【手続補正書】
【提出日】令和3年7月1日(2021.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下にアルキン又はアジドによる修飾を少なくとも1つ含むことを特徴とする修飾メッセンジャーRNA（mRNA）：
a）ORF及びUTR、
b）ORF、UTR及びポリ（A）テール、又は
c）ポリ（A）テールのみ。
【請求項２】
ヌクレオチドの4つの標準型（AMP、CMP、GMP、UMP）のうち少なくとも1つが部分的に又は完全に修飾され、好ましくはウラシル又はアデニンがエチニル又はアジド修飾されている、請求項１に記載の修飾mRNA。
【請求項３】
少なくとも1つのヌクレオチドがアルキン修飾されており、少なくとも1つのヌクレオチドがアジド修飾されている、請求項１又は２に記載の修飾mRNA。
【請求項４】
ヌクレオチドの4つの標準型の少なくとも1つが、非修飾形態と比較して1：100〜10：1、好ましくは1：10〜1：10又は1：1の比率で修飾形態で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の修飾mRNA。
【請求項５】
別の方法で修飾された天然又は人工ヌクレオチド、好ましくはプソイドウリジン又はN1-メチルプソイドウリジンを含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の修飾mRNA。
【請求項６】
前記修飾mRNAが、相応に修飾された、アルキン又はアジドを含む検出可能な標識又は機能性分子と修飾mRNAとのクリック反応によって導入された検出可能な標識及び機能性分子のうち1つ以上を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の修飾mRNA。
【請求項７】
前記検出可能な標識が有色の若しくは蛍光発生分子であり、及び/又は、前記機能性分子が組織若しくは細胞特異的な標的化基若しくはリガンド、好ましくは糖部分若しくは脂肪酸部分である、請求項６に記載の修飾mRNA。
【請求項８】
カチオン性又はポリカチオン性化合物と複合体化されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の修飾RNA。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNAの製造方法であって、鋳型DNAからmRNAをin vitro転写すること、又は、代わりに原核生物若しくは真核生物宿主細胞を用いて発酵プロセスを行い、発現ベクターに含まれる鋳型DNAを発現させることを含み、前記方法が、mRNA転写に必要な4つの標準型ヌクレオチドを含むヌクレオチド混合物及びRNAポリメラーゼの存在下で行われ、前記ヌクレオチド混合物において、ヌクレオチドの4つの型のうち少なくとも1つの少なくとも一部が、アルキン若しくはアジド修飾を含むように修飾されている、前記方法。
【請求項１０】
ポリ（A）テールにアルキン又はアジド修飾を含む修飾mRNAの製造方法であって、ATPの存在下で、mRNA上のポリ（A）テールにおいてポリ（A）ポリメラーゼ付加反応を行うことを含み、前記ATPが、アデノシンにおいて少なくとも部分的にアルキン又はアジド修飾されている、前記方法。
【請求項１１】
クリック反応を行うための条件下において、相応にアルキン又はアジド修飾された検出可能な標識及び/又は機能性分子を添加して、請求項６又は７に記載の修飾mRNAを製造することをさらに含む、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
対応するヒト、動物又は植物の親細胞に、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNAをex vivoトランスフェクションして得られる細胞調製物。
【請求項１３】
前記細胞が、ヒト又は動物の免疫系の細胞である、請求項１２に記載の細胞調製物。
【請求項１４】
活性剤として請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNA又は請求項１２若しくは１３に記載の細胞調製物を含み、任意に、医薬的に許容可能なアジュバント若しくは賦形剤と組み合わせて含む、及び/又は、医薬的に許容可能な担体に含まれる、医薬組成物。
【請求項１５】
mRNAベースの治療的及び/又は予防的用途で使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNA又は請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の治療的及び/又は予防的用途で使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNA又は請求項１４に記載の医薬組成物であって、前記治療的及び/又は予防的用途が、前記mRNAによってコードされる特定のエンドヌクレアーゼ（例えば、CRISPR/Cas9）と組み合わせた標的化遺伝子治療、遺伝子補充治療における、ワクチン接種における、がん治療における、並びに、（遺伝性）疾患及び遺伝的異常の治療のための細胞特異的な遺伝子発現若しくは遺伝子編集のための、標的化送達、又は免疫学的アジュバントとしての使用を含む、前記修飾mRNA又は医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の治療的及び/若しくは予防的用途でヒト若しくは動物において使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNA又は請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
植物及び植物細胞へのトランスフェクションのための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNAの使用。
