【手続補正書】
【提出日】令和3年1月18日(2021.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、第１の鎖が前記所定の配列のヌクレオチドの組み込みによって伸長され、前記第１の鎖にハイブリダイズされた第２の鎖がヌクレオチドの組み込みによって伸長され、それによって前記第１の鎖の前記組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成し、
各サイクルが、前記所定の配列の前記ヌクレオチドを付着した可逆的ターミネーター基と一緒に組み込むことによって前記第１の鎖を伸長させ、続いて前記第２の鎖を伸長させることを含み、さらに
各サイクルにおいて、前記ヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドに組み込まれ、
各サイクルが、
（１）足場ポリヌクレオチドを提供することと、
（２）前記所定の配列のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記足場ポリヌクレオチドに組み込むことであって、前記ヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（３）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することと、
（４）連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが前記所定の配列の前記ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、前記所定の配列の前記ヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（５）工程（４）の後に前記所定の配列の前記ヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去するか、または、工程（２）の後かつ工程（３）の前か、もしくは、工程（３）の後かつ工程（４）の前に前記所定の配列の前記ヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、方法。
【請求項２】
工程（１）が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖がプライマー鎖部分を含み、前記支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含み、工程（３）が、前記足場ヌクレオチドを切断部位で切断することを含み、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含み、工程（４）において、前記連結ポリヌクレオチドが、次のサイクルで使用するための切断部位を定義するユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖を含み、前記連結ポリヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、
（１）合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、一本鎖切断によって分離されたプライマー鎖部分およびヘルパー鎖部分を含み、前記支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、
（２）前記所定の配列の１番目のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記合成鎖に組み込むことであって、前記１番目のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（３）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記合成鎖中に前記１番目のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
（４）二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、前記連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖に突出した前記１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを前記支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドを前記ヘルパー鎖中に含み、前記支持鎖の連結時に、前記１番目のヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（５）工程（４）の後かつ工程（６）の前か、工程（２）の後かつ工程（３）の前か、もしくは、工程（３）の後かつ工程（４）の前に前記１番目のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
（６）前記所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖に組み込むことであって、前記隣のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（７）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記合成鎖中に前記隣のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
（８）二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、前記連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖に突出した前記隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを前記支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドを前記ヘルパー鎖中に含み、前記支持鎖の連結時に、前記隣のヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（９）工程（８）の後かつ工程（１０）の前か、工程（６）の後かつ工程（７）の前か、もしくは、工程（７）の後かつ工程（８）の前に前記隣のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
（１０）工程６〜９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、（ａ）工程１および６における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程３および７における位置ｎとｎ−１との間で切断される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、（ａ）工程１および６における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において位置ｎに対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対して近位方向／前記プライマー鎖に対して遠位方向において位置ｎに対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程３および７における位置ｎとｎ−１との間で切断される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、（ａ）工程１および６における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、位置ｎ−２が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において位置ｎ−１に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程３および７における位置ｎ−１とｎ−２との間で切断される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
ａ）工程（１）／（６）において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記一本鎖切断に隣接する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され（位置ｎ）、
ｂ）工程（２）／（６）において、前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記１番目の／隣のヌクレオチドが前記ユニバーサルヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、前記支持鎖が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチド位置（位置ｎ）と、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチド位置の隣の前記ヌクレオチド（位置ｎ−１、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において）との間の位置で切断され、切断が、前記支持鎖に突出した前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を生成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、前記連結ポリヌクレオチドの連結末端が、一塩基突出を含み、
