(57)【要約】【課題】簡易な工程で細胞にダメージを与えることなく必要な細胞を回収する。【解決手段】細胞懸濁液Ｂを流動させる流路４と、該流路４の途中位置に配置され、該流路４を流動してきた細胞懸濁液Ｂを流通させるカラム５とを備え、該カラム５が、筒体５ａと、該筒体５ａ内に小流路を形成するように充填された多数の粒子５ｂとを備え、粒子５ｂの表面に、表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体が担持されている細胞回収装置２を提供する。【選択図】図１
2010057381.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞懸濁液を流動させる流路と、
該流路の途中位置に配置され、該流路を流動してきた細胞懸濁液を流通させるカラムとを備え、
該カラムが、筒体と、該筒体内に小流路を形成するように充填された多数の粒子とを備え、
前記粒子の表面に、表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体が担持されている細胞回収装置。
【請求項２】
前記粒子が、磁気ビーズからなり、
前記筒体外部に、前記粒子を磁気的に吸着させる磁石が配置されている請求項１に記載の細胞回収装置。
【請求項３】
前記粒子が、所定の温度で流動化する温度感受性材料からなるビーズである請求項１に記載の細胞回収装置。
【請求項４】
生体組織を消化液とともに容器内に収容して攪拌することにより、細胞を単離させる細胞分離部と、
該細胞分離部の外部に配置された循環流路と、
該循環流路の途中位置に配置され、該循環流路を流動してきた細胞懸濁液を流通させるカラムとを備え、
該カラムが、筒体と、該筒体内に小流路を形成するように充填された多数の粒子とを備え、
前記粒子の表面に、表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体が担持されている細胞分離回収装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞回収装置および細胞分離回収装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、脂肪組織等の生体組織から脂肪由来幹細胞等を回収する方法として、生体組織を消化酵素液とともに容器内において攪拌して細胞を単離させ、得られた細胞懸濁液を遠心分離する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第０５／０１２４８０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞懸濁液を遠心分離することにより細胞を回収する方法では、細胞懸濁液内に存在している赤血球等の不要成分を除去するために、細胞を単離させた容器内から取り出した細胞懸濁液を遠心分離機内の遠心分離容器内に投入する作業と、細胞に大きな遠心力をかける作業と、細胞を洗浄する作業とを繰り返す必要があり、作業工程が複雑であるとともに、細胞にダメージが与えられてしまうという不都合がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、簡易な工程で細胞にダメージを与えることなく必要な細胞を回収することができる細胞回収装置および細胞分離回収装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、細胞懸濁液を流動させる流路と、該流路の途中位置に配置され、該流路を流動してきた細胞懸濁液を流通させるカラムとを備え、該カラムが、筒体と、該筒体内に小流路を形成するように充填された多数の粒子とを備え、前記粒子の表面に、表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体が担持されている細胞回収装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、流路内を流動させられた細胞懸濁液がカラム内に入ると、カラムを構成する筒内に充填されている多数の粒子により形成されている小流路内を通過させられる。粒子の表面には表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体が担持されているので、表面抗原マーカＣＤ９０＋を発現している細胞が表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体に吸着されてカラム内に残り、赤血球等の他の粒子はそのままカラムを通過させられる。
【０００８】
