(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを通じてフェノール誘導体またはアニリン誘導体が結合した、同種または異種の下記一般式（１）で表される２つ以上の高分子が、互いに隣接する２つ以上の高分子間がフェノール誘導体またはアニリン誘導体間の脱水素結合によって連結されてなり、
前記フェノール誘導体は、チラミン、ヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシプロピオン酸、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、
前記アニリン誘導体は、ヒドロキシエチルアニリン、アミノエチルアニリン、アミノベンジルアルコール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、ことを特徴とする、下記一般式（２）で表される生体内形成注入ヒドロゲル。
【化１】
0005608741.tif 000011
・・・（１）
【化２】
0005608741.tif 000012
・・・（２）
（前記一般式（１）または一般式（２）で、Ｒは、ヒドロキシまたはアミン基であり、Ｌは、リンカーであって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリプロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ｐｏｌｙＮＩＰＡＡＭ）、ポリフマレート、ポリオルガノホスファゼン、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙＡＡｃ）、ポリアクリルスルホン酸、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐｏｌｙＨＥＭＡ）、及びこれらの共重合体からなる群から選択される）
【請求項２】
前記高分子に西洋ワサビペルオキシダーゼ及び過酸化水素を添加することにより、高分子が生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で架橋した、請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【請求項３】
前記一般式（１）で表される高分子は水溶性高分子をリンカーとして用い、アミノ基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を有する高分子主鎖に、下記一般式（３）で表されるフェノール誘導体またはアニリン誘導体をアミド、ウレタン、ウレア、またはエステル結合させて製造され、
前記フェノール誘導体は、チラミン、ヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシプロピオン酸、及びこれら組み合せからなる群から選択され、
前記アニリン誘導体は、ヒドロキシエチルアニリン、アミノエチルアニリン、アミノベンジルアルコール、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【化３】
0005608741.tif 000013
・・・（３）
（前記一般式（３）で、Ｒ１はヒドロキシル基またはアミン基であり、Ｒ２は、カルボキシル基またはアミン基である）
【請求項４】
前記高分子骨格は、ゼラチン、キトサン、ヘパリン、セルロース、デキストラン、デキストランサルフェート、コンドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェート、デルマタンサルフェート、アルギン酸、コラーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミリン、エラスチン、ビトロネクチン、及びフィブリノーゲルからなる群から選択された、１つまたは２つ以上の高分子である、請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【請求項５】
前記共重合体は、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）シリーズ）、４−アームＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）シリーズ）、ＰＥＧ−ＰＥＩ、ＰＥＧ−ＰＶＡ、ＰＥＧ−ＰＥＩ−ＰＶＡ、ＰＥＩ−ＰＶＡ、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−ＡＡｃ）、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−ＨＥＭＡ）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【請求項６】
前記ヒドロゲルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及び過酸化水素の濃度を調節して、ゲル化時間、ゲル安定性（分解時間）、機械的強度、または含水率から選択された物理化学的性質を調節してなる、請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【請求項７】
前記ヒドロゲルは、水溶性高分子の分子量を調節して、ゲル化時間、ゲル安定性、機械的強度、または含水率から選択された物理化学的性質を調節してなる、請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【請求項８】
前記ヒドロゲルは、二連シリンジキットを構成して、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）架橋形成してなる、請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【請求項９】
前記二連シリンジキットにスプレーノズルを結合してスプレー可能にしてなる、請求項８に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【請求項１０】
前記二連シリンジキットとテフロン型とを用いて、ヒドロゲルシートまたはディスクを製造してなる、請求項８に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【請求項１１】
チロシンを含むペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲル。
【請求項１２】
請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲルを含む、組職再生及び増強用インプラント素材。
【請求項１３】
前記インプラント素材は、軟骨再生、骨再生、歯槽骨再生、皮膚再生、心筋再生、人工水晶体、脊髓神経再生、脳神経再生、声帯再生及び充填剤、癒着防止膜、尿失禁治療剤、シワ除去用増強剤、火傷治療剤、組職増強剤、及び脊椎椎間板治療剤からなる群から選択された何れか１つに適用される、請求項１２に記載の組職再生及び充填用インプラント素材。
【請求項１４】
請求項１に記載の生体内形成注入ヒドロゲルを含む、薬物伝達用担体。
【請求項１５】
前記薬物は、ペプチドまたはタンパク質医薬品、抗菌剤、抗癌剤、及び抗炎症剤からなる群から選択された何れか１つまたは２つ以上である、請求項１４に記載の薬物伝達用担体。
【請求項１６】
前記ペプチドまたはタンパク質医薬品は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、転換成長因子（ＴＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）、白血球増殖因子（Ｇ−ＣＳＦ）、赤血球増殖因子（ＥＰＯ）、マクロファージ増殖因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インターフェロン−α，β，γ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、カルシトニン、神経成長因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子、アンジオテンシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン作動薬（ＬＨＲＨアゴニスト）、インシュリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ソマトスタチン、グルカゴン、エンドルフィン、バシトラシン、マゲイン、コリスチン、単一抗体、ワクチン類、及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つである、請求項１５に記載の薬物伝達用担体。
