(57)【要約】ウンカリア属植物の種を高い精度で判別する方法を提供する。本発明は、被検試料に含まれるウンカリア属植物の種を鑑別する方法であって、被検試料に含まれる植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜１１の塩基配列から選択される少なくとも１つのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法に関する。
2009014269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料に含まれるウンカリア属植物の種を鑑別する方法であって、被検試料に含まれる植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜１１の塩基配列から選択される少なくとも１つのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
【請求項２】
被検試料が生薬である、請求の範囲第１項記載の方法。
【請求項３】
被検試料に含まれるウンカリア属植物が、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシス、ウンカリア・マクロフィラ、ウンカリア・ワンギイ、ウンカリア・スカンデス、ウンカリア・ホモメラ、ウンカリア・ヒルスタ、ウンカリア・ランシフォリア、ウンカリア・セッシリフルクタス、ウンカリア・ラエビガタおよびウンカリア・ユナネンシスのいずれであるかを鑑別する請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
【請求項４】
被検試料に含まれるウンカリア属植物が、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラのいずれかであるか、またはそれ以外であるかを鑑別する、請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
【請求項５】
配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、４７位、７８位、７９位、８４位、８５位、８６位、９４位、１０４位、１０５位、１６９位、１７２位、１７７位、２０９位、２１０位、２１１位、２１５位、３６５位、３９５位、４１２位、４１３位、４１５位、４３３位、４４６位、４４７位、４５０位、４５１位、４６１位、５１４位、５１８位、５２６位、５３２位、５３７位、５４６位、５５４位、５６７位、５７０位、５８５位、５８８位、５９０位、５９２位、６０８位または６０９位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つの塩基を比較する、請求の範囲第４項記載の方法。
【請求項６】
配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、４７位、７９位、８４位、８５位、８６位、９４位、１０４位、１０５位、１６９位、１７２位、１７７位、２０９位、２１０位、２１１位、２１５位、３６５位、３９５位、４１２位、４１３位、４１５位、４３３位、４４６位、４４７位、４５０位、４５１位、４６１位、５１４位、５１８位、５２６位、５３２位、５３７位、５４６位、５５４位、５６７位、５７０位、５８５位、５８８位、５９０位、５９２位、６０８位または６０９位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つの塩基を比較する、請求の範囲第５項記載の方法。
【請求項７】
配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、８５位、９４位、１０４位、１６９位、１７７位、２０９位、２１１位、２１５位、４１２位、４１３位、４１５位、４５０位、４６１位、５３２位、５３７位、５８５位、５８８位または６０８位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つの塩基を比較する、請求の範囲第６項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子学的な手法によりウンカリア属植物の種を鑑別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
釣藤鈎（チョウトウコウ）は、日本薬局方において第１４局第１追補より収載され、鈎藤（Ｕｎｃａｒｉａ  ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌａ  Ｍｉｑｕｅｌ）、華鈎藤（Ｕｎｃａｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｈａｖｉｌａｎｄ）、および大葉鈎藤（Ｕｎｃａｒｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  Ｗａｌｌｉｃｈ）の３種がその基原植物として記載されている生薬である。ところが中国には１１種のウンカリア属植物が分布しており（Ｈｓｕｅ  Ｈ．＆  Ｗｕ  Ｈ．，１９９９．Ｕｎｃａｒｉａ  ｉｎ  Ｌｏ  Ｈ．ｅｄ．Ｆｌｏｒａ  Ｒｅｉｐｕｂｌｉｃａｅ  Ｐｏｐｕｌａｒｉｓ  Ｓｉｎｉｃａｅ  ７１（１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ）、上記の３種以外の種に由来する生薬が流通している。しかし、そのような生薬と上記３種のウンカリア属植物を含む真正生薬とを鑑別することは困難であった。従って、釣藤鈎の漢方製剤としての品質の安定性には問題があった。これに対し、中国に分布するウンカリア属植物について、化学成分や解剖学的特徴によって鑑別する技術が報告されているが（榊原他（１９９９）植物研究雑誌７４：４２−５２）、より高い精度でウンカリア属植物の種を鑑別する方法が求められていた。
一方近年の分子遺伝学の発展は、生物分類学における方法論に多大な影響を与えた。すなわちこれまでの形態学的な分類に加えて、ある特定の遺伝子を選択して、生物種についてその塩基配列を比較すると、遺伝子の類似性からその進化の過程を推定し、分類することが可能となった。
生物種による遺伝子の差異の度合いは、基本的な生命活動をつかさどる蛋白質をコードする遺伝子で驚くほど保存されている一方、多くの遺伝子ではそれぞれの蛋白質の機能の分散に従って変化し、もはや同一起源であるかどうかの判断さえ難しいものまで様々である。従って分類の対象となる生物種の範囲に応じて適切な遺伝子領域を選択することで、例えば鯨と他の哺乳類との関係のような、広い範囲の近縁関係から、カラスの地域差のような、ごく限定された範囲内の詳細な分類まで可能となる。このような進化上の相対距離の推定及び分類に最も一般的に利用される遺伝子としては、リボソームＲＮＡ遺伝子（Ｂｒｕｃｅ  Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．，４３９−４４０，１９９８）やミトコンドリア遺伝子（宝来聰、細胞工学、１４巻、１０３１〜１０３５、１９９５）等が数多く報告されている。
