(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微細藻類ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属  オイリティカス（ｏｉｌｉｔｉｃｕｓ）種ＪＰＣＣ ＤＡ０５８０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２０１）。
【請求項２】
請求項１に記載の微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法。
【請求項３】
前記培養する工程の後に、当該培養に用いた培地中の栄養塩類の濃度を低減した別の培
地で前記微細藻類を更に培養する工程を有する、請求項２に記載の油分の製造方法。
【請求項４】
前記油分が中性脂質を含む、請求項２又は３に記載の油分の製造方法。
【請求項５】
前記油分がスクアレンを含む、請求項２〜４の何れか一項に記載の油分の製造方法。
【請求項６】
前記培養する工程の後、培養物から有機溶媒で油分を抽出する工程を有し、当該有機溶
媒が、ｎ−へキサンからなる溶媒、ｎ−へキサン及びメタノールからなる溶媒、又はｎ−
へキサン及びエタノールからなる溶媒の何れかである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の油分の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載の微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体。
【請求項８】
請求項１に記載の微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属に属する微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、および該微細藻類から採取した油分に関する。より詳細には、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の産生能を有するナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属に属する微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ燃料と呼称される重質油系または軽質油系の炭化水素を、微細藻類の培養によって製造する方法がいくつか報告されている。
重質油系炭化水素の産生能を有する藻類としては、炭素数３６の炭化水素の産生能をもつ微細藻類ボツリオコッカス  ブラウニー（非特許文献１参照。）や炭素数３３の炭化水素の産生能をもつ微細藻類ボツリオコッカス・ブラウニーＡレース（特許文献１参照。）が知られる。
また、軽質油系炭化水素の産生能を有する藻類としては、炭素数１７の炭化水素の産生能をもつ微細藻類Ｎｏｓｔｏｃ  ｍｕｓｃｏｒｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｓｍｉｕｍ  ｅｒｙｔｈａｅｕｍ、Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ  ｔｅｒｅｂｒａｎｓ等（非特許文献１参照。）、炭素数１９の炭化水素の産生能をもつ微細藻類Ｃｏｃｃｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｅｌａｂｅｎｓ等（非特許文献１参照。）、炭素数１７、１８、１９、および２０の炭化水素の産生能をもつ微細藻類シュードコリシスチス  エリプソイディア  ＭＢＩＣ１１２０４株（特許文献２参照。）、炭素数１７、１９、２１、および２３の炭化水素の産生能をもつ微細藻類コリシスチス  マイナー  ＳＡＧ１７．９８株（特許文献２参照。）が知られる。【０００３】
微細藻類の産生しうる軽質油系炭化水素はディーゼル燃料として産業上有用であり、地球温暖化防止を志向したカーボンニュートラルな燃料としても期待されている。
しかしながら、前記微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体において、軽質油系炭化水素の含有率は通常０．０２５〜０．１２質量％程度であり（非特許文献１参照。）、その炭化水素産生能は必ずしも十分ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２３４０５５号公報
【特許文献２】国際公開第２００６／１０９５８８号パンフレット
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｒ．Ｒａｊａ，Ｓ．Ｈｅｍａｉｓｗａｒｙａ，Ｎ．Ａｓｈｏｋ  Ｋｕｍａｒ，Ｓ．Ｓｒｉｄｈａｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｒｅｎｇａｓａｍｙ（２００８）  Ａ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ．  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３４：７７−８８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の産生能の高い微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明は下記の構成をとる。
（１）微細藻類ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属 オイリティカス  （ｏｉｌｉｔｉｃｕｓ）種  ＪＰＣＣ ＤＡ０５８０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２０１）。
（２）前記（１）に記載の微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法。
（３）前記培養する工程の後に、当該培養に用いた培地中の栄養塩類の濃度を低減した別の培地で前記微細藻類を更に培養する工程を有する、前記（２）に記載の油分の製造方法。
（４）前記油分が中性脂質を含む、前記（２）又は（３）記載の油分の製造方法。
（５）前記油分がスクアレンを含む、前記（２）〜（４）の何れか一つに記載の油分の製造方法。
（６）前記培養する工程の後、培養物から有機溶媒で油分を抽出する工程を有し、当該有機溶媒が、ｎ−へキサンからなる溶媒、ｎ−へキサン及びメタノールからなる溶媒、又はｎ−へキサン及びエタノールからなる溶媒の何れかである前記（２）〜（５）のいずれか一つに記載の油分の製造方法。
（７）前記（１）に記載の微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体。
（８）前記（１）に記載の微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法。
【０００８】
なお、本特許請求の範囲および明細書中において、「炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の産生能を有する」とは、主に炭素数１６、１８、２０、２２、２４および２６の脂肪族炭化水素の産生能を有するという意である。また、「油分」とは、主に疎水性有機化合物からなる液体成分をいう。該疎水性有機化合物としては、脂肪族炭化水素、中性脂肪等が挙げられる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の産生能の高い微細藻類、該微細藻類を培養する工程を有する油分の製造方法、該微細藻類から採取した油分、該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体、該微細藻類から得られる燃料、および該微細藻類を培養する工程を有する二酸化炭素固定方法を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の１８Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列を使用して得られた分子系統樹を示す図である。
【図２】ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の増殖曲線である。
【図３】ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の海水成分濃度を変化させた培養における増殖曲線である。
