(57)【要約】  本発明は、ペリオスチンのＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域に対する抗体を含む、癌治療用医薬組成物に関する。更に詳しくは、癌組織をはじめとして組織再構築の間質において特異的に発現する、抗細胞接着作用を有するペリオスチンのスプライシングバリアントを認識する抗ペリオスチン抗体を含む、癌治療用医薬組成物、または前記抗ペリオスチン抗体を用いた癌の診断方法および診断薬に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３、配列番号４および配列番号２１からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を含有する、癌治療用医薬組成物。
【請求項２】
前記抗体が配列番号２６のアミノ酸配列からなる部位と特異的に結合する抗体である、請求項１記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が配列番号３４のアミノ酸配列からなる部位を特異的に認識する抗体である、請求項１または２記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項４】
癌治療が癌の転移の抑制である、請求項１〜３のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項５】
癌治療が癌の原発巣の増殖の抑制である、請求項１〜３のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項６】
癌治療が癌の骨浸潤および／または癌の骨浸潤による骨破壊の抑制である、請求項１〜３のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項７】
前記癌が食道癌、肺癌、胸腺癌、膵臓癌、甲状腺癌、胃癌、小腸癌、結腸（大腸）癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、腎臓癌、乳癌、乳管癌、乳腺癌、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、精巣癌、リンパ腫、副腎癌、前立腺癌、骨肉腫、悪性黒色腫、滑膜腫、または白血病である、前請求項１〜６のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項８】
前記癌が悪性黒色腫または乳癌である、請求項１〜６のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
【請求項９】
配列番号３、配列番号４および配列番号２１からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を用いて、生体試料中のＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域をもつペリオスチン量を測定する工程を含む、癌の診断方法。
【請求項１０】
配列番号３，配列番号４および配列番号２１からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を含む、癌の診断薬。
【請求項１１】
配列番号３５のヌクレオチドおよび配列番号３６のヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーにより生体試料中のＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域をもつペリオスチン量を測定する工程を含む、癌の診断方法。  
【請求項１２】
配列番号３５のヌクレオチドおよび配列番号３６のヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーを含む癌の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペリオスチンのＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域に対する抗体を含む、癌治療用医薬組成物に関する。更に詳しくは、癌組織をはじめとして組織再構築の間質において特異的に発現する、抗細胞接着作用を有するペリオスチンのスプライシングバリアントを認識する抗ペリオスチン抗体を含む、癌治療用医薬組成物、または前記抗ペリオスチン抗体を用いた癌の診断方法および診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、癌治療法の進歩によって癌の治癒率は着実に向上している。特に、外科的手術、放射線治療あるいは化学療法による原発癌の除去に対する成功率の向上がその進歩に寄与している。しかしながら、世界的に見て癌による死亡数は人口の高齢化が進んだことなどから増加の一途を辿っており、依然として死因のトップである。その原因として、原発癌の除去が完全になされても癌の転移により死亡する場合が少なくなく、外科的手術、放射線治療あるいは化学療法では癌の転移を完全に阻止するには限界があり、依然として癌による死亡原因において癌の遠隔転移が直接的又は間接的に関与している。癌の転移は、原発巣から遊離した癌細胞の血管やリンパ管内への浸潤、転移臓器への癌細胞の選択的な移動、血管から転移臓器への癌細胞の浸潤、転移先の微小環境に支えられた癌細胞の増殖、血管新生を伴った直径数ミリメートル以上となる腫瘍の増殖等の過程よりなる (非特許文献１、非特許文献２)。これらの複雑な転移成立過程の中で、癌細胞の運動能の亢進による浸潤・転移は極めて重要な段階である（非特許文献３）。これまでに、高転移性癌細胞は、それ自身が自己分泌型運動因子を産生し、固有運動を亢進させることが報告されている（非特許文献４）。この悪性因子に対する阻害物質が転移抑制剤として期待されているが、現在までにその特異的阻害剤は見出されていない。【０００３】
ペリオスチンは、細胞外マトリックスタンパク質の一種であり、分子量約9万のポリペプチドからなる。各ポリペプチド鎖には、シグナル配列、システインリッチドメイン、４回繰り返しドメイン、C末端ドメインが含まれている。【０００４】
ペリオスチンは、当初、骨芽細胞特異的因子−2（ＯＳＦ−2）と呼ばれ、マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に特異的に発現している遺伝子として分離同定されたが（特許文献１、非特許文献５）、後に現在の名称であるペリオスチンと呼ばれるようになり、骨芽細胞における接着促進活性が報告された（非特許文献６）。【０００５】
初期の研究では、ペリオスチンは骨組織に特異的に発現する細胞外マトリックスであると考えられていた。しかし、現在では骨組織のみならず心不全（非特許文献７、非特許文献８）、動脈瘤（非特許文献９）、高転移性癌（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）、子癇前症（非特許文献１３）等の発症において極めて高く発現しており、また正常組織においてもごく僅かであるが発現していることが明らかになっている。また、いくつかのペリオスチンスプライシングバリアントが骨芽細胞で発現していることも明らかになっている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献１４、特許文献２）。【０００６】
ペリオスチンの作用について、細胞接着作用に関しては、811アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−2に相当）（非特許文献６）および782アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（非特許文献１５）が細胞接着作用を有すると報告されていた。これに対し、838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−１に相当）は、該ペリオスチンスプライシングバリアントをコーティングしたプレートには心線維芽細胞が接着しないこと、すなわち細胞接着活性を有しないこと、正常ラットに比べ心不全モデルラットにおいて838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−１に相当）の遺伝子発現が有意に増加していること、加えてそれが心拡大を惹起させる増悪因子であること、およびこのタンパク質の発現を抑制すると有意に生存率が上昇したことが報告されている（非特許文献７）。さらに、838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−１に相当）に対するアンチセンスヌクレオチドを用いて、該ペリオスチンスプライシングバリアントの発現を抑制することによる心不全の予防剤または治療剤について報告されている（特許文献３）。加えて、本発明者らにより、811アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−2に相当）が細胞接着に関っているのに対し、838アミノ酸から成るペリオスチンスプライシングバリアント（図１におけるＰＮ−１に相当）は細胞の剥離活性を有し、そのエクソン１７配列を抗原にした抗体がその剥離活性を抑制し、かつ、急性心筋梗塞モデル動物での心機能の改善が見られたことによる心不全の予防剤または治療剤について報告されている（特願２００５−３８０００９）。【０００７】
癌に関しては、高転移性癌でのペリオスチンの高発現が各種論文で報告されている（非特許文献１６（膵臓癌）、非特許文献１７（口腔癌）、非特許文献１８（膵臓癌）、非特許文献１９（乳癌）、非特許文献２０（頭頸部癌）、非特許文献２１（結腸癌）、非特許文献１０（乳癌）、非特許文献１２（乳癌）、非特許文献２２（胸腺癌）、非特許文献２３（非小細胞性肺癌）、非特許文献１１（頭頚部扁平上皮癌））。しかしながら、これらの文献においては、ペリオスチンのスプライシングバリアントには着目されておらず、ペリオスチンの発現確認をＲＴ−ＰＣＲ法によって解析した報告（非特許文献６、１１、１３、１４、１７、１８、２０、２６、２８、２９）はあるものの、何れもＥｘｏｎ−１７領域とは異なる部位でプライマーを作製しており、Ｅｘｏｎ−１７領域を持ったバリアントを特異的に解析してはいない。また、高転移性癌においては転写因子Twistが高発現していることが報告され（非特許文献２４、非特許文献２５）注目されているが、ペリオスチンのプロモーター領域にもTwistが有ることが報告されている（非特許文献２６）。加えて、発癌性かつ非転移性であるヒト胎児腎上皮細胞株293T細胞にペリオスチン遺伝子を導入すると、浸潤能が亢進することが報告されている（非特許文献２７）。また、種々の癌細胞で、ラットペリオスチンのマウスホモログの発現が低下していたこと、膀胱癌細胞への該ペリオスチンの遺伝子導入により膀胱癌細胞の浸潤が抑制されたこと、およびマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞への該ペリオスチンの遺伝子導入により肺への転移が抑制されたことが報告されている（非特許文献２８）。  【０００８】
このように、ペリオスチン遺伝子の発現が心不全の病態に関連するのみならず癌の病態にも関連することが示唆されているが、各スプライシングバリアントの癌病態の進行における機能については明らかではない。【０００９】
またペリオスチンに対する抗体としては、ペリオスチンの過発現により増大する間葉細胞の遊走を阻害する抗ペリオスチン抗体（非特許文献２９）が報告されているが、これはマウス若しくはラットのペリオスチンタンパク質のＮ末側１２３〜１４１のアミノ酸配列（KLREEIEGKGSYTYFAPSN）を抗原としたポリクローナル抗体である。また、ペリオスチンによる結腸直腸癌における増殖および細胞分化を抑制する抗ペリオスチン抗体（非特許文献３０）が報告されているが、この論文ではペリオスチンのバリアントに関して全く記載がなく、抗原として用いた精製したタンパク質がどのバリアントであるのか不明であり、どの部位を認識する抗体かも不明である。
【特許文献１】特開平５−２６８９８２号公報
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／０１９４７１号公報
【特許文献３】再公表特許ＷＯ０２／０２００５５号公報
【非特許文献１】Folkman J. Semin. Cancer Biol, 3, 65-71 (1992)
【非特許文献２】Hanahan D. et al.Cell, 86, 353-364 (1996)
【非特許文献３】Liotta LA.et al.Cell, 64, 327-336 (1991)
【非特許文献４】Liotta LA.et al.Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 3302-3306 (1986)
【非特許文献５】Takeshita S. et al., Biochem J (1993) 294, 271-8
【非特許文献６】Horiuchi K. et al., J. Bone Miner. Res. (1999) 14, 1239-49
【非特許文献７】Katsuragi N. et al., Circulation (2004) 110, 1806-13
【非特許文献８】Wang D. et al., Hypertension (2003) 42, 88-95
【非特許文献９】Peters DG. et al., Stroke (2001) 32, 1036-42
【非特許文献１０】Shao R. et al., Mol Cell Biol. (2004) 24, 3992-4003
【非特許文献１１】Gonzalez HE. et al., Arch Otolaryngol Head Neck Surg. (2003) 129, 754-9
【非特許文献１２】Sasaki H. et al., Breast Cancer Res Treat.(2003) 77, 245-52
【非特許文献１３】Sasaki H. et al., Am J Obstet Gynecol. (2002) 186, 103-8
【非特許文献１４】Litvin J. et al., J Cell Biochem. (2004) 92, 1044-61
【非特許文献１５】Gillan L. et al., Cancer Res. (2002) 62, 5358-64
【非特許文献１６】Erkan M. et al. Gastroenterology, 132(4),1447-64 (2007)
【非特許文献１７】Siriwardena BS. et al. Br J Cancer, 95(10), 1396-403 (2006 )
【非特許文献１８】Baril P. et al. Oncogene, 26(14),2082-94 (2007)
【非特許文献１９】Grigoriadis A. et al. Breast Cancer Res, 8(5), R56 (2006)
【非特許文献２０】Kudo Y. et al. Cancer Res, 66(14), 6928-35 (2006)
【非特許文献２１】Bao S. et al. Cancer Cell. 5(4), 329-39 (2004)
【非特許文献２２】Sasaki H. et al. Cancer Lett.,72(1), 37-42 (2001)
【非特許文献２３】Sasaki H. et al. Cancer, 92(4), 843-8 (2001)
【非特許文献２４】Thiery JP. et al. Nat Med. 10(8), 777-8 (2004)
【非特許文献２５】Yang J, et al. Cell. 117(7), 927-39 (2004)
【非特許文献２６】Oshima A, et al. J Cell Biochem, 86(4), 792-804 (2002)
【非特許文献２７】Yan W. et al. J. Biol. Chem., 281(28), 19700-8 (2006)
【非特許文献２８】Kim CJ, et al. Int J Cancer, 117(1), 51-8 (2005)
【非特許文献２９】Lindner V.et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. (2005) 25, 77-83
【非特許文献３０】Tai IT. et al., Carcinogenesis (2005）26, 908-15
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、生活の質の改善および長期生命予後の改善が可能であり、かつ既存のメカニズムとは異なる新たな癌の治療剤を提供することである。さらに、本発明の目的は、癌の診断方法および診断薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、細胞接着活性を有しないペリオスチンスプライシングバリアント（ＰＮ−１）が抗細胞接着活性、すなわち接着した細胞を剥離する活性を有することを明らかにし、また、一方、細胞接着活性を有するペリオスチン（ＰＮ−２）は抗細胞接着活性を有さない、すなわち接着した細胞を剥離しないことを確認した。そして、抗細胞接着活性を有するペリオスチンスプライシングバリアント（ＰＮ−１）と、抗細胞接着活性を示さないペリオスチン（ＰＮ−２）において、その構造と細胞接着における活性の相違に注目し、抗細胞接着活性を有するペリオスチンスプライシングバリアントに特異的に存在する領域、すなわちＥｘｏｎ−１７領域を阻害することにより、抗細胞接着活性を有するペリオスチン関連疾患の予防または治療が可能であることを既に示した（特願２００５−３８０００９）。  【００１２】
ここでは、本発明者らはＰＮ−１タンパク質が持つ細胞の剥離作用すなわち細胞を遊離させる作用が、先に述べた癌転移の過程における、原発巣から癌細胞が遊離することに関係しており、癌転移を促進させていると考え、ＰＮ−１タンパク質と癌病態の関係について明らかとすることを試みた。【００１３】
ペリオスチンのスプライシングバリアントが形成されるC-末端ドメインは、exon（エクソン）15から23で構成されているが、ラットでは、下記（１）から（４）が存在する。
（１）全てを保持しているもの（ＰＮ−1と呼ぶ；配列番号１として示す838アミノ酸からなる；cDNA配列を配列番号６として示す）、
（２）Ｅｘｏｎ−１７が欠失しているもの（ＰＮ−2と呼ぶ；配列番号５として示す811アミノ酸からなる；ＰＮ−1から配列番号３で示される２７アミノ酸（Ｅｘｏｎ−１７）が欠失しているもの；ｃDNA配列を配列番号７として示す）、
（３）Ｅｘｏｎ−２１が欠失しているもの（ＰＮ−3と呼ぶ；810アミノ酸からなる）、
（４）Ｅｘｏｎ−１７とＥｘｏｎ−２１が欠失しているもの（ＰＮ−4と呼ぶ；783アミノ酸からなる）
また、ラット以外でも、マウス及びヒトについてＰＮ−1及びＰＮ−2が見出されている（マウスＰＮ−1：配列番号８（アミノ酸配列）、配列番号９（cDNA配列）；マウスＰＮ−2：配列番号１０（アミノ酸配列）、配列番号１１（cDNA配列）；ヒトＰＮ−1：配列番号１２（cDNA配列）；ヒトＰＮ−2：配列番号１３（アミノ酸配列）、配列番号１４（cDNA配列））。【００１４】
そして、癌病態時に発現が亢進するペリオスチンスプライシングバリアントを調べた結果、細胞の接着を抑制し、および接着細胞を剥離させる機能を有するＰＮ−１が、マウスメラノーマ（悪性黒色腫）Ｂ１６−Ｆ１０細胞、或いはマウス４T１乳癌細胞肺転移モデルマウスの腫瘍組織において、正常組織に比べて極めて高く発現していることを明らかとし、ＰＮ−１が癌病態時に極めて高く発現することを見出した（後述実施例１２、実施例13）。【００１５】
