(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−キヌクリジノンに、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、若しくはリゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｉ）又はその処理物を作用させることにより（Ｒ）−３−キヌクリジノールを得ることを特徴とする、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【請求項２】
前記微生物がリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＹＧＫ−５７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３３４）である、請求項１に記載の（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを選択的に製造する方法に関する。（Ｒ）−３−キヌクリジノールは、医農薬中間体を始め、各種ファインケミカルでの中間体として用いられ、産業上有用な化合物である。
【背景技術】
【０００２】
微生物学的方法により不斉還元酵素を利用して、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造する方法としては次の方法が知られている。
ナカザワエワ（Ｎａｋａｚａｗａｅａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属に属する微生物からなる群から選ばれる微生物を作用させる方法（特許文献１）がある。この方法では、光学純度は４９％ｅｅから最高９２％ｅｅ、蓄積濃度は最高３．７ｇ／Ｌ（０．３７ｗ／ｖ％）で、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを得ているが、光学純度と蓄積濃度がともに低いという問題点がある。
【０００３】
ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、スポリディオボルス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、ロドスポリディウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｒｏｎ）属、ゴルドナ（Ｇｏｒｄｏｎａ）属、及びノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属に属する微生物からなる群から選ばれる微生物を作用させる方法（特許文献２）がある。この方法では、光学純度は最高１００％ｅｅ、収率が最高７１％（蓄積濃度は１８ｇ／Ｌ（１．８ｗ／ｖ％）、ただし、菌体の５倍濃縮物での評価）で、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを得ており、光学純度は高いものがあるが、蓄積濃度と収率がともに低いという問題点がある。
【０００４】
アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｔｅｒ）属、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、オーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属、及びフィロバシディウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属に属する微生物からなる群から選ばれる微生物を作用させる方法（特許文献３）がある。この方法では、光学純度は９２％から最高９８％ｅｅ、収率は８３％〜９０％、蓄積濃度は最高５．７ｇ／Ｌ（０．５７ｗ／ｖ％）で、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを得ているが、蓄積濃度が低いという問題点がある。
また、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を作用させる方法（非特許文献１）がある。この方法では、基質濃度１０％で９５％以上の収率を示したものの、光学純度は８５％ｅｅと、選択性が十分でないという問題点がある。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２４３７９５号公報
【特許文献２】特開平１１−１９６８９０号公報
【特許文献３】特開２０００−２４５４９５号公報
【非特許文献１】日本農芸化学会２００７年度（平成１９年度）大会講演要旨集、２００７年３月５日発行、ｐ４４、２Ａ１１ｐ０９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のように、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを産生することのできる微生物は、２０属にもおよび、多くの種が報告されているが、光学純度、蓄積濃度、收率の３つを高いレベルで満たす微生物は、報告されていなかった。特に、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造する上では、光学純度が１００％ｅｅであることは非常に有利であり、このような微生物は特許文献２に報告されている微生物のみであるが、前記のようにこれらの微生物は蓄積濃度と収率が低いという欠点を有していた。
【０００７】
本発明者らは、上記問題点を解決すべき鋭意検討を重ねた結果、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物［ただし、リゾビウム・ラディオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）を除く］が、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを選択的に著量生成し、蓄積する能力を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、３−キヌクリジノンに、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物［ただし、リゾビウム・ラディオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）を除く］又はその処理物を作用させることにより（Ｒ）−３−キヌクリジノールを得ることを特徴とする、（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法に関する。