したがって、細胞懸濁液内に存在している脂肪由来細胞、血管内皮細胞、血管周細胞、血管周前駆細胞および繊維芽細胞等の表面抗原マーカＣＤ９０＋を発現している細胞のみを吸着して分離し、他の細胞をカラムから放出することができる。これにより、細胞に過大な遠心力を作用させることもなく、カラム内に流通させるという簡易な操作のみによって必要な細胞を回収することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記粒子が、磁気ビーズからなり、前記筒体外部に、前記粒子を磁気的に吸着させる磁石が配置されていてもよい。
このようにすることで、表面抗原マーカＣＤ９０＋を発現している細胞を吸着した粒子は、筒体の外部に配置されている磁石からの磁力によって筒体内に保持されているので、磁石からの磁力を取り除くことによって容易に筒体内から取り出すことができる。すなわち、表面抗原マーカＣＤ９０＋を発現している細胞は、粒子への吸着後に磁力を取り除いて、粒子を筒体外に取り出すことにより、粒子とともに簡易に回収することができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記粒子が、所定の温度で流動化する温度感受性材料からなるビーズであってもよい。
このようにすることで、カラム内の粒子に表面抗原マーカＣＤ９０＋を発現している細胞を吸着させた状態で、粒子の温度を変化させて流動化させることにより、筒体内から簡易に流出させて細胞を回収することができる。
【００１１】
また、本発明は、生体組織を消化液とともに容器内に収容して攪拌することにより、細胞を単離させる細胞分離部と、該細胞分離部の外部に配置された循環流路と、該循環流路の途中位置に配置され、該循環流路を流動してきた細胞懸濁液を流通させるカラムとを備え、該カラムが、筒体と、該筒体内に小流路を形成するように充填された多数の粒子とを備え、前記粒子の表面に、表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体が担持されている細胞分離回収装置を提供する。
【００１２】
本発明によれば、細胞分離部において生成された細胞懸濁液が循環流路内を流通させられる間にカラムを通過させられて、必要な細胞のみがカラム内の粒子に吸着される。これにより、細胞分離部において生体組織から細胞を単離させながら、循環流路を循環させるという簡単な動作で、必要な細胞を吸着して回収することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、簡易な工程で細胞にダメージを与えることなく必要な細胞を回収することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の第１の実施形態に係る細胞回収装置２および細胞分離回収装置１について、図１〜図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離回収装置１は、生体組織から細胞を単離させる細胞分離部３と、該細胞分離部３に接続された細胞回収装置２とを備えている。細胞回収装置２は、細胞分離部３に接続された循環流路４と、該循環流路４の途中位置に配置されたカラム５と、カラム５内に洗浄液Ａを流通させる洗浄液流通手段６とを備えている。
【００１５】
細胞分離部３は、生体組織を消化液とともに貯留する分離容器７と、該分離容器７内の生体組織および消化液を攪拌する攪拌手段８とを備えている。攪拌手段８は、例えば、分離容器７の下部に配置されたマグネチックスターラ８ａと、分離容器７の内部に配置されたプロペラ式の攪拌子８ｂとを備えている。
【００１６】
マグネチックスターラ８ａが、強力な磁石（図示せず）を回転させることにより、分離容器７内に配置された攪拌子８ｂが磁力で回転させられて、分離容器７内に貯留されている生体組織と消化液とを攪拌するようになっている。分離容器７には、生体組織から分離された細胞よりも大きな生体組織片が分離容器７内から循環流路４内に排出されないように捕捉するフィルタ９が備えられている。
【００１７】
循環流路４は、その両端が分離容器７に接続された配管４ａと、該配管の途中位置に配置されたポンプ４ｂとを備え、ポンプ４ｂの作動によって、分離容器７内において生体組織から分離された細胞群を含みフィルタ９を通過した細胞懸濁液Ｂが流動させられるようになっている。
カラム５は、図１に示されるように、循環流路４の途中位置に配置され、循環流路４を流通してきた細胞懸濁液Ｂを流通させる筒状のカラム本体（筒体）５ａと、該カラム本体５ａ内に充填された磁気ビーズ５ｂと、カラム本体５ａに設けられ、電流のオンオフによって磁力を発生または消滅させる電磁石（磁石）５ｃとを備えている。電磁石５ｃにはそのオンオフを制御する制御部１０が接続されている。
【００１８】
磁気ビーズ５ｂは、例えば、直径約５０μｍ（Miltenyibiotec社製）の球体であり、その表面に表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体がコーティングにより担持されている。
