【手続補正書】
【提出日】令和2年12月3日(2020.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含む医薬組成物であって、前記バクテリオファージのそれぞれが、ＮＣＩＭＢ（ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫ）に、ＮＣＩＭＢ  ４２９１５（Ｆ９９／１０）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、ＮＣＩＭＢ  ４２９１６（Ｆ２７／１２）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、ＮＣＩＭＢ  ４２９１７（Ｆ９５／１３）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、ＮＣＩＭＢ  ４２９１８（Ｆ３９１／０８）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、ＮＣＩＭＢ  ４２９１９（Ｆ９２／１５）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、およびＮＣＩＭＢ  ４２９２０（Ｆ１０５／１５）の受託番号で寄託されたバクテリオファージから選択され、かつ緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する、医薬組成物。
【請求項２】
ＮＣＩＭＢ  ４２９１５（Ｆ９９／１０）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、ＮＣＩＭＢ  ４２９１６（Ｆ２７／１２）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、およびＮＣＩＭＢ  ４２９１７（Ｆ９５／１３）の受託番号で寄託されたバクテリオファージを含み、該３種のバクテリオファージのそれぞれが緑膿菌に対する抗菌活性を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
緑膿菌に対する抗菌活性を有する１種または２種以上の追加のバクテリオファージをさらに含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＮＣＩＭＢ  ４２９１８（Ｆ３９１／０８）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、ＮＣＩＭＢ  ４２９１９（Ｆ９２／１５）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、およびＮＣＩＭＢ  ４２９２０（Ｆ１０５／１５）の受託番号で寄託されたバクテリオファージを含み、該３種のバクテリオファージのそれぞれがクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
クレブシエラ・ニューモニエに対して有効な１種または２種以上の追加のバクテリオファージをさらに含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
エアロゾルとして投与するために製剤化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
他の治療薬と組み合わせて用いられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＮＣＩＭＢ（ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫ）に、ＮＣＩＭＢ  ４２９１５（Ｆ９９／１０）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、ＮＣＩＭＢ  ４２９１６（Ｆ２７／１２）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、ＮＣＩＭＢ  ４２９１７（Ｆ９５／１３）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、ＮＣＩＭＢ  ４２９１９（Ｆ９２／１５）の受託番号で寄託されたバクテリオファージ、およびＮＣＩＭＢ  ４２９２０（Ｆ１０５／１５）の受託番号で寄託されたバクテリオファージから選択され、かつ緑膿菌またはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する、精製バクテリオファージ。
【請求項９】
請求項８に記載のバクテリオファージ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
必要とする対象において細菌感染症を治療するまたはその発症を低減するために使用するための請求項１〜７および９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記細菌感染症が緑膿菌またはクレブシエラ・ニューモニエ細菌株により引き起こされる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記細菌感染症が、呼吸器感染症、好ましくは、院内細菌性肺炎、または嚢胞性線維症に関連する感染症、または人工呼吸器関連肺炎である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が該組成物の最初の投与の約４〜６時間後に再投与される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
細菌感染症の原因物質を診断する方法であって、
（ｉ）患者からの組織試料を培養するステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の培養物を、請求項８に記載のバクテリオファージと接触させるステップ；および
（ｉｉｉ）前記培養物の増殖または溶解の形跡をモニタリングするステップ；
を含み、前記培養物の溶解の形跡は、ステップ（ｉｉ）で用いられたバクテリオファージに感受性を有することが分かっている細菌株を前記培養物が含むことを示す、方法。
【請求項１５】
前記組織試料が、前記患者の気道から採取した組織生検またはスワブである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
非生体表面における細菌のコロニー形成または増殖を低減または阻害する方法であって、前記表面を請求項８に記載のバクテリオファージと接触させることを含む、方法。
【請求項１７】
表面における細菌のコロニー形成または増殖を低減または阻害するための組成物であって、請求項８に記載のバクテリオファージを含み、前記表面に該バクテリオファージを接触させる、組成物。
【請求項１８】
前記表面は、哺乳動物の粘膜、好ましくはヒトの気道の粘膜である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記非生体表面は、病院の装置または病院設備の表面、より好ましくは手術用装置または手術用設備の表面である、請求項１６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】呼吸器抗菌性ファージを含むバクテリオファージ組成物、およびその使用法
【関連出願の相互参照】
【０００１】
配列表
本出願は、優先権書類においてＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出した配列表を含み、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１６年１０月２８日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、１４１１６＿１０５０１７Ｐ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、２，２１７，６７６バイトのサイズである。１１０
【０００２】
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１６年１２月５日出願の米国仮特許出願第６２／４３０，１１３号に基づく優先権を主張する。
【技術分野】
【０００３】
本出願は、細菌感染症、特に細菌性肺炎などの呼吸器細菌感染症を治療および制御するためのファージ療法分野に関する。より具体的には、本発明は、Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２、Ｐｓａ＿Ｆ９５／１３、Ｆ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１４１／１５、ならびにそれらのバリアントを含めた新規なバクテリオファージ株、その産物およびカクテル；ならびに、例えば緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）および／またはクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって引き起こされる呼吸器感染症を含めた細菌感染症の治療および予防においてそれらを使用する方法に関する。カクテルは、単独でまたは他の療法（例えば、抗生物質もしくは呼吸器感染症のための他の標準的および非標準的な療法）とさらに組み合わせて、医薬組成物として使用される。
【背景技術】
【０００４】
バクテリオファージ（ファージ）は、具体的には、細菌に感染しそれを溶解するウイルスである。ファージ療法、すなわち細菌感染性疾患の治療にファージウイルス全体を使用する方法は、Ｆｅｌｉｘ  ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅによって１９２０年代に導入された。しかしながら、西洋では、１９４０年代に抗生物質が開発されたことにより、ファージに基づく治療法への関心は減退した。この減退に寄与する最も重要な要因のうちの１つは、標準化された試験および生成方法がないことであった。ファージ療法の試験に関する業界全体の標準を開発できなかったことが研究結果の文書化を妨げ、これが、ファージ療法の価値に関して、有効性に欠けているという認識および信用性の問題につながった。ファージ生成における別の問題は、市販のファージ調製物の純度グレードに関連しており、調製物は望ましくない細菌性成分（例えば内毒素）を含んでいた。従って、有害事象は、特に静脈内にそれらを投与される患者において、調製物と関連することが多かった。
【０００５】
それにもかかわらず、東欧およびかつてのソビエト連邦では、抗生物質の利用が限られており、ファージ療法の開発および使用が、抗生物質と共にまたは抗生物質の代わりに続いた。さらに、西洋では、多くの細菌の抗生物質耐性株の台頭と共に、ファージに基づく治療法への関心が戻ってきた。すなわち、たとえ新規なクラスの抗生物質が開発されたとしても、細菌が最終的にその新しい薬物に対する耐性を生じるという見通しによって、細菌感染症を制御、予防および治療するための非化学療法的手段の探索が強化された。
【０００６】
ファージ療法、および特にファージカクテルは、細菌感染症、特に院内肺感染症を含めて呼吸器感染症の治療のための抗生物質の代替を提示する。呼吸器感染症は、毎年４００万人を超える死亡の原因となる。院内細菌性肺炎（ＨＡＢＰ）は急性肺感染症であり、集中治療室で獲得する最も頻度の高いタイプの感染症の１つであり、死亡率の上昇（３３〜４１％の範囲）に関連する（非特許文献１）。院内肺感染症は、典型的には、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、グラム陰性腸内細菌科細菌（クレブシエラ・ニューモニエなど）、またはグラム陰性非腸内細菌科細菌（緑膿菌およびアシネトバクター属菌など）により生じる（非特許文献２および３）。
【０００７】
抗生物質療法がＨＡＢＰにおいて日常的に用いられるが、多剤耐性（ＭＤＲ）細菌、特にグラム陰性細菌のための治療選択肢は乏しい。最近は新たなクラスの薬物は導入されておらず、現在利用可能な少ない選択肢として、コリスチン、チゲサイクリン、およびホスホマイシンが挙げられる。重篤な院内感染に対して、抗生物質の選択肢は非常に少ない（非特許文献４）。
【０００８】
抗生物質のエアロゾル投与は、抗生物質の静脈内投与と比較して、より多くの抗生物質を肺実質に送達させることができる（非特許文献５）。しかしながら、気道および肺実質への直接的な抗生物質毒性による副作用のせいで、今日まで、肺感染症の治療において、エアロゾル化されたコリスチンなどの抗生物質を用いることの明確な臨床的利益はない。それらには、例えば、粘膜刺激、ならびにアミノグリコシドおよびポリミキシンの腎毒性などの、抗生物質の全身吸収により生じる副作用が含まれる（非特許文献６および７）。
【０００９】
様々な試験において、異なる経路を介して投与されるバクテリオファージを用いて細菌性肺感染症を治療することが試みられた（非特許文献８〜１０）。しかしながら、確立された感染をエアロゾル化バクテリオファージが治癒させる実験的研究の証拠はほとんど発表されていない（非特許文献１１）。以前公開された試験は、確立された感染におけるバクテリオファージのエアロゾル投与の効果を評価しておらず、ほとんどが感染のほんの数時間後の結果を検査している（非特許文献１２および１３）。さらに、おそらく、貯蔵安定性を維持しながらファージの異なる特異性を組み合わせるのが困難であるために、異なる細菌に対して抗微生物活性を有するファージカクテルはほとんど存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Guzman-Herrador B, et al, 2014, Hosp Infect 86(l):53-56
【非特許文献２】Quartin AA, et al., 2013, BMC Infect Dis 13:561-566
【非特許文献３】Di Pasuale M, et al, 2014, Crit Care Med 42(2): 303-312
【非特許文献４】Orsi GB, et al, 2011, Expert Rev Anti Infect Ther 9(8):653-679
【非特許文献５】Luyt CE, et al, 2009, Crit Care 13(6):R200
【非特許文献６】Luyt CE, et al., 2013, Expert Rev Anti Infect Ther 11 (5): 511-521
【非特許文献７】Quon BS, et al, 2014, Ann Am Thorac Soc ll(3):425-434
【非特許文献８】Hoe S, et al., 2013, J Aerosol Med Pulm Drug Deliv 26:317- 335
【非特許文献９】Morello E. et al, 2011, PLoS One 6(2): el6963
【非特許文献１０】Debarbieux L, et al, 2010, J Infect Dis 201(7): 1096-1104
【非特許文献１１】Ryan EM, et al, 2011, Pharm Pharmacol 63: 1253-1264
【非特許文献１２】Wilson KR, et al, 200, Microbiology 153(Pt 4):968-979
【非特許文献１３】Alemayehu D. et al, 2012, MBio 3(2):e00029-12
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、病原性細菌、特に肺の細菌に対して、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための治療剤および／または予防剤として新規なファージ産物を開発する必要性が依然としてある。また、呼吸器感染症、好ましくは院内細菌性肺炎、あるいは嚢胞性線維症に関連する感染症または人工呼吸器関連肺炎のための、より良好な治療、特にエアロゾル治療の必要性もある。特に、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエ細菌を含めて、院内呼吸器感染症の原因となる細菌を溶解することができるバクテリオファージカクテルの必要性がある。この出願はこれらおよび他の必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
新規な緑膿菌バクテリオファージおよびクレブシエラ・ニューモニエバクテリオファージ、ならびに細菌感染症の治療におけるそれらの使用を提供する。本明細書に記載のバクテリオファージまたは本明細書に記載のバクテリオファージの２つ以上の組合せを含む医薬組成物は、細菌感染症、特に緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエ感染症の治療、管理または予防に使用され得る。そのような医薬組成物は、呼吸器感染症の治療、管理または予防において特に有用となり、その組成物は肺送達用に製剤化され得る。
【００１３】
本発明の１つの態様は、新規な緑膿菌バクテリオファージおよびクレブシエラ・ニューモニエバクテリオファージに関する。一部の実施形態では、配列番号１、２、または３（それぞれ、緑膿菌ファージＦ９９／１０、Ｆ１１０／１０、またはＦ２７／１２に対応する）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつ緑膿菌に対する抗菌活性を有する精製バクテリオファージを提供する。一部の実施形態では、本発明は、配列番号４（緑膿菌ファージＦ８３／１３に対応する）に対して少なくとも９５％の配列同一性または配列番号５（緑膿菌ファージＦ９５／１３に対応する）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつ緑膿菌に対する抗菌活性を有する精製バクテリオファージを提供する。好ましい実施形態では、バクテリオファージは、配列番号１（Ｆ９９／１０）、配列番号２（Ｆ１１０／１０）、配列番号３（Ｆ２７／１２）、配列番号４（Ｆ８３／１３）、配列番号５（Ｆ９５／１３）、配列番号７（Ｆ９２／１５）、配列番号８（Ｆ１０５／１５）、配列番号９（Ｆ１３４／１５）、および配列番号１０（Ｆ１４１／１５）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む。これら前述したヌクレオチド配列は、記載されるバクテリオファージのゲノムを含むかまたはからなることが理解されるであろう。
【００１４】
一部の態様では、上記のバクテリオファージゲノムは、第１のまたは主要なコンティグ配列に対応し、そこにはファージゲノムを完成させるのに使用するための、ファージの完全ゲノム（comple genome）に関連する追加のコンティング配列（通常かなり短い配列）が残っている。
【００１５】
特に、配列番号５は、４３,０２０塩基対の第１のコンティグ配列に対応する。配列番号６３４〜６３６はそれぞれ、関連する第２、第３および第４のコンティングに対応する。
【００１６】
配列番号７は、２９，８６８塩基対の第１のコンティグ配列に対応する。配列番号６３７〜６５３はそれぞれ、関連する第２〜第１８のコンティングに対応する。
【００１７】
配列番号８は、１７，２４７塩基対の第１のコンティグ配列に対応する。配列番号６５４〜６９８はそれぞれ、関連する第２〜第４６のコンティングに対応する。
【００１８】
配列番号９は、１０，０９０塩基対の第１のコンティグ配列に対応する。配列番号６９９〜７４７はそれぞれ、関連する第２〜第５０のコンティングに対応する。
【００１９】
配列番号１０は、３２，１０５塩基対の第１のコンティグ配列に対応する。配列番号７４８〜７４９はそれぞれ、関連する第２および第３のコンティングに対応する。
【００２０】
一部の実施形態では、本発明は、配列番号７（クレブシエラ・ニューモニエファージＦ９２／１５に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性、または配列番号８（クレブシエラ・ニューモニエファージＦ１０５／１５に対応する）に対して少なくとも９９％の配列同一性、または配列番号９（クレブシエラ・ニューモニエファージＦ１３４／１５に対応する）に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０（クレブシエラ・ニューモニエファージＦ１４１／１５に対応する）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する精製バクテリオファージを提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、本発明のバクテリオファージまたはファージ産物、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。一部の実施形態では、医薬組成物は、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する１種または２種以上の追加のバクテリオファージまたはファージ産物をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、それを必要とする対象に組成物を投与する際に約１〜約１０の感染多重度（ＭＯＩ）を提供する量でバクテリオファージが存在する剤形に製剤化される。好ましい実施形態では、組成物はエアロゾルとしての投与用に製剤化される。
【００２２】
本発明の別の態様は、カクテル組合せ中に２つ以上の異なる精製バクテリオファージを含む組成物に関する。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも２つの異なるファージを含む医薬組成物に関し、各ファージは、配列番号１、または３（それぞれ、緑膿菌ファージＦ９９／１０またはＦ２７／１２に対応する）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号５（緑膿菌ファージＦ９５／１３に対応する）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号６（クレブシエラ・ニューモニエファージＦ３９１／０８に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号７（クレブシエラ・ニューモニエファージＦ９２／１５に対応する）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号８（クレブシエラ・ニューモニエファージＦ１０５／１５に対応する）に対して少なくとも９９％の配列同一性、配列番号９（クレブシエラ・ニューモニエファージＦ１３４／１５に対応する）に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０（クレブシエラ・ニューモニエファージＦ１４１／１５に対応する）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつ緑膿菌またはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する。特に好ましい実施形態では、バクテリオファージは、配列番号１（Ｆ９９／１０）、配列番号３（Ｆ２７／１２）、配列番号５（Ｆ９５／１３）、配列番号６（Ｆ３９１／０８）、配列番号７（Ｆ９２／１５）、配列番号８（Ｆ１０５／１５）、配列番号９（Ｆ１３４／１５）、および配列番号１０（Ｆ１４１／１５）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、組成物は３つの異なるバクテリオファージを含み、各ファージは、配列番号１、３、または５（それぞれ、ファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２、またはＦ９５／１３に対応する）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子を含み、かつ緑膿菌に対する抗菌活性を有する。一部の好ましい実施形態では、組成物は５つの異なるバクテリオファージを含み、各ファージは、配列番号１または３に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４（Ｆ８３／１３）に対して少なくとも９５％の配列同一性、または配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸分子を含み、かつ緑膿菌に対する抗菌活性を有する。さらに好ましい実施形態では、組成物は、エアロゾルとしての投与のためおよび肺送達のために製剤化される。
【００２４】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象において細菌感染症を治療する、または細菌感染症の発症を低減する、または細菌感染症を管理する方法であって、前記対象に治療または予防有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む方法、ならびにこれに関連する医薬組成物の使用に関する、一部の実施形態では、細菌感染症は、１または２以上の公知の抗生物質に対して耐性を示すおよび／またはバイオフィルムを形成することができる細菌株を含めて、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエ菌株により引き起こされる。好ましい実施形態では、治療すべきまたは発症を低減すべき細菌感染症は、呼吸器感染症、より好ましくは、院内細菌性肺炎、または嚢胞性線維症に関連する呼吸器感染症である。特に好ましい実施形態では、組成物をエアロゾルとして肺に投与する。一部の実施形態では、組成物を、最初の投与の約４〜６時間後に再投与する。
【００２５】
本発明の別の態様は、細菌感染症の原因物質（causative agent）を診断する方法であって、（ｉ）スワブまたは喀痰、あるいは感染を生じさせる細菌を培養するのに適した他の試料などの、患者からの試料を培養するステップ；（ｉｉ）ステップ（ｉ）の培養物を、本発明のバクテリオファージまたはファージ産物と接触させるステップ；および（ｉｉｉ）前記培養物の増殖または溶解の形跡(evidence)をモニタリングするステップ；を含み、前記培養物の溶解の形跡は、ステップ（ｉｉ）で用いられたバクテリオファージまたはファージ産物に感受性を有することが分かっている細菌株を含むことを示す方法に関する。一部の実施形態では、試料は、患者の気道から採取した組織生検またはスワブである。例えば、試料は、気管支肺胞洗浄液または気管支分泌物を含んでいてよい。
【００２６】
本発明のさらに別の態様は、表面における細菌のコロニー形成または増殖を低減または阻害する方法であって、前記表面を本発明のバクテリオファージまたはファージ産物と接触させることを含む方法を提供する。一部の実施形態では、前記表面は、哺乳動物の粘膜、好ましくはヒトの気道の粘膜である。一部の実施形態では、表面は、非生体表面、好ましくは病院の装置または病院設備の表面、より好ましくは手術用装置または手術用設備の表面である。
【００２７】
定義
本明細書で使用する場合、核酸分子の文脈における用語「単離（された）」は、第１の核酸分子の天然源に存在する他の核酸分子から分離された第１の核酸分子を意味する。「ｏｒｆ」またはファージゲノムなどの「単離」核酸分子は、組換え技術によって産生された場合は、他の細胞物質または培地を実質的に含んでおらず、あるいは化学的に合成された場合は、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含んでおらず；さらに例えば、核酸ライブラリー中の他のクローンからまたは単離ファージから精製および単離された場合は、他のＤＮＡまたは他のゲノムＤＮＡ分子を含んでいない可能性がある。さらに、「単離」ゲノムＤＮＡは、組換え技術によって産生された場合またはファージから単離された場合は、他のウイルス物質もしくは細胞物質または培地を実質的に含んでおらず、あるいは化学的に合成された場合は、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含んでおらず、さらに例えば、他のバクテリオファージまたは細胞材料を含有する調製物から精製および単離された場合は、他のＤＮＡまたは他のゲノムＤＮＡ分子を含んでいない可能性がある。
【００２８】
バクテリオファージに関する用語「精製（された）」は、任意の精製方法（これらに限定されないが、環境または培養物からの単離、例えば、増殖および／または増幅、遠心分離などの後の培養物からの単離を含む）によって、ファージの濃度がある程度まで高められ、それによって、部分的に、実質的に、ほぼ完全にまたは完全に、例えば宿主細胞および宿主細胞成分などの不純物が除去されたことを意味する。当業者であれば、所定の使用に必要な精製量を理解するであろう。例えば、ヒトへの投与が意図された治療組成物で使用するための精製ファージは、規制基準および適正製造基準に準拠して高純度でなければならない。
【００２９】
ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質または核酸分子に関する用語「精製（された）」は、任意の精製方法（これらに限定されないが、カラムクロマトグラフィ、ＨＰＬＣ、沈殿、電気泳動などを含む）によって、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質または核酸分子の濃度がある程度まで高められ、それによって、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質または核酸分子の調製に関連する前駆体または他の化学物質などの不純物が、部分的に、実質的に、ほぼ完全にまたは完全に除去されたことを意味する。当業者であれば、所定の使用に必要な精製量を理解するであろう。例えば、ヒトへの投与が意図された治療組成物で使用するための単離および精製されたゲノムＤＮＡまたはタンパク質またはポリペプチドは、通常、規制基準および適正製造基準に準拠して高純度でなければならない。
