(57)【要約】【課題】リン酸化合物に対する新規な分子インプリントポリマーおよびその製造方法を開発し、その保持能および分子認識能を評価するとともにリン酸化ペプチドの特異的認識への適用を検討する。【解決手段】ポリマー鎖内に、機能性モノマーとして４−ビニルピリジンを用いて形成された部位を有し、当該部位によってリン酸化合物を特異的に認識する、分子インプリントポリマー、ならびにその製造方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー鎖内に、機能性モノマーとして４−ビニルピリジンを用いて形成された部位を有し、当該部位によってリン酸化合物を特異的に認識する、分子インプリントポリマー。
【請求項２】
ｐＨ７以下の条件で用いられる、請求項１に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項３】
ＢＥＴ法により測定された比表面積が５０〜４００ｍ2／ｇ、細孔容量が０．０５〜１ｃｍ3／ｇ、平均細孔径が０．５〜１０ｎｍである、請求項１または２に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項４】
ポリマー鎖の形成に用いられるテンプレート分子がリン酸ジフェニルまたはリン酸１−ナフチルである、請求項１〜３のいずれかに記載の分子インプリントポリマー。
【請求項５】
テンプレート分子と、当該テンプレート分子と相互作用を有する機能性モノマーと、架橋剤と、希釈剤とを用いた多段階膨潤重合法によって製造されたものであり、
架橋剤がグリセロールジメタクリレートまたはエチレングリコールジメタクリレートであり、希釈剤がシクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールである、請求項４に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項６】
テンプレート分子がリン酸ジフェニル、架橋剤がグリセロールジメタクリレート、希釈剤が１−ヘキサノールである、請求項５に記載の分子インプリントポリマー。
【請求項７】
テンプレート分子と、当該テンプレート分子と相互作用を有する機能性モノマーと、架橋剤と、希釈剤とを用いた多段階膨潤重合法によって分子内インプリントポリマーを製造する方法であって、
テンプレート分子がリン酸ジフェニルまたはリン酸１−ナフチルであり、機能性モノマーが４−ビニルピリジンであり、架橋剤がグリセロールジメタクリレートまたはエチレングリコールジメタクリレートであり、希釈剤がシクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールである、分子インプリントポリマーの製造方法。
【請求項８】
テンプレート分子がリン酸ジフェニル、架橋剤がグリセロールジメタクリレート、希釈剤が１−ヘキサノールである、請求項７に記載の分子インプリントポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リン酸化合物を特異的に認識する部位を有する分子インプリントポリマーおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子インプリント法は、テンプレート分子とその分子と相互作用を持つ機能性モノマーとの複合体を形成後、架橋剤の存在下で重合し、テンプレート分子を除去することにより、ポリマー鎖内にテンプレート分子を特異的に認識する部位を有する分子インプリントポリマー（Moleculary imprinted polymer；ＭＩＰ）を創製する方法である。
【０００３】
一方、タンパク質のリン酸化は、細胞内情報伝達系、代謝調節などにおいて、重要な役割を担っており、注目されている翻訳後修飾の１つである。リン酸化タンパク質の同定、リン酸化部位の特定は重要な課題であり、リン酸化プロテオーム解析が行われている。
【０００４】
そこで、リン酸化タンパク質およびリン酸化ペプチドの認識を目的として、リン酸化合物に対するＭＩＰを製造し、リン酸化ペプチドの特異的認識への適用が試みられてきている。従来、リン酸化合物の認識を目的としたＭＩＰとしては、たとえばA. Kugimiya and H. Taki, Anal. Chim Acta, 606, 252(2008)（非特許文献１）に開示された、テンプレート分子としてリン酸ジフェニル、機能性モノマーとして１−アリル−２−チオ尿素、架橋剤としてエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）を用いて調製されたＭＩＰが知られている。また、たとえばK. Moller et al., J. Chromatogr. A, 938, 121(2001)（非特許文献２）に開示された、テンプレート分子としてリン酸ジトリル、機能的モノマーとしてメタクリル酸または２−ビニルピリジン、架橋剤としてエチレングリコールジメタクリレート（ＥＤＭＡ）を用いて調製されたＭＩＰ、たとえばA. J. Hall et al., Anal. Chim Acta, 538, 9(2005)（非特許文献３）に開示された、テンプレート分子としてリン酸トリフェニルまたはリン酸ジエチルフェニル、機能性モノマーとして１，３−ジアリール尿素、架橋剤としてＥＤＭＡを用いて調製されたＭＩＰなども知られている。
