(57)【要約】  本発明は、組織滞留性キトサンゲルの抗腫瘍活性を初めて見出したことに基づき、組織滞留性キトサンゲルを含有する抗腫瘍剤組成物を提供する。本発明の組織滞留性キトサンゲルは、糖鎖を導入したキトサン誘導体を基本とし、その糖鎖含有キトサン誘導体に光反応性基を更に導入して光架橋させたキトサンゲル、あるいは、糖鎖含有キトサン誘導体と他の物質、例えば酸性多糖類とのポリイオンコンプレックスからなるキトサンゲルが好ましい。本発明の抗腫瘍剤組成物は、腫瘍の近傍に配置しておくだけで、腫瘍組織に接触することなく腫瘍成長を抑制できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織滞留性キトサンゲルを含有する抗腫瘍剤組成物。
【請求項２】
前記組織滞留性キトサンゲルが、下記式（１）及び（２）：
2008096547.tif 000013
で表される構成単位を含んで成るキチン・キトサン類のグルコサミン単位（１）の２位のアミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖鎖を導入した糖鎖含有キトサン誘導体と、酸性多糖類とから形成されるポリイオンコンプレックスからなることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酸性多糖類が、低分子量ヘパリン又はフコイダンであることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組織滞留性キトサンゲルが、下記式（１）及び（２）：
2008096547.tif 000014
で表される構成単位を含んで成るキチン・キトサン類のグルコサミン単位（１）の２位のアミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖鎖を導入し、他の少なくとも一部に光反応性基を導入してなる光反応性キトサン誘導体を光架橋させたゲルであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
アミノ酸及び/又は糖類を更に含有することを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記アミノ酸が必須アミノ酸であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記糖類が、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコースから選択される中性糖であることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
抗癌剤を更に含有することを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織滞留性キトサンゲルを含有する抗腫瘍組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
キトサンは抗菌性を持ち、さらに創傷治癒促進効果も示すことから、創傷被覆材等の素材としての用途が期待され、また、その生分解性に基づきドラッグデリバリーの薬物担体としての使用も模索されていた。
しかしながら、キトサンは元来、酸性条件下でしか水に可溶化しないことから、上記用途に適したゲル状水性組成物の調製は困難であった。本発明者等は、キトサンに水溶性の糖鎖構造を導入することにより、キトサンに中性ｐＨ領域での水溶性を付与することに成功した（特許文献１）。【０００３】
さらに本発明者等は、糖鎖含有キトサン誘導体をゲル化して薬剤を包接させる検討を行い、糖鎖含有キトサン誘導体のキトサン骨格に光反応性基を導入し、光架橋させることによってゲル化さする方法を確立した。これらのキトサンゲルは生理的条件下で水不溶性となり、適度な強度と弾性を維持するので、木駅の組織部位に滞留することができる。また、形成されたキトサンゲルは、その内部に薬物を安定に包接することができ、キトサンの生分解によって包接された薬物を徐放する性質を有するため、ドラッグデリバリーにおける薬物担体として極めて優れている。【０００４】
本発明者等は実際に、光架橋したキトサンゲル（特許文献２）及びキトサンと低分子化したヘパリンとのポリイオンコンプレックスからなるキトサンゲル（特許文献３）に細胞増殖因子（ＦＧＦ）を加えた組成物が、目的とする組織部位において内包されたＦＧＦを徐々に放出することにより、血管新生を誘導して創傷治癒を格段に促進することを確認している。【０００５】
