(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトミセス・モバラエンシス由来のトランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが、ストレプトミセス・モバラエンシス由来の成熟型トランスグルタミナーゼに非共有結合により結合した構造からなり、
プロ配列ペプチドが、以下の（１）〜（３）のいずれかの配列からなる、安定型トランスグルタミナーゼ：
（１）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡ（配列番号１）；
（２）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳ（配列番号２）；
（３）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳ（配列番号３）。
【請求項２】
成熟型トランスグルタミナーゼが、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
【請求項３】
トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが結合していない成熟型トランスグルタミナーゼと比較して、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性及び保存安定性からなる群より選択される一以上の安定性が高い、請求項１又は２に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の安定型トランスグルタミナーゼを含有する酵素製剤。
【請求項５】
トランスグルタミナーゼ産生能を有するストレプトミセス・モバラエンシスを、トランスグルタミナーゼを産生する条件下で培養するステップ、
培養液より、トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが非共有結合により結合した成熟型トランスグルタミナーゼを分離・回収するステップ、
を含む、安定型トランスグルタミナーゼの製造法であって、
プロ配列ペプチドが、以下の（１）〜（３）のいずれかの配列からなる、安定型トランスグルタミナーゼの製造法：
（１）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡ（配列番号１）；
（２）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳ（配列番号２）；
（３）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳ（配列番号３）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はトランスグルタミナーゼに関する。詳しくは、酸化安定性や温度安定性などに優れた安定型トランスグルタミナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシルアミド基のアシル転移反応を触媒する酵素で、アシル受容体としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が作用すると、タンパク質分子の分子内あるいは分子間においてε−（γ−Ｇｌｎ）−Ｌｙｓ架橋結合を形成させる。従って、トランスグルタミナーゼの作用を利用すればタンパク質又はペプチドの改質を行うことができるため、ストレプトミセス属由来の微生物酵素を用いたトランスグルタミナーゼ（特許文献１参照）が肉の結着、ソーセージ、豆腐、パン、麺類の製造に使用されている。【０００３】
トランスグルタミナーゼは、発酵過程でプロ体を経て成熟型に変換されるシスティンを活性中心残基とするチオール酵素であることから安定性が悪く、製造工程中あるいは製品保存中での失活を抑えるため、安定化剤の添加が必要であった。
トランスグルタミナーゼの保存中の安定性を改善するための方法として、有機酸、無機酸、ポリフェノール、チオール、糖アルコールなどを添加することが提案された（特許文献１）。また、タンパク質（小麦タンパク質や大豆タンパク質など）やタンパク質の部分加水分解物を添加して安定性を高める方法も開発された（特許文献２）。さらには、トレハロースを利用して安定化する技術も開発された（特許文献３）。
【特許文献１】特開平４−２０７１９４号公報
【特許文献２】特許第３６５１００３号公報
【特許文献３】特開２００４−３０５０１０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これまでに各種の安定化技術が提案されたものの、依然としてトランスグルタミナーゼを安定化することに対するニーズは高い。前述の通り、トランスグルタミナーゼは食品分野で広く利用されている。従って、不測の事態を回避するためには、可能な限り余分な成分を添加しないことが望まれる。