【図４】ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属  オイリティカス（ｏｉｌｉｔｉｃｕｓ）種  ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２０１）の電子顕微鏡像（左：倍率１万倍、右：倍率１万５千倍）である。
【図５】Ｎｉｌｅ  ｒｅｄで染色したナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属  オイリティカス（ｏｉｌｉｔｉｃｕｓ）種  ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２０１）の蛍光顕微鏡像（明るい蛍光発色の領域：Ｎｉｌｅ  ｒｅｄで発色した藻体内の油脂、薄暗い領域：自家蛍光で発色した光合成色素等）である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明について詳しく説明する。
＜ナビクラ属に属する微細藻類＞
本発明におけるナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属に属する微細藻類は、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の産生能を有するものである。ここで、前記炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素は、主に炭素数１６、１８、２０、２２、２４、および２６の脂肪族炭化水素である。
【００１２】
該微細藻類としては、特に、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の藻体中における含有率が高く、容易に培養できる観点から、微細藻類ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属  オイリティカス（ｏｉｌｉｔｉｃｕｓ）種が好ましく、微細藻類ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属  オイリティカス（ｏｉｌｉｔｉｃｕｓ）種  ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２０１）（以下、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株と略称する。）がより好ましい。
ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、前記炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の産生能に加えて、中性脂質およびスクアレンの高い産生能を有する観点からも、本発明の微細藻類として、より好ましい。該中性脂質の説明は、後述する。  
【００１３】
ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、発明者が汽水域の海水から単離した黄色植物門  珪藻綱羽状目有縦溝亜目  ナビクラ科に属する海洋微細藻類の新種の新規株である。
以下に、該微細藻類の単離方法および該微細藻類のＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を新種の新規株と判定するに至った経緯を説明する。
【００１４】
（培地調製方法）
硝酸ナトリウム７５．０ｍｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、メタケイ酸ナトリウム９水和物３０．０ｍｇ／ｌ、ｆ／２微量金属溶液１．０ｍｌ、ｆ／２ビタミン溶液０．５ｍｌ、および人工海水｛製品名：マリンアート・ＳＦ−１（千寿製薬株式会社製）｝３７ｇ／ｌを蒸留水に上記所定の濃度で溶解した液体培地を、ｆ／２培地として調製した。
前記ｆ／２微量金属溶液は、Ｎａ２ＥＤＴＡ２水和物４．３６ｇ／ｌ、塩化第二鉄６水和物３．１５ｇ／ｌ、塩化マンガン(ＩＩ)４水和物１８０ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛７水和物２２．０ｍｇ／ｌ、塩化コバルト(ＩＩ)６水和物１０．０ｍｇ／ｌ、モリブテン(ＶＩ)酸二ナトリウム２水和物６．３ｍｇ／ｌ、硫酸銅(ＩＩ)５水和物９．８ｍｇ／ｌの組成をもつ水溶液として調製した。
前記ｆ／２ビタミン溶液は、チアミン２００．０ｍｇ／ｌ、ビオチン０．１ｍｇ／ｌ、ビタミン（Ｂ１２）１．０ｍｇ／ｌの組成をもつ水溶液として調製した。
また、前記ｆ／２培地の組成に加えて、さらに寒天を１．２％（ｗ／ｖ）の濃度となるように添加した寒天ｆ／２培地を調製した。
なお、前記人工海水は、天然海水に含まれる塩類を模した塩類である。前記人口海水の所定量（３７ｇ／ｌ）を蒸留水に溶解することで、天然海水を模した海水成分をもつ水溶液を作製することができる。
【００１５】
（単離方法）
前記ｆ／２培地２ｍｌを含む２４穴のマイクロタイタープレートに、２００５年７月鹿児島県奄美市住用川と役勝川の合流地点にあるマングローブ林より採取した砂泥サンプルを適量添加した。つづいて、１０００ルクス（ｌｘ）の光照射下で静置培養を行い、微細藻類の生育が確認できたウェル中の培養液の一部を分取した。その分取した培養液を前記ｆ／２寒天培地上に接種して、前記光照射条件下で培養することによって、茶色の単細胞藻類ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株が、単菌化（単離）された微細藻類のコロニーとして得られた。
【００１６】
（形態学的性質）
前記寒天培地上で、２５℃、７日間培養した結果、直径２．０〜５．０ｍｍ程度の茶色のＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株のコロニーが得られた。コロニーの形状は点状で、隆起の無い半レンズ状であった。周縁は全縁であり、表面はスムーズな形状であった。また、変異によるコロニーの形態の変化は見られず、培養条件や生理的状態によるコロニー形態の変化も見られなかった。
前記コロニー中の海洋微細藻類は、大きさが平均して１０〜２０μｍ程度の単細胞藻類で、時に群体を形成し、栄養細胞には点眼や収縮胞は無く、細胞形は菱形であった。浮遊性は無く、ガラス質の殻を有し、被殻に縦溝があり、細胞表面は滑らかである。栄養細胞は鞭毛を持たず運動性を示さない。
ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の電子顕微鏡像を図４に示す。
【００１７】
（生殖様式）
ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、有性生殖と無性生殖の両方を行う。無性生殖は二分裂により無性的に増殖する。細胞分裂は被殻の中で進行し、二つの娘細胞は親細胞の外殻と内殻の内側にそれぞれ新たな半被殻を形成する。親細胞の半被殻はそれぞれ一つずつ娘細胞に分配される。その結果、娘細胞の一つは親細胞と同じ大きさ（の被殻）であるが、もう一方は内殻を外殻として利用する。その結果、親細胞より一回り小さくなるため、ある程度小さくなった細胞では有性生殖が行われる。その細胞では、減数分裂を行って同形配偶子が形成される。この接合子が被殻を介して近接し、原形質をアメーバ状に変化させて接合、増大胞子を形成し、成長して体積を増し、然るべき大きさの通常細胞に戻る様式を取っている。
【００１８】
（生理学・生化学的性状）
・  培養液：海水を基調とする培養液中で生育する。淡水では生育しない。
・  光合成：光合成による光独立栄養生育ができる。従属栄養生育は確認されない。
・  含有色素：クロロフィルａ、ｃ１、ｃ２、フコキサンチン及びフコキサンチン誘導体を中心とするカロテノイド色素類
・  貯蔵物質：デンプン
・  生育温度：２０℃〜３５℃（至適温度２５℃）
・  生育ｐH：７．０〜９．０（至適ｐＨ８．０）
・  細胞内にＮｉｌｅ  ｒｅｄで染色される、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素、中性脂質およびスクアレンを含む大量の油分を蓄積する。
・  生育期間：1週間｛濁度（ＯＤ７５０）が０．０５から１．２に達するのに要する期間｝
【００１９】
