(57)【要約】本発明の目的は、多糖類の効果を維持しつつ多糖類を低分子化できる方法及び低分子化多糖類を提供することである。本発明は、二酸化チタンの存在下で多糖類に可視領域の光を照射して多糖類を低分子化する方法に関する。本発明方法において、多糖類は、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸の少なくともいずれかを含むことが好ましい。なお、照射される可視領域の光のエネルギー量は、１ＭＪ以上２０ＭＪ以下であることも好ましい。また、二酸化チタンを、前記多糖類１ｇに対し０．１ｇ以上１０ｇ以下の範囲内で用いることも好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
二酸化チタンの存在下で多糖類に可視領域の光を照射して多糖類を低分子化する方法。
【請求項２】
前記多糖類は、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸の少なくともいずれかを含む、請求項１記載の多糖類を低分子化する方法。
【請求項３】
照射される前記可視領域の光のエネルギー量は、１ＭＪ以上２０ＭＪ以下である請求項１記載の多糖類を低分子化する方法。
【請求項４】
前記多糖類はヘパリンであって、
照射される前記可視領域の光のエネルギー量は、５ＭＪ以上１２ＭＪ以下である請求項１記載の多糖類を低分子化する方法。
【請求項５】
前記多糖類はコンドロイチン硫酸であって、
照射される前記可視領域の光のエネルギー量は、１ＭＪ以上２０ＭＪ以下である請求項１記載の多糖類を低分子化する方法。
【請求項６】
前記二酸化チタンを、前記多糖類１ｇに対し０．１ｇ以上１０ｇ以下の範囲内で用いる請求項１記載の多糖類を低分子化する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により製造された、低分子化多糖類。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖類を低分子化する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸といった多糖類は、保湿、血液凝固阻止、細胞増殖制御、免疫活性調節等の作用を有し、近年、化粧品、医薬品、健康食品等多岐にわたり用いられている。なかでもヘパリンは、セリンプロテアーゼインヒビターであるアンチトロンビンに結合し、抗血液凝固活性を示すことから、臨床の場で抗血液凝固剤として広く用いられている。また、コンドロイチン硫酸及びヒアルロン酸は、変形性関節炎に対する抗炎症作用や皮膚の老化防止作用が期待され、健康食品として広く用いられている。【０００３】
ところで、上記多糖類は、一般に大きな分子量を有する高分子であり、医薬品あるいは健康食品として用いる場合、その薬理活性、生理活性を発現するために水溶性であることが必要であり、より低分子化された多糖類とすることが重要である。さらにヘパリンの場合は、高分子であることに起因すると考えられる副作用ヘパリン起因性血小板減少症（ＨＩＴ）の発症を抑える観点からも、低分子化することが重要である。また、コンドロイチン硫酸においても、腸管からの吸収性を高めるために、低分子化することが重要である。【０００４】
なお、多糖類を低分子化する技術としては、例えば下記特許文献１乃至５、非特許文献１乃至３に記載がある。【０００５】
例えば下記特許文献１、２には、亜硝酸を用いることによりヘパリンを低分子化する技術が記載されている。また下記特許文献３、４には、２価の金属と過酸化水素によりヘパリンを低分子化する技術が記載されている。また下記特許文献５には、酵素へパリチナーゼによりヘパリンを低分子化する技術が記載されている。更に、下記特許文献６には、二酸化チタン触媒を使用して高圧水銀灯の光照射によりヒアルロン酸ナトリウムを低分子化する技術が記載されている。また下記非特許文献１には、塩基を用いたベータ脱離反応を利用してヘパリンを低分子化する技術が記載されている。そして非特許文献２には、過酸化物を用いたラジカル反応によりヘパリンを低分子化する技術が記載されている。【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ２００６／０１１１７９号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ  １９９８／０１４４８１号公報
【特許文献３】国際公開ＷＯ  １９８２／００３６２７号公報