このように、糖鎖修飾したキトサン誘導体に光反応性基を導入して架橋させたり、酸性多糖類と複合体を形成させたりすることにより、ドラッグデリバリーの薬物担体として極めて優れた特性を得ることができた。本発明者等はさらに、光架橋したキトサンゲルに抗癌剤の一種であるパクリタキセルを内包させ、それを腫瘍組織の近傍に配置してパクリタキセルを徐放させることによって、パクリタキセルを単独で局所投与した場合に比較して格段に優れた腫瘍成長抑制効果が発揮されることを確認した（非特許文献１）。
【特許文献１】ＷＯ００／０２７８８９号パンフレット
【特許文献２】ＷＯ０３／０９０７６５号パンフレット
【特許文献３】ＷＯ２００５／０２５５３８号パンフレット
【非特許文献１】K. OBARA, et al., J. Control Release, 110, 79-89 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、抗癌剤を含む様々な薬物を包接し、目的組織に良好に滞留して包接された薬物を徐放する担体として糖鎖含有キトサンゲルが特に適していることはわかっていたが、当該キトサンゲル自体が抗腫瘍活性を有することは知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
即ち本発明は、組織滞留性キトサンゲルが抗腫瘍活性を有することを初めて見出したことに基づき、当該キトサンゲルを含有する抗腫瘍剤組成物を提供する。
本発明における「組織滞留性キトサンゲル」とは、目的とする組織部位に所定時間滞留できる性質を有するキトサンゲル、好ましくはハイドロゲルを意味する。本発明における組織滞留性キトサンゲルは、不溶化したキトサン分子及び溶媒（好ましくは水）を癌入試、目的組織部位に滞留する性質を有していればよく、当該キトサン分子は糖鎖就職されていてもいなくてもよい。特に、糖鎖を導入したキトサン誘導体を基本とし、その糖鎖含有キトサン誘導体に光反応性基を更に導入して光架橋させたキトサンゲル、あるいは、糖鎖含有キトサン誘導体と他の物質、例えば酸性多糖類とのポリイオンコンプレックスからなるキトサンゲルが好ましい。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る抗腫瘍剤組成物は、組織滞留性キトサンゲルを含有しているため、目的とする組織部位に良好に滞留する。驚くべきことに、本発明に係る組成物を腫瘍の近傍に配置しておくだけで、当該腫瘍の成長を阻害することができる。即ち本発明の組成物は腫瘍組織の近傍にあればよく、腫瘍組織に接触させる必要はない。【０００９】
また、本発明に係る組成物に、組織滞留性キトサンゲルに加えてアミノ酸及び／又は糖類を共存させることにより、好中球を中心とする多核球がキトサン層及び腫瘍内部にも浸潤することが明らかになった。この現象に基づいて、引き続いてキトサンゲル自身の生分解が起こると同時に炎症性サイトカイン等が放出され、腫瘍成長が阻害されると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】癌細胞を植え付けたマウスにおける、本発明の組成物、ヒアルロン酸、及び生理食塩水を注入した場合の腫瘍の変化を示す写真である。
【図２】腫瘍の最大面積の変化を示すグラフである。
【図３】本発明の組成物を注入した腫瘍における病理組織学的所見の変化を示す写真である。
【図４】本発明の組成物又は生理食塩水を注入した腫瘍における病理組織学的所見の変化を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
上記したように、本発明の抗腫瘍剤組成物は、組織滞留性キトサンゲルを必須成分として含有する。
本発明の組成物で使用される組織滞留性キトサンゲルは、一般にキチン・キトサン類と呼ばれている高分子骨格に糖鎖構造とを導入した構造を有する糖鎖含有キトサン誘導体を基礎としている。特に、少なくとも一部が脱アセチル化されたキチン・キトサン類を構成するグルコサミン単位の２位アミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖類を導入してなる誘導体が好ましい。【００１２】
通常、キチン・キトサン類は、カニ殻由来のキチン質（ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）をアルカリ処理することによって得られる脱アセチル化した酸可溶性画分であって、一般に下記式（１）、（２）で示される構成単位を有するものである。
2008096547.tif 000002
【００１３】
