(57)【要約】    【課題】  本発明は、血清、血漿等の生体試料中の低密度リポ蛋白中コレステロール（ＬＤＬ）の測定方法およびその試薬に関する。    【解決手段】  酵素反応による低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法において、第一反応で、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質およびカゼイン、および／または第四級アンモニウム塩、および／またはベタイン化合物を含む緩衝液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、第二反応で、第一反応における上記両酵素の低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質をさらに含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定することを特徴とする方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法であって、
第一反応で、以下の（ａ）〜（ｄ）を含む緩衝液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、以下の（ａ）〜（ｅ）を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する、
低密度リポ蛋白中のコレステロール測定方法。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
（ｄ）カゼイン、および／または、第四級アンモニウム塩、および／または、ベタイン化合物
（ｅ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
【請求項２】
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項３】
コール酸誘導体が３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドまたはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドより選択される１種または複数である請求項２項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項４】
第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項５】
第一反応において２価金属イオンを含有する請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項６】
第四級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリンである請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項７】
ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体である請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項８】
第一反応においてさらに脂肪酸を含有する請求項１〜７項のいずれかに記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項９】
第一反応および第二反応のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない請求項１項記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれかに記載の、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法に用いるための試薬であって、
第一試薬に、以下の（ａ）〜（ｃ）および緩衝液を含み、かつ、
第一試薬と第二試薬とを合わせた組成物に、以下の（ａ）〜（ｅ）を含むように構成されている、低密度リポ蛋白中のコレステロール測定試薬。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
（ｄ）カゼイン、および／または、第四級アンモニウム塩、および／または、ベタイン化合物
（ｅ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清、血漿等の生体試料中の低密度リポ蛋白中コレステロール（ＬＤＬ）の測定方法およびその試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
血清中の脂質の主な成分は、コレステロール、中性脂肪、リン脂質等である。これら血清脂質はアポ蛋白と結合してリポ蛋白を形成し、血液中を循環している。このリポ蛋白は密度の差により高密度リポ蛋白（ＨＤＬ）、ＬＤＬ、超低密度リポ蛋白（ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）等に分類される。これらリポ蛋白のうち、ＨＤＬは組織に沈着した過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、抗動脈硬化作用がある。一方、ＬＤＬは肝臓から各組織へのコレステロールの主たる運搬体であり、ＬＤＬの増加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられている。このことから、ＬＤＬ中のコレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）は、動脈硬化症、虚血性心疾患（冠動脈疾患）の危険因子と考えられ、ＬＤＬ−Ｃの含有量を知ることは、これら疾患の診断、治療、および予防において重要である。【０００３】
従来、ＬＤＬ−Ｃの測定法としては、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法、算出式による算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈殿法、超遠心法及び電気泳動法は、沈殿・遠心分離処理、超遠心分離処理、電気泳動処理により、ＬＤＬとＬＤＬ以外のリポ蛋白とを分離する前処理工程が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査分野で広く普及している自動分析機だけで直接測定を実施することができないという問題点がある。また、フリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の式で知られている総コレステロール値、ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）値及び中性脂肪値から算出する算出法も、中性脂肪高値試料を用いた場合には食事の影響等を受け、正確なＬＤＬ−Ｃ量を測定、算出することができないという問題点がある。【０００４】
