(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸試料の配列を決定する方法であって、
ａ．核酸インサートおよび前記核酸試料を含む少なくとも１組のインサート−試料ユニットを含む環状核酸分子を提供すること、ここで、前記インサートは既知の配列を有し、
ｂ．少なくとも２組のインサート−試料ユニットの配列を含む配列データを得ること、ここで、少なくとも２組のインサート−試料ユニットを含む核酸分子が生成され、
ｃ．ステップ（ｂ）の前記配列データの少なくとも２つのインサートの前記配列のスコアを、前記配列を前記インサートの前記既知の配列と比較することにより計算すること、
ｄ．前記核酸試料の前記配列のリピートのすぐ上流および下流にある前記インサートの前記配列の一方または両方の前記スコアにしたがって、ステップ（ｂ）の前記配列データの前記核酸試料の前記配列の前記リピートのうち少なくとも２つを受け入れるか、あるいは拒否すること、
ｅ．ステップ（ｄ）で受け入れられた前記核酸試料の前記配列の少なくとも１つのリピートを含む受け入れられた配列セットをコンパイルすること、ならびに
ｆ．前記受け入れられた配列セットを用いて前記核酸試料の前記配列を決定すること、
を含む方法。
【請求項２】
配列データを得ることが、単一分子配列決定を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単一分子配列決定が、合成およびライゲーションシークエンシングによる単一分子配列決定から選ばれる方法よる配列決定を含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単一分子配列決定が、合成によるリアルタイム単一分子配列決定を含む請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記単一分子配列決定が、パイロシークエンシング、可逆的ターミネーターシークエンシング、および第三世代シークエンシングから選ばれる方法による合成による単一分子配列決定を含む請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記単一分子配列決定がナノポアシークエンシングを含む請求項３に記載の方法。
【請求項７】
環状核酸分子を提供することが、前記核酸試料を前記核酸インサートにライゲートして前記環状核酸分子を形成することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記環状核酸分子が二本鎖である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸試料がＲＮＡ試料から得られる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸試料がゲノムＤＮＡ試料から得られる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記環状核酸分子が少なくとも２組のインサート−試料ユニットを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸インサートがプロモーターを含み、かつ前記核酸分子を生成することが、前記プロモーターを、前記プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼに接触させ、続いてリボヌクレオチド残基を含む生成物の核酸分子を合成することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸インサートが３０℃から９０℃の融解温度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸インサートが１４から２００ヌクレオチド残基の長さを有する請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記受け入れられた配列セットが、ステップ（ｅ）で拒否された前記核酸試料の前記配列のリピートを消去、上書き、または除くように処理されたステップ（ｂ）の前記配列データを含む多要素変数および単一のデータ文字列から選ばれた形式である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記受け入れられた配列セットが、リスト、配列、ハッシュ、および行列から選ばれるタイプの多要素変数の形式である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸試料の前記配列の少なくとも２つのリピートが、ステップ（ｄ）で受け入れられ、かつ前記核酸試料の前記配列を決定することが、ステップ（ｄ）で受け入れられた前記核酸試料の前記配列の前記少なくとも２つのリピートに基づいて共通配列を決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記共通配列が、ステップ（ｄ）で受け入れられた前記核酸試料の前記配列の前記少なくとも２つのリピートで一致しない少なくとも１つの位置に、確率的に表された塩基を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸試料の前記配列の少なくとも３つのリピートが、ステップ（ｄ）で受け入れられ、かつ共通配列を決定することが、ステップ（ｄ）で受け入れられた前記核酸試料の前記配列の前記少なくとも３つのリピートの過半数の票を決定することを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記共通配列が位置特異的重み行列である請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記共通配列がフラットな配列である請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記フラットな配列が少なくとも１つの多義性コードを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記共通配列が信頼度を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記信頼度が、塩基の出現頻度、情報内容、およびフレッド（ｐｈｒｅｄ）クオリティスコアから選ばれた形式で表現される請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１のステップ（ｂ）〜（ｆ）がリアルタイムで実行され、かつ前記共通配列および信頼度がリアルタイムで更新される請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、前記共通配列の位置の事前に選択されたパーセンテージにおける規定の信頼の最低レベルに達せられるまで実行される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
位置の事前に選択されたパーセンテージが前記規定の信頼の最低レベルに達するときに警告を発生することをさらに含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記規定の信頼の最低レベルが、９０％、９５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％、および９９．９９％のベースコールの正確度から選ばれる請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１の前記核酸試料の前記配列に部分的に重なる配列を有する請求項１の前記核酸試料と同じ起源、種、または菌株からの少なくとも１つの他の核酸試料を用いて、請求項１の前記ステップを繰り返すこと、これにより少なくとも１つの他の配列を決定すること、および前記少なくとも１つの他の配列をステップ（ｆ）の前記配列と共にアセンブルしてコンティグを形成することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｃ）の前記スコアが、ステップ（ｂ）の前記配列データ全体の信頼度を評価するのに用いられる請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
スコアを計算することが、前記配列データの前記少なくとも２つのインサートと前記インサートの前記既知の配列との間のミスマッチの数を決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
スコアを計算することが、前記配列データの前記少なくとも２つのインサートの、前記インサートの前記既知の配列に対する同一性パーセントを決定することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
スコアを計算することが、前記配列データの前記少なくとも２つのインサートと前記インサートの前記既知の配列との間のアライメントを行うことを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
アライメントを行うことが、ＢＬＡＳＴ、ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメント、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアライメントから選ばれたアルゴリズムを用いることを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記スコアが、カウントベースおよび比率ベースから選ばれる根拠に基づいて生成される請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
ステップ（ｂ）の前記配列データの前記核酸試料の前記配列の前記リピートの少なくとも２つを受け入れるか、あるいは拒否することが、スコアが事前に定めた閾値以上である試料インサート配列のすぐ上流または下流にある前記核酸試料の前記配列の前記少なくとも２つのリピートのうちのそれらリピートを受け入れること、およびそうではないそれらを拒否することを含む請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
プロセッサ、ストレージ、バスシステム、および少なくとも１つのユーザーインターフェースエレメントを含む計算装置に操作可能に連結された配列決定装置を含むシステムであって、前記ストレージが、ユーザーの任意入力により、前記プロセッサにより実行されるときに、下記の方法を実行するオペレーティングシステム、ユーザーインターフェースソフトウェア、および命令を含む、プログラミングによりエンコードされたものであり、該方法が
ａ．核酸インサートおよび核酸試料を含む少なくとも１組のインサート−試料ユニットを含む環状核酸分子から配列データを獲得すること、ここで、
（ｉ）前記インサートが既知の配列を有し、
（ｉｉ）前記配列データが少なくとも２組のインサート−試料ユニットの配列を含み、かつ
（ｉｉｉ）少なくとも２組のインサート−試料ユニットを含む核酸分子が生成され、
ｂ．ステップ（ａ）の前記配列データの少なくとも２つのインサートの前記配列のスコアを、前記配列を前記インサートの前記既知の配列と比較することにより計算すること、
ｃ．前記核酸試料の前記配列のリピートのすぐ上流および下流にある前記インサートの前記配列の一方または両方の前記スコアにしたがって、ステップ（ａ）の前記配列データの前記核酸試料の前記配列の前記リピートの少なくとも２つを受け入れるか、あるいは拒否すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で受け入れられた前記核酸試料の前記配列の少なくとも１つのリピートを含む受け入れられた配列セットをコンパイルすること、ならびに
ｅ．前記受け入れられた配列セットを用いて前記核酸試料の前記配列を決定すること、
を含み、
前記システムの出力が、（ｉ）核酸試料の配列または（ｉｉ）核酸試料中の少なくとも１つの位置に修飾塩基があることの表示のうち少なくとも１つを生じるのに用いられる、システム。
【請求項３８】
ユーザーの任意入力により、プロセッサ、ストレージ、バスシステム、および少なくとも１つのユーザーインターフェースエレメントを含む計算装置に操作可能に連結された配列決定装置を含むシステム上のプロセッサにより実行されるときに、下記の方法を実行するオペレーティングシステム、ユーザーインターフェースソフトウェア、および命令を含むプログラミングによりエンコードされたストレージであって、該方法が、
ａ．核酸インサートおよび核酸試料を含む少なくとも１組のインサート−試料ユニットを含む環状核酸分子から配列データを獲得すること、ここで、
（ｉ）前記インサートが既知の配列を有し、
（ｉｉ）前記配列データが少なくとも２組のインサート−試料ユニットの配列を含み、かつ
（ｉｉｉ）少なくとも２組のインサート−試料ユニットを含む核酸分子が生成され、
ｂ．ステップ（ａ）の前記配列データの少なくとも２つのインサートの前記配列のスコアを、前記配列を前記インサートの前記既知の配列と比較することにより計算すること、
ｃ．前記核酸試料の前記配列のリピートのすぐ上流および下流にある前記インサートの前記配列の一方または両方の前記スコアにしたがって、ステップ（ａ）の前記配列データの前記核酸試料の前記配列の前記リピートのうち少なくとも２つを受け入れるか、あるいは拒否すること、
ｄ．ステップ（ｃ）で受け入れられた前記核酸試料の前記配列の少なくとも１つのリピートを含む受け入れられた配列セットをコンパイルすること、ならびに
ｅ．前記受け入れられた配列セットを用いて前記核酸試料の前記配列を決定すること、を含み、
前記方法により、（ｉ）核酸試料の配列または（ｉｉ）核酸試料中の少なくとも１つの位置に修飾塩基があることの表示のうち少なくとも１つを生じるのに用いられる出力が生じることとなる、ストレージ。
【請求項３９】
二本鎖核酸試料の配列および前記配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、
ａ．フォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、
ｂ．単一分子配列決定により前記環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、前記配列データは、前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、
ｃ．前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖の前記配列を比較することによって前記二本鎖核酸試料の前記配列を決定すること、
ｄ．前記環状ペアロック分子の特定タイプの塩基の塩基対合特異性を変えて、変化した環状ペアロック分子を生成すること、
ｅ．前記変化した環状ペアロック分子の前記配列データを得ること、ここで、前記配列データが変化したフォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、ならびに
ｆ．前記変化したフォワード鎖およびリバース鎖の前記配列を比較することによって前記二本鎖核酸試料の前記配列中の修飾塩基の前記位置を決定すること、
を含む方法。
【請求項４０】
前記二本鎖核酸試料が、細胞、ウィルス、または環境起源からの一次単離物として得られる請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記一次単離物が、請求項３９のステップ（ａ）よりも前に、実質的に二価陽イオンおよび核酸修飾酵素がない条件において２５℃以下に保たれる請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記二本鎖核酸試料が、インビトロ反応から、または細胞外核酸から得られる請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記環状ペアロック分子の特定タイプの塩基の前記塩基対合特異性を変化させることが、亜硫酸水素塩処理を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記環状ペアロック分子の特定タイプの塩基の前記塩基対合特異性を変化させることが、光化学的トランジションを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記フォワード鎖およびリバース鎖をロックすることが、同じであっても同じでなくてもよい２つの核酸インサートを、１つを各々の末端につなげて、前記二本鎖核酸試料に連結することを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸インサートが１４から２００ヌクレオチド残基の長さを有する請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸インサートが既知の配列を有する請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸インサートがオーバーハングを有するヘアピンを形成し、かつ前記核酸試料が、前記核酸インサートの前記オーバーハングと適合するオーバーハングを有する請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
配列データを得ることが、前記核酸インサートのうち少なくとも１つの少なくとも一部に相補的なプライマーを、鋳型にアニーリングすること、および前記プライマーを伸長させることを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記核酸インサートのうちの少なくとも１つがプロモーターを含み、かつ配列データを得ることが、前記プロモーターを、前記プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼに接触させ、続いてリボヌクレオチド残基を含む生成物の核酸分子を合成することを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
連結がライゲーションにより達成される請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記二本鎖核酸試料が、連結された複数の試料を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５３】
前記複数の前記試料が、介在する核酸インサートを介して連結される請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記フォワード鎖およびリバース鎖をロックすることが、前記核酸インサートのオーバーハングを前記核酸試料の適合するオーバーハングに接触させることにより形成される複合体をライゲートすることを含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記二本鎖核酸試料がゲノムＤＮＡフラグメントである請求項３９に記載の方法。
【請求項５６】
前記二本鎖核酸試料が少なくとも１つのＲＮＡ鎖を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５７】
前記単一分子配列決定が、合成およびライゲーションシークエンシングによる単一分子配列決定から選ばれる方法による配列決定を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５８】
