【手続補正書】
【提出日】令和3年3月29日(2021.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）  第１の複数の細胞を含む第１のサンプル及び第２の複数の細胞を含む第２のサンプルを、それぞれ第１のオリゴヌクレオチド結合抗体及び第２のオリゴヌクレオチド結合抗体と接触させて、それぞれ第１のバーコード化サンプル及び第２のバーコード化サンプルを形成する工程、
ここで、第１のバーコード化サンプルは、第１のオリゴヌクレオチド結合抗体に関連付けられた細胞を含み、第２のバーコード化サンプルは、第２のオリゴヌクレオチド結合抗体に関連付けられた細胞を含み、
前記第１の抗体は、第１の複数の細胞の各々のタンパク質標的に特異的に結合することができ、且つ、ポリ（Ａ）テールと第１のサンプルインデックス用配列とを含む第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドと結合されており、
前記第２の抗体は、第２の複数の細胞の各々のタンパク質標的に特異的に結合することができ、且つ、ポリ（Ａ）テールと第２のサンプルインデックス用配列とを含む第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドと結合されており、
第１のサンプルインデックス用配列及び第２のサンプルインデックス用配列は、異なる配列を含み、且つ
第１の複数の細胞の各々のタンパク質標的及び第２の複数の細胞の各々のタンパク質標的は、同一である、
（ｂ）  第１のバーコード化サンプルと第２のバーコード化サンプルをプールして、第１のオリゴヌクレオチド結合抗体に関連付けられた第１の複数の細胞と第２のオリゴヌクレオチド結合抗体に関連付けられた第２の複数の細胞とを含む、組み合わされたバーコード化サンプルを形成する工程、
（ｃ）  組み合わされたバーコード化サンプルの第１のオリゴヌクレオチド結合抗体に関連付けられた第１の複数の細胞と第２のオリゴヌクレオチド結合抗体に関連付けられた第２の複数の細胞とを、複数の区画に分ける工程、ここで、複数の区画の各区画は、組み合わされたバーコード化サンプルの１つの細胞を含む、
（ｄ）  複数の区画の各区画において、バーコーディング粒子を第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドと接触させる工程、ここで、バーコーディング粒子は、複数のオリゴヌクレオチドプローブを含み、その各々は、ポリ（Ｔ）領域とバーコーディング粒子の複数のオリゴヌクレオチドプローブに共通のバーコード配列とを含む、
（ｅ）  第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドのポリ（Ａ）テールとオリゴヌクレオチドプローブのポリ（Ｔ）領域との間のハイブリダイゼーションを介して第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした各オリゴヌクレオチドプローブを伸長させて、第１の標識化核酸又は第２の標識化核酸を生成する工程、ここで、第１の標識化核酸は、第１のサンプルインデックス用配列又はその相補配列とバーコード配列とを含み、第２の標識化核酸は、第２のサンプルインデックス用配列又はその相補配列とバーコード配列とを含む、
（ｆ）  第１のサンプルインデックス用配列を含む第１の標識化核酸又は第２のサンプルインデックス用配列を含む第２の標識化核酸、或いはそれらの一部の配列情報を得る工程、並びに
（ｇ）  組み合わされたバーコード化サンプルの複数の区画の各区画にある１つの細胞が、第１のサンプル由来であるか第２のサンプル由来であるかを、前記配列情報における、それぞれ第１のサンプルインデックス用配列又は第２のサンプルインデックス用配列、又はそれらの相補配列、又はそれらの一部に基づき、決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）の後に、第１の複数の細胞に関連付けられていない第１のオリゴヌクレオチド結合抗体及び第２の複数の細胞に関連付けられていない第２のオリゴヌクレオチド結合抗体を除く工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の複数の細胞の各々のタンパク質標的に特異的に結合することのできる第１の抗体及び第２の複数の細胞の各々のタンパク質標的に特異的に結合することのできる第２の抗体が同一である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第１のオリゴヌクレオチド結合抗体及び第２のオリゴヌクレオチド結合抗体から、それぞれ第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド及び第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを切り離す工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第１のサンプルインデックス用配列及び第２のサンプルインデックス用配列の少なくとも１つが、６〜６０ヌクレオチド長である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド及び第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、５０〜５００ヌクレオチド長である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第１の複数の細胞の各々のタンパク質標的及び第２の複数の細胞の各々のタンパク質標的の少なくとも１つが、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター、抗体、主要組織適合性複合体、腫瘍抗原、レセプター又はそれらの組み合わせである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）において組み合わされたバーコード化サンプルの第１の複数の細胞及び第２の複数の細胞を分ける工程が、組み合わされたサンプルの、第１のオリゴヌクレオチド結合抗体に関連付けられた第１の複数の細胞及び第２のオリゴヌクレオチド結合抗体に関連付けられた第２の複数の細胞と、前記バーコーディング粒子を含む複数のバーコーディング粒子とを、複数の区画に分けることを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１の標識化核酸又は第２の標識化核酸或いはそれらの一部の配列情報を得る工程（ｆ）が、第１の標識化核酸又は第２の標識化核酸を１つ以上の核酸増幅反応に供して、核酸シーケンシング用の第１セットの核酸又は第２セットの核酸を生成することを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
