【手続補正書】
【提出日】令和3年2月25日(2021.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発現構築物であって、組み換え分泌シグナルに作動可能に連結されているタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記組み換え分泌シグナルがリーダーペプチド及びシグナルペプチドを含み、前記リーダーペプチドが天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）、または配列番号１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体であり、前記シグナルペプチドがｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）を含まない、前記発現構築物。
【請求項２】
前記機能的変異体が、
１つまたは２つの置換アミノ酸を含む天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）である、
配列番号２である、または
配列番号１と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、
請求項１に記載の発現構築物。
【請求項３】
前記シグナルペプチドが表１から選択されるか、または、表１から選択されるシグナルペプチドと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体であって、任意で、前記機能的変異体が、表１から選択されるシグナルペプチドと少なくとも８５％、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項４】
前記組み換え分泌シグナルが、表２から選択されるか、または、表２から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、もしくは、
表２から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有する、
請求項１に記載の発現構築物。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド配列が、複数のコピーで存在する、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項７】
前記プロモーターが、
ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｐＧＣＷ１４プロモーターである、
ピキア・パストリスのｐＧＡＰプロモーターである、または
誘導性プロモーターである、
請求項６に記載の発現構築物。
【請求項８】
前記タンパク質が、シルクまたはシルク様タンパク質であって、任意で、前記タンパク質が、配列番号１７を含む、または配列番号１７の複数のコピーを含む、請求項１に記載の発現構築物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現構築物を含む組み換えベクターであって、任意で、
前記発現構築物が、複数のコピーで存在する、または
前記ベクターが、ＰＡＲＳを含む、
組み換えベクター。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現構築物を含む組み換え宿主細胞。
【請求項１１】
酵母細胞であり、任意で、出芽酵母細胞またはメチロトローフ酵母細胞である、請求項１０に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１２】
ピキア種である、またはピキア・パストリスである、請求項１１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１３】
前記発現構築物が、前記組み換え宿主細胞のゲノム内に安定して組み込まれている、
前記発現構築物が、前記組み換え宿主細胞において染色体外に維持されている、または
前記組み換え宿主細胞により産生される前記タンパク質の総収量の少なくとも３０重量％の分泌収量である、前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質を産生する、
請求項１０に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞及び培養培地を含む、発酵であって、任意で、
前記発酵が、前記組み換え宿主細胞により産生される前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質の総収量の少なくとも３０重量％を分泌タンパク質として含む、または、
前記発酵の前記培養培地が、前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質を少なくとも０．５ｇ／Ｌ含む、
発酵。
【請求項１５】
タンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）培養培地中で請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組み換え宿主細胞を培養して、請求項１４に記載の発酵を得るステップ、及び
（ｂ）前記培養培地から前記タンパク質を抽出するステップ
を含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
従って、必要なものは、組み換え宿主細胞における過剰発現の負の影響を緩和しながら、望ましい組み換えタンパク質の発現の増加を可能にする方法及び組成物である。
[本発明1001]
発現構築物であって、組み換え分泌シグナルに作動可能に連結されているタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、前記組み換え分泌シグナルがリーダーペプチド及びシグナルペプチドを含み、前記リーダーペプチドが天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）、または配列番号1と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体であり、前記シグナルペプチドがｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）を含まない、前記発現構築物。
[本発明1002]
前記機能的変異体が、1つまたは2つの置換アミノ酸を含む天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1003]
前記機能的変異体が、配列番号2である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1004]
前記機能的変異体が、配列番号1と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1001の発現構築物。
[本発明1005]
前記シグナルペプチドが表1から選択されるか、または、表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1006]
前記機能的変異体が、表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも85％、少なくとも90％同一、少なくとも95％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1005の発現構築物。
[本発明1007]
前記組み換え分泌シグナルが表2から選択されるか、または、表2から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1008]
前記組み換え分泌シグナルが、表2から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1001の発現構築物。
[本発明1009]
前記ポリヌクレオチド配列が、複数のコピーで存在する、本発明1001の発現構築物。
[本発明1010]
前記ポリヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されている、本発明1001の発現構築物。
[本発明1011]
前記プロモーターが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｐＧＣＷ14プロモーターである、本発明1010の発現構築物。
[本発明1012]
前記プロモーターが、ピキア・パストリスのｐＧＡＰプロモーターである、本発明1010の発現構築物。
[本発明1013]
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、本発明1010の発現構築物。
[本発明1014]
前記タンパク質が、シルクまたはシルク様タンパク質である、本発明1001の発現構築物。
[本発明1015]
前記タンパク質が、配列番号17を含む、本発明1014の発現構築物。
[本発明1016]
前記タンパク質が、配列番号17の複数のコピーを含む、本発明1014の発現構築物。
[本発明1017]
本発明1001〜1016のいずれかの発現構築物を含む組み換えベクター。
[本発明1018]
前記発現構築物が、複数のコピーで存在する、本発明1017の組み換えベクター。
[本発明1019]
前記ベクターが、ＰＡＲＳを含む、本発明1017の組み換えベクター。
[本発明1020]
本発明1001〜1016のいずれかの発現構築物を含む組み換え宿主細胞。
[本発明1021]
酵母細胞である、本発明1020の組み換え宿主細胞。
[本発明1022]
出芽酵母細胞である、本発明1021の組み換え宿主細胞。
[本発明1023]
メチロトローフ酵母細胞である、本発明1021の組み換え宿主細胞。
[本発明1024]
ピキア種である、本発明1022の組み換え宿主細胞。
[本発明1025]
ピキア・パストリスである、本発明1023の組み換え宿主細胞。
[本発明1026]
前記発現構築物が、前記組み換え宿主細胞のゲノム内に安定して組み込まれている、本発明1020の組み換え宿主細胞。
[本発明1027]
前記発現構築物が、前記組み換え宿主細胞において染色体外に維持されている、本発明1020の組み換え宿主細胞。
[本発明1028]
前記組み換え宿主細胞により産生される前記タンパク質の総収量の少なくとも30重量％の分泌収量である、前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質を産生する、本発明1020の組み換え宿主細胞。
[本発明1029]
本発明1020〜1028のいずれかの組み換え宿主細胞及び培養培地を含む、発酵。
[本発明1030]
前記組み換え宿主細胞により産生される前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質の総収量の少なくとも30重量％を分泌タンパク質として含む、本発明1029の発酵。
[本発明1031]
前記発酵の前記培養培地が、前記発現構築物に含まれる前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる前記タンパク質を少なくとも0．5ｇ／Ｌ含む、本発明1029の発酵。
[本発明1032]
タンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）培養培地中で本発明1020〜1028のいずれかの組み換え宿主細胞を培養して、本発明1029〜1031のいずれかの発酵を得るステップ、及び
（ｂ）前記培養培地から前記タンパク質を抽出するステップ
を含む、前記方法。