前記単一分子配列決定が、合成によるリアルタイム単一分子配列決定を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項５９】
前記単一分子配列決定が、パイロシークエンシング、可逆的ターミネーターシークエンシング、および第三世代シークエンシングから選ばれる方法による合成による単一分子配列決定を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項６０】
前記単一分子配列決定がナノポアシークエンシングを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項６１】
前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖が核酸インサートによりロックされており、
ステップ（ｂ）で得られた前記配列データが、前記環状ペアロック分子の前記配列の少なくとも２つのコピーを含み、各コピーは第１および第２のインサート−試料ユニットの配列を含んでおり、
前記第１および第２のインサート−試料ユニットの前記配列は、同じであっても同じでなくてもよいインサート配列、および前記核酸試料の前記配列の反対向きのリピートを含み、かつ
前記方法が、
ｇ．前記配列データ中に含まれる少なくとも４つのインサートの前記配列のスコアを、前記少なくとも４つのインサートの前記配列を前記インサートの既知の配列と比較することによって計算すること、
ｈ．各方向における少なくとも１つの試料配列が受け入れられるという条件にしたがい、前記試料配列のすぐ上流および下流にある前記インサートの前記配列の一方または両方のスコアに基づいて、前記配列データ中に含まれる前記核酸試料の前記配列の前記リピートの少なくとも４つを受け入れるか、あるいは拒否すること、
ｉ．ステップ（ｇ）で受け入れられた各方向における前記少なくとも１つの試料の配列を含む受け入れられた配列セットをコンパイルすること、ならびに
ｊ．前記受け入れられた配列セットを用いて前記核酸試料の前記配列を決定すること
をさらに含む請求項３９に記載の方法。
【請求項６２】
二本鎖核酸試料の配列および前記配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、
ａ．前記核酸試料のフォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、
ｂ．単一分子配列決定により前記環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、配列データは、前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、ならびに
ｃ．前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖の前記配列を比較することによって前記二本鎖核酸試料の前記配列および前記二本鎖核酸試料の前記配列中の前記少なくとも１つの修飾塩基の前記位置を決定すること、
を含む方法。
【請求項６３】
前記二本鎖核酸試料が、５−ブロモウラシル、ウラシル、５,６−ジヒドロウラシル、リボチミン、７−メチルグアニン、ヒポキサンチン、およびキサンチンから選ばれる少なくとも１つの修飾塩基を含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記二本鎖核酸試料中の少なくとも１つの修飾塩基が、その優先的なパートナー塩基とは異なる塩基対合特異性を有する塩基と対合する請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
二本鎖核酸試料の配列および前記配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、
ａ．前記核酸試料のフォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、
ｂ．前記環状ペアロック分子中の特定タイプの塩基の塩基対合特異性を変化させること、
ｃ．単一分子配列決定により前記環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、配列データは、前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、ならびに
ｄ．前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖の前記配列を比較することによって前記二本鎖核酸試料の前記配列および前記二本鎖核酸試料の前記配列中の前記少なくとも１つの修飾塩基の前記位置を決定すること、
を含む方法。
【請求項６６】
二本鎖核酸試料の配列および前記配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、
ａ．フォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、
ｂ．単一分子配列決定により前記環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、前記配列データは、前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、
ｃ．前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖の前記配列を比較することによって前記二本鎖核酸試料の前記配列を決定すること、
ｄ．単一分子配列決定により前記環状ペアロック分子の配列決定データを得ること、ここで、塩基とその修飾型を区別する少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、前記少なくとも１つの異なるように標識されたヌクレオチド類似体が取り込まれた少なくとも１つの位置を含む配列データを得るために用いられ、ならびに
ｅ．前記フォワード鎖およびリバース鎖の前記配列を比較することによって前記二本鎖核酸試料の前記配列中の修飾塩基の前記位置を決定すること、
を含む方法。
【請求項６７】
二本鎖核酸試料の配列および前記配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、
ａ．前記核酸試料のフォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、
ｂ．単一分子配列決定により前記環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、塩基とその修飾型を区別する少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、前記少なくとも１つの異なるように標識されたヌクレオチド類似体が取り込まれた少なくとも１つの位置を含む配列データを得るために用いられ、ならびに
ｃ．前記環状ペアロック分子の前記フォワード鎖およびリバース鎖の前記配列を比較することによって前記二本鎖核酸試料の前記配列および前記二本鎖核酸試料の前記配列中の前記少なくとも１つの修飾塩基の前記位置を決定すること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の配列を決定する方法および核酸中の修飾塩基の位置を同定する方法に関する。
【０００２】
本出願は、２００８年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６１／１１２，５４８号および２００９年４月７日に出願された米国仮特許出願第６１／１６７，３１３号の利益を主張し、その両方が参照として本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
最近のＤＮＡ配列決定技術の発展は、ゲノムレベルにおける高度に個別化された予防医療の可能性を高めた。さらに、１またはそれ以上の集団内の多数の個体から大量の配列データを迅速に得ることの可能性は、生物医科学において、ゲノミクス革命の新風を吹き込む。
【０００４】
遺伝子型間の一塩基の違いは、実質的な表現型効果を生じ得る。例えば、酵素活性欠損を生じさせ、かつ高フェニルアラニン血症やフェニルケトン尿症の疾患を引き起こすフェニルアラニン異化およびタンパク質と神経伝達物質との生合成において、フェニルアラニンをチロシンに変換する酵素であるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）をエンコードする遺伝子に、３００を超える突然変異が確認されている。例えば、非特許文献１を参照されたい。
【０００５】
配列データは、サンガー配列決定法を用いて得ることができ、それにおいては、標識されたジデオキシ鎖ターミネーターヌクレオチド類似体が大量のプライマー伸長反応中に取り込まれ、異なる長さの生成物に分けられ、解析され、取り込まれたターミネーターの同一性が決定される。例えば、非特許文献２を参照されたい。実際に、この技術を用いて、多くのゲノム配列が決定されている。しかし、サンガー配列決定法により配列データを得るコストおよびスピードは、制限されている。
【０００６】
新しい配列決定技術は、１塩基あたりサンガー配列決定法よりも低いコストで、１日に何百ものメガ塩基対という驚異的な速度で配列データを取り出すことができる。例えば、非特許文献３を参照されたい。しかし、これらの配列決定技術を用いて得られる生データは、従来のサンガー配列決定法に比べて、よりエラーが発生しやすい。これは、大量の集団の代わりに個別のＤＮＡ分子から情報を得ることに起因する可能性がある。
【０００７】
例えば、合成による単一分子の配列決定においては、装置が弱いシグナルを拾えないことにより、または、蛍光色素の退色により生じるシグナルの欠如により、または、ポリメラーゼが速く作用しすぎて装置に検出され得ないことにより、塩基が抜け落ちることがある。上述した事象の全ては、生配列において欠失のエラーを生じさせる。同様に、変異のエラーおよび挿入のエラーも、おそらくは従来の方法よりも弱いシグナルおよび速い反応という単純な理由によって、より高い頻度で起こり得る。
【０００８】
低い正確度の配列データは、アセンブルするのがより難しい。全真核生物ゲノムの配列決定のような大規模な配列決定では、ＤＮＡ分子は、より小さな断片に断片化される。これらの断片が並行して配列決定され、次いで、結果として得られた読み取りデータがアセンブルされ、元の試料ＤＮＡ分子の全配列が再構成される。断片化は、例えば、機械的せん断または酵素的切断によって達成され得る。
【０００９】
配列の小さなリードの大きなゲノムへのアセンブリには、断片化されたリードが正しくグループ化できるほど十分に正確であることが要求される。このことは、生データの正確度が９５％より高くなり得るサンガー法により産出される生配列決定データに対しては、概ね当てはまる。正確な単一分子配列決定技術は、単一塩基の修飾または突然変異核酸試料を検出するのに適用できる。しかし、単一分子配列決定技術の生データの正確度は上述した制限のために、より低くなることがある。生配列データの個々のリードの正確度は、６０％から８０％にまで下がり得る。非特許文献４を参照されたい。したがって、正確な単一分子配列決定法を提供することは有益となるであろう。
【００１０】
また、ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たす。例えば、プロモーターにおけるメチル化は、しばしば転写サイレンシングを引き起こす。メチル化はまた、遺伝子刷り込みおよびＸ−染色体の不活化に不可欠なメカニズムとしても知られている。しかし、複雑な全ゲノムのメチル化プロフィール解析の進展は、制限されていた。よって、高スループットにＤＮＡメチル化プロフィールを決定する方法は、有用であろうし、それにもまして、この方法は、正確な配列の決定を提供するはずである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）ら、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・ヒューマン・ジェネティックス（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ）８，６８３−６９６（２０００）
【非特許文献２】サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）７４，５４６３−５４６７（１９９７）
【非特許文献３】カトウ（Ｋａｔｏ）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・メディスン（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ）２，１９３−２０２（２００９）
【非特許文献４】ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）３２０：１０６−１０９（２００８）
【発明の概要】
【００１２】
いくつかの実施形態において、本発明は、核酸試料の配列を決定する方法であって、（ａ）核酸インサートおよび核酸試料を含む少なくとも１組のインサート−試料ユニットを含む環状核酸分子を提供すること、ここで、インサートは既知の配列を有し、（ｂ）少なくとも２組のインサート−試料ユニットの配列を含む配列データを得ること、ここで、少なくとも２組のインサート−試料ユニットを含む核酸分子が生成され、（ｃ）ステップ（ｂ）の配列データの少なくとも２つのインサートの配列のスコアを、該配列をインサートの既知の配列と比較することにより計算すること、（ｄ）核酸試料の配列のリピートのすぐ上流および下流にあるインサートの配列の一方または両方のスコアにしたがって、ステップ（ｂ）の配列データの核酸試料の配列のリピートのうち少なくとも２つを受け入れるか、あるいは拒否すること、（ｅ）ステップ（ｄ）で受け入れられた核酸試料の配列の少なくとも１つのリピートを含む受け入れられた配列セットをコンパイルすること、ならびに（ｆ）受け入れられた配列セットを用いて核酸試料の配列を決定すること、を含む方法を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本発明は、プロセッサ、ストレージ、バスシステム、および少なくとも１つのユーザーインターフェースエレメントを含む計算装置に操作可能に連結された配列決定装置を含むシステムであって、該ストレージが、ユーザーの任意入力により、プロセッサにより実行されるときに、下記の方法を実行するオペレーティングシステム、ユーザーインターフェースソフトウェア、および命令を含む、プログラミングによりエンコードされたものであり、該方法が、（ａ）核酸インサートおよび核酸試料を含む少なくとも１組のインサート−試料ユニットを含む環状核酸分子から配列データを獲得すること、ここで、（ｉ）インサートが既知の配列を有し、（ｉｉ）配列データが少なくとも２組のインサート−試料ユニットの配列を含み、かつ（ｉｉｉ）少なくとも２組のインサート−試料ユニットを含む核酸分子が生成され、（ｂ）ステップ（ａ）の配列データの少なくとも２つのインサートの配列のスコアを、該配列をインサートの既知の配列と比較することにより計算すること、（ｃ）核酸試料の配列のリピートのすぐ上流および下流にあるインサートの配列の一方または両方のスコアにしたがって、ステップ（ａ）の配列データの核酸試料の配列のリピートのうちの少なくとも２つを受け入れるか、あるいは拒否すること、（ｄ）ステップ（ｃ）で受け入れられた核酸試料の配列の少なくとも１つのリピートを含む受け入れられた配列セットをコンパイルすること、ならびに（ｅ）受け入れられた配列セットを用いて核酸試料の配列を決定すること、を含み、システムの出力が、（ｉ）核酸試料の配列または（ｉｉ）核酸試料中の少なくとも１つの位置に修飾塩基があることの表示のうち少なくとも１つを生じるのに用いられる、システムを提供する。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本発明は、ユーザーの任意入力により、プロセッサ、ストレージ、バスシステム、および少なくとも１つのユーザーインターフェースエレメントを含む計算装置に操作可能に連結された配列決定装置を含むシステム上のプロセッサにより実行されるときに、下記の方法を実行するオペレーティングシステム、ユーザーインターフェースソフトウェア、および命令を含むプログラミングによりエンコードされたストレージであって、該方法が、（ａ）核酸インサートおよび核酸試料を含む少なくとも１組のインサート−試料ユニットを含む環状核酸分子から配列データを獲得すること、ここで、（ｉ）インサートが既知の配列を有し、（ｉｉ）配列データが少なくとも２組のインサート−試料ユニットの配列を含み、かつ（ｉｉｉ）少なくとも２組のインサート−試料ユニットを含む核酸分子が生成され、（ｂ）ステップ（ａ）の配列データの少なくとも２つのインサートの配列のスコアを、該配列をインサートの既知の配列と比較することにより計算すること、（ｃ）核酸試料の配列のリピートのすぐ上流および下流にあるインサートの配列の一方または両方のスコアにしたがって、ステップ（ａ）の配列データの核酸試料の配列のリピートの少なくとも２つを受け入れるか、あるいは拒否すること、（ｄ）ステップ（ｃ）で受け入れられた核酸試料の配列の少なくとも１つのリピートを含む受け入れられた配列セットをコンパイルすること、ならびに（ｅ）受け入れられた配列セットを用いて核酸試料の配列を決定すること、を含み、該方法により、（ｉ）核酸試料の配列、または（ｉｉ）核酸試料中の少なくとも１つの位置に修飾塩基があることの表示のうち少なくとも１つを生じるのに用いられる出力が生じることとなるストレージを提供する。
【００１５】
