(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
再灌流によって誘発された心臓の炎症状態の処置および／または予防のための薬剤の製造における、Ｔｏｌｌ様受容体２に対するリガンドもしくは結合化合物の結合を阻害または遮断する抗体である抗体または前記抗体由来の結合断片の使用であって、
前記抗体の結合断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、およびｄＡｂからなる群より選択される、使用。
【請求項２】
前記再灌流によって誘発された心臓の炎症状態は、心筋虚血、虚血性心疾患、高血圧心筋虚血、鬱血性心不全、急性冠症候群、肥大、心筋梗塞、および不整脈からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記再灌流によって誘発された心臓の炎症状態は、低酸素症、脳卒中、および心臓発作からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および合成抗体またはそれらの結合断片からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、ラクダ抗体、およびサメ抗体、あるいはそれらのいずれか由来の結合断片からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥからなる群より選択されるアイソタイプである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記抗体または結合断片は、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍの解離定数（Ｋｄ）でＴｏｌｌ様受容体２に存在する阻害エピトープに結合する、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記抗体または結合断片は、ヒトＴｏｌｌ様受容体２の細胞外ドメインによって規定されるエピトープに結合する、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記抗体は、２つの完全な重鎖、および２つの完全な軽鎖、またはそれらの抗原結合断片を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記拮抗薬は、Ｔｏｌｌ様受容体２がＴｏｌｌ様受容体１、Ｔｏｌｌ様受容体４、Ｔｏｌｌ様受容体６またはＴｏｌｌ様受容体１０とヘテロ二量体を形成するか否かに関わらず、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能を抑制する、請求項１〜９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記抗体は、ハイブリドーマクローンＴ２．５またはそのヒト化型由来の抗ＴＬＲ２抗体である、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗体または結合断片は、少なくとも１つの免疫抑制剤化合物と同時に、別々に、または連続して投与されるためのものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記免疫抑制剤化合物は、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、代謝拮抗物質、抗ＣＤ２抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、およびＦＴＹ７２０からなる群より選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記抗体または結合断片は、少なくとも１つの治療的心臓血管化合物と同時に、別々に、または連続して投与されるためのものであり、
前記治療的心臓血管化合物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、血管拡張剤、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、β遮断薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、カルシウムチャンネル遮断薬、抗凝固剤、アデノシン二リン酸受容体拮抗薬、チクロピジン、硫酸クロピドグレル、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬、ビバリルジン、アルガトロバン、ヘパリン、βアドレナリン受容体作動薬、抗血栓溶解剤、抗酸化剤、およびα遮断薬からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記抗体または結合断片は、虚血後に投与されるためのものである、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、虚血再灌流障害を処置および予防するための方法に関する。特に、本発明は、虚血再灌流障害を処置または予防する際に使用するための新規の標的としてのＴｏｌｌ様受容体２を同定する。拮抗薬によってＴｏｌｌ様受容体２の機能活性を遮断することは、再灌流障害に関連する炎症過程を下方制御し、これにより、Ｔｏｌｌ様受容体２拮抗薬が投与される被験体にとって改善された治療結果を生じる。
【背景技術】
【０００２】
心臓麻痺は、心臓が身体の循環系を通して十分な速度で血液を送り出すことができない病態生理学的状態である。この状態は、心臓の低下したポンプ機能に起因して過剰体液が蓄積する場合に生じる状態である鬱血性心不全を引き起こし得る。心臓組織への血液供給の遮断により、血液供給が与えられない組織領域の壊死を生じる場合、心筋梗塞が生じる。
【０００３】
身体の臓器または一部が十分な血液供給を受けられない場合、虚血が生じる。適切な血液供給が与えられない臓器は、低酸素といわれる。一時的な欠乏後、血流が臓器に対して再開する場合、再灌流が生じる。
【０００４】
再灌流障害は、虚血期間後、組織に対して血液供給が戻ってくる際に組織または臓器に生じる損傷に関する。虚血期間の間の酸素および栄養素の欠乏は、血液循環が再開した場合、炎症および酸化的損傷の期間を生じる。虚血再灌流障害の例としては、低酸素症、脳卒中、心臓麻痺、慢性腎不全または臓器移植が挙げられる。
【０００５】
再灌流障害の病因学は、炎症性免疫反応に強く関連するが、多因子性である。特に、以前に血流が与えられない領域に対する血流の再循環は、白血球付着および湿潤、フリーラジカルの放出ならびにサイトカイン産生などの多くの炎症性過程の開始を生じ得る。さらに、虚血を受けた領域における細胞膜に対する損傷は、さらなるフリーラジカルの放出を生じ得る。プログラム細胞死（アポトーシス）も生じ得るが、虚血領域への白血球の移動は、毛細血管の閉塞を生じ得、これにより、血流の制限およびさらなる虚血の関連した危険性が生じる。従って、虚血期間後の血流の回復は、実際に、虚血性イベント自体より損傷を与え得る。
【０００６】
薬理学的であろうとまたは機械的であろうと、心筋梗塞の処置のための治療戦略は、心筋組織の血流および灌流を回復させるために、閉塞した冠状動脈を開くこと、または開き続けることに狙いを定めている。梗塞に関係した動脈における血流および生存の危険にさらされた心筋の再灌流の早期の回復は、臨床転帰を改善する。しかしながら、逆説的にではあるが、再灌流自体は、虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害といわれる心筋細胞における壊死およびアポトーシスの促進を生じる。生存している心筋組織の損傷に起因する合併症は、心筋梗塞後もまだ見られるため、再灌流だけでは、危険にさらされた心筋を救うのに不十分のようである。
【０００７】
再灌流は、先天性免疫系によって媒介される炎症反応を活性化させる。先天性免疫系のこの活性化はまた、炎症性サイトカインの放出に起因する心筋細胞の死を引き起こし、好中球と心筋細胞との間の細胞−細胞間の相互作用を害する。細胞内の核因子−κＢ（ＮＦ−ｋＢ）シグナル伝達経路は、心筋虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害における炎症性遺伝子の転写を媒介する。さらに、酸素の再導入は、損傷を与えるフリーラジカルの大量の産生、炎症媒介物の増加、および関連した壊死の発現を生じる。再灌流の重症度は、虚血の持続時間、虚血の重症度、および再灌流の速度などの多くの要因に起因して変化し得る。
【０００８】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、先天性免疫応答を活性化するのに重要な役割を有するパターン認識受容体のファミリーを形成する。１１のＴｏｌｌ様受容体が、今までヒトにおいて同定されている。Ｔｏｌｌ様受容体ファミリーの膜は、１０〜１５のＴｏｌｌ様受容体を有するほとんどの哺乳動物種と共に高度に保存される。各Ｔｏｌｌ様受容体は、特定の病原体関連分子の特徴を認識する。Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２、ＣＤ２８２、ＴＬＲ−２）は、ペプチドグリカン、リポタンパク質およびリポタイコ酸によって活性化され得る。
【０００９】
今までの研究は、虚血および再灌流の間に誘発される複合体相互作用の調節および炎症機構を完全に解明していない。さらに、異なる動物モデル、異なる患者、および異なる組織において発現するため、虚血再灌流障害の性質および変動は、治療的介入および虚血再灌流の予防のための方法を特定することに関するさらなる障壁となっている。
【００１０】
多数の実験の後に、本発明者らは驚くべきことに、Ｔｏｌｌ様受容体２が、虚血の期間を受けた組織または臓器における虚血再灌流障害に関連する先天性炎症性免疫の発現および進行において重要な役割を有することを確認した。本発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有し、Ｔｏｌｌ様受容体２の作動物質として機能する化合物が、再灌流障害の進行に関連する異常な炎症性免疫応答を予防する際に有用性を有することを確認した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、本発明者らは、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化およびシグナル伝達を抑制することにより媒介される虚血再灌流障害の予防および処置のための治療的アプローチが、特にＴｏｌｌ様受容体２の保存されている性質として潜在的に重要であることを確認し、これは、そのような治療的アプローチが、様々な種、組織および細胞型におけるこの状態の処置に包括的なアプローチを提供することを示唆する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の第１の態様によれば、虚血再灌流障害に関与するＴＬＲ２発現細胞または組織におけるＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）の１つ以上の生物学的活性を減少させる方法であって、
細胞または組織におけるＴＬＲ２の１つ以上の生物学的活性を減少させるのに十分な量で、ＴＬＲ２活性または発現の少なくとも１つの拮抗薬と、細胞または組織とを接触させる工程を含む、方法を提供することである。
【００１３】
本明細書中に定義する場合、用語「虚血再灌流障害に関与するＴＬＲ２発現細胞または組織」とは、虚血再灌流障害の発現または進行を引き起こす細胞または組織、あるいは虚血再灌流障害を受けた細胞型または組織を意味する。
【００１４】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２発現細胞または組織は、心筋虚血の細胞または組織である。特定の実施形態において、ＴＬＲ２発現細胞または組織は、限定されないが、心筋虚血、虚血性心疾患、高血圧心筋虚血、鬱血性心不全、組織虚血、臓器虚血、急性冠症候群、肥大、脳梗塞、心筋梗塞、不整脈、虚血再灌流障害（Ｉ／Ｒ障害）からなる群より選択される再灌流によって誘発された心臓の炎症状態に関する細胞または組織である。
【００１５】
特定の実施形態において、組織および／または細胞をＴＬＲ２拮抗薬と接触させる工程は、細胞溶解物、再構成系または培養物中の細胞において起こる。実施形態において、接触させる工程は、被験体に存在する細胞または組織で起こる。特定の実施形態において、ＴＬＲ２はヒトＴＬＲ２またはマウスＴＬＲ２であり得る。
【００１６】
特定の実施形態において、この方法は、虚血再灌流障害を有するか、または有する危険性があるヒト被験体で実施される。
【００１７】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＴＬＲ２拮抗薬は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、および低分子化合物からなる群より選択される。
【００１８】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、抗体分子である。典型的に、その抗体は、ヒトＴＬＲ２に存在するエピトープ、特にＴＬＲ２の規定された細胞外ドメインのアミノ酸残基を含むエピトープに対する結合特異性を有する。特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、ヒトＴＬＲ２のアミノ酸配列のアミノ末端およびカルボキシル末端由来のアミノ酸残基を含む不連続エピトープに結合する。特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、配列番号１のアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９を含むＴＬＲ２上のエピトープに結合する。
【００１９】
特定の実施形態において、抗体は、限定されないが、ＴＬＲ２に対する結合特異性を有するヒト、ヒト化、キメラ、合成、ラクダ、サメまたは生体外の抗体からなる群より選択される。特定のさらなる実施形態において、結合断片が使用されてもよく、前記結合断片は、上記抗体のいずれか由来である。特定の実施形態において、抗体は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、および断片からなる群より選択される抗体結合断片である。特定の実施形態において、抗体分子は、２つの完全な重鎖、および２つの完全な軽鎖、またはそれらの抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗体は、アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭである。抗体がアイソタイプＩｇＧである実施形態において、抗体は、サブタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３であり得る。
【００２０】
特定の実施形態において、抗体は、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体（ハイブリドーマクローンＴ２．５，ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｂ．ｖ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＵＳＡ：カタログ番号１０５４由来のマウスＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体）またはそのヒト化型である。
【００２１】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、ＴＬＲ２タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸の発現を阻害する。特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ分子からなる群より選択される。
【００２２】
特定の実施形態において、１つより多いＴＬＲ２拮抗化合物は、細胞、組織または被験体に投与される。例えば、ＴＬＲ２特異的ＴＬＲ２拮抗抗体は、ＴＬＲ２の活性化を防止するために投与されてもよく、一方、阻害核酸もまた、ＴＬＲ２の発現を阻害するために投与されてもよい。
【００２３】
本発明のなおさらなる態様によれば、虚血再灌流障害またはそれによって引き起こされるか、もしくはそれと関連する状態の処置および／または予防のための方法であって、その方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２の機能を調節する治療有効量の薬剤を提供する工程、および
そのような処置を必要とする被験体に前記化合物を投与する工程を含む、方法が提供される。
【００２４】
本明細書中に定義する場合、用語「機能を調節する」とは、薬剤が、Ｔｏｌｌ様受容体２の１つ以上の生物学的機能活性を変化または修正することを意味する。特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能の調節は、薬剤が、ＴＬＲ２特異的リガンドの結合後、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能活性を阻害すること、および／またはＴＬＲ２リガンドなどによる活性化の後、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介される下流の細胞内シグナル伝達を阻害もしくは抑制することを意味する。ＴＬＲ２の機能の調節はさらに、Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質の発現の抑制または阻害、あるいはＴｏｌｌ様受容体２をコードする遺伝子の発現の阻害または遮断にまで及ぶことができ、従って、ＴＬＲ２機能を調節する薬剤はさらに、ＴＬＲ２タンパク質の発現を阻害し得るか、またはＴＬＲ２遺伝子産物の発現を遮断し得る。
【００２５】
本明細書中に定義する場合、ＴＬＲ２を調節する「薬剤」は、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化もしくは機能を抑制または遮断する化合物である。「薬剤」は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対するリガンドもしくは結合化合物の結合を阻害または遮断する拮抗化合物であり得る。例えば、「薬剤」は、Ｔｏｌｌ様受容体２の細胞外ドメインに結合するＴｏｌｌ様受容体２結合薬剤であってもよく、前記薬剤は、ＴＬＲ２に対する結合特異性を有する活性化リガンドの結合を阻害する。さらに、「薬剤」は、リガンド結合および／またはＴｏｌｌ様受容体２活性化の後、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介される細胞内シグナル伝達を阻害または抑制する化合物であってもよい。「薬剤」はさらに、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質をコードする遺伝子の発現を阻害することによって、Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質または遺伝子発現を調節する化合物であってもよい。このような化合物はまた、ＴＬＲ２調節薬剤としても公知であり得る。
