(57)【要約】  効率的にターゲッティングし、薬物徐放性に優れ、かつ肝臓集積を低減することにより副作用を軽減させた低分子薬物含有ナノ粒子を提供することであり、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、これをポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られる陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、これをポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られる陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項２】
さらに、塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする請求項１に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項３】
さらに界面活性剤を配合することからなる請求項１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項４】
粒子の直径が２０〜３００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである請求項１〜３のいずれかに記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項５】
金属イオンが、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン又はコバルトイオンの１種又は２種以上である請求項１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項６】
陰荷電基を持つ低分子薬物が、前記金属イオンにより疎水化されるためのリン酸基、硫酸基又はカルボキシル基を有していることを特徴とする請求項１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項７】
陰荷電基を持つ低分子薬物が、抗炎症性ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタグランジン又はその誘導体、抗微生物薬又は抗癌薬である請求項１、２又は６に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項８】
ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体の重量平均分子量が３，０００〜３０，０００である請求項１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項９】
塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである請求項２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項１０】
界面活性剤が、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体から選択される１種又は２種以上のものである請求項３に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子。
【請求項１１】
請求項１〜１０に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子を有効成分とする非経口投与用製剤。
【請求項１２】
製剤が静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤又は噴霧剤である請求項１１に記載の非経口投与用製剤。
【請求項１３】
陰荷電基を持つ低分子薬物と金属イオンを溶媒中で混合して疎水性薬物とし、この混合液中にポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体を加えて混合することを特徴とする請求項１に記載された陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３の製造方法において、さらに塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする請求項１３に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法。
【請求項１５】
塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである請求項１４に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物含有ナノ粒子に関し、さらに詳しくは患部ターゲッティング及び徐放性に優れ、かつ肝臓集積を低減し、血中滞留性を高めた陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、乳酸・グリコール酸共重合体（以後、「ＰＬＧＡ」と記す場合もある）、または乳酸重合体（以後、「ＰＬＡ」と記す場合もある）のマイクロ粒子ないしナノ粒子に薬物を封入する研究が種々行われている。【０００３】
例えば、米国特許第４６５２４４１号公報（特許文献１）には生物活性ポリペプチドを含有するＰＬＧＡ等のマイクロカプセル及びその製法が開示されている。また、特表平１０−５１１９５７号公報（特許文献２）には、種々の薬物を含有する血管内投与可能なＰＬＧＡ等のナノ粒子が開示されている。さらに、特開平８−２１７６９１号公報（特許文献３）には、水溶性ペプチド性生理活性物質の水不溶性又は水難溶性多価金属塩を、ＰＬＧＡ等のマイクロカプセルに封入した徐放性製剤が開示されている。【０００４】
しかしながら、これらの先行特許においては、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化したのち、ＰＬＡ又はＰＬＧＡとポリエチレングリコール（以後、「ＰＥＧ」と記す場合もある）とを結合したＰＬＡ−ＰＥＧブロック共重合体又はＰＬＧＡ−ＰＥＧブロック共重合体に封入することについてはなんら言及されていない、【０００５】
