【手続補正書】
【提出日】令和2年11月5日(2020.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a. 内皮細胞を含むヒドロゲルが生体適合性スキャホールドの第1の表面に付着するように、該ヒドロゲルと第1の培地とを含む第1のバイオインクを、互いに反対側にある第1の表面および第2の表面を含む該生体適合性スキャホールド上に堆積させる工程；
b. 該内皮細胞が血管を形成することができるようにするべく、該生体適合性スキャホールドの該第1の表面上に堆積した該第1のバイオインクを、第2の培地中で少なくとも4日間成熟させる工程；
c. 該生体適合性スキャホールドが該内皮細胞と網膜色素上皮細胞の間に存在するように、該生体適合性スキャホールドの該第2の表面上に単一細胞層を形成するべく、第3の培地中に該網膜色素上皮細胞を堆積させる工程；ならびに
d. 堆積した該網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように、該第3の培地中に堆積した該網膜色素上皮細胞を、該生体適合性スキャホールド上で培養する工程
を含み、
それによって、該第1の表面上に人工脈絡膜を有しかつ該第2の表面上に人工網膜色素上皮を有する三次元工学的（three-dimensional engineered）血液網膜関門（BRB）を形成する、
脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む該三次元工学的BRBを製造する方法。
【請求項２】
前記生体適合性スキャホールドが、ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（-L-乳酸）（PLLA）、ポリ（グリコール）酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエチレングリコール（PEG）、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化もしくは組換え）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記生体適合性スキャホールドがポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記生体適合性スキャホールドが、架橋されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）からなる、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、前記第1のバイオインクを堆積させる工程の前に酸素プラズマで処理される、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、前記第1のバイオインクを堆積させる工程の前に1日未満の間、前記酸素プラズマで処理される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記第1のバイオインクが線維芽細胞および／または周皮細胞をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約500万〜約3000万個の内皮細胞、1ミリリットルあたり約1000万〜約5000万個の線維芽細胞、および1ミリリットルあたり約50万〜約300万個の周皮細胞を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：0.3：0.1〜1：10：1の比で前記第1のバイオインク中に存在する、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：2：0.5の比で前記第1のバイオインク中に存在する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記第1のバイオインクがバイオプリントにより堆積され、該バイオプリントが、前記生体適合性スキャホールド上への該バイオインクの押し出しを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第1のバイオインク中の前記ヒドロゲルが、コラーゲンベースのヒドロゲルを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第1のバイオインク中の前記ヒドロゲルが、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、ゼラチンメタクリロイルヒドロゲル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第1の培地および前記第2の培地が、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、アンギオポエチン1、IGF、EGF、FGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン、およびアプロチニンを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第1の培地が、1〜1,000 ng/mlの内皮細胞成長因子（VEGF）、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体適合性スキャホールドの前記第2の表面上に前記網膜色素上皮細胞を堆積させる前に、該生体適合性スキャホールドの該第2の表面を細胞外マトリクスでコーティングする工程をさらに含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、および／もしくはフィブロネクチン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記網膜色素上皮細胞を堆積させる工程が、網膜色素上皮細胞の懸濁物を前記生体適合性スキャホールドの前記第2の表面に添加することを含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および／または前記周皮細胞が、誘導多能性幹細胞から生成されている、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
