(57)【要約】微細加工技術を利用して、試料中の大量の細胞を、ダメージを与えることなく高効率で１細胞レベルで分離・捕捉するマイクロ流路デバイス（microfluidicdevice）を提供するものである。試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロメッシュ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板と、細胞捕捉用の複数の微細貫通孔を有するプラスチック製のマイクロメッシュを保持した保持平板と、吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板とを順次備え、前記マイクロメッシュの細胞捕捉用の微細貫通孔の形状が反すり鉢状又は円筒状であり、前記上部平板を前記上部基板に比較して軟質のプラスチックで構成する。
2009016842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロメッシュにより試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉することができるマイクロ流路デバイスであって、
表面に試料供給口及び試料排出口が形成され、下面に試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、
前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にマイクロメッシュ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板と、
前記上部平板の開口窓の下方に相当する位置に、細胞捕捉用の複数の微細貫通孔を有するプラスチック製のマイクロメッシュと、該マイクロメッシュを保持する保持板からなるマイクロメッシュ保持平板と、
前記保持平板のマイクロメッシュの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、
表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板と、
を順次備え、
前記マイクロメッシュの細胞捕捉用の微細貫通孔の形状が反すり鉢状又は円筒状であり、前記上部平板が前記上部基板に比較して軟質のプラスチックで構成されており、
前記上部基板と上部平板、又は上部平板とマイクロメッシュ保持平板とが装脱着可能に構成されている
ことを特徴とするマイクロ流路デバイス。
【請求項２】
マイクロメッシュが、ＰＥＴ製又は着色ＰＥＴ製であることを特徴とする請求項１記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項３】
マイクロメッシュが、１０００〜１００００の微細貫通孔を有することを特徴とする請求項１又は２記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項４】
上部基板と上部平板が、ＰＤＭＳ(poly-dimethylsiloxisane)を主剤とするプラスチック製であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項５】
マイクロ流路内面が非イオン性界面活性剤で処理されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項５記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項７】
マイクロメッシュを保持する保持板が、ガラス製であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項８】
少なくとも、細胞捕捉率が５０％以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載のマイクロ流路デバイスの試料供給口から細胞を含む試料を注入し、−１０ｋＰａ〜−０．１ｋＰａの吸引圧で吸引することを特徴とする試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉する方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか記載のマイクロ流路デバイスを用いて、試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉し、捕捉された各細胞に蛍光プローブを導入した後、蛍光励起により単一細胞の遺伝子発現を定量的に解析する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉することができる単一細胞捕捉用のマイクロ流路デバイスや、かかるマイクロ流路デバイスを用いた試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで分離・捕捉する方法や、前記マイクロ流路デバイスを利用した単一細胞の遺伝子発現の定量的解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、単一細胞捕捉手段に関しては、まだ有効な手段は確立されていないため、世界的な競争が行われており、オプトエレクトロニックツイーザーズによる単一細胞の大量並行操作（例えば、非特許文献１参照）や、ポリスチレン製のマイクロチャンバーアレイチップによる単一細胞のマイクロアッセイ（例えば、非特許文献２参照）や、高密度ハイドロダイナミック細胞単離アレイによる単一細胞の分離（例えば、非特許文献３参照）等の論文の他、以下に示す細胞捕捉用の装置や方法に関する特許文献がある。【０００３】
例えば、一般の血液検査室に存在する器具を使用し、熟練を要することなく細胞を分離し、遺伝子解析を行うことを可能にする細胞分離用のスライドであって、細胞を付着させた後、１または複数個の細胞が付着した部分を切り取ることによって細胞を分離することを可能にした細胞分離用スライド（例えば、特許文献１参照）や、癌、感染性疾病又は他の病理学的過程についての診断キットであって、接着剤特性を有する選択領域を提供するように活性化され得る選択的活性化可能移送表面、及び正常組織からの細胞材料サンプルと異常組織からの細胞材料サンプルとを区別するために前記異常組織からの細胞材料サンプルに適用され得る少なくとも１つのプローブ又はマーカーを含んで成るキット（例えば、特許文献２参照）が知られている。【０００４】
また、多数の細胞を含む細胞懸濁液に対して処理を行なって細胞を間隔を隔てて整列させて流す細胞整列部と、細胞整列部で整列された細胞に対して検知処理を行って細胞に関する情報を検知する細胞情報検知部と、細胞情報検知部で検知された情報に基づいて細胞を選別する細胞選別部とを具備し、前記細胞整列部は、細胞懸濁液を流す第１通路と、第１通路にこれと交差する方向に連通すると共に第１通路の細胞懸濁液の流れを分断させる分断用液状物を流す第２通路とを備えている、細胞に与えるダメージを抑えつつ、径小の多数の細胞含有液滴を生成することができる細胞分離選別装置及び細胞整列用基板が知られている（例えば、特許文献３参照）。【０００５】
また、トランスポーターを介して標識識別用の特定物質を目的細胞内に取り込ませる工程と、前記取り込まれた標識識別用の特定物質標識物を光学的に検出して前記目的細胞を分離する工程と、前記分離された目的細胞に取り込まれている標識識別用の特定物質を分離する工程とよりなり、細胞を標識し、目的細胞に電界による力を作用させて、他の細胞から分離する細胞分離装置を用いて細胞を分離回収するにあたり、細胞に与える影響を最小とし、回収した細胞の利用を容易とする細胞分離方法が知られている（例えば、特許文献４参照）。【０００６】
また、細胞の捕捉および細胞の透過観察を容易且つ確実に行うことのできる細胞捕捉装置であって、細胞捕捉装置の細胞シャーレは、底板部の二箇所位置に、一対の貫通孔と、これら貫通孔の下開口部とを連続する吸入流路とを形成し、溝部を底板部の下方側から封着する透明板部材を設け、貫通孔の上開口部位置には捕捉用プレートを配置させ、貫通孔の上開口部には、吸引ポンプから通じる吸引チューブを接続する構成とした細胞捕捉装置が知られている（例えば、特許文献５参照）。【０００７】