以上の背景の下、本発明は、安定性に優れたトランスグルタミナーゼ、その製造法、並びにその用途を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは以上の課題に鑑み鋭意検討した。その結果、トランスグルタミナーゼ生産菌の培養液中にトランスグルタミナーゼ中間体の存在を認め、これを回収することに成功した。検討を更に進めたところ、回収された中間体は、プロ配列ペプチドが成熟型トランスグルタミナーゼ（成熟型ＴＧａｓｅ）に結合したものであることが明らかとなった。一方、中間体の安定性を評価した結果、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性及び保存安定性のいずれについても成熟型ＴＧａｓｅを凌ぐことが判明した。
本発明は以上の知見に基づき完成されたものであり、次の通りである。
［１］トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが成熟型トランスグルタミナーゼに結合した構造からなる、安定型トランスグルタミナーゼ。
［２］成熟型トランスグルタミナーゼが微生物由来である、［１］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
［３］微生物がストレプトミセス属微生物である、［２］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
［４］微生物がストレプトミセス・モバラエンシスである、［２］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
［５］成熟型トランスグルタミナーゼが、配列番号６に示すアミノ酸配列を有する、［１］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
［６］プロ配列ペプチドが微生物由来である、［１］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
［７］微生物がストレプトミセス属微生物である、［６］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
［８］微生物がストレプトミセス・モバラエンシスである、［６］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
［９］プロ配列ペプチドが、以下の（１）〜（３）のいずれかの配列を有する、［１］に記載の安定型トランスグルタミナーゼ：
（１）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡ（配列番号１）；
（２）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳ（配列番号２）；
（３）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳ（配列番号３）。
［１０］トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが結合していない成熟型トランスグルタミナーゼと比較して、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性及び保存安定性からなる群より選択される一以上の安定性が高い、［１］〜［９］のいずれかに記載の安定型トランスグルタミナーゼ。
［１１］［１］〜［１０］のいずれかに記載の安定型トランスグルタミナーゼを含有する酵素製剤。
［１２］トランスグルタミナーゼ産生能を有する微生物を、トランスグルタミナーゼを産生する条件下で培養するステップ、
培養液より、プロ配列ペプチドが結合した成熟型トランスグルタミナーゼを分離・回収するステップ、
を含む、安定型トランスグルタミナーゼの製造法。
［１３］微生物が、ストレプトミセス属微生物である、［１２］に記載の安定型トランスグルタミナーゼの製造法。
［１４］微生物が、ストレプトミセス・モバラエンシスである、［１２］に記載の安定型トランスグルタミナーゼの製造法。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ−ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ−ＴＧａｓｅ）のｐＨ安定性の比較。横軸はｐＨ、縦軸は残存活性（％）。
【図２】安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ−ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ−ＴＧａｓｅ）の温度安定性の比較。横軸は処理時間（分）、縦軸は残存活性（％）。
【図３】安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ−ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ−ＴＧａｓｅ）の酸化安定性の比較。横軸は過酸化水素濃度（％）、縦軸は残存活性（％）。
