(57)【要約】【課題】  蛍光標識ＤＮＡのブラウン運動の速さの変化の測定によるＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用の検出方法に於いて、１本鎖の蛍光標識ＤＮＡの残留物又は試料中の自家蛍光を発する物質の存在によらず、信頼性の高い蛍光測定結果が得られるようにすること。【解決手段】  本発明の方法は、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡと被検試料を混合し、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーの吸収波長の励起光を用いて測定用試料溶液を励起し蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターの発光波長の光を観測することにより測定用試料溶液の蛍光強度を測定し、その蛍光強度の時間変化に基づいて測定用試料溶液中の２本鎖ＤＮＡの運動の速さがその２本鎖ＤＮＡと同一の長さのＤＮＡが単独で運動している場合に比して遅くなったか否かを判定する。【選択図】        図１
2010057364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡと結合する物質を検出する方法であって、
蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡと前記２本鎖ＤＮＡと結合するか否かが判定されるべき被検物質とを含む測定用試料溶液を調製する過程と、
前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーの吸収波長の励起光を用いて前記測定用試料溶液を励起し前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターの発光波長の光を観測することにより前記測定用試料溶液の蛍光強度を測定する過程と、
前記蛍光強度の時間変化に基づいて前記測定用試料溶液中の前記２本鎖ＤＮＡの運動の速さが前記２本鎖ＤＮＡと同一の長さのＤＮＡが単独で運動している場合に比して遅くなったか否かを判定する過程とを含み、
前記測定用試料溶液中の前記２本鎖ＤＮＡの運動の速さが遅くなったと判定された場合には、前記被検物質が前記２本鎖ＤＮＡに結合したと判定することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＤＮＡと結合する物質を検出する方法であって、
蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡと前記２本鎖ＤＮＡと結合するＤＮＡ結合性タンパク質を含むか否かが判定されるべき被検試料とを混合して測定用試料溶液を調製する過程と、
前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーの吸収波長の励起光を用いて前記測定用試料溶液を励起し前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターの発光波長の光を観測することにより前記測定用試料溶液の蛍光強度を測定する過程と、
前記蛍光強度の時間変化に基づいて前記測定用試料溶液中の前記２本鎖ＤＮＡの運動の速さが前記２本鎖ＤＮＡと同一の長さのＤＮＡが単独で運動している場合に比して遅くなったか否かを判定する過程とを含み、
前記測定用試料溶液中の前記２本鎖ＤＮＡの運動の速さが遅くなったと判定された場合には、前記被検試料が前記ＤＮＡ結合性タンパク質を含んでいると判定することを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１又は２の方法であって、前記測定用試料溶液を調製する過程が、前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーが付加された１本鎖ＤＮＡと前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターが付加された１本鎖ＤＮＡとを混合して前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡを形成する過程と、前記２本鎖ＤＮＡを含む前記二種類の１本鎖ＤＮＡを混合してなる混合物を用いて前記測定用試料溶液を調製する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１又は２の方法であって、前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡが前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーが付加された１本鎖ＤＮＡと前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターが付加された１本鎖ＤＮＡとを混合して形成された２本鎖ＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、前記蛍光強度の時間変化に基づいて前記２本鎖ＤＮＡの運動の速さの指標を算出する過程と、前記速さの指標と前記２本鎖ＤＮＡの濃度と前記被検物質の濃度とに基づいて前記２本鎖ＤＮＡと前記被検物質との解離定数を算出する過程とを含むことを特徴とする方法
【請求項６】
請求項５の方法であって、前記２本鎖ＤＮＡの濃度と前記被検物質の濃度の少なくとも二つの組み合わせにて前記蛍光強度の測定を行い、前記蛍光強度の時間変化に基づいて前記少なくとも二つの濃度の組み合わせの各々について前記２本鎖ＤＮＡの速さの指標を算出し、前記２本鎖ＤＮＡと前記被検物質との解離定数を算出する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１又は２の方法であって、前記蛍光強度の測定が蛍光相関分光法により為されることを特徴とする方法。
【請求項８】
ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の解離定数を決定する方法であって、
蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡと前記ＤＮＡ結合性タンパク質とを含む測定用試料溶液を調製する過程と、
前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーの吸収波長の励起光を用いて前記測定用試料溶液を励起し前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターの発光波長の光を観測することにより前記測定用試料溶液の蛍光強度を測定する過程と、