また、ヒトの多様な癌組織（食道癌、肺癌、胸腺癌、膵臓癌、甲状腺癌、胃癌、小腸癌、結腸（大腸）癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、腎臓癌、乳癌、乳管癌、乳腺癌、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、精巣癌、リンパ腫、副腎癌、前立腺癌、骨肉腫、悪性黒色腫、滑膜腫、白血病）においてもｅｘｏｎ−１７領域を持つバリアントの発現が確認された。（後記実施例１６）。【００１６】
そこで、本発明者らは、細胞の接着を抑制する機能を有するＰＮ−1と細胞を接着させる機能を有するＰＮ−2において、構造上異なる部位であり、ＰＮ−1のみに存在するＥｘｏｎ−１７部位が細胞接着の抑制に関与している領域であると考え、該Ｅｘｏｎ−１７部位を阻害することにより、ＰＮ−１の細胞接着抑制という機能を阻害することができ、さらには、癌の転移を抑制することができると考えた。ＰＮ−１が有するＥｘｏｎ−１７部位の阻害物質としては、該部位によりコードされるアミノ酸配列からなるペプチド部分を特異的に認識する抗体の作製を検討した。【００１７】
抗体を作製するためには、免疫原として用いる物質が親水性であることが必要であり、また、タンパク質のような大きなポリペプチドの一部分を用いて抗体を作製する際には、免疫原として使用する部分が、該タンパク質の表面に出ており、エピトープ部分を構成していることが必要である。そこで、Ｅｘｏｎ−１７ペプチド鎖を抗原として用いることの可能性を検討するために、最初に、バイオインフォマティクス分野で汎用されているaccelrys社のソフト、Mac Vector 7.2を使用してエピトープ検索を行なった。その結果、“親水性（Hydrophilicity）”、“表面への露出のしやすさ（Surface Probability）”および“抗原性（Antigenicity）”から見て、Ｅｘｏｎ−１７領域のTTKIITKLVEPKIKVIQGSLQPIIKTE（配列番号３）は殆どが疎水性領域であり、タンパク質分子の表面に出ている可能性が非常に低いことが示唆され、抗原性を有しておらず、抗体が作製できないと考えられ、実際に抗体を作製することは困難であることが予想された。【００１８】
しかしながら、Ｅｘｏｎ−１７領域によりコードされるペプチドを構成する27アミノ酸からなるペプチドを合成し、ウサギに免疫させ、得られた血清からIgG画分を精製し、抗Ｅｘｏｎ−１７ペプチドポリクローナル抗体を作製したところ、驚くべきことに、疎水性であって、抗原性はないと予測されたにも関わらず、ＰＮ−１に特異的に存在するＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域に対する抗体（以下、抗Ｅｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体と称する）が作製できた（後述実施例１）。【００１９】
次に、ＰＮ−１タンパク質をコートしたプレートにマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞若しくはマウス４Ｔ１乳癌細胞を加えると、細胞の接着が認められなかったことから、ラットＰＮ−１タンパク質には細胞を接着させない作用（すなわち非細胞接着作用）を有していることが明らかとなった（後述実施例２）。また、８０％コンフルエントに培養したマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞、或いはマウス４Ｔ１乳癌細胞にＰＮ−1タンパク質を添加すると、ほぼ１００％の細胞の脱離（すなわち、抗細胞接着活性）が観察された（後述実施例３）。この実験系に抗Ｅｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体を投与した結果、ＰＮ−1タンパク質による細胞の脱離を抑制したことから、該抗Ｅｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体はＰＮ−1タンパク質に対する中和活性を持つ抗体で有ることが明らかとなった（後述実施例４）。また、マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞、或いはマウス４Ｔ１細胞に抗Ｅｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体を添加した結果、細胞増殖抑制が見られたことから、該抗Ｅｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体はマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞、或いはマウス４T１乳癌細胞の増殖を抑制する効果も併せ持つことが明らかとなった。（後述実施例５）
次に、マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞、或いはマウス４T１乳癌細胞を足踵に注射し肺転移を起こすモデルマウスに抗Ｅｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体を週に一度投与し続けたところ、モデル作製後３〜５週間で原発巣の増殖のみならず原発巣から肺への転移率・転移コロニー数を有意に抑制した（後述実施例１４、実施例１５）。また、マウス４T１乳癌細胞においては原発巣からの乳癌細胞の骨浸潤及び癌の骨浸潤による骨破壊を有意に抑制した（後述実施例１５）。これにより、抗Ｅｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体が癌病態の進行とともに起こる原発巣の増殖を抑制する活性、骨浸潤を抑制する活性及び癌の骨浸潤による骨破壊を抑制する活性ならびに原発巣から肺への転移を抑制する活性を持つ抗体であることが明らかとなった。このことから、ＰＮ−１に対する中和抗体はＰＮ−１が有する接着阻害作用を抑制し、悪性黒色腫或いは乳癌細胞の増殖および肺転移並びに乳癌細胞の骨浸潤、骨破壊を抑制する新規治療薬として有用であることが示された。以上の知見から、癌病態において、ＰＮ−１が原発巣の増殖ならびに原発巣からの転移をおこす機能を有していることが明らかとなり、ＰＮ−１に特異的に存在するＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域に対する抗体により、これらの癌病態の進行を抑制することができることを見出した。【００２０】
さらに、本発明者らは、ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖に対するモノクローナル抗体（以下、抗Ｅｘｏｎ−１７モノクローナル抗体と称する）を作製した（後述実施例６）。そして、マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞肺転移モデルマウスを用いた実験において、抗Ｅｘｏｎ−１７モノクローナル抗体の投与により、癌増殖抑制および原発巣から肺への転移率・転移コロニー数の抑制作用が示された（後述実施例１４）。【００２１】
これらの知見により、多様な癌組織において発現が上昇するＥｘｏｎ−１７領域を持つペリオスチン（ＰＮ−１）が、原発巣の増殖ならびに原発巣からの転移をおこす機能を有しており、ＰＮ−１に特異的に存在するＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域に対する抗体（抗Ｅｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体または抗Ｅｘｏｎ−１７モノクローナル抗体）の投与によって、原発巣の増殖ならびに原発巣からの転移が抑制され、癌病態の進行を抑制できることが明らかとなり、本発明を完成した。【００２２】
すなわち、本発明は、ペリオスチンに対する抗体、特にＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域に対する抗体を含有する、癌治療用医薬組成物を提供するものである。【００２３】
すなわち、本発明としては、以下を挙げることができる。
（１）配列番号３、配列番号４および配列番号２１からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を含有する、癌治療用医薬組成物。
（２）前記抗体が配列番号２６のアミノ酸配列からなる部位と特異的に結合する抗体である、上記（１）記載の癌治療用医薬組成物。
（３）前記抗体が配列番号３４のアミノ酸配列からなる部位を特異的に認識する抗体である、上記（１）または（２）記載の癌治療用医薬組成物。
（４）癌治療が癌の転移の抑制である、上記（１）〜（３）のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
（５）癌治療が癌の原発巣の増殖の抑制である、上記（１）〜（３）のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
（６）癌治療が癌の骨浸潤および癌の骨浸潤による骨破壊の抑制である、上記（１）〜（３）のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
（７）前記癌が食道癌、肺癌、胸腺癌、膵臓癌、甲状腺癌、胃癌、小腸癌、結腸（大腸）癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、腎臓癌、乳癌、乳管癌、乳腺癌、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、精巣癌、リンパ腫、副腎癌、前立腺癌、骨肉腫、悪性黒色腫、滑膜腫、白血病である、前記（１）〜（６）のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
（８）前記癌が悪性黒色腫または乳癌である、上記（１）〜（６）のいずれか一項記載の癌治療用医薬組成物。
（９）配列番号３、配列番号４および配列番号２１からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を用いて、生体試料中のＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域をもつペリオスチン量を測定する工程を含む、癌の診断方法。
（１０）配列番号３，配列番号４および配列番号２１からなる群から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を含む、癌の診断薬。
（１１）配列番号３５のヌクレオチドおよび配列番号３６のヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーにより生体試料中のＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域をもつペリオスチン量を測定する工程を含む、癌の診断方法。
（１２）配列番号３５のヌクレオチドおよび配列番号３６のヌクレオチドからなるＰＣＲプライマーを含む癌の診断薬。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、マウスのペリオスチンのスプライシングバリアントを示す模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ラットＰＮ−１タンパク質のマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞に対する非細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例２）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ラットＰＮ−１タンパク質のマウス４Ｔ１乳癌細胞に対する非細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例２）。
【図３Ａ】図３Ａは、ラットＰＮ−１タンパク質のマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞に対する抗細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例３）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ラットＰＮ−１タンパク質のマウス４Ｔ１乳癌細胞に対する抗細胞接着作用を測定した結果を示す図である（実施例３）。
【図４Ａ】図４Ａは、マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞に対する抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体が有するラットＰＮ−１タンパク質の活性阻害について測定した結果を示す図である（実施例４）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、マウス４Ｔ１乳癌細胞に対する抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体が有するラットＰＮ−１タンパク質の活性阻害について測定した結果を示す図である（実施例４）。
【図５Ａ】図５Ａは、抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体がマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞の細胞増殖阻害について測定した結果を示す図である（実施例５）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体がマウス４Ｔ１乳癌細胞の細胞増殖阻害について測定した結果を示す図である（実施例５）。
【図６Ａ】図６ＡはマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞を接種した原発巣および正常組織におけるＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域を持つペリオスチンの発現を示す図である（実施例１２）。
【図６Ｂ】図６Ｂはマウス４Ｔ１乳癌細胞を接種した原発巣および正常組織におけるＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域を持つペリオスチンの発現を示す図である（実施例１３）。
【図７】図７は、マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（No.1およびNo.3）の効果を測定した結果を示す図である（実施例１４）。
【図８】図８は、マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である（実施例１４：原発巣の増加率、肺転移率、転移コロニー数）。
【図９】図９は、マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（No.3）の効果を測定した結果を示す図である（実施例１４：原発巣の増加率、肺転移率、転移コロニー数）。
【図１０】図１０は、マウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である（実施例１５：体重変化）。
【図１１】図１１は、マウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である（実施例１５：原発巣における腫瘍体積の変化）。
【図１２】図１２はマウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である（実施例１５：骨浸潤による骨破壊における骨面積比較）。
【図１３】図１３はマウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である（実施例１５：骨浸潤による骨破壊における破骨細胞数比較）。
【図１４】図１４は、マウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体の効果を測定した結果を示す図である（実施例１５：マウス４Ｔ１乳癌細胞接種後、３週間での転移コロニー数）。
【図１５】図１５はＡＴＣＣおよびＥＣＡＣＣから購入したヒト癌細胞株でのＥｘｏｎ−１７領域を持つバリアントの発現を確認した図である。
【図１６】図１６はＡｍｂｉｏｎ社から購入したヒト癌細胞株ｔｏｔａｌ ＲＮＡでのＥｘｏｎ−１７領域を持つバリアントの発現を確認した図である。
【図１７】図１７はＡｍｂｉｏｎ社から購入したヒト癌組織由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡでのＥｘｏｎ−１７領域を持つバリアントの発現を確認した図である。
【図１８】図１８はＢｉｏｃｈａｉｎ社から購入したヒト癌組織由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡでのＥｘｏｎ−１７領域を持つバリアントの発現を確認した図である。
【図１９】図１９はCLONTECH社およびCOSMO BIO社から購入したヒト正常組織由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡでのＥｘｏｎ−１７領域を持つバリアントの発現を確認した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
１．癌治療用医薬組成物
本発明は、抗細胞接着作用を有するペリオスチンのスプライシングバリアント（ＰＮ−１タンパク質）を認識する抗ペリオスチン抗体を含む、癌治療用医薬組成物である。  【００２６】
本発明の医薬組成物は、癌を治療または診断するために使用することができる。本発明の対象の癌としては、これに限定されるものではないが、例えば、悪性黒色腫、乳癌、大腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、胃癌、皮膚癌、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、結腸癌、卵管癌、食道癌、小腸癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、胸腺癌、膵臓癌、肝癌、乳管癌、乳腺癌、子宮頚癌、卵巣癌、精巣癌、リンパ腫、骨肉腫、滑膜腫、及び白血病を挙げることができ、悪性黒色腫、乳癌、大腸癌または肺癌等のような転移性が高い癌に特に適用できる。【００２７】
本発明の医薬組成物は、癌の原発巣の増殖を抑制する効果、癌細胞の骨浸潤、癌細胞の骨浸潤による骨破壊、および癌の転移を抑制する効果を有する。従って、癌の原発巣の増殖の抑制、癌細胞の骨浸潤、癌細胞の骨浸潤による骨破壊、または癌の転移の抑制により癌治療を行うことができる。【００２８】
本発明の医薬組成物は、通常の製剤化の際に用いられる担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて調製される。【００２９】
本発明の医薬組成物の有効成分である抗体は、公知の薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、希釈剤等と混合して医薬、特に抗体医薬に一般に使用されている投与方法、例えば、静脈内投与、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または経口投与等によって投与するのが好ましい。【００３０】
