(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）【化１】2008029770.tif 000040［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｙ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｑ1、Ｑ2およびＡｒは、明細書中に定義したとおりである］で表される繰り返し単位を含み、架橋剤モノマー由来の繰り返し単位を含んでいてもよい共重合体、または式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で表される繰り返し単位および架橋剤モノマー由来の繰り返し単位を含む共重合体、ならびに当該共重合体を含んでなる蛍光性温度センサーを提供する。
2008029770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ａ）：
【化１】
2008029770.tif 000032
［式中、Ｒ1は、水素原子およびＣ1-3アルキルから選択され；
Ｒ4およびＲ5は、独立に、水素原子およびＣ1-20アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ1-6アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、またはＲ4およびＲ5はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ1-10アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマー；および
式（ｂ）：
【化２】
2008029770.tif 000033
［式中、Ｒ2は、水素原子およびＣ1-3アルキルから選択され；
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ11であり；
Ｒ11は、水素原子、Ｃ1-6アルキル、または−Ｑ1−Ｙであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、およびＣ1-6アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｑ1は、独立に、Ｃ1-20アルキレン、Ｃ3-20アルケニレン、またはＣ3-20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ｙは、独立に、１以上の正電荷または負電荷を有しうるイオン性官能基であって、−ＳＯ3Ｘa、−ＰＯ（ＯＸb）（ＯＸc）、−ＣＯＯＸd、−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23Ｘe-、−Ｃ（＝ＮＲ41）−ＮＲ42Ｒ43、および下式
【化３】
2008029770.tif 000034
により表される基から選択され；
ここで、Ｘa、Ｘb、Ｘc、およびＸdは、独立に、水素原子、またはカウンターカチオンから選択され、Ｘe-およびＸf-はカウンターアニオンであり；
Ｒ21、Ｒ22、およびＲ23は、独立に、Ｃ1-10アルキル、およびＣ7-14アラルキルから選択され、またはＲ21およびＲ22は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；
Ｒ24は、Ｃ1-10アルキル、またはＣ7-14アラルキルであり；
Ｒ41、Ｒ42およびＲ43は、独立に、水素原子およびＣ1-10アルキルから選択され、またはＲ41およびＲ42は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ42およびＲ43は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよい］
で表されるモノマー、および／または分子中に２以上の二重結合を含む架橋剤モノマー：および
式（ｃ）：
【化４】
2008029770.tif 000035
［式中、Ｒ3は、水素原子およびＣ1-3アルキルから選択され；
Ｘ2は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ12であり；
Ｘ3は、直接結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、Ｎ（−Ｒ13）、ＣＯＮ（−Ｒ16）、Ｎ（−Ｒ16）ＣＯ、Ｎ（−Ｒ17）ＣＯＮ（−Ｒ18）、ＳＯ2Ｎ（−Ｒ19）またはＮ（−Ｒ19）ＳＯ2であり；
Ｑ2は、Ｃ1-20アルキレン、Ｃ3-20アルケニレン、またはＣ3-20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ａｒは、６〜１８員芳香族炭素環基、または５〜１８員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の１以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−ＣＨ2−は−Ｃ（Ｏ）−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、Ｃ1-6アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ1-6アルキルカルボニル、Ｃ1-6アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ6Ｒ7、および−ＳＯ2ＮＲ14Ｒ15から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、Ｃ1-6アルキルスルホニル、Ｃ1-6アルキルカルボニルおよびＣ1-6アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｒ6およびＲ7は、独立に、水素原子、Ｃ1-10アルキル、アリール、Ｃ1-10アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ1-10アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、Ｎ−（Ｃ1-10アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ1-10アルキル）カルバモイルから選択され、ここで前記Ｃ1-10アルキル、Ｃ1-10アルキルカルボニル、Ｃ1-10アルキルスルホニル、Ｎ−（Ｃ1-10アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ1-10アルキル）カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
Ｒ6およびＲ7はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ1-10アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ12は、水素原子、Ｃ1-6アルキル、または−Ｑ2−Ｘ3−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、およびＣ1-6アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ13は、水素原子、またはＣ1-6アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、およびＣ1-6アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ14およびＲ15は、独立に、水素原子、およびＣ1-6アルキルから選択され；またはＲ14およびＲ15はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し；
Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18およびＲ19は、独立に、水素原子、およびＣ1-6アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、およびＣ1-6アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体（但し、前記共重合体が、前記式（ｂ）で表されるモノマー由来の繰り返し構造を含まない場合、前記共重合体は、使用するモノマーに対して７モル％以上の量の反応開始剤を使用する共重合反応により調製され、当該反応開始剤が、式（ｄ）：
Ｙ1−（Ｃ1-10アルキレン）−Ｎ＝Ｎ−（Ｃ1-10アルキレン）−Ｙ1
｛式中、Ｃ1-10アルキレンは、独立に、ハロゲン原子およびシアノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｙ1は、独立に、１以上の正電荷または負電荷を有しうるイオン性官能基であり、−ＣＯＯＸd、および−Ｃ（＝ＮＲ41）−ＮＲ42Ｒ43から選択され；Ｘd、Ｒ41、Ｒ42、およびＲ43は既に定義したとおりである｝で表されるアゾ化合物、または過硫酸塩から選択される）。
【請求項２】
前記架橋剤モノマーが、式（ｅ）：
【化５】
2008029770.tif 000036
［式中、Ｒ9およびＲ10は、独立に、水素原子およびＣ1-3アルキルから選択され；
Ｘ4およびＸ5は、独立に、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ12であり；
Ｑ3は、Ｃ1-20アルキレン、Ｃ3-20アルケニレン、またはＣ3-20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよい］
で表される化合物、ジビニルスルホンおよびＣ1-10アルキレンビスマレイミドから選択される化合物である、請求項１に記載の共重合体。
【請求項３】
前記反応開始剤が過硫酸塩から選択される、請求項１または２に記載の共重合体。
【請求項４】
使用するモノマーに対して１４モル％以上の量の反応開始剤を使用する共重合反応により調製される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の共重合体。
【請求項５】
式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）：
【化６】
2008029770.tif 000037
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｙ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｑ1、Ｑ2およびＡｒは、請求項１に定義したとおりである］
で表される繰り返し単位を含む、請求項１に記載の共重合体。
【請求項６】
式（ＩＶ）：
【化７】
2008029770.tif 000038
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｙ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｑ1、Ｑ2、およびＡｒは請求項１に定義したとおりであり；
ａ、ｂ、およびｃは、式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表される共重合体であって、ａ＋ｂ＋ｃ＝１００であって、ｃが０．０１〜２０である、請求項５に記載の共重合体。
【請求項７】
ｂが１〜２０である、請求項５または６に記載の共重合体。
【請求項８】
Ａｒが、下式：
【化８】
2008029770.tif 000039