【特許文献４】特開平１１−１３０８０１号公報
【特許文献５】特開平１０−２１９００２号公報
【特許文献６】特開２０００−２９６１７４号公報
【非特許文献１】Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，（２００６）  ３４６（３）：９４６−９５７
【非特許文献２】Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、（２００５）、３４４（２）：１９３−２０３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記特許文献、非特許文献に記載の技術では、ヘパリンを低分子化することはできるが、低分子化された多糖類の構造に不飽和結合、あるいはグリコシド結合以外での開裂を発生させてしまい、また、糖鎖の構造変化、硫酸基の脱離なども起こってしまうためヘパリン本来の効果が低下してしまうといった課題がある。なお、上記特許文献５には、放線菌由来の酵素を用いるため医薬品として用いる場合、特に過大なる安全性試験が求められ製品コストを上昇させてしまうといった課題がある。又、上記特許文献６に記載の技術では、高圧水銀灯からの光照射に含まれる紫外線によって生じるフェトン反応（過酸化水素と、同イオン又は鉄イオン等の金属イオンとの反応）を利用して、ヒドロキシラジカルを生成させて高分子を分解する非常に激しい方法である。その為に、多糖におけるグリコシド結合以外の共有結合の切断、脱炭酸化、脱硫酸化及び脱アミノ化等が起こり、その結果、得られる低分子化物は、元のヒアルロン酸とは異なる構造を有する物質となってしまい、もはや、「ヒアルロン酸オリゴ糖」と呼べる物質ではない。【０００８】
そこで、本発明は、上記課題を鑑み、多糖類の作用・効果を維持しつつ安全に多糖類を低分子化できる新規な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
即ち、本発明は上記課題を解決するための一の手段として、以下の各態様に係るものである。
［態様１］
二酸化チタンの存在下で多糖類に可視領域の光を照射して多糖類を低分子化する方法。
［態様２］
前記多糖類は、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸の少なくともいずれかを含む、態様１記載の多糖類を低分子化する方法。
［態様３］
照射される前記可視領域の光のエネルギー量は、１ＭＪ以上２０ＭＪ以下である態様１記載の多糖類を低分子化する方法。
［態様４］
前記多糖類はヘパリンであって、
照射される前記可視領域の光のエネルギー量は、５ＭＪ以上１２ＭＪ以下である態様１記載の多糖類を低分子化する方法。
［態様５］
前記多糖類はコンドロイチン硫酸であって、
照射される前記可視領域の光のエネルギー量は、１ＭＪ以上２０ＭＪ以下である態様１記載の多糖類を低分子化する方法。
［態様６］
前記二酸化チタンを、前記多糖類１ｇに対し０．１ｇ以上１０ｇ以下の範囲内で用いる態様１記載の多糖類を低分子化する方法。
［態様７］態様１〜７のいずれか一項に記載の方法により製造された、低分子化多糖（オリゴ糖）類。【００１０】
ここで、「多糖類」とは、天然に見出される単糖類、すなわち中性、酸性、塩基性のアルドース、ケトースを構成糖とし、それらがグリコシド結合によって重合した高分子をいう。この多糖類の例としては、限定されるわけではないが、例えばコンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸等を挙げることができる。またここで「可視領域の光」とは、波長が３５０ｎｍ以上７５０ｎｍ以下の範囲にある光をいう。かかる可視領域の光は、当業者に公知の任意の手段、例えば、高圧水銀ランプを光源として使用し、パイレレックス製ガラスフィルターにより紫外線をカットすることにより、容易に得ることができる。【００１１】
また、本手段において、限定されるわけではないが、多糖類は、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸の少なくともいずれかを含むことが好ましい。【００１２】
また、本手段において、限定されるわけではないが、照射される前記可視領域の光のエネルギー量は１ＭＪ以上２０ＭＪ以下であることが好ましく、多糖類がヘパリンの場合、５ＭＪ以上１２ＭＪ以下であることは好ましい。【００１３】