本発明の（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法の好ましい態様によれば、前記微生物が、リゾビウム２ａ亜属に属する微生物であり、特には、前記微生物が、配列番号１又は配列番号２で表される塩基配列に対して９９％以上の相同性を示す塩基配列の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物である。
また、本発明の（Ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法のより好ましい態様によれば、前記微生物がリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、又はリゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｉ）であり、特には、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＹＧＫ−５７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３３４）、又はリゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｉ）ＮＢＲＣ  １５２４７である。
また、本発明は、受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３３４である、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＹＧＫ−５７４にも関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを選択的にかつ高収率で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
３−キヌクリジノンに対して、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物［ただし、リゾビウム・ラディオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）を除く］又はその処理物を作用させることにより、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを選択的にかつ高収率で製造することができる。
本発明における微生物としては、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを著量生成し、蓄積する能力を有する、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物［ただし、リゾビウム・ラディオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）を除く］であればその種及びその起源は何ら問わない。
【００１１】
本発明の微生物は、好ましくは、図１の系統樹におけるリゾビアセア（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科のリゾビウム属の、リゾビウム・エトリ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｔｌｉ）、リゾビウム・レグリノサラム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ：新分類では、リゾリウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）と命名されており、以下、リゾリウム・リゾゲネスと称する）、リゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｉ）、リゾビウム・ガリカム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｇａｌｌｉｃｕｍ）、リゾビウム・モンゴレンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｏｎｇｏｌｅｎｓｅ）、リゾビウム・ハイナネンス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｈａｉｎａｎｅｎｓｅ）が含まれるリゾビウム属の亜属（以下、リゾビウム２ａ亜属と称する）に属するリゾビウム種である。図１の系統樹は、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｖｏｌｕｍｅ  Ｔｗｏ、Ｐａｒｔ  Ｃ、（２００５）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ［以下、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌという。］の３３７頁に記載されたものである。なお、本明細書においてリゾビウム２ａ亜属とは、配列番号１又は２で表される塩基配列に対して、９６％以上の相同性を示す塩基配列の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するリゾビウム・エトリ、リゾビウム・レグリノサラム、リゾリウム・リゾゲネス、リゾビウム・トロピシ、リゾビウム・ガリカム、リゾビウム・モンゴレンス、リゾビウム・ハイナネンスを含むリゾビウム種のサブグループを意味するものである。