いくつかの実施形態において、本発明は、二本鎖核酸試料の配列および配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、（ａ）フォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、（ｂ）単一分子配列決定により環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、配列データは、環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、（ｃ）環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することによって二本鎖核酸試料の配列を決定すること、（ｄ）環状ペアロック分子の特定タイプの塩基の塩基対合特異性を変えて、変化した環状ペアロック分子を生成すること、（ｅ）変化した環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、配列データは変化したフォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、ならびに（ｆ）変化したフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することによって二本鎖核酸試料の配列中の修飾塩基の位置を決定すること、を含む方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本発明は、二本鎖核酸試料の配列を決定する方法であって、（ａ）核酸試料のフォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、（ｂ）単一分子配列決定により環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、配列データは、環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、ならびに（ｃ）環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することによって二本鎖核酸試料の配列を決定すること、を含む方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、二本鎖核酸試料の配列および配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、（ａ）核酸試料のフォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、（ｂ）単一分子配列決定により環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、配列データは、環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、ならびに（ｃ）環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することによって二本鎖核酸試料の配列および二本鎖核酸試料の配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定すること、を含む方法を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、二本鎖核酸試料の配列および配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、（ａ）核酸試料のフォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、（ｂ）環状ペアロック分子中の特定タイプの塩基の塩基対合特異性を変化させること、（ｃ）単一分子配列決定により環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、配列データは、環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、ならびに（ｄ）環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することによって二本鎖核酸試料の配列および二本鎖核酸試料の配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定すること、を含む方法を提供する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本発明は、二本鎖核酸試料の配列および配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、（ａ）フォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、（ｂ）単一分子配列決定により環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、配列データは、環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を含み、（ｃ）環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することによって二本鎖核酸試料の配列を決定すること、（ｄ）単一分子配列決定により環状ペアロック分子の配列決定データを得ること、このうち、塩基とその修飾型を区別する少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、少なくとも１つの異なるように標識されたヌクレオチド類似体が取り込まれた少なくとも１つの位置を含む配列データを得るために用いられ、ならびに（ｅ）フォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することによって二本鎖核酸試料の配列中の修飾塩基の位置を決定すること、を含む方法を提供する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本発明は、二本鎖核酸試料の配列および配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定する方法であって、（ａ）核酸試料のフォワード鎖およびリバース鎖をロックして環状ペアロック分子を形成すること、（ｂ）単一分子配列決定により環状ペアロック分子の配列データを得ること、ここで、塩基とその修飾型を区別する少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、少なくとも１つの異なるように標識されたヌクレオチド類似体が取り込まれた少なくとも１つの位置を含む配列データを得るために用いられ、ならびに（ｃ）環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することによって二本鎖核酸試料の配列および二本鎖核酸試料の配列中の少なくとも１つの修飾塩基の位置を決定すること、を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明のさらなる目的および長所は、一部は以下に続く説明中に記載されており、一部は説明から明らかとなり、または本発明の実施により知ることができる。本発明の目的および長所は、添付のクレームにおいて具体的に挙げられる要素および組み合わせによって実現および達成される。
【００２２】
上述の概略的な記載および以下の詳細な説明は、いずれも例示的および説明的なものにすぎず、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではないことが理解される。
【００２３】
この明細書に組み込まれかつその一部を成す添付の図面は、説明と共に本発明のいくつかの実施形態を例示し、本発明の原理を説明するのに役立つものとなる。
【００２４】
上述したこの発明の態様および長所は、以下のような添付の図面を参照にして、以下の詳細な説明から明らかとなり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明のいくつかの実施形態に基づく環状ＤＮＡ分子の作製である。ＤＮＡ試料１が断片化される。断片２は、その５’末端（菱形）にてリンカー３に、その３’末端（矢じり形）にて別のリンカー４にライゲートされる。リンカー３および４は、隣接するオリゴヌクレオチド５のセグメントに相補的である。５の３および４へのアニーリングは、ライゲーションによる環状化の基質を提供し、その反応の結果として、（リンカー３および４の配列からの）核酸インサートならびに（フラグメント２の配列からの）核酸試料を含む環状分子６が生じる。
【図２】ローリングサークル型の増幅である。図１におけるように生成された環状分子６にアニールされたオリゴヌクレオチド５が、表面８に固定されたポリメラーゼ７に結合される。オリゴヌクレオチドの伸長により、環状分子の相補的な線状コピー９が得られる。引き続いての伸長により、環状分子の多数のコピーを含む分子１０の鎖置換と合成が生じることとなる。
【図３Ａ】環状ペアロック分子である。（Ａ）フォワード鎖１１およびリバース鎖１２を含む二本鎖分子は、同じでも同じでなくてもよいヘアピン１３および１４を形成するインサートに結合して、環状ペアロック分子が形成され得る。いくつかの実施形態において、リンカーはオーバーハングおよび陥凹末端（３７および３８）を有する。これらは、ポリメラーゼを用いて充填され得るか、あるいは二本鎖分子中のオーバーハング（図示せず）に相補的であり得る。完全な環状ペアロック分子において、３７および３８は、該分子が連続的な、一本鎖の、かつ環状バックボーンを持つように充填されると共に封止される。
【図３Ｂ】環状ペアロック分子である。（Ｂ）必要に応じたギャップの充填および末端結合後、ここでは、融解した形式で示される、フォワード鎖１１、リンカー１４、リバース鎖１２、およびリンカー１３を含む環状ＤＮＡが形成される。この分子は、例えば、プライマーをリンカーのうちの１つにアニーリングし、さらに鎖置換活性を持たないポリメラーゼ、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを用いて、それを伸長し、続いてライゲーションすることによって、二本鎖の形式に変換することができる。
【図４】環状ペアロック分子を用いた配列決定ならびに配列およびメチル化プロフィール決定のスキームである。（左）環状ペアロック分子が、少なくとも１の該分子の全長について配列決定され、相補配列のリードが提供される。引き続いての配列決定が、さらなる冗長度を提供するために用いられ得る。配列データは、試料核酸の正確な配列が得られるよう、インサート核酸の配列に基づいて、アライメントされると共に評価され得る。（右）例えば、亜硫酸水素塩変換または光化学的トランジションによる特定タイプのヌクレオチドの変換、その後の変更された配列とその未変更の相補配列の配列決定、アライメント、および比較が、正確な配列データおよびメチル化プロフィールを得るために用いられ得る。試料核酸配列の多数のリピートを含む伸長された配列のリードが、正確度の向上のために用いられ得る。
【図５Ａ】ヌクレオチド変換である。（Ａ）インサート１３および１４、少なくとも１つの５−メチルシトシン（ｍＣ）残基を含むフォワード鎖１５、ならびにリバース鎖１６を含む環状ペアロック分子が光化学的トランジションのような処理を受け、ｍＣがＴに変換されることにより、変換されたフォワード鎖１７ができる。リバース鎖中の相補ヌクレオチドは影響を受けず、Ｇ−Ｔゆらぎ対ができる。（リバース鎖中のｍＣ残基は、存在する場合は、この処理により変換することとなる。）
【図５Ｂ】ヌクレオチド変換である。（Ｂ）インサート１３および１４、少なくとも１つの５−メチルシトシン（ｍＣ）残基を含むフォワード鎖１５、ならびにリバース鎖１６を含む環状ペアロック分子が亜硫酸水素塩変換のような処理を受け、Ｃ（ｍＣではない）がＵに変換されることにより、変換されたフォワード鎖３９および変換されたリバース鎖４０ができる。変換されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドは影響を受けず、Ｇ−Ｕゆらぎ対ができる。
【図６Ａ】環状ペアロック分子からの配列データおよびメチル化プロフィールの獲得である。（Ａ）プライマー１８が図５Ａの変換された環状ペアロック分子にアニールされ、さらにポリメラーゼにより伸長されることで、１６、１４、および１７の配列に相補的なセグメント１９、２０、および２１を有する鎖の合成が起こることになる。
【図６Ｂ】環状ペアロック分子からの配列データおよびメチル化プロフィールの獲得である。（Ｂ）少なくとも２つのリピート、つまり、試料１７のリピートおよび新たに合成されたフォワード鎖２１の相補鎖のリピートのうち少なくとも１つ、ならびに新たに合成されたリバース鎖１９の相補鎖のリピートおよびリバース鎖１６のリピートのうち少なくとも１つ、を含む配列が得られる。これらのリピートはアライメントされる。リピート間で不一致がある位置４１は、塩基がその位置で修飾されていることを意味する。用いた修飾のタイプにより、核酸試料の対応する位置に元々存在する塩基が決定され得る。この例では、環状ペアロック分子がｍＣからＴへの変換（図５Ａを参照）によって修飾された場合、不一致は、ｍＣが位置４１のフォワード鎖中の核酸試料に存在したということを表す。この論理は、配列で一致しない位置において、変換反応の生成物である塩基、Ｔが、核酸試料中に存在していた変換反応の基質、ｍＣに取って代わった、というものである。
【図７Ａ】環状核酸分子鋳型から得られた生の配列データおよび処理された配列データである。（Ａ）環状鋳型から得ることのできる配列の内容が図示されている。核酸試料の配列はダッシュ記号で示され、核酸インサートの配列は円で示されている。図示された配列は、核酸試料の部分配列２２から始まり、核酸インサートの配列２３が続く。核酸試料の配列２４、核酸インサートの配列２５、核酸試料の配列２６、および核酸インサートの配列２７がこれらに続く。２８は、この図に示されていないさらなる配列を表すものであり、核酸インサートの配列２９、核酸試料の配列３０、核酸インサートの配列３１、および核酸試料の部分配列３２が続く。環状鋳型が単一の核酸試料および単一の核酸インサートを含む場合、２２および２４の両方は、後続の核酸試料配列２６、３０、および３２と共に、同じ単一の核酸試料の配列である。同様に、この場合において、２３、２５、２７、２９、および３１は同じ単一の核酸インサートの配列である。環状鋳型が、環状ペアロック分子のケースのように、核酸試料の配列のフォワードリピートおよびリバースリピートならびに同じでも同じでなくてもよい既知の配列を持つ２つの核酸インサートを含む場合、核酸試料の配列は、互い違いの方向を有し、かつ互い違いの形式で２つの核酸試料のリピートに対応する（例えば、２２はフォワード方向であり得る、つまりそれはリバースリピートの配列であるということを意味し、かつ２４はリバース方向であり得る、つまり、それはフォワードリピートの配列であるということを意味し、またはその逆も同様である）。同様に、核酸インサートの配列２３、２５なども、環状鋳型の、同じでも同じでなくてもよい２つの核酸インサートと互い違いの形式で対応することとなる。
【図７Ｂ】環状核酸分子鋳型から得られた生の配列データおよび処理された配列データである。（Ｂ）図７Ａに示される配列は、各々が核酸試料の配列のリピート、例えば、２４を含むセグメントに分解することができる。それらセグメントは、核酸インサートの少なくとも１つのリピート、例えば核酸インサートの２つのリピート、例えば２３および２５も含む。一部のセグメントは、部分配列、例えば３３だけ、または非常に長い配列、例えば、３４を含む場合がある。かかるセグメントは、配列決定時におけるエラーによって生じ得る。いくつかの実施形態において、かかるセグメントについては、さらなる検討は加えない。
【図８】配列処理ステップの図である。いくつかの実施形態において、図示されるように、生配列データが検査され、処理され、そして、受け入れられるか、あるいは拒否される。
【図９】ローリングサークル型の増幅産物である。実施例１において記載した反応の生成物に電気泳動がかけられ、かつゲルが記載したように可視化されている。左から、Ｃ１およびＣ２は、陰性コントロールレーンである。最も左のＭｒレーンは、バンドの大きさが２５０から１００００ｂｐであるファーメンタス・ジェネルーラー（ＦＥＲＭＥＮＴＡＳ  ＧＥＮＥＲＵＬＥＲ）１ｋｂラダー、カタログ番号ＳＭ０３１１を含む。次の１０レーンは、２つのプライマーまたは１つのプライマーを用いて生成された、示されたようなローリングサークル型増幅反応の生成物（増幅コントロール）、および表示された時間に取り出されたＬ０（陰性ライゲーションコントロール）またはＬ３反応のライゲーション反応の生成物を含む。実施例１を参照されたい。次のＭｒレーンは、バンドの大きさが１００から３０００ｂｐであるファーメンタス・ジェネルーラー１００ｂｐプラス・ラダー、カタログ番号ＳＭ０３２１を含む。次の１０レーンは、それら生成物が１％ＳＤＳ含有の負荷色素と混合されていることを除いて、前の１０の生成物のレーンと同じ生成物を含む。
【図１０Ａ】シミュレートされた核酸試料のリピート配列および推定された元の配列を示すアライメントである。全てのアライメントされた配列が一致する位置は、アスタリスクでマークされている。（Ａ）実施例２のリードａおよびｂが、核酸試料のフォワード鎖の、「ｏ」で表示された推定された元の配列と共に示されている。元の配列は、表５に示されるルールを用いて推定されたものである。示された３つの全ての配列がＣを有する位置は、シミュレートされた核酸試料がフォワード鎖中にメチル化シトシンを含んだ位置である。示された３つの全ての配列がＧを有する位置は、シミュレートされた核酸試料がリバース鎖中にメチル化シトシンを含んだ位置である。
【図１０Ｂ】シミュレートされた核酸試料のリピート配列および推定された元の配列を示すアライメントである。全てのアライメントされた配列が一致する位置は、アスタリスクでマークされている。（Ｂ）実施例３のリードａおよびｂが、「ｒ＿ａ」で表示された、フォワード鎖の推定された元の配列と共に示されている。元の配列は、表６のルールを用いて推定されたものである。推定された元の配列がリードａと一致しないＣを有する位置は、シミュレートされた核酸試料がフォワード鎖中にメチル化シトシンを含んだ位置である。推定された元の配列がリードｂと一致しないＧを有する位置は、シミュレートされた核酸試料がリバース鎖中にメチル化シトシンを含んだ位置である。
【図１１Ａ】計算装置およびストレージである。（Ａ）いくつかの実施形態において、本発明は、ディスプレイ５７、キーボード５８、およびマウス５９から選択された少なくとも１つのユーザーインターフェースエレメント、ならびに、ストレージ５４（パネルＢ参照）、バスシステム５５、およびプロセッサ５６を含む少なくとも１つのコンピュータ５３を含む計算装置５２に操作可能に連結された配列決定装置５１に関する。
【図１１Ｂ】計算装置およびストレージである。（Ｂ）いくつかの実施形態において、本発明は、オペレーティングシステム６０、ユーザーインターフェースソフトウェア６１、およびプロセッシングソフトウェア６２を含むストレージ５４に関する。ストレージは、配列決定装置（図１１Ａにおける５１）から得られる配列データ６３をさらに含んでいてもよい。
【図１２】線状ペアロック分子を用いた、亜硫酸水素塩変換を利用する配列決定および５−メチルシトシンの位置決定に関する一般スキームである。５−メチルシトシンを含む二本鎖核酸試料が提供される（最上部）。線状ペアロック分子は、ヘアピンインサートを分子の一方の二本鎖末端へライゲートすることにより構築され（最初の矢印の下方、右側）、これにより、二本鎖試料のフォワード鎖およびリバース鎖がロックされることとなる。また、線状フラップが、他方の二本鎖末端に付着する（左側）。亜硫酸水素塩変換が実行されて、シトシンがウラシルに変換されるが、５−メチルシトシンは影響を受けないままである。分子は、線状ペアロック分子の３’末端に付着した線状フラップに結合するプライマーを提供すること、およびポリメラーゼによりプライマーを伸長させることによってコピーされる。末端が、例えば、制限消化により処理されて、後続のクローニングおよび／または配列決定のために分子が作製される。
【図１３】線状ペアロック分子を用いた、光化学的トランジションを利用する配列決定および５−メチルシトシンの位置決定に関する一般スキームである。５−メチルシトシンを含む二本鎖核酸試料が提供される（最上部）。線状ペアロック分子は、ヘアピンインサートを分子の一方の二本鎖末端へライゲートすることにより構築され（最初の矢印の下方、右側）、これにより、二本鎖試料のフォワード鎖およびリバース鎖がロックされることとなる。また、線状フラップが、他方の二本鎖末端に付着する（左側）。光化学的トランジションが実行されて、５−メチルシトシンがチミンに変換されるが、未修飾シトシンは影響を受けないままである。分子は、線状ペアロック分子の３’末端に付着した線状フラップに結合するプライマーを提供すること、およびポリメラーゼによりプライマーを伸長させることによってコピーされる。末端が、例えば、制限消化により処理されて、後続のクローニングおよび／または配列決定のために分子が作製される。
【図１４】環状ペアロック分子を用いた配列決定に関する一般スキームである。二本鎖核酸試料が提供される（最上部）。環状ペアロック分子は、ヘアピンインサートを分子の両方の二本鎖末端へライゲートすることにより構築され（最初の矢印の下方、右側および左側）、これにより、二本鎖試料のフォワード鎖およびリバース鎖がロックされることとなる。配列決定が実行され、その配列データが分析されて試料の配列が決定される。例えば、実施例５を参照されたい。