【非特許文献１】A. Kugimiya and H. Taki, Anal. Chim Acta, 606, 252(2008）
【非特許文献２】K. Moller et al., J. Chromatogr. A, 938, 121(2001)
【非特許文献３】A. J. Hall et al., Anal. Chim Acta, 538, 9(2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、リン酸化合物に対する新規な分子インプリントポリマーおよびその製造方法を開発し、その保持能および分子認識能を評価するとともにリン酸化ペプチドの特異的認識への適用を検討することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の分子インプリントポリマーは、ポリマー鎖内に、機能性モノマーとして４−ビニルピリジンを用いて形成された部位を有し、当該部位によってリン酸化合物を特異的に認識することを特徴とする。
【０００７】
本発明の分子インプリントポリマーは、ｐＨ７以下の条件で用いられることが好ましい。
【０００８】
また、本発明の分子インプリントポリマーは、ＢＥＴ法により測定された比表面積が４０〜４００ｍ2／ｇ、細孔容量が０．０５〜１ｃｍ3／ｇ、平均細孔径が０．５〜１０ｎｍであるのが好ましい。
【０００９】
本発明の分子インプリントポリマーは、ポリマー鎖の形成に用いられるテンプレート分子がリン酸ジフェニルまたはリン酸１−ナフチルであることが好ましい。
【００１０】
本発明の分子インプリントポリマーはまた、テンプレート分子と、当該テンプレート分子と相互作用を有する機能性モノマーと、架橋剤と、希釈剤とを用いた多段階膨潤重合法によって製造されたものであり、架橋剤がグリセロールジメタクリレートまたはエチレングリコールジメタクリレートであり、希釈剤がシクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールであることが好ましい。さらにこの場合、テンプレート分子がリン酸ジフェニル、架橋剤がグリセロールジメタクリレート、希釈剤が１−ヘキサノールであることがより好ましい。
【００１１】
本発明はまた、テンプレート分子と、当該テンプレート分子と相互作用を有する機能性モノマーと、架橋剤と、希釈剤とを用いた多段階膨潤重合法によって分子内インプリントポリマーを製造する方法であって、テンプレート分子がリン酸ジフェニルまたはリン酸１−ナフチルであり、機能性モノマーが４−ビニルピリジンであり、架橋剤がグリセロールジメタクリレートまたはエチレングリコールジメタクリレートであり、希釈剤がシクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールである分子インプリントポリマーの製造方法についても提供する。
【００１２】
本発明の分子インプリントポリマーの製造方法において、テンプレート分子がリン酸ジフェニル、架橋剤がグリセロールジメタクリレート、希釈剤が１−ヘキサノールであることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、リン酸化合物に対する新規な分子インプリントポリマーおよびその製造方法が提供される。このような分子インプリントポリマーは、リン酸化ペプチドの特異的認識に好適に用いられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
＜分子インプリントポリマーの製造方法＞
まず、本発明の分子インプリントポリマー（以下、「ＭＩＰ」）の製造方法について説明する。本発明のＭＩＰの製造方法は、テンプレート分子と、当該テンプレート分子と相互作用を有する機能性モノマーと、架橋剤と、希釈剤とを用いた多段階膨潤重合法を用いることを前提とする。ここで、図１は、本発明に用いられる多段階膨潤重合法を模式的に示す図である。多段階膨潤重合法は、種粒子を膨潤助剤を用いて膨潤させ、これに希釈剤、開始剤を添加し、さらに、テンプレート分子、機能性モノマーおよび架橋剤を添加し、熱重合させて、ＭＩＰを製造する方法である。このような多段階膨潤重合法を用いてＭＩＰを製造することで、他の方法（たとえば、塊状重合法や懸濁重合法など）でＭＩＰを製造する場合と比較して、粒子径の均一な球状の粒子が得られるという利点がある。
【００１５】
本発明のＭＩＰの製造方法において、種粒子としては、たとえばポリスチレン種粒子、ポリメタクリル酸エステルの種粒子などが用いられるが、中でも、得られる種粒子の粒子径の変動係数が小さいことから、ポリスチレン種粒子が好ましい。
【００１６】
