(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メソセリン配列番号：３７０に特異的な抗原結合領域を含む、単離されたヒトまたはヒト化抗体あるいはその機能的なフラグメントであって、前記抗体またはその機能的なフラグメントが、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）のごとき別の細胞外抗原により覆われていないメソセリンのエピトープを認識し、メソセリンタンパク質を発現する細胞に内部移行し、抗原結合領域を有する、ここで、該抗原結合領域は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、
ａ）ＨＣＤＲ１は配列番号５であり、
ｂ）ＨＣＤＲ２は配列番号３９であり、
ｃ）ＨＣＤＲ３は配列番号７１であり、
ｄ）ＬＣＤＲ１は配列番号１０３であり、
ｅ）ＬＣＤＲ２は配列番号１３３であり、
ｆ）ＬＣＤＲ３は配列番号１６９である、
抗体またはその機能的なフラグメント。
【請求項２】
配列番号２１２の可変重鎖アミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
配列番号３７２の可変軽鎖アミノ酸配列を含む、請求項１記載の抗体。
【請求項４】
ＩｇＧである、請求項１−３のいずれか記載の抗体。
【請求項５】
ＦａｂまたはｓｃＦｖ抗体フラグメントである、請求項１−３のいずれか記載の抗体の単離された機能的なフラグメント。
【請求項６】
請求項１−５のいずれか記載のヒト抗体またはその機能的なフラグメントの抗原結合領域をコードする単離された核酸。
【請求項７】
請求項１−５のいずれか記載の単離された抗体またはその機能的なフラグメントの可変重鎖および可変軽鎖をコードする核酸。
【請求項８】
請求項７記載のいずれか１つの核酸を含む、ベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、細菌または哺乳動物の細胞である、請求項９記載の単離された細胞。
【請求項１１】
請求項１−５のいずれか記載の抗体または機能的なフラグメント、ならびにその医薬上許容される担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
所望されないメソセリンの存在に関連する疾患または症状を治療するための薬剤の製造のための、請求項１−５のいずれか記載の抗体またはフラグメントの使用。
【請求項１３】
ヒト抗体が合成ヒト抗体である、請求項１−５のいずれか記載のヒト抗体またはフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜アンカー型の４０ｋＤａのメソセリンポリペプチドに特異的であるような抗原結合領域を含む、組み換え抗原結合領域、ならびに抗体および機能的なフラグメントであって、前記メソセリンポリペプチドが、膵臓および卵巣の腫瘍、中皮腫ならびに肺癌細胞のごとき数種類の腫瘍で過剰発現されるものを提供する。従って、これらの抗体は、これらおよびその他の疾患および症状を治療するのに用いることができる。本発明の抗体はまた、診断分野、さらには、癌関連疾患の進行におけるメソセリンの役割を研究するために用いることができる。本発明はまた、前記抗体をコードする核酸配列、これを含むベクター、医薬組成物ならびに使用説明書を添付したキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
抗体に基づく治療は、固形癌を含む様々な癌の治療に極めて有効であることが明らかになってきた。例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標）は乳癌を治療するのによく用いられている。成功した抗体に基づく治療の開発の中心は、腫瘍細胞上で選択的に発現することが見出された細胞表面たんぱく質に対する抗体の単離である。メソセリン前駆ポリペプチドは、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）に固定され、グリコシル化された細胞表面タンパク質であって、このタンパク質は、３０ｋＤａのＮ末端分泌ポリペプチドおよび４０ｋＤａのＣ末端ポリペプチドにタンパク質切断され、これは主に、膜に結合したＧＰＩアンカー型形態で生じ（Chang, K. and I. Pastan, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, (1996) 93(1):136)）、本明細書においてメソセリンと称される。メソセリンは、一定の腫瘍細胞、特に、中皮腫細胞、膵臓腫瘍細胞および卵巣癌細胞にて選択的に発現される一方で、その発現は正常な組織でおいて限定され、腫瘍治療のための理想的な標的とされる（Argani, P. et al., Clin. Cancer Res. (2001) 7(12): 3862; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1):3937)）。メソセリンの機能は知られておらず、生殖、血液学的、または解剖学的な明らかな異常は、メソセリン遺伝子の発現を欠損したマウスにおいて見られなかった（Bera, T.K. and I. Pastan, Mol. Cell. Biol. (2000) 20(8):2902）。
【０００３】
メソセリン発現癌細胞を標的とする抗体に基づく治療は、肺、卵巣および膵臓癌の治療用に提案されている。Ｍａｂ  Ｋ１は、公表された膜結合メソセリンポリペプチドに対する最初の抗体であった（Chang, K., et al., Int. J. Cancer, (1992) 50(3):373）。Ｍａｂ  Ｋ１はマウスを免疫させることにより作成された。当該抗体の低い親和性および内部移行の低下のため、シュードモナス外毒素Ａの化学的に修飾された短縮形態に連結したＭａｂ  Ｋ１からなる免疫毒素は、臨床開発に適切であると考えられた（Hassan, R., et al., J. Immunother. (2000) 23(4):473; Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1): 3937）。その後、ＳＳ１−（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８を含むより高い親和性を有する単鎖抗体が開発された。このＳＳ１−（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８は、インビトロにおける腫瘍細胞の死滅活性（Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res. (2002) 8(11): 3520）ならびにヒトメソセリンを発現する腫瘍のマウスモデルにおける効力（Fan, D., et al., Mol. Cancer Ther. (2002) 1(8): 595）を示した。これらのデータは、複数の癌の免疫治療に適する標的としてのメソセリンを実証する。しかしながら、臨床試験において、ＳＳ１−（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８は、大半の患者に対して２回目の投与を妨げる免疫原性であった。さらに、ＳＳ１−（ｄｓＦｖ）−ＰＥ３８は、最初の血液クリアランスを示すことが示されており、融合タンパク質をペグ化することにより分子量を増加させる試みが報告されている（Filpula, D., et al., Bioconjugate Chem. (2007) 18(3): 773）。
【０００４】
ＭＳ−１、ＭＳ−２およびＭＳ−３は、メソセリン結合抗体であり、それらのヒトＩｇＧ１アイソタイプにより細胞表面において免疫エフェクター活性を誘発し、メソセリン発現細胞に内部移行する（WO2006/099141 A2）。これらの抗体のうちの１つである、抱合されていないＩｇＧ抗メソセリン抗体ＭＯＲ  Ａｂ００９は、現在、膵臓癌の治療における治療効果について臨床試験にてテストされている。
【０００５】
免疫毒素癌治療の臨床結果に関する異種移植片マウス癌モデルの予測値は、それらのマウスホモログによる治療抗体の交差反応の欠如によりしばしば限定され、正常な組織に対する非特異的結合の減少を生じる。一方で、マウスまたはキメラ抗体で治療される患者中で形成される抗マウスＦｖ抗体の中和は、用量制限毒性または治療効果の減少のいずれかを生じうる。それゆえ、癌治療において特異的メソセリン発現の効力を十分に利用するために、親和性の増加および解離速度の減少の利点を、完全なヒト可変鎖形およびマウス交差反応を組み合わせる標的抗体が必要とされる。
【０００６】
新規な抗体のさらなる必須の特徴は、細胞表面においてメソセリンを発現する異なる癌細胞株に対する不変的な親和性である。メソセリンは、翻訳後タンパク質消化ならびに複数の部位にグリコシル化を受ける、高度に可変的なタンパク質である（Hassan, R., et al., Clin. Cancer Res. (2004) 10(12 Pt 1): 3937）。可変性は、３つの異なるスプライスバリアントが検出されたことから、転写レベルにまで及ぶが、転写バリアント１（ＮＭ＿００５８２３）は、これまでテストされた腫瘍細胞株において提示される大半の種を示すようである（Muminova, Z.E., et al., BMC Cancer (2004) 4:19; Hellstrom, I., et al., Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. (2006) 15(5):1014）。それゆえ、有効な抗メソセリン抗体は、異なる形態のメソセリンの発現を生じるグリコシル化パターンの変化を含むが、これだけに限定されない個体間の相違とは無関係に異なる患者由来の腫瘍細胞により不変的に提示されるエピトープに結合しなくてはならない。
【０００７】
高い不変的な親和性を有するメソセリンに結合し、効率的に内部移行し、好ましくは、別の種に由来するメソセリンに交差反応する、抗体、その抗原結合抗体フラグメント、またはそのバリアントが本明細書で提供される。治療活性剤の癌細胞への送達を容易にする抗体、その抗原結合抗体フラグメント、またはそのバリアントを用いる、癌、特に、メソセリン発現腫瘍、例えば、膵臓、卵巣、または肺癌に対する抗体に基づく治療もまた提供される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、４０ｋＤａのメソセリン前駆ポリペプチドのＣ末端細胞外部分に高い選択性を有し、膵臓、卵巣、および肺癌のごとき疾病状態に関連するメソセリン発現の検出方法、およびかかる疾病状態の治療に用いることができる、ヒトおよびヒト化抗体、またはその抗原結合抗体フラグメント、またはそのバリアントを提供することである。これらのために、本発明の目的は、メソセリンポリペプチドに存在するエピトープ（配列番号：３７０）に特異的に結合する、単離されたヒト抗体、またはその抗原結合抗体フラグメントであって、該エピトープが、メソセリンを発現する癌細胞株により不変的に提示され、同程度の親和性を有するこれらの抗体により結合されるものである、単離されたヒト抗体またはその抗原結合抗体フラグメントを提供することである。本明細書で用いられるように、エピトープの「不変的な提示」なる用語は、メソセリンの異なる形態を発現するメソセリン発現腫瘍細胞株の広い範囲における特定の抗体により認識されるエピトープの存在をいう。本明細書で用いられるように、メソセリンの異なる「形態」は、異なる糖型、異なるイソ型または異なる翻訳および翻訳後修飾を受けたメソセリンポリペプチドを含むが、これらに限定されない。本明細書で用いられるように、用語「同程度の親和性」は、異なる形態のメソセリンを発現する細胞に結合する抗体のＦＡＣＳデータのスキャッチャード解析により得られた半最大抗体能力（ＥＣ５０）値をいい、その値は、ファクター（ｆａｃｔｏｒ）１０、または、好ましくは、ファクター５、または、さらに好ましくは、ファクター２より大きく異ならない。
【０００９】
本発明の別の目的は、ヒト投与に安全である抗体、またはその抗原結合抗体フラグメント、またはそのバリアントを提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ヒトメソセリンに結合し、別の種のメソセリンに交差反応する、抗体、またはその抗原結合抗体フラグメント、あるいはそのバリアントを提供することである。好ましくは、前記別の種は、例えば、マウスまたはラットのごとき齧歯類である。最も好ましくは、抗体、またはその抗原結合抗体フラグメント、あるいはそのバリアントは、ヒトメソセリンに結合し、マウスメソセリンに交差反応する。
【００１１】
本発明の別の目的は、同程度の親和性を有する異なるメソセリン発現細胞株に不変的に結合する抗体、その抗原結合抗体フラグメント、またはそのバリアントを提供することである。本発明で用いられるように、特定のタンパク質のメソセリンへの「不変的な結合」なる用語は、異なる形態のメソセリンを発現する広範囲のメソセリン発現癌細胞株でメソセリンに結合するその能力をいう。不変的な結合は、抗体、またはその抗原結合抗体フラグメント、あるいはそのバリアントが、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）のごとき別の細胞外抗原により覆われていないメソセリンのエピトープを認識し、メソセリンと相互作用するという事実により引き起こされうるが、これだけに限定されるものではない。
【００１２】
本発明の別の目的は、本発明の１つまたはそれ以上の抗体またはそのバリアントを用いることにより、異なるメソセリン発現癌細胞または腫瘍細胞に結合し、メソセリン発現癌細胞に対して免疫エフェクター活性（例えば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ）を誘発する抗体またはそのバリアントを提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、メソセリン発現細胞への結合後に内部移行される抗体、またはその抗原結合抗体フラグメントを提供することである。本発明の目的は、本発明の１つまたはそれ以上の抗体、またはその抗原結合抗体フラグメント、あるいはそのバリアントを用いることにより、細胞性薬剤または薬剤放出酵素をメソセリン発現癌細胞に送達することにより疾患を治療する方法を提供することである。
【００１４】