図５に示すように、Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ染色したＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を蛍光顕微鏡で観察すると、蛍光視野中の藻体において、明るい蛍光発色の領域としてＮｉｌｅ  ｒｅｄで発色した油分の存在が確認される。該油分は藻体細胞内に油滴として蓄積されうる。また、該油分は炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素、中性脂質、およびスクアレンを含む。
【００２０】
前述の形態学的性質、生殖様式、および生理学・生化学的性状の点からＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、黄色植物門  珪藻綱羽状目有縦溝亜目  ナビクラ科に属する藻類であると推定された。さらに、従来公知の方法に従って、ＤＮＡ抽出キット｛製品名：ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡブロードミニキット５０（株式会社キアゲン社製）｝を用いて、該ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法により、１８Ｓ  ｒＤＮＡの領域を増幅させてシークエンス解析を行い、１８Ｓ  ｒＤＮＡ領域の塩基配列を決定した。得られた１８Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を配列表の配列番号１に示す。得られた１８Ｓ  ｒＤＮＡの塩基配列を公共のデータベースである日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）と照合して相同性を検索（Ｂｌａｓｔ検索）し、解析ソフトＣｌｕｓｔａｌＷおよび表示ソフトＴｒｅｅｖｉｅｗを用いて系統解析を行なった。その結果得られた系統図を図１に示す。
【００２１】
単離したＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、前記系統樹において、ナビクラ科に分類され、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属の珪藻とクラスターを形成した。しかしながら、遺伝子レベルで確認されているナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属の既知の種と分岐が確認されたことから、本発明者が単離したＪＰＣＣ ＤＡ０５８０株は、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属の新種の藻類であると判断された。そこで、当該株を、ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属  オイリティカス（ｏｉｌｉｔｉｃｕｓ）種  ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株と命名した。
【００２２】
ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、平成２１年３月１６日付で受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１２０１として、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に受託されている（２００９年３月１６日に寄託された、国内受託番号：ＦＥＲM  Ｐ−２１７８８より移管）。
【００２３】
ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、藻体中に炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素、中性脂質、およびスクアレンを含む油分を蓄積しうる。さらに、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体における該炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の含有率は、０．２質量％以上に達しうる。また、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体における該中性脂質の含有率は、３６質量％以上に達しうる。さらに、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体における該スクアレンの含有率は、０．３質量％以上に達しうる。
【００２４】
また、該油分は前記炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素、中性脂質、およびスクアレンの他に、炭素数２７以上の脂肪族炭化水素、リン脂質、遊離脂肪酸、ステロイド化合物、およびフコキサンチン及びフコキサンチンの誘導体を含むカロテノイド等の光合成色素等も含みうる。
前記炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素は、主に炭素数１６、１８、２０、２２，２４および２６の脂肪族炭化水素であり、より詳しくは、主に炭素数１６、１８、２０、２２，２４および２６の直鎖脂肪族飽和炭化水素である。
前記中性脂質は、後述するように、主にテトラデカノイル基（ミリストイル基）、ヘキサデカノイル基（パルミトイル基）、ヘキサデセノイル基（パルミトレオイル基）、オクタデセノイル基（オレオイル基）、およびエイコサペンタエノイル基を、アシル基として有する中性脂質であり、主にこれらのアシル基を有するトリグリセライドである。
前記スクアレンは、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチルテトラコサ−２，６，１０，１４，１８，２２−ヘキサエンである。
前記炭素数２７以上の脂肪族炭化水素は、スクアレン以外の脂肪族炭化水素である。
【００２５】
ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株に含まれる油分を、ｎ−ヘキサンを溶媒として抽出した場合、通常、当該抽出された油分のうち、約８０質量％は前記トリグリセライド等の中性脂質であり、これはＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体の約３６質量％以上に達しうる。ただし、これらの値は、前記トリグリセライドがオレイン酸トリグリセライドであるとして計算した場合である。
また、当該抽出された油分に含まれる、前記炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の量および前記スクアレンの量は、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体の、約０．２質量％以上および約０．３質量％以上に、それぞれ達しうる。
ただし、当該抽出された油分のこれらの組成は、前記ｆ／２培地を用いて、後述する通気培養の方法によって、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を培養した際に通常得られるものであり、当該微細藻類の培養方法を変更した場合には、当該抽出された油分の組成は変動しうる。
【００２６】
前記トリグリセライド等の中性脂質を構成する脂肪酸は、主にテトラデカン酸｛ミリスチン酸（炭素数は１４、二重結合数は０）｝、ヘキサデカン酸｛パルミチン酸（炭素数は１６、二重結合数は０）｝、ヘキサデセン酸｛パルミトレイン酸（炭素数は１６、二重結合数は１）｝、オクタデセン酸｛オレイン酸（炭素数は１８、二重結合数は１）｝、およびエイコサペンタエン酸｛ＥＰＡ（炭素数は２０、二重結合数は５）｝である。これらのトリグリセライド等の中性脂質を構成している脂肪酸の、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体当たりの含有量は、順に、約１．０質量％、約１２．７質量％、約１７．０質量％、約０．８質量％、および約１．４質量％である。すなわち、当該乾燥藻体の約３２．９質量％を、前記トリグリセライド等の中性脂質を構成する脂肪酸が占める。
なお、前記トリグリセライド等の中性脂質を構成する脂肪酸の乾燥藻体中の含有率は、当該脂肪酸をメチルエステル化した場合に、その脂肪酸メチルエステルの質量が前記乾燥藻体中に占める割合である。
【００２７】
＜油分の製造方法＞
