【手続補正書】
【提出日】令和3年2月5日(2021.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作されたナチュラルキラー(NK)細胞であって、該細胞におけるFcRγ鎖の発現、活性、および/またはシグナル伝達を低減させるように遺伝子操作されている、前記操作されたNK細胞。
【請求項２】
FcRγ鎖をコードする遺伝子の遺伝的破壊および/または操作されたNK細胞におけるFcRγ鎖の発現の低減をもたらす遺伝的破壊;
FcRγ鎖の発現もしくは活性を調節するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的破壊および/またはFcRγ鎖の発現もしくは活性を調節するタンパク質の発現の低減をもたらす遺伝的破壊; ならびに/あるいは
FcRγ鎖依存性シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子の遺伝的破壊および/またはFcRγ鎖依存性シグナル伝達に関与するタンパク質の発現の低減をもたらす遺伝的破壊
を含む、請求項1に記載の操作されたNK細胞。
【請求項３】
遺伝的破壊が、遺伝子中の未成熟終止コドンまたは遺伝子の読み取り枠のフレームシフトをもたらす欠失、変異、および/または挿入を含む、請求項2に記載の操作されたNK細胞。
【請求項４】
FcRγ鎖をコードする遺伝子、FcRγ鎖の発現もしくは活性を調節するタンパク質をコードする遺伝子、および/またはFcRγ鎖依存性シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子の両対立遺伝子が、操作されたNK細胞において破壊されている、請求項2または請求項3に記載の操作されたNK細胞。
【請求項５】
FcRγ鎖の発現の低減、FcRγ鎖の発現もしくは活性を調節するタンパク質の発現の低減、および/またはFcRγ鎖依存性シグナル伝達に関与するタンパク質の発現の低減をもたらすNK細胞における遺伝子を標的とする阻害核酸分子を含む、請求項1に記載の操作されたNK細胞。
【請求項６】
FcRγ鎖、FcRγ鎖の発現もしくは活性を調節するタンパク質、および/またはFcRγ鎖依存性シグナル伝達に関与するタンパク質の発現が、遺伝子操作されていないNK細胞でのタンパク質の発現と比較して50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%を超えて、または約50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%を超えて、低減されている、請求項2〜5のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項７】
FcRγ鎖の発現または活性を調節するタンパク質の発現が、操作されたNK細胞において低減されており、該タンパク質が転写因子である、請求項2〜6のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項８】
転写因子がPLZF (ZBTB16)またはHELIOS (IKZF2)である、請求項7に記載の操作されたNK細胞。
【請求項９】
FcRγ鎖依存性シグナル伝達に関与するタンパク質の発現が、操作されたNK細胞において低減されており、該タンパク質が下流シグナル伝達分子である、請求項2〜6のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項１０】
下流シグナル伝達分子が、SYK、DAB2、またはEAT-2である、請求項9に記載の操作されたNK細胞。
【請求項１１】
FcRγ鎖の発現が、前記操作された細胞において低減されている、請求項2〜6のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項１２】
FcRγ鎖をコードする遺伝子における遺伝的破壊を含む操作されたNK細胞であって、FcRγの発現が該細胞において低減されている、前記操作されたNK細胞。
【請求項１３】
遺伝的破壊が、遺伝子中の未成熟終止コドンまたは遺伝子の読み取り枠のフレームシフトをもたらす欠失、変異、および/または挿入を含む、請求項12に記載の操作されたNK細胞。
【請求項１４】
FcRγ鎖をコードする遺伝子の両対立遺伝子が、操作されたNK細胞のゲノムにおいて破壊されている、請求項12または請求項13に記載の操作されたNK細胞。
【請求項１５】
FcRγ鎖をコードする遺伝子を標的とする阻害核酸分子を含む、請求項1、5、または6のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項１６】
阻害核酸分子が、FcRγ鎖をコードする遺伝子に相補的な配列を含む、請求項15に記載の操作されたNK細胞。
【請求項１７】
FcRγ鎖の発現が、遺伝子操作されていないNK細胞での発現と比較して50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%を超えて、または約50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%を超えて、低減されている、請求項11〜16のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項１８】
阻害核酸がRNA干渉剤を含む、請求項5〜6および15〜17のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項１９】
阻害核酸が、siRNA、shRNA、またはmiRNAを含む、請求項5〜6および15〜18のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項２０】
FcRγの発現、活性、および/またはシグナル伝達の低減が、永続性、一過性、または誘導性である、請求項1〜19のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項２１】
FcRγ鎖の発現、活性、および/またはシグナル伝達が、遺伝子操作されていないNK細胞での発現、活性、および/またはシグナル伝達と比較して50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%を超えて、または約50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%を超えて、低減されている、請求項1〜20のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項２２】