本発明の別の目的は、メソセリン発現が正常の組織と比較して上昇している悪性腫瘍または疾患状態の診断のための道具を構成する抗体を提供することである。検出可能なマーカーに抱合された抗メソセリン抗体が提供される。好ましいマーカーは、放射性酵素、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）または蛍光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）である。
【００１５】
本発明はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、本発明の抗体を発現する細胞、本発明の抗体を産生するための方法、抗体を用いて異形成細胞の増殖を阻害するための方法、ならびに前記抗体を用いて癌を治療および検出するための方法に関する。
【００１６】
本発明は、ａ）メソセリンに不変的に結合し、ｂ）マウスメソセリンに交差反応し、ｃ）より低い親和性でメソセリンに結合し、ｄ）メソセリン発現細胞に効率的に内部移行し、およびｅ）ヒト可変領域を含む点において、Ｍａｂ  Ｋ１、ＳＳ１、ＭＳ−１、ＭＳ−２およびＭＳ−３とは区別される抗体を提供する。
【００１７】
本発明のこれらおよびその他の目的は、本明細書により詳細に記載されている。
【００１８】
１の態様において、本発明は、４０ｋＤａメソセリンポリペプチドのエピトープに特異的である抗原結合領域を含む、単離された抗体または機能的な抗体フラグメントを提供する。
【００１９】
かかる抗体またはその機能的なフラグメントは、配列番号：６７〜９８に記載されるＨ−ＣＤＲ３領域を含む抗原結合領域を含んでもよく；抗原結合領域は、さらに、配列番号：３１〜６６に記載されるＨ−ＣＤＲ２領域を含んでもよく；ならびに抗原結合領域はまた、配列番号：１〜３０に記載されるＨ−ＣＤＲ１領域を含んでもよい。本発明のかかるメソセリン−特異的抗体は、配列番号：１６０〜１９７に記載されるＬ−ＣＤＲ３領域を含む抗原結合領域を含んでもよく；抗原結合領域は、さらに、配列番号：９９〜１２８に記載されるＬ−ＣＤＲ１領域を含んでもよく；ならびに抗原結合領域はまた、配列番号：１２９〜１５９に記載されるＬ−ＣＤＲ２領域を含んでもよい。
【００２０】
本明細書で開示される配列のペプチドバリアントはまた、本発明に包含される。それゆえ、本発明は、配列番号：１〜１９７に記載されるＣＤＲ領域を有するＣＤＲ領域において少なくとも６０％配列同一性；および／または配列番号：１〜１９７に記載されるＣＤＲ領域を有するＣＤＲ領域において少なくとも８０％配列相同性を有する重鎖アミノ酸配列を有する抗メソセリン抗体を含む。さらに、配列番号：１〜１９７に記載されるＣＤＲ領域を有するＣＤＲ領域において少なくとも６０％配列同一性；および／または配列番号：１〜１９７に記載されるＣＤＲ領域を有するＣＤＲ領域において少なくとも８０％配列相同性を有する軽鎖アミノ酸配列を有する抗メソセリン抗体を含む。
【００２１】
本発明の抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）であってもよく、一方で抗体フラグメントは、例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖであってもよい。それゆえ、本発明の抗体フラグメントは、本明細書に記載されるごとく、１つまたはそれ以上の方法で作用する抗原結合領域であってもよく、あるいは含んでいてもよい。
【００２２】
本発明はまた、単離された核酸配列に関するものであって、その各々は、メソセリンのエピトープに特異的であるヒト抗体またはその機能的なフラグメントの抗原結合領域をコードすることができる。かかる核酸配列は、抗体の可変重鎖をコードし、配列番号：２８４〜３２６からなる群から選択される配列：または配列番号：２８４〜３２６の相補鎖に対して高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含んでいてもよい。核酸は、単離された抗体またはその機能的なフラグメントの可変軽鎖をコードしてもよく、配列番号：３２７〜３６９からなる群から選択される配列、または配列番号：３２７〜３６９の相補鎖に対して高いストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含んでもよい。
【００２３】
本発明の核酸は、組み換え産生に適する。それゆえ、本発明はまた、本発明の核酸配列を含むベクターおよび宿主細胞に関する。
【００２４】
本発明の組成物は、治療または予防の適用に用いられてもよい。それゆえ、本発明は、本発明の抗体（または機能的な抗体フラグメント）およびその医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を含む。関連する態様において、本発明は、メソセリン発現細胞の望ましくない存在に関連する疾患または状態を治療するための方法を提供する。かかる方法は、それを必要とする患者に、本明細書に記載されるか、または包含されるごとく本発明の抗体を含む医薬組成物の有効量を投与する工程を含む。
【００２５】
本発明はまた、メソセリンに特異的および不変的に結合する抗体ライブラリーの１つまたはそれ以上のメンバーを単離するために抗体ライブラリーを使用するための説明書を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、Ｂｉａｃｏｒｅペアワイズ結合解析によりグループ化された抗メソセリン抗体エピトープを示す。抗体ペアの競合結合を、１つの抗体をセンサーチップに固定化し、可溶性メソセリンをこの抗体に結合し、次いで、すぐに二次抗体をメソセリンに結合させることにより調べた。メソセリンにおける同一または重複するエピトープを認識する抗体のペアは同時に結合することができない。抗体ペアの全ての組み合わせをテストした。ＭＦ−Ｔに関する代表的なデータを（Ａ）に示す。図Ｂは、７つの抗−メソセリン抗体のエピトープの相対的な位置を表し、その競合を円の重複により表す。
【図２】図２は、本発明の抗体により認識されるメソセリンの異なる形態を示す。１および２：ＯＶＣＡＲ−３細胞抽出物においてメソセリンに結合するＭＦ−Ｊ；３および４：ＣＨＯ−Ａ９細胞抽出物においてメソセリンに結合するＭＦ−Ｊ；５：ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞抽出物においてメソセリンに結合するＭＦ−Ｊ；６：組み換え体、脱グリコシル化メソセリンに結合するＭＦ−Ｊ；７：ＯＶＣＡＲ−３細胞抽出物に結合するＭＯＲ０６６３５；ならびに８：ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞抽出物に結合するＭＯＲ０６６３５を示す。
【図３】図３は、ＭＯＲ０６６４０およびＭＦ−Ｔを含むメソセリン抗体の一部に結合され、一方で、ＭＦ−２２６のごとき他の抗体がメソセリン結合に対してＣＡ１２５と競合する場合に、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）がメソセリンに結合することを示す。データを、ＳＥＣＴＯＲ  Ｌｉｇｈｔ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）により検出される相対発光量（ＲＬＵ）で示す。プレートを、表示したメソセリン抗体でコートした。メソセリンを、表示した漸減する濃度で添加した。次いで、ＣＡ１２５を一定濃度で結合させた。マウス抗−ＣＡ１２５抗体およびＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏタグ標識抗マウスＦＡＢ抗体で検出を行った。
【図４】図４は、メソセリンを発現するＣＨＯ−Ａ９細胞における１２５Ｉ−抗−メソセリン抗体の内部移行に関するデータを供する。安定化二次抗体の非存在（Ａ）および存在（Ｂ）下における市販の陽性コントロールＫＩを含む７つの抗−メソセリンｍａｂの相対的な内部移行を示す。ＭＦ−２２６と二次抗体を用いた代表的なデータは、０℃の非許容温度（Ｄ）と比較して、３７℃で一晩（Ｃ）において解離された表面結合および内部移行した抗体の相対量を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、メソセリンに対して特異的または高い親和性を有する新規な抗体の知見に基づき、患者に治療効果をもたらしうる。本発明の抗体は、ヒトまたはヒト化であってもよく、本明細書でさらに十分に記載される多くの場面で用いることができる。
【００２８】
定義
「ヒト」抗体または機能的なヒト抗体フラグメントは、本明細書において、キメラでなく（例えば、「ヒト化」でなく）、非ヒト種（全体または一部のいずれ）に由来しないものとされる。ヒト抗体または機能的な抗体フラグメントは、ヒトに由来しうるか、または合成ヒト抗体でありうる。「合成ヒト抗体」は、本明細書において、公知のヒト抗体配列の解析に基づく合成配列に由来し、全体または一部にｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生じる配列を有する抗体と定義される。ヒト抗体配列またはそのフラグメントのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計は、例えば、ヒト抗体または抗体フラグメント配列のデータベースを解析し、そこから得られるデータを利用してポリペプチド配列を考案することにより行うことができる。ヒト抗体または機能的な抗体フラグメントの別の例は、ヒト起源の抗体配列のライブラリー（すなわち、ヒトの天然供給源から取得された抗体に基づくような抗体）から単離された核酸によりコードされるものである。ヒト抗体の例は、Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57および米国特許第6,300,064号に記載されるごときＨｕＣＡＬ抗体を含む。
【００２９】
「ヒト化抗体」または機能的なヒト化抗体フラグメントは、本明細書において、（ｉ）抗体がヒト生殖系列の配列に基づく、非ヒト供給源（例えば、異種免疫系を生じるトランスジェニックマウス）、（ｉｉ）可変ドメインが非ヒト起源であり、定常ドメインがヒト起源であるキメラ、あるいは（ｉｉｉ）可変ドメインのＣＤＲが非ヒト起源であり、可変ドメインの１つまたはそれ以上のフレームワークがヒト起源であり、（もしあれば）定常ドメインがヒト起源である、ＣＤＲ移植片に由来するものとされる。
【００３０】
本明細書で用いられるように、「特異的に結合する」抗体は、かかる抗体が抗原および１つまたはそれ以上の対照の抗原を区別できる場合、抗原（本明細書では、メソセリン）「に特異的である」または「を特異的に認識する」ことができる。なぜなら、結合特異性は、絶対的ではなく、相対的なものだからである。その最も一般的な形態（であって、定義された対照が言及されていない場合）において、「特異的な結合」は、例えば、以下の方法のうちの１つにより調べられるように、目的の抗原および関連しない抗原間を区別する抗体の能力を意味する。かかる方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ−テストおよびペプチドスキャンを含むが、これらだけに限定されない。例えば、一般的なＥＬＩＳＡアッセイが行われうる。一般的な発色（例えば、セイヨウワサビペルオキシドによる二次抗体および過酸化水素によるテトラメチルベンジジン）により評価が行われてもよい。あるウェルにおける反応は、例えば、４５０ｎｍにおける吸光度により評価される。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は、０．１ＯＤであってもよく；典型的な陽性反応は、１ＯＤであってもよい。このことは、陽性／陰性の相違が１０倍より大きいものでありうることを意味する。典型的に、結合特異性の実験は、単一の対照抗原ではなく、粉乳、ＢＳＡ、トランスフェリンまたはこれらの類似物質などの約３から５つの関連しない抗原の一組を用いて行われる。
【００３１】
しかしながら、「特異的な結合」はまた、標的抗原と、対照として用いられる１つまたはそれ以上の極めて関連した抗原間を区別する抗体の能力を意味してもよい。加えて、「特異的結合」は、その標的抗原の異なる部分、例えば、メソセリンのＮ末端またはＣ末端領域におけるエピトープのごときメソセリンの異なるドメインまたは領域間、あるいはメソセリンの１つまたはそれ以上の主要なアミノ酸残基またはアミノ酸残基のストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）間を区別する抗体の能力に関連していてもよい。
【００３２】
また、本明細書に用いられるように、「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書において、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤ（またはそのいずれかのサブクラス）に属するタンパク質とされ、全ての慣用的で公知の抗体およびその機能的なフラグメントを含む。本明細書において、抗体／免疫グロブリンの「機能的なフラグメント」または「抗原結合抗体フラグメント」は、抗原結合領域を保有する抗体／免疫グロブリンのフラグメント（例えば、ＩｇＧの可変領域）とされる。抗体の「抗原結合領域」は、典型的に、抗体の１つまたはそれ以上の超可変領域、すなわち、ＣＤＲ−１、−２
、および／または−３領域で見出される；しかしながら、可変的な「フレームワーク」領域はまた、ＣＤＲに対する骨格を供することなどにより抗原結合において重要な役割を果たしうる。好ましくは、「抗原結合領域」は、可変軽鎖（ＶＬ）の少なくともアミノ酸残基４個から１０３個および可変重鎖（ＶＨ）の５個から１０９個を含み、より好ましくはＶＬのアミノ酸残基３個から１０７個およびＶＨの４個から１１１個、特に好ましくは、完全なＶＬおよびＶＨ鎖（ＶＬのアミノ酸位置１から１０９およびＶＨの１から１１３；ＷＯ９７／０８３２０による番号付け）である。本発明の使用のための免疫グロブリンの好ましいクラスは、ＩｇＧである。本発明の「機能的なフラグメント」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；二特異性抗体；直鎖抗体（ｌｉｎｅａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）；単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）；および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体（C. A. K Borrebaeck, editor (1995) Antibody Engineering (Breakthroughs in Molecular Biology), Oxford University Press; R. Kontermann & S. Duebel, editors (2001) Antibody Engineering (Springer Laboratory Manual), Springer Verlag）を含む。「二特異性」または「二機能性」抗体以外の抗体は、各々同一の結合部位を有すると認識されている。Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１およびＣＬドメイン間に生じる分子間ジスルフィド相互作用を最小化または完全に除去するように改変されてもよい。
