(57)【要約】  本発明の課題は、従来のＨＢｓ抗原の分析方法では、測定値が低くなる検体及び偽陰性となる検体について、ＨＢｓ抗原の量をより正確に測定できるようにすることである。  本発明のＨＢｓ抗原の分析方法においては、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の２６〜８０番のアミノ酸残基からなる第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉プローブ、及び９８〜１５６番のアミノ酸残基からなる第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉プローブを捕捉プローブとして使用し、前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出プローブ及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出プローブを検出プローブとして使用する。
2008053901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉プローブ及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉プローブを捕捉プローブとして使用し、前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出プローブ及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出プローブを検出プローブとして使用することを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法。
【請求項２】
前記内側捕捉プローブが結合するエピトープと前記内側検出プローブが結合するエピトープが異なり、前記外側捕捉プローブが結合するエピトープと外側検出プローブが結合するエピトープが異なる、請求項１に記載のＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法。
【請求項３】
前記内側捕捉プローブが、配列番号１で表されるアミノ酸配列における５１〜６０番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記外側捕捉プローブが配列番号１で表されるアミノ酸配列における１１１〜１３０番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記内側検出プローブが、配列番号１で表されるアミノ酸配列における５１〜６９番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記外側検出プローブが配列番号１で表されるアミノ酸配列における９８〜１５６番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブである、請求項１又は２に記載のＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法。
【請求項４】
前記プローブが、モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法。
【請求項５】
前記内側捕捉モノクローナル抗体がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１１７抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００抗体及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記内側検出モノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１１７抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００抗体及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記外側捕捉モノクローナル抗体がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１抗体及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記外側検出モノクローナル抗体がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１抗体及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であって、前記内側捕捉モノクローナル抗体と前記内側検出モノクローナル抗体とが異なる抗体であり、前記外側捕捉モノクローナル抗体と前記外側検出モノクローナル抗体とが異なる抗体である、請求項４に記載のＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法。
【請求項６】
Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉プローブ及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉プローブを捕捉プローブとして含む抗体固相担体、及び前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出プローブ及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出プローブを検出プローブとして含む試薬を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析キット。
【請求項７】
国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００であるマウスハイブリドーマ又は国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７であるマウスハイブリドーマ。
【請求項８】
国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００であるマウスハイブリドーマ、及び国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７であるマウスハイブリドーマからなる群から選択されるハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法及びＢ型肝炎ウイルスｓ抗原に結合するモノクローナル抗体に関する。本発明によれば、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原（以下、ＨＢｓ抗原と称することもある）の第１内側領域ペプチドに結合するプローブ及び第２外側領域ペプチドに結合するプローブ、特にはモノクローナル抗体を用いてＨＢｓ抗原を測定することにより、被検試料（以下、検体と称することもある）中のＨＢｓ抗原を正確に分析することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
輸血に用いる血液は、しばしば輸血後感染症の原因となることがある。Ｂ型肝炎ウイルス（以下、ＨＢＶと称することがある）は、輸血後肝炎の原因ウイルスであり、手術時の輸血等によって感染する。そのため、輸血用血液のスクリーニングによって、血液のＨＢＶへの感染の有無を診断することは極めて重要である。このＨＢＶの感染を診断する方法として、ＨＢｓ抗原を検出及び定量するＨＢｓ抗原の分析方法が広く用いられている。【０００３】
ＨＢｓ抗原は、感染性を有するＨＢＶ粒子表面の主要構成外被蛋白であり、ＨＢＶ−ＤＮＡを含むコア粒子を包み込んでいる肝細胞由来の脂質二重膜に包含されている。また、ＨＢＶ感染者の血液中には、コア粒子が無くＨＢｓ抗原からなる感染性のない小型球形粒子や管状粒子も存在する。小型球形粒子は血中に最も多量に存在しており、ＨＢＶ粒子が１〜数個に対して約１０００個の比率で観察される。現在市販されているＨＢｓ抗原検査薬は、主にこの小型球形粒子の形態にあるＨＢｓ抗原を検出するものである。【０００４】
ＨＢｓ抗原は、全長２２６アミノ酸残基からなる脂質二重膜を４回貫通する膜蛋白である。ＨＢｓ抗原の膜貫通構造モデルは完全に解明されているわけではないが、Ｈｏｗａｒｄらは、ＨＢｓ抗原は、ＨＢｓ抗原のＮ末側の１〜１１番のアミノ酸残基からなる脂質二重層の第１外側（ＥＲルーメン側）領域、１２〜２８番のアミノ酸残基からなる脂質二重膜を貫通する疎水性の第１膜貫通領域、２９〜８０番のアミノ酸残基からなる脂質二重層の第１内側領域、８１〜９７番のアミノ酸残基からなる疎水性の第２膜貫通領域、９８〜１５６番のアミノ酸残基からなる親水性の第２外側（ＥＲルーメン）領域、そして１５７番目以降の疎水性の第３膜貫通領域、第２内側領域、第４膜貫通領域、及び第３外側（ＥＲルーメン）領域から形成されると提唱している（非特許文献１：図１）。【０００５】
