【手続補正書】
【提出日】令和3年6月8日(2021.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列のライブラリーを調製するための方法であって、
（ａ）標的核酸が第１の増幅を受ける条件下で、核酸試料を前記試料中の１つ以上の標的核酸配列の増幅が可能である複数のアダプターと接触させることと、
（ｂ）もたらされる第１の増幅生成物を消化して、もたらされるプライマーダイマーを低減または排除し、かつ部分的に消化された標的アンプリコンを調製すること、ギャップのある二本鎖アンプリコンを生成すること、次いで前記部分的に消化された標的アンプリコンを修復することと、
（ｃ）前記修復された標的アンプリコンを第２の増幅においてユニバーサルプライマーを使用して増幅することと、
それにより標的核酸配列のライブラリーを生成することとを含み、
前記複数のアダプターのそれぞれが、ユニバーサルハンドル配列と、標的核酸配列と、切断可能な部分と、任意に１つ以上のタグ配列とを含み、少なくとも２個および最大１０万個の標的特異的アダプター対が含まれ、
前記アダプターの前記標的核酸配列が、少なくとも１つの切断可能な部分を含み、前記ユニバーサルハンドル配列が、前記切断可能な部分を含まない、方法。
【請求項２】
任意のタグ配列が、少なくとも１つのアダプターに含まれ、前記切断可能な部分が、前記タグ配列のいずれかの末端に隣接するアダプター配列に含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各ユニバーサル配列の融解温度が、各標的核酸配列および存在する各タグ配列の融解温度よりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
単一の追加のみのワークフロー反応において行われ、高度に多重化された標的とされたライブラリーの迅速な生成を可能にする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アダプターの全てが、タグ配列を含み、前記タグ配列が、該タグ配列のいずれかの末端に隣接する切断可能な基を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）の前記消化および修復が、単一ステップで行われるか、またはステップ（ｂ）の前記消化および修復が、異なる温度で時間的に離れて行われる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記方法ステップの１つ以上が、手動モードもしくは自動モード、またはそれらの組み合わせで行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つの精製ステップをさらに含み、精製ステップがステップ（ｃ）の後にのみ行われてもよく、または第１の精製ステップがステップ（ｂ）の後に行われ第２の精製ステップがステップ（ｃ）の後に行われてもよい、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）の第１の増幅から得られるアダプター−ダイマー副生成物が、もたらされるライブラリーから除去されるか、または増幅された標的核酸の富化集団が、低減した量のアダプター−ダイマー副生成物を含有するか、またはアダプター−ダイマー副生成物が排除される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上の標的核酸配列の増幅が可能である前記複数のアダプターが、少なくとも２つの異なる標的核酸配列の増幅が可能であるアダプター対のマルチプレックスを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数のアダプターの各標的特異的対が、異なるタグ配列を含む最大１６，７７７，２１６個の異なるアダプターの組み合わせを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
生成された各標的特異的アンプリコン配列が、少なくとも１個の異なる配列および最大１０7個の異なる配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸配列のもたらされるライブラリーの配列を分析することをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
分析が、従来のシーケンシング反応、高スループット次世代シーケンシング、標的化多重アレイ配列検出、またはこれらの２つ以上の組み合わせによるシーケンシングを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料中の前記標的核酸配列の少なくとも１つの存在量を決定することをさらに含む、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
分析が、高スループット次世代シーケンシングによって行われ、かつ任意に、シーケンシングが双方向様式で行われ、それにより所定のアンプリコンについて順方向鎖および逆方向鎖の両方で配列リードを生成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
消化試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、アプリンエンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＰＥ１）、ＲｅｃＪｆ、ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）、ＮｔｈエンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび／またはヒトＤＮＡポリメラーゼベータのうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
