(57)【要約】【課題】塩水環境および／または塩水および淡水環境の両方に耐えることができるＡＯＢの同定。【解決手段】本明細書に記載されるのは、新規なアンモニア酸化細菌およびこれらのアンモニア酸化細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡの代表的な単離されたヌクレオチド配列である。本発明の特別な細菌は、淡水の環境、塩水の環境またはその両方に耐性である。さらに、種々の実施形態では、本発明の種々の細菌は、凍結乾燥処理を生存し得、その後に生存し得る。細菌の種々の組み合わせを含む組成物がさらに記載され、これらの細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡに基づいてこれらの細菌を検出するために用いられ得るポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーおよびオリゴヌクレオチドプローブも記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は概してアンモニア酸化因子に、そして詳細にはアンモニアを亜硝酸塩に酸化し
得る細菌に関する。
【０００２】
（関連出願）
本発明は、その全体が本明細書に援用される、２０００年５月１９日提出の米国特許出
願第０９／５７３，６８４号の一部継続出願である。本出願は、米国特許法第１１９条の
もとで、その全ての内容が参考として本明細書に援用される、２００２年９月１９日提出
の米国仮特許出願第６０／３８６，２１７号、２００２年９月１９日提出米国仮特許出願
第６０／３８６，２１８号、および２００２年９月１９日提出米国仮特許出願第６０／３
８６，２１９号の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
アンモニアは、淡水および塩水の両方における硬骨類および多くの無脊椎動物による主
要な窒素排泄物である。アンモニアは、生物体がその食餌から取り込むタンパク質の脱ア
ミノ化またはアミノ基転移反応により生じる。しかし、高いアンモニア濃度はこれらの同
じ水生生物体の多くにとって毒となり得る。自然の系、例えば湖、川および海では、水量
あたりの魚（および他の生物体）の密度が低いので、アンモニア濃度が有毒なレベルに達
することはめったにない。
【０００４】
しかし、人工的な水系、例えば水産養殖の囲い、タンク、導水路および生け簀ならびに
水槽では、公共物および私有物のいずれにおいても、アンモニアは、時には極めて急速に
有毒な濃度に達する可能性がある。その理由の１つは、上述の系では、少ない水量に対し
て魚類密度が極めて高くなり得るということである。別の理由は、これらの系の多くでは
、水が連続的に交換されず；むしろ単に定期的に一部の水を交換して水がこの系を循環し
ていることである。
【０００５】
従って、ほとんどの水産養殖系および水槽では、何らかの形態の濾過を行い、水生生物
体の保全および増殖に適切であるように、水質の程度を調節する。このような濾過ユニッ
トの主な構成要素は、生物学的フィルターである。生物学的フィルターは、酸化によりア
ンモニアを他の化合物（亜硝酸塩）に変換する能力を有する、細菌を増殖させるための基
板または部位として機能するという事実から名付けられている。高濃度の亜硝酸塩はまた
有毒になり得るが、各々があたかも完全に記載されるかのようにその全体が参考として本
明細書に援用されている、米国特許第６，２６８，１５４号、同第６，２６５，２０６号
および同第６，２０７，４４０号に記載の細菌種のような、生物学的フィルター上で増殖
し、かつ亜硝酸塩を硝酸塩に酸化する他の細菌種が存在する。硝酸塩は非常に高濃度の極
端な場合を除いて、水生生物体に対して無毒であると考えられている。
【０００６】
生物学的フィルターを使用する他の状況または適用が存在する。これらとしては下水処
理施設、廃水処理施設および飲料水濾過設備が挙げられる。各々が生物学的フィルターを
使用する独自の具体的な理由を有するが、その目的は同じであり：毒性の無機窒素化合物
をより無害な窒素物質に変換することである。アメリカ合衆国環境保護局（Ｅｎｖｉｒｏ
ｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）（ＥＰＡ）により規定された国
際推奨水質判定基準（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｗａｔｅｒ  Ｑｕａ
ｌｉｔｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ）を満たすために、多くの施設が生物学的フィルターを必要
としている。
【０００７】
アンモニアの亜硝酸塩への酸化は、細菌媒介性のプロセスである。詳細には、以下の式
で示されるアンモニアの亜硝酸塩への変換を含む二段階酸化である：
ＮＨ３＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ＋２ｅ−→ＮＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ  （１）
ＮＨ２ＯＨ＋Ｈ２Ｏ→ＮＯ２−＋５Ｈ＋＋４ｅ−      （２）
最も一般に研究されているアンモニア酸化細菌（ＡＯＢ）はＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ
ｅｕｒｏｐａｅａである。これはもともと土壌から単離され、水産養殖施設（Ｗｈｅａ
ｔｏｎ，Ｆ．Ｗ．１９７７．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｊｏ
ｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．）、廃水処理施設（Ｐａ
ｉｎｔｅｒ，Ｈ．Ａ．１９８６．Ｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａ
ｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｗａｇｅ  ａｎｄ  ｗａｓｔｅ−ｗａｔｅｒｓ．Ｉｎ  Ｎｉｔｒ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｊ．Ｉ．Ｐｒｏｓｓｅｒ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ）
および水槽（Ｓｐｏｔｔｅ，Ｓ．１９７９．Ｓｅａｗａｔｅｒ  Ａｑｕａｒｉｕｍｓ−Ｔ
ｈｅ  Ｃａｐｔｉｖｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃ
ｅ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）において、活性ＡＯＢと称されている。これらの引用文献、およ
び本明細書に引用される他の引用文献は、あたかも完全に記載されているかのようにその
全体が参考として本明細書に援用される。
【０００８】
しかし、生物体（または生物体の群）のＤＮＡ配列の独自性を用いる現代的な分子方法により実施された近年の研究では、Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａおよびその近縁種が淡水水槽環境において検出限界を下回ることが見出されている（非特許文献１）。別の研究によって、Ｎ．ｅｕｒｏｐａｅａが廃水処理施設において主要なＡＯＢでないことが実証されている（非特許文献２）。
【０００９】
さらに、水槽の環境および廃水処理において特に重要な環境的要因は、塩分であり、さ
らに詳細には、淡水と塩水環境との間の多くの生理化学的相違である。局所環境において
このような劇的な変化に耐える能力の種々のＡＯＢの間での相違は、これらの系の設計お
よびその中でのＡＯＢの実行において重要である。従って、塩水環境に対する特別のＡＯ
Ｂによって示された耐性によって、特別な水槽および廃水の環境における使用、ならびに
淡水と塩水の環境の間での変化に耐える弾力性において適切なＡＯＢがさらに広範な意味
を有し得るようになるかもしれない。
【００１０】
さらに、ＡＯＢの貯蔵および輸送はしばしば、凍結乾燥処理に種々のＡＯＢ株が耐えら
れないことに少なくとも一部は起因して、液体に、そして同様の潜在的に不便な媒体に限
定される。このようなプロセスによって、ある容積のＡＯＢを、例えば温度のさらに大き
い変動に耐えることが可能であり、そして市販品の輸送および取り扱いの目的のため、ま
たは同様の考慮に、および長い保管期間を維持するために、対応してさらに実際的であり
得る固体、凍結乾燥粉末または同様の組成物に処方することができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｈｏｖａｎｅｃ，Ｔ．Ａ．およびＥ．Ｆ．ＤｅＬｏｎｇ．１９９６．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｒｅｓｈｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｍａｒｉｎｅ  ａｑｕａｒｉａ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２８８８〜２８９６
【非特許文献２】Ｊｕｒｅｔｓｃｈｋｏ，Ｓ．ら、１９９８．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｓｌｕｄｇｅ：Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ−ｌｉｋｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｓ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：３０４２〜３０５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って、ＡＯＢ、特に塩水環境および／または塩水および淡水環境の両方に耐えること
ができるＡＯＢの同定が当該分野において必要である。凍結乾燥処理に供した後にも生存
したままであるＡＯＢも当該分野で必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の要旨）
本発明の実施形態では、アンモニアを亜硝酸塩に酸化することができる単離された細菌
または菌株が提供される。１実施形態では、この細菌または菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９または
配列番号２０のヌクレオチド配列を有する。配列番号１８、配列番号１９および配列番号
２０として記載されるヌクレオチド配列は、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｅｓｔｕａｒ
ｉｉ様ＡＯＢの例示である。
【００１４】
種々の実施形態では、細菌または菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号１８、配列番号
１９または配列番号２０のヌクレオチド配列（すなわち、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａ
ｅｓｔｕａｒｉｉ様ＡＯＢ）、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、また
は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９もし
くは配列番号２０に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９
８％類似または少なくとも９９％類似であるその改変体を有する。
【００１５】
本発明はまた、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配
列番号１９もしくは配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号２、
配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に対して少
なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似もしくは少なくとも
９９％類似であるその改変体を有する核酸配列および配列を有する細菌を包含する。
【００１６】
本出願の目的に関して、「９６％類似（９６％  ｓｉｍｉｌａｒ）」とは、単一の塩基
置換が塩基の最大４％まで生じてもよいことを意味し、「９７％類似」とは、単一の塩基
置換が塩基の最大３％まで生じてもよいことを意味し、「９８％類似」とは、単一の塩基
置換が塩基の最大２％まで生じてもよいことを意味し、そして「９９％類似」とは、単一
の塩基置換が塩基の最大１％まで生じてもよいことを意味する。
【００１７】
本発明はまた、媒体におけるアンモニアの蓄積を軽減する方法を包含する。本発明は、
菌株または菌株を含む組成物の十分な量をこの媒体に入れる工程を包含し、ここでこの菌
株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号
１８、配列番号１９もしくは配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号１、配列
番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に
対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似もしくは少
なくとも９９％類似であるその改変体を有する。
【００１８】
本発明はまた、アンモニアを亜硝酸塩へ酸化し得る細菌の媒体における量を検出および
決定するための方法を包含する。この方法は、本発明の検出可能に標識されたプローブを
提供する工程と、媒体から総ＤＮＡを単離する工程と、この細菌の１６  ｒＤＮＡが配列
番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９もしくは配
列番号２０のヌクレオチド配列を有する場合、この細菌の核酸配列にのみこのプローブが
ハイブリダイズする条件下でこのプローブに対してこの単離されたＤＮＡを曝露させる工
程と、このプローブを検出および測定して、この細菌の量を検出および測定する工程とを
包含する。
【００１９】
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
アンモニアを亜硝酸塩に酸化する単離された菌株を含む組成物であって、該菌株が配列番
号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択される配列に示されるヌク
レオチド配列を含む、組成物。
（項目２）
上記組成物が液体、凍結形態、凍結乾燥形態および粉末からなる群より選択される形態で
ある項目１に記載の組成物。
（項目３）
上記組成物がポリマーに含まれる、項目１に記載の組成物。
（項目４）
上記ポリマーがアクリルアミド、アルギン酸、カラギナンおよびそれらの組み合わせから
なる群より選択される、項目３に記載の組成物。
（項目５）
アンモニアを亜硝酸塩に酸化する濃縮された菌株を含む組成物であって、該菌株の１６Ｓ
ｒＤＮＡが、配列番号１８の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオ
チド配列、配列番号１９の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオチド
配列、および配列番号２０の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオチ
ド配列：からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、組成物。
（項目６）
上記菌株が配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択される配
列に同一である１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を有する、項目５に記載の組成物。
（項目７）
アンモニア酸化微生物、亜硝酸酸化微生物、亜硝酸還元微生物、従属栄養微生物およびそ
れらの組み合わせからなる群より選択される微生物をさらに含む、項目５に記載の組成
物。
（項目８）
配列番号１８の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオチド配列、配列
番号１９の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオチド配列、および配
列番号２０の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオチド配列からなる
群より選択される単離された核酸。
（項目９）
上記配列が配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択される配
列に同一である、項目８に記載の単離された核酸。
（項目１０）
配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドプローブ。
（項目１１）
配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なくとも９６％
同一性を有するオリゴヌクレオチドプローブであって、該オリゴヌクレオチドプローブは
、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択される配列に対し
てその全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオチド配列を有する１６Ｓ
ｒＤＮＡを有する細菌の核酸に対してハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドプロー
ブ。
（項目１２）
配列番号２２および配列番号２３からなる群より選択されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）プライマー。
（項目１３）
配列番号２２および配列番号２３からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対してそ
の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プラ
イマーであって、該ＰＣＲプライマーは、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２
０からなる群より選択される配列に対してその全長にわたって少なくとも９６％同一性を
有するヌクレオチド配列を有する１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する細菌の核酸に対してハイブリ
ダイズする、ＰＣＲプライマー。
（項目１４）
アンモニアを亜硝酸塩に酸化する少なくとも２つの菌株を含む組成物であって、該少なく
とも２つの菌株の各々が、配列番号１８の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有す
るヌクレオチド配列、配列番号１９の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌ
クレオチド配列、および配列番号２０の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有する
ヌクレオチド配列：からなる群より独立して選択されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ  