前記蛍光強度の時間変化に基づいて前記２本鎖ＤＮＡの運動の速さの指標を算出する過程と、前記速さの指標と前記２本鎖ＤＮＡの濃度と前記ＤＮＡ結合性タンパク質の濃度とに基づいて前記２本鎖ＤＮＡと前記被検物質との解離定数を算出する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８の方法であって、前記測定用試料溶液を調製する過程に於いて、前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーが付加された１本鎖ＤＮＡと前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターが付加された１本鎖ＤＮＡとを混合して前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡを形成する過程と、前記２本鎖ＤＮＡを含む前記二種類の１本鎖ＤＮＡを混合してなる混合物と前記ＤＮＡ結合性タンパク質とを混合する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項８の方法であって、前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡが前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーが付加された１本鎖ＤＮＡと前記蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターが付加された１本鎖ＤＮＡとを混合して形成された２本鎖ＤＮＡであることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項８の方法であって、前記蛍光強度の測定が蛍光相関分光法により為されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光分析を用いてＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用を検出する方法に係る。
【背景技術】
【０００２】
２本鎖ＤＮＡに結合するＤＮＡ結合性タンパク質は、種々の生理現象に於いて、ＤＮＡと相互作用して、遺伝子の発現の制御する重要な役割を担っていると考えられている。例えば、出芽酵母のＤＮＡの複製過程に於いては、ＯＲＣ（複製オリジン認識複合体、タンパク質）がＤＮＡの複製起点に結合し、これを足場として、別のタンパク質ｐｒｅ−ＲＣ（複製前複合体、タンパク質）がＤＮＡに結合し、ＤＮＡ鎖伸長反応による複製が進行していくことが知られている（非特許文献１）。また、マウスの個体発生における骨芽細胞分化及び骨形成の過程に於いては、転写因子Ｒｕｎｘ２（タンパク質）がＤＮＡに結合し、別の転写因子Ｏｓｘ（タンパク質）によるＤＮＡの転写を促進すると考えられている（非特許文献２）。更に、免疫応答に於いては、細胞外ドメインにロイシンリッチリピート構造を有するTLR9（膜受容体タンパク質）が細菌由来の非メチル化ＣｐＧモチーフを持つＤＮＡと結合してインターフェロンを誘導することも知られている。近年、上記の如き遺伝子の発現制御に於けるＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡとの相互作用の役割が注目され、かかる相互作用をより詳細に研究する試みがなされ、更に、医学、薬学の分野に於いては、かかる相互作用を、新規な薬剤又は病気の治療方法に、或いは、病態や健康状態に関する臨床検査に応用しようとする試みも為されている。
【０００３】
そのようなＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用に関する研究やかかる相互作用を薬剤・治療方法等に応用する現場に於いて、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡの相互作用の有無の検出、相互作用の強さ又は特異性などを、任意の条件において特徴付けるための方法は、下記の如く、種々提案されている。例えば、特許文献１には、ビーズ上に固相化した２本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用を検出する方法が提案されている。また、非特許文献４に於いては、放射性標識した２本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の反応液を電気泳動することにより、相互作用の有無を検出する方法（「ヌクレアーゼプロテクションアッセイ」）が記載されている。更に、本願出願人による特許文献２及び非特許文献５に於いては、蛍光標識された短い（約５０ｂｐ以下）ＤＮＡ断片と任意のタンパク質と混合し、蛍光標識されたＤＮＡの運動の速さの変化を検出することにより（これらの文献では特に蛍光相関分光法が採用されている。）、混合されたＤＮＡとタンパク質とが結合するか否か、即ち、相互作用するか否かを検出するともに（ＤＮＡとタンパク質とが結合すると、ＤＮＡ上の蛍光標識のブラウン運動の速さが遅くなる）、ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の結合の強さ（解離定数）を決定することが示されている。
【０００４】
上記の特許文献２及び非特許文献５に記載の如き蛍光標識ＤＮＡのブラウン運動の速さの変化を測定することによるＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用の検出・測定方法は、比較的少ない手間で、簡便に相互作用の有無や強度、特異性などを特徴付けることが可能である。特許文献１や非特許文献４に記載のＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用を検出する手法が、ＤＮＡの固相化、電気泳動などの処理操作が煩雑で時間を要し、放射性物質や神経毒性を持つアクリルアミドの使用といった安全性に特に注意を要する処理過程を含むといった不具合があるのに対し、蛍光標識ＤＮＡのブラウン運動の速さの変化の測定では、相互作用の検出する段階に於ける処理が、「Mix&Measure」という言葉で紹介されるように、蛍光標識されたＤＮＡと任意のタンパク質試料を混ぜて蛍光測定を行うだけなので（測定に要する時間は、数秒から十数秒間程度でよい。測定結果の解析は、コンピュータにより容易に実行できる。）、測定者に熟練した測定処理技術を要することはなく、検出・測定の操作手順を標準化しやすいという利点を有する。また、蛍光相関分光法の場合には、数十μｌ程度の微少量の試料だけで測定が実行できるので、検査・測定に要する試料量も従前の方法に比べて大幅に低減できる。これら蛍光標識ＤＮＡのブラウン運動の速さの変化の測定による方法の利点は、例えば、新規な薬剤の開発又は薬剤として使用できる物質の探索に於いて多数の被検物質についてＤＮＡと被検物質（ＤＮＡ結合性タンパク質）の相互作用をスクリーニングする場合や、臨床検査に於いて多数の患者から収集された検体を短時間で検査する場合など、相互作用の有無や強さについて検査されるべき試料が多い場合に特に有利である。