磁気ビーズ５ｂは、電磁石５ｃをオン状態にすることでカラム本体５ａ内に吸着状態に保持される。カラム本体５ａ内に吸着された球状の磁気ビーズ５ｂは、相互に密着するように充填されることにより、相互間に隙間を形成する。磁気ビーズ５ｂ間に形成される隙間は、相互に連絡していて、カラム本体５ａ内に多数の微小流路を形成する。
【００１９】
これにより、上述したように、微小流路を構成している磁気ビーズ５ｂの表面には表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体がコーティングされているので、微小流路の内面には表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体が配置されることになる。
洗浄液流通手段６は、洗浄液Ａを貯留する洗浄液容器６ａと、該洗浄液Ａをカラム５に導く供給配管６ｂと、カラム５を通過した洗浄液Ａを排出する排出管６ｃとを備えている。供給配管６ｂおよび排出管６ｃは、循環流路４を構成する配管４ａに三方弁１１，１２によって接続されている。排出管６ｃは排出容器１３に接続されている。
また、排出管６ｃの下流側には、三方弁１４を介して回収容器１５が接続されている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る細胞分離回収装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る細胞分離回収装置１を用いて、生体組織、例えば、脂肪組織から脂肪由来細胞等の有用な細胞を分離回収するには、分離容器７内に脂肪組織と消化液とを貯留し、攪拌手段８の作動によって攪拌する。これにより、分離容器７内に脂肪由来細胞等が単離された細胞懸濁液Ｂが生成される。
【００２１】
この状態で、循環流路４のポンプ４ｂを作動させることにより、分離容器７内の細胞懸濁液Ｂが循環流路４の配管４ａ内に流入する。分離容器７内にはフィルタ９が配置されているので、単離された細胞よりも大きな生体組織の塊は分離容器７内からの流出が防止される。
【００２２】
循環流路４に流入した細胞懸濁液Ｂは、図２に示されるように、カラム５に流入させられる。このとき、カラム本体５ａに設けられた電磁石５ｃへの電流をオン状態にしておく。これにより、カラム本体５ａ内に磁気ビーズ５ｂが吸着状態に維持されているので、細胞懸濁液Ｂは、磁気ビーズ５ｂ間に形成されている微小流路内を流動させられる。
【００２３】
磁気ビーズ５ｂの表面に表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体がコーティングされていることにより、細胞懸濁液Ｂが微小流路内を流動する間に、細胞懸濁液Ｂ内に存在している表面抗原マーカＣＤ９０＋を発現している細胞のみが磁気ビーズ５ｂに吸着される。図３に示されるように、有用な細胞は全て表面抗原マーカＣＤ９０＋を発現している一方、他の表面抗原マーカについては常に発現しているとは限らない。
【００２４】
有用な細胞は、例えば、脂肪由来細胞、血管内皮細胞、血管周細胞、血管周前駆細胞および繊維芽細胞等である。これらの細胞は磁気ビーズ５ｂに吸着され、不要な赤血球等は微小流路を通過してカラム５から排出される。排出された細胞懸濁液Ｂは、循環流路４を介して分離容器７内に戻される。
【００２５】
この状態で、図４に示されるように、三方弁１１，１２を切り替えて、細胞懸濁液Ｂのカラム５内への流入を停止し、洗浄液容器６ａから洗浄液Ａをカラム５内に流入させる。これにより、カラム５内の微小流路に洗浄液Ａが流通させられて微小流路内面が洗浄される。微小流路の内面には上述したように有用な細胞が吸着されているとともに、細胞懸濁液Ｂに含有されていた消化液が付着しているので、洗浄液Ａによって消化液が押し流されて細胞のみが吸着状態に残る。微小流路の内面を洗浄した洗浄液Ａは、排出管６ｃを介して排出容器１３に回収される。
【００２６】
次に、図５に示されるように、三方弁１２を切り替えて、洗浄液Ａの排出管６ｃへの排出を停止した状態で、回収容器１５への三方弁１４を開いて、電磁石５ｃの電流をオフ状態に切り替える。これにより、電磁石５ｃによる磁気吸引力が消滅するので、カラム本体５ａ内に保持されていた磁気ビーズ５ｂは洗浄液Ａによって、カラム本体５内から排出させられて回収容器１５に流入し回収される。
【００２７】
このように、本実施形態に係る細胞分離回収装置１によれば、磁気ビーズ５ｂに施した表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体のコーティングにより、有用な細胞のみを吸着し、電磁石５ｃのオンオフにより、回収するので、簡易に、有用な細胞を回収することができる。