ｉ．前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ）、それと対合され、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドの隣に位置付けられ、
ｉｉｉ．前記支持鎖の前記末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）／（６）の前記１番目の／隣のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドである、請求項３または４に記載の方法。
【請求項８】
ａ）工程（１）において、前記足場ポリヌクレオチドが、工程（２）の前記１番目のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであるヌクレオチド（位置ｎ）を有する前記支持鎖中に提供され、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ＋１、前記ヘルパー鎖に対して近位方向／前記プライマー鎖に対して遠位方向において）、
ｂ）工程（２）／（６）において、前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記パートナーヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、前記支持鎖が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドから前記１番目のヌクレオチド（位置ｎ）と２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）との間の位置で切断され、切断が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、前記支持鎖に突出した前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が一塩基突出を含み、
ｉ．前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記最後から２番目のヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ＋１）、それと対合され、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ）、
ｉｉｉ．前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチド（位置ｎ）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程（６）において前記隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
ｉｖ．前記支持鎖の前記末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）の前記１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程（６）の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである、請求項３または５に記載の方法。
【請求項９】
ａ）工程（１）／（６）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記一本鎖切断に隣接する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され（位置ｎ）、
ｂ）工程（２）／（６）において、前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記１番目の／隣のヌクレオチドが前記ユニバーサルヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、前記支持鎖が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドからの前記１番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）と前記２番目のヌクレオチド（位置ｎ−２）との間の位置で切断され、切断が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、前記支持鎖に突出した前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
ｉ．前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ）、それと対合され、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ、
ｉｉｉ．前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）／（６）における前記１番目の／隣のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドである、請求項３または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記所定の配列の１番目の／隣のヌクレオチドと対合するヌクレオチドが、前記１番目の／隣のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（１）および／または（６）が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖がヘルパー鎖なしで提供される、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、またはすべての合成サイクルにおいて、前記二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後で、かつ前記所定のヌクレオチド配列の前記隣のヌクレオチドを前記足場ヌクレオチドの前記合成鎖に組み込む工程の前に、前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、よって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第２の工程と、を含み、任意選択的に、前記第１の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われ、および／または、前記第２の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ、任意選択的に、前記脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、請求項１〜４、７および１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含み、任意選択的に、前記酵素が、前記ユニバーサルヌクレオチドの隣にある前記ヌクレオチドの後の前記支持鎖を切断し、それによって前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記合成鎖中に前記突出末端を作成し、任意選択的に、前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、請求項１および１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（１）および／または（６）において、
ａ）前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続され、
ｂ）前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されており、
任意選択的に、前記連結ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、前記突出末端と反対側の末端で前記支持鎖と前記ヘルパー鎖とを接続するヘアピンループを含む単一分子として提供され、好ましくは、各合成サイクルの前記連結ポリヌクレオチドが、前記突出末端と反対側の末端で前記支持鎖と前記ヘルパー鎖とを接続するヘアピンループをそれぞれ含む単一分子として提供される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、共通の表面に、任意選択的に１つ以上の共有結合を介して、繋留されており、好ましくは、前記１つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と前記足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基であり、より好ましくは、前記共通の表面上の前記官能基がブロモアセチル基であり、任意選択的に前記ブロモアセチル基が、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記所定の配列のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する工程が、前記切断工程の前、または前記連結工程の前に行われる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われ、任意選択的に、前記微小流体システムがエレクトロウェッティングシステムであり、好ましくは、前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得るか、合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、好ましくはＰＣＲによって増幅される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５１３】
