【手続補正書】
【提出日】令和3年9月3日(2021.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞のペリプラズムから組換えポリペプチドを抽出する方法であって、前記宿主細胞は、発現制御配列に作動可能に連結された前記組換えポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、および発現制御配列に作動可能に連結されたＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、前記方法は、
（ａ）前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における前記組換えポリペプチドおよび前記ホスホリパーゼの同時発現を可能にする条件下で、培地中で前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することと、
（ｂ）必要に応じて、発現された組換えポリペプチドおよび発現されたホスホリパーゼを含む前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を、キレート剤を含む抽出緩衝液と接触させることと、
（ｃ）必要に応じて、前記培地から前記組換えポリペプチドを収集することと、含む、方法。
【請求項２】
（ａ）前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における前記組換えポリペプチドおよび前記ホスホリパーゼの同時発現を可能にする条件下で、培地中で前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記発現された組換えポリペプチドおよび前記発現されたホスホリパーゼを含む前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を、キレート剤を含む抽出緩衝液と接触させることと、を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組換えポリペプチドが、ＣＲＭ１９７、プロテインＤおよびエキソプロテインＡから選択されるキャリアタンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ホスホリパーゼが、ＧｌｐＱ、ＹｂａＣ、ＯｍｐＬＡ、ＰｌｄＢ、およびＴｅｓＡから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ホスホリパーゼが、配列番号１〜５として示されるアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、または同一である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ホスホリパーゼがｐｌｄＡであり、配列番号４として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、または同一である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記発現制御配列の一方または両方が誘導性プロモーターを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発現制御配列の両方が誘導性プロモーターを含み、前記誘導性プロモーターが異なる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現制御配列の両方が誘導性プロモーターを含み、前記誘導性プロモーターが同じである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のヌクレオチド配列が、前記組換えポリペプチドの前記ペリプラズムへの移動を方向付けるシグナル配列に融合した組換えポリペプチドをコードする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えポリペプチドを前記ペリプラズムに方向付ける前記配列が、ＯｍｐＡ、ＭａｌＥ、ＨｄｅＡ、ＯｐｐＡ、ＨｄｅＢ、ＧｌｎＨ、ＭｇｌＢ、ａｇｐ、ＯｍｐＣ、ＲｂｓＢ、ＦｋｐＡまたはＹｔｆＱシグナル配列から、より好ましくは、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、またはＹｔｆＱシグナル配列から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程（ｂ）の抽出緩衝液が、１〜１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、好ましくは３ｍＭ〜７ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは約５ｍＭのＥＤＴＡを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抽出緩衝液が、５０〜２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、好ましくは１００ｍＭ〜２００ｍＭ
