(57)【要約】  本発明では、虚血再灌流により作成した炎症小腸モデル動物を使用し、ランダムな配列の7アミノ酸からなるペプチドを粒子表面に提示するファージライブラリーについてこれらモデル動物から回収した小腸組織を用いたex vivoパンニングを行い、腸管炎症部位に特異的に吸着するペプチドを探索した。  その結果、ファージ粒子を炎症小腸に特異的に結合させる能力を有するペプチドを見出しその配列を明らかにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチド。
（ａ）配列番号：１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号：１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号：１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が付加、欠失、もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチド
【請求項２】
腸管正常部位には実質的に吸着しないことを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２に記載のポリペプチドと結合する抗体。
【請求項５】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含有する、任意の分子に腸管炎症部位吸着活性を付与するための薬剤。
【請求項６】
任意の分子が任意のポリペプチドである、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
請求項１または２に記載のポリペプチドを含む、腸管炎症部位吸着活性を有する分子。
【請求項８】
分子がファージ粒子、または該ファージ粒子の外殻タンパク質である、請求項７に記載の分子。
【請求項９】
分子が請求項１または２に記載のポリペプチドとの融合タンパク質である、請求項７に記載の分子。
【請求項１０】
請求項１または２に記載のポリペプチドからなる、腸管炎症部位送達用キャリア。
【請求項１１】
請求項１または２に記載のポリペプチドが、ミセル、リポソームまたはマイクロカプセルと結合した構造からなる、腸管炎症部位送達用キャリア。
【請求項１２】
請求項１または２に記載のポリペプチドが、ウイルスベクター表面に提示される構造からなる、腸管炎症部位送達用遺伝子治療ベクター。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の腸管炎症部位送達用キャリアに薬物が担持された構造からなる、炎症性腸疾患治療剤。
【請求項１４】
任意の分子に請求項１または２に記載のポリペプチドを結合させる工程を含む、腸管炎症部位吸着活性を有する分子の製造方法。
【請求項１５】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、腸管炎症部位吸着活性を有するタンパク質分子の製造方法。
（ａ）発現可能な状態で任意のタンパク質分子をコードするＤＮＡと、請求項１または２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡとが結合した構造のＤＮＡを含む発現ベクターを作製する工程
（ｂ）前記発現ベクターを細胞へ導入する工程
（ｃ）前記ベクターからの発現産物を回収する工程
【請求項１６】
以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、任意の分子を非ヒト動物の腸管炎症部位へ吸着させる方法。
（ａ）任意の分子と請求項１または２に記載のポリペプチドとが結合した構造の腸管炎症部位移行活性を有する分子を製造する工程
（ｂ）前記分子を非ヒト動物体内へ投与する工程
【請求項１７】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、請求項１または２に記載のポリペプチドに対して結合活性を有する分子のスクリーニング方法。
（ａ）請求項１または２に記載のポリペプチドと被検分子とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリペプチドと被検分子との結合活性を検出する工程
（ｃ）前記ポリペプチドと結合する分子を選択する工程
【請求項１８】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドのスクリーニング方法。
（ａ）被検ポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させたファージ粒子を作製する工程
（ｂ）該ファージ粒子を、腸管炎症部位と接触させる工程
（ｃ）腸管炎症部位への吸着活性を有するファージ粒子を選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において回収されたファージ粒子に提示された被検ポリペプチドを腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドとして選択する工程
【請求項１９】
工程（ａ）につづいて、さらに、腸管正常部位に吸着しないファージ粒子を選択する工程、を含む請求項１８に記載のスクリーニング方法。
【請求項２０】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドのスクリーニング方法。
（ａ）被検ポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させたファージ粒子を作製する工程
（ｂ）該ファージ粒子を、非ヒト動物へ投与する工程
（ｃ）該非ヒト動物の腸管炎症部位からファージ粒子を回収する工程
（ｄ）工程（ｃ）において回収されたファージ粒子に提示された被検ポリペプチドを腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドとして選択する工程
【請求項２１】
ファージがＭ１３ファージである、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
工程（ａ）につづいて、さらに、腸管炎症部位に吸着するが腸管正常部位に吸着しないファージ粒子を選択する工程、を含む請求項２０または２１に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症腸管標的活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含む分子、ならびに炎症腸管標的活性を付与する薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
１）炎症性腸疾患の病態と現行の治療
炎症性腸疾患(IBD)とは、潰瘍性大腸炎(UC)、クローン病(CD)などの何らかの原因により、腸の粘膜に炎症が起こり、びらんや潰瘍ができる病気である。腸に起こる炎症のために、下痢や粘血便、発熱や体重減少などの症状が現れる。【０００３】
UCとCDは原因不明の難病として、1973年と翌1974年に厚生省(現厚生労働省)特定疾患に登録された。欧米に比べてわが国では頻度の少ない疾患であったが、食生活の欧米化に伴い患者数は年々増加の傾向にあり、潰瘍性大腸炎は6万人強、クローン病では2万人弱の患者数に達している。厚生労働省の特定疾患調査研究班による積極的な病態研究にもかかわらずその病因や遷延化因子などについては未だに不明の状態であり、従って特異な病態を基盤とした治療法は確立されていない状況である。若年者に好発し、再燃を繰り返すため長期間の治療を要し、長期間経過例における癌化のリスクが高い、あるいは鼻管・中心静脈栄養・薬物経動脈投与など極めて侵襲性の高い治療がしばしば必要とされるなど患者のQOLの点から見て改善が必要とされる疾患である。【０００４】
治療としては栄養療法(経腸栄養療法など)や薬物療法（5-aminosalicylic acidなどのサルファ剤、プレドニゾロンなどのステロイド剤、アザチオプリンなどの免疫抑制剤）、血球成分除去療法などが状況に応じて用いられている。また近年では抗TNF抗体(anti-TNF antibody)であるinfliximabが用いられるようになり、これらを組み合わせる事により、一定の治療効果を得ている。【０００５】
ステロイド療法は強力な抗炎症作用にて顕著な治療効果を示すが、長期大量投与により様々な副作用をもたらす問題点が指摘されており、いかにして副作用を少なくするかが重要課題となっている。また、infliximabにおいても、多くの報告の中でクローン病における十分な臨床的、内視鏡的，組織学的効果が証明されているが（非特許文献１−５）、infliximab治療の後もしくは治療中にアナフィラキシー様症状の出現（非特許文献６）や、細菌、ウイルス，真菌感染などの感染症、ループスなどの合併症が報告されている（非特許文献７−９）。また，infliximabの長期間繰り返し投与により中和抗体（Human anti-chimeric antibody : HACA）が出現して効果が減弱することも報告されている。このような副作用をきたす要因のひとつは、病変部以外の他臓器に薬物が影響を与えている事が考えられる。これらの薬物をより効率よく病変部に集積させる事ができれば投与量が減量でき、副作用の軽減とより長期の緩解維持が可能になると推測される。【０００６】
２）治療薬の改変
治療薬を選択的に腸管に集積させるため、種々の技術が工夫されている。Zouらは、5-ASA（5-aminosalycylic acid）に化学修飾をすることで、より腸管に薬剤を集積させる報告をしている（非特許文献１０）。GuliyevaらはChitosanを用い（非特許文献１１）、Metzらはpolymeric microcapsulesを用いて（非特許文献１２）腸管への薬剤(agents)の集積を試みている。さらには、アデノウイルスベクター（非特許文献１３）や細菌の細胞外タンパク質(extracellular protein)であるinvasin （非特許文献１４）を用いたデリバリーシステムも試みられている。【０００７】
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
【非特許文献１】Hanauer SB, et al. Lancet 359(9317):1541-1549,2002.
【非特許文献２】Feagan BG, et al. Am J Gastroenterol 98(10):2232-2238,2003.
【非特許文献３】Sands BE, et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2(10):912-920,2004.
【非特許文献４】Hanauser SB, et al. Clin Gastroenterol Hepatol 2(7):542-553,2004.
