(57)【要約】  本発明は、免疫賦活作用とγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の産生能を併せ持つ、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株を提供すること、及び、この菌株の菌体を含有する飲料及び食品並びにこれらを有効成分として含有する免疫賦活剤を提供することを目的としている。本発明は、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株であって、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生し、免疫賦活作用を有する菌株を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株であって、
発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生し、
免疫賦活作用を有する菌株。
【請求項２】
前記免疫賦活作用は、ＩｇＡの産生促進作用である、請求項１記載の菌株。
【請求項３】
クトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のＳＢＣ８０４４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３１）である、請求項１又は２のいずれか一項記載の菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載の菌株の菌体を含有する飲料。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか一項記載の菌株の菌体を含有する食品。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項記載の菌株の菌体を有効成分として含有する免疫賦活剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
免疫賦活作用を有する菌株並びにその菌株を含有する飲料、食品及び免疫賦活剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌や感染症の治療では、抗癌剤や抗生物質等を用いた化学療法を中心に、外科的療法及び放射線療法を組み合わせて治療方針が立てられてきた。しかし、近年では、低下した免疫機能を活性化して、病原ウイルスや悪性腫瘍を自ら排除する免疫療法が注目を集めている。例えば、日常生活では、悪性腫瘍細胞や感染細胞体が生体内のあらゆるところで発生するが、ＮＫ細胞がこれらと闘って癌や感染症から身を守っている。免疫療法とは、こうした免疫システムの働きに目をつけて、これを高めて正常に保つことによってさまざまな疾患を治療していこうとするものである。【０００３】
免疫賦活剤の探索は、生体における免疫機能を高め、健康を維持するために有効であり、これまでも行われてきた。これらの中で、毒性が低く、有効性が確認されている免疫賦活剤としては、微生物やキノコ或いは植物等が生産する免疫賦活物質が知られる。例えば、微生物の細胞壁多糖類、又はアガリクスやシイタケのようなキノコに由来する多糖類が該当する（特許文献１及び２）。最近では、グルコシド結合を有する多糖類に特に効果があるとして開示されている（特許文献３、４及び５）
【特許文献１】特公昭４９−４８４号公報
【特許文献２】特公昭５６−４６４８１号公報
【特許文献３】特開平７−１８４５９５号公報
【特許文献４】特開平１０−１９４９７７号公報
【特許文献５】特開２００５−２２００６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、免疫調節物質や免疫刺激剤等の薬物は、血中で免疫反応に関与する分子に直接作用し、生体の恒常性維持に必要な免疫反応にも影響を与えるため、副作用が大きいという問題点がある。また、これまでに報告されている乳酸菌由来の免疫賦活剤は、粘膜免疫を活性化する作用が弱く、癌、感染症、さらにはアレルギー性疾患等の生活習慣病の予防及び治療において効果が不十分であった。さらに、免疫賦活作用を有し、かつ、抗ストレス作用を有するγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生する乳酸菌の菌株については、これまで報告がなかった。【０００５】
そこで本発明の目的は、免疫賦活作用とγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の産生能を併せ持つ、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株を提供することにある。また本発明の目的は、このラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株の菌体を含有する飲料及び食品並びにこれらを有効成分として含有する免疫賦活剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、ラクトバチラス・ブレビスの亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株であって、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生し、免疫賦活作用を有する菌株を提供する。【０００７】