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、Ｃ1-6アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ1-6アルキルカルボニル、Ｃ1-6アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ6Ｒ7（Ｒ6およびＲ7は、請求項１に定義されたとおりである）、および−ＳＯ2ＮＲ14Ｒ15（Ｒ14およびＲ15は、請求項１に定義されたとおりである）から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、Ｃ1-6アルキルスルホニル、Ｃ1-6アルキルカルボニルおよびＣ1-6アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｘ10は、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択され；
Ｒ8は、水素原子、Ｃ1-10アルキル、およびアリールから選択され、当該アルキルは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリールは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい、請求項１〜７のいずれか１項に記載の共重合体。
【請求項９】
Ｙが、−ＳＯ3Ｘaまたは−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23Ｘe-である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の共重合体。
【請求項１０】
温度の測定に使用する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の共重合体。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の共重合体を含んでなる蛍光性温度センサー。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の共重合体を使用する温度測定方法。
【請求項１３】
液体に請求項１〜９のいずれか１項に記載の共重合体を溶解する工程；および励起光照射下、蛍光強度を測定する工程、を含む、請求項１２に記載の温度測定方法。
【請求項１４】
液体に請求項１〜９のいずれか１項に記載の共重合体を溶解する工程；および励起光照射下、平均蛍光寿命を測定する工程、を含む、請求項１２に記載の温度測定方法。
【請求項１５】
細胞内の温度を測定するための、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の温度測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な蛍光性ポリマーおよび当該ポリマーを用いる温度の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
温度の変化に伴い物性が変化する分子の、温度センサーとしての使用が検討されている（非特許文献１〜５）。その一例として、感熱性ポリマーであるポリアクリルアミドに環境応答性の蛍光団である２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル基を組み込むという原理に基づいた蛍光性温度センサーが既に報告されている（非特許文献６）。また、ポリマーの製造時に架橋剤を添加して得られる、蛍光団が組み込まれたポリアクリルアミドのマイクロゲルの、蛍光性温度センサーとしての使用についても報告されている（非特許文献７）。この蛍光性温度センサーは、主鎖であるポリアクリルアミドの熱による相転移により、水性溶液中で温度上昇に伴って蛍光強度が増加するという特性を有するため、蛍光強度を測定することにより系中の温度の変化を観測することができる。このような温度センサーは、最小機能単位が一分子であり、マイクロリアクター内部などの微小空間の温度測定を可能にすることから、近年注目を集めている。【０００３】
また、周囲環境の温度およびｐＨに応答するポリアクリルアミドの論理ゲートとしての利用も検討されている（非特許文献９）。
【非特許文献１】Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９５年，第６２巻，第４１６〜４２５頁
【非特許文献２】Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２００４年，第３７巻，第２９３８〜２９４３頁
【非特許文献３】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６年，第７８巻，第５０９４〜５１０１頁
【非特許文献４】Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００５年，第８７巻，第２０１１０２頁
【非特許文献５】Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８年，第７４巻，第８２〜８９頁
【非特許文献６】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３年，第７５巻，第５９２６〜５９３５頁
【非特許文献７】Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．２００５年，第１５巻，第２７９６〜２８００頁
【非特許文献８】Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年，第７６巻，第１７９３〜１７９８頁
【非特許文献９】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４年，第１２６巻，第３０３２〜３０３３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
蛍光団が組み込まれた直鎖型または架橋型のポリアクリルアミドを利用する蛍光性温度センサーに関して、既に報告されているポリマーは、温度の上昇時と下降時で同一温度における蛍光強度が異なるという現象が確認され、そのために蛍光強度に対して温度を一義的に定めることができないという問題を有することが判明した。また、これらのポリマーは、ポリアクリルアミドの熱相転移が鋭敏であるため、測定が可能な温度の範囲が狭いという問題も有していた。【０００５】
さらに、これらのポリマーは、一定以上の塩分濃度の溶液中では凝集してしまうことから、塩を含む反応系中や細胞内などの温度の測定には不向きであり、例えば、非特許文献７に開示されているマイクロゲルは、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中では温度の上昇に伴い塩析してしまうという問題を有していた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を進めたところ、ポリマーにイオン性のユニットを導入することにより、より実用性の高い蛍光性温度センサーとして利用することができる本発明を完成させた。【０００７】
すなわち、本発明の１つの側面によれば、式（ａ）：【０００８】
【化１】
2008029770.tif 000003
【０００９】
［式中、Ｒ1は、水素原子およびＣ1-3アルキルから選択され；
Ｒ4およびＲ5は、独立に、水素原子およびＣ1-20アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ1-6アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、またはＲ4およびＲ5はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ1-10アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマー；および
式（ｂ）：【００１０】
【化２】
2008029770.tif 000004
【００１１】
［式中、Ｒ2は、水素原子およびＣ1-3アルキルから選択され；
Ｘ1は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ11であり；
Ｒ11は、水素原子、Ｃ1-6アルキル、または−Ｑ1−Ｙであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、およびＣ1-6アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｑ1は、独立に、Ｃ1-20アルキレン、Ｃ3-20アルケニレン、またはＣ3-20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ｙは、独立に、１以上の正電荷または負電荷を有しうるイオン性官能基であって、−ＳＯ3Ｘa、−ＰＯ（ＯＸb）（ＯＸc）、−ＣＯＯＸd、−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23Ｘe-、−Ｃ（＝ＮＲ41）−ＮＲ42Ｒ43、および下式【００１２】
【化３】
2008029770.tif 000005
【００１３】
により表される基から選択され；
ここで、Ｘa、Ｘb、Ｘc、およびＸdは、独立に、水素原子、またはカウンターカチオンから選択され、Ｘe-およびＸf-はカウンターアニオンであり；
Ｒ21、Ｒ22、およびＲ23は、独立に、Ｃ1-10アルキル、およびＣ7-14アラルキルから選択され、またはＲ21およびＲ22は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；
Ｒ24は、Ｃ1-10アルキル、またはＣ7-14アラルキルであり；
Ｒ41、Ｒ42およびＲ43は、独立に、水素原子およびＣ1-10アルキルから選択され、またはＲ41およびＲ42は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ42およびＲ43は、結合する窒素原子と一緒になって、５〜７員含窒素ヘテロ環を形成してもよい］
で表されるモノマー、および／または分子中に２以上の二重結合を含む架橋剤モノマー：および
式（ｃ）：【００１４】
【化４】
2008029770.tif 000006
【００１５】
［式中、Ｒ3は、水素原子およびＣ1-3アルキルから選択され；
Ｘ2は、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ12であり；
Ｘ3は、直接結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ2、Ｎ（−Ｒ13）、ＣＯＮ（−Ｒ16）、Ｎ（−Ｒ16）ＣＯ、Ｎ（−Ｒ17）ＣＯＮ（−Ｒ18）、ＳＯ2Ｎ（−Ｒ19）またはＮ（−Ｒ19）ＳＯ2であり；
Ｑ2は、Ｃ1-20アルキレン、Ｃ3-20アルケニレン、またはＣ3-20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
