(57)【要約】【課題】ＦＧＦＲ１を標的とした癌の抗体療法において、特異性が高く細胞殺傷作用の強い効果的な抗体を用いなくとも、効果的に癌の抗体療法を行うことのできる技術を提供すること。【解決手段】線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤と、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体とを含有することを特徴とする癌治療剤及びこれを用いた癌の治療方法。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤、及び、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片の組み合わせからなり、同時に、連続的に、又は、時間を置いて別々に投与される癌治療剤。
【請求項２】
線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片、及び、末梢血単核球の組み合わせからなり、同時に、連続的に、又は、時間を置いて別々に投与される癌治療剤。
【請求項３】
線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤が、インターフェロンα、インターフェロンβ、アドリアマイシン、又は、５−アザシチジンである、請求項１又は請求項２に記載の癌治療剤。
【請求項４】
抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片に抗癌剤が結合している、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の癌治療剤。
【請求項５】
抗癌剤が、抗癌剤含有標的化リポソームである、請求項４に記載の癌治療剤。
【請求項６】
肝癌、胆癌、大腸癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、骨髄腫、又は、白血病の治療剤である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の癌治療剤。
【請求項７】
癌の治療方法であって、癌患者の癌細胞における線維芽細胞増殖因子受容体１の発現を亢進させること、及び、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片を投与することを含む方法。
【請求項８】
更に、末梢血単核球を投与することを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
癌の治療方法であって、癌患者に、線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤を投与すること、及び、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片を含有する薬剤を投与することを含む方法。
【請求項１０】
更に、末梢血単核球を含有する薬剤を投与することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
薬剤が、同時に、連続的に、又は、時間を置いて別々に投与される、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤が、インターフェロンα、インターフェロンβ、アドリアマイシン、又は、５−アザシチジンである、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片に抗癌剤が結合している、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
抗癌剤が、細胞性トキシン、又は、標的化リポソームである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
肝癌、胆癌、大腸癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、骨髄腫、又は、白血病の治療方法である、請求項９又は請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
癌患者に、インターフェロンα、インターフェロンβ、アドリアマイシン、又は、５−アザシチジンを投与し、肝癌細胞の線維芽細胞増殖因子受容体１発現を亢進させ、次いで、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片を投与することにより、肝癌細胞の増殖を阻害することを特徴とする癌の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療剤及び癌の治療方法に関し、更に詳細には、生理活性タンパク質と抗体とを組み合わせた癌治療剤及び癌の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌に対する治療方法としては、現在、外科的手術、超音波や電磁波を利用した経皮的治療方法、そして経カテーテル的治療方法が存在している。これらの治療方法は癌細胞を選択的に除去・死滅させることができるため局所制御能が高く、今後、更に局所制御能が高まることが期待されている。【０００３】
しかしながら、これらの治療による局所制御能が改善されたとしても、それが生命予後に十分に反映されていないのが現状である。その理由として、これらの治療の繰り返しが癌細胞の周囲にある正常な細胞にも影響を与えることにより、臓器の機能低下（肝臓の場合は肝の予備能力の低下）を引き起こすことが考えられている。今後の癌の治療における第一に必要な要件は、臓器の機能（肝臓の予備能力）の維持を図りながら、癌細胞の増殖抑制、血管新生阻害、（肝癌の場合には予後規定因子である門脈内浸潤）の抑制を可能にすることである。【０００４】
肝癌は、Ｃ型又はＢ型肝硬変から生じることが多く、肝予備能力の低下が多く認められる。また、肝癌は、血液を介する転移（肝内転移、血管浸潤）や新たな肝癌の発生（多中心性発癌）により再発しやすく、２００３年の報告で３年生存率が５２．５％、５年生存率が３５．４％と予後が非常に悪いことが知られている。現在の肝癌の治療法は、多中心性発癌の完全な抑制が不可能であること、門脈浸潤をコントロールすることが困難であること、及び、肝予備能低下を治療できないこと等の問題が指摘されている。また、肝癌患者の高齢化に伴い、より低侵襲性の治療が求められている。【０００５】
線維芽細胞増殖因子受容体（fibroblast growth factor receptor（以下、「ＦＧＦＲ」という）は、一回膜貫通型の受容体で、哺乳類ではＦＧＦＲ１〜ＦＧＦＲ４とＦＧＦＲ５／１Ｌの５種類が存在する。これらのＦＧＦＲは、細胞外の三つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内の二つのチロシンキナーゼドメインから成る。ＦＧＦＲは前記三つのＩｇ様ドメインの内、二つ（Ｉｇ様ドメインＩＩ、Ｉｇ様ドメインＩＩＩ）を使ってＦＧＦと結合し二量体を形成する。また、ＦＧＦＲは選択的スプライシングにより、多くの転写産物が存在するが、これがＦＧＦＲのリガンド特異性に影響をもたらしている。【０００６】
これらのＦＧＦＲのうち、ＦＧＦＲ１は、肝癌においては発現が確認されており、発癌刺激に伴う肝癌の進展を促進することが知られている（非特許文献１）。また、このＦＧＦＲ１は非癌肝細胞には発現していないこと（非特許文献２）、さらに、ＦＧＦＲ１を介した刺激は細胞増殖及び細胞浸潤の他、血管新生にも関与していることが報告されている（非特許文献３）。【０００７】
これらの知見からＦＧＦＲ１は、癌治療の標的として注目されてきた。特に、ＦＧＦＲ１は、血管新生に関与しているｂＦＧＦへの親和性が高いことから、抗癌剤の分子標的として考えられてきた。スイスプロット比較分析等により、アフリカツメガエルのＦＧＦＲ１がヒト及びマウスのＦＧＦＲ１とアミノ酸配列においてそれぞれ７４％及び８０％の相同性を有することが知られている。アフリカツメガエルのＦＧＦＲ１を用いたワクチン療法では抗癌作用が見られるものの、マウスＦＧＦＲ１を用いたワクチン療法では抗癌作用が得られていなかった。その他、ＦＧＦＲ１に対する抗体等も報告されているものの、未だＦＧＦＲ１を標的とする効果的な癌治療薬は見出されていない。【０００８】
インターフェロンは、ウィルスや細胞の増殖抑制、炎症反応と関係することが知られているサイトカインであり、インターフェロンα、インターフェロンβ等のタイプＩインターフェロンとインターフェロンγのタイプＩＩインターフェロンが知られている。このうちインターフェロンγは、肝線維症の発症や進展に寄与する細胞として知られているヒト肝星細胞に対して、増殖及び線維化を抑制するサイトカインとして知られている。ヒト肝星細胞をインターフェロンγで刺激した場合のｃＤＮＡマイクロアレイ解析の結果、ＦＧＦＲ１の発現が減少することが報告されている（非特許文献４参照）。【０００９】
【非特許文献１】Ectopic Activity of Fibroblast Growth Factor Receptor 1 in Hepatocytes Accelerates Hepatocarcinogenesis by Driving Proliferation and Vascular Endothelial Growth Factor&#8211;Induced Angiogenesis, Cancer Res 2006; 66(3): 1481-90
【非特許文献２】Expressions of Basic Fibroblast Growth Factor and Its Receptors and Their Relationship to Proliferation of Human Hepatocellular Carcinoma Cell Lines, HEPATOLOGY 1996;24:198-205.