本発明の医薬組成物は、例えば、有効成分を生理学的に許容される担体、香味剤、賦形剤、安定剤、希釈剤、乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等と、適宜混和することにより製造することができ、錠剤、散剤、顆粒剤、溶液剤等として用いることができる。錠剤等に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチンのような結合剤、コーンスターチのような潤沢剤等を用いることができ、また糖衣又は医溶性若しくは腸溶性物質のフィルムにより被膜してもよい。カプセルの剤型である場合には、前記の組成物に更に液状担体を含有させることができる。注射のための無菌組成物も、通常の処方を適用して製造することができる。注射用の水性液としては、ブドウ糖などを含む等張液などが挙げられ、ポリエチレングリコールのような適当な溶解補助剤などと併用してもよい。また、緩衝剤、安定剤、保存剤、酸化防止剤、無痛化剤などと配合してもよい。経口投与において、消化管内で有効成分が分解を受けやすい場合、消化管内で分解を受けにくい製剤、例えば活性成分をリポソーム中に包容したマイクロカプセル剤として経口投与することも可能である。また、直腸、鼻腔内、舌下、肺などの消化管以外の粘膜から吸収せしめる投与方法も可能である。この場合は、座剤、点鼻剤、舌下剤、経肺剤といった形態で投与することができる。【００３１】
本発明の医薬組成物の投与量は、治療に用いられる場合、治療に有効な投与量が決められるが、当該投与量は投与対象者の年齢、体重、症状の程度および投与経路等によって異なり、個々の場合に応じて決められる。通常、経口投与による場合、成人一日当たりの投与量は０．１〜１０００ｍｇ程度であり、これを１ないし数回に分けて投与すればよい。持続静脈内投与においては０．０１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜１．０μｇ／ｋｇ／ｍｉｎの範囲で投与することができ、０．０２５μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ〜０．１μｇ／ｋｇ／ｍｉｎで投与するのが望ましい。
２．抗体
本発明に用いられる抗体は、ＰＮ−１タンパク質に特異的に存在する領域に対する抗体である。【００３２】
本明細書において、ＰＮ−１タンパク質としては、配列番号１（ラットペリオスチンＰＮ−1、８３８アミノ酸）、配列番号２（ヒトペリオスチンＰＮ−1、８３６アミノ酸：ラットペリオスチンよりもＮ末端のシグナル配列が２アミノ酸少ない）、または配列番号８（マウスペリオスチンＰＮ−1）のアミノ酸配列からなるペリオスチンを挙げることができる。【００３３】
ＰＮ−１タンパク質に特異的に存在する領域としては、Ｅｘｏｎ−１７のスプライシング部位を挙げることができ、さらには、Ｅｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域を挙げることができる。具体的には、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号３で示されるペプチド部分（配列番号１の６７２〜６９８アミノ酸）、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号４で示されるペプチド部分（配列番号２の６７０〜６９６アミノ酸）、または配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するペリオスチンの配列番号２１で示されるペプチド部分（配列番号８の６７２〜６９８アミノ酸）が挙げられる。【００３４】
本発明の好ましい態様において、Ｅｘｏｎ−１７によりコードされるペプチドに対する抗体は、Ｅｘｏｎ−１７によりコードされるペプチドのアミノ酸配列におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（配列番号２６）からなるペプチドと特異的に結合するものを挙げることができる。また、Ｅｘｏｎ−１７によりコードされるペプチドのアミノ酸配列におけるＮ末端の１番目のトレオニンから６番目のトレオニンまでのアミノ酸配列（配列番号３４）からなるペプチドを特異的に認識することができるものが好ましい。【００３５】
１つの態様において、本発明に用いる抗体は、上記のＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域を抗原として作製されるモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体である。ここで、「モノクローナル抗体」とは、前記の抗原に反応性を有する任意のモノクローナル抗体であって、「モノクローナル抗体」には、前記の抗原を、マウス、ラット、ハムスター、モルモットあるいはウサギ等の哺乳動物に免疫して得られる天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラモノクローナル抗体（キメラ抗体）及びヒト化モノクローナル抗体（ヒト化抗体；CDR-grafted抗体）、並びにヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒトモノクローナル抗体（ヒト抗体）も包含される。また、本発明に用いられる抗体は、IgG（IgG1,IgG2,IgG3,IgG4）、IgM、IgA、IgDあるいはIgE等のいずれのアイソタイプを有するモノクローナル抗体をも包含する。好ましくは、IgG（IgG1,IgG2,IgG3,IgG4）またはIgMである。
３．抗体の調製
本発明に用いる抗体は、癌病態時等の癌細胞に特異的なスプライシングバリアントが形成されるC-末端ドメインのＥｘｏｎ−１７領域によりコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを化学合成したものを抗原として作製できるが、係るペプチドは、ペリオスチンタンパク質の酵素消化や遺伝子工学的手法などによっても得られ、その由来は問わない。【００３６】
抗原に上記ペプチドを用いる場合には、それ自身抗原として用いることも可能であるが、抗原性を高めるために、上記ペプチドをポリビニルピロリドン、ラテックス、ポリメチルメタクリレートなどの巨大分子の物質に吸着させて免疫する方法、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin：スカシ貝ヘモシアニン）やBSA（牛血清アルブミン）などのキャリアー蛋白に結合して用いる方法等があり、いずれの方法をも使用することができる。一般的にはペプチドをキャリヤー蛋白に結合して用いる方法が好ましく、結合方法は公知の方法を用いることができる（例えば、「続医薬品の開発、14巻、廣川書店、1991」）。ペプチドはキャリアー蛋白と結合させて方向性を持たせるために、ペプチドのＣ末端またはＮ末端にシステイン基を導入し、システイン基を介してキャリアー蛋白と結合させる方法が用いられる。この目的に合った結合方法であれば当技術分野において一般に用いられている架橋剤を用いることができる。スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（以下「SMCC」と略す）や３−マレイミドベンゾイックアシッド−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（MBS）などが適している。モノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタインによる細胞融合法（G.Kohler et al Nature (1975) 256,495-7) により作製されたハイブリドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離することにより調製される。すなわち、Ｅｘｏｎ−１７によりコードされるアミノ酸配列を有するペプチド等で哺乳動物を免疫した後、この動物の抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させハイブリドーマを得る。Ｅｘｏｎ−１７に結合する抗体を産生するハイブリドーマの検索は、例えばハイブリドーマ上清について抗原を固定したマイクロプレートを用いる酵素免疫測定法（以下「ELISA」と略す）によって行われる。免疫に使用する動物としては特に制限はなく、各種の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等を使用することができる。モノクローナル抗体の作製には、上記の免疫動物のうち、取扱い易さ等の理由により一般にはBalb/cマウスが用いられるが、他の系統のマウスを使用することもできる。その際、免疫に用いる抗原の濃度は、十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されるよう選択し、好ましくは１〜１００μgの抗原を適当な濃度に生理食塩水などで希釈し、フロイント完全アジュバントあるいはフロイント不完全アジュバント等の懸濁液とし、動物に腹腔内注射または皮下注射などによって投与する。投与は２〜４週毎に１〜数回行う。最終免疫は通常１〜１００μgの抗原を添加した生理食塩溶液を静脈注射または皮下注射などにより投与して行われる。最終免疫の数日後に細胞融合のため免疫した動物から抗原産生細胞、例えばリンパ球、好ましくは脾臓細胞またはリンパ節細胞を取り出す。次に、抗体産生細胞として脾臓細胞を用いた場合について説明するが、脾臓細胞以外の抗体産生細胞も同様に細胞融合に供し得る。細胞融合は、最終免疫３〜４日後に無菌的に取り出した脾臓から調製した脾臓細と適当なミエローマ細胞を融合促進剤の存在下で細胞融合させる。融合に用いるミエローマ細胞は、哺乳動物からのものでよいが、一般には、免疫に用いた動���と同じ種の動物に由来するものが好適であり、既に公知の種々の細胞株、例えばマウスではSP2/0-Ag14(SP2)[[Nature, 276, 269(1978)]、NS-1-Ag4/1（NS-1）、P3-X63Ag8U.1（P3U1）[Curr. Top. Microbiol. Immunol. 81, 1-7(1978)：ATCCから入手可、ATCC No. CRL-1597]、P3-NS1-1-Ag4-1、P3-X63Ag8（P3）、FO、X63Ag8.653（X63.653）、210.RCY3.Ag1.2.3、S194/5XXO.BU1、SKO-007、GM15006TG-A12等が好適に使用され、ラットではY3.Ag1.2.3等が好適に使用される。好ましい融合促進剤として例えば、平均分子量が1000〜6000のポリエチレングリコール（PEG）のほかセンダイウィルスも使用できる。融合時の脾臓細胞とミエローマ細胞の混合比率は、一般に１０：１〜２：１の範囲が好ましい。【００３７】
融合した細胞よりハイブリドーマの分離は、未融合の脾臓細胞、未融合のミエローマ細胞及び融合した細胞の混合物を未融合のミエローマ細胞が生存できない選択培地で、未融合の細胞が死滅するまでの適当な時間（約１週間）培養することにより行なえる。選択培地は、例えばHAT 培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）が使用される。この選択培地中では、未融合のミエローマ細胞は死滅し、また未融合の脾臓細胞は、非腫瘍性細胞であるので、一定期間後（約１週間後）死滅するので、生育できる細胞を選択することによりハイブリドーマを得ることができる。目的の抗体を産生するハイブリドーマは、通常の限界希釈法によって、目的とする抗体の産生株の検索及び単一クローン化が行える。このようにして得られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、生育に適した培地中で生育でき、また超低温冷凍庫や液体窒素中などで容易に長期に保存が可能である。このようにして得られたハイブリドーマは、栄養培地中あるいは哺乳動物の腹腔内で増殖させることにより抗体を産生させることができ、産生した抗体は培養上清あるいはその哺乳動物の腹水または血清から精製することができる。ハイブリドーマとしては、例えば、平成１８年１１月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１８として寄託されているハイブリドーマを使用することができる。抗体の精製は、遠心分離、透析、硫酸アンモニウム等による塩析、DEAEカラム等によるイオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどの一般的な単離、精製方法を用いて行なうことができる。かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行なうことができる。まず、同定法としてはオクテルロニー（Ouchterlony）法、ELISA法、またはRIA法が挙げられる。オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。一方、ELISA法またはRIA法を用いる場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。さらに、タンパク質の定量は、フォーリンロウリー法、及び280nmにおける吸光度［1.4（OD280）＝イムノグロブリン１mg/ml］より算出する方法により行うことができる。この様にして得られたモノクローナル抗体は、配列番号１、配列番号２または配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるペリオスチン（ＰＮ−１タンパク質）、配列番号３、配列番号４または配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明に用いられるモノクローナル抗体は、アミノ酸配列YTTKIITKVV（配列番号２６）からなるペプチド、すなわちヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバ���ンまでのアミノ酸配列からなるペプチド、およびヒトペリオスチンＰＮ−１のアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末端から６６９番目のチロシンから６７９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列部位（TTKIITKVV；配列番号２２）或いはその一部を特異的に認識することができる。さらに好ましくは、本発明に用いられるモノクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および８〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドを認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）またはラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号３）の少なくともＮ末端から１番目のトレオニンから６番目のトレオニンまでのアミノ酸配列部位（配列番号３４）またはその一部を特異的に認識することができる。さらに、本発明に用いられるモノクローナル抗体は、ＰＮ−１タンパク質の癌細胞の接着抑制作用および接着細胞剥離作用を抑制または阻害する、すなわちＰＮ−１タンパク質の癌細胞の接着抑制作用および接着細胞剥離作用を中和する活性を有する。さらに、癌の原発巣の増殖抑制活性、癌細胞の骨浸潤抑制活性、癌細胞の骨浸潤による骨破壊抑制活性、および癌細胞の転移抑制活性を有する。【００３８】
抗体としてポリクローナル抗体を使用する場合、ポリクローナル抗体は通常行われている方法、例えば「日本生化学会編、新生化学実験講座12、東京化学同人、1992」記載の方法によって得ることができる。免疫動物としては、特に限定されるものではないが、馬、山羊、羊、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどが挙げられる。免疫動物としてウサギを用いる場合には、抗原を適当な濃度に生理食塩水などで希釈し、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバントまたは水酸化アルミニウムアジュバントなどの懸濁液とし、10〜1000μg／回／匹を注射し、さらに２〜４週間後に追加免疫注射を１〜３回行い、抗血清を得る。注射は多数箇所の皮下に行なうのが好ましい。抗血清からポリクローナル抗体の調製は、上記モノクローナル抗体の精製と同様の方法で行なうことができる。この様にして得られたポリクローナル抗体は、配列番号１、配列番号２または配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるペリオスチン（ＰＮ−１タンパク質）、配列番号３、配列番号４または配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるＥｘｏｎ−１７でコードされるペプチドを特異的に認識する。好ましくは、本発明に用いられるポリクローナル抗体は、アミノ酸配列YTTKIITKVV（配列番号２６）からなるペプチド、すなわちヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチド、およびヒトペリオスチンＰＮ−１のアミノ酸配列（配列番号２）におけるＮ末端から６６９番目のチロシンから６７９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドを特異的に認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列部位（TTKIITKVV；配列番号２２）或いはその一部を特異的に認識することができる。さらに好ましくは、本発明に用いられるポリクローナル抗体は、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および８〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチドを認識して結合することができる。すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）またはラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号３）の少なくともＮ末端から１番目のトレオニンから６番目のトレオニンまでのアミノ酸配列部位（配列番号３４）またはその一部を特異的に認識することができる。さらに、本発明に用いられるポリクローナル抗体は、ＰＮ−１タンパク質の癌細胞の接着抑制作用および接着細胞剥離作用を抑制または阻害する、すなわちＰＮ−１タンパク質の癌細胞の接着抑制作用および接着細胞剥離作用を中和する活性を有する。さらに、癌の原発巣の増殖抑制活性、癌細胞の骨浸潤抑制活性、癌細胞の骨浸潤による骨破壊抑制活性、および癌細胞の転移抑制活性を有する。
４．ヒト型抗体の作製