【００３０】
本明細書において使用される場合、用語「バクテリオファージ産物」または「生物活性バクテリオファージ産物」は、本発明のバクテリオファージから単離または誘導され、かつそれが単離または誘導された元のバクテリオファージに関連する生物学的機能または活性（例えば、溶解による殺細胞などの抗菌活性）を保持しているタンパク質、またはその断片もしくはバリアント、ならびにそれらをコードする核酸を意味する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、ヌクレオチド配列の文脈における用語「バリアント（variant）」は、基準核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むかまたはからなるヌクレオチド配列を意味する。基準核酸配列の１つ以上の機能を保持するバリアントを選択してもよい。例えば、バリアントバクテリオファージは、例えばそれが由来するバクテリオファージの抗菌活性（例えば溶菌性殺活性）などの、少なくとも１つの生物活性を示し得る。当業者であれば、所定のファージは、抗生物質としてのその産生中を含めて、それが複製するときに少なくとも１％の変異（variation）を示すように、ファージにおける核酸複製が１００％未満の正確さであることを理解するであろう。ファージの製造および使用中の予測されるゲノム変異は、親ゲノムのヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するバリアントである子孫をもたらし得る。ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、親ファージのヌクレオチド配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するゲノムを含むかまたはからなり、かつ親ファージの標的（宿主）細菌に対する抗菌活性を保持する。
【００３２】
例えば、ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、配列番号１（Ｆ９９／１０）、配列番号３（Ｆ２７／１２）または配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなり、かつ緑膿菌に対する抗菌活性を保持する。ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、配列番号８（Ｆ１０５／１５）または配列番号９（Ｆ１３４／１５）に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなり、かつクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を保持する。
【００３３】
本明細書中の新規なファージのいずれかに関して用語「子孫」は、本明細書で特定されている特定核酸のバクテリオファージの継代培養に従い、または当業者に公知の方法により、産生される子孫を含むバクテリオファージ複製物、あるいは本明細書で特定されている特定核酸のバクテリオファージに実質的に相当するＲＦＬＰ（制限断片長多型）ＤＮＡプロファイルを有するバクテリオファージを意味する。用語「実質的に相当するまたは等しいＲＦＬＰを有する」は、Ｔｅｎｏｖｅｒらにより示唆される方法に従い生物間での変動性を表すために表現される（Tenover, F. C. et al. Interpreting Chromosomal DNA Restriction Patterns Produced by Pulsed-Field Gel Electrophoresis: Criteria for Bacterial Strain Typing. J. Clin. Microbiol 33:2233-2239 (1995)）。Ｔｅｎｏｖｅらは、同一の増殖生物のゲノムを制限酵素で制限し、その後電気泳動するという条件で、許容レベルの変動性を示唆する。Ｔｅｎｏｖｅｒらにより示唆される基準に従えば、相当するＲＦＬＰ  ＤＮＡプロファイルを有する子孫は、本明細書で特定されている特定核酸のバクテリオファージに実質的に相当するバクテリオファージ、すなわち、実質的に、配列番号１〜１０の何れかのヌクレオチド配列を有する核酸配列を含むバクテリオファージの同等物であると考えることができる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「コンティグ」は、コンティングを作成するためにより大きな配列（例えば、バクテリオファージのゲノムに対応する）の断片の重なり合うリードを一組の重なり合わない領域内につなげる（merging）ことに基づきアセンブルされたヌクレオチド配列を意味する。最初に、シークエンシングエラー（配列決定誤差）または上記のような生物学的変動のせいである例えば許容されるミスマッチ（ヌクレオチド位置での変動）の数に基づき２つ以上のコンティグを得ることができる。従って、コンティグは重なり合う配列の異なる配置（arrangement）を表す。コンティグをさらに解析および再配置して、例えば完全ゲノム配列などの完全配列の全てまたはほとんどを作成することができる。例えば、ファージＦ９５／１３のゲノムは、配列番号５（４３，０２０塩基対の第１のコンティグ配列に対応する）に対応する核酸、ならびに配列番号６３４〜６３６（それぞれ、このファージの完全長遺伝子配列決定のための関連する第２、第３および第４のコンティングに対応する）に対応する核酸配列により表される。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、核酸分子をトランスフェクトさせた特定の対象細胞、ならびにその核酸分子またはその染色体に組み込まれた形態を含むそのような細胞の子孫または潜在的子孫を意味する。そのような細胞の子孫は、次世代で起こり得る突然変異もしくは環境の影響、または宿主細胞ゲノムへの核酸分子の組込みのせいで、核酸分子をトランスフェクトさせた親細胞と同一でない場合もある。「宿主細胞」は、そこでバクテリオファージが生きおよび複製する、バクテリオファージ（例えばファージ全体）が感染した細菌細胞などの細胞も意味する。バクテリオファージの生成に関して、宿主細胞は、それからバクテリオファージが単離または培養されたものと同じ種または株であってもまたはそうでなくてもよい。
【００３６】
本明細書において使用される場合、用語「断片」は、完全長タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも２５個の連続するアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも７０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも連続する８０個のアミノ酸残基、少なくとも連続する９０個のアミノ酸残基、少なくとも連続する１００個のアミノ酸残基、少なくとも連続する１２５個のアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続するアミノ酸残基、少なくとも連続する１７５個のアミノ酸残基、少なくとも連続する２００個のアミノ酸残基、または少なくとも連続する２５０個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドを意味する。特定の実施形態では、断片は、それが単離されるタンパク質の少なくとも１つの機能（例えば、溶菌による殺細胞などの抗菌活性）を保持しているという点で機能的断片である。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「組み合わせて」または「さらなる組合せで」または「さらに組み合わせて」は、本発明のバクテリオファージまたはファージ産物（本発明の異なるバクテリオファージのファージカクテルを含む）と共に、追加の予防剤および／または治療剤を使用することを意味する。用語「組み合わせて」の使用は、予防剤および／または治療剤を対象に投与する順序を制限するものではない。第１の予防剤または治療剤を、第２の予防剤または治療剤（第１の予防剤または治療剤とは異なる）の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８間週または１２週間前）に、第２の予防剤または治療剤の投与と同時に、あるいは第２の予防剤または治療剤の投与の後（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）に対象に投与してよい。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「ブースト」または「ブースター」は、本発明のバクテリオファージ、ファージ産物、またはファージカクテルの反復投与など、同じまたは実質的に同じ予防剤および／または治療剤の後続の繰返し使用を意味する。予防剤または治療剤を、同じまたは実質的に同じ予防剤または治療剤の第２の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）に対象に最初に投与してよい。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「予防剤（単数）」および「予防剤（複数）」という用語は、疾病または疾患、特に細菌感染症に関連する疾病または疾患、さらに特に、院内感染細菌性肺炎、または嚢胞性線維症に関連する呼吸器細菌感染症などの、呼吸器細菌感染症に関連する疾病または疾患の、１または２以上の症状の予防、管理または制御、あるいはその発症の低減において使用することができる、本発明のバクテリオファージ、ファージ産物、またはファージカクテルなどの薬剤を意味する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「治療剤（単数）」および「治療剤（複数）」は、疾病または疾患、特に細菌感染症に関連する疾病または疾患、さらに特に、院内感染細菌性肺炎、または嚢胞性線維症に関連する呼吸器細菌感染症などの、呼吸器細菌感染症に関連する疾病または疾患の、１または２以上の症状の治療、管理または制御において使用することができる、本発明のバクテリオファージ、ファージ産物、またはファージカクテルなどの薬剤を意味する。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「治療する（treat）」、「治療（treatment）」、および「治療すること（treating）」という用語は、医薬組成物を受けた対象において治療的利益を得ることを意味する。治療的利益の達成に関して、その目的は、病的状態または疾患に関連する症状または根本原因（例えば細菌感染）を消失させる、軽減する、その重篤性を低減する、緩和する、またはその進行を遅らせることである。「治療有効量」は、医薬組成物を受けている対象において少なくとも１つの治療的利益を達成するのに十分である、本発明の医薬組成物中のバクテリオファージまたはファージ産物などの治療剤の量を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「予防する」、「予防」および「予防すること」は、医薬組成物を受けている対象において、予防的利益を得ることを意味する。予防的利益の達成に関して、その目的は、病的状態または疾患に関連する症状または根本原因（例えば、細菌感染）を遅延させる、発症を減らす、または防止することである。「予防有効量」は、医薬組成物を受けている対象において少なくとも１つの予防的利益を達成するのに十分である、本発明の医薬組成物中のバクテリオファージまたはファージ産物などの予防剤の量を意味する。
【００４３】
本明細書で使用する場合、バクテリオファージまたはバクテリオファージ産物（例えばファージタンパク質）、あるいはそれらのバリアントまたは断片に関連する用語「抗菌活性」および「抗微生物活性」は、微生物、特に、バクテリオファージが感染する細菌の種もしくは株を殺傷するおよび／またはその増殖もしくは生殖を阻害する能力を意味する。ある実施形態では、抗菌活性は、細菌、例えば、グラム陰性細菌（緑膿菌またはクレブシエラ・ニューモニエ）を、標準的な手法（例えば、液体培養または寒天プレートで）に従って培養し、その培養物を、本発明のバクテリオファージ、ファージタンパク質、またはそれらのバリアント、あるいはバクテリオファージ、ファージタンパク質、またはそれらのバリアントのカクテルと接触させ、さらに前記接触後に細胞増殖をモニタリングすることによって評価される。例えば、液体培養では、培養物の指数増殖の中間点を表す光学密度（「ＯＤ」）まで細菌を増殖させてよく；この培養物を、１つまたは２つ以上の濃度の本発明の１種または２種以上のバクテリオファージ、バクテリオファージ産物またはそれらのバリアントに曝露させ、対照培養物と比較してＯＤをモニタリングする。対照培養物と比較して低下したＯＤは、抗菌活性（例えば溶菌性殺活性）を示すファージまたはファージ産物を表す。同様に、細菌コロニーを寒天プレート上に形成させることができ、このプレートを本発明の１種または２種以上のバクテリオファージまたはファージ産物、あるいはそれらのバリアントに曝露し、その後のコロニー増殖を、対照プレートと関連付けて評価する。コロニーサイズの低減またはコロニー総数の減少は、抗菌活性を有するファージまたはファージ産物を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明のバクテリオファージで急性肺感染症を治療するマウスモデルを使用するための試験設計を示す。
【図２】本発明のバクテリオファージ組成物のエアロゾル投与のためのクラスＩＩ生物学的安全キャビネット内で使用するための噴霧システムを示す。
【図３】Ｆ９９／１０ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその下にさらにリストして示す。
【図４】Ｆ２７／１２ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその右にさらにリストして示す。
【図５】Ｆ９５／１３ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその右にさらにリストして示す。
【図６】Ｆ３９１／０８ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその右および下にさらにリストして示す。
【図７】Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその右および下にさらにリストして示す。
【図８−１】Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその右および下にさらにリストして示す。
【図８−２】図８−１の続き
【図９】透過電子顕微鏡を用いて、バクテリオファージＦ９９／１０（Ａ）、Ｆ２７／１２（Ｂ）、およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３（Ｃ）の形態学的特徴を示す。
【図１０】透過電子顕微鏡用いて、バクテリオファージＦ３９１／０８（Ａ）、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５（Ｂ）、およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５（Ｃ）の形態学的特徴を示す。
【図１１】ＭＯＩ＝１を用いた緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３ファージの個々の溶菌曲線を示す。
【図１２】ＭＯＩ＝１０を用いた緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３ファージの個々の溶菌曲線を示す。
【図１３】ＭＯＩ＝１０を用いた緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３ファージの組み合わせた溶菌曲線を示す。
【図１４】ＭＯＩ＝１０を用いたクレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージの個々の溶菌曲線を示す。
【図１５】ＭＯＩ＝１０を用いたクレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージの組み合わせた溶菌曲線を示す。
【図１６】緑膿菌１９９２／０５株に関して、感染後３４時間で、処置後２２時間の肺の細菌数に基づき、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３のバクテリオファージカクテルの効果を示す。
【図１７】陰性対照群、緑膿菌１９９２／０５感染群、緑膿菌１９９２／０５抗生物質処置群、および緑膿菌１９９２／０５ファージ処置群由来のマウスの肺の切片からの、（Ａ）マウスの肺組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色した光顕微鏡写真、および（Ｂ）肺胞腔および隔壁の詳細を示す。
【図１８】ｔ０、ｔ１、およびｔ３に創傷をスワブし、細菌コロニー形成単位の数を感染群とＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３のファージカクテルでの処置群との間で比較した、創傷の細菌負荷量を示す。
【図１９】緑膿菌１９９２／０５感染、Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３のファージカクテルでのファージ処置、およびビヒクルに暴露したラットにおける皮膚創傷の顕微鏡写真を示す。
【図２０】ファージＦ９９／１０およびＦ２７／１２の溶解物から抽出したＤＮＡからの１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅領域（８〜１５２５ｂｐ）のアガロースゲル電気泳動を示す。
【図２１】ファージＰｓａ＿Ｆ９５／１３の溶解物から抽出したＤＮＡからの１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅領域（８〜１５２５ｂｐ）のアガロースゲル電気泳動を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、細菌感染症、特に、嚢胞性線維症に関連する細菌性肺炎および呼吸器感染症、または人工呼吸器関連肺炎などの、呼吸器細菌感染症を治療および制御するためのファージ療法に関する。本発明の１つの態様は、新規なバクテリオファージ株（緑膿菌ファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２、Ｐｓａ＿Ｆ９５／１３；およびクレブシエラ・ニューモニエファージＫｌｅ＿Ｆ９２／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５、およびＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５を含む）、ならびにそれらのバリアントおよび産物（有用なファージタンパク質およびそれをコードする核酸を含む）に関する。本発明の別の態様は、本発明の１種または２種以上のバクテリオファージおよび／またはファージ産物のカクテル組成物、ならびにＦ３９１／０８（国際出願第ＰＣＴ／ＰＴ２０１１／００００３１号で以前開示された）などの、他のファージとの組合せに関する。さらに別の態様は、ファージ（単数および複数）および／またはファージ産物（単数および複数）の医薬組成物、ならびに、細菌感染症、特に緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエにより引き起こされる呼吸器感染症の治療および予防においてそれを使用する方法に関する。さらに他の本発明の態様は、ファージ、ファージ産物、およびそれらの組合せの、診断ツールおよび殺菌剤としての使用に関する。
【００４６】
バクテリオファージおよびそのバリアント
本発明の１つの態様は、緑膿菌の多くの株を標的とする新規な緑膿菌バクテリオファージに関する。緑膿菌は、土壌、水、皮膚の菌叢、およびほとんどの人工環境に見られる、一般的なグラム陰性桿菌である。これは、正常な大気中のみならず、通性嫌気性菌のように酸素がほとんどなくても盛んに増殖し、損傷組織、あるいは免疫不全の個体に感染することができる。肺、尿路、および腎臓などの重要な体の器官でそのようなコロニー形成が生じると、致命的な結果となることがある。緑膿菌は表面で盛んに増殖するため、この細菌は、カテーテルを含めて、医療機器上および医療機器内にも見られ、病院および診療所での交差感染の原因となる。緑膿菌は、最も関連する日和見性の院内感染病原体の１つであり、１０の院内感染のうち１つは、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）によるものであると推定されている。緑膿菌はまた、カテーテルなどの医療装置に最も頻繁にコロニー形成するものである。
【００４７】
一実施形態では、本発明は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージを提供する。この実施形態に従う具体例は、精製バクテリオファージＦ９９／１０であり、それは緑膿菌の多くの株を標的とする。Ｆ９９／１０のゲノム内のオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）、そのｏｒｆによりコードされるアミノ酸配列、およびそのコードされるアミノ酸配列（すなわち、コードされるタンパク質）の推定機能を、図３に提供する。
【００４８】
図３は、Ｆ９９／１０ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその下にさらにリストして示す。ゲノムおよび遺伝子産物のさらなる解析は下記の実施例で論じる。
【００４９】
ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、配列番号１の核酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有するゲノムを含むかまたはからなり、そのバクテリオファージは、Ｆ９９／１０の少なくとも１つの生物活性、例えば溶菌性殺活性などの抗菌活性を示す。特定の実施形態において、バクテリオファージは、配列番号１に対して少なくとも９７％、またはそれより高い配列同一性を有する。代わりにまたは加えて、本発明のバクテリオファージは、配列番号１の核酸の機能的断片を含むゲノムを有していてよい。
【００５０】
別の実施形態では、本発明は、配列番号３のヌクレオチド配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージを提供する。この実施形態に従う具体例は、精製バクテリオファージＦ２７／１２であり、それも多くの緑膿菌株を標的とする。Ｆ２７／１２のゲノム内のオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）、そのｏｒｆによりコードされるアミノ酸配列、およびそのコードされるアミノ酸配列（すなわち、コードされるタンパク質）の推定機能を、図４に提供する。
【００５１】
図４は、Ｆ２７／１２ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその右にさらにリストして示す。ゲノムおよび遺伝子産物のさらなる解析は下記の実施例で論じる。
【００５２】
ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、配列番号３の核酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有するゲノムを含むかまたはからなり、そのバクテリオファージは、Ｆ２７／１２の少なくとも１つの生物活性、例えば溶菌性殺活性などの抗菌活性を示す。特定の実施形態において、バクテリオファージは、配列番号３に対して少なくとも９７％超の配列同一性を有する。代わりにまたは加えて、本発明のバクテリオファージは、配列番号３のヌクレオチド配列の機能的断片を含むゲノムを有していてよい。
【００５３】
別の実施形態では、本発明は、配列番号５の核酸配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージを提供する。この実施形態に従う具体例は、精製バクテリオファージＦ９５／１３（「Ｐｓａ＿Ｆ９５／１３」と互換的に用いられる表示）であり、それも緑膿菌の多くの株を標的とする。Ｆ９５／１３のゲノム内のオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）、そのｏｒｆによりコードされるアミノ酸配列、およびそのコードされるアミノ酸配列（すなわち、コードされるタンパク質）の推定機能を、図５に提供する。
【００５４】
図５は、Ｆ９５／１３ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその右にさらにリストして示す。ゲノムおよび遺伝子産物のさらなる解析は下記の実施例で論じる。
【００５５】
ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、配列番号５の核酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有するゲノムを含むかまたはからなり、そのバクテリオファージは、Ｆ９５／１３の少なくとも１つの生物活性、例えば溶菌性殺活性などの抗菌活性を示す。特定の実施形態において、バクテリオファージは、配列番号５に対して少なくとも９７％超の配列同一性を有する。代わりにまたは加えて、本発明のバクテリオファージは、配列番号５のヌクレオチド配列の機能的断片を含むゲノムを有していてよい。
【００５６】
本発明の別の態様は、クレブシエラ・ニューモニエの多くの株を標的とする新規なクレブシエラ・ニューモニエバクテリオファージに関する。クレブシエラ・ニューモニエは、口腔、皮膚、および腸の正常な細菌叢において見られる、グラム陰性の非運動性の桿菌である。莢膜を持つ通気嫌気性菌として、この細菌は土壌中に自然にも生じる。臨床的に、これは、腸内細菌科細菌のクレブシエラ属の最も重要なメンバーである。クレブシエラ属の感染は、例えばアルコール依存症患者や糖尿病患者などの不適切な食事で免疫系が弱まった人々において生じる傾向がある。クレブシエラ属はまた、慢性肺疾患、鼻粘膜萎縮、嚢胞性線維症、および鼻硬化症を有する患者にとって日和見性の病原体である。クレブシエラ・ニューモニエの新たな抗生物質耐性株が出現しており、それは、例えば汚染した機器との接触に起因する、院内感染としてますます見いだされている。
【００５７】
クレブシエラ・ニューモニエは、実際に、ヒトにおける気道感染症の最も重要な原因病原体の１つであり、単独でグラム陰性細菌に起因する院内肺炎の２５〜４３％を占める（Chibber S et al, 2008, J Med Microbiol 57(12): 1508-1513）。多剤耐性細菌の高い発生は、現在の抗生物質での効果を制限し、さらに高い確率で耐性株による患者のコロニー形成をもたらす。莢膜多糖は、クレブシエラ属菌株の重要な病原性因子であり、かつファージ感染の制限要因である。文献は７８種類の莢膜型を記載しており（Hus CR, et al., 2013, PLoS One 8(8):e70092）、これらの菌種に感染するファージはこの「バリア」を克服した。クレブシエラ・ニューモニエの毒性株は、例えば化膿性肝膿瘍におけるように、主にＫ１およびＫ２莢膜血清型に関連している（Cleg S et al., 2016, Microbiol Spectr 4(1)；およびLin TZ et al., 2014, J Infect Dis 210: 1734-1744）が、Ｋ１莢膜多糖は院内感染型分離株よりも市中感染型分離株に関連していた（Tsay RW et al., 2002, Arch Intern Med 162(9): 1021-1027）。それでもなお、感染のタイプによって、菌株は様々な莢膜血清型を示し、クレブシエラ・ニューモニエ莢膜血清型の分布は世界中で異なる（Hus CR et al, 2013, PLoS One 8(8):e70092）。
【００５８】
一実施形態では、本発明は、配列番号７のヌクレオチド配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージを提供する。この実施形態に従う具体例は、精製バクテリオファージＦ９２／１５（「Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５」と互換的に用いられる表示）であり、それはクレブシエラ・ニューモニエの多くの株を標的とする。Ｆ９２／１５のゲノム内のオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）、そのｏｒｆによりコードされるアミノ酸配列、およびそのコードされるアミノ酸配列（すなわち、コードされるタンパク質）の推定機能を、図７に提供する。
【００５９】
図７は、Ｆ９２／１５ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその右および下にさらにリストして示す。ゲノムおよび遺伝子産物のさらなる解析は下記の実施例で論じる。
【００６０】
ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、配列番号７のヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有するゲノムを含むかまたはからなり、そのバクテリオファージは、Ｆ９２／１５の少なくとも１つの生物活性、例えば溶菌性殺活性などの抗菌活性を示す。特定の実施形態において、バクテリオファージは、配列番号７に対して少なくとも７９％超の配列同一性を有する。代わりにまたは加えて、本発明のバクテリオファージは、配列番号７のヌクレオチド配列の機能的断片を含むゲノムを有していてよい。
【００６１】
ある実施形態では、本発明は、配列番号８のヌクレオチド配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージを提供する。この実施形態に従う具体例は、精製バクテリオファージＦ１０５／１５（「Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５」と互換的に用いられる表示）であり、それもクレブシエラ・ニューモニエの多くの株を標的とする。Ｆ１０５／１５のゲノム内のオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）、そのｏｒｆによりコードされるアミノ酸配列、およびそのコードされるアミノ酸配列（すなわち、コードされるタンパク質）の推定機能を、図８に提供する。
【００６２】
図８は、Ｆ１０５／１５ゲノムの概略構成を、機能を割り当てられたＯＲＦをその右および下にさらにリストして示す。ゲノムおよび遺伝子産物のさらなる解析は下記の実施例で論じる。
【００６３】
ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、配列番号８の核酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有するゲノムを含むかまたはからなり、そのバクテリオファージは、Ｆ１０５／１５の少なくとも１つの生物活性、例えば溶菌性殺活性などの抗菌活性を示す。特定の実施形態において、バクテリオファージは、配列番号８に対して少なくとも９９％超の配列同一性を有する。代わりにまたは加えて、本発明のバクテリオファージは、配列番号８のヌクレオチド配列の機能的断片を含むゲノムを有していてよい。
【００６４】
ある実施形態では、本発明は、配列番号９のヌクレオチド配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージを提供する。この実施形態に従う具体例は、精製バクテリオファージＦ１３４／１５（「Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５」と互換的に用いられる表示）であり、それもクレブシエラ・ニューモニエの多くの株を標的とする。
【００６５】
ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、配列番号９のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有するゲノムを含むかまたはからなり、そのバクテリオファージは、Ｆ１３４／１５の少なくとも１つの生物活性、例えば溶菌性殺活性などの抗菌活性を示す。特定の実施形態において、バクテリオファージは、配列番号９に対して少なくとも９８％超の配列同一性を有する。代わりにまたは加えて、本発明のバクテリオファージは、配列番号９のヌクレオチド配列の機能的断片を含むゲノムを有していてよい。
【００６６】
ある実施形態では、本発明は、配列番号１０のヌクレオチド配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージを提供する。この実施形態に従う具体例は、精製バクテリオファージＦ１４１／１５（「Ｋｌｅ＿Ｆ１４１／１５」と互換的に用いられる表示）であり、それもクレブシエラ・ニューモニエの多くの株を標的とする。
【００６７】
ある実施形態では、本発明のバクテリオファージは、配列番号１０のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のヌクレオチド配列同一性を有するゲノムを含むかまたはからなり、そのバクテリオファージは、Ｆ１４１／１５の少なくとも１つの生物活性、例えば溶菌性殺活性などの抗菌活性を示す。特定の実施形態において、バクテリオファージは、配列番号１０に対して少なくとも９５％超の配列同一性を有する。代わりにまたは加えて、本発明のバクテリオファージは、配列番号１０のヌクレオチド配列の機能的断片を含むゲノムを有していてよい。
【００６８】
本発明は、本発明の１種または２種以上のバクテリオファージが感染した単離細菌も提供する。ある実施形態では、本発明は、配列番号１、２、３、４、５のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなる１種または２種以上のバクテリオファージが感染した精製緑膿菌を提供する。他の実施形態では、本発明は、配列番号７〜１０のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなる１種または２種以上のバクテリオファージが感染した精製クレブシエラ・ニューモニエを提供する。
【００６９】
ファージタンパク質およびそのバリアント
本発明は、本発明のバクテリオファージから単離したポリペプチドも提供する。単離ポリペプチドは完全長バクテリオファージタンパク質であってよく、あるいはバクテリオファージタンパク質の断片またはバリアントであってもよいが、その断片またはバリアントはそれが由来するバクテリオファージまたはポリペプチドに関連する少なくとも１つの生物活性を示すことを条件とする。ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、バクテリオファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２、またはＦ９５／１３から単離され、それらの各バクテリオファージは典型的には緑膿菌に感染する。
【００７０】
ある実施形態では、本発明のポリペプチドは、バクテリオファージＦ９２／１５、Ｆ１０５／１５、Ｆ１３４／１５、またはＦ１４１／１５から単離され、それらの各バクテリオファージは典型的にはクレブシエラ・ニューモニエに感染する。
【００７１】
ある実施形態では、本発明のポリペプチドを、治療剤（例えば、異種ポリペプチドまたは小分子）に、組換えによって融合させるかまたは化学的に結合させて（共有結合および非共有結合の両方を含む）、融合タンパク質またはキメラポリペプチドを生成する。融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を介して、または化学結合を介して生じさせてもよい。本発明のポリペプチドを結合させ得る治療剤の非限定的な例は、ペプチド性または非ペプチド性の細胞毒素（抗微生物剤および／または抗生物質を含む）、トレーサー／マーカー分子（例えば、放射性核種およびフルオロフォア）、ならびに当技術分野で既知の他の抗生物質化合物または抗菌化合物である。
【００７２】
カクテル組成物
本発明の特定の態様は、異なるバクテリオファージのカクテル組成物に関する。「カクテル」は、少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる精製バクテリオファージまたはそのバリアントを含んでいてよい。カクテルは、単独で使用しても、あるいは例えば抗生物質および／または抗真菌剤などの他の治療薬とさらに組み合わせて使用してもよい。
【００７３】
ファージカクテルは、例えば、特定の種または株の細菌に対する溶菌活性を増大させる、および／または個々のバクテリオファージに耐性の細菌が出現する可能性を減らすなど、ファージを個別に使用することを超える利点をもたらす。異なるバクテリオファージをカクテルとして混合して、それらの特性を広げることができ、好ましくは、集合的により大きな抗菌活性スペクトルをもたらす。しかしながら、おそらく、別個の株の存在下で個々のバクテリオファージの感染能力および／または溶菌活性を維持しながら、バクテリオファージ株の異なる特異性を組み合わせるのは困難であるため、異なる細菌に対して抗微生物活性を有するファージカクテルはほとんど存在しない。
【００７４】
一部の実施形態では、本発明は、同じまたは異なる細菌種または株に対して抗菌活性を有する少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含むカクテル組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含むカクテル組成物であって、各バクテリオファージが、配列番号１（Ｆ９９／１０）、配列番号３（Ｆ２７／１２）、配列番号５（Ｆ９５／１３）、配列番号６（Ｆ３９１／０８）、配列番号７（Ｆ９２／１５）、配列番号８（Ｆ１０５／１５）、配列番号９（Ｆ１３４／１５）、および配列番号１０（Ｆ１４１／１５）から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有するそのバリアントである、カクテル組成物を提供する。例えば、カクテルは、それぞれバクテリオファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２、Ｆ９５／１３、Ｆ３９１／０８、Ｆ９２／１５、Ｆ１０５／１５、Ｆ１３４／１５、およびＦ１４１／１５の例えば抗菌活性（例えば溶菌性殺活性）などの少なくとも１つの生物活性を示すバリアントバクテリオファージを与えるように、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０の配列の機能的断片を含むゲノムを有するファージバリアントを含んでいてよい。
【００７５】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含むカクテル組成物であって、各バクテリオファージが、配列番号１（Ｆ９９／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３（Ｆ２７／１２）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号６（Ｆ３９１／０８）少なくとも９０％の配列同一性、配列番号７（Ｆ９２／１５）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号８（Ｆ１０５／１５）に対して少なくとも９９％の配列同一性、配列番号９（Ｆ１３４／１５）に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０（Ｆ１４１／１５）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつ緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有するカクテル組成物を提供する。例えば、医薬組成物は、配列番号１（Ｆ９９／１０）、配列番号３（Ｆ２７／１２）、配列番号５（Ｆ９５／１３）、配列番号６（Ｆ３９１／０８）、配列番号７（Ｆ９２／１５）、配列番号８（Ｆ１０５／１５）、配列番号９（Ｆ１３４／１５）、および配列番号１０（Ｆ１４１／１５）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸をそれぞれが含む少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含んでいてよい。
【００７６】
一部の好ましい実施形態では、その組合せは、別個のバクテリオファージ株の存在下で個々のバクテリオファージの感染能力または宿主域および／または溶菌活性を損なわずまたは低減しない（あるいは実質的にまたは有意に損なわずまたは低減しない）。一部の特に好ましい実施形態では、カクテル組合せ中の少なくとも１種のファージの効果は、カクテル組合せ中の少なくとも１種の他のファージの存在により増強または改善され、相乗効果をもたらす。
【００７７】
一部の実施形態では、カクテル組成物は、緑膿菌に対する抗菌活性を示す少なくとも１種のファージを含む。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含むカクテル組成物であって、各バクテリオファージが、配列番号１（Ｆ９９／１０）、配列番号３（Ｆ２７／１２）、または配列番号５（Ｆ９５／１３）から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいは緑膿菌に対する抗菌活性を有するそのバリアントである、カクテル組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、各々が、配列番号１（Ｆ９９／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３（Ｆ２７／１２）に対して少なくとも９７％の配列同一性、または配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつ緑膿菌に対する抗菌活性を有する、少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含むカクテル組成物を提供する。
【００７８】
特に好ましい実施形態では、組成物は、配列番号１（Ｆ９９／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３（Ｆ２７／１２）に対して少なくとも９７％の配列同一性、および配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつ緑膿菌に対する抗菌活性を有する３種のバクテリオファージを含む。例えば、組成物は、配列番号１（Ｆ９９／１０）、配列番号３（Ｆ２７／１２）、および配列番号５（Ｆ９５／１３）の核酸を含む３種のバクテリオファージを含んでいてよい。
【００７９】
一部の実施形態では、カクテル組成物は、クレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を示す少なくとも１種のファージを含む。一部の実施形態では、本発明は、少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含むカクテル組成物であって、各バクテリオファージが、配列番号６（Ｆ３９１／０８）、配列番号７（Ｆ９２／１５）、配列番号８（Ｆ１０５／１５）、配列番号９（Ｆ１３４／１５）、および配列番号１０（Ｆ１４１／１５）から選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、あるいはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有するそのバリアントである、カクテル組成物を提供する。例えば、一部の好ましい実施形態では、バクテリオファージＦ３９１／０８のバリアントは、配列番号６の核酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するゲノムを含むかまたはからなり、かつクレブシエラ属菌の１または２以上の株、より好ましくはクレブシエラ・ニューモニエを含む株に対する抗菌活性（例えば溶菌性殺活性）を保持する。
【００８０】
一部の実施形態では、本発明は、少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含むカクテル組成物であって、各バクテリオファージが、配列番号６（Ｆ３９１／０８）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号７（Ｆ９２／１５）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号８（Ｆ１０５／１５）に対して少なくとも９９％の配列同一性、配列番号９（Ｆ１３４／１５）に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０（Ｆ１４１／１５）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有するカクテル組成物を提供する。
【００８１】
特に好ましい実施形態は、両方の細菌種に対する抗菌活性を組み合わせる。例えば、一部の実施形態では、本発明は、少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含むカクテル組成物であって、第１のファージは、配列番号１（Ｆ９９／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３（Ｆ２７／１２）に対して少なくとも９７％の配列同一性、または配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつ緑膿菌に対する抗菌活性を有し；および第２のファージは、配列番号６（Ｆ３９１／０８）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号７（Ｆ９２／１５）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号８（Ｆ１０５／１５）に対して少なくとも９９％の配列同一性、配列番号９（Ｆ１３４／１５）に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０（Ｆ１４１／１５）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含み、かつクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する、カクテル組成物を提供する。例えば、医薬組成物は、少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含んでいてよく、第１のファージは、配列番号１（Ｆ９９／１０）、配列番号３（Ｆ２７／１２）、および配列番号５（Ｆ９５／１３）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含み；および第２のファージは、配列番号６（Ｆ３９１／０８）、配列番号７（Ｆ９２／１５）、配列番号８（Ｆ１０５／１５）、配列番号９（Ｆ１３４／１５）、および配列番号１０（Ｆ１４１／１５））からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する核酸を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、本発明は、Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２、Ｆ９５／１３、Ｆ３９１／０８、Ｆ９２／１５、Ｆ１０５／１５、Ｆ１３４／１５、またはＦ１４１／１５以外の少なくとも１種の追加のファージとさらに組み合わせてカクテル組成物を提供する。一部の好ましい実施形態では、追加のファージは、（国際公開第２０１０／０９０５４２号に開示されているような）エンテロコッカス・フェカリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）および／またはエンテロコッカス・フェシウム（Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）の１または２以上の株に対して抗生物質活性を有するバクテリオファージＦ１６８／０８、（国際公開第２０１０／０９０５４２号に開示されているような）エンテロコッカス・フェカリスおよび／またはエンテロコッカス・フェシウムの１または２以上の株に対して抗生物質活性を有するバクテリオファージＦ１７０／０８、（国際公開第２０１０／０９０５４２号に開示されているような）緑膿菌の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ７７０／０５、（国際公開第２０１０／０９０５４２号に開示されているような）黄色ブドウ球菌の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ１９７／０８、（国際公開第２０１０／０９０５４２号に開示されているような）黄色ブドウ球菌の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ８６／０６、（国際公開第２０１０／０９０５４２号に開示されているような）黄色ブドウ球菌の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ８７ｓ／０６、（国際公開第２０１０／０９０５４２号に開示されているような）黄色ブドウ球菌の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ９１ａ／０６、（国際公開第２０１０／０９０５４２号に開示されているような）アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉ）の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ１２４５／０５、（国際公開第２０１２／０３６５８０号に開示されているような）アシネトバクター・バウマニの１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージ株Ｆ３９４／０８、（国際公開第２０１２／０３６５８０号に開示されているような）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ４８８／０８、国際公開第２０１２／０３６５８０号に開示されているような）緑膿菌の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ５１０／０８、（国際公開第２０１２／０３６５８０号に開示されているような）黄色ブドウ球菌の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ４４／１０、（国際公開第２０１２／０３６５８０号に開示されているような）クレブシエラ・ニューモニエの１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ３８７／０８、および（国際公開第２０１２／０３６５８０号に開示されているような）黄色ブドウ球菌の１または２以上の株に対して抗菌活性を有するバクテリオファージＦ１２５／１０からなる群より選択される（それぞれの内容は、参照によりそ��全体が本明細書に組み込まれる）。
【００８３】
本発明は、１種または２種以上の本発明のバクテリオファージ、特に本発明に従うカクテル組合せが感染した単離細菌（２種またはそれ以上の異なる細菌株または種を含める）も提供する。ある実施形態では、本発明は、２種またはそれ以上の異なるファージが感染した単離緑膿菌株であって、その各ファージが、配列番号１、配列番号３、または配列番号５のヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなる、あるいは、配列番号１（Ｆ９９／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３（Ｆ２７／１２）に対して少なくとも９７％の配列同一性、または配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなりかつ緑膿菌に対する抗菌活性を有するファージのようなそのバリアントである、単離緑膿菌株を提供する。用いられる細菌株は、ファージの天然の宿主であってもまたはそうでなくてもよい。特定の実施形態では、緑膿菌は、緑膿菌１１４／１２株、緑膿菌４６０／０６株、緑膿菌４３３／０７株、緑膿菌６６／０９株および／または緑膿菌１９９２／０５株を含む。
【００８４】
ある実施形態では、本発明は、２種またはそれ以上のバクテリオファージが感染した単離クレブシエラ・ニューモニエ株であって、その各バクテリオファージが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなる、あるいは、配列番号６（Ｆ３９１／０８）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号７（Ｆ９２／１５）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号８（Ｆ１０５／１５）に対して少なくとも９９％の配列同一性、配列番号９（Ｆ１３４／１５）に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０（Ｆ１４１／１５）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなりかつクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有するバクテリオファージのようなそのバリアントである、単離クレブシエラ・ニューモニエ株を提供する。用いられる細菌株は、ファージの天然の宿主であってもまたはそうでなくてもよい。
【００８５】
細菌株およびファージは、下記のＮＣＩＭＢ受託番号で２０１７年１２月１日にＮＣＩＭＢ（ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ，Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫ）に寄託された：
ＮＣＩＭＢ  ４２９１４  緑膿菌  １９９２／０５−Ｂ４
ＮＣＩＭＢ  ４２９１５  緑膿菌ファージＦ６−Ｆ９９／１０
ＮＣＩＭＢ  ４２９１６  緑膿菌ファージＦ７−Ｆ２７／１２
ＮＣＩＭＢ  ４２９１７  緑膿菌ファージＦ８−Ｆ９５／１３
ＮＣＩＭＢ  ４２９１８  クレブシエラ・ニューモニエ  Ｆ９−Ｆ３９１／０８
ＮＣＩＭＢ  ４２９１９  クレブシエラ・ニューモニエ  Ｆ１０−Ｆ９２／１５
ＮＣＩＭＢ  ４２９２０  クレブシエラ・ニューモニエ  Ｆ１１−Ｆ１０５／１５
ＮＣＩＭＢ  ４２９１３  クレブシエラ・ニューモニエ  １２１／１５−Ｂ５
【００８６】
本発明のバクテリオファージおよび／または本発明のカクテル組成物で使用するためのバクテリオファージは、当技術分野で既知のおよび／または本明細書に開示されている任意の方法によって得ることができる。一部の実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の核酸配列を含むかまたはからなるバクテリオファージを生成および精製する方法を提供する。例えば、ゲノム配列は、全ゲノムのデノボ合成により生成し得る（例えば、Mueller et al, 2009, Chemistry & Biology 16(3): 337-347（この分野における画期的な開発をレビューし、９０年代半ばから２０００年代後半の関連技術の商業的入手性を調査し、さらにオリゴヌクレオチドを合成しおよび長い合成ＤＮＡをアセンブルする方法における開発の概要を説明する）を参照のこと）。
【００８７】
さらに、バクテリオファージは、本明細書に開示されているおよび／または当技術分野で既知の任意の方法を用いて細菌試料から単離してもよい（例えば、Carlson, “Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches,” In, Kutter and Sulakvelidze (Eds) Bacteriophages: Biology and Applications, 5th ed. CRC Press (2005)（参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。用い得る具体的な細菌株として、例えば、緑膿菌１１４／１２、４６０／０６、４３３／０７、６６／０９、および１９９２／０５株（例えばファージＦ９９／１０、Ｆ１１０／１０、Ｆ２７／１２、Ｆ８３／１３、および／またはＦ９５／１３を単離するため）；またはクレブシエラ・ニューモニエ２２３／１４、３９７／０７、１６３３／０５、２４１／１４株（例えば、ファージＦ３９１／０８、Ｆ９２／１５、Ｆ１０５／１５、Ｆ１３４／１５、および／またはＦ１４１／１５を単離するため）が挙げられる。バクテリオファージは、１種または２種以上のバクテリオファージが感染しやすくかつその中でバクテリオファージが複製する任意の他の細菌株から単離してもよい。
【００８８】
当業者は、より大量の所定のファージを得るために、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の核酸配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージ、ならびにそのバリアントを増殖または増幅させる１または２以上の方法も使用してよい。一部の実施形態では、配列番号１、配列番号３、または配列番号５のヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなるゲノムを有する追加のファージ、あるいはそのバリアントを生成および／または単離する方法は、（ｉ）緑膿菌の培養物を得ること、（ｉｉ）その培養物に、配列番号１、配列番号３、または配列番号５のヌクレオチド配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージ、あるいはそのバリアントを感染させること、（ｉｉｉ）培養物の十分な溶解が観察されるまで培養すること、および（ｉｖ）培養物からバクテリオファージを単離することを含み得る。用いる宿主細胞はいかなる細菌株でもよく、例えば、ファージが感染しやすく、ファージを複製するのに使用できるいかなる緑膿菌株でもよい。一部の実施形態では、用いる宿主細胞は、緑膿菌１１４／１２株、緑膿菌４６０／０６株、緑膿菌４３３／０７株、緑膿菌６６／０９株、および緑膿菌１９９２／０５株であってよい。一部の特定の例では、緑膿菌１１４／１２株を用いてファージＦ２７／１２（配列番号３）を増幅させ；緑膿菌４６０／０６株を用いてＦ９９／１０（配列番号１）を増幅させ；緑膿菌４３３／０７株を用いてＰｓａ＿Ｆ８３／１３、ならびにＦ９９／１０またはＦ２７／１２のいずれかを増幅させ；緑膿菌６６／０９を用いてファージＰｓａ＿Ｆ９５／１３を増幅させ、および緑膿菌１９９２／０５を用いてＦ９９／１０（配列番号１）またはＦ２７／１２（配列番号３）またはＦ９５／１３（配列番号５）を増幅させる。