【００２６】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２機能を調節する「薬剤」は、結合特異性を有するか、またはＴｏｌｌ様受容体２に特異的に結合する結合化合物であってもよい。特定の実施形態において、結合化合物は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、アプタマー、低分子化合物、および植物由来化合物もしくは模倣物などの天然化合物、それらの類似体または誘導体からなる群より選択されてもよい。
【００２７】
特定の実施形態において、薬剤は、既知のＴＬＲ２リガンド結合部位以外の結合部位でＴｏｌｌ様受容体２に結合する結合化合物であり、これにより、ＴＬＲ２に対する結合の際に、Ｔｏｌｌ様受容体２活性化および／またはＴＬＲ２拮抗リガンド結合の阻害を引き起こすＴｏｌｌ様受容体２の構造の変化が生じる。
【００２８】
用語「特異的に結合する」または「結合特異性」とは、非標的エピトープに結合するより大きい親和性でＴＬＲ２上に存在する標的エピトープに結合するＴＬＲ２調節薬剤またはＴＬＲ２結合化合物の能力をいう。特定の実施形態において、特異的結合とは、非標的エピトープに対する親和性より少なくとも１０、５０、１００、２５０、５００、または１０００倍高い親和性でＴＬＲ２に存在する特定の標的エピトープに対して結合することをいう。特定の実施形態において、結合親和性は、親和性ＥＬＩＳＡアッセイによって測定される。特定の実施形態において、親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定される。特定の実施形態において、結合親和性は、速度論的方法によって測定される。特定の実施形態において、親和性は、平衡／溶液方法によって測定される。
【００２９】
一実施形態によれば、ＴＬＲ２拮抗薬などのＴＬＲ２結合薬剤を含むＴＬＲ２調節因子は、高い親和性でＴＬＲ２に結合し、これは、例えば、少なくとも約１０７Ｍ−１、典型的に約１０８Ｍ−１、より典型的に約１０９Ｍ−１〜１０１０Ｍ−１またはそれ以上の親和定数を有する結合親和性として定義され、これは、ＴＬＲ２応答細胞および／または組織における１つ以上のＴＬＲ２生物学的活性を調節、例えば、減少および／または阻害する。
【００３０】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、虚血期間後に再灌流を受ける可能性のある細胞または組織で発現されたＴｏｌｌ様受容体２に標的化される。このような標的化は、局所的送達、送達ベクターの使用などの当業者に公知の任意の適切な手段、または標的化されるべき細胞もしくは組織で発現された細胞表面標的に対する結合特異性を有する抗体などの標的化手段によってであってもよい。本発明の方法および組成物を用いて、調節、例えば、阻害または減少され得る例示的なＴＬＲ２活性の例としては、限定されないが、以下：（ｉ）ＴＬＲ２発現を阻害または抑制すること、（ｉｉ）ＴＬＲ２リガンド結合および関連するＴＬＲ２活性化を阻害すること、ならびに（ｉｉｉ）ＴＬＲ２によって媒介される細胞内シグナル伝達を阻害または抑制すること、のうちの１つ以上が挙げられる。
【００３１】
従って、さらなる態様において、本発明は、ＴＬＲ２応答細胞および／または組織（例えば、虚血を受けた組織、虚血を受ける可能性のある組織、または再灌流を受ける可能性のある組織）における機能を調節する（例えば、ＴＬＲ２の１つ以上の生物学的活性を変える）方法を提供する。この方法は、ＴＬＲ２応答細胞および／またはＴＬＲ２応答組織を、ＴＬＲ２応答細胞または組織の機能、あるいはその細胞または組織におけるＴＬＲ２の生物学的活性を調節するのに十分な量で、ＴＬＲ２調節薬剤、例えば、ＴＬＲ２結合薬剤、例えば、ヒトＴＬＲ２活性または発現の拮抗薬と接触させる工程を含む。一実施形態において、接触させる工程は、生体外、例えば、細胞溶解物または再構成系中で達成され得る。あるいは、本発明の方法は、培養物中の細胞、例えば、生体外（ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏ）で実施され得る。例えば、精製細胞または組み換え細胞などの細胞は生体外で培養されてもよく、接触工程は、ＴＬＲ２調節因子を培地に加えることによって達成されてもよい。典型的に、ＴＬＲ２応答細胞はヒト細胞などの哺乳動物細胞である。一部の実施形態において、ＴＬＲ２応答組織は、虚血を受け、再灌流を受ける可能性のある組織、またはそれに関連する細胞集団である。他の実施形態において、この方法は、例えば、生体内プロトコルの一部として被験体、または動物被験体（例えば、ヒト被験体、または生体内動物モデルを含む）に存在する細胞で実施されてもよい。生体内プロトコルは、治療的または予防的であってもよく、炎症性モデルは、例えば、過剰発現したＴＬＲ２を有する動物モデルなどの遺伝子組み換えされたモデル、あるいはＴＬＲ受容体の変異体または欠失体であってもよい。生体内での方法に関して、単独または別の薬剤と組み合わせて、ＴＬＲ２調節因子は、被験体における１つ以上のＴＬＲ２媒介活性または機能を調節するのに十分な量で、関節リウマチなどの自己免疫疾患に罹患する被験体に投与されてもよい。一部の実施形態において、投与されるＴＬＲ２調節因子の量または投与量は、ＴＬＲ２の１つ以上の機能活性を変える、例えば、減少または阻害するのに必要とされるＴＬＲ２調節因子の量を生体外（ｉｎ−ｖｉｔｒｏまたはｅｘ−ｖｉｖｏ）で試験することによって投与前に決定されてもよく、前記機能活性は、典型的に、本明細書に記載される１つ以上のＴＬＲ２生物学的活性である。
【００３２】
１つ以上のＴＬＲ２生物学的活性を阻害、減少または低下させることが所望される特定の実施形態において、ＴＬＲ２応答細胞および／または組織は、例えば、ＴＬＲ２拮抗薬を被験体に投与することにより、ＴＬＲ２拮抗薬と接触される。一実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、ＴＬＲ２タンパク質の発現に関するＴＬＲ２ポリペプチドまたはｍＲＮＡと相互作用、例えば、結合し、１つ以上のＴＬＲ２活性を減少または阻害する。典型的に、拮抗されるＴＬＲ２は、哺乳動物ＴＬＲ２（またはその機能的変異体）、例えば、ヒトＴＬＲ２またはマウスＴＬＲ２である。特定の実施形態において、拮抗されるＴＬＲ２は、図１２（配列番号１）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＣ  ３４１３３（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に規定される７８４アミノ酸全長ヒトＴｏｌｌ様受容体配列を含む）に規定されるヒトＴＬＲ２配列、図１３（配列番号２）（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＮＰ＿０３６０３５（Ｍｕｓ  筋肉））に規定されるアミノ酸配列を含むマウスＴＬＲ２配列、またはそれらの一部、および／あるいはそれらと実質的に相同、特に少なくとも９０％の配列相同同一性、あるいはヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本明細書中に定義する場合、用語「Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化」とは、リガンドによるＴｏｌｌ様受容体２の結合を意味し、ここで、そのリガンドは、細胞内シグナル伝達カスケードを誘発するために、作動物質として作用し、Ｔｏｌｌ様受容体２を活性化させる。Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化およびシグナル伝達後に媒介される細胞内シグナル伝達は、炎症性免疫反応を媒介する転写因子および遺伝子の発現の活性化を生じる。
【００３４】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２とＴｏｌｌ様受容体２の作動物質リガンドとの間の相互作用を阻害する。
【００３５】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化および／またはシグナル伝達を抑制するＴＬＲ２調節薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２の拮抗薬として作用する化合物である。典型的に、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能の拮抗作用は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対するリガンド結合が阻止されるような方法において、Ｔｏｌｌ様受容体２に対するＴｏｌｌ様受容体２の調節因子の結合によって達成される。Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンド結合のこの阻害は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンド結合部位を部分的または完全に遮断すること、あるいは例えば、ＴＬＲ２リガンド結合を阻止するＴｏｌｌ様受容体２のリガンド結合部位の三次構造の構造変化に起因する、Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンド結合を阻止する方法で変化したＴｏｌｌ様受容体２のリガンド結合部位を生じるＴｏｌｌ様受容体２に結合もしくは会合する際の構造変化を誘導することによる多くの手段によって達成され得る。
【００３６】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２に存在する少なくとも１つのエピトープに結合し、ここで、このエピトープに対する結合は、ＴＬＲ２機能、最も典型的にはＴＬＲ２活性化またはＴＬＲ２によって媒介される下流シグナル伝達の阻害を生じる。本明細書中に定義する場合、「エピトープ」とは、リガンド、低分子、抗体などの結合化合物によって認識され、結合され得るＴＬＲ２タンパク質をコードする複数のアミノ酸残基をいう。エピトープは、一般に、化学的に活性な表面基から構成され、特異的な三次元構造特性、および特異的な電荷特性、エピトープの三次元構造に起因する前述のものを有する。
【００３７】
典型的に、ＴＬＲ調節薬剤はＴＬＲ２の機能活性に拮抗し、そのようにして、阻害エピトープまたは抑制エピトープとして公知のエピトープに結合する。「阻害」または「抑制」エピトープとは、低分子または抗体などの結合化合物によって結合した場合、例えば、ＴＬＲ２作動物質によってＴＬＲ２の結合を阻止する結合化合物に起因してＴＬＲ２の生物学的活性の損失を生じるＴＬＲ２に存在するエピトープを意味する。ＴＬＲ２に存在し、ＴＬＲ２機能に拮抗するために、結合化合物により結合されるエピトープは、５以上のアミノ酸残基を含み得る。
【００３８】
特定の実施形態において、本発明のＴＬＲ２調節薬剤は、連続エピトープを認識する。さらなる実施形態において、エピトープは、成熟Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）タンパク質のＮ末端（アミノ末端）およびＣ末端（カルボキシ末端）部分の両方由来の残基を含む不連続エピトープである。特定の実施形態において、エピトープは、配列番号３（図１４）に示されるＴｏｌｌ様受容体２の細胞外ドメインの５８６アミノ酸配列から決定されるため、残基１９〜３９を含み得る。そのようなエピトープはさらに、それを含むアミノ酸に関して規定されてもよく、該エピトープは、配列番号３に規定されるＴＬＲ２の細胞外ドメインの少なくともアミノ酸残基ＫＥＥＳＳＮＱＡＳＬＳＣＤＲＮＧＩＣＫＧＳ（配列番号４）を含む。さらに、結合エピトープは、配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端領域に存在するため、Ｔｏｌｌ様受容体２のアミノ酸残基５３８〜５４９をさらに含み得、この配列はアミノ酸ＣＳＣＥＦＬＳＦＴＱＥＱＱ（配列番号５）を含む。ＴＬＲ２調節薬剤結合部位は、配列番号１のアミノ酸残基１９〜３９、または５３８〜５４９によって、あるいは配列番号１のアミノ酸残基１９〜３９および５３８〜５４９によってさらに規定され得る。
【００３９】
Ｔｏｌｌ様受容体２の機能活性の減少、阻害または拮抗は、Ｔｏｌｌ様受容体２が別のＴｏｌｌ様受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体１、Ｔｏｌｌ様受容体６または別のＴｏｌｌ様受容体（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体４またはＴｏｌｌ様受容体１０））とヘテロ二量体を形成するか否かに関わらず、起こり得る。用語「Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化および下流を介するシグナル伝達」によってとは、ＴＬＲ２の活性化によって誘導されるいずれかの細胞内シグナル伝達経路を意味する。シグナル伝達経路は、ＴＬＲ２特異的経路であり得るか、または例えば、シグナル伝達経路が他の源によって、例えば、転写因子ＮＦ−κＢなどの免疫応答の媒介物の活性化に起因するＴＬＲ２以外の受容体の活性化によって、活性化され得る「共有」シグナル伝達経路であり得る。
【００４０】
ＴＬＲ２が、２つの機能的ヘテロ二量体に二量体化することは公知である。特に、ＴＬＲ２が、Ｔｏｌｌ様受容体１またはＴｏｌｌ様受容来６のいずれかとヘテロ二量体を形成することは公知である。さらなるヘテロ二量体が、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４、ＴＬＲ−４）およびＴｏｌｌ様受容体１０（ＴＬＲ１０、ＴＬＲ−１０）と形成することは可能である。この二量体化は、異なる微生物由来のリガンドによってＴＬＲ２の結合をもたらす識別と関連すると考えられる。加えて、ＴＬＲ２の細胞外ドメインは、循環系および哺乳動物の乳においてＣＤ１４と可溶性ヘテロ二量体を形成し得る。
【００４１】
本発明者らは、虚血後の再灌流の間、または後にＴＬＲ２媒介性炎症を抑制することにおける包括的な治療的アプローチを与えるために、ヘテロ二量体がＴＬＲ２と別のＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ１、ＴＬＲ６、ＴＬＲ４またはＴＬＲ１０）との間に形成されるか否かに関わらず、ＴＬＲ２に対する結合特異性を有する結合化合物を与えることが望ましいと認識している。これに関して、多数の実験後に、本発明者らは、結合する場合、ＴＬＲ２機能活性を抑制するＴＬＲ２タンパク質のＮ末端およびＣ末端の両方に存在するアミノ酸残基からなる立体構造の不連続エピトープを同定した。ＴＬＲ２拮抗結合化合物によるこのエピトープの結合は、ＴＬＲ２がＴＬＲ１、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６またはＴＬＲ１０とヘテロ二量体を形成するか否かに関わらず、ＴＬＲ２機能を抑制するのに役立つ。
【００４２】
従って、特定のさらなる実施形態において、本発明によって与えられるＴＬＲ２調節薬剤は、以下の特性のうちの少なくとも１つを有し得る：（ｉ）それはモノクローナル抗体である、（ｉｉ）それはヒト由来または生体外で産生された抗体である、（ｉｉｉ）それは配列番号４および／または配列番号５のアミノ酸を含むヒトまたはマウスＴＬＲ２の立体構造の不連続エピトープに結合し、ヘテロ二量体がＴＬＲ２と、ＴＬＲ１、ＴＬＲ６、ＴＬＲ４またはＴＬＲ１０との間に形成されるか否かに関わらず、ＴＬＲ２機能の抑制を媒介する、（ｉｖ）それは少なくとも１０−６Ｍの親和定数（Ｋａ）でＴＬＲ２の細胞外ドメインに存在するエピトープに結合する
【００４３】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能および／またはシグナル伝達および／または発現を抑制または阻害するＴＬＲ２調節因子は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、ポリヌクレオチド、多糖、オリゴペプチド、炭水化物、脂質、低分子化合物、および天然化合物からなる群のうちの少なくとも１つより選択される。
【００４４】
典型的に、ＴＬＲ２の機能を調節する薬剤はＴＬＲ２拮抗薬である。特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、および低分子化合物からなる群より選択される結合化合物である。
【００４５】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、抗体または抗体由来の結合断片である。特定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体または合成抗体からなる群より選択される。特定のさらなる実施形態において、抗体は、ヒトＴＬＲ２に対するヒト、ヒト化、ラクダ、生体外で産生した抗体からなる群より選択される。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥからなる群より選択されるアイソタイプであってもよい。抗体は、約１０−７Ｍ〜約１０−１１Ｍの解離定数（Ｋｄ）でＴＬＲ２に存在する阻害エピトープに結合し得る。
【００４６】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、組み換えＴｏｌｌ様受容体２の可溶性形態である。特に、ＴＬＲ２の可溶性形態は、二次タンパク質に結合したＴＬＲ２タンパク質上の細胞外ドメインを実質的に含む融合タンパク質である。特定の実施形態において、二次タンパク質は、抗体、またはその断片のＦｃドメインであり得る。
【００４７】
特定のさらなる実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２タンパク質の発現を阻害する阻害核酸である。特定の実施形態において、阻害核酸タンパク質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択される。
【００４８】
特定の実施形態において、本発明の方法は、心筋のＴＬＲ２発現細胞または組織における１つ以上のＴＬＲ２の生物学的活性を減少または阻害するために、治療有効量のＴＬＲ２調節薬剤を、そのような処置を必要とする被験体に投与するために使用されて、それにより、その状態を処置する。
【００４９】
特定の実施形態において、本発明の方法は、被験体における低酸素症、脳卒中、心臓発作、慢性腎不全または臓器移植からなる群より選択される少なくとも１つの状態に起因し得る虚血再灌流障害の処置または予防のために使用され得る。
【００５０】
特定の実施形態において、この方法は、虚血／再灌流障害または関連状態の処置または予防に使用するための少なくとも１つの二次治療化合物の治療有効量を投与するさらなる工程を含み得る。典型的に、前記二次治療化合物は、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、代謝拮抗物質、抗ＣＤ２抗体または関連結合断片、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムスまたはＦＴＹ７２０からなる群より選択され得る。
【００５１】
特定のさらなる実施形態において、前記二次治療化合物は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、血管拡張剤、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、β遮断薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、カルシウムチャンネル遮断薬、抗凝固剤、チクロピジンまたは硫酸クロピドグレルなどのアデノシン二リン酸受容体拮抗薬、ビバリルジン、アルガトロバンまたはヘパリンなどの糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ拮抗薬、βアドレナリン受容体作動薬、抗血栓溶解剤、抗酸化剤、およびα遮断薬からなる群より選択され得る。
