【手続補正書】
【提出日】令和3年8月17日(2021.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／またはＴ１３３７の３つ、４つ、５つまたは６つすべてで変異を有する、単離された化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質であって、前記変異が、ＶＳＲＥＥＲまたはＶＳＲＥＱＲではない、タンパク質。
【請求項２】
表Ａ、１、２または３に示される変異のセット、好ましくは下記の変異のセットを含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質：
ＩＲＡＶＱＬ、ＶＲＡＶＱＬ、ＬＲＳＶＱＬ、ＬＲＫＩＱＫ、ＬＲＳＶＱＫ、ＶＲＫＬＬＲ、ＬＷＫＩＱＫ、ＶＲＫＩＱＫ、ＧＲＫＩＱＫ、ＶＲＭＨＣＫ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＶＲＫＬＲＳ、ＳＷＲＶＶＶ、ＳＷＫＶＬＫ、ＭＳＧＶＫＣ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＫＴＬＲＰ、ＭＷＶＨＬＮ、ＴＷＳＭＲＧ、ＫＲＲＣＫＶ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＭＨＣＫ、ＧＷＫＬＬＲ、ＧＷＫＯＱＫ、ＶＡＫＬＬＲ、ＶＡＫＩＱＫ、ＶＡＫＩＬＲ、ＧＲＫＩＬＲ、ＭＱＳＶＱＬ、またはＴＡＨＦＫＶバリアント（例えば、ＮＧＴＮ  ＰＡＭについて）；
ＭＱＫＳＥＲ、ＶＲＫＳＥＲ、ＩＣＫＳＥＲ、ＬＷＬＥＴＲ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＩＣＣＣＥＲ、ＭＣＳＦＥＲ、ＶＲＲＥＥＲ、ＬＷＲＶＶＡ、ＷＭＱＡＹＧ、ＬＲＳＶＥＲ、ＬＳＲＷＥＲ、ＬＳＲＷＱＲ、ＬＷＲＶＶＡ、ＬＷＲＳＥＹ、ＳＱＳＷＲＳ、ＬＫＡＷＲＳ、ＬＷＧＷＱＨ、ＬＷＭＲＥＱ、ＨＳＳＷＶＲ、ＭＷＳＥＰＴ、ＧＳＮＹＱＳ、ＦＭＱＷＶＮ、ＹＣＳＷＶＧ、ＭＣＡＷＣＧ、ＦＭＱＷＶＲ、またはＳＳＫＷＰＡバリアント（例えば、ＮＧＣＮ  ＰＡＭについて）；
ＳＲＭＨＣＫ、ＬＷＫＩＱＫ、ＬＣＲＱＱＲ、ＣＷＳＨＱＲ、ＬＲＳＶＲＳ、ＳＲＱＭＲＧ、ＬＲＬＳＡＲ、ＫＷＭＭＣＧ、ＡＷＮＦＱＶ、ＬＷＴＴＬＮ、ＳＲＭＨＣＫ、ＣＷＣＱＣＶ、ＶＲＭＨＣＫ、ＭＲＡＲＫＥ、ＶＲＧＡＫＥ、ＡＥＥＱＱＲ、ＩＲＡＶＲＳ、ＧＷＥＫＶＲ、ＮＲＡＶＮＧ、ＬＲＳＹＬＨ、ＶＲＧＮＮＲ、ＶＱＤＡＱＲ、ＧＷＲＱＳＫ、ＡＷＬＣＬＳ、ＫＷＡＲＶＶ、ＭＷＡＡＲＰ、ＳＲＭＨＣＫ、ＶＫＭＡＫＧ、ＱＲＫＴＲＥ、ＳＲＴＨＴＱ、ＬＷＥＶＩＲ、ＶＳＳＶＲＳ、ＶＲＳＶＲＳ、ＳＲＳＶＲＳ、ＶＲＲＥＱＲ、ＶＲＧＥＱＲ、またはＡＷＴＥＶＴＲバリアント（例えば、ＮＧＡＮ  ＰＡＭについて）。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である配列を含む、請求項１または２に記載の単離されたタンパク質。
【請求項４】
Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３またはＤ９８６；およびＨ８４０またはＮ８６３での変異からなる群から選択されるヌクレアーゼ活性を減少させる１つまたは複数の変異をさらに含み、任意選択で、前記変異が、
（ｉ）Ｄ１０ＡまたはＤ１０Ｎ、および
（ｉｉ）Ｈ８４０Ａ、Ｈ８４０ＮまたはＨ８４０Ｙ
である、前記請求項のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項５】
Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｎ６９２、Ｍ６９４、Ｑ６９５、Ｈ６９８、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｑ９２６、Ｋ１００３およびＲ０１６０での変異、ならびに任意選択でＫ５２６および／またはＲ６９１での変異からなる群から選択される特異性を増加させる１つまたは複数の変異をさらに含み、任意選択で、
Ｎ６９２Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ、Ｈ６９８Ａ、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｋ８１０Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ０１６０Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｙ４５０Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｌ１６９Ａ／Ｙ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｌ１６９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｙ４５０Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ、Ｎ４９７Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ、およびＹ４５０Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ／Ｄ１１３５Ｅ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ、Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｎ６９２Ａ／Ｍ６９４Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ；Ｍ６９４Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｑ６９５Ａ／Ｈ６９８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｇ５８２Ａ／Ｖ５８３Ａ／Ｅ５８４Ａ／Ｄ５８５Ａ／Ｎ５８８Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｔ６５７Ａ／Ｇ６５８Ａ／Ｗ６５９Ａ／Ｒ６６１Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ／Ｑ９２６Ａ；Ｆ４９１Ａ／Ｍ４９５Ａ／Ｔ４９６Ａ／Ｎ４９７Ａ；Ｋ９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ／Ｑ９２６Ａ；または９１８Ａ／Ｖ９２２Ａ／Ｒ９２５Ａ；Ｋ８５５Ａ；Ｋ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ；またはＫ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ、および任意選択でＫ５２６Ａおよび／またはＲ６９１Ａの変異を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項６】
