(57)【要約】  腸の上皮細胞におけるＧｓｄｍｄおよびそれをコードするＧｓｄｍｄ遺伝子の機能を解明するための、モデルマウスを提供する。染色体上でＧｓｄｍｄをコードするＧｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体を有し、Ｇｓｄｍｄが非発現であるマウスを、モデルマウスとする。まず、マウスゲノムＤＮＡにおけるＧｓｄｍｄ遺伝子のエキソン２を含む断片を有するターゲティングベクターをマウス胚幹細胞に導入し、相同組換えによりＧｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされた胚幹細胞からキメラ胚細胞を作製する。これを仮親マウスに移植して、生まれたＧｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたキメラマウスを交配して、ヘテロ接合体マウスを選択し、前記へテロ接合体マウス同士を交配することによって、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体のモデルマウスが得られる。
2008084566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子がノックアウトされたモデルマウスであって、
前記マウスが、染色体上でＧｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体であることを特徴とするモデルマウス。
【請求項２】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン２が欠失したホモ接合体である、請求の範囲１記載のモデルマウス。
【請求項３】
Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン１およびエキソン２が欠失したホモ接合体である、請求の範囲１記載のモデルマウス。
【請求項４】
モデルマウスの形質が、腸が損傷を受けた場合、腸細胞の増殖機能が減退する形質である、請求の範囲１記載のモデルマウス。
【請求項５】
下記（Ａ）〜（Ｈ）工程により製造される、請求の範囲１記載のモデルマウス。
（Ａ）  マウスのゲノムＤＮＡにおけるＧｓｄｍｄ遺伝子のゲノム領域を含む断片を有するターゲティングベクターを準備する工程
（Ｂ）  マウス胚幹細胞に前記ターゲティングベクターを導入し、マウスゲノムＤＮＡと前記ターゲティングベクターとの相同組換えを行う工程
（Ｃ）  前記相同組換えによりＧｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされた胚幹細胞を選択する工程
（Ｄ）  前記（Ｃ）工程で得られた胚幹細胞からキメラ胚細胞を作製する工程
（Ｅ）  前記キメラ胚細胞を仮親マウスに移植する工程
（Ｆ）  前記仮親マウスから生まれた、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたキメラマウスを選択する工程
（Ｇ）  前記キメラマウスを交配して、ヘテロ接合体マウスを選択する工程
（Ｈ）  前記へテロ接合体マウス同士を交配して、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体マウスを選択する工程  
【請求項６】
前記（Ａ）工程において、前記ターゲティングベクターが、少なくとも２つのＣｒｅリコンビナーゼの認識配列を含むカセットを有し、前記カセットにおいて、前記Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン２を含む断片の両端が前記Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列で挟まれている、請求の範囲５記載のモデルマウス。
【請求項７】
さらに、前記（Ｈ）工程の後、腸に損傷を与える下記（Ｉ）工程を含む、請求の範囲５記載のモデルマウス。
（Ｉ）  前記ノックアウトマウスに、γ線照射、薬剤暴露、および、細菌感染からなる群から選択された少なくとも一つを施す工程
【請求項８】
遺伝子がノックアウトされたモデルマウスの製造方法であって、
前記モデルマウスが、請求の範囲１記載のモデルマウスであり、下記（Ａ）〜（Ｈ）工程を含むことを特徴とする、モデルマウス製造方法。
（Ａ）  マウスのゲノムＤＮＡにおけるＧｓｄｍｄ遺伝子のゲノム領域を含む断片を有するターゲティングベクターを準備する工程
（Ｂ）  マウス胚幹細胞に前記ターゲティングベクターを導入し、マウスゲノムＤＮＡと前記ターゲティングベクターとの相同組換えを行う工程
（Ｃ）  前記相同組換えによりＧｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされた胚幹細胞を選択する工程
（Ｄ）  前記（Ｃ）工程で得られた胚幹細胞からキメラ胚細胞を作製する工程
（Ｅ）  前記キメラ胚細胞を仮親マウスに移植する工程
（Ｆ）  前記仮親マウスから生まれた、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたキメラマウスを選択する工程
（Ｇ）  前記キメラマウスを交配して、ヘテロ接合体マウスを選択する工程
（Ｈ）  前記へテロ接合体マウス同士を交配して、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体マウスを選択する工程
【請求項９】
前記（Ａ）工程において、前記ターゲティングベクターが、少なくとも２つのＣｒｅリコンビナーゼの認識配列を含むカセットを有し、前記カセットにおいて、前記Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン２を含む断片の両端が前記Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列で挟まれている、請求の範囲８記載のモデルマウス製造方法。
【請求項１０】
前記（Ａ）工程において、エキソン２を含む断片が、さらにエキソン１を含む、請求の範囲８記載のモデルマウス製造方法。
【請求項１１】
さらに、前記（Ｈ）工程の後、腸に損傷を与える下記（Ｉ）工程を含む、請求の範囲８記載のモデルマウス製造方法。
（Ｉ）  前記ノックアウトマウスに、γ線照射、薬剤暴露、および、細菌感染からなる群から選択された少なくとも一つを施す工程
【請求項１２】
前記ターゲティングベクターにおいて、前記Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列が、ｌｏｘＰ配列である、請求項９記載のモデルマウスの製造方法。
【請求項１３】
前記ターゲティングベクターが、さらに、選択マーカーを含むベクターである、請求項８記載のモデルマウスの製造方法。
【請求項１４】
損傷を受けた細胞の細胞増殖機能を回復する薬剤のスクリーニング方法であって、
下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
（ａ）  腸に損傷を受けた請求の範囲１記載のモデルマウスを準備する工程
（ｂ）  前記モデルマウスに候補物質を投与する工程
（ｃ）  前記モデルマウスの損傷を受けた腸において細胞増殖機能を向上させた候補物質を、目的の薬剤として選択する工程
【請求項１５】
