【手続補正書】
【提出日】令和2年12月2日(2020.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物核酸配列を含んでなるＣａｓ９タンパク質をコードする核酸分子であって、前記真核生物核酸配列が、少なくとも１７ヌクレオチド長であって、前記Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含んでなるか、またはそれに隣接する、核酸分子。
【請求項２】
前記ＰＡＭに隣接する前記真核生物核酸配列の一部に相補的な標的化ドメインを含んでなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードする、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
前記ｇＲＮＡの前記標的化ドメインが１６〜２４ヌクレオチド長である、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記真核生物核酸配列がＣａｓ９コード配列中にある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
前記真核生物核酸配列が前記Ｃａｓ９タンパク質の修飾部分をコードする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６】
前記真核生物核酸配列が、その３'および５'各末端に、グリシン、アラニン、またはバリンのための少なくとも１つのコドンを含む核酸分子の部分内にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項７】
ポリペプチドをコードする前記真核生物核酸配列を含んでなる前記核酸分子の部分が、Ｇ−（Ｘ）６〜１０−Ｇの配列を含んでなる、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、
Ｅ２７１＿Ｎ２７２ｉｎｓＧＸ６〜１０Ｇ；
Ｌ３７１＿Ｎ３７２ｉｎｓＧＸ６〜１０Ｇ；および
Ｑ７３７＿Ａ７３８ｉｎｓＧＸ６〜１０Ｇ
からなる群から選択される、配列番号２に対するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項９】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、前記Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端またはその付近に、配列番号２に対するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、配列番号３〜５および１０からなる群から選択される配列と、少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
ｃ．８１３＿８１４ｉｎｓＮ２４〜３６；
ｃ．１１１３＿１１１４ｉｎｓＮ２４〜３６；および
ｃ．２２１１＿２２１２ｉｎｓＮ２４〜３６
からなる群から選択される、配列番号６に対する挿入を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１２】
Ｃａｓ９タンパク質コード配列のＮ末端またはその付近に、配列番号６に対する挿入を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
配列番号７〜９および１１からなる群から選択される配列と、少なくとも約９５％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
配列番号１と少なくとも約８０％の配列同一性を有する配列を含んでなり、ｃ．１５７ｉｎｓＮ１９〜３６の挿入を含んでなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＣａｓ９タンパク質を含んでなる、一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項１６】
前記システムが、細胞内因性標的遺伝子と前記Ｃａｓ９タンパク質の発現との双方を改変する、請求項１５に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項１７】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質タンパク質の少なくとも約８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項１５または１６に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ウイルスベクター。
【請求項１９】
前記ウイルスベクターを使用して、細胞内因性標的遺伝子と前記Ｃａｓ９タンパク質の発現との双方が改変される、請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２０】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１８または１９に記載のベクター。
【請求項２１】
前記ｇＲＮＡの標的部位が前記ベクター骨格内にある、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２２】
配列番号１と少なくとも約９５％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる、請求項２０または２１に記載のベクター。
【請求項２３】
真核生物核酸配列に相補的な標的化ドメインを含んでなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および
真核生物ヌクレオチド配列とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを含んでなる核酸分子によってコードされる、操作されたＣａｓ９タンパク質
を含んでなり、前記ＰＡＭが、前記Ｃａｓ９タンパク質によって認識され、前記真核生物ヌクレオチド配列中にあるか、またはそれに隣接する、一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項２４】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項２３に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項２５】
前記ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が前記核酸分子を切断するように適合されている、請求項２４に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項２６】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質が、前記真核生物ヌクレオチド配列によって少なくとも部分的にコードされるアミノ酸挿入または置換を含んでなる、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項２７】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質の少なくとも約８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項２８】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質が、Ｇ−（Ｘ）６〜１０−Ｇの配列を有するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項２６または２７に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項２９】
配列番号２に対する前記アミノ酸挿入が、
Ｅ２７１＿Ｎ２７２ｉｎｓＧＸ６〜１０Ｇ；
Ｌ３７１＿Ｎ３７２ｉｎｓＧＸ６〜１０Ｇ；および
Ｑ７３７＿Ａ７３８ｉｎｓＧＸ６〜１０Ｇ
からなる群から選択される、請求項２８に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３０】
