(57)【要約】      （修正有）【課題】広範囲のHIV主単離物を中和する抗体を誘導するための免疫原、またかかる免疫原を用いて抗HIV抗体を誘導する方法の提供。【解決手段】IgGFc構成要素、HIVエンベロープ構成要素、およびC3d構成要素を含む融合タンパク質。IgGFc構成要素が、前記融合タンパク質において前記HIVエンベロープ構成要素に対してＮ末端に存在する、前記HIVエンベロープ構成要素が、前記融合タンパク質において前記C3d構成要素に対してＮ末端に存在する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）IgG  Fc構成要素、
ii）HIVエンベロープ構成要素、および
iii）C3d構成要素
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記IgG  Fc構成要素が、前記融合タンパク質において前記HIVエンベロープ構成要素に対してＮ末端に存在する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記HIVエンベロープ構成要素が、前記融合タンパク質において前記C3d構成要素に対してＮ末端に存在する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記IgG  Fc構成要素が、前記融合タンパク質において前記HIVエンベロープ構成要素に対してＮ末端に存在し、前記HIVエンベロープ構成要素が、前記融合タンパク質において前記C3d構成要素に対してＮ末端に存在する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質が、前記構成要素の少なくとも２つの間に少なくとも１つの介在配列を更に含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記IgG  Fc構成要素が、ヒトIgG  Fc構成要素である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記C3d構成要素が、ヒトC3dである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記C3d構成要素が、前記融合タンパク質を、CD21を発現する抗原提示細胞に対するターゲットにし、これにより抗原提示を促進する、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記HIVエンベロープ構成要素が、HIV-1  gp120、gp140、gp160、gp41、またはgp120もしくはgp41の免疫原性部分である、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記HIVエンベロープ構成要素が、gp120のV3ドメインの残基を含み、B細胞中和抗体エピトープを含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１１】
請求項１に記載の前記融合タンパク質を少なくとも１つ含む免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記組成物がキャリアをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記融合タンパク質の前記HIVエンベロープ構成要素が活性化され、その結果、前記HIVエンベロープ構成要素の保存された中和エピトープの中間コンフォメーションが露出される、請求項１に記載の前記融合タンパク質を含む複合体。
【請求項１４】
前記HIVエンベロープ構成要素が、前記HIVエンベロープ構成要素のCD4結合部位およびCCR5結合部位の少なくとも１つをアップレギュレートするリガンドに結合する、請求項１に記載の前記融合タンパク質を含む複合体。
【請求項１５】
前記リガンドが、抗体、またはそのFab2もしくはFabフラグメントである、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１６】
前記リガンドが、前記HIVエンベロープ構成要素のCCR5結合部位に結合し、前記HIVエンベロープ構成要素のCD4結合部位をアップレギュレートする、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１７】
前記リガンドが、前記HIVエンベロープ構成要素上のCCR5およびCD4結合部位をアップレギュレートする、請求項１６に記載の複合体。
【請求項１８】
哺乳動物に免疫応答を誘導する方法であって、前記誘導を生じさせるのに十分な量の請求項１に記載の前記融合タンパク質を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の前記融合タンパク質をコードする核酸配列。
