(57)【要約】  本発明は、象牙質の形成（再生）に有効に利用される象牙質形成促進剤および象牙質形成覆髄材を提供する。また歯の再生治療に有用な象牙芽細胞の製造方法、および得られた象牙芽細胞の用途を提供する。本発明の象牙質形成促進剤および象牙質形成覆髄材は、いずれもHMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分とすることを特徴とする。また歯髄細胞に分化可能な細胞を、HMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で培養することによって象牙芽細胞を製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分とする象牙質形成促進剤。
【請求項２】
HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである請求項１に記載する象牙質形成促進剤。
【請求項３】
HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分とする象牙質形成覆髄材。
【請求項４】
HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２に記載する象牙質形成覆髄材。
【請求項５】
象牙芽細胞に分化可能な細胞を、HMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で培養する工程を含む、象牙芽細胞の製造方法。
【請求項６】
象牙芽細胞に分化可能な細胞が、歯髄幹細胞、歯乳頭由来幹細胞、および象牙芽細胞前駆細胞からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載する象牙芽細胞の製造方法。
【請求項７】
0.1〜10μM濃度のHMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で培養することを特徴とする、請求項５に記載する象牙芽細胞の製造方法。
【請求項８】
HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項５に記載する象牙芽細胞の製造方法。
【請求項９】
請求項５に記載する方法で得られた象牙芽細胞を含む、歯科治療材。
【請求項１０】
HMG-CoA還元酵素阻害剤の象牙質形成促進剤または象牙質形成覆髄材の有効成分としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は象牙質の形成（再生）に有効に利用される象牙質形成促進剤および象牙質形成覆髄材に関する。また本発明は、歯の再生治療に有用な象牙芽細胞の製造方法、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯が齲蝕に罹患すると、その程度により、歯髄を除去しないで保護する処置（直接歯髄覆罩）、歯髄の一部（冠部歯髄）のみを除去し、根部歯髄を保存する処置（生活歯髄切断）、歯髄の全部を除去して空洞を金属やレジンで封鎖する処置（抜髄）などが施される。しかしながら、歯髄除去後は、歯への栄養の供給が絶たれるため象牙質の脆弱化が起こり、また痛みを伝える神経がないため、再び齲蝕が進行した場合に自覚症状が得られず悪化するという問題がある。従って、近年では、歯の健康状態を維持するためにはできるだけ歯髄を保存するのが好ましいと考えられている。【０００３】
歯髄を保存し、その機能を維持するためには、象牙質の破損状態と歯髄の病理学的状態に応じて、間接覆髄材または直接覆髄材が用いられる。間接覆髄材は、象牙質は破損しているが歯髄が露出していない状態に用いられ、また、直接覆髄材は、歯髄が露出している場合や治療により歯髄の一部を切断した場合に用いられる。直接覆髄材としては、従来、水酸化カルシウム製剤、フォルムクレゾール製剤が用いられている。しかしながら、水酸化カルシウムには、象牙芽細胞誘導作用はなく、象牙質形成促進は望めない。これまで、象牙質形成促進作用を有するものとして、ウシの血液抽出物（特許文献１）、N-アセチルグルコサミンなどの多糖類（特許文献２）、BMP-2（骨形成タンパク質）等の骨形成因子（特許文献３）やTGF-βなどの成長因子（非特許文献１）などが報告されている。しかしながら、ウシの血液抽出物を用いた場合、狂牛病等のプリオン感染や未知のウイルス感染等の危険性があり実際にヒトに用いることは困難である。また、N-アセチルグルコサミンを用いた場合も、昆虫や甲殻類の殻といった生体組織を原料とするため、未知の感染源や汚染物質による影響を否定することはできない。BMP-2（骨形成タンパク質）等の骨形成因子やTGF-βを用いる方法では、ヒト由来の組換えタンパク質の調製法が複雑で収率も悪いため、極めて高価な製品になる可能性がある。【０００４】
一方、HMG-CoA還元酵素阻害剤であるスタチンは、従来から高脂血症治療薬として多くの患者に汎用されている薬剤であるが、間葉系幹細胞や骨芽細胞の骨系分化促進作用、骨折の治癒の促進作用を有することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、HMG-CoA還元酵素阻害剤に、歯髄幹細胞などの象牙芽細胞前駆細胞から象牙芽細胞への分化を促進する作用があること、すなわちHMG-CoA還元酵素阻害剤に象牙質形成（再生）促進作用があることについては知られていない。
【特許文献１】特開2002-363084号公報
【特許文献２】特開平06-256132号公報
【特許文献３】特開平06-340555号公報
【非特許文献１】Sloan AJ, Smith AJ.:Stimulation of the dentine-pulp complex of rat incisor teeth by transforming growth factor-beta isoforms 1-3 in vitro. Arch Oral Biol., 44(2):149-56, 1999.
【非特許文献２】Mundy G, Garrett R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science, 286:1946-1949, 1999.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、歯髄幹細胞を初めとする、象牙芽細胞に分化可能な細胞（以下、「象牙芽細胞前駆体」という）を効率的に象牙芽細胞に分化誘導し象牙質を形成（再生）するための技術を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、「象牙芽細胞前駆体」から象牙芽細胞に分化誘導する作用を有し、齲蝕部分や露出した歯髄面（露髄面）の前処理剤として好適に使用することができる象牙質形成促進剤を提供することを目的とする。また本発明は、齲蝕治療の歯髄処置に際して露髄面を被覆保護することによって、「象牙芽細胞前駆体」から象牙芽細胞への分化を誘導して象牙質形成を促進することができる象牙質形成覆髄材を提供することを目的とする。さらに本発明は、「象牙芽細胞前駆体」を用いて、象牙質を再生する為に必要な歯科治療材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討していたところ、象牙質の形成に関わる歯髄幹細胞（dental pulp stem cell: DPSC）を、HMG-CoA還元酵素阻害剤であるスタチンの存在下で培養することにより、DPSCの増殖が抑制されるとともに、象牙芽細胞の特異的マーカーであるDSPP（dentin sialophosphoprotein）、ならびに石灰化の特異的マーカーであるOCN（osteocalcin）の遺伝子発現が顕著に上昇することを確認した。また本発明者らは、当該スタチンによるDPSC増殖抑制作用は、コレステロール合成経路においてHMG-CoA還元酵素阻害剤によって産生が阻害されるメバロン酸を補うことによって消失することを確認した。すなわち、これらの知見は、コレステロール合成経路においてHMG-CoA還元酵素を阻害する作用を有するHMG-CoA還元酵素阻害剤が、歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化を誘導して象牙質形成を促進させる作用を有すること、言い換えれば、HMG-CoA還元酵素阻害剤が、象牙質形成促進剤や象牙質形成覆髄材の有効成分として有用であることを示すものである。また、上記の知見は、HMG-CoA還元酵素阻害剤を用いることによって、従来の感染組織を除去し人工物で補う歯科治療から、感染・除去した象牙質を再生する医療（修復象牙質の再生、歯根の再生）へと変革させうる方法が提供できることを意味する。【０００７】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであって、下記の構成を有することを特徴とする。【０００８】
Ｉ．象牙質形成促進剤
（I-1）HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分とする象牙質形成促進剤。
（I-2）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである（I-1）に記載する象牙質形成促進剤。
（I-3）HMG-CoA還元酵素阻害剤の象牙質形成促進剤としての使用。
（I-4）HMG-CoA還元酵素阻害剤の象牙質形成促進剤の製造のための使用。
（I-5）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである（I-3）または（I-4）に記載する使用。【０００９】
II．象牙質形成覆髄材
（II-1）HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分として含む象牙質形成覆髄材。
（II-2）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである（II-1）に記載する象牙質形成覆髄材。
（II-3）HMG-CoA還元酵素阻害剤の象牙質形成覆髄材の有効成分としての使用。
（II-4）HMG-CoA還元酵素阻害剤の象牙質形成覆髄材の製造のための使用。
（II-5）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである（II-3）または（II-4）に記載する使用。【００１０】
III．象牙芽細胞の製造方法、および象牙芽細胞の用途
（III-1）象牙芽細胞に分化可能な細胞を、HMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で培養する工程を含む、象牙芽細胞の製造方法。
（III-2）象牙芽細胞に分化可能な細胞が、歯髄幹細胞、歯乳頭由来幹細胞、および象牙芽細胞前駆細胞からなる群から選択される少なくとも１つである、（III-1）に記載する象牙芽細胞の製造方法。
（III-3）0.1〜10μM濃度のHMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で培養することを特徴とする、（III-1）または（III-2）に記載する象牙芽細胞の製造方法。
（III-4）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである、（II1-1）乃至（III-3）のいずれかに記載する象牙芽細胞の製造方法。
（III-5）（III-1）乃至（III-4）のいずれかに記載する方法で得られた象牙芽細胞を含む、歯科治療材。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の象牙質形成促進剤は、特に齲蝕部分や露出した歯髄面（露髄面）への充填修復における前処理剤として好適であり、このような修復の前処置に使用することにより齲蝕部分や露髄面と修復物との境界面における象牙質形成（再生）を促進することができる。また象牙質形成覆髄材は、齲蝕治療において露髄面を直接覆う被覆材（歯牙被覆材）として用いることにより、歯髄を保護するとともに、歯髄幹細胞を初めとする、象牙芽細胞に分化可能な細胞を象牙芽細胞に分化誘導させることにより、象牙質形成（再生）を促進することができる。また、本発明の方法によって製造される象牙芽細胞は、歯科治療において歯再生材料として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（Ｉ）象牙質形成促進剤
本発明の象牙質形成促進剤は、HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分とすることを特徴とする。【００１３】
