(57)【要約】  本発明は、パイエル板の機能を高めてIgAの産生をうながし、かつヒト腸管に定着性を有するLactobacillus属細菌および前記Lactobacillus属細菌菌体を有効成分とするIgA産生促進剤を提供する。本発明は、ラクトバチルス・アミロボラスの菌体を有効成分とするIgA産生促進剤、特に、ラクトバチルス・アミロボラスがCP1750株（FERM BP-10532）を有効成分とするIgA産生促進剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・アミロボラスの菌体を有効成分とするIgA産生促進剤。
【請求項２】
受託番号FERM BP-10532で特定されるクトバチルス・アミロボラスCP1750株の菌体を有効成分とする、請求項１記載のIgA産生促進剤。
【請求項３】
食品への添加用である、請求項１または２記載のIgA産生促進剤。
【請求項４】
受託番号FERM BP-10532で特定されるラクトバチルス・アミロボラスCP1750株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、IgAの産生促進剤に関する。特に、本発明は腸内で効果的に作用するIgA産生促進剤に関する。【０００２】
（背景技術）
IgAは、唾液、腸、気管等の分泌液中に存在し、口内および小腸などの粘膜から侵入する微生物およびアレルゲンを遮断するなど粘膜バリア機能の増強において重要な役割を有する分子であることが知られている。またIgAは免疫機能の未熟な乳児の生体を防御するために、受動免疫として母乳由来のIgAが乳児の免疫機能補填に使用されていることもよく知られている。
一方、乳酸菌の免疫修飾機能については、近年様々な報告がなされており、作用機作や菌種・菌株による差異についての情報も少しずつ明らかにされてくるようになった（廣田哲二：New Food Industry, Vol.32, No.10, p9 (1990)。しかし、これらの報告においても、全ての免疫修飾機能をカバーしているわけではなく、また、全ての乳酸菌種について検討がなされているわけでもない。したがって、未だに全体像が把握されていないきわめて不完全な情報が得られているにすぎない。IgAの分泌を促進する乳酸菌についても一部検討がなされてきており、特に、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌については乳児糞便中での存在比が高いため、乳児では何らかの働きを有すると考えられている。ビフィドバクテリウム属細菌をパイエル板細胞と共培養し、IgA誘導活性の高いものを選別するといった試みがなされている。具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）やビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）にIgAの分泌促進作用の強い菌株が存在することが報告されている（特開平02-280059）。しかしながら、ビフィドバクテリウム属細菌はそもそもヒト成人の小腸にはほとんど存在しないことが知られており、従って、通常ではパイエル板との接触もほとんどないと予測される。実際、個々に選ばれたこのような菌種・菌株がインビボ、特にヒトの腸内において十分機能しうるかどうかは確かめられていない。【０００３】
乳酸菌一般を俯瞰した場合、ラクトバチルス（Lactobacillus）属細菌についてはIgA産生との関連性を示唆する報告はなく、特に腸管免疫に重要な働きを有するパイエル板が存在する小腸に多く存在し、定着性に富むラクトバチルス属菌種・菌株のIgA産生促進機能について菌種・菌株間で比較し、活性の高い菌種・菌株を見いだそうとする試みに関する報告はみられない。また、ラクトバチルス属細菌のヒト腸内局在性について、ラクトバチルス・アミロボラス(Lactobacillus amylovorus、L.amylovorus)は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ガッセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ジョンソニィ（Lactobacillus johnsonii）とともにヒトフローラにおいて優勢なラクトバチルス属乳酸菌であることが報告されている(Bioscience Microflora, 22 (3), 75-83, 2003)。【０００４】
（発明の開示）
本発明は、パイエル板等の機能を高めてIgAの産生をうながすことができ、かつヒト腸管に定着性を有するラクトバチルス属細菌、および前記ラクトバチルス属細菌の菌体を有効成分とするIgA産生促進剤を提供する。【０００５】