ｒＤＮＡを有する、組成物。
（項目１５）
上記組成物が、配列番号１８に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する
菌株と、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する菌株と
、配列番号２０に記載のヌクレオチド配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する菌株とを含む
、項目１４に記載の組成物。
（項目１６）
媒体におけるアンモニアの蓄積を軽減または防止する方法であって：
アンモニアを亜硝酸塩に酸化する菌株を提供する工程であって、該菌株が、配列番号１
８の全長にわたって９６％を超える同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号１９の全
長にわたって９６％を超える同一性を有するヌクレオチド配列、および配列番号２０の全
長にわたって９６％を超える同一性を有するヌクレオチド配列：からなる群より選択され
るヌクレオチド配列を含む工程と；
該媒体中のアンモニアの蓄積を軽減または防止するのに十分な量の該菌株を該媒体中に
導入する工程と；
を包含する、方法。
（項目１７）
菌株の非存在下で存在するアンモニアのレベルと比較した場合、少なくとも３０％までア
ンモニアが減少される項目１６に記載の方法。
（項目１８）
上記媒体が水槽である、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
上記水槽が淡水の水槽である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
上記水槽が塩水の水槽である、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
上記媒体が廃水を含む、項目１６に記載の方法。
（項目２２）
ある量の菌株を媒体中に導入する工程が、回転生物接触法の媒体中に該菌株を入れる工程
をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目２３）
ある量の菌株を媒体中に導入する工程が、バイオフィルター上の媒体中に菌株を入れる工
程をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目２４）
媒体におけるアンモニアの蓄積を軽減または防止する方法であって：
アンモニアを亜硝酸塩に酸化する菌株を提供する工程であって、該菌株が、配列番号１
８、配列番号１９および配列番号２０からなる群より選択される配列に示される１６Ｓ  
ｒＤＮＡヌクレオチド配列を含む工程と；
該媒体中のアンモニアの蓄積を軽減または防止するのに十分な量の該菌株を該媒体中に
導入する工程と；
を包含する、方法。
（項目２５）
媒体におけるアンモニアの蓄積を軽減または防止するバイオレメディエーションプロセス
であって：
アンモニアを亜硝酸塩に酸化する菌株を提供する工程であって、該菌株が、配列番号１
８の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号１９の
全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオチド配列、および配列番号２０
の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有するヌクレオチド配列：からなる群より選
択されるヌクレオチド配列を含む工程と；
該媒体を修正するのに十分な量の該菌株を該媒体中に導入する工程と；
を包含する、プロセス。
（項目２６）
媒体におけるアンモニアの蓄積を軽減または防止する方法であって：
アンモニアを亜硝酸塩に酸化する少なくとも２つの菌株を含む組成物を提供する工程で
あって、該少なくとも２つの菌株の各々が、配列番号１８の全長にわたって少なくとも９
６％同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号１９の全長にわたって少なくとも９６％
同一性を有するヌクレオチド配列、および配列番号２０の全長にわたって少なくとも９６
％同一性を有するヌクレオチド配列：からなる群より独立して選択されるヌクレオチド配
列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する工程と；
該媒体におけるアンモニアの蓄積を軽減または防止するのに十分な量の該組成物を該媒
体に導入する工程と；
を包含する、方法。
（項目２７）
上記組成物が、配列番号１８に示されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有す
る菌株と、配列番号１９に示されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する菌
株と、配列番号２０に示されるヌクレオチド配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する菌株と
を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡが配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０からなる群よ
り選択されるヌクレオチド配列を含む、媒体中でアンモニアを亜硝酸塩に酸化する該細菌
の量を検出および決定するための方法であって：
配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を含む検出可能に標識されたプローブを提供
する工程と；
該媒体から総ＤＮＡを単離する工程と；
該ヌクレオチド配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する細菌の核酸のみに該プローブがハ
イブリダイズする条件下で、該検出可能に標識されたプローブに対して該単離された総Ｄ
ＮＡを曝露させる工程と；
該ハイブリダイズされたプローブの量を検出および測定する工程とを包含し、
該ハイブリダイズされたプローブの存在がアンモニアを亜硝酸塩に酸化する細菌の存在
の指標であり、そしてハイブリダイズされたプローブの量が該媒体においてアンモニアを
亜硝酸塩に酸化する細菌の量の指標である、方法。
（項目２９）
上記媒体が水槽の水、淡水、塩水および廃水からなる群より選択される、項目２８に記
載の方法。
（項目３０）
上記媒体として、水槽の砂利、フィルターのスポンジ、フィルターフロスおよびプラスチ
ックフィルター媒体からなる群より選択される物質が挙げられる、項目２８に記載の方
法。
（項目３１）
上記総ＤＮＡが上記物質から単離される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
検出可能に標識されたプローブを提供する工程がさらに、ＤＮＡチップ上に検出可能に標
識されたプローブを含む工程をさらに包含する、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
媒体におけるアンモニアを亜硝酸塩に酸化する細菌の量を検出および決定するための方法
が自動化プロセスである、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
上記自動化されたプロセスが、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、バイ
オセンサー、バイオプローブ、キャピラリー電気泳動およびリアルタイムＰＣＲからなる
群より選択される、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡが、配列番号１８の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有
するヌクレオチド配列、配列番号１９の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有する
ヌクレオチド配列、および配列番号２０の全長にわたって少なくとも９６％同一性を有す
るヌクレオチド配列からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、媒体中でアンモ
ニアを亜硝酸塩に酸化する該細菌の量を検出および決定するための方法であって：
配列番号２１に示されるヌクレオチド配列に対してその全長にわたって少なくとも９６
％の同一性を有する検出可能に標識されたプローブを提供する工程と；
該媒体から総ＤＮＡを単離する工程と；
該ヌクレオチド配列を含む１６Ｓ  ｒＤＮＡを有する細菌の核酸のみに該プローブがハ
イブリダイズする条件下で、該検出可能に標識されたプローブに対して単離された総ＤＮ
Ａを曝露させる工程と；
該ハイブリダイズされたプローブの量を検出および測定する工程とを包含し、
該ハイブリダイズされたプローブの存在がアンモニアを亜硝酸塩に酸化する細菌の存在
の指標であり、そしてハイブリダイズされたプローブの量が該媒体においてアンモニアを
亜硝酸塩に酸化する該細菌の量の指標である、方法。
（項目３６）
上記媒体が水槽の水、淡水、塩水および廃水からなる群より選択される、項目３５に記
載の方法。
（項目３７）
上記媒体として、水槽の砂利、フィルターのスポンジ、フィルターフロスおよびプラスチ
ックフィルター媒体からなる群より選択される物質が挙げられる、項目３５に記載の方
法。
（項目３８）
上記総ＤＮＡが上記物質から単離される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
検出可能に標識されたプローブを提供する工程がさらに、ＤＮＡチップ上に検出可能に標
識されたプローブを含む工程をさらに包含する、項目３５に記載の方法。
（項目４０）
媒体におけるアンモニアを亜硝酸塩に酸化する細菌の量を検出および決定するための方法
が自動化プロセスである、項目３５に記載の方法。
（項目４１）
上記自動化されたプロセスが、ＤＮＡマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイ、バイ
オセンサー、バイオプローブ、キャピラリー電気泳動およびリアルタイムＰＣＲからなる
群より選択される、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
固体基板と；
該固体基板上に構成された配列番号２１に示されるヌクレオチド配列を含むプローブと
、
を備える、ＤＮＡチップ。
（項目４３）
上記プローブが共有結合によって上記固体基板に結合される、項目４２に記載のＤＮＡ
チップ。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の実施形態による１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の比較分析から推測される３種の菌株（すなわち、配列番号１、配列番号２および配列番号３によって表される菌株）および１つの亜株（すなわち、配列番号４によって表される株）の系統的関係を図示する。この系統樹は、最低１４３０ヌクレオチドを含む配列の近隣距離分析（ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に基づく。
【図２】図２は、本発明の実施形態による、選択された培養物、ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によって表されるアンモニア酸化細菌由来のバイオマスの変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を図示する。
【図３】図３は、本発明の実施形態による、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によって表される菌株の特殊性を実証するＤＧＧＥを図示する。各々の前述の細菌タイプの２つの複製物を、アンモニア酸化細菌の３つの純培養物からの抽出物と並べている。
【図４】図４（Ａ〜Ｄ’）は、本発明の実施形態による、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によって表される菌株について細菌添加ＶＩ試験のアンモニアおよび亜硝酸塩の平均的傾向を図示する。
【図５】図５（Ａ〜Ｄ’）は、本発明の実施形態による、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によって表される菌株について細菌添加ＶＩＩ試験のアンモニアおよび亜硝酸塩の平均的傾向を図示する。
【図６】図６は、本発明の実施形態による１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列の比較分析から推測される２つの菌株（すなわち、配列番号１８および配列番号１９によって表される菌株）および１つの亜株（すなわち、配列番号２０によって表される株）の系統的関係を図示する。この系統樹は、配列番号１８および配列番号１９によって表される２つの菌株ならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４によって表される菌株の間の関係をさらに示す。この系統樹は、最低１４３０ヌクレオチドを含む配列の近隣距離分析に基づく。
【図７】図７は、配列番号１、配列番号３および配列番号４によって表されるアンモニア酸化細菌の選択された淡水培養物由来のバイオマスと並べて、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によって表されるアンモニア酸化細菌の塩水培養物ならびにアンモニア酸化細菌Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓ、およびＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｃｒｙｏｔｏｌｅｒａｎｓの純培養物の変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を図示する。
【図８】図８は、本発明の実施形態による、配列番号１、配列番号２および配列番号３によって表される淡水菌株、ならびに配列番号１８、配列番号１９によって表される塩水菌株および２つのＮ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ様株とともに２つの市販の硝化細菌混合物について細菌添加ＶＩＩＩ試験のアンモニア濃度の平均的傾向を図示する。
【図９】図９は、細菌添加ＩＸ試験における水槽についてのアンモニア濃度の平均的傾向を図示するが、この試験では、本発明の実施形態による、配列番号１８、配列番号１９によって表される塩水菌株および２つのＮ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ様株を与えた。
【図１０】図１０は、細菌添加Ｘ試験のアンモニア濃度の平均的傾向を図示する。配列番号１８、配列番号１９によって表される塩水菌株および２つのＮ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ様株の２つの細菌混合物を、本発明の実施形態に従って接種していない水槽に対して試験した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、淡水および／または塩水の環境においてアンモニア酸化し得、かつ凍結乾燥
処理後にも生存して生存可能なままであり得る新規な菌株の発見に基づく。本発明の実施
形態は、菌株を用いるための方法を記載する。
【００２２】
本発明は、アンモニアを亜硝酸塩に酸化し得る、単離された菌株または生物学的に純粋
な菌株の培養物が提供されるが、この菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、表１〜７に示されるよ
うな配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４、配列番号１８、配列番号１
９または配列番号２２のヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
表１．ＡＯＢタイプＡアンモニア酸化細菌の配列。Ｒ７クローン１４０によって表され
る。配列番号１。
【００２４】
【表１】
2010057494.tif 000002
表２．ＡＯＢタイプＡ１アンモニア酸化細菌の配列。Ｒ７クローン１８７によって表さ
れる。配列番号２。
【００２５】
【表２】
2010057494.tif 000003
表３．ＡＯＢタイプＢアンモニア酸化細菌の配列。Ｒ３クローン５によって表される。
配列番号３。
【００２６】
【表３】
2010057494.tif 000004
表４．ＡＯＢタイプＣアンモニア酸化細菌の配列。Ｒ５クローン４７によって表される
。配列番号４。
【００２７】
【表４】
2010057494.tif 000005
表５．Ｐ４クローン４２によって表されるＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｓｅｔｕａｒ
ｉｉ様ＡＯＢの配列。配列番号１８。
【００２８】
【表５】
2010057494.tif 000006
表６．Ｐ４クローン３１によって表されるＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｓｅｔｕａｒ
ｉｉ様ＡＯＢの配列。配列番号１９。
【００２９】
【表６】
2010057494.tif 000007
表７．ＢＦ１６クローン５７によって表されるＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｓｅｔｕ
ａｒｉｉ様ＡＯＢの配列。配列番号２０。
【００３０】
【表７】
2010057494.tif 000008
本発明の目的に関し、単離された菌株とは、天然環境からある程度精製された１つの株
を意味する。細菌の少なくとも２０％が１つの菌株に由来する場合、細菌培養物は生物学
的に純粋であると見なされる。しかし、培養物は少なくとも３３％純粋であるのが好まし
く、培養物が少なくとも４５％純粋であればより好ましく、少なくとも９０％が純粋であ
ることが最も好ましい。
【００３１】
本発明の菌株はまた、含水媒体を維持または精製するための組成物を提供するために、
他の細菌種、栄養分、および／または他の成分をお互いに組み合わせてよい。例えば本発
明の細菌を、含水媒体から汚染物質または所望しない化合物を除去することができる細菌
と組み合わせることが望まれ得る。このような細菌の例としては、亜硝酸酸化細菌（亜硝
酸塩を硝酸塩に酸化する化学無機独立栄養細菌）、従属栄養細菌（有機物質をアンモニア
および他の物質に無機化する）、および当業者に公知の別の細菌が挙げられる。亜硝酸酸
化細菌は、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ細菌群、ならびにＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａのα、
γおよびδ亜門から公知である。その例としてはＮｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｎｉｔｒｏｓｐ
ｉｎａおよびＮｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属の種が挙げられる。硝酸塩還元細菌は、Ａｚｏａ
ｒｃｕｓ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属から知られている。
従属栄養細菌は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
およびＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属から公知である。このような菌は公知の供給源から入手
可能であり（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ  ２０１
００，ＵＳＡ）または水槽バイオフィルターから直接単離できる。
【００３２】
例えば、本発明の菌株は、水系に存在するアンモニアを亜硝酸塩に酸化し、亜硝酸塩を
硝酸塩に酸化するように亜硝酸酸化細菌と組み合わされてもよい。別の例は、本発明の菌
株を好気性または嫌気性の脱窒細菌と混合することである。この場合、本発明の菌株と亜
硝酸酸化細菌との相互作用により生成される硝酸塩は、二窒素または他の窒素をベースと
する生成物に還元される。第３の例は、本発明の菌株と従属栄養細菌とを合わせることで
あり、この従属栄養細菌が、有機物を次には本発明の菌株によって基質として利用するこ
とができるより単純な無機物に無機化する。
【００３３】
本発明はまた、アンモニアを亜硝酸塩に酸化し得る濃縮された菌株を含む混合物を提供
するが、この細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番
号４、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０のヌクレオチド配列、または配
列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９もしくは
配列番号２０に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％
類似もしくは少なくとも９９％類似であるその改変体を有する。本発明の実施形態によれ
ば、菌株は、この菌株が自然に存在するその濃度よりも高い濃度で存在する場合、濃縮さ
れているとみなされる。一般には、菌株の濃度は、適切なコントロールおよび列挙法を用
い、当業者に公知である蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技術を用
いて分子プロービングのような標準的技術によって決定した場合、サンプル中の総細胞の
少なくとも２０％である。さらに好ましくは、菌株の濃度は、総細胞の３３％以上、さら
に好ましくは総細胞の４５％、そして最も好ましくは９０％以上である。しかし、配列番
号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９または配列番
号２０のヌクレオチド配列を有する細菌の２つ以上を混合物中に有することが好ましいか
もしれない。この場合、上記のパーセンテージは、細胞集団のバランスが亜硝酸酸化細菌
または他のタイプの細菌から構成され得るということを理解した上で、混合物中の総ＡＯ
Ｂのパーセンテージを述べたものである。
【００３４】
詳細には、ただしいかなる理論によっても束縛されることは望まないが、本発明によっ
て記載される種々の菌株のうち配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に表され
る株は、塩水環境に特に耐性であると考えられる；しかしこれらの株は、淡水環境におい
て利用され得、そしてその中で効率的に機能すると考えられる。配列番号１８、配列番号
１９および配列番号２０によって表される株以外の菌株および株を含む混合物はまた、適
切な程度まで塩水環境に耐性であり得るが、本発明のさらに好ましい実施形態では、これ
は、アンモニアを亜硝酸塩に酸化するために塩水環境に含まれる配列番号１８、配列番号
１９または配列番号２０によって表される株である。
【００３５】
さらに、本発明の菌株のいずれが凍結乾燥されてもよいが、配列番号１８、配列番号１
９および配列番号２０によって表される株は、このような処理の後にそれらが生存可能な
ままである能力、およびこのような処理の後にアンモニアを亜硝酸塩に酸化する能力によ
って証明した場合、凍結乾燥処理に特に耐性であると考えられる。従って、本発明の好ま
しい実施形態では、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によって表される菌
株は、凍結乾燥されてもよく、その後に淡水または塩水の環境のいずれかでアンモニアを
酸化するために用いられてもよい。
【００３６】
本発明の菌株、および混合物は、当業者に容易に認識され得る、粉末形態、液体形態、
凍結形態、凍結乾燥形態または任意の他の適切な形態であってもよい。これらは一般的に
「市販の添加物（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ）」と呼ばれ、これには以
下が挙げられるがこれらに限定されない：
（１）細胞の生存率が貯蔵の経過中に損なわれないように、１つ以上の株が無機塩また
は有機化合物を含有する液体溶液中に存在する、液体形態；
（２）細胞の溶解を防止するため必要に応じて凍結保護化合物を含有する上記の液体混
合物中に１つ以上の株が存在し、これを凍結させ、３２°Ｆ以下の温度で凍結させて保存
する、凍結形態ならびに；
（３）凍結乾燥または他の方法で製造され、ここで１つ以上の株または混合物の脱水形
態が、通常の室温で生存率を損なうことなく保存可能である、粉末形態。
【００３７】
本発明の菌株および混合物を適当な形で取得することについては、本開示の観点から当
業者が精通していることである。本発明の菌株および混合物は、単独で使用されてもよく
、または他の成分と組み合わせて使用されてもよいことも理解されている。このような成
分の例としては、亜硝酸酸化細菌、従属栄養亜硝酸酸化細菌、従属栄養アンモニア酸化細
菌などが挙げられるがこれらに限定されない。生物学的に純粋な菌株の全ての形態はまた
、栄養分、アミノ酸、ビタミン、および菌株の増殖を維持および促進するための他の化合
物を含有してよい。本発明の菌株ならびに混合物および組成物を、淡水水槽、塩水水槽、
および廃水に用いて、アンモニアの蓄積を軽減することができる。これらはまた、アンモ
ニアにより引き起こされる汚染レベルを低減するために、バイオレメディエーション（生
物的環境浄化）プロセスに利用してもよい。バイオレメディエーションプロセスは、バイ
オオーグメンテーション（生物的強化）とも呼称され、これには、元の系に存在する１つ
以上の形態の化合物の変化を生じる、生物学的および／または化学的プロセスを促進また
は確立するために、ある系（例えば、生物学的または化学的な汚染の見られる場所）へ微
生物を補足的に添加することが挙げられるが、これに限定されない。
【００３８】
従って、本発明の１つの局面は、媒体中のアンモニアの蓄積を軽減する方法を提供する
ことである。この方法は、媒体中のアンモニアの蓄積を軽減するために、アンモニアを亜
硝酸塩へ酸化できるのに十分な量の菌株を、この媒体中に導入する工程を包含し、ここで
、この菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、
配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号
１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番
号２０に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似も
しくは少なくとも９９％類似であるその改変体を有する。添加した細菌が媒体中のアンモ
ニアの蓄積を軽減または防止できる場合、この菌株（単数または複数）の量は十分である
。一般的に、本発明の１つ以上の菌株の淡水または塩水の水槽への添加によって、最大ア
ンモニア濃度は、菌株（単数または複数）の非存在下で到達するレベルの少なくとも５０
％を超えるまで低下されることが予想される。
【００３９】
本発明の別の実施形態では、アンモニアの媒体における蓄積を軽減する方法は、水を含
有する媒体を維持または精製するために、本明細書に開示されるような、十分な量の組成
物を媒体に入れる工程を包含する。この組成物は、アンモニアを亜硝酸塩へ酸化できる１
つ以上の菌株を含んでもよく、ここで、この菌株（単数または複数）の１６Ｓ  ｒＤＮＡ
は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９も
しくは配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号２、配列番号３、
配列番号４、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に対して少なくとも９６
％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似もしくは少なくとも９９％類似で
あるその改変体を有する。
【００４０】
所定の設定で達成される実際のレベルは、系の大きさと内容（すなわち魚類、植物等の
数）の関数であることが理解される。新規の設定では、１０匹の魚がいる３７リットルの
水槽で、アンモニア濃度は菌株の添加なしでは７ｍｇ／Ｌ以上に達し得、これに対して菌
株を添加することによって最大レベルを約２ｍｇ／Ｌまで低下させることができる。通常
、本発明の菌株をこのような系へ添加する場合、最大アンモニア濃度が３ｍｇ／Ｌを超え
るとは予想されない。系が定常状態に達すると、アンモニアのレベルは０．５ｍｇ／Ｌ未
満まで戻り、本発明の菌株があればこの過程はより急速になる。
【００４１】
本発明の１つの実施形態では、本発明の菌株を、限定はしないが淡水水槽、塩水水槽お
よび廃水のような媒体へ直接導入する。本発明の別の実施形態では、細菌を回転生物接触
法で増殖させて、その後、媒体へ導入してもよい。異なる実施形態では、本発明の細菌は
、媒体中に存在するバイオフィルターユニットに導入できる。別の実施形態では、本発明
の細菌を、限定はしないがアクリルアミド、アルギン酸塩またはカラギナンのような固定
化ポリマー中に固定してもよい。次いでこの細菌入り（ｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｌａｃｅｄ
）ポリマー物質をフィルター中に導入してもよいし、またはそれ自体を適切な装備の濾液
流中に導入してもよい。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「水槽（ａｑｕａｒｉｕｍ）」という用語は、水を保持
しかつその中で水生生物（例えば魚類、植物、細菌および無脊椎動物）が生存する容器で
あって、限定はしないがガラス、プラスチックもしくは木材を組み合わせてまたはそれ自
体で作成され得る容器ならびにその内容物を意味する。水槽は、水生生物体の展示、短時
間または長時間の保持、科学的調査、輸送および他の目的を意図してもよい。淡水水槽は
一般的に、液体媒体が１０００分の１５部未満の塩度を有する水槽である。塩水水槽は一
般的に、液体媒体が１０００分の１５部を超える塩度を有する水槽である。「水槽の水（
ａｑｕａｒｉｕｍ  ｗａｔｅｒ）」という用語を用いて、中に水槽生物体が生息している
水槽およびそれに付随したフィルターシステム中に含まれる媒体のことをいう。水槽水は
広い範囲の無機または有機化学物質を含有してよく、従って、幾つか例を挙げれば塩濃度
、ｐＨ、全溶解固体、および温度のようなパラメーターとして広範囲を有してもよい。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「廃水（ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ）」とは一般的に、工業
的または人為的な過程の産物である液体媒体を意味する。廃水は１回以上の濾過法による
処理で環境に害が少ない状態にし、これによって政府機関の規定した廃棄規準を満たす必
要があるかもしれない。廃水はまた、環境に廃棄されないようにリサイクルされてもよい
。
【００４４】
本明細書において用いる場合、「生物学的フィルター（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｉｌｔ
ｅｒ）」は、「バイオフィルター（ｂｉｏｆｉｌｔｅｒ）」とも称され、これは、一般的
に、その目的が微生物の増殖を促進することであるかまたは微生物の付着および増殖のた
めの基板を提供することであるようなタイプのフィルターを意味する。バイオフィルター
は水槽の濾過系または廃水濾過系の一部であってよい。本明細書において用いる場合、「
回転生物接触法（ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｔａｃｔｏｒ）」と
いう用語は、一般的に、水中または媒体中で回転するある種類のバイオフィルターを意味
する。これは水または媒体中に完全にまたは部分的に浸漬されてもよい。当業者は、あた
かも完全に記載されているかのように本明細書において参考として各々が援用される、米
国特許第２，０８５，２１７号；同第２，１７２，０６７号；同第５，４２３，９７８号
；同第５，４１９，８３１号；同第５，６７９，２５３号；同第５，７７９，８８５号、
および全ての継続出願、改良出願および対応する外国出願において具現化されているもの
として回転生物接触法を認識する。
【００４５】
本明細書において用いる場合、「フィルターフロス（ｆｉｌｔｅｒ  ｆｌｏｓｓ）」と
は、バイオフィルター、機械的フィルターまたはそれらの組み合わせとして機能し得る、
不規則な形状をした天然または合成のマルチストランド（ｍｕｌｔｉ−ｓｔｒａｎｄｅｄ
）物質を意味する。
【００４６】
本明細書において用いる場合、「水槽用砂利（ａｑｕａｒｉｕｍ  ｇｒａｖｅｌ）」と
は、水槽の内部の底に通常敷かれている物質を意味する。それは、岩、サンゴ、プラスチ
ックまたは他の物質の不規則なまたな規則的な形状の破片から構成されてもよい。それは
バイオフィルター、機械的フィルターとして、装飾目的で、またはそれらの組み合わせと
して機能し得る。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「フィルタースポンジ（ｆｉｌｔｅｒ  ｓｐｏｎｇｅ）
」という用語は、水槽中で使用されるかまたは水槽濾過システムの一部として使用される
場合に、機械的フィルターまたはバイオフィルターまたはその両方として機能し得る天然
または合成の物質を意味する。
【００４８】
本明細書において用いる場合、「プラスチックフィルター媒体（ｐｌａｓｔｉｃ  ｆｉ
ｌｔｅｒ  ｍｅｄｉａ）」とは、バイオフィルター、機械的フィルターまたはその両方と
して機能する人工の物質を意味する。これはプラスチック成形されても、または注入成形
されてもよい。
【００４９】
別の実施形態では、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８
、配列番号１９もしくは配列番号２０のヌクレオチド配列、または配列番号１、配列番号
２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９もしくは配列番号２０に対し
て少なくとも９６％類似、少なくとも９７％類似、少なくとも９８％類似もしくは少なく
とも９９％類似であるその改変体を有する核酸配列および配列を有する細菌も提供される
。
【００５０】
別の実施形態では、媒体に存在する本発明の細菌の量を検出および測定するためのヌク
レオチドプローブが提供される。このプローブは、配列番号５、配列番号８および配列番
号２１に記載されるヌクレオチド配列を有する。本発明のヌクレオチドプローブは当該分
野で公知の方法によって合成できる。
【００５１】
本発明のヌクレオチドプローブは、検出可能な任意の標識で標識されてもよい。好適な
標識の例としては、放射線標識、蛍光標識などが挙げられるがこれらに限定されない。適
切な標識物質は市販されており、当業者に公知である。オリゴヌクレオチドまたはポリヌ
クレオチドの標識法はまた、当業者に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．
Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ
−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎ
ｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００５２】
本発明のヌクレオチドプローブは、本発明の菌株の１６Ｓ  ｒＤＮＡとハイブリダイズ
し得る。従って、本発明のヌクレオチドプローブは、本発明の細菌の量を検出および測定
するための方法における使用に十分適している。
【００５３】
本発明の１局面では、媒体中でアンモニアを亜硝酸塩へ酸化できる細菌の量を検出およ
び測定するための方法が提供されるが、ここでこの細菌の１６Ｓ  ｒＤＮＡは配列番号１
、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２
０のヌクレオチド配列を有する。この方法は：
（ａ）本発明の検出可能な標識プローブを提供する工程と；
（ｂ）媒体から総ＤＮＡを単離する工程と；
（ｃ）このプローブがこの細菌の核酸とのみハイブリダイズする条件下で、この単離し
た総ＤＮＡを検出可能な標識プローブに対して曝露する工程であって、ここで、この細菌
の１６Ｓ  ｒＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１
８、配列番号１９または配列番号２０のヌクレオチド配列を有する工程と；
（ｄ）細菌の量を検出および測定するためにハイブリダイズしたプローブを検出および
測定する工程と；
を包含し得る。
【００５４】
本発明のプローブは、配列番号５、配列番号８および配列番号２１によって表される。
上述のプローブのいずれかの全長にわたって少なくとも９６％類似性である配列を用いて
、本発明の細菌を検出することができる。これらのプローブは以下の実施例にさらに記載
される。
【００５５】
媒体は水槽水であってよく、そこからＤＮＡを単離する。媒体はまた水槽用砂利、スポ
ンジ・フィルター物質、フィルターフロス、またはプラスチックフィルター媒体のような
物質を含んでもよいが、これに限定されるものではない。従って、ＤＮＡは、そのような
細菌が存在すると予想され得る上記のおよび他の供給源から単離できる。
【００５６】
本発明の方法は、ＤＮＡチップまたは当業者に公知の同様のツールと組み合わせて行な
うことができる。ＤＮＡチップは、固体キャリア、および共有結合によってこの固体キャ
リアに固定されたヌクレオチド誘導体またはそれらのアナログの群を含んでもよい。ＤＮ
Ａチップを用いた核酸フラグメントの検出は一般に、検出されるべき核酸フラグメントに
相補的なプローブオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーションによって行なわ
れる。このプローブオリゴヌクレオチドは一般にこの固体キャリア（例えば固体基板）に
固定される。この検出過程では、サンプル液体中の核酸フラグメントは、蛍光標識または
放射性同位体標識を備えてもよく、次いでサンプル液体はＤＮＡチップのプローブオリゴ
ヌクレオチドと接触されてもよい。サンプル液体中のこの標識された核酸フラグメントが
プローブオリゴヌクレオチドに対して相補的である場合、この標識された核酸フラグメン
トは、ハイブリダイゼーションによってこのプローブオリゴヌクレオチドと組み合わされ
る。次いで、このプローブオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによってＤＮ
Ａチップに固定されたこの標識された核酸フラグメントは、適切な検出方法によって、例
えば、蛍光またはオートラジオグラフィーによって、検出され得るが、他の検出方法が利
用されてもよい。
【００５７】
この方法は代替的には、当業者によって容易に認識され、慣用的な実験によって行なわ
れる広範な種々の自動的なプロセスと組み合わせて行なわれてもよい。例えば、本発明の
