(57)【要約】  本発明は、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクの判定に用いられるプローブ、プライマー、プライマーセット、および抗体の提供を目的とする。本発明によれば、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のチミン残基の検出に用いられるプローブ、プライマー、プライマーセット、および抗体が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＩＩＩａ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基がチミン残基であるポリヌクレオチド、または該チミン残基を含んでなるその断片。
【請求項２】
以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその断片：
（ｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列またはその一部からなるタンパク質をコードする、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその断片。
【請求項４】
配列番号：１で表されるヌクレオチド配列またはその一部からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその断片。
【請求項５】
ＧＰＩＩＩａタンパク質のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、ＧＰＩＩＩａタンパク質の４０７番目のアミノ酸残基がセリン残基であるタンパク質、または該セリン残基を含んでなるその断片。
【請求項６】
以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択される、請求項５に記載のタンパク質またはその断片：
（ｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【請求項７】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列またはその一部からなる、請求項５に記載のタンパク質またはその断片。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができ、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域の、核酸増幅法による増幅に用いられる、プライマー。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドからなる、請求項８に記載のプライマー。
【請求項１０】
少なくとも１２〜３０塩基の長さである、請求項８または９に記載のプライマー。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の二種以上のプライマーからなり、かつＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域の、核酸増幅法による増幅に用いられる、プライマーセット。
【請求項１２】
新生児血小板減少性紫斑病もしくはその発症リスク、または血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性の判定に用いられる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のプライマーまたは請求項１１に記載のプライマーセット。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができ、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のチミン残基の検出に用いられる、プローブ。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる、請求項１３に記載のプローブ。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個のヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドからなる、請求項１３または１４に記載のプローブ。
【請求項１６】
少なくとも１２〜３０塩基の長さである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１７】
新生児血小板減少性紫斑病もしくはその発症リスク、または血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性の判定に用いられる、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載のタンパク質またはその断片に対する抗体。
【請求項１９】
ＧＰＩＩＩａ遺伝子の変異を検出することにより、新生児血小板減少性紫斑病もしくはその発症リスク、または血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定する方法であって、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のプライマー、請求項１１に記載のプライマーセット、または請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のプローブを用いて、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のチミン残基を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項２０】
ＧＰＩＩＩａ遺伝子の変異を検出することにより、新生児血小板減少性紫斑病もしくはその発症リスク、または血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定する方法であって、請求項１８に記載の抗体を用いて、ＧＰＩＩＩａタンパク質における４０７番目のセリン残基を検出する工程を含んでなる、方法。
【請求項２１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載のプライマー、請求項１１に記載のプライマーセット、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のプローブ、または請求項１８に記載の抗体を少なくとも含んでなる、新生児血小板減少性紫斑病もしくはその発症リスク、または血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクを判定するためのマーカーである新規ＧＰＩＩＩａ遺伝子に関する。詳細には、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における変異の検出手段、該変異の検出方法および検出キットに関する。
【０００２】
背景技術
血小板は、血管障害部に粘着し、その後血小板同士が結合（凝集）し、血栓を形成するが、血小板膜に存在する様々なタンパク質がこれらの機能を司っている。このような膜タンパク質としては、ＧＰＩ（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉ）、ＧＰＩＩｂ（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ）、ＧＰＩＩＩａ（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩＩａ）等が知られている。ＧＰＩＩＩａについては、健常人の血小板よりＧＰＩＩＩａタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡを単離され、その遺伝子構造が明らかにされている（J. Biol. Chem. 262 (9)p3936-3939）。また、これらの膜タンパク質上に存在する血小板型抗原（ＨＰＡ−１〜７）について研究が進められてきている（J.Clin. Invest 40 p1597 (1961)、Prog. Hematol. 4 p222 (1964)、Vox Sang 4 p161 (1959)、 Vox Sang 39 p113 (1980) ）。
【０００３】
血小板型抗原は新生児同種免疫性血小板減少性紫斑病（ＮＡＩＴＰ，  ｎｅｏｎａｔａｌ  ａｌｌｏｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）、輸血後紫斑病  （ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｐｕｒｐｕｒａ）、血小板輸血不適応（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）等の原因として知られている。日本人では抗ＨＰＡ−２ｂ抗体が血小板輸血不適応に、抗ＨＰＡ−４ｂ抗体がＮＡＩＴＰに関与しているといわれている。このようなことから血小板の抗原型のタイピングは臨床上重要になりつつある。
【０００４】
血小板抗原型は、いくつかの糖タンパク質の多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）によって生じ（表１）、このような多型は、タンパクレベルでは１アミノ酸置換、遺伝子レベルでは１塩基置換によってもたらされる。したがって、遺伝子による血小板型抗原のタイピングはこのような１塩基の違いが判定される（Japanese Journal of Transfusion Medicine.Vol.No.1 39(1):204-211,1993）。
【表１】
2008146797.tif 000002
【０００５】
