【手続補正書】
【提出日】令和3年4月12日(2021.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも７５％の不活性なブタ内在性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）要素を有するブタ細胞を含む、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）不活化ブタを生成する方法であって、：
ｉ．核を有するブタ核ドナー細胞を得ることであって、ここで、前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であり、ここで、前記核ドナー細胞は、体細胞、胎児細胞、生殖系列細胞、幹細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択されること；
ｉｉ．核移植卵母細胞を生成するため、前記核ドナー細胞の前記核をレシピエント除核卵母細胞にトランスファーすること；
ｉｉｉ．胚盤胞又は胚を生成するため、前記核移植卵母細胞を培養すること；
ｉｖ．前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること；及び
ｖ．前記胚盤胞又は胚から生きたＰＥＲＶ不活化ブタを生成すること；
を含む方法。
【請求項２】
ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）不活化ブタを生成する方法であって、：
ｉ．胚盤胞又は胚を生成するため核ドナー細胞の核を使用することであって、前記核ドナー細胞におけるＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること；及び
ｉｉ．ＰＥＲＶ不活化ブタを作成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること；
を含む方法。
【請求項３】
核ドナー細胞が胎児細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核ドナー細胞は、キメラＰＥＲＶ不活化胎児から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児は、妊娠約９ヶ月未満で単離される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児はゲノム改変剤を使用して生成される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ゲノム改変剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、デアミナーゼ、及びクラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）会合ヌクレアーゼもしくはニッカーゼからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核ドナー細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３０未満の集団倍加を受ける、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ブタドナー細胞が、生後１０週未満のブタから単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＥＲＶ不活化ブタが、妊娠後少なくとも１ヶ月間、同じ又は同様のレベルのＰＥＲＶ不活化を維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの野生型胚盤胞又は胚を前記サロゲートにトランスファーすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法によって生成された単離されたブタ細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法により生成された細胞から得られた器官又は組織。
【請求項１５】
前記ブタ核ドナー細胞がブタ胎児線維芽細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ブタ核ドナー細胞が成体細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
成体細胞が成体耳線維芽細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ブタ核ドナー細胞がＹｕｃａｔａｎブタから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ブタ核ドナー細胞がＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の転写または翻訳の破壊によって不活化される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の転写または翻訳の破壊が、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の欠失を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