【００３３】
本発明の抗体は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで設計され、合成で作成される核酸によりコードされたアミノ酸配列に基づく組み換え抗体ライブラリーに由来してもよい。抗体配列のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ設計は、例えば、ヒト配列のデータベースを解析し、そこから得られたデータを利用してポリペプチド配列を考案することにより行われる。ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで作成される配列を設計し、取得するための方法は、例えば、Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57；Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67；および出典明示により本願発明に取り込まれるKnappikらの米国特許第6,300,064号に記載される。
【００３４】
本明細書で用いられるように、抗体、例えば、メソセリンの異なる「形態」は、本明細書において、一次メソセリン転写物のスプライシングにおける相違、グリコシル化の相違、および翻訳後タンパク質分解切断の相違などであるが、これらだけに限られない異なる翻訳および翻訳後修飾を生じる異なるタンパク質分子とされる。
【００３５】
本明細書で用いられるように、特定の抗体のメソセリンに対する用語「不変的結合」は、メソセリンの異なる形態を発現する広範囲のメソセリン発現癌細胞株においてメソセリンに結合する能力を意味する。不変的に結合する抗体においては、２つの異なる癌細胞株におけるＦＡＣＳ測定により決定されたＥＣ５０値は、１０倍、または好ましくは、５倍、最も好ましくは、１から３倍の間より大きく相違しえない。
【００３６】
本明細書で用いられるように、用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができるいずれのタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖のごとき分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特異的な三次元構造特性、ならびに特異的な荷電特性を有する。ある１つの抗体が、当業者に周知な方法のいずれかによる競合結合アッセイにおいて第２の抗体と競合することが示される場合、２つの抗体は「同一エピトープに結合する」とされる。
【００３７】
本発明の抗体
本発明は、抗メソセリン抗体を提供することにより、メソセリン陽性癌細胞の増殖および腫瘍性疾患の進行を抑制する方法に関する。ヒトモノクローナル抗体、その抗原結合抗体フラグメント、ならびに抗体およびフラグメントのバリアントであって、本明細書で「メソセリン」と呼ばれる、メソセリン前駆ポリペプチドの４０ｋＤａのＣ末端ドメイン（配列番号：３７０）に特異的に結合するものが提供される。
【００３８】
本発明の抗体、抗原結合抗体フラグメント、ならびに抗体およびフラグメントのバリアントは、軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる。本発明に含まれる抗体または抗原結合抗体フラグメントのバリアントは、メソセリンに対する抗体または抗原結合抗体フラグメントの結合活性が維持される分子である。
【００３９】
本明細書を通して、本発明の以下の代表的な抗体が参照される：「ＭＦ−Ｊ」、「ＭＯＲ０７２６５」、「ＭＯＲ０６６３１」、「ＭＯＲ０６６３５」、「ＭＯＲ０６６６９」、「ＭＯＲ０７１１１」、「ＭＯＲ０６６４０」、「ＭＯＲ０６６４２」、「ＭＯＲ０６６４３」、「ＭＦ−２２６」、「ＭＯＲ０６６２６」、「ＭＯＲ０６６３８」、「ＭＦ−Ａ」、「ＭＯＲ０６６５７」、「ＭＦ−Ｔ」、「ＭＦ１」、「ＭＦ−５」、「ＭＦ−８」、「ＭＦ−２４」、「ＭＦ−２５」、「ＭＦ−２７」、「ＭＦ−７３」、「ＭＦ−７８」、「ＭＦ−８４」、「ＭＦ−１０１」、「ＭＦ−２３０」、「ＭＦ−２３６」、「ＭＦ−２５２」、「ＭＦ−２５７」、「ＭＦ−４２３」、「ＭＦ−４２７」、「ＭＦ−４２８」、ＭＦ−Ｃ」、「ＭＦ−Ｉ」、「ＭＦ−Ｌ」、「ＭＦ−Ｍ」、「ＭＦ−Ｐ」、「ＭＦ−Ｑ」、「ＭＦ−Ｓ」、「ＭＦ−Ｖ」、「ＭＦ−Ｗ」、および「ＭＦ−Ｙ」。ＭＦ−Ｊは、配列番号：２８４（ＤＮＡ）／配列番号：１９８（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３２７（ＤＮＡ）／配列番号：２４１（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０７２６５は、配列番号：２８５（ＤＮＡ）／配列番号：１９９（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３２８（ＤＮＡ）／配列番号：２４２（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０６６３１は、配列番号：２８６（ＤＮＡ）／配列番号：２００（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３２９（ＤＮＡ）／配列番号：２４３（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０６６６９は、配列番号：２８７（ＤＮＡ）／配列番号：２０１（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３３０（ＤＮＡ）／配列番号：２４４（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０７１１１は、配列番号：２８８（ＤＮＡ）／配列番号：２０２（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３３１（ＤＮＡ）／配列番号：２４５（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０６６４０は、配列番号：２８９（ＤＮＡ）／配列番号：２０３（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３３２（ＤＮＡ）／配列番号：２４６（タンパク質）可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０６６４２は、配列番号：２９０（ＤＮＡ）／配列番号：２０４（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３３３（ＤＮＡ）／配列番号：２４７（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０６６４３は、配列番号：２９１（ＤＮＡ）／配列番号：２０５（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３３４（ＤＮＡ）／配列番号：２４８（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−２２６は、配列番号：２９２（ＤＮＡ）／配列番号：２０６（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３３５（ＤＮＡ）／配列番号：２４９（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０６６２６は、配列番号：２９３（ＤＮＡ）／配列番号：２０７（タンパク質）に相当する可変重鎖領域お��び配列番号：３３６（ＤＮＡ）／配列番号：：２５０（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０６６３５は、配列番号：２９４（ＤＮＡ）／配列番号：２０８（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３３７（ＤＮＡ）／配列番号：２５１（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０６６３８は、配列番号：２９５（ＤＮＡ）／配列番号：２０９（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３３８（ＤＮＡ）／配列番号：２５２（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ａは、配列番号：２９６（ＤＮＡ）／配列番号：２１０（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３３９（ＤＮＡ）／配列番号：２５３（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＯＲ  ０６６５７は、配列番号：２９７（ＤＮＡ）／配列番号：２１１（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４０（ＤＮＡ）／配列番号：２５４（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｔは、配列番号：２９８（ＤＮＡ）／配列番号：２１２（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４１（ＤＮＡ）／配列番号：２５５（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｌは、配列番号：２９９（ＤＮＡ）／配列番号：２１３（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４２（ＤＮＡ）／配列番号：２５６（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−１は、配列番号：３００（ＤＮＡ）／配列番号：：２１４（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４３（ＤＮＡ）／配列番号：２５７（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−５は、配列番号：３０１（ＤＮＡ）／配列番号：２１５（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４４（ＤＮＡ）／配列番号：２５８（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−８は、配列番号：３０２（ＤＮＡ）／配列番号：２１６（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４５（ＤＮＡ）／配列番号：２５９（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−２４は、配列番号：３０３（ＤＮＡ）／配列番号：２１７（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４６（ＤＮＡ）／配列番号：２６０（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−２５は、配列番号：３０４（ＤＮＡ）／配列番号：２１８（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４７（ＤＮＡ）／配列番号：２６１（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−２７は、配列番号：３０５（ＤＮＡ）／配列番号：２１９（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４８（ＤＮＡ）／配列番号：２６２（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−７３は、配列番号：３０６（ＤＮＡ）／配列番号：２２０（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３４９（ＤＮＡ）／配列番号：２６３（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−７８は��配列番号：３０７（ＤＮＡ）／配列番号：２２１（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５０（ＤＮＡ）／配列番号：２６４（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−８４は、配列番号：３０８（ＤＮＡ）／配列番号：２２２（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５１（ＤＮＡ）／配列番号：２６５（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−１０１は、配列番号：３０９（ＤＮＡ）／配列番号：２２３（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５２（ＤＮＡ）／配列番号：２６６（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−２３０は、配列番号：３１０（ＤＮＡ）／配列番号：２２４（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５３（ＤＮＡ）／配列