前記細胞において発現されるFcRγ鎖の発現が、免疫ブロットアッセイ法で検出不能である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞。
【請求項２３】
操作されたNK細胞の表面にCD16が発現されている、請求項1〜22のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項２４】
CD3-ゼータ(CD3ζ)鎖を発現する、請求項1〜23のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞。
【請求項２５】
対象から得られた初代細胞に由来する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞。
【請求項２６】
対象がヒトである、請求項25に記載の操作されたNK細胞。
【請求項２７】
クローン細胞株に由来する、請求項1〜24のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞。
【請求項２８】
クローン細胞株が、NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6、またはIMC-1である、請求項27に記載の操作されたNK細胞。
【請求項２９】
組み換えもしくは異種CD16遺伝子および/または組み換えもしくは異種CD3-ゼータ(CD3ζ)鎖を含む、請求項1〜28のいずれかに記載の操作されたNK細胞。
【請求項３０】
CD16が、CD16活性化変異、IgG1に対するさらに高い親和性をもたらす変異、158V変異および/または158F変異を含む、請求項29に記載の操作されたNK細胞。
【請求項３１】
操作されたNK細胞が、改変のないNK細胞と比べてCD16を通じて刺激された場合に活性の増加を示す、請求項1〜30のいずれかに記載の操作された細胞。
【請求項３２】
改変のないNK細胞と比べてNKp46、NKp30、および/またはNKp44の表面発現が低減されている、請求項1〜31のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞。
【請求項３３】
NK細胞を遺伝子操作して、該細胞におけるFcRγ鎖の発現、活性、および/またはシグナル伝達を低減させる段階を含む、操作されたNK細胞を産生する方法。
【請求項３４】
発現を低減させる段階が、
FcRγ鎖をコードする遺伝子を破壊もしくは抑制すること、および/またはNK細胞におけるFcRγ鎖の発現の低減をもたらす遺伝子を破壊もしくは抑制すること;
FcRγ鎖の発現もしくは活性を調節するタンパク質をコードする遺伝子を破壊もしくは抑制すること、および/またはNK細胞におけるFcRγ鎖の発現もしくは活性を調節するタンパク質の発現の低減をもたらす遺伝子を破壊もしくは抑制すること; ならびに/あるいは
FcRγ鎖依存性シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする遺伝子を破壊もしくは抑制すること、および/またはNK細胞におけるFcRγ鎖依存性シグナル伝達に関与するタンパク質の発現の低減をもたらす遺伝子を破壊もしくは抑制すること
を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子に欠失、変異、または挿入を導入する段階を含む、請求項33または請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記遺伝子がFcRγ鎖をコードする、請求項33〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子が、転写因子であるFcRγ鎖の発現または活性を調節するタンパク質をコードする、請求項33〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
転写因子がPLZFまたはHELIOSである、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記遺伝子が、下流シグナル伝達分子であるFcRγ鎖依存性シグナル伝達に関与するタンパク質をコードする、請求項33〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
下流シグナル伝達分子が、SYK、DAB2、またはEAT2である、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
遺伝子の破壊または抑制が、遺伝子の破壊または抑制を可能にする条件の下で、NK細胞における遺伝子を標的とするエンドヌクレアーゼを導入することにより行われる、請求項33〜40のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
エンドヌクレアーゼが、TALヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Cas9、およびアルゴノートからなる群より選択される、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
破壊または抑制が、遺伝子の抑制をもたらす条件の下で、遺伝子を標的とする阻害核酸をNK細胞に導入することにより行われる、請求項33〜40のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
阻害核酸分子が、FcRγ鎖をコードする遺伝子に相補的な配列を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
阻害核酸がRNA干渉剤を含む、請求項43または請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
核酸が、siRNA、shRNA、またはmiRNAである、請求項43〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