従来のＨＢｓ抗原の分析方法としては、ＨＢｓ抗原の共通抗原決定基ａに結合する抗体を使用する方法が一般的であった。共通抗原決定基ａは、ＨＢｓ抗原の第２外側（ＥＲルーメン）領域、すなわちウイルス粒子表面に局在している９８番目から１５６番目のアミノ酸残基の１１０〜１５６番のアミノ酸残基からなるペプチド上に位置している。この共通抗原決定基ａは複雑な高次構造からなり、その上に、少なくとも４つのエピトープが存在すると報告されている（非特許文献２）。【０００６】
一方、前記の抗原決定基ａに結合する抗体を使用するＨＢｓ抗原の分析方法は、ＨＢｓ抗原のａ領域にアミノ酸変異を有するＨＢＶを検出できないことがある。そのため、最近、２６〜８０番のアミノ酸残基からなる脂質二重層の第１内側領域のペプチドに結合する抗体を使用するＨＢｓ抗原の分析方法が開発された（特許文献１）。
【特許文献１】国際公開第２００６／０３３３６８号パンフレット
【非特許文献１】ハワードら（Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．）「バイラル・ヘパタイティス・アンド・リバー・ディジーズ（Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ）（ｅｄ  ｂｙ  Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ  ＡＪ，Ａｌａｎ  Ｒ）」（米国）リス・インク・ニューヨーク（Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，）１９８８年、ｐ．１０９４−１１０１
【非特許文献２】岡本宏明「日本臨床、分子肝炎ウイルス病学  基礎・臨床・予防  下巻  Ａ，Ｂ，Ｄ，Ｅ型肝炎ウイルス編」、平成７年１０月２６日発行、ｐ．２１２−２２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＨＢＶの急性感染の患者においては、感染初期においてＨＢｓ抗原が陽性であるが、その後ＨＢｓ抗体が陽性となり、ＨＢｓ抗原が陰性となる。患者の血液中のＨＢｓ抗体が陽性の場合、前記の共通抗原決定基ａに結合する抗体を用いた方法でＨＢｓ抗原を分析すると、患者のＨＢｓ抗体により分析方法に使用する抗体のＨＢｓ抗原への結合が阻害され、測定値が低くなることがわかった。また、２６〜８０番のアミノ酸残基からなる脂質二重層の第１内側領域のペプチドに結合する抗体を使用するＨＢｓ抗原の分析方法を用いて、ＨＢｓ抗原を測定したところ、ウイルスが血液中に存在するにもかかわらず分析することができない偽陰性の検体が存在することがわかった。
本発明者らは、これらの従来のＨＢｓ抗原の分析方法では、測定値が低くなる検体及び偽陰性となる検体について、ＨＢｓ抗原の量を正確に測定できるようにするために、鋭意研究を重ねた結果、ＨＢｓ抗原の特定の領域のペプチドを認識する抗体を組合せることによって、偽陰性の発生を無くし、ＨＢｓ抗原の量を正確に測定することができるＨＢｓ抗原の分析方法を見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
従って、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉プローブ及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉プローブを捕捉プローブとして使用し、前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出プローブ及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出プローブを検出プローブとして使用することを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法に関する。【０００９】
本発明によるＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法の好ましい態様においては、前記内側捕捉プローブが結合するエピトープと前記内側検出プローブが結合するエピトープが異なり、前記外側捕捉プローブが結合するエピトープと外側検出プローブが結合するエピトープが異なるものである。
本発明によるＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法の別の好ましい態様においては、前記内側捕捉プローブが、配列番号１で表されるアミノ酸配列における５１〜６０番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記外側捕捉プローブが配列番号１で表されるアミノ酸配列における１１１〜１３０番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記内側検出プローブが、配列番号１で表されるアミノ酸配列における５１〜６９番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブであり、前記外側検出プローブが配列番号１で表されるアミノ酸配列における９８〜１５６番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブである。
本発明によるＢ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法の別の好ましい態様においては、前記プローブが、モノクローナル抗体又はその抗体フラグメントであり、特には、内側捕捉モノクローナル抗体がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１１７抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００抗体及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記内側検出モノクローナル抗体が、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１１７抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００抗体及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記外側捕捉モノクローナル抗体がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１抗体及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であり、前記外側検出モノクローナル抗体がＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３抗体、ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１抗体及びＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７抗体からなる群から選択されるモノクローナル抗体であって、前記内側捕捉モノクローナル抗体と前記内側検出モノクローナル抗体とが異なる抗体であり、前記外側捕捉モノクローナル抗体と前記外側検出モノクローナル抗体とが異なる抗体である。【００１０】
また、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉プローブ及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉プローブを捕捉プローブとして含む抗体固相担体、及び前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出プローブ及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出プローブを検出プローブとして含む試薬を含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析キットにも関する。【００１１】
更に、本発明は、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００であるマウスハイブリドーマ又は国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７であるマウスハイブリドーマにも関する。【００１２】
更に、本発明は、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１であるマウスハイブリドーマ、国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００であるマウスハイブリドーマ又は国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７であるマウスハイブリドーマ、及びこれらのハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体にも関する。【００１３】
