(57)【要約】【課題】  ミッドカインの機能を阻害する抗体を提供する。【解決手段】  ミッドカインの、６２〜１０４番目のアミノ酸からなるエピトープを認識する抗体またはその断片、当該抗体またはその断片をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有する組み換えベクター、当該ベクターを有する形質転換体または当該抗体を産生するハイブリドーマ、当該形質転換体またはハイブリドーマに抗体またはその断片を産生させその抗体またはその断片を採取することによる抗体の製造方法、当該抗体またはその断片を有効成分として含有する医薬組成物、並びに、当該抗体またはその断片を有効成分として含有する診断薬等。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミッドカインの６２〜１０４番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片。
【請求項２】
ミッドカインの６４〜７３番目及び７８〜１０１番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片。
【請求項３】
ミッドカインの６４〜６６番目のアミノ酸、６４〜６７番目のアミノ酸、６４〜６９番目のアミノ酸、６４〜７３番目のアミノ酸、８４〜９６番目のアミノ酸、または、８７〜９６番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片。
【請求項４】
ミッドカインの６４番目チロシン、６５番目リシン、６６番目フェニルアラニン、６７番目グルタミン酸、６９番目トリプトファン、７３番目アスパラギン酸、８４番目トレオニン、８６番目リシン、８７番目リシン、９０番目チロシン、及び、９６番目グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片。
【請求項５】
ミッドカインの６２〜１０４番目のアミノ酸に存在する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片。
【請求項６】
ミッドカインの、６２〜６４番目のアミノ酸、６６番目のアミノ酸、６８〜７０番目のアミノ酸、７２番目のアミノ酸、７９番目のアミノ酸、８１番目のアミノ酸、８５〜８９番目のアミノ酸、１０２番目のアミノ酸、及び、１０３番目のアミノ酸から選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片。
【請求項７】
ミッドカインの、６３番目リジン、７９番目リジン、８１番目アルギニン、８６番目リジン、８７番目リジン、８９番目アルギニン、及び、１０２番目リジンから選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片。
【請求項８】
重鎖のＣＤＲ３が、配列番号１５若しくは配列番号２１に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有する抗ミッドカイン抗体またはその断片。
【請求項９】
重鎖のＣＤＲ１が配列番号１３若しくは配列番号１９に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１４に若しくは配列番号２０に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１６若しくは配列番号２２に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１７若しくは配列番号２３に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１８若しくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有する、請求項５に記載の抗体。
【請求項１０】
重鎖のＣＤＲ３が、配列番号１５若しくは配列番号２１に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する抗ミッドカインモノクローナル抗体またはその断片。
【請求項１１】
重鎖のＣＤＲ１が配列番号１３若しくは配列番号１９に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号１４に若しくは配列番号２０に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号１６若しくは配列番号２２に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１７若しくは配列番号２３に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１８若しくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の抗体またはその断片。
【請求項１２】
重鎖のＣＤＲ１が配列番号１３の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ３が配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する、抗ミッドカイン抗体またはその断片。
【請求項１３】
重鎖のＣＤＲ１が配列番号１９の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する、抗ミッドカイン抗体またはその断片。
【請求項１４】
請求項８〜請求項１３のいずれか１項に記載の抗体が認識するミッドカイン上のエピトープを認識する抗体またはその断片。
【請求項１５】
請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を産生する細胞系。
【請求項１６】
請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を有効成分として含有する、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を有効成分として含有する、細胞遊走に起因する疾患、自己免疫疾患、癌、炎症性疾患、または多発性硬化症の予防または治療のための医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の抗体またはその断片が結合するミッドカイン上のエピトープに結合する物質をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ミッドカインに被検化合物及び請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を接触させる工程、及び、
（ｉｉ）請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の抗体またはその断片とミッドカインとの結合を測定する工程を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミッドカインに対する抗体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ミッドカイン（midkine：以下、「ＭＫ」という）は、肺性腫瘍細胞（ＥＣ）のレチノイン酸による分化誘導の過程で一過性に発現する遺伝子の産物として発見された増殖・分化因子で、塩基性アミノ酸とシステインに富む分子量１３ｋＤａのポリペプチドである（例えば、非特許文献１及び非特許文献２参照）。【０００３】
ＭＫは様々な生物活性を有することが知られている。ヒトの癌細胞においてＭＫの発現が増大していることが知られている。この発現の増大は、食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫（ニューロブラストーマ）、神経膠芽腫（グリオブラストーマ）、子宮癌、卵巣癌、ウイルムス腫瘍といった多様ながんで確認されている（例えば、特許文献１及び非特許文献３参照）。また、ＭＫはがん細胞の生存と移動を促進し、血管新生を促し、がんの進展を助けると考えられている。【０００４】
また、ＭＫは炎症像形成の過程で中核を占める分子の一つであることが知られている。例えば、血管に傷害を与えた時の新生内膜の形成と虚血傷害時の腎炎の発症が、ＭＫ遺伝子を欠失させたノックアウトマウスでは軽減されていることが知られている。また、リウマチモデル、手術後の癒着もノックアウトマウスで大きく軽減されることが知られている（例えば、特許文献２、特許文献３及び特許文献４参照）。このように、ＭＫは、関節炎、自己免疫疾患、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、多発性硬化症、手術後の癒着、炎症性大腸炎、乾癬、狼瘡、喘息、好中球機能異常等の炎症性疾患に関与していることが知られている。更に、ＭＫはマクロファージや好中球といった炎症性細胞の移動（遊走）を促進することが知られている。この移動は炎症像の成立に必要なので、ＭＫが欠失すると炎症に基盤がある病気が起こりにくいと考えられる。（例えば、特許文献５参照）。【０００５】
また、進行子宮内膜症の女性の腹腔液において、ＭＫレベルが増加していること、及び、ＭＫが培養子宮内膜間質細胞の増殖を刺激することから、ＭＫが子宮内膜症の発症や進行に関与することが知られている（例えば、特許文献６参照）。【０００６】
更に、ＭＫは、血管内膜肥厚作用を有することから、血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞等の血管閉塞性疾患に関与することが知られている（例えば、特許文献２参照）。【０００７】
細胞遊走は、癌細胞の浸潤・転移、動脈硬化巣での内膜肥厚、血管新生などの機序に重要であることが知られている。また、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、脳出血、高血圧などの循環器疾患に、炎症性の細胞の遊走が深く関わっていることが知られている。【０００８】
また、ＭＫはその立体構造がＮＭＲにより決定され報告されている（例えば、非特許文献４参照）。ＭＫは、1〜５２番目のアミノ酸よりなるＮ末端側のフラグメント（以下、「Ｎ−フラグメント」という）、６２〜１２１番目のアミノ酸よりなるＣ末端側のフラグメント（以下、「Ｃ−フラグメント」という）及びそれらを結合するループ領域（５３〜６１番目のアミノ酸）（以下、「ループ」という）から構成されている。
Ｎ−フラグメント及びＣ−フラグメントのそれぞれは、主として３本の逆βシート構造からなる立体構造を持つ部分（以下、「ドメイン」といい、１５〜５２番目のアミノ酸からなるＮ−フラグメント中のドメインを「Ｎ−ドメイン」、６２〜１０４番目のアミノ酸からなるＣ−フラグメント中のドメインを「Ｃ−ドメイン」という）と、ドメインの外側に位置し、特定の立体構造をとらない部分（以下、「テイル」といい、１〜１４番目のアミノ酸からなるＮ−フラグメント中のテイルを「Ｎ−テイル」、１０５〜１２１番目のアミノ酸からなるＣ−フラグメント中のテイルを「Ｃ−テイル」という）より構成されている。Ｃ−ドメイン表面の塩基性アミノ酸は２つのクラスターを形成しており、それぞれ、７９番目のリシン、８１番目のアルギニン、１０２番目のリシンからなるクラスター（クラスターＩ）と、８６番目のリシン、８７番目のリシン、８９番目のアルギニンからなるクラスター（クラスターＩＩ）である（例えば、非特許文献４参照）。双方のクラスターが、共に、ヘパリン結合能に関与することが知られている（例えば、非特許文献４及び非特許文献５参照）。【０００９】
一方、ＭＫの抗体については、ＭＫは種間でのタンパク質の保存度が高く、ヒトとマウスのＭＫでは、アミノ酸配列において８７％の相同性があるため、ヒトＭＫタンパク質を免疫原としてマウスに免疫した場合、当該マウスの体内で外来の異種タンパク質として認識する程度が低いことが考えられている。そこで、ＭＫ遺伝子をノックアウトしたマウスを利用することにより、抗ヒトＭＫモノクローナル抗体を得られることが知られている（例えば、特許文献７参照）。しかし、ＭＫの機能を阻害する活性を有する抗ヒトＭＫ抗体が認識するＭＫ上のエピトープについてはこれまでに報告されていなかった。
【特許文献１】特開平６−１７２２１８号公報
【特許文献２】国際公開第２０００／１０６０８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００４／０７８２１０号パンフレット
【特許文献４】国際公開第２００４／０８５６４２号パンフレット
【特許文献５】国際公開第１９９９／０３４９３号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００６／０１６５７１号パンフレット
【特許文献７】特開２００２−８５０５８号公報
【非特許文献１】Kadomatsu, K. et al.: (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun., 151:p.1312-1318
【非特許文献２】Tomokura, M. et al.: (1999) J.Biol. Chem, 265: p.10765-10770
【非特許文献３】Muramatsu, T.: (2002) J. Biochem. 132, p.359-371
【非特許文献４】Iwasaki, W. et al.: (1997) EMBO J. 16, p.6936-6946