また、マイクロインジェクション法の実際の使用における種々の問題を解決し、顕微鏡で細胞を観察しながらの粒子の捕捉や針の刺入などが容易であって、効率良く粒子（例えば、細胞）に物質を注入することのできるマイクロチャネルアレイ装置であって、基板を貫通する貫通孔を有する窪みと、該窪みと基板の端面の間を連通する多数の微細な溝とを該基板表面に有する第１基板と、透明な第２基板とからなり、前記第１基板の表面に前記第２基板を接合させることにより、前記第１基板と前記第２基板との接合部であって前記第１基板の端面に、前記溝によって形成される粒子捕捉用開口端が形成されているマイクロチャネルアレイ装置が知られている（例えば、特許文献６参照）。【０００８】
他方、本発明者らは、試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置において、流体供給口および流体吸引口を含むフロー流路が内部に形成された平板基板と、平板基板の流体吸引口に設けられ対象微生物の最小径より小さい径の複数の貫通孔からなる捕捉部とを有するマイクロチップと、マイクロチップの捕捉部に接続され試料水を吸引する試料水吸引手段と、マイクロチップの平板基板の流体供給口に接続され試料水を供給する試料水供給手段とを備えた、試料水から対象微生物を選択的に精度良く分離して回収することができる微生物分離装置（例えば、特許文献７参照）を報告している。【０００９】
【特許文献１】特開平１０−３３２６８８号公報
【特許文献２】特開２００６−３４５８６８号公報
【特許文献３】特開２００４−１４４号公報
【特許文献４】特開２００６−４２６５４号公報
【特許文献５】特開２００６−２８０２３１号公報
【特許文献６】特開２００２−２７９６９号公報
【特許文献７】特開２００７−８９５６６号公報
【非特許文献１】Pei Yu Chiou, AaronT. Ohta, Ming C. Wu, All,  natureVol.436, 21 Jul. 2005,  ｐ370
【非特許文献２】Shohei Yamamura他, Anal. Chem. 2005, Vol.77,p8050-8056
【非特許文献３】Dino Di Cario, Nima Aghdam, Luke P. Lee, Anal.Chem. 2006, Vol.78, p4925-4930
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
近年、がんや自己免疫疾患という病態での免疫細胞の異常クローンが注目されているが、免疫のダイナミックな順応メカニズムを考えれば、個々の細胞の機能的性格が異なることは容易に想像できる。免疫応答の観点からしてもＴＣＲや抗体遺伝子の変異も最初は１個の細胞から始まる現象であり、免疫細胞の機能研究においては、１細胞レベルでの研究はもはや避けては通れない時代である。このように、細胞解析のターゲットは細胞群から単一細胞、さらには細胞内分子へと細分化されつつある。単一細胞解析では、細胞を高速かつ網羅的に捕捉し、一括で解析することが望まれる。本発明の課題は、微細加工技術を利用して、試料中の大量の細胞を、ダメージを与えることなく高効率で１細胞レベルで分離・捕捉するマイクロ流路デバイス（microfluidicdevice）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、先に試料水中に含まれる対象微生物を分離して回収する微生物分離装置を提案している（特許文献７参照）。すり鉢状の貫通孔が複数設けられている厚さ５μｍのＳＵＳ３０４の薄板からなるマイクロチップを備えたこの微生物分離装置を用いると、クリプトスポリジウム模擬粒子等の微生物は効率よく捕捉しうるが、この微生物分離装置を用いて試料中の細胞を１細胞レベルで分離・捕捉しようと試みたところ、ダメージを与えることなく効率のよい１細胞レベルでの分離・捕捉が困難で、流体供給口及び流体吸引口を含むフロー流路内に細胞が吸着する上、細胞表面の観察が十分できず、分離・捕捉した細胞の分取に不便であることが判明した。【００１２】
そこで、マイクロメッシュの材質の検討、マイクロメッシュの細胞捕捉用の微細貫通孔の形状の検討、マイクロ流路内での細胞吸着防止用界面活性剤の検討、マイクロ流路デバイス構成部材の材質・構造の検討、吸引圧の検討等を行った。そして、ＰＥＴ(polyethylene terephthalate)基板に対して直径２μｍの反すり鉢状の微細孔を１００孔アレイ状に加工し、ＰＥＴマイクロメッシュを作製し（図１参照）、ＰＥＴマイクロメッシュを硬度の異なる２枚のＰＤＭＳ(polydimethylsiloxane)製平板から形成したマイクロ流路と統合し、マイクロ流路内面を非イオン性界面活性剤で処理してマイクロ流路デバイスを構築し（図２参照）、Raji細胞懸濁液を流路内へ導入し、細胞をマイクロメッシュ上へ吸引捕捉したところ、最大で約８０％という、従来のデバイスと比較して高効率での細胞捕捉が可能であり、捕捉細胞を等間隔にアレイ化することができることを見い出した。また、細胞捕捉後にＦＩＳＨプローブ導入のための膜透過処理を行い、続いて、ヒトβ−アクチンｍＲＮＡをターゲットとした蛍光標識プローブを流路に導入し、ＦＩＳＨによる染色を行った後、細胞の蛍光強度を測定し、個々の細胞のヒトβ−アクチンｍＲＮＡ発現量を定量的に評価したところ、血清供給条件と血清飢餓条件で培養した細胞におけるヒトβ−アクチンｍＲＮＡ発現量の変動を単一細胞レベルで明らかにすることができることを見い出した。本発明は、以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。【００１３】
すなわち本発明は、［１］マイクロメッシュにより試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉することができるマイクロ流路デバイスであって、表面に試料供給口及び試料排出口が形成され、下面に試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にマイクロメッシュ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板と、前記上部平板の開口窓の下方に相当する位置に、細胞捕捉用の複数の微細貫通孔を有するプラスチック製のマイクロメッシュと該マイクロメッシュを保持する保持板からなるマイクロメッシュ保持平板と、前記保持平板のマイクロメッシュの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板と、を順次備え、前記マイクロメッシュの細胞捕捉用の微細貫通孔の形状が反すり鉢状又は円筒状であり、前記上部平板が前記上部基板に比較して軟質のプラスチックで構成されており、前記上部基板と上部平板、又は上部平板とマイクロメッシュ保持平板とが装脱着可能に構成されているマイクロ流路デバイスに関する。【００１４】
また本発明は、［２］マイクロメッシュが、ＰＥＴ製又は着色ＰＥＴ製であることを特徴とする上記［１］記載のマイクロ流路デバイスや、［３］マイクロメッシュが、１０００〜１００００の微細貫通孔を有することを特徴とする上記［１］又は［２］記載のマイクロ流路デバイスや、［４］上部基板と上部平板が、ＰＤＭＳ(poly-dimethylsiloxisane)を主剤とするプラスチック製であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスや、［５］マイクロ流路内面が非イオン性界面活性剤で処理されていることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスや、［６］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤であることを特徴とする上記［５］記載のマイクロ流路デバイスや、［７］マイクロメッシュを保持する保持板が、ガラス製であることを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスや、［８］少なくとも、細胞捕捉率が５０％以上であることを特徴とする上記［１］〜［７］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスに関する。【００１５】