【請求項１７】
前記抗菌剤は、ミノサイクリン、テトラサイクリン、オフロキサシン、ホスホマイシン、マゲイン、プロフロキサシン、アンピシリン、ペニシリン、ドキシサイクリン、チエナマイシン、セファロスポリン、ノルキサシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ミクロノマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、セフォタキシン、セファクロル、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、エノキサシン、バンコマイシン、イミペネム、フシジン酸、及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つである、請求項１５に記載の薬物伝達用担体。
【請求項１８】
前記抗癌剤は、パクリタキセル、タキソテール、アドリアマイシン、エンドスタチン、アンギオスタチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、カボプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、アクチノマイシン−Ｄ、及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つである、請求項１５に記載の薬物伝達用担体。
【請求項１９】
前記抗炎症剤は、アセトアミンフェン、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、ピロキシカム、フェノプロフェン、フルビプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、スプロフェン、ロキソプロフェン、シノキシカム、テノキシカム、及びこれらの混合物からなる群から選択された何れか１つである、請求項１５に記載の薬物伝達用担体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、向上した生体安定性及び優れた機械的強度を有する生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成生体内注入型ヒドロゲル及びその生医学的用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲルは、その生体適合性、高水分含量及び栄養分と代謝産物の優れた透過性によって、挿入物、薬物、及び細胞伝達担体のような薬学及び生物医学的応用のための材料として広く研究されてきた。このようなヒドロゲルは、天然及び合成高分子を用いて製造が可能であり、多様な化学的及び物理的交差−結合を通じてヒドロゲル形成が可能である。ここ１０年間の研究によって、高分子溶液を生体内に注入して生体内でヒドロゲルを形成する生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲル形態で改良化された。
【０００３】
このような生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルは、生体注入型ヒドロゲルシステムとして使用可能である。生体注入型ヒドロゲルシステムは、最小浸透技術に基づいて患者の苦痛を和らげる容易な形態への応用が多くの注目を浴びた。これらのシステムは、所望の組職、器官または体腔内で凝固される前に、最小浸透方式で身体内でヒドロゲルを形成することができる注入型流動体である。
【０００４】
例えば、生体注入型ヒドロゲルシステムは、移植のための外科的施術を要さず、多くの治療薬物の単純な混合を通じて統合することができる。これら生体注入型ヒドロゲルを用いて、欠陥または体腔陷沒部位を充填させることが可能である。ヒドロゲルシステムは、機械的物性が低い一方、高い細胞分周効率、生理活性薬物、例えば、ペプチド、タンパク質、及びＤＮＡなどの伝達用担体、及び細胞及び生成物への優れた営養物運送のような多くの長所を有している。
【０００５】
生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルは、ＵＶ−重合反応やマイケル付加反応を通じた化学的交差結合を利用したヒドロゲルと、イオン結合、立体錯体結合と、疎水性相互作用を利用した温度感応性のような物理化学的交差結合を利用したヒドロゲルとに大きく区分される。化学的交差結合を利用した生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルの場合、光開始剤と交差結合剤のような毒性添加剤の使用による細胞毒性及び生体内安定性の問題で一部制限を有している。一方、物理化学的交差結合を利用した生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルの場合、前述した毒性物質が添加されないが、低い機械的強度と安定性などの制限を有している。
【０００６】
特に、温度感応性ヒドロゲルの場合、ヒドロゲルを形成する前に、前駆体である高分子溶液の高い粘度によって薬物または細胞を均一に混合しにくく、高分子溶液の製造に長時間がかかるという欠点を有する。また、立体錯体結合によるヒドロゲルの場合、分解される副産物の酸性によって細胞毒性及び周辺組職壊死を誘発するという欠点を有する。
【０００７】
このような問題点を改善するために、最近、酵素感応性生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルが開発されている。このような酵素感応性ヒドロゲルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）との存在下で、酵素反応を通じた生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルシステムとして開発され、これは、化学的交差結合によるヒドロゲルが有する長所である高い機械的強度と優れた生体内安定性とを有するヒドロゲルを生成できるようにする。
【０００８】
現在開発されている酵素感応性生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルは、次の通りである。デキストラン−チラミン（ｄｅｃ−ＴＡ）（Ｒｏｎｇ  Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００７）、ヒアルロン酸−チラミン（ＨＡ−ＴＡ）（Ｍｏｔｏｉｃｈｉ  Ｋｕｒｉｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００５）、ゼラチン−ヒドロキシプロパン酸（ＧＨＰＡ）（Ｌｉｓｈａｎ  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００９）、ゼラチン−チラミン（ＧＴＡ）（Ｓｈｉｎｊｉ  Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｉｒａｌｓ  ２００９）、アルギン酸−ヒドロキシフェニル酢酸（ＡＨＰＡ）（Ｓｈｉｎｊｉ  Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｃｔａ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｉａ２００７）などが、これに属する。
【０００９】
ヒアルロン酸−チラミンの場合、アメリカのＬｉｆｅＣｏｒｅ社によって製品が販売されており、数編のＰＣＴ及びアメリカ特許が登録されている状況である。前述したヒドロゲルは、高分子鎖内にフェノール誘導体を含んでおり、このフェノール誘導体がＨＲＰ媒介カップルリング反応を通じてオルト位置での炭素−炭素結合またはオルト位置の炭素とフェノキシ酸素との間の炭素−酸素結合を通じてヒドロゲルを形成する。
