(57)【要約】リウマチを初めとする自己免疫疾患の病因として、消化管内のエンドトキシンの体内移行が関係している。エンドトキシンを除去することにより、リウマチモデルにおいて改善がみられる。人体に安全に服用でき、消化管内のエンドトキシンを除去できる吸着剤を提供する。  エンドトキシン結合活性を有する経口摂取が可能で、腸内のエンドトキシン量に見合う結合能力を有し、且つ、安全性の面からも問題を生じない非消化性、非吸収性を特徴とするエンドトキシン除去剤をもちいることにより、例えば関節リウマチである自己免疫疾患の治療、予防が可能となる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
経口摂取が可能な非消化性および非吸収性を特徴とする粒子で、粒子径５μｍ以下が体積換算分布で１％以下、且つ、粒子径５０μｍ以下が９０％以上のエンドトキシン吸着体。
【請求項２】
エンドトキシンの試験管内吸着活性が、乾燥粉末１ｇ当たり１０×１０６エンドトキシン単位（ＥＵ）以上である請求項１に記載したエンドトキシン吸着体。
【請求項３】
エンドトキシンの試験管内吸着活性が、乾燥粉末１ｇ当たり５０×１０６エンドトキシン単位（ＥＵ）以上である請求項１に記載したエンドトキシン吸着体。
【請求項４】
エンドトキシンの試験管内吸着活性が、乾燥粉末１ｇ当たり１００×１０６エンドトキシン単位（ＥＵ）以上である請求項１に記載したエンドトキシン吸着体。
【請求項５】
請求項１に記載したエンドトキシン吸着体を含む自己免疫疾患予防治療剤。
【請求項６】
自己免疫疾患が関節リウマチである請求項５に記載した自己免疫疾患予防治療剤。
【請求項７】
エンドトキシン結合活性基とこれを担持する細粒子を含む請求項１に記載したエンドトキシン吸着体。
【請求項８】
エンドトキシン結合活性を有するリピドＡ結合分子を含む請求項７に記載したエンドトキシン吸着体。
【請求項９】
リピドＡ結合分子がポリミキシンＢである請求項８に記載したエンドトキシン吸着体。
【請求項１０】
リピドＡ結合分子がポリミキシンＢであり、担体微粒子がカルボキシル基を有する弱酸性陽イオン交換樹脂である請求項８に記載したエンドトキシン吸着体。
【請求項１１】
請求項１に記載したエンドトキシン吸着体を患者に投与することを含む自己免疫疾患を予防または治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は消化管内のエンドトキシンを除去することにより関節リウマチなどの自己免疫疾患の予防治療するエンドトキシン吸収剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシン、内毒素はグラム陰性菌外膜の構成成分の一つで、化学的にはリポ多糖体（ＬＰＳ）で、リピドＡが毒性を示す。（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．Ｄａｖｉｓ  ＢＤ，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ  Ｒ，Ｅｉｓｅｎ  ＨＮ，Ｈａｒｏｌｄ  Ｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ＨＳ，Ｂａｒｒｙ  Ｗ．Ａ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９７０，ｐ．６１５−６１７）。
エンドトキシンの生理作用は多彩で、十分量が注射されると１時間以内にショック状態に陥る。また、微量でも強い発熱が起こすことから発熱物質・パイロジェンとよばれる。従って、注射剤や輸液製剤など、非経口的に投与される医薬品にあってはエンドトキシンを含まない製剤であることが求められている。
人・動物の消化管内には通常、大腸菌その他のグラム陰性菌が多数生息し、したがってそれらの構成成分であるエンドトキシンも消化管に存在するが、特に発熱することは無い。このことは、エンドトキシンが高分子であるために、消化管粘膜バリヤーやＩｇＡ抗体による免疫バリアーによって発熱作用するほどの量には吸収されないものと考えられている。
免疫機構は、外来微生物はもとより、癌などの異常細胞も含めて正常な自己成分とは異なる異物性を識別し、これらを攻撃・排除して、生体の恒常性を維持する機構である。しかし、正常な免疫機構のバランスを失って失調をきたし、自己成分を攻撃・排除するに至ると、多種の難治性疾病を発症する。これらの疾病は総称して、自己免疫疾患といわれ、関節リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性腎炎、内耳自己免疫病、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性甲状腺炎、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、多発性皮膚筋炎、乾癬、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病、ギランバレー症候群などが知られている。
