(57)【要約】      （修正有）【課題】抗体よりも簡便に調製可能で、且つ抗体と比べて同等以上の結合性を有する、マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子、及びこの核酸分子を用いた検出キットを提供する。【解決手段】マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子。マウス由来のＩｇＧ抗体への結合を検出する検出キット。上記の核酸分子を含有する試薬。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有することを特徴とする核酸分子。
【請求項２】
マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子であって、
当該核酸分子は、該核酸分子の塩基配列をステム領域と一本鎖領域とに分割して得た二次構造候補のエネルギー関数を最小化することに基づく二次構造予測を用いて得た該核酸分子の二次構造において、ステム長さ３以上のステム領域を当該核酸分子の末端に有することを特徴とする核酸分子。
【請求項３】
前記のステム長さ３以上のステム領域の一本鎖領域側の末端の塩基に隣接する塩基は、アデニン以外の塩基であることを特徴とする請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
前記のステム長さ３以上のステム領域は、グアニン残基及びシトシン残基のみから構成されていることを特徴とする請求項２又は３に記載の核酸分子。
【請求項５】
配列番号１に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項６】
配列番号２に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号３に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項８】
配列番号４に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項９】
配列番号５に記載の配列からなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
配列番号６に記載の配列からなることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１１】
配列番号７に記載の配列からなることを特徴とする請求項１又は３に記載の核酸分子。
【請求項１２】
配列番号８に記載の配列からなることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項１３】
配列番号９に記載の配列からなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１４】
配列番号１０に記載の配列からなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１５】
配列番号１１に記載の配列からなることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項１６】
配列番号１２に記載の配列からなることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸分子。
【請求項１７】
配列番号１９に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１８】
配列番号２０に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項１９】
配列番号２１に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２０】
配列番号２２に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２１】
配列番号２３に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２２】
配列番号２４に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２３】
配列番号２５に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２４】
配列番号２６に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２５】
配列番号２７に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２６】
配列番号２８に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２７】
配列番号２９に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２８】
配列番号３０に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項２９】
配列番号３１に記載の配列からなることを特徴とする請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３０】
ウリジン残基の２’位の水素をフルオロ化したものであることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３１】
前記ＩｇＧ抗体は、サブタイプ１のＩｇＧ抗体、サブタイプ２ａのＩｇＧ抗体及びサブタイプ３のＩｇＧ抗体からなる群から選択されたＩｇＧ抗体であることを特徴とする請求項１乃至３０のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項３２】
マウス由来のＩｇＧ抗体への結合を検出する検出キットであって、
請求項１乃至３１のいずれか一項に記載の核酸分子を含有する試薬を有することを特徴とする検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子、及びこの抗体への結合を検出する検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
マウスや核酸分子等のオリゴヌクレオチドは、主としてタンパク質の合成に関与する分子種としての機能を主として有するものと考えられてきたが、リボザイムやＲＮＡｉといった、遺伝子がタンパク質や高分子等の分子種と直接相互作用することにより、分子種の有する機能を制御し得る現象が見出され、注目されている。なかでも、アプタマーは、近年、タンパク質などの分子種に結合して、その機能を改変し得る核酸として注目されており、医薬品等への応用を目的として、新規のアプタマーが多く取得されている。
【０００３】
一方、マウス、ラット、ウサギなどの実験動物に由来するＩｇＧなどの各クラスに属する抗体は、タンパク質などの抗原や、抗原−抗体複合体を形成し得る抗体など、高分子化合物に水素結合などの結合様式で結合し得るタンパク性の物質を総称する。抗体は、例えば抗原−抗体複合体における抗体に特異的に結合する抗体として、診断薬など医療分野等において広く用いられている。
【０００４】
しかしながら、抗体は、抗原と特異的な活性を有する点で、有用であるものの、抗体の調製には、種々の問題が指摘されている。例えば、抗体を得るには、マウス、ラット、ウサギ等の被免疫動物に抗原を反復的に注入して免疫反応を惹起した後、血清等から、所望する、抗原との結合性を有する画分を調製する必要があり、作業の面でも、コストの面でも、非常に不利である。また、抗体は、この抗体が特異的に結合する抗原以外にも、種々のタンパク質や、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリエチレン（ＰＥ）といった容器等を構成する材料にも非特異的に結合する性質を有しており、ハンドリングの面でも不利である。さらに、抗体の調製には、上述の通り、被免疫動物を用いる必要があり、動物愛護の面からも、好ましいものではない。
【０００５】
また、抗体は、上述の診断薬などに二次抗体として用いる場合、抗原−抗体複合体への結合の程度を分光光度的に検出するため、ペルオキシダーゼ等の標識化合物とのコンジュゲート体として用いられることが多いが、このようなコンジュゲート体の調製は、二次抗体の調製に加えて、さらに煩雑となる。
【０００６】
さらに、現在の抗体市場においては、抗体の由来動物としては、抗体に対応する抗原の由来動物と免疫学的に交叉性を有さない点で、被検動物と異なる動物が挙げられ、例えば、ウサギ、ヤギ、モルモットが含まれる。しかしながら、抗体の由来動物として、マウスも汎用的に用いられており、マウスは、抗体の由来動物として、依然需要の高い動物であると言える。
【０００７】
従って、抗体に代わって、抗原と特異的に結合し得る分子種が所望されていた。
【０００８】