【非特許文献５】Asai, S. et al.: (1995) Biochem. Biophys. Res Commun. 206, P.468-473.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＭＫのエピトープを認識する抗体またはその断片を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ヒトＭＫに対する抗体を作製し、得られた抗体の中からＭＫの細胞遊走機能を阻害する活性を有する抗体を見出した。本発明者らは、得られた抗体を用いてＥＡＥモデル動物試験を行ったところ、これらの抗体が優れたＥＡＥ発症抑制作用を備えることを見出した。また、本発明者らは、これらのＭＫの機能を阻害する活性を有する抗体が認識するＭＫ上のエピトープを見出した。更に、本発明者らは、これらの抗体のＭＫ上のエピトープが共通して備える特長について鋭意検討を行った結果、いずれもＭＫの立体構造において静電ポテンシャルが高い部位に結合していることを見出し、この部位がＭＫの機能発現に寄与していることを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、ＭＫの、６２〜１０４番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識する抗体またはその断片、ＭＫの６２〜１０４番目のアミノ酸に存在する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、当該抗体またはその断片をコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有する組み換えベクター、当該ベクターを有する形質転換体、当該形質転換体に抗体またはその断片を産生させその抗体またはその断片を採取することによる抗体またはその断片の製造方法、当該抗体またはその断片を有効成分として含有する医薬組成物、並びに、当該抗体またはその断片を含有する診断薬に関する。また、本発明は、ＭＫの６２〜１０４番目のアミノ酸に存在するエピトープを認識する抗体またはその断片が認識するＭＫ上のエピトープを認識する物質をスクリーニングする方法に関する。【００１３】
より好ましくは、本発明は、以下の（１）〜（４１）に関する。
（１）  ＭＫの６２〜１０４番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
（２）  ＭＫの６４〜７３番目及び７８〜１０１番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
（３）  ＭＫの６４〜７３番目のアミノ酸、６４〜６９番目のアミノ酸、６４〜６７番目のアミノ酸、及び、８４〜９６番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
（４）  ＭＫの６４〜６６番目のアミノ酸、及び、８７〜９６番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
（５）  ＭＫの６４番目チロシン、６５番目リシン、６６番目フェニルアラニン、６７番目グルタミン酸、６９番目トリプトファン、７３番目アスパラギン酸、８４番目トレオニン、８６番目リシン、及び、９６番グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
（６）  ＭＫの６４番目チロシン、６６番目フェニルアラニン、８７番目リシン、９０番目チロシン、及び、９６番グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
（７）エピトープが立体構造エピトープである、（１）から（６）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片、
（８）  立体構造エピトープが反並行βシート構造エピトープである、（７）に記載の抗体またはその断片、
（９）  上記（１）から（８）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片であって、エピトープの少なくとも３個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片、
（１０）  ＭＫの６２〜１０４番目のアミノ酸に存在する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片、
（１１）  （１０）に記載の抗体またはその断片であって、前記クラスターの少なくとも３個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片、
（１２）  ＭＫの、６２〜６４番目のアミノ酸、６６番目のアミノ酸、６８〜７０番目のアミノ酸、７２番目のアミノ酸、７９番目のアミノ酸、８１番目のアミノ酸、８５〜８９番目のアミノ酸、１０２番目のアミノ酸、及び、１０３番目のアミノ酸から選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片、
（１３）  ＭＫの、６３番目リジン、７９番目リジン、８１番目アルギニン、８６番目リジン、８７番目リジン、８９番目アルギニン、及び、１０２番目リジンから選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片、
（１４）  重鎖のＣＤＲ３が、配列番号１５若しくは配列番号２１に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有する抗ＭＫ抗体またはその断片、
（１５）  重鎖のＣＤＲ１が配列番号１３若しくは配列番号１９に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、重鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１４に若しくは配列番号２０に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ１が配列番号１６若しくは配列番号２２に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１７若しくは配列番号２３に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１８若しくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列、またはそれらの保存的改変アミノ酸配列を有する、請求項５に記載のモノクローナル抗体、
（１６）  重鎖のＣＤＲ３が、配列番号１５若しくは配列番号２１に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する抗ＭＫモノクローナル抗体またはその断片、
（１７）  重鎖のＣＤＲ１が配列番号１３若しくは配列番号１９に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号１４に若しくは配列番号２０に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号１６若しくは配列番号２２に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域のＣＤＲ２が配列番号１７若しくは配列番号２３に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１８若しくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する、請求項５に記載のモノクローナル抗体またはその断片、
（１８）重鎖のＣＤＲ１が配列番号１３の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号１４に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ３が配列番号１５に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号１６に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号１７に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１８に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する、抗ＭＫモノクローナル抗体またはその断片、
（１９）  重鎖のＣＤＲ１が配列番号１９の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２０に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２１に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号２２に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列、その保存的改変アミノ酸配列またはそのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する、抗ＭＫモノクローナル抗体またはその断片、
（２０）  重鎖のＣＤＲ１が配列番号１３の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ３が配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＭＫモノクローナル抗体またはその断片、
（２１）  重鎖のＣＤＲ１が配列番号１９の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する、抗ＭＫモノクローナル抗体またはその断片、
（２２）  （１４）〜（２１）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体が認識するＭＫ上のエピトープを認識する抗体またはその断片。
（２３）ＭＫと特異的に結合する、（１）から（２２）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片、
（２４）  ＭＫがヒトＭＫである、（１）から（２３）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片、
（２５）  抗体が、モノクローナル抗体である、（１）から（２４）のいずれか１項に記載の抗体、
（２６）  抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、または、ヒト抗体である、（１）から（２５）のいずれか１項に記載の抗体、
（２７）  抗体断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（Ｄｉａｂｏｄｙ）、または、ＣＤＲを含むペプチドから選択される抗体断片である、（１）から（２６）のいずれか１項に記載の抗体の断片、
（２８）  （１）から（２７）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片をコードするＤＮＡ、
（２９）  （２８）のＤＮＡを含有する組み換えベクター、
（３０）  （２９）の組み換えベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換細胞、
（３１）  （１）から（２７）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を産生する細胞、
（３２）  ハイブリドーマ細胞系である、（３０）または（３１）に記載の細胞、
（３３）  （３０）から（３２）のいずれか１項に記載の細胞を培養し、培養物中に抗体またはその断片を生成させ、培養物から抗体またはその断片を抽出することを特徴とする、（１）から（３０）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片の製造方法。
（３４）  （１）から（２７）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を有効成分として含有する、医薬組成物、
（３５）  （１）から（２７）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を有効成分として含有する、ＭＫ関連疾患の予防または治療のための医薬組成物、
（３６）  ＭＫ関連疾患が、細胞遊走に起因する疾患である、（３５）に記載の医薬組成物、
（３７）  細胞遊走に起因する疾患が癌（若しくは癌の転移）又は炎症性疾患である、（３６）に記載の医薬組成物、
（３８）  ＭＫ関連疾患が、自己免疫疾患である、（３７）に記載の医薬組成物、
（３９）  自己免疫疾患が、多発性硬化症である、（３８）に記載の医薬組成物、
（４０）  （１）から（２７）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を含有する、ＭＫ関連疾患の診断薬、並びに、
（４１）  （１）から（２７）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片が結合するＭＫ上のエピトープに結合する物質をスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ＭＫに被検化合物及び（１）から（２７）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を接触させる工程、及び、
（ｉｉ）（１）から（２７）のいずれか１項に記載の抗体またはその断片とＭＫとの結合を測定する工程を備える方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗体またはその断片は、ＭＫの機能を阻害する。特に、本発明の抗体またはその断片はＭＫの細胞遊走活性を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＣＳＭ−１、ＣＳＭ−４に対する、ＭＫ  Ｃ−フラグメント（MK_62-121）のアラニンポイントミューテーションの抗原性の変化を示す。図中、黒丸は抗原性が大きく低下したことを示し、白丸は抗原性が低下したことを示し、−は抗原性に変化がなかったことを示す。