本発明者らは、ヒトの腸管に存在する、あるいは存在しない（ヒト糞便由来のものと他の由来のもの）ラクトバチルス属のいくつかの種の菌株を用いてそれらのパイエル板細胞に対するIgA産生促進活性を測定し、ラクトバチルス属菌種間においてパイエル板細胞のIgA産生促進活性に差が認められることを明らかにした。特に、ヒト腸管定着性のラクトバチルス属菌種の中で、ラクトバチルス・アミロボラスがIgA産生誘導活性に富むことを見いだした。
従って、本発明は、ラクトバチルス・アミロボラスの菌体を有効成分とするIgA産生促進剤である。特に、ラクトバチルス・アミロボラス CP1750株（FERM BP-10532）を有効成分とするIgA産生促進剤である。【０００６】
本発明により、免疫バリアを増強することのできるIgA産生促進剤が提供される。従って、本発明により免疫バリア増強を目的とする免疫調節剤、食品または飼料（飲料を含む）、特に発酵乳、栄養食品、機能性食品、特定保健用食品、ドリンク剤、タブレットなどが提供される。本発明のIgA産生促進剤により、花粉、ダニ、ハウスダストなどの環境アレルゲンのほか、食物アレルゲンや病原性の微生物の侵入を防ぐため、生体の粘膜バリア機能を高めることができる。【０００７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、アレルゲンを含め抗原物質が粘膜への接触を阻害する作用を有するIgAの誘導能について従来知られていなかったラクトバチルス属細菌菌体を有効成分とする、IgA産生促進剤である。本明細書において「IgA産生促進剤」はIgAの産生を促進させる活性を有する組成物を意味する。また、本発明の「IgA産生促進剤」はIgA産生促進を目的とする限り特に用途は限定されず、例えば、医薬として、または、食品（飲料を含む）への添加用として使用することができる。特に、本発明のIgA産生促進剤は、腸管の免疫担当組織との接触の機会が高いと考えられる腸管定着性に富むラクトバチルス属の中でも、高いIｇA産生誘導能が認められたラクトバチルス・アミロボラスの菌体を有効成分として含む。本発明に使用し得るラクトバチルス・アミロボラスの菌株には、ラクトバチルス・アミロボラスCP1750株が含まれる。ラクトバチルス・アミロボラスCP1750株は平成１７年３月８日に独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６、郵便番号305-8566）に寄託され、受託番号FERM BP-10532が付与されている。【０００８】
IgAは一般にパイエル板を含む粘膜組織によって多く産生され、気管、小腸からの分泌液や唾液、初乳中に多く見られる抗体である。パイエル板はヒトを含む哺乳動物の小腸の粘膜に存在し、IgA産生細胞を多数含んでいる組織である。本発明者らは、ヒト腸内フローラに認められる種々のラクトバチルス属細菌、およびヒト腸内フローラにはほとんど若しくは全く存在しない種々のラクトバチルス属細菌の菌体存在下でパイエル板を培養し、パイエル板細胞のIgA産生を調べ、その結果、上述のように、ラクトバチルス属菌種間でパイエル板細胞のIgA産生促進活性に差が認められることを明らかにし、ヒト腸内フローラにおいて優勢なラクトバチルス種の中でもL.amylovorusが特に高いIgA産生促進活性を有することを見いだした。種々のL.amylovorus菌株の菌体存在下でパイエル板細胞を共存培養し、共存培養下でパイエル板細胞が産生したIgA量を測定することによって、これらのL.amylovorus株が本発明に使用できることを確認することができる。【０００９】
パイエル板細胞に対するIgA産生促進活性は例えば以下のように測定することができる。細菌、例えばラクトバチルス属細菌を通常の培地および条件、例えばMRS培地（Difco）で約37℃〜45℃にて12〜18時間培養し、遠心により菌体を回収し、得られた菌体を滅菌水またはPBS等の適切なバッファーで洗浄した後、凍結乾燥する。凍結乾燥した菌体はPBS等の適切なバッファーに懸濁し、100℃にて加熱（例えば、約10分間）して殺菌処理し、その後の測定のために保存しておくことができる。一方、パイエル板細胞はマウスの小腸から調製することができる。マウスの小腸をコラゲナーゼ（約１mg/ml）を含む、パイエル板に対して適切な培地、例えばRPMI培地中に置き、細胞がばらばらになるまで、例えば約37℃にて約1時間撹拌する。得られた細胞懸濁液をメッシュを通過させて不要な残渣を除去し、得られた細胞を適切な培地、例えばRMPIで洗浄してパイエル板細胞調製物を得ることができる。得られたパイエル板細胞は適切な培地、例えば５％FCSを含むRPMI培地を入れた96ウェルプレートに約５ｘ105細胞／ウェルになるように播種し、各ウェルに前述の細菌菌体を約10μg/mlになるように添加し、５％CO2雰囲気下で37℃にて約７日間培養し、培養上清を得る。【００１０】