なお、出願人は出願時点までに本発明に関連する公開された先行技術文献を発見することができなかった。よって、先行技術文献情報を開示していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記の従来の問題に鑑みてなされたものであって、抗体よりも簡便に調製可能で、且つ抗体と比べて同等以上の結合性を有する、マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明による核酸分子は、マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有することを特徴とする。
【００１１】
一方、本発明による検出キットは、マウス由来のＩｇＧ抗体への結合を検出する検出キットであって、上記の核酸分子を含有する試薬を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、マウス由来のＩｇＧ抗体と特異的に結合し得る核酸分子を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（本発明による核酸分子）
本発明による核酸分子は、マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有することを特徴とするものである。
【００１４】
本発明において、核酸分子とは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）など種々の核酸を有するヌクレオチドであれば、特に制約はなく、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど、鎖の本数や、核酸が修飾されているか否か等に制約はない。また、本発明による核酸分子は、マウス由来のＩｇＧ抗体への結合の程度に影響を与えない範囲で、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素などのハロゲンや、メチル、エチル、プロピルなどのアルキル基など、適当に置換された核酸分子の置換体も包含する。ＲＮＡに対する修飾核酸としては、そのほかにもＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、チオール化などが挙げられる。
【００１５】
本発明において、マウス由来のＩｇＧ抗体のサブクラスとしては、特に制約はなく、例えば、サブクラス１、サブクラス２ａ及びサブクラス３並びにこれらを任意に有する異なるサブクラスを有するＩｇＧ抗体を混合したものが挙げられる。
【００１６】
本発明による核酸分子は、いわゆるＲＮＡプールなどの核酸分子と、標的物質としてのマウス由来のＩｇＧ抗体とを用いて、核酸分子と標的物質とが特異的に結合して形成される核酸分子／標的物質複合体から、この複合体の形成に関与した核酸分子のみを選択する方法で製造することが可能である。このような方法としては、例えば、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）と称される方法や、アガロースゲルやポリアクリルアミドゲルなどの担体を用いて核酸分子／標的物質複合体を得た後にこの複合体の形成に関与した核酸分子のみを回収する方法などが挙げられる。
【００１７】
（ＳＥＬＥＸ法に準じた本発明による核酸分子の製造方法）
本発明による核酸分子は、ＳＥＬＥＸ法に従って、またこの方法に準じた方法で、ＲＮＡプールと標的物質とを反応させて得られるＲＮＡプール−標的物質複合体を回収した後、この複合体から、この複合体の形成に関与したＲＮＡプールのみを回収して、製造することが可能である。
【００１８】
ＲＮＡプールとは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵからなる群から選択された塩基、及びこの塩基の置換体を２０〜１２０個程度連結した領域（この領域を、以下、「ランダム領域」と称する。）を有する遺伝子配列を総称する遺伝子の混合物をいう。従って、ＲＮＡプールは、４２０〜４１２０（１０１２〜１０７２）種類の複数の遺伝子が含まれ、４３０〜４６０（１０１８〜１０３６）種類の遺伝子が含まれることが好ましい。塩基の置換体としては、フッ素、塩素、臭素及び要素などのハロゲンや、メチル、エチル、プロピルなどのアルキル基など、適当に置換された塩基が挙げられる。また、上記の通り、ＬＮＡ、ＥＮＡ等を用いた修飾、チオール化などされた塩基が挙げられる。
【００１９】
ＲＮＡプールは、ランダム領域を有する限り、その他の構造に制約はないが、本発明による核酸分子をＳＥＬＥＸ法に準じて製造する場合、ランダム領域の５’末端及び／又は３’末端には、後述のＰＣＲ等で利用するプライマー領域や、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域を有することが好ましい。例えば、ランダム領域は、５’末端側からＴ７プロモーターなどのＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識領域（以下、この領域を「ＲＮＡポリメラーゼ認識領域」と称する。）と、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を「５’末端側プライマー領域」と称する。）とを連結し、この５’末端側プライマー領域の３’末端にランダム領域を連結し、さらにこのランダム領域の３’末端側にＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼのプライマー領域（以下、この領域を、「３’末端側プライマー領域」と称する。）を連結した構造を有してもよい。また、ＲＮＡプールは、これらの領域の他に、標的物質への結合を補助する公知の領域を有してもよい。さらに、ＲＮＡプールは、ランダム領域の一部が各ＲＮＡプールにおいて同じ配列を有するものであってもよい。
【００２０】
ランダム領域は、ＲＮＡプールのランダム領域のＵをＴに置き換えた初期プールを鋳型として、ＰＣＲ法に基づいて、遺伝子増幅した後、得た遺伝子産物と、Ｔ７ポリメラーゼ等のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとを反応させて、調製されてもよい。また、初期プールに相補的な遺伝子を合成し、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域と、５’末端側プライマー領域に相補的な配列とからなるプライマーを、初期プールにおいてこのプライマーと相補的な遺伝子にアニーリングさせて、ＰＣＲ法に基づいて、調製されてもよい。
【００２１】
次に、このようにして合成したＲＮＡプールと、標的物質であるマウス由来のＩｇＧ抗体とを水素結合などの分子間力を介して結合させる。この結合方法としては、ＲＮＡプールと標的物質とを、標的物質の結合などの機能が保たれる緩衝液中で一定時間インキュベートする方法が挙げられる。このようにして、緩衝液中でＲＮＡプール−標的物質複合体が形成される。
【００２２】
次に、このように形成されたＲＮＡプール−標的物質複合体を回収する。緩衝液中には、この複合体の他、複合体の形成に関与しなかったＲＮＡプールや標的物質が含まれるが、この複合体の回収方法としては、標的物質に結合性を有する核酸分子を回収することを目的として、緩衝液中に存在する複合体の形成に関与しなかったＲＮＡプールを除去する方法により行えばよい。この方法としては、標的物質及びＲＮＡプールの特定の成分への吸着性の違いを利用する方法や、複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用する方法が挙げられる。
【００２３】
標的物質及びＲＮＡプールの特定の成分への吸着性の違いを利用した方法としては、例えば、ニトロセルロース等の標的物質に吸着性を有する膜を用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を有する緩衝液を濾過し、この膜上にＲＮＡプール−標的物質複合体を吸着させ、その後、膜上に残存したＲＮＡプール−標的物質複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを、例えばこの複合体におけるＲＮＡプールと標的物質との結合を解除した後にＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。
【００２４】
また、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとの分子量の違いを利用した方法としては、アガロースゲルなど、ＲＮＡプールを通過させ得るがＲＮＡプール−標的物質複合体を通過させ得ない程度のポアを有する担体を利用して、ＲＮＡプール−標的物質複合体とＲＮＡプールとを電気的に分離し、この複合体から、複合体の形成に関与したＲＮＡプールを回収する方法が挙げられる。
【００２５】
