(57)【要約】分析精度を担保したうえで、簡便性及び迅速性を兼ね備えたジチオカルバメート系農薬の分析方法を提供する。生薬もしくはこれを含む製剤又はこれらの処理物、酸触媒水溶液、Ｌ−システイン又はその塩、及び抽出用有機溶媒を反応容器に入れて密閉後、マイクロ波を照射し、生薬又はこれを含む製剤中に存在していたジチオカルバメート系農薬を二硫化炭素に分解し、前記有機溶媒へ分配抽出した後、分析することを特徴とするジチオカルバメート系農薬の分析方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生薬もしくはこれを含む製剤又はこれらの処理物、Ｌ−システイン又はその塩、及び抽出用有機溶媒を反応容器に入れて密閉後、マイクロ波を照射し、生薬又はこれを含む製剤中に存在していたジチオカルバメート系農薬を二硫化炭素に分解し、前記有機溶媒へ分配抽出した後、分析することを特徴とするジチオカルバメート系農薬の分析方法。
【請求項２】
反応容器に更に酸触媒水溶液を入れて密閉する請求項１記載の方法。
【請求項３】
酸触媒水溶液が塩化スズ(II)又はその水和物及び塩酸を含有する請求項２記載の方法。
【請求項４】
抽出用有機溶媒がシクロヘキサン又は２，２，４−トリメチルペンタンである請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
分析をガスクロマトグラフで行う請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ジチオカルバメート系農薬がプロピネブを含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
生薬もしくはこれを含む製剤が生薬、漢方製剤、健康食品、医薬部外品又は化粧品である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のジチオカルバメート系農薬を分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ジチオカルバメート系農薬は、殺菌剤、殺線虫剤として農薬分野で広く使用されており、漢方製剤の原料である薬用生薬においても利用されている。【０００３】
代表的なジチオカルバメート系農薬の分析法である二硫化炭素法は、試料に残留するジチオカルバメート系農薬を、酸触媒中で加熱して二硫化炭素へ分解させて測定し、二硫化炭素換算残留値として定量する手法であるが、特殊な分解用ガラス器具や多種の劇薬（塩酸、濃硫酸、アルカリ）を使用する必要があり、分析法として煩雑である。その他にジチオカルバメート系農薬を誘導体化して定量するメチル化法があるが、残留する農薬種（エチレンビスジチオカルバメート類、ジメチルジチオカルバメート類、プロピレンビスジチオカルバメート類）が判定できる点において二硫化炭素法より優れているが、操作性、検体処理能力において二硫化炭素法と大差がない。またジチオカルバメート系農薬はその物性（分解性、難溶解性）のため、近年一般的となっている一度に多くの残留農薬を確認できる一斉分析法の適用が困難である。【０００４】
このような理由からジチオカルバメート系農薬はその使用量が多いにもかかわらず、残留分析が効率の悪い個別分析法に頼らざるを得ず、残留農薬管理が困難であるとされてきた。【０００５】
非特許文献１には、乾燥タバコ及び桃中に残留するジチオカルバメート系農薬をマイクロ波照射加熱により二硫化炭素に分解して定量する方法が開示されている。この分析法は、樹脂製の筒の中に、検体、５ｍｏｌ／Ｌ塩酸、触媒として塩化スズ(II)、有機溶媒としてイソオクタンを加え密閉後、マイクロ波で加熱して残留しているジチオカルバメート系農薬を二硫化炭素へ分解させ、反応用筒内にて有機溶媒に分配抽出後、有機溶媒相を採取して炎光光度型検出器付きガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＦＰＤ）で分析するといった極めて単純な手法である。【０００６】
しかしながら、本発明者らが生薬及び漢方製剤等について非特許文献１に記載の分析法を適用したところ、農薬の添加回収試験で不十分な結果となり、更なる改良が必要であった。【０００７】
非特許文献２には、Ｌ−システインがエチレンビスジチオカルバメート系農薬であるマンコゼブ（マンゼブ）のエチレンチオウレアへの分解を防ぐことが記載されているが、エチレンビスジチオカルバメート系農薬、プロピレンビスジチオカルバメート系農薬及びジメチルジチオカルバメート系農薬の二硫化炭素への分解については何ら言及していない。【０００８】
非特許文献３には、果実や野菜の試料を磨砕すると、ジチオカルバメート系農薬が水分との接触により速やかに分解されること、及び当該試料中にＬ−システインを加えると、ジチオカルバメート系農薬の分解が抑制されることが記載されているが、如何なる分解反応を抑制するかについて明らかにされておらず、マイクロ波によるジチオカルバメート系農薬の二硫化炭素への分解反応系にＬ−システインに共存させた場合にどのように作用するかについては何ら示唆されていない。また、非特許文献３におけるＬ−システインの効果は、なつみかん、ぶどう、りんご及びレタスの試料については認められるが、ミニトマトの試料については、効果は認められていない。
【非特許文献１】J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 2220-2226
【非特許文献２】J. Agric. Food Chem., 1992, 40, 76-80
【非特許文献３】２００６年第２９回農薬残留分析研究会講演要旨集第１６８〜１７１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、分析精度を担保したうえで、簡便性及び迅速性を兼ね備えたジチオカルバメート系農薬の分析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の要旨は以下のとおりである。【００１１】
（１）生薬もしくはこれを含む製剤又はこれらの処理物、Ｌ−システイン又はその塩、及び抽出用有機溶媒を反応容器に入れて密閉後、マイクロ波を照射し、生薬又はこれを含む製剤中に存在していたジチオカルバメート系農薬を二硫化炭素に分解し、前記有機溶媒へ分配抽出した後、分析することを特徴とするジチオカルバメート系農薬の分析方法。【００１２】
（２）反応容器に更に酸触媒水溶液を入れて密閉する前記（１）に記載の方法。【００１３】
（３）酸触媒水溶液が塩化スズ(II)又はその水和物及び塩酸を含有する前記（２）に記載の方法。【００１４】
（４）抽出用有機溶媒がシクロヘキサン又は２，２，４−トリメチルペンタンである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。【００１５】
（５）分析をガスクロマトグラフで行う前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。【００１６】
（６）ジチオカルバメート系農薬がプロピネブを含む前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。【００１７】