Ｔｒｉｓ、より好ましくは約１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記抽出緩衝液が、６．５〜９、好ましくは７〜８、より好ましくは約７．７５〜８のｐＨを有する、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｂ）が、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を抽出緩衝液中で少なくとも１時間かつ２４時間未満、好ましくは少なくとも６時間かつ２４時間未満、２０℃〜３０℃、好ましくは約２５℃の温度でインキュベートすることを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）が振盪することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が野生型株、好ましくは野生型Ｋ−１２またはＢ株である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、その天然の親株のゲノムよりも約２％〜約３０％小さくなるように遺伝子操作されるゲノムを有する縮小ゲノム株である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記天然の親株がＫ−１２またはＢ株である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３およびｂ２９４５を欠いているか、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている、減少ゲノム株である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３、ｂ２９４５、ｂ２４８１〜ｂ２４９２、ｂ２２１９〜ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７〜ｂ３７２３、ｂ０６４４〜ｂ０６５０、ｂ４０７９〜４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２〜ｂ４１０６、ｂ０７３０〜ｂ０７３２、ｂ３５７２〜ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５〜ｂ２７４０、ｂ２４０５〜ｂ２４０７、ｂ３８９６〜ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３〜ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４〜ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８〜ｂ０５００、およびｂ０５０２、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている減少ゲノム株である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が機能的ｒｅｃＡ遺伝子を欠いている、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が機能的ｄｉｎＢ遺伝子を欠いている、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記天然の親がＫ−１２株であり、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、以下の改変、（ｉ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ産生を回復するためのｉｌｖＧ遺伝子のネイティブ−２フレームシフト変異の修正、および（ｉｉｉ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子のすべてまたは一部の欠失、を含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、以下の毒素抗毒素遺伝子、ｙａｆＱ、ｄｉｎＪ、ｈｈａ、ｔｏｍＢ、ｇｎｓＡ、ｙｍｃＥ、ｙｏｅＢ、ｙｅｆＭ、ｍａｚＦ、ｍａｚＥ、ｍａｚＧ、ｃｐｔＡ／ｙｇｆＸ、ｃｐｔＢ／ｓｄｈＥ、ｍｑｓＲ、ｍｑｓＡ、ｈｉｇＢ、ｈｉｇＡ、ｙｈａＶ、ｐｒｌＦ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｉｓｔＲ−２、ｔｉｓＢ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＳ、ｒａｔＡ、ｒａｔＢ、ｌｄｒＡ、ｒｄｌＡ、ｌｄｒＢ、ｒｄｌＢ、ｌｄｒＣ、ｒｄｌＣ、ｈｏｋＢ、ｓｏｋＢ、ｓｉｂＡ、ｉｂｓＡ、ｓｉｂＢ、ｉｂｓＢ、ｏｈｓＣ、ｓｈｏＢ、ｓｉｂＣ、ｉｂｓＣ、ｓｉｂＤ、ｓｉｂＥ、ｉｂｓＤ、ｉｂｓＥ、ｄｉｎＱ、ａｇｒＡ、ａｇｒＢ、ｇｈｏＴ、ｇｈｏＳ、ｙｆｅＣ、ｙｆｅＤ、ｆｉｃ、ｙｈｆＧ、ｙｈｊＪ、ｙｈｊＭ、ｙｈｊＮ、ｙｊｊＪ、ｅｃｎＡ、およびｅｃｎＢを欠いており、かつ必要に応じて、ｈｉｐＡおよびｈｉｐＢを欠いている、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が機能的ｒｎｃ遺伝子を欠いており、好ましくは、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主がｒｎｃ遺伝子の完全または部分的欠失を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記組換えポリペプチドの少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記ペリプラズムから抽出される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が連続発酵モードで、好ましくは少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上の期間培養され、好ましくは、それによって、１日あたり１リットルあたり少なくとも１グラム、少なくとも２グラム、少なくとも３グラムまたはそれ以上の前記組換えタンパク質が産生される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組換えポリペプチドおよび前記ホスホリパーゼが、二シストロン性発現ベクターから同時発現され、前記組換えポリペプチドおよび前記ホスホリパーゼが、同じプロモーターの制御下にある、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明の改変されたＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株を利用して異種核酸（例えば、プラスミドなどのベクター）を増幅するための方法もまた提供される。