【手続補正書】
【提出日】令和3年11月1日(2021.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）カシタスB系統リンパ腫プロトオンコジーン-b（CBLB）遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNAと、RNAガイドヌクレアーゼとを含む、ゲノム編集システム、または
（ii）CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNAをコードするポリヌクレオチドと、RNAガイドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む、ベクター
のうちの1つを細胞に投与する工程を含む、前記細胞内のCBLB遺伝子発現を改変する方法であって、前記gRNAおよびRNAガイドヌクレアーゼが30％以上の頻度で挿入または欠失をもたらす、方法。
【請求項２】
前記ターゲティングドメインが、
SEQ ID NO：1〜14からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列を含む、および／もしくは
前記RNAガイドヌクレアーゼが化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）Cas9ヌクレアーゼであり、
前記ターゲティングドメインが、
（a）SEQ ID NO：3、
（b）SEQ ID NO：4、
（c）SEQ ID NO：8、
（d）SEQ ID NO：12、および
（e）SEQ ID NO：14
からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列を含む、
請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記RNAガイドヌクレアーゼが、黄色ブドウ球菌（S.aureus）Cas9ヌクレアーゼであり、任意で、
i）前記黄色ブドウ球菌Cas9ヌクレアーゼが、NNNRRTまたはNNNRRVのいずれかのPAMを認識し、前記ゲノム編集システムがCBLBを標的とする、および／もしくは
ii）前記RNAガイドヌクレアーゼが変異体Cas9ヌクレアーゼである、
請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
i）前記ターゲティングドメインが、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、または約26ヌクレオチドの長さを有し、任意で、前記ターゲティングドメインが、CBLB遺伝子に相補的な少なくとも約18個の連続したヌクレオチドを含む、および／もしくは
ii）前記ゲノム編集システムが、2つ、3つ、または4つの別個のgRNAを含む、
請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記ゲノム編集システムが、細胞内のCBLB遺伝子発現を低下させるかまたは排除し、任意で、
i）前記細胞が、癌に罹患している対象に由来し、任意で、フレームシフト変異が前記CBLB遺伝子に導入される、もしくは
ii）前記ゲノム編集システムが、ベースライン測定値と比較して30％以上CBLBの発現を低下させ、任意で、CBLBタンパク質の発現が、ウエスタンブロットまたは間接的細胞内染色フローサイトメトリーによって決定される、
請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
i）CBLB遺伝子発現がノックアウトまたはノックダウンされる、および／もしくは
ii）前記細胞が、癌に罹患している対象に由来する、
請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が免疫細胞であり、任意で、
i）前記免疫細胞がT細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞であり、任意で、前記T細胞がCD4+および／またはCD8+T細胞である、および／もしくは
ii）前記免疫細胞が、操作されたT細胞受容体（eTCR）、キメラ抗原受容体（CAR）、組換え抗原受容体または操作された抗原受容体を含む、
請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記免疫細胞が、操作された免疫細胞であり、かつ
i）操作されていない免疫細胞と比較して、CD28共刺激の非存在下で増殖を維持するか、または増強されている、もしくは
ii）操作されていない免疫細胞と比較して、サイトカインの非存在下で増殖を維持するか、または増強されている、もしくは
iii）操作されていない免疫細胞と比較して、IFN-γ、IL-2、およびTNF-αの発現を維持するか、または増加されている、もしくは
iv）操作されていない免疫細胞と比較して、標的細胞殺傷能力を維持するか、または増加されている、
請求項7記載の方法。
【請求項９】
i）前記gRNAおよび前記RNAガイドヌクレアーゼが、リボ核タンパク質（RNP）複合体を構成する、もしくは
ii）前記方法が、別個のgRNAを含む2つ以上のRNP複合体を投与する工程を含み、任意で、別個のgRNAを含む2つのRNP複合体を使用して、前記細胞内のCBLB遺伝子にオフセット一本鎖切断を形成する、もしくは