【００５２】
特定の実施形態において、二次治療薬剤は、少なくとも１つのＴＬＲ２調節薬剤と同時に、連続して、または別に投与され得る。
【００５３】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節化合物は、被験体が、血管形成、心臓バイパス手術、血栓溶解、動脈内膜切除、臓器移植、および冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）からなる群より選択される外科手術を受ける前、間、または後に被験体に投与される。特定の実施形態において、この方法は、細胞または組織において生じる虚血性イベント発生の前、間、または後に被験体で実施される。特定の実施形態において、この方法は、再灌流の発生の間、または後に被験体で実施される。特定の実施形態において、この方法は、虚血性イベント後に臨床的に決定される緊急の猶予時間の間、被験体で実施される。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明のこの態様の方法は虚血再灌流障害を予防し、従って、再灌流の後または間の臓器障害を阻害する。特定のさらなる実施形態において、本発明のこの態様の方法は、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２、ＴＬＲ−２、ＣＤ２８２）を介するシグナル伝達によって媒介され、細胞、組織または臓器の虚血後の再灌流の間または後に、細胞、組織または臓器障害の原因となる炎症性免疫反応の抑制または阻害により、虚血再灌流障害を予防する。
【００５５】
本発明のなおさらなる態様によれば、虚血再灌流障害またはそれに関する状態の処置および予防に使用するための医薬組成物が提供され、その医薬組成物は、少なくとも１つの薬理学的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤と共にＴｏｌｌ様受容体２の機能または発現を調節する薬剤を含む。
【００５６】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または抗体断片、アプタマー、融合タンパク質およびペプチド模倣物からなる群より選択されるＴＬＲ２拮抗薬である化合物である。
【００５７】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２受容体の可溶性形態である。ＴＬＲ２の前記可溶性形態は組み換え体であり得る。
【００５８】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２の発現を阻害する阻害核酸ベースの化合物である。
【００５９】
特定の実施形態において、医薬組成物は、限定されないが、グルココルチコイド、特にサイトカインの発現を抑制するグルココルチコイド；アルキル化剤などの細胞増殖抑制剤、メトトレキサートなどの代謝拮抗物質；ＯＫＴ−３、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））またはアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））などの抗ＣＤ３抗体などの抗体または関連結合断片；シクロスポリン、タクロリムスまたはシロリムスなどのイムノフィリンで作用する薬剤化合物；あるいはＦＴＹ７２０またはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、血管拡張剤、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、β遮断薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、カルシウムチャンネル遮断薬、抗凝固剤、チクロピジンもしくは硫酸クロピドグレルなどのアデノシン二リン酸受容体拮抗薬、ビバリルジン、アルガトロバンもしくはヘパリンなどの糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬、βアドレナリン受容体作動薬、抗血栓溶解剤、抗酸化剤、およびα遮断薬のうちの少なくとも１つ以上を含む治療的心臓血管化合物などの低分子からなる群より選択されるうちの少なくとも１つであり得る、限定されないが、免疫抑制剤などの二次治療薬剤をさらに含み得る。
【００６０】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２調節薬剤は、１日あたり被験体の体重の約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で被験体に経口投与される。特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２調節薬剤の用量は、１日あたり約１００ｍｇ〜１日あたり約１０００ｍｇである。特定のさらなる実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の調節薬剤の用量は、１日あたり約２００ｍｇ〜１日あたり約３００ｍｇである。
【００６１】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の調節薬剤は、哺乳動物の体重の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲で、非経口で被験体に投与される。
【００６２】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の調節薬剤は、Ｔｏｌｌ様受容体２のレベルおよび／または活性を下方制御するのに十分な期間かつ条件下で、被験体に投与される。
【００６３】
本発明のなおさらなる態様は、心臓病またはそれに関連する状態を処置または予防するための方法を提供し、その方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２の機能を調節する治療有効量の薬剤を提供する工程、および
前記化合物を、そのような処置を必要とする被験体に投与する工程、を含む。
【００６４】
特定の実施形態において、心臓炎症状態は、限定されないが、心筋虚血、虚血性心疾患、高血圧心筋虚血、鬱血性心不全、組織虚血、臓器虚血、急性冠症候群、肥大、脳梗塞、心筋梗塞、不整脈、虚血再灌流障害（Ｉ／Ｒ）からなる群より選択される。
【００６５】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２の機能を調節する薬剤はＴＬＲ２拮抗薬である。特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、脂質、および低分子化合物からなる群より選択される結合化合物である。
【００６６】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または抗体断片、アプタマー、融合タンパク質およびペプチド模倣物からなる群より選択されるＴＬＲ２拮抗薬である化合物である。
【００６７】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２受容体の可溶性形態である。ＴＬＲ２の前記可溶性形態は、組み換え技術によって産生され得る。
【００６８】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２調節薬剤は、ＴＬＲ２の発現を阻害する阻害核酸ベースの化合物である。特定の実施形態において、この阻害核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋分子、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｈＲＮＡからなる群より選択され得る。
【００６９】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２拮抗薬は、抗体またはその抗体由来の結合断片である。その抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または合成抗体からなる群より選択され得る。
【００７０】
特定の実施形態において、この方法は、本明細書に記載される二次治療化合物を投与する工程をさらに含み得る。
【００７１】
従って、本発明のさらなる態様は、再灌流から生じる組織または臓器障害を予防する方法を提供し、その方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質の発現を遮断する、治療有効量の阻害核酸を提供する工程、および
そのような処置を必要とする被験体に前記阻害核酸を投与する工程、を含む。
【００７２】
特定の実施形態において、阻害核酸としては、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡが挙げられ得る。
【００７３】
特定の実施形態において、再灌流は、前記臓器または組織の虚血の期間後に生じる。
【００７４】
本明細書に定義する場合、Ｔｏｌｌ様受容体２の遺伝子発現に関連して使用される場合、用語「遮断する」および「遮断している」とは、Ｔｏｌｌ様受容体２タンパク質の発現を生じる少なくとも１つの遺伝子の発現のサイレンシングを意味する。
【００７５】
遺伝子サイレンシングは、遺伝子組み換え以外の機構によって遺伝子の発現を停止させる。遺伝子サイレンシングは、転写レベルまたは転写後レベルで媒介され得る。転写遺伝子サイレンシングは、転写装置に隔絶される遺伝子を生じ得、例えば、ヒストン修飾によって媒介され得る。転写後遺伝子サイレンシングは、破壊される遺伝子のｍＲＮＡに起因し、従って、ＴＬＲ２タンパク質が存在する場合、タンパク質などの活性遺伝子産物を防止する。
【００７６】
従って、一実施形態において、本発明のこの態様は、ＴＬＲ２タンパク質の発現を遮断するために、例えば、干渉リボ核酸（例えば、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）などのＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）剤またはその転写鋳型（例えば、被験体に存在する少なくとも１つの細胞型、組織または臓器に対してｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡ）などの有効量の阻害核酸分子の被験体への投与を提供する。
【００７７】
特定のさらなる実施形態において、阻害核酸分子は、アンチセンスＲＮＡ分子であり得る。アンチセンスは遺伝子発現の抑制を引き起こし、ｍＲＮＡに物理的に結合する一本鎖ＲＮＡ断片を含み、これにより、ｍＲＮＡの転写を遮断する。阻害核酸を使用するための適切な核酸の調製のための技術は、当業者に周知である。
【００７８】
本発明のさらなる態様によれば、再灌流に起因する細胞、組織または臓器障害の処置のための医薬の調製におけるＴｏｌｌ様受容体２タンパク質の発現を遮断する阻害核酸の使用が提供される。
【００７９】
本発明のなおさらなる態様は、再灌流に起因する細胞、組織または臓器障害を処置するためのＴｏｌｌ様受容体２の発現を遮断する際に使用するための阻害核酸を提供する。
【００８０】
特定の実施形態において、再灌流は、虚血の期間の後に生じる。
【００８１】
特定の実施形態において、阻害核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡからなる群より選択される。
【００８２】
本発明のなおさらなる態様によれば、虚血／再灌流障害によって引き起こされる細胞、組織または臓器障害を処置するための医薬組成物が提供され、この組成物は、少なくとも１つの薬理学的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤と共に、Ｔｏｌｌ様受容体２の発現を遮断する治療有効量の阻害核酸を含む。
【００８３】
特定の実施形態において、この阻害核酸は、限定されないが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡからなる群より選択される。
【００８４】
特定の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの免疫抑制因子化合物をさらに含み得る。特定の実施形態において、免疫抑制因子（免疫抑制剤としても公知である）は、限定されないが、グルココルチコイド、特にサイトカインの発現を抑制するグルココルチコイド；アルキル化剤などの細胞増殖抑制剤、メトトレキサートなどの代謝拮抗物質；ＯＫＴ−３、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））またはアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））などの抗ＣＤ３抗体などの抗体または関連結合断片；シクロスポリン、タクロリムスまたはシロリムスなどのイムノフィリンで作用する薬剤化合物；あるいはＦＴＹ７２０などの低分子からなる群のうちの少なくとも１つであり得る。
【００８５】
Ｔｏｌｌ様受容体２の発現を遮断する核酸を阻害する場合に使用するための適切な核酸の調製のための技術は、当業者に周知である。
【００８６】
特定の実施形態において、この阻害核酸は、被験体が、限定されないが、血管形成、心臓バイパス手術、血栓溶解、臓器移植、動脈内膜切除、および冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）からなる群より選択される外科手術を受ける前、間、または後に被験体に投与される。
【００８７】
特定のさらなる実施形態において、阻害核酸は、虚血性イベントの前、間、または後に被験体に投与される。特定の実施形態において、阻害核酸は、再灌流の間、または後に被験体に投与される。特定の実施形態において、阻害核酸は、虚血性イベント後の緊急の猶予の間、被験体に投与される。
【００８８】
特定の実施形態において、阻害核酸は、被験体が、細胞、組織または少なくとも１つの臓器の移植であるか、またはそれらに関連する外科手術を受ける前、間、または後に被験体に投与される。典型的に、前記方法は、組織障害、特に再灌流に起因する細胞または組織障害を引き起こすＴＬＲ２媒介性免疫応答を予防または制限するために実施される。
【００８９】
さらなる態様において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能活性の遮断または抑制を引き起こす、Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有する少なくとも１つのアプタマーの提供にまで及ぶ。例えば、ＳＥＬＥＸ技術を用いる、適切なアプタマーを選択するための技術は当業者に周知である。
【００９０】
従って、種々のさらなる実施形態において、本発明は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有する核酸リガンドを同定および単離する方法にまで及び、この方法は、
（ａ）核酸の候補混合物を提供する工程、
（ｂ）Ｔｏｌｌ様受容体２を発現する細胞を前記候補核酸混合物と接触させる工程、
（ｃ）他の候補核酸に比べてＴｏｌｌ様受容体２に対する高い親和性を有する核酸を選択する工程、
（ｄ）Ｔｏｌｌ様受容体２に対する親和性を有する少なくとも１つの核酸を提供するために、前記選択された核酸を増幅させる工程、および
（ｅ）Ｔｏｌｌ様受容体２に対する高い親和性および特異性を有する核酸から少なくとも１つの核酸を選択する工程、を含む。
【００９１】
本発明者らはさらに、Ｔｏｌｌ様受容体２の機能の抑制が、膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２を活性化するのに利用可能なリガンドの量を減少させることによって達成され得ることを確認した。膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２に結合するのに利用可能なリガンドの量の減少は、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介されるシグナル伝達の下方制御を生じ、それによって、炎症性免疫応答のＴＬＲ２によって媒介される活性化の下方制御を生じる。特に、本発明者らは、炎症性応答のＴｏｌｌ様受容体２によって媒介される活性化を抑制する際にＴｏｌｌ様受容体２の可溶性形態またはその機能的断片のいずれかである可溶性ペプチドの有用性を確認した。前記抑制は、ＴＬＲ２特異的結合リガンドについてＴＬＲ２の膜結合形態と競合するＴｏｌｌ様受容体２の可溶性形態またはＴｏｌｌ様受容体２の切断非膜形態に起因する。この競合的結合は、Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンドに利用可能なＴＬＲ２の効果的な「仕上げ（ｍｏｐｐｉｎｇ  ｕｐ）」の可溶性形態または切断形態を生じる。膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２の結合および活性化の関連する減少は、Ｔｏｌｌ様受容体２によって媒介される炎症性免疫応答の下方制御を生じる。
【００９２】
従って、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態の投与は、虚血再灌流の間および後に組織損傷の原因となる炎症性免疫応答を抑制するための方法において有用性を有する。
【００９３】
従って、本発明のさらなる態様は、細胞、組織、または臓器の虚血再灌流障害を処置および／または予防する方法を提供し、この方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンドに結合できるＴｏｌｌ様受容体２の可溶性形態またはその可溶性断片の治療有効量を提供する工程、および
治療有効量の前記化合物をそのような処置を必要とする被験体に投与する工程、を含む。
【００９４】
ヒトＴｏｌｌ様受容体２の細胞外ドメイン（外部ドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ））のアミノ酸配列は、配列番号３（図１４）として本明細書に提供される。Ｔｏｌｌ様受容体２のヒト形態の細胞外ドメインは、５８７アミノ酸残基、特にＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＣ  ３４１３３（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に規定されるように、規定７８４アミノ酸の完全長ヒトＴｏｌｌ様受容体配列のアミノ酸１〜５８７を含む。本明細書に定義する場合、ＴＬＲ２の外部ドメインは、細胞外スペースにわたるＴＬＲ２の膜結合形態の一部である。