【００１０】
形成されたヒドロゲルのゲル化時間、機械的強度、生分解性などの物理化学的性質は、ＨＲＰとＨ２Ｏ２との濃度調節を通じて容易に調節することができる、という特徴を有する。しかし、このような酵素感応性ヒドロゲルは、高分子溶液の溶解度、フェノール−フェノール結合の反応性による低い安定性及び機械的強度のような、まだ解決することができないさまざまな課題を有する。
【００１１】
例えば、前述したヒドロゲルは、ゲルを形成する前の高分子溶液の高い粘度によって１〜５重量％内外で使わなければならないという欠点を有する。このようなヒドロゲル形成前の高分子溶液の高い粘度は、ヒドロゲル内部での細胞または薬物の均一な混合に多くの欠点を有しており、実際に用いるにあたって、多くの課題を残す。
【００１２】
ゼラチン−チラミン（ＧＴＡ）ヒドロゲルの場合、高分子溶液の低い溶解度によって、ヒドロゲル形成時に不透明になるという欠点と、高分子溶液可溶濃度が５ｗｔ％以内の場合のみ使用可能である、という欠点とを有している。特に、ゼラチンを利用した場合には、低い温度での溶解度が非常に重要な問題として注目されるために、このような課題の解決が必要である。
【００１３】
また、ゼラチン−ヒドロキシプロパン酸（ＧＨＰＡ）ヒドロゲルの場合、形成されたヒドロゲルの最大強度が６００Ｐａ前後で相対的に弱い機械的強度を有する、という欠点を有する。このような問題は、高分子主鎖にフェノール誘導体が直接結合されることにより発生する問題点とみなされている。フェノール−フェノール誘導体を形成するために、フェノール誘導体の移動度が重要な役割を行うが、これは、フェノール−フェノール結合のためには、ＨＲＰ分子とフェノール誘導体との距離が数Å（オングストローム）になるとラジカルが生成されるためである。したがって、フェノール誘導体が直接結合されている形態では、前記のような制限点を表わす。
【００１４】
したがって、生体安定性及び優れた機械的強度を有する生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルを開発する必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前記従来技術の問題点を解決するために、本発明者は、高分子主鎖として用いられる天然または合成高分子とフェノールまたはアニリン誘導体との間に、リンカーとしてポリエチレングリコールのような親水性高分子（水溶性高分子）を用いることによって、高分子の溶解度を向上させ、取り扱いが容易であり、かつ、フェノール−フェノール結合またはアニリン−アニリン結合の反応性を増加させてより安定し、機械的強度が向上した生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルを開発した。
【００１６】
これにより、本発明の目的は、生体安定性及び優れた機械的強度を有する生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルを開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
前記目的を果たすために、本発明は、リンカーを通じてフェノール誘導体またはアニリン誘導体が結合された同種または異種の下記一般式（１）で表される２つ以上の高分子について、隣接する２つ以上の高分子間のフェノール部またはアニリン部間の脱水素結合によって連結されてなる、ことを特徴とする下記一般式（２）で表される生体内注入型ヒドロゲルを提供する：
【００１８】
【化１】
0005608741.tif 000002
・・・（１）
【００１９】
【化２】
0005608741.tif 000003
・・・（２）
【００２０】
前記一般式（１）または一般式（２）で、
Ｒは、ヒドロキシル基またはアミン基であり、Ｌは、リンカーであって、親水性高分子鎖（水溶性高分子リンカー）である。
【００２１】
前記高分子に西洋ワサビペルオキシダーゼ、及び過酸化水素を添加することにより、高分子が生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）で架橋される。
【００２２】
前記化学式１で表される高分子は、親水性高分子（水溶性高分子）をリンカーとして用いて、アミノ基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を有する高分子主鎖に、化学式３で表されるフェノール誘導体またはアニリン誘導体を、アミド、ウレタン、ウレア、またはエステル結合させることで製造可能である：
【００２３】
【化３】
0005608741.tif 000004
・・・（３）
【００２４】
前記一般式（３）で、Ｒ１が、ヒドロキシル基またはアミン基であり、Ｒ２は、カルボキシル基またはアミン基である。
【００２５】
例えば、下記の反応式１ないし５のように、化学式１で表される高分子を製造することができる。この場合、反応式において、ＥＤＣは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＴＥＡは、トリエチルアミン、ＤＭＡＰは、ジメチルアンモ二ウムピリジン、ＮＰＣＦは、ｐ−ニトロフェニルクロロフォーメイトを意味する。
【００２６】
より詳細には、（ｉ）ヒドロキシル基またはカルボキシル基を有する水溶性高分子を調製する工程と、（ｉｉ）フェノール誘導体またはアニリン誘導体のうち何れか１つを添加する工程と、（ｉｉｉ）アミン基またはヒドロキシル基を有する高分子主鎖を添加する工程と、を経て化学式１で表される高分子を製造することができる。
【００２７】
前記水溶性高分子に、無水コハク酸またはＮＰＣＦのうち何れか１つの化合物、ＴＥＡ及びＤＭＡＰを添加する工程を工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）の間にさらにあってもよい。
【００２８】
前記フェノール誘導体またはアニリン誘導体の添加時に、ＥＤＣ及びＨＮＳをともに添加して、前記フェノール誘導体またはアニリン誘導体を活性化し、親水性高分子（水溶性高分子）と反応させることができる。また、高分子主鎖添加時にも、ＥＤＣ及びＨＮＳをともに添加して活性化することができる。
【００２９】
また、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）の間に、ジアミン化合物を添加する工程を追加することもできる。
【００３０】
【化４】
0005608741.tif 000005
【００３１】
【化５】
0005608741.tif 000006
【００３２】
【化６】
0005608741.tif 000007
【００３３】
【化７】
0005608741.tif 000008
【００３４】
【化８】
0005608741.tif 000009
【００３５】
また、本発明における前記高分子骨格としては、ゼラチン、キトサン、ヘパリン、セルロース、デキストラン、デキストランサルフェート、コンドロイチンサルフェート、ケラタンサルフェート、デルマタンサルフェート、アルギン酸、コラーゲン、アルブミン、フィブロネクチン、ラミリン、エラスチン、ビトロネクチン、及びフィブリノーゲルからなる群から選択された１つまたは２つ以上の高分子が使用可能であるが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
本発明で用いられた前記フェノール誘導体は、チラミン、ヒドロキシフェニル酢酸、ヒドロキシプロピオン酸、及びその誘導体からなる群から選択された１つまたは２つ以上であり、前記アニリン誘導体としては、ヒドロキシエチルアニリン、アミノエチルアニリン、アミノベンジルアルコール、及びその誘導体からなる群から選択された１つまたは２つ以上使用できる。
【００３７】