単層が形成されるまで前記網膜色素細胞が前記第3の培地中で培養される、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第1のバイオインクを前記生体適合性スキャホールドの前記第1の表面上にバイオプリントしてから5日後またはそれ以降に、前記網膜色素上皮細胞が該生体適合性スキャホールドの前記第2の表面上に堆積される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体適合性スキャホールドの表面1センチメートルあたり100,000〜400,000個の網膜色素上皮細胞を堆積させる工程を含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記網膜色素上皮細胞を堆積させる工程が、網膜色素上皮細胞と前記第3の培地とを含む第2のバイオインクを堆積させることを含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第2のバイオインクがヒドロゲルを含み、かつ該第2のバイオインク中の該ヒドロゲルが、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、またはゼラチンメタクリロイルヒドロゲルを含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記内皮細胞および前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、前記周皮細胞、および前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、請求項7〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
a. 内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞が生体適合性の酸素プラズマ処理されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）PDGLAスキャホールドの第1の表面に付着するように、コラーゲンヒドロゲルおよびフィブリノゲンヒドロゲル中の該内皮細胞、該線維芽細胞、および該周皮細胞と、トロンビン、血管内皮成長因子、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含む第1の培地とを含む第1のバイオインクを、該生体適合性スキャホールド上に堆積させる工程；
b. 該内皮細胞が血管を形成することができるようにするべく、堆積した該第1のバイオインクを、血管内皮成長因子、EGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、ならびにアンギオポエチン-1およびアプロチニンの有効量を含む第2の培地中、トロンビンの非存在下で、少なくとも4日間成熟させる工程；
c. 該生体適合性スキャホールドが該内皮細胞と網膜色素上皮細胞の間に存在するように、該生体適合性スキャホールドの第2の表面上に層を形成するべく第3の培地中に該網膜色素上皮細胞を堆積させる工程であって、該生体適合性スキャホールドの該第1の表面および該第2の表面が互いに反対側にある表面であり、かつ該第2の表面がビトロネクチンでコーティングされ、かつ該第3の培地がタウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む、工程；
d. 堆積した該網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む該第3の培地中で、堆積した該網膜色素上皮細胞を培養する工程；ならびに
e. 有効量の血管内皮成長因子を含み、トロンビンおよびアンギオポエチン-1を含まない第4の培地中で、該内皮細胞、該線維芽細胞、および該周皮細胞を培養する工程；
f. 有効量の血管内皮細胞を任意で含み、トロンビン、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含まない第5の培地中で、該内皮細胞、該線維芽細胞、および該周皮細胞を培養する工程；ならびに
g. 該第3の培地に添加された有効量のプロスタグランジンE2を含む第6の培地中で、該網膜色素上皮細胞を培養する工程
を含み、
それによって三次元工学的血液網膜関門（BRB）を形成する、
脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む該三次元工学的BRBを製造する方法。
【請求項２８】
三次元工学的外側血液網膜関門
を含み、
該三次元工学的外側血液網膜関門が、
第1のバイオインクを含む脈絡膜を含み、該第1のバイオインクが複数の内皮細胞を含む、第1の層；ならびに
複数の網膜色素上皮細胞を含み、該第1の層および第2の層が該三次元工学的外側血液網膜関門を形成する、該第2の層
を含む、
三次元工学的眼組織モデル。
【請求項２９】
生体適合性スキャホールドをさらに含み、該生体適合性スキャホールドが前記第1の層と前記第2の層の間に存在する、請求項28に記載の眼組織モデル。
【請求項３０】
前記生体適合性スキャホールドが、ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（-L-乳酸）（PLLA）、ポリ（グリコール）酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエチレングリコール（PEG）、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化もしくは組換え）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項29に記載の眼組織モデル。
【請求項３１】
前記生体適合性スキャホールドがポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）を含む、請求項29に記載の眼組織モデル。
【請求項３２】
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、架橋されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）である、請求項31に記載の眼組織モデル。
【請求項３３】
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、酸素プラズマ処理されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）である、請求項31または32に記載の眼組織モデル。
【請求項３４】
前記第1のバイオインクが複数の線維芽細胞をさらに含む、請求項28〜33のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項３５】
前記第1のバイオインクが複数の周皮細胞をさらに含む、請求項28〜34のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項３６】
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約500万〜約3000万個の内皮細胞を含む、請求項28、34、または35のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項３７】
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約1000万〜約5000万個の線維芽細胞を含む、請求項34〜36のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項３８】