iii）前記RNP複合体が、酵素的に活性なCas9（eaCas9）ヌクレアーゼを含み、任意で、前記RNP複合体が、標的核酸に二本鎖切断を形成するかまたは標的核酸に一本鎖切断を形成する、eaCas9ヌクレアーゼを含む、
請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
a）CBLBを標的とする十分な量の前記gRNA、および前記RNAガイドヌクレアーゼと、前記細胞とを接触させる工程、ならびに
b）前記細胞のCBLB遺伝子内のCBLB標的位置にまたはその近くに、第1のDNA二本鎖切断を形成する工程であって、前記第1のDNA二本鎖切断がNHEJによって修復され、前記修復が前記CBLB遺伝子の発現を改変する、工程
を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記挿入または欠失の頻度が、40％以上、または50％以上である、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか一項記載の方法に従って改変された細胞。
【請求項１３】
対象の癌を治療する方法において使用するための操作された免疫細胞であって、該方法が、操作された免疫細胞を対象に投与する工程を含み、前記操作された免疫細胞が、CBLB遺伝子の低下した発現を有し、かつ任意で、操作されたT細胞受容体（eTCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を有し、前記操作された免疫細胞が、CBLB遺伝子の近くに挿入または欠失を有する、操作された免疫細胞。
【請求項１４】
i）前記操作された免疫細胞が、T細胞またはNK細胞を含む、もしくは、
ii）前記eTCRまたはCARが、癌細胞に対して抗原特異性を有する、もしくは、
iii）前記CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNAと、RNAガイドヌクレアーゼとを含むゲノム編集システムを前記免疫細胞に導入することにより、前記操作された免疫細胞内のCBLB発現が低下する、もしくは、
iv）T細胞が、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞である、
請求項13記載の使用のための操作された免疫細胞。
【請求項１５】
前記操作された免疫細胞が、
i）操作されていない免疫細胞と比較して、CD28共刺激の非存在下で増殖を維持するか、または増強されている、もしくは、
ii）操作されていない免疫細胞と比較して、サイトカインの非存在下で増殖を維持するか、または増強されている、もしくは、
iii）操作されていない免疫細胞と比較して、IFN-γ、IL-2、およびTNF-αの発現を維持するか、または増加されている、もしくは、
iv）操作されていない免疫細胞と比較して、標的細胞殺傷能力を維持するか、または増加されている、
請求項13記載の使用のための操作された免疫細胞。
【請求項１６】
CD28共刺激が低下または欠如している免疫細胞の増殖を増強する方法であって、
CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNA分子と、RNAガイドヌクレアーゼとを含むゲノム編集システムを、該免疫細胞に導入する工程、および
該免疫細胞内のCBLB発現を低下させる工程
を含む、方法。
【請求項１７】
サイトカインが欠如または減少している状態で増殖を増強する工程をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
サイトカインIL-2、IL-7、およびIL-15の欠如または減少がある、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
カシタスB系統リンパ腫プロトオンコジーン-b（CBLB）遺伝子を標的とする第1のgRNAと、
T細胞受容体αコンスタント（TRAC）遺伝子を標的とする第2のgRNAと、
T細胞受容体βコンスタント（TRBC）遺伝子を標的とする第3のgRNAと、
RNAガイドヌクレアーゼと
を含む、ゲノム編集システム。
【請求項２０】
CBLB遺伝子を標的とする第1のgRNAと、
TRAC遺伝子を標的とする第2のgRNAと、
TRBC遺伝子を標的とする第3のgRNAと
を含む、組成物。
【請求項２１】
操作された免疫細胞を対象に投与する工程を含む、前記対象の癌を治療する方法であって、前記操作された免疫細胞では、CBLB遺伝子発現が低下し、TRAC遺伝子発現が低下し、かつTRBC発現が低下している、方法。
【請求項２２】
前記操作された免疫細胞が、操作されたT細胞受容体（eTCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を発現する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記eTCRまたはCARが、癌抗原に対して特異性を有する、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
CBLB遺伝子ノックアウトと、
TRAC遺伝子ノックアウトと、
TRBC遺伝子ノックアウトと
を含む、操作された免疫細胞。
【請求項２５】
CBLB遺伝子ノックダウンと、
TRAC遺伝子ノックダウンと、