【図２】ＥＡＥモデルマウスへＣＳＭ−１を投与した場合のマウスのスコアを示す。縦軸は各群の臨床スコアの平均値を表し、横軸はＭＯＧ感作後の日数を表す。また、図中、黒丸はコントロールを、白抜き三角はＣＳＭ−１を投与したマウスを表す。
【図３】ＥＡＥモデルマウスへＣＳＭ−４を投与した場合のマウスのスコアを示す。縦軸は各群の臨床スコアの平均値を表し、横軸はＭＯＧ感作後の日数を表す。また、図中、黒丸はコントロールを、白抜き三角はＣＳＭ−４を投与したマウスを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の抗体は、ＭＫと結合する抗体であって、配列番号２記載のＭＫアミノ酸配列における６２〜１０４番目のアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片（以下、「Ｃ−ドメイン認識抗体等」という）である。本発明のＣ−ドメイン認識抗体等として、好ましくは、ＭＫの６４〜７３番目及び７８〜１０１番目のアミノ酸に存在するエピトープ、ＭＫの６４〜７３番目のアミノ酸、６４〜６９番目のアミノ酸、６４〜６７番目のアミノ酸、または、８４〜９６番目のアミノ酸に存在するエピトープ、ＭＫの６４〜６６番目のアミノ酸または８７〜９６番目のアミノ酸に存在するエピトープ、ＭＫの６４番目チロシン、６５番目リシン、６６番目フェニルアラニン、６７番目グルタミン酸、６９番目トリプトファン、７３番目アスパラギン酸、８４番目トレオニン、８６番目リシン、及び、９６番目グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在するエピトープ、並びに、ＭＫの６４番目チロシン、６６番目フェニルアラニン、８７番目リシン、９０番目チロシン、及び、９６番目グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在するエピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片である。【００１７】
また、ＭＫアミノ酸配列における６４〜１０１番目のアミノ酸は、ＭＫのＣ−ドメインを形成し、３本の逆βシート構造からなる立体構造を有する。本発明のＣ−ドメイン認識抗体等として、好ましくは、ＭＫの６４〜７３番目及び７８〜１０１番目のアミノ酸に存在する立体構造エピトープ、ＭＫの６４〜７３番目のアミノ酸、６４〜６９番目のアミノ酸、６４〜６７番目のアミノ酸、または、８４〜９６番目のアミノ酸に存在する立体構造エピトープ、ＭＫの６４〜６６番目のアミノ酸または８７〜９６番目のアミノ酸に存在する立体構造エピトープ、ＭＫの６４番目チロシン、６５番目リシン、６６番目フェニルアラニン、６７番目グルタミン酸、６９番目トリプトファン、７３番目アスパラギン酸、８４番目トレオニン、８６番目リシン、及び、９６番目グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在する立体構造エピトープ、並びに、ＭＫの６４番目チロシン、６６番目フェニルアラニン、８７番目リシン、９０番目チロシン、及び、９６番目グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在する立体構造エピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片である。本発明のＣ−ドメイン認識抗体等として、より好ましくは、ＭＫの６４〜７３番目及び７８〜１０１番目のアミノ酸に存在する反並行βシート構造エピトープ、ＭＫの６４〜７３番目のアミノ酸、６４〜６９番目のアミノ酸、６４〜６７番目のアミノ酸、または、８４〜９６番目のアミノ酸に存在する反並行βシート構造エピトープ、ＭＫの６４〜６６番目のアミノ酸または８７〜９６番目のアミノ酸に存在する反並行βシート構造エピトープ、ＭＫの６４番目チロシン、６５番目リシン、６６番目フェニルアラニン、６７番目グルタミン酸、６９番目トリプトファン、７３番目アスパラギン酸、８４番目トレオニン、８６番目リシン、及び、９６番目グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在する反並行βシート構造エピトープ、並びに、ＭＫの６４番目チロシン、６６番目フェニルアラニン、８７番目リシン、９０番目チロシン、及び、９６番目グルタミン酸から選択されるアミノ酸に存在する反並行βシート構造エピトープの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片である。【００１８】
本発明において、「立体構造エピトープ」とは、当該エピトープを構成するアミノ酸が、全長ＭＫタンパク質において示す立体構造と同一または類似の立体構造を構成した場合に抗体が結合する部位のことである。例えば、ＭＫアミノ酸配列における６４〜７３番目、７８〜８５番目、及び、９７〜１０１番目のアミノ酸には、一次構造上は離れた位置に存在するが、二次構造（βシート構造）をとることにより互いに近接した位置に存在して、一緒になって立体構造エピトープを構成するアミノ酸の組み合わせが存在する。【００１９】
また、別の態様において、本発明の抗体又はその断片は、ＭＫの６２〜１０４番目のアミノ酸に存在する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片に関する。ここで、「高静電ポテンシャルクラスター」とは、ミッドカインタンパク質において、正の静電ポテンシャルを備える部位のことである。静電ポテンシャルとして、好ましくは、pymolを用いた計算によって１０units k_bT/e_c以上を示すポテンシャルであり、より好ましくは、２０units k_bT/e_c以上を示すポテンシャルであり、更に好ましくは、３０units k_bT/e_c以上を示すポテンシャルであり、より更に好ましくは、４０units k_bT/e_c以上を示すポテンシャルであり、最も好ましくは、５０units k_bT/e_c以上を示すポテンシャルである。ＭＫの６２〜１０４番目のアミノ酸に存在する高静電ポテンシャルクラスターの少なくとも一部を認識する抗体またはその断片として、好ましくは、ＭＫの、６２〜６４番目のアミノ酸、６６番目のアミノ酸、６８〜７０番目のアミノ酸、７２番目のアミノ酸、７９番目のアミノ酸、８１番目のアミノ酸、８５〜８９番目のアミノ酸、１０２番目のアミノ酸、及び、１０３番目のアミノ酸から選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片であり、より好ましくは、ＭＫの、６３番目リジン、７９番目リジン、８１番目アルギニン、８６番目リジン、８７番目リジン、８９番目アルギニン、及び、１０２番目リジンから選択されるアミノ酸のうち、少なくとも１個のアミノ酸を認識する抗体またはその断片である。【００２０】
本願において、「少なくとも一部を認識する」とは、少なくとも１個のアミノ酸を認識することであるが、好ましくは、少なくとも２個のアミノ酸を認識することであり、より好ましくは、少なくとも３個のアミノ酸を認識することである。また、ＭＫは立体構造をとるため、本発明において、エピトープ及びクラスターは非連続的なアミノ酸により形成されている。【００２１】
また、別の態様において本発明の抗体またはその断片は、ＣＤＲが配列番号１３〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する抗体またはその断片である。本発明において、「ＣＤＲ」とは、Ｋａｂａｔら（"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat E.ら, U.S. Department of Health and Human Services, 1983）またはＣｈｏｔｈｉａら（Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987）の定義によるものである。また、別の態様において、本発明の抗体またはその断片は、ＣＤＲが配列番号１３〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列の保存的改変アミノ酸配列を有する抗体またはその断片である。本発明において、「保存的改変」とは、当該アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に顕著に影響しないか、またはそれを顕著に変えないアミノ酸改変のことである。このような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加および削除を挙げることができる。保存的改変は、当業者に周知の方法（例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲを介する変異誘発）により、導入することができる。アミノ酸の置換により保存的改変を行う場合、所望のアミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基と置換することにより改変することができる。置換するアミノ酸残基は、同様の側鎖であることが当業者に周知のアミノ酸であれば特に限定されない。例えば、アミノ酸の側差が同様であるか否かは、次に挙げるアミノ酸の側鎖の性質により判断することができる：塩基性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性の側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β−分枝状側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を挙げることができる。【００２２】
更に、別の態様において、本発明の抗体またはその断片は、ＣＤＲが配列番号１３〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する抗体またはその断片であり、好ましくは、ＣＤＲが配列番号１３〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列と９８％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する抗体またはその断片であり、より好ましくは、ＣＤＲが配列番号１３〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列と９９％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する抗体またはその断片である。また、別の態様において、本発明の抗体は、ＣＤＲが配列番号１３〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列の１または数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する抗体またはその断片であり、好ましくは、１または２個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する抗体またはその断片であり、より好ましくは、１個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有する抗体またはその断片である。【００２３】
別の態様において、本発明は、重鎖のＣＤＲ３が、配列番号１５若しくは配列番号２１に記載のアミノ酸配列、それらの保存的改変アミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列を有する抗ミッドカイン抗体またはその断片である。【００２４】
別の態様において、本発明は、重鎖のＣＤＲ１が配列番号１３の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ３が配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する、抗ミッドカインモノクローナル抗体またはその断片である。また、別の態様において、本発明は、重鎖のＣＤＲ１が配列番号１９の記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ２が配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有し、重鎖のＣＤＲ３が配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ１が配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ２が配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有し、軽鎖のＣＤＲ３が配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する、抗ミッドカインモノクローナル抗体またはその断片である。【００２５】
本発明の抗体は、本発明の抗体として利用可能であれば、ＭＫ以外の物質への結合する抗体であってもよいが、好ましくは、ＭＫと特異的に結合する抗体である。また、本発明の抗体が認識するＭＫの種としては、特に限定されるものではなく、好ましくは、哺乳動物のＭＫであり、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、ラビット又はヒトのＭＫであり、好ましくは、ヒトＭＫである。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体である。【００２６】