約１５０ｂｐを超えるＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の欠失を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子は、クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ベースの作用物質を使用して破壊される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質がＣａｓタンパク質を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質が、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質が少なくとも４つのｇＲＮＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記胚盤胞または胚がＰＥＲＶ再感染に耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記核ドナー細胞のゲノムがＣａｓ９タンパク質をコードしない、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記器官又は組織が、肝臓、肺、心臓、脳、膵臓、筋肉、血液、骨、精巣、及び卵巣からなる群から選択される、請求項１４に記載の器官又は組織。
【請求項３０】
ＰＥＲＶの複製および／またはアセンブリに関与する遺伝子に特異的なゲノム修飾剤を細胞に投与すること、及びオプションで、ｐ５３阻害剤を細胞に投与することにより、前記ブタ細胞のＰＥＲＶ要素を不活性化することによって、ブタ核ドナー細胞が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ＰＥＲＶの複製および／またはアセンブリに関与する遺伝子に特異的なゲノム修飾剤を細胞に投与すること、及びオプションで、成長因子を細胞に投与することにより、前記ブタ細胞のＰＥＲＶ要素を不活性化することによって、ブタ核ドナー細胞が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
オプションで、ｐ５３阻害剤と成長因子を前記核ドナー細胞に投与する前に、ＰＥＲＶの複製及び／又はアセンブリに関与する遺伝子に特異的なゲノム修飾剤を細胞に投与することによって、前記ブタ核ドナー細胞が得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
成長因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｐ５３阻害剤は、ピフィスリン−アルファ、ピフィスリン−ベータ、ピフィスリン−アルファ臭化水素酸塩、ピフィスリン−ミュー、エリプチシン、９−ヒドロキシエリプチシン、ヌトリン−３、ロスコビチン、およびＳＪ  １７２５５０からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ゲノム修飾剤は、配列番号１〜３または２６〜１８１のいずれか１つのヌクレオチド配列、それらのいずれの株特異的遺伝子変異体、またはそれらのいずれの組み合わせを含むＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ゲノム修飾剤は、配列番号１〜３または２６〜１１６のいずれか１つのヌクレオチド配列、それらのいずれの株特異的遺伝子変異体、またはそれらのいずれの組み合わせを含むＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡである、請求項３０に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】図１Ａは、感染したヒト細胞のＰＥＲＶコピー数が時間とともに増加することを示している。ヒトＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞は、同等数のブタＰＫ１５細胞と１週間、共培養した。前記ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ単一細胞は、ＧＦＰシグナルに基づいたフローサイトメトリーによって分離され、その後クローンに成長した。前記ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンを分離し、且つ、７０、８７、１３２日間培養した。ＰＥＲＶ  ｐｏｌプライマーを使用したｄｄＰＣＲにより、ＰＥＲＶコピー数を分析した。ＰＫ１５細胞のいずれの接触なしのＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰをコントロールとして使用した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、高度に感染したｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンのＰＥＲＶ挿入部位を示す。