(57)【要約】本発明は自己免疫性皮膚疾患、特に水疱性類天疱瘡に対する新規な医薬の提供を目的とする。ヒトXVII型コラーゲンに特異的に結合して、ヒトXVII型コラーゲンとこれに対する自己抗体との結合を阻害するポリペプチドを有効成分とする、自己免疫性皮膚疾患治療薬。本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、疾患の原因因子に対する特異性の高いポリペプチドを利用するものであり、ステロイド剤などの従来の治療剤に比べて副作用等の心配が無く、自己免疫性皮膚疾患の発症原因そのものに対して作用するので、当該疾患の根本的な治療法を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトXVII型コラーゲンに特異的に結合して、ヒトXVII型コラーゲンとこれに対する自己抗体との結合を阻害するポリペプチドを有効成分とする、自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【請求項２】
自己抗体がヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に結合する抗体である、請求項１に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【請求項３】
ポリペプチドが、ヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に特異的に結合する抗体の補体活性化領域の一部若しくは全部が欠失し、補体活性化能を有しない抗体断片に相当するポリペプチドである、請求項２に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【請求項４】
ポリペプチドがヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ）’２断片である、請求項３に記載の水疱性類天疱瘡治療剤。
【請求項５】
Ｆａｂ断片が、下記（ａ）〜（ｃ）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の組合せより選ばれるいずれかのＦａｂ断片である、請求項４に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＨ鎖と配列番号２に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＬ鎖
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＨ鎖と配列番号４に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＬ鎖
（ｃ）配列番号５に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＨ鎖と配列番号６に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＬ鎖
【請求項６】
自己免疫性皮膚疾患が水疱性類天疱瘡である、請求項１〜５の何れかに記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は自己免疫性皮膚疾患治療薬、特に水疱性類天疱瘡に対して治療効果を有するポリペプチドからなる医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の高齢化に伴い、自己免疫性皮膚疾患、特に水疱性類天疱瘡患者数の増加が指摘されている。水疱性類天疱瘡は、皮膚科領域において最も頻度の高い自己免疫水疱症の１つであり、その特徴的臨床症状としては、浮腫性紅斑や水疱の発生と破損による糜爛の形成が挙げられる。糜爛が全身に生じると、細菌感染、体内の水分や蛋白などの喪失による全身浮腫、血液中の電解質異常および脱水などを引き起こすことがある。また病理組織学的所見としては、表皮下の水疱、好酸球主体の炎症細胞浸潤、蛍光抗体直接法による基底膜部領域へのIgG、C3の沈着が認められる。【０００３】
水疱性類天疱瘡による水疱は、表皮基底膜部のヘミデスモソームを構成するタンパク質であるXVII型コラーゲン（180kDaの類天疱瘡抗原であり、BP180又はBPAG2とも呼ばれる）及びBP230（230kDa類天疱瘡抗原であり、BPAG1とも呼ばれる）に対する自己抗体が産生されることにより生じる。特に、XVII型コラーゲンのNC16A領域に対する自己抗体が当該領域に結合することによってXVII型コラーゲンの機能が阻害されることが、水疱性類天疱瘡の病因であると考えられている（非特許文献１）。またXVII型コラーゲンは、水疱性類天疱瘡の他に、妊娠性疱疹、瘢痕性類天疱瘡、線状IgA水疱症といった自己免疫性疾患の抗原蛋白質であることも報告されている（非特許文献２）【０００４】
しかし、NC16a領域のどこに自己抗体が結合するのかは個々の患者により異なり、さらに一人の患者は複数の異なるNC16a領域エピトープに対する複数の自己抗体を保有していることが判明している（非特許文献３）。また、病態の発生には、補体成分の表皮下への蓄積と活性化、マスト細胞の脱顆粒、好中球の浸潤等、複雑な要素が絡み合っていることが報告されている。そのため、従来、水疱性類天疱瘡の治療は、副腎皮質ホルモン等のステロイド薬の外用、テトラサイクリン系の抗生物質とニコチン酸アミドの併用又は副腎皮質ホルモン剤の内服による全身投与、あるいは血漿交換療法などの非特異的療法によって行われている。しかしながら、水疱性類天疱瘡を根本的に治癒することのできる方法は現在までのところ報告が無く、前記の治療法でさえ、非特異的な免疫抑制作用による感染症併発や、糖尿病誘発等の副作用が発生するなどの問題を抱えている。