本特許出願人による出願である国際公開ＷＯ２００３／１０１４９３号公報（特許文献４）には、薬物をＰＬＧＡ又はＰＬＡの微粒子に封入し、当該微粒子の表面に界面活性剤を吸着させた製剤が記載されている。また、同じく本特許出願人による出願である国際公開ＷＯ２００４／８４８７１号公報（特許文献５）には、金属イオンにより疎水化した陰荷電基を持つ低分子医薬品をＰＬＧＡ又はＰＬＡナノ粒子に封入し、当該ナノ粒子の表面に界面活性剤を吸着させた製剤が記載されている。【０００６】
しかしながら、特許文献４に開示されている微粒子は薬物の封入率が低く、初期バーストを生じるため徐放性が不充分であり、また、特許文献５に開示されているナノ粒子は封入率が向上され、初期バーストが改善されたものの、静脈投与において薬物が肝臓に滞留するという不都合が生じた。【０００７】
ポリ乳酸又はポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体とポリエチレングリコールとからなるブロックコポリマーに関しては、特開昭５８−１９１７１４号公報（特許文献６）に親水性ポリマーであるポリエチレングリコールと、疎水性ポリマーであるポリ乳酸とのブロックコポリマーについて記載されており、また特開平９−１５７３６８号公報（特許文献７）にポリ乳酸−ポリエチレングリコール−ポリ乳酸からなる三元ブロック共重合体の精製方法が記載されている。【０００８】
ポリ乳酸又はポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体とポリエチレングリコールとからなるブロックコポリマーを医薬組成物の素材として利用した例としては、特開平２−７８６２９号公報（特許文献８）には、乳酸及び／又はグリコール酸の共重合体とポリエチレングリコールとの共重合体にポリペプタイドを含有された医薬組成物が記載されており、特開平９−１５１１３６号公報（特許文献９）には、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体と蛋白質の含有溶液について記載されている。【０００９】
しかしながら、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、これをポリ乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体、又はポリ（乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体とを作用させることにより得られる陰荷電基を持つ低分子薬物を含有するナノ粒子については知られていない。【００１０】
そこで本特許出願人は、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、これをポリ乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体、及びポリ乳酸又はポリ（乳酸／グリコール酸）共重合体とを作用させることにより得られるナノ粒子に封入することにより、患部ターゲッティング及び徐放性に優れ、なおかつ肝臓集積を低減し、血中滞留性を高めた薬物含有ナノ粒子について特許出願した（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２３８２０）。【００１１】
【特許文献１】米国特許第４６５２４４１号公報
【特許文献２】特表平１０−５１１９５７号公報
【特許文献３】特開平８−２１７６９１号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００３／１０１４９３号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００４／８４８７１号公報
【特許文献６】特開昭５８−１９１７１４号公報
【特許文献７】特開平９−１５７３６８号公報
【特許文献８】特開平２−７８６２９号公報
【特許文献９】特開平９−１５１１３６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、前記ＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２３８２０の発明をさらに改良したものであり、陰荷電基を持つ低分子薬物を患部に効率的にターゲッティングし、薬物徐放性に優れ、かつ肝臓集積を低減することにより副作用を軽減させた、特にＰＣＴ／ＪＰ２００６／３２３８２０比べて徐放性に優れた陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子を提供することを課題とする。【００１３】
かかる課題を解決するべく、本発明者らは鋭意検討した結果、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、ポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体とを作用させることにより得られる陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子が、患部ターゲッティング及び徐放性に優れ、なおかつ肝臓集積を低減し、血中滞留性に優れ、特に徐放性に優れることを確認して、本発明を完成するに至った。
特に、本発明は、ポリＤＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体の代わりにＬ体であるポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体を使用することにより徐放性効果が一層優れていることが特徴である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
したがって本発明は、患部ターゲッティング及び徐放性に優れ、肝臓集積を低減することにより副作用を軽減し、さらに血中滞留性に優れた陰荷電基を持つ低分子薬物を含有するナノ粒子を提供する。
さらに本発明は、当該ナノ粒子を有効成分とする静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、噴霧剤などの非経口投与用製剤を提供する。【００１５】
より具体的には、本発明は以下の構成からなる。すなわち、