【請求項２０】
プロモーターに動作可能に連結された請求項１９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本発明は、2002年7月23日に出願された仮出願No.60/397,605の優先権を主張し、その全内容を参照により本明細書の開示内容の一部とする。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、一般に免疫原に関し、とりわけ広範囲のHIV主単離物（primary isolates）を中和する抗体を誘導するための免疫原に関する。また本発明は、かかる免疫原を用いて抗HIV抗体を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
HIVの流行は世界中に広がりつづけ、有効なHIVワクチンに対する必要性がなお急がれている。HIVワクチン開発に対する重大な障害は、HIVの異常なまでの変動性、およびHIV突然変異の迅速性と広範性である（Wain-Hobson in The Evolutionary biology of Retroviruses, SSB Morse Ed. Raven Press, NY, pgs 185-209 (1994)）。
【０００４】
Myers、Korberらは、世界中でHIV配列を分析し、HIV単離物をグループまたはクレードに分け、個々のHIV単離物の進化的関係を相互に評価するための基礎を提供した（Myers et al (Eds), Human Retroviruses and AIDS (1995), Published by Theoretical Biology and Biophysics Group, T-10, Mail Stop K710, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 87545）。また、CTLおよびTヘルパーエピトープを含有するHIVタンパク質領域のバリエーション度が、Korber et alにより近年分析され、配列のバリエーションが、HIV単離物の間で多くのCTLおよびTヘルパーエピトープにおいて記載されている（Korber et al (Eds), HIV Molecular Immunology Database (1995), Published by Theoretical Biology and Biophysics Group, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 87545）。
【０００５】
新たなレベルのHIVバリエーションの複雑性が、クレード間のHIVの頻繁な組換えを証明することにより、Hahn et alにより近年報告された（Robinson et al, J. Mol. Evol. 40: 245-259 (1995)）。これら著者らは、HIV単離物の10％もが、組換えのモザイクであることを示し、このことは、たった一つのHIVクレードに基づくワクチンでは、免疫化された被検体を、モザイクのHIV単離物から保護できないことを示唆する（Robinson et al, J. Mol. Evol. 40: 245-259 (1995)）。
【０００６】
本発明は、HIVワクチンに使用するのに適した免疫原に関する。この免疫原は、ヒトにおいて広く交差反応する中和抗体を誘導し、広範囲のHIV主単離物を中和する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、広範囲のHIV主単離物を中和する抗体を誘導するための免疫原に関する。また本発明は、かかる免疫原を用いて抗HIV抗体を誘導する方法に関する。
【０００８】
本発明の目的および効果は、後述の記載から明らかになるでしょう。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】C3d−89.6  gp120−hIg構築物の略図。
【図２】C3d−89.6  gp120−Igの構築物の略図。
【発明の詳細な説明】
【００１０】
本発明は、有効なAIDSワクチンに必要な広い反応性の中和抗体を誘導する免疫原に関する。本発明の免疫原は、少なくとも３つの構成要素：ｉ）IgG  Fc構成要素、ii）HIVエンベロープ構成要素、およびiii）C3d構成要素を含む融合タンパク質を少なくとも１つ含む。好ましくは、IgG  Fc構成要素は、融合タンパク質において、C3d構成要素に対してＮ末端にあるHIVエンベロープ構成要素に対してＮ末端に存在する。しかし、これら構成要素は、実際には任意の順序で存在することができる。更に、介在配列（たとえばリンカー）が存在することもできる。更に本発明は、かかる融合タンパク質をコードする核酸配列に関する。
