１６ｍｇ以上である。ブタ浮腫病ワクチンは、一定の間隔をおいて、複数回投与することが好ましい。例えば、４〜７日おきに、合計２〜３回投与する方法が挙げられる。
【実施例】
【００４５】
（１）ＧＦＰ発現ベクターの構築
レタス細胞におけるタンパク質の局在化制御について検討するために、各シグナルペプチドが付加された緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを以下のようにして作製した（図１）。
タバコアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の5'非翻訳領域（NtADH 5’UTR、配列番号１）を、ADH-221(Sato et. al., 2004) を鋳型として、ADH XbaI-F プライマー（配列番号２５）及びADH NsiI-R プライマー（配列番号２６）を用いたPCR により増幅した。β-D glucan exohydrolase(GenBank ACCESSION AB017502)のシグナルペプチド（配列番号１１）をコードするＤＮＡ領域を、タバコゲノムＤＮＡを鋳型にして、βD NsiI-F プライマー（配列番号２７）およびβD EcoRI-R プライマー（配列番号２８）を用いて増幅した。得られたNtADH 5'UTR およびシグナルペプチドの各ＤＮＡ断片をNsiI (TOYOBO社製)で処理し、ligation high (TOYOBO社)を用いてライゲーションした後、末端を平滑化してpBluescript II SK (Stratagene社製)のEcoRV ギャップにクローニングした（plasmid 1）。【００４６】
Plasmid 1をNsiI で処理し、T4 DNA polymerase (TOYOBO社製)で末端を平滑化した後セルフライゲーションして、NtADH の開始コドン(atg)とbeta-D glucan exohydrolase の開始コドンが一致するように融合した（plasmid 2）。液胞輸送シグナル(配列番号１９)をC 末端に有するGFP (pSGFP5T, Di Sansebastiano et al., 1998)をコードするＤＮＡを、EcoRI サイトを介してplasmid 2に挿入した（液胞型GFP）。【００４７】
pSGFP5Tを鋳型として、GFP-F プライマー(配列番号２９)およびGFP-Rプライマー(配列番号３０)を用いてPCRを行った。得られたDNA断片の末端を平滑化したのち、pBluescript II SKのEcoRVギャップにクローニングした（plasmid 3）。Plasmid 3から、EcoRIとXhoIを用いてGFP断片を切り出し、plasmid 2のEcoRI-XhoIギャップに挿入した（アポプラスト型GFP）。【００４８】
Plasmid 3から、NsiIとXhoI を用いてGFP 断片を切り出し、plasmid 1のNsiI-EcoRI ギャップに挿入した（細胞質型GFP）。【００４９】
pSGFP5を鋳型として、GFP-F プライマーおよびGFP HDEL-R プライマー(配列番号３１)を用いてPCR を行った。得られたDNA 断片の末端を平滑化したのち、pBluescript II SKのEcoRV ギャップにクローニングした（plasmid 4）。Plasmid 4からEcoRI とXhoI を用いてGFP断片を切り出し、plasmid 2のEcoRI-XhoI ギャップに挿入した（小胞体型GFP）。【００５０】
レタスRbcs（ルビスコスモールサブユニット）(GenBank ACCESSION D14001)由来葉緑体移行シグナルペプチド（トランジットペプチド、T.P.、配列番号４５）をコードするDNA 断片を、レタス葉cDNA を鋳型として、TP NsiI-F プライマー （配列番号３２）およびTP EcoRI-R プライマー （配列番号３３）を用いてPCRにより増幅した。得られた断片をNsiIとEcoRIで処理し、plasmid 1のNsiI-EcoRI ギャップに連結した（plasmid 5）。Plasmid 5をNsiI で処理し、T4 DNA polymerase (TOYOBO社製)で末端を平滑化した後セルフライゲーションして、NtADHの開始コドンとRbcsの開始コドンが一致するように融合した（plasmid 6）。Plasmid 3から、EcoRI とXhoI を用いてGFP断片を切り出し、plasmid 6のEcoRI-XhoI ギャップに挿入した（葉緑体型GFP）。
なお、これらのＧＦＰ発現ベクターの構築に際しては、下記文献を参照することができる。
Di Sansebastiano et. al., Specific accumulation of GFP in a non-acidic vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. (1998) 15, 449-457
Satoh et al., The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. J. Biosci. Bioeng. (2004) 98,1-8【００５１】
上記各局在型GFPを、以下のようにして植物細胞における一過性発現用ベクター、ｐＢＩ２２１(Clontech 社)のマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に挿入した。
ＭＣＳにSalI、KpnI及びSmaIサイトを導入するために、SalKpnSma-F（配列番号３４）とSalKpnSma-R （配列番号３５）をアニーリング後、T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)(TaKaRa 社)を用いてリン酸化し、pBI221 のSacI ギャップに挿入した(plasmid 7)。各局在型GFPをXbaI とKpnIを用いて、plasmid 7に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター（35S pro．）とパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター（NOS-T）の間に配置し、ＧＦＰ発現ベクターを作製した。【００５２】