【特許文献１】特開２００１−３２１１９９公報
【特許文献２】特開２００５−００６５６６公報
【非特許文献１】浴俊彦他、２００４年、羊土社発行「キーワードで理解するシグナル伝達イラストマップ第２部［キーワード解説］生命現象からみたシグナル伝達因子  ３．ＤＮＡ複製・修復」、69-83頁
【非特許文献２】田中栄他、２００４年、羊土社発行「キーワードで理解するシグナル伝達イラストマップ第２部［キーワード解説］生命現象からみたシグナル伝達因子  ２１．骨代謝」、251-259頁
【非特許文献３】改正恒康他、２００５年、羊土社発行、実験医学増刊、「解明が進むウイルス・細菌感染と免疫応答  第3章  病原体感染に対する免疫応答メカニズム  ２．核酸成分を認識するTLRによる感染防御機構および自己免疫疾患との関係」、134-140頁
【非特許文献４】マイケル等、１９９３年、ジーントランスクリプション：プラクティカルアプローチ、２２９−２７６頁
【非特許文献５】コバヤシ外３名、アナリティカル・バイオケミストリー、２００４年  ３３２巻  ５８−６６頁
【非特許文献６】カルデュッロ外４名、１９８８年、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシィス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、８５巻、8790-8794頁
【非特許文献７】リーグラ及びエルソン、２０００年  「蛍光相関分光法  理論と応用」204-224頁  （R.  Riegler  and  E.S.  Elson(2000)  ”Fluorescence  Correlation  Spectroscopy  Theory  and  Application”  p.204-224  10.  Nanoparticle  Immunoassays:  A  New  Method  for  Use  in  Molecular  Diagnosis  and  High  Throughput  Pharmaceutical  Screening  based  on  Fluorescence  Correlation  Spectroscopy）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、蛍光相関分光法の如き蛍光標識ＤＮＡのブラウン運動の速さの変化の測定によるＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用の検出・測定方法に於いてプローブとして使用される蛍光標識されたＤＮＡは、一般的には、人工的に１本鎖のＤＮＡに蛍光色素が付加されたものを合成した後、１本鎖の蛍光標識ＤＮＡを２本鎖のＤＮＡにするべくアニーリング処理することにより調製される。そして、２本鎖に成れなかった１本鎖のＤＮＡは、もしそれらが試料に残存すると蛍光測定に於いて誤差の原因となるので、酵素処理によりモノヌクレオチドへ分解され、除去される。しかしながら、かかる１本鎖のＤＮＡの除去は、通常３−４時間程度の時間を要するとともに、酵素処理には、熟練した技術を要する。又、１本鎖のＤＮＡの除去処理中に或る程度の量の２本鎖ＤＮＡも損失してしまう。即ち、現在のところ、蛍光標識ＤＮＡのブラウン運動の速さの変化の測定による相互作用の検出・測定方法は、蛍光測定の過程そのものは、迅速に実行できるが、測定のためのプローブとして使用される蛍光標識されたＤＮＡの調製のために、測定そのものよりも非常に長い時間を要し、１本鎖のＤＮＡの除去処理により損失される２本鎖ＤＮＡの量を見越して１本鎖の蛍光標識ＤＮＡを準備する必要がある。
【０００６】
また、創薬や臨床検査に於いて用いられる生体試料や薬剤の候補物質は、自家蛍光を発する物質を含んでいることが多い。もしそのような自家蛍光を持つ物質の励起・蛍光波長特性が、ＤＮＡの蛍光標識の波長特性に近似していたとすると、かかる自家蛍光が蛍光測定に於いてノイズとなり、測定結果に誤差を生ずる原因と成り得る。
【０００７】
従って、もし測定試料中に１本鎖の蛍光標識ＤＮＡや自家蛍光を発する物質が残留していても、検出・測定結果がそれらの残留物の影響をより低くでき、これにより、測定結果の誤差を低減できる方法があれば、上記の如き１本鎖のＤＮＡの除去処理を行う必要はなくなり、また、測定結果の信頼性を向上されることとなろう。
【０００８】
かくして、本発明の一つの課題は、上記の如き蛍光標識ＤＮＡのブラウン運動の速さの変化の測定によるＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用の検出・測定方法であって、１本鎖の蛍光標識ＤＮＡの残留物又は試料中の自家蛍光を発する物質の存在によらず、信頼性の高い蛍光測定結果が得られるよう改良された方法を提供することである。
【０００９】
また、本発明のもう一つの課題は、蛍光相関分光法によるＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用の検出・測定方法を改良して、検査に要する時間と試料量又は費用を節約することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題は、本発明によれば、ＤＮＡと結合する物質を検出する方法又はＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の結合の強さを測定する方法に於いてプローブとして用いられる蛍光標識された２本鎖ＤＮＡとして、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識されたものを採用することにより達成される。
【００１１】
