(57)【要約】  分子量が極めて大きい硫酸化多糖であるフコイダンを医薬品、健康食品として開発する際に生じる、フコイダンの吸収性、抗原性、均一性、抗凝血活性等に関する問題を解消し、かつ良質の味質を持った、特定された構造と機能を有するフコイダン由来低分子化合物を提供する。フコイダンを酸加水分解して得られる低分子化合物を分析することにより、フコイダンオリゴ糖（I）〜（XII）を同定した。さらに、これらオリゴ糖にはα−グルコシダーゼ阻害やリパーゼ阻害により糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制作用があることが見出された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルクロン酸（Ｇ）、フコース（Ｆ）、硫酸化フコース（Ｓ）、アセチル化フコース（Ｆａ）を１分子に下記のように含む化合物。
ＧＦ、ＧＦＦ（ＧＦ２）、ＳＦ、ＧＳ、ＧＳＦ、ＧＳＦＦ（ＧＳＦ２）、ＧＳＦＡａＦ、ＧＧＦＦＦ（Ｇ２Ｆ３）、ＧＧＦａＦＦ（Ｇ２ＦａＦ２）、ＧＳＦＦＦ（ＧＳＦ３）、ＧＳＦａＦＦＦ（ＧＳＦａＦ３）又はＧＧＦＦ（Ｇ２Ｆ２）
【請求項２】
下記構造式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、または（ＸＩ）または（XII）で示される化合物。
【化１】
2008090631.tif 000021
【化２】
2008090631.tif 000022
【化３】
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【化４】
2008090631.tif 000024
【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【請求項３】
請求項１記載の式（Ｉ）〜（XII）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含むリパーゼ阻害、α−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項４】
請求項１記載の式（Ｉ）〜（XII）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含む肥満防止、血糖増加抑制剤。
【請求項５】
請求項１記載の式（Ｉ）〜（XII）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含むα−グルコシダーゼ阻害することにより糖質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制剤。
【請求項６】
請求項１記載の式（Ｉ）〜（XII）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含むリパーゼ阻害することによる肥満防止剤。
【請求項７】
請求項１記載の式（Ｉ）〜（XII）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含むリパーゼ阻害およびα−グルコシダーゼ阻害を併せ持つ肥満防止剤。
【請求項８】
請求項１記載の式（Ｉ）〜（XII）で表される化合物から選択される少なくとも一種を添加した飲食品。
【請求項９】
請求項１記載の式（Ｉ）〜（XII）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含む医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１記載の式（Ｉ）〜（XII）で表される化合物から選択される少なくとも一種を含む化粧品。
【請求項１１】
フコイダンを０．１〜５Ｎの酸で２５〜１３０℃、１５分〜６時間加水分解して得られる組成物を含むリパーゼ阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤。
【請求項１２】
フコイダンを１〜２Ｎの酸で５０〜１０５℃、１５分〜３時間加水分解して得られる組成物を含む請求項１１に記載のリパーゼ阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はα−グルコシダーゼ阻害、およびリパーゼ阻害を有し、糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制などを目的とした飲食品、健康食品、機能性食品、医薬品、化粧品等に利用可能な新規化合物およびそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
フコイダンは藻類に含まれる硫酸化多糖であり、抗血液凝固作用、脂血清澄作用（血液中のコレステロールや過酸化脂質を除去する作用）、抗腫瘍作用、癌転移抑制作用、抗エイズウイルス感染作用等の様々な活性を有することが報告されている。【０００３】
一方、フコイダンの構造は、由来となる藻類やその生育環境などにより異なることが知られている。その理由の一つは、フコイダンの構成成分であるフコース、ガラクトース、キシロース、グルクロン酸等の組成が、藻類やその生育環境によって変動するためである。また、それら構成糖上のエステル結合およびグルコシド結合の位置が変動し得ることも、フコイダン構造の多様性に寄与している。そのため、未だに多くのフコイダンの構造が特定されていない。さらに、フコイダンは原料由来の異味があり食品への利用が限られていた。【０００４】
これらの理由により、フコイダンを利用して飲食品や医薬品などを開発する場合には、それらに適切なフコイダンを選定するのに多大な時間を要することが多かった。また、消費者にとっても、どのフコイダンを選べばよいのか明確ではなかった。さらに、フコイダンは分子量が極めて大きい硫酸化多糖であり、このためそのまま飲食品や医薬品として用いる際には、吸収性、抗原性、均一性、抗凝血活性等に関する問題がある。【０００５】
また、これまでに、化学合成によるフコース含有オリゴ糖が報告されている（非特許文献１、２および３）。【０００６】
一方、フコイダンを加水分解してフコイダンを低分子化する方法も報告されている。例えば、特許文献１には、フコイダンを酸加水分解する方法が開示されており、得られた低分子フコイダンは、５×１０3以下の分子量分布を有していたことが記載されている。また、特許文献２には、酸を外部から添加することなくフコイダンを加水分解してオリゴ糖を得る方法が記載されている。また、特許文献３のように酵素によりフコイダンを加水分解する方法も報告されている。【０００７】
また、フコイダンの加水分解により得られ、構造が決定されたオリゴ糖がいくつか報告されている。例えば、特許文献４においては、モズク等の藻類から得たフコイダンを酸加水分解してオリゴ糖を製造したことが報告されており、数種の低分子フコイダン由来オリゴ糖の構造が特定されている。また、特許文献５および６においては、フコイダンを酵素的に加水分解して得たオリゴ糖の構造が開示されている。【０００８】
さらに非特許文献４にはＧＦの存在やフコースが１〜２分子でその一部が硫酸化しているものの存在を示している。【０００９】
また、コンドロイチン硫酸やキトサンがリパーゼ阻害活性を持つことは知られている（非特許文献５、６）。
【特許文献１】特開平７−２１５９９０
【特許文献２】特開２００２−２２６４９６
【特許文献３】特開２０００−２３６８８９
【特許文献４】特開２０００−３５１７９０
【特許文献５】特開２００３−１９９５９６
【特許文献６】特開２００１−２２６４０８
【特許文献７】特開平６−６５０８０
【特許文献８】特開平８−２３９７３
【特許文献９】特開平１０−２９０６８１
【非特許文献１】Carbohydrate research 4, 189-195 (1967)
【非特許文献２】Carbohydrate research 37, 75-79 (1974)
【非特許文献３】Carbohydrate research 41, 308-312 (1975)
【非特許文献４】Glucoconjugate Journal 16,19-26  (1999)
【非特許文献５】International Journal of obesity 24,1131-1138(2000)
【非特許文献６】International Journal of obesity 23,174-179(1999)
【非特許文献７】Infection and Immunity, 35, 71-78(1982)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、特許文献１〜３に記載の方法で得られた物質は構造が特定されていない。したがって、これら構造不明のオリゴ糖を食品に使用する際には、品質の管理が容易ではないという問題がある。また、特許文献１〜３に記載の方法で得られた物質は有機合成反応により調製されているため食品などに使用するのは好ましくなかった。【００１１】