【図１５】亜硫酸水素塩変換および環状ペアロック分子を用いた、配列決定および５−メチルシトシンの位置決定に関する一般スキームである。５−メチルシトシンを含む二本鎖核酸試料が提供される（最上部）。環状ペアロック分子は、ヘアピンインサートを分子の両方の二本鎖末端へライゲートすることにより構築され（最初の矢印の下方、右側および左側）、これにより、二本鎖試料のフォワード鎖およびリバース鎖がロックされることとなる。亜硫酸水素塩変換が実行されて、シトシンがウラシルに変換されるが、５−メチルシトシンは影響を受けないままである。配列決定が実行され、その配列データが分析されて試料の配列および５−メチルシトシンの位置が決定される。例えば、実施例６を参照されたい。
【図１６】光化学的トランジションおよび環状ペアロック分子を用いた、配列決定および５−メチルシトシンの位置決定に関する一般スキームである。５−メチルシトシンを含む二本鎖核酸試料が提供される（最上部）。環状ペアロック分子は、ヘアピンインサートを分子の両方の二本鎖末端へライゲートすることにより構築され（最初の矢印の下方、右側および左側）、これにより、二本鎖試料のフォワード鎖およびリバース鎖がロックされることとなる。光化学的トランジションが実行されて、５−メチルシトシンがチミンに変換されるが、未修飾シトシンは影響を受けないままである。配列決定が実行され、その配列データが分析されて試料の配列および５−メチルシトシンの位置が決定される。例えば、実施例７を参照されたい。
【図１７】環状ペアロック分子を用いた、配列決定および５−ブロモウラシルの位置決定に関する一般スキームである。５−ブロモウラシルを含む二本鎖核酸試料が提供される（最上部）。環状ペアロック分子は、ヘアピンインサートを分子の両方の二本鎖末端へライゲートすることにより構築され（最初の矢印の下方、右側および左側）、これにより、二本鎖試料のフォワード鎖およびリバース鎖がロックされることとなる。配列決定が実行され、その配列データが分析されて試料の配列および５−ブロモウラシルの位置が決定される。例えば、実施例８を参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本発明の理解を助けるため、多数の用語を以下に定義する。本明細書において定義されない用語は、本発明に関する分野において通常の技術を有する者に普通に理解されるような意味を持つ。「１つの」および「その」などの用語は、単数の存在のみに言及することが意図されたものではなく、具体例が説明のために用いられ得る一般的な分類をも含む。本明細書中の専門用語は本発明の具体的な実施形態を説明するために用いられるが、特許請求の範囲に記載されている場合を除き、それらの使用が本発明の範囲を定めることはない。
【００２７】
核酸という用語は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む。
【００２８】
ハイブリダイゼーションの高ストリンジェンシー条件とは、２つの核酸が互いにハイブリダイズするための高度な相同性を備えるはずの条件をいう。ハイブリダイゼーションの高ストリンジェンシー条件の例は、６５℃または７０℃で、４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中におけるハイブリダイゼーション、あるいは、約４２℃または５０℃で、４×ＳＳＣおよび５０％ホルムアミド中におけるハイブリダイゼーションを含み、続いて６５℃または７０℃で、１×ＳＳＣ中における少なくとも１回、少なくとも２回、もしくは少なくとも３回の洗浄が行われる。
【００２９】
融解温度とは、溶液中の核酸の半分が融解された状態で存在し、半分が融解されていない状態で存在し、これにより十分な相補的核酸の存在が推測される温度をいう。相補配列に対して過剰に存在するオリゴヌクレオチドの場合、融解温度は、相補配列の半分がオリゴヌクレオチドとアニールされる温度である。ヘアピンを形成することのできる核酸インサートの場合は、融解温度は、インサートの半分が部分的に自己ハイブリダイズした「ヘアピン」形となる温度である。融解温度は条件に依存的であるため、ここに述べられるオリゴヌクレオチドの融解温度とは、５０ｍＭの塩化ナトリウムの水溶液中、オリゴヌクレオチドが０．５μＭのときの融解温度のことをいう。融解温度は、当該分野で知られる各種方法、例えば、アラウィ（Ａｌｌａｗｉ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），３６，１０５８１−１０５９４（１９９７）において見出された最隣接熱力学的パラメータを標準的な熱力学方程式と共に用いることによって、推定することができる。
【００３０】
核酸分子における部位は、それが核酸分子中でユニーク配列を有し、かつ相補的なオリゴヌクレオチドが許容される融解温度、例えば、４５℃から７０℃、５０℃から７０℃、４５℃から６５℃、５０℃から６５℃、５５℃から７０ ℃、６０℃から７０℃、５５℃から６０℃、６０℃から６５℃、または５０℃から５５℃の融解温度を有するような長さおよび組成である場合に、プライマーの結合に適している。
【００３１】
プライマー、オリゴヌクレオチド、または核酸を伸長させるとは、少なくとも１つのヌクレオチドをプライマー、オリゴヌクレオチド、または核酸に加えることをいう。これには、ポリメラーゼまたはリガーゼ活性により触媒される反応が含まれる。
【００３２】
配列決定プライマーは、配列データを産出することとなるように、プライマーの結合に適した核酸分子中の部位に結合でき、かつ配列決定反応において伸長され得るオリゴヌクレオチドである。
【００３３】
核酸インサートは、それが部分的に自己ハイブリダイズでき、かつその自己ハイブリダイズした形態が少なくとも１５℃の融解温度を有する場合、ヘアピンを形成することができる。
【００３４】
オーバーハングは、二本鎖核酸分子またはヘアピンの末端における一本鎖のセグメントである。
【００３５】
リピートまたはリピート配列は、核酸中に複数回現れる配列のことである。核酸分子中にリピートが存在する場合、最初の例を含む全ての配列の例がリピートであると見なされる。リピートは、環状ペアロック分子中に現れるような、互いに逆相補配列である配列を含む。リピートはまた、全く同じではないが、同一の配列から派生した配列、例えば、合成時における誤取り込みの事象もしくはその他のポリメラーゼのエラーのために異なる配列、または初めは同じであったもしくは完全な逆相補配列であったが、例えば、光化学的トランジションもしくは亜硫酸水素塩処理のような手段による修飾のために異なる配列をも含む。
【００３６】
核酸インサートおよび核酸試料は、インサートと試料との間に他の介在するインサートまたは試料のリピートがない場合は、互いにすぐ上流または下流にある。一本鎖分子において、上流とは５’方向のことを指し、下流とは３’方向のことを指す。二本鎖分子において、極性は任意に決定され得る、またはプロモーター、コード配列などのような方向要素の大半が同じ方向を向く場合、かかる要素の極性にしたがって決定され得る。プロモーターの極性とは、ＲＮＡポリメラーゼの合成を開始する方向が下流に向かうことである。コード配列の極性とは、開始から終止コドンへの方向が下流に向かうことである。
【００３７】
２つのリピートは、それらが互いの逆相補配列である、または一方もしくは両方が互いの逆相補配列の派生配列である場合、互いに対してフォワード方向およびリバース方向となると共に、反対の向きを持つ。どのリピートがフォワードであると見なされるかは、前の段落で述べたように、任意とすることができる、またはリピート中の要素の極性にしたがって決定され得る。
【００３８】
修飾塩基とは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、またはウラシル以外の塩基であって、核酸またはヌクレオチド中に、前述した塩基のうちの１つまたはそれ以上の代わりに含まれ得るものである。
【００３９】
多義性コードとは、表示された塩基のいずれかが現れ得るという意味で、配列における塩基の組み合わせを表すコード、例えば、Ｙ＝ピリミジン（Ｃ、Ｕ、またはＴ）、Ｒ＝プリン（ＡまたはＧ）、Ｗ＝弱（Ａ、Ｔ、またはＵ）、Ｓ＝強（ＧまたはＣ）、Ｋ＝ケト（Ｔ、Ｕ、またはＧ）、Ｍ＝アミノ（ＣまたはＡ）、Ｄ＝Ｃではない（Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＵ）、Ｖ＝ＴまたはＵではない（Ａ、Ｃ、またはＧ）、Ｈ＝Ｇではない（Ａ、Ｃ、Ｔ、またはＵ）、Ｂ＝Ａではない（Ｃ、Ｇ、Ｔ、またはＵ）である。
【００４０】
位置特異的重み行列とは、行が核酸配列中の位置に対応し、列が塩基に対応している、またはその逆の行列のことであり、行列中の各要素は、特定の位置における特定の塩基の重みである。配列は、該配列の各塩基に対応する重みを合計することにより、位置特異的重み行列に対してスコアリングされ得る。例えば、配列がＡＣＧである場合、そのスコアは、行列の第１の列におけるＡの重み、第２の列におけるＣの重み、および第３の列におけるＧの重みの合計となり、位置に対応した列が推測されることとなる。位置特異的重み行列は、行列における位置の数よりも大きい長さを持つ配列上に、行列に対し配列を繰り返してスコアリングすることにより実行することができ、該行列においては、各ランで開始位置が１位置ずつ増える。このような方法で、行列に対して最大または最小のスコアを生み出す配列中の位置が特定され得る。
【００４１】
ストレージとは、コンピュータによるアクセス可能なデジタル情報の収納場所である。それは、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ハードドライブ、不揮発性固体メモリ、光ディスク、磁気ディスク、およびこれらの均等物を含む。
【００４２】
データ構造とは、データを含むストレージ内のオブジェクトまたは変数のことである。データ構造は、スカラーデータ（例えば、個々の文字、数、または文字列）、スカラーデータの集合（例えば、スカラーの行列または配列）、または再帰的な集合（例えば、サブリスト、行列、配列、および／またはスカラーを要素として含む多次元的なものであり得るリストであって、該サブリストそれら自体がサブリスト、行列、配列、および／またはスカラーを要素として含むことのできる、リスト）を含んでいてよい。
【００４３】
核酸試料
本発明の方法は、核酸試料の配列を決定すること、および／または、核酸試料中の修飾塩基の位置を決定することを含む。「核酸試料」という用語は、その配列および／または修飾塩基の位置が本発明の方法において決定されることとなる核酸のことをいう。
【００４４】
核酸試料は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｔＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、および染色体外もしくは細胞外ＤＮＡを含むが、これらに限定されるものではない）またはＲＮＡ（ｍＲＮＡ、一次転写物ＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびｓｎｏＲＮＡを含むが、これらに限定されるものではない）を含む起源から得ることができるが、これらに限定されるものではない。核酸試料は、個人、患者、検体、細胞培養物、生体膜、器官、組織、細胞、胞子、動物、植物、真菌、原生生物、細菌、古細菌、ウィルス、またはビリオンからのものであってよい。いくつかの実施形態において、核酸試料は、例えば、土壌または水域からの環境試料として得られる。核酸試料は、核酸が細胞性、細胞外性、またはウィルス性のものであるかどうかの明確な知識なしに環境試料として得ることができる。さらに、核酸は、合成、組換え、または天然の核酸が酵素、例えば、メチルトランスフェラーゼにより修飾される反応を含む化学または酵素反応から得ることができる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、核酸試料は、例えば、上に挙げたうちの１種のような起源に処理を施した試料である。例えば、単離された核酸は、超音波処理もしくは狭い開口を通すピペット操作によるような、せん断、または制限エンドヌクレアーゼであり得るエンドヌクレアーゼを用いるような酵素消化によって断片化することができる。いくつかの実施形態において、核酸試料は、少なくとも１つのオーバーハングを有する。単離された核酸は、まず、例えば、細菌もしくは酵母人工染色体、ミニ染色体、プラスミド、コスミド、染色体外要素、または染色体に組み込まれた構築物のような宿主細胞および／またはベクター中でクローン化または増殖され得る。
【００４６】
環状核酸分子の提供
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、核酸インサートおよび核酸試料を含むインサート−試料ユニットを含む環状核酸分子を提供することを含み、このうち、該インサートは、既知の配列を有している。環状核酸分子は、一本または二本鎖であってよい。
【００４７】
いくつかの実施形態において、環状核酸分子は、その配列の一部が既知であるために核酸インサートとなり得る場合（例えば、該環状分子中に含まれる遺伝子の配列内の保存モチーフが既知であるかもしれないし、あるいは、該分子が、高ストリンジェンシー条件下で既知の配列を有する別の核酸にハイブリダイズするその能力に基づく配列を含むことが知られているかもしれない）、それをその起源から環状の形で単離することによって提供される。いくつかの実施形態において、配列の情報がストリンジェントなハイブリダイゼーションの特性から導かれる場合であれば、核酸インサートの配列は不正確にしか分からない。いくつかの実施形態において、環状核酸分子が既知のバックボーン配列を有する、または既知の配列を含むように操作されている場合であれば、核酸インサートの配列は正確に分かる。
【００４８】
いくつかの実施形態において、環状核酸分子は、核酸インサートと共に核酸試料を環状分子へ取り込むための１回のインビトロ反応または複数の反応を行うことにより提供される。１回のインビトロ反応または複数の反応は、いくつかの実施形態では、リガーゼによるライゲーションおよび／またはリコンビナーゼおよびトポイソメラーゼを含む各種酵素により触媒され得るようなその他の鎖結合反応を含み得る。ＤＮＡリガーゼまたはＲＮＡリガーゼは、アダプター分子またはリンカーを用いて、または用いずに、線状鋳型の両端を酵素的に連結して円を形成するのに用いることができる。例えば、テッシエール（Ｔｅｓｓｉｅｒ）ら、アナーレン・デア・バイオヘミー（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ），１５８：１７１−７８（１９８６）に記述されているように、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを連結する。また、ＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（登録商標）（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、マジソン、ウィスコンシン州）は一本鎖核酸のライゲーションを触媒するのにも用いられ得る。あるいは、大腸菌またはＴ４  ＤＮＡリガーゼのような二本鎖リガーゼは、環状化反応を行うのに用いることが可能である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、環状核酸分子を提供することは、相補領域を含むプライマー（それは、核酸インサートとなり得る既知の配列を持つ５’フラップを有するランダムプライマーであってよい）で核酸鋳型を増幅すること、およびリガーゼまたはリコンビナーゼにより触媒され得るような、増幅された核酸を環状化することを含む。増幅された核酸は、いくつかの実施形態において、環状化に先立ち、例えば、制限またはリン酸化反応により、その末端が処理されてもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態において、環状核酸分子は、化学的な環状化を行うことによって提供される。化学的手法では、ＢｒＣＮとイミダゾールおよび二価金属、Ｎ−シアノイミダゾールとＺｎＣｌ２、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３エチルカルボジイミド塩酸塩、ならびにその他のカルボジイミド類およびカルボニルジイミダゾール類のような周知のカップリング剤を用いる。線状鋳型の末端は、５’−ホスフェートおよび３’−ヒドロキシル、または５’−ヒドロキシルおよび３’−ホスフェートを縮合することによっても連結され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、環状核酸分子は、環状ペアロック分子（ｃＰＬＭ）である。このタイプの分子が以下に詳細に述べられる。
【００５２】
核酸試料のフォワードリピートおよびリバースリピートの提供；環状ペアロック分子
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、核酸試料のフォワードリピートおよびリバースリピートを提供すること、ならびにフォワード鎖およびリバース鎖をロックしてｃＰＬＭを形成することを含む。ｃＰＬＭの一般構造が図３Ａに示されている。ｃＰＬＭは、核酸試料のフォワードリピートおよびリバースリピートを含む一本鎖の環状核酸分子である。図３Ａに示されるように、リピートは核酸インサートに囲まれている。核酸インサートは、同じであっても同じでなくてもよい。いくつかの実施形態において、インサートは、少なくとも５０ｎｔまたは少なくとも１００ｎｔの長さを有する。いくつかの実施形態において、インサートは、５０または１００ｎｔから１００００または５００００ｎｔの長さを有する。
【００５３】
線状二本鎖核酸試料の鎖が、例えば、ヘアピンを形成する核酸インサートを分子の各末端にライゲートすることによりロックされ、ｃＰＬＭが形成され得る。いくつかの実施形態において、ヘアピンを形成する核酸インサートは、少なくとも２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃の融解温度を有する。ライゲーションは、平滑末端または粘着末端ライゲーションとすることができる。ヘアピン構造は、塩基対ステム領域および不対ループ領域を有する。いくつかの実施形態において、インサート核酸は、少なくとも２０、２２、２５、３０、または３５ヌクレオチドのサイズのループ領域を含む。いくつかの実施形態において、このループ領域は、プライマーの結合に適している。いくつかの実施形態において、ループ領域は、少なくとも４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃の融解温度でプライマーを結合させる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、核酸試料は、制限酵素を用いて異なる制限部位を消化することにより生成され得るような異なる粘着末端を含み、これらの異なる粘着末端は、異なる核酸インサートのライゲーションを促進する。いくつかの実施形態において、このような方法で変換されることとなる二本鎖核酸は、既知の配列を持つ５’フラップを含むランダムプライマーを、所望の試料の配列を含む鋳型に沿って伸長させることにより得ることができる。
【００５５】