【非特許文献３】THE ANTI-ANGIOGENIC ACTIVITY OF rPAI-123 INHIBITS FIBROBLAST GROWTH FACTOR-2 FUNCTIONS, JBC Papers in Press. Published on September 1, 2006 as Manuscript M607097200
【非特許文献４】Interferon-γ down-regulates expression of tumor necrosis factor-α converting enzyme/a disintegrin and metalloproteinase 17 in activated hepatic stellate cells of rats, International journal of molecular medicine 17: 605-616, 2006
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ＦＧＦＲ１を標的とした癌の治療法を提供することを課題とする。特に、本発明は、癌細胞に対して、ＦＧＦＲ１発現亢進剤と抗ＦＧＦＲ１抗体を組み合わせて用いることにより、癌治療を行うことを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ある種の生理活性タンパク質等による刺激が、癌細胞におけるＦＧＦＲ１の発現を亢進すること、及び、当該生理活性タンパク質により発現が亢進したＦＧＦＲ１を標的として、抗ＦＧＦＲ１抗体を作用させることにより、癌細胞の増殖・生存を効果的に抑制することができることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明者らは、ＦＧＦＲ１を標的とする癌治療剤により十分な癌抑制効果を得られない原因の一つは、当該治療薬による癌治療のために十分な量のＦＧＦＲ１が癌細胞において発現していない（例えば、免疫組織学的染色より確認した場合、肝癌部における発現はわずかしか観察されない）ことであることを見出した。そして、本発明者らは、ＦＧＦＲ１発現亢進剤とＦＧＦＲ１を分子標的とする医薬とを組み合わせることにより、効果的な癌治療を行えることを見出し、本発明を完成させた。更に、本発明者らは、ＦＧＦＲ１を標的とする治療薬の有効成分として、治療の効果を充分に発揮することができ、特異性が高く細胞殺傷作用の強い効果的な抗ＦＧＦＲ１抗体を得ることにより、本発明を完成させた。特に驚くことに、本発明者らは、インターフェロンγが、ｍＲＮＡレベルでＦＧＦＲ１の発現量を減少させることが報告されているにも拘らず、インターフェロンがＦＧＦＲ１の発現を亢進させることを見出した。また、本発明者らは、ある種の抗癌剤等にＦＧＦＲ１の発現を亢進させる活性があることを見出した。【００１２】
より詳細には、本発明は、以下の癌治療剤、及び、癌の治療方法に関する：
（１）  線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤、及び、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片の組み合わせからなり、同時に、連続的に、又は、時間を置いて別々に投与される癌治療剤。
（２）  線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片、及び、末梢血単核球の組み合わせからなり、同時に、連続的に、又は、時間を置いて別々に投与される癌治療剤。
（３）  線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤が、インターフェロンα、インターフェロンβ、アドリアマイシン、又は、５−アザシチジンである、（１）又は（２）に記載の癌治療剤。
（４）  抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片に抗癌剤が結合している、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の癌治療剤。
（５）  抗癌剤が、細胞性トキシン、又は、標的化リポソームである、（４）に記載の癌治療剤。
（６）  肝癌、胆癌、大腸癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、骨髄腫、又は、白血病の治療剤である、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の癌治療剤。
（７）  癌の治療方法であって、癌患者の癌細胞における線維芽細胞増殖因子受容体１の発現を亢進させること、及び、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片を投与することを含む方法。
（８）  更に、末梢血単核球を投与することを含む、（７）に記載の方法。
（９）  癌の治療方法であって、癌患者に、線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤を投与すること、及び、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片を含有する薬剤を投与することを含む方法。
（１０）  更に、末梢血単核球を含有する薬剤を投与することを含む、（９）に記載の方法。
（１１）  薬剤が、同時に、連続的に、又は、時間を置いて別々に投与される、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１２）  線維芽細胞増殖因子受容体１発現亢進剤が、インターフェロンα、インターフェロンβ、アドリアマイシン、又は、５−アザシチジンである、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１３）  抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片に抗癌剤が結合している、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１４）  抗癌剤が、細胞性トキシン、又は、標的化リポソームである、（１３）に記載の方法。
（１５）  肝癌、胆癌、大腸癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、骨髄腫、又は、白血病の治療方法である、（９）又は（１０）に記載の方法。
（１６）  癌患者に、インターフェロンα、インターフェロンβ、アドリアマイシン、又は、５−アザシチジンを投与し、肝癌細胞の線維芽細胞増殖因子受容体１発現を亢進させ、次いで、抗線維芽細胞増殖因子受容体１抗体又はその断片を投与することにより、肝癌細胞の増殖を阻害することを特徴とする癌の治療方法。【００１３】
本発明において、「ＦＧＦＲ１発現亢進剤」とは、細胞におけるＦＧＦＲ１の発現を亢進させる物質であれば特に限定されない。このようなＦＧＦＲ１発現亢進剤として、好ましくは、癌細胞（好ましくは、肝癌細胞、胆癌細胞、大腸癌細胞、胃癌細胞、乳癌細胞、膵臓癌細胞、骨髄腫細胞又は白血病細胞）におけるＦＧＦＲ１の発現を亢進させる物質である。このようなＦＧＦＲ１発現亢進剤には、例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγアドリアマイシン（以下、「ＡＤＲ」ということがある）、及び、デシタビン（decitabine）等の５−アザシチジン（以下、「Ａｚａ」ということがある）等が含まれる。【００１４】
本発明において、「抗ＦＧＦＲ１抗体」とは、ＦＧＦＲ１と結合する抗体であれば特に限定されない。また、本発明の抗ＦＧＦＲ１抗体のＦＧＦＲ１以外の物質への結合は、癌治療に利用可能であれば、特に限定は無いが、より好ましくは、ＦＧＦＲ１と特異的に結合する抗体である。本発明の治療薬又は治療方法は、癌細胞表面上のＦＧＦＲ１の発現を亢進させるため、ＦＧＦＲ１抗体と抗原との結合に基づくＡＤＣＣ活性を高めることによる抗癌活性を得ることができる。よって、本発明の抗ＦＧＦＲ１抗体として、好ましくは、強いＡＤＣＣ活性を備える抗体である。抗体は、糖鎖修飾（J. Biol. Chem., Vol. 278, Issue 5, 3466-3473, January 31, 2003； J Immunol Methods. 2005 Nov 30; 306 (1-2): 151-60; Clin Cancer Res. 2005 Mar 15; 11(6): 2327-36）等により、そのＡＤＣＣ活性が高まることが知られており、本発明の抗体は、ＡＤＣＣ活性を高めるために、適宜その糖鎖修飾が変更されていてもよい。また、本発明の抗体の断片は、少なくともＮＫ細胞上のＦｃレセプター（ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６））に認識される部位を備えていてもよい。また、本発明の抗体又はその断片は、ＦＧＦＲ１とＦｃγＲＩＩＩの両方を認識する（バイスペシフィック）抗体であってもよい。【００１５】
本発明の抗ＦＧＦＲ１抗体が認識するＦＧＦＲ１としては、特に限定されないが、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ヒト等の哺乳動物のＦＧＦＲ１であり、より好ましくは、ヒトＦＧＦＲ１である。本発明の抗ＦＧＦＲ１抗体として好ましくは、ヒトＦＧＦＲ１の全アミノ酸配列（配列番号１）のうち、１〜８２２番目、２２〜８２２番目に該当するポリペプチドを認識する抗体である。【００１６】
本発明の抗ＦＧＦＲ１抗体は、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、好ましくは、モノクローナル抗体である。また、本発明の抗体のイムノグロブリンクラスは特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹのいずれのイムノグロブリンクラスであってもよい。また、本発明の抗体はいずれのアイソタイプの抗体をも包含するものである。【００１７】
本発明の抗ＦＧＦＲ１抗体は、非ヒト動物の抗体、非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体、及び、ヒト抗体を包含する。非ヒト動物の抗体としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ニワトリ、アヒル等の抗体を挙げることができ、好ましくは、ハイブリドーマを作製することができる動物の抗体であり、より好ましくはマウスの抗体である。非ヒト動物の抗体のアミノ酸配列とヒト由来の抗体のアミノ酸配列を有する抗体としては、ヒト抗体に動物由来のモノクローナル抗体の抗原結合ドメインＦｖを入れ替えたヒト型キメラ抗体、動物由来抗体モノクローナル抗体の抗原結合に直接関わるＦｖドメイン上の配列であるＣＤＲをヒト抗体のフレームに組み込んだヒト化抗体を挙げることができる。ここで、ＣＤＲとは、Ｋａｂａｔら（"Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E.ら, U.S. Department of Health and Human Services, 1983）又はＣｈｏｔｈｉａら（Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196, 901-917, 1987）の定義によるものである。また、ヒト抗体とは、完全にヒト由来の抗体遺伝子の発現産物であるヒト抗体のことである。【００１８】