有用な細胞は磁気ビーズ５ｂに吸着されているので、本実施形態によれば有用な細胞は磁気ビーズ５ｂごと回収されることになる。磁気ビーズ５ｂはその直径が十分に小さく、細胞の生存率や活性に与える影響が少ないので、そのまま移植材として使用することができる。
【００２８】
また、本実施形態によれば、細胞を回収する前に、細胞を洗浄液Ａによって洗浄するので、細胞に付着している消化液の濃度を低減し、消化液が細胞に与えるダメージを低減することができる。また、従来の遠心分離のように過大な遠心力を細胞にかける必要もなく、細胞に与えるダメージをさらに低減することができる。
【００２９】
なお、本実施形態においては、磁気ビーズ５ｂに作用させる磁気をオンオフするための電磁石５ｃを採用したが、これに代えて、カラム本体５ａに対して着脱可能に設けられた永久磁石（図示略）を採用してもよい。
【００３０】
次に、本発明の第２の実施形態に係る細胞分離回収装置２０について、図６を参照して以下に説明する。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る細胞分離回収装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００３１】
本実施形態に係る細胞分離回収装置２０は、図６に示されるように、カラム２１の構造において第１の実施形態に係る細胞分離回収装置１と相違している。
本実施形態においては、カラム本体５ａの内部に磁気ビーズ５ｂに代えて、温度感受性材料（例えば、Cellseed社製）からなり直径約５０〜１００μｍに加工された多数のビーズ２１ｂが充填されている。カラム本体５ａの出口には、ビーズ２１ｂが流出しないように、十分に小さい網目を有するメッシュ２１ｃが配置されている。
【００３２】
ビーズ２１ｂの表面には、第１の実施形態と同様にして、表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体がコーティングされている。
また、カラム本体５ａには、電磁石５ｃに代えて、例えば、冷却液を流通させる冷却流路２１ｄと、該冷却流路２１ｄに冷却液を供給する冷却液供給部２２とが設けられている。冷却液は、２０℃程度の温度に設定されており、カラム本体５ａ内のビーズ２１ｂを室温から２０℃程度まで冷却することができるようになっている。
【００３３】
このように構成された本実施形態に係る細胞分離回収装置２０によれば、分離容器７において単離された細胞を含む細胞懸濁液Ｂが循環流路４を介してカラム２１内に流入すると、細胞懸濁液Ｂに含まれている表面抗原マーカＣＤ９０＋を発現している有用な細胞がビーズ２１ｂに吸着される。この状態で、三方弁１１，１２を切り替えて洗浄液Ａにより細胞を洗浄した後、三方弁１２，１４を回収容器１５側に切り替える。そして、冷却流路２１ｄに冷却液を流通させることによりカラム本体５ａを冷却する。
【００３４】
これにより、ビーズ２１ｂを構成している温度感受性材料がゾル化して流動し、メッシュ２１ｃの網目を抜けて回収容器１５に回収される。ビーズ２１ｂには有用な細胞が吸着されているので、ゾル化したビーズ２１ｂとともに有用な細胞が回収容器１５に回収されることになる。その結果、第１の実施形態と同様に、細胞懸濁液Ｂ内の有用な細胞のみを、ダメージを与えることなく簡易に回収することができるという利点がある。
なお、上記実施形態においては表面抗原マーカＣＤ９０＋抗体をビーズ５ｂ，２１ｂにコーティングすることとしたが、これに代えて、表面抗原マーカＣＤ４５−抗体をコーティングすることにしてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る細胞分離回収装置を説明する全体構成図である。
【図２】図１の細胞分離回収装置による細胞の捕捉工程を説明する全体構成図である。
【図３】図１の細胞分離回収装置により回収される細胞と、該細胞に発現している表面抗原マーカとを示す図表である。
【図４】図１の細胞分離回収装置による洗浄工程を説明する全体構成図である。
【図５】図１の細胞分離回収装置による細胞回収工程を説明する全体構成図である。
【図６】本発明の第２の実施形態に係る細胞分離回収装置を説明する全体構成図である。
【符号の説明】
【００３６】
Ｂ  細胞懸濁液
１，２０  細胞分離回収装置
２  細胞回収装置
３  細胞分離部
４  循環流路（流路）
５，２１  カラム
５ａ  カラム本体（筒体）
５ｂ  磁気ビーズ（粒子）
５ｃ  電磁石（磁石）
２１ｂ  ビーズ（粒子）
【図１】
2010057381.tif 000003
【図２】
2010057381.tif 000004
【図３】
2010057381.tif 000005
【図４】
2010057381.tif 000006
【図５】
2010057381.tif 000007
【図６】
2010057381.tif 000008