発現の低減が、永続性、一過性、または誘導性である、請求項33〜46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
FcRγ鎖の発現、活性、および/またはシグナル伝達が、遺伝子操作されていないNK細胞での発現と比較して50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%を超えて、または約50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%を超えて、低減される、請求項33〜47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
FcRγ鎖の発現レベルが、免疫ブロットアッセイ法で検出不能である、請求項33〜48のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記遺伝子操作の前に、ヒト対象からNK細胞を単離する段階を含む、請求項33〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
末梢血単核細胞(PBMC)からNK細胞を単離する段階を含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
NK細胞を単離する段階が、NK細胞マーカーを用いてPBMCからNK細胞を選択することを含む、請求項50または51に記載の方法。
【請求項５３】
NK細胞マーカーが、CD56、Cd161、KIR、NKG2A、NKG2D、NKp30、NKp44、および/またはNKp46である、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
CD16および/またはCD3ζを発現するNK細胞を選択する段階をさらに含む、請求項50〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
表面CD3を発現しないNK細胞を選択する段階をさらに含む、請求項50〜54のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
NK細胞がNK細胞株である、請求項33〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
細胞株が、NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6、またはIMC-1である、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
NK細胞株を操作して組み換えまたは異種CD16および/またはCD3ζを発現させる段階をさらに含む、請求項56または請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
CD16および/またはCD3ζをコードする核酸をNK細胞に導入する段階を含む、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
CD16遺伝子が活性化変異および/またはIgGに対するCD16の親和性を増加させる変異を含む、請求項58または請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
CD16が、158Vである変異を含む、請求項58〜60のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
CD16が、158Fである変異を含む、請求項58〜60のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
CD16および/またはCD3ζをコードする核酸をNK細胞にウイルス形質導入する段階を含む、請求項58〜62のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
CD16および/またはCD3ζをコードする核酸をNK細胞にトランスフェクションする段階を含む、請求項58〜62のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記NK細胞においてCD16またはCD3ζを一過的に、誘導的に、または永続的に発現させる段階を含む、請求項58〜64のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
操作されたNK細胞を培養する段階または増殖させる段階をさらに含む、請求項33〜65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
操作されたNK細胞をフィーダー細胞とともに培養する段階を含む、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
操作されたNK細胞をサイトカインとともに培養する段階を含む、請求項66または請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
請求項33〜68のいずれか一項に記載の方法によって産生された、操作されたNK細胞。
【請求項７０】
請求項1〜32または69のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞の有効量を含む、組成物。
【請求項７１】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項70に記載の組成物。
【請求項７２】
担体が、生理食塩水溶液、デキストロース溶液、または5%ヒト血清アルブミンである、請求項71に記載の組成物。
【請求項７３】
1×105〜1×108個の細胞/mLを含む、請求項70〜72のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
抗凍結剤を含む、請求項70〜73のいずれかに記載の組成物。
【請求項７５】
請求項1〜32もしくは69のいずれか一項に記載の操作された細胞または請求項70〜74のいずれか一項に記載の組成物と、疾患の処置のためのさらなる作用物質とを含む、キット。
【請求項７６】
さらなる作用物質が抗体またはFc融合タンパク質である、請求項75に記載のキット。
【請求項７７】
抗体が腫瘍関連抗原を認識または特異的に結合する、請求項76に記載のキット。