Ａｒは、６〜１８員芳香族炭素環基、または５〜１８員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の１以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−ＣＨ2−は−Ｃ（Ｏ）−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、Ｃ1-6アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ1-6アルキルカルボニル、Ｃ1-6アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ6Ｒ7、および−ＳＯ2ＮＲ14Ｒ15から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、Ｃ1-6アルキルスルホニル、Ｃ1-6アルキルカルボニルおよびＣ1-6アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｒ6およびＲ7は、独立に、水素原子、Ｃ1-10アルキル、アリール、Ｃ1-10アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ1-10アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、Ｎ−（Ｃ1-10アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ1-10アルキル）カルバモイルから選択され、ここで前記Ｃ1-10アルキル、Ｃ1-10アルキルカルボニル、Ｃ1-10アルキルスルホニル、Ｎ−（Ｃ1-10アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ−ジ（Ｃ1-10アルキル）カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
Ｒ6およびＲ7はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ1-10アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ12は、水素原子、Ｃ1-6アルキル、または−Ｑ2−Ｘ3−Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、およびＣ1-6アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ13は、水素原子、またはＣ1-6アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、およびＣ1-6アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
Ｒ14およびＲ15は、独立に、水素原子、およびＣ1-6アルキルから選択され；またはＲ14およびＲ15はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成し；
Ｒ16、Ｒ17、Ｒ18およびＲ19は、独立に、水素原子、およびＣ1-6アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、およびＣ1-6アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体（但し、前記共重合体が、前記式（ｂ）で表されるモノマー由来の繰り返し構造を含まない場合、前記共重合体は、使用するモノマーに対して７モル％以上の量の反応開始剤を使用する共重合反応により調製され、当該反応開始剤が、式（ｄ）：
Ｙ1−（Ｃ1-10アルキレン）−Ｎ＝Ｎ−（Ｃ1-10アルキレン）−Ｙ1
｛式中、Ｃ1-10アルキレンは、独立に、ハロゲン原子およびシアノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；Ｙ1は、独立に、１以上の正電荷または負電荷を有しうるイオン性官能基であり、−ＣＯＯＸd、および−Ｃ（＝ＮＲ41）−ＮＲ42Ｒ43から選択され；Ｘd、Ｒ41、Ｒ42、およびＲ43は既に定義したとおりである｝で表されるアゾ化合物、または過硫酸塩から選択される）が提供される。【００１６】
本発明の別の側面によれば、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）：【００１７】
【化５】
2008029770.tif 000007
【００１８】
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｙ、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3、Ｑ1、Ｑ2およびＡｒは、既に定義したとおりである］
で表される繰り返し単位を含む共重合体が提供される。【００１９】
本発明のさらに別の側面によれば、本明細書において既に定義された共重合体であって、Ａｒが、下式：【００２０】
【化６】
2008029770.tif 000008
【００２１】
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、Ｃ1-6アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ1-6アルキルカルボニル、Ｃ1-6アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−ＮＲ6Ｒ7、および−ＳＯ2ＮＲ14Ｒ15から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、Ｃ1-6アルキルスルホニル、Ｃ1-6アルキルカルボニルおよびＣ1-6アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
Ｘ10は、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択され；
Ｒ8は、水素原子、Ｃ1-10アルキル、およびアリールから選択され、当該アルキルは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ1-6アルキルアミノ、ジ（Ｃ1-6アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリールは、ハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい、前記共重合体が提供される。【００２２】
本発明の上記側面の１つの態様において、Ａｒは、下式：【００２３】
【化７】
2008029770.tif 000009
【００２４】
により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6アルコキシ、Ｃ1-6アルキルチオ、Ｃ1-6アルキルスルフィニル、Ｃ1-6アルキルスルホニル、ニトロ、Ｃ1-6アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、シアノ、ホルミル、Ｃ1-6アルキルカルボニル、Ｃ1-6アルコキシカルボニル、カルボキシおよび−ＳＯ2ＮＲ14Ｒ15から選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。【００２５】
本発明の別の側面によれば、上記の共重合体を使用する温度測定方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、液体に上記の共重合体を溶解する工程；および励起光照射下、蛍光強度を測定する工程、を含む温度測定方法が提供される。液体に上記の共重合体を溶解する工程；および励起光照射下、平均蛍光寿命を測定する工程、を含む温度測定方法。当該温度測定方法は、例えば、細胞内の温度測定に使用することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明の共重合体は、広い温度範囲にわたり高い温度分解能が保たれる蛍光性温度センサーとして使用することができる。また、塩濃度の高い溶液中でも塩析を起こさないことから、塩を含む反応系中や細胞内の温度測定にも使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】化合物１〜４（純水中０．０１ｗ／ｖ％）の蛍光強度の感熱応答性試験の結果（励起波長：４５６ｎｍ；●は温度上昇時、○は温度下降時を示す）の一例である。
【図２】蛍光性温度センサーの温度と蛍光強度の関係の模式図である。
【図３】化合物１〜３の温度分解能評価結果（±標準偏差、ｎ＝３）の一例である。
【図４】化合物４の温度分解能評価結果の一例である。
【図５】比較例である化合物５〜７（●化合物５、▲化合物６、◆化合物７）の蛍光強度の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ）の一例である。
【図６】化合物５〜７の温度分解能評価の結果の一例である。
【図７】ナノゲル１（純水中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５０ｎｍ；温度上昇時：●、温度下降時：○を示す）とナノゲル３（純水中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５４ｎｍ；温度上昇時：▲、温度下降時：△を示す）の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である。
【図８】ナノゲル１（１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５０ｎｍ；温度上昇時：●、温度下降時：○を示す）とナノゲル３（１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５４ｎｍ；温度上昇時：▲、温度下降時：△を示す）の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である。
【図９】ナノゲル２（純水中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５５ｎｍ；温度上昇時：●、温度下降時：○を示す）とナノゲル４（純水中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５８ｎｍ；温度上昇時：▲、温度下降時：△を示す）の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である。
【図１０】ナノゲル２（１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５０ｎｍ；温度上昇時：●、温度下降時：○を示す）とナノゲル４（１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５８ｎｍ；温度上昇時：▲、温度下降時：△を示す）の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である。
【図１１】ナノゲル２（純水中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５５ｎｍ）とナノゲル４（純水中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５８ｎｍ）の蛍光強度の温度分解能評価結果の一例である。
【図１２】ナノゲル２（１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５０ｎｍ）とナノゲル４（１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５８ｎｍ）の温度分解能評価結果の一例である。
【図１３】ナノゲル５（純水中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５０ｎｍ）の蛍光強度の感熱応答性試験の結果（温度上昇時：●、温度下降時：○を示す）の一例である。
【図１４】ナノゲル５（純水中０．０１ｗ／ｖ％、蛍光波長５５０ｎｍ）の温度分解能評価結果の一例である。
