【手続補正書】
【提出日】令和3年4月12日(2021.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プール前駆細胞集団を同期する方法であって、前記プール前駆細胞集団を、同期したプール前駆細胞集団を産生するのに十分な期間にわたって、同期条件に曝露するステップを含み、
前記プール前駆細胞集団は、２体以上のドナーに由来する多能性幹細胞を含み、
前記同期条件が、ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤、およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）経路阻害剤を含む化合物カクテルを含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記プール前駆細胞集団は、約１０体のドナー〜約１，０００体のドナーに由来する多能性幹細胞を含む、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、または、胚盤葉上層幹細胞である、方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法において、前記ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ阻害剤である、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法において、前記ＭＥＫ／ＥＲＫ経路阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１である、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法において、ＧＳＫ３経路阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法において、前記同期したプール前駆細胞集団を産生するのに十分な期間は、約１〜６日間である、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法において、前記化合物カクテルが、
エストロゲン関連受容体ガンマ（ＥＲＲγ）アゴニスト、ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤、および１型トランスフォーミング成長因子−ｂ（ＴＧＦＢ）受容体経路阻害剤、をさらに含む、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、前記ＥＲＲγアゴニストは、ＧＳＫ５１８２である、方法。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の方法において、前記ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤は、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤である、方法。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか１つに記載の方法において、前記ＲＨＯ／ＲＯＣＫ経路阻害剤は、Ｙ−２７６３２である、方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１つに記載の方法において、前記ＴＧＦＢ受容体経路阻害剤は、Ａ−８３−０１である、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１つに記載の方法において、前記同期条件が、低酸素培養条件をさらに含む、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、前記低酸素培養条件は、約２％Ｏ２〜約５％Ｏ２である、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１つに記載の方法であって、前記同期したプール前駆細胞集団を、前記同期したプール前駆細胞集団を同期した分化細胞集団に分化させるのに十分な期間および条件下で培養するステップをさらに含む、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記同期した分化細胞集団は、胚体内胚葉、中胚葉、後方前腸、内皮、肝細胞、またはオルガノイドを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記同期した分化細胞集団は、胚体内胚葉を含み、前記胚体内胚葉は、２体以上のドナーからの細胞を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法において、前記同期した分化細胞集団は、オルガノイド組成物を含み、前記オルガノイド組成物が２体以上のドナー由来の細胞を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法であって、ドナー特異的プライマーを使用して、前記同期したプール前駆細胞集団または前記同期した分化細胞集団の細胞培養上清中の環境ＤＮＡを増幅することにより、前記同期したプール前駆細胞集団または前記同期した分化細胞集団におけるそれぞれのドナーの相対比を検出する工程をさらに含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、前記同期したプール前駆細胞集団または前記同期した分化細胞集団を化合物と接触させる工程と、前記化合物と接触させた後、ドナー特異的プライマーを使用して前記同期したプール前駆細胞集団または前記同期した分化細胞集団の細胞培養上清中の環境ＤＮＡを増幅することにより、前記同期したプール前駆細胞集団または前記同期した分化細胞集団におけるそれぞれのドナーの相対比変化を決定する工程とをさらに含む、方法。