（７）生薬もしくはこれを含む製剤が生薬、漢方製剤、健康食品、医薬部外品又は化粧品である前記（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、多数の検体を一度に安全かつ短時間で処理することが可能となる。これにより、これまで煩雑であったジチオカルバメート系農薬の分析を劇的に簡便化することが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明のジチオカルバメート系農薬の分析方法は、ジチオカルバメート系農薬分析法である二硫化炭素法の原理を活用、改良したものである。本手法は農薬の分解をマントルヒーターなどの直接的な加熱ではなく、マイクロ波照射による間接的な加熱によって促進すると同時に、分解生成した二硫化炭素を有機溶媒へ抽出分配し、これをガスクロマトグラフ等で測定、二硫化炭素換算残留値として農薬残留値を定量する手法である。【００２０】
本発明において分析対象となるジチオカルバメート系農薬とは、次式：  ＞Ｎ−ＣＳ−Ｓ−  で示されるジチオカルバメート構造を有する農薬であれば制限はなく、例えば、次式（Ｉ）、(II)又は（III）：
【化１】
2009016897.tif 000002
【００２１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって、水素原子、置換又は非置換のフェニル基、置換又は非置換のＣ１−５−アルキル基、置換又は非置換のＣ３−７−アルキル基、アミノ基、ベンゾチアゾリル基を表し、Ｒ１及びＲ２は、共同して炭素数１〜４のアルキレン基を表してもよく、ｎは１又は２であり、Ｘは水素原子、アンモニウム基、金属原子を表す。）
で示される化合物が挙げられる。【００２２】
前記式において、Ｒ１又はＲ２で表されるＣ１−５−アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、アミル基が挙げられ、Ｃ３−７−アルキル基としては、例えばシクロヘキシル基が挙げられる。Ｒ１又はＲ２で表されるフェニル基、Ｃ１−５−アルキル基及びＣ３−７−アルキル基は、ジチオカルバモイル基によって置換されていてもよい。【００２３】
Ｘで表される金属原子としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属原子；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属原子；亜鉛、ニッケル、カドミウム、鉄、銅、マンガン、砒素が挙げられる。【００２４】
前記ジチオカルバメート系農薬の具体例としては、ジネブ、マンネブ、マンゼブ、アンバム、ポリカルバメート（ビスジメチルジチオカルバモイルジンクエチレンビスジチオカルバメート）、有機ニッケル（ジメチルジチオカルバミン酸ニッケル）、フェルバム、プロピネブ、メチラム、ジラム、チウラム、メチルジチオカルバミン酸ナトリウムが挙げられる。【００２５】
本発明に適用しうる試料としては、ジチオカルバメート系農薬の残留が疑われる生薬もしくはこれを含む製剤又はこれらの処理物であれば特に制限はなく、例えば生薬、漢方製剤、健康食品、医薬部外品（例えば、歯磨き粉）、化粧品、農作物、土壌などが挙げられる。生薬もしくはこれを含む製剤は、必要に応じて、粉砕、切栽等の処理をして用いてもよい。【００２６】
本発明では、Ｌ−システイン又はその塩を含有する水溶液が用いられる。Ｌ−システインの塩としては、例えば塩酸塩又はその水和物が挙げられる。当該水溶液におけるＬ−システイン又はその塩の濃度は、通常０．１〜１０．０ｗ／ｖ％である。生薬の分析においては、２．０〜６．０ｗ／ｖ％であり。好ましくは４．０％ｗ／ｖ％である。【００２７】
Ｌ−システインまたその塩の濃度が２％未満であると、添加回収率の点で不十分となり、１０％を超えると反応溶液の粘度が高くなり溶液の均一性が低下することから二硫化炭素への分解反応が不十分となる。【００２８】
本発明においては、Ｌ−システイン又はその塩を含有する水溶液とともに、必要に応じて、酸触媒水溶液を用いてもよい。ここで用いる酸触媒水溶液としては、例えば塩化スズ(II)又はその水和物及び塩酸を含有する水溶液、硫酸、リン酸、パラトルエンスルホン酸などの酸性水溶液が挙げられる。塩化スズ(II)又はその水和物、塩酸及び水は、それぞれ別々に反応容器に入れてもよく、また、予め、塩化スズ(II)又はその水和物、塩酸及び水、更に必要に応じて、Ｌ−システイン又はその塩を混合して水溶液としたものを反応容器に入れてもよい。【００２９】
塩化スズ(II)は、無水和物、又は二水和物等の水和物として用いられる。Ｌ−システインの塩としては、例えば塩酸塩又はその水和物が挙げられる。【００３０】
予め、塩化スズ(II)又はその水和物、塩酸、及びＬ−システイン又はその塩を含有する水溶液を調製する場合、当該水溶液中の塩酸濃度は、通常０．５〜６．０ｍｏｌ／Ｌであり、塩化スズ(II)又はその水和物の濃度は、通常０．１〜５．０ｗ／ｖ％であり、Ｌ−システイン又はその塩の濃度は、通常０．１〜５．０ｗ／ｖ％である。【００３１】
抽出用有機溶媒としては、一般的には、非極性ないし弱極性のもの、具体的には、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、イソオクタン（２，２，４−トリメチルペンタン；以下同様）、トルエン等が、マイクロ波の透過性及び抽出の選択性の点で好ましく、添加回収率の点で、シクロヘキサン、イソオクタンが特に好ましい。【００３２】
反応容器としては、耐圧力設計のもので、温度制御が可能なもので、かつ密閉可能な容器であれば特に制限はない。反応容器の材質としては、マイクロ波透過性のものであれば特に制限はなく、例えばフッ素樹脂（例えば、テフロン、ＰＦＡ）、ガラス（例えば、パイレックスＴＭ、石英）等が挙げられる。【００３３】
通常、１本の反応容器（７０ｍＬ容）当たり、試料（生薬もしくはこれを含む製剤又はこれらの処理物）０．１〜５ｇ、Ｌ−システイン又はその塩を含有する酸触媒水溶液（又はＬ−システイン又はその塩を含有する水溶液）１０〜３０ｍＬ、抽出用有機溶媒５〜２０ｍＬを加える。この値は、装置の規模により変化するものであり、マイクロ波照射装置、マイクロ波出力及び反応容器それぞれの大きさに応じて適宜変更することができる。【００３４】
反応容器を密閉後、マイクロ波溶媒抽出装置に入れて、反応容器の外側からマイクロ波を照射して加熱する。マイクロ波加熱は、３００ＭＨｚ〜３００ＧＨｚの範囲の電磁波による誘導加熱方式である。マイクロ波加熱は、電磁波によって生じる媒体中の存在するイオン電流と分子の双極子回転によるものである。【００３５】
マイクロ波の照射は、通常、反応容器１本当たり１０〜１００Ｗ、温度が８０〜１００℃に保たれるようコントロールしながら連続的又は断続的に１５〜３０分間照射することにより、行われる。【００３６】
本発明では例えば以下の３段階によりマイクロ波の照射を行う。【００３７】
反応溶液の温度を前記範囲とするため、マイクロ波の照射開始当初、マイクロ波出力を高くし速やかに昇温させる。（第１ステップ）
溶液温度が前記範囲となった以降、温度を保てる程度にマイクロ波出力をコントロールし必要時間照射する。（第２ステップ）
マイクロ波照射完了後、室温まで反応溶液温度を低下させる。（第３ステップ）