本発明者らは、ラクトバチラス・ブレビス種の乳酸菌のうち亜種ブレビスに属する菌株が、特に効果的に、マウスパイエル板からのＩｇＡの産生を誘導することを見出した。このＩｇＡの産生促進作用は粘膜免疫を活性化し、生体防御機能の維持と改善に有用である。乳酸菌は、古くから発酵食品に利用されている細菌であり、化学合成された免疫賦活剤と比較して、人体に対する安全性がはるかに優れている。また、通常の乳酸菌は、発泡性アルコール飲料中で増殖不可能であるが、本発明の菌株は、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であるため、この性質を利用して本発明の菌株から免疫賦活作用を有しない他の乳酸菌株を除くことができる。さらに、本発明の菌株は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するため、上記の免疫賦活作用に加えて抗ストレス作用も有しており、身体的ストレス及び精神的ストレスと相関のある癌及び感染症等の予防及び治療に対して強い効果が期待できる。このような菌株としては、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスのＳＢＣ８０４４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３１）が特に好ましい。【０００８】
上記の免疫賦活作用は、ＩｇＡの産生促進作用であることが好ましい。【０００９】
ＩｇＡは、主に腸管粘液、唾液、涙、母乳などの分泌液に含まれる免疫グロブリンの１つであり、粘膜局所の生体防御機構として重要な役割を果たしている。本発明の菌株は、ＩｇＡの産生を促進できるため、粘膜局所の生体防御機構を高めることができ、感染症、さらにはアレルギー性疾患等の生活習慣病の予防及び治療に利用できる。【００１０】
また、本発明は、上記菌株の菌体を含有する飲料及び食品を提供する。【００１１】
上記菌株の菌体は、免疫賦活作用を有し、人体に対して安全であることから、健康食品素材として飲料及び食品に含有させて利用できる。さらに、上記菌株はγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するため、抗ストレス作用、血圧降下作用及び精神安定作用を併せ持ち、健康食品素材として利用価値が高い。【００１２】
また、本発明は、上記菌株の菌体を有効成分として含有する免疫賦活剤を提供する。【００１３】
上記菌株の菌体は、ＩｇＡの産生促進作用を有するため、この菌体を有効成分として含有する免疫賦活剤を製造すれば、化学合成された医薬品よりも安全性に優れた免疫賦活剤として利用できる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、これまでに知られる乳酸菌株よりも強い免疫賦活作用を有するラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株を提供できる。また、本発明の菌株は、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であるため、この性質を利用して本発明の菌株から免疫賦活作用を有しない他の乳酸菌株を除くことができる。さらに、本発明の菌株は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するため、免疫賦活作用に加えて抗ストレス作用も有しており、身体的ストレス及び精神的ストレスと相関のある癌、感染症、さらにはアレルギー性疾患等の生活習慣病の予防及び治療に対して強い効果が期待できる。また本発明によれば、上記菌株の菌体を含有し、安全性に優れ、かつ、免疫賦活作用を有する飲料、食品及び免疫賦活剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株の菌体縣濁液の添加によりマウスパイエル板細胞が産生したＩｇＡの量を示したものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。【００１７】
本発明の菌株は、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する菌株であって、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生し、免疫賦活作用を有することを特徴としている。【００１８】
ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）には、４つの亜種（ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ）が存在し、それぞれ、ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、グレブセンシス（ｇｒａｖｅｓｅｎｓｉｓ）、オタキエンシス（ｏｔａｋｉｅｎｓｉｓ）、コアギュランス（ｃｏａｇｕｌａｎｓ）であるが、上記菌株は、亜種ブレビスに属する。亜種ブレビスに属する菌株は、１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列及び糖からの酸生成の違い等を指標に分離でき、亜種グレブセンシス、亜種オタキエンシス及び亜種コアギュランスに属さない菌株として分類できる。【００１９】
「免疫賦活作用」とは、生体の免疫力を強化して病気に対する抵抗力をつけることをいう。例えば、マクロファージ、好中球及びＮＫ細胞等を活性化して、自然免疫機能を高めたり、ＩｇＡ等の免疫グロブリンの産生を促進したりすることが挙げられる。特に、ＩｇＡ産生促進作用は、粘膜免疫を高めることができるため、感染症、さらにはアレルギー性疾患等の生活習慣病の予防及び治療に対して強い効果を期待できる。【００２０】