これらのキチン・キトサン類のうち脱アセチル化度の低いもの（通常４０％未満のもの）を「キチン」、そして脱アセチル化度の高いもの（通常４０％以上のもの）を「キトサン」と呼ぶこともあるが、以下、本明細書では、少なくとも一部が脱アセチル化されたキチン・キトサン類を総称して「キトサン」という。なお、本発明におけるキトサンは天然由来のものに限らず、化学的、酵素的、または発酵工学的に合成された類似構造を有する化学修飾糖鎖であってもよい。【００１４】
ここで、「脱アセチル化度」とは、キトサン（あるいは、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン）を構成する糖単位の２位のアセチルアミノ基が脱アセチル化によって遊離アミノ基に変換されている割合である。本明細書では、脱アセチル化度は、「健康食品規格規準集（その４）」財団法人日本健康・栄養食品協会（1996年）第55頁に記載の「コロイド滴定法」によって定量される。【００１５】
本発明の糖鎖含有キトサン誘導体は、このキトサンをさらに化学的に修飾することにより機能化したものであり、原料として使用されるキトサンとしては、脱アセチル化度が少なくとも４０％、特に６０〜１００％、さらに特に６５〜９５％の範囲にあるものが好適である。なお、脱アセチル化度が１００％のキトサンは、上記式（１）の構成単位のみからなり、式（２）の構成単位は含まない。
前記キトサンの分子量には特に制限はなく、最終のキトサン誘導体の使用目的に応じて広い範囲で変えることができるが、一般には、数平均分子量が５,０００〜２,０００,０００、好ましくは１０,０００〜から１,８００,０００、より好ましくは４０,０００〜１,５００,０００の範囲のものが適している。【００１６】
本発明で好ましい糖鎖含有キトサン誘導体は、上記キトサンを構成する式（１）のグルコサミン単位の２位のアミノ基の少なくとも一部に還元性末端を有する糖類を導入したものである。このようなキトサン誘導体の詳細については、ＷＯ００／２７８８９号パンフレット（特許文献１）を参照されたい。【００１７】
キトサン誘導体に導入される還元性末端を有する糖類としては、アルドース類、ケトース類が包含され、中でも、構成糖単位の数が２０個以下、特に１〜７個のものが好適に使用される。具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、フコース、マンノース、アラビノース、キシロース、エリトロース、ヘプツロース、ヘキシロースなどのペンタオースやヘキサオース；グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクサミンなどのアミノ糖類；ウロン酸類やデオキシ糖類などの糖誘導体；これらの単糖類を組み合わせた糖鎖からなる、マルトース、イソマルトース、ラクトース、メリビオース、マルトトリオースなどの二もしくは三糖類；各種オリゴ糖類などが挙げられるが、中でもマルトース、ラクトース、メリビオースなどの中性二糖類が好適である。
上記糖類に換えて、ポリエーテル、多価アルコールなどの有機化合物をキトサンに誘導することもできるが、生体適合性などの面で天然の糖鎖を利用するのが好ましい。【００１８】
キトサンの前記式（１）のグルコサミン単位の２位アミノ基への上記の糖類の導入は、それ自体既知の方法を用いて行うことができ、例えば、糖類の還元性末端をカルボキシル化した後、該２位アミノ基にアミド結合により結合させる方法（例えば、特開平１０−１２０７０５号公報参照）や、糖類の還元性末端をアルデヒド化またはカルボニル化した後、グルコサミン単位の２位アミノ基に、シッフ塩基を経由する還元アルキル化法により結合させる方法（例えば、キチン・キトサン研究会編「キチン・キトサンの応用」53-56頁、1990年2月20日、技法堂出版(株)発行参照）などが含まれる。
本発明でキトサンに導入される糖類は１種のみに限定されるものではなく、２種以上を組み合わせて使用することもできる。【００１９】
本発明のキトサン誘導体を構成する糖側鎖の具体例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限られるわけではない。
(i) ラクトースから誘導される糖鎖：
2008096547.tif 000003
(ii) マルトースから誘導される糖鎖：
2008096547.tif 000004
(iii) メリビオースから誘導される糖鎖：
2008096547.tif 000005
(iv) セロビオースから誘導される糖鎖：
2008096547.tif 000006
