(57)【要約】【課題】  目的タンパク質を高効率で細胞外に分泌させる、タンパク質の製造方法の提供を目的とする。【解決手段】  本発明のタンパク質製造方法は、前記目的タンパク質をコードする核酸に、シグナルペプチドをコードする核酸を２つ以上付加した核酸を宿主細胞に導入し、前記宿主細胞を培養することにより、前記目的タンパク質を培養液中に分泌させる目的タンパク質の製造方法である。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質をコードする核酸が導入された宿主を培養して、前記目的タンパク質を培養液中に分泌させる目的タンパク質の製造方法であって、
前記目的タンパク質をコードする核酸に、シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加されていることを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記目的タンパク質をコードする核酸に、前記シグナルペプチドをコードする核酸が２つ付加されている、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
前記目的タンパク質をコードする核酸の５’末端に、前記シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加されている、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
前記宿主と、前記シグナルペプチドの由来とが同一である、請求項１から３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記宿主が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属である、請求項１から４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記宿主が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである、請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
前記シグナルペプチドの由来が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属である、請求項１から６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記シグナルペプチドの由来が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである、請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
前記シグナルペプチドが、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼＡ、グルコアミラーゼＢおよびＴａｋａ−アミラーゼＡからなる群から選択された少なくとも一つのシグナルペプチドである、請求項１から８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記シグナルペプチドをコードする核酸が、配列番号１、３、５および７で表される塩基配列からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１から９のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記目的タンパク質をコードする核酸に前記シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加された発現ベクターを、宿主に導入する工程と、
前記発現ベクターが導入された宿主を培養する工程とを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１２】
さらに、培養液の上清を回収する工程を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の目的タンパク質の製造方法に使用する発現ベクターであって、
目的タンパク質をコードする核酸を挿入可能な挿入領域と、
シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加されたシグナルペプチドコード領域とを有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１４】
前記シグナルペプチドコード領域において、前記シグナルペプチドをコードする核酸が２つ付加されている、請求項１３記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記シグナルペプチドコード領域の下流に、前記挿入部位が配置されている、請求項１３または１４記載の発現ベクター。
【請求項１６】
前記シグナルペプチドの由来が、前記発現ベクターを導入する宿主と同一である、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
前記シグナルペプチドの由来が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属である、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記シグナルペプチドの由来が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである、請求項１７記載の発現ベクター。
【請求項１９】
前記シグナルペプチドが、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼＡ、グルコアミラーゼＢおよびＴａｋａ−アミラーゼＡからなる群から選択された少なくとも一つのシグナルペプチドである、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項２０】
前記シグナルペプチドをコードする核酸が、配列番号１、３、５および７で表される塩基配列からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質の製造方法およびそれに用いる発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の遺伝子工学の発展に伴い、自然界に存在するあらゆるタンパク質を、宿主細胞内で人為的に製造することが、可能になっている。通常、目的タンパク質の遺伝子を連結した発現ベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して形質転換を行い、得られた形質転換体を培養することによって、前記目的タンパク質を発現させている。他方、タンパク質は、一般に、細胞外に分泌される、いわゆる分泌タンパク質（例えば、菌体外タンパク質）と、細胞内に蓄積される、いわゆる非分泌タンパク質（例えば、菌体内タンパク質）とに分類される。前者の場合、目的タンパク質は細胞外に放出されるため、例えば、形質転換体の培養液上清を回収するのみで、前記目的タンパク質を単離できる。しかしながら、後者の場合、目的タンパク質は細胞内に蓄積されるため、例えば、培養液から培養細胞を回収し、回収した前記培養細胞を破砕して、その内部から前記目的タンパク質を放出させる必要がある。さらに、前記培養細胞の破砕により、前記目的タンパク質以外の様々な成分が放出されるため、前者と比べて夾雑物が多く、目的タンパク質の精製が煩雑になるという問題がある。そこで、形質転換によるタンパク質の製造において、分泌に関与するシグナルペプチドを利用する方法が試みられている。分泌タンパク質は、細胞内においてシグナルペプチドが付加した状態で生成され、このシグナルペプチドの存在によって膜を通り抜ける。そして、通り抜けた後、膜の裏側のシグナルペプチダーゼで前記シグナルペプチドが切断され、前記タンパク質が細胞外に放出される。このシグナルペプチドのコード遺伝子を、非分泌タンパク質である目的タンパク質の遺伝子に付加することで、宿主細胞内で生成された前記目的タンパク質を宿主細胞外に放出することが可能となる。
【０００３】