本明細書に引用されるすべての公報、特許、および特許出願は、それらの全体が参照に
より本明細書に組み込まれる。
また、本発明は以下を提供する。
［１］
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、第１の鎖が前記所定の配列のヌクレオチドの組み込みによって伸長され、前記第１の鎖にハイブリダイズされた第２の鎖がヌクレオチドの組み込みによって伸長され、それによって前記第１の鎖の前記組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する、方法。
［２］
各サイクルが、前記所定の配列の前記ヌクレオチドを付着した可逆的ブロッキング基と一緒に組み込むことによって前記第１の鎖を伸長させ、続いて前記第２の鎖を伸長させることを含み、前記可逆的ブロッキング基が、前記第２の鎖が伸長される前または後に除去される、［１］に記載の方法。
［３］
各サイクルにおいて、前記ヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドに組み込まれる、［１］または［２］に記載の方法。
［４］
各サイクルが、
（１）足場ポリヌクレオチドを提供することと、
（２）前記所定の配列のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記足場ポリヌクレオチドに組み込むことであって、前記ヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（３）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することと、
（４）連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが前記所定の配列の前記ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、前記所定の配列の前記ヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（５）前記所定の配列の前記ヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、［３］に記載の方法。
［５］
工程（１）が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖がプライマー鎖部分を含み、前記支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含み、工程（３）が、前記足場ヌクレオチドを切断部位で切断することを含み、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含み、工程（４）において、前記連結ポリヌクレオチドが、次のサイクルで使用するための切断部位を定義するユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖を含み、前記連結ポリヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖に連結される、［４］に記載の方法。
［６］
前記方法が、
（１）合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、一本鎖切断によって分離されたプライマー鎖部分およびヘルパー鎖部分を含み、前記支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、
（２）前記所定の配列の１番目のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記合成鎖に組み込むことであって、前記１番目のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（３）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記合成鎖中に前記１番目のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
（４）二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、前記連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖に突出した前記１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを前記支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドを前記ヘルパー鎖中に含み、前記支持鎖の連結時に、前記１番目のヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（５）前記１番目のヌクレオチドから前記ターミネーター基を除去することと、
（６）前記所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖に組み込むことであって、前記隣のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
（７）前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記合成鎖中に前記隣のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
（８）二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、前記連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖に突出した前記隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを前記支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドを前記ヘルパー鎖中に含み、前記支持鎖の連結時に、前記隣のヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
（９）前記隣のヌクレオチドから前記ターミネーター基を除去することと、
（１０）工程６〜９を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、［４］または［５］に記載の方法。
［７］
所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、（ａ）工程１および６における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程３および７における位置ｎとｎ−１との間で切断される、［５］または［６］に記載の方法。
［８］
所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、（ａ）工程１および６における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎ＋１を占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において位置ｎに対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、位置ｎ＋１が、前記ヘルパー鎖に対して近位方向／前記プライマー鎖に対して遠位方向において位置ｎに対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程３および７における位置ｎとｎ−１との間で切断される、［５］または［６］に記載の方法。
［９］
所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、（ａ）工程１および６における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ（ｂ）工程４および８における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置ｎを占め、位置ｎが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置ｎ−１が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、位置ｎ−２が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において位置ｎ−１に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程３および７における位置ｎ−１とｎ−２との間で切断される、［５］または［６］に記載の方法。