【００８９】
当業者は、より大量の所定のファージを得るために、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の核酸配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージ、ならびにそのバリアントを増殖または増幅させる１または２以上の方法も使用してよい。一部の実施形態では、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０の核酸配列を含むかまたはからなるゲノムを有する追加のファージ、あるいはそのバリアントを生成および／または単離する方法は、（ｉ）クレブシエラ・ニューモニエの培養物を得ること、（ｉｉ）その培養物に、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のヌクレオチド配列を含むかまたはからなるゲノムを有するバクテリオファージ、あるいはそのバリアントを感染させること、（ｉｉｉ）培養物の十分な溶解が観察されるまで培養すること、および（ｉｖ）培養物からバクテリオファージを単離することを含み得る。用いる宿主細胞はいかなる細菌株でもよく、例えば、バクテリオファージが感染しやすく、バクテリオファージを複製するのに使用できるいかなるクレブシエラ・ニューモニエ株でもよい。一部の実施形態では、用いる宿主細胞は、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ５７３／０７株、クレブシエラ・ニューモニエ２２３／１４株、クレブシエラ・ニューモニエ３９７／０７株、クレブシエラ・ニューモニエ１６３３／０５株、および／またはクレブシエラ・ニューモニエ２４１／１４株であってよい。一部の特定の例では、ファージＦ３９１／０８をクレブシエラ・ニューモニエ５７３／０７株で増幅させ；ファージＫｌｅ＿Ｆ９２／１５をクレブシエラ・ニューモニエ２２３／１４株で増幅させ；ファージＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５をクレブシエラ・ニューモニエ１６３３／０５株で増幅させ；Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５をクレブシエラ・ニューモニエ３９７／０７株で増幅させ；およびＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５をクレブシエラ・ニューモニエ２４１／１４株で増幅させる。
【００９０】
医薬組成物
本発明の精製バクテリオファージおよびファージ産物（ファージポリペプチド、その断片またはバリアント、およびファージカクテル組合せを含む）は、単独で投与しても、あるいは、例えば細菌（限定はされないが、緑膿菌およびクレブシエラ・ニューモニエを含む）により引き起こされる感染症などの、細菌感染症の治療または予防に使用するための医薬組成物中に組み込んでもよい。バクテリオファージ（複数可）またはファージ産物（複数可）を、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と組み合わせてよい。薬学的に許容される担体、賦形剤、および安定剤の例には、これらに限定されないが、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミンおよびゼラチンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなどの単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。本発明の医薬組成物（例えば、抗菌組成物）は、上記の材料に加え、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、および保存剤も含み得る。
【００９１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、エアロゾルとして投与するために製剤化される。エアロゾル送達用製剤は、乾燥粉末、微粒子、ナノ粒子、溶液、凍結乾燥調製物、リポソーム調製物などの形態でよい。リポソーム製剤は、喀痰の過酷な条件からバクテリオファージを保護し、さらにはバイオフィルム内への侵入を向上させおよび／または気道内での薬剤のより持続的な放出を可能にする。エアロゾル送達用製剤は、典型的には、気管支刺激および気管支痙攣などの副作用を低減するために、滅菌水を含み、かつ保存剤をほとんどまたは全く含まない。エアロゾル送達用製剤は、気道表面液のオスモル濃度（浸透圧）と同じ、または実質的に同じオスモル濃度を有することが好ましい。
【００９２】
本発明のファージおよび／またはファージ産物は、本明細書に記載のおよび／または当技術分野で既知の細菌感染症の治療に有用な１または２以上の他の治療剤および／または予防剤（例えば１種または２種以上の他のファージ）と組み合わせてもよい。例えば、本発明の医薬組成物は、２種またはそれ以上の本発明の精製バクテリオファージ（同じまたは異なる細菌種または株に対する抗菌活性を有する）、本発明のバクテリオファージおよびポリペプチドの組合せ、あるいは本発明のバクテリオファージおよび／またはポリペプチドと、当術分野で既知のバクテリオファージおよび／またはポリペプチドとの組合せを含んでいてよい。特定の実施形態では、組合せの治療成分は、細菌の２またはそれ以上の種または株を標的とするか、あるいは異なる酵素活性を示す。例えば、リシン（lysin）は、通常、アミダーゼ活性、エンドペプチダーゼ活性、ムラミダーゼ活性、またはグルコサミダーゼ活性の内の１つを示す。従って、ファージを異なる活性を示すリシンと組み合わせることによって、本発明の医薬組成物の治療活性を相乗的に増強させることができる。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されたおよび／または当技術分野で既知の細菌感染症の治療および／または予防に有用な１または２以上の非ファージ治療剤および／または予防剤（例えば１または２以上の伝統的な抗生剤）と組み合わせてもよい。本発明のファージ（複数可）またはファージ産物（複数可）と組み合わせて使用され得る他の治療剤および／または予防剤としては、これらに限定されないが、抗生物質剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、または局部麻酔薬が挙げられる。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、肺感染症の治療および／または予防用に製剤化され、抗生物質剤、抗真菌剤、および局部麻酔薬から選択される、１または２以上の追加の治療剤および／または予防剤を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、本発明のファージカクテル組合せを含み、それは標準的または伝統的な抗生物質剤の不在下で投与される。
【００９４】
標準的な抗生物質剤として、これらに限定されないが、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロドストレプトマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、アプラマイシン、リファマイシン、ナフトマイシン、ムピロシン、ゲルダナマイシン、アンサマイトシン、カルバセフェム、イミペネム、メロペネム、エルタペネム、ファロペネム、ドリペネム、パニペネム／ベタミプロン、ビアペネム、ＰＺ−６０１、セファロスポリン、セファセトリル、セファドロキシル、セファレキシン、セファログリシン、セファロニウム、セファロリジン、セファロチン、セファピリン、セファトリジン、セファザフル、セファゼドン、セファゾリン、セフラジン、セフロキサジン、セフテゾール、セファクロル、セフォニシド、セフプロジル、セフロキシム、セフゾナム、セフメタゾール、セフォテタン、セフォキシチン、セフカペン、セフダロキシム、セフジニル、セフジトレン、セフェタメト、セフィキシム、セフメノキシム、セフテラム、セフチブテン、セフチオフル、セフチオレン、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフォペラゾン、セフタジジム、ラタモキセフ、セフクリジン、セフェピム、セフルプレナム、セフォセリス、セフォゾプラン、セフピロム、セフキノム、フロモキセフ、セフトビプロール、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、アズトレオナム、ペニシリンおよびペニシリン誘導体、アクチノマイシン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ、シノキサシン、フルメキン、ナリジクス酸、オキソリン酸、ピロミド酸、ピペミド酸、ロソキサシン、シプロフロキサシン、エノキサシン、フレロキサシン、ロメフロキサシン、ナジフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、ペフロキサシン、ルフロキサシン、バロフロキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、パズフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、トスフロキサシン、クリナフロキサシン、ガレノキサシン、ゲミフロキサシン、スチフロキサシン（ｓｔｉｆｌｏｘａｃｉｎ）、トロバルフロキサシン（ｔｒｏｖａｌｆｌｏｘａｃｉｎ）、プルリフロキサシン、アセタゾラミド、ベンゾラミド、ブメタニド、セレコキシブ、クロルタリドン、クロパミド、ジクロフェナミド、ドルゾラミド、エトキシゾールアミド、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、インダパミド、マフェンダイド（ｍａｆｅｎｄｉｄｅ）、メフルシド、メトラゾン、プロベネシド、スルファセタミド、スルファジメトキシン、スルファドキシン、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、スルチアム、スマトリプタン、キシパミド、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン（ｏｘａｃｉｌｉｎ）、クロキサシリン、バンコマイシン、テイコプラニン、クリンダマイシン、コトリモキサゾール、フルクロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリンならびにそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００９５】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する抗生物質剤を含む。一部の他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエ以外の細菌に対する抗菌活性を有する抗生物質剤を含む。好ましい実施形態では、抗生物質剤は、所定の感染に関して本発明のファージ、ファージ産物、またはファージカクテルの治療および／または予防効果を相加的または相乗的に増強するのに有効な量で用いられる。
【００９６】
標準的な抗真菌剤として、アムホテリシンＢリポソーム製剤またはアムホテリシンＢ非リポソーム製剤などの、アムホテリシンＢが挙げられる。
【００９７】
一部の好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、エアロゾルとして投与するために製剤化され、それもエアロゾル送達用である１または２以上の抗生物質をさらに含む。エアロゾル送達用の抗生物質として、例えば、トブラマイシン（トブラマイシン液剤またはトブラマイシン乾燥粉末など）、ゲンタマイシン、アミカシンなどの吸入アミノグリコシド系；コリスチン液剤またはコリスチン乾燥粉末およびコリスチンメタナトリウムなどの吸入ポリミキシン系；およびアズトレオナム液剤または噴霧用アズトレオナムリジンなどの吸入モノバクタム系；ならびにエアロゾル化レボフロキサシン、セフタジジム、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、アムホテリシン、カプレオマイシン、フィファンピン（fifampin）、イソニアジド、およびシプロフラキシン（ciproflaxin）などが挙げられる（Quon BS et al, 2014, Annals ATS 11(3):425- 434）。一部の実施形態では、エアロゾル化された本発明の医薬組成物は、アミホテリシンＢリポソーム製剤などの、それもエアロゾル送達用である１または２以上の抗真菌剤をさらに含む。
【００９８】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、緑膿菌などのシュードモナス属菌種により引き起こされる細菌感染症を処置および／または予防するのに使用するために製剤化される。一部のそのような実施形態では、医薬組成物は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５のヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなるゲノムを有する１種または２種以上のバクテリオファージ、あるいは配列番号１（Ｆ９９／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３（Ｆ２７／１２）に対して少なくとも９７％の配列同一性、または配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなりかつ緑膿菌に対する抗菌活性を有するバクテリオファージのようなそのバリアントを含む、カクテル組成物を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、緑膿菌に対する抗菌活性を有する抗生物質剤および／または緑膿菌以外の細菌に対する抗菌活性を有する抗生物質剤などの、追加薬剤をさらに含んでいてよい。
【００９９】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、クレブシエラ・ニューモニエなどのクレブシエラ属菌種により引き起こされる細菌感染症を治療および／または予防するのに使用するために製剤化される。一部のそのような実施形態では、医薬組成物は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０のヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなるゲノムを有する１種または２種以上のバクテリオファージ、あるいは配列番号６（Ｆ３９１／０８）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号７（Ｆ９２／１５）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号８（Ｆ１０５／１５）に対して少なくとも９９％の配列同一性、配列番号９（Ｆ１３４／１５）に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０（Ｆ１４１／１５）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むかまたはからなりかつクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有するバクテリオファージのようなそのバリアントを含む、カクテル組成物を含有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、例えば、クレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する抗生物質剤および／またはクレブシエラ・ニューモニエ以外の細菌に対する抗菌活性を有する抗生物質剤などの追加薬剤をさらに含んでいてよい。
【０１００】
本発明のファージ、ファージ産物、またはファージカクテルを含む医薬組成物は、単位用量製剤または多用量製剤に製剤化することができる。好ましい製剤は、上述したようにエアロゾルとして送達することができる製剤である。他の適切な製剤としては、懸濁液、エマルジョン、ローション、液剤、クリーム、軟膏、または散布剤、あるいは皮膚パッチ中などが挙げられる。
【０１０１】
加えてまたは代わりに、本発明の医薬組成物は、坐剤もしくはペッサリーの形態で、または経口的に（例えば、デンプンまたは乳糖などの賦形剤を含有し得る錠剤として、それぞれ、任意選択で、香料、着色剤および／または賦形剤を含有する、カプセル剤、卵形剤、エリキシル剤、液剤、もしくは懸濁液として）投与することができ、あるいは、それらは、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下）注射してもよい。非経口投与に関して、組成物は、例えば、溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖などの、他の物質を含有し得る無菌水溶液の形態で使用してよい。口腔投与または舌下投与では、組成物は、従来の様式で製剤され得る錠剤またはトローチ剤の形態で投与することができる。局所製剤は通常、滅菌ＰＢＳ、水もしくは食塩緩衝液、または滅菌ＳＭ緩衝液などの、滅菌緩衝液を含む。
【０１０２】
本明細書に記載のおよび／または当技術分野で既知の投与方法を用い、適切な投薬レジメンに従い、所望の投薬量の本発明のファージ、ファージ産物および／またはファージカクテルを送達することができる。投薬量および投薬レジメンは、特定の製剤、投与経路、治療している状態、および他の因子によって変動し得る。動物実験は、例えば通常の医師の技術の範囲内であるようなヒト治療での有効用量の決定のための信頼性のあるガイダンスを提供することができる。有効用量の種間スケーリングは、例えばMordenti, J. et al. “The use of interspecies scaling in toxicokinetics” in Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, New York 1989, pp 42-96に記載されている。例えば、下記の実施例に記載するように、急性肺感染症のマウスモデルを用いて本発明の医薬組成物の有効性を評価することができる。
【０１０３】
本発明の医薬組成物は、投薬レジメンに従って投与することができる。一部の実施形態では、投薬レジメンは、本発明のカクテル組成物を６時間ごとに投与することを含む（本発明者は、糖尿病性皮膚創傷への局所用ファージカクテルのための複数回投与レジメンを以前開示した（Mendes JJ, et al., 2013, Wound Repair Regen 21 : 595-603)）。好ましい実施形態では、最初の投与の後に、医薬組成物の再投与を伴う第２のまたは「ブースター」投与を行う。例えば、ブースターを、最初の投与の約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１０時間、１２時間、１日、または２日後に行ってよい。好ましい実施形態では、例えば、呼吸器感染症または肺感染症（限定はされないが、院内細菌性肺炎（ＨＡＢＰ）を含む）の治療において、ブースター投与を最初の投与の約４時間、約５時間、または約６時間後に使用する。
【０１０４】
治療的使用
本発明の別の態様は、細菌感染症の予防および／または治療のための医薬品における本発明のファージ、ファージ産物、またはファージカクテルの使用に関する。多剤耐性に関連するものを含めて病原性細菌を溶解するその特異性および効力（Larche J, et al, 2012, Antimicrob Agents Chemother 56(12):6175-6180)、バイオフィルムにおける細菌に対するその潜在的な効力(Phee A et al., 2013, J Endod 39(3):364-369）、ヒトおよび動物細胞に対するその病原性の欠如（Abedon ST et al., 2011, Bacteriophage 1(2): 66-85）、ならびに高い細菌負荷量でさえ微好気環境でのその活性（Azeredo J, et al. 2008. Curr Pharm Biotechnol 9:261-266）により、ファージは細菌感染症を治療する大きな可能性を提示する。ファージカクテルは特に、例えば、特定の細菌株に対する溶菌活性を高める、宿主域を増大させる、および／または個々のバクテリオファージに対して出現する細菌耐性の可能性を減らすなど、個々のファージの使用を超える追加の利点を提供することができる。実際に、異なるバクテリオファージをカクテルとして混合してそれらの特性を多様化し、好ましくは、例えば宿主域の拡大など集合的により大きな抗菌スペクトルをもたらし、それはその薬剤を受けた対象において耐性を生じさせにくくする。
【０１０５】
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物を受ける対象は哺乳動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ類、霊長類（例えばヒト）、齧歯類、ウサギ目の動物、または鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ））である。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物を受ける対象は、ヒト、特に、院内細菌性肺炎（ＨＡＢＰ）または嚢胞性線維症関連感染症を含めて呼吸器感染症または肺感染症に罹患するまたは罹患するリスクを有する患者である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、複数の細菌株に対して活性を有する。一部の好ましい実施形態では、医薬組成物は、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエの複数の株に対して活性を有するファージカクテル組合せを含む。従って、本発明は、本発明のファージ、ファージ産物、またはファージカクテル組成物を用いて、ヒトおよび動物の両方において、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエに関連する感染症を治療および／または予防する方法を提供する。他の態様では、本発明は、これらの細菌の関係する種または株に関連する感染症を治療および／または予防する方法を提供する。
【０１０７】
緑膿菌およびクレブシエラ・ニューモニエは、特に免疫不全の個体において、多くの重篤な日和見感染症の原因となる。本発明の医薬組成物は、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエに関連する、あるいは他の種または株の細菌に関連するあらゆる感染症を治療および／または予防することが意図されており、そのような感染症として、それらに限定されないが、肺および気道の感染症、術後感染症、カテーテルおよび外科用ドレーンに関連する感染症、ならびに血液の感染症が挙げられる。好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物は、肺および気道に関連する細菌感染症を治療および／または予防するのに用途が見いだされる。
【０１０８】
呼吸器および肺感染症として、それらに限定されないが、嚢胞性線維症に関連する感染症（嚢胞性線維症の気管支拡張症など）；肺炎（院内細菌性肺炎、人工呼吸器関連肺炎、および気管支肺炎を含む）；非嚢胞性線維症の気管支拡張症；気管支炎；慢性閉塞性肺疾患；マイコバクテリア症、肺移植後感染症；結核関連感染症；有瘻性膿胸、有瘻性の胸膜炎、肺膿瘍；鼻炎；化膿性嚢胞；および肺由来の敗血症が挙げられる。呼吸器感染症または肺感染症の症状として、例えば、咳、喘鳴、喀痰の産生、呼吸困難、発声障害（発声困難）、および全体的な生活の質（ＱＯＬ）の低下が挙げられる。特に好ましい実施形態では、呼吸器感染症または肺感染症は院内細菌性肺炎（ＨＡＢＰ）である。
【０１０９】
ＨＡＢＰに関して、入院中の発症の日時は、特定の病原体および結果に関するリスクの指標である。例えば入院の最初の４日以内のような早期の発症の場合、最もよく見られる菌は、肺炎レンサ球菌およびインフルエンザ菌のような内在性の微生物叢、ならびに抗生物質に感受性のグラム陰性市中（院外の）黄色ブドウ球菌である。例えば入院後５日以上たってからの発症のような遅い発症の場合、グラム陰性細菌が大部分の症例の原因であり、例えば緑膿菌、クレブシエラ・ニューモニエ、エンテロバクター属およびアシネトバクター属の特定の株など、ならびに特定の黄色ブドウ球菌の感染、特に神経外科患者、糖尿病患者、および慢性的な腎臓の問題を有する患者におけるそれらの感染など、その多くは抗生物質に耐性である（2005, Am JRespir Crit Care Med Vol 171(4):388:416）。緑膿菌、クレブシエラ・ニューモニエの株は、遅発性のＨＡＢＰに特に関連する。
【０１１０】
緑膿菌およびクレブシエラ・ニューモニエは、高液体内容物を有する他の器官系に関係する感染症にも関連し、本発明のファージカクテルは、そのような感染症に関して治療的および／または予防的使用を有することも意図されている。例えば、本発明の医薬組成物は、脳脊髄液、腹水、および尿路の感染症の予防または治療のために使用され得る。
【０１１１】
一部の実施形態では、本発明は、治療的または予防的有効量の本発明の医薬組成物を必要とする対象に投与することを含む、呼吸器感染症または肺感染症を治療および／または予防する方法を提供する。好ましい実施形態では、投与は、例えば努力性呼吸または呼吸促拍を正常に戻すなど、呼吸の改善をもたらす。
【０１１２】
特に好ましい実施形態では、本発明は、本発明のファージカクテルを用いて、驚くべき範囲の緑膿菌またはクレブシエラ・ニューモニエ細菌株を処理する方法を提供する。例えば、緑膿菌ファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３を含むファージカクテルは、例えば均一な緑膿菌ファージと比較した場合に、極めて広範にわたる緑膿菌臨床株に対して有効性を示す（４２％感染）。他の実施形態では、クレブシエラ・ニューモニエファージＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５、およびＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５を含むファージカクテルは、例えば特定の他のクレブシエラ・ニューモニエファージ（Kesik-Szeloch A et al., 2013, Virol J 10: 100）と比較した場合に、様々な莢膜血清型を提示する極めて広範にわたるクレブシエラ・ニューモニエ臨床株に対して有効性を示す（３２％感染）。
【０１１３】
好ましい実施形態では、投与は、対象の１または２以上の気道へのエアロゾルを介した医薬組成物の投与（例えば吸入による投与）を含む。吸入による投与は、感染の標的部位（すなわち気道）への薬物送達を改善しおよび／または全身的な副作用の可能性を限定することができる。エアロゾルとしての医薬組成物の投与には、限定はされないが、吸入による投与、鼻腔内点滴、気管へのカテーテル挿入、肺の胸膜腔への送達、または気管支鏡検査（Abedon ST, 2015, Bacteriophage, 5(l):el020260-l to el020260-13）が含まれる。エアロゾルとして医薬組成物を投与する間、バクテリオファージは生存可能なままであり、下気道に到達するのに適したサイズの粒子中に含まれていてよい。例えば、特に好ましい実施形態では、エアロゾル化粒子の過半は、直径が５μｍ未満であり、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％の粒子は、直径が５μｍ未満であり、より好ましくは直径が約２μｍである。
【０１１４】
鼻腔内投与または吸入による投与に関して、本発明のバクテリオファージおよび／またはファージ産物は、乾燥粉末、微粒子、ナノ粒子、溶液、凍結乾燥調製物、リポソーム調製物などの形態で送達され得る。典型的には、本発明のファージ、ファージ産物、および／またはファージカクテルを含む製剤は、適切な推進剤を使用して、加圧容器、ポンプ、スプレーまたはネブライザー（噴霧器）から出る乾燥粉末吸入剤またはエアロゾルスプレーの形態であり、そのような推進剤は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ  １３４Ａ．ＴＭ．）もしくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡ．ＴＭ）などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、または他の適切なガスである。
【０１１５】
加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーは、例えば、溶媒としてエタノールと推進剤との混合物を使用して、活性化合物の溶液または懸濁液を含有してよく、前記溶媒は、例えばソルビタントリオレエートなどの潤滑剤をさらに含有し得る。吸入器または送気装置（insufflator）において使用するためのカプセルおよびカートリッジ（例えばゼラチンで作られた）は、本発明のファージ、ファージ産物、および／またはファージカクテルと、乳糖またはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物を含有するように製剤化することができる。