しかしながら、目的タンパク質の遺伝子にシグナルペプチドのコード遺伝子を付加しても、細胞内に前記目的タンパク質が残留し、十分な分泌効率が得られないという問題がある（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｈａｍａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ，；  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ２８−ａｍｉｎｏ−ａｃｉｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ｌｉｐａｓｅ  ｉｎ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ７９，  １００９−１０１８，  （２００８）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、タンパク質を高効率で分泌させるタンパク質製造方法、および前記タンパク質製造方法に用いる発現ベクターの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するために、本発明のタンパク質製造方法は、目的タンパク質をコードする核酸が導入された宿主を培養して、前記目的タンパク質を培養液中に分泌させる目的タンパク質の製造方法であって、前記目的タンパク質をコードする核酸に、シグナルペプチドをコードする核酸が、２つ以上付加されていることを特徴とする。
【０００７】
また、本発明のタンパク質製造方法に使用する発現ベクターは、目的タンパク質をコードする核酸を挿入可能な挿入領域と、シグナルペプチドをコードする核酸が、２つ以上付加されたシグナルペプチドコード領域とを有することを特徴とする。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の製造方法によれば、前記目的タンパク質を高効率で宿主外に分泌させることが可能となる。このため、例えば、本来、細胞内に蓄積される非分泌タンパク質や、十分に細胞外に分泌されなかった分泌タンパク質についても、宿主外での効率のよい回収が可能となる。また、例えば、培養液上清からの回収が可能となるため、前記目的タンパク質の精製も、より容易となる。したがって、本発明は、例えば、有用性の高いタンパク質の大量製造等において、極めて有用な方法と言える。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施例における発現ベクターの構造の概略を示す模式図である。
【図２】本発明の実施例におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図３】本発明の実施例における蛍光強度測定の結果を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例におけるウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図５】本発明の実施例における蛍光強度測定の結果を示すグラフである。
【図６】本発明の実施例における蛍光強度測定の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明の製造方法は、目的タンパク質をコードする核酸が導入された宿主を培養して、前記目的タンパク質を培養液中に分泌させる目的タンパク質の製造方法であって、前記目的タンパク質をコードする核酸に、シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加されていることを特徴とする製造方法である。
【００１１】
本発明の製造方法において、前記目的タンパク質をコードする核酸に、前記シグナルペプチドをコードする核酸が２つ付加されていることが好ましい。
【００１２】
本発明の製造方法において、前記目的タンパク質をコードする核酸の５’末端に、前記シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加されていることが好ましい。
【００１３】
本発明の製造方法において、前記宿主と、前記シグナルペプチドの由来とが、同一であることが好ましい。
【００１４】
本発明の製造方法において、前記宿主は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属であることが好ましく、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである。
【００１５】
本発明の製造方法において、前記シグナルペプチドの由来は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属であることが好ましく、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである。
【００１６】
本発明の製造方法において、前記シグナルペプチドは、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼＡ、グルコアミラーＢおよびＴａｋａ−アミラーゼＡからなる群から選択された少なくとも一つのシグナルペプチドであることが好ましい。
【００１７】
本発明の製造方法において、前記シグナルペプチドをコードする核酸は、配列番号１、３、５および７で表される塩基配列からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００１８】
本発明の製造方法は、前記目的タンパク質をコードする核酸に前記シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加された発現ベクターを、宿主に導入する工程と、前記発現ベクターが導入された宿主を培養する工程とを含むことが好ましい。
【００１９】
本発明の製造方法は、さらに、培養液の上清を回収する工程を含むことが好ましい。
【００２０】
本発明の発現ベクターは、本発明の目的タンパク質の製造方法に使用する発現ベクターであって、前記目的タンパク質をコードする核酸を挿入可能な挿入領域と、シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加されたシグナルペプチドコード領域とを有することを特徴とする。
【００２１】
本発明の発現ベクターにおいて、前記シグナルペプチドコード領域は、前記シグナルペプチドをコードする核酸が２つ付加されていることが好ましい。
【００２２】
本発明の発現ベクターにおいて、前記シグナルペプチドコード領域の下流に、前記挿入部位が配置されていることが好ましい。
【００２３】
本発明の発現ベクターにおいて、前記シグナルペプチドの由来は、前記発現ベクターを導入する宿主と同一であることが好ましい。
【００２４】
本発明の発現ベクターにおいて、前記シグナルペプチドの由来は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属であることが好ましく、より好ましくは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである。
【００２５】
本発明の発現ベクターにおいて、前記シグナルペプチドは、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼＡ、グルコアミラーゼＢおよびＴａｋａ−アミラーゼＡからなる群から選択された少なくとも一つのシグナルペプチドであることが好ましい。
【００２６】
本発明の発現ベクターにおいて、前記シグナルペプチドをコードする核酸は、配列番号１、３、５および７で表される塩基配列からなる群から選択された少なくとも一つの塩基配列からなるポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００２７】
＜目的タンパク質の製造方法＞
本発明の製造方法は、前述のように、目的タンパク質をコードする核酸が導入された宿主を培養して、前記目的タンパク質を培養液中に分泌させる目的タンパク質の製造方法であって、前記目的タンパク質をコードする核酸に、シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加されていることを特徴とする。本発明において、以下、目的タンパク質をコードする核酸を「タンパク質遺伝子」、シグナルペプチドをコードする核酸を「シグナルペプチド遺伝子」とも言う。本発明において、前記核酸は、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡがあげられ、この他に、例えば、ＰＮＡ等の人工核酸であってもよい。
【００２８】
本発明は、前記タンパク質遺伝子に、前記シグナルペプチド遺伝子を２つ以上付加することが特徴であって、その他の工程や条件については、何ら制限されない。
【００２９】