次に、このようにして得たＲＮＡプール−標的物質複合体から回収した複合体の形成に関与したＲＮＡプールを用いて、遺伝子増幅を行う。この遺伝子増幅の方法としては、ＲＮＡプールに含まれる５’末端側プライマー領域、３’末端側プライマー領域、ＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用する方法が挙げられる。例えば、複合体の形成に関与したＲＮＡプールの３’末端側プライマー領域に相補的な遺伝子断片をプライマーとして用いて、トリ骨髄芽球症ウィルス由来リバーストランスクリプターゼ（ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）などのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応に従ってｃＤＮＡを調製した後、このｃＤＮＡに含まれる５’末端側プライマー領域及び３’末端側プライマー領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応を行い、得た遺伝子産物に含まれるＲＮＡポリメラーゼ認識領域を利用して、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行って、ＲＮＡプールの遺伝子増幅を行ってもよい。
【００２６】
このように遺伝子増幅された複合体の形成に関与したＲＮＡプールと、標的物質とを用いて、上述のＲＮＡプール−標的物質複合体を形成する方法以下の各方法を繰り返し行い、最終的に、標的物質としてのマウス由来のＩｇＧ抗体に特異的に結合する核酸分子、つまり、マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有する核酸分子を得ることができる。
【００２７】
（本発明における二次構造予測）
本発明による核酸分子は、上記の通りに得ることが出来るが、その塩基配列に基づいた二次構造予測の手法を用いた結果を参照して、得た核酸分子の一部を改変されたものであってもよい。この二次構造予測としては、核酸分子の二次構造の候補を探索し、この探索された二次構造候補のうち、エネルギー的に安定な二次構造を予測する方法であれば、特に制約はない。例えば、核酸分子の塩基配列を、ワトソン・クリック型などの塩基対を構成するステム領域と、このステム領域以外の塩基で構成されるループ構造などの一本鎖領域とに分割して得た二次構造候補のエネルギー関数を最小化することに基づく二次構造予測であってもよい。
【００２８】
この二次構造候補のエネルギー関数を最小化することに基づく二次構造予測について、説明する。まず、対象となる核酸分子の塩基配列のうち、ワトソン・クリック型などの塩基対を構成する塩基の候補と、この塩基対候補以外の一本鎖領域の候補とを探索する。探索された塩基対候補及び一本鎖領域候補の全組合せのうち、塩基対候補を構成する塩基と一本鎖領域候補を構成する塩基とが重複するなど、理論的に取り得ない組合せを除いて、二次構造候補を同定する。同定された二次構造候補のうち、二次構造候補のエネルギー関数を算出し、算出されたエネルギー関数が最小となる二次構造を探索する。この際、この二次構造候補のエネルギー関数の算出方法としては、二次構造候補を構成する個々のステム領域及び一本鎖領域の自由エネルギーに基づいて、この二次構造候補における自由エネルギーを、二次構造候補のエネルギー関数とする方法であってもよい。このようにして、同定された二次構造候補のうち、エネルギー関数の最も小さい二次構造を、対象となる核酸分子の塩基配列の二次構造とする。
【００２９】
本発明による核酸分子は、このようにして得た二次構造の結果を参照して、二次構造のうちの特徴ある部位を構成する塩基の置換若しくは欠失によって、又は二次構造のうちの特徴ある部分への塩基の挿入などによって、改変されてもよい。例えば、上記の通り調製した核酸分子を親分子として、二次構造のステム領域及び／又は一本鎖領域を構成する塩基の一部を置換してもよい。また、二次構造のステム領域及び／又は一本鎖領域を構成する塩基の一部を欠失させてもよい。また、二次構造のステム領域及び／又は一本鎖領域に、単数又は複数の塩基を挿入して、ステム長さ及び／又は一本鎖領域の長さを短縮／延長してもよい。
【００３０】
本発明による核酸分子は、この二次構造予測を用いて得た核酸分子の二次構造において、ステム長さ３以上のステム領域を、この核酸分子の末端に有することが好ましい。また、本発明による核酸分子において、ステム長さ３以上のステム領域の一本鎖領域側の末端の塩基に隣接する塩基が、アデニン以外の塩基であることが好ましい。また、本発明による核酸分子において、ステム長さ３以上のステム領域は、グアニン残基及びシトシン残基のみから構成されていることが好ましい。これらにより、マウス由来のＩｇＧ抗体への結合性がさらに向上される。
【００３１】
（本発明による核酸分子の用途等）
本発明による核酸分子は、上記の通り、マウス由来のＩｇＧ抗体に結合性を有することを特徴とするものである。従って、本発明による核酸分子の用途としては、マウス由来のＩｇＧ抗体への結合性を利用する用途であれば特に制約はなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）法に準じて行われる泳動対象物の検出用として、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）の測定の対象物若しくはこの対象物からなる複合体の検出用として、ノースウェスタン法に準じて行われる泳動対象物の検出用として、又はマウス由来のＩｇＧ抗体若しくはこの抗体を利用した精製用として用いられてもよい。
【００３２】
例えば、本発明による核酸分子をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に用いる場合には、泳動されたタンパク質を検出するために用いられてもよく、泳動されたタンパク質を検出するのに用いられたマウス由来のＩｇＧ抗体を検出するのに用いられてもよい。
【００３３】
また、本発明による核酸分子をＥＬＩＳＡ法に用いる場合には、測定の対象となるマウスＩｇＧを検出するのに用いられてもよく、また、測定の対象を検出するために用いられたマウス由来のＩｇＧ抗体を検出するのに用いられてもよい。
【００３４】
また、本発明による核酸分子をノースウェスタン法に用いる場合には、電気泳動の対象となるマウス由来のＩｇＧ抗体を検出するのに用いられてもよく、また、泳動の対象となるタンパク質の検出に用いられるマウス由来のＩｇＧ抗体を検出するのに用いられてもよい。
【００３５】
また、本発明による核酸分子をマウス由来のＩｇＧの精製に用いる場合、精製の対象となるマウス由来のＩｇＧ抗体を精製するのに適当な形態で利用すればよく、例えば、本発明による核酸分子を、アガロースや合成樹脂からなるビーズに結合して、使用してもよい。このようにビーズに結合する形態としては、精製に用いる担体（例えば、アガロースや、合成樹脂からなるビーズ）に結合性を有するように、ビオチン化など、種々の改変が挙げられる。従って、本発明による核酸分子は、ビオチン化などの種々の改変を受けたものであってもよい。
【００３６】
（本発明による核酸分子の応用例）
本発明による核酸分子の応用例としては、得た核酸分子を試薬、この試薬を有するキットなど、マウス由来のＩｇＧ抗体への結合性を利用したものが挙げられる。例えば、上記の本発明による核酸分子を含有する試薬を用いて、マウス由来のＩｇＧ抗体への結合を検出する検出キットとしてもよい。このようなキットの測定対象物としては、溶液、懸濁液のような液体系であってもよく、培養細胞や組織切片など、固形物であってもよい。
【００３７】
また、本発明による検出キットにおいて、本発明による核酸分子以外の試薬としては、標的物質と核酸分子との結合を検出するために必要な物質を適宜選択すればよく、これは、検出キットに用いる核酸分子によって適宜選択すればよい。
【００３８】
例えば、本発明による検出キットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法（ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法）に準じて行うものであってもよく、この場合、検出キットに含まれる試薬としては、電気泳動の対象となるタンパク質の検出に用いるマウスＩｇＧに結合性を有する核酸分子であってもよく、また電気泳動の対象となるマウスＩｇＧに結合性を有する核酸分子であってもよい。
【００３９】
また、本発明による検出キットは、ＥＬＩＳＡ法（酵素免疫測定法；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）に準じて行うものであってもよく、この場合、検出キットに含まれる試薬としては、測定の対象となるマウスＩｇＧに結合性を有する核酸分子が挙げられる。
【００４０】
また、本発明による検出キットは、ノースウェスタン法に準じて行われるものであってもよく、この場合、検出キットに含まれる試薬としては、泳動の対象となるタンパク質の検出に用いられるマウスＩｇＧに結合性を有する核酸分子であってもよく、また電気泳動の対象となるマウスＩｇＧに結合性を有する核酸分子であってもよい。
【実施例】
【００４１】
（製造例１）
配列番号１３に示す初期プールを、北海道システム・サイエンス株式会社に依頼して合成した。この初期プール（５００ｎＭ）と、プライマー１（配列番号１４）と、プライマー２（配列番号１５）と、５Ｕ／μＬのＤＮＡポリメラーゼ（商品名：ＴａＫａＲａ  Ｅｘ−Ｔａｑ、タカラバイオ株式会社製、カタログ番号：ＲＲ００１Ａ）とを用いて、初期プールと、初期プールに相補的な遺伝子鎖とからなるｃＤＮＡを得た。次に、このようにして得たｃＤＮＡと、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＥＲ社製）とを用いて、転写反応を行い、ＲＮＡプール（配列番号１６）を得た。