更に、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉プローブ及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉プローブ、被検試料、並びに前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出プローブ及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出プローブを接触させる接触工程；及び検出プローブのシグナルを検出する検出工程を含む、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法に関する。
なお、本明細書における「分析」には、分析対象化合物の存在の有無を判定する「検出」と、分析対象化合物の存在量を決定する「定量」との両方が含まれる。
また、本発明による「Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の分析方法」は、「Ｂ型肝炎ウイルスの診断方法」として用いることが可能である。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、従来のＨＢｓ抗原の分析方法では偽陰性となる検体のＨＢｓ抗原を分析することが可能である。また、従来の抗原の分析方法では、測定値が低くなる検体のＨＢｓ抗原の量を正確に分析することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＨＢｓ抗原の膜貫通モデルの模式図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明のＨＢｓ抗原の分析方法は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉プローブ、及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉プローブを捕捉プローブとして使用し、前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出プローブ及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出プローブを検出プローブとして使用する。【００１７】
本発明のＨＢｓ抗原の分析方法で測定されるＨＢｓ抗原は、脂質二重膜を４回貫通する２２６アミノ酸残基からなる膜タンパク質である。ＨＢＶにはいくつかの遺伝子型、例えば、遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧがあることが知られており、その遺伝子型によって、ＨＢｓ抗原のアミノ酸配列が異なっている。更に、ウイルス株によっても、遺伝子変異、特にＨＢＶ粒子の脂質二重膜の外側１１０〜１５６番の領域のアミノ酸配列には、多くの変異があることが知られている。本発明のＨＢｓ抗原の分析方法により測定されるＨＢｓ抗原は、これらのヘテロジェナイティーのあるアミノ酸配列を有するＨＢｓ抗原を測定対象とし、本発明の分析方法によりそれらを測定することが可能である。【００１８】
図１にＨｏｗａｒｄらの提唱するＨＢｓ抗原の膜貫通構造モデルを示す。第１内側領域ペプチドは、例えば、Ｈｏｗａｒｄらの提唱するＨＢｓ抗原の膜貫通構造モデルにおける２９〜８０番のアミノ酸残基からなる脂質二重層の第１内側領域に相当するものであるが、ＨＢｓ抗原の２９〜８０番のアミノ酸番号で特定されるものではなく、ＨＢｓ抗原のアミノ酸の変異、欠失及び／又は挿入によりアミノ酸番号は異なることがある。また、第２外側領域ペプチドは、例えば、膜貫通構造モデルにおける９８〜１５６番のアミノ酸残基からなる親水性の第２外側（ＥＲルーメン）領域に相当するものであるが、ＨＢｓ抗原の９８〜１５６番のアミノ酸番号で特定されるものではなく、ＨＢｓ抗原のアミノ酸の変異、欠失及び／又は挿入によりアミノ酸番号は異なることがある。【００１９】
第１内側領域ペプチドとしては、好ましくは、ＨＢｓ抗原の２６〜８０番のアミノ酸残基からなるＨＢＶ粒子の脂質二重膜の内側に存在する親水性ペプチドである。その標準的なアミノ酸配列は、配列番号１の２６〜８０番のアミノ酸配列である。しかしながら、本明細書における第１内側領域ペプチドは、ＨＢｓ抗原のＮ末側から第１番目の脂質二重層の内側に存在するペプチドであればＨＢｓ抗原の配列番号１の２６〜８０番のアミノ酸配列からなるペプチドに限定されず、例えば、Ｎ末側からのアミノ酸の番号が異なるペプチドや、配列番号１の２６〜８０番のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換（変異）、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドを含むことができる。
また、第２外側領域ペプチドは、好ましくは、ＨＢｓ抗原の９８〜１５６番のアミノ酸残基からなるＨＢＶ粒子の脂質二重膜の外側のＥＲルーメンに存在する親水性のペプチドである。その標準的なアミノ酸配列は、配列番号１の９８〜１５６番のアミノ酸配列である。しかしながら、本明細書における第２外側領域ペプチドは、ＨＢｓ抗原のＮ末側から第２番目の脂質二重層の外側（ルーメン側）に存在するペプチドであればＨＢｓ抗原の配列番号１の９８〜１５６番のアミノ酸配列からなるペプチドに限定されず、例えば、Ｎ末側からのアミノ酸の番号が異なるペプチドや、配列番号１の９８〜１５６番のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換（変異）、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドを含むことができる。【００２０】
本発明で使用することのできる内側捕捉プローブ及び内側検出プローブは、前記第１内側領域ペプチドを認識し、結合することのできるプローブであれば、特に限定されないが、例えば、配列番号１の２６〜８０番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブ及び配列番号１の２６〜８０番のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換（変異）、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブを含むことができる。より具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸における３１〜５０番のアミノ酸配列からなるペプチド、５１〜６０番のアミノ酸配列からなるペプチド、５１〜６９番のアミノ酸配列からなるペプチド、５１〜７０番のアミノ酸配列からなるペプチド、２１〜４０番のアミノ酸配列からなるペプチド、７１〜９０番のアミノ酸配列からなるペプチド、及び６１〜８０番のアミノ酸配列からなるペプチド、又はそれらのペプチドの一部のアミノ酸が置換されたペプチド等に結合するプローブが含まれる。【００２１】
本発明で使用することのできる外側捕捉プローブ及び外側検出プローブは、前記第２外側領域ペプチドを認識し、結合することのできるプローブであれば、特に限定されないが、例えば、配列番号１の９８〜１５６番のアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブ及び配列番号１の９８〜１５６番のアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が置換（変異）、欠失及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドに結合するプローブを含むことができる。より具体的には、配列番号１で表されるアミノ酸における１２１〜１３０番のアミノ酸配列からなるペプチド、１５１〜１７０番のアミノ酸配列からなるペプチド、１１１〜１３０番のアミノ酸からなるペプチド、１２１〜１４０番のアミノ酸からなるペプチド、９８〜１５６番のアミノ酸配列からなるペプチド、又はそれらのペプチドの一部のアミノ酸が置換されたペプチド等に結合するプローブが含まれる。更に、外側捕捉プローブが結合するエピトープは、複雑な高次構造からなる構造エピトープ、例えば、共通抗原決定基ａも含んでいる。従って、配列番号１の９８〜１５６番のアミノ酸配列のみからなる部分ペプチドでは形成することができず、その部分ペプチドより長いペプチド、例えば、ＨＢｓ抗原の全長である２２６アミノ酸残基からなる全長ペプチドによって形成されるエピトープも存在する。本発明で使用することのできる外側捕捉プローブ及び外側検出プローブは、例えば、配列番号１のアミノ酸における９８〜１５６番のアミノ酸配列のみからなる部分ペプチドより長いペプチドによって形成され、９８〜１５６番のアミノ酸配列からなる領域に存在する構造エピトープ（以下、「第２外側領域の領域構造エピトープ」と称する）に結合することのできるプローブを含む。【００２２】