また、特許文献４に記載のオリゴ糖は、食品などに利用した場合の機能が明らかにされておらず安全性が高いとは言い難い。さらに、特許文献５に記載のオリゴ糖には分子量が大きいという問題がある。【００１２】
さらに非特許文献４にはＧＦの存在やフコースが１〜２分子でその一部が硫酸化しているものの存在を示されているが、これを単離してその物性を評価することはなされていない。【００１３】
また、α−グルコシダーゼ阻害やリパーゼ阻害活性が肥満防止効果や血糖増加抑制効果に有効であることは知られている（特許文献７，８，９、非特許文献５，６参照）。例えば、肥満防止効果を得るため、α−グルコシダーゼ阻害やリパーゼ阻害活性を持つオリゴ糖としては、キシロビースにα−グルコシダーゼ阻害作用があるが、緩慢な効果でしかない。さらに、α−グルコシダーゼ阻害とリパーゼ阻害活性を併せて持つものは知られていない。【００１４】
そこで、様々な用途に用いることができる素材として、上記のように、特定された構造を有し、正確に品質管理できるフコイダン由来オリゴ糖を開発することが望まれていた。また、飲食品や医薬品における用途を考慮すると、低分子で扱いやすいものであること、さらには安全性が高いものであること、また異味のないものであることが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
そこで、本発明の目的は、構造が特定された新規なフコイダン由来オリゴ糖を提供することである。【００１６】
また、本発明の別の目的は、安全性が高く、α−グルコシダーゼ阻害活性やリパーゼ阻害活性を有し、糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制作用を持ち、さらに異味がなく、良質な味質を持ったフコイダン由来オリゴ糖を提供することである。本発明のさらなる目的は、効果量を的確に飲食品、医薬組成物、化粧品等に添加することができるフコイダン由来オリゴ糖を提供することである。【００１７】
本発明者は、フコイダンから新規オリゴ糖を製造し、それらのα−グルコシダーゼ阻害活性、リパーゼ阻害活性を確認し、さらに味質を確認することにより、本発明を完成するに至った。本発明においては、これらオリゴ糖をフコイダンオリゴ糖とも称する。【００１８】
すなわち本発明は、
（１）下記構造式（I）、（II）、（III）、（IV）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）、（X）、（XI）、または（XII）で表されるフコイダンオリゴ糖：【００１９】
【化１】
2008090631.tif 000002
【００２０】
【化２】
2008090631.tif 000003
【００２１】
【化３】
2008090631.tif 000004
【００２２】
【化４】
2008090631.tif 000005
【００２３】
【化５】
2008090631.tif 000006
【００２４】
【化６】
2008090631.tif 000007
【００２５】
【化７】
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【００２６】
【化８】
2008090631.tif 000009
【００２７】
【化９】
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【００２８】
【化１０】
2008090631.tif 000011
【００２９】
【化１１】
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【００３０】
【化１２】
2008090631.tif 000013
（２）式（I）〜(XII)で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物を含む
α−グルコシダーゼ阻害剤やリパーゼ阻害剤。
（３）式（I）〜(XII)で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物を含む
肥満防止剤、血糖増加抑制剤。
（４）式（I）〜(XII)で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物を添加
した飲食品；および
（５）式（I）〜(XII)で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物を含む
化粧品に関する。
【発明の効果】
【００３１】
本発明の新規フコイダンオリゴ糖は、α−グルコシダーゼ阻害作用やリパーゼ阻害作用を有する。また、本発明のフコイダンオリゴ糖は、食品素材から分離されたものであるため、極めて安全性が高く、良質な味を有する。従って、本発明のオリゴ糖は非常に有用であり、その応用範囲は健康食品のみならず、医薬品および化粧品にも適用可能である。【００３２】
即ち、本発明のオリゴ糖を添加することにより、オリゴ糖が糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制作用を有する、飲食品、医薬組成物、または化粧品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】沖縄モズクから熱水抽出により得られるフコイダンの糖組成分析を示すＨＰＬＣチャートである。
【図２】式（I）で表される分子量３４０のフコイダンオリゴ糖のＭＳスペクトルを示す図である。
【図３】式（II）で表される分子量４８６のフコイダンオリゴ糖のＭＳスペクトルを示す図である。
【図４】式（I）の化合物に対応する標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図５】式（I）の化合物に対応する標識化オリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図６】式（II）の化合物に対応する標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図７】式（II）の化合物に対応する標識化オリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図８】式（III）の化合物に対応する分子量５３９の標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図９】式（III）の化合物に対応する分子量５３９の標識化オリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１０】式（V）の化合物に対応する分子量７１５の標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１１】式（V）の化合物に対応する分子量７１５の標識化オリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１２】式（VI）の化合物に対応する分子量８６１の標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１３】式（VI）の化合物に対応する分子量８６１の標識化オリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１４】式（VII）の化合物に対応する分子量９０３の標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１５】式（VII）の化合物に対応する分子量９０３の標識化オリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１６】式（VIII）の化合物に対応する分子量９５７の標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１７】式（VIII）の化合物に対応する分子量９５７の標識化オリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１８】式（IX）の化合物に対応する分子量９９９の標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図１９】式（IX）の化合物に対応する分子量９９９の標識化オリゴ糖の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２０】式