(57)【要約】  本発明は、未分化細胞、好ましくは、ＥＳ細胞のテラトーマの発生を抑制する方法を提供する。また、当該方法によって得られる生物材料、および当該生物材料を患者に移植する治療方法を提供する。  未分化細胞、特に好ましくはＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体を作製し、該胚様体をタイプＩコラーゲン製の固体３次元担体又はその類似体に少なくとも１週間以上培養して接着させる。さらに、これによって生物材料を得て、当該生物材料を哺乳類患者に移植する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化細胞を培養して増殖した胚様体を作製し、該胚様体を３次元担体に培養して接着させることを特徴とするテラトーマの発生を抑制する方法。
【請求項２】
前記未分化細胞はＥＳ細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記胚様体を３次元担体に培養する期間は少なくとも１週間以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記３次元担体は、天然のタイプＩコラーゲンの若しくは人工のタイプＩコラーゲン類似材料の固体担体、又は該固体担体の類似体であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記３次元担体は、ＥＣＭ成分で塗布されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＣＭ成分は、タイプＩコラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンからなる群から選択された一種であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法により得られる生物材料。
【請求項８】
請求項７に記載の生物材料を患者に移植することを特徴とする患者の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療における胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞）を含む未分化細胞からのテラトーマの発生を抑制する方法に関する。さらに、本発明は、当該方法によって得られる生物材料に関し、また、当該生物材料を患者に移植する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＳ細胞は、全能性で自己増殖能が高く、かつ、どのような細胞にも誘導しうる細胞なので、現在の医療では治療できないような病気を治療しうる再生医療の材料として、世界中の多くの科学者が注目している。また、サルやマウスのＥＳ細胞は既存の株が入手可能であり研究に使用している（例えば、非特許文献１参照）。例えば、糖尿病は、すい臓の中でインスリンを産生するベータ細胞が、おそらく自己免疫反応のために自分で壊れてしまうことにより発病し、インスリン注射の処方で、ある程度回復するものの、根本的な治療法はない。糖尿病に対する再生医療では、ＥＳ細胞から、試験管内で、ベータ細胞を特異的かつ効率的に誘導し、純化したベータ細胞を患者の体内に移植して、当該患者を根本的に治療することを目的としている（例えば、非特許文献２、３及び４参照）。【０００３】
また、パーキンソン病は、ドーパミンという神経伝達物質が不足することにより発病し、補充療法などの処方があるが、根本的治療法はない。しかしながら、パーキンソン病に対する再生医療では、ＥＳ細胞から、試験管内で、ドーパミンを分泌する神経細胞を特異的かつ効率的に誘導し、純化したドーパミン産生細胞を患者の体内に移植して、当該患者を根本的に治療することを目的としている（例えば、非特許文献５参照）。【０００４】
このように、ＥＳ細胞から、試験管内で、患者が必要とする特殊な細胞や、あるいは、その細胞の前駆細胞を、どのようにして特異的に、かつ、効率よく作るかという研究に、世界の多くの科学者が挑戦している。【０００５】
しかし、ＥＳ細胞を使った再生医療には、目的とする細胞を患者の体内へ移植した後に起こることが予想される幾つかの課題が残っている。それらは、移植した細胞が患者の体内で十分に機能するか、移植した部位に血管や神経がネットワークを作って定着するか、テラトーマ（ＥＳ細胞特異的良性腫瘍）を作らないか、そして、免疫拒絶反応が起こらないか、などである（例えば、非特許文献６及び７参照）。【０００６】
このうち、テラトーマの発生を抑制することが大変重要である。その理由は、テラトーマは、移植された細胞群の中に含まれる「未分化なＥＳ細胞」から発生すると考えられているからである。仮に、患者に細胞群を移植しても、長期間にわたりテラトーマの発生を抑制できる方法があれば、その期間に体内で「未分化なＥＳ細胞」が目的の細胞に十分に分化でき、その結果、血管や神経のネットワークにより移植した細胞群が患者の体内で定着し、かつ十分に機能して患者の病気を治療することも期待できる。免疫拒絶反応については、例えば、患者の体細胞の核を移植したオーダーメードなＥＳ細胞から目的の細胞を誘導するなど、別の技術で解決できる見通しもある（例えば、非特許文献８、９、１０、１１及び１２参照）。【０００７】
よって、ＥＳ細胞を含む多分化能を有する未分化細胞を利用した再生医療を実現するためには、テラトーマの発生を抑制する方法の開発が緊急、かつ重要であるが、そのような方法は存在しなかった。
【非特許文献１】J.A. Thomson et al., Science 282, 1145 (1998).