得られた培養上清中のIgA量は常法に従って、例えばELISA法により測定することができる。例えば、適切に希釈した抗-マウスIgA抗体を一次抗体としてELISAプレートに50 μl程度添加して、4℃、一晩静置してコーティングを行なう。ウェルをPBS-Tween溶液で洗浄した後、100 μlの１% BSA/PBS-Tween溶液を各ウェルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行なう。ウェルを洗浄後、IgA標準品または適宜希釈したサンプルをウェルに50 μl添加し、室温で２時間静置する。ウェルを洗浄後、１% BSA/PBS-Tween溶液で希釈した二次抗体、例えば、ビオチン化抗-マウスIgAをウェルに50 μl添加し、室温で２時間静置する。PBS-Tweenでウェルを洗浄後、１% BSA/PBS-Tween溶液で適切に希釈したアルカリフォスファターゼ溶液を50μlウェルに添加し、室温で１時間静置する。PBS-Tweenでウェルを洗浄後、4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウムをジエタノールアミン-塩酸緩衝液(pH8.9) に１mg/mlになるように溶解させ、それをウェルに50μl添加して発色させ、405nmの吸光度を測定することによって各ウェル中の産生されたIgA量を測定することができる。
このような方法によって見いだされた、パイエル板に対するIgA産生促進活性にすぐれたL.amylovorusの一菌株であるCP1750株（FERM BP-10532）はヒト腸管親和性が特に高いため、ヒト、特にヒト腸内において非常に高いIgA産生促進活性を示すことが期待され、本発明のIgA産生促進剤の有効成分として特に好ましい。【００１１】
いかなる理論にも束縛される意図はないが、本発明者らは、IgA産生誘導能を有するヒト腸管定着性の乳酸菌、特にL.amylovorusを含むラクトバチルス属菌種・菌株はパイエル板中の抗体産生細胞に対してIgA産生を促し、さらにはIgA産生細胞に非特異的に働きかけ、IgA産生を高めることによって、抗原をより有効に処理できるようにするアジュバント活性を含むトータルの活性に秀でたものであると考えている。【００１２】
パイエル板のIgA産生を促進させる活性を有することが確認されたL.amylovorus株、例えばCP1750株（FERM BP-10532）は生菌体、死菌体、菌体破砕物、菌体溶解物、菌体粉末を含むどのような形態でもあっても、IgA産生促進活性を失わない限り本発明のIgA産生促進剤の有効成分として使用することができる。従って、特に明示的に示さない限り、「L.amylovorusの菌体」には、生菌体、死菌体、菌体破砕物、菌体溶解物および菌体粉末その他のいずれの形態も含まれる。特に、培養した生菌体および凍結乾燥したL.amylovorus菌体がその簡便性の点で利用価値が高いであろう。必要であれば、いずれの形態についても、上述した方法によりそれらがパイエル板に対してIgA産生促進活性を有することを確認することができる。
本発明のIgA産生促進剤を医薬として使用する場合は、L.amylovorusの菌体の他、他の医薬、並びに、製薬的に許容できる一般的な賦形剤および添加剤を含むことができる。剤形としては、例えば錠剤、散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、糖衣剤、およびシロップ剤でよく、これらは常法に従って製造することができる。また、本発明のIgA産生促進剤は、種々の食品（飲料を含む）または飼料、特に発酵乳、栄養食品、機能性食品、特定保健用食品、ドリンク剤、タブレットに添加することもできる。いずれの形態であっても、本発明のIgA促進剤の目安摂取量は菌体質量（乾燥質量）として、1日当たり20mg（乾燥質量）（菌体数量として約1010個；菌体数はコールターカウンター計数器等で計測することができる）以上が好ましい。または、発酵乳、発酵汁としては、100g程度を1日で摂取するのが好ましい。本発明の有効成分であるL.amylovorusはヒトの小腸内に存在する乳酸菌であるので、本発明のIgA産生促進剤を多量に摂取しても問題となる副作用はないと考えられる。従って、本発明のIgA産生促進剤はヒトの食品用として適している。すなわち、本発明のIgA産生促進剤はそのまま食品として、または、食品に添加して使用するために適している。【００１３】