二本鎖核酸の鎖は、二本鎖の末端をヘアピンに変換する酵素、例えば、二本鎖分子のうちの一方の鎖とホスホチロシン結合を形成し、これに続いて他方の鎖によるホスホチロシン結合への求核攻撃によりヘアピン形成が行われるようにするリコンビナーゼを用いる処理によりロックされてｃＰＬＭを形成することができる。λインテグラーゼおよびＦｌｐリコンビナーゼのようなファミリーのメンバーは、かかるリコンビナーゼの例である。例えば、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）６９，６４７−６５８（１９９２）；ロス（Ｒｏｔｈ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）９０，１０７８８−１０７９２（１９９３）を参照されたい。いくつかの実施形態において、核酸試料は、二本鎖の末端をヘアピンに変換する酵素に対する認識配列を含む。いくつかの実施形態において、二本鎖の末端をヘアピンに変換する酵素に対する認識配列は、例えば、ライゲーションによって核酸試料に付加される。
【００５６】
いくつかの実施形態において、試料核酸は、最初は、一本鎖の形式で得られ、そして、ｃＰＬＭの形成に先立ち、二本鎖の形式に変換される。これは、例えば、オーバーハングを有するヘアピンを試料核酸の３’末端にライゲートしてから、ライゲートされたヘアピンの３’末端から伸長させて相補鎖を合成することにより達成され得る。次いで、第２のヘアピンが該分子につなげられ、ｃＰＬＭが形成され得る。
【００５７】
核酸インサート
本発明の方法は、少なくとも１つの核酸インサートを含んでいる、ｃＰＬＭｓを含む環状核酸分子を提供および／または使用することを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸インサートは、上に述べたように、部分的に、不正確に、または完全に分かっている配列を有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸インサートの配列は完全に分かっている。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸インサートは、配列決定プライマーを含むオリゴヌクレオチドに適した結合部位を含んでいる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのインサート核酸は、ヘアピンを形成する。
【００５８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸インサートは、１０から３００、１５から２５０、３０から２００、または３０から１００ヌクレオチド残基の長さを有する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸インサートは、４５ ℃から７０℃または５０℃から６５℃の融解温度を有する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸インサートは、プロモーター、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。例えば、グオ（Ｇｕｏ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）２８０，１４９５６−１４９６１（２００５）を参照されたい。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ合成を開始する部位として認識される。さらなるプロモーターも当該分野において知られている。
【００６０】
インサート−試料ユニット
本発明の方法において用いられる環状核酸分子は、少なくとも１組のインサート−試料ユニットとしてグループ化される少なくとも１つの核酸試料および少なくとも１つの核酸インサートを含む。インサート−試料ユニットは、核酸インサートが核酸試料のすぐ上流または下流にある核酸のセグメントである。
【００６１】
いくつかの実施形態において、環状核酸分子はｃＰＬＭであり、それは２組のインサート−試料ユニットを含む。これら２つのユニットにおける核酸試料は、互いに反対の向きとなっている、つまり、一方が核酸試料のフォワードリピートであり、他方がリバースリピートである。ｃＰＬＭが、インサートが試料の上流または下流のいずれかにくる２組のインサート−試料ユニットを含むものだと見なされ得ることに留意しなければならない、すなわち、図３Ｂに示される構造にしたがったｃＰＬＭは、要素１１（フォワードリピート）、１４（インサート）、１２（リバースリピート）、および１３（インサート）をこの順で含み、１３がまた１１につながって円を閉じる。インサート−試料ユニットが１１と１４および１２と１３からなるものと見なされるか、または１３と１１および１４と１２からなるものと見なされるかにかかわらず、分子は２組のインサート−試料ユニットを含む。試料に対するインサートの方向および／またはその位置決めが機能上重要である。例えば、インサートがプロモーターまたはプライマー結合部位を含む実施形態では、インサートと、プライマー結合部位またはプロモーターが向かう方向にある試料、つまり、プライマー結合部位またはプロモーターから開始するポリメラーゼによって最初にコピーされることとなる試料とがグループ化されるように、インサート−試料ユニットをグループ化することが最も有効であり得る。
【００６２】
配列データの獲得
配列決定法
本発明の方法は配列データを得ることを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２組のインサート試料ユニットを含む核酸分子が配列データを得るステップにおいて生成される。いくつかの実施形態において、少なくとも２組のインサート試料ユニットを含む核酸分子は、提供された環状核酸分子からそれを合成することによって生成され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも２組のインサート試料ユニットを含む核酸分子は、提供された環状核酸分子を変化させることにより、例えば、環状核酸分子を線状核酸分子に変換することにより生成することができ、いくつかの実施形態ではそれは一本鎖であってよい。いくつかの実施形態において、提供された環状核酸分子またはその鋳型合成生成物であり得る核酸分子中の少なくとも１つのホスホジエステル結合が、配列データを得るステップにおいては形成または切断される。
【００６３】
いくつかの実施形態において、配列データは合成法による配列決定を用いて得られる。いくつかの実施形態において、配列データは、単一分子配列決定法を用いて得られる。いくつかの実施形態において、単一分子配列決定法は、パイロシークエンシング、可逆的ターミネーターシークエンシング、ライゲーションシークエンシング、ナノポアシークエンシング、および第三世代シークエンシングから選ばれる。
【００６４】
いくつかの実施形態において、配列データは、大量配列決定法、例えば、サンガー配列決定法またはマクサム・ギルバート配列決定法を用いて得られる。
【００６５】
単一分子配列決定法は、単一の核酸分子が配列決定の手順の一部として単離されるかどうかによって、大量配列決定法と区別される。核酸分子は一本鎖または二本鎖であってよい。２本のアニールされた核酸鎖は、この目的のために単一分子と見なされる。単一分子の単離は、光学的に分解可能な方法による顕微鏡スライドのような基板への直接もしくは間接的な付着によって、ナノポアを用いマイクロウェル中で、または配列データが個々の分子から得られるようなその他の任意の方式で、生じ得る。間接的な付着では、単一分子は、単一分子に結合する連結構造、例えば、タンパク質またはオリゴヌクレオチドを介して基板に付着する。特に、単一分子が単離されてから増幅され、かつ配列データがその増幅産物（複数の増幅産物）から直接得られる方法は、単一分子が単離されて配列データの最重要な起源となっているため、依然として単一分子法と見なされる。（対照的に、大量配列決定法では、多数の分子を含む核酸試料が用いられ、かつ多数の分子から発せられたシグナルを含むデータが得られる。)。いくつかの実施形態において、単一分子配列決定が行われ、このうち冗長配列が同一分子から得られる。冗長配列は、分子内の少なくとも２つのダイレクトもしくは逆方向リピートについて配列決定をすることによって、または分子の同じセグメントについて複数回配列決定をすることによって得ることができる。冗長配列は、完全に冗長であっても、例えば、特定タイプの塩基の塩基対合特異性の変化により導かれる相違のため、または配列決定プロセスにおいて起こり得るエラーのため、いくらかの変化を伴って部分的に冗長であってもよい。いくつかの実施形態において、塩基対合特異性の変化は、配列決定より前に起こり得る。いくつかの実施形態においては、同一分子が多数回配列決定され、任意で、繰り返す配列決定の間に現れる特定タイプの塩基の塩基対合特異性を選択的に変化させる中間の処理を伴う。
【００６６】
標識されたジデオキシ鎖ターミネーターを用いることを含むサンガー配列決定法は、当該分野においてよく知られている。例えば、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）７４，５４６３−５４６７（１９９７）を参照されたい。核酸試料の断片に対して多数回の部分的な化学分解反応を行い、続いて断片の検出および分析を行って配列を推定することを含むマクサム・ギルバート配列決定法も、当該分野においてよく知られている。例えば、マクサム（Ｍａｘａｍ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）７４，５６０−５６４（１９７７）を参照されたい。別の大量配列決定法は、ハイブリダイゼーションによる配列決定であり、それにおいては、試料の配列が、例えばマイクロ配列または遺伝子チップ上で、複数の配列に対するそのハイブリダイゼーションの特性に基づいて推定される。例えば、ドラマナック（Ｄｒｍａｎａｃ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）１６，５４−５８（１９９８）を参照されたい。
【００６７】
単一分子配列決定法は、例えば、カトウ（Ｋａｔｏ）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・メディスン（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ）２，１９３−２０２（２００９）およびその中の参照文献において全般的に論じられている。
【００６８】
パイロシークエンシング、可逆的ターミネーターシークエンシング、およびライゲーションシークエンシングは、第二世代の配列決定法であると見なされている。通常、これらの方法は、単一分子から生成される増幅産物を用い、それらは他の分子から生成される増幅産物とは空間的に分離されたものである。空間的な分離は、エマルジョン、ピコリットルのウェルを用いることにより、またはスライドガラスへの付着により実施することができる。配列情報は、ヌクレオチドの取り込みにおける蛍光によって得られる。データを得た後、新たに取り込まれたヌクレオチドの蛍光は取り除かれ、そのプロセスが次のヌクレオチドについて繰り返される。
【００６９】
パイロシークエンシングでは、重合反応により放出されるピロリン酸イオンがＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン５’ホスホ硫酸と反応してＡＴＰを生成する。次いで、ＡＴＰがルシフェラーゼによりルシフェリンのオキシルシフェリンと光への変換を促す。蛍光は過渡的なものであるため、蛍光を除去するための分離のステップはこの方法では必要ない。一度に１種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が加えられ、どのｄＮＴＰが反応部位で有効なシグナルを生じるかに基づいて配列情報が判別される。市販されているロシェ（Ｒｏｃｈｅ）ＧＳ  ＦＬＸの機器では、この方法を用いて配列が得られる。この技術およびその応用は、例えば、ロナギ（Ｒｏｎａｇｈｉ）ら、アナーレン・デア・バイオヘミー（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）２４２，８４−８９（１９９６）およびマルグリース（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４３７，３７６−３８０（２００５）（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）４４１，１２０（２００６）の誤植）に詳細に述べられている。
【００７０】
可逆的ターミネーターシークエンシングでは、保護基の存在のために可逆的鎖ターミネーターとなる蛍光色素標識ヌクレオチド類似体が、単一塩基伸長反応に取り込まれる。塩基の同一性は蛍光色素分子により決定される。換言すれば、各塩基は異なる蛍光色素分子とそれぞれ対になる。蛍光／配列データが得られた後、蛍光色素分子および保護基が化学的に除去され、そして、そのサイクルが配列情報の次の塩基を得るために繰り返される。イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）ＧＡの機器は、この方法により作動する。この技術およびその応用は、例えば、ルパレル（Ｒｕｐａｒｅｌ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）１０２，５９３２−５９３７（２００５）、およびハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）３２０，１０６−１０９（２００８）に詳細に述べられている。
【００７１】
ライゲーションシークエンシングでは、リガーゼ酵素が、オーバーハングを持つ部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドを配列決定される核酸に連結するのに用いられ、それはオーバーハングを有する。ライゲーションが起こるようにするためには、それらオーバーハングは相補的でなければならない。部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドのオーバーハング中の塩基は、部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされた蛍光色素分子および／または部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチドの他の部分にハイブリダイズする二次的なオリゴヌクレオチドに基づいて同定され得る。蛍光データの獲得後、ライゲートされた複合体は、（部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド中に含まれていた）その認識部位から一定の距離をおいた部位で切断する、例えば、ＩＩｓ型制限酵素、例としてＢｂｖＩにより、ライゲーション部位の上流が切断される。この切断反応は前のオーバーハングのすぐ上流に新たなオーバーハングを露呈させ、そして、該プロセスが繰り返される。この技術およびその応用は、例えば、ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）１８，６３０−６３４（２０００）に詳細に述べられている。いくつかの実施形態において、ライゲーションシークエンシングは、環状核酸分子のローリングサークル型増幅産物を得ること、および該ローリングサークル型増幅産物をライゲーションシークエンシングの鋳型として用いることにより、本発明の方法に適するようになる。
【００７２】
ナノポアシークエンシングでは、例えば、電気泳動の駆動力を利用して一本鎖核酸分子にポアを通過させ、そして、一本鎖核酸分子がポアを通過するときに得られるデータを分析することによって配列が推定される。該データは、イオン電流データであり得、各塩基は、例えば、ポアを通過する電流を部分的にブロックすることによって、差異があり、区別可能な程度に電流を変化させる。
【００７３】
第三世代シークエンシングにおいては、多数の小さな（〜５０ｎｍ）孔を持つアルミニウム膜を備えたスライドが、ゼロモード導波管として用いられる（例えば、レヴィン（Ｌｅｖｅｎｅ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２９９，６８２−６８６（２００３）を参照されたい）。そのアルミニウム表面は、ポリホスホネートの化学的性質、例えば、ポリビニルホスホネートの化学的性質によって、ＤＮＡポリメラーゼの付着から保護される（例えば、コルラック（Ｋｏｒｌａｃｈ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）１０５，１１７６−１１８１（２００８）を参照されたい）。このことは、アルミニウム膜の孔内において露出しているシリカへのＤＮＡポリメラーゼ分子の優先的な付着をもたらす。この構成により、エバネッセント波の現象が蛍光バックグラウンドを減少させるべく利用されることとなり、これによってより高濃度の蛍光標識ｄＮＴＰｓの使用が可能となる。蛍光色素分子はｄＮＴＰの末端ホスフェートに付着し、これによりｄＮＴＰの取り込みにおいて、蛍光が放出されるが、蛍光色素分子は新たに取り込まれたヌクレオチドに付着したままではなく、つまり、その複合体はすぐに再度の取り込みができる状態になる。この方法によると、アルミニウム膜の孔内に存在する個々のプライマー−鋳型複合体へのｄＮＴＰｓの取り込みを検出することができる。例えば、エイド（Ｅｉｄ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）３２３，１３３−１３８（２００９）を参照されたい。
【００７４】
配列決定鋳型；得られる配列決定データの量
いくつかの実施形態において、配列データは環状核酸分子から、つまり環状核酸分子を鋳型として用いることにより、直接得られる。鋳型として用いられる環状核酸分子は、環状ペアロック分子であってよい。いくつかの実施形態において、配列データは、それ自体が環状核酸分子を鋳型として用いて合成されたものである生成物核酸分子から得られる。つまり、配列データが得られる鋳型は、環状核酸分子鋳型から合成された生成物核酸分子であり得る。いくつかの実施形態において、配列データは、環状核酸分子鋳型、および環状核酸分子鋳型より合成された生成物の核酸分子の両方から得られる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、環状核酸分子を鋳型として用いて、少なくとも２組のインサート−試料ユニットを含む生成物核酸分子を合成することを含むローリングサークル型増幅が行われる。いくつかの実施形態において、ローリングサークル型増幅は、少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００組のインサート−試料ユニットを含む生成物核酸分子を合成することを含む。多数の鋳型のコピーを生成するためのローリングサークル型増幅の使用は、当該分野において、よく知られている。例えば、ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）２６４，８９３５−８９４０（１９８９）およびバナー（Ｂａｎｅｒ）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ）２６，５０７３−５０７８（１９９８）を参照されたい。ローリングサークル型増幅は、環状核酸分子が配列決定鋳型である配列決定の一部として、または配列決定鋳型として用いられることとなる生成物核酸分子を合成するために、行われ得る。
【００７６】
鋳型にかかわらず、本発明の方法により得られる配列データは、少なくとも２つの核酸試料配列のリピートを含む。これら少なくとも２つのリピートは、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの核酸試料配列のフォワードリピートおよび少なくとも１つの核酸試料配列のリバースリピートを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、配列データは、少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００の核酸試料配列のリピートを含む。いくつかの実施形態において、配列データは、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００の核酸試料配列のフォワードリピートを含む。いくつかの実施形態において、配列データは、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００の核酸試料配列のリバースリピートを含む。いくつかの実施形態において、配列データは、核酸試料配列のフォワードリピートおよびリバースリピートをそれぞれ少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００含む。
【００７７】
スコアの計算
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、配列データにおける少なくとも２つのインサートの配列のスコアを、その配列をインサートの既知の配列と比較することによって計算することを含む。インサートの配列が部分的または不正確にのみ分かっている実施形態においては、核酸インサートの既知の配列は、例えば、多義性コードまたは位置特異的重み行列の使用によって、不明確なまたは未知の位置を含み得る。
【００７８】
配列をインサートの既知の配列と比較することは、配列データ中の少なくとも２つのインサートの配列を識別することを含む。配列を識別することは、いくつかの実施形態では、目視検査によって、つまり人が配列データを目視で調べ、かつそこに含まれるインサート核酸の配列を見分けることにより、またはコンピュータ支援のアライメント法により、行われ得る。例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２００９／０１７６７８号パンフレットを参照されたい。いくつかの実施形態において、配列を識別することは、配列を認識するアルゴリズムを用いて配列データを走査することにより、例えば、核酸インサートの既知の配列に最も密接に対応する局所的極値を識別するために、配列データ内の多数の位置について繰り返して、または、発見的学習法によって、スコアを計算することにより、行うことができる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの核酸インサートの配列を識別することは、スコアを計算するのと同時に行われ、両方のプロセスは同じスコアを使用することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態において、スコアを計算することは、適したアライメントアルゴリズムを用いてアライメントを実行することを含み、その多くが当該分野において知られ、かつ容易に利用可能であり、例えば、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）、メガブラスト（ＭＥＧＡＢＬＡＳＴ）、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アライメント、およびニードルマン−ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ）アライメントである。例えば、アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ）２１５，４０３−４１０（１９９０）を参照されたい。適したアライメントアルゴリズムには、ギャップを許すアルゴリズムとギャップを許さないアルゴリズムの両方が含まれる。あるいは、いくつかの実施形態において、スコアを計算することは、配列について位置特異的重み行列を実行し、かつその配列に対応する行列の要素の合計を計算するようなアルゴリズムを用いて配列を分析することを含む。このようにして、スコアが、段階的な方式で行列を配列リードに適用することにより得られた極大値として計算され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、スコアは、既知の配列に対する少なくとも２つの核酸インサートの配列の近さと正の相関関係がある（例えば、最大可能スコアは完全な一致の結果生じる）。かかる正の相関関係があるスコアは、同一性パーセント、ビットスコア、およびマッチング塩基カウントを含むが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
いくつかの実施形態において、スコアは、既知の配列に対する少なくとも２つの核酸インサートの配列の近さと逆の相関関係がある（例えば、最小可能スコアは完全な一致の結果生じる）。かかる負の相関関係があるスコアは、ｅ−値、ミスマッチの数、ミスマッチおよびギャップの数、ミスマッチのパーセント、ならびにミスマッチ／ギャップのパーセントを含むが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
いくつかの実施形態において、スコアは、比率ベースで計算される。比率ベースで計算されるスコアの可能な範囲は、比較される配列の長さに応じて変化しない。比率ベースで計算されるスコアの例は、同一性パーセントおよびミスマッチ／ギャップのパーセントを含むが、これらに限定されるものではない。
【００８３】
いくつかの実施形態において、スコアはカウントベースで計算される。カウントベースで計算されるスコアの可能な範囲は、比較される配列の長さに応じて変化する。カウントベースで計算されるスコアの例は、ビットスコア、ミスマッチの数、ミスマッチおよびギャップの数、ならびにマッチング塩基カウントを含むが、これらに限定されるものではない。
【００８４】
核酸試料の配列のリピートの受け入れまたは拒否；受け入れられた配列セット
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、核酸試料の配列のリピートのすぐ上流および下流にあるインサートの配列の一方または両方のスコアにしたがって、配列データ中の核酸試料の配列のリピートを受け入れるか、あるいは拒否することを含む。よって、各種の実施形態において、すぐ上流およびすぐ下流の核酸インサート両方のスコア、いずれか一方のスコア、または一方もしくは他方のスコアは、配列データ中の核酸試料の配列を受け入れるか、あるいは拒否するかを決定するのに用いられる。
【００８５】
スコアが既知の配列に対する少なくとも２つの核酸インサートの配列の近さと正の相関関係がある実施形態において、配列を受け入れるためにはスコアは閾値よりも大きいまたはそれ以上であることが要求される。適した閾値の選択は、用いられるスコアのタイプ、配列決定のエラー率、ならびに時間および冗長度の検討事項を含む多数の要因によってなされる。
【００８６】
核酸試料の配列のリピートを受け入れることおよび拒否することは、核酸試料の配列を決定するべく、少なくとも１つの受け入れられたリピートが用いられ、かついずれの拒否されたリピートも用いられないことになるような各種方法により実行され得る。リピートを受け入れることおよび拒否することは、受け入れられた配列セットをコンパイルすることと協調的な方式で行われても、または行われなくてもよい。例えば、受け入れられたリピートの配列は、受け入れられた配列セットとなる新たなデータ構造にそれらが受け入れられるときにコピーされ得る。あるいは、拒否されたリピートの配列は、それらが拒否されるときに消去または上書きされ得る（例えば、ヌルまたは排除データを表す「０」または「Ｘ」の文字で）。この場合において、拒否された配列が一旦消去または上書きされると、元のデータ構造は、受け入れられたデータセットとなるように修正される。これらの例では、リピートを受け入れるおよび拒否することが、受け入れられた配列セットをコンパイルすることと協調的な方式で行われるものと見なされる。
【００８７】
いくつかの実施形態において、核酸試料の配列のリピートは、核酸試料の配列の他のリピートの長さから逸脱する長さを持つといったような、さらなる根拠に基づいて、拒否され得る（例えば、図７Ｂを参照されたい）。例えば、核酸試料の配列のリピートは、それが、他の核酸試料の配列の、または上述したような核酸試料の配列のリピートのすぐ上流および下流にあるインサートの配列のうち一方もしくは両方のスコアに基づいて受け入れられた核酸試料の配列のリピートを含むものであって、中央値または平均の長さの計算のために一時的に除かれる拒否の可能性が検討されている核酸試料の配列のリピートを有していても有していなくてもよい受け入れられた配列セットの仮バージョンの、平均または中央値の長さからの閾値の範囲にそれる場合に、拒否され得る。閾値の範囲は、絶対的な長さ、例えば、１、２、５、１０、２０、もしくは５０ヌクレオチドで、相対的な長さ、例えば１％、２％、５％、１０％、２０％、もしくは５０％で、または標準偏差のような統計的尺度、例えば、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、もしくは５の標準偏差で表すことができる。
【００８８】
あるいは、配列は、受け入れられたまたは拒否されたものとしてフラッギングされ、次いで、そのフラッギングプロセスが完了した後、受け入れられた配列が新たなデータ構造中にコピーされ、または拒否された配列が消去もしくは上書きされて、協調的でない方式で受け入れられた配列セットが生成され得る。
【００８９】
受け入れられた配列セットは、核酸試料の配列の少なくとも１つの受け入れられたリピートおよび連結された形式の任意のさらなる受け入れられたリピートを含む単一のデータ文字列、ならびに各要素が核酸試料の配列の受け入れられたリピートまたはそのサブパートを表す多要素変数を含む形式から選ばれ得る。いくつかの実施形態において、多要素変数は、リスト、配列、ハッシュ、および行列から選ばれる。核酸試料の配列の少なくとも１つの受け入れられたリピートの保存、およびそれに続く核酸試料の配列の決定を可能とするいかなる形式のデータ構造も、使用に適している。
【００９０】
受け入れられた配列セットの形式が生配列データの形式とは異なる（例えば、生配列データが文字列の形式をとり、受け入れられた配列セットが配列のような多要素データ構造の形式をとる）実施形態では、生配列データは、リピート、インサート−試料ユニット、または当該方法における生配列データが得られた後および最後の受け入れられた配列セットが生成される前の時点で両側にすぐ上流および下流のインサートが位置する試料のリピートを含む要素に解析され得る。この解析のステップは、上に述べたスコアリングステップの前または後に生じるものとすることができる。
【００９１】
核酸試料の配列の決定；共通配列；信頼度
いくつかの実施形態において、当該方法は、核酸試料の配列を決定することを含む。
【００９２】
核酸試料の配列を決定する方式は、条件付きで、受け入れられた配列セット中の核酸試料のリピートの数を基に選ぶことができる。例えば、受け入れられた配列セットが１つの受け入れられたリピートのみを含む場合、核酸試料の配列は、受け入れられたリピートの配列であると決定され得る。受け入れられた配列セットが２つのみ、または少なくとも３つの受け入れられたリピートを含む場合、核酸試料の配列は、受け入れられたリピートの共通配列（下記参照）であると決定され得る。受け入れられた配列セットが少なくとも３つの受け入れられたリピートを含む場合は、共通配列がどのように決定されるかについて、より多くの選択肢がある。
【００９３】
共通配列
共通配列は、受け入れられたリピートのアライメント（「スコアの計算」のセクションにおいて上に述べたように実行される）から決定される。受け入れられたリピートが同一の塩基を含むアライメント中の位置において、共通配列はその塩基を含む。いくつかの実施形態では、受け入れられたリピートが同一の塩基を含まないアライメント中の位置において、共通配列は適した多義性コード（例えば、受け入れられたリピートがある位置においてＡおよびＧを含む場合にはＲ）を含む。いくつかの実施形態では、受け入れられたリピートが同一の塩基を含まないアライメント中の位置において、共通配列は、Ｎまたは未知の塩基を示すその他の符号を含む。いくつかの実施形態では、受け入れられたリピートが同一の塩基を含まないアライメント中の位置において、共通配列は、配列の獲得時においてより強いまたはより強固なシグナルを出した受け入れられたリピートからの塩基を含む（例えば、生データが蛍光の形式であった場合、（いくつかの実施形態では、適した正規化および／または標準化の後に）より明るい蛍光発光に基づいてコールされた塩基は、共通配列中に置かれる。
【００９４】
共通配列が、少なくとも３つの受け入れられたリピートを含む受け入れられた配列セットから決定される場合、共通配列の各位置における塩基は、いくつかの実施形態では、多数決によって決定され得る。つまり、受け入れられたリピートの半数以上におけるある位置に現れる塩基は、共通配列中のその位置に置かれる。受け入れられたリピートが、そこに過半数の票がないようなある位置において一致しない場合、共通配列中のその位置における塩基は別の方法で決定され、例えば、相対多数決を用いてもよく（つまり、受け入れられたリピート中のある位置に最も頻繁に現れる塩基が、共通配列中のその位置に置かれる）、または前の段落で述べた手段のうちの１つを用いてもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態において、共通配列が少なくとも３つの受け入れられたリピートを含む受け入れられた配列セットから決定される場合、共通配列の各位置における塩基は、いくつかの実施形態では、受け入れられたリピート中のその位置における各塩基の出現頻度に基づいて決定され得る。よって、共通配列は、各塩基が核酸試料中の各位置に現れる見込みの確率的表現であり得る。かかる表現は、位置特異的重み行列の形式をとることができる。いくつかの実施形態において、位置特異的重み行列の要素は、受け入れられたリピートのアライメント中の各位置に各塩基が見られた頻度である。
【００９６】
いくつかの実施形態において、位置特異的重み行列の要素は、受け入れられたリピートのアライメント中の各位置に各塩基が見られた頻度から計算される。この計算には他の因子を用いることもでき、例えば、いくつかの受け入れられたリピートの配列が、他のリピートに比べ、配列の獲得時においてより強いまたはより強固なシグナルにより得られた場合、それら受け入れられたリピートの配列により大きい重みが与えられ得る、および／または、他のリピートにより小さい重みが与えられ得る。重みが変更される度合いは、例えば、シグナルの強度に基づいて定量的に決定することができる、あるいは、それは一定した変更であってもよい。例えば、比較的に強いシグナルにより得られた塩基の重みは、５０％もしくは１００％のような値だけ増やされてもよい、および／または、比較的に弱いシグナルの塩基の重みは、３３％もしくは５０％のような値だけ減らされてもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態において、位置特異的重み行列の要素は、（おそらくは上述のように重みが付けられている）各位置における各塩基の変換された出現頻度から導かれた値である。出現頻度は、対数的にまたは累乗法によって、変換されてもよい。いくつかの実施形態において、変換は、ある位置においてまれにしか見られない塩基の重みを減らす、および／または、ある位置によく見られる塩基もしくは複数の塩基の重みを増やす効果を有する。例えば、ＴがＮ個の受け入れられたリピートの配列のアライメント中のある位置にＭ回現れ（ここで、Ｎ＞２かつＭ＜Ｎ／２である）、Ｃが残りのすべての回数現れる（つまり、Ｎ−Ｍ回）場合、いくつかの実施形態では、これら出現頻度の変換により、位置特異的重み行列におけるＴの重みがＭ／Ｎ（もしくはそれに対応するパーセンテージ）よりも小さくなる、および／またはＣの重みが（Ｎ−Ｍ）／Ｎ（もしくはそれに対応するパーセンテージ）よりも大きくなることになる。いくつかの実施形態においては、最もよく見られる塩基（または出現頻度が同数の場合の塩基）の重みを増やすだけのために、変換が選ばれる。
【００９８】
信頼度
いくつかの実施形態において、信頼度が、核酸試料の配列中の少なくとも１つの位置について決定される。信頼度は、多くの方式、例えば、パーセンテージとしてもしくはフレッド（ｐｈｒｅｄ）スコアとして表される全体のベースコールの正確度の値で、またはエラー率で表すことができる。いくつかの実施形態において、信頼度は、ある位置に最もよく見られる塩基もしくは複数の塩基の出現頻度、または最もよく見られるものではない塩基の組み合わせた出現頻度から決定される。いくつかの実施形態において、これら出現頻度は、上述したように変換され、重みが増やされ、および／または、重みが減らされる。
【００９９】
配列全体の信頼度の決定；核酸試料の配列ならびに信頼度のリアルタイムでのおよび／または所望の信頼のレベルとなるまで行う決定
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、配列全体の信頼度を決定することを含む。配列全体の信頼度は、多くの方式、例えば、パーセンテージもしくはフレッド（ｐｈｒｅｄ）スコアとして表される全体のベースコールの正確度の値、エラー率、または配列中の予測されるエラーの数で表すことができる。
【０１００】
個々の位置からの信頼度は、上のセクションで述べたように、配列全体の信頼度を計算するのに用いることができる。例えば、全体の信頼度は、核酸試料の配列の各位置における信頼度の統計的な母集団の算術平均、幾何平均、中央値、または最頻値の信頼度として決定され得る。いくつかの実施形態において、核酸試料の配列の各位置における信頼度の統計的な母集団は、配列全体の信頼度の計算の前に処理され、例えば、異常値が棄却される。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、核酸試料の配列および信頼度をリアルタイムで決定することを含む。これら実施形態では、配列決定のステップにおいて得られたデータは、例えば、ローリングサークル型増幅産物のさらなるリピートからのさらなる配列データの獲得と同時に配列および信頼度を決定するために処理される。さらなる配列データが得られるとき、決定された配列および信頼度の両方が更新される。いくつかの実施形態において、該リアルタイムプロセスは、事前に選択された信頼度に達するまで続けられる。事前に選択された信頼度は、例えば、９０％、９５％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９５％、または９９．９９％のベースコールの正確度とすることができる。事前に選択された信頼度は、配列における位置の全体または一部としての配列に対するものであってよく、例えば、５０％、６７％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．５％、および９９．９％のような値から選ぶことができる。
【０１０２】
多数の試料；コンティグのアセンブル