【０１１６】
当技術分野で既知の任意の手段を用いてまたは本明細書に記載されているように噴霧を達成することができる。典型的には、高圧下の空気または酸素を使用してエアロゾルを生成するジェットネブライザーにより噴霧を達成する。他のネブライザーとして、サイズ変動を低減しかつ噴霧時間を減らす、電圧アクチュエーターにより駆動される振動メッシュ式ネブライザーが挙げられる。別のアプローチは、ネブライザーを人工呼吸器回路の吸気性突出部分に接続する機械換気を含む。さらに別のアプローチは、エマルジョンベースの「スプレー乾燥」を用いて溶液またはエマルジョンを流動状態から均一なサイズ分布（例えば１〜５μｍ）を有する微粒子へと変換する。２つの典型的なクラスのネブライザーとして、ＡｅｒｏＥｃｌｉｐｓ（Ｔｒｕｄｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、患者が吸入したときのみに噴霧が生じるジェットネブライザー；および、オムロン（オムロン，ＭｉｃｒｏＡｉｒ  Ｕ２２）、圧電結晶の振動によって目の細かいメッシュを通して薬剤を押し出してエアロゾルを作り出す電池式のメッシュ式ネブライザー（Sahota et al, 2015, J. Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery 28(0): 1-8）が挙げられる。一部の好ましい実施形態では、ＳＹＳＴＡＭ  Ｌ２９０（ＳＹＳＴＡＭ，Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ  Ｓｕｒ  Ｌｏｔ，Ｆｒａｎｃｅ）ネブライザーを用いる。このネブライザーは、粒子の約７０％が５μｍ未満の直径を有する超音波エアロゾルを生成する。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のように、治療および／または予防有効量の１種または２種以上のファージまたはファージ産物を含む。治療および／または予防有効量は、その量を受けた対象において、それぞれ治療的および／または予防的利益をもたらす量を意味する。治療および／または予防有効量は、特定の製剤、投与経路、治療している状態、他の薬剤または療法を本発明の方法と組み合わせて使用しているか否か、および他の因子によって変動するであろう。
【０１１８】
一部の実施形態では、医薬組成物は、約１〜約１０の感染多重度（ＭＯＩ）に対応する量で１種または２種以上のバクテリオファージを提供するようにそれを必要とする対象に送達される。ＭＯＩは、肺におけるおよその細菌負荷量を算定する（例えば、実施例で用いられるマウスモデルにおいて２ｘ１０６ｃｆｕ／ｇ肺）、または特定患者の肺における細菌負荷量を計算する、または所定のタイプの呼吸器感染症に関する推定値を用いることにより決定し；さらにその後、所望のＭＯＩを与えるように計算された量（例えば、マウスモデルにおいて２ｘ１０７ｐｆｕ／ｇ肺はＭＯＩ＝１０を与える）でファージを提供する。ＭＯＩは、「多重度の１０ルール（multiplicity of 10 rule）」に基づき選択してよく、それは細菌当たり１０の桁数の吸着ファージがある場合には細菌密度が有意に減少する（Abedon ST, 2009, Foodborne Pathog Dis 6:807-815;および、Kasman LM, et al, 2002, Virol 76:5557-5564）が；より低い力価（titer）のファージを投与する（例えば、１０より低いＭＯＩを用いる）と成功する可能性が低い（Goode D, et al, 2003, App Environ Microbiol 69:5032-5036; Kumari S, et al, 2010, J Infect Dev Ctries 4:367-377）ことを述べる。
【０１１９】
一部の好ましい実施形態では、１と１０の間のＭＯＩの各ファージを提供するように送達されたＦ９９／１０およびＦ１１０／１０を含むファージカクテルは、約８０％、約８５％、約９５％、約９７％、約９８％、またはほぼ約１００％（生細胞数はゼロに減少する）の、肺における緑膿菌の減少をもたらす。一部の好ましい実施形態では、１と１０の間のＭＯＩの各ファージを提供するように送達されたＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３を含むファージカクテルは、約８０％、約８５％、約９５％、約９７％、約９８％、またはほぼ約１００％の、肺における緑膿菌の減少をもたらす。一部の特に好ましい実施形態では、Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９お５／１３を含むファージカクテルは、驚くことに相乗的な溶菌作用を示す。
【０１２０】
一部の実施形態では、より少ない用量が、驚くことに高用量を超える利点をもたらす。例えば、一部の実施形態では、１または約１のＭＯＩは、１０または約１０のＭＯＩよりも、長い期間のあいだ肺において細菌を低レベルに維持する。例えば、より低いＭＯＩのＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３は、例えば処置後１２時間、１５時間、１８時間、２４時間、３０時間、３６時間、またはそれより長い間のような、処置後より長い期間の間、感染動物の肺においてより低い緑膿菌負荷量を達成することができる。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、これは、より低用量のファージを受けて細菌耐性の出現が遅延したせいであり得る。
【０１２１】
一部の他の実施形態では、約０．２〜０．４程度の低いＭＯＩが、驚くことに有効性をもたらし、例えば、Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３を含むファージカクテルを送達して約０．２〜０．４のＭＯＩの各ファージを提供して、感染動物の肺において緑膿菌負荷量の統計的に有意な低減をもたらすことができる。特定の理論に拘束されることなく、有効性は積極的療法（active therapy）によるものであろう。すなわち、１０のＭＯＩでのファージ用量は、ファージの複製または生活環の完了の必要なしに細菌負荷量を減らすために標的細菌集団より十分過剰にファージを提供する。より低いファージ用量は、標的細菌を減らすためにファージ感染／複製サイクルを含む積極的療法に依存し得る（Loc Carrillo C, et al., 2005, Appl Environ Microbiol 71 :6554-6563;Cairns BJ, et al, 2009, PLoS Pathog 5:el000253;およびHooton SP, et al., 2011, Int J Food Microbiol 151 : 157-163も参照のこと）。
【０１２２】
ある実施形態では、本発明のファージ、ファージ産物、またはファージカクテルは、呼吸器感染症または肺感染症などの、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエにより引き起こされる感染症を治療または予防するために単剤として使用される。他の実施形態では、本発明のファージカクテルは、同じまたは異なる種類の細菌を標的とする標準抗生物質などの、他の薬剤とさらに組み合わせて使用され、そのような細菌には、任意のグラム陽性菌、任意のグラム陰性菌、およびグラム陽性にもグラム陰性にも分類されない任意の他の群の細菌から選択される細菌が含まれる。本発明の組成物は、当業者に知られている細菌感染症を治療する任意の他の手段、特に呼吸器感染症を治療する任意の他の手段と組み合わせて使用してもよい。
【０１２３】
一部の特に好ましい実施形態では、本発明は、本発明のファージカクテルを、標準および／または非標準療法と組み合わせて投与することを含む、呼吸器感染症または肺感染症を治療および／または予防する方法を提供する。呼吸器感染症の標準療法として、トブラマイシン、アミカシン、コリスチン、アズトレオナム、ならびにレボフロキサシン、セフタジジム、ホスホマイシン、ゲンタマイシン、バンコマイシン、アムホテリシン、カプレオマイシン、リファンピン（fifampin）、イソニアジド、およびシプロフラキシン（ciproflaxin）などの抗生物質剤の吸入および／または全身投与；ならびにアムホテリシンＢなどの抗真菌剤の吸入および／または全身投与が挙げられる。
【０１２４】
一部の実施形態では、本発明のファージ、ファージ産物、またはファージカクテルはエアロゾルとして投与されるが、追加の薬剤は全身投与される。例えば、一部の好ましい実施形態では、本発明のファージカクテル組成物は吸入により投与されるが、緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエに対する活性を有する抗生物質剤などの抗生物質剤は全身投与される。一部の実施形態では、本発明のファージカクテル組成物は、それもエアロゾルとして投与される追加の薬剤と一緒に吸入により投与される。例えば、一部の好ましい実施形態では、本発明のファージカクテル組成物は、別の抗生物質剤または抗真菌剤と一緒にエアロゾルとして肺に投与される。
【０１２５】
一部の実施形態では、本発明は、本発明のファージ、ファージ産物、またはファージカクテルを、呼吸器感染症のための非標準療法と組み合わせて投与することを含む、呼吸器感染症または肺感染症を治療および／または予防する方法を提供する。非標準療法は通常、呼吸器感染症が１または２以上の標準療法に不応性である場合に用いられる。
【０１２６】
殺菌および抗感染用途
細菌性病原体は、粘膜において（例えば、上気道または下気道の粘膜、泌尿生殖器系の粘膜、眼の構造体の粘膜などを通して）最もよく感染する。粘膜それ自体はしばしば、環境において見られる多くの病原性細菌の貯留槽（reservoir）であり、単にそのような貯留槽であるだけの場合もある。病原性細菌のこの貯留槽を制御するように設計された抗感染薬は非常にわずかしか存在していないが、研究によって、特に病院および介護施設などの環境において、この貯留槽を低減または排除すると、感染症の発症を顕著に減らすことが示されている。
【０１２７】
本発明のファージ、ファージ産物、およびファージカクテルを、院内感染症の発生を予防または低減させるために、細菌、特にクレブシエラ・ニューモニエおよび緑膿菌の増殖を制御するための抗感染組成物において使用することができる。抗感染組成物は、それら細菌と接触する表面上の細菌のコロニー形成または増殖を低減または阻害する用途がある。本発明のファージ、ファージ産物、およびファージカクテルを、皮膚および粘膜などの生体表面への適用のため、ならびに非生体表面への適用のために製剤化される組成物中に組み込んでよい。
【０１２８】
生体表面で使用するための抗感染製剤として、限定はされないが、ゲル、クリーム、軟膏、スプレーなどが挙げられる。特定の実施形態では、抗感染製剤は、手術野、あるいは医療従事者および／または患者の手および／または露出した皮膚を滅菌するのに用いられる。好ましい実施形態では、生体表面は、哺乳動物の粘膜、より好ましくはヒトの粘膜である。特に好ましい実施形態では、生体表面は、鼻粘膜；咽頭、喉頭、気管、気管支および／または肺の内層；などの気道の粘膜である。
【０１２９】
非生体表面で使用するための抗感染製剤として、スプレー、溶液、懸濁液、溶液または懸濁液を染みこませたワイプなどである。特定の実施形態では、抗感染製剤は、例えば、電気器具、カウンタートップ、ならびに医療機器、病院設備を含めて、病院、介護施設、救急車などにおける固体表面で使用される。好ましい実施形態では、非生体表面は、病院の装置または手術用設備の表面である。特に好ましい実施形態では、非生体表面は、手術用装置または手術用設備の表面である。
【０１３０】
診断方法
本発明は、細菌感染症における原因物質を決定するための診断方法も包含する。ある実施形態では、細菌感染症の原因物質の診断は、（ｉ）患者からの試料（例えば、スワブ、喀痰、または感染症を引き起こす細菌を培養するのに適切な他の試料）を培養する、（ｉｉ）培養物を１種または２種以上の本発明のファージ、ファージ産物およびファージカクテルと接触させる、および（ｉｉｉ）前記培養物の増殖および／または溶解の形跡をモニタリングすることによって行われる。ファージおよび／またはその単離産物（例えば、ポリペプチド、その生物活性断片またはバリアント、もしくはそれらをコードする核酸）の活性は、種または株に特異的な傾向があるため、１種または２種以上の本発明のファージ、ファージ産物およびファージカクテルに対する感受性または感受性の欠如は、感染を引き起こしている細菌の種または株を示すことができる。
【０１３１】
一部の実施形態では、患者から試験培養物を得て、それを、配列番号１〜５のいずれかのヌクレオチド配列を含む／からなる核酸を含む１種または２種以上のファージ、またはそのバリアント、そのファージ産物（例えばリシンまたは尾部タンパク質などのファージタンパク質を含む）、そのバリアントまたは断片、あるいはそれらをコードする核酸と接触させる。培養物の増殖および／または溶解の低減は、試験試料が、緑膿菌、特に、本明細書に記載のような、用いられたファージ、ファージ産物、またはファージカクテルに感染し易い緑膿菌株を含むことを示し、それによって感染菌を同定し、さらに適切な診断および／または治療を可能にすることができる。
【０１３２】
一部の実施形態では、試験培養物を患者から得て、それを、配列番号６〜１０のいずれかのヌクレオチド配列を含む／からなる核酸を含む１種または２種以上のファージ、またはそのバリアント、そのファージ産物（例えばリシンまたは尾部タンパク質などのファージタンパク質を含む）、そのバリアントまたは断片、あるいはそれらをコードする核酸と接触させる。培養物の増殖および／または溶解の低減は、試験試料が、クレブシエラ・ニューモニエ、特に本明細書に記載のような、用いられたファージ、ファージ産物、またはファージカクテルに感染し易いクレブシエラ・ニューモニエ株を含むことを示し、それによって感染菌を同定し、さらに適切な診断および／または治療を可能にすることができる。
【０１３３】
試料は、患者から採取した組織生検またはスワブ、あるいは血液、涙、または尿などの流体試料であってよい。好ましい実施形態では、組織試料は、患者の気道から得られ、例えば、粘液試料、喀痰、または鼻孔からのスワブである。
【０１３４】
アミノ酸バリアント
本発明は、アミノ酸配列のバリアントを包含する。一部の実施形態では、それは、置換バリアント、挿入バリアントおよび／または欠失バリアントである。欠失バリアントは、典型的には、機能（例えば抗菌活性）に必須ではない天然タンパク質の１または２以上の残基を欠く。挿入突然変異体は、典型的には、ポリペプチド内の非末端点に物質の付加を含む。置換バリアントは、典型的には、ポリペプチド内の１または２以上の部位での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含み、好ましくは他の機能または特性の損失（または実質的な損失）なしに、タンパク質分解による切断に対する安定性などの、ポリペプチドの１または２以上の特性を変化させるように設計され得る。この種類の置換は、好ましくは保存的なものであり、すなわち、１つのアミノ酸が類似の形状および電荷を有するアミノ酸で置き換えられる。保存的置換は当技術分野において周知であり、例えば、アラニンからセリンへ；アルギニンからリジンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリン；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ；リジンからアルギニンへ；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニンへ；セリンからスレオニンへ；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへ；の変化が含まれる。
【０１３５】
遺伝子の全体的な領域が、例えば本明細書に記載されるようにリシンとして同定されるなど、特定の抗菌活性をコードすると同定されると、点突然変異を利用して、どのアミノ酸残基がその抗菌活性に重要であるかを詳細に同定することができる。当業者は、例えばＤＮＡ鎖に単一塩基変化を引き起こして、所望の機能を保存する改変コドンおよび／またはミスセンス突然変異をもたらすことができる。
【０１３６】
好ましくは、タンパク質のアミノ酸の突然変異によって、同等のまたは改良さえされた、第２世代の分子を作り出す。例えば、あるアミノ酸は、機能（例えば抗菌活性）の検出可能なまたは実質的な損失なしに、タンパク質構造における他のアミノ酸に置き換わることができる。そのような変更を加える際に、アミノ酸のハイドロパシー指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を与えるのにハイドロパシーアミノ酸指標が重要であることは、当技術分野において一般に理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特徴が、得られるタンパク質の二次構造に寄与することが認められており、その二次構造は、タンパク質の他の分子との相互作用、例えばグラム陽性細菌の外殻内のペプチドグリカンとの相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷特徴に基づいてハイドロパシー指標を指定されており、例えば、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。当技術分野において、類似したアミノ酸の置換が親水性に基づき有効になされ得ることも理解されている。疎水性と同様に、親水性の値が各アミノ酸に指定されており、アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、およびトリプトファン（−３．４）である。同等の分子を、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に置換することによって得ることができ、それらのハイドロパシー指標および／またはそれらの親水性指数は、互いの±２以内、好ましくは±１以内、または最も好ましくは±０．５以内である。
【０１３７】
ある実施形態では、本発明は、本明細書に開示されているアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはそれ以上のアミノ酸修飾（例えば挿入、置換、欠失など）を含む単離ペプチドを包含する。好ましい実施形態では、親ポリペプチドの生物活性が保持または実質的に保持されるように突然変異がなされる。例えば、本発明は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはそれ以上のアミノ酸修飾を含むように突然変異され、かつ１または２以上の緑膿菌株に対して抗菌活性を保持する／示す、バクテリオファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２、またはＦ９５／１３由来のポリペプチドを包含する。一部の実施形態では、本発明は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、あるいはそれ以上のアミノ酸修飾を含むように突然変異され、かつ１または２以上のクレブシエラ・ニューモニエ株に対して抗菌活性を保持する／示す、バクテリオファージＦ９２／１５、Ｆ１０５／１５、Ｆ１３４／１５、およびＦ１４１／１５由来のポリペプチドを包含する。
【０１３８】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
本発明は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（核酸）を提供する。本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに抗生物質活性および／または他の生物活性を有する修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに、高ストリンジェント、中ストリンジェントまたは低ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも包含する。
【０１３９】
当技術分野で既知のあらゆる方法によって、ポリヌクレオチドを得ることができ、そのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源（例えば緑膿菌バクテリオファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２、およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３、クレブシエラ・ニューモニエバクテリオファージＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５、およびＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５）由来の核酸から生成されたものでよい。ヌクレオチド配列は、当技術分野で既知の通常の方法によって（例えば、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、Carlson, “Working with bacteriophages: common techniques and methodological approaches,” In, Kutter and Sulakvelidze (Eds) Bacteriophages: Biology and Applications, 5th ed. CRC Press (2005)を参照されたい）、あるいは実施例において本明細書に記載されているように、ファージゲノムから単離することができる。特定のポリペプチドをコードする核酸を含む供給源が入手不可能であるが、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列が分かっている場合、ポリペプチドをコードする核酸を化学的に合成し、当技術分野で既知のあらゆる方法を使用して、複製可能なクローニングベクター内にクローニングしてもよい。
【０１４０】
本発明のポリペプチドのヌクレオチド配列が決定されると、そのヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列を操作するための当技術分野で周知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなどを使用して操作し（例えば、双方とも参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYにおいて記載されている技術を参照されたい）、例えばアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を生じさせるなど、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを作製してもよい。
【０１４１】
本発明の分子の組換え発現
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が得られると、その分子を生成するためのベクターを、当技術分野で周知の技術を使用して、組換えＤＮＡ技術により作製することができる。当業者に周知の方法を使用して、適切な転写および翻訳制御シグナルと共にそのコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えが含まれる（例えば、Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY、およびAusubel et al. eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NYに記載されている技術を参照されたい）。
【０１４２】
本発明は、本発明のファージタンパク質、その生物活性断片またはバリアントをコードする発現ベクターを提供する。本発明の分子のヌクレオチド配列を有する核酸を含む発現ベクターを、従来技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿など）によって宿主細胞に移送することができ、その後、トランスフェクトされた細胞を従来技術によって培養して本発明のポリペプチドを生成する。好ましい実施形態では、宿主細胞は、その配列を含むバクテリオファージが由来する親細菌種以外のものである。特定の実施形態では、ポリペプチドの発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターにより制御される。特定の実施形態では、発現ベクターは、ｐＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ社製）またはｐＥＴ−２９（ａ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）である。
【０１４３】
様々な宿主発現ベクター系を用いることができる。そのような宿主発現系は、その系により本発明のポリペプチドのコード配列が産生およびその後精製され得るビヒクル（媒体）を表すが、適切なコード核酸で形質転換またはトランスフェクトしたときに本発明のポリペプチドをｉｎ  ｓｉｔｕで発現する細胞も意味する。
【０１４４】
本発明のポリペプチドを発現させるのに用いる宿主細胞は、本発明のバクテリオファージ、ファージタンパク質、またはそのバリアントもしくは断片に感受性であるまたは非感受性である細菌細胞であってよい。例えば、一部の実施形態では、用いる宿主細胞は、緑膿菌１１４／１２株、緑膿菌４６０／０６株、緑膿菌４３３／０７株、緑膿菌６６／０９および／または緑膿菌１９９２／０５株である。一部の特定の例では、緑膿菌１１４／１２株を用いてファージＦ２７／１２のポリペプチドを発現させ；緑膿菌４６０／０６株を用いてファージＦ９９／１０のポリペプチドを発現させ；緑膿菌４３３／０７株を用いてファージＦ９９／１０、およびＦ２７／１２のいずれかのポリペプチドを発現させ；緑膿菌６６／０９株を用いてファージＰｓａ＿Ｆ９５／１３のポリペプチドを発現させ；および緑膿菌１９９２／０５株を用いてファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３のいずれかのポリペプチドを発現させる。一部の実施形態では、例えば、用いる宿主細胞は、クレブシエラ・ニューモニエ５７３／０７株、クレブシエラ・ニューモニエ２２３／１４株、クレブシエラ・ニューモニエ３９７／０７株、クレブシエラ・ニューモニエ１６３３／０５株、および／またはクレブシエラ・ニューモニエ２４１／１４株である。一部の特定の例では、ファージＦ３９１／０８のポリペプチドをクレブシエラ・ニューモニエ５７３／０７株において発現させ；ファージＫｌｅ＿Ｆ９２／１５のポリペプチドをクレブシエラ・ニューモニエ２２３／１４株において発現させ；ファージＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５のポリペプチドをクレブシエラ・ニューモニエ１６３３／０５株において発現させ；Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５のポリペプチドをクレブシエラ・ニューモニエ３９７／０７株において発現させ；およびＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５のポリペプチドをクレブシエラ・ニューモニエ２４１／１４株において発現させる。
【０１４５】
一部の実施形態では、本発明のバクテリオファージ、ファージタンパク質、またはそのバリアントもしくは断片に非感受性である細菌（例えば枯草菌）を用いる。いずれにしても、本発明のポリペプチドのコード配列を含む、組み換えファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで細菌を形質転換させることができる。
【０１４６】
一部の実施形態では、例えば、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、サッカロミセス・ピチア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｉｃｈｉａ））；本発明のポリペプチドをコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；本発明のポリペプチドをコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフワラーモザイクウイルス（ＣａＭＶ、ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ、ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）を感染させたもしくは本発明のポリペプチドをコードする配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した、植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、またはワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）と共に、組換え発現構築物中に本発明のポリペプチドをコードする配列を含む、哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、３Ｔ３細胞、リンパ球（米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）、またはＰｅｒ  Ｃ．６細胞（ヒト網膜細胞））などの、他の微生物を宿主発現系として用いる。