(v) ラミナリビオースから誘導される糖鎖：
2008096547.tif 000007
(vi) マンノビオースから誘導される糖鎖：
2008096547.tif 000008
(vii) Ｎ-アセチルキトビオースから誘導される糖鎖：
2008096547.tif 000009
【００２０】
上記(i)〜(vii)の糖側鎖のうち、左側に記載したものが、糖のカルボキシル基とキトサンの２位アミノ基との縮合によって導入される残基を表し、右側に記載したものが、シッフ塩基を介して結合させた残基を表す。
このようにして、キトサンのグルコサミン単位の２位アミノ基を糖類で置換することにより、キトサンの酸依存的溶解性が緩和され、中性領域での可溶化が達成される。
キトサンのグルコサミン単位の２位アミノ基の糖側鎖による置換度は、最終のキトサン誘導体に望まれる物性などに応じて変えることができるが、置換度が、一般的には０．１〜８０％、特に０．５〜６０％、さらに特に１〜４０％の範囲内にあるのが好適である。ここで、糖側鎖の「置換度」は、キトサンを構成する糖単位の２位のアミノ基が糖側鎖で置換されている程度であり、キトサンを構成する糖単位の２位の遊離アミノ基と置換アミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合として示す。本明細書では、糖側鎖の置換度は、硫酸中で糖鎖がフェノールと反応することに基づく特徴的な発色を４９０ｎｍの吸光度で検知する「フェノール−硫酸法」によって測定される（J.E.Hodge, B.T.Hofreiter, "Methods in Carbohydrate Chemistry", ed. by R.L.Whistler, M.L.Wolfrom, vol.1, p388, Academic Press, New York(1962)参照）。【００２１】
また、本発明のキトサン誘導体では、キトサンを構成する前記式（１）の糖単位の２位のアミノ基や、式（１）又は（２）の糖単位の３位あるいは６位の水酸基の少なくとも一部に、両親媒性基を導入してもよく、それにより架橋後のマトリクスに飛躍的に向上した含水性を付加することができる。この両親媒性基は、疎水性基を具備する疎水ブロックと親水基を具備する親水ブロックとを有する基であり、一般に界面活性剤機能を有する場合が多い。中でも、疎水ブロック（Ｘ）と親水ブロック（Ｙ）の分子量の割合が、Ｘ：Ｙ=１：５〜５：１のものが好適に用いられ、解離性のイオン基を持たない非イオン性の基がより好適に使用できる。特に、疎水性のアルキルブロックと親水性のポリオキシアルキレンブロックから構成される分子量が少なくとも９０以上、より好ましくは５００〜１０,０００のポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。疎水ブロックを持たないポリエーテル類も使用できるが、疎水ブロックと親水ブロックの両方を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテルが含水性向上の点から好ましい。【００２２】
かかる両親媒性基のキトサンへの導入は、例えば、両親媒性基の親水ブロック又は疎水ブロックのいずれか一方の末端に、アミノ基と反応して共有結合を形成しうる基、例えば、アルデヒド基やエポキシ基などを持つ化合物を導入した後、キトサンのグルコサミンの２位アミノ基と反応させる方法や、カルボキシル基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル誘導体とキトサンを縮合剤の存在下で反応させる方法、さらには酸クロリド基を有するポリオキシアルキレンアルキルエーテル誘導体とキトサンの水酸基やアミノ基と反応させる方法などを用いて行うことができる。【００２３】
例えば、末端にエポキシ基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基あるいは末端にアルデヒド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基をキトサンのアミノ基に導入した場合、キトサン骨格に結合した側鎖は下記式（ａ）あるいは（ｂ）で表される。また、末端に酸クロリド基を誘導したポリオキシアルキレンアルキルエーテル基をキトサンの３位または６位の水酸基に結合させた場合、キトサン骨格に結合した側鎖は、下記式（ｃ）で表される。ただし、下記式（ａ）〜（ｃ）におけるｎ及びｍは１以上の繰返し単位数である。
2008096547.tif 000010