前記（ａ）工程が、請求の範囲１記載のモデルマウスに、γ線照射、薬剤暴露、および、細菌感染からなる群から選択された少なくとも一つを施す工程である、請求の範囲１４記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モデルマウスおよびその製造方法に関する。より詳細には、腸の上皮細胞におけるＧａｓｄｅｒｍｉｎ（Ｇｓｄｍ）ＤおよびそれをコードするＧｓｄｍｄ遺伝子の解析に使用できるモデルマウスおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスの皮膚において、表皮の過形成、角質増殖および異常発毛という形質を示す変異Ｒｉｍ３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ３）が知られており、本発明者らによって、その原因遺伝子がＧｓｄｍａ３遺伝子であることが解明されている（特許文献１参照）。そして、本発明者らのさらなる研究により、Ｇｓｄｍａ３遺伝子を含む合計８つのマウス遺伝子、すなわち、Ｇｓｄｍａ１、Ｇｓｄｍａ２、Ｇｓｄｍａ３、Ｇｓｄｍｃ１、Ｇｓｄｍｃ２、Ｇｓｄｍｃ３、Ｇｓｄｍｃ４およびＧｓｄｍｄが、相互に関連するＧｓｄｍファミリーを形成していることが明らかとなった。このＧｓｄｍファミリーに属する遺伝子は、全て、皮膚や消化管等をはじめとする種々の組織の上皮細胞において特異的な発現が確認されている。そして、Ｒｉｍ３の表現型やＧｓｄｍａ３遺伝子の機能から、このファミリーに属する各遺伝子は、例えば、上皮細胞の増殖、分化、上皮形態形成に関与していると推測される。【０００３】
しかしながら、特に、小腸や大腸等の腸の上皮細胞において発現するＧｓｄｍｄ遺伝子については、その機能が全く解明されていない。また、マウスのＧｓｄｍファミリーに対応して、ヒトの染色体にも、ＧＳＤＭファミリーの存在が知られている。このため、マウスＧｓｄｍｄ遺伝子の機能解明は、ヒトのＧＳＤＭ遺伝子の機能解明にとっても極めて有用な情報となる。
【特許文献１】ＷＯ  ２００４／０７６６６６（ＰＣＴ／ＪＰ０３／０２３４５）
【非特許文献２】Ｋａｔｏｈ，Ｍ．ａｎｄ  Ｋａｔｏｈ，Ｍ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＦＮＡ５Ｌ，ｍｏｕｓｅ  Ｄｆｎａ５ｌ  ａｎｄ  ｒａｔ  Ｄｆｎａ５ｌ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ．  Ｉｎｔ  Ｊ  ｏｎｃｏｌ．２５，７６５−７７０，  ２００４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、腸の上皮細胞におけるＧｓｄｍｄおよびそれをコードするＧｓｄｍｄ遺伝子の機能を解明するための、モデルマウスの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
前記目的を達成するために、本発明のモデルマウスは、遺伝子がノックアウトされたモデルマウスであって、前記マウスが、染色体上でＧｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体であることを特徴とする。【０００６】
本発明の製造方法は、遺伝子がノックアウトされたモデルマウスの製造方法であって、前記モデルマウスが、本発明のモデルマウスであり、下記（Ａ）〜（Ｈ）工程を含むことを特徴とする。
（Ａ）  マウスのゲノムＤＮＡにおけるＧｓｄｍｄ遺伝子のゲノム領域を含む断片を有するターゲティングベクターを準備する工程
（Ｂ）  マウス胚幹細胞に前記ターゲティングベクターを導入し、マウスゲノムＤＮＡと前記ターゲティングベクターとの相同組換えを行う工程
（Ｃ）  前記相同組換えによりＧｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされた胚幹細胞を選択する工程
（Ｄ）  前記（Ｃ）工程で得られた胚幹細胞からキメラ胚細胞を作製する工程
（Ｅ）  前記キメラ胚細胞を仮親マウスに移植する工程
（Ｆ）  前記仮親マウスから生まれた、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたキメラマウスを選択する工程
（Ｇ）  前記キメラマウスを交配して、ヘテロ接合体マウスを選択する工程
（Ｈ）  前記へテロ接合体マウス同士を交配して、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体マウスを選択する工程【０００７】
本発明の薬剤スクリーニング方法は、損傷を受けた細胞の細胞増殖機能を回復する薬剤のスクリーニング方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする。
（ａ）  腸に損傷を受けた本発明のモデルマウスを準備する工程
（ｂ）  前記モデルマウスに候補物質を投与する工程
（ｃ）  前記モデルマウスの損傷を受けた腸における細胞増殖機能を向上させた候補物質を、目的の薬剤として選択する工程
【発明の効果】
【０００８】
本発明のモデルマウスは、染色体上における内在性Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体である。このため、このモデルマウスを用いることにより、例えば、腸の上皮細胞におけるＧｓｄｍｄやＧｓｄｍｄ遺伝子の機能解析を行うことができる。また、本発明のモデルマウスは、本発明者らによって、例えば、腸が損傷を受けた場合、腸細胞の増殖機能が減退する形質を示すことが明らかとなった。このため、さらに腸に損傷を与えた本発明のモデルマウスを用いることによって、例えば、細胞増殖機能を回復させる薬剤のスクリーニングも可能となる。また、損傷後の組織における細胞増殖機能は、後述するように、ホメオスタシスを担う機能であることから、本発明のモデルマウスは、例えば、腸組織のホメオスタシスの解明においても極めて有用なツールとなる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明の実施例１における相同組換えの概略を示す図であり、マウスＧｓｄｍｄ遺伝子のゲノム構造、ターゲティングベクターの構造、組換えアレル（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ）の構造、および、Ｇｓｄｍｄヌルアレル（Ｃｒｅ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ）の概略を示す。
【図２】図２は、本発明の前記実施例１における結果であり、（Ｂ）は、前記組換えＥＳ細胞の遺伝子型タイピングの結果を示す図であり、（Ｃ）は、Ｇｓｄｍｄヌルアレルの遺伝子型タイピングの結果を示す図であり、（Ｄ）は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子およびβ−アクチン遺伝子の発現レベルを示す図である。
【図３】図３は、本発明の実施例２における、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスの腸管の染色写真であり、（Ａ）および（Ｃ）は、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスの小腸（Ａ）と大腸（Ｃ）の染色写真であり、（Ｂ）および（Ｄ）は、野生型マウスの小腸（Ｂ）と大腸（Ｄ）の染色写真である。
【図４】図４は、本発明の前記実施例２における、マウス腸管の染色写真であり、左欄（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）が、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスの小腸上皮の染色写真であり、右欄（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）が、野生型マウスの小腸上皮の染色写真である。
【図５】図５は、本発明の前記実施例２における、マウス腸管の染色写真であり、左欄（Ａ、Ｃ）が、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスの大腸上皮の染色写真であり、右欄（Ｂ、Ｄ）が、野生型マウスの大腸上皮の染色写真である。
【図６】図６は、本発明の実施例３における、Ｇｓｄｍｄヌルマウス小腸の細胞増殖およびアポトーシスの解析結果であり、（Ａ）および（Ｂ）が、細胞増殖を示す免疫組織化学染色の結果、（Ｃ）および（Ｄ）が、アポトーシスを示す免疫組織化学染色の結果である。
【図７】図７は、本発明の前記実施例３における、Ｇｓｄｍｄヌルマウス大腸の細胞増殖およびアポトーシスの解析結果であり、（Ａ）および（Ｂ）が、細胞増殖を示す免疫組織化学染色の結果、（Ｃ）および（Ｄ）が、アポトーシスを示す免疫組織化学染色の結果である。