（１）陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、これをポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られる陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（２）さらに、塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする上記１に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（３）さらに界面活性剤を配合することからなる上記１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（４）粒子の直径が２０〜３００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである上記１〜３のいずれかに記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（５）金属イオンが、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン又はコバルトイオンの１種又は２種以上である上記１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（６）陰荷電基を持つ低分子薬物が、前記金属イオンにより疎水化されるためリン酸基、硫酸基又はカルボキシル基を有していることを特徴とする上記１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（７）陰荷電基を持つ低分子薬物が、抗炎症性ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタグランジン又はその誘導体、抗微生物薬又は抗癌薬である上記１、２又は６に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（８）ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体の重量平均分子量が３，０００〜３０，０００である上記１又は２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（９）塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである上記２に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（１０）界面活性剤が、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体から選択される１種又は２種以上のものである上記３に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子；
（１１）上記１〜１０に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子を有効成分とする非経口投与用製剤；
（１２）製剤が静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤又は噴霧剤である上記１１に記載の非経口投与用製剤；
（１３）陰荷電基を持つ低分子薬物と金属イオンを溶媒中で混合して疎水性薬物とし、この混合液中にポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体を加えて混合することを特徴とする上記１に記載された陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法；
（１４）上記１３の製造方法において、さらに塩基性低分子化合物を混合することを特徴とする上記１３に記載された陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法；
（１５）塩基性低分子化合物が、（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミンから選択される１種又は２種以上のものである上記１４に記載の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子の製造方法；【００１６】
すなわち本発明は、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、この疎水化された薬物を、ポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることによりナノ粒子に封入した陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子を作製することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明が提供する陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、陰荷電基を持つ低分子薬物を患部ターゲッティングし、薬物の徐放性に優れ、さらに肝臓集積を低減することにより副作用を軽減し、さらにまた血中滞留性に優れており、特に徐放性において優れている。ポリＤＬ−乳酸又はポリ（ＤＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体の代わりにＬ体であるポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体を使用する場合に徐放性効果が一層優れていることが本発明の特徴である。
したがって、これまで十分に達成されていなかった陰荷電基を持つ低分子薬物のターゲッティング及び徐放性を向上させ、さらに肝臓集積による副作用を軽減し、さらに血中濃度を向上させるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】実施例４における、ローダミンを封入したナノ粒子の細胞内取り込みの蛍光顕微鏡写真である。  図中、写真Ａ）はローダミンのみ添加、写真Ｂ）はＰＬＬＡのみから調製されたローダミン及びＰＧＥ１封入ナノ粒子、写真Ｃ）はＰＬＬＡ及びＰＤＬＬＡ−ＰＥＧから調製したローダミン及びＰＧＥ１ナノ粒子の濃度分布を表す。なお、スケールバーは５０μｍを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の態様である陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、陰荷電基を持つ低分子薬物を金属イオンにより疎水化し、この疎水化した薬物をポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、及びポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と作用させることにより得られる。また、界面活性剤を配合してもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化することができる。【００２０】