【００１１】
本発明の融合タンパク質のIgG  Fc（好ましくはヒトIgG  Fc）構成要素は、血清/血漿/細胞外流体の半減期が長い融合タンパク質を提供する。C3d（好ましくはヒトC3d）構成要素は、その融合タンパク質を、CD21（C3dレセプター）を発現する免疫系の抗原提示細胞に対するターゲットにし、これにより抗原提示を促進する（Ahearn et al, Adv. Immunol. 46: 183 (1989)、Cooper et al, Ann. Rev. Immunol. 6: 85 (1988)、Dempsey et al, Science 271: 348 (1996)、Ross et al, AIDS Res. Hum. Retroviruses 17: 829 (2001)を参照）。HIVエンベロープ構成要素は、好ましくは、HIV-1  gp120であるが、HIV-1  gp140、gp160、gp41、並びにgp120およびgp41の小さな一部分を使用することもできる。HIV構成要素は、T-ヘルパーエピトープを含むことができ、HIV  gp120のC4ドメイン由来の残基（たとえば、C4ドメイン由来の約16個の連続残基（たとえば、421〜436残基）（WO 03/039470におけるC4ドメイン配列も参照））を含むことができる。HIV構成要素は、たとえばB細胞中和抗体エピトープを含むように選択されたgp120のV3ドメイン由来の残基を含むことができる。好ましくは、V3ドメインの少なくとも23個の連続残基、たとえばHIV  gp120のV3ドメインの少なくとも297〜322残基が使用される。V3残基は、ある集団に存在する高次構造モチーフであって、エンベロープ介在型のHIVの宿主細胞との相互作用の間にV3機能に介在するモチーフを代表するように選択することができる。Los Alamos National Laboratories Human Retroviruses and AIDS Data base (たとえば、Human Retroviruses and AIDS, 2000, Published by the Theoretical Biology and Biophysics GT-10, Mail StopK710, LANL, Los Alamos, NMを参照) は、現在14,000を超えるHIV  V3エンベロープ配列を有する。本発明での使用に適したV3配列の例には、WO 03/039470に記載されるものや、以下に挙げるものが含まれるがこれらに限定されない。
【表Ａ】
2010057490.tif 000002
【表Ｂ】
2010057490.tif 000003
【００１２】
融合タンパク質は、免疫原としてそれ自体使用することができ、あるいは融合タンパク質は、複合体として存在することができ、複合体においてHIVエンベロープ構成要素は、「活性化」され、通常HIVビリオンの表面に一時的にしか露出されないか、またはあまり露出されない保存された中和エピトープの中間コンフォメーションを露出する。HIVエンベロープの「フリーズした」誘発（triggered）形態が、Ｂリンパ球に提示するための有用な特定のエピトープをつくる。このエピトープ提示の結果、広くHIVを中和する抗体が産生される。
【００１３】
誘発エンベロープの概念は、gp41  HR-2領域ペプチド、DP178が、gp41の巻かれていないコンフォメーションを捕捉することができるという観察と一致し（Furata et al, Nature Struct. Biol. 5: 276 (1998)）、また、ホルマリン固定HIV感染細胞が、広く中和する抗体を作成することができるという報告と一致する（LaCasse et al, Science 283: 357 (1997)）。近年、二重コイル（coiled-coil）領域に対するモノクローナル抗体は、二重コイルgp41構造のHR1およびHR2領域においてgp41のコンフォメーション決定基に結合したが、HIVを中和しなかった（Jiang et al, J. Virol. 10213 (1998)）。しかし、この後者の研究により、二重コイル領域は、適切な抗体が作成されれば、抗体が結合するのに有用であることが証明された。
【００１４】
HIVエンベロープ上の保存された中和部位は、２つの領域上であり得：gp41上であり得、gp120上であり得る。
【００１５】
Gp140（またはgp160）の「誘発」（「活性化」）の間に露出されるgp41の領域およびコンフォメーションは、保存されていると予測することができ、その理由は、ｉ）二重コイル領域のアミノ酸配列が保存されており、ii）融合形成（fusogenic）エンベロープ複合体の機能が保存され、ウイルスの病原性に必須であるからである。この保存は、広く中和する抗HIV抗体を産生するのに重要である。