【非特許文献５】Lichtenstein GR, et al. Am J Gastroenterol 99(1):91-96,2004.
【非特許文献６】Stallmach A, et al. Eur J Gastroenterol Hepatol 16(6):627-630, 2004.
【非特許文献７】Helbling D, et al. Eur J Gastroenterol Hepatol 14(12):1393-1395, 2002.
【非特許文献８】De Rosa FG, et al. Infect Control Hosp Epidemiol 24(7):477-482, 2003.
【非特許文献９】Sarzi-Puttini P, et al. Dig Liver Dis 35(11):814-817, 2003.
【非特許文献１０】Zou MJ, et al. World J Gastroenterol 2005; 11(47): 7457-7460.
【非特許文献１１】Guliyeva U, et al. Eur J Pharm Biopharm 2006; 62(1): 17-25.
【非特許文献１２】Metz T, et al. Cell Biochem Biophys 2005; 43(1): 77-85.
【非特許文献１３】Vallance BA, et al. Am J Physiol Gastrointest liver Physiol 2005; 289(1): G116-128.
【非特許文献１４】Palumbo RN, et al. Curr Drug Deliv 2006; 3(1): 47-53.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、腸管炎症部位に吸着しうる分子、好ましくは腸管炎症部位に特異的に吸着しうる分子の提供を課題とする。より具体的には本発明は、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含む分子、並びに腸管炎症部位移行活性を付与する薬剤の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った。まず本発明者らは、新しい薬物送達システム(DDS)の開発を念頭に、ファージディスプレイペプチドライブラリー(Phage Display Peptide Library)を用いて腸管炎症部位に特異的に吸着するペプチドの同定を試みた。【００１０】
ファージディスプレイは、ファージ粒子の表面に発現させた多種類の配列をもつペプチドやタンパクのライブラリーから、パンニングと呼ばれる操作を行うことにより標的とするタンパク質等に親和性のあるファージ粒子を回収し、標的に特異的に結合するペプチドやタンパク質を同定する有力な方法である。パンニングとは具体的には標的タンパク質でコートしたプレートに、多種類のペプチド配列を表面に発現しているM13ファージライブラリーのファージ粒子を曝して結合させ、適当な強度で洗浄して非特異的なファージ粒子を除去したのち標的タンパク質に特異的に結合しているファージ粒子を回収する操作である。回収されたファージを増幅しパンニング操作を繰り返すことにより、標的タンパク質と特異的に結合するファージの純度を高めることができライブラリー中にごく少数しか含まれていないペプチドでも同定することができる。ファージ粒子はそれ自体で、標的に対する親和性という機能とそれをもたらしているペプチドをコードするDNAの物理的リンクを創りあげているので、パンニングによって単離されたファージ粒子のDNA配列を決定することにより標的に対する親和性を示すペプチドを速やかに特定することができる。【００１１】
現在、ファージディスプレイを利用して分子特異的なリガンドペプチド(ligand peptides)の検出が多くの分野で試みられている（Kolonin MG, et al. FASEB J 2006; 20(7): 979-981.；Duerr DM, et al. J Virol Methods 2004; 116(2): 177-180.；Chen Y, et al. J Biol Chem 2006; 281(18): 12767-12775.）。Higginsらは腸管内にライブラリー(library)を投与するインビボファージディスプレイ(in vivo phage display)でM細胞を標的にしたリガンドをスクリーニングしている（Higgins LM, et al. Pharm Res 2004; 21(4): 695-705.）。これらの研究では正常マウスを用いているが、それに対し本発明では、炎症腸管モデル動物の小腸組織をEx vivoで用いることにより特異性の高いペプチドをスクリーニングしたことが大きく異なっている。従来、ファージディスプレイでは、ターゲットに組織そのものを用いる事は少なかった。なぜなら、ターゲットとなる分子が無数にあり、標的に特異的な親和性を示すペプチド配列を絞り込む事が困難となる為である。このような難点を克服するため、本発明者らはファージライブラリーを目的とする標的である炎症小腸に吸着させる前にまず正常小腸に吸着させるステップを挿入し、非特異的に腸管に親和性を有するファージ粒子を除いてから炎症小腸に反応させる事で，非特異的に吸着するファージを減らす工夫をした。その結果炎症小腸に対して特異的に高い吸着活性を示すペプチド配列が得られた。該配列を有するポリペプチドは腸管炎症部位吸着活性を有することから、該ポリペプチドを任意の分子と結合させることによって、該分子を腸管炎症部位へ誘導することが可能である。即ち、本発明のポリペプチドは、任意の分子に腸管炎症部位吸着活性を付与するための薬剤として有用である。【００１２】
上述の如く本発明者らは、上記課題の解決に成功し、本発明を完成させた。即ち本発明は、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドを含む分子、並びに腸管炎症部位移行活性を付与する薬剤に関し、より具体的には、
〔１〕  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のポリペプチド、
（ａ）配列番号：１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号：１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号：１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が付加、欠失、もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチド
〔２〕  腸管正常部位には実質的に吸着しないことを特徴とする、〔１〕に記載のポリペプチド、
〔３〕  〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
〔４〕  〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドと結合する抗体、
〔５〕  〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドを含有する、任意の分子に腸管炎症部位吸着活性を付与するための薬剤、
〔６〕  任意の分子が任意のポリペプチドである、〔５〕に記載の薬剤、
〔７〕  〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドを含む、腸管炎症部位吸着活性を有する分子、
〔８〕  分子がファージ粒子、または該ファージ粒子の外殻タンパク質である、〔７〕に記載の分子、
〔９〕  分子が〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドとの融合タンパク質である、〔７〕に記載の分子、
〔１０〕  〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドからなる、腸管炎症部位送達用キャリア、
〔１１〕  〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドが、ミセル、リポソームまたはマイクロカプセルと結合した構造からなる、腸管炎症部位送達用キャリア、
〔１２〕  〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドが、ウイルスベクター表面に提示される構造からなる、腸管炎症部位送達用遺伝子治療ベクター、
〔１３〕  〔１０〕または〔１１〕に記載の腸管炎症部位送達用キャリアに薬物が担持された構造からなる、炎症性腸疾患治療剤、
〔１４〕  任意の分子に〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドを結合させる工程を含む、腸管炎症部位吸着活性を有する分子の製造方法、
〔１５〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、腸管炎症部位吸着活性を有するタンパク質分子の製造方法、
（ａ）発現可能な状態で任意のタンパク質分子をコードするＤＮＡと、〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡとが結合した構造のＤＮＡを含む発現ベクターを作製する工程
（ｂ）前記発現ベクターを細胞へ導入する工程
（ｃ）前記ベクターからの発現産物を回収する工程
