【手続補正書】
【提出日】令和3年9月3日(2021.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット。
【請求項２】
前記二官能性ｉｓｐＤＦ酵素が、以下のｉｓｐＤＦ酵素、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  ＨＰ１０２０、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  Ｊ９９  ｊｈｐ０４０４、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ  ＨＰＡＧ１  ＨＰＡＧ１＿０４２７、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ  ＨＨ１５８２、Ｈ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ  ｓｔ．Ｓｈｅｅｂａ  Ｈａｃ＿１１２４、Ｗ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ  ＤＳＭ  １７４０  ＷＳ１９４０、Ｓ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ  ＤＳＭ  １２５１  Ｓｕｄｅｎ＿１４８７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ  ＮＣＴＣ  １１１６８Ｃｊ１６０７、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ＲＭ１２２１  ＣＪＥ１７７９、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ  ｓｕｂｓｐ．ｊｅｊｕｎｉ  ８１−１７６  ＣＪＪ８１１７６＿１５９４、及び、Ｃ．ｆｅｔｕｓ  ｓｕｂｓｐ．ｆｅｔｕｓ  ８２−４０  ＣＦＦ８２４０＿０４０９と、少なくとも１つのアミノ酸が異なる、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする前記核酸に機能的に連結した前記プロモーターが、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターから選択される、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項４】
前記二官能性ｉｓｐＤＦ酵素が、配列番号１、配列番号２、または、配列番号３の３００個の連続したアミノ酸に対して、少なくとも５０％、または、５５％が同一であるアミノ酸配列を含むか；あるいは、前記二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸が、コドン最適化したものであるか；あるいは、前記二官能性ｉｓｐＤＦが、ＣＪ−ｉｓｐＤＦに対して、３１％以下が類似している、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記発現カセットが、ｄｘｓ、ｉｄｉ、及び、ｉｓｐＥからなる群から選択した１つ以上、２つ以上、または、すべての酵素をコードする核酸をさらに含むか；あるいは、前記発現カセットが、ｄｘｓ、及び、ｉｄｉをコードする核酸をさらに含むか；あるいは、前記発現カセットが、ｄｘｓ、ｉｄｉ、及び、ｉｓｐＥをコードする核酸をさらに含む、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセットを含むプラスミド。
【請求項７】
前記プラスミドが、（１）イソプレンシンターゼ（ｉｓｐＳ）をコードする核酸を含む発現カセット；（２）ＧＰＰシンターゼをコードする核酸を含む発現カセット；（３）真核生物由来のＧＰＰシンターゼをコードする核酸を含む発現カセット；又は（４）植物由来のＧＰＰシンターゼをコードする核酸を含む発現カセット、をさらに含む、請求項６に記載のプラスミド。
【請求項８】
前記ＧＰＰシンターゼをコードする核酸を含む発現カセットが、真核生物由来であり、かつ、前記ＧＰＰシンターゼをコードする前記核酸が、コドン最適化したものである、請求項７に記載のプラスミド。
【請求項９】
ＧＰＰシンターゼをコードする前記核酸を含む前記発現カセットが、（１）リコピン合成経路（例えば、ｃｒｔＥ、ｃｒｔ１、及び／または、ｃｒｔＢ）、または、モノテルペンシンターゼの１つ以上の成分をコードする核酸；（２）カレンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、または、リモネンシンターゼをコードする核酸；あるいは（３）カンナビノイドシンターゼをコードする核酸、をさらに含む、請求項７に記載のプラスミド。
【請求項１０】
前記カンナビノイドシンターゼを、Ｃａｎｎａｂｉｓ  ＣＢＧＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択する、請求項９に記載のプラスミド。
【請求項１１】
（１）請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセットのいずれか１つ；（２）請求項６〜１０のいずれか１項に記載のプラスミドのいずれか１つ；あるいは（３）請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現カセットのいずれか１つ、及び請求項６〜１０のいずれか１項に記載のプラスミドのいずれか１つを含む宿主細胞。
【請求項１２】
宿主細胞であって：
ａ．二官能性ｉｓｐＤＦ酵素をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット；及び
ｂ．テルペノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット、を含む前記宿主細胞。
【請求項１３】