本発明は、また、抗ＦＧＦＲ１抗体の断片も含むものである。ここで、「抗体の断片」とは、抗体の一部分（部分断片）又は抗体の一部分を含むペプチドであって、抗体の抗原への作用を保持するもののことである。このような抗体の断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）若しくはこれらの重合体、二量体化Ｖ領域（以下、「Ｄｉａｂｏｄｙ」という）、又は、ＣＤＲを含むペプチドを挙げることができる。【００１９】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。Ｆａｂ’は、該Ｆ（ａｂ’）のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｓｄＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬがペプチドリンカーで連結された抗原結合活性を有するポリペプチドである。ｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のシステイン残基に置換されたアミノ酸残基がジスルフィド結合を介して結合している抗原結合活性を有する断片である。Ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した断片である。本発明のＤｉａｂｏｄｙは、モノスペシフィックでもよいし、バイスペシフィック（多重特異性抗体）でもよい。二量体化しているｓｃＦｖは、同一であっても良いし、異なっていても良い。ＣＤＲを含むペプチドは、重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３並びに軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び、ＣＤＲ３から選ばれる少なくとも１つのＣＤＲのアミノ酸配列を含むペプチドのことである。【００２０】
本発明の治療剤又は治療方法は、癌細胞表面のＦＧＦＲ１の発現を増強させることから、抗ＦＧＦＲ１抗体又はその断片は、所望の抗癌剤と結合させることにより抗癌剤の標的指向性を高める目的で使用してもよい。ここで、抗癌剤とは、直接的又は生体防御等の生理的機能を活性化させることにより間接的に癌治療の効果を有する薬剤であれば特に限定されない。ＦＧＦＲ１により癌細胞への標的指向性を高める抗癌剤は、例えば、イホスフォミド、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、又は、メルファラン等のアルキル化剤；エノシタビン、カペシタビン、カルモフール、ゲムシタビン、シタラビン、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム（ＴＳ−１）、フルオロウラシル、又は、メトトレキサート等の代謝拮抗剤；イリノテカン、エトポシド、ソブゾキサン、ドセタキセル、ノギテカン、パクリタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンデシン、又は、ビンブラスチン等の植物アルカノイド；アクチノマイシンＤ、アクラルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、ペプロマイシン、マイトマイシンＣ、又は、ミトキサントロン等の抗癌性抗生物質；オキサリプラチン、カルボプラチン、シスプラチン、又は、ネダプラチン等のプラチナ製剤；アナストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、タモキシフェン、ビカルタミド、フルタミド、ブレドニゾロン、リュープロレリン、又は、レトロゾール等のホルモン剤；インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インターロイキン２、ウベニメクス、乾燥ＢＣＧ、又は、レンチナン等の生物学的応答調節剤；イマチニブ、ゲフェチニブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、タミバロテン、トラスツズマブ、トレチノイン、ボルテゾミブ、又は、リツキシマブ等の分子標的薬等の抗癌剤として既知の薬剤、放射性同位元素、並びに、ゼバリン、ベクサール、マイロターグ等の細胞性障害化合物（細胞性トキシン）を含む。また、抗癌剤としては、例えば、生体防御等の生理的機能を活性化させる作用のある、補体、ＮＫ細胞を活性化させる抗ＦｃγＩＩＩ抗体又はその断片（Protein Engineering Design and Selection 2008 21(1):1-10）等を含む。抗ＦＧＦＲ１抗体又はその断片は、直接これらの抗癌剤と結合していてもよいし、又は、これらの抗癌剤を含む標的化リポソームと結合していてもよい。【００２１】
本発明において、「末梢血単核球」とは、末梢血から分離されるリンパ球又は単球のことであり、末梢血からフィコールＴＭと癌ヨード化合物メトリザミド等で濃度勾配を作り遠心分離により得られる。末梢血単核球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、形質細胞、活性化Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞等を含む。本発明の治療剤又は治療方法において、特にＡＤＣＣ活性依存的な効果を期待する場合、末梢血単核球は少なくともＡＤＣＣ活性を亢進させる効果がある量のＮＫ細胞を含有する。また、末梢血単核球を使用しＡＤＣＣ活性依存的な効果を期待する場合、抗ＦＧＦＲ１抗体又はその断片は、少なくともＮＫ細胞のＦｃレセプターに認識される部位を備えていてもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の癌治療剤又は癌治療方法は、正常な細胞には影響を与えず、癌細胞のみの増殖等を抑制することができる。従って、本発明の癌治療剤は、正常な臓器の機能（肝の予備能力）低下を引き起こすことなく癌を治療することができる。本発明の癌治療剤又は癌治療方法が使用できる癌としては、肝癌、胆癌、大腸癌、胃癌、乳癌、膵臓癌、骨髄腫、又は、白血病が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】肝癌細胞株ＨｅｐＧ２移植ＳＣＩＤマウスを用いたＩＦＮα投与実験におけるＤＮＡアレイ解析の結果を示す。
【図２】抗ＦＧＦＲ１抗体のウェスタンブロッティングによる特異性試験の結果を示す（ここでレーン２はＦＧＦＲ１全長のｃＤＮＡを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞の溶解液、レーン１は遺伝子を導入していないＮＩＨ３Ｔ３細胞の溶解液を表す）。
【図３】肝癌細胞株におけるＩＦＮ投与によるＦＧＦＲ１発現の亢進をウェスタンブロッティングによって蛋白レベルで解析した結果を示す。
【図４】肝癌細胞株表面におけるＩＦＮ投与によるＦＧＦＲ１発現の亢進をＦＡＣＳ法によって解析した結果を示す。
【図５】肝癌細胞株ＨｅｐＧ２移植ＳＣＩＤマウスの切除材料におけるＩＦＮα投与後のＦＧＦＲ１の発現解析を免疫組織学的に解析した結果を示す。
【図６】抗ＦＧＦＲ１抗体による肝癌細胞株の増殖抑制試験の結果を示す。
【図７】ＩＦＮβ及び抗ＦＧＦＲ１抗体による肝癌細胞株の増殖抑制試験の結果を示す。
【図８】肝癌移植ＳＣＩＤマウスに、ＩＦＮα、抗ＦＧＦＲ１抗体、又は、ＩＦＮα＋抗ＦＧＦＲ１抗体の投与による、肝癌の大きさの変化を表す図である。図中、縦軸は肝癌の大きさを、横軸は各薬剤投与後の経過時間を示す。
【図９】癌細胞株表面におけるＩＦＮ投与によるＦＧＦＲ１発現の亢進をＦＡＣＳ法によって解析した結果を示す。
【図１０】多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ１２ＢＭにおけるＡＤＲ又は／及びデシタビン（decitabine）投与によるｍＲＮＡレベルにおけるＦＧＦＲ１発現の変化を示す。図中、縦軸は、コントロール（非投与）を１とした場合のFoldのexpression changeを示す。また、図中横軸のＡｚａはデシタビン（decitabine）を意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の癌治療剤（以下、「本発明の治療剤」という）は、ＦＧＦＲ１発現亢進剤、及び、線維芽細胞増殖因子受容体１に対する抗体又はその断片を有効成分とするものである。【００２５】
本発明の治療剤の有効成分であるＦＧＦＲ１発現亢進剤は、所望の物質について癌細胞（好ましくは肝癌細胞）におけるＦＧＦＲ１の発現を亢進するか否かを測定し、ＦＧＦＲ１の発現を亢進する物質を選択することにより得ることができる。所望の物質がＦＧＦＲ１の発現を更新するか否かは、例えば、癌細胞株を移植したマウスに所望の物質を投与して癌細胞株におけるｍＲＮＡ又はタンパク質発現を測定することにより調べることができる。より具体的には、例えば、重症免疫力不全（ＳＣＩＤ）マウスに、１×１０５〜１×１０７の癌細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２等）を移植し、移植２〜４週間後にマウスの腫瘍が３〜１０ｍｍ（好ましくは、５〜８ｍｍ）程度になった時点で、所望の物質を１〜数回静脈内投与して、所望の物質を投与する前、及び、投与２４時間後に腫瘍組織を採取し、採取した腫瘍組織よりｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡに変換し、ＤＮＡアレイ解析を行うか、又は、採取した腫瘍組織を免疫染色することにより、所望の物質が癌細胞におけるＦＧＦＲ１の発現を亢進するか否かを調べることができる。【００２６】
ＩＦＮα、ＩＦＮβ及びＩＦＮγは、生体から分離精製することにより、又は、市場において流通しているものを入手することができる。市販されているＩＦＮαとしては、例えば、スミフェロン（住友製薬株式会社）、ＯＩＦ（大塚製薬株式会社）、イントロンＡ（シェリング・プラウ製）、アドバフェロン（アステラス製薬株式会社）、ペガシス（中外製薬株式会社）、ペグイントロン（シェリング・プラウ製）等を挙げることができる。また、市販されているＩＦＮβとしては、例えば、フェロン（東レ株式会社）、ＩＦＮβモチダ（持田製薬株式会社）等を挙げることができる。
