【手続補正書】
【提出日】令和2年12月16日(2020.12.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変された溶血血液サンプルにおける鎌状赤血球突然変異の補正のレベルを評価する方法であって、
（ａ）トリプシンと共に前記サンプルをインキュベーションしてヘモグロビンの断片を得て、そこで、前記ヘモグロビン断片がＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを含むことと；（ｂ）液体クロマトグラフィーによって、前記トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素から前記ＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｃ）前記クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析して前記溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、前記ＨＢＢ／ＨＢＳ比が、ステップ（ｃ）の質量分析の結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定されることと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記スタンダードカーブが、
（ａ）一連のスタンダード溶液を調製し、そこで、一連のスタンダード溶液のメンバーが、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＢペプチド及び配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＳペプチドの異なる既知の比を含有していることと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記スタンダード溶液をトリプシンと共にインキュベーションすることと；
（ｃ）液体クロマトグラフィーによって、前記インキュベーションされたスタンダード溶液中の他の構成要素から前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｄ）各々のスタンダード溶液について前記クロマトグラフィー分離された合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；
（ｅ）各々のスタンダード溶液について前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドの質量分析のピーク体積を決定することと；
（ｆ）スタンダードカーブを生成することと、
によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一連のスタンダード溶液が、１００：０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１の溶液、９０：１０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第２の溶液、８０：２０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第３の溶液、７０：３０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第４の溶液、６０：４０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第５の溶液、５０：５０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第６の溶液、４０：６０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第７の溶液、３０：７０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第８の溶液、２０：８０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第９の溶液、１０：９０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１０の溶液、及び０：１００の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１１の溶液を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶血血液サンプルが、遺伝子改変を含む被験体からの血漿サンプルから得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記溶血血液サンプルが、遺伝子改変を含む被験体からの赤血球の集団から得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記赤血球が、遺伝子改変された造血幹細胞または誘導された多能性幹細胞から分化し、前記細胞が、ヘモグロビンをコードするゲノム配列中の鎌状赤血球突然変異を補正するように治療された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比を、ヘモグロビンをコードするゲノム配列中で補正された鎌状赤血球突然変異を有する複数の遺伝子改変された造血幹細胞を含む造血幹細胞の集団が、被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状を低減するのに有効かどうかの指標とする方法であって、
（ａ）前記造血幹細胞の集団の第１の亜集団を赤血球へと分化させることと；
（ｂ）前記造血幹細胞の集団の第２の亜集団を保存しておくことと；
（ｃ）前記赤血球から溶血血液サンプルを得ることと；
（ｄ）トリプシンと共に前記溶血血液サンプルをインキュベーションすることと；
（ｅ）液体クロマトグラフィーによって、前記トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素からＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｆ）前記クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；
（ｇ）前記溶血血液サンプルにおける前記ＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、約３０％以上のＨＢＢ／ＨＢＳ比が、造血幹細胞の保存しておいた亜集団は前記被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状の低減に有効であろうことを示すことと、
を含む、前記方法。
【請求項８】
前記ＨＢＢ／ＨＢＳ比が、ステップ（ｇ）の前記結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての前記質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記スタンダードカーブが、
（ａ）一連のスタンダード溶液を調製し、そこで、一連のスタンダード溶液のメンバーが、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＢペプチド及び配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＳペプチドの異なる既知の比を含有していることと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記スタンダード溶液をトリプシンと共にインキュベーションすることと；
（ｃ）液体クロマトグラフィーによって、前記インキュベーションされた溶液中の他の構成要素から前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｄ）各々のスタンダード溶液について前記クロマトグラフィー分離された合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；
（ｅ）各々のスタンダード溶液について前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドの質量分析のピーク体積を決定することと；
（ｆ）スタンダードカーブを生成することと、
によって生成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記一連の溶液が、１００：０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１の溶液、９０：１０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第２の溶液、８０：２０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第３の溶液、７０：３０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第４の溶液、６０：４０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第５の溶液、５０：５０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第６の溶液、４０：６０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第７の溶液、３０：７０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第８の溶液、２０：８０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第９の溶液、１０：９０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１０の溶液、及び０：１００の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１１の溶液を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の第２の亜集団が、鎌状赤血球疾患を有する被験体の中へ移植される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体における鎌状赤血球疾患の前記症状が低減または消失される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子改変が相同組み換え修復を含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）精製されたＨＢＢペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが配列番号１を含み、前記組成物が全長ヘモグロビンβ（ＨＢＢ）ポリペプチド配列を含まない、前記組成物と；
ｂ）精製されたＨＢＳペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが配列番号２を含み、前記組成物が全長鎌状赤血球ヘモグロビンβ（ＨＢＳ）ポリペプチド配列を含まず、前記ＨＢＢペプチド及び前記ＨＢＳペプチドのうちの１つまたは複数がマーカーを含む、前記組成物と、
を含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本明細書において提供される方法（このプロトコールが挙げられるがこれらに限定されない）を使用して、補正された細胞（例えば造血細胞）が成功裡に分化し、被験体の中へ細胞を移植する前にＨＢＢ／ＨＢＳの必要な比を産生できることを確認できる。図２中で示されるように、患者細胞を、（ｉ）取り出し、（ｉｉ）補正し、（ｉｉｉ）凍結することができる。（ｉｖ）補正された細胞の一部分の成熟血液細胞（ＲＢＣ）へのインビトロの分化、及び（ｖ）ＲＢＣの集団がＨＢＳに比べて十分な量のＨＢＢを産生すること（例えば少なくとも約３０％のＨＢＢ）の確認、に後続して、（ｖｉ）患者は、ステップ（ｉｉｉ）から凍結／融解した補正された細胞を受け入れるように条件付けることができる。最終的に、（ｖｉｉ）これらの細胞は被験体の中へ移植することができる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
