【手続補正書】
【提出日】令和3年7月27日(2021.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンカータンパク質を含む少なくとも１つの包埋タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを含む二重層又はミセルであるリン脂質組成物であって、前記アンカータンパク質は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるとともに、
ａ）  酵素である、又は、
ｂ）  アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないタンパク質である、組成物。
【請求項２】
前記リン脂質二重層は、細胞、任意的に間葉系幹細胞又は心筋細胞の表面膜を形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アンカータンパク質は、アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないタンパク質であり、前記アンカータンパク質は、ＣｓｈＡである又は配列番号１９を含むＣｓｈＡの機能的変異体若しくは部分である２次分子に結合する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のリン脂質組成物を含み、薬学的に許容される担体、希釈剤、又はビヒクルをさらに含む、医薬又は外科用組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の組成物を作製する方法であって、
ａ）  タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートを提供するステップ、及び、
ｂ）  前記コンジュゲートにリン脂質二重層又はミセルを接触させるステップを含み、
前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるとともに、（ｉ）酵素である、及び／又は、（ｉｉ）アミノ酸側鎖に共有結合する−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＣＨ３（ＣＨ２）３Ｎ（ＣＨ３）２Ｈ＋リンカーを含まないタンパク質であるアンカータンパク質を含む、方法。
【請求項６】
前記リン脂質二重層は細胞であり、ステップ（ｂ）は、前記細胞を前記コンジュゲートに接触させることと、低くとも約１０℃の温度で少なくとも約２分の時間インキュベートすることと、任意的に、その後前記細胞を洗浄することとを含む、及び／又は、
ステップ（ａ）は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるアンカータンパク質と界面活性剤との静電的コンジュゲーションを可能にする条件下で、前記アンカータンパク質を前記界面活性剤に接触させることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるアンカータンパク質と界面活性剤との静電的コンジュゲーションを可能にする条件下で、前記アンカータンパク質を前記界面活性剤に接触させることを含み、
前記アンカータンパク質は、
ｉ）  アンカー前駆体タンパク質の溶液をＮ，Ｎ’−ジメチル−１，３−プロパンジアミン（ＤＭＰＡ）又はその類似体のｐＨ中和溶液と混合するステップ、及び任意的に、混合物をｐＨ５〜７に調節するステップ、
ｉｉ）  その後又は同時に、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミドハイドロクロライド（ＥＤＣ）などのカルボジイミドを添加するステップ、及び前記混合物をｐＨ４〜７に調節するステップ、
ｉｉｉ）  （ｉｉ）の前記混合物をｐＨ４〜７において０〜２５℃の温度で１〜３０時間かく拌するステップ、
ｉｖ）  水又はバッファーに対して（ｉｉｉ）の前記混合物内の前記タンパク質をｐＨ６．５〜８．５において少なくとも４時間透析するステップ、
ｖ）  必要であれば、（ｉｖ）の前記混合物のｐＨをｐＨ６．５〜８．５に調節するステップ、を含む方法によって得られ、
前記アンカー前駆体タンパク質は酵素であり、さらに、
−  ステップ（ｉｉｉ）は約１２０分以下継続され、及び／又は、
−  前記方法は、ステップ（ｉｖ）、若しくは存在する場合はステップ（ｖ）の前記混合物にサイズ排除クロマトグラフィーを行うステップ（ｖｉ）をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）は、カチオン化タンパク質又はアニオン化タンパク質であるアンカータンパク質と界面活性剤との静電的コンジュゲーションを可能にする条件下で、前記アンカータンパク質を前記界面活性剤に接触させることを含み、
前記アンカータンパク質は、スーパーチャージタンパク質をコードする組換えＤＮＡ配列の発現を含む方法によって得られ、
任意に、前記組換えＤＮＡ配列は、前記スーパーチャージタンパク質と２次分子とを含む融合タンパク質をコードし、
任意に、前記２次分子は、ＣｓｈＡ、配列番号１９を含むＣｓｈＡの機能的変異体若しくは部分、ＯｐｄＡ（配列番号１０若しくは配列番号３９）、トロンビン、プロトロンビン、ＰＩＧＦ−２（配列番号２２）、若しくは配列番号２１を含むＰＩＧＦ−２の機能的変異体若しくは部分、スパイキャッチャーポリペプチド（配列番号２３）、若しくはスパイタグポリペプチド（配列番号２４）の１つ以上を含む、又は非変異体配列に対して少なくとも約６０％の配列同一性を有するこれらのいずれかの機能的変異体を含み、
前記組換えＤＮＡ配列は配列番号４〜７の配列を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質標識で細胞を標識する方法であって、請求項５〜８のいずれかに記載の方法を含み、前記リン脂質二重層が前記細胞の外膜を形成し、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが前記タンパク質標識を含む、方法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のリン脂質組成物を含む組織工学用足場であって、