ここでHGM-CoA還元酵素阻害剤は、体内のコレステロール合成経路においてHMG-CoA還元酵素の作用を阻害し、メバロン酸の生成を阻止する作用を有する物質である。なお、HMG-CoA還元酵素（3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA還元酵素）は、コレステロールの生合成の過程で、HMG-CoAを還元してメバロン酸を生成するうえで必要な酵素である。このため、上記作用を有するHGM-CoA還元酵素阻害剤は、メバロン酸の生成を阻止してコレステロールの生合成を抑制し、コレステロールを低下させることから、従来から高脂血症治療薬として広く用いられている。【００１４】
HGM-CoA還元酵素阻害剤としては、HGM-CoA還元酵素の作用を阻害し、メバロン酸の生成を阻止する作用を有するものであれば特に制限されない。制限されないが、具体的には、水溶性スタチンであるプラバスタチン；脂溶性スタチンであるシンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、およびこれらの塩を例示することができる。なお、プラバスタチンは、商品名メバロチンとして第一三共（株）から、シンバスタチンは商品名リポバスとして萬有製薬（株）から、フルバスタチンは商品名ローコールとしてノバルティスファーマ（株）から、アトルバスタチンは商品名リピトールとしてアステラス製薬（株）から、ロスバスタチンは商品名クレストールとして塩野義製薬（株）から、ピタバスタチンは商品名リバロとして興和（株）から、メバスタチンはCALBIOCHEM社から、またロバスタチンは商品名メバコアとしてメルク（株）から入手することができる。【００１５】
これらのHGM-CoA還元酵素阻害剤のうち、メバスタチンおよびロバスタチンはラクトン型であり、それ自体にHGM-CoA還元酵素阻害活性はないが、体内で酸型に変化し、HGM-CoA還元酵素阻害活性を有するようになる。このため、本発明でいうHGM-CoA還元酵素阻害剤には、体内でのみHGM-CoA還元酵素阻害活性を発揮する物質も包含される。【００１６】
本発明の象牙質形成促進剤は、かかるHMG-CoA還元酵素阻害剤を有効量含有するものであればよく、例えば上記のHMG-CoA還元酵素阻害剤を、水に溶解または分散させた水性液剤の形状、または界面活性剤などを利用して乳化させた乳化剤の形状に調製することもできる。【００１７】
本発明の象牙質形成促進剤をかかる水性液剤または乳化剤とする場合、HMG-CoA還元酵素阻害剤の使用時における濃度が、通常0.1〜10μM、好ましくは0.2〜5μM、より好ましくは0.5〜2μMとなるように調製することが望ましい。言い換えれば、象牙質形成時に使用されるHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度が上記範囲にあればよく、象牙質形成促進剤に含まれるHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度はこれに限定されない。通常、使用時に希釈されることを鑑みれば、上記より濃い濃度でHMG-CoA還元酵素阻害剤を含んでいることが好ましい。【００１８】
当該象牙質形成促進剤には、本発明の効果を妨げないことを限度として、所望により、他の成分を配合することができる。当該他の成分としては、抗齲蝕効果を有するフッ化ナトリウムやフッ化ジアミン銀（商品名：サホライド）等のフッ化金属塩、およびフォルムクレゾール、ならびに、偏性嫌気性菌等に有効な抗生物質や抗菌物質を挙げることができる。また、象牙質の再生に可能性がある生体機能分子として、象牙質形成促進作用を有する骨形成因子〔bone morphogenic protein (BMP)-2, 4, 7〕、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、トランスフォーミング成長因子(TGFβ)、結合組織成長因子（CTGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、インシュリン様成長因子（IGF-I，II）、ソニックヘッジホッグ（SHH）等を配合することもできる。さらに骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）、歯髄幹細胞（DPSC）および歯乳頭由来幹細胞（SCAP）などを細胞成分として配合することもできる（Sonoyama W, Liu Y, Fang D, Yamaza T, Seo B-M, et al (2006) Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLoS ONE 1(1): e79. doi:10.1371/journal.pone.0000079．）。さらにまた、ハイドロキシアパタイト、α- or β-TCP、接着性レジン、歯科用セメント（グラスアイオノマー、カルボン酸セメント等）、アテロコラーゲン、ヒアルロン酸などのキャリアー材料；また、歯髄の炎症が強い場合には、抗炎症作用のある薬剤、例えばフェノールカンファー（CC）や抗炎症剤などを用いることもできる。【００１９】
また、従来から直接覆髄剤（歯髄の一部が露出している場合に歯髄組織を保護する薬剤）として使用されている、例えば水酸化カルシウム製剤など；ならびに間接覆髄剤（象牙質が薄くなっている場合に、外来刺激を遮断し殺菌などを目的に使用される薬剤）として使用されている、例えば酸化亜鉛ユージノール製剤や、酸化亜鉛クレオソート製剤などの薬剤を併用することもできる。【００２０】
さらに本発明の象牙質形成促進剤には、本発明の効果を妨げないことを限度として、必要に応じて、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、アセトン、メチルエチルケトン等）、安定化剤（例えばグリセリン、エチレングリコール等の多価アルコール、マクロゴールド等）、保存剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル類、塩化ベンザルコニウム等）等の添加剤、または殺菌剤、抗生物質もしくは抗炎症剤などの他の薬効成分を配合してもよい。【００２１】
当該水性液剤の形態を有する本発明の象牙質形成促進剤は、齲蝕処置時に、歯、特に露髄面（髄腔開拡、歯髄切断面など）への塗布に直接使用される。具体的には、口腔内の歯面の目的部位（露髄面）に噴霧または塗布したり、また脱脂綿等に含ませた状態で目的部位に塗布または充填することもできる。斯くして本発明の象牙質形成促進剤は、露髄面から歯髄細胞、特に歯髄幹細胞を初めとする、象牙芽細胞に分化可能な細胞（象牙芽細胞前駆体）に効率よく浸透浸潤させることができ、これらの細胞における象牙芽細胞への分化誘導、すなわち象牙質の形成を促進することができる。【００２２】
本発明の象牙質形成促進剤は、またその形状（剤型）を特に制限されるものではない。例えば、前述する水性液剤や乳化剤の形状のほか、ゲル状、クリーム状または軟膏状を有するものであってもよい。かかるゲル状、クリーム状または軟膏状の場合、歯面の目的部位（露髄面）への塗布が容易になるだけでなく充填が可能であり、その結果、露髄面における滞留性がよくなり、HMG-CoA還元酵素阻害剤の効果をより効果的に享受することができる。なお、前述する水性液剤や乳化剤の場合は、増粘剤を配合することによって粘稠性を付与してもよい。【００２３】
なお、増粘剤としては、特に限定はされないが、例えば、コロイダルシリカ、ヒュームドシリカ、酸化アルミニウム微粒子、モンモリロナイト微粒子、ハイドロキシアパタイト、α-またはβ-TCP、接着性レジン、歯科用セメント（グラスアイオノマー、カルボン酸セメント等）、アテロコラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチンハイドロゲル等を挙げることができる。これらはいずれか１種を使用しても２種以上を併用してもよい。【００２４】
また粉状または顆粒状の形態を有していてもよく、この場合は使用時に水などの適当な溶媒に溶解、分散もしくは混練して使用することもできる。【００２５】
本発明の象牙質形成促進剤は、例えば、齲蝕部や露髄面を充填修復など処置する際の前処理剤として好適に使用される。かかる処置時に本発明の象牙質形成促進剤を用いて前処理することにより、有効成分であるHMG-CoA還元酵素阻害剤が露髄面から「象牙芽細胞前駆体」に浸透浸潤して、象牙芽細胞への分化が誘導されて象牙質形成が促進される。その結果、歯と修復物との接合界面における耐久性を向上させることができる。【００２６】
（II）象牙質形成覆髄材
前述する象牙質形成促進剤は、有効成分であるHMG-CoA還元酵素阻害剤の効果をより効果的に享受する目的で、当該有効成分を、「象牙芽細胞前駆体」から象牙芽細胞への分化誘導および象牙質の形成に十分な期間、患部（露髄面）に滞留保持させるために、担体に担持された形状の歯科材料として調製することもできる。本発明の「象牙質形成覆髄材」は、こうした歯科材料であって、HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分として含むことを特徴とするものである。【００２７】
具体的には、HMG-CoA還元酵素阻害剤、好ましくはHMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分とする前述の液状、ゲル状、クリーム状または軟膏状の象牙質形成促進剤を、モノフィラメント、フィルム、繊維集合体、スポンジ、微小粒などの構造体に固定化または含浸させた形態を有するものを挙げることができる。【００２８】
かかる象牙質形成覆髄材におけるHMG-CoA還元酵素阻害剤の量は、使用時におけるHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度が、通常0.1〜10μM、好ましくは0.2〜5μM、より好ましくは0.5〜2μMとなるように調製することが望ましい。すなわち、象牙質形成時に使用されるHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度が上記範囲になるような割合である。【００２９】
斯くして調製される象牙質形成覆髄材によれば、露髄部をこれで直接覆うことができるため、神経（歯髄）への外的刺激が防止できるとともに、露髄部に有効成分であるHMG-CoA還元酵素阻害剤を長期間にわたって滞留保持させることができるため、象牙芽細胞への分化誘導ならびに象牙質形成促進効果をより効果的に享受することができる。【００３０】
（III）象牙芽細胞の製造方法、ならびにそれらの用途
また本発明は、象牙芽細胞の製造方法を提供する。当該方法は、象牙芽細胞に分化可能な細胞（象牙芽細胞前駆体）、具体的には歯髄幹細胞、歯乳頭由来幹細胞、または象牙芽細胞前駆細胞を、HMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で培養することによって実施することができる。【００３１】
ここで象牙芽細胞とは、象牙質の基質成分を分泌する成熟した細胞を意味する。一方、完全に成熟した象牙芽細胞ではないものの、象牙芽細胞に分化する能力を持ちながら、若干未分化な細胞は「象牙芽細胞前駆細胞」と称されている。また「歯髄幹細胞」は、歯髄組織に含まれる多分化能を持つ未分化間葉系幹細胞を意味する。当該歯髄幹細胞は、通常、歯髄組織を幹細胞特異的培養液中で培養することによって単離することができる。すなわち、これらは、分化度から次のような関係になる（(1)分化度最低（未分化）：歯髄幹細胞、歯乳頭由来幹細胞、(2)分化度中等：象牙芽細胞前駆細胞、(3)分化度最大（成熟）：象牙芽細胞）。【００３２】
本発明において、これらの象牙芽細胞に分化可能な細胞（本発明においては、これらの歯髄幹細胞、歯乳頭由来幹細胞、および象牙芽細胞前駆細胞を含めて「象牙芽細胞前駆体」と総称する）として、1種類の細胞から成る単一の細胞を培養してもよいし、２種類以上の細胞からなる細胞混合物を培養してもよい。「象牙芽細胞前駆体」の由来は特に制限されないが、好ましくはほ乳類である。具体的には、ラット、マウス、ウサギ、サル、ブタ、イヌ、およびヒトを挙げることができるが、好ましくはサルおよびヒトであり、より好ましくはヒトである。【００３３】