本発明において、目的タンパク質の種類は、何ら制限されない。前記目的タンパク質は、例えば、その由来において、分泌タンパク質でも、非分泌タンパク質でもよい。前記分泌タンパク質としては、その由来において、例えば、菌体外タンパク質、ペリプラズムタンパク質、細胞外タンパク質等があげられ、前記非分泌タンパク質としては、その由来において、例えば、菌体内タンパク質、細胞内タンパク質等があげられる。前記タンパク質は、前述のように、何ら制限されず、所望のタンパク質があげられ、例えば、酵素、生物学的な機能を有するタンパク質およびペプチド等を含む。前記酵素として、例えば、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、イソメラーゼ、インベルターゼ、トランスフェラーゼ、リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、キチナーゼ、カタラーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、ラッカーゼ、グルクロノアラビノキシラナーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオハイドラーゼ等の酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、リガーゼ等があげられる。前記生物学的な機能を有するタンパク質および前記ペプチドとして、例えば、レクチン等の糖関連タンパク質、ディフェンシン等の抗菌ペプチド、抗ウイルスペプチド、抗真菌ペプチド、種々の抗原ペプチド、血圧降下活性等の生物学的な機能を有するペプチド等があげられる。
【００３０】
前記タンパク質遺伝子には、例えば、発現した目的タンパク質の精製を容易にできることから、ペプチドタグをコードする配列を付加してもよい。前記ペプチドタグは、特に制限されず、例えば、カルモジュリン結合ペプチドタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｔ７タグ、Ｓタグ、セルロース結合ドメインタグ、ＨＡＴタグ、ビオチンタグ、ポリヒスチジンペプチドタグ等があげられる。前記ペプチドタグは、例えば、前記目的タンパク質のＣ末に付加することが好ましいことから、前記ペプチドタグのコード配列を、前記タンパク質遺伝子の３’末端側に付加することが好ましい。前記ペプチドタグのコード配列と前記タンパク質遺伝子とは、例えば、直接連結してもよいし、介在配列を介して連結してもよい。後者の場合、前記介在配列がコードするアミノ酸配列は、例えば、前記ペプチドタグを取り除くためのＦａｃｔｏｒ  Ｘａ、トロンビン、エンテロキナーゼ、Ｈ６４ＡズブチリシンＴＥＶプロテアーゼ、ＩｇＡプロテアーゼ、ＧＳＴプロテアーゼ３Ｃ等の部位特異的プロテアーゼの認識配列、ヒドロキシルアミンやシアノゲンブロマイド等の化合物による切断部位等があげられる。
【００３１】
前記シグナルペプチド遺伝子の個数は、前述のように、２個以上であればよいが、例えば、２〜１０個であり、好ましくは２〜４個であり、より好ましくは２個である。
【００３２】
前記シグナルペプチド遺伝子としては、例えば、同じシグナルペプチド遺伝子を２つ以上付加してもよいし、異なるシグナルペプチド遺伝子を２種類以上付加してもよい。
【００３３】
前記シグナルペプチド遺伝子の配置部位は、特に制限されないが、例えば、前記タンパク質遺伝子の５’末端側に付加されていることが好ましい。このように配置することで、宿主内において、Ｎ末端にシグナルペプチドが付加された目的タンパク質が生成される。前記２以上のシグナルペプチド遺伝子は、例えば、同じ向きで、前記タンパク質遺伝子の５’末端側に付加されていることが好ましい。
【００３４】
本発明において、前記シグナルペプチド遺伝子と前記タンパク質遺伝子とは、例えば、直接連結してもよいし、介在配列を介して連結してもよい。前記介在配列の長さは、特に制限されないが、例えば、３の倍数の塩基数であることが好ましく、具体的には、例えば、アミノ酸１〜４０残基をコードする塩基数が好ましく、より好ましくは、アミノ酸１〜３残基をコードする塩基数である。また、本発明において、各シグナルペプチド遺伝子間は、例えば、直接連結してもよいし、介在配列を介して連結してもよい。前記介在配列の長さは、特に制限されないが、例えば、３の倍数の塩基数であることが好ましく、具体的には、例えば、アミノ酸１〜４０残基をコードする塩基数が好ましく、より好ましくは、アミノ酸１〜３残基をコードする塩基数である。
【００３５】
本発明において、前記シグナルペプチド遺伝子の由来生物は、特に限定されないが、例えば、宿主と同一属または近縁属であることが好ましく、より好ましくは、同一属であり、さらに好ましくは、同一種または近縁種であり、特に好ましくは同一株または近縁株である。
【００３６】
本発明は、前述のように、前記タンパク質遺伝子に２つ以上のシグナルペプチド遺伝子を付加することが特徴であり、前記シグナルペプチド遺伝子の種類は、何ら制限されない。
【００３７】
前記シグナルペプチド遺伝子の由来タンパク質としては、特に限定されないが、例えば、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼＡ、グルコアミラーゼＢまたはＴａｋａ−アミラーゼＡ等があげられる。中でも、トリアシルグリセロールリパーゼおよびＴａｋａ−アミラーゼＡが好ましい。前記タンパク質の由来生物は、特に限定されないが、好ましくは、酵母、糸状菌、担子菌を含むキノコ類等の真菌類であり、中でも糸状菌が好ましい。前記糸状菌としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｒｉｚｏｐｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属等があげられ、好ましくは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属であり、特に好ましくは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである。
【００３８】
以下に、前記シグナルペプチド遺伝子の塩基配列および前記シグナルペプチドのアミノ酸配列の具体例を示すが、本発明は、これらには限定されない。
トリアシルグリセロールリパーゼシグナルペプチド
5'−ATGCATCTTGCTATCAAGTCTCTCTTTGTCTCTCTCCTCGGAGCCAGCGTTCTCGCAAGCCCTCTTCCCAGCAATGCTCTGGTTGAGAGA−3'（配列番号１）
MHLAIKSLFVSLLGASVLASPLPSNALVER（配列番号２）
グルコアミラーゼＡシグナルペプチド
5'−ATGGTGTCTTTCTCCTCTTGTCTCCGGGCCTTAGCCCTCGGATCCTCAGTTCTCGCGGTCCAACCTGTCCTTAGA−3'（配列番号３）
MVSFSSCLRALALGSSVLAVQPVLR（配列番号４）
グルコアミラーゼＢシグナルペプチド
5'−ATGCGGAACAACCTTCTTTTTTCCCTCAATGCCATTGCTGGCGCTGTCGCGCATCCGTCCTTCCCTATCCATAAGAGG−3'（配列番号５）
MRNNLLFSLNAIAGAVAHPSFPIHKR（配列番号６）
Ｔａｋａ−アミラーゼＡシグナルペプチド
5'−ATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCT−3'（配列番号７）
MMVAWWSLFLYGLQVAAPALA（配列番号８）
【００３９】
本発明において、前記シグナルペプチドのアミノ酸配列は、例えば、由来となったタンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列に対して、完全に同一でもよいし、異なっていてもよい。後者の場合、前記由来となったタンパク質におけるシグナルペプチドに対して、例えば、１個または数個のアミノ酸が、欠失、置換または付加されてもよく、前記アミノ酸の数は、例えば、１〜１０個があげられる。また、前記シグナルペプチド遺伝子の塩基配列は、例えば、前記アミノ酸配列に基づいてコドンに置き換えることで設計できる。また、分泌に関与するシグナルペプチドは、例えば、一般的に、そのＮ末端付近に塩基性アミノ酸を有し、さらにそのＣ末端側に、１０数残基の疎水性アミノ酸残基に富む領域を有し、さらにそのＣ末端側に数残基の親水性残基とシグナルペプチダーゼ認識切断部位（例えば、Ａｌａ−Ｘ−Ａｌａ等）とを有する構成があげられる。そこで、前記シグナルペプチドの配列としては、例えば、このような構成を満たす人工設計配列等でもよい。前記人工設計配列は、例えば、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ等で予測可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ．ｓｅｑ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／またはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／等。）