これに対し、これらの問題点を解消する方法としてＬＤＬ−Ｃを遠心分離等の前処理なく自動分析機で直接測定する方法が開発されてきている。ポリアニオンを含むリポ蛋白凝集剤を用いた方法として、特許文献１には、ＬＤＬのみを凝集させる水溶性ポリマーの存在下でＬＤＬ−Ｃの凝集によって上昇する反応液濁度を測定する方法が開示されている。また、特許文献２には、ＬＤＬを一旦凝集させた後ＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去し、さらに凝集したＬＤＬを解凝集させ、ＬＤＬ−Ｃを酵素反応させてＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている。特許文献３には、ＬＤＬのみを反応阻害する試薬の存在下でＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを消去した後に残存したＬＤＬ−Ｃを反応させ検出する、あるいはＨＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを凝集させてＨＤＬ−Ｃを反応消去した後にＬＤＬのみに作用する酵素を用いてＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている。特許文献４、特許文献５にはＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールの酵素反応を抑制するシクロデキストリン誘導体を用いる方法が開示されている。しかし、これらポリアニオンおよび２価金属イオンを含むリポ蛋白凝集剤を用いた方法は、凝集体の濁りの散乱光を吸光度として測定することから特異性、精密性が劣る。またポリアニオンおよび２価金属イオンを含むリポ蛋白凝集剤と自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じることから、排液ラインがつまり自動分析機の故障もしくは他測定項目の正確性、精密性に悪影響をもたらす。
【特許文献１】特許２７４９００９号
【特許文献２】特許３１０７４９２号
【特許文献３】特許３２５６２４１号
【特許文献４】特開平１０−３１１８３３
【特許文献５】特開平１１−３０６１７
【０００５】
界面活性剤を用いた方法として、特許文献６には、第一工程でＨＬＢ値が１３〜１５のポリアルキレンオキサイド誘導体等の界面活性剤を用いてＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールを全て反応させた後に残存したＬＤＬ−Ｃを第二工程で別種の界面活性剤を用いて反応させ検出する方法が開示されている。しかし、ここで用いられる界面活性剤はＨＤＬ−Ｃにはよく作用するが、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する作用は充分ではなく、２価金属イオンを大過剰存在させる必要があり、前述のごとく自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じ、自動分析機への適用性に問題が生じる。特許文献７には、血清に対しポリオキシエチレンアルキレンフェニルエーテル及びポリオキシエチレンアルキレントリベンジルフェニルエーテルから選ばれる界面活性剤、コレステロール測定用酵素試薬を添加し、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中コレステロールを優先的に反応させた後、その後の反応量を測定することでＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている。本法においても、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する作用は充分ではなく、ＶＬＤＬ、ＣＭに対する反応性を増強するためにポリアニオンおよび２価金属を必要とすることから、前述のごとく自動分析機のアルカリ性のセル洗浄液との反応により沈殿物が生じ、自動分析機への適用性に問題が生じる。特許文献８には両性界面活性剤とカルボキシル基またはスルホン酸基を有する脂肪族アミン類の存在下でＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法が開示されている。また、特許文献９には両性界面活性剤とポリアニオンの存在下でＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法が開示されている。これらの方法は、第一反応においてＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ等のＬＤＬ以外のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を抑制し第二反応でＬＤＬ−Ｃのみを特異的に測定する方法であるが、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭに対する反応抑制が十分でなく測定値が高値化するという問題点がある。また、特許文献１０には、ＬＤＬのみに作用する化学修飾酵素を用いてＬＤＬ−Ｃを選択的に反応させ検出する方法も開示されている。
【特許文献６】特許３０５８６０２号
【特許文献７】特許３１９３６３４号
【特許文献８】特開平１０−８４９９７
【特許文献９】特開平２０００−６０６００
【特許文献１０】特開平１０−８０３００
【０００６】
また、特許文献１１には、生体試料と膵臓由来コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを、アルブミンが測定系全体の０．０１重量％以上及び胆汁酸又はその塩が存在する条件下で反応させ、その後微生物由来コレステロールエステラーゼを作用させ測定する方法が開示されている。この方法は、第一反応においてＨＤＬ−Ｃは酵素反応により測定系外に導き、ＶＬＤＬ、ＣＭはアルブミンにより酵素反応を阻害し、第二反応においてＬＤＬ−Ｃを特異的に測定する方法であるが、ＶＬＤＬ、ＣＭを多く含む乳び検体においては、ＶＬＤＬ、ＣＭが高濃度であるため、アルブミンのこれらに対する酵素反応の阻害が不十分となり測定値が高値化してしまうという問題点がある。また、第一試薬と第二試薬に、由来の異なるコレステロールエステラーゼを作用させることから、酵素使用量が多くなることになり経済性に問題がある。また、特許文献１２には、被検試料中のＬＤＬ以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去する第１工程をアルブミンの存在下に行い、次いで、被検試料中の残存コレステロールを定量し、ＬＤＬ−Ｃを測定する方法が開示されている。この方法は、第一反応でアルブミンを作用させ、ＶＬＤＬ、ＣＭ酵素反応後の分解物のＬＤＬへの吸着を抑えＬＤＬ−Ｃの非特異的消去による測定値低下を回避するが、一方でアルブミンはＨＤＬ−ＣおよびＶＬＤＬ−Ｃの消去反応を阻害することから問題である。
【特許文献１１】特開平１１−９３００