本発明で、リンカーとしては、ポリカチオン、ポリアニオン、両性高分子、非イオン性高分子、ポリペプチド、脂肪族高分子、芳香族高分子、ポリエステル、ポリアンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリウレタン、及びポリアミド鎖からなる群から選択された何れか１つの水溶性高分子が使用可能である。前記共重合体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ｐｏｌｙＮＩＰＡＡＭ）、ポリフマレート、ポリオルガノホスファゼン、ポリアクリル酸（ｐｏｌｙＡＡｃ）、ポリアクリルスルホン酸、ポリヒドロキシエチルメタクリレート（ｐｏｌｙＨＥＭＡ）、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）シリーズ）、４−アーム  ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）シリーズ）、ＰＥＧ−ＰＥＩ、ＰＥＧ−ＰＶＡ、ＰＥＧ−ＰＥＩ−ＰＶＡ、ＰＥＩ−ＰＶＡ、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−ＡＡｃ）、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ−ｃｏ−ＨＥＭＡ）、及びこれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されるものではない。
【００３８】
また、本発明で用いられたリンカーであって、水溶性高分子としては、親水性線形またはマルチ−アームブロック共重合体から選択されたものを使い、前記マルチ−アームブロック共重合体としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−ポリ（ＤＬ−乳酸−ＣＯ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（（プロピレン）フマール酸）、ポリ（（エチレン）フマール酸）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択することができるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
また、前記ヒドロゲルは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、及び過酸化水素の濃度を調節してゲル化時間、ゲル安定性（分解時間）、機械的強度、または含水率から選択された物理化学的性質を調節することができる。
【００４０】
また、前記ヒドロゲルは、水溶性高分子の分子量を調節してゲル化時間、ゲル安定性、機械的強度、または含水率から選択された物理化学的性質を調節することができる。
【００４１】
本発明によるヒドロゲルは、二連シリンジキットを構成して生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）架橋を形成し、前記二連シリンジキットにスプレーノズルを結合してスプレー可能とする。また、前記二連シリンジキットとテフロン型とを用いてヒドロゲルシートまたはディスクを製造することができる。
【００４２】
また、本発明は、前記生体内注入型ヒドロゲルに、さらにフェノールまたはアニリン基を有する生理活性物質を含んで生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）架橋形成されたことを特徴とする生体内注入型ヒドロゲルを提供する。前記生理活性物質としては、チロシンを含むペプチドを使用し得る。
【００４３】
また、本発明は、前記生体内注入型ヒドロゲルを含む組職再生及び充填用インプラント素材を提供する。
【００４４】
前記インプラント素材は、軟骨再生、骨再生、歯槽骨再生、皮膚再生、心筋再生、人工水晶体、脊髓神経再生、脳神経再生、声帯再生及び増強剤、癒着防止膜、尿失禁治療剤、シワ除去剤、火傷治療剤、組職増強剤、及び脊椎椎間板治療剤からなる群から選択された何れか１つに適用可能である。
【００４５】
また、本発明は、前記生体内注入型ヒドロゲルを含む生理活性物質または薬物伝達体用担体を提供する。
【００４６】
前記生理活性物質または薬物は、ペプチドまたはタンパク質医薬品、抗菌剤、抗癌剤、及び抗炎症剤からなる群から選択された何れか１つまたは２つ以上として使用し得る。
【００４７】
前記ペプチドまたはタンパク質医薬品は、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、骨形成因子（ＢＭＰ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ブタ成長ホルモン（ｐＧＨ）、白血球増殖因子（Ｇ−ＣＳＦ）、赤血球増殖因子（ＥＰＯ）、マクロファージ増殖因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インターフェロン−α，β，γ、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、カルシトニン、神経増殖因子（ＮＧＦ）、成長ホルモン放出因子、アンジオテンシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン作動薬（ＬＨＲＨアゴニスト）、インシュリン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、アンジオスタチン、エンドスタチン、ソマトスタチン、グルカゴン、エンドルフィン、バシトラシン、マゲイン、コリスチン、モノクローナル抗体、ワクチン類、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００４８】
前記抗菌剤は、ミノサイクリン、テトラサイクリン、オフロキサシン、ホスホマイシン、マゲイン、プロフロキサシン、アンピシリン、ペニシリン、ドキシサイクリン、チエナマイシン、セファロスポリン、ノルキサシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ミクロノマイシン、アミカシン、トブラマイシン、ジベカシン、セフォタキシン、セファクロル、エリスロマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、エノキサシン、バンコマイシン、イミペネム、フシジン酸、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００４９】
前記抗癌剤は、パクリタキセル、タキソテール、アドリアマイシン、エンドスタチン、アンギオスタチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、シスプラチン、カボプラチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、アクチノマイシン−Ｄ、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００５０】
前記抗炎症剤は、アセトアミンフェン、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、インドメタシン、ピロキシカム、フェノプロフェン、フルビプロフェン、ケトプロフェン、ナプロキセン、スプロフェン、ロキソプロフェン、シノキシカム、テノキシカム、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００５１】
本発明の一実施例において、高分子主鎖として酵素分解性天然高分子であるゼラチンと、中間にリンカーとしてＰＥＧのような水溶性高分子とを用いて、フェノール誘導体を結合させてゼラチン−ＰＥＧ−チラミン（ＧＰＥＧ−ＴＡ）を合成し、ＨＲＰとＨ２Ｏ２存在下で前記高分子からヒドロゲルを製造した。このように製造されたヒドロゲルは、リンカーで連結されていない高分子、すなわち、ゼラチン−ヒドロキシフェニル酢酸（ＧＨＰＡ）から製造されたヒドロゲルと比較した場合、高分子溶液の溶解度向上、ゲル化時間短縮、機械的強度向上、及び生体内安定性向上を示した。
【００５２】
本発明によるヒドロゲルは、組織工学用注入型骨格、タンパク質、ＤＮＡ、成長因子及び細胞のような薬物の徐放型薬物伝達体、組職充填剤、傷治療剤、及び腸癒着防止剤などの多様な生物医学的応用が可能である。
【００５３】