オリゴヌクレオチドプローブの各々が、細胞標識、ユニバーサルプライマー用の結合部位、増幅アダプター、シーケンシングアダプター、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
複数のオリゴヌクレオチドプローブの少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブが、バーコーディング粒子上に固定されているか、部分的に前記粒子上に固定されているか、前記粒子内に封入されているか、部分的に前記粒子内に封入されているか、それらの組み合わせである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｄ）が、１つの細胞を含む区画内で、複数のオリゴヌクレオチドプローブをバーコーディング粒子から遊離させることを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
バーコーディング粒子が、セファロースビーズ、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、ヒドロゲルビーズ、又は崩壊性ヒドロゲルビーズである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
複数の区画がウェル又はドロップレットを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
第１の複数の細胞及び第２の複数の細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、腫瘍細胞、骨髄細胞、血液細胞、正常細胞、胎児細胞、母体細胞、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
複数の区画のうちの１区画の１つの細胞が、関心のある複数のタンパク質を含み、且つ
工程（ａ）が、第３の複数のオリゴヌクレオチド結合抗体を前記１つの細胞と接触させることを更に含み、ここで、第３の複数のオリゴヌクレオチド結合抗体の各々は、ユニーク識別子及びポリ（Ａ）テールを含む抗体特異的オリゴヌクレオチドと結合した抗体を含み、ユニーク識別子は当該ユニーク識別子と結合した抗体用のユニーク識別子であり、且つ前記抗体は関心のある前記複数のタンパク質の少なくとも１つと特異的に結合することができ、
工程（ｅ）が、抗体特異的オリゴヌクレオチドのポリ（Ａ）テールとオリゴヌクレオチドプローブのポリ（Ｔ）領域との間のハイブリダイゼーションを介して、抗体特異的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを伸長させて、第１の複数の標識化核酸を生成することを更に含み、ここで、第１の複数の標識化核酸の各々は、ユニーク識別子又はその相補配列とバーコード配列とを含み、且つ
工程（ｆ）が、第１の複数の標識化核酸又はその一部の配列情報を得て、１つの細胞内の関心のある複数のタンパク質のうちの１つ以上の量を決定することを更に含む、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
抗体特異的オリゴヌクレオチドが、分子標識、細胞標識、ユニバーサルプライマー用の結合部位、増幅アダプター、シーケンシングアダプター、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
関心のある複数のタンパク質のうちの関心のある各タンパク質が、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター、抗体、主要組織適合性複合体、腫瘍抗原、レセプター、又はそれらの組み合わせである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つの細胞が、複数のｍＲＮＡ標的分子を含み、且つ
工程（ｄ）が、ｍＲＮＡ標的分子のポリ（Ａ）テールとオリゴヌクレオチドプローブのポリ（Ｔ）領域との間で、１つの細胞由来のｍＲＮＡ標的分子を、複数のオリゴヌクレオチドプローブのオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせることを更に含み、
工程（ｅ）が、ｍＲＮＡ標的分子のポリ（Ａ）テールとオリゴヌクレオチドプローブのポリ（Ｔ）領域との間のハイブリダイゼーションを介してｍＲＮＡ標的分子にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブを伸長させて、第２の複数の標識化核酸を生成することを更に含み、ここで、第２の複数の標識化核酸の各々は、ｍＲＮＡ標的分子の１つの相補的配列とバーコード配列とを含み、且つ
工程（ｆ）が、第２の複数の標識化核酸又はその一部の配列情報を得て、１つの細胞内における複数のｍＲＮＡ標的分子のうちの１つ以上の量を決定することを更に含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
以下の工程：
（ａ）  第１の複数の細胞を含む第１のサンプル及び第２の複数の細胞を含む第２のサンプルを、それぞれ第１のサンプルインデックス用組成物及び第２のサンプルインデックス用組成物と接触させて、それぞれ第１の標識化サンプル及び第２の標識化サンプルを形成する工程、ここで、第１の標識化サンプルは、第１のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた細胞を含み、第２の標識化サンプルは第２のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた細胞を含み、
第１のサンプルインデックス用組成物は、第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドに関連付けられた第１の細胞成分結合用試薬を含み、第１の細胞成分結合用試薬は、第１の複数の細胞の各々の細胞成分標的に特異的に結合することができ、
第２のサンプルインデックス用組成物は、第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドに関連付けられた第２の細胞成分結合用試薬を含み、第２の細胞成分結合用試薬は、第２の複数の細胞の各々の細胞成分標的に特異的に結合することができ、
第１及び第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドは、それぞれ第１のサンプルインデックス用配列及び第２のサンプルインデックス用配列を含み、且つ第１のサンプルインデックス用配列及び第２のサンプルインデックス用配列は、異なる配列を含み、且つ
第１の複数の細胞の各々の細胞成分標的及び第２の複数の細胞の各々の細胞成分標的は、同じである、