さらに本発明は、［９］上記［１］〜［８］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスの試料供給口から細胞を含む試料を注入し、−１０ｋＰａ〜−０．１ｋＰａの吸引圧で吸引することを特徴とする試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉する方法や、［１０］上記［１］〜［８］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスを用いて、試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉し、捕捉された各細胞に蛍光プローブを導入した後、蛍光励起により単一細胞の遺伝子発現を定量的に解析する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】細胞アレイとマイクロメッシュの模式図である。
【図２】本発明のマイクロ流路デバイスの模式図である。Ａは組立図、Ｂは縦断面図。
【図３】細胞捕捉における吸引圧の検討結果を示す図である。圧力差９０ｋＰａ（−９０ｋＰａ）でＳＵＳ製マイクロメッシュ上に捕捉したRaji細胞の蛍光顕微鏡写真で、Ａは上面，Ｂは下面。Raji細胞はＤＡＰＩで染色され、ＷＵフィルターセット（ex.:330-385,em.:420<）で観察。スケールバーは５０μｍ。
【図４】細胞捕捉における吸引圧の検討結果を示す図である。ＳＵＳ製マイクロメッシュ上に捕捉したRaji細胞の蛍光顕微鏡写真で、Ａは圧力差４０ｋＰａ（−４０ｋＰａ）；Ｂは圧力差２０ｋＰａ（−２０ｋＰａ）；Ｃは圧力差１０ｋＰａ（−１０ｋＰａ）；Ｄは圧力差５ｋＰａ（−５ｋＰａ）で、左が上面、右が下面。Raji細胞はＤＡＰＩで染色され、ＷＵフィルターセット（ex.:330-385,em.:420<）で観察。スケールバーは１００μｍ。
【図５】マイクロメッシュの材料の検討結果を示す図である。
【図６】ＰＥＴ製マイクロメッシュとＳＵＳ製マイクロメッシュにおける微細貫通孔の形状を示す図である。
【図７】ＰＥＴ製マイクロメッシュとＳＵＳ製マイクロメッシュにおける微細貫通孔の形状を示す図である。
【図８】ＳＵＳ製マイクロメッシュの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージを示す図である。Ａ，Ｂは上面、Ｃ，Ｄは下面。
【図９】圧力差１．５ｋＰａ（−１．５ｋＰａ）の吸引条件下、１００００の微細貫通孔を有するブラックＰＥＴ製マイクロメッシュにおける細胞の捕捉効率を示す図である。Ａは走査イメージ、Ｂはマイクロメッシュ上に捕捉された細胞数、Ｃは捕捉効率。
【図１０】非イオン性界面活性剤（プルロニックＦ１２７）で処理したマイクロ流路内面に付着するRaji細胞の蛍光顕微鏡写真を示す図である。CellTracker Red CMTPXで染色したRaji細胞１５００個をＰＤＭＳマイクロ流路に導入し、ＷＩＧフィルターセット（ex.:520-550,em.:580）で観察。
【図１１】捕捉したRaji細胞をＦＩＳＨにより検出した蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図１２】捕捉したRaji細胞をＦＩＳＨにより検出した蛍光強度のヒストグラムを示す図である。
【図１３】本発明の１００００穴マイクロ流路デバイスを用いたヒト抹消血単核球細胞（ＰＢＭＣｓ）から造血幹細胞（ＨＳＣｓ）の分離を示す模式図である。
【図１４】本発明の１００００穴マイクロ流路デバイス上のＣＤ３４＋細胞の検出結果を示す図である。幹細胞マーカーであるＣＤ３４発現細胞は写真中下段右から１番目の１点に赤色で示され、白血球共通抗原であるＣＤ４５は上段の４点全て及び下段の左から１〜３番目の３点に緑色で示されている。スケールバーは６０μｍである。
【図１５】ＰＥ及びＦＩＴＣの蛍光強度相関関係を示す図である。各点は単一細胞の蛍光強度を示す。単一細胞に対しては、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体及びＰＥ標識抗ＣＤ３４抗体で染色を行った。
【図１６】ＲＴ−ＰＣＲを用いた単一細胞ｍＲＮＡ発現分析の結果を示す図である。１００００穴ブラックＰＥＴマイクロメッシュで捕捉したＰＢＭＣｓから分離した単一細胞（ＣＤ３４＋細胞及びＣＤ４５＋細胞）に発現しているＣＤ３４ｍＲＮＡの発現を解析した。βアクチンｍＲＮＡの発現についても解析し対照実験とした。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明のマイクロ流路デバイスとしては、マイクロメッシュにより試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉することができるマイクロ流路デバイスであって、表面に試料供給口及び試料排出口が形成され、下面に試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にマイクロメッシュ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板と、前記上部平板の開口窓の下方に相当する位置に、細胞捕捉用の複数の微細貫通孔を有するプラスチック製のマイクロメッシュと該マイクロメッシュを保持する保持板からなるマイクロメッシュ保持平板と、前記保持平板のマイクロメッシュの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板と、を順次備え、前記マイクロメッシュの細胞捕捉用の微細貫通孔の形状が反すり鉢状又は円筒状であり、前記上部平板が前記上部基板に比較して軟質のプラスチックで構成されており、前記上部基板と上部平板、又は上部平板とマイクロメッシュ保持平板とが装脱着可能に構成されている装置であれば特に制限されるものではなく、少なくとも、細胞捕捉率が５０％以上、中でも６０％以上である装置が好ましい。また、上記細胞としては、ヒト細胞、ヒト以外の哺乳動物細胞、昆虫細胞等の動物細胞を好適に例示することができ、Ｔ細胞、Ｂ細胞等の免疫細胞を特に好適に例示することができる。これら細胞はあらかじめ修飾、改変、標識化しておいてもよい。また、これら細胞を含む試料としては流体試料であれば特に制限されず、例えば、血液、リンパ液、培養細胞懸濁液、体細胞懸濁液等でもよいが、本発明のマイクロ流路デバイスの効果を十分享受し得るように、少なくとも１００〜１０００００個の細胞を含む試料が好ましい。【００１８】
前記上部基板としては、表面（上面又は側面）に試料供給口及び試料送出口が形成され、下面に試料供給口と試料送出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製の平板であれば特に制限されず、上面は多少曲面となっていてもよく、また、下面は前記上部平板の上面と液密に積層しうる限り多少曲面となっていてもよいが、上下面とも水平面からなる平板が加工の簡便さの点で好ましい。マイクロ流路形成用の溝は、細胞の付着防止の点から、曲面状の内面となる溝、例えば半円筒状（断面半円弧状）の内面溝や断面が矩形の角形溝を好適に例示することができる。上記試料供給口に試料を供給するため、通常、試料供給ポンプ等の試料供給手段が試料供給ラインを介して接続されている。さらに試料供給ラインのうち試料供給ポンプの上流には、試料供給バルブ及び試料貯留槽が上流側から下流側に向って順次接続しておくこともできる。また、上記試料送出口には、試料送出ポンプ等の試料送出手段が試料送出ラインを介して接続しておいてもよく、単に試料送出バルブを取付けておくこともできる。上記試料供給ポンプや試料送出ポンプとしては、チューブポンプもしくはプランジャポンプ等の微小流量を制御可能なマイクロポンプを具体的に例示することができる。【００１９】