番号：２６７（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−２３６は、配列番号：３１１（ＤＮＡ）／配列番号：２２５（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５４（ＤＮＡ）／配列番号：２６８（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−２５２は、配列番号：３１２（ＤＮＡ）／配列番号：２２６（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５５（ＤＮＡ）／配列番号：２６９（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−２７５は、配列番号：３１３（ＤＮＡ）／配列番号：２２７（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５６（ＤＮＡ）／配列番号：２７０（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−４２３は、配列番号：３１４（ＤＮＡ）／配列番号：２２８（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５７（ＤＮＡ）／配列番号：２７１（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−４２７は、配列番号：３１５（ＤＮＡ）／配列番号：２２９（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５８（ＤＮＡ）／配列番号：２７２（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−４２８は、配列番号：３１６（ＤＮＡ）／配列番号：２３０（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３５９（ＤＮＡ）／配列番号：２７３（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｃは、配列番号：３１７（ＤＮＡ）／配列番号：２３１（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６０（ＤＮＡ）／配列番号：２７４（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｉは、配列番号：３１８（ＤＮＡ）／配列番号：２３２（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６１（ＤＮＡ）／配列番号：２７５（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｍは、配列番号：３１９（ＤＮＡ）／配列番号：２３３（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６２（ＤＮＡ）／配列番号：２７６（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｐは、配列番号：３２０（ＤＮＡ）／配列番号：２３４（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６３（ＤＮＡ）／配列番��：２７７（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｑは、配列番号：３２１（ＤＮＡ）／配列番号：２３５（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６４（ＤＮＡ）／配列番号：２７８（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｓは、配列番号：３２２（ＤＮＡ）／配列番号：：２３６（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６５（ＤＮＡ）／配列番号：２７９（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｕは、配列番号：３２３（ＤＮＡ）／配列番号：２３７（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６６（ＤＮＡ）／配列番号：２８０（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｖは、配列番号：３２４（ＤＮＡ）／配列番号：２３８（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６７（ＤＮＡ）／配列番号：２８１（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｗは、配列番号：３２５（ＤＮＡ）／配列番号：２３９（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６８（ＤＮＡ）／配列番号：２８２（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。ＭＦ−Ｙは、配列番号：３２６（ＤＮＡ）／配列番号：２４０（タンパク質）に相当する可変重鎖領域および配列番号：３６９（ＤＮＡ）／配列番号：２８３（タンパク質）に相当する可変軽鎖領域を有する抗体を示す。
【００４０】
１の態様において、本発明は、メソセリンのエピトープに結合する抗体であって、該エピトープのアミノ酸配列が、配列番号：３７０により示され、Ｍａｂ  Ｋ１により認識されるメソセリンエピトープとは区別されるものである抗体を提供する。
【００４１】
別の態様において、本発明は、抗体ＭＦ−ＪまたはＭＦ−Ｔのエピトープの１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する抗体を提供する。特定の態様において、前記抗体は、抗体ＭＦ−ＪまたはＭＦ−Ｔのエピトープのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたは少なくとも６つのアミノ酸に結合する。特定の態様において、本発明の抗体は、抗体ＭＦ−Ｊにより認識されるエピトープの１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する。別の態様において、本発明の抗体は、抗体ＭＦ−Ｔにより認識されるエピトープの１つまたはそれ以上のアミノ酸に結合する。
【００４２】
別の態様において、本発明は、メソセリンの１つまたはそれ以上の領域であって、その領域のアミノ酸配列が、配列番号：３７０により示されるものに特異的に結合できるか、また当該領域に対して高い親和性を有する抗原結合領域を有する抗体を提供する。抗体は、親和性測定が少なくとも１００ｎＭ（Ｆａｂフラグメントの一価親和性）である場合、抗原に対して「高い親和性」を有するとされる。本発明の抗体または抗原結合領域は、好ましくは、約１００ｎＭより少ない、より好ましくは、約６０ｎＭより少ない、さらにより好ましくは、約３０ｎＭより少ない親和性を示してメソセリンに結合することができる。さらに好ましくは、約１０ｎＭより少ない、より好ましくは約３ｎＭより少ない親和性を示してメソセリンに結合する抗体である。例えば、メソセリンに対する本発明の抗体の親和性は、約１０．０ｎＭまたは０．１９ｎＭ（Ｆａｂフラグメントの一価親和性）であってもよい。
【００４３】
表１は、直接固定化されたメソセリンにおいて表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）により測定されるごとく、本発明の代表的な抗体の解離定数および解離速度の概要を供する。
【００４４】
表１：表面プラズモン共鳴により抗メソセリンＦａｂにおいて測定されたメソセリンに対する一価解離定数および解離速度
【００４５】
【表１】
0005608091.tif 000002
【００４６】
ＩｇＧ１型を、細胞に基づく親和性測定に用い、スキャッチャード解析と組み合わせた蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）、および生存細胞を酵素結合免疫測定法により調べた。
【００４７】
表２は、メソセリン発現ＣＨＯ−Ａ９細胞における代表的なＩｇＧ抗体の結合強度を表す。
【００４８】
表２：メソセリン発現ＣＨＯ−Ａ９細胞において細胞ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳにより調べられるごとく、抗メソセリン抗体の細胞に基づく結合能
【００４９】
【表２】
0005608091.tif 000003
【００５０】
抗体の作成
合成抗体ファージディスプレイライブラリー（Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. (2000) 296(1): 57）を、全細胞およびタンパク質のパニングの組み合わせにより、特異的な道具の開発を通して、高い親和性のメソセリン特異的なヒトモノクローナル抗体を単離するのに用いた。これらの道具および方法は、メソセリン発現組み換え細胞株、ならびに細胞表面において提示されるメソセリンに結合し、他の種に由来するメソセリンに交差反応する抗体を同定できるパニング方法、ならびにスクリーニングアッセイの開発を含む。
【００５１】
中皮癌細胞表面マーカー、メソセリンに対する抗体を、３つのファージディスプレイ技術（ＰＤＴ）において３つの今までにないアプローチの組み合わせにより見出した。第一に、メソセリンの膜結合の４０ｋＤａドメインを発現する組み換え細胞株を、タンパク質のＧＰＩ−アンカー型Ｃ末端部分（配列番号：３７１）をコードするプラスミドを用いるＣＨＯ−ＫＩ細胞の安定なトランスフェクションにより構築し、ＣＨＯ−Ａ９細胞株を得た。第二に、後の組み換え細胞株および扁平上皮癌細胞株を用いて二重交代性細胞表面選択（ｄｕａｌ−ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を行った。親細胞のエピトープに結合するＦａｂフラグメントの選択を回避するために、ＣＨＯ−ＫＩ細胞による前吸着を含ませた。組み換え体の可溶性精製ヒトメソセリン（「ＭＦ−２４」、「ＭＦ−２５」、および「ＭＦ−２７」のユニークな供給源）、組み換えマウスメソセリン、精製された脱グリコシル化メソセリン（「ＭＦ−５」および「ＭＦ−８」のユニークな供給源）、および可溶性相におけるビオチン化メソセリンを用いてさらなる選択を行った。第三に、全ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞ならびにＣＨＯ−Ａ９細胞におけるパニングにおいて得られたファージ産出の連続的なスクリーニングを可能にするスクリーニング方法を開発した。これらの特異的な方法の組み合わせは、ユニークな抗体「ＭＦ−Ｊ」、「ＭＦ−２２６」、「ＭＦ−Ａ」、「ＭＦ−Ｔ」、「ＭＦ−１」、「ＭＦ−５」、「ＭＦ−８」、「ＭＦ−２４」、「ＭＦ−２５」、「ＭＦ−２７」、「ＭＦ−７３」、「ＭＦ−７８」、「ＭＦ−８４」、「ＭＦ−１０１」、「ＭＦ−２３０」、「ＭＦ−２３６」、「ＭＦ−２５２」、「ＭＦ−２７５」、「ＭＦ−４２３」、「ＭＦ−４２７」、「ＭＦ−４２８」、「ＭＦ−Ｃ」、「ＭＦ−Ｉ」、「ＭＦ−Ｌ」、「ＭＦ−Ｍ」、「ＭＦ−Ｐ」、「ＭＦ−Ｑ」、「ＭＦ−Ｓ」、「ＭＦ−Ｕ」、「ＭＦ−Ｖ」、「ＭＦ−Ｗ」、および「ＭＦ−Ｙ」の単離を可能にした。
【００５２】
これらのユニークな抗体を、さらに、二細胞に基づくＥＬＩＳＡにおけるそれらの結合親和性により、可溶性メソセリンに結合するＢＩＡｃｏｒｅにより、可溶性メソセリンにおいて異なるエピトープを認識するそれらの能力により、ならびにＦＡＣＳおよび免疫ブロッティングにより測定されるマウスメソセリンと交差反応する能力、および３つの異なる細胞に基づくアッセイにおいて内部移行されるそれらの能力により特徴付けた。内部移行アッセイのうちの２つは、ヒトＩｇＧに対する二次抗体の非存在または存在下のいずれにおいて放射性標識された抗メソセリン抗体の内部移行を定量的に測定した。このデータを、さらなる親和性成熟に関する４つの抗体を選択するのに用いた。
【００５３】
異なる癌細胞株上にディスプレイされるメソセリンの異なる形態に強く不変的な結合を有する抗体を得、種の交差反応性を増加させ、さらに親和性を増加させ、解離速度を減少させるために、親和性成熟のための計画を設計した。親和性成熟を、抗体「ＭＦ−Ｊ」、「ＭＦ−２２６」、「ＭＦ−Ｌ」および「ＭＦ−Ａ」において行った。親和性成熟は、親抗体のＨ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３、またはＨ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３両方の組み合わせの交換による新しい抗体レパートリーの作成を含んだ。別の選択を、磁性ビーズを用いて、溶液中で２つのメソセリン発現癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２６およびＯＶＣＡＲ−３、ならびに組み換え精製およびビオチン化ヒトおよびマウスメソセリンにて行った。ストリンジェンシーの上昇を、抗原の段階的減少および洗浄工程の延長により得た。
【００５４】
まず、Ｍ−３８４  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＢｉｏＶｅｒｉｓ）にて電気化学発光シグナルを測定することにより溶液中の抗原でコートされたビーズにて調べるごとく、親和性を減少させることによりヒットしたものをランク付けすることによりスクリーニングを行った。次に、高い親和性結合物として生じた選択物を、溶解平衡滴定（ＳＥＴ）にかけた（Haenel, C., et al., Anal. Biochem. (2005) 339(1): 182）。さらに、最良の結合物を、マウスメソセリンに対する交差反応の解析、ならびにＦＡＣＳによるＮＣＩ−Ｈ２２６細胞におけるメソセリンへの結合についての解析によりスクリーニングにかけた。これらの特定の方法の組み合わせは、ユニークな抗体「ＭＯＲ０７２６５」、「ＭＯＲ０６６３１」、「ＭＯＲ０６６３５」、「ＭＯＲ０６６６９」、「ＭＯＲ０７１１１」、「ＭＯＲ０６６４０」、「ＭＯＲ０６６４２」、「ＭＯＲ０６６４３」、「ＭＯＲ０６６２６」、「ＭＯＲ０６６３８」および「ＭＯＲ０６６５７」の単離を可能にした。
【００５５】