本発明における油分の製造方法は、本発明にかかる前記ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属に属する微細藻類を培養する工程を有するものである。本発明にかかる微細藻類を培養し、当該培養工程によって生育させた当該微細藻類を培地中から回収し、得られた微細藻類中に含まれる油分を採取することによって、当該油分を製造することができる。
【００２８】
当該ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属に属する微細藻類としては、特に、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の藻体中における含有率が高く、容易に培養できる観点から、微細藻類ナビクラ（Ｎａｖｉｃｕｌａ）属  オイリティカス  種が好ましく、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株がより好ましい。
ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、前記炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の産生能に加えて、中性脂質およびスクアレンの高い産生能を有する観点からも、本発明の微細藻類として、より好ましい。
【００２９】
当該微細藻類を培養する工程としては、ナビクラ属に属する微細藻類を培養できる公知の方法が適用できる。例えば、液体培地を入れた偏平フラスコ等の培養容器に該微細藻類を接種して、藻体が沈殿しない程度に緩やかに攪拌しながら光照射下で通気培養すればよい。
【００３０】
前記液体培地としては当該微細藻類を培養できる液体培地であれば特に制限されず、公知のものが使用できる。例えば、前述のＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を単離する際に用いた、ｆ／２培地が、生育が良好である観点から、好ましいものとして挙げられる。
【００３１】
前記液体培地における人工海水｛製品名：マリンアート・ＳＦ−１（千寿製薬株式会社製）｝の濃度としては、３７ｇ／ｌを添加した場合を１００％（ｗ／ｖ）とした時、３０〜１００％（ｗ／ｖ）が好ましく、５０〜１００％（ｗ／ｖ）がより好ましく、７０〜１００％（ｗ／ｖ）がさらに好ましく、９０〜１００（ｗ／ｖ）が特に好ましく、９５〜１００％（ｗ／ｖ）が最も好ましい。ここで、前記人工海水の所定の量（３７ｇ／ｌ）を蒸留水に溶解した水溶液は、天然の海水の塩濃度とほぼ等しいとされる。
【００３２】
前記光照射条件としては、培養液中の藻体濃度によって適宜調節すればよく、例えば５００ルクス以上（ｌｘ）が好ましく、１０００〜３００００ルクス（ｌｘ）がより好ましく、１０００〜１００００ルクス（ｌｘ）がさらに好ましく、１０００〜６０００ルクス（ｌｘ）が特に好ましく、１０００〜３０００ルクス（ｌｘ）が最も好ましい。
【００３３】
前記通気培養における通気ガスとしては、当該微細藻類が生育するのに適した公知の通気ガスを用いることができ、例えば、通常の空気、ＣＯ２を添加した空気等を使用できる。なかでも、当該微細藻類の生育をより良好にして生育期間を短縮しうることから、ＣＯ２を添加した空気を用いることが好ましい。
前記ＣＯ２を添加した空気におけるＣＯ２濃度としては、０．０５〜１０％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．０５〜５．０％（ｖ／ｖ）がより好ましく、１．０〜３．０％（ｖ／ｖ）が最も好ましい。
【００３４】
前記通気培養における通気量としては、当該微細藻類が生育するのに適した公知の通気量が適用でき、例えば、０．５〜５ｖｖｍが好ましく、０．５〜３．０ｖｖｍがより好ましく、０．５〜２．０ｖｖｍがさらに好ましい。
前記通気培養における培養温度としては、当該微細藻類が生育するのに適した公知の培養温度でよく、通常、２０〜３５℃で行うことが好ましく、２５〜３０℃で行うことがより好ましい。
前記通気培養の期間としては、当該微細藻類が生育する限り培養を継続することができ、通常、１〜４週間で行うことが好ましく、１〜３週間で行うことがより好ましく、１〜２週間で行うことがさらに好ましい。
【００３５】
本発明における油分の製造方法において、当該微細藻類の前記通気培養期間の後に、栄養制限下でさらに培養してもよい。該栄養制限下で培養することにより、藻体中に含まれる油分の含有率（乾燥藻体中に含まれる油分の質量％）を高めうる。したがって、前記通気培養期間に、栄養制限のない培地（栄養培地）で当該微細藻類を生育させて、所望の量まで培養した後に、栄養制限下での培養に切り換えることによって藻体中に含まれる油分の含有率を高めて、当該油分の製造効率を高めることができる。
【００３６】
ここで、前記栄養制限下での培養とは、培地に含まれるビタミン等を含む栄養塩類を通常よりも少なくした培地（栄養制限培地）で培養を行うことである。例えば、前述のＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を単離する際に用いたｆ／２培地（栄養液体培地）におけるビタミン等を含む栄養塩類（硝酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、メタケイ酸ナトリウム、ｆ／２微量金属溶液、およびｆ／２ビタミン溶液）の含有量を１００％とした場合、該含有量が１００％未満であるｆ／２培地（栄養制限液体培地）を用いて培養することが、栄養制限下で培養することにあたる。
【００３７】
前記栄養制限液体培地に含まれる、ビタミン等の栄養塩類の含有量としては、当該微細藻類中の油分の含有率を高める観点から、０〜６０％が好ましく、０〜３０％がより好ましく、０〜２０％がさらに好ましく、０〜１０％が特に好ましく、０％が最も好ましい。
【００３８】
前述の、栄養液体培地から栄養制限液体培地へ切り換える方法としては、特に制限されず、一度に栄養制限培地に切り換えてもよく、漸次切り換えてもよい。前記一度に切り換える方法としては、例えば遠心によって藻体を沈殿させて、上澄み液である栄養液体培地を除去し、つぎに栄養制限液体培地を投入する方法が挙げられる。また、漸次切り換える方法としては、例えば半透膜で隔てた一方の側に藻体を含む栄養液体培地を入れ、他方の側に栄養制限液体培地を入れることで、浸透圧の原理によって藻体を含む液体培地のビタミン等を含む栄養塩類の含有濃度を漸次低下させ、栄養制限液体培地にする方法が挙げられる。
【００３９】
前記栄養制限下での培養の期間は、本発明の効果を損なわない範囲であれば特に制限されず、当該微細藻類の油分含有率を高められる期間であればよい。該期間としては、好ましくは３〜２０日、より好ましくは３〜１０日、さらに好ましくは３〜７日で行うことができる。
【００４０】
培養した微細藻類の回収方法としては、公知の方法で行うことができ、例えば培養液を遠心することによって藻体を沈殿させてペレットとして回収する方法、当該微細藻類が通過できない孔をもつフィルターに培養液を通過させてフィルターに残った藻体を回収する方法等が挙げられる。
【００４１】
前記培養方法および回収方法で得られた藻体中に含まれる油分を採取する方法としては、本発明の効果を損なうものでなければ特に制限されない。例えば回収した藻体を有機溶媒中に懸濁することで藻体中に含まれる油分を、該有機溶媒中へ抽出することができる。
該有機溶媒としては、本発明の効果を損なわず、藻体中に含まれる油分を溶解できるものであれば特に制限されず、例えば、ｎ−ヘキサン（以下では、ヘキサンという。）、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノール、ブタノール、クロロホルム等が挙げられる。これらのなかでも、油分の抽出効率の観点から、ヘキサンが好ましい。また、これらの有機溶媒は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
また、該油分の抽出効率を高めるために、該藻体を懸濁した有機溶媒を超音波ホモジナイザー等にかけて、該藻体を物理的に破壊することが好ましい。
【００４２】
前記油分を前記微細藻類の藻体から抽出するための好ましい溶媒として挙げた前述のヘキサンは、単独の１相溶媒として用いてもよいし、メタノール及び／又はエタノールを混合した２相溶媒として用いてもよい。
メタノールを混合した２相溶媒とした場合、ヘキサン：メタノール＝１０：０〜５：５の割合（体積比）で混合することが好ましく、ヘキサン：メタノール＝１０：０．５〜８：２の割合で混合することがより好ましく、ヘキサン：メタノール＝１０：１〜９：１の割合で混合することがさらに好ましい。