（２）Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクターの構築
各シグナルペプチドが付加された、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のＢサブユニット（Ｓｔｘ２ｅＢ）をコードするＤＮＡ（配列番号５）を含む本発明のＤＮＡ構築物を含むベクターを、以下のようにして作製した。【００５３】
Kozak-stx2eb-Fプライマー(配列番号３６)とstx2eb-R プライマー(配列番号３７)を用いてＰＣＲを行い、Ｓｔｘ２ｅＢの成熟領域(ペリプラズムへの分泌シグナルペプチドを除く、Ａｌａ１９〜Ａｓｎ８７)をコードするＤＮＡ断片を増幅した。得られたＤＮＡ断片をpBluescript II SKのEcoRV ギャップにクローニングした。得られたプラスミドをHindIII で切断し、T4 DNA polymerase で処理した後セルフライゲーションを行い、HindIII サイトをNheI サイトに変換した(plasmid 8)。
Plasmid 8 からXbaI とKpnI でKozak-Stx2eB 断片を切り出し、plasmid 7 のXbaI-KpnI ギャップに挿入し、Kozak連結細胞質型Stx2eB発現ベクター（Kozak-Cytosol-Stx2eB）を作製した(plasmid 9)。【００５４】
NtADH 5'UTR 断片を、ADH XbaI-FとADH BamHI-Rプライマー (配列番号３８)を用いて増幅した。得られたDNA 断片を、XbaI とBamHI で処理し、plasmid 9のXbaI-BamHI ギャップに挿入し、NtADH 5'-UTR連結細胞質型Stx2eB発現ベクター（ADH-Cytosol-Stx2eB）を作製した(plasmid 10)。【００５５】
分泌シグナルペプチドの増幅のために、plasmid 2 を鋳型として、βD-Kozak-F プライマー(配列番号３９)とβD BamHI-R プライマー(配列番号４０)を用いてPCRを行った。得られたDNA 断片をXbaI およびBamHI で処理し、plasmid 9のXbaI-BamHI ギャップに挿入した(plasmid 11)（Kozak-Apoplast-Stx2eB）。【００５６】
小胞体残留シグナル付加のために、HDEL-Fプライマー(配列番号４１)とHDEL-Rプライマー(配列番号４２)をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化し、アルカリフォスファターゼ(AP)(TaKaRa社)で脱リン酸化処理したplasmid 11のBglIIギャップに挿入し、Kozak連結小胞体型Stx2eB発現ベクター（Kozak-ER-Stx2eB）を作製した(plasmid 12)。【００５７】
NtADH 5'UTRと分泌シグナルペプチドが融合したDNA 断片を作製するために、plasmid 2を鋳型として用い、ADH XbaI-F プライマーとβD BamHI-R プライマーを用いてPCRを行った。得られたDNA断片をXbaI およびBamHI で処理し、plasmid 9 のXbaI-BamHIギャップに挿入し、NtADH 5'連結アポプラスト型Stx2eB発現ベクター（ADH-Apoplast-Stx2eB）を作製した(plasmid 13)。【００５８】
小胞体残留シグナル付加のために、HDEL-F プライマーとHDEL-R プライマーをアニーリングしてT4 PNK でリン酸化し、APで脱リン酸化処理したplasmid 13 のBglII ギャップに挿入し、NtADH 5'-UTR連結小胞体型Stx2eB発現ベクター（ADH-ER-Stx2eB）を作製した(plasmid 14)。【００５９】
液胞輸送シグナル付加のために、VSD-F プライマー(配列番号４３)とVSD-R プライマー(配列番号４４)をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化し、APで脱リン酸化処理したplasmid 13 のBglII ギャップに挿入し、NtADH 5'-UTR連結液胞型Stx2eB発現ベクター（ADH-Vacuole-Stx2eB）を作製した(plasmid 15)。【００６０】
葉緑体移行シグナルペプチド（配列番号４５）の付加のために、plasmid 6 を鋳型にして、ADH XbaI-F プライマーとTP BamHI-R プライマー(配列番号４６)を用いてPCR を行った。得られたDNA 断片をXbaI およびBamHI で処理し、plasmid 9 のXbaI-BamHI ギャップに挿入し、NtADH 5'-UTR連結葉緑体型Stx2eB発現ベクター（ADH-Chloroplast Stx2eB）を作製した(plasmid 16)。【００６１】
なお、Ｓｔｘ２ｅＢ検出用のペプチドタグとして、ＨＡタグを融合した。HA タグの付加のために、HA-F プライマー(配列番号４７)とHA-R プライマー(配列番号４８) をアニーリングしてT4 PNK でリン酸化した。得られたリン酸化ＨＡ断片を、plasmid 9, 10, 12, 13, 14, 15 および16 のBamHI ギャップへ挿入し、Kozak-Cytosol-Stx2eB、ADH-Cytosol-Stx2eB、Kozak-ER-Stx2eB、ADH-Apoplast-Stx2eB、ADH-ER-Stx2eB、ADH-Vacuole-Stx2eB、ADH-Chloroplast-Stx2eB の各Stx2eB 発現ベクターを作製し、以下の発現試験に用いた（図２）。【００６２】
