【手続補正書】
【提出日】令和3年9月17日(2021.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において標的ＲＮＡに対するＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし前記真核細胞は植物細胞ではなく、前記方法は、前記ＲＮＡサイレンシング分子のサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤を前記真核細胞に導入し、それによって前記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする前記遺伝子を改変する工程を含み、前記標的ＲＮＡ及び前記第２の標的ＲＮＡは異なる方法。
【請求項２】
真核細胞においてＲＮＡサイレンシング活性を有さない非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子を改変する方法であって、ただし前記真核細胞は植物細胞ではなく、前記方法は、目的の標的ＲＮＡに対する前記非コードＲＮＡ分子のサイレンシング特異性を付与するＤＮＡ編集剤を前記真核細胞に導入し、それによって前記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる前記遺伝子を改変する工程を含む方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする前記遺伝子が、前記真核細胞に対して内在性である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる前記遺伝子が、前記真核細胞に対して内在性である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ＲＮＡと前記第２の標的ＲＮＡとが異なる遺伝子にコードされている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡサイレンシング分子をコードする前記遺伝子を前記改変することが、前記ＲＮＡサイレンシング分子に、前記第２の標的ＲＮＡに対して少なくとも４５％の相補性を付与することを含む請求項１、３又は５に記載の方法。
【請求項７】
前記非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる前記遺伝子を前記改変することが、前記非コードＲＮＡ分子に、前記目的の標的ＲＮＡに対して少なくとも４５％の相補性を付与することを含む請求項２又は４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡサイレンシング分子の前記サイレンシング特異性が、前記第２の標的ＲＮＡのＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを測定することによって決定される請求項１、３、５又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記非コードＲＮＡ分子の前記サイレンシング特異性が、前記目的の標的ＲＮＡのＲＮＡレベル又はタンパク質レベルを測定することによって決定される請求項２、４又は請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子の前記サイレンシング特異性が表現型的に決定される請求項１から９のいずれか一項に記載の方法であって、前記表現型的に決定されることは、任意で、細胞サイズ、成長速度／阻害、細胞形状、細胞膜完全性、腫瘍サイズ、腫瘍形状、生物の色素沈着、感染パラメータ及び炎症パラメータからなる群から選択される少なくとも１つの表現型の決定によってもたらされる、方法。
【請求項１１】
前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子の前記サイレンシング特異性が遺伝子型的に決定される請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法であって、任意で、表現型が遺伝子型の前に決定されるか、あるいは、遺伝子型が表現型の前に決定される、方法。
【請求項１２】
前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子が、
（ａ）前駆体からプロセシングされる；及び／又は
（ｂ）ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子であり、任意で、前記ＲＮＡｉ）分子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）及びトランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）からなる群から選択される
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記非コードＲＮＡ分子が、核内小分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体小分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リピート由来ＲＮＡ、及び転移因子ＲＮＡからなる群から選択される請求項２、４、７および９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子がＲＮＡｉ分子であり、前記ＲＮＡｉ分子が、二次ＲＮＡ構造を保存し、細胞ＲＮＡｉ因子によって認識されるように改変される請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子の前記改変は、欠失、挿入、点突然変異及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変によって行われる請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法であって、前記改変は、任意で、
（ａ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域にある；
（ｂ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のループ領域にある；
（ｃ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子の非構造化領域にある；
（ｄ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域にある；又は
（ｅ）前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子のステム領域及びループ領域、並びに非構造化領域にある
方法。
【請求項１６】
前記改変が最大２００ヌクレオチドの改変を含む、及び／又は、前記方法は前記真核細胞にドナーオリゴヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ編集剤が、
（ａ）植物発現性プロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのｇＲＮＡを含む；及び／又は