【図４】安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ−ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ−ＴＧａｓｅ）の保存安定性の比較。横軸は保存期間（月）、縦軸は残存活性（％）。
【図５】安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ−ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ−ＴＧａｓｅ）の温度安定性の比較。横軸は処理時間（分）、縦軸は残存活性（％）。
【図６】安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ−ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ−ＴＧａｓｅ）の酸化安定性の比較。横軸は過酸化水素濃度（％）、縦軸は残存活性（％）。
【図７】安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ−ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ−ＴＧａｓｅ）の温度安定性の比較。横軸は処理時間（分）、縦軸は残存活性（％）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（安定型ＴＧａｓｅ）
本発明の安定型トランスグルタミナーゼ（安定型ＴＧａｓｅ）は、トランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドが成熟型ＴＧａｓｅに結合した構造を有する。即ち、必須の構成要素はトランスグルタミナーゼのプロ配列ペプチドと成熟型ＴＧａｓｅであり、これらの要素が結合していることが特徴となる。この特徴によって、本発明の安定型ＴＧａｓｅは、成熟型ＴＧａｓｅよりも高い安定性を示す。本明細書において用語「安定性」は、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性、保存安定性を包括する表現として使用される。従って、本発明の安定型ＴＧａｓｅは、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性及び保存安定性からなる群より選択される一以上の安定性について成熟型ＴＧａｓｅよりも優れることになる。好ましい態様の安定型ＴＧａｓｅは、ｐＨ安定性、温度安定性、酸化安定性、及び保存安定性の全てについて成熟型ＴＧａｓｅよりも優れる。【０００８】
ところで、分泌型タンパク質であるトランスグルタミナーゼはシグナル配列（プレ配列）及びプロ配列が連結されたプレプロ型トランスグルタミナーゼとして翻訳された後、シグナル配列が切断されてプロ型トランスグルタミナーゼに変換され、続いてプロ配列が切断され、成熟型トランスグルタミナーゼ（成熟型ＴＧａｓｅ）になる。後述の実施例に示す通り、本発明者らは、この一連の過程の中で、切断されたプロ配列ペプチドが成熟型トランスグルタミナーゼに結合した構造の中間体が存在することを見出すとともに、それが安定性に優れることを明らかにした。本発明の安定型ＴＧａｓｅは、典型的には、上記の過程で生成される中間体として得られるが、プロ配列ペプチドが成熟型ＴＧａｓｅに結合した構造を有し、成熟型ＴＧａｓｅよりも安定性が向上している限りにおいてその製造法（取得法）は特に限定されない。従って、プロ配列ペプチドと成熟型ＴＧａｓｅを別々に用意し、両者を結合させて得られるものも、安定性の向上が認められる限り、本発明の安定型ＴＧａｓｅに該当する。【０００９】
本明細書において「プロ配列ペプチド」とは、プロ配列（即ち、プレ配列と成熟型タンパク質配列の間に存在する配列）を構成するペプチドの一部又は全部のことをいう。プロ配列ペプチドの例として３種のペプチドを以下に示す。【００１０】
プロ配列ペプチドの例１：ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡ（配列番号１）の配列からなるペプチド
プロ配列ペプチドの例２：ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳ（配列番号２）の配列からなるペプチド
プロ配列ペプチドの例３：ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳ（配列番号３）の配列からなるペプチド【００１１】
プロ配列ペプチドの由来（起源）は特に限定されない。好ましくは、プロ配列ペプチドは微生物由来である。「微生物由来のプロ配列ペプチド」には、ストレプトミセス属などの微生物が産生するトランスグルタミナーゼ（例えば特開昭６４−２７４７１号公報を参照）のプロ配列ペプチドの他、当該プロ配列ペプチド（即ち、微生物が産生するトランスグルタミナーゼのプロ配列の一部又は全長）と同一のアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。微生物が産生するトランスグルタミナーゼのプロ配列全長のアミノ酸配列の例を配列番号４（ストレプトミセス・モバラエンシス）、配列番号５（ストレプトミセス・シナモネウス）に示す。【００１２】