〔１６〕  以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む、任意の分子を非ヒト動物（もしくはヒトを含む腸管を有する動物）の腸管炎症部位へ吸着させる方法、
（ａ）任意の分子と〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドとが結合した構造の腸管炎症部位移行活性を有する分子を製造する工程
（ｂ）前記分子を非ヒト動物（もしくはヒトを含む腸管を有する動物の）体内へ投与する工程
〔１７〕  以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む、〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドに対して結合活性を有する分子のスクリーニング方法、
（ａ）〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチドと被検分子とを接触させる工程
（ｂ）前記ポリペプチドと被検分子との結合活性を検出する工程
（ｃ）前記ポリペプチドと結合する分子を選択する工程
〔１８〕  以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドのスクリーニング方法、
（ａ）被検ポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させたファージ粒子を作製する工程
（ｂ）該ファージ粒子を、腸管炎症部位と接触させる工程
（ｃ）腸管炎症部位への吸着活性を有するファージ粒子を選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において回収されたファージ粒子に提示された被検ポリペプチドを腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドとして選択する工程
〔１９〕  工程（ａ）につづいて、さらに、腸管正常部位に吸着しないファージ粒子を選択する工程、を含む〔１８〕に記載のスクリーニング方法、
〔２０〕  以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドのスクリーニング方法、
（ａ）被検ポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させたファージ粒子を作製する工程
（ｂ）該ファージ粒子を、非ヒト動物へ投与する工程
（ｃ）該非ヒト動物の腸管炎症部位からファージ粒子を回収する工程
（ｄ）工程（ｃ）において回収されたファージ粒子に提示された被検ポリペプチドを腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドとして選択する工程
〔２１〕  ファージがＭ１３ファージである、〔２０〕に記載のスクリーニング方法、
〔２２〕  工程（ａ）につづいて、さらに、腸管炎症部位に吸着するが腸管正常部位に吸着しないファージ粒子を選択する工程、を含む〔２０〕または〔２１〕に記載のスクリーニング方法、を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】虚血・再灌流による炎症小腸モデル動物の作成、および反転腸管の作成による炎症小腸標本の作成を示した写真および図である。
【図２】正常小腸標本および炎症小腸標本を用いてEx vivoパンニングを行い、炎症小腸特異的結合を示すファージ粒子を濃縮する方法を示した図である。
【図３】正常小腸標本および炎症小腸標本を用いてEx vivoパンニングを行い、炎症小腸特異的結合を示すファージ粒子が濃縮される経過を示した図である。
【図４】炎症小腸特異的結合を指標として単離されたファージクローンを、正常小腸標本および炎症小腸標本に対する結合能について、インサートを持たないコントロールファージと比較し評価した図である。
【図５】炎症小腸特異的結合を示すファージクローン5種について、正常小腸標本および炎症小腸標本に対する結合能について、例数を増やしてさらに詳しく評価した図である。評価には片側t-検定を利用した。**：P<0.025、*<0.05、参考として、+：P<0.1。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドを提供する。本発明において「腸管炎症部位吸着活性」とは、ポリペプチド等の分子が体内へ投与（例えば、経口投与等）された際に、該分子が腸管炎症部位へ吸着する活性を言う。本発明のポリペプチドは、他の物質（分子）と結合させることにより、他の分子を腸管炎症部位へ吸着させる機能を有する。従って、本発明のポリペプチドは、「腸管炎症部位吸着活性を付与するポリペプチド」、「腸管炎症部位吸着ペプチドタグ」、「腸管炎症部位吸着活性付与剤」と表現することもできる。
後述の実施例で示す実験によって、以下の表１に示される配列を有するポリペプチドは、腸管炎症部位吸着活性を有することが判明した。【００１５】
【表１】
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【００１６】
本明細書におけるアミノ酸は、一般的に使用される一文字表記にならって記載した。また、一般的な記載方法にならい、Ｎ末からＣ末方向の順にアミノ酸配列を記載した。
本発明のポリペプチドとしては、より具体的には、例えば、上述の表１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることができるが、これらは本発明のポリペプチドの一例であり、本発明のポリペプチドはこれらに限定されない。表１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは該ポリペプチドを外殻タンパク質上に発現させたファージ分子は、後述の実施例で示すように、実際に腸管炎症部位吸着活性を有することが本発明者によって示された。【００１７】
従って本発明の好ましい態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）に記載のポリペプチドを提供する。
（ａ）配列番号：１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号：１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号：１〜５のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が付加、欠失、もしくは置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチド【００１８】
本発明のポリペプチドが吸着活性を示す腸管の由来する生物種は、腸管を有する動物であれば特に制限されないが、通常、哺乳動物であり、好ましくは、マウス、ラット、スナネズミ、ネコ、ウシ、サル、もしくはヒトである。
上記（ｃ）においては、一般的に「数個」とは、少数の個数を言うが、例えば、２〜９個、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜５の範囲を意味する。【００１９】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、腸管正常部位に対して実質的に吸着しないポリペプチドである。即ち、本発明のポリペプチドは、腸管炎症部位に対して特異的に吸着する活性を有することが好ましい。例えば、腸管炎症部位に対して吸着するが、腸管正常部位には実質的に吸着しないポリペプチド、または、腸管炎症部位に対する吸着活性が正常部位に対する吸着活性よりも強いポリペプチドを挙げることができる。【００２０】
該吸着活性は、例えば、腸管炎症部位もしくは正常部位に対するポリペプチドの吸着数によって評価することも可能である。本発明のポリペプチドの好ましい態様としては、腸管炎症部位に対する吸着数が、正常部位と比べて有意に高いポリペプチドが挙げられる。ここで「吸着数」とは、一例を示せば、後に述べるパンニング法において、該ポリペプチドを外殻タンパク質上に発現させたファージが腸管正常部位または腸管炎症部位に吸着する数をいう。「特異的な差」とは、統計学的な有意な差をいうが、例えば、2倍以上、好ましくは3倍以上、より好ましくは5倍以上の差を例示することができる。【００２１】
ファージを利用せずに、任意のポリペプチドについて炎症腸管部位との結合活性（吸着活性）の有無を評価する方法の具体例として、放射標識、蛍光標識、酵素標識により適宜標識したポリペプチドを炎症小腸標本と接触させたのち当該ペプチドを炎症小腸標本から回収し、標識の回収率をコントロールのペプチドと比較することにより、炎症腸管部位との結合活性（吸着活性）を評価する方法を挙げることができる。また、このような標識を施した場合には、炎症小腸標本の蛍光、放射能もしくは酵素活性に基づく画像により結合活性（吸着活性）を評価することもできる。【００２２】
また本発明のポリペプチドは、天然タンパク質由来ポリペプチド、組換えタンパク質由来ポリペプチド、または化学合成ポリペプチド等のいずれのポリペプチドであってもよい。当業者においては、任意のアミノ酸配列からなるポリペプチドを合成することが可能である。例えば、上記のアミノ酸配列または上記アミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が付加、欠失、もしくは置換されたアミノ酸配列を有するようなポリペプチドの合成は、当業者に公知の方法、例えば、市販のポリペプチド合成機等を利用して適宜実施することができる。【００２３】