【特許文献１２】特開２００１−２２４３９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このことから、本発明が解決しようとする課題は、遠心分離、電気泳動等の前処理の必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能であり、高濃度のＶＬＤＬ、ＣＭの存在下でも特異性、精密性よくＬＤＬ−Ｃを測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討した結果、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応で測定する手段において、
第一反応でＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに作用する、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼ、これらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質を含む緩衝液中で、高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、さらに、第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定することで、ＬＤＬ−Ｃを簡便に、特異性、精密性良く分別測定できることを見出した。また、本測定法ではポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく、自動分析機への適用性が優れていることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法であって、
第一反応で、以下の（ａ）〜（ｄ）を含む緩衝液中で、試料中の高密度リポ蛋白、超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールを優先的に消去した後、
第二反応で、以下の（ａ）〜（ｅ）を含む緩衝液中で、低密度リポ蛋白中のコレステロールを測定する、
低密度リポ蛋白中のコレステロール測定方法。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
（ｄ）カゼイン、および／または、第四級アンモニウム塩、および／または、ベタイン化合物
（ｅ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
（２）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である（１）記載の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
（３）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドまたはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドより選択される１種または複数である（２）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（４）コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である（２）または（３）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（５）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（６）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２モル）ポリオキシエチレンデシルエーテルである（５）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（７）第一反応において２価金属イオンを含有する（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（８）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（７）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（９）第四級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１０）ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体、である（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１１）第一反応においてさらに脂肪酸を含有する（１）〜（１０）のいずれかの低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
（１２）第一反応および第二反応のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない（１）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１３）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（１２）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法
（１４）（１）ないし（１３）のいずれかに記載の、試料中の低密度リポ蛋白中のコレステロールを酵素反応を利用して測定する方法に、用いるための試薬であって、
第一試薬に、以下の（ａ）〜（ｃ）および緩衝液を含み、かつ、
第一試薬と第二試薬とを合わせた組成物に、以下の（ａ）〜（ｅ）を含むように構成されている、低密度リポ蛋白中のコレステロール測定試薬。
（ａ）コレステロールエステラーゼ、
（ｂ）コレステロールオキシダーゼ、
（ｃ）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、
（ｄ）カゼイン、および／または、第四級アンモニウム塩、および／または、ベタイン化合物
（ｅ）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を、軽減または消失せしめる物質