【００４２】
このようにして得たＲＮＡプールと、下記の標的物質１〜４とを、結合バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中で、室温、２０分間インキュベートした。
【００４３】
標的物質１：マウスＩｇＧ抗体（サンタクルス社製、カタログ番号ｓｃ−２０２５、０．１％アジ化ナトリウム及び０．１％ゼラチンを含有）であって、ゼラチンを取り除くためにカラム（Ｐｒｏ−ｃｈｅｍ社製  ＰＲＯＴＥＵＳ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  カタログ番号ＰＣ−ＭＧＫ１６）で精製したもの
標的物質２：マウス由来抗ＦＬＡＧ−ＩｇＧ抗体（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号Ｆ３１６５、サブタイプ１）
標的物質３：マウス由来抗ＭＢＰ−ＩｇＧ抗体（ＮＥＢ社製、カタログ番号Ｅ８０３２Ｓ、サブタイプ２ａ）
標的物質４：マウス由来抗体ＭＢＰ−ＩｇＧ抗体（ＭＢＬ社製、カタログ番号Ｍ０９１−３、サブタイプ３）
【００４４】
その後、得た混合物について、下記の[ゲル法］に準じて、第一のサイクルを行い、その後、下記の［フィルター法］に準じて、第二から第七のサイクルを行った。
【００４５】
このようにして配列番号１〜４に示すＲＮＡを得た。
【００４６】
［ゲル法］
得た混合物を、１％のアガロースゲルのウェルに導入し、ＴＢ緩衝液（４４．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４４．５ｍＭ  ホウ酸、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）中、１００Ｖで７分間、電気泳動を行った。その後、ウェルに残存する液を回収した。
【００４７】
その後、回収した溶液は、エタノール沈殿を行った。その後、プライマー３（配列番号１７）と、ＡＭＶ由来逆転写酵素トランスクリプターゼ（ロシュ社製）とを用いて、５５℃で、３０分間、及び８５℃で５分間、逆転写反応を行った。
【００４８】
この反応産物全量と、５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｅｘ−Ｔａｑ、タカラバイオ株式会社製）と、３０ｎＭのプライマー１（配列番号１４）と、プライマー２（配列番号１５）とを用いて、９０℃×５０秒、５３℃×７０秒及び７４℃×５０秒の順で行うサイクルを１サイクルとして、３サイクルでＰＣＲ反応を行った。得た液にエタノール沈殿を施し、二本鎖ＤＮＡ産物を得た。
【００４９】
この二本鎖ＤＮＡ産物を８μＬのＲＮａｓｅフリー水に溶解し、そのうち４μＬと、１６μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ溶液（商品名：Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製））とを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。なお、ここまでの工程を１サイクルと定義する。
【００５０】
［フィルター法］
得た混合物を、ポップトップホルダーに固定したニトロセルロース膜に導入してろ過し、膜を１ｍＬの結合バッファーで洗浄した。その後、この膜を４００μＬの溶出バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７Ｍ  尿素）に浸漬して、９０℃、５分間加温した。得た液にエタノール沈殿を施し、オリゴヌクレオチドを得た。
【００５１】
その後、このオリゴヌクレオチド全量と、プライマー３（配列番号１７）と、ＡＭＶ由来逆転写酵素トランスクリプターゼ（１０Ｕ、ロシュ・ダイアグノスティックス社製）とを用いて、５５℃で、３０分間、及び８５℃で５分間、逆転写反応を行った。
【００５２】
この反応産物全量と、５ＵのＤＮＡポリメラーゼ（商品名：Ｅｘ−Ｔａｑ、タカラバイオ株式会社製）と、３０ｎＭのプライマー１（配列番号１４）と、プライマー２（配列番号１５）とを用いて、９０℃×５０秒、５３℃×７０秒及び７４℃×５０秒の順で行うサイクルを１サイクルとして、４サイクル以上でＰＣＲ反応を行った。得た液にエタノール沈殿を施し、二本鎖ＤＮＡ産物を得た。
【００５３】
この二本鎖ＤＮＡ産物を８μＬのＲＮａｓｅフリー水に溶解し、そのうち４μＬと、２μＬのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（商品名：Ａｍｐｌｉｓｃｒｉｂｅ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製））とを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物を得た。なお、ここまでの工程を１サイクルと称する。
【００５４】
（実施例１）
配列番号１〜４について、表面プラズモン共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ３０００（ビアコア社製）を用いて、以下の通り測定した。
【００５５】
まず、リガンドとして、配列番号１〜４に示す各ＲＮＡの３’末端側にアデニン２４塩基を連結したものを、定法に従い調製した。５’末端側にビオチンを標識した２４塩基のデオキシチミンをセンサーチップＳＡ（ビアコア社製）に固定化し、つぎに、調製したＲＮＡをデオキシチミンと結合させた。これに、２００ｎＭの標的物質５〜８を、流速２０μＬ／分で２分間添加し、測定物の結合を観察した後、３分間にわたって解離を観察した。
【００５６】
標的物質５：マウスＩｇＧ抗体（Ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅＩｇＧ（SantaCruz社製）、カタログ番号：ｓｃ−２０２５、サブタイプ：混合）
標的物質６：マウスＩｇＧ抗体（商品名、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２、シグマ社製、カタログ番号：Ｆ３１６５、サブタイプ：１）
標的物質７：マウスＩｇＧ抗体（商品名Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉ−ＧＳＴ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）、カタログ番号：２００−３０１−２００、サブタイプ：１）
標的物質８：マウスＩｇＧ抗体（ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）、カタログ番号：０１０−０１０３、サブタイプ：混合）
【００５７】
反応は２５℃で行った。この観察で結合の有無を観察した。結果を表１に示す。表１中、「＋」印は、結合の見られたものを示しており、コントロールと比較してノイズ幅よりも大きなシグナルが観察されたものに相当する。
【００５８】
また、上記の２００ｎＭの標的物質５〜８に代えて、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ及び６．２５ｎＭのマウスＩｇＧ抗体（商品名、ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２、シグマ社製、カタログ番号：Ｆ３１６５、サブタイプ：１）を用いて得たセンサグラムから、各配列の結合定数（Ｋｄ値）を算出した。また、これらの結合定数の値について、χ（カイ）２乗検定を行った。結果を表２に示す。
【００５９】
【表１】
2010057451.tif 000002
【００６０】
【表２】
2010057451.tif 000003
【００６１】
（製造例２）
配列番号１に記載のＲＮＡについて、上記の二次構造予測を行った。具体的には、対象となる配列番号１に示す塩基配列において、ワトソン・クリック型などの塩基対を構成する塩基の候補と、この塩基対候補以外の一本鎖領域の候補とを探索した。探索された塩基対候補及び一本鎖領域候補の全組合せのうち、塩基対候補を構成する塩基と一本鎖領域候補を構成する塩基とが重複するなど、理論的に取り得ない組合せを除いて、二次構造候補を同定した。同定された二次構造候補のうち、二次構造候補のエネルギー関数を算出し、算出されたエネルギー関数が最小となる二次構造を探索した。この際、この二次構造候補のエネルギー関数の算出方法としては、二次構造候補を構成する個々のステム領域及び一本鎖領域の自由エネルギーに基づいて、この二次構造候補における自由エネルギーを、二次構造候補のエネルギー関数とした。このようにして、同定された二次構造候補のうち、エネルギー関数の最も小さい二次構造を、対象となる核酸分子の塩基配列の二次構造とした。その結果を図１に示す。
【００６２】