配列番号２に対する前記アミノ酸挿入が、Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端またはその付近にある、請求項２９に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３１】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質が、配列番号３〜５および１０からなる群から選択される配列と、少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３２】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸分子が、
ｃ．８１３＿８１４ｉｎｓＮ２４〜３６；
ｃ．１１１３＿１１１４ｉｎｓＮ２４〜３６；および
ｃ．２２１１＿２２１２ｉｎｓＮ２４〜３６
からなる群から選択される、配列番号６に対する挿入を含んでなる、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３３】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸分子が、Ｃａｓ９タンパク質コード配列のＮ末端またはその付近にある、配列番号６に対する挿入を含んでなる、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３４】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする核酸分子が、配列番号７〜９および１１からなる群から選択される配列と、少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含んでなる、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３５】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質が、操作されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３６】
細胞内因性標的遺伝子とＣａｓ９タンパク質の発現との双方の改変に使用するための請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３７】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項３６に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３８】
前記Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ複合体が、前記操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする前記核酸分子と前記細胞内因性標的遺伝子をコードする核酸分子との双方を切断するように適合されている、請求項３７に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項３９】
少なくとも１７ヌクレオチド長の真核生物核酸配列によって少なくとも部分的にコードされるアミノ酸挿入または置換を含んでなる、Ｃａｓ９タンパク質。
【請求項４０】
前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質の少なくとも約８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項３９に記載のＣａｓ９タンパク質。
【請求項４１】
前記真核生物核酸配列が哺乳類配列である、請求項３９または４０に記載のＣａｓ９タンパク質。
【請求項４２】
前記真核生物核酸配列が、前記操作されたＣａｓ９タンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含んでなるか、またはそれに隣接する、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のＣａｓ９タンパク質。
【請求項４３】
前記真核生物核酸配列が、前記ＰＡＭに隣接する少なくとも１７ヌクレオチドを含んでなる、請求項４２に記載のＣａｓ９タンパク質。
【請求項４４】
Ｇ−（Ｘ）６〜１０−Ｇの配列を有する挿入を含んでなる、請求項３９〜４３のいずれか一項に記載のＣａｓ９タンパク質。
【請求項４５】
挿入が、
Ｅ２７１＿Ｎ２７２ｉｎｓＧＸ６〜１０Ｇ；
Ｌ３７１＿Ｎ３７２ｉｎｓＧＸ６〜１０Ｇ；および
Ｑ７３７＿Ａ７３８ｉｎｓＧＸ６〜１０Ｇ
からなる群から選択される、請求項３９または４４に記載のＣａｓ９タンパク質。
【請求項４６】
挿入が、前記Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端またはその付近にある、請求項３９〜４４のいずれか一項に記載のＣａｓ９タンパク質。
【請求項４７】
配列番号３〜５および１０からなる群から選択される配列に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項３９〜４６のいずれか一項に記載のＣａｓ９タンパク質。
【請求項４８】
請求項３９〜４７のいずれか一項に記載のＣａｓ９タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項４９】
細胞内の標的部位の改変に使用するための請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項５０】
前記操作されたＣａｓ９タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣａｓ９／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体が、前記操作されたＣａｓ９タンパク質をコードする前記核酸分子と前記細胞内の前記標的部位との双方を切断するように適合されている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
真核生物核酸配列を含んでなるＣｐｆ１  Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸分子であって、前記真核生物核酸配列が少なくとも１７ヌクレオチド長であり、前記Ｃａｓ９タンパク質によって認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含んでなるか、またはそれに隣接する、核酸分子。
【請求項５３】
前記ＰＡＭに隣接する前記核酸配列の部分と相補的な標的化ドメインを含んでなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらにコードする、請求項５２に記載の核酸分子。
【請求項５４】
前記ｇＲＮＡの標的化ドメインが１６〜２４ヌクレオチド長である、請求項５２または５３に記載の核酸分子。
【請求項５５】
前記真核生物核酸配列がＣｐｆ１コード配列中にある、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５６】
前記真核生物核酸配列が前記Ｃｐｆ１タンパク質の修飾部分をコードする、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５７】
前記真核生物核酸配列が、その３'および５'各末端に、グリシンのための少なくとも１つのコドンを含む核酸分子の部分内にある、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５８】
ポリペプチドをコードする前記真核生物核酸配列を含んでなる前記核酸分子の部分が、Ｇ−（Ｘ）６〜１０−Ｇの配列を含んでなる、請求項５７に記載の核酸分子。
【請求項５９】
前記Ｃｐｆ１タンパク質が、
アミノ酸位置１４７と１４８の間、
アミノ酸位置４８４と４９２の間の任意の箇所、
アミノ酸位置５６８と５９０の間の任意の箇所、
アミノ酸位置７９５と８５５の間の任意の箇所、
アミノ酸位置１１３１と１１４０の間の任意の箇所、および
アミノ酸位置１１６０と１１７３の間の任意の箇所