（１５）コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼおよびこれらの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質が、コール酸誘導体である（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１６）コール酸誘導体が、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドまたはＮ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドより選択される１種または複数である（１５）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１７）コール酸誘導体の第一反応中の濃度が、０．０１〜０．２％である（１５）または（１６）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１８）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテルより選択される１種または複数である（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（１９）第一反応におけるコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白中のコレステロールに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質が、ポリオキシプロピレン（２モル）ポリオキシエチレンデシルエーテルである（１８）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２０）第一試薬に２価金属イオンを含有する（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２１）２価金属イオンが、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンである（２０）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２２）第４級アンモニウム塩が、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリン、である（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２３）ベタイン化合物が、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体、である（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２４）第一試薬にさらに脂肪酸を含有する（１４）〜（２３）のいずれかの低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法。
（２５）第一試薬および第二試薬のいずれにおいても、ポリアニオンを含有しない（１４）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
（２６）ポリアニオンが、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩である（２５）の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定試薬
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、遠心分離、電気泳動等の試料の前処理を行なう必要性がなく、種々の自動分析機に適用可能であり、高濃度のＶＬＤＬ、ＣＭの存在下でも特異性、精密性よくＬＤＬ−Ｃを測定する方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明で用いるコレステロールオキシダーゼ（コレステロールを酸化して過酸化水素を生成する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、ノカルディア属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明においては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＬＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
コレステロールオキシダーゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましい下限は、第一試薬中で通常０．５Ｕ／ｍＬ、好ましくは１Ｕ／ｍＬである。好ましい上限は通常１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。【００１１】
本発明に用いるコレステロールエステラーゼ（コレステロールエステルを加水分解する能力を有する酵素）は、その起源は特に限定されないが、例えば、キャンディダ属、シュードモナス属等の微生物、牛膵臓等動物臓器に由来する物等を用いることができる。これらは市販のものを入手することが出来る。
本発明においては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性がＬＤＬ−Ｃに対するよりも良好な酵素を用いるのが好ましい。
また、これら酵素のＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性を向上させる目的でポリエチレングリコールを主成分とする基、単糖、水溶性のオリゴ糖残基、スルホプロピル基などで上記酵素を化学的に修飾したものが用いられる。
また、遺伝子操作によってこれらの遺伝子を取り、別の微生物に導入して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体、あるいはこれらの遺伝子を改変して発現させた酵素またはこれらを化学的に修飾した修飾体等も好適に用いられる。
コレステロールエステラーゼの使用量は特に限定されるものではないが、好ましい下限は、第一試薬中で通常０．０１Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．０５Ｕ／ｍＬである。好ましい上限は通常１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは５Ｕ／ｍＬである。【００１２】
なお、本発明で用いるコレステロールオキシダーゼおよびコレステロールエステラーゼは、いずれも「第一反応でＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに実用上十分に作用する酵素」を意味する。すなわち、「第一反応でＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールのいずれかに対して十分に作用しない」酵素は本願発明の方法および試薬に使用することはできない。
「実用上十分」とは、血清試料中に標準的に含まれるとされる濃度の、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭそれぞれのコレステロールに作用し、これを消去するに十分であることをいう。【００１３】
本発明で用いる、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質としては、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールに対する反応性への影響が実質的になく、ＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させるものであれば特に限定はない。