前記上部平板としては、上記の上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にマイクロメッシュ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板であれば特に制限されず、上部基板と協働してマイクロ流路を形成するため、上部基板に設けられたマイクロ流路形成用の溝に相当する上面位置に、マイクロ流路形成用の溝、例えば半円筒状（断面半円弧状）の内面溝を設けることもできるが、上面を平面としてマイクロ流路を形成することもできる。また、マイクロメッシュ用開口窓は、マイクロメッシュの全面が露出する大きさのものが好ましく、窓の形状は円形、正方形等の矩形を具体的に例示することができる。【００２０】
前記マイクロメッシュ保持平板としては、細胞捕捉用の複数の反すり鉢状又は円筒状の微細貫通孔を有するプラスチック製のマイクロメッシュを保持した平板であれば特に制限されず、マイクロメッシュと、マイクロメッシュより少し小さめのマイクロメッシュ保持開口を有する保持板から構成されている。微細貫通孔の形状がすり鉢状の場合、細胞を１細胞レベルで分離・捕捉することができない場合があり、反すり鉢状又は円筒状の微細貫通孔とすることで、確実に細胞を１細胞レベルで分離・捕捉することが可能となる。微細貫通孔の上端開口径は、捕捉する細胞の径よりも少し小さい径とされ、２〜１０μｍとすることができる。また、微細貫通孔の数は、１００〜１０００００、好ましくは１０００〜１００００である。また、微細貫通孔の中心間の距離を３０〜７０μｍ、好ましくは４０〜６０μｍ、より好ましくは５０μｍとすることで細胞の捕捉効率を高めることができる。したがって、１０００００個の微細貫通孔を備えたマイクロメッシュの大きさは、０．８ｃｍ×２ｃｍ程度になる。【００２１】
また、マイクロメッシュの材質は、プラスチック製であることを必要とし、ＳＵＳ製等の金属製では上端開口径が２μｍ以下の微細貫通孔の場合、均一なサイズ・均一な形状（反すり鉢状又は円筒状）に安定して加工することが困難である。捕捉対象が微生物の場合と異なり、細胞の場合は低減圧吸引条件が適用されるため、吸引圧による耐久性が低いが、均一なサイズ・均一な形状の微細貫通孔を簡便に形成しうるなど安価で成形性に優れたプラスチック製とすることができる。かかるプラスチックの中でも、透明性があり、自家蛍光の少ない材質が好ましい。透明であることで細胞の表面が観察することができる。具体的には、ＰＥＴ、ＰＭＭＡ、ＰＣ、ＣＯＰ、エポキシ等のプラスチックを例示することができるが、レーザー加工による熱変形が少なく、加工精度が高い点でＰＥＴが好ましい。また、バックグラウンドの自家蛍光を低下させる目的で、黒、焦げ茶、濃紺等の着色プラスチックを有利に用いることができ、例えば、ブラックＰＥＴを特に好適に例示することができる。【００２２】
前記プラスチック製下部平板としては、マイクロメッシュ保持平板のマイクロメッシュの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられ、前記下部基板と協働して吸引流路を形成しうる平板であれば特に制限されず、吸引用開口窓の形状も特に制限されないが、通常円形として構成される。この下部平板は、減圧吸引条件下に、前記マイクロメッシュ保持平板と下部基板との隙間を気密に維持しうる平板形状に構成されている。【００２３】
前記下部基板としては、表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなるものであれば特に制限されず、吸引口は減圧吸引手段に連結され、マイクロメッシュ上の試料液は、微細貫通孔、吸引用開口窓、吸引流路、吸引口を順次経由して排出され、このときに細胞が微細貫通孔の上端開口部に１個ずつ捕捉されることになる。この吸引時には、前記上部基板の試料送出口の下流の試料送出バルブを閉塞しておくこともできる。また、下部基板の片側に、下から順次下部平板、マイクロメッシュ保持平板、上部平板、上部基板を積層したときと同じ高さとなるような段差部を設けておくことが好ましい。このような段差部を設けることにより、減圧吸引時に下部基板上に下部平板、マイクロメッシュ保持平板、上部平板、上部基板を安定に積層載置することができ、吸引圧によりこれら平板を互いにボルト等により固着することなく、しっかりと固定することができ、逆に、減圧解放時には簡便にこれら平板を互いにとり外すことができる。【００２４】
前記上部基板、上部平板、下部平板、下部基板の材質としては、硬質のプラスチックが好ましく、これらは同じ材質でも異なる材質でも特に制限されず、ＰＤＭＳ、ＰＭＭＡ、ＰＣ、硬質ポリエチレン製等のプラスチック平板を例示することができるが、マイクロメッシュ保持平板との密着性の点でＰＤＭＳが好ましい。また、マイクロメッシュ保持平板の材質としては、ガラスの他、上記プラスチック等を例示することができるが、プラスチック製の平板との密着性及び貼り合わせ作業性の点でガラス（スライドグラス）が好ましい。【００２５】
そして、前記のように、本発明は前記上部平板を前記上部基板に比較して軟質のプラスチックで構成する点に特徴を有する。高減圧吸引条件下では、マイクロメッシュ用開口窓が設けられた上部平板とスライドグラス製のマイクロメッシュ保持平板が密着するため、試料液の漏出なく送液を行うことができるが、動物細胞の捕捉は低減圧吸引条件下で行うため、上部基板と同じ固さの上部平板を用いたとき、密着性に問題が生じ、試料液が漏出するおそれがある。そこで、前記上部平板を前記上部基板に比較して軟質のプラスチックで構成することで、上部基板と上部平板とマイクロメッシュを保持する保持板との粘着性（密着性）を高めることにより、試料液の漏出を防止することができる。例えば、上部基板に比べて軟質材料で構成した上部平板は、ＰＤＭＳの主剤に混合する硬化剤の配合割合を、上部基板に比べて１／１０〜１／２、好ましくは１／５〜１／３とすることにより作製することができる。このように、上部基板に比べて軟質材料で構成した上部平板を用いると、上部基板と上部平板とマイクロメッシュを保持する保持板との液密性を高めることができ、その結果、低減圧吸引条件下であっても、漏出なく送液操作を行うことができる上に、細胞を捕捉する前後に、少なくとも前記上部基板と上部平板、又は上部平板とマイクロメッシュ保持平板とを容易に装脱着することができ、捕捉細胞のピックアップや顕微鏡観察を簡便に行うことが可能となる。さらに、上部基板の下面と上部平板の上面をプラズマ処理を行い、プラズマ処理後すぐに張り合わせることで接着しておくこともできる。【００２６】
同様に、前記下部平板を前記下部基板に比較して軟質のプラスチックで構成することで、下部基板と下部平板とマイクロメッシュを保持する保持板との粘着性（密着性）を高めることにより、試料液の漏出を防止することができる。このように、本発明において軟質のプラスチックとは、減圧吸引時にマイクロメッシュを保持する保持板との粘着性（密着性）を高め、試料液の漏出を防止しうる軟度のプラスチックをいう。例えば、下部基板に比べて軟質材料で構成した下部平板は、ＰＤＭＳの主剤に混合する硬化剤の配合割合を、下部基板に比べて１／１０〜１／２、好ましくは１／５〜１／３とすることにより作製することができる。このように、下部基板に比べて軟質材料で構成した下部平板を用いると、下部基板と下部平板とマイクロメッシュを保持する保持板との液密性を高めることができ、その結果、低減圧吸引条件下であっても、漏出なく吸引操作を行うことができる。さらに、下部基板の上面と下部平板の下面をプラズマ処理を行い、プラズマ処理後すぐに張り合わせることで接着しておくこともできる。【００２７】