本発明の一つの態様によれば、本発明のＤＮＡと結合する物質を検出する方法は、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡとその２本鎖ＤＮＡと結合するか否かが判定されるべき被検物質とを含む測定用試料溶液を調製する過程と、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーの吸収波長の励起光を用いて測定用試料溶液を励起し蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターの発光波長の光を観測することにより測定用試料溶液の蛍光強度を測定する過程と、その蛍光強度の時間変化に基づいて測定用試料溶液中の２本鎖ＤＮＡの運動の速さがその２本鎖ＤＮＡと同一の長さのＤＮＡが単独で運動している場合に比して遅くなったか否かを判定する過程とを含み、測定用試料溶液中の２本鎖ＤＮＡの運動の速さが遅くなったと判定された場合には、被検物質が２本鎖ＤＮＡに結合したと判定することを特徴とする。なお、蛍光強度の測定は、蛍光標識が担持されている分子の運動の速さの変化が分かる測定方法であれば、任意のものであってよく、特許文献２に記載されている如き蛍光相関分光法、或いは、蛍光偏光解消法であってもよい。蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素の組み合わせは、例えば、ドナーとしてＴＡＭＲＡ（カルボキシメチルローダミン）を用い、アクセプターとしてＡｌｅｘａ６４７等が用いられてよいが、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素の組み合わせとして、この分野に於いて知られている任意の組み合わせであってよい。
【００１２】
上記の本発明の方法は、基本的な処理操作は、特許文献２に記載されている如き方法と同様に、単に蛍光標識された２本鎖ＤＮＡと、それに結合するか否かが判定されるべきタンパク質等の被検物質とを混合し、蛍光測定を行うだけでよい。蛍光標識された２本鎖ＤＮＡと被検物質とが結合すれば、２本鎖ＤＮＡの運動が遅くなり、そのことが２本鎖ＤＮＡに担持された蛍光標識からの蛍光強度の時間変化に反映され、かくして、２本鎖ＤＮＡと被検物質との結合の有無が検出される。しかしながら、本発明に於いては、被検物質がＤＮＡに結合するものであるか否かを判定するためのＤＮＡプローブとして、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識されたものを用いることにより、励起光と、測定する蛍光との波長帯域が離れ、これにより、蛍光強度に於いてプローブの２本鎖ＤＮＡ以外からの物質から発せられる蛍光の寄与が混在してくる可能性が低減され、かくして、蛍光強度に於けるノイズや誤差を低減することができることとなる。
【００１３】
上記の本発明の方法の構成に於いて、より好ましくは、プローブとして用いられる２本鎖ＤＮＡは、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーが付加された１本鎖ＤＮＡと蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターが付加された１本鎖ＤＮＡとを混合して形成された２本鎖ＤＮＡである。かかる２本鎖ＤＮＡをプローブとして用いる場合、仮に、プローブの２本鎖ＤＮＡ試料中に、蛍光標識された１本鎖ＤＮＡが残留していても、本発明の構成に於いては、蛍光測定の際、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーの吸収波長の励起光を用いて測定用試料溶液を励起し、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターの発光波長に於ける測定用試料溶液の蛍光強度を測定することになるので、２本鎖を形成していないＤＮＡからの蛍光強度は、測定値に殆ど寄与しないこととなる。即ち、プローブの２本鎖ＤＮＡ試料中に於ける１本鎖ＤＮＡを除去しなくても、ノイズ又は誤差の少ない測定結果が得られることとなる。従って、本発明の方法の実施するに当たっては、例えば、測定用試料溶液を調製する過程に於いて、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーが付加された１本鎖ＤＮＡと蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターが付加された１本鎖ＤＮＡとを混合して蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡを形成する過程と、その２本鎖ＤＮＡを含む二種類の１本鎖ＤＮＡを混合してなる混合物と被検物質とを混合する過程とを行うようにするだけでよく、被検試料中に１本鎖ＤＮＡが残留していても気にする必要はないのである。
【００１４】
更に、上記の本発明の構成に於いては、蛍光強度の時間変化に基づいて２本鎖ＤＮＡの運動の速さの指標を算出する過程と、速さの指標と２本鎖ＤＮＡの濃度と前記被検物質の濃度とに基づいて前記２本鎖ＤＮＡと前記被検物質との解離定数を算出する過程とを含んでいてよい。その場合、特に、２本鎖ＤＮＡの濃度と被検物質の濃度の少なくとも二つの組み合わせにて蛍光強度の測定を行い、蛍光強度の時間変化に基づいて少なくとも二つの濃度の組み合わせの各々について２本鎖ＤＮＡの速さの指標を算出し、２本鎖ＤＮＡと前記被検物質との解離定数を算出するようにしてよい。２本鎖ＤＮＡの速さの指標としては、蛍光測定が蛍光相関分光法による場合には、後に説明される如き並進拡散時間であってよい。又、蛍光測定が蛍光偏光解消法による場合には、偏光度であってよい。かかる構成によれば、ノイズ又は誤差の少ない蛍光強度の測定結果に基づいて解離定数が得られ、従って、２本鎖ＤＮＡと被検物質との結合の強さを信頼性良く見積もることができることとなる。その際、溶液の条件を種々変更して蛍光測定を行ってもノイズ又は誤差の少ない蛍光強度の測定結果が得られることが期待され（例えば、試料中にｐＨやイオン強度で蛍光強度が変化する夾雑物があってもそれらの蛍光強度の測定への寄与は低減されているので）、２本鎖ＤＮＡと被検物質との結合の強さの変化も従前に比して信頼性よく観測できるであろう。
【００１５】
なお、上記の本発明の一つの態様は、或る被検物質が２本鎖ＤＮＡのプローブと結合するか否かを判定するものであるが、或る任意の被検試料が２本鎖ＤＮＡと結合するＤＮＡ結合性タンパク質を含むか否かが判定する場合にも用いることができる。その場合、測定用試料溶液は、２本鎖ＤＮＡのプローブとその２本鎖ＤＮＡと結合するＤＮＡ結合性タンパク質を含むか否かが判定されるべき被検試料とを混合することにより調製され、蛍光測定の結果の解析により、測定用試料溶液中の２本鎖ＤＮＡの運動の速さが遅くなったと判定された場合には、被検試料がＤＮＡ結合性タンパク質を含んでいると判定されることとなる。
【００１６】