ペプチドバリアント
本発明の抗体は、本明細書で供される特異的なペプチド配列に限られない。むしろ、本発明はまた、これらのペプチドのバリアントを具体化するものである。即時開示および従来利用可能な技術および文献を参照にして、当業者は、本明細書で開示される抗体の機能的なバリアントを調製、試験および利用することができる一方で、メソセリンに結合する能力を有するバリアントが本発明の範囲に入ることを評価することができるであろう。
【００５６】
バリアントは、例えば、本発明で開示されるペプチド配列に対して少なくとも１つの変化した相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変）および／またはフレームワーク（ＦＲ）（可変）ドメイン／位置を有する抗体を含みうる。この概念をより例示するための抗体の構造の簡単な説明が以下である。
【００５７】
抗体は、２つのペプチド鎖からなり、ぞれぞれ、１つ（軽鎖）または３つ（重鎖）の定常ドメインおよび可変領域（ＶＬ、ＶＨ）を含むものであり、そのうちの可変領域は、いずれの場合でも、４つのＦＲ領域および３つの間隙のＣＤＲから構成される。抗原結合部位は、１つまたはそれ以上のＣＤＲにより形成され、ＦＲ領域は、ＣＤＲに関する構造フレームワークを提供し、それゆえ、抗原結合において重要な役割を果たす。ＣＤＲまたはＦＲ領域において１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を変えることにより、当業者は、通常、変異の入った、または多様化した抗体配列を作成することができ、当該抗体配列は、例えば、新規なまたは向上した特性に関して、抗原に対してスクリーニングすることができる。
【００５８】
表３（ＶＨ）および４（ＶＬ）は、本発明の一定の抗体のＣＤＲおよびＦＲ領域を表し、所定の位置におけるアミノ酸を、（米国特許第6,300,064号に記載されるごとき）それぞれ他のおよび対応する共通または「マスター遺伝子」配列と比較する。
【００５９】
【表３】
0005608091.tif 000004
【００６０】
【表４】
0005608091.tif 000005
【００６１】
一定の態様において、本発明は、
−ＨＣＤＲ１領域が、配列番号の［全ての各配列番号の］１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０から選択されるものであり、
−ＨＣＤＲ２領域が、配列番号の３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、または６６から選択されるものであり、
−ＨＣＤＲ３領域が、配列番号の６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７または９８から選択されるものであり、
−ＬＣＤＲ１領域が、配列番号の９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１０２または１２８から選択されるものであり、
−ＬＣＤＲ２領域が、配列番号の１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９または１５５から選択されるものであり、
−ＬＣＤＲ３領域が、配列番号の１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６または１９７、あるいはこれらのＣＤＲ領域の組み合わせから選択されるものである
抗体を提供する。
【００６２】
好ましい態様は、ＣＤＲ配列が、表７に示されるＭＦ−Ｊシリーズまたは表７に示されるＣＤＲ領域のその他の組み合わせから選択されるものである。
【００６３】
一定の態様において、本発明は、
−ＶＨが、配列番号：１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９または２４０から選択されるものであり、
−ＶＬが、配列番号：２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２または２８３から選択されるものである
抗体を提供する。
【００６４】
上述のとおり、表７に示されるＭＦ−Ｊシリーズまたは表７に示されるＶＨおよびＶＬ領域のその他の組み合わせが好ましい態様である。
【００６５】
当業者は、表３、４および７におけるデータを用いることにより本発明の範囲内であるペプチドバリアントを設計することができる。バリアントは、１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸を変えることにより構築されることが好ましく；バリアントはまた、１つまたはそれ以上の変化したフレームワーク領域を有していてもよい。相互に新規な抗体の比較に関して、変えることができる候補残基は、例えば、ＭＦ−２２６およびＭＦ−Ｔの可変軽鎖の残基３または４５、および可変重鎖の残基１６または４３を含む。これらは、互いに向かい合った変化（variance）の位置にあるからである。変化はフレームワーク領域でなされてもよい。例えば、ペプチドＦＲドメインは、生殖細胞系列の配列と比較して残基に偏差が存在する位置で変化されてもよい。
【００６６】
対応する共通または「マスター遺伝子」配列に対する新規な抗体の比較に関して、Knappik et al., 2000に記載されており、変えることができる候補残基は、例えば、ＶＬλ２と比較したＭＦ−Ｔの可変軽鎖の残基２９または５２、例えば、ＶＨ１Ａと比較したＭＦ−Ａの可変重鎖の残基４３または５７を含む（Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. (2000) 296(1): 57）。代替的に、当業者は、例えば、Knappik, A., et al. (2000)およびKnappikらの米国特許第6,300,064号により記載される方法を用いて、本発明に開示されるアミノ酸配列を、かかる抗体の同一クラスの抗体の公知配列と比較することにより同一の解析を行うことができる。
【００６７】
さらに、バリアントは、抗体における１つまたはそれ以上のアミノ酸残基、好ましくは、１つまたはそれ以上のＣＤＲにおけるアミノ酸残基を多様化することによる最適化の開始点として１つの抗体を用いることにより、次いで、生じた抗体バリアントの収集物を、改善された特性を有するバリアントについてスクリーニングすることにより取得されてもよい。特に好ましくは、ＶＬのＣＤＲ−３、ＶＨのＣＤＲ−３、ＶＬのＣＤＲ−１および／またはＶＨのＣＤＲ−２における１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の多様化である。多様化は、トリヌクレオチド変異原性（ＴＲＩＭ）技術を用いて、ＤＮＡ分子の収集物を合成することにより行うことができる（Virnekas,B.,Ge,L.,Pluckthum,A.,Schneider,K.C.,Wellnhofer,G.,and Moroney S.E.(1994)Trinucleotide phosphoramidites:ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.Nucl.Acids Res.22,5600）。
【００６８】
保存アミノ酸バリアント
ポリペプチドバリアントは、本明細書に記載される抗体ペプチド配列の全体の分子構造を保存するように作成されてもよい。個々のアミノ酸の特性を仮定すれば、いくつかの合理的な置換は、当業者により理解される。アミノ酸置換、すなわち、「保存された置換」は、例えば、含まれる残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて作成されてもよい。
【００６９】
例えば、（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む；（ｂ）極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む；（ｃ）陽性荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リジン、およびヒスチジンを含む；（ｄ）陰性荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。置換は、典型的にグループ（ａ）〜（ｄ）内でなされてもよい。さらに、グリシンとプロリンはαヘリックスを妨げるそれらの能力に基づいて互いに置換されてもよい。同様に、特定のアミノ酸、例えば、アラニン、システイン、ロイシン、メチオニン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジンおよびリジンは、より一般的に、αヘリックス内で見出されるが、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびスレオニンは、より一般的に、βプリーツ（pleated）シート内で見出される。グリシン、セリン、アスパラギン酸、アスパラギン、およびプロリンは、一般にターンで見出される。いくつかの好ましい置換は、以下の群の間で行われてもよい：（ｉ）ＳとＴ；（ｉｉ）ＰとＧ；および（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、ＬとＩ。公知の遺伝学的コード、ならびに組換えおよび合成ＤＮＡ技術を仮定すれば、当業者は、保存されたアミノ酸バリアントをコードするＤＮＡを容易に構築することができる。一つの特定の例において、配列番号：１９９〜２０５、２０７〜２１１または２１３〜２４０におけるアミノ酸位置３は、ＱからＥに変えることができる。
【００７０】
本明細書で用いられるように、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、配列間で同一のアミノ酸のパーセンテージを示す。「配列類似性」は、同一であるか、または保存アミノ酸置換を示すアミノ酸のパーセンテージを示す。発明の好ましいポリペプチド配列は、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％または８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のＣＤＲ領域において配列同一性を有する。好ましい抗体はまた、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％のＣＤＲ領域において配列同一性を有する。
【００７１】
本発明のＤＮＡ分子
本発明はまた、発明の抗体をコードするＤＮＡ分子に関する。これらの配列は、配列番号：２８４〜３６９に記載されたそれらＤＮＡ分子を含むが、これらだけに限定されない。
【００７２】
本発明のＤＮＡ分子は、本明細書にて開示された配列だけではなく、それらのバリアントも含むが、これらだけに限定されない。本発明の範囲内のＤＮＡバリアントは、ハイブリダイゼーションにおけるそれらの物理的特性に関して記載されてもよい。当業者は、ＤＮＡがその相補体を同定するのに用いることができ、ＤＮＡが二本鎖であることから、その均等物または類似体を核酸ハイブリダイゼーション技術を用いて同定することができることを理解している。ハイブリダイゼーションは１００％相補性より低くても生じうることも理解されている。しかしながら、条件の適切な選択により、ハイブリダイゼーション技術を用いることにより、特定のプローブに対するそれらの構造上の関連性に基づいてＤＮＡ配列間を区別することができる。かかる条件に関するガイダンスに関しては、Sambrook et al.,1989（Sambrook,J.,Frisch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory press,Cold Spring Harbor,USA）およびAusubel et al.,1995（Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Sedman,J.G.,Smith,J.A.,&Struhl,K.eds(1995). Current Protocols in Molecular Biology.New York:John Wiley and Sons）を参照のこと。
【００７３】
２つのポリペプチド配列の間の構造類似性は、２つの配列が互いにハイブリダイズする条件下の「ストリンジェンシー」に応じて表すことができる。本明細書で用いられるように、用語「ストリンジェンシー」は、条件がハイブリダイゼーションに好ましくない（disfavor）範囲を意味する。ストリンジェントの条件は、ハイブリダイゼーションに極めて好ましくなく、最も構造上関連する分子はかかる条件下で相互にハイブリダイズする。反対に、非ストリンジェントな条件は、より低い程度の構造上の関連性を表す分子のハイブリダイゼーションを好む。それゆえ、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、２つの核酸配列の構造上の関連性に直接相関する。以下の関係式は、ハイブリダイゼーションと関連性とを関連付けるのに有用である（式中、Ｔｍは核酸２本鎖の融解温度である）：
ａ．Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（Ｇ＋Ｃ）％
ｂ．ミスマッチ塩基対数の１％ごとの増加により二本鎖ＤＮＡのＴｍは１℃低下する。
ｃ．（Ｔｍ）μ２−（Ｔｍ）μｌ＝１８．５ｌｏｇ１０μ２／μ１
（式中、μ１およびμ２は２つの溶液のイオン強度である。）
【００７４】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、全ＤＮＡ濃度、イオン強度、温度、プローブの大きさ、および水素結合を破壊する薬剤の存在を含む多くの因子に関連するものである。ハイブリダイゼーションを促進する因子は、高いＤＮＡ濃度、高いイオン強度、低い温、より長いプローブの大きさおよび水素結合を破壊する薬剤の非存在を含む。ハイブリダイゼーションは、典型的に、２つの相：「結合」相と「洗浄」相で行われる。
【００７５】