「象牙芽細胞前駆体」は、これらのほ乳類の抜去歯等から採取することができる。例えば、ヒトの歯髄細胞は、About Iらの方法（About I et al.: Human dentin production in vitro. Exp Cell Res., 258:33-41, 2000）に従って採取することができる。また、ヒトの「象牙芽細胞前駆細胞」は、例えば、Gronthos S らの方法（Gronthos S et al.: Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A., 97:13625-30, 2000）に従って、歯髄組織より採取することができる。【００３４】
具体的には、ヒトの「象牙芽細胞前駆体」は、下記の方法に従って採取することができる：
(1)まず埋伏歯を無菌的に取り出し、Phosphate Buffered Saline（以下、PBSと略す）溶液などの適当な保存液で保存する。【００３５】
(2)歯牙の中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を小片にして、PBS溶液などを用いて組織を洗浄する。【００３６】
(3)次いで、コラゲナーゼやディスパーゼなどの酵素を用いて組織を処理する。【００３７】
(4)酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収する。【００３８】
(5)回収した細胞の多分化能、増殖能を検討し、これらの回収した細胞の中に「象牙芽細胞前駆体」が含まれていることを確認する。【００３９】
「象牙芽細胞前駆体」の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温から37℃の温度；5％CO2インキュベーター内など）の下で行なうことができる。また、培地には、アスコルビン酸などの添加剤を加えることも可能である。培養の形態は特に限定されないが、例えば、静置培養で行なうことができる。【００４０】
当該「象牙芽細胞前駆体」の培養において使用するHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度は、培地中において0.1〜10μM、好ましくは0.2〜5μM、より好ましくは0.5〜2μMを挙げることができる。【００４１】
なお、HGM-CoA還元酵素阻害剤としては、体内のコレステロール合成経路においてHGM-CoA還元酵素の作用を阻害し、メバロン酸の生成を阻止する作用を有するものであれば特に制限されず、具体的には、前述するように、プラバスタチン（商品名：メバロチン）、シンバスタチン（商品名：リポバス）、フルバスタチン（商品名：ローコール）、アトルバスタチン（商品名：リピトール）、ロスバスタチン（商品名：クレストール）、ピタバスタチン（商品名：リバロ）、メバスタチン、ロバスタチンおよびこれらの塩を用いることができる。【００４２】
また「象牙芽細胞前駆体」の培養は担体の上で行ってもよい。ここで担体としては、象牙芽細胞ならびにその後の象牙質の形成に要する時間、培養の足場となる耐久性を備えるものであることが好ましいが、さらに好ましくは生分解性を有するものである。また、「象牙芽細胞前駆体」と親和性を有する材料からなる担体であることが好ましい。【００４３】
かかる担体の素材としては、制限されないが、例えば、セラミック系の材料（例えば、ハイドロキシアパタイト（HAp）、リン酸三カルシウム（β-TCP）、リン酸四カルシウム）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）（PLGA）、ポリ乳酸（PLLA）、ポリカプロラクトンなどの合成高分子材料；またはコラーゲン、ゼラチン、フィブリンなどの蛋白質材料；あるいはヒアルロン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、象牙、サンゴなどの天然由来材料を挙げることができる。なお、PGA、PLLA、PLGAまたはポリカプロラクトンなどの合成材料を使用する場合には、細胞の接着及び増殖性を高めるために、表面にコラーゲン溶液又はフィブロネクチン溶液などをコートして使用することもできる。【００４４】
かかる担体の形態としては、メッシュ形態、スポンジ形態、ゲル形態、不織布形態、粒状形態などが可能である。また担体は、象牙芽細胞前駆体を移植しやすい形状に加工したものが好ましく、板状、球状の多孔体あるいは中空で一端が開放されており、周囲から血管が進入しやすくなっているものが好ましい。【００４５】
担体を用いて培養する場合、本発明の方法は、以下の３工程を含むことができる。
（ｉ）分離した「象牙芽細胞前駆体」を培養する工程（一次培養）；
（ii）上記一次培養によって得られた細胞を、担体に播種して培養する工程（二次培養）；及び
（iii）上記担体上での培養を、HGM-CoA還元酵素阻害剤の存在下で行う工程（分化誘導）。【００４６】
上記の（i）一次培養工程は、以後の工程において象牙質を再生するのに必要な数の細胞を得るために行う培養である。工程（i）における「象牙芽細胞前駆体」の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温〜37℃の温度、5％CO2インキュベーター内での培養など）の下で行なうことができる。培養の形態は特に限定されないが、例えば、静置培養で行なうことができる。また、工程（i）で得られた細胞は、凍結保存しておくことも可能であり、必要時に解凍して増殖させたものを、上記工程(ii)以降の操作に使用することもできる。【００４７】
上記の工程（ii）は、担体上で「象牙芽細胞前駆体」を増殖させる工程である。担体に播種した細胞は、担体に接着して、増殖する。工程（ii）における「象牙芽細胞前駆体」の培養も、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温〜37℃の温度；5％CO2インキュベーター内での培養など）の下で行なうことができる。培養期間としては、好ましくは１〜３０日、さらに好ましくは５〜２５日である。【００４８】
上記の工程（iii）は、象牙芽細胞への分化誘導を行う工程である。HGM-CoA還元酵素阻害剤の使用量は上記の通りであり、培地中の濃度として0.1〜10μM、好ましくは0.2〜5μM、より好ましくは0.5〜2μMを挙げることができる。【００４９】
斯くして調製される象牙芽細胞を用いることによって象牙質を形成することができる。例えば、歯髄幹細胞を移植すると、その細胞は象牙質を作ることが知られている（Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A., 97:13625-13630, 2000）。【００５０】
ゆえに、本発明の方法により分化誘導された象牙芽細胞は、歯科治療材として、齲蝕などの歯科疾患を有する患者に移植することによって、当該歯科患者を治療することができる。この場合、本発明の方法によって得られた象牙芽細胞を担体と一緒に直接患者に移植しても良い。斯くして、当該患者の移植した部位（髄腔の穿孔や露髄部）で象牙質を再生させることができる。【００５１】
また、本発明の方法により分化誘導された象牙芽細胞は、必要に応じて担体と一緒に、一旦、ヒト以外のほ乳動物に移植して当該移植動物の体内で象牙質を再生させ、次いでこれを歯科治療材として、齲蝕などの歯質欠損部位に移植することも考えられる。ここで移植動物の種類は特に限定されないが、好ましくは、マウス（ヌードマウスなど）、ラット（ヌードラットなど）などの免疫不全げっ歯類動物を使用することができる。また、歯科疾患により歯を欠損したヒト患者の歯槽骨に人工象牙質歯根として移植することもできる。この際、ハイドロキシアパタイトやチタンなどの歯根型生体材料の表面に細胞培養もしくは移植により象牙質を形成させて、人工歯根を作成しておくこともできる。なお、ヒト以外のほ乳動物への移植の部位は特に限定されないが、例えば、背部皮下などが挙げられる。
【実施例】
【００５２】
以下、本発明を実験例により詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実験例に限定されるものではない。【００５３】
実験例１
（１）歯髄幹細胞（dental pulp stem cell:DPSC）の単離・培養
歯髄幹細胞（DPSC）は、岡山大学歯学部倫理委員会の許可のもと、インフォームドコンセントを得た上で提供を受けたヒト抜去歯から、Gronthosら（Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 13625-30, 2000）の手法に準じて単離した。【００５４】
具体的には、ヒト抜去歯から採取した歯髄を3 mg/ml タイプ１コラーゲナーゼ (Worthington Biochemicals Corp.)、ならびに4 mg/ml ディスパーゼ (Roche Diagnostic/Boehringer Mannheim Corp.) で37℃で30分間、酵素処理した後、10％仔牛由来血清（FBS）と0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地を用いて培養した。 【００５５】
2〜10代にわたって継代培養したDPSCについて、象牙質の特異的マーカーであるdentin sialo-phospho-protein(DSPP)遺伝子（Narayanan K, et al.,J Biol Chem., 281(28):19064-71, 2006）の発現を、RT-PCT法を用いて確認した。【００５６】
RT-PCRの結果を図１に示す。象牙質歯髄幹細胞におけるDSPPの発現量から、３〜５代の継代培養細胞を以下の実験に使用した。【００５７】
（２）HGM-CoA還元酵素阻害剤の細胞増殖に与える影響
HGM-CoA還元酵素阻害剤としてシンバスタチン（simvastatin: SVS）（CALBIOCHEM社）を用いて、HGM-CoA還元酵素阻害剤の歯髄幹細胞（DPSC）の増殖に与える影響を調べた。【００５８】
具体的には、SVSを1μMの濃度で含む10％仔牛由来血清（FBS）、ならびに0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地に、上記（１）で調製したDPSCを37℃、5％CO2下で培養した。培地の交換は週に２回行い、１、３、５および７日目の細胞数を、MTS法（Barltrop, J.A. et al. 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimenthylthiazoly)-3-(4-sulfophenyl)tetrazolium, inner salt (MTS) and related analogs of 3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide (MTT) reducing to purple water-soluble formazans a cell-viability indicators. Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1, 611, 1991）を用いて間接的に評価した。【００５９】
なお、対照試験（control）としてSVSの代わりにPBSを添加した10％仔牛由来血清（FBS）、ならびに0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地、また比較試験としてSVSの代わりに、象牙質形成促進作用が知られているBMP-2（骨形成タンパク質）（R&D systems）を100ng/ml濃度添加した10％仔牛由来血清（FBS）、ならびに0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM  L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地をそれぞれ用いて、上記と同様に、DPSCを培養して細胞数を評価した。【００６０】
結果を図２に示す。図２からわかるように、培養開始から５日目において、100ng/ml 濃度のBMP-2の存在下での培養では、歯髄幹細胞（DPSC）の増殖は有意に促進されたのに対して（1.05倍、p<0.0070）、1μM濃度のSVSの存在下での培養では、歯髄幹細胞（DPSC）の増殖は有意に抑制された（0.73倍、p<0.0001）。このことから、HGM-CoA還元酵素阻害剤であるシンバスタチンには歯髄幹細胞（DPSC）の増殖を抑制する作用があることが判明した。【００６１】
（３）HGM-CoA還元酵素阻害剤の細胞分化に与える影響
HGM-CoA還元酵素阻害剤としてシンバスタチン（simvastatin: SVS）（CALBIOCHEM社）を用いて、HGM-CoA還元酵素阻害剤の歯髄幹細胞（DPSC）の象牙芽細胞への分化に与える影響を調べた。【００６２】