しかしながら、未知の血小板型抗原も存在し、充分解明されてないのが現状である。ＨＰＡ−７については、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目の塩基がシトシン（４０７番目のアミノ酸がプロリン）であるＨＰＡ−７ａ、遺伝子の１２９７番目の塩基がグアニン（４０７番目のアミノ酸がアラニン）であるＨＰＡ−７ｂの遺伝子多型が報告されているのみである（Blood：83：70-76,1993）。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、新生児血小板減少性紫斑病（ＮＡＩＴＰ）の解析において、新規な血小板特異抗原を見出した。具体的には、ＧＰＩＩＩａ遺伝子のエクソン９に存在する１２９７番目のヌクレオチド残基が、通常はシトシンであるが、新生児血小板減少性紫斑病患者においてはこのシトシンがチミンに置換されていることを見出した。また、この置換が新生児同種免疫性血小板減少性紫斑病と関連することを見出した（実施例１）。本発明はこの知見に基づくものである。
【０００７】
本発明は、新規ＧＰＩＩＩａ変異遺伝子およびタンパク質、該遺伝子および該タンパク質における変異の検出手段、該変異の検出方法および検出キットを提供することを目的とする。
【０００８】
本発明によれば、ＧＰＩＩＩａ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基がチミン残基であるポリヌクレオチド、または該チミン残基を含んでなるその断片（以下、「本発明によるポリヌクレオチド」ということがある）が提供される。
【０００９】
本発明によれば、ＧＰＩＩＩａタンパク質のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質において、ＧＰＩＩＩａタンパク質の４０７番目のアミノ酸残基がセリン残基であるタンパク質、または該セリン残基を含んでなるその断片（以下、「本発明によるタンパク質」ということがある）が提供される。
【００１０】
本発明によれば、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができ、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域の、核酸増幅法による増幅に用いられる、プライマー（以下、「本発明によるプライマー」ということがある）が提供される。
【００１１】
本発明によれば、二種以上の本発明によるプライマーからなり、かつＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域の、核酸増幅法による増幅に用いられる、プライマーセット（以下、「本発明によるプライマーセット」ということがある）が提供される。
【００１２】
本発明によれば、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができ、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のチミン残基の検出に用いられる、プローブ（以下、「本発明によるプローブ」ということがある）が提供される。
【００１３】
本発明によれば、本発明によるタンパク質またはその断片に対する抗体（以下、「本発明による抗体」ということがある）が提供される。
【００１４】
本発明によれば、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の変異を検出することにより、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクを判定する方法であって、本発明によるプライマー、プライマーセット、またはプローブを用いて、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のチミン残基を検出する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１５】
本発明によればまた、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の変異を検出することにより、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクを判定する方法であって、本発明による抗体を用いて、ＧＰＩＩＩａタンパク質における４０７番目のセリン残基を検出する工程を含んでなる、方法が提供される（以下、上記二つの方法を併せて、「本発明による第一の態様の方法」ということがある）。
【００１６】
本発明によれば、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の変異を検出することにより、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定する方法であって、本発明によるプライマー、プライマーセット、またはプローブを用いて、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のチミン残基を検出する工程を含んでなる方法が提供される。
【００１７】
本発明によればまた、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の変異を検出することにより、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定する方法であって、本発明による抗体を用いて、ＧＰＩＩＩａタンパク質における４０７番目のセリン残基を検出する工程を含んでなる、方法が提供される（以下、上記二つの方法を併せて、「本発明による第二の態様の方法」ということがある）。
【００１８】
本発明によれば、本発明によるプライマー、プライマーセット、プローブ、または抗体を少なくとも含んでなる、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクを判定するためのキットが提供される。
【００１９】
本発明によれば、本発明によるプライマー、プライマーセット、プローブ、または抗体を少なくとも含んでなる、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定するためのキットが提供される。
【００２０】
本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクを判定するためのマーカーとして利用することができる。したがって、本発明は新生児血小板減少性紫斑病の遺伝子診断等において有用である。また、本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定するためのマーカーとして利用することができる。したがって、本発明は血小板輸血の輸血効果の予測等において有用である。
【発明の具体的説明】
【００２１】
［変異遺伝子および変異タンパク質］
本発明によるポリヌクレオチドは、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基の変異、すなわちチミン残基への置換（以下、「ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型」という）を検出するために、コンペティティブハイブリダイゼーションにおける標識標準核酸として使用することができる（実施例１）。また、検出に用いられるオリゴヌクレオチドプローブのヌクレオチド配列としても用いることができる。
【００２２】
本願明細書において、「ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基」とは、ＧＰＩＩＩａ遺伝子において、シグナルペプチドをコードする領域の開始コドンのアデニン残基を１番目とし、これを基点として、１２９７番目に位置するヌクレオチド残基を意味する。
【００２３】
ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１〜７８番目はシグナルペプチドをコードする領域であり、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の７９〜２３６４番目は成熟型タンパク質をコードする領域である。
【００２４】
ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出するための標識標準核酸としては、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のヌクレオチド残基のチミン残基への置換を検出することができるものであればよく、本発明によるポリヌクレオチドの断片であってもよい。本発明によるポリヌクレオチドの断片としては、具体的には、ＧＰＩＩＩａ遺伝子のヌクレオチド配列において、１２９７番目のヌクレオチド残基がチミン残基であるポリヌクレオチドの断片であって、該チミン残基を含んでなるその断片である。
【００２５】
本発明によるポリヌクレオチドとしては、例えば、以下の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）から選択されるポリヌクレオチドが挙げられる：
（ｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ただし、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の１２９７番目のヌクレオチド残基はチミン残基であるポリヌクレオチド）；
（ｉｉｉ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ただし、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の１２９７番目のヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基はチミン残基であるポリヌクレオチド）；および
（ｉｖ）配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ただし、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の１２９７番目のヌクレオチド残基に対応するヌクレオチド残基はチミン残基であるポリヌクレオチド）。
【００２６】
なお、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列の１〜７８番目の配列はシグナルペプチドをコードする配列である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００２１２）。本発明において、シグナルペプチドをコードする配列は、シグナルペプチドとして機能するペプチドをコードすることができる限り、該配列に限定されない。
【００２７】