マイクロ波溶媒抽出装置としては、反応容器を一度に多数組み立て設置でき、一度に多検体を処理可能であれば制限はなく、例えばマイルストーン社製の多検体同時処理用２４本ローター、トルクレンチ締め式１２本ローターなどが挙げられ、耐圧性能が高い点で、トルクレンチ締め式１２本ローターが好ましい。【００３８】
分解反応を終了させた後、各種分析手段、例えばガスクロマトグラフ、好ましくは炎光光度型検出器付きガスクロマトグラフ（ＧＣ−ＦＰＤ）により分析することにより、試料中のジチオカルバメート系農薬を分析することができる。【００３９】
マイクロ波オーブン装置に多数の分解反応用容器を入れて一度にマイクロ波照射を行えば、多数の検体を一度に安全かつ短時間で処理することが可能となる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものではない。【００４１】
実施例１  触媒試液として、４．０％Ｌ−システイン塩酸塩水溶液を用いた生薬におけるチウラム、マンゼブおよびプロピネブの添加回収試験
以下に記載する検体、分析装置、分析条件および操作により生薬における３種のジチオカルバメート系農薬（チウラム、ジネブ、プロピネブ）の添加回収試験をおこなった。【００４２】
(１)検体、試薬その他
(a)検体
以下の２０種類の生薬を、原体あるいは切裁または粉砕等を行い、３〜５ｍｍ程度にしたものを検体として用いた。【００４３】
当帰、センキュウ、牡丹皮、橙皮、陳皮、半夏、柴胡、細辛、山薬、遠志、大棗、キジツ、五味子、牛膝、麦門冬、ビャクシ、蘇葉、山椒、小麦、枇杷葉
(b) 試薬・試液
Ｌ−システイン塩酸塩一水和物：和光純薬工業（株）、試薬特級
２，２，４−トリメチルペンタン（イソオクタン）：関東化学（株）、鹿一級
アセトン：関東化学（株）、残留農薬試験用
蒸留水（ヘキサン洗浄品）：和光純薬工業（株）、残留農薬試験用
(c)触媒試液
４．０％システイン塩酸塩水溶液：Ｌ−システイン塩酸塩一水和物２０ｇを蒸留水に溶解し５００ｍＬとした。【００４４】
(d)被検農薬
農薬標準品
二硫化炭素：和光純薬工業（株）、試薬特級、試薬純度９９％
チウラム標準品：和光純薬工業（株）、農薬標準品、試薬純度１００％
プロピネブ標準品：ジーエルサイエンス（株）、農薬標準品、試薬純度８０％以上
マンゼブ標準品：和光純薬工業（株）、農薬標準品、試薬純度９１％
農薬標準溶液の調製
チウラム標準溶液（二硫化炭素換算８０μｇ／ｍＬ溶液）：チウラム３．１６ｍｇを量りとり、アセトンを加え正確に２５ｍＬとした。【００４５】
プロピネブ標準溶液（二硫化炭素換算８０μｇ／ｍＬ溶液）：プロピネブ４．７５ｍｇを量りとり、蒸留水を加え超音波照射を行い懸濁溶液とした後、正確に２５ｍＬとした。【００４６】
マンゼブ標準溶液（二硫化炭素換算８０μｇ／ｍＬ溶液）：マンゼブ３．８９ｍｇを量りとり、蒸留水又はアセトニトリルを加え超音波照射を行い懸濁溶液とした後、正確に２５ｍＬとした。【００４７】
(e)添加農薬
チウラム、マンゼブあるいはプロピネブ農薬標準溶液(二硫化炭素換算80μｇ／ｍＬ)を各検体に対しそれぞれ二硫化炭素換算濃度が１０ｐｐｍになるように直接添加した。【００４８】
（２）マイクロ波溶媒抽出処理
(a)マイクロ波溶媒抽出装置（以下、ＭＷ装置と略す）
マイクロ波溶媒抽出装置ＥＴＨＯＳ１（マイルストーン社）
＊ＭＷ装置本体ＥＴＨＯＳ１（仕様）
コントロールターミナル６４０
アップトランスＭＤＭ−１０００−２４０−４Ｋ
内部温度コントロールキットＡＴＣ−ＦＯ
赤外線外部温度コントロールキットＩＲＴ
マグネチックスターラーＡＳＭ−４００
＊セグメント中圧ローターＭＰＲ−６００／１２（仕様）
ボトムプレート
トッププレート
中圧セグメントＭＰＲ−６００／１２用
スプリングＨＴＣ−６００
アダプタープレートＡＰ−４５／ＨＴ
ＴＦＭカバーＳＤ−０５／Ｓ
インジゲーターリングＩＲ−５４／２５
ＴＦＭ分解容器（１００ｍＬ）ＨＰＶ−１００
プロテクションシールドＳＳ−０５
ＡＴＣ用中圧セグメント
ＡＴＣカバーセット（圧力ポートなし）
＊その他
ＡＴＣセラミックサーモウェル１４０ｍｍ  ＡＴＣ−ＦＯ（黄色カバーＡＮ０５３２）
ＴＦＭ回転子（φ８ｍｍ×２０ｍｍ）
トルクレンチ（２２．５Ｎｍ）
(b)ＭＷ装置による抽出処理
テフロン製容器（１００ｍＬ）に粉砕した検体生薬２．０ｇを量りとり、容器をプロテクションシールドにはめ込んだ。分解容器内部に攪拌子を入れ、次いで速やかにイソオクタン１０ｍＬ及び触媒溶液３０ｍＬを加えた。ＴＦＭカバーで蓋をし、アダプタープレート、スプリング及びプロテクションリングをはめ込み、中圧セグメントに取り付けトルクレンチ（２２．５Ｎｍ）で締め付けた。測定する本数分同様の操作を行った。セグメンテッド中圧ローターのボトムプレートをＥＴＨＯＳ１庫内にあらかじめセットしておき、中圧セグメントを点対称になるように取り付け、トッププレートを上からはめ込んだ。別途、内部温度センサー用として、ＴＦＭ回転子、イソオクタン１０ｍＬ及び触媒溶液３０ｍＬを加えたＴＦＭ容器にＡＴＣカバーセットを取り付け、ＡＴＣ用中圧セグメントに取り付けてトルクレンチ（２２．５Ｎｍ）で締め付けた。温度センサープローブをＡＴＣ用中圧セグメントのサーモウェルとＥＴＨＯＳ１庫内のコネクターに差し込み、ＡＴＣ用中圧セグメントをボトムプレートに取り付けた。ＥＴＨＯＳ１のドアを閉め、下記の表１に示す条件のマイクロ波抽出プログラムを開始した。プログラムが終了し、反応容器が十分に冷えたことを確認して、反応液の上層（イソオクタン）をサンプルバイアルに採取し、ＧＣ分析試料とした。
【表１】
2009016897.tif 000003
【００４９】
(c)検量線用二硫化炭素溶液の調製
２５ｍＬの褐色メスフラスコに半容量程度のイソオクタンをとり、栓をしてメスフラスコの質量を正確に量った。これに、二硫化炭素１ｍＬを正確にとり、栓をしてメスフラスコの質量を正確に量った。イソオクタンで正確に２５ｍＬとして原液Ａ（約５０，０００μｇ／ｍＬ）とした。【００５０】
原液Ａ１ｍＬを正確に量りとり、イソオクタンで正確に５０ｍＬとして原液Ｂ（約１，０００μｇ／ｍＬ）とした。【００５１】
原液Ｂ１ｍＬを正確に量りとり、イソオクタンで正確に５０ｍＬとして原液Ｃ（約２０μｇ／ｍＬ）とした。【００５２】
原液Ｃ５ｍＬを正確に量りとり、イソオクタンで正確に２５ｍＬとして標準溶液１（４．０μｇ／ｍＬ相当）とした。【００５３】
標準溶液１  １０ｍＬを正確に量りとり、イソオクタンで正確に２０ｍＬとして標準溶液２（２．０μｇ／ｍＬ相当）とした。【００５４】
標準溶液２  １０ｍＬを正確に量りとり、イソオクタンで正確に２０ｍＬとして標準溶液３（１．０μｇ／ｍＬ相当）とした。【００５５】
標準溶液３  １０ｍＬを正確に量りとり、イソオクタンで正確に２０ｍＬとして標準溶液４（０．５μｇ／ｍＬ相当）とした。【００５６】
標準溶液４  １０ｍＬを正確に量りとり、イソオクタンで正確に２５ｍＬとして標準溶液５（０．２μｇ／ｍＬ相当）とした。【００５７】
(３)ガスクロマトグラフによる分析操作
(a)ガスクロマトグラフ装置  機器識別番号：ＧＣ−７（ＧＣ−ＦＰＤ／ＦＰＤ）
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ６８９０Ｎ（本体）
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ７６８３（オートサンプラー）
注入口：スプリット／スプリットレス注入口