【図８】図８は、本発明の前記実施例４において、Ｇｓｄｍｃ２遺伝子、Ｇｓｄｍｃ３遺伝子および、Ｇｓｄｍｃ４遺伝子のｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の前記実施例５における、Ｇｓｄｍｄヌルマウスの生存期間と死亡率との関係を示すグラフである。
【図１０】図１０は、本発明の前記実施例６において、γ線照射後のマウス小腸についてのアポトーシスの結果であり、（Ａ）は、アポトーシス細胞／陰窩のグラフ、（Ｂ）は、Ｇｓｄｍｄヌルマウス小腸の写真、（Ｃ）は、野生型マウス小腸の写真である。
【図１１】図１１は、本発明の前記実施例６において、γ線照射後のマウス大腸についてのアポトーシスの結果であり、（Ａ）は、アポトーシス細胞／陰窩のグラフ、（Ｂ）は、Ｇｓｄｍｄヌルマウス大腸の写真、（Ｃ）は、野生型マウス大腸の写真である。
【図１２】図１２は、本発明の前記実施例６において、γ線照射後のマウス小腸についての細胞増殖の結果であり、（Ａ）は、ＢｒｄＵ陽性細胞／陰窩のグラフ、（Ｂ）は、Ｇｓｄｍｄヌルマウス小腸の写真、（Ｃ）は、野生型マウス小腸の写真である。
【図１３】図１３は、本発明の前記実施例６において、γ線照射後のマウス大腸についての細胞増殖の結果であり、（Ａ）は、ＢｒｄＵ陽性細胞／陰窩のグラフ、（Ｂ）は、Ｇｓｄｍｄヌルマウス大腸の写真、（Ｃ）は、野生型マウス大腸の写真である。
【図１４】図１４は、本発明の前記実施例６において、γ線照射後のマウス小腸についてのＢｒｄＵ陽性細胞数の度数分布をバーダイヤグラムで表した図である。
【図１５】図１５は、本発明の前記実施例６において、γ線照射後のマウス大腸についてのＢｒｄＵ陽性細胞数の度数分布をバーダイヤグラムで表した図である。
【図１６】図１６は、マウスのＧｓｄｍｄ遺伝子の染色体位置を示す図である。
【図１７】図１７は、染色体１５におけるマウスＧｓｄｍファミリーのゲノム構造を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明のモデルマウスは、前述のように、遺伝子がノックアウトされたモデルマウスであって、染色体上でＧｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体であることを特徴とする。本発明において、「Ｇｓｄｍｄ遺伝子のノックアウト」とは、染色体上の内在性Ｇｓｄｍｄ遺伝子の働きを無くすことであって、例えば、遺伝子変異によりＧｓｄｍｄ遺伝子を不活性化して、Ｇｓｄｍｄを発現する機能を失わせることを意味する。【００１１】
前記遺伝子変異の方法は、制限されず、例えば、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の欠失、置換、付加等があげられる。また、遺伝子変異によりＧｓｄｍｄ遺伝子の働き（例えば、Ｇｓｄｍを発現する機能）を失えばよく、例えば、Ｇｓｄｍｄ遺伝子全体の変異でもよいし、部分的な変異でもよい。すなわち、例えば、染色体上のＧｓｄｍｄ遺伝子全体が欠失、置換または付加されてもよいし、部分的に欠失、置換または付加されてもよい。具体例としては、Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン２が翻訳開始部位（ＡＴＧ）を含むことから、例えば、エキソン２が欠失、置換または付加されていることが好ましく、また、エキソン１およびエキソン２を含む領域が欠失、置換または付加されていることも好ましい。この他にも、例えば、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の転写調節領域（Ｇｓｄｍｄエキソン１の５’上流ゲノム領域）を欠失等させてもよい。【００１２】
本発明のモデルマウスは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体であることから、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の遺伝子産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）が非発現という形質を示す。また、本発明者らは、得られた本発明のモデルマウスについて研究を重ねた結果、以下の形質を明らかとした。すなわち、本発明のモデルマウスは、腸が損傷を受けた場合、腸細胞の増殖機能が減退する形質を示す。通常、生体は、組織が損傷を受けた場合、損傷細胞のアポトーシスと細胞（幹細胞）の増殖率向上とによって、組織の再生を図り、ホメオスタシスを維持している。このため、損傷後の組織における細胞増殖機能は、ホメオスタシスを担う機能といえる。本発明のマウスは、前述のように、腸細胞の増殖機能が減退している。このことから、Ｇｓｄｍｄ遺伝子は、例えば、細胞分化や組織の形態形成ではなく、成熟期における腸の上皮細胞のホメオスタシスを担う遺伝子と推測される。【００１３】
このように、腸組織が損傷を受けた場合、本発明のモデルマウスは、細胞増殖機能が減退する形質を示す。したがって、腸組織を損傷させた本発明のモデルマウスは、例えば、後述するように、細胞の増殖機能を回復させる薬剤のスクリーニング用モデルマウスとしても有用である。【００１４】
本発明のモデルマウスは、前述のように、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体を有し、Ｇｓｄｍｄが未発現であればよい。このため、その製造方法は制限されないが、例えば、本発明のモデルマウス製造方法によって製造できる。以下に、本発明のモデルマウスの製造方法について、一例をあげて説明する。なお、本発明は、これには限定されない。【００１５】
まず、マウスのゲノムＤＮＡにおけるＧｓｄｍｄ遺伝子のエキソン２を含む断片、好ましくは、エキソン２およびエキソン１を含む断片（エキソン間のイントロンも含む）を有するターゲティングベクターを準備する（Ａ工程）。この断片の調製方法は、制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例として、マウス遺伝子ライブラリー（ゲノムＤＮＡ）からクローニングしたり、ＰＣＲ等によって目的断片を増幅する方法等があげられる。マウスにおけるＧｓｄｍｄ遺伝子の配列は、例えば、ＮＣＢＩアクセッション：Ｎｏ．Ａｋ００７７１０に登録されている。マウスＧｓｄｍｄ遺伝子の染色体１５における位置の概略を図１６に、ゲノム構造の概略を図１７に示す。なお、両図中、Ｇｓｄｍ遺伝子の種類について、ＧｓｄｍＣ１〜ＧｓｄｍＣ４およびＧｓｄｍＤと大文字で記載するが、これらはそれぞれＧｓｄｍｃ１〜Ｇｓｄｍｃ４およびＧｓｄｍｄであり、他の図についても同様である。【００１６】
前記ターゲティングベクターは、前記断片の両端をＣｒｅリコンビナーゼの認識配列で挟んだカセットを有することが好ましい。Ｃｒｅリコンビナーゼの認識配列としては、特に制限されないが、例えば、従来公知のｌｏｘＰ配列があげられる。ｌｏｘＰを使用すれば、いわゆるＣｒｅ−ｌｏｘＰ組換え系によって、容易に遺伝子ターゲティングを行うことができる。また、前記カセットは、さらに、選択マーカーを含むことが好ましい。前記選択マーカーとしては、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー等があげられる。前記薬剤耐性マーカーとしては、例えば、ネオマイシン耐性マーカー、ゼオシン耐性マーカー、ピューロマイシン耐性マーカー、ハイグロマイシン耐性マーカー、ヒスチジノール耐性マーカー等があげられる。このような選択マーカーを含むことによって、例えば、後述する胚幹細胞（ＥＳ細胞）の選択が容易になる。【００１７】
つぎに、マウスＥＳ細胞に前記ターゲティングベクターを導入し、マウスゲノムＤＮＡと前記ターゲティングベクターとの相同組換えを行う（Ｂ工程）。ＥＳ細胞への前記ターゲティングベクターの導入は、例えば、ベクターの種類に応じて適宜決定できる。具体例としては、前記ターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション等によってＥＳ細胞に導入する方法があげられる。【００１８】