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２１】式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖のＴＯＦ-ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２２】式（VII）で表される分子量７５４のフコイダンオリゴ糖を再生した後のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２３】式（IV）で表される分子量４２０のフコイダンオリゴ糖のESI-ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２４】式（IV）で表される分子量４２０のフコイダンオリゴ糖のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２５】式（X）で表される分子量８５８および式（XI）で表される分子量９００のフコイダンオリゴ糖のＦＡＢ-ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２６】式（X）で表される分子量８５８のフコイダンオリゴ糖のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２７】式（XI）で表される分子量９００のフコイダンオリゴ糖のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。
【図２８】沖縄モズクを加水分解後、ＡＢＥＥで蛍光標識化したＥＳＩ−ＭＳのチャートを示す図である。
【図２９】各種フコイダンオリゴ糖のα−グルコシダーゼ阻害効果を示す図である。
【図３０】各種フコイダンオリゴ糖のリパーゼ阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
フコイダン
フコイダンとは藻類由来の硫酸化多糖の総称であり、主な構成糖であるフコースに加えて、ガラクトース、グルクロン酸、硫酸化フコース、キシロース等を含有する。構成糖の種類や量は、フコイダンの由来となる藻類やその生育環境により異なる。【００３５】
本発明のフコイダンオリゴ糖のための原料として用いられるフコイダンは、どのような構造のものでもよく、またいずれの藻類から取得してもよい。藻類の例には、クロガシラ目（Sphacelariales）、ナガマツモ目（Chordariales）、カヤモノリ目（Scytosiphonales）、ウイキョウモ目（Dictyosiphonales）、ムチモ目（Cutleriales）、ケヤリモ目（Sporochnales）、アミジグサ目（Dictyotales）、コンブ目（Laminariales）、ヒバマタ目（Fucales）を含む褐藻綱Phaeophyceaeの海藻が含まれる。好ましくはモズク、より好ましくは沖縄モズク由来のフコイダンを用いる。【００３６】
フコイダンの抽出方法
フコイダンを藻類から抽出する方法は種々検討されており、広く知られている（例えば、特開平１０−２４５３３４に記載されているような水を用いる方法、特開平１０−１９５１０６に記載されているような酸を用いる方法、特開２００２−２６２７８８に記載されているようなアルカリ水性溶媒を用いる方法等である）。本発明オリゴ糖の原料として用いるフコイダンはこれら公知の方法により取得することができる。本発明においては、例えば、以下の方法により取得したものを用いる。【００３７】
即ち、藻類（例えば沖縄モズク）に蒸留水５〜１０倍量を加え、５０〜１００℃で０〜５時間、好ましくは８０〜１００℃で０．５〜２時間、さらに好ましくは９０〜１００℃で約１時間抽出する。このようにして得られた藻類抽出物を冷却、吸引濾過、脱塩および乾燥することにより、容易に水に溶解するフコイダン画分を得ることができる。このようにして得られたフコイダン画分は、さらに精製することなく次の工程に用いてもよいし、更に精製してから用いてもよい。【００３８】
フコイダンは、好ましくは上記のように藻類から抽出したものを用いるが、藻類に含まれた状態で用いてもよい。フコイダンまたはそれを含む藻類を次の加水分解工程に付すことによって本発明による化合物が得られる。【００３９】
フコイダンオリゴ糖混合物の製造方法
本発明のフコイダンオリゴ糖を製造するには、先ず、特許文献１〜３に記載されているように、フコイダンを酸や酵素を用いる方法により加水分解することにより、フコイダンオリゴ糖の混合物を得る。好ましくは、以下の様な酸加水分解条件を用いる。【００４０】
即ち、上記のようにして藻類から得られたフコイダンを含む画分またはフコイダンを、酸、好ましくは塩酸もしくは硫酸を用い分解する。より具体的には、０．１〜５．０Ｎ、好ましくは０．５〜４.０Ｎ、さらに好ましくは０.５〜３.０ＮのＨＣｌを含む、２５〜１３０℃、好ましくは３０〜１０５℃、さらに好ましくは５０〜１００℃の水性溶媒中で、０.１〜６時間、好ましくは０.２５〜３時間、さらに好ましくは０.５〜２時間加水分解を行なう。得られた反応物を塩基、例えば約１ＮのＮａＯＨで中和した後、電気透析もしくはゲル濾過等の適切な手段で脱塩し、乾燥（例えば、凍結乾燥）することにより、フコイダンオリゴ糖混合物を得ることができる。【００４１】
オリゴ糖の精製
このようにして得られるフコイダンオリゴ糖混合物は活性炭処理や脱塩処理などで不純物を除き、純度高いフコイダンオリゴ糖混合物を得ることができる。フコイダンオリゴ糖をさらに精製するためには、クロマトグラフィー、再結晶、透析、アルコール沈殿等の方法を単独で、または組み合わせて用いることができる。例えば、以下の操作に従ってオリゴ糖を精製する。【００４２】
先ず、フコイダンの加水分解により得られたオリゴ糖混合物を陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、吸着されずに通過する硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（中性及びグルクロン酸糖画分）と、酸性溶出液により溶出する、硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）とを分離する。【００４３】
もしくは、フコイダンの加水分解により得られたオリゴ糖混合物を、弱塩基性陰イオン交換樹脂を用いたクロマトグラフィーに付して、吸着されずに通過する画分（フコースなどの中性糖画分）と、弱酸で溶出する硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（グルクロン酸糖画分）と、強酸性溶出液により溶出する、硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）とを分離することもできる。【００４４】
さらに強酸性溶出液により溶出する画分の後半を分画することにより、硫酸基を含むオリゴ糖を含まない、純度の高い硫酸化フコースを得ることができる。【００４５】
中性及びグルクロン酸糖画分をさらにゲル濾過に付すことにより、式（I）で表される二糖と式（II）で表される三糖を得ることができる。【００４６】
さらに、グルクロン酸糖画分をさらに分取用のＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーに付すことにより、式（I）で表される二糖、式（II）で表される三糖、式（XII）で表される四糖、式（VIII）で表される五糖、をそれぞれ得ることができる。【００４７】
一方、硫酸化糖画分を分取用のＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーに付すことにより、式（V）、式（VI）、式（VII）で表される各成分を単離することができる。【００４８】
各オリゴ糖は、精製、構造解析をより容易にするために適宜標識化または誘導体化してもよい。例えば、オリゴ糖は、４−アミノ安息香酸エチル（ＡＢＥＥ）のような試薬で蛍光標識化することができ、これによりオリゴ糖の検出が容易となる。標識化された各オリゴ糖を分離した後にその標識化部分を除去することにより、純粋なオリゴ糖を取得することができる。【００４９】
こうして得られるフコイダンオリゴ糖は、それぞれの物質単独のみならず、加水分解物を活性炭や電気透析などにより不純物を除去したオリゴ糖混合物、さらにはイオン交換樹脂分画などで得た硫酸基をほとんど含まないオリゴ糖を含有する画分（グルクロン酸糖画分）から不純物を除去したオリゴ糖混合物や、硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）から不純物を除去したオリゴ糖混合物を、例えば飲食品、医薬品、化粧品等に用いて、これらにα−グルコシダーゼ阻害作用やリパーゼ阻害作用を有し、糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制作用を付与することができる。【００５０】