（ｂ）  第１の標識化サンプル及び第２の標識化サンプルをプールして、第１のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた細胞及び第２のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた細胞をそれぞれ含む、組み合わされた標識化サンプルを形成する工程、
（ｃ）  組み合わされた標識化サンプルの第１のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた細胞及び第２のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた細胞を、複数の区画に分ける工程、ここで、複数の区画の各区画は、組み合わされた標識化サンプルの１つの細胞を含む、
（ｄ）  第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを１つ以上の核酸増幅反応に供し、第１のサンプルインデックス用配列又はその相補体を含む第１のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチド或いは第２のサンプルインデックス用配列又はその相補体を含む第２のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを生成する工程、
（ｅ）  第１のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチド或いはそれらの一部の配列情報を得る工程、
（ｆ）  組み合わされた標識化サンプル内の細胞が、第１のサンプル由来であるか第２のサンプル由来であるかを、工程（ｅ）において得られた配列情報内のそれぞれ第１のサンプルインデックス用配列又は第２のサンプルインデックス用配列、それらの相補配列又はそれらの一部に基づいて決定する工程
を含む、方法。
【請求項２１】
細胞成分結合用試薬が、タンパク質結合用試薬を含み、ここで、タンパク質結合用試薬は、サンプルインデックス用オリゴヌクレオチドに関連付けられており、且つ、細胞成分標的はタンパク質標的を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｄ）において、第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを１つ以上の核酸増幅反応に供して、第１のサンプルインデックス用配列又はその相補体を含む第１のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチド、或いは第２のサンプルインデックス用配列又はその相補体を含む第２のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを生成する工程が、
複数のバーコードを用いて、第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドをバーコード化して、第１のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを生成することを含む、
請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
組み合わされた標識化サンプル中の細胞が第１サンプル由来であるか第２サンプル由来であるかを決定する工程が、バーコード化サンプルインデックス用組成物内における第１サンプルインデックス用配列、第２サンプルインデックス用配列、それらの相補配列又はそれらの一部の存在の有無を同定することを含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
第１のサンプルインデックス用配列及び第２のサンプルインデックス用配列の少なくとも１つが、６〜６０ヌクレオチド長である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
第１の複数の細胞の各々の細胞成分標的及び第２の複数の細胞の各々の細胞成分標的の少なくとも１つが、細胞表面上にある、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
第１の複数の細胞に関連付けられていない第１のサンプルインデックス用組成物及び第２の複数の細胞に関連付けられていない第２のサンプルインデックス用組成物を除く工程を含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドが、第１の細胞成分結合用試薬から切り離せないように構成されているか、第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドが、第２の細胞成分結合用試薬から切り離せないように構成されているか、或いはその両方である、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
第１の細胞成分結合用試薬から第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを切り離すこと、第２の細胞成分結合用試薬から第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを切り離すこと、或いはその両方を含む、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
第１及び／又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドが、第１及び／又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドの配列を捕捉するように構成されている捕捉配列に相補的な配列を含み、且つ
前記バーコードの各々が、前記捕捉配列を含む標的結合領域を含む、
請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
標的結合領域がポリ（ｄＴ）領域を含み、且つ捕捉配列に相補的なサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドの配列が、ポリ（ｄＡ）領域を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド及び第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、分子標識配列、ユニバーサルプライマー用の結合部位、又はその両方を含む、請求項２０〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