方法は、いくつかの一般的な方法論であるＤＮＡまたはタンパク質のマイクロアレイ、バ
イオセンサー、バイオプローブ、キャピラリー電気泳動およびリアルタイムＰＣＲで行な
うことができる；しかしこの列挙が全てを包括するわけではないということは当業者によ
って容易に理解される。
【００５８】
本発明の検出方法は、媒体中でアンモニアを亜硝酸塩に酸化し得る細菌の存在をモニタ
ーおよび検出するための有効なツールを提供する。この方法によってまた、本発明の細菌
の存在または量を測定することにより、市販の添加物を確認して、この添加物の有効性を
確認するためのツールが提供される。
【００５９】
別の実施形態では、本発明の細菌および核酸配列を検出するために用いられ得るＰＣＲ
プライマーが提供される。このプライマー対は、配列番号６および配列番号７、配列番号
９および配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２および配列番号２２および配列
番号２３によって表される。前述のＰＣＲプライマーのいずれかの全長にわたって少なく
とも９６％類似である配列を用いてまた、本発明の細菌を検出することができる。これら
のＰＣＲプライマーは以下の実施例においてさらに記載される。
【００６０】
本発明の細菌および核酸配列を検出するために依然として用いられ得る前述のオリゴヌ
クレオチドプローブおよびＰＣＲプライマーの改変体は、本発明の範囲内であることが当
業者には容易に理解される。例えば、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失または置換に起
因して配列番号５、配列番号８、配列番号２１、配列番号６、配列番号７、配列番号９、
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、または配列番号２３とは異
なり、ただし本発明の細菌および核酸配列を検出するために依然として用いられ得る、任
意のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーの改変体は、本発明に包含される。
【００６１】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番
号１９および配列番号２０として本明細書において同定される配列、またはそれらの配列
の改変体を含む、単離された細菌、単離された菌株、細菌培養物およびヌクレオチド配列
を包含する。特に好ましい改変体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４
、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０に対して高い程度の類似性を有する改
変体である。本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１
８、配列番号１９または配列番号２０に対して少なくとも９６％類似、少なくとも９７％
類似、少なくとも９８％類似または少なくとも９９％類似である改変体を含む。参照配列
（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号
１９または配列番号２０）を作成および使用する方法はまた、当業者に対して所望の改変
体を作成および使用する方法を教示するのに十分であるということが当該分野では理解さ
れる。
【００６２】
亜硝酸酸化細菌、この細菌を用いる方法およびこの細菌を検出する用法を記載する３つ
の同一出願人による特許が米国で発行されている（米国特許第６，２０７，４４０号、同
第６，２６５，２０６号および同第６，２６８，１５４号を参照のこと）。３つ全ての特
許が、あるヌクレオチド配列およびその配列に対して９６．１％より大きい相同性を有す
る任意の改変体を記載する。これらの特許の刊行物は、４つの特定の配列を設定し特定の
改変体を記載する明細書によって当業者がこの配列およびその記載された改変体を作成お
よび使用できるようになるということを実証する。さらに、ヌクレオチド配列を開示する
特許はまた、それらの配列の改変体を開示および請求することが当該分野では一般的であ
る（例えば、米国特許第６，４６５，６２１号、同第６，５０９，１７０号および同第６
，５７３，０６６号を参照のこと）。
【００６３】
特定のヌクレオチド配列の改変体は、天然に存在する多形性または合成の配列変更であ
ってもよい（例えば、米国特許第６，４８５，９３８号を参照のこと）。天然および合成
の両方のヌクレオチド配列に対する多様な種々の修飾は、合成改変体を作成するための方
法とともに当該分野で一般的かつ周知である（例えば、米国特許第６，４４８，０４４号
および同第６，５０９，１７０号を参照のこと）。２つ以上のヌクレオチド配列の類似性
を比較するための方法は当該分野で周知である。同様の配列はしばしばＢＥＳＴＦＩＴお
よびＢＬＡＳＴのようなコンピュータープログラムを用いて同定されている（例えば、米
国特許第６，４６１，８３６号を参照のこと）。さらに、ハイブリダイゼーションを用い
て、改変体配列と参照配列との間の類似性を検出してもよい（例えば、米国特許第６，５
７３，０６６号を参照のこと）。従って、当業者は、公知の技術を用いることによって、
参照配列の改変体であるヌクレオチド配列を容易に合成および同定することができる。従
って、ヌクレオチド配列およびその改変体を記載する明細書によって、当業者はその配列
およびその改変体を作成および使用することが可能になる。
【実施例】
【００６４】
（実施例）
一連のアッセイおよび実験を、本明細書に報告される菌株を単離し、同定し、そしてそ
の菌株の有効性を示すために行なった。それらは、種々の細菌培養技術、培養のサンプル
から抽出したＤＮＡの分子生物学的分析、菌株の分子生物学的分析、および菌株の濃縮培
養物を水槽へ与えることによってアンモニア濃度を調整する能力を測定することを含む。
【００６５】
（実施例１  細菌培養）
細菌培養容器（リアクターと称する）を構築して、使用中の水槽から収集した細菌バイ
オマスを播種した。各リアクターに、５０ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、５０ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、１
８．７５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．２５ｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏおよび１ｇ  Ｆ
ｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含有する無機塩溶液（蒸留水中で製造する）の４．９５Ｌを入れた
。溶存酸素が７．５ｍｇ／Ｌ以上になるように空気を送り、攪拌して、このリアクターを
約２８℃で暗いキャビネット中に放置した。
【００６６】
塩水環境における本発明のＡＯＢの株を単離および培養するために、３０〜３３ｐｐｔ
の塩濃度になるまで、合成の海塩（ＩＮＳＴＡＮＴ  ＯＣＥＡＮ，Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ）を添加した。
【００６７】
アンモニアおよび亜硝酸塩濃度を、電極（Ｄｅｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍ
ｏｄｅｌ  ２２５  ｐＨ／ＩＳＥメーターおよび付属のｐＨ／ＡＴＣ電極）を用いてｐＨ
を測定しながら、フロー・インジェクション分析（ＦＩＡ，Ｔｅｃａｔｏｒ  ＦＩＡＳｔ
ａｒ５０１０システム）を用いて毎日測定した。硝酸塩および伝導度を定期的に測定し、
水の交換をすべきかを決定する際にこのデータを用いた。細菌バイオマスは本質的にまさ
に綿状であるので、細菌バイオマスは水の交換中もリアクターに保持された。従って、適
当なサンプリングポートを介してリアクターの容積の５０％をデカントする前に、空気を
除きかつ装置を１時間攪拌することにより、バイオマスを沈降させる。さらに、リアクタ
ーを定期的にこすって表面からバイオマスを除き、それによってバイオマスを懸濁液に戻
す。さらなる分析のためのＤＮＡ抽出（ＰＣＲ用）および細胞固定（ＦＩＳＨ用）のため
に、微生物サンプルをルーチン的に回収した。
【００６８】
（実施例２  核酸のサンプリングおよび抽出）
ＤＮＡ抽出のために、適当な生物学的濾過媒体のサンプルを回収し、細胞溶解緩衝液（
４０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３）中に再懸濁した。サン
プルを、抽出を行うまで−２０℃または−７４℃で貯蔵した。処理に際し、最終濃度が１
０ｍｇ／ｍｌとなるようにリゾチームをサンプルへ添加した。３７℃で９０分インキュベ
ートした後、２０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が１％になるように
添加した。次いでこのサンプルを４回の凍結／解凍サイクルに供して、その後プロテイナ
ーゼＫ（貯蔵濃度、１０ｍｇ／ｍｌ）を最終濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、７
０℃で３５分インキュベートした。時には、さらにプロテイナーゼ−ＫおよびＳＤＳを添
加し、そしてサンプルを５５℃でさらに３０分インキュベートした。
【００６９】
細胞溶解後に、Ｅａｓｙ  ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  
Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ；本明細書においてこれ以降では「Ｑｉａｇｅｎ」）を用いてＤＮ
Ａを抽出した。ＤＮＡを５０μｌ容積まで溶出させ、Ｈｏｅｃｈｓｔタイプ３３２５８染
料の結合および蛍光測定（ＤｙｎａＱｕａｎｔ  ２００，Ｈｏｅｆｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により定量した
。
【００７０】
（実施例３  ＰＣＲ増幅ｒＲＮＡ遺伝子のクローンライブラリー）
クローンライブラリーはリアクターおよび水槽から回収したバイオマスサンプルからの
ＤＮＡ抽出物に由来する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号
１８および配列番号２０という配列によって表される細菌由来の細菌リボゾームＲＮＡ遺
伝子フラグメントを、プライマーＳ−Ｄ−Ｂａｃｔ−００１１−ａ−Ｓ−１７（８ｆ；Ｇ
ＴＴ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＣＴＣ  ＡＧ）（配列番号１３）および１４９２ｒ（真
性細菌；ＧＧＴ  ＴＡＣ  ＣＴＴ  ＧＴＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  Ｔ）（配列番号１４）を用
いて増幅した。ＰＣＲ条件、サイクルパラメーター、および反応成分はこれまでに記載の
とおりであった（ＤｅＬｏｎｇ，Ｅ．Ｆ．１９９２．Ａｒｃｈａｅａ  ｉｎ  ｃｏａｓｔ
ａｌ  ｍａｒｉｎｅ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ  ８９：５６８５〜５６８９）。ＰＣＲ生成物をアガロース・ゲル電気泳動に
より評価した。ＴＥ緩衝液でリンスし、ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ濃縮装置（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉ
ｎｃ．Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で３０μｌまで濃縮した後、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット
（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示書に記載
のとおり、ＰＣＲフラグメントをクローニングした。
【００７１】
（実施例４  配列決定および系統学的分析）
クローンライブラリーを含む各クローン由来の１６Ｓ  ｒＤＮＡ挿入物を、１６Ｓ  ｒ
ＤＮＡ挿入物が増幅可能であることを確認して、１６Ｓ  ｒＤＮＡが、ＨａｅＩＩＩ酵素
で切断される場合に特殊なＲＥＡパターンを保有するかどうかを決定するために、制限酵
素ＨａｅＩＩＩを用いて、制限酵素分析（ＲＥＡ）によりスクリーニングした。クローン
が増幅可能で、特殊なＲＥＡパターンを有するならば、目的の１６Ｓ  ｒＤＮＡ挿入物を
含むクローンのプラスミドを部分的に配列決定した。配列決定のために選択された、各ク
ローンの増幅ＰＣＲ１６Ｓ  ｒＤＮＡテンプレートを、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎキット  カタログ番号２８１４２（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて清浄した。配列決定はＬｉ
Ｃｏｒ  ４０００Ｌ自動ＤＮＡシークエンサーを用いて、テンプレートに関して実施し、
蛍光標識プライマーおよびＳＥＱＵＩＴＨＥＲＭ  ＥＸＣＥＬ  ＩＩ  ＤＮＡ  配列決定
キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用
いてサイクルシーケンシング（ｃｙｃｌｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ）した。
【００７２】
同一のＲＥＡパターンである２または３種のクローンまでを部分的に配列決定して、そ
れらが同一であることを確認した。多くのクローンを完全に配列決定して、ＰＡＵＰ（Ｐ
ｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ  ｖｅｒ
４．０ｂ２ａ，Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ）（ブーストラップ値および距離分析）、Ａ
ＲＢ（Ａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄ
ａｔｅ，Ｗ．Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  Ｏ．Ｓｔｒｕｎｋ）（系統樹）およびＰｈｙｌｉｐ
（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｊ．Ｆｅｌｓｅｎｔｅｉ
ｎ）（類型マトリクス）により系統的に分析した。クローンライブラリーに由来する目的
のクローンのためのプライマーおよびプローブを、ＡＲＢプローブデザインおよびプロー
ブマッチプログラム（ｐｒｏｂｅ  ｍａｔｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）ならびにアフターマ
ニュアルアラインメント（ａｆｔｅｒ  ｍａｎｕａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を使用して
発展させた。プライマーおよびプローブをＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０．
Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｏｏｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１
５：４０３〜４１０）で二重にチェックした。プライマーの特異性は、それをクローン由
来のＤＮＡ抽出物および公知の細菌の純培養物に用いることによって決定した。プローブ
の特異性を、公知の細菌の純培養物およびリアクター由来のサンプルを用いて試験した。
【００７３】
（実施例５  ＤＧＧＥ分析およびプロファイリング）
一般的な真性細菌ＤＧＧＥ分析のため、Ｍｕｒｒａｙ等が記載するように（Ｍｕｒｒａ
ｙら、１９９６．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｐｌａｎｋｔｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｗｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｅｓｔｕａｒ
ｉｅｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｂｙ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  
ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ａｐ
ｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：２６７６〜２６８０）、５’末端に
４０ｂｐのＧＣクランプを有するフォワード３５８ｆ（真性細菌；ＣＣＴ  ＡＣＧ  ＧＧ
Ａ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＡＧ）（配列番号１５）およびリバースプライマーＳ−＊−Ｕｎｉ
ｖ−０５１９−ａ−Ａ−１８（５１９ｒ：ＧＷＡ  ＴＴＡ  ＣＣＧ  ＣＧＧ  ＣＫＧ  Ｃ
ＴＧ）（配列番号１６）を用いてｒＤＮＡフラグメントを増幅した。特異的なＡＯＢ  Ｄ
ＧＧＥ分析のために、５’末端に４０ｂｐのＧＣクランプを有するフォワードプライマー
３５８ｆ（配列番号１５）をリバースプライマーＳ−＊−Ｎｔｒｏｓ−０６３９−ａ−Ａ
−２０（Ｎｉｔｒｏｓｏ４ｅ：ＣＡＣ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＹＴＴ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＴＣ
）（配列番号１７）とともに使用した。ＰＣＲ条件は同一であり、ＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ
ＧＲＡＤＩＥＮＴ  ９６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）上で、Ｔ
ＡＱ  ＰＣＲコアキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて実施した。ＰＣＲ条件はホットスター
ト（８０℃）およびタッチダウン手順を含んだ。最初の変性を９４℃で３分実施した後、
９４℃で１分変性し、タッチダウン・アニーリングを６５℃から５５℃で１分２９秒実施
し（タッチダウン中、１サイクル毎に１．４秒ずつアニーリング時間を延長した）、プラ
イマー伸長を７２℃で５６秒実施した（サイクル毎に１．４秒ずつ伸長時間を延長する）
。上記の熱サイクルの最後の温度系列を全部で２０サイクル繰り返し、その後７２℃で５
分、最後の伸長を行う。アンプリコンをアガロース・ゲル電気泳動により調査した。ＤＧ
ＧＥをＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｄ−ＧＥＮＥ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ；本明細書において以降では「Ｂｉｏ−Ｒａｄ」）
を用いて行なった。ゲルは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ試薬（Ｄ  ＧＥＮＥ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ
ｒｅｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，Ｂｉｏ  Ｒａｄ）を用いた８．５％のアクリルア