真核生物リボソームＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたＲＮＡがプロセッシングを受けて、いくつかの断片に分かれ、リボソームを構成する小サブユニット（ＳＳ；Ｓｍａｌｌ  Ｓｕｂｕｎｉｔ）と大サブユニット（ＬＳ；Ｌａｒｇｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ）に組み込まれる。小サブユニットに組み込まれるＲＮＡは１８ＳｒＲＮＡとよばれ、約１９００（酵母）〜２０００塩基（ヒト）から成り、大サブユニットに組み込まれるＲＮＡは２８ＳｒＲＮＡと５．８ＳｒＲＮＡの２種類で、２８ＳｒＲＮＡは約４７００（酵母）ないし５０００塩基、５．８ＳｒＲＮＡは約１６０塩基（酵母またはヒト）からなる。
これらをコードするＤＮＡは、ｒＲＮＡ遺伝子上、すなわちリボソームＲＮＡをコードする核リボソームＤＮＡ上に、１８Ｓ、５．８Ｓ、２８Ｓの順に縦列にならび、１８Ｓと５．８Ｓ、５．８Ｓと２８Ｓの間はＩＴＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ）とよばれる非コード領域によって分断されている。上記リボソームＲＮＡをコードするリボソームＤＮＡ内のＩＴＳは、植物に普遍的であり、多くの植物についてその存在が報告されている。しかし、ウンカリア属植物の多数の種についてその塩基配列を決定して分類し、それに基づいて種の判別を行った例はない。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の課題は、ウンカリア属植物の種を高い精度で判別する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を行った結果、ウンカリア属植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列上に、種特異的な多型が存在すること、さらに、この多型を利用してウンカリア属植物の種を鑑別できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）被検試料に含まれるウンカリア属植物の種を鑑別する方法であって、被検試料に含まれる植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜１１の塩基配列から選択される少なくとも１つのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することを含む、前記方法。
（２）被検試料が生薬である、（１）記載の方法。
（３）被検試料に含まれるウンカリア属植物が、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシス、ウンカリア・マクロフィラ、ウンカリア・ワンギイ、ウンカリア・スカンデス、ウンカリア・ホモメラ、ウンカリア・ヒルスタ、ウンカリア・ランシフォリア、ウンカリア・セッシリフルクタス、ウンカリア・ラエビガタおよびウンカリア・ユナネンシスのいずれであるかを鑑別する（１）または（２）記載の方法。
（４）被検試料に含まれるウンカリア属植物が、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラのいずれかであるか、またはそれ以外であるかを鑑別する、（１）または（２）記載の方法。
（５）配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、４７位、７８位、７９位、８４位、８５位、８６位、９４位、１０４位、１０５位、１６９位、１７２位、１７７位、２０９位、２１０位、２１１位、２１５位、３６５位、３９５位、４１２位、４１３位、４１５位、４３３位、４４６位、４４７位、４５０位、４５１位、４６１位、５１４位、５１８位、５２６位、５３２位、５３７位、５４６位、５５４位、５６７位、５７０位、５８５位、５８８位、５９０位、５９２位、６０８位または６０９位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つの塩基を比較する、（４）記載の方法。
（６）配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、４７位、７９位、８４位、８５位、８６位、９４位、１０４位、１０５位、１６９位、１７２位、１７７位、２０９位、２１０位、２１１位、２１５位、３６５位、３９５位、４１２位、４１３位、４１５位、４３３位、４４６位、４４７位、４５０位、４５１位、４６１位、５１４位、５１８位、５２６位、５３２位、５３７位、５４６位、５５４位、５６７位、５７０位、５８５位、５８８位、５９０位、５９２位、６０８位または６０９位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つの塩基を比較する、（５）記載の方法。
（７）配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、８５位、９４位、１０４位、１６９位、１７７位、２０９位、２１１位、２１５位、４１２位、４１３位、４１５位、４５０位、４６１位、５３２位、５３７位、５８５位、５８８位または６０８位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つの塩基を比較する、（６）記載の方法。
本発明により、ウンカリア属植物の種を高い精度で鑑別する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ウンカリア属に属する１１種において、それぞれ複数のサンプルについて決定したリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列のアライメントをとって調査した結果見出された、６４の変異部位の詳細を示す。
図２−１は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−２は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−３は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−４は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−５は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−６は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−７は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−８は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−９は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−１０は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