更に、本発明の抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどの抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト抗体に動物由来のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインＦｖを入れ替えたヒト型キメラ抗体、動物由来抗体モノクローナル抗体の抗原結合に直接関わるＦｖドメイン上の配列であるＣＤＲをヒト抗体のフレームに組み込んだヒト化抗体を挙げることができる。また、ヒト抗体とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことである。【００２７】
本発明は、また、抗ＭＫ抗体の断片も含むものである。ここで、「抗体の断片」とは、抗体の一部分（部分断片）または抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（以下、「Ｄｉａｂｏｄｙ」という）、またはＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、該Ｆ（ａｂ’）のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｄＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬがペプチドリンカーで連結された抗原結合活性を有するポリペプチドである。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合している抗原結合活性を有する断片である。Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した断片である。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、モノスペシフィックでもよいし、バイスペシフィック（多重特異性抗体）でもよい。二量体化しているｓｃＦｖは、同一であっても良いし、異なっていても良い。ＣＤＲを含むペプチドは、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３から選択される少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含むペプチドのことである。【００２８】
抗体またはその断片が認識するアミノ酸の数は、抗体がＭＫに結合し、ＭＫの機能を阻害することができる数であれば、特に限定はない。抗体またはその断片が認識するアミノ酸の数は、好ましくは、少なくとも１個であり、より好ましくは、少なくとも３個である。
また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよく、好ましくはＩｇＧである。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。【００２９】
本発明の抗体は、ＭＫの機能を阻害することから、ＭＫ関連疾患の治療薬および予防薬として使用することができる。本発明において「ＭＫ関連疾患」とは、ＭＫの機能が関与している疾患のことであり、このような疾患としては、例えば、癌（食道癌、甲状腺癌、膀胱癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌、肝臓癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、ウイルムス腫瘍）、子宮内膜症等の細胞増殖または血管新生に起因する疾患；関節炎、自己免疫疾患（臓器特異的自己免疫疾患等）、リウマチ性関節炎（慢性関節リウマチ（ＲＡ）、変形性関節症（ＯＡ））、多発性硬化症（再発寛解型多発性硬化症等）、炎症性腸炎（クローン病等）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、進行性全身性硬化症（ＰＳＳ）、シェーグレン症候群、多発性筋炎（ＰＭ）、皮膚筋炎（ＤＭ）、結節性動脈周囲炎（ＰＮ）、甲状腺疾患（バセドウ病等）、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、突発性血小板減少性紫斑病、自己免疫溶血性貧血、重症筋無力症（ＥＡＭＧ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、Ｉ型糖尿病、移植時の拒絶反応、手術後の癒着、子宮内膜症、乾癬、狼瘡、アレルギー、喘息、好中球機能異常等の炎症性疾患または細胞遊走に起因する疾患；血管再建術後再狭窄、心臓冠動脈血管閉塞性疾患、脳血管閉塞性疾患、腎血管閉塞性疾患、末梢血管閉塞性疾患、動脈硬化、脳梗塞等の血管閉塞性疾患または血管内膜肥厚に起因する疾患を挙げることができる。本発明のＭＫ関連疾患として、好ましくは、癌、動脈硬化、血管新生関連疾患、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞、脳出血、高血圧、多発性硬化症である。【００３０】
本発明の抗体は、ＭＫ関連疾患の診断薬として使用することができる。診断薬として使用する場合、使用する抗体またはその断片は、ＭＫを特異的に認識する抗体またはその断片であることが望ましい。【００３１】
１．抗ＭＫ抗体作製
本発明の抗体は、例えば、ＭＫ、または、ＭＫの６４〜１０４番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、ＭＫの６４〜７３番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、６４〜６９番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、６４〜６７番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、ＭＫの６４〜６６番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、ＭＫの７８〜１０１番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、８４〜９６番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド、及び／若しくは、ＭＫの８７〜９６番目に含まれるアミノ酸配列を有するペプチド等のＭＫの一部を有するペプチド（以下、「ＭＫの一部を有するペプチド」という）を、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、または、フロインドの不完全アジュバント等）とともに、非ヒト哺乳動物または鳥類に免疫することにより作製することができる。本発明の抗体は、好ましくは、ＭＫをＭＫノックアウトマウスに免疫することにより作製することができる（特開２００２−８５０５８号公報、Nakamura, E. et al. :Genes Cells 3, p.811-822.参照）。【００３２】
免疫原として使用するＭＫは、哺乳動物のＭＫであれば、特に限定は無いが、好ましくは、ヒトＭＫである。例えば、マウス、ウサギ、ヒトのＭＫは既にクローニングされており、ヒトＭＫはその配列が報告されている（配列番号１）（特開平５−９１８８０号公報、Tsutui, J. et al. :Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, p.792-797.参照）。従って、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、ＭＫをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより得ることができる。例えば、ＭＫをコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込み、当該ベクターをピキア酵母に導入して発現させ、その培養上清から採取することにより、組み換えＭＫとして調製することができる（特開平９−９５４５４号公報参照）。【００３３】
免疫原として、ＭＫの一部を有するペプチドを使用する場合には、これらのペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより免疫原を得ることができる。【００３４】
免疫原として、ＭＫの一部を有するペプチドを使用する場合には、ＭＫの一部を有するペプチドをそのまま使用することもできるし、１種類または２種類以上のＭＫの一部を有するペプチドをリンカーを介して結合させて使用することもできる。例えば、ＭＫのＣ−フラグメント（ＭＫの６２〜１２１番目のアミノ酸配列を有するペプチド）、ＭＫの６４〜１０１番目のアミノ酸配列を有するペプチド等のＭＫの一部を有するペプチドをそのまま使用することができ、ＭＫの６４〜７３番目のアミノ酸配列を有するペプチドとＭＫの７８〜１０１番目のアミノ酸配列を有するペプチドは、リンカーを介して結合させて使用することができる。【００３５】
ＭＫまたはＭＫの一部を有するペプチドは、Ｆｍｏｃ法またはＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製できることができる。例えば、ＭＫまたはＭＫの一部を有するペプチドのＣ末端のアミノ酸をポリスチレン担体に固定化し、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）またはtert-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護されたアミノ酸を、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の縮合剤を用いて反応させることにより結合させ、洗浄、脱保護の工程を繰り返すことにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。【００３６】
また、ＭＫまたはＭＫの一部を有するペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。このようなペプチド合成機としては、例えば、ＰＳＳＭ−８（島津製作所）；モデル４３３Ａペプチドシンセサイザ（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems, Inc.））；ＡＣＴ３９６Ａｐｅｘ（アドバンストケムテック社（Advanced ChemTech Inc.））等が挙げられる。また、ＭＫは、報告された方法に従って合成することもできる（Inui, T. et al. :J. Peptide Sci., 2: p.28-39, 1996）。【００３７】
免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ニワトリ、アヒル等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスまたはラットであり、より好ましくは、マウスであり、最も好ましくは、ＭＫノックアウトマウスである。【００３８】
動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射または足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射または腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回または適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を合計２〜５回行い、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩または尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。【００３９】
本発明のモノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Galfre, G. & Milstein,C.,Methods Enzymol.73:3-46,1981）を挙げることができる。【００４０】
使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウスまたはラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができ、好ましくは、脾臓より採取する。【００４１】
使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビットまたはヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、in vitro で増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Nature, 256, 495, 1975）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Eur. J. Immunol., 6, 292, 1976）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（J. Immunol., 123, 1548, 1979）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Nature, 276, 269, 1978）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（J. Immunol. Methods, 35, 1, 1980）等を挙げることができ、好ましくは、Ｐ３Ｕ１である。【００４２】