【０１４７】
細菌系において、異なる発現ベクターが、発現されるポリペプチドの意図された用途に応じて選択され得る。例えば本発明のポリペプチドを含む医薬組成物のために、大量のタンパク質が望まれる場合、高レベルのタンパク質産物の発現を導くベクターが用いられ、特に、例えば容易に精製できる融合構築物として発現される場合、発現産物が容易に精製され得るそのようなベクターが用いられる。そのようなベクターとして、限定はされないが、融合タンパク質が産生されるようにコード配列がｌａｃＺコード領域と共にインフレームでベクター内にライゲーションされている大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791);ｐＩＮベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109、Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509）などが挙げられる。ｐＧＥＸベクターも、外来ポリペプチドを、この場合グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と共に、融合タンパク質として発現させるために使用することができる。通常、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズのマトリックスに吸着させ、その後、遊離グルタチオンを用いて溶出することによって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビン切断部位または因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計され、従って、標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から放出させることができる。
【０１４８】
昆虫系では、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用することができる。このウイルスは、好ましくはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内で増殖する。ポリペプチドのコード配列を、そのウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置いてよい。
【０１４９】
本発明のポリペプチドが組換えによって発現されると、ポリペプチドの精製のための当技術分野で既知のあらゆる方法によって、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティおよびサイズ排除カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、溶解度の差、またはポリペプチドの精製のための他のあらゆる標準的な技術によって、それを精製することができる。
【実施例】
【０１５０】
以下の実施例および本明細書に記載の実施形態は例示目的にすぎず、それに照らして様々な改変または変更が当業者に示唆され、それらは本出願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。
【０１５１】
別段指示がない限り、本明細書に開示する特定のバクテリオファージは、以下の方法に従って単離し、処理し、および解析した。さらに、以下に記載する研究は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  ｄｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの動物倫理委員会により所内で承認され、ポルトガルの法律に基づいて、ポルトガルのＧｅｎｅｒａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｄｉｒｅｃｃａｏ  Ｇｅｒａｌ  ｄｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ）によって国家的に承認された。研究におけるすべての動物は、欧州指針８６／６０９／ＥＣ（Council of the European Communities. Council Directive 86/609/EEC of 24 November 1986 on the approximation of laws, regulations and administrative provisions of the Member States regarding the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. Off J Eur Communities L358:1-28）、ポルトガルの法律（条例１００５／９２）（Portuguese Agricultural Ministry. Portaria no.1005/92 of 23 October on the protection of animals used for experimental and other scientific purposes. Diario da Republica I - Serie B245:4930-4942）、および実験動物の管理と使用に関する指針（ＮＲＣ２０１１）（Institute for Laboratory Animal Research. 2011. Guide for the care and use of laboratory animals. Washington (DC): National Academies Press.）に基づいて維持した。
【０１５２】
この研究の１つの目的は、急性肺感染症のマウス実験モデルにおいて、緑膿菌およびクレブシエラ・ニューモニエに対する噴霧されたバクテリオファージカクテルの抗微生物活性を調べることであった。エアロゾル化バクテリオファージの噴霧は、肺患部に直接送達させることを可能にし、噴霧された抗生物質のいくらかの副作用を克服する。
【０１５３】
細胞株の調製
緑膿菌１１４／１２、４６０／０６、４３３／０７、６６／０９、１９９２／０５株、ならびにクレブシエラ・ニューモニエ２２３／１４、３９７／０７、１６３３／０５、２４１／１４株を、リスボン地区の病院で採取および同定されたヒト臨床試料から単離した。加えて、本発明のバクテリオファージの感染能力を評価するために、１００の緑膿菌臨床株および１０３のクレブシエラ・ニューモニエ臨床株を単離した。１００の緑膿菌株の内、５２株をパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により解析し、別個の分子プロフィールを示した（Kaufmann ME, 1998, Protocols and Clinical Applications, Humana Press Inc., pages 33-50、およびTenover F, et al., 1995, Clin Microbiol 33(9):2233-2239）。また、緑膿菌株の１０の代表的な分離株を、配列型（ＳＴ）において細菌分離株のタイピングを可能にする多座位配列タイピング（ＭＬＳＴ）により特徴付けした。
【０１５４】
クレブシエラ・ニューモニエ株、特に臨床分離株は、頻繁に粘性の多糖莢膜を生成する。これら莢膜の生化学的複雑さが株特異的抗原型の莢膜物質の産生を生じさせる（Clegg S, et al, 2016, Microbiol Spectr 4(1)）。この研究において、１０３のクレブシエラ・ニューモニエ臨床株の内７３株は、クレブシエラ・ニューモニエ抗原に対する市販の抗血清によって莢膜多糖に関してすでに特徴付けされており、Ａｉｄａ  Ｄｕａｒｔｅ教授により親切に提供された。これらの株により示される莢膜血清型は、１５株のＫ２、８株のＫ３、５株のＫ８、８株のＫ１５、１株のＫ１６、１株のＫ１９、１株のＫ２０、１株のＫ２１、３株のＫ２４、１株のＫ２６、１株のＫ２８、１株のＫ３０、１株のＫ３５、１株のＫ４４、４株のＫ５５、３株のＫ６８、１株のＫ８，４７、１株のＫ６，６８、１株のＫ８，３５，５５、１２株のＯ：１（莢膜なし、Ｏ抗原が同定される）、１株のＯ：５（莢膜なし、Ｏ抗原が同定される）、２株のｎｅｇ（血清型が同定されていない莢膜株）であった。
【０１５５】
各細菌分離株をトリプトンソイ寒天培地プレート（ＴＳＡ、Ｂｉｏｋａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，Ｐａｎｔｉｎ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）上に画線し、＋３７℃で１８時間インキュベートした。すべての臨床株を、必要になるまで、１５％グリセロール（ｗ／ｖ）を含むトリプトンソイブロス（ＴＳＢ、Ｂｉｏｋａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，Ｐａｎｔｉｎ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）中において−７０℃で保管した。
【０１５６】
−７０℃で凍結保存した株を３７℃でＴＳＡ上において一晩増殖させた。
【０１５７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験用に、シングルコロニーを、撹拌しながら３７℃でＴＳＢ中において一晩増殖させた。新たな細菌懸濁液（一晩培養したものの希釈物）を調製し、撹拌しながら３７℃でインキュベートした。指数増殖期（６００ｎｍで０．３〜０．５の光学密度を有する）に達した時に採取した。およそ２．０×１０６ｃｆｕ／ｍｌの接種材料を、溶菌曲線を作製するために用いた。
【０１５８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験用に、シングルコロニーを３７℃でＴＳＢ上において一晩増殖させた。新たな細菌懸濁液（一晩培養したものの希釈物）を調製し、指数増殖期に達した時に細菌を採取し、高速遠心分離により濃縮した。６ｍｌの細菌懸濁液を０．９％ＮａＣｌ中に調製し、およそ２．０ｘ１０１０ｃｆｕ／ｍｌでの各臨床株の噴霧に使用した。
【０１５９】
バクテリオファージ株の調製
以下の毒性バクテリオファージをリスボン領域の汚水から単離した：緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２、Ｐｓａ＿Ｆ９５／１３、クレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５、およびＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５。それらファージを以下のように臨床細菌株において増殖させた：ファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３は緑膿菌１９９２／０５において増殖させた；ファージＦ２７／１２は緑膿菌１１４／１２において増殖させた；ファージＰｓａ＿Ｆ９５／１３は緑膿菌６６／０９において増殖させた；ファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２、Ｐｓａ＿Ｆ９５／１３は緑膿菌１９９２／０５において増殖させた；ファージＦ３９１／０８はクレブシエラ・ニューモニエ５７３／０７において増殖させた；ファージＫｌｅ＿Ｆ９２／１５はクレブシエラ・ニューモニエ２２３／１４において増殖させた；ファージＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５はクレブシエラ・ニューモニエ１６３３／０５において増殖させた；Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５はクレブシエラ・ニューモニエ３９７／０７において増殖させた；およびＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５はクレブシエラ・ニューモニエ２４１／１４において増殖させた。
【０１６０】
本発明者は、（パルスフィールドゲル電気泳動および／またはポリメラーゼ連鎖反応または他の核酸増幅技術により評価して）遺伝的に多様なＴｅｃｈｎｏＰｈａｇｅ社のコレクション菌株に対して活性を有するいくつかの溶菌ファージを単離した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性試験は、ＴｅｃｈｎｏＰｈａｇｅ株の少なくとも９０％を溶解することができる１つの特定のファージを含む、そのコレクション中のすべてのＴｅｃｈｎｏＰｈａｇｅ株を累積的に溶解することができるＴｅｃｈｎｏＰｈａｇｅコレクションをもたらした。
【０１６１】
緑膿菌およびクレブシエラ・ニューモニエに対する溶菌バクテリオファージを単離するために、いくつかの臨床株を用いた。リスボンの市街地の様々な起源からの汚水を、二重寒天重層プラークアッセイ（double agar overlay plaque assay)により様々な緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエ臨床株に感染する能力に関して試験した(Kropinsk A, et al., 2009, Methods Mol Biol 501 :69-76）。
【０１６２】
簡単に説明すると、細菌株を攪拌しながら３７℃でＴＳＢ中において一晩増殖させた。新たな細菌懸濁液（一晩培養したものの希釈物）を調製し、撹拌しながら３７℃でインキュベートし、指数増殖期（６００ｎｍで０．３〜０．５の光学密度）に達した時に採取した。各培養物を水試料に添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、予め平衡化した３ｍｌの０．７％軟寒天を加えた。この寒天−水−細菌懸濁物を、１．５％ＴＳＡプレート上に重層し、室温で固化させ、さらに３７℃でインキュベートした。１８時間のインキュベーション後、このプレートを、バクテリオファージの存在を示す細菌叢内のファージプラーク（透明な領域）の存在について確認した。滅菌ピペットチップを用いてバクテリオファージのプラークを突つき、ＳＭ緩衝液に移し、４℃で保管した。
【０１６３】
ファージの増殖および特徴付け
宿主域を評価する前に、新たに単離したバクテリオファージは、指標株において、増殖、増幅および精製（３連続溶出を用いる）の処理を受けた。特定のバクテリオファージ感染に対する３０の緑膿菌およびクレブシエラ・ニューモニエの細菌分離株の感受性を、二重寒天重層プラークアッセイを用いて評価した。簡単に説明すると、細菌株を攪拌しながら３７℃でＴＳＢ中において一晩増殖させた。新たな細菌懸濁液（一晩培養したものの希釈物）を調製し、撹拌しながら３７℃でインキュベートし、指数増殖期（６００ｎｍで０．３〜０．５の光学密度）に達した時に採取した。各培養物を、予め希釈した単離バクテリオファージに添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その後、予め平衡化した３ｍｌの０．７％軟寒天を加えた。この寒天−バクテリオファージ−細菌懸濁物を、１．５％ＴＳＡプレート上に重層し、室温で固化させ、さらに３７℃でインキュベートした。プレートを室温で乾燥させた後、３７℃で一晩インキュベートした。バクテリオファージの存在を示す細菌叢内のファージプラークの出現を観察することにより、特定のバクテリオファージに対する３０の細菌分離株の感受性を決定した。
【０１６４】
最も大きな宿主域を有するバクテリオファージを選択し、増幅、高速遠心分離による濃縮、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配での精製、バクテリオファージゲノムＤＮＡの抽出、ならびに制限断片長多型および形質導入アッセイによる解析などの後の処理にかけた。宿主ＤＮＡのファージゲノム断片が、誤って、ファージＤＮＡの代わりにファージ頭部内にパッケージングされたときに、普遍形質導入ファージが生じる。宿主ゲノムのいずれの部分もこのやり方でパッケージおよび移送できるため、そのプロセスは普遍形質導入と呼ばれる。この能力は、ＰＣＲによる特定宿主遺伝子の増幅によって試験される。その遺伝子は宿主ゲノム内にいくつかのコピーを有し、細菌間で非常に保存されているべきである。その試験はファージの溶解物中の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅に基づく（Beumer et al, 2005; Del Casale et al, 2011）。
【０１６５】
この段階に達したバクテリオファージを、１００の緑膿菌の細菌分離株および１０３のクレブシエラ・ニューモニエの細菌分離株を用いて、宿主域に関して個別に試験した。高い割合（％）の感染を示すものをゲノムシークエンシングのために選択した。バイオインフォマティック分析の後、最も有望なバクテリオファージを治療カクテルの組成物のために選択した。
【０１６６】
緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３バクテリオファージのそれぞれの形態を、カナダのケベック州のラバル大学のＦｅｌｉｘ  ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓで透過電子顕微鏡により解析した。Ｐｓａ＿Ｆ９５／１３は、ポルトガルのリスボンのＨｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅで解析した。これらのデータを、ゲノム解析を用いて統合し、これらのバクテリオファージをアッカーマン分類（Ackermann classification）（Ackermann, 2009, Methods Mol Biol 501 :69-76）に準拠して分類した。
【０１６７】
クレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージの形態を、ポルトガルのリスボンのＨｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅで解析した。これらのデータもゲノム解析で統合し、そのファージをアッカーマン分類（Ackermann, 2009, Methods Mol Biol 501 :69-76）に準拠して分類することを可能にした。
【０１６８】
ファージカクテルのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性
バクテリオファージカクテル組成物をまずｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて評価した。個々のファージ、ならびにそれらの組合せを用いて溶菌培養（Lysis culture）を実施して、選択された緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２、およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３バクテリオファージ、ならびにクレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージの有効性を観察した。他のバクテリオファージも同様に試験した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、動物モデルで使用するためのバクテリオファージ療法プロトコルを確立するための基礎的理解を提供する。
【０１６９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、緑膿菌１９９２／０５株に対して液体培養で、個々でのおよび組み合わせた場合における、緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３バクテリオファージの抗菌活性を評価した。これらアッセイは、抗微生物剤の殺菌または静菌活性を決定するのに用いられる時間−殺菌曲線（time-kill curves）（Rizvi M, et al, 2013, J Global Antimicrob Resist 1 : 103-108）に類似した。また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにより、クレブシエラ・ニューモニエ１２１／１５株に対して、単一培養で、または液体培養で組み合わせて、バクテリオファージの溶菌活性を評価した。簡単に説明すると、細菌株を攪拌しながら３７℃でＴＳＢ中において一晩増殖させた。新たな細菌懸濁液（一晩培養したものの希釈物）を調製し、撹拌しながら３７℃でインキュベートし、指数増殖期に達した時に採取した。各細菌に関して、３つの液体培養物を調製し、同時にアッセイを行った。対照細菌培養物には、培地、および２．０×１０６ｃｆｕ／ｍｌの指数増殖期の細菌を接種した。対照バクテリオファージ培養物には、培地、および試験すべきバクテリオファージを所定の感染多重度で接種した。各試験培養物には、培地、試験すべきバクテリオファージを所定の感染多重度で、および２．０×１０６ｃｆｕ／ｍｌの指数増殖期の細菌を接種した。培養物を軽く攪拌しながら３７℃でインキュベートし、ｔ＝０の時点、およびその後１時間間隔で８時間の間、さらには再度２４時間のインキュベーション後、各培養物から試料を採取した。
【０１７０】
生菌数を１０倍段階希釈法によって定量化した（Murray PR, et al. 2003. Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press.）。対照細菌培養物および試験培養物に関して、緑膿菌培養物についてはセトリマイド寒天プレート（Ｂｉｏｋａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐａｎｔｉｎ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）、またクレブシエラ・ニューモニエ培養物についてはＨｉＣｒｏｍｅ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ａｇａｒ  Ｂａｓｅプレート（ＨｉＭｅｄｉａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社，Ｍｕｍｂａｉ，Ｉｎｄｉａ）上に、１００μｌの各希釈物を広げた。プレートを好気性条件下において３７℃で２４時間インキュベートし、その後コロニー数を計測した。対照バクテリオファージ培養物に関して、ｔ＝０の時点に１００μｌのアリコートを採取し、直ちに希釈して、二重寒天重層プラークアッセイによって各バクテリオファージの最初の濃度を決定した。プレートをインキュベート後、プラーク形成単位（ｐｆｕ）を計測することによりバクテリオファージの力価（タイター）を決定した。
【０１７１】
Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２、Ｆ９５／１３、Ｆ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージのためのＩｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに続いて、個々におよび組み合わせて、１および１０のＭＯＩを用いて、動物実験で試験するために０．９％ＮａＣｌ中にバクテリオファージカクテルを調製した。
【０１７２】
ラットモデルにおけるファージカクテルのｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性
急性肺感染症のマウス実験モデルを緑膿菌感染症用に適合させた。マウスに細菌を接種するため、ならびに確立された急性肺感染症を治療するために緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３バクテリオファージで構成される本発明のバクテリオファージカクテルを送達させるために、噴霧を用いた。このアッセイでは、比較物質として抗生物質を用いた。コリスチンは、カルバペネムに耐性である緑膿菌により引き起こされる感染症の治療での重要性により用いられる抗生物質であった。
【０１７３】
噴霧
図２は、クラスＩＩ生物学的安全キャビネット内で使用される噴霧システムを示す。動物実験の過程中に使用されるネブライザー設備は、ＡＩＲＰＲＯＪＥＣＴ  ＰＩＣ溶液（Ａｒｔｓａｎａ  Ｓ．ｐ．ａ．，Ｇｒａｎｄａｔｅ，Ｉｔａｌｙ）、すなわち以下の動作仕様：薬物最大容量：６．５ｍＬ；周波数：２．５ＭＨｚ；粒子径：３．６μｍ±０．１５の空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）；および７１％の通気性フラクション；の超音波エアロゾルである。ＡＩＲＰＲＯＪＥＣＴ  ＰＩＣを吸入チャンバに接続し、動物（最高５匹の動物）を、感染中は細菌懸濁液に、および１０分の平均噴霧時間で処置中はバクテリオファージカクテルに曝した。
【０１７４】
動物
体重が３０〜３５ｇの１０週齢の特定病原体未感染（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｆｒｅｅ；ＳＰＦ）の雌のＣＤ１マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。この動物を、以下の条件：湿度（５０〜７０％）および温度（２０〜２２℃）に制御され、１２時間明期および１２時間暗期のサイクルで、ペレット化した齧歯動物用固形飼料および濾過滅菌水に自由にアクセスできる部屋の中のマイクロアイソレーターでの飼育；下で、承認された動物ケアセンターにおいて飼育した。動物は最初に５つの群で収納した。感染後、実験群によって収納した。すべての外科的処置は、オートクレーブ滅菌した器具を用いてクラスＩＩ生物学的安全キャビネット内で実施した。この試験では、全３３匹のマウスに、感染の４日前に１５０ｍｇ／ｋｇ体重のシクロホスファミドを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、さらに感染の１日前に１００ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドをｉ．ｐ．投与して、一過性の好中球減少状態にした。
【０１７５】
感染
２９匹のマウスにエアロゾルを吸入させて緑膿菌１９９２／０５に感染させた。１５分の間に６ｍｌの緑膿菌１９９２／０５（およそ１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ）懸濁液を噴霧した。１２時間後、２匹のマウスを安楽死させ、ｃｆｕ定量のために肺を採取した。２７匹の感染動物を３つの実験群：緑膿菌１９９２／０５感染群（ｎ＝９）；ファージ処置群（ｎ＝９）；抗生物質処置群（ｎ＝９）にランダムに分けた。陰性対照群は、６ｍｌの０．９％ＮａＣｌを噴霧した２匹の動物を含んだ。
【０１７６】
バクテリオファージ処置のプロトコル
バクテリオファージでの処置は、感染後（ｐ．ｉ．）２４時間で開始した。感染多重度（ＭＯＩ）を評価するために、２匹の非感染動物および１回投与（１用量）で処置した動物を安楽死させ、ｐｆｕ定量のために肺を採取した（処置対照群）。
【０１７７】
ファージ処置群のマウスに、１５分の間に６ｍｌのバクテリオファージカクテル（およそ６．０ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌ）を噴霧した。抗生物質処置群の動物は、コリスチン硫酸塩＞１５０００Ｕ／ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を１６ｍｇ／ｋｇ用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射して処置した（Hengzhuang, 2012）。処置プロトコルは、４回投与を含み、６時間間隔で投与し、その後４時間の休薬期間の後、動物を安楽死させ、微生物学的および組織病理学的解析のために肺を採取した。緑膿菌感染群および陰性対照群の動物には、同じスケジュールで０．９％のＮａＣｌを噴霧した。
【０１７８】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ評価
実験研究中、試験動物を評価した。スコアシートを用いて、所定の間隔（感染後２４時間および４８時間）で各動物の健康状態を調べた。動物の毛、活動、呼吸および動きの直接観察に従い、０から３（正常から重篤）までのスコアを指定し、スコアは各マウスの動物福祉の概要を提供する役割を果たした。
【０１７９】
安楽死および肺採取
クラスＩＩ生物学的安全キャビネットにおいて、自家製の小容量の密閉チャンバ内で動物をイソフルレン（Ｉｓｏｆｌｏ，Ｅｓｔｅｖｅ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）吸入により安楽死させた。解剖を始める前に、いずれの呼吸運動も心拍もないことをチェックすることにより、動物が死んでいることを確認した。その後、手術部位を７０％エタノールで洗浄した。清浄で無菌の手術器具、ピンセットおよびハサミを用いて、胸郭の真下に小切開を作り、マウスを横断して皮膚および結合組織を切り開いた。マウスの首までそれぞれの側で側方切開術を行った。鉗子により胸郭を引き離して臓器および肺を露出させ；さらにその後、結合組織をハサミで切り、肺は無傷のままにしながら、気管を徐々に強く引っ張ることにより肺を切り取った。肺全体を採取し、使用まで１５ｍｌの遠心チューブ内に入れた。あらゆる血液および破片を除去し、およそ３０秒間高温のガラスビーズ滅菌器内に浸し、完全に冷却し、さらにその後７０％エタノールで洗浄することにより、異なる動物での使用の間に器具を滅菌した。各マウスの採取した肺組織の重さを量り、２ｍｌの０．９％ＮａＣｌ中でホモジナイズした。