本発明によるポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列または配列番号：２で表されるアミノ酸配列の４０７番目のアミノ酸残基を含むその一部からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００２８】
本発明において、配列番号：２で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。
【００２９】
従って、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号：１で表されるＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとする。本発明においてはさらに、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００３０】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００３１】
本願明細書において、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するかどうかは配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現と関連する生体現象あるいは機能を評価することにより決定することができる。
【００３２】
本発明によるポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号：１の１２９７番目のヌクレオチド残基を含むその断片である。本発明によるポリヌクレオチドは、より好ましくは、少なくとも配列番号：７で表されるヌクレオチド配列（配列番号：１の１２０１〜１３９１番目のヌクレオチド配列）からなるポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。本発明によるポリヌクレオチドは、さらに好ましくは、少なくとも配列番号：３で表されるヌクレオチド配列（配列番号：１の１２８１〜１３２０番目のヌクレオチド配列）からなるポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。
【００３３】
本発明によるタンパク質は、ＧＰＩＩＩａタンパク質の４０７番目のアミノ酸残基の変異、すなわちセリン残基への置換（以下、「ＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型」という）を検出することができる抗体を作製するための抗原として使用することができる。
【００３４】
本願明細書において、「ＧＰＩＩＩａタンパク質の４０７番目のアミノ酸残基」とは、ＧＰＩＩＩａ成熟型タンパク質を構成するアミノ酸配列において、Ｎ末端のグリシン残基を１番目とし、これを基点として、４０７番目に位置するアミノ酸残基を意味する。
【００３５】
「ＧＰＩＩＩａ成熟型タンパク質」とは、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の７９〜２３６４番目のヌクレオチド配列でコードされるタンパク質であって、シグナルペプチドを含まないタンパク質である。例えば、配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００３６】
本発明によるタンパク質としては、例えば、以下の（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）から選択されるタンパク質が挙げられる：
（ｖ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質（ただし、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の４０７番目のアミノ酸残基はセリン残基であるタンパク質）；
（ｖｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質（ただし、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の４０７番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基はセリン残基であるタンパク質）；および
（ｖｉｉｉ）配列番号：２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質（ただし、配列番号：２で表されるアミノ酸配列の４０７番目のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基はセリン残基であるタンパク質）。
【００３７】
本発明によるタンパク質は、好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質または配列番号：２の４０７番目のアミノ酸残基を含むその断片である。本発明によるタンパク質は、より好ましくは、少なくとも配列番号：８で表されるアミノ酸配列（配列番号：２の３８１〜４５０番目のアミノ酸配列）からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質（ポリペプチド）である。本発明によるタンパク質は、さらに好ましくは、少なくとも配列番号：４で表されるアミノ酸配列（配列番号：２の３９５〜４２０番目のアミノ酸配列）からなるポリペプチドを含んでなるタンパク質（ポリペプチド）である。
【００３８】
ＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型を検出することができる抗体を作製するための抗原としては、ＧＰＩＩＩａタンパク質における４０７番目のアミノ酸残基のセリン残基への置換を検出することができればよく、本発明によるタンパク質の断片（ペプチド）であってもよい。本発明によるタンパク質の断片としては、具体的には、ＧＰＩＩＩａタンパク質のアミノ酸配列において、４０７番目のアミノ酸残基がセリン残基であるタンパク質の断片であって、該セリン残基を含んでなる断片である。
【００３９】
本発明によるタンパク質の断片は、少なくとも６アミノ酸残基以上（例えば、８、１０、１２または１５アミノ酸残基以上）のポリペプチドである。
【００４０】
本発明において、「ＧＰＩＩＩａ遺伝子」は、血小板の膜タンパク質をコードする遺伝子として公知であり、ＧｅｎＢａｎｋに登録番号Ｍ３５９９９（配列番号：５（塩基配列）、配列番号：６（アミノ酸配列））またはアクセッション番号ＮＭ＿０００２１２として登録されている。
【００４１】
ＧＰＩＩＩａ遺伝子としては、以下の（ｉ’）のポリヌクレオチドに加えて、（ｉｉ’）、（ｉｉｉ’）、および（ｉｖ’）から選択される、相同ポリヌクレオチドが挙げられる：
（ｉ’）配列番号：５で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；
（ｉｉ’）配列番号：５で表されるヌクレオチド配列において、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされたヌクレオチド配列からなり、かつ配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ’）配列番号：５で表されるヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；および
（ｉｖ’）配列番号：５で表されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと７０％以上の同一性を有し、かつ配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【００４２】
なお、配列番号：５で表されるヌクレオチド配列の１〜７８番目の配列はシグナルペプチドをコードする配列である（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００２１２）。本発明において、シグナルペプチドをコードする配列は、シグナルペプチドとして機能するペプチドをコードすることができる限り、該配列に限定されない。
【００４３】
ＧＰＩＩＩａ遺伝子としては、好ましくは、配列番号：５で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドである。
【００４４】
ＧＰＩＩＩａ遺伝子としてはまた、好ましくは、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。
【００４５】
ＧＰＩＩＩａタンパク質として、以下の（ｖ’）のタンパク質に加えて、（ｖｉ’）、（ｖｉｉ’）、および（ｖｉｉｉ’）から選択される、相同タンパク質（ポリペプチド）が提供される：
（ｖ’）配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質；
（ｖｉ’）配列番号：６で表されるアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のアミノ酸の付加がなされたアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；
（ｖｉｉ’）配列番号：６で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされ、かつ配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質；および
（ｖｉｉｉ’）配列番号：６で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質。
【００４６】
ＧＰＩＩＩａタンパク質としては、好ましくは配列番号：５で表されるヌクレオチド配列でコードされたタンパク質である。
【００４７】
ＧＰＩＩＩａタンパク質としてはまた、さらに好ましくは、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質が提供される。
【００４８】