（ｂ）（ｉ）エンドヌクレアーゼを含まない；もしくは
（ｉｉ）エンドヌクレアーゼを含み、任意で、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲからなる群から選択されるＤＮＡ編集を含む
請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ編集剤がエンドヌクレアーゼを含み、前記エンドヌクレアーゼがＣａｓ９を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ編集剤が、
（ａ）ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＲＮＰとして前記細胞に適用される；及び／又は
（ｂ）真核細胞における発現を監視するためのレポーターに連結され、任意で、前記レポーターは蛍光タンパク質である
請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記目的の標的ＲＮＡ又は前記第２の標的ＲＮＡが、
（ａ）前記真核細胞に対して内在性であり、任意で、癌に関連するか、又は
（ｂ）前記真核細胞に対して外来性であり、任意で感染症に関連する
請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記真核細胞が、
（ａ）哺乳動物、昆虫、線虫、鳥類、爬虫類、魚類、甲殻類、真菌及び藻類からなる群から選択される真核生物から得られる；及び／又は
（ｂ）哺乳動物細胞であり、任意で、前記哺乳動物細胞は（ｉ）ヒト細胞もしくは（ｉｉ）非ヒト生物の細胞を含む；及び／又は
（ｃ）全能性幹細胞である
請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記真核細胞が自然環境から単離される、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
必要とする対象において感染症を処置する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において前記感染症を処置する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは、前記感染症の発症又は進行と関連する方法。
【請求項２４】
必要とする対象において単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において前記単一遺伝子劣性遺伝疾患を処置する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記単一遺伝子劣性遺伝疾患と関連する方法。
【請求項２５】
必要とする対象において自己免疫疾患を処置する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において前記自己免疫疾患を処置する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記自己免疫疾患と関連する方法。
【請求項２６】
必要とする対象において癌性疾患を処置する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において前記癌性疾患を処置する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記癌性疾患と関連する方法。
【請求項２７】
必要とする対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増強する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において化学療法剤の有効性及び／又は特異性を増強する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記化学療法剤の有効性及び／又は特異性の増強と関連する方法。
【請求項２８】
必要とする対象において細胞アポトーシスを誘導する方法であって、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って、非コードＲＮＡ分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされるか又はＲＮＡサイレンシング分子をコードするか若しくはそれにプロセシングされる遺伝子を改変し、それによって前記対象において細胞アポトーシスを誘導する工程を含み、前記目的の標的ＲＮＡは前記アポトーシスと関連する方法。
【請求項２９】
真核性非ヒト生物を生成する方法であって、ただし前記生物は植物ではなく、前記生物の細胞の少なくともいくつかは、目的の標的ＲＮＡに対するサイレンシング特異性を含む非コードＲＮＡ分子をコードするか又はそれにプロセシングされる改変遺伝子を含み、前記方法は、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法に従って、遺伝子を改変し、それによって前記真核性非ヒト生物を生成する工程を含む方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡサイレンシング分子が、前記第２の標的ＲＮＡからのｍＲＮＡ及び／又はタンパク質産物のレベルにおける観察可能な減少を提供する、請求項１、３、５、６、８、１０から１２、及び１４から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＲＮＡサイレンシング分子の元の特異性が破壊される、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記改変が、ネイティブなＲＮＡサイレンシング分子と比較して１０から２５０ヌクレオチドの改変である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記改変が、少なくとも５塩基の連続する核酸配列における改変である、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
改変前の前記非コードＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡサイレンシング分子が、前記第２の標的ＲＮＡ又は前記目的の標的ＲＮＡに対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％の相補性、かつ９９％までの相補性を有するものである、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ＲＮＡサイレンシング分子をコードするか又はそれにプロセシングされる遺伝子の標的ＲＮＡに対するサイレンシング特異性を第２の標的ＲＮＡに向けてリダイレクトするＤＮＡ編集剤であって、前記標的ＲＮＡと前記第２の標的ＲＮＡとは異なり、前記第２の標的ＲＮＡは感染症、単一遺伝子劣性遺伝疾患、自己免疫疾患又は癌性疾患と関連し、それを必要とする対象における、前記感染症、前記単一遺伝子劣性遺伝疾患、前記自己免疫疾患又は前記癌性疾患の治療に使用するための、剤。