【００１６】
一つの態様において、本発明の融合タンパク質は、露出したCCR5結合領域を備えたレセプター(CD4)−連結（ligated）エンベロープの特徴を有するが、ブロックされたCD4結合部位を有するCD4−連結タンパク質とは異なり、この融合タンパク質は露出した（オープンの）CD4結合部位を有する。更に、この態様において、融合タンパク質は、宿主CD4を欠損させることができ、これにより、宿主に投与した際に潜在的に有害な抗CD4抗体の産生が回避される。
【００１７】
本発明の融合タンパク質のgp120エンベロープ構成要素は、A32モノクローナル抗体（mab）により認識されるgp120上の部位に結合するリガンドと連結させる（ligate）ことができる（Wyatt et al, J. Virol. 69: 5723 (1995)、Boots et al, AIDS Res. Hum. Retro. 13: 1549 (1997)、Moore et al, J. Virol. 68: 8350 (1994)）。あるA32  mabは、CD4に似ていることが示されており、gp120に結合すると、CCR5結合部位をアップレギュレートする（露出する）（Wyatt et al, J. Virol. 69: 5723 (1995)）。また、かかるリガンドとgp120のライゲーション（ligation）は、CD4結合部位をアップレギュレートし、gp120へのCD4の結合をブロックしない。好ましくは、かかるリガンドは、切断されたgp120、未切断のgp140、および切断されたgp41に結合することができるgp41のHR-2結合部位もアップレギュレートし、これにより、これらタンパク質上のHR-2結合部位を更に露出する  −  その各々は、IgFc/gp120/C3d融合タンパク質として発現すると、抗HIV中和抗体に対する潜在的なターゲットである。
【００１８】
この態様の特定の側面において、本発明の融合タンパク質のHIV-1  gp120、gp140またはgp160構成要素は、完全なA32  mab、A32  mabのFab2フラグメント、またはA32  mabのFabフラグメントの何れかと連結させ（ligate）、その結果、gp120、gp140またはgp160上のCD4結合部位、CCR5結合部位、およびHR-2結合部位が露出され/アップレギュレートされる。この免疫原は、融合タンパク質のgp120構成要素に結合したA32  mab（またはそのフラグメント）を含むことができ、あるいは融合タンパク質のgp120構成要素に結合し、.3 %ホルムアルデヒドなどのクロスリンカーまたはDTSSP（Pierce Chemical Company）などのヘテロ二官能性クロスリンカーでクロスリンクしたA32  mabを含むことができる。融合タンパク質のgp140またはgp120構成要素に結合したA32  mab（またはそのフラグメント）は、gp120およびgp140におけるHR-2結合部位のアップレギュレーション（露出）という結果に至る。また、gp120またはgp140構成要素へのA32  mab（またはそのフラグメント）の結合は、CD4結合部位およびCCR5結合部位のアップレギュレーションという結果に至る。gp120含有融合タンパク質を含む複合体と同様、gp140含有融合タンパク質およびA32  mab（またはそのフラグメント）を含む複合体は、クロスリンクしていないか、または.3 %ホルムアルデヒドまたはDTSSPなどのクロスリンカーでクロスリンクした免疫原として使用することができる。一つの態様において、本発明は、A32  mabのFabフラグメントに結合しクロスリンクし、任意にHR-2結合タンパク質に結合しクロスリンクしたgp140構成要素を含む融合タンパク質を含む免疫原に関する。
【００１９】
gp120上のA32  mab結合部位に結合するリガンドで誘発された本発明の融合タンパク質は、A32  mab結合部位とは離れた部位（たとえば、mab  17bにより認識されるCCR5結合部位）に結合するリガンドにより誘発される、第二のHIV-1  gp120（またはgp140）構成要素を含む少なくとも１つの第二の融合タンパク質と組み合わせて投与することができる。17b  mab（Kwong et al, Nature 393: 648 (1988)、AIDS Reference Repository, NIAID, NIHから入手可能）は、gp120へのsCD4の結合を増大させる。この第二の融合タンパク質は、たとえば、完全な17b  mab、17b  mabのFab2フラグメント、または17b  mabのFabフラグメントの何れかと連結したHIV-1  gp120構成要素を含むことができる。