【手続補正書】
【提出日】令和3年3月26日(2021.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対を成すＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖の配列、又はその抗原結合部分を単離する方法であって、
（ａ）生体試料から、がん特異的な変異によりコードされる変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞を単離する工程；
（ｂ）単離されたＴ細胞を、変異したアミノ酸配列を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共培養する工程であって、それによりＴ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する工程；
（ｃ）共培養されたＴ細胞を分取して分離した単一のＴ細胞試料とする工程；
（ｄ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡを単離する工程；
（ｅ）各々の分離した単一のＴ細胞試料からｍＲＮＡを配列決定する工程であって、ここで該配列決定は：
（ｉ）ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡを増幅する工程；
（ｉｉ）増幅された該ｃＤＮＡの多様な断片を作製し、該多様な断片にタグを付す工程；
（ｉｉｉ）タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を増幅する工程；及び
（ｉｖ）増幅され、タグが付された該ｃＤＮＡの多様な断片を配列決定する工程であって；ここで配列決定は、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を同定する工程；
（ｆ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーの既知の配列に対してアラインメントして、どの単一のＴ細胞試料が、１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する単一のＴ細胞を含むかを同定する工程；
（ｇ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してアラインメントして、（ｆ）で１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現すると同定された、各々の分離した単一のＴ細胞試料のｃＤＮＡの多様な断片の、ＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程、
（ｈ）（ｇ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と、（ｇ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列を同定する工程；
（ｉ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数を計測する工程；
（ｊ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片を採取し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる工程；
（ｋ）（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を同定し、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；並びに
（ｌ）（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖、及び
（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、
をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をアセンブリングし、
任意選択で、（ｋ）で同定された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲア
ルファ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含む第２のＴＣＲアルファ鎖、及び、
（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列と（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖、
をコードする１つ以上の第２のヌクレオチド配列をアセンブリングし、
単離され、対を成すＴＣＲアルファ及びベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を作製する工程、
を含む方法。
【請求項２】
１つ以上のＴ細胞活性化マーカーが、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、インターロイキン（ＩＬ）−２、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ１０７ａ、グランザイムＢ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２２の１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各々の分離した単一のＴ細胞試料に由来するｍＲＮＡを、各々の分離した単一のＴ細胞試料に対する異なるタグによりラベル化する工程をさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
（ｈ）が、アルファとベータ鎖のＶセグメントによりコードされるアミノ酸配列のＣ末端近傍に位置する、保存されたアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列を同定することにより、ＴＣＲ  ＣＤＲ３配列を同定する工程を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
（ｋ）が、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の定常（Ｃ）領域配列と、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列を同定する工程、をさらに含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（ｌ）が、（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖をアセンブリングする工程、並びに、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖をアセンブリングする工程、を含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｌ）が、（ｋ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、外因性のＴＣＲアルファ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲアルファ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲアルファ鎖をアセンブリングする工程、並びに、（ｋ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、外因性のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、及び（ｊ）で採取されたＴＣＲベータ鎖のＣＤＲ３配列を含むＴＣＲベータ鎖をアセンブリングする工程、を含む請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
使用者のコンピューター装置において、（ｆ）で同定された単一のＴ細胞のｃＤＮＡの多様な断片の配列を受け取る工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法であって；
ここで（ｇ）は、ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してコンピューター化されたアラインメントをして、（ｆ）で同定された単一のＴ細胞のｃＤＮＡの多様な断片の、ＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベ
ータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程を含み；
ここで（ｈ）は、（ｇ）で同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内と（ｇ）で同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ  ＣＤＲ３配列のコンピューター化された同定を行う工程を含み；
ここで（ｉ）は、同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数のコンピューター化された計測を行う工程を含み；
ここで（ｊ）は、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片、のコンピューター化された採取を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列とは異なる工程を含み；及び
ここで（ｋ）は、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｊ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｊ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列のコンピューター化された同定を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程を含む、
方法。
【請求項９】
対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列、又はその抗原結合部分を発現する細胞集団を調製する方法であって、該方法は、
請求項１〜８のいずれか１項の方法により、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分を単離する工程、及び
単離された、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞内に導入し、対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖配列又はその抗原結合部分を発現する細胞を得る工程、
を含む方法。
【請求項１０】
対を成すＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分を発現する宿主細胞の数を増大させる工程をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法により単離された、一対のＴＣＲアルファとベータ鎖の配列又はその抗原結合部分。
【請求項１２】
請求項９又は１０により調製された単離された細胞集団。
【請求項１３】
（ａ）請求項１１の一対のＴＣＲアルファとベータ鎖の配列若しくはその抗原結合部分、又は（ｂ）請求項１２の単離されたＴ細胞集団、及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１１の一対のＴＣＲアルファとベータ鎖の配列若しくはその抗原結合部分、又は請求項１２の単離された細胞集団を含む、哺乳動物においてがんを治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項１５】
細胞集団が哺乳動物に対して自家である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
がん特異的な変異によりコードされる、変異したアミノ酸配列に対して抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファとベータ鎖のＶセグメント配列とＴＣＲのＣＤＲ３配列を自動的に同定する方法であって、該方法は、
（ａ）使用者のコンピューター装置において、ｃＤＮＡの多様な断片の配列を受け取る工程であって、ここで該ｃＤＮＡは単一のＴ細胞により、該Ｔ細胞と変異したアミノ酸配列を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）との共培養に続いて作製されるｍＲＮＡによりコードされ、それによって該Ｔ細胞は１つ以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する工程；
（ｂ）ｃＤＮＡの多様な断片の各々の配列を、参照ＴＣＲ配列データベースに対してコンピューター化されたアラインメントをして、ｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の可変（Ｖ）セグメント配列とＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；
（ｃ）（ｂ）において同定されたＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、及び、（ｂ）において同定されたＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列を含むｃＤＮＡの多様な断片内の、ＴＣＲ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列のコンピューター化された同定を行う工程；
（ｄ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数と、同じベータ鎖のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有するｃＤＮＡの多様な断片の数、のコンピューター化された計測を行う工程；
（ｅ）同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、同じベータ鎖のＣＤＲ３配列をコードする最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片、及び任意選択で、同じアルファ鎖のＣＤＲ３配列をコードする２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のコンピューター化された採取を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＣＤＲ３配列を同定する工程であって、ここで２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列は、最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片によりコードされるアルファ鎖のＣＤＲ３配列と異なる工程；並びに
（ｆ）（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列、（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＶセグメント配列、及び任意選択で、（ｅ）で採取された２番目に数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖のＶセグメント配列のコンピューター化された同定を行い、ＴＣＲアルファとベータ鎖のＶセグメント配列を同定する工程；
を含む方法。
【請求項１７】
（ｃ）が、アルファとベータ鎖のＶセグメントによりコードされるアミノ酸配列のＣ末端の近傍に位置する、保存されたアミノ酸残基をコードするｃＤＮＡ配列を同定することにより、ＴＣＲのＣＤ３配列を同定する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
保存されたアミノ酸残基が
ＹＸ１ＣＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９Ｘ２０Ｘ２１Ｘ２２(配列番号５)
のアミノ酸配列を含み、
ここで：
Ｘ１-Ｘ９の各々は任意の天然由来のアミノ酸であり、
Ｘ１０-Ｘ２１の各々はアミノ酸がないか又は任意の天然由来のアミノ酸であり、及び、
Ｘ２２はフェニルアラニン又はトリプトファンである、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
（ｆ）は、（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲアルファ鎖の定常（Ｃ）領域配列と、（ｅ）で採取された最も数が多いｃＤＮＡの多様な断片のＴＣＲベータ鎖のＣ領域配列、のコンピューター化された同定を行う工程をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。