前記上部基板と上部平板とで協働して形成されたマイクロ流路の内面、好ましくはマイクロ流路の内面に加えてマイクロメッシュの上面を非イオン性界面活性剤であらかじめ処理しておくことが、マイクロ流路内面への細胞の付着を防除する上で好ましい。この非イオン性界面活性剤処理に先だって、表面プラズマ処理をすることがより好ましい。陰イオン界面活性剤を用いて表面を被覆することにより、表面電位が負に帯電している微生物の吸着を防除することはできるが、細胞は十分に防除することができず、非イオン性界面活性剤で処理する必要がある。かかる非イオン性界面活性剤としては、ブロックポリマー型エーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ショ糖脂肪酸エステル（シュガーエステル）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステルを例示することができるが、ブロックポリマー型エーテル、特にポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤が好ましい。上記ブロックポリマー型  エーテルとしては、例えば、ポリオキシエチレン（１９６）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＦ１２７）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）、ポリオキシエチレン（４２）ポリオキシプロピレン（６７）グリコール（プルロニックＰ１２３）、ポリオキシエチレンオキシプロピレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ４Ｐ．Ｏ）を挙げることができる。ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油としては、例えば、水素添加ヒマシ油ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレン水素添加ヒマシ油等を挙げることができる。ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、例えば、ポリソルベート４０（ツイーン４０）、ポリソルベート６０（ツイーン６０）、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０（ツイーン８０）、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン（２０Ｅ．Ｏ）を挙げることができる。例えば、プルロニックＦ１２７などのポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤を用いる場合、その濃度は０．５〜１０％、好ましくは１〜５％程度である。【００２８】
本発明の試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉する方法としては、上記の本発明のマイクロ流路デバイスの試料供給口から細胞を含む試料を注入し、−１０ｋＰａ〜−０．１ｋＰａ、好ましくは−５ｋＰａ〜−１ｋＰａの吸引圧で吸引する方法であれば特に制限されず、−１０ｋＰａより高い吸引圧（圧力差１０ｋＰａ超）、例えば吸引圧−２０ｋＰａで吸引すると細胞が破壊され、−０．１ｋＰａより小さい吸引圧（圧力差０．１ｋＰａ未満）では捕捉効率が悪くなる。【００２９】
本発明の解析方法としては、上記の本発明のマイクロ流路デバイスを用いて、試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉し、捕捉された各細胞に蛍光プローブを導入した後、蛍光励起により単一細胞の遺伝子発現を定量的に解析するＦＩＳＨ法等であれば特に制限されず、より具体的には、マイクロ流路デバイスに細胞を１個ずつ捕捉させた後、５０％エタノール／ＰＢＳをマイクロ流路に導入し、ホットプレート上にマイクロ流路デバイスをセットして、細胞の透過化処理を行い、この透過化処理が施された細胞に、特定の遺伝子ｍＲＮＡに対するＣｙ３標識化オリゴヌクレオチドプローブなど蛍光標識化オリゴヌクレオチドプローブを導入して、ハイブリダイズを行わせた後、個々の単一細胞の蛍光強度を測定することにより、単一細胞の遺伝子発現を定量的に解析することが可能となる。【００３０】
また、本発明のマイクロ流路デバイスを用いることにより、試料中に含まれるＴ細胞やＢ細胞を１細胞レベルに分離・捕捉することができ、がん特異的抗原ペプチドを認識するＴＣＲを細胞膜上に発現する１個のＴ細胞レベルでの機能的なＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の解析・同定や、がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現する１個のＢ細胞レベルでの機能的な抗体の解析・同定が可能となり、免疫応答のモニタリングを行うことができる。このようにして、がん患者のがん特異的ＴＣＲや抗体の遺伝子を解析・同定することにより、患者個人の体内で産生されているがん抗原特異的ＴＣＲや抗体の種類の全体像に関する情報を得ることができ、テイラーメイド的な患者個人の診断が可能となる。【００３１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。【００３２】
［マイクロ流路デバイスの構築］
マイクロ流路（深さ；１ｍｍ，幅；１ｍｍ）作製のための鋳型を、ＣＡＤ−ＣＡＭＭ(computer-aided design-computeraided modeling machineシステム；ＰＮＣ−３００，ローランド株式会社製)を用いて、厚さ３ｍｍのＰＭＭＡ(polymethylmethacrylate) の基板を切削することにより作製した。この鋳型を超音波洗浄した後に乾燥させ、ＰＤＭＳ(poly-dimethylsiloxisane) の主剤と硬化剤（シルガード１８４；ダウコーニング社製）とを１０：１で混合し、鋳型に注入後、減圧下において脱気し、上部基板を作製した。また、マイクロメッシュ用開口窓が設けられた上部平板はＰＤＭＳと硬化剤を５０：１で配合したものを使用した。このＰＤＭＳを８５℃で２０分間以上加熱することにより硬化させた。これらの表面に２０秒間プラズマ処理を行い、プラズマ処理後すぐに張り合わせることでＰＤＭＳを接着し、マイクロ流路部材を作製した。また、試料供給口と試料送出口にはシリコンチューブ（内径１ｍｍ×外径３ｍｍ）を接続した。同様に、ＰＤＭＳと硬化剤とを１０：１で混合し、鋳型に注入後、減圧下において脱気し、下部基板を作製した。また、下部平板は主剤と硬化剤を５０：１で配合したものを使用した。このＰＤＭＳを８５℃で２０分間以上加熱することにより硬化させた。これらの表面に２０秒間プラズマ処理を行い、プラズマ処理後すぐに張り合わせることでＰＤＭＳを接着し、吸引流路部材を作製した。また、吸引口にはシリコンチューブを接続した。【００３３】
マイクロメッシュを作製するため、厚さ３８μｍの黒色のｂＰＥＴ(black polyethylene terephthalate；村中医療器社製)を使用した。各微細貫通孔は反すり鉢状をしており、孔径が小さい側の直径が２μｍになるように設計した。さらにこれらの中心間距離を３０μｍとして、１０×１０の合計１００孔、中心間距離を６０μｍとして２５×５０の合計１２５０孔、及び中心間距離を６０μｍとして１００×１００の合計１００００孔をそれぞれアレイ状に配置した。この設計を基にクロムを蒸着したガラス基板によりフォトマスクを作製した。このマスクを用いて、エキシマレーザー微細加工機 (Optec Micro-Master System，Optec社) により波長２４８ｎｍ、周波数１５０Ｈｚのレーザーを用いて、ｂＰＥＴ基板に微細貫通孔を加工した。このｂＰＥＴ基板を直径１０ｍｍの貫通孔をあけたスライドガラスにエポキシ接着剤を用いて接着してマイクロメッシュ保持平板を作製した。最終的に、前記マイクロ流路部材と吸引流路部材の間にマイクロメッシュ保持平板を挟み込み、マイクロ流路デバイスの構築を行った。【００３４】