遺伝子改変された溶血血液サンプルにおける鎌状赤血球突然変異の補正のレベルを評価する方法であって、
（ａ）トリプシンと共に前記サンプルをインキュベーションしてヘモグロビンの断片を得て、そこで、前記ヘモグロビン断片がＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを含むことと；（ｂ）液体クロマトグラフィーによって、前記トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素から前記ＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｃ）前記クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析して前記溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、前記ＨＢＢ／ＨＢＳ比が、ステップ（ｃ）の質量分析の結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定されることと、
を含む、前記方法。
(項目２)
前記スタンダードカーブが、
（ａ）一連のスタンダード溶液を調製し、そこで、一連のスタンダード溶液のメンバーが、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＢペプチド及び配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＳペプチドの異なる既知の比を含有していることと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記スタンダード溶液をトリプシンと共にインキュベーションすることと；
（ｃ）液体クロマトグラフィーによって、前記インキュベーションされたスタンダード溶液中の他の構成要素から前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｄ）各々のスタンダード溶液について前記クロマトグラフィー分離された合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；
（ｅ）各々のスタンダード溶液について前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドの質量分析のピーク体積を決定することと；
（ｆ）スタンダードカーブを生成することと、
によって生成される、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記一連のスタンダード溶液が、１００：０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１の溶液、９０：１０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第２の溶液、８０：２０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第３の溶液、７０：３０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第４の溶液、６０：４０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第５の溶液、５０：５０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第６の溶液、４０：６０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第７の溶液、３０：７０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第８の溶液、２０：８０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第９の溶液、１０：９０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１０の溶液、及び０：１００の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１１の溶液を含む、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記溶血血液サンプルが、遺伝子改変を含む被験体からの血漿サンプルから得られる、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
前記溶血血液サンプルが、遺伝子改変を含む被験体からの赤血球の集団から得られる、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
前記赤血球が、遺伝子改変された造血幹細胞または誘導された多能性幹細胞から分化し、前記細胞が、ヘモグロビンをコードするゲノム配列中の鎌状赤血球突然変異を補正するように治療された、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
ヘモグロビンをコードするゲノム配列中で補正された鎌状赤血球突然変異を有する複数の遺伝子改変された造血幹細胞を含む造血幹細胞の集団が、被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状を低減するのに有効かどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記造血幹細胞の集団の第１の亜集団を赤血球へと分化させることと；
（ｂ）前記造血幹細胞の集団の第２の亜集団を保存しておくことと；
（ｃ）前記赤血球から溶血血液サンプルを得ることと；
（ｄ）トリプシンと共に前記溶血血液サンプルをインキュベーションすることと；
（ｅ）液体クロマトグラフィーによって、前記トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素からＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｆ）前記クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；
（ｇ）前記溶血血液サンプルにおける前記ＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、約３０％以上のＨＢＢ／ＨＢＳ比が、造血幹細胞の保存しておいた亜集団は前記被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状の低減に有効であろうことを決定することと、
を含む、前記方法。
(項目８)
前記ＨＢＢ／ＨＢＳ比が、ステップ（ｇ）の前記結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての前記質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定される、項目７に記載の方法。
(項目９)
前記スタンダードカーブが、
（ａ）一連のスタンダード溶液を調製し、そこで、一連のスタンダード溶液のメンバーが、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＢペプチド及び配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＳペプチドの異なる既知の比を含有していることと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記スタンダード溶液をトリプシンと共にインキュベーションすることと；
（ｃ）液体クロマトグラフィーによって、前記インキュベーションされた溶液中の他の構成要素から前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｄ）各々のスタンダード溶液について前記クロマトグラフィー分離された合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；
（ｅ）各々のスタンダード溶液について前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドの質量分析のピーク体積を決定することと；
（ｆ）スタンダードカーブを生成することと、
によって生成される、項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記一連の溶液が、１００：０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１の溶液、９０：１０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第２の溶液、８０：２０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第３の溶液、７０：３０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第４の溶液、６０：４０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第５の溶液、５０：５０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第６の溶液、４０：６０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第７の溶液、３０：７０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第８の溶液、２０：８０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第９の溶液、１０：９０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１０の溶液、及び０：１００の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１１の溶液を含む、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記細胞の第２の亜集団が、鎌状赤血球疾患を有する被験体の中へ移植される、項目７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記被験体における鎌状赤血球疾患の前記症状が低減または消失される、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記遺伝子改変が相同組み換え修復を含む、項目７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
ａ）精製されたＨＢＢペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが配列番号１を含み、前記組成物が全長ヘモグロビンβ（ＨＢＢ）ポリペプチド配列を含まない、前記組成物と；
ｂ）精製されたＨＢＳペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが配列番号２を含み、前記組成物が全長鎌状赤血球ヘモグロビンβ（ＨＢＳ）ポリペプチド配列を含まず、前記ＨＢＢペプチド及び前記ＨＢＳペプチドのうちの１つまたは複数がマーカーを含む、前記組成物と、
を含む、キット。