本願明細書において、「ポリヌクレオチドにおいて、１または複数個のヌクレオチドの挿入、置換、欠失、および／またはその一方または両末端への１または複数個のヌクレオチドの付加がなされた」および「アミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸の挿入、置換または欠失、および／またはその一方または両末端への付加がなされた」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、または天然に生じ得る程度の複数個の数のヌクレオチドあるいはアミノ酸の置換等により改変がなされたことを意味する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の改変の個数は、例えば１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜２個の挿入、置換、または欠失、および／またはその一方または両末端への付加がなされたものであることができる。
【００４９】
本発明によるポリヌクレオチドの改変ヌクレオチド配列は、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基に影響を与えない改変ヌクレオチド配列であり、好ましくは、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の、配列番号：２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の機能に影響を与えない変異を有する、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列であることができる。
【００５０】
ＧＰＩＩＩａ遺伝子の改変ヌクレオチド配列は、好ましくは、１個または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の、配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の機能に影響を与えない変異を有するＧＰＩＩＩａ遺伝子のヌクレオチド配列であることができる。
【００５１】
本発明によるタンパク質の改変アミノ酸配列は、ＧＰＩＩＩａタンパク質の４０７番目のアミノ酸残基に影響を与えない改変アミノ酸配列であり、好ましくは、１または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の保存的置換を有する、配列番号：２で表される本発明によるタンパク質のアミノ酸配列であることができる。
【００５２】
ＧＰＩＩＩａタンパク質の改変アミノ酸配列は、好ましくは、１または複数個（例えば、１個ないし数個あるいは１、２、３、または４個）の保存的置換を有する、配列番号：６で表されるＧＰＩＩＩａタンパク質のアミノ酸配列であることができる。
【００５３】
本願明細書において、「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００５４】
本願明細書において「ハイブリダイズする」とは、ストリンジェントな条件下で標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、標的ヌクレオチド以外のヌクレオチドにはハイブリダイズしないことを意味する。「ストリンジェントな条件」は、プローブ配列、プライマー配列とその相補鎖との二本鎖の融解温度（℃）および溶液の塩濃度等に依存して決定できる。プローブ配列またはプライマー配列を選択した後にそれに応じたストリンジェントな条件を設定することは当業者に周知の技術である（例えば、Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)等）。
【００５５】
ハイブリダイゼーションは、公知の方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００５６】
本願明細書において、塩基配列またはアミノ酸配列についての「同一性」とは、比較される配列間において、各々の配列を構成する塩基またはアミノ酸残基の一致の程度の意味で用いられる。本明細書において示した「同一性」の数値はいずれも、当業者に公知の相同性検索プログラムを用いて算出される数値であればよく、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、容易に算出することができる。
【００５７】
配列番号：２で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
【００５８】
配列番号：６で表されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列は、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、そして最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列であることができる。
【００５９】
本発明において、配列番号：６で表されるアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするヌクレオチド配列は容易に定まり、配列番号：６で表されるアミノ酸配列をコードする種々のヌクレオチド配列を選択することができる。
【００６０】
従って、配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとは、配列番号：５で表されるＤＮＡ配列の一部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列として有する配列をも意味するものとする。本発明においてはさらに、これらに対応するＲＮＡ配列も含まれる。
【００６１】
配列番号：６で表されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号：５で表されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６２】
本願明細書において、配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するかどうかは配列番号：６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現と関連する生体現象あるいは機能を評価することにより決定することができる。
【００６３】
本発明によれば、ＧＰＩＩＩａ遺伝子のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドにおいて、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基がチミン残基であるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の相補配列からなるポリヌクレオチド、または該チミン残基に対合する残基を含んでなるその断片が提供される。
【００６４】
［プライマーおよびプライマーセット］
本発明によるプライマーは、本発明によるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域を、核酸増幅法により増幅することができる。従って、本発明によるプライマーは、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクを判定するためのマーカーとして用いることができる。また、本発明によるプライマーは、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定するためのマーカーとして用いることができる。
【００６５】
本発明によるプライマーは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等からなるものを意味するが、好ましくは、ＤＮＡからなるものである。
【００６６】
本発明によるプライマーは、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列のうち、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域を核酸増幅法により増幅することができればよい。例えば、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２１個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。本発明によるプライマーはまた、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１０〜３０個、１２〜３０個、１５〜３０個、２０〜３０個、または２１〜３０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。
【００６７】
本発明によるプライマーはまた、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列のうち、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域にハイブリダイズすることができるものであってもよい。
【００６８】
ここで、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続するヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドは、本発明によるプライマーとして機能すればよく、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続するヌクレオチドに、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基に影響を与えない１または数個（例えば、１、２、３、または４個）の変異（例えば、挿入、置換、欠失、および付加から選択することができる）が導入されたヌクレオチドを含んでなる改変ポリヌクレオチドも含まれる。改変ポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１２〜３０個のヌクレオチドに、１または数個の変異が導入されたヌクレオチドを含んでなり、かつ本発明によるプライマーとして機能するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６９】