更に、上記の本発明の方法の構成に於けるプローブとして用いられる蛍光標識された２本鎖ＤＮＡとして、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識されたものを採用するという特徴は、既にＤＮＡと結合が分かっているＤＮＡ結合性タンパク質について、その結合の強さを見積もるべく、解離定数を決定する場合にも有利に用いられる。従って、本発明のもう一つの態様によれば、ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の解離定数を決定する方法であって、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質とを含む測定用試料溶液を調製する過程と、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーの吸収波長の励起光を用いて測定用試料溶液を励起し蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターの発光波長の光を観測することにより測定用試料溶液の蛍光強度を測定する過程と、蛍光強度の時間変化に基づいて２本鎖ＤＮＡの運動の速さの指標を算出する過程と、速さの指標と２本鎖ＤＮＡの濃度とＤＮＡ結合性タンパク質の濃度とに基づいて２本鎖ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質との解離定数を算出する過程とを含むことを特徴とする方法が提供される。
【００１７】
上記の如くＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の解離定数を決定する場合も、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡは、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーが付加された１本鎖ＤＮＡと蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターが付加された１本鎖ＤＮＡとを混合して形成された２本鎖ＤＮＡであってよく、測定用試料溶液を調製する過程に於いて、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のドナーが付加された１本鎖ＤＮＡと蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素のアクセプターが付加された１本鎖ＤＮＡとを混合して蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡを形成する過程と、その２本鎖ＤＮＡを含む二種類の１本鎖ＤＮＡを混合してなる混合物と前記のＤＮＡ結合性タンパク質とを混合する過程とが含まれていてよい。蛍光強度の測定は、蛍光相関分光法により為されてよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法は、上記の説明から理解されるように、プローブとして、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡを用い、試料をドナーの励起波長の光で励起してアクセプターの発光波長で試料の蛍光を検出することにより、検出される蛍光強度に於いて、蛍光共鳴エネルギー移動が起きた結果に生ずる蛍光、即ち、プローブからの蛍光、以外の夾雑物からの蛍光を排除しようとするものであると言える。かかる特徴によれば、生体由来の試料など、種々の自家蛍光を発する物質が含まれている試料であっても、従前の方法に比して信頼性良く、ＤＮＡと試料中の物質との結合若しくは相互作用の有無又は結合の強さを観測することが可能となり、ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用の検出方法が、より広範囲の臨床検査や薬剤のスクリーニングに応用できることとなろう。
【００１９】
また、特に、２本鎖ＤＮＡのプローブを、蛍光共鳴エネルギー移動に於けるドナーを付加した１本鎖ＤＮＡとアクセプターを付加した１本鎖ＤＮＡとを混合して調製する場合には、上記の如く、２本鎖ＤＮＡに成らなかった１本鎖ＤＮＡを除去する必要がなくなるので、蛍光標識されたＤＮＡプローブの調製が簡単化される。従って、本発明の方法によれば、従前に比して、熟練した技術を要せずにＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用の有無又はその強さを検出することが可能となり、臨床検査や薬剤のスクリーニングの用途に於いて、誰でも比較的簡単に測定が実施できるよう処理操作を標準化することが可能となるであろう。
【００２０】
本発明のその他の目的及び利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の説明により明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に添付の図を参照しつつ、本発明を幾つかの好ましい実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
図１は、本発明の方法の好ましい実施形態に於ける処理に於いて想定される分子の状態の変化を模式的に示したものである。
【００２３】
図１を参照して、本発明の方法の実施を開始する当たり、蛍光色素にて標識された２本鎖ＤＮＡであるプローブＤＮＡが準備される（図１（Ａ）〜（Ｃ））。後に説明される蛍光測定の際、試験試料中の物質又はＤＮＡ結合性タンパク質とプローブＤＮＡが結合したか否かは、プローブＤＮＡの運動の速さの変化から判定されることとなるので、プローブＤＮＡの大きさ（即ち、塩基数）は、ＤＮＡと結合するか否かが検査される被検物質、又は、ＤＮＡと結合すると想定される試験試料中のＤＮＡ結合性タンパク質の大きさよりも小さい方が好ましい。典型的には、ＤＮＡの長さは、合成のコスト及び検出の容易さから、好ましくは、１０〜１００merであり、より好ましくは２０から４０merである。
【００２４】
プローブＤＮＡには、本発明に於いては、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる少なくとも２種類の蛍光標識として蛍光色素が付加されている（図１（Ｃ））。かかるＤＮＡを蛍光共鳴エネルギー移動に於けるドナーの蛍光色素の吸収波長の光で励起すると、ドナーで吸収されたエネルギーは、アクセプターへ移動し、アクセプターの発光波長の蛍光が放出されることとなる。この点に関し、ＤＮＡに於いて異なる蛍光色素を付加して蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるためには、非特許文献６の知見によれば、蛍光色素の種類にも依るが、典型的には、ドナーの発光波長スペクトルの波長帯域とアクセプターの吸収波長スペクトルの波長帯域が重複し、且、ドナーの蛍光分子とアクセプターの蛍光分子のＤＮＡ上の距離が１０ｂｐ以内になっていればよいことが見出されている。また、蛍光共鳴エネルギー移動を高効率に発生させるには、蛍光色素は、高い蛍光量子収率を有し、光消光を起こしにくく、又、三重項状態を生成しにくいものであることが望ましく、また、ドナーの発光波長帯域とアクセプターの吸収波長帯域との重複が大きければ大きいほどよい。そのような蛍光色素のドナーとアクセプターの組み合わせとしては、例えば、TAMRAとAlexa  Fluoro  647、Rhodamine  GreenとTAMRA、Alexa  Fluoro  546とEVOblue50などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