免疫グロブリンＧ（以下、単に「IgG」という。）は、分子量約23000の軽ポリペプチド鎖（以下「軽鎖」という）、分子量約50000の重ポリペプチド鎖（以下「重鎖」という）の各２本ずつから構成される。重鎖、軽鎖とも約110残基からなる、アミノ酸配列が保存されている領域の繰り返し構造を持ち、これらはIgGの３次元構造の基本単位（以下、「ドメイン」という。）を構成する。重鎖および軽鎖は、それぞれ連続した４個、および２個のドメインから構成されている。重鎖、軽鎖いずれにおいても、アミノ末端のドメインは他のドメインに比べ各抗体分子間でのアミノ酸配列の変異が大きく、このドメインは可変ドメイン（variable domain：以下、「Ｖドメイン」という。）と呼ばれる。IgGのアミノ末端においては、重鎖、軽鎖のＶドメインが相補的に会合し可変領域を形成している。これに対し、残余のドメインは、全体として定常領域を形成する。定常領域は、各動物種に特徴的な配列を有し、例えば、マウスIgGの定常領域はヒトIgGの定常領域とは異なっているので、マウスIgGはヒトの免疫系によって異物として認識され、その結果、ヒト抗マウス抗体（Human Anti Mouse Antibody：以下「HAMA」という。）応答が起こる（Schroff RW. et al Cancer Res. (1985)45,879-85）。従って、マウス抗体はヒトに繰返し投与することはできない。このような抗体をヒトに投与するためには、抗体の特異性を保持したままHAMA応答を起こさないように抗体分子を修飾する必要がある。Ｘ線結晶構造解析の結果によれば、一般に、このようなドメインは３本から５本のβ鎖からなる逆平行βシートが二層重なり合った長円筒状の構造をとる。可変領域では、重鎖、軽鎖のＶドメインそれぞれにつき各３個のループが集合し、抗原結合部位を形成する。この各ループは相補性決定領域（complementarity determining region：以下、「CDR」という。）と呼ばれ、アミノ酸配列の変異が最も著しい。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、一般に、CDRの構造を保持する役割を有し、「フレームワーク」と呼ばれる。カバトらは、重鎖、軽鎖の可変領域の一次配列を多数収集し、配列の保存性に基づき、それぞれの一次配列をCDRおよびフレームワークに分類した表を作成した（Kabatt et al. SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No.91-3242, E.A.）。また、各フレームワークは、アミノ酸配列が共通の特徴を有する複数のサブグループに分類された。さらに、ヒトとマウスの間で対応するフレームワークが存在することも見いだされた。このようなIgGの構造的特徴に関する研究から以下のヒト化抗体の作製法が考案された。研究初期の段階では、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体が提案された（Morrison SL. et al Proc Natl Acad Sci U S A. (1984)81,6851-5）。しかし、そのようなキメラ抗体は、依然として、多くの非ヒトアミノ酸残基を含むので、特に長期間投与した場合にはHAMA応答を誘導しうる（Begent et al., Br. J. Cancer, (1990)62, 487）。【００３９】
ヒトに対しＨＡＭＡ応答を発現する可能性のある、非ヒト哺乳動物由来のアミノ酸残基を更に少なくする方法として、CDR部分のみをヒト由来の抗体に組み込む方法が提案された（Peter T et al. Nature, (1986) 321, 522-5）が、一般に、抗原に対する免疫グロブリン活性を保持するにはCDRのみの移植では不十分であった。一方、チョッチアらは、1987年、Ｘ線結晶構造解析データを用い、（ａ）CDRのアミノ酸配列中には、抗原に直接結合する部位とCDR自体の構造を維持する部位とが存在し、CDRの取り得る三次元構造は、複数の典型的なパターン（カノニカル構造）に分類されること、（ｂ）カノニカル構造のクラスは、CDRのみならずフレームワーク部分の特定の位置のアミノ酸の種類によって決定されること、を見いだした（Chothia C. et al. J. Mol. Biol. (1987)196, 901-17）。この知見に基づき、CDR移植法を用いる場合、CDRの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植する必要性が示唆された（特表平4-502408号）。一般に、移植すべきCDRを有する非ヒト哺乳動物由来の抗体は「ドナー」、CDRが移植される側のヒト抗体は「アクセプター」と定義され、CDR移植法を実施する際に考慮すべき点は、可能な限りCDRの構造を保存し、免疫グロブリン分子の活性を保持することにある。この目的を達成するためには、（ａ）アクセプターは、いずれのサブグループに属するものを選択すべきか、及び、（ｂ）ドナーのフレームワークからいずれのアミノ酸残基を選択すべきか、の２点に留意する必要がある。【００４０】
クィーンらは、ドナーのフレームワークのアミノ酸残基が、以下の基準の少なくともひとつに該当する場合、CDR配列とともにアクセプターに移植するデザインの方法を提唱した（特表平4-502408号）：
（ａ）アクセプターのフレームワーク領域中のアミノ酸がその位置において稀であり、ドナーの対応するアミノ酸がアクセプターの前記位置において普通であること
（ｂ）該アミノ酸がCDRのひとつのすぐ近くであること
（ｃ）該アミノ酸が三次元免疫グロブリンモデルにおいてCDRの約３Å以内に側鎖原子を有し、そして抗原とまたはヒト化抗体のCDRと相互作用することができると予想されること。【００４１】
本発明に用いる抗Ｅｘｏｎ−１７モノクローナル抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNAは、上記抗Ｅｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞よりmRNAを調製し、該mRNAを逆転写酵素でcDNAに変換してから、該抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNAをそれぞれ単離することにより得ることができる。
５．ヒト抗体の作製
本発明で使用される「ヒト抗体」あるいは「ヒト免疫グロブリン」とは、免疫グロブリンを構成するＨ鎖の可変領域（VH）及びＨ鎖の定常領域（CH）並びにＬ鎖の可変領域（VL）及びＬ鎖の定常領域（CL）を含む全ての領域がヒトイムノグロブリンをコードする遺伝子に由来するイムノグロブリンである。換言すれば、Ｈ鎖がヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子に由来し、軽鎖がヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子に由来するものである抗体を意味する。ヒト抗体は、常法に従って、例えば、少なくともヒトイムノグロブリン遺伝子をマウス等のヒト以外の哺乳動物の遺伝子座中に組込むことにより作製されたトランスジェニック動物を、抗原で免疫感作することにより、前述したモノクローナル抗体の作製法と同様にして製造することができる。例えば、ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスは、既報(Mendez MJ et al.Nature Genetics(1997)15, 146-56, Green LL et al. Nature Genetics(1994)7, 13-21, 表平4-504365号公報；国際出願公開WO94/25585号公報；日経サイエンス、６月号、第40〜第50頁、1995年；Nils Lonberg et al. Nature(1994) 368, 856-9, 及び特表平6-500233号公報)に記載の方法に従って作製することができる。【００４２】
本発明で使用される抗体は、抗体の分子全体に限らず、抗細胞接着活性を有するペリオスチンの該活性を阻害（抑制）するものであれば、抗体の断片または誘導体であってもよい。
６．抗体断片
抗体断片としては、例えば、Fab、F(ab’)2、Fv、一本鎖抗体（scFv）、ジスルフィド安定化抗体（dsFv）、CDRを含有するペプチド等を挙げることができる。【００４３】
本発明で使用される抗体断片のうちFab、F(ab’)2等は、ＰＮ−１のＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチドに対する抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理して得ることができ、また、得られた抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。【００４４】
本発明で使用される抗体断片のうちscFvは、ＰＮ−１のＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチドに対する抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域を、適当なペプチドリンカー等を用いて連結し、作製することができる。また、上記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。【００４５】
本発明で使用される抗体断片のうちdsFvは、ＰＮ−１のＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチドに対する抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間でジスルフィド結合を介して結合させた抗体断片であり、システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測により選択することができる。該抗体断片をコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。【００４６】
本発明で使用される抗体断片のうちＣＤＲを含有するペプチドは、ペリオスチンの抗細胞接着活性を阻害する抗体のＨ鎖またはＬ鎖のＣＤＲ領域のうち、少なくとも１つのＣＤＲ領域以上を含んで構成される。また複数のＣＤＲ領域を適当なペプチドリンカーを介する等の方法により結合させてもよい。該ＣＤＲを含有するペプチドは、これをコードする遺伝子の全配列又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させて作製することができる。また、Fmoc法またはtBoc法等の化学合成によっても作製できる。
７．診断薬
本発明はまた、上記の抗体をマーカー標識することにより作製した癌の診断薬を提供する。ここでマーカーとしては、酵素、放射性同位元素、蛍光色素等を用いることができる。ここで用いる酵素としては、ターンオーバー数（turn over number）が大きく、かつ酵素と結合しても安定であること、基質と特異的に反応して発色させることができる等の条件を満たす物であれば特に制限されるものではなく、通常の酵素免疫アッセイ（EIA）に用いられる酵素を使用することができる。好ましい酵素の例としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることができる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。【００４７】
これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法により行うことができる。基質としては、使用する酵素に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。マーカーとして用いる放射性同位元素としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のラジオイムノアッセイ（RIA）で用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。また、本診断薬は、癌組織間質を特異的に染色することが可能な、免疫組織学的染色として使用することができる。また、放射性同位体を標識した場合には、体内に投与することによって、癌病態時の病変部を画像化するために使用することもできる。
８．診断方法
本発明はまた、本発明に使用される抗体を用いることによる生体試料、例えばヒト又は動物の血液から調製した血清中におけるＥｘｏｎ−１７でコードされるペプチド領域をもつペリオスチン量を測定することによる癌の診断方法である。本方法において、いわゆるサンドイッチELISA法（Enzyme-linked immunosorbent assay：酵素免疫測定法）によってＥｘｏｎ−１７でコードされるペプチド領域をもつペリオスチンを検出することができる。診断キットを用いる場合には、まず抗一次抗体を固相化したプレートに試料を接触させて両者を結合させ、この結合体にマーカー標識した二次抗体を結合させ、この三者の結合体におけるマーカーのシグナル強度を測定することにより、Ｅｘｏｎ−１７でコードされるペプチド領域をもつペリオスチンを検出または定量することができる。特にＥｘｏｎ−１７でコードされるペプチド領域を持つペリオスチンは、癌等の病態時に高発現し、原発巣の増殖および癌の転移に関するスプライシングバリアントであるので、その産生をモニターすることにより癌等における病態の診断をすることができる。【００４８】
このように、本発明に使用される抗体を標識化して、二次抗体として使用する事が可能である。【００４９】
本発明はまた、Ｅｘｏｎ−１７領域に特異的なプライマー（ｓｅｎｓｅ鎖：５’−ＴＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号３５）、およびａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖：５’−ＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番号３６））を用いて、生体試料、例えばヒト又は動物の組織から調製したＲＮＡ中におけるＥｘｏｎ−１７領域をもつペリオスチン量を測定することによる癌の診断方法である。本方法において、いわゆるＲＴ−ＰＣＲやSYBR（登録商標）Green Iを用いたPCRによってＥｘｏｎ−１７領域をもつペリオスチンの有無を検出および定量することができる。特にＥｘｏｎ−１７領域を持つペリオスチンは、癌の病態時に高発現し、原発巣の増殖および癌の転移に関するスプライシングバリアントであるので、その産生をモニターすることにより癌における病態の診断をすることができる。【００５０】
以下、実施例を用いて本発明について詳細かつ具体的に説明する。
＜実施例＞
［製造例１］サブトラクション法によるペリオスチンの検索
１−１  心不全病態モデルラットの作製及び左心室サンプルの採取
雄性ダール食塩感受性ラット（Ｄａｈｌ−Ｓ）（清水実験材料）を６週齢より８％高食塩含有食で飼育し、心肥大期（１１週齢）および心不全期（１４週齢）に各３匹の左心室を採取した。【００５１】
１−２  mＲＮＡの調整
総ＲＮＡは上記左心室約５００ｍｇからＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって調整した。次に心肥大期、心不全期それぞれ３匹分を合わせた総ＲＮＡ約４００μｇよりＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）を用いて説明書に記載の方法にしたがってｍＲＮＡを精製し、それぞれ約３μｇのｍＲＮＡを回収した。【００５２】
１−３  ｃＤＮＡサブトラクション
ｃＤＮＡサブトラクションは、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡ  サブトラクションキット（クローンテック社）により、説明書に記載の方法にしたがって行った。すなわち、上記１−２で得られたｍＲＮＡそれぞれ２μｇよりｃＤＮＡを合成し、制限酵素Ｒｓａｌで消化した。次に、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１１週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとし、テスターｃＤＮＡにｋｉｔ添付の２種類のアダプターを別々に連結させた後、サブトラクトハイブリダイゼーションを行った。次に、アダプターに相補的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、発現量に違いのあるｃＤＮＡ断片を特異的に増幅させ、増幅産物１を得た。【００５３】
また、同様のサブトラクションを１１週齢から合成されたｃＤＮＡをテスターｃＤＮＡ、１４週齢から合成されたｃＤＮＡをドライバーｃＤＮＡとして行い、得られた増幅産物を増幅産物２とした。【００５４】
１−４  ドットブロットスクリーニング
Ａ．ドットブロットの作製
増幅産物１をＰＣＲ  IIベクター（インビトロジェン社）にＴＡクローニングし、挿入断片の入ったクローンを選択した。各クローンの挿入断片を増幅したＰＣＲ反応後、それぞれ１μＬを熱処理後、２枚のナイロンメンブレンフィルター（ベーリンガー社）にドットブロットし、ＵＶクロスリンカー（ストラタジーン社）により固定した。【００５５】
Ｂ．ｃＤＮＡプローブの作製
増幅産物１を制限酵素Ｒｓａｌ及びＥａｅｌ、Ｓｍａｌで消化し、アダプターを除去し、ＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットII（ベーリンガー社）を用いて説明書に記載の方法に従ってＤＩＧ−ｄＵＴＰでランダムプライム標識を行い、ｃＤＮＡプローブ１を作製した。増幅産物２より同様にして、ｃＤＮＡプローブ２を作製した。【００５６】
Ｃ．スクリーニング
上記Ａで作製したドットブロットメンブランの1枚をｃＤＮＡプローブ１、他の１枚をｃＤＮＡプローブ２とハイブリダイゼーションを行った。具体的には、ベーリンガー社のＤＩＧハイプライムＤＮＡラベリング／検出キットIIを用いて、説明書に記載の方法にしたがい、ＤＩＧイージーハイブ液中４２℃で一晩ハイブリダイセーションを行った。2×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで室温にて５分間２回、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６８℃にて１５分間２回洗浄した後、キットに添付のブロッキングバッファー中でアルカリホスファターゼ標識抗ＤＩＧ抗体と反応後、ＣＳＰＤ  ｒｅａｄｙ−ｔｏ  ｕｓｅを加えて化学発光を進行させ、Ｘ線フィルムを露光させた。ｃＤＮＡプローブ１でのシグナルがｃＤＮＡプローブ２でのシグナルより強いクローンをポジティブクローンとして選択し、塩基配列の決定を行った。【００５７】
１−５  塩基配列の決定
塩基配列は、THERMO SequenaseTM II dye terminator cycle sequencing kit（アマシャムファルマシア社）を用いて自動ＤＮＡ配列読み取り装置モデル３７３Ａ（PE Applied Biosystems社）で解析することにより決定した。得られた遺伝子配列をＧｅｎＢａｎＫのデータバンクに照会した結果、クローンの１つ（ＳＦ０１４）がマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッションＮｏ．Ｄ１３６６４）と８６％ホモロジーのある遺伝子であることが判明した。【００５８】
［製造例２］ラットペリオスチン  ｃＤＮＡのクローニング
ラットペリオスチンｃＤＮＡの単離はλｇｔIIベクターに挿入されたｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｃＤＮＡライブラリー（クローンテック社）より作製した約４０００クローンのファージサブプール１０個（計約４万クローン）をＳＦ０１４の塩基配列を基に設計したプライマー（１）５’−ＧＴＴＣＡＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＡＴＧＧＴＣ−３’（配列番号１５）、（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号１６）を用いてＰＣＲスクリーニングを行い、３個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅された断片をＡｌｋＰｈｏｓ  ＤｉｒｅｃｔTM（アマシャムファルマシア社）を用いてアルカリフォスファターゼ標識したプローブを用いてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い、１個のポジティブクローンラットペリオスチン＃１を得た。その挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  II（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、製造例１−５の方法に従って全塩基配列を決定した。【００５９】