このようにして得た配列番号１の二次構造の結果を参照すると、１６〜１９残基目及び４５〜４８残基目の塩基が４塩基対からなるステム長を有するステム領域を形成することが分かった。そこで、このステム領域の末端側のいわゆるプライマー領域を欠失させ、グアノシン及びシチジンを用いて、ステム領域のステム長さを２つ延ばし、５’末端側にＧを付加した配列番号５に示すＲＮＡを合成した。また、同様に、ステム領域のステム長さを２つ延ばすなどした配列番号６に示すＲＮＡを合成した。さらに、配列番号６のステム領域に対応する配列を、グアニン残基及びシトシン残基のみからなるものとした配列番号７に示すＲＮＡを合成した。
【００６３】
（実施例２）
実施例１において、配列番号１〜４の代わりに、配列番号５〜７を用い、標的物質５〜８の代わりに、下記の標的物質９〜１２の各標的物質を用いた以外は、実施例１と同様に行い、結合の有無を観察した。その結果を表３に示す。
【００６４】
標的物質９：マウスＩｇＧ抗体（mouse IgG Isotype Control IgG１（BD Biosciences社製）、カタログ番号：５５７２７３、サブタイプ：１）
標的物質１０：マウスＩｇＧ抗体（mouse IgG Isotype Control IgG２ａ（BD Biosciences社製）、カタログ番号：５５３４５４、サブタイプ：２ａ）
標的物質１１：マウスＩｇＧ抗体（mouse IgG Isotype Control IgG２ｂ（BD Biosciences社製）、カタログ番号：５５７３５１、サブタイプ：２ｂ）
標的物質１２：マウスＩｇＧ抗体（mouse IgG Isotype Control IgG３（BD Biosciences社製）、カタログ番号：５５３４８６、サブタイプ：３）
【００６５】
【表３】
2010057451.tif 000004
【００６６】
（比較例１）
実施例２において、配列番号５及び６に示すＲＮＡの代わりに、配列番号１及び２の配列、並びに配列番号１〜４に示すＲＮＡのうち、シトシン残基及びウリジン残基をＤｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製、カタログ番号：ＤＳ０１０９２５社製）を用いてフルオロ化した配列を用いた以外は、実施例２と同様に、結合の有無を観察した。その結果を表４に示す。なお、表４において、「１Ｆ」、「２Ｆ」、「３Ｆ」及び「４Ｆ」は、それぞれ、配列番号１〜４に示すＲＮＡを上記の通りフルオロ化したものを示す。
【００６７】
【表４】
2010057451.tif 000005
【００６８】
（実施例３）
比較例１において、配列番号１及び２並びにフルオロ化した各配列に代えて、配列番号１〜６に示すＲＮＡのうち、ウリジン残基のみをＤｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製、カタログ番号：ＤＳ０１０９２５社製）を用いてフルオロ化した配列を用いた以外は、比較例１と同様に行い、結合の有無を観察した。その結果を表５に示す。なお、表５において、「１ＦＵ」、「２ＦＵ」、「３ＦＵ」、「４ＦＵ」、「５ＦＵ」及び「６ＦＵ」は、それぞれ、配列番号１〜６に示すＲＮＡを上記の通りフルオロ化したものを示す。
【００６９】
【表５】
2010057451.tif 000006
【００７０】
（比較例２）
実施例３において、フルオロ化した各配列に代えて、配列番号１〜６に示すＲＮＡのうち、シトシン残基のみをＤｕｒａｓｃｒｉｂｅ（登録商標）  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ社製、カタログ番号：ＤＳ０１０９２５社製）を用いてフルオロ化した配列を用いた以外は、実施例３と同様に行い、結合の有無を観察した。その結果を表６に示す。なお、表６において、「１ＦＣ」、「２ＦＣ」、「３ＦＣ」、「４ＦＣ」、「５ＦＣ」及び「６ＦＣ」は、それぞれ、配列番号１〜４に示すＲＮＡを上記の通りフルオロ化したものを示す。
【００７１】
【表６】
2010057451.tif 000007
【００７２】
（製造例３）
製造例２において、配列番号１の代わりに、配列番号４を用いた以外は、製造例２と同様に、二次構造を予測した。その結果を図２に示す。
【００７３】
このようにして得た配列番号４の二次構造の結果を参照すると、１６〜１９残基目及び４５〜４８残基目の塩基が４塩基対からなるステム長を有するステム領域を形成することが分かった。
【００７４】
製造例２において二次構造の予測を行った配列番号１とともに、本製造例３において二次構造の予測を行った配列番号４について、それぞれの二次構造に基づいて、種々のＲＮＡを合成した。
【００７５】
まず、配列番号１の二次構造においてステム領域の末端側のいわゆるプライマー領域を欠失させ、グアノシン及びシチジンを用いて、ステム領域のステム長さを２つ延ばした配列番号８に示すＲＮＡを合成した。また、配列番号１の二次構造においてステム領域の末端側のいわゆるプライマー領域を欠失させ、ステム領域のステム長４の塩基対を、グアニン残基及びシトシン残基からなるステム長５のステム領域とした配列番号９、及びステム長６のステム領域とした配列番号１０を、それぞれ合成した。
【００７６】
一方、配列番号４の二次構造においてステム領域の末端側のいわゆるプライマー領域を欠失させ、このステム領域に代えて、グアノシン及びシチジンを用いて、ステム長さ４のステム領域を有する配列番号１１に示すＲＮＡを合成した。
【００７７】
さらに、配列番号１の二次構造において、ステム領域の末端側のいわゆるプライマー領域を欠失させ、グアノシン及びシチジンを用いて、ステム領域のステム長さを２つ延ばしたステム長５の配列において、３’末端側のステム領域に隣接するシトシン残基を、グアニン残基に改変した、配列番号１２に示すＲＮＡを合成した。
【００７８】
またさらに、配列番号１の二次構造において、ステム領域の末端側のいわゆるプライマー領域を欠失させ、グアノシン及びシチジンを用いて、ステム領域のステム長さを２つ延ばしたステム長６の、配列番号１９に示すＲＮＡを合成した。また、配列番号４の二次構造において、ステム領域の末端側のいわゆるプライマー領域を欠失させ、グアノシン及びシチジンを用いて、ステム領域のステム長さを２つ延ばしたステム長６の、配列番号２０に示すＲＮＡを合成した。
【００７９】
（実施例４）
実施例２において、配列番号５〜７の代わりに、配列番号８〜１２及び１９〜２０を用いた以外は、実施例２と同様に行い、結合の有無を観察した。その結果を表７に示す。
【００８０】
【表７】
2010057451.tif 000008
【００８１】
（比較例３）
実施例４において、配列番号８〜１２及び１９〜２０の代わりに、配列番号１２において、５’末端側のステム領域に隣接するウリジン残基をグアニン残基に改変するとともに、３’末端側のステム領域に隣接するグアニン残基をアデニン残基に改変した配列番号１８の配列を用いた以外は、実施例４と同様に行い、結合の有無を観察した。その結果を表８に示す。
【００８２】
【表８】
2010057451.tif 000009
【００８３】
（製造例４）
製造例１と同様に行い、配列番号２１〜２３を得た。
【００８４】
（実施例５）
実施例１において、配列番号１〜４の代わりに、配列番号２１〜２３を用い、且つ標的物質５〜８の代わりに、標的物質９を用いて行った以外は、実施例１と同様に行い、結合の有無を観察した。その結果を表９に示す。表９中、「＋」印は、結合の見られたものを、「△」印は、わずかに結合が見られたものを示す。
【００８５】
【表９】
2010057451.tif 000010
【００８６】
（製造例５）
安定化の目的のため、配列番号１１の塩基のうち、５’末端から２残基目のグアニン残基をシトシン残基に、３’末端から２残基目のシトシン残基をグアニン残基に、それぞれ改変した配列（以下、本製造例において、改変配列と称する。）を合成した。
【００８７】
得た改変配列の５’末端を、定法に従いビオチン化して、配列番号２４に示すＲＮＡを得た。
【００８８】
また、改変配列の５’末端側にデオキシアデニンを５残基付加した配列を合成し、その５’末端を、上記と同様にビオチン化して、配列番号２５に示すＲＮＡを得た。
【００８９】
また、改変配列の３’末端側にデオキシアデニンを１０残基付加した配列を合成し、その３’末端を、上記と同様にビオチン化して、配列番号２６に示すＲＮＡを得た。
【００９０】
また、改変配列の５’末端側に、炭素数１８からなる炭素鎖（商品名; SPACER18, GLEN RESERCH社，品番10-1918-90）を３つ付加した配列を合成し、その５’末端を、上記と同様にビオチン化して、配列番号２７に示すＲＮＡを得た。
【００９１】
さらに、改変配列の３’末端を、定法に従いビオチン化して、配列番号２８に示すＲＮＡを得た。
【００９２】
また、改変配列の３’末端側にデオキシアデニンを５残基付加した配列を合成し、その３’末端を、上記と同様にビオチン化して、配列番号２９に示すＲＮＡを得た。
【００９３】
また、改変配列の５’末端側にデオキシアデニンを１０残基付加した配列を合成し、その５’末端を、上記と同様にビオチン化して、配列番号３０に示すＲＮＡを得た。
【００９４】
また、改変配列の３’末端側に、上記と同様に炭素数１８からなる炭素鎖を３つ付加した配列を合成し、その５’末端を、上記と同様にビオチン化して、配列番号３１に示すＲＮＡを得た。