特に好ましいリゾビウム種は、リゾビウム・リゾゲネス及びリゾビウム・トロピシである。リゾビウム・リゾゲネスとは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の塩基配列に対して９９％以上の相同性を示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するリゾビウム属の種を意味する。すなわち、配列番号１で表される塩基配列に対して９９％以上、好ましくは１００％の相同性を示す塩基配列の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物を意味するものである。リゾビウム・トロピシ種とは、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の塩基配列に対して９９％以上の相同性を示す１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有するリゾビウム属の種を意味する。すなわち、配列番号２で表される塩基配列に対して９９％以上、好ましくは１００％の相同性を示す塩基配列の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を有する微生物を意味するものである。配列番号２は、リゾビウム・トロピシＮＢＲＣ  １５２４７の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子１４０６ｂｐの塩基配列を示している。
【００１２】
本発明における微生物として更に好ましくは、リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＹＧＫ−５７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３３４）を挙げることができる。本菌株は平成１９年７月３１日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に上記受託番号で国内寄託されている。
【００１３】
本発明において使用することのできるリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＹＧＫ−５７４（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１３３４）の菌学的性質は次のとおりである。
１−１．形態的・培養的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）細胞形態：桿菌
（２）幅：０．７〜０．８μｍ
（３）長さ：１．０〜１．２μｍ
（４）胞子形成：−
（５）運動性：＋
（６）コロニー形態：淡黄色、円形、隆起状態レンズ状、周縁全縁、表面形状スムーズ、透明度不透明、粘稠度バター様
【００１４】
１−２．生理学的性質（＋は陽性、−は陰性を表す。）
（１）グラム染色：−
（２）各培養温度での生育：３７℃  −、４５℃  −
（３）カタラーゼ：＋
（４）オキシダーゼ：＋
（５）酸／ガス産生（グルコース）：−／−
（６）Ｏ／Ｆテスト（グルコース）：＋／−
（７）硝酸塩還元：−
（８）インドール産生：−
（９）ブドウ糖  酸性化：−
（10）アルギニンジヒドロラーゼ：−
（11）ウレアーゼ：＋
（12）エスクリン加水分解：＋
（13）ゼラチン加水分解：−
（14）β−ガラクトシダーゼ：＋
（15）各種化合物の資化性
ブドウ糖：＋
Ｌ−アラビノース：＋
Ｄ−マンノース：＋
Ｄ−マンニトール：＋
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン：−
マルトース：＋
グルコン酸カリウム：＋
ｎ−カプリン酸：−
アジピン酸：−
ｄｌ−リンゴ酸：＋
クエン酸ナトリウム：＋
酢酸フェニル：−
（16）チトクロームオキシダーゼ：＋
【００１５】
１−３．化学分類学的性質
本菌株よりゲノムＤＮＡを抽出し、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）の配列を解析した。決定された１４４５ｂｐの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。こうして得られた本菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）を用いて、ＤＮＡ塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）に対して相同性を検索し、近縁菌群と系統樹を作製した結果、本菌株はリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属すると推定された。最も近縁であった基準株はリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ１１３２５株〔Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＹ９４５９５５〕であり、１００．０％の相同性を示した。以上の結果より、本菌株をリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）であると判定した。
【００１６】
本発明で使用するリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）［旧名：アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）］と、非特許文献１に記載のリゾビウム・ラディオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）［旧名：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）］とは、現在、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ）属のリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属への統廃合により、同じリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に命名されている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、（２００１）、５１、ｐ８９−１０３）が、分類学上は大きく異なる。
Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ（ｐ３３７）には、本発明で使用されるリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属を含むリゾビアセア（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）科の分類学的コメントが記載され、アグロバクテリム（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ）属、アロリゾビウム（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｉｚｏｂｉｕｍ）属の４種の分類について記載している（図１）。図１は、１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列に基づき、リゾビアセア科（アグロバクテリウム属、アロリゾビウム属、リゾビウム属、シノリゾビウム属と関連する科の微生物）の中で、関連性を表した隣接結合法による系統樹を示している。
【００１７】
シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｉｚｏｂｉｕｍ）属を含む１つ目の集団（シノリゾビウム属）と、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属とアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ）属とアロリゾビウム（Ａｌｌｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属の三つの属が混在した２つ目の集団（リゾビウム属）とに分類したうえで、２つ目の集団を更に２ａと２ｂの２つのサブグループに分類している。本明細書においては、これらのサブグループを、それぞれリゾビウム２ａ亜属及びリゾビウム２ｂ亜属と称する。
本発明で使用するリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）［旧名：アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）］は２ａに属し、非特許文献１に記載のリゾビウム・ラディオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）［旧名：アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）］は２ｂに属する。両者の微生物を比較すると、表１〜表３（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ（ｐ３３４−３３６））に示すように、形態的、栄養的性質、生理学的性質も大きく異なり、図１（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ（ｐ３３７））に示す系統樹でも異なる集団に分かれている。
【００１８】
以上より、本発明で使用するリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）［旧名アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）］が属するリゾビウム２ａ亜属は、リゾビウム・ラディオバクター（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｏｒ）［旧名アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）］が属するリゾビウム２ｂ亜属とは分類学上別属と判断される。
また、後述の実施例で示したように、リゾビウム２ａ亜属に属するリゾビウム・リゾゲネス及びリゾビウム・トロピシは、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールの変換において、光学純度が１００％ｅｅの（Ｒ）−３−キヌクリジノールを製造することが可能である。一方、リゾビウム・ラディオバクターは、非特許文献１で報告されているように、光学純度は８５％ｅｅで（Ｒ）−３−キヌクリジノールへ変換されている。リゾビウム２ａ亜属とリゾビウム２ｂ亜属は系統樹での分類では、比較的近い亜属であるが、前記のように形態的、栄養的性質、生理学的性質、並びに３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールの変換の点においては、その性質が異なっており、当業者にとっては予想外である。
【００１９】
【表１】
0005403498.tif 000002
【００２０】
【表２】
0005403498.tif 000003
【００２１】
【表３】
0005403498.tif 000004
【００２２】
次に、本発明方法において使用するリゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属に属する微生物の培養方法について説明する。
前記微生物の培養液の調整方法としては、（ア）炭素源及び窒素源を適宜添加した培地に微生物の菌体を接種して同一の該培地中で増殖させて培養液を得る方法、（イ）培養を段階的に行って培養液を得る方法、すなわち、前培養と本培養を組み合わせて培養液を得る方法が挙げられるが、好ましくは（イ）の方法である。（イ）の方法は、まず、前培養として、炭素源及び窒素源を適宜添加した培地に前記微生物の菌体を接種して微生物を増殖させて、本培養で使用する微生物の確保を目的として第一段階の培養液（以下、前培養液という。）を得た後、次に本培養として、容量を増大させた培地に前培養液を加えて、炭素源及び窒素源を適宜添加して微生物を培養することで蓄積反応に十分な酵素の産生を目的として第二段階の培養液（以下、本培養液という）を得る方法である。しかしながら、前記微生物の菌体を含む培養液の調製方法は、これらの方法に限定されるものではなく、更に、３回以上の培養を組み合わせて行うことも可能である。
前記微生物を培養するための培地は、通常これらの微生物が生育可能な培地であれば特に制限はなく、一般的な微生物用の任意の公知培地を用いることができる。培地の炭素源及び窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、肉エキス、アミノ酸、無機窒素、有機酸、糖類などを使用することができる。また、必要に応じて、微量金属塩、ビタミン類、核酸関連物質、無機塩類などを添加することもできる。
【００２３】
