【手続補正書】
【提出日】令和3年9月17日(2021.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞において標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、前記ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を前記植物細胞に導入し、それによって前記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする前記遺伝子を改変する工程を含み、前記標的ＲＮＡ及び前記第２の標的ＲＮＡが異なる方法。
【請求項２】
植物細胞においてＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、目的の標的ＲＮＡに対する前記非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を前記植物細胞に導入し、それによって前記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる前記遺伝子を改変する工程を含む方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする前記遺伝子が、前記植物細胞に対して内在性である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる前記遺伝子が、前記植物細胞に対して内在性である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ＲＮＡと前記第２の標的ＲＮＡとが異なる遺伝子にコードされている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする前記遺伝子を前記改変することが、前記ＲＮＡサイレンシング分子に、前記第２の標的ＲＮＡに対して少なくとも４５％の相補性を付与することを含む請求項１、３又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる前記遺伝子を前記改変することが、前記非コードＲＮＡ分子に、前記目的の標的ＲＮＡに対して少なくとも４５％の相補性を付与することを含む請求項２又は４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡサイレンシング分子の前記サイレンシング特異性が、前記第２の標的ＲＮＡのＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを測定することによって決定される請求項１、３、５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記非コードＲＮＡ分子の前記サイレンシング特異性が、前記目的の標的ＲＮＡのＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを測定することによって決定される請求項２、４又は請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子の前記サイレンシング特異性が、表現型的に決定される請求項１から９のいずれか一項に記載の方法であって、前記表現型的に決定されることは、任意で、植物の葉の着色、花の着色、成長速度、植物の大きさ、作物の収率、果実の形質、生物的ストレス耐性、及び非生物的ストレス耐性からなる群から選択される少なくとも１つの植物表現型の決定によってもたらされる、方法。
【請求項１１】
前記非コードＲＮＡ分子の前記サイレンシング特異性が、遺伝子型的に決定される請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法であって、任意で、植物表現型が植物遺伝子型の前に決定されるか、あるいは、植物遺伝子型が植物表現型の前に決定される、方法。
【請求項１２】
前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子が、前駆体からプロセシングされる請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法であって、前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子は、任意で、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）及びトランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子であり、前記ＲＮＡｉ分子は、任意で、前記ＲＮＡｉ分子の配列が、構造のオリジナリティを保存し、細胞ＲＮＡｉ因子によって認識されるように改変される、方法。
【請求項１３】
前記非コードＲＮＡ分子が、核内小分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リピート由来ＲＮＡ、及び転移因子ＲＮＡからなる群から選択される請求項２、４、７、９および１０から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子の前記改変は、欠失、挿入、点突然変異、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変によって行われる請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法であって、前記改変は、任意で、
（ａ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域にある；
（ｂ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のループ領域にある；
（ｃ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子の非構造化領域にある；
（ｄ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域にある；又は
（ｅ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域、並びに非構造化領域にある
方法。
【請求項１５】
前記改変が、最大２００ヌクレオチドの改変を含む、及び／又は、前記方法は前記植物細胞にドナーオリゴヌクレオチド配列を導入する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ編集剤が、
（ａ）植物発現性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのｇＲＮＡを含む；及び／又は
（ｂ）（ｉ）エンドヌクレアーゼを含まない；もしくは
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼを含み、任意で、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムのものである
である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ編集剤がエンドヌクレアーゼを含み、前記エンドヌクレアーゼがＣａｓ９を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ編集剤が、
（ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＰとして前記細胞に適用される；及び／又は
（ｂ）植物細胞における発現を監視するためのレポーターに連結され、任意で、前記レポーターは蛍光タンパク質である
請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記目的の標的ＲＮＡ又は前記第２の標的ＲＮＡが、前記植物細胞に対して内在性であるか、又は外来性である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記植物細胞がプロトプラストである請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＮＡサイレンシング分子が、前記第２の標的ＲＮＡからのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物のレベルにおける観察可能な減少を提供する、請求項１、３、５、６、８、１０から１２、及び１４から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＲＮＡサイレンシング分子の元の特異性が無効化される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記改変が、ネイティブなＲＮＡサイレンシング分子と比較して１０から２５０ヌクレオチドの改変である、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記改変が、少なくとも５塩基の連続する核酸配列における改変である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
改変前の前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子が、前記第２の標的ＲＮＡ又は前記目的の標的ＲＮＡに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％の相補性、かつ９９％までの相補性を有するものである、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法に従って生成された植物細胞。
【請求項２７】
請求項２６に記載の植物細胞を含む植物。
【請求項２８】
標的遺伝子の発現が低下した植物を生成する方法であって、
（ａ）請求項２７に記載の植物細胞を育種する工程と、
（ｂ）前記目的の標的ＲＮＡ若しくは前記第２の標的ＲＮＡの発現が低下した子孫植物、又は前記非コードＲＮＡ分子中に目的の標的ＲＮＡに対するサイレンシング特異性を含み、前記ＤＮＡ編集剤を含まない子孫植物を選択し、それによって標的遺伝子の発現が低下した前記植物を生成する工程と
を含み、それによって前記標的遺伝子の発現が低下した植物を生成させ、
任意で、前記育種は交配もしくは自配を含む、及び／又は、前記目的の標的ＲＮＡもしくは前記第２の標的ＲＮＡは、ストレス感受性、除草剤感受性、収率の低下、生長速度の低下もしくは収量品質の低下を付与する植物の遺伝子のものである、方法。
【請求項２９】
増加したストレス耐性、増加した収率、増加した成長速度、又は増加した収量品質を有する植物を生成する方法であって、請求項１から２８のいずれか一項に記載の植物細胞において非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子にプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記植物を生成する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡが、ストレスに対する感受性、低下した収率、低下した成長速度、又は低下した収量品質を付与する植物の遺伝子のものである方法。
【請求項３０】
病原体もしくは病害虫耐容性又は耐性植物を生成する方法であって、請求項１から２８のいずれか一項に記載の植物細胞において非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子にプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記病原体もしくは病害虫耐容性又は耐性植物を生成する工程を含み、前記第２の標的ＲＮＡ又は前記目的の標的ＲＮＡは、前記病原体もしくは病害虫に対する感受性を付与する植物の遺伝子のものであるか、あるいは、前記目的のＲＮＡ又は前記第２の標的ＲＮＡは、前記病原体もしくは病害虫の遺伝子のものである、方法。
【請求項３１】
除草剤耐性植物を生成する方法であって、請求項１から２８のいずれか一項に記載の植物細胞において非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子にプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記除草剤耐性植物を生成する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡが、前記除草剤に対する感受性を付与する植物の遺伝子のものである方法。
【請求項３２】
請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法に従って生成された植物。
【請求項３３】
前記植物が、遺伝子組換えされていない（非ＧＭＯである）請求項２７若しくは３２に記載の植物、又は請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項２７、３２又は３３に記載の植物の種子。
【請求項３５】
前記植物が、作物、花及び樹木からなる群から選択される請求項１から２０、２８から３１及び３３のいずれか一項に記載の方法、請求項２６に記載の植物細胞、請求項２７、３２若しくは３３に記載の植物、又は請求項３４に記載の種子。