このような物質として例えばコール酸誘導体がある。コール酸誘導体としては、特に限定されないが、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、グリココール酸、リトコール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、１２−オキソリトコール酸、１２−オキソケノデオキシコール酸、７−オキソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、デヒドロコール酸等およびこれらの塩が挙げられる。塩としては、例えばアンモニウム塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等が挙げられる。好ましくは、少ない添加量でＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させ得ることから、Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドおよびその塩が良い。また、これらのコール酸誘導体より選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。これらの使用量としては特に限定されるものではないが、コール酸誘導体の総量として第一試薬中で通常０．００１〜５％の範囲で用いられ得るが、好ましくは限界ミセル濃度（ｃ．ｍ．ｃ）付近かそれ以下で使用するのがよい。これは、これらコール酸誘導体の本来ある界面活性剤としての作用が反って本発明の期待するコレステロールエステラーゼおよび／またはコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応阻害効果を弱めることに起因する。
限界ミセル濃度の測定は電気伝導度、浸透圧、氷点降下、蒸気圧、粘度、密度、可溶化能、洗浄力、光散乱、色素の変化などの物理性質の急変点を測定することで測定が可能である。例えば、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸の限界ミセル濃度は、０．５０％（ｗ／ｖ）であり、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸は０．５１％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミドは０．２６％（ｗ／ｖ）であり、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミドは０．１２％（ｗ／ｖ）であることが知られている。したがって、これらの好ましい使用量としては０．０１〜０．６％である。また、その他のコール酸誘導体についても同じく限界ミセル濃度を知ることで使用量の最適化が可能である。【００１４】
本発明において「阻害」とは、ＬＤＬを凝集させることなく、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼのＬＤＬに対する反応性を低下させることを意味する。【００１５】
本発明で用いるカゼインは公知のものならば特に限定なく用いられる。該カゼインとしては乳タンパク質の主体をなすもので乳に酸を加えてｐＨ４．６にする等電点沈澱することにより調製される酸性カゼインが好適に用いられる。該酸性カゼインは一般に電気泳動的にα、β、γの３成分に分離できるがα、β、γのいずれでもよくまた２種類以上の混合物として用いることも可能である。さらに加熱、加圧等の物理的分解、酸・アルカリ等での化学的分解、タンパク質分解酵素での酵素的分解により低分子化したものも同様に用いることができる。カゼイン分解物としてはブロックエース（雪印社製）が市販されている。これらの使用量は特に限定されるものではないが、第一試薬中で通常０．０５〜１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．２〜３％（ｗ／ｖ）である。【００１６】
本発明で用いる第四級アンモニウム塩としては特に限定されないが、塩化コリン、臭化コリン、塩化アセチルコリンなどが挙げられる。これらの使用量は、第一試薬中で通常０．０５〜２０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．２〜５％（ｗ／ｖ）である。【００１７】
本発明で用いるベタイン化合物としては特に限定されないが、ベタイン、アルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、これらの誘導体等が挙げられる。これらの使用量は、第一試薬中で通常０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０２〜０．３％（ｗ／ｖ）である。【００１８】
本発明では第一反応におけるＶＬＤＬ、ＣＭ中のリポ蛋白コレステロールの消去能を向上させる目的で、遊離脂肪酸を含有するのが好ましい。遊離脂肪酸としては特に限定されないが、ブチル酸、バレリアン酸、カプロン酸、ヘプチル酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、オレイン酸、パルミチン酸、パルミトイル酸、マルガリン酸、ステアリン酸、バクセン酸、リノール酸、リノレイン酸、エレステアリン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ネルボン酸、セロチン酸、モンタン酸、メリシン酸およびこれらの塩が挙げられる。これらの使用量は特に限定されるものではないが、第一試薬中で通常０．０００５〜０．１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．００２〜０．０３％（ｗ／ｖ）である。【００１９】
一方、ポリアニオン等の凝集剤等もＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させるものであるが、自動分析機への適用性に悪影響を及ぼすことから、添加しないかまたは前述の自動分析機で用いられるアルカリ性洗剤との共存により濁りまたは沈殿が生じない程度に添加することができる。しかし、好ましくは添加しない方がよい。このようなポリアニオンとしては、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン流酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリルアミド、またはこれらの塩が挙げられる。
これらの使用量としては、反応終濃度として０〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０〜０．５％（ｗ／ｖ）である。【００２０】
本発明で用いる２価金属イオンとしては、第一反応におけるＨＤＬ−Ｃまたは第二反応におけるＬＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させることを目的として、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、マンガンイオン、ニッケルイオン、銅イオン、鉄イオンが用いられるが、好ましくは、マグネシウムイオン、カルシウムイオンが好適である。また、これらの２価金属イオンは選択される１種を用いてもよいし、または複数を組合わせて用いてもよい。これらの使用量は、自動分析機への適用性を考慮し、第一試薬中で通常０．０００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．００５〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。また、第ニ試薬中で通常０．０００５〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．００１〜０．１ｍｏｌ／Ｌ、更に好ましくは０．００５〜０．０５ｍｏｌ／Ｌである。【００２１】