【非特許文献２】P. Blyszczuk, J. Czyz, G. Kania, M. Wagner, U. Roll, L. St-Onge, A.M. Wobus, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 100, 998 (2003).
【非特許文献３】N. Lumelsky, O. Blondel, P. Laeng, I. Velasco, R. Ravin, R. McKay, Science 292, 1389 (2001).
【非特許文献４】B. Soria, E. Roche, G. Berna, T. Leon-Quinto, J.A. Reig, F. Martin, Diabetes 49, 157  (2000).
【非特許文献５】J.-H. Kim, J.M. Auerbach, J.A. Rodriguez-Gomez, I. Velasco, D. Gavin, N. Lumelsky, S.-H. Lee, J. Nguyen, R. Sanchez-Pernaute, K. Bankiewicz, R. McKay, Nature 418, 50 (2002).
【非特許文献６】Cookson, C. Sci. Amer. (July) A6-A11 (2005).
【非特許文献７】C.R. Freed, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 1755 (2002).
【非特許文献８】K. Hochedlinger, R. Jaenish, Nature 415, 1035 (2002).
【非特許文献９】I. Wilmut, A.E. Shnieke, J. McWhir, A.J. Kind, K.H. Campbell, Nature 385, 810 (1997).
【非特許文献１０】D. Solter, Nature Rev. Genet. 1, 199 (2000).
【非特許文献１１】C.A. Cowan, J. Atienza, D.A. Melton, K. Eggan, K. Science 309, 1369 (2005).
【非特許文献１２】M. Tada, Y. Takahama, K. Abe, N. Nakatsuji, T. Tada, Curr. Biol. 11, 1553 (2001).
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は上述に鑑みてなされたものであり、ＥＳ細胞や多分化能を有する未分化細胞の移植後のテラトーマの発生を抑制する方法を提供することを目的とする。また、本発明の別の目的は、当該方法によって作製された生物材料を提供することを目的とする。さらにまた、本発明の別の目的は、再生医療において、当該生物材料を患者に移植する治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、本発明に先立ち、未分化細胞を用いた歯の形成方法を開発しているが、その発明の過程において、マウス胎仔歯胚由来の間葉系細胞とマウスＥＳ細胞のキメラ胚様体から歯の構成物質である象牙芽細胞とエナメル芽細胞とを誘導することができ、当該キメラ胚様体をマウスに移植した後、腫瘍化しなかったことが観察された。【００１０】
そこで、本発明者は、この観察結果に着目し、さらなる鋭意検討を重ねた結果、ＥＳ細胞やＥＳ細胞の塊である胚様体をタイプＩコラーゲンの固体３次元担体に培養し接着させてマウスの体内に移植することで、ＥＳ細胞が体内でテラトーマを発生しないことを見出し、本発明の独特な方法を開発した。【００１１】
即ち、上記目的は、請求項１に記載されるがごとく、未分化細胞を培養して増殖した胚様体を作製し、該胚様体を３次元担体に培養して接着させることを特徴とするテラトーマの発生を抑制する方法によって達成される。これによって、未分化細胞を培養して増殖した胚様体が十分に３次元担体に接着して、その結果、テラトーマの発生が効果的に抑制できる。【００１２】
請求項２にかかる発明は、請求項１に記載の発明において、前記未分化細胞はＥＳ細胞であることを特徴とする。これによって、ＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体が十分に３次元担体に接着して、その結果、テラトーマの発生が効果的に抑制できる。【００１３】