具体的には、SVSを1μMの濃度で含む10％仔牛由来血清（FBS）、ならびに0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地に、上記（１）で調製したDPSCを、37℃で5％CO2気相下で培養し、培養から3、7および10日目に採取した細胞から、total RNAを回収し、象牙芽細胞特異的マーカーであるdentin sialophosphoprotein (DSPP)（Ritchie HH, et al. J Biol Chem., 269:3698-702, 1994; Butler WT, et al. Matrix., 12:343-51, 1992）、および石灰化マーカーであるosteocalcin (OCN)(Bronckers AL, et al. Connect Tissue Res., 22:65-70, 1989)の遺伝子発現を定量的RT-PCRにて評価した（Narayanan K, et al., J Biol Chem., 281(28):19064-71, 2006）。【００６３】
なお、対照試験として、SVSの代わりにPBSを添加した10％ダルベッコ修飾イーグル培地、また比較試験としてSVSの代わりにBMP-2（R&D systems）を100ng/ml濃度添加した10％ ダルベッコ修飾イーグル培地をそれぞれ用いて、上記と同様に、DPSCを培養してDSPPとOCNの遺伝子発現を評価した。【００６４】
DSPPの遺伝子発現を示す結果を図３に、OCNの遺伝子発現を示す結果を図４に示す。【００６５】
これらの図からわかるように、歯髄幹細胞（DPSC）をSVS含有培地で培養すると、象牙芽細胞特異的マーカーであるDSPPの遺伝子発現は、有意に促進されていた (10.9倍、p=0.0111)。また、石灰化マーカーであるOCNの遺伝子発現も、対照群 (18.8倍、p=0.0004)、BMP-2群(7.4倍、p=0.0002)と比べて有意に促進されていた(Scheffe'sの多重比較検定)。【００６６】
以上のことから、HGM-CoA還元酵素阻害剤であるシンバスタチンに、歯髄幹細胞（DPSC）の細胞増殖を抑制し、象牙芽細胞への分化を促進する作用があることが明らかとなった。【００６７】
実験例２
HGM-CoA還元酵素阻害剤として、実験例１で使用したシンバスタチン（Simvastatin:CALBIOCHEM）に加えて、メバスタチン（vastatin：Toronto Research Chemicals Ins)、フルバスタチン（Fluvastatin：CALBIOCHEM)、ロバスタチン（Lovastatin、SIGMA）、ピタバスタチン（Pitavastatin：Toronto Research Chemicals Ins)、プラバスタチン（Plavastatin：第一三共製薬（株）)を用いて、実験例１の（２）と（３）と同様の実験を行った。【００６８】
（１）HGM-CoA還元酵素阻害剤の歯髄幹細胞（DPSC）に与える影響
HGM-CoA還元酵素阻害剤として、シンバスタチン1μM、メバスタチン1μM、フルバスタチン1μM、ロバスタチン1μM、ピタバスタチン1μM、およびプラバスタチン200μM をそれぞれ使用し、実験例１の（２）と同様の方法で、DPSCを培養した。そして培養０日目、３日目、５日目に、DPSCの細胞数をMTS法にて計測した。対照群（control）も、実験例１（２）と同様に設定し、実験を行った。【００６９】
結果を図５に示す。図５からわかるように、細胞培養５日目において、脂溶性スタチン類（シンバスタチン、メバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン）では1μMの濃度で対照群と比べ有意差をもってDPSCの増殖を抑制した。また水溶性スタチン（プラバスタチン）では200μMの濃度でDPSCの増殖を抑制することが観察された。【００７０】
（２）HGM-CoA還元酵素阻害剤の細胞分化に与える影響
HGM-CoA還元酵素阻害剤として、シンバスタチン1μM、フルバスタチン1μM、メバスタチン1μM、ロバスタチン1μM、およびプラバスタチン200μM をそれぞれ使用し、実験例１の（３）と同様の方法で、歯髄幹細胞（DPSC）を培養し、14日目に石灰マーカーであるOCNの遺伝子発現を定量的RT-PCRにて評価した。また、対照群（control）および比較群（BMP-2）も、実験例１（３）と同様に設定し、実験を行った。【００７１】
結果を図６に示す。図６からわかるように、細胞培養14日目において、脂溶性スタチン類（シンバスタチン、メバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン）および水溶性スタチン（プラバスタチン）で処理することで、対照群および比較群（BMP-2）と比べて、石灰マーカーであるOCNの遺伝子発現が促進されていることが観察された。【００７２】
以上のことから、実験例１で確認したシンバスタチンだけでなく、HGM-CoA還元酵素阻害活性を有する物質全般にわたって、歯髄幹細胞（DPSC）の細胞増殖を抑制し、象牙芽細胞への分化を促進する作用があることが示唆された。【００７３】
実験例３【００７４】
（１）HGM-CoA還元酵素阻害剤と同じくRho/Rhoキナーゼ阻害作用を有する物質であるFasudil（旭化成）を用いて、歯髄幹細胞（DPSC）の増殖に与える影響を調べた。【００７５】
具体的には、HGM-CoA還元酵素阻害剤としてシンバスタチン（Simvastatin:CALBIOCHEM）1μM、並びに上記Fasudil 1μM、10μMおよび100μMをそれぞれ用いて、実験例１の（２）と同様の方法で、DPSCを培養した。そして培養５日目に、DPSCの細胞数をMTS法にて計測した。対照群（control）も、実験例１（２）と同様に設定し、実験を行った。【００７６】
結果を図７に示す。図７からわかるように、細胞培養５日目において、10μM以上の濃度でFasudilはDPSCの増殖を抑制した。【００７７】
（２）HGM-CoA還元酵素阻害剤としてシンバスタチン（Simvastatin:CALBIOCHEM）を用いて、シンバスタチンによって生じる歯髄幹細胞（DPSC）の増殖抑制（実験例１（２）参照）が、メバロン酸またはFasudil（旭化成）を補うことによってどのようになるかを調べた。【００７８】
なお、メバロン酸は、体内のコレステロール合成経路において、HGM-CoA還元酵素の作用によってHGM-CoAから産生される生体内分子である。すなわち、HGM-CoA還元酵素阻害剤によってHGM-CoAからの産生が阻止される生体内分子である。またFasudilは、HGM-CoA還元酵素阻害剤と同じくRho/Rhoキナーゼ阻害作用を有する物質である。【００７９】
具体的には、実験例１（２）の方法において、歯髄幹細胞(DPSC)の培養を、(a)シンバスタチン1μM（シンバスタチン添加群）、(b)シンバスタチン1μMとメバロン酸1mM（メバロン酸添加群）、(c)シンバスタチン1μMとメバロン酸1mMとFasudil 10μM（Fasudil併用群）の存在下でそれぞれ行い、培養から０日目、３日目、５日目に、MTS法によりDPSCの細胞数を計測した。また対照試験（control）として、実験例１（２）と同様に上記被験物質に代えてPBSを用いて同様に試験を行った。【００８０】
結果を図８に示す。図８からわかるように、培養５日目にて、(b)メバロン酸添加群では、HGM-CoA還元酵素阻害剤添加による細胞増殖抑制効果が解消された。またメバロン酸 1mMの添加に加えてFasudil 10μMを添加した(c)Fasudil併用群では、メバロン酸添加にもかかわらず(a)シンバスタチン添加群と同様に、対照群と比べてDPSCの細胞増殖が抑制された。【００８１】
（１）と（２）の実験結果から、HGM-CoA還元酵素阻害剤によってメバロン酸の産生を抑止することによってDPSCの細胞増殖が抑制されることがわかる。【００８２】
すなわち、実験例１〜３の結果から、体内でのコレステロール合成経路において、HGM-CoA還元酵素の作用を阻害してメバロン酸の産生を阻止する作用を有する物質、すなわちHGM-CoA還元酵素阻害剤は、象牙芽細胞分化誘導剤ならびに象牙質再生促進剤として有用であるといえる。【００８３】
実験例４    BMPの細胞増殖抑制に与える影響の検討
実験例１（２）の方法において、歯髄幹細胞(DPSC)の培養を、(a)HGM-CoA還元酵素阻害剤（スタチン添加群）、（b）HGM-CoA還元酵素阻害剤により誘導されることが報告されているBMP-2（BMP-2添加群）、(c)BMPの阻害薬であるNoggin（R&D systems）（Noggin添加群）、(d) HGM-CoA還元酵素阻害剤とNoggin（スタチン・Noggin添加群）、(e) BMP-2とNoggin（BMP-2・Noggin添加群）の存在下で行い、DPSCの細胞数を細胞培養0、3、5日目にMTS法にて計測を行った。【００８４】
結果を図９に示す。培養５日目でBMP添加群およびNoggin添加群は対照群と比べ、DPSC細胞増殖に影響を認められなかった。また、スタチン群ならびにスタチン・Noggin添加群では、DPSC細胞増殖抑制が認められた。これらのことから、スタチンが誘導するBMP-2とは別経路により、DPSCの細胞増殖抑制が起こっていると考えられる。【００８５】
本発明の臨床応用例として、コラーゲンゲルなどのキャリアーまたは歯科分野で使用されている充填材などにHGM-CoA還元酵素阻害剤を含浸させて、これを露髄面に配置または充填することが考えられる。こうすることによって、歯髄の細胞を象牙質へ分化誘導することができ、その結果、象牙質の再生を図ることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】歯髄幹細胞（DPSC）を継代培養して、象牙質の特異的なマーカー（DSPP）の発現をRT-PCRで測定した結果を示す。
【図２】HGM-CoA還元酵素阻害剤（図中「statin」と表記する。以下同じ）の存在下、他の象牙質形成促進剤（BMP-2）の存在下、および非存在下（control）で、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す。
【図３】HGM-CoA還元酵素阻害剤（statin）の存在下、他の象牙質形成促進剤（BMP-2）の存在下、および非存在下（control）で、それぞれ歯髄幹細胞を培養して、各々のDSPP（dentin sialophosphoprotein）の遺伝子発現に対する影響を測定した結果を示す。
【図４】HGM-CoA還元酵素阻害剤（statin）の存在下、他の象牙質形成促進剤（BMP-2）の存在下、および非存在下（control）で、それぞれ歯髄幹細胞を培養して、各々のOCN（osteocalcin）の遺伝子発現に対する影響を測定した結果を示す。
【図５】各種のHGM-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Mevastatin(CALBIOCHEM社)1μmM, Fluvastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Lovastatin (SIGMA社)1μM, Pitavastatin (Toronto Research Chemicals Ins社)1μM, Plavastatin (第一三共株式会社)200μM〕の存在下、および非存在下（control）で、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す（実験例２）。
【図６】各種のHGM-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Mevastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Fluvastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Lovastatin (SIGMA社)1μmM, Plavastatin (第一三共株式会社)200μM〕の存在下、他の象牙質形成促進剤（BMP-2）の存在下、および非存在下（control）で、それぞれ歯髄幹細胞を培養して、各々のOCN（osteocalcin）の遺伝子発現に対する影響を測定した結果を示す。
【図７】HGM-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μmM〕の存在下、Rho/Rhoキナーゼ阻害剤Fasudilの存在下（1μM、10μM、100μM）、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す（実験例３（１））。