【請求項１９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNAの製造及び/又は送達用キット。
【請求項２０】
細胞、組織又は器官における、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNAの存在、送達及び/又は分布についてのin vitroスクリーニングのための診断用組成物であって、前記組成物が、検出可能な標識、好ましくはフルオロフォア標識若しくは放射性核種標識を含む前記修飾mRNAを含む、前記組成物。
【請求項２１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNAの存在、送達及び/若しくは分布についてのin vivoスクリーニングに、又は、請求項１２若しくは１３に記載の細胞調製物の再投与でのin vivoモニタリングに使用するための診断用組成物であって、前記組成物が、フルオロフォア標識若しくは放射性核種標識を含む前記修飾mRNAを含むか、又は、前記細胞が、フルオロフォア標識若しくは放射性核種標識を含む修飾mRNAによってトランスフェクトされる、前記組成物。
【請求項２２】
mRNAの安定化方法であって、ポリ（A）ポリメラーゼ付加反応において、及び/又はRNA合成中に、部分的に又は完全にアルキン及び/又はアジド修飾形態のヌクレオチドの4つの標準型（ATP、CTP、GTP及びUTP）のうち少なくとも1つを含むことによってアルキン及び/又はアジド修飾を導入して、請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNAを生成し、任意に、相応に修飾された、アルキン又はアジドを含む検出可能な標識又は機能性分子と修飾mRNAとのクリック反応によって、検出可能な標識及び機能性分子のうちの1つ以上を導入する、前記方法。
【請求項２３】
蛍光活性化細胞スキャン分析によって、標的細胞への請求項１〜８のいずれか一項に記載の修飾mRNAの送達及びトランスフェクションを定性的又は定量的に測定するin vitro方法であって、前記修飾mRNAが、アルキン若しくはアジドを含む相応に修飾された蛍光発生分子とのクリック反応によって修飾mRNAに導入された1つ以上の蛍光発生分子を含み、及び/又は、前記修飾mRNAが蛍光タンパク質をコードする、前記方法。
【請求項２４】
蛍光発生分子又は蛍光タンパク質によって発せられる蛍光シグナルが、修飾mRNAをトランスフェクトされた標的細胞について測定され、トランスフェクトされていない標的細胞と比較される、請求項２３に記載のin vitro方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
本発明の一つの主題に関連して上に開示された全ての情報は、明示的に繰り返されていなくても、この情報が発明の文脈内で認識可能な関連性を有する他の主題の文脈において、等しく適用されると考えられる。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］5'-キャップ構造、5'-非翻訳領域（5'-UTR）、オープンリーディングフレーム領域（ORF）、3'-非翻訳領域（3'-UTR）並びにポリ（A）テール領域を含み、ORF、5'-UTR、3'-UTR及びポリ（A）テール領域のうちの少なくとも1つの領域内の少なくとも1つのヌクレオチドにおいて、アルキン又はアジドによる修飾を少なくとも1つ含むことを特徴とする修飾メッセンジャーRNA（mRNA）。
［実施形態２］以下の領域内に修飾されたヌクレオチドを含むことを特徴とする、実施形態１に記載の修飾mRNA：
a）ORF及びUTR、
b）ORF、UTR及びポリ（A）テール、又は
c）ポリ（A）テールのみ。
［実施形態３］ヌクレオチドの4つの標準型（AMP、CMP、GMP、UMP）のうち少なくとも1つが部分的に又は完全に修飾され、好ましくはウラシル又はアデニンがエチニル又はアジド修飾されている、実施形態１又は２に記載の修飾mRNA。
［実施形態４］前記少なくとも1つのヌクレオチドがアルキン修飾されており、少なくとも1つのヌクレオチドがアジド修飾されている、実施形態１〜３のいずれかに記載の修飾mRNA。
［実施形態５］ヌクレオチドの4つの標準型の少なくとも1つが、非修飾形態と比較して1：100〜10：1、好ましくは1：10〜1：10又は1：1の比率で修飾形態で存在する、実施形態１〜４のいずれかに記載の修飾mRNA。
［実施形態６］別の方法で修飾された天然又は人工ヌクレオチド、好ましくはプソイドウリジン又はN1-メチルプソイドウリジンを含むことを特徴とする、実施形態１〜５のいずれかに記載の修飾mRNA。
［実施形態７］前記修飾mRNAが、相応に修飾された、アルキン又はアジドを含む検出可能な標識又は機能性分子と修飾mRNAとのクリック反応によって導入された検出可能な標識及び機能性分子のうち1つ以上を含む、実施形態１〜６のいずれかに記載の修飾mRNA。
［実施形態８］前記検出可能な標識が有色の若しくは蛍光発生分子であり、及び/又は、前記機能性分子が組織若しくは細胞特異的な標的化基若しくはリガンド、好ましくは糖部分若しくは脂肪酸部分である、実施形態７に記載の修飾mRNA。
［実施形態９］少なくとも1つのヌクレオチドにおいて少なくとも1つのアルキン若しくはアジド修飾を含む修飾RNA又は実施形態１〜８のいずれかに記載の修飾mRNAであって、カチオン性又はポリカチオン性化合物と複合体化されている、前記修飾RNA。