CD4結合部位が露出される結果に至る、他の抗体（またはそのフラグメント）を含む他のCCR5リガンドが、17b  mabの代わりに使用可能であることが理解されるでしょう。この更なる融合タンパク質は、それに結合した17b  mabまたはそのフラグメント（または上述の他のCCR5リガンド）を備えたgp120構成要素を含むことができ、あるいはそれに結合し、.3 %ホルムアルデヒドなどの薬剤またはDTSSP（Pierce Chemical Company）などのヘテロ二官能性クロスリンカーでクロスリンクした17b  mabまたはそのフラグメント（または上述の他のCCR5リガンド）を備えたgp120構成要素を含むことができる。（完全な17b  mab、17b  mabのFab2フラグメント、または17b  mabのFabフラグメント（または他のCCR5リガンド）の何れかと連結したHIV-1  gp120構成要素を含むこの第二の融合タンパク質は、それ自体、免疫原として使用することもできる。）
【００２０】
可溶性HR-2ペプチド、たとえばT649Q26LやDP178は、上述の複合体に添加し、融合タンパク質のgp120またはgp140構成要素のエピトープを安定化することができ、免疫原複合体とともに、クロスリンクして、またはクロスリンクせずに投与することができる。
【００２１】
多くのHIV主単離物を中和する一連のモノクローナル抗体（mabs）が作成され、たとえば、上述の17b  mabに加えて、gp120上のCD4結合部位に結合するmab  IgG1b12（Roben et al, J. Virol. 68: 482 (1994)、Mo et al, J. Virol. 71: 6869 (1997)）、gp120上のコンフォメーション決定基に結合するmab  2G12（Trkola et al, J. Virol. 70: 1100 (1996)）、およびgp41の膜近接領域に結合するmab  2F5（Muster et al, J. Virol. 68: 4031 (1994)）が挙げられる。誘発されるエンベロープ構成要素を含む融合タンパク質混合物は、広範囲のHIV主単離物を中和する抗体の誘導を最適化するために使用することができる。かかる融合タンパク質は、霊長類に投与すると、たとえば全身においてまたは粘膜部位において、HIV主単離物に対して広い反応性の中和抗体を誘導する。
【００２２】
上述のとおり、本発明に従って、融合形成（fusogenic）エピトープを「フリーズ」させるために種々のアプローチを使用することができる。たとえば、「フリージング」は、二重コイル領域の一部を代表し、CD4誘発エンベロープに添加すると融合（fusion）を妨害する可溶性HR-2ペプチド、たとえばDP-178またはT-649Q26Lペプチドを添加することにより行うことができる（Rimsky et al, J. Virol. 72: 986-993 (1998)）。HR-2ペプチドは、本発明の融合タンパク質のgp140構成要素に結合することができ（またはDTSSP（Pierce Co.）、ホルムアルデヒドによりクロスリンクすることができ）、その複合体は、免疫原として使用することができる。また、「フリージング」は、複合体を安定化するために、0.1％〜3％ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒド（何れもタンパク質のクロスリンク剤）を複合体に添加することにより行うこともできる（LaCasse et al, Science 283: 357-362 (1999)）。更にgp120融合中間体の「フリージング」は、クロスリンクし、CD4、CCR5またはCXCR4、gp160複合体を安定化するために、アミノ基と反応する２つのNHSエステルを使用するヘテロ二官能性薬剤、たとえばDSP（ジチオビス[スクシミジルプロピオネート]）（Pierce Co. Rockford, ILL., No. 22585ZZ）または水溶性DTSSP（Pierce Co.）を添加することにより行うことができる。
【００２３】
本質的な違いは、異なる地理的位置の患者に由来するHIVクレード間のHIV単離物に、およびHIV単離物の間に存在する。HIVワクチン開発のための誘発融合タンパク質は、種々のHIVクレードおよび種々の位置に由来するHIVエンベロープ構成要素を用いて作成することができる。上述の複合体の特性を有する組換えタンパク質を作成するために、融合タンパク質と、たとえば抗体のFab領域の重鎖および軽鎖との両方を、プラスミドにおいてジシストロン（dicistronic）方法で同時発現させることにより、CCR5結合部位、CD4結合部位、またはその両方をアップレギュレートする抗体またはそのフラグメント、またはCD4誘導可能な抗体またはそのフラグメントを含む誘発融合タンパク質を作成することができる。