【図８】HGM-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μM〕の存在下、HGM-CoA還元酵素阻害剤とメバロン酸の存在下、HGM-CoA還元酵素阻害剤とメバロン酸との存在下、Rhoキナーゼ阻害剤Fasudilの存在下（1μM、10μM、100μM）、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す（実験例３（２）。
【図９】HGM-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μM〕の存在下、HGM-CoA還元酵素阻害剤とNogginの存在下、BMP-2の存在下、BMP-2とNogginの存在下、またはNogginの存在下、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す（実験例４）。
【図１】
2008120720.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008120720.tif 000008
【図８】
2008120720.tif 000009
【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年9月18日(2009.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は象牙質の形成（再生）に有効に利用される象牙質形成促進剤および象牙質形成覆髄材に関する。また本発明は、歯の再生治療に有用な象牙芽細胞の製造方法、およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯が齲蝕に罹患すると、その程度により、歯髄を除去しないで保護する処置（直接歯髄覆罩）、歯髄の一部（冠部歯髄）のみを除去し、根部歯髄を保存する処置（生活歯髄切断）、歯髄の全部を除去して空洞を金属やレジンで封鎖する処置（抜髄）などが施される。しかしながら、歯髄除去後は、歯への栄養の供給が絶たれるため象牙質の脆弱化が起こり、また痛みを伝える神経がないため、再び齲蝕が進行した場合に自覚症状が得られず悪化するという問題がある。従って、近年では、歯の健康状態を維持するためにはできるだけ歯髄を保存するのが好ましいと考えられている。
【０００３】
歯髄を保存し、その機能を維持するためには、象牙質の破損状態と歯髄の病理学的状態に応じて、間接覆髄材または直接覆髄材が用いられる。間接覆髄材は、象牙質は破損しているが歯髄が露出していない状態に用いられ、また、直接覆髄材は、歯髄が露出している場合や治療により歯髄の一部を切断した場合に用いられる。直接覆髄材としては、従来、水酸化カルシウム製剤、フォルムクレゾール製剤が用いられている。しかしながら、水酸化カルシウムには、象牙芽細胞誘導作用はなく、象牙質形成促進は望めない。これまで、象牙質形成促進作用を有するものとして、ウシの血液抽出物（特許文献１）、N-アセチルグルコサミンなどの多糖類（特許文献２）、BMP-2（骨形成タンパク質）等の骨形成因子（特許文献３）やTGF-βなどの成長因子（非特許文献１）などが報告されている。しかしながら、ウシの血液抽出物を用いた場合、狂牛病等のプリオン感染や未知のウイルス感染等の危険性があり実際にヒトに用いることは困難である。また、N-アセチルグルコサミンを用いた場合も、昆虫や甲殻類の殻といった生体組織を原料とするため、未知の感染源や汚染物質による影響を否定することはできない。BMP-2（骨形成タンパク質）等の骨形成因子やTGF-βを用いる方法では、ヒト由来の組換えタンパク質の調製法が複雑で収率も悪いため、極めて高価な製品になる可能性がある。
【０００４】
一方、HMG-CoA還元酵素阻害剤であるスタチンは、従来から高脂血症治療薬として多くの患者に汎用されている薬剤であるが、間葉系幹細胞や骨芽細胞の骨系分化促進作用、骨折の治癒の促進作用を有することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、HMG-CoA還元酵素阻害剤に、歯髄幹細胞などの象牙芽細胞前駆細胞から象牙芽細胞への分化を促進する作用があること、すなわちHMG-CoA還元酵素阻害剤に象牙質形成（再生）促進作用があることについては知られていない。
【特許文献１】特開2002-363084号公報
【特許文献２】特開平06-256132号公報
【特許文献３】特開平06-340555号公報
【非特許文献１】Sloan AJ, Smith AJ.:Stimulationof the dentine-pulp complex of rat incisor teeth by transforming growth factor-beta isoforms 1-3 in vitro. Arch Oral Biol., 44(2):149-56, 1999.
【非特許文献２】Mundy G, Garrett R, Harris S, et al. Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins. Science, 286:1946-1949, 1999.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、歯髄幹細胞を初めとする、象牙芽細胞に分化可能な細胞（以下、「象牙芽細胞前駆体」という）を効率的に象牙芽細胞に分化誘導し象牙質を形成（再生）するための技術を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、「象牙芽細胞前駆体」から象牙芽細胞に分化誘導する作用を有し、齲蝕部分や露出した歯髄面（露髄面）の前処理剤として好適に使用することができる象牙質形成促進剤を提供することを目的とする。また本発明は、齲蝕治療の歯髄処置に際して露髄面を被覆保護することによって、「象牙芽細胞前駆体」から象牙芽細胞への分化を誘導して象牙質形成を促進することができる象牙質形成覆髄材を提供することを目的とする。さらに本発明は、「象牙芽細胞前駆体」を用いて、象牙質を再生する為に必要な歯科治療材を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討していたところ、象牙質の形成に関わる歯髄幹細胞（dental pulp stem cell: DPSC）を、HMG-CoA還元酵素阻害剤であるスタチンの存在下で培養することにより、DPSCの増殖が抑制されるとともに、象牙芽細胞の特異的マーカーであるDSPP（dentin sialophosphoprotein）、ならびに石灰化の特異的マーカーであるOCN（osteocalcin）の遺伝子発現が顕著に上昇することを確認した。また本発明者らは、当該スタチンによるDPSC増殖抑制作用は、コレステロール合成経路においてHMG-CoA還元酵素阻害剤によって産生が阻害されるメバロン酸を補うことによって消失することを確認した。すなわち、これらの知見は、コレステロール合成経路においてHMG-CoA還元酵素を阻害する作用を有するHMG-CoA還元酵素阻害剤が、歯髄幹細胞から象牙芽細胞への分化を誘導して象牙質形成を促進させる作用を有すること、言い換えれば、HMG-CoA還元酵素阻害剤が、象牙質形成促進剤や象牙質形成覆髄材の有効成分として有用であることを示すものである。また、上記の知見は、HMG-CoA還元酵素阻害剤を用いることによって、従来の感染組織を除去し人工物で補う歯科治療から、感染・除去した象牙質を再生する医療（修復象牙質の再生、歯根の再生）へと変革させうる方法が提供できることを意味する。
【０００７】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであって、下記の構成を有することを特徴とする。
【０００８】
Ｉ．象牙質形成促進剤
（I-1）HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分とする象牙質形成促進剤。
（I-2）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである（I-1）に記載する象牙質形成促進剤。
（I-3）HMG-CoA還元酵素阻害剤の象牙質形成促進剤としての使用。
（I-4）HMG-CoA還元酵素阻害剤の象牙質形成促進剤の製造のための使用。
（I-5）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである（I-3）または（I-4）に記載する使用。
【０００９】
II．象牙質形成覆髄材
（II-1）HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分として含む象牙質形成覆髄材。
（II-2）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである（II-1）に記載する象牙質形成覆髄材。
（II-3）HMG-CoA還元酵素阻害剤の象牙質形成覆髄材の有効成分としての使用。
（II-4）HMG-CoA還元酵素阻害剤の象牙質形成覆髄材の製造のための使用。
（II-5）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである（II-3）または（II-4）に記載する使用。
【００１０】
III．象牙芽細胞の製造方法、および象牙芽細胞の用途
（III-1）象牙芽細胞に分化可能な細胞を、HMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で培養する工程を含む、象牙芽細胞の製造方法。
（III-2）象牙芽細胞に分化可能な細胞が、歯髄幹細胞、歯乳頭由来幹細胞、および象牙芽細胞前駆細胞からなる群から選択される少なくとも１つである、（III-1）に記載する象牙芽細胞の製造方法。
（III-3）0.1〜10μM濃度のHMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で培養することを特徴とする、（III-1）または（III-2）に記載する象牙芽細胞の製造方法。
（III-4）HMG-CoA還元酵素阻害剤が、プラバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、およびこれらの塩からなる群から選択される少なくとも１つである、（II1-1）乃至（III-3）のいずれかに記載する象牙芽細胞の製造方法。
（III-5）（III-1）乃至（III-4）のいずれかに記載する方法で得られた象牙芽細胞を含む、歯科治療材。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の象牙質形成促進剤は、特に齲蝕部分や露出した歯髄面（露髄面）への充填修復における前処理剤として好適であり、このような修復の前処置に使用することにより齲蝕部分や露髄面と修復物との境界面における象牙質形成（再生）を促進することができる。また象牙質形成覆髄材は、齲蝕治療において露髄面を直接覆う被覆材（歯牙被覆材）として用いることにより、歯髄を保護するとともに、歯髄幹細胞を初めとする、象牙芽細胞に分化可能な細胞を象牙芽細胞に分化誘導させることにより、象牙質形成（再生）を促進することができる。また、本発明の方法によって製造される象牙芽細胞は、歯科治療において歯再生材料として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】歯髄幹細胞（DPSC）を継代培養して、象牙質の特異的なマーカー（DSPP）の発現をRT-PCRで測定した結果を示す。
【図２】HMG-CoA還元酵素阻害剤（図中「statin」と表記する。以下同じ）の存在下、他の象牙質形成促進剤（BMP-2）の存在下、および非存在下（control）で、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す。
【図３】HMG-CoA還元酵素阻害剤（statin）の存在下、他の象牙質形成促進剤（BMP-2）の存在下、および非存在下（control）で、それぞれ歯髄幹細胞を培養して、各々のDSPP（dentin sialophosphoprotein）の遺伝子発現に対する影響を測定した結果を示す。
【図４】HMG-CoA還元酵素阻害剤（statin）の存在下、他の象牙質形成促進剤（BMP-2）の存在下、および非存在下（control）で、それぞれ歯髄幹細胞を培養して、各々のOCN（osteocalcin）の遺伝子発現に対する影響を測定した結果を示す。