図２−１１は、表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を示す。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００７−１９４９７３号の明細書、図面及び特許請求の範囲に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
リボソームＲＮＡは、すべての生物の生命活動に不可欠な蛋白合成に関わっており、これをコードする遺伝子であるリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）はほとんどの生物でゲノム内に複数コピー存在し、真核生物では数百から数万コピー存在することが知られている。ｒＤＮＡは、真核生物では一般に１８ＳｒＲＮＡ、５．８ＳｒＲＮＡ、２８ＳｒＲＮＡをコードする領域（それぞれ、１８ＳｒＤＮＡ、５．８ＳｒＤＮＡ、２８ＳｒＤＮＡという）が連続して存在し、反復配列を繰り返している。そして、１８Ｓと５．８Ｓの間、５．８Ｓと２８Ｓの間にそれぞれＩＴＳ（Ｉｎｔｅｎａｌ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  Ｓｐａｃｅｒ）１およびＩＴＳ２が存在する。本明細書においては、上記２つのＩＴＳとその間にある５．８ＳをまとめてＩＴＳ領域と称する。
リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列は、生物の分類に広く用いられている。その理由としては、真核生物のなかで最も単純な酵母から非常に複雑な哺乳動物にいたるまで広く保存されている一方、一部ＩＴＳのようにプロセッシングの過程で捨てられる配列については、ある程度大きな変異が期待できるからである。本発明のように、交配種の差を見るには、配列間のある程度の差異が必要であるが、あまりにも差異の度合いが強い場合は配列の決定や増幅プライマーに問題が生じたりすることがある。その点リボソームＤＮＡのＩＴＳを中心とする配列決定では、保存性の高いＳＳ領域やＬＳ領域を足がかりに、分散度の高いＩＴＳを探索できる。
ウンカリア属植物としては、例えば、ウンカリア・リンコフィラ（Ｕｎｃａｒｉａ  ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌａ）、ウンカリア・シネンシス（Ｕｎｃａｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、ウンカリア・マクロフィラ（Ｕｎｃａｒｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ）、ウンカリア・ワンギイ（Ｕｎｃａｒｉａ  ｗａｎｇｉｉ）、ウンカリア・スカンデンス（Ｕｎｃａｒｉａ  ｓｃａｎｄｅｎｓ）、ウンカリア・ホモメラ（Ｕｎｃａｒｉａ  ｈｏｍｏｍｅｌｌａ）、ウンカリア・ヒルスタ（Ｕｎｃａｒｉａ  ｈｉｒｓｕｔａ）、ウンカリア・ランシフォリア（Ｕｎｃａｒｉａ  ｌａｎｃｉｆｏｌｉａ）、ウンカリア・セッシリフルクタス（Ｕｎｃａｒｉａ  ｓｅｓｓｉｌｉｆｒｕｃｔｕｓ）、ウンカリア・ラエビガタ（Ｕｎｃａｒｉａ  ｌａｅｖｉｇａｔａ）、ウンカリア・ユナネンシス（Ｕｎｃａｒｉａ  ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ）、ウンカリア・ガンビール（Ｕｎｃａｒｉａ  ｇａｍｂｉｒ）、ウンカリア・ギアネンシス（Ｕｎｃａｒｉａ  ｇｕｉａｎｅｎｓｉｓ）およびウンカリア・トメントーサ（Ｕｎｃａｒｉａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）などが挙げられる。
本発明者らは、日本薬局方において、生薬としてのチョウトウコウの基原植物として記載されているウンカリア・リンコフィラ（鈎藤；Ｕｎｃａｒｉａ  ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌａ  Ｍｉｑｕｅｌ）、ウンカリア・シネンシス（華鈎藤；Ｕｎｃａｒｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ  Ｈａｖｉｌａｎｄ）、およびウンカリア・マクロフィラ（大葉鈎藤；Ｕｎｃａｒｉａ  ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ  Ｗａｌｌｉｃｈ）の３種、ならびに中国に分布しているその他８種のウンカリア属植物、すなわち、ウンカリア・ワンギイ、ウンカリア・スカンデンス、ウンカリア・ホモメラ、ウンカリア・ヒルスタ、ウンカリア・ランシフォリア、ウンカリア・セッシリフルクタス、ウンカリア・ラエビガタ、ウンカリア・ユナネンシスの合計１１種について、それぞれ複数のサンプルを用いてリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域（ＩＴＳ１およびＩＴＳ２とその間にある５．８Ｓを含む領域）の塩基配列を決定し（それぞれ、配列番号１２〜５３）、アライメントをとって比較した結果、ウンカリア属植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列上に種特異的な多型が存在することを見出した。
すなわち、被検試料に含まれる植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜１１の塩基配列から選択される少なくとも１つのＩＴＳ領域の塩基配列と比較することにより、ウンカリア属植物の種を識別できることを見出した。配列番号１はウンカリア・リンコフィラのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号２はウンカリア・シネンシスのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号３はウンカリア・ワンギイのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号４はウンカリア・スカンデンスのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号５はウンカリア・ホモメラのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号６はウンカリア・ヒルスタのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号７はウンカリア・ランシフォリアのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号８はウンカリア・セッシリフルクタスのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号９はウンカリア・ラエビガタのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号１０はウンカリア・マクロフィラのＩＴＳ領域の塩基配列を表し、配列番号１１はウンカリア・ユナネンシスのＩＴＳ領域の塩基配列を表す。