［１０］
ａ）工程（１）／（６）において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記一本鎖切断に隣接する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され（位置ｎ）、
ｂ）工程（２）／（６）において、前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記１番目の／隣のヌクレオチドが前記ユニバーサルヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、前記支持鎖が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチド位置（位置ｎ）と、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチド位置の隣の前記ヌクレオチド（位置ｎ−１、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において）との間の位置で切断され、切断が、前記支持鎖に突出した前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を生成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、前記連結ポリヌクレオチドの連結末端が、一塩基突出を含み、
ｉ．前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ）、それと対合され、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドの隣に位置付けられ、
ｉｉｉ．前記支持鎖の前記末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）／（６）の前記１番目の／隣のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドである、［６］または［７］に記載の方法。
［１１］
ａ）工程（１）において、前記足場ポリヌクレオチドが、工程（２）の前記１番目のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであるヌクレオチド（位置ｎ）を有する前記支持鎖中に提供され、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ＋１、前記ヘルパー鎖に対して近位方向／前記プライマー鎖に対して遠位方向において）、
ｂ）工程（２）／（６）において、前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記パートナーヌクレオチドと反対側の位置（位置ｎ）で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、前記支持鎖が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドから前記１番目のヌクレオチド（位置ｎ）と２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）との間の位置で切断され、切断が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、前記支持鎖に突出した前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が一塩基突出を含み、
ｉ．前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記最後から２番目のヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ＋１）、それと対合され、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ（位置ｎ）、
ｉｉｉ．前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチド（位置ｎ）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程（６）において前記隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
ｉｖ．前記支持鎖の前記末端ヌクレオチド（位置ｎ−１）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）の前記１番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程（６）の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである、［６］または［８］に記載の方法。
［１２］
ａ）工程（１）／（６）において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記一本鎖切断に隣接する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され（位置ｎ）、
ｂ）工程（２）／（６）において、前記１番目の／隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記１番目の／隣のヌクレオチドが前記ユニバーサルヌクレオチドと対合し、
ｃ）工程（３）／（７）において、前記支持鎖が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向／前記プライマー鎖に対して近位方向において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドからの前記１番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）と前記２番目のヌクレオチド（位置ｎ−２）との間の位置で切断され、切断が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、前記支持鎖に突出した前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、
ｄ）工程（４）／（８）において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
ｉ．前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ（位置ｎ）、それと対合され、
ｉｉ．前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ、
ｉｉｉ．前記支持鎖の前記最後から２番目のヌクレオチド（位置ｎ−１）が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程（２）／（６）における前記１番目の／隣のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドである、［６］または［９］に記載の方法。
［１３］
前記所定の配列の１番目の／隣のヌクレオチドと対合するヌクレオチドが、前記１番目の／隣のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドである、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の方法。
［１４］
工程（１）および／または（６）が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖がヘルパー鎖なしで提供される、［６］〜［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］
任意の１つ以上の合成サイクルにおいて、またはすべての合成サイクルにおいて、前記二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後で、かつ前記所定のヌクレオチド配列の前記隣のヌクレオチドを前記足場ヌクレオチドの前記合成鎖に組み込む工程の前に、前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、［６］〜［１４］のいずれか一項に記載の方法。
［１６］