本発明のＭＩＰの製造方法に用いられる膨潤助剤としては、特に制限されるものではないが、たとえば１−クロロドデカン、フタル酸ジブチルなどが挙げられる。中でも、粒子径の均一な多孔性の粒子を製造するのに好適な、フタル酸ジブチルを膨潤助剤として用いることが好ましい。膨潤助剤は種粒子を膨潤させ得る程度の量を添加すればよく、添加量についても特に制限されるものではないが、種粒子１００重量部に対し１００〜６０００重量部の範囲内で添加することが好ましい。
【００１７】
本発明のＭＩＰの製造方法に用いられる希釈剤としては、シクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールが用いられる。シクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールを希釈剤として用いることで、他の希釈剤（トルエン、クロロホルムなど）を用いる場合と比較して、テンプレート分子が溶け易いという利点がある。中でも、リン酸化合物に対して認識能の高いＭＩＰが得られることから、１−ヘキサノールを希釈剤として用いることが好ましい。希釈剤の添加量についても特に制限されるものではないが、テンプレート分子１００重量部に対し２００〜２００００重量部の範囲内で添加することが好ましく、５００〜４０００重量部の範囲内で添加することがより好ましい。希釈剤の添加量がテンプレート分子１００重量部に対し２００重量部未満である場合には、認識サイトの数が少ない傾向にあるためであり、また、２００００重量部を超える場合には、粒子の耐圧性が低い傾向にあるためである。
【００１８】
本発明のＭＩＰの製造方法に用いられる開始剤としては、特に制限されるものではないが、たとえばアゾビスイソブチロニトリル、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）、過酸化ベンゾイルなどが挙げられる。中でも、希釈剤およびモノマーに溶解しやすいことから、２，２−アゾビス（２，４−ジメチルバレロニトリル）を開始剤として用いることが好ましい。開始剤の添加量についても特に制限されるものではないが、テンプレート分子１００重量部に対し２０〜２０００重量部の範囲内で添加することが好ましい。
【００１９】
本発明のＭＩＰの製造方法では、膨潤助剤、希釈剤および開始剤を添加した後の膨潤した状態の種粒子に、テンプレート分子、機能性モノマーおよび架橋剤をさらに添加する。本発明においては、テンプレート分子としては、下記式
【００２０】
【化１】
2010100708.tif 000003
【００２１】
で示されるリン酸ジフェニル（以下、「ＤＰＰ」）または下記式
【００２２】
【化２】
2010100708.tif 000004
【００２３】
で示されるリン酸１−ナフチル（以下、「１−ＮａｐＰ」）が用いられる。ＤＰＰまたは１−ＮａｐＰをテンプレート分子として用いることで、他のテンプレート分子（たとえばリン酸ジトリル、リン酸トリフェニル、リン酸ジエチルフェニルなど）を用いる場合と比較して、リン酸化合物を群特異的に認識可能であるという利点がある。中でも、リン酸化合物に対して高い認識能が得られることから、ＤＰＰをテンプレート分子として用いることが好ましい。
【００２４】
また本発明のＭＩＰの製造方法においては、機能性モノマーとして４−ビニルピリジン（以下、「４−ＶＰＹ」）を用いる。４−ＶＰＹは市販されており、合成する必要がある１−アリル−２−チオ尿素、１，３−ジアリール尿素などの他の機能性モノマーを用いる場合と比較して、簡便に利用できるためである。
【００２５】
機能性モノマーの添加量についても特に制限されるものではないが、テンプレート分子１００重量部に対し２０〜１０００重量部の範囲内であることが好ましく、１００〜５００重量部の範囲内であることがより好ましい。機能性モノマーの添加量がテンプレート分子１００重量部に対し２０重量部未満である場合には、分子認識能が低い傾向にあるためであり、また、１０００重量部を超える場合には、非特異的な吸着が起こる傾向にあるためである。
【００２６】
また、本発明においては、架橋剤としては、下記式
【００２７】
【化３】
2010100708.tif 000005
【００２８】
で示されるグリセロールジメタクリレート（以下、「ＧＤＭＡ」）または下記式
【００２９】
【化４】
2010100708.tif 000006
【００３０】
で示されるエチレングリコールジメタクリレート（以下、「ＥＤＭＡ」）が用いられる。ＧＤＭＡまたはＥＤＭＡを架橋剤として用いることで、他の架橋剤（たとえばジビニルベンゼンあるいはポリ（メタ）アクリレートなど）を用いる場合と比較して、得られたＭＩＰがテンプレート分子に対し高い選択性を示すという利点があり、かかる観点からは、上記中でも、ＧＤＭＡを架橋剤として用いることが好ましい。
【００３１】