からなる群から選択される位置に、配列番号１３に対するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６０】
前記Ｃｐｆ１タンパク質が、前記Ｃｐｆ１タンパク質のＮ末端またはその付近に、配列番号１３に対するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６１】
前記Ｃｐｆ１タンパク質が、配列番号１３と少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項５２〜６０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６２】
核酸位置４４１と４４２の間、
核酸位置１４５２と１４７４の間の任意の箇所、
核酸位置１７０４と１７６８の間の任意の箇所、
核酸位置２３８５と２５６３の間の任意の箇所、
核酸位置３３９３と３４１８の間の任意の箇所、および
核酸位置３４８０と３５１７の間の任意の箇所
からなる群から選択される位置に、配列番号１４に対する挿入を含んでなり、前記挿入が前記核酸分子の読み枠を改変しない、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６３】
Ｃｐｆ１タンパク質コード配列のＮ末端またはその付近に、配列番号１４に対する挿入を含んでなる、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６４】
配列番号１４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる、請求項５２〜６３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項６５】
請求項５２〜６４のいずれか一項に記載の核酸分子によってコードされるＣａｓ９タンパク質を含んでなる、一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項６６】
前記システムが、細胞内因性標的遺伝子と前記Ｃｐｆ１タンパク質との双方を改変する、請求項６５に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項６７】
前記Ｃｐｆ１タンパク質が、野生型Ｃｐｆ１タンパク質の少なくとも約８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項６５または６６に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項６８】
請求項５２〜６４のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ウイルスベクター。
【請求項６９】
一過性活性ゲノム編集システムであって、前記一過性発現ゲノム編集システムが、
真核生物核酸配列に相補的な標的化ドメインを含んでなるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）；および
前記真核生物ヌクレオチド配列とプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）とを含んでなる核酸分子によってコードされる、操作されたＣｐｆ１タンパク質
を含んでなり、前記ＰＡＭが、前記ＣｐＦ１タンパク質によって認識され、前記真核生物ヌクレオチド配列中にあるか、またはそれに隣接する、一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７０】
前記操作されたＣｐｆ１タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項６９に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７１】
前記Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体が、前記操作されたＣｐｆ１タンパク質をコードする前記核酸分子を切断するように適合されている、請求項７０に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７２】
前記Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体が、前記操作されたＣｐｆ１タンパク質をコードする前記核酸と前記細胞内の前記標的部位との双方を切断するように適合されている、請求項７０に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７３】
前記操作されたＣｐｆ１タンパク質が、前記真核生物ヌクレオチド配列によって少なくとも部分的にコードされるアミノ酸挿入または置換を含んでなる、請求項６９〜７２のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７４】
前記操作Ｃｐｆ１タンパク質が、野生型Ｃｐｆ１タンパク質の少なくとも約８０％のヌクレアーゼ活性を有する、請求項６９〜７３のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７５】
前記真核生物核酸配列を含んでなる前記核酸分子の部分が、Ｇ−（Ｘ）６〜１０−Ｇの配列を含んでなるポリペプチドをコードする、請求項６９〜７４のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７６】
前記Ｃｐｆ１タンパク質が、
アミノ酸位置１４７と１４８の間、
アミノ酸位置４８４と４９２の間の任意の箇所、
アミノ酸位置５６８と５９０の間の任意の箇所、
アミノ酸位置７９５と８５５の間の任意の箇所、
アミノ酸位置１１３１と１１４０の間の任意の箇所、および
アミノ酸位置１１６０と１１７３の間の任意の箇所
からなる群から選択される位置に、配列番号１３に対するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７７】
前記Ｃｐｆ１タンパク質が、前記Ｃｐｆ１タンパク質のＮ末端またはその付近に、配列番号１３に対するアミノ酸挿入を含んでなる、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７８】
前記Ｃｐｆ１タンパク質が、配列番号１３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項７９】
核酸位置４４１と４４２の間、
核酸位置１４５２と１４７４の間の任意の箇所、
核酸位置１７０４と１７６８の間の任意の箇所、
核酸位置２３８５と２５６３の間の任意の箇所、
核酸位置３３９３と３４１８の間の任意の箇所、および
核酸位置３４８０と３５１７の間の任意の箇所
からなる群から選択される位置に、配列番号１４に対する挿入を含んでなり、前記挿入が前記核酸分子の読み枠を改変しない、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項８０】
Ｃｐｆ１タンパク質コード配列のＮ末端またはその付近に、配列番号１４に対する挿入を含んでなる、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項８１】
配列番号１４と少なくとも約９５％の配列同一性を有する核酸配列を含んでなる、請求項６９〜７５のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項８２】
細胞内の標的部位の改変に使用するための請求項６９〜８１のいずれか一項に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項８３】
前記操作されたＣｐｆ１タンパク質および前記ｇＲＮＡがＣｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体を形成する、請求項８２に記載の一過性活性ゲノム編集システム。
【請求項８４】
前記Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体が、前記操作されたＣｐｆ１タンパク質をコードする前記核酸と前記細胞内の前記標的部位との双方を切断するように適合されている、請求項８３に記載の一過性活性ゲノム編集システム。