【図１５】０、５０、１００、１５０、および２００ｍＭ塩化カリウム水溶液中におけるナノゲル３（いずれも０．００１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ、蛍光波長５６０ｎｍ）の感熱応答性試験の結果（●水中、▲５０ｍＭ  ＫＣｌ中、◆１００ｍＭ  ＫＣｌ中、■１５０ｍＭ  ＫＣｌ中、■２００ｍＭ  ＫＣｌ中を示す）の一例である。
【図１６】ナノゲル３を含む生細胞の蛍光像（励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１５−５５０ｎｍ、培地温度約３７℃）の写真の一例である。
【図１７】培地温度を変化させた際の、ナノゲル３を含む生細胞の蛍光像（励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１５−５５０ｎｍ）の変化を示す写真の一例である。
【図１８】生細胞内のナノゲル３（励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１５−５５０ｎｍ）の蛍光強度の感熱応答性試験（ｎ＝４）の結果の一例であり、各温度における蛍光強度は３７℃の値を１とした相対強度として示している。
【図１９】生細胞内のナノゲル３（励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５１５−５５０ｎｍ）の蛍光強度の感熱応答の可逆性確認試験の結果の一例であり、各温度における蛍光強度は１回目の値を１とした相対強度として示している。
【図２０】化合物３（純水中０．０２ｗ／ｖ％、励起波長２７５ｎｍ、蛍光波長５６０ｎｍ）の蛍光寿命の感熱応答性試験の結果の一例である。
【発明の実施の形態】
【００２８】
以下、本発明を更に具体的に説明する。
【００２９】
本明細書において「Ｃ1-3アルキル」とは、炭素数１〜３の直鎖状、分岐鎖状、または
環状のアルキル基を意味し、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、シクロプロピルが含まれる。
【００３０】
本明細書において「Ｃ1-6アルキル」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロプロピルメチルなどが含まれ、例えば、Ｃ1-4アルキルおよびＣ1-3アルキルなども含まれる。
【００３１】
本明細書において「Ｃ1-10アルキル」とは、炭素数１〜１０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ1-6アルキルおよびＣ1-3アルキルなどが含まれる。
【００３２】
本明細書において「Ｃ1-20アルキル」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ1-10アルキル、Ｃ1-6アルキルおよびＣ1-3アルキルなどが含まれる。
【００３３】
本明細書において「Ｃ1-6アルコキシ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、３−メチルブトキシ、２−メチルブトキシ、１−メチルブトキシ、１−エチルプロポキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、４−メチルペントキシ、３−メチルペントキシ、２−メチルペントキシ、１−メチルペントキシ、３−エチルブトキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロプロピルメチルオキシなどが含まれ、例えば、Ｃ1-4アルコキシおよびＣ1-3アルコキシなども含まれる。
【００３４】
本明細書において「アリール」とは、６〜１０員芳香族炭素環基を意味し、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチルなどが含まれる。
【００３５】
本明細書において「Ｃ7-14アラルキル」とはアリール基を含む炭素数が７〜１４のアリールアルキル基を意味し、例えば、ベンジル、１−フェネチル、２−フェネチル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチルなどが含まれる。
【００３６】
本明細書においてハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子などが挙げられる。
【００３７】
本明細書において「Ｃ1-20アルキレン」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキレン基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなど、さらにＣ1-10アルキレンおよびＣ1-6アルキレンなどが含まれる。
【００３８】
本明細書において「Ｃ3-20アルケニレン」とは、炭素数３〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルケニレン基を意味し、例えば、プロペニレン、ブテニレンなど、さらにＣ3-10アルケニレンおよびＣ3-6アルケニレンなどが含まれる。
【００３９】
本明細書において「Ｃ3-20アルキニレン」とは、炭素数３〜２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキニレン基を意味し、例えば、プロピニレン、ブチニレンなど、さらにＣ3-10アルキニレンおよびＣ3-6アルキニレンなどが含まれる。
【００４０】
本明細書において「Ｃ1-6アルキルチオ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルチオ基を意味し、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｉ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｓ−ブチルチオ、ｉ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオなどが含まれる。
【００４１】
本明細書において「Ｃ1-6アルキルスルフィニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルフィニル基を意味し、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ−プロピルスルフィニル、ｉ−プロピルスルフィニル、ｎ−ブチルスルフィニル、ｓ−ブチルスルフィニル、ｉ−ブチルスルフィニル、ｔ−ブチルスルフィニルなどが含まれる。
【００４２】
本明細書において「Ｃ1-6アルキルスルホニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１〜６のアルキル基を有するアルキルスルホニル基を意味し、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ−プロピルスルホニル、ｉ−プロピルスルホニル、ｎ−ブチルスルホニル、ｓ−ブチルスルホニル、ｉ−ブチルスルホニル、ｔ−ブチルスルホニルなどが含まれる。
【００４３】
本明細書において「６〜１８員芳香族炭素環基」とは、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、インダニル、テトラリニルなどが含まれる。
【００４４】
本明細書において「５〜１８員芳香族ヘテロ環基」とは、酸素、窒素および硫黄から選択される１以上のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロ環であり、例えば、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリジル、インドリル、キノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾピラニル、ベンゾクロメニルなどが含まれる。
【００４５】
本明細書において「Ｃ2-6アルケニルスルホニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ2-6アルケニル基を有するアルケニルスルホニル基を意味し、例えばビニルスルホニル、アリルスルホニルなどが含まれる。
【００４６】
本明細書において「Ｃ2-6アルケニルカルボニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ2-6アルケニル基を有するアルケニルカルボニル基を意味し、例えばアクリロイル、メタクリロイルなどが含まれる。
【００４７】
本明細書において「Ｃ2-6アルキニルカルボニル」とは、アルキニル部分として既に定義したＣ2-6アルキニル基を有するアルキニルカルボニル基を意味し、例えばエチニルカルボニルなどが含まれる。
【００４８】
本明細書において「Ｃ1-6アルキルカルボニル」とは、基−ＣＯ（Ｃ1-6アルキル）を表し、ここで当該Ｃ1-6アルキルは既に定義したとおりである。
【００４９】
本明細書において「Ｃ1-6アルコキシカルボニル」とは、基−ＣＯ（Ｃ1-6アルコキシ）を表し、ここで当該Ｃ1-6アルコキシは既に定義したとおりである。
【００５０】
本明細書において「Ｃ1-6アルキルカルボニルアミノ」とは、基−ＮＨＣＯ（Ｃ1-6アルキル）を表し、ここで当該Ｃ1-6アルキルは既に定義したとおりである。
【００５１】
本明細書において「Ｃ1-6アリールカルボニルアミノ」とは、基−ＮＨＣＯ（アリール）を表し、ここで当該アリールは既に定義したとおりである。
【００５２】
本明細書における「５〜７員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など飽和ヘテロ環が含まれる。
【００５３】
本明細書における「４〜８員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、アゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など、および５〜７員含窒素ヘテロ環が含まれる。
【００５４】
本明細書における「２つの窒素原子を含む５〜７員ヘテロ環」には、例えば、イミダゾリジン、テトラヒドロピリミジンなどが含まれる。
【００５５】
本明細書において、アルキレンが１以上の個所においてＯが挿入されている場合、当該アルキレン鎖は主鎖中にエーテル結合を含むことになり、当該挿入は安定な構造となるために、−Ｏ−Ｏ−および−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−の構造とならないように行われることは当業者であれば容易に理解するはずである。以上のことはアルキレンへのＳの挿入においても当てはまる。
【００５６】
本明細書において「カウンターカチオン」とは、有機化学の技術分野で有機化合物のカウンターカチオンとして通常用いられるカチオンであれば特に制限されず、例えば、アンモニウムイオン、アルカリ金属イオン（例えば、ナトリウム、リチウムおよびカリウムイオン）、アルカリ土類金属イオン（例えば、カルシウムイオン、バリウムイオン）、置換アンモニウムカチオン（例えば、Ｎ−（Ｃ1-6アルキル）ピリジニウムカチオン、テトラ（Ｃ1-10アルキル）アンモニウムカチオン）などが含まれる。本発明のおいて好ましいカウンターカチオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、テトラメチルアンモニウムイオンなどが挙げられる。
【００５７】