エタノールを混合した２相溶媒とした場合、ヘキサン：エタノール＝１０：０〜５：５の割合（体積比）で混合することが好ましく、ヘキサン：エタノール＝１０：０．５〜８：２の割合で混合することがより好ましく、ヘキサン：エタノール＝１０：１〜９：１の割合で混合することがさらに好ましい。
エタノール及びメタノールをヘキサンに混合した２相溶媒の場合、エタノール及びメタノールは任意の割合（体積比）で混合した１相の溶媒として用いられる。この場合、ヘキサン：エタノール及びメタノール＝１０：０〜５：５の割合（体積比）で混合することが好ましく、ヘキサン：エタノール及びメタノール＝１０：０．５〜８：２の割合で混合することがより好ましく、ヘキサン：エタノール及びメタノール＝１０：１〜９：１の割合で混合することがさらに好ましい。
なお、溶媒の安全性及び油分抽出量を高める観点から、メタノールよりもエタノールを用いる方がより好ましい。
【００４３】
前記藻体から有機溶媒を用いて油分を抽出する場合、該藻体を乾燥させた後で有機溶媒による油分抽出を行ってもよく、該藻体に水分が含まれる未乾燥状態で有機溶媒による油分抽出を行ってもよい。
本発明にかかる微細藻類の藻体から有機溶媒を用いて油分を抽出する場合、該藻体を予め乾燥させずに未乾燥状態の藻体から有機溶媒による油分抽出を行う方が、油分抽出量を高めることができるので、好ましい。
公知の微細藻類の藻体から有機溶媒を用いて油分を抽出する場合には、該藻体を予め乾燥させておき、乾燥状態の藻体から有機溶媒による油分抽出を行う方が、一般に油分抽出量を高めることができる。しかし、予め藻体を乾燥することは、乾燥処理にかかる時間・エネルギーコストの面から不利である。この点において、本発明にかかる微細藻類の藻体は、未乾燥状態の藻体から効率的に油分を抽出できる、非常に優れた性質を持つといえる。この利点によって、本発明の微細藻類を用いたバイオ燃料等の製造プロセスの低エネルギー化を図ることができる。
【００４４】
未乾燥状態の前記藻体から油分を有機溶媒により抽出する場合は、ヘキサンとメタノール及び／又はエタノールとからなる２相溶媒を用いると、抽出量を多くすることができる。この２相溶媒としては、ヘキサン：メタノール＝１０：１の割合（体積比）で混合した２相溶媒、又はヘキサン：エタノール＝１０：１の割合（体積比）で混合した２相溶媒が特に好ましい。
乾燥状態の前記藻体から油分を有機溶媒により抽出する場合は、ヘキサンからなる１相溶媒を用いると、より高い抽出効率が得られる。
【００４５】
前記有機溶媒は、当該油分よりも沸点が低いので、窒素気流の吹きつけ、減圧留去等によって除くことができる。また、再利用も可能である。
また、前記有機溶媒によって抽出した油分は、必要に応じてさらに精製することができる。その精製方法としては、公知の方法で行えばよく、例えばシリカゲルを用いた固相抽出、液体クロマトグラフィー、蒸留等によって、当該油分に含まれる成分ごとに分取する方法が挙げられる。
【００４６】
本発明の油分の製造方法によって製造された油分は、当該微細藻類をＮｉｌｅ  ｒｅｄで染色した際に観察される油分を含む。該油分は、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素を含有する。前記炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素は、主に炭素数１６、１８、２０、２２、２４、および２６の脂肪族炭化水素である。
また、該油分は前記炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の他に、中性脂質、スクアレン、炭素数２７以上の脂肪族炭化水素、リン脂質、遊離脂肪酸、ステロイド化合物、およびカロテノイド等の光合成色素等も含みうる。
【００４７】
本発明の油分の製造方法において、当該微細藻類としてＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を用いた場合、その製造された油分の説明は、前述の、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株が藻体中に蓄積しうる油分の説明と同様である。
【００４８】
＜油分＞
本発明における油分は、本発明にかかる油分の製造方法によって製造されたものである。
当該油分の説明は、前述の油分の製造方法における油分の説明と同様である。
また、当該油分から炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素を精製することもできる。さらに、当該油分が中性脂質及び／又はスクアレンを含む場合は、その中性脂質及び／又はスクアレンを該油分から精製することもできる。
該精製方法としては、特に制限されず、公知の方法で行うことができる。例えば、当該微細藻類からヘキサン抽出した油分をヘキサン等の有機溶媒に溶解し、該溶液にシリカゲルを投入することにより、脂肪族炭化水素以外の物質をシリカゲルに吸着させ、該脂肪族炭化水素のみを溶出させることで精製できる。また、シリカゲルに吸着した中性脂質を有機溶媒等で溶出させることで精製できる。さらに、溶出した脂肪族炭化水素を蒸留、クロマトグラフィー等の公知の精製方法にかけることにより、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素とスクアレンとを分離できる。
なお、当該油分を溶解する有機溶媒としては、前述の油分の製造方法における有機溶媒の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００４９】
＜乾燥藻体＞
本発明における乾燥藻体は、本発明にかかる前記ナビクラ属に属する微細藻類を乾燥させたものである。
当該微細藻類としては、本発明にかかる前記ナビクラ属に属する微細藻類の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
当該微細藻類を乾燥させる方法としては、藻体中の水分を除去できる方法であれば特に制限されない。例えば、藻体を天日干しにする方法、藻体に乾燥空気を吹き付ける方法、藻体を凍結乾燥（フリーズドライ）する方法等が挙げられる。これらのうち、藻体に含まれる成分の分解を抑制できる観点から、凍結乾燥による乾燥方法が好ましい。
【００５０】
＜燃料＞
本発明における燃料は、本発明にかかる前記ナビクラ属に属する微細藻類から得られたものである。
当該微細藻類としては、本発明にかかる前記ナビクラ属に属する微細藻類の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
当該微細藻類を燃料として用いる方法としては、当該微細藻類を燃焼させる方法、当該微細藻類から採取した油分を燃焼させる方法、当該微細藻類から採取した油分から精製した炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素、中性脂質、及び／又はスクアレンを燃焼させる方法等が例示できる。
【００５１】
当該微細藻類を燃焼させる場合、燃焼効率を高める観点から、当該微細藻類を乾燥して得られる乾燥藻体を用いることが好ましい。該乾燥藻体は、本発明にかかる前記乾燥藻体と同様である。当該微細藻類がＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株である場合には、その乾燥藻体の有する熱量は、石炭の有する熱量（約６０００ｋｃａｌ／ｋｇ）と同等以上に達しうる。
【００５２】
当該微細藻類から採取した油分を燃焼させる場合、該油分は、本発明にかかる前記油分と同様である。当該微細藻類から採取した油分は可燃性であり、例えばボイラー等の燃料として使用することができる。当該微細藻類がＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株である場合には、そのヘキサン抽出物（油分）の有する熱量は、８７００ｋｃａｌ／ｋｇ以上に達しうる。
【００５３】
当該微細藻類から採取した油分から精製した炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素、中性脂質、及び／又はスクアレンを燃焼させる場合、該炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素、中性脂質、およびスクアレンは、本発明にかかる前記油分における該炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素、中性脂質、およびスクアレンと同様である。該炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素はディーゼルエンジンの燃料として用いることができる。また、該中性脂質は、公知のエステル交換法等によってディーゼル燃料（いわゆるバイオディーゼル燃料）とすることができる。