【００４０】
本発明において、前記宿主は、特に限定されず、例えば、形質転換が可能な生物があげられる。前記生物としては、例えば、菌類、昆虫、高等動物等の真核生物、真正細菌や古細菌等の原核生物があげられる。前記菌類としては、糸状菌や酵母等の真菌類があげられる。前記糸状菌としては、特に限定されないが、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、Ｒｉｚｏｐｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属、Ｍｕｃｏｒ属、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ属、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ属、Ｈｕｍｉｃｏｌａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ属等があげられる。中でも、高いタンパク質製造能を有する点で、糸状菌が好ましく、特にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属が好ましい。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属としては、特に制限されないが、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｕｓａｍｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｕｓ等があげられ、より好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅである。前記真正細菌としては、例えば、大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属等があげられる。前記昆虫としては、例えば、Ｓｆ９細胞等の昆虫培養細胞等、カイコ等の虫体等があげられる。前記高等動物としては、例えば、ヒトを含む脊椎動物等由来の培養細胞等、脊椎動物等の個体等があげられる。
【００４１】
本発明においては、前述のように、前記シグナルペプチド遺伝子の由来と前記宿主の種類とは、特に限定されないが、例えば、前記両者が同一属または近縁属であることが好ましく、より好ましくは、同一種または近縁種であり、特に好ましくは、同一株または近縁株である。
【００４２】
本発明は、例えば、一実施形態として、発現ベクターを用いて行うことができる。具体的には、例えば、前記目的タンパク質をコードする核酸に前記シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加された発現ベクターを、宿主に導入する工程と、前記発現ベクターが導入された宿主を培養する工程とを含む方法があげられる。
【００４３】
前記発現ベクターは、例えば、２つ以上の前記シグナルペプチド遺伝子が付加された前記タンパク質遺伝子を有していればよく、その他の構成等は何ら制限されない。前記発現ベクターは、例えば、従来公知のベクターに、前述のシグナルペプチド遺伝子および前記タンパク質遺伝子を挿入することにより製造できる。前記ベクターは、特に限定されず、例えば、前記発現ベクターを導入する宿主の種類、導入方法等に応じて適宜決定できる。遺伝子を挿入する前記ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記非ウイルスベクターとしては、例えば、ｐＩＳＩ（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８１，  ７１１−７１９，  （２００８）．）、ＹＩｐ５、ＹＥｐ２４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，  １９３−２００，  （１９９１）．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＨＳＧ２９８／２９９、ｐＨＳＧ３９６／８等の市販のプラスミドベクター等があげられる。中でも、宿主が糸状菌の場合は、例えば、ｐＩＳＩ（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８１，  ７１１−７１９，  （２００８）．）、ｐＵＣ系プラスミドベクター（例えば、ｐＵＣ１８／１９等）等の宿主当りのプラスミドのコピー数が高いものが好ましい。また、前記宿主が酵母の場合は、例えば、ＹＩｐ５、ＹＥｐ２４等が好ましい。また、前記宿主が大腸菌の場合は、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等が好ましい。また、前記宿主が高等動物の場合は、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，  １９３−２００，  （１９９１）．）等が好ましい。前記ウイルスベクターとしては、例えば、バキュロウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶベクター；ａｄｅｎｏ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、シミアンウイルス−４０（ＳＶ−４０）等のＤＮＡウイルスやＲＮＡウイルス等があげられる。中でも、前記宿主が昆虫の場合は、例えば、バキュロウイルスの一種であるＡｃＮＰＶ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）ベクター等が好ましい。これらのベクターには、例えば、従来公知の方法に基づいて、挿入遺伝子を発現可能なように挿入できる。
【００４４】
前記発現ベクターは、さらに、前記挿入した遺伝子の発現を調節する調節配列を含んでもよい。前記調節配列としては、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー配列、ポリアデニル化シグナル、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。これらの調節配列は、例えば、ベクター、宿主、目的タンパク質等の種類に応じて、適宜設定できる。また、前記調節配列には、例えば、所望の宿主で調節配列として機能しうる配列が含まれ、改変を加えた改良型の調節配列等も含まれる。前記プロモーターとしては、特に制限されないが、例えば、宿主が糸状菌の場合、ｓｏｄＭ、ａｍｙＡ、ａｍｙＢ、ａｍｙＣ、ｇｌａＡ、ａｇｄＡ、ｇｌａＢ、ＴＥＦ１、ｘｙｎＦ１  ｔａｎｎａｓｅ、Ｎｏ．８ＡＮ、ｇｐｄＡ、ｐｇｋＡ、ｅｎｏＡ、ｍｅｌＯ、ｃａｔＡ、ｃａｔＢ、Ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ２Ａ、ｓｍａｌｌ  ｖ−ＡＴＰａｓｅ、ｃｒｕｃｉｆｏｒｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ、ａｃｔｉｎ遺伝子を制御するプロモーター等があげられる。前記宿主が酵母の場合は、例えば、ＰＨＯ５、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＡＤＨ１、ＧＡＬ等があげられ、前記宿主が高等動物の場合は、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ＳＶ−４０、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）等由来のプロモーター、筋βアクチンプロモーター等の構成プロモーター、チミジンキナーゼプロモーター等の組織特異的プロモーター、成長ホルモン調節性プロモーター、亜鉛誘導性メタロチオネインプロモーター等の誘導性プロモーターや調節性プロモーターがあげられる。前記ターミネーターとしては、特に制限されないが、例えば、ｇｌａＢターミネーター（Ｇｅｎｅ  ２０７，  １２７−１３４，  （１９９８）．）、ａｍｙＡターミネーター（Ｇｅｎｅ  ８４，  ３１９−３２７，  （１９８９）．）等があげられる。前記調節配列は、例えば、従来公知の方法に基づいて、前記遺伝子の発現を機能的に調節できる部位に配置または結合させればよい。
【００４５】