本発明で使用することのできるプローブとしては、第１内側領域ペプチド、第２外側領域ペプチド又は第２外側領域の領域構造エピトープと結合することのできる分子であれば、特に限定されない。例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、レセプター、又はアナログなどを挙げることができるが、好ましくはモノクローナル抗体又はその抗体フラグメントである。【００２３】
モノクローナル抗体の抗体フラグメントとしては、第１内側領域ペプチド、第２外側領域ペプチド又は第２外側領域の領域構造エピトープと結合する抗原結合領域を含む抗体フラグメントであれば、限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ等を挙げることができる。これらの抗体フラグメントは、例えば、本発明のモノクローナル抗体を常法によりタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン又はパパイン等）によって消化し、続いて、常法のタンパク質の分離精製の方法により精製することで、得ることができる。
以下、プローブとして抗体、特にはモノクローナル抗体を用いた態様について説明を行うが、その他のプローブを用いても、本発明のＨＢｓ抗原の分析方法を同様に実施することが可能である。【００２４】
ＨＢｓ抗原の分析方法の測定原理は、ＨＢｓ抗原を捕捉抗体と検出抗体を使用して検出する方法であれば、特に限定されないが、好ましくは、サンドイッチ法である。サンドイッチ法としては、２ステップ法であるフォワードサンドイッチ法、リバースサンドイッチ法、及び１ステップ法を挙げることができる。
ＨＢｓ抗原の分析方法は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉抗体及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉抗体、被検試料、並びに前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出抗体及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出抗体を接触させる接触工程；及び検出抗体のシグナルを検出する検出工程を含むことができる。
また、前記接触工程は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉抗体及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉抗体並びに被検試料を接触させる第１接触工程と、第１接触工程で形成された抗原抗体複合体及び前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出抗体及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出抗体を接触させる第２接触工程に分けて行うことも可能である。【００２５】
より具体的には、フォワードサンドイッチ法は以下のように行うことができる。まず、マイクロプレートやビーズなどの不溶性担体に、ＨＢｓ抗原と結合する捕捉抗体を固相化する。次に、捕捉抗体や不溶性担体への非特異的な吸着を防ぐために、適当なブロッキング剤（例えば、牛血清アルブミンやゼラチン等）で不溶性担体のブロッキングを行う。捕捉抗体が固相化されたプレートやビーズに、測定するＨＢｓ抗原が含まれる被検試料を一次反応液と一緒に加え、捕捉抗体とＨＢｓ抗原を接触させ、結合させる（一次反応工程）。この後、捕捉抗体に結合しなかった抗原や夾雑物を適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含むリン酸緩衝液）で洗浄する。次に、捕捉されたＨＢｓ抗原を認識する抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素が結合した標識抗体を添加し、捕捉された抗原に標識抗体を結合させる（二次反応工程）。この反応により、捕捉抗体−抗原−標識抗体の免疫複合体がマイクロプレート等の担体上に形成される。結合しなかった標識抗体を洗浄液で洗浄し、標識抗体の酵素に対する発色基質や発光基質を添加し、酵素と基質を反応させることによりシグナルを検出する。【００２６】
本発明のＨＢｓ抗原の分析方法において使用する捕捉抗体とは、被検試料中のＨＢｓ抗原を捕捉する抗体であるが、前記の不溶性担体を用いたサンドイッチ法では、不溶性担体に固相化される固相抗体である。この捕捉抗体は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉抗体、及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉抗体を組み合わせて使用する。この２つの抗体に加えて、更に他の抗体を追加して捕捉抗体として使用することも可能である。【００２７】
本発明のＨＢｓ抗原の分析方法において使用する検出抗体とは、捕捉抗体によって捕捉された被検試料中のＨＢｓ抗原を検出する抗体であるが、前記の不溶性担体を用いたサンドイッチ法では、酵素などによって標識された標識抗体である。この検出抗体は、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出抗体、及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出抗体を組み合わせて使用する。この２つの抗体に加えて、更に他の抗体を追加して検出抗体として使用することも可能である。【００２８】
Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する内側捕捉抗体と内側検出抗体は、それらの結合するエピトープが異なる抗体が好ましい。「エピトープが異なる」とは、エピトープが完全に一致しないことを意味する。例えば、２つの抗体が同じモノクローナル抗体である場合や、２つの抗体がエピトープ阻害試験により、完全に阻害される抗体である場合は、２つの抗体のエピトープが完全に一致している。内側捕捉抗体エピトープと内側検出抗体のエピトープが一部重複している場合でも、多くの場合、本発明のＨＢｓ抗原の分析方法において使用することができる。【００２９】
また、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の９８〜１５６番のアミノ酸残基からなる第２外側領域ペプチドに結合する外側捕捉抗体と外側検出抗体も、それらの結合するエピトープが異なる抗体が好ましい。「エピトープが異なる」とは、エピトープが完全に一致しないことを意味する。例えば、２つの抗体が同じモノクローナル抗体である場合や、２つの抗体がエピトープ阻害試験により、完全に阻害される抗体である場合は、２つの抗体のエピトープが完全に一致している。内側捕捉抗体エピトープと内側検出抗体のエピトープが一部重複している場合でも、多くの場合、本発明のＨＢｓ抗原の分析方法において使用することができる。【００３０】
本発明のプローブ、特にはモノクローナル抗体やその抗体フラグメントの認識するエピトープは、連続するアミノ酸残基から構成される連続エピトープ、及びＨＢｓ抗原のシート構造やヘリックス構造によって形成される連続でないアミノ酸の組み合わせから構成される構造エピトープ（不連続エピトープ）が含まれる。【００３１】
抗体を標識する酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びルシフェラーゼなどを挙げることができる。また酵素以外にも、標識物質として、アクリジニウム誘導体などの発光物質、ユーロピウムなどの蛍光物質、Ｉ１２５などの放射性物質などを使用することができる。また、標識物質に会わせて基質や発光誘導物質を適宜選択することができる。
更に、本発明における標識抗体は、検出マーカーとしてハプテンや低分子量のペプチド、レクチンなどの抗原抗体反応のシグナルの検出に利用できる物質を結合させた抗体も含む。ハプテンにはビオチン、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ＦＩＴＣなどが含まれる。例えばビオチンを抗体に結合させ、プローブ複合体を作成した場合、ビオチンに親和性のあるアビジンにＨＲＰなどの酵素、フルオレセインなどの蛍光物質、又はアクリジニウム誘導体などの発光物質を標識し、プローブ複合体と反応させ発色、蛍光、発光などによりシグナルを検出することができる。【００３２】
抗体の標識方法は、特に限定されず、従来公知の方法を用いることができるが、例えば、抗体を酵素などの標識物で直接標識する方法、デキストランなどの高分子化合物に抗体と酵素などの標識物を結合させる方法、標識抗体をデキストランなどの高分子化合物に結合させる方法などが含まれる。【００３３】