炭素源及び窒素源の供給方法としては、（１）培地作製時にあらかじめ添加しておく方法、（２）微生物の増殖にあわせて、炭素源及び窒素源を連続又は間欠的に供給していく方法が挙げられるが、好ましくは（２）の方法である。前記（２）の方法は、微生物の増殖により消費した炭素源及び窒素源を追加していくため、高濃度の炭素源及び窒素源により微生物の生育阻害がある場合でも、微生物の濃度を高くすることができる利点がある。前記（２）の方法を更に具体的に説明すると、微生物が炭素源及び窒素源を消費する速度に合わせて炭素源及び窒素源を添加する方法などがある。例えば、微生物が生育するとともにｐＨが上昇し、かつ、炭素源及び窒素源を含む水溶液が酸性である場合、ｐＨコントローラーを用いて、培養液のｐＨが一定になるように、炭素源及び窒素源を含む酸性の水溶液を添加すると、微生物の増殖の進行とともに、炭素源及び窒素源を少しずつ添加する方法を用いることができる。
【００２４】
更に、培養の際に、前記微生物が有する、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する能力を最大限に引き出すために、糖類、有機酸又はアミノ酸を添加して培養することもできる。特に効果が得られる物質は、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、スクロース、Ｄ−リボース、マンニトール、グリセロール、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｄ−ラクトース、マルトース、Ｌ−リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、グルコン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミンなどであり、培地に対して０．１〜５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜３．０ｗ／ｖ％である。なお、本明細書において、ｗ／ｖは質量／容積を、ｖ／ｖは容積／容積を意味する。
【００２５】
前記微生物の培養温度は１０〜３７℃、好ましくは２３〜３２℃である。培養時の培地のｐＨは６．０〜１０．０であり、好ましくはｐＨ６．５〜９．０である。培養は、好気的条件下で行うことが好ましく、液体培養時には通気及び撹拌を行うことが望ましい。培養時間は１０時間〜１週間であり、好ましくは１〜３日間であり、より好ましくは１〜２日である。
本培養の進行とともに、酵素生産量も増加していくが、本培養の後半には、生育速度の低下とともに、炭素源及び窒素源の消費速度、酵素生産速度も低下し、本培養を終了する。炭素源及び窒素源の総添加量、培養時間、菌体の濃度、酵素生産量などから本培養の終了を判断することもできる。
【００２６】
以上のようにして、前記微生物の培養菌体を培養液中に蓄積させ、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応に用いることができる。
［ｉ］得られた培養液はそのまま以下に述べる蓄積反応に使用してもよいし、
［ii］微生物を培養液から回収して反応に使用したり、更に
［iii］微生物の処理物、例えば、破砕物、粗酵素、精製酵素などを反応に使用することもできる。
続いて、前記微生物又はその処理物により、３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する反応を行うことができる。この蓄積反応は、バッチ式でも、バイオリアクターなどを用いた連続式でも可能である。バッチ式反応の場合には、数時間から７日間で行うことができる。
【００２７】
上述の［ｉ］の場合を具体的に説明すると、上記の培養方法で増殖させた前記微生物を含む培養液に、直接、３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などを加え、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを系内に蓄積させる反応を開始させることができる。蓄積反応のｐＨは６．０〜１０．０、好ましくはｐＨ６．０〜８．０である。反応温度は１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃である。基質の３−キヌクリジノンの添加量は、反応液に対して０．１〜１０．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜５．０ｗ／ｖ％である。３−キヌクリジノンの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の３−キヌクリジノンによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。
【００２８】
一般的に、３−キヌクリジノン不斉還元酵素は、３−キヌクリジノンの不斉還元反応において、３−キヌクリジノンと等量の還元型補酵素（還元型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、又は還元型ニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を還元剤として要求するとされている。３−キヌクリジノンの還元反応後は、補酵素はそれぞれ酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）又は酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＰ＋）へと変換される。
触媒量の補酵素で３−キヌクリジノンの不斉還元反応を進行させるためには、酸化型補酵素のＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋をそれぞれ還元型補酵素のＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨへと再生する反応が必要であり、一般的に、この補酵素再生反応には、グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの酸化反応が利用されている。
【００２９】
また、一般的に、補酵素供給源として、高価な試薬であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨなどを反応系に添加し、また、グルコースデヒドロゲナーゼなどの補酵素を再生する酵素の供給源として、市販酵素を使用したり、遺伝子組み替えにより補酵素を再生する酵素を生産させることが行われるが、本発明においては、補酵素及び補酵素を再生する酵素を添加することなく、糖類、有機酸、アルコール類などを添加するのみで、効率よく３−キヌクリジノンから（Ｒ）−３−キヌクリジノールへの変換を行うことができる。