上記の如きプローブＤＮＡの調製に於いては、好ましくは、まず、当業者にとって任意の公知の方法により、ドナーとなる蛍光色素が付加された１本鎖オリゴヌクレオチド（ＤＮＡ）（図１（Ａ））と、アクセプターとなる蛍光色素が付加された１本鎖オリゴヌクレオチド(図１（Ｂ）)とがそれぞれ合成される。その際、既に述べた如く、蛍光共鳴エネルギー移動を発生させるために、１本鎖ＤＮＡが会合した際に、ドナーとアクセプターとが１０ｂｐ以内に位置するよう、各々の1本鎖の塩基配列と色素の付加する位置は、予め設計される。そして、かくして調製されたそれぞれの１本鎖オリゴヌクレオチドは、互いに等モル量になるよう混合され、当業者にとって公知の態様にて（温度を変化させるなどして）アニーリング処理され、２本鎖ＤＮＡの調製が完了する(図１（Ｃ）)。なお、「発明の開示」の欄に於いて述べた如く、本発明の場合、蛍光測定に於いて、ドナーの吸収波長帯域の励起光で試料を励起し、アクセプターの蛍光波長帯域の光の強度を観測するので（ドナーの発光波長帯域の光は、フィルター等により遮断される。）、観測される蛍光は、実質的には、蛍光共鳴エネルギー移動を発生している蛍光標識からの蛍光だけとなる。従って、プローブ試料として用いられる２本鎖ＤＮＡ試料中に、未会合の１本鎖ＤＮＡが残留していてもよく、従前では必要であった１本鎖ＤＮＡの除去処理、即ち、未会合の１本鎖ＤＮＡのモノヌクレオチドへの分解及びモノヌクレオチドの除去、を行わなくてよいということは理解されるべきである。これにより、測定者に要求される処理操作が低減され、また、１本鎖ＤＮＡの除去処理に要する時間（通常、３−４時間）が節約されることとなる。
【００２６】
上記のプローブＤＮＡ試料は、調製された後、プローブＤＮＡと結合するか否かが検査される被検物質若しくはそのような物質（ＤＮＡ結合性タンパク質）を含んでいるか否かが検査される被検試料、又は、プローブＤＮＡとの結合の強さが検査されるＤＮＡ結合性タンパク質（以下、これらを総じて「被検物質」と称する。）と混合され、測定用試料溶液が調製される(図１（Ｄ）)。プローブＤＮＡの濃度は、典型的には、０．５ｎＭ〜１０ｎＭ程度であってよい。プローブＤＮＡと結合するか否かが検査される被検物質又はそのような物質を含む被検試料は、血清サンプル又はその他の生体から得られたら任意の液体であってよい。また、生体から得られた体液そのものではなく、或るタンパク質についてその純度又は濃度が高くなるよう精製された試料であってもよい。また、ＤＮＡ結合性タンパク質の解離定数（結合の強さ）を測定する場合には、任意の方法にて精製されたタンパク質を任意の水溶液に溶解又は分散した溶液が用いられてよい。タンパク質は、無細胞タンパク質合成法などを用いて調製したものであってもよい。測定用試料溶液の組成、反応時間（試料の混合から蛍光測定を開始するまでの時間）、反応温度等の条件は、検出しようとするＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の相互作用によって任意に設定される。後に説明する蛍光測定は、数十μｌの溶液量にて実行できるので、試料は、従前の電気泳動等を用いる場合に比して極めて微量でよいことは理解されるべきである。
【００２７】
被検物質がプローブＤＮＡと結合する性質を有している場合には、図２（Ｄ）に模式的に示されている如く、測定用試料溶液中で被検物質がプローブＤＮＡと結合し、従って、プローブＤＮＡのブラウン運動は、被検物質に拘束され遅くなる。
【００２８】
かくして、測定用試料溶液の蛍光測定が行われる。蛍光測定は、共焦点顕微鏡の光学系とフォトンカウンティング（１光子検出）により光強度の検出を行う光検出装置とを組み合わせて、蛍光一分子からの蛍光強度を測定し、その時間変化又は揺らぎを解析して蛍光一分子の状態又は運動を観測する一分子蛍光分析システム（例えば、オリンパス社  ＭＦ−２０）を用いて、蛍光標識されたプローブＤＮＡの運動の早さの変化を検出することのできる蛍光相関分光法、蛍光偏光解消法などにより実行されてよい。
【００２９】
蛍光相関分光法では、微小の蛍光観察領域（共焦点顕微鏡の対物レンズの焦点領域）をブラウン運動により通過する分子の移動（並進運動）の速さが観測される。分子の並進運動の速さは、測定された蛍光強度の時間を変数とした自己相関関数の形状に反映される（図２参照）。分子の並進運動の速さの指標としては、測定開始時から自己相関関数の値が半分になるまでの時間の長さ（並進拡散時間）が用いられる。分子の移動は、分子の大きさが小さいほど、速くなるので、並進拡散時間が短くなる。本発明の場合、プローブＤＮＡに被検物質が結合すると、プローブＤＮＡの運動が遅くなり、従って、並進拡散時間が長くなるので、並進拡散時間の変化からプロープＤＮＡの運動の速さの変化、従って、プローブＤＮＡと被検物質の結合の有無を検出することができる。
【００３０】
蛍光偏光解消法では、この分野に於いて知られている如く、分子の回転ブラウン運動（自転）の速さが観測される。分子の回転運動の速さは、測定された蛍光の縦偏光と横偏光の強度の割合又は偏光度に反映される。分子の回転は、分子の大きさが大きいほど、遅くなるので、偏光度が大きくなる。本発明の場合、プローブＤＮＡに被検物質が結合すると、プローブＤＮＡの運動が遅くなり、従って、偏光度が上がるので、偏光度の変化から、プロープＤＮＡの運動の速さの変化、従って、プローブＤＮＡと被検物質の結合の有無を検出することができる。なお、蛍光偏光解消法による測定は、蛍光相関分光法と同一の光学系を用いた二次元蛍光強度分散分析法により行われてよい。
【００３１】
上記の蛍光測定に於いて留意すべきことは、本発明では、プローブＤＮＡ上に於ける蛍光共鳴エネルギー移動の後に発せられる蛍光を検出するので、励起光の波長は、実質的にドナーの蛍光色素のみが励起され、アクセプターの蛍光色素が殆ど励起されないよう選択され、検出装置の受光の波長帯域は、ドナーの蛍光色素から直接発せられる蛍光が遮断され、アクセプターの蛍光色素からの発光波長のみが受光されるよう選択されるということである。具体的には、励起光の選択は、使用するレーザーの種類を選択することにより又は任意にバンドパス又はローパスフィルターを用いることにより為される。また、検出装置の受光の波長帯域は、バンドパス又はハイパスフィルター又は回折格子等を用いて選択されてよい。