また、アドリアマイシン、５−アザシチジンは、市場において流通しているもの、例えば、アドリアシン（登録商標）（協和発酵株式会社）、ビダザ（Ｖｉｄａｚａ）（登録商標）（ファーミオン  コーポレーション）として入手することができる。【００２７】
抗ＦＧＦＲ１抗体は、以下の方法により得ることができる。まず、ＦＧＦＲ１の全部若しくはその一部を有するポリペプチド、又は、それらをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ哺乳動物細胞用発現ベクター等を調製しこれを抗原とする。モノクローナル抗体を作成する場合、この抗原を用い、モノクローナル抗体作製の公知の方法、例えば「抗ペプチド抗体実験プロトコール」、大海忍、辻村邦夫、稲垣昌樹著、秀潤社、１９９４年、「単クローン抗体実験マニュアル」富山朔二・安東民衛／編、講談社、１９８７年等に記載の方法に従って動物を免疫する。次いで、免疫した動物から得られた免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取する。最後に採取した抗体を、抗原に用いたＦＧＦＲ１やその一部に一致するポリペプチドを利用した抗原特異精製を行うことによりＦＧＦＲ１のモノクローナル抗体を得ることができる。また、ポリクローナル抗体を作成する場合、上記と同様の抗原を利用し、ポリクローナル抗体作製の公知の方法、例えば「続生化学実験講座、免疫生化学研究法」（日本生化学会編）等に記載の方法に従って動物を免疫し、免疫した動物から血液を採取し、この血液から血清を分離し、この血清に対して上記抗原を利用した抗原特異精製を行うことにより得ることができる。【００２８】
上記抗原を用いた動物の免疫は、上記抗原をリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ）に溶解し、必要に応じて免疫賦活剤（例えば、鉱油若しくはアルミニウム沈殿物と加熱死菌若しくはリポ多糖体、フロインドの完全アジュバント、又は、フロインドの不完全アジュバント等）と共に、非ヒト哺乳動物又は鳥類に免疫することにより行われる。【００２９】
免疫原として使用するＦＧＦＲ１は、哺乳動物のＦＧＦＲ１であれば、特に限定は無いが、好ましくは、ヒトＦＧＦＲ１である。例えば、ヒトＦＧＦＲ１はその全アミノ酸配列（配列番号１：Accession No. NM_023110）、及び、ｃＤＮＡ配列（配列番号２：Accession No. NM_023110）が報告されている。また、ＦＧＦＲ１の全部又は一部に一致するポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、ＦＧＦＲ１ｃＤＮＡ等のほ乳類由来のＦＧＦＲ１ｃＤＮＡをプローブとしてヒト腫瘍細胞株等のｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることによっても得ることができる。従って、本発明の抗体の作製に使用する免疫原は、ＦＧＦＲ１をコードするｃＤＮＡを含む、ｐＧＥＸ（大腸菌用）、ｐｃＤＮＡ３.１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、動物細胞発現用）等の発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に形質転換し、形質転換した大腸菌等の宿主微生物・培養細胞をＬＢ培地等で培養して発現させることによりリコンビナントタンパク質やポリペプチドとして得ることができる。また、免疫原として、ＦＧＦＲ１の一部を有するペプチドを使用する場合には、これらのペプチドをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等に導入し、発現させることにより免疫原を得ることができる。発現させたＦＧＦＲ１又はその断片は、アフィニティーカラムやニッケルカラム等で精製することができる。【００３０】
免疫原として、ＦＧＦＲ１の一部を有するペプチドを使用する場合には、ＦＧＦＲ１の一部を有するペプチドをそのまま使用することもできるし、１種類又は２種類以上のＦＧＦＲ１の一部を有するペプチドを、リンカーを介して結合させて使用することもできる。【００３１】
ＦＧＦＲ１又はその一部を有するペプチドは、Ｆｍｏｃ法又はＢｏｃ法等を用いて化学合成により作製できることができる。例えば、ＦＧＦＲ１又はその一部を有するペプチドのＣ末端のアミノ酸をポリスチレン担体に固定化し、９-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）又はtert-ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）で保護されたアミノ酸を、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の縮合剤を用いて反応させることにより結合させ、洗浄、脱保護の工程を繰り返すことにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。【００３２】
また、ＦＧＦＲ１又はその一部を有するペプチドは、自動ペプチド合成機を用いて合成することもできる。このようなペプチド合成機としては、例えば、ＰＳＳＭ−８（島津製作所）；モデル４３３Ａペプチドシンセサイザ（アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems, Inc.））；ＡＣＴ３９６Ａｐｅｘ（アドバンストケムテック社（Advanced ChemTech Inc.））等が挙げられる。【００３３】
免疫動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビット、ニワトリ、アヒル、ヤギ、ウマ等ハイブリドーマを作製することが可能な動物であれば特に限定はないが、好ましくは、マウス又はラットであり、より好ましくは、マウスである。【００３４】
動物への免疫原の投与は、例えば、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射又は足蹠注射により行うことができるが、好ましくは、皮下注射又は腹腔内注射である。使用する免疫原の量は、抗体を産生できる量であれば特に限定は無いが、好ましくは、０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは、１〜５００μｇであり、より更に好ましくは、１０〜１００μｇである。免疫は、１回又は適当な間隔をあけて数回行うことができる。好ましくは、１〜５週間に１回の免疫を複数回（好ましくは、合計２〜５回）行うことができ、より好ましくは、３週間に１回の免疫を合計３回行う。最後の免疫から１〜２週間後に、免疫した動物の眼窩又は尾静脈から採血を行い、その血清を用いて抗体価の測定を行う。抗体価の測定は、当業者周知の方法で行うことができる。例えば、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ法）、固相酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ法）、蛍光抗体法、受身血球凝集反応法を挙げることができ、好ましくは、ＥＬＩＳＡ法である。本発明の抗体は、十分な抗体価を示す動物の血清から精製することにより得ることができる。【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、上記方法により免疫した免疫感作動物から得た抗体産生細胞と、骨髄腫系細胞（ミエローマ細胞）を融合することにより得られるハイブリドーマを培養することにより得ることができる。当該融合方法としては、例えば、ミルステインらの方法（Galfre, G. & Milstein,C.,Methods Enzymol.73:3-46,1981）を挙げることができる。【００３６】
使用する抗体産生細胞は、上記方法により免疫し血清が十分な抗体価を示したマウス又はラットの脾臓、膵臓、リンパ節、末梢血より採取することができ、好ましくは、脾臓より採取する。【００３７】
使用する骨髄腫系細胞は、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ラビット又はヒト等の哺乳動物に由来する細胞であって、in vitro で増殖可能な細胞であれば特に限定はない。このような細胞としては、例えば、Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８（Ｘ６３）（Nature, 256, 495, 1975）、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ１）（Eur. J. Immunol., 6, 292, 1976）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 81, 1, 1978）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（６５３）（J. Immunol., 123, 1548, 1979）、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４（Ｓｐ２／Ｏ）（Nature, 276, 269, 1978）、Ｓｐ２／Ｏ／ＦＯ−２（ＦＯ−２）（J. Immunol. Methods, 35, 1, 1980）等を挙げることができ、好ましくは、Ｐ３Ｕ１である。【００３８】
上述の方法に従って得られた抗体産生細胞及び骨髄腫細胞は、培地、ＰＢＳ(Phosphate Buffered Saline)等で洗浄後、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」という）等の細胞凝集性媒体を加え、細胞を融合させる（Elsevier Publishing, 1988）。融合させる際の抗体産生細胞及び骨髄腫細胞の比率は、例えば、２：１〜１：２である。細胞融合を行った後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン（Hypoxanthine）−アミノプテリン（aminopterin）−（チミジン）thymidine）培地等の培地で培養することにより、ハイブリドーマを選択的に増殖させる。培養後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡ等により、抗原タンパク質に結合するサンプルを選択する。好ましくは、抗原タンパク質に結合し、非抗原タンパク質に結合しないサンプルを選択する。当該サンプルを限界希釈法により単一細胞化を行い、安定して高い抗体価を示す細胞を選択することにより、モノクローナル抗体を産生する細胞を得ることができる。【００３９】