本発明のコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質とは、第一試薬中におけるＬＤＬ−Ｃに対する阻害を、当該物質を含む第二試薬の添加により軽減または消失が可能なものであれば特に限定されないが、好ましくはポリオキシプロピレンポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルより選択される１種または複数を組合わせて用いられる。更に好ましくはポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類より選択される１種または複数を組合わせて用いられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としては、エマルゲンＡ６０（ＨＬＢ：１２．８）、エマルゲンＡ９０（ＨＬＢ：１４．５）、エマルゲンＢ６６（ＨＬＢ：１３．２）等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７（ＨＬＢ：１０）、エマレックスＤＡＰＥ０２１０（ＨＬＢ：１１）、エマレックスＤＡＰＥ０２１２（ＨＬＢ：１２）、エマレックスＤＡＰＥ０２１５（ＨＬＢ：１３）、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１４）、エマレックスＤＡＰＥ０２２０（ＨＬＢ：１５）等が挙げられる。ポリオキシアルキレンアルキルエーテルとしてはエマルゲンＬＳ−１０６（ＨＬＢ：１２．５）、エマルゲンＬＳ−１１０（ＨＬＢ：１３．４）、エマルゲンＬＳ−１１４（ＨＬＢ：１４．０）、エマルゲンＭＳ−１１０（ＨＬＢ：１２．７）等が挙げられる。これら界面活性剤のＨＬＢは「新界面活性剤」、堀内博著、昭和６１年、三共出版編で公知であるが、ＨＬＢの範囲として通常、１０〜１５であり、好ましくは１０〜１３、更に好ましくは１０〜１２である。これらの使用量は特に限定されるものではないが、自動分析機への適用性を考慮し、第ニ試薬中で通常０．００５〜１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、更に好ましくは０．０５〜０．３％（ｗ／ｖ）である。【００２２】
本発明で用いる色原体としては特に限定されないが、水素供与体、ロイコ体、テトラゾリウム塩などが挙げられる。【００２３】
水素供与体としては、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジアミン等が挙げられる。また、これら水素供与体はカップラーと組合わせて用いることができる。カプラーとしては４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。【００２４】
また、ロイコ体としては、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。【００２５】
また、テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。【００２６】
色原体の使用量としては、溶解度を考慮して反応終濃度として０．０１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。【００２７】
本発明では、さらにＬＤＬ−Ｃに対する特異性、精密性を損なわない範囲で、界面活性剤を共存させることができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤または／および両性イオン界面活性剤が好適に用いられる。【００２８】
本発明で用いる非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＢ−３０等が挙げられる。【００２９】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ  ＯＰ−３０、等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ  ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ  ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０等が挙げられる。ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ  ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ  ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。【００３０】
本発明で用いる両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、等が挙げられる。【００３１】
また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＮ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、３−〔Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ〕−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−〔４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２−ヒドロキシ−３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシ−３−プロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノニ酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン（Ｂｉｃｉｎｅ）、Ｎ−〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、などが例示される。第一試薬における該緩衝液のｐＨはＬＤＬ−Ｃに対する反応性を低下させる目的で６〜９の範囲で調整される。さらには７〜８．５が好ましい。また、第二試薬は、第二試薬との混合したときのｐＨを考慮し、ＬＤＬ−Ｃに対する反応性を向上させる目的で６．０〜７．５が好ましい。これらの使用量は、通常０．０１〜０．２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０２〜０．１ｍｏｌ／Ｌである。【００３２】
本発明において、防腐剤、塩類、酵素安定化剤、色原体安定化剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等が挙げられる。抗生物質としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコール等が挙げられる。抗菌剤としては、イミダゾリジニルウレア等が挙げられる。塩類としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アルミニウム等が挙げられる。酵素安定化剤としては、シュークロース、トレハロース、シクロデキストリン、グルコン酸塩、アミノ酸類等が挙げられる。色原体安定化剤としては、エチレンジアミン四酢酸およびその塩等のキレート剤、シクロデキストリン等が挙げられる。【００３３】
本発明において、第一反応におけるＨＤＬ、ＶＬＤＬ及びＣＭ中のコレステロールを優先的に消去する方法としては、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼの作用により生成した過酸化水素を、例えばカタラーゼ、またはペルオキシダーゼと前述の色原体、またはペルオキシダーゼと前述のカプラーを用いて消去することができるが、特に限定されない。【００３４】
本発明の一実施態様として、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、カタラーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、ペルオキシダーゼ、カプラー、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質、２価金属イオン等を構成するＬＤＬ−Ｃ測定試薬がある。【００３５】
また、第一試薬に、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、色原体、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼの低密度リポ蛋白に対する反応性を阻害する物質、２価金属イオン等を構成し、第二試薬に、カプラー、コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼのＬＤＬ−Ｃに対する阻害作用を軽減または消失せしめる物質、２価金属イオン等を構成するＬＤＬ−Ｃ測定試薬がある。
【実施例】
【００３６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
下記組成１〜１０のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し下記測定条件で、試料としてヒト血清より精製したＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭを測定し、各測定値より各々のリポ蛋白中のコレステロール濃度を１００％として相対％を求めた。また、比較例として下記組成１１のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の検討を行なった。尚、精製リポ蛋白画分の調製はＨａｔｃｈ  ａｎｄ  Ｌｅｅｓの方法の、３種の密度液を用い超遠心分離にて分離・分取した。
（試薬の調製）
下記組成１〜１１のＬＤＬ−Ｃ測定試薬をそれぞれ調製した。【００３７】
組成１
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製）  ０．２％
カゼイン（和光純薬）  ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００３８】
組成２
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製）  ０．２％
ブロックエース（雪印社製）  ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００３９】
組成３
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製）  ０．２％
カゼイン（和光純薬）  ２．５ｇ／Ｌ
塩化コリン  ３ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００４０】
組成４
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製）  ０．２％
カゼイン（和光純薬）  ２．５ｇ／Ｌ
ベタイン一水和物  ３ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００４１】
組成５
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製）  ０．２％
カゼイン（和光純薬）  ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００４２】
組成６
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）  ０．２％
カゼイン（和光純薬）  ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００４３】
組成７
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（同仁化学社製）  ０．２％
カゼイン（和光純薬）  ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００４４】
組成８
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）コラミド（同仁化学社製）  ０．２％
カゼイン（和光純薬）  ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００４５】
組成９
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコラミド（同仁化学社製）  ０．２％
カゼイン（和光純薬）  ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００４６】
組成１０
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
タウロコール酸ナトリウム（ナカライテスク社製）  ０．２％
オレイン酸ナトリウム（ナカライテスク社製）  ０．０１％
カゼイン（和光純薬）  ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  １Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシアルキレンアルキルエーテル（エマルゲンＭＳ−１１０：花王社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００４７】
組成１１
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸（同仁化学社製）  ０．２％
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製）    ０．３％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００４８】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料２．４μＬに第一試薬  １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６００ｎｍ主波長、８００ｎｍ副波長で吸光度を測定した。ＬＤＬ−Ｃ濃度未知試料のＬＤＬ−Ｃ濃度の算出は、精製水および１１０ｍｇ／ｄＬ  ＬＤＬ−Ｃ標準血清の測定吸光度より算出して求めた。【００４９】
【表１】
2008087896.tif 000002
【００５０】
結果    表１に示す。実施例の組成１〜４はいずれもＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異反応は５．０％以下であり、良好な特異性が確認された。一方、比較例の組成５はＬＤＬ−Ｃの回収率が不良であり、ＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中のコレステロールに対する非特異が大きい。この原因としては、ＬＤＬ−Ｃが第一反応において大部分が消去され、一方、相対的にＨＤＬ、ＶＬＤＬ、ＣＭ中の未消去のコレステロール量の比率が高くなったものと考えられる。【００５１】
（実施例２）
実施例１に示す組成１〜１０のＬＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例１に示す測定条件で、試料として血清２０検体を測定した。また、比較例として組成１１のＬＤＬ−Ｃ測定試薬を調製し実施例と同様の測定を行なった。各試薬における測定値は、当該検体の総コレステロール値（東洋紡社製  コレスカラー・リキッド使用）、ＨＤＬ−Ｃ値（第一化学社製  分画剤試液により分画した試料を東洋紡社製  コレスカラー・リキッドで測定）及び中性脂肪値（東洋紡社製  リピドス・リキッド）を測定し、フリーデワルド（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）の計算式を用いて算出したＬＤＬ−Ｃ値を対照として相対％を求めた。【００５２】
【表２】
2008087896.tif 000003
【００５３】
【表３】
2008087896.tif 000004
【００５４】
結果    表２に測定値を示し、表３に対照の測定値に対する相対％を示す。各組成の相対％は、実施例の組成１で８３．２〜１１３．６％、組成２で９０．４〜１１０．７％、組成３で９２．２〜１０７．１％、組成４で９５．２〜１０８．９％、組成５で９５．９〜１０４．０％、組成６で９４．６〜１０４．８％、組成７で９６．６〜１０４．９％、組成８で９７．８〜１０７．１％、組成９で９７．７〜１０３．６％、組成１０で９８．５〜１０３．６％と良好であった。一方、比較例では、組成１１で５１．２〜２０５．４％と特異性に問題があった。【００５５】
（実施例３）
実施例１に示す組成６、１０のＬＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例１に示す測定条件で、試料として血清９容に対し干渉チェックＡプラス・乳び（シスメックス社製）を３００００ホルマジン濁度に調製した試料を１容添加したもの、および乳びに変えてブランク用試料を添加したものを各々測定し、乳び３０００ホルマジン濁度の測定値をブランク用試料の測定値に対する相対％として求め、乳びの影響を算出した。また、比較例として、実施例１で示す組成１１および以下の組成１２のＬＤＬ−Ｃ測定試薬にて実施例と同様の測定を行なった。【００５６】
組成１２
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化マグネシウム  １０ｍｍｏｌ／Ｌ
エマルゲンＢ６６（花王社製）  ０．２％
牛血清アルブミン（シグマ）  ２．５ｇ／Ｌ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡社製ＣＯＥ−３１１）  ０．１Ｕ／ｍＬ
コレステロールオキシダーゼ（東洋紡社製ＣＯＯ−３２１）  ３Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（ロッシュ社製  微生物由来）  １００Ｕ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン    ０．１ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ  ５０ｍＭ  ｐＨ７．５
エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム塩  ０．２ｍｍｏｌ／Ｌ
塩化カルシウム  ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
トリトンＸ−１００  ２．０％
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１）  ８Ｕ／ｍＬ
Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（同仁化学社製）    ０．４ｇ／Ｌ【００５７】
【表４】
2008087896.tif 000005
【００５８】
結果    表４に相対％を示す。各組成の相対％は、実施例の組成６で９５．８％、組成１０で１００．０％、と良好であった。一方、比較例では、組成１１で８９．６％、組成１２で８６．３％と乳びの影響がみられた。比較例においては第一反応、第二反応を通じて徐々に吸光度の低下がみられた。この要因として、乳びに多く存在するＶＬＤＬ、ＣＭが第一反応でコレステロールエステラーゼなどの作用を受けＶＬＤＬ、ＣＭが徐々に可溶化するがその作用は遅く第一反応時間内では十分消去されないことから検体に起因する試薬の濁りが残存することになる。その後、第二試薬添加後、残存した濁りは第二試薬の界面活性剤により非特異的に可溶化し濁度（吸光度）が低下することから、負の誤差が生じたものと考察する。【００５９】
なお、実施例１における組成１〜１１、および、実施例３における組成１２の主要構成を表５にまとめた。【００６０】
【表５】
2008087896.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明の低密度リポ蛋白中コレステロールの測定方法は、血中の低密度リポ蛋白中コレステロールを、高濃度の超低密度リポ蛋白及びカイロミクロン中のコレステロールの存在下でも、簡便に、特異性、精密性良く分別測定でき、ポリアニオン等の公知のリポ蛋白凝集剤を用いる必要がなく自動分析機への適用性が優れていることから、特に動脈硬化症等の臨床検査の分野においてより的確で迅速な診断を行なうことができる。
【国際調査報告】
2008087896.tif 000007
2008087896.tif 000008