いくつかの実施形態において、当該方法は、配列を有する核酸試料と同じ起源、種、または菌株からの少なくとも１つの他の試料であって、該核酸試料の配列と部分的に重なる試料を用いて当該方法の上記ステップを繰り返すこと、これにより少なくとも１つの他の配列を決定すること、およびその少なくとも１つの他の配列を元の試料の配列と共にアセンブルしてコンフィグを形成すること、を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、０．５、１、２、５、１０、もしくは１００ｋｂ、または１、２、５、１０、１００、もしくは１０００Ｍｂよりも大きいサイズのコンフィグが作成されるように、多くの試料を用いて、当該方法の上記ステップを繰り返すことを含む。いくつかの実施形態において、コンフィグは、例えば、限定はされないが、染色体、ミニ染色体、人工染色体、ウィルスゲノム、または染色体外要素であり得る核酸分子の全配列、またはヘテロクロマチンもしくは無反応性領域を除く全配列を表す。コンフィグのアセンブリは、当該分野において周知の方法を用いて実行することができる。
【０１０３】
修飾塩基
いくつかの実施形態において、核酸試料は、少なくとも１つの修飾塩基、例えば、５−メチルシトシン、５−ブロモウラシル、ウラシル、５,６−ジヒドロウラシル、リボチミン、７−メチルグアニン、ヒポキサンチン、またはキサンチンを含む。ウラシルはＤＮＡ鎖において修飾塩基と見なすことができ、リボチミンはＲＮＡ鎖において修飾塩基と見なすことができる。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸試料における少なくとも１つの修飾塩基は、その優先的なパートナー塩基とは異なる塩基対合特異性により対合する。これは、例えば、二本鎖分子中の１つの塩基が、それを標準塩基のうちの１つから同じ優先的なパートナー塩基を持たない修飾塩基に変換する反応を受けた（例えば、散発的な酸化、または放射物もしくは化学的な突然変異物質のような突然変異剤への暴露のため）ときに起こり得る。
【０１０４】
優先的なパートナー塩基は、ワトソン・クリック型塩基対の法則に基づくものである。例えば、アデニンの優先的なパートナー塩基はチミン（またはウラシル）であり、逆もそうである。シトシンの優先的なパートナー塩基はグアニンであり、逆もそうである。修飾塩基の優先的なパートナー塩基は、当業者には広く知られている、または標準塩基のそれらに類似する位置における水素結合の供与体および受容体の存在に基づいて予測することができる。例えば、グアニンのように、ヒポキサンチンはプリン環の６位に水素結合受容体（二重結合酸素）を持ち、それゆえ、その優先的なパートナー塩基は、ピリミジン環の６位に水素結合受容体（アミン基）を持つシトシンである。特に、ヒポキサンチンは、アデニンの脱アミノ化によって形成され得る。アデニンはＤＮＡ中で通常はチミンと対合するため、この脱アミノ反応の結果としてヒポキサンチン−チミン対が生じることとなり、修飾塩基であるヒポキサンチンはその優先的なパートナー塩基に対合しない 。また、シトシンも脱アミノ化されてウラシルを形成し得る。ＤＮＡとの関連では、ウラシルは修飾塩基と見なすことができ、それが（通常の二本鎖ＤＮＡにおけるシトシンの脱アミノ化によって起こり得るように）グアニンに対合する場合は、これもまた修飾塩基であるウラシルがその優先的なパートナー塩基に対合しないという状況となる。
【０１０５】
修飾塩基の検出；特定タイプの塩基の塩基対合特異性の変化
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、特定タイプの塩基の塩基対合特異性を変化させることを含む。特定タイプの塩基の塩基対合特異性を変化させることは、塩基の未修飾型、例えば、シトシンの塩基対合特異性を特異的に変化させることを含み得る。この場合、少なくとも１つの塩基の修飾型、例えば、５−メチルシトシンの塩基対合特異性は変化させない。
【０１０６】
あるいは、特定タイプの塩基の塩基対合特異性を変化させることは、塩基の修飾型（例えば、５−メチルシトシン）の塩基対合特異性を特異的に変化させることを含み得るが、塩基の未修飾型（シトシン）のそれは変化させない。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、特定タイプの塩基の塩基対合特異性を変化させることは、５−メチルシトシン（未修飾のシトシンではない）をチミンに変換する光化学的トランジションを含む。例えば、マツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ）ら、ヌクレイック・アシッズ・シンポジウム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ）整理番号５１，２３３−２３４（２００７）を参照されたい。この反応は、光化学的トランジションを受ける塩基の塩基対合特異性をグアニンからアデニンへ変化させる（グアニンは５−メチルシトシンと対合し、一方アデニンはチミンと対合する）。
【０１０８】
別の実施形態において、特定タイプの塩基の塩基対合特異性を変化させることは、シトシン（５−メチルシトシンではない）をウラシルに変換する亜硫酸水素塩変換を含む。例えば、レアド（Ｌａｉｒｄ）ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ）１０１，２０４−２０９（２００４）およびジルバーマン（Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ）ら、ディベロップメント（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）１３４，３９５９−３９６５（２００７）を参照されたい。この反応は、亜硫酸水素塩変換を受ける塩基の塩基対合特異性をグアニンからアデニンへ変化させる（グアニンはシトシンと対合し、一方アデニンはウラシルと対合する）。
【０１０９】
また、別の実施形態においては、修飾塩基が塩基の未修飾型と比べて変化した塩基対合特異性を有している場合におけるように、変化のステップを行うことなく、修飾塩基が検出され得る。かかる塩基の例には、５−ブロモウラシル、ウラシル、５，６−ジヒドロウラシル、リボチミン、７−メチルグアニン、ヒポキサンチン、およびキサンチンが含まれ得る。例えば、アデニンに比べてグアニンへの対合を増やすこととなるケト−エノール互変異性化を受ける５−ブルモウラシルの傾向、およびアデニンの脱アミノ化による（チミンより優先的にシトシンに対合する）ヒポキサンチンの形成について論じている。ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）、ゲノムズ（Ｇｅｎｏｍｅｓ）、第２版、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ，インク（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、ニューヨーク州、２００２、第１４章、「変異、修復、および組換え（Ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」を参照されたい。
【０１１０】
塩基とその修飾型とを区別するヌクレオチド類似体
いくつかの実施形態において、配列データは、塩基とその修飾型とを区別する少なくとも１つのヌクレオチド類似体（「区別類似体」；これは、塩基およびその修正型のうちの一方と優先的に対合し、他方にはそうではない）を用いて得られる。ヌクレオチド類似体は、例えば、可逆的ターミネーターシークエンシングもしくはライゲーションシークエンシングにおける異なる標識の使用により、またはヌクレオチドを１度に１種ずつ加えてから洗い流すことのできるパイロシークエンシングに取り入れられる場合に、それが標準の４種の塩基に加えて第５の塩基であるかのように用いられると共に、検出され得る。いくつかの実施形態において、区別類似体は、その対応する天然ヌクレオチドの前に加えられる（例えば、パイロシークエンシングで）、またはその同族の天然ヌクレオチドの濃度よりも１０から１００倍高い濃度で提供される（例えば、可逆的ターミネーターシークエンシングで）。例えば、区別類似体は、シトシンと５−メチルシトシンとを区別するデオキシグアノシン三リン酸の類似体とすることができる（例えば、それはシトシンと対合するが、５−メチルシトシンとは対合しない）。該類似体は、デオキシグアノシン三リン酸の濃度よりも１０から１００倍高い濃度で提供され得る。このようにして、該類似体は、通常、それが優先的に対合する塩基の配列方式と相反する形態で取り込まれるはずであるが、天然塩基は、通常、該類似体が優先的に対合しない塩基の配列方式と相反する形態で取り込まれるはずである。
【０１１１】
区別類似体の例は、米国特許第７，３９９，６１４号に見られ、例えば、未修飾シトシンと５−メチルシトシンとを区別し、前者と優先的に対合する次の分子を含む。
【０１１２】
【化１】
0005483628.tif 000002
および
【０１１３】
【化２】
0005483628.tif 000003
これら分子は、それぞれ区別類似体１および区別類似体２と称される。
【０１１４】
核酸試料中の修飾塩基の位置の決定
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、核酸試料中の修飾塩基の位置を決定することを含む。これら実施形態は、（ｉ）二本鎖の形式の核酸試料を提供すること、（ｉｉ）核酸試料を環状ペアロック分子に変換すること、このうち、環状ペアロック分子は、核酸試料の配列のフォワードリピートおよびリバースリピートならびに同じであっても同じでなくてもよい既知の配列を持つ２つの核酸インサートを含み、（ｉｉｉ）環状ペアロック分子中の特定タイプの塩基の塩基対合特異性を選択的に変化させること、(ｉｖ）次いで、環状ペアロック分子のフォワードリピートおよびリバースリピート、またはその相補配列を鋳型として配列データを得ること、ならびに（ｖ）少なくともフォワードリピートおよびリバースリピートまたはそのコピーの配列データを用いて核酸試料中の修飾塩基の位置を決定すること、を含む。特に、フォワードリピートを鋳型とした配列は、リバースリピートと同じセンスを持つようになるが（逆の場合も同じ）、リバースリピートと完全に同じであっても、そうでなくてもよい。違いは、リバースリピート中の対応する塩基以外の塩基に対合することのできる塩基を含むフォワードリピートにより生じ得る。そのような状況の例は、ｃＰＬＭ中のフォワードリピートはリバース鎖中のアデニンに対合した５−ブロモウラシルを含むが、合成による配列決定反応におけるグアニンの添加の鋳型となる場合である。
【０１１５】
少なくとも２つのリピート、つまり、試料のリピート（例えば、図５Ａにおいて１７と標示されているリピート）および新たに合成されたフォワード鎖の相補鎖のリピート（例えば、図６Ａにおいて２１と標示されているリピート）のうち少なくとも１つ、ならびに新たに合成されたリバース鎖の相補鎖のリピート（例えば、図６Ａにおいて１９と標示されているリピート）およびリバース鎖のリピート（例えば、図６Ａにおいて１６と標示されているリピート）のうち少なくとも１つ、を含む配列データが得られる。これらリピートがアライメントされる。このアライメントは、上述したような任意の適したアルゴリズムを用いて実行され得る。リピート間で不一致がある位置（例えば、図６Ｂにおいて４１と標示されている位置）は、その位置の核酸試料中の塩基が、その塩基対合特異性の変化を受けたことを表す。該プロセスに用いられるまたは試料中に存在する修飾のタイプ、修飾塩基、および／または、区別類似体により、核酸試料の対応する位置に元々存在する塩基が決定され得る。
【０１１６】
例えば、ｍＣからＴへの変換（図５Ａ参照）によって環状ペアロック分子が変化した場合、不一致は、ｍＣが、あるリードにおいては、Ｔである位置またはＡに相補的である位置、および、別のリードにおいては、Ｃである位置またはＧに相補的である位置の核酸試料中に存在していたことを示す。その論理は、配列で不一致となる位置において、変換反応の生成物である塩基、Ｔが、核酸試料中に存在していた変換反応の基質、ｍＣに取って代わったというものである。
【０１１７】
もう一つの例では、ＣからＵへの変換によって環状ペアロック分子が変化した場合、不一致は、Ｃが、あるリードにおいては、ＵもしくはＴである位置またはＡに相補的である位置、および、別のリードにおいては、Ｃである位置またはＧに相補的である位置の核酸試料中に存在していたことを示す。その論理は、配列で不一致となる位置において、変換反応の生成物である塩基、Ｕ（シークエンシングシステムよりＴと読まれることもある）が、核酸試料中に存在していた変換反応の基質、Ｃに取って代わったというものである。ｍＣ残基はＣからＵへの変換によっては変化しないため、リードがある位置におけるＣおよび／またはその相補体としてのＧを示すことで一致している位置は、ｍＣが元の試料中のこの位置に存在していたことを示す。
【０１１８】
上述のように区別類似体が用いられた実施形態では、それが優先的に結合する塩基の存在が、区別類似体が出現する位置に対応する元の配列の位置における元の配列にあることが推測され得る。
【０１１９】
システム／コンピュータ可読媒体
いくつかの実施形態において、本発明は、プロセッサ、ストレージ、バスシステム、および少なくとも１つのユーザーインターフェースエレメントを含む計算装置に操作可能に連結された配列決定装置を含むシステムに関する。ユーザーインターフェースエレメントは、ディスプレイ、キーボード、およびマウスから選択することができる。いくつかの実施形態において、該システムは、少なくとも１つの集積回路および／または少なくとも１つの半導体を含む。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、配列決定装置は、上述した配列決定法のうち少なくとも１つを実行するように構成された配列決定装置から選ばれる。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ディスプレイは、単独のユーザーインターフェースエレメントとしての機能を果たすタッチスクリーンであってよい。ストレージは、ユーザーの任意入力により、プロセッサ、ストレージ、バスシステム、および少なくとも１つのユーザーインターフェースエレメントを含む計算装置に操作可能に連結された配列決定装置を含むシステム上のプロセッサにより実行されるときに、上述のような本発明の方法を実行するオペレーティングシステム、ユーザーインターフェースソフトウェア、および命令を含むプログラミングによりエンコードされたものである。いくつかの実施形態において、ストレージは、上述した形式のいずれか、例えば、生配列データ、受け入れられた配列セット、共通配列などであり得る配列データをさらに含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ストレージおよびその内容の全ては１台のコンピュータ内に配置される。別の実施形態では、ストレージは少なくとも２台のコンピュータ、例えば、ネットワーク接続を介して連結されたコンピュータ間で分けられる。いくつかの実施形態において、ユーザーインターフェースは、システムの少なくとも１つの構成要素、例えば、プロセッシングソフトウェアを含む少なくとも１台の他のコンピュータと通信状態にある１台のコンピュータの一部である。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、プロセッサにより実行されるシステムまたは方法の出力の結果として、核酸試料中の少なくとも１つの位置に修飾塩基があるという表示がなされることになる。その表示は、さまざまな形式、例えば、配列中の修飾位置のリスト、修飾位置が、例えば、アスタリスクまたは類似の文字、あるいは、太字、イタリック体または下線の書式、カラーテキストで強調またはマーキングされる配列のテキストもしくはグラフィック表現、または修飾塩基の構造を含む核酸の化学構造の描写であってよい。
【実施例】
【０１２４】
以下の具体的な実施例は、単なる例示であり、いかなる方式においても、その他の部分の開示を限定するものではないと解釈されるべきである。さらに詳細な説明がなくとも、当業者は、本明細書における記載に基づいて本発明をその最大の範囲において利用することができると考えられる。
【０１２５】
実施例１：合成環状ペアロック分子のローリングサークル型増幅
表１に示されるような４つのオリゴデオキシリボヌクレオチドを提供した。
【０１２６】
【表１】
0005483628.tif 000004
【０１２７】
５μＬの１０×Ｔ４リガーゼバッファ（ＮＥＢ製；１０ｍＭのＡＴＰを含む１０×ストックバッファ）の存在下、３０μＬの１０μＭオリゴデオキシリボヌクレオチド（最終濃度）を１μＬの１０Ｕ／μＬ  Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ニューイングランド・バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（「ＮＥＢ」）製、カタログ番号：Ｍ０２０１Ｓ）で処理する別々の５０μＬ反応で、ＣＰＬＭ−１およびＣＰＬＭ−２をリン酸化した。１４μＬのｄｄＨ２Ｏを加えて、最終体積を５０μＬとした（表２を参照）。その反応を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて６５℃で２０分間酵素不活性化を行った。
【０１２８】
【表２】
0005483628.tif 000005
【０１２９】
上記反応から得られたリン酸化ＣＰＬＭ−１およびＣＰＬＭ−２（それぞれ５’Ｐ−ＣＰＬＭ−１および５’Ｐ−ＣＰＬＭ−２）の濃度を６μＭに調整した。
【０１３０】
次いで、精製したリン酸化ＣＰＬＭ−１およびＣＰＬＭ−２を９５℃で５分間変性させてから、氷上に置き、バッファ、ｄｄＨ２Ｏ、およびＴ４リガーゼ（ＮＥＢ製、カタログ番号：Ｍ０２０２Ｓ）と混ぜ、表３に示されるような環状ペアロック分子を生成した。ライゲーションは２５℃で起こり、１８μＬのアリコートを１０、３０および６０分間で取り出した。リガーゼを用いない陰性コントロールを並行して行った（表３の列Ｌ０）。
【０１３１】
【表３】
0005483628.tif 000006
【０１３２】
ライゲーション生成物を、表４に示されるように、ｐＳ−Ｔ１および／またはｐＳ−Ｔ２プライマー、ｄＮＴＰｓ、ＲｅｐｌｉＰＨＩ（登録商標）Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）製、カタログ番号：ＰＰ０３１０１０）、ならびに，適当な１０×反応バッファＲｅｐｌｉＰＨＩ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ポリメラーゼバッファと合わせた。
【０１３３】
【表４】
0005483628.tif 000007
【０１３４】
Ｐｈｉ２９ポリメラーゼを入れずに反応物をアセンブルし、９５℃で５分間変性させてから、氷上に５分間置いた。Ｐｈｉ２９ポリメラーゼを加え、続いて３０℃で１８時間インキュベートした。
【０１３５】
５μＬの反応生成物の試料を１μＬの６×ローディング色素（０．０３％ブロモフェノールブルー、０．０３％キシレンシアノールＦＦ、６０％グリセロール、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ｐＨ７．６））と混合し、９５℃で１０分間加熱してから、すぐに氷上に置いた。１％ＳＤＳをさらに加えたことを除き、第２の組の反応生成物試料を同じように処理した。
【０１３６】