インサート：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製スプリット／スプリットレス  ライナ（５１８３−４７１１）
検出器：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製  ＦＰＤ検出器（硫黄モード波長フィルター、３９３ｎｍ）
(b)ＧＣ−ＦＰＤの分析条件
カラム：ＧＳ−ＧａｓＰｒｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、長さ１５ｍ、内径０．３２ｍｍ、膜圧０
カラム温度：４０℃（１．５ｍｉｎ）→３０℃／ｍｉｎ→２２０℃（６．５ｍｉｎ）
注入口温度：１２０℃
注入モード及び注入量：スプリット（１０：１）、１μＬ
キャリアーガス：ヘリウム、コンスタントフローモード、平均線速度３７ｃｍ／ｓｅｃ
検出器：ＦＰＤ−Ｓ  温度２２０℃、水素流量５０ｍＬ／ｍｉｎ、空気流量６０ｍＬ／ｍｉｎ、窒素＋ヘリウム流量５０ｍＬ／ｍｉｎ
(c)検量線の作成
検量線用二硫化炭素標準溶液１〜５をＧＣ−ＦＰＤにて１回ずつ分析し、二硫化炭素濃度（Ｘ）の常用対数（Ｘｉ）に対するピーク面積値（Ｙ）の常用対数（Ｙｉ）の値から、最小二乗法で直線回帰することにより検量線を作成した。【００５８】
（iv）分析試料中濃度の計算及び数値の扱い
二硫化炭素のピーク面積（ｙ）の常用対数（ｙｉ）を求め、検量線の一次式Ｙｉ＝ａＸｉ＋ｂの傾きａ及びｙｉ切片ｂを用い、以下の計算方法により農薬濃度（Ｘｐｐｍ二硫化炭素換算）を算出した。【００５９】
Ｘ（ｐｐｍ）＝１０（ｙｉ−ｂ）／ａ×Ｃ
（補正係数＝Ｃ：検体１ｇに対するイソオクタンの添加量の相対比）
添加回収率は、添加した農薬標準溶液の正確な二硫化炭素換算濃度に対する分析試料中の農薬濃度を百分率で算出した。Ｎ＝１での測定では、回収率の小数点第２桁を四捨五入して、小数点第１桁まで求めた。Ｎ＝３で測定した場合、回収率の小数点第３桁を切り捨てて小数点第２桁まで求めた後、平均及び相対標準偏差（ＲＳＤ）は小数点第２桁を四捨五入して、小数点第１桁まで求めた。【００６０】
（４）試験結果および考察
表２に示すとおり、２０種類の生薬のすべてで、３種類の農薬において、残留農薬における分析試験成立の条件とされている、添加回収率７０％〜１２０％に適合していることが確認された。
【表２】
2009016897.tif 000004
【００６１】
実施例２  触媒試液として、４．０％Ｌ−システイン水溶液を用いた生薬のマンゼブの添加回収試験
（１）検体、試薬他
(a)検体
下記の８０種類の生薬を、原体あるいは切裁または粉砕等を行い、３〜５ｍｍ程度にして検体として用いた。【００６２】
シャクヤク、桂皮、茯苓、香附子、桃仁、甘草、黄連、生姜、丁子、延胡索、カッコン、浜防風、黄耆、オウゴン、桔梗、大黄、防己、防風、黄柏、厚朴、薄荷、麻黄、ケイガイ、茴香、呉茱萸、山梔子、カロニン、杏仁、牛蒡子、酸棗仁、車前子、胡麻、冬瓜子、ヨクイニン、辛夷、阿膠、蝉退、カロコン、和羌活、苦参、乾姜、前胡、知母、天麻、天門冬、独活、白朮、木香、升麻、吉草根、威霊仙、センナ、茵陳蒿、ガイヨウ、釣藤鉤、地骨皮、ボクソツ、山茱萸、麻子仁、レンギョウ、竜眼肉、猪苓、ビンロウジ、麦芽、縮砂、粳米、木通、菊花、良姜、蓮肉、紅花、忍冬、シツリシ、何首烏、竹茹、川骨、桑白皮、天南星、蘇木、貝母、羌活、百合、紫根、附子、杜仲、山査子、熟地黄、吐根、粉末飴、竹節人参
（１）(a)検体と添加回収試験の対象農薬をマンゼブとしたこと以外、実施例１と同一の条件で添加回収試験をおこなった。【００６３】
（４）試験結果および考察
表３に示すとおり、８０種類の生薬のすべてで、マンゼブの添加回収試験において、残留農薬における分析試験成立の条件とされている、添加回収率７０％〜１２０％のに適合していることが確認された。
【表３】
2009016897.tif 000005
【００６４】
実施例３  触媒試液として１．５％塩化スズ、１％Ｌ−システイン含有５ｍｏｌ／Ｌ塩酸を用いた生薬におけるチウラム、マンゼブおよびプロピネブの添加回収試験
（１）検体、試薬他
(a)検体
下記の５種類の生薬を、原体あるいは切裁または粉砕等を行い、３〜５ｍｍ程度にして検体として用いた。【００６５】
ソウジュツ、タクシャ、乾地黄、人参、竜胆
(b)試薬・試液
塩酸：和光純薬工業（株）、試薬特級
塩化スズ(II)二水和物：関東化学（株）、試薬特級、試薬純度９７．０％、ＪＩＳ  Ｋ８１３６
Ｌ−システイン塩酸塩一水和物：和光純薬工業（株）、試薬特級、試薬純度９９．０％
シクロヘキサン：関東化学（株）、残留農薬試験用
２，２，４−トリメチルペンタン（イソオクタン）：関東化学（株）、鹿一級
アセトン：関東化学（株）、残留農薬試験用
蒸留水（ヘキサン洗浄品）：和光純薬工業（株）、残留農薬試験用
５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液：塩酸１２４０ｍＬに精製水をゆっくりと加え、３０００ｍＬとした。【００６６】
(c)触媒試液
１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液：塩化スズ(II)二水和物９．２０ｇを正確に量りとり、５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え５００ｍＬ溶液とした。【００６７】
１％Ｌ−システイン１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液：塩化スズ(II)二水和物９．２ｇを量りとり、またＬ−システイン塩酸塩一水和物７．３ｇを量りとり、５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え５００ｍＬ溶液とした。【００６８】
(d)被検農薬および(e)添加農薬については、実施例１と同様である。【００６９】
（２）マイクロ波溶媒抽出処理
(a)ＭＷ装置は、実施例１と同様である。【００７０】
(b)ＭＷ装置による抽出処理
テフロン製容器（１００ｍＬ）に粉砕した検体生薬２．０ｇを量りとり、容器をプロテクションシールドにはめ込んだ。分解容器内部に攪拌子を入れ、次いで速やかにイソオクタン１０ｍＬ及び触媒溶液３０ｍＬを加えた。ＴＦＭカバーで蓋をし、アダプタープレート、スプリング及びプロテクションリングをはめ込み、中圧セグメントに取り付けトルクレンチ（２２．５Ｎｍ）で締め付けた。測定する本数分同様の操作を行った。セグメンテッド中圧ローターのボトムプレートをＥＴＨＯＳ１庫内にあらかじめセットしておき、中圧セグメントを点対称になるように取り付け、トッププレートを上からはめ込んだ。別途、内部温度センサー用として、ＴＦＭ回転子、イソオクタン１０ｍＬ及び触媒溶液３０ｍＬを加えたＴＦＭ容器にＡＴＣカバーセットを取り付け、ＡＴＣ用中圧セグメントに取り付けてトルクレンチ（２２．５Ｎｍ）で締め付けた。温度センサープローブをＡＴＣ用中圧セグメントのサーモウェルとＥＴＨＯＳ１庫内のコネクターに差し込み、ＡＴＣ用中圧セグメントをボトムプレートに取り付けた。ＥＴＨＯＳ１のドアを閉め、表４に示す条件のマイクロ波抽出プログラムを開始した。プログラムが終了し、反応容器が十分に冷えたことを確認して、反応液の上層（イソオクタン）をサンプルバイアルに採取し、ＧＣ分析試料とした。
【表４】
2009016897.tif 000006
【００７１】
(c)検量線用二硫化炭素溶液の調製