より詳細には、本発明によるヒドロゲルは、組織工学用有効骨格を形成する人工細胞外マトリックスとして用いられる。この際、ヒドロゲルの分解速度は、ゲル内部にある細胞の分化及び成長に対して、非常に重要な役割を担うので、適切な分解速度調節が必須である。例えば、ゼラチンは、細胞が分泌するマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、特に、ＭＭＰ−２，９によって特異的に分解される。ゼラチンを含有するヒドロゲルマトリックスは、このような酵素によって分解され、再び細胞が分泌する細胞外マトリックス（ＥＣＭ）として再形成されることにより、ヒドロゲル内部の細胞が効果的に成長し、分化することができる。
【００５４】
また、組織工学用有効骨格として用いられるヒドロゲルのマトリックス剛度も、ゲル内部にある細胞の成長と分化とに多くの影響を及ぼす。また、各細胞に適切なマトリックス剛度が要求される。例えば、骨細胞は、剛度の高いマトリックスでよく成長することが明らかであり、、軟組織細胞、例えば、繊維芽細胞、筋肉母細胞などは、剛度の低いマトリックスでよく成長すると知られている。酵素反応を利用したシステムでは、過酸化水素の量を調節することで容易にヒドロゲルの架橋を調節し、それにより、ヒドロゲルの剛度を容易に調節することができる。
【００５５】
また、本発明によるヒドロゲルは、薬物伝達用有効骨格としての人工細胞外マトリックスとして用いられる。例えば、多様な成長因子との物理的結合を向上させるヘパリンにチラミンを導入して成長因子を効果的に胆持し、徐放型放出挙動を可能とする（成長因子結合サイト）。フェノールで修飾された細胞接着ペプチドまたはタンパク質、例えば、ＲＧＤＹまたはＹＩＧＳＲを用いてヒドロゲルマトリックス内部の細胞接着力を向上させることができる。効果的な細胞の成長と分化とに必要なこのような成分から、酵素的機序を用いて、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形態で人工ＥＣＭを作ることができる。
【発明の効果】
【００５６】
本発明によれば、高分子主鎖として用いられる天然または合成高分子とフェノールまたはアニリン誘導体との間に、リンカーとしてＰＥＧのような水溶性高分子を用いることによって、高分子の溶解度を向上させ、取り扱いが容易であり、かつ、フェノール−フェノール、アニリン−アニリンなどの結合の反応性を増加させ、リンカーを用いていない高分子で製造されたヒドロゲルに比べ、結果的に生体内安定性及び機械的強度が向上した新たな形態の生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルを提供することができる。また、このような生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルを用いて、生物医学的適用範囲を拡張させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
本発明における、上記のまたは他の目的、特徴及び効果は、下記の図面と組み合わせて、下記の詳細な説明によって、より鮮明に理解されるであろう。
【図１】ＧＰＥＧ−ＴＡの合成の模式図を示す。
【図２】ＧＨＰＡの合成の模式図を示す。
【図３】酵素反応を利用したＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの製造の模式図を示す。
【図４】二連シリンジを利用した生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルの製造の模式図を示す。
【図５】二連シリンジ及びスプレーキットを利用したスプレー型ヒドロゲルの製造方法を示す図である。
【図６】テフロン型を利用した、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルシート及びディスクの製造方法を示す図である。
【図７】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、２Ｄ細胞付着及び増殖結果を示す図である。
【図８】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、３Ｄ細胞付着及び増殖結果を示す図である。
【図９】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性の評価結果を示す図である。
【図１０】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）放出挙動の評価結果を示す図である。
【図１１】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、軟骨再生の評価結果を示す図である。
【図１２】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、脊髓再生の評価結果を示す図である。
【図１３】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、声帯再生または充填の評価結果を示す図である。
【図１４】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、癒着防止の評価結果を示す図である。
【図１５】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、椎間板再生の評価模式図及び方法を示す図である。
【図１６】ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、椎間板再生の評価模式図及び方法を示す図である。
【図１７】酵素濃度によるＧＰＥＧ−ＴＡ及びＧＨＰＡヒドロゲル形成時間の変化を比較した図である。
【図１８】ＧＰＥＧ−ＴＡ及びＧＨＰＡヒドロゲルの機械的強度の比較及びＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルのＨ２Ｏ２濃度による機械的強度の変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明の一実施例においては、高分子主鎖としてゼラチンを使い、リンカーとしてＰＥＧを用いて、フェノール誘導体であるチラミンを結合してゼラチン−ＰＥＧ−チラミン（ＧＰＥＧ−ＴＡ）高分子を合成し、前記高分子から酵素反応を用いて新たな形態の生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルを製造することができた。
【００５９】
リンカーとしてＰＥＧを導入することによって、高分子の溶解度を向上させるだけではなく、チラミンの反応性を増加させて、結果的にリンカーを用いていないヒドロゲルに比べて、安定性と機械的強度とが向上したことを確認した。実験の対照群としては、ゼラチン−ヒドロキシフェニル酢酸（ＧＨＰＡ）を用いて、リンカーの有無による物理化学的差についての評価を行った。
【００６０】
製造された生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲル内で、ゼラチンは、細胞に対するＭＭＰ及び生理活性基質によるタンパク質性分解に対する基質としての役割を担う。ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの物理化学的特性、例えば、ゲル化時間、ゲル安定性、膨潤程度、及び機械的強度は、過酸化水素濃度に応じて特定された。特に、体外細胞活性測定は、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの細胞適合性を確認するために実施され、生体内安定性及び多様な組職再生評価のために、軟骨再生、声帯再生及び増強、腸癒着防止、脊髓再生、椎間板再生、骨組職再生などの動物実験が、以下のように行われた。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。しかし、このような実施例によって、本発明の範囲が限定されるものではない。
【００６２】
＜製造例１＞ゼラチン−ＰＥＧ−チラミン（ＧＰＥＧ−ＴＡ）の合成
図１は、ＧＰＥＧ−ＴＡ共重合体の合成模式図を示す。
【００６３】
１．ポリエチレングリコール−（ｐ−ニトロフェニルクロロフォーメイト）（ＰＥＧ−ＮＰＣＦ）の合成