本発明によるプライマーの長さは、少なくとも１０塩基であることができ、好ましくは、少なくとも１５塩基、より好ましくは、少なくとも２０塩基、さらに好ましくは、少なくとも２１塩基である。本発明によるプライマーはまた、１２〜３０塩基、２０〜３０塩基、または２１〜３０塩基である。
【００７０】
本発明によるプライマーの好ましい態様によれば、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個（より好ましくは、少なくとも１５個、より好ましくは、少なくとも２０個、さらに好ましくは、少なくとも２１個）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなり、ＧＰＩＩＩａ遺伝子のヌクレオチド配列のうち、１２９７番目に位置するヌクレオチド残基を含む領域を、核酸増幅法により増幅することができ、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型の検出に用いられる、１２〜３０塩基の長さのプライマーが提供される。
【００７１】
本発明によるプライマーは、二種以上の本発明によるプライマーを組み合わせてなるプライマーセットとしても使用することができる。
【００７２】
本発明によるプライマーセットは、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列のうち、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域を、核酸増幅法により増幅することができるように選択することができる。核酸増幅法は周知であり、当業者であれば核酸増幅用プライマーペアを適宜選択することができる。例えば、ＰＣＲ法においては、二つのプライマーの一方がＧＰＩＩＩａ変異遺伝子のプラス鎖に対合し、他方のプライマーがＧＰＩＩＩａ変異遺伝子のマイナス鎖に対合し、かつ一方のプライマーにより伸長された伸長鎖にもう一方のプライマーが対合するようにプライマーを選択できる。また、ＬＡＭＰ法（ＷＯ００／２８０８２号公報）においては、標的遺伝子に対して３’末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという３つの領域を、５’末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３という３つの領域を、それぞれ規定し、この６つの領域を用いて４種類のプライマーを設計することができる。
【００７３】
本発明によるプライマーおよびプライマーセットは、ＰＣＲ法（Saiki,R.K.,Bugawan,T.L.,et al.(1986)Nature,324,163-166) 、ＮＡＳＢＡ法（Comptom,J.(1991)Nature,650,91-92）、ＴＭＡ法（Kacian,D.L.,and Fultz,T.J.(1995)US.Patent 5,399,491）、ＳＤＡ法（Walker,G.T.,Little,M.C.,et al(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392-396）、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Orita,M.,Iwahara,H.,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,2776-2770 ）等の公知の核酸増幅法において、常法に従ってプライマーおよびプライマーセットとして利用することができる。
【００７４】
本発明によるプライマーは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プライマーの調製は周知であり、常法に従って実施できる。
【００７５】
［プローブ］
本発明によるプローブは、本発明によるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することができる。従って、本発明によるプローブは、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクを判定するためのマーカーとして用いることができる。また、本発明によるプローブは、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定するためのマーカーとして用いることができる。
【００７６】
本発明によるプローブは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等からなるものを意味するが、好ましくは、ＤＮＡからなるものである。
【００７７】
本発明によるプローブとしては、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列のうち、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域にハイブリダイズすることができるものが挙げられる。
【００７８】
本発明によるプローブは、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個、好ましくは、少なくとも１４個、より好ましくは、少なくとも１５個、さらに好ましくは、少なくとも１６個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。本発明によるプローブは、また、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する１０〜２０個、１２〜２０個、１４〜２０個、１５〜２０個、１６〜２０個、１０〜３０個、１２〜３０個、１４〜３０個、１５〜３０個、または１６〜３０個のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなるものが挙げられる。
【００７９】
ここで、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続するヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドは、本発明によるプローブとして機能すればよく、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続するヌクレオチドに、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基に影響を与えない１または数個（例えば、１、２、３、または４個）の変異（例えば、挿入、置換、欠失、および付加から選択することができる）が導入されたヌクレオチドを含んでなる改変ポリヌクレオチドも含まれる。改変ポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：１で表されるヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１２〜３０個のヌクレオチドに、１または数個の変異が導入されたヌクレオチドを含んでなり、かつ本発明によるプローブとして機能するポリヌクレオチドが挙げられる。
【００８０】
本発明によるプローブの長さは、少なくとも１０塩基である。本発明によるプローブの長さは、また、１２〜３０塩基である。
【００８１】
本発明によるプローブの好ましい態様によれば、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列の連続する少なくとも１０個（より好ましくは、少なくとも１５個）のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドからなり、ＧＰＩＩＩａ遺伝子のヌクレオチド配列のうち、１２９７番目に位置するヌクレオチド残基を含む領域にハイブリダイズすることができ、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型の検出に用いられる、１２〜３０塩基の長さのプローブおよびプライマーが提供される。
【００８２】
本発明によるプローブは、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の公知の方法において、常法に従ってプローブとして使用することができる。
【００８３】
本発明によるプローブは、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づき、化学合成できる。プローブの調製は周知であり、常法に従って実施できる。
【００８４】
［抗体］
本発明による抗体は、本発明によるタンパク質を特異的に認識し、ＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型を検出することができる。従って、本発明による抗体は、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクを判定するためのマーカーとして用いることができる。また、本発明による抗体は、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性を判定するためのマーカーとして用いることができる。
【００８５】
本発明による抗体の好ましい態様によれば、本発明によるタンパク質のアミノ酸配列のうち、ＧＰＩＩＩａタンパク質の４０７番目の位置するアミノ酸残基を含む領域を認識する抗体が提供される。このような抗体を用いることにより、ＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型を検出が可能となる。このような抗体としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列のうち、４０７番目の位置するアミノ酸残基を含む少なくとも６アミノ酸残基を含んでなるタンパク質に対する抗体が挙げられる。
【００８６】
本発明によるタンパク質に対する抗体の例としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列またはその一部を有するタンパク質に対する抗体が挙げられる。
【００８７】
本発明による抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ヒト化抗体、多特異性抗体、並びに、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ、Ｆｖ等の抗体断片が含まれる。
