【手続補正書】
【提出日】令和3年9月27日(2021.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較して短縮型のアミノ酸配列を含み、配列番号７６のアミノ酸配列を含む、組換えポリペプチド。
【請求項２】
全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較して短縮型の前記アミノ酸配列が、全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較して５０アミノ酸〜８００アミノ酸の短縮を有する、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較して短縮型の前記アミノ酸配列が、全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較してＮ末端の短縮、全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較してＣ末端の短縮、または全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較して内部の短縮を含む、請求項１または２に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較して短縮型の前記アミノ酸配列が、全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較してＮ末端の短縮および全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較してＣ末端の短縮を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較して短縮型の前記アミノ酸配列が、５０アミノ酸〜６００アミノ酸のＮ末端の短縮を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
全長ヒトタイプ２１アルファ１コラーゲンと比較して短縮型の前記アミノ酸配列が、５０アミノ酸〜２５０アミノ酸のＣ末端の短縮を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
前記組換えポリペプチドが配列番号７６のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の組換えポリペプチド。
【請求項８】
分泌タグ、ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質タグ、プロテアーゼ切断部位およびベータラクタマーゼタンパク質からなる群から選択される１つまたはそれより多くをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項９】
前記分泌タグがＤｓｂＡである、請求項８に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドをコードする異種核酸配列の少なくとも１つのコピーを含む組換え細胞。
【請求項１１】
前記組換え細胞が細菌細胞である、請求項１０に記載の組換え細胞。
【請求項１２】
前記細菌細胞が大腸菌種の細胞である、請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
前記異種核酸配列が配列番号７５を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
前記異種核酸配列が細胞における発現のためにコドン最適化されている、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の組換え細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４２】
配列番号１１５のポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２８ａにサブクローニングし、宿主大腸菌細胞において発現させ、本明細書に記載されるように、短縮型Ｒｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓコラーゲンタイプ１短縮１を精製した。精製コラーゲンは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで明確なバンドを生じさせ、抗ＦＬＡＧウエスタンは、約２５キロダルトンで観察された。このタンパク質の発現の非存在下では、ゲル上のその位置に現れるバンドは存在しなかった。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
クラゲコラーゲン、ヒト、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）およびＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓ（ジンベイザメ）からなる群より選択される、天然に存在しないコラーゲン。
(項目２)
短縮されている、項目１に記載の天然に存在しないコラーゲン。
(項目３)
５０アミノ酸〜３００アミノ酸の内部短縮により短縮されている、項目２に記載の天然に存在しない短縮型コラーゲン。
(項目４)
前記コラーゲンのアミノ酸配列が、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、配列番号配列番号１０８、配列番号１１０および配列番号１１２からなる群より選択される、項目１〜３のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲン。
(項目５)
分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位およびベータラクタマーゼタンパク質からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む、項目１〜４のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲン。
(項目６)
前記分泌タグがＤｓｂＡである、項目５に記載の天然に存在しないコラーゲン。
(項目７)
配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートをさらに含む、項目１〜６のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲン。
(項目８)