【００９５】
（実施例６）
実施例１において、配列番号１〜４に代えて、配列番号２４〜２７を用いた以外は、実施例１と同様に行い、各配列の結合定数（Ｋｄ値）を算出した。その結果を表１０に示す。
【００９６】
【表１０】
2010057451.tif 000011
【００９７】
（実施例７）
実施例６において、配列番号２４〜２７のうち、配列番号２５を用い、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ及び６．２５ｎＭのマウスＩｇＧ抗体の代わりに、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ及び６．２５ｎＭの標的物質９、１０及び１２を用いた以外は、実施例６と同様に行い、この配列の各標的物質に対する結合定数（Ｋｄ）を算出した。その結果を表１１に示す。
【００９８】
【表１１】
2010057451.tif 000012
【００９９】
（実施例８）
９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（商品名：Ｉｍｍｕｎｏ  ９６  Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（Ｎｕｎｃ社製）、カタログ番号：４３０３４１）に、４００ｎｇの抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧ抗体（標的物質２）を有する５０μＬのＰＢＳ溶液（ＰＢＳ：８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ（Ｎｉｐｐｏｎ  Ｇｅｎｅ社製、カタログ番号：３１４−９０８１５））を各ウェルに分注し、４℃で一昼夜静置した。その後、ブロッキング溶液（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１×デンハルト溶液及び０．１％  アセチル化ＢＳＡ）１００μＬを各ウェルに分注し、１時間、室温で静置し、その後、ウェルの液を取り除いた。
【０１００】
その後、配列番号２４〜２７及び配列番号２８〜３１の配列からなるＲＮＡであって、９５度３分間の加熱後室温にて除冷しリフォールディングさせたもの（３００ｎＭ）、及びストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（商品名ＥＣＬ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、カタログ番号：ＲＰＮ２１９５）（１／５００）を有するＰＢＳ−Ｔ＋Ｍｇ溶液（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）であるＲＮＡ溶液５０μＬを各ウェルに分注し、３０分間、室温で静置した。
【０１０１】
その後、１００μＬのＰＢＳ−Ｔ＋Ｍｇ溶液を用いて３回各ウェルを洗浄し、各ウェルに１００μＬのＨＲＰ基質（商品名：１−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ  （ＰＩＥＲＣＥ社製）、カタログ番号：３４０２２））を加え、３０分間、室温で反応させ、その後、１ＭのＨ２ＳＯ４で反応を停止した。各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度（参照波長は６２０ｎｍ）を測定した。その結果を図３に示す。
【０１０２】
図３において、縦軸は、４５０ｎｍの測定波長、６２０ｎｍの参照波長を用いて得た吸光度を示し、横軸は、ＲＮＡ溶液に含まれるＲＮＡに対応する配列番号の番号を示す。また、「ＮＣ」は、ＲＮＡ溶液において、ＲＮＡを有さないものを用いて得た結果を示し、「ＰＣ」は、標的物質２を有するＰＢＳ溶液を用いて一昼夜行う反応を行わずに、且つＨＲＰ基質を用いた反応を行う際に、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（商品名ＥＣＬ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製、カタログ番号：ＲＰＮ２１９５）（１／５００）を有するＰＢＳ−Ｔ＋Ｍｇ溶液を添加した得た結果を示す。
【０１０３】
（実施例９）
実施例８において、下記（Ｉ）〜（Ｖ）の通りとした以外は、実施例８と同様に行い、４５０ｎｍの測定波長、６２０ｎｍの参照波長を用いた吸光度を得た。
【０１０４】
（Ｉ）抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧ抗体（標的物質２）の代わりに、下記（１）〜（６）の各ＩｇＧを用いた
（ＩＩ）配列番号２４〜２７及び配列番号２８〜３１の配列からなるＲＮＡの代わりに、配列番号２８に示す配列からなるＲＮＡを用いた
（ＩＩＩ）リフォールディングさせたＲＮＡの濃度を５０ｎＭとした
（ＩＶ）ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（１／５００）に代えて、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（１／１０００）を用いた
（Ｖ）ＲＮＡ溶液を各ウェルに分注して室温で静置する時間を２０分間とした
【０１０５】
（１）マウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（標的物質２）（図４中、マウスと表記）
（２）ウサギ抗ＧＳＴポリクローナル抗体（ケミコン社製、カタログ番号：ＡＢ３２８２）（図４中、ウサギと表記）
（３）ラットＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製、カタログ番号：ｓｃ−２０２６）（図４中、ラットと表記）
（４）ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ社製、カタログ番号：ＡＰ−１３２）（図４中、ヤギと表記）
（５）ヒト抗ＩｇＧ（Ｂｅｔｈｙｌ社製、カタログ番号：Ｐ８０−１０４）（図４中、ヒトと表記）
（６）モルモットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、カタログ番号：００６−０００−００２）（図４中、モルモットと表記）
【０１０６】
また、配列番号２８に示す配列からなるＲＮＡに代えて、ヒツジ由来の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合完全抗体（ＧＥ社製、カタログ番号：Ｎ９３１）をＰＢＳ−Ｔ＋Ｍｇで２０００倍に希釈したものを用いて、上記と同様に吸光度を得た。その結果を図５に示す。なお、図４及び５において、「ＮＣ」及び「ＰＣ」は、図３と同様である。
【０１０７】
（実施例１０）
実施例９において、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の通りに変更した以外は、実施例９と同様に行い、４５０ｎｍの測定波長、６２０ｎｍの参照波長を用いた吸光度を得た。
【０１０８】
（Ｉ）上記（１）〜（６）の各ＩｇＧに代えて、下記表１２に記載の（１）〜（１４）の各ＩｇＧを用いた
（ＩＩ）ＲＮＡ溶液中のＲＮＡの濃度を２００ｎＭとした
（ＩＩＩ）各ウェルにＨＲＰ基質を添加して室温で反応させる時間を５０分間とした
【０１０９】
その結果を図６に示す。なお、図６において、「ＮＣ」及び「ＰＣ」は、図３と同様である。
【０１１０】
【表１２】
2010057451.tif 000013
【０１１１】
（実施例１１）
実施例９において、下記（Ｉ）〜（ＩＶ）の通りとした以外は、実施例９と同様に行い、４５０ｎｍの測定波長、６２０ｎｍの参照波長を用いた吸光度を得た。
【０１１２】
（Ｉ）４００ｎｇの標的物質２に代えて、１０００ｎｇ、１００ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ、０．００１ｎｇ及び０．０００１ｎｇの標的物質２を用いた
（ＩＩ）リフォールディングさせたＲＮＡの濃度を５０ｎＭとした
（ＩＩＩ）ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（１／５００）に代えて、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（１／１０００）を用いた
（ＩＶ）ＲＮＡ溶液を各ウェルに分注して室温で静置する時間を２０分間とした
【０１１３】
その結果を図７に示す。なお、図７において、横軸は、標的物質２の量を示し、縦軸は、４５０ｎｍの測定波長、６２０ｎｍの参照波長を用いて得た吸光度を示す。
【０１１４】
また、標的物質２８に示す配列からなるＲＮＡに代えて、ヒツジ由来の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合完全抗体（ＧＥ社製、カタログ番号：Ｎ９３１）をＰＢＳ−Ｔ＋Ｍｇで２０００倍に希釈したものを用いて、上記と同様に吸光度を得た。その結果を図８に示す。図８において、横軸は、ＩｇＧ抗体の量を示し、縦軸は、図７と同様である。
【０１１５】
（実施例１２）