第１に、結合相において、プローブは、ハイブリダイゼーションに適した条件下で標的に結合される。ストリンジェンシーは、通常、温度を変化させることによりこの段階で調節される。高いストリンジェンシーにおいては、短い（＜２０ｎｔ）オリゴヌクレオチドプローブが用いられる場合でない限り、温度は、通常、６５℃と７０℃の間である。代表的なハイブリダイゼーション溶液は、６ＸＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、５Ｘデンハルト溶液および１００μｇの非特異的キャリアＤＮＡを含む。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，セクション２．９、補遺２７（１９９４）を参照のこと。もちろん、多くの相違する、さらに機能的に均等であるバッファー条件が知られている。関連性の程度がより低い場合、より低い温度が選択されてもよい。低いストリンジェントの結合温度は、約２５℃と４０℃の間である。中程度のストリンジェンシーは、少なくとも約４０℃から約６５℃までである。高いストリンジェンシーは、少なくとも約６５℃である。
【００７６】
第２に、過剰なプローブが洗浄により除去される。この段階において、よりストリンジェントな条件が、通常、適用される。それゆえ、この「洗浄」段階がハイブリダイゼーションによる関連性を調べる際に最も重要である。洗浄溶液は、典型的に、より低い塩濃度を含む。１つの例示的な中程度のストリンジェンシー溶液は、２ＸＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳを含む。高いストリンジェンシー洗浄溶液は、約０．１ＸのＳＳＣを含む好ましいストリンジェント溶液である約０．２ＸＳＳＣより低い（イオン強度における）均等物を含む。様々なストリンジェンシーに関連する温度は、「結合」についても上述と同じである。洗浄溶液はまた、典型的に、洗浄の間に複数回交換される。例えば、典型的な高いストリンジェンシー洗浄条件は、５５℃で３０分間２回の洗浄および６０℃で１５分間３回の洗浄を含む。
【００７７】
従って、本発明は、高いストリンジェントの結合および洗浄条件下で配列番号：２８４〜３６９に記載された分子にハイブリダイズする核酸分子を含み、かかる核酸分子は、本明細書で記載されるごとき特性を有する抗体またはその機能的なフラグメントをコードする。（ｍＲＮＡを見通した）好ましい分子は、本明細書に記載されるＤＮＡ分子の１つと、少なくとも７５％または８０％（好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％）の相同性または配列同一性を有するものである。本発明のバリアントの１つの特定の例において、配列番号：２５８〜２９１、２９３〜２９７、または２９９〜３２６における核酸位置７がＣからＧに置換され、それによりコドンをＣＡＡからＧＡＡに変化させることができる。
【００７８】
機能的に均等なバリアント
本発明の範囲内にあるＤＮＡバリアントのさらに別のクラスは、それらがコードする産物に関して記載されていてもよい。これらの機能的に均等な遺伝子は、遺伝子コードの縮重により、配列番号：２８４〜３６９で見出されるのと同じペプチド配列をコードするという事実により特徴付けられる。
【００７９】
本明細書で供されるＤＮＡ分子のバリアントは、いくつかの異なる様式にて構築することができる。例えば、それらは完全な合成ＤＮＡとして構築することができる。２０から約１５０ヌクレオチドの範囲でオリゴヌクレオチドを効率的に合成する方法が広く利用可能である。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，セクション２．１１、補遺２１（１９９３）を参照のこと。重複するオリゴヌクレオチドは、Khorana et al., J.Mol.Biol.72:209-217(1971)により最初に報告された様式にて合成され、集められてもよい；前出のＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，のセクション８．２も参照のこと。合成ＤＮＡは、好ましくは、適切なベクターへのクローン化を容易にするために遺伝子の５’および３’末端において改変された利便的な制限酵素部位を用いて設計される。
【００８０】
示されるとおり、バリアントを作成する方法は、本明細書で開示されるＤＮＡのうちの「１つから開始し、次いで、部位特異的変異導入を行うことである。Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出、８章、補遺３７（１９９７）を参照のこと。典型的な方法において、標的ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡバクテリオファージビヒクルにクローン化される。一本鎖ＤＮＡが単離され、所望のヌクレオチド変化を含むオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされる。相補鎖が合成され、二本鎖ファージが宿主に導入される。生じた子孫のいくらかは所望の変異体を含み、ＤＮＡ配列決定により確認することができる。さらに、子孫ファージが所望の変異体である確率を増加させる様々な方法が利用可能である。これらの方法は、当該技術分野で周知であり、かかる変異体を作成するためのキットが市販されている。
【００８１】
組換えＤＮＡ構築物および発現
本発明は、さらに、本発明の１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ構築物を提供する。本発明の組換え構築物は、本発明の抗体をコードするＤＮＡ分子が挿入される、プラスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターのごときベクターと繋げて用いられる。
【００８２】
コードされた遺伝子は、Sambrook et al.,1989およびAusubel et al.,1989に記載される技術により産生されてもよい。代替的に、ＤＮＡ配列は、例えば、合成機を用いて化学合成されてもよい。例えば、出典明示により本明細書に取り込まれる、ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（１９８４，Ｇａｉｔ，編纂、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード）に記載の技術を参照のこと。本発明の組換え構築物は、ＲＮＡおよび／またはコードされたＤＮＡのタンパク質産物を発現することができる発現ベクターから構成される。前記ベクターは、さらに、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されたプロモーターを含む調節配列を含んでもよい。前記ベクターは、さらに、選択可能なマーカー配列を含んでもよい。特定の開始シグナルおよび細菌の分泌シグナルもまた、挿入される標的遺伝子をコードする配列の効率的な翻訳に必要であってもよい。
【００８３】
本発明は、さらに、本発明のＤＮＡの少なくとも１つを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、実質的に、発現ベクターが利用可能な細胞のいずれであってもよい。例えば、哺乳類細胞のごとき高等真核宿主細胞、酵母細胞のごとき下等真核宿主細胞であってよく、細菌細胞のごとき原核細胞であってもよい。組換え構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはファージ感染により行うことができる。
【００８４】
細菌発現
細菌の使用に有用な発現ベクターは、タンパク質をコードする構造ＤＮＡ配列を、適切な翻訳開始および終結シグナルを機能的なプロモーターとともに、作動可能な読み枠で挿入することにより構築される。前記ベクターは、１つまたはそれ以上の表現形選別可能マーカーおよび複製開始点を含むことにより、ベクターの維持を確認し、所望であれば、宿主内の増幅を供する。形質転換に適する原核生物の宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ、バチルスサチリス、サルモネラティフィミリウム、ならびにシュードモナス属、ストレプトミセス属およびスタフィロコッカス属内の様々な種を含む。
【００８５】
細菌のベクターは、例えば、バクテリオファージ−、プラスミド−、またはファージミド−に基づくものであってもよい。これらのベクターは、周知なクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）のエレメントを典型的に含む市販されているプラスミドに由来する、選択可能なマーカーおよび細菌複製開始点を含みうる。適切な宿主株の形質転換および宿主株の適切な細胞密度への増殖後、選択されたプロモーターは、適切な手法（例えば、温度シフトまたは化学誘導）により脱抑制／誘導され、細胞は、さらなる期間培養される。細胞は、一般的に、遠心分離により回収され、物理的または化学的手法により破壊され、生じた粗抽出物は、さらなる精製のために維持される。
【００８６】
細菌系において、多くの発現ベクターは、発現されるタンパク質に意図される用途に応じて、有利に選択されてもよい。例えば、大量のかかるタンパク質が生産される場合、抗体の作成またはペプチドライブラリーのスクリーンのために、例えば、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指令するベクターが所望されてもよい。
【００８７】
治療方法
治療方法は、本発明により意図される抗体の治療上有効な量を処置を必要とする患者に投与することを含む。本明細書における「治療上有効な」量は、患者の治療領域において、単一用量としてもしくは複数用量投薬計画により、単独もしくはその他の薬剤と組み合わせて、メソセリン陽性細胞を涸渇させるのに十分な抗体の量であって、悪い症状の軽減を生じるが、毒物学的に許容される量と定義される。患者は、ヒトまたは非ヒト動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、サルまたはその他の低級程度の霊長類）であってもよい。
【００８８】
本発明の抗体は、公知の医薬と同時投与されてもよく、いくつかの例において、前記抗体は、それ自身に修飾されてもよい。例えば、抗体は、免疫毒素または放射性同位元素に抱合されることにより、さらに潜在的に効力を増加させることができる。
【００８９】
本発明の抗体は、メソセリンの発現または発見が所望されない様々な状況において、治療または診断用の道具として用いることができる。本発明の抗体による治療に特に適する疾患および症状は、膵臓癌、卵巣癌、中皮腫および肺癌である。
【００９０】
いずれかの前記疾患を治療するために、本発明による使用のための医薬組成物は、１つまたはそれ以上の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を用いる慣用的手法にて製剤化されてもよい。本発明の抗体は、いずれの適切な手法により投与することができ、処置される疾患の種類により変動しうる。可能な投与経路は、非経口（例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、または皮下）、肺内および鼻腔内、ならびに局所性免疫抑圧的な処置を所望であれば、外傷内（intraleisonal）投与を含む。さらに、発明の抗体は、パルスインフュージョンにより、例えば、低下させた用量の抗体と共に投与されてもよい。投与される量は、臨床上の兆候、個体の体重、他の薬剤を投与されているか等の様々な因子に依存することになる。当業者は、疾患または処置される症状により投与経路が変動することを理解する。
【００９１】
本発明によれば、新たなポリペプチドの医薬有効量を決定することは、特定の患者の特性、投与経路および処置される疾患の性質に大きく依存している。一般的なガイダンスは、例えば、International Conference on Harmonisationの刊行物およびREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、チャプター27および28、pp. 484-528（18th ed., Alfonso R. Gennaro, Ed., Easton, Pa.: Mack Pub. Co., 1990）に見出される。より詳細には、医薬有効量を決定することは、医薬品の毒性および有効性などの因子に依存する。毒性は、当該分野にて周知で、上記刊行物にて見出される方法を使用して決定され得る。有効性は、下記の実施例に記載の方法と併せて同じガイダンスを用いて決定され得る。
【００９２】
診断方法
メソセリン抗体は、メソセリンを発現する腫瘍の存在を検出するために使用され得る。血清、前立腺および他の組織生検標本を含む種々の生物学的サンプル内のメソセリンを含む細胞の存在は、メソセリン抗体を用いて検出され得る。さらに、メソセリン抗体は、.sup.99mTc（または他のアイソタイプ）で抱合された抗体を用いる免疫シンチグラフィーなどの種々のイメージング方法にて使用され得る。例えば、.sup.111Inで抱合された抗体を用いて最近記載されたものに類似するイメージングプロトコルを用いて、膵臓または卵巣細胞腫が検出されてもよい（Sodee et al., Clin. Nuc. Med. 21: 759-766, 1997）。使用し得る他の検出方法は、陽電子放射断層撮影法である（Herzog et al., J. Nucl. Med. 34:2222-2226, 1993を参照のこと）。
【００９３】
医薬組成物および投与
本発明はまた、メソセリン抗体を、単独または安定化化合物などの少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて含み得る医薬組成物に関し、該医薬組成物は、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、ブドウ糖および水などを含む、滅菌で生体適合性の医薬担体にて投与され得る。これらの分子のいずれも、単独または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて、賦形剤または医薬上許容される担体と混合した医薬組成物にて、患者に投与され得る。本発明の１つの実施態様において、医薬上許容される担体は、医薬上不活性である。
【００９４】
本発明はまた、医薬組成物の投与に関する。そのような投与は、経口または非経口で達成される。非経口送達の方法としては、局所、動脈内（腫瘍に直接）、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内または鼻腔内投与が挙げられる。有効成分に加え、これらの医薬組成物は、医薬として使用され得る調製物への有効な化合物の処理を容易にする、賦形剤および助剤を含む医薬上許容される適切な担体を含み得る。処方物および投与のための技術のさらなる詳細が、Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Maack Publishing Co, Easton, Pa.)の最新の版にて見出され得る。