TRBC遺伝子ノックダウンと
を含む、操作された免疫細胞。
【請求項２６】
CBLB遺伝子ノックアウトまたはノックダウンと、
TRAC遺伝子ノックアウトまたはノックダウンと、
TRBC遺伝子ノックアウトまたはノックダウンと
含む、操作された免疫細胞。
【請求項２７】
（i）免疫細胞を単離する工程、および
（ii）CBLB遺伝子を標的とする第1のgRNAと、TRAC遺伝子を標的とする第2のgRNAと、TRBC遺伝子を標的とする第3のgRNAと、RNAガイドヌクレアーゼとを含むゲノム編集システムを、免疫細胞と接触させて、操作された免疫細胞を生成する工程
を含む、CBLB遺伝子、TRAC遺伝子、およびTRBC遺伝子を破壊する挿入または欠失を有する操作された免疫細胞を生成する方法。
【請求項２８】
前記細胞が、操作されたT細胞受容体（eTCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をさらに含む、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
（a）抗原に特異的に結合する組換え受容体と、
（b）CBLBポリペプチドの発現を防止するかまたは低下させる、CBLB遺伝子の遺伝子破壊と
を含む、操作された免疫細胞であって、
組成物中の前記細胞の少なくとも約70％、少なくとも約75％、もしくは少なくとも約80％、または少なくとも約90％もしくは約90％超が、前記遺伝子破壊を含み、前記内因性CBLBポリペプチドを発現せず、連続したCBLB遺伝子を含まず、CBLB遺伝子を含まず、および/または機能的なCBLB遺伝子を含まず、および/またはCBLBポリペプチドを発現せず、ならびに/あるいは
組換え受容体を発現する組成物中の前記細胞の少なくとも約70％、少なくとも約75％、もしくは少なくとも約80％、または少なくとも約90％もしくは約90％超が、前記遺伝子破壊を含み、前記内因性CBLBポリペプチドを発現せず、および/またはCBLBポリペプチドを発現しない、
操作された免疫細胞。
【請求項３０】
T細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞である、請求項29記載の操作された免疫細胞。
【請求項３１】
前記組換え受容体が、組換え抗原受容体または操作された抗原受容体、任意で組換えTCRまたは操作されたT細胞受容体（eTCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を含む、請求項29記載の操作された免疫細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
[本発明1001]
カシタスB系統リンパ腫プロトオンコジーン-b（CBLB）遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含む、ガイドRNA（gRNA）と、
RNAガイドヌクレアーゼと
を含む、ゲノム編集システム。
[本発明1002]
CBLB遺伝子の標的配列が、エクソン2、エクソン4、またはエクソン5の配列を含む、本発明1001のゲノム編集システム。
[本発明1003]
CBLB遺伝子の標的配列が、SEQ ID NO：88〜92からなる群より選択される配列を含む、本発明1001のゲノム編集システム。
[本発明1004]
ターゲティングドメインが、CBLB遺伝子の標的配列に対して少なくとも85％の相補性を有する、本発明1001のゲノム編集システム。
[本発明1005]
ターゲティングドメインが、CBLB標的位置の約500bp、約450bp、約400bp、約350bp、約300bp、約250bp、約200bp、約150bp、約100bp、約50bp、約25bp、または約10bp以内に二本鎖切断または一本鎖切断を形成するように構成され、それによりCBLB遺伝子発現を改変する、本発明1001のゲノム編集システム。
[本発明1006]
CBLB遺伝子発現がノックアウトまたはノックダウンされる、本発明1005のゲノム編集システム。
[本発明1007]
ターゲティングドメインが、CBLB遺伝子のコード領域または非コード領域を標的とするように構成され、非コード領域が、CBLB遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、3’UTR、5’UTR、またはポリアデニル化シグナル領域を含む、本発明1001〜1006のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1008]
コード領域が、エクソン2、エクソン4、およびエクソン5から選択される、本発明1001〜1007のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1009]
ターゲティングドメインが、
SEQ ID NO：1〜14からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、本発明1001〜1008のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1010]
RNAガイドヌクレアーゼが化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）Cas9ヌクレアーゼであり、