本発明の抗体は、上述の方法により得られたハイブリドーマをin vitroで培養し、培養液を精製することによって得ることができる。また、本発明の抗体は、予めプリスタンを腹腔内に投与した同系動物又は免疫不全動物にハイブリドーマを移植した後、腹水化させ、採取した腹水を精製することによっても得ることができる。【００４０】
抗体の精製は、遠心分離後、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム等を用いてＩｇＧ画分を回収することにより得ることができる。抗体のクラスが、ＩｇＹ及びＩｇＭの場合には、メルカプトピリジンをリガンドとしたカラムで精製することができる。また、抗体のクラスによらず、ＦＧＦＲ１固相化カラム、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー等を用いて精製することもできる。また、抗原を固相化した９６穴マイクロタイタープレートを用いたＥＩＡ法によって抗原特異精製（スクリーニング）を行うことによって、抗ＦＧＦＲ１モノクローナル抗体を得ることもできる。【００４１】
２．ヒト型キメラ抗体・ヒト化抗体、ヒト抗体の作製
（１）ヒト型キメラ抗体
本発明のヒト型キメラ抗体は、ＦＧＦＲ１と結合する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを調製し、これをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（Morrison, S.L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, 1984）。【００４２】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、次の方法により得ることができる。当該モノクローナル抗体を産生する動物Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出する。ｍＲＮＡの抽出は、当業者周知の方法で行うことができ、例えば、グアニジン−超遠心法（Chirgwin, J. M.ら, Biochemistry, 18, 5294-5299, 1979）、ＡＧＰＣ法（Chomczynski, Pら, Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987）等によりＲＮＡを調製した後、ｍＲＮＡピュリフィケーションキット（Purification Kit）（ファルマシア社製、タカラバイオ社製）等により精製することにより行うことができる。抽出したｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーを使用することによりｃＤＮＡを作製してベクターに組み込む。ベクターに組み込んだｃＤＮＡの中から、非ヒト動物由来モノクローナル抗体の一部をプローブとして使用して、非ヒト動物由来モノクローナル抗体をコードしているｃＤＮＡを単離する。単離されたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、目的のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。【００４３】
また、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡを得る別の方法として、次の方法が挙げられる。上述の方法で得られたｃＤＮＡを、ＶＨ又はＶＬを増幅可能なプライマー（例えば、非ヒト動物として、マウスを利用する場合、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズするプライマー及びマウスＬ鎖γ鎖定常領域の保存配列とハイブリダイズするプライマー等（R. Orlandiら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833, 1989））を用いてＰＣＲ法で増幅することにより、又は、モノクローナル抗体を産生する動物Ｂ細胞からｍＲＮＡを抽出し、当該ＶＨ又はＶＬを増幅可能なプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法で当該ＶＨ又はＶＬを増幅させる。得られたＰＣＲ産物から目的のＤＮＡ断片を抽出する。目的のＤＮＡ断片の抽出は、例えば、アガロースゲル電気泳動後に目的のＤＮＡのサイズを示すバンドを切り出し、当該ゲル切片よりＤＮＡを抽出することにより行うことができる。当該ベクター及び抽出したＤＮＡを制限酵素で処理した後、抽出したＤＮＡをベクターに組み込み、組み込まれたＤＮＡがコードするＤＮＡ配列を決定することにより、目的のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列を得ることができる。【００４４】
ヒト型キメラ抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のキメラ抗体を発現するベクターを作製することができる。【００４５】
ヒト型キメラ抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーター又は非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを使用する場合、免疫グロブリン遺伝子の発現調節機構はマウスとヒトで共通であることから、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子間に存在するマウス又はヒトのエンハンサー配列を含む形で組換えＤＮＡを作製することもできる。【００４６】
動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、pSV2-gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 209, 1422, 1980) を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト型キメラ抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。
（２）ヒト化抗体【００４７】
本発明のヒト化抗体は、ＦＧＦＲ１と結合する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲをコードするアミノ酸配列をヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植したＶ領域をコードするＤＮＡを構築し、構築したＤＮＡをヒト由来免疫グロブリンの定常領域ｃＤＮＡと結合して発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞に当該ベクターを導入して発現させることにより得ることができる（L. Rieohmannら, Nature, 332, 323, 1988; Kettleborough, C. A.ら, Protein Eng., 4, 773-783, 1991; Clark M., Immunol. Today., 21, 397-402, 2000参照）。【００４８】
非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲは、上述の方法によって得られた非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列と、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列とを比較し、各ＣＤＲのアミノ酸配列を得ることができる。既知の抗体のアミノ酸配列は、例えば、プロテイン・データ・バンク等のデータベースに登録されている抗体のアミノ酸配列より得ることができる。【００４９】
また、ヒト抗体のＦＲとしては、移植後の抗体が本発明の効果を奏するものであれば特に限定は無いが、好ましくは、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲである。選択したヒト抗体のＦＲを有するヒト化抗体のＶ領域が、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるか否かは、例えば、選択したヒト抗体のＦＲ含むＶ領域のＤＮＡ配列情報を基にコンピューターモデリングにより立体構造を予測し、使用した非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域の立体構造との比較を行うことにより判断することができる。使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列は、上述の方法により得られたＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ配列から予測されるアミノ酸配列及びＣＤＲのアミノ酸配列の情報より得ることができる。また、ヒト化抗体のＶ領域が非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＶ領域と類似の立体構造となるヒト抗体のＦＲ、又は、使用する非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＦＲのアミノ酸配列と相同性が高いヒト抗体ＦＲとするため、得られたヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に適宜変異をいれることもできる。【００５０】
使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列は、非ヒト動物由来モノクローナル抗体のＣＤＲのアミノ酸配列とヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列を結合したアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列として設計する。ヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、設計したＤＮＡ配列を基に、当業者周知の方法によって作製することができる。例えば、設計したＤＮＡを基に１００ｂｐ前後の長さのＤＮＡ断片を合成ＤＮＡとして化学合成し、当該ＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅することによって得ることができる。また、当該１００ｂｐ前後のＤＮＡ断片をリガーゼ等の酵素を用いて結合させ、設計されたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡ配列の両末端の配列をコードするプライマーを用いてＰＣＲを行い、所望の長さのＤＮＡ断片を抽出することによっても得ることができる。更に、ＰＣＲ使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、ＣＤＲグラフティングとして知られる方法によっても得ることができる。また、使用するヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、部位特異的変異によりＣＤＲをコードするＤＮＡをヒト抗体のＶ領域のＤＮＡに組み込むことによっても得ることができる。部位特異的変異は、例えば、ジーンテイラーサイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（Gene Tailor Site-Directed Mutagenesis System）（インビトロジェン社）、トランスフォーマー（Transformer）部位特異的突然変異誘発キット（クローンテック社）、サイトダイレクティッドミュータジェネシスシステム（Site-Directed Mutagenesis System）（タカラバイオ社）等を用いて、当該キットの説明に従うことにより行うことができる。【００５１】