架橋剤の添加量については特に制限されるものではないが、テンプレート分子１００重量部に対し１００〜１００００重量部の範囲内で添加することが好ましく、５００〜５０００重量部の範囲内で添加することがより好ましい。架橋剤の添加量がテンプレート分子１００重量部に対し１００重量部未満である場合には、粒子の耐圧性に問題があるためであり、また、１００００重量部を超える場合には、分子認識能が低い傾向にあるためである。
【００３２】
多段階膨潤重合法では、上述したようなテンプレート分子、機能性モノマーおよび架橋剤を添加した後、加熱して重合させる。重合温度は４０〜８０℃の範囲内であることが好ましく、５０〜６０℃の範囲内であることがより好ましい。重合温度が４０℃未満である場合、重合速度が遅いまたは重合が不完全である傾向にあるためであり、また、重合温度が８０℃を超えると、分子認識能が低い傾向にあるためである。重合時間は特に制限されないが、分子認識能の高い、安定なＭＩＰを得る観点からは、１２〜２４時間程度であることが好ましい。
【００３３】
＜分子インプリントポリマー＞
上述したような本発明のＭＩＰの製造方法によって、ポリマー鎖内に、機能性モノマーとして４−ＶＰＹを用いて形成された部位を有し、当該部位によってリン酸化合物を特異的に認識するＭＩＰが好適に製造される。本発明は、このようなＭＩＰについても提供する。なお、本発明のＭＩＰは、ポリマー鎖内に、機能性モノマーとして４−ＶＰＹを用いて形成された部位を有し、当該部位によってリン酸化合物を特異的に認識するものであればよく、本発明の製造方法によって製造されたものに限定されるものではないが、粒子径の均一な、球状の粒子が得られることから、上述した本発明のＭＩＰの製造方法によって製造されたものであることが好ましい。
【００３４】
本発明のＭＩＰは、リン酸化合物に対する保持能を増加させる観点から、ｐＨ７以下の条件で用いられることが好ましく、ｐＨ６以下の条件で用いられることがより好ましい。実験例で後述するように、本発明のＭＩＰのリン酸化合物に対する保持能について、液体クロマトグラフを用いて、移動相ｐＨ３〜６の範囲で評価したところ、移動相ｐＨが低くなるとともにリン酸化合物の保持が増加した。このことは、リン酸化合物の保持および認識に、形状認識に加え、ＭＩＰとの水素結合が重要な役割を果たしていることを示唆する。なお、得られたＭＩＰのｐＨ安定性の観点からは、本発明のＭＩＰは、ｐＨ２以上の条件で用いられることが好ましく、ｐＨ３以上の条件で用いられることがより好ましい。
【００３５】
本発明のＭＩＰは、比表面積・細孔分布測定装置Ｔｒｉｓｔａｒ（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を用い、ＢＥＴ法により測定された比表面積が５０〜４００ｍ2／ｇ（より好適には１００〜３００ｍ2／ｇ）、細孔容量が０．０５〜１ｃｍ3／ｇ（より好適には０．１〜０．５ｃｍ3／ｇ）、平均細孔径が０．５〜１０ｎｍ（より好適には１〜５ｎｍ）であることが好ましい。ＭＩＰの表面積が５０〜４００ｍ2／ｇの範囲内であり、細孔容量が０．０５〜１ｃｍ3／ｇの範囲内であり、かつ、平均細孔径が０．５〜１０ｎｍの範囲内であることで、リン酸化合物に対する群特異的な認識能が得られるという利点がある。
【００３６】
また本発明のＭＩＰは、高速液体クロマトグラフＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所製）を用い、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）法により測定されたミクロ細孔容量が０．０２〜０．１ｍＬ（より好適には０．０２〜０．０８ｍＬ）、メソ細孔容量が０．０２〜０．１ｍＬ（より好適には０．０２〜０．０８ｍＬ）、マクロ細孔容量が０．１〜１ｍＬ（より好適には０．１〜０．５ｍＬ）であることが好ましい。ＭＩＰのミクロ細孔容量が０．０２〜０．１ｍＬの範囲内であり、メソ細孔容量が０．０２〜０．１ｍＬの範囲内であり、かつ、マクロ細孔容量が０．１〜１ｍＬの範囲内であることで、リン酸化合物に対する群特異的な認識能が得られるという利点がある。
【００３７】
本発明のＭＩＰにおいて、ポリマー鎖の形成に用いられるテンプレート分子はＤＰＰまたは１−ＮａｐＰであることが好ましい。ポリマー鎖の形成に用いられるテンプレート分子がＤＰＰまたは１−ＮａｐＰであることで、他のテンプレート分子を用いてポリマー鎖を形成した場合と比較して、リン酸化合物に対する群特異的な分子認識能が得られるという利点があるためである。
【００３８】
本発明のＭＩＰはまた、テンプレート分子と、当該テンプレート分子と相互作用を有する機能性モノマーと、架橋剤と、希釈剤とを用いた多段階膨潤重合法によって製造されたものであり、架橋剤がＧＤＭＡまたはＥＤＭＡであり、希釈剤がシクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールであることが好ましい。上述したように、ＧＤＭＡまたはＥＤＭＡを架橋剤として用いることで、他の架橋剤を用いる場合と比較して、リン酸化合物に対して群特異的な認識能が得られるという利点がある。また、希釈剤としてシクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールを用いることで、他の希釈剤を用いる場合と比較して、リン酸化合物に対して群特異的な認識能が得られるという利点がある。