ターゲティングドメインが、
（a）SEQ ID NO：3、
（b）SEQ ID NO：4、
（c）SEQ ID NO：8、
（d）SEQ ID NO：12、および
（e）SEQ ID NO：14
からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、
本発明1001〜1009のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1011]
化膿性連鎖球菌Cas9ヌクレアーゼが、NGGのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を認識し、
ゲノム編集システムがCBLBを標的とし、
ターゲティングドメインが、
SEQ ID NO：3、4、8、12および14から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、
本発明1010のゲノム編集システム。
[本発明1012]
RNAガイドヌクレアーゼが、黄色ブドウ球菌（S.aureus）Cas9ヌクレアーゼである、本発明1001〜1009のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1013]
黄色ブドウ球菌Cas9ヌクレアーゼが、NNNRRTまたはNNNRRVのいずれかのPAMを認識し、ゲノム編集システムがCBLBを標的とする、本発明1012のゲノム編集システム。
[本発明1014]
RNAガイドヌクレアーゼが変異体Cas9ヌクレアーゼである、本発明1001〜1013のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1015]
gRNAが、モジュラーgRNAまたはキメラgRNAである、本発明1001〜1014のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1016]
ターゲティングドメインが、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、または約26ヌクレオチドの長さを有する、本発明1001〜1015のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1017]
ターゲティングドメインが、CBLB遺伝子に相補的な少なくとも約18個の連続したヌクレオチドを含む、本発明1016のゲノム編集システム。
[本発明1018]
2つ、3つ、または4つの別個のgRNAを含む、本発明1001〜1017のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1019]
細胞内のCBLB遺伝子発現を低下させるかまたは排除するのに使用するための、本発明1001〜1018のいずれかのゲノム編集システム。
[本発明1020]
細胞が、癌に罹患している対象に由来する、本発明1019のゲノム編集システム。
[本発明1021]
CBLBの発現が、ベースライン測定値と比較して30％以上低下する、本発明1019のゲノム編集システム。
[本発明1022]
CBLBタンパク質の発現が、ウエスタンブロットまたは間接的細胞内染色フローサイトメトリーによって決定される、本発明1021のゲノム編集システム。
[本発明1023]
フレームシフト変異がCBLB遺伝子に導入される、本発明1020のゲノム編集システム。
[本発明1024]
CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNAを含む、組成物。
[本発明1025]
CBLB遺伝子の標的配列が、エクソン2、エクソン4、またはエクソン5の配列を含む、本発明1024の組成物。
[本発明1026]
CBLB遺伝子の標的配列が、SEQ ID NO：88〜92からなる群より選択される配列を含む、本発明1024の組成物。
[本発明1027]
ターゲティングドメインが、CBLB遺伝子の標的配列に対して少なくとも85％の相補性を有する、本発明1024の組成物。
[本発明1028]
ターゲティングドメインが、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25または約26ヌクレオチドの長さを有する、本発明1024の組成物。
[本発明1029]
ターゲティングドメインが、CBLB遺伝子に相補的な少なくとも約18個の連続したヌクレオチドである、本発明1028の組成物。
[本発明1030]
ターゲティングドメインが、
SEQ ID NO：1〜14から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、本発明1024の組成物。
[本発明1031]
1つ、2つ、3つまたは4つの別個のgRNAを含む、本発明1024または1030の組成物。
[本発明1032]
Cas9ヌクレアーゼをさらに含む、本発明1024〜1031のいずれかの組成物。
[本発明1033]
Cas9ヌクレアーゼが、化膿性連鎖球菌Cas9分子または黄色ブドウ球菌Cas9ヌクレアーゼである、本発明1032の組成物。
[本発明1034]
野生型Cas9ヌクレアーゼおよび変異体Cas9ヌクレアーゼの一方または両方をさらに含む、本発明1032の組成物。
[本発明1035]
Cas9ヌクレアーゼが化膿性連鎖球菌Cas9ヌクレアーゼであり、