そして、前記相同組換えによって、Ｇｓｄｍｄ遺伝子にＣｒｅリコンビナーゼ認識配列（例えば、ｌｏｘＰ配列）が挿入されたＥＳ細胞を選択する（Ｃ工程）。具体例として、前述のエキソン２およびエキソン１を含む断片の両端をｌｏｘＰ配列で挟んだターゲティングベクターを使用した場合、例えば、Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン１の上流とイントロン２（エキソン２とエキソン３の間、以下同様）とにｌｏｘＰ配列が挿入されたＥＳ細胞を選択する。選択の方法は、何ら制限されない。前述のように、ターゲティングベクターが前記選択マーカーを有する場合は、例えば、ＥＳ細胞の培養を行い、選択マーカーの発現株を選択すればよい。この選択マーカーの発現株が、相同組換えにより前記カセットが導入されたアレルを有する組換えＥＳ細胞株である。前記選択マーカーが薬剤耐性マーカーの場合には、薬剤耐性株を選択すればよい。【００１９】
得られた組換えＥＳ細胞を、例えば、マウスの胚細胞（胚盤胞）に注入してキメラ胚細胞を作製し（Ｄ工程）、このキメラ胚細胞を仮親マウスの子宮に移植する（Ｅ工程）。そして、この前記仮親マウスから生まれたマウスより、Ｇｓｄｍｄ遺伝子にｌｏｘＰ配列が挿入されたキメラマウスを選別する（Ｆ工程）。具体例として、Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン１の上流とイントロン２とにｌｏｘＰ配列が挿入された前述のＥＳ細胞を使用した場合、Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン１の上流とイントロン２とにｌｏｘＰ配列が挿入されたキメラマウスを選別する。この選別は、例えば、使用するマウスの系統の組み合わせを調整し、生まれたマウスの毛色により、外観から識別して行うことができる。【００２０】
前記キメラマウスを交配して、ヘテロ接合体マウスを選択する（Ｇ工程）。この選別は、例えば、適切なＰＣＲプライマーを選択し、生まれたマウスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより行える。前記ターゲティングベクターにおいて、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の断片をＣｒｅリコンビナーゼの認識配列（ｌｏｘＰ配列）で挟んでいる場合は、例えば、Ｃｒｅを発現するトランスジェニックマウスと前記キメラマウスを交配すればよい。そして、得られた前記へテロ接合体マウス同士を交配して、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされたホモ接合体マウスを選択する。このようにして、本発明のモデルマウスを製造できる。【００２１】
また、前述のように、本発明のモデルマウスは、さらに、腸に損傷を与えたマウスであってもよい。このため、前述のようにして得られた前記ホモ接合体マウスに、さらに、γ線照射、薬剤暴露、細菌感染等の処理を施してもよい。このような処理によって腸に損傷を受けた本発明のモデルマウスは、前記腸組織において、細胞増殖機能が減退するという形質を示す。このようなモデルマウスは、例えば、後述するスクリーニングに有用である。前記薬剤としては、制限されないが、エタノール、酢酸、塩酸、デキストラン硫酸ナトリウム、インドメタシン、トリニトロベンゼンスルホン酸、ペプチドグリカン−ポリサッカライド、免疫複合体／ホルマリン、シクロスポリン等があげられる。前記細菌としては、例えば、ピロリ菌等があげられる。【００２２】
つぎに、本発明のスクリーニング方法は、前述のように、損傷を受けた細胞の細胞増殖機能を回復させる薬剤のスクリーニング方法であって、下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特徴とする。
（ａ）  腸に損傷を受けた本発明のモデルマウスを準備する工程
（ｂ）  前記モデルマウスに候補物質を投与する工程
（ｃ）  前記モデルマウスの腸における細胞増殖機能を向上させた候補物質を、目的の薬剤として選択する工程【００２３】
この方法によれば、減退した細胞増殖機能を回復する薬剤をスクリーニングすることができる。このようにしてスクリーニングした薬剤は、ホメオスタシスを担う細胞増殖機能を回復または増強することが可能であるため、例えば、医療分野等において非常に有用である。
【実施例】
【００２４】
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例により制限されない。【００２５】
［実施例１］
Ｇｓｄｍｄ遺伝子のヌル変異マウスの作製
マウスのＥＳ細胞について、相同組換えにより、Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン１およびエキソン２を欠失させ、Ｇｓｄｍｄ遺伝子産物を欠損するヌル変異マウスを作製した。なお、Ｇｓｄｍｄ遺伝子のエキソン２は、翻訳開始部位のＡＴＧを含む。【００２６】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から、ＭＣＨ（Ｍｕｌｔｉ  Ｃｒｏｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄ（ＩＣＲ））系統マウスおよびＢ６Ｃ３Ｆ１（Ｃ５７ＢＬ／６ＪとＣ３Ｈ系統のＦ１）系統マウスは、ＣＬＥＡ  ＪＡＰＡＮ，ＩＮＣ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）からそれぞれ購入した。【００２７】
（１）ターゲティングベクターの作製
まず、ベーシックターゲティングベクターとして、５’ｌｏｘＰ−ｆｌｒｔｅｄ  Ｐｇｋ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）−ｎｅｏ−３’ｌｏｘＰおよびＰｇｋ−ＤＴＡ（ジフテリアトキシンＡサブユニット）を含むｐｌｏｘＦＮＦＤＴを準備した。前記ｐｌｏｘＦＮＦＤＴは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）のマルチクローニングサイトに、５’−ｌｏｘＰ配列・ＦＲＴ配列・Ｐｇｋ（ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）プロモーター・ネオマイシン耐性遺伝子・ＦＲＴ配列・ｌｏｘＰ配列−３’、および、Ｐｇｋ−ＤＴＡ（ジフテリアトキシンＡサブユニット）を導入したベクターである。他方、マウスゲノムのＧｓｄｍｄ遺伝子の断片として、５’フランキング断片（５．４ｋｂ）、エキソン１および２を含む断片（３．５ｋｂ）、エキソン３および４を含む断片（１．４ｋｂ）を、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスＢＡＣクローン（ＢＡＣ  ＲＰＣＩ２４  ３４０Ｊ１２）から、従来法により調製した。以下、エキソン１および２を含む断片を「エキソン１−２断片」、エキソン３および４を含む断片を「エキソン３−４断片」という。そして、前記ｐｌｏｘＦＮＦＤＴにおいて、前記５’−ｌｏｘＰ上流に前記５’フランキング断片を、前記５’−ｌｏｘＰとｆｌｒｔｅｄ  Ｐｇｋ−ｎｅｏ部位との間に前記エキソン１−２断片を、前記３’−ｌｏｘＰ下流に前記エキソン３−４断片を、それぞれ結合させた。このベクターをターゲティングベクターとした。図１Ａに、マウスＧｓｄｍｄ遺伝子のゲノム構造、および、ターゲティングベクターの構造の概略を示す。同図において、Ｅｘはエキソン、ＤＴはＤＴＡ（ジフテリアトキシンＡサブユニットのコード配列）、Ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子、大きな矢印で表されるｌｏｘＰは組換え酵素Ｃｒｅの標的配列、縦長の楕円印で表されるＦＲＴは組換え酵素Ｆｌｐの標的配列（ｆｌｒｔｅｄ）をそれぞれ示す。また、同図において小さい矢印は、後述する各種プライマーを示す。図１Ａに示すように、作製したターゲティングベクターは、エキソン１−２断片およびｎｅｏカセットが、ｌｏｘＰで挟まれた領域を有する。【００２８】