一実施形態において、核酸は、好適な栄養条件下で異種核酸を含む改変Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株を培養し、それによって核酸を増幅することにより産生される。さらに別の態様では、核酸産生は、同じ増殖条件下でそのような改変細胞が達成することができるより多くの細胞数により、本明細書に記載の改変を含まないＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２またはＢ株よりも高いレベルで増加する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞のペリプラズムから組換えポリペプチドを抽出する方法であって、前記宿主細胞は、発現制御配列に作動可能に連結された前記組換えポリペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列、および発現制御配列に作動可能に連結されたＥ．ｃｏｌｉホスホリパーゼをコードする第２のヌクレオチド配列を含み、前記方法は、
（ａ）前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における前記組換えポリペプチドおよび前記ホスホリパーゼの同時発現を可能にする条件下で、培地中で前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することと、
（ｂ）必要に応じて、発現された組換えポリペプチドおよび発現されたホスホリパーゼを含む前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を、キレート剤を含む抽出緩衝液と接触させることと、
（ｂ）必要に応じて、前記培地から前記組換えポリペプチドを収集することと、含む、方法。
（項目２）
（ａ）前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主における前記組換えポリペプチドおよび前記ホスホリパーゼの同時発現を可能にする条件下で、培地中で前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を培養することと、
（ｂ）前記発現された組換えポリペプチドおよび前記発現されたホスホリパーゼを含む前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を、キレート剤を含む抽出緩衝液と接触させることと、を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記組換えポリペプチドが、ＣＲＭ１９７、プロテインＤおよびエキソプロテインＡから選択されるキャリアタンパク質である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記ホスホリパーゼが、ＧｌｐＱ、ＹｂａＣ、ＯｍｐＬＡ、ＰｌｄＢ、およびＴｅｓＡから選択される、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記ホスホリパーゼが、配列番号１〜５として示されるアミノ酸配列のいずれか１つに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、または同一である、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記ホスホリパーゼがｐｌｄＡであり、配列番号４として示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、または同一である、項目４に記載の方法。
（項目７）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、前記第１のヌクレオチド配列および／または前記第２のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記発現制御配列の一方または両方が誘導性プロモーターを含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記発現制御配列の両方が誘導性プロモーターを含み、前記誘導性プロモーターが異なる、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記発現制御配列の両方が誘導性プロモーターを含み、前記誘導性プロモーターが同じである、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記第１のヌクレオチド配列が、前記組換えポリペプチドの前記ペリプラズムへの移動を方向付けるシグナル配列に融合した組換えポリペプチドをコードする、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記組換えポリペプチドを前記ペリプラズムに方向付ける前記配列が、ＯｍｐＡ、ＭａｌＥ、ＨｄｅＡ、ＯｐｐＡ、ＨｄｅＢ、ＧｌｎＨ、ＭｇｌＢ、ａｇｐ、ＯｍｐＣ、ＲｂｓＢ、ＦｋｐＡまたはＹｔｆＱシグナル配列から、より好ましくは、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＦ、またはＹｔｆＱシグナル配列から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１２）