ＰＥＧ  １０ｇ（２．９ｍｍｏｌ）をメチレンクロライド（ＭＣ）１００ｍＬに溶解させた後、この溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）０．７７９ｇ（６．３８ｍｍｏｌ）とトリメチルアミン（ＴＥＡ）０．６４５ｇ（６．３８ｍｍｏｌ）とをＭＣ  １０ｍｌに溶解させた溶液と、ＮＰＣＦ  １．２８６ｇ（６．３８ｍｍｏｌ）をＭＣ  ５０ｍｌに溶解させた溶液とを順次に混合させた。この際、ＰＥＧ：ＤＭＡＰ：ＴＥＡ：ＮＰＣＦのｍｏｌ比率は、１：２．２：２．２：２．２とし、反応温度は３０℃とし、窒素雰囲気下で２４時間反応を進行させた。
【００６４】
反応終了後、濾過器を用いて溶液に残存する試薬を除去した後、回転式蒸発濃縮器を用いて反応溶液を濃縮させた。濃縮溶液を冷エーテル１６００ｍＬに滴下して沈澱を生成させ、この沈殿物を濾過器を用いて濾過して生成物を得た。該得られた生成物は、残余有機溶媒を除去するために、真空オーブンに２４時間静置した後、結果的に白色の粉末形態の生成物（ＰＥＧ−ＮＰＣＦ）を得た。
【００６５】
２．ＧＰＥＧ−ＴＡの合成
予め用意したＰＥＧ−ＮＰＣＦ  ５ｇ（１．４７１ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）１００ｍＬに溶解させた溶液にチラミン（ＴＡ）０．２０２ｇ（１．４７１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ  ５０ｍＬに溶解させた溶液を添加して反応を進行させた。ＰＥＧ−ＮＰＣＦ：ＴＡのｍｏｌ比率は、１：１とし、この場合、反応温度は３０℃とし、窒素雰囲気下で６時間反応を進行させた。６時間後、ゼラチン溶液（１ｇ／２００ｍＬ  ｉｎ  ＤＭＳＯ）と混合して、３０℃の窒素雰囲気下で２４時間反応を進行させた。
【００６６】
反応終了後、水を用いて反応溶液をメンブレン透析（６０００〜８０００ｄａ分子量遮断）に供し、未反応のＰＥＧ−ＴＡを除去した。透析が完了した後、溶液を凍結乾燥して白色の粉末生成物（ＧＰＥＧ−ＴＡ）を得た。合成されたＧＰＥＧ−ＴＡの化学構造は、１Ｈ  ＮＭＲを通じてＴＡ置換物の特性ピーク（６．９１〜７．２３ｐｐｍ）の出現よりを確認し、合成が良好に行われたことを確認した。
【００６７】
＜製造例２＞ゼラチン−ヒドロキシフェニル酢酸（ＧＨＰＡ）の合成
図２は、ＧＨＰＡの合成模式図を示す。
すなわち、１０ｇのゼラチンを０．１Ｍ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）２００ｍｌに溶解させた（溶液Ａ）。４−ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡ）０．６０９ｇ（４ｍｍｏｌ）を０．１Ｍ  ＭＥＳ  ５０ｍｌに溶解させた（溶液Ｂ）。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）０．９２ｇ（４．８ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．２７６ｇ（２．４ｍｍｏｌ）とを、それぞれ５ｍｌの０．１Ｍ  ＭＥＳに溶解させた。
【００６８】
次いで、ＥＤＣ溶液とＮＨＳ溶液とを溶液Ｂに１５分間隔で順次に加えた。ＥＤＣ／ＮＨＳで活性化された溶液Ｂを溶液Ａに混合して反応を始めた。このとき、反応温度は４０℃とし、反応時間は、２４時間とした。
【００６９】
反応終了後、反応溶液を、シリンジフィルター（４５０ｎｍ）を用いて濾過した。次いで、蒸留水を用いて、３〜４日間メンブレン透析（３５００Ｄａ分子量遮断）を実施した。透析後の溶液を凍結乾燥して、白色粉末形態の生成物（ＧＨＰＡ）を得た。合成されたＧＨＰＡの化学構造は、１Ｈ  ＮＭＲを通じて、ＴＡ置換物の特性ピーク（６．９１〜７．２３ｐｐｍ）の出現により確認し、合成が良好に行われたことを確認した。
【００７０】
＜実施例１＞酵素反応を利用したＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの製造
ＧＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨＲＰ溶液に溶かした溶液（溶液Ａ）とＧＰＥＧ−ＴＡをＨ２Ｏ２溶液に溶かした溶液（溶液Ｂ）とを混合することによって、ヒドロゲルを形成させた。このとき、高分子溶液の最終濃度は、１〜２０重量％まで調節が可能であり、二連シリンジキット、スプレーキット、テフロン型などを用いて多様な形態への応用が可能であった。
【００７１】
ＧＨＰＡ及びＣＨＰＡ、ＧＰＥＧ−ＰＡまたはＣＰＥＧ−ＴＡをＨ２Ｏ２に懸濁し（溶液Ｂ）、ＨＲＰ中Ｔｅｔ−Ｔａ／ＤＡ溶液（溶液Ａ）と混合してヒドロゲルを調製した。
【００７２】
ＧＨＰＡヒドロゲルの場合も同じ方法で製造可能であるが、高分子溶液の最終濃度を５〜１０重量％までしか調節することができず、１０重量％濃度でも、実際的に高い粘度によって高分子溶液を扱うのが困難であった。相対的にＰＥＧが導入されたＧＰＥＧ−ＴＡの場合、ＧＨＰＡに比べて水に対する優れた溶解度を有し、低い粘度によって高分子溶液を扱うのが容易であった。
【００７３】
図３は、酵素反応を利用したＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの製造の模式図を示す。
【００７４】
＜実施例２＞二連シリンジキットを利用した生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルの製造
ＧＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨＲＰ溶液に溶かした溶液（溶液Ａ）とＧＰＥＧ−ＴＡをＨ２Ｏ２溶液に溶かした溶液（溶液Ｂ）とを二連シリンジキットを用いて生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルを製造した。この際、溶液Ａと溶液Ｂは、それぞれのシリンジで注入した。図４は、二連シリンジキットを利用した生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルの製造の模式図を示す。
【００７５】
＜実施例３＞二連シリンジキットとスプレーキットとを利用したスプレー型ヒドロゲルの製造
ＧＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨＲＰ溶液に溶かした溶液（溶液Ａ）とＧＰＥＧ−ＴＡをＨ２Ｏ２溶液に溶かした溶液（溶液Ｂ）とをシリンジにそれぞれ挿入して二連シリンジキットを構成し、ノズルにスプレーキットを用いてスプレー型ヒドロゲルを製造した。図５は、二連シリンジキットとスプレーキットとを利用した、スプレー型ヒドロゲルの製造の模式図を示す。
【００７６】
＜実施例４＞テフロン型を利用したヒドロゲルシート及びディスクの製造
ＧＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨＲＰ溶液に溶かした溶液（溶液Ａ）とＧＰＥＧ−ＴＡをＨ２Ｏ２溶液に溶かした溶液（溶液Ｂ）とをシリンジにそれぞれ挿入して、二連シリンジキットを構成し、該構成された溶液を注射針を用いて、製造されたテフロン型に注入し、所望の形状のヒドロゲルシート及びディスクを製造した。図６は、テフロン型を利用したＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルシート及びディスクの製造の模式図を示す。
【００７７】
＜実験例１＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した２Ｄ細胞適合性の評価
体外細胞適合性の評価のために、実施例４のように、テフロン型を用いてＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルディスクを製造した後、該製造されたヒドロゲルディスクの表面に多様な細胞を培養して、細胞付着及び増殖評価を行った。製造されたヒドロゲルの最終濃度は５重量％とし、機械的強度は、２７００Ｐａとした。
【００７８】
実験に用いられた細胞群は、筋肉母細胞（Ｃ２Ｃ１２）、造骨細胞（ＭＣ３Ｔ３）、ラット中間葉幹細胞（ＭＳＣ）を用いて細胞適合性の評価を行った。実験に用いられた細胞の濃度は、１Ｘ１０５  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌであり、培養された細胞は、位相差顕微鏡とｌｉｖｅ／ｄｅａｄ解析とを通じて観察した。
【００７９】