ヒト化抗体のヒト抗体ＣＨ及びＣＬとしては、任意のヒト抗体のＣＨ及びＣＬを用いることができる。例えば、ヒトγ１、γ２のＣＨ及びヒトκのＣＬを挙げることができる。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードする遺伝子としては、染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡを用いることができる。上述の方法により得られたヒト化抗体のＶ領域をコードするＤＮＡは、例えば、それぞれヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡと結合し、動物細胞用発現ベクターに組み込むことにより、本発明のヒト化抗体を発現するベクターを作製することができる。【００５２】
ヒト化抗体の発現に使用するエンハンサー及びプロモーターとしては、免疫グロブリン遺伝子自身のエンハンサー及びプロモーター又は非免疫グロブリン用エンハンサー及びプロモーターを挙げることができる。例えば、非ヒト動物としてマウスを使用する場合、免疫グロブリン遺伝子の発現調節機構はマウスとヒトで共通であることから、Ｊ遺伝子とＣ遺伝子間に存在するマウス又はヒトのエンハンサー配列を含む形で組換えＤＮＡを作製することもできる。【００５３】
動物細胞用発現ベクターとしては、例えば、pSV2-gpt(R. C. Mulligan and P. Berg, Science, 209, 1422, 1980) を使用することができる。上述の方法により作製した本発明のヒト化抗体のＨ鎖及びＬ鎖をコードする遺伝子は、同一のベクターに組み込まれていても良いし、異なるベクターに組み込まれていても良い。【００５４】
なお、上述のヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体の作製において使用される、非ヒト動物由来モノクローナル抗体は、ＦＧＦＲ１と結合する抗体であれば特に限定はないが、好ましくは、マウスモノクローナル抗体である。【００５５】
（３）ヒト抗体
ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体ファージライブラリー又はヒト抗体産生トランスジェニックマウスを利用することにより得ることができる（富塚ら, Nature Genet., 15, 146-156(1997)）。【００５６】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞由来の様々な配列をもつ抗体遺伝子プールからＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子をファージ遺伝子に導入することにより、ヒト抗体のＦａｂ又はｓｃＦｖ等を融合タンパク質として表面に提示させたファージのライブラリーである。このようなヒト抗体ファージライブラリーとしては、正常なヒトの持つ抗体のＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を末梢血リンパ球などからＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、ライブラリー化することにより得られたナイーブ・非免疫ライブラリー（ケンブリッジアンチボディテクノロジー（Cambridge Antibody Technology）社；メディカルリサーチカウンセル（Medical Research Council）；ダイアックス（Dyax）社等）、ヒトＢ細胞内の機能的な特定の抗体遺伝子を選び、Ｖ遺伝子断片のＣＤＲ３領域などの抗原結合領域の部分を適当な長さのランダムなアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドによって置換し、ライブラリー化した合成ライブラリー（バイオインベント（BioInvent）社；クルーセル（Crucell）社；モルホシス（Morphosys）社）、及び、癌、自己免疫疾患又は感染症患者、あるいは、対象抗原をワクチンとして接種した人のリンパ球から作製したライブラリーである、免疫ライブラリーを挙げることができる。【００５７】
例えば、ナイーブヒト抗体ファージライブラリーは、以下の方法により作製することができる。人の末梢血からｍＲＮＡを調製し、イムノグロブリンのγ、μ、κ、λ鎖の定常領域に特異的なプライマーを用いて、Ｖ遺伝子のｃＤＮＡを合成し、各Ｖ遺伝子をＶ遺伝子ファミリーに特異的なＤＮＡプライマーのセットを用いて合成し、それらを（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３等のリンカーペプチドをコードするリンカーＤＮＡを用いてＰＣＲによって連結し、ｓｃＦｖ遺伝子を合成する。合成したｓｃＦｖ遺伝子を、両側にベクター導入用の制限酵素サイトを使って、ｐＣＡＮＴＡｂ５Ｅ等のファージミドベクターに挿入し、当該ベクターを大腸菌に形質転換し、ヘルパーファージによるレスキューを行う。【００５８】
ヒト抗体ファージライブラリーを利用する場合、例えば、標的となるＦＧＦＲ１を固相に固定化し、ファージ抗体ライブラリーを反応させて、非結合のファージを洗浄除去した後、結合したファージを回収することにより、所望のクローンを得ることができる（パンニング）。また、得られたファージを増幅させ、増幅させたライブラリーについて更にパニングを繰り返し行うことにより、得られたクローンの精度を上げることができる。得られたクローンのＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子を解析することにより、これらの遺伝子配列を有する完全なヒト抗体を作製することもできる。【００５９】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、内因性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子をノックアウトしたマウスにヒト抗体のＩｇ遺伝子を導入したマウスである。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスは、例えば、以下の方法により得ることができる。ヒト−マウスハイブリッド細胞を４８時間コルセミド（紡錘糸形成阻害剤）処理することにより、１から数本の染色体が核膜に包まれた構造体である、ミクロセルを形成する。サイトカラシンＢ存在下で単離されたミクロセルを染色体受容細胞（マウスＥＳ細胞）とポリエチレングリコールにより融合し、ミクロセルハイブリッドＥＳ細胞を作製し、マウス胚へ注入する。【００６０】
ヒト抗体産生トランスジェニックマウスを免疫動物として、上述の抗ＦＧＦＲ１抗体作製方法に準じて抗原を免疫することにより、抗ＦＧＦＲ１ヒト抗体を得ることができる。【００６１】
３．抗体断片の作製
本発明の抗体の断片（Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ若しくはこれらの重合体、Ｄｉａｂｏｄｙ、又は、ＣＤＲを含むペプチド）は、以下の方法により作製することができる。【００６２】
本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、本発明のＦＧＦＲ１に結合するＩｇＧ抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理し、Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断することにより、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦ（ａｂ’）２断片は、後述のＦａｂ’をチオエーテル結合又はジスルフィド結合させることにより得ることができる。【００６３】
本発明のＦａｂ’断片は、上述の方法により得られた本発明のＦＧＦＲ１に結合するＦ（ａｂ’）２を還元剤であるジチオスレイトール処理して得ることができる。また、本発明のＦａｂ’断片は、本発明のＦＧＦＲ１に結合する抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００６４】
本発明のＦａｂ断片は、本発明のＦＧＦＲ１に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理し、Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断することにより、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分の領域とＬ鎖の全領域がジスルフィド結合により結合された分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片として得ることができる。また、本発明のＦａｂ断片は、本発明のＦＧＦＲ１に結合する抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００６５】
本発明のｓｃＦｖは、本発明のＦＧＦＲ１に結合する抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、これらの遺伝子の間にリンカー配列をコードするＤＮＡを挿入し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。リンカーの長さは、ＶＨとＶＬが会合することができる長さであれば特に限定は無いが、好ましくは１０〜２０残基であり、より好ましくは１５残基である。また、リンカーの配列は、ＶＨとＶＬの二つのドメインのポリペプチド鎖の折りたたみを阻害しないものであれば特に限定は無いが、好ましくは、グリシン及び／又はセリンからなるリンカーであり、より好ましくは、ＧＧＧＧＳ（Ｇ：グリシン、Ｓ：セリン）又はその繰り返し配列である。【００６６】