【非特許文献１】清水宏著、「あたらしい皮膚科学」、中山書店、2005年、第218-220頁
【非特許文献２】Yancey KB、The Journal of Clinical Investigation、2005年、第115巻、第825-828頁
【非特許文献３】Fairley JAら、The Journal of Investigation Dermatology、2005年、第125巻、第467-472頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は自己免疫性皮膚疾患、特に水疱性類天疱瘡に対する新規な医薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、水疱性類天疱瘡を発症するモデル動物にXVII型コラーゲンとこれに対する自己抗体との結合を阻害することのできるペプチドを投与することによって、当該モデル動物において水疱性類天疱瘡を治療することができることを確認し、下記の各発明を完成させた。【０００７】
（１）ヒトXVII型コラーゲンに特異的に結合して、ヒトXVII型コラーゲンとこれに対する自己抗体との結合を阻害するポリペプチドを有効成分とする、自己免疫性皮膚疾患治療薬。【０００８】
（２）自己抗体がヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に結合する抗体である、（１）に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。【０００９】
（３）ポリペプチドが、ヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に特異的に結合する抗体の補体活性化領域の一部若しくは全部が欠失し、補体活性化能を有しない抗体断片に相当するポリペプチドである、（２）に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。【００１０】
（４）ポリペプチドがヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に特異的に結合する抗体のＦａｂ断片である、（３）に記載の水疱性類天疱瘡治療剤。【００１１】
（５）Ｆａｂ断片が、下記（ａ）〜（ｃ）のＶＨ鎖及びＶＬ鎖の組合せより選ばれるいずれかのＦａｂ断片である、請求項４に記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＨ鎖と配列番号２に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＬ鎖
（ｂ）配列番号３に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＨ鎖と配列番号４に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＬ鎖
（ｃ）配列番号５に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＨ鎖と配列番号６に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＬ鎖【００１２】
（６）自己免疫性皮膚疾患が水疱性類天疱瘡である、（１）〜（５）の何れかに記載の自己免疫性皮膚疾患治療薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、疾患の発症要因に対する特異性の高いポリペプチドを利用するものであり、ステロイド剤などの従来の治療剤に比べて副作用等の心配が無い。また、非特異的な治療法ではなく、自己免疫性皮膚疾患の発症要因である自己抗体が認識する自己抗原そのものに対して作用するので、当該疾患の根本的な治療法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】COL17レスキューマウスに、水疱性類天疱瘡患者由来の血清から抽出したIgG（図のａ）、IgGとFab断片（図のｂ）、PBS（ネガティブコントロール、図のｃ）をそれぞれ投与したときの水疱発生の様子を示した写真である。
【図２】COL17レスキューマウスに、水疱性類天疱瘡患者由来のIgG（図のａ）、IgGとFab断片（図のｂ）、PBS（ネガティブコントロール、図のｃ）をそれぞれ投与したときの、皮膚切片の染色試験の結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、ヒトXVII型コラーゲンに特異的に結合して、ヒトXVII型コラーゲンとこれに対する自己抗体との結合を阻害するポリペプチドを有効成分とする。その様なポリペプチドとしては、COL17に特異的に結合するポリペプチド、特にCOL17のNC16A領域に特異的に結合するポリペプチドを挙げることができる。  COL17の全アミノ酸配列は公知であり、またNC16A領域も既に特定されている（Gatalica B. ら、 Am J Hum Genet.、1997年、第60巻、第352-365頁）。【００１６】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、ヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に特異的に結合する抗体の補体活性化領域の一部若しくは全部が欠失し、補体活性化能を有しない抗体断片に相当するポリペプチドである。