得られたクローンの長さは約３ｋｂであり、マウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｄ１３６６４）の２９２番から３’−末端までに相当するものであり、５’−末端が欠けたクローンであることが示唆された。【００６０】
そこで、ＳＭＡＲＴTM  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（クローンテック社）を用いて説明書に記載の方法にしたがって、ｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｃＤＮＡを鋳型として、上記プライマー（２）５’−ＧＡＧＡＴＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＧＧＴＣＣＴ−３’（配列番号１６）とラットペリオスチン＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１７）を用いて５’−ＲＡＣＥ反応を行った。得られたＰＣＲ産物をインビトロジェン社のＰＣＲ  IIベクターにＴＡクローニングし、ラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ  ＃１と命名した。塩基配列を製造例１−５の方法にしたがって決定した。【００６１】
その結果、ラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ  ＃１は最初に得られたラットペリオスチン＃１より５’方向に約３００ｂｐ長いクローンであり、５’−末端はマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｄ１３６６４）の５’−末端より１５ｂｐ長いクローンであった。さらにラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ  ＃１の塩基配列を基に設計したプライマー（４）５’−ＡＣＧＧＡＧＣＴＣＡＧＧＧＣＴＧＡＡＧＡＴＧ−３’（配列番号１８）と上記プライマー（３）５’−ＣＡＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣ−３’（配列番号１７）を用いて上記ｒａｔ  ａｏｒｔａ  ｃＤＮＡライブラリーより作製した約４万クローンのファージサブプール１０個（計約４０万クローン）をＰＣＲスクリーニングすることにより２個のポジティブなサブプールを得た。そのうち１個のサブプールを上記ＰＣＲによって増幅される断片をプローブとしてハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行い１個のポジティブクローンを得、ラットペリオスチン＃２と命名した。挿入断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII（ストラタジーン社）のＥｃｏＲＩ部位に組み込み、塩基配列を製造例１−５の方法にしたがって決定した。【００６２】
得られたクローンの長さは約２．６ｋｂであり、５’−末端は５’−ＲＡＣＥで得られたクローンと同一であったが、３’−末端はマウスペリオスチン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．Ｄ１３６６４）の２４１０番までに相当するクローンであった。また、先に得られたラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ＃１の塩基配列とラットペリオスチン＃２の相当する領域の塩基配列は全く同一であった。ラットペリオスチン＃１とラットペリオスチン＃２よりラットペリオスチンｃＤＮＡの完全長を完成させた。この完全長ｃＤＮＡの塩基配列とこの塩基配列より翻訳されるアミノ酸配列を配列番号６及び１に示す。【００６３】
［製造例３］Myc-His-ラットペリオスチン融合タンパク質発現ベクターの構築
製造例２で得られたラットペリオスチン遺伝子のコード領域から翻訳されるタンパク質のカルボキシル末端にＭｙｃエピトープと６個のヒスチジンタグを有し、ＣＭＶプロモーターを有する発現ベクターを作製した。【００６４】
まず、ｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２ベクター（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶで消化したベクター断片に、製造例２で得られたラットペリオスチン５’ＲＡＣＥ  ＃１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約５００ｂｐの断片と製造例２で得られたラットペリオスチン＃１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＨｐａｌで消化して得られた約２７８０ｂｐの断片をライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られたプラスミドをｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２／ラットペリオスチンと命名した。このようにして作製したｐＴｒａｃｅｒ−ＣＭＶ２／ラットペリオスチンを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳｍａｌで消化し、ラットペリオスチン遺伝子のコード領域を含む約２３３０ｂｐの断片を得、製造例２で得られたラットペリオスチン＃１を鋳型としてその配列を基に設計したプライマー（５）５’−ＧＡＣＣＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号１９）とラットペリオスチンの終止コドンの直前にＢｓｔＥＩＩサイトが挿入されるように設計したプライマー（６）５’−ＴＧＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣ−３’（配列番号２０）を用いてＰＣＲを行い、精製後、制限酵素ＳｍａｌとＢｓｔＥＩＩで消化して約２７０ｂｐの断片を得た。上記の２つの断片を、発現ベクター構築用のプラスミドｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｔｙｐｅ  Ｃ（インビトロジェン社）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢｓｔＥＩＩで消化したベクター断片に、ライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られたプラスミドをｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ラットペリオスチンと命名した。挿入部分の全塩基配列は製造例に記載の方法により確認した。【００６５】
［製造例４］バキュロウイルス用発現ベクターの構築
製造例３で得られたプラスミドｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ラットペリオスチンを、制限酵素ＳａｃＩ及びＰｍｅｌで消化し、ペプチド断片ｒａｔ  ＰＮ−１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓを切り出した。これを、ｐＦａｓｔＢａｃＨＴｃ（インビトロジェン社）を制限酵素ＳａｃＩとＫｐｎＩ（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）で消化して得られたベクター断片に、ライゲーションキット（宝酒造（株））を用いて連結し、得られた発現ベクターをｐＦａｓｔＢａｃ／ラットペリオスチン−１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓと命名した。挿入部分の塩基配列は製造例１−５に記載の方法により確認した。【００６６】
［製造例５］組換えバキュロウイルスの調製および培養
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＤＨ１０ＢＡＣ細胞を、製造例５で得られたｐＦａｓｔＢａｃ／ラットペリオスチン−１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓで形質転換し、組換えバキュロウイルスを調製した。得られたバキュロウイルスは、電気泳動およびＰＣＲにより、目的のものが挿入されていることを確認した。【００６７】
この組換えバキュロウイルスをＭＯＩ＝０．１にて感染させた昆虫Ｓｆ９細胞（２×１０６ cells/mL）を、無血清培地（Ｓｆ−９００IIＳＦＭ（インビトロジェン社製）２０００ｍＬ中にゲンタマイシンを５０μｇ／ｍＬの濃度になるように添加）中、２８℃で４〜５日培養した後、培養上清を回収した。【００６８】
［製造例６］ラットペリオスチンタンパク質の精製
製造例５で得られた培養上清２０００ｍＬを平衡化バッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー  ｐH６．０  ０．１M塩化ナトリウム）で平衡化したＳＰｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  １０ｍＬ  ｂｅｄに供し、得られたFlow Through（通過分画）をＳＰセファロース通過分画とした。【００６９】
平衡化バッファーで２８０ｎｍの吸光度が０付近になるまで（約１００ｍＬ）洗浄し、ＳＰセファロース洗浄分画とした。【００７０】
溶出バッファー（５０ｍＭリン酸２水素ナトリウム（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール）１００ｍＬで溶出し、ＳＰセファロース溶出分画とした。【００７１】
次に、１００ｍＬのＳＰセファロース溶出分画を、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー  ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウムおよび５ｍＭイミダゾールで平衡化したＮｉ−ＮＴＡａｇａｒｏｓｅ  ５ｍＬ  ｂｅｄに供し、得られた通過分画をＮｉ−ＮＴＡアガロース通過分画とした。【００７２】
洗浄バッファー（５０ｍＬ  リン酸２水素ナトリウム  ｐＨ８．０、０．５Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭイミダゾール）約５０ｍＬで洗浄し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース洗浄分画とした。【００７３】
溶出バッファーは以下の通り（（１）５０ｍＭリン酸２水素ナトリウム、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭイミダゾール、以降イミダゾール量が（２）３０ｍＭ、（３）４０ｍＭ、（４）５０ｍＭ、（５）６０ｍＭ）とし、それぞれ約２５ｍＬで溶出し、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース溶出分画（１）〜（６）とした。【００７４】
ウエスタンブロット法により目的蛋白が含まれることが確認された分画を、１ｍＬ以下に濃縮した。【００７５】
次に、脱気したＰＢＳ（−）（１３７ mM ＮａＣｌ、８．１ mM Ｎａ２ＨＰＯ４、 ２．６８ mM ＫＣｌ、１．４７ mM ＫＨ２ＰＯ４）で平衡化したゲルろ過カラム（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲ  Φ１１ｍｍ×９５ｃｍ；容量：９０ｂｅｄ）に上記濃縮試料を供し、ＰＢＳ（−）で溶出し、凍結乾燥することにより、ラットペリオスチン精製タンパク質を得た。
＜実施例１＞ラットＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖の合成およびポリクローナル抗体の作製
ノーマルのＳＤラットの心臓にＰＮ−１遺伝子を高発現させると心拡大が惹起され、またダール心不全モデルラットの心臓にラットペリオスチンのアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すると生存率が改善されたことに加え、報告されてきたＰＮ−２とは異なり、ラットＰＮ−１タンパク質には細胞接着作用が無いことが明らかとなったことを受け、ラットＰＮ−１タンパク質に特異的な構造は夫々の配列比較からＥｘｏｎ−１７配列であると同定した（図１参照）。このＥｘｏｎ−１７によりコードされるアミノ酸配列のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチドを、純度８０％以上にて10ｍｇ、化学合成した。キャリアタンパク質としてＫＬＨ６ｍｇを結合させたものをウサギ(Ｋｂｌ:ＪＷ)に免疫させた。免疫方法は初回免疫にはＦＣＡ(フロイント完全アジュバント)を使用し、２次免疫以降はＦＩＡ (フロイント不完全アジュバント)を使用した。また、投与部位は背部皮下２０ヶ所、投与週 は０、２、４、６週、投与量は初回免疫では８００μgペプチド/匹、2次免疫以降では４００μgペプチド/匹にて免疫した。抗体力価はＥＬＩＳＡ法にて測定し 投与週７週目に全血清を集めた。その後、合成ペプチドを用いたアフィニティーカラムを作製し、Ｅｘｏｎ−１７ペプチドに特異的に反応する抗体のみを回収した。以降、上記の、ラットペリオスチンのＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチドに対するポリクローナル抗体を、抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体と称する。
＜実施例２＞ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるラットＰＮ−１タンパク質の非細胞接着活性の有無の検討
細胞培養用９６穴マルチウェルプレートに１０mｇ／ｍｌフィブロネクチン、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、 １０mｇ／ｍｌＰＮ−１タンパク質をそれぞれ添加し４℃にて一晩コーティングした。タンパク質液を除去したウェルに、ＤＭＥＭ（１０％  ＢＳＡ，ＰＣ／ＳＭ）に懸濁したマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−６４７５）若しくはマウス４Ｔ１乳癌細胞（ATCC番号：CRL-2539）１０４個／ウェルを加え、３７℃インキュベーターにて３時間培養した。細胞の接着量測定は、培養上清を除去した後、２．５％グルタルアルデヒドにて３０分間固定し、０．０２％クリスタルバイオレッドにて染色した後プレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、 Ｍｏｄｅｌ ６８０ マイクロプレートリーダー）にてＯＤ  ５５０  ｎｍの吸光度を測定した。バックグラウンドとして、無処理のウェルを染色したものを用い、その吸光度値にて補正した値を比較した。データの解析はＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ検定により行った（図２A、B）。その結果、陽性コントロールであるフィブロネクチンでは細胞が接着し、陰性コントロールであるＢＳＡでは細胞が接着しなかった。ラットＰＮ−１タンパク質を添加した群では細胞の接着が認められなかったことから、ラットＰＮ−１タンパク質には細胞を接着させない作用、すなわち非細胞接着作用を有していることが明らかとなった。
＜実施例３＞ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるラットＰＮ−１タンパク質の抗細胞接着活性の有無の検討
細胞培養用９６穴マルチウェルプレートに、ＤＭＥＭ(１０％  ＢＳＡ，ＰＣ／ＳＭ)に懸濁したマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞若しくはマウス４Ｔ１乳癌細胞１０４個／ウェルを添加し、３７℃インキュベーターにて一晩培養した。培養上清を除去した後、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチン(ＳＩＧＭＡ)、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ  (ＳＩＧＭＡ)、ＰＮ−１タンパク質を添加し３７℃インキュベーターにて１〜３時間培養した。細胞の接着量測定には、培養上清を除去した後、２．５％  グルタルアルデヒドにて３０分間固定し、０．０２％クリスタルバイオレッドで染色した後、プレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、 Ｍｏｄｅｌ ６８０ マイクロプレートリーダー）によりＯＤ  ５５０ｎｍの吸光度を測定した。バックグラウンドとして、無処理のウェルを染色したものを用い、その吸光度値にて補正した値を比較した。データの解析はＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ検定により行った（図３A、B）。細胞は、実体顕微鏡ＬＥＩＣＡ  ＭＺ１６付属のＮｉｋｏｎ  ＣＯＯＬＰＩＸ４５００にて撮影した。その結果、コントロールであるフィブロネクチンおよびＢＳＡを投与した群ならびに無添加群では接着していた細胞の剥離は起こらず、抗細胞接着作用が見られなかったが、ラットＰＮ−１タンパク質を添加した群では細胞の剥離が認められたことから、ラットＰＮ−１タンパク質は接着細胞の剥離作用、すなわち抗細胞接着作用を有していることが明らかとなった。
＜実施例４＞ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体の中和活性の検討
実施例３と同様に、細胞培養用９６穴マルチウェルプレートに、ＤＭＥＭ(１０％  ＢＳＡ，ＰＣ／ＳＭ)に懸濁したマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞若しくはマウス４Ｔ１乳癌細胞１０４個／ウェルを添加し、３７℃インキュベーターにて一晩培養した。培養上清を除去後、培養液を１０μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドを加えた１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に変更し、３７℃、１時間培養した。その後、予め３７℃に温めたＤＭＥＭ培地（無血清）で細胞を２度洗い、終濃度１０μｇ／ｍｌのラットペリオスチンタンパク質と抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体を終濃度１００ μｇ／ｍｌになるようにＤＭＥＭ培地（無血清）に添加した。陽性コントロールとしてラットペリオスチンタンパク質のみを、陰性コントロールとしてＢＳＡを用いた。３７℃で１時間培養後の顕微鏡観察においてラットペリオスチンタンパク質のみを添加した群はほぼ完全に細胞が剥がれたため、ＰＢＳ（−）にて２度洗った後、１０％中性緩衝ホルマリン液にて３０分間細胞を固定した。その後、ＰＢＳ（−）にて３度洗った後、クリスタルバイオレットを用いて３０分間細胞を染色した。その後、５５０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、 Ｍｏｄｅｌ ６８０ マイクロプレートリーダー）を用いて細胞の染色度を測定した（図４A、B）。その結果、抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体は、ＰＮ−１タンパク質による接着細胞の剥離を抑制する、つまりＰＮ−１タンパク質の抗細胞接着作用を抑制する、すなわちラットＰＮ−１タンパク質の抗細胞接着作用を中和する活性を有した抗体であることが判明した。