その結果、図７のように、あらゆる細胞群で優れた細胞付着及び増殖が観察されたことで、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの優れた体外細胞適合性の結果が確認された。一方、ＧＨＰＡヒドロゲルの場合、ヒドロゲル安定性がＧＰＥＧ−ＴＡに比べて著しく低くて、２４時間以内にヒドロゲル構造が崩壊するという問題発生して、細胞適合性の評価を行うことができなかった。
【００８０】
ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの場合、ＰＥＧ導入によってチラミンの反応性が増加して架橋度が向上し、結果的に優れた安定性を示すことが予想され、また、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの多様な細胞に対する優れた細胞適合性が確認されたことによって、これを利用した多様な組職再生が可能であることが確認された。
【００８１】
＜実験例２＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した３Ｄ細胞付着及び増殖の評価
ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを用いて３Ｄ細胞カプセル化実験を行った。ＧＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨＲＰに溶かした溶液（溶液Ａ）とＧＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨ２Ｏ２に溶かした溶液（溶液Ｂ）とを製造した後、溶液Ａに細胞を投入した。細胞を投入した溶液Ａと溶液Ｂとを同量で混合してヒドロゲルを形成した後、７日間細胞培養を進行させた。
【００８２】
製造されたヒドロゲルの最終濃度は５重量％とし、実験に使った細胞群は、人間心臓前駆細胞（ｈＣＰＣ）とラットＭＳＣとし、細胞濃度は、５Ｘ１０４  細胞／ウェルとして実験を行った。培養された細胞は、Ｆ−アクチン分析とｌｉｖｅ／ｄｅａｄ分析とを通じて分析した。
【００８３】
その結果、図８のように、３Ｄカプセル化された細胞がヒドロゲルマトリックスの内部で効果的に付着し、増殖することを確認した。これを通じて、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが多様な細胞の効果的な３次元培養が可能であり、多様な組職再生に応用が可能となることが確認された。
【００８４】
＜実験例３＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用したｉｎ  ｖｉｖｏ安定性の評価
白ウサギを用いて、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの生体内安定性の評価を行った。実験のために、ＧＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨＲＰに溶かした溶液（溶液Ａ）とＧＰＥＧ−ＴＡ高分子をＨ２Ｏ２に溶かした溶液（溶液Ｂ）とを製造した後、実施例２のような方法で二連シリンジキットを構成した。該構成されたキットを用いて白ウサギに経皮注入して２週間移植した後、組職を摘出してＨ＆Ｅ染色を通じて炎症反応及び周辺組職浸湿を観察した。
【００８５】
その結果、図９のように、注入されたＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの内部に周辺組職が成長して貫入することが確認され、特異的な炎症反応や異物反応は確認されなかった。このような結果を通じて、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが生体内で安定し、組職再生にも効果的であることが確認され、また、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した移植が可能であるということが確認された。
【００８６】
＜実験例４＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用したｉｎ  ｖｉｖｏ人間成長ホルモン（ｈＧＨ）放出挙動の評価
生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）放出挙動の評価を行った。実験動物モデルとしては、Ｓ．Ｄ．ラット（５〜６週齢）を使った。
【００８７】
実験のために、実施例２と同じ方法で二連シリンジキットを構成し、この際、人間成長ホルモン（ｈＧＨ）は、溶液Ａに混合した。構成されたキットを用いてラットの経皮に注入した後、２週間実験を進行させた。
【００８８】
その結果、図１０のように、生体内でｈＧＨが徐放型に放出されることが確認され、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルは２週後、生体内で分解した。また、過酸化水素または高分子の濃度を調節することで、放出速度の調節を行うことが可能であった。このような結果を通じて、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルがｈＧＨ伝達体として効果的に用いられることが確認された。
【００８９】
＜実験例５＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した軟骨再生の評価
生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した軟骨再生の評価を行った。実験群は、対照群（ｄｅｆｅｃｔ  ｏｎｌｙ）、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲル、ＧＰＥＧ−ＴＡに軟骨細胞が混合されたヒドロゲル、ＧＰＥＧ−ＴＡにＴＧＦ−β３と軟骨細胞とがともに混合されたヒドロゲルを用いて実験を行った。
【００９０】
実験のために、実施例２と同じ方法で二連シリンジキットを構成し、この際、軟骨細胞とＴＧＦ−β３とを溶液Ａに混合した。構成されたキットを用いて白ウサギの軟骨に注入した後、４週間実験を進行させた。
【００９１】
その結果、図１１のように、対照群を除いたあらゆる実験群で効果的な軟骨の再生を確認することができた。このような結果を通じて、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが軟骨再生において効果的に用いられることが確認された。
【００９２】
＜実験例６＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した脊髓再生の評価
生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した脊髓再生の評価を行った。実験のために、実施例２と同じ方法で二連シリンジキットを構成した。動物モデルとしてラットを用い、ラット脊髓に片側切除を施して欠損を作り、構成された二連シリンジキットを用いて欠損部位に注入して、２週間実験を進行させた。
【００９３】
その結果、図１２のように、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが欠損部位を良好に埋設することを確認し、注入２週間後に組職を摘出し、組職免疫染色を行うことで脊髓再生程度を観察した。組職染色結果により、注入されたＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが周辺宿主組職とよく融化されていることが確認することができ、脊髓組職が再生されていることを確認することができた。
【００９４】
このような結果を通じて、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが脊髓再生に効果的に用いられることが確認された。
【００９５】
＜実験例７＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した声帯再生または充填剤の評価
生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した、声帯再生及び増強剤の評価を行った。実験のために、実施例２と同じ方法で二連シリンジキットを構成した。溶液Ａに軟骨細胞を混合して実験を進行させた。