【００２４】
本発明の融合タンパク質は、当該技術分野で周知の技術を用いて薬学的に許容可能なキャリアおよび/またはアジュバント（たとえばミョウバン）と製剤化することができる。本発明の免疫原の適切な投与ルートは、全身（たとえば筋内または皮下）を含む。粘膜免疫系（たとえば鼻腔内）において免疫応答が求められるときには代わりのルートを使用することができる。あるいは、融合タンパク質をコードする構築物を、コードする配列が発現され融合タンパク質が産生される条件下において投与することができる。
【００２５】
本発明の特定の側面は、後述の非限定的な例において更に詳細に説明される。（2001年9月24日に出願されたWO 02/024149、出願番号09/960,717、および2003年5月8日に出願された出願番号10/431,596および2003年5月19日に出願された仮出願番号60/471,327も参照され、これらは参照により本明細書の開示内容の一部とする。）
【００２６】
例１
モルモットをIgG−89.6gp120−C3d融合タンパク質で免疫処置した。このタンパク質は、完全フロイントアジュバント（CFA）中で投与し、その後不完全フロイントアジュバント（IFA）中で投与した。得られた中和抗体（NAb）力価を表１に示す。（SHIV-89.6Pは、中和抗体が標的にするウイルスである。）
【００２７】
【表１】
2010057490.tif 000004
【００２８】
c3d-gp120  89.6  Ig構築物（図１）を作成するために、標準的な分子技術を利用して以下の工程を行った（図２）：
１）クローニングを容易にするため、NheI制限酵素部位を有する５’プライマー（Nhe1-c3d-3064/F1, CCG TGC TAG CCC ACC TCA TTG TGA CCC CCT CG）、およびBamHI制限酵素部位を有する３’プライマー（BamH1-c3d-3946/R1: CTA TTG GAT CCC GGC GGC TGG GCA GTT GGA GGG ACA C）を、補体C3から導き出し、合成した。
【００２９】
２）c3dコード配列を含有するDNAフラグメントを、鋳型として完全なC3  cDNAを含有するプラスミドpC3d（David Montifioriから入手）を用いて、Nhe1-c3d-3064/F1およびBamHI-c3d-3946/R1のプライマーを用いて、PCRにより作成した。
【００３０】
３）PCR産物を、Nhe1およびBamHIで処理し、CD5セクレショナル（secrational）配列を含有するプラスミドCD-19-Rgと連結した（ligate）。
【００３１】
４）その後、CD5セクレショナル（secrational）シグナル配列を伴ったc3d  DNAフラグメントを、XhoIおよびBamHIを用いて、得られたプラスミドから切り出し、ヒトIg遺伝子を含有するCDM8プラスミドにおけるXhoI-BamHI部位にクローニングした。
【００３２】
５）89.6  gp120をクローニングするため、BamHI制限酵素部位を有する５’プライマー（Bam89.6/F1: CTA TTG GAT CCA GCA AAA GAA AAA ACG TGG GTC ACA ATC）および３’プライマー（Bam89.6gp120R1: CTC TGG ATC CCG TCT TTT TTC TCT TTG CAC TGT TCT TCT C）を、HIV 89.6 envから導き出し、合成した。
【００３３】
６）HIV  89.6  エンベロープ  gp120  DNA（From Bob Dome）を、鋳型として89.6gp120プラスミドを用いて、Bam89.6/F1およびBam89.6gp120R1のプライマーを用いて、PCRにより作成した。
【００３４】
７）その後、HIV  89.6  エンベロープ  gp120  PCR産物を、BamHIで処理し、BamHI処理プラスミドCDM8-c3d  DNAと連結した（ligate）。正方向のHIV  89.6  エンベロープ  gp120遺伝子を有するクローンを、配列決定により同定した。
【００３５】
上で引用されたすべての文書は、参照によりその全体を本明細書の開示内容の一部とする。
【００３６】
当業者であれば、この開示を読むことにより、本発明の真の範囲を逸脱することなく、形式および細部において種々の変更を行うことができることが理解されるでしょう。
【図１】
2010057490.tif 000005
【図２】
2010057490.tif 000006
【外国語明細書】
2010057490000001.pdf