【００３０】
糖類、有機酸、アルコール類などとしては、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、スクロース、Ｄ−リボース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、Ｄ−ラクトース、マルトースなどの糖類、クエン酸などの有機酸、エタノールなどのアルコール類などを挙げることができる。糖類、有機酸、アルコール類などの添加量は、３−キヌクリジノンを還元して（Ｒ）−３−キヌクリジノールを生成する反応液に対して０．２〜１５．０ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜６．０ｗ／ｖ％である。糖類、有機酸、アルコール類などの添加は一度に行ってもよいが、高濃度の糖類、有機酸、アルコール類などによる反応阻害が見られる場合には分割して添加してもよい。
（Ｒ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応は、前記微生物が十分に増殖して、変換能力が十分となった時点から開始することができるが、前記微生物の増殖が十分でない培養初期段階でも、生育阻害が起こらない濃度範囲で培地に３−キヌクリジノンを添加して、微生物の増殖と（Ｒ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応を同時に行うことができる。
【００３１】
また、上述の［ii］の場合には、上記の培養方法で増殖させた微生物をろ過又は遠心分離により培養液から回収して蓄積反応に使用することができる。すなわち、得られた微生物は３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などを含む生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などの水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。反応条件（ｐＨ、温度、３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などの添加量）は［ｉ］の場合と同じである。
【００３２】
更に、上述の［iii］の場合には、前記培養方法で増殖させ、回収した微生物の処理物（例えば、破砕物、粗酵素、精製酵素）は、３−キヌクリジノンと糖類、有機酸、アルコール類などを含む水性溶媒に懸濁して反応に使用することができる。あるいは、微生物又はその処理物を公知の方法で適当な担体に固定化し、その固定化物を水性溶媒と接触させて反応に使用してもよい。前記微生物又はその処理物を使用した蓄積反応に用いる水性溶媒としては、生理食塩水、リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、ホウ酸−水酸化ナトリウム緩衝液などを挙げることができる。反応条件は［ｉ］の場合と同様である。
【００３３】
以上のようにして得られた蓄積反応後の反応液から、必要に応じて、ろ過、遠心分離などにより微生物を除去した後、溶媒で（Ｒ）−３−キヌクリジノールを抽出して、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを回収することができる。粗酵素、精製酵素などの処理物を使用した場合などでは微生物除去操作を省略することができる。また、クロマトグラフィーなどの公知の精製方法により（Ｒ）−３−キヌクリジノールを回収することもできる。
【実施例】
【００３４】
以下に代表的な実施例を示し、本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【００３５】
実施例において使用する培地組成を以下に記載する。
（１）培地［Ａ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス５．０ｇ、スクロース３．０ｇ、塩化アンモニウム０．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．１ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを６．８に調整した培地。
【００３６】
（２）培地［Ｂ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス１０．０ｇ、スクロース３０．０ｇ、塩化アンモニウム２．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物２．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ、塩化マンガン（II）四水和物０．２ｇ、塩化カルシウム０．２ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを６．８に調整した培地。
【００３７】
（３）培地［Ｃ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス５．０ｇ、グルコース５．０ｇ、塩化アンモニウム０．５ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．１ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを６．８に調整した培地。
【００３８】
（４）培地［Ｄ］
脱塩水１．０Ｌ中に酵母エキス１０．０ｇ、グルコース１０．０ｇ、塩化アンモニウム２．０ｇ、リン酸水素二ナトリウム十二水和物１．０ｇ、リン酸二水素カリウム１．０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．１ｇ、塩化マンガン（II）四水和物０．１ｇ、塩化カルシウム０．１ｇを含み、水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨを６．８に調整した培地。
【００３９】
次に、実施例で使用するＧＣの分析条件を以下に記載する。
［ＧＣの分析条件］
カラム；ＣＰ−ＣＨＩＲＡＳＩＬ−ＤＥＸ  ＣＢ（Ｖａｒｉａｎ社製）２５ｍ×０．２５ｍｍ、