逆ＰＣＲにより検出された前記２２のＰＥＲＶ挿入部位のうち、１５が遺伝子内領域にマッピングされた。遺伝子内ヒットの一部がテストされた。１２個中７個がジャンクションＰＣＲにより検証され、且つ表示されている。３０ｂｐヒトゲノム配列が実線の下線付きで示されている一方、ＰＥＲＶ  ＬＴＲは二重下線で示されている。ゲノム配列はＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒにアラインされ、且つ対応する遺伝子がリストされる。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒトからヒトへのＰＥＲＶ伝達を調べるために使用される実験計画の簡略図を示す。ＧＦＰで標識されたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ）に感染したＰＥＲＶを、非標識ＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）と１４日間、共培養した。ＨＥＫ２９３Ｔクローンを共培養から分離し、且つ、ゲノムＤＮＡを抽出して、ＨＥＫ２９３Ｔクローンがｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞由来のＰＥＲＶに感染しているかどうかを判定した。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヒトからヒトへのＰＥＲＶ伝達の検出を示す。ＨＥＫ２９３Ｔの個々のクローンは、フローサイトメトリーによるｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰとＨＥＫ２９３Ｔとの共培養から分離された単一細胞から増殖した。ＰＣＲゲル画像は、ランダムにテストされた４つのＨＥＫ２９３Ｔクローンのうち３つがＰＥＲＶ配列を含んでいたが（ＰＥＲＶ  ｐｏｌ、ｅｎｖ、及びｇａｇ）、ＧＦＰ又はブタゲノムＤＮＡの配列を含んでいなかったことを示す（ブタ固有のＧＧＴＡでテスト済み）。サンプルの順番は次のとおり。：  １）ＨＥＫ２９３Ｔクローン１；  ２）ＨＥＫ２９３Ｔクローン２；  ３）ＨＥＫ２９３Ｔクローン３；  ４）ＨＥＫ２９３Ｔクローン４；  ５）ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰコントロール；  ６）ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ；  ７）ＰＫ１５  ＷＴ；及び８）ネガティブコントロール。
【図１Ｅ】図１Ｅは、異なるｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンが異なる感染力を持っていることを示す。ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰとＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔとの共培養からの感染したＨＥＫ２９３Ｔクローンの割合は、２０％から９７％まで変化した。割合は、培養中のｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンのＰＥＲＶコピー数に対応する。４つの親ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンのＰＥＲＶコピー数は、それぞれ、１５、２８、２７及び２８である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＰＥＲＶ挿入部位の染色体マッピングを示す。染色体上のＰＥＲＶ統合部位は、ハイブリダイゼーションキャプチャ及びロングリードＰａｃｂｉｏシーケンシングを使用して、ＷＴ  ＦＦＦ３細胞株で検出された。灰色のバーは染色体の足場(scaffolds)を表す。矢印（上向き）は、前方又はプラスの染色体鎖のＰＥＲＶを表す。矢印（下向き）は、リバースストランド又はマイナスストランドのＰＥＲＶを表す。
【図２Ｂ−Ｃ】図２Ｂは、高度に修飾されたＦＦＦ３クローンの生存率をグラフ化したものである。ＦＦＦ３中のＰＥＲＶをターゲットにした後、単一細胞をソートし、すぐに遺伝子型を決定した。単一細胞間でのＰＥＲＶターゲティング周波数のバイモーダル分布が観察された（上のパネル）。１００％ＰＥＲＶを含まないＦＦＦ３細胞は、直接遺伝子型決定された単一細胞の中に存在していた。ただし、このパターンは単一細胞の増殖後に変化した（下のパネル）。単一細胞クローンの中で、効率の低いもの（≦３９％、集団の平均ターゲティング効率は３７％であった）のみが得られ、且つ、ＰＥＲＶが１００％根絶されなかったいくつかのＦＦＦ３クローンの持続性が観察された（下のパネル）。  図２Ｃは、ＰＦＴα及びｂＦＧＦによる処理が高度に修飾されたＦＦＦ３クローンの成長を維持することを示す。ｐ５３の阻害剤と成長因子との併用により、高度に編集された細胞が救出される。ＦＦＦ３の集団は、遺伝子編集実験中にＰＦＴα及びｂＦＧＦで処理された。；次に、単一細胞を直接遺伝子型決定のため及びコロニー成長のためにソートし、その後遺伝子型決定を行った。単一細胞と拡大クローンの両方が、ＰＥＲＶターゲティング効率で同様の二峰性分布を示し、且つ高度に修飾されたクローンがこの条件下で生き残った。