より好ましくは、COL17のNC16A領域に特異的に結合する抗体の可変領域からなる断片（Fab断片、F(ab)'2断片など）である。さらに好ましくは、（ａ）配列番号１に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＨ鎖と配列番号２に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＬ鎖との組合せであるFab断片、（ｂ）配列番号３に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＨ鎖と配列番号４に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＬ鎖との組合せであるFab断片、並びに（ｃ）配列番号５に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＨ鎖と配列番号６に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるＶＬ鎖との組合せであるFab断片である。【００１７】
本発明のポリペプチドは、NC16A領域に特異的に結合する機能を有するが、当該領域に対する自己抗体のような補体活性化領域を持たないポリペプチドであるので、当該ポリペプチドがCOL17に特異的に結合しても患者自身の補体活性化は誘導されない。【００１８】
後に示す実施例から明らかなように、本発明のポリペプチドは、水疱性類天疱瘡を発症するモデル動物に投与されることによって、当該動物において水疱性類天疱瘡の症状である水疱の発生を抑制することができる。特に、本発明のポリペプチドは、COL17のNC16A領域の一つのエピトープを認識して結合するモノクローナル型の特異性を有するポリペプチドであるにも拘わらず、水疱性類天疱瘡を発症するモデル動物に対して、複数種類の自己抗原が加えられた場合でも水疱の発生を抑制することができる。背景技術において述べたように、NC16a領域のどこに自己抗体が結合するのかは個々の患者により異なり、さらに一人の患者は複数の異なるNC16a領域エピトープに対する複数の自己抗体を保有している（非特許文献３）ことからすれば、モノクローナル型の特異性を有するポリペプチドの一種を投与することで、自己抗体の種類によらずに水疱の発生が抑制されることは、全く意外なことであった。【００１９】
また、本発明にかかるポリペプチドは、自己抗体ではなくCOL17に結合し、自己抗体とCOL17との結合を妨げると推測される。従って本発明にかかるポリペプチドは、自己抗体−ポリペプチド複合体を形成せず、その分解速度も遅く、よって持続的な治療効果が期待され得ると期待される。
本発明では、上記に述べた機能を備える限り、数個のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドも、十個以上あるいは数十個以上のアミノ酸残基からなるポリペプチドも利用可能であり、従って本発明にいうポリペプチドについて、構成するアミノ酸残基の個数には格別の制限はない。【００２０】
また、COL17は水疱性類天疱瘡の他に、妊娠性疱疹、瘢痕性類天疱瘡、線状IgA水疱症といった自己免疫性疾患の抗原蛋白質であることも報告されている（前記非特許文献２）。従って本発明にかかるポリペプチドは、妊娠性疱疹、瘢痕性類天疱瘡、線状IgA水疱症といった自己免疫性皮膚疾患に対しても治療効果を有すると期待される。【００２１】
本発明にかかるポリペプチドは、種々の保護基で修飾されたアミノ酸を原料として化学合成的に製造することができる。ポリペプチドを遺伝子や宿主細胞を用いずに有機化学的に合成する方法は当業者に広く知られている。例えば、「第５版 実験化学講座16 有機化合物の合成ＩＶ」（相本三郎ら著、日本化学会編）などは、ポリペプチドの化学合成法を種々紹介しており、本発明のポリペプチドはこれらのいずれの方法を用いても合成することが出来る。また、一般にペプチドシンセサイザーと称される市販機器を用いて合成することもできる。【００２２】
また、本発明にかかるポリペプチドは、それらをコードするDNAに種々の公知の遺伝子組み換え手法を適用することで、当該ポリペプチドを組み換え蛋白質として製造することも可能である。典型的には、本発明にかかるポリペプチドをコードするDNAを適当なDNA合成機を用いて合成し、当該技術分野における参考書、例えばSambrookらのMolecular Cloning：A laboratory Manual、第2版（Cold Spring Harbor laboratory Press、1989年等）に紹介されている種々の手法を適当に選択あるいは組み合わせて本発明のポリペプチドを発現する発現ベクターを構築し、大腸菌等の適当な宿主細胞をこの発現ベクターで形質転換させ、当該ポリペプチドを生産させればよい。その際、His-tagの付加などの様に、組み換えポリペプチドの製造に利用される種々の操作を加えてもよい。【００２３】
さらに、本発明のポリペプチド、特に、ヒトXVII型コラーゲンのNC16A領域に特異的に結合する抗体の補体活性化領域の一部若しくは全部が欠失し、補体活性化能を有しない抗体断片に相当するポリペプチドは、実施例において示すような、水疱性類天疱瘡患者の自己抗体産生Ｂ細胞を基に作製されるファージ抗体ライブラリーから、所望のクローンを選択することで得ることもできる。ファージ抗体ライブラリーの作製法は、例えばBarbasら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1991年、第88巻、第7978−7982頁）によって報告されているように、公知の方法である。【００２４】