本発明のｄｓＦｖは、ＶＨ及びＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基を部位特異的突然変異によりシステイン残基に置換し、ＶＨ及びＶＬを当該システイン残基間のジスルフィド結合で結合させることにより得ることができる。置換するアミノ酸は、立体構造に基づき抗原結合に影響の無いアミノ酸残基であれば特に限定はない。【００６７】
本発明のＤｉａｂｏｄｙは、上述のｓｃＦｖをコードするＤＮＡにおいて、リンカーのアミノ酸配列が８残基以下（好ましくは５残基）となるように構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。バイスペシフィックなＤｉａｂｏｄｙは、異なる２種類のｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬのＤＮＡを組み合わせてｓｃＦｖを作製することにより得ることができる。【００６８】
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明のＦＧＦＲ１に結合する抗体のＶＨ又はＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを構築し、当該ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、当該ベクターを宿主細胞に導入し、発現させることにより得ることができる。【００６９】
本発明の末梢血単核球は、密度勾配遠心法等の当業者周知の方法により採取することができる。例えば、採血した血液をＰＢＳで２倍量に希釈し、当該希釈液６ｍＬをリンパ球分離液（３ｍＬ）に静かに重層し、１５００ｒｐｍで３０分間遠心する。リンパ球・単球からなる末梢血単核球は、血漿（黄色味を帯びる）と分離液（透明）の中間に、白い帯状の層として観察される。白い帯状の単核細胞層（細胞浮遊液）をパスツールピペットで吸い上げるように回収する。回収した細胞浮遊液にＰＢＳを加えて攪拌後、１５００ｒｐｍで１０分間遠心する。遠心後、上清を除去し、細胞ペレットにＰＢＳを１０ｍＬ加えて細胞を懸濁させ、１５００ｒｐｍで１０分間遠心する。遠心後、上清を除去し、ＰＢＳで懸濁させることにより、末梢血単核球懸濁液を得ることができる。【００７０】
本発明の治療剤又は治療方法においては、１のＦＧＦＲ１発現亢進剤を用いてもよいし、２以上のＦＧＦＲ１発現亢進剤を適宜組み合わせて使用してもよい。また、本発明の治療剤又は治療方法における、ＦＧＦＲ１発現亢進剤の投与量は、癌の種類、ＦＧＦＲ１発現亢進剤のＦＧＦＲ１の発現能、患者の症状の程度、年齢、性別や使用する製剤の剤型等に応じて適宜定めることができ、例えば、ＦＧＦＲ１発現亢進剤として、ＩＦＮαを用いる場合、例えば、１回の投与量を５００万〜１０００万単位とすることができる。また、ＦＧＦＲ１発現亢進剤としてＩＦＮβを用いる場合、例えば、一回の投与量を３００万〜６００万単位とすることができる。また、アドリアマイシン、及び、５−アザシチジンを使用する場合には、例えば、それぞれ一回の投与量を０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内（例えば、０．４ｍｇ／ｋｇ）、及び、１〜１００ｍｇ／ｍ２の範囲内（例えば、１５ｍｇ／ｍ２）とすることができる。また、投与は、１日１〜５回（好ましくは１〜数回）、一度に又は連続的に行うことができる。【００７１】
本発明の治療剤又は治療方法においては、１の抗ＦＧＦＲ１抗体又はその断片を用いてもよいし、２以上の抗ＦＧＦＲ１抗体又はその断片を適宜組み合わせて使用してもよい。本発明の治療剤又は治療方法における、抗ＦＧＦＲ１抗体又はその断片の投与量は、患者の症状の程度、年齢、性別、体重や使用する製剤の剤型、抗体の結合力価等により適宜選択することができる。例えば、１回の投与量で１００〜２００ｍｇ程度である。また、投与は、１日１〜５回（好ましくは１〜数回）、一度に又は連続的に行うことができる。【００７２】
本発明の治療剤又は治療方法における、末梢血単核球の投与量は、患者の症状の程度、年齢、性別、体重や、投与する細胞の状態、由来、末梢血単核球に含まれる各細胞の分布等により異なるが、例えば、１×１０５〜１×１０９個／投与であり、又は、１×１０６〜１×１０８個／投与であってもよい。【００７３】
本発明の治療剤は、上記のＦＧＦＲ１発現亢進剤（ＩＦＮα、ＩＦＮβ）及び抗ＦＧＦＲ１抗体を、必要によりさらに精製した後、単一の製剤として、又は、別々の製剤として、常法に従って製剤化することによって調製される。本発明の治療剤の製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、製剤の剤型に応じた担体や添加剤（「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」APhA Publications社参照）を使用することができる。本発明治療剤の剤型としては、例えば、注射剤、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤等を挙げることができる。また、本発明の治療方法として、末梢血単核球を投与する場合、末梢血単核球は当業者周知の方法を用いて、適宜生体に投与可能な懸濁液に懸濁した状態で使用することができる。【００７４】
本発明の治療剤の投与部位としては、経口投与、口腔内投与、気道内投与、皮下投与、筋肉内投与、血管内（静脈内）投与等を挙げることができる。本発明の治療剤の投与方法は、特に制限されないが、例えば、注射器や点滴等で皮下や静脈から投与する方法やカテーテル等で動脈から投与する方法が挙げられる。より具体的には、例えば、ＩＦＮαは、注射器による皮下注射、ＩＦＮβ、アドリアマイシン、５−アザシチジン又は抗ＦＧＦＲ１抗体は点滴による静脈注射が好ましい。また、本発明の治療方法において末梢血単核球を投与する場合、投与方法としては、血管内（静脈内）投与であってもよい。【００７５】
また、本発明の治療方法において、本発明の治療剤の投与間隔は治療効果が得られる限り特に制限されない。例えば、ＦＧＦＲ１発現亢進剤及び抗ＦＧＦＲ１抗体は、同時に、連続的に又は時間を置いて別々に投与されてもよい。例えば、ＦＧＦＲ１発現亢進剤及び抗ＦＧＦＲ１抗体を同時に投与する場合、ＦＧＦＲ１発現亢進剤及び抗ＦＧＦＲ１抗体は同一製剤として癌患者に投与してもよい。また、ＦＧＦＲ１発現亢進剤及び抗ＦＧＦＲ１抗体を時間を置いて別々に投与する場合、まず癌患者にＦＧＦＲ１発現亢進剤（例えば、ＩＦＮα又はＩＦＮβ）を投与し、癌細胞に特異的にＦＧＦＲ１の発現を亢進させることが可能な時間を置いた後、抗ＦＧＦＲ１抗体又はその断片を投与し、発現亢進されたＦＧＦＲ１と抗ＦＧＦＲ１抗体又はその断片と結合させてもよい。具体的な投与間隔としては、癌患者にＦＧＦＲ１発現亢進剤（ＩＦＮα又はＩＦＮβ）を投与してから３２〜４８時間経過後に、抗ＦＧＦＲ１抗体を投与することを１サイクルとし、これを１週間に２回行うことが挙げられる。
さらに、本発明の治療方法において、末梢血単核球を投与する場合、末梢血単核球は、ＦＧＦＲ１発現亢進剤及び／又は抗ＦＧＦＲ１抗体と同時に投与されてもよいし、連続的に又は時間を置いて別々に投与されてもよい。
【実施例】
【００７６】
以下、実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約を受けるものではない。【００７７】
実施例１
肝癌細胞株ＨｅｐＧ２移植ＳＣＩＤマウスにおけるＩＦＮ投与試験（ＤＮＡアレイ解析）
重症免疫力不全（ＳＣＩＤ）マウス１匹に対して肝癌細胞株ＨｅｐＧ２を移植（１×１０６）した。移植３週間後にマウスの腫瘍が６〜７ｍｍ程度になった時点で、ＩＦＮα（ＯＩＦ：大塚製薬製）を２０００Ｕ／匹で二回、静脈内投与した。ＩＦＮα投与前、投与後２４時間後に腫瘍組織を採取した。【００７８】
採取した腫瘍組織よりトリゾール（ｔｒｉｚｏｌ：ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）でＲＮＡを抽出し、スーパースクリプトIII（Ｓｕｐｅｒ  ｓｕｃｒｉｐｔＩＩＩ：ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）によりｃＤＮＡに変換した。その後、ジーンナビゲーターｃＤＮＡアレイフィルタ  −ヒューマンキャンサー−（Ｇｅｎｅ  Ｎａｖｉｇａｔｏｒ  ｃＤＮＡ  Ａｒｒａｙ  Ｆｉｌｔｅｒ  −ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ−：東洋紡製）を用いて、反応を行い、フルオ−Ｓマルチイメージャー（Ｆｌｕｏｒ−Ｓ  ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ：ＢＩＯ  ＲＡＤ製）にてＤＮＡアレイ解析を行った。【００７９】
ＤＮＡアレイ解析の結果を図１に示した。また、得られたシグナル強度をコントロール値で補正したものを表１に示した。この結果、ＩＦＮαの投与により肝癌細胞のＦＧＦＲ１遺伝子が特異的に強く発現誘導されることが明らかになった。【００８０】
【表１】
2008149521.tif 000003
【００８１】
実施例２
抗ＦＧＦＲ１抗体の作製
（１）免疫用抗原（発現ベクター）の作製
全長のＦＧＦＲ１（Accession No. NM_000604）を鋳型として、配列番号１で表されるＦＧＦＲ１の全アミノ酸配列の１番から８２２番目までの領域に対応するポリヌクレオチドを、以下に示したプライマーＮｏ．５’−３及びＮｏ．３’−３を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）により増幅させた。次に上記で得られたポリヌクレオチドを、ｐｃＤＮＡ３.１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）に挿入し、発現ベクターを構築した。
プライマーＮｏ．５’−３（配列番号３）：
５’−ＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡＣＡ−３’
プライマーＮｏ．３’−３（配列番号４）：
５’−ＡＡＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＧＧＣＣＧＧＡ−３’【００８２】
（２）モノクローナル抗体の作製（発現ベクターの免疫）