（３）コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクターの構築
配列番号５で表されるＳｔｘ２ｅＢをコードするＤＮＡの塩基配列のコドンを改変し、NtADH 5'UTRが付加された、小胞体型コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢを以下の方法により作製した。【００６３】
（ａ）コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢのデザイン
コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢとして１）Kang et al.(2004)の方法に基づく配列、２）レタスにおいて使用頻度の高いコドンを選択した配列、３）GC含量が高いコドンのうち、レタスにおいて使用頻度の高いコドンを選択した配列、４）ハウスキーピング遺伝子（アクチン遺伝子、β−チューブリン遺伝子）において使用頻度の高いコドンを選択した配列の４種をデザインした。【００６４】
１）Kang et al. (2004)の方法に基づく配列
この文献に示してある改変前後のLTB遺伝子配列とタバコのコドン使用頻度表を基に、コドンの改変フローチャートを作成し、このフローチャート及びレタスのコドン使用頻度表を基に、Stx2eBのコドン改変を行った。作製したコドン改変Stx2eBをmStx2eB1とした（配列番号６）。レタスのコドン使用頻度表は、かずさDNA研究所のデータベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）上にあるレタスのCodon usageを利用した（以下同じ）。【００６５】
２）レタスにおいて使用頻度の高いコドンを選択した配列
レタスのコドン使用頻度表を基に、使用頻度が最も高いコドンだけを使用して、コドン改変を行った。例えば、Alaのコドンのでは使用頻度が最も高いコドンはGCAであるため、Stx2eB中のAlaのコドンは全てGCAに統一した。作成したコドン改変Stx2eBをmStx2eB2とした（配列番号７）。【００６６】
３）GC含量が高いコドンのうち、レタスにおいて使用頻度の高いコドンを選択した配列
レタスのコドン使用頻度表を基に、GC含量が多く、かつ使用頻度の高いコドンを選択してコドン改変を行った。例えば、AlaのコドンではGC含量が最も高いコドンはGCCとGCGであり、さらに使用頻度の高いコドンはGCCであることから、Stx2eB中のAlaは全てGCCに変換した。作成したコドン改変Stx2eBをmStx2eB3とした（配列番号８）。【００６７】
４）ハウスキーピング遺伝子（アクチン遺伝子、β−チューブリン遺伝子）において使用頻度の高いコドンを選択した配列
レタスのハウスキーピング遺伝子において高い頻度で使用されるコドンを選択し、コドン改変を行った。ハウスキーピング遺伝子としてactin、β-tubulin1, 2, 3を選択した。両遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を使用した。両遺伝子で使用されているコドンおよびコドン使用頻度を表１及び表２にまとめた。この中から最も使用頻度が高いコドンを選択しコドン改変を行った。作成したコドン改変Stx2eBをmStx2eB4とした（配列番号９）。【００６８】
【表１】
2009004842.tif 000003
【００６９】
【表２】
2009004842.tif 000004
【００７０】
デザインしたmStx2eB 1-4の塩基配列をCLUSTALW（http://align.genome.jp/）で比較した（図３）。
コドン改変前後のStx2eBの配列XXG/C（Xは任意の塩基）比とGC比を表3に示した。mStx2eB2以外のXXG/C比はStx2eBよりも高く、mStx2eB3では100%であった。GC比も同様にmStx2eB2以外でStx2eBよりも高く、最も高かったのはmStx2eB3の61.4%であった。【００７１】
【表３】
2009004842.tif 000005
【００７２】
（ｂ）コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢの作製
mStx2eB 1−4の塩基配列をもとに、それぞれ６種類の塩基配列を有するプライマーを作製した。【００７３】
１）Kang et al.(2004)の方法に基づく配列
Ａ：配列番号４９
Ｂ：配列番号５０
Ｃ：配列番号５１
Ｄ：配列番号５２
Ｅ：配列番号５３
Ｆ：配列番号５４【００７４】
２）レタスにおいて使用頻度の高いコドンを選択した配列
Ａ：配列番号５５
Ｂ：配列番号５６
Ｃ：配列番号５７
Ｄ：配列番号５８
Ｅ：配列番号５９
Ｆ：配列番号６０【００７５】
３）GC含量が高いコドンのうち、レタスにおいて使用頻度の高いコドンを選択した配列
Ａ：配列番号６１
Ｂ：配列番号６２
Ｃ：配列番号６３
Ｄ：配列番号６４
Ｅ：配列番号６５
Ｆ：配列番号６６【００７６】
４）ハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択した配列
Ａ：配列番号６７
Ｂ：配列番号６８
Ｃ：配列番号６９
Ｄ：配列番号７０
Ｅ：配列番号７１
Ｆ：配列番号７２【００７７】