本発明に使用するL.amylovorusは当業者によく知られた培地および培養条件に従って培養することができるが、ヒト用の医薬、食品および飲料のようなヒトに摂取させる調製物を作製することを目的とする場合は、ヒトが摂取して有害でない培地、例えば、食品規格成分のみで作製した培地を使用することが好ましい。例えば、L.amylovorusを食品規格の成分のみで調製した半合成培地（種類は問わない）を用い、37〜45℃の範囲において12〜18時間培養し、遠心分離を行ない、菌体を回収して、続いて回収した菌体を滅菌水により遠心洗浄する(必要に応じて洗浄を繰り返す)ことによって、本発明のIgA産生促進剤の有効成分として使用するL.amylovorus菌体を得ることができる。得られた菌体は、そのままの状態ないし例えば適宜デキストリンなどの賦形剤を加えた状態で凍結し、凍結乾燥を行なうことで生菌体を含む食品原料を得ることができる。一方、滅菌水洗浄菌体を加熱殺菌したうえで、そのまま、または適宜デキストリンなどの賦形剤をくわえた状態で凍結し、凍結乾燥を行なうか、または噴霧乾燥を行ない、死菌の食品原料を得ることが出来る。このような菌体自体または菌体を食品に添加する形態の場合、１日当たり20mg以上（乾燥質量換算）の菌体が摂取できるように種々の食品または医薬を調製するのが好ましい。
一方、スターター用培地で培養したL.amylovorus培養物を野菜汁、果汁、麦汁、おもゆ、乳汁ならびにこれらの混合汁に数％、例えば３〜６％添加して37℃〜45℃にて発酵させ、仕上がり酸度0.85以上にて冷却して、発酵乳、発酵汁または混合発酵汁を得ることができる。得られた生成物に適宜、甘味料および／または香料を加え、官能特性を整え、そのままチルド製品食品とすることもでき、更に殺菌してシェルフライフを延長した製品を調製してもよい。このような発酵産物の場合、発酵産物として100g程度／日の量で経口摂取するのが好ましい。好ましくは、このような発酵産物100g中、約1010個のL.amylovorus菌体が含まれる。【００１４】
パイエル板細胞を本発明のIgA産生促進剤とともに培養すると、その培養液中に産生されるIgA量が有意に増加する（実施例参照）。一般に粘膜組織細胞においてIgAの産生がよく見られるので、本発明のIgA産生促進剤はパイエル板細胞だけでなく他の粘膜組織におけるIgA産生を促進する作用があると考えられる。従って、本発明のIgA産生促進剤を経口摂取することにより腸管粘膜のみならず全身の粘膜系におけるIgAの産生を促進することができ、全身の粘膜系の感染防御機能を増強し、粘膜より侵入するアレルゲンを遮断し、食物アレルギーを含めアレルギー一般の発症を抑制することができる。例えば、本発明のIgA産生促進剤は口腔内のIgA産生を促進することによって、歯周病菌を抑制し、歯周病の改善・予防のためにも使用することができる。本発明のIgA産生促進剤は副作用がほとんど又は全くなく、きわめて安全である。これに加え、特にCP1750株の菌体を有効成分とするIgA産生促進剤は、ヒト腸管に対して特に親和性が高いため、そのIgA産生促進活性は特に高いと考えられる。【００１５】
実施例
実施例１．
１）乳酸菌菌体の調製
使用した種および菌株は以下の通りである。
L.rhamnosus A  (ラクトバチルス・ラムノサス A株)
L.reuteri A  (ラクトバチルス・ロイテリ A株)
L.plantarum A  (ラクトバチルス・プランタルム A株)
L.paracasei A  (ラクトバチルス・パラカゼイ A株)
L.paracasei B  (ラクトバチルス・パラカゼイ B株)
L.johnsonii A  (ラクトバチルス・ジョンソニィ A株)
L.johnsonii B  (ラクトバチルス・ジョンソニィ B株)
L.galinarum A  （ラクトバチルス・ガリナルム A株）
L.gasseri A  (ラクトバチルス・ガッセリ A株)
L.gasseri B  (ラクトバチルス・ガッセリ B株)
L.fermentum A  (ラクトバチルス・ファーメンタム A株)
L.crispatus A  (ラクトバチルス・クリスパタス A株)
L.buchneri A  (ラクトバチルス・ブフネリ A株) 
L.amylovorus CP1750  (ラクトバチルス・アミロボラス CP1750株)
L.acidophilus A  (ラクトバチルス・アシドフィルス A株)【００１６】
L.amylovorus CP1750は出願人らの標準L.amylovorus保存ストックから任意に選んだ菌株である。これらのラクトバチルス属菌種・菌株をそれぞれMRS培地(Difco Laboratories)100ml中で37℃にて18時間培養後、菌体を洗浄し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、約1011個（約100mg）の乾燥菌体がそれぞれの菌株について得られた。凍結乾燥した菌体の一部をPBSに懸濁し、100℃にて10分間加熱して殺菌処理を行ない、以後の実験に使用した。【００１７】
２）ラクトバチルス属細菌の菌体存在下におけるパイエル板細胞の培養