本発明の抗体には、動物のポリクローナル抗体及びヒトやマウスのモノクローナル抗体を含むが、抗体を得るために動物を免疫する方法、及びモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得るための方法は、ＨＢｓ抗原やＨＢｓ抗原の部分ペプチドを免疫原として用いることを除いて、公知の方法によって実施することができ、例えば、続生化学実験講座（日本生化学会編）、又は免疫生化学研究法（日本生化学会編）に記載の方法に従って、行うことができる。免疫用のＨＢｓ抗原は、ウイルス粒子、又はウイルス粒子からＨＢｓ抗原を精製し、用いることができる。また、ＨＢｓ抗原、第１内側領域ペプチド及び第２外側領域ペプチドは、例えば、それらの抗原を遺伝子組み換えにより大腸菌で発現させ、精製することによって得ることができる。更に、ＨＢｓ抗原の部分ペプチドは、化学合成によって調製することができ、例えば、Ｆｍｏｃ固相合成法、Ｂｏｃ固相合成法によって合成できる。合成したペプチドは、ＨＰＬＣ等の公知の方法で精製することができ、末端のアミノ酸をシステインとし、そのＳＨ基を利用して、ペプチドを担体タンパク質に結合させ、免疫原として使用することもできる。【００３４】
ＨＢｓ抗原、第１内側領域ペプチド及び第２外側領域ペプチドを免疫原として用いて、動物を免疫することによって、本発明の抗体を取得することができる。免疫に用いる動物は、特に限定されないが、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、トリ、ウシ、ウマなどを用いることができる。ＨＢｓ抗原、第１内側領域ペプチド及び第２外側領域ペプチドを、例えば、等量のフロイントの完全アジュバント又はＴｉｔｅｒ−Ｍａｘ  ｇｏｌｄ（Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ社）と乳化混合し、ウサギの皮下や、マウスの腹腔内に投与する。以後、１〜２週間間隔で、同様の免疫操作を行う。このようにして免疫した動物から採血し、血清又は血漿とすることにより、本発明の抗体を調製することができる。【００３５】
本発明のモノクローナル抗体を産生する本発明のハイブリドーマは、前記の免疫操作を行った動物から取得することができる。例えば、マウスに数回の免疫操作を行った２週後に、尾静脈からリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）等に溶解したＨＢｓ抗原、第１内側領域ペプチド及び第２外側領域ペプチドを接種する。その２〜３日後に、マウスから抗体を産生するリンパ球を含む脾臓を無菌的に摘出する。このリンパ球を、例えば、ミエローマ細胞と細胞融合させることにより、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立することが可能である。【００３６】
細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールの存在下で、リンパ球及びミエローマ細胞を融合させることによって行うことができる。ミエローマ細胞は、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナ−ゼ欠損のようなマーカーを有する公知の細胞を用いることができる。具体的には、例えば、ｐ３・ＮＳ−１／１・Ａｇ４．１又はＳＰ２／０−Ａｇ１４などの細胞を挙げることができる。融合した細胞は、選択培地、例えばＨＡＴ培地を用いて、融合しなかった細胞を死滅させることによって選択する。
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清中の抗体産生の有無をスクリーニングする。スクリーニングは、ＨＢｓ抗原、第１内側領域ペプチド及び第２外側領域ペプチドに対する特異抗体の産生を固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）などを用いて測定することによって実施することができる。目的の抗体を分泌しているハイブリドーマのクローンを選択し、更に限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことによって、モノクローナル抗体のクローン性を保証することができる。このようにして、本発明の抗体を産生するハイブリドーマを選択することができ、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株ＨＢｓ１２１〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７〕、ＨＢｓ１２３〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８〕、ＨＢｓ１３６〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９〕、ＨＢｓ１６３〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００〕、ＨＢｓ６０５Ｃ３〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１〕、ＳＦ１１１〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２〕、ＳＦ１２４ＣＳ〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３〕は、平成１８年１０月１２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国際寄託された。また、ハイブリドーマ細胞株６Ｇ６〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１１７〕は、平成１６年９月９日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに国際寄託された。
なお、本明細書において、ハイブリドーマ細胞株から産生された抗体は、そのハイブリドーマ細胞株の名称又は国際受託番号に「抗体」を付けた名称で表す。例えば、ハイブリドーマ細胞株ＨＢｓ１２１から産生された抗体は「ＨＢｓ１２１抗体」又は「ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７抗体」と称する。【００３７】
本発明のハイブリドーマは、公知の任意の培地、例えば、ＲＰＭＩ１６４０で継代培養することができる。本発明のモノクローナル抗体は、このハイブリドーマを培養することによって、調製することができるが、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ウシ胎児血清を加え、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養することによって、培養上清中に抗体が産生される。また、プリスタンで前処理したマウスの腹腔内にハイブリドーマを接種し、１０〜２０日後に、腹水を回収することによって、腹水中に抗体を産生させることが可能である。本発明の抗体は、公知の方法により精製することができるが、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＧ又はＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いた精製法、ＨＢｓ抗原を結合させたアフィニティーカラムを用いる方法、又はイオン交換カラムを用いる方法などで精製することができる。【００３８】
得られたモノクローナル抗体の認識するエピトープは、ＨＢｓ抗原由来の配列から、作製した組換え抗原、第１内側領域ペプチド、第２外側領域ペプチド又は化学合成した１０〜２０アミノ酸程度の合成ペプチドを用いて、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によって、決定することができる。本発明の各ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体のエピトープは、遺伝子型の異なるＨＢｓ抗原のアミノ酸配列に基づき１０残基ずつオーバーラップし、化学合成した２０アミノ酸残基からなるペプチドに対する反応性によって決定した。ＨＢｓ１２１抗体は、遺伝子型Ｃ及びＤの１５１〜１７０番のアミノ酸残基からなるペプチドに結合し、遺伝子型Ａ及びＢの１５１〜１７０番のアミノ酸残基からなるペプチドには結合しない抗体である。ＨＢｓ１２３抗体は遺伝子型Ａ〜Ｄの３１〜５０番のアミノ酸残基からなるペプチドに結合する抗体である。ＨＢｓ１３６抗体は遺伝子型Ａ、Ｃ、及びＤの１１１〜１３０番のアミノ酸残基からなるペプチドに結合する抗体である。ＨＢｓ１６３抗体は遺伝子型Ａ〜Ｄの３１〜５０番のアミノ酸残基からなるペプチドに結合する抗体である。ＳＦ１１１抗体は遺伝子型Ａ、Ｂ及びＣの５１〜６９番のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する抗体である。一方、ＨＢｓ６０５Ｃ３抗体、及びＳＦ１２４ＣＳ抗体は、いずれの２０アミノ酸残基からなるペプチドとも結合しなかった。ＨＢｓ６０５Ｃ３抗体及びＳＦ１２４ＣＳ抗体は、１〜２２６番のアミノ酸残基からなるＨＢｓ抗原とは結合し、９８〜１５６番のアミノ酸残基からなるペプチドと結合するため、Ｂ型肝炎ウイルスｓ抗原の構造エピトープ、例えば、共通抗原決定基ａを認識する抗体である。また、後述の実施例で使用している６Ｇ６抗体は、５１〜６０番のアミノ酸残基からなるペプチドに結合する抗体であり、具体的には、ＨＢｓ抗原の４１〜６０番のアミノ酸残基からなるペプチド、及び５１〜７０番のアミノ酸残基からなるペプチドと結合する。【００３９】