【００３２】
蛍光強度の計測は、上記の如き一分子蛍光分析システムを用いる場合には、例えば、１５秒の測定を５回行うなどして為されてよい。一分子蛍光分析システムは、時間の関数として得られた蛍光強度を自動的に解析して、並進拡散時間又は偏光度等を算出する。プローブＤＮＡがフリーのときと比較して、並進拡散時間又は偏光度等がプローブＤＮＡのブラウン運動の速さが低下した認められるときには、プローブＤＮＡに被検物質が結合した判定することができる。
【００３３】
測定が、或る被検物質が２本鎖ＤＮＡと結合するか否かが判定するものである場合には、被検物質がプローブＤＮＡに結合したと判定されたときには、被検物質がＤＮＡに結合性を有するものであると判定される。また、測定が或る試料に於いて２本鎖ＤＮＡと結合する物質又はＤＮＡ結合性タンパク質を含んでいるか否かを判定するときには、プローブＤＮＡに被検物質が結合したと判定されたときには、その試料中に２本鎖ＤＮＡと結合する物質又はＤＮＡ結合性タンパク質が含まれていたと判定される。
【００３４】
更に、プローブＤＮＡと被検試料との相対的な量の比を種々変化させて上記の手順により、プローブＤＮＡのブラウン運動の速さの指標を算出して、プローブＤＮＡと被検試料との量比又は濃度比を関数とした指標の変化から解離定数（又は結合定数）を算出することができる（後述の実施例及び図３参照）。また、プローブＤＮＡの濃度を種々変化させて蛍光測定を行い、プローブＤＮＡのブラウン運動の速さの指標を算出し、プローブＤＮＡの濃度の関数としてそのブラウン運動の速さの指標をプロットし、ＤＮＡとＤＮＡ結合性タンパク質の解離定数を用いてプロットに対して計量線をフィッティングすることにより、任意の被検試料中の被検物質又はＤＮＡ結合性タンパク質の濃度を推定することも可能である。
【００３５】
上記の蛍光測定に於いては、既に述べた如く、検出される蛍光強度は、ドナーから蛍光共鳴エネルギー移動により受け取ったエネルギーがアクセプターから放出されることにより発せられる蛍光であり、そのような光を発する分子は、測定用試料溶液中に於いて、よほど特別なことがない限り、プローブＤＮＡに付加された蛍光色素であると考えられる。従って、上記の蛍光測定の検出結果に於いては、夾雑物から蛍光の寄与は、従前の方法（励起光により励起された蛍光色素からそのまま発せられる蛍光を検出する場合）に比して、通常、大幅に低減され、かくして得られた蛍光強度に基づいて解析されて得られた結果は、従前の方法よりもより信頼性のあるものであると考えられる。
【００３６】
なお、上記の方法に於いて、一つの一本鎖ＤＮＡ上に二つの蛍光共鳴エネルギー移動を起す蛍光色素が付加されてもよいが、その場合には、会合しなかった蛍光標識された１本鎖ＤＮＡを、従前と同じ態様にて除去する必要がある。しかしながら、検出される蛍光強度は、蛍光共鳴エネルギー移動が生じた後に発せられる蛍光であるから、そのようにして得られた蛍光強度に基づいて解析されて得られた結果も、従前の方法よりもより信頼性のあるものであると考えられる。
【００３７】
上記に説明した本発明の有効性を検証するために、以下の実験を行った。なお、以下の実施例は、本発明の有効性を例示するものであって、本発明の範囲を限定するものではないことは理解されるべきである。
【実施例１】
【００３８】
ＤＮＡプローブとＤＮＡ結合性タンパク質との結合の検出
本実施例では、蛍光相関分光法に従って、ＤＮＡ結合性タンパク質の一種であるＡＰ−１が結合する塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして、ＡＰ−１とプローブＤＮＡとの相互作用の検出を行った。
【００３９】
プローブＤＮＡは、蛍光共鳴エネルギー移動の際ドナーとなる蛍光色素ＴＡＭＲＡにて標識された塩基配列
5’-TAMRA-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3’
を有する１本鎖のオリゴヌクレオチドと、蛍光共鳴エネルギー移動の際アクセプターとなる蛍光色素AlexaFluoro647にて標識された塩基配列
5’-TTCCGGCTGACTCATCAAGCG-AlexaFluoro647-3’
を有する１本鎖のオリゴヌクレオチドを、それぞれ、最終濃度が5μＭになるようにSTEバッファ（100ｍＭ  NaCl＋ＴＥバッファ（10ｍＭ  Tris-HCl(pH8.0)、1mM  Na2EDTA））中で混合した。なお、上記二種類の１本鎖のオリゴヌクレオチドは、株式会社日本バイオサービス社が人工的に合成したものを用いた。次いで、オリゴヌクレオチドの混合液は、２本鎖ＤＮＡを形成するようアニーリング処理した。アニーリング処理に於いては、混合液を、MJ  Research社のPeltier  Thermal  Cycler  PTC-200で、９５℃、５分間曝した後、温度を徐々に２０℃まで下げた。
【００４０】
アニーリング後の混合液は、ＤＮＡが２本鎖ＤＮＡであるとして、最終濃度が２０ｎＭになるようにSTEバッファで希釈し、２本鎖ＤＮＡの濃度を一定にして、種々の濃度のＤＮＡ結合性タンパク質ＡＰ−１（プロメガ社のrhAP-1(c-jun)を使用。）と混合し、下記の４つの測定用試料溶液を調製した。総量は、それぞれ３０μｌとした。
測定用試料溶液１
アニーリング後ＤＮＡ混合液      ３μｌ
ｒｈＡＰ−１（0.3mg/ml）        ３μｌ
ＡＰ−１用溶媒バッファ          ０μｌ
ＴＥバッファ                    ２４μｌ
測定用試料溶液２
アニーリング後ＤＮＡ混合液      ３μｌ
ｒｈＡＰ−１（0.3mg/ml）        １μｌ
ＡＰ−１用溶媒バッファ          ２μｌ
ＴＥバッファ                    ２４μｌ
測定用試料溶液３
アニーリング後ＤＮＡ混合液      ３μｌ
ｒｈＡＰ−１（0.3mg/ml）        ０．５μｌ
ＡＰ−１用溶媒バッファ          ２．５μｌ
ＴＥバッファ                    ２４μｌ
測定用試料溶液４
アニーリング後ＤＮＡ混合液      ３μｌ
ｒｈＡＰ−１（0.3mg/ml）        ０μｌ
ＡＰ−１用溶媒バッファ          ３μｌ
ＴＥバッファ                    ２４μｌ
【００４１】
上記の測定用試料溶液は、混合後、室温にて、約１０分静置した後、1分子蛍光分析システムＭＦ−２０を用いて、蛍光相関分光法により蛍光測定を行った。励起光は、波長５４３ｎｍのレーザー光を用いた。また、受光器の前には、ドナーの蛍光を遮断するべく、ハイパスフィルター６７０ＤＦ４０（６７０ｎｍ以上の波長の光を透過  ＯＭＥＧＡ社）を配置した。ＭＦ−２０に於ける蛍光強度の一回の測定時間を１５秒とし、測定を５回繰り返した。しかる後、ＭＦ−２０は、測定毎に時間の関数として蛍光強度の自己相関関数を計算し、並進拡散時間を算出し、次に５回の測定の平均値を算出した。その結果、それぞれの測定用試料溶液の並進拡散時間は、