【図２Ｄ−Ｅ】図２Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９処理後のＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子座の１００％ＰＥＲＶを含まないクローンの１つのハプロタイプを示す。ＰＦＴα及びｂＦＧＦで処理されたＦＦＦ３集団から、いくつかの１００％ＰＥＲＶを含まないクローンが達成された。ｙ軸は、編集されたＰＥＲＶ遺伝子座を示す。ｘ軸は、ＰＥＲＶ遺伝子座内のインデルの相対位置を示す。ＰＥＲＶｐｏｌシーケンス内の整列されたインデルイベントは、赤で表される。紫色の色合いは、ＰＥＲＶの異なるハプロタイプを示す。  図２Ｅは、１００％のＰＥＲＶ改変クローンではＰＥＲＶ産生が排除されることを示す。細胞培養上清に存在するＰＥＲＶ粒子の逆転写酵素（ＲＴ）活性は、逆転写アッセイにより検出された。その結果、１００％ＰＥＲＶを含まないクローン上清ではＰＥＲＶ産生が見られなかったのに対し、ＷＴ  ＦＦＦ３細胞の上清では顕著なＲＴ活性が示された。サンプルの順序は左から右である。：  ２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；ＲＴ＋（市販の逆転写酵素（ＲＴ）を使用）；ＲＴ−（ＲＴ酵素なし）；ＲＴ＋／ＦＦ  ＷＴ（市販のＲＴ酵素プラスＷＴ  ３ＦＦＦ溶解（３ＦＦＦ培地からのウイルスペレットの溶解）；１００％ＦＦＦ３（１００％ＰＥＲＶ不活化ＦＦＦ３クローン溶解）；ＷＴ  ＦＦ（ＷＴ  ３ＦＦＦ溶解）；ｎｅｇ（溶解なし又はＲＴ酵素、ＲＮＡテンプレートなし）。
【図３Ａ】図３Ａは、１００％ＰＥＲＶを含まないＰＦＦＦ３からクローン化されたブタ胚盤胞を示す。７日目ＰＥＲＶを含まないブタ胚盤胞は、ＳＯＸ２（内部細胞塊）、ＤＡＰＩ（核）、及びファロイジン（細胞境界）で染色された。レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、染色された胚盤胞を画像化した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、１００％ＰＥＲＶを含まないＰＦＦＦ３からクローン化された胎児のＰＥＲＶターゲティング効率を示している。ｙ軸は、編集されたＰＥＲＶ遺伝子座を示す。ｘ軸は、ＰＥＲＶ遺伝子座内のインデルの相対位置を示す。ＰＥＲＶ  ｐｏｌシーケンス内の整列されたインデルイベントは、赤で表される。紫色の色合いは、異なるＰＥＲＶハプロタイプを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｉＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰの選択されたクローンのＰＥＲＶコピー数を示している。ＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔ（非ＧＦＰ）細胞を、同等数のＰＥＲＶ感染ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ（ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ）クローン１０の細胞と２週間、共培養した。ＧＦＰネガティブ単一ヒト細胞は、ＧＦＰシグナルに基づいたフローサイトメトリーにより分離された。単一細胞コロニーが成長した後、ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローン１０  ＰＥＲＶコピー数を標準マーカーとして使用して、ＧＦＰネガティブクローンのＰＥＲＶ要素を検出及び定量するために、ｑＰＣＲを介してゲノムＤＮＡを増幅した（クローン１０のＰＥＲＶコピー数は、共培養実験の前にｄｄＰＣＲで検出された）。ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローン１０からＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔヒト細胞へのＰＥＲＶ伝達はＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子のｑＰＣＲによって検出され、且つ、異なるＷＴ  ＨＥＫ２９３ＴクローンはＰＥＲＶの異なるコピー数を示した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、開いたクロマチン及び転写活性領域にＰＥＲＶが優先的に挿入されることを示す。遺伝子発現レベル、ＤＮａｓｅシグナル、及びＰＥＲＶ挿入部位周辺の領域と残りの接合部との間のＨ３Ｋ２７Ａｃシグナルを測定し、且つ比較した。ＰＥＲＶ挿入部位の転写、ＤＮａｓｅシグナル、及びＨ３Ｋ２７Ａｃレベルの増加が観察された。