上記で合成したオリゴマーを使用し、Kang et al.(2004)の方法に基づき以下の条件で1st PCR反応を行い、４種類のコドン改変Stx2eBを合成した。すなわち、プライマーＡとＢ、ＣとＤ、ＥとＦの組み合わせでPCRを行い、それぞれ87bp（Ａ＋Ｂ）、78bp（Ｃ＋Ｄ）、69bp（Ｅ＋Ｆ）の遺伝子断片を合成した。次にＡ＋ＢとＣ＋Ｄの組み合わせで2nd PCRを行い、153bp（Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）の遺伝子断片を合成した。最後にＡ＋Ｂ＋Ｃ＋ＤとＥ＋Ｆの組み合わせで3rd PCRを行い、最終的に210bpの遺伝子を合成した（図４参照）。反応条件は最終容量が25μlとなるよう、10 pmol オリゴヌクレオチド、0.2mM dNTP、pfu DNA polymerase buffer、0.3U pfu DNA polymeraseを添加し、94℃, 5分間加熱した後、94℃, 1分間、56℃または60℃, 1分間、72℃, 1分間の加熱処理を25または30サイクル行い、最後に72℃で5分間加熱した。2nd PCR、3rd PCRには、1st PCR、2nd PCR後の反応液1μlをテンプレートとして使用した。1st PCRと2nd PCRでは目的のDNAが増幅したが、3rd PCRでは目的の大きさのDNAが増幅しなかった。しかし、3rd PCR産物をテンプレートにしてEx TaqによるPCRを行ったところ、210bp付近に増幅産物を認めた（図５）。増幅産物をTAクローニングした後、ダイレクトPCRでインサートの有無を確認し（図６）、インサートを確認したものにつき、シーケンシングにより配列を確かめた。その結果目的とするmStx2eB1-4が得られたことを確認した。【００７８】
（ｃ）コドン改変Stx2eB発現ベクターの構築
コドン改変Stx2eB1−4の翻訳量を評価するための一過性発現ベクターを構築した。上述したカリフラワーモザイクウィルス35Ｓプロモーター、タバコ由来アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子5'非翻訳領域、シグナルペプチド、小胞体残留シグナル及びＨＡタグを付加したベクターpBI221を制限酵素で切断後、目的のDNA断片をDNA Ligation Kit (Mighty Mix) (TaKaRa)でつなぎ、NtADH5'UTRが付加された、小胞体型コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクター（ADH-ER-mStx2eB1-4）を作製した。【００７９】
（４）Ｓｔｘ２ｅＡ発現ベクターの構築
小胞体移行シグナルペプチドが付加された、Ｓｔｘ２ｅタンパク質のＡサブユニットの成熟領域（ペリプラズムへの分泌シグナルペプチド領域を除く、Gln23〜Glu319）（Stx2eA）をコードするＤＮＡ（配列番号４）を以下の方法により作製した。
Stx2eA BamHI-F プライマー(配列番号７３)とStx2eA BglII-R プライマー(配列番号７４)を用いてPCR を行った。得られたDNA 断片をBamHIとBglIIで処理した後、上述したKozak-ER-Stx2eB及びADH-ER-Stx2eBの発現ベクターのBamHI-BglIIギャップにそれぞれ挿入し、Kozak-ER-Stx2eA又はADH-ER-Stx2eAを作製した（図７）。【００８０】
（５）レタスプロトプラストを用いた一過性発現実験
鉢植えしたレタス（Lactuca sativa）（グリーンウェーブ）の葉、約1gをメスで0.5cm四方程度に切り刻んでリーフディスクを作製した。リーフディスクを500mMマンニトールに浸漬し、1時間振盪した。リーフディスクを50mlのプロトプラスト化酵素溶液 (1.0% cellulose RS (ヤクルト本社), 0.25% macerozyme R-10 (ヤクルト本社), 400mM マンニトール, 8mM CaCl2, and 5mM Mes-KOH, pH 5.6)に浸漬し、室温で2時間振盪した。プロトプラスト懸濁液を、100μmおよび40μmのメッシュに通してリーフディスクを取り除いた。プロトプラスト懸濁液を60gで5分間遠心し、プロトプラストを沈殿させた。プロトプラストを167mMマンニトールおよび133mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストを333mMマンニトールおよび66.7mM CaCl2を含む水溶液に再懸濁し、40gで5分間遠心した。プロトプラストをW5 solution (154mM NaCl, 125mM CaCl2, 5mM KCl, 2mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁し、氷上に1時間静置した。プロトプラスト懸濁液を40gで5分間遠心し、プロトプラスト濃度が2×106個/mlになるように、MaMg solution (400mM マンニトール, 15mM MgCl2, and 4mM Mes-KOH, pH 5.6)に懸濁した。【００８１】
上記で作製したＧＦＰレポーター発現ベクター、Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクター、改変Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクター及びＳｔｘ２ｅＡ発現ベクターを、それぞれ120μlのプロトプラスト懸濁液と混合した後、140μlのPEG solution (400mM マンニトール, 100mM Ca(NO3)2, and 40% PEG)を加えて穏やかに混和し、７分間インキュベートした。約20分間かけて1mlのW5 solutionをプロトプラスト懸濁液に添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、400mM マンニトールとW5 solutionを4:1の割合で混ぜた溶液を1ml添加した。遠心により沈殿させたプロトプラストに、1%スクロース、400mM マンニトールおよび0.3mMカルベニシリンを含むLS培地を1ml添加し、暗所25℃で24時間培養した。【００８２】
（６）ウェスタン解析