「発泡性アルコール飲料」には、例えば、ビール、雑酒、発泡酒が含まれる。「発泡性アルコール飲料中で増殖可能」とは、発泡性アルコール飲料中で乳酸菌が死滅せず、かつ、細胞分裂して細胞数が増えることをいい、発泡性アルコール飲料のアルコール濃度が５％以上であることが好ましい。【００２１】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株は、自然界から容易に分離でき、１６ＳリボゾームＤＮＡの塩基配列を調べることにより同定できる。また、ＡＴＣＣ等の細胞バンクから購入できる。【００２２】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のうち、発泡性アルコール飲料中で増殖可能である菌株は、特開２００３−２５０５５７号公報に記載された方法に従って選抜できる。具体的には、ラクトバチルス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として所定のプライマーセット（特開２００３−２５０５５７号公報の配列表の配列番号１及び配列番号２に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット）でＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子断片を制限酵素で切断し、アクリルアミドゲル電気泳動後の制限酵素切断パターンを解析し、グループＩＩｂに属する菌株を選抜すればよい。制限酵素切断パターンは、大きく４つのグループに分類されるが、発泡性アルコール飲料中で増殖可能な菌株はグループＩＩｂに属することが判明している。【００２３】
上記の方法以外でも、ラクトバチルス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株を、発泡性アルコール飲料中に移植して培養し、増殖の可否を調べることによっても選抜できる。培養温度は、３０℃が適しているが、１５℃〜４５℃、好ましくは２０℃〜３７℃、特に３０℃前後であれば培養可能である。【００２４】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のうち、γ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡ）を産生する菌株は、培養上清をアミノ酸分析装置等で分析し、ＧＡＢＡの含有量を調べることによって選抜できる。【００２５】
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のうち、免疫賦活作用を有する菌株は、例えば、マウスパイエル板細胞に対するＩｇＡの産生促進作用を試験することによって選抜できる。【００２６】
具体的には、マウスの腸管からパイエル板細胞を分離して培養し、そこに被検菌株の菌体を滅菌して調製した菌体縣濁液を加えて一定時間培養し、パイエル板細胞から分泌されるＩｇＡの産生量をＥＬＩＳＡ等で測定し、ＩｇＡの産生促進作用の有無を調べればよい。【００２７】
尚、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、ＧＡＢＡを産生し、免疫賦活作用を有する、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属するＳＢＣ８０４４（受託の日：２００６年６月２８日；受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３１）は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託されており、入手可能である。【００２８】
本発明の飲料、食品及び免疫賦活剤は、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株であって、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、ＧＡＢＡを産生し、免疫賦活作用を有する、上記の菌株を含有することを特徴としている。【００２９】
上記菌株の菌体は、癌及び感染症等の予防及び治療を目的として飲料及び食品に添加できる。上記飲料及び食品は、上記の菌株の菌体のみからなっていてもよく、当該分野で通常使用される添加物を含んでいてもよい。この添加物としては、例えば、リンゴファイバー、大豆ファイバー、肉エキス、黒酢エキス、ゼラチン、コーンスターチ、蜂蜜、動植物油脂、グルコース等の単糖類、スクロース、フルクトース及びマンニトール等の二糖類、デキストロース及びデンプン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール及びソルビトール等の糖アルコール類、ビタミンＣ等のビタミン類が挙げられ、これらの添加物は単独種又は複数種であってもよい。【００３０】
さらに、癌及び感染症等の予防の目的で、食品添加物として、特定保健用食品、特殊栄養食品、栄養補助食品、健康食品、機能性食品や病者用食品等の飲食物に配合することもできる。【００３１】
本発明の免疫賦活剤は、上記の菌株の菌体を有効成分として含み、担体、賦形剤及び／又はその他の添加物を加えて製剤化すれば、安全性に優れた免疫賦活剤として利用できる。薬学的に許容される添加物としては、例えば、グルコース等の単糖類、スクロース、フルクトース及びマンニトール等の二糖類、デキストロース及びデンプン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール及びソルビトール等の糖アルコール類、ビタミンＣ等のビタミン類、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、珪酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース誘導体、トラガカント、ゼラチン、シロップ、ヒドロキシ安息香酸メチル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、水、鉱油が挙げられ、これらの添加物は単独種又は複数種であってもよい。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００３３】
１）実験に用いた各菌株について
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  ｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ  ｂｒｅｖｉｓ）に属する２１菌株（ＳＢＣ８０４４及び菌株Ａ〜Ｔ）は発明者が分離し、実験に用いるまで凍結乾燥菌体として４℃で保管した。【００３４】