【図５】各種のHMG-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Mevastatin(CALBIOCHEM社)1μmM, Fluvastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Lovastatin (SIGMA社)1μM, Pitavastatin(Toronto Research Chemicals Ins社)1μM, Plavastatin (第一三共株式会社)200μM〕の存在下、および非存在下（control）で、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す（実験例２）。
【図６】各種のHMG-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Mevastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Fluvastatin(CALBIOCHEM社)1μM, Lovastatin(SIGMA社)1μM, Plavastatin (第一三共株式会社)200μM〕の存在下、他の象牙質形成促進剤（BMP-2）の存在下、および非存在下（control）で、それぞれ歯髄幹細胞を培養して、各々のOCN（osteocalcin）の遺伝子発現に対する影響を測定した結果を示す。
【図７】HMG-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μM〕の存在下、Rho/Rhoキナーゼ阻害剤Fasudilの存在下（1μM、10μM、100μM）、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す（実験例３（１））。
【図８】HMG-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μM〕の存在下、HMG-CoA還元酵素阻害剤とメバロン酸の存在下、HMG-CoA還元酵素阻害剤とメバロン酸との存在下、Rhoキナーゼ阻害剤Fasudilの存在下（1μM、10μM、100μM）、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す（実験例３（２）。
【図９】HMG-CoA還元酵素阻害剤〔Simvastatin(CALBIOCHEM社)1μM〕の存在下、HMG-CoA還元酵素阻害剤とNogginの存在下、BMP-2の存在下、BMP-2とNogginの存在下、またはNogginの存在下、歯髄幹細胞を培養して、各々の細胞増殖に与える影響を対比した結果を示す（実験例４）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
（Ｉ）象牙質形成促進剤
本発明の象牙質形成促進剤は、HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分とすることを特徴とする。
【００１４】
ここでHMG-CoA還元酵素阻害剤は、体内のコレステロール合成経路においてHMG-CoA還元酵素の作用を阻害し、メバロン酸の生成を阻止する作用を有する物質である。なお、HMG-CoA還元酵素（3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA還元酵素）は、コレステロールの生合成の過程で、HMG-CoAを還元してメバロン酸を生成するうえで必要な酵素である。このため、上記作用を有するHMG-CoA還元酵素阻害剤は、メバロン酸の生成を阻止してコレステロールの生合成を抑制し、コレステロールを低下させることから、従来から高脂血症治療薬として広く用いられている。
【００１５】
HMG-CoA還元酵素阻害剤としては、HMG-CoA還元酵素の作用を阻害し、メバロン酸の生成を阻止する作用を有するものであれば特に制限されない。制限されないが、具体的には、水溶性スタチンであるプラバスタチン；脂溶性スタチンであるシンバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、ロバスタチン、およびこれらの塩を例示することができる。なお、プラバスタチンは、商品名メバロチンとして第一三共（株）から、シンバスタチンは商品名リポバスとして萬有製薬（株）から、フルバスタチンは商品名ローコールとしてノバルティスファーマ（株）から、アトルバスタチンは商品名リピトールとしてアステラス製薬（株）から、ロスバスタチンは商品名クレストールとして塩野義製薬（株）から、ピタバスタチンは商品名リバロとして興和（株）から、メバスタチンはCALBIOCHEM社から、またロバスタチンは商品名メバコアとしてメルク（株）から入手することができる。
【００１６】
これらのHMG-CoA還元酵素阻害剤のうち、メバスタチンおよびロバスタチンはラクトン型であり、それ自体にHMG-CoA還元酵素阻害活性はないが、体内で酸型に変化し、HMG-CoA還元酵素阻害活性を有するようになる。このため、本発明でいうHMG-CoA還元酵素阻害剤には、体内でのみHMG-CoA還元酵素阻害活性を発揮する物質も包含される。
【００１７】
本発明の象牙質形成促進剤は、かかるHMG-CoA還元酵素阻害剤を有効量含有するものであればよく、例えば上記のHMG-CoA還元酵素阻害剤を、水に溶解または分散させた水性液剤の形状、または界面活性剤などを利用して乳化させた乳化剤の形状に調製することもできる。
【００１８】
本発明の象牙質形成促進剤をかかる水性液剤または乳化剤とする場合、HMG-CoA還元酵素阻害剤の使用時における濃度が、通常0.1〜10μM、好ましくは0.2〜5μM、より好ましくは0.5〜2μMとなるように調製することが望ましい。言い換えれば、象牙質形成時に使用されるHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度が上記範囲にあればよく、象牙質形成促進剤に含まれるHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度はこれに限定されない。通常、使用時に希釈されることを鑑みれば、上記より濃い濃度でHMG-CoA還元酵素阻害剤を含んでいることが好ましい。
【００１９】
当該象牙質形成促進剤には、本発明の効果を妨げないことを限度として、所望により、他の成分を配合することができる。当該他の成分としては、抗齲蝕効果を有するフッ化ナトリウムやフッ化ジアミン銀（商品名：サホライド）等のフッ化金属塩、およびフォルムクレゾール、ならびに、偏性嫌気性菌等に有効な抗生物質や抗菌物質を挙げることができる。また、象牙質の再生に可能性がある生体機能分子として、象牙質形成促進作用を有する骨形成因子〔bone morphogenic protein (BMP)-2, 4, 7〕、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）、トランスフォーミング成長因子(TGFβ)、結合組織成長因子（CTGF）、肝細胞増殖因子（HGF）、インシュリン様成長因子（IGF-I，II）、ソニックヘッジホッグ（SHH）等を配合することもできる。さらに骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）、歯髄幹細胞（DPSC）および歯乳頭由来幹細胞（SCAP）などを細胞成分として配合することもできる（Sonoyama W, Liu Y, Fang D, Yamaza T, Seo B-M, et al (2006) Mesenchymal Stem Cell-Mediated Functional Tooth Regeneration in Swine. PLoS ONE 1(1): e79. doi:10.1371/journal.pone.0000079．）。さらにまた、ハイドロキシアパタイト、α- or β-TCP、接着性レジン、歯科用セメント（グラスアイオノマー、カルボン酸セメント等）、アテロコラーゲン、ヒアルロン酸などのキャリアー材料；また、歯髄の炎症が強い場合には、抗炎症作用のある薬剤、例えばフェノールカンファー（CC）や抗炎症剤などを用いることもできる。
【００２０】
また、従来から直接覆髄剤（歯髄の一部が露出している場合に歯髄組織を保護する薬剤）として使用されている、例えば水酸化カルシウム製剤など；ならびに間接覆髄剤（象牙質が薄くなっている場合に、外来刺激を遮断し殺菌などを目的に使用される薬剤）として使用されている、例えば酸化亜鉛ユージノール製剤や、酸化亜鉛クレオソート製剤などの薬剤を併用することもできる。
【００２１】
さらに本発明の象牙質形成促進剤には、本発明の効果を妨げないことを限度として、必要に応じて、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、アセトン、メチルエチルケトン等）、安定化剤（例えばグリセリン、エチレングリコール等の多価アルコール、マクロゴール等）、保存剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル類、塩化ベンザルコニウム等）等の添加剤、または殺菌剤、抗生物質もしくは抗炎症剤などの他の薬効成分を配合してもよい。
【００２２】
当該水性液剤の形態を有する本発明の象牙質形成促進剤は、齲蝕処置時に、歯、特に露髄面（髄腔開拡、歯髄切断面など）への塗布に直接使用される。具体的には、口腔内の歯面の目的部位（露髄面）に噴霧または塗布したり、また脱脂綿等に含ませた状態で目的部位に塗布または充填することもできる。斯くして本発明の象牙質形成促進剤は、露髄面から歯髄細胞、特に歯髄幹細胞を初めとする、象牙芽細胞に分化可能な細胞（象牙芽細胞前駆体）に効率よく浸透浸潤させることができ、これらの細胞における象牙芽細胞への分化誘導、すなわち象牙質の形成を促進することができる。
【００２３】
本発明の象牙質形成促進剤は、またその形状（剤型）を特に制限されるものではない。例えば、前述する水性液剤や乳化剤の形状のほか、ゲル状、クリーム状または軟膏状を有するものであってもよい。かかるゲル状、クリーム状または軟膏状の場合、歯面の目的部位（露髄面）への塗布が容易になるだけでなく充填が可能であり、その結果、露髄面における滞留性がよくなり、HMG-CoA還元酵素阻害剤の効果をより効果的に享受することができる。なお、前述する水性液剤や乳化剤の場合は、増粘剤を配合することによって粘稠性を付与してもよい。
【００２４】
なお、増粘剤としては、特に限定はされないが、例えば、コロイダルシリカ、ヒュームドシリカ、酸化アルミニウム微粒子、モンモリロナイト微粒子、ハイドロキシアパタイト、α-またはβ-TCP、接着性レジン、歯科用セメント（グラスアイオノマー、カルボン酸セメント等）、アテロコラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチンハイドロゲル等を挙げることができる。これらはいずれか１種を使用しても２種以上を併用してもよい。
【００２５】
また粉状または顆粒状の形態を有していてもよく、この場合は使用時に水などの適当な溶媒に溶解、分散もしくは混練して使用することもできる。
【００２６】
本発明の象牙質形成促進剤は、例えば、齲蝕部や露髄面を充填修復など処置する際の前処理剤として好適に使用される。かかる処置時に本発明の象牙質形成促進剤を用いて前処理することにより、有効成分であるHMG-CoA還元酵素阻害剤が露髄面から「象牙芽細胞前駆体」に浸透浸潤して、象牙芽細胞への分化が誘導されて象牙質形成が促進される。その結果、歯と修復物との接合界面における耐久性を向上させることができる。
【００２７】
（II）象牙質形成覆髄材
前述する象牙質形成促進剤は、有効成分であるHMG-CoA還元酵素阻害剤の効果をより効果的に享受する目的で、当該有効成分を、「象牙芽細胞前駆体」から象牙芽細胞への分化誘導および象牙質の形成に十分な期間、患部（露髄面）に滞留保持させるために、担体に担持された形状の歯科材料として調製することもできる。本発明の「象牙質形成覆髄材」は、こうした歯科材料であって、HMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分として含むことを特徴とするものである。
【００２８】
具体的には、HMG-CoA還元酵素阻害剤、好ましくはHMG-CoA還元酵素阻害剤を有効成分とする前述の液状、ゲル状、クリーム状または軟膏状の象牙質形成促進剤を、モノフィラメント、フィルム、繊維集合体、スポンジ、微小粒などの構造体に固定化または含浸させた形態を有するものを挙げることができる。
【００２９】