＜実施例５＞ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体の細胞増殖に与える影響の検討
実施例３と同様に、細胞培養用９６穴マルチウェルプレートに、ＤＭＥＭ(無血清，ＰＣ／ＳＭ)に懸濁したマウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞１０４個／ウェルを添加し、３７℃インキュベーターにて一晩培養した。培養上清を除去した後、抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体およびウサギＩｇＧ抗体が各々１００mｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌの終濃度になるように添加したＤＭＥＭ(無血清，ＰＣ／ＳＭ)培地を加えて、再度一晩培養した。翌日、全てのウェルの培地をＤＭＥＭ(１０％  ＢＳＡ，ＰＣ／ＳＭ)に交換し、Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit（プロメガ）を用いて、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ液を１００μｌの培地に対し２０μｌずつ加え、３７℃で１時間培養した。その後、４９０ｎｍのプレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、 Ｍｏｄｅｌ ６８０ マイクロプレートリーダー）を用いて細胞の染色度を測定した（図５Ａ）。同様に、マウス４Ｔ１乳癌細胞においては抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体およびウサギＩｇＧ抗体が各々２００μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌの終濃度になるように添加し測定した（図５Ｂ）。その結果、抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体は、高濃度にて細胞増殖を抑制する活性を有した抗体であることが判明した。
＜実施例６＞ヒトペリオスチンのＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖に対するモノクローナル抗体の作製
(1)  抗原の作製
ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７によりコードされるアミノ酸配列（配列番号４）のＮ末端にＣｙｓ残基を付加したペプチド（抗原ペプチド；配列番号２５）を、Ｆｍｏｃ法にて化学合成し、純度９０％以上の抗原ペプチド１０ｍｇを得た。この抗原ペプチド５ｍｇにキャリアタンパク質としてＫＬＨ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製）５ｍｇを結合させ、抗原溶液を得た。すなわち、ＫＬＨをＰＢＳ（０．０１Ｍ）に溶解して３．３ｍｇ／ｍＬに調整し、０．２５２４ｍｇ／ｍＬのＭＢＳ溶液（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を滴下して室温で６０分間攪拌し反応させた。ジクロロメタンを用いてフリーのＭＢＳを除き、ＫＬＨ−ＭＢを得た。このＫＬＨ−ＭＢ５ｍｇと、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解した抗原ペプチド５ｍｇとを混合し、４℃で１２時間攪拌して反応させ、抗原溶液を得た。
(2)  免疫
６週齢のＢＡＬＢ／c雌性マウス３匹の両足に、(1)で得られたＫＬＨ結合抗原ペプチド １００μg を含む抗原溶液 ５０μlと、ＦＣＡ(フロイント完全アジュバント) ５０μlとの混合乳濁液全量を皮下注射した。その後２週間間隔で２回、用時調製した上記抗原溶液とＦＩＡ (フロイント不完全アジュバント) との混合乳濁液を両足に投与した。その後、そのマウスを頸椎脱臼により致死させ、無菌的に足部リンパ節を採取した。ＲＰＭＩ培地（コージンバイオ株式会社製）を供給しながら上記リンパ節を破砕し、孔径約１０μｍのメッシュを通過させて ＲＰＭＩ培地に懸濁状態のリンパ節細胞を得た。これを1000ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけて、リンパ節細胞を沈殿画分として得た。この沈殿画分に、０．８４ ％の塩化アンモニウム溶液に２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ ７．４） を加えた溶液１ｍｌを入れて溶血させ、赤血球を除いた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけた。得られた沈殿画分（細胞画分）をRPMI培地で数回洗浄し、細胞融合に用いた。
(3)  ミエローマ細胞の調製
８-アザグアニン耐性でかつイムノグロブリン非分泌型のマウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１ 株）を、２０％のウシ胎児血清(ＦＣＳ) を含む ＲＰＭＩ培地で、１０％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター内で培養し、対数増殖期にある細胞を集め、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけて沈殿画分として細胞のみを取得し、ＲＰＭＩ培地に懸濁させた。
(4)  細胞の融合
(2)で得た免疫化リンパ節細胞１０8 〜３×１０8 個を含む RPMI培地と、(3)で得たミエローマ細胞１０8 個を含むRPMI培地とを混合した後、１，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけた。上清を静かに除いて沈殿画分として細胞を取得し、これに２５％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ １５００ 、ベーリンガー社製)１ｍｌを加えた後、更にＲＰＭＩ培地をゆっくりと加えて総量を１０ｍｌとした。これに２０％ ＦＣＳを含む ＲＰＭＩ培地１０ｍｌを加えて、少し静置させた後、１，０００ｒｐｍ、５分間の遠心分離にかけ、得られた沈殿画分（細胞画分）に２０％ＦＣＳを含む ＲＰＭＩを加えて細胞濃度が１０6 個／ｍｌになるように調整した細胞懸濁液を、コーニング社製の９６穴培養プレートに２００μＬ／ウェルずつ分注した。５％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター中で２４時間培養後、ＨＡＴ 溶液（インビトロジェン社製）を添加した後、更に２週間培養した。
(5)ＥＬＩＳＡ法によるスクリーニング
培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ウェルのスクリーニングを行った。【００７６】
アッセイ用の抗原溶液には、（１）で得られた抗原ペプチド２ｍｇに、キャリアタンパク質として卵白アルブミン（ＯＶＡ）を結合させたコンジュゲートを用いた。【００７７】
９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３５３９１２）の各ウェルを、上記コンジュゲート１μg ／ｍｌで４℃下一夜静置してコーティングした。このプレートを洗浄後、（４）の培養上清（モノクローナル抗体を含む）５０μｌを各ウェルに滴下し、３７℃のインキュベーター内で２時間放置した後、ＰＢＳ（−）(リン酸緩衝液) で洗浄した。これにアルカリフォスターゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ社製）を加え、３７℃インキュベーターで１時間放置し、ＰＢＳ（−）で洗浄後、発色基質剤(ＡＬＰ)を加えて２０分間発色させ、プレートリーダー（ＢＩＯ−ＲＡＤ、Ｍｏｄｅｌ６８０マイクロプレートリーダー）で各ウェルのＯＤ４９０ｎｍの吸光度（抗体価）を測定し、抗原ペプチドとの反応性を確認し、培養上清が抗原ペプチドと反応する陽性ウェルを決定した。
(6)  抗体産生細胞のクローニング
（５）のＥＬＩＳＡ法で抗原ペプチドとの反応性が確認された陽性ウェル内の細胞から、限界希釈法により、抗体産生細胞株のクローニングを行った。すなわち、陽性ウェル内の細胞を９６穴培養プレートの各ウェルに撒き込み、５％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター内で２週間培養した。各ウェルの培養上清について、（５）の方法と同様に、ＥＬＩＳＡ法にて、抗原ペプチドとの反応性を確認し、陽性ウェルについて、再度、限界希釈法によるクローニングを行い、抗原ペプチドとの反応性が高く、細胞コロニーの発育が良好な３０個の細胞を得た。これら細胞を２４穴培養プレートに移し、５％ＣＯ2 ・３７℃インキュベーター内で２週間培養した。培養上清について、再び、（５）の方法と同様に、ＥＬＩＳＡ法にて、抗原ペプチドとの反応性（抗体価）を確認した。ＯＤ４９０ｎｍの吸光度が高かった１０ウェル内の細胞、すなわち１０個のハイブリドーマ細胞株を、抗体産生細胞として有用であると判断し、選別した。【００７８】
【表１】
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このようにして得た抗体産生細胞は、本発明で用いられる抗体である抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を常時産生するので、この抗体産生細胞を培養した培養液の上清液は、直接、本発明抗体溶液として使用することができる。なお、上記の抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞株（ハイブリドーマ）No.1（SBM337）は、平成１８年１１月１日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−１０７１８として寄託されている。
（７）ヒトペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性の確認
（６）で得られた抗体産生細胞１０個が産生する抗体と、ヒトペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、実施例８で得られた合成タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）を５μｌずつＨｙｂｏｎｄ-ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンに（６）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の0.4mｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ECL plus western blotting detection system、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、（６）でクローニングした抗体産生細胞１０個全てが、ヒトペリオスチンＰＮ−１と結合することが確認された。
（8）モノクローナル抗体の大量調製と精製
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内にプリスタン[２,６,１０,１４-テトラメチルペンタデカン(和光純薬製)]０.５ｍｌを投与し、２〜３週間飼育した。予め、対数増殖期に維持しておいたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ No.1およびNo.3を回収し、培養上清を除いた沈殿画分の細胞にＦＣＳ不含のＲＰＭＩ培地を加え、細胞数が１×１０７個／ｍｌになるように細胞液を調製した。この細胞液を、プリスタン前投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔中に注入し、３週間後頃から漏出した腹水を腹部より注射器で回収した。採取した腹水を、孔径０.２２μmφのフィルターを用いて濾過した後、濾液をプロテインＧ-セファロースカラム(Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１１５１１３２４)によるアフィニティークロマトグラフィーによって常法に従い精製し、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体２種を調製した。
＜実施例７＞抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位解析
得られたモノクローナル抗体２種（No.1およびNo.3）についてヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位の解析（エピトープの同定）を行った。すなわち、セルロースメンブレン上に、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４；１位のスレオニンから２７位のグルタミン酸まで）のＮ末端から−９番目のフェニルアラニンから、Ｃ末端から９番目のイソロイシンまでの計４５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列において、下記のアミノ酸１０個からなるペプチド３６種を膜結合型ペプチドアレイを作製した（シグマアルドリッチジャパン株式会社カスタムＳｐｏｔｓ サービス）。【００７９】
【化１】
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このメンブレンを少量のメタノール中で５分間放置した後、ＴＢＳ溶液で３回洗浄した。ブロッキングバッファー（カゼイン、SPOTsに添付）を加えて、室温で２時間攪拌した。メンブレンに実施例６（８）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液中で１０分間振盪洗浄を３回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の０．４μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて２時間インキュベートした後、メンブレンをＴＢＳ溶液で５分間振盪洗浄を３回行った。検出用試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、モノクローナル抗体No.1およびNo.3は、アミノ酸配列YTTKIITKVV（配列番号２６）からなる合成ペプチドＮｏ．９、すなわちヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖のアミノ酸配列（配列番号４）におけるＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでであり、ヒトペリオスチンＰＮ−１のアミノ酸配列（配列番号２）におけるのＮ末端から６６９番目のチロシンから６７９番目のバリンまでのアミノ酸配列からなるペプチドとのみ反応し、結合した。
＜実施例８＞抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体のヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位解析
実施例１で作製したポリクローナル抗体について、実施例７と同様に、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位の解析（エピトープの同定）を行った。その結果、実施例７のモノクローナル抗体と同様に、該ポリクローナル抗体は合成ペプチドＮｏ．９とのみ反応し、モノクローナル抗体と同様の部位を特異的に認識していることが明らかとなった。従って、ラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製しても、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作製しても、同様な特異性をもつ抗体が得られることが示唆された。
＜実施例９＞ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性の確認
得られたモノクローナル抗体２種（No.1およびNo.3）について、ラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）との結合性について、ドットブロット法にて確認した。すなわち、製造例６で得られた精製タンパク質（３０μｇ／ｍｌ）を５μｌずつＨｙｂｏｎｄ-ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンにモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の0.4μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ECL plus western blotting detection system、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。その結果、得られたモノクローナル抗体２種はラットペリオスチンＰＮ−１とも結合することが確認された。
＜実施例１０＞抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のエピトープ解析
実施例７の結果から、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のエピトープ部分はヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（TTKIITKVV；配列番号２２）を認識していることが明らかとなり、また実施例９の結果において、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体がラットペリオスチンタンパク質（ＰＮ−１）とも結合することが確認された。このことから、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体のエピトープ部分はヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端のスレオニンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（TTKIITKVV；配列番号２２）のうち、ヒトとラットの種間においてアミノ酸に相違がない部分、すなわち、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）またはラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号３）のＮ末端のスレオニンから７番目のリジンまでのアミノ酸配列の全部またはその一部分を認識していることが示唆された。そこで、さらに詳細にエピトープ部分を解析するために、アラニンスキャンの手法にて解析を行った。【００８０】
ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）のうち、一部のアミノ酸をアラニンに変換した下記１０種のペプチドを純度８０％以上で合成した。【００８１】
【化２】