本発明にかかるポリペプチドは、遊離のポリペプチドとして利用できるが、蛍光物質や放射性物質等の適当な標識化合物を付したり、種々の化学修飾物質やポリエチレングリコール等の高分子と結合させたり、不溶性担体へ結合させたりして、化学修飾ポリペプチドとして利用してもよい。【００２５】
本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、本発明にかかる前記ポリペプチドの他に、これらの作用を損なわない範囲で、医薬の製剤化のために一般的に利用される種々の賦形剤や他の医薬活性成分、例えば従来用いられてきたステロイド剤や抗生物質等を含んでいてもよい。特に、本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬は、前記ポリペプチドを安定に保持できる緩衝剤を含む剤型、例えばローション、軟膏、クリーム、スプレー、貼付剤等の外用剤、注射剤、シロップ等の液剤、または錠剤等の固形剤として利用されることが好ましい。緩衝剤を含む液剤の非限定的な例としては、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水などを挙げることができる。また、上記の剤型は、例えばグルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の糖質、タンパク質、アミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、浸透圧調節剤、懸濁剤、増粘剤および／または保存剤その他、薬学的に許容可能な種々の成分を含んでいてもよい。【００２６】
本発明の自己免疫性皮膚疾患治療薬の投与量は、患者の年齢、体重等の薬学的要因、さらには疾患の重篤度や疾患部位の範囲等の臨床的要因を基に調節することができるが、概ね0.1mg／kg体重／日〜100.0mg／kg体重／日、好ましくは1.0mg／kg体重／日〜10.0mg／kg、より好ましくは1.0mg／kg体重／日〜5.0mg／kgの範囲内で調節すればよい。【００２７】
次に、非限定的な実施例を示して本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００２８】
＜実施例１＞  Fab断片の調製
１）ファージ抗体ライブラリーの作成
水疱性類天疱瘡患者より末梢血50mlを採取し、Ficollを用いた密度勾配遠心法によって、抹消血から自己抗体産生Ｂ細胞を含む単核球（１×10８個）を分離した。分離した単核球からRNA Eazy Maxi Kit（Qiagen社）を用いて抽出したmRNAを鋳型とし、オリゴdtプライマーを用いた逆転写PCR法によってcDNAレパトアーを作成した。さらに当該cDNAレパトアーを鋳型として、プライマー１（配列番号７）及びプライマー２〜５（配列番号８〜１１）を用いてIgG H鎖を、プライマー６（配列番号１２）及びプライマー７（配列番号１３）を用いてL鎖κ鎖のFab領域遺伝子を、プライマー８（配列番号１４）及びプライマー９（配列番号１５）を用いてL鎖λ鎖のFab領域遺伝子をそれぞれPCR法で増幅して、Ｈ鎖抗体cDNAライブラリー及びＬ鎖抗体ライブラリーを作成した。得られたライブラリーをそれぞれp3MHベクター（Scripps Research Institute）にクローニング後、大腸菌XL-1-Blue株（Stratagene社）に形質転換し、Barbasら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、1991年、第88巻、第7978−7982頁）の方法に従い、ファージ抗体ライブラリーを作成した。【００２９】
２）ファージ抗体ライブラリーからの陽性クローンの選択
ヒトNC16A蛋白質発現ベクター、ヒトNC16A1-3蛋白質発現ベクター、ヒトNC16A1蛋白質発現ベクター、ヒトNC16A2蛋白質発現ベクター、ヒトNC16A2.5蛋白質発現ベクター及びヒトNC16A3蛋白質発現ベクター（すべてウイスコンシン医科大学より供与）を用い、非特許文献３に記載の方法に従い、大腸菌XL-1-Blue株を宿主として組み換えヒトNC16A蛋白質、組み換えヒトNC16A1-3蛋白質、組み換えヒトNC16A1蛋白質、組み換えヒトNC16A2蛋白質、組み換えヒトNC16A2.5蛋白質及び組み換えヒトNC16A3蛋白質をそれぞれ作製し、Marksらの方法（J. Mol. Biol.、1991年、第222巻、第581−597頁）に従ってプレートに固定した。【００３０】
前記１）で作成したファージ抗体ライブラリーを、組み換えヒトNC16Aを固相化したプレート上で37℃、2時間培養した（ステップ１）後、組み換えNC16Aに対する抗原特異性を持たないファージミドを、PBSを含む0.05％ (v／v) Tween-20を用いてプレートから洗浄除去してから、0.1Mトリエチルアミン（Sigma-Aldrich社）を用いてプレートに残ったポジティブファージクローンを回収した（ステップ２）。回収されたポジティブファージクローンを用いて大腸菌XL-1-Blue株（Stratagene社）を形質転換し、得られた形質転換体を培養して、前記Barbasらの方法に従い、ファージ抗体ライブラリーを再度得た（ステップ３）。上記ステップ１〜３を２〜４度繰り返し、組み換えヒトNC16Aに対する抗原特異性の高いファージ抗体クローン（クローンB4、クローン19及びクローン106）を選択した。【００３１】