【００３９】
上述した中でも、リン酸化合物に対し高い保持能および分子認識能を有し、さらには、リン酸化合物に対して群特異的な認識能が得られるという利点があることから、本発明のＭＩＰは、テンプレート分子がＤＰＰ、架橋剤がＧＤＭＡ、希釈剤が１−ヘキサノールであることが、特に好ましい。
【００４０】
本発明のＭＩＰは、リン酸化合物に対し高い保持能および分子認識能を有するものである。本発明のＭＩＰは、たとえばアデノシン（Adenosine）に対する保持係数ｋが０．５以上、選択係数Ｓが１．１以上であり、ＡＭＰ（Adenosine 5'-monophosphate）に対する保持係数ｋが１０以上、選択係数Ｓが２．５以上であり、ＡＤＰ（Adenosine 5'-diphosphate）に対する保持係数ｋが４５以上、選択係数Ｓが４．５以上であり、また、ＡＴＰ（Adenosine 5'-triphosphate）に対する保持係数ｋが１００以上、選択係数Ｓが６以上であることが好ましい。このように本発明のＭＩＰは、アデノシン＜ＡＭＰ＜ＡＤＰ＜ＡＴＰの順で、リン酸基の数が増すほど、保持能および分子認識能が大きくなる。なお、保持係数ｋは、以下の条件でのＨＰＬＣの結果から算出され、また、選択係数Ｓは、ＭＩＰの保持係数（ｋMIP）とＮＩＰの保持係数（ｋNIP）との比（ｋMIP／ｋNIP）から算出された値を指す。
【００４１】
・カラムサイズ：５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．
・カラム形成材料：ステンレス
・溶出液：１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液−アセトニトリル(15/85(v/v))
・カラム温度：２５℃
・流量：１．０ｍＬ／分
・検出：２１０ｎｍ
・注入量：１０００ｎｇ
このようにリン酸化合物に対し高い保持能および分子認識能を有する本発明のＭＩＰは、リン酸化ペプチドの選択的濃縮に好適に適用できると考えられる。リン酸化ペプチドの精製・濃縮法としては、従来、Ｆｅ3+、Ｇａ3+などの三価の陽イオン、二核金属錯体（Ｐｈｏｓ−ｔａｇ）などを用いた固定化金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、酸化チタン（ＴｉＯ2）、酸化ジルコニア（ＺｒＯ2）、ヒドロキシ酸修飾酸化金属クロマトグラフィー、酸化チタン（ＴｉＯ2）の焼成（ルチル型の結晶構造）などを用いた酸化金属クロマトグラフィーなどが挙げられるが、本発明のＭＩＰを用いたリン酸化ペプチドの選択的濃縮によれば、これらの方法と比較してリン酸化合物に対して群特異的な認識能が得られるという利点がある。また、本発明のＭＩＰは、上述したようにリン酸化ペプチドに対し選択性を示すことから、リン酸化プロテオーム解析に応用できる可能性が示唆される。
【００４２】
以下に実験例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実験例に限定されるものではない。
【００４３】
＜実験例１＞
（リン酸化合物に対するＭＩＰの調製）
テンプレート分子にＤＰＰまたは１−ＮａｐＰ、機能性モノマーに４−ＶＰＹ、架橋剤にＧＤＭＡまたはＥＤＭＡ、希釈剤にシクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールを用い、表１に示す組み合わせで、図１に示した多段膨潤重合法によって、それぞれ５０℃で２４時間重合し、ＭＩＰ１〜４を調製した。
【００４４】
【表１】
2010100708.tif 000007
【００４５】
なお、種粒子としてはポリスチレン種粒子を用い、テンプレート分子であるＤＰＰまたは１−ＮａｐＰはこのポリスチレン種粒子１００重量部に対し３００重量部、４−ＶＰＹはＤＰＰまたは１−ＮａｐＰ１００重量部に対し８０重量部、架橋剤であるＧＤＭＡまたはＥＤＭＡはＤＰＰまたは１−ＮａｐＰ１００重量部に対し２０００重量部、希釈剤であるシクロヘキサノールまたは１−ヘキサノールはポリスチレン種粒子１００重量部に対し６２５０重量部添加した。
【００４６】
（ＮＩＰの調製）
また、比較のためにテンプレート分子を用いないこと以外は同一の条件下で重合したノンインプリントポリマー（Non−imprinted polymer：ＮＩＰ）１〜４（ＮＩＰ１〜４）も調製した。
【００４７】
＜実験例２＞
（ＭＩＰ４の移動相ｐＨの影響、分子認識能の評価）
架橋剤としてＥＤＭＡを用いたＭＩＰ４について、以下の条件でＨＰＬＣを行い、テンプレート分子であるＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する移動相ｐＨの影響を評価した。また、ＮＩＰ４についても同様の条件でＨＰＬＣを行い、ＭＩＰ４の保持係数（ｋMIP）とＮＩＰ４の保持係数（ｋNIP）との比（ｋMIP／ｋNIP）を選択係数Ｓと定義し、ＭＩＰ４のＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する分子認識能を評価した。