【００５４】
＜二酸化炭素固定方法＞
本発明における二酸化炭素固定方法は、本発明にかかる前記ナビクラ属に属する微細藻類を培養する工程を有するものである。
当該微細藻類が生育する際に行う光合成は、培養液中（大気中）の二酸化炭素を同化する作用がある。すなわち、当該微細藻類を培養することによって、二酸化炭素を固定することができる。
当該微細藻類としては、本発明にかかる前記ナビクラ属に属する微細藻類の説明で挙げたものと同様のものが挙げられる。
当該微細藻類を培養する工程は、本発明にかかる前記油分の製造方法における当該微細藻類の培養方法と同様である。
【００５５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
＜ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の炭化水素産生能＞
ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を２４穴ウェルで１２週間培養した後、その藻体をＮｉｌｅ  ｒｅｄで染色することにより、藻体中に油分が産生および蓄積されていることを確認した。【００５７】
具体的には、前記ｆ／２培地２ｍｌを含む２４穴のマイクロタイタープレートに、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を接種して、１０００ルクス（ｌｘ）の光照射下で、１２週間静置培養した。つづいて、培養液を１．５ｍｌ容のマイクロチューブに移して、１３０００ｒｐｍで遠心することにより藻体をペレットとして回収した。該ペレットに含まれる培地を除くために０．５ｍｌの生理食塩水に懸濁した後、１３０００ｒｐｍの遠心を５分行い、藻体をペレットとして回収した。
つぎに、そのペレットを４５０μｌの生理食塩水に再懸濁して、さらに５０μｌのＮｉｌｅ  ｒｅｄ溶液を加えて混合した後、室温で１０分間のインキュベーションを行った。その後、１３０００ｒｐｍの遠心を５分行ってペレットを回収し、余分なＮｉｌｅ  ｒｅｄ溶液を洗い流すために該ペレットを０．５ｍｌの生理食塩水へ懸濁してから再度遠心してペレットとして藻体を回収した。得られた藻体を５０μｌの生理食塩水へ懸濁したものを、蛍光顕微鏡によって観察した。その結果、藻体中にＮｉｌｅ  ｒｅｄで染色された油分の存在領域を示す黄色の蛍光を発する領域を確認することができた。該蛍光顕微鏡像では、藻体内に大量の油分が油滴状に蓄積されている様子が確認された（図５）。
なお、前記Ｎｉｌｅ  ｒｅｄ溶液は、１ｍｇのＮｉｌｅ  ｒｅｄを１０ｍｌのアセトンに溶解し、さらに生理食塩水で４倍に希釈した溶液である。
【実施例２】
【００５８】
＜ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株に蓄積される炭化水素の同定＞
前記ｆ／２培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコにＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を接種して、３０００ルクス（ｌｘ）の光照射下、通気量１ｖｖｍで１週間、通気培養を行った。その後、遠心で回収した藻体ペレットを、一晩凍結乾燥した。
得られた乾燥藻体０．１ｇにヘキサン６ｍｌを加えて懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて室温で藻体を破砕しながら３０分間の抽出を行った。つぎに、そのヘキサン抽出液を遠心し、藻体の残渣を沈殿させ、上清のヘキサン抽出溶液を約６ｍｌ回収した。沈殿として残った藻体の残渣に対して、再び新しいヘキサン６ｍｌを加えて懸濁し、同じ抽出操作をさらに２回（合計３回の抽出操作）を行った。その後、回収したヘキサン抽出液約１８ｍｌをＳｅｐ−ｐａｋ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（６ ｃｃ／１ｇ）（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製)シリカゲルカラムを用いて、中性脂質、遊離脂肪酸、色素等を除去し、脂肪族炭化水素画分を含む１６ｍｌ得た。窒素気流によって乾燥させ、ヘキサン０．５ｍｌに再溶解させたものを試料とした。その試料をガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣＭＳ）によって分析し、試料に含まれる炭化水素を同定した。【００５９】
使用したガスクロマトグラフ機器は株式会社島津製作所製のＧＣ２０１０であり、使用したカラムはＤＢ−１（カラム長：３０ｍ、カラム内径：０．２５ｍｍ）であり、測定条件（昇温：１００℃（０分）〜３３０℃(１０℃／分、ｈｏｌｄ)、注入温度：３００℃、注入モード：スプリットレス、キャリアガス：Ｈｅ、注入量：１．０μｌ）で行った。
質量分析機器は、電子衝撃（ＥＩ）法によるイオン化を行う、株式会社島津製作所製のＧＣＭＳ−ＱＰ５０５０Ａを使用した。【００６０】
ＧＣＭＳ分析の結果、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素を産生していることが明らかとなった。より具体的には、炭素数１６、１８、２０、２２、２４および２６の直鎖状脂肪族飽和炭化水素が主な成分として確認された。
また、軽油０．１％をヘキサンに溶解した試料を定量用の試料として、ＧＣＭＳチャートにおける当該炭化水素を示す面積比からＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株が産生する炭化水素量を定量したところ、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体における当該炭素数１６、１８、２０、２２、２４および２６の直鎖状脂肪族飽和炭化水素の含有率は約０．２質量％であった。この含有率は、これまでに公知の、軽質油系の脂肪族炭化水素を産生する藻類の含有率よりも高いものであった。なお、当該公知の藻類は、非特許文献１のＴＡＢＬＥ２に記載されているように、その乾燥藻体において、０．０２５〜０．１２質量％を軽質油系脂肪族炭化水素が占める。
さらに、前記ＧＣＭＳチャートにおいて最大の面積をもつピークは、スクアレンであると同定された。そのピーク面積から計算した、当該ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体当たりのスクアレン含有率は約０．３質量％であった。【００６１】
また、前述のシリカゲルカラムを用いた精製を行う前のヘキサン抽出液約１８ｍｌのうち微量を分取しておいた試料を、前記ＧＣＭＳによって、同じ条件で分析した。
その結果、ヘキサンによって抽出された油分は、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体のうち、４５．５質量％以上を占めることが確認された。なお、同一条件で培養して得られた、別の培養ロットから得られたＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の藻体では、その乾燥藻体のうち、最大で５８質量％を前記へキサンによって抽出された油分が占めることも確認された。
【実施例３】
【００６２】
＜ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株に蓄積されるトリグリセライドを構成する脂肪酸の同定＞
実施例２と同様の方法で培養して得たＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の藻体ペレットを、一晩凍結乾燥した。
当該乾燥藻体２０ｍｇを試料として、一回の抽出操作に用いたヘキサンを７ｍｌとした以外は実施例２と同様の方法で、ヘキサン抽出液約２０ｍｌを得た。該ヘキサン抽出液の溶媒であるヘキサンを窒素気流によって蒸発させて除き、９．１ｍｇのヘキサン抽出物（油分）を得た。したがって、当該乾燥藻体の４５．５質量％をヘキサン抽出物（油分）が占めることを確認した。
前記ヘキサン抽出物（油分）に５％塩酸−メタノール溶液を加え、封管した試験管中で９０℃、２時間反応させ、前記ヘキサン抽出物に含まれるトリグリセライド等の中性脂質を構成する脂肪酸のメチルエステル化を行った。その後、クロロフォルムで抽出し、クロロフォルム相を分取し試料とした。