請求項３にかかる発明は、請求項１又は２に記載の発明において、前記胚様体を３次元担体に培養する期間は少なくとも1週間以上であることを特徴とする。これによって、未分化細胞、特にＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体が十分に３次元担体に接着して、その結果、テラトーマの発生が効果的に抑制できる。【００１４】
請求項４にかかる発明は、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の発明において、前記３次元担体は、天然のタイプＩコラーゲン若しくは人工のタイプＩコラーゲン類似材料の固体担体、又は該固体担体の類似体であることを特徴とする。これによって、未分化細胞、特にＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体が十分に天然のタイプＩコラーゲン若しくは人工のタイプＩコラーゲン類似材料の固体担体、又は該固体担体の類似体である、３次元担体に接着して、その結果、テラトーマの発生が効果的に抑制できる。【００１５】
請求項５にかかる発明は、請求項４に記載の発明において、前記３次元担体は、ＥＣＭ成分で塗布されることを特徴とする。これによって、未分化細胞、特にＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体がＥＣＭ成分で塗布された３次元担体に十分吸着して、その結果、テラトーマの発生が効果的に抑制できる。【００１６】
請求項６にかかる発明は、請求項５に記載の発明において、前記ＥＣＭ成分は、タイプＩコラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンからなる群から選択された一種であることを特徴とする。これによって、未分化細胞、特にＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体が、ＥＣＭ成分である、タイプＩコラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンからなる群から選択された一種で塗布された３次元担体に十分吸着して、その結果、テラトーマの発生が効果的に抑制できる。【００１７】
請求項７にかかる発明は、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法により得られる生物材料によって達成される。これによって、患者に移植できる組織、器官、臓器などの機能性細胞として再生医療に利用することができる。【００１８】
請求項８にかかる発明は、請求項７に記載の生物材料を患者に移植することを特徴とする患者の治療方法によって達成される。これによって、ＥＳ細胞を用いても患者でテラトーマの発生を抑制できる再生治療が実現できる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、未分化細胞、特に、好ましくは、ＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体を作製し、該胚様体をタイプＩコラーゲンの固体３次元担体に培養して接着させることによって、テラトーマの発生を抑制する方法を提供することができる。例えば、本発明によって、哺乳類の体内に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再生した未分化細胞を培養し、その胚様体を固体３次元担体に培養して接着させた本発明の生物材料、例えば、組織、器官、臓器を移植してテラトーマの発生のない完全な臓器移植を行なうなど、生体本来の再生機能を活用する再生医療の手法が提供できる可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明のプロトコルを示す図である。
【図２】タイプＩコラーゲン製の３次元担体へのＥＳ細胞の胚様体の接着と細胞の移動を示し、Ａは蛍光顕微鏡観察、Ｂは位相差顕微鏡観察を示す図である。
【図３】テラトーマの発生を示す図である。
【図４】Hematoxilin-Eosin染色像を示し、Ａはコラーゲン担体に接着し移植した胚様体、Ｂは負対照、Ｃは正対照を示す図である。
【図５】血管と神経の特異染色を示し、上段は血管内皮細胞、下段は神経細胞を示す図である。
【図６】テラトーマ内で再生している種々の細胞や組織を示す図である。
【図７】様々な材料に関するテラトーマ発生の検査を示す図である。
【図８】各種ＥＣＭ成分に関するテラトーマ発生の検査を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の一つの好ましい態様について詳述して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００２２】