本発明の方法により、少なくとも上記１１種ウンカリア属植物の種を鑑別することができる。本発明の方法は、特に、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラの３種を鑑別するために有用である。
本発明において、ウンカリア属植物の種を鑑別することには、特定の種であると鑑別すること、特定の種ではないと鑑別すること、特定の種の群に含まれると鑑別すること、ならびに特定の種の群に含まれないと鑑別することが包含される。
例えば、一実施形態において本発明の方法では、被検試料に含まれるウンカリア属植物が、日本薬局方において生薬としてのチョウトウコウの基原植物として記載されているウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラの３種のうちのいずれかであるか、またはそれ以外であるかを鑑別できる。換言すれば、被検試料が、日本薬局方におけるチョウトウコウとして、真正な生薬であるかどうかを鑑別することができる。
被検試料に含まれる植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を、配列番号１〜１１の塩基配列から選択される少なくとも１つのＩＴＳ領域の塩基配列と比較する識別方法としては、ＩＴＳ領域の塩基配列全体を比較する方法、１〜数カ所の特定部位の塩基を比較する方法、または１〜数カ所の特定部位の塩基の違いを複数組み合わせてパターン化して比較する方法を利用できる。
ＩＴＳ領域の塩基配列全体を比較する方法としては、被検試料に含まれる植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定し、上記配列番号１〜１１の塩基配列と比較し、その相同性の割合で判定する方法がある。一般に生物種は近接する種であっても、進化の過程を反映して微妙にその相同性に違いをみせるので、被検試料から得られた塩基配列は必ずしも上記配列番号１〜１１の塩基配列と１００％同一ではないことが多い。このような場合にも、相同性の割合を求めることにより、相対的な類縁関係の推測を容易に行うことができる。
ＩＴＳ領域の塩基配列を決定する方法としては、被検試料からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＩＴＳ領域を増幅し、ダイレクトシーケンシングを行うかクローニングを行って、塩基配列を決定する方法が挙げられる。ＩＴＳ領域の増幅、ダイレクトシーケンシング、クローニングおよび塩基配列決定は、いずれも定法により行うことができる。例えば、ＩＴＳ領域の増幅には、ＰＣＲ以外に、例えば、ＬＡＭＰ法（栄研化学）、ＩＣＡＮ法（宝酒造）などを利用することができる。
従って、一実施形態において本発明の方法は、１）被検試料からＤＮＡを抽出する工程、２）該ＤＮＡを鋳型としてＩＴＳ領域を増幅する工程、３）ＩＴＳ領域の塩基配列を決定する工程、および４）得られた塩基配列を配列番号１〜１１の塩基配列の少なくとも１つと比較し、最も高い相同性を有するウンカリア属種として同定する工程を含む。
ＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーとしては、公知のユニバーサルプライマーを使用することができる（Ｗｈｉｔｅ  Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ，Ｅｄｓ．）ｐｐ．３１５−３２２．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
ＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーは、ウンカリア属植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を基に設計してもよい。プライマーの設計条件は、特に限定されない。例えば、配列番号１〜１１に示されるいずれか一つまたは複数の塩基配列もしくはこれらの塩基配列に相補的な塩基配列の一部であって、かつ、１０塩基以上の連続した塩基配列からなるヌクレオチドを設計すればよい。１０塩基未満であると、確率的にその塩基配列に相補的な塩基配列が鋳型ＤＮＡ上に複数存在することが想定されるため、増幅に用いるプライマーとして精度が低くなるため、１０塩基以上とすることが好ましい。また、プライマーとして用いる塩基配列の１０％以下の数の塩基が置換、欠失、挿入または付加された塩基配列からなるヌクレオチドであっても、鋳型ＤＮＡとハイブリダイズが可能であるため、プライマーとして使用することができる。プライマーは、例えば、市販のＤＮＡ合成装置等を用いて合成することができる。
ウンカリア属植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーの具体例として、以下のものが挙げられる。
ＩＴＳ領域、すなわち、ＩＴＳ１、５．８ＳおよびＩＴＳ２を一括して増幅するためのプライマーとして、例えば、次のプライマーセット：ＩＴＳ５（５’−ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  Ｇ−３’）およびＩＴＳ４（５’−ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＧＣ−３’）を利用することができる（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９０、前掲）。ここでＩＴＳ５およびＩＴＳ４はプライマーの名称を表す。
ＩＴＳ１およびＩＴＳ２を別々に増幅するためのプライマーとして、例えば、次のプライマーセット：ＩＴＳ２（５’−ＧＣＴ  ＧＣＧ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＧＣ−３’）およびＩＴＳ３（５’−ＧＣＡ  ＴＣＧ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＡＡＣ  ＧＣＡ  ＧＣ−３’）を利用することができる（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９０、前掲）。ここでＩＴＳ２およびＩＴＳ３はプライマーの名称を表す。