得られたファージ抗体クローンB4、クローン19及びクローン106で形質転換した大腸菌XL-1-Blue株を培養し、Kobayashiらの方法（J. Dermatol. Sci.、2002年、第30巻、第224−232頁）に従ってヒトCOL17 ELISA法にて該抗体のCOL17に対する親和性と特異性を確認し、高い親和性と特異性が確認されたクローンを選択した。該クローンから制限酵素NheIを用いてgene III領域を除去、セルフライゲーションした後に大腸菌XL-1-Blue株（Stratagene社）に形質転換し、IPTG（Sigma社）を1mM添加したSB培養液で一晩、30℃で培養し、上清中に溶出したFab抗体を遠心分離にて回収した。得られたFab抗体は、His-Trap FF crude Column（GE Healthcare社）を用いて精製し、PBS中で塩析した後、さらにAmicon ultrafiltration（Millipore社）を用いて濃縮した。
また上記Fab遺伝子を含む領域をプライマー１（配列番号７）およびプライマー１０（配列番号１６）を用いてVH領域を、プライマー８（配列番号１４）およびプライマー１１（配列番号１７）を用いてVL領域をともにPCR法にて増幅し、ダイレクトシークエンス法にて塩基配列を決定した。クローンB4は配列番号１及び配列番号２に示された塩基配列からなるFab遺伝子を有し、クローン19は配列番号３及び配列番号４に示された塩基配列からなるFab遺伝子を有し、クローン106については配列番号５及び配列番号６に示された塩基配列からなるFab遺伝子を有していた。
３）Fab抗体のエピトープマッピング【００３２】
前記２）で得られたFab抗体を、組み換えヒトNC16A1-3蛋白質、組み換えヒトNC16A1蛋白質、組み換えヒトNC16A2蛋白質、組み換えヒトNC16A2.5蛋白質及び組み換えヒトNC16A3蛋白質が固相化されたプレートを用いて、HRP標識抗ヒトλ鎖抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories社）あるいはHRP標識抗ヒトκ鎖抗体（Bethyl Laboratories社）を用いたELISA法により、エピトープマッピングを行った。その結果、クローンB4はNC16A2とNC16A2.5に対し反応性が高く、クローン19はNC16A2に対し反応性が高く、クローン106はNC16A1に対し反応性が高いことが判明した。【００３３】
＜実施例２＞治療効果の確認
１）COL17レスキューマウスの作製
マウス129Sv／Evゲノムライブラリー（Stratagene社）から、14.7kbのマウスCOL17遺伝子をクローニングし、さらにそこから11.5kbの制限酵素NheI−NotIフラグメントをサブクローニングした。このフラグメント中にあるエクソン２からイントロン３の部位へPGK／Neoカセットを組み込んでターゲッティングベクター（Stratagene社）を作製し、129Sv／Evマウスの胚性肝細胞に組み換えベクターを導入し、正確にターゲット化された胚細胞をC57BL／6Jマウスのblastcyteに注入してキメラマウスを作製した。このキメラマウスとC57BL／６Jマウスとをさらに交配させ、F1ヘテロ動物を4世代以上にわたってクロスさせてヘテロマウス（COL17ｍ＋／−）を作製した。【００３４】
K14プロモーターの下流へCOL17ｃDNAを組み込むことによって、表皮下層のみに特異的にヒトCOL17を発現するC57BL／６Jをバックグラウンドとするトランスジェニックマウス（COL17ｍ＋／＋、ｈ＋）とヘテロマウス（COL17ｍ＋／−）をクロスさせた。その結果得られたヘテロかつヒトCOL17トランスジーンを有するマウス（COL17ｍ＋／−、ｈ＋）同士をかけ合わせて、COL17レスキューマウス（COL17ｍ−／−、ｈ＋）を作製した。【００３５】
２）Fab断片の水疱性類天疱瘡発症の抑制効果の確認
COL17レスキューマウスの新生仔を３つのグループに分け、グループ１には水疱性類天疱瘡患者から採取した血清より抽出したIgG（50μg/g 体重）を、グループ２には同IgGに加えて、配列番号１に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるVH鎖と配列番号２に示される塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるVL鎖との組合せであるFab抗体（15-60μg/g 体重）を、グループ３にはPBS（ネガティブコントロール）を、それぞれ腹腔内投与した。投与の48時間後に水疱性類天疱瘡の発症を調べた。【００３６】
グループ１には水疱性類天疱瘡の発症が確認されたが、グループ２、３には確認されなかった（図１）。また各グループのマウスの皮膚切片をヘマトキシリン−エオジン染色し病理組織学的に検討したところ、グループ１には水疱性類天疱瘡同様の表皮下水疱の形成が確認されたが、グループ２、３には確認されなかった（図２）。さらに、それぞれのグループのマウスから採取した皮膚切片をFITC標識抗ヒトIgG抗体（Jackson Immunoresearch Laboratories）FITC標識、抗マウスＣ3抗体（Cappel, ICN Pharmaceuticals社）を用いた直接蛍光抗体法で観察したところ、グループ１にはマウスＣ3及びヒトIgGの皮下への蓄積が確認されたが、グループ２、３には確認されなかった。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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