【００９５】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２の可溶性形態は、組み換え技術によって調製される。Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態は、典型的に、ＴＬＲ２の細胞外ドメインのみを含み、従って、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＣ  ３４１３３に規定されるＴｏｌｌ様受容体２の細胞内および膜貫通ドメインは存在しない。特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態は、規定されるヒトＴｏｌｌ様受容体２の配列のアミノ酸１〜５８７を含み得る。可溶性Ｔｏｌｌ様受容体２の配列は、１以上のアミノ酸残基の付加、欠失または置換によって修飾され得る。従って、特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態は、配列番号３において本明細書に規定されるＴｏｌｌ様受容体２の決定された膜結合形態の細胞外ドメイン由来である。さらなる実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態は、配列番号３（図１４）において本明細書に規定されるＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列に結合した完全長の膜の切断形態由来であり、前記切断形態は、（ｉ）可溶性であり、（ｉｉ）Ｔｏｌｌ様受容体２の膜結合形態に存在する少なくとも１つのエピトープに対する結合特異性を有するリガンドによって結合できる機能特性を示す。
【００９６】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２の膜結合形態から規定される細胞内および／または膜貫通ドメインに関連するアミノ酸残基の欠失および／または置換に加えて、欠失および／または置換によってさらに、細胞外ドメインのアミノ酸残基が作製され得る。ＴＬＲ２の細胞外ドメインのアミノ酸残基の任意のこのような欠失および／または置換は、ＴＬＲ２の修飾形態が、ＴＬＲ２の膜結合形態に存在する少なくとも１つのエピトープに結合できるリガンドに結合できる限りなされ得る。
【００９７】
特定の実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２の可溶性形態（ｓＴＬＲ２）は、虚血後、再灌流を受けた、または虚血後、再灌流を受けている臓器、組織または細胞に標的化され得るか、あるいは虚血を受け、やがて再灌流を受ける可能性のある少なくとも１つの特異的細胞型に標的化され得る。ｓＴＬＲ２の全身投与は、ＴＬＲ２受容体の全体的な免疫抑制、それによって、一部の場合において望まれない場合があるＴＬＲ２によって媒介されるシグナル伝達の抑制を生じ得るため、このようなｓＴＬＲ２の標的化は有用である。
【００９８】
ｓＴＬＲ２の可溶性形態の標的化は、融合タンパク質の形成によって提供され得、前記融合タンパク質は、ＴＬＲ２受容体の可溶性部分からなり、典型的に、細胞外ドメインまたはその一部は、二次ペプチドに結合され、典型的に、Ｆｃ受容体結合タンパク質は、免疫グロブリン、典型的に、ヒト免疫グロブリンの重鎖由来である。Ｆｃドメインは、治療タンパク質の循環半減期を延長するために広範に使用されている。
【００９９】
特定の実施形態において、ｓＴＬＲ２の可溶性形態は、限定されないが、血管形成、心臓バイパス手術、血栓溶解、臓器移植、動脈内膜切除、および冠動脈バイパス術（ＣＡＢＧ）からなる群より選択される外科手術を被験体が受ける前、間、または後に投与され得る。
【０１００】
特定のさらなる実施形態において、ｓＴＬＲ２の可溶性形態は、虚血性イベントの前、間、または後に被験体に投与され得る。特定の実施形態において、ｓＴＬＲ２の可溶性形態は、再灌流の発生の間、または後に被験体に投与され得る。特定の実施形態において、ｓＴＬＲ２の可溶性形態は、虚血性イベント後の緊急の猶予の間に被験体に投与され得る。
【０１０１】
特定の実施形態において、ｓＴＬＲ２の可溶性形態は、細胞、組織または少なくとも１つの臓器の移植であるか、またはそれらに関連する外科手術を被験体が受ける前、間、または後に被験体に投与され得る。典型的に、前記方法は、組織障害を引き起こすＴＬＲ２によって媒介される免疫応答を予防または制限するために実施される。
【０１０２】
本発明のなおさらなる態様は、前記調製物の投与についての指示書とともに、Ｔｏｌｌ様受容体２の膜結合形態によって媒介される機能、発現またはシグナル伝達を抑制する薬剤を含む医薬調製物を含むキットを提供する。
【０１０３】
特定の実施形態において、この指示書は、調製物が、限定されないが、バイパス術、血栓溶解、動脈内膜切除および血管形成からなる群より選択される外科手術の前、間、または後に被験体に投与されるべきであることを明示し得る。
【０１０４】
本発明はさらに、再灌流の間または後に、細胞、組織または臓器に対して再灌流障害を予防できる化合物を同定するのに使用するためのスクリーニングアッセイにまで及び、前記再灌流障害は、ＴＬＲ２の活性化またはＴｏｌｌ様受容体２の機能を抑制することによってＴＬＲ２経路を介するシグナル伝達により媒介される。
【０１０５】
本発明のなおさらなる態様は、再灌流の間または後に発生するＴｏｌｌ様受容体２によって媒介される炎症および関連細胞、組織または臓器障害を抑制する化合物を同定するためのスクリーニング法を提供し、この方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２に結合特異性を有するリガンドと共に膜結合Ｔｏｌｌ様受容体２の受容体を提供する工程、
候補化合物をＴｏｌｌ様受容体２と接触させる工程、
Ｔｏｌｌ様受容体２をＴｏｌｌ様受容体２のリガンドに曝露する工程、
Ｔｏｌｌ様受容体２に対するＴｏｌｌ様受容体２のリガンドの結合を測定する工程、を含み、Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンドによるＴｏｌｌ様受容体２の結合の阻害は、前記候補化合物がＴｏｌｌ様受容体２の活性化およびシグナル伝達の調節因子であることを示す。
【０１０６】
特定の実施形態において、再灌流の間または後に発生するＴｏｌｌ様受容体２によって媒介される炎症および関連細胞、組織または臓器障害を抑制する化合物は、ＴＬＲ２作動物質である。
【０１０７】
本発明のさらなる態様は、再灌流障害を予防または処置するためにＴＬＲ２によって媒介される炎症応答を抑制するのに使用するための本発明の上述の態様に従って同定された調節薬剤を提供する。
【０１０８】
本明細書に定義する場合、再灌流障害とは、血液供給が虚血の期間の後に組織に戻る場合に引き起こされる組織に対する障害をいう。再灌流障害は脳の虚血性カスケードと関連があると考えられ、これは脳卒中および脳損傷に関与し、従って、再灌流障害を予防する際に、本発明のＴＬＲ２調節薬剤は、脳卒中および／または脳損傷を予防するのにも役立ち得る。
【０１０９】
本発明者らはさらに、受容者における移植されたドナー細胞、または組織の免疫学的拒絶を予防することによって、被験体への細胞、組織または臓器の移植を改善するのに使用するための本発明の方法およびＴＬＲ２調節薬剤の有用性を認めた。
【０１１０】
一般に、移植手術の間、ドナー臓器、組織、または細胞塊は、血液供給の不足に起因する長期の虚血に供され、それにより、ドナー臓器、組織または細胞塊の酸素レベルは枯渇する。再灌流障害に対する主用な要因と考えられる免疫応答はさらに、移植手術後、宿主によって起こされる移植片拒絶を生じる全身的免疫応答の原因となる。
【０１１１】
従って、本発明のなおさらなる態様は、受容者によって移植された組織、臓器または細胞塊の拒絶の原因となり得る異常な免疫応答を抑制するための方法を提供し、この方法は、
Ｔｏｌｌ様受容体２の活性化および／またはシグナル伝達を調節する治療有効量の薬剤を提供する工程、および
治療有効量の前記化合物をそのような処置を必要とする被験体に投与する工程、を含む。
【０１１２】
本発明のなおさらなる態様は、移植外科手術後、受容者によって受容されるドナー組織の拒絶を引き起こす異常な免疫応答を予防するのに使用するための医薬の調製においてＴｏｌｌ様受容体２の機能を抑制する薬剤の使用を提供する。
【０１１３】
本発明者らはさらに、虚血再灌流障害に付随するか、または関連する心臓病を処置するための本発明の方法および化合物の有用性を確認した。
【０１１４】
従って、本発明のさらなる態様は、心臓病またはそれに関連する病状を処置または予防するための方法を提供し、この方法は、
治療有効量のＴｏｌｌ様受容体２の抑制薬剤を提供する工程、および
前記処置を必要とする被験体に前記抑制薬剤を投与する工程、を含む。
【０１１５】
特定の実施形態において、心臓の炎症状態は、心筋虚血、虚血性心疾患、高血圧心筋虚血、鬱血性心不全、組織虚血、臓器虚血、急性冠症候群、肥大、脳梗塞、心筋梗塞、不整脈、虚血再灌流障害（Ｉ／Ｒ）からなる群より選択される少なくとも１つの状態であり得る。
【０１１６】
本発明のさらなる態様によれば、心臓病またはそれに関連する疾患もしくは炎症状態を処置するための医薬組成物が提供され、この組成物は、少なくとも１つの薬理学的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／または補助剤と共に、Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有し、その機能を阻害する結合化合物を含む。
【０１１７】
特定の実施形態において、心臓病またはそれに関連する疾患状態は、心筋虚血、虚血性心疾患、高血圧心筋虚血、鬱血性心不全、組織虚血、臓器虚血、急性冠症候群、肥大、脳梗塞、心筋梗塞、不整脈、虚血再灌流障害（Ｉ／Ｒ）、アテローム性動脈硬化症、同種移植片血管障害、高血圧、鬱血性心不全からなる群より選択される少なくとも１つの状態であり得る。
【０１１８】
特定の実施形態において、医薬組成物はさらに、限定されないが、グルココルチコイド、特にサイトカインの発現を抑制するグルココルチコイド；アルキル化剤などの細胞増殖抑制剤、メトトレキサートなどの代謝拮抗物質；ＯＫＴ−３、抗ＣＤ２０抗体、抗ＴＮＦ−α抗体インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ）またはアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）などの抗ＣＤ３抗体などの抗体または関連結合断片；シクロスポリン、タクロリムスまたはシロリムスなどのイムノフィリンで作用する薬剤化合物；あるいはＦＴＹ７２０などの低分子化合物あるいはＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、血管拡張剤、利尿薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、β遮断薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、カルシウムチャンネル遮断薬、抗凝固剤、チクロピジンもしくは硫酸クロピドグレルなどのアデノシン二リン酸受容体拮抗薬、ビバリルジン、アルガトロバンもしくはヘパリンなどの糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬、βアドレナリン受容体作動薬、抗血栓溶解剤、抗酸化剤、およびα遮断薬のうちの少なくとも１つを含む治療的心臓血管化合物からなる群のうちの少なくとも１つであり得る、限定されないが、免疫抑制剤などの二次治療薬剤を含み得る。
【０１１９】
本発明のなおさらなる態様は、Ｔｏｌｌ様受容体２に対する結合特異性を有し、心臓病に関連する炎症を処置するための医薬の調製においてＴｏｌｌ様受容体２の機能を抑制するために機能する結合薬剤の使用を提供する。
【０１２０】
本発明は、ここで、例示の目的のために提供され、本発明を限定すると解釈することを意図しない以下の実施例を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】陽性対照としてのｐ３８阻害剤（ＳＢ２３９０６３）の投与後の心臓の断面を示す。
【図２】ＰＢＳの投与後の心臓の断面を示す。
【図３】陰性対照としてのＩｇＧアイソタイプの抗体の投与後の心臓の断面を示す。
【図４】実験的な抗ＴＬＲ２拮抗モノクローナル抗体ＯＰＮ−３０１の投与後の心臓の断面を示す。
【図５】全左心室（ＬＶ）のパーセントとしてのリスク領域（ＡＡＲ）のグラフを示す。
【図６】リスク領域（ＡＡＲ）のパーセントとしての梗塞面積を示す。
【図７】全左心室（ＬＶ）のパーセントとしての梗塞面積を示す。
【図８】全左心室（ＬＶ）のパーセントとしての梗塞面積を示す。
【図９】リスク領域（ＡＡＲ）のパーセントとしての梗塞面積を示す。
【図１０】左心室のパーセントとしてのリスク領域（Ａａｒ）を示す。
【図１１】リスク領域のパーセントとしての梗塞面積を示す。
【図１２】ヒトＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図１３】ヒトＴｏｌｌ様受容体２のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図１４】ヒトＴｏｌｌ様受容体２の細胞外ドメイン（配列番号３）を示す。
【図１５】陽性対照としてのｐ３８阻害剤（ＳＢ２３９０６３）の投与後の心臓の第２の断面を示す。
【図１６】ＰＢＳの投与後の心臓の第２の断面を示す。
【図１７】陰性対照としてのＩｇＧアイソタイプの抗体の投与後の心臓の第２の断面を示す。
【図１８】実験的な抗ＴＬＲ２拮抗モノクローナル抗体ＯＰＮ−３０１の投与後の心臓の第２の断面を示す。
【図１９】全左心室（ＬＶ）のパーセントとしてのリスク領域（ＡＡＲ）の第２のグラフを示す。
【図２０】リスク領域（ＡＡＲ）のパーセントとしての梗塞面積の第２のグラフを示す。
【図２１】全左心室（ＬＶ）のパーセントとしてのさらなる梗塞面積を示す。
【図２２】全左心室（ＬＶ）のパーセントとしての梗塞面積を示す。
【図２３】図２３Ａは、３０分の虚血に続いて２４時間の再灌流後の血液ＫＯおよび臓器ＫＯのキメラマウス由来の心臓部分におけるマクロファージの数のグラフを示す。心臓部分からの代表的な画像は、マクロファージについて（赤色細胞を青色の核で）染色した。細胞密度の差は染色した膜であった。図２３Ｂは、マクロファージについて染色した心臓部分からの代表的な画像、マクロファージについて（赤色細胞を青色の核で）染色した心臓部分からの代表的な画像を示す。細胞密度の差は染色した膜であった。
【図２４】心臓機能および形状およびベースライン（ｔ＝０）および梗塞後（ｔ＝２８）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
本発明は、ＴＬＲ２の生物学的機能を阻害するか、または虚血後の再灌流に起因する組織または臓器障害を予防するのに使用するためのＴＬＲ２の発現を遮断するＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）に特異的である調節薬剤に関する。
【０１２３】
本明細書に定義する場合、Ｔｏｌｌ様受容体２は、ＴＬＲ２、ＴＬＲ−２またはＣＤ２８２ともいわれ得る。典型的に、Ｔｏｌｌ様受容体２は、ヒトＴｏｌｌ様受容体２である。あるいは、Ｔｏｌｌ様受容体２は、マウスＴｏｌｌ様受容体２である。さらなる実施形態において、Ｔｏｌｌ様受容体２は、ヒトまたはマウス以外の任意の哺乳動物、例えば、ウシまたはラット由来のヒトＴＬＲ２のホモログまたはオルソログである。特定のさらなる実施形態において、ＴＬＲ２機能を抑制する化合物は、異なる種由来のＴｏｌｌ様受容体２においてＴｏｌｌ様受容体２の機能の抑制を媒介するという点で交差反応性である。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、用語「エピトープ」とは、特異的結合リガンドによって結合され得る高分子の一部、この場合においてポリペプチド、特にＴｏｌｌ様受容体２の一部に関する。エピトープは、ポリペプチド配列内に含まれるアミノ酸残基の隣接配列または非隣接配列から規定され得る。用語「隣接エピトープ（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、エピトープを規定するポリペプチド内の直線状の一連のアミノ酸残基からなるエピトープを規定する。「非隣接エピトープ（ｎｏｎ−ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、配列が非直線状である一連のアミノ酸残基からなるエピトープであり、それによって、その残基はポリペプチド配列の長さに沿って不連続様式で間隔があいているか、または集合している。不連続（ｎｏｎ−ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ）エピトープは、アミノ酸残基が２つの直線状配列に集合する不連続エピトープであり得るか、または不連続エピトープは、エピトープの一因となる残基が、ポリペプチドの長さに沿って配列された直線状アミノ酸配列の３以上の集団で与えられる不連続散在性エピトープであり得る。
【０１２５】
（抗体）
「抗体」は、天然または部分的もしくは完全に合成的に産生される免疫グロブリンである。この用語はまた、結合ドメイン、つまり抗体結合ドメイン、またはそれに相同的である結合ドメインを有する任意のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを含む。これらは天然源由来であってもよいか、またはそれらは部分的もしくは完全に合成的に産生されてもよい。抗体の例は、免疫グロブリンアイソタイプおよびそれらの同形のサブクラスならびにＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄ、および二重特異性抗体などの抗原結合ドメインを含む断片である。
【０１２６】
特定の実施形態において、その抗体は、ラクダ抗体、特にラクダ重鎖抗体であり得る。さらに、その抗体断片は、ラクダ重鎖抗体由来のドメイン抗体またはナノボディであり得る。特定の実施形態において、その抗体は、サメ抗体またはサメ由来の抗体であり得る。
【０１２７】
特定の実施形態において、その抗体は「単離抗体」である。これは抗体が、（１）通常見出される少なくとも一部のタンパク質を含まず、（２）同じ源、例えば、同じ種由来の他のタンパク質を実質的に含まず、（３）異なる種由来の細胞によって発現されるか、または（４）天然に発生しないことを意味する。
【０１２８】
抗体は多くの方法で修飾され得るため、用語「抗体」は、必要とされる特異性で結合ドメインを有する任意の結合メンバーまたは物質を含むと解釈されるべきである。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、またはその断片、誘導体、機能的等価物もしくは相同体であり得る。この用語は、天然または完全もしくは部分的に合成であろうとなかろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む。従って、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメイン、または等価物を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、欧州特許出願公開ＥＰ０，１２０，６９４号および欧州特許出願公開ＥＰ０，１２５，０２３号に記載される。
【０１２９】
抗体の定常領域は任意の適切な免疫グロブリンサブタイプであり得るが、抗体サブタイプがＩｇＧ１であることが好ましい。しかしながら、代替の実施形態において、抗体のサブタイプは、ヒト免疫グロブリン分子が使用されるクラスＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥであり得る。そのような抗体はさらに、任意のサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に属し得る。
【０１３０】