本明細書において「カウンターアニオン」とは、有機化学の技術分野で有機化合物のカウンターアニオンとして通常用いられるアニオンであれば特に制限されず、例えば、ハロゲン化物アニオン（塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、ヨウ化物イオン）、有機酸のアニオン（例えば酢酸、トリフルオロ酢酸）、硝酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオンなどが含まれる。本発明のおいて好ましいカウンターアニオンとしては、例えば、塩化物イオン、硝酸イオンなどが挙げられる。
【００５８】
なお、カウンターカチオンまたはカウンターアニオンが２価以上である場合、それに対応する個数のイオン性官能基とイオン結合を形成することは当業者により容易に理解されるとおりである。
【００５９】
本発明において、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、好ましくは、水素原子およびメチルから選択される。
【００６０】
式（ａ）、式（Ｉ）および（ＩＶ）における−ＮＲ4Ｒ5は、特には限定されないが、例えば、Ｒ4が水素原子であり、Ｒ5はＣ2-10アルキルであってもよい。また、Ｒ4およびＲ5はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４〜８員含窒素ヘテロ環を形成する場合、例えば、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環などを形成してもよい。
【００６１】
式（ｂ）、式（ＩＩ）および（ＩＶ）における−Ｘ1−Ｑ1−は、好ましくは、Ｘ1は、Ｏ、ＮＨまたはＮ（Ｃ1-6アルキル）であり、Ｑ1はＣ2-10アルキレンである。
【００６２】
式（ｃ）、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）における−Ｘ2−Ｑ2−は、好ましくは、Ｘ2は、Ｏ、ＮＨまたはＮ（Ｃ1-6アルキル）であり、Ｑ2はＣ2-10アルキレンである。
【００６３】
式（ｃ）、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）における−Ａｒは、好ましくは、下式（Ｖ）〜（ＸＩＩ）：
【００６４】
【化８】
2008029770.tif 000010
［式中、Ｒ31は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、および−ＳＯ2ＮＲ14Ｒ15から選択され；Ｒ32はＣ1-6アルキルであり；Ｘ11は、Ｎ−Ｒ33、ＯまたはＳであり；Ｒ33は水素原子またはＣ1-6アルキルであり；Ｘ10、Ｒ14およびＲ15は、既に定義したとおりである］
から選択される基である。
【００６５】
式（Ｖ）について好ましいＸ3としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ16）、Ｎ（−Ｒ16）ＣＯ、ＳＯ2Ｎ（−Ｒ19）またはＮ（−Ｒ19）ＳＯ2が挙げられる。
【００６６】
式（ＶＩ）について好ましいＸ3としては、例えば、Ｎ−Ｒ13（ここで、好ましいＲ13としてはメチルなどのＣ1-3アルキルが挙げられる）、またはＳが挙げられる。
【００６７】
式（ＶＩＩ）について好ましいＸ3としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ16）、Ｎ（−Ｒ16）ＣＯ、ＳＯ2Ｎ（−Ｒ19）またはＮ（−Ｒ19）ＳＯ2が挙げられる。
【００６８】
式（ＶＩＩＩ）について好ましいＸ3としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（−Ｒ16）、Ｎ（−Ｒ16）ＣＯ、ＳＯ2Ｎ（−Ｒ19）またはＮ（−Ｒ19）ＳＯ2が挙げられる。
【００６９】
式（ＩＸ）について好ましいＸ3としては、例えば、直接結合が挙げられる。
【００７０】
式（Ｘ）について好ましいＸ3としては、例えば、直接結合が挙げられる。
【００７１】
式（ＸＩ）について好ましいＸ3としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ2、ＳＯ2Ｎ（−Ｒ19）またはＣＯＮ（−Ｒ16）（ここで前記ＳＯ2Ｎ（−Ｒ19）およびＣＯＮ（−Ｒ16）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
【００７２】
式（ＸＩＩ）について好ましいＸ3としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ2、ＳＯ2Ｎ（−Ｒ19）またはＣＯＮ（−Ｒ16）（ここで前記ＳＯ2Ｎ（−Ｒ19）およびＣＯＮ（−Ｒ16）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
【００７３】
本発明において、基−Ｘ3−Ａｒは環境応答性の蛍光団として機能し、例えば、式（Ｖ）または（ＶＩＩ）の蛍光団を使用した場合は温度の上昇に伴い蛍光強度が低下する温度センサーが、式（ＶＩ）または（ＶＩＩＩ）〜（ＸＩＩ）の蛍光団を使用した場合は、温度の上昇に伴い蛍光強度も上昇する温度センサーが得られる。
【００７４】
使用する式（ｂ）のモノマーの量は、特には限定されないが、例えば、式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のモノマーの使用量に対して、０．０１〜２０モル％の量を使用することができる。
【００７５】
本発明に係る共重合体は、高分子合成の技術分野における通常の知識に基づいて合成することができ、例えば、ラジカル重合によるランダム共重合体として得ることができる。その場合に使用することができるラジカル開始剤としては、特に限定はされないが、α，α'−アゾビスイソブチロニトリル、過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウムなどが挙げられる。
【００７６】
ただし、本発明の共重合体が、前記式（ｂ）で表されるモノマー由来の繰り返し構造を含まない場合、前記共重合体は、使用するモノマーに対して７モル％以上の量の反応開始剤を使用する共重合反応により調製され、当該反応開始剤は、式（ｄ）：
Ｙ1−（Ｃ1-10アルキレン）−Ｎ＝Ｎ−（Ｃ1-10アルキレン）−Ｙ1
｛式中、Ｙ1は、独立に、１以上の正電荷または負電荷を有しうるイオン性官能基であり、前記Ｃ1-10アルキレンは、独立に、ハロゲン原子およびシアノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい｝で表されるアゾ化合物、または過硫酸塩から選択される。当該反応開始剤の具体例としては、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムなどの過硫酸塩；２，２'−アゾビス（２−メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２'−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩、４，４'−アゾビス（４−シアノ吉草酸）などのアゾ化合物が挙げられる。これらの反応開始剤を使用することにより、反応開始剤由来のイオン性官能基が導入されたポリマーを得ることができる。
【００７７】
反応開始剤の使用量は、使用するモノマー（架橋剤モノマーを含む）に対して７モル％以上の量であればよく、例えば、１４モル％以上、好ましくは２５モル％以上の反応開始剤を使用することができる。
【００７８】
重合に使用する反応溶媒は、特に限定されないが、例として、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノールなどが挙げられる。ラジカル重合は、特に限定はされないが、例えば０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃の反応温度、および例えば１〜４８時間、好ましくは２〜１６時間の反応時間で行うことができる。
【００７９】
本発明で使用する架橋剤モノマーは、分子中に２以上のビニル基を含むモノマーであって、架橋剤として通常使用されているものであれば特に限定されない。当該架橋剤としては、例えば、式（ｅ）：
【００８０】
【化９】
2008029770.tif 000011
［式中、Ｒ9およびＲ10は、独立に、水素原子およびＣ1-3アルキルから選択され；
Ｘ4およびＸ5は、独立に、Ｏ、Ｓ、またはＮ−Ｒ12であり；
Ｑ3は、Ｃ1-20アルキレン、Ｃ3-20アルケニレン、またはＣ3-20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよい］
で表される化合物、ジビニルスルホンおよびＣ1-10アルキレンビスマレイミドから選択される化合物を使用することができ、具体的には、式（ｅ）｛式中、Ｘ4およびＸ5は、独立に、ＮＨまたはＮ（Ｃ1-6アルキル）であり、Ｑ3は、Ｃ1-6アルキレンである｝の化合物が挙げられる。架橋剤モノマーのより具体的な例としては、Ｎ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ'−エチレンビスアクリルアミド、Ｎ，Ｎ'−メチレンビスメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ'−エチレンビスメタクリルアミド、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレートなどが挙げられる。
【００８１】
使用する架橋剤モノマーの量は、特には限定されないが、例えば、式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のモノマーに対して、０．１〜２０モル％の量を使用することができる。
【００８２】
本件発明の共重合体の製造に使用するモノマーは、購入により入手可能であるか、文献により合成方法が既知であるか、既知の合成方法に基づいて容易に調製可能であるか、または以下の実施例の記載に基づいて合成可能であるかのいずれかである。
【００８３】
架橋剤モノマーを使用する場合の共重合反応は、当該技術分野で慣用の手法により行うことができる。当該共重合反応に使用する反応溶媒としては、特に限定されないが、例えば、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム、ペンタデカン硫酸ナトリウム、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロマイド、Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロマイド、トライトンＸ−１００など）を含む水を使用することができる。架橋剤モノマーを使用して得られる共重合体のナノゲルのサイズは、共重合反応における撹拌効率、反応温度、界面活性剤の使用量、反応開始剤の使用量、架橋剤モノマーの使用量により調節することができる。例えば、界面活性剤および／または反応開始剤の使用量を増加させることにより、サイズが小さいナノゲルを得ることができる。得られるナノゲルのサイズは、本発明が属する当業者であれば適宜調節することができ、本発明の共重合体のナノゲルのサイズは、例えば、５〜１００ｎｍである。当該共重合反応は、特に限定はされないが、例えば０〜１００℃、好ましくは５０〜７０℃の反応温度、および例えば１〜４８時間、好ましくは２〜１６時間の反応時間で行うことができる。
【００８４】
本発明の共重合体を含む溶液中のｐＨや塩濃度に影響を受けずに温度測定を行うために、当該共重合体に含まれるイオン性官能基は、広範囲のｐＨにおいてイオン性を維持するという方が望ましい。このような観点から、Ｙは−ＳＯ3Ｘaまたは−Ｎ+Ｒ21Ｒ22Ｒ23Ｘe-が好ましい。さらに、共重合反応において特定の反応開始剤を使用することによってもイオン性官能基を導入することができる。したがって同様の観点から、反応開始剤は、−ＳＯ3Ｘaを導入することができる過硫酸塩が好ましい。
【００８５】