【図５Ａ】図５Ａは、ＤＮＡ損傷効果のモジュレーターの効果を示すグラフである。ＦＦＦ３細胞をｂＦＧＦ、ＰＦＴａ、及びｂＦＧＦ＋ＰＦＴａで処理した。ｂＦＧＦとＰＦＴａの両方で処理しただけではＰＥＲＶ編集効率は向上しなかったが、ｂＦＧＦとＰＦＴａのカクテルで処理するとターゲティング頻度が大幅に向上し（ｐ値＝０．００１６）、ｂＦＧＦとＰＦＴａとの間に相乗効果があることが実証された。
【図５Ｂ】図５Ｂは、経時的なＦＦＦ３−＃５の集団に対するＰＦＴ−ａとｂＦＧＦとのカクテルによる処置の効果を示すグラフである（Ｄ＝日数）。結果は持続的な高いＰＥＲＶターゲティング効率を示した一方、前記カクテルで処理されなかったＦＦＦ３−＃４の集団はＰＥＲＶ編集効率の減少したパターンを示した。（ＡＮＯＶＡ、日（ｐ値＝０．２３）、ＰＦＴａ／ｂＦＧＦ処置（ｐ値＝０．００００２））。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＦＦＦ３細胞に対するｂｃｌ−２による７日間の処置の効果を示すグラフである。Ｂｃｌ−２の異なる投与量を用いた処置の間で有意差（ｐ値＝０．５６５）は検出されなかった。Ｂｃｌ−２の用量依存性細胞毒性も実験中に観察された。
【図６Ａ】図６Ａは、ＦＦＦ３集団におけるＰＥＲＶのターゲティング効率に対するラージＴ抗原(large  T  antigen)の効果を示すグラフである（ｐ値＝０．０５、ウィルコクソン検定（片側））。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＥＲＶ編集効率を分析するために使用されるソートされた単一細胞から成長したクローンに対するラージＴ抗原の効果を示す表である。ラージＴ抗原処理は、未処理のグループと比較して、ＰＥＲＶ−ｋｏクローンの比率がそれぞれ８０％及び９０％増加し、それぞれ３．７５倍及び５．０６倍になった。
【図７】図７は、１００％ＰＥＲＶを含まないＰＦＦＦ３の転写プロファイルを示す。ＲＮＡｓｅｑを使用して、ｐｏｌ遺伝子のＰＥＲＶの不活性化を分析した。ｙ軸はサイトを示す。Ｘ軸は、ＰＥＲＶ遺伝子座内のインデルの相対位置を示す。ＰＥＲＶ  ｐｏｌシーケンスの整列されたインデルイベントが赤色で表される。
【図８】図８は、ＦＦ３ＣＦのＰＥＲＶジャンクションを検出するために使用されるプライマーを示す。
【図９】図９は、ＰＥＲＶフリーＦＦＦ３で生まれた１匹の子豚のＰＥＲＶターゲティング効率を示している。ｙ軸は、編集されたＰＥＲＶ遺伝子座を示す。ｘ軸は、ＰＥＲＶ遺伝子座内のインデルの相対位置を示す。ＰＥＲＶｐｏｌシーケンス内の整列されたインデルイベントは、赤で表される。紫色の濃淡は、異なるＰＥＲＶのハプロタイプを示している。ブタの遺伝子型は、ＰＥＲＶの２５コピーすべてが機能的に変異していることを示した。
【図１０】図１０は、ＰＥＲＶフリーＦＦＦ３で生まれた９匹の子豚のＰＥＲＶターゲティング効率を示している。「＃１」子豚（左に６本のバー）と「＃２」子豚（右に３本のバー）は、２つの異なるＰＥＲＶフリーＦＦＦ３クローンを示す。
【図１１】図１１は、ブタＰＫ１５及びＰＫ１５と共培養されたヒトＨＥＫ２９３Ｔ（ｉＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ）のＰＥＲＶコピー数を示す。  Ａ）  ＰＫ１５細胞株のＰＥＲＶ  ｅｎｖ  Ａ、Ｂ、Ｃのコピー数。ＰＫ１５細胞において、ＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂは検出されたが、ＰＥＲＶ−Ｃは検出されなかった。ＰＥＲＶ−Ａのコピー数は、ＰＥＲＶ−Ｂの約２倍である。各２Ｄ増幅プロットにおいて、黒いドット（左下象限）は増幅なしの液滴を表し、緑（右下象限）はＧＡＰＤＨ（参照遺伝子）を含有する液滴を表し、青（左上象限）はサブタイプＡ、Ｂ又はCからのＰＥＲＶ  ｅｎｖを含有する液滴を表し、オレンジ（右上の象限）は、ＧＡＰＤＨ及びＰＥＲＶ  ｅｎｖを含有する液滴を表す。ＧＡＰＤＨと比較して測定したＰＥＲＶサブタイプＡ、Ｂ、及びＣのコピー数は、各プロットの下に表示される。  Ｂ）  ＰＫ１５はＰＥＲＶをＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰヒト細胞に伝達し、且つＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰのＰＥＲＶコピー数は時間とともに増加する。ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞を同等数のＰＫ１５細胞と共培養した。ヒト細胞集団は、ＧＦＰ発現に基づいてソートする順次ラウンド(sequential  rounds)により分離された。精製したヒト細胞を３つの時点で収集した。そして、ヒト細胞内のＰＥＲＶ要素を検出及び定量するため、ゲノムＤＮＡを収集し且つｄｄＰＣＲにより増幅した。ブタＰＫ１５からヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＰＥＲＶ伝達は、ＰＥＲＶ  ｅｎｖ遺伝子のｄｄＰＣＲによって検出された。ＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂは、ＰＫ１５との接触の履歴があるＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出されたが、ＰＥＲＶ−Ｃは検出されなかった。そしてＰＥＲＫコピー数はＨＥＫ２９３Ｔ細胞において経時的に増加した。
