【手続補正書】
【提出日】令和3年6月21日(2021.6.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、融合タンパク質：
（ｉ）ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン；
（ｉｉ）リンカー；および
（ｉｉｉ）配列番号７１３と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、および、アミノ酸１０６、１２７、１３６および１３７において少なくとも１つの変異を含む、Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメイン。
【請求項２】
ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメイン、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１ドメイン、ヌクレアーゼ不活性アルゴノートドメイン、およびそれらのバリアントからなる群から選択され、任意に、ｄＣａｓ９が、Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異を含み、任意に、ｄＣａｓ９のＮ末端メチオニンが除去されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメインであり、任意に、ｄＣａｓ９が、Ｄ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異を含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１のＤ１０Ａおよび／またはＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含み、任意に、ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１に示されるＮ末端メチオニンを含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ｄＣａｓ９ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７１２と９５％以上の配列同一性を有する、または、ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号７２１を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７１３のＨ１０６Ｙ、Ｉ１２７Ｌ、Ｉ１３６Ｒ、およびＧ１３７Ｆの変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ｇｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインのアミノ酸配列が、配列番号７１３である、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
リンカーが、
（ａ）ペプチドリンカー、
（ｂ）アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、もしくはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）を有するＸＴＥＮリンカー、
（ｃ）任意に６〜１０個の反復または８個の反復を包含する、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含むアミノ酸配列、または、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８３）、
（ｄ）ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１１）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号１３）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１４）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１５）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１６）、もしくはＧＧＳＭ（配列番号１７）を含むアミノ酸配列、あるいは、
（ｅ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖類、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む、非ペプチドリンカー
である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
核局在化シグナル（ＮＬＳ）ドメインをさらに含み、任意に、融合蛋白質は、構造：ＮＨ２−［リコンビナーゼ触媒ドメイン］−［リンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ＮＬＳドメイン］−ＣＯＯＨを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＮＬＳドメインが、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインまたはＧｉｎリコンビナーゼ触媒ドメインに、１つ以上の第２のリンカーを介して結合している、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
第２のリンカーが、
（ａ）ペプチドリンカー、
（ｂ）アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡ（配列番号８）、もしくはＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）を有するＸＴＥＮリンカー、
（ｃ）任意に６〜１０個の反復または８個の反復を包含する、トリペプチドＧＧＳの１つ以上の反復を含むアミノ酸配列、または、アミノ酸配列ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１８３）、
（ｄ）ＶＰＦＬＬＥＰＤＮＩＮＧＫＴＣ（配列番号１０）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号１１）、ＳＩＶＡＱＬＳＲＰＤＰＡ（配列番号１２）、ＭＫＩＩＥＱＬＰＳＡ（配列番号１３）、ＶＲＨＫＬＫＲＶＧＳ（配列番号１４）、ＧＨＧＴＧＳＴＧＳＧＳＳ（配列番号１５）、ＭＳＲＰＤＰＡ（配列番号１６）、もしくはＧＧＳＭ（配列番号１７）を含むアミノ酸配列、あるいは、
（ｅ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、コポリ（エチレン／プロピレン）グリコール、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）、ポリウレタン、ポリホスファゼン、多糖類、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルエチルエーテル、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、ポリシアノアクリレート、脂質ポリマー、キチン、ヒアルロン酸、ヘパリン、またはアルキルリンカーを含む、非ペプチドリンカー
である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
融合タンパク質が、配列番号７１９または配列番号１８５に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