また、本手段において、限定されるわけではないが、二酸化チタンは、前記多糖類１ｇに対し０．１ｇ以上１０ｇ以下の範囲内の量用いられることも好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
以上、本発明により、多糖類の構造及び作用・効果を維持しつつ多糖類を低分子化できる方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】化合物１に対してＨＰＬＣを行った結果を示す図である。
【図２】化合物１及び低分子化を行わなかったヘパリンのＮＭＲスペクトルである。
【図３】化合物１に対する抗血液凝固活性測定を行った結果を示す図である。
【図４】化合物２に対してＨＰＬＣを行った結果を示す図である。
【図５】化合物２に対する抗血液凝固活性測定を行った結果を示す図である。
【図６】化合物３に対してＨＰＬＣを行った結果を示す図である。
【図７】化合物３に対する抗血液凝固活性測定を行った結果を示す図である。
【図８】化合物４に対してＨＰＬＣを行った結果を示す図である。
【図９】化合物４に対する抗血液凝固活性測定を行った結果を示す図である。
【図１０】化合物５対してＨＰＬＣを行った結果を示す図である。
【図１１】化合物５に対する抗血液凝固活性測定を行った結果を示す図である。
【図１２】化合物６に対してＨＰＬＣを行った結果を示す図である。
【図１３】化合物６及び低分子化を行わなかったコンドロイチン硫酸のＮＭＲスペクトルである。
【図１４】化合物６に対するＴ細胞分化誘導作用測定を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態について、詳細に説明する。なお本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例に限定されないことはいうまでもない。【００１７】
本実施形態に係る多糖類の低分子化は、二酸化チタンの存在下で多糖類に可視領域の光を照射することを特徴の一つとする。【００１８】
多糖類としては、天然に見出される単糖類、すなわち中性、酸性、塩基性のアルドース、ケトースを構成糖とし、それらがグリコシド結合によって重合した高分子である限りにおいて限定されるわけではないが、例えばコンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸等をあげることができる。低分子化される前の多糖類の分子量としては、天然物由来である限り限定されるわけではないが、５，０００以上１，０００，０００以下であることが好ましく、より好ましくは１０，０００以上２００，０００以下である。尚、本発明における「低分子化」の程度に特に制限はなく、元の多糖の種類及びその分子量、並びに低分子化の目的等に基づき、当業者が適宜設定することができる。例えば、元の多糖類の分子量の４０〜８５％程度の分子量になるまで分子量が低下することを意味する。【００１９】
また、本実施形態における多糖類は、そのまま用いることもできるが、反応効率、回収率の観点から溶媒に溶解されていることも好ましい。溶媒としては、多糖類を溶解できる限りにおいて限定されることは無いが、安全性、溶解性の観点から水、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等であることが好ましい。また、溶媒に溶解される多糖類の濃度としては、分解反応を進行させることができる限りにおいて限定されるわけではないが、例えば０．１ｍｏｌ／ｌ以上１０ｍｏｌ／ｌ以下の範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｏｌ／ｌ以上５ｍｏｌ／ｌ以下の範囲である。【００２０】
ここで二酸化チタンは、可視領域の光を受けて触媒として作用する。二酸化チタンの量としては、限定されるわけではないが、例えば低分子化の対象となる多糖類１ｇに対し、０．１ｇ以上１０ｇ以下の範囲にあることが好ましく、より好ましくは０．５ｇ以上２ｇ以下である。【００２１】
また、本実施形態において用いられる可視領域の光としては、多糖類の分解反応が進行する限りにおいて限定されないが、波長の範囲としては、例えば３５０ｎｍ以上５００ｎｍ以下であることが好ましく、より好ましくは３６０ｎｍ以上４００ｎｍ以下である。また、この光のエネルギー量としても、多糖類の分解反応が進行する限りにおいて限定されるわけではないが、低分子化による効果を十分得ることができる一方多糖類としての作用を十分維持する観点から、１ＭＪ以上２０ＭＪ以下の範囲内であることが好ましく、より好ましくは５ＭＪ以上１０ＭＪ以下の範囲内である。更に、限定されるわけではないが、多糖類がヘパリンの場合、高分子であることにより生じる副作用を防止する一方、抗血液凝固活性作用を維持する観点から、５ＭＪ以上１２ＭＪ以下の範囲内にあることが好ましく、多糖類がコンドロイチン硫酸の場合、高分子であることにより生じる副作用を防止する一方、免疫賦活作用を維持する観点から、１ＭＪ以上２０ＭＪ以下の範囲内にあることが好ましく、多糖類がヒアルロン酸の場合、高分子であることにより生じる副作用を防止する一方、水分保持作用を維持する観点から、１ＭＪ以上２０ＭＪ以下の範囲内にあることが好ましい。【００２２】