フコイダンオリゴ糖を含む食品添加物および飲食品、並びにそれを添加した飲食品
本発明のフコイダンオリゴ糖を飲食品に用いる場合には、それを含みα−グルコシダーゼ阻害やリパーゼ阻害作用を有し、糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制作用を有する食品添加物および飲食品として、並びにそれを添加したα−グルコシダーゼ阻害作用やリパーゼ阻害作用を有し、糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制作用を有する健康食品として実施することが好適である。【００５１】
それらは、公知の甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合してユーザーの嗜好に合う製品とすればよい。飲食品は、例えば、錠剤、カプセル剤、清涼飲料、茶飲料、ドリンク剤、ヨーグルトや乳酸菌飲料等の乳製品、調味料、加工食品、デザート類、菓子（例えば、ガム、キャンディ、ゼリー）等の形態で提供することが可能である。本発明の飲食品には、α−グルコシダーゼ阻害作用やリパーゼ阻害作用により糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制作用を有する旨の表示を容器や説明書に付した機能性食品（特定保健用食品や条件付き特定保健用食品が含まれる）も含まれる。表示場所は容器またはそれに添付した指示書などが挙げられるが、これらに限られない。容器には、瓶、缶、ペットボトル、プラスチックボトル、紙パック等が含まれるが、それらに限定されない。また、表示の方法には、印刷、刻印、シール等が含まれるが、それらに限定されない。また、飲食品は、ペットの餌として加工したペットフード等や動物飼料等でもよい。【００５２】
フコイダンオリゴ糖を含む医薬組成物
本発明のフコイダンオリゴ糖は、例えば、α−グルコシダーゼ阻害やリパーゼ阻害活性を有し、糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制剤として用いることができる。したがって、１つの態様において、本発明はフコイダンオリゴ糖を含む、α−グルコシダーゼ阻害やリパーゼ阻害活性を有し、糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制作用を有する医薬組成物である。【００５３】
医薬組成物は、主薬に希釈剤、担体、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤、座剤、クリーム剤、軟膏剤、エマルション、ハップ剤、注射剤等を挙げることができ、特に限定されるものではない。本医薬品の投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経腸投与等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。【００５４】
フコイダンオリゴ糖を含む化粧品
本発明のフコイダンオリゴ糖を用いることにより、リパーゼ阻害作用により脂質の分解を阻害することによるアクネ菌の増殖を抑え（非特許文献７）、にきびなどの皮膚疾患を予防する作用を持つ化粧品を製造することができる。【００５５】
本発明オリゴ糖が添加または配合される化粧品は、例えば、顔用、皮膚用、頭髪用のクリーム、ローション、ゲル、ムース、シャンプー、リンス等である。【００５６】
他の成分との併用
本発明のフコイダンオリゴ糖は、飲食品、医薬組成物、および化粧品において、それ自体単独で使用してもよいが、他のα−グルコシダーゼ阻害やリパーゼ阻害作用により糖質や脂質の吸収を阻害することによる肥満防止、血糖増加抑制作用を有する食品素材または物質と併用することも好適である。そのような食品素材または物質としては、乳酸菌、キノコ類、フコイダン、キシロオリゴ糖、アラビノース、キシロース、フコース等が挙げられる。【００５７】
本発明の飲食品、組成物には、これら活性成分以外に、具体的な態様に応じて、一般的な成分、例えば、担体、希釈剤、賦形剤または添加剤等の成分を配合することができる。ここで担体、希釈剤または賦形剤としては、フコイダンオリゴ糖の生理活性を妨げないものであれば特に制限されず、例えばシュクロース、グルコース、アラビノース、果糖、マルトース、トレハロース、乳糖、澱粉、水飴、異性化液糖などの糖類、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン等のアルコール類、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール、ラクチトール、キシリトール、マルチトール、還元パラチノース、還元澱粉分解物等の糖アルコール類、トリアセチン等の溶剤、アラビアガム、カラギナン、キサンタンガム、グァーガム、ジェランガム、ペクチン等の多糖類、または水を挙げることができる。また添加剤としては、キレート剤等の助剤、香料、香辛料抽出物、防腐剤などを挙げることができる。これらの担体、添加剤等を本発明の効果を損なわない限り配合することができる。【００５８】
飲食品、医薬組成物および化粧品におけるオリゴ糖の配合量は、選択する他の配合成分との関係等により適宜選択されるものであり、特に限定されるものではない。しかしながら、通常、フコイダンオリゴ糖は、飲料または食品中、医薬組成物中に添加する場合、個体の体重６０ｋｇに対して０．０１ｇ〜１０ｇ／日、好ましくは０．０５ｇ〜１ｇ／日、特に好ましくは０．０５ｇ〜０.５ｇ／日である。化粧品中には、０．０１〜２０重量％、好ましくは０．０５〜１５重量％用いられる。【００５９】
本発明のオリゴ糖は、抽出精製品や合成製品を単独で飲食品、医薬組成物、および化粧品に用いることもできるが、本発明オリゴ糖の１つ以上を含む混合物の形態で飲食品等に添加することもできる。【００６０】
なお本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
[実施例]【００６１】
以下、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されないことは言うまでもない。【００６２】
以下の実施例においては、特に明記しない限り、ＥＣＡ−６００型核磁気共鳴装置（日本電子株式会社）を用いてＮＭＲ分析を行なった。測定溶媒として重水（Ｄ2Ｏ）を用いた。構成糖の結合様式は、２Ｄ-ＮＭＲを用いて行なった。
【実施例１】
【００６３】
フコイダンオリゴ糖の調製−１
ａ）フコイダン画分の調製  
沖縄モズク藻体１００ｇに蒸留水を１０００ｍｌ加え、１００℃で１時間抽出した。得られた抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析（脱塩）をして凍結乾燥し、フコイダン画分を２ｇ得た。このフコイダンを２Ｎ-Ｈ2ＳＯ4を含む１００℃の水溶液で１時間加水分解し、得られた水溶液を２Ｎ-ＮａＯＨを用いて中和し、ＡＢＥＥで蛍光標識化することで単糖分析サンプルを調製した。その構成糖の組成は、硫酸化フコース：グルクロン酸：フコース：キシロース＝４９．３：４．９：１２．１：１であることを確認した（図１）。
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  Ｃ１８  ＡＲ−II（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ）
移動相：１０％アセトニトリル含有０．２Ｍホウ酸カリウム緩衝液
流速：１．０ｍｌ／分
温度：４５℃
検出：蛍光検出器（株式会社島津製作所）、Ｅｘ：３０５ｎｍ、Ｅｍ：３６０ｎｍ
ｂ）フコイダンの加水分解およびオリゴ糖の分離
得られたフコイダン画分１ｇに２Ｎ-ＨＣｌを１００ｍｌ加えて５０〜１００℃で１時間酸加水分解を行ない、次いで１Ｎ-ＮａＯＨで中和した。得られた反応液をゲル濾過（バイオゲルＰ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に付して脱塩し、凍結乾燥を行なうことによりフコイダンオリゴ糖混合物を８９５ｍｇ得た。得られたフコイダンオリゴ糖混合物は、蟻酸で活性化した陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社）を用いるクロマトグラフィーに付した。結果として、オリゴ糖混合物は、水で溶出することで得られた硫酸基を含まないオリゴ糖を含有する画分（中性及び酸性糖画分）２８０ｍｇと、２Ｎ-ＨＣｌで溶出することで得られた硫酸基を多く含むオリゴ糖を含有する画分（硫酸化糖画分）４２５ｍｇに分離された。