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１ｍｇの合成ペプチドをＰＢＳ（−）５０μlで可溶化させ、１．５μlずつＨｙｂｏｎｄ-ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製）にスポットし、ＴＢＳ溶液で１回洗浄した。ブロッキングバッファー（ブロックエース、雪印乳業株式会社製）を加えて、室温で１時間振盪した。メンブレンに実施例９（８）で得られたモノクローナル抗体（一次抗体）の１μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて３時間振盪した後、ＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。メンブレンにＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（プロメガ社製）（二次抗体）の０．４μｇ／ｍｌ濃度溶液を加えて室温にて１時間振盪した後、メンブレンをＴＢＳ溶液で１０分間振盪洗浄を４回行った。検出用試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）を加えて１分間反応させ、化学発光法により検出した。【００８２】
その結果、該モノクローナル抗体は、上記合成ペプチド＃７（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および８〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）と強く反応し、＃１（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖の（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチド）および＃２（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および９〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）とは弱く反応し、＃３（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１〜２番目および９〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）および＃８（ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖（配列番号４）のＮ末端から−１番目のチロシンから９番目のバリンまでのアミノ酸配列（YTTKIITKVV；配列番号２６）からなるペプチドにおいて、Ｎ末端から１番目および７〜１０番目のアミノ酸をアラニンに置換したペプチド）とは更に弱く反応した。
＜実施例１１＞抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体のヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位解析
実施例１で作製したポリクローナル抗体について、実施例１０と同様に、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチド鎖における認識部位の解析（エピトープの同定）を行った。その結果、実施例１０のモノクローナル抗体と同様に、該ポリクローナル抗体は合成ペプチドＮｏ．＃７と強く反応し、＃１および＃２とは弱く反応し、＃３および＃８とは更に弱く反応し、モノクローナル抗体と同様の部位を特異的に認識していることが明らかとなった。従って、ラットペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてポリクローナル抗体を作製しても、ヒトペリオスチンＥｘｏｎ−１７ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作製しても、同様な特異性をもつ抗体が得られることが示唆された。
＜実施例１２＞マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞肺転移モデルマウスを用いた原発巣でのＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域を持つペリオスチンの発現
マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞注射後２週目にマウス原発巣を採取し、ホモジナイズした組織をＲＩＰＡバッファー (ＲＩＰＡ Ｌｙｓｅｓ Ｂｕｆｆｅｒ １０×; Ｕｐｓｔａｔｅ)、１８０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、プロテアーゼ阻害剤カクテル (ナカライテスク)、２００ｍＭ  ＮａＦ を添加し、氷上にて１５分静置した。その後、１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、その上清を採取した。抽出したタンパク質はＤＣプロテインアッセイ試薬（ＢＩＯ−ＲＡＤ） により濃度を測定した。その後、２×サンプルバッファー （Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ)、５％ ２−メルカプトエタノール) に混合し、９８℃、５分加熱処理を加えた。調製したタンパク質のサンプルをマルチゲルIIミニ７．５ (第一化学) を用いて １０ｍＡで１８０分間泳動した後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ） に３０Ｖ、４℃で一晩転写させた。その後、メンブレンは５％ スキムミルクｉｎ  ＰＢＳ−Ｔに１時間、または ブロッキングワンP (ナカライテスク) に２０分間浸し、室温で振盪させブロッキングした。その後一次抗体（抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（No.3）、１：５００に希釈、コントロールとして抗ニワトリα−ｔｕｂｌｉｎモノクローナルＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）、１：５０００に希釈）を添加し４℃にて一晩反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで５分×３回の洗浄を行った。その後、二次抗体（Ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ （ＰＲＯＭＥＧＡ）、１：１００００に希釈）を添加し１時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔにて１０分×１回、３０分×２回洗浄した後、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ （Amersiam Biosciences）を用いて化学発光法によりバンドの検出を行なった。その結果、正常下肢ではＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域を持つペリオスチンの発現は見られなかったのに対し、腫瘍組織では発現が亢進していることが明らかとなった（図６Ａ）。
＜実施例１３＞マウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた原発巣でのＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域を持つペリオスチンの発現
マウス４Ｔ１乳癌細胞注射後２週目にマウス原発巣を採取し、ホモジナイズした組織をＲＩＰＡバッファー (ＲＩＰＡ Ｌｙｓｅｓ Ｂｕｆｆｅｒ １０×; Ｕｐｓｔａｔｅ)、１８０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、プロテアーゼ阻害剤カクテル (ナカライテスク)、２００ｍＭ  ＮａＦ を添加し、氷上にて１５分静置した。その後、１５０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心し、その上清を採取した。抽出したタンパク質はＤＣプロテインアッセイ試薬（ＢＩＯ−ＲＡＤ） により濃度を測定した。その後、２×サンプルバッファー （Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  （ＢＩＯ−ＲＡＤ)、５％ ２−メルカプトエタノール) に混合し、９８℃、５分加熱処理を加えた。調製したタンパク質のサンプルをマルチゲルIIミニ７．５ (第一化学) を用いて １０ｍＡで１８０分間泳動した後、Immobilon-P Transfer Membranes （ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ） に３０Ｖ、４℃で一晩転写させた。その後、メンブレンは５％ スキムミルク（ＰＢＳ−Ｔ中）に１時間、または ブロッキングワンP (ナカライテスク) に２０分間浸し、室温で振盪させブロッキングした。その後一次抗体（抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（No.3）、１：５００に希釈、コントロールとして抗ニワトリα−ｔｕｂｌｉｎモノクローナルＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）、１：５０００に希釈）を添加し４℃にて一晩反応させた後、ＰＢＳ−Ｔで５分×３回の洗浄を行った。その後、二次抗体（Ａｎｔｉ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  ＨＲＰ （ＰＲＯＭＥＧＡ）、１：１００００に希釈）を添加し１時間室温で反応させた。ＰＢＳ−Ｔにて１０分×１回、３０分×２回洗浄した後、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ （Ａｍｅｒｓｉａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて化学発光法によりバンドの検出を行なった。その結果、正常下肢でのペリオスチンの発現は見られなかったのに対し、腫瘍組織では発現が亢進していることが明らかとなった（図６B）。
＜実施例１４＞マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体および抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体の効果  
マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞を３７℃インキュベーターにて培養し、ＰＢＳで洗浄した後、トリプシン／ＥＤＴＡにて細胞を浮遊させ回収した。その後１５００ｒｐｍ、３分間遠心を行い回収した細胞を５×１０５個／匹になるようにカウントし１００μｌのＰＢＳに懸濁した。調整した細胞は、２９Ｇマイジェクター注射針付インスリン用シリンジ (ＴＥＲＭＯ) を用いマウスＣ５７ＢＬ／６Ｎオス８週齢の足底部に注入した。先ず初めに実施例６で得られた２種のモノクローナル抗体（No.1およびNo.3）の効果を検討するために細胞の接種と同時にマウス頸静脈より２９Ｇマイジェクター注射針付インスリン用シリンジにて抗体２μｇ／匹を投与した。コントロールとしてＮｏｒｍａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ(Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用いた。細胞および抗体の投与後1週間での下肢腫大部の径をノギスにて計測し、原発巣の増加率を評価した。その結果、コントロール群で74.5±6.3％（ｎ＝１1）、抗体（No.1）群で17.8±4.4％(ｎ＝１0)、抗体（No.3）群で19.5±9.9％ (ｎ＝１0)であり、両抗体共に癌増殖抑制活性を同程度に持つことが明らかとなった(図７)。【００８３】
次に、マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞を接種後、期間をおいてから抗体を投与し、より臨床に近い形で効果が有るのかを検討した。抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体(０．７５ｍｇ／ｍｌ)を用いた実験では細胞注射を行った1週間後に、また抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体(No.3)（２．１４ｍｇ／ｍｌ)を用いた実験では、細胞注射を行なった３日後と７日後にマウス頸静脈より２９Ｇマイジェクター注射針付インスリン用シリンジにて抗体２０μｇ／匹を投与した。コントロールとしてＮｏｒｍａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ(Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用いた。細胞注射を行なった後、1週間毎に下肢腫大部の径をノギスにて計測し、原発巣の増加率を評価した。原発巣の過増殖により腹膜下に癌が直接浸潤してマウスが死亡することを防ぐ為、細胞注射後２週目で原発巣の下肢を切除した。細胞注射後５週目に剖検を行い、原発巣から肺への転移の有無と肺への転移コロニー数のカウントを行なった。原発巣の増加率は、マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞注射前の足の径を１００としたときの増加分を百分率で示し、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によりデータ解析を行なった。また、原発巣から肺への転移率はΧ２検定、肺への転移コロニー数はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定によりデータ解析を行なった。【００８４】
抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体投与実験においては、細胞注射後2週目の原発巣の増加率 (細胞を注射する前の足の径との比較した) は、コントロール群で１９８．１±１０．４２８％（ｎ＝１０）、中和抗体群で１６３．２±２１．０１５％(ｎ＝１１)であった(図８)。一方、原発巣から肺への転移率は、コントロール群が５７．１％（ｎ＝７） であったのに対し、中和抗体群では０％（ｎ＝６）と有意に転移を抑制していた(図８)。コントロール群の原発巣から肺への転移コロニー数は、１．１４３±０．５５３ 個であった(図８)。【００８５】
次に、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（No.3）投与実験においては、細胞注射後１週目の原発巣の増加率 (細胞を注射する前の足の径との比較した) は、コントロール群で７７．６±９．４８４％（ｎ＝１２）であったのに対し、中和抗体群では４８．９±７．０６０％（ｎ＝１１）で有意に増殖を抑制していた(Ｐ＜０．０５)(図９)。また、原発巣から肺への転移率では、コントロール群が７５％（ｎ＝１２） に対し、中和抗体群 （ｎ＝１０）では４０％で転移率の減少傾向を示した(Ｐ＝０．０９６４)(図９)。原発巣から肺への転移コロニー数は、コントロール群では９．４１±４．３８個であったのに対し、中和抗体群では０．７±０．３３５ 個で有意に転移コロニー数を抑制していた(Ｐ＜０．０５) (図９)。以上の結果より、抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体はメラノーマ細胞の肺への転移抑制効果を有することが認められた。さらに、抗ヒトＥｘｏｎ−１７モノクローナル抗体（No.3）では、原発巣の増殖抑制効果も有することが明らかとなった。
＜実施例１５＞マウス４Ｔ１乳癌細胞肺転移モデルマウスを用いた抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体の効果
マウス４Ｔ１乳癌細胞を１０％牛血清アルブミン （ＦＢＳ）（Ｂｉｏ  ｗｅｓｔ）、Penicillin-streptomycin Mixed solution (ナカライテスク)、含有ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ） を用いて１０ｃｍ  Tissue Culture Dishes （Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種し、３７℃インキュベーターにて２４時間培養した。その後、培養上清を除去し、ＰＢＳにて洗浄した後にトリプシン／ＥＤＴＡにより浮遊させた。細胞を回収し１５００ｒｐｍ、３分間遠心した後、１．５×１０５個の細胞を継代し３７℃インキュベーターにて７２時間培養後、対数増殖期にある細胞を１×１０６個／匹になるようにカウントし１００μｌのＰＢＳに懸濁した。調整した細胞は、２９Ｇマイジェクター注射針付インスリン用シリンジ(ＴＥＲＭＯ)を用いマウスＢＡＬＢ／ｃメス８週齢の足底部に注入した。また、マウス頸静脈より２９Ｇマイジェクター注射針付インスリン用シリンジにて抗体２０μｇ／匹を投与した。抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体 (１ｍｇ／ｍｌ)を用いた実験では、細胞注射と同時に抗体を投与し、さらに細胞注射を行なった１週間後と２週間後に抗体を投与した。コントロールとしてＮｏｒｍａｌ  Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ (Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ)を用いた。細胞注射を行なった後、１週間毎に体重測定と下肢腫大部の径をノギスにて計測し、原発巣の体積を評価した。評価方法はDethlefsen LA. et al. J. Natl. Cancer Inst., 40, 389(1968)に記載方法に従い、（足裏の長さ）×（足裏の幅の２乗）÷２にて求めた。細胞注射後３週目に剖検を行い、体重測定、原発巣から肺への転移の有無と肺への転移コロニー数のカウントを行なった。それぞれ、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によりデータ解析を行なった。結果は、体重変化において細胞注射後２週目までは両群間に有意な差は見られなかったが３週間後において、コントロール群で１７．５０±０．７０３ｇ（ｎ＝６）、中和抗体群で２１．２４±０．５１７ｇ（ｎ＝６）で有意に原発巣の増殖を抑制していた (Ｐ＜０．０５)(図１０)。また、細胞注射後１週目の原発巣の腫瘍体積は、コントロール群で３０１．３±１１．４９ｍｍ３（ｎ＝１０）、中和抗体群で２３５．９±７．８４２ｍｍ３(ｎ＝１０)で有意に原発巣の増殖を抑制していた(Ｐ＜０．０５)、また、細胞注射後２週目の原発巣の腫瘍体積は、コントロール群で８４２．４±３４．７１ｍｍ３（ｎ＝１０）、中和抗体群で６１３．９±４５．１７ｍｍ３(ｎ＝１０)で有意に原発巣の増殖を抑制していた (Ｐ＜０．０５) (図１１)、細胞注射後３週目ではコントロール群の足が壊死による脱落が起こったが、中和抗体群では脱落は見られなかった。また、原発巣からの乳癌細胞の骨浸潤による骨破壊の評価は下肢距骨に対してＨＥ染色、ＴＲＡＰ染色を行った後、骨面積および破骨細胞数を測定した。骨への直接浸潤による残存骨面積はコントロール群では３２６６５６±５３６２８．７（ｎ＝５）であったのに対し、中和抗体群では５４５７５６．８±６５９２８．８（ｎ＝５）で有意に骨の残存が見られた（ｐ＜０．０５）(図１２)。さらに、破骨細胞数も残存骨面積に逆相関し、コントロール群では４９±９．５７６個（ｎ＝５）であったのに対し、中和抗体群では２０±５．１６７個（ｎ＝５）と有意に減少していた（ｐ＜０．０５）(図１３)。一方、原発巣���ら肺への転移率は、何れの群でも転移が見られたが、転移コロニー数はコントロール群では８９±２８．９個であったのに対し、中和抗体群では３０．５±６．３０個で有意に転移コロニー数を抑制していた(Ｐ＜０．０５)(図１４)。以上の結果より、抗ラットＥｘｏｎ−１７ポリクローナル抗体は乳癌細胞の原発巣の増殖を抑制すると共に、肺への転移抑制効果を有することが明らかとなった。