本発明の安定型ＴＧａｓｅの構成要素の一つである成熟型ＴＧａｓｅの由来（起源）も特に限定されない。例えば、ストレプトミセス属などの微生物が産生する成熟型ＴＧａｓｅ（例えば特開昭６４−２７４７１号公報を参照）、哺乳動物が産生する成熟型ＴＧａｓｅ（例えば特公平１−５０３８２号公報を参照）、組換えＤＮＡ技術を利用して得られるリコンビナント（組換え型）成熟型ＴＧａｓｅ（例えば特開平５−１９９８８３号公報、特開２００４−９７０９９号公報）等を用いることができる。好ましくは、成熟型ＴＧａｓｅは微生物由来である。「微生物由来の成熟型ＴＧａｓｅ」には、ストレプトミセス属などの微生物が産生する天然型の成熟型ＴＧａｓｅ（例えば特開昭６４−２７４７１号公報を参照）の他、微生物が産生するトランスグルタミナーゼの遺伝子が導入された形質転換体を培養して得られるリコンビナント成熟型ＴＧａｓｅが含まれる。微生物由来の成熟型ＴＧａｓｅのアミノ酸配列の例を配列番号６（ストレプトミセス・モバラエンシス）、配列番号７（ストレプトミセス・シナモネウス）に示す。【００１３】
プロ配列ペプチド及び／又は成熟型ＴＧａｓｅの由来としての微生物は、好ましくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である。ストレプトミセス属に属する微生物としては、ストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）（旧ストレプトベルチシリウム・モバラエンス）Ｎｏ．１４０２２６株（特開２００５−７３６２８号公報）、ストレプトミセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）Ｎｏ．４６６（特許第２８４９７７３号明細書、特許文献１参照）、ストレプトミセス・エスピー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．）Ｎｏ．８３（特許第２８４９７７３号明細書、特許文献１参照）等を挙げることができる。また、紫外線照射やＮＴＧ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｎ’−ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ）等の常法を用いて生産性を高めたり、プロテアーゼやアミラーゼなどの夾雑蛋白の生成を減らしたり、抗生物質などの生理活性物質を抑制又は欠如させたような変異株を使用することもでき、更には、遺伝子組換え菌等の使用もできる。【００１４】
組換えＤＮＡ技術を利用すれば（即ち、遺伝子組換え菌を使用する場合）、プロ配列ペプチドの由来と成熟型ＴＧａｓｅの由来が異なる安定型ＴＧａｓｅを得ることも可能である。但し、好ましくは、プロ配列ペプチドの由来と成熟型ＴＧａｓｅの由来は同一である。このような形態の安定型ＴＧａｓｅは、典型的には、トランスグルタミナーゼ生産菌（本来的に生産能を有する菌又はトランスグルタミナーゼ遺伝子が導入された組換え菌）を培養することによって、中間体として得られる。以下、当該形態の安定型ＴＧａｓｅの製造法の一例を説明する。【００１５】
（安定型ＴＧａｓｅの製造法）
まず、トランスグルタミナーゼ産生能を有するストレプトミセス属微生物（例えばストレプトミセス・モバラエンシスＮｏ．１４０２２６株）を用意し、トランスグルタミナーゼを産生する条件下で培養する。トランスグルタミナーゼを産生することが可能である限り、培養条件は特に限定されない。培養条件の具体例は、後述の実施例に示される。当業者であれば、必要に応じて培養条件を適宜変更可能である。【００１６】
培地には、デンプン、蔗糖、乳糖、グリセロール、グルコース等の炭素源、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム等の窒素源、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等の微量金属塩など一般的に用いられる培地原料を使用できる。また、発泡を抑えるために消泡剤の添加も必要に応じて行うことができる。培養温度は２５℃〜３５℃が一般的である。また、各種発酵容器を用いて培養すればよく、通常２日間〜６日間の通気撹拌が行われる。使用する菌株の種類や発酵培地によっては必ずしもこの条件に従わなくても良い。例えば、培地原料をフイーヂングしたり、高濃度の培地原料を含む場合は、一般的に培養時間が更に長くなることもある。また、培地ｐＨの制御も必要に応じて行われる。【００１７】
培養終了後における発酵混合物からの菌体等の除去は、濾過あるいは遠心分離により行われる。濾過としては、けい藻土を加えた加圧濾過が好ましく、また、室温以下で実施することが好ましい。得られた濾液、すなわちトランスグルタミナーゼ粗酵素液は、必要に応じて冷却される。尚、Ｅｕｒ，．Ｊ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５７，５７０−５７６（１９９８）に記載されているように、トランスグルタミナーゼは前駆体として生産されることが知られており、安定型ＴＧａｓｅへの変換のため発酵混合物を一定時間プロテアーゼ或いはペプチダーゼ等の酵素を添加して処理しても良い。また、トランスグルタミナーゼは、酵素活性を持たない酸化型としても一部存在することが知られているため、システィンやグルタチオン、あるいはそれらを含む物質を添加して活性型に変換することも望ましい。但し、これらの活性化操作は、精製工程の段階に限定して行われるものではないが、好ましくは、精製の早い段階で行うのが好ましい。【００１８】