２）ビール中での増殖能力の判定
上記のラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する２１菌株について、ビール中での増殖能を選抜した。選抜方法は、特開２００３−２５０５５７号公報に記載された方法に従って行なった。すなわち、ラクトバチルス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のゲノムＤＮＡを鋳型として所定のプライマーセット（特開２００３−２５０５５７号公報の配列表の配列番号１及び配列番号２に記載の核酸配列からなるオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット）でＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡジャイレースサブユニットＢ遺伝子断片を制限酵素で切断し、アクリルアミドゲル電気泳動後の制限酵素切断パターンを解析することにより判定した。この方法では、制限酵素切断パターンは、大きく４つのグループに分類でき、ビール中で増殖可能である菌株は、グループＩＩｂに属することが判明している。【００３５】
その結果、調べたラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する２１菌株は総てビール中で増殖する菌株であると判定された。尚、これらの菌株を実際にビール中に植菌し増殖の可否を確認したが、上記方法の判定結果と同じであった。【００３６】
３）免疫賦活作用の評価
i)菌体懸濁液の調製
上記の各菌株の免疫賦活作用を評価するために、各菌株の菌体懸濁液を調製した。まず、各菌株を嫌気的条件下（Ｎ２：ＣＯ２：Ｈ２＝９０：５：５のガス組成）、ＭＲＳ液体培地（ディフコ社製、組成：１％プロテオースペプトン、１％牛肉エキス、０．５％酵母エキス、２％ブドウ糖、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ８０、０．５％クエン酸アンモニウム、０．０１％硫酸マグネシウム、０．００５％硫酸マンガン、０．２％リン酸二カリウム）で３日間静置培養し、その培養液を１，５００回転で１０分間遠心分離して、各菌株の菌体を回収した。得られた菌体は、ＰＢＳで洗浄した後に凍結乾燥し、１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳに懸濁した。こうして得られた菌体懸濁液は、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分）して以下の実験に使用した。【００３７】
ii)マウスパイエル板細胞に対するラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株のＩｇＡ産生促進作用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）：
マウスパイエル板細胞にラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する２１菌株の菌体縣濁液を加えて一定時間培養し、パイエル板細胞から分泌されるＩｇＡの量を調べることにより、各菌株のＩｇＡ産生促進作用を評価した。【００３８】
（マウスのパイエル板細胞の調製）
まず、６週齢のＢＡＬＢ/ｃマウス（雌）から腸管を無菌的に摘出し、そこからパイエル板をハサミで外して、ＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社）に浸漬した。ピペットでパイエル板を吸い上げる操作を繰り返すことにより、パイエル板を十分に洗浄し、パイエル板を空のシャーレに移した後に、１０ｍＬのディスパーゼ溶液（１．５ｍＬの１５  ｍｇ／ｍＬ  ディスパーゼ（ＤＩＳＰＡＳＥ；ＧＩＢＣＯ社）と８．５ｍＬのＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ社）を加えて、３７℃で４０〜４５分間、撹拌しながら反応させた。こうして得られた細胞縣濁液は、１，５００回転で１０分間遠心分離してパイエル板細胞を沈殿させ、上清を捨てた後に１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加える操作を繰り返すことによりパイエル板細胞を洗浄した。その後、パイエル板細胞の数が５×１０６個／ｍＬになるように１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて懸濁し、以下の実験に用いた。【００３９】
（ＩｇＡのＥＬＩＳＡによる測定）
細胞密度が２．５×１０６個／ｍＬになるように９６ウェルプレートにマウスパイエル板細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地で７２時間培養した。パイエル板細胞を培養している各ウェルに、各菌株の菌体縣濁液（最終濃度：１μｇ／ｍＬ）を添加し、７日間経過後に培養上清中に分泌されたＩｇＡの量をＥＬＩＳＡで定量した。ポジティブコントロールには、マウスの脾臓細胞に対してＩｇＡ産生促進作用を有するリポポリサッカライド（以下、ＬＰＳ）（ＳＩＧＭＡ社、最終濃度：１０μｇ／ｍＬ）を、ネガティブコントロールには、ＰＢＳを使用した。【００４０】
ＩｇＡの測定には、ＩｇＡ  ＥＬＩＳＡキット（ＩｇＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ＢＥＴＨＹＬ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用い、製造元のプロトコールに従って定量した。【００４１】