関節リウマチは代表的自己免疫の一つであり、患者数が多く、苦痛が激しく患者の社会生活も困難なことから特に注目されている。関節リウマチは全身の関節に進行性の慢性炎症が起こる病気で関節の破壊、変形が進み、痛みと運動機能障害のために、寝たきりの生活になる。
自己免疫疾患の治療は免疫の異常亢進を止めるために、非ステロイド性抗炎症剤、抗炎症ステロイド剤、免疫抑制剤、抗サイトカイン抗体（レミケード（登録商標））などを使用する治療が中心で、いずれも対象療法である。慢性関節炎リウマチなどの自己免疫疾患の病因についてはいくつかの仮説が提唱されているが、その原因とメカニズムは今だに明らかでない。
本発明者らはリウマチ患者血清や関節軟骨から回収される自己抗体の分析を行った。その結果から、自己免疫疾患は消化管粘膜の透過性亢進により、慢性的に過剰量のミミック抗原、即ち、自己抗原に類似した異種生物由来の抗原やバクテリア毒素などが吸収されることによって発症するとの仮説に到達した。この仮説は、まず関節リウマチモデルにおいて証明された。即ち、異種動物の関節軟骨から精製しＩＩ型コラーゲンやＬＰＳを単独または混合して実験動物に経口投与して、３種の異なるタイプの関節炎を惹起することにより証明された。特に、エンドトキシンなどのバクテリアが産生する毒素類はその種類に関係なく、ホストの免疫系を非特異的に刺激し、免疫のバランスを崩すだけでなく、直接関節炎などを惹起するなど多くの病因としての作用がある。そこで、本発明者らは、消化管内のバクテリアが最も大量に生産し、自己免疫疾患発症の主要原因と推察されるＬＰＳに注目し、その消化管吸収を防止することにより自己免疫疾患を予防ならびに治療に役立つ仮説を考案した。
まず、マウスにニワトリのＩＩ型コラーゲンを１０週間以上に亘り経口投与したところ、明らかにニワトリコラーゲンに対する抗体が産生され、その一部がマウスＩＩ型コラーゲンと交叉反応し、臨床的に明確な関節炎が発症した（Ｋ．Ｔｅｒａｔｏ，Ｘ．Ｙ．Ｙｅ，Ｈ．Ｍｉｙａｈａｒａ，Ｍ．Ａ．Ｃｒｅｍｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｇｒｉｆｉｔｈｓ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏ−ｉｍｍｕｎｅ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ＤＢＡ／１  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｏｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ：Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．３５，８２８−８３８，１９９６）．
一方、ヒトでも動物でも、ＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体が陽性であるからといって必ずしも関節炎が発症するわけではなく、第２の因子が関与している可能性が大きい。第２の因子として各種の細菌毒素が上げられるが、エンドトキシンが恒常的に大量に消化管内に存在しているため、エンドトキシンが最も頻繁に自己免疫と関与していることが容易に伺い知れ、これを証明するための実験を行った。即ち、抗体単独では関節炎を発症しない量のＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体をマウスに投与し、このマウスにＬＰＳを腹腔内さらには経口投与したところ、激しい関節炎が発症した。この結果から、エンドトキシンなどの外的要因が最も重要な病因であろうと考えられ、関節リウマチの病因の仮説が実証されたと考えるに至った。
（Ｋ．Ｔｅｒａｔｏ，Ｄ．Ｓ．Ｈａｒｐｅｒ，Ｍ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｄ．Ａ．Ｈａｓｔｙ，Ｘ．Ｙ．Ｙｅ，Ｍ．Ａ．Ｃｒｅｍｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｓｅｙｅｒ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｙｐａｓｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．