遠心により回収したプロトプラストに30μlのSDS-sample buffer(4% (w/v) SDS, 20% (w/v) glycerol, 0.05%(w/v) ブロモフェノールブルー, 300mM β-、メルカプトエタノール, 125mM Tris-HCl, pH 6.8)を加え、95℃で2分間熱変性させ、試料とした。15%アクリルアミドゲルを用いてタンパク質を分離後、エレクトロトランスファー装置を用いてPVDFメンブレン(Hybond-P; Amersham 社）上にタンパク質をブロットした。抗HA抗体(No. 11 867 423 001, Roche)を用いて、Stx2eB及びStx2eAを検出した。
以下、結果を示す。【００８３】
（ａ）ＧＦＰ発現ベクターの発現
（１）で作製した各ＧＦＰ発現ベクターを、レタスのプロトプラストに導入し、レポーター遺伝子を一過的に発現させた。ＧＦＰレポーター遺伝子の発現量を解析するため、共焦点レーザー顕微鏡を用いてＧＦＰ蛍光観察を行った（図８）。
細胞質型ＧＦＰを発現させた場合、葉緑体周辺の細胞質と思われる領域と核内に蛍光シグナルが検出された。なお、核移行シグナルペプチドを持たなくても、ＧＦＰなどの低分子量のタンパク質は核膜孔を通過可能であることが報告されている。【００８４】
次に、小胞輸送経路への輸送シグナルについて検討した。アポプラスト型、小胞体型、液胞型のいずれのタイプのGFPを発現させた場合も、プロトプラスト培養初期においては小胞体と思われる区画に蛍光が確認された。プロトプラストの培養時間が経過するにつれ、アポプラストタイプでは蛍光シグナルが見えなくなり(細胞外に分泌されたと思われる）、液胞タイプでは細胞体積の大部分を占める大きな液胞にシグナルが検出された。一方、小胞体タイプでは小胞体に蛍光がとどまったままであった。【００８５】
また、葉緑体移行シグナルペプチドも検討した。葉緑体型GFP を発現した場合、赤色自家蛍光を発する葉緑体領域に緑色シグナルが検出された。
以上の結果から、レタス細胞において、シグナルペプチドの付加によって組み換えタンパク質の局在化制御が可能であることがわかった。【００８６】
（ｂ）Ｓｔｘ２ｅＢ生産における局在化シグナルおよび翻訳エンハンサーの効果
（２）で作製した各Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクターを、レタスのプロトプラストに導入し、Ｓｔｘ２ｅＢを一過的に発現させ、抗HA抗体を用いたウェスタン解析によりStx2eB蓄積量を評価した。結果を図９に示す。
Kozak配列を用いて細胞質型Ｓｔｘ２ｅＢを発現させた場合は、Ｓｔｘ２ｅＢが全く検出されなかったが、小胞体型Ｓｔｘ２ｅＢを発現させた場合は、Ｓ．Ｐ．が切断されていないＳｔｘ２ｅＢ前駆体（約１２ｋＤａ、pre-mature）及びＳｔｘ２ｅＢ（約８ｋＤａ、mature）が検出された。
NtADH 5'UTRを用いて細胞質型Ｓｔｘ２ｅＢを発現させた場合は、Ｓｔｘ２ｅＢが全く検出されなかったが、小胞体型Ｓｔｘ２ｅＢ及び液胞型Ｓｔｘ２ｅＢを発現させた場合には、Ｓ．Ｐ．が切断されていないＳｔｘ２ｅＢ前駆体及びＳｔｘ２ｅＢが検出された。また、アポプラスト型Ｓｔｘ２ｅＢを発現させた場合には、Ｓｔｘ２ｅＢが検出された。また、葉緑体型Ｓｔｘ２ｅＢを発現させた場合には、Ｓｔｘ２ｅＢが検出された。【００８７】
Kozak-ER（小胞体型）とNtADH-ER（小胞体型）のレーンのバンドの観察から、NtADH 5'UTRを用いることにより、Kozak配列を用いた場合に比して、Ｓｔｘ２eＢの発現量が極めて大きくなることが判った。
また、小胞輸送経路にStx2eBを送り込むことにより、植物細胞におけるStx2eBの蓄積量を高められることが判った。なお、小胞輸送経路の３区画(小胞体、アポプラスト、液胞)の違いによる、Stx2eB蓄積量の差は小さかった。【００８８】
（ｃ）Ｓｔｘ２ｅＢのコドン改変が発現に及ぼす効果
各コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢ発現ベクターを、レタスのプロトプラストに導入し、コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢを一過的に発現させ、抗HA抗体を用いたウェスタン解析によりStx2eB蓄積量を評価した。結果を図１０及び１１に示す。
レーン０（ADH-ER-Stx2eB）、レーン１（ADH-ER-mStx2eB1）、レーン２（ADH-ER-mStx2eB2）、レーン３（ADH-ER-mStx2eB3）、レーン４（ADH-ER-mStx2eB4）の全てで、Ｓ．Ｐ．が切断されていないＳｔｘ２ｅＢ前駆体（約１２ｋＤａ、pre-mature）及びＳｔｘ２ｅＢ（約８ｋＤａ、mature）が検出されたが、レーン２においては、検出量はわずかであった。
これより、配列番号７５、７７、７８の塩基配列をそれぞれ有するADH-ER-mStx2eB1, ADH-ER-mStx2eB3, ADH-ER-mStx2eB4を用いた場合に、Ｓｔｘ２ｅＢタンパク質の蓄積量が特に増大することが判った。【００８９】
（ｄ）Ｓｔｘ２ｅＡ生産における、翻訳エンハンサーの効果
各Ｓｔｘ２ｅＡ発現ベクターを、レタスのプロトプラストに導入し、Ｓｔｘ２ｅＡを一過的に発現させ、抗HA抗体を用いたウェスタン解析によりStx2eA蓄積量を評価した。結果を図１２に示す。
NtADH-ER-Stx2eA（小胞体型）を発現させた場合は、それぞれ約３４ｋＤａ、約３８ｋＤａの位置に２本のバンドが検出された。一方Kozak-ER-Stx2eAを発現させた場合は、Ｓｔｘ２ｅＡの発現量は検出限界以下であった。
これより、NtADH 5'UTRを用いることにより、Kozak配列を用いた場合に比して、Ｓｔｘ２ｅＡの発現量が極めて大きくなることが判った。【００９０】
（８）Ｓｔｘ２ｅＢ有効生産量の設定及び性能評価
（ａ）Stx2eB‐GST融合タンパク質の精製