実施例１と同じ。【００７２】
（３)ガスクロマトグラフによる分析操作
実施例１と同じ。【００７３】
（４）試験結果および考察
表５に示すとおり、５種類の生薬で、３種類の農薬についてソウジュツにおけるプロピネブ以外全て残留農薬における分析試験成立の条件とされている、添加回収率７０％〜１２０％に適合していることが確認された。
【表５】
2009016897.tif 000007
【００７４】
実施例４  触媒試液として１．０％Ｌ−システイン塩酸塩水溶液を用いた生薬におけるチウラムの添加回収試験
（１）検体、試薬他
(a)検体  キジツ、センキュウおよび山椒を、原体あるいは切裁または粉砕等を行い、３〜５ｍｍ程度にして検体として用いた。【００７５】
(b)試薬・試液
Ｌ−システイン塩酸塩一水和物：和光純薬工業（株）、試薬特級
２，２，４−トリメチルペンタン（イソオクタン）：関東化学（株）、鹿一級
アセトン：関東化学（株）、残留農薬試験用
蒸留水（ヘキサン洗浄品）：和光純薬工業（株）、残留農薬試験用
(c)触媒試液
１．０％システイン水溶液：Ｌ−システイン塩酸塩一水和物５．０ｇを蒸留水に溶解し５００ｍＬとした。【００７６】
(d)被検農薬
農薬標準品
二硫化炭素：和光純薬工業（株）、試薬特級、試薬純度９９％
チウラム標準品：和光純薬工業（株）、農薬標準品、試薬純度１００％
農薬標準溶液の調製
チウラム標準溶液（二硫化炭素換算８０μｇ／ｍＬ溶液）：チウラム３．１６ｍｇを量りとり、アセトンを加え正確に２５ｍＬとした。【００７７】
(e)添加農薬
チウラム農薬標準溶液(二硫化炭素換算80μｇ／ｍＬ)を各検体に対しそれぞれ二硫化炭素換算濃度が１０ｐｐｍになるようにマイクロピペットを用いて直接添加した。【００７８】
（２）マイクロ波溶媒抽出処理
試験装置および試験条件等は基本的には実施例１と同じであるが、マイクロ波抽出プログラム条件は表６に示す。
【表６】
2009016897.tif 000008
【００７９】
（３）ガスクロマトグラフによる分析操作
実施例１と同じである
（４）試験結果および考察
表７に示すとおり、５種類の生薬で、３種類の農薬についてソウジュツにおけるプロピネブ以外全て残留農薬における分析試験成立の条件とされている、添加回収率７０％〜１２０％に適合していることが確認された。
【表７】
2009016897.tif 000009
【００８０】
実施例５  触媒試液として０．５％、１．０％及び２．０％Ｌ−システイン水溶液を使用したマンゼブの添加回収試験
（１）検体、試薬他
(a)検体  キジツ、センキュウ、山椒および蘇葉を、原体あるいは切裁または粉砕等を行い、３〜５ｍｍ程度にして検体として用いた。【００８１】
(b)試薬・試液
Ｌ−システイン塩酸塩一水和物：和光純薬工業（株）、試薬特級
２，２，４−トリメチルペンタン（イソオクタン）：関東化学（株）、鹿一級
アセトン：関東化学（株）、残留農薬試験用
蒸留水（ヘキサン洗浄品）：和光純薬工業（株）、残留農薬試験用
(c)触媒試液
０．５％システイン水溶液：Ｌ−システイン塩酸塩一水和物２．５ｇを蒸留水に溶解し５００ｍＬとした。【００８２】
１．０％システイン水溶液：Ｌ−システイン塩酸塩一水和物５．０ｇを蒸留水に溶解し５００ｍＬとした。【００８３】
２．０％システイン水溶液：Ｌ−システイン塩酸塩一水和物１０．０ｇを蒸留水に溶解し５００ｍＬとした。【００８４】
(d)被検農薬
農薬標準品
二硫化炭素：和光純薬工業（株）、試薬特級、試薬純度９９％
マンゼブ標準品：和光純薬工業（株）、農薬標準品、試薬純度９１％
農薬標準溶液の調製
マンゼブ標準溶液（二硫化炭素換算８０μｇ／ｍＬ溶液）：マンゼブ３．８９ｍｇを量りとり、蒸留水又はアセトニトリルを加え超音波照射を行い懸濁溶液とした後、正確に２５ｍＬとした。【００８５】
(e)添加農薬
マンゼブ農薬標準溶液(二硫化炭素換算80μｇ／ｍＬ)を各検体に対しそれぞれ二硫化炭素換算濃度が１０ｐｐｍになるようにマイクロピペットを用いて直接添加した。【００８６】
（２）マイクロ波溶媒抽出処理
試験装置および試験条件等は基本的には実施例１と同じであるが、マイクロ波抽出プログラム条件は表８に示す。
【表８】
2009016897.tif 000010
【００８７】
（３）ガスクロマトグラフによる分析操作
実施例１と同じである
（４）試験結果および考察
表９に示すとおり、４種類の生薬でマンゼブの添加回収試験をおこなった結果、触媒試液が０．５％あるいは１．０％Ｌ−システイン水溶液の場合は、添加回収率７０％〜１２０％を満たさなかったが、２．０％Ｌ−システイン水溶液の場合は４生薬全てで適合していることが確認された。
【表９】
2009016897.tif 000011
【００８８】
実施例６
実施例６に用いた試薬・試液、並びに標準品及び農薬標準溶液の調製方法は以下のとおりである。【００８９】
１．試薬・試液
塩酸：和光純薬工業（株）、試薬特級
塩化スズ(II)二水和物：関東化学（株）、試薬特級、試薬純度９７．０％、ＪＩＳ  Ｋ８１３６
Ｌ−システイン塩酸塩一水和物：和光純薬工業（株）、試薬特級、試薬純度９９．０％
シクロヘキサン：関東化学（株）、残留農薬試験用
２，２，４−トリメチルペンタン（イソオクタン）：関東化学（株）、鹿一級
アセトン：関東化学（株）、残留農薬試験用
蒸留水（ヘキサン洗浄品）：和光純薬工業（株）、残留農薬試験用
５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液：塩酸１２４０ｍＬに精製水をゆっくりと加え、３０００ｍＬとした。【００９０】
１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液：塩化スズ(II)二水和物９．２０ｇを正確に量りとり、５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え５００ｍＬ溶液とした。【００９１】
１％Ｌ−システイン１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液：塩化スズ(II)二水和物９．２ｇを量りとり、またＬ−システイン塩酸塩一水和物７．３ｇを量りとり、５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加え５００ｍＬ溶液とした。【００９２】
２．標準品及び農薬標準溶液調製
二硫化炭素：和光純薬工業（株）、試薬特級、ＪＩＳ  Ｋ８７３２
チウラム標準品：和光純薬工業（株）、農薬標準品、試薬純度１００％
プロピネブ標準品：ジーエルサイエンス（株）、農薬標準品、試薬純度８０％以上
チウラム標準溶液（二硫化炭素換算２０μｇ／ｍＬ溶液）：チウラム３．１６ｍｇを量りとり、アセトンを加え正確に１００ｍＬとした。【００９３】
プロピネブ標準溶液（二硫化炭素換算２０μｇ／ｍＬ溶液）：プロピネブ４．７５ｍｇを量りとり、蒸留水を加え超音波にて破砕懸濁した後、正確に１００ｍＬとした。【００９４】
Ａ．前処理操作
装置（マイクロ波溶媒抽出装置）：
ＭＩＬＥＳＴＯＮＥ社製ＥＴＨＯＳ１（オーブン本体、オプション内部温度センサー、マグネチックスターラー）
ＭＩＬＥＳＴＯＮＥ社製ＰＲＯ２４（２４本同時処理ローター）
攪拌子  直径６ｍｍ×全長２０ｍｍ
前処理操作：