【００８８】
本発明による抗体は、当業者に周知の方法を用いて得ることができる。
【００８９】
［検出方法］
ＧＰＩＩＩａ遺伝子のヌクレオチド配列において、１２９７番目のヌクレオチド残基のチミン残基への置換は、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクの指標となる。従って、本発明によれば、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することにより、新生児血小板減少性紫斑病またはその発症のリスクを判定することができる。
【００９０】
また、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目のヌクレオチド残基がチミン残基へ置換された血小板抗原（ＨＰＡ−７抗原）は、血小板輸血に際し、抗原の違いによる血小板輸血不応状態を生じさせる可能性が高い。そのため、該置換は、血小板輸血において血小板輸血不応状態となるか否か、すなわち血小板輸血の輸血効果の指標となる。従って、本発明によればまた、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することにより、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性があると判定することができる。
【００９１】
本発明による検出方法としては、被験試料におけるＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型またはＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型を検出できる方法であれば特に限定されず、例えば、ハイブリダイゼーション法、核酸増幅法、抗原抗体反応法が挙げられる。
【００９２】
ここで、「被験試料」とは、ＧＰＩＩＩａ遺伝子における１２９７番目に位置するヌクレオチド残基、またはＧＰＩＩＩａタンパク質における４０７番目に位置するアミノ酸残基を含む領域を含むものであればよく、検出しようとする対象者（被験者）から遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質を抽出して得ることができる。ｍＲＮＡは必要に応じてｃＤＮＡに変換して試料として使用できる。本明細書において「遺伝子」にはこのようなｃＤＮＡも含まれるものとする。
【００９３】
ここで、「被験者」は、新生児のみならず、新生児の血縁者であってもよい。本発明によれば、出生前に新生児血小板減少性紫斑病の発症のリスクを判定することができる点で有利である。
【００９４】
被験者の遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質は、人体のすべての細胞から抽出することが可能であるが、好ましくは、白血球の細胞である。
【００９５】
本発明によれば、抽出した遺伝子あるいはｍＲＮＡはそのまま制限酵素多型性解析法（ＲＦＬＰ法）（Southerns,E.M.(1975)J.Mol.Biol.98,503)、アリル特異性オリゴヌクレオチドプローブ法（ＡＳＯ法）（Wallace,R.B.,Schaffer,N.J.,et al.(1979)Nucleic Acid Res.,6,3543)あるいはＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法を用いてＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することができる。
【００９６】
本発明による検出方法によれば、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（ｍＲＮＡまたはその逆転写産物）を増幅させ、増幅産物を解析することにより、被検試料におけるＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することができる。
【００９７】
核酸増幅法を利用したＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ｃ）被験試料由来のポリヌクレオチドを鋳型とし、本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法を実施する工程；および
（ｄ）形成された増幅産物を解析する工程。
【００９８】
工程（ｃ）において、被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を鋳型として用いることができる。
【００９９】
遺伝子の増幅は、ＰＣＲ法（Saiki,R.K.,Bugawan,T.L.,et al.(1986)Nature,324,163-166) 、ＮＡＳＢＡ法（Comptom,J.(1991)Nature,650,91-92）、ＴＭＡ法（Kacian,D.L.,and Fultz,T.J.(1995)US.Patent 5,399,491 ）、ＳＤＡ法（Walker,G.T.,Little,M.C.,et al(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,392-396）等の核酸増幅法を用いて実施できる。
【０１００】
これらの方法により増幅された遺伝子は、その増幅物の特性に応じてＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することができる。例えば、ＰＣＲ法で増幅された断片は、塩基配列決定法により容易にヌクレオチド配列を決定することが可能であり、それによりＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目がチミンであるかを決定することができる。
【０１０１】
また、ＰＣＲでの遺伝子増幅を一塩基の違いを識別して行うＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を用いて行うこともできる（Orita,M.,Iwahara,H.,et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,2776-2770 ）。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、ＰＣＲによって増幅した核酸断片を熱変性により一本鎖にした後、一定温度の非変性ポリアクリルアミドゲルを用いて分離させることにより検出する方法である。ヌクレオチド断片の違いによる高次構造形成の違いを電気泳動度の差として評価して、一塩基の違いを検出することができる。
【０１０２】
その他ＰＣＲ法で増幅された断片は、制限酵素多型性解析法（ＲＦＬＰ法）（ Southern,E.M.,(1975)J,Mol.Biol.98,503）、アリル特異的オリゴヌクレオチドプローブ法（ＡＳＯ法）（Saiki,R.K,Bugawan,T.L.,et al,(1986) Nature,324,163-166）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ法（Landegren,U,Kaiser,R.,et al.(1990)PCR Protocols,Academic Press,Inc.p92-98)、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法（Oka,T., Matsunaga, H.,et al.(1994)Nucleic Acids Res.22,1541-1547)、ＰＣＲ−ｒＳＳＯ法（Kawai,S.,et al,(1994) Hum Immunol,41(2),121-126）等により解析することができる。多検体同時処理を行う場合にはＰＣＲ−ＰＨＦＡ法またはＰＣＲ−ｒＳＳＯ法が好ましい。
【０１０３】
本発明による検出方法によればまた、本発明によるポリヌクレオチドのヌクレオチド配列またはその相補配列のうち、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目のヌクレオチド残基またはそれに対合する残基を含む領域にハイブリダイズすることができる本発明によるプライマーまたはプライマーセットを用いて核酸増幅法により核酸試料（ｍＲＮＡまたはその逆転写産物）を増幅させ、増幅産物を検出することにより、被検試料におけるＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することができる。
【０１０４】
本発明による第一の態様の方法によれば、１２９７番目のヌクレオチド残基がチミンと解析された被検者は、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型が検出されたと評価されるため、新生児血小板減少性紫斑病患者であるとまたはその発症のリスクがあると診断または判定することができる。
【０１０５】
本発明による第二の態様の方法によれば、１２９７番目のヌクレオチド残基がチミンと解析された被検者は、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型が検出されたと評価されるため、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性があると判定することができる。
【０１０６】
本発明による検出方法によれば、本発明によるプローブを核酸試料（ｍＲＮＡまたはその逆転写産物）とハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体、すなわちヌクレオチド二本鎖、を検出することにより被検試料におけるＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することができる。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、Nucleic Acid Hybridization Bios Scientific Publishers(1999)を参照することができる。
【０１０８】
ハイブリダイゼーション法を利用したＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ａ）被験試料由来のポリヌクレオチドと、本発明によるプローブとを接触させる工程；および 