ミド／Ｂｉｓであった。２０〜６０％の変性勾配（１００％の変性は４０％の脱イオン化
ホルムアミドと７Ｍ  尿素との混合物である）を有するＢｉｏ−Ｒａｄ試薬（Ｄ  ＧＥＮ
Ｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，Ｂｉｏ  Ｒａｄ）およ
びＢｉｏ−Ｒａｄ勾配送達システム（Ｍｏｄｅｌ  ４７５，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、
ゲル勾配をかける。全てのゲルを２００ボルトで６時間泳動した。ゲルを二元の片方で可
視化した。分離したＤＮＡバンドの可視化および回収のために、ゲルを最初に、１００μ
ｌの臭化エチジウム（１ｍｇ／ｍｌ）を添加した２５０ｍｌの１×ＴＡＥ緩衝液中で１０
分染色し、次いで１×ＴＡＥ緩衝液で１０分洗浄した。考察目的で、いくつかのゲルをＶ
ｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎ（１：１０，０００希釈）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉ
ｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ；本明細書において以降では「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄ
ｙｎａｍｉｃｓ」）で２０分染色し、続いて１×ＴＡＥ緩衝液で２０分洗浄し、次いでＦ
ＬＵＯＲＩＭＡＧＥＲ  ＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）でスキャンした
。
【００７４】
個々のバンドをアルコール滅菌したメスを用いてＤＧＧＥゲルから切り出した。ゲルか
らのＤＮＡの切り出しはＦｅｒｒｉｓらの方法に従った（Ｍ．Ｊ．Ｆｅｒｒｉｓら  １９
９６．Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓ
ｉｓ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉ
ｏｎ  ｉｎｈａｂｉｔｉｎｇ  ａ  ｈｏｔ  ｓｐｒｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｍａｔ
ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：３４０
〜３４６）。切り出したバンドを５００μｌの滅菌脱イオン水の入った滅菌の２ｍｌのス
クリューキャップチューブに入れた。このチューブは半分がガラス・ビーズ（カタログ番
号１１０７９−１０１、Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｂａｒｔｌｅｓ
ｖｉｌｌｅ，ＯＫ；本明細書において以降では「Ｂｉｏｓｐｅｃ」）で満たされ、最も高
い設定で３分間、機械的なビーズビーター（ＭＩＮＩ−ＢＥＡＤＢＥＡＴＥＲ−８，Ｂｉ
ｏｓｐｅｃ）に入れた。処理したＤＮＡを４℃で一晩チューブ中に放置した。一晩貯蔵し
た後、このチューブを３，２００×ｇで、４℃で８分遠心分離し、ゲルフラグメントを濃
縮した。上清を清浄なエッペンドルフチューブに移した。
【００７５】
抽出効率を確認するために、この上清をＤＧＧＥプライマーで再増幅し、ＤＧＧＥによ
って再分析した。混合した集団サンプル中で元のＤＧＧＥバンドと同時に移動する単一バ
ンドがＤＧＧＥ分析で生じた場合に、抽出を許容し得るとみなした。切り出したバンドの
ヌクレオチド配列は、先に記載した方法によって、蛍光標識プライマーを用いて配列決定
した。
【００７６】
（実施例６  オリゴヌクレオチドプローブの開発）
オリゴヌクレオチドプローブは、本研究において、リアクターに由来する密接に関係し
た細菌から単離された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列と特異的にハイブリダイズするように
設計した。１つのプローブ（Ｓ−Ｇ−Ｎｓｓｐａ−０１４９−ａ−Ａ−１８）（配列番号
５）は、配列番号３および配列番号４の配列によって表される配列を含む他のβ亜門Ｐｒ
ｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌアンモニア酸化細菌でもなく、配列番号１８、配列番号１９
および配列番号２０によって表されるＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ様
細菌でもなく、配列番号１および配列番号２の配列によって表される、２つのリアクター
由来Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ様細菌を標的としている。
【００７７】
第２のプローブ（Ｓ−Ｇ−Ｎｓｓｐａ−０１４９−ａ−Ａ−１９）（配列番号８）は、
配列番号１、配列番号２、配列番号４ならびに他のβ亜門Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ
ｌアンモニア酸化細菌ではなく、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０によっ
て表されるＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ様細菌でもなく、配列番号３
の配列によって表される、１つの、リアクター由来Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ様細菌を標
的としている。
【００７８】
本研究においてリアクター由来の他の細菌から単離された１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子と特
異的にハイブリダイズするさらなるオリゴヌクレオチドプローブを設計した。１つのプロ
ーブ、Ｓ−Ｇ−Ｎｔｓｍｓ−０１４９−ａ−Ａ−１８）（配列番号２１）は、配列番号１
、配列番号２、配列番号３、配列番号４によって表される他のＡＯＢ配列、ならびにｈａ
ｌｏｐｈｉｌｉａ様細菌由来の配列ではなく、配列番号１８、配列番号１９および配列番
号２０の配列によって表されるＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ様細菌を
標的としている。
【００７９】
プローブのマッチングを最初にＢＬＡＳＴ（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０．
Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｏｏｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１
５：４０３〜４１０）およびＣＨＥＣＫ＿ＰＲＯＢＥ（Ｂ．Ｌ．Ｍａｉｄａｋら、１９９
４．Ｔｈｅ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｐｒｏｊｅｃｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：３４８５〜３４８７）を用いてスクリーニングした。プロ
ーブは、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）により合成した。
プローブのヌクレオチド配列および位置を表１０に示す。
【００８０】
表１０：
アンモニア酸化細菌のためのオリゴヌクレオチドプローブおよびＰＣＲプライマーセッ
トのヌクレオチド配列および位置
【００８１】
【表８】
2010057494.tif 000009
プローブ（配列番号５、配列番号８および配列番号２１）のストリンジェンシーは、リ
アクターバイオマスを本明細書の細菌配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列
番号４、配列番号１８、配列番号１９または配列番号２０）の陽性コントロールとして用
いて、種々のホルムアミド濃度での一連のＦＩＳＨ実験によって確認した。プローブの特
異性は、他のベータ亜門アンモニア酸化細菌（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａ
ｅａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ
ｃｒｙｏｔｏｌｅｒａｎｓ）の純培養物の陰性コントロール細胞に対して試験すること
により検証した。固定し固定化した細胞のインサイチュハイブリダイゼーションを、０．
９Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．０１％ドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）、２５ｎｇ  オリゴヌクレオチドプローブおよび種々の量のホルム
アミドから構成されるハイブリダイゼーション溶液中で行なった。スライドを、平衡化し
た湿度のチャンバ中で、４６℃で、９０〜１２０分インキュベートした。ハイブリダイゼ
ーション溶液を予め加熱（４８℃）した洗浄溶液で洗い流した。次に、スライドを洗浄溶
液中で、４８℃で１５分インキュベートした。洗浄工程の間に、ハイブリダイゼーション
工程と同様のストリンジェンシーを得るために、洗浄溶液には２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）、０．０１％  ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよびＮａＣｌを含んだ。Ｎ
ａＣｌの濃度は、溶液で使用するホルムアルデヒドの割合に応じて変化した。２０％ホル
ムアルデヒドではＮａＣｌ濃度は２１５ｍＭであり、３０％では１２０ｍＭであり、４０
％ではＮａＣｌ濃度は４６ｍＭであった。細胞は、ＦＩＴＣ／ＦＬＵＯ３およびＨＱ  Ｃ
Ｙ３のフィルターセットを装備したＡＸＩＯＳＫＯＰ  ２表面蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚ
ｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて検出した。最適のストリンジェンシーは
、Ｓ−Ｇ−Ｎｓｓｐａ−０１４９−ａ−Ａ−１８プローブについては３０％ホルムアミド
であると確認された。Ｓ−Ｇ−Ｎｓｓｐａ−０１４９−ａ−Ａ−１９プローブについては
、最適のストリンジェンシーは２０％ホルムアミドであると確認された。最適のストリン
ジェンシーは、配列番号２１によって表されるプローブについて２０％ホルムアミドであ
ると確認されて、配列番号２４によって表されるプローブについては２０％ホルムアムド
であると確認された。
【００８２】
（実施例７  ＰＣＲプライマーの開発）
本発明の配列のＮｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ様細菌を特異的に検出する２セットのＰＣＲ
プライマーを開発した。本発明の配列のＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ様細菌を特異的に検出
する第３セットのＰＣＲプライマーを開発した。第１セット（配列番号６および配列番号
７）は、他のアンモニア酸化細菌ではなく、配列番号１および配列番号２を有するＮｉｔ
ｒｏｓｏｓｐｉｒａ様細菌を特異的に検出する（表１１）。第２セット（配列番号９およ
び配列番号１０）は、他のアンモニア酸化細菌ではなく、配列番号３を有するＮｉｔｒｏ
ｓｏｓｐｉｒａ様細菌を特異的に検出する（表１１）。第３のセット（配列番号１１およ
び配列番号１２）は、他のアンモニア酸化細菌ではなく、配列番号４を有するＮｉｔｒｏ
ｓｏｍｏｎａｓ様細菌を特異的に検出する（表１１）。
【００８３】
第４のセット（配列番号２２および配列番号２３）は、他のアンモニア酸化細菌ではな
く、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０を有するＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ
ａｅｓｔｕａｒｉｉ様細菌を特異的に検出する。ＰＣＲ条件はアニーリング温度が変え
られた以外、前記した通りであった。
【００８４】
表１１Ａ：
開発されたＰＣＲプライマーの特異性試験およびアニーリング温度実験の結果
【００８５】
【表９】
2010057494.tif 000010
表１１Ｂ：
開発されたＰＣＲプライマーの特異性試験およびアニーリング温度実験の結果
【００８６】
【表１０】
2010057494.tif 000011
各々のプライマーセットの特異性は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲの
温度勾配モードを用い各プライマーセットを用いるＰＣＲ実験を実施することにより最適
化された。このモードでは、１２種類までの種々のアニーリング温度を用いた全ての反応
を１回の実験で実施できる。代表的には、２℃ずつの間隔で上昇させた４〜６種類の異な
る温度で実験を行なった。各ＰＣＲプライマーセットを、配列番号１、配列番号２、配列
番号３、配列番号４、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０のヌクレオチド配
列を有するクローン生成物に対して試験した。Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａ
ｅａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｌｏｂｕｓ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓおよびＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎ
ａｓ  ｃｒｙｏｔｏｌｅｒａｎｓの純培養物から抽出したｒＤＮＡも試験した。表１０に
ＰＣＲプライマーセットを提示しており、最適のアニーリング温度の結果を表１１に示す
。
【００８７】
（実施例８  類似性分析）
亜硝酸塩へのアンモニアの酸化を担うアンモニア酸化因子（単数または複数）の同一性
を決定するために、多数の淡水および塩水の硝化バイオマスから１３個のクローンライブ
ラリーを構築した。このバイオマスの詳細は表１２に表す。
【００８８】
表１２：
バイオマスを抽出してクローンライブラリーを構築したリアクターおよび水槽について
の詳細。
【００８９】
【表１１】
2010057494.tif 000012
このクローンライブラリーデータによって、低アンモニア供給リアクター（例えばＲ３
、Ｒ７）に存在する３群のアンモニア酸化細菌の存在が示される。しかし、あらゆるリア
クターに３種全部のＡＯＢタイプが見出されたのではない。３種の細菌は３種のＡＯＢク
ローン群−ＡＯＢタイプＡ（配列番号１）（およびサブタイプＡ１（配列番号２））、お
よびＡＯＢタイプＢ（配列番号３）により表される。４種目のクローンタイプは、高アン
モニア供給リアクターで見出され、ＡＯＢタイプＣ（配列番号４）であった。
【００９０】
類似性のランク付けを４種のクローン配列についてＲＤＰを用いて行なった（Ｍａｉｄ
ａｋ，Ｂ．Ｌ．、Ｊ．Ｒ．Ｃｏｌｅ、Ｃ．Ｔ．Ｐａｒｋｅｒ、Ｊｒ，Ｇ．Ｍ．Ｇａｒｒｉ
ｔｙ、Ｎ．Ｌａｒｓｅｎ、Ｂ．Ｌｉ，Ｔ．Ｇ．Ｌｉｌｂｕｒｎ、Ｍ．Ｊ．ＭｃＣａｕｇｈ
ｅｙ、Ｇ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ、Ｒ．Ｏｖｅｒｂｅｅｋ、Ｓ．Ｐｒａｍａｎｉｋ、Ｔ．Ｍ．Ｓ
ｃｈｍｉｄｔ、Ｊ．Ｍ．ＴｉｅｄｊｅおよびＣ．Ｒ．Ｗｏｅｓｅ．Ａ  ｎｅｗ  ｖｅｒｓ
ｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＤＰ（Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｐｒｏｆｅｃ
ｔ）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：１７１〜１７３（１９９９））（表
８）。類似性分析により、ＡＯＢタイプＡ（配列番号１）およびタイプＡ１（配列番号２
）が９９．６％類似することが示された。このことは、タイプＡ（配列番号１）のタイプ
配列とタイプＡ１（配列番号２）のタイプ配列との間で、１６Ｓ  ｒＤＮＡに５個のミス
マッチが存在するということを示した１６Ｓ  ｒＤＮＡデータとも一致する。この類似性
分析から、タイプＡおよびＡ１配列がＮｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａまたはＮｉｔｒｏｓｏｍ
ｏｎａｓ分岐のいずれの公知ＡＯＢとも大きく異なっていることが分かった（表１３）。
この結果は、さらに、ＡＯＢタイプＡ（配列番号１）およびタイプＡ１（配列番号２）ク
ラスターが共に、ＮｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａまたはＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ分岐のいず
れとも異なる群であることを示すブートストラップ分析によって支持される（図１）。従
って、ＡＯＢタイプＡ（配列番号１）およびタイプＡ１（配列番号２）で表される細菌は
少なくとも新規な種である。
【００９１】
表１３：
リアクターおよび水槽から単離されたアンモニア酸化クローンに関する類似性のランク
付け
【００９２】
【表１２−１】
2010057494.tif 000013
【００９３】
【表１２−２】
2010057494.tif 000014
ＡＯＢタイプＢ（配列番号３）の類似性分析によって、この細菌がＡＯＢのＮｉｔｒｏ
ｓｏｓｐｉｒａ分岐におさまることが示される（表１３）。ブートストラップ分析によっ
てこの結果が確証される（図１）。しかし、この生物体は最も近縁のＮｉｔｒｏｓｏｓｐ
ｉｒａ  ＡＯＢ（Ｎｉｔｒｏｓｏｖｉｂｒｉｏ  ｔｅｎｕｉｓ）とは全く異なっており、
新種と見なされてもよい。
【００９４】
ＡＯＢタイプＣ（配列番号４）の類似性分析によって、この細菌がＡＯＢのＮｉｔｒｏ
ｓｏｍｏｎａｓ分岐におさまることが示される（表１３）。ブートストラップ分析によっ
てこの結果が確証される（図１）。しかし、この生物体は最も近縁のＮｉｔｒｏｓｏｍｏ
ｎａｓ  ＡＯＢ（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ）とは全く異なっており
、新種と見なしてもよい。
【００９５】
Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ様である、本発明者らが単離した塩水
耐性ＡＯＢの類似性分析によって、Ｐ４ｃ３１（配列番号１９）がＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎ
ａｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉに対して９８．３％類似性であること、およびクローンＰ４Ｃ
４２（配列番号１８）がＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉに対して９７．
７％類似性であることが明らかになる。系統学的分析によってクローンＰ４Ｃ４２（配列
番号１８）およびＰ４ｃ３１（配列番号１９）によって表される配列の特異性が実証され
る（図６）。
【００９６】
表１３に示した類似性のランク付けは、お互いに対する菌株の特異性を決定するのに役
立つ。どの程度の割合で新種とみなすかについて、強固でかつ確たる規則はない。しかし
、０．９８９の類似性ランクを有するＮｉｔｒｏｓｏｌｏｂｕｓ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉ
ｓおよびＮｉｔｒｏｓｏｖｉｂｒｉｏ  ｔｅｎｕｉｓは、あらゆる微生物の権威から異種
であると認識されており、Ｎｉｔｒｏｓｏｌｏｂｕｓ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓおよびＮ
ｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ  ｂｒｉｅｎｓｉｓ（類似性ランク０．９８０）も同様である。
本明細書で報告される菌株の類似性の値は、上記の種の対についての値よりも高くなく、
このことは本明細書の株が新規かつ特殊なものであることをさらに立証している。
【００９７】
従って、クローンデータ、ＰＣＲの結果、系統学的分析、ＤＧＧＥデータおよび類似性
のランク付けという全体から、本明細書で報告される菌株が特殊であり、公知のアンモニ
ア酸化細菌とは異なることが実証される。さらに、本明細書に記載するようなミクロ（ま
たは特殊化された）環境での付加的な研究が、本明細書に報告される株に関連したさらな
るＡＯＢの発見をもたらすことを本発明者らは期待する。
【００９８】
（実施例９  細菌の分析および実験結果）
タイプＡのＡＯＢ（配列番号１および配列番号２）のクローンのメンバーは、ＢＦ１６
バイオマス（クローンライブラリーの９％）およびＢＣ５バイオマス（クローンライブラ
リーの１〜２％）の両方で見出された（図２）。ＢＣ５バイオマスを用いて低濃度アンモ
ニアリアクター（Ｒ１）に播種し、これをＲ７を播種するのに使用した。タイプＡのＡＯ
Ｂクローン（配列番号１および配列番号２）（クローンライブラリーの７％）のみを含有
するＲ７バイオマスからＲ７クローンライブラリーを生成した（図２）。これによって、
タイプＡのＡＯＢ細菌は淡水バイオファームからＢＣ５タンクへ、次いでＲ１リアクター
を介してＲ７リアクターへ、首尾よく継代培養された。これによって、細菌の良好な培養
能力、および本明細書の配列を有するＡＯＢの生存可能な培養の維持能力が実証される。
さらに、この細菌の割合がＢＣ５クローンライブラリーでの１〜２％からＲ７ライブラリ
ーでの７％に増加することから、タイプＡのＡＯＢを選択的に富化させる能力についても
実証される。
【００９９】
外面的には、３つのシステム（バイオファーム１６、ＢＣ５タンクおよびＲ７リアクタ
ー）の操作は全く異なっていると思われる（表１２を参照のこと）。しかし、これらの系
には、タイプＡのＡＯＢの存在を説明できる共通の物理化学的条件が存在する。バイオフ
ァームは最初高濃度のアンモニアを供給されるが、これはある期間でアンモニア濃度が低
レベルに低下され（５ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎを下回る）、従ってタイプＡ細菌はこのシス
テムに留まることが可能であり、極めて低いアンモニア濃度（＜５ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ
）で増殖できる特殊な生理学的ニッチが開拓される。同様に、ＢＣ５タンクおよびＲ７リ
アクターでは、いずれもアンモニアを５ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ以下のレベルで供給し、か
つ維持した。タイプＡのＡＯＢ細菌は５ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎを上回るアンモニア濃度で
存在できるが、高濃度のアンモニアでは、他のタイプのＡＯＢによって競合排除されるこ
とが明らかであり（すなわち、タイプＢ（配列番号３）および／またはタイプＣ（配列番
号４））、これは、アンモニア濃度が高く維持されているリアクター中でのこれらのタイ
プのＡＯＢの存在およびタイプＡのＡＯＢの非存在によって証明される（表１４）（図２
）。
【０１００】
Ｒ７バイオマスは、細菌添加試験ＶＩ（ＢＡ６）およびＶＩＩ（ＢＡ７）（以下に考察
）において特に良好であり、同じ播種（Ｒ１）を用いた同一の形態で増殖されたバイオマ
ス（Ｒ１９）も細菌添加試験ＶＩＩＩ（ＢＡ８）（Ｒ１９）で同様であった。タイプＡの
ＡＯＢが、特異的タイプＡのＡＯＢ  ＰＣＲおよびＦＩＳＨ試験により、多数のリアクタ
ーおよび多数のＰｏｓｔ  ＢＡ試験バイオマスの両方で見出されている（表１４）（図２
）。
【０１０１】
従って、タイプＡのＡＯＢ（配列番号１）およびタイプＡ１（配列番号２）というこれ
らの２種の新規に発見された細菌が、水槽等の低アンモニア濃度環境で優勢であり；そし
てそれらは、天然に存在するよりも生成された状態でこのような環境に添加された場合、
このような環境中でのアンモニア酸化の確立を促進できる（以下に考察）。
【０１０２】
ＢＣタンク（ＢＣ５）へ播種するために用いた淡水バイオファームバイオマス（例えば
クローンライブラリーのＢＦ１６〜３４％）中で、タイプＢのクローンのメンバーが見出
された。タイプＢのＡＯＢ細菌は、ＢＣ５およびＲ７クローンライブラリーに存在せず、
このことは、これらのＡＯＢが高アンモニア濃条件およびバイオファームの供給法にさら
に適し得ることを示している（図２）。タイプＢのＡＯＢはまた、Ｒ３クローンライブラ
リーでも見出された（クローンライブラリーの１９％）（図２）。Ｒ３リアクターの変遷
は、そのバイオマスを最初に高アンモニア濃度（３０００ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ）におい
て富化させ、１１ヶ月貯蔵し、次いで、低アンモニア濃度（５ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ）で
このリアクターを長期間熟成させるというものであった。最初の培養期間中、アンモニア
濃度は期間を通して低下するようであり−従って、タイプＡのＡＯＢよりもタイプＣおよ
び／またはタイプＢのＡＯＢの増殖がより助長された。１１ヶ月の貯蔵の間にアンモニア
が消費されて、タイプＢのＡＯＢ細菌のこの系における維持および、培養期間中に生き延
びた残留するタイプＡのＡＯＢの生存を潜在的に後押しするようであった。最後に、リア
クターの成熟期において、タイプＢのＡＯＢ細菌は維持されることが可能であり、タイプ
ＡのＡＯＢは富化されて、最初の培養期にもともと選択された残留するタイプＣは競合排
除されて消滅した。
【０１０３】
相対的に、バイオファームのバイオマスは、設定期間中、比較的高濃度のアンモニアを
供給され、次いで経時的にアンモニアを徐々に消費し、高濃度から低濃度へのアンモニア
濃度の勾配を生じ（タイプＢのＡＯＢの増殖を助長）、しばしばゼロに達して、これによ
ってタイプＡのＡＯＢの増殖ウィンドウ−低アンモニア濃度が得られる。これはＲ３バイ
オマスの培養期よりも速度の速いサイクル（日）であるが、バイオマス中での高濃度から
低濃度へのアンモニア濃度条件の変化とやはり一致している。従って、バイオファームの
バイオマスでのアンモニア濃度の勾配は、ＡＯＢタイプの富化範囲を助長し、このことは
クローンライブラリーのデータおよびＤＧＧＥ試験の結果から裏付けられる。
【０１０４】
タイプＢのＡＯＢは、多数のリアクターおよび多数のＰｏｓｔＢＡ試験バイオマスの両
方で、特異的タイプＢのＡＯＢ  ＰＣＲ、ＤＧＧＥおよびＦＩＳＨにより見出されている
。しかし、このタイプＢのＡＯＢは、多くの細菌添加試験後またはクローンライブラリー
では、タイプＡのＡＯＢほどは見られなかった（表１４）。タイプＡのＡＯＢを試験に接
種すると多くの場合に回復されるが、タイプＢのＡＯＢは、タイプＡのＡＯＢが接種物に
もともと存在しない系でのみ回復したようであった。従って、タイプＡのＡＯＢは、それ
らが存在する系では優先的に増殖するが、タイプＢのＡＯＢはタイプＡのＡＯＢが不在な
場合に満足であった。
【０１０５】
タイプＡのＡＯＢは、水槽のような低アンモニア環境について好ましいＡＯＢ硝化群生
の最も重要なメンバーであるが、それらは、存在する唯一のＡＯＢではない。他のＡＯＢ
、例えばタイプＢ（配列番号３）は、たとえ短期間（日）であっても効率的にアンモニア
の濃度を変動させるためにこの系に必要であり得る。
【０１０６】
タイプＣのＡＯＢは、水槽で見られる典型的な低アンモニア濃度のための細菌添加物中
のＡＯＢとしては所望のものではない。タイプＣのＡＯＢ細菌が低濃度アンモニウム環境
であるＢＦ１６、ＢＣ５またはＲ７のクローンライブラリーでは見られなかったことによ
って、タイプＣのＡＯＢ細菌がこれらの３つの環境において見出される条件とは異なる条
件下で増殖したであろうということが示された（図２）。タイプＣ細菌は、Ｒ５、Ｒ３お
よびＲ１７のクローンライブラリーで見出された（図２）。Ｒ５バイオマスは高濃度（３
０ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ）では一貫して増殖し、その播種物は極めて高いアンモニア濃度
に由来し（＞５００ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ）、Ｒ３’のバイオマスは低アンモニア濃度（
５ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ）に変化される前に高アンモニア濃度で最初に増殖されて、Ｒ１
７バイオマスは低濃度（５ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ）から高アンモニア濃度（３０ｍｇ／Ｌ
ＮＨ３−Ｎ）へ変化されて、その後再度戻されたものである。
【０１０７】
Ｒ５バイオマスは、Ｒ５リアクターへ移行される前でも長期間、高アンモニア濃度に富
化されており、アンモニア濃度がフィード・マイクロフィルター中で低レベルには決して
低下しないことから、タイプＡのＡＯＢ細菌の増殖は事実上、起こらない。バイオマスが
Ｒ５へ移されて、アンモニアの濃度が低レベルへ低下される場合、タイプＢのＡＯＢが富
化されてこの培養中で優勢なＡＯＢとなった。タイプＣ細菌は、最初にマイクロフィルタ
ー中で富化されて、次いで比較的高いアンモニア濃度（３０ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ）で供
給が維持された場合にＲ５バイオマス中に残存した細菌を代表する。
【０１０８】
Ｒ３バイオマスは最初に高アンモニア濃度で増殖されているが、経時的にアンモニアが
消費されていく。この方法ではまずタイプＣのＡＯＢ（高アンモニア濃度において）およ
びタイプＢのＡＯＢ（アンモニアが利用されたので）の増殖が助長される。さらにこれら
の圧力によって、常に低レベルのアンモニアに依存するタイプＡのＡＯＢの富化は許され
ない。Ｒ３リアクターの低アンモニウム濃度での稼動中に、タイプＣのＡＯＢ細菌はこれ
に対抗して富化され、タイプＢもまだ生存しているが、タイプＡのＡＯＢ細菌は最初の富
化で当初から最小化されていたので、リアクター内の新しい条件を利用できるものはごく
僅かしか残らない。従って、タイプＢのＡＯＢがこの環境で優勢なＡＯＢであると予想さ
れる。
【０１０９】
Ｒ１７バイオマスによって、タイプＡおよび／またはタイプＢのＡＯＢを培養するのに
必要でないものが代表的には示される。Ｒ１７バイオマスはＲ７バイオマスに由来するが
、これを３週間、高アンモニア濃度（３０ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ）で培養し、細菌群生の
シフトが起こるか否かを観察した。ＦＩＳＨ、ＰＣＲおよびＤＧＧＥ実験の結果により実
証されたとおり、あるシフトが生じ、タイプＣのＡＯＢが優勢となった。さらに、このシ
フトは不可逆的であった。バイオマスを低アンモニア濃度（５ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎ）環
境に戻した後、タイプＣのＡＯＢはまだ優勢なＡＯＢであったが、これに対してタイプＡ
およびタイプＢのＡＯＢはＦＩＳＨまたはＤＧＧＥのいずれでも検出されなかった。これ
によって３週間の間にタイプＡ  およびＢのＡＯＢがＲ１７バイオマスから排除されたこ
とが示唆される。Ｒ１７バイオマスが続くＢＡ  ＶＩＩＩ試験で好ましくない結果であっ
たことによって、タイプＣのＡＯＢが、水槽の比較的低いアンモニア状況で用いられるべ
き効果的な細菌添加物に必要とされる、好適なＡＯＢタイプでないことが示唆される。こ
の結果はさらに、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ分岐ＡＯＢを含む既存の市販されている細菌
混合物が水槽中での硝化の確立を加速するには効果的でないことを示す細菌添加試験の結
果からも支持される（以下に考察）。
【０１１０】
タイプＣ  細菌は、ほぼ３０ｍｇ／Ｌ  ＮＨ３−Ｎのアンモニア濃度を供給されている
排水処理施設中で見出されている（Ｒ５に類似の）細菌と系統分類的に極めて密接に関連
している。
【０１１１】
本明細書に記載されるＰＣＲプライマーセットを用いて、種々の環境でここに報告され
ているＡＯＢ株の有無を検出した。この環境としては、細菌添加試験前の混合物、細菌添
加試験後の水槽フィルター、および他の会社から製造販売されている硝化細菌の市販の混
合物が挙げられる。さらに、他のＡＯＢの純培養物から抽出したＤＮＡを試験した。
【０１１２】
これらの実験の結果を表１４に要約した。このデータによって、ＰＣＲプライマー群が
本明細書に報告した菌株に特異的であり、他の株ではなく、それぞれの株を検出できるこ
とが示される。さらに、公知のＡＯＢ純培養物は、本明細書に報告したいずれのＰＣＲプ
ライマーセットでも増幅しない。これによって、本明細書で報告される細菌が公知のＡＯ
Ｂと識別できることが実証される。
【０１１３】
このデータによってまた、近年市場に出回っている市販の添加物は好適な種の細菌を含
有していないために、新規に設定された水槽での硝化の確立を促進できないと当業者に思
われていることが示される（さらに詳細には以下の節に述べる）。
【０１１４】
（実施例１０  クローンおよびリアクターの変性勾配ゲル電気泳動調査）
本明細書に報告される種々の菌株の新規性は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）試験
の結果からさらに実証される。図３は、タイプＡのＡＯＢ（配列番号１）、タイプＡ１の
ＡＯＢ（配列番号２）、タイプＢのＡＯＢ（配列番号３）、およびタイプＣのＡＯＢ（配
列番号４）の各々について一般的な真正細菌ＤＧＧＥにおける、それぞれ２クローンずつ
のＤＧＧＥの結果を示すものである。本明細書に記載される各ＡＯＢタイプの細菌配列は
、ゲルの異なる位置で変性される。これは独自性を示しており、その他のＡＯＢから、ま
たは公知のＡＯＢからも各々のＡＯＢタイプを識別する別の方法を提供する。上記の細菌
配列はいずれもＮｉｔｏｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉ
ｒａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｉｓおよびＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｃｒｙｏｔｏｌｅｒａ
ｎｓと一緒に移動することはなかった（図３）。さらに、種々のリアクターから抽出され
たバイオマスのＤＧＧＥ分析によって、ＰＣＲおよびＦＩＳＨ試験の結果が確証された。
【０１１５】
図７は、ＤＧＧＥの結果を提示するが、これは本発明の種々のＡＯＢ株をさらに識別す
る。Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ様クローンＰ４ｃ４２およびＰ４ｃ
３１に相当するバンド（配列番号１８および１９）は、タイプＡのＡＯＢ（配列番号１）
、タイプＢのＡＯＢ（配列番号３）、タイプＣのＡＯＢ（配列番号４）というＡＯＢの株
、ならびにＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ａｅｓｔｕａｒｉｉ様クローンＢＦ１６ｃ５７（
配列番号２０）に相当するバンドとは同時に泳動しなかった。これらの株のうちＮｉｔｏ
ｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａ、Ｎｉｔｒｏｓｏｓｐｉｒａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒ
ｍｉｓまたはＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｃｒｙｏｔｏｌｅｒａｎｓと一緒に移動したも
のはなかった（図７）。
【０１１６】
（実施例１１  細菌添加試験）
一連の実験を行って、本発明の菌株を含有する種々の細菌混合物の有効性を、１）混合
物を供給されなかったコントロールの水槽、２）熱帯魚水槽用に細菌混合物を接種した水
槽、および３）本発明の菌株の保持または貯蔵した細菌混合物：と比較して決定した。
【０１１７】
本発明のアンモニア酸化菌株が水槽のアンモニアを酸化すること、およびさらに、他の
菌株（例えば、亜硝酸酸化菌株）と組み合わせた場合にこの細菌が水槽での硝化の確立を
加速することが示されることによって、混合物の効果が実証される。硝化の確立は少なく
とも３種の方法で測定できる。第１の方法は、新しい水槽を設定した後、水槽水のアンモ
ニアおよび亜硝酸塩の濃度が０ｍｇ／Ｌ濃度に到達するまでにかかる日数を計数するもの
である。新規に設定した淡水水槽において、代表的には、アンモニア濃度が０ｍｇ／Ｌに
なるには約１４日かかり、亜硝酸塩が０ｍｇ／Ｌになるには約３０〜３５日かかる。
【０１１８】
水槽へ添加した硝化菌株の有益な作用を測定する第２の方法は、０ｍｇ／Ｌまで濃度が
低下する前に到達したアンモニアまたは亜硝酸塩の最大濃度を比較するものである。硝化
細菌を添加した水槽で達するアンモニアまたは亜硝酸塩の最大濃度がコントロール水槽で
達する最大濃度よりもかなり低いならば、ある程度の有効性が実証される。
【０１１９】
そこに組み込まれる硝化菌株および混合物の効果を評価する第３の方法は、最初の２つ
の方法を組み合わせて毒性曝露曲線を形成することである。このタイプの曲線によって、
曝露の期間（日数）および程度／強度の両方が説明される。本発明の実施形態によれば、
この曲線は、毒素の濃度を経時的にプロットすることによって作成される。次いでこの曲
線の面積は、標準的なコンピューター計算による方法によって（例えばこの曲線を数学的
に積分することによって）各々の処理および毒素について決定され得る。次いで各々の試
験の処理をお互いに対して、および同じ試験のコントロールに対して比較する。コントロ
ールの曲線面積を任意値１として、その後に他の面積をこのコントロール面積に対する比
として算出してもよい。このように、ある処理の値が１を上回る場合はコントロールより
も有効であり、逆に１を下回る値ではその処理がコントロールよりも有効でないことが示
唆され、これは硝化の確立を阻害しているのかもしれない。
【０１２０】
（実施例１２  細菌添加試験ＶＩ）
この試験の目的は、本明細書の菌株を含む４種の細菌混合物が淡水水槽中の硝化確立を
促進する能力を評価することであった。この試験はまた、本発明の菌株およびいかなる種
類の細菌接種もしなかったコントロールの水相の間で硝化を確立する能力を比較するため
に行なった。
【０１２１】
２７個の１０ガロン水槽および２７個のＰｅｎｇｕｉｎ  １７０Ｂ（Ｍａｒｉｎｅｌａ
ｎｄ  Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ハングオンザバック（ｈａｎｇ−ｏｎ−ｔ
ｈｅ−ｂａｃｋ）形式のパワー・フィルターを滅菌し、しっかりとリンスし、空気乾燥さ
せた。次にリンスした水槽用砂利（ＲＭＣ  Ｌｏｎｅｓｔａｒ＃３）１０ｌｂｓを各々の
水槽に充填し、フィルターを取り付けた。次いで、活性炭を通して濾過した水道水３５ｌ