あるいは、ウンカリア属植物内で保存されている領域に設計したプライマーとして、以下のプライマーセットを用いることにより、ＩＴＳ１およびＩＴＳ２をそれぞれ２分割、合計４分割して別々に増幅することができる：
ＩＴＳ１の増幅…ＩＴＳ５  ＆  ＩＴＳ−ＵｎｃａｒｉａＲ２（５’−ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＧＣＧ  ＣＧＴ  ＴＣＣ  Ｇ−３’）、ＩＴＳ−ＵｎｃａｒｉａＦ１（５’−ＣＧＣ  ＧＣＧ  ＧＡＡ  ＡＡＣ  ＧＴＡ  ＡＣＴ  ＣＡＡ−３’）＆  ＩＴＳ２
ＩＴＳ２の増幅…ＩＴＳ３  ＆  ＩＴＳ−ＵｎｃａｒｉａＲ１（５’−ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＧＴＧ−３’）、ＩＴＳ−ＵｎｃａｒｉａＦ２（５’−ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＧＡＧ  ＡＧＴ  ＣＣＴ  ＣＧＧ  ＣＧ−３’）＆  ＩＴＳ４。
本発明者らは、さらにウンカリア属に属する上記１１種において、それぞれ複数のサンプルについて決定したリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列のアライメントをとって調査した結果、６４の変異部位を見出した。そして、ＩＴＳ領域における特定部位の塩基のみを比較することによっても、ウンカリア属植物の種を鑑別できることを見出した。各種およびサンプルについての、上記６４の変異部位における塩基の詳細を図１にまとめる。本発明における塩基配列の比較では、１〜数カ所の特定部位の塩基の違いを比較する方法においてこれら６４の変異部位の違いを比較することにより、ウンカリア属の種を鑑別できる。
すなわち、一実施形態において本発明は、配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、４７位、７８位、７９位、８４位、８５位、８６位、９４位、１０４位、１０５位、１６９位、１７２位、１７７位、２０９位、２１０位、２１１位、２１５位、３６５位、３９５位、４１２位、４１３位、４１５位、４３３位、４４６位、４４７位、４５０位、４５１位、４６１位、５１４位、５１８位、５２６位、５３２位、５３７位、５４６位、５５４位、５６７位、５７０位、５８５位、５８８位、５９０位、５９２位、６０８位または６０９位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の塩基を比較することによりウンカリア属植物の種を鑑別するものである。
これらのうち、好ましくは、配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、４７位、７９位、８４位、８５位、８６位、９４位、１０４位、１０５位、１６９位、１７２位、１７７位、２０９位、２１０位、２１１位、２１５位、３６５位、３９５位、４１２位、４１３位、４１５位、４３３位、４４６位、４４７位、４５０位、４５１位、４６１位、５１４位、５１８位、５２６位、５３２位、５３７位、５４６位、５５４位、５６７位、５７０位、５８５位、５８８位、５９０位、５９２位、６０８位または６０９位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３の塩基を比較する。
本明細書において、「配列番号１の塩基配列を参照配列としたときのＸ位に相当する位置の塩基」という表現は、配列番号１の塩基配列を参照配列として、任意のＩＴＳ領域の塩基配列中の所定の塩基の位置を指定するために使用される。すなわち、被検試料由来のＩＴＳ領域の塩基配列（以下、塩基配列Ｙと証する）を、配列番号１の塩基配列とアラインメントしたときに、配列番号１の塩基配列の１番目の塩基から数えてＸ番目の塩基に対してアラインされる（すなわち、アラインメントにおいて同じ縦列に整列される）、塩基配列Ｙ中の塩基を意味する。また、「配列番号１の塩基配列を参照配列としたときのＶ−Ｗ位に相当する位置の塩基」という表現は、配列番号１の塩基配列を参照配列として、被検試料由来のＩＴＳ領域の塩基配列（以下、塩基配列Ｙと証する）を、配列番号１の塩基配列とアラインメントしたときに、配列番号１の塩基配列の１番目の塩基から数えてＶ番目とＷ番目の塩基に対してアラインされる塩基配列中の２つの塩基間に挿入された塩基または挿入の有無を意味する。配列番号１を参照配列として上記のように塩基の位置を表す場合、配列番号１の５１７位のＴの次の５１８位は欠失とし、５１７位のＣの次のＧを５１９位、その次のＡを５２０位とする。また、前記のとおり数えて５６９位（配列番号１における５６８番目の塩基）のＴの次の５７０位も欠失とし、５６９位のＴの次のＧ（配列番号１における５６９番目の塩基）を５７１位、その次のＡ（配列番号１における５７０番目の塩基）を５７２位とする。なお、本発明において、上記塩基の位置は、特に、アライメントソフトとしてＢｉｏＥｄｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）を用いてアライメントをとったときの塩基の位置を意味する。なお、ＢｉｏＥｄｉｔは、以下のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／ＢｉｏＥｄｉｔ．ｚｉｐ）からダウンロードすることができる。
配列番号１の塩基配列は、ＩＴＳ１、５．８ＳおよびＩＴＳ２からなるＩＴＳ領域であり、ＩＴＳ１の開始部位を１位とするものである。なお、ウンカリア属植物のＩＴＳ１の開始部位の配列は、５’−ＴＣＧＡＡＴＣＣＴＧとする。
配列番号１の塩基配列と他の塩基配列とのアラインメントは、手作業で行うこともできるが、例えばマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，ｐ．４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより作成することができる。当該プログラムは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ）のウェブサイトから利用することができる。当業者であれば、得られたアラインメントを、必要に応じて最適なアラインメントとなるように更に調整することできる。そのような最適アラインメントは、塩基配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。
より具体的には次のとおり識別することができる。８５位がＴ（チミン）であるか、および／または２１５位がＴもしくはＫ（ＴとＧ（グリシン）の混合塩基配列）である場合は、ウンカリア・リンコフィラと鑑別できる。２１５位がＡ（アデニン）であるか、４１５位がＴであるか、および／または４６１位がＴである場合は、ウンカリア・シネンシスと鑑別できる。４３位がＣ（シトシン）であるか、１７７位がＣであるか、および／または５３２位がＣである場合は、ウンカリア・マクロフィラと鑑別できる。これらの塩基は、１塩基でも上記に該当すれば、特定の種であると鑑別できる。例えば、配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの８５位がＴであることさえわかれば、他の塩基を見ることなく、被検試料にウンカリア・リンコフィラが含まれると鑑別できる。その他の塩基についても同様である。