また、本発明者らは、７アミノ酸長のポリペプチドが、他の物質（分子）に対し、有効な腸管炎症部位吸着活性を付与できることを明らかにした。従って、少なくとも、７アミノ酸程度の短いポリペプチドであっても、他の分子に対し有効な腸管炎症部位吸着活性を付与する機能があるものと言える。本発明のポリペプチドの長さは、特に制限されないが、例えば１００アミノ酸以内であり、好ましくは５０アミノ酸以内であり、より好ましくは１５アミノ酸以内であり、さらに好ましくは７アミノ酸以内である。
さらに本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。上記ポリヌクレオチドとは、通常、DNAまたはRNAの双方が含まれる。即ち、本発明のポリヌクレオチドをコードするDNA、および該DNAの転写産物であるRNAは、本発明に包含される。【００２４】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドが挿入されたベクター、本発明のポリヌクレオチドまたは該ベクターを保持する宿主細胞、および該宿主細胞を利用した本発明のポリペプチドの製造方法を提供する。【００２５】
本発明のベクターとしては、挿入したDNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製)などが好ましい。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。【００２６】
本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。【００２７】
宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。【００２８】
本発明のポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。【００２９】
本発明は、本発明のポリペプチドと結合する（好ましくは特異的に結合する）抗体に関する。ここで「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、さらにFabまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含むFabフラグメントが含まれる。
本発明のポリペプチド、またはそれらを発現する細胞は、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するための免疫原としても使用することができる。抗体は、好ましくは、本発明のポリペプチドに免疫特異的である。「免疫特異的」とは、その抗体が他のポリペプチドに対するその親和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い親和性を有することを意味する。【００３０】
本発明のポリペプチドに結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。本発明のポリペプチドあるいはそのGSTとの融合タンパク質をウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば、本発明のポリペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、本発明のポリペプチドに結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、本発明のポリペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。【００３１】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドやこれを発現する細胞の単離、同定、および精製に利用することができる。また本発明のポリペプチドは、後述の本発明のポリペプチドに対し結合活性を有する分子のスクリーニング方法において好適に使用することができる。
本発明のポリペプチドは腸管炎症部位吸着活性を有することから、本発明のポリペプチドが結合した分子は腸管炎症部位吸着活性を有することが期待される。本発明者らは、通常腸管炎症部位吸着活性を有しないファージ粒子が、その外殻タンパク質に本発明のポリペプチドを含むことにより、実際に腸管炎症部位吸着活性を獲得することを示した。従って、本発明のポリペプチドは、任意の分子に対し結合することにより、任意の分子について腸管炎症部位吸着活性を付与させる機能を有するものと考えられる。即ち本発明のポリペプチドは、他の分子に腸管炎症部位吸着活性を付与し得る有用な用途を持つ。本発明は、本発明のポリペプチドを含む、任意の分子に腸管炎症部位吸着活性を付与するための薬剤を提供する。さらに本発明には、本発明の上記薬剤によって腸管炎症部位吸着活性を付与された分子も含まれる。【００３２】
本発明のポリペプチド（薬剤）によって腸管炎症部位吸着活性を付与される分子は、特に制限されず、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、糖鎖、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物、微生物産生物、ファージ、抗原、抗体、ミセル（高分子ミセル等）、リポソーム、マイクロカプセル、遺伝子治療ベクター、ペプチド核酸(PNA)、医薬化合物等を挙げることができる。本発明のポリペプチドもしくは上記分子は必要に応じて適宜標識することも可能である。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識、酵素標識等を挙げることができる。【００３３】
また、本発明のポリペプチドによって腸管炎症部位吸着活性を付与される分子の大きさは、特に制限されない。後述の実施例で示すように、通常のファージ程度の大きさの分子も、本発明のポリペプチドの作用によって腸管炎症部位へ吸着することが可能である。従って、上記の付与される分子は、ファージと同等の大きさを呈する程度の分子（物質）であってもよい。例えば、上記の付与される分子がアミノ酸で構成される場合には、１０万程度のアミノ酸を含有する分子であってもよい。
上記分子と本発明のポリペプチドとは、当業者においては、該分子の種類を考慮して適宜、公知の方法を利用して結合させることが可能である。
一例を示せば、市販のカップリング試薬（N-結合型、COOH-結合型、アミノ酸残基修飾型、S-S結合型等）を用いる方法、クロラミンTを用いる方法、イソチアネート基を導入する方法等により、該分子と本発明のポリペプチドとを結合させることができる。【００３４】
本発明の上記ポリペプチドが腸管炎症部位吸着活性を付与する該分子に対してのタグの一例としては、ペプチドとビオチンとのコンジュゲート分子を挙げることができる。該コンジュゲート分子は、アビジンと結合した任意の分子と、適宜結合させることができる。該コンジュゲート分子を用いることにより、アビジンと結合させた所望の分子を、腸管炎症部位へ吸着させることが可能である。該コンジュゲート分子を用いた、任意の分子を腸管炎症部位へ吸着させる方法もまた、本発明に含まれる。【００３５】
また、該分子がタンパク質である場合には、該タンパク質と本発明のポリペプチドとの融合タンパク質をコードするＤＮＡを用いて、本発明のポリペプチドが結合した分子を作製することも可能である。
より具体的には、以下の工程を含む方法によって作製することができる。
（ａ）発現可能な状態で任意のタンパク質分子をコードするＤＮＡと、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡとが結合した構造のＤＮＡを含む発現ベクターを作製する工程
（ｂ）前記発現ベクターを細胞へ導入する工程
（ｃ）前記ベクターからの発現産物を回収する工程【００３６】
また本発明は、本発明の腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドからなる腸管炎症部位送達用キャリアを提供する。該キャリアは、「担体」あるいは「運搬体」と表現することも可能である。本発明の腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチド自体も、上記キャリアの例として挙げることができる。即ち、本発明のポリペプチドと、腸管炎症部位へ吸着させるべき分子とを直接結合させることによって、該分子を腸管炎症部位へ送達させることができる。また、本発明の上記キャリアの好ましい態様としては、例えば、本発明のポリペプチドが、ミセル（高分子ミセル）、リポソームまたはマイクロカプセルと結合した構造からなるキャリアを挙げることができる。【００３７】
また本発明は、本発明の腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドが、ウイルスベクター表面に提示された構造からなる、腸管炎症部位送達用遺伝子治療ベクター（遺伝子治療ベクター、あるいは単にベクターと記載する場合もある）を提供する。本発明において利用することができるベクターとしては、宿主に対する毒性が低く、導入遺伝子の高い発現が得られるものが好ましい。本発明のベクターとして利用可能なウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター等を挙げることができる。【００３８】