（２）遺伝子ターゲティング
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスとＣＢＡ／Ｊマウスとの交配により得られたＦ１マウスから樹立されたＴＴ２細胞株（Ｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２１４，７０−７６，１９９３）を、ＥＳ細胞として使用した。このＥＳ細胞に、線状化した前記ターゲティングベクターを、エレクトロポレーションによって導入し、ネオマイシン（Ｇ４１８）耐性株を選択した（計２１８株）。さらに、前記Ｇ４１８耐性株から、以下の方法により、前記ターゲティングベクターと相同組換えした組換えアレルを有する組換えＥＳ細胞株をスクリーニングした（１１株）。この組換えアレル（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ）の概略を図１Ａにあわせて示す。【００２９】
前記Ｇ４１８耐性株のスクリーニングは、以下に示す二種類のプライマーセット（ＥＳＰＣＲ１、ＥＳＰＣＲ２）を用いたＰＣＲにより行った。ＰＣＲの条件は、常法に基づいて設定した。各プライマーセットのゲノムＤＮＡに対するアニーリング部位の概略を、図１Ａの組換えアレル（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｌｌｅｌｅ）にあわせて示す。このスクリーニングは、まず、ＥＳＰＣＲ１プライマーセットにより増幅が確認された株を選択し、さらに、ＥＳＰＣＲ２プライマーセットにより増幅が確認された株を選択して行った。プライマーセットＥＳＰＣＲ１およびＥＳＰＣＲ２を用いて、前記組換えＥＳ細胞について遺伝子型タイピングを行った結果を図２Ｂに示す。図２Ｂにおいて、上のパネルは、ＥＳＰＣＲ１プライマーセットにより増幅されたバンドを示し、下のパネルは、ＥＳＰＣＲ２プライマーセットにより増幅されたバンドを示す。野生型アレルを有するゲノムＤＮＡ（ホモ接合体：＋／＋）は、１６８８ｂｐの断片（エキソン１−２断片およびｎｅｏカセットがｌｏｘＰで挟まれた領域）が導入されていない。このため、図２Ｂの上パネル左レーンに示すように、ＥＳＰＣＲ１プライマーセットによる増幅バンドは確認されず、下パネル左レーンに示すように、ＥＳＰＣＲ２プローブセットによる増幅バンド（５’ｌｏｘＰを含まない１０８０ｂｐ）が確認されたのみであった。これに対して、組換えアレルを有するゲノムＤＮＡ（へテロ接合体：＋／ｆｌｏｘ）は、１６８８ｂｐの断片（エキソン１−２断片およびｎｅｏカセットがｌｏｘＰで挟まれた領域）が導入されたため、図２Ｂの上パネルの右レーンに示すように、ＥＳ  ＰＣＲ１プライマーセットによる増幅バンドが確認された。さらに、下パネル左レーンに示すように、ＥＳ  ＰＣＲ２プローブセットによる増幅バンド（５’ｌｏｘＰを含む１１００ｂｐの断片）も確認された。【００３０】
ＥＳＰＣＲ１プライマーセット
Ｐ１Ｆ
５’−ＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧ−３’        （配列番号１）
Ｐ１Ｒ
５’−ＡＧＧＴＣＡＣＣＡＡＣＴＣＡＣＴＴＡＴＣＣ−３’      （配列番号２）
ＥＳＰＣＲ２プライマーセット
Ｐ２Ｆ
５’−ＧＣＡＴＧＣＧＴＡＧＴＴＧＴＧＣＡＣＴＴ−３’        （配列番号３）
Ｐ２Ｒ
５’−ＧＧＣＴＡＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号４）
＊  Ｆはフォワードプライマー、Ｒはリバースプライマー【００３１】
得られたＧ４１８耐性の組換えＥＳ細胞株を８細胞胚に注入し、仮親マウス（Ｂ６Ｃ３Ｆ１）の子宮に移植した。前記仮親マウスから生まれたオスのキメラを、ＭＣＨメスマウスと交配させ、生まれたマウスの毛色が黒色であるか否かによって、前記組換えアレルの伝達を確認した。交配により生まれたマウスのうち、ｌｏｘＰが導入された前記組換えアレルを有するヘテロ型変異マウスを、Ｂ６．Ｔｇ（ＣＡＧ−Ｃｒｅ）トランスジェニックマウスと交配し、Ｇｓｄｍｄ−ヌルアレルを有するヘテロ型変異マウスを得た。なお、前記ヘテロ型変異マウスとＢ６．Ｔｇ（ＣＡＧ−Ｃｒｅ）トランスジェニックマウスとの交配により生まれたマウスは、Ｃｒｅを発現することにより、ｌｏｘＰ配列間で組換えが生じる。この組換えが生じたＧｓｄｍｄヌルアレル（Ｃｒｅ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ）の概略を、図１Ａにあわせて示す。【００３２】
そして、Ｇｓｄｍｄヌルアレル（Ｃｒｅ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ）を有するヘテロ接合体変異マウス（Ｇｓｄｍｄ＋／−）同士を交配して、ホモ接合体変異マウス（Ｇｓｄｍｄ−／−）を得た。ホモ接合体変異マウスを、以下、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスともいう。【００３３】
交配により得られたマウスについて、Ｇｓｄｍｄヌルアレルの遺伝子型タイピングは、マウス尾部由来ゲノムＤＮＡと、以下に示す二種類のプライマーセット（ｇｔＰＣＲ１、ｇｔＰＣＲ２）とを用いたＰＣＲにより行った。各プライマーセットのゲノムＤＮＡに対するアニーリング部位の概略を、図１ＡのＧｓｄｍｄおよびＣｒｅ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅにあわせて示す。この遺伝子タイピングの結果を図２Ｃに示す。図２Ｃにおいて、上のパネルは、ｇｔＰＣＲ１プライマーセットにより増幅されたバンドを示し、下のパネルは、ｇｔＰＣＲ２プライマーセットにより増幅されたバンドを示す。野生型アレルを有するゲノムＤＮＡ（野生型＋／＋）は、図２Ｃの上パネル左レーンに示すように、ｇｔＰＣＲ１プライマーセットによる６１２ｂｐの増幅バンドが確認されるのみであった。他方、Ｇｓｄｍｄヌルアレルを有するゲノムＤＮＡ（ホモ接合体−／−）は、ｇｔＰＣＲ１プライマーセットによる増幅バンドは確認されず、下パネル右レーンに示すように、ｇｔＰＣＲ２プローブセットによる増幅バンド（９４３ｂｐ）が確認された。【００３４】
ｇｔＰＣＲ１プライマーセット
ｇｔ１Ｆ
５’−  ＴＴＣＣＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧ−３’  （配列番号５）
ｇｔ１Ｒ
５’−  ＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＡＣ−３’  （配列番号６）
ｇｔＰＣＲ２プライマーセット
ｇｔ１Ｆ
５’−  ＴＴＣＣＡＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＴＡＡＧＡＧ−３’  （配列番号７）
ｇｔ２Ｒ
５−  ＡＧＣＴＣＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＡＣ−３’    （配列番号８）【００３５】
また、ホモ接合体変異マウス（Ｇｓｄｍｄ−／−）の発生を確認したところ、下記表１に示すように、ほぼ通常のメンデルの分離比で発生することがわかった。【００３６】
【表１】
2008084566.tif 000003
【００３７】