修復試薬が、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＤＮＡポリメラーゼベータ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび／もしくはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、ならびに／または９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼのうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）における、複数の、ギャップのあるポリヌクレオチド生成物を消化試薬および修復試薬と同時に接触させるか、またはステップ（ｂ）における、複数の、ギャップのあるポリヌクレオチド生成物を消化試薬および修復試薬と順次接触させる、請求項６に記載の方法。
【請求項２０】
消化試薬および修復試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、アプリンエンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＰＥ１）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、７  ＤＮＡリガーゼのうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
消化試薬および修復試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＰＮＫおよびＴ７  ＤＮＡリガーゼのうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法により生成された核酸ライブラリーを含む組成物の、前記核酸ライブラリーの配列の分析のための使用。
【請求項２３】
複数の核酸アダプターを含む組成物であって、前記複数のアダプターのそれぞれが、５’ユニバーサルハンドル配列と、１つ以上のタグ配列と、３’標的核酸配列とを含み、各アダプターが、切断可能な部分を含み、
前記アダプターの前記標的核酸配列が、少なくとも１つの切断可能な部分を含み、切断可能な部分が、前記タグ配列のいずれかの末端に隣接して含まれ、前記ユニバーサルハンドル配列が、前記切断可能な部分を含まず、
少なくとも２個および最大１０万個の標的特異的アダプター対が含まれ、かつ前記アダプターが一本鎖または二本鎖である、組成物。
【請求項２４】
各アダプターユニバーサル配列の融解温度が、同じアダプターに存在する各標的核酸配列および各タグ配列の融解温度よりも高く、かつ任意に、前記アダプターの全てがタグ配列を含み、前記タグ配列は該タグ配列のいずれかの末端に隣接する切断可能な基を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記複数のアダプターの各標的特異的対が、異なるタグ配列を含む最大１６，７７７，２１６個の異なるアダプターの組み合わせを含み、かつ任意に、生成された各標的特異的アンプリコン配列が、少なくとも１つの異なる配列および最大１０7個の異なる配列を含んでもよい、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の組成物を含み、かつ増幅試薬、消化試薬、および修復試薬をさらに含んでもよいキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
ＭｉＳｅｑ配列決定ランは、クラスターを正常に生成し、配列決定およびインデックスリードをもたらした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑでのパネルランの配列決定結果は、５４０チップを使用したＩｏｎ  Ｓ５での標準ＡｍｐｌｉＳｅｑ  ＨＤバージョンランと比較して同様の性能を示す。表７を参照されたい。
【表１０】
2020526195.tif 000001
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕標的核酸配列のライブラリーを調製するための方法であって、
（ａ）標的核酸が第１の増幅を受ける条件下で、核酸試料を前記試料中の１つ以上の標的核酸配列の増幅が可能である複数のアダプターと接触させることと、
（ｂ）もたらされる第１の増幅生成物を消化して、もたらされるプライマーダイマーを低減または排除し、かつ部分的に消化された標的アンプリコンを調製すること、ギャップのある二本鎖アンプリコンを生成すること、次いで前記部分的に消化された標的アンプリコンを修復することと、
（ｃ）前記修復された標的アンプリコンを第２の増幅においてユニバーサルプライマーを使用して増幅することと、
それにより標的核酸配列のライブラリーを生成することとを含み、
前記複数のアダプターのそれぞれが、ユニバーサルハンドル配列と、標的核酸配列と、切断可能な部分と、任意に１つ以上のタグ配列とを含み、少なくとも２個および最大１０万個の標的特異的アダプター対が含まれ、
前記アダプターの前記標的核酸配列が、少なくとも１つの切断可能な部分を含み、前記ユニバーサルハンドル配列が、前記切断可能な部分を含まない、方法。
〔２〕任意のタグ配列が、少なくとも１つのアダプターに含まれ、前記切断可能な部分が、前記タグ配列のいずれかの末端に隣接するアダプター配列に含まれる、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕各ユニバーサル配列の融解温度が、存在する各標的核酸配列および各タグ配列の融解温度よりも高い、前記〔１〕に記載の方法。