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約50万〜約300万個の周皮細胞を含む、請求項35〜37のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項３９】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：0.3：0.1〜1：10：1の比で前記第1のバイオインク中に存在する、請求項35〜38のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４０】
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：2：0.5の比で前記第1のバイオインク中に存在する、請求項35〜38のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４１】
前記第1のバイオインクがヒドロゲルをさらに含む、請求項28〜40のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４２】
前記ヒドロゲルが、コラーゲンベースのヒドロゲルを含む、請求項41に記載の眼組織モデル。
【請求項４３】
前記ヒドロゲルが、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、ゼラチンメタクリロイルヒドロゲル、またはそれらの組み合わせを含む、請求項41に記載の眼組織モデル。
【請求項４４】
前記バイオインクが第1の培地をさらに含む、請求項28〜43のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４５】
前記第1の層および／または前記第2の層が前記第1の培地中で培養される、請求項28〜43のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４６】
前記第1の培地が、トロンビン、血管内皮成長因子、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、アプロチニン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項44または45に記載の眼組織モデル。
【請求項４７】
前記第1の培地が、1〜1,000 ng/mlの内皮細胞成長因子（VEGF）、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含む、請求項46に記載の眼組織モデル。
【請求項４８】
前記第1の層および／または前記第2の層が第2の培地中で培養される、請求項28〜47のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項４９】
前記第2の培地が、血管内皮成長因子、EGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、およびアンギオポエチン-1、アプロチニン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項48に記載の眼組織モデル。
【請求項５０】
前記第1の層および／または前記第2の層が第3の培地中で培養される、請求項28〜49のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５１】
前記第3の培地が、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清、またはそれらの組み合わせを含む、請求項50に記載の眼組織モデル。
【請求項５２】
前記生体適合性スキャホールドが、該生体適合性スキャホールドの表面をコーティングしている細胞外マトリクスをさらに含む、請求項29〜51のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５３】
前記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、フィブロネクチン、またはそれらの組み合わせを含む、請求項52に記載の眼組織モデル。
【請求項５４】
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞の1つまたは複数が、誘導多能性幹細胞から生成されている、請求項28〜53のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５５】
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞の1つまたは複数が有病細胞である、請求項28〜54のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５６】
前記生体適合性スキャホールドの表面1センチメートルあたり約100,000〜400,000個の網膜色素上皮細胞を含む、請求項29〜55のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５７】
前記第1の層がバイオプリントによって堆積される、請求項28〜56のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項５８】
前記バイオプリントが、前記生体適合性スキャホールドの第1の表面上への前記第1のバイオインクの押し出しを含む、請求項57に記載の眼組織モデル。
【請求項５９】
ヒト対象の眼への移植に使用するための、請求項28〜58のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６０】
創薬、薬物試験、前臨床研究、毒性試験、吸収、分布、代謝、および排出試験（ADME）、薬物代謝および薬理試験（DMPK）、疾患モデリング、感染病モデリング、宿主疾患モデル、三次元生物学研究、細胞ベースのスクリーニング、遺伝子療法試験、ならびに／またはバイオマーカー発見の1つまたは複数に使用するための、請求項28〜59のいずれか一項に記載の眼組織モデル。
【請求項６１】
使用時に前記生体適合性スキャホールドを実質的に含まない、請求項59または60に記載の眼組織モデル。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の上記および他の特徴および利点は、添付図面を参照しつつ進められる以下の様々な態様の詳細な説明からより明らかになるであろう。
[本発明1001]
a. 内皮細胞を含むヒドロゲルが生体適合性スキャホールドの第1の表面に付着するように、該ヒドロゲルと第1の培地とを含む第1のバイオインクを、互いに反対側にある第1の表面および第2の表面を含む該生体適合性スキャホールド上に堆積させる工程；
b. 該内皮細胞が血管を形成することができるように、該生体適合性スキャホールドの該第1の表面上に堆積した該第1のバイオインクを、第2の培地中で少なくとも4日間成熟させる工程；