前記試料を下記のＧＣＭＳ装置によって分析し、オレイン酸メチルエステルを標準物質として用いて定量した。【００６３】
使用したガスクロマトグラフ機器は、アジレント・テクノロジー・インターナショナル株式会社製のＧＣ６８９０Ｎ（型番）であり、使用したカラムはＪ＆Ｗ製のＤＢ−ＷＡＸ（カラム長：３０ｍ、カラム内径：０．２５ｍｍ、膜厚：０．２５μｍ）であり、測定条件｛昇温：５０℃（０分）〜２５０℃(１０℃／分、１５分保持)、注入温度：２３０℃、注入モード：スプリット注入（スプリット比１０：１）、キャリアガス：Ｈｅ（１．２ｍｌ／分）、検出器：ＦＩＤ（２５０℃）、注入量：０．６μｌ｝で行った。
質量分析機器は、電子衝撃（ＥＩ）法によるイオン化を行う、日本電子株式会社製のＪＭＳ−ＧＣｍａｔｅ−ＩＩ型を使用した。【００６４】
ＧＣＭＳ分析の結果、前記トリグリセライド等の中性脂質を構成している脂肪酸は、主にテトラデカン酸｛ミリスチン酸（Ｃ１４：０）｝、ヘキサデカン酸｛パルミチン酸（Ｃ１６：０）｝、ヘキサデセン酸｛パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）｝、オクタデセン酸｛オレイン酸（Ｃ１８：１）｝、およびエイコサペンタエン酸｛ＥＰＡ（Ｃ２０：５）｝であった。これらの脂肪酸の、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体当たりの含有量は、順に、約１．０質量％、約１２．７質量％、約１７．０質量％、約０．８質量％、および約１．４質量％であった。すなわち、当該乾燥藻体の約３２．９質量％を、前記トリグリセライド等の中性脂質を構成する脂肪酸が占めていた。
前記トリグリセライド等の中性脂質を構成する脂肪酸が、全てオレイン酸であると仮定した場合、当該乾燥藻体の約３．８質量％が前記トリグリセライド等の中性脂質を構成するグリセリンであると計算され、当該乾燥藻体の約３６．７質量％が前記トリグリセライド等の中性脂質であると結論した。
【実施例４】
【００６５】
＜ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の生育速度＞
実施例２と同様の方法でＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を培養した。また、液体培地を下記ＩＭＫ培地に変えた以外は実施例２と同様の方法でＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を培養した。それぞれの培地におけるＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の生育を評価するために、各培養液の濁度（ＯＤ７５０）を経時的に測定した。その結果を図２に示す。【００６６】
前記ＩＭＫ培地の調製は、以下の通りに行った。
ビタミン等を含む栄養塩類｛硝酸ナトリウム２００ｍｇ／ｌ、リン酸水素二ナトリウム１．４ｍｇ／ｌ、リン酸二水素ナトリウム５．０ｍｇ／ｌ、塩化アンモニウム６８ｍｇ／ｌ、チアミン０．２ｍｇ／ｌ、ビオチン０．００１５ｍｇ／ｌ、ビタミン（Ｂ１２）０．００１５ｍｇ／ｌ、Ｎａ２ＥＤＴＡ３７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＥＤＴＡ５．２ｍｇ／ｌ、ＭｎＥＤＴＡ０．３３３２ｍｇ／ｌ、塩化マンガン（ＩＩ）四水和物０．１８ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛七水和物０．０２４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物０．０１４ｍｇ／ｌ、モリブテン（ＶＩ）酸二ナトリウム二水和物０．００７２ｍｇ／ｌ、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２４ｍｇ／ｌ、亜セレン酸五水和物０．００１６ｍｇ／ｌ｝、および人工海水｛製品名：マリンアート・ＳＦ−１（千寿製薬株式会社製）｝３７ｇ／ｌを蒸留水に上記所定の濃度で溶解した液体培地を、ＩＭＫ培地として作製した。【００６７】
得られた結果から、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、前記ｆ／２培地において、１週間の培養期間で、ＯＤ７５０が０．０５〜０．９となり、その生育が定常に達することが確認された。その定常に達した藻体を回収して乾燥凍結し、その乾燥藻体の回収量を調べたところ、培養液１Ｌあたり０．４６ｇであった。
実施例２に前述したとおり、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体当たりのヘキサン抽出物（油分）の含量は５５質量％以上を占めるまでに達しうるので、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の１週間当たりの油分生産性は、培養スケール１Ｌ当たりで０．２６ｇ以上に達することが確認された。【００６８】
一方、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、前記ＩＭＫ培地において、１週間の培養期間では、その生育が定常に達しなかった。
【実施例５】
【００６９】
＜ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の海水要求性＞
実施例２で使用したｆ／２培地の組成のうち、人工海水｛製品名：マリンアート・ＳＦ−１（千寿製薬株式会社製）｝の濃度を変化させた栄養液体培地を５種類作製した。当該人口海水の濃度は、０ｇ／ｌで添加した場合を０％とし、以下同様に、１１．１ｇ／ｌ（３０％）、１８．５ｇ／ｌ（５０％）、２９．８ｇ／ｌ（８０％）、３７ｇ／ｌ（１００％）とした。
これらの培地５００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の偏平フラスコにＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を接種して、実施例２と同様の培養条件で、１週間の静置培養を行った。生育を評価するために培養液の濁度（ＯＤ７５０）を経時的に測定した。その結果を図３に示す。【００７０】
得られた結果から、１週間の生育期間中、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、人工海水（海水成分）を１００％含む条件において最も生育が良いことが確認された。また、人工海水（海水成分）濃度が減少するにつれて生育が減少し、人工海水（海水成分）が０％であると生育しないことが確認された。
このことから、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、海洋性の微細藻類であることが確認された。
【実施例６】
【００７１】
＜ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体の発熱量＞
実施例２と同様の培養方法でＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を、１週間培養した。その後、培養液から遠心で回収した藻体ペレットを、凍結乾燥した。
得られた乾燥藻体を試料として、ボンベ型熱量計（株式会社吉田製作所製、型式：１０１３−Ｊ、熱量の計測範囲：４０００〜３３５００Ｊ）で発熱量を測定したところ、６７３０ｋｃａｌ／ｋｇであった。すなわち、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の乾燥藻体は、石炭と同等以上の発熱量をもつことが確認された。
また、得られた乾燥藻体を試料として、実施例２と同様の方法で得られたヘキサン抽出液を窒素気流によって乾燥させ、ヘキサン抽出物（油分）として得た。これを試料として、前記ボンベ型熱量計で発熱量を測定したところ、該ヘキサン抽出物（油分）の発熱量は、８７８０ｋｃａｌ／ｋｇであった。
【実施例７】
【００７２】
＜ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の藻体から油分抽出する際の有機溶媒の検討１＞
実施例２と同様の方法でＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を、１週間培養した。その後、培養液から遠心によって藻体ペレットを回収した。