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程。
【０１０９】
工程（ａ）において、被験試料から調製されたｍＲＮＡまたはそのｍＲＮＡから逆転写された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、被験細胞試料由来のポリヌクレオチドとして、プローブと接触させることができる。
【０１１０】
プローブを用いた検出法においては、プローブを標識して用いることができる。標識としては例えば、放射性物質、酵素、蛍光物質等を利用した標識が挙げられる。
【０１１１】
ハイブリダイゼーション産生物の検出は、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等の周知の方法を用いて実施できる。
【０１１２】
本発明による第一の態様の方法によれば、ハイブリダイゼーション複合体が検出された被検者は、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型が検出されたと評価されるため、新生児血小板減少性紫斑病患者であるとまたはその発症のリスクがあると診断または判定することができる。
【０１１３】
本発明による第二の態様の方法によれば、ハイブリダイゼーション複合体が検出された被検者は、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型が検出されたと評価されるため、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性があると判定することができる。
【０１１４】
本発明による検出方法によれば、本発明による抗体と被検試料とを接触させ、抗原抗体反応を検出することにより被検試料におけるＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型を検出することができる。
【０１１５】
抗原抗体反応を利用したＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型の検出は、例えば、下記工程により実施することができる：
（ｅ）被験試料由来のタンパク質と、本発明による抗体とを接触させる工程； および
（ｆ）抗原抗体複合体を検出する工程。
【０１１６】
抗原抗体反応の検出方法は当業者に周知であり、例えば、免疫学的方法により、ドーパミン産生ニューロン増殖前駆細胞を含むと考えられる被験細胞試料中のＧＰＩＩＩａタンパク質を検出することができる。免疫学的方法としては、細胞試料を必要に応じて適切な処理、例えば、細胞の分離、抽出操作などをした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、競合法、サンドイッチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用いる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行うことができる。標識化剤としては螢光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質を使用することができる。
【０１１７】
本発明による第一の態様の方法によれば、抗原抗体複合体が検出された被検者は、ＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型が検出されたと評価されるため、新生児血小板減少性紫斑病患者であるとまたはその発症のリスクがあると診断または判定することができる。
【０１１８】
本発明による第二の態様の方法によれば、抗原抗体複合体が検出された被検者は、ＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型が検出されたと評価されるため、血小板輸血において血小板輸血不応状態となる可能性があると判定することができる。
【０１１９】
［検出キット］
本発明によれば、本発明による検出方法を実施するための検出キットが提供される。
【０１２０】
本発明による検出方法を実施するための検出キットとしては、具体的には、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出するためのキットであって、本発明によるプローブ、プライマー、もしくはプライマーセットを少なくとも含んでなるキットが挙げられる。本発明による検出方法を実施するための検出キットとしては、またＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型を検出するためのキットであって、本発明による抗体を少なくとも含んでなるキットが挙げられる。
【０１２１】
本発明によるプローブ、プライマー、プライマーセット、または抗体は、標識されたものであってもよい。
【０１２２】
本発明によるプローブを少なくとも含んでなる本発明による検出用キットは、ハイブリッド形成法によりＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出する。
【０１２３】
本発明によるキットは、所望により、ハイブリッド形成法を実施するための種々の試薬、例えば標識の検出に用いられる基質化合物、ハイブリダイゼーション緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１２４】
本発明によるプライマーまたは本発明によるプライマーセットを少なくとも含んでなる本発明による検出用キットは、核酸増幅法によりＧＰＩＩＩａ遺伝子の発現を検出する。
【０１２５】
本発明によるキットは、所望により、核酸増幅法を実施するための種々の試薬、例えば緩衝液、ＰＣＲが正常に進行し得ることを示す内部標準、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【０１２６】
本発明による抗体を少なくとも含んでなる本発明による検出用キットは、抗原抗体反応を検出することによりＧＰＩＩＩａタンパク質４０７Ｓ多型を検出する。
【０１２７】
本発明によるキットは、第三の態様の検出方法は、所望により、抗原抗体反応を実施するための種々の試薬、例えばＥＬＩＳＡ法等に用いる２次抗体、発色試薬、緩衝液、説明書、および／または器具などを更に含むことができる。
【実施例】
【０１２８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明、例えば、プライマーの配列、プローブの配列等、はこれらに限定されるものではない。【０１２９】
実施例１：ＧＰＩＩＩａ（ＨＰＡ−７）遺伝子中の多型と新生児血小板減少性紫斑病との関連
新生児血小板減少性紫斑病（ＮＡＩＴＰ）と診断された患児については、母親の血清中に含まれる抗体が患児の血小板と反応することが予想された。患児は第二子であることから、第一子妊娠の際に父親由来の血小板特異抗原に対する感作が生じた母体は、この抗原に対する抗体産生能を獲得し、第二子の妊娠の際に産生された抗体により患児の血小板が攻撃されたものと考えられる。患児の血小板特異抗原は父親に由来することから、患児とその母親の血清の父親の血小板に対する反応性をＭＰＨＡ法により確認した（Japanese Journal of Transfusion and Cell Therapy,Vol.52.No.6 52(6) 678-683,2006）。【０１３０】
まず、父親の血小板をマイクロプレートのウェルに固定化し、これに患児および母親の血清、並びにそれらの希釈液を反応させた。これにヒトＩｇＧ抗体をコートしたヒツジ赤血球を反応させ、生じた凝集像を観察した。【０１３１】
その結果、母親血清は１０２４倍希釈、患児血清は１６倍希釈まで父親の血小板に対して陽性反応を示した。【０１３２】
次に、血小板抗原遺伝子のタイピングをＰＣＲ−ＰＨＦＡ法（ＷＯ９８／０２５７４号公報）を用いて解析した。【０１３３】
その結果、血小板抗原型のうち、ＨＰＡ−２は、母親が（ａ−ｂ＋）、父親が（ａ＋ｂ−）、患児が（ａ＋ｂ＋）、また、ＨＰＡ−３は、母親が（ａ＋ｂ−）、父親と患児が（ａ＋ｂ＋）、と不一致がみられた。しかし、ＨＰＡ−１、４、５、および６の血小板抗原型については両親、患児とも（ａ＋ｂ−）と一致していた。一方、ＨＰＡ−７については、従来報告されていたＨＰＡ−７ａ、ＨＰＡ−７ｂの標準ＤＮＡとＰＨＦＡ法によって比較したところ、いずれにおいてもＨＰＡ−７ａ遺伝子が存在し、ＨＰＡ−７ｂ遺伝子は存在しないことが判明した。【０１３４】
患児には父親由来の血小板特異抗原の存在が考えられる。そこで、父親の血小板の既知抗体に対する反応性を確認したところ、ＨＰＡ−１〜ＨＰＡ−６抗体に対しては陰性を示したが、ＨＰＡ−７ｂ抗体に対しては反応性を示した。ここで、父親の血小板がＨＰＡ−７ｂ抗体に反応したことから、ＧＰＩＩＩａ遺伝子のなかのＨＰＡ−７に相当する領域に何らかの塩基置換が予想された。そこで父親の染色体ＤＮＡのＧＰＩＩＩａ遺伝子のエキソン９を以下のプライマーで増幅したものをＷｉｚａｒｄ  Ｐｌｕｓ  ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｓｙｓｔｅｍを用いて精製後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株（TAKARA社製）に導入した。
ＷＨＰＡ７−Ａ：５’−TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG（配列番号：９）
ＷＨＰＡ７−Ｂ：５’−CTGGCAGGCACAGTCACAATC（配列番号：１０）【０１３５】
得られた白色コロニーを培養後、プラスミドを精製し、Ｍ１３−Ｆ１８（TAKARA社製）およびＭ１３−Ｒ１８プライマー（TAKARA社製）を用いてシークエンシングを行い、クローニングした領域の塩基配列を確認した。シークエンシングはＢｉｇＤｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖｅｒ．１．１（Applied Biosystems社製）を使用した。シークエンシングの結果は表２に示される通りであった。ＨＰＡ−７ａはＨＰＡ−７ａ遺伝子を、ＨＰＡ−７ｂはＨＰＡ−７ｂ遺伝子を、ＨＰＡ−７ｎｅｗはＨＰＡ−７ａ遺伝子、ＨＰＡ−７ｂ遺伝子とは異なる新規遺伝子を、それぞれ示す。
【表２】
2008146797.tif 000003
【表３】
