【手続補正書】
【提出日】平成16年7月6日(2004.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
［実施例２］  ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）
ＰＣＲ用プライマーは、参考例により決定されたＮ末端アミノ酸配列と現在クローニングの報告がされているシュードモナス  エルギノーサ及びシュードモナス  プチダの塩基配列を基にして作成した。その配列は配列表・配列番号３と配列表・配列番号４に記載した。なお、配列番号３のプライマーには制限酵素ＥｃｏＲＩ認識配列、配列番号４のプライマーにはＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を導入した。
実施例１で得たＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合液５μｌ、反応緩衝液５μｌ、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）２．５Ｕ、５％（Ｖ／Ｖ）ＤＭＳＯを混和し５０μｌとした。これを９５℃、３０秒間の変性反応、５５℃、１分間のアニーリング反応、および７２℃、１分間の伸長反応を２５サイクル繰り返してＰＣＲを行った。その結果、目的の大きさである約７８０ｂｐのフラグメントが増幅された。
このＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、シュードモナス  エルギノーサ、シュードモナス  プチダの３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子の塩基配列と比較したところ、高い相同性を示した。またその配列は開始コドンから終始コドンまでのオープンリーディングフレーム全長をコードしており、目的の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子が増幅されたことが明らかとなった。決定したＤＮＡ配列及びＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号２に示した。ＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列から求められる３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の分子量は２６６８４であった。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
［実施例４］  ３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子の配列決定
ｐＢＤＨ／ＫＫにサブクローニングされたＰＣＲ産物の塩基配列はｐＫＫ２２３−３の配列を基に作成したシークエンシング用プライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンシングＦＳレディーリアクションキット（アプライドバイオシステムズ社製）及びＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社製）により挿入ＤＮＡの両端よりＤＮＡ配列を決定した。決定したＤＮＡ配列及び推定されるアミノ酸配列を、シュードモナス  エルギノーサ、シュードモナス  プチダの３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子のＤＮＡ配列と比較したところ、高い相同性を示した。またその配列は開始コドンから終始コドンまでのオープンリーディングフレーム全長をコードしており、目的の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子が増幅されたことが明らかとなった。決定したＤＮＡ配列及びＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号２に示した。ＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列から求められる３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の分子量は２６６８４であった。
［実施例５］  形質転換体からの３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造
実施例３で得られた形質転換体エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＨＢＤ／ＫＫ）を１００ｍｌのＬＢ液体培地（５００ｍｌ容坂口フラスコ；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．４）４本にそれぞれ１白金耳植菌し３０℃、１６時間培養し種培養液とした。この培養液を２０ＬのＮ−ブロス（３０Ｌジャーファーメンター；１％肉エキス、１％ポリペプトン、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に全量植菌し、３７℃で１６時間通気攪拌培養を行った。培養終了時の培養液の３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の生産性は約０．５Ｕ／ｍｌであった。
遠心分離により菌体を回収した後を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に懸濁した。ダイノミルで菌体を破砕して粗酵素液を取得した。この粗酵素液に対し４０％飽和度になるよう硫安を添加し不溶化する夾雑物を遠心分離により除去した。この遠心上清液を４０％飽和硫安を含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したトヨパール  ＨＷ６５Ｃカラムにかけ、４０〜０％の硫安濃度勾配によって溶出を行い３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性画分回収した。回収した活性画分をセファデックスＧ―２５ゲルろ過により脱塩し、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパールカラムにアプライし、０〜０．７Ｍ  ＮａＣｌの濃度勾配によって溶出を行い３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素活性画分を回収した。本法により分離・精製された３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素を精製酵素表品として以後の検討に使用した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
【配列表】
<110>  Toyo Boseki Kabushiki Kaisha
<120>  新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素遺伝子及び新規３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素の製造法
<130>  02-0421
<141>  2002-05-29
<160>  4
<170>  PatentIn version 2.1
<210>  1
<211>  260
<212>  PRT
<213>  Pseudomonas sp. TE3192 (FERM BP-8049)
<400>  1
Met Leu Lys Gly Lys Val Ala Val Val Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ile 
1               5                   10                  15
Gly Leu Gly Ile Ala Thr Ala Leu Ala Ala Gln Gly Ala Asp Ile Val 
20                  25                  30
Leu Asn Gly Phe Gly Asp Ala Ala Glu Ile Glu Lys Val Arg Ala Gly 
35                  40                  45
Leu Ala Ala Gln His Gly Val Lys Val Leu Tyr Asp Gly Ala Asp Leu 
50                  55                  60
Ser Lys Gly Glu Ala Val Arg Gly Leu Val Asp Asn Ala Val Arg Gln 
65                  70                  75                  80
Met Gly Arg Ile Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Gln His Thr 
85                  90                  95
Ala Leu Ile Glu Asp Phe Pro Thr Glu Lys Trp Asp Ala Ile Leu Ala 
100                 105                 110 
Leu Asn Leu Ser Ala Val Phe His Gly Thr Ala Ala Ala Leu Pro His 
115                 120                 125 
Met Lys Lys Gln Gly Phe Gly Arg Ile Ile Asn Ile Ala Ser Ala His 
130                 135                 140 
Gly Leu Val Ala Ser Ala Asn Lys Ser Ala Tyr Val Ala Ala Lys His 
145                 150                 155                 160 
Gly Val Val Gly Phe Thr Lys Val Thr Ala Leu Glu Thr Ala Gly Gln 
165                 170                 175 
Gly Ile Thr Ala Asn Ala Ile Cys Pro Gly Trp Val Arg Thr Pro Leu 
180                 185                 190 
Val Glu Lys Gln Ile Ser Ala Leu Ala Glu Lys Asn Gly Val Asp Gln 
195                 200                 205 
Glu Thr Ala Ala Arg Glu Leu Leu Ser Glu Lys Gln Pro Ser Leu Gln 
210                 215                 220 
Phe Val Thr Pro Glu Gln Leu Gly Gly Thr Ala Val Phe Leu Ala Ser 
225                 230                 235                 240 
Asp Ala Ala Ala Gln Ile Thr Gly Thr Thr Val Ser Val Asp Gly Gly 
245                 250                 255 
Trp Thr Ala Arg 
260 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
<210>  2
<211>  780
<212>  DNA
<213>  Pseudomonas sp. TE3192 (FERM BP-8049)
<400>  2
atgctcaaag gaaaagtcgc agtcgtcacc ggttccacca gcgggatcgg cctgggtatc     60
gccaccgcgc tggccgcgca gggcgccgat atcgtcctga acggcttcgg cgacgccgcc    120
gagatcgaaa aggtgcgcgc cggcctggcc gcccagcatg gcgtcaaggt gctgtacgac    180
ggcgccgacc tgtccaaggg cgaggccgtg cgcggcctgg tcgacaacgc ggtgcgccag    240
atgggccgca tcgacatcct ggtcaacaac gccggcatcc agcacaccgc gctgatcgag    300
gactttccca ccgaaaaatg ggacgccatc ctggcgctga acctgtcggc cgtgttccat    360
ggcaccgccg ccgcgctgcc gcacatgaag aagcagggct tcggccgcat catcaacatc    420
gcctcggcgc acggcctggt ggcctcggcc aacaagtcgg cctacgtcgc cgccaagcac    480
ggcgtggtgg gcttcaccaa ggtgaccgcg ctggaaaccg ccggccaggg catcaccgcc    540
aacgccatct gcccgggctg ggtgcgcