(57)【要約】本発明は、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質を含むマラリアワクチンを提供する：（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質を含むマラリアワクチン：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項２】
該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
該物質が（３）の発現ベクターである、請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
マラリア感染に対する予防接種に使用するための、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項５】
該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、請求項４記載の物質。
【請求項６】
（３）の発現ベクターである、請求項４記載の物質。
【請求項７】
哺乳動物に、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質の有効量を投与することを含む、該哺乳動物におけるマラリア感染の予防方法：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
【請求項８】
該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該物質が（３）の発現ベクターである、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マラリアに対するワクチンに関する。詳細には、本発明は、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ遺伝子のマラリアワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリアは熱帯、亜熱帯地域の７０ヶ国以上に分布している原虫感染症である。全世界で年間３〜５億人、累計で約８億人の患者がマラリアに感染し、１００〜１５０万人がマラリアで死亡すると報告されている。
マラリアの病原体は単細胞生物であるマラリア原虫で、ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐｐ．）によって媒介される。熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）の四種が存在する。特に熱帯熱マラリア原虫によるマラリアは症状が重い。
マラリアワクチンとして最も高い防御効果が確認されているのは、感染型マラリア原虫であるスポロゾイトを放射線照射により不活化したワクチンである。しかし、生産に高度の施設がいるため、開発途上地域においては普及に不向きである。そのため、強力且つ調製が簡易な新たなワクチンの開発が期待されている。しかし、ヒトマラリアは基本的には霊長類にしか感染しないため、ワクチンの有効性の確認は、サル・ヒトを用いた実験か、マウスマラリア原虫をマウスに感染させる模擬的実験によってしか行うことができない。従って、ヒトマラリアに対する新たなワクチンの開発は困難を極めている。
上記ワクチンと同等の効果を有するワクチンタンパクを精製し、サブユニットワクチン（ペプチド製剤）として生産するのがより実用的であると考えられている。これまで、いくつかのマラリアワクチン候補分子が発見され、一部は臨床治験が開始されているが、有効性が確認されたとの報告はなされていない。
また、生ワクチンと比較して、生産性や保存等の取り扱いが非常に簡便なワクチンとしてＤＮＡワクチンが知られている。ＤＮＡワクチンは容易に製造することが可能であるので、変異が早いウイルスに対して、速やかに改良型ワクチンを提供することが可能である。しかしながら、熱帯熱マラリアに対して有効なＤＮＡワクチンは未だ開発されていない。
一方、マラリア原虫のゲノム配列の解析により、ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ遺伝子のアミノ酸配列及びヌクレオチド配列が明らかとなっている（非特許文献１）。しかし、該遺伝子のマラリアワクチンとしての使用については報告がない。
【非特許文献１】Ｎａｇａｍｕｎｅ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．１００，ｐａｇｅｓ  １０６８２−１０６８７，２００３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の目的は、強力且つ調製が簡易な新たなマラリアワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、マラリア、特にヒトへの感染性を有する熱帯熱マラリアに対して有効なワクチンを開発すべく、強力なワクチン活性を有する候補分子を探索した。
熱帯熱マラリアは霊長類以外の哺乳動物（例えばマウス）へは感染しないため、動物実験により熱帯熱マラリアに対するワクチンの効果を直接確認することは困難である。そこで本発明者らは、マラリアゲノムの情報から熱帯熱マラリアの遺伝子と相同性が高いマウスマラリア（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の細胞表面タンパク（ＧＰＩアンカータンパク）をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで９つ選択し、これらのｃＤＮＡを調製した後に、市販の発現ベクターに組み込み、ＤＮＡワクチンとしてマウスに投与した。ＤＮＡワクチンの投与は圧縮空気を用いた皮下注射により行い、プライムブースター後、マラリア原虫をマウスに感染させ、防御効果を観察した。その結果、ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分ペプチドをコードする発現ベクターの投与により、マラリア原虫の感染が強力に抑制された。該ワクチン投与群ではマラリア原虫に対する血中抗体が確認されたことから、この感染防除効果は、生体内において発現されたＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分ペプチドに対する特異的免疫反応が誘導されたことによるものと考えられた。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
即ち、本発明は以下に関する。
［１］以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質を含むマラリアワクチン：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
［２］該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、［１］のワクチン。
［３］該物質が（３）の発現ベクターである、［１］のワクチン。
［４］マラリア感染に対する予防接種に使用するための、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
［５］該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、［４］記載の物質。
［６］（３）の発現ベクターである、［４］記載の物質。
［７］哺乳動物に、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質の有効量を投与することを含む、該哺乳動物におけるマラリア感染の予防方法：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
［８］該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、［７］の方法。
［９］該物質が（３）の発現ベクターである、［７］の方法。
［１０］マラリアワクチンを製造するための、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質の使用：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
［１１］該部分アミノ酸配列が、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれる、［１０］の使用。
［１２］該物質が（３）の発現ベクターである、［１０］の使用。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、強力且つ調製が簡易な新たなマラリアワクチンが提供される。特に、ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分ペプチドを発現し得る発現ベクターは、マラリアに対するＤＮＡワクチンとして顕著な効果を示すことから、従来のサブユニットワクチンよりもより安価で安定なマラリアワクチンとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】マウスの生存率に対する発現ベクター含有ワクチンの効果を示す（第２回試行）。Ｇ１：ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（ＰＹ０３４７０）、Ｇ２：ＰＹ０５０００。
【図２】マウスの生存率に対する発現ベクター含有ワクチンの効果を示す（第３回試行）。Ｇ１：ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（ＰＹ０３４７０）、Ｇ２：ＰＹ０５０００、Ｇ１６：ＰＹ０１４９０。
【図３】各マウス個体における原虫血症の発症に対する発現ベクター含有ワクチンの効果を示す（第２回試行）。Ｇ１ｍ（１〜７）：ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（ＰＹ０３４７０）、Ｇ２ｍ（１〜５）：ＰＹ０５０００、Ｃ（１〜２）：コントロール。
【図４】各マウス個体における原虫血症の発症に対する発現ベクター含有ワクチンの効果を示す（第３回試行）。Ｇ１ｍ（１〜２）：ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（ＰＹ０３４７０）、Ｇ２ｍ（１〜２）：ＰＹ０５０００、Ｇ１６ｍ（１〜２）：ＰＹ０１４９０、Ｃ（１〜２）：コントロール。
【図５】マウスの生存率に対する発現ベクター含有ワクチンの効果を示す（第４回試行）。Ｇ１：ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（ＰＹ０３４７０）。
【図６】各マウス個体における原虫血症の発症に対する発現ベクター含有ワクチンの効果を示す（第４回試行）。Ｇｍ（１〜６）：ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（ＰＹ０３４７０）。
【図７】マウスの生存率に対する発現ベクター含有ワクチンの効果を示す（第５回試行）。Ｇ１：ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（ＰＹ０３４７０）。
【図８】各マウス個体における原虫血症の発症に対する発現ベクター含有ワクチンの効果を示す（第５回試行）。Ｇ１ｍ（１〜１３）：ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（ＰＹ０３４７０）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（Ｉ）マラリアワクチン
本発明は、以下の（１）〜（３）から選択されるいずれかの物質を含むマラリアワクチン（以下、本発明のワクチンという場合がある）を提供するものである：
（１）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（２）マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該部分アミノ酸配列が６アミノ酸以上の長さを有し、且つ免疫原性を有する、ポリペプチド；及び
（３）（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る発現ベクター。
本明細書中、マラリアの種類は特に限定されない。原虫の種類によってマラリアは、熱帯熱マラリア、三日熱マラリア、四日熱マラリア、卵形マラリア、マウスマラリア等に分類され、いずれの種類のマラリアも本発明の範囲内に含まれる。マラリアは、好ましくは熱帯熱マラリア又はマウスマラリアである。
本明細書中、マラリア原虫の種類は特に限定されない。マラリア原虫の種類としては、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、マウスマラリア原虫（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）等を挙げることができる。それぞれの種類のマラリア原虫の感染により、対応する種類のマラリアが発症する。
マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼは公知の遺伝子であり、そのヌクレオチド配列やアミノ酸配列も公知である。熱帯熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列としては配列番号２で表されるアミノ酸配列を挙げることができ、例えば配列番号１で表されるヌクレオチド配列にコードされる。また、熱帯熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列には、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列も含まれる。マラリア原虫の遺伝子を構成するヌクレオチド配列は、自然突然変異により変異することが知られている。このような自然突然変異により生じた配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドも、熱帯熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに含まれる。該アミノ酸配列としては、例えば、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）上記（１）〜（４）の変異が組み合わせれたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）であって、天然に存在するアミノ酸配列が含まれる。
また、マウスマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列としては配列番号４で表されるアミノ酸配列を挙げることができ、例えば配列番号３で表されるヌクレオチド配列にコードされる。また、マウスマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列には、配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたアミノ酸配列であって、天然に存在するアミノ酸配列も含まれる。マラリア原虫の遺伝子を構成するヌクレオチド配列は、自然突然変異により変異することが知られている。このような自然突然変異により生じた配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドも、マウスマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに含まれる。該アミノ酸配列としては、例えば、（１）配列番号４に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、（３）配列番号４に示されるアミノ酸配列に１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列中の１又は複数（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）上記（１）〜（４）の変異が組み合わせれたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）であって、天然に存在するアミノ酸配列が含まれる。
他の種類のマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼオルソログのヌクレオチド配列やアミノ酸配列も、本明細書中の配列表に開示された上記ヌクレオチド配列やアミノ酸配列の情報や、公知の配列データベースを利用して、適切なプライマーやプローブを設計し、ＲＴ−ＰＣＲやプラークハイブリダイゼーション等の通常の遺伝子工学的手法を用いて容易に決定することが出来る。
マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの遺伝子配列はマラリア原虫の種類により異なっているため、標的とするマラリアの種類に応じて、ワクチンに用いるＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの由来を変更することが好ましい。即ち、熱帯熱マラリアに対するワクチンを製造する場合には、熱帯熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。三日熱マラリアに対するワクチンを製造する場合には、三日熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。四日熱マラリアに対するワクチンを製造する場合には、四日熱マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。卵形マラリアに対するワクチンを製造する場合には、卵形マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。マウスマラリアに対するワクチンを製造する場合には、マウスマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼが好適に用いられる。
上記（２）のポリペプチドに含まれるマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列は、免疫原性を有することが必要である。「アミノ酸配列が免疫原性を有する」とは、該アミノ酸配列からなるポリペプチドを哺乳動物に投与することにより、該ポリペプチドに対する特異的免疫反応（特異的抗体の産生、特異的Ｔ細胞の増殖等）が該哺乳動物内に誘導され得ることを意味する。
上記（２）のポリペプチドに含まれるマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列の長さは、通常６アミノ酸以上、好ましくは１０アミノ酸以上であり、ワクチン接種を受けた哺乳動物の体内にマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ（又はマラリア原虫自体）に対する特異的免疫反応を誘導できる限り、その長さは限定されない。誘導される免疫反応の抗原特異性を高くするため、部分アミノ酸配列の長さは長い方が好ましく、該部分アミノ酸配列の長さは、例えば５０アミノ酸以上、好ましくは１００アミノ酸以上、より好ましくは２００アミノ酸以上である。
上記（２）のポリペプチドに含まれる部分アミノ酸配列は、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのどの部分に由来するものであってもよいが、好ましくは、該部分配列は、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列の第１７−２４０アミノ酸の領域内に含まれるものである。該領域内の部分アミノ酸配列を用いることにより、より強力な感染防御効果を得ることが出来る。