c. 該生体適合性スキャホールドが該内皮細胞と網膜色素上皮細胞の間に存在するように、該生体適合性スキャホールドの該第2の表面上に単一細胞層を形成するために第3の培地中に該網膜色素上皮細胞を堆積させる工程；ならびに
d. 堆積した該網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように、該生体適合性スキャホールド上において該網膜色素上皮細胞を該第3の培地中で培養する工程
を含み、
それによって、該第1の表面上に人工脈絡膜を有しかつ該第2の表面上に人工網膜色素上皮を有する三次元工学的（three-dimensional engineered）血液網膜関門（BRB）を形成する、
脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む該三次元工学的BRBを製造する方法。
[本発明1002]
前記生体適合性スキャホールドが、ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（-L-乳酸）（PLLA）、ポリ（グリコール）酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエチレングリコール（PEG）、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化もしくは組換え）、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記生体適合性スキャホールドがポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記生体適合性スキャホールドが、架橋されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）からなる、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、前記第1のバイオインクを堆積させる工程の前に酸素プラズマで処理される、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、前記第1のバイオインクを堆積させる工程の前に1日未満の間、前記酸素プラズマで処理される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記第1のバイオインクが線維芽細胞および／または周皮細胞をさらに含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約500万〜約3000万個の内皮細胞、1ミリリットルあたり約1000万〜約5000万個の線維芽細胞、および1ミリリットルあたり約50万〜約300万個の周皮細胞を含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：0.3：0.1〜1：10：1の比で前記第1のバイオインク中に存在する、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：2：0.5の比で前記第1のバイオインク中に存在する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記第1のバイオインクがバイオプリントにより堆積され、該バイオプリントが、前記生体適合性スキャホールド上への該バイオインクの押し出しを含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記第1のバイオインク中の前記ヒドロゲルが、コラーゲンベースのヒドロゲルを含む、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記第1のバイオインク中の前記ヒドロゲルが、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、ゼラチンメタクリロイルヒドロゲル、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1001〜1011のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記第1の培地および前記第2の培地が、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、アンギオポエチン1、IGF、EGF、FGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン、およびアプロチニンを含む、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記第1の培地が、1〜1,000 ng/mlの内皮細胞成長因子（VEGF）、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
前記生体適合性マトリクスの前記第2の表面上に前記網膜色素上皮細胞を堆積させる前に、該生体適合性マトリクスの該第2の表面を細胞外マトリクスでコーティングする工程をさらに含む、本発明1001〜1016のいずれかの方法。
[本発明1017]
前記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、および／もしくはフィブロネクチン、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記網膜色素上皮細胞を堆積させる工程が、網膜色素上皮細胞の懸濁物を前記生体適合性マトリクスの前記第2の表面に添加することを含む、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および／または前記周皮細胞が、誘導多能性幹細胞から生成されている、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
単層が形成されるまで前記網膜色素細胞が前記第3の培地中で培養される、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記第1のバイオインクを前記生体適合性スキャホールドの前記第1の表面上にバイオプリントしてから5日後またはそれ以降に、前記網膜色素上皮細胞が該生体適合性マトリクスの前記第2の表面上に堆積される、本発明1001〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記生体適合性マトリクスの表面1センチメートルあたり100,000〜400,000個の網膜色素上皮細胞を堆積させる工程を含む、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記網膜色素上皮細胞を堆積させる工程が、網膜色素上皮細胞と前記第3の培地とを含む第2のバイオインクを堆積させることを含む、本発明1001〜1021のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記第2のバイオインクがヒドロゲルを含み、かつ該第2のバイオインク中の該ヒドロゲルが、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、またはゼラチンメタクリロイルヒドロゲルを含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記内皮細胞および前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、前記周皮細胞、および前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、本発明1007〜1024のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記脈絡膜を網膜色素上皮細胞と共に対象の眼に移植する工程をさらに含む、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記対象が急性黄斑変性を有する、本発明1027の方法。