得られたＧｓｄｍｄヌル変異マウスは、外見上、野生型マウスおよびヘテロ接合体変異マウスと区別がつかなかった。そこで、各成熟マウス（野生型マウスＧｓｄｍｄ−／−、ヘテロ接合体変異マウスＧｓｄｍｄ＋／−、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスＧｓｄｍｄ−／−）について、小腸におけるＧｓｄｍｄ遺伝子の発現レベルを、下記プライマーセットを用いたＲＴ−ＰＣＲにより解析した。また、コントロールとして、β−アクチンの発現レベルについても同様に解析した。これらの結果を図２Ｄに示す。図２Ｄに示すように、野生型マウスならびにヘテロ接合体変異マウスについては、ＧｓｄｍｄのｍＲＮＡの発現が確認されたが、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスは、ｍＲＮＡの発現が確認されなかった。この結果から、得られたＧｓｄｍｄヌル変異マウスは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子が部分的に削除されることにより、その遺伝子産物を欠損していることが確認できた。以上のようにして、Ｇｓｄｍｄの遺伝子産物を欠損するホモ接合体Ｇｓｄｍｄ変異マウスを得ることができた。【００３８】
Ｇｓｄｍｄ用プライマーセット
Ｇｓｄｍｄ−Ｆ
５’−ＣＡＴＧＧＣＣＴＣＡＡＴＧＴＧＣＴＴＧＣ−３’（配列番号９）
Ｇｓｄｍｄ−Ｒ
５’−ＧＧＴＧＧＧＣＡＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＡＣ−３’（配列番号１０）
β−アクチン用プライマーセット
β−アクチン−Ｆ
５’−ＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴＣＴＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号１１）
β−アクチン−Ｒ
５’−ＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡＧＴＧ−３’（配列番号１２）【００３９】
［実施例２］
（Ｇｓｄｍｄヌルマウスの表現系の確認）
Ｇｓｄｍｄ遺伝子は、主に、成熟マウスの小腸および大腸で発現される。そこで、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウス（Ｇｓｄｍｄ−／−）の小腸および大腸について、染色による組織学的解析を行い、表現系を確認した。【００４０】
まず、生後２ヶ月のマウスから、腸管全体を取り出し、内容物を除去するために、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を穏やかに流して洗浄した。洗浄後の小腸と大腸を、それぞれ円状に巻き、４体積％ＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）を含むＰＢＳ中、４℃で一晩固定した。これをパラフィンに封埋し、厚み７μｍのパラフィン切片を調製した。この切片をキシレンによって脱パラフィンし、エタノールで再水和した後、ＨＥ（ヘマトキシリン／エオシン）染色を行った。野生型マウス（Ｇｓｄｍｄ＋／＋）についても同様の解析を行った。野生型マウスとしては、ヘテロ接合体変異マウスＧｓｄｍｄ＋／−同士を交配し、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウス（Ｇｓｄｍｄ−／−）と同時に得られた遺伝型正常同腹子Ｇｓｄｍｄ＋／＋を使用した（以下、同様）。【００４１】
これらの結果を、図３に示す。図３において、ＡおよびＣは、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスの小腸（Ａ）と大腸（Ｃ）の染色写真であり、ＢおよびＤは、野生型マウスの小腸（Ｂ）と大腸（Ｄ）の染色写真である（全て、拡大率２００倍）。これらの図からわかるように、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスは、野生型マウスと比較して、小腸および大腸のいずれについても組織学的特徴に違いは見られなかった。この結果は、少なくとも生後２ヶ月までの間、Ｇｓｄｍｄ遺伝子は、小腸および大腸の発達ならびに形態形成に関与しないこと示唆している。【００４２】
（Ｇｓｄｍｄ遺伝子の細胞分化への影響）
Ｇｓｄｍ遺伝子ファミリーの一つであるＧｓｄｍａ３遺伝子は、前述のように、突然変異によって、上皮の細胞分化に異常（Ｒｉｍ３の表現型）を引き起こすことが、発明者らにより確認されている。そこで、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウス（Ｇｓｄｍｄ−／−）の小腸および大腸について、細胞分化を解析し、Ｇｓｄｍｄ遺伝子が細胞分化に与える影響を確認した。細胞分化の解析は、染色による組織学解析ならびに免疫組織化学的解析により行った。【００４３】
腸管上皮は、杯状細胞、パネート細胞、腸細胞および腸内分泌細胞という４つの分化細胞から構成されている。そこで、本実施例においては、これら４つの分化細胞を下記方法によって確認した。なお、以下に示す組織学的染色方法、および、各細胞に特異的な抗体を用いた免疫組織学的方法は、特に示さない限り、従来公知の方法に基づいて行った。【００４４】
具体的には、前述のようにして、脱パラフィン処理および水和処理を施した切片（小腸および大腸）に、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）による染色、ならびに、一次抗体を用いた免疫組織化学を行った。杯状細胞およびパネート細胞の検出には、ＰＡＳ染色法を採用した。腸細胞および腸内分泌細胞は、一次抗体を用いた免疫組織化学法を採用し、前記一次抗体として、腸細胞には、ウサギ抗ラット肝臓脂肪酸結合タンパク質（Ｆａｂｐ−Ｌ）抗体（希釈率１：１００；Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製）を、腸内分泌細胞には、ウサギ抗クロモグラニンＡ＋Ｂ（Ｃｈｇａ）抗体（希釈率１：２００；Ｐｒｏｇｅｎ社製）を、それぞれ使用した。前記一次抗体の希釈用溶媒は、ブロッキング溶液（１．５％ヤギ血清／ＰＢＳ）を使用した（以下、同様）。【００４５】
前者のＰＡＳ染色は、常法に基づいて行った。後者の免疫組織化学は、以下のように行った。まず、前述のように調製した脱パラフィンならびに水和処理を施した前記切片に対して、抗原の賦活化処理を行った。この抗原の賦活化処理には、市販の抗原アンマスキング溶液（希釈倍率１：１００；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を使用した。具体的には、オートクレーブにおいて、前記切片を前記溶液中で、１０５℃、１５分間インキュベーションした。そして、処理後の切片を３％Ｈ２Ｏ２中で１０分間インキュベートし、さらに、前記一次抗体を添加して、４℃で一晩インキュベートした。続いて、この切片に対し、染色キット（商品名Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いたＡＢＣ法により免疫組織化学染色を行った。なお、抗体のブロッキング処理には、１．５％ヤギ血清／ＰＢＳを用いると共に、全ての操作は、前記キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット）の使用説明書に基づいて行った。発色反応は、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）／５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液を用いて行った。なお、野生型マウス（Ｇｓｄｍｄ＋／＋）についても同様に解析を行った。【００４６】