前記テルペノイドシンターゼが、イソプレンシンターゼであるか；又は、リコピン合成経路の成分であるか；又は、カンナビノイドシンターゼである、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記テルペノイドシンターゼが、カンナビノイドシンターゼであり、前記カンナビノイドシンターゼが、ＣＢＧＡシンターゼ、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼ、好ましくは、Ｃａｎｎａｂｉｓ属のシンターゼからなる群から選択されるか；あるいは、前記カンナビノイドシンターゼが、ＴＨＣＡシンターゼ、ＣＢＤＡシンターゼ、及び、ＣＢＣＡシンターゼからなる群から選択する切断したカンナビノイドシンターゼであり、前記切断が、シグナルペプチドの全部または一部の欠失である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞が、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセットを含むか；あるいは、ａ）またはｂ）の前記発現カセットが、ＧＰＰシンターゼをコードする核酸をさらに含む、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記宿主細胞が、１つ以上の発現カセットの少なくとも１つを含まないコントロール細胞と比較して、ＭＥＰ経路を通るフラックスの増加を示す、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、ｉｓｐＣ、ｉｓｐＥ、ｉｓｐＧ、または、ｉｓｐＨをコードする異種核酸；それらの組み合わせ；または、それらのすべてを含まない、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、原核生物であるか；あるいは、ａ）及び／またはｂ）の前記発現カセットが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれているか；あるいは、ａ）及び／またはｂ）の前記発現カセットが、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれており、かつ前記宿主細胞が、原核生物である、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
前記宿主細胞が、プロモーターに機能的に連結したカンナビノイドシンターゼをコードする核酸を含み、かつ、前記カンナビノイドシンターゼをコードする核酸に機能的に連結したプロモーターが、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターから選択される、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
ａ）の前記発現カセット、及び、ｂ）の前記発現カセットが、単一のプラスミドに存在しており、または、単一の遺伝子座で前記宿主細胞のゲノムに挿入されるか；あるいは、ａ）の前記発現カセット、及び、ｂ）の前記発現カセットが、異なるプラスミドにあり、または、異なる遺伝子座で前記宿主細胞のゲノムに挿入される、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、オリベトール酸（ＯＡ）をさらに含む、請求項１２〜２０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記オリベトール酸が、前記宿主細胞に対して外因性である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、（１）１つ以上のグリコシル化経路遺伝子をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーターを含む発現カセット；（２）ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｄｈＡ、ｄｌｄ、ａｄｈＥ、ｐｐｓ、及び、ａｔｏＤＡからなる群から選択する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または、すべての遺伝子における欠失；あるいは（３）１つ以上のグリコシル化経路遺伝子をコードする核酸に機能的に連結した異種プロモーター、並びに、ａｃｋＡ−ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｌｄｈＡ、ｄｌｄ、ａｄｈＥ、ｐｐｓ、及び、ａｔｏＤＡからなる群から選択する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または、すべての遺伝子における欠失を含む発現カセット、を含む、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
標的代謝産物を得る方法であって、請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の宿主細胞を、１つ以上の宿主細胞発現カセットで発現を誘導するのに適した条件下で、適切な培地で培養し、次いで、培養した細胞、または、使用済培地を回収し、それにより、前記標的代謝産物を得ることを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記代謝産物が、カンナビノイドであるか；あるいは、ＴＨＣＡ、ＣＢＤＡ、ＣＢＣＡ、ＣＢＮ、ＴＨＣ、ＣＢＤ、または、ＣＢＣ、または、それらの１つ以上の混合物から選択されるカンナビノイドであるか；あるいは、テルペノイド、または、イソプレンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、前記培養細胞を回収、及び、溶解し、それにより、細胞溶解物を生産することを含む、請求項２４又は２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、前記細胞溶解物、又は前記使用済培地、又は前記細胞溶解物及び前記使用済培地から、前記標的代謝産物を精製し、それにより、精製した標的代謝産物を生産することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記精製した標的代謝産物が、カンナビノイドであり、かつ、前記方法が、（１）医薬組成物にカンナビノイドを処方すること；あるいは（２）前記精製カンナビノイドの塩、プロドラッグ、または、溶媒和物を形成すること；あるいは（３）前記精製カンナビノイドの塩、プロドラッグ、または、溶媒和物を形成すること、並びに医薬組成物にカンナビノイドを処方すること、を含む、請求項２７に記載の方法。