上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、培地、ＰＢＳ(Phosphate Buffered Saline)等で洗浄後、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等の細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させる（Elsevier Publishing, 1988）。融合させる際の抗体産生細胞及び骨髄腫細胞の比率は、例えば、２：１〜１：２である。細胞融合を行った後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン（Hypoxanthine）−アミノプテリン（aminopterin）−（チミジン）thymidine）培地等の培地で培養することにより、ハイブリドーマを選択的に増殖させる。培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に結合し、非抗原タンパク質に結合しないサンプルを選択する。当該サンプルを限界希釈法により単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択する。【００４３】
本発明のモノクローナル抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをin vitroで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、本発明のモノクローナル抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物または免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。【００４４】
モノクローナル抗体の精製は、遠心分離後、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより得ることができる。抗体のクラスが、ＩｇＹ及びＩｇＭの場合には、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムで精製することができる。また、抗体のクラスによらず、ＭＫ固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー等を用いて精製することもできる。【００４５】
２．ヒト型キメラ抗体・ヒト化抗体、ヒト抗体の作製
（１）ヒト型キメラ抗体
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＭＫと結合し、ＭＫの機能を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Morrison, S.L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984）。【００４６】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、次の方法により得ることができる。当該モノクローナル抗体を産生する動物Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡの抽出は、当業者周知の方法で行うことができ、例えば、グアニジン−超遠心法（Chirgwin, J. M.ら, Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979）、ＡＧＰＣ法（Chomczynski, Pら, Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987）等によりＲＮＡを調製した後、ｍＲＮＡピュリフィケーションキット（Purification Kit）（ファルマシア社製、タカラバイオ社製）等により精製することにより行うことができる。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを使用することによりｃＤＮＡを作製してベクターに組み込む。ベクターに組み込んだｃＤＮＡの中から、非ヒト動物由来モノクローナル抗体の一部をプローブとして使用して、非ヒト動物由来モノクローナル抗体コードしているｃＤＮＡを単離する。単離されたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、目的のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。【００４７】
また、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを得る別の方法として、次の方法が挙げられる。上述の方法で得られたｃＤＮＡを、ＶＨまたはＶＬを増幅可能なプライマー（例えば、非ヒト動物として、マウスを利用する場合、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするプライマー及びマウスＬ鎖γ鎖定常領域の保存配列とハイブリダイズするプライマー等（R. Orlandiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833, 1989））を用いてＰＣＲ法で増幅することにより、または、モノクローナル抗体を産生する動物Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出し、当該ＶＨまたはＶＬを増幅可能なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法で当該ＶＨまたはＶＬを増幅させる。得られたＰＣＲ産物から目的のＤＮＡ断片を抽出する。目的のＤＮＡ断片の抽出は、例えば、アガロースゲル電気泳動後に目的のＤＮＡのサイズを示すバンドを切り出し、当該ゲル切片よりＤＮＡを抽出することにより行うことができる。当該ベクター及び抽出したＤＮＡを制限酵素で処理した後、抽出したＤＮＡをベクターに組み込み、組み込まれたＤＮＡがコードするＤＮＡ配列を決定することにより、目的のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。【００４８】
ヒト型キメラ抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のキメラ抗体を発現するベクターを作製することができる。【００４９】
ヒト型キメラ抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーターまたは非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを使用する場合、免疫グロブリン遺伝子の発現調節機構はマウスとヒトで共通であることから、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子間に存在するマウスまたはヒトのエンハンサー配列を含む形で組換えＤＮＡを作製することもできる。【００５０】
動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、pSV2-gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 209, 1422, 1980) を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト型キメラ抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。【００５１】
（２）ヒト化抗体
本発明のヒト化抗体は、ＭＫと結合し、ＭＫの細胞遊走活性を阻害する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（L. Rieohmannら, Nature, 332, 323, 1988; Kettleborough, C. A.ら, Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., Immunol. Today., 21, 397-402, 2000参照）。【００５２】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較し、各ＣＤＲのアミノ酸配列を得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。ＣＤＲのアミノ酸配列として、好ましくは、配列番号１３〜配列番号２４に記載のアミノ酸配列、それらの保存的改変アミノ酸配列、またはそれらのアミノ酸配列と９５％以上の相同性示すアミノ酸配列である。【００５３】
また、ヒト抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、または、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。選択したヒト抗体のＦＲを有するヒト化抗体のＶ領域が、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるか否かは、例えば、選択したヒト抗体のＦＲ含むＶ領域のＤＮＡ配列情報を基にコンピューターモデリングにより立体構造を予測し、使用した非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域の立体構造との比較を行うことにより判断することができる。使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列は、上述の方法により得られたＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列及びＣＤＲのアミノ酸配列の情報より得ることができる。また、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、または、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲとするため、得られたヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に適宜変異をいれることもできる。【００５４】
使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。例えば、設計したＤＮＡを基に１００ｂｐ前後の長さのＤＮＡ断片を合成ＤＮＡとして化学合成し、当該ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅することによって得ることができる。また、当該１００ｂｐ前後のＤＮＡ断片をリガーゼ等の酵素を用いて結合させ、設計されたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列の両末端の配列をコードするプライマーを用いてＰＣＲを行い、所望の長さのＤＮＡ断片を抽出することによっても得ることができる。更に、ＰＣＲ使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、ＣＤＲグラフティングとして知られる方法によっても得ることができる。また、使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、部位特異的変異によりＣＤＲをコードするＤＮＡをヒト抗体のＶ領域のＤＮＡに組み込むことによっても得ることができる。部位特異的変異は、例えば、ジーンテイラーサイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System）（インビトロジェン社）、トランスフォーマー（Transformer）部位特異的突然変異誘発キット（クローンテック社）、サイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（Site-Directed Mutagenesis System）（タカラバイオ社）等を用いて、当該キットの説明に従うことにより行うことができる。【００５５】
ヒト化抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のヒト化抗体を発現するベクターを作製することができる。【００５６】
ヒト化抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーターまたは非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを使用する場合、免疫グロブリン遺伝子の発現調節機構はマウスとヒトで共通であることから、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子間に存在するマウスまたはヒトのエンハンサー配列を含む形で組換えＤＮＡを作製することもできる。【００５７】
動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、pSV2-gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 209, 1422, 1980) を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト化抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。【００５８】
なお、上述のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の作製において使用される、非ヒト動物由来モノクローナル抗体は、ＭＫと結合し、ＭＫの細胞遊走活性を阻害する抗体であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスモノクローナル抗体である。【００５９】
（３）ヒト抗体