本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、ナノ粒子を形成するために使用する生分解性高分子として、Ｌ異性体であるポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体を使用することをひとつの特徴とする。
ポリ−Ｌ−乳酸はポリ−ＤＬ−乳酸に比し、有機溶媒への溶解性が異なり、また結晶性が高いことが知られている。本発明では、ポリ−Ｌ−乳酸を、ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体と共に混合しナノ粒子を形成させることにより、ポリ−Ｌ−乳酸の水相での結晶化を抑止し、安定に分散可能なナノ粒子を調製することができる。
ポリ−Ｌ−乳酸は、アセトンに不溶性であるため、その溶解性を上げるために、アセトン／ジオキサンあるいはアセトン／テトラヒドロフランの混合液を使用して、ナノ粒子を調製した。【００２１】
上記の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、界面活性剤を配合していてもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化し、粒子間の凝集を抑止することができる。【００２２】
上記により提供される本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、噴霧剤などの非経口投与用製剤とすることにより、投与することができる。【００２３】
本発明が提供する陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、以下のとおり作製することができる。
すなわち、陰荷電基を持つ低分子薬物と金属イオンを、有機溶媒又は含水有機溶媒の溶媒中で混合して疎水性薬物とし、この混合液中にポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、さらにポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体を加えて攪拌し、この溶液を水中に添加、拡散することにより調製することができる。【００２４】
また、ポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体、さらにポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体を溶媒に溶解した溶液と、陰荷電基を持つ低分子薬物の水溶液、及び金属イオン水溶液を同時に加えて混合しても同様のナノ粒子を調製することができる。【００２５】
ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体をナノ粒子の表面修飾剤として用いることで、ポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体の水相における結晶化を抑制し、その結果、粒子の大きさが均一で安定なナノ粒子を得ることができる。【００２６】
使用される金属イオンとしては、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン、ニッケルイオン、ベリリウムイオン、マンガンイオン、コバルトイオンのいずれかであり、それらの水溶性金属塩の１種又は２種以上が使用される。そのなかでも好ましくは亜鉛イオン、鉄イオンであり、塩化亜鉛、塩化鉄などが好ましく使用できる。【００２７】
上記の反応に使用される溶媒としては、アセトン、アセトニトリル、エタノール、メタノール、プロパノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、テトラヒドロフランなどの有機溶媒、あるいはこれらの含水溶媒であり、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラヒドロフランが好ましい。【００２８】
陰荷電基を持つ低分子薬物は、上記の金属イオンと結合して疎水化され易いように分子内にリン酸基、硫酸基又はカルボキシル基を有していることが好ましく、また分子量が１，０００以下であることが好適である。【００２９】
そのような陰荷電基を持つ低分子薬物としては、種々の薬物を挙げることができるが、なかでも水溶性の抗炎症性ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、プロスタグランジン又はその誘導体、抗微生物薬、又は抗癌薬が好適であり、より具体的には、リン酸ベタメタゾン、リン酸デキサメタゾン、リン酸プレドニゾロン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸プレドニゾロン、コハク酸ヒドロコルチゾンなどの抗炎症性ステロイド；ロキソプロフェン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ジクロフェナック、フェンブフェンなどの非ステロイド性抗炎症薬；プロスタグランジンＥ１、プロスタグランジンＥ２又はその誘導体；バンコマイシン、コハク酸クロラムフェニコール、ラタモキセフ、セフピロム、リン酸クリンダマイシン、カルモナムなどの抗微生物薬；ビンクリスチン、ビンブラスチンなどの抗癌薬などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００３０】
ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＤＬ−体をＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ、Ｌ−体をＰＬＬＡ−ＰＥＧということもある）又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＤＬ−体をＰＤＬＬＧＡ−ＰＥＧ、Ｌ−体をＰＬＬＧＡ−ＰＥＧということもある）は、ポリＤＬ−乳酸（ＰＤＬＬＡということもある）若しくはポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡということもある）又はポリ（ＤＬ−乳酸／グリコール酸）共重合体（ＰＤＬＬＧＡということもある）若しくはポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体（ＰＬＬＧＡということもある）（これらの重合体をブロックＡという）とポリエチレングリコール（ＰＥＧということもある）（ブロックＢという）とを、エチレンジメチルアミノプロピルカルボジイミドなどの縮合剤のもとで反応させることにより、生成することができるが、市販されている同様のブロック共重合体を使用してもよい。【００３１】
ブロック共重合体の構成としてはＡ−Ｂタイプ、Ａ−Ｂ−Ａタイプ、Ｂ−Ａ−Ｂタイプのいずれであっても本発明の目的を達成することができる。また、これらのブロック共重合体の重量平均分子量は３，０００〜３０，０００であることが好ましい。【００３２】
また、本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、ポリＤＬ−又はＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体又はポリ（ＤＬ−又はＬ−乳酸／グリコール酸）−ポリエチレングリコールブロック共重合体に対するポリＬ−乳酸又はポリ（Ｌ−乳酸／グリコール酸）共重合体の混合比を高くすると、大きなナノ粒子が生成され、かつ薬物のナノ粒子への封入率が増加する傾向にある。【００３３】
本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子おいて、さらに塩基性低分子化合物を混合することにより薬物のナノ粒子への封入率が増加し、１０％程度まで封入することができる。
このような塩基性低分子化合物としては（ジメチルアミノ）ピリジン、ピリジン、ピペリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、キノリン、キヌクリジン、イソキノリン、ビス（ジメチルアミノ）ナフタレン、ナフチルアミン、モルホリン、アマンタジン、アニリン、スペルミン、スペルミジン、ヘキサメチレンジアミン、プトレシン、カダベリン、フェネチルアミン、ヒスタミン、ジアザビシクロオクタン、ジイソプロピルエチルアミン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン等を挙げることができ、好ましくは、２級又は３級アミン類であり、ジエタノールアミンが特に好ましい。【００３４】
かくして調製された陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子に界面活性剤を配合してもよく、界面活性剤を配合することにより、生成したナノ粒子を安定化し、かつ粒子間の凝集を抑制することができる。したがって、ナノ粒子を含有する製剤の製剤化工程にとって好ましいものとなる。【００３５】
使用される界面活性剤としては、ホスファチジルコリン、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、ポリオキシエチレン（８０）オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン（２０）コレステロールエステル、脂質−ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油及び脂肪酸−ポリエチレングリコール共重合体等をあげることができ、これらの界面活性剤から選択される１種又は２種以上を使用するのが好ましい。【００３６】
本発明が提供する陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子にあっては、その粒子の直径は２０〜３００ｎｍの範囲内であり、好ましくは５０〜２００ｎｍであり、それぞれの薬物が目的とするターゲット患部に依存して、その粒子径を決定することができる。
例えば、薬物を関節炎、癌、閉塞性動脈硬化症などに使用する場合には、５０〜２００ｎｍの粒径を有するナノ粒子を静脈注射することが好ましい。この粒径は、ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ若しくはＰＬＬＡ−ＰＥＧ又はＰＤＬＬＧＡ−ＰＥＧ若しくはＰＬＬＧＡ−ＰＥＧを溶解する溶媒、好ましくはアセトン又はジオキサンの量を調節することにより調整することができ、アセトン又はジオキサンの量を多くすることにより小さな粒径のナノ粒子が得られる。また、ナノ粒子の粒径が大きくなるほど薬物の封入率が高くなる傾向にある。【００３７】
かくして調製した本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、ナノ粒子の溶液又は懸濁液を、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、フィルター濾過、ファイバー透析などの操作により適宜精製した後、凍結乾燥して取得、保存される。【００３８】
その際、凍結乾燥した製剤を再懸濁して投与できるようにするため安定化剤及び／又は分散化剤を加えて凍結乾燥されることが好ましく、そのような安定化剤、分散化剤としてはショ糖、トレハロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが好ましく使用される。【００３９】
本発明が提供する陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、静脈注射用製剤、局所注射用製剤、点鼻剤、点眼剤、吸入剤、噴霧剤などの非経口投与用製剤の医薬品として使用され、なかでも静脈注射用製剤とすることで、当該ナノ粒子の特性、効果をより良く発揮することができる。【００４０】