さらに、本発明のキャリアを利用することにより、所望の薬剤を腸管炎症部位へ送達させることが可能である。例えば、炎症性腸疾患に対して治療効果を有する化合物（医薬組成物）を、上記キャリアに担持させることにより、該化合物を効率的に腸管炎症部位へ送達させ、有効な治療効果を発揮させることが可能である。該化合物（医薬組成物）を担持させたキャリア自体は、炎症性腸疾患治療剤として期待される。従って本発明は、本発明の上記腸管炎症部位送達用キャリアに薬物が担持された構造からなる、炎症性腸疾患治療剤を提供する。なお、上記「担持された」とは、薬物をキャリアと直接結合させた状態でもよいし、薬物（医薬組成物）をキャリアに内包させた状態でもよい。【００３９】
また、本発明の腸管炎症部位送達用遺伝子治療ベクターを利用することにより、所望の遺伝子（例えば、治療用タンパク質をコードする遺伝子）を腸管炎症部位へ送達させることも可能である。例えば炎症性腸疾患に対して治療効果を有する遺伝子を、上記ベクターに担持させることにより、該遺伝子を効率的に腸管炎症部位へ送達させ、有効な治療効果を発揮させることが可能である。該遺伝子を担持させたベクター自体も、炎症性腸疾患治療剤として期待される。従って本発明には、本発明の上記遺伝子治療ベクターに、治療用タンパク質をコードする遺伝子（治療遺伝子）が担持された構造からなる、炎症性腸疾患治療剤が含まれる。【００４０】
また本発明は、本発明の腸管炎症部位吸着活性を有する分子の製造方法を提供する。本発明の製造方法の好ましい態様においては、任意の分子に本発明のポリペプチドを結合させる工程を含む、腸管炎症部位吸着活性を有する分子の製造方法である。また、該分子がタンパク質である場合には、本発明は好ましい態様として、上記工程（ａ）〜（ｃ）を含む製造方法を提供する。
なお、本発明のポリペプチドは、腸管炎症部位吸着活性を付与したい分子の外側に配置するように該分子と結合させることが好ましい。即ち、本発明のポリペプチドは、該分子の表面上へ配置されるように該分子と結合させることが望ましい。【００４１】
本発明の好ましい態様においては、本発明のポリペプチドとして上記配列を挟むようにシステイン残基（Ｃ）を配置させた配列を含むポリペプチドを挙げることができる。ポリペプチド中の２つのシステイン残基のＳＨ基は、通常、自動酸化により架橋結合（ジスルフィド結合）することが知られている。このように２つのシステイン間で架橋結合が形成されることにより、その間に位置するモチーフ配列を含むポリペプチド鎖はループ状に突出することが期待される。即ち、本発明のポリペプチドに上記のようなシステイン残基を導入することにより、本発明のポリペプチドを分子表面（外側）へ効率的に配置させることが可能となる。その他に、本発明のポリペプチドを外側へ配置させる方法として、例えば、ポリペプチド鎖を導入するタンパク質分子の外側に露出するドメインに本発明のポリペプチドを配置させるように組換え体を作成する方法、PEGのような架橋剤をタンパク質、脂質、人工担体などに結合させ、PEG鎖の末端にポリペプチド鎖を結合させる方法、ポリペプチド鎖を担体表面に化学結合させる方法等が挙げられる。【００４２】
本発明のポリペプチドと結合させる分子として、例えば、炎症性腸疾患の治療のために腸管炎症部位へ直接送達させることが望ましい化合物等を挙げることができる。該化合物は、本発明のポリペプチドによって腸管炎症部位吸着活性が付与され、その結果、体内へ投与された際に効率的に腸管炎症部位へ送達され吸着し、治療効果を発揮することが期待される。
本発明には、上記のような炎症性腸疾患に対して治療効果が期待される腸管炎症部位吸着活性を有する分子、または該分子を含む薬剤が含まれる。【００４３】
本発明の腸管炎症部位移行活性を有するポリペプチドを用いた炎症性腸疾患の治療に対する治療戦略としては、例えば次のようなものがあげられる。
炎症性腸疾患に有効な薬物にはさまざまな副作用が伴う。例えばステロイド剤は長期大量投与により種々の副作用をもたらす。また、infliximabは種々の合併症や中和抗体の出現が見られる。腸管炎症部位への特異的なドラッグデリバリーシステムが必要とされていた。本発明のポリペプチドを用いることにより、末梢臓器にあまり影響を与えず腸管炎症部位に特異的に薬物投与ができると考えられる。また治療薬剤のみならず、発症に伴い欠乏するタンパク質や酵素、または治癒を促進する物質など、治療用遺伝子を運ぶ遺伝子治療ベクター、さらにまた腸管細胞死を抑制し、腸管細胞の再生を促す因子を分泌する細胞や腸管組織の一部として生着する再生治療用細胞などへのキャリアーとしての適用もあげられる。【００４４】
本発明の上記薬剤は、本発明のポリペプチドもしくは該ポリペプチドを含む腸管炎症部位吸着活性を有する分子のみを成分とするものであってもよいし、また、公知の製剤学的製造法によって、製剤化することもできる。例えば、薬剤として一般的に用いられる適当な担体、または媒体、例えば滅菌水や生理食塩水、植物油（例、ゴマ油、オリーブ油等）、着色剤、乳化剤（例、コレステロール）、懸濁剤（例、アラビアゴム）、界面活性剤（例、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、溶解補助剤（例、リン酸ナトリウム）、安定剤（例、糖、糖アルコール、アルブミン）、または保存剤（例、パラベン）、等と適宜組み合わせて、生体に効果的に投与するのに適した注射剤、経鼻吸収剤、経皮吸収剤、経口剤等の医薬用製剤、好ましくは注射剤に調製することができる。例えば、注射剤の製剤としては、凍結乾燥品や、注射用水剤等で提供できる。【００４５】
また体内への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経口的、または経直腸的に当業者に公知の方法により行うことができる。
また本発明には、本発明の上記薬剤によって腸管炎症部位吸着活性を付与された分子も含まれる。その一例を示せば、本発明のポリペプチドを外殻タンパク質上へ発現させたファージを好適に挙げることができる。
上記ファージは、特に制限されないが、例えば、Ｍ１３ファージ等を好適に示すことができる。Ｍ１３ファージを用いる場合には、キャプシド(Capsid)と呼ばれる外殻タンパク質の外側に本発明のポリペプチドを提示させることができる。【００４６】
本発明は、本発明のポリペプチドに対し結合活性を有する分子のスクリーニング方法を提供する。本発明の上記方法の好ましい態様においては、以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む方法である。
（ａ）本発明のポリペプチドと被検分子とを接触させる工程、
（ｂ）前記ポリペプチドと被検分子との結合活性を検出する工程、
（ｃ）前記ポリペプチドと結合する分子を選択する工程【００４７】
本発明の上記スクリーニング方法によって、例えば、本発明のポリペプチドと結合する分子（タンパク質等）を取得することが可能である。該分子は、腸管における炎症の発症・病態に関与することが期待される。本発明のスクリーニング方法によって取得される分子の機能を解析することにより、炎症性腸疾患のメカニズムの解明が大いに期待され、本発明のスクリーニング方法は非常に有用なものである。
上記工程（ａ）における「接触」は、通常、本発明のポリペプチドの状態に応じて適宜、実施される。例えば、本発明のポリペプチドが精製された状態であれば、精製標品に被検分子（試料）を添加することにより行うことができる。また、本発明のポリペプチドが細胞内に発現した状態または細胞抽出液内に発現した状態であれば、それぞれ、細胞の培養液または該細胞抽出液に被検分子（試料）を添加することにより行うことができる。被検分子がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質をコードするDNAを含むベクターを、本発明のポリペプチドが発現している細胞へ導入する、または該ベクターを本発明のポリペプチドが発現している細胞抽出液に添加することによって行うことも可能である。【００４８】
また、上記スクリーニング方法に用いる被検分子、もしくは本発明のポリペプチドは、必要に応じて適宜標識して用いられる。標識としては、例えば、放射標識、蛍光標識、酵素標識等が挙げられる。
上記結合活性の測定は、当業者においては周知の方法、例えば、酵母ツーハイブリッドシステムを利用した方法、免疫沈降を利用した方法等により、適宜実施することができる。タンパク質間の相互作用（結合活性）の測定方法としては、種々の方法が知られており、本発明の結合活性の測定についても、特定の方法に限定されるものではない。【００４９】
一例を示せば、本発明のポリペプチドとの結合活性を評価する被検分子を含む試料、例えば、細胞の培養上清や細胞抽出物等を接触させ、その後、本発明の抗体を添加して、本発明のポリペプチドとともに該分子を免疫沈降させることが可能である。そして免疫沈降した産物の電気泳動度が本発明のポリペプチドのみの場合と比較して変化しているか否かに基づいて、被検分子と本発明のポリペプチドとの結合を検出することができる。また、結合が検出された試料からの被検分子の回収は、本発明のポリペプチドとの結合を利用した方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどを用いて実施することができる。【００５０】