本発明のキトサン誘導体における両親媒性基の導入の程度は、特に制限されるものではないが、導入後のキトサン誘導体の重量変化に基づいて、通常５〜７０％、好ましくは１５〜５５％の範囲内とすることができる。【００２４】
本発明の組成物で用いられるキトサンゲルは、上記した糖鎖含有キトサン誘導体に、（１）光反応性基を導入して光り架橋させる、あるいは（２）他の物質とポリイオンコンプレックスを形成させることにより、組織滞留性が付与されている。【００２５】
（１）光反応性基の導入
糖鎖含有キトサン誘導体を構成する前記式（１）のグルコサミン単位の２位アミノ基の少なくとも一部に光反応性官能基を導入することにより、光照射による自己架橋性が付与される。光反応性基を導入した糖鎖含有キトサン誘導体を、本明細書において「ＰＲＣ(Photo Reactive Chitosan)」と呼ぶこともある。
本発明に従ってキトサンの化学修飾に使用される光反応性官能基は、紫外線、特に約２００〜３８０ｎｍの近紫外領域を含む紫外線の照射によって該光反応性官能基同士で及び/又はキトサン中に存在するアミノ基あるいは水酸基などと反応して架橋結合を形成するような基を含み、例えば、ベンゾフェノン類、ケイ皮酸類、アジド類、ジオレフィン類、ビスアントラセンのような環状不飽和化合物などから誘導されるものが包含され、特に、カルボニルアジド基、スルホニルアジド基、芳香族アジド基を有するものが好適である。【００２６】
また、光反応性官能基は、約４００〜５００ｎｍ程度の可視光の照射で反応する置換基であってもよい。このような官能基としては、例えば、下記式であらわされるような、Journal of Polymer Science: Polymer Chemistry Edition, Vol.20, 1419-1432 (1982)に記載されたホルミルスチリル化合物等が挙げられる。
2008096547.tif 000011
（上記式中、Ａｒは、ピリジン、アルキルピリジニウム塩、キノリン、アルキルキノリニウム塩等の複素環を表す。）【００２７】
糖鎖含有キトサン誘導体のグルコサミン単位の２位のアミノ基への光反応性官能基の導入は、それ自体既知の方法により行うことができ、例えば、カルボキシル基を有するアジド化合物を縮合剤の存在下に該２位のアミノ基に結合させる方法（特開平１０−１２０７０５号公報参照）；酸クロリド基、アルデヒド基、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル基又はエポキシ基を介してアジド化合物を該２位のアミノ基と反応させる方法（キチン・キトサン研究会編「キチン、キトサンの応用」第45〜65頁、1990年2月20日、技報堂出版(株)発行、参照）等の方法により行うことができきる。上記のホルミルスチリル化合物のホルミル基をキトサンのアミノ基とカップリングさせることによっても好適に導入できる。【００２８】
なお、従来、アジド基の架橋反応において、ビスアジド以上の多官能性化合物が有効であるとされているが（特開平９−１０３４８１号公報参照）、本発明ではその必要はなく、モノアジド化合物の導入によっても、十分に自己架橋性を有するキトサン誘導体が得られる。【００２９】
しかして、本発明のキトサン誘導体（ＰＲＣ）を構成する光反応性官能基の具体例としては、例えば、紫外線の場合は、下記式（Ａ）から（Ｄ）で表されるものが挙げられる。式（Ａ）の基は、ｐ−アジド安息香酸から誘導されるものであり、式（Ｂ）の基は、ｐ−アジドベンズアルデヒドから誘導されるものであり、式（Ｃ）の基は、ｐ−ベンゾイル安息香酸から誘導されるものであり、式（Ｄ）の基は、ケイ皮酸から誘導されるものであり、そして式（Ｅ）は、１-メチル-４-[２-(ホルミルフェニル)エテニル]ピリジニウムから誘導されるものである。
2008096547.tif 000012
【００３０】
これらの光反応性官能基の導入の程度は、最終のキトサン誘導体に望まれる架橋反応に基づくゲル化（不溶化）の程度等に応じて変えることができるが、光反応性官能基の置換度が０.１％〜８０％、特に０.５〜５０％、さらに特に１〜３０％の範囲内にすることが望ましい。ここで、光反応性官能基の「置換度」は、キトサンを構成する糖単位の２位のアミノ基が光反応性感応基で置換されている程度であり、キトサンを構成する糖単位の２位の遊離アミノ基と置換アミノ基の合計に対する置換アミノ基の割合である。本明細書では、光反応性官能基、例えばアジド基の置換度は、４−アジド安息香酸の２７０ｎｍにおける特性吸収から得られる検量線に基づいて決定することができる。