【図１２】図１２は、ＦＦＦ３におけるＰＥＲＶサブタイプコピー数の検証を示す。ＷＴブタ初代胎児線維芽細胞株（ＦＦＦ３）のＰＥＲＶコピー数は、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の両方のｄｄＰＣＲによって検出された。ｐｏｌ遺伝子によって決定されるＰＥＲＶコピー数（２５）は、ｅｎｖ遺伝子によって検出されるもの（２４）と類似している。
【図１３】図１３は、ブタゲノム内のＰＥＲＶの位置を検出するプロセスを説明する概略図を示している。ＰＥＲＶの位置をマッピングするために、ＰＥＲＶ固有のハイブリダイゼーションキャプチャの後にＰａｃＢｉｏロングリードゲノムシーケンス（Ｎ５０＝２，４３９ｂｐ、以下で説明）を実行した。そしてゲノムの非反復領域においてＰＥＲＶの２１コピーをマッピングした。
【図１４】図１４は、ｐｏｌを標的とするｇＲＮＡの設計プロセスを説明する概略図を示す。
【図１５】図１５Ａは、ブタのクローニングに使用されたＰＥＲＶを含まないクローンの代表的な核型を示している。核型分析を使用して異なるクローンを分析した。５つは異常な核型を示し、３つは正常を示した。３つの異常な核型の例。注目すべきは、転座（色のペアで示される）又は挿入又は削除を伴うすべての染色体には、１つの場合（ｔ（１０，１２）の転座ペアの染色体１０、上のパネル）を除いてＰＥＲＶが含まれる。    図１５Ｂは、代表的な正常な核型を示している。このＰＥＲＶを含まないクローンは、完全に正常な核型を示している。
【図１６】図１６Ａは、ＰＥＲＶ−ＫＯ胎児の代表的な画像を示している。合計６頭の生きた胎児（２頭のＷＴ及び４頭のＰＥＲＶを含まない胎児）が３頭のサロゲート(sarrogate)繁殖用雌豚(sows)から達成された。この写真は、妊娠（pregnancy）５０日目に１頭のサロゲート繁殖用雌豚から達成された３つの生きたＰＥＲＶフリー胎児を示していた。    図１６Ｂは、胎児のゲノムＤＮＡにおけるＰＥＲＶの不活性化効率を示している。胎児ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＥＲＶ不活化効率を測定した。由来するＰＥＲＶフリー細胞株と同様に、ＰＥＲＶ−ＫＯ胎児も〜１００％ＰＥＲＶ不活化効率を示した。これは、妊娠中にサロゲート繁殖用雌豚からの再感染が発生しなかったことを示唆している。
【図１７】図１７Ａは、ＰＥＲＶを含まないブタの画像を示している。この写真は、出生後２日目に最初に生まれたブタ（Ｌａｉｋａ）を示している。    図１７Ｂは、ブタのゲノムＤＮＡにおけるＰＥＲＶ不活性化を示している。ＰＥＲＶ−ＫＯブタは、ＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子座のディープシーケンシングにより、さまざまな年齢で遺伝子型を特定した。調べたブタはすべて、ＰＥＲＶの不活化効率が１００％を示した。これは、サロゲート繁殖用雌豚からクローンブタへのＰＥＲＶの再感染は検出されないことを実証している。    図１７Ｃは、ｍＲＮＡレベルでのＰＥＲＶ不活性化を示している。全ｍＲＮＡ生成ｃＤＮＡを使用して、ＰＥＲＶ−ＫＯブタ転写物のＰＥＲＶ不活性化効率を検出した。すべてのブタは、ｍＲＮＡレベルで〜１００％のＰＥＲＶ根絶効率を示した。
【図１８】図１８は、３０ｄ  ＰＥＲＶを含まないブタに由来する単一細胞のＰＥＲＶ不活性化効率を示している。３０ｄ  Ｈ９ｐ０１  ＰＥＲＶフリー豚由来の細胞を単一細胞に分類した。そして、ＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子断片を、単一細胞のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用したディープシーケンスにより遺伝子型を特定した。すべての単一細胞は１００％のＰＥＲＶ不活性化を示した。
【図１９】図１９は、ＰＥＲＶを含まないブタ及びＷＴ  ＦＦＦ３線維芽細胞のＰＥＲＶコピー数を示す。ＰＥＲＶを含まないブタのゲノムＤＮＡ及びＷＴ  ＦＦＦ３線維芽細胞を使用して、ｄｄＰＣＲによりＰＥＲＶコピー数を測定した。すべてのＰＥＲＶを含まないブタは、ＷＴ  ＦＦＦ３線維芽細胞と同様のＰＥＲＶコピー数を示した。
【図２０】図２０は、すべてのＰＥＲＶ非含有ブタの核型代表を示す。すべてのＰＥＲＶを含まないブタは、正常な核型を示した。
【図２１】図２１は、本明細書に記載の一実施形態に係る細胞株の構築ストラテジーの概略図を示す。
【図２２】図２２は、本明細書に記載の一実施形態による細胞品質管理戦略の概略図を示す。
【図２３】図２３は、本明細書に記載の一実施形態によるＳＣＮＴクローニング手順の概略図を示す。