上記（１）又は（２）のポリペプチドは、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列又はその部分配列に加え、１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜１００個程度、より好ましくは１〜１５個程度）の付加的なアミノ酸を含んでいてもよい。このようなアミノ酸付加は、ポリペプチドがマラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに対する特異的免疫反応を誘導する限り許容される。付加されるアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えばポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグを挙げることが出来る。タグとしては、Ｆｌａｇタグ、ヒスチジンタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＡＵ１タグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ等）、イムノグロブリンＦｃタグ等を例示することが出来る。アミノ酸配列が付加される位置は、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼのアミノ酸配列又はその部分配列のＮ末端及び／又はＣ末端である。
上記（３）の発現ベクターにおいては、上述の（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ、好ましくはＤＮＡ）が、投与対象である哺乳動物の細胞内でプロモーター活性を発揮し得るプロモーターの下流に機能的に連結されている。即ち、（３）の発現ベクターは、プロモーターの制御下で、転写産物として（１）又は（２）のポリペプチドを発現し得る。（３）の発現ベクターを哺乳動物に投与することにより、該哺乳動物の体内において（１）又は（２）のポリペプチドが産生され、該哺乳動物に（１）又は（２）のポリペプチドに対する特異的免疫反応が誘導される。
使用されるプロモーターは、投与対象である哺乳動物の細胞内で機能し得るものであれば特に制限はない。プロモーターとしては、ｐｏｌＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩ系プロモーター、ｐｏｌＩＩＩ系プロモーター等を使用することができる。具体的には、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ等のウイルスプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成蛋白質遺伝子プロモーター等が用いられる。
上記（３）の発現ベクターは、好ましくは上述の（１）又は（２）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの下流に転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有する。さらに、形質転換細胞選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有することもできる。
本発明において発現ベクターに使用されるベクターの種類は特に制限されないが、ヒト等の哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクター等を挙げることが出来る。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等が挙げられる。製造及び取り扱いの容易性や経済性を考慮すると、プラスミドベクターが好ましく用いられる。
本発明のワクチンは、上記（１）若しくは（２）のポリペプチド又は（３）の発現ベクターに加え、任意の担体、例えば医薬上許容される担体を含む医薬組成物として提供され得る。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
発現ベクターの細胞内への導入を促進するために、本発明のワクチンは更に核酸導入用試薬を含むことができる。発現ベクターとしてウイルスベクターを使用する場合には、遺伝子導入試薬としてはレトロネクチン、ファイブロネクチン、ポリブレン等を用いることができる。また、発現ベクターとしてプラスミドベクターを使用する場合には、リポフェクチン、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、ＤＯＧＳ（トランスフェクタム）、ＤＯＰＥ、ＤＯＴＡＰ、ＤＤＡＢ、ＤＨＤＥＡＢ、ＨＤＥＡＢ、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）等の陽イオン性脂質を用いることが出来る。
ワクチン効果を増強するために、本発明のワクチンは更にアジュバントを含むことが出来る。該アジュバントとしては、鉱油オイル、アルミニウムゲル等を挙げることができる。
本発明のワクチンは、経口又は非経口的に哺乳動物に対して投与することが出来る。ポリペプチドや発現ベクターは、胃の中で分解され得るので、非経口的に投与することが好ましい。経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解または懸濁すればよい状態で保存することもできる。
医薬組成物中の有効成分の含有量は、通常、医薬組成物全体の約０．１乃至１００重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
本発明のワクチンの投与量は、投与する対象、投与方法、投与形態等によって異なるが、有効成分が上記（１）又は（２）のポリペプチドの場合は、通常成人１人当たりポリペプチドを、一回当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ〜１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。有効成分が上記（３）の発現ベクターの場合は、通常成人１人当たり発現ベクターを、一回当たり１μｇ〜１０００μｇの範囲、好ましくは２０μｇ〜１００μｇの範囲で、通常４週間から１８ヶ月に亘って、２回から３回投与する。
本発明のワクチンを哺乳動物へ投与することにより、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに対する特異的免疫応答（特異的抗体産生、特異的Ｔ細胞の増殖等）が誘導され、該哺乳動物がマラリア感染への抵抗性を獲得する。
本発明のワクチンの投与対象である哺乳動物は、通常、標的とするマラリア原虫が感染し得る哺乳動物である。例えば、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫及び卵形マラリア原虫は霊長類（ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等）に感染するので、これらのマラリア原虫の感染予防を目的とする場合には、本発明のワクチンは霊長類に投与される。また、マウスマラリア原虫はげっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモット等）に感染するので、マウスマラリア原虫の感染予防を目的とする場合には、本発明のワクチンはげっ歯類に投与される。