全抗体の断片は抗原結合の機能を実施し得る。そのような結合断片の例は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１抗体ドメインからなるＦａｂ断片；単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結したＦａｂ断片を含む二価断片；一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここで、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインを結合させて抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって連結される；または遺伝子融合によって構築される多価もしくは多特異的断片であり得る二重特異性抗体である。
【０１３１】
本発明において使用するための抗体またはポリペプチドの断片は、例えば、ＴＬＲ２特異的抗体の断片であり、一般に、少なくとも５〜７の隣接アミノ酸、しばしば少なくとも約７〜９の隣接アミノ酸、典型的に少なくとも約９〜１３の隣接アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０〜３０またはそれ以上の隣接アミノ酸、および最も好ましくは少なくとも約３０〜４０またはそれ以上の連続アミノ酸のアミノ酸残基の伸長を意味する。
【０１３２】
このような抗体またはポリペプチド、あるいはＴＬＲ２特異的抗体の断片の「誘導体」とは、タンパク質のアミノ酸配列を変化させること、例えば、タンパク質をコードする核酸の操作によって、あるいはタンパク質それ自体を変化させることによって修飾された抗体またはポリペプチドを意味する。天然アミノ酸配列のこのような誘導体は、１つ以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を含み得るが、好ましくは、ＴＬＲ２結合活性を有するペプチドを与える。好ましくは、このような誘導体は、２５以下のアミノ酸、より好ましくは１５以下、さらにより好ましくは１０以下、なおより好ましくは４以下、最も好ましくは１または２のアミノ酸のみの挿入、付加、欠失および／または置換を含む。
【０１３３】
特定の実施形態において、ヒト化抗体もまた提供される。ヒト化抗体は、例えば、米国特許第５，５８５，０８９号に記載されるＷｉｎｔｅｒの方法によって産生され得る。
【０１３４】
ヒト化抗体は、ＴＬＲ２特異的抗体などのモノクローナル抗体の超可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する修飾された抗体であり得る。従って、結合メンバーはヒト定常領域を含み得る。
【０１３５】
超可変領域以外の可変領域はまた、ヒト抗体の可変領域由来であっても、および／またはＴＬＲ２特異的抗体などのモノクローナル抗体由来であってもよい。このような場合において、全可変領域は、マウスモノクローナル抗体、ＴＬＲ２特異的抗体由来であり得、その抗体はキメラ化されたといわれる。キメラ抗体を作製するための方法は、当該分野において公知である。このような方法は、例えば、Ｂｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）およびＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）によって米国特許に記載されるものが挙げられる。例えば、それぞれ、米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号を参照のこと。
【０１３６】
元の抗体の特異性を保有する他の抗体またはキメラ分子を産生するために、モノクローナルおよび他の抗体を利用すること、ならびに組み換えＤＮＡ技術の技術を使用することが可能である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域、または定常領域プラスフレームワーク領域に導入することを含み得る。例えば、欧州特許出願公開第０，１８４，１８７号、英国特許出願公開第２，１８８，６３８Ａ号または欧州特許出願公開第０，２３９，４００号を参照のこと。ハイブリドーマまたは他の抗体産生細胞は、産生された抗体の結合特異性を変化させ得るか、または変化させ得ない遺伝子操作または他の変更に供されてもよい。
【０１３７】
特定の実施形態において、ＴＬＲ２阻害化合物またはＴＬＲ２結合化合物が抗体または抗体結合断片である場合、その抗体は治療有効量で被験体に投与される。特定の実施形態において、治療有効量は、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１ｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００ｐｇ／ｋｇおよび５００ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇから選択される範囲の抗体を含む。
【０１３８】
（抗体の産生）
本発明によって提供される抗体は、多くの手段によって提供され得る。例えば、ファージディスプレイベースのバイオパニングアッセイなどの組み合わせスクリーニング技術が、本発明の結合エピトープに対する結合特異性を有するアミノ酸配列を同定するために使用され得る。このようなファージディスプレイバイオパニング技術は、糸状菌の表面上の抗体結合断片のディスプレイを介して、免疫選択を模倣する手順において適切なエピトープ結合リガンドを同定する方法で利用されるファージディスプレイライブラリーの使用を含む。特異的結合活性を有するファージが選択される。選択されたファージはその後、キメラ、ＣＤＲ移植、ヒト化またはヒト抗体の産生に使用され得る。
【０１３９】
さらなる実施形態において、その抗体は、培養物中の連続細胞株によって抗体分子を産生する任意の適切な方法を用いて産生され得るモノクローナル抗体である。適切な方法は当業者に周知であり、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７．１９７５）の方法が挙げられる。キメラ抗体またはＣＤＲ移植抗体はさらに、本発明の範囲内で提供される。特定の実施形態において、本発明の抗体は、宿主細胞における組み換えＤＮＡの発現によって産生され得る。
【０１４０】
特定の実施形態において、モノクローナル抗体は、トランスジェニック動物、例えば、優先的に発現されるヒト重鎖および軽鎖をコードする遺伝子座で内因性マウス免疫グロブリン遺伝子の発現を欠失または抑制するために遺伝子操作されているトランスジェニックマウスを用いて産生されたヒト抗体であり得、これにより、完全なヒト抗体の産生を生じる。
【０１４１】
特定の実施形態において、その結合化合物は、抗体、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）などの抗体結合断片由来の結合断片である。
【０１４２】
特定の実施形態において、結合化合物は、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、合成された抗体もしくは合成抗体、融合タンパク質、またはそれらの断片、あるいは天然もしくは合成キメラ化合物またはペプチド模倣物を含む。本発明のＴＬＲ２エピトープに対する親和性および結合特異性を有する抗体を産生するための方法論は、以上に記載される。
【０１４３】
本発明の、および本発明に使用するための抗体（複数も含む）断片はまた、キメラ合成によって完全または部分的に産生され得る。その抗体は、十分に確立されている標準的な液相、または好ましくは固相ペプチド合成法に従って容易に調製され得る。その概要は広範に利用でき、当業者に周知である。さらに、それらは、液相法または固相、液相および溶液化学の任意の組み合わせによって溶液中で調製され得る。
【０１４４】
本発明における使用に適切な抗体（複数も含む）断片を産生する別の簡便な方法は、発現系における核酸の使用により、それらをコードする核酸を発現することである。
【０１４５】
本発明に従って使用するための核酸はＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、完全または部分的に合成され得る。好ましい態様において、本発明において使用するための核酸は、上記の本発明の抗体（複数も含む）断片をコードする。当業者は、本発明の抗体（複数も含む）断片をさらに提供するそのような核酸に対して置換、欠失および／または付加を決定できる。
【０１４６】
本発明で使用するための抗体（複数も含む）断片をコードする核酸配列は、本明細書に含まれる情報および参考文献ならびに当該分野において公知の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９２）を参照のこと）、所定の核酸配列および利用可能なクローンを用いて当業者によって容易に調製され得る。これらの技術は、（ｉ）例えば、ゲノム源由来のそのような核酸の試料を増幅させるためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製を含む。抗体断片をコードするＤＮＡは、コードＤＮＡを利用すること、発現される部分のいずれかの側で適切な制限酵素認識部位を同定すること、およびＤＮＡ由来の前記部分を切断することを含む、当業者に公知の任意の適切な方法で産生され、使用され得る。次いで、その部分は、標準的な市販の発現系における適切なプロモーターに作動可能に連結され得る。別の組み換えアプローチは、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの関連部分を増幅させることである。配列に対する修飾は、例えば、修飾されたペプチドの発現を生じさせるため、または核酸を発現するために使用される宿主細胞におけるコドン選択を考慮するために、部位特異的突然変異誘発法を用いてなされ得る。
【０１４７】
核酸は、上記の少なくとも１つの核酸を含むプラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物として含まれ得る。この構築物は、上記の１つ以上の構築物を含む組み換え宿主細胞内に含まれ得る。発現は、適切な条件下で、核酸を含む組み換え宿主細胞を培養することによって簡便に達成され得る。発現によって産生した後、抗体（複数も含む）断片は、任意の適切な技術を用いて単離および／または精製され得、次いで、適切な場合に使用され得る。
【０１４８】
種々の異なる宿主細胞においてポリペプチドをクローニングおよび発現するための系は周知である。適切な宿主細胞としては、細菌、哺乳動物細胞、酵母、昆虫およびバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドを発現するための当該分野において利用可能な哺乳動物細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳ０マウス骨髄腫細胞が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞における抗体（複数も含む）断片の発現は、当該分野において確立されている。培養物中の真核細胞における発現もまた、結合メンバーを産生するための選択肢として当業者に利用可能である。
【０１４９】
抗体を産生するための一般的技術は当業者に周知であり、そのような方法は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７；米国特許第４，３７６，１１０号；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（１９８８）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（これらの内容は本明細書に参照として援用される）に議論されている。組み換え抗体分子を調製するための技術は、上記の参考文献および例えば、欧州特許ＥＰ０，６２３，６７９号および欧州特許ＥＰ０，３６８，６８４号（これらは本明細書に参照として援用される）にも記載されている。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態において、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする挿入を含む組み換え核酸が利用される。定義により、そのような核酸は、コーディング一本鎖核酸、前記コーディング核酸およびその相補的核酸からなる二本鎖核酸、またはそれらの相補的（一本鎖）核酸それ自体を含む。
【０１５１】
さらに、抗体の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、天然重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメイン、あるいはそれらの変異体をコードする真の配列を有する酵素的または化学的に合成された核酸であり得る。
【０１５２】
組み換えＤＮＡ技術は、本発明の抗体を改良するために使用され得る。従って、キメラ抗体は、診断または治療用途においてその免疫原性を減少させるために構築され得る。さらに、例えば、ブタなどのトランスジェニック生物内の免疫原性は、抗体をヒト化する類似の技術のＣＤＲ移植によって抗体を変化させることにより最小化され得る。そのような技術の例は、Ｗｉｎｔｅｒによる欧州特許ＥＰ０，２３９，４００号に記載される。受容者内の免疫原性を減少させるために、本発明は、ヒト定常ドメインに融合される抗体の重鎖可変ドメインをコードする挿入を含む組み換え核酸を使用し得る。同様に、本発明は、ヒト定常ドメインκまたはλ領域に融合される抗体の軽鎖可変ドメインをコードする挿入を含む組み換えＤＮＡに関する。
【０１５３】
さらに、抗体は、抗体遺伝子の変異誘発によって産生されて、抗体の５個の人工レパートリーを産生され得る。この技術は抗体ライブラリーの調製を可能にする。抗体ライブラリーは市販されてもいる。従って、本発明は有利に、本発明のエピトープに対する特異性を有する結合分子を同定するために、免疫グロブリン源として、免疫グロブリンの人工レパートリー、好ましくは人工ｓｃＦｖレパートリーを利用する。
【０１５４】
（抗体選択系）
本発明のエピトープに結合でき、従って本発明の方法に使用され得る免疫グロブリンは、当業者に公知の任意の技術を用いて同定され得る。そのような免疫グロブリンは、簡便に、免疫グロブリンポリペプチドの人工レパートリーを含むライブラリーから単離され得る。「レパートリー」とは、複数の結合特異性を与えるために、核酸レベルで、ランダム、準ランダムまたは１つ以上の鋳型分子の直接変異によって産生される分子のセットをいう。レパートリーを産生するための方法は、当該分野において十分に特徴付けられている。
【０１５５】
任意のライブラリー選択系が本発明と併せて使用され得る。多くのライブラリーの所望のメンバーを単離するための選択プロトコルは、ファージディスプレイ技術が典型例であるように、当該分野において公知である。種々のペプチド配列が糸状バクテリオファージの表面で表示されるそのようなシステムは、生体外での選択および標的抗原に結合する特異的抗体断片の増幅のための抗体断片（およびそれらをコードするヌクレオチド配列）のライブラリーを作製するのに有用であると証明されている。ＶＨおよびＶＬ領域をコードするヌクレオチド配列は、それらをＥ．ｃｏｌｉの周辺質のスペースに方向付けるリーダーシグナルをコードする遺伝子断片に連結され、その結果として得られた抗体断片は、バクテリオファージの表面に、典型的にバクテリオファージコートタンパク質（例えばｐＩＩＩまたはｐＶＩＩＩ）との融合として表示される。あるいは、抗体断片は、ラムダファージカプシド（ファージ本体）の外面に表示される。ファージベースのディスプレイ系の利点は、それらが生物学系であるため、選択されたライブラリーメンバーが、細菌細胞において選択されたライブラリーメンバーを含むファージを増殖させることによって簡単に増幅され得ることである。さらに、ポリペプチドライブラリーメンバーをコードするヌクレオチド配列は、ファージまたはファージミドベクターに含まれ、配列決定、発現およびその後の遺伝子操作は、比較的、連続して進められる。
【０１５６】
バクテリオファージ抗体ディスプレイライブラリーおよびラムダファージ発現ライブラリーを構築するための方法は、当該分野において周知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８  ５５２−５５４）。１つの特に有益なアプローチは、ｓｃＦＶファージディスプレイライブラリーの使用である（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡを参照のこと）。
【０１５７】
ファージまたは他のクローンライブラリーの使用の代替案は、核酸、好ましくは、選択された標的、例えば、本発明のＴＬＲ２エピトープで免疫化された動物のＢ細胞由来のＲＮＡを使用することである。
【０１５８】
Ｖ領域およびＣ領域のｍＲＮＡの単離により、ＦａｂまたはＦｖなどの抗体断片が細胞内に発現することを可能にする。つまり、ＲＮＡは、免疫化された動物のＢ細胞から、例えば、免疫化されたマウスの脾臓、またはラマの循環Ｂ細胞から単離され、ＰＣＲプライマーが、ＲＮＡプールから選択的にＶＨおよびＶＬ  ｃＤＮＡを増幅させるために使用される。従って、得られたＶＨおよびＶＬ配列は、ｓｃＦＶ抗体を作製するために結合される。ＰＣＲプライマー配列は、公開されたＶＨおよびＶＬ配列に基づいてもよい。
【０１５９】
（ペプチド模倣物）
ペプチド模倣物またはペプチド模倣薬などのペプチド類似物は、鋳型ペプチドの代表的な特性を有する非ペプチド化合物である。そのようなペプチド類似物は、典型的に、コンピューターによる分子モデリングを用いて開発される。本発明のＴＬＲ２結合エピトープに対する親和性および結合特異性を有するペプチドに構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の診断的、予防的および治療的効果を媒介するために使用され得る。
【０１６０】
ペプチド模倣物は、典型的に、鋳型ペプチドと構造的に類似しているが、当該分野において周知である方法によって、別の結合と置換される１つ以上のペプチド結合を有する。例えば、本発明のＴＬＲ２エピトープに対する結合特異性を有するペプチドは、アミド結合置換、非ペプチド部分の導入、または骨格環化を含むように修飾され得る。適切に、システインが存在する場合、この残基のチオールが、遊離硫酸基の損傷を防止するためにキャップされる。ペプチドはさらに、プロテアーゼ攻撃からペプチドを保護するために天然配列から修飾され得る。
【０１６１】
適切に、本発明のペプチドおよび本発明に使用するためのペプチドはさらに、少なくとも１つのＣ末端および／またはＮ末端キャッピング、ならびに／あるいはシステイン残基キャッピングを用いて修飾され得る。適切に、本発明のペプチドおよび本発明に使用するためのペプチドは、アセチル基を用いてＮ末端残基でキャップされ得る。適切に、本発明のペプチドおよび本発明に使用するためのペプチドは、アミン基を用いてＣ末端でキャップされ得る。適切に、システインのチオール基は、アセトアミドメチル基を用いてキャップされる。
【０１６２】
本発明のエピトープおよびその断片を規定するポリペプチドの発現、単離および精製は、任意の適切な技術によってなされ得る。ポリペプチドを産生するための方法は、ポリペプチドの発現を促進する条件下で、ポリペプチドをコードする組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養すること、次いでその培養物から発現したポリペプチドを回収することを含む。当業者は、発現されたポリペプチドを精製するための手順が、利用される宿主細胞のタイプなどの要因に従って変化し、そのポリペプチドが細胞内、膜結合または可溶性形態であろうとなかろうと、その宿主細胞から分泌されることを理解するだろう。
【０１６３】