【請求項７８】
腫瘍関連抗原が、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-アルファ、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、散乱因子(scatter factor)受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケラチン(cytokerain)、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2 (HER2)、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-アルファ、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7 (CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンである、請求項77に記載のキット。
【請求項７９】
抗体が、全長抗体であり、かつ/またはFcドメインを含む、請求項76〜78のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８０】
状態を処置するための、請求項70〜74のいずれか一項に記載の組成物であって、それを必要とする個体に投与される、組成物。
【請求項８１】
操作されたNK細胞を投与する段階の前に、該操作されたNK細胞を請求項33〜68のいずれかに記載の方法によって産生する、請求項80に記載の組成物。
【請求項８２】
1×108〜1×1010個の細胞/m2もしくは約1×108〜1×1010個の細胞/m2が前記個体に投与される、または1×106〜1×1010個のNK細胞/kgもしくは約1×106〜1×1010個のNK細胞/kgが前記個体に投与される、請求項80または請求項81に記載の組成物。
【請求項８３】
さらなる作用物質と組み合わせて用いられる、請求項80〜82のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８４】
さらなる作用物質が抗体またはFc融合タンパク質である、請求項83に記載の組成物。
【請求項８５】
抗体が腫瘍関連抗原を認識する、請求項84に記載の組成物。
【請求項８６】
腫瘍関連抗原が、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD52、CD56、CD70、CD74、CD140、EpCAM、CEA、gpA33、メソテリン、α-フェトプロテイン、ムチン、PDGFR-アルファ、TAG-72、CAIX、PSMA、葉酸結合タンパク質、散乱因子受容体キナーゼ、ガングリオシド、サイトケラチン、frizzled受容体、VEGF、VEGFR、インテグリンαVβ3、インテグリンα5β1、EGFR、EGFL7、ERBB2 (HER2)、ERBB3、フィブロネクチン、HGF、HER3、LOXL2、MET、IGF1R、IGLF2、EPHA3、FR-アルファ、ホスファチジルセリン、シンデカン1、SLAMF7 (CD319)、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP、ビメンチン、またはテネイシンである、請求項84または請求項85に記載の組成物。
【請求項８７】
抗体が、Fcドメインを含み、かつ/または全長抗体である、請求項84〜86のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８８】
さらなる作用物質および操作されたNK細胞が連続的に投与される、請求項83〜87のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
操作されたNK細胞の投与の前にさらなる作用物質が投与される、請求項88に記載の組成物。
【請求項９０】
さらなる作用物質および操作されたNK細胞が同時に投与される、請求項83〜87のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９１】
前記状態が、炎症状態、感染症、およびがんからなる群より選択される、請求項80〜90のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９２】
感染症がウイルス感染症または細菌感染症である、請求項91に記載の組成物。
【請求項９３】
がんが白血病またはリンパ腫である、請求項92に記載の組成物。
【請求項９４】
がんが固形腫瘍を含む、請求項92に記載の組成物。
【請求項９５】
個体がヒトである、請求項80〜94のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９６】
操作されたNK細胞が個体に対して同種である、請求項80〜95のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９７】
操作されたNK細胞が対象にとって自己由来である、請求項80〜95のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９８】
NK阻害受容体の発現を低減させるように遺伝子操作されている、請求項1〜32のいずれか一項に記載の操作されたNK細胞。
【請求項９９】
NK阻害受容体をコードする遺伝子の遺伝的破壊および/またはNK阻害受容体の発現の低減をもたらす遺伝的破壊を含む; あるいは
NK阻害受容体をコードする遺伝子を標的とするおよび/またはNK阻害受容体の発現を低減させる阻害核酸を含む、
請求項98に記載の操作されたNK細胞。
【請求項１００】
阻害受容体がNKG2AまたはKIR2DL1である、請求項98または請求項99に記載の操作されたNK細胞。
【請求項１０１】
NK細胞を遺伝子操作して阻害受容体の発現または活性を低減させる段階をさらに含む、請求項32〜68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
発現または活性を低減させる段階が、NK阻害受容体をコードする遺伝子またはNK阻害受容体の発現の低減をもたらす遺伝子の発現を破壊または抑制することを含む、請求項101に記載の方法。
【請求項１０３】
阻害受容体がNKG2AまたはKIR2DL1である、請求項102に記載の方法。