【００９６】
動物モデルは、白ウサギを利用し、構成された二連シリンジキットを用いて声帯に注入した後、１ヶ月間実験を進行させた。移植期間中にＣＴ撮影を通じて声帯再生と修復とを確認し、実験終了後、組職を摘出して炎症及び免疫反応を確認し、軟骨細胞の増殖及び組職再生程度ＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロットなどを用いて確認した。
【００９７】
その結果、図１３のように、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが声帯再生または増強に効果的に用いられることが確認された。
【００９８】
＜実験例８＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した癒着防止膜の評価
生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した癒着防止膜の評価を行った。実験のために、実施例３と同じ方法でスプレー型二連シリンジキットを構成した。実験のための動物モデルとしては、ラットを使い、ラットの盲腸と腹膜とに傷を出して傷部位に構成されたスプレー型二連シリンジキットを用いてヒドロゲルを塗布した後、２週間実験を進行させた。２週後に開腹して腸癒着程度と炎症及び異物反応とを観察した。
【００９９】
その結果、図１４のように、腸癒着が発生せず、特異的な炎症及び異物反応は観察されなかった。このような結果から生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが癒着防止膜として効果的に用いられることが確認された。
【０１００】
＜実験例９＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した椎間板再生の評価
生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した椎間板再生の評価を図１５及び図１６のように実験した。実験のために、実施例２と同じ方法で二連シリンジキットを構成した。動物モデルは、ブタを利用し、構成された二連シリンジキットを用いて椎間板（髓核）に注入した後、１ヶ月間実験を進行させた。
【０１０１】
移植期間中にＭＲＩ撮影によって髓核再生程度を確認し、実験終了後、組職を摘出して炎症及び免疫反応有無を観察し、髓核再生程度を組職学的染色及びＲＴ−ＰＣＲなどを用いて確認した。
【０１０２】
その結果、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが椎間板治療に効果的に用いられることが確認された。
【０１０３】
＜実験例１０＞ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した骨組職再生の評価
生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルを利用した骨組職再生の評価を行った。実験のために、実施例２と同じ方法で二連シリンジキットを構成した。溶液Ａに、ヒドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウムのような骨形成に効果的な無機物質と、骨形成因子（ＢＭＰ）または形質転換増殖因子（ＴＧＦ）のような骨形成に効果的な成長因子とを混合して実験を進行させた。
【０１０４】
動物モデルは、ラットを利用し、構成された二連シリンジキットを用いて頭蓋骨欠損部位に注入した後、１〜２ヶ月間実験を進行させた。移植期間中にＣＴ撮影を通じて骨組職再生程度を観察し、実験終了後、組職を摘出して炎症及び免疫反応を確認し、骨組職再生程度を組職染色及びカルシウム形成により確認した。
【０１０５】
本実験を通じて、生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが骨組職再生に効果的に用いられることが確認された。
【０１０６】
＜実験例１１＞酵素濃度によるＧＰＥＧ−ＴＡとＧＨＰＡヒドロゲル形成時間の変化比較
ＨＲＰ濃度によるＧＰＥＧ−ＴＡとＧＨＰＡヒドロゲルのゲル化時間の変化を評価した。実験のために、実施例１のような方法で溶液Ａと溶液Ｂとを製造した後、２つの溶液を同量で混合してヒドロゲルを製造した。このとき、溶液Ａは、多様なＨＲＰの濃度を用いて製造した。ヒドロゲル形成時間は、バイアル傾斜法（ｖｉａｌ  ｔｉｌｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて溶液が流れなくなる時間を測定して分析した。
【０１０７】
その結果、図１７のように、ＨＲＰの濃度の調節により、ゲル化時間を５〜１８０秒の範囲内で調節可能であることが確認された。ＨＲＰの濃度が増加するにつれてゲル形成時間が短くなるが、その原理は、ＨＲＰの濃度が増加するにつれて過酸化水素の分解が促進されてラジカルの生成速度が速くなり、その結果、生成されたラジカルによってゲルが形成され、ゲル形成時間が短くなることによる。
【０１０８】
また、同じＨＲＰ濃度では、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが、ＧＨＰＡヒドロゲルに比べてゲル化時間が早いことが確認された。これは、高分子主鎖（ゼラチン）とチラミンとの間にＰＥＧが導入されたＧＰＥＧ−ＴＡ高分子が、主鎖（ゼラチン）にフェノール基が直接結合されたＧＨＰＡに比べて、反応性に優れ、結果的により効果的なチラミン−チラミン接合を形成することができることを暗示する。
【０１０９】
＜実験例１２＞ＧＰＥＧ−ＴＡとＧＨＰＡヒドロゲルの機械的強度の比較及びＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルのＨ２Ｏ２濃度による機械的強度の変化評価
レオメーターを用いて、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルとＧＨＰＡヒドロゲルとの機械的強度を比較測定し、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの場合、過酸化水素の濃度を調節して機械的強度の変化について評価した。実験に用いられたヒドロゲルの最終濃度は、５重量％とした。
【０１１０】
同じ条件（ＨＲＰ、過酸化水素と高分子溶液の濃度同一）で、ＧＨＰＡヒドロゲルは１００ＰａとＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルは２７００Ｐａの機械的強度を示した（図１８参照）。これは、フェノール基が直接結合されたＧＨＰＡに比べて、主鎖とチラミンとの間にＰＥＧが導入されたＧＰＥＧ−ＴＡの場合、チラミン−チラミン接合反応性に優れて、より高い架橋度を有することによると考えられる。
【０１１１】
また、ＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルの場合、過酸化水素の濃度を調節してヒドロゲルの機械的強度調節が可能であるということが確認され、その範囲は、９０〜２７００Ｐａであった。
【０１１２】
その結果、図１８のように、ＰＥＧが中間リンカーとして用いられたＧＰＥＧ−ＴＡヒドロゲルが、同じ条件でＧＨＰＡより優れた機械的強度を示し、過酸化水素の濃度調節を通じて多様な機械的強度を有する生体内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成ヒドロゲルを製造できることが確認された。
【０１１３】
【表１】
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【産業上の利用可能性】
【０１１４】
本発明は、生体内注入型ヒドロゲル及びその生物医学的用途に関連する分野に適用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１７】
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【図１８】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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