BALB/cマウス（日本クレアより購入）から小腸を取り出し、そこからパイエル板を切り出した。コラゲナーゼ(Sigma)を１mg/mlになるように5% FCS-RPMIに溶解し、そこに切り出したパイエル板を入れて37℃で１時間攪拌した。細胞がばらばらになったら、細胞懸濁液をメッシュに通してゴミを除き、細胞をRPMIで洗浄してパイエル板細胞を得た。パイエル板細胞を5% FCS-RPMIを入れた96ウェルプレートに5×105細胞/ウェルになるように播種した。そこに１）で調製した菌体懸濁液を10μg/ml（菌体乾燥質量）になるように添加し、5% FCS-RPMI中５％CO2雰囲気下で37℃にて培養し、7日間の培養後に培養上清を回収した。【００１８】
３）パイエル板細胞からのIgA産生量の測定
２）で得られた培養上清中のIgA量をELISA法により測定した。一次抗体 (ヤギ抗-マウス IgA, Zymed Laboratories) を0.1 M Na2HPO4溶液で1000倍希釈したものをELISAプレートに50 μl添加して、4℃、一晩静置してコーティングを行なった。ウェルをPBS-Tween溶液で洗浄した後、100 μlの1% BSA/PBS-Tween溶液を各ウェルに添加し、室温で2時間静置してブロッキングを行なった。ウェルを洗浄後、IgA標準品(IgA; Purified Mouse Myeloma IgA, Zymed Laboratories) もしくは適宜希釈したサンプルをウェルに50 μl添加し、室温で２時間静置した。ウェルを洗浄後、1% BSA/PBS-Tween溶液で希釈した二次抗体(IgA; ビオチン 抗-マウス IgA, クローン; C10-1, BD Pharmingen)をウェルに50 μl添加し、室温で2時間静置した。PBS-Tweenでウェルを洗浄後、1% BSA/PBS-Tween溶液で1000倍希釈したアルカリフォスファターゼ溶液 (Zymed)を50μlウェルに添加し、室温で1時間静置した。PBS-Tweenでウェルを洗浄後、4-ニトロフェニルリン酸二ナトリウム(東京化成工業)をジエタノールアミン-塩酸緩衝液(pH8.9)に１mg/mlになるように溶解させ、それをウェルに50μl添加して発色させ、405nmの吸光度を測定した。産生されたIgA量を、IgA標準品のデータを基準としてグラフ化した（図１）。
IgA産生促進活性の比較的高かった菌株、L.reuteri A、L.buchneri A、L.amylovorus CP1750、L.acidophilus A（図１参照）のうち、L.reuteri A、L.buchneri AおよびL.acidophilus Aは通常ヒトの小腸には見られない種または菌株であるのに対して、CP1750株を含めてL.amylovorusはヒト小腸に定着する乳酸菌であって、ヒト腸内フローラにおいて優勢であることが分かっている。【００１９】
４）L.amylovorus CP1750の菌学的性質
市販の細菌同定キット(アピ５０ＣＨ：ビオメリュー社製、品番５０３０７)を用いてL.amylovorus CP1750について糖の資化性を調べた。結果を以下の表１に示す。
表１
2008075685.tif 000002
【００２０】
表１続き
2008075685.tif 000003
＊  ＋は資化性有りを示し、−は資化性なしを示す。
またL.amylovorus CP1750は45℃においても良好な生育を示す。【００２１】
参考文献
１．特開平2-280059号公報
２．New Food Industry, Vol.32, No.10, p9 (1990)
３．Bioscience Microflora, Vol.22, No.3, p75-83 (2003)
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】種々のLactobacillus属細菌のIgA産生促進活性の比較。Controlは菌体を含まないPBSのみを添加した対照である。バーは標準誤差を示す。
【図１】
2008075685.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成20年8月5日(2008.8.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・アミロボラスの菌体を有効成分とするＩｇＡ産生促進剤。
【請求項２】
ラクトバチルス・アミロボラスが受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５３２で特定されるラクトバチルス・アミロボラスＣＰ１７５０株である、請求項１記載のＩｇＡ産生促進剤。
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
（削除）
【請求項５】