任意に、前記リン脂質組成物は、そのアンカー前駆体タンパク質形態において組織の成長及び／若しくは治癒を促進することが知られているアンカータンパク質を含む、並びに／又は、前記リン脂質組成物は、組織の成長及び／若しくは治癒を促進することが知られている２次分子を含み、
任意に、前記アンカータンパク質は、カチオン化若しくはスーパーチャージのトロンビン、若しくはトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体、若しくはプロトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体である、並びに／又は、前記２次分子は、トロンビン、プロトロンビン、ＰＩＧＦ−２（配列番号２２）、若しくは配列番号２１を含むＰＩＧＦ−２の機能的変異体若しくは部分である、組織工学用足場。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組織工学用足場を形成するインビトロ又はエクスビボ方法であって、前記リン脂質組成物はアンカータンパク質を含み、
前記方法は、前記タンパク質がカチオン化若しくはスーパーチャージのトロンビン若しくはプロトロンビン、若しくは、トロンビン若しくはプロトロンビンのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体である、又は、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートがトロンビン若しくはプロトロンビン、若しくはトロンビン若しくはプロトロンビンの機能的変異体である２次分子を含む請求項２に記載の細胞を、フィブリノゲン含有ゲル又は構造などのフィブリノゲン組成物に接触させるステップを含む、方法。
【請求項１２】
組織の成長及び／又は治癒を促進するインビトロ又はエクスビボ方法であって、前記アンカータンパク質が前記組織の成長及び／若しくは治癒を促進することで知られている、又は、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが前記組織の成長及び／若しくは治癒を促進することで知られている２次分子を含む請求項２に記載のリン脂質組成物である細胞を、前記組織の成長及び／又は治癒が求められる部位に導入することによって、該細胞を使用するステップを含み、
任意に、前記細胞は間葉系幹細胞であり、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートは、ＰＩＧＦ−２（配列番号２２）又は配列番号２１を含むその機能的変異体若しくは部分である２次分子を含み、
請求項４に記載の組成物又は請求項１０に記載の組織工学用足場を使用するステップを含む、方法。
【請求項１３】
細胞を組織にターゲティングするインビトロ又はエクスビボ方法であって、請求項２に記載のリン脂質組成物である細胞を使用するステップを含み、前記リン脂質二重層が前記細胞の外膜を形成し、前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートが前記組織に特異的なタンパク質を含み、
任意に、前記組織に特異的な前記タンパク質は、前記アンカータンパク質又は２次分子であり、
任意に、前記２次分子は、カチオン化若しくはスーパーチャージの抗体、レクチン、インテグリン、又は接着分子、任意的にＣｓｈＡ（配列番号２０）又は配列番号１９を含むその部分若しくは機能的変異体であり、
任意に、請求項４に記載の組成物又は請求項１０に記載の組織工学用足場を使用するステップを含む、方法。
【請求項１４】
タンパク質を細胞内部に送達するインビトロ又はエクスビボ方法であって、請求項２に記載のリン脂質組成物である細胞を得るため請求項５〜８のいずれかに記載の方法を使用するステップを含み、前記リン脂質二重層が前記細胞の外膜を形成し、さらに前記タンパク質−ポリマー界面活性剤コンジュゲートがエンドサイトーシスのスピード／速度を促進又は抑制する分子を含む、方法。
【請求項１５】
治療における使用のための、請求項１〜３のいずれかに記載のリン脂質組成物、又は請求項４に記載の組成物又は請求項１０に記載の組織工学用足場であって、
任意に、前記組成物は組織の成長及び／又は治癒を促進することが知られているタンパク質を含み、前記使用は前記組織の成長及び／又は治癒の促進における使用、例えば心筋梗塞、心筋症、及び／又は心筋炎の処置の方法における使用であり、
任意に、前記リン脂質組成物は、（ａ）毒物を中和可能な酵素であるアンカータンパク質を含み、又は（ｂ）毒物に結合若しくは毒物を中和可能な２次分子に結合するアンカータンパク質を含み、前記使用は前記毒物に接触した被毒ヒト又は動物の処置における使用であり、
酵素である前記アンカータンパク質は、任意に、カチオン化若しくはスーパーチャージのＯｐｄＡ、若しくは、有機リン化合物を分解することができるそのカチオン化若しくはスーパーチャージの機能的変異体若しくは部分である、又は、前記アンカータンパク質に結合する前記２次分子は、ＯｐｄＡ（配列番号１０若しくは配列番号３９）、若しくは有機リン化合物を分解することができるその機能的変異体若しくは部分である、リン脂質組成物、組成物又は組織工学用足場。
【請求項１６】
配列番号１１、４０若しくはそれらの非変異体配列と少なくとも約９７％の配列同一性を有する機能的変異体、又は配列番号１３〜１６のいずれか、若しくはそれらの非変異体配列と少なくとも約６０％の配列同一性を有するそれらのいずれかの機能的変異体を含む、又は、
スーパーチャージＧＦＰ及び配列番号１０、若しくは１９〜３９のいずれか、若しくはスーパーチャージＧＦＰ及び非変異体配列と少なくとも６０％の配列同一性を有する配列番号１０、若しくは１９〜３９のいずれかの機能的変異体の融合タンパク質を含む、ポリペプチド。