実施例８において、下記（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の通りとした以外は、実施例８と同様に行い、４５０ｎｍの測定波長、６２０ｎｍの参照波長を用いて得た吸光度を得た。
【０１１６】
（Ｉ）配列番号２４〜２７及び配列番号２８〜３１の配列からなるＲＮＡであって、９５度３分間の加熱後室温にて除冷しリフォールディングさせたもの（３００ｎＭ）に代えて、８００ｎＭ、４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２．５ｎＭ及び６．２５ｎＭの配列番号２５の配列からなるＲＮＡを用いた
（ＩＩ）ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（１／５００）に代えて、ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（１／１０００）を用いた
（ＩＩＩ）ＲＮＡ溶液を各ウェルに分注して室温で静置する時間を２０分間とした
【０１１７】
その結果を図９に示す。図９において、横軸は、用いたＲＮＡの濃度を示し、縦軸は、図３と同様である。
【０１１８】
（実施例１３）
ＳＡ−Ａｇａｒｏｓｅ（商品名：ＵｌｔｒａＬｉｎｋ（登録商標）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｐｌｕｓ（ＰＩＥＲＣＥ社製）、カタログ番号：５３１１７）をカラム（Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−ｓｐｉｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎｓ  （Ｂｉｏ−ｒａｄ社製、カタログ番号：７３２−６２０４））に充填し、ＰＢＳ溶液で２回洗浄した。
【０１１９】
一方、配列番号２５に示すＲＮＡとＰＢＳ−Ｍｇ溶液とからなるＲＮＡ溶液（ＲＮＡ濃度１０μＭ）を調製した。
【０１２０】
上記のＳＡ−Ａｇａｒｏｓｅを有するカラムに、このＲＮＡ溶液を添加し、４℃で１時間、インキュベーションした後、ＰＢＳ溶液２５０μＬを用いて、３回洗浄した。
【０１２１】
このようにして調製したカラムに、マウス腹水（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｏｕｓｅ  ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｏｄ  Ｃｌｏｎｅ  ＮＳ−１（ＳＩＧＭＡ社製）、カタログ番号：Ｍ８２７３、２３ｍｇ／ｍｌタンパク）と標的物質２に示すマウス抗ＦＬＡＧ抗体とを有するＰＢＳ−Ｍｇ溶液（抗体濃度１ｍｇ／ｍＬ）（以下、腹水−抗ＦＬＡＧ抗体混合液と称する。）を添加し、室温で３０分間、インキュベートした。
【０１２２】
このようにして得たカラムを、遠心分離し、上清を回収し、素通り画分とした。さらにこのカラムに、ＰＢＳ溶液２５０μＬで３回洗浄し、この洗浄液を全て回収した。なお、これらの洗浄液をそれぞれ、洗浄液１、２及び３と称する。
【０１２３】
次に、このカラムに、５０μＬのＰＢＳ溶液を添加して、室温で１０分間インキュベートし、カラムを遠心分離して、溶出液１を得た。また、このカラムに、上記と同様にＰＢＳ溶液を用いて、インキュベーション及び遠心分離を行い、溶出液２を得た。
【０１２４】
その後、このカラムに、５０μＬのＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳ及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加して、室温で１０分間インキュベートし、カラムを遠心分離して、溶出液３を得た。また、このカラムに上記と同様にＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液を用いて、インキュベーション及び遠心分離を行い、溶出液４を得た。
【０１２５】
その後、このカラムに、５０μＬのＰＢＳ−ＲＮａｓｅＡ（ＰＢＳ＋０．０１ｍｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅＡ）を添加して、室温で１０分間インキュベートし、カラムを遠心分離して、溶出液５を得た。
【０１２６】
このようにして得た各サンプルを、ＳＤＳサンプルバッファーに加え、９５℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。これを、５〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルにアプライし、３０分間泳動し、染色液（ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製、カタログ番号：２４５９０））で染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を得た。その結果を図１０に示す。なお、図１０において、各レーンは、下記に示す通りである。
【０１２７】
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）、カタログ番号：１６１−０３７５）
１：腹水−抗ＦＬＡＧ抗体混合液  １μＬ（１１．５μｇｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＋  １μｇ  ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ＭＡｂ相当）
２：素通り画分１μＬ  （腹水−抗ＦＬＡＧ抗体混合液のカラム素通り画分ｔｏｔａｌ  ５０μＬ）
３：洗浄液３  ５μＬ（カラムｗａｓｈ  ｔｏｔａｌ  ２５０μＬ）
４：溶出液１  ５μＬ（ＰＢＳ；Ｍｇ（−）での溶出画分  ｔｏｔａｌ  ５０μＬ）
４：溶出液２  ５μＬ（ＰＢＳ；Ｍｇ（−）での溶出画分  ｔｏｔａｌ  ５０μＬ）
６：溶出液３  ５μＬ（ＰＢＳ；ＥＤＴＡ（＋）での溶出画分  ｔｏｔａｌ  ５０μＬ）
７：溶出液４  ５μＬ（ＰＢＳ；ＥＤＴＡ（＋）での溶出画分  ｔｏｔａｌ  ５０μＬ）
８：溶出液５  ５μＬ（ＰＢＳ；ＲＮＡ（＋）での溶出画分  ｔｏｔａｌ  ５０μＬ）
９：溶出終了後のＳＡ−Ａｇａｒｏｓｅ  ５μＬ（溶出後のＳＡ−ａｇａｒｏｓｅ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧアプタマー複合体  ｔｏｔａｌ  ５０μＬ）
１０：抗ＦＬＡＧ抗体  １μＬ（１ｍｇ／ｍｌ  １μｇ相当）
【０１２８】
（実施例１４）
１０ｍｇ／ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：１１２．０５Ｄ）２５０μＬを１．５ｍＬチューブに移し、ＭａｇｎａＲａｃｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、カタログ番号：ＣＳ１５０００）に立て、上清を回収した後、ＰＢＳ−Ｍｇ溶液（ＰＢＳ及び５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）で２回洗浄した。
【０１２９】
一方、配列番号２５及び２６に示すＲＮＡを有するＰＢＳ−Ｍｇ溶液（ＲＮＡ濃度１０μＭ）を調製した。
【０１３０】
上記のＤｙｎａｂｅａｄｓを有する液に、このＲＮＡ溶液を添加し、４℃で１時間、インキュベーションした後、ＰＢＳ−Ｍｇ５００μＬを用いて、３回洗浄した。
【０１３１】
このようにして調製したＤｙｎａｂｅａｄｓに、マウス腹水（Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｍｏｕｓｅ  ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｏｄ  Ｃｌｏｎｅ  ＮＳ−１（ＳＩＧＭＡ社製）、カタログ番号：Ｍ８２７３、２３ｍｇ／ｍｌタンパク）と標的物質２に示すマウス抗ＦＬＡＧ抗体を有するＰＢＳ−Ｍｇ−Ｉ溶液（抗体濃度１ｍｇ／ｍＬ）とを有する腹水−抗ＦＬＡＧ抗体混合液を添加し、４℃で１５分間、インキュベートした。
【０１３２】
このようにして得たＤｙｎａｂｅａｄｓを、遠心分離し、上清を回収し、素通り画分とした。さらにこのＤｙｎａｂｅａｄｓに、ＰＢＳ−Ｍｇ溶液で３回洗浄し、この洗浄液を全て回収した。なお、これらの洗浄液をそれぞれ、洗浄液１、２及び３と称する。
【０１３３】
次に、このＤｙｎａｂｅａｄｓに、５０μＬのＰＢＳ溶液を添加して、４℃で１０分間インキュベートし、カラムを遠心分離して、溶出液１を得た。さらに、このＤｙｎａｂｅａｄｓに、５０μＬのＰＢＳ−ＥＤＴＡ溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び１×ＰｒｏｔｅｃｔＲＮＡ（登録商標）ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（同前））を添加して、４℃で１０分間インキュベートし、カラムを遠心分離して、溶出液２を得た。
【０１３４】