かかる象牙質形成覆髄材におけるHMG-CoA還元酵素阻害剤の量は、使用時におけるHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度が、通常0.1〜10μM、好ましくは0.2〜5μM、より好ましくは0.5〜2μMとなるように調製することが望ましい。すなわち、象牙質形成時に使用されるHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度が上記範囲になるような割合である。
【００３０】
斯くして調製される象牙質形成覆髄材によれば、露髄部をこれで直接覆うことができるため、神経（歯髄）への外的刺激が防止できるとともに、露髄部に有効成分であるHMG-CoA還元酵素阻害剤を長期間にわたって滞留保持させることができるため、象牙芽細胞への分化誘導ならびに象牙質形成促進効果をより効果的に享受することができる。
【００３１】
（III）象牙芽細胞の製造方法、ならびにそれらの用途
また本発明は、象牙芽細胞の製造方法を提供する。当該方法は、象牙芽細胞に分化可能な細胞（象牙芽細胞前駆体）、具体的には歯髄幹細胞、歯乳頭由来幹細胞、または象牙芽細胞前駆細胞を、HMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で培養することによって実施することができる。
【００３２】
ここで象牙芽細胞とは、象牙質の基質成分を分泌する成熟した細胞を意味する。一方、完全に成熟した象牙芽細胞ではないものの、象牙芽細胞に分化する能力を持ちながら、若干未分化な細胞は「象牙芽細胞前駆細胞」と称されている。また「歯髄幹細胞」は、歯髄組織に含まれる多分化能を持つ未分化間葉系幹細胞を意味する。当該歯髄幹細胞は、通常、歯髄組織を幹細胞特異的培養液中で培養することによって単離することができる。すなわち、これらは、分化度から次のような関係になる（(1)分化度最低（未分化）：歯髄幹細胞、歯乳頭由来幹細胞、(2)分化度中等：象牙芽細胞前駆細胞、(3)分化度最大（成熟）：象牙芽細胞）。
【００３３】
本発明において、これらの象牙芽細胞に分化可能な細胞（本発明においては、これらの歯髄幹細胞、歯乳頭由来幹細胞、および象牙芽細胞前駆細胞を含めて「象牙芽細胞前駆体」と総称する）として、1種類の細胞から成る単一の細胞を培養してもよいし、２種類以上の細胞からなる細胞混合物を培養してもよい。「象牙芽細胞前駆体」の由来は特に制限されないが、好ましくはほ乳類である。具体的には、ラット、マウス、ウサギ、サル、ブタ、イヌ、およびヒトを挙げることができるが、好ましくはサルおよびヒトであり、より好ましくはヒトである。
【００３４】
「象牙芽細胞前駆体」は、これらのほ乳類の抜去歯等から採取することができる。例えば、ヒトの歯髄細胞は、About Iらの方法（About I et al.: Human dentin production in vitro. Exp Cell Res., 258:33-41, 2000）に従って採取することができる。また、ヒトの「象牙芽細胞前駆細胞」は、例えば、Gronthos S らの方法（Gronthos S et al.: Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A., 97:13625-30, 2000）に従って、歯髄組織より採取することができる。
【００３５】
具体的には、ヒトの「象牙芽細胞前駆体」は、下記の方法に従って採取することができる：
(1)まず埋伏歯を無菌的に取り出し、Phosphate Buffered Saline（以下、PBSと略す）溶液などの適当な保存液で保存する。
【００３６】
(2)歯牙の中の石灰化した部分を取り除き、メスにて組織を小片にして、PBS溶液などを用いて組織を洗浄する。
【００３７】
(3)次いで、コラゲナーゼやディスパーゼなどの酵素を用いて組織を処理する。
【００３８】
(4)酵素処理後、ピペッティング操作と遠心操作により細胞を回収する。
【００３９】
(5)回収した細胞の多分化能、増殖能を検討し、これらの回収した細胞の中に「象牙芽細胞前駆体」が含まれていることを確認する。
【００４０】
「象牙芽細胞前駆体」の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温から37℃の温度；5％CO2インキュベーター内など）の下で行なうことができる。また、培地には、アスコルビン酸などの添加剤を加えることも可能である。培養の形態は特に限定されないが、例えば、静置培養で行なうことができる。
【００４１】
当該「象牙芽細胞前駆体」の培養において使用するHMG-CoA還元酵素阻害剤の濃度は、培地中において0.1〜10μM、好ましくは0.2〜5μM、より好ましくは0.5〜2μMを挙げることができる。
【００４２】
なお、HMG-CoA還元酵素阻害剤としては、体内のコレステロール合成経路においてHMG-CoA還元酵素の作用を阻害し、メバロン酸の生成を阻止する作用を有するものであれば特に制限されず、具体的には、前述するように、プラバスタチン（商品名：メバロチン）、シンバスタチン（商品名：リポバス）、フルバスタチン（商品名：ローコール）、アトルバスタチン（商品名：リピトール）、ロスバスタチン（商品名：クレストール）、ピタバスタチン（商品名：リバロ）、メバスタチン、ロバスタチンおよびこれらの塩を用いることができる。
【００４３】
また「象牙芽細胞前駆体」の培養は担体の上で行ってもよい。ここで担体としては、象牙芽細胞ならびにその後の象牙質の形成に要する時間、培養の足場となる耐久性を備えるものであることが好ましいが、さらに好ましくは生分解性を有するものである。また、「象牙芽細胞前駆体」と親和性を有する材料からなる担体であることが好ましい。
【００４４】
かかる担体の素材としては、制限されないが、例えば、セラミック系の材料（例えば、ハイドロキシアパタイト（HAp）、リン酸三カルシウム（β-TCP）、リン酸四カルシウム）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）（PLGA）、ポリ乳酸（PLA）、ポリカプロラクトンなどの合成高分子材料；またはコラーゲン、ゼラチン、フィブリンなどの蛋白質材料；あるいはヒアルロン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、象牙、サンゴなどの天然由来材料を挙げることができる。なお、PGA、PLA、PLGAまたはポリカプロラクトンなどの合成材料を使用する場合には、細胞の接着及び増殖性を高めるために、表面にコラーゲン溶液又はフィブロネクチン溶液などをコートして使用することもできる。
【００４５】
かかる担体の形態としては、メッシュ形態、スポンジ形態、ゲル形態、不織布形態、粒状形態などが可能である。また担体は、象牙芽細胞前駆体を移植しやすい形状に加工したものが好ましく、板状、球状の多孔体あるいは中空で一端が開放されており、周囲から血管が進入しやすくなっているものが好ましい。
【００４６】
担体を用いて培養する場合、本発明の方法は、以下の３工程を含むことができる。
（ｉ）分離した「象牙芽細胞前駆体」を培養する工程（一次培養）；
（ii）上記一次培養によって得られた細胞を、担体に播種して培養する工程（二次培養）；及び
（iii）上記担体上での培養を、HMG-CoA還元酵素阻害剤の存在下で行う工程（分化誘導）。
【００４７】
上記の（i）一次培養工程は、以後の工程において象牙質を再生するのに必要な数の細胞を得るために行う培養である。工程（i）における「象牙芽細胞前駆体」の培養は、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温〜37℃の温度、5％CO2インキュベーター内での培養など）の下で行なうことができる。培養の形態は特に限定されないが、例えば、静置培養で行なうことができる。また、工程（i）で得られた細胞は、凍結保存しておくことも可能であり、必要時に解凍して増殖させたものを、上記工程(ii)以降の操作に使用することもできる。
【００４８】
上記の工程（ii）は、担体上で「象牙芽細胞前駆体」を増殖させる工程である。担体に播種した細胞は、担体に接着して、増殖する。工程（ii）における「象牙芽細胞前駆体」の培養も、動物細胞の培養に用いる通常の血清入り培地や無血清培地を用いて、通常の動物細胞の培養条件（例えば、室温〜37℃の温度；5％CO2インキュベーター内での培養など）の下で行なうことができる。培養期間としては、好ましくは１〜３０日、さらに好ましくは５〜２５日である。
【００４９】
上記の工程（iii）は、象牙芽細胞への分化誘導を行う工程である。HMG-CoA還元酵素阻害剤の使用量は上記の通りであり、培地中の濃度として0.1〜10μM、好ましくは0.2〜5μM、より好ましくは0.5〜2μMを挙げることができる。
【００５０】
斯くして調製される象牙芽細胞を用いることによって象牙質を形成することができる。例えば、歯髄幹細胞を移植すると、その細胞は象牙質を作ることが知られている（Gronthos S, Mankani M, Brahim J, Robey PG, Shi S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A., 97:13625-13630, 2000）。
【００５１】
ゆえに、本発明の方法により分化誘導された象牙芽細胞は、歯科治療材として、齲蝕などの歯科疾患を有する患者に移植することによって、当該歯科患者を治療することができる。この場合、本発明の方法によって得られた象牙芽細胞を担体と一緒に直接患者に移植しても良い。斯くして、当該患者の移植した部位（髄腔の穿孔や露髄部）で象牙質を再生させることができる。
【００５２】
また、本発明の方法により分化誘導された象牙芽細胞は、必要に応じて担体と一緒に、一旦、ヒト以外のほ乳動物に移植して当該移植動物の体内で象牙質を再生させ、次いでこれを歯科治療材として、齲蝕などの歯質欠損部位に移植することも考えられる。ここで移植動物の種類は特に限定されないが、好ましくは、マウス（ヌードマウスなど）、ラット（ヌードラットなど）などの免疫不全げっ歯類動物を使用することができる。また、歯科疾患により歯を欠損したヒト患者の歯槽骨に人工象牙質歯根として移植することもできる。この際、ハイドロキシアパタイトやチタンなどの歯根型生体材料の表面に細胞培養もしくは移植により象牙質を形成させて、人工歯根を作成しておくこともできる。なお、ヒト以外のほ乳動物への移植の部位は特に限定されないが、例えば、背部皮下などが挙げられる。
【実施例】
【００５３】
以下、本発明を実験例により詳細に説明する。但し、本発明はこれらの実験例に限定されるものではない。
【００５４】
実験例１
（１）歯髄幹細胞（dental pulp stem cell:DPSC）の単離・培養
歯髄幹細胞（DPSC）は、岡山大学歯学部倫理委員会の許可のもと、インフォームドコンセントを得た上で提供を受けたヒト抜去歯から、Gronthosら（Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 13625-30, 2000）の手法に準じて単離した。
【００５５】
具体的には、ヒト抜去歯から採取した歯髄を3 mg/ml タイプ１コラゲナーゼ (Worthington Biochemicals Corp.)、ならびに4 mg/ml ディスパーゼ (Roche Diagnostic/Boehringer Mannheim Corp.) で37℃で30分間、酵素処理した後、10％仔牛由来血清（FBS）と0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地を用いて培養した。 
【００５６】
2〜10代にわたって継代培養したDPSCについて、象牙質の特異的マーカーであるdentin sialo-phospho-protein(DSPP)遺伝子（Narayanan K, et al.,J Biol Chem., 281(28):19064-71, 2006）の発現を、RT-PCR法を用いて確認した。
【００５７】
RT-PCRの結果を図１に示す。象牙質歯髄幹細胞におけるDSPPの発現量から、３〜５代の継代培養細胞を以下の実験に使用した。
【００５８】
（２）HMG-CoA還元酵素阻害剤の細胞増殖に与える影響
HMG-CoA還元酵素阻害剤としてシンバスタチン（simvastatin: SVS）（CALBIOCHEM社）を用いて、HMG-CoA還元酵素阻害剤の歯髄幹細胞（DPSC）の増殖に与える影響を調べた。
【００５９】