Stx2eBサブユニットとグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質を作成するため、大腸菌タンパク質発現用ベクターpGEX-6P-1のGST3'側にフレームを併せてStx2eBをサブクローニング後、大腸菌に形質転換した。常法によりIsopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside（IPTG）を添加、recombinant (r) Stx2eB‐GST融合タンパク質の発現を誘導し、グルタチオンセファロース4Bカラムを用いて以下のようにして精製を行った。
Stx2eB‐GST融合タンパク質を大腸菌内で発現させた後、菌体を水溶性のバッファーに懸濁し超音波処理を行ったところ、上清中に該融合タンパク質の存在が少なかったことから、該融合タンパク質は不溶性画分に存在することがわかった。そこで該融合タンパク質を8M尿素で可溶化し、カラムで精製した後、リフォールディングを行った（図１３）。【００９１】
（ｂ）タンパク質のマウス経鼻投与実験（抗体価の確認）
溶出したStx2eB‐GST融合タンパク質について、Stx2eに対する抗体（抗VT2抗体）を用いウエスタンブロッティングを行った。その結果、Stx2eB‐GST融合タンパク質およびStx2eBの分子量に一致する特異的な2つのバンドを検出し、該融合タンパク質は抗原性を保持していることを確認した(図１４)。
続いて、精製したStx2eB‐GST融合タンパク質10, 20, 50μgを一週間隔で3回マウスに経鼻接種した。0, 1, 2, 3週間目に採血を行い、該融合タンパク質を抗原としてELISAを行いIgG抗体価を測定した。その結果、該融合タンパク質50μg投与区は投与後1週間目には抗体価の上昇がみられ、2週間目には10、20μg投与区でも抗体価の上昇を確認し、3週間目にかけて経時的に抗体価が上昇することがわかった（図１５）。【００９２】
（９）Ｓｔｘ２ｅＢの生産
（ａ）Ｓｔｘ２ｅＢ発現バイナリーベクターの構築
植物の安定形質転換体を用いてStx2eB の生産を行うために、ADH-ER-Stx2eB を形質転換用ベクターにサブクローニングした。すなわち、ADH-ER-Stx2eB をXbaIおよびSacIを用いてpBI121(Clontech 社)に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター（35S pro．）とパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター（NOS-T）の間に配置し、Stx2eB発現バイナリーベクターを作製した。【００９３】
（ｂ）形質転換アグロバクテリウムの作製
Agrobacterium tumefacience EHA105 (Hood EE, Gelvin SB, Melchers LS, Hoekema A (1993) New Agrobacterium helper plasmids for gene transfer to plants. Transgenic Res. 2: 208-218)の単一コロニーを 5 mlのYEB培地(Bacto-peptone 5 g/l, Beaf extract 5 g/l, Yeast extract 1 g/l, sucrose 5 g/l, MgSO4・7H2O 0.5 g/l)に植菌し、28℃で1晩振盪培養した。この培養液を、500 mlのYEP培地に植菌し、600 nmにおける濁度が0.5になるまで28℃で振盪培養した。培養液を遠心分離 (5000 rpm, 10分, 4 ℃ ;BECKMAN JLA-10,500ローター)により集菌して上清を捨て、菌体を洗浄するため 500 ml の滅菌水を加えて懸濁し、再度遠心分離 (5000 rpm, 10分, 4℃; BECKMAN JLA-10,500ローター) により集菌して上清を捨てた。この操作を 2 回繰り返した後、沈殿に20 ml の冷却した滅菌 10% glycerol を加えて懸濁した。ナルゲンチューブに移し遠心分離 (5000 rpm, 10 min, 4℃ BECKMAN JLA-10,500ローター) により集菌して上清を捨てた。沈殿に3 mlの冷却した滅菌10% Glycerolを加えて懸濁し、40 μlずつ1.5 ml微小遠心管に分注して、液体窒素で凍結させてから −８０℃で保存した。
コンピテントセルを氷中で解凍後、1〜2 μlの上記バイナリーベクター溶液を加え、氷令した2 mmキュベットに移した。エレクトロポレーター（BIO RAD、Gene Pulser）により電気パルス（2.5 KV、25 μF、400 Ω）を与え、ベクターを導入した。1 mlのSOC培地を加え、28℃で1時間振盪培養した後、スピンダウンして上清を大部分除き菌体を得て、残った培地に菌体を懸濁して適当な抗生物質を含む LB 寒天培地上に広げ、30℃で2晩培養した。【００９４】
（ｃ）形質転換タバコの作製
タバコBY2培養細胞の形質転換は、An (An G (1985) High efficiency transformation of cultured tobacco cells. Plant Physiol. 79: 568-570)の方法に従って行った。上記（ｂ）の方法に従って得た形質転換アグロバクテリウムの菌体をカナマイシン100 mg/l を含む5 mlのLB培地で28℃、2晩培養したアグロバテリウム培養液100 μlと、培養4日目のタバコBY2培養細胞懸濁液 5〜10 mlをシャーレに入れてよく混ぜ、25℃で2 晩、暗所下で静置して共存培養した。アグロバクテリウムを除くため、シャーレの中の培養液を 15 mlの遠心管に移して遠心(1000 rpm, 5分, 4℃; BECKMAN GS-6KR centrifuge)し、上清を取り除いた。新しい改変LS培地を入れて遠心分離 (1000 rpm, 5分, 4℃; BECKMAN GS-6KR centrifuge)し、細胞を洗浄した。この操作を4回繰り返し、アグロバクテリウムを除いた後、タバコBY2培養細胞をカナマイシン 100 mg/lの入った改変 LS寒天培地にまき、25℃で暗黒下に静置して培養した。約2-3週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。カナマイシン100 mg/lを加えた改変LS培地30 mlに移し、継代培養を行った。【００９５】