（ＩＩ）併用ワクチン
また、上記（１）又は（２）のポリペプチドと、上記（３）の発現ベクターとを適量配合して、或いは適量併用して使用することにより、好適なマラリアワクチンを提供することができる。即ち、本発明は上記（１）又は（２）のポリペプチド、及び上記（３）の発現ベクターを組み合わせてなる、マラリアワクチンを提供する。
上記ポリペプチドと上記発現ベクターとの併用に際しては、該ポリペプチドと該発現ベクターの投与時期は限定されず、該ポリペプチドと該発現ベクターとを、投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。該ポリペプチド及び該発現ベクターの投与量は、本発明の併用ワクチンにおいて用いられた際にマラリアの発症を予防し得る範囲で特に限定されず、投与対象、投与ルート、疾患、組み合わせ等により適宜選択することが出来る。
上記ポリペプチドと上記発現ベクターの投与形態は、特に限定されず、投与時に、該ポリペプチドと該発現ベクターとが組み合わされていればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、（２）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での同時投与、（３）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての投与、（４）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での同時投与、（５）上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを別々に製剤化して得られる２種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与（例えば、該ポリペプチド→該発現ベクターの順序での投与、あるいは逆の順序での投与）等が挙げられる。以下、これらの投与形態をまとめて、本発明の併用ワクチンと略記する。
本発明の併用ワクチンは、上記（Ｉ）の本発明のワクチンと同様に、医薬上許容される担体と混合して、常套手段に従って製剤化することができる。
上記ポリペプチドと上記発現ベクターとを同時に製剤化して単一の医薬組成物として使用する場合、本発明の併用ワクチンにおける該ポリペプチドの含有量は、製剤の形態等によって相違するが、通常、医薬組成物全体の約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
また、本発明の併用ワクチンにおける該発現ベクターの含有量は、製剤の形態等によって相違するが、通常、医薬組成物全体の約０．１〜９９．９重量％、好ましくは約１〜９９重量％、さらに好ましくは約１０〜９０重量％程度である。
本発明の併用ワクチンにおける上記ポリペプチドと上記発現ベクターとの配合比は、投与対象、投与ルート、疾患等により適宜選択することができる。
本発明の併用ワクチンの投与量は、上記ポリペプチドおよび上記発現ベクターの種類、投与ルート、症状、患者の年令等によっても異なり、適宜選択することが出来るが、通常は、上記（Ｉ）の本発明のワクチンと同様である。
上記ポリペプチド及び上記発現ベクターをそれぞれ別々に製剤化する場合も同様の含有量でよい。
上記ポリペプチドと上記発現ベクターをそれぞれ別々に製剤化して併用投与するに際しては、該ポリペプチドを含有する医薬組成物と該発現ベクターを含有する医薬組成物とを同時期に投与してもよいが、該発現ベクターを含有する医薬組成物を先に投与した後、該ポリペプチドを含有する医薬組成物を投与してもよいし、該ポリペプチドを含有する医薬組成物を先に投与し、その後で該発現ベクターを含有する医薬組成物を投与してもよい。好ましくは、初回のワクチン接種は上記発現ベクターを含有する医薬組成物の投与により行い、２回目以降のワクチン接種は上記ポリペプチドを含有する医薬組成物の投与により行う。時間差をおいて投与する場合、時間差は投与する有効成分、剤形、投与方法により異なるが、例えば、上記発現ベクターを含有する医薬組成物を先に投与する場合、該発現ベクターを含有する医薬組成物を投与した後、通常２週間〜１２ヶ月以内、好ましくは４週間〜６ヶ月以内に上記ポリペプチドを含有する医薬組成物を投与する方法が挙げられる。上記ポリペプチドを含有する医薬組成物を先に投与する場合、該ポリペプチドを含有する医薬組成物を投与した後、通常２週間〜１２ヶ月以内、好ましくは４週間〜６ヶ月以内に上記発現ベクターを含有する医薬組成物を投与する方法が挙げられる。
本発明の併用ワクチンを哺乳動物へ投与することにより、マラリア原虫ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに対する特異的免疫応答（特異的抗体産生、特異的Ｔ細胞の増殖等）が強力に誘導され、該哺乳動物がマラリア感染への抵抗性を獲得する。本発明の併用ワクチンの投与対象である哺乳動物の態様は、上記（Ｉ）の本発明のワクチンと同一である。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０００８】
（実施例１）
マラリアゲノムの情報から熱帯熱マラリアの遺伝子と相同性が高いマウスマラリア（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の細胞表面タンパク（ＧＰＩアンカータンパク）をｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで９つ選択し（表１）、これらのｃＤＮＡを調製した後に、市販のｐＶＡＸＤＥＳＴ２００ベクターに組み込み、針なし空気圧式の注射器ｓｈｉｍａｊｅｔを用いて５週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮下に投与した。投与量は１匹のマウスあたり４μｇであった（４μｇ／１００μｌ）。２週間の間隔をおいて計３回の同様の投与を行った後、１０日後にＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｙｏｅｌｉｉ  １７ＸＬ  １００万個を腹腔内投与して感染させ、その後の原虫血症と生存数を観察した。
【表１】
2009035160.tif 000002
表１において、遺伝子ＩＤは、Ｔｈｅ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｌａｓｍｏｄｂ．ｏｒｇ／ｐｌａｓｍｏ／ｈｏｍｅ．ｊｓｐ）におけるＩＤ番号を示す。配列番号６で表されるアミノ酸配列は、マウスマラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分アミノ酸配列（第１７−２４０アミノ酸）に相当する。