測定用試料溶液１        ４２３．９±１μ秒
測定用試料溶液２        ３２１．７±３５．８μ秒
測定用試料溶液３        ３２５±１６．５μ秒
測定用試料溶液４        ２７９．３±２１．５μ秒
であった。
【００４２】
上記の結果は、特許文献２及び非特許文献５の結果と同様に、ＡＰ−１の濃度が増大するほど、並進拡散時間が長くなることを示しており、ＤＮＡプローブに結合するＡＰ−１の数が増えるとともに、ＤＮＡプローブの運動が遅くなることを示している。この結果は、蛍光共鳴エネルギー移動を起した後の蛍光を検出し解析することにより、ＤＮＡ結合性タンパク質とＤＮＡプローブとの結合、即ち、相互作用の有無を検出できることを示している。
【実施例２】
【００４３】
ＤＮＡ結合性タンパク質（ＡＰ−１）とＤＮＡの解離定数の算出
実施例１と同様の手順にて、測定用試料溶液中のＡＰ−１の濃度を更に細かく広範囲に変更して、蛍光強度の蛍光相関分光法による自己相関関数と並進拡散時間とを測定し、その結果に基づいてＡＰ−１とＤＮＡとの解離定数を算出した。
【００４４】
図３は、ＤＮＡ濃度を２ｎＭとして、ＡＰ−１の濃度を変更して得た並進拡散時間の変化を示す。同図に示されている如く、ＡＰ−１の数が増えるともに急激に増大した後、約１０５０μ秒に達し飽和した。測定試料中に於いてＤＮＡとＡＰ−１との結合が、反応式
［ＡＰ−１濃度］・［ＤＮＡ濃度］／［ＡＰ−１・ＤＮＡ濃度］＝Ｋｄ
（Ｋｄは、解離定数）
に従うとすると、並進拡散時間が飽和に達したとき、全てのＤＮＡプローブがＡＰ−１に結合した状態であると考えられる。そこで、試料中で、ＤＮＡが、ＡＰ−１に結合していない状態と、ＡＰ−１と１対１に結合した複合体の状態との２状態のいずれかにて存在するとして、種々のＡＰ−１濃度に於いて得られた自己相関関数が前記の２状態の各々の自己相関関数の重ね合わせとなるとのモデル（非特許文献７参照）に基づいて、Ｋｄ値を算出した。算出方法は、以下の通りである。
【００４５】
まず、測定試料中に於いて蛍光プローブの状態が２状態存在する場合、即ち、２成分の(規格化された)蛍光強度の自己相関関数は、
【数１】
2010057364.tif 000003
により与えられる。ここで、Ｎは蛍光分子の検出領域中の個数、ＹがＡＰ−１に結合したＤＮＡ分子の割合、τｆは、結合していないＤＮＡ分子の並進拡散時間、τｂは、ＡＰ−１に結合しているＤＮＡ分子の並進拡散時間、ｗは装置定数であり、また、Ｔは三重項状態からの緩和時間τＴを持つ蛍光色素の割合である。上記の式のうち、Ｎ、ｗ、Ｔ、τＴは、それぞれ、予め既知のパラメータとして与えられる。結合していないＤＮＡ分子の並進拡散時間τｆは、ＡＰ−１濃度が０のときの測定値であり、ＡＰ−１に結合しているＤＮＡ分子の並進拡散時間τｂは、上記の並進拡散状態が飽和したときのその値である。従って、並進拡散状態が飽和する前の任意のＡＰ−１濃度に於いて得られる自己相関関数を上記の式にフィッティングすることにより、ＡＰ−１に結合したＤＮＡ分子の割合Ｙが得られ、これにより、前記のＫｄ値が与えられる。
【００４６】
図４は、測定によって得られた結果に対して上記の２成分自己相関関数Ｇ（ｔ）を（最小二乗法）フィッティングさせて得られたＡＰ−１に結合したＤＮＡ分子の割合ＹをＡＰ−１濃度に対してプロットしたものを示している。なお、演算に於いて、τｆ＝４８５．３μ秒、τｂ＝１０５０μ秒とした。図４のプロットに於いて前記の結合反応式に従って（最小二乗法）フィッティングしたところ、解離定数は、Ｋｄ＝０．５×１０−７となり、非特許文献５の場合（Ｋｄ＝１．９×１０−７）と概ね一致した。この結果は、蛍光共鳴エネルギー移動を生ずる蛍光色素にて蛍光標識されたＤＮＡプローブを用いて、ＡＰ−１とＤＮＡとの相互作用の有無を決定するとともに結合の強さを算出することができることを示している。また、上記の結果は、２本鎖に成れなかった１本鎖ＤＮＡの除去処理を行うことなく、従って、夾雑物の存在下に於いても、相互作用の有無と結合の強さを決定できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、本発明の方法の好ましい第一の実施形態に於ける処理過程中に於けるＤＮＡ分子の構造の変化を模式的に表したものである。蛍光共鳴エネルギー移動に於いて、ドナーとなる蛍光色素Ｄが付加された１本鎖ＤＮＡ（Ａ）と、アクセプターとなる蛍光色素Ａが付加された１本鎖ＤＮＡ（Ｂ）とが混合され、アニーリングされると、蛍光色素Ｄと蛍光色素Ａとが近接した状態の２本鎖ＤＮＡが形成される（Ｃ）。この状態で蛍光色素Ｄを励起する励起光を照射すると、２本鎖ＤＮＡでは、蛍光色素Ｄに吸収されたエネルギーが蛍光色素Ａに移動し、蛍光色素Ａから蛍光が放出される。２本鎖を形成していないＤＮＡ上の蛍光色素Ｄは、励起光を吸収し、そのまま蛍光が放出される。光検出器の受光面（図示せず）の前には、ハイパスフィルターが配置され、蛍光色素Ａからの蛍光は透過するが、蛍光色素Ｄからの蛍光は透過させない。（Ｄ）は、被検物質と（Ｃ）のＤＮＡ試料とを混合した状態を示す。被検物質中にＤＮＡ結合性タンパク質が含まれていると、２本鎖ＤＮＡは、タンパク質に結合する。
【図２】図２は、蛍光相関分光法に於ける蛍光強度の自己相関関数の時間変化の例を示す。ＤＮＡにタンパク質が結合すると（結合した場合）、結合していない場合に比して並進拡散時間が長くなる。
【図３】図３は、本発明による蛍光標識されたＤＮＡプローブをＤＮＡ結合性タンパク質の一種であるＡＰ−１と反応させた場合のＤＮＡプローブの、蛍光相関分光法により測定した蛍光強度の自己相関関数に於ける並進拡散時間のＡＰ−１濃度に対する変化を示すグラフである。
【図４】図３の並進拡散時間が飽和したときに、ＤＮＡプローブの全て（１００％）がＡＰ−１に結合したものとして換算したＡＰ−１が結合したＤＮＡプローブの割合ＹのＡＰ−１濃度に対する変化を示すグラフである。ＡＰ−１の結合したＤＮＡのＹの算出は、1分子蛍光分析システムＭＦ２０の解析機能（LowHighFixモード）を用いて行った。図中、点線は、ＡＰ−１とＤＮＡとが一対一に結合するとしたときのＡＰ−１が結合したＤＮＡプローブの割合を表す曲線をフィッティングしたものである。
【図１】
2010057364.tif 000004
【図２】
2010057364.tif 000005
【図３】
2010057364.tif 000006
【図４】
2010057364.tif 000007
【配列表】
2010057364000001.app