ｃ）化合物（I）および（II）の単離
ｂ）で得られた中性及び酸性糖画分１００ｍｇをゲル濾過（バイオゲルＰ−４（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、溶出溶媒：０．２Ｍホウ酸カリウム（Ｋ2Ｂ4Ｏ7）水溶液）に付すことにより、当該画分から分子量３４０の二糖と分子量４８６の三糖が分離された(化合物 I、II)。これらの分子量は、ＦＡＢ−ＭＳにより求めた(図２、３；化合物（I）［Ｍ−Ｈ］-：３３９．２、化合物（II）［Ｍ−Ｈ］-：４８５．０)。これらの化合物５ｍｇに、水１ｍｌ、ＡＢＥＥ（４−アミノ安息香酸エチル）１.６ｇ、ＮａＢＨ3ＣＮ（水素化シアノほう素ナトリウム）３５０ｍｇ、メタノール３.５ｍｌ、酢酸４１０μｌを加え、６５℃、４時間撹拌した。反応液をクロロホルムと水で分配することにより蛍光標識化された上記二糖および三糖を約７〜９ｍｇ取得した。これら標識化オリゴ糖について測定した1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲのチャートを図４〜７に示し、それらを解析した結果を表１、２に示した。これらの結果より、得られた分子量３４０の二糖は式（I）で表されるα−Ｄ−ＧｌｃＡ−(１→２)−Ｌ−Ｆｕｃであり、分子量４８６の三糖は式（II）で表されるα−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃであることが分かった。【００６４】
【表１】
2008090631.tif 000014
【００６５】
【表２】
2008090631.tif 000015
ｄ）化合物（III）〜（XI）の製造
次に、硫酸化糖画分をゲル濾過（バイオゲルＰ−６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に付すことにより脱塩した。得られた硫酸化糖画分１００ｍｇに、水１ｍｌ、ＡＢＥＥ（４−アミノ安息香酸エチル）１．６ｇ、ＮａＢＨ3ＣＮ（水素化シアノほう素ナトリウム）３５０ｍｇ、メタノール３．５ｍｌ、酢酸４１０μｌを加え、６５℃、４時間撹拌した。得られた生成物を真空で乾燥させ、水とクロロホルムに分配し、水層を逆相カラムで（担体：Ｌｉｃｈｒｏｐｒｅｐ  ＲＰ−８（２５−４０μｍ）（Ｍｅｒｃｋ）、１０mmφ×２２０ｍｍ；溶媒条件：５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ）、８％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ）、１５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ）、２０％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（１００ｍｌ））処理することにより蛍光標識化されたオリゴ糖の混合物を得た。得られた蛍光標識化合物をＨＰＬＣ（カラム：ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−II、１０mmφ×２５０ｍｍ；溶媒条件：１２．５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（５分）、１２．５−２７．５％ＣＨ3ＣＮ／０．１％ＴＦＡ（５０分）；流速：３ｍｌ／分）でアセトニトリル：０．１％ＴＦＡ水溶液を５〜３０％の濃度勾配で溶出して、分子量が５３９、７１５、８６１、９０３、９５７、９９９であり硫酸基を有する６つの標識化フコイダンオリゴ糖を混合物から分離した（分子量は、ＥＳＩ−ＭＳにより決定した）。得られた標識化オリゴ糖についてＮＭＲスペクトルを測定し、その結果を解析した。標識化オリゴ糖の1Ｈ−ＮＭＲおよび13Ｃ−ＮＭＲのチャートを図８〜１９に示し、それらを解析した結果を表３〜６に示す。これら結果から、分子量５３９、７１５、８６１、９０３、９５７、９９９の化合物は、それぞれ、化合物（III）、（V）、（VI）、（VII）、（VIII）、（IX）の標識体であることが明らかとなった。【００６６】
確認のため、各オリゴ糖上に結合していたＡＢＥＥを除去し、再生したオリゴ糖の純品を得た。即ち、これら分離した各標識化オリゴ糖１０ｍｇ（１００μｌ）に、過酸化水素、酢酸を各１０μｌ加えて一昼夜放置した後、乾固した。こうして得られた再生オリゴ糖のうち、分子量９０３の化合物から得られたものを1Ｈ−ＮＭＲ（図２０）、ＴＯＦ−ＭＳ（装置Voyager DE-STR（Applied Biosystems）、Ion mode: negative、Mode of operation： reflector、Accelerating voltage： 20kV、Matrix： 2,5-dihydroxybenzoic acid）（図２１）、ＭＳ／ＭＳ（図２２）で解析したところ、その結果は、確かに式（VII）の構造を示していた。【００６７】
また、上記方法で分離できなかった分子量４２０、８５８、９００の化合物（それぞれ（IV）、（X）、（XI））に関しては、反応混合物をＦＡＢ−ＭＳ／ＭＳ（装置：HX110A/HX110A(JEOL)、Ion mode：MS, MS/MS(negative)、Xe atom beam：5kV、Ion source accelerating potential：10kV、Collision energy：2keV、Matrix：Glycerol）、およびＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳで分析することによりその存在を確認した。これら未標識化オリゴ糖の分析結果を図２３〜２７に示す。図２３に（IV）のＦＡＢ−ＭＳチャート、図２４にＭＳ／ＭＳチャートを示した。また図２５に（X）および（XI）のＦＡＢ−ＭＳチャートを、図２６、２７にそれぞれのＭＳ／ＭＳチャートを示した。【００６８】
これらの結果より、分子量３９０の二糖は化学式（III）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−
４−Ｏ−ＳＯ3H-−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量４２０の二糖は化学式（IV）で表されるα−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量５６６の三糖は化学式（V）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3H-−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量７１２の四糖は化学式（VI）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3H-−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、そして分子量７５４の四糖は化学式（VII）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3H-−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−アセチル−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量８０８の５糖は化学式（VIII）で表される［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）］−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量８５０の５糖は化学式（IX）で表される［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）］−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−４−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量８５８の５糖は化学式（X）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3H-−（１→３）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃ、分子量９００の５糖は化学式（XI）で表されるα−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−ＳＯ3H-−（１→３）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−α−Ｌ−Ｆｕｃ−４−Ｏ−アセチル−（１→３）−Ｌ−Ｆｕｃであることが分かった。【００６９】