本発明のサンドイッチ法によるＨＢｓ抗原の分析キットは、ＨＢｓ抗原の第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側捕捉プローブ及び第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側捕捉プローブが固相化された不溶性担体（例えば、９６ウェルプレート又はビーズ）、及び前記第１内側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの内側検出プローブ及び前記第２外側領域ペプチドに結合する少なくとも１つの外側検出プローブを検出プローブとして含むＨＢｓ抗原の分析試薬を含むことができる。ＨＢｓ抗原の分析試薬は溶液の状態で提供されてよいが、凍結乾燥させた粉末状態で提供されてもよい。本発明のＨＢｓ抗原の分析キットは、Ｂ型肝炎ウイルス抗原、他の抗Ｂ型肝炎ウイルス抗体、使用説明書などを含むことができる。
【実施例】
【００４０】
以下に実施例及び比較例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００４１】
《実施例１》モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの樹立
（Ａ）ＨＢｓ抗原
ＨＢｓ抗原の２６〜８０番からなるペプチドをコードするＤＮＡ断片を発現ベクターであるｐＡＴｔｒｐＥベクターに導入した。得られたｐＡＴｔｒｐＥ−ＨＢｓ（２６−８０）を、大腸菌ＨＢ１０１株で発現させ、菌体を回収した。発現抗原をゲルろ過及びイオン交換カラムで精製し、ＴｒｐＥ−ＨＢｓ（２６−８０）抗原を取得した。このＴｒｐＥ−ＨＢｓ（２６−８０）抗原、購入したｒＨＢｓＡｇ（Ｙｅａｓｔ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）及びｒＨＢｓＡｇ（ＣＨＯ；ａｎａｐｕｒｅ社）を免疫及びＥＬＩＳＡ法によるマウスの抗体価の測定及びスクリーニングに使用した。
（Ｂ）免疫
ＴｒｐＥ−ＨＢｓ（２６−８０）抗原、ｒＨＢｓＡｇ（Ｙｅａｓｔ）又はｒＨＢｓＡｇ（ＣＨＯ）の抗原溶液（２ｍｇ／ｍＬ）を等量のＴｉｔｅｒ−Ｍａｘ  Ｇｏｌｄ（Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ  ＵＳＡ社）と乳化するまで混和し、その混合液０．１ｍＬを４〜６週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウス、の腹腔内又はフットパッドに注射することにより、免疫を行った（第１回免疫）。１週おきに２回、同様の方法で調整した混合液０．１ｍＬを腹腔内に投与した（第２及び３回免疫）。第２及び第３回、場合によっては第４回又は第５回の免疫を行って１週後にマウスから採血し、抗体価を後述の（Ｃ）の方法に従い、測定した。抗体価の上昇したマウスに対し、ＴｒｐＥ−ＨＢｓ（２６−８０）抗原、ｒＨＢｓＡｇ（Ｙｅａｓｔ）、又はｒＨＢｓＡｇ（ＣＨＯ）の抗原溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を等量のＰＢＳで希釈し、その希釈液０．１ｍＬをマウスの静脈内に投与した（最終免疫）。最終免疫から３日経過した後に、マウスから脾臓又は鼠径リンパ節を無菌的に摘出し、以下の（Ｄ）の細胞融合の工程に使用した。【００４２】
（Ｃ）ＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定
９６穴ＥＬＩＳＡ用プレート（Ｎｕｎｃ社）に、ＴｒｐＥ−ＨＢｓ（２６−８０）抗原、ｒＨＢｓＡｇ（Ｙｅａｓｔ）抗原、又はｒＨＢｓＡｇ（ＣＨＯ）抗原（１μｇ／ｍＬ）を各々１００μＬずつ分注し、４℃で一夜放置した。次に、このプレートの各ウェルを０．５％カゼインナトリウム及び２％スクロースを含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で３０分ブロッキングした。このブロッキング液を除去した後、前記工程（Ｂ）で得られた血清を０．１％カゼインナトリウム、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで１，０００倍から、１，０００，０００倍まで希釈し、１００μＬをウェルに添加した。室温で６０分放置した後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ（以下、ＰＢＳＴと称する）で３回洗浄した。続いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗マウスＩｇＧ抗体（ヤギ；Ｊａｃｋｓｏｎ社）１００μＬ（０．０８μｇ／ｍＬ）を加え、室温で１時間放置した後、再び、ＰＢＳＴで４回洗浄した。ＯＰＤ基質溶液［２．２ｍＭｏ−フェニレンジアミン、０．０３％過酸化水素水を含む０．０７５Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）］１００μＬを各ウェルに加え、２５℃で３０分間反応させ、１Ｍ硫酸１００μＬを各ウェルに加え、各ウェルの４９２ｎｍにおける吸光度を測定した。【００４３】
（Ｄ）細胞融合
無菌的に摘出したマウスの脾臓又は鼠径リンパ節をＲＰＭＩ１６４０培地８ｍＬの入ったシャーレーに入れた。脾臓細胞を流出させた後、この脾臓又は鼠径リンパ節細胞懸濁液をメッシュに通し、５０ｍＬ遠心チューブに集めてＲＰＭＩ１６４０培地３２ｍＬを加え、懸濁後、１５０×ｇで５分間遠心した。上清を吸引後、ＲＰＭＩ培地４０ｍＬに懸濁し、１５０×ｇで５分間遠心した。この操作を２回行った。このようにして得られた細胞ペレットをＲＰＭＩ１６４０培地４０ｍＬで再懸濁し、脾細胞又はリンパ節細胞数を測定した。【００４４】
一方、５０ｍＬチューブに予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／０−Ａｇ１４［理化学研究所ジーンバンク］（約２×１０７個）に前記脾臓又はリンパ節細胞（約１×１０８個）を加え、ＲＰＭＩ１６４０培地中でよく混合し、遠心分離を行った（１５０×ｇ、５分間）。その上清を吸引し、ペレットをよく解きほぐし、３７℃に保温しておいた５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００溶液１ｍＬを滴下し、遠心チューブを手で、１分間穏やかに回転することによってＰＥＧ溶液と細胞ペレットとを混合させた。次に、３７℃に保温しておいたＲＰＭＩ１６４０培地９ｍＬを加え、チューブを穏やかに回転させた。その後、遠心分離（１５０ｘｇ、５分）を行い、上清を除去した後、細胞ペレットを１０％ウシ胎児血清と、５％ブライクローン（ヒトＩＬ−６、大日本製薬）を含むＨＡＴ培地（ＲＰＭＩ１６４０培地にアミノプテリン４×１０−７Ｍ、チミジン１．６×１０−５Ｍ、及びヒポキサンチン１×１０−４Ｍになるように添加したもの）５０ｍＬに懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウェル細胞培養プレートの各ウェルに１００μＬずつ分注し、５％炭酸ガスを含む３７℃の炭酸ガス培養器で培養を開始した。培養中、２〜３日間隔で各ウェルの培地約１００μＬを除き、新たに前記のＨＡＴ培地１００μＬを加えることによりＨＡＴ培地中で増殖するハイブリドーマを選択した。約１０日目に、以下のハイブリドーマのスクリーニングを行った。【００４５】
（Ｅ）ハイブリドーマのスクリーニング
血清試料の代わりに、ハイブリドーマの培養上清１００μＬを用いること以外は、前記工程（Ｃ）のＥＬＩＳＡ法による抗体価の測定を繰り返して、ハイブリドーマのスクリーニングを行った。抗体産生が認められたウェル中の各ハイブリドーマを、限界希釈法によりクローニングした。１０日後に、同様にＥＬＩＳＡ法を行って、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンをスクリーニングした。その結果、ハイブリドーマ細胞株ＨＢｓ１２１〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９７〕、ＨＢｓ１２３〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９８〕、ＨＢｓ１３６〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９９〕、ＨＢｓ１６３〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７００〕、ＨＢｓ６０５Ｃ３〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０１〕、ＳＦ１１１〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０２〕、ＳＦ１２４ＣＳ〔国際受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７０３〕のハイブリドーマ株を樹立した。各ハイブリドーマは、平成１８年１０月１２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に国際寄託された。【００４６】