本発明のキトサン誘導体における糖側鎖と光反応性官能基の合計の置換度は、特に制限されるものではなく、広い範囲にわたり変えることができるが、一般には０．２〜８０％、好ましくは１．５〜６５％、さらに好ましくは３〜５０％の範囲内とすることができる【００３１】
このようにして光反応性基を導入したキトサン誘導体（ＰＲＣ）は、光照射することによって容易に架橋してゲルを形成し、組織滞留性が付与される。【００３２】
（２）ポリイオンコンプレックスの形成
組織滞留性を付与する第二の方法は、糖鎖含有キトサン誘導体と、他の物質、好ましくは少なくとも１種の酸性多糖類とでハイドロゲルを形成させることである。
本発明で用いられる「酸性多糖類」とは、硫酸基、カルボン酸基等の酸性基を有する多糖類又はその構造の一部を有する天然又は合成の有機分子を含み、好ましくは、アルギン酸、あるいは、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸などのグリコサミノグリカンを含む硫酸化ムコ多糖、フコイダン等の多糖類、及びこれらの誘導体から選択される。これらの酸性多糖類の中で、ヘパリンを酵素的又は化学的に分解して得られる低分子量ヘパリンが好ましく、分解によって未修飾(天然）のヘパリンが有する抗凝固活性を低下させた低分子量ヘパリンが好ましい。特に好ましいのは、過ヨウ素酸分解したヘパリン（以下「ＩＯ４ヘパリン」とする）である。ＩＯ４ヘパリンの調製方法等は、例えば、K. Ono等, Br. J. Cancer; 86, 1803-1812 (2002)に記載されている。過ヨウ素酸で酸化されたヘパリン（ＩＯ４ヘパリン）は、アンチトロンビンＩＩＩと相互作用する特有の五単糖構造を持たないことが知られており、従って、その抗凝固活性は未収色ヘパリンに比較して格段に低い。【００３３】
塩基性のキトサン分子（糖鎖含有キトサン誘導体）は、酸性多糖類（ＩＯ４ヘパリン等）と複合し、イオン性相互作用を介してハイドロゲル（ポリイオンコンプレックス）を形成することにより組織滞留性が付与される。最近の実験結果によると、酸性多糖類としてフコイダンを用いた場合、フコイダン水溶液と糖鎖含有キトサン誘導体水溶液とを一定条件下で混合することにより、約１０μｍ程度の大きさの粒子が形成されることがわかった。このような粒子はピンセットで摘める一方、それらが分散した液は注射針を容易に通過できるため、目的組織への輸送及び目的組織での対流といった操作が極めて容易になる。【００３４】
本発明の抗腫瘍剤組成物は、上記したように光架橋又はポリイオンコンプレックスによって組織体粒性を付与された糖鎖含有キトサン誘導体（以下「組織滞留性キトサン誘導体」という）を必須成分として含有する。即ち、本発明の組織滞留性キトサンゲルは、組織滞留性キトサン誘導体と溶媒（好ましくは水性）を含有している。ここで用いられる溶媒は、好ましくは水性媒体であり、蒸留水、緩衝水溶液、生理食塩水、細胞培養液などが好ましく用いられる。
組織滞留性キトサンゲルは、他の有効成分を含んでいなくても、腫瘍組織の近傍に配置するだけで、腫瘍に接触することなく腫瘍の成長を阻害する効果を有する。【００３５】
本発明の組成物における組織体粒性キトサン誘導体の含有量は、腫瘍周辺部への注入性を確保し、なおかつ優れた組織滞留性を有するように調整される。例えば、光反応性基を導入した場合は、架橋前の水溶液を腫瘍近傍に注入した後に光架橋させてゲル化することができる。ポリイオンコンプレックスの場合には、糖鎖含有キトサン誘導体水溶液と酸性多糖類等の水溶液を別々又は一緒に注入して複合体を形成させればよい。一般的には、組織滞留性キトサン誘導体の含有量は、１〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは５〜５０ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは１０〜３０ｍｇ／ｍｌ、特に２０ｍｇ／ｍｌ程度とされる。【００３６】
また、本発明の抗腫瘍剤組成物は、前記組織滞留性キトサン誘導他に加えて他の成分を含んでいてもよい。
例えば、本発明の組成物は、アミノ酸及び／又は糖類を含有してもよい。本発明で用いられるアミノ酸は、グルタミン、アラニン、セリン等の一般に知られたアミノ酸であってよく、特に限定されないが、特に必須アミノ酸（フェニルアラニン、ロイシン、バリン、ヒスチジン、メチオニン、イソロイシン、リジン、スレオニン、トリプトファン、アルギニン、グリシン）を用いるのが好ましい。
一方、本発明で用いられる糖類は、特にグルコース、ガラクトース、マンノース又はフコース等の中性の単糖類、二糖類、オリゴ糖類などの比較的低分子量の糖類が好ましい。アニオン性の糖類を使用した場合、キトサン誘導体との間でポリイオンコンプレックスを形成して光照射しなくてもゲル化してしまうことがある。【００３７】