このようにして得た各サンプルを、ＳＤＳサンプルバッファーに加え、９５℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルとした。これを、５〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ゲルにアプライし、３０分間泳動し、染色液（ＧｅｌＣｏｄｅ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社製、カタログ番号：２４５９０））で染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ像を得た。その結果を図１１に示す。なお、図１１において、各レーンは、下記に示す通りである。
【０１３５】
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｂｉｏ−ｒａｄ社製）、カタログ番号：１６１−０３７５）
１：腹水−抗ＦＬＡＧ抗体混合液  １μＬ（１１．５μｇｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＋  １μｇ  ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  ＭＡｂ相当）
２：溶出液１  ４０μＬ相当  
（ＰＢＳのみでの溶出画分  ｔｏｔａｌ  ５０μＬのうち４０μＬをＴＣＡ沈殿で濃縮）
３：溶出液２  ４０μＬ相当  
（ＰＢＳ＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡでの溶出画分  ｔｏｔａｌ  ５０μＬのうち４０μＬをＴＣＡ沈殿で濃縮）
４：溶出後に得たＤｙｎａＢｅａｄｓ  ５μＬ
（溶出後のＤｙｎａＢｅａｄｓ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧアプタマー複合体  ｔｏｔａｌ  ５０μＬ）
５：抗ＦＬＡＧ抗体  １μＬ（１ｍｇ／ｍｌ  １μｇ相当）
−：ＲＮＡなし
２８：配列番号２５に示すＲＮＡ
３１：配列番号２６に示すＲＮＡ
【０１３６】
（参考例１）
実施例８において、４００ｎｇの抗ＦＬＡＧマウスＩｇＧ抗体（標的物質２）に代えて、０．０１ｎｇ、０．０２５ｎｇ、０．０５ｎｇ、０．１ｎｇ、０．２５ｎｇ、０．５ｎｇ、１ｎｇ、２．５ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ及び１００ｎｇの抗体を用い、配列番号２４〜２７及び配列番号２８〜３１の配列からなるＲＮＡであって、９５度３分間の加熱後室温にて除冷しリフォールディングさせたものの代わりに、実施例１３で得た溶出液１、２、３、４及び５を１００倍及び１０００倍（溶出液３については、１０００倍及び１００００倍、溶出液５については、１００倍）に希釈して得た液を用いた以外は、実施例８と同様に行い、溶出液１、２、３、４及び５に含まれるＩｇＧの量を定量した。その結果を表１３に示す。
【０１３７】
また、上記と同様に、実施例１３で得た溶出液２に代えて、実施例１４で得た溶出液１及び２を用いた以外は、上記と同様に、各溶出液に含まれるＩｇＧの量を定量した。その結果を表１３に示す。
【０１３８】
なお、ＩｇＧの量の定量には、上記の通りの抗体の希釈系列から導出した標準曲線に基づいて、定法に従い、行った。
【０１３９】
【表１３】
2010057451.tif 000014
【０１４０】
（実施例１５）
標的物質として、Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＦＬＡＧ−ＢＡＰ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号；Ｐ７５８２）を用い、これをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法に準じて、電気泳動を行い、得たバンドをＰＶＤＦ膜（商品名：Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（ＧＥ社製）、カタログ番号：ＲＰＮ１４１６Ｆ）に転写した。これを、一次抗体として、標的物質２に示すＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  （ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：Ｆ３１６５、ロット番号：０８６Ｋ６０１２）の５００倍希釈液に浸漬し、洗浄・ブロッキングを行った後、得た膜を、配列番号２４〜２７及び配列番号２８〜３１に示す配列のＲＮＡを有するＲＮＡ溶液（１００ｎＭ、１５μｇ／ｍＬ）で処理した。この膜を、化学発光基質としてＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：ＣＰＳ−１−６０）を用いて発光させ、発光像を観察した。その結果を、図１２に示す。図１２において、各レーンは、下記に示す通りである。なお、発光時間は、２秒であった。また、図１２において、「ＳＡ−ＨＲＰ」は、上記のＲＮＡ溶液を用いずに発光させて得た発光像である。
【０１４１】
Ｍ：ビオチン化した分子量マーカー
１：１μｇのＦＬＡＧ−ＢＡＰ
２：２００ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＡＰ
３：１００ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＡＰ
【０１４２】
（実施例１６）
実施例１５において、Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ＦＬＡＧ−ＢＡＰ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号；Ｐ７５８２）に加えて、標的物質２に示すＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳＩＧＭＡ社製、カタログ番号：Ｆ３１６５、ロット番号：０８６Ｋ６０１２）を用い、配列番号２４〜２７及び配列番号２８〜３１に示す配列のＲＮＡの代わりに、配列番号２５を用いた以外は、実施例１５と同様に行い、ＰＤＶＦ膜の発光像を得た。結果を図１３に示す。図１３において、各レーンは、下記の通りである。なお、発光時間は、８秒とした。
【０１４３】
Ｍ：ビオチン化した分子量マーカー
１：０．５μｇの抗ＦＬＡＧ−マウスＩｇＧ抗体
２：０．５μｇの抗ＦＬＡＧ−マウスＩｇＧ抗体及び１００ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＡＰ
３：１００ｎｇのＦＬＡＧ−ＢＡＰ
【０１４４】
以上、本発明の好適な実施の形態により本発明を説明した。ここでは特定の具体例を示して本発明を説明したが、特許請求の範囲に定義された本発明の広範な趣旨および範囲から逸脱することなく、これら具体例に様々な修正および変更を加えることができることは明らかである。すなわち、具体例の詳細および添付の図面により本発明が限定されるものと解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】製造例２で得た二次構造予測の結果である。
【図２】製造例３で得た二次構造予測の結果である。
【図３】実施例８で得た吸光度を示す棒グラフである。
【図４】実施例９において、配列番号２８に示す配列からなるＲＮＡを用いて得た吸光度を示す棒グラフである。
【図５】実施例９において、ヒツジ由来の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合完全抗体を用いて得た吸光度を示す棒グラフである。
【図６】実施例１０で得た吸光度を示す棒グラフである。
【図７】実施例１１において、配列番号２８に示す配列からなるＲＮＡを用いて得た吸光度を示すグラフである。
【図８】実施例１１において、ヒツジ由来の抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ結合完全抗体を用いて得た吸光度を示すグラフである。
【図９】実施例１２において、４００ｎｇの標的物質２を用いて得た吸光度を示すグラフである。
【図１０】実施例１３で得たＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図１１】実施例１４で得たＳＤＳ−ＰＡＧＥ像である。
【図１２】実施例１５で得たＰＤＶＦ膜の発光像である。
【図１３】実施例１６で得たＰＤＶＦ膜の発光像である。
【図１】
2010057451.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2010057451.tif 000021
【図８】
2010057451.tif 000022
【図９】
2010057451.tif 000023
【図１２】
2010057451.tif 000024
【図１３】
2010057451.tif 000025
【図１０】
2010057451.tif 000026
【図１１】
2010057451.tif 000027
【配列表】
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