菌体を１０１０個以上含む、請求項１または２記載のＩｇＡ産生促進剤。
【請求項６】
ラクトバチルス・アミロボラス菌体を含む、ラクトバチルス・アミロボラスの発酵産物からなる、請求項１記載のＩｇＡ産生促進剤。
【請求項７】
ラクトバチルス・アミロボラスがラクトバチルス・アミロボラスＣＰ１７５０株である、請求項６記載のＩｇＡ産生促進剤。
【請求項８】
発酵産物１００ｇあたり菌体を１０１０個以上含む、請求項６または７記載のＩｇＡ産生促進剤。
【請求項９】
食品への添加用である、請求項１または２または５〜８いずれかに１項記載のＩｇＡ産生促進剤。
【請求項１０】
受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５３２で特定されるラクトバチルス・アミロボラスＣＰ１７５０株。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
（Ｄｉｆｃｏ）で約３７℃〜４５℃にて１２〜１８時間培養し、遠心により菌体を回収し、得られた菌体を滅菌水またはＰＢＳ等の適切なバッファーで洗浄した後、凍結乾燥する。凍結乾燥した菌体はＰＢＳ等の適切なバッファーに懸濁し、１００℃にて加熱（例えば、約１０分間）して殺菌処理し、その後の測定のために保存しておくことができる。一方、パイエル板細胞はマウスの小腸から調製することができる。マウスの小腸をコラゲナーゼ（約１ｍｇ／ｍｌ）を含む、パイエル板に対して適切な培地、例えばＲＰＭＩ培地中に置き、細胞がばらばらになるまで、例えば約３７℃にて約１時間撹拌する。得られた細胞懸濁液をメッシュを通過させて不要な残渣を除去し、得られた細胞を適切な培地、例えばＲＭＰＩで洗浄してパイエル板細胞調製物を得ることができる。得られたパイエル板細胞は適切な培地、例えば５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地を入れた９６ウェルプレートに約５×１０５細胞／ウェルになるように播種し、各ウェルに前述の細菌菌体を約１０μｇ／ｍｌになるように添加し、５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて約７日間培養し、培養上清を得る。
［００１０］
得られた培養上清中のＩｇＡ量は常法に従って、例えばＥＬＩＳＡ法により測定することができる。例えば、適切に希釈した抗−マウスＩｇＡ抗体を一次抗体としてＥＬＩＳＡプレートに５０μｌ程度添加して、４℃、一晩静置してコーティングを行なう。ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で洗浄した後、１００μｌの１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液を各ウェルに添加し、室温で２時間静置してブロッキングを行なう。ウェルを洗浄後、ＩｇＡ標準品または適宜希釈したサンプルをウェルに５０μｌ添加し、室温で２時間静置する。ウェルを洗浄後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で希釈した二次抗体、例えば、ビオチン化抗−マウスＩｇＡをウェルに５０μｌ添加し、室温で２時間静置する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでウェルを洗浄後、１％  ＢＳＡ／ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ溶液で適切に希釈したアルカリフォスファターゼ溶液を５０μｌウェルに添加し、室温で１時間静置する。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでウェルを洗浄後、４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムをジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ８．９）に１ｍｇ／ｍｌになるように溶解させ、それをウェルに５０μｌ添加して発色させ、４０５ｎｍの吸光度を測定することによって各ウェル中の産生されたＩｇＡ量を測定することができる。
このような方法によって見いだされた、パイエル板に対するＩｇＡ産生促進活性にすぐれたＬ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓの一菌株であるＣＰ１７５０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０５３２）はヒト腸管親和性が特に高いため、ヒト、特にヒト腸内において非常に高いＩｇＡ産生促進活性を示すこと
【国際調査報告】
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