任意の適切な発現系が利用されてもよい。ベクターは、本発明のポリペプチドまたは断片をコードするＤＮＡを含み、哺乳動物、トリ、微生物、ウイルス、細菌、または昆虫遺伝子由来のものなどの適切な転写または翻訳調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結される。ヌクレオチド配列は、調節配列がＤＮＡ配列に機能的に関連する場合、作動可能に連結される。従って、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御する場合、ＤＮＡ配列に作動可能に連結される。形質転換体が同定される所望（Ｅ．ｃｏｌｉ）の宿主細胞、および選択遺伝子において複製する能力を与える複製起点は、発現ベクターに一般的に導入される。
【０１６４】
さらに、適切なシグナルペプチド（天然または異種）をコードする配列は、発現ベクターに導入され得る。シグナルペプチド（分泌腺リーダー）についてのＤＮＡ配列は、フレームにおいて本発明の核酸配列と融合され得、その結果、そのＤＮＡは最初に転写され、ｍＲＮＡがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳される。意図される宿主細胞において機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。そのシグナルペプチドは、翻訳の間、ポリペプチドから開裂されるが、細胞からのポリペプチドの分泌を可能にする。
【０１６５】
ポリペプチドを発現するための適切な宿主細胞は、高等真核細胞および酵母を含む。原核細胞系もまた、適切である。哺乳動物細胞、および特にＣＨＯ細胞が、宿主細胞としての使用のために特に好ましい。哺乳動物、原核生物、酵母、菌類および昆虫細胞の宿主を用いて使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８６）（ＩＳＢＮ  ０４４４９０４０１８）に記載されている。
【０１６６】
（低分子）
種々のさらなる態様において、本発明は、ＴＬＲ２活性または発現に拮抗する低分子化合物を同定するのに使用するためのスクリーニングおよびアッセイ方法に関する。特定のさらなる態様は、同定された化合物にまで及び、従って、前記結合化合物は、結合した場合、エピトープに対する親和性および結合特異性を有し、ＴＬＲ２の機能活性を阻害する。
【０１６７】
ＴＬＲ２受容体の拮抗薬として同定される物質はペプチドであってもよいか、または天然の非ペプチド、例えば、上記のペプチド模倣物であってもよい。しかしながら、非ペプチド「低分子」は、しばしば、多くの生体内の薬理学的用途に好ましい。従って、本発明に使用するためのＴＬＲ２結合化合物の模倣薬または模倣剤は、薬理学的用途のために設計され得る。
【０１６８】
公知の薬理学的に活性な化合物に対する模倣薬の設計は、「鉛」化合物に基づく薬理学の開発に対する公知のアプローチである。これは、活性化合物を合成することが難しいか、または費用がかかる場合、あるいは特定の投与方法が不適切な場合に望まれ得る。例えば、ペプチドは消化管に存在するプロテアーゼによって分解されるため、経口組成物および投与のための活性因子として十分に適さない。模倣薬の設計、合成および試験は、標的特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを避けるために使用され得る。
【０１６９】
所定の標的特性を有する化合物からの模倣薬の設計に一般に利用されるいくつかの工程が存在する。最初に、標的特性を決定する際に決定的および／または重要である化合物の特定の部分が決定される。ペプチドの場合、これは、ペプチドのアミノ酸残基を体系的に変化させることにより、例えば、順に各アミノ酸残基を置換することによりなされ得る。化合物の活性領域を構成する残基のこれらの部分は、その「活性基」として公知である。
【０１７０】
一旦、活性基が決定されると、その構造は、様々な範囲の源、例えば、分光技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲからのデータを用いて、その物理的特性、例えば、立体化学、結合、サイズおよび／または電荷に従ってモデル化される。コンピューター分析、類似マッピング（原子間の結合よりむしろ、電荷および／または活性基の量をモデル化する）および他の技術もまた、このモデル化プロセスに使用され得る。
【０１７１】
このアプローチの変形において、ＴＬＲ２結合化合物の三次元構造がモデル化される。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが、結合の際に構造を変化する場合に特に有用であり得、そのモデルの模倣薬の設計を考慮に入れることができる。
【０１７２】
次いで、鋳型分子が選択され、その鋳型分子上で活性基を模倣する化学基が組み込まれ得る。その鋳型分子およびそれに組み込まれた化学基は簡便に選択され得、その結果、模倣薬は、合成しやすく、薬理学的に許容される可能性があり、生体内で分解せず、一方で鉛化合物の生物学的活性も保持する。このアプローチによって見出される模倣薬（複数も含む）は、次いで、それらが標的特性を有するかどうか、またはそれらがどの程度まで標的特性を示すかを調べるためにスクリーニングされ得る。次いで、さらなる最適化または修飾が、生体内または臨床試験についての１つ以上の最終模倣物に到達するように実施され得る。
【０１７３】
特定の実施形態において、模倣薬結合化合物は、薬物スクリーニング計画に使用される天然または合成化合物であってもよい。いくつかの特徴付けられた、または特徴付けられていない成分を含む植物の抽出物も使用され得る。
【０１７４】
なおさらなる態様において、本発明は、エピトープに結合するか、またはエピトープに結合するリガンドの活性を調節するそれらの能力についての潜在的に膨大な数の異なる物質を試験する効果的な方法を提供する組み合わせライブラリー技術（Ｓｃｈｕｌｔｚ，ＪＳ（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１２：７２９−７４３）の使用にまで及ぶ。活性の調節についてのスクリーニングの前、およびスクリーニング時に、試験物質が、例えば、（コード核酸から酵母において発現され得るポリペプチドおよび試験物質の両方を必要とする）酵母２ハイブリッド法においてポリペプチドと相互作用する能力についてスクリーニングされ得る。これは、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力について物質を試験する前に粗いスクリーニングとして使用され得る。
【０１７５】
本発明のアッセイに加えられ得る試験物質または化合物の量は、通常、使用される化合物のタイプに依存して試行錯誤によって決定される。典型的に、約０．０１〜１００ｎＭ濃度の推定阻害化合物、例えば、０．１〜１０ｎＭが使用され得る。ペプチドが試験物質である場合、より高い濃度が使用され得る。
【０１７６】
（併用医薬）
上記のように、本発明は併用治療にまで及び、組成物または方法は、再灌流障害の原因となり得る免疫応答を抑制するか、または心臓病を処置するのに役立つ少なくとも１つのさらなる治療化合物と組み合わせて投与されるＴＬＲ２の機能的活性を阻害する結合化合物の投与に関する。
【０１７７】
典型的に、一次および二次治療組成物は同時に与えられる。特定の実施形態において、一次治療組成物（すなわち、ＴＬＲ２の機能的活性に拮抗する結合化合物）および二次治療化合物は同時に投与される。特定のさらなる実施形態において、それらは連続して投与される。
【０１７８】
特定の実施形態において、併用治療は、サイトカイン阻害剤（例えば、限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１５の阻害剤）、および腫瘍壊死因子の阻害剤、増殖因子阻害剤、免疫抑制因子、抗炎症剤、酵素阻害剤、代謝阻害剤、細胞毒性剤または細胞増殖抑制剤のうちの少なくとも１つと共に被験体に同時投与されるＴＬＲ２機能的阻害剤を含み得る。
【０１７９】
当業者は、併用治療の被験体への投与が、治療的に有効な効果を達成して関連させるために、被験体へのより少ない用量の治療薬の投与を可能にするという点で有益であり得ることを理解するだろう。より少ない併用用量の投与により、被験体が、投与される化合物に由来する少ない毒性レベルにしか曝露されないという結果も生じる。さらに、本発明によって提供される併用治療の一部として投与される二次治療化合物は、異なる経路を標的とし、治療の全体的な効果を相乗的に向上する可能性がある。効果の向上により、投与され、それによって関連する毒性を減少させる、より少ない用量の必要性を再び生じる。
【０１８０】
本発明のＴＬＲ２阻害化合物と共に投与するための適切な二次治療化合物を同定および選択する際に、前記二次治療化合物は、再灌流障害に関連する炎症を生じる炎症反応の異なる段階で免疫応答を調節するような化合物に基づいて選択され得る。このような二次化合物としては、限定されないが、可溶性受容体、ペプチド阻害化合物、低分子、融合タンパク質またはリガンド、抗体、および抗炎症性効果を媒介するサイトカインが挙げられ得る。
【０１８１】
（投与）
本発明のモノクローナル抗体または融合タンパク質は単独で投与され得るが、好ましくは、意図される投与経路に依存して選択される一般に適切な薬理学的に許容できる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物として投与される。適切な薬理学的担体の例としては、水、グリセロール、エタノールおよび他のＧＲＡＳ試薬が挙げられる。
【０１８２】
本発明のモノクローナル抗体または融合タンパク質は、任意の適切な経路を介して処置を必要とする患者に投与され得る。本明細書に定義する場合、組成物が、注射または注入により非経口的に投与されることが好ましい。非経口投与のための好ましい経路の例としては、限定されないが、静脈内、心臓内、動脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、経粘膜的、吸入または経皮的が挙げられる。
【０１８３】
投与経路はさらに、局所的および腸内、例えば、粘膜（肺を含む）、経口、経鼻、直腸を含み得る。
【０１８４】
特定の実施形態において、組成物は、注射可能組成物として送達可能である。静脈内、筋肉内、皮内または皮下適用に関して、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容できる水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射、リンガー液、または乳酸化リンガー液などの等張性ビヒクル用いて適切な溶液を十分に調製できる。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／または他の添加剤が、必要な場合、含まれ得る。
【０１８５】
組成物はまた、ミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子送達系または血液を含む特定の組織に配置される徐放性製剤を介して投与され得る。
【０１８６】
本発明に従って使用され得る上記の技術およびプロトコルならびに他の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ；第２０版  ＩＳＢＮ  ０−９１２７３４−０４−３ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃら，第７版  ＩＳＢＮ  ０−６８３３０５−７２−７（それらの全開示は本明細書に参照として援用される）に見出され得る。
【０１８７】
組成物は、好ましくは、「治療有効量」で個体に投与され、これは、その組成物が投与される個体に有益であることを示すのに十分である。投与される実際の用量、ならびに投与速度および投与期間は、処置される状態の性質および重症度、ならびに処置される患者の年齢、性別および体重、および投与経路などの要因に依存し、それらを考慮して決定され得る。さらに、組成物の特性、例えば、その結合活性および生体内での血漿中の半減期、製剤中の融合タンパク質の濃度、ならびに送達の経路、部位および速度が考慮されるべきである。
【０１８８】
投薬計画は、本発明の組成物の単回投与またはその組成物の複数回の管理上の投与を含んでもよい。その組成物はさらに、本発明の融合タンパク質が処置するために投与される状態の処置に使用される他の治療薬または医薬と連続して、または別々に投与されてもよい。
【０１８９】
被験体に投与され得る投与計画の例は、限定されないが、１μｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、１０μｇ／ｋｇ／日〜１ｍｇ／ｋｇ／日を含む群から選択され得る。
【０１９０】
本発明のＴＬＲ２調節薬剤は、好ましくは、「治療有効量」で個体に投与され、これは個体に有用性を示すのに十分である。投与される実際の量、ならびに投与速度および期間は、処置されるものの性質および重症度に依存する。処置の処方箋、例えば、投薬量などの決定は、最終的に、一般開業医および他の医師の責任および決定の範囲内であり、典型的に、処置される疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および医師に公知の他の要因が考慮される。
【０１９１】
他に定義されない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明の当業者によって一般に理解される意味を有する。
【０１９２】
文脈が他に要求しない限り、明細書全体にわたって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、あるいは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、記載される整数または整数の群を包含するが、いかなる他の整数または整数の群も排除しないことを示すことが理解されるだろう。
【０１９３】
本明細書で使用する場合、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などの用語は、文脈が他に明確に要求しない限り、単数形および複数形の指示対象を含む。従って、例えば、「活性な薬剤」または「薬理学的に活性な薬剤」に対する言及は、単一の活性な薬剤および組み合わせた２つ以上の異なる活性な薬剤を含み、一方、「担体」に対する言及は、２つ以上の担体の混合物および単一の担体などを含む。
【０１９４】
本発明の融合タンパク質のポリペプチド構成要素を記載するために使用される命名は、従来の実務に従い、アミノ基（Ｎ）は各アミノ酸残基の左に提示され、カルボキシ基は右に提示される。
【０１９５】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸」との語句は、天然および合成アミノ酸の両方、ならびにＤおよびＬアミノ酸の両方を含むことを意図する。合成アミノ酸はまた、限定されないが、アミドなどの塩、およびアミノ酸誘導体を含む化学的に修飾されたアミノ酸を含む。本発明のポリペプチド内に存在するアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化またはそれらの生物学的活性に悪影響を与えずに循環半減期を変化させ得る他の化学基での置換によって修飾され得る。
【０１９６】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合またはアイソスターなどの修飾されたペプチド結合による一連の少なくとも２つのアミノ酸共有結合を記載するために本明細書に交換可能に使用される。ペプチドまたはタンパク質を含み得るアミノ酸の最大数に制限は課されない。さらに、用語ポリペプチドは、ペプチドの断片、類似体および誘導体にまで及び、前記断片、類似体または誘導体は、その断片、誘導体または類似体が誘導されるペプチドと同じ生物学的機能活性を保持する。
【０１９７】
さらに、本明細書で使用する場合、用語「融合タンパク質」はまた、融合ポリペプチド、融合ペプチドなどの意味を取り得るか、または免疫抱合体ともいわれ得る。用語「融合タンパク質」は、２つ以上のサブユニット分子、典型的に、ポリペプチドが、共有結合または非共有結合されている分子をいう。
【０１９８】
本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」とは、限定されないが、被験体における低酸素症、脳卒中、心臓発作、慢性腎不全または臓器移植を含む群より選択される少なくとも１つの状態に起因する再灌流障害の原因となるＴＬＲ２媒介性炎症を抑制するのに必要とされる本発明の薬剤、結合化合物、低分子、融合タンパク質またはペプチド模倣物の量を意味する。
【０１９９】
本明細書で使用する場合、用語「予防的に有効な量」とは、限定されないが、被験体における低酸素症、脳卒中、心臓発作、慢性腎不全または臓器移植を含む群より選択される少なくとも１つの状態に起因する再灌流障害の原因であるＴＬＲ２媒介性炎症の初期の発現、進行または再発を予防するのに必要とされる組成物の量に関する。
【０２００】
本明細書で使用する場合、用語「処置」ならびに「処置する」および「処置している」などの関連用語は、ＴＬＲ２媒介性状態の少なくとも１つの症状の進行、重症度および／または持続の減少を意味し、前記減少または改善は、本発明のＴＬＲ２結合エピトープに対する特異性を有する結合化合物の投与に起因する。従って、用語「処置」とは、被験体に有益であり得る任意の投薬計画をいう。この処置は、既存の状態に関してであってもよいか、または予防的（予防的治療）であってもよい。処置は、治療的、軽減的または予防的効果を含んでもよい。本明細書において「治療的」および「予防的」処置に対する言及は、それらの最も広い状況とみなされるべきである。用語「治療的」とは、被験体が完全に回復するまで処置されることを必ずしも意味するわけではない。同様に、「予防的」とは、被験体が最終的に疾患状態にかからないことを必ずしも意味するわけではない。
【０２０１】
本明細書で使用する場合、用語「被験体」とは、動物、好ましくは、哺乳動物、特にヒトをいう。特定の実施形態において、その被験体は哺乳動物、特にヒトである。用語「被験体」は、本明細書で使用する場合、用語「患者」と交換可能である。
【実施例】
【０２０２】
（実施例１  心臓における再灌流障害に対するＴＬＲ２拮抗抗体の効果）
（材料および方法）
（ｉ）動物および実験計画
雄性Ｃ５７ＢＬ６マウス（８〜１２週齢、体重２５〜３０グラム）に、３０分の虚血後、２４時間の再灌流を受けさせた。
【０２０３】
実験化合物を、尾静脈を介して再灌流の５分前に投与した。マウスに、陰性対照（ｎ＝１０）としてＩｇＧアイソタイプの抗体１０ｍｇ／ｋｇ、陽性対照（ｎ＝１０）としてＳＢ２３９０６３  ０．５ｍｇ／ｋｇ（（Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ番号ＡＬＸ−２７０−３５１）ＳＢ２３９０６３は、トランス−１−（４−ヒドロキシシクロヘキシル）−４−（フルオロフェニル）−５−（２−メトキシピリミジン−４−イル）イミダゾールとしても公知である、ＬＰＳ誘導ヒト末梢血単球においてＩＬ−１およびＴＮＦ−α産生（それぞれ、ＩＣ５０＝１２０ｎＭおよび３５０ｎＭ）を阻害するｐ３８ＭＡＰキナーゼの有力な細胞透過性阻害剤（組み換え体の精製されたヒトｐ３８αについてＩＣ５０＝４４ｎＭ））の、ＰＢＳ（ｎ＝１１）および実験的ＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体１５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）、１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝１０、ｎ＝５）、１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝５）のいずれかを含む４００〜４５０μｌのストックを与えた。ＯＰＮ−３０１（ＯＰＮ３０１）は、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体（マウスＴｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）抗体、クローンＴ２．５、ＨｙＣｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｂ．ｖ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｎｔｏｎ，ＵＳＡ：カタログ番号１０５４）である。