［予備実験；吸引圧の検討］
Raji細胞（ヒトバーキットリンパ腫）を供試細胞とし、細胞にダメージを与えない方法として、厚さ３８μｍのブラックＰＥＴ（ｂＰＥＴ）に代えて厚さ５μｍのＳＵＳ３０４の薄板からなるマイクロメッシュを備えた以外は図２に示されるマイクロ流路デバイスを用いて、細胞捕捉における吸引圧の検討を行った。その結果、図３に示すように、微生物の場合と異なり細胞の場合は圧力差９０ｋＰａ（−９０ｋＰａ）では細胞が破壊した。そこで、吸引圧を、−４０ｋＰａ（圧力差４０ｋＰａ）、−２０ｋＰａ（圧力差２０ｋＰａ）、−１０ｋＰａ（圧力差１０ｋＰａ）、−５ｋＰａ（圧力差５ｋＰａ）に変えて同様に細胞捕捉における吸引圧の検討を行った。結果を図４に示す。その結果、−５ｋＰａという低減圧吸引条件下で細胞を効率よく捕捉可能なことがわかった。【００３５】
［マイクロメッシュの材料の検討］
マイクロメッシュの材料として、厚さ５μｍのＳＵＳ３０４の薄板、厚さ５μｍのＰＥＴフィルム（村中医療器社製）、厚さ３８μｍのブラックＰＥＴフィルム（村中医療器社製）を用いて、バックグラウンドの自家蛍光について調べた。結果を図５に示す。その結果、透明のＰＥＴよりも、ＳＵＳや半透明のブラックＰＥＴの方が自家蛍光が少ないことがわかった。【００３６】
［ＰＥＴ製マイクロメッシュとＳＵＳ製マイクロメッシュにおける微細貫通孔の形状観察］
ＰＥＴ製マイクロメッシュとＳＵＳ製マイクロメッシュにおける反すり鉢状微細貫通孔の形状を調べた。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージを図６〜図８に示す。図６〜図８より、ＰＥＴの方がＳＵＳよりも均一な微細加工を精度よく行うことができることがわかった。【００３７】
［細胞の捕捉効率］
１００００の微細貫通孔を有するブラックＰＥＴ製マイクロメッシュが装着されたマイクロ流路デバイスに、圧力差１．５ｋＰａ（−１．５ｋＰａ）の吸引条件下、１０００個、３０００個、５０００個及び１００００個のRaji細胞を注入し、マイクロメッシュ上に捕捉された細胞数をスキャナーで測定した。走査イメージ、マイクロメッシュ上に捕捉された細胞数、捕捉効率を図９に示す。図９からわかるように、本発明のマイクロ流路デバイスを用いると、細胞捕捉率６０％以上を達成することができる。【００３８】
［捕捉細胞の生存率］
Calcein-AMで染色した１０００個のRaji細胞を、圧力差１．５ｋＰａ（−１．５ｋＰａ）の吸引条件下、ブラックＰＥＴ製マイクロメッシュが装着されたマイクロ流路デバイスに捕捉させる前後の生存率を求めた。捕捉前後のCalcein-AM染色Raji細胞をＰＩ溶液を導入し、ＮＩＢＡフィルターセット（ex.:470-490,em.:515-550）及びＷＩＧフィルターセット（ex.:520-550,em.:580）を用いて、蛍光顕微鏡写真（合成画像）により観察した。その結果、捕捉前の細胞生存率は９６．８％であり、捕捉後の細胞生存率は９１．３％であったことから、本発明の細胞の捕捉方法によると、捕捉細胞の生存率はきわめて高いものと評価できる。【００３９】
［非イオン性界面活性剤によるＰＤＭＳマイクロ流路への細胞の付着防止］
ＰＤＭＳ製マイクロ流路部材を備えたマイクロ流路デバイスのマイクロ流路を、０．１％，１％，１０％の各濃度の非イオン性界面活性剤（プルロニックＦ１２７）で処理した後、CellTracker RedCMTPXで染色したRaji細胞１５００個を注入し、マイクロ流路内面に付着したRaji細胞をＷＩＧフィルターセット（ex.:520-550,em.:580）の蛍光顕微鏡写真により観察した。結果を図１０に示す。１％のプルロニックＦ１２７溶液処理で、ＰＤＭＳマイクロ流路への細胞の付着を防止できることがわかった。【００４０】
［蛍光励起による単一細胞の遺伝子発現の定量的解析］
Raji細胞をブラックＰＥＴ製マイクロメッシュが装着されたマイクロ流路デバイスに捕捉させた後、５０％エタノール／ＰＢＳをマイクロ流路に導入し、ホットプレート上にマイクロ流路デバイスをセットして、細胞の透過化処理を行った。透過化処理が施された細胞に、ヒトβ−アクチンに対するＣｙ３標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いて、４２℃で２時間ハイブリダイズを行った。蛍光顕微鏡写真を図１１に示す。また、Calcein-AMで標識した血清飢餓Raji細胞（ｎ＝３８）と血清処理Raji細胞（ｎ＝２８）との混合懸濁液を、マイクロ流路デバイスに導入後、ブラックＰＥＴ製マイクロメッシュ上に捕捉させた後、ヒトβ−アクチンｍＲＮＡに対して、ヒトβ−アクチンｍＲＮＡ用Ｃｙ３標識化オリゴヌクレオチドプローブを用いてＦＩＳＨをマイクロ流路デバイス上で行った。次いで、単一細胞の蛍光強度を測定した。結果を図１２に示す。血清処理によりヒトβ−アクチンｍＲＮＡの発現が増強した細胞の蛍光強度は、ヒトβ−アクチンｍＲＮＡの発現が抑制された血清飢餓細胞よりも強かった。これらのことから、マイクロ流路デバイスを用いることにより、単一細胞の遺伝子発現の定量的解析が可能であることがわかる。【００４１】
［マイクロ流路デバイスによるＣＴＬの１細胞レベルでの分離・捕捉］
ＣＴＬマーカーであるＣＤ８と、ｇｐ１００ペプチドへの抗原レセプターとをともに発現している細胞のみを単離する目的で、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体＋／ＰＥ標識ｇｐ１００−ＨＬＡ-Ａ２−テトラマーで二重蛍光免疫染色したＣＴＬ細胞懸濁液をマイクロ流路デバイスに導入し、−２．０ｋＰａで減圧吸引を行うことで、細胞をブラックＰＥＴマイクロメッシュ上へ捕捉した。蛍光顕微鏡（ＢＸ−５１； Olympus社製) を用いて、ブラックＰＥＴマイクロメッシュ上の細胞を観察したところ、１細胞レベルで分離・捕捉できていることを確認した。【００４２】
［マイクロ流路デバイスによる稀少細胞の分離・捕捉］
マイクロ流路デバイスを用いたヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣｓ）中に約０．１％の割合で存在する稀少細胞である造血幹細胞（ＨＳＣｓ）の分離・捕捉の概要を図１３に示す。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４５抗体及びＰＥ標識抗ＣＤ３４抗体を用いて二重蛍光免疫染色を行った１０４個のＰＢＭＣｓを１００００穴ブラックＰＥＴ製マイクロメッシュが装着されたマイクロ流路デバイスに捕捉させた後、電動ステージを配した蛍光顕微鏡下でＮＩＢＡ及びＷＩＧフィルターセットを用いて観察を行い、マイクロメッシュ全体の蛍光画像を取得した。この蛍光顕微鏡写真を図１４に示す。写真は、緑色に染色されたＣＤ４５＋細胞（上段の４点全て及び下段の左から１〜３番目の３点）、及び、赤色に染色されたＣＤ３４＋細胞（写真中下段右から１番目の１点）を示す。また、二重蛍光免疫染色を行った１０４個のＰＢＭＣｓのＰＥ及びＦＩＴＣの蛍光強度の相関関係を図１５に示す。【００４３】
この結果、本発明にかかるマイクロメッシュを用いることにより、ＰＢＭＣｓ中にわずか０．１％程度の存在率しかないＨＳＣｓ細胞を、１万穴に９割以上の極めて高い確率で細胞1個の単位で捕捉することができたので、ごく稀少な細胞（赤色に染色された細胞）でもロスなく確実に回収することができることが確認できた。このように本発明のマイクロ流路デバイスを使用すると、免疫染色法を用いた細胞の多重染色により、末梢血中に含まれる細胞のプロファイリング解析に利用できる。また、基板材として顔料を含有したプラスチックを用いていることで、目的細胞の超高感度検出が可能であることがわかった。  【００４４】
［キャピラリーによる単一細胞分離］