５３７位がＴであるか、および／または５８５位がＴである場合は、ウンカリア・リンコフィラまたはウンカリア・シネンシスのいずれかであると鑑別できる。これらの塩基は、１塩基でも上記に該当すれば、ウンカリア・リンコフィラまたはウンカリア・シネンシスのいずれかであると鑑別できる。
４１２位がＴであり、かつ３７位がＡであるか、９４位がＡであるか、４１３位がＡであるか、４５０位がＡであるか、および／または６０８位がＣである場合は、ウンカリア・リンコフィラまたはウンカリア・シネンシスのいずれかであると鑑別できる。これらの塩基は、２塩基が上記に該当すれば、すなわち、４１２位がＴであり、かつ、３７位、９４位、４１３位、４５０位および６０８位のいずれかが上記に該当することさえ確認できれば、ウンカリア・リンコフィラまたはウンカリア・シネンシスのいずれかであると鑑別できる。
１６９位がＴであるか、２０９位がＣであるか、および／または２１１位がＣであり、かつ１２位がＧであるか、１０４位がＴであるか、５８８位がＴであるか、および／または５９０位がＴである場合は、ウンカリア・マクロフィラであると鑑別できる。これらの塩基も、２塩基が上記に該当すれば、すなわち、１６９位、２０９位または２１１位のいずれか上記に該当すること、かつ１２位、１０４位、５８８位または５９０位のいずれかが上記に該当すること、さえ確認できれば、ウンカリア・マクロフィラであると鑑別できる。
従って、被検試料に含まれるウンカリア属植物が、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラのいずれかであるか、またはそれ以外であるかの識別は、配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、８５位、９４位、１０４位、１６９位、１７７位、２０９位、２１１位、２１５位、４１２位、４１３位、４１５位、４５０位、４６１位、５３２位、５３７位、５８５位、５８８位または６０８位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、例えば、１つまたは２つの塩基を比較することにより実施できる。
また、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラ以外の種については、以下の部位を比較することにより識別できる。
１２位がＡであるか、１０４位がＣであるか、５７０位にＴの挿入があるか、５８８位がＣであるか、および／または５９０位がＡである場合は、ウンカリア・ユナネンシスであると鑑別できる。すなわち、これらの塩基は、１塩基でも上記に該当すれば、ウンカリア・ユナネンシスであると鑑別できる。
４７位がＴであるか、２１０位がＡであるか、３６５位がＡであるか、および／または４３３位がＣである場合は、ウンカリア・ヒルスタであると鑑別できる。すなわち、これらの塩基は、１塩基でも上記に該当すれば、ウンカリア・ヒルスタであると鑑別できる。
８６位がＴであるか、１０５位がＴであるか、および／または４５０位がＣであれば、ウンカリア・ランシフォリアであると鑑別できる。すなわち、これらの塩基は、１塩基でも上記に該当すれば、ウンカリア・ランシフォリアであると鑑別できる。
８４位がＣであるか、３９５位がＴであるか、４５１位がＣもしくはＭ（ＡとＣの混合塩基配列）であるか、５１８位に塩基の挿入があるか、５２６位がＴもしくはＷ（ＡとＴの混合塩基配列）であるか、５５４位がＡであるか、および／または６０９位がＡであれば、ウンカリア・セッシリフルクタスであると鑑別できる。すなわち、これらの塩基は、１塩基でも上記に該当すれば、ウンカリア・セッシリフルクタスであると鑑別できる。
８４位がＧであるか、４５１位がＧであるか、および／または５１４位がＡであれば、ウンカリア・ラエビガタであると鑑別できる。すなわち、これらの塩基は、１塩基でも上記に該当すれば、ウンカリア・ラエビガタであると鑑別できる。
４４６位がＴであるか、および／または５６７位がＴであれば、ウンカリア・ホモメラであると鑑別できる。すなわち、これらの塩基は、１塩基でも上記に該当すれば、ウンカリア・ホモメラであると鑑別できる。
換言すれば、配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、４７位、８４位、８６位、１０４位、１０５位、２１０位、３６５位、３９５位、４３３位、４４６位、４５０位、４５１位、５１４位、５１８位、５２６位、５５４位、５６７位、５７０位、５８８位、５９０位または６０９位の塩基のいずれかが上記に該当すれば、被検試料に含まれるウンカリア属植物が、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラ以外の種であると鑑別できる。
さらに、７９位がＣであるか、１７２位がＡであるか、３９５位がＴであるか、４４７位がＴであるか、５４６位がＧであるか、および／または５９２位がＣである場合は、いずれの種であるかは鑑別できないが、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラ以外の種であると鑑別できる。すなわち、これらの塩基は、１塩基でも上記に該当すれば、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラ以外の種であると鑑別できる。
従って、被検試料に含まれるウンカリア属植物が、ウンカリア・リンコフィラ、ウンカリア・シネンシスおよびウンカリア・マクロフィラのいずれかであるか、またはそれ以外であるかの識別は、配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの、１２位、３７位、４３位、４７位、７９位、８４位、８５位、８６位、９４位、１０４位、１０５位、１６９位、１７２位、１７７位、２０９位、２１０位、２１１位、２１５位、３６５位、３９５位、４１２位、４１３位、４１５位、４３３位、４４６位、４４７位、４５０位、４５１位、４６１位、５１４位、５１８位、５２６位、５３２位、５３７位、５４６位、５５４位、５６７位、５７０位、５８５位、５８８位、５９０位、５９２位、６０８位または６０９位に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜５、さらに好ましくは１〜３、例えば、１つまたは２つの塩基を比較することにより実施できる。
ウンカリア属植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列において、種の識別に有用な部位について、配列番号１を参照配列として、以下の表１（薬用種）および表２（薬用種以外）にまとめる。