【００４８】
・カラムサイズ：５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．
・カラム形成材料：ステンレス
・溶出液：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液−アセトニトリル(50/50(v/v))
・カラム温度：２５℃
・流量：０．５ｍＬ／分
・検出：２１０ｎｍ
・注入量：２５０ｎｇ
図２は、ＭＩＰ４におけるＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する移動相ｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸は保持係数（ｋ）、横軸は溶出液のｐＨである（図２中、実線がＤＰＰ、破線が１−ＮａｐＰ）。また、図３は、ＭＩＰ４におけるＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する分子認識能を示すグラフであり、縦軸は選択係数（Ｓ）である。図２、３から、架橋剤にＥＤＭＡを用いて調製したＭＩＰは、テンプレート分子であるＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する選択性が低いことが分かる。このことから、以下の実験例では、架橋剤としてＧＤＭＡを用いたＭＩＰ１〜３について検討した。
【００４９】
＜実験例３＞
（ＭＩＰ１〜３の移動相ｐＨの影響、分子認識能の評価）
架橋剤としてＧＤＭＡを用いたＭＩＰ１〜３について、以下の条件でＨＰＬＣを行い、テンプレート分子であるＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する移動相ｐＨの影響を評価した。また、ＮＩＰ１〜３についても同様の条件でＨＰＬＣを行い、ＭＩＰの保持係数（ｋMIP）とＮＩＰの保持係数（ｋNIP）との比（ｋMIP／ｋNIP）を選択係数Ｓと定義し、ＭＩＰ１〜３それぞれのＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する分子認識能を評価した。
【００５０】
・カラムサイズ：５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．
・カラム形成材料：ステンレス
・溶出液：２０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液−アセトニトリル(50/50(v/v))
・カラム温度：２５℃
・流量：０．５ｍＬ／分
・検出：２１０ｎｍ
・注入量：２５０ｎｇ
図４（ａ）は、ＭＩＰ１〜３におけるＤＰＰに対する移動相ｐＨの影響を示すグラフ、図４（ｂ）は、ＭＩＰ１〜３における１−ＮａｐＰに対する移動相ｐＨの影響を示すグラフであり、それぞれ縦軸は保持係数（ｋ）、横軸は溶出液のｐＨである。図４（ａ），（ｂ）に示す結果から、いずれのＭＩＰも、ｐＨ３〜６の範囲で、移動相ｐＨが低くなるとともにＤＰＰおよび１−ＮａｐＰの保持が増加することが分かる。このような結果は、リン酸化合物の保持および分子認識には、形状認識に加えて、ＭＩＰとの水素結合が重要な役割を果たしていることを示唆している。また、図５は、ＭＩＰ１〜３におけるＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する分子認識能を示すグラフであり、縦軸は選択係数（Ｓ）である。図５から、ＭＩＰ１〜３は、いずれもテンプレート分子に対して高い分子認識能を示すことが分かる。
【００５１】
＜実験例４＞
（ＭＩＰ１〜３の比表面積、細孔容量および平均細孔径の評価）
ＭＩＰ１〜３について、表面積・細孔分布測定装置Ｔｒｉｓｔａｒ（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製）を用いたＢＥＴ法により比表面積、細孔容量および平均細孔径を測定した。
【００５２】
また、ＭＩＰ１〜３について以下の条件でＨＰＬＣを行った。
・カラムサイズ：５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．
・カラム形成材料：ステンレス
・溶出液：テトラヒドロフラン
・カラム温度：２５℃
・流量：０．２ｍＬ／分
・検出：２５４ｎｍ
・注入量：２μｇ
上記ＨＰＬＣの結果に基づき、ＳＥＣ法により以下の各式でミクロ細孔容量、メソ細孔容量およびマクロ細孔容量を算出した。
【００５３】
・ミクロ細孔容量＝ベンゼンの溶出容量−ヘキシルベンゼンの溶出容量
・メソ細孔容量＝ヘキシルベンゼンの溶出容量−ポリスチレン（分子量：580）の溶出容量
・マクロ細孔容量＝ポリスチレン（分子量：580）の溶出容量−ポリスチレン（分子量：73000000）の溶出容量