［実施形態１０］実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNAの製造方法であって、鋳型DNAからmRNAをin vitro転写すること、又は、代わりに原核生物若しくは真核生物宿主細胞を用いて発酵プロセスを行い、発現ベクターに含まれる鋳型DNAを発現させることを含み、前記方法が、mRNA転写に必要な4つの標準型ヌクレオチドを含むヌクレオチド混合物及びRNAポリメラーゼの存在下で行われ、前記ヌクレオチド混合物において、ヌクレオチドの4つの型のうち少なくとも1つの少なくとも一部が、アルキン若しくはアジド修飾を含むように修飾されている、前記方法。
［実施形態１１］ポリ（A）テールにアルキン又はアジド修飾を含む修飾mRNAの製造方法であって、ATPの存在下で、mRNA上のポリ（A）テールにおいてポリ（A）ポリメラーゼ付加反応を行うことを含み、前記ATPが、アデノシンにおいて少なくとも部分的にアルキン又はアジド修飾されている、前記方法。
［実施形態１２］クリック反応を行うための条件下において、相応にアルキン又はアジド修飾された検出可能な標識及び/又は機能性分子を添加して、実施形態７又は８に記載の修飾mRNAを製造することをさらに含む、実施形態１０又は１１に記載の方法。
［実施形態１３］対応するヒト、動物又は植物の親細胞に、実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNAをex vivoトランスフェクションして得られる細胞。
［実施形態１４］前記細胞が、ヒト又は動物の免疫系の細胞である、実施形態１３に記載の細胞。
［実施形態１５］活性剤として実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNA又は実施形態１３若しくは１４に記載の細胞を含み、任意に、医薬的に許容可能なアジュバント若しくは賦形剤と組み合わせて含む、及び/又は、医薬的に許容可能な担体に含まれる、医薬組成物。
［実施形態１６］mRNAベースの治療的及び/又は予防的用途で使用するための、実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNA又は実施形態１５に記載の医薬組成物。
［実施形態１７］実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNA又は実施形態１５に記載の医薬組成物であって、特に、実施形態１６に記載の治療的及び/又は予防的用途で使用され、前記治療的及び/又は予防的用途が、前記mRNAによってコードされる特定のエンドヌクレアーゼ（例えば、CRISPR/Cas9）と組み合わせた標的化遺伝子治療、遺伝子補充治療における、ワクチン接種における、がん治療における、並びに、（遺伝性）疾患及び遺伝的異常の治療のための細胞特異的な遺伝子発現若しくは遺伝子編集のための、標的化送達、又は免疫学的アジュバントとしての使用を含む、前記修飾mRNA又は医薬組成物。
［実施形態１８］特に、実施形態１６又は１７に記載の治療的及び/若しくは予防的用途でヒト若しくは動物において使用するための、実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNA又は実施形態１５に記載の医薬組成物。
［実施形態１９］植物及び植物細胞へのトランスフェクションのための、実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNAの使用。
［実施形態２０］実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNAの製造及び/又は送達用キット。
［実施形態２１］細胞、組織又は器官における、実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNAの存在、送達及び/又は分布についてのin vitroスクリーニングのための診断用組成物であって、前記組成物が、検出可能な標識、好ましくはフルオロフォア標識若しくは放射性核種標識を含むmRNAを含む、前記組成物。
［実施形態２２］実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNAの存在、送達及び/若しくは分布についてのin vivoスクリーニングに、又は、実施形態１３若しくは１４に記載の細胞の再投与でのin vivoモニタリングに使用するための診断用組成物であって、前記組成物が、フルオロフォア標識若しくは放射性核種標識を含む修飾mRNAを含むか、又は、前記細胞が、フルオロフォア標識若しくは放射性核種標識を含む修飾mRNAによってトランスフェクトされる、前記組成物。
［実施形態２３］RNA、特にmRNAの安定化方法であって、ポリ（A）ポリメラーゼ付加反応において、及び/又はRNA合成中に、部分的に又は完全にアルキン及び/又はアジド修飾形態のヌクレオチドの4つの標準型（ATP、CTP、GTP及びUTP）のうち少なくとも1つを含むことによってアルキン及び/又はアジド修飾を導入して修飾（m）RNAを生成し、任意に、相応に修飾された、アルキン又はアジドを含む検出可能な標識又は機能性分子と修飾（m）RNAとのクリック反応によって、検出可能な標識及び機能性分子のうちの1つ以上を導入する、前記方法。
［実施形態２４］蛍光活性化細胞スキャン分析によって、標的細胞への実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾mRNAの送達及びトランスフェクションを定性的又は定量的に測定するin vitro方法であって、前記修飾mRNAが、アルキン若しくはアジドを含む相応に修飾された蛍光発生分子とのクリック反応によって修飾mRNAに導入された1つ以上の蛍光発生分子を含み、及び/又は、前記修飾mRNAが蛍光タンパク質をコードする、前記方法。
［実施形態２５］蛍光発生分子又は蛍光タンパク質によって発せられる蛍光シグナルが、修飾mRNAをトランスフェクトされた標的細胞について測定され、トランスフェクトされていない標的細胞と比較される、実施形態２４に記載のin vitro方法。