本発明は、哺乳類において、多種多様な細胞や、組織に分化することができる、未分化細胞を培養して増殖した胚様体を作製し、さらに、作製された胚様体を３次元担体に培養して接着させることによって、テラトーマの発生を抑制する方法を導くことを特徴とする。【００２３】
先ず、本発明でいうところの未分化細胞について説明する。未分化細胞は、「胚または生体の組織に存在する未分化な細胞」のことであり、自分と同じ細胞を作る能力（自己複製能）及び組織や臓器を構成する多種類の細胞に分化する能力（多分化能）を持った細胞のことを意味し、幹細胞ともいう。（以下、未分化細胞・幹細胞を総称して、未分化細胞と記載）未分化細胞は、ある細胞に変化するようにという指示を受けると特定の細胞に変身、すなわち分化する能力を有する細胞であり、また、変化を遂げる前の未分化の状態で長期間にわたって自らを複製、再生する能力も備えている細胞である。未分化細胞には階層性があり、より未分化な未分化細胞は自己複製能が高く、非常に広範な細胞系列に分化できるが、未分化細胞も下位になるに従い分化できる細胞系列が限定されてくる。【００２４】
ＥＳ細胞は、俗にいう万能細胞と呼ばれ、受精卵に次いで上位に位置する未分化細胞である。哺乳類の臓器には、組織特異的な未分化細胞（すなわち、体性幹細胞、別名組織幹細胞）が存在する。体性幹細胞は固有の系列への分化能を有するとともに、分裂した際自己と同じ能力を持った細胞を再生（自己複製）することにより、それぞれの組織を維持していると考えられている。つまり、胚からは胚性幹細胞、すなわちＥＳ細胞、成人からは体性幹細胞、胎児からは胚生殖細胞を取り出すことができる。【００２５】
特に、ＥＳ細胞は、ある一定の培養条件下で未分化な状態を保持しながら半永久的に自己複製し、生殖細胞系列を含むあらゆる種類の細胞に分化できる全能性、多分化能を有する細胞として知られている。【００２６】
ＥＳ細胞は、受精した胚、つまり、受精卵が分化して胎児に発展するまでの状態である胚の初期段階から採り出されるもので、身体のどのような細胞にも成長できる性質を有するため多能性幹細胞とも呼ばれている。ＥＳ細胞は、受精後５、６日目の胚盤胞の内層細胞（内部塊細胞）から採り出して培養され、人体から採り出される体性幹細胞と違って、培養によって実験室において無限に増殖させることができ、かつ、どのような細胞にも変化できる万能性を有することから、事故や病気によって機能を損なわれた細胞や組織、臓器などの取って代わるための各種細胞を作り出すことのできる"素材"として研究されている。理論上、ＥＳ細胞から分化させた細胞に遺伝子治療の技術を用いて免疫関係の遺伝子を入れ替えたり、患者の遺伝情報を持つ胚を作り、そこからＥＳ細胞を取り出して目的の細胞に誘導したりすることによって、拒絶反応を起こさずに臓器を移植する方法も考えられる。【００２７】
一方、体性幹細胞とは、体の中にすでにかたちづくられた組織の中から採り出される分化する前の状態の細胞をいう。組織内には、その組織における特定の働きを担う、すでに分化を終えた細胞が多数存在しているが、中にはそうした特定の働きを持つ細胞へと分化する前の未分化細胞が混在している。体性幹細胞は、自らと同じ細胞を複製し、製造する能力を持つとともに、分化によって、それが存在していた組織内のあらゆる個別細胞を作り出すことができる。特定の組織に分化することがわかっているためにすでに多くの治療に活かされ、白血病などの治療に必要な骨髄移植に用いられる骨髄幹細胞などが代表的な例である。【００２８】
したがって、上述したような機能を有する未分化細胞を用いることによって、本発明を達成することが可能である。【００２９】
本発明において用いる未分化細胞の採取及び作製は特に限定されず、公知文献等に記載の任意の手法に従って行われてよい。また、本発明において用いる未分化細胞は、特に、哺乳類のＥＳ細胞が好ましく、例えば、げっ歯類（マウスＥＳ細胞およびラットＥＳ細胞等）、霊長類（カニクイザルＥＳ細胞およびヒトＥＳ細胞等）などから採取して作製してよく、これらＥＳ細胞は、マウスやヒトの胚性生殖細胞から得ることができる。また、ＥＳ細胞は、公知文献等で報告されている方法により哺乳類受精卵から得てもよいし、市販されているＥＳ細胞を用いてもよい。例えば、一般的に用いられる未分化細胞として、マウスＥＳ細胞の作製を説明する。マウスは受精から約２０日間で誕生するが、その過程において、発生１２日目くらいにはマウスのかたちになる。ＥＳ細胞は、そのかたちができ始める前、すなわちマウスでいえば発生から３．５日、ヒトでいえば１週間の胚盤胞という状態に由来する。胚盤胞の中には２種類の細胞があり、一つは栄養外胚葉で胎盤となり、もう一つは内層細胞（内部塊細胞）で、これはすべての細胞を生み出していく。この内部塊細胞をとり出してシャーレの中で必要な薬品を加えて培養したものがＥＳ細胞となる。このＥＳ細胞は条件さえ整えれば、増殖可能である。【００３０】