【０２０４】
マウスを、ＦＥＮＴＡＮＹＬ（商標）（Ｎ−（１−フェネチル−４−ピペリジル）−Ｎ−フェニル−プロパンアミド）０．０５ｍｇ／ｋｇ、ＤＯＲＭＩＣＵＭ（商標）（Ｍｉｄａｚｏｌｕｍ、８−クロロ−６−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−４Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］［１，４］ベンゾジアゼピン）５ｍｇ／ｋｇおよびＤＯＭＩＴＯＲ（商標）（塩酸メデトミジン）０．５ｍｇ／ｋｇ（腹腔内注射）の混合物で麻酔した。アトロピン（（８−メチル−８−アザビシクロ［３．２．１］オクト−３−イル）３−ヒドロキシ−２−フェニルプロパノアート）０．０５ｍｇ／ｋｇを、冠動脈結紮前に皮下投与した。中核体温を、直腸温度計および自動加熱毛布を用いて連続モニタリングによって手術の間、３６℃〜３７．５℃に維持した。マウスをインキュベートし、１００％の酸素を通気した（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  Ｉｎｃ．）。左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）を、ＬＡＤを覆ったポリエチレン−１０チューブの一部で８−０バイクリル（ｖｉｃｒｙｌ）縫合糸を用いて結紮した。
【０２０５】
虚血を心筋が白くなることにより確認した。再灌流を、結紮糸をほどき、ポリエチレン−１０チューブを除去することにより開始した。危険にさらされた心筋の再灌流を、最初の数分間の典型的な充血により特徴付けた。緩めた縫合糸の一片を、虚血領域を決定するために適所に置いたままにした。胸壁を閉じ、その動物に、ＡＮＴＩＳＥＤＡＮ（商標）（塩酸アチパメゾール、ＤＯＭＩＴＯＲ（商標）（塩酸メデトミジン）についての鎮静反転剤）２．５ｍｇ／ｋｇ、ＡＮＥＸＡＴＥ（商標）（Ｆｌｕｍａｚｅｎｉｌ（フルマゼピルとしても公知である））０．５ｍｇ／ｋｇおよびＴＥＭＧＥＳＩＣ（商標）（ブプレノルフィン）０．１ｍｇ／ｋｇを皮下に与えた。
【０２０６】
（梗塞面積）
梗塞面積（ＩＳ）を、リスク領域（ＡＡＲ）および全左心室（ＬＶ）の割合として表した。ＡＡＲ／ＬＶの比を、虚血および再灌流を受けた心筋組織の範囲（すなわち、危険にさらされた面積）について測定した。ＩＳ／ＡＡＲの比は、危険にさらされた心筋内の梗塞面積を決定するための正確な尺度であり、さらに主用評価項目であり、その主用評価項目から処置の有効性が取り扱われる。副次的評価項目ＩＳ／ＬＶの比は、全左心室壁内の梗塞面積の割合である。
【０２０７】
ＡＡＲを決定するために、ＬＡＤを、（適所に置いたままにした縫合糸によってマークした位置で）再び結紮し、４％のエバンスブルー染料を、胸大動脈を介して逆行性に注射した。心臓を迅速に外植し、０．９％の生理的食塩水でリンスし、透明な食品ラップで包み、１時間、−２０℃で凍結した。次いで、心臓を、５つの１ｍｍの断片に機械的にスライスした。心臓断片を、３７℃で１５分間、１％の塩化トリフェニルテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）でインキュベートした後、それらをさらに１５分間、ホルムアルデヒドに入れた。生存組織を赤く染色したので、梗塞組織は白く見えた。心臓断片を、顕微鏡（ＣＡＲＬ  ＺＥＩＳＳ（商標））下で、デジタル写真（ＣＡＮＯＮ  ＥＯＳ  ４００Ｄ）でとった。ＩＳ、ＡＡＲおよび全ＬＶ面積を、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．３４）を用いて測定した。
【０２０８】
（統計的分析）
全てのデータを平均±ＳＤとして表した。歪度±ＳＤおよび尖度±ＳＤの正規性を確認した後、ボンフェローニ調整（表２）およびダネットＴ検定（両側（２−ｓｉｄｅｄ））（表４）を用いて一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＢＡ）を、群間の差を試験するために使用した。異常分布が疑われた場合（すなわち、尖度および歪度の値がそれらの標準偏差の２倍である場合）、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験を実施した。全ての統計的分析を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＳＰＳＳ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）用のＳＰＳＳバージョン１３．０を用いて実施し、ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【０２０９】
（結果）
生存−全ての動物が３０分の虚血後、２４時間の再灌流で生存していた。
【０２１０】
心臓の断面−図１〜４は、異なる群における心臓の断面の代表的な例を示す。
【０２１１】
記述的統計−表１、表３および図５、６、７、８および９は、データおよびそれらの分布を示す。全てのデータを正規分布した。ｐ３８阻害剤の群は、異常分布に対する疑いがあったが、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験により、その正規性（ｐ＝０．０７７）が示された。
【０２１２】
全左心室内のリスク領域（ＡＡＲ）−ＡＡＲ／ＬＶは、群の中で統計的に異なっておらず、左心室は群の間の処置によって等しい影響を受けていたことを意味する（図５）。
【０２１３】
梗塞面積−表２および表４は、実験群の間の平均の比較を示す。ｍＡｂは、他の群と比較して平均ＩＳ／ＡＡＲの有意差を示す唯一の群である。ＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体での処置は、ＩｇＧアイソタイプ（ｐ＝０．００７）およびｐ３８阻害剤（ｐ＝０．００６）で処置したマウスの両方と比較して４３％のＡＡＲ内の梗塞面積（ＩＳ／ＡＡＲ）の減少を生じる。ＩＳ／ＡＡＲの減少は、ＰＢＳで処置したマウスと比較してさらに顕著である、５０％（ｐ＜０．００１）（図６）。
【０２１４】
全左心室のパーセントとしての梗塞面積（ＩＳ／ＬＶ）はまた、実験的抗ＴＬＲ２  ＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体で処置したマウスで減少する：ＩｇＧアイソタイプ（ｐ＝０．０１）と比較して５３％の減少、ｐ３８阻害剤（ｐ＝０．０３２）と比較して４９％の減少およびＰＢＳ（ｐ＜０．００１）で処置したマウスと比較して６５％の減少（図７）。
【０２１５】
ｐ３８阻害剤およびＩｇＧアイソタイプで処置したマウスと、ＰＢＳで処置したマウスとの間の平均ＩＳ／ＬＶの差（それぞれ、−２６％および−３１％）は、統計的に有意ではなかった（図７）。
【０２１６】
【表１】
0005576275.tif 000002
【０２１７】
【表２】
0005576275.tif 000003
【０２１８】
【表３】
0005576275.tif 000004
【０２１９】
【表４】
0005576275.tif 000005
【０２２０】
ＴＬＲ２に対する結合特異性を有する実験的ＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体は、梗塞面積の大幅な減少を生じることが示される。
【０２２１】
実験化合物は再灌流の５分前に投与した。これにより、陽性対照（ＳＢ２３９０６３）が梗塞面積を減少させなかったことが明らかになった。陽性対照が効果的であることを示した研究において、ｐ３８阻害剤（ＳＢ２３９０６３またはＳＢ２０３５８０のいずれか）は、虚血前および／または再灌流の間に投与された。臨床的環境において、このプロトコルはいくつかの理由のために可能ではない。第一に、心筋梗塞は予測できず、従って、患者はｐ３８阻害剤を虚血期間前に摂取できない。ｐ３８阻害剤はそれらの作用を及ぼすのに長時間必要とするため、それらはまた、全虚血期間を与える可能性がある。これにより、心筋虚血／再灌流に対する治療が不適切となり、血流の早期の回復が患者にとって有益である：薬物は効果的である十分な時間を有さない。抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ−３０１は、これらの状況下でさえ、梗塞面積を減少させることができた。
【０２２２】
全左心室のパーセントとしての梗塞面積（ＩＳ／ＬＶ）（ｐ＝０．０５９、表２）を減少させることにおけるｐ３８阻害剤ＳＢ２３９０６３の効果への傾向が存在した。これは、ａ）ＰＢＳ群におけるデータの拡散；ｂ）以前の研究において虚血期間の前に与えられるものと同じほどの効果を除いて、ＳＢ２３９０６３はほとんど効果を有さない、またはｃ）ＳＢ２３９０６３に対する動物の間の反応性の変動性によって引き起こされ得る。
【０２２３】
図９は、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ−３０１の１５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／ｋｇの投与が、生理的食塩水群での３４．５％と比較して、それぞれ、２１％、２１％および２５％のリスク領域の梗塞を生じることを示す。ｎ＝５での１０ｍｇ／ｋｇの投与は、図６（ＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体で１９％の梗塞）で得られた結果と統計的に類似している。しかしながら、５ｍｇ／ｋｇと生理的食塩水群との間の梗塞面積の差は、統計的に有意にはならなかった（ｐ＝０．１３１）。
【０２２４】
要約すれば、５ｍｇ／ｋｇ用量のマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１は、１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１と比較して梗塞面積を有意に減少させなかった。１０ｍｇ／ｋｇについてのｎ＝１０と比較して、比較的少ない数のマウス、すなわちｎ＝５は、標準偏差の等しい大きさで正規分布したデータを得るのに十分であったため、１５ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１の効果により、抗体の有力な効力が示された。従って、１５ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１は、１０ｍｇ／ｋｇのマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１と同様の効力である。
【０２２５】
（実施例２  心臓における再灌流障害に対するＴＬＲ２拮抗抗体の効果へのさらなる調査）
実施例１の実験を以下に示すように、および図１５〜２３にさらに示すように繰り返した。
【０２２６】
（生存）
全ての動物は、３０分の虚血／２４時間の再灌流で生存していた。ＩｇＧアイソタイプで処置した２匹のマウスを除いて、全ての動物は、ＭＩ／Ｒ障害後２８日にも生存していた。死因は、手順および／または感染症の原因と関連していなかった。
【０２２７】
（心臓の断面）
図１５、１６、１７および１８は、異なる群における心臓の断面の代表的な例を示す。
【０２２８】
（記述的統計）
表５ならびに図１９、２０および２１は、データおよびそれらの分布を示す。全てのデータは正規分布されている。ｐ３８阻害剤群は異常分布に対する疑いがあったが、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ試験により、その正規性（ｐ＝０．０７７）が示された。
【０２２９】
（全左心室内のリスク領域）
ＡＡＲ／ＬＶは群の中で異ならず、左心室は群の間の処置によって等しい影響を受けていたことを意味する（図１）。
【０２３０】
（梗塞面積）
表５は、ＰＢＳ処置に対する多重比較を示す。ＴＬＲ２ノックアウトおよびマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１処置は、有意な梗塞面積の減少を生じる。マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１での処置は、ＡＡＲ内の梗塞面積（ＩＳ／ＡＡＲ）を４５％（ｐ＝０．００１）減少させる。ＴＬＲ２ノックアウト（ＫＯ）マウスは、３３．３％（ｐ＝０．０２５）の減少を示す。意図される陽性対照ｐ３８阻害剤で処置したマウスは、梗塞面積の減少を示さない（ｐ＝０．９５６）（図２０）。
【０２３１】
全左心室（ＩＳ／ＬＶ）のパーセントとしての梗塞面積はまた、ＯＰＮ−３０１で処置したマウスにおいて減少した：生理的食塩水処置と比較して５２％の減少（ｐ＜０．００１）。再び、梗塞面積の差は、ＩｇＧアイソタイプとｐ３８阻害剤処置とで観測されなかった（図２１）。
【０２３２】
単一の循環細胞上でＴＬＲ２を欠くマウスは、全ノックアウトと同程度の心臓保護の利点がある。血液ノックアウトの梗塞面積は、全ＴＬＲ２ノックアウトマウス（ＡＡＲ内の梗塞の３３．３％の減少；ｐ＝０．０１９）と類似している。対照的に、実質細胞上でＴＬＲ２を欠くマウスは、ＭＩ／Ｒ障害に対して保護されていない（図２２）。ＴＬＲ２がＭＩ／Ｒ障害における炎症応答を媒介するという本発明者らの仮説に従って、血液ノックアウトマウスは、２４時間の再灌流後の心筋において２．５倍少ないマクロファージ流入を示す（ｐ＝０．０００５；図２３）。これらのデータは、循環細胞上のＴＬＲ２発現がＭＩ／Ｒ障害を媒介するという考えを支持する。
【０２３３】
（心臓機能および形状）
図２４および表６は、梗塞２８日後の心臓機能および形状の変化を示す。拡張終期および収縮末期の体積の両方は、生理的食塩水およびＩｇＧアイソタイプ処置で増加するが、ＯＰＮ−３０１処置は、両方のパラメーターの減少を生じる。さらに、駆出率は、生理的食塩水およびＩｇＧアイソタイプで処置したマウスにおいて悪化する。対照的に、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１は、駆出率のわずかな増加によって示されるように、梗塞２８日後の心臓機能を保存する。これらのデータは、ＯＰＮ−３０１処置での梗塞面積の減少が、ＭＩ／Ｒ障害後、保存された心臓機能および心臓形状になることを示唆する。
【０２３４】
【表５】
0005576275.tif 000006
【０２３５】
【表６】
0005576275.tif 000007
【０２３６】
（実施例３  ブタ血液試料におけるＴＬＲ２活性の阻害）
ブタ血液試料を、室温で保存されている試料を用いて、ヘパリン化したチューブに与える（ｎ＝４〜５）。ＴＬＲ２機能を拮抗するＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体の阻害可能性を決定する。ＴＬＲ−２／ＴＬＲ−４阻害ペプチドおよびＴＬＲ−４阻害ペプチドをまた、精製されたブタＰＢＭＣの誘導後に、定義したＴＬＲ作動薬を用いて評価する。
【０２３７】
（実験プロトコル）
ブタＰＢＭＣを、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１（１０００−０．０１ｎｇ／ｍｇ）またはＴＬＲ阻害ペプチドの投薬量の存在下または非存在下において、ＴＬＲ−２作動薬Ｐａｍ３ＣＳＫ４およびＦＳＬ−１またはＴＬＲ−４作動薬ＬＰＳで誘導する。細胞を６時間および２４時間誘導し、ＴＮＦ−αの存在について上清を試験した。
【０２３８】
有意差は、ブタの種の間で存在できる。すなわち、血栓症研究において、ミニブタは、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１に対して応答することはできないが、他の種のブタはすることができる。
【０２３９】
マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１は、ラットまたはアカゲザル由来のＰＢＭＣにおいてＴＬＲ２リガンドによって誘導されたＴＮＦα産生の阻害をほとんどまたは全く示さなかった。しかしながら、カニクイザルＰＢＭＣの結果は、第１の研究で実施した参照と食い違ったので、さらなる研究をカニクイザルで実施した。
【０２４０】
これらのさらなる研究により、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１が、（ＦＡＣＳ分析によって）カニクイザル単球上のＴＬＲ２に結合し、ＴＬＲ２の不十分な発現がサルのリンパ球で観測されたことが示された。さらに、ＴＬＲ２リガンドによって誘導されるＴＮＦ−α産生の阻害が、２０００ｎｇ／ｍｌまでの濃度でカニクイザルのＰＢＭＣで非常にわずかだけ観測されたか、またはほとんど観測されなかった。従って、むしろ、カニクイザルにおいてマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１の弱い交差反応性があるように見え、この種由来のＰＢＭＣの効力検定において見られる低い活性は、ヒトおよびマウスでの調製物に比べて、非常に低い生物学的活性を示す。
【０２４１】
マウスは安全な研究を実施するための通常の種ではないため、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１は、監督機関を満たすために十分な広範囲の毒性プログラムを必要とする。ブタの虚血などの急性疾患および安全試験は、類似の臓器部位および代謝に起因するヒトの状態により関連する。従って、本実験は、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１が、ブタモデルの虚血再灌流障害および可能性のある将来の毒性研究の使用に適切な治療剤であることを立証する。
【０２４２】
（実施例４  ウサギにおけるＴＬＲ２活性の阻害）
ウサギＰＢＭＣを、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１（１０００〜０．０１ｎｇ／ｍｌ）またはＴＬＲ阻害ペプチドの用量範囲の存在下または非存在下において、ＴＬＲ−２拮抗薬Ｐａｍ３ＣＳＫ４およびＦＳＬ−１またはＴＬＲ−４作動薬ＬＰＳで誘導する。細胞を６時間および２４時間誘導し、上清をＴＮＦ−αの存在について試験した。
【０２４３】
この実験により、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１が、ウサギモデルの動脈形成における使用に適切な治療剤であるか否かを立証する。
【０２４４】
マウスをこれらの研究に使用したが、ウサギが、ヒトの疾患状態についてより関連したモデルとみなされる。しかしながら、ウサギの動脈形成を実施するために、抗体またはペプチドは、ＴＬＲ作動薬によって媒介されるウサギＰＢＭＣ由来の炎症応答を生体外で阻害できることを示されなければならない。
【０２４５】
（実施例５−虚血マウスの機構研究）