ターゲティングドメインが、
（a）SEQ ID NO：3、
（b）SEQ ID NO：4、
（c）SEQ ID NO：8、
（d）SEQ ID NO：12、および
（e）SEQ ID NO：14
からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、
本発明1032の組成物。
[本発明1036]
化膿性連鎖球菌Cas9ヌクレアーゼが、NGGのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を認識し、
前記組成物がCBLBを標的とし、
ターゲティングドメインが、
SEQ ID NO：3、4、8、12、および14から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、
本発明1035の組成物。
[本発明1037]
黄色ブドウ球菌Cas9ヌクレアーゼが、NNNRRTまたはNNNRRVのいずれかのPAMを認識し、前記組成物がCBLBを標的とする、本発明1033の組成物。
[本発明1038]
細胞内のCBLB遺伝子発現を低下させるかまたは排除するのに使用するための、本発明1024〜1037のいずれかの組成物。
[本発明1039]
細胞が、癌に罹患している対象に由来する、本発明1038の組成物。
[本発明1040]
CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNAをコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1041]
ターゲティングドメインが、
SEQ ID NO：1〜14からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、本発明1040のベクター。
[本発明1042]
Cas9ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1040または1041のベクター。
[本発明1043]
Cas9ヌクレアーゼが、化膿性連鎖球菌Cas9ヌクレアーゼまたは黄色ブドウ球菌Cas9ヌクレアーゼである、本発明1042のベクター。
[本発明1044]
野生型Cas9ヌクレアーゼおよび変異体Cas9ヌクレアーゼの一方または両方をさらに含む、本発明1042のベクター。
[本発明1045]
Cas9ヌクレアーゼが化膿性連鎖球菌Cas9ヌクレアーゼであり、
ターゲティングドメインが、
（a）SEQ ID NO：3、
（b）SEQ ID NO：4、
（c）SEQ ID NO：8、
（d）SEQ ID NO：12、および
（e）SEQ ID NO：14
からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、
本発明1042のベクター。
[本発明1046]
化膿性連鎖球菌Cas9ヌクレアーゼが、NGGのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を認識し、
前記ベクターが、CBLBを標的とするgRNAをコードし、
ターゲティングドメインが、
SEQ ID NO：3、4、8、12、14から選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、
本発明1045のベクター。
[本発明1047]
黄色ブドウ球菌Cas9ヌクレアーゼが、NNNRRTまたはNNNRRVのいずれかのPAMを認識し、前記ベクターが、CBLBを標的とするgRNAをコードする、本発明1043のベクター。
[本発明1048]
ウイルスベクターである、本発明1040〜1047のいずれかのベクター。
[本発明1049]
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターまたはレンチウイルス（LV）ベクターである、本発明1048のベクター。
[本発明1050]
細胞内のCBLB遺伝子発現を低下させるかまたは排除するのに使用するための、本発明1040〜1049のいずれかのベクター。
[本発明1051]
細胞が、癌に罹患している対象に由来する、本発明1050のベクター。
[本発明1052]
（i）CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNAと、RNAガイドヌクレアーゼとを含む、ゲノム編集システム、または
（ii）CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNAをコードするポリヌクレオチドと、RNAガイドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとを含む、ベクター
のうちの1つを細胞に投与する工程を含む、細胞内のCBLB遺伝子発現を改変する方法。
[本発明1053]
CBLB遺伝子発現がノックアウトまたはノックダウンされる、本発明1052の方法。
[本発明1054]
細胞が、癌に罹患している対象に由来する、本発明1052または1053の方法。
[本発明1055]
gRNAおよびRNAガイドヌクレアーゼが、リボ核タンパク質（RNP）複合体を構成する、本発明1052の方法。
[本発明1056]
別個のgRNAを含む2つ以上のRNP複合体を投与する工程を含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