テフロン製容器（反応容器筒、７０ｍＬ）を直接天秤に置き検体を正確に量りとり、攪拌子を入れた。これにイソオクタン又はシクロヘキサンをディスペンサーピペットで５．０ｍＬ加えた。添加回収試験の場合は、次いで農薬標準溶液をディスペンサーピペットで添加した。これにＬ−システイン、塩化スズ(II)二水和物５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液をディスペンサーで３０ｍＬ加え、テフロン製カバーをした後、圧力容器に入れセーフティバルブを閉めた。測定する本数分同様の操作を行い、別途内部温度センサーを取り付けた圧力容器を１本組み立てた。圧力容器をローターボディに円対称になるように並べて置き、カバーをした後、内部温度センサーローブを取り付けオーブン本体にセットし、結果の項に示す前処理メソッドを実行した。【００９５】
前処理メソッド終了後、圧力容器を取り出しセーフティバルブを開き、テフロン製容器を取り出しテフロン製カバーをはずし、有機層をパスツールピペットで測定用バイアル瓶にサンプリングした。【００９６】
反応容器の一つに温度センサーを取り付け、ポジションを点対称に均等に分布するように各反応容器を配置し処理メソッドを実行した。【００９７】
Ｂ．検量線用二硫化炭素溶液の調製
２５ｍＬの褐色メスフラスコに半容量程度のシクロヘキサンをとり、栓をしてメスフラスコの質量を正確に量った。これに、二硫化炭素１ｍＬを正確にとり、栓をしてメスフラスコの質量を正確に量った。シクロヘキサンで正確に２５ｍＬとして標準原液とした。【００９８】
標準原液１ｍＬを正確に量りとり、シクロヘキサンで正確に５０ｍＬとして１０００μｇ／ｍＬ溶液とした。【００９９】
１０００μｇ／ｍＬ溶液１ｍＬを正確に量りとり、シクロヘキサンで正確に５０ｍＬとして２０μｇ／ｍＬ溶液とした。【０１００】
２０μｇ／ｍＬ溶液１ｍＬを正確に量りとり、シクロヘキサンで正確に２５ｍＬとして標準溶液１（０．８μｇ／ｍＬ）とした。【０１０１】
標準溶液１  １０ｍＬを正確に量りとり、シクロヘキサンで正確に２０ｍＬとして標準溶液２（０．４μｇ／ｍＬ）とした。【０１０２】
標準溶液２  １０ｍＬを正確に量りとり、シクロヘキサンで正確に２０ｍＬとして標準溶液３（０．２μｇ／ｍＬ）とした。【０１０３】
標準溶液３  １０ｍＬを正確に量りとり、シクロヘキサンで正確に２０ｍＬとして標準溶液４（０．１μｇ／ｍＬ）とした。【０１０４】
標準溶液４  １０ｍＬを正確に量りとり、シクロヘキサンで正確に２５ｍＬとして標準溶液５（０．０４μｇ／ｍＬ）とした。【０１０５】
Ｃ．結果と考察
１．分析条件及び検量線の検討
夾雑ピークと二硫化炭素のピークが大きく離れ、キャリアーガス流量も一般的な値で十分な分離が得られることから、分析カラムとしてＧＳ−ＧａｓＰｒｏを用いた。【０１０６】
（１）ＧＳ−ＧａｓＰｒｏを用いたＧＳ−ＦＰＤ条件
装置（ガスクロマトグラフ）
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製６８９０Ｎ（本体）
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製７６８３（オートサンプラー）
注入口：スプリット／スプリットレス注入口、パルスドスプリットレスモード（パルス圧３０ｐｓｉ）
インサート：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製スプリット／スプリットレス  ライナ（５１８３−４７１１）
ＧＣ−ＦＰＤの測定条件：
カラム：ＧＳ−ＧａｓＰｒｏ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、長さ１５ｍ、内径０．３２ｍｍ、膜圧０
カラム温度：４０℃（１．５ｍｉｎ）→３０℃／ｍｉｎ→２２０℃（１．５ｍｉｎ）
注入口：スプリット／スプリットレス
注入口温度：１２０℃
注入モード及び注入量：パルスドスプリットレス（３０ｐｓｉ、１．５ｍｉｎ）、１μＬ
キャリアーガス：ヘリウム、コンスタントフローモード、平均線速度３７ｃｍ／ｓｅｃ
検出器：ＦＰＤ−Ｓ  温度２２０℃、水素流量５０ｍＬ／ｍｉｎ、空気流量６０ｍＬ／ｍｉｎ、窒素＋ヘリウム流量５０ｍＬ／ｍｉｎ
（２）検量線の作成
検量線用二硫化炭素溶液をＧＣ−ＦＰＤの測定条件１で分析し、二硫化炭素の濃度とピーク面積値から、検量線を作成し、相関係数及び標準溶液濃度の真度を求めた。【０１０７】
計算：濃度の常用対数に対しピーク面積の常用対数をプロット（両対数プロット）し、一次回帰相関係数はいずれの計算方法でも０．９９以上と良好であったが、真度は両対数プロットによる一次回帰でのみすべての濃度において±５％以内の良好な結果が得られた（表１０）。検量線範囲の０．０４〜０．８μｇ／ｍＬは検体中農薬濃度０．２〜４ｐｐｍに相当する。
【表１０】
2009016897.tif 000012
【０１０８】
２．Ｌ−システイン添加による効果
（反応容器の容量）
７０ｍＬ（同時前処理最大２４本）
（検量線）
５点濃度（０．０５、０．２、０．４、０．６、１μｇ／ｍＬ）の二硫化炭素検量線によるＧＣ−ＦＰＤ定量値と抽出溶媒の検体希釈倍率の積で定量値を算出した。【０１０９】
（分析条件）
前記測定条件を使用した。【０１１０】
（検体）
補中益気湯各１．０ｇを検体として使用した。【０１１１】
（添加農薬）
農薬標準溶液（二硫化炭素換算２０μｇ／ｍＬ溶液）１００μＬをそれぞれの検体に添加した。（検体中の二硫化炭素換算濃度２．０μｇ／ｍＬ）
（前処理試液条件）
シクロヘキサン５．０ｍＬと、１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液３０ｍＬ又は１％Ｌ−システイン１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液３０ｍＬとを加え、７本同時処理した。表１１に示した前処理メソッドパラメータを実行した。
【表１１】
2009016897.tif 000013
【０１１２】
（結果と考察）
１％Ｌ−システイン１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液を添加した場合の添加回収率（Ｎ＝３）は、Ｌ−システイン未添加の場合と比較して、１０％程度高い結果となった（表１２）。これはＬ−システイン添加によりプロピネブの副分解反応が抑えられ、速やかに二硫化炭素への分解が行われたためと考えた。【０１１３】
一般的に、残留農薬試験における分析法成立の条件とされている７０％〜１２０％添加回収率を得ることができた。
【表１２】
2009016897.tif 000014
【０１１４】
３．Ｌ−システイン添加時の抽出溶媒の影響
（反応容器の容量）
７０ｍＬ（同時前処理最大２４本）
（検量線）
５点濃度（０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８μｇ／ｍＬ）の二硫化炭素検量線によるＧＣ−ＦＰＤ定量値と抽出溶媒の検体希釈倍率の積で定量値を算出した。【０１１５】
（分析条件）
前記測定条件を使用した。【０１１６】
（検体）
補中益気湯、大建中湯各１．０ｇを検体として使用した。【０１１７】
（添加農薬）
チウラム及びプロピネブ農薬標準溶液（二硫化炭素換算２０μｇ／ｍＬ溶液）１００μＬをそれぞれの検体に添加した。（検体中の二硫化炭素換算濃度２．０μｇ／ｍＬ）
（前処理試液条件）