なお、本実施形態に係る低分子化は、限定されるわけではないが、弱酸性（ｐＨ４〜７）から弱アルカリ性（ｐＨ７〜１０）の雰囲気中で行われることが好ましく、より好ましくはｐＨ７である。【００２３】
以上、本実施形態に係る方法は、可視領域の光を照射することで、ガンマ線、紫外線などといった人体に有害な光を使用せず、また、安全性の高い食品添加物として承認され、広く用いられている二酸化チタン（ＴｉＯ２）を光触媒として用いているため、緩和な条件下、例えば室温、中性条件で行うことができる。更に、可視領域の光を照射するために、低分子化が緩和な条件下で起こり、その為に、低分子化された多糖類の構造に不飽和結合の発生やグリコシド結合以外での開裂を発生させることが極めて少ない。また、糖鎖の構造変化、硫酸基の脱離なども殆ど起こらず、多糖類本来の効果を高く維持することができる。即ち、従来の方法において生ずる不飽和結合の導入や糖鎖の構造変化による活性低下といった課題を極力抑えることができ、元の多糖類の構造、及び作用・効果を維持しつつ安全に多糖類を低分子化できる方法を提供することができる。
【実施例】
【００２４】
上記説明した多糖類の低分子化について、実際に実験を行い、効果を確認した。以下に説明する。【００２５】
（実施例１：ヘパリンの低分子化）
（化合物１）
まず、平均分子量２０，０００のヘパリン（セルサス社製、アメリカ合衆国オハイオ州）１ｇを、２０ｍｌの水（溶媒）に溶かし、試料溶液を得た。次に、二酸化チタン（日本薬局方「製造専用」、和光社製）１ｇを添加し、波長３７０ｎｍ、５００Ｗの強度の光を１８０分間照射した。そして、この照射後の試料溶液に対し、遠心分離による二酸化チタンの除去及び凍結乾燥を行うことで、白色の化合物１を得た。尚、本発明の実施例で使用する可視領域の光は、せん光工業社（大阪、日本）製高圧水銀ランプを使用し、パイレレックス製ガラスフィルターにより紫外線をカットして得ている。【００２６】
次に、この得られた化合物１に対し、溶離液として０．１ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ７の緩衝液及びゲル濾過用ＨＰＬＣカラム（アサヒパックＧＦ５１０、内径８ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を用いて、検出器には示差屈折計を用い、溶離液の流速０．５ｍｌ／分のもと、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。この結果を図１に示す。なお図１中、横軸の数字は保持時間を示す。この結果、上記の方法を経由していないヘパリンについては分子量の変化は当然ない一方で、上記の反応を経由した化合物１は分子量が８，０００程度減少していることが確認できた。【００２７】
また、アルドリッチ社製の純度１００％の重水０．７ｍｌに５ｍｇの完全に乾燥した上記化合物１を溶解し、ＮＭＲスペクトルを測定した（日本電子社製ＧＳＸ５００αを使用）。測定条件は共鳴周波数５００ＭＨｚ、観測幅１０，０００Ｈｚ、積算回数３００回、パルス幅１２μｓ、温度４５℃とした。そして得られたスペクトルから、化合物１の構造解析を行った。この結果を図２ａに示す。また、比較対象として、反応させる前のヘパリンに対して同様に行ったＮＭＲによる構造解析の結果を図２ｂに示す。この結果、図２ａでは図２ｂの反応前のヘパリンのスペクトルと比べて、各シグナルの線幅がシグナル高さに対して小さく、可視光線照射による二酸化チタンとの反応によって、ヘパリンが低分子化されていることが予想された。また図２ａと２ｂに観測されたシグナルはまったく同一であることが確認できた。即ち、反応前と反応後において構造変化がないことを確認した。【００２８】
更に、上記得られた化合物１に対し、抗血液凝固活性測定を行った。抗血液凝固活性の測定は、クロモザイムＴを発色基質としてヒト血清を用いて行った。この結果を図３に示す。この結果、血液凝固阻止活性の値は１６２ＵＳＰ単位／ｍｇであり、ヘパリン本来の抗血液凝固作用は大きく低減していないことが確認できた。【００２９】