RNP複合体が、酵素的に活性なCas9（eaCas9）ヌクレアーゼを含む、本発明1055の方法。
[本発明1058]
RNP複合体が、
標的核酸に二本鎖切断を形成するかまたは標的核酸に一本鎖切断を形成する、eaCas9ヌクレアーゼ
を含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
別個のgRNAを含む2つのRNP複合体を使用して、細胞内のCBLB遺伝子にオフセット一本鎖切断を形成する、本発明1056の方法。
[本発明1060]
本発明1001〜1023のいずれかのゲノム編集システム、本発明1023〜1039のいずれかの組成物、または本発明1040〜1051のいずれかのベクターを含む、細胞。
[本発明1061]
CBLBを発現する、本発明1060の細胞。
[本発明1062]
T細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞である、本発明1060もしくは1061または本発明1112〜1114のいずれかの細胞。
[本発明1063]
操作されたT細胞受容体（eTCR）、キメラ抗原受容体（CAR）、または組換え抗原受容体もしくは操作された抗原受容体をさらに含む、本発明1062または本発明1112〜1114のいずれかの細胞。
[本発明1064]
本発明1052〜1059のいずれかの方法に従って改変された細胞。
[本発明1065]
（a）CBLBを標的とする十分な量のgRNA、およびRNAガイドヌクレアーゼと、細胞とを接触させる工程、ならびに
（b）細胞のCBLB遺伝子内のCBLB標的位置にまたはその近くに、第1のDNA二本鎖切断を形成する工程であって、第1のDNA二本鎖切断がNHEJによって修復され、修復がCBLB遺伝子の発現を改変する、工程
を含む、細胞内のCBLB遺伝子発現を改変するRNAガイドヌクレアーゼ媒介方法。
[本発明1066]
CBLB標的位置にまたはその近くに、第2のDNA二本鎖切断を形成する工程をさらに含む、本発明1065の方法。
[本発明1067]
第1の二本鎖切断が、CBLB標的位置の約500bp、約450bp、約400bp、約350bp、約300bp、約250bp、約200bp、約150bp、約100bp、約50bp、約25bp、または約10bp以内に形成される、本発明1066の方法。
[本発明1068]
第1および第2の二本鎖切断が、CBLB標的位置の約500bp、約450bp、約400bp、約350bp、約300bp、約250bp、約200bp、約150bp、約100bp、約50bp、約25bp、または約10bp以内に形成される、本発明1066の方法。
[本発明1069]
第1の二本鎖切断が、CBLB遺伝子のコード領域または非コード領域に形成され、非コード領域が、CBLB遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、3’UTR、5’UTR、またはポリアデニル化シグナル領域を含む、本発明1066の方法。
[本発明1070]
第1および第2の二本鎖切断が、CBLB遺伝子のコード領域または非コード領域に形成され、非コード領域が、CBLB遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、イントロン、3’UTR、5’UTR、またはポリアデニル化シグナル領域を含む、本発明1066の方法。
[本発明1071]
コード領域が、エクソン2、エクソン4、およびエクソン5から選択される、本発明1065〜1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
ターゲティングドメインが、
SEQ ID NO：1〜14からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、本発明1065〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
RNAガイドヌクレアーゼが化膿性連鎖球菌Cas9ヌクレアーゼであり、
ターゲティングドメインが、
（a）SEQ ID NO：3、
（b）SEQ ID NO：4、
（c）SEQ ID NO：8、
（d）SEQ ID NO：12、および
（e）SEQ ID NO：14
からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、
本発明1065〜1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
RNAガイドヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌Cas9ヌクレアーゼである、本発明1065〜1072のいずれかの方法。
[本発明1075]
RNAガイドヌクレアーゼが変異体Cas9ヌクレアーゼである、本発明1073または1074の方法。
[本発明1076]
NHEJ修復が、20％以上の頻度で挿入または欠失をもたらす、本発明1065の方法。
[本発明1077]
挿入または欠失の頻度が、30％以上、40％以上、または50％以上である、本発明1076の方法。
[本発明1078]
CBLB遺伝子の標的位置の近くにまたはCBLB遺伝子の標的位置に挿入または欠失を含む、ゲノム操作された細胞であって、