本発明の１つの側面において、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーならびに架橋剤モノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体が提供される。ここで、当該共重合体を得るために使用される式（ｂ）で表されるモノマーの量は、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、１〜２０モル％であり、好ましくは２〜１５モル％であり、より好ましくは２．５〜１０モル％である。また、使用される式（ｃ）で表されるモノマーの量は、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、０．０１〜２０モル％であり、具体的には０．０１〜１０モル％であり、好ましくは０．０５〜２モル％であり、より好ましくは０．１〜１モル％である。また、使用される架橋剤モノマーの量は、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、０．１〜２０モル％であり、好ましくは０．５〜１０モル％であり、より好ましくは１〜５モル％である。
【００８６】
本発明の別の側面において、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体が提供される。ここで、当該共重合体を得るために使用される式（ｂ）で表されるモノマーの量は、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、１〜２０モル％であり、好ましくは２〜１５モル％であり、より好ましくは２．５〜１０モル％である。また、使用される式（ｃ）で表されるモノマーの量は、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、０．０１〜２０モル％であり、具体的には０．０１〜１０モル％であり、好ましくは０．０５〜２モル％であり、より好ましくは０．１〜１モル％である。
【００８７】
本発明のさらに別の側面において、前記式（ａ）および（ｃ）で表されるモノマーならびに架橋剤モノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体であって、使用するモノマーに対して７モル％以上の量の反応開始剤を使用する共重合反応により調製され、当該反応開始剤が、前記式（ｄ）で表されるアゾ化合物、または過硫酸塩から選択される前記共重合体が提供される。ここで、当該共重合体を得るために使用される式（ｃ）で表されるモノマーの量は、前記式（ａ）および（ｃ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、０．０１〜２０モル％であり、具体的には０．０１〜１０モル％であり、好ましくは０．０５〜２モル％であり、より好ましくは０．１〜１モル％である。また、使用される架橋剤モノマーの量は、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、０．１〜２０モル％であり、好ましくは０．５〜１０モル％であり、より好ましくは１〜５モル％である。
【００８８】
本発明の１つの側面において、式（ＩＶ）中のａ，ｂおよびｃは式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数であり、特に限定されないが、例えば、ａ＋ｂ＋ｃ＝１００であって、ｃは０．０１〜２０であり、具体的には０．０１〜１０であり、好ましくは０．０５〜２であり、より好ましくは０．１〜１である。また、例えば、ｂは１〜２０であり、好ましくは２〜１５であり、より好ましくは２．５〜１０である。また、本発明のポリマーの重量平均分子量は、特には限定されないが、例えば５０００〜１００００００、好ましくは１００００〜２０００００である。
【００８９】
本発明の共重合体の感熱応答性による蛍光強度の変化は、通常の蛍光強度測定方法により測定することができる。測定での励起波長および測定する蛍光波長は、特に限定はされないが、例えは、測定試料の励起スペクトルを測定した際の最大励起波長またはその付近の波長を使用することができる。また、測定する蛍光波長も特には限定されないが、例えば、蛍光強度が増加する温度で測定試料の蛍光スペクトルを測定した際の最大蛍光波長またはその付近の波長を使用することができる。
【００９０】
本発明の共重合体の感熱応答性による蛍光寿命の変化は、一般的な蛍光寿命測定方法、例えば、単一光子計数法、位相変調法、パルスサンプリング法、励起プローブ法などの手法により測定することができる。このうち、単一光子計数法は、時間軸上の発光強度分布と光子１個の発光確率とが相関関係にあることを利用して蛍光寿命を測定する方法であり、蛍光団を１ｎｓ程度の非常に短い（パルス）光で励起した後、検出される光の発生時刻を測定し、励起を多数回繰り返して得られるヒストグラムを蛍光減衰曲線として指数関数の和で近似して蛍光寿命を決定する。単一光子計数法による蛍光寿命の測定は、市販されている時間相関単一光子計数法蛍光寿命測定装置（例えば、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＦＬ−９００ＣＤＴ、実施例参照）およびそれに付随している測定・解析プログラムを使用して行うことができる。
【００９１】
本発明の共重合体は、細胞内部の温度測定に使用することができる。共重合体を細胞内部に導入する方法としては、特に限定はされないが、例えば、当該共重合体を添加した培地中で細胞を培養することによっても導入することができると考えられる。その他、陽性荷電脂質を利用する方法（リポフェクション法など）、電気的方法（エレクトロポレーション法など）、化学的方法（リン酸カルシウム法など）、物理的方法（マイクロインジェクション法など）などの方法を利用してもよい。
【００９２】
以下に実施例を示すことにより本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９３】
試薬及びデータ測定
Ｎ−イソプロピルアクリルアミドはｎ−ヘキサンを用いた再結晶により精製して用いた。Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミドは一般的なＮ−アルキルアクリルアミドの合成手順に従い合成・精製したものを用いた。α，α'−アゾビスイソブチロニトリルはメタノールを用いた再結晶により精製して用いた。その他の試薬は購入したものをさらに精製することなく使用した。【００９４】
1Ｈ−ＮＭＲはＢＲＵＫＥＲ  ＡＶＡＮＣＥ４００スペクトロメーター（４００ＭＨｚ）を使用して測定し、ケミカルシフトはｐｐｍで表示した。質量分析はＪＥＯＬ  ＭＳｔａｔｉｏｎ  ＪＭＳ−７００スペクトロメーターを使用し、元素分析はＹａｎａｃｏ  ＭＴ−６  ＣＨＮ  ＣＯＲＤＥＲスペクトロメーターを使用して行った。融点測定はＹａｎａｇｉｍｏｔｏ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｐｏｉｎｔ  Ａｐｐａｒａｔｕｓを使用して測定し、補正は行わなかった。数平均分子量、重量平均分子量はＪＡＳＣＯ  ＧＰＣ  ｓｙｓｔｅｍ（ＪＡＳＣＯ  ＰＵ−２０８０ポンプ、ＪＡＳＣＯ  ＲＩ−２０３１示差屈折計、ＪＡＳＣＯ  ＣＯ−２０６０カラムオーブン、Ｓｈｏｄｅｘ  ＧＰＣ  ＫＤ−８０６Ｍカラム）を使用し、ポリスチレン標準試料により得られる較正曲線を用いて算出した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、関東化学ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｎ（４０−５０μＭ）を使用した。吸光度の測定には、ＪＡＳＣＯ  Ｖ−５５０紫外可視光分光光度計を使用した。
［実施例１］
Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミドの合成【００９５】
【化１０】
2008029770.tif 000012
４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−７−フルオロ−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（９３ｍｇ）をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解し、この溶液をＮ，Ｎ'−ジメチルエチレンジアミン（１．２９ｍｌ）に加えて１５分間室温にて撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧乾固させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてジクロロメタン−メタノール＝１０：１→５：１を使用）にて精製を行い、Ｎ，Ｎ−ジメチル−７−［メチル｛２−（メチルアミノ）エチル｝アミノ］−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−スルホンアミドを橙色液体（１１８ｍｇ、＞９９％）として得た。【００９６】
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），４．１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ），３．３５（３Ｈ，ｓ），２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．４Ｈｚ）２．８７（６Ｈ，ｓ），２．４８（３Ｈ，ｓ）；ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  計算値（Ｃ12Ｈ20Ｎ5Ｏ3Ｓ）  ［Ｍ＋Ｈ］+  ３１４．１２８７；測定値３１４．１２７１。【００９７】
Ｎ，Ｎ−ジメチル−７−［メチル｛２−（メチルアミノ）エチル｝アミノ］−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−スルホンアミド（１３０ｍｇ）をアセトニトリル（１３ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（５７．８μＬ、１ｅｑ）とアクリル酸クロリド（４３．８μＬ、１．３ｅｑ）を０℃にて加えた後、１時間半室温にて撹拌した。反応溶液にＮａ2ＣＯ3（１ｇ）を加えろ過した後、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒として酢酸エチル−ｎ−ヘキサン＝３：１を使用）にて精製を行い、表題の化合物を橙色結晶（８８ｍｇ、５８％）として得た。【００９８】
融点１４４−１４６℃；1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），６．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，１０．４Ｈｚ），６．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ），６．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ），５．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ）４．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），３．７４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１３．９Ｈｚ），３．３５，３．２３（３Ｈ，ｓ），３．１３，３．１２（３Ｈ，ｓ），２．９０，２．８７（６Ｈ，ｓ）；ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ：ｍ／ｚ  計算値（Ｃ15Ｈ22Ｎ5Ｏ3Ｓ）  ［Ｍ＋Ｈ］+  ３６８．１３９３；測定値  ３６８．１４２２。元素分析：計算値（Ｃ15Ｈ21Ｎ5Ｏ3Ｓ）  Ｃ：４９．０３、Ｈ：５．７６、Ｎ：１９．０６；測定値  Ｃ：４９．１９、Ｈ：５．７８、Ｎ：１８．５２。
