【手続補正書】
【提出日】令和3年6月25日(2021.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み、
各cRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、
ベクター。
【請求項２】
ヌクレオチド配列(a)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター若しくは強力なプロモーターを含む、及び／又は、
ヌクレオチド配列若しくはアレイ(b)が、宿主細胞における配列若しくはアレイの発現のための構成的なプロモーター若しくは強力なプロモーターを含む、並びに／又は、
(a)及び(b)が、同じオペロンによって含まれる若しくは細胞において作動可能な共通プロモーターの制御下にある、
請求項1に記載のベクター。
【請求項３】
宿主細胞が野生型宿主細胞である、及び／又は、宿主細胞が、細菌若しくは古細菌細胞である、又は、細胞が、大腸菌、ストレプトコッカス若しくは、サルモネラ細胞、任意選択で、EHEC大腸菌若しくはS.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム細胞である、
請求項1又は2に記載のベクター。
【請求項４】
1つ又は複数のCas配列の転写が抑制され、任意選択で、タイプI CRISPR/CasシステムのCasA、B、C、D及びEのうちの1つ又は複数の転写が抑制される、請求項1から3のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
宿主細胞ゲノムのCas改変が、
(a)宿主細胞を死滅させる;
(b)細胞又はエピソームの成長又は増殖を減少させる;
(c)細胞又はエピソームの成長又は増殖を増加させる;
(d)前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を減少させる又は防止する;又は
(e)前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を増加させる、請求項1から4のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
抑制因子がH-NS、StpA、LRP若しくはCRPである、又は、抑制因子が、acr、acrIIA2及びacrIIA4、aca1及びaca2遺伝子若しくはそのオルソログ、ホモログ若しくはパラログによってコードされる、又は、抑制因子が、AcrIIAタンパク質、任意選択で、AcrIIA2及び/若しくはAcrIIA4である、請求項1から5のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
(i)脱抑制因子が、宿主細胞において、それぞれ、H-NS、StpA、LRP若しくはCRP抑制因子との複合体を形成可能であり、CRISPR/Casシステムの抑制を防止する若しくは減少させる、変異体H-NS、StpA、LRP若しくはCRPである、及び／又は、
脱抑制因子がLeuO若しくはLysR若しくはその機能的な均等物である、あるいは、
(ii)脱抑制因子は、抑制因子をコードする宿主細胞遺伝子によって含まれるヌクレオチド配列に相補的なサイレンシングRNA(siRNA)である、
請求項1から6のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
発現可能なhtpG配列を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
細胞が、Cascade及びCas3を含むCRISPR/Casシステムを含み、Cascadeが、宿主細胞において抑制され、ベクターが、
(i)前記Cascade抑制の脱抑制因子をコードする発現可能なヌクレオチド配列;及び
(ii)宿主細胞における脱抑制Cascadeと共に機能できる、Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み;ヌクレオチド配列が、宿主細胞において発現可能であり、
任意選択で、(i)及び(ii)のヌクレオチド配列が、細胞において作動可能な1つ又は複数の構成的なプロモーターの制御下にある、
請求項1から8のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
細菌又は古細菌宿主細胞への導入のための、請求項1から9のいずれか一項に記載の核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって天然で抑制される、内因性CRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み;
各cRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変し、
ここで、
(c)抑制因子が、細胞ゲノムによってコードされるH-NS、StpA、LRP若しくはCRP又はその機能的な均等物であり;
(d)ヌクレオチド配列(a)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含み;及び
(e)ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含み、
任意選択で、脱抑制因子が、LeuO又はその機能的な均等物;又は抑制因子の変異体;又は抑制因子をコードする宿主細胞によって含まれるヌクレオチド配列に相補的なsiRNAである、
ベクター。
【請求項１１】
プロトスペーサー配列が、染色体配列、内因性宿主細胞配列、野生型宿主細胞配列、非ウイルス染色体宿主細胞配列であり、外因性配列及び/又は非ファージ配列ではない、請求項1から10のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
(i)CRISPR/CasシステムがCas3及び抑制Cascadeを含み、脱抑制因子が細胞におけるCascadeを脱抑制可能であり、ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が脱抑制CRISPR/Casシステムと共に作動可能なCRISPR反復配列を含み、反復配列が配列番号49〜52から選択される配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む又はそれからなり、
任意選択で、Cas3が、配列番号58又は60から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む、並びに／あるいは、
(ii)Cas3が、ヌクレオチド配列AWGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能である、
請求項1から11のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３】
Cascadeが抑制CasAを含み、脱抑制因子がCasAを脱抑制可能であり、CasAが配列番号66若しくは68から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項12に記載のベクター。
【請求項１４】
(i)細胞がS.エンテリカ細胞であり、CRISPR/Casシステムが抑制されたタイプE(Cse)Casを含み、脱抑制因子がCasを脱抑制可能であり、任意選択で、脱抑制因子がLeuO又はその機能的な均等物である、及び／あるいは、
(ii)CRISPR/CasシステムがCas3及び抑制Cascadeを含み、脱抑制因子が細胞におけるCascadeを脱抑制可能であり、ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が脱抑制CRISPR/Casシステムと共に作動可能なCRISPR反復配列を含み、反復配列が配列番号53又はそれと少なくとも70%同一である配列を含む又はそれからなる、任意選択で、Cas3が、配列番号56若しくは64から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む、及び／あるいは、
Cascadeが抑制CasAを含み、脱抑制因子がCasAを脱抑制可能であり、CasAが配列番号70若しくは72から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む、
請求項1から11のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が、細胞において脱抑制CRISPR/Casシステムと共に作動可能なCRISPR反復配列を含み、反復配列が細胞のCRISPR/Casシステムによって含まれる宿主アレイにおける反復と少なくとも90%同一であり、ベクター又は配列又はアレイ(b)が、宿主CRISPR/CasシステムのCasヌクレアーゼによって認識されるPAMを含まない、請求項1から14のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１６】