[本発明1029]
本発明1001〜1026のいずれかの方法によって製造された、脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む三次元工学的BRBを、試験作用物質と接触させる工程、ならびに
網膜色素上皮細胞を伴う該脈絡膜内の細胞の表現型を評価し、かつ／または網膜色素上皮細胞を伴う該脈絡膜の三次元構造を評価する工程
を含む、試験作用物質の効果を判定する方法であって、
該細胞の表現型の変化または三次元構造の変化によって、該作用物質が効果を有することが示される、方法。
[本発明1030]
a. 内皮細胞、線維芽細胞、および周皮細胞が生体適合性の酸素プラズマ処理されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）PDGLAスキャホールドの第1の表面に付着するように、コラーゲンヒドロゲル中およびフィブリノゲンヒドロゲル中の該内皮細胞、該線維芽細胞、および該周皮細胞と、トロンビン、血管内皮成長因子、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含む第1の培地とを含む第1のバイオインクを、該生体適合性スキャホールド上に堆積させる工程；
b. 該内皮細胞が血管を形成することができるように、堆積させた該第1のバイオインクを、血管内皮成長因子、EGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、ならびにアンギオポエチン-1およびアプロチニンの有効量を含む第2の培地中で少なくとも4日間、トロンビンの非存在下で成熟させる工程；
c. 該生体適合性スキャホールドが該内皮細胞と該網膜色素上皮細胞の間に存在するように、該生体適合性スキャホールドの第2の表面上に層を形成するために第3の培地中に網膜色素上皮細胞を堆積させる工程であって、該生体適合性スキャホールドの該第1の表面および該第2の表面が互いに反対側にある表面であり、かつ該第2の表面がビトロネクチンでコーティングされ、かつ該第3の培地がタウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む、工程；
d. 堆積した該網膜色素上皮細胞が増殖および成熟するように、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清の有効量を含む該第3の培地中で、堆積した該網膜色素上皮細胞を培養する工程；ならびに
e. 有効量の血管内皮成長因子を含む第4の培地中で、該内皮細胞、該線維芽細胞、および該周皮細胞を培養する工程であって、該第4の培地がトロンビンおよびアンギオポエチン-1を含まない、工程；
f. 有効量の血管内皮細胞を任意で含む第5の培地中で、該内皮細胞、該線維芽細胞、および該周皮細胞を培養する工程であって、該第5の培地がトロンビン、アンギオポエチン-1、およびアプロチニンを含まない、工程；ならびに
g. 該第3の培地に添加された有効量のプロスタグランジンE2を含む第6の培地中で、該網膜色素上皮細胞を培養する工程
を含み、
それによって三次元工学的血液網膜関門（BRB）を形成する、
脈絡膜と網膜色素上皮細胞とを含む該三次元工学的BRBを製造する方法。
[本発明1031]
三次元工学的外側血液網膜関門
を含み、
該三次元工学的外側血液網膜関門が、
第1のバイオインクを含む脈絡膜を含み、該第1のバイオインクが複数の内皮細胞を含む、第1の層；ならびに
複数の網膜色素上皮細胞を含み、該第1の層および第2の層が該三次元工学的外側血液網膜関門を形成する、該第2の層
を含む、
三次元工学的眼組織モデル。
[本発明1032]
生体適合性スキャホールドをさらに含み、該生体適合性スキャホールドが前記第1の層と前記第2の層の間に存在する、本発明1031の眼組織モデル。
[本発明1033]
前記生体適合性スキャホールドが、ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）、ポリ（乳酸）（PLA）、ポリ（-L-乳酸）（PLLA）、ポリ（グリコール）酸（PGA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエチレングリコール（PEG）、シルク、フィブロイン、コラーゲン（ガラス化もしくは組換え）、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1032の眼組織モデル。
[本発明1034]
前記生体適合性スキャホールドがポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）を含む、本発明1032の眼組織モデル。
[本発明1035]
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、架橋されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）である、本発明1034の眼組織モデル。
[本発明1036]
前記ポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）が、酸素プラズマ処理されたポリ（D,L-ラクチド コ-グリコリド）（PDGLA）である、本発明1044または1045の眼組織モデル。
[本発明1037]
前記第1のバイオインクが複数の線維芽細胞をさらに含む、本発明1031〜1036のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1038]
前記第1のバイオインクが複数の周皮細胞をさらに含む、本発明1031〜1037のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1039]
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約500万〜約3000万個の内皮細胞を含む、本発明1031、1037、または1038のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1040]