未乾燥状態の前記藻体ペレット（乾燥時の質量は０．１ｇ）に対して、ヘキサン／メタノールからなる２相溶媒（混合比（体積比）はヘキサン：メタノール＝１０：１）を６ｍｌ加えて懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて室温で藻体を破砕しながら３０分間の抽出を行った。つぎに、その抽出液を遠心し、藻体の残渣を沈殿させ、上清の抽出溶液を約６ｍｌ回収した。沈殿として残った藻体の残渣に対して、再び新しい前記２相溶媒６ｍｌを加えて懸濁し、同じ抽出操作をさらに２回（合計３回の抽出操作）を行った。得られた抽出液（合計１８ｍｌ）を窒素気流によって乾燥させ、実施例２と同様の方法でＧＣＭＳによって定量した。
その結果、前記２相溶媒によって抽出された油分は、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の藻体の乾燥時質量のうち、５１．８質量％を占めることが確認された。この結果を表１に併記する。【００７３】
つぎに、前記培養液から遠心によって回収された藻体ペレットを一晩凍結乾燥して得られた乾燥藻体０．１ｇに対して、前記２相溶媒に代えて、ヘキサンからなる１相溶媒を用いて、同様の方法で油分を抽出した。得られた抽出液（合計１８ｍｌ）を窒素気流によって乾燥させ、実施例２と同様の方法でＧＣＭＳによって定量した。
その結果、前記へキサンからなる１相溶媒によって抽出された油分は、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の藻体の乾燥時質量のうち、４６．２質量％を占めることが確認された。この結果を表１に併記する。【００７４】
また、前記培養液から遠心によって回収された藻体ペレットを一晩凍結乾燥して得られた乾燥藻体０．１ｇに対して、前記２相溶媒（ヘキサン／メタノール（混合比（体積比）１０：１））を用いて、同様の方法で油分を抽出した。得られた抽出液（合計１８ｍｌ）を窒素気流によって乾燥させ、実施例２と同様の方法でＧＣＭＳによって定量した。
その結果、前記へキサンからなる１相溶媒によって抽出された油分は、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の藻体の乾燥時質量のうち、４５．３質量％を占めることが確認された。この結果を表１に併記する。【００７５】
【表１】
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【００７６】
以上の結果では、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の未乾燥状態の藻体から油分を有機溶媒によって抽出する場合は、ヘキサンとメタノールとからなる２相溶媒を用いると、高い抽出効率が得られた。  上記結果を比較すると、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株から油分を抽出する場合、未乾燥状態の藻体ペレットに対して、ヘキサン／メタノールからなる２相溶媒を使用して抽出することがより好ましい。
【実施例８】
【００７７】
＜ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の藻体から油分抽出する際の有機溶媒の検討２＞
実施例２と同様の方法でＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株を、１週間培養した。その後、培養液から遠心によって藻体ペレットを回収した。
未乾燥状態の前記藻体ペレット（乾燥時の質量は０．１ｇ）に対して、ヘキサン／エタノールからなる２相溶媒（混合比（体積比）はヘキサン：エタノール＝１０：１）を６ｍｌ加えて懸濁し、超音波ホモジナイザーを用いて室温で藻体を破砕しながら３０分間の抽出を行った。つぎに、その抽出液を遠心し、藻体の残渣を沈殿させ、上清の抽出溶液を約６ｍｌ回収した。得られた抽出液（合計６ｍｌ）を窒素気流によって乾燥させ、実施例２と同様の方法でＧＣＭＳによって定量した。
その結果、前記２相溶媒によって抽出された油分は、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の藻体の乾燥時質量のうち、３１．５質量％を占めることが確認された。この結果を表２に併記する。【００７８】
つぎに、ヘキサン／エタノールからなる前記２相溶媒に代えて、ヘキサン／メタノールからなる２相溶媒（混合比（体積比）はヘキサン：メタノール＝１０：１）を用いて、同様に、未乾燥状態の前記藻体ペレット（乾燥時の質量は０．１ｇ）から油分を抽出し、ＧＣＭＳによって定量した。
その結果、前記２相溶媒によって抽出された油分は、ＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株の藻体の乾燥時質量のうち、３０．７質量％を占めることが確認された。この結果を表２に併記する。
なお、実施例７における油分抽出量よりも、実施例８における油分抽出量が少ない理由は、有機溶媒による抽出回数を３回（実施例７）から１回（実施例８）に減じたためである。【００７９】
【表２】
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【００８０】
他の属に分類される微細藻類の藻体から油分抽出する際の抽出効率
セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｒｕｂｅｓｃｅｎｓ） ＪＰＣＣ ＧＡ００２４株（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２１７４９）、シアノバクテリア（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）、テトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ  ｓｔｒｉａｔａ）の３種の微細藻類を公知の方法で培養して、それぞれ藻体ペレットを得た。これら３種の微細藻類は、その藻体中に油分を蓄積するものである。該油分は、少なくともトリグリセライド等の中性脂質を含有する。【００８１】
各藻体ペレットの乾燥時質量０．１ｇを試料として、未乾燥状態の藻体ペレットに対して２相溶媒《ヘキサン／メタノール（混合比（体積比）１０：１）》を用いて、実施例７と同様の方法で油分を抽出した。
つぎに、各藻体ペレットの乾燥時質量０．１ｇを試料として、乾燥状態の藻体ペレットに対して１相溶媒（ヘキサン）を用いて、実施例７と同様の方法で油分を抽出した。
また、各藻体ペレットの乾燥時質量０．１ｇを試料として、乾燥状態の藻体ペレットに対して２相溶媒《ヘキサン／メタノール（混合比（体積比）１０：１）》を用いて、実施例７と同様の方法で油分を抽出した。
得られた各抽出液（合計１８ｍｌ）を窒素気流によって乾燥させ、実施例２と同様の方法でＧＣＭＳによって定量した。その結果を表３に併記する。【００８２】
【表３】
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【００８３】
表３の結果から、公知の微細藻類の藻体から有機溶媒を用いて油分を抽出する場合、未乾燥状態の藻体から油分抽出を行うと、極めて油分抽出量が少なくなってしまうことが明らかである。すなわち、予め該藻体を乾燥させる工程が必要である。該藻体の乾燥プロセスには、少なからず時間やコストが必要となる。
一方、本発明にかかる微細藻類の藻体は、未乾燥状態の藻体から効率的に油分を抽出できる非常に優れた性質を持つため、本発明の微細藻類を用いたバイオ燃料等の製造プロセスの低エネルギー化を図ることができる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明にかかる微細藻類は、炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の産生能が高いために、ディーゼル燃料の生産に利用可能であり、地球温暖化防止を志向したカーボンニュートラルな燃料としても期待できる。本発明のＪＰＣＣ  ＤＡ０５８０株は、前記炭素数１６〜２６の脂肪族炭化水素の産生能に加えて、中性脂質およびスクアレンの高い産生能を有する観点からも、特に期待できるものである。
なお、該中性脂質は、公知のエステル交換法等によってディーゼル燃料（いわゆるバイオディーゼル燃料）とすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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