前記工程（ｂ）の抽出緩衝液が、１〜１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、好ましくは３ｍＭ〜７ｍＭのＥＤＴＡ、より好ましくは約５ｍＭのＥＤＴＡを含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記抽出緩衝液が、５０〜２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、好ましくは１００ｍＭ〜２００ｍＭ
Ｔｒｉｓ、より好ましくは約１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記抽出緩衝液が、６．５〜９、好ましくは７〜８、より好ましくは約７．７５〜８のｐＨを有する、項目１２または１３に記載の方法。
（項目１５）
工程（ｂ）が、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞を抽出緩衝液中で少なくとも１時間かつ２４時間未満、好ましくは少なくとも６時間かつ２４時間未満、２０℃〜３０℃、好ましくは約２５℃の温度でインキュベートすることを含む、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
工程（ｂ）が振盪することを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が野生型株、好ましくは野生型Ｋ−１２またはＢ株である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、その天然の親株のゲノムよりも約２％〜約３０％小さくなるように遺伝子操作されるゲノムを有する縮小ゲノム株である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記天然の親株がＫ−１２またはＢ株である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３およびｂ２９４５を欠いているか、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている、減少ゲノム株である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３、ｂ２９４５、ｂ２４８１〜ｂ２４９２、ｂ２２１９〜ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７〜ｂ３７２３、ｂ０６４４〜ｂ０６５０、ｂ４０７９〜４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２〜ｂ４１０６、ｂ０７３０〜ｂ０７３２、ｂ３５７２〜ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５〜ｂ２７４０、ｂ２４０５〜ｂ２４０７、ｂ３８９６〜ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３〜ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４〜ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８〜ｂ０５００、およびｂ０５０２、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている減少ゲノム株である、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が機能的ｒｅｃＡ遺伝子を欠いている、項目１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が機能的ｄｉｎＢ遺伝子を欠いている、項目１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記天然の親がＫ−１２株であり、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、以下の改変、（ｉ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ産生を回復するためのｉｌｖＧ遺伝子のネイティブ−２フレームシフト変異の修正、および（ｉｉｉ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子のすべてまたは一部の欠失、を含む、項目１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が、以下の毒素抗毒素遺伝子、ｙａｆＱ、ｄｉｎＪ、ｈｈａ、ｔｏｍＢ、ｇｎｓＡ、ｙｍｃＥ、ｙｏｅＢ、ｙｅｆＭ、ｍａｚＦ、ｍａｚＥ、ｍａｚＧ、ｃｐｔＡ／ｙｇｆＸ、ｃｐｔＢ／ｓｄｈＥ、ｍｑｓＲ、ｍｑｓＡ、ｈｉｇＢ、ｈｉｇＡ、ｙｈａＶ、ｐｒｌＦ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｉｓｔＲ−２、ｔｉｓＢ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＳ、ｒａｔＡ、ｒａｔＢ、ｌｄｒＡ、ｒｄｌＡ、ｌｄｒＢ、ｒｄｌＢ、ｌｄｒＣ、ｒｄｌＣ、ｈｏｋＢ、ｓｏｋＢ、ｓｉｂＡ、ｉｂｓＡ、ｓｉｂＢ、ｉｂｓＢ、ｏｈｓＣ、ｓｈｏＢ、ｓｉｂＣ、ｉｂｓＣ、ｓｉｂＤ、ｓｉｂＥ、ｉｂｓＤ、ｉｂｓＥ、ｄｉｎＱ、ａｇｒＡ、ａｇｒＢ、ｇｈｏＴ、ｇｈｏＳ、ｙｆｅＣ、ｙｆｅＤ、ｆｉｃ、ｙｈｆＧ、ｙｈｊＪ、ｙｈｊＭ、ｙｈｊＮ、ｙｊｊＪ、ｅｃｎＡ、およびｅｃｎＢを欠いており、かつ必要に応じて、ｈｉｐＡおよびｈｉｐＢを欠いている、項目１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が機能的ｒｎｃ遺伝子を欠いており、好ましくは、前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