必要に応じて粗酵素液は濃縮される。濃縮方法は特に限定されないが、濃縮と精製が同時に可能な限外濾過によることが好ましい。濃縮は通常１０倍〜１００倍程度まで行うことができる。但し、次の工程が可能な濃度まで濃縮される限り、濃縮の程度は特に問わない。なお、限外濾過膜は、ＴＧａｓｅの分子量（約３８，０００）を考慮すれば、それ以下の例えば分子量１３，０００の平均孔径を有する旭化成工業製ＡＣＰ−１３０００等の使用が好ましい。但し、分子量５０，０００の孔径を有する膜を使用してもほとんど酵素が漏れることがないので、必要に応じて膜の選択を行うことで精製度を高めることも可能である。脱塩濃縮において沈殿を生じることもあるが、適切な緩衝液あるいは塩類溶液等を加えることにより溶解させることが可能である。また、濃縮時の温度は、特に限定されるものではないが、１０℃〜３０℃が好ましい。温度が高い程濃縮は効率的に実施できるが、その反面、失活のおそれがある。【００１９】
濃縮液中には目的の安定型ＴＧａｓｅ（プロ配列ペプチドが結合した成熟型ＴＧａｓｅ）と成熟型ＴＧａｓｅが含まれる。そこで、濃縮液から目的の安定型ＴＧａｓｅを回収する。以下、安定型ＴＧａｓｅの回収法の一例を説明する。まず、夾雑タンパク質などを除去するため、エタノール、ポリエチレングリコール等を使用した前処理によって濃縮液を部分精製する。この前処理によって回収された沈澱を適当な緩衝液に溶解した後、透析に供する。透析後、硫安や塩化ナトリウム等の塩類を加えて塩析する。これによって成熟型ＴＧａｓｅが沈澱する。上清を回収した後、塩析、カラムクロマトグラフィー、遠心分離等を利用して上清中の安定型ＴＧａｓｅを分離・精製する。必要に応じて脱塩、濃縮などを行う。【００２０】
（安定型ＴＧａｓｅを含有する酵素製剤）
安定型ＴＧａｓｅを用いて酵素製剤を構成することができる。本発明の酵素製剤の形状は特に限定されず、例えば粉末状、顆粒状、液体状、カプセル状等である。本発明の酵素製剤は、必須の有効成分として安定型ＴＧａｓｅを含有する。その他の成分は任意である。本発明の酵素製剤が含有可能な成分として、食品用賦形剤、各種タンパク質、各種タンパク質の分解物、各種エキス類、各種塩類、各種酸化防止剤、システイン、グルタチオン、グルタミン酸ナトリウム、イノシン酸ナトリウム、グアニル酸ナトリウム、貝殻焼成カルシウム、二酸化ケイ素を例示することができる。尚、食品用賦形剤の例は、デキストリン、分岐デキストリン、サイクロデキストリン、グルコース、乳糖、蔗糖、トレハロース、マルチトール、マンニトール、ソルビトール、多糖類、澱粉（馬鈴薯澱粉やコーンスターチ）、難消化性デキストリン、ガム類、乳化剤（ショ糖脂肪酸エステル、レシチンなど）、ペクチン、油脂である。タンパク質の例は、大豆タンパク質、小麦タンパク質、トウモロコシタンパク質、乳タンパク質、動物由来タンパク質などである。エキス類の例は肉エキス、植物エキス、酵母エキスなどである。塩類の例は、塩化塩、リン酸塩、ポリリン酸塩、ピロリン酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、炭酸塩などである。酸化防止剤の例は、L-アスコルビン酸塩、亜硫酸水素ナトリウムなどである。
【実施例】
【００２１】
１．安定型ＴＧａｓｅの精製
可溶性デンプン２％、ショ糖５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二カリウム０．２％、アデカノール０．０５％を含む培地を用い、トランスグルタミナーゼ生産菌であるストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｎｏ．１４０２２６株（特開２００５−７３６２８号公報を参照）を３０℃で２日間振とう培養し、粗酵素液４０００ｍＬを得た。尚、特に言及しない限り、％は重量％を意味する（以下の各実施例においても同様）。【００２２】
次に、限外濾過膜（旭化成社製ＡＣＰ１０１０）により粗酵素液を脱塩・濃縮し、２００ｍＬの濃縮液を得た。濃縮液に最終１／１０濃度となるようにマッキルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ６．０）を添加・混合した後、冷エタノール５０％で分画した。回収した沈殿を、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む１／１０濃度のマッキルバイン（ＭｃＩｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した後、透析に供した。続いて、透析液に飽和濃度になるまで塩化ナトリウムを添加し、低温で３日間静置した後、上清を回収した。沈殿は成熟型ＴＧａｓｅ（Ｍ−ＴＧａｓｅ）の結晶であり、飽和食塩溶液による再結晶化によりＭ−ＴＧａｓｅ精製酵素が得られた。Ｍ−ＴＧａｓｅ精製酵素の比活性（ｕ／Ａｂｓ２８０ｎｍ）は１９．１であった。尚、Ｍ−ＴＧａｓｅのアミノ酸配列を配列番号６に示した。【００２３】