をこの水槽に導入した。フィルターを取り付けた後に、各水槽の水位を印付け、蒸発およ
びサンプリングで失われる水を考慮して脱イオン水（ＤＩ）で全ての水槽を満たした。細
菌添加物および魚類を添加する前にフィルターを一晩稼動させた。
【０１２２】
試験０日目に、水槽をＤＩ水で満たし、ベースラインの水のサンプルを分析用に採取し
た。カーボンカートリッジ（Ｍａｒｉｎｅｌａｎｄ  Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．ＰＡ  ０１３３）を水道水でリンスして、各フィルターに配置した
。新しいＢＩＯＷＨＥＥＬＳ（Ｍａｒｉｎｅｌａｎｄ  Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．ＰＲ  １９３５Ｂ）を各フィルターに配置した。３０分後、各タ
ンクに、それぞれ計画した細菌添加物を接種するか、またはタンクがコントロール水槽の
場合には細菌混合物を導入しなかった。
【０１２３】
実験用細菌添加物を添加した３０分後、第二のセットの水のサンプルを分析用に採取し
た。次いで、５匹のロージーバルブ（Ｐｕｎｔｉｕｓ  ｃｏｎｃｈｏｎｉｕｓ）および１
匹のジャイアントダニオ（Ｄａｎｉｏ  ａｅｑｕｉｐｉｎｎａｔｕｓ）を各タンクへ加え
た。魚には、日に２回に分けて、約０．４ｇの熱帯魚フレークスピリットを与えた（ほぼ
午前９：００および午後４：３０に）。
【０１２４】
水サンプルを収集して、毎日、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩および伝導度について分析
して試験した。月曜日、水曜日、および金曜日に水を硝酸塩および濁度について試験した
。陰イオンおよび陽イオンを周期的に測定した。ｐＨの測定を、Ｄｅｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔ
ｒｕｍｅｎｔｓ  ｐＨ組み合わせ電極を装備したＤｅｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ
Ｍｏｄｅｌ  ２２５  ｐＨ／Ｉｏｎメーターを用いて行った。Ｔｅｃａｔｏｒ  ＦＩＡ
ｓｔａｒ  ５０１０  Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、Ｔｅｃａｔｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ  Ｎｏｔｅｓに記載の方法を用いて、アンモニア、亜硝酸塩、および硝酸塩（すなわち
窒素）を測定した。陽イオン（ナトリウム、アンモニウム−窒素、カリウム、マグネシウ
ム、およびカルシウム）を、ＣＳ１５  ４−ｍｍ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｌｕｍｎ
を備えたＤｉｏｎｅｘ  ＤＸ５００  Ｓｙｓｔｅｍを用いて分析した。ＹＳＩ  Ｍｏｄｅ
ｌ  ３０の携帯型の塩濃度、伝導率、および温度のシステムを用いて、毎日、ほぼ午後１
２：３０頃に各タンクで直接、比伝導率を測定した。濁度データは、ＤＲＴ−１００濁度
メーター（ＨＦ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。
【０１２５】
この試験では４種の細菌混合物を用い、各処理において２つの投与レベルを行なった：
各水槽あたり混合物３０ｍｌまたは１００ｍｌのいずれか。各々の混合／用量の組み合わ
せの３つの複製を、細菌混合物を導入していない３つのコントロール水槽とともに試験し
た；試験水槽は全部で２７個であった（すなわち（４×２×３）＋３＝２７）。種々の細
菌混合物についての条件は以下のとおりであった：
１）ＢＣ５  −  試験前に５５３日培養した細菌混合物。この混合物の陽性の結果によ
って、培養条件下での細菌の長期生存性および培養技術の適正性が示される；
２）Ｒｔｒ３  −  試験前に１１８日暗野でビン詰めして保管した細菌混合物。この混
合物の陽性の結果によって、この貯蔵法が有効であることおよびこの混合物が少なくとも
貯蔵下に１１９日その生存度を保持するということが示される；
３）Ｒｔｒ４  −  試験前に１１８日暗野で瓶詰めして保管した細菌混合物。この混合
物の陽性の結果によって、この貯蔵法が有効であることおよびこの混合物が少なくとも貯
蔵下に１１９日その生存度を保持することが示される；
４）Ｒｔｒ７  −  ＢＣ５からの接種物を増殖させた細菌混合物。この混合物の陽性の
結果によって、連続継代の混合物中で細菌集合体を培養可能であり、その生存が維持され
ることが示される。
【０１２６】
この試験は２３日間継続し、この終わりには水槽中のアンモニアおよび亜硝酸塩の濃度
は実質的に０ｍｇ／Ｌであった。種々の水槽についてのアンモニアおよび亜硝酸塩の平均
最高濃度、ならびにその水槽について０ｍｇ／Ｌ濃度に到達するまでに要する時間の間に
は大きな相違があった。細菌混合物の間の他の相違を表１１に示す。
【０１２７】
表１４：アンモニア酸化菌株の検出
【０１２８】
【表１３】
2010057494.tif 000015
＋＋＋非常に強い存在、高い量の標的生物をはっきりと示す。
＋＋強い存在、シグナルの有意の検出を示す。
＋明確な存在、シグナル検出。
−／−可能性のある存在、シグナルは弱いが、バックグラウンド以上。
−存在／シグナル検出せず。
【０１２９】
表１５：細菌添加試験ＶＩの結果
【０１３０】
【表１４】
2010057494.tif 000016
図４は、４種混合物とコントロールとの試験期間を通してのアンモニアおよび亜硝酸塩
の濃度の平均を示す。ＢＣ５混合物については、アンモニアは、ＢＣ５混合物を１００ｍ
ｌ供給した水槽で８日目に、そしてＢＣ５混合物を３０ｍｌ供給した水槽で１０日目に０
ｍｇ／Ｌに達した。コントロール水槽のアンモニア濃度は１２日まで０ｍｇ／ｌに達しな
かった。コントロール水槽で到達する最大平均アンモニア濃度は４．９ｍｇ／Ｌであった
。しかし、ＢＣ５細菌混合物３０ｍｌを供給した水槽では、平均最大アンモニア濃度は４
．１ｍｇ／Ｌであって、一方、ＢＣ５細菌混合物１００ｍｌを供給した水槽では平均最大
アンモニア濃度が２．４ｍｇ／Ｌであった。従って、ＢＣ５細菌混合物の新規に設定した
水槽への添加によって、魚類へのアンモニアの暴露を低下させる結果となった。
【０１３１】
３０ｍｌまたは１００ｍｌのＢＣ５混合物を供給した水槽のアンモニア曝露曲線面積の
値は、コントロール水槽曲線面積値のそれぞれ６７％および３７％であった（表１６）；
処理水槽における魚類に対するアンモニアの曝露は、それぞれ１．５および２．７分の１
に低下。
【０１３２】
表１６：細菌添加ＶＩ試験の毒性曝露データ
【０１３３】
【表１５】
2010057494.tif 000017
亜硝酸塩の濃度は、１００ｍｌのＢＣ５混合物を供給した水槽では１８日までに、３０
ｍｌのＢＣ５混合物を供給した水槽では２１日までに、そしてコントロール水槽では２３
日までに０ｍｇ／Ｌに達した。コントロール水槽は１３．４ｍｇ／Ｌの平均最大亜硝酸塩
コントロールに達したが、３０ｍｌのＢＣ５混合物を供給した水槽は最大平均亜硝酸塩濃
度が８．９ｍｇ／Ｌであって１００ｍｌのＢＣ５混合物を供給した水槽はわずか４．５ｍ
ｇ／Ｌの最大亜硝酸塩濃度を示した（表１５；図４）。
【０１３４】
３０ｍｌまたは１００ｍｌのＢＣ５混合物を供給した水槽の亜硝酸塩曝露曲線面積の値
は、コントロール水槽曲線面積値の、それぞれ、７５％および３３％であった（表１６）
；処理水槽における魚類に対する亜硝酸塩の曝露は、それぞれ１．３および３．１分の１
に低下。
【０１３５】
１１８日間貯蔵した細菌混合物Ｒｔｒ３を含む水槽は、コントロール水槽よりも急速に
硝化を確立した。３０ｍｌまたは１００ｍｌのＲｔｒ３混合物を供給した水槽の平均最大
アンモニア濃度は、それぞれ、３．１ｍｇ／Ｌおよび１．９ｍｇ／Ｌであった（表１５）
。対照的に、コントロールの水槽は、４．９ｍｇ／Ｌという平均最大アンモニア濃度を示
した。コントロール水槽では１２日後に０ｍｇ／Ｌのアンモニア濃度に達したが、Ｒｔｒ
３細菌混合物を３０ｍまたは１００ｍｌ供給した水槽では０ｍｇ／Ｌに達するのにそれぞ
れ、わずか９日および７日しか要さなかった（表１５）。
【０１３６】
コントロール水槽では、平均最大亜硝酸塩濃度が１３．４ｍｇ／Ｌであったが、Ｒｔｒ
３細菌混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽では、平均最大亜硝酸塩濃度はそ
れぞれ、わずか５．９ｍｇ／Ｌおよび３．４ｍｇ／Ｌであった。コントロール水槽は２３
日で０ｍｇ／Ｌの亜硝酸塩濃度に達するのに対して、Ｒｔｒ３細菌混合物を３０ｍｌまた
は１００ｍｌ供給した水槽では、それぞれわずか１５日および１１日後に、０ｍｇ／Ｌに
到達した（表１５）。
【０１３７】
Ｒｔｒ３混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽のアンモニア曝露面積曲線値
は、コントロール水槽曲線面積の値に対して、それぞれ４５％および２６％であった（表
１５）；処理水槽における魚類に対するアンモニアの曝露は、それぞれ２．２および３．
９分の１に低下。
【０１３８】
Ｒｔｒ３混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽の亜硝酸塩曝露曲線面積の値
は、コントロール水槽の曲線面積の値の、それぞれ、２８％および１１％であった（表１
５）；処理水槽における魚類に対する亜硝酸塩の曝露は、それぞれ３．６および８．８分
の１に低下。
【０１３９】
Ｒｔｒ４混合物を供給した水槽では、３０ｍｌおよび１００ｍｌの供給容積で、それぞ
れ、平均最大アンモニア濃度は２．９ｍｇ／Ｌおよび２．７ｍｇ／Ｌであった（表１５）
が、コントロール水槽は、４．９ｍｇ／Ｌの平均最大アンモニア濃度に達した。Ｒｔｒ４
混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽のアンモニア曝露曲線面積の値は、コン
トロール水槽の曲線面積の値のそれぞれ４５％および３８％であった。これらの値によっ
て、コントロール水槽と比較して処理水槽での魚類に対するアンモニアの曝露が、混合物
の添加により、それぞれ２．２および２．７分の１に低下したことが示される（表１５）
。Ｒｔｒ４混合物を３０ｍｌ供給した水槽は、１０日で硝化サイクルを完了したが、Ｒｔ
ｒ４混合物を１００ｍｌ供給した水槽では８日で硝化が確立した（表１５）。コントロー
ル水槽では硝化は２３日で確立された。
【０１４０】
Ｒｔｒ４細菌混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽では、平均最大亜硝酸塩
濃度は、それぞれ２．１ｍｇ／Ｌおよび０．６ｍｇ／Ｌであった。コントロール水槽は１
３．４ｍｇ／Ｌの平均最大亜硝酸塩濃度を有した。
【０１４１】
Ｒｔｒ４混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌを供給した水槽での亜硝酸塩曝露曲線面積
値は、コントロール水槽の曲線面積値の、それぞれ５％および２％であった；処理水槽に
おける魚類に対する亜硝酸塩の曝露は、それぞれ２０．２および６０．９分の１に低下（
図４；表１５）。
【０１４２】
ＢＣ５混合物由来の継代培養物である細菌混合物Ｒｔｒ７によって、コントロール水槽
と比較した場合、硝化確立が有意に早いことが実証された。コントロール水槽では０ｍｇ
／Ｌのアンモニア濃度に達するのに１２日を要するが、Ｒｔｒ７細菌混合物を３０ｍｌま
たは１００ｍｌ供給した水槽では、それぞれわずか７日および６日しか要しない（表１５
）。Ｒ７混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽の平均最大アンモニア濃度は、
それぞれ１．９ｍｇ／Ｌおよび１．１ｍｇ／Ｌであった。これは、４．９ｍｇ／Ｌの平均
最大アンモニア濃度を有するコントロール水槽とは対照的である（表１５）。
【０１４３】
亜硝酸塩濃度は、コントロール水槽で、１３．４ｍｇ／Ｌの平均最大濃度に達し、これ
に対して、Ｒｔｒ７細菌混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽では、平均最大
亜硝酸塩濃度は、それぞれわずか３．７ｍｇ／Ｌおよび１．４ｍｇ／Ｌであった（表１５
）。コントロール水槽は２３日で０ｍｇ／Ｌの亜硝酸塩濃度に到達したが、Ｒｔｒ７細菌
混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽では、０ｍｇ／Ｌに達するのにそれぞれ
わずか１０日および７日しか要さなかった（表１５；図４）。
【０１４４】
Ｒｔｒ７混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽のアンモニア曝露曲線面積の
値は、コントロール水槽曲線面積値の、それぞれ２８％および１７％であった（表１５）
；処理水槽における魚類に対するアンモニアの曝露は、それぞれ３．６および５．７分の
１に低下。
【０１４５】
Ｒｔｒ７混合物を３０ｍｌまたは１００ｍｌ供給した水槽の亜硝酸塩曝露曲線面積の値
は、コントロール水槽曲線面積の値の、それぞれ１０％および４％であった；処理水槽に
おける魚類に対する亜硝酸塩の曝露は、それぞれ５．７および２５．５分の１に低下（表
１５）。
【０１４６】
まとめると、この試験からのデータによって、本発明の種々の細菌混合物が、水槽の硝
化の確立を加速することが示される。これらの混合物の水槽中での使用によって、魚類に
対するアンモニアおよび亜硝酸塩の曝露の程度は有意に低下した。この結果によってさら
に、長時間にわたって混合物が生存維持され得ること（例えば、ＢＣ５）、この混合物が
数ヶ月貯蔵可能であること（例えばＲｔｒ３およびＲｔｒ４）、ならびにこの混合物の継
代培養物が硝化能を保持していること（例えばＲｔｒ７）が実証される。
【０１４７】
（実施例１３  細菌添加試験ＶＩＩ）
この試験の目的は、本発明の菌株の２種混合物を、「現実世界（ｒｅａｌ  ｗｏｒｌｄ
）」の設定で行われ得るように評価し、このとき市販の細菌混合物の能力に対してそれら
の能力を比較することであった。
【０１４８】
一般的に、新しい水槽の持ち主は最初に水生生物を維持できる水槽を据え付けるのに必
要な装具を購入する。この装具としては、水槽自体、装飾、ヒーターおよびフィルター、
ならびに水質調節剤を挙げることができる。次いで、水槽を組み立てて、水で満たし、フ
ィルターを稼動開始して、ヒーターを適当な水温に調節して、水質調節剤を添加して塩素
を除く。この時点で魚を通常加えるが、水槽のアンモニアおよび亜硝酸塩の濃度を生物学
的に安全な（すなわち非毒性の）濃度（例えば、０．５ｍｇ／Ｌ−Ｎ未満）に保つには存
在するアンモニア酸化細菌および亜硝酸酸化細菌の群が不十分であるかもしれない。従っ
て、新規に設定する水槽は一般に「ニュータンクシンドローム」（ｎｅｗ  ｔａｎｋ  ｓ
ｙｎｄｒｏｍｅ）と称される事態（すなわち、安全なアンモニアおよび亜硝酸塩の濃度を
維持するのに存在する硝化細菌の数が十分でない場合、この設定した新しい水槽の最初の
数週間にアンモニアおよび亜硝酸塩の濃度が上昇）を表すこととなる。
【０１４９】
少なくとも部分的にニュータンクシンドロームを軽減するために、微生物または酵素の
混合物（すなわち、細菌混合物）を購入してこの新しい水槽に導入して、ニュータンクシ
ンドロームを促進するかまたはある場合には軽減してもよい。理論的には、瓶詰めの混合
物を導入すると、このような混合物がない場合よりも、最初の数週間にこの水槽中のアン
モニアおよび亜硝酸塩の濃度が相対的に低くなるはずである。また、アンモニアおよび亜
硝酸塩の濃度が０ｍｇ／Ｌに達するまでに要する時間は短縮されるはずである。
【０１５０】
３３個の１０ガロン水槽および３３個のＰｅｎｇｕｉｎ  １７０Ｂ（Ｍａｒｉｎｅｌａ
ｎｄ  Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ハングオンザバック形式のパワー・フィル
ターを滅菌し、しっかりとリンスし、空気乾燥させた。リンスした１０ｌｂｓの水槽用砂
利（ＲＭＣ  Ｌｏｎｅｓｔａｒ＃３）を各水槽へ充填し、フィルターを裏側に取り付けた
。次に、活性炭を通して事前に濾過した水道水３５Ｌで各々の水槽を満たし、各水槽の水
位を印付けた。この印は、蒸発およびサンプリングのせいで失われる水を考慮して水槽の
水を満たす必要がある場合、指針として利用される。水槽を満たすのに脱イオン水を用い
た。細菌添加物および魚類を添加する前にフィルターを一晩稼動させた。
【０１５１】
試験初日に、水およびベースラインの水サンプルを考慮して水槽を脱イオン水で満たし
た。カーボンカートリッジ（Ｍａｒｉｎｅｌａｎｄ  Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ，Ｐａｒｔ  Ｎｏ．ＰＡ  ０１３３）を水道水でリンスし、各フィルターに設置した。
新しいＢＩＯＷＨＥＥＬＳ（Ｍａｒｉｎｅｌａｎｄ  Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ，Ｐａｒｔ  ＮＯ．ＰＲ  １９３５Ｂ）を各フィルターに設置した。３０分後、各タン
クに、それぞれ計画した細菌添加物を投与した。投与量は表１７に記載した。細菌添加物
を添加した３０分後に、第２セットの水サンプルを分析用に採取した。次いで、６匹の雑
多なバルブ（ｂａｒｂ）［（Ｐｕｎｔｉｕｓ  ｃｏｎｃｈｏｎｉｕｓ）ロージーバルブ；
（Ｐｕｎｔｉｕｎ  ｔｅｔｒａｚｏｎａ）アルビノタイガーバルブおよびタイガーバルブ
］を各タンクへ添加した。水槽中の魚には、日に２回（ほぼ午前９：００および午後４：
３０）、１日あたり全部で約０．４ｇの熱帯魚用フレークを与えた。
【０１５２】
水サンプルを回収し、毎日、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩および伝導率を分析して試験
した。月曜日、水曜日、および金曜日に水を亜硝酸塩および濁度について試験した。陰イ
オンおよび陽イオンを周期的に測定した。ｐＨの測定を、Ｄｅｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔｓ  ｐＨ組み合わせ電極を装備したＤｅｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏ
ｄｅｌ  ２２５  ｐＨ／Ｉｏｎメーターを用いて行った。Ｔｅｃａｔｏｒ  ＦＩＡｓｔａ
ｒ  ５０１０  Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、Ｔｅｃａｔｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎ
ｏｔｅｓに記載の方法を用いてアンモニア、亜硝酸塩および硝酸塩（窒素として）を測定
した。陽イオン（ナトリウム、アンモニウム−窒素、カリウム、マグネシウム、およびカ
ルシウム）を、ＣＳ１５  ４−ｍｍ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｌｕｍｎを備えたＤｉ
ｏｎｅｘ  ＤＸ５００  Ｓｙｓｔｅｍを用いて分析した。ＹＳＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３０携帯
型の塩分、伝導率および温度のシステムを用いて、毎日、午後１２：３０頃に各タンクで
直接、比伝導率を測定した。濁度のデータは、ＤＲＴ−１００濁度メーター（ＨＦ  Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した。
【０１５３】
本発明の菌株を含む２種の配合物を、４つの市販の細菌混合物と共に試験した。試験の
初日に、第１配合物（Ｒｔｒ５）１００ｍｌを４個の水槽の各々に添加し、第２配合物（
Ｒｔｒ７）１００ｍｌを別の４個の水槽に添加した。
【０１５４】