2008146797.tif 000004
【０１３６】
表２および表３に示すように、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目の塩基がチミンであり、この遺伝子から作られるタンパクの４０７番目のアミノ酸がセリンである遺伝子（ＨＰＡ−７ｎｅｗ）が確認された（配列番号：７（塩基配列）、配列番号：８（アミノ酸配列））。これまでＨＰＡ−７遺伝子に関しては、遺伝子多型として、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目の塩基がシトシン、４０７番目のアミノ酸がプロリンであるＨＰＡ−７ａ遺伝子、ＧＰＩＩＩａ遺伝子の１２９７番目の塩基がグアニン、４０７番目のアミノ酸がアラニンであるＨＰＡ−７ｂ遺伝子が報告されているが、今回確認された遺伝子はそれらとは異なる新しい配列を有することが確認された。【０１３７】
実施例２：ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法によるＨＰＡ−７の新規アリル検出システムの構築
ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法によるＨＰＡ−７の新規アリル検出システムの構築について以下に述べる。ＰＨＦＡ法においては、検体を非標識プライマーで増幅したもの（検体ＤＮＡ）と、同じ領域を標識プライマーで増幅したもの（標準ＤＮＡ）とを混合し、熱変性した後、温度勾配により徐冷する際に生じる鎖置換の程度から、検体ＤＮＡと標準ＤＮＡの配列が同一であるか否かを検定する。【０１３８】
（１）標識標準ＤＮＡの調製
ＨＰＡ−７ａ遺伝子、ＨＰＡ−７ｂ遺伝子、実施例１で確認された新規アリル（ＨＰＡ−７ｎｅｗ）を組み込んだプラスミドを下記のプライマーで増幅することにより、一方の末端がＤＮＰ（ジニトロフェニル基）で、他方の末端をビオチンで標識したＰＣＲ産物を調製し、それぞれをＨＰＡ−７ａ、ＨＰＡ−７ｂ、およびＨＰＡ−７ｎｅｗの標準ＤＮＡとする。
ＤＮＰ−ＷＨＰＡ７−Ａ  ：５’−TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG（配列番号：１１）
ビオチン−ＷＨＰＡ７−Ｂ：５’−CTGGCAGGCACAGTCACAATC（配列番号：１２）【０１３９】
（２）検体ＤＮＡの調製
ＨＰＡ−７ａ、ＨＰＡ−７ｂ、およびＨＰＡ−７ｎｅｗを組み込んだプラスミドを下記の非標識プライマーを用いてＰＣＲ増幅し、検体ＤＮＡを得た。また、あらかじめ遺伝子型が分かっている染色体ＤＮＡを同じプライマーで増幅し、検体ＤＮＡを得た。
ＷＨＰＡ７−Ａ：５’−TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG（配列番号：９）
ＷＨＰＡ７−Ｂ：５’−CTGGCAGGCACAGTCACAATC（配列番号：１０）【０１４０】
（３）コンペティティブハイブリダイゼーション
両末端に標識を持つ標準ＤＮＡ  １μｌと検体ＤＮＡ  ２０μｌとを、３０μｌの終濃度３ｘＳＳＣ中で混和し、９８℃、１０分加熱して一本鎖に変性した。これを１℃／１０分の速度７０℃まで徐冷し、アニーリングさせた。このとき、配列が完全に一致する相補鎖が、ミスマッチを持つものに比べて優先的に再構成された。すなわち、標準ＤＮＡと全く同じ配列を検体ＤＮＡが持つ場合には、標準ＤＮＡの両末端にある標識は数学的に希釈されるために、同一分子が両方の標識を持つものは全体の１／２１程度と予想される。これに対して、標準ＤＮＡと同じ配列が検体ＤＮＡ中に存在しない場合には、もとの両末端に標識を持つ標準ＤＮＡ分子が優先的に再構成された。【０１４１】
（４）再構成された標準ＤＮＡの検出
あらかじめストレプトアビジンをコーティングしたマイクロプレートのウェルに、両末端に標識をもつ標準ＤＮＡを加えると、末端のビオチンを介してウェル中に保持された。これに抗ＤＮＰ抗体で標識したアルカリ性フォスファターゼを加えることにより、標準ＤＮＡを介して、アルカリ性フォスファターゼがウェル中に捕獲されることになる。これにこの酵素の基質であるｐＮＰＰ（パラニトロフェノール）を加えると、黄色に発色した。この色を４０５ｎｍの吸光度を測定することにより定量、検出した。標準ＤＮＡと同じ配列が検体ＤＮＡ中に存在する場合には吸光度は低くなり、同じ配列がない場合には高い吸光度を示す。Ｉｎｄｅｘ値は各標準ＤＮＡを水と混合し、吸光度を計ったものを１００として、それぞれの検体と混和、熱変性、温度勾配の後に測定した吸光度の割合を示した。この値が２０以下の場合にはその標準ＤＮＡに対して陽性、２０以上の場合に陰性と判定する。【０１４２】
ＨＰＡ−７ａ、ＨＰＡ−７ｂ、ＨＰＡ−７ｎｅｗ遺伝子から調製した標準ＤＮＡに対し、それぞれの検体ＤＮＡが示すＩｎｄｅｘ値を測定した。その結果は表４に示される通りであった。
【表４】
2008146797.tif 000005
【０１４３】
それぞれの遺伝子をクローニングしたプラスミドから調製した検体ＤＮＡは、それぞれの標準ＤＮＡに対して低いＩｎｄｅｘ値を示した。【０１４４】
ここで、検体＃１、＃３〜＃７は、Ｉｎｄｅｘ値がＨＰＡ−７ａに対しては２０以下の値であるのに対し、他のＨＰＡ−７ｂ、ＨＰＡ−７ｎｅｗに対してはいずれも５０を超える値を示していることから、ＨＰＡ−７ａのホモの遺伝子型であることが推測される。一方、検体＃２は、Ｉｎｄｅｘ値がＨＰＡ−７ａとＨＰＡ−７ｎｅｗの標準ＤＮＡに対して２０以下の値を示していることから、ＨＰＡ−７ａ／ｎｅｗのヘテロの遺伝子型であることが推測される。【０１４５】
以上の結果から、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法を用いることにより、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することができることが示された。【０１４６】
実施例３：蛍光ビーズ法による新規アリルの検出法の構築
蛍光ビーズ法によるＨＰＡ−７の新規アリル検出システムの構築について以下に述べる。蛍光ビーズ法（Clin Chem. 43(9) p1799-801(1997)）においては、ビーズを二種類の蛍光色素をそれぞれ１０階調で着色することにより、１００種類のビーズを識別することが可能である。それぞれのビーズに異なるプローブを固定し、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを行うことにより、多数のＤＮＡプローブに対する反応性を同時に検出することにより検定する。【０１４７】
（１）遺伝子増幅
ヒト染色体ＤＮＡを以下のプライマーを用いて、常法に従いＰＣＲ増幅を行った。
ビオチン−Ｐ６／７ＦＣ    ：５’−CCATCCAGGTGAGCTTCAGC（配列番号：１３）
ビオチン−Ｐ６／７ＲＣ−２：５’−AGTGGTTGCAGGTATATGAGGG（配列番号：１４）【０１４８】
（２）Ｌｕｍｉｎｅｘビーズの調製
プローブ配列として以下のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプローブとし、常法に従い、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズ（Luminex社製）に固定した。
ビーズ＃１（ＨＰＡ−７ａ検出用ビーズ）    ：５’−GCTGTCCCCAGGAG−３’ （配列番号：１５）
ビーズ＃２（ＨＰＡ−７ｂ検出用ビーズ）    ：５’−GAGGCTGTGCCCAGGA−３’ （配列番号：１６）
ビーズ＃３（ＨＰＡ−７ｎｅｗ検出用ビーズ）：５’−GAGGCTGTTCCCAGG−３’ （配列番号：１７）
ビーズ＃４（ＨＰＡ−７検出用共通ビーズ）  ：５’−TGAACCTAATAGCCATCGC−３’ （配列番号：１８）【０１４９】
（３）ハイブリダイゼーションおよび検出
検体として以下のものを用いた。
検体＃１：ＨＰＡ−７ａ遺伝子を有するプラスミド
検体＃２：ＨＰＡ−７ｂ遺伝子を有するプラスミド
検体＃３：ＨＰＡ−７ｎｅｗ遺伝子を有するプラスミド検体
検体＃４：染色体ＤＮＡ＃００１
検体＃５：染色体ＤＮＡ＃０１９
検体＃６：染色体ＤＮＡ＃１９３【０１５０】
これらを検体として、ＰＣＲ増幅、プローブとのハイブリダイゼーションを行い、ビーズに結合したプローブに捕獲されたＰＣＲ産物の蛍光値を測定した。【０１５１】
まず、５μｌのＰＣＲ反応液を５μｌのアルカリ溶液と混合し、ＤＮＡを一本鎖に変性した。これを上記４種のビーズ、および蛍光標識ストレプトアビジン（BD Biosciences社製）を含むハイブリダイゼーション溶液２５μｌと混合することで中和した。これを５５℃、３０分間保温し、プローブとＰＣＲ産物をハイブリダイズさせるとともに、ＰＣＲ産物に蛍光標識を行った。その後、洗浄液を加え、混和した後、遠心操作で上清を除去することにより、プローブと結合しなかったＰＣＲ産物、過剰の蛍光標識ストレプトアビジンを除いた。洗浄液でビーズを懸濁後、Ｌｕｍｉｎｅｘ装置による検出操作により、ビーズ上のプローブにハイブリダイズした蛍光標識されたＰＣＲ産物と、４種のビーズの識別を行った。検出結果は表５に示される通りであった。
【表５】
2008146797.tif 000006
【０１５２】
蛍光値に関して、カットオフ値を２０００とすると、着色したセルが陽性となる。検体＃１、検体＃２、および検体＃３は、それぞれＨＰＡ−７ａ、ＨＰＡ−７ｂ、およびＨＰＡ−７ｎｅｗの配列を有するプラスミドであることから、それぞれのプローブに対して特異的に反応し、カットオフ値よりも高い蛍光値を与えた。また、いずれも共通配列をプローブとして有するビーズ＃４と反応し、高い蛍光値を与えた。一方、染色体ＤＮＡである、検体＃４、＃５はＨＰＡ−１ａ、および共通配列と結合するビーズに対して高い蛍光値を与えていることから、ＨＰＡ−７ａのホモであることが分かる。また、検体＃６はＨＰＡ−７ａ、ＨＰＡ−７ｎｅｗ、および共通配列と結合するビーズに対して高い蛍光値を与えていることから、ＨＰＡ−７ａとＨＰＡ−７ｎｅｗのヘテロであることが分かる。【０１５３】
以上の結果から、蛍光ビーズ法を用いることにより、ＧＰＩＩＩａ遺伝子１２９７Ｔ多型を検出することができることが示された。
【配列表】
2008146797000001.app
【国際調査報告】
2008146797.tif 000007
2008146797.tif 000008
2008146797.tif 000009
2008146797.tif 000010