以前の実験により、マウス虚血再灌流障害におけるマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１の治療効果が示された。マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１の作用機構をより完全に決定する研究は有益である。マウスで実施した以前の虚血研究と同様のプロトコルを使用するが、免疫組織化学、炎症、好中球、サイトカイン、アポトーシスおよびマトリクスターンオーバーなどの他のパラメーターを試験する。
【０２４６】
この実験により、免疫系で治療的マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１の作用機構が立証される。さらに、薬物投与の最適経路を確立するキメラマウス研究を使用する。抗体／ペプチドが、血液（湿潤単球など）中、または心臓上皮細胞上の免疫細胞で作用することにより、それらの治療効果を有するか否かを立証するために、野生型由来の血液を有するＴＬＲ２ノックアウトマウスを、野生型の心臓を有するＴＬＲ２ノックアウトマウスと比較する。これらの研究の結果は、本発明の治療化合物の投与の静脈内（ｉ．ｖ．）か、冠動脈内経路のいずれかが最適であることを決定する。
【０２４７】
（実施例６  二重介入研究）
虚血再灌流を、ＴＬＲ−２とＴＬＲ４阻害剤との組み合わせを用いて評価する。これは、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１が、この動物モデルにおいて機能を示すことを与えるブタで実施する。以前に実施した研究により、心臓虚血炎症応答におけるＴＬＲ４の役割が明確に示されている。マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１で実施した以前の研究が、ＴＬＲ２を阻害する治療効果を示すため、併用治療アプローチはさらに有益であり得る。
【０２４８】
（実施例７  アテローム性動脈硬化に対するＴＬＲ−２阻害の効果）
実験は、マウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１が特定のマウスモデル（ＡｐｏＥ−／−腱板モデル）において治療効果を有するか否かを評価する。動脈硬化性プラーク形成の内在する一連のイベントにおける最初の工程の１つは、血管損傷部位への単球のリクルートメントである。ＴＬＲファミリーの１０個のメンバーのうち、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、およびＴＬＲ４の発現は、ヒト動脈硬化性プラークにおいて著しく向上する。最近、ＴＬＲ４およびＴＬＲ２のライゲーションは、マウスの動脈において内膜新生を促進することが観測されている。さらに、向上したＴＬＲ２発現は、プラークを不安定化することが示されている。従って、この実験は、プラークサイズおよび形成を減少する際のＯＰＮ−３０１およびＴＬＲ阻害ペプチドの治療可能性を試験し、アテローム性動脈硬化のマウスマデルにおけるプラーク安定性を評価する。
【０２４９】
（実施例８  ＴＬＲ２拮抗化合物でコーティングしたステント）
ステント挿入後、炎症応答は、典型的に、ステント−ステントを移植された被験体の免疫系によって開始される。典型的に、動脈閉塞は、この炎症免疫応答の結果として生じる。これらの実験は、ステントがマウスＩｇＧ１抗ＴＬＲ２抗体ＯＰＮ−３０１または類似のＴＬＲ阻害ペプチドでコーティングされる新規の処置計画の治療可能性を試験する。このアプローチの利点は、炎症の局所部位に非常に高い局所性を与え、内膜新生を防止し、さらなる下流の他のプラークを安定化する可能性がある。
【０２５０】
（実施例９  梗塞面積に対する抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体での処置の効果）
この実施例は、抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体ＯＰＮ−３０１が、マウスにおける梗塞面積を減少させるのに効果的である機構を考える。この実験は、炎症のためのマーカー、アポトーシスの範囲および生存経路の活性化を考える。
【０２５１】
キメラマウス実験は、局所または全身Ｔｏｌｌ様受容体阻害が、梗塞面積を減少するのにより効果的であるか否かを評価する。マウスの対照および実験群を、再灌流の１、２４および７２時間後、上記の目的のために評価する。最後に、処置の前および２８日後に心臓機能を評価する。
【０２５２】
Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）に対する実験的モノクローナル抗体は、虚血の３０分後、続く、再灌流の２４時間後、マウスにおける梗塞面積を著しく減少させる。Ｔｏｌｌ様受容体は、活性化の際の炎症カスケード；サイトカインおよび他の炎症性化学的誘因因子の放出、好中球およびマクロファージの活性化を開始する。ＴＬＲと生存経路ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔとの間のクロストーク（ｃｒｏｓｓ−ｔａｌｋ）も記載されている。
【０２５３】
Ｔｏｌｌ様受容体は、循環（炎症）および常在（臓器特異的）細胞の両方で発現されるため、それらは、依然として扱われるべきＩ／Ｒ障害における有害作用に関与する。この問題はまた、臨床的展望から重要である。なぜなら、Ｔｏｌｌ様受容体阻害は、全身および局所的に生じ得るからである。抗ＴＬＲ２ＯＰＮ−３０１の全身投与は、循環および常在細胞を阻害するが、十分な化合物を必要とする。モノクローナル抗体の局所（すなわち、冠動脈内）注射は、主に、冠状動脈内皮細胞および心筋細胞上のＴＬＲを阻害し、より少ない化合物を必要とする。
【０２５４】
この研究の目的は、ＯＰＮ−３０１投与を用いた梗塞面積減少の内在プロセスを明確にすることである。対照および実験群は、炎症活性、アポトーシスおよび生存経路活性の差異について研究されている。マウスの心臓は、時間依存性生化学プロセスを研究するために、２つの時点で免疫組織化学およびサイトカイン分析のために移植される。キメラマウス実験は、心筋再灌流障害に対して実質または循環細胞によるＴＬＲ２発現の相対的寄与を扱う。さらに、本発明者らは、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）技術を用いた抗ＴＬＲモノクローナル抗体ＯＰＮ−３０１処置の心臓機能に対する効果を扱う。
【０２５５】
（材料および方法）
１群あたり６匹のマウスの群に、再灌流の５分前に尾静脈を介して１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照または実験的抗ＴＬＲ２ＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を投与した。
【０２５６】
処置群は以下のとおりであった：
群                          処置
１．ビヒクル対照            ＰＢＳ
２．実験的ｍＡｂ            １０ｍｇ／ｋｇ  ＯＰＮ３０１
３．陰性対照                １０ｍｇ／ｋｇ  ＩｇＧアイソタイプ
４．偽処置                  ＰＢＳ
５．キメラ合成              １０ｍｇ／ｋｇ  ＯＰＮ３０１
６．キメラ心臓              １０ｍｇ／ｋｇ  ＯＰＮ３０１
【０２５７】
マウスを、免疫組織化学、サイトカインおよびケモカイン分析のために再灌流の１、２４および７２時間後、屠殺した。心臓機能を、生理的食塩水処置、ＯＰＮ−３０１抗ＴＬＲモノクローナル抗体処置および偽処置したマウスで心筋虚血／再灌流障害の前後に評価する。
【０２５８】
（マウスにおける虚血再灌流の手順）
Ｃ５７／ＢＬ６マウス（２５〜３０ｇ）を、３０分の心筋虚血、および２４時間の再灌流または偽処置に供した。簡単に、マウスを、フェンタニル−ドルミカム−メデトミジン（Ｆｅｎｔａｎｙｌ−Ｄｏｒｍｉｃｕｍ−Ｄｏｍｉｔｏｒ）（上述）の混合物で麻酔した。麻酔を維持するために必要な場合、さらなる用量を与えた。マウスをインキュベートし、１００％の酸素を通気した。虚血を、通常配置される左心房の頂部から１ｍｍのＬＣＡの上に配置されたＰＥ−１０チューブの一部で、８〜０絹縫合糸を用いて左冠静脈（ＬＣＡ）を結紮することにより達成した。３０分間の閉塞後、再灌流を、結紮をほどき、ＰＥ−１０チューブを除去することにより、開始した。偽処置したマウスにおいて、絹縫合糸を、ＬＣＡを結紮せずに配置した。
【０２５９】
マウスを、１時間の再灌流期間の間、麻酔下に維持した。その後、心臓を移植し、生理的食塩水で迅速にリンスした。心臓を、梗塞面積にわたって半分に切断した：半分の一方は、免疫組織化学分析のためにパラフィンで包埋した。半分のもう一方の梗塞面積および隔離面積を、再び分離して、タンパク質／ＲＮＡ／ｃＤＮＡ単離のために液体窒素に保存した。
【０２６０】
２４および７２時間、生存しているマウスにおいて、結紮をほどいた後に胸壁を閉じ、その動物を抜管し、体温を、３７℃のウォームプレートの使用により維持した。上述の停止手順を、生存の２４および７２時間後、これらの動物で繰り返した。
【０２６１】
（免疫組織化学分析）
免疫組織化学分析のために、心臓を、一晩、４％のホルモル生理的食塩水で固定し、パラフィンで包埋した。４μｍの断片を切断し、障害の形態および証拠を評価するために、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織学染色は、抗マウスＭＡＣ−３（＃５５０２９２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，クローンＭ３／８４，ラット抗マウスＩｇＧ１）、ＣＤ４５抗体（＃５５０５３９，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，クローン３０−Ｆ１１，ラット抗マウスＩｇＧ２ｂ）および好中球特異的マーカーＧＲ−１（＃Ａｂ３４３４５，Ａｂｃａｍ，クローン７／４，ラット抗マウスＩｇＧ２ａ）を含んだ。適切な単独型二次抗体を、陽性結合を検出するために使用した。一次抗体の特異性を、種およびアイソタイプを適合した抗体を用いることにより調べた。
【０２６２】
核酸化ストレスを、８−ヒドロキシ−２’−デオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）、ＤＮＡに対する酸化ストレスの産物に特異的な免疫染色を用いて評価した。組織断片を、３０分間、１０％の正常ウマ血清、４℃で一晩、０．１％のＰＢＳＡ中のマウス抗８−ＯＨｄＧ（ＯＸＩＳインターネット、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）１：２０、１時間、ビオチン標識したウマ抗マウス（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）１：５００、および１時間、ストレプトアビジン−ＨＲＰＯ１：１０００とともにインキュベートした。最後に、断片を１０分間、Ｈ２Ｏ２−ジアミンベンジジンとともにインキュベートした。８−ＯＨｄＧ陽性核の量を、２００倍の倍率でデジタル画像顕微鏡ソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｏｓ，Ｍｕｎｓｔｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１つの断片につき４つのランダムに選択した領域で定量化した。
【０２６３】
（サイトカイン分析）
ＴＮＦ−α、ＩＬ−１ｂ／６／８、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１についての重要なバイオマーカーの発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した。他の関連する分析は、マクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）−１、および生存経路タンパク質（例えば、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ）のリン酸化反応の評価を含んだ。
【０２６４】
全ＲＮＡを、製造業者の指示書に従ってＴｒｉｐｕｒｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて梗塞および隔離心筋から抽出し、ｃＤＮＡに変換し、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に供した。ＴＮＦα、ＩＣＡＭおよびＶＣＡＭを、Ｓｕｐｅｒａｒｒａｙ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のプライマーを用いてｍＲＮＡレベルで決定した。ＭＣＰ−１、インターロイキンおよびＭＩＰを、市販のサイトフローミックス（ｃｙｔｏｆｌｏｗｍｉｘ）多重アレイ（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ）を用いてタンパク質レベルで（Ｔｒｉｐｕｒｅ単離、Ｒｏｃｈｅにも続いて）決定した。Ａｋｔのリン酸化およびＯＰＮ−３０１モノクローナル抗体での阻害の際のＴＬＲ２タンパク質の量を、ウェスタンブロッティングを用いて定量化する。
【０２６５】
（キメラマウス実験）
大腿骨および脛骨を、１０％のＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）を含む滅菌ＰＢＳでフラッシュすることにより、全骨髄を雄性ＴＬＲ２＋／＋またはＴＬＲ２−／−マウスから回収した。受容体の短期間の生存を確実にするために、雄性ＴＬＲ２＋／＋またはＴＬＲ２−／−マウス由来の同系脾臓の単細胞の懸濁液を、４０μｍの細胞濾過器を通して１０％のＦＣＳ、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むＰＢＳにおいて脾臓を破砕することによって得た。雄性ＴＬＲ２＋／＋およびＴＬＲ２−／−マウスに、ヒトのコンピューター断層撮影において７Ｇｙの１放射線量で致死的な放射線を浴びせた。放射後、滅菌ＰＢＳ中の５×１０６のＴＬＲ２＋／＋またはＴＬＲ２−／−骨髄細胞および２×１０５のＴＬＲ２＋／＋またはＴＬＲ２−／−の脾臓細胞を、受容体の放射線照射したマウスの尾静脈に注入した。マウスを６週間、マイクロアイソレータケージに維持して、骨髄提供の移植を完了し、その後、心筋Ｉ／Ｒ障害を誘発させ、梗塞面積を、ＴＴＣ染色を用いて２４時間後に測定した。上記の免疫組織化学分析を用いて病態生理学評価も実施できる。
【０２６６】
（磁気共鳴映像法）
高分解磁気共鳴映像法（ＭＲＩ，９．４Ｔ，Ｂｒｕｋｅｒ，Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による心臓容積および機能の経時的評価を、心筋虚血／再灌流障害の前および２８日後に実施した。スライス間の１．０ｍｍの間隔で長軸および短軸の画像を得て、拡張末期容積（ＥＤＶ）、収縮末期容積（ＥＳＶ）、１回拍出量（ＳＶ）および心拍量（ＣＯ）を計算するために使用した。駆出率（ＥＦ）を１００＊（ＥＤＶ−ＥＳＶ）／ＥＤＶとして計算し、一方、ＳＶはＥＤＶとＥＳＶとの間の絶対差である。心拍出量は、１分あたりのＳＶ＊平均心拍として計算される１分以内の全容積の拍出量である。全てのＭＲＩデータを、Ｑｍａｓｓデジタル画像ソフトウェア（Ｍｅｄｉｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて解析した。
【０２６７】
（結果）
Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）  ｖ１５．０用のＳＰＳＳソフトウェアパッケージを用いることによってデータを解析し、統計的分析を実施した。
【０２６８】
（ｉ）梗塞後のＭＲＩ心臓機能
ベースラインでの差は存在しない。梗塞の２８日後、ＯＰＮ−３０１で処置したマウスにおいて、拡張末期容積および収縮末期容積（ＥＤＶ、ＥＳＶ）は小さく、１回拍出量（ＳＶ）および駆出率（ＥＦ）は大きいため、ＯＰＮ−３０１抗ＴＬＲ２モノクローナル抗体で処置したマウスの心臓機能は、生理的食塩水処置に比べて良好である。左心室（左心室重量）は群の間で異ならなかった（それは良い状態である、なぜなら、他の向上した機能はより大きな心臓によって引き起こされ得るからである）。
【０２６９】
しかしながら、偽群は分析から排除した。なぜなら、ベースラインにおいて、それらは他の群と比べて非常に異なっていたからである。それは生物学的変化によって説明できない。本発明者らは、計算の誤差またはマウスの異なるバッチ／バックグランドがこのことに関与し得ると考えている。本発明者らは、偽処置について新しいバッチのＣ５７ＢＩ６Ｊマウスの誤差または単に順序を調べる。
【０２７０】
【表７】
0005576275.tif 000008
【０２７１】
【表８】
0005576275.tif 000009
【０２７２】
（ｉｉ）キメラマウス実験の結果
キメラ化は成功したことを示した。１匹のマウスは、非常に低い梗塞のため分析で排除した。梗塞面積の減少を両方の群で観測した。しかしながら、血液中にＴＬＲ２を欠くマウスはより大きな減少を示した。ＴＬＲ２に陽性の循環細胞は、再灌流障害により関与しているように見える。梗塞面積の減少の差は、小さい試料のサイズのため、統計的差異に到達していなかった。
【０２７３】
【表９】
0005576275.tif 000010
【０２７４】
【表１０】
0005576275.tif 000011
【０２７５】
表９に示す結果を、図１０および１１にさらに例示する。図１０は、左心室のパーセントとしてリスク領域（ＡＡＲ＿ＬＶ）を示す。図１１は、リスク領域のパーセントとして梗塞面積（ＩＳ＿ＡＡＲ）を示す。
【０２７６】
本明細書で引用した全ての文書は、参照により本明細書に援用される。本発明の記載した実施形態に対する様々な変更およびバリエーションは、本発明の範囲から逸脱せずに当業者に明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関して記載されているが、特許請求される本発明はそのような特定の実施形態に極度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者に明白である本発明を実施する記載される方法の様々な変更は、本発明に含まれると意図されるべきである。
【図１】
0005576275.tif 000012
【図２】
0005576275.tif 000013
【図３】
0005576275.tif 000014
【図４】
0005576275.tif 000015
【図５】
0005576275.tif 000016
【図６】
0005576275.tif 000017
【図７】
0005576275.tif 000018
【図８】
0005576275.tif 000019
【図９】
0005576275.tif 000020
【図１０】
0005576275.tif 000021
【図１１】
0005576275.tif 000022
【図１２】
0005576275.tif 000023
【図１３】
0005576275.tif 000024
【図１４】
0005576275.tif 000025
【図１５】
0005576275.tif 000026
【図１６】
0005576275.tif 000027
【図１７】
0005576275.tif 000028
【図１８】
0005576275.tif 000029
【図１９】
0005576275.tif 000030
【図２０】
0005576275.tif 000031
【図２１】
0005576275.tif 000032
【図２２】
0005576275.tif 000033
【図２３】
0005576275.tif 000034
【図２４】
0005576275.tif 000035
【配列表】
0005576275000001.app