任意の介在リンカーで異種性機能ドメインと融合された請求項１〜５に記載の単離されたタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リンカーが、前記融合タンパク質の活性を妨げない、融合タンパク質。
【請求項７】
前記異種性機能ドメインが、
（ｉ）転写活性化ドメインであり、任意選択で、前記転写活性化ドメインが、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ｒＴＡ、ＮＦ−κＢ  ｐ６５または複合性ＶＰＲ（ＶＰ６４−ｐ６５−ｒＴＡ）からのものであり、または、
（ｉｉ）転写サイレンサーまたは転写抑制ドメインであり、任意選択で、前記転写抑制ドメインが、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）もしくはｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）であり、前記転写サイレンサーが、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）であり、または
（ｉｉｉ）ＤＮＡのメチル化状態を改変する酵素であり、任意選択で、ＤＮＡのメチル化状態を改変する前記酵素が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）またはＴＥＴタンパク質であり、任意選択で、前記ＴＥＴタンパク質が、ＴＥＴ１であり、または
（ｉｖ）ヒストンサブユニットを改変する酵素であり、任意選択で、ヒストンサブユニットを改変する前記酵素が、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）またはヒストンデメチラーゼであり、または
（ｖ）塩基エディターであり、任意選択で、前記塩基エディターが、（ａ）シチジンデアミナーゼドメイン、好ましくは、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、デアミナーゼの触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリー、任意選択で、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３ＨもしくはＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、任意選択で、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）；シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）もしくはＣＤＡ２；またはｔＲＮＡに作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼドメイン、または（ｂ）アデノシンデアミナーゼ、好ましくは、アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡ１）、ＡＤＡ２；ＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ１）、ＡＤＡＲ２、ＡＤＡＲ３；ｔＲＮＡ１に作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ１）、ＡＤＡＴ２、ＡＤＡＴ３；および天然に存在するまたは遺伝子操作されたｔＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＴａｄＡ）からなる群から選択されるアデノシンデアミナーゼであり、または
（ｖｉ）生物学的テザーであり、任意選択で、前記生物学的テザーが、ＭＳ２、Ｃｓｙ４またはラムダＮタンパク質であり、または
（ｖｉｉ）ＦｏｋＩである、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７に記載のタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項８に記載の単離された核酸が、以下の位置：Ｄ１１３５、Ｓ１１３６、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ｒ１３３５および／またはＴ１３３７の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つすべてで変異を有する、単離された化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質を発現するための１つまたは複数の制御ドメインに作動可能に連結された、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載の核酸を含み、および任意選択で、請求項１〜７に記載のタンパク質を発現する宿主細胞、好ましくは、哺乳動物宿主細胞。
【請求項１２】
細胞のゲノムを変更する方法であって、請求項１〜７に記載の単離されたタンパク質もしくは融合タンパク質、および前記細胞の前記ゲノムの選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡを、前記細胞で発現させること、または前記細胞をこれらと接触させることを含む方法。
【請求項１３】
前記単離されたタンパク質または融合タンパク質が、核局在化配列、細胞透過性ペプチド配列および／またはアフィニティタグの１つまたは複数を含み、任意選択で、前記細胞が、幹細胞であり、任意選択で、前記細胞が、胚性幹細胞、間葉系幹細胞もしくは人工多能性幹細胞であるか、生きている動物における細胞であるか、または胚における細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子を変更する方法であって、前記ｄｓＤＮＡ分子を、請求項１〜７に記載の単離されたタンパク質または融合タンパク質、および前記ｄｓＤＮＡ分子の選択された部分に相補的な領域を有するガイドＲＮＡと接触させることを含む方法。
【請求項１５】
前記ｄｓＤＮＡ分子が、インビトロにあり、前記融合タンパク質およびＲＮＡが、リボヌクレオタンパク質複合体にある、請求項１４に記載の方法。