特に好ましくは、前記の成分（アミノ酸及び糖類）を含有している細胞培養液であるダルベッコの変性イーグル培地（Ｄ-ＭＥＭ）とハムのＦ１２培地との混合培地で、組織滞留性キトサンゲルを調製する。
これらの付加成分を含有していない場合（組織滞留性キトサンゲルの単なる水溶液を用いる場合）には、キトサンゲルの周辺のみに白血球が存在するのに対し、上記付加成分が共存する場合には、組織滞留性キトサンげるの内部にまで白血球が浸潤し、キトサンゲルが良好に分解されることが観察された。即ち、本発明の組成物による抗腫瘍作用には白血球からの炎症性サイトカインの放出が関与していることが示唆された。【００３８】
アミノ酸及び／又は糖類の含有量は特に限られないが、アミノ酸としては約０.０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約０.１〜２５ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは約０.２〜２００ｍｇ／ｍｌで所望の分解性が得られ、また、糖類としては約０.１〜２５０ｍｇ／ｍｌで、より好ましくは約１.０〜２００ｍｇ／ｍｌ、更に好ましくは約１.５〜１５０ｍｇ／ｍｌで所望の分解性が得られる。【００３９】
また、本発明の抗腫瘍剤組成物には、更に抗癌剤を添加してもよい。組織滞留性キトサンゲルは、添加された抗癌剤を内包し、腫瘍組織近傍で自己分解しながら抗癌剤を徐々に放出するため、更なる抗腫瘍効果を得ることができる。
本発明で使用される抗癌剤としては、組織滞留性キトサンゲルの作用を阻害しない限り特に限られない。例えば、ペメトレキセド、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、ナイトロジェンナスタード-Ｎ-オキシド（塩酸塩）、カルボコン、チオテパ、ブスルファン、ニムスチン（塩酸塩）、ラニムスチン、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、ダカルバシン、プロカルバシン（塩酸塩）、ミトブロニトール、メルカプトプリン、６-メルカプトプリンリボシド、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、タガフール、カルモフール、ドキシフルリジン、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメスタット・オタスタットカリウム配合剤、レボホリナートカルシウム、シタラビン、シタラビンオクホスファート、エノシタビン、ゲムシタビン（塩酸塩）、メトトレキサート、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン（塩酸塩）、ドキソルビシン（塩酸塩）、エピルビシン（塩酸塩）、ピラルビシン（塩酸塩）、アクラルビシン（塩酸塩）、イダルビシン（塩酸塩）、ミトキサントロン（塩酸塩）、ブレオマイシン（塩酸塩）、ペプロマイシン（塩酸塩）、ネオカルチノスタチン、ジノスタチン・スチマラマー、ビンクリスチン（塩酸塩）、ビンブラスチン（塩酸塩）、ビンデシン（塩酸塩）、ビノレルビン（酒石酸塩）、ドセタキセル、パクリタキセル、エトポシド、イリノテカン（塩酸塩）、ノギテカン（塩酸塩）、燐酸エストラムスチンナトリウム、ホスフェストロール、フルタミド、ゴセレリン（酢酸塩）、リュープロレリン（酢酸塩）、ビカルタミド、デキサメタゾン、タモキシフェン（クエン酸塩）、トレミフェン（クエン酸塩）、ファドゾロール水和物（塩酸塩）、アナストロゾール、メドロキシプロゲステロン（硫酸塩）、メピチオスタン、エピチオスタノール、プレドニゾロン、デキサメタゾン類、メドロキシプロゲステロン（酢酸塩）、Ｌ-アスパラギナーゼ、アセグラトン、オクトレオチド（酢酸塩）、ポルフィナーナトリウム、ソブゾキサン、トレチノイン、ペントスタチン、トラスツズマブ、リツキシマブ等を挙げることができる。【００４０】
このようにして調製された本発明の抗腫瘍剤組成物は、注入などの適切な手段によって腫瘍組織近傍に輸送され、腫瘍組織の近傍に滞留することによって腫瘍成長を阻害する。
光架橋性キトサン誘導体（ＰＲＣ）を用いる場合には、腫瘍組織の近傍において所定強度の光（紫外線及び可視光など）を所定時間照射することにより、短時間で架橋して不溶性の組織滞留性ゲルを形成できる。