2008029897.tif 000002
ＬＰＳが関節リウマチ以外の自己免疫病の発症に関わることは、自己免疫性脳脊髄炎（Ｎｏｇａｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５，１７５；９５９−９６６），ループス肺炎（Ｃｈａｅ  ＢＳ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２００６  ２９；３０２−３０９）自己免疫性甲状腺炎（Ｄａｍｏｔｔｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ  ２００３  １４；５２−５９）原発性胆汁性肝硬変（Ｂａｌｌｏｔ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  ２００４  ２２；１５３−１５８），ギランバレー症候群（Ｙｕｋｉ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００４  １０１；１１４０４−１１４０９）などにおいても知られている。
本発明者らは、さらに、このモデル動物を用い、エンドトキシンに対する抗体を経口投与することにより、関節炎の発症を阻止しうることを証明した（ＪＰ−Ａ  ２００６−１５１９１４）。このことは、ＬＰＳの除去が自己免疫疾患の治療に役立つことが関節リウマチにおいて示されたと考えられる。
抗体は、これを医薬品として用いるためには、大量生産が困難で、高額の生産コストがかかる。さらに、抗体は熱により活性が失われやすく物性が不安定で、たんぱく質であるために、経口摂取では消化酵素による抗体活性の失活などの問題点があり、経済的のみならず物性的に問題点が大きい。そこで、物性が安定、大量生産可能、低価格であるとともに、安全性についても問題のない除去剤の創出が望まれる。
注射剤などの製造にあたっては、微量であっても発熱などの副作用の原因となるので、エンドトキシンを除去する必要がある。そのために、エンドトキシンの特異的な除去剤が工業的に使用されている。それらは、エンドトキシンに高い親和性を有する分子基を結合させた合成繊維や布、粒子による形成物で、エンドトキシンを除きたい溶液に接触させることによりエンドトキシンのみを特異的に吸着させて、エンドトキシンを
除くことが出来るものであり、多種の製品が使用されている（アフィプレップポリミキシン（バイオ・ラッド社、米国）トレミキシン（東レ・メデイカル（株））、ＪＰ−Ａ  １１−３３５３９６、ＪＰ−Ａ  ２００２−２６３４８６）。
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、経口摂取が可能な非消化性および非吸収性を特徴とする粒子で、粒子径５μｍ以下が体積換算分布で１％以下で、且つ、粒子径５０μｍミクロン以下が９０％以上のエンドトキシン吸着体である。
さらに、本発明は、上記エンドトキシン吸着体を含むエンドトキシン吸収剤または自己免疫疾患予防治療剤、上記エンドトキシン吸着体を患者に投与することを含む自己免疫疾患を予防または治療する方法、上記エンドトキシン吸着体の自己免疫疾患予防または治療剤を製造する用途も提供する。
発明の詳細な説明
本発明のエンドトキシン吸着剤開発に関しての基本要件について述べると、エンドトキシン吸着体を自己免疫疾患の治療に用いるためには、その吸着体は、１）エンドトキシン吸着能が高いとだけでなく、２）患者への経口投与に適した物性を持ち、しかも、３）有害な副作用を持たない人体に安全なものである、ことである。消化管に生息する細菌は１００兆個とも言われ、ＬＰＳ保有腸内細菌も莫大な数と推察される。従って、消化管内に存在する大量のエンドトキシンを効率的に除去するには用いるエンドトキシン吸着剤は、まず多量のエンドトキシン結合能があることが必要である。
これらの諸問題点を解決するために鋭意研究を重ね、エンドトキシン吸着活性と安全性の両面から、人体使用に適した新規エンドトキシン吸着剤を完成させるに至った。
エンドトキシンの毒性活性は分子中の脂質部分にあり、リピドＡと呼ばれている。本発明はリピドＡ結合分子とこれを担持する細粒子で構成され、これを摂取して、消化管内のエンドトキシンを吸着し便中に排泄させ、リウマチをはじめとする自己免疫疾患を予防、治療剤するものである。
本発明は次の好ましい態様を含む。
１．エンドトキシンの試験管内吸着活性が、乾燥粉末１ｇ当たり１０×１０６エンドトキシン単位（ＥＵ）以上である上記エンドトキシン吸着体。