ＭＩＰ１〜３のＢＥＴ法により測定された比表面積、細孔容量および平均細孔径、ならびに、ＳＥＣ法により算出されたミクロ細孔容量、メソ細孔容量およびマクロ細孔容量を表２に示す。
【００５４】
【表２】
2010100708.tif 000008
【００５５】
＜実験例５＞
（アデノシン類に対するＭＩＰ１〜３の保持能および分子認識能の評価）
ＭＩＰ１〜３について以下の条件でＨＰＬＣを行い、アデノシン類（ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰおよびアデノシン）に対するＭＩＰ１〜３の保持能および分子認識能を評価した。なお、分子認識能の評価にあたり選択係数Ｓを算出するため、ＮＩＰ１〜３についても同様の条件でＨＰＬＣを行った。その結果、いずれのＭＩＰにおいても、保持係数ｋはアデノシン＜ＡＭＰ＜ＡＤＰ＜ＡＴＰの順となり、溶質のリン酸基の数が増すほど大きくなることが分かった。リン酸化合物に対して最も高い保持能および分子認識能を示したＭＩＰ２を、リン酸化ペプチドの特異的認識に適用した。
【００５６】
・カラムサイズ：５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．
・カラム形成材料：ステンレス
・溶出液：１０ｍＭ  ジヒドロリン酸ナトリウム−アセトニトリル(15/85(v/v))
・カラム温度：２５℃
・流量：１．０ｍＬ／分
・検出：２１０ｎｍ
・注入量：１０００ｎｇ
ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰおよびアデノシンに対する、ＭＩＰ１〜３の保持係数（ｋ）および選択係数（Ｓ＝ｋMIP／ｋNIP）を表３に示す。
【００５７】
【表３】
2010100708.tif 000009
【００５８】
＜実験例６＞
（アデノシン類の保持に対するアセトニトリル含量の影響）
ＭＩＰ２およびＮＩＰ２について以下の条件で、溶出液のアセトニトリル含量を変化させてＨＰＬＣを行い、アデノシン類（ＡＤＰ、ＡＭＰおよびアデノシン）の保持に対するアセトニトリル含量の影響を評価した。
【００５９】
・カラムサイズ：５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．
・カラム形成材料：ステンレス
・溶出液：１０ｍＭ  ジヒドロリン酸ナトリウム−アセトニトリル
・カラム温度：２５℃
・流量：１．０ｍＬ／分
・検出：２１０ｎｍ
・注入量：２５０ｎｇ
図６（ａ）は、ＭＩＰ２におけるアデノシン類の保持に対するアセトニトリル含量の影響を示すグラフ、図６（ｂ）は、ＮＩＰ２におけるアデノシン類の保持に対するアセトニトリル含量の影響を示すグラフであり、それぞれ縦軸は保持係数、横軸はアセトニトリル含量（％）である。
【００６０】
＜実験例７＞
（アデノシン類のクロマトグラム）
ＭＩＰ２およびＮＩＰ２のそれぞれについて、アデノシン、ＡＭＰ、ＡＤＰおよびＡＴＰのＨＰＬＣを行った。図７（ａ）は、ＭＩＰ２におけるＨＰＬＣクロマトグラム、図７（ｂ）はＮＩＰ２におけるＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフであり、いずれも横軸は保持時間（分）である。
【００６１】
・カラムサイズ：５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．
・カラム形成材料：ステンレス
・溶出液：１０ｍＭ  ジヒドロリン酸ナトリウム−アセトニトリル(15/85(v/v))
・カラム温度：２５℃
・流量：１．０ｍＬ／分
・検出：２１０ｎｍ
・注入量：各２５０ｎｇ
＜実験例８＞
（リン酸化ペプチドの特異的認識へのＭＩＰの適用）
リン酸化標準ペプチドとして、エノラーゼトリプシン消化物Ｔ１８  １Ｐ（ＮＶＰＬｐＹＫ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）（同位体質量：８１３．３９〔M＋H〕+）、Ｔ１９  １Ｐ（ＨＬＡＤＬｐＳＫ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）（同位体質量：８６３．４０〔M＋H〕+）、Ｔ４３  １Ｐ（ＶＮＱＩＧｐＴＬＳＥＳＩＫ）（Ｗａｔｅｒｓ社製）（同位体質量：１３６８．６８〔M＋H〕+）を用いた。図８に模式的に示すように、カラム（１０ｍｍ×４．０ｍｍ  ｉ．ｄ．）とＯＤＳカラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ18−ＡＲ−ＩＩ、１５０ｍｍ×２．０ｍｍ  ｉ．ｄ．）とを接続したＬＣ／ＭＳシステムを用いて、移動相に０．５％酢酸および０．５％酢酸を含む水−アセトニトリルの混液を用い、グラジエント溶出を行い、検出はＥＳＩ正イオンモードで、ｓｉｎｇｌｅ  ｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ（ＳＩＭ）法により行い、ＭＩＰ２およびＮＩＰ２についてリン酸化ペプチドの特異的認識能の評価を行った。ＬＣ条件は以下のとおりである。