光による架橋条件は、使用する光架橋性キトサン誘導体に導入した光反応性官能基の種類や置換度、組成物に含有されるキトサン誘導体の量や、使用する組成物の量に応じて変化しうるが、400nm以下の波長の紫外線による所定の積算光量が得られれば架橋反応が速やかに達成され、実用的なキトサンハイドロゲル体が得られる。
例えば、365nm検出タイプの市販の照度計（UIT-150、ウシオ電機）による光量測定において、50-300mj/cm2の積算光量で当該組成物は良好な架橋ハイドロゲル形成を達成する。当該組成物は400nm以下の波長のUV-LED、エキシマレーザー、水銀ランプなどによる紫外線で架橋反応し、照射時間は照射強度を高くすれば必要な積算光量を得るまでの時間を短縮でき、1秒以下の照射時間で所望のハイドロゲル体を得ることも可能である。【００４１】
キトサンマトリクスの光反応性基の架橋反応度は特に限られないが、本発明の架橋キトサンマトリクスは、少なくとも３０％、好ましくは４０〜１００％、より好ましくは５０〜１００％、より好ましくは６０〜１００％、さらに好ましくは７０〜１００％の架橋反応度を有する。ここで、本発明でいう「架橋反応度（又は架橋度）」は、光架橋性キトサン誘導体に存在する光反応性官能基の中で他の官能基等と結合したものの割合を指すものとする。
【実施例】
【００４２】
以下、本発明を具体例を用いて更に詳細に説明するが、これらの具体例は本発明の範囲を限定するものではない。
（合成例１）
光架橋性キトサン誘導体（ＰＲＣ）の合成
キトサン骨格に紫外線反応性官能基及び糖鎖を導入したＰＲＣを、ＷＯ００／２７８８９に記載された方法に準じて合成した。具体的には、エビ由来の８００〜１０００ｋＤａの分子量及び８５の脱アセチル化度を持つキトサン（焼津水産工業（株）製）のアミノ基に、アジド(ｐ-アジド安息香酸)及びラクトース（ラクトビオン酸）を縮合反応により導入した。ラクトースの導入により中性領域のｐＨで可溶性であり、ｐ-アジド安息香酸及びラクトビオン酸の置換度が、各々約２．５％及び５.０％であることが確認された。
また、カニ殻及びイカ軟骨由来のキトサン素材を使用した場合も  同様の誘導体が合成できた。【００４３】
（実施例１）
マウス（C57BL6、8週齢、雄、平均体重20±5ｇ；LC Japan）の背部に2.0×10７個/mlのＢ１６細胞のＤＭＥＭ溶液0.05mlを注入した。約7日後、腫瘤が米粒大（50mg）になった辞典で、腫瘍床部にイカの物質を注入した。
（１）２％のPRC水溶液
（２）０．５％のヒアルロン酸ナトリウム水溶液
（３）１０％の高張生理食塩水【００４４】
注入(投与）後、注入の1週間後及び2週間後における該当箇所の写真を図１に示す。ヒアルロン酸及び生理食塩水を注入したマウスでは腫瘤が拡大しているのに対し、本発明の組成物（PRC)）水溶液を注入したマウスでは腫瘤増大が明らかに抑制されている。【００４５】
次に、注入４週間後までの腫瘍面積の変化を示したのが図２である。本発明の組成物（ＰＲＣゲル）では腫瘍増殖が殆ど見られないのに対し、ヒアルロン酸及び生理食塩水を注入した群では腫瘍が顕著に増大している。【００４６】
本発明の組成物（ＰＲＣゲル）を注入したマウスの注入部の組織学的観察を実施した。注入１週間後において、ＰＲＣゲル及び腫瘍内部に好中球の浸潤が認められた（図３）。一方、生理食塩水を注入したマウスでは、そのような現象は観察されなかった（図４下側）。【００４７】
以上の結果から、組織滞留性キトサンゲルを含有する本発明の組成物が腫瘍成長抑制作用を有することが確認された。その抑制作用には、マクロファージ等の貪食細胞浸潤が関与している可能性が示唆された。このような白血球浸潤は、フコイダン／糖鎖含有キトサン誘導体、あるいはＩＯ４処理ヘパリン／糖鎖含有キトサン誘導体から形成された組織滞留性キトサンゲルでも観察された。
【産業上の利用可能性】
【００４８】
本発明の組成物は組織滞留性キトサンゲルを含有しているため、目的とする組織部位に良好に滞留し、腫瘍の近傍に（非接触で）配置しておくだけで、当該腫瘍の成長を阻害することができる。本発明の組成物による腫瘍成長抑制作用には、炎症性サイトカインや貪食細胞などが関与していることが示唆され、アミノ酸及び／又は糖類を共存させることによりそれらの作用が活発化され得る。
また、本発明の組成物に含まれるキトサンゲルは他の抗癌剤を内包することができるため、目的とする腫瘍組織近傍で内包した抗癌剤を徐々に放出させることにより抗癌活性を更に高めることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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