【表１】
2009014269.tif 000003
【表２】
2009014269.tif 000004
また、７８位がＡであれば、ウンカリア・マクロフィラ、ウンカリア・ユナネンシスおよびウンカリア・セッシリフルクタスのいずれかであると鑑別できる。
上記の特定部位の塩基の比較は、被検試料に含まれる植物のリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の塩基配列を決定し、得られたＩＴＳ領域の塩基配列における上記特定部位の塩基を比較することにより実施できる。ＩＴＳ領域の塩基配列を決定する方法については既に述べたとおりである。すなわち、被検試料からＤＮＡを抽出し、それを鋳型としてＩＴＳ領域を増幅し、ダイレクトシーケンシングを行うかクローニングを行って、塩基配列を決定することができる。プライマーについても、上記と同様である。
従って、一実施形態において本発明の方法は、１）被検試料からＤＮＡを抽出する工程、２）該ＤＮＡを鋳型としてＩＴＳ領域を増幅する工程、３）ＩＴＳ領域の塩基配列を決定する工程、および４）配列番号１の塩基配列を参照配列としたときの上記位置に相当する位置の塩基から選択される少なくとも１つの塩基を配列番号１〜１１の塩基配列の少なくとも１つと比較する工程、を含む。
１〜数カ所の特定部位の塩基を比較する方法として、ＰＣＲプライマーを用いる方法を利用してもよい。塩基配列を比較し、相違のある領域にＰＣＲプライマーを設定し、どのプライマーによって増幅されるかによって判別する方法である。この場合非相同的な領域だけでなく、相同的な領域にもプライマーを設定し、インターナルコントロールとするのが望ましい。増幅が見られないのは、反応の失敗ではなくリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域の配列によるものであることを確認するためである。
上記の特定のプライマーによってリボソームＤＮＡのＩＴＳ領域が増幅するかどうかで判別する方法は、ＰＣＲ以外の増幅法であってもよい。例えば、ＬＡＭＰ法（栄研化学）、ＩＣＡＮ法（宝酒造）などを利用することも可能である。
分類は必ずしも核酸の増幅によるものでなくてもよい。例えば１本鎖の核酸同士をハイブリダイズさせて、それを電気的に検出する方法は、非常に感度が良いので、核酸の増幅なしで検出が可能である。１本鎖のプローブを上記増幅法と同様に非相同的な領域に設定することにより、ハイブリダイズしたかどうかで配列を確認できる。
また、１ないし数カ所の特定部位の塩基を比較する方法による識別は、ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法でも可能である。識別の対象となる何種類かの塩基配列を比較し、制限酵素による切断に違いのある部分を見つけ、増幅されたＤＮＡ断片にその部分が含まれるように、プライマーを設定する。増幅したＤＮＡ断片がその制限酵素によって切断されるか否かによって配列の違いが判断できる。切断の有無は通常の電気泳動法等によって容易に判定可能である。
さらに、上記の特定部位における塩基の違いを複数組み合わせ、パターン化して比較する方法がある。例えば、上記プライマー法で、いくつかのプライマー対を用いる方法や、あるいは上記ＲＦＬＰ法で、比較的広い領域を増幅し、複数の制限酵素で切断し、それぞれの切断パターンによって判別することも可能である。
被検試料としては、ウンカリア属植物を含む可能性のある試料であれば特に制限されない。例えば、ウンカリア属植物の破砕物、粉砕物、乾燥物および抽出物、これらを含む生薬や漢方薬、ならびに該生薬や漢方薬を含む医薬品、食品、飲料および化粧品などが挙げられる。
なお本発明において用いる、ＩＴＳ領域の増幅、ＰＣＲ、クローニング、塩基配列の決定、核酸化学合成等の実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，（２００１）３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の範囲は実施例に限定されない。
【実施例】
【０００６】
（実施例１）
材料
形態により鑑別可能な押葉標本を用いて、鑑別に有効な変異サイトを調査した。調査に用いたサンプルを表３に示す。ウンカリア・ホモメラを除き、１種につき複数のサンプルについて、ＩＴＳ領域の塩基配列を決定し、種特異的部位を調査した。
【表３】
2009014269.tif 000005
方法
サンプルから約２００ｍｇの葉もしくは果皮を採り、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＤＮＡを抽出した。ＩＴＳ領域のＰＣＲ増幅は、サンプルの状態により増幅可能な長さが異なっていたため、以下のステップで実施した。また、増幅が困難なサンプルに関しては、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いた全ＤＮＡの精製を試みた。
（１）プライマーセット（ＩＴＳ５  ＆  ＩＴＳ４）を用いて、ＩＴＳ１、５．８Ｓ、ＩＴＳ２を一括して増幅した（Ｗｈｉｔｅ  Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｒｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．３１５−３２２．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。
2009014269.tif 000006
（２）プライマーセット（ＩＴＳ５  ＆  ＩＴＳ２、ＩＴＳ３  ＆  ＩＴＳ４）（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９０、前掲）を用いて、ＩＴＳ１およびＩＴＳ２を別々に増幅した。
2009014269.tif 000007
（３）上記（１）、（２）で増幅、配列決定した塩基配列をもとにウンカリア属植物内で保存されている領域にプライマーを設計し、ＩＴＳ１およびＩＴＳ２をそれぞれ２分割、合計４分割して別々に増幅した。用いたプライマーセットは以下の通りである。
2009014269.tif 000008
反応液はいずれも以下のとおりである：１０  ｘ  ＧｅｎｅＴａｑ−Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）４μｌ、ファワードプライマー（ＩＴＳ５：１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、リバースプライマー（ＩＴＳ４：１０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、テンプレートＤＮＡ  １．２５μｌ、Ｇｅｎｅ−Ｔａｑ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ）０．２５μｌ、ＤＭＳＯ  ５μｌ、Ｄ．Ｄ．Ｗ．３２．５μｌ（ＴａＫａＲａ）。