本発明の各ハイブリドーマから産生されるモノクローナル抗体のエピトープをＨＢｓ抗原由来の２０アミノ酸残基のペプチドを用いたＥＬＩＳＡ法で決定した。遺伝子型の異なるＨＢｓ抗原のアミノ酸配列に基づき、１０残基ずつオーバーラップした２０アミノ酸残基又は１９アミノ酸残基からなるペプチドを化学合成し、ＥＬＩＳＡ法の抗原として用いた。エピトープの決定に用いたペプチドを、表１に示す。ＨＢｓ抗原の１〜２０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１ＡＤ（配列番号２）、ＰｅｐＨＢＳ１Ｂ（配列番号３）、ＰｅｐＨＢＳ１Ｃ２（配列番号４）、及びＰｅｐＨＢＳ１Ｃ（配列番号５）を、１１〜３０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ２ＡＣＤ（配列番号６）、ＰｅｐＨＢＳ２Ｂ（配列番号７）を、２１〜４０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ３ＡＣＤ（配列番号８）を、３１〜５０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ４Ａ（配列番号９）、ＰｅｐＨＢＳ４Ｂ（配列番号１０）、ＰｅｐＨＢＳ４Ｃ（配列番号１１）、及びＰｅｐＨＢＳ４Ｄ（配列番号１２）を、４１〜６０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ５Ａ（配列番号１３）、ＰｅｐＨＢＳ５Ｂ（配列番号１４）、ＰｅｐＨＢＳ５Ｃ（配列番号１５）、及びＰｅｐＨＢＳ５Ｄ（配列番号１６）を、５１〜６９番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ６ＡＣ（配列番号１７）、及びＰｅｐＨＢＳ６Ｂ（配列番号１８）を、６１〜８０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ７ＡＣ（配列番号１９）、及びＰｅｐＨＢＳ７Ｄ（配列番号２０）を、７１〜９０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ８ＡＣＤ（配列番号２１）、及びＰｅｐＨＢＳ８Ｂ（配列番号２２）を、８１〜１００番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ９ＡＣＤ（配列番号２３）を、９１〜１１０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１０Ｃ（配列番号２４）を、１０１〜１１９番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１１Ａ（配列番号２５）、ＰｅｐＨＢＳ１１ＢＤ（配列番号２６）、及びＰｅｐＨＢＳ１１Ｃ（配列番号２７）を、１１１〜１３０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１２Ａ（配列番号２８）、ＰｅｐＨＢＳ１２Ｃ（配列番号２９）、ＰｅｐＨＢＳ１２Ｄ１（配列番号３０）、及びＰｅｐＨＢＳ１２Ｄ２（配列番号３１）を、１２１〜１４０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１３Ａ（配列番号３２）、ＰｅｐＨＢＳ１３Ｂ（配列番号３３）、ＰｅｐＨＢＳ１３Ｃ（配列番号３４）、ＰｅｐＨＢＳ１３Ｄ１（配列番号３５）、及びＰｅｐＨＢＳ１３Ｄ２（配列番号３６）を、１３１〜１５０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１４Ａ（配列番号３７）、及びＰｅｐＨＢＳ１４Ｃ（配列番号３８）を、１４１〜１６０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１５Ｃ（配列番号３９）を、１５１〜１７０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１６ＡＢ（配列番号４０）、ＰｅｐＨＢＳ１６Ｃ２（配列番号４１）、ＰｅｐＨＢＳ１６Ｃ（配列番号４２）、及びＰｅｐＨＢＳ１６Ｄ（配列番号４３）を、１６１〜１８０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１７Ｃ（配列番号４４）、及びＰｅｐＨＢＳ１７Ｄ（配列番号４５）を、１７１〜１９０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１８ＡＢＤ（配列番号４６）、及びＰｅｐＨＢＳ１８Ｃ（配列番号４７）を、１８１〜２００番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ１９Ａ（配列番号４８）、及びＰｅｐＨＢＳ１９Ｃ（配列番号４９）を、１９１〜２１０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ２０Ａ（配列番号５０）、ＰｅｐＨＢＳ２０Ｂ（配列番号５１）、及びＰｅｐＨＢＳ２０Ｃ（配列番号５２）を、２０１〜２２０番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ２１Ａ（配列番号５３）、ＰｅｐＨＢＳ２１Ｂ（配列番号５４）、ＰｅｐＨＢＳ２１Ｃ（配列番号５５）、及びＰｅｐＨＢＳ２１Ｄ（配列番号５６）を、２１１〜２２６番のアミノ酸残基からなるペプチドとして、ＰｅｐＨＢＳ２２ＣＤ（配列番号５７）を用いた。各ペプチドの末尾のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ等の文字は、そのペプチドのアミノ酸配列が代表的な遺伝子型のアミノ酸配列であることを示している。また、ＡＢの文字は、そのペプチドのアミノ酸配列が遺伝子型Ａ及びＢに共通なアミノ酸配列であることを示している。【００４７】
エピトープ解析の結果、ＨＢｓ１２１抗体は、１５１〜１７０番のアミノ酸残基からなるペプチドである、ＰｅｐＨＢＳ１６Ｃ２、ＰｅｐＨＢＳ１６Ｃ、及びＰｅｐＨＢＳ１６Ｄに結合したが、ＰｅｐＨＢＳ１６ＡＢには結合しなかった。ＨＢｓ１２３抗体は３１〜５０番のアミノ酸残基からなるペプチドである、ＰｅｐＨＢＳ４Ａ、ＰｅｐＨＢＳ４Ｂ、ＰｅｐＨＢＳ４Ｃに結合したが、ＰｅｐＨＢＳ４Ｄには結合しなかった。ＨＢｓ１３６抗体は、１１１〜１３０番のアミノ酸残基からなるペプチドである、ＰｅｐＨＢＳ１２Ａ、ＰｅｐＨＢＳ１２Ｃ、ＰｅｐＨＢＳ１２Ｄ１、及びＰｅｐＨＢＳ１２Ｄ２に結合した。ＨＢｓ１６３抗体は、３１〜５０番のアミノ酸残基からなるペプチドである、ＰｅｐＨＢＳ４Ａ、ＰｅｐＨＢＳ４Ｂ、ＰｅｐＨＢＳ４Ｃに結合したが、ＰｅｐＨＢＳ４Ｄには結合しなかった。ＳＦ１１１抗体は、５１〜６９番のアミノ酸残基からなるペプチドである、ＰｅｐＨＢＳ６ＡＣに結合したが、ＰｅｐＨＢＳ６Ｂには結合しなかった。一方、ＨＢｓ６０５Ｃ３抗体、及びＳＦ１２４ＣＳ抗体は、１〜２２６番のアミノ酸残基からなるＨＢｓ抗原とは結合したが、２０アミノ酸残基からなるペプチドとは結合しなかった。【００４８】
【表１】
2008053901.tif 000003
【００４９】
《実施例２》樹立したモノクローナル抗体の調製
（Ａ）培養上清からのモノクローナル抗体の調製
樹立したマウスハイブリドーマを、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ）で、３７℃にて５％炭酸ガス雰囲気中において７２〜９６時間培養した。培養液を、リコンビナントプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）にアプライした。カラムから抗体をｐＨ５．５の緩衝液で溶出して、精製された本発明のモノクローナル抗体を得た。培養液５００ｍＬから約１０ｍｇの抗体を取得することができた。
（Ｂ）腹水からのモノクローナル抗体の調製
４〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、マウス１匹あたりプリスタン０．５ｍＬを投与し、７日後に、増殖させた各ハイブリドーマをマウス一匹あたり５×１０６細胞となるように腹腔内に接種した。５匹のマウスから約１５ｍＬの腹水が得られ、２ｍＬの腹水から約１０ｍｇの抗体が得られた。腹水中のモノクローナル抗体の精製は、前記の培養上清中からの精製と同様の方法で行った。【００５０】
《実施例３》モノクローナル抗体のＨＲＰ標識
抗体のＨＲＰ標識は、Ｐｉｅｒｃｅ社のＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｐｌｕｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを用いて行った。この方法は、抗体分子中のアミノ基にアルデヒド基が導入されたＨＲＰを結合させる方法である。標識はメーカーの提供するプロトコールに従って実施した。【００５１】