これらの非経口投与用製剤の調製に使用される基剤、その他の添加剤成分としては、製剤学的に許容され、使用されている各種基剤、成分を挙げることができる。具体的には、生理食塩水、単糖類、二糖類、糖アルコール類、多糖類などの糖類；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースなどの高分子添加剤；イオン性又は非イオン性界面活性剤；などが剤型に応じて適宜選択され、使用することができる。
【実施例】
【００４１】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４２】
実施例１：ポリＤＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ）の合成
メトキシ−ＰＥＧ４０ｇ（Ｍｗ５２００、日本油脂社製）、Ｄ、Ｌ−ラクチド４０ｇ（Purac社製）、オクチル酸スズ（４００ｍｇ）を二口丸底フラスコに入れ十分に混合した。油圧ポンプにて脱気後、オイルバスにて１１０℃で加熱し溶解した。溶解後１５５℃に昇温し、４時間反応させた。反応物（固形物）を冷却後、２５０ｍＬ程度のジクロロメタンに溶解し、氷冷したイソプロパノール２．５Ｌに徐添加で再沈精製し、凍結乾燥することでポリＤＬ−乳酸−ポリエチレングリコールブロック共重合体（ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ）を合成した。合成物は、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）あるいはプロトンＮＭＲにて評価した。【００４３】
ＧＰＣから、メトキシ−ＰＥＧに比べ分子量の増大が認められ、またプロトンＮＭＲからポリ乳酸の存在が確認できたことから、ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧが合成された。また、Ｄ，Ｌ−ラクチドの量を変えて上記と同様に操作し、分子量の異なるＰＤＬＬＡ−ＰＥＧを得た。
さらに、Ｄ，Ｌ−ラクチドをＤ，Ｌ−ラクチドとグリコライドの混合物に変更した以外は上記と同様に操作して、ＰＤＬＬＧＡ−ＰＥＧを合成した。【００４４】
実施例２：プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）を封入したＰＬＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧからなるナノ粒子の製造法
ＰＬＬＡ（多木化学社製）を所定量計り、２２５μＬのジオキサンに溶解した。実施例１で合成したＰＤＬＬＡ−ＰＥＧを所定量計り、アセトン１７５μＬに溶解し、前記のジオキサン溶液とともに混合した。この混合液に、５ｍｇのＰＧＥ１を溶解した２５０μＬのアセトン溶液を添加し、つづいて所定量のジエタノールアミンを溶解した１００μＬのアセトン溶液を添加した。直ちに、５００ｍＭの無水塩化第二鉄アセトン溶液を所定量加えて混和し、室温で１０分間放置した。５０ｍＬのサンプル瓶に２５ｍＬの水を入れ２ｃｍのスターラーバーで攪拌しながら、そこに２６Ｇ注射針をつけた３ｍＬシリンジで上記の反応液を徐々に滴下した（スターラー回転数：１０００ｒｐｍ、注射針：２６Ｇ、シリンジ：ニプロ３ｍＬ、滴下速度：４８Ｌ／ｈｒ）。得られた懸濁液に５００ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ７）を２．５ｍＬ及び２００ｍｇ／ｍＬのＴｗｅｅｎ８０［ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート］水溶液を１２μＬ添加した。限外濾過（ＹＭ−５０、アミコン社製）にて濃縮後、５０ｍＭのＥＤＴＡ水溶液（ｐＨ７）を添加し、再び濃縮を行った（これを２回繰返した）。得られた濃縮懸濁液を超音波照射３０秒後、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）にて凝集塊を除去し、動的光散乱測定装置で粒径測定及び粒子内のＰＧＥ１の封入量をＨＰＬＣにて定量した。【００４５】
塩化第二鉄とジエタノールアミンの使用量によるナノ粒子へのＰＧＥ１の封入率の関係を表１に、塩化第二鉄の添加量によるナノ粒子へのＰＧＥ１の封入率の関係を表２に、ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧとＰＬＬＡの混合割合におけるナノ粒子の粒径及びＰＧＥ１の封入率の関係を表３に示した。【００４６】
表１：鉄量を一定（７．５μｍｏｌ）使用して、ジエタノールアミン量を変えて調製したナノ粒子のＰＧＥ１封入率【００４７】
【表１】
2008139804.tif 000003
【００４８】
表１の結果から判明するように、ＰＧＥ１封入率は、ジエタノールアミン量に影響されており、封入率を上げるための最適のジエタノールアミン量が存在していた。【００４９】
表２：鉄の総添加量を変えて調製したナノ粒子のＰＧＥ１の封入率【００５０】
【表２】
2008139804.tif 000004
【００５１】
表２に示した結果から判明するように、ＰＧＥ１封入率は、添加した鉄量に影響されており、鉄量が増加するほど封入率が上昇していた。【００５２】
表３：ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧとＰＬＬＡの混合比を変えて調製したナノ粒子の粒径及びＰＧＥ１封入率【００５３】
【表３】
2008139804.tif 000005
【００５４】
表３に示した結果から判明するように、ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧのＰＬＬＡに対する混合比が高いほど、小さな粒子が調製できるが、ＰＧＥ１の封入率は低くなった。
また、上記表１〜３中のいずれの粒子においても、ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧを用い粒子を調製することにより、水中でもＰＬＬＡが結晶化せず、粒径維持が可能な安定な粒子が調製できた。【００５５】
実施例３：プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）を封入したＰＬＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧからなるナノ粒子の徐放性