本発明では、ＥＳ細胞を用いるが、これに限定されず、生物の未分化細胞であれば、いずれも本発明に対して適用可能である。【００３１】
次に、上述した未分化細胞を培養して増殖し、それらの塊である胚様体を作製する好ましい方法は、下記の実施例にも詳述するが、未分化細胞としてＥＳ細胞を用い、一例として、以下の手法によってなされる。【００３２】
０．１％のゲラチンでコートした培養用フラスコに支持細胞（フィーダー細胞）無しで、３７度５％ＣＯ２下の条件で、ＥＳ細胞を少なくとも５日間培養する。この場合、１５%のknockout serum replacement（KSR）、０．１ mMのβ-mercaptoethanol、０．１ mMの非必須アミノ酸、８ mMのL-グルタミン酸、１０００ U/mlの白血病阻止因子を含む培養液KnockOut DMEMを用いて、通常２日おきに交換する。【００３３】
培養後、増殖した細胞を集め、トリプシンＥＤＴＡ溶液で処理して細胞をばらばらにして回収し、さらに、４０ミクロン径のフィルターを通して、単一の細胞にする。このように処理した細胞を含む溶液を、それぞれ１ｘ１０４個の細胞を含むように低接着性の９６穴培養プレートに移し、MSCGM(ヒト間葉系細胞用培地)培地において３７度５％ＣＯ２下で２日間培養して胚様体を作製する。次いで、この胚様体を低接着性の２４穴培養プレートに移し、同様培地、同上条件下でさらに３日間培養する。【００３４】
次に、この胚様体を３次元担体と共にMSCGM培地において３７度５％ＣＯ２下で培養して、当該３次元担体に接着させる。上述の方法で作製した胚様体を、例えば、１乃至２ｘ１乃至２ｘ１乃至２ｍｍの３次元担体上で培養し、同様培地、同上条件下で少なくとも１週間培養する。この過程で、胚様体が３次元担体に接着される。【００３５】
また、本発明で用いる３次元担体は、タイプＩコラーゲン製の固体３次元担体が好ましい。タイプＩコラーゲンは、細胞外マトリックス（（extracellular matrix）ＥＣＭ）成分の一種であり、細胞と細胞の間を埋めるものである。主な成分としては、タイプＩコラーゲン、タイプＩＶコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン等がある。ここで、タイプＩコラーゲン製の３次元担体は、一般に市販されているものを用いることができるが、本発明で用いるタイプＩコラーゲンは天然でも、人工的に作製した類似の材料でもよい。【００３６】
また、本発明で使用する３次元担体は、上記胚様体を培養して接着させることができれば、他に同様の効果を有する類似体を用いてもよいが、この場合、３次元担体はＥＣＭ成分で塗布される。３次元担体へのＥＭＣ成分の塗布は、３７度５％ＣＯ２下で3次元担体をＥＣＭ溶液に一晩浸し、その後、安全キャビネット内で1日乾燥させることによって行う。特に、本発明において、好ましいＥＭＣ成分は、タイプＩコラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンである。【００３７】
したがって本発明では、３次元担体の素材に関係なく、タイプＩコラーゲン、ラミニンまたはフィブロネクチンのいずれか一種のＥＣＭ成分が３次元担体に塗布された状態において、未分化細胞を培養して増殖した胚様体が、３次元担体上でさらに十分に培養して接着することができる。これにより、３次元担体に接着した未分化細胞が３次元担体上で適度に分化するために、テラトーマ形成能を抑制できる。その結果、テラトーマの発生を効果的に抑制するためには、タイプＩコラーゲン、ラミニンまたはフィブロネクチンの存在が必要であることが認識できる。【００３８】
このように、未分化細胞を培養して増殖した胚様体を、さらに３次元担体に培養して接着させることで生物材料が提供され、この生物材料は、接着した３次元担体ごと患者の所望の患部に移植できる機能性細胞として提供できる。すなわち、本発明に係る生物材料を用いて、疾患や事故等の原因で生じた組織や臓器等の損傷を回復させることができる。換言すれば、本発明に係る生物材料は、いわゆる再生医療に効果的に利用可能であり、上記生物材料を患者の患部に移植する治療方法が提供される。ここで、上記生物材料は、一般的に用いられる周知の移植手術、例えば、注入移植等の外科的手術によって哺乳類患者の所望の患部に移植することができる。また、未分化細胞として患者自身の体性幹細胞を利用することによって、免疫拒絶の問題を回避することができる。また、患者は、ヒトを含めた哺乳類一般に適用できる。【００３９】