その結果、対照群では約５日間で全てのマウスがマラリア血症で死亡したが、マウスマラリアのＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼをコードする発現ベクターを投与した群（Ｇ１）においては、３回の独立した試験においてそれぞれ５０％、５７％及び１００％のマウスが生存していた（表２、図１及び２）。ＰＹ０５０００をコードする発現ベクターを投与した群（Ｇ２）においても、マウスの生存率が若干上昇したが、その他の遺伝子の発現ベクターを投与しても、生存率に対する効果はほとんど認められなかった。
ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ群（Ｇ１）においては、原虫血症の発症が強力に抑制された（図３及び４）。ＰＹ０５０００群（Ｇ２）においても、原虫血症の発症が若干抑制されたが、その他の遺伝子の発現ベクターを投与しても、原虫血症の発症はほとんど抑制されなかった。
更なる２回の追加実験においても、同一の効果が確認された（図５〜８）。
ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ群（Ｇ１）においては、マラリア原虫（特に血液段階のマラリア原虫）に対する血中抗体が確認されたことから、この感染防除効果は、生体内において発現されたＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼに対する特異的免疫反応が誘導されたことによるものと考えられた。
以上より、マラリア原虫のＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼ、又はその部分ペプチドをコードする発現ベクターがマラリアワクチンとして極めて有効であることが確認された。
【表２】
2009035160.tif 000003
【産業上の利用可能性】
【０００９】
本発明により、強力且つ調製が簡易な新たなマラリアワクチンが提供される。特に、ＧＰＩ８Ｐトランスアミダーゼの部分ペプチドを発現し得る発現ベクターは、マラリアに対するＤＮＡワクチンとして顕著な効果を示すことから、従来のサブユニットワクチンよりもより安価で安定なマラリアワクチンとして有用である。
本出願は日本で出願された特願２００７−２３９４８８（出願日：２００７年９月１４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
［配列表］
2009035160.tif 000004
2009035160.tif 000005
2009035160.tif 000006
2009035160.tif 000007
2009035160.tif 000008
2009035160.tif 000009
2009035160.tif 000010
2009035160.tif 000011
2009035160.tif 000012
2009035160.tif 000013
2009035160.tif 000014
2009035160.tif 000015
2009035160.tif 000016
2009035160.tif 000017
2009035160.tif 000018
2009035160.tif 000019
2009035160.tif 000020
2009035160.tif 000021
2009035160.tif 000022
2009035160.tif 000023
2009035160.tif 000024
2009035160.tif 000025
2009035160.tif 000026
2009035160.tif 000027
2009035160.tif 000028
2009035160.tif 000029
2009035160.tif 000030
2009035160.tif 000031
2009035160.tif 000032
2009035160.tif 000033
2009035160.tif 000034
2009035160.tif 000035
2009035160.tif 000036
2009035160.tif 000037
2009035160.tif 000038
2009035160.tif 000039
2009035160.tif 000040
2009035160.tif 000041
2009035160.tif 000042
2009035160.tif 000043
2009035160.tif 000044
2009035160.tif 000045
2009035160.tif 000046
2009035160.tif 000047
2009035160.tif 000048
2009035160.tif 000049
2009035160.tif 000050
2009035160.tif 000051
2009035160.tif 000052
2009035160.tif 000053
2009035160.tif 000054
2009035160.tif 000055
2009035160.tif 000056
2009035160.tif 000057
2009035160.tif 000058
2009035160.tif 000059
2009035160.tif 000060
2009035160.tif 000061
2009035160.tif 000062
2009035160.tif 000063
2009035160.tif 000064
2009035160.tif 000065
2009035160.tif 000066
2009035160.tif 000067
2009035160.tif 000068
2009035160.tif 000069
2009035160.tif 000070
2009035160.tif 000071
【図１】
2009035160.tif 000072
【図２】
2009035160.tif 000073
【図３】
2009035160.tif 000074
【図４】
2009035160.tif 000075
【図５】
2009035160.tif 000076
【図６】
2009035160.tif 000077
【図７】
2009035160.tif 000078
【図８】
2009035160.tif 000079
【国際調査報告】
2009035160.tif 000080
2009035160.tif 000081
2009035160.tif 000082
2009035160.tif 000083
2009035160.tif 000084