反応サイクルはステップ（１）が（９４℃，１分；４８℃，２分；７２℃，３分）ｘ３０サイクル、（７２℃，７分）ｘ１サイクル、ステップ（２）および（３）が（９４℃，１分；４５℃，１分；７２℃，２分）ｘ４５サイクル、（７２℃，７分）ｘ１サイクルとした。
ＰＣＲ反応液は２．０％アガロースゲルを用いて電気泳動してＤＮＡをサイズごとに分離し、目標サイズのＤＮＡバンドだけを切り出してＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。
精製産物についてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．１．１とＭｏｄｅｌ  ３１００  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシーケングを行った。シーケングの際には増幅に用いたプライマーを用い、５’末端および３’末端の双方から配列決定し、両者を比較して塩基配列を確定した。
結果
増幅困難なサンプルに関して用いたステップ（３）において使用した４プライマーセットのうち、ＩＴＳ−ＵｎｃａｒｉａＦ１  ＆  ＩＴＳ２の増幅成功率が最も高く、ＩＴＳ５  ＆  ＩＴＳ−ＵｎｃａｒｉａＲ２の増幅成功率が最も低かった。
調査したウンカリア属植物はＩＴＳ１が２２７−２２８ｂｐ、５．８Ｓが１６２−１６３ｂｐ、ＩＴＳ２が２１９−２２０ｂｐであった。ＩＴＳ１では、ウンカリア・セッシリフルクタスの２サンプルで１塩基の欠失の有無に基づくゲノム内多型が見られ、ダイレクトシーケンスにおいて波形の乱れが見られ、５．８Ｓではウンカリア・マクロフィラ、ウンカリア、ユナネンシスに共通して１塩基の欠失が見られ、ＩＴＳ２では、ウンカリア・セッシリフルクタスで１塩基の挿入、ないし同一サイトにおける挿入の有無に基づくゲノム内多型が見られ、ウンカリア・ユナネンシスで１塩基の挿入が見られた。ウンカリア・セッシリフルクタスにおいては、ＩＴＳ５  ＆  ＩＴＳ４のプライマーセットで全領域の増幅に成功しても、全塩基配列の解読にはＩＴＳ２  ＆  ＩＴＳ３のプライマーセットを用いて配列決定する必要があった。
調査領域には、６４の変異サイトが見いだされた（図１）。表３に示す４２種のサンプルから得られたＩＴＳ領域の塩基配列をアライメントした結果を図２−１〜１１に示す（上から順に、それぞれ、配列番号１２〜５３を表す）。そのうち４５サイトが完全な塩基の違いがサンプル間で見られるサイトであった（１２位、３７位、４３位、４７位、７８位、７９位、８４位、８５位、８６位、９４位、１０４位、１０５位、１６９位、１７２位、１７７位、２０９位、２１０位、２１１位、２１５位、３６５位、３９５位、４１２位、４１３位、４１５位、４３３位、４４６位、４４７位、４５０位、４５１位、４６１位、５１４位、５１８位、５２６位、５３２位、５３７位、５４６位、５５４位、５６７位、５７０位、５８５位、５８８位、５９０位、５９２位、６０８位、６０９位）。残りの１９サイトは不完全な塩基置換のみが見られるサイトで、このような置換が見られるサンプルはそれぞれのサイトにつき、１ないしごく少数だった。
いくつかの例外を除いて各種は固有、かつ安定した変異パターンを有しており、ＩＴＳ領域が釣藤鈎基原植物とその近縁種の鑑別に有効であることが明らかとなった。
以上の結果から、釣藤鈎基原植物および近縁なウンカリア属植物は、ＩＴＳ領域塩基配列により判別可能であることが明らかになった。
（実施例２）
四川省古藺県黄荊郷で入手した釣藤鈎（生薬）および四川省の産地公司より入手した釣藤鈎（生薬）のＩＴＳ領域塩基配列を解析することにより、いずれの種のウンカリア属植物を含むか鑑別した。
材料
サンプルとして、四川省古藺県黄荊郷で入手した釣藤鈎２サンプルおよび成都龍泉天然薬品開発有限公司より入手した釣藤鈎２ロット８サンプルを用いた。
方法
約２００μｇのサンプルからＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＤＮＡを抽出した。ＩＴＳ領域のＰＣＲ増幅には、プライマーセット（ＩＴＳ５  ＆  ＩＴＳ３）を用いた。反応液の組成は以下のとおりである：１０  ｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μｌ、ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（２．５ｍＭ）４μｌ、プライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）２．５μｌ×２、１０％  ＤＭＳＯ  ３０．７５μｌ、テンプレートＤＮＡ  ５μｌ、Ｇｅｎｅ−Ｔａｑ  ０．２５μｌ。反応サイクルは、（９４℃，４分）ｘ１サイクル、（９５℃，３０秒；７０℃，１５秒；７２℃，１５秒）ｘ３サイクル、（９５℃，３０秒；６６℃，１５秒；７２℃、１５秒）ｘ３サイクル、（９５℃，３０秒；６２℃，１５秒；７２℃，１５秒）ｘ３サイクル、（９５℃，３０秒；５８℃，１５秒；７２℃，１５秒）ｘ３サイクル、（９５℃，３０秒；５４℃，１５秒；７２℃，１５秒）ｘ３サイクル、（９５℃，３０秒；４８℃，１分および３０秒；７２℃，２分および３０秒）ｘ２０サイクル、および（７２℃，７分）ｘ１サイクルとした。
ＰＣＲ反応液は２．０％アガロースゲルを用いて電気泳動してＤＮＡをサイズごとに分離し、目標サイズのＤＮＡバンドだけを切り出してＧＦＸＴＭ  ＰＣＲ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｇｅｌ  Ｂａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。
精製産物についてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．３．１とＭｏｄｅｌ  ３１３０ｘＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシーケングを行った。シーケングの際には増幅に用いたプライマーを用い、５’末端および３’末端の双方から配列決定し、両者を比較して塩基配列を確定した。
結果
各生薬サンプルについて得られたＩＴＳ領域塩基配列を解析した結果、四川省で得られた釣藤鈎の基原植物はウンカリア・リンコフィラとウンカリア・シネンシスと同定され、四川省古藺県にもウンカリア・シネンシスが生育することが確認された。以上から、生薬をサンプルとして用いた場合でも、ＩＴＳ領域塩基配列によりウンカリア属植物の種を判別可能であることが明らかになった。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【国際調査報告】
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