〔４〕単一の追加のみのワークフロー反応において行われ、高度に多重化された標的とされたライブラリーの迅速な生成を可能にする、前記〔１〕に記載の方法。
〔５〕前記アダプターの全てが、タグ配列を含み、前記タグ配列が、該タグ配列のいずれかの末端に隣接する切断可能な基を有する、前記〔２〕に記載の方法。
〔６〕ステップ（ｂ）の前記消化および修復が、単一ステップで行われる、前記〔１〕または前記〔２〕に記載の方法。
〔７〕ステップ（ｂ）の前記消化および修復が、異なる温度で時間的に離れて行われる、前記〔１〕に記載の方法。
〔８〕前記方法ステップの１つ以上が、手動モードもしくは自動モード、またはそれらの組み合わせで行われる、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔９〕前記方法ステップのそれぞれが、自動モードで行われる、前記〔８〕に記載の方法。
〔１０〕少なくとも１つの精製ステップをさらに含む、前記〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１〕精製ステップが、ステップ（ｃ）の後にのみ行われる、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕第１の精製ステップが、ステップ（ｂ）の後に行われ、第２の精製ステップが、ステップ（ｃ）の後に行われる、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕ステップ（ａ）の第１の増幅から得られるアダプター−ダイマー副生成物が、もたらされるライブラリーから除去される、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１４〕増幅された標的核酸の富化集団が、低減した量のアダプター−ダイマー副生成物を含有する、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１５〕アダプター−ダイマー副生成物が排除される、前記〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕１つ以上の標的核酸配列の増幅が可能である前記複数のアダプターが、少なくとも２つの異なる標的核酸配列の増幅が可能であるアダプター対のマルチプレックスを含む、前記〔１〕〜〔１５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１７〕前記複数のアダプターの各標的特異的対が、異なるタグ配列を含む最大１６，７７７，２１６個の異なるアダプターの組み合わせを含む、前記〔２〕に記載の方法。
〔１８〕生成された各標的特異的アンプリコン配列が、少なくとも１個の異なる配列および最大１０7個の異なる配列を含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕標的核酸配列のもたらされるライブラリーの配列を分析することをさらに含む、前記〔１〕〜〔１８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２０〕分析が、従来のシーケンシング反応、高スループット次世代シーケンシング、標的化多重アレイ配列検出、またはこれらの２つ以上の組み合わせによるシーケンシングを含む、前記〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕前記試料中の前記標的核酸配列の少なくとも１つの存在量を決定することをさらに含む、前記〔１９〕または前記〔２０〕に記載の方法。
〔２２〕分析が、高スループット次世代シーケンシングによって行われる、前記〔２０〕に記載の方法。
〔２３〕シーケンシングが、双方向様式で行われ、それにより所定のアンプリコンについて順方向鎖および逆方向鎖の両方で配列リードを生成する、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕消化試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、アプリンエンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＰＥ１）、ＲｅｃＪｆ、ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）、ＮｔｈエンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび／またはヒトＤＮＡポリメラーゼベータのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む、前記〔１〕〜〔２３〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕修復試薬が、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＤＮＡポリメラーゼベータ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび／もしくはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、ならびに／または９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む、前記〔１〕〜〔２４〕のいずれかに記載の方法。
〔２６〕ステップ（ｂ）における、複数の、ギャップのあるポリヌクレオチド生成物を消化および修復試薬と同時に接触させるか、またはステップ（ｂ）における、複数の、ギャップのあるポリヌクレオチド生成物を消化および修復試薬と順次接触させる、前記〔６〕または前記〔７〕に記載の方法。