標的位置が、
SEQ ID NO：1〜14から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、
ゲノム操作された細胞。
[本発明1079]
挿入または欠失が、CBLB標的位置の約500bp、約450bp、約400bp、約350bp、約300bp、約250bp、約200bp、約150bp、約100bp、約50bp、約25bp、または約10bp以内にある、本発明1078の細胞。
[本発明1080]
T細胞またはNK細胞である、本発明1078の細胞。
[本発明1081]
eTCRまたはCARをさらに含む、本発明1080の細胞。
[本発明1082]
a. CBLB標的位置にまたはその近くに挿入または欠失を含むCBLB遺伝子を含む細胞の集団であって、CBLB標的位置が、SEQ ID NO：1〜14から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的であるかまたは約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列を含む、細胞の集団と、
b. 保存緩衝液と
を含む、組成物。
[本発明1083]
細胞の集団が、T細胞またはNK細胞を含む、本発明1082の組成物。
[本発明1084]
T細胞またはNK細胞が、eTCRまたはCARをさらに含む、本発明1083の組成物。
[本発明1085]
操作された免疫細胞を対象に投与する工程を含む、対象の癌を治療する方法であって、
操作された免疫細胞が、CBLB遺伝子の低下した発現を有し、かつ任意で、操作されたT細胞受容体（eTCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を有し、操作された免疫細胞が、CBLB遺伝子の近くに挿入または欠失を有する、
方法。
[本発明1086]
操作された免疫細胞が、T細胞またはNK細胞を含む、本発明1088の方法。
[本発明1087]
eTCRまたはCARが、癌細胞に対して抗原特異性を有する、本発明1088の方法。
[本発明1088]
CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNAと、RNAガイドヌクレアーゼとを含むゲノム編集システムを免疫細胞に導入することにより、操作された免疫細胞内のCBLB発現が低下する、本発明1085の方法。
[本発明1089]
T細胞が、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞である、本発明1085の方法。
[本発明1090]
操作された免疫細胞が、操作されていない免疫細胞と比較して、CD28共刺激の非存在下で増殖を維持するか、または増強されている、本発明1085の方法。
[本発明1091]
操作された免疫細胞が、操作されていない免疫細胞と比較して、サイトカインの非存在下で増殖を維持するか、または増強されている、本発明1085の方法。
[本発明1092]
操作された免疫細胞が、操作されていない免疫細胞と比較して、IFN-γ、IL-2、およびTNF-αの発現を維持するか、または増加されている、本発明1085の方法。
[本発明1093]
操作された免疫細胞が、操作されていない免疫細胞と比較して、標的細胞殺傷能力を維持するか、または増加されている、本発明1085の方法。
[本発明1094]
CD28共刺激が低下または欠如している免疫細胞の増殖を増強する方法であって、
CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNA分子と、RNAガイドヌクレアーゼとを含むゲノム編集システムを、該免疫細胞に導入する工程、および
該免疫細胞内のCBLB発現を低下させる工程
を含む、方法。
[本発明1095]
サイトカインが欠如または減少している状態で増殖を増強する工程をさらに含む、本発明1094の方法。
[本発明1096]
サイトカインIL-2、IL-7、およびIL-15の欠如または減少がある、本発明1095の方法。
[本発明1097]
複数の操作されたT細胞を含む組成物であって、操作されたT細胞が、操作されていないT細胞と比較してCBLB遺伝子発現の低下を示す、組成物。
[本発明1098]
操作されたT細胞が、操作されていないT細胞内のCBLB発現レベルの約50％、約40％、約30％、約20％、約10％、または約5％であるCBLB遺伝子発現レベルを示す、本発明1097の組成物。
[本発明1099]
操作されたT細胞が、eTCRまたはCARの発現をさらに含む、本発明1097の組成物。
[本発明1100]
T細胞が、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞である、本発明1097の組成物。
[本発明1101]
（a）CD28共刺激の非存在下で維持されたかまたは増加した増殖、
（b）CD28共刺激の非存在下で維持されたかまたは増加した標的細胞殺傷、
（c）標的抗原に対する増大した感受性、
（d）減少した標的抗原の存在下で維持されたかまたは増加した標的細胞殺傷、および
（e）増加したサイトカイン産生能力
のうちの1つまたは複数を有することによって、操作されたT細胞がさらに特徴付けられる、本発明1097の組成物。
[本発明1102]
複数の操作されたT細胞を含む組成物であって、