これらの結果を、図４および図５に示す。図４において、左欄（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｇ）は、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスの小腸上皮の染色写真であり、右欄（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）は、野生型マウスの小腸上皮の染色写真である。図４におけるＡ〜Ｄ、ＧおよびＨの拡大率は１００倍であり、ＥおよびＦの拡大率は２００倍である。図４のうち、ＡおよびＢにおけるＦａｂｐ−Ｌの検出シグナルは腸細胞、ＣおよびＤにおけるＰＡＳ染色は杯状細胞、ＥおよびＦにおけるＰＡＳ染色（矢印で示すシグナル）はパネート細胞、ＧおよびＨにおけるＣｈｇａ検出シグナルは腸内分泌細胞を、それぞれ示す。図５において、左欄（Ａ、Ｃ）は、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスの大腸上皮の染色写真であり、右欄（Ｂ、Ｄ）は、野生型マウスの大腸上皮の染色写真である。図５における拡大率は１００倍である。また、図５のうち、ＡおよびＢにおけるＰＡＳ染色はパネート細胞、ＣおよびＤにおけるＣｈｇａ検出シグナルは腸内分泌細胞を、それぞれ示す。これらの図に示すように、Ｇｓｄｍｄヌルマウスと野生型マウスの小腸上皮ならびに大腸上皮において、これらのマーカーの発現に有意差は確認されなかった。この結果から、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の転写産物の機能が、小腸および大腸の最終分化には関与していないことが示唆された。【００４７】
［実施例３］
（Ｇｓｄｍｄ遺伝子の細胞増殖およびアポトーシスへの影響）
前記Ｇｓｄｍａ３遺伝子の変異は、前述の上皮細胞の異常分化以外に、過剰な細胞増殖を引き起こすことが本発明者らにより確認されている。そこで、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウス（Ｇｓｄｍｄ−／−）の小腸および大腸について、細胞増殖およびアポトーシスを解析し、Ｇｓｄｍｄ遺伝子が与える影響を確認した。細胞分化の解析は、染色による組織学解析ならびに免疫組織化学的解析により行った。【００４８】
（細胞増殖の解析）
Ｓ相において細胞のＤＮＡに取り込まれるブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を検出することにより、Ｇｓｄｍｄヌルマウスの細胞増殖率を確認した。まず、生後２ヶ月のマウスの腹膜に、ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／マウスｋｇ）を注射し、注射から２時間経過した後、前記実施例２と同様に、マウスから小腸および大腸の切片を採取し、パラフィン切片を調製した。前記実施例２と同様に脱パラフィンならびに水和処理を施した前記切片に対して、ＤＮＡを変性させるために、２規定塩酸で３７℃  ２０分間処理し、そして、抗原の賦活化をトリプシンで３７℃、３分間で行った。一次抗体としてマウス抗ＢｒｄＵ（希釈率１：１０００；シグマ社製）を使用した以外は、前記実施例２と同様にして、免疫組織化学染色を行った。なお、野生型マウス（Ｇｓｄｍｄ＋／＋）についても同様に解析を行った。【００４９】
（アポトーシスの解析）
アポトーシスのマーカーである活性型カスパーゼ３の検出により、細胞のアポトーシスを確認した。具体的には、一次抗体としてウサギ抗開裂カスパーゼ３（希釈率１：２００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を使用した以外は、前記実施例３と同様にして、免疫組織化学染色（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７６，３７−４３，１９９５）を行った。なお、野生型マウス（Ｇｓｄｍｄ＋／＋）についても同様に解析を行った。【００５０】
これらの結果を、図６および図７にあわせて示す。図６は、小腸における細胞増殖およびアポトーシスの解析結果である。図６において、ＡおよびＢが、細胞増殖を示す免疫組織化学染色の結果であり（拡大率１００倍）、ＣおよびＤが、アポトーシスを示す免疫組織化学染色の結果であり（拡大率２００倍）、左欄がＧｓｄｍｄヌルマウス、右欄が野生型マウスの結果である。また、図７は、大腸における細胞増殖およびアポトーシスの解析結果である。図７において、ＡおよびＢが、細胞増殖を示す免疫組織化学染色の結果であり（拡大率２００倍）、ＣおよびＤが、アポトーシスを示す免疫組織化学染色の結果であり（拡大率２００倍）、左欄がＧｓｄｍｄヌルマウス、右欄が野生型マウスの結果である。図６および図７に示すように、ＢｒｄＵを取り込んだ増殖細胞と、アポトーシスを示す活性型カスパーゼ３陽性細胞について、Ｇｓｄｍｄヌルマウスと野生型マウスとの間に有意差は確認されなかった。この結果から、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウスは、小腸および大腸において、通常の細胞増殖およびアポトーシスが生じており、Ｇｓｄｍｄ遺伝子および遺伝子産物が、細胞増殖とアポトーシスに影響しないことが示唆された。【００５１】
［実施例４］
（Ｇｓｄｍｃクラスター遺伝子の発現制御）
本発明者らにより、同じＧｓｄｍ遺伝子ファミリーであるＧｓｄｍｃクラスター遺伝子が、Ｇｓｄｍｄの発現領域に隣接する、腸管の陰窩領域で発現されることが確認された。そこで、ＧｓｄｍｄヌルマウスにおけるＧｓｄｍｃクラスター遺伝子の発現を確認し、Ｇｓｄｍｄ遺伝子がＧｓｄｍｃクラスター遺伝子の発現に与える影響を確認した。【００５２】
Ｇｓｄｍｃクラスター遺伝子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いたリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法により行った。トータルＲＮＡは、試薬（商品名ＩＳＯＧＥＮ、株式会社ニッポンジーン社製）を使用し、その製品マニュアルに従って、月齢２ヶ月のＧｓｄｍｄヌルマウスから抽出し、さらに、商品名ＲＱ１  ＤＮａｓｅ（ＰＲＯＭＥＧＡ社製）で精製することにより調製した。ＲＴ−ＰＣＲの鋳型ｃＤＮＡは、商品名Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩおよび商品名ランダムヘキサマープライマー（インビトロゲン社製）を用いたＰＣＲにより、前記トータルＲＮＡ１μｇから生成した。なお、前記ＰＣＲは、下記条件の増幅を３回行った。一回のＰＣＲは、５０℃で２分、９５℃で１０分処理した後、９５℃で１５秒および６０℃で１分を１サイクルとして５０サイクルを繰り返した。そして、得られたｃＤＮＡを鋳型とし、Ｇｓｄｍｃクラスター遺伝子の各遺伝子に特異的なプライマー−プローブセットを用いて、従来公知の条件に基づいてＲＴ−ＰＣＲによる定量を行った。前記プライマー−プローブセットは、市販品（アプライドバイオシステム社製、カタログＮｏ．４３１９４１４３Ｅ）であり、Ｇｓｄｍｃ１用は、商品番号Ｍｍ００４５３２５０  ｍ１、Ｇｓｄｍｃ２用は、商品番号Ｍｍ０１７０１３５３  ｇＨ、Ｇｓｄｍｃ３用は、商品番号Ｍｍ０１１９４４１１  ｍＨｍ、Ｇｓｄｍｃ４用は、商品番号Ｍｍ０１１９４４９７  ｇ１である。また、１８ＳリボソームＲＮＡアッセイキット（アプライドバイオシステム社製のプローブ・プライマーセット、カタログＮｏ．４３１９４１４３Ｅ）を、インプットｃＤＮＡのバリエーションの標準化に使用した。また、遺伝子発現の相対的なレベルは、商品名ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００シーケンス検出システム（アプライドバイオシステム社製）およびＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ試薬（アプライドバイオシステム社製）を用いて検出し、デルタ−デルタＣｔ法（アプライドバイオシステム社のＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを参照）により解析した。野生型マウスについては、ヘテロ接合体変異マウスＧｓｄｍｄ＋／−同士を交配し、Ｇｓｄｍｄヌル変異マウス（Ｇｓｄｍｄ−／−）と同時に得られた遺伝型正常同腹子Ｇｓｄｍｄ＋／＋からトータルＲＮＡを調製した以外は、同様に解析を行った。【００５３】