２．エンドトキシンの試験管内吸着活性が、乾燥粉末１ｇ当たり５０×１０６エンドトキシン単位（ＥＵ）以上である上記エンドトキシン吸着体。
３．エンドトキシンの試験管内吸着活性が、乾燥粉末１ｇ当たり１００×１０６エンドトキシン単位（ＥＵ）以上である上記エンドトキシン吸着体。
４．エンドトキシン結合活性基とこれを担持する細粒子を含む上記エンドトキシン吸着体。
５．エンドトキシン結合活性を有するリピドＡ結合分子を含む上記エンドトキシン吸着体。
６．リピドＡ結合分子がポリミキシンＢである上記エンドトキシン吸着体。
７．リピドＡ結合分子がポリミキシンＢであり、担体微粒子がカルボキシル基を有する弱酸性陽イオン交換樹脂である上記エンドトキシン吸着体。
８．上記エンドトキシン吸着体の薬理学上の有効量を自己免疫疾患の予防または治療が必要な患者に投与することを含む自己免疫疾患を予防または治療する方法。
本発明は、本発明エンドトキシン吸着体の自己免疫病予防剤または治療剤を提供する。好ましくは、ループス肺炎、原発性胆汁性肝硬変、関節リウマチ、自己免疫性肝炎、自己免疫性腎炎、内耳自己免疫病、自己免疫性脳脊髄炎、自己免疫性甲状腺炎、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス、多発性皮膚筋炎、乾癬、シェーグレン症候群、潰瘍性大腸炎、クローン病またはギランバレー症候群に対する予防剤または治療剤を提供する。
即ち、本発明は、本発明エンドトキシン吸着体の上記病への予防または治療用途、予防剤または治療剤の製造養用途あるいは予防または治療方法を提供する。
本発明は、本発明エンドトキシン吸着体により自己免疫病を緩和または抑制することができる。
リピドＡ結合物質としては、ペプチド抗生物質であるポリミキシンＢやＬＰＳ結合性を有するペプチド（ＪＰ−Ａ  １１−３３５３９６、ＪＰ−Ａ  ２００２−２６３４８６、ＪＰ−Ａ  ２００２−３１１０２９、ＪＰ−Ａ  ２００４−２９２３５７、ＪＰ−Ａ  ２００１−５１２１４０）が知られている。これらのいずれも本発明に使用できる。
ＬＰＳ結合活性物を担持する担体としては、形状は服用に適した粒子または微粉末で、担体の素材としては、セルロース、アガロース、マンナン、グルカン、キチンなどの多糖体とそれらの誘導体、ポリアクリル系、ポリスチレン系、ポリプロピレン系、ポリアミド系、ポリビニル系、などが挙げられる。
担体にリピドＡ結合物質を共有結合させる方法は特に限定されるものではなく、固定化酵素の一般的な架橋試薬、例えば水溶性カルボジイミド試薬であるＥＣＤＩ、ヘキサメチレンジイソシアネート、２個のエポキシ基を有するプロピレングリコールジグリシジルエーテル、エピクロルヒドリンを用いることができる。
リピドＡ結合物質と担体の結合物は無害であること、体内移行がないこと、胃酸やひとが分泌する消化酵素のみならず、消化管内の微生物により分解、変性を受けないものであることが望ましい。本発明の非消化性とは動物の消化酵素と微生物による分解を受けないことを意味する。
消化管内に生息する微生物には、人体の消化酵素には分解できない植物繊維などを分解する細菌が存在することが知られている（文献Ｋｏｐｅｃｎｙ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ．Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（Ｐｒａｈａ）．２００４；４９：１７５−７），Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｅｔａｒｙ−ｆｉｂｅｒ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎｓｔａｒｃｈｙ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｕｓｉｎｇ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２；５９：１８２−９）。  従って、本発明に当たっては、ＬＰＳ結合活性物を担持する担体としては、細菌による分解を受けない素材を選択し、セルロース、アガロース、マンナン、グルカン、キチンなどの天然由来の多糖体は除外した。
天然由来の多糖体に対し、合成樹脂の多くは消化酵素や微生物由来の酵素の影響を受けない。また、人が摂取しても安全であることはカリウム血漿治療剤としてのポリスチレンスルホン酸カルシウムやコレステロール低下剤としての陰イオン交換樹脂製剤であるコレスチラミンなどが使用されていることから、合成樹脂の中からリピドＡ結合物質の担体を選択することが望ましい。