具体的には、SVSを1μMの濃度で含む10％仔牛由来血清（FBS）、ならびに0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地に、上記（１）で調製したDPSCを37℃、5％CO2下で培養した。培地の交換は週に２回行い、１、３、５および７日目の細胞数を、MTS法（Barltrop, J.A. et al. 5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4,5-dimenthylthiazoly)-3-(4-sulfophenyl)tetrazolium, inner salt (MTS) and related analogs of 3-(4,5-dimethylthiazolyl)-2,5-diphenyl- tetrazolium bromide (MTT) reducing to purple water-soluble formazans a cell-viability indicators. Bioorg. & Med. Chem. Lett. 1, 611, 1991）を用いて間接的に評価した。
【００６０】
なお、対照試験（control）としてSVSの代わりにPBSを添加した10％仔牛由来血清（FBS）、ならびに0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地、また比較試験としてSVSの代わりに、象牙質形成促進作用が知られているBMP-2（骨形成タンパク質）（R&D systems）を100ng/ml濃度添加した10％仔牛由来血清（FBS）、ならびに0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM  L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地をそれぞれ用いて、上記と同様に、DPSCを培養して細胞数を評価した。
【００６１】
結果を図２に示す。図２からわかるように、培養開始から５日目において、100ng/ml 濃度のBMP-2の存在下での培養では、歯髄幹細胞（DPSC）の増殖は有意に促進されたのに対して（1.05倍、p<0.0070）、1μM濃度のSVSの存在下での培養では、歯髄幹細胞（DPSC）の増殖は有意に抑制された（0.73倍、p<0.0001）。このことから、HMG-CoA還元酵素阻害剤であるシンバスタチンには歯髄幹細胞（DPSC）の増殖を抑制する作用があることが判明した。
【００６２】
（３）HMG-CoA還元酵素阻害剤の細胞分化に与える影響
HMG-CoA還元酵素阻害剤としてシンバスタチン（simvastatin: SVS）（CALBIOCHEM社）を用いて、HMG-CoA還元酵素阻害剤の歯髄幹細胞（DPSC）の象牙芽細胞への分化に与える影響を調べた。
【００６３】
具体的には、SVSを1μMの濃度で含む10％仔牛由来血清（FBS）、ならびに0.1 mM L-アスコルビン酸、2 mM L-グルタミン、100μg/mlペニシリン、および100μg/mlストレプトマイシンを加えたα-MEM培地に、上記（１）で調製したDPSCを、37℃で5％CO2気相下で培養し、培養から3、7および10日目に採取した細胞から、total RNAを回収し、象牙芽細胞特異的マーカーであるdentin sialophosphoprotein (DSPP)（Ritchie HH, et al. J Biol Chem., 269:3698-702, 1994; Butler WT, et al. Matrix., 12:343-51, 1992）、および石灰化マーカーであるosteocalcin (OCN)(Bronckers AL, et al. Connect Tissue Res., 22:65-70, 1989)の遺伝子発現を定量的RT-PCRにて評価した（Narayanan K, et al., J Biol Chem., 281(28):19064-71, 2006）。
【００６４】
なお、対照試験として、SVSの代わりにPBSを添加した10％ダルベッコ修飾イーグル培地、また比較試験としてSVSの代わりにBMP-2（R&D systems）を100ng/ml濃度添加した10％ ダルベッコ修飾イーグル培地をそれぞれ用いて、上記と同様に、DPSCを培養してDSPPとOCNの遺伝子発現を評価した。
【００６５】
DSPPの遺伝子発現を示す結果を図３に、OCNの遺伝子発現を示す結果を図４に示す。
【００６６】
これらの図からわかるように、歯髄幹細胞（DPSC）をSVS含有培地で培養すると、象牙芽細胞特異的マーカーであるDSPPの遺伝子発現は、有意に促進されていた (10.9倍、p=0.0111)。また、石灰化マーカーであるOCNの遺伝子発現も、対照群 (18.8倍、p=0.0004)、BMP-2群(7.4倍、p=0.0002)と比べて有意に促進されていた(Scheffe'sの多重比較検定)。
【００６７】
以上のことから、HMG-CoA還元酵素阻害剤であるシンバスタチンに、歯髄幹細胞（DPSC）の細胞増殖を抑制し、象牙芽細胞への分化を促進する作用があることが明らかとなった。
【００６８】
実験例２
HMG-CoA還元酵素阻害剤として、実験例１で使用したシンバスタチン（Simvastatin:CALBIOCHEM）に加えて、メバスタチン（mevastatin：Toronto Research Chemicals Ins)、フルバスタチン（Fluvastatin：CALBIOCHEM)、ロバスタチン（Lovastatin、SIGMA）、ピタバスタチン（Pitavastatin：Toronto Research Chemicals Ins)、プラバスタチン（Plavastatin：第一三共製薬（株）)を用いて、実験例１の（２）と（３）と同様の実験を行った。
【００６９】
（１）HMG-CoA還元酵素阻害剤の歯髄幹細胞（DPSC）に与える影響
HMG-CoA還元酵素阻害剤として、シンバスタチン1μM、メバスタチン1μM、フルバスタチン1μM、ロバスタチン1μM、ピタバスタチン1μM、およびプラバスタチン200μM をそれぞれ使用し、実験例１の（２）と同様の方法で、DPSCを培養した。そして培養０日目、３日目、５日目に、DPSCの細胞数をMTS法にて計測した。対照群（control）も、実験例１（２）と同様に設定し、実験を行った。
【００７０】
結果を図５に示す。図５からわかるように、細胞培養５日目において、脂溶性スタチン類（シンバスタチン、メバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン）では1μMの濃度で対照群と比べ有意差をもってDPSCの増殖を抑制した。また水溶性スタチン（プラバスタチン）では200μMの濃度でDPSCの増殖を抑制することが観察された。
【００７１】
（２）HMG-CoA還元酵素阻害剤の細胞分化に与える影響
HMG-CoA還元酵素阻害剤として、シンバスタチン1μM、フルバスタチン1μM、メバスタチン1μM、ロバスタチン1μM、およびプラバスタチン200μM をそれぞれ使用し、実験例１の（３）と同様の方法で、歯髄幹細胞（DPSC）を培養し、14日目に石灰マーカーであるOCNの遺伝子発現を定量的RT-PCRにて評価した。また、対照群（control）および比較群（BMP-2）も、実験例１（３）と同様に設定し、実験を行った。
【００７２】
結果を図６に示す。図６からわかるように、細胞培養14日目において、脂溶性スタチン類（シンバスタチン、メバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン）および水溶性スタチン（プラバスタチン）で処理することで、対照群および比較群（BMP-2）と比べて、石灰マーカーであるOCNの遺伝子発現が促進されていることが観察された。
【００７３】
以上のことから、実験例１で確認したシンバスタチンだけでなく、HMG-CoA還元酵素阻害活性を有する物質全般にわたって、歯髄幹細胞（DPSC）の細胞増殖を抑制し、象牙芽細胞への分化を促進する作用があることが示唆された。
【００７４】
実験例３
（１）HMG-CoA還元酵素阻害剤と同じくRho/Rhoキナーゼ阻害作用を有する物質であるFasudil（旭化成）を用いて、歯髄幹細胞（DPSC）の増殖に与える影響を調べた。
【００７５】
具体的には、HMG-CoA還元酵素阻害剤としてシンバスタチン（Simvastatin:CALBIOCHEM）1μM、並びに上記Fasudil 1μM、10μMおよび100μMをそれぞれ用いて、実験例１の（２）と同様の方法で、DPSCを培養した。そして培養５日目に、DPSCの細胞数をMTS法にて計測した。対照群（control）も、実験例１（２）と同様に設定し、実験を行った。
【００７６】
結果を図７に示す。図７からわかるように、細胞培養５日目において、10μM以上の濃度でFasudilはDPSCの増殖を抑制した。
【００７７】
（２）HMG-CoA還元酵素阻害剤としてシンバスタチン（Simvastatin:CALBIOCHEM）を用いて、シンバスタチンによって生じる歯髄幹細胞（DPSC）の増殖抑制（実験例１（２）参照）が、メバロン酸またはFasudil（旭化成）を補うことによってどのようになるかを調べた。
【００７８】
なお、メバロン酸は、体内のコレステロール合成経路において、HMG-CoA還元酵素の作用によってHMG-CoAから産生される生体内分子である。すなわち、HMG-CoA還元酵素阻害剤によってHMG-CoAからの産生が阻止される生体内分子である。またFasudilは、HMG-CoA還元酵素阻害剤と同じくRho/Rhoキナーゼ阻害作用を有する物質である。
【００７９】
具体的には、実験例１（２）の方法において、歯髄幹細胞(DPSC)の培養を、(a)シンバスタチン1μM（シンバスタチン添加群）、(b)シンバスタチン1μMとメバロン酸1mM（メバロン酸添加群）、(c)シンバスタチン1μMとメバロン酸1mMとFasudil 10μM（Fasudil併用群）の存在下でそれぞれ行い、培養から０日目、３日目、５日目に、MTS法によりDPSCの細胞数を計測した。また対照試験（control）として、実験例１（２）と同様に上記被験物質に代えてPBSを用いて同様に試験を行った。
【００８０】
結果を図８に示す。図８からわかるように、培養５日目にて、(b)メバロン酸添加群では、HMG-CoA還元酵素阻害剤添加による細胞増殖抑制効果が解消された。またメバロン酸 1mMの添加に加えてFasudil 10μMを添加した(c)Fasudil併用群では、メバロン酸添加にもかかわらず(a)シンバスタチン添加群と同様に、対照群と比べてDPSCの細胞増殖が抑制された。
【００８１】
（１）と（２）の実験結果から、HMG-CoA還元酵素阻害剤によってメバロン酸の産生を抑止することによってDPSCの細胞増殖が抑制されることがわかる。
【００８２】
すなわち、実験例１〜３の結果から、体内でのコレステロール合成経路において、HMG-CoA還元酵素の作用を阻害してメバロン酸の産生を阻止する作用を有する物質、すなわちHMG-CoA還元酵素阻害剤は、象牙芽細胞分化誘導剤ならびに象牙質再生促進剤として有用であるといえる。
【００８３】
実験例４    BMPの細胞増殖抑制に与える影響の検討
実験例１（２）の方法において、歯髄幹細胞(DPSC)の培養を、(a) HMG-CoA還元酵素阻害剤（スタチン添加群）、（b）HMG-CoA還元酵素阻害剤により誘導されることが報告されているBMP-2（BMP-2添加群）、(c)BMPの阻害薬であるNoggin（R&D systems）（Noggin添加群）、(d) HMG-CoA還元酵素阻害剤とNoggin（スタチン・Noggin添加群）、(e) BMP-2とNoggin（BMP-2・Noggin添加群）の存在下で行い、DPSCの細胞数を細胞培養0、3、5日目にMTS法にて計測を行った。
【００８４】
結果を図９に示す。培養５日目でBMP添加群およびNoggin添加群は対照群と比べ、DPSC細胞増殖に影響を認められなかった。また、スタチン群ならびにスタチン・Noggin添加群では、DPSC細胞増殖抑制が認められた。これらのことから、スタチンが誘導するBMP-2とは別経路により、DPSCの細胞増殖抑制が起こっていると考えられる。
【００８５】
本発明の臨床応用例として、コラーゲンゲルなどのキャリアーまたは歯科分野で使用されている充填材などにHMG-CoA還元酵素阻害剤を含浸させて、これを露髄面に配置または充填することが考えられる。こうすることによって、歯髄の細胞を象牙質へ分化誘導することができ、その結果、象牙質の再生を図ることが可能になる。
【国際調査報告】
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