実施例２において、ＰＧＥ１を５ｍｇ、ＰＬＬＡを１３ｍｇ、ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧを１２ｍｇ、ジエタノールアミンを４．７ｍｇ及び塩化第二鉄を７．５μｍｏｌ使用した以外は同様の方法によりＰＧＥ１を封入したＰＬＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧからなるナノ粒子（ＰＬＬＡ粒子という）を作製した。
対照として、ＰＬＬＡの代わりにＤＬ−体であるポリＤＬ−乳酸（ＰＤＬＬＡ）を使用することにより、ＰＧＥ１を封入したＰＤＬＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧからなるナノ粒子（ＰＤＬＬＡ粒子という）を作製した。【００５６】
作製したＰＬＬＡ粒子又はＰＤＬＬＡ粒子をリン酸緩衝液／ウシ血清（等量ずつの混合液）中に分散し、３７℃でインキュベートした。両粒子の徐放性を測定するために、経時的に粒子内に残存しているＰＧＥ１量をＨＰＬＣにより定量した。
その結果を表４に示した。【００５７】
表４：ＰＧＥ１ナノ粒子からの放出（徐放性）【００５８】
【表４】
2008139804.tif 000006
ＮＤ：未検出【００５９】
表４に示した結果から判明するように、ＰＬＬＡ（Ｌ体）から調製したナノ粒子では、ＰＤＬＬＡ（ＤＬ体）から調製したナノ粒子に比べ、よりゆっくりと、長期間ＰＧＥ１を放出するので、徐放性に優れていることが判明する。【００６０】
実施例４：プロスタグランジンＥ１（ＰＧＥ１）を封入したＰＬＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧからなるナノ粒子の細胞内への取り込み
蛍光色素であるローダミンを封入したナノ粒子は、アセトン溶液にローダミンを添加したこと以外は、実施例３と同じ方法により調製した。また対照として、ＰＤＬＬＡ−ＰＥＧを用いずに、ＰＬＬＡのみからなるローダミン及びＰＧＥ１封入ナノ粒子を同様に調製した。得られたそれぞれのナノ粒子をＲＡＷ細胞（マウスマクロファージ様細胞）に添加し、３７℃で２時間インキュベート後、細胞を蛍光顕微鏡により観察した。【００６１】
その結果を図１に示した。図１から明らかなように、対照であるＰＬＬＡのみから調製されたナノ粒子では顕著に細胞内に取り込まれたのに対し、ＰＬＬＡ及びＰＤＬＬＡ−ＰＥＧから調製したナノ粒子では細胞内への取り込みが抑制された。【００６２】
図１において、青はＤＡＰＩ（４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール）による核染色、赤はローダミンの分布を表す。また、写真Ａ）はローダミンのみ添加、写真Ｂ）はＰＬＬＡのみから調製されたローダミン及びＰＧＥ１封入ナノ粒子、写真Ｃ）はＰＬＬＡ及びＰＤＬＬＡ−ＰＥＧから調製したローダミン及びＰＧＥ１ナノ粒子の濃度分布を表す。スケールバーは５０μｍを表す。【００６３】
実施例５：リン酸ベタメタゾンを封入したＰＬＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧからなるナノ粒子の製造法
ＰＬＬＡ（多木化学社製）を３６ｍｇ計り、４５０μＬのジオキサンに溶解した。実施例１で合成したＰＤＬＬＡ−ＰＥＧを１４ｍｇおよびジエタノールアミン７．５ｍｇ計りアセトン１０５０μＬに溶解し、前記のジオキサン溶液とともに混合した。この混合液に１Ｍ塩化亜鉛水溶液６８μＬを添加し、続いて３５０ｍｇ／ｍＬのリン酸ベタメサゾン水溶液２８μＬを添加した。室温にて３０分程度静置した。５０ｍＬのサンプル瓶に２５ｍＬの水を入れ２ｃｍのスターラーバーで攪拌しながら、そこに２６Ｇ注射針をつけた３ｍＬシリンジで上記の反応液を徐々に滴下した（スターラー回転数：１０００ｒｐｍ、注射針：２６Ｇ、シリンジ：ニプロ３ｍＬ、滴下速度：４８Ｌ／ｈｒ）。得られた懸濁液に０．５Ｍクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７）５００μＬおよびＴｗｅｅｎ８０［ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート］水溶液（２００ｍｇ／ｍＬ）水溶液を１２５μＬ添加した。限外濾過（ＹＭ−５０、アミコン社製）にて濃縮後、水を添加し、再び濃縮を行った（これを２回繰返した）。得られた濃縮懸濁液を超音波照射３０秒後、遠心（１０００ｒｐｍ、５分）にて凝集塊を除去した。【００６４】
得られたナノ粒子の粒径を動的光散乱測定装置で測定し、リン酸ベタメタゾンのナノ粒子内への封入率をＨＰＬＣで定量した。【００６５】
その結果、リン酸ベタメタゾンのナノ粒子内への封入率は８．６重量％で粒径は約１００ｎｍであり、ＰＬＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧの粒子にリン酸ベタメタゾンを封入したナノ粒子が調製された。【００６６】
実施例６：リン酸プレドニゾロンを封入したＰＬＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧからなるナノ粒子の製造法
上記実施例５と同様の方法により、ＰＬＬＡ（多木化学社製）、実施例１で合成したＰＤＬＬＡ−ＰＥＧ、ジエタノールアミンをアセトンに溶解し、ＰＬＬＡのジオキサン溶液とともに混合した。この混合液に１Ｍ塩化亜鉛水溶液を添加し、続いてリン酸プレドニゾロン水溶液を添加し、その後実施例５と同様に処理を行い、リン酸プレドニゾロン封入ナノ粒子を得た。
得られたナノ粒子の粒径を動的光散乱測定装置で測定し、リン酸プレドニゾロンのナノ粒子内への封入率をＨＰＬＣで定量した結果、封入率は８．５重量％で粒径は約１００ｎｍであり、ＰＬＬＡとＰＤＬＬＡ−ＰＥＧの粒子にリン酸プレドニゾロンを封入したナノ粒子が調製された。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
以上記載したように、本発明の陰荷電基を持つ低分子薬物含有ナノ粒子は、陰荷電基を持つ低分子薬物を患部ターゲッティングし、薬物の徐放性に優れ、さらに肝臓集積を低減することにより副作用を軽減し、さらに血中滞留性に優れているので、医薬品として有用であり、その産業上の利用可能性は多大なものである。
【図１】
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【国際調査報告】
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