担体の大きさについて考察すると、小腸、大腸にはパイエル板といわれるリンパ組織があり、パイエル板の表面を覆うＭ細胞は消化管内面に露出し、粒子状の物質も貪喰することが知られており（Ｇｅｒｂｅｒｔ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｃｙｔｏｌ．１９９６；１６７：９１−１５９）、酵母程度の数μｍの粒子は貪食される。本発明においては、ポリスチレンスルホン酸カルシウムの日本薬局方における品質規格と同様に径５μｍ以下の粒子は含めないこととした。
ＬＰＳは分子量１万を上回る高分子で、ＬＰＳの吸着は主として担体粒子の表面であると考えられ、表面積が大きいことが要求される。そのためには、粒子粉末は小さい径であるほど、活性が高いと考えられる。このことは、実施例１２において示された。
工業的な樹脂の微粉砕技術としては、乾式法と湿式法に大別される。乾式法としては衝撃式、スクリーン式、摩砕式等がある。湿式法としては媒体撹拌式等があげられる。他にも様々な粉砕方法があるが、樹脂を微粉化できる技術であれば特に限定されない。いずれの方法でも可能である。
粒子の大きさは粒度分布の測定により実施した。方法は第十三改正日本薬局方、第二追補の一般試験法６５項の粉黛粒度測定法第一法光学顕微鏡法に準じて粒度分布を測定した。粒子の大きさは５０％粒径、即ち累積体積換算値が５０％を示すときの粒径、をμｍ単位により示した。
ＬＰＳ結合活性に関して、試験管内における評価は日本薬局方エンドトキシンシ試験法に準拠した測定と、より簡便な紫外部吸収による測定を開発して実施した。その詳細を実施例１０，１１に記載した。
ＬＰＳ吸着除去による自己免疫疾患予防治療効果を調べる方法については、ＪＰ−Ａ  ２００６−１５１９１４に記載した方法に順じ評価される。即ち、マウス関節コラーゲンにたいするマウスモノクローナル抗体のカクテル（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ製）は、この十分量の注射をすると３日目には、あるいは３日以内には、１００％の確立で関節炎を発症する（Ｔｅｒａｔｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８，２１０３−２１０８）。しかし、この自己抗体の量を減らして、２ｍｇの投与では関節炎を発症しない。ＤＢＡ／１マウスに自己抗体投与日を０日として、マウス当たりＬＰＳの３ｍｇを０日、１日、２日の３日間経口投与することにより、関節炎を発症し、６〜７日で最大の腫れを記録する。しかし、ＬＰＳの経口投与に際し、ＬＰＳの消化管吸収を高めるために、動物にインドメタシンと鶏卵由来の蛋白分解阻害活性を有するオボムコイドを投与して、前処置することにより、ＬＰＳ投与による関節の腫脹を高めることが出来る。この試験系にＬＰＳ吸着剤を経口投与することにより、関節炎の発症は抑制され、抑制の程度を測定して、ＬＰＳ吸着剤の評価をおこなうことができる。本特許ではこの方法を採用した。この方法の特徴は、マウスに軟骨由来のＩＩ型コラーゲンを注射して免疫することにより発症する方法に較べて、短期間ですみ、関節炎の程度の、マウス個体によるばらつきが少なく、従って、エンドトキシン除去活性の評価が正確となるという特徴を有する。
リピドＡ結合物質と担体の結合物は、人が服用して用いるために、経口摂取で用いる一般の医薬品としての製剤、例えば、末剤、散剤、カプセル剤、錠剤、液剤として用いられる。これらの製剤は、通常の方法で、薬学的に許容される賦形剤、添加剤と共に各種製剤にすることができる。
治療予防の投与量、投与回数は通常は成人に対し、１日当たり約１０ｍｇ〜１０ｇを１回もしくは３回に分けて投与することができる。
【実施例】
【０００４】
以下に、本発明について実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１、  エポキシアクリル樹脂ポリミキシンＢ結合体ＲＰＭＢ
ポリミキシンＢ硫酸塩３００万単位（マルコ製薬株式会社製）を０．１ＭＮａＣｌ溶液２００ｍｌに溶かし、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８に調整し、ビーカーに入れた。エポキシ活性基を有するポリアクリル樹脂（アンバーザイム；米国ロームアンドハース社製）４ｇを加え、攪拌プロペラで７２時間攪拌した。樹脂を５μｍメンブレンフィルター上で精製水１０００ｍｌで洗浄し、あらかじめ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．０に調整した１Ｍグリシン溶液５０ｍｌを含むビーカーに入れ、一夜置き、ろ過後、精製水２リットルを流して洗浄した。樹脂に残留する水分はデシケータ内に置いて乾燥させ、ポリミキシン結合樹脂（以下球状ＲＰＭＢとする）３．９ｇを得た。