操作されたT細胞が、操作されていないT細胞と比較してCBLB遺伝子発現の低下を示し、
操作されたT細胞が、
CBLB遺伝子の標的配列と相補的なターゲティングドメインを含むgRNAと、
RNAガイドヌクレアーゼと
を含むゲノム編集システムを、操作されていないT細胞と接触させることにより生成される、
組成物。
[本発明1103]
操作されたT細胞が、eTCRまたはCARを発現するベクターまたはポリヌクレオチドをさらに含む、本発明1102の組成物。
[本発明1104]
ベクターがウイルスベクターであり、および/またはポリヌクレオチドがT細胞のゲノムに組み込まれている、本発明1103の組成物。
[本発明1105]
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターまたはレンチウイルス（LV）ベクターである、本発明1103または1104の組成物。
[本発明1106]
RNAガイドヌクレアーゼが化膿性連鎖球菌Cas9ヌクレアーゼであり、
ターゲティングドメインが、
（a）SEQ ID NO：3、
（b）SEQ ID NO：4、
（c）SEQ ID NO：8、
（d）SEQ ID NO：12、および
（e）SEQ ID NO：14
からなる群より選択されるヌクレオチド配列と同一であるか、または約3ヌクレオチド以下だけ異なるヌクレオチド配列
を含む、
本発明1102〜1105のいずれかの組成物。
[本発明1107]
カシタスB系統リンパ腫プロトオンコジーン-b（CBLB）遺伝子を標的とする第1のgRNAと、
T細胞受容体αコンスタント（TRAC）遺伝子を標的とする第2のgRNAと、
T細胞受容体βコンスタント（TRBC）遺伝子を標的とする第3のgRNAと、
RNAガイドヌクレアーゼと
を含む、ゲノム編集システム。
[本発明1108]
CBLB遺伝子を標的とする第1のgRNAと、
TRAC遺伝子を標的とする第2のgRNAと、
TRBC遺伝子を標的とする第3のgRNAと
を含む、組成物。
[本発明1109]
操作された免疫細胞を対象に投与する工程を含む、対象の癌を治療する方法であって、
操作された免疫細胞では、CBLB遺伝子発現が低下し、TRAC遺伝子発現が低下し、かつTRBC発現が低下している、
方法。
[本発明1110]
操作された免疫細胞が、操作されたT細胞受容体（eTCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を発現する、本発明1109の方法。
[本発明1111]
eTCRまたはCARが、癌抗原に対して特異性を有する、本発明1110の方法。
[本発明1112]
CBLB遺伝子ノックアウトと、
TRAC遺伝子ノックアウトと、
TRBC遺伝子ノックアウトと
を含む、操作された免疫細胞。
[本発明1113]
CBLB遺伝子ノックダウンと、
TRAC遺伝子ノックダウンと、
TRBC遺伝子ノックダウンと
を含む、操作された免疫細胞。
[本発明1114]
CBLB遺伝子ノックアウトまたはノックダウンと、
TRAC遺伝子ノックアウトまたはノックダウンと、
TRBC遺伝子ノックアウトまたはノックダウンと
含む、操作された免疫細胞。
[本発明1115]
（i）免疫細胞を単離する工程、および
（ii）CBLB遺伝子を標的とする第1のgRNAと、TRAC遺伝子を標的とする第2のgRNAと、TRBC遺伝子を標的とする第3のgRNAと、RNAガイドヌクレアーゼとを含むゲノム編集システムを、免疫細胞と接触させて、操作された免疫細胞を生成する工程
を含む、CBLB遺伝子、TRAC遺伝子、およびTRBC遺伝子を破壊する挿入または欠失を有する操作された免疫細胞を生成する方法。
[本発明1116]
前記細胞が、操作されたT細胞受容体（eTCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をさらに含む、本発明1115の方法。
[本発明1117]
（a）抗原に特異的に結合する組換え受容体と、
（b）CBLBポリペプチドの発現を防止するかまたは低下させる、CBLB遺伝子の遺伝子破壊と
を含む、操作された免疫細胞であって、
組成物中の細胞の少なくとも約70％、少なくとも約75％、もしくは少なくとも約80％、または少なくとも約90％もしくは約90％超が、遺伝子破壊を含み、内因性CBLBポリペプチドを発現せず、連続したCBLB遺伝子を含まず、CBLB遺伝子を含まず、および/または機能的なCBLB遺伝子を含まず、および/またはCBLBポリペプチドを発現せず、ならびに/あるいは
組換え受容体を発現する組成物中の細胞の少なくとも約70％、少なくとも約75％、もしくは少なくとも約80％、または少なくとも約90％もしくは約90％超が、遺伝子破壊を含み、内因性CBLBポリペプチドを発現せず、および/またはCBLBポリペプチドを発現しない、
操作された免疫細胞。
[本発明1118]
T細胞またはナチュラルキラー（NK）細胞である、本発明1117の操作された免疫細胞。
[本発明1119]
組換え受容体が、組換え抗原受容体または操作された抗原受容体、任意で組換えTCRまたは操作されたT細胞受容体（eTCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を含む、本発明1117の操作された免疫細胞。
本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。