第１の複数の細胞の各々の細胞成分標的、第２の複数の細胞の各々の細胞成分標的、又はその両方が、炭水化物、脂肪、タンパク質、細胞外タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター、主要組織適合性複合体、腫瘍抗原、レセプター、細胞内タンパク質、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
複数のバーコードが、粒子に関連付けられている、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
複数のバーコードの少なくとも１つのバーコードが、粒子上に固定化されているか、部分的に粒子上に固定化されているか、粒子内に封入されているか、部分的に粒子内に封入されているか、これらの組み合わせである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
粒子が、崩壊性ビーズ又は崩壊性ヒドロゲルビーズである、請求項３３又は３４に記載の方法。
【請求項３６】
複数のバーコードを用いて第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドをバーコード化することが、
複数のバーコードを第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドと接触させて、バーコードを第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる工程、ここで、前記バーコードの各々は、第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用ヌクレオチド或いはそれらの両方に特異的に結合することのできる標的結合領域を含む、並びに
第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたバーコードを伸長させて、第１のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを生成する工程、
を含む、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
複数のバーコードの各々が、同一のバーコード配列を含む、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド及び第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、５０〜５００ヌクレオチド長である、請求項２０〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
第１の細胞成分結合用試薬及び第２の細胞成分結合用試薬の少なくとも１つが、抗体、四量体、アプタマー、タンパク質骨格、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドがリンカーを介して第１の細胞成分結合用試薬に結合されているか、第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドがリンカーを介して第２の細胞成分結合用試薬と結合されているか、或いはその両方である、請求項２０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
第１の細胞成分結合用試薬及び第２の細胞成分結合用試薬が同一である、請求項２０〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
第１の複数の細胞の各々の細胞成分標的及び第２の複数の細胞の各々の細胞成分標的の少なくとも１つが、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、細胞マーカー、Ｂ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター、抗体、主要組織適合性複合体、腫瘍抗原、レセプター、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
複数の区画がウェル又はドロップレットを含む、請求項２０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
第１の複数の細胞、第２の複数の細胞、又はその両方が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、腫瘍細胞、骨髄細胞、血液細胞、正常細胞、胎児細胞、母体細胞、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
複数のバーコードの各々が、細胞標識、ユニバーサルプライマーのための結合部位、増幅アダプター、シーケンシングアダプター、又はその組み合わせを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４６】
工程（ｃ）における、組み合わされたバーコード化サンプルの第１のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた第１の複数の細胞及び第２のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた第２の複数の細胞を、複数の区画に分ける工程が、組み合わされたバーコード化サンプルの、第１のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた第１の複数の細胞、第２のサンプルインデックス用組成物に関連付けられた第２の複数の細胞、及び前記複数のバーコードを含む前記粒子を含む複数の粒子を複数の区画に分けることを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ｄ）の前に、前記１つの細胞を含む区画において、前記粒子から複数のバーコードのうちの１つ以上を遊離させることを含む、請求項３３又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを１つ以上の核酸増幅反応に供することが、複数の区画の各区画において、第１のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチド又は第２のサンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを１つ以上の核酸増幅反応に供して、第１のサンプルインデックス用配列又はその相補体を含む第１のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチド、又は第２のサンプルインデックス用配列又はその相補体を含む第２のバーコード化サンプルインデックス用オリゴヌクレオチドを生成することを含む、請求項２０〜４７のいずれか１項に記載の方法。