【０１８０】
感染後３４時間で、かつ処置開始の２２時間後に、感染群、ファージ処置群、抗生物質処置群から６匹のマウス、および陰性対照群からの１匹のマウスを安楽死させ、ｃｆｕ定量のために肺を採取した。感染群、ファージ処置群および抗生物質処置群からの３匹のマウス、および陰性対照群からの１匹のマウスの肺も組織病理学的解析のために採取した。
【０１８１】
微生物学的解析
ホモジナイズした肺組織を５秒間ボルテックスし、懸濁液の１００μｌのアリコートを段階希釈に用いた。１０倍段階希釈法を用いて生菌数を計測した（Murray PR, 2003, Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press）。各希釈物から１００μｌをセトリミド寒天選択培地のプレート（Ｂｉｏｋａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐａｎｔｉｎ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）に接種した。プレートを好気性条件下において＋３７℃で２４時間インキュベートし、その後コロニー数を計測した。セトリミド寒天培地上で増殖させたコロニーを、その形態に基づき緑膿菌として推定的に同定した（Brown VI, et al, 1965, Clin Pathol 18:752-756）。
【０１８２】
組織病理学的解析
組織病理学的解析のために、動物をクラスＩＩ生物学的安全キャビネット内で上記のように安楽死させた。解剖を始める前に、いずれの呼吸運動も心拍もないことをチェックすることにより、動物が死んでいることを確認した。その後、手術部位を７０％エタノールで洗浄した。清浄で無菌の手術器具、ピンセットおよびハサミを用いて、胸郭の真下に小切開を作り、マウスを横断して皮膚および結合組織を切り開いた。マウスの首までそれぞれの側で側方切開術を行った。鉗子を用いて胸郭を引き離した後、できるだけ多くの骨を除くことを目指して残りの胸郭および他の組織を注意深く除いて気管を露出させた。鉗子を気管の下に置いて気管を露出したままに維持し、気管が食道から分離されていることを確実にし、ホルモアルデヒド、４％リン酸塩緩衝液（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、肺が膨張するまで気管内（軟骨リングの間）に注入した。結合組織をハサミで切りながら、気管を徐々に強く引っ張ることにより肺を切り取った。肺全体を採取し、およそ１０ｍｌのホルモアルデヒド、４％リン酸塩緩衝液を含む１５ｍｌの遠心チューブ内に入れ、２４時間の固定の間、攪拌しながら室温で維持した。その後、ホルモアルデヒド、４％リン酸塩緩衝液を７０％エタノールで置換した。
【０１８３】
ＩＭＭでのＨｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅにより組織学的解析を実施した。組織をパラフィン包埋し、３μｍ増分で縦方向に切片を作った。それによって、肺の構造を明確に可視化させ、細い気道に分枝しさらに最終的に肺胞管および肺胞腔内に通じる太い気道を見ることができるようにする。各肺に関して、２つの連続切片を２枚のスライドに置き、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）およびグラム染色した。組織スライドを光学顕微鏡下で検査し、カラーカメラ（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ２５００、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ社，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた電動式倒立明視野顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して５０×倍率で切片を撮影した。
【０１８４】
第２の齧歯動物モデル−慢性創傷感染
慢性創傷感染のラット実験モデルを緑膿菌感染症用に最適化させた。そのモデルは、糖尿病の誘発なしに、２０１２年にＭｅｎｄｅｓらにより記載されているやり方に基づく。緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３バクテリオファージから構成されるバクテリオファージカクテルを、確立された感染症の処置のために創傷に直接投与した。
【０１８５】
動物
体重が１７５〜２００ｇ（８週齢）の特定病原体未感染（ＳＰＦ）の雄のウィスターラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。この動物を、以下の条件：湿度（５０〜７０％）および温度（２０〜２２℃）に制御され、１２時間明期および１２時間暗期のサイクルで、ペレット化した齧歯動物用固形飼料および濾過滅菌水に自由にアクセスできる部屋の中のマイクロアイソレーターでの飼育；下で、承認された動物ケアセンターで飼育した。動物を最初に３つの群で収納した。潰瘍形成および感染後、実験群に従い個別に収納した。すべての外科的処置は、オートクレーブ滅菌した器具を用いてクラスＩＩ生物学的安全キャビネット内で実施した。この試験では、全１５匹のラットを用いた。
【０１８６】
感染
１２匹のラットを除毛および潰瘍形成（Mendes et al 2013）し、その後に緑膿菌１９９２／０５を感染させた。細菌懸濁液を０．９％ＮａＣｌ中に調製し、マクファーランドスケール（McFarland’s Scale）０．５で１．５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度に調整し、そこから１００μｌを用いて傷に接種した。陰性対照群からの３匹の動物の傷には１００μｌの０．９％ＮａＣｌを接種した。４日後、感染動物を２つの実験群：緑膿菌１９９２／０５感染群（ｎ＝６）；ファージ処置群（ｎ＝６）にランダムに分けた。創傷後４、５および７日目に、半閉塞性包帯を切り取り、創傷を清拭した。ｃｆｕの決定のためにスワブを回収した。
【０１８７】
バクテリオファージ処置のプロトコル
ファージ処置プロトコルは、感染後（ｐ．ｉ．）４日目に開始した。すべての試験群が、導入期および維持期からなるバクテリオファージ処置プロトコルを受けた。導入期は、最初のデブリードマン（創傷後４日目）の後に生じ、５回（４時間毎）の１００μＬの初期(primary)バクテリオファージカクテルの投与からなっていた。維持期は５日目〜８日目であり、１日２回（１２時間毎）の１００μＬの初期バクテリオファージカクテルの投与からなっていた。デブリードマンを実施した場合は、バクテリオファージ投与が続いた。対照群には、１００μＬの滅菌生理食塩水を同じ頻度で与えた。バクテリオファージカクテルはおよそ２ｘ１０１１ｐｆｕ／ｍｌを有する。
【０１８８】
動物の安楽死および創傷の採取
創傷後７日目に屠殺する前に、設置したデジタル顕微鏡を使用して、１．５ｃｍの標準的な高さから創傷を撮影した。創傷後７日目にイソフルレンの過量投与により屠殺し、各潰瘍およびその周りの０．５ｃｍの皮膚境界を、滅菌した外科用ハサミを使用して収集し、チューブ内に入れた。
【０１８９】
微生物学的解析
創傷後４、５および７日目ならびにデブリードマンの後に、液体Ａｍｉｅｓ溶出スワブ（ｅＳｗａｂ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｃｏｐａｎ社，Ｃｏｒｏｎａ，ＣＡ）を用いて、スワブ培養物を採取および搬送した。細菌採取は、Ｓｕｌｌｉｖａｎらにより記載されている１点法を使用して実施した。簡単に説明すると、滅菌したスワブを使用して、十分な指圧でスワブを時計回りに３回回転させて、各創傷の中心表面をよくこすり、小量の滲出液を得た。次いで、そのスワブをチューブに挿入し、即時処理のために実験室に搬送した。このスワブ採取チューブを、（中のスワブと共に）５秒間ボルテックスし、得られた懸濁液の１００μＬのアリコートを段階希釈に使用した。１０倍段階希釈方法を使用して定量を実施した（Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Pfaller MA, Yolken RH. 2003. Manual of clinical microbiology. Washington, DC: ASM Press)。１００μＬの各希釈物を、セトリミド寒天（Ｂｉｏｋａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐａｎｔｉｎ  Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）選択培地のプレートに接種した。プレートを好気性条件下において＋３７℃で２４時間インキュベートし、その後コロニー数を計測した。セトリミド寒天培地上で増殖させたコロニーを、その形態に基づき緑膿菌として推定的に同定した（Brown VI, Lowbury EJ. 1965. Use of improved cetrimide agar medium and other culture methods for Pseudomonas aeruginosa. J Clin Pathol 18:752-756）。
【０１９０】
組織病理学的解析
組織病理学的解析のために、動物を、動物設備のクラスＩＩ生物学的安全キャビネット内で上記のように安楽死させた。採取した試料を１０％緩衝ホルマリン溶液中で固定し、一晩固定した後、組織をトリミングし、最大幅のマージンで切り開き、パラフィン包埋し、３ｍｍ増分で切片を作製した。前後軸に垂直でかつ創傷表面に垂直に、切片を作製した。各創傷について、２つの連続切片をスライド上に置き、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。カラーカメラ（Ｌｅｉｃａ  ＤＭ２５００，Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた電動式倒立明視野顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、５０×倍率で切片を撮影した。（Brown VI, Lowbury EJ. 1965. Use of improved cetrimide medium and other culture methods for Pseudomonas aeruginasa. J Clin Pathol 18:752-756）に記載されているように、上皮間隙（epithelial gap）（ＥＧ）および真皮間隙（dermal gap）（ＤＧ）について各画像を解析した。
【０１９１】
血液学的および生化学的分析
血液学的および生化学的分析のために、５匹の動物（緑膿菌４６０／０６感染群から１匹；緑膿菌１１４／１２感染群から１匹；緑膿菌４６０／０６処置群から１匹；緑膿菌１１４／１２処置群から１匹；および陰性対照群から１匹）から心穿刺により血液試料を採取した。各動物の全血試料を２つのマイクロチューブに分けた（血液学的分析のために約５０μｌ、および生化学的分析のために１００μｌ）。
【０１９２】
全血試料を、ＷＢＣ（白血球数）、（ＲＢＣ）赤血球数、ＨＧＢ（ヘモグロビン）、ＨＣＴ（ヘマトクリット）、ＰＬＴ（血小板数）に関して、Ｐｏｃｈ−１００ｉｖ  Ｄｉｆｆ血液分析装置（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｏｂｅ、Ｊａｐａｎ）で分析した。生化学的分析用の血液試料は４℃で一晩冷蔵して完全な凝血を確実にした。凝固血液を１３，２００ｒｐｍで５分間遠心して、破片および凝固細胞から血清を分離した。血清を新たなマイクロチューブに移して、必要となるまで−２０℃で保管した。健康状態に関する化学および電解質分析を提供するＶｅｔＳｃａｎ（Ａｂａｘｉｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の包括的診断プロファイルを用いて、ＡＬＢ（アルブミン）、ＡＬＰ（アルカリホスファターゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、ＡＭＹ（アミラーゼ）、ＢＵＮ（血中尿素窒素）、ＣＡ（カルシウム）、ＣＲＥ（クレアチニン）、ＧＬＯＢ（グロブリン）、ＧＬＵ（グルコース）、Ｋ＋（カリウム）、Ｎａ＋（ナトリウム）、ＰＨＯＳ（リン）、ＴＢＩＬ（総ビリルビン）、およびＴＰ（総タンパク質）に関して血清を分析した。
【０１９３】
統計解析
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験からのすべての定量的な微生物学的結果を、対応する標準偏差と共に平均として提示し、肺組織試料に関して対数に変換した値ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ）として表す。両側のマン・ホイットニー検定を用いて群間の比較を行い、０．０５未満のｐ値を有意とみなした。統計解析のためにすべてのデータを表計算プログラム（Ｅｘｃｅｌ，Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）に入力した。解析的統計は、ウィンドウズ（登録商標）用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  バージョン  ５．０４（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ，ｗｗｗ，ｇｒａｐｈｐａｄ．Ｃｏｍ）を用いて実施した。
【０１９４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の結果
形質導入アッセイ
バクテリオファージが普遍形質導入を実行する能力を、ファージの溶解物中の１６ｓ  ｒＲＮＡの増幅により分析した。対応する宿主から抽出したＤＮＡをＰＣＲにおける陽性対照として用いた。加えて、ファージＤＮＡの各試料も、反応対照として働くスパイクＤＮＡ（０．５ｎｇの宿主ＤＮＡ）の存在下で増幅させた。図２０および２１は、宿主およびファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３からのＤＮＡ中の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の増幅を示す。
【０１９５】
緑膿菌分離株におけるバクテリオファージ宿主域の解析
選択された緑膿菌バクテリオファージの感染効率を、臨床分離株のパネルに対してファージを試験することにより解析した。具体的には、各バクテリオファージを用いて、１００株（５２株は別個の分子プロファイルを有し、そのうち１０株は異なるＳＴプロファイルから）の感受性を試験し、以下の表１〜５に結果を示す。各場合において、バクテリオファージ懸濁液（ＣｓＣｌ精製溶解物から調製した）の段階希釈物を調製した。３つの希釈物をプレートに播き、その希釈物は単離ファージプラークをもたらす力価を有する。各株のバクテリオファージに対する感受性を、透明なプレート（＋＋＋＋）から計測できるファージプラーク（＋）までを示すスケールを用いて評価した。ファージ感染に対する耐性は（−）として示した。感染され得る菌株の割合（％）も示した。
【０１９６】
表１は、呼吸器臨床試料から単離された１００の緑膿菌（ＰＳＡ）株においてプラークアッセイにより決定したＦ９９／１０の宿主域を示す。
【表１】
2020500935.tif 000001
【０１９７】
表２は、呼吸器臨床試料から単離された１００の緑膿菌（ＰＳＡ）株においてプラークアッセイにより決定したＦ１１０／１０の宿主域を示す。
【表２】
2020500935.tif 000002
【０１９８】
表３は、呼吸器臨床試料から単離された１００の緑膿菌（ＰＳＡ）株においてプラークアッセイにより決定したＦ２７／１２の宿主域を示す。
【表３】
2020500935.tif 000003
【０１９９】
表４は、呼吸器臨床試料から単離された１００の緑膿菌（ＰＳＡ）株においてプラークアッセイにより決定したＰｓａ＿Ｆ８３／１３の宿主域を示す。
【表４】
2020500935.tif 000004
【０２００】
表５は、呼吸器臨床試料から単離された１００の緑膿菌（ＰＳＡ）株においてプラークアッセイにより決定したＰｓａ＿Ｆ９５／１３の宿主域を示す。
【表５】
2020500935.tif 000005
【０２０１】
表６は、表１、３および５の３つのバクテリオファージの結果を合わせて、ファージを個々でおよび組み合わせて使用した場合の感染された緑膿菌の割合（％）を示す。表６は、組合せが、感染される菌株の割合（％）を増大させ、４４％の緑膿菌宿主域をもたらすことを示す。
【表６】
2020500935.tif 000006
【０２０２】
加えて、５２の分子的に多様な緑膿菌分離株のみからのこれらバクテリオファージの結果を考慮した場合、組み合わせたパーセンテージは同じであった。さらには、１９％の菌株には１つのバクテリオファージのみが感染し、１５％は少なくとも３つのバクテリオファージに感受性を有していた。５つすべてのバクテリオファージが感染する菌株はなかった。
【０２０３】
クレブシエラ・ニューモニエ分離株におけるバクテリオファージ宿主域の解析
選択されたクレブシエラ・ニューモニエバクテリオファージの感染効率を、臨床分離株のパネルに対してファージを試験することにより解析した。具体的には、各バクテリオファージを用いて、１０３の臨床株の感受性を試験し、以下の表７〜１１に結果を示す。１０３の臨床株の内、７３株を、バクテリオファージが細菌に感染する能力に直接影響する特徴である莢膜多糖により特徴付けした。各場合において、バクテリオファージ懸濁液（ＭＳＰ溶解物）の段階希釈物を調製した。３つの希釈物をプレートに接種し、その希釈物は単離ファージプラークをもたらす力価を有する。各株のバクテリオファージに対する感受性を透明なプレート（＋＋＋＋）から計測できるファージプラーク（＋）までを示すスケールを用いて評価した。ファージ感染に対する耐性は（−）として示した。感染され得る菌株の割合（％）も示した。
【０２０４】
表７は、臨床試料（３０の呼吸器臨床試料、および７３の多様な臨床試料）から単離された１０３のクレブシエラ・ニューモニエ（ＫＬＥ）株においてプラークアッセイにより決定したＦ３９１／０８の宿主域を示す。
【表７】
2020500935.tif 000007
【０２０５】
表８は、臨床試料（３０の呼吸器臨床試料、および７３の多様な臨床試料）から単離された１０３のクレブシエラ・ニューモニエ（ＫＬＥ）株においてプラークアッセイにより決定したＫｌｅ＿Ｆ９２／１５の宿主域を示す。
【表８】
2020500935.tif 000008
【０２０６】
表９は、臨床試料（３０の呼吸器臨床試料、および７３の多様な臨床試料）から単離された１０３のクレブシエラ・ニューモニエ（ＫＬＥ）株においてプラークアッセイにより決定したＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５の宿主域を示す。
【表９】
2020500935.tif 000009
【０２０７】
表１０は、臨床試料（３０の呼吸器臨床試料、および７３の多様な臨床試料）から単離された１０３のクレブシエラ・ニューモニエ（ＫＬＥ）株においてプラークアッセイにより決定したＫｌｅ＿Ｆ１３４／１５の宿主域を示す。
【表１０】
2020500935.tif 000010
【０２０８】
表１１は、臨床試料（３０の呼吸器臨床試料、および７３の多様な臨床試料）から単離された１０３のクレブシエラ・ニューモニエ（ＫＬＥ）株においてプラークアッセイにより決定したＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５の宿主域を示す。
【表１１】
2020500935.tif 000011
【０２０９】
最も高い感染（％）は、Ｆ３９１／０８およびＫｌｅ＿Ｆ９２／１５を用いて得られ、それぞれ１７％の感染を示した。Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５、およびＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５はそれぞれ、８％、３％、および２％の感染（％）を示した。
【０２１０】
表１２は、表７〜１１の５つのバクテリオファージの結果を合わせて、ファージを個々でおよび組み合わせて使用した場合の感染されたクレブシエラ・ニューモニエの割合（％）を示す。表１２は、組合せが、感染される菌株の割合（％）を増大させ、３２％のクレブシエラ・ニューモニエの宿主域をもたらすことを示す。
【表１２】
2020500935.tif 000012
【０２１１】
表１３は、宿主域に関して試験した細菌の莢膜血清型に関連してバクテリオファージ感染を解析し、個々のクレブシエラ・ニューモニエファージのそれぞれにより感染され得る特定の莢膜多糖のクレブシエラ・ニューモニエ株の数を示す。
【表１３】
2020500935.tif 000013
【０２１２】
表１３に示すように、Ｋ６８株（Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５、およびＦ３９１／０８）に感染したすべてのバクテリオファージが、Ｋ６，６８株にも感染した。Ｋ８，４７株に感染したバクテリオファージのうち１つのみが、Ｋ８株（Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５）にも感染した。Ｆ３９１／０８は、同じ血清型由来のより多くの株に感染した。Ｋｌｅ＿Ｆ１４１／１５は１つの株のみに感染し、それは莢膜非形成株（non-capsulateed strain）であった。Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５は、特徴づけられた莢膜血清型を有する試験株のいずれにも感染しなかった唯一のバクテリオファージであった。８つのＫ１５株はいずれも感染されず、またＫ１６、Ｋ１９、Ｋ２０、Ｋ２１、Ｋ３５、Ｋ４４、およびＫ８，３５，５５株も全く感染されなかった。しかしながら、重要なこととして、本発明のバクテリオファージは、いずれの単一の莢膜血清型にも限定されず、多様な血清型にわたる宿主域を示した。
【０２１３】
ゲノム解析の結果
緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３、ならびにクレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５、Ｋｌｅ＿Ｆ１３４／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１４１／１５のゲノムＤＮＡの全ゲノムシークエンシングをパイロシークエンス法を用いて実施した。カクテルに含まれるＦ９９／１０およびＦ２７／１２バクテリオファージの完全ゲノム配列を、ゲノムシークエンサーＦＬＸ  Ｔｉｔａｎｉｕｍを用いてパイロシークエンス法により決定し、ＧＳ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ（すべて、Ｍａｃｒｏｇｅｎ社，Ｓｅｏｕｌ，Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）を用いてクオリティフィルタをかけたリードのアセンブリを実施した。Ｐｓａ＿Ｆ９５／１３のゲノムを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２０００  ゲノムアナライザー（ＢａｓｅＣｌｅａｒ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてシークエンシングした。
【０２１４】
ＮＣＢＩヌクレオチドコレクションデータベースにおいてＢＬＡＳＴＮプログラム（Zhang,Z,et al,2000,Comput Biol 7:203-214）を用いてＤＮＡ相同性検索を実施した。アノテーションに基づき、各ゲノムの環状マップを作製し、タンパク質をコードする予測ｏｒｆ、ならびにそれらの推定機能を示す。緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３、ならびにクレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｆ９２／１５およびＦ１０５／１５の各々について、結果をそれぞれ図３、図４、図５、図６、図７および図８に示す。
【０２１５】
図３は、Ｆ９９／１０ゲノム概略構成を示す。約９３ｋｂのゲノム内の予測ｏｒｆを矢印で表わし、黒字で数字を付し、矢印の方向は転写の方向を示す。
【０２１６】
最初のＮＣＢＩヌクレオチドｂｌａｓｔ解析（ｂｌａｓｔｎ）に基づき、ファージＦ９９／１０のＤＮＡ（９２，７９２ｂｐのゲノムサイズを有する）が、シュードモナスファージｖＢ＿ＰａｅＭ＿Ｃ２−１０＿Ａｂ０２（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＬＮ６１０５７２．１）のＤＮＡに対して９６％の類似性を有し、ファージｖＢ＿ＰａｅＭ＿Ｃ２−１０＿Ａｂ０２と比較してそのゲノムの９６％において９７％までの配列同一性を共有することが分かった。１８０のｏｒｆが予測され、２８％が推定機能を割り当てられた。
【０２１７】
図４は、Ｆ２７／１２ゲノムの概略構成を示す。約８６ｋｂのゲノム内の予測ｏｒｆを矢印で表わし、黒字で数字を付し、矢印の方向は転写の方向を示す。
【０２１８】
Ｆ２７／１２に関して、解析は、最も関連するゲノム配列が、緑膿菌バクテリオファージＤＬ５２（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＫＲ０５４０２８．１）およびｖＢ  ＰａｅＭ  Ｃ１−１４＿Ａｂ２８（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＬＮ６１０５８９．１）に該当することを明らかにした。ＤＮＡ相同性検索は、ファージＦ２７／１２のＤＮＡ（６５，８５５ｂｐのゲノムサイズを有する）の１００％がＤＬ５２に類似性が高く、ＤＬ５２と比較してそのゲノムの１００％において９７％までの同一性を有することを示した。９０のｏｒｆが予測され、それらのうち２８％において推定機能を割り当てられた。
【０２１９】
図５は、Ｆ９５／１３ゲノムの概略構成を示す。約４３ｋｂのゲノム内の予測ｏｒｆを矢印で表わし、黒字で数字を付し、矢印の方向は転写の方向を示す。
【０２２０】
Ｆ９５／１３に関して、解析は、ファージＰｓａＦ９５／１３のＤＮＡの〜９７％が、シュードモナスファージｖＢ＿ｐａｅ＿ＰＳ９Ｎ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＡＢ９１０３９３．１）のＤＮＡに対して高い類似性を有することを明らかにした。配列同一性は、９７％のゲノム配列において９９％までであった。５７のＯＲＦが予測され、４２％が推定機能を割り当てられた。ＮＣＢＩ非冗長（non-redundant）タンパク質配列データベースからのいずれの配列とも有意な相同性を有していなかったのは予測ＯＲＦの１％未満であった。公知の毒性または毒素タンパク質、あるいは典型的には溶原性に関連する要素（インテグラーゼ、リプレッサー、およびアンチリプレッサー）との有意な類似性はこれらバクテリオファージの配列中に見いだされなかった。
【０２２１】
クレブシエラ・ニューモニエバクテリオファージに関して、そのゲノムを同様に解析した。クレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージのゲノムＤＮＡの全ゲノムシークエンシングを実施した。選択されたバクテリオファージの完全ゲノム配列の最初のＮＣＢＩヌクレオチドｂｌａｓｔ解析（ｂｌａｓｔｎ）を実施した。クレブシエラ・ニューモニエバクテリオファージＦ３９１／０８は、ゲノムのほんの一部以外は、他のバクテリオファージと有意な相同性を示さなかった。最も高い類似性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バクテリオファージｖＢ  ＥｃｏＳ  ＦＦＨ１（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＫＪ１９０１５７．１）に関して見られた。Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５バクテリオファージ（ＦＡＳＴＡ配列の添付ファイル）は、バクテリオファージサルモネラファージＳｔｉｔｃｈ（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＫＭ２３６２４４．１）と最も高い類似性を示した。バクテリオファージＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５のゲノム配列は、ＮＣＢＩデータベースからの他の配列と高い相同性を示した。最も高い類似性は、クレブシエラファージＪＤ１８（ＮＣＢＩリファレンス配列：ＫＴ２３９４４６．１）に関して見いだされた。１１３０７３ｂｐのゲノムサイズを有するバクテリオファージＦ３９１／０８は、大腸菌バクテリオファージｖＢ  ＥｃｏＳ  ＦＦＨ１とほんの９％のゲノムカバレッジ（genome coverage）において７４％までの配列同一性を共有した。１７２のＯＲＦが予測され、その３９．５％において推定機能を割り当てられた。予測ＯＲＦの３６％は、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質配列データベースからのいずれの配列とも有意な相同性を有していなかった。Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５バクテリオファージのゲノム解析は、その１１１７７５ｂｐのゲノムサイズが、バクテリオファージサルモネラファージＳｔｉｔｃｈの９４％のゲノムカバレッジにおいて９８％までの配列同一性を共有することを明らかにした。その１７６の予測ＯＲＦは、４７．２％において推定機能を割り当てられた。予測ＯＲＦの５．７％のみが有意な相同性を有していなかった。１６５３２６ｂｐのゲノムを有するバクテリオファージＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５は、クレブシエラファージＪＤ１８と高い類似性を示した。配列同一性は、ゲノム配列の９８％において９６％までであった。２８９のＯＲＦが予測され、その４５．３％が推定機能を割り当てられた。その予測ＯＲＦのおよそ５４％が、ＮＣＢＩ非冗長タンパク質配列データベースからの配列と相同性を有していたが、機能を割り当てられていない。