実施例２、  エポキシアクリル樹脂ポリミキシンＢ結合体ＲＰＭＢ−１
エポキシ活性基を有するポリアクリル樹脂（アンバーザイム；米国ロームアンドハース社製）４ｇを乳鉢にいれた。ポリミキシンＢ硫酸塩３００万単位を０．１ＭＮａＣｌ溶液２００ｍｌに溶かし、水酸化ナトリウムを加えてｐＨを８に調整した。調整したポリミキシンＢ硫酸塩溶液を少量ずつ加え、乳棒を用いて樹脂を擂り潰した。すべてのポリミキシンＢ硫酸塩溶液を加え、７２時間マグネチックスタラーで攪拌した。樹脂を５μｍメンブレンフィルター上で精製水１０００ｍｌで洗浄し、これを、あらかじめ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．０に調整した１Ｍグリシン溶液５０ｍｌを含むビーカーに入れ、一夜置き、ろ過後、精製水２リットルを流して洗浄した。樹脂に残留する水分はデシケータ内に置いて乾燥させ、ポリミキシン結合樹脂（以下ＲＰＭＢ−１とする）３．２ｇを得た。
実施例３、  エポキシアクリル樹脂ポリミキシンＢ結合体ＲＰＭＢ−２
エポキシ活性基を有するポリアクリル樹脂（アンバーザイム；米国ロームアンドハース社製）１ｇを乳鉢にいれ、こすって樹脂粒子を砕いた。これを２０ｍｌの水に懸濁させ、エピクロルヒドリン０．６ｇと５０％ＮａＯＨ溶液０．３ｍｌを加え２時間撹拌しながら反応させた。反応物を５μｍメンブレンフィルター上で精製水１００ｍｌで洗浄し、得られたエポキシアクリル樹脂をビーカーに移し、ポリミキシンＢ硫酸塩３００万単位を含むｐＨ１０の１Ｍりん酸緩衝液５ｍｌを加えて懸濁し、４０℃で１６時間攪拌して反応させた。これに、あらかじめ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．０に調整した１Ｍグリシン溶液５０ｍｌを含むビーカーに入れ、一夜置き、ろ過後、精製水２リットルを流して洗浄した。樹脂に残留する水分はデシケータ内に置いて乾燥させ、ポリミキシンＢ結合樹脂、４／３００を０．５ｇ（ＲＰＭＢ−２）を得た。
実施例４、  弱酸性陽イオン交換樹脂ポリミキシンＢ結合体
カルボキシル基を有する弱酸性陽イオン交換樹脂（ダウエックスＭＡＣ−３）４ｇをビーカーにとり、０．１Ｍ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５５０ｍｌを加え、カップリング試薬１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（シグマ）１ｇを加え、４℃で２時間振蕩した。樹脂を５μｍメンブレンフィルター上で精製水２００ｍｌで洗浄し、活性化樹脂を得た。をこの樹脂をビーカーに取り、０．１Ｍ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５  ５０ｍｌに懸濁し、次いで、１０ｍｌの０．１Ｍ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５に溶解したポリミキシンＢ硫酸塩溶液の３００万単位を加えて、４℃に１６時間振蕩した。樹脂を５μｍメンブレンフィルター上に集め、あらかじめ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．０に調整した１Ｍグリシン溶液５０ｍｌを含むビーカーに入れ、４℃で一夜置き、ろ過後、精製水２リットルを流して洗浄した。樹脂に残留する水分はデシケータ内に置いて乾燥させ、弱酸性陽イオン交換樹脂ポリミキシンＢ結合体の３．８ｇを得た。これを４／３００とした。
実施例５、  弱酸性陽イオン交換樹脂ポリミキシンＢ結合体  １／３００
弱酸性陽イオン交換樹脂（ダウエックスＭＡＣ−３）１ｇを用い、実施例４と同じ操作にて、弱酸性陽イオン交換樹脂ポリミキシンＢ結合体０．９ｇを得た。これを１１３００とした。
実施例６、  弱酸性陽イオン交換樹脂ポリミキシンＢ結合体  ４Ｍ／３００