図１は、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する２１菌株の菌体縣濁液の添加によりマウスパイエル板細胞が産生したＩｇＡの量を示したものである。その結果、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスのＳＢＣ８０４４は、マウスパイエル板細胞に対してＩｇＡの産生を誘導し、その産生量はコントロール及び他のラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属する菌株（菌株Ａ〜Ｔ）によって誘導される量と比較して顕著に高いものであり、ＬＰＳの作用に匹敵するものであった。ＩｇＡ産生促進作用を有するＳＢＣ８０４４（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６３１；受託の日：２００６年６月２８日）は、国際寄託当局である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に寄託した。【００４２】
４）γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の産生能の測定
ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属するＳＢＣ８０４４のγ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡ）の産生能について試験した。まず、ＳＢＣ８０４４を、１００ｍＬの液体培地（３％麦芽エキス（ＤＩＦＣＯ社）、２％酵母エキス（ＤＩＦＣＯ社）、０．２％グルタミン酸ナトリウム、ｐＨ６．０）に植菌し、４日間静置培養した。その後、ＳＢＣ８０４４の培養液を１，５００回転で１０分間遠心分離して培養上清を回収し、その培養上清に含まれるＧＡＢＡの量をＨＰＬＣで定量した。使用したＨＰＬＣの条件は以下の通りである。
・ＨＰＬＣ装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ  １１００
・使用カラム：ＺＯＲＢＡＸ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ＡＡＡ（４．６×１５０ｍｍ、３．５μｍ）（島津ジーエルシー社）
・カラムオーブン：４０℃
・流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・蛍光検出器：Ｅｘ．３４０ｎｍ、Ｅｍ．４５０ｎｍ
・ＨＰＬＣ試薬：１０ｍｇ／ｍＬ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＯＰＡ試薬（０．４Ｍ  ホウ酸バッファー、ｐＨ１０．２）（島津ジーエルシー社）
・溶離液：Ａ液：４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．８）
Ｂ液：４５体積％アセトニトリル、４５体積％ＭｅＯＨ、１０％Ｈ２Ｏ
・  タイムテーブル（グラジェント）：表１を参照【００４３】
【表１】
2008023662.tif 000002
【００４４】
その結果、ＳＢＣ８０４４は、培養上清中にＧＡＢＡを８５７．７  μｍｏｌ／Ｌ産生した。【００４５】
以上の結果より、ラクトバチラス・ブレビス亜種ブレビスに属するＳＢＣ８０４４は、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であり、抗ストレス作用を有するＧＡＢＡを産生し、免疫賦活作用を有する菌株であることが判明した。【００４６】
５）ＳＢＣ８０４４を用いて製造した果汁乳酸発酵液の官能検査
免疫賦活作用を有するＳＢＣ８０４４を用いて果汁乳酸発酵液を製造し、得られた果汁乳酸発酵液の香りと風味について官能検査を行なった。【００４７】
表２は、乳酸発酵に使用した果汁について、果実の種類、糖度及びｐＨを示したものである。【００４８】
【表２】
2008023662.tif 000003
【００４９】
各果汁は、それぞれグレープフルーツ濃縮果汁、りんご濃縮果汁、白ぶどう濃縮果汁及びレモン濃縮果汁を滅菌水で希釈して所定の糖度になるように調製し、ｐＨはＮａＯＨを添加して調整した。乳酸発酵は、各果汁１００ｍＬに対し１．１×１０９細胞のＳＢＣ８０４４を植菌し、１日１回の撹拌を行い、３０℃で７２時間、攪拌時以外は静置条件下で行なった。発酵終了後、各乳酸発酵液の濁度を分光光度計（タイテック社）で測定し、乳酸量をＦ−ｋｉｔ  Ｄ−／Ｌ−乳酸（Ｊ．Ｋ．インターナショナル社）で測定した。各乳酸発酵液の濁度は、ＳＢＣ８０４４の増殖の指標とし、乳酸量は乳酸発酵の程度の指標とした。【００５０】
表３は、各乳酸発酵液の濁度、乳酸量及び官能検査の結果を示したものである。【００５１】
【表３】
2008023662.tif 000004
【００５２】
その結果、試験に用いた全ての果汁でＳＢＣ８０４４の乳酸発酵は進み、果汁乳酸発酵液を製造するに至った。特に、りんご果汁及び白ぶどう果汁を用いた発酵では、ヨーグルト風味はなく、ベース果汁の風味が保持されており、乳酸発酵飲料として好ましい性質を備えるものであった。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明の菌株は、発泡性アルコール飲料中で増殖可能であるため、この性質を利用して本発明の菌株から免疫賦活作用を有しない他の乳酸菌株を除くことができる。さらに、本発明の菌株は、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生するため、免疫賦活作用に加えて抗ストレス作用も有しており、身体的ストレス及び精神的ストレスと相関のある癌、感染症、さらにはアレルギー性疾患等の生活習慣病の予防及び治療に対して強い効果が期待できる。
【図１】
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【国際調査報告】
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