一方、回収した上清に飽和濃度になるまで硫酸アンモニウムを添加し、沈殿を回収した。回収した沈澱を２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ７．２）に溶解後、同緩衝液で透析した。次に、透析液に１．７Ｍとなるように硫酸アンモニウムを添加し、１．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ７．２）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに供した。硫酸アンモニウム濃度１．７Ｍで洗浄した後、硫酸アンモニウム濃度１．０Ｍで溶出した。本溶出画分に目的の安定型ＴＧａｓｅ（Ｐ−ＴＧａｓｅ）が溶出した。このようにして得られたＰ−ＴＧａｓｅの比活性（ｕ／Ａｂｓ２８０ｎｍ）は７．９であった。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を添加した場合と添加しない場合のゲルろ過（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００）の溶出パターンを比較した結果、Ｐ−ＴＧａｓｅは、成熟型ＴＧａｓｅにプロ配列ペプチドが結合した構造を有することが判明した。【００２４】
トランスグルタミナーゼの活性の測定は、特開昭６４−２７４７１号公報に記載の方法により行った。すなわち、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミンを基質としてＣａ２＋非存在下で反応を行い、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸共存下で鉄錯体を形成させ、５２５ｎｍの吸収を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量線より求めトランスグルタミナーゼ活性を算出する。以下、測定法の詳細を説明する。まず、以下の試薬Ａ及びＢを用意する。
試薬Ａ：０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．１Ｍヒドロキシルアミン、０．０１Ｍ還元型グルタチオン、０．０３Ｍベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニルグリシン
試薬Ｂ：３Ｎ塩酸、１２％トリクロロ酢酸、５％ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ（Ｏ．１Ｎ−ＨＣｌに溶解）の１：１：１の混合液【００２５】
酵素液０．０５ｍＬに試薬Ａを０．５ｍＬ加えて混合した後、３７℃で１０分間反応させる。試薬Ｂを加えて反応を停止させるともにＦｅ錯体を形成させた後、５２５ｎｍの吸光度を測定する。対照として、予め熱失活させた酵素液を用いて同様に反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差を求める。別途、酵素液の代わりにＬ−グルタミン酸−γ−モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求める。１分間に１μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を１単位とする。特に言及しない限り、以下の各試験においても当該測定法によりトランスグルタミナーゼの活性を測定した。【００２６】
２．プロ配列ペプチドの精製
１．で得られたＰ−ＴＧａｓｅ溶液１．８ｍＬに５．０ｍｇの炭酸ナトリウムを添加・溶解した後、１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液を０．２ｍＬ混合し、３７℃で３０分処理した。処理液２．０ｍＬを、０．１％ＳＤＳを含む２０ｍＭＫＰＢ（ｐＨ７．２）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００（カラム体積１６０ｍＬ）に供した。吸光度２８０ｎｍをモニタリングし、移動相量１２３ｍＬ付近に見られるピークを回収した。回収した溶液をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（Ｕｌｔｒａｃｅｌ−５Ｋ）を用い、４℃の条件下、遠心濃縮した。得られた濃縮液（サンプル）をＮ末端アミノ酸解析及び質量分析に供した。Ｎ末端アミノ酸分析の結果から、ペプチドのＮ末端がＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳであることが明らかになった。一方、質量分析の結果、ｍ／ｚ  （１）３６２３．９３８、（２）３６４０．９０３、（３）３７１０．７８０、（４）３７２７．８４５、（５）３８１３．７３５の５つのピークが観測された。（１）と（３）はそれぞれ（２）と（４）の脱アミド体と考えられる。Ｎ末端アミノ酸解析の結果と質量分析の結果より、その他の３ピークのアミノ酸配列は（１）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡ（配列番号１）、（２）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳ（配列番号２）、（３）ＤＮＧＡＧＥＥＴＫＳＹＡＥＴＹＲＬＴＡＤＤＶＡＮＩＮＡＬＮＥＳＡＰＡＡＳＳ（配列番号３）と同定された。尚、これらの配列は、プロ配列全長（配列番号４）の一部に相当する。【００２７】