Ｎ２流速；１ｍＬ／分、
カラム温度；１４０℃、
インジェクション温度；２２０℃、
検出；ＦＩＤ、２２０℃、
保持時間；３−キヌクリジノン６．９分、（Ｓ）−３−キヌクリジノール１３．９分、（Ｒ）−３−キヌクリジノール１４．４分
【００４０】
《実施例１：リゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＹＧＫ−５７４の静止菌体を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応》
（１）前培養
培地［Ａ］１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、栄養寒天培地に維持したリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ＹＧＫ−５７４の菌体を１白金耳接種し、２７℃で２４時間振とう培養して、前培養液を得た。
【００４１】
（２）本培養
一方、撹拌、通気、温度及びｐＨ調整が可能な２Ｌ容のジャーファーメンターに培地［Ｂ］１Ｌを入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。このジャーファーメンターに、上記前培養液２０ｍＬを加え、撹拌及び通気を実施しながら２８℃及びｐＨ６．８で培養を行った。
５ｖ／ｖ％アンモニア水溶液で培養液のｐＨを調整しながら、培養を継続した。本培養を開始してから３４時間目で、アンモニア溶液の添加量が１８．０ｇとなり、生育速度と酵素生産速度が低下したため、培養を終了し、本培養液を得た。
【００４２】
（３）蓄積反応
上記本培養液１００ｍＬを遠心分離により集菌し静止菌体を得た。これに、３−キヌクリジノン塩酸塩５．２ｗ／ｖ％とＤ−グルコース６．０ｗ／ｖ％を含む、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液１００ｍＬを加えて懸濁し、ｐＨを７．０に調整した。この懸濁液を撹拌下３５℃にて反応を開始した。基質の３−キヌクリジノン塩酸塩とＤ−グルコースを適宜追加し、水酸化ナトリウム水溶液により適宜ｐＨを７．０に調整しながら反応を行い、目的物の生成速度が低下したため９０時間目で反応を終了した。
【００４３】
添加量の合計は３−キヌクリジノン塩酸塩１４．１ｇ（８７．２ｍｍｏｌ）、Ｄ−グルコース２３．２ｇ、反応後の最終液量は１３１ｍＬであった。その後、遠心分離により、菌体を除去し、得られた上澄み液の５倍希釈液０．５ｍＬに５０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液を０．５ｍＬ、クロロホルム１ｍＬを加え、抽出を行った。得られたクロロホルム層をＧＣ分析した結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを蓄積濃度８．３％、重量１０．９ｇ（８５．７ｍｍｏｌ）（収率９８．２％（８５．７／８７．２×１００））で取得した。また、ＧＣ分析では、（Ｓ）−３−キヌクリジノールは検出されず、光学純度は１００％ｅｅであった。
【００４４】
《実施例２：リゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｉ）ＮＢＲＣ  １５２４７の静止菌体を用いた（Ｒ）−３−キヌクリジノールの蓄積反応》
（１）前培養
培地［Ｃ］１００ｍＬを５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施した。この三角フラスコに、栄養寒天培地に維持したリゾビウム・トロピシ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｉ）ＮＢＲＣ  １５２４７（独立行政法人製品評価技術基盤機構  生物遺伝資源部門の分譲菌株）の菌体を１白金耳接種し、２７℃で２４時間振とう培養して、前培養液を得た。
【００４５】
（２）本培養
一方、培地［Ｄ］５００ｍＬを１００ｍＬずつ５００ｍＬ容の三角フラスコに分注し、各々同じように以下の操作を行った。１２１℃で２０分間、オートクレーブ滅菌を実施したのち、培地１００ｍＬにつき、上記前培養液を２ｍＬ加え、２８℃で振とう培養を行った。
Ｄ−グルコース、塩化アンモニウムを少しずつ添加し、培養を継続した。本培養を開始してから４５時間目で、培地１００ｍＬにつき、Ｄ−グルコースの添加量が１．８ｇ、塩化アンモニウムの添加量が０．３６ｇとなり、生育速度と酵素生産速度が低下したため、培養を終了し、本培養液を得た。
【００４６】
（３）蓄積反応
上記本培養液５００ｍＬを遠心分離により集菌し静止菌体を得た。これに、３−キヌクリジノン塩酸塩４．０ｗ／ｖ％とＤ−グルコース５．０ｗ／ｖ％を含む、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液１００ｍＬを加えて懸濁し、ｐＨを７．０に調整することにより、菌体を５倍濃縮した懸濁液を得た。この懸濁液を撹拌下３５℃にて反応を開始した。基質の３−キヌクリジノン塩酸塩とＤ−グルコースを適宜追加し、水酸化ナトリウム水溶液により適宜ｐＨを７．０に調整しながら反応を行い、目的物の生成速度が低下したため９３時間目で反応を終了した。
【００４７】
添加量の合計は３−キヌクリジノン塩酸塩２３．６ｇ（１４６．０ｍｍｏｌ）、Ｄ−グルコース３３．４ｇ、反応後の最終液量は１７５ｍＬであった。その後、遠心分離により、菌体を除去し、得られた上澄み液の５倍希釈液０．５ｍＬに５０ｗ／ｖ％水酸化ナトリウム水溶液を０．５ｍＬ、クロロホルム１ｍＬを加え、抽出を行った。得られたクロロホルム層をＧＣ分析した結果、（Ｒ）−３−キヌクリジノールを蓄積濃度１０．１％、重量１７．７ｇ（１３９．２ｍｍｏｌ）（収率９５．３％（１３９．２／１４６．０×１００））で取得した［ただし、菌体の５倍濃縮物での評価］。また、ＧＣ分析では、（Ｓ）−３−キヌクリジノールは検出されず、光学純度は１００％ｅｅであった。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】リゾビアセア科に属する微生物における関連性を表した隣接結合法による系統樹を示した図である。図中の分岐点に記載された数値は、ブートストラップ確率である。
【図１】
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【配列表】
0005403498000001.app