免疫用抗原として、上記（１）において得られた発現ベクターを用い、１週間、又は２週間おきに５０μｌ（５０μｇ）を投与し、マウスを免疫した。抗原は初回免疫のみにフロイント完全アジュバントと混和し、二回目からはフロイント不完全アジュバントと混和した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（J. Immunol. 146:3721-3728）に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化されたＦＧＦＲ１に反応する細胞を選択することにより行った。上記のようにして選択した細胞を無血清培地のＧＩＴ培地（和光純薬）で細胞の８０％が死滅するまで抗体を産生させた。次いでこの培地から遠心（１,０００ｒｐｍ、１５分）により細胞を取り除いた後、硫酸アンモニウムを５０％飽和状態にして４℃で一晩静置し、沈殿を遠心（１,０００ｒｐｍ、３０分）により回収した。更にこの沈殿を２倍に希釈したバインディングバッファー（binding buffer：Ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＭＡＰＳ II ｋｉｔ製）に溶解させた後、プロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ製）にＩｇＧを吸着させた。その後、ＰＢＳ透析を一晩行って抗体を精製し、ＦＧＦＲ１を認識する抗体を複数得た。そしてこれらの抗体のうちのひとつをＡ２Ｃ９−１と名付けた。【００８３】
（３）ウェスタンブロッティングによるモノクローナル抗体Ａ２Ｃ９−１の特異性の確認
上記（２）で得られたモノクローナル抗体Ａ２Ｃ９−１がＦＧＦＲ１を認識することを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞に強制発現させたＦＧＦＲ１タンパク質等のサンプルを用いたウェスタンブロッティングにより確認した。それぞれのサンプルにはウェスタンブロッティングを行う前に、２−メルカプトエタノール（２Ｍｅ）を加えて還元状態とした。ウェスタンブロッティングは常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い行った。【００８４】
ウェスタンブロッティングの結果を図２に示した。この図２によるとモノクローナル抗体Ａ２Ｃ９−１が、ＦＧＦＲ１を強制発現させたサンプルについて、ＦＧＦＲ１の発現部位にバンドを有することが確認され、この抗体がＦＧＦＲ１に対し反応性を有することが確認された。以下、このモノクローナル抗体Ａ２Ｃ９−１を抗ＦＧＦＲ１抗体という。【００８５】
実施例３
肝癌細胞株におけるＩＦＮ投与によるタンパク質レベルにおけるＦＧＦＲ１発現の亢進の確認（１）
肝癌細胞株ｈｕＨ−７に、ＩＦＮα又はＩＦＮβをそれぞれ１,０００ＩＵ／ｍｌで投与した。投与後４８時間におけるＦＧＦＲ１の挙動をウェスタンブロッティング解析によって調べた。その結果を図３に示した。この図より、ＩＦＮα又はＩＦＮβの投与によりＦＧＦＲ１のタンパク質レベルでの発現量の増大が認められた。【００８６】
実施例４
肝癌細胞株におけるＩＦＮ投与によるタンパク質レベルにおけるＦＧＦＲ１発現の亢進の確認（２）
肝癌細胞株ｈｕＨ−７に、ＩＦＮα又はＩＦＮβをそれぞれ１,０００ＩＵ／ｍｌで投与した。投与後４８時間におけるＦＧＦＲ１の挙動をＦＡＣＳ解析によって調べた。その結果を図４に示した。この図より、ＦＡＣＳ解析においてもウェスタンブロッティング解析と同様に、ＩＦＮα又はβの投与によりＦＧＦＲ１の発現量の増大が認められた。【００８７】
実施例５
肝癌細胞株移植マウスからの切除材料におけるＦＧＦＲ１発現解析
ＳＣＩＤマウスにＨｅｐＧ２を移植（１×１０６）した。マウスの腫瘍が１０ｍｍとなった時点で、ＩＦＮα（ＯＩＦ：大塚製薬製）を１００Ｕ／ｇで投与し、投与２４時間後の腫瘍組織を採取し、抗ｈＦＧＦＲ１抗体（ｓｃ−１２１：Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ製）で染色した。その結果を図５に示した。この図より、ＩＦＮα投与前に比べてＩＦＮα投与後はＦＧＦＲ１が強く発現していることが確認された。【００８８】
実施例６
抗ＦＧＦＲ１抗体による肝癌細胞株の増殖抑制試験
ＩＦＮβ及び抗ＦＧＦＲ１抗体投与による肝癌細胞株への影響を調べるため、ＩＦＮβ（フェロン（Ｆｅｒｏｎ）、東レ株式会社製）及び抗ＦＧＦＲ１抗体存在下における肝癌細胞株の増殖、生存率を調べた。まず、２４穴プレートにｈｕＨ−７細胞を１.０×１０４の細胞を播き込んだ後、実施例２で作成した抗ＦＧＦＲ１抗体、及び陰性対象として抗体を含まない培養上清をそれぞれ添加した場合、及び何も添加しない場合（コントロール）について、それぞれ０〜６日培養した。その後、細胞をトリプシンで剥離し、細胞数及び生存率を計測した。その結果を図６に示した。この図より、ＩＦＮβ非存在下で、抗ＦＧＦＲ１抗体単独でも細胞増殖の抑制及び生存率の低下が認められた。さらに、同様な実験系に、ＩＦＮβを添加した場合の結果を図７に示した。この図より、ＩＦＮβ単独添加時にも細胞増殖の抑制及び生存率の低下が認められたが、ＩＦＮβに加えて抗ＦＧＦＲ１抗体を添加することによって、抗ＦＧＦＲ１抗体非投与時と比べてさらに生存率が約４０％減少した。【００８９】
実施例７
ヒト肝細胞がん移植マウスを用いた治療実験
CB17-scid/scidマウスを用いて、５×１０６個のヒト肝がん由来細胞株HepG2を皮下(背部)に移植した。腫瘍体積が100mm3に達した段階で抗ＦＧＦＲ１抗体、末梢血単核球、及び薬剤をそれぞれ次のように投与した。
PBS投与群：PBS(250μＬ)／Normal mouse IgG （100μｇ）／mouseを腹腔内注射
IFNα投与群：IFNα(OIF:4000U)／Normal mouse IgG（100μｇ）／mouseを腹腔内注射 
抗体単独投与群：PBS／抗FGFR1抗体（100mg）／mouseを静注
IFNα+抗体併用投与群：IFNα／抗FGFR1抗体（各同量）を腹腔内注射及び静注
IFNα+抗体＋末梢血単核球併用群：IFNα／抗FGFR1抗体（各同量）を腹腔内注射及び静注さらにPBMNC(1X107個)/mouseを静注【００９０】
投与は、初回投与日を０日目（ｄａｙ０）として、１週間後(w1)、２週間後（w2）、５週間後（w5）、６週間後（w6）の合計５回投与した。ただし、w6時のみ200μｇ／mouseを投与した。各群は4匹、腫瘍測定は投与開始後、毎週、｛長径×(短径)２｝／２で計測を行った。結果を図８に示す。また、ひし形で表される「ＰＢＳ」はコントロール群、四角で表される「ＩＦＮα」はＩＦＮα投与群、三角で表される「ＦＧＦＲ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ」は抗ＦＧＦＲ１抗体投与群、バツで表される「ＩＦＮα＋ＦＧＦＲ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ」は、ＩＦＮα及び抗ＦＧＦＲ抗体の併用群を表す。図８に示されるとおり、抗体単独投与群、及び、ＩＦＮα単独投与群では、コントロールとの差異が見られなかったが、ＩＦＮαと抗体の併用投与群においては明らかに腫瘍の増殖に対して抑制効果が認められた。さらに、末梢血単核球を用いた群においては、4匹中2匹の腫瘍の消失を含めて著明な抗腫瘍効果を認めた。【００９１】
上記実施例により、ＩＦＮα又はＩＦＮβは肝癌細胞株のＦＧＦＲ１の発現を亢進することが示された。また、ＦＧＦＲ１の発現が亢進された肝癌細胞は、抗ＦＧＦＲ１抗体により、増殖・生存が顕著に抑制されることが示された。さらに末梢血単核球を併用した結果から、ヒト生体内においては一層の効果が期待できるものであった。【００９２】
実施例８
肝癌、胆癌、骨髄腫、大腸癌、胃癌、乳癌、白血病、及び、膵臓癌細胞株におけるＩＦＮ投与によるタンパク質レベルにおけるＦＧＦＲ１発現の亢進の確認
それぞれ１×１０６個の、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２及びｈｕＨ−７、肝癌（胆癌）細胞株ＣＨＣ４、骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ８２２６、大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、胃癌細胞株ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４及びＳＨ１０１、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ及びＭＲＫ−ｎｕ１、白血病細胞株Ｕ９３７、並びに、膵臓癌細胞株ＨＰＣ−ｙｏを１００ｍｍ２プレートに播種し、ＩＦＮα（大塚製薬株式会社）、ＩＦＮβ（東レ株式会社）又はＩＦＮγ（肝癌細胞株のみ）をそれぞれ１,０００ＩＵ／ｍｌで添加後、５％ＣＯ２、３７℃で４８時間培養した。培養後のＦＧＦＲ１の挙動を、一次抗体として、２０μｇ／ｍＬの抗ＦＧＦＲ１モノクローナル抗体Ｍ１９Ｂ２（カタログ番号３０１０１、ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、二次抗体として、２５μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ＋Ｍ−ＦＩＴＣ（カタログ番号１７６２１、株式会社免疫生物研究所）を使用して、ＦＡＣＳ解析を行った。抗体陽性コントロール細胞としてＤｏｘ４０細胞を、抗体陰性コントロール細胞としてｊｕｒｋａｔ細胞を使用した。結果を図９に示す。本結果から、肝癌以外の癌細胞においてもＩＦＮ刺激によりＦＧＦＲ１の発現量が増大することが認められた。【００９３】
実施例９
多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ１２ＢＭにおけるＡＤＲ及び／又はデシタビン（decitabine）投与によるｍＲＮＡレベルにおけるＦＧＦＲ１発現の亢進の確認
ＤＮＡアレイを用いて、ＫＭＳ１２ＢＭ細胞に対して、デシタビン（decitabine）１μＭ、又は／及び、ＡＤＲ０．５μｇ／ｍｌを投与し、デシタビン（decitabine）は投与から７２時間後、ＡＤＲは投与から２４時間後のＦＧＦＲ１のｍＲＮＡレベルでの発現の変化を検討した。結果を図１０に示す。図中、縦軸は薬剤を投与しなかった細胞株における発現レベルを１とした比で表した。また、図中デシタビン（decitabine）投与群をＡｚａで表す。本結果から、ＡＤＲ及び／又はデシタビン（decitabine）刺激によりＦＧＦＲ１の発現量が増大することが認められた。【００９４】
本願は、２００７年５月２９日に出願された日本国特許出願第２００７−１４２３０８号に関する優先権の利益を主張するものである。これらの文献の中身は全て参照により本願に組み込まれる。また、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９５】
本発明の肝癌治療剤は、正常な肝細胞には影響を与えず、肝癌細胞の増殖・生存のみに影響するものであるので肝癌の治療に用いることができる。
【図４】
2008149521.tif 000004
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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