上述のようにしてマイクロメッシュ上に捕捉された細胞群の中から、赤色に染色されたＣＤ３４＋細胞（ＨＳＣｓ細胞）のみを手動でキャピラリーにより分離し、ピッキングした。また対照として、ＣＤ４５＋細胞のみを手動でキャピラリーにより分離し、ピッキングした。そして、ピッキングしたＣＤ３４＋細胞及びＣＤ４５＋細胞を試料として用い、ＲＴ−ＰＣＲを行った。逆転写反応は、４２℃で６０分間の条件で行い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の各条件で５０サイクルずつ行った。増幅産物に対し電気泳動を行い、細胞内に発現しているｍＲＮＡについて解析した。このＲＴ−ＰＣＲを用いた単一細胞ｍＲＮＡ発現分析によるＣＤ３４ｍＲＮＡ及びβアクチンｍＲＮＡの発現結果を図１６に示す。【００４５】
この結果、マイクロメッシュ上に捕捉された細胞を、その状態のままでプラスチック製上部平板を剥がして表面に露出させ、露出した細胞群からキャピラリーで単一細胞として回収することができるので、細胞がダメージを受けることなく、発現解析試料に供することができ、また一細胞ずつ分離した試料を分析することで、細胞とその内部に発現している核酸の関連性を比較的容易に直接調べることができることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明のマイクロ流路デバイスを用いると、試料中の大量の細胞を、ダメージを与えることなく８０％という高効率で１細胞レベルで確実に分離・捕捉できること；特に基板材として顔料を含有したプラスチックを用いていることで、目的細胞の超高感度検出が可能であること；一細胞ずつ分離した試料を分析することで、細胞とその内部に発現している核酸の関連性を比較的容易にダイレクトに調べることができること；マイクロメッシュ上に捕捉された細胞を、その状態のままで、プラスチック製上部平板を簡易に剥離し（粘着性の材質なので脱着可能）、表面に露出させてキャピラリーで回収することができるので、細胞がダメージを受けることなく、発現解析試料に供することができること；が明らかとなった。例えば、試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉し、捕捉された各細胞に蛍光プローブを導入した後、蛍光励起により単一細胞の遺伝子発現の定量的解析、すなわちＦＩＳＨ（Fluorescence in situ hybridization ）法により単一細胞内ｍＲＮＡの可視化及び定量的解析が可能となり、また、腫瘍免疫学的観点から見ると従来不可能とされてきた１個のＴ細胞レベルでの機能的なＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を解析・同定することができ、免疫応答のモニタリングが可能となる。
また、本発明のマイクロ流路デバイスは、送液による各種試薬の導入が容易であることから、リアルタイム観察による細胞の解析にも最適なツールであり、現在注目されているiPS細胞をはじめとする幹細胞等において、目的細胞の誘導メカニズムの解析や目的細胞の培養にも利用可能な研究支援ツールとして有望である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年3月4日(2009.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロメッシュにより試料中に含まれる動物細胞を１細胞レベルで捕捉することができるマイクロ流路デバイスであって、
表面に試料供給口及び試料排出口が形成され、下面に試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、
前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にマイクロメッシュ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板と、
前記上部平板の開口窓の下方に相当する位置に、細胞捕捉用の複数の微細貫通孔を有するプラスチック製のマイクロメッシュと、該マイクロメッシュを保持する保持板からなるマイクロメッシュ保持平板と、
前記保持平板のマイクロメッシュの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、
表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板と、
を順次備え、
前記マイクロメッシュの細胞捕捉用の微細貫通孔の形状が反すり鉢状又は円筒状であり、前記上部平板が前記上部基板に比較して軟質のプラスチックで構成されており、
前記上部基板と上部平板、又は上部平板とマイクロメッシュ保持平板とが装脱着可能に構成されている
ことを特徴とするマイクロ流路デバイス。
【請求項２】
マイクロメッシュが、着色ＰＥＴ製であることを特徴とする請求項１記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項３】
下部基板の片側に、下から順次下部平板、マイクロメッシュ保持平板、上部平板、上部基板を積層したときと同じ高さとなるような段差部が設けられ、減圧吸引時に下部基板上に下部平板、マイクロメッシュ保持平板、上部平板、上部基板を安定に積層載置するよう構成されたことを特徴とする請求項１又は２記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項４】
上部基板と上部平板が、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を主剤とするプラスチック製であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項５】
マイクロ流路内面が非イオン性界面活性剤で処理されていることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項６】
非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項５記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項７】
マイクロメッシュを保持する保持板が、ガラス製であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項８】
マイクロメッシュがＰＥＴ製であると共に反すり鉢状の細胞捕捉用の微細貫通孔を有し、上部基板と上部平板がＰＤＭＳを主剤とするプラスチック製であり、マイクロメッシュを保持する保持板がガラス製であり、上部基板と上部平板とで協働して形成されたマイクロ流路内面が非イオン性界面活性剤で処理されているデバイスであって、少なくとも、細胞捕捉率が５０％以上であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載のマイクロ流路デバイス。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか記載のマイクロ流路デバイスの試料供給口から動物細胞を含む試料を注入し、−１０ｋＰａ〜−０．１ｋＰａの吸引圧で吸引することを特徴とする試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉する方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか記載のマイクロ流路デバイスを用いて、試料中に含まれる動物細胞を１細胞レベルで捕捉し、捕捉された各細胞に蛍光プローブを導入した後、蛍光励起により単一細胞の遺伝子発現を定量的に解析する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
統合し、マイクロ流路内面を非イオン性界面活性剤で処理してマイクロ流路デバイスを構築し（図２参照）、Ｒａｊｉ細胞懸濁液を流路内へ導入し、細胞をマイクロメッシュ上へ吸引捕捉したところ、最大で約８０％という、従来のデバイスと比較して高効率での細胞捕捉が可能であり、捕捉細胞を等間隔にアレイ化することができることを見い出した。また、細胞捕捉後にＦＩＳＨプローブ導入のための膜透過処理を行い、続いて、ヒトβ−アクチンｍＲＮＡをターゲットとした蛍光標識プローブを流路に導入し、ＦＩＳＨによる染色を行った後、細胞の蛍光強度を測定し、個々の細胞のヒトβ−アクチンｍＲＮＡ発現量を定量的に評価したところ、血清供給条件と血清飢餓条件で培養した細胞におけるヒトβ−アクチンｍＲＮＡ発現量の変動を単一細胞レベルで明らかにすることができることを見い出した。本発明は、以上の知見に基づいて完成するに至ったものである。