３．Ｐ−ＴＧａｓｅの安定性試験１
Ｐ−ＴＧａｓｅとＭ−ＴＧａｓｅのｐＨ安定性を比較した。ｐＨ２〜４はクエン酸−塩酸緩衝液、ｐＨ４〜１１はユニバーサル（Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液を用いて各酵素希釈液を調製し、５０℃、１時間処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。その結果、Ｐ−ＴＧａｓｅはｐＨ４でも９３％の残存活性を有しているのに対して、同条件でのＭ−ＴＧａｓｅの残存活性は２％であった（図１）。このように、Ｐ−ＴＧａｓｅは酸性域で高い安定性を示した。【００２８】
一方、Ｐ−ＴＧａｓｅとＭ−ＴＧａｓｅの温度安定性も比較した。０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で各酵素希釈液を調製し、各温度で熱処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。その結果、５０℃で８０分処理した場合の残存活性は、Ｍ−ＴＧａｓｅが３３％であるのに対して、Ｐ−ＴＧａｓｅは６４％であった（図２）。このように、Ｐ−ＴＧａｓｅはＭ−ＴＧａｓｅよりも高い熱安定性を示した。【００２９】
４．Ｐ−ＴＧａｓｅの安定性試験２
溶液中の酸化に対する安定性（酸化失活のしにくさ）を評価するため、阻害試験（対過酸化水素）を実施した。過酸化水素水（試薬、３０％（ｗ／ｖ））を適宜０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈して酵素溶液に添加し、３７℃で３０分処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。処理濃度０．０３％（ｗ／ｖ）の場合の残存活性は、Ｍ−ＴＧａｓｅが３％であるのに対して、Ｐ−ＴＧａｓｅは５４％であった（図３）。このように、Ｐ−ＴＧａｓｅは溶液中において高い酸化安定性を示した。【００３０】
５．Ｐ−ＴＧａｓｅの安定性試験３
粉末状態での安定性を評価した。凍結乾燥によりＰ−ＴＧａｓｅとＭ−ＴＧａｓｅをそれぞれ粉末化した。Ｍ−ＴＧａｓｅ粉末にはデキストリンを混合し、Ｐ−ＴＧａｓｅ粉末と重量あたりのトランスグルタミナーゼ活性が同一となるようにした。保存温度は４４℃とした。２ヶ月後の残存活性は、Ｍ−ＴＧａｓｅが７９％であるのに対して、Ｐ−ＴＧａｓｅは８５％であった（図４）。このように、粉末状態の場合もＰ−ＴＧａｓｅは高い安定性を示した。【００３１】
６．Ｐ−ＴＧａｓｅの精製（ストレプトミセス・ラベンデュラエ  Ｎｏ．４６６）
可溶性デンプン２％、ショ糖５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二カリウム０．２％、アデカノール０．０５％を含む培地を用い、トランスグルタミナーゼ生産菌であるストレプトミセス・ラベンデュラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）Ｎｏ．４６６（特許第２８４９７７３号公報、特開平４−２０７１９４号公報を参照）を３０℃で３日間振とう培養し、粗酵素液１５００ｍＬを得た。【００３２】
次に、限外濾過膜（旭化成社製ＡＣＰ１０１０）により粗酵素液を濃縮し、３００ｍＬの濃縮液を得た。濃縮液を８０％飽和濃度硫酸アンモニウムで塩析し、沈殿を回収した。回収した沈殿を２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ７．２）で溶解し、更に同緩衝液で透析した。透析サンプルから不溶物を除去し、上清を同じく２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ７．２）で平衡化したＢｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに供した。同緩衝液での洗浄画分を回収し、１．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ６．８）で透析した。透析サンプルを同じく１．７Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ＫＰＢ；ｐＨ６．８）で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗに供した。同緩衝液で洗浄後、硫酸アンモニウム濃度１．７Ｍ〜０Ｍのリニアグラジエントで溶出したところ、溶出液硫酸アンモニウム濃度１．０Ｍ付近にＰ−ＴＧａｓｅが溶出した。また溶出液硫酸アンモニウム濃度０．８Ｍ付近にＭ−ＴＧａｓｅが溶出した。【００３３】