さらに、本発明のポリペプチドと結合し得るタンパク質等の被検分子を発現していることが予想される組織もしくは細胞より、ファージベクターを用いたcDNAライブラリーを作製し、これをアガロース上で発現させてフィルターにタンパク質を転写後、標識した本発明のポリペプチドを反応させ、結合する被検分子を発現しているプラークを検出する「ウエストウエスタンブロッティング法」によっても、本発明の方法を実施することができる。
また、固相などに固定させた本発明のポリペプチドに、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリー等を作用させ、結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニングにより候補化合物を単離する方法も、当業者においては通常行い得る技術である。【００５１】
被検化合物としては、特に制限はなく、例えば、種々の公知化合物やペプチド、あるいはファージディスプレイ法等を応用して作成されたランダムペプチド群を用いることができる。本発明のポリペプチドを提示させたファージと、上記ランダムペプチド群を提示させたファージを用いた、所謂「ダブルファージディスプレイ法」（J. Castillo, B. Goodson and J. Winter:T7 displayed peptides as targets for selecting peptide specific scFvs from M13 scFv display libraries:J Immunol Methods:257:1-2:117-22:2001）も本発明のスクリーニング方法に好適に利用することができる。
また、微生物の培養上清や、植物、海洋生物由来の天然成分などもスクリーニングの対象となる。その他、生体組織抽出物、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物などが挙げられるが、これらに特に制限されない。【００５２】
また、通常遺伝子産物であるポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖によってコードされている。このとき、他方の鎖によってコードされると仮定したときのアミノ酸配列のペプチドはアンチセンスペプチドと呼ばれる。このアンチセンスペプチドは、本来のペプチド（センスペプチド）と相互反応をするという仮説がBlalock(1984)らにより提唱され、それ以後センスペプチドとアンチセンスペプチドが相互反応をするとする報告が多数知られている。従って、本発明のポリペプチドをコードするDNAの相補鎖配列に基づくアンチセンスペプチドを被検分子として、本発明のスクリーニング方法に供することにより、効率的に本発明のポリペプチドと結合する分子を取得することが可能である。【００５３】
また本発明は、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドの取得方法に関する。
本発明の好ましい態様においては、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドのスクリーニング方法（取得・単離方法）を提供する。
（ａ）被検ポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させたファージ粒子を作製する工程
（ｂ）該ファージ粒子を、腸管炎症部位と接触させる工程
（ｃ）腸管炎症部位への吸着活性を有するファージ粒子を選択する工程
（ｄ）工程（ｃ）において回収されたファージ粒子に提示された被検ポリペプチドを腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドとして選択する工程【００５４】
上記の方法における被検ポリペプチドの配列は特に制限されず、任意のアミノ酸配列からなるポリペプチドを用いることができる。通常、本発明の被検ポリペプチドは、ランダムなアミノ酸配列からなる、複数種のポリペプチドである。また、被検ポリペプチドの長さは、ファージ外殻タンパク質上へ提示させるのに許容される長さであれば特に制限されず、当業者においては、ファージの種類等を考慮して、被検ポリペプチドの長さを適切に設定することができる。任意のアミノ酸配列からなるポリペプチドの作製は、当業者においては公知の技術を用いて容易に行い得ることである。例えば、市販のペプチド合成機等を利用して被検ポリペプチドを作製することができる。【００５５】
上記工程（ａ）において、任意のポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させる方法は、所謂ファージディスプレイ法として当業者においては一般的に公知の技術である。ファージの生活環を利用して、任意のポリペプチドをファージ外殻タンパク質上に提示させて、通常、ライブラリー化した分子群を調製する。一例を示せば、ランダム化したDNAを化学合成し、遺伝子工学技術を用いてファージDNAに挿入する。このDNAを大腸菌等の宿主細胞へ導入することにより、ファージ分子が生合成され、ウイルス粒子の外殻タンパク質上へ上記ランダム化DNAによってコードされるポリペプチドが提示される。
より具体的には、被検ポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させたファージ粒子を作製する工程の一例として、後述の実施例に記載の方法（手順）を示すことができる。【００５６】
本発明に用いられるファージとしては、例えば、M13、T7、f1、fd等の公知のファージを好適に用いることができるが、好ましくはM13ファージである。ファージ外殻タンパク質としては、例えば、pIII、10A、10B、Capcid等を挙げることができる。pIIIタンパク質上へ提示するライブラリー等は市販されており、本発明のスクリーニング方法においては、これらの市販のライブラリーを適宜使用することができる。【００５７】
また、本発明の好ましい態様は、工程（ａ）につづいて、さらに腸管正常部位に吸着しないファージ粒子を選択する工程を含む上記のスクリーニング方法である。具体的には、工程（ａ）によって作製されたファージ粒子を、工程（ｂ）の前に予め、腸管正常部位の細胞に添加し、腸管正常細胞に特異的に結合し得るファージ粒子および腸管に非特異的に結合し得るファージ粒子を吸収し、除去することができる。この過程から工程（ｂ）および工程（ｃ）の過程はパンニング法と呼ばれる。パンニング法は、タンパク質の相互作用を利用した選択方法であり、当業者においては、そのファージの種類等を考慮して適宜実施することができる。本発明のスクリーニング方法におけるパンニング法の利用例を示せば、まず、腸管炎症部位の細胞に結合しやすいファージを培養下で濃縮するために、対照細胞（腸管正常部位の細胞）と反応して非特異的に結合するファージを吸収除去し、さらに腸管炎症部位の細胞に特異的に接着するファージを濃縮する。より具体的には、後述の実施例に記載の手順によってパンニングを実施することができる。
上記工程（ｂ）において用いる非ヒト動物の腸管の由来は、例えば、マウス、ラット、スナネズミ、ネコ、ウシ、サル等を挙げることができる。その他、家畜動物あるいはペット動物等を挙げることができる。【００５８】
また、上記工程（ｂ）において用いられるファージは必ずしもファージ粒子全体である必要はなく、例えば、被検ポリペプチドを提示させた外殻タンパク質のみを非ヒト動物へ投与することによっても、本発明のスクリーニングを行うことが可能である。
上記工程（ｃ）において、腸管組織からのファージ粒子の回収は、通常、以下のように行うことが可能である。腸管のホモジネートの希釈シリーズを作製する。続いて、該希釈液を寒天培地上へ撒き、ファージのプラークを形成させた後、該プラークをピックアップし、ファージ粒子の回収を行う。ただし、この方法は一例であって、当業者においては、ファージの種類等を考慮して、適宜、腸管組織からファージ粒子の回収を行うことができる。
次いで、上記工程（ｄ）において選択されたポリペプチドは、当業者に公知の方法によってそのアミノ酸配列を決定することができる。【００５９】
また本発明の他の好ましい態様においては、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む、腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドのスクリーニング方法（取得・単離方法）を提供する。
（ａ）被検ポリペプチドをファージ外殻タンパク質上へ提示させたファージ粒子を作製する工程
（ｂ）該ファージ粒子を、腸管炎症を惹起した非ヒトモデル動物へ投与する工程
（ｃ）該非ヒト動物の腸組織からファージ粒子を回収する工程
（ｄ）工程（ｃ）において回収されたファージ粒子に提示された被検ポリペプチドを腸管炎症部位吸着活性を有するポリペプチドとして選択する工程
上記工程（ａ）におけるファージ粒子の作製は、例えば、上述の方法によって実施することができる。【００６０】
また、本発明の好ましい態様においては、工程（ａ）によって作製されたファージ粒子に対し、工程（ｂ）の前に予め、腸管炎症部位の細胞と結合するが腸管正常部位の細胞と結合しないファージ粒子を、前記記載のパンニングによって選択することができる。この操作により、本発明のスクリーニングを効率的に行うことが可能である。
上記工程（ｂ）において、ファージ粒子を投与する非ヒト動物としては、例えば、マウス、ラット、スナネズミ、ネコ、ウシ、サル等を挙げることができる。その他、家畜動物あるいはペット動物等を挙げることができる。