【表３】
2008090631.tif 000016
【００７０】
【表４】
2008090631.tif 000017
【００７１】
【表５】
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【００７２】
【表６】
2008090631.tif 000019
【実施例２】
【００７３】
フコイダンオリゴ糖の調製-２
オキナワモズク藻体１００ｇに２Ｎ-ＨＣｌ１０００ｍｌを入れ、１時間、５０〜１００℃で酸加水分解を行った。得られた抽出物を冷却後、吸引濾過、電気透析（脱塩）を行ない凍結乾燥しフコイダン画分を２ｇ得た。得られたフコイダン画分をＡＢＥＥで蛍光標識化したものをＥＳＩ−ＭＳ（４０００Ｑ  ＴＲＡＰ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム(Applied Biosystems）；分析条件  Ｐｏｌａｒｉｔｙ：Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ；Ｄｅｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：−５０ｖ；Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｅｎｅｒｇｙ：−１０ｅＶ；Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：５５０℃）で分析した結果、図２８で示されるチャートが得られ、式（I）〜（XI）に示されるフコイダンオリゴ糖の存在が確認できた。
【実施例３】
【００７４】
硫酸化フコース非含有フコイダンオリゴ糖の調製
１．  沖縄発酵化学社製フコイダン１０ｇを２００ｍｌの１Ｎ−ＨＣｌに加えメジウム瓶中で攪拌しながら７０〜１０５℃で１５〜３０分加水分解を行った。
２．  冷却後ＮａＯＨで中和し、ろ過を行った。ろ過に時間がかかる場合は遠心分離で固液分離を行いその後、液体部分をろ過する。
３．  ろ液に粉末活性炭を加え常温で１５分攪拌後、０．４５μｍのミリポアフィルターでろ過し、活性炭を除去した。
４．  旭化成社製マイクロ・アシライザーＧ３を用い、ＡＣ１１０の膜を用いて電導度が一定になるまで脱塩を行った。
５．  強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ型）（三菱化学株式会社製）１００ｍｌに全量約３００ｍｌを負荷後、水１００ｍｌで洗浄、すべての溶出液（水溶出画分）を採取し金属などの陽イオンは樹脂に吸着させて除去した。
６．  水溶出画分全量を弱塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ３０（ＯＨ型）  （三菱化学株式会社製）１２０ｍｌに負荷後、水６００ｍｌで中性糖（フコース、キシロースなど）を溶出後、１０％蟻酸５００ｍｌで硫酸化フコース非含有酸性オリゴ糖を溶出。その後０．５Ｎ−ＨＣｌ、３００ｍｌ、１Ｎ−ＨＣｌ、３００ｍｌ、３Ｎ−ＨＣｌ、３００ｍｌで硫酸化フコース含有酸性オリゴ糖を溶出した。
７．  １０％蟻酸５００ｍｌ溶出した硫酸化フコース非含有酸性オリゴ糖画分を減圧濃縮して蟻酸を除去した。この溶液を実施例７−アの方法でＨＰＬＣ分析を行い、ＧＦ（I）
、ＧＦ２（II）、Ｇ２Ｆ２（XII）、Ｇ２Ｆ３（VIII）のピークを確認した。
本溶液を凍結乾燥し、粉末を得た。
８．  １Ｎ−ＨＣｌ溶出画分（硫酸化フコース含有酸性オリゴ糖画分）を減圧濃縮した。
本画分を実施例７−アの方法でＨＰＬＣ分析することにより、硫酸化フコース、三糖としてＧＳＦ（V）、四糖としてＧＳＦ２（VI）、およびＧＳＦaＦ（VII）が検出された。
９．  １０％蟻酸溶出画分の凍結乾燥品を水に溶解後、粉末活性炭を加え、２０分攪拌後０．４５μｍのミリポアフィルターでろ過し色素成分を除去した。
１０．  ろ液をアミコンフィルターＹＭ１０を装着した限外ろ過装置（分子量１０，０００カット膜）を用いて限外ろ過し、ろ液を３ｍｌに減圧濃縮した。
１１．  濃縮液を４回に分け、それぞれ０．５ｍｌ、０．６２５ｍｌ、０．６２５ｍｌ、０．６２５ｍｌをそれぞれＮＨ２カラム（ＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２−Ｐ−９０（２０ｘ３００ｍｍ）に負荷しＣＨ３ＣＮ：５０ｍＭ−ＨＣｌ＝４：１、６ｍｌ／分でカラムオーブンを５０℃に加温し、７０分溶出後、ＣＨ３ＣＮ：５０ｍＭ−ＨＣｌ＝３：１、６ｍｌ／分でさらに５０分間溶出を行った。
２１０ｎｍの吸光度を測定し、ＧＦ（I）、ＧＦ２（II）、Ｇ２Ｆ２（XII）、Ｇ２Ｆ３（
VIII）に相当するピークを分取した。
１２．  それぞれの画分を減圧濃縮後、ＮａＯＨで中和後、旭化成社製マイクロ・アシライザーＳ１を用い、膜にＡＣ１１２を用い電導度が一定になるまで脱塩し、減圧濃縮後凍結乾燥した。【００７５】
その結果、ＧＦ（I）、ＧＦ２（II）、Ｇ２Ｆ２（XII）、Ｇ２Ｆ３（VIII）のナトリウム塩を採取した。
【実施例４】
【００７６】
硫酸化フコース含有フコイダンオリゴ糖の調製
１．  実施例３と同様の方法で沖縄発酵化学社製フコイダン加水分解し、ＮａＯＨで中和しろ過し、活性炭処理を行い、マイクロ・アシライザーで脱塩を行った。
２．  強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ型）１００ｍｌ（三菱化学株式会社製）に全量約２５０ｍｌを負荷後、水６０ｍｌで洗浄、すべての溶出液（水溶出画分）を採取し金属などの陽イオンは樹脂に吸着させて除去した。
３．  水溶出画分全量を弱塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ３０（ＯＨ型）  （三菱化学株式会社製）２００ｍｌに負荷後、水１０００ｍｌで中性糖（フコース、キシロースなど）を溶出後、１０％蟻酸１０００ｍｌで硫酸化フコース非含有酸性オリゴ糖を溶出した。その後０．２Ｎ−ＨＣｌ、６００ｍｌ、０．４Ｎ−ＨＣｌ、７５０ｍｌ、１Ｎ−ＨＣｌ、１０００ｍｌで硫酸化フコース含有酸性オリゴ糖を溶出した。
４．  ０．４Ｎ塩酸溶出画分の後半５２０ｍｌ（硫酸化フコース含有酸性オリゴ糖画分）を５０ｍｌに減圧濃縮して塩酸を除去した。
５．  濃縮液を１Ｎ−ＮａＯＨで中和し、旭化成社製マイクロ・アシライザーＧ３を用い、膜にＡＣ１１０を用い電導度が一定になるまで脱塩した。
６．  脱塩液をアミコンフィルターＹＭ１０を装着した限外ろ過装置（分子量１０，０００カット膜）を用いてろ過し、水洗浄し、ろ液および洗浄液を減圧濃縮し、凍結乾燥し、乾燥粉末を得た。本画分を実施例７−アの方法でＨＰＬＣ分析することにより、硫酸化フコース、三糖としてＧＳＦ（V）、四糖としてＧＳＦＦ（VI）、およびＧＳＦａＦ（VII）が検出された。
７．  乾燥粉末を３回に分け、それぞれをＮＨ２カラム（ＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２−Ｐ−９０、２０ｍｍφｘ３００ｍｍ）に負荷し、ＣＨ３ＣＮ：１３３ｍＭ−ＨＣｌ＝７：３、６ｍｌ／分でカラムオーブンを５０℃に加温し、１５０分間溶出を行った。
８．  ８０分付近（VIIを含む画分）、１３５分付近（VおよびVIを含む画分）の溶出画分
を減圧濃縮後、ＮａＯＨで中和し、旭化成社製マイクロ・アシライザーＳ１を用い、膜にＡＣ１１０を用い電導度が一定になるまで脱塩し、減圧濃縮後凍結乾燥した。
その結果、VIIを含む画分、VおよびVIを含む画分のナトリウム塩を得た。
【実施例５】
【００７７】
硫酸化フコースの調製
１．  実施例３と同様の方法で沖縄発酵化学社製フコイダン加水分解し、ＮａＯＨで中和し、ろ過し、活性炭処理を行い、マイクロ・アシライザーで脱塩を行い、脱塩液を陽イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ型）に負荷後、溶出液（水溶出画分）を採取し金属などの陽イオンは樹脂に吸着させて除去した。
２．  水溶出画分全量を弱塩基性陰イオン交換樹脂ＷＡ３０（ＯＨ型）２００ｍｌに負荷後、水１０００ｍｌで中性糖（フコース、キシロースなど）を溶出後、１０％蟻酸１０００ｍｌで硫酸化フコース非含有酸性オリゴ糖を溶出。その後０．２Ｎ−ＨＣｌ、６００ｍｌ、０．４Ｎ−ＨＣｌ、７５０ｍｌ、１Ｎ−ＨＣｌ、１０００ｍｌで硫酸化フコース含有酸性オリゴ糖を溶出した。