＜実施例１６＞ヒト癌細胞および正常組織におけるＥｘｏｎ−１７領域を持ったペリオスチンの発現の検討
先ず初めにＥｘｏｎ−１７領域に特異的なプライマー（ｓｅｎｓｅ鎖：５’−ＴＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＣＣＡＡＡＧＴＴＧＴＧＧＡＡＣＣ−３’（配列番号３５）、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ鎖：５’− ＡＧＴＧＴＧＧＧＴＣＣＴＴＣＡＧＴＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番号３６））を作製した。
次に、下記１）〜６）のヒト癌細胞株をＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）およびＥＣＡＣＣ（European Collection of Cell Cultures）より購入し、当該細胞株の説明書に記載の方法に従って培養後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用い説明書に記載の方法に従ってｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。
１）Ｂｒｅａｓｔ Ｄｕｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ (乳管癌、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ｓ) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＨＴＢ−１２９、
２）Ｂｒｅａｓｔ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ (乳腺腺癌、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＨＴＢ−２６、
３）Ｂｒｅａｓｔ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ (乳腺腺癌、ＭＣＦ−７) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＨＴＢ−２２、
４）Ｌｕｎｇ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ (肺癌、Ａ−５４９) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＣＣＬ−１８５、
５）Ｍｅｌａｎｏｍａ (メラノーマ、ＳＫ−ＭＥＬ−５) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＨＴＢ−７０、
６）Ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ(乳癌、Ｈｓ ５７８Ｔ) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＥＣ８６０８２１０４
また、下記１）〜１１）のヒト癌細胞株由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ社より購入した。
１）Ｌｅｕｋｅｍｉａ (白血病、ＫＧ−１) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８３０、
２）Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ (前立腺腺癌、ＰＣ−３) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８３４、
３）Ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ Ｓａｒｃｏｍａ (骨肉腫、ＳａＯＳ−２) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８４０、
４）Ｂｌａｄｄｅｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ (膀胱癌、Ｔ−２４) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８４４、
５）Ｂｒｅａｓｔ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ (乳腺腺癌、ＭＣＦ−７) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８４６、
６）Ｌｉｖｅｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ (肝癌、ＨｅｐＧ２) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８４８、
７）Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ (子宮頸部腺癌、ＨｅＬａ−Ｓ３) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８５２、
８）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ (乳癌、Ｔ−４７０) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８７４、
９）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ (乳癌、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８７６、
１０）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ (乳癌、ＤＵ−４４７５) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８７８、
１１）Ｂｒｅａｓｔ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ (乳腺腺癌、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１) Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７８７２）
また、下記１）〜１６）のヒト癌組織由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ社より購入した。
１）Ｌｕｎｇ： Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  （肺腺癌）   Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２２５、
２）Ｐａｎｃｒｅａｓ： Ａｃｉｎａｒ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（膵臓腺房細胞癌）  Cａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２２９、
３）Ｃｏｌｏｎ： Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（結腸腺癌） Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２３７、
４）Ｌｉｖｅｒ： Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ＣＡ（肝細胞癌） Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２４５、
５）Ｂｌａｄｄｅｒ： ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ（膀胱移行細胞癌） Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２４９、
６）Ｋｉｄｎｅｙ： Ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（腎細胞癌）Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２５３、
７）Ｓｔｏｍａｃｈ： Ｕｎｋｎｏｗｎ（胃癌） Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２６５、
８）Ｂｒｅａｓｔ： Ｄｕｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（乳管癌）Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２２１、
９）Ｕｔｅｒｕｓ： Ｓｕｒｇｅｒｙ（子宮癌）Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２３３、
１０）Ｔｈｙｒｏｉｄ: Ｈｕｒｔｈｌｅ ｃｅｌｌ ｎｅｏｐｌａｓｍ（甲状腺ヒュルトレ細胞癌） Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２４１、
１１）Ｏｖａｒｙ: Ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｃｙｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（卵巣乳頭状嚢包腺癌）   Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２５７、
１２）Ｔｅｓｔｉｓ： Ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ（精巣胚細胞腫）  Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２６１、
１３）Ｌｙｍｐｈｏｍａ： Ｌａｒｇｅ Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ（大細胞型B細胞リンパ腫）  Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２６９、
１４）Ｃｅｒｖｉｘ： Ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ（子宮頸癌）  Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２７７、
１５）Ｐｒｏｓｔａｔｅ： Ａｃｉｎａｒ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（前立腺腺房腺癌）Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２８９、
１６）Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ： Ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ Ｌｙｍｐｈｏｍａ（濾胞性リンパ腫）   Ｃａｔ． Ｎｏ． ＡＭ７２９１）
また、Ｂｉｏｃｈａｉｎ社より、下記１）〜１１）のヒト癌組織由来ｔｏｔａｌ ＲＮＡを購入した。
１）Ａｄｒｅｎａｌ： Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ（副腎褐色細胞腫）   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５００４−１０、
２）Ｂｏｎｅ： Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ（骨肉腫） Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５０２３−１０、
３）Ｂｒｅａｓｔ： Ｌｏｂｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（乳小葉癌）   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５０８６−５０、
４）Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ: Ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ（食道扁平上皮癌）   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５１０６−５０、
５）Ｌｕｎｇ： Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（肺腺癌）   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５１５２−５０、
６）Ｏｖａｒｙ： Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（卵巣腺癌）   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５１８３−１０、
７）Ｒｅｃｔｕｍ： Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ（直腸腺癌）   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５２０６−５０、
８）Ｓｋｉｎ： Ｓｋｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ（悪性黒色腫（メラノーマ））   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５２１８Ａ−１０、
９）Ｓｍａｌｌ Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ： Ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ（小腸中皮腫）   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５２２６−１０、
１０）Ｓｏｆｔ Ｔｉｓｓｕｅ： Ｓｙｎｏｖｉｏｓａｒｃｏｍａ（滑膜腫）   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５２５７−１０、
１１）Ｔｈｙｍｕｓ： Ｔｈｙｍｏｍａ（胸腺腫）   Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｒ１２３５２６４−１０。
また、ヒト正常組織由来のｔｏｔａｌ ＲＮＡはCLONTECH社から以下のものを購入した。１）Adrenal Gland（副腎、Cat.No.636528）、
２）Bladder（膀胱、Cat.No. 636542）、
３）Peripheral Leukocytes（白血球、Cat.No. 636580）、
４）Colon（結腸、Cat.No. 636553）、
５）Kidney（腎臓、Cat.No. 636529）、
６）Liver（肝臓、Cat.No. 636531）、
７）Lung（肺、Cat.No. 636524）、
８）Mammary Gland（乳腺、Cat.No. 636576）、
９）Pancreas（膵臓、Cat.No. 636577）、
１０）Prostate（前立腺、Cat.No. 636550）、
１１）Small Intestin（小腸、Cat.No. 636539）、
１２）Testis（精巣、Cat.No. 636533）、
１３）Thymus（胸腺、Cat.No. 636549）、
１４）Thyroid（甲状腺、Cat.No. 636536）、
１５）Uterus（子宮、Cat.No. 636551））、
また、COSMO BIO社からは以下のものを購入した。  
１）Esophagus（食道、Cat.No. CB-R1234106-50）、  
２）Rectum（直腸、Cat.No. CB-R1234206-50）、
３）Skin（皮膚、Cat.No. CB-R1234218-50）、
４）Uterus Cervix（子宮頸部、Cat.No. CB-R1234275-50）、
５）Lymph Node（リンパ節、Cat.No. CB-R1234161-10）、
６）Ovary（卵巣、Cat.No. CB-R1234183-50）、
７）Stomach（胃、Cat.No. CB-R1234248-50））
これらのｔｏｔａｌ ＲＮＡに対しＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩファーストストランドシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（社））を用いて ４２℃ ５０ｍｉｎ、７０℃  １０ｍｉｎにてｃＤＮＡを作製した。その後、配列番号35,36のプライマーとＫＯＤ ｐｌｕｓ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡（株））を用いたＰＣＲ法 (熱変性９４℃ ３０ｓｅｃ、アニーリング５６℃ ３０秒、伸長反応６８℃ ３０秒×４０サイクル) を行った後、３％アガロースゲルを用い電気泳動を行ない、Ｅｘｏｎ−１７領域を持ったペリオスチンの発現の検討を行った。その結果、検討した全ての癌種（食道癌、肺癌、胸腺癌、膵臓癌、甲状腺癌、胃癌、小腸癌、結腸（大腸）癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、腎臓癌、乳癌、乳管癌、乳腺癌、子宮癌、子宮頚癌、卵巣癌、精巣癌、リンパ腫、副腎癌、前立腺癌、骨肉腫、悪性黒色腫（メラノーマ）、滑膜腫、白血病）で発現していることを確認した（図１５、図１６、図１７、図１８）。一方、それに対応した正常組織において発現を検討した結果、乳腺で僅かな発現を認めたが癌組織と比べると発現が非常に弱かった。また、他の正常組織では殆ど認められなかった（図１９）。以上の結果から、Ｅｘｏｎ−１７領域を持ったペリオスチンは癌組織に特異的に発現していることが示され、その発現量を測定することによって癌の診断が可能であることが示された。ペリオスチンのＥｘｏｎ−１７部位によりコードされるペプチドに対する抗体は、メラノーマ或いは乳癌のみならず上記癌をもターゲットとして良いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
ペリオスチンのＥｘｏｎ−１７によりコードされるペプチド領域に対する抗体を用いることにより、癌の治療、詳しくは原発巣の増殖抑制および転移抑制を行うことができる。また、前記抗体またはＥｘｏｎ−１７領域に特異的なプライマーを用いて患者サンプル中の該ペリオスチン量を測定することにより、癌の有無および病状の進行程度を知ることができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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