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリーまたはヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら, Nature Genet., 15, 146-156(1997)）。【００６０】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞由来の様々な配列をもつ抗体遺伝子プールからＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をファージ遺伝子に導入することにより、ヒト抗体のＦａｂまたはｓｃＦｖ等を融合タンパク質として表面に提示させたファージのライブラリーである。このようなヒト抗体ファージライブラリーとしては、正常なヒトの持つ抗体のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を末梢血リンパ球などからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ライブラリー化することにより得られたナイーブ・非免疫ライブラリー（ケンブリッジアンチボディテクノロジー（Cambridge Antibody Technology）社；メディカルリサーチカウンセル（Medical Research Council）；ダイアックス（Dyax）社等）、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片のＣＤＲ３領域などの抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドによって置換し、ライブラリー化した合成ライブラリー（バイオインベント（BioInvent）社；クルーセル（Crucell）社；モルホシス（Morphosys）社）、及び、癌、自己免疫疾患または感染症患者、あるいは、対象抗原をワクチンとして接種した人のリンパ球から作製したライブラリーである、免疫ライブラリーを挙げることができる。【００６１】
例えば、ナイーブヒト抗体ファージライブラリーは、以下の方法により作製することができる。人の末梢血からｍＲＮＡを調製し、イムノグロブリンのγ、μ、κ、λ鎖の定常領域に特異的なプライマーを用いて、Ｖ遺伝子のｃＤＮＡを合成し、各Ｖ遺伝子をＶ遺伝子ファミリーに特異的なＤＮＡプライマーのセットを用いて合成し、それらを（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３等のリンカーペプチドをコードするリンカーＤＮＡを用いてＰＣＲによって連結し、ｓｃＦｖ遺伝子を合成する。合成したｓｃＦｖ遺伝子を、両側にベクター導入用の制限酵素サイトを使って、ｐＣＡＮＴＡｂ５Ｅ等のファージミドベクターに挿入し、当該ベクターを大腸菌に形質転換し、ヘルパーファージによるレスキューを行う。【００６２】
ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、標的となるＭＫを固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。【００６３】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、例えば、以下の方法により得ることができる。ヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間コルセミド（紡錘糸形成阻害剤）処理することにより、１から数本の染色体が核膜に包まれた構造体である、ミクロセルを形成する。サイトカラシンＢ存在下で単離されたミクロセルを染色体受容細胞（マウスＥＳ細胞）とポリエチレングリコールにより融合し、ミクロセルハイブリッドＥＳ細胞を作製し、マウス胚へ注入する。
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の抗ＭＫ抗体作成方法に準じて抗原を免疫することにより、抗ＭＫヒト抗体を得ることができる。【００６４】
３．抗体断片の作製
本発明の抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、または、ＣＤＲを含むペプチド）は、以下の方法により作製することができる。【００６５】
本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、本発明のＭＫに結合するＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理し、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断することにより、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、後述のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合させることにより得ることができる。【００６６】
本発明のＦａｂ’断片は、上述の方法により得られた本発明のＭＫに結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明のＭＫに結合する抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００６７】
本発明のＦａｂ断片は、本発明のＭＫに結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理し、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断することにより、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明のＭＫに結合する抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００６８】
本発明のｓｃＦｖは、本発明のＭＫに結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、これらの遺伝子の間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／またはセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）またはその繰り返し配列である。【００６９】
本発明のｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基を部位特異的突然変異によりシステイン残基に置換し、ＶＨ及びＶＬを当該システイン残基間のジスルフィド結合で結合させることにより得ることができる。置換するアミノ酸は、立体構造に基づき抗原結合に影響の無いアミノ酸残基であれば特に限定はない。【００７０】
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。【００７１】
本発明の、ＣＤＲを含むペプチドは、本発明のＭＫに結合する抗体のＶＨまたはＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００７２】
４．Ｃ−ドメイン認識抗体等の選択
本発明のＣ-ドメイン認識抗体等は、上述の方法により得られた抗体またはその断片のうち、所望のエピトープを認識する抗体等を選択することにより得ることができる。また、本発明のＣ−ドメイン認識抗体は、上述の抗ＭＫ抗体作製方法において、抗原として所望のエピトープ配列を有するペプチドを投与することにより得ることができる。【００７３】
得られた抗体が本発明の抗体の認識するエピトープを認識するか否かは、当業者周知の方法により行うことができる。例えば、ＭＫを構成するアミノ酸のうち、本発明のＣ−ドメイン認識抗体等が認識するアミノ酸配列にアラニンミューテーションを導入した全長ＭＫまたはＭＫ断片を作製し、得られた抗体との結合活性を測定する。全長ＭＫまたはＭＫ断片のアラニンミュータントとの結合が弱まる抗体を選択することにより、本発明の抗体を得ることができる。【００７４】
得られた抗体とアラニンミューテーション導入ＭＫとの結合は、当業者周知の方法で測定することができる。このような方法として、例えば、ウエスタンブロッティング、Ｘ線結晶解析の他、ビアコアシステム（ビアコア社）を挙げることができる。【００７５】
５．医薬組成物
本発明の抗体を医薬として使用する場合、投与部位としては、経口投与、口腔内投与、気道内投与、皮下投与、筋肉内投与、血管内（静脈内）投与等を挙げることができる。また、製剤としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤、貼布剤、軟膏等を挙げることができる。本発明の抗体は、単独で投与しても良いし、薬理学的に許容される単体（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」APhA Publications社参照）と共に投与されてもよい。【００７６】
６．診断薬
本発明の診断薬は、抗体分子を用いた公知の方法に基づくことができる。このような方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ（Catty, Raykundalia, 1989）、ラジオイムノアッセイ（Catty, Murphy, 1989）、免疫組織化学的方法（Heiderら、1993）、または、ウェスタンブロット等を挙げることができる。本発明の診断薬の検体としては、例えば、生検として被験者から採取した組織試料または液体を使用することができる。使用される生検は、ＭＫの免疫学的測定の対象となるものであれば特に限定はなく、例えば、組織、血液、尿、漿液、髄液、関節液、眼房水、涙液、唾液またはそれらの分画物若しくは処理物を挙げることができる。本発明の診断薬による分析は、定性的、定量的または半定量的に行うことができる。【００７７】
以下、本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。【００７８】
（実施例１）マウス抗ヒトＭＫモノクローナル抗体の作製
１．ＭＫ遺伝子ノックアウトマウスの作製
ＭＫ遺伝子ノックアウトマウスは、公知の方法（特開２００２−８５０５８号公報、Nakamura, E. et al. :Genes Cells 3, p.811-822.）により作製した。【００７９】
２．マウス抗ヒトＭＫモノクローナル抗体の作製
２−１．抗原の作製
ヒトＭＫｍＲＮＡを、ウイルムス腫瘍由来の培養株細胞Ｇ−４０１より調製した（Tsutsui, J. ら、Biochem. Biophys. Res. Commun. 176, 792-797, 1991）。プライマーとして、制限酵素EcoRIに認識される配列（5'-GAATTC-3'）を含むように設計した、センスPCRプライマー：5'-GCGGAATTCATGCAGCACCGAGGCTTCCTC-3'（配列番号：３）、及び、アンチセンスPCRプライマー：5'-GCGGAATTCCTAGTCCTTTCCCTTCCCTTT-3'（配列番号：４）を用い、ヒトＭＫｍＲＮＡを鋳型として、93℃→37℃→72℃の温度変化を１サイクルとする30サイクルのＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を行い、ＭＫコーディング領域の両端にEcoRI認識部位をもつヒトＭＫｃＤＮＡを調製した。【００８０】
ＭＫｃＤＮＡ及び酵母ピキア・パトリスＧＳ１１５（Pichia pastoris GS115、以下、「ピキア酵母ＧＳ１１５」という）用発現ベクターｐＨＩＬ３０１（ヒスチジン及びネオマイシン耐性遺伝子含有、特開平２−１０４２９２号、欧州特許公開０３３９５６８号公報参照）を、制限酵素EcoRIで消化した後、ライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて結合させ、組み換え発現ベクターを作製した。【００８１】
エレクトロポレーション法を用いて、上記で調製した組み換え発現ベクターをピキア酵母ＧＳ１１５（インビトロジェン社製）へ導入した。ベクターを導入したピキア酵母ＧＳ１１５を、ヒスチジンを含まない、G418含有培地で培養することにより、目的のMK遺伝子を持つ複数のクローンを得た。得られたクローンを、メタノールで誘導しながら培養を行った。培養上清を採取し、ウサギ抗マウスMKポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロット解析を行うことにより、当該クローンがMKを分泌するかどうか確認した。【００８２】
誘導により、培養上清中にMKを分泌するクローンの１つをT3L-50-4Pと名付け、このクローンを培養した（特開平７−３９８８９号公報参照）。培養上清からMKの分泌産物を回収し、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンカラムを使用したアフィニティクロマトグラフィーによって精製し、高純度MKを得た。【００８３】
２−２．免疫
抗原をMKノックアウトマウスに免疫した。抗原の調製はマウス1匹あたり10μgを生理食塩水で0.1mlに希釈したものを抗原溶液とし、FCA0.1mlと混合し乳化させマウスの背皮に皮下投与した。2週間毎に8回免疫操作をした。8回目の免疫は抗原溶液のまま10μgを生理食塩水0.1mlに溶解し、マウス尾静脈に静脈注射した。【００８４】
4回免疫後6日目と、6回免疫後8日目に、マウスの眼底から採取した血清を用いて、血中抗体価をELISA法にて調べた。【００８５】