［実施例２］
Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド／３−スルホプロピル  アクリレート／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造【００９９】
【化１１】
2008029770.tif 000013
Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド（５７２ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ、以下、ＮＴＢＡＭとも称する）、３−スルホプロピル  アクリレートカリウム塩（１１６ｍｇ、５００μｍｏｌ、以下、ＳＰＡカリウム塩とも称する）、Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド（１．８４ｍｇ、５μｍｏｌ、以下、ＤＢＤ−ＡＡとも称する）、α,α'−アゾビスイソブチロニトリル（８．２１ｍｇ、５０μｍｏｌ、以下、ＡＩＢＮとも称する）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、３０分間窒素ガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１２時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（３００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、再沈操作（アセトン３ｍｌ−ｎ−ヘキサン２００ｍｌ）にて精製を行い、表題の共重合体を淡黄色粉末（２６８ｍｇ、３８％）として得た。【０１００】
数平均分子量２７２００、重量平均分子量５１４００、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＴＢＡＭ：ＳＰＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝８８．８：１１．２：０．１２。なお、共重合体におけるＮＴＢＡＭユニットとＳＰＡユニットの割合は1Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール（４４２ｎｍにおいてモル吸光係数１０６００Ｍ-1ｃｍ-1）と比較することにより算出した。
［実施例３］
Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド／３−スルホプロピル  アクリレート／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造【０１０１】
【化１２】
2008029770.tif 000014
Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド（５５２ｍｇ、４．８７５ｍｍｏｌ、以下、ＮＮＰＡＭとも称する）、ＳＰＡカリウム塩（２９．０ｍｇ、１２５μｍｏｌ）、ＤＢＤ−ＡＡ（１．８４ｍｇ、５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（８．２１ｍｇ、５０μｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、３０分間窒素ガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１２時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、再沈操作（メタノール３ｍｌ−ジエチルエーテル２００ｍｌ）にて精製を行い、表題の共重合体を淡黄色粉末（３５２ｍｇ、６０％）として得た。【０１０２】
数平均分子量１６１００、重量平均分子量２９４００、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＮＰＡＭ：ＳＰＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝９６．２：３．８：０．０９４。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＳＰＡユニットの割合は1Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。
［実施例４］
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド／３−スルホプロピル  アクリレート／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造【０１０３】
【化１３】
2008029770.tif 000015
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（５５２ｍｇ、４．８７５ｍｍｏｌ、以下、ＮＩＰＡＭとも称する）、ＳＰＡカリウム塩（２９．０ｍｇ、１２５μｍｏｌ）、ＤＢＤ−ＡＡ（１．８４ｍｇ、５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（８．２１ｍｇ、５０μｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、３０分間窒素ガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１２時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、再沈操作（メタノール４ｍｌ−ジエチルエーテル２００ｍｌ）にて精製を行い、表題の共重合体を淡黄色粉末（２２８ｍｇ、３９％）として得た。【０１０４】
数平均分子量３００００、重量平均分子量４８７００、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＩＰＡＭ：ＳＰＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝９５．９：４．１：０．１３。なお、共重合体におけるＮＩＰＡＭユニットとＳＰＡユニットの割合は1Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。
［実施例５］
Ｎ−ｔ−ブチルアクリルアミド／（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド共重合体の製造【０１０５】
【化１４】
2008029770.tif 000016
ＮＴＢＡＭ（５７２ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（１０３ｍｇ、５００μｍｏｌ、以下、ＡＰＴＭＡクロリドとも称する）、ＤＢＤ−ＡＡ（１．８４ｍｇ、５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（８．２１ｍｇ、５０μｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、３０分間窒素ガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１２時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（３００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、再沈操作（アセトン４ｍｌ−ヘキサン３００ｍｌ）にて精製を行い、淡黄色粉末（２１８ｍｇ）を得た。この粉末９７．８ｍｇを透析によりさらに精製し、表題の化合物（２５．９ｍｇ、３．８％）を得た。なお、上記透析は、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、得られた粉末を１０ｍｌの純水に溶解してチューブに入れ、透析外液を１０００ｍｌとして冷蔵庫内で４８時間透析、その間、約１２時間ごとに透析外液を純水に交換して行った。【０１０６】
数平均分子量４３００、重量平均分子量５４５０、共重合体中の各ユニットの組成比  ＮＴＢＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ−ＡＡ＝８５．３：１４．７：０．０８６。なお、共重合体におけるＮＴＢＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は1Ｈ−ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ−ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４−Ｎ，Ｎ−（ジメチルアミノ）−７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル−２，１，３−ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。【０１０７】
感熱応答性試験
実施例２、３、４および５で製造した共重合体（それぞれ以下、化合物１、２、３および４と称する）の感熱応答性試験を以下の手順で行った。ＪＡＳＣＯ  ＦＰ−６５００分光蛍光光度計を使用し、溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いた。１、２、３および４の初期濃度は０．０１ｗ／ｖ％とし、励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ  ＥＴＣ−２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。化合物１〜３では、溶液温度を１℃刻みで上昇させた後、測定開始温度まで１℃刻みで下降させ、各温度における蛍光強度を測定した。化合物４では、溶液温度を２度刻みで上昇させた後、測定開始温度まで２℃刻みで下降させ、各温度における蛍光強度を測定した。【０１０８】
試験結果を図１に示す。いずれの化合物も、高温領域で強い蛍光を示し、温度の変化に鋭敏に反応して蛍光強度が変化することが確認された。また、各温度において温度上昇時と下降時の蛍光強度が良く一致していることも確認された。蛍光応答の低再現性は、高温時に見られる高分子同士の分子間凝集に起因するが、本発明により新たに導入されたイオン性官能基が、これを静電反発により効果的に抑制するため、再現性が向上したと考えられる。【０１０９】
温度分解能の評価
図２に温度と蛍光強度の関係の模式図を示す。∂は微小量、δは誤差（ｅｒｒｏｒ）を表している。図２（ａ）から、∂とδの間には以下のような関係があることがわかる。【０１１０】
【化１５】
2008029770.tif 000017
ここで、∂が微小量を表すことから、【０１１１】
【化１６】
2008029770.tif 000018
は図２の直線の傾きを示している。
Ｔ〜Ｔ＋１℃においては、傾きが【０１１２】
【化１７】
2008029770.tif 000019
で表されるので、【０１１３】
【化１８】
2008029770.tif 000020
となる。（図２（ｂ）参照）
δは誤差を表しているので、δＦＩは蛍光強度の誤差である。ここでは標準偏差を誤差値として用いた。Ｔ〜Ｔ＋１℃における蛍光強度の標準偏差は、【０１１４】
【化１９】