また、本発明において、上記生物材料を患者の患部に移植する治療方法で、未分化細胞を培養して増殖した胚様体を３次元担体に接着させることによって、（１)患部局所で作用する十分な細胞数を確保することができ、（２）生物材料（目的細胞として）を注入移植後、患部に留まらせることが可能となり、効果的な再生医療の治療として用いることができる。【００４０】
また、本発明で３次元担体を用いる利点としては、現在、研究されている「二次元細胞の移植」だけではなく、疾患や事故等の原因で生じた、大きな組織損傷や臓器の再生等が必要となった場合には、目的の細胞を３次元化する必要が必須であり、生体に無害で移植後吸収されるようなＥＣＭ成分の３次元担体は、非常に有効な移植手段となるためである。【００４１】
したがって、本発明によれば、未分化細胞を培養して増殖した胚様体を作製し、該胚様体を３次元担体に培養して接着させて、これによって得た生物材料を哺乳類患者の患部に移植することで、テラトーマを発生せずにＥＳ細胞などの未分化細胞を利用した再生医療が実現される。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例により本発明の方法にしたがって実施した具体例を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない限り、その細部については様々な態様が可能である。【００４３】
本実施例では、図１に示すように、ＥＳ細胞を培養して増殖し、それらＥＳ細胞の塊である胚様体を作製した。さらに、作製した胚様体をタイプＩコラーゲン製の固体３次元担体と共に少なくとも１週間培養して接着させた。次いで、このようにして上記固体３次元担体に培養して接着された胚様体を、３次元担体ごと免疫不全マウスの腎臓皮膜下に移植した。移植後、７週間観察しテラトーマができるか否かを観察した。【００４４】
下記に上述した本実施例をより詳細に説明する。【００４５】
未分化細胞の培養法
本実施例では、上述した未分化細胞のうち、ＥＳ細胞（マウス）を用いた。【００４６】
ＥＳ細胞は、論文（GFPを結合した自家製、K.Eggan, H.Akutsu, L.Loring, L.Jackson-Grusby, M.Klemm, WM III, Rideout, R.Yanagimachi, R.Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 6209 (2001)）に従って作製したものを用いた。【００４７】
このＥＳ細胞を0.1%のゲラチン（Cosmo Bio）でコートした培養用フラスコで支持細胞（フィーダー細胞）無しで播種し、37度5％ＣＯ２の条件で５日間培養した。培養液はKnockOut DMEM（Gibco）で、15%のknockout serum replacement（KSR）、0.1 mMのβ-mercaptoethanol（Cosmo Bio）、0.1 mMの非必須アミノ酸（Cosmo Bio）、8 mMのL-グルタミン酸（Cosmo Bio）、1000 U/mlの白血病阻止因子（Chemicon）を含む。培養液は通常２日おきに交換した。【００４８】
培養後、増殖したＥＳ細胞を集め、トリプシンEDTA溶液（Gibco）で処理して細胞をばらばらにし、さらに、４０ミクロン径のフィルター（Falcon）を通して、単一の細胞にした。このように処理したＥＳ細胞を含む溶液を、それぞれ１ｘ１０４個のＥＳ細胞を含むように低接着性の９６穴培養プレート（Nunc）に移し、３７度５％ＣＯ２下で２日間培養して胚様体を作製した。さらに、作製した胚様体を低接着性の２４穴培養プレート（Nunc）に移し、さらに同培地、同条件下で３日間培養した。低接着性の９６穴培養プレートに播種して１日培養した時点で細胞は丸くなるが、この細胞はまだ小さくて細胞数が十分ではないので、低接着性の２４穴培養プレートに移して栄養（すなわち、血清培地）を十分に与えて大きくした。【００４９】
次いで、この胚様体を、１〜２ｘ１〜２ｘ１〜２ｍｍのタイプＩコラーゲン製の３次元担体（商品名; Collagen Sponge HoneycombＴＭ，高研）と共にMSCGM培地において３７度５％ＣＯ２下で１週間培養して接着させた（図２）。タイプＩコラーゲン製の３次元担体に接着した胚様体は、ハニカム構造をしたコラーゲン担体の梁部分に接着し伸展していることが分かった。【００５０】