２〜５０個のアミノ酸トリマーリピートを含む、項目７に記載の天然に存在しないコラーゲン。
(項目９)
クラゲコラーゲンである、項目１〜８のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲン。
(項目１０)
０．００５％〜３０％ｗ／ｗの項目１〜９のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンを含む組成物であって、線維芽細胞の成長を刺激し、および／またはプロコラーゲンの合成を刺激し、および／またはチミン−チミン（ＴＴ）ダイマー形成の形成を減少させる、組成物。
(項目１１)
０．００５％〜１％の天然に存在しないコラーゲンを含む、項目１０に記載の組成物。
(項目１２)
０．０１％〜１％の天然に存在しないコラーゲンを含む、項目１０に記載の組成物。
(項目１３)
０．０２％〜０．５％の天然に存在しないコラーゲンを含む、項目１０に記載の組成物。
(項目１４)
局所用担体および／または保存剤を含む少なくとも１つのさらなる成分をさらに含む局所用組成物である、項目１０〜１３のいずれかに記載の組成物。
(項目１５)
前記局所用組成物がマスクである、項目１４に記載の組成物。
(項目１６)
前記局所用担体が、リポソーム、生分解性マイクロカプセル、ローション、スプレー、エアロゾル、ダスティングパウダー、生分解性ポリマー、鉱油、トリグリセリドオイル、シリコーンオイル、グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、アルコール、乳化剤、流動石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ワックス、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、シクロメチコン、シクロペンタシロキサンおよび水からなる群より選択される、項目１４または１５に記載の局所用組成物。
(項目１７)
前記保存剤が、トコフェロール、ジヨードメチル−ｐ−トリルスルホン、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、シス異性体１−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタンクロリド、グルタルアルデヒド、４，４−ジメチルオキサゾリジン、７−エチルビシクロオキサゾリジン、メチルパラベン、ソルビン酸、ＧｅｒｍａｂｅｎＩＩ、ローズマリーエキスおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、項目１４〜１６のいずれかに記載の局所用組成物。
(項目１８)
皮膚損傷を低減するか、損傷皮膚の修復を促進するか、ＵＶ損傷から皮膚を保護するか、または皮膚細胞の生存度を増加させる方法であって、項目１〜１７のいずれかに記載の組成物を被験体の皮膚または皮膚細胞に適用する工程を含む、方法。
(項目１９)
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞の生存度を増加させる、項目１８に記載の方法。
(項目２０)
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞によるプロコラーゲンの合成を増加させる、項目１８に記載の方法。
(項目２１)
クラゲエラスチン、ヒトエラスチン、Ｃｈｏｎｄｒｏｓｉａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（ジンゾウナンコツカイメン）エラスチンまたはＲｈｉｎｃｏｄｏｎ  ｔｙｐｕｓエラスチンからなる群より選択される、天然に存在しないエラスチン。
(項目２２)
短縮されている、項目２１に記載の天然に存在しないエラスチン。
(項目２３)
少なくとも５０アミノ酸の短縮により短縮されている、項目２２に記載の天然に存在しない短縮型エラスチン。
(項目２４)
前記エラスチンのアミノ酸配列が、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号９８および配列番号１００からなる群より選択される、項目２１〜２３のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチン。
(項目２５)
分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位およびベータラクタマーゼタンパク質からなる群より選択されるアミノ酸配列をさらに含む、項目２１〜２４のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチン。
(項目２６)
前記分泌タグがＤｓｂＡである、項目２５に記載の天然に存在しないエラスチン。
(項目２７)
配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートをさらに含む、項目２１〜２６のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチン。
(項目２８)
２〜５０個のアミノ酸トリマーリピートを含む、項目２７に記載の天然に存在しないエラスチン。
(項目２９)
ヒトのものである、項目２１〜２８のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチン。
(項目３０)
０．００５％〜３０％ｗ／ｗの項目２１〜２９のいずれかに記載の天然に存在しないエラスチンを含む組成物であって、線維芽細胞の成長を刺激し、および／またはプロコラーゲンの合成を刺激する、組成物。
(項目３１)
０．００５％〜１％の天然に存在しないエラスチンを含む、項目３０に記載の組成物。
(項目３２)
０．０１％〜１％の天然に存在しないエラスチンを含む、項目３０に記載の組成物。
(項目３３)
０．０２％〜０．５％の天然に存在しないエラスチンを含む、項目３０に記載の組成物。
(項目３４)
局所用担体および／または保存剤を含む少なくとも１つのさらなる成分をさらに含む局所用組成物である、項目３０〜３３のいずれかに記載の組成物。
(項目３５)
前記局所用組成物がマスクである、項目３４に記載の組成物。
(項目３６)
前記局所用担体が、リポソーム、生分解性マイクロカプセル、ローション、スプレー、エアロゾル、ダスティングパウダー、生分解性ポリマー、鉱油、トリグリセリドオイル、シリコーンオイル、グリセリン、モノステアリン酸グリセリン、アルコール、乳化剤、流動石油、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ワックス、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、シクロメチコン、シクロペンタシロキサンおよび水からなる群より選択される、項目３４または３５に記載の局所用組成物。