2008029770.tif 000021
で表される。したがって、温度の誤差、すなわち温度分解能は、【０１１５】
【化２０】
2008029770.tif 000022
により算出される。図３に化合物１，２，３における、温度と（１）式により算出された温度分解能の関係を示す。化合物１、２、３において、広い温度範囲にわたり高い温度分解能が保たれていることがわかる。具体的には、化合物１では９℃から３３℃の間、化合物２では３０℃から５１℃の間、化合物３では４９℃から６６℃の間で、温度分解能が０．２℃以下に保たれている。したがって、この３種類の蛍光性温度センサーにより、約１０℃から６５℃の広範囲で、０．２℃の温度分解能が達成された。高い温度分解能は、本発明により新たに導入されたイオン性官能基の効果により、蛍光応答の再現性が向上したため達成されたと考えられる。【０１１６】
図４に化合物４における、温度と算出された温度分解能の関係を示す。化合物４においては、温度を２℃刻みで変化させているため、温度分解能の算出式は（２）式のようになる。【０１１７】
【化２１】
2008029770.tif 000023
化合物４においても、広い温度範囲にわたり高い温度分解能が保たれていることがわかる。したがって、イオン性官能基としてカチオン性のものを用いても高い温度分解能が達成された。【０１１８】
［比較例１］【０１１９】
【化２２】
2008029770.tif 000024
比較例として、上記の化合物５、６および７を以下の方法により合成した。【０１２０】
ＮＮＰＡＭ、ＮＩＰＡＭ、またはＮ−イソプロピルメタクリルアミド（５ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（５０μｍｏｌ）、ＤＢＤ−ＡＡ（５μｍｏｌ）をジオキサン（１０ｍｌ）に溶解し、３０分間窒素ガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１２時間（化合物５および６）または１６時間（化合物７）反応させ、反応溶液をジエチルエーテル２００ｍｌ（化合物６）または３００ｍｌ（化合物５および７）に注いだ。得られた結晶を濾取し、再沈操作によって目的の化合物を得た。再沈溶媒にはアセトン（３ｍｌ）とジエチルエーテル（２００ｍｌ）（化合物５）、ジオキサン（１０ｍｌ）とジエチルエーテル（２００ｍｌ）（化合物６）、アセトン（３ｍｌ）とヘキサン（２００ｍｌ）（化合物７）をそれぞれ用いる。得られた温度センサーの各ユニット比や分子量は、実施例と同様の手法により、1Ｈ−ＮＭＲ、吸光度、ＧＰＣ測定により求めた。【０１２１】
図５に化合物５〜７の蛍光強度の感熱応答性試験結果を、図６に化合物５〜７の温度分解能の評価の結果をそれぞれ示す。各化合物の温度分解能は最高で０．２℃程度であったが、その温度範囲は非常に狭く、ほとんどの温度範囲において温度分解能は０．２℃を大きく超えていた。
［実施例６〜９］
共重合体のナノゲル粒子の製造
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、Ｎ，Ｎ'−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＡＭ）、３−スルホプロピル  アクリレート（ＳＰＡ）、Ｎ−｛２−［（７−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）−２，１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル］（メチル）アミノ｝エチル−Ｎ−メチルアクリルアミド（ＤＢＤ−ＡＡ）、過硫酸ナトリウム（ＡＰＳ）、およびＮ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＥＤＡ）のそれぞれを、以下の表に示す量で使用して、実施例６〜９の共重合体を製造した。【０１２２】
【表１】
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反応は以下の方法により行った。ＮＩＰＡＭ、ＭＢＡＭ、ＳＰＡ（実施例７および９のみ）、ＤＢＤ−ＡＡ、およびＴＭＥＤＡを、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液（１２．６ｍＭ、２０ｍＬ、但し、実施例９では１６．６ｍＬを使用）に溶解させ、メカニカルスターラーを用いて約２５０ｒｐｍで撹拌し、７０℃に加熱した。溶存する酸素を除去するために、窒素ガスを３０分間撹拌中の溶液に吹き込み、ＡＰＳを加えた。７０℃、２５０ｒｐｍで４時間撹拌し、その後、反応液を冷水（４００ｍＬ）に注いだ。析出物が生じるまでＮａＣｌを加え、グラスフィルターで回収した。透析により精製した後に、凍結乾燥し、共重合体のナノゲル粒子を得た。各実施例におけるナノゲル粒子の収量、０．０１ｗ／ｖ％溶液に含まれる蛍光団の濃度、水中で膨潤状態のサイズ（直径）を以下の表に示す。なお、上記の透析は、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、サンプルを１０〜２５ｍｌの純水に溶解してチューブに入れ、透析外液を２００ｍｌとして攪拌しながら常温で５〜６日間透析し、その間、約１２時間ごとに透析外液を純水に交換して行った。透析外液のＵＶ測定または凍結乾燥後のサンプルのＮＭＲ測定によりモノマー由来のピークが検出されないことを確認した。【０１２３】
【表２】
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なお、表２における膨潤状態のナノゲルのサイズは、０．０１ｗ／ｖ％（実施例７および８）または０．００１ｗ／ｖ％（実施例６）のナノゲル水溶液を用いて、ＭＡＬＶＥＲＮ社  ゼーターサイザーナノ  ＺＳを使用し動的光散乱法により測定した。【０１２４】
感熱応答性試験
実施例６〜９で製造した共重合体（以下、ナノゲル１、２、３および４とそれぞれ称する）の感熱応答性試験を、溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍから得た超純水と、１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液を用いて測定した以外は、上述の手順と同様の手順で行った。化合物１〜４で、溶液温度を１℃刻みで上昇させた後、測定開始温度まで１℃刻みで下降させ、各温度における蛍光強度を測定した。【０１２５】
感熱応答性試験結果を図７〜１０に、ナノゲル２およびナノゲル４の温度分解能評価結果を図１１および１２に示す。いずれのナノゲルも、温度センサーとして機能することが確認され、ナノゲル２および４については、各温度において温度上昇時と下降時の蛍光強度が良く一致していることも確認された。【０１２６】
［比較例２］
以下の表３に示す出発原料を使用し、実施例６〜９と同様の操作により、比較例２のナノゲル（以下、ナノゲル５と称する）を得た。収量および物性を以下の表４に示す。【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
【表４】
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様々な塩濃度下における蛍光強度の感熱応答試験
ナノゲル３を０，５０，１００，１５０，２００ｍＭ  塩化カリウム水溶液にそれぞれ０．００１ｗ／ｖ％になるよう溶解し、上述の手順と同様の手順で蛍光強度の感熱応答試験を行った。各溶液について、溶液温度を１℃刻みで上昇させたあと、測定開始温度まで１℃刻みで下降させ、各温度における蛍光強度を測定した。【０１２９】
感熱応答性試験結果を図１５に示す。溶液の塩化カリウム濃度が上昇すると、蛍光強度が上昇する温度が低くなり、相対蛍光強度の増分が大きくなることがわかった。また、塩化カリウム濃度が１００ｍＭ以上になると、応答はほぼ一定になることも明らかとなった。【０１３０】
細胞内における蛍光強度の感熱応答試験
ナノゲル３をインジェクション水溶液（８０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ リン酸水素二カリウム、４ｍＭ 塩化ナトリウム、pH 7.2）に加え、ナノゲル３を１ｗ／ｖ％で含むインジェクション溶液を調製した。当該インジェクション溶液をフィルター（Ultrafree-MC, Millipore）付きエッペンドルフチューブに入れ、10000 rpmで7分遠心してろ過し、直径220 nm以上の浮遊物を除去した。【０１３１】
Cos7細胞（カニクイザル腎臓系培養細胞/African Green Monkey SV40-transf'd kidney fibroblast cell line、東京都臨床医学総合研究所より譲渡）を、通常条件下DMEM培地で培養し、観察時のみHEPES培地で培養した。培養した細胞の入ったシャーレをヒーター付ステージ（MI-IBC, Olympus）に載せ、落射型倒立蛍光顕微鏡（IX70, Olympus）、60倍油浸対物レンズ（UplanApo N.A. 1.40, Olympus）、冷却CCDカメラ（ORCA-ER, Hamamatsu Photonics）を用いて観察した。調製したナノゲルを含むインジェクション溶液をインジェクション用ガラス製針（Femtotips II, Eppendorf）に注入し、インジェクター（FemtoJet, Eppendorf）を用いてCos7細胞に数fLインジェクションした。その後、上記ＣＣＤカメラで、細胞に488 nmのレーザー（Saphhire488, Coherent）を当て、励起光や散乱光をカットするためのフィルター（DM505, BA515-550）を通した後の蛍光像および蛍光強度（蛍光波長：５１５−５５０ｎｍ）を、培地温度を変化させて観察した。それぞれの温度における蛍光像を図１７に、蛍光強度の変化を図１８、および可逆性試験結果を図１９に示す。本発明の共重合体は細胞内の環境下でも感熱応答性を示し、可逆的に蛍光強度を変化させることが確認された。【０１３２】
蛍光寿命変化の感熱応答試験
実施例４で製造した化合物３の蛍光寿命の感熱応答試験を以下の手順により行った。【０１３３】
Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＦＬ−９００ＣＤＴ 時間相関単一光子計数法蛍光寿命測定装置を使用し、溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ−Ｑ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いた。化合物３の初期濃度は０．０２ｗ／ｖ％とし、励起波長は２７５ｎｍとした。溶液の励起には、ナノ秒パルス水素放電管（パルス幅１ナノ秒、パルス繰り返し数４０ｋＨｚ）を用いた。溶液の温度制御には恒温槽を使用した。測定前に熱電対により溶液の温度が安定したことを確認した後、各温度における蛍光寿命を蛍光波長を５６０ｎｍとして測定した。得られた蛍光減衰曲線を以下に示す式により近似し、２成分の蛍光寿命を得た。【０１３４】
【化２３】
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得られた蛍光寿命から、以下に示す式を用いて各温度における平均蛍光寿命を算出した。【０１３５】
【化２４】
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試験結果を表５および図２０に示す。高温領域で化合物３の平均蛍光寿命が延長し、温度の変化に鋭敏に反応して平均蛍光寿命が変化することが確認された。【０１３６】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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