試料を１×ＴＡＥバッファ中の０．７％アガロースゲルにロードし、１３５Ｖで２８分間電気泳動させた。ＤＮＡをＧｅｌＲｅｄ（登録商標）プレキャストゲル染色（バイオチウム（Ｂｉｏｔｉｕｍ）製、カタログ番号：４１００３  ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｉｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｇｅｌ  Ｓｔａｉｎ、水中に１００００×希釈）により可視化した。そのゲルが図９に示されている。見掛けの分子量が１０ｋｂよりも大きいローリングサークル型増幅産物が、Ｌ３ライゲーション反応生成物ならびにｐＳ−Ｔ１およびｐＳ−Ｔ２プライマーの両方を用いた反応からの試料中に観測されたが、Ｌ０コントロールまたはプライマーを欠いた試料を用いた試料には観測されなかった。ＳＤＳで処理したＬ３ライゲーション反応生成物ならびにｐＳ−Ｔ１およびｐＳ−Ｔ２プライマーの両方を用いた試料では、ウェル中により多くの生成物の残留が見られ、ＲＣＡ産物中の二次構造の変性に合致していた。
【０１３７】
実施例２：線状ペアロック分子を用いた亜硫酸水素塩処理によるＣからＵへの変換を利用したメチル化の検出シミュレーション
亜硫酸水素塩処理によるＣ残基からＵ残基への変換を利用した仮想二本鎖ＤＮＡフラグメントの配列および５−メチルシトシンの位置の決定を以下のようにシミュレートする。この例の一般スキームが図１２に図示されている。ＤＮＡの配列は以下に示される。
【０１３８】
ＤＮＡ試料（メチル化されたＣはｍＣと示した）
【０１３９】
【化３】
0005483628.tif 000008
【０１４０】
２本の鎖をライゲーションによりリンカー配列（「ｎｎｎｎ」と表されている）に連結し、以下の生成物を得る。そのリンカー配列は配列決定プライマーとして用いるのに適している。
【０１４１】
【化４】
0005483628.tif 000009
【０１４２】
加えて、既知の配列を有する線状フラップ（図示せず）を配列番号７の分子の各末端に付着させる。３’末端のフラップは、配列決定または複製のためのプライマーの結合に適している。５’末端のフラップの相補体は、配列決定または複製のためのプライマーの結合に適している。
【０１４３】
その生成物を亜硫酸水素塩ナトリウムで処理すると、シトシン（５−メチルシトシンではない）残基からウラシルへの変換が起こり、以下の生成物が得られる。新たに形成されたウラシル残基は、太字とされ、かつ塩基の上にアスタリスクで印が付られている。
【０１４４】
【化５】
0005483628.tif 000010
【０１４５】
相補鎖（以下に配列番号９と示されている）を、３’末端に付加されたフラップへのプライマーのアニーリングを含むＤＮＡ複製によって合成する。
【０１４６】
【化６】
0005483628.tif 000011
【０１４７】
上記二本鎖について両方向に配列決定する。配列決定の中間物が以下に示されている。その配列が獲得されている新生鎖は、反応ａにおける配列番号１０および反応ｂにおける配列番号１１である。
【０１４８】
【化７】
0005483628.tif 000012
【０１４９】
【化８】
0005483628.tif 000013
【０１５０】
したがって、これらの反応から得られることが予測されるリードは次の配列を含む。
【０１５１】
【化９】
0005483628.tif 000014
【０１５２】
シトシンのメチル化状態を含む元の試料の配列は、表５に要約されている以下のルールを適用して決定される。元の配列のフォワード鎖は、上記の２つのリードと同じセンスを持つ鎖である。
【０１５３】
リードａおよびリードｂがいずれもＡを有する位置において、元の配列のフォワード鎖もＡを有し、リバース鎖はＴを有する。リードａおよびリードｂがいずれもＴを有する位置においては、元の配列のフォワード鎖もＴを有し、リバース鎖はＡを有する。
【０１５４】
リードａおよびリードｂがいずれもＣを有するとき、元の配列のフォワード鎖はｍＣを有し、リバース鎖はＧを有する。リードａおよびリードｂがいずれもＧを有するとき、元の配列のフォワード鎖はＧを有し、リバース鎖はｍＣを有する。
【０１５５】
一方のリードが、他方のリードがＡを有する位置にＧを有するとき、元の配列のフォワード鎖はＧを有し、リバース鎖はＣを有する。
【０１５６】
一方のリードが、他方のリードがＣを有する位置にＴを有するとき、元の配列のフォワード鎖はＣを有し、リバース鎖はＧを有する。
【０１５７】
両リードで異なる位置にどちらのリードがＧおよびＴ残基を含むかにより、リードａおよびｂは、表５の列１および２にマッチする。この例では、リードａは列１に対応している。
【０１５８】
【表５】
0005483628.tif 000015
【０１５９】
配列番号１０および１１に上記ルールを適用すると、元の配列、つまり、配列番号５および６に回復することとなる（リンカー配列ｎｎｎｎの除去後）。リードａおよびｂの元の配列のフォワード鎖とのアライメントが図１０Ａに示されている。
【０１６０】
実施例３：線状ペアロック分子を用いた光化学的トランジションによるＣからＴへの変換を利用したメチル化の検出シミュレーション
光化学的トランジションによるｍＣからＴへの変換を利用した仮想二本鎖ＤＮＡフラグメントの配列および５−メチルシトシンの位置の決定を以下のようにシミュレートする。この例の一般スキームが図１３に図示されている。ＤＮＡの配列は以下に示される。
【０１６１】
【化１０】
0005483628.tif 000016
【０１６２】
２本の鎖をライゲーションによりリンカー配列（「ｎｎｎｎ」と表されている）に連結し、以下の生成物を得る。そのリンカー配列は配列決定プライマーとして用いるのに適している。線状フラップ（図示せず）もこの分子の３’および５’末端に付加する。
【０１６３】
【化１１】
0005483628.tif 000017
【０１６４】
５−メチルシトシン（シトシンではない）残基をチミンに光化学的に変換するべく、上記生成物を光で処理して以下の生成物を得る。新たに形成されたチミン残基は、太字とされ、かつ塩基の上または下にアスタリスクで印が付られている。
【０１６５】
【化１２】
0005483628.tif 000018
【０１６６】
相補鎖（以下に配列番号１３と示されている）を、分子の３’末端に付加されたフラップに結合するプライマーを用いてＤＮＡ複製により合成する。
【０１６７】
【化１３】
0005483628.tif 000019
【０１６８】
上記二本鎖について、上記の実施例２におけるように、両方向に配列決定し、以下のリードを得る。
【０１６９】
【化１４】
0005483628.tif 000020
【０１７０】
シトシンのメチル化状態を含む元の試料の配列は、表６に要約されている以下のルールを適用して決定される。元の配列のフォワード鎖は、上記の２つのリードと同じセンスを持つ鎖である。
【０１７１】
リードａおよびリードｂがいずれもＡを有する位置において、元の配列のフォワード鎖もＡを有し、リバース鎖はＴを有する。リードａおよびリードｂがいずれもＴを有する位置においては、元の配列のフォワード鎖もＴを有し、リバース鎖はＡを有する。
【０１７２】
リードａおよびリードｂがいずれもＣを有するとき、元の配列のフォワード鎖はＣを有し、リバース鎖はＧを有する。リードａおよびリードｂがいずれもＧを有するとき、元の配列のフォワード鎖はＧを有し、リバース鎖はＣを有する。
【０１７３】
一方のリードが、他方のリードがＡを有する位置にＧを有するとき、元の配列のフォワード鎖はＧを有し、リバース鎖はｍＣを有する。
【０１７４】
一方のリードが、他方のリードがＣを有する位置にＴを有するとき、元の配列のフォワード鎖はｍＣを有し、リバース鎖はＧを有する。
【０１７５】
両リードで異なる位置にどちらのリードがＧおよびＴ残基を含むかにより、リードａおよびｂは、表６の列１および２にマッチする。この例では、リードａは列１に対応している。
【０１７６】
【表６】
0005483628.tif 000021
【０１７７】
配列番号１４および１５に上記ルールを適用すると、元の配列、つまり、配列番号５および６に回復することとなる（リンカー配列ｎｎｎｎの除去後）。リードａおよびｂの元の配列のフォワード鎖とのアライメントが図１０Ｂに示されている。
【０１７８】
【化１５】
0005483628.tif 000022
【０１７９】
実施例４：シミュレートされたシングルリードおよびマルチプルリード配列決定の正確度の比較
ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号Ｕ０００９６、長さ４６３９６７５ｂｐのアセンブルされた大腸菌ゲノムの配列をジェンバンクからダウンロードした。長さ５００ｂｐから２０００ｂｐまでの無作為に選ばれたフラグメントをこの配列から抽出した。これらのフラグメントをマスター配列に指定した。
【０１８０】
表７に示されるように定められた比率で、コンピュータにより欠失および誤読エラーを導入することによって、５つの配列をマスター配列から生成した。
【０１８１】
エラーを含む５つの配列について、クラスタルダブル（ＣＬＵＳＴＡＬＷ）アルゴリズム（デフォルト設定）を用いて、マルチプル配列比較分析を行った。共通配列を得るために、クラスタルダブル（ＣＬＵＳＴＡＬＷ）分析の結果をエンボス（ＥＭＢＯＳＳ）パッケージのプログラム「ｃｏｎｓ」の入力として用いた。プログラム「ｃｏｎｓ」は、ライス（Ｒｉｃｅ）ら、トレンズ・イン・ジェネティックス（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ）１６，２７６−２７７（２０００）およびマラン（Ｍｕｌｌａｎ）ら、ブリーフ・バイオインフォーマティクス（Ｂｒｉｅｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ）３，９２−９４（２００２）に記載されている。
【０１８２】
最初の部分配列および共通配列をそれぞれマスター配列と比較し、ギャップと誤読の頻度を表にした。表７を参照されたい。その結果、マルチプルリードを用いて共通配列を形成すると、試験された様々なエラー率の各々における誤読およびギャップの頻度が減ることが明らかとなった。各組の欠失および誤読エラー率について、単一のシミュレートされたリードおよび５つのシミュレートされたリードから決定された共通配列をマスター配列に対してアライメントした。誤読されたおよびギャップになった位置の数およびパーセンテージを、アライメントにおける位置の割合として決定した。
【０１８３】
【表７】
0005483628.tif 000023
【０１８４】
実施例５：ｃＰＬＭを用いた配列決定のシミュレーション
実施例２におけるように二本鎖核酸試料を提供する。図１４のｃＰＬＭ構築ステップに示されるようなヘアピンを形成するインサートの分子の各末端へのライゲーションにより、試料のフォワード鎖およびリバース鎖をロックして、環状ペアロック分子を形成する。合成反応による単一分子配列決定を、インサートのうちの１つに結合するプライマーを用いて行う。試料のフォワード鎖の少なくとも１つの配列および試料のリバース鎖の少なくとも１つの配列を含む配列データを得る。表８にしたがって、環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することにより配列データを分析し、核酸試料の配列を決定する。
【０１８５】
【表８】
0005483628.tif 000024
【０１８６】
注：表８および以下の表９〜１１において、フォワード鎖を鋳型として獲得した配列は、図１４〜１７中の配列決定データの上のライン（つまり、「配列決定」と表示された矢印の下方かつ「配列分析」と表示された矢印の上方に示されている配列）にそれぞれ対応する。同様に、リバース鎖を鋳型として獲得した配列は、図１４〜１７中の配列決定データの下のラインにそれぞれ対応する。
【０１８７】
実施例６：環状ペアロック分子を用いた亜硫酸水素塩処理によるＣからＵへの変換を利用したメチル化の検出のシミュレーション
この例の一般スキームは図１５に示されている。実施例２におけるように少なくとも１つの５−メチルシトシンを含む二本鎖核酸試料を提供する。実施例５におけるように環状ペアロック分子を形成する。実施例２におけるように亜硫酸水素塩変換を行う。実施例５におけるように配列データを得る。表９のルールにしたがって、環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することにより配列データを分析し、核酸試料の配列および少なくとも１つの５−メチルシトシンの位置を決定する。
【０１８８】
【表９】
0005483628.tif 000025
【０１８９】
実施例７：環状ペアロック分子を用いた光化学的トランジションによるＣからＴへの変換を利用したメチル化の検出のシミュレーション
この例の一般スキームは図１６に示されている。実施例３におけるように少なくとも１つの５−メチルシトシンを含む二本鎖核酸試料を提供する。実施例５におけるように環状ペアロック分子を形成する。実施例３におけるように光化学的トランジションを行う。実施例５におけるように配列データを得る。表１０のルールにしたがって、環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することにより配列データを分析し、核酸試料の配列および少なくとも１つの５−メチルシトシンの位置を決定する。
【０１９０】
【表１０】
0005483628.tif 000026
【０１９１】
実施例８：環状ペアロック分子を用いた５−ブロモウラシルの検出のシミュレーション
この例の一般スキームは図１７に示されている。少なくとも１つの５−ブロモウラシルを含む二本鎖核酸試料を提供する。実施例５におけるように環状ペアロック分子を形成する。実施例５におけるように配列データを得る。表１１のルールにしたがって、環状ペアロック分子のフォワード鎖およびリバース鎖の配列を比較することにより配列データを分析し、核酸試料の配列および少なくとも１つの５−ブロモウラシルの位置を決定する。
【０１９２】
【表１１】
0005483628.tif 000027
【０１９３】
本明細書は、本明細書中で引用された参照文献の教示内容に照らせば、最も完全に理解される。本明細書中の実施形態は、本発明の実施形態の説明を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものと解されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に含まれることを容易に理解する。この開示において引用した全ての刊行物および特許は、それら全体として参照として組み込まれる。参照として組み込まれる材料が本明細書と相反するまたは矛盾する限りにおいては、本明細書は、いかなるそのような材料にも優先し得る。本明細書中のいかなる参照文献の引用も、かかる参照文献が本発明の先行技術であるということの承認ではない。
【０１９４】
特に示さない限り、特許請求の範囲を含めて本明細書中で用いられる成分、反応条件、およびその他の量を表す数字は、いずれも、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、そうでないということが特に示されない限り、数値パラメーターは近似値であり、かつ、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変わり得る。最低限でも、そしてクレームの範囲への均等論の適用を制限しようとするのではなく、各数値パラメータは、有効数字の数および通常の丸めの手法を踏まえて解釈されるべきである。本明細書における異なる量の有効桁数を持つ一連の数字の列挙は、与えられたより少ない有効桁数を持つ数字が、与えられたより多い有効桁数を持つ数字と同じ精度を有することを示唆するものと解釈されるべきではない。
【０１９５】
特許請求の範囲および／または明細書において、「含む」という用語と共に用いる場合の「１つの」という用語の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つまたは複数の」、「少なくとも１つの」および「１つまたは１つよりも多くの」という意味にも整合するものである。特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみを指すこと、あるいは、それら選択肢が相互排他的であることが明示的に示されている場合を除いて、「および／または」を意味するものとして用いられるが、本開示は選択肢のみと「および／または」を指すという定義を支持する。
【０１９６】
特に示さない限り、一連の要素の前に来る「少なくとも」という用語は、その連なりの中のすべての要素に言及するということが理解されなければならない。当業者は、日常的なものにすぎない実験によって、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認めるか、あるいは確認することができる。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【０１９７】
特に定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、この発明が属する分野における当業者が通常理解しているのと同じ意味を有する。本明細書において記載されたのと同じようなまたは均等ないかなる方法および構成要素も、本発明の実施または試験に用いられ得るが、ここでは好ましい方法および構成が記載される。
【０１９８】
本明細書で述べた刊行物は、それらの開示が本願の出願日よりも早いために、提示されているにすぎない。先発明の理由で本発明がかかる刊行物に先行する権利がないことの承認と解釈されるものは、本明細書に含まれていない。さらに、提示した刊行日は、実際の刊行日と異なる場合があり、個別に確認することが必要かもしれない。
【０１９９】
本発明の他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書に開示される本発明の実施から、当業者には明らかとなろう。本明細書および実施例は単なる例示であると考えられることを意図しており、以下の特許請求の範囲により本発明の真の範囲および精神が示される。
【符号の説明】
【０２００】
１  ＤＮＡ試料、２  フラグメント、３  リンカー、４  リンカー、５  オリゴヌクレオチド、６  環状分子、７  ポリメラーゼ、８  表面、９  線状コピー、１０  分子、１１  フォワード鎖、１２  リバース鎖、１３  ヘアピン、１４  ヘアピン、１５  フォワード鎖、１６  リバース鎖、１７  フォワード鎖、１８  プライマー、１９  セグメント、２０  セグメント、２１  セグメント、２２  核酸試料の部分配列、２３  核酸インサートの配列、２４  核酸試料の配列、２５  核酸インサートの配列、２６  核酸試料の配列、２７  核酸インサートの配列、２８  さらなる配列、２９  核酸インサート、３０  核酸試料の配列、３１  核酸インサートの配列、３２  核酸試料の部分配列、３３  部分配列、３４  非常に長い配列、３７  オーバーハングまたは陥凹末端、３８  オーバーハングまたは陥凹末端、４１  位置、５１  配列決定装置、５２  計算装置、５３  コンピュータ、５４  ストレージ、５５  バスシステム、５６  プロセッサ、５７  ディスプレイ、５８  キーボード、５９  マウス、６０  オペレーティングシステム、６１  ユーザーインターフェースソフトウェア、６２  プロセッシングソフトウェア、６３  配列データ
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図９】
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