３．  １Ｎ−ＨＣｌ溶出画分の前半２５０ｍｌ（硫酸化フコース画分）を５０ｍｌに減圧濃縮した。
４．  濃縮液を１Ｎ−ＮａＯＨで中和し、旭化成社製マイクロ・アシライザーＧ３を用い、膜にＡＣ１１０を用い電導度が一定になるまで脱塩した。
５．  脱塩液をアミコンフィルターＹＭ１０を装着した限外ろ過装置（分子量１０，０００カット膜）を用いてろ過し、ろ液を減圧濃縮した。本画分を実施例７−アの方法でＨＰＬＣ分析することにより、硫酸化フコースであることがわかった。
６．  濃縮液０．５ｍｌを２回に分け、ＮＨ２カラム（ＡｓａｈｉｐａｋＮＨ２−Ｐ−９０、２０ｍｍφｘ３００ｍｍ）に負荷し、ＣＨ３ＣＮ：１３３ｍＭ−ＨＣｌ＝７：３、６ｍｌ／分でカラムオーブンを５０℃に加温し、１５０分間溶出を行った。ＲＩの吸光度を測定し、１００分付近に溶出する硫酸化フコースに相当するピークを分取した。
７．  この画分を減圧濃縮後、ＮａＯＨで中和し、旭化成社製マイクロ・アシライザーＳ１を用い、膜にＡＣ１１０を用い電導度が一定になるまで脱塩し、減圧濃縮後凍結乾燥した。【００７８】
その結果、硫酸化フコースのナトリウム塩を採取した。
【実施例６】
【００７９】
フコイダンオリゴ糖の調製
１．  沖縄発酵化学社製フコイダン６０ｇに１２００ｍｌの１Ｎ−ＨＣｌを加え、メジウム瓶中で７０〜１０５℃で１５分〜３時間、加水分解を行う。
２．  冷却後ＮａＯＨで中和し、ろ過を行う。ろ過に時間がかかる場合は遠心分離で固液    分離を行いその後、液体部分をろ過する。
３．  ろ液に粉末活性炭を加え常温で１５分攪拌後、０．４５μｍのミリポアフィルター    でろ過し、活性炭を除去した。
４．  旭化成社製マイクロ・アシライザーＧ３を用い、ＡＣ１１０の膜を用いて電導度が一定になるまで脱塩を行い、白濁脱塩液を得る。
５．  白濁脱塩液を０．４５μｍのミリポアフィルターでろ過し濁りを除去した。
６．強酸性陽イオン交換樹脂ダイヤイオンＳＫ１Ｂ（Ｈ型）１００ｍｌ（三菱化学株式会社製）に全量を負荷し溶出させた後、水１００ｍｌで洗浄、溶出液全量（水溶出画分）を採取し金属などの陽イオンは樹脂に吸着させて除去した。
７．  水溶出画分全量を減圧濃縮し２５０ｍｌにする。そのうち１００ｍｌを弱塩基性陰イオン交換樹脂ダイヤイオンＷＡ３０（ＯＨ型）（三菱化学株式会社製）１２０ｍｌに負荷後、水４７５ｍｌで中性糖（フコース、キシロースなど）を溶出後、１０％蟻酸５００ｍｌで硫酸化フコース非含有酸性オリゴ糖を溶出。その後１Ｎ−ＨＣｌ、５００ｍｌで硫酸化フコース含有酸性オリゴ糖を溶出した。
８．  １０％蟻酸５００ｍｌで溶出した硫酸化フコース非含有酸性オリゴ糖画分を減圧濃縮して蟻酸を除去した。
この溶液を実施例７−アの方法でＨＰＬＣ分析を行い、ＧＦ（I）のピークを確認した。本溶液を凍結乾燥し、白色粉末を得た。
【実施例７】
【００８０】
単離品の純度測定、定性分析
ア．ＨＰＬＣ法
実施例３で得られたＧＦ（I）、ＧＦ２（II）、Ｇ２Ｆ２（XII）、Ｇ２Ｆ３（VIII）サンプルの各５％水溶液を、カラムに資生堂ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫ−ＮＨ２（４．６ｍｍφ×２５０ｍｍ）を使用し、カラム温度を６０℃で、移動相にアセトニトリル：１００ｍＭ−ＨＣｌ（７５：２５）もしくは（７０：３０）で１ｍｌ／ｍｉｎを用いＲＩおよびＵＶ（２１０ｎｍ）で検出し分析した。【００８１】
その結果、ＧＦ（I）はＲＩ検出で９．０４８分にピークが検出され、４．３分に検出されるナトリウム塩を除いた、ＲＩ純度は約９８％であった。【００８２】
ＧＦ２（II）はＲＩ検出で１０．５５分にピークが検出され、４．３分に検出されるナトリウム塩を除いた、ＲＩ純度は約９３％であった。【００８３】
Ｇ２Ｆ２（XII）はＲＩ検出で１８．２９分にピークが検出され、４．３分に検出されるナトリウム塩を除いた、ＲＩ純度は約７７％であった。残りの２３％はＧ２Ｆ３（VIII）であった。【００８４】
Ｇ２Ｆ３（VIII）はＲＩ検出で２１．５６９分にピークが検出され、４．３分に検出されるナトリウム塩を除いた、ＲＩ純度は約７８％であった。残りの２２％はＧ２Ｆ２（XII）であった。
イ．ＭＳによる定性分析
実施例３で得られたＧＦ（I）、ＧＦ２（II）、Ｇ２Ｆ２（XII）、Ｇ２Ｆ３（VIII）を約１０ｐｐｍとなるように５０％メタノール／Ｈ2Ｏに溶解し、Ｑ−ＴＯＦ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ製、ＵＫ）でＺ−スプレー、ＥＳＩイオン源、ナノキャピラリーを用いネガティブモードで測定を行った。キャピラリー電圧は１０００Ｖ、ｃｏｎｅ  ｅｎｅｒｇｙ  は３０Ｖで測定した。その結果、ＧＦはｍ／ｚ３３９［Ｍ−Ｈ］−，  ＧＦ２はｍ／ｚ４８５［Ｍ−Ｈ］−，Ｇ２Ｆ２はｍ／ｚ６６１［Ｍ−Ｈ］−，Ｇ２Ｆ３はｍ／ｚ８０７［Ｍ−Ｈ］−にそれぞれのオリゴ糖を示すイオンが認められた。
ウ．標識化とＮＭＲによる構造解析
ＡＢＥＥ（４−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃａｃｉｄ  ｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ）による標識化糖の調製
［反応］
１）  ４．２８０ｍｇのＧ２Ｆ２＝XII（実施例３で取得）画分を８５．６μＬ  の水に溶解させ５ｗｔ％水溶液とし、３２０μＬ  のＡＢＥＥ試薬溶液*（ＡＢＥＥ試薬溶液*：４−アミノ安息香酸エチル１６５ｍｇ  （１．０ｍｍｏｌ  ）、  ジメチルアミンボラン３４ｍｇ  （０．５８ｍｍｏｌ）、メタノール３５０μＬ、酢酸４１μＬ  ）を加え攪拌後６５℃で１時間反応した。
２）  反応溶液にクロロホルム１．６ｍＬ−  水１．６ｍＬを加え３回液々抽出した。
３）  水層をＳｅｐＰａｋＣ１８で固相抽出（溶出液：３０％％アセトニトリル／水）後、凍結乾燥し、２．８ｍｇの粉末を得た。
［ＨＰＬＣ分取条件］
カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＯＤＳ−ＡＭ−３２３ Ｓ−５μｍ（１０ｍｍφ ｘ ２５０ｍｍ）
移動相：Ａ：Ｈ2Ｏ−０．１％ＨＣＯＯＨ、Ｂ：ＣＨ３ＣＮ−０．１％ＨＣＯＯＨ
流速：２．０ｍＬ／ｍｉｎ
グラジュエント：  Ｂｃｏｎｃ．  ８％アイソクラティック（２０分）、Ｂ８％→３０％（４０分）
検出：  Ａ３０５ｎｍ
４５分から４７分に溶出した画分（ＡＢＥＥ標識化Ｇ２Ｆ２）を集めて凍結乾燥し０．６ｍｇを得た。
［ＡＢＥＥ標識化Ｇ２Ｆ２（XII）の機器分析］
分取ＨＰＬＣで得られたＡＢＥＥ標識化Ｇ２Ｆ２をＬＣＭＳ−ＩＴ−ＴＯＦ（株式会社島津製作所製）でＥＳＩイオン源、ネガティブモードで質量分析を行った。その結果ｍ／ｚ  ８１０．２６２４に［Ｍ−Ｈ］−のイオンが認められ、分子式はＣ３３Ｈ４９Ｏ２２Ｎ（分子量計算値  ８１０．２６６８との誤差−５．４３ｐｐｍ）と求められた。【００８５】
次にＡＢＥＥ標識化Ｇ２Ｆ２＝XIIをＣＤ３ＯＤに溶解し、ＡＶＡＮＣＥ−７５０  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＢＲＵＫＥＲ  ＢＩＯＳＰＩＮ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）にてＮＭＲの測定を行った。測定項目は1Ｈ−ＮＭＲ，ＣＯＳＹ，ＴＯＣＳＹ，ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣである。【００８６】
ＭＳおよびＮＭＲにより構造解析した結果、オリゴ糖部分は化合物（XII）で示される［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）−α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）］−［α−Ｄ−ＧｌｃＡ−（１→２）］−Ｌ−Ｆｕｃであることが明らかになった。
【実施例８】
【００８７】
α−グルコシダーゼ活性の測定
１．  ０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ2Ｏ  と０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ2Ｏを混合しｐＨ７．０に調整）、２ｇ／Ｌの牛血製アルブミン（ナカライテスク株式会社製、Ｆ−Ｖ、ｐＨ５．２、純度９６％）および０．２ｇ／ＬのＮａＮ３（ナカライテスク株式会社製、試薬特級）を添加した。酵素溶液は上記、緩衝液にα−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ（和光純薬株式会社製、酵母由来、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｇ）を０．５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ（１００μｇ／２０ｍｌ）となるように溶解した。基質溶液は、上記、緩衝液にｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ナカライテスク株式会社製、試薬特級）を５ｍＭ（７．５２５ｍｇ／５ｍｌ）となるように溶解した。