また、前記発現ベクターは、例えば、栄養要求性マーカー、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等の選択マーカーをコードする配列（選択マーカー遺伝子）を有してもよい。これらの選択マーカーは、例えば、ベクター、宿主、目的タンパク質等の種類に応じて、適宜設定できる。前記選択マーカー遺伝子としては、例えば、ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子およびハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＥＧＦＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰ）、ＥＣＦＰ、ＥＹＦＰ等の変異型ＧＦＰ、ＲＦＰ（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ルシフェラーゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ等があげられる。宿主が糸状菌の場合、前記選択マーカー遺伝子は、例えば、ｎｉａＤ、ａｒｇＢ、ｓＣ、ＬｅｕＡ、ｐｔｒＡ、ｐｙｒＧ、ａｍｄＳ、オーレオバシジン耐性遺伝子、ベノミル耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子およびカルボキシン耐性遺伝子等が好ましく、より好ましくは、ｎｉａＤである。また、前記宿主が酵母の場合、前記選択マーカー遺伝子は、例えば、シクロヘキシミド耐性遺伝子、Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子等が好ましい。前記宿主が大腸菌の場合、前記選択マーカー遺伝子は、例えば、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が好ましい。前記宿主が高等動物の場合、前記選択マーカー遺伝子は、例えば、Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子等が好ましい。
【００４６】
前記発現ベクターの宿主細胞への導入方法は、特に制限されず、例えば、ベクター、宿主等の種類に応じて、適宜設定できる。前記導入方法の具体例としては、例えば、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、Ｈａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクター等を用いた感染導入法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法等があげられる。中でも、宿主が糸状菌の場合は、例えば、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、ウイルスベクターを用いた感染導入法等があげられるが、プロトプラスト法等が好ましい。また、前記宿主が酵母である場合は、例えば、酢酸リチウム法、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法等が好ましい。前記宿主が大腸菌である場合、例えば、Ｈａｎａｈａｎ法、エレクトロポレーション法等が好ましい。前記宿主が昆虫である場合、例えば、前述のＡｃＮＰＶベクター等を用いた感染導入法等が好ましい。前記宿主が高等動物細胞である場合、例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、超音波核酸導入法、遺伝子銃による導入法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、前述のようなウイルスベクター等を用いた感染導入法等が好ましい。
【００４７】
前記発現ベクターが導入された宿主（形質転換体）の培養方法は、特に制限されず、例えば、ベクター、宿主、目的タンパク質等の種類に応じて、適宜設定できる。また、前記培養条件は、特に制限されないが、前記宿主中の前記発現ベクターを維持させる条件を満たすことが好ましい。
【００４８】
前記発現ベクターが導入された宿主の培養により、宿主外に分泌した状態で目的タンパク質を得ることができる。このようにして分泌された目的タンパク質は、例えば、宿主を含む培養液の状態で使用してもよいし、前記培養液から前記目的タンパク質を含む上清を回収して、使用してもよい。また、前記培養液の上清の回収方法は、特に制限されないが、例えば、遠心分離、ろ過等の方法が使用できる。また、前記目的タンパク質は、例えば、さらに前記培養液上清から精製してもよい。タンパク質の精製方法は、特に制限されず、従来公知の方法が採用でき、前記目的タンパク質の種類に応じて適宜決定できる。前記精製方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫酸アンモニウム等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ＤＥＡＥセファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（アマシャムファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子ふるいを用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動法等の電気泳動法等が採用できる。また、例えば、前記目的タンパク質自体が沈殿する場合、例えば、培養液を遠心分離して、その沈殿を回収してもよい。
【００４９】
＜発現ベクター＞
本発明の発現ベクターは、前述のように、本発明の目的タンパク質の製造方法に使用する発現ベクターであって、目的タンパク質をコードする核酸を挿入可能な挿入領域と、シグナルペプチドをコードする核酸が２つ以上付加されたシグナルペプチドコード領域とを有することを特徴とする。本発明の発現ベクターは、前記挿入領域と前記シグナルペプチドコード領域とを有していればよく、その他の構成等は、何ら制限されない。前記発現ベクターは、例えば、従来公知のベクターに、前記シグナルペプチド遺伝子を挿入することで製造できる。前記シグナルペプチド遺伝子を導入する前記ベクターは、特に限定されず、例えば、前記発現ベクターを導入する宿主の種類、導入方法等に応じて適宜決定できる。なお、本発明の発現ベクターは、前記挿入領域と前記シグナルペプチド領域とを有する以外は、特に示さない限り、前述の発現ベクターと同様である。
【００５０】
本発明の発現ベクターは、前述のような各種ベクターに、前記シグナルペプチド遺伝子を２つ以上挿入することで製造できる。また、前記挿入領域の配列は、何ら制限されず、例えば、制限酵素認識配列があげられる。前記挿入配列における前記制限酵素認識配列の個数は、何ら制限されず、例えば、いわゆるマルチクローニングサイトであってもよい。本発明においては、前記挿入領域に目的タンパク質遺伝子を導入した場合に、発現した目的タンパク質にシグナルペプチドが付加されるように、前記挿入領域と前記シグナルペプチドコード領域とが配置されていることが好ましい。
【００５１】
本発明の発現ベクターは、さらに、前記挿入領域に目的タンパク質遺伝子を有していてもよい。また、本発明の発現ベクターは、例えば、使用時に前記発現ベクターと前記目的タンパク質遺伝子とを、それぞれ制限酵素で処理し、前記発現ベクターの挿入領域に前記目的タンパク質遺伝子を連結してもよい。
【００５２】
さらに、本発明の目的タンパク質の製造方法は、第二の形態として、目的タンパク質をコードする核酸が導入された宿主を培養して、前記目的タンパク質を培養液中に分泌させる目的タンパク質の製造方法であって、前記目的タンパク質をコードする核酸に、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼＡ、グルコアミラーゼＢおよびＴａｋａ−アミラーゼＡからなる群から選択された少なくとも一つのシグナルペプチドをコードする核酸が付加されていることを特徴とする。
【００５３】
このように、目的タンパク質遺伝子に、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼＡ、グルコアミラーゼＢおよびＴａｋａ−アミラーゼＡからなる群から選択された少なくとも一つのシグナルペプチドをコードする核酸を付加することで、宿主内で発現した目的タンパク質を効率よく前記宿主外に分泌することができる。なお、特に示さない限りは、前述の形態と同様である。
【００５４】
本発明において、前記目的タンパク質遺伝子に、前記シグナルペプチド遺伝子が２つ以上付加されていることが好ましく、前記シグナルペプチド遺伝子が２つ付加されていることがより好ましい。