〔２７〕消化および修復試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、アプリンエンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＰＥ１）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、７  ＤＮＡリガーゼのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む、前記〔１〕〜〔２６〕のいずれかに記載の方法。
〔２８〕消化および修復試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＰＮＫおよびＴ７  ＤＮＡリガーゼのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む、前記〔１〕〜〔２７〕のいずれかに記載の方法。
〔２９〕前記〔１〕〜〔２８〕のいずれか一項に記載の方法により生成された核酸ライブラリーを含む組成物。
〔３０〕前記核酸ライブラリーの配列の分析のための、前記〔２９〕に記載の組成物の使用。
〔３１〕標的核酸配列のライブラリーを調製するための方法であって、
（ｄ）標的核酸が第１の増幅を受ける条件下で、核酸試料を前記試料中の１つ以上の標的核酸配列の増幅が可能である複数のアダプターと接触させることと、
（ｅ）もたらされる第１の増幅生成物を消化して、もたらされるプライマーダイマーを低減または排除し、かつ部分的に消化された標的アンプリコンを調製すること、ギャップのある二本鎖アンプリコンを生成すること、次いで前記部分的に消化された標的アンプリコンを修復することと、
（ｆ）前記修復された標的アンプリコンを第２の増幅においてユニバーサルプライマーを使用して増幅することと、
それにより標的核酸配列のライブラリーを生成することとを含み、
前記複数のアダプターのそれぞれが、ユニバーサルハンドル配列と、１つ以上のタグ配列と、標的核酸配列と、切断可能な部分とを含み、少なくとも２個および最大１０万個の標的特異的アダプター対が含まれ、
前記アダプターの前記標的核酸配列が、少なくとも１つの切断可能な部分を含み、切断可能な部分が、前記タグ配列の隣接するいずれかの末端に含まれ、前記ユニバーサルハンドル配列が、前記切断可能な部分を含まない、方法。
〔３２〕各ユニバーサル配列の融解温度が、存在する各標的核酸配列および各タグ配列の融解温度よりも高い、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕単一の追加のみのワークフロー反応において行われ、高度に多重化された標的とされたライブラリーの迅速な生成を可能にする、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３４〕前記アダプターの全てが、タグ配列を含み、前記タグ配列が、該タグ配列のいずれかの末端に隣接する切断可能な基を有する、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３５〕ステップ（ｂ）の前記消化および修復が、単一ステップで行われる、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３６〕ステップ（ｂ）の前記消化および修復が、異なる温度で時間的に離れて行われる、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３７〕前記方法ステップの１つ以上が、手動モードもしくは自動モード、またはそれらの組み合わせで行われる、前記〔３１〕〜〔３６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔３８〕前記方法ステップのそれぞれが、自動モードで行われる、前記〔３７〕に記載の方法。
〔３９〕少なくとも１つの精製ステップをさらに含む、前記〔３１〕〜〔３８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４０〕精製ステップが、ステップ（ｃ）の後にのみ行われる、前記〔３９〕に記載の方法。
〔４１〕第１の精製ステップが、ステップ（ｂ）の後に行われ、第２の精製ステップが、ステップ（ｃ）の後に行われる、前記〔４０〕に記載の方法。
〔４２〕ステップ（ａ）の第１の増幅から得られるアダプター−ダイマー副生成物が、もたらされるライブラリーから除去される、前記〔４１〕に記載の方法。
〔４３〕増幅された標的核酸の富化集団が、低減した量のアダプター−ダイマー副生成物を含有する、前記〔４１〕に記載の方法。
〔４４〕アダプター−ダイマー副生成物が排除される、前記〔４３〕に記載の方法。
〔４５〕１つ以上の標的核酸配列の増幅が可能である前記複数のアダプターが、少なくとも２つの異なる標的核酸配列の増幅が可能であるアダプター対のマルチプレックスを含む、前記〔３１〕〜〔４３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４６〕前記複数のアダプターの各標的特異的対が、異なるタグ配列を含む最大１６，７７７，２１６個の異なるアダプターの組み合わせを含む、前記〔３１〕に記載の方法。
〔４７〕生成された各標的特異的アンプリコン配列が、少なくとも１個の異なる配列および最大１０7個の異なる配列を含む、前記〔４６〕に記載の方法。
〔４８〕標的核酸配列のもたらされるライブラリーの配列を分析することをさらに含む、前記〔３１〕〜〔４７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔４９〕分析が、従来のシーケンシング反応、高スループット次世代シーケンシング、標的化多重アレイ配列検出、またはこれらの２つ以上の組み合わせによるシーケンシングを含む、前記〔４８〕に記載の方法。