CasA、B、C、D及びEヌクレオチド配列からなる群からの配列を含まない、若しくは、前記群の配列の全てを含まない、並びに／又は、
Cas1、Cas2、Cas5及びCas6配列からなる群からの配列を含まない、並びに／又は、
Cas3ヌクレオチド配列を含まない、
請求項1から15のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１７】
ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する医学的な使用のための、請求項1から16のいずれか一項に記載のベクターであって、
宿主細胞が、対象によって含まれ、及び／あるいは、
前記ベクターが、ヒト又は動物マイクロバイオームにおいて、前記宿主細胞を死滅させるための又はその成長若しくは増殖を減少させるための、医学的使用のためのものであり、
任意選択で、マイクロバイオームが、複数の前記宿主細胞を含み、宿主細胞の種又は株とは異なる種又は株の更なる細胞を含み、更なる細胞がプロトスペーサー配列を含まない、
ベクター。
【請求項１８】
任意選択で、ベクターが同一である、請求項1から17のいずれか一項に記載の複数のベクターを含む複数のバクテリオファージ又はファージミド。
【請求項１９】
複数の請求項1から18のいずれか一項に記載のベクター、バクテリオファージ又はファージミドを含み、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態の治療又は予防において使用するための、1つ又は複数の医療薬又は抗生物質を更に含む組成物であって、
任意選択で、前記組成物が細菌又は古細菌細胞への導入のための医薬であり、
(a)各細胞が、細胞におけるH-NS及び/又はStpAから選択される抑制因子によって抑制される、CRISPR/Casシステムを含み、
(b)ベクターが、細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列を含み、配列が、任意選択で、強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下で脱抑制因子を産生するために、細胞において発現可能である、
組成物。
【請求項２０】
宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)
(i)細胞における1つ若しくは複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ若しくはCRISPRスペーサー配列;又は、
(ii)細胞におけるガイドRNA(gRNA)をコードするヌクレオチド配列
の導入のための部位
を含み;
前記cRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変し、
任意選択で、(i)又は(ii)の前記部位への挿入が、請求項1から17のいずれか一項に記載のベクターを形成する、
ベクター。
【請求項２１】
Cascade Cas、Cas3又はCas9が抑制される、請求項1から20のいずれか一項に記載の使用のための、ベクター、複数のバクテリオファージ、ファージミド、又は、組成物。
【請求項２２】
(i)システムが、
(a)配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号49〜52から選択される配列を含む反復、及びAWGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログである、Cas;又は
(b)配列番号56、64、70及び72から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号53を含む反復と共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログである、Cas;又は
(c)配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、又はNNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログである、Casを含む、
並びに／あるいは、  
(ii)システムが、
(a)配列番号49〜52から選択される配列(又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列)を含む反復、及びAWGを含む又はそれからなるPAM;
(b)配列番号53(又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列)を含む反復;又は
(c)NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はそれからなるPAMを含む、
並びに／あるいは、
(iii)システムが抑制Casを含み、Casが、
(a)AWGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む);又は
(b)NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む)と共に作動可能である、
並びに／あるいは、
(iv)抑制因子が、
(a)配列番号17、19、21、23、25及び27から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列;又は
(b)配列番号29、31、33及び35から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、
並びに／あるいは、
(v)脱抑制因子が、
(a)配列番号3、5、7、9、11、13及び15から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列;又は
(b)配列番号37、39及び41から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列;又は
(c)配列番号43、45及び47から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項1から21のいずれか一項に記載の使用のためのベクター、複数のバクテリオファージ、ファージミド、又は、組成物。
【請求項２３】
該又は各ベクターが、Casコードヌクレオチド配列又はシステムの抑制Casをコードするヌクレオチド配列を欠く、請求項1から22のいずれか一項に記載の使用のためのベクター、複数のバクテリオファージ、ファージミド、又は、組成物。
【請求項２４】
細菌細胞(任意選択で、大腸菌細胞)において核酸リコンビニアリングを実施するインビトロ方法であって、細胞が、抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、方法が、
(a)所望の核酸(NOI)を細胞に導入する工程;
(b)請求項1から17及び21から23のいずれか一項に記載のベクターを細胞に導入する工程であって、工程(a)及び(b)は、同時に又は任意の順序で実施される;
(c)細胞において、ベクターによってコードされる脱抑制因子及びcrRNA又はgRNAを発現させる工程、ここで、脱抑制因子が、CRISPR/Casシステムを脱抑制し、システムのCasヌクレアーゼがcrRNA又はgRNAによってガイドされて、NOIによって含まれるプロトスペーサー配列を改変(例えば、切断)する;及び
(d)任意選択で、改変されたNOIを単離する工程;並びに、
(e)任意選択で、単離され改変されたNOIを第二細胞に導入する工程及び任意選択で、そこから子孫細胞を得る工程;
を含む、方法。
【請求項２５】
第二細胞が、非ヒト動物胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS)であり、
任意選択で、第二細胞又は子孫細胞を非ヒト動物に発生させる工程を含む、又は、
動物からタンパク質又は核酸(又はそのヌクレオチド配列)を単離する工程を更に含む、及び、
任意選択で、核酸又はそのヌクレオチド配列を発現ベクター又は宿主細胞に、その核酸又はヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質の発現のために、挿入する工程、タンパク質を発現させる工程、及びタンパク質を単離する工程、及び任意選択で、単離されたタンパク質を、ヒト又は動物における使用のための医薬に製剤化する工程を更に含む、請求項24に記載の方法。