（ｄ）ウェスタン解析
上記で作製した形質転換タバコBY2培養細胞におけるStx2eBの蓄積量を、上記と同様に抗ＨＡ抗体を用いたウェスタン解析により評価した。結果を図１６に示す。図１６の各レーンの数字はそれぞれ独立した系統を表す。「Empty vector」は「ADH-ER-Stx2eB」を含まないベクターpBI121のみを導入したものを示す。【００９６】
（１０）Ｓｔｘ２ｅＢの生産
（ａ）コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢのデザイン
コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢとしてGC含量が高いコドンのうち、レタスにおいて使用頻度の低いコドンを選択した配列をデザインした。作成したコドン改変Stx2eBをmStx2eB5とした（配列番号７９）。【００９７】
デザインしたmStx2eB5の塩基配列をCLUSTALW（http://align.genome.jp/）で比較した（図１７）。コドン改変前後のStx2eBの配列XXG/C（Xは任意の塩基）比は、１００％であり、GC比は６２．４％であった。【００９８】
（ｂ）コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢの作製
デザインしたmStx2eB5の塩基配列をもとに、６種類の塩基配列を有するプライマーを作製した。これらのプライマーを使用し、上記（３）におけるコドン改変Ｓｔｘ２ｅＢの作製と同様の方法で、mStx2eB5を得た。【００９９】
プライマー
Ａ：配列番号８０
Ｂ：配列番号８１
Ｃ：配列番号８２
Ｄ：配列番号８３
Ｅ：配列番号８４
Ｆ：配列番号８５【０１００】
（ｃ）コドン改変Ｓｔｘ２ｅＢ発現バイナリーベクターの構築
植物の安定形質転換体を用いてコドン改変Stx2eB の生産を行うために、上記（３）で作製したmStx2eB1-4、及び（b）で作製したmStx2eB5を用いて、ADH-ER-mStx2eB1-5 （配列番号７５〜７８、８６）を形質転換用ベクターにサブクローニングした。すなわち、ADH-ER-mStx2eB1-5 をそれぞれXbaIおよびSacIを用いてpBI121(Clontech 社)に挿入し、カリフラワーモザイクウイルス35S RNA プロモーター（35S pro．）とパリン合成酵素遺伝子転写ターミネーター（NOS-T）の間に配置し、mStx2eB1-5発現バイナリーベクターを作製した。【０１０１】
（ｄ）形質転換アグロバクテリウムの作製
（ｃ）で作製したmStx2eB1-5発現バイナリーベクターを、上記（９）（ｂ）に示した方法と同様にして、Agrobacterium tumefacience EHA105に導入し、形質転換アグロバクテリウムを得た。【０１０２】
（ｅ）形質転換タバコの作製
（ｂ）で得た形質転換アグロバクテリウムの菌体を用いて、上記（９）（ｃ）に示した方法と同様にして、タバコBY2培養細胞に、mStx2eB1-5発現バイナリーベクターをそれぞれ導入し、形質転換タバコを作製した。【０１０３】
（ｄ）ウェスタン解析
上記で作製した形質転換タバコBY2培養細胞におけるStx2eBタンパク質の蓄積量を、上記と同様に抗ＨＡ抗体を用いたウェスタン解析により評価した。結果を図１８及び１９に示す。図１８には、ｍＲＮＡレベルの測定結果を併せて示す。
図１８に示すように、レーン０（ADH-ER-Stx2eB）、レーン１（ADH-ER-mStx2eB1）、レーン２（ADH-ER-mStx2eB2）、レーン３（ADH-ER-mStx2eB3）、レーン４（ADH-ER-mStx2eB4）、レーン５（ADH-ER-mStx2eB5）の全てで、Ｓ．Ｐ．が切断されていないＳｔｘ２ｅＢ前駆体（約１２ｋＤａ、pre-mature）及びＳｔｘ２ｅＢ（約８ｋＤａ、mature）が検出されたが、レーン２においては、検出されなかった。
図１９において、codon 1〜5はそれぞれmStx2eB1-5を示す。また、各レーンの数字はそれぞれ独立した系統を表す。mStx2eB1, mStx2eB3, mStx2eB4, mStx2eB5では、いくつかの系統でタンパク質が検出されたが、mStx2eB2では、全ての系統でタンパク質が検出されなかった。タンパク質が検出された系統で、その検出量を比較すると、特にmStx2eB3及びmStx2eB5で多かった。すなわち、レタスでの使用頻度に関わらず、GC含量が高いコドンをデザインすることにより、翻訳量が増大することがわかった。【０１０４】
（１１）ブタ浮腫病ワクチン投与試験
（ａ）ブタ浮腫病ワクチンの製造
上述した（８）（ａ）で精製したStx2eB‐GST融合タンパク質を8 mg /mlの濃度でＰＢＳにけん濁し、ブタ浮腫病ワクチンとした。【０１０５】
（ｂ）浮腫病菌カプセルの作製
［菌種］
ブタ由来ベロ毒素産生Escherichia coli (VTEC) No.1362-1 （４０日齢死亡豚由来）
血液型：Ｏ１３９；  fedA, +
毒素：stx2e, +;  ST, +;  LT, -
［作製］
上記No.1362-1菌株をＴＳブロス培地で３７℃、４時間培養した。培養後、遠心分離を行い、沈殿を脂溶性カプセルに入れた。【０１０６】
（ｃ）ワクチン及び浮腫病菌の投与