(項目３７)
前記保存剤が、トコフェロール、ジヨードメチル−ｐ−トリルスルホン、２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール、グルタルアルデヒド、４，４−ジメチルオキサゾリジン、７−エチルビシクロオキサゾリジン、メチルパラベン、ソルビン酸、ＧｅｒｍａｂｅｎＩＩ、ローズマリーエキスおよびＥＤＴＡからなる群より選択される、項目３４〜３６のいずれかに記載の局所用組成物。
(項目３８)
皮膚損傷を低減するか、損傷皮膚の修復を促進するか、またはＵＶ損傷から皮膚を保護する方法であって、項目２１〜３７のいずれかに記載の組成物を被験体の皮膚に適用する工程を含む、方法。
(項目３９)
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞またはケラチノサイトの生存度を増加させる、項目３８に記載の方法。
(項目４０)
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞によるプロコラーゲンの合成を増加させる、項目３８に記載の方法。
(項目４１)
天然に存在しないコラーゲンをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号９０、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３および配列番号１０５からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
(項目４２)
ベクターである、項目４１に記載のポリヌクレオチド。
(項目４３)
分泌タグをコードする核酸、ヒスチジンタグをコードする核酸、緑色蛍光タンパク質をコードする核酸、プロテアーゼ切断部位をコードする核酸およびベータラクタマーゼタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される核酸をさらに含む、項目４１または４２に記載のポリヌクレオチド。
(項目４４)
配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目４１〜４３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(項目４５)
項目４１または４５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
(項目４６)
天然に存在しないコラーゲンを宿主細胞のペリプラズム空間に輸送する、項目４８に記載の宿主細胞。
(項目４７)
クラゲコラーゲンを産生する、項目４５または４６に記載の宿主細胞。
(項目４８)
グラム陰性細菌である、項目４５〜４７のいずれかに記載の宿主細胞。
(項目４９)
大腸菌である、項目４８に記載の方法。
(項目５０)
前記大腸菌がスイッチ大腸菌である、項目４９に記載の方法。
(項目５１)
天然に存在しないコラーゲンを生産する方法であって、
ａ．培養培地中で、項目４５〜５０のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程；および
ｂ．前記宿主細胞から前記天然に存在しないコラーゲンを単離する工程
を含む、方法。
(項目５２)
天然に存在しないエラスチンをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７２、配列番号９９および配列番号１０１からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
(項目５３)
ベクターである、項目５２に記載のポリヌクレオチド。
(項目５４)
分泌タグをコードする核酸、ヒスチジンタグをコードする核酸、緑色蛍光タンパク質をコードする核酸、プロテアーゼ切断部位をコードする核酸およびベータラクタマーゼタンパク質をコードする核酸からなる群より選択される核酸をさらに含む、項目５２または５３に記載のポリヌクレオチド。
(項目５５)
配列グリシン−グルタミン酸−リジン（ＧＥＫ）および／またはグリシン−アスパラギン酸−リジン（ＧＤＫ）の１つまたはそれを超えるアミノ酸トリマーリピートをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、項目５２〜５４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
(項目５６)
項目５２〜５５のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
(項目５７)
天然に存在しないコラーゲンを前記宿主細胞のペリプラズム空間に輸送する、項目５６に記載の宿主細胞。
(項目５８)
クラゲコラーゲンを産生する、項目５６または５７に記載の宿主細胞。
(項目５９)
グラム陰性細菌である、項目５６〜５８のいずれかに記載の宿主細胞。
(項目６０)
大腸菌である、項目５９に記載の方法。
(項目６１)
前記大腸菌がスイッチ大腸菌である、項目６０に記載の方法。
(項目６２)
天然に存在しないエラスチンを生産する方法であって、
ａ．培養培地中で、項目５６〜６１のいずれかに記載の宿主細胞を培養する工程；および
ｂ．前記宿主細胞から前記天然に存在しないエラスチンを単離する工程
を含む、方法。
(項目６３)
皮膚細胞による炎症性サイトカインの産生を減少させる方法であって、項目１〜１７のいずれかに記載の組成物を前記皮膚細胞に適用する工程を含む、方法。
(項目６４)
前記炎症性サイトカインがＩＬ−１ａである、項目６３に記載の方法。
(項目６５)
前記皮膚細胞がケラチノサイトである、項目６３に記載の方法。
(項目６６)
皮膚細胞の生存度を増加させる方法であって、項目１〜１７のいずれかに記載の組成物を被験体の皮膚または皮膚細胞に適用する工程を含む、方法。
(項目６７)
前記被験体の皮膚中に存在するケラチノサイトの生存度を増加させる、項目６６に記載の方法。
(項目６８)
前記被験体の皮膚中に存在する線維芽細胞の生存度を増加させる、項目６６に記載の方法。
(項目６９)
アーバンダストへの曝露の影響から皮膚細胞を保護する方法であって、項目１〜１７のいずれかに記載の組成物を皮膚細胞に適用する工程を含み、ここで前記皮膚細胞の生存度が増加される、方法。
(項目７０)
前記皮膚細胞がケラチノサイトまたは線維芽細胞である、項目６９に記載の方法。