前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、（ｉ）前記足場ポリヌクレオチドを約８０℃］〜［約９５℃の温度に加熱し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉ）前記足場ポリヌクレオチドを８Ｍ尿素などの尿素溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、（ｉｉｉ）１００％ホルムアミドなどのホルムアミドまたはホルムアミド溶液で前記足場ポリヌクレオチドを処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、または（ｉｖ）前記足場ポリヌクレオチドを、前記ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させ、それによって前記ヘルパー鎖部分と前記足場ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを競合的に阻害すること、によって前記足場ポリヌクレオチドから除去される、［１５］に記載の方法。
［１７］
各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、よって脱塩基部位を形成することを含む第１の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第２の工程と、を含む、［４］〜［７］、［１０］および［１３］〜［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［１８］
前記第１の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われる、［１７］に記載の方法。
［１９］
前記ヌクレオチド除去酵素が、３−メチルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ酵素である、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記ヌクレオチド除去酵素が、ヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）である、［１９］に記載の方法。
［２１］
前記第２の工程が、塩基である化学物質を用いて行われる、［１７］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
前記塩基が、ＮａＯＨである、［２１］に記載の方法。
［２３］
前記第２の工程が、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われる、［１７］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］
前記有機化学物質が、Ｎ，Ｎ’−ジメチルエチレンジアミンである、［２３］に記載の方法。
［２５］
前記第２の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われる、［１７］〜［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２６］
前記酵素が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩである、［２５］に記載の方法。
［２７］
前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、［４］および［１３］〜［１６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
前記酵素が、前記ユニバーサルヌクレオチドの隣にある前記ヌクレオチドの後の前記支持鎖を切断し、それによって前記１番目の／隣のヌクレオチドを含む前記合成鎖中に前記突出末端を作成する、［２７］に記載の方法。
［２９］
前記酵素がエンドヌクレアーゼＶである、［２８］に記載の方法。
［３０］
前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖がＤＮＡ鎖である、［１］〜［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
前記合成鎖および前記支持鎖がＤＮＡ鎖である、［５］〜［３０］のいずれか一項に記載の方法。
［３２］
組み込まれたヌクレオチドがｄＮＴＰである、［３０］または［３１］に記載の方法。
［３３］
組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰである、［３２］に記載の方法。
［３４］
可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’−Ｏ−アリル−ｄＮＴＰである、［３３］に記載の方法。
［３５］
可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの１つ以上が、３’−Ｏ−アジドメチル−ｄＮＴＰである、［３３］に記載の方法。
［３６］
前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの第１の鎖がＤＮＡ鎖であり、前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの第２の鎖がＲＮＡ鎖である、［１］〜［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３７］
前記合成鎖がＲＮＡ鎖であり、前記支持鎖がＤＮＡ鎖である、［１］〜［２９］および［３６］のいずれか一項に記載の方法。
［３８］
組み込まれたヌクレオチドがＮＴＰである、［３７］に記載の方法。
［３９］
組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰである、［３８］に記載の方法。
［４０］
可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’−Ｏ−アリル−ＮＴＰである、［３９］に記載の方法。
［４１］
可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、３’−Ｏ−アジドメチル−ＮＴＰである、［３９］に記載の方法。
［４２］
前記ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むｄＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＤＮＡポリメラーゼである、［１］〜［３５］のいずれか一項に記載の方法。
［４３］
前記ポリメラーゼが、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種９°Ｎ、好ましくは種９°Ｎ−７由来の天然ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、［４２］に記載の方法。
［４４］
前記ポリメラーゼが、Ｔ３またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ、任意選択的に、未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むＮＴＰを組み込む能力が増強された修飾ＲＮＡポリメラーゼである、［１］〜［２９］および［３６］〜［４１］のいずれか一項に記載の方法。
［４５］
前記１番目の／隣のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する工程が、トリス（カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いて行われる、［３］〜［４４］のいずれか一項に記載の方法。
［４６］
二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程が、リガーゼ酵素を用いて行われる、［３］〜［４５］のいずれか一項に記載の方法。
［４７］
前記リガーゼ酵素が、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼである、［４６］に記載の方法。
［４８］
工程（１）および／または（６）において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されている、［３］〜［４７］のいずれか一項に記載の方法。
［４９］
工程（１）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されている、［３］〜［４７］のいずれか一項に記載の方法。
［５０］
工程（１）および／または（６）において、
ａ）前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続され、
ｂ）前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されている、［３］〜［４７］のいずれか一項に記載の方法。
［５１］
前記連結ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、前記突出末端と反対側の末端で前記支持鎖と前記ヘルパー鎖とを接続するヘアピンループを含む単一分子として提供される、［３］〜［５０］のいずれか一項に記載の方法。
［５２］
各合成サイクルの前記連結ポリヌクレオチドが、前記突出末端と反対側の末端で前記支持鎖と前記ヘルパー鎖とを接続するヘアピンループをそれぞれ含む単一分子として提供される、［３］〜［５１］のいずれか一項に記載の方法。
［５３］
工程（１）において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが共通の表面に繋留されている、［３］〜［５２］のいずれか一項に記載の方法。
［５４］