タイプＩコラーゲン製の３次元担体への細胞の接着と移動
胚様体はタイプＩコラーゲン製の３次元担体と共に培養すると直ちに胚様体が崩れはじめて細胞が担体の梁を伝わって移動した。培養して１週間後に顕微鏡で観察すると、十分な接着を確認できた。【００５１】
テラトーマの観察
タイプＩコラーゲン製の３次元担体に接着した胚様体を、３次元担体ごと免疫不全マウス（市販のSCID mouse）の左腎臓皮膜下に移植した（試料群）。同じマウスの右腎臓皮膜下には何も移植しなかった（負対照群）。また、正対照群として、マウスの同じく左腎臓皮膜下に、タイプＩコラーゲン製の３次元担体に接着しない胚様体を移植し、テラトーマが必ず発生することを確認した。なお、マウスへの移植方法は、従来法の注入移植によって行った。移植後、７週間観察し、テラトーマが発生するか否かを観察した。【００５２】
観察の結果、タイプＩコラーゲン製の３次元担体に接着した胚様体は、最終的に９件中いずれもテラトーマを発生しなかった（図３の上図）。これにより、胚様体をタイプＩコラーゲン製の３次元担体に対して、少なくとも１週間以上にわたって十分に接着させるとテラトーマの発生が良好に抑制された。すなわち、胚様体をタイプＩコラーゲン製の３次元担体に十分に接着させることでテラトーマの発生を完全に抑制できることが認識できた。また、テラトーマを発生しない図３の上図の例では、移植後２７週間を経過しても新しくテラトーマを発生することが無かった。一方、タイプＩコラーゲン製の３次元担体に接着しない胚様体（正対照群）は例外なく移植後7週間までにテラトーマを発生した（図３の中央図）。また、胚様体を移植しない負対照群では、まったくテラトーマの発生が無かった（図３の下図）。同様の試験を、胚様体を作る前のＥＳ細胞の細胞溶液についても行なったが、胚様体とまったく同じ結果を得た。通常、ＥＳ細胞のみをマウスに移植すると、約３〜４週間でテラトーマが形成されることが多くの研究から報告され、我々の実験から、そのまま飼い続けるとテラトーマの影響で次々と死んでいき、７週間でほぼ全滅することが分かったため、上記の実施例から、ＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体と、タイプＩコラーゲン製の３次元担体との培養期間を少なくとも１週間以上にして、かつ顕微鏡で十分な接着を確認すれば、テラトーマの発生を完全に抑制できることが認識できる。【００５３】
移植組織像
移植した胚様体を腎臓ごと分離して４％パラフォルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋して溝切し、hematoxilin-eosin染色して組織像を観察した（図4）。胚様体をタイプＩコラーゲン製の３次元担体に接着して移植した腎臓（図4A）は、負対照群（無移植、図4B）のものと同じく異常所見が無かった。一方、正対照群（コラーゲン担体に接着しない胚様体、図4C）では腎臓にテラトーマを形成し、粘液分泌腺や軟骨、筋肉、神経、血管などの三胚葉由来の構造を形成していた。【００５４】
次に、タイプＩコラーゲン製の３次元担体に接着して移植した胚様体を、抗CD31抗体（PECAM, R&D Systems）（図5上図）と抗Tuj1抗体（Convance）（図5下図）で免疫蛍光染色して、血管内皮細胞と神経細胞の発達の様子を観察した。GFPは緑色で、抗体染色は赤色（ローダミン）なので、両方が重なる部位は黄色になる。これはGFPを発現しているES細胞由来の細胞が、抗体に染まっていることを示す。なお、核をDAPI（Molecular Probe）で蛍光染色した（青色）。CD31は血管内皮細胞に特異的に発現するので、赤く染まった細胞は血管細胞を示している。【００５５】
一方、Tuj1は、神経特異的β-チューブリンを染色するので、赤く染まった細胞は神経細胞を示している。これら血管内皮細胞も神経細胞も、共に、GFP蛍光（緑色）と重なるので、重ね合わせると黄色になった。すなわち、血管細胞と神経細胞が共にＥＳ細胞から誘導されたことが確認された。（図５参照）
次に、分離したテラトーマ腎臓（図4C）を上記のように固定にしてパラフィンに包埋して、抗GFP抗体で免疫染色し、DABを使ったperoxidase法で発色させ（茶色）、さらにHematoxilinで細胞の核を染色した。これらの２重染色像から、テラトーマ腎臓の中に、軟骨細胞、神経細胞、粘液産生細胞、粘液腺、筋肉、管空構造など種々の細胞や組織が作られており、それらが３胚葉性であること、ならびに、ＥＳ細胞に由来することが分かった。（図６参照）