【図２４】図２４は、本明細書に記載の一実施形態による、細胞生存条件を改善するための方法の概略図を示す。簡単に言えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養時間ウィンドウを短縮するために、単一細胞のクローニングプロセスはスキップされる。細胞成長時間を短縮するため、ＳＣＮＴのための単一細胞クローンの代わりに選択された細胞集団が使用される。そして、繁殖用雌豚自体が胎児の発育に最適な遺伝子改変を行った胚を選択する。
【図２５】図２５は、本明細書に記載の一実施形態による、細胞生存率条件を改善する方法の概略図を示す。簡単に言えば、細胞へのストレスを軽減するために、細胞の代わりにマイクロインジェクションによって接合体に対して修飾が行われる。
【図２６】図２６は、本明細書に記載の実施形態による、細胞生存条件を改善する方法の概略図を示す。簡単に説明すると、線維芽細胞は３０日目の胎児から分離され、ＳＣＮＴによる再クローン化に使用される。
【図２７】図２７は、ＰＥＲＶノックアウト（ＫＯ）効率がトランスフェクションで使用されるｇＲＮＡの数とともに増加することを示している。胎児線維芽細胞は、Ｙｕｃａｔａｎから５０〜６０ＰＥＲＶコピーで入手した。フラグメント分析からクロマトグラフィーデータが表示される。
【図２８】図２８は、不活化ＰＥＲＶｐｏｌがヒトＥＲＶｐｏｌの活性によって補完されないことを示すＰＣＲデータを示している。
【図２９】図２９は、代理母の選択が出産率(delivery  rate)、同腹仔数(liter  size)、生存率（survival  rate）、及び繁殖用雌豚あたりの予想ブタ数(expected  pigs  per  sow)に与える影響を実証している。
【図３０】図３０は、ブタ生産中に再クローン化ステップを含めることが、出産率、同腹仔数(liter  size)、生存率、及び繁殖用雌豚あたりの予想豚数に与える影響を実証している。
【図３１】図３１Ａは、ＷＴブタにおけるＰＥＲＶフラグメント分析のクロマトグラフィーデータを示している。    図３１Ｂは、ＰＥＲＶ  ＫＯ  ＹｏｒｋｓｈｉｒｅにおけるＰＥＲＶフラグメント分析のクロマトグラフィーデータを示している。データは、大部分が１００塩基対（ｂｐ）を超える、大規模な欠失のみを伴う１００％ＰＥＲＶ  ＫＯを示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本明細書を通して、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」又はその変形「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、指定された整数又は整数のグループの包含を意味するが、いずれの他の整数又は整数のグループの除外を意味しないと理解される。本明細書で使用される場合、用語「含む」も狭い用語「からなる」及び「から本質的になる」の使用を包含する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
いくつかの実施形態において、因子はｐ５３阻害剤である。いくつかの実施形態において、因子はピフィスリン分子又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、因子はピフィスリンアルファ及び／又はピフィスリンベータである。ピフィスリン（ＰＦＴ）−αは、ｐ５３依存性の転写活性化とアポトーシスを可逆的に阻害することが実証されており、ＰＦＴ−μは、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２へのｐ５３結合親和性を低下させることにより、ミトコンドリアへのｐ５３の結合を阻害することが実証されている。いくつかの実施形態において、ｐ５３阻害剤は、環化ＰＦＴ−α  ｐ５３不活性化剤、例えば環式ピフィスリン−α臭化水素酸塩など、である。いくつかの実施形態において、ｐ５３阻害剤は、細胞内のｐ５３発現を低減又は排除する核酸である。いくつかの態様において、核酸はアンチセンス及び／又はＲＮＡｉ分子である。いくつかの態様において、ｐ５３阻害剤は、ドミナントネガティブｐ５３タンパク質、又はドミナントネガティブｐ５３阻害剤をコードする核酸である。いくつかの実施形態において、ｐ５３阻害剤は、ピフィスリン−α、ピフィスリン−ベータ、ピフィスリン−α臭化水素酸塩、ピフィスリン−ミュー（ｍｕ）、エリプチシン、９−ヒドロキシエリプチシン、ヌトリン−３、ロスコビチン、及びＳＪ  １７２５５０からなる群から選択される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
本開示の特定の実施形態が議論されてきたが、上記の明細書は例示であって制限的なものではない。本明細書及び以下の特許請求の範囲を検討することにより、開示の多くの変形が当業者に明らかになるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲、均等物の全範囲、及び明細書、ならびにそのような変形を参照することにより決定されるべきである。