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約1000万〜約5000万個の線維芽細胞を含む、本発明1037〜1039のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1041]
前記第1のバイオインクが、1ミリリットルあたり約50万〜約300万個の周皮細胞を含む、本発明1038〜1040のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1042]
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：0.3：0.1〜1：10：1の比で前記第1のバイオインク中に存在する、本発明1038〜1041のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1043]
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞が、それぞれ1：2：0.5の比で前記第1のバイオインク中に存在する、本発明1038〜1041のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1044]
前記第1のバイオインクがヒドロゲルをさらに含む、本発明1031〜1043のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1045]
前記ヒドロゲルが、コラーゲンベースのヒドロゲルを含む、本発明1044の眼組織モデル。
[本発明1046]
前記ヒドロゲルが、ゼラチンヒドロゲル、コラーゲンヒドロゲル、フィブリンヒドロゲル、多糖ヒドロゲル、アルギネートヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、フィブロネクチンヒドロゲル、ラミニンヒドロゲル、ビトロネクチンヒドロゲル、ポリエチレングリコールヒドロゲル、ゼラチンメタクリロイルヒドロゲル、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1044の眼組織モデル。
[本発明1047]
前記バイオインクが第1の培地をさらに含む、本発明1031〜1046のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1048]
前記第1の層および／または前記第2の層が前記第1の培地中で培養される、本発明1031〜1046のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1049]
前記第1の培地が、トロンビン、血管内皮成長因子、上皮成長因子（EGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、インスリン様成長因子（IGF）、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、アンギオポエチン-1、アプロチニン、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1047または1048の眼組織モデル。
[本発明1050]
前記第1の培地が、1〜1,000 ng/mlの内皮細胞成長因子（VEGF）、50〜1000 ng/mlのアンギオポエチン1、および0.075〜0.5 U/mlのアプロチニンを含む、本発明1049の眼組織モデル。
[本発明1051]
前記第1の層および／または前記第2の層が第2の培地中で培養される、本発明1031〜1050のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1052]
前記第2の培地が、血管内皮成長因子、EGF、FGF、IGF、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、ヘパリン硫酸、およびアンギオポエチン-1、アプロチニン、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1051の眼組織モデル。
[本発明1053]
前記第1の層および／または前記第2の層が第3の培地中で培養される、本発明1031〜1051のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1054]
前記第3の培地が、タウリン-ヒドロコルチゾン-トリヨード-サイロニン、ヒドロコルチゾン、トリヨード-サイロニン、ウシ胎仔血清、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1053の眼組織モデル。
[本発明1055]
前記生体適合性スキャホールドが、該生体適合性スキャホールドの表面をコーティングしている細胞外マトリクスをさらに含む、本発明1032〜1054のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1056]
前記細胞外マトリクスが、コラーゲン、ラミニン、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、プロテオグリカン、エラスチン、ヒアルロン酸、ビトロネクチン、フィブロネクチン、またはそれらの組み合わせを含む、本発明1055の眼組織モデル。
[本発明1057]
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞の1つまたは複数が、誘導多能性幹細胞から生成されている、本発明1031〜1056のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1058]
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞の1つまたは複数が有病細胞である、本発明1031〜1057のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1059]
前記生体適合性スキャホールドの表面1センチメートルあたり約100,000〜400,000個の網膜色素上皮細胞を含む、本発明1032〜1058のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1060]
前記第1の層がバイオプリントによって堆積される、本発明1031〜1059のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1061]
前記バイオプリントが、前記生体適合性スキャホールドの第1の表面上への前記第1のバイオインクの押し出しを含む、本発明1060の眼組織モデル。
[本発明1062]
前記内皮細胞および前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、本発明1031〜1061のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1063]