また、上記工程（ｂ）において投与されるファージは必ずしもファージ粒子全体である必要はなく、例えば、被検ポリペプチドを提示させた外殻タンパク質のみを非ヒト動物へ投与することによっても、本発明のスクリーニングを行うことが可能である。
非ヒト動物体内への投与は、通常、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射、経皮投与、経口投与、経直腸投与等により行うが、これらには限定されない。【００６１】
上記工程（ｃ）において、腸管組織からのファージ粒子の回収は、通常、以下のように行うことが可能である。非ヒト動物の腸管を摘出し、腸管のホモジネートの希釈シリーズを作製する。続いて、該希釈液を寒天培地上へ撒き、ファージのプラークを形成させた後、該プラークをピックアップし、ファージ粒子の回収を行う。ただし、この方法は一例であって、当業者においては、ファージの種類等を考慮して、適宜、腸管組織からファージ粒子の回収を行うことができる。
次いで、上記工程（ｄ）において選択されたポリペプチドは、当業者に公知の方法によってそのアミノ酸配列を決定することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。【００６３】
〔実施例１〕炎症小腸モデル動物からの摘出腸管標本の作成
Ex vivo パンニングに用いるモデル動物の摘出腸管標本の作成には8週齡のマウス雄C57BLの腸管を使用した。マウスは処置前日より14時間の絶食後に使用した。【００６４】
1. 小腸虚血再灌流の実施
炎症小腸モデル動物作成のため、小腸の虚血再灌流を実施した。手技としては、Megisonらの方法（Megison SM, et al. J Surg Res 49,168-173,1990；A.A.Riaz, et al. British Journal of Surgery 2002,89,1572-1580.）に従い、マウスにネンブタール（大日本製薬）:エタノール（Wako）:0.9% NaClを1:2:7の割合で混合して、0.01 ml/BW(g)を腹腔内投与することで麻酔を行なったのち、マウスを仰臥位とし、腹部を正中切開して腸間膜や脈管を傷つけないように腸管を創外へ引き出し、5-0ナイロン糸で上腸間膜動脈の空腸枝末梢部と回結腸動脈末梢部を結紮した。上腸間膜動脈と上部小腸を鉗子でつまみ血流を遮断し、回腸末端部の小腸も同様に鉗子でつまみ虚血を行った（図１）。30分間の虚血後鉗子を外し、再灌流させて閉腹して2時間静置した。【００６５】
2. 炎症小腸モデル動物からの摘出腸管標本の作成
虚血再灌流を行なったマウスをジエチルエーテル（SAJ）麻酔で犠死させた後、腹部を正中切開して.腸管を創外に引き出し、十二指腸から回腸末端までの小腸を摘出して氷冷した0.9%NaClに浸した。
正常動物として、虚血再灌流を実施しなかったマウスより十二指腸から回腸末端までの小腸を摘出して氷冷した0.9% NaClに浸してすすいだ。
摘出腸管は、シリンジを用いて氷冷した0.9% NaClで腸管内部を十分に洗浄し、自作のツールを用いて腸管を反転させ、氷冷した0.9% NaCl中で再びすすいだ（図１）。その後室温にて30 mlの0.9% NaClに溶解させたプロナーゼ（科研製薬,20000unit/0.5 g）に腸管を15分浸して粘液を除去し、続いて氷冷した 0.9% NaClで再びすすいだのち炎症小腸標本もしくは正常小腸標本として使用した。【００６６】
〔実施例２〕ファージディスプレイによる炎症小腸標的活性ペプチドの単離
M13ファージディスプレイライブラリーはNew England BiolabsのPh.D.-C7C TM Phage Display Peptide Library Kit（New England Biolabs, E8120S）を使用した。当該キットは両端をシステイン残基で囲まれたランダムな7アミノ酸からなるペプチドを提示するライブラリーで、ペプチドはファージ粒子のアッセンブリーの際に酸化を受けてジスルフィド結合を形成しループとして標的に提示される。【００６７】
1. 大腸菌ER2738の培養
キットに付属のホスト大腸菌ER2738を、20μg/ml テトラサイクリン(片山)を含むLB培地にて37℃で一晩振盪培養し、20μg/ml テトラサイクリンを含むLBプレートにストリークしたものをER2738のワーキングストックとし、2週間毎に新たなワーキングストックを作成した。
ファージの増幅や力価測定に使用したER2738はこのストリークしたワーキングストックよりシングルコロニーをピックアップし、20μg/ml テトラサイクリンを含むLB培地にて37℃で一晩振盪培養したものを用いた。【００６８】
2. Ex vivo パンニング
2-1. 1回目のパンニング
Ex vivoのパンニングは、2個体の動物から作製した炎症腸管標本を用い、一連の操作をduplicateで行った。予め正常小腸標本にファージライブラリーを吸着させて正常小腸に対して親和性を示すファージ粒子を除いたのち、炎症小腸標本を用いてパンニングを実施した（図２）。【００６９】
1回目のパンニングでは1011 pfuのM13-C7Cファージライブラリーを含む20 mlの反応溶液〔UV照射により感染能力を消失させたM13KE 4.8 x 109 pfu/ml、5μg/ml アプロチニン(Wako)、5μg/ml ロイペプチン(SIGMA)、0.5 mM PMSF(Wako)、0.1 mg/ml BSA、0.01% NaN3を含むHanks buffer〕に正常小腸標本を1匹分加え、37℃で振盪しながら10分反応させた。10分後に反応溶液から正常小腸標本を取り除き、残った反応溶液中に炎症小腸標本を1匹分加えて吸着反応を再開させ60分反応させた。【００７０】
2-2. 吸着ファージの洗浄と抽出
ファージライブラリーと反応させた炎症小腸標本を回収し、個別に14 mlスナップキャップチューブへ移した。
5 mlのTBSを添加してキャップを締め、10回転倒攪拌して小腸標本を取り出し、ペーパータオル上に置き余分な水分を吸収させた。14 mlスナップキャップチューブ内のTBSを新しいものに交換して取り出した小腸標本を戻した。これを5セット繰り返した後、TBSを0.1% Tween20/TBSに置き換えて10回転倒攪拌してから小腸標本を取り出し、ペーパータオル上に置き余分な水分を吸収させた。秤量済みの2 ml tubeへ小腸標本を移しハサミで細かく刻み、小腸標本の湿重量を秤量した。【００７１】
0.5 mlのホモジナイズ溶液〔20 mM HEPES (SIGMA)/0.25 M スクロース/ 1 mM EDTA に使用直前に10μg/ml アプロチニン/ 10μg/ml ロイペプチン、1 mM PMSFを添加〕を加え、ポリトロン(Heidolph)を用いてホモジナイズした。続いてホモジナイズ溶液へ0.5 mlの100 mM LiCl(片山)/PBSを添加して混合した。
ホモジネート中のファージの力価は下記「2-3. ファージの力価測定 (Titration)」に示した方法で決定した。
残りのホモジネートは下記「2-4. ファージの増幅と精製」に示した方法で増幅および精製を行い、次のEx vivo パンニングに使用した。【００７２】
2-3. ファージの力価測定 (Titration)
ファージ溶液の力価 (Titer) は以下のように測定した。
14 ml スナップキャップチューブ (Falcon) にER2738 の終夜培養液を250μlとIPTG(片山)/X-gal (SIGMA) mixture (50μg/ml IPTG / 40μg/ml X-gal) を3μl加え、溶解したTop Agarose (6μg/ml Agarose / LB 培地) を2.5 ml添加して混合した。直ちに、LB/IPTG/X-gal plateに広げ、ホスト大腸菌ER2738 のbacterial lawnを作製した。力価を測定するファージ溶液はTBSにて希釈シリーズを作成し、plateのbacterial lawn上に10μlずつブロットして、流れない程度にまで乾燥させた後、37℃で一晩培養した。青く発色したプラークをカウントすることでファージ溶液の力価を算出した。【００７３】
2-4. ファージの増幅と精製
ER2738の終夜培養液を20μg/ml テトラサイクリンを含むLB培地にて100倍に希釈し、増幅するファージ溶液を加えてバッフル付き三角フラスコで37℃で4.5から5時間振盪培養した。続いて、10000 r.p.m. 10分、4℃で遠心して上清を回収した。さらに上清を10000 r.p.m. 10分、4℃で遠心することでER2738を完全に除いた。この上清に1/6量の30% PEG/ 3 M NaCl (SIGMA) を添加して氷上で一晩静置してファージを沈殿させた。続いて10000 r.p.m. 45分、4℃で遠心して、上清をデカンテーションにより除去し、さらに10000 r.p.m. 10分、4℃で遠心して、ファージの沈殿を集めた。ファージの沈殿は2 mlのTBS/0.02% NaN3 (SIGMA)で完全に溶解し、10000 r.p.m. 5分、4℃で遠心して上清を回収した。上清に0.467 g/ml になるようにCsCl (Wako)を添加して80000 r.p.m. 18時間、15℃で密度勾配遠心を行い、精製されたファージのバンドを回収した。回収した精製ファージはTBSで透析してCsClを除去し、0.02% になるようにNaN3を加えて4℃で保存した。【００７４】
2-5. 2回目のパンニング