【００６２】
・前処理カラムのサイズ：１０ｍｍ×４．０ｍｍ  ｉ．ｄ．
・分析カラムのサイズ：１５０ｍｍ×２．０ｍｍ  ｉ．ｄ．
（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ18−Ａｒ−ＩＩ）
・溶出液Ａ：０．５％酢酸
・溶出液Ｂ：０．５％酢酸を含むアセトニトリル−水（80:20(v/v)）
・線状勾配：５−１０％溶出液Ｂ  ５分間
１０−４０％溶出液Ｂ  ６０分間
４０−１００％溶出液Ｂ  ５分間
１００％溶出液Ｂ  １０分間
・カラム温度：２５℃
・流量：０．２ｍＬ／分
・試料サイズ：リン酸化ペプチド  ５０ｐｍｏｌ
・注入容量：５μｌ
図９（ａ）は、ＮＩＰ２についてのリン酸化ペプチドのＳＩＭクロマトグラム、図９（ｂ）はＭＩＰ２についてのリン酸化ペプチドのＳＩＭクロマトグラムを示しており、いずれも横軸は時間（分）である。図９（ａ）、（ｂ）から、ＭＩＰ２は、リン酸化ペプチドに対し認識能を示したことから、リン酸化プロテオーム解析に応用できる可能性が示唆された。
【００６３】
＜実験例９＞
（トリプシン消化後のリン酸化ペプチドの特異的認識へのＭＩＰの適用）
試料として、α−ｃａｓｅｉｎのトリプシン消化物を用いた。ＭＩＰ２またはＮＩＰ２とＯＤＳカラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ18−ＡＲ−ＩＩ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ）を接続し、移動相として０．１％トリフルオロ酢酸と０．１％トリフルオロ酢酸を含む水−アセトニトリルの混液を用い、グラジエント溶出を行い、検出は２１５ｎｍで行った。ＭＩＰ２、ＮＩＰ２を用いて得られたクロマトグラムを比較し、ＮＩＰ２を用いた場合にのみ検出されたピークを分取し、遠心濃縮後、マトリックスとしてα−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄを加え、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより質量スペクトルを得た。次に、主要な質量ピークのリストを作成し、ＥｘＰＡＳｙを用いて、検索・解析した。その結果、α−ｃａｓｅｉｎのトリプシン消化物に含まれているリン酸化ペプチドを検出し、同定することができた。以上の結果より、調製したＭＩＰはリン酸化ペプチドの認識が可能であり、リン酸化プロテオーム解析におけるリン酸化ペプチドの検出および同定に適用できることが明らかとなった。
【００６４】
今回開示された実施の形態および実験例は、全ての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記した説明ではなくて特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明に用いられる多段階膨潤重合法を模式的に示す図である。
【図２】ＭＩＰ４におけるＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する移動相ｐＨの影響を示すグラフであり、縦軸は保持係数（ｋ）、横軸は溶出液のｐＨである（図２中、実線がＤＰＰ、破線が１−ＮａｐＰ）。
【図３】ＭＩＰ４におけるＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する分子認識能を示すグラフであり、縦軸は選択係数（Ｓ）である。
【図４】図４（ａ）は、ＭＩＰ１〜３におけるＤＰＰに対する移動相ｐＨの影響を示すグラフ、図４（ｂ）は、ＭＩＰ１〜３における１−ＮａｐＰに対する移動相ｐＨの影響を示すグラフであり、それぞれ縦軸は保持係数（ｋ）、横軸は溶出液のｐＨである。
【図５】ＭＩＰ１〜３におけるＤＰＰ、１−ＮａｐＰに対する分子認識能を示すグラフであり、縦軸は選択係数（Ｓ）である。
【図６】図６（ａ）は、ＭＩＰ２におけるアデノシン類の保持に対するアセトニトリル含量の影響を示すグラフ、図６（ｂ）は、ＮＩＰ２におけるアデノシン類の保持に対するアセトニトリル含量の影響を示すグラフであり、それぞれ縦軸は保持係数、横軸はアセトニトリル含量（％）である。
【図７】図７（ａ）は、ＭＩＰ２におけるアデノシン類のＨＰＬＣクロマトグラム、図７（ｂ）はＮＩＰ２におけるアデノシン類のＨＰＬＣクロマトグラムを示すグラフであり、いずれも横軸は保持時間（分）である。
【図８】実験例８に用いたＬＣ／ＭＳシステムを模式的に示す図である。
【図９】図９（ａ）は、ＮＩＰ２についてのリン酸化ペプチドのＳＩＭクロマトグラム、図９（ｂ）はＭＩＰ２についてのリン酸化ペプチドのＳＩＭクロマトグラムであり、いずれも横軸は時間（分）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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