ELISA法は、以下の方法により行った。まず、抗原溶液をPBS（ｐH7.2〜7.4）で、1.0μg/mlあるいは0.1μg/mlの濃度に調製し、50μl/wellあるいは100μl/wellで96wellアッセイプレート（FALCON社製、353912あるいはNUNC社製、468667）に分注して4℃で一晩静置して抗原を固相化させた。0.05％Tween 20-PBSで3回洗浄後、ブロックエース（大日本製薬製）4倍希釈を100μl/wellあるいは1% BSA（和光純薬工業社製、014-15134）-0.05％Tween 20-PBSを300μl/wellで加え、37℃で2時間あるいは4℃で一晩静置してブロッキングを行った。0.05％Tween 20-PBSで3回洗浄後、培養上澄原液を50μl/wellあるいは精製抗体1μg/mlを100μl/well加え、37℃あるいは室温で1時間静置した。0.05％Tween 20-PBSで3回洗浄後、2次抗体として、ブロックエースで10倍に希釈したヤギ抗マウスIgG＋IgM HRP標識（Goat anti-Mouse IgG+IgM HRP conjugate）（BIOSOUCE社製、AMI3704）10000倍希釈を50μl/wellあるいは1% BSA-0.05％Tween-PBSで10000倍希釈したウサギ抗マウスIgG HRP標識（Rabbit anti-Mouse IgG (H+L), peroxidase conjugated）（PIERCE（ピアス）社製、31452）を100μl/well加え、37℃あるいは室温で1時間静置した。0.05％Tween 20-PBSで3回洗浄後、HRP基質（基質液（クエン酸一水和物 10.206mg/ml、リン酸水素二ナトリウム12水 36.82mg/ml in distilled H2O） 25ml、OPD 10mg、30％H2O2 5μl）を50μl/wellあるいはTMB+Substrate Chromogen（ダコ（DAKO）社製、S1599）を100ul/wellで加え、室温、遮光した状態で20分間静置した。1N硫酸50μl/wellを加えて反応を停止させ、492nmあるいは450nmの波長で測定した。【００８６】
6回免疫後8日目に行なったELISA法で十分な抗体価があったので追加で2回免疫した3日後に細胞融合を行なった。【００８７】
２−３．細胞融合
マウスを捕定し胸部をアルコール綿で拭き、2.5mlのシリンジと23Gの針を用いて心臓採血を行った。採血した後、マウスを消毒用アルコール20mlの入ったビーカーに3分間程度入れた。採血した血液は1.5ｍｌチューブに入れ37℃で1時間放置した後、4℃で一晩放置し、3,000rpmで10分間遠心分離した。血清を他の1.5ｍｌチューブに移し0.05％アジ化ナトリウムを加え4℃で保存した。【００８８】
採血したマウスの上皮をはさみとピンセット用いて剥がした。さらに、内皮を持ち上げ切込みをいれて脾臓を取り出した。あらかじめシャーレ5枚に分注しておいた200ｍｌのRPMI1640 S.P培地で順に5回洗浄した。洗浄後、脾臓をメッシュに乗せハサミで数回切込みを入れ、ガラス棒ですり潰し、RPMI1640 S.P培地で網を洗い、40mlのガラス遠沈管に脾臓細胞を集めた。集めた脾臓細胞は1200rpmで10分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで吸い上げ、RPMI1640 S.P培地を40ｍｌ入れ1200rpmで10分間遠心分離した。得られた秘蔵細胞にRPMI1640 S.P培地を40ｍｌ加えよく攪拌し、血球計算版で細胞数を計測した。【００８９】
シャーレに入っているミエロ―マ細胞（P3U1）を、ピペットを用いて数回吹きつけ、50ｍｌの遠沈管に集めた。1000rpmで5分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで除きRPMI1640 S.P培地を40ｍｌ加え、1000rpmで5分間遠心分離した。得られたミエローマ細胞にRPMI1640 S.P培地を40ｍｌ加えてよく攪拌し、血球計算版で細胞数を計測した。【００９０】
上述の細胞数の計測の結果を基に、脾臓細胞5に対してミエローマ細胞1となるよう、脾臓細胞が入っていた50ｍｌのガラス遠沈管にミエローマ細胞を入れた。混合した後、1200rpmで10分間遠心分離し、上澄を吸引ピッペットで吸い取りタッピングをした。タッピング後、PEG（ポリエチレングリコール）1ｍｌを、1分間かけて混合しながらゆっくり添加し、そのまま、2分間混合する。PEGの混合後、あらかじめウォーターバスに入れ37℃に加温しておいたRPMI1640 S.P培地1ｍｌを、1分間かけて混合しながらゆっくり添加した。これを3回繰り返した。その後、37℃に加温しておいたRPMI1640 S.P培地10ｍｌを、3分間かけて混合しながらゆっくり添加した。培地添加後、37℃、5％CO2インキュベーターで5分間加温した後、1,000rpmで5分間遠心分離し、上澄を吸引ピペットで吸いタッピングをした。【００９１】
タッピング後、（細胞を播種するプレートの枚数）×10ｍｌのRPMI1640 S.P 15%FCS HAT培地を吹き付け、8連のマイクロピッペット(各100μl）と専用の受け皿を使い、イエローチップを用いて96wellプレートに細胞を播種した。37℃、5％CO2インキュベーターで7日〜14日培養し、コロニーの成長具合を見てELISAで抗体産生能をスクリーニングした。【００９２】
２−４．抗MK陽性抗体産生ハイブリドーマの選択
細胞融合から10日後、96well培養プレートの上清を使用しELISA法にて優位に吸光度の高い12wellをクローニング用サンプルとした。ハイブリドーマの細胞数を数え、96well培養プレートの３列に5 cells/well、３列に1 cell/well、2列に0.5 cells/wellとなるようにハイブリドーマ細胞を播種した。また、各wellにフィダー細胞を1×106 cells/wellとなるように播種した。クローニング後5日目にコロニーカウントを行い、コロニーが1個であるwellを確認し、2〜3日毎に培地を交換し、コロニーがwellの1/3をしめてきたところでELISA法を用いてコロニーが1個で陽性反応を示すwellを選択し、コロニー1個でELISAにおいて陽性であり、かつ細胞の状態が良好な２種類のwellから得られた細胞をハイブリドーマＣＳＭ−１、ハイブリドーマＣＳＭ−４と名付け、樹立株とした。得られたハイブリドーマを用い、ヌードマウスでの腹水化法により抗体を作製し、プロテインＧカラムで精製した。【００９３】
上述と同様に０．１μｇ／ｍＬに調製した抗原溶液を固相化させた96wellアッセイプレートを用いて得られた抗体の抗体価を測定した結果、ＣＳＭ−１及びＣＳＭ−４のＤ４５０値は、２．５及び２．６を示した。【００９４】
（実施例２）マウス抗ヒトＭＫモノクローナル抗体の細胞遊走活性測定
１．ＭＫ固相化チャンバーの作製
ポアサイズ8μｍの24穴プレート用ケモタキセル（倉敷紡績社製）の底面を上に向け、精製水に溶解したＭＫ（20μg/ml）を30μl/チャンバーとなるように滴下し、チップの先端で均一となるよう塗布した。室温で１時間静置した後、ＰＢＳ（リン酸バッファーサリン）で２回洗浄した。【００９５】
ＢＳＡ（シグマ（SIGMA）社製、A4503）をＤＭＥＭ（4,500mg/ml glucose Dulbecco's Modified Eagle's medium、シグマ社製、D5796）に最終濃度が0.3％となるよう溶解し、0.2μmフィルターでろ過滅菌した培地（以下、「0.3%BSA DMEM」という）を、450μl/wellとなるように24wellプレート（TPP社製、#92424、販売元：ＢＭ機器）に添加した。0.3％ＢＳＡ ＤＭＥＭで100μg/mlに希釈した実施例1で得られた各マウス抗ヒトＭＫ抗体を50μl加え（終濃度10μg/ml）、コントロールのWellには0.3％ＢＳＡ ＤＭＥＭのみを50μl加えた後、各wellに上記で作製したＭＫ固相化ケモタキセルをセットした。【００９６】
２．ラット骨芽細胞様細胞UMR106の用意
10％ＦＣＳ ＤＭＥＭ（4,500mg/ml glucose Dulbecco's Modified Eagle's medium、シグマ社製、D5796）に懸濁したラット骨芽細胞様細胞UMR106（ATCC No.CRL1661）を直径10cmディッシュ（TPP社製、#93100、販売元：ＢＭ機器）に1×106cells/10ml medium/dishとなるように播種し、37℃、5%CO2で2日間培養した。培養後、培地を除去し、0.25％トリプシン−ＥＤＴＡ（ギブコ（GIBCO）社製、25200-056）を3ml加え、37℃、5％CO2で2分間静置した。ディッシュを軽くたたいて細胞を剥がし、10％ＦＣＳ ＤＭＥＭ（4,500mg/ml glucose Dulbecco's Modified Eagle's medium、シグマ社製、D5796）を7ml加えて懸濁させ、遠心管に回収した。回収した細胞懸濁液の一部を採取して細胞数を測定した。培養後の細胞数は4〜8×106cells/dishであった。残りの細胞懸濁液を1200rpm（260Xg）で3分間遠心分離を行い、沈殿物を0.3%ＢＳＡ ＤＭＥＭに懸濁して回収した。細胞濃度が、1×106cells/mlとなるように0.3%ＢＳＡ ＤＭＥＭを加えて懸濁させた。【００９７】
３．ラット骨芽細胞様細胞UMR106遊走試験
上記２．で作製した細胞懸濁液（1×106cells/ml）を上記１．でセットしたケモタキセルの内層に200μl/チャンバー（2×105cells/チャンバー）となるよう加え、37℃、5%CO2、で4時間培養した。培養後、ケモタキセルの内側の細胞を培地と共に除去し、ＰＢＳ200μlで2回洗浄し、チャンバーの底面の角にペーパータオルを当てて水分を除去した。24wellプレートに−20℃冷凍庫で冷却した100%メタノールを500μl/well添加し、ケモタキセルをセットした。室温で20分間静置した後、ケモタキセルの内面を綿棒でこすって洗浄した。24wellプレートに1%クリスタルバイオレット水溶液を100μl/wellとなるよう添加し、チャンバーの外面のみが色素と接触するようケモタキセルをセットした。室温で30分間静置後、チャンバーの底面の角にペーパータオルを当てて色素を除去した後、チャンバーを500mlビーカーに満たした水に浸して洗浄した。室温で一晩静置して乾燥させた後、24wellプレートに1%SDS、1%Triton X-100を200μl/wellとなるよう添加し、ケモタキセルをセットした。室温で1時間振とうさせた後、150μlを96wellプレート（NUNC社製、#469957）に移し、ＯＤ590nm（POWERSCAN HT、大日本住友製薬）を測定した。抗体未添加サンプル（コントロール）のＯＤ値に対する抗体添加サンプルのＯＤの割合（％）を算出し抗体の活性を評価した。【００９８】
結果を表１に示す。表１で示されるとおり、本発明の抗体はＭＫによる細胞浸潤誘導を有意に抑制した。本結果から、本発明の抗体は、ＭＫが関与する細胞遊走に起因する各種疾患の治療薬及び予防薬として利用可能であることが示された。
（表１）ＵＭＲ１０６細胞浸潤(％  of  control)
――――――――――――――――――――――――――――――――――
ＣＳＭ−１              ＣＳＭ−４
――――――――――――――――――――――――――――――――――
平均値±標準偏差    ４１．０±２２．１        ３１．５±１．７
――――――――――――――――――――――――――――――――――【００９９】
（実施例３）ヒトＭＫ上のエピトープ解析
１．インサート作製
ｐｃＤＮＡ３．１（−）（インビトロジェン社製、V795-20）にヒトＭＫのコード領域をクローニングしたプラスミドを鋳型として、センスPCRプライマー：5'-AAAAAGAAAGATAAGGTGAAGAAGGGCGGCCCG-3'（配列番号５）、5'-AAGAAGGGCGGCCCGGGGAGCGAGTGC-3'（配列番号６）、5'-TGCGCTGAGTGGGCCTGGGGG-3'（配列番号７）、5'-TGCAAGTACAAGTTTGAGAACTGGGGT-3'（配列番号８）、及び、ヒスチジン（His×6）タグ配列、終止コドン、及び制限酵素XhoIに認識される配列（5'-CTCGAG-3'）を付加した、アンチセンスPCRプライマー：5'-AGTTCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGTCCTTTCCCTTCCCTTT-3'（配列番号９）、5'-AGTTCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGTCGGCTCCAAACTCCTT-3'（配列番号１０）、5'-AGTTCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGGCACCCTGCACCGGAT-3'（配列番号１１）、5'-AGTTCTCGAGTCA ATGATGATGATGATGATGGCAGGGCTTGGTGACGCG-3'（配列番号１２）を使用して、94℃→55℃→72℃の温度変化を１サイクルとする30サイクルのＰＣＲによりMK_1-121（ＭＫ全長）、MK_1-61（Ｎ―フラグメント＋ループ）、MK_7-51、MK_15-61（Ｎ―ドメイン＋ループ）、MK_15-51（Cys52を除いたＮ-ドメイン)、MK_62-121（Ｃ―フラグメント)、MK_62-104（Ｃ-ドメイン)のインサートを作製した（ここで、「MK_a-b」とは、ＭＫのa番目のアミノ酸からb番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するペプチドをコードするＤＮＡを示す）。【０１００】