シクロヘキサン又はイソオクタン５．０ｍＬ、及び１％Ｌ−システイン１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液３０ｍＬを加え、２４本同時処理した。表１３に示した前処理メソッドパラメータを実行した。
【表１３】
2009016897.tif 000015
【０１１８】
（結果と考察）
結果を表１４に示す。いずれの処方、添加農薬の場合においても、抽出溶媒としてシクロヘキサンを用いた場合の添加回収率が高い結果となった。
【表１４】
2009016897.tif 000016
【０１１９】
４．システイン濃度の影響
補中益気湯、大建中湯に対して、添加するシステインの濃度による添加回収率の変化について検討した。添加濃度は０、０．１、０．５、１、５％の５濃度で実施することにした。【０１２０】
（反応容器の容量）
７０ｍＬ（同時前処理最大２４本）
（検量線）
５点濃度（０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８μｇ／ｍＬ）の二硫化炭素検量線によるＧＣ−ＦＰＤ定量値と抽出溶媒の検体希釈倍率の積で定量値を算出した。【０１２１】
（分析条件）
前記測定条件を使用した。【０１２２】
（検体）
補中益気湯、大建中湯各１．０ｇを検体として使用した。【０１２３】
（添加農薬）
プロピネブ農薬標準溶液（二硫化炭素換算２０μｇ／ｍＬ溶液）１００μＬをそれぞれの検体に添加した。（検体中の二硫化炭素換算濃度２．０μｇ／ｍＬ）
（前処理試液条件）
シクロヘキサン５．０ｍＬと、１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液３０ｍＬ又はＬ−システイン１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液３０ｍＬとを加え、２１本同時処理した。また各濃度のＬ−システイン溶液は、前記１％Ｌ−システイン１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液の調製方法に準じて調製した。表１５に示した前処理メソッドパラメータを実行した。
【表１５】
2009016897.tif 000017
【０１２４】
（結果と考察）
結果を表１６に示す。プロピネブの添加回収の場合、補中益気湯ついては、Ｌ−システイン濃度が増加するに従って添加回収率が向上することがわかった。
【表１６】
2009016897.tif 000018
【０１２５】
５．前処理反応時間の影響
（反応容器の容量）
７０ｍＬ（同時前処理最大２４本）
（検量線）
５点濃度（０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８μｇ／ｍＬ）の二硫化炭素検量線によるＧＣ−ＦＰＤ定量値と抽出溶媒の検体希釈倍率の積で定量値を算出した。【０１２６】
（分析条件）
前記測定条件を使用した。【０１２７】
（検体）
補中益気湯各１．０ｇを検体として使用した。【０１２８】
（添加農薬）
プロピネブ農薬標準溶液（二硫化炭素換算２０μｇ／ｍＬ溶液）１００μＬをそれぞれの検体に添加した。（検体中の二硫化炭素換算濃度２．０μｇ／ｍＬ）
（前処理試液条件）
シクロヘキサン５．０ｍＬ、及び１％Ｌ−システイン１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液３０ｍＬを加え、３本それぞれ同時処理した。表１７、表１８に示した前処理メソッドパラメータを実行した。
【表１７】
2009016897.tif 000019
【表１８】
2009016897.tif 000020
【０１２９】
（結果と考察）
結果を表１９に示す。５〜２０分、１００℃で分解した結果では添加回収率に大きな差が認められなかった。２５分分解した場合でわずかに５％程度回収率が向上した。２５分間、１００℃で分解することになると、トータルで３０分間マイクロ波による加熱を行うことになるが、バランス的に時間が短く、最もデータのばらつきが少ない１００℃、１０分間の分解がよいと結論した。
【表１９】
2009016897.tif 000021
【０１３０】
６．汚染処方の残留農薬実測値の確認
環境省告示法（食品衛生検査指針、残留農薬編、第８６４頁）でジチオカルバメート系農薬が検出された汚染サンプルの実測データとの比較を行った。【０１３１】
（反応容器の容量）
７０ｍＬ（同時前処理最大２４本）
（検量線）
５点濃度（０．０４、０．１、０．２、０．４、０．８μｇ／ｍＬ）の二硫化炭素検量線によるＧＣ−ＦＰＤ定量値と抽出溶媒の検体希釈倍率の積で定量値を算出した。【０１３２】
（分析条件）
前記測定条件を使用した。【０１３３】
（検体）
汚染サンプル各１．０ｇを検体として使用した。【０１３４】
（前処理試液条件）
シクロヘキサン５．０ｍＬ、及び１％Ｌ−システイン１．５％塩化スズ５．０ｍｏｌ／Ｌ塩酸溶液３０ｍＬを加え、３本それぞれ同時処理した。表２０に示した前処理メソッドパラメータを実行した。
【表２０】
2009016897.tif 000022
【０１３５】
（結果と考察）
結果を表２１に示す。マイクロ波試験法は環境省告示法の実測データと比較してほぼ同等の値で、且つばらつきも小さい結果であった。環境省告示法の結果と比較してやや小さい値であるが、添加回収率の成立条件（添加回収率７０〜１２０％）から許容できる値である。また検量線範囲の最小値付近における定量の誤差が原因であると推測している。今回の結果と先の添加回収試験の結果から、本試験法は農薬試験法としての精度を十分担保できていると結論した。
【表２１】
2009016897.tif 000023
【０１３６】
（実施例２）
医療用医薬品、一般用医薬品及びその他製品について、マイクロ波二硫化炭素法によるジチオカルバメート系農薬の添加回収試験を実施した。【０１３７】
１．方法
（１）機器
前処理装置：マイクロ波溶媒抽出装置
ＭＩＬＥＳＴＯＮＥ社製ＥＴＨＯＳ１（オーブン本体、オプション：内部温度センサー、マグネチックスターラー）
ＭＩＬＥＳＴＯＮＥ社製ＰＲＯ２４（２４本同時処理ローター）
攪拌子  直径６ｍｍ×全長２０ｍｍ
分析装置：ＧＣ−ＦＰＤ（機器識別番号ＧＣ−７）
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製６８９０Ｎ（本体）
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製７６８３（オートサンプラー）
注入口：スプリット／スプリットレス注入口
インサート：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製スプリット／スプリットレス  ライナ（５１８３−４７１１）
ＦＰＤ検出器（硫黄モード波長フィルタ３９３ｎｍ）
（２）試薬
二硫化炭素（以下ＣＳ２）：和光純薬工業（株）、試薬特級
塩酸：和光純薬工業（株）、試薬一級
塩化スズ(II)二水和物：関東化学（株）、試薬特級
Ｌ−システイン塩酸塩一水和物：和光純薬工業（株）、試薬特級
シクロヘキサン：関東化学（株）、残留農薬・ＰＣＢ試験用又は試薬特級
アセトン：関東化学（株）、残留農薬・ＰＣＢ試験用
アセトニトリル：関東化学（株）、残留農薬・ＰＣＢ試験用
蒸留水（ヘキサン洗浄品）：和光純薬工業（株）、残留農薬試験用
（３）農薬標準品