７．Ｐ−ＴＧａｓｅ（ストレプトミセス・ラベンデュラエ  Ｎｏ．４６６）の安定性試験１
Ｐ−ＴＧａｓｅとＭ−ＴＧａｓｅの温度安定性も比較した。０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で各酵素希釈液を調製し、各温度で熱処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。その結果、５０℃で２０分処理した場合の残存活性は、Ｍ−ＴＧａｓｅが１２％であるのに対して、Ｐ−ＴＧａｓｅは２９％であった（図５）。このように、ストレプトミセス・ラベンデュラエ  Ｎｏ．４６６株由来のＰ−ＴＧａｓｅは同株由来のＭ−ＴＧａｓｅよりも高い熱安定性を示した。【００３４】
８．Ｐ−ＴＧａｓｅ（ストレプトミセス・ラベンデュラエ  Ｎｏ．４６６）の安定性試験２
溶液中の酸化に対する安定性（酸化失活のしにくさ）を評価するため、阻害試験（対過酸化水素）を実施した。過酸化水素水（試薬、３０％（ｗ／ｖ））を適宜０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈して酵素溶液に添加し、３７℃で１５分処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。処理濃度０．００６％（ｗ／ｖ）の場合の残存活性は、Ｍ−ＴＧａｓｅが３５％であるのに対して、Ｐ−ＴＧａｓｅは６２％であった（図６）。このように、ストレプトミセス・ラベンデュラエ  Ｎｏ．４６６株由来のＰ−ＴＧａｓｅは溶液中において高い酸化安定性を示した。【００３５】
９．プロ型トランスグルタミナーゼの調製
可溶性デンプン２％、ショ糖５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．２％、硫酸マグネシウム０．１％、リン酸二カリウム０．２％、アデカノール０．０５％を含む培地を用い、トランスグルタミナーゼ生産菌であるストレプトミセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）Ｎｏ．１４０２２６株（特開２００５−７３６２８）を３０℃で２日間振とう培養し、粗酵素液１５００ｍＬを得た。粗酵素液を限外濾過膜（旭化成社製ＡＣＰ１０１０）により濃縮し、１５０ｍＬの濃縮液を得た。濃縮液を文献情報（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７，５７０−５７６（１９９８））に基づいた方法で精製し、プロ型トランスグルタミナーゼを得た。【００３６】
１０．Ｐ−ＴＧａｓｅの調製（プロテアーゼ処理によるプロ型トランスグルタミナーゼからの変換）
プロ型トランスグルタミナーゼ溶液を１５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．４）で透析して透析サンプル（Ａｂｓ．２８０ｎｍ＝１．８）を得た。透析サンプルにディスパーゼII（ロシェ製）を処理液終濃度０．０８ｕ／ｍＬとなるように添加後、３０℃で６０分処理してＰ−ＴＧａｓｅを調製した。反応停止は５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．２Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で下記「１１．」の使用濃度まで希釈することにより行った。一方、下記「１１．」で使用するＭ−ＴＧａｓｅもＰ−ＴＧａｓｅと同様にディスパーゼII処理したサンプルを用いた。【００３７】
１１．Ｐ−ＴＧａｓｅ（プロテアーゼ処理品）の安定性試験
Ｐ−ＴＧａｓｅとＭ−ＴＧａｓｅの温度安定性も比較した。０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．０）で各酵素希釈液を調製し、各温度で熱処理した後、トランスグルタミナーゼ活性を測定した。その結果、５０℃で６０分処理した場合の残存活性は、Ｍ−ＴＧａｓｅが４１％であるのに対して、Ｐ−ＴＧａｓｅは７６％であった（図７）。このように、プロテアーゼ処理によって得られたＰ−ＴＧａｓｅもＭ−ＴＧａｓｅよりも高い熱安定性を示した。このことから、プロテアーゼ処理によって得られた上記「１０.」のＰ−ＴＧａｓｅは上記「１.」のＰ−ＴＧａｓｅと同じ物質であると考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
本発明の安定型トランスグルタミナーゼは成熟型トランスグルタミナーゼに比較してｐＨ安定性、温度安定性などの点で優れる。本発明の安定型トランスグルタミナーゼの用途の例は、肉の結着、ソーセージ、豆腐、パン、麺類の製造である。【００３９】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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