１つ以上のアフィニティタグをさらに含み、任意に、アフィニティタグは、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン（ポリＨｉｓ）タグ、ポリアルギニン（ポリＡｒｇ）タグ、Ｍｙｃタグ、およびＨＡタグからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）に結合している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載の融合タンパク質の、二量体。
【請求項１６】
二量体が、ＤＮＡ分子に結合している、請求項１５に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項１７】
二量体の各融合タンパク質が、ＤＮＡ分子の同じ鎖に結合している、請求項１６に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項１８】
二量体の各融合タンパク質が、ＤＮＡ分子の対向鎖に結合している、請求項１６に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項１９】
二量体のｇＲＮＡが、リコンビナーゼ部位に隣接するｇＲＮＡ結合部位にハイブリダイズする、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項２０】
リコンビナーゼ部位が、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列を含む、請求項１９に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項２１】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、３〜７塩基対である、請求項２０に記載の二量体。
【請求項２２】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、５〜６塩基対である、請求項２０または２１に記載の二量体。
【請求項２３】
第１の二量体が第２の二量体に結合し、それによって融合タンパク質の四量体を形成する、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質の二量体。
【請求項２４】
任意に、四量体は、標的ＤＮＡ分子に結合しており、および、四量体の各二量体は、ＤＮＡの対向鎖に結合しているか、または、ＤＮＡの同じ鎖に結合している、請求項１４に記載の融合タンパク質の、四量体。
【請求項２５】
２つのＤＮＡ分子間の部位特異的組換え方法であって、
（ａ）第１のＤＮＡを第１の融合タンパク質と接触させること、ここで、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第１のＤＮＡの第１領域にハイブリダイズする第１のｇＲＮＡに結合する；
（ｂ）第１のＤＮＡを第２の融合タンパク質と接触させること、ここで、第２の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第１のＤＮＡの第２領域にハイブリダイズする第２のｇＲＮＡに結合する；
（ｃ）第２のＤＮＡを第３の融合タンパク質と接触させること、ここで、第３の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第２のＤＮＡの第１領域にハイブリダイズする第３のｇＲＮＡに結合する；および
（ｄ）第２のＤＮＡを第４の融合タンパク質と接触させること、ここで、第４の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、第２のＤＮＡの第２領域にハイブリダイズする第４のｇＲＮＡに結合する；を含み、
ここで、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合タンパク質の結合は、ＤＮＡが組み換えされるような条件下で、融合タンパク質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、およびここで、第１、第２、第３、および／または第４の融合タンパク質は、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質である、前記方法。
【請求項２６】
単一のＤＮＡ分子の２つの領域間の部位特異的組換え方法であって、
（ａ）ＤＮＡを第１の融合タンパク質と接触させること、ここで、ガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第１領域にハイブリダイズする第１のｇＲＮＡに結合する；
（ｂ）ＤＮＡを第２の融合タンパク質と接触させること、ここで、第２の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第２領域にハイブリダイズする第２のｇＲＮＡに結合する；
（ｃ）ＤＮＡを第３の融合タンパク質と接触させること、ここで、第３の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第３領域にハイブリダイズする第３のｇＲＮＡに結合する；および
（ｄ）ＤＮＡを第４の融合タンパク質と接触させること、ここで、第４の融合タンパク質のガイドヌクレオチド配列プログラム可能ＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、ＤＮＡの第４領域にハイブリダイズする第４のｇＲＮＡに結合する；を含み、
ここで、ステップ（ａ）〜（ｄ）における融合タンパク質の結合は、ＤＮＡが組み換えされるような条件下で、融合タンパク質のリコンビナーゼ触媒ドメインの四量体化をもたらし、およびここで、第1、第２、第３、および／または第４の融合タンパク質は、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質である、前記方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）および（ｂ）のｇＲＮＡ、および／またはステップ（ｃ）および（ｄ）のｇＲＮＡが、リコンビナーゼ部位に隣接するｇＲＮＡ結合部位にハイブリダイズする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
リコンビナーゼ部位が、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、３〜７塩基対である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列と少なくとも１つのｇＲＮＡ結合部位との間の距離が、５〜６塩基対である、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項３３】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、組換えタンパク質発現用ベクター。
【請求項３４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現するための遺伝子構築物を含む、細胞。
【請求項３５】
Ｇｉｎリコンビナーゼが、任意に、ヌクレオチド配列ＮＮＮＮＡＡＡＳＳＷＷＳＳＴＴＴＮＮＮＮ（配列番号１９）を含む、ｇｉｘコアまたはｇｉｘ関連コアの配列に結合し、ここでＮは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴ、およびＳはＧまたはＣであり、任意に、ｇｉｘコアリコンビナーゼ結合部位が、ヌクレオチド配列ＣＴＧＴＡＡＡＣＣＧＡＧＧＴＴＴＴＧＧＡ（配列番号７００）を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。