【００９５】
経口投与のための医薬組成物が、経口投与に適切な投与中の当該分野にて周知の医薬上許容される担体を使用して処方され得る。そのような担体は、医薬組成物が患者による摂取のための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などとして処方されることを可能にする。
【００９６】
経口での使用のための医薬調製物は、適切な助剤を添加した後で、有効な化合物の固体の賦形剤との組合せ、所望により、得られた混合物を粉砕し、および顆粒の混合物を処理することによって、所望により、錠剤または糖衣錠のコアを得るために、得られる。適切な賦形剤は、ラクトース、ショ糖、マンニトールまたはソルビトール；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモもしくは他の植物由来のデンプン；メチル、セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；およびアラビアもしくはトラガカントゴム；およびゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質を含む、糖などの炭水化物およびタンパク質充填剤である。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムなどのその塩といった崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
【００９７】
糖衣錠のコアは、濃縮された糖溶液などのコーティングと一緒に提供され、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（carbopol）ゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物をまた含み得る。色素またはピグメントを、製品同一性のため、または有効な化合物の量（すなわち、投与量）を特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加してもよい。
【００９８】
経口で使用し得る医薬調製物は、ゼラチンでできた押し込み型のカプセルおよびゼラチンでできた密封した軟カプセル、ならびにグリセロールまたはソルビトールなどのコーティングを含む。押し込み型のカプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および所望により安定化剤と混合した有効成分を含み得る。軟カプセルでは、安定化剤と一緒にまたは含まずに、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に溶解または懸濁され得る。
【００９９】
非経口投与のための医薬処方物は、有効な化合物の水溶液を含む。注射のために、本発明の医薬組成物は、水溶液にて、好ましくは、ハンク溶液、リンゲル液または生理学的緩衝化食塩水などの生理学的に適合性の緩衝液にて処方され得る。水性注射懸濁物は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの、懸濁物の粘性を増加させる物質を含んでもよい。さらに、有効な化合物の懸濁物は、適切な油性注射懸濁物として調製され得る。適切な疎水性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。所望により、懸濁物はまた、適切な安定化剤または化合物の溶解度を増加させる薬剤を含んで、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする。
【０１００】
局所または経鼻投与のために、浸透すべき特定のバリアに適切な浸透剤を処方物にて使用してもよい。そのような浸透剤は、当該分野にて一般に知られている。
【０１０１】
キット
本発明はさらに、本発明の上記組成物の１つまたは複数の試薬で満たされた１つまたは複数の容器を含む、医薬パックおよびキットに関する。ヒトでの投与のための製品の製造、利用または販売の政府機関による証明を反映した、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関による所定の形の警告を容器に付してもよい。
【０１０２】
別の実施態様において、キットは、本発明の抗体をコードするＤＮＡ配列を含み得る。好ましくは、これらの抗体をコードするＤＮＡ配列は、宿主細胞へのトランスフェクションおよび宿主細胞による発現に適したプラスミドにて提供される。プラスミドは、宿主細胞での発現を調節するためのプロモーター（しばしば誘導性プロモーター）を含み得る。プラスミドはまた、他のＤＮＡ配列のプラスミドへの挿入を容易にして、種々の抗体を産生するための適切な制限部位を含み得る。プラスミドはまた、コードされたタンパク質のクローニングおよび発現を容易にするための多数の他のエレメントを含んでもよい。そのようなエレメントは、当業者によく知られており、例えば、選択可能なマーカー、開始コドン、終止コドンなどが挙げられる。
【０１０３】
製造および貯蔵
本発明の医薬組成物は、当該分野にて公知の手法、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、製粉、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスの手段によって、製造され得る。
【０１０４】
医薬組成物は塩として提供してもよく、限定するものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む酸と形成され得る。塩は、対応する遊離塩基の形態である水性または他のプロトン溶媒にてより可溶性である傾向を有する。他の場合では、好ましい調製物は、使用の直前に緩衝液と組み合わされる、４．５〜５．５の範囲のｐＨでの１ｍＭ〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、２％〜７％マンニトールの凍結乾燥粉末であり得る。
【０１０５】
許容可能な担体にて処方される本発明の化合物を含む医薬組成物を調製した後で、それらを適切な容器に入れ、意図される状態の処置のためのラベルを付してもよい。メソセリン抗体の投与のために、そのようなラベルは、投与の量、頻度および方法を含み得る。
【０１０６】
治療上の有効用量
本発明における使用に適した医薬組成物としては、有効成分が意図した目的、すなわち、メソセリンの発現によって特徴付けられる特定の疾患状態の処置を達成するための有効量で含まれる組成物が挙げられる。有効用量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【０１０７】
いずれの化合物についても、医療上の有効用量は、細胞培養アッセイ（例えば、腫瘍細胞）または動物モデル（通常、マウス、ウサギ、イヌまたはブタ）のいずれかにてまず評価され得る。動物モデルはまた、投与の望ましい濃度範囲および経路を達成するために使用される。次いで、そのような情報は、ヒトでの有用な用量および経路を決定するために使用され得る。
【０１０８】
治療上の有効用量は、症状または状態を改善するタンパク質またはその抗体、アンタゴニストもしくはインヒビターの量をいう。そのような化合物の治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物での標準的な医薬手順、例えば、ＥＤ５０（５０％の集団にて治療上有効な用量）およびＬＤ５０（５０％の集団に対して致死の用量）によって決定され得る。治療および毒性効果の用量の割合は、治療の指標であり、ＥＤ５０／ＬＤ５０の割合として示される。大きな治療指標を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物調査から得られるデータは、ヒトでの使用のための投与量の範囲を処方するために使用される。そのような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性を有しないＥＤ５０を含むもの循環濃度の範囲内である。投与量は、用いる投与形態、患者の感受性および投与経路に依存して、この範囲内で変動する。
【０１０９】
正確な投与量は、処置すべき患者を考慮して、各医師によって選択され得る。投与量および経路は、有効部分の十分なレベルを提供するか、または所望の効果を維持するために、調整され得る。考慮され得るさらなる因子としては、疾患状態の重篤度、例えば、腫瘍の大きさおよび場所；患者の年齢、体重および年齢；投与のダイエット（diet）、時間および頻度、薬物の組合せ、反応の感受性および治療への耐性／応答が挙げられる。長時間作用する医薬組成物は、３〜４日間に一度、１週間に１回または２週間に１回、特定の処方物の半減期およびクリアランス速度に依存して投与されなければならない。
【０１１０】
通常の投与量は、投与経路に依存して、０．１〜１０００００マイクログラム、約１ｇの合計用量まで変動し得る。特定の投与量および送達経路に関するガイダンスが文献にて提供されている。米国特許第4,657,760号;第5,206,344号;または第5,225,212号を参照のこと。当業者は、タンパク質またはそれらのインヒビターと比べて、ポリヌクレオチドのための異なる処方物を用いるだろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、場所などに特異的である。放射標識した抗体のための好ましい詳細な活性は、０．１〜１０ｍＣｉ／ｍｇのタンパク質の範囲であり得る（Riva et al., Clin. Cancer Res. 5:3275s-3280s, 1999; Wong et al., Clin. Cancer Res. 6:3855-3863, 2000; Wagner et al., J. Nuclear Med. 43:267-272, 2002）。
【０１１１】
本発明を、以下の実施例にてさらに説明する。実施例は、特定の実施態様を参照して、本発明を単に説明するものである。本発明の特定の態様を説明する一方、これらの例示は、本発明の範囲を限定または制限するものではない。
【０１１２】
特に詳述しない場合、全ての実施例を、当業者に周知で、慣用の標準的な技術を使用して実施する。以下の実施例の慣用の分子生物学の技術を、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989などの標準的な研究室のマニュアルに記載されるように実施する。
【実施例１】
【０１１３】
実施例１：ＨｕＣＡＬライブラリーからの抗体の作成
メソセリンに対する治療用抗体の作成のために、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤファージディスプレーライブラリーを用いた選択を行った。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）は、ＨｕＣＡＬ（登録商標）コンセプトに基づくＦａｂライブラリーであり(Knappik, A., et al., J. Mol. Biol. (2000) 296(1): 57; Krebs, B., et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254(1-2): 67)、６つのＣＤＲ全てが多様化されており、Ｆａｂフラグメントをファージの表面に結合させるために、ＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を用いている(Lohning, 2001; WO 01/05950)。
【０１１４】
Ａ．ファージミドレスキュー、ファージの増幅および精製
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドライブラリーを、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％のグルコース（２×ＴＹ−ＣＧ）を含む２×ＴＹ培地にて増幅した。０．５のＯＤ６００でのヘルパーファージ感染（ＶＣＳＭ１３）の後で（３０分間、３７℃で、振盪せず；３０分間、３７℃で、２５０ｒｐｍで振盪する）、細胞をスピンダウンし（４１２０ｇ；５分間；  ４℃）、２×ＴＹ／３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール／５０μｇ／ｍｌのカナマイシンに再懸濁し、２２℃で一晩増殖させた。ファージを上清からＰＥＧで沈殿させ、ＰＢＳ／２０％グリセロールに再懸濁し、−８０℃で保存した。２つのパニングラウンド（panning round）の間でのファージの増幅を以下のとおり実施した：対数増殖期中期のＴＧ１細胞を溶出したファージに感染させ、１％のグルコースおよび３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充したＬＢ寒天培地（ＬＢ−ＣＧ）にプレーティングした。３０℃で一晩インキュベートした後で、コロニーを取り出し、０．５のＯＤ６００に調整し、上記のヘルパーファージを添加した。
【０１１５】
Ｂ．ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）を用いたパニング
選択のために、ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージを異なるＶＨマスター遺伝子に対応する３つのプールに分けた（プール１：ＶＨ１／５λκ、プール２：ＶＨ３λκ、プール３：ＶＨ２／４／６λκ）。これらのプールを、適切でない抗体ファージの枯渇のために、メソセリンネガティブＣＨＯ−Ｋ１細胞上にそれぞれ事前に吸収させ、続いて、メソセリンを発現するＣＨＯ−Ａ９およびＮＣＩ−Ｈ２２６細胞上での３回の代替全細胞パニング、続いて、ｐＨ溶出に供した。さらに、残りの抗体ファージを、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＴＧ１細胞を感染させるために使用した。遠心分離の後で、細菌のペレットを２×ＴＹ培地に再懸濁し、寒天培地にプレーティングし、３０℃で一晩インキュベートした。次いで、選択したコロニーをプレートから取り出し、ファージをレスキューし、増幅した。第２ラウンドおよび第３ラウンドの選択を、第１のラウンドと同様に実施した。