前記プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがそれぞれ切断可能なリンカーを含み、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、［５３］に記載の方法。
［５５］
工程（１）において、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続され、前記ヘアピンループが表面に繋留されている、［３］〜［５２］のいずれか一項に記載の方法。
［５６］
前記ヘアピンループが切断可能なリンカーを介して表面に繋留され、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、［５５］に記載の方法。
［５７］
前記切断可能なリンカーがＵＶ切断可能なリンカーである、［５４］または［５６］に記載の方法。
［５８］
前記表面が微粒子である、［５３］〜［５７］のいずれか一項に記載の方法。
［５９］
前記表面が平坦な表面である、［５３］〜［５７］のいずれか一項に記載の方法。
［６０］
前記表面がゲルを含む、［５９］に記載の方法。
［６１］
前記表面が、約２％のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくは前記ポリアクリルアミド表面がガラスなどの固体支持体に結合されている、［６０］に記載の方法。
［６２］
前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、１つ以上の共有結合を介して前記共通の表面に繋留されている、［５３］〜［６１］のいずれか一項に記載の方法。
［６３］
前記１つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と前記足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基である、［６２］に記載の方法。
［６４］
前記共通の表面上の前記官能基がブロモアセチル基であり、任意選択的に前記ブロモアセチル基が、Ｎ−（５−ブロモアセトアミジルペンチル）アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、［６３］に記載の方法。
［６５］
前記所定の配列のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する工程が、前記切断工程の前、または前記連結工程の前に行われる、［３］〜［５９］のいずれか一項に記載の方法。
［６６］
合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われる、［１］〜［６５］のいずれか一項に記載の方法。
［６７］
前記微小流体システムがエレクトロウェッティングシステムである、［６６］に記載の方法。
［６８］
前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、［６６］に記載の方法。
［６９］
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得る、［１］〜［６８］のいずれか一項に記載の方法。
［７０］
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、好ましくはＰＣＲによって増幅される、［１］〜［６９］のいずれか一項に記載の方法。
［７１］
所定の配列を有するポリヌクレオチドを構築する方法であって、所定の配列を有する第１のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する１つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために［１］〜［７０］のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法。
［７２］
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが二本鎖である、［７１］に記載の方法。
［７３］
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが一本鎖である、［７１］に記載の方法。
［７４］
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、連結によって一緒に接合される、［７１］〜［７３］のいずれか一項に記載の方法。
［７５］
前記第１のポリヌクレオチドおよび前記１つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、［７４］に記載の方法。
［７６］
前記合成および／または構築工程が、微小流体システム内の液滴中で行われる、［６８］〜［７５］のいずれか一項に記載の方法。
［７７］
前記構築工程が、所定の配列を有する第１の合成ポリヌクレオチドを含む第１の液滴と、所定の配列を有する追加の１つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第２の液滴とを提供することを含み、前記液滴が互いに接触し、前記合成ポリヌクレオチドが一緒に接合され、それによって前記第１のポリヌクレオチドおよび前記追加の１つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを構築する、［７６］に記載の方法。
［７８］
前記合成工程が、複数の液滴を提供することであって、各液滴が前記合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、提供することと、前記合成サイクルの前記工程に従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を順次送達することと、によって行われる、［７７］に記載の方法。
［７９］
液滴の送達後かつ次の液滴の送達の前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程が実施される、［７８］に記載の方法。
［８０］
前記微小流体システムがエレクトロウェッティングシステムである、［７８］および［７９］に記載の方法。
［８１］
前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム（ＥＷＯＤ）である、［８０］に記載の方法。
［８２］
合成工程および構築工程が、同じシステム内で行われる、［７８］〜［８１］のいずれか一項に記載の方法。
［８３］
［１］〜［７６］および［７８］〜［８２］のいずれか一項に記載の方法を実施するためのポリヌクレオチド合成システムであって、（ａ）反応領域のアレイであって、各反応領域が少なくとも１つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイと、（ｂ）前記反応試薬を前記反応領域に送達するための手段と、任意選択的に（ｃ）前記足場ポリヌクレオチドからの前記合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段と、を含む、ポリヌクレオチド合成システム。
［８４］
前記反応試薬を液滴で提供するための手段と、前記合成サイクルに従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を送達するための手段とをさらに含む、［８３］に記載のシステム。
［８５］
［８３または８４］に記載のシステムと共に使用され、［１］〜［７５］のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、前記合成サイクルの前記工程に対応する反応試薬の容量を含む、キット。
［８６］
ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法であって、前記マイクロアレイが複数の反応領域を含み、各領域が所定の配列を有する１つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記方法が、
ａ）複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が１つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
ｂ）各反応領域で［１］〜［６８］のいずれか一項に記載の方法に従って合成サイクルを行い、それによって各領域で所定の配列を有する１つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを合成することと、を含む、方法。
［８７］
合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、各領域が所定の配列を有する１つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含むマイクロアレイを提供する、［８６］に記載の方法。
［８８］
配列番号１〜６７のいずれか１つに定義されるような配列を有するポリヌクレオチド分子を含むヌクレオチド分子構築物。
［８９］
配列番号１〜６７のいずれか１つに定義されるような配列を有するポリヌクレオチド分子を含むヌクレオチド分子構築物であって、配列番号１〜６７のいずれか１つに定義されるような各ポリヌクレオチド配列が、存在する場合、図に示されるそれぞれの修飾（複数可）によって修飾される、ヌクレオチド分子構築物。