〔５０〕前記試料中の前記標的核酸配列の少なくとも１つの存在量を決定することをさらに含む、前記〔４８〕または前記〔４９〕に記載の方法。
〔５１〕分析が、高スループット次世代シーケンシングによって行われる、前記〔４９〕に記載の方法。
〔５２〕シーケンシングが、双方向様式で行われ、それにより所定のアンプリコンについて順方向鎖および逆方向鎖の両方で配列リードを生成する、前記〔５１〕に記載の方法。
〔５３〕消化試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、アプリンエンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＰＥ１）、ＲｅｃＪｆ、ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）、ＮｔｈエンドヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよび／またはヒトＤＮＡポリメラーゼベータのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む、前記〔３１〕〜〔５２〕のいずれかに記載の方法。
〔５４〕修復試薬が、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＤＮＡポリメラーゼベータ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼおよび／もしくはＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、ならびに／または９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む、前記〔３１〕〜〔５３〕のいずれかに記載の方法。
〔５５〕ステップ（ｂ）における、複数の、ギャップのあるポリヌクレオチド生成物を消化および修復試薬と同時に接触させるか、またはステップ（ｂ）における、複数の、ギャップのあるポリヌクレオチド生成物を消化および修復試薬と順次接触させる、前記〔５４〕または前記〔５５〕に記載の方法。
〔５６〕消化および修復試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、アプリンエンドヌクレアーゼ（例えば、ＡＰＥ１）、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、７  ＤＮＡリガーゼのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む、前記〔３１〕〜〔５６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５７〕消化および修復試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、ホルムアミドピリミジン［ｆａｐｙ］−ＤＮＡグリコシラーゼ（ｆｐｇ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｐｅｒＦｉＵ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＰＮＫおよびＴ７  ＤＮＡリガーゼのうちのいずれか１つまたは組み合わせを含む、前記〔３１〕〜〔５６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５８〕前記〔３１〕〜〔５７〕のいずれか一項に記載の方法により生成された核酸ライブラリーを含む組成物。
〔５９〕前記核酸ライブラリーの配列の分析のための、前記〔５８〕に記載の組成物の使用。
〔６０〕試料中の低頻度対立遺伝子の存在の決定のための、前記〔５９〕に記載の使用。
〔６１〕複数の核酸アダプターを含む組成物であって、前記複数のアダプターのそれぞれが、５’ユニバーサルハンドル配列と、１つ以上のタグ配列と、３’標的核酸配列とを含み、各アダプターが、切断可能な部分を含み、
前記アダプターの前記標的核酸配列が、少なくとも１つの切断可能な部分を含み、切断可能な部分が、前記タグ配列のいずれかの末端に隣接して含まれ、前記ユニバーサルハンドル配列が、前記切断可能な部分を含まず、
少なくとも２個および最大１０万個の標的特異的アダプター対が含まれる、組成物。
〔６２〕各アダプターユニバーサル配列の融解温度が、同じアダプターに存在する各標的核酸配列および各タグ配列の融解温度よりも高い、前記〔６１〕に記載の組成物。
〔６３〕前記組成物が、高度に多重化された標的とされたライブラリーの迅速な生成を可能にする、前記〔６１〕に記載の組成物。
〔６４〕前記アダプターの全てが、タグ配列を含み、前記タグ配列が、該タグ配列のいずれかの末端に隣接する切断可能な基を有する、前記〔６１〕に記載の組成物。
〔６５〕１つ以上の標的核酸配列の増幅が可能である前記複数のアダプターが、少なくとも２つの異なる標的核酸配列の増幅が可能であるアダプター対のマルチプレックスを含む、前記〔６１〕〜〔６４〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔６６〕前記複数のアダプターの各標的特異的対が、異なるタグ配列を含む最大１６，７７７，２１６個の異なるアダプターの組み合わせを含む、前記〔６１〕に記載の組成物。
〔６７〕生成された各標的特異的アンプリコン配列が、少なくとも１個の異なる配列および最大１０7個の異なる配列を含む、前記〔６６〕に記載の組成物。
〔６８〕前記アダプターが、一本鎖または二本鎖である、前記〔６１〕〜〔６７〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔６９〕前記〔６１〕〜〔６８〕のいずれかに記載のアダプター組成物を含むキット。
〔７０〕増幅試薬、消化試薬、および修復試薬をさらに含む、前記〔６９〕に記載のキット。