［００１３］
すなわち本発明は、［１］マイクロメッシュにより試料中に含まれる動物細胞を１細胞レベルで捕捉することができるマイクロ流路デバイスであって、表面に試料供給口及び試料排出口が形成され、下面に試料供給口と試料排出口を連通するマイクロ流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる上部基板と、前記上部基板と協働してマイクロ流路を形成するとともに、マイクロ流路の一部に相当する位置にマイクロメッシュ用開口窓が設けられたプラスチック製上部平板と、前記上部平板の開口窓の下方に相当する位置に、細胞捕捉用の複数の微細貫通孔を有するプラスチック製のマイクロメッシュと該マイクロメッシュを保持する保持板からなるマイクロメッシュ保持平板と、前記保持平板のマイクロメッシュの下方に相当する位置に吸引用開口窓が設けられたプラスチック製下部平板と、表面に吸引口が形成され、上面に前記下部平板と協働して前記吸引用開口窓と吸引口を連通する吸引流路形成用の溝が設けられたプラスチック製平板からなる下部基板と、を順次備え、前記マイクロメッシュの細胞捕捉用の微細貫通孔の形状が反すり鉢状又は円筒状であり、前記上部平板が前記上部基板に比較して軟質のプラスチックで構成されており、前記上部基板と上部平板、又は上部平板とマイクロメ
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
ッシュ保持平板とが装脱着可能に構成されているマイクロ流路デバイスに関する。
［００１４］
また本発明は、［２］マイクロメッシュが、着色ＰＥＴ製であることを特徴とする上記［１］記載のマイクロ流路デバイスや、［３］下部基板の片側に、下から順次下部平板、マイクロメッシュ保持平板、上部平板、上部基板を積層したときと同じ高さとなるような段差部が設けられ、減圧吸引時に下部基板上に下部平板、マイクロメッシュ保持平板、上部平板、上部基板を安定に積層載置するよう構成されたことを特徴とする上記［１］又は［２］記載のマイクロ流路デバイスや、［４］上部基板と上部平板が、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を主剤とするプラスチック製であることを特徴とする上記［１］〜［３］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスや、［５］マイクロ流路内面が非イオン性界面活性剤で処理されていることを特徴とする上記［１］〜［４］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスや、［６］非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレンブロックコポリマー型非イオン性界面活性剤であることを特徴とする上記［５］記載のマイクロ流路デバイスや、［７］マイクロメッシュを保持する保持板が、ガラス製であることを特徴とする上記［１］〜［６］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスや、［８］マイクロメッシュがＰＥＴ製であると共に反すり鉢状の細胞捕捉用の微細貫通孔を有し、上部基板と上部平板がＰＤＭＳを主剤とするプラスチック製であり、マイクロメッシュを保持する保持板がガラス製であり、上部基板と上部平板とで協働して形成されたマイクロ流路内面が非イオン性界面活性剤で処理されているデバイスであって、少なくとも、細胞捕捉率が５０％以上であることを特徴とする上記［１］〜［７］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスに関する。
［００１５］
さらに本発明は、［９］上記［１］〜［８］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスの試料供給口から動物細胞を含む試料を注入し、−１０ｋＰａ〜−０．１ｋＰａの吸引圧で吸引することを特徴とする試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉する方法や、［１０］上記［１］〜［８］のいずれか記載のマイクロ流路デバイスを用いて、試料中に含まれる動物細胞を１細胞レベルで捕捉し、捕捉された各細胞に蛍光プローブを導入した後、蛍光励起により単一細胞の遺伝子発現を定量的に解析する方法に関する。
図面の簡単な説明
［００１６］
［図１］細胞アレイとマイクロメッシュの模式図である。
［図２］本発明のマイクロ流路デバイスの模式図である。Ａは組立図、Ｂは縦断面図。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
て、試料中に含まれる細胞を１細胞レベルで捕捉し、捕捉された各細胞に蛍光プローブを導入した後、蛍光励起により単一細胞の遺伝子発現を定量的に解析するＦＩＳＨ法等であれば特に制限されず、より具体的には、マイクロ流路デバイスに細胞を１個ずつ捕捉させた後、５０％エタノール／ＰＢＳをマイクロ流路に導入し、ホットプレート上にマイクロ流路デバイスをセットして、細胞の透過化処理を行い、この透過化処理が施された細胞に、特定の遺伝子ｍＲＮＡに対するＣｙ３標識化オリゴヌクレオチドプローブなど蛍光標識化オリゴヌクレオチドプローブを導入して、ハイブリダイズを行わせた後、個々の単一細胞の蛍光強度を測定することにより、単一細胞の遺伝子発現を定量的に解析することが可能となる。
［００３０］
また、本発明のマイクロ流路デバイスを用いることにより、試料中に含まれるＴ細胞やＢ細胞を１細胞レベルに分離・捕捉することができ、がん特異的抗原ペプチドを認識するＴＣＲを細胞膜上に発現する１個のＴ細胞レベルでの機能的なＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の解析・同定や、がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現する１個のＢ細胞レベルでの機能的な抗体の解析・同定が可能となり、免疫応答のモニタリングを行うことができる。このようにして、がん患者のがん特異的ＴＣＲや抗体の遺伝子を解析・同定することにより、患者個人の体内で産生されているがん抗原特異的ＴＣＲや抗体の種類の全体像に関する情報を得ることができ、テイラーメイド的な患者個人の診断が可能となる。
［００３１］
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［００３２］
［マイクロ流路デバイスの構築］
マイクロ流路（深さ；１ｍｍ，幅；１ｍｍ）作製のための鋳型を、ＣＡＤ−ＣＡＭＭ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ａｉｄｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ−ｃｏｍｐｕｔｅｒａｉｄｅｄ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｍａｃｈｉｎｅシステム；ＰＮＣ−３００，ローランド株式会社製）を用いて、厚さ３ｍｍのＰＭＭＡ（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）の基板を切削することにより作製した。この鋳型を超音波洗浄した後に乾燥させ、ＰＤＭＳ（ｐｏｌｙ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）の
【国際調査報告】
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