2回目のパンニングでは、「2-4. ファージの増幅と精製」の結果得られた各精製ファージ溶液を1011pfuもちいて「2-1. 1回目のパンニング」と同様に実施した。2回目のパンニングの結果得られたホモジネートは、「2-3. ファージの力価測定 (Titration)」に示した方法でファージの力価を決定した。2回目のパンニングではファージ力価の回収率が上昇しており、腸管への親和性を示すファージの顕著な濃縮が認められた（図３）。【００７５】
3. ファージのクローニングおよび配列決定
3-1. クローニング
「2-5. 2回目のパンニング」の結果得られた2サンプルの腸管ホモジネートよりクローニングを実施し腸管親和性ファージクローンの回収を行った。それぞれの腸管ホモジネートの希釈シリーズをTBSで作成し、上記「2-3. ファージの力価測定 (Titration)」に記載の方法に従って、ファージのプラークを形成させ、シングルプラークを1 ml のTBS中にピックアップした。ピックアップしたおのおのの溶液を用いて、この操作をもう一度行なってファージのクローニングを行なった。【００７６】
3-2. ファージDNAの調製
ファージクローンの配列を決定するためのテンプレートとして以下の方法を用いて各ファージクローンごとにファージDNAを調製した。
14 ml スナップキャップチューブに 2 ml のLB培地と20μlのER2738終夜培養液とファージクローン溶液を200μl添加し、37℃で4.5時間振盪培養した。8000 r.p.m. 5分、4℃で遠心してER2738を沈殿させ、上清を1 ml ずつ2本の1.5 ml エッペンドルフチューブへ移し、15000 r.p.m. 5分、4℃で遠心し上清を新しい1.5 ml エッペンドルフチューブへ移した。上清の1 mlは4℃で保存し、「4. ファージクローンの評価」において使用した。残りの1 ml の上清に30% PEG/3 M NaCl を400μl添加して転倒攪拌した後、4℃で一晩静置した。15000 r.p.m. 45分、4℃で遠心して上清をアスピレートにより完全に除去した。沈殿したファージに200μl TEを加えて、30秒間ボルテックスして、15分間静置後再び30秒間ボルテックスすることでファージを再懸濁した。続いて200μl の中性フェノール pH 8（0.5 M Tris-HCl pH 8にて中性に平衡化した：SAJ）を加え1分間ボルテックスを行い、5分間室温で静置した。続いて15000 r.p.m. 5分、20℃で遠心して上清180μlを新しい1.5 ml エッペンドルフチューブへ回収した。そこへ200μlのCIA(96% クロロホルム/4% イソアミルアルコール: SAJ)を加えて30秒間ボルテックスを行い、1分間室温で静置後再び30秒間ボルテックスを行なった。続いて15000 r.p.m. 5分、20℃で遠心して上清150μlを新しい1.5 ml エッペンドルフチューブへ回収した。そこへ1.5μlのグリコーゲン(Ambion.Inc.)、15μl の3 M 酢酸ナトリウム(Wako) pH 5.2、330μlの100％エタノール(SAJ)を加えて転倒攪拌後-30℃で30分静置した。続いて15000 r.p.m. 30分、4℃で遠心してファージDNAを沈殿させた。沈殿を失わないように上清を除去し、750μlの70% エタノールを緩やかに加えながらチューブ内を洗浄した。15000 r.p.m. 5分、20℃で遠心後上清を除去し、沈殿をデシケーターにて10分程度乾燥させ、20μlのTEを添加して溶解して260 nm波長の吸収量を元にDNA量を算出した。【００７７】
3-3. 配列決定 (sequencing)
得られたファージクローンの塩基配列の決定は、ファージDNAをテンプレートとして用い、-96 gIII シーケンシングプライマー (5’-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’（配列番号：２４）)(NEB)とBigDye(R) Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit(ABI)を用いてABI 310 DNAシーケンサー(ABI)を用いて行った。2つのサンプルの腸管より回収されたクローンよりランダムに50クローンずつ塩基配列決定を行い、塩基配列に基づいてインサートのアミノ酸配列を決定した。インサート部分が欠失しており解析できなかったクローンが25、解読できなかったものが8クローン存在した。同定されたペプチド配列は合計23種であった（表２）。【００７８】
【表２】
2008044599.tif 000003
Ex vivoパンニングにより濃縮された炎症小腸特異的結合を示すファージから単離した100個のクローンの持つペプチド配列を示す表である。【００７９】
4. ファージクローンの評価
「3-3 配列決定(sequencing)」の結果得られた23種のクローンのうち、インサート配列の相同性により20種を選びさらに評価した。個々のファージクローンについて正常小腸標本と炎症小腸標本それぞれに対する吸着活性を求め、インサートを持たないコントロールファージであるM13KEの吸着活性と比較して評価を行なった。【００８０】
「実施例１ 炎症小腸モデル動物からの摘出腸管標本の作成」に示した方法に従い、正常小腸標本および炎症小腸標本を作成した。それぞれの小腸標本を長さが等しくなるように２分割し、1/2匹分ずつの小腸標本を用いduplicateでファージクローンの吸着活性の測定を行った。「3-2. ファージDNAの調製」でファージクローンの評価用に保管しておいた、増幅したファージクローン培養液を用いて1×108 pfu のファージクローンを含む5 ml の反応溶液を調製し、これに正常小腸標本もしくは炎症小腸標本を加えて、37℃で60分振盪培養して吸着反応とした。続いて「2-2. 吸着ファージの洗浄と抽出」に記載した方法に従って洗浄操作と抽出操作を行い、得られたホモジネート中のファージ力価を「2-3. ファージの力価測定(Titration)」に記載の方法に従って決定した。
クローンごとに正常小腸標本もしくは炎症小腸標本から回収されるファージ力価を決定し、それらをコントロールファージM13KEの同様な操作の後に回収される力価と比較した。【００８１】
コントロールファージに比べて炎症小腸標本に高い吸着率を示したクローンとして、6204、6227、6245、6246、6261の5種類が認められた（図４）。これらについてさらに炎症小腸標本の例数を増やして吸着活性の測定を繰り返し、回収される吸着ファージ力価の値をもとに統計的解析を行った。力価の比較にはStudent’s t-testを用い、p < 0.05をもって有意とした。その結果、図５に示すようにクローン6204、クローン6246およびクローン6261は炎症腸管に対する吸着率においてコントロールファージに比べ有意に高い値を示した。また、クローン6204、クローン6227、クローン6245およびクローン6261は正常腸管に対する吸着率においてコントロールファージに比べ有意に高い値を示した。5つのクローンのうちクローン6245以外のいずれのクローンも正常腸管より炎症腸管に対し高い吸着率を示した。クローン6246は正常腸管に対する吸着率においてコントロールファージと差がないが炎症腸管に対する吸着率がコントロールファージに比べ有意に高い値を示し、さらに正常腸管よりも炎症腸管に対し有意に高い吸着率を示した。【００８２】
これら5種のクローンの正常腸管および炎症腸管に対する親和性をコントロールファージと比較する（コントロールファージの腸管からの回収率を１としたときの各クローンの回収率の比で表す）と表３のとおりである。
これらのクローンにより示されるペプチドは小腸の炎症部位に集積する能力を持ち、タンパクや低分子薬、遺伝子治療用ウイルスベクターなどを病変部位に送達することに利用できる。とりわけ、クローン6246の配列SQSHPRH（配列番号：４）は正常の小腸には集積せず、小腸の炎症部位に特異的に集積する能力を有することから特に有用であると考えられる。【００８３】
【表３】
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炎症小腸特異的結合を示すファージクローン5種について正常小腸標本および炎症小腸標本に対する結合能を比較し、コントロールファージの回収率を1としたときの各クローンの回収率の比で表し、各クローンのペプチド配列とともに示した表である。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明では、通常ファージディスプレイにおいてパンニングに用いられる標的タンパクをコートしたプレートの代わりに、虚血再灌流により作成した炎症小腸モデル動物から回収した小腸組織を用いてEx vivoパンニングを行い、腸管炎症部位に特異的に吸着するペプチドを探索した。
その結果、炎症小腸内腔に特異的に結合するペプチド、および正常小腸内腔側に特異的に結合するが炎症小腸内腔により強く結合するペプチドを見出しその配列を明らかにした。
これら腸管内腔側に吸着するペプチド、とりわけ腸管炎症部位に特異的に吸着するペプチドは、治療薬や遺伝子治療用ベクター等を効率よく小腸、もしくは炎症を起こした小腸病変部に集積させるための手段として利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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