ＢＩＯＺＹＭＥ、ＣＹＣＬＥ，ＦＲＩＴＺ−ＺＹＭＥ  Ｎｏ．７およびＳＴＲＥＳＳ  
ＺＹＭＥの処理のために、市販の細菌混合物を製造業者の指示書に従って供給した。さら
に、これらの市販の各々の細菌混合物を推奨される供給レベルで３回試験した（表１７）
。各処理／用量の１つの組み合わせあたり４個の複製の水槽が存在するので、水槽は全部
で３３個であった（すなわち、（（（４×３）×２）＋（２×３）＋３）＝３３）。
【０１５５】
細菌添加試験ＶＩＩの処理およびコントロールについてのアンモニアおよび亜硝酸塩の
傾向は図５に示す。表出を明確にするために、試験した各々の市販の細菌混合物はコント
ロールおよび本発明の菌株を含む２つの試験混合物と共に提示する。各プロットの尺度は
同一であるので、全ての処理物の間を容易に比較できる。このデータによって、本発明の
菌株を含むＲｔｒ５およびＲｔｒ７混合物が、新しく設定される水槽において、投与され
ていない（コントロールの）水槽または市販の細菌混合物を供給した水槽に比較して、硝
化を確立するまでに要する時間が大きく短縮されることが示される。さらに、Ｒｔｒ５お
よびＲｔｒ７細菌混合物のいずれを供給した水槽でも、到達した最大のアンモニアおよび
亜硝酸塩濃度は、他の全ての処理よりも大きく低下した（図５；表１８）。
【０１５６】
表１８：細菌添加試験ＶＩＩの結果
【０１５７】
【表１６】
2010057494.tif 000018
Ｒｔｒ５およびＲｔｒ７混合物は、新しく設定された水槽で、市販の混合物および処理
していない水槽よりも、有意に早く硝化を確立した。Ｒｔｒ７混合物では８日、Ｒｔｒ５
混合物では１０日で、完全に硝化が確立された（表１８）。これらに最も近い処理は、通
常供給レベルのＦＲＩＴＺ−ＺＹＭＥ、通常の３倍の供給レベルのＣＹＣＬＥ、および通
常供給レベルのＳＴＲＥＳＳ  ＺＹＭＥであった；いずれも２２日を要した（表１８）。
従って、Ｒｔｒ５およびＲｔｒ７混合物はこれらの他の混合物よりも硝化を確立するのが
２．２〜２．８倍早かった。
【０１５８】
種々の混合物およびコントロールで達成されるアンモニアまたは亜硝酸塩の最大濃度の
相違も有意に異なっていた（表１８）。Ｒｔｒ５混合物では試験中に１．５ｍｇ／Ｌの平
均（Ｎ＝３）最大アンモニア濃度に達し、これは最も近い市販の混合物である通常レベル
で供給されたＦＲＩＴＺ−ＺＹＭＥの４．８分の１であった（平均７．２ｍｇ／Ｌ、Ｎ＝
３）（表１８）。Ｒｔｒ５混合物の平均最大亜硝酸塩濃度は、０．９ｍｇ／Ｌであった。
ここでも、通常レベルで供給されたＦＲＩＴＺ−ＺＹＭＥが最も近い市販の混合物であり
、平均最大亜硝酸塩濃度は３．１ｍｇ／Ｌであった。従って、Ｒｔｒ５混合物は、試験し
た現在の市販の混合物よりも、硝化の確立に３．４倍効果的であった。
【０１５９】
Ｒｔｒ７混合物はＲｔｒ５混合物と同様の傾向を示し、すなわちこの混合物を供給した
水槽では、最大アンモニア−窒素および亜硝酸塩−窒素の濃度が、市販の細菌混合物を供
給した水槽よりもかなり低かった（表１８）。Ｒｔｒ７混合物はそれぞれ２．８ｍｇ／Ｌ
および１．３ｍｇ／Ｌの平均最大アンモニアおよび硝酸塩濃度を有した。これらは、それ
ぞれ、最も近い市販の細菌混合物（通常推奨レベルで供給したＦＲＩＴＺ−ＺＹＭＥ）の
２．６および２．４分の１であった（図５；表１８）。
【０１６０】
曝露曲線に関して、本発明の菌株を組み込まれた細菌混合物Ｒｔｒ５およびＲｔｒ７は
、市販の混合物よりも有意に優れていた（表１９）。詳細には、Ｒｔｒ７は、いずれの混
合物よりも優秀であり、魚類はコントロールと比較してアンモニアでは１３％および亜硝
酸塩では５％で曝露されただけであった。Ｒｔｒ５もまずまず良好であり、アンモニア曝
露はコントロールレベルの１４％であり、亜硝酸塩曝露はコントロールの９％であった（
表１９）。これらの結果は、Ｒｔｒ７またはＲｔｒ５のいずれかを供給された水槽の魚類
が、コントロール水槽の魚類の、７．３〜７．６分の１のアンモニア、そして１１．６〜
１９．６分の１の亜硝酸塩に曝露されたことを意味している。Ｒｔｒ７およびＲｔｒ５の
次に優れた混合物は、コントロールと比較してアンモニアおよび亜硝酸塩の曝露を５０％
まで低下させただけであった（表１９）。
【０１６１】
表１９：細菌添加ＶＩＩ試験での毒性曝露データ
【０１６２】
【表１７】
2010057494.tif 000019
（実施例１４  細菌添加試験ＶＩＩＩ）
この試験の目的は、本発明のＡＯＢ株の種々の混合物を、「現実世界（ｒｅａｌ  ｗｏ
ｒｌｄ）」の設定で行われ得るように評価することであった。本発明のこれらの混合物の
能力を本発明の他のＡＯＢ株に対して、そして市販の細菌混合物に対して比較して、それ
らが淡水または塩水のいずれの水槽における使用にも適切であることを述べる。
【０１６３】
この試験のために１５個の１０ガロン水槽および１５個のＰｅｎｇｕｉｎ  １７０Ｂ（
Ｍａｒｉｎｅｌａｎｄ  Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ハングオンザバック形式
のパワー・フィルターを滅菌し、しっかりとリンスし、空気乾燥させた。翌日、各々のタ
ンクに、リンスした１０ｌｂｓのＴｉｄｅｌｉｎｅ  Ｃｒｕｓｈｅｄ  Ｃｏｒａｌ＃５を
充填し、滅菌したパワー・フィルター（ＰＦ  ０１７０Ｂ）およびリンスしたカーボンカ
ートリッジを取り付けた。各々のタンクに３５Ｌの人工的な海水を満たした。この塩水は
、Ｔｒｏｐｉｃ  Ｍａｒｉｎｅ塩混合物とその後の３０ｐｐｔの塩分までのＧＡＣ水の組
み合わせであった。細菌添加物および魚類の添加の前にフィルターを一晩稼動させた。
【０１６４】
翌朝、蒸発および水サンプルの採取を補償するために、このタンクを超純水で満たした
。各々のタンクに１つの細菌処理を行なったが、コントロール群には細菌混合物は与えな
かった。
【０１６５】
この試験には４つの処理を用いた：リアクター３は配列番号１、配列番号２および配列
番号３で表される本発明のＡＯＢの株を含んだ；リアクター２９は配列番号１８、配列番
号１９および２つのｈａｌｏｐｈｉｌａ様株由来の配列で表される本発明のＡＯＢの株を
含んだ；ＣＹＣＬＥ（淡水または塩水における使用のための市販の細菌混合物）；および
ＳＴＲＥＳＳ  ＺＹＭＥ（淡水または塩水における使用のための別の市販の細菌混合物）
。各々の処理には３つの複製があった。リアクター３およびリアクター２９処理を受けた
水槽には、試験の初日に１００ｍｌのいずれかの混合物を１回投与した。ＣＹＣＬＥまた
はＳＴＥＲＥＳＳ  ＺＹＭＥ処理を受けた水槽に、試験の初日に１０ｍｌのいずれかの処
理を投与し、試験の７日目にさらに１０ｍｌを投与し、この試験の期間後に７日毎にさら
に５ｍｌを投与した。４つの種々のスズメダイ（ｄａｍｓｅｌ）（Ｐｏｍａｃｅｎｔｒｕ
ｓ種）を試験の初日に各々のタンクに添加して１日２回給餌した。
【０１６６】
水サンプルを収集して、毎日、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩および伝導度について分析
した。月曜日、水曜日、および金曜日に水を亜硝酸塩および濁度について試験した。ｐＨ
の測定を、Ｄｅｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｐＨ組み合わせ電極を装備したＤｅ
ｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２２５  ｐＨ／Ｉｏｎメーターを用い
て行った。Ｔｅｃａｔｏｒ  ＦＩＡｓｔａｒ  ５０１０  Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、Ｔｅ
ｃａｔｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅｓに記載の方法を用いて、アンモニア、
亜硝酸塩、および硝酸塩（すなわち窒素）を測定した。ＹＳＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３０の携帯
型の塩濃度、伝導率、および温度のシステムを用いて、毎日、各タンクで直接、塩分を測
定した。濁度データは、ＤＲＴ−１００濁度メーター（ＨＦ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を
用いて決定した。
【０１６７】
４つの処理およびコントロールについての平均アンモニア濃度を図８に示す。配列番号
１８、配列番号１９によって表されるＡＯＢの株および２つのＮ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ様
株から構成される処理リアクター２９は、他の処理よりもアンモニアを顕著に急速に酸化
した。処理リアクター２９の平均最大アンモニア濃度はまた、他の３つの処理よりも有意
に低かった。実際、新しく設定した水槽の最初の１４日にわたって他の３つの処理につい
てのアンモニアの傾向は、コントロール（接種なし）の処理とは有意に相違しなかった。
水槽に対する市販のＡＯＢ混合物のさらなる添加によってアンモニア酸化に要する時間が
短縮されることは証明されなかった。
【０１６８】
これらの結果によっていくつかのポントが明らかになる：（１）配列番号１、配列番号
２および配列番号３によって表される本発明のＡＯＢの株は、配列番号１８および配列番
号１９によって表される本発明の菌株とは異なる；（２）市販の混合物に含まれるＡＯＢ
（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａであることが報告されている）は、新し
い塩水の水槽の設定の間にアンモニアを制御するのに有効ではない；そして（３）配列番
号１８および配列番号１９によって表されるＡＯＢは、新しく設定された塩水水槽におい
てアンモニア濃度を制御および維持するのに有効である。
【０１６９】
（実施例１５  細菌添加試験ＩＸ）
この試験の目的は、細菌接種をされなかった水槽に対して、リアクターＳＢ７由来のバ
イオマス物質（これは配列番号１８、配列番号１９によって表される本発明のＡＯＢの株
および２つのＮ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ様株を含んだ）を比較することであった。
【０１７０】
この試験のために、８個の１０ガロン水槽および８個のＰｅｎｇｕｉｎ  １７０Ｂ（Ｍ
ａｒｉｎｅｌａｎｄ  Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ハングオンザバック形式の
パワー・フィルターを滅菌し、しっかりとリンスし、空気乾燥させた。翌日、１０ｌｂｓ
のリンスしたＴｉｄｅｌｉｎｅ  Ｃｒｕｓｈｅｄ  Ｃｏｒａｌ＃５を各タンクに充填し、
滅菌したパワー・フィルター（ＰＦ  ０１７０Ｂ）およびリンスしたカーボンカートリッ
ジを取り付けた。各々のタンクに３５Ｌの人工的な塩水を満たした。塩分が３０ｐｐｔに
なるまでカーボン濾過した水道水にＩＮＳＴＡＮＴ  ＯＣＥＡＮ  ＳｅａＳａｌｔｓ（Ａ
ｑｕａｒｉｕｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ）を添加することによって人
工的な海水を作成した。水槽にこの海水を充填して細菌添加物および魚類の添加の前に一
晩フィルターを稼動させた。
【０１７１】
翌日、蒸発および水サンプルの採取を補償するために、このタンクを超純水で満たした
。次いで４つのタンクに１５０ｍｌのＳＢ７リアクター細菌混合物を投与した。他の４つ
のタンクには細菌混合物は投与しなかった。ＳＢ７  ＡＯＢリアクター混合物は、配列番
号１８、配列番号１９によって表される本発明のＡＯＢの株および２つのＮ．ｈａｌｏｐ
ｈｉｌａ様株から構成された。６匹のカクレクマノミ（Ａｍｐｈｉｐｒｉｏｎ  ｏｃｅｌ
ｌａｒｉｓ）を試験の初日に各々のタンクに添加して、１日に２回給餌した。この魚の餌
は、塩水凍結エビおよびＳｐｉｒｕｌｉｎａ魚用フレークの混合物であった。試験の３日
目に、４匹のさらなるカクレクマノミ（Ａｍｐｈｉｐｒｉｏｎ  ｏｃｅｌｌａｒｉｓ）を
各々の水槽に添加した。
【０１７２】
水サンプルを収集して、毎日、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩および伝導度について分析
して試験した。月曜日、水曜日、および金曜日に水を亜硝酸塩および濁度について試験し
た。ｐＨの測定を、Ｄｅｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｐＨ組み合わせ電極を装備
したＤｅｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２２５  ｐＨ／Ｉｏｎメータ
ーを用いて行った。Ｔｅｃａｔｏｒ  ＦＩＡｓｔａｒ  ５０１０  Ａｎａｌｙｚｅｒを用
い、Ｔｅｃａｔｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅｓに記載の方法を用いて、アン
モニア、亜硝酸塩、および硝酸塩（すなわち窒素）を測定した。ＹＳＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３
０の携帯型の塩濃度、伝導率、および温度のシステムを用いて、毎日、各タンクで直接、
塩分を測定した。濁度データは、ＤＲＴ−１００濁度メーター（ＨＦ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ）を用いて決定した。
【０１７３】
ＳＢ７処理およびコントロールについての平均アンモニア濃度を図９に示す。配列番号
１８、配列番号１９によって表されるＡＯＢの株および２つのＮ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ様
株を含むＳＢ７処理は、コントロールよりもアンモニアを顕著に急速に酸化した。ＳＢ７
措置を受けたタンクでは平均アンモニア濃度は９日目に０ｍｇ／Ｌに達したが、コントロ
ール水槽では、アンモニア値が同じレベルである０ｍｇ／Ｌに達するまでに１７日を要し
た。さらに、ＳＢ７処理の平均最大アンモニア濃度（約０．４ｍｇ／Ｌ−Ｎ）は、コント
ロール処理（１．７２ｍｇ／Ｌ−Ｎ）よりも有意に低かった。
【０１７４】
この結果によって、配列番号１８、配列番号１９によって表される本発明のＡＯＢの株
は、新しく設置された海水水槽においてアンモニア濃度を制御するのに有効であることが
示される。
【０１７５】
（実施例１６  細菌添加試験Ｘ）
この試験の目的は、細菌接種をされなかった水槽に対して、リアクターＳＢ７由来のバ
イオマス物質（これは配列番号１８、配列番号１９によって表される本発明のＡＯＢの株
および２つのＮ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ様株を含んだ）およびリアクターＢ７を比較するこ
とであった。
【０１７６】
この試験のために、１２個の１０ガロン水槽および１２個のＰｅｎｇｕｉｎ  １７０Ｂ
（Ｍａｒｉｎｅｌａｎｄ  Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）ハングオンザバック形
式のパワー・フィルターを滅菌し、しっかりとリンスし、空気乾燥させた。翌日、滅菌し
たパワー・フィルター（ＰＦ  ０１７０Ｂ）およびリンスしたカーボンカートリッジを各
々のタンクに取り付けた。各々のタンクに１９Ｌの人工的な塩水を満たした。塩分が２９
ｐｐｔになるまでカーボン濾過した水道水にＩＮＳＴＡＮＴ  ＯＣＥＡＮ  ＳｅａＳａｌ
ｔｓ（Ａｑｕａｒｉｕｍ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ）を添加することに
よって人工的な海水を作成した。水槽に海水を充填して細菌添加物およびアンモニアの添
加の前に一晩フィルターを稼動させた。
【０１７７】
翌朝、蒸発および水サンプルの採取を補償するために、このタンクを超純水で満たした
。各々の処理およびコントロールの水槽は、４つの複製を有した。４つの水槽に１５０ｍ
ｌのＳＢ７リアクター細菌混合物を投与し、４つの水槽には１５０ｍｌのＢ７リアクター
細菌混合物を投与し、そして４つの水槽にはいかなる細菌混合物も投与しなかった。ＳＢ
７  ＡＯＢリアクター混合物は、配列番号１８、配列番号１９によって表される本発明の
ＡＯＢの株および２つのＮ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ様株から構成された。Ｂ７  ＡＯＢリア
クター混合物は、ＡＯＢの２つのＮ．ｈａｌｏｐｈｉｌａ様株から構成された。
【０１７８】
毎日１１．５ｍｇのアンモニア−窒素を各々の水槽に添加した。水サンプルを収集して
、毎日、ｐＨ、アンモニア、亜硝酸塩および伝導度について分析して試験した。月曜日、
水曜日、および金曜日に水を亜硝酸塩および濁度について試験した。ｐＨの測定を、Ｄｅ
ｎｖｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ｐＨ組み合わせ電極を装備したＤｅｎｖｅｒ  Ｉｎ
ｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２２５  ｐＨ／Ｉｏｎメーターを用いて行った。Ｔｅ
ｃａｔｏｒ  ＦＩＡｓｔａｒ  ５０１０  Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、Ｔｅｃａｔｏｒ  Ａ
ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅｓに記載の方法を用いて、アンモニア、亜硝酸塩、およ
び硝酸塩（すなわち窒素）を測定した。ＹＳＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３０の携帯型の塩濃度、伝
導率、および温度のシステムを用いて、毎日、各タンクで直接、塩分を測定した。濁度デ
ータは、ＤＲＴ−１００濁度メーター（ＨＦ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて決定した
。
【０１７９】
この２つの処理およびコントロールについての平均アンモニア濃度を図１０に示す。リ
アクターＳＢ７またはリアクターＳＢ７処理のいずれかを与えられた水槽についてのアン
モニアの値は、ほぼ同じ速度でアンモニアを酸化した；これはコントロールよりも顕著に
速かった。Ｂ７またはＳＢ７処理のいずれかを受けたタンクについて平均最大アンモニア
濃度は３日目に０ｍｇ／Ｌに達し、そしてＢ７およびＳＢ７処理の平均最大アンモニア濃
度（約０．２ｍｇ／Ｌ−Ｎ）は、コントロール処理（２．０ｍｇ／Ｌ−Ｎ）よりも有意に
低かった（図９）。
【０１８０】
この結果によって、配列番号１８、配列番号１９によって表される本発明のＡＯＢの株
は、新しく設置された海水水槽においてアンモニア濃度を制御するのに有効であることが
示される。
【０１８１】
上記の説明は、本発明の特定の実施形態を言及するが、本発明の趣旨から逸脱すること
なく多数の改変がなされ得るということが当業者には容易に明らかであるはずである。添
付の特許請求の範囲は、このような改変があたかも本発明の趣旨および範囲内におさまる
として包含することを意図する。従って、本明細書に開示された実施形態は、あらゆる点
で例示的なものであり制限するものではないとして解釈され、本発明の範囲は、前述の詳
細な説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意義および
その等価な範囲内にある全ての改変は、本明細書に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2010057494.tif 000028
【図１０】
2010057494.tif 000029
【配列表】
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