【０１１６】
選択したＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージのインサートをコードするＦａｂを発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×９＿Ｆａｂ＿ＦＳ(Rauchenberger, R., et al., J. Biol. Chem. (2003) 278(40): 38194)にサブクローニングして、可溶性Ｆａｂの迅速な発現を容易にした。選択したクローンのＤＮＡをＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、Ｆａｂをコードするインサート（ｏｍｐＡ−ＶＬＣＬおよびｐｈｏＡ−Ｆｄ）を切断し、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ切断ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）×９＿Ｆａｂ＿ＦＳにクローニングした。このベクターで発現されるＦａｂは、検出および精製のための２つのＣ末端タグ（ＦＬＡＧ（商標）および  Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ）を担持する。
【０１１７】
Ｃ．ＣＤＲカセットの段階的な交換による選択したＦａｂの親和性成熟親和性成熟
選択した抗体フラグメント（ＭＦ−Ｌ、ＭＦ−Ａ、ＭＦ−Ｊ、ＭＦ−ＴおよびＭＦ−２２６）の親和性および生物学的活性を増加させるために、トリヌクレオチドに関する変異誘発を使用したカセット変異誘発によって、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２領域を同時に最適化する一方(Virnekas et al, Nucleic Acids Res. 22(25): 5600-7)、フレームワーク領域を一定に保った(WO2006122797)。高い親和性のＦａｂフラグメントを示したファージを選択するパニングを、精製したビオチン化組換えメソセリン（ヒトまたはマウスメソセリン）上で、またはメソセリン発現細胞株（ＮＣＩ−Ｈ２２６またはＯＶＣＡＲ−３）上で直接実施した。これらの異なるパニングストラテジーの組合せを、実施した３ラウンドのパニングによって適用した。
【実施例２】
【０１１８】
実施例２：エピトープのグループ化
エピトープのグループ化の実験を、固定化したメソセリンに対する抗メソセリン抗体の対の同時結合をモニタリングすることによって、Ｂｉａｃｏｒｅを使用して実施した。つまり、第１の抗体をｎ−ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＣ）およびＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）を使用する１級アミンを介して、センサーチップに共有結合により固定化した。表面の占有されていない結合部位をエタノールアミドを用いてブロックした。可溶性メソセリンを固定化した抗体を介して表面にて捕獲し、捕獲した抗体のエピトープを、全ての結合したメソセリン分子についてブロックした。ただちに、第２の抗体を表面に通し、固定化したメソセリンに結合させた。同じまたは重複するエピトープを認識する２つの抗体は、メソセリンに結合できない一方、異なるエピトープを有する抗体は結合可能である。抗体表面を、グリシン、ｐＨ２．８を用いて再生し、結合したタンパク質を除去し、次いで、プロセスを他の抗体を用いて繰り返した。７つの抗体の全ての組合せを試験した。ＭＦ−Ｔおよび７つの他の抗体を使用した代表的な結果を図１Ａに示す。第２の抗体としてのＭＦ−Ｔの使用は、ポジティブコントロールとして機能し、抗ＦＬＡＧはネガティブコントロールとして機能した。図１Ｂは、各エピトープを示す円を有するＶｅｎｎダイアグラムにて、７つの抗メソセリン抗体についての対での結合結果の概要を示す。重複した円は、重複したエピトープを示す。ＭＦ４２８は、結合について、試験した他の全ての抗体と競合した。ＭＦ−ＪおよびＭＦ−Ｔは、互いに、およびＭＦ−Ａ、ＭＦ−２２６およびＭＦ−Ｌとは異なるエピトープに結合し、同じエピトープ領域について競合しているようである。市販のマウス抗体Ｋ１は、ＭＦ−ＪおよびＭＦ−Ｔによって認識される領域と異なるエピトープ領域に結合しているが、ＭＦ−Ａ、ＭＦ−ＬおよびＭＦ−２２６と類似のエピトープ領域を有しているようである。
【実施例３】
【０１１９】
実施例３：マウスメソセリンへの交差反応性
ＢｉａｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡ調査の結果を表５に示すが、本発明の抗体のマウスメソセリンへの交差反応性を示している。動力学的定数ｋｏｎおよびｋｏｆｆを、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を使用して、ヒトまたはマウスメソセリンに共有結合で固定化した精製した各Ｆａｂフラグメントの段階希釈物を用いて決定した。共有結合性の抗原の固定化は、標準的なＥＤＣ−ＮＨＳカップリング手順によって達成された。動力学的測定は、１．５〜５００ｎＭの範囲のＦａｂ濃度を使用して、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中で、２０μｌ／分の流速で行った。各濃度についてのインジェクション時間は１分間であり、続いて、３分間の分離フェーズを行った。再生のために、１０ｍＭのグリセリン緩衝液（ｐＨ１．８）５μｌを使用した。ＢＩＡ評価ソフトウェア（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、全てのセンソグラム（sensogram）を合わせた。
【０１２０】
【表５】
0005608091.tif 000006
【実施例４】
【０１２１】
実施例４：異なるがん細胞株でのメソセリンへの不変の結合
図２は、抗メソセリン抗体ＭＦ−Ｊ（Ａ）およびＭＯＲ  ０６６３５（Ｂ）を用いて得られたメソセリン発現細胞株のイムノブロットを示す。すなわち、ＤＮＡａｓｅおよびＲＮａｓｅの存在下で、３分間細胞を超音波処理することによる標準的な溶解プロトコルによって、細胞抽出物を得た。細胞タンパク質を変性および還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜にブロッティングし、適切な第１抗体（ＭＦ−Ｊ−ＩｇＧまたはＭＯＲ  ０６６３５−Ｆａｂ）を用いてインキュベートした。抗ヒトＩｇＧペルオキシダーゼ結合第２抗体を、ＥＣＬ基質を用いて実施する検出で使用した。ＯＶＣＡＲ−３細胞の抽出物をメソセリン抗体を用いてブロッティングした場合、１つのバンドのみ生じ、ＣＨＯ−Ａ９およびＮＣＩ−Ｈ２２６細胞では複数のバンドが観察された。これは、ＯＶＣＡＲ−３、ＣＨＯ−Ａ９およびＮＣＩ−Ｈ２２６細胞株にて異なるアイソフォームのメソセリンの存在を示す。ＯＶＣＡＲ−３およびＣＨＯ−Ａ９は同じもの、完全にスプライシングされた転写物バリアント(Muminova, Z.E., et al., BMC Cancer (2004) 4:19)および配列番号３７１を発現するので、複数のバンドは、限定するものではないが、例えば、グルコシル化パターンの差異であるなど、転写または翻訳後修飾によって引き起こされたものであるに違いない。
【０１２２】
表６は、ＮＣＩ−Ｈ２２６およびＯＶＣＡＲ−３細胞に対する本発明の代表的な親和性成熟抗体のＦＡＣＳ用量設定によって得られたＥＣ５０値が、ＩｇＧのサブセット（すなわち、ＭＯＲ０７２６５、−６６３１、−６６６９、−７１１１、−６６４０、−６６４２）について有意に変動しない一方で、他のＩｇＧがＮＣＩ−Ｈ２２６と比べてＯＶＣＡＲ−３に対して８倍より高いＥＣ５０値を示す（すなわち、ＭＯＲ０６６２６、−６６３８、−６６５７、−６６４３）ことを示す。最も注目すべきは、ＩｇＧｓ  ＭＯＲ０７２６５、−６６３１、−６６３５、−６６６９、−７１１１、−６６４０、−６６４２は、親のＩｇＧ  ＭＦ−Ｊの親和性成熟誘導体であることであり、これらのＩｇＧがＯＶＣＡＲ−３およびＮＣＩ−Ｈ２２６細胞に不変に存在する関連のエピトープに結合することを示している。そのため、これらのデータは、本発明にて提供される不変の結合の質を示している。
【０１２３】
ＦＡＣＳ用量設定を９６ウェルのマイクロタイタープレートにて実施し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中３％  ＦＣＳ、０．０２％  ＮａＮ３）８０μｌの体積中の第１抗体の段階希釈物を、アキュターゼ（accutase）またはトリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥離した１０６細胞／ｍｌの細胞懸濁物２０μｌと混合し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。インキュベーションを４℃で１時間、攪拌しながら実施した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中抗ヒトＰＥ結合体溶液１００μｌ／ウェルに再懸濁した。上述のとおり、インキュベーションおよび洗浄を実施した。細胞結合抗体の分析を、ＦＡＣＳ  Ａｒｒａｙデバイスを使用して行った。ＥＣ５０値を、非線形回帰適合を適用するＰｒｉｓｍ４．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、２つ組の蛍光中央値から決定した。
【０１２４】
【表６】
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【実施例５】
【０１２５】
実施例５：がん抗原１２５（ＣＡ１２５）の存在下でのメソセリンへの結合
図３は、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）がメソセリンに結合し、次いで、ＭＯＲ０６６４０およびＭＦ−Ｔを含むメソセリン抗体のサブセットに結合する一方、ＭＦ−２２６などの他の抗体は、メソセリンへの結合についてＣＡ１２５と競合することを示す。示したデータは、ＳＥＣＴＯＲ  Ｌｉｇｈｔ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）によって検出された相対光単位（ＲＬＵ）である。プレートを１５μｇ／ｍｌのメソセリン抗体でコーティングし、続くインキュベーションの後で、洗浄およびブロッキングした。メソセリンを示した濃度で添加し、１０μｇ／ｍｌから０．０８μｇ／ｍｌまで用量設定した。続いて、プレートをＣＡ１２５（Ｌｅｅ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｃａｔ＃１５０−１１、５００００Ｕ／ｍｌ  １：３００希釈）と一緒にインキュベートした。マウス抗ＣＡ１２５抗体およびＭＳＤ  Ｓｕｌｆｏタグ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で標識した抗マウスＦａｂ抗体を用いて、検出を実施した。非特異的なヒトコントロール抗体をコントロールとしてコーティングした。さらなるコントロールとして、試験した最も高い濃度（１０μｇ／ｍｌ）のメソセリンおよびＣＡ１２５またはマウス抗ＣＡ１２５抗体のいずれかを有する完全なアッセイのセットアップ、またはメソセリンを含まない完全なアッセイのセットアップを含めた。この実施例は、メソセリンに不変に結合する抗体、抗原結合抗体フラグメントまたはそのバリアントがインビトロでの試験によって同定され得ることを示す。
【実施例６】
【０１２６】
実施例６：内部移行
ＣＨＯ−Ａ９細胞における抗メソセリン抗体の相対的な内部移行を図４に示す。簡単に説明すると、メソセリンタンパク質を発現するＣＨＯ−Ａ９細胞を、１２５Ｉ−抗メソセリン抗体で０℃で２時間標識することにより、細胞表面メソセリンに対する標識した抗体を結合させた。低い温度は内部移行を阻害した。結合していない抗体を、冷緩衝液を用いて洗い流し、標識された細胞の各アリコットを３７℃水槽に置き、内部移行を開始した。３つのサンプルを０、１５、３０、４５、６０、７５および９０分で採取する時間経過で行った。各時点において、サンプルを細胞が沈殿するまで遠心分離し、細胞から解離した抗体を含む上澄み液を採取した。次に、細胞の沈殿物を、細胞表面に結合した標識抗体を取り除くために酸（ＰＢＳ＋１％  グルコース  ｐＨ１．０）で簡単に洗浄し、次いで、遠心分離で沈殿にした。細胞表面から溶出した抗体を含む上澄み液を収集した。内部移行した抗体を含む沈殿物のフラクションを別々に収集した。前記時間経過の終了後、全ての時点からの各フラクションの放射性を、ガンマカウンターを用いて調べた。フラクションに存在する合計カウントの割合は、各時点において解離するか、細胞表面に結合するか、または内部移行した抗体の割合を表す。二次抗体（各々、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ、またはヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ）が一次標識された抗体と一緒に添加されて架橋され、それにより細胞表面結合抗体が安定化された実験では、一次抗体のみで処理した細胞と比較してより低い抗体解離速度が観察された。同様に、二次抗体でテストした全ての抗体においてもより高い内部移行レベルも達した。二次抗体の非存在下において、Ｂｉａｃｏｒｅ実験で見られるような、抗体の比較的急速なオフ率（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、細胞表面における抗体の存在時間を減少させ、結果として内部移行は顕著に減少した。それゆえ、４つの候補抗体を親和性成熟に関して選択することにより、解離速度の低い前駆抗体を得た。
【０１２７】
【表７−１】
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【０１２８】
【表７−２】
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【０１２９】
【表７−３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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