２．  サンプルは実施例３で精製した、ＧＦ（I）を２００ｍｇ／ｍｌ Ｈ2Ｏとなるように調製し、６段階に２倍希釈を行った。９６穴マイクロプレートを用い、サンプル溶液１０μＬに酵素液４５μＬを加え、３７℃で５分間、プレインキュベーションした後、基質溶液、４５μＬを加えＡ４０５ｎｍの吸光度を測定（０ｍｉｎのＡ４０５ｎｍ）し、３７℃で５分間、インキュベーションした後、Ａ４０５ｎｍの吸光度を測定（５ｍｉｎのＡ４０５ｎｍ）した。コントロールとしてサンプルのかわりにＨ2Ｏを添加したものの吸光度を測定し、コントロールのＡ４０５ｎｍとの差を阻害率として算出した。活性測定は４連で行った。
３．  サンプルは実施例３で精製したＧＦ（I）、ＧＦ２（II）、Ｇ２Ｆ２（XII）、Ｇ２Ｆ３（VIII）、実施例４で製造したＧＳＦａＦ（VII）を含む画分、ＧＳＦ及びＧＳＦＦを含む画分（V＆VI））、実施例5で精製した硫酸化フコース（Ｓ）を５０ｍｇ／ｍｌ Ｈ2Ｏとなるように調製した。比較対照としてＸ２（キシロビオース）およびグルクロン酸（シグマアルドリッチ）をＮａＯＨで中和しグルクロン酸換算で５０ｍｇ／ｍｌ Ｈ2Ｏとなるように調製した。９６穴マイクロプレートを用い、サンプル溶液１０μＬに酵素液４５μＬを加え、３７℃で５分間、プレインキュベーションした後、基質溶液、４５μＬを加えＡ４０５ｎｍの吸光度を測定（０ｍｉｎのＡ４０５ｎｍ）し、３７℃で５分間、インキュベーションした後、Ａ４０５ｎｍの吸光度を測定（５ｍｉｎのＡ４０５ｎｍ）した。コントロールとしてサンプルのかわりにＨ2Ｏを添加したものとのＡ４０５ｎｍの差を阻害率として算出した。活性測定は２連で行った。
４．  計算式
（コントロ−ルのＡ４０５ｎｍの５ｍｉｎの値）−（コントロ−ルのＡ４０５ｎｍの０ｍｉｎの値）＝△Ａ４０５ｎｍ（ｃｏｎｔ．）
（サンプルのＡ４０５ｎｍの５ｍｉｎの値）−（サンプルのＡ４０５ｎｍの０ｍｉｎの値）＝△Ａ４０５ｎｍ（ｓａｍｐｌｅ）
｛△Ａ４０５ｎｍ（ｃｏｎｔ．）−△Ａ４０５ｎｍ（ｓａｍｐｌｅ）｝÷△Ａ４０５ｎｍ（ｃｏｎｔ．）  ｘ  １００＝阻害率（％）
として算出した。
５．  ２の結果、ＧＦ（I）は用量依存的にα−グルコシダーゼを阻害し、ＩＣ５０は２０．４ｍｇ／ｍｌであった。
６．  ３の結果、フコイダン由来オリゴ糖のうちグルクロン酸とフコースからなるオリゴ糖（I、II、VIII、XII）は５ｍｇ／ｍｌにおいて、２３〜３１％のα−グルコシダーゼ阻害活性を示し、硫酸化フコースおよび硫酸化フコースとグルクロン酸とフコースからなるオリゴ糖は１７〜３６％のα−グルコシダーゼ阻害活性を示し、α−グルコシダーゼ阻害を有することが知られているＸ２の１０．１５％を上回る強い活性が認められた。（特許文献８）また構成糖であるグルクロン酸を中和した物は８％の阻害活性であった。（図２９）
【実施例９】
【００８８】
リパーゼ阻害活性の測定
１．  ９６穴平底プレートに実施例３で製造したＧＦ（Ｉ）、実施例４で製造したＧＳＦａＦ（VII）を含む画分およびＧＳＦ（V）とＧＳＦＦ（VI）とを含む画分を終濃度４ｍｇ／ｍｌとなるように調製し２５μｌ、緩衝液（１３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．３６ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む））５０μｌ、４−メチルウンベリフェロンオレイン酸エステル（シグマ）を２５μｌ（終濃度１００μＭ）添加し、３０分間室温で放置した。その後リパーゼ（ブタ膵リパーゼ、シグマ）を５０μｌ（最終濃度１００Ｕ／ｍｌ）添加し反応を開始した。
２．  ３０分後クエン酸バッファー（ｐＨ４．２）を１００μｌ添加することで反応を停止した。反応によって生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度（励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ）を蛍光プレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｅｎｔ  ＣＦ）を用い測定した。
３．  コントロールとしてサンプルの代わりに水を用いたもの、ブランクとしてサンプルの代わりに水、リパーゼの代わりにバッファーを用いたものを用い、下記式を用いてリパーゼ阻害活性を算出した。
４．  計算式
リパーゼ阻害活性（％）＝１００−（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｂ）×１００
Ａ：サンプルの蛍光強度、Ｂ：ブランクの蛍光強度、Ｃ  ：コントロールの蛍光強度
５．  結果、ＧＦ（Ｉ）は４ｍｇ／ｍｌにおいて８１％のリパーゼ阻害活性、ＧＳＦａＦ（VII）を含む画分（図３０中（VII））およびＧＳＦ（V）とＧＳＦＦ（VI）とを含む画分（図３０中ＧＳＦ＆ＧＳＦＦ）は４ｍｇ／ｍｌにおいて１７％程度のリパーゼ阻害活性が認められた（図３０）。
【実施例１０】
【００８９】
味質評価
実施例３−７で製造した硫酸化フコース非含有フコイダンオリゴ糖の５％水溶液、実施例４−６で製造した硫酸化フコース含有フコイダンオリゴ糖の５％水溶液、実施例６で製造したＧＦ（I）、フコイダンの常温での官能試験を４名のパネラーでおこない、自由に意見を記入させた。【００９０】
その結果を表７に示す。硫酸化フコース非含有フコイダンオリゴ糖と硫酸化フコース含有フコイダンオリゴ糖はほのかな甘みをもつオリゴ糖であった。また、フコイダンは濃い褐色溶液で海草臭が後に残るのに対して、ＧＦは無色の溶液で若干の甘味を持ったさわやかな酸味料であった。【００９１】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【手続補正書】
【提出日】平成21年10月5日(2009.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
また、コンドロイチン硫酸やキトサンがリパーゼ阻害活性を持つことは知られている（非特許文献５、６）。
【特許文献１】特開平７−２１５９９０
【特許文献２】特開２００２−２２６４９６
【特許文献３】特開２０００−２３６８８９
【特許文献４】特開２０００−３５１７９０
【特許文献５】特開２００３−１９９５９６
【特許文献６】特開２００１−２２６４０８
【特許文献７】特開平６−６５０８０
【特許文献８】特開平８−２３９７３
【特許文献９】特開平１０−２９０６８１
【非特許文献１】Carbohydrate research 4, 189-195 (1967)
【非特許文献２】Carbohydrate research 37, 75-79 (1974)
【非特許文献３】Carbohydrate research 41, 308-312 (1975)
【非特許文献４】Glycoconjugate Journal 16,19-26 (1999)
【非特許文献５】International Journal of obesity 24,1131-1138(2000)
【非特許文献６】International Journal of obesity 23,174-179(1999)
【非特許文献７】Infection and Immunity, 35, 71-78(1982)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
また、α−グルコシダーゼ阻害やリパーゼ阻害活性が肥満防止効果や血糖増加抑制効果に有効であることは知られている（特許文献７，８，９、非特許文献５，６参照）。例えば、肥満防止効果を得るため、α−グルコシダーゼ阻害やリパーゼ阻害活性を持つオリゴ糖としては、キシロビオースにα−グルコシダーゼ阻害作用があるが、緩慢な効果でしかない。さらに、α−グルコシダーゼ阻害とリパーゼ阻害活性を併せて持つものは知られていない。
【国際調査報告】
2008090631.tif 000063
2008090631.tif 000064
2008090631.tif 000065
2008090631.tif 000066
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