カルボキシ基を有する弱酸性陽イオン交換樹脂（ダウエックスＭＡＣ−３）４ｇを乳鉢を用いて擂り、十分に樹脂粒子を細かくした。０．１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液  ｐＨ７．５  ５０ｍｌを加え、カップリング試薬１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（シグマ）１ｇを加え、４℃で２時間振蕩した。樹脂を、５μｍメンブレンフィルター上で精製水２００ｍｌで洗浄し、活性化樹脂を得た。をこの樹脂を０．１Ｍ  ＭＯＰＳ  ｐＨ７．５  ５０ｍｌに溶かし、ビーカーに入れ、次いで、１０ｍｌの０．１Ｍ  ＭＯＰＳ緩衝液  ｐＨ７．５に溶解した硫酸ポリミキシンＢ硫酸塩３００万単位を加えて、４℃に１６時間振蕩した。樹脂を５μｍメンブレンフィルター上に集め、あらかじめ水酸化ナトリウムを加えてｐＨ８．０に調整した１Ｍグリシン溶液５０ｍｌを含むビーカーに入れ、一夜置き、ろ過後、精製水２リットルを流して洗浄した。樹脂に残留する水分はデシケータ内に置いて乾燥させ、樹脂３．１ｇを得た。これを４Ｍ／３００とした。
実施例７、  弱酸性陽イオン交換樹脂ポリミキシンＢ結合体  １Ｍ／３００
弱酸性陽イオン交換樹脂（ダウエックスＭＡＣ−３）１ｇを乳鉢を用いて擂り、十分に樹脂粒子を細かくした。実施例６と同じ操作で、４Ｍ／３００と同様にポリミキシンＢ硫酸塩３００万単位とカップリングし、弱酸性陽イオン交換樹脂ポリミキシンＢ結合体の０．５２ｇを得た。これを１Ｍ／３００とした。
実施例８、  樹脂の粉砕（工業スケールにおける樹脂の粉砕）
ダウエックス社製樹脂ＭＡＣ−３（粒子径３００〜１２００□ｍ）３３００Ｌをダルトン製ネアミルＮＥＡ−４８型粉砕機により処理し、粒子径１０〜５０□ｍ、平均粒子径  ３０□ｍの粉砕樹脂約１４００ｋｇを得た。
実施例９
粒度分布の測定は第十三改正日本薬局方、第二追補の一般試験法６５項の粉黛粒度測定法第一法光学顕微鏡法に準じて粒度分布を測定した。光学顕微鏡はＥ６００，ニコン  ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００，カメラはビクターＫＹ−Ｆ５５Ｂ，解析ソフトはＮａｎｏ  Ｈｕｎｔｅｒ  ＮＳ２Ｋ−Ｐｒｏを用いて実施例１で調整したＲＰＭＢの粒度分布を測定した。表１に結果を示したごとく、ＲＰＭＢは５０％粒径、２１３μｍで、粒径５．０μｍ以下の細かい粒子の含量は０％であった。
【表１】
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実施例１０、  エンドトキシン吸着除去活性（１）
エンドトキシンの測定は、エンドスペシーＥＳ―２４Ｓセット（生化学工業）を用いてエンドポイント比色法により定量した。シグマ社製大腸菌Ｏ−１１１株のリポポリサッカライド（製品番号Ｌ４１３０）をパイロジェンフリーの精製水に５μｇ／ｍｌに溶解し、試験菅にその１ｍｌを入れ、実施例１において調製したＲＰＭＢ−１を１００μｇ、５０μｇ、また、対照として、ポリミキシンＢを結合しない樹脂を１００μｇを加え、３７℃で回転子を加えて攪拌し、ＲＰＭＢ−１添加前、添加１０，２０分後のエンドトキシン量を測定した。
その結果、表２に示したごとく、ポリミキシンＢを結合した樹脂（ＲＰＭＢ−１）がＬＰＳを特異的に吸着除去しうることが示された。
【表２】
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実施例１１、  エンドトキシン吸着除去活性（２）
エンドトキシン濃度の高い濃度におけるポリミキシンＢ結合樹脂の吸着除去能について評価した。
りん酸緩衝生理食塩液ｐＨ７．２に大腸菌Ｏ−１１１株ＬＰＳ（シグマ、製品番号Ｌ４１３０）を０．２ｍｇ／ｍｌに溶解し、その４ｍｌをＲＰＭＢ−１の２０．６ｍｇを入れた試験管に加え、３７℃でマグネチックスタラーにて攪拌し、３０分おきに、遠心上清を採取し、波長２１０ｎｍにおける紫外部吸光度を測定した。
２１０ｎｍにおける吸光値は最初の３０分で１．０から０．６に減少し、その後は一定となった。そこで、その上清にあらたに２０．５ｍｇのＲＰＭＢ−１を加えたところ吸光度は０．６から０．４に低下したことから、試験管１にあったＲＰＭＢ１の２０．６ｍｇはＬＰＳが飽和状態に吸着していると判断し、吸光度の減少からＲＰＭＢ−１のＬＰＳ吸着量を試験に用いたシグマＬＰＳ換算値として算出した。なお、用いたＬＰＳ標品は純粋なものではなく、ＤＮＡや蛋白質の混在があり、最終的な吸光値０．４はそれらに由来するものと推定された。従って、１ｇのＲＰＭＢ−１は以下の計算式により、シグマ社ＬＰＳの約２５．９ｍｇを吸着すると計された。
（０．８ｍｇ  ｘ０．４／０．６）／０．０２０６＝２５．９ｍｇ
なお、用いたＬＰＳの１ｍｇはエンドトキシンの１．１×１０６ＥＵに相当するので、ＲＰＭＢ−１の１ｇは２９×１０６ＥＵのエンドトキシンを吸着すると計算された。
実施例１２、  粒子サイズとエンドトキシン除去活性
実施例１〜実施例７において調整した、樹脂ポリミキシンＢ結合体のそれぞれについて、実施例９に示した粒度分布測定の方法、ならびに実施例１１に示したエンドトキシン吸着除去活性測定の方法に従い、それぞれ粒度分布とＬＰＳ吸着活性を測定し、その粒子サイズとエンドトキシン吸着能の関係を調べた。なお、陽性対象としてバイオラット社のアフィプレップポリミキシンＢを用いた。