養豚場で飼育されている健康なほ乳期子豚を３頭の母豚から６頭ずつ合計１８頭選抜し、表４に示すように５群に分けた。この際、異なる母豚由来の子豚が各群に含まれるように、また雌雄の何れもが各群に含まれるように分けた。２〜４群の子豚には、６、１２、１８日齢で、表４に示す所定量（１回当たり）のブタ浮腫病ワクチンをピペットを用いて点鼻投与し、２１日齢まで養豚場にて母豚につけて飼育を行った。１、５群の子豚には、ＰＢＳ 0.5mlを同様の方法で点鼻投与した。子豚が２１日齢になったところで、子豚を母豚から離して、保温灯で温度管理されたコンクリート床製オガコ敷き子豚房に群ごとに収容して飼育した。飼料は、ＳＤＳＮｏ．１（日本配合飼料株式会社製）を用い、飼料及び水は自由摂取させた。なお、飼育期間中、飼料摂取量（質量）及び体重を記録した。収容から４日経過後、１〜４群の子豚に、１日１回、３日間（２５〜２７日齢の間）浮腫病菌カプセルを強制経口投与した。５群には、生理食塩水を腸溶性カプセルに入れて強制投与した。【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
浮腫病菌の強制投与０日目から１１日目まで、毎日、臨床観察を行った。観察は、浮腫病の臨床症状として知られている、目周囲の浮腫、神経症状、運動機能、姿勢、糞便性状、食欲、呼吸状態の項目について行い、以下の基準に基づいて、臨床症状スコアをつけた。
目周囲の浮腫（0：なし  1：軽度  2：中度  3：重度）
神経症状（0：なし  1：軽度  2：中度  3：重度）
運動機能（0：正常  1：減退  2：消失）
姿勢（0：正常  1：犬座  2：腹臥・横臥）
糞便性状（0：正常   1：軟便   2：泥状便  3：水様・粘血便）
食欲（0：正常  1：やや不振  2：不振  3：廃絶）
呼吸状態（0：正常  1：やや速拍  2：速拍）【０１０９】
また、浮腫病菌の強制投与０、３、７及び１１日目に糞便を、浮腫病菌の強制投与０及び１１日目に血液を採取した。【０１１０】
（ｄ）試験結果
（i）抗体価の測定
浮腫病菌の強制投与０日目に採取した糞便中のStx特異的IgAの抗体価をELISAにより測定した。なお、糞便は、９倍量のPBSで希釈後、懸濁し、遠心分離して上清を回収し、測定試料とした。結果を図２０に示す。また、浮腫病菌の強制投与０日目に採取した血液中のStx特異的IgGの抗体価をELISAにより測定した。結果を図２１に示す。抗体価は、個体差が大きく群間で有意差はなかったが、浮腫病ワクチンを投与した群では高値を示す個体が見られた。
（ii）浮腫病菌の検出
浮腫病菌の強制投与３日目に採取した糞便中の浮腫病菌遺伝子を定量し、浮腫病菌数を求めた。すなわち、糞便中のDNAをQUICK GENE (富士フィルム)を用いて抽出し、リアルタイムPCR（Tsukahara et al. (2007)に準拠）を用いて浮腫病菌遺伝子を定量し、浮腫病菌数を求めた。結果を図２２に示す。浮腫病菌を投与した１〜４群の個体について、浮腫病菌への感染が確認された。
（iii）飼料要求率の算出
飼料摂取量及び体重の測定結果から、浮腫病菌の強制投与の日前４〜１日（d-4〜-1）、浮腫病菌の強制投与の０〜３日目(d0〜3)、４〜７日目(d4〜7)、８〜１１日目(d8〜11)の飼料要求率を求めた。また上記全期間（d-4〜11）の飼料要求率を求めた。なお、飼料要求率は、一定期間における１ｋｇの体重増加に要した飼料摂取量で表される。
飼料要求率＝飼料摂取量／増体重
全期間の飼料要求率を図２３に、飼料要求率の推移を図２４に示す。全期間の飼料要求率は、浮腫病ワクチン無投与で浮腫病菌に感染した１群が最も大きく、浮腫病ワクチンを４ｍｇ／頭で投与した３群が最も小さかった。また、１群は、浮腫病菌の投与０〜３日目に極めて大きい飼料要求率を示した。これは浮腫病菌感染により下痢が引き起こされ、飼料摂取量に応じた体重増加がみられず、飼料要求率が高くなったものと思われる。【０１１１】
（iv）臨床観察
各項目について得た臨床症状スコアから、日ごとに、各群の子豚1頭当たりの平均臨床症状スコアを算出した。平均臨床症状スコアの推移を図２５に示す。また、子豚１頭当たりの全期間（浮腫病菌投与０〜１１日目）の合計臨床症状スコアの平均も算出した。これを図２６に示す。浮腫病ワクチン無投与の１群の子豚においては、浮腫病菌投与１〜３日目にかけて浮腫病の臨床症状が出現、悪化し、１１日目まで同様の臨床症状が観察された。浮腫病ワクチンを１ｍｇ投与した２群の子豚においては、浮腫病菌投与１〜４日目にかけて浮腫病の臨床症状が出現、悪化し、１１日目まで同様の臨床症状が観察された。一方、浮腫病ワクチンを４ｍｇ投与した３群の子豚、及び浮腫病ワクチンを１６ｍｇ投与した４群の子豚、浮腫病菌非感染の５群の子豚においては、全期間に渡って、浮腫病の臨床症状はあまり観察されなかった。特に、これらの群では、浮腫病に特徴的な目周囲の浮腫は全く観察されなかった。浮腫病ワクチン無投与の１群の子豚、及び浮腫病ワクチンを１６ｍｇ投与した４群の子豚の１１日目の写真を図２７に示す。浮腫病ワクチン無投与の１群の子豚は、目周囲に重度の浮腫が見られ、水様の下痢を起こしている。一方、浮腫病ワクチンを１６ｍｇ投与した４群の子豚は、目周囲に浮腫は見られず、下痢も起こしていない。
また、全期間の合計臨床症状スコアからも、浮腫病ワクチンを投与することにより、浮腫病の臨床症状を緩和、又は抑制できることが明らかとなった。特に、３回の投与においては、浮腫病ワクチンを１回当たり４ｍｇ以上投与することにより、浮腫病の臨床症状を効果的に抑制できることが明らかとなった。
【産業上の利用の可能性】
【０１１２】
本発明のＤＮＡ構築物を用いて、植物等を形質転換することにより、効率良くＳｔｘ２ｅタンパク質を生産する形質転換体を得ることができる。本発明のＤＮＡ構築物を用いれば、レタス等の栽培コストが低い植物を用いて、ブタ浮腫病ワクチンを効率良く製造することができる。また、本発明のブタ浮腫病ワクチンを用いれば、簡便かつ効果的にブタ浮腫病を防除することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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