【請求項２１】
２体以上のドナー、好ましくは約１０体のドナー〜約１，０００体のドナー由来の分化細胞集団を含む組成物を作製する方法であって、
ａ．前駆細胞集団を、同期したプール内胚葉集団を産生するのに十分な期間にわたって、クローン条件に曝露するステップと、
ｂ．前記プール内胚葉細胞集団を化合物カクテルと接触させるステップであって、前記化合物カクテルが、例えば、ＴＧＦＢ受容体経路阻害剤、好ましくはＡ−８３−０１、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）経路阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１、ＦＧＦ経路刺激剤、好ましくはＦＧＦ２、ＥＧＦ経路刺激剤、好ましくはＥＧＦ、およびＶＥＧＦ経路刺激剤、好ましくはＶＥＧＦを含む、接触させるステップと、を含み、
好ましくは、前記ステップａおよび／または前記ステップｂが、約２％Ｏ２〜約５％Ｏ２の低酸素培養条件下で実行される、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１４のいずれか１つに記載の方法によって産生された同期したプール前駆細胞集団。
【請求項２３】
請求項１５〜１８のいずれか１つに記載の方法によって産生された同期した分化細胞集団。
【請求項２４】
化合物を対象とする特徴について試験する方法であって、前記化合物を請求項２２に記載の前記同期したプール前駆細胞集団、または、請求項２３に記載の前記同期した分化細胞集団と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２５】
前記対象とする特徴が、細胞死、細胞成長、細胞生存、胆汁うっ滞、ミトコンドリア過負荷、ミトコンドリア機能不全を示すＲＯＳ産生、線維症、細胞硬化、線維症、病状に対する有効性、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物が、薬物様分子、治療剤、栄養補給剤、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記同期した分化細胞集団が、肝臓オルガノイドであり、前記対象とする特徴が、ＮＡＦＬＤ、胆汁うっ滞、または、黄疸に対する有効性であり、病状が、前記化合物と接触したときに前記肝臓オルガノイドで誘発される、請求項２４〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２８】
集団におけるドナー個体を特定する方法であって、代表的なプール細胞組成物を作製することと、前記ドナー個体由来の細胞を必要とするレシピエントと免疫学的に適合する細胞を特定することと、を含む、方法。
【請求項２９】
表現型の遺伝的基盤を特定する方法であって、
ａ．１）オルガノイドプールまたは２）分化細胞プールを接触させるステップであって、前記オルガノイドプール、または、前記分化細胞プールは、２体以上のドナーに由来する同期したプール前駆細胞集団に由来する細胞を含む、接触させるステップと、
ｂ．前記オルガノイドプールまたは分化細胞プールを、対象とする物質と接触させるステップと、
ｃ．前記オルガノイドプールまたは分化細胞プールにおける対象とする表現型をアッセイするステップと、
ｄ．前記表現型を前記同期したプール前駆細胞集団由来の遺伝子型と相関させるステップと、を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
大集団の研究に効率的な方法は、当該技術分野における満たされていない要求である。例えば、ある集団における潜在的な新たな薬物または治療の安全性および有効性の研究は、薬物承認のための臨床試験の必要条件である。薬物誘発性肝臓損傷（ＤＩＬＩ）用のリスク化合物の前臨床検出は、依然として薬物開発における重要な課題であり、人間が作り出す予測システムの必要性を浮き彫りにしている。すなわち、臨床試験には費用も時間もかかり、多くの薬物は、多くの場合、臨床試験に多大な投資がなされた後に、毒性および／または有効性の欠如の点で不合格になる。ある集団を代表するインビトロ研究ツールを使用した毒性（具体的には、薬物誘発性肝毒性）または有効性の初期決定により、開発までの時間が短縮され、かつ／または臨床試験参加者が避けられるはずの損傷が回避され、かつ／または薬物の発売に関連する費用が削減され得る。したがって、薬物安全性および有効性研究の集団コホートをスクリーニングするための実行可能なインビトロプラットフォームが非常に望ましいであろう。肝機能障害を有する個体等の脆弱集団における初期検出に有用なスクリーニングがさらに望ましい。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許出願公開第２０１０／００７５２９５号明細書
（特許文献２）  国際公開第２０１５／０７５１７５号
（特許文献３）  米国特許出願公開第２０１３／００９５５６７号明細書
（特許文献４）  米国特許出願公開第２０１４／０２４３２２７号明細書
（非特許文献）
（非特許文献１）  ＲＩＥＤＩＮＧＥＲ  ｅｔ  ａｌ．"Ｒｅｖｅｒｓｉｂ｜ｅ  ｓｈｕｔｄｏｗｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｉｎ  Ｅｈｒｌｉｃｈ  ａｓｃｉｔｅｓ  ｃｅｌｌｓ：  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｓｈｏｒｔ−ｌｉｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ，"  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，０１  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９２  （０１．１２．１９９２）．Ｖｏｌ．２１０，Ｎｏ．２，Ｐｇｓ．３８９−３９８