【００５５】
本発明の発現ベクターは、第二の形態として、本発明の第二の目的タンパク質の製造方法に使用する発現ベクターであって、前記目的タンパク質をコードする核酸を挿入可能な挿入領域と、トリアシルグリセロールリパーゼ、グルコアミラーゼＡ、グルコアミラーゼＢおよびＴａｋａ−アミラーゼＡからなる群から選択された少なくとも一つのシグナルペプチドをコードする核酸を含むシグナルペプチドコード領域とを有することを特徴とする。なお、特に示さない限りは、前述の形態と同様である。
【実施例】
【００５６】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。
【００５７】
［実施例１］
非分泌タンパク質であるＥＧＦＰタンパク質の遺伝子にシグナルペプチド遺伝子を付加し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅに導入して、発現した前記ＥＧＦＰタンパク質の局在を確認した。
【００５８】
発現ベクターの構築
まず、ＥＧＦＰタンパク質を発現する発現ベクターｐＩＳＩ−ＥＧＦＰを作製した（Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ８１，  ７１１−７１９，  （２００８）．）。この発現ベクターの構造の概略を図１に示す。他方、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅのゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ法により、トリアシルグリセロールリパーゼのシグナルペプチド遺伝子（ｓｔｇｌＡ）、グルコアミラーゼＡのシグナルペプチド遺伝子（ｓｇｌａＡ）、グルコアミラーゼＢのシグナルペプチド遺伝子（ｓｇｌａＢ）およびＴａｋａ−アミラーゼＡのシグナルペプチド遺伝子（ｓＴＡＡ）を増幅させた。この際、５’末端にＡｓｃＩ認識配列を、３’末端にＳａｌＩ認識配列を付加した。そして、前記ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰのｓｏｄＭプロモーター下流のｓｓ−Ｎ２８部分を制限酵素ＡｓｃＩおよびＳａｌＩで除去し、そこに、制限酵素ＡｓｃＩおよびＳａｌＩで処理した前記ｓｇｌａＡ、ｓｇｌａＢ、ｓＴＡＡまたはｓｔｇｌＡのＤＮＡ断片を挿入した。このようにして得られた発現ベクターを、それぞれ、ｐＩＳＩ−ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ、ｐＩＳＩ−ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ、ｐＩＳＩ−ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰおよびｐＩＳＩ−ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰとした。
【００５９】
また、ｓｔｇｌＡを２つ同方向にタンデムに連結した遺伝子（２ｓｔｇｌＡ）およびｓＴＡＡを２つ同方向にタンデムに連結した遺伝子（２ｓＴＡＡ）を作製し、前述と同様にしてｐＩＳＩ−ＥＧＦＰに挿入した。このようにして得られた発現ベクターを、ｐＩＳＩ−２ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰおよびｐＩＳＩ−２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰとした。
【００６０】
以下に、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰに挿入した各ＤＮＡ断片の塩基配列を、ＡｓｃＩ認識配列およびＳａｌＩ認識配列とあわせて示す。下記各塩基配列において、５’末端および３’末端の下線部が、それぞれＡｓｃＩ認識配列およびＳａｌＩ認識配列であり、下線を引いたＡＴＧが、各シグナルペプチド遺伝子の開始コドンである。また、塩基配列の下に、対応するアミノ酸配列を示す。下記アミノ酸配列において、Ｃ末端のジペプチド「ＶＤ」は、付加したＳａｌＩ認識配列に対応するアミノ酸残基である。また、ＥＧＦＰのコード配列およびアミノ酸配列を、配列番号２１および２２に示す。
ｐＩＳＩ−ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ
5'−GGCGCGCCCATGCATCTTGCTATCAAGTCTCTCTTTGTCTCTCTCCTCGGAGCCAGCGTTCTCGCAAGCCCTCTTCCCAGCAATGCTCTGGTTGAGAGAGTCGAC−3'（配列番号９）
MHLAIKSLFVSLLGASVLASPLPSNALVERVD（配列番号１０）
ｐＩＳＩ−ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ
5'−GGCGCGCCCATGGTGTCTTTCTCCTCTTGTCTCCGGGCCTTAGCCCTCGGATCCTCAGTTCTCGCGGTCCAACCTGTCCTTAGAGTCGAC−3'（配列番号１１）
MVSFSSCLRALALGSSVLAVQPVLRVD（配列番号１２）
ｐＩＳＩ−ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ
5'−GGCGCGCCCATGCGGAACAACCTTCTTTTTTCCCTCAATGCCATTGCTGGCGCTGTCGCGCATCCGTCCTTCCCTATCCATAAGAGGGTCGAC−3'（配列番号１３）
MRNNLLFSLNAIAGAVAHPSFPIHKRVD（配列番号１４）
ｐＩＳＩ−ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ
5'−GGCGCGCCCATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCTGTCGAC−3'（配列番号１５）
MMVAWWSLFLYGLQVAAPALAVD（配列番号１６）
ｐＩＳＩ−２ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ
5'−GGCGCGCCCATGCATCTTGCTATCAAGTCTCTCTTTGTCTCTCTCCTCGGAGCCAGCGTTCTCGCAAGCCCTCTTCCCAGCAATGCTCTGGTTGAGAGAATGCATCTTGCTATCAAGTCTCTCTTTGTCTCTCTCCTCGGAGCCAGCGTTCTCGCAAGCCCTCTTCCCAGCAATGCTCTGGTTGAGAGAGTCGAC−3'（配列番号１７）
MHLAIKSLFVSLLGASVLASPLPSNALVERMHLAIKSLFVSLLGASVLASPLPSNALVERVD（配列番号１８）
ｐＩＳＩ−２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ
5'−GGCGCGCCCATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCTATGATGGTCGCGTGGTGGTCTCTATTTCTGTACGGCCTTCAGGTCGCGGCACCTGCTTTGGCTGTCGAC−3'（配列番号１９）
MMVAWWSLFLYGLQVAAPALAMMVAWWSLFLYGLQVAAPALAVD（配列番号２０）
【００６１】
宿主株の形質転換および培養
宿主株は、ｎｉａＤ欠損のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ  ＩＦ４  ｎｉａＤ−株を使用し、培地は、下記組成のＣｚａｐｅｋ−Ｄｏｘ（ＣＤ）培地（ｐＨ５．５）を使用した。なお、発現ベクター未導入の宿主は、Ｎ源としてＮａＮＯ２を含むＣＤ培地を使用し、発現ベクター導入後の宿主は、Ｎ源としてＮａＮＯ３を含むＣＤ培地を使用した。
【００６２】
（ＣＤ培地：ｐＨ５．５）
２％                      グルコース
０．２％                      Ｎ源（ＮａＮＯ２またはＮａＮＯ３）
０．１％                      ＫＨ２ＰＯ４
０．０５％                      ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．２％                      ＫＣｌ
０．８ｍｏｌ／Ｌ              ＮａＣｌ
適量                          微量元素            
合計                            １００ｍＬ