前記内皮細胞、前記線維芽細胞、前記周皮細胞、および／または前記網膜色素上皮細胞がヒト細胞である、本発明1037〜1062のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1064]
前記網膜色素上皮細胞、前記内皮細胞、前記線維芽細胞、および前記周皮細胞の1つまたは複数が、有病ヒトドナー由来の有病細胞である、本発明1031〜1063のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1065]
神経支配されていない、本発明1031〜1064のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1066]
ヒト対象の眼への移植に使用するための、本発明1031〜1065のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1067]
創薬、薬物試験、前臨床研究、毒性試験、吸収、分布、代謝、および排出試験（ADME）、薬物代謝および薬理試験（DMPK）、疾患モデリング、感染病モデリング、宿主疾患モデル、三次元生物学研究、細胞ベースのスクリーニング、遺伝子療法試験、ならびに／またはバイオマーカー発見の1つまたは複数に使用するための、本発明1031〜1066のいずれかの眼組織モデル。
[本発明1068]
使用時に前記生体適合性スキャホールドを実質的に含まない、本発明1066または1067の眼組織モデル。
[本発明1069]
培養チャンバーにちょうど収まるよう、かつ露出しているプリント用フレーム内でプリント用基材を提示するための該プリント用フレームを形成するように適合されたインサート
を含む、
スキャホールドにバイオプリントするためおよび既定の幅を有する該培養チャンバーの壁に対して該スキャホールドを挿入するためのバイオプリント用インサート。
[本発明1070]
前記インサートが、前記培養チャンバーと実質的に同じ外側寸法を有し、該インサートが該培養チャンバー内にちょうど収まってしっかりと保持され、かつ該インサートの外壁が、該インサートがちょうど収まる該チャンバーの壁に対して形状に関して相補的であり、
該インサートが、前記プリント用フレームを取り囲む中央開放部を有し、かつ該インサートが、該中央開放部に対して該スキャホールドを把持するようかつ該プリント用フレーム内で該スキャホールドを露出させるように、該中央開放部内に保持可能なホルダと係合可能である、
本発明1069のインサート。
[本発明1071]
前記インサートが、前記プリント用フレームを含むより小さい開口部を取り囲むカラー、および前記チャンバーの壁に対して配置するのに十分な距離だけ該カラーから半径方向に延びている複数のスペーサーアームを含み、かつ該アームが、該壁の形状に合致する表面で終結する、本発明1069または1070のインサート。
[本発明1072]
前記チャンバーの壁が湾曲しており、かつ前記アームが、該壁の湾曲に対して相補的な湾曲した表面で終結する、本発明1071のインサート。
[本発明1073]
前記チャンバーが培養皿であり、かつ前記アームが、ウェルを該培養皿内の中心に配置するのに十分な距離だけ前記カラーから実質的に対称的に延びている、本発明1071または1072のインサート。
[本発明1074]
前記培養皿が、マルチウェルプレート内の培養ウェルである、本発明1069〜1073のいずれかのインサート。
[本発明1075]
前記開口部が、多角形であり、かつ前記カラーによって取り囲まれるのに十分なサイズであり、かつ、該カラーが、該開口部よりも大きい前記スキャホールドを保持するのに十分なサイズである、本発明1071〜1074のいずれかのインサート。
[本発明1076]
前記カラーが円柱状であり、かつ前記プリント用フレームが、長方形であり、かつ該カラーによって取り囲まれている、本発明1071〜1075のいずれかのインサート。
[本発明1077]
入口ポートおよび出口ポートをさらに含み、該入口ポートおよび出口ポートが、前記インサートを通ってフレーム開口部を通りそしてインサートボディ部の外側へと培養用培地を流し込むために該インサートを通って延びている、本発明1069〜1076のいずれかのインサート。
[本発明1078]
前記カラーの内壁に対してちょうど収まるような形状にされたシートである前記スキャホールドをさらに含む、本発明1071〜1077のいずれかのインサート。
[本発明1079]
前記プリント用フレームの前記開口部に対して前記スキャホールドをしっかりと保持するように前記カラー内に挿入された前記ホルダをさらに含む、本発明1071〜1078のいずれかのインサート。
[本発明1080]
前記ホルダが、漏斗形状であり、かつ円錐台状ボディ部および円柱状ステム部を含み、該円柱状ステム部が、前記開口部に対して前記基材を保持するように前記カラー内にちょうど収まる、本発明1079のインサート。
[本発明1081]
前記スキャホールドを、前記カラー内に配置し、かつ前記プリント用フレームの開口部を通じて露出させ、かつ、プリント用スキャホールドを該フレームに対してしっかりと保持するように前記ホルダを前記インサートボディ部に挿入する、本発明1071〜1080のいずれかのインサートを使用する方法。
[本発明1082]
前記インサートボディ部の前記カラーに合致して該カラー内にちょうど収まるようなサイズにされた前記スキャホールドが、前記プリント用フレームの前記開口部に向かって該カラー内に設置され、かつ、前記ホルダの円柱状係合部分が、該プリント用フレーム内で露出している該スキャホールドを保持するように該スキャホールドの上部において該カラー内に挿入される、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記プリント用フレームを通じて前記スキャホールド上にバイオプリントする工程をさらに含む、本発明1082の方法。
[本発明1084]
前記フレームを通じて露出していない前記スキャホールドの反対側の面に播種またはバイオプリントする工程をさらに含む、本発明1083の方法。
[本発明1085]
前記反対側の面に播種またはバイオプリントする工程が、前記ホルダを通じて播種またはバイオプリントすることを含む、本発明1084の方法。
[本発明1086]
前記プリント用フレームを通じて前記培養チャンバーの底側に前記スキャホールドが露出している状態で、前記インサートを該培養チャンバーに挿入する工程をさらに含む、本発明1081〜1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
前記ポートを通じて前記プリント用フレーム内に培養用培地を流し込む工程をさらに含む、本発明1080〜1086のいずれかの方法。
[本発明1088]
前記基材上にバイオプリントする工程が、前記プリント用フレームをバイオプリンタに露出させた状態で前記ホルダを支持表面上に設置し、かつ該プリント用フレームの前記開口部を通じて該基材上にバイオプリントすることを含む、本発明1081〜1087のいずれかの方法。
[本発明1089]
前記培養チャンバーが培養ウェルであり、該培養ウェルに対して前記インサートが円周方向に合致する、本発明1086の方法。