同じ３００万単位のＰＭＢを用いて調整した各ロットのエンドトキシン吸着剤につき、エンドトキシン除去活性をエンドトキシン単位（ＥＵ）と、この実験に用いたＬＰＳ標品（シグマ製大腸菌Ｏ−１１１，Ｂ４株菌体よりトリクロル酢酸法により抽出したＬＰＳ、製品番号Ｌ４１３０）の乾燥質量に換算して示した。
結果は表３に示したごとく、実施例１〜７の樹脂ポリミキシンＢ結合体は、いずれもポリミキシンＢ硫酸塩３００万単位を用いて調整したものであるが、５０％粒径が小さいほど、ＬＰＳ吸着活性が高いことが示された。
【表３】
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実施例１３：自己抗体とＬＰＳの関与する関節炎モデルにおける評価
関節炎モデル用のマウスはＤＢＡ／１ＪＮＣｒｊマウス（日本チャールス・リバー株式会社）を１群５匹として５群（Ｇ１−Ｇ５）を用意した。ＬＰＳの経口吸収を高めるために、マウス１匹あたりにインドメタシン（シグマ）４０μｇとオボムコイド（シグマ）２ｍｇを、−６日〜−２日の連日５回、すべてのマウスに経口投与した。次いで、０日に抗コラーゲン抗体カクテル（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液の０．２ｍｌをすべてのマウスに静脈投与した。また、大腸菌Ｏ−１１１由来エンドトキシン（シグマ社製、フェノール抽出リポポリサッカライド）は７．５ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳに溶解し、その０．２ｍｌを０日、１日、２日にＧ１−Ｇ４のマウスに経口投与した。エンドトキシン吸着剤、ＲＰＭＢ−１、は１００ｍｇ／ｍｌとなるように蒸留水に懸濁し、真空ポンプで樹脂中の空気を抜き、凝集した樹脂を均一なサスペンジョンにし用いた。ＲＰＭＢ−１はＬＰＳ投与後、Ｇ２のマウスに０．１２５ｍｌ，Ｇ３に０．２５ｍｌ、Ｇ４に０．５ｍｌを１日２回、経口投与した。またコントロールのＧ１には０．２５ｍｌの非結合樹脂のみを投与した。また、関節炎陽性コントロールとして用いたＧ５には３日に０．１ｍｌのＬＰＳ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ，ＰＢＳ）の０．１ｍｌを腹腔に投与した。
抗体投与の０日から１４日まで毎日関節炎の発症を観察し、関節炎の重篤度は０−４の５段階のスコアーで表示した。０；腫れの症状なし。１；指の１本に腫脹発赤、２；指２本以上の腫脹発赤または手足の甲のみの発赤、３；手足の甲の腫脹発赤、４；手足首とすべての指関節の発赤腫脹。各マウスについて四肢の合計を合わせて、最高１６点が固体のスコアーである。
各グループ５匹の平均値をもとめ、それを用いてまた、関節症状の抑制率の算出は次式によった。
抑制率％＝（（１−テスト群のスコアー）／コントロール群のスコアー）×１００
マウスの関節炎は７日にピークに達したので、エンドトキシン吸着剤による関節症状の抑制効果は７日における抑制率により評価した。実施例２で作成したＲＰＭＢ−１の２５ｍｇ，５０ｍｇ，１００ｍｇをマウスに経口投与した時の関節炎抑制効果を表４に示した。ＲＰＭＢ−１の１００ｍｇの投与を受けたマウスは５匹とも全く関節炎の発症は見られず、５０ｍｇ投与群では５匹中２匹（平均スコアー：２）に、また２５ｍｇ投与群では５匹中４匹（平均スコアー：９）に関節炎の発症が認められ、関節炎抑制率に用量依存性のあることが判明した（表４、実験１）。
同様に、ＲＰＭＢ−１よりもエンドトキシン吸着能の高い、ＲＰＭＢ−２，１Ｍ／３００並びに４Ｍ／３００の１０ｍｇをマウスに投与し、それらの関節炎抑制作用を調べた。その結果、これらの３種のエンドトキシン吸着剤はいずれも同程度に有効で、関節炎発症をほぼ完全に押さえた（表４、実験２）。
【表４】
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実施例１４：錠剤
実施例７に示した１Ｍ／３００の１５ｇを２．５ｇの乳糖、２．４ｇのトウモロコシデンプン及び０．１ｇのステアリン酸マグネシウムと混合し、打錠機により打錠して、１Ｍ／３００が１錠当たり２００ｍｇ含む錠剤とした。
実施例１５：  カプセル剤
実施例３に示したＲＰＭＢ−２の粉末を硬カプセルに１５０ｍｇとなるように充填してカプセル剤を得た。
【国際調査報告】
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