主がｒｎｃ遺伝子の完全または部分的欠失を含む、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記組換えポリペプチドの少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の前記ペリプラズムから抽出される、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞が連続発酵モードで、好ましくは少なくとも１４日間、少なくとも３０日間、またはそれ以上の期間培養され、好ましくは、それによって、１日あたり１リットルあたり少なくとも１グラム、少なくとも２グラム、少なくとも３グラムまたはそれ以上の前記組換えタンパク質が産生される、項目１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
４．４１Ｍｂ〜２．７８Ｍｂのゲノムを有し、以下の毒素抗毒素遺伝子、ｙａｆＱ、ｄｉｎＪ、ｈｈａ、ｔｏｍＢ、ｇｎｓＡ、ｙｍｃＥ、ｙｏｅＢ、ｙｅｆＭ、ｍａｚＦ、ｍａｚＥ、ｍａｚＧ、ｃｐｔＡ／ｙｇｆＸ、ｃｐｔＢ／ｓｄｈＥ、ｍｑｓＲ、ｍｑｓＡ、ｈｉｇＢ、ｈｉｇＡ、ｙｈａＶ、ｐｒｌＦ、ｌｄｒＤ、ｒｄｌＤ、ｉｓｔＲ−２、ｔｉｓＢ、ｃｈｐＢ、ｃｈｐＳ、ｒａｔＡ、ｒａｔＢ、ｌｄｒＡ、ｒｄｌＡ、ｌｄｒＢ、ｒｄｌＢ、ｌｄｒＣ、ｒｄｌＣ、ｈｏｋＢ、ｓｏｋＢ、ｓｉｂＡ、ｉｂｓＡ、ｓｉｂＢ、ｉｂｓＢ、ｏｈｓＣ、ｓｈｏＢ、ｓｉｂＣ、ｉｂｓＣ、ｓｉｂＤ、ｓｉｂＥ、ｉｂｓＤ、ｉｂｓＥ、ｄｉｎＱ、ａｇｒＡ、ａｇｒＢ、ｇｈｏＴ、ｇｈｏＳ、ｙｆｅＣ、ｙｆｅＤ、ｆｉｃ、ｙｈｆＧ、ｙｈｊＪ、ｙｈｊＭ、ｙｈｊＮ、ｙｊｊＪ、ｅｃｎＡ、およびｅｃｎＢを欠いており、かつ／または機能的ｒｎｃ遺伝子を欠いている、天然には存在しないＥ．ｃｏｌｉ細菌。
（項目３０）
前記ｒｎｃ遺伝子の完全または部分的欠失を含む、項目２９に記載の細菌。
（項目３１）
前記細菌が、ＩＳ１、ＩＳ２、ＩＳ３、ＩＳ５、ＩＳ１５０およびＩＳ１８６挿入配列のすべてをさらに欠く、項目２９または３０に記載の細菌。
（項目３２）
前記細菌がｄｉｎＢ遺伝子の欠失をさらに含む、項目２９〜３１のいずれか一項に記載の細菌。
（項目３３）
前記細菌がｒｅｃＡ遺伝子の欠失をさらに含む、項目２９〜３２のいずれか一項に記載の細菌。
（項目３４）
前記細菌の親株がＫ−１２またはＢ株である、項目２９〜３３のいずれか一項に記載の細菌。
（項目３５）
前記細菌の前記親株がＫ−１２株である、項目３４に記載の細菌。
（項目３６）
細前記菌が、以下の改変、（ｉ）オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を増強するためのｒｐｈ遺伝子の欠失、（ｉｉ）活性アセトヒドロキシ酸シンターゼＩＩ産生を回復するためのｉｌｖＧ遺伝子のネイティブ−２フレームシフト変異の修正、および（ｉｉｉ）ｉｃｌＲ遺伝子およびａｒｐＡ遺伝子のすべてまたは一部の欠失、のうちの１つ以上、及び好ましくはすべてを含む、項目３５に記載の細菌。
（項目３７）
前記細菌の前記親株がＫ−１２またはＢ株である、項目２９〜３６のいずれか一項に記載の細菌。
（項目３８）
前記細菌の前記親株がＫ１２株ＭＧ１６５５である、項目３７に記載の細菌。
（項目３９）
前記細菌が前記Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３およびｂ２９４５を欠いているか、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている、項目２９〜３８のいずれか一項に記載の細菌。
（項目４０）
前記細菌が前記Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株ＭＧ１６５５の少なくとも以下の遺伝子、ｂ０２４５〜ｂ０３０１、ｂ０３０３〜ｂ０３１０、ｂ１３３６〜ｂ１４１１、ｂ４４２６〜ｂ４４２７、ｂ２４４１〜ｂ２４５０、ｂ２６２２〜ｂ２６５４、ｂ２６５７〜ｂ２６６０、ｂ４４６２、ｂ１９９４〜ｂ２００８、ｂ４４３５、ｂ３３２２〜ｂ３３３８、ｂ２３４９〜ｂ２３６３、ｂ１５３９〜ｂ１５７９、ｂ４２６９〜ｂ４３２０、ｂ２９６８〜ｂ２９７２、ｂ２９７５〜ｂ２９７７、ｂ２９７９〜ｂ２９８７、ｂ４４６６〜４４６８、ｂ１１３７〜ｂ１１７２、ｂ０５３７〜ｂ０５６５、ｂ００１６〜ｂ００２２、ｂ４４１２〜ｂ４４１３、ｂ０５７７〜ｂ０５８２、ｂ４４１５、ｂ２３８９〜ｂ２３９０、ｂ２３９２〜ｂ２３９５、ｂ０３５８〜ｂ０３６８、ｂ０３７０〜ｂ０３８０、ｂ２８５６〜ｂ２８６３、ｂ３０４２〜ｂ３０４８、ｂ０６５６、ｂ１３２５〜ｂ１３３３、ｂ２０３０〜ｂ２０６２、ｂ２１９０〜ｂ２１９２、ｂ３２１５〜ｂ３２１９、ｂ３５０４〜ｂ３５０５、ｂ１０７０〜ｂ１０８３、ｂ１８７８〜ｂ１８９４、ｂ１９１７〜ｂ１９５０、ｂ４３２４〜ｂ４３４２、ｂ４３４５〜ｂ４３５８、ｂ４４８６、ｂ０４９７〜ｂ０５０２、ｂ０７００〜ｂ０７０６、ｂ１４５６〜ｂ１４６２、ｂ３４８１〜ｂ３４８４、ｂ３５９２〜ｂ３５９６、ｂ０９８１〜ｂ０９８８、ｂ１０２１〜ｂ１０２９、ｂ２０８０〜ｂ２０９６、ｂ４４３８、ｂ３４４０〜ｂ３４４５、ｂ４４５１、ｂ３５５６〜ｂ３５５８、ｂ４４５５、ｂ１７８６、ｂ０１５０〜ｂ０１５３、ｂ２９４５、ｂ２４８１〜ｂ２４９２、ｂ２２１９〜ｂ２２３０、ｂ４５００、ｂ３７０７〜ｂ３７２３、ｂ０６４４〜ｂ０６５０、ｂ４０７９〜４０９０、ｂ４４８７、ｂ４０９２〜ｂ４１０６、ｂ０７３０〜ｂ０７３２、ｂ３５７２〜ｂ３５８７、ｂ１６５３、ｂ２７３５〜ｂ２７４０、ｂ２４０５〜ｂ２４０７、ｂ３８９６〜ｂ３９００、ｂ１２０２、ｂ４２６３〜ｂ４２６８、ｂ０６１１、ｂ２３６４〜ｂ２３６６、ｂ０８３９、ｂ０４８８〜ｂ０５００、およびｂ０５０２を欠いているか、または異なるＫ−１２もしくはＢ株の対応する遺伝子を欠いている、項目２９〜３９のいずれか一項に記載の細菌。