（化合物２）
本化合物は化合物１とほぼ同じであるが、可視領域の光の照射時間が異なる。即ち、化合物１では、波長３７０ｎｍ、５００Ｗの強度の光を１８０分間照射したのに対し、化合物２では６０分間照射した点のみ異ならせた。この結果、本実施例において白色の化合物２を得ることができた。【００３０】
また、この結果得られた化合物２に対しても化合物１と同じ測定を行った。ＨＰＬＣの結果を図４に、抗血液凝固活性測定の結果を図５にそれぞれ示す。なお図４における横軸及び縦軸の示す物理量は図１と同様であり、図５における横軸及び縦軸の示す物理量は図３と同様である。【００３１】
ＨＰＬＣの結果によると、本実施例の方法を経由していないヘパリンについては分子量の変化は当然ない一方で、本実施例の方法を経由した化合物２は３，０００程度減少していることが確認できた。【００３２】
なお、ＮＭＲによる構造解析の結果は、反応前のヘパリンのスペクトルと比べて、各シグナルの線幅がシグナル高さに対して小さく、可視光線照射による二酸化チタンとの反応によって、ヘパリンが低分子化されていることが予想された。【００３３】
また、抗血液凝固活性測定の結果によると、この結果、抗血液凝固活性の値は１７１ＵＳＰ単位／ｍｇであり、ヘパリン本来の抗血液凝固作用は大きく低減していないことが確認できた。【００３４】
（化合物３）
本化合物は化合物１とほぼ同じであるが、可視領域の光の照射時間が異なる。即ち、化合物１では、波長３７０ｎｍ、５００Ｗの強度の光を１８０分間照射したのに対し、化合物３では１２０分間照射した点のみ異ならせた。この結果、本実施例において白色の化合物３を得ることができた。【００３５】
また、この結果得られた化合物３に対しても化合物１と同じ測定を行った。ＨＰＬＣの結果を図６に、抗血液凝固活性測定の結果を図７にそれぞれ示す。なお図６における横軸及び縦軸の示す物理量は図１と同様であり、図７における横軸及び縦軸の示す物理量は図３と同様である。【００３６】
ＨＰＬＣの結果によると、本実施例の方法を経由していないヘパリンについては分子量の変化は当然ない一方で、本実施例の方法を経由した化合物３は、６，０００程度減少していることが確認できた。【００３７】
なお、ＮＭＲによる構造解析の結果は、反応前のヘパリンのスペクトルと比べて、各シグナルの線幅がシグナル高さに対して小さく、可視光線照射による二酸化チタンとの反応によって、ヘパリンが低分子化されていることが予想された。【００３８】
また、抗血液凝固活性測定の結果によると、この結果、抗血液凝固活性の値は１６８ＵＳＰ単位／ｍｇであり、ヘパリン本来の抗血液凝固作用は大きく低減していないことが確認できた。【００３９】
（化合物４）
本化合物は化合物１とほぼ同じであるが、可視領域の光の照射時間が異なる。即ち、化合物１では、波長３７０ｎｍ、５００Ｗの強度の光を１８０分間照射したのに対し、化合物４では２４０分間照射した点のみ異ならせた。この結果、本実施例において白色の化合物４を得ることができた。【００４０】
また、この結果得られた化合物３に対しても化合物１と同じ測定を行った。ＨＰＬＣの結果を図８に、抗血液凝固活性測定の結果を図９にそれぞれ示す。なお図８における横軸及び縦軸の示す物理量は図１と同様であり、図９における横軸及び縦軸の示す物理量は図３と同様である。【００４１】
ＨＰＬＣの結果によると、本実施例の方法を経由していないヘパリンについては分子量の変化は当然ない一方で、本実施例の方法を経由した化合物４は、１０，０００程度減少していることが確認できた。【００４２】
なお、ＮＭＲによる構造解析の結果は、反応前のヘパリンのスペクトルと比べて、各シグナルの線幅がシグナル高さに対して小さく、可視光線照射による二酸化チタンとの反応によって、ヘパリンが低分子化されていることが予想された。【００４３】
また、抗血液凝固活性測定の結果によると、この結果、抗血液凝固活性の値は１５０ＵＳＰ単位／ｍｇであり、ヘパリン本来の抗血液凝固作用は大きく低減していないことが確認できた。【００４４】
（化合物５）
本化合物は化合物１とほぼ同じであるが、可視領域の光の照射時間が異なる。即ち、化合物１では、波長３７０ｎｍ、５００Ｗの強度の光を１８０分間照射したのに対し、化合物５では３６０分間照射した点のみ異ならせた。この結果、本実施例において白色の化合物５を得ることができた。【００４５】