【００６３】
プロトプラスト法により、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＩＦ４  ｎｉａＤ−株に前記各種発現ベクターを導入し、１．５％寒天含有ＣＤ培地（Ｎ源はＮａＮＯ３）で形質転換株を選択した（参考文献：Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５９，  １７９５−１７９７，  （１９９５）．）。選択した形質転換株の芽胞を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０に懸濁した。そして、下記組成のＧＰＹ培地１００ｍｌを入れた坂口フラスコ（５００ｍｌ）に、前記懸濁液を１．０×１０６ｓｐｏｒｅｓ／ｍｌとなるように無菌的に植菌した。前記坂口フラスコを、１５０振動／分、振幅５０ｍｍ、３０℃の条件で２４〜２４０時間インキュベートした。以下、ｐＩＳＩ−ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ、ｐＩＳＩ−ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ、ｐＩＳＩ−ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ、ｐＩＳＩ−ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ、ｐＩＳＩ−２ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰまたはｐＩＳＩ−２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰにより形質転換した株を、それぞれ、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ株、ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株、２ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株または２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株という。
【００６４】
（ＧＰＹ培地）
３％                      グルコース
０．５％                      ｐｅｐｔｏｎ
０．５％                      酵母抽出物
０．１％                      ＫＨ２ＰＯ４
０．０５％                      ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
０．２％                      ＫＣｌ              
合計                            １００ｍＬ
【００６５】
ウエスタンブロッティング
各形質転換体の培養上清をそれぞれ回収し、ＥＧＦＰタンパク質の量を下記ウエスタンブロッティングにより定量した。また、コントロールとして、シグナルペプチドを有さないＥＧＦＰタンパク質を発現するｐＩＳＩ−ＥＧＦＰを導入したＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ  ＩＦ４  ｎｉａＤ−株（以下、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株という）についても、同様にウエスタンブロッティングを行った。
【００６６】
培養開始から１９２時間後の培養液より上清を回収し、前記上清１００μｌを商品名ビバスピン500（ザルトリウス社製）を用いて遠心し、１０μｌに脱塩濃縮した。前記濃縮液を、１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）した後、２．０ｍＡ／ｃｍ２、室温、１時間の条件で、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜上に分画したタンパク質をトランスファーした。前記ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク液でブロッキングした後、１μｇ／ｍＬの抗ＧＦＰマウスモノクローナル抗体（ＭＢＬ社製）と反応させ、ついで、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。そして、ニトロブルーテトラゾリウム（プロメガ社）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（プロメガ社）を用いて、プロトコールに従って、前記ＰＶＤＦ膜の染色を行った。
【００６７】
蛍光強度測定
各形質転換体の培養上清をそれぞれ回収し、ＥＧＦＰタンパク質の量を蛍光強度測定により定量した。また、コントロールとして、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株の培養上清を用いて同様に蛍光強度測定を行った。具体的には培養開始から所定時間（０、２、４、６、８、１０日）経過後に、培養上清を回収し、マイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて、前記培養上清５０μｌの蛍光強度を測定した。
【００６８】
まず、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ株およびｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株のウエスタンブロッティングの結果について、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株の結果と併せて、図２に示す。同図は、各形質転換体の培養液上清におけるＥＧＦＰタンパク質量を示すウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。同図において、レーン１〜５は、それぞれ、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ株およびｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株の結果を示す。同図のレーン１に示すように、シグナルペプチド遺伝子を付加していない形質転換体ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株では、矢印で示す部位にＥＧＦＰタンパク質のバンドは確認できなかった。これに対して、同図のレーン２〜５に示すように、シグナルペプチド遺伝子を付加したｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ株およびｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株では、矢印で示すように、ＥＧＦＰタンパク質が確認でき、ＥＧＦＰタンパク質が、宿主外に分泌されていることが示された。中でも、ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ株またはｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株について、効率よく宿主外への分泌が行われた。これらの結果から、各種シグナルペプチド遺伝子を非分泌タンパク質遺伝子に付加することにより、発現した非分泌タンパク質を宿主外に分泌できることが分かった。
【００６９】