《実施例４》
本実施例４では、サンドイッチ法の捕捉抗体に内側捕捉抗体単独、外側捕捉抗体単独、又は内側捕捉抗体及び外側捕捉抗体の組み合わせを用い、検出抗体に内側検出抗体単独、外側検出抗体単独、又は内側検出抗体及び外側検出抗体の組み合わせを用い、ＨＢＶ感染患者の検体のＨＢｓ抗原を測定した。
内側捕捉抗体として６Ｇ６抗体、外側捕捉抗体としてＨＢｓ１３６抗体、内側検出抗体としてＳＦ１１１抗体、外側検出抗体としてＳＦ１２４ＣＳ抗体を使用した。６Ｇ６抗体単独、ＨＢｓ１３６抗体単独、６Ｇ６抗体及びＨＢｓ１３６抗体の等量混合の抗体を、４μｇ／ｍＬの濃度で９６穴マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ２５９２）の各ウェルに１００μＬ加え、４℃で一晩インキュベートした。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３で２回洗浄後、０．５％カゼインナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液を各ウェルに３５０μＬ加え、３７℃で５時間ブロッキングを行った。ブロッキング液除去後、２％Ｎラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＮＬＳ）（ＷＡＫＯ）を含む反応緩衝液（ｐＨ７．２）２５μＬと健常人検体又はＨＢＶ陽性検体７５μＬを各ウェルに加え、攪拌しながら室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３（洗浄液）で８回洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したＳＦ１２４ＣＳ抗体、ＳＦ１１１抗体、またはＳＦ１２４ＣＳ抗体及びＳＦ１１１抗体の等量混合抗体を２％ＢＳＡ、１％マウス血清、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３で希釈して各ウェルに１００μＬ添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた。洗浄液で８回洗浄し、基質溶液（オルトフェニレンジアミン、ＳＩＧＭＡ）を各ウェルに１００μＬ加え、室温で３０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸を各ウェルに１００μＬ加えて反応を停止させた。ＴＯＳＯＨの検出器を用いて波長６２０ｎｍの吸光度を対照として４９２ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．）を測定した。結果を表２に示した。健常人検体の結果はＯ．Ｄ．で示し、ＨＢＶ陽性検体はそのＯ．Ｄ．を健常人のＯ．Ｄ．で除したＳｉｇｎａｌ／Ｎｅｇａｔｉｖｅ（Ｓ／Ｎ）で示した。Ｓ／Ｎが１以下はＮ．Ｄ．（Ｎｏｎｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ）とした。なお、表２における捕捉抗体のＩｎｔは６Ｇ６抗体、ＥｘｔはＨＢｓ１３６抗体、検出抗体のＩｎｔはＳＦ１１１抗体、ＥｘｔはＳＦ１２４ＣＳ抗体である。【００５２】
捕捉抗体にＩｎｔのみを使用したＨＢｓ抗原の分析方法では、ＨＢＶ陽性検体４、５及び６のＨＢｓ抗原を測定することができなかった。また、検出抗体にＩｎｔのみを使用したＨＢｓ抗原検出法では、ＨＢＶ陽性検体４、５、及び６のＨＢｓ抗原を測定することができず、ＨＢＶ陽性検体１０及び１２のＨＢｓ抗原の測定値が著しく低下していた。一方、捕捉抗体にＥｘｔ及び検出抗体にＥｘｔを、捕捉抗体にＥｘｔ及び検出抗体にＩｎｔ＋Ｅｘｔを、捕捉抗体にＩｎｔ＋Ｅｘｔ及び検出抗体にＥｘｔを、又は捕捉抗体にＩｎｔ＋Ｅｘｔ及び検出抗体にＩｎｔ＋Ｅｘｔを使用した場合は、全てのＨＢｓ陽性検体を測定することができた。【００５３】
【表２】
2008053901.tif 000004
【００５４】
《実施例５》
本実施例５では、実施例４の捕捉抗体及び検出抗体の組み合わせの抗体を用いるＨＢｓ抗原の分析方法で、ＨＢｓ抗体陰性の条件とＨＢｓ抗体陽性条件でのＨＢｓ抗原を測定した。具体的には、ＨＢｓ抗原陽性の被検試料に、抗体価の高いＨＢｓ抗体陽性の血漿を添加して、その影響を調べた。【００５５】
内側捕捉抗体として６Ｇ６抗体、外側捕捉抗体としてＨＢｓ１３６抗体、内側検出抗体としてＳＦ１１１抗体、外側検出抗体としてＳＦ１２４ＣＳ抗体を使用した。６Ｇ６抗体単独、ＨＢｓ１３６抗体単独、６Ｇ６抗体及びＨＢｓ１３６抗体の等量混合の溶液を、４μｇ／ｍＬの濃度で９６穴マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ２５９２）の各ウェルに１００μＬ加え、４℃で一晩インキュベートした。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３で２回洗浄後、０．５％カゼインナトリウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝液を各ウェルに３５０μＬ加え３７℃で５時間ブロッキングを行った。ブロッキング液除去後、２％ＮＬＳ（ＷＡＫＯ）を含む反応緩衝液（ｐＨ７．２）２５μＬとＨＢｓ抗体陰性、又はＨＢｓ抗体陽性の血漿を用いて健常人検体又はＨＢＶ陽性検体を希釈し、７５μＬを各ウェルに加え、攪拌しながら室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３（洗浄液）で５回洗浄した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したＳＦ１１１抗体、ＳＦ１２４ＣＳ抗体又はその等量混合抗体を２％ＢＳＡ、１％マウス血清、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．３で希釈して各ウェルに１００μＬ添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた。洗浄液で５回洗浄し、基質溶液（オルトフェニレンジアミン、ＳＩＧＭＡ）を各ウェルに１００μＬ加え、室温で３０分間インキュベートし、２Ｎ硫酸を各ウェルに１００μＬ加えて反応を停止させた。ＴＯＳＯＨの検出器を用いて波長６２０ｎｍの吸光度を対照として４９２ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を表３に示した。ＨＢｓ抗体陰性血漿で希釈した値を１００％とした場合、ＨＢｓ抗体陽性血漿で希釈した値の百分率をｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ（％）で表した。なお、表３における捕捉抗体（１ｓｔＡｂ）のＩｎｔは６Ｇ６抗体、ＥｘｔはＨＢｓ１３６抗体、検出抗体（２ｎｄＡｂ）のＩｎｔはＳＦ１１１抗体、ＥｘｔはＳＦ１２４ＣＳ抗体である。【００５６】
捕捉抗体にＥＸｔのみを使用したＨＢｓ抗原の分析方法では、ＨＢＶ陽性検体１及び８では、全ての測定値が６３．５％以下を、ＨＢＶ陽性検体３では、４４．２％以下を示した。一方、捕捉抗体にＩｎｔ又はＩｎｔ＋Ｅｘｔを使用したＨＢｓ抗原の分析方法では、ＨＢＶ陽性検体１及び８の全ての測定値が７２．３％以上を、ＨＢＶ陽性検体３では、５９．４％以上を示した。従って、捕捉抗体にＩｎｔ又はＩｎｔ＋Ｅｘｔを使用したＨＢｓ抗原の分析方法が、患者の体内の抗ＨＢｓ抗体の影響を受けにくいことが示唆された。【００５７】
【表３】
2008053901.tif 000005
【００５８】
前記の表２及び表３の結果を、表４にまとめた。表２は、実施例４で全ての検体を測定することのできた抗体の組み合わせを○とした。また、表３は、実施例５で、ＨＢＶ陽性検体１において測定値が８０％以上、ＨＢＶ陽性検体３において測定値が６０％以上、ＨＢＶ陽性検体８において測定値が８０％以上を示した抗体の組み合わせを○とした。【００５９】
【表４】
2008053901.tif 000006
【００６０】
表４に示すように、捕捉抗体にＩｎｔ＋Ｅｘｔ及び検出抗体にＩｎｔ＋Ｅｘｔを使用した場合に、偽陰性の発生を低減し、患者の生体内の抗ＨＢｓ抗体の影響を受けにくいＨＢｓ抗原の分析方法を開発することが可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のＨＢｓ抗原の分析方法をＨＢＶ感染のスクリーニングに用いることにより、従来の方法では測定することができなかったＨＢＶに感染した被検試料を測定することが可能となる。また、ＨＢＶ感染患者のＨＢｓ抗原量をより正確に測定することができ、患者の病態の把握に役立てることができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図１】
2008053901.tif 000007
【配列表】
2008053901000001.app
【国際調査報告】
2008053901.tif 000008
2008053901.tif 000009