また、二段階ＰＣＲ（overlap extension法）により、Ｎ―フラグメント＋ループ（MK_1-61）のＮ−ドメイン部分にアラニンポイントミューテーションをかけた、MK_1-61(W18A)、MK_1-61(W20A)、MK_1-61(P22A)、MK_1-61(T24A+P25A)、MK_1-61(S26A)、MK_1-61(S27A)、MK_1-61(K28A)、MK_1-61(V32A)、MK_1-61(F34A)、MK_1-61(R35A)、MK_1-61(E36A)、MK_1-61(T38A)、MK_1-61(Q42A)、MK_1-61(T43A)、MK_1-61(Q44A)、MK_1-61(R45A)、MK_1-61(I46A)、MK_1-61(R47A)、MK_1-61(R49A)、またはＣ―フラグメント（MK_62-121）のＣ−ドメイン部分にアラニンポイントミューテーションをかけた、MK_62-121(K63A)、MK_62-121(Y64A)、MK_62-121(K65A)、MK_62-121(F66A)、MK_62-121(E67A)、MK_62-121(N68A)、MK_62-121(W69A)、MK_62-121(D73A)、MK_62-121(R81A)、MK_62-121(T84A)、MK_62-121(K86A)、MK_62-121(K87A)、MK_62-121(R89A)、MK_62-121(Y90A)、MK_62-121(Q93A)、MK_62-121(Q95A)、MK_62-121(E96A)、MK_62-121(R99A)、及び、MK_62-121(K102A)のインサートを作製した（ここで、「MK_a-b(XcY)」（a、b、cは数字、X、Yは大文字英字）とは、ＭＫのa番目のアミノ酸からb番目のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するペプチドであって、ＭＫのｃ番目のアミノ酸がXからYに変異しているペプチドをコードするＤＮＡを示す。X及びYは、アミノ酸を一文字表記により表したものである）。【０１０１】
これらのインサートをＤＮＡブランティングキット（タカラバイオ社製、6025）を用いて両端を平滑化し、続いて制限酵素Xho I（タカラバイオ社製、1094A、以下同じ）で処理することにより３’側を突出末端とした。【０１０２】
２．プラスミドベクター作製
次に、ｐＧＥＸ−６Ｐ−２（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、27-4598-01）プラスミドベクターを制限酵素 Sma I（東洋紡社製、SMA-111T) および Xho I で処理した。処理後のベクター（Sma I 切断部位は平滑末端）に、１．で作製した各インサートを、ＤＮＡライゲーションキットVer. 1（タカラバイオ社製、6025）を用いて挿入し、ＭＫ配列の前に開始コドン及びＧＳＴコーディング領域を有するプラスミドベクターを作製した。【０１０３】
作製したプラスミドベクターを用いて、ヒートショック法により水浴中で42℃、30秒熱処理を行い、Competent high E.coli JM109（東洋紡社製、DNA-900）をトランスフォーメーションした。これを、100μg/mlアンピシリンＬＢ(Luria-Bertani)培地に播き、37℃、一晩静置して複数のシングルコロニーを得た。各シングルコロニーを7mlの100μg/mlアンピシリンＬＢ培地で、37℃、一晩培養し、Mini Prep 法（J. Sambrook and D. W. Russell: Molecular Cloning: a laboratory manual, 3rd ed. (2001) Vol. I, p1.32-1.34参照）によりプラスミドを精製した。このプラスミドをベクター側のｐＧＥＸ５’シークエンシングプライマー（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、27-1410-01）を使用してＤＮＡ配列解析（アプライドバイオシステムズ社製、3730xl DNA Analyzer）を行い、目的のプラスミドを持つシングルコロニーを選んだ。【０１０４】
シングルコロニーを2mlの100μg/mlアンピシリンLB培地に投入し、37℃で一晩培養した。培養液20μlを2mlの100μg/mlアンピシリンLB培地に移し、37℃で、2時間培養後、終濃度0.2mMとなるようにIPTGを添加し、37℃で、2時間誘導して目的のタンパク質を得た。この培養液から1mlを回収し、1,900g、3分間遠心分離した。上清を捨て、沈殿物を200μlのサンプルバッファー（4％ SDS、10％ メルカプトエタノール、10％ グリセロール、0.1M Tris-HCl、pH 7.2）に分散し、10秒間、3回の超音波処理をおこなった。【０１０５】
３．マウス抗ヒトＭＫモノクローナル抗体のエピトープ測定
全長ＭＫ、部分ＭＫ（MK_1-61、MK_15-61、MK_7-51、MK_15-51、MK_62-121、及び、MK_62-104）、並びに、MK_1-61及びMK_62-121のアラニンミュータント3.5μlを12％ポリアクリルアミドゲル２枚に同じパターンでロードして電気泳動をおこなった。１枚目のゲルは、ＣＢＢ（Coomassie Brilliant Blue）染色し、各タンパク質の発現量が同程度であるかを確認した。２枚目のゲルは、セミドライ方式（6V、2.5h）でPVDF膜に転写した。このPVDF膜を5% スキムミルク-0.05％ Tween 20-PBSにて室温で２時間ブロッキングした後、実施例１で取得したマウスモノクローナル抗MK抗体2μg/mlを含有する0.05％ Tween 20-PBSを添加し、4℃で一晩静置した。0.05％ Tween 20-PBSで10分、3回洗浄後、1/10,000 Anti-Mouse IgG Peroxidase Conjugated（ピアス（PIERCE）社製、31452）-0.05％ Tween 20-PBSを添加し、室温で1時間静置した。さらに、0.05％ Tween 20-PBSで10分、3回洗浄後、TMB Membrane Peroxidase Substrate System（キルケガードアンドペリーラボラトリーズ（Kirkegaard & Perry Laboratries：KPL）社製、50-77-00）にて発色させた。【０１０６】
全長ＭＫ及び部分ＭＫ（MK_1-61、MK_15-61、MK_7-51、MK_15-51、MK_62-121、及び、MK_62-104）、並びに、MK_1-61及びMK_62-121のアラニンミュータントの発色強度を比較し、エピトープが含まれる部位を探索した。エピトープがＮ−ドメインまたはＣ−ドメインにある場合には、MK_1−61またはMK_62-121のドメイン内アラニンミュータントとそれぞれのワイルドタイプ（ミューテーションなし）の発色強度を比較し、アラニンポイントミューテーションをおこなったアミノ酸残基がエピトープにどの程度関与しているかを検討した。【０１０７】
結果を図３に示す。本結果より、ＣＳＭ−１は、ＭＫの６４番目のチロシン、６５番目のリシン、６７番目のグルタミン酸、８４番目のトレオニン、８６番目のリシンに対して抗原性が大きく低下しており、６６番目のフェニルアラニン、６９番目のトリプトファン、７３番目のアスパラギン酸、９６番目のグルタミン酸に対して抗原性が低下することから、ＭＫの６４番目のチロシン、６５番目のリシン、６７番目のグルタミン酸、８４番目のトレオニン、８６番目のリシン、６６番目のフェニルアラニン、６９番目のトリプトファン、７３番目のアスパラギン酸、９６番目のグルタミン酸（特に、６４番目のチロシン、６５番目のリシン、６７番目のグルタミン酸、８４番目のトレオニン、８６番目のリシン）を認識していることが示された。【０１０８】
ＣＳＭ−４は、ＭＫの６４番目のチロシン、８７番目のリシン、９０番目のチロシンに対して抗原性が大きく低下しており、６６番目のフェニルアラニン、９６番目のグルタミン酸に対して抗原性が低下することから、ＭＫの６４番目のチロシン、８７番目のリシン、９０番目のチロシン、６６番目のフェニルアラニン、９６番目のグルタミン酸（特に、６４番目のチロシン、８７番目のリシン、９０番目のチロシン）を認識していることが示された。【０１０９】
（実施例４）ＣＳＭ−１及びＣＳＭ−４のＣＤＲ配列の解読
当業者周知の方法（Johanssonら,J.Exp.Med.,180,pp.1873-1888(1994)及びOrlandiら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,pp.3833-3837(1989)参照）により、実施例１で得られたマウス抗ヒトＭＫモノクローナル抗体ＣＳＭ−１及びＣＳＭ−４のＣＤＲ配列を解析した。その結果、ＣＳＭ−１は、重鎖のＣＤＲ配列が、ＣＤＲ１：ＤＹＦＬＨ（配列番号１３）、ＣＤＲ２：ＲＩＤＰＥＤＳＥＴＫＹＡＰＫＦＱＧ（配列番号１４）、ＣＤＲ３：ＮＹＧＧＧＧＦＡＹ（配列番号１５）であり、軽鎖のＣＤＲ配列が、ＣＤＲ１：ＫＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡ（配列番号１６）、ＣＤＲ２：ＳＡＳＹＲＹＴ（配列番号１７）、ＣＤＲ３：ＱＱＨＹＳＳＰＦＴ（配列番号１８）であった。また、ＣＳＭ−４は、重鎖のＣＤＲ配列が、ＣＤＲ１：ＳＹＷＭＮ（配列番号１９）、ＣＤＲ２：ＭＩＨＰＳＤＳＥＴＩＬＮＱＫＦＫＤ（配列番号２０）、ＣＤＲ３：ＷＳＡＫＲＧＤＦ（配列番号２１）であり、軽鎖のＣＤＲ配列が、ＣＤＲ１：ＲＡＳＥＳＩＳＮＮＬＨ（配列番号２２）、ＣＤＲ２：ＹＡＳＱＳＩＳ（配列番号２３）、ＣＤＲ３：ＱＱＳＮＳＷＰＬＴ（配列番号２４）であった。【０１１０】
（実施例５）マウス抗ヒトＭＫモノクローナル抗体のＥＡＥモデル動物試験
１．Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide（ＭＯＧ）エマルジョンの調整
Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55（ＭＯＧ、東レリサーチセンター、配列：ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）１０ｍｇを純水５ｍＬに溶解して２ｍｇ／ｍＬのＭＯＧペプチド溶液を調整した。Heat-killed Mycobacterium tuberculosis H37Ra（ＭＴＢ）１ｍｇ／ｍＬ含有Complete Freund's adjuvant（ＣＦＡ、ＳＩＧＭＡ）に、ＭＴＢ（Ｄｉｆｃｏ）を加え、ＭＴＢを３ｍｇ／ｍＬ含有するＭＴＢ  ＣＦＡ溶液を調製した。ＭＯＧペプチド溶液に等量のＭＴＢ  ＣＦＡ溶液を加え、エマルジョン化するまで混合した。ビーカーに入れた水の上に混合物を一滴滴下し、分散しないことでエマルジョン化を確認した。
２．ＭＯＧ感作
マウスは、メス７週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌ（日本クレア、富士生育場）を使用した。入荷後、８日間飼育し、外見及び行動に異常がないことを確認した。８週齢となったマウスに、生理食塩水で５倍に希釈したソムノペンチル（ペントバルビタールナトリウム、共立製薬）を１００μＬ腹腔内投与し、麻酔した。マウスの背から腰の部分の毛を刈り、１．で作成したＭＯＧエマルジョン各５０μＬを４箇所、皮下に注入した。マウスが麻酔から回復した後、終濃度が２μｇ／ｍＬとなるよう生理食塩水で１００倍に希釈した０．２ｍｇ／ｍＬ  Pertussis toxin  ５０％グリセロール溶液（ＰＴＸ、ＳＩＧＭＡ）１００μＬを腹腔内投与した。また、ＭＯＧ感作日を０日目として、２日後にＰＴＸを同量、腹腔内に投与した。
３．抗体の投与
ＭＯＧ感作及びＰＴＸ投与後、マウスの体重を測定し、体重が均等に分散するようにコントロール群、各抗体投与群に、各４匹を群分けした。ＣＳＭ−１及びＣＳＭ−４の各抗体は生理食塩水（大塚製薬）で１ｍｇ／ｍＬとなるよう希釈し、マウスの体重２０ｇにつき２００μＬを腹腔内に投与した（１０ｍｇ／ｋｇ体重）。投与は、ＭＯＧ感作日を０日目として、０、４、７、１１、１４日目に計５回行った。コントロール群には、抗体を含まない生理食塩水をマウスの体重２０ｇにつき２００μＬとなるよう投与した。
４．病態観察
感作後、毎日マウスの病態について観察を行った。病態の判定は、以下の臨床スコアにより行った。
臨床スコア
０：症状なし
０．５：尾がやや垂れる
１：尾が完全に垂れる
２：裏返せる、傾いて少しふらふら歩く
３：尻を床に着けて歩く、裏返すとなかなか戻れない
４：胸を床に着けて歩く、前足も弱い、時々くるくる回って歩く
５：完全に後足が伸びきって動かない
６：瀕死、または死亡
５．結果
抗体としてＣＳＭ−１を投与した結果を図４に、抗体としてＣＳＭ−４を投与した結果を図５に示す。図に示すとおり、ＣＳＭ−１及びＣＳＭ−４のいずれを投与した場合にも、ＥＡＥモデルマウスにおける発症が抑制されていた。ＥＡＥモデルマウスは多発性硬化症のモデルとして用いられることから、本実験結果より、ＣＳＭ−１及びＣＳＭ−４が、多発性硬化症の治療及び予防効果を有することが示された。【０１１１】
（実施例６）マウス抗ヒトＭＫモノクローナル抗体の結合部位の検討
プロテイン・データ・バンクよりＭＫの立体構造を入手し、Pymol(ver.0.99)を使用してＭＫの静電ポテンシャルを計算した。計算された静電ポテンシャルと、実施例３で得られたＣＳＭ−１及びＣＳＭ−４のエピトープとの関係を検討した結果、いずれも６２〜６４番目のアミノ酸、６６番目のアミノ酸、６８〜７０番目のアミノ酸、７２番目のアミノ酸、７９番目のアミノ酸、８１番目のアミノ酸、８５〜８９番目のアミノ酸、１０２番目のアミノ酸、及び、１０３番目のアミノ酸により形成される高静電ポテンシャル部位のうち３個のアミノ酸を認識していることが示された。また、これらの高静電ポテンシャル部位のうち、特に正電荷をもつアミノ酸である、６３番目リジン、７９番目リジン、８１番目アルギニン、８６番目リジン、８７番目リジン、８９番目アルギニン、及び、１０２番目リジンのうち１個のアミノ酸を認識していることが示された。これらの結果から、上述のＣＳＭ−１及びＣＳＭ−４の効果は、ＭＫの高静電ポテンシャル部位と結合することにより発揮されていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１２】
本発明の抗体またはその断片は、ＭＫの機能を阻害することから、ＭＫ関連疾患の治療剤または予防剤として有用である。また、本発明の抗体は、ＭＫ関連疾患の診断薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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