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ただし、純度はいずれもメーカー値である。【０１３８】
（４）検体
医療用医薬品：医療用漢方エキス製剤１２８処方、一般用医薬品及びその他製品：一般用漢方エキス製剤（顆粒）６品目、一般用生薬製剤（顆粒）２品目、一般用漢方エキス製剤（錠）６品目、一般用生薬製剤（錠）２品目、その他１６品目
（５）試薬の調製
触媒試薬：１．５５％塩化スズ(II)−１％Ｌ−システイン−５ｍｏｌ／Ｌ塩酸
塩化スズ(II)二水和物１８．４ｇ及びＬ−システイン塩酸塩一水和物１４．７ｇを５ｍｏｌ／Ｌ塩酸１０００ｍＬに溶解した。【０１３９】
（６）検量線用ＣＳ２標準溶液の調製
２５ｍＬメスフラスコに約１２ｍＬのシクロヘキサンをとり、質量を正確に量った。ここに、１ｍＬのＣＳ２を加え、再度質量を正確に量った。シクロヘキサンで２５ｍＬにメスアップした溶液を標準原液とし、シクロヘキサンで段階希釈して、標準溶液１〜５（約０．８、０．４、０．２、０．１、０．０４μｇ／ｍＬ）を調製した。【０１４０】
標準溶液の正確な濃度は、ＣＳ２ １ｍＬの正確な質量から算出した。【０１４１】
（７）添加回収率検討用農薬標準品溶液の調製
農薬標準品溶液は、以下に従ってＣＳ２換算２０μｇ／ｍＬとなるように調製した。【０１４２】
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農薬標準品溶液の正確なＣＳ２換算濃度は、秤量した標準品の正確な質量と純度及びＣＳ２換算係数から以下の式に従って算出した。【０１４３】
ＣＳ２換算濃度（μｇ／ｍＬ）＝農薬標準品濃度（μｇ／ｍＬ）×純度÷ＣＳ２換算係数
（８）試料前処理
分解容器を直接天秤に置き検体を正確に量りとり、攪拌子を入れふたをした。検体中の農薬が製剤規格値の２ｐｐｍ（ＣＳ２換算）となるように農薬標準溶液をディスペンサーピペットで１００μＬ添加した後、シクロヘキサンをディスペンサーピペットで５ｍＬ加えた。これに触媒試薬３０ｍＬをディスペンサーで加え、圧力容器に入れセーフティバルブを閉めた。測定する本数分同様の操作を行い、別途内部温度センサーを取り付けた圧力容器を１本組み立てた。圧力容器をローターボディに円対称になるように並べて置き、カバーをした後、内部温度センサープローブを取り付けオーブン本体にセットし、以下に示す前処理メソッドにより分解抽出操作を行った。【０１４４】
分解抽出操作後、圧力容器を取り出しセーフティバルブを開き、分解容器を取り出しふたをはずし、シクロヘキサン層をパスツールピペットで測定用バイアル瓶にサンプリングした。【０１４５】
検体中ジチオカルバメート系農薬の実測値を求める場合には、農薬標準品溶液を添加せずに前記と同様の前処理操作を行った。【０１４６】
＜前処理装置メソッド１＞
スターラー出力：８０％
ローター回転：ＯＮ
分解容器内温度コントロール：室温→１００℃／５分→１００℃（１０分ホールド）
反応後空冷時間：７５分
＜前処理装置メソッド２＞
スターラー出力：８０％
ローター回転：ＯＮ
分解容器内温度コントロール：室温→９０℃／７分→９０℃（１０分ホールド）
反応後空冷時間：７３分
（９）ＧＣ−ＦＰＤの測定条件：
実施例１と同様。【０１４７】
（１０）検量線の作成
検量線用ＣＳ２標準溶液１〜５をＧＣ−ＦＰＤにて１回ずつ分析し、ＣＳ２濃度（ｘ）の常用対数（ｘｉ）に対するピーク面積値（ｙ）の常用対数（ｙｉ）から、最小二乗法で直線回帰することにより検量線を作成した。【０１４８】
（１１）分析試料中濃度の計算及び数値の取り扱い
ＣＳ２のピーク面積値（Ｙ）の常用対数（Ｙｉ）を求め、検量線の一次式ｙｉ＝ａ  ｘｉ＋ｂの傾きａ及びｙｉ切片ｂを用い、以下の計算方法により農薬濃度（Ｘｐｐｍ、ＣＳ２換算）を算出した。【０１４９】
Ｘ（ｐｐｍ）＝１０（Ｙｉ−ｂ）／ａ×５
（補正係数＝５：製剤１ｇに対して５ｍＬのシクロヘキサンを添加しているため）
回収率は、添加した農薬標準品溶液の正確なＣＳ２換算濃度に対する分析試料中の農薬濃度を百分率で算出した。Ｎ＝１での測定では、回収率の小数点第２桁を四捨五入して、小数点第１桁まで求めた。Ｎ＝３で測定した場合、回収率の小数点第３桁を切り捨てて小数点第２桁まで求めたのち、平均及び相対標準偏差（ＲＳＤ）は小数点第２桁を四捨五入して小数点一桁まで求めた。【０１５０】
２．結果
添加回収試験
医療用漢方エキス製剤の添加回収試験は、２０処方については、チウラム、ジネブ、及びプロピネブの添加回収試験をＮ＝３で実施した。更に、当帰芍薬散、補中益気湯、大建中湯については、ジラム、有機ニッケル、フェルバム、マンネブ、マンゼブ、ポリカーバメートの添加回収試験も実施した（Ｎ＝３）。それ以外の処方は、チウラム、ジネブ、及びプロピネブの添加回収試験をＮ＝１で実施した。【０１５１】
医療用漢方エキス製剤１２８処方におけるチウラム、ジネブ、プロピネブの添加回収率を表２２に示す。
【表２２】
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【０１５２】
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【０１５３】
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【０１５４】
すべての処方で７０〜１２０％の添加回収率を達成した。汚染処方は検体中実測ジチオカルバメート系農薬濃度が０．２３μｇ／ｍＬであったので添加回収率の実測値補正を行ったが、７０〜１２０％の添加回収率となった。【０１５５】
当帰芍薬散、補中益気湯、大建中湯におけるジラム、有機ニッケル、フェルバム、マンネブ、マンゼブ、ポリカーバメートの添加回収率を表２３に示す。
【表２３】
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【０１５６】
すべての農薬、検体で７０〜１２０％の添加回収率を達成した。また、添加回収率のばらつき（ＲＳＤ）も１０％以内であった。【０１５７】
トコンシロップ「ツムラ」におけるチウラム、ジネブ、プロピネブの添加回収率を表２４に示す。
【表２４】
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【０１５８】
トコンシロップ「ツムラ」では添加回収率が基準をクリアした。【０１５９】
一般用医薬品及びその他製品におけるチウラム、ジネブ及びプロピネブの添加回収率を表２５に示す。
【表２５】
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【０１６０】
製剤形態（顆粒、固形、液）に関わらず、熊膽丸以外のすべての製品で基準の７０〜１２０％の添加回収率が確認された。熊膽丸は、チウラム、ジネブの添加回収率が１２０％を越えてしまったが、検体中実測ジチオカルバメート系農薬濃度が０．２９μｇ／ｍＬであり、実測値補正を行うことで１２０％以内の添加回収率となった。また、このときプロピネブの添加回収率は７０％以上であった。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明は、生薬又はこれを含む製剤中に存在していたジチオカルバメート系農薬分析方法として利用される。
【国際調査報告】
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