これらの結果を、図８に示す。図８は、Ｇｓｄｍｃ２遺伝子、Ｇｓｄｍｃ３遺伝子、Ｇｓｄｍｃ４遺伝子のｍＲＮＡの相対発現レベルを示すグラフである。発現レベルは、野生型マウスの発現量を１として、これに対する相対値を示した。同図に示すように、Ｇｓｄｍｄヌルマウスは、野生型マウスと比較して、Ｇｓｄｍｃクラスター遺伝子の発現量が著しく低下した。これは、Ｇｓｄｍｄ遺伝子の欠損により、Ｇｓｄｍｃクラスター遺伝子の発現がダウンレギュレーションを受けていると推測される。この結果から、Ｇｓｄｍｄヌルマウスの小腸と大腸における特異的な表現型の欠如が、Ｇｓｄｍｃクラスター遺伝子の影響によるものではないことがわかった。【００５４】
［実施例５］
（Ｇｓｄｍｄヌルマウスの死亡率）
生後１ヶ月〜６ヶ月における、Ｇｓｄｍｄヌルマウスの死亡率を確認した。死亡率の確認は、Ｇｓｄｍｄヌルマウス（Ｇｓｄｍｄ−／−）２４匹、ヘテロ接合体変異マウス（Ｇｓｄｍｄ＋／−）４５匹、野生型マウス（Ｇｓｄｍｄ＋／＋）３４匹について確認した。【００５５】
この結果を図９に示す。図９は、生存期間（Ｍｏｎｔｈ）と死亡率との関係を示すグラフであり、ホモ接合体変異マウス（Ｇｓｄｍｄヌルマウス）を◆、ヘテロ接合体変異マウスを■、野生型マウスを▲で示す。図９に示すように、Ｇｓｄｍｄヌルマウスは、ヘテロ接合体変異マウスおよび野生型マウスと比較して、極めて死亡率が高いという結果が得られた。具体的には、月齢１２ヶ月での死亡率が、野生型およびヘテロ接合体でそれぞれ５．９％（２／３４）と１１．１％（５／４５）であるのに対して、ホモ接合体は２９．２％（７／２４）を示した。この月齢での死亡率からも、突然死の率が高いといえる。なお、マウスの活動や外観を確認したところ、Ｇｓｄｍｄヌルマウスについて、死亡する２４時間前には、特に異常は確認できなかった。【００５６】
このように、Ｇｓｄｍｄの発現を欠くＧｓｄｍｄヌルマウスは、突然死の頻度が顕著である。このことから、Ｇｓｄｍｄの機能は、消化管の発達や形態形成というよりも、成熟期における腸上皮のホメオスタシスに関与していると推測される。【００５７】
［実施例６］
（ガンマ線照射後の細胞増殖およびアポトーシス）
腸の上皮は、例えば、ヒトやマウスにおいて非常に高い再生能力を有している。例えば、何らかの損傷を受けた上皮細胞は、複製を停止し、アポトーシスを経て上皮シートから除外される。そして、残った幹細胞がその増殖率を向上して、陰窩を再生する。前述のように、Ｇｓｄｍｄ遺伝子が、上皮細胞のホメオスタシスに関係するならば、Ｇｓｄｍｄヌルマウスは、この修復機能が変化していると考えられる。そこで、Ｇｓｄｍｄヌルマウスにガンマ線を照射して腸管上皮を損傷させ、その後、小腸および大腸のアポトーシスならびに細胞増殖率の解析を行った。【００５８】
（アポトーシスの解析）
まず、生後２ヶ月のマウス（ｎ＝３）に、１分当たりの照射線量２．８１×１０−２Ｃ／Ｋｇ／分、吸収線量８Ｇｙの条件で、１３７Ｃｓ−ガンマ線を照射した。ガンマ線照射４．５時間後に、被爆したマウスの小腸（盲直から２ｃｍ以内の小腸部分）と大腸（肛門から２ｃｍ以内の大腸部分）から切片を採取し、それぞれアポトーシス解析用の小腸サンプルおよび大腸サンプルとした。これらのサンプルについて、商品名ＡｐｏｐＴａｇ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を用いて、その製品マニュアルにしたがって、アポトーシスの解析を行った。アポトーシス細胞の計数は、マウス１匹あたり３０の陰窩についてスコアをとり、陰窩ごとのアポトーシス細胞数は、完全な構造が見られる陰窩あたりのＡｐｏ−Ｔａｇ陽性細胞の計数により決定した。なお、コントロールとして野生型マウスについても同様の解析を行った。【００５９】
これらの結果を、図１０および図１１に示す。図１０は、小腸についてのアポトーシス解析の結果であり、図１１は、大腸についてのアポトーシス解析の結果である。両図において、Ａは、Ｇｓｄｍｄヌルマウスと野生型マウスの小腸または大腸のアポトーシス細胞／陰窩（平均値±ＳＤ）を示し、Ｂは、Ｇｓｄｍｄヌルマウスの小腸または大腸の写真であり(左下)、Ｃは、野生型マウスの小腸または大腸の写真である(右下)。両図のＢおよびＣにおいて、矢印は、アポトーシス細胞を示す（拡大率４００倍）。小腸については、図１０Ａに示すように、野生型マウスは、ガンマ線照射後に、平均２．７７のアポトーシス細胞／陰窩を示し、Ｇｓｄｍｄヌルマウスでは、平均２．３３アポトーシス細胞／陰窩を示した。また、大腸についても、図１１Ａに示すように、野生型マウスは、ガンマ線照射後に、平均２．７７のアポトーシス細胞／陰窩を示し、Ｇｓｄｍｄヌルマウスでは、平均２．４１アポトーシス細胞／陰窩を示した。さらに、アポトーシス細胞の分布については、図１０Ｂおよび図１１Ｂ（Ｇｓｄｍｄヌルマウス）と図１０Ｃおよび図１１Ｃ（野生型マウス）とを比較した結果、違いは観察されなかった。この結果は、Ｇｓｄｍｄ遺伝子ならびに遺伝子産物が、アポトーシスに関する機能を有さないことを示唆している。【００６０】
（細胞増殖の解析）
まず、生後２ヶ月のマウス（ｎ＝３）に、１分当たりの照射線量２．８１×１０−２Ｃ／Ｋｇ／分、吸収線量１０Ｇｙの条件で、１３７Ｃｓ−ガンマ線を照射した。ガンマ線の照射は、健常マウスの小腸および大腸において細胞増殖がピークを示す３．５日までとした。被爆後のＧｓｄｍｄヌルマウスおよび野生型マウスに、前記実施例４の「細胞増殖の解析」と同様に、ＢｒｄＵを注射して、ＢｒｄＵ陽性細胞の検出を行った。なお、コントロールとして野生型マウスについても同様の解析を行った。【００６１】
これらの結果を、図１２および図１３に示す。図１２は、小腸についての細胞増殖解析の結果であり、図１３は、大腸についての細胞増殖解析の結果である。両図において、Ａは、Ｇｓｄｍｄヌルマウスと野生型マウスの小腸または大腸のＢｒｄＵ陽性細胞／陰窩（平均値±ＳＤ）を示し、Ｂは、Ｇｓｄｍｄヌルマウスの小腸または大腸の写真であり、Ｃは、野生型マウスの小腸または大腸の写真である（拡大率４００倍）。両図において、褐色部分がＢｒｄＵ陽性の増殖細胞である。小腸については、図１２Ａに示すように、野生型マウスは、ガンマ線照射後に、平均２０．４９のＢｒｄＵ陽性細胞／陰窩を示したのに対し、Ｇｓｄｍｄヌルマウスでは、平均１５．７２ＢｒｄＵ陽性細胞／陰窩と、非常に小さい値を示した。また、大腸についても、図１３Ａに示すように、野生型マウスは、ガンマ線照射後に、平均３．５８のＢｒｄＵ陽性細胞／陰窩を示したのに対し、Ｇｓｄｍｄヌルマウスでは、野生型のほぼ半分である平均１．８６ＢｒｄＵ陽性細胞／陰窩という非常に小さい値を示した。小腸および大腸での解析値は、野生型とホモ接合体との間で統計学的に有意差を示した（Ｐ＜０．０５）。さらに、ホモ接合体と野生型におけるＢｒｄＵ陽性細胞数の度数分布をバーダイヤグラムで表したところ、図１４および図１５に示すように、その違いは明らかであった。図１４は、小腸の結果、図１５は、大腸の結果である。このように、Ｇｓｄｍｄヌルマウスは、腸の上皮が損傷を受けた後における、細胞増殖や組織の回復に欠陥を有することわかった。この結果からも、Ｇｓｄｍｄ遺伝子およびその遺伝子産物は、ホメオスタシスにおける機能を担っていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明のモデルマウスによれば、染色体上における内在性Ｇｓｄｍｄ遺伝子がノックアウトされているため、例えば、腸管上皮細胞におけるＧｓｄｍｄやＧｓｄｍｄ遺伝子の機能解析を行うことができる。また、本発明のモデルマウスは、例えば、腸が損傷を受けた場合、腸細胞の増殖機能が減退する形質を示すことが明らかとなった。このため、さらに腸に損傷を与えた本発明のモデルマウスを用いることによって、細胞増殖機能を回復する薬剤のスクリーニングも可能となる。また、損傷後の組織における細胞増殖機能は、ホメオスタシスを担う機能であることから、このような本発明のモデルマウスは、腸におけるホメオスタシスの解明においても極めて有用なツールとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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