【０２２２】
図６は、国際出願第ＰＣＴ／ＰＴ２０１１／００００３１号にもすでに開示されているＦ３９１／０８ゲノムの概略構成を示す。約１１３ｋｂのゲノム内の予測ｏｒｆを矢印で表わし、黒字で数字を付し、矢印の方向は転写の方向を示す。
【０２２３】
図７は、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５ゲノムの概略構成を示す。約１１２ｋｂのゲノム内の予測ｏｒｆを矢印で表わし、黒字で数字を付し、矢印の方向は転写の方向を示す。
【０２２４】
図８は、Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５ゲノムの概略構成を示す。約１１２ｋｂのゲノム内の予測ｏｒｆを矢印で表わし、黒字で数字を付し、矢印の方向は転写の方向を示す。
【０２２５】
形態学的検査の結果
精製バクテリオファージを、透過電子顕微鏡を用いて、そのウイルス粒子形態に基づき分類した。Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３の形態学的特徴を図９の代表的画像に示し、Ｆ３９１／９８、Ｆ９２／１５およびＦ１０５／０５の形態学的特徴を図１０の代表的画像に示す。画像は、ファージサイズ、二十面体頭部、収縮性尾部、および尾部の先端に付着する尾部繊維を含む、形態学的特徴を示す。
【０２２６】
緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９３／１５は、カウドウイルス目に属するように見えた。ファージＦ９９／１０およびＦ２７／１２は、尾部の先端において認識できる基盤（base plate）構造および尾部繊維と共に、収縮性尾部および二十面体頭部（カプシド）を示す。Ｆ９５／１３は、非収縮性の長い尾部を示した。これらの特徴は、それらのゲノム特性と共に、これらバクテリオファージをそれぞれマイオウイルス科およびサイフォウイルス科の一員として分類した。具体的には、Ｆ９９／１０は、７９．９±３．７ｎｍのカプシドサイズおよび１３１．９±３．０ｎｍの尾部の長さを示し；Ｆ２７／１２は、７６．８±２．３ｎｍのカプシドサイズおよび１４１．１±３．３ｎｍの尾部の長さを示し；Ｆ９５／１３は、５１．９±２．５ｎｍのカプシドサイズおよび１５６±３．０ｎｍの尾部の長さを示した（図９）。
【０２２７】
クレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージは、カウドウイルス目に属するように見える。Ｆ３９１／０８およびＫｌｅ＿Ｆ９２／１５バクテリオファージは、柔軟性であることが多い長い非収縮性の細い尾部と共に、二十面体頭部を示した。これらの特徴は、それらのゲノム特性と共に、これらバクテリオファージをサイフォウイルス科の一員として分類することを可能にした。Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージは、基盤構造および尾部繊維と共に、収縮性尾部および二十面体頭部（カプシド）を示すマイオウイルス科の一員として分類された。具体的には、Ｆ３９１／０８は、６０．８±１．９ｎｍのカプシドサイズおよび２２３±１０．９ｎｍの尾部の長さを示し；Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５は、７１．６±４．８ｎｍのカプシドサイズおよび１７０．０±２２．１ｎｍの尾部の長さを示し；Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５は、１０２．１±２．９ｎｍのカプシドサイズおよび９５．９±４．５ｎｍの尾部の長さを示した（図１０）。
【０２２８】
ファージカクテルの開発
急性肺感染症に使用するためのバクテリオファージカクテルを開発するために、緑膿菌１９９２／０５株の浮遊性培養物に対する溶菌活性に関して、バクテリオファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９３／１５を評価した。以前決定した接種細菌を用いて、制御条件下で通常の溶菌曲線を作成した。マウスモデルにおいて肺に到達する緑膿菌の負荷質量を決定するために予備試験を実施した。ｃｆｕの決定によって、およそ２×１０６ｃｆｕ／ｇ肺の細菌負荷量が示され、これを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで使用する接種材料とした。
【０２２９】
ファージカクテル用の組成物を決定する際に、各ファージを、個別にならびに他のファージと組み合わせて、および異なるＭＯＩで、細菌培養物において試験した。生菌数を、１時間間隔で８時間の間、ならびに再度２４時間目に計測し、１０倍段階希釈法を用いて定量化した。結果を図１１〜図１５に示す。
【０２３０】
図１１は、ＭＯＩ＝１を用いて、緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３バクテリオファージの個々の溶菌曲線を示す。図１１が示すように、ファージＦ９９／１０が緑膿菌１９９２／０５に感染する能力を、ＭＯＩ＝１で個別に試験した。最初の４時間以内に、生菌数は、対照細菌培養物と比較しておよそ５ｌｏｇ単位減少した。その後、細菌数は増加し始め、感染後８時間で、生菌数は２×１０６ｃｆｕ／ｍｌに達した。２４時間のインキュベーション後には、生菌数は対照細菌培養物と同様であった。これは、対照細菌培養物と比較して９２％の低減を示した。ファージに感染しにくい細菌の出現が、Ｆ９９／１０による宿主細胞の完全な排除を妨げた可能性がある。
【０２３１】
また図１１が示すように、ファージＦ２７／１２が緑膿菌１９９２／０５に感染する能力もＭＯＩ＝１で試験した。４時間の間、生菌数は対照細菌培養物と比較しておよそ６ｌｏｇ単位減少した。８時間のインキュベーション後、生菌数は２．５ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌに達した。２４時間のインキュベーション後、生菌数は、対照細菌培養物と同様の４．１ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌに達した。
【０２３２】
また図１１が示すように、ファージＦ９５／１３が緑膿菌１９９２／１５に感染する能力もＭＯＩ＝１で試験した。このバクテリオファージは、４時間の培養まで、およそ３ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌで生細胞を安定に維持することができた。ちょうど６時間のインキュベーションで、対照細菌培養物と比較しておよそ４ｌｏｇ単位の生菌数の有意な減少が観察された。８時間と２４時間の培養の間、生菌数は増加して、インキュベーション期間（２４時間）の終わりには８．５ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌに達した。
【０２３３】
個別にアッセイした場合に、インキュベーション期間の終わりにおける生細胞の増加が３つのバクテリオファージで観察され、おそらく、バクテリオファージに感染しにくい細菌の出現の結果であった。
【０２３４】
３つのバクテリオファージは、最初の８時間のインキュベーション中の変動で示されるように、緑膿菌１９９２／０５において明確に異なる挙動を示した。バクテリオファージＦ９９／１０は、最初に細菌負荷量を有意に低減させ、続いてＦ２７／１２であった。Ｐｓａ＿Ｆ９５／１３は、この宿主では、培養のさらに後に作用する傾向があった。これは、おそらくは、この特定宿主におけるそれらファージの生活環における違いを反映するものと思われる。
【０２３５】
図１２は、ＭＯＩ＝１０を用いて、緑膿菌Ｆ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＦ９５／１３バクテリオファージの個々の溶菌曲線を示す。図１２が示すように、１０に近いＭＯＩを用いた培養物が、ファージＦ９９／１０およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３に関して、１に等しいＭＯＩを用いた培養物と同様の傾向を示した。Ｆ２７／１２は、高いＭＯＩを用いると異なる挙動を示した。しかしながら、すべてが生菌数のより大きな減少を達成した。Ｆ９９／１０に関して、生細胞数の最大の減少は、３時間のインキュベーションで観察され、３ｘ１０１ｃｆｕ／ｍｌであり、対照細菌培養物と比較して６ｌｏｇ単位の減少であった。インキュベーション期間（２４時間）の終わりには、生菌数は６．５ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌであり、対照培養物と比較して６０．６％の減少であった。バクテリオファージＦ２７／１２は、ファージ接種後１時間で細菌数の有意な減少を示したが、細胞は急速に増殖し始め、ｃｆｕの最も著しい減少は６時間の培養でみられ、２．８ｘ１０２ｃｆｕ／ｍｌに達した。インキュベーションの終わりには、生菌数は５ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌであり、Ｆ９９／１０と比較して同様の減少であった。Ｐｓａ＿Ｆ９５／１３は、４時間の培養までは同様の挙動を示し、その後、９ｘ１０１ｃｆｕ／ｍｌに達するより顕著なｃｆｕの減少がみられ、対照培養物と比較して７ｌｏｇ単位の減少であった。培養（２４時間）の終わりには、細菌数の減少は、対照培養物と比較して８０．６％であった。
【０２３６】
図１３が示すように、およそ１０のＭＯＩを用いたその３つのバクテリオファージの組合せの溶菌活性を、ＰＳＡ  １９９２／０５に対して、最終の単一バクテリオファージカクテルにおいて一緒に試験した。バクテリオファージカクテルを、所定のＭＯＩで存在する各バクテリオファージを用いて生理食塩水中に調製した。生細胞数を１０倍段階希釈法により定量し、１時間間隔で８時間、ならびに再度２４時間目にモニタリングした。
【０２３７】
１０に近いＭＯＩを有するバクテリオファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３は、ほとんど６時間の培養の間、細菌数を有意に減少させることができた。その有意な減少は、カクテルの接種後２時間で観察されかつ８時間の培養まで見られ、その減少は８ｌｏｇ単位に達した（６時間の培養で、生細胞数は１ｘ１０１ｃｆｕ／ｍｌであった）。インキュベーション期間（２４時間）の終わりには、生菌数は８ｘ１０７ｃｆｕ／ｍｌであった。これは、対照細菌培養物と比較して、９９．２％の減少を表す。単一のバクテリオファージ培養物と比較して、ファージカクテルを用いた培養物で観察されるこの減少は、緑膿菌株に対する抗菌活性を高めかつバクテリオファージに対する細菌の耐性の出現の可能性を低減するために２つ以上のバクテリオファージを用いることの必要性を実証する。
【０２３８】
これらの結果は、異なるバクテリオファージをカクテルとして混合して、それらの特性を広げることができ、より大きな抗菌スペクトルをもたらすことも実証する（Loc-Carrillo C, et al, 2011, Bacteriophage 1 (2): 111-114）。
【０２３９】
齧歯動物モデル
緑膿菌株の毒性特徴のため、緑膿菌バクテリオファージＦ９９／１０、Ｆ２７／１２およびＰｓａ＿Ｆ９５／１３の組み合わせた抗菌活性を緑膿菌１９９２／０５株に対してｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。この目的のために２つの異なる感染モデルを確立した。
【０２４０】
感染およびバクテリオファージ処置−肺感染症モデル
感染後１２時間でかつ処置プロトコルの開始前に、細菌負荷量を、肺における実際のＭＯＩを計算する試みにおいて決定した。緑膿菌１９９２／０５に感染した２匹の動物の生細胞数の平均値は８．５ｘ１０５ｃｆｕ／ｇ肺組織であった。２匹の非感染１用量処置動物（処置対照群）も安楽死させ、ｐｆｕ定量のために肺を採取した。噴霧プロトコルは、平均値で７．５ｘ１０４ｐｆｕ／ｇを肺に送達したことが観察された。従って、以前の結果を考慮して、バクテリオファージカクテルでの処置の最初の投与で用いられるＭＯＩはおよそ０．１であると外挿された。このＭＯＩは、計画されたものよりも低かった。用いたカクテルは後で滴定され、各バクテリオファージの濃度はかなり高く、平均は６．３ｘ１０８ｐｆｕ／ｍｌであった。おそらく、システムのチューブに沿ったおよび噴霧チャンバ内での多量のファージ損失があった。
【０２４１】
微生物学的解析
感染後３４時間で、バクテリオファージカクテル処置の開始の２２時間後に、合計１７匹の動物を安楽死させた。感染群から４匹の動物、ファージ処置群から６匹の動物、抗生物質処置群から６匹の動物、および陰性対照群から１匹を屠殺し、ｃｆｕを決定するために肺を採取した。感染群の２匹のマウスは、感染後３０時間で死亡したことが分かった。死亡の原因は不明であった。
【０２４２】
図１６が示すように、感染群からの４匹の動物の肺のコロニー数を、ファージ処置群および抗生物質処置群からの６匹の動物のものと比較した。感染群のコロニー数をファージ処置群のものと比較した。ファージ処置群において、〜３ｌｏｇの減少（９９．８７％の減少）が観察された。それら２つの群間でコロニー数に統計的有意差があった（感染群：８．３２±０．１３  ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ）；ファージ処置群：３．４４±１．３６  ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ）；ｐ値＜０．０５）。感染群と抗生物質処置群に関して同じ解析を行った。抗生物質処置群において〜７ｌｏｇの減少（ほぼ１００％の減少）が観察された（図１２）。それら２つの群間でコロニー数に統計的有意差があった（感染群：８．３２±０．１３  ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ）；抗生物質処置群：３．２５±０．８６  ｌｏｇ（ｃｆｕ／ｇ）；ｐ値＜０．０５）。
【０２４３】
組織病理学的解析
感染後３４時間の実験の終わりに、陰性対照群の１匹のマウス、ならびに感染群、ファージ処置群および抗生物質処置群の３匹のマウスを安楽死させ、組織病理学的解析のために肺を採取した。
【０２４４】
図１７が示すように、陰性対照群からのマウスの肺組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色光顕微鏡写真の組織病理学的所見は、正常な気腔、間質および細気管支を示し；感染群は間質および細気管支周囲の炎症を有し；抗生物質処置群は同様の正常な気腔、間質および細気管支を示し；ファージ処置群は肺胞浮腫、間質および細気管支周囲の炎症、ならびに壊死を示す。炎症性細胞の浸潤および細菌が、感染動物およびファージ処置動物の両方の群でみられたが、原因不明の多巣性壊死がファージ処置動物で観察され、組織病理学的解析の全体の結果は結論に達しないものであった。
【０２４５】
感染およびバクテリオファージ処置−慢性創傷感染症モデル
図１８は、実験群の動物における平均スワブコロニー数を示す。ｔ０、ｔ１、およびｔ３に創傷をスワブし、細菌コロニー形成単位の数を感染群とファージ処置群との間で比較した。ビヒクル対照群動物は、アッセイ中に創傷における細菌増殖を示さなかった。
【０２４６】
処置の前（ｔ０）に、感染群、ファージ処置群およびビヒクル対照群における平均スワブコロニー数はそれぞれ、４．８７±１．２７  ｌｏｇ（ｃｆｕ／スワブ）、４．５３±０．８０  ｌｏｇ（ｃｆｕ／スワブ）、および０．００±０．０  ｌｏｇ（ｃｆｕ／スワブ）であった。感染群とファージ処置群との間に統計的有意差はなかった（ｐ＞０．０５）。導入療法後（ｔ１）、感染群とファージ処置群との間に細菌数の統計的有意差があった（感染群：４．９８±０．３５  ｌｏｇ（ｃｆｕ／スワブ）；ファージ処置群：３．４７±０．５３  ｌｏｇ（ｃｆｕ／スワブ）；ｐ＜０．０５）。処置開始後３日目（ｔ３）に、生細胞数の統計的有意差は感染群とファージ処置群との間で維持された（感染群：４．２３±１．４７  ｌｏｇ（ｃｆｕ／スワブ）；ファージ処置群：２．５５±１．３４  ｌｏｇ（ｃｆｕ／スワブ）；ｐ＜０．０５）。ビヒクル対照群動物はアッセイ中に創傷における細菌増殖を示さなかった。
【０２４７】
組織病理学的解析
図１９は、緑膿菌１９９２／０５感染、ファージ処置、およびビヒクルに曝したラットにおける皮膚創傷の代表的顕微鏡写真を示す。表皮間隙の長さおよび皮膚創傷の長さを描く。高倍率の肉芽組織は、異なる治癒段階における創傷を示す。
【０２４８】
組織学的研究の結果は、顕微鏡写真が、各実験群の１つだけの創傷を表すことを浮き彫りにする。新規な解析は、統計解析を可能にするようになされている。しかしながら、ビヒクル対照群のラットの創傷では炎症および組織形成がみられ、感染群のラットの創傷では主に組織形成がみられ、またファージ処置群のラットの創傷では、発毛と共に、組織の形成およびリモデリングがみられた。
【０２４９】
感染症の動物モデルに適用するためのバクテリオファージカクテルを得るために、新たに単離および特徴付されたクレブシエラ・ニューモニエＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージの溶菌活性を、クレブシエラ・ニューモニエ１２１／１５株の浮遊性培養物に対して評価した。以前決定した接種細菌を用いて、制御条件下で通常の溶菌曲線を作成した。およそ２ｘ１０６ｃｆｕ／ｍｌの接種細菌を用いて培養物を調製した。各バクテリオファージを個別におよび組み合わせて、およそ１０のＭＯＩを用いて試験して（図２０および２１）、瀬在的治療薬に関するそれらの有効性をスクリーニングした。生菌数を１時間間隔で８時間、ならびに再度２４時間目にモニタリングした。
【０２５０】
バクテリオファージＦ３９１／０８を１０に近いＭＯＩで個別に試験し、最初の３時間以内に、生菌数は、対照細菌培養物と比較しておよそ５ｌｏｇ単位減少した。その後、細菌は増加し始め、培養物の感染後８時間における生菌数は１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。２４時間のインキュベーション時に、生菌数は９．８ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。これは、個別にアッセイしたときに３つのバクテリオファージで観察され、おそらく、バクテリオファージが感染しにくい細菌の出現の結果であった。バクテリオファージＫｌｅ＿Ｆ９２／１５もクレブシエラ・ニューモニエ１２１／１５に対してＭＯＩ＝１で用い、３時間で生菌数は対照細菌培養物と比較しておよそ５ｌｏｇ単位減少した。８時間のインキュベーション時に、生菌数は１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであったが、インキュベーション期間（２４時間）の終わりには、生菌数は６．８ｘ１０９ｃｆｕ／ｍｌであり、Ｆ３９１／０８の値よりもわずかに低かった。Ｋｌｅ＿Ｆ１０５／１５バクテリオファージは、他の２つのファージよりも、株１２１／１５に対してより高い効果を示した。２時間での生菌数は対照細菌培養物と比較しておよそ５ｌｏｇ単位減少し、５．２ｘ１０２ｃｆｕ／ｍｌに達した。８時間のインキュベーション時に、生菌数は４．３ｘ１０５ｃｆｕ／ｍｌに増加した。２４時間の培養で、このファージは対照細菌培養物と比較して生細胞数の８０％の減少を達成することができた。培養においてバクテリオファージにより示される挙動の明らかな違いは、おそらくは、この株でのそれらファージの吸着率、潜伏期間および放出量（burst size）における違いを反映する。クレブシエラ・ニューモニエ１２１／１５と共に培養した３つのバクテリオファージＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５の組合せが、細菌増殖をより顕著に低減させることが期待され、それは観察された。１０に近いＭＯＩを有するバクテリオファージＦ３９１／０８、Ｋｌｅ＿Ｆ９２／１５およびＫｌｅ＿Ｆ１０５／１５は、早期に細菌を溶解し、対照細菌培養物と比較して〜６ｌｏｇ単位の減少（２ｘ１０２ｃｆｕ／ｍｌの生菌数）を達成した。生菌数は急速に増加し始めたが、８時間の培養時に、対照細菌培養物と比較して〜３ｌｏｇの減少であった。インキュベーション（２４時間）の終わりには、生細胞はかなり増加し、対照細菌培養物と比較してほんのわずかな減少（２９％）を示した。
【０２５１】
この研究の目的は、感染症の関連動物モデルに適用される、この細菌に対して広い活性を示すバクテリオファージを用いて、クレブシエラ・ニューモニエ株に対するバクテリオファージカクテルを作製することであった。
【０２５２】
前述の説明を読めば、当業者はいくつかの改変および改善を思い浮かべるであろう。すべてのそうした改変および改善は、簡潔さと読み易さのために本明細書において削除されているが、それらは当然に以下の特許請求の範囲の範囲内にあることを理解されたい。
【０２５３】
本明細書に引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
少なくとも２種の異なる精製バクテリオファージを含む医薬組成物であって、前記バクテリオファージの各々が、配列番号１（Ｆ９９／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２（Ｆ１１０／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３（Ｆ２７／１２）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４（Ｆ８３／１３）に対して少なくとも９５％の配列同一性、配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号６（Ｆ３９１／０８）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号７（Ｆ９２／１５）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号８（Ｆ１０５／１５）に対して少なくとも９９％の配列同一性、配列番号９（Ｆ１３４／１５）に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０（Ｆ１４１／１５）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、あるいはそれらのバリアントを含み、かつ緑膿菌および／またはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する、医薬組成物。
［実施態様２］
配列番号１（Ｆ９９／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３（Ｆ２７／１２）に対して少なくとも９７％の配列同一性、および配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、あるいはそれらのバリアントを含み、かつ緑膿菌に対する抗菌活性を有する３種のバクテリオファージを含む、実施態様１に記載の医薬組成物。
［実施態様３］
緑膿菌に対する抗菌活性を有する１種または２種以上の追加のバクテリオファージをさらに含む、実施態様２に記載の医薬組成物。
［実施態様４］
配列番号６（Ｆ３９１／０８）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号７（Ｆ９２／１５）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号８（Ｆ１０５／１５）に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、あるいはそれらのバリアントを含み、かつクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する３種のバクテリオファージを含む、実施態様１に記載の医薬組成物。
［実施態様５］
配列番号９（Ｆ１３４／１５）に対して少なくとも９８％の配列同一性または配列番号１０（Ｆ１４１／１５）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチドを有する核酸、あるいはそれらのバリアントを含み、かつクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有するバクテリオファージをさらに含む、実施態様４に記載の医薬組成物。
［実施態様６］
クレブシエラ・ニューモニエに対して有効な１種または２種以上の追加のバクテリオファージをさらに含む、実施態様５に記載の医薬組成物。
［実施態様７］
エアロゾルとして投与するために製剤化されている、実施態様１〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
［実施態様８］
他の治療薬と組み合わせて用いられる、実施態様１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
［実施態様９］
配列番号１（Ｆ９９／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号２（Ｆ１１０／１０）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号３（Ｆ２７／１２）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号４（Ｆ８３／１３）に対して少なくとも９５％の配列同一性、配列番号５（Ｆ９５／１３）に対して少なくとも９７％の配列同一性、配列番号７（Ｆ９２／１５）に対して少なくとも９０％の配列同一性、配列番号８（Ｆ１０５／１５）に対して少なくとも９９％の配列同一性、配列番号９（Ｆ１３４／１５）に対して少なくとも９８％の配列同一性、または配列番号１０（Ｆ１４１／１５）に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、あるいはそれらのバリアントを含み、かつ緑膿菌またはクレブシエラ・ニューモニエに対する抗菌活性を有する、精製バクテリオファージ。
［実施態様１０］
実施態様９に記載のバクテリオファージ、および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
［実施態様１１］
必要とする対象において細菌感染症を治療するまたはその発症を低減する方法であって、前記対象に治療または予防有効量の実施態様１〜８および１０のいずれかに記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
［実施態様１２］
必要とする対象において細菌感染症を治療するまたはその発症を低減するのに使用するための実施態様１〜８および１０のいずれかに記載の医薬組成物。
［実施態様１３］
前記細菌感染症が緑膿菌またはクレブシエラ・ニューモニエ細菌株により引き起こされる、実施態様１１に記載の方法または実施態様１２に記載の使用のための医薬組成物。
［実施態様１４］
前記細菌感染症が、呼吸器感染症、好ましくは、院内細菌性肺炎、または嚢胞性線維症に関連する感染症、または人工呼吸器関連肺炎である、実施態様１３に記載の方法または使用のための医薬組成物。
［実施態様１５］
前記組成物が該組成物の最初の投与の約４〜６時間後に再投与される、実施態様１１に記載の方法または実施態様１２に記載の使用のための医薬組成物。
［実施態様１６］
細菌感染症の原因物質を診断する方法であって、
（ｉ）患者からの組織試料を培養するステップ；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）の培養物を、実施態様９に記載のバクテリオファージと接触させるステップ；および
（ｉｉｉ）前記培養物の増殖または溶解の形跡をモニタリングするステップ；
を含み、前記培養物の溶解の形跡は、ステップ（ｉｉ）で用いられたバクテリオファージに感受性を有することが分かっている細菌株を前記培養物が含むことを示す、方法。
［実施態様１７］
前記組織試料が、前記患者の気道から採取した組織生検またはスワブである、実施態様１６に記載の方法。
［実施態様１８］
表面における細菌のコロニー形成または増殖を低減または阻害する方法であって、前記表面を実施態様９に記載のバクテリオファージと接触させることを含む、方法。
［実施態様１９］
前記表面は、哺乳動物の粘膜、好ましくはヒトの気道の粘膜である、実施態様１８に記載の方法。
［実施態様２０］
前記表面は、非生体表面、好ましくは病院の装置または病院設備の表面、より好ましくは手術用装置または手術用設備の表面である、実施態様１８に記載の方法。