他の担体の効果
上述のごとく、ＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体をタイプＩコラーゲン製の固体３次元担体上に接着させることにより、ＥＳ細胞からのテラトーマの発生を効率よく抑制できた。また、このテラトーマ抑制効果が、タイプＩコラーゲンに特有の効果か、あるいは、その他の固体担体でも同じく抑制効果があるのかを確認するために、図１と同じ検査を、タイプＩコラーゲンのゲル（ニッタゼラチン）、タイプＩＶコラーゲンからできたゲル（BD Biosciences）、およびポリ乳酸製の３次元固体担体（BD Biosciences;OPLA）に関して、上記と同様の方法で実施した。その結果を図７に示す。なお、ポリ乳酸は人工産物であるが、生体内で分解されるため、無害であるとして移植に用いられている。また、「乳酸」は生体がエネルギーをつくり出す時に生成する産物である。図７から分かるように、タイプＩコラーゲン製の固体担体以外のゲル状の担体においては、見かけ上テラトーマ抑制効果があるように見えたが、ゲルが急速に体内で消化された結果、抑制効果が消失した可能性があり最終的にテラトーマを形成した。【００５６】
また、タイプＩコラーゲン以外に、他のＥＣＭ成分のテラトーマ形成能の制御効果を調べる目的で、テラトーマ形成を全く制御しなかったポリ乳酸３次元担体（図７参照）に、タイプＩコラーゲン（新田ゼラチン）、タイプＩＶコラーゲン（新田ゼラチン）、ラミニン（Ｇｉｂｃｏ）、フィブロネクチン（Ｇｉｂｃｏ）を塗布した３次元担体を製作した。塗布は、３７度５％ＣＯ２下で3次元担体をおのおののＥＣＭ溶液に一晩浸し、その後、安全キャビネット内で1日乾燥させることによって行った。上記と同様のＥＳ細胞を培養して増殖した胚様体を、上記の各３次元担体に接着させて移植する一連の実験を上述と同様の方法で行い、移植後７週目でテラトーマの有無を観察した。（図８参照）
その結果、対照としていたタイプＩコラーゲンの３次元担体が最も強力にテラトーマ形成能を制御したが、ラミニンとフィブロネクチンをそれぞれ塗布した３次元担体でも有意な制御効果が認められた。テラトーマ形成を全く制御しないポリ乳酸３次元担体に塗布するという、テラトーマ形成を制御するには悪い条件下でも、タイプＩコラーゲンは５０％、ラミニンとフィブロネクチンはそれぞれ３３％の制御率であったことから、ラミニンやフィブロネクチンにもテラトーマを制御する効果があるものと認められる。【００５７】
【表１】
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したがって、本発明によれば、未分化細胞を培養して増殖した胚様体を作製し、該胚様体を３次元担体に培養して接着させることで、ＥＳ細胞のテラトーマ発生を抑制することができ、これによって得た生物材料を患者の所望の患部に移植することで、テラトーマを発生せずにＥＳ細胞を含む未分化細胞を利用した再生医療が実現される。【００５８】
以上本発明の好ましい実施例について詳述したが、本発明はかかる特定の実施形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された本発明の趣旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によって、再生医療の鍵を握ると期待されているＥＳ細胞が持つ欠点である移植後のテラトーマの発生の問題を解決できるので、本法、あるいは、その修正技術が世の中に知られることで、再生医療の研究が飛躍的に進み、一部の、あるいは多くの再生医療が現実のものとなるような多大な医療効果が期待できる。これは患者本人のＱＯＬ（クオリティーオブライフ）に有効であるが、その他にも、増大の一途を辿る医療費の削減にも大きく貢献することが期待できる。さらには、テラトーマの発生を抑制する試験系として、ＥＳ細胞を含む未分化細胞の特性を解明して、安全な再生医療の方法を開発するためにも有効であると期待できる。したがって、本発明は、上に述べたすべての可能性を拓くものであり、その実用化の見通しと産業上の利用価値は極めて高い。【００６０】
本国際出願は、２００６年８月２８日に出願した日本国特許出願２００６−２３０９０５号に基づく優先権を主張するものであり、２００６−２３０９０５号の全内容を本国際出願に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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