また、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ株およびｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株の蛍光強度測定の結果について、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株の結果と併せて、図３に示す。同図は、各形質転換体の培養液上清におけるＥＧＦＰタンパク質の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。同図において、△、○、□、■および◆は、それぞれ、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ株、ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ株およびｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株の結果を示す。同図に示すように、シグナルペプチド遺伝子を付加していない形質転換体ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株（△）では、蛍光強度の経時的な増加が確認されなかった。これに対して、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株（○）、ｓｇｌａＡ−ＥＧＦＰ株（□）、ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ株（■）およびｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株（◆）では、蛍光強度の経時的な増加が確認でき、ＥＧＦＰタンパク質が、宿主外に分泌されていることが示された。中でも、ｓｇｌａＢ−ＥＧＦＰ株またはｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株により、効率よく宿主外への分泌が行われた。これらの結果から、各種シグナルペプチド遺伝子を非分泌タンパク質遺伝子に付加することにより、発現した非分泌タンパク質を宿主外に分泌できることが分かった。
【００７０】
つぎに、２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株のウエスタンブロッティングの結果を、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株およびｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株の結果と併せて、図４に示す。同図は、各形質転換体の培養液上清におけるＥＧＦＰタンパク質量を示すウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。同図において、レーン１〜３は、それぞれ、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株、ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株および２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株の結果を示す。同図のレーン１に示すように、シグナルペプチド遺伝子を付加していない形質転換体ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株では、矢印で示す部位にＥＧＦＰタンパク質のバンドは確認できなかった。一方、同図のレーン２および３に示すように、ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株および２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株では、矢印で示す部位にＥＧＦＰタンパク質が確認できた。特に、シグナルペプチド遺伝子を２つ連結させた２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株では、大量のＥＧＦＰタンパク質を示す濃いバンドが確認できた。これらの結果から、２つのシグナルペプチド遺伝子を非分泌タンパク質遺伝子に付加することにより、発現した非分泌タンパク質を宿主外に分泌する効率を顕著に向上できることが分かった。
【００７１】
また、２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株の蛍光強度測定の結果を、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株およびｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株の結果と併せて、図５に示す。同図は、各形質転換体の培養液上清におけるＥＧＦＰタンパク質の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。同図において、○、◆および●は、それぞれ、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株、ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株および２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株の結果を示す。同図に示すように、シグナルペプチド遺伝子を付加していない形質転換体ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株（○）では、蛍光強度の経時的な増加が確認されなかった。これに対して、ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株（◆）および２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株（●）では、蛍光強度の経時的な増加が確認された。特に、シグナルペプチド遺伝子を２つ連結させた２ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株（●）は、培養開始後４日以降、ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株（◆）よりも蛍光強度の顕著な増加を示し、培養開始後１０日目には、ｓＴＡＡ−ＥＧＦＰ株の約２．５倍の蛍光強度を示した。これらの結果から、２つのシグナルペプチド遺伝子をタンパク質遺伝子に付加することにより、発現した目的タンパク質を宿主外に分泌する効率を顕著に向上できることが分かった。
【００７２】
つぎに、２ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株の蛍光強度測定の結果を、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株およびｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株と合わせ、図６に示す。同図は、各形質転換体の培養液上清におけるＥＧＦＰタンパク質の蛍光強度の経時変化を示すグラフである。同図において、○、□および■は、それぞれ、ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株および２ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株の結果を示す。同図に示すように、シグナルペプチド遺伝子を付加していない形質転換体ｐＩＳＩ−ＥＧＦＰ株（○）では、蛍光強度の経時的な増加が確認されなかった。これに対して、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株（□）および２ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株（■）では、蛍光強度の経時的な増加が確認された。特に、２ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株（■）は、培養開始後２日以降、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株（□）よりも蛍光強度の顕著な増加を示し、培養開始後８日目には、ｓｔｇｌＡ−ＥＧＦＰ株の約４．９倍の蛍光強度を示した。これらの結果から、２つのシグナルペプチド遺伝子をタンパク質遺伝子に付加することにより、発現した目的タンパク質を宿主外に分泌する効率を顕著に向上できることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
以上のように、本発明の製造方法によれば、前記目的タンパク質を高効率で宿主外に分泌させることが可能となる。このため、例えば、本来、細胞内に蓄積される非分泌タンパク質や、十分に細胞外に分泌されなかった分泌タンパク質についても、細胞外での効率のよい回収が可能となる。また、例えば、培養液上清からの回収が可能となるため、目的タンパク質の精製も、より容易となる。したがって、本発明は、例えば、有用性の高いタンパク質の大量製造等において、極めて有用な方法と言える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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