また、この結果得られた化合物５に対しても化合物１と同じ測定を行った。ＨＰＬＣの結果を図１０に、抗血液凝固活性測定の結果を図１１にそれぞれ示す。なお図１０における横軸及び縦軸の示す物理量は図１と同様であり、図１１における横軸の示す物理量は図３と同様である。【００４６】
ＨＰＬＣの結果によると、本実施例の方法を経由していないヘパリンについては分子量の変化は当然ない一方で、本実施例の方法を経由した化合物５は、１２，０００程度減少していることが確認できた。【００４７】
なお、ＮＭＲによる構造解析の結果は、反応前のヘパリンのスペクトルと比べて、各シグナルの線幅がシグナル高さに対して小さく、可視光線照射による二酸化チタンとの反応によって、ヘパリンが低分子化されていることが予想された。【００４８】
また、抗血液凝固活性測定の結果によると、この結果、抗血液凝固活性の値は１４４ＵＳＰ単位／ｍｇであり、ヘパリン本来の抗血液凝固作用は大きく低減していないことが確認できた。【００４９】
（実施例２：コンドロイチン硫酸の低分子化）
（化合物６）
まず、平均分子量５０，０００のコンドロイチン硫酸（サメ軟骨由来、生化学工業社製、東京）１ｇを、２０ｍｌの水（溶媒）に溶かし、試料溶液を得た。次に、二酸化チタン１ｇを添加し、波長３７０ｎｍ、５００Ｗの強度の光を３６０分間照射した。そして、この照射後の試料溶液に対し、遠心分離による二酸化チタンの除去、および凍結乾燥を行うことで、白色の化合物６を得た。【００５０】
次に、この得られた化合物６に対し、溶離液として０．１ｍｏｌ/ｌの塩化ナトリウムを含むｐＨ７の緩衝液、ゲル濾過用ＨＰＬＣカラム（アサヒパックＧＦ５１０、内径８ｍｍ、長さ３０ｃｍ）を用いて、検出器には示差屈折計を用い、溶離液の流速０．５ｍｌ／分の元、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行った。この結果を図１２に示す。なお図１２において横軸の数字は保持時間を示し、縦軸の数字は示差屈折計の任意の応答強度を示す。この結果、上記の方法を経由していないコンドロイチン硫酸については分子量の変化は当然ない一方で、上記の反応を経由した化合物６は分子量が２５，０００程度減少していることが確認できた。【００５１】
また、上記化合物６に対し、アルドリッチ社製の純度１００％の重水０．７ｍｌに５ｍｇの完全に乾燥した化合物６を溶解し、日本電子社製ＧＳＸ５００αを用いてＮＭＲスペクトルを測定した。測定条件は共鳴周波数５００ＭＨｚ、観測幅１０，０００Ｈｚ、積算回数３００回、パルス幅１２μｓ、温度４５℃である。得られたスペクトルから、化合物６の構造解析を行った。この結果を図１３ａに示す。また、比較対象として、反応させる前のコンドロイチン硫酸に対して同様に行ったＮＭＲによる構造解析の結果を図１３ｂに示す。この結果、図１３ａでは図１３ｂの反応前のコンドロイチン硫酸のスペクトルと比べて、各シグナルの線幅がシグナル高さに対して小さく、可視光線照射による二酸化チタンとの反応によって、コンドロイチン硫酸が低分子化されていることが予想された。また図１３ａと図１３ｂに観測されたシグナルはまったく同一であることが確認できた。即ち、反応前と反応後において構造変化がないことを確認した。【００５２】
更に、上記得られた化合物６に対し、コンドロイチン硫酸が示すマウス胸腺由来Ｔ細胞分化誘導作用の測定を行った。マウス胸腺由来Ｔ細胞分化誘導作用の測定は、１０週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、２週間に２度のアジュバンド、オブアルブミンの静脈内注射を行い、脾臓細胞を活性化し、本来のコンドロイチン硫酸、あるいは化合物６を脾臓細胞の培地に添加した。１週間培養することによって培地に放出されたサイトカイン類を測定キットにより定量し、１型２型ヘルパーＴ細胞への誘導活性を調査した。この結果を図１４に示す。この結果、コンドロイチン硫酸本来のＴ細胞の分化を制御する作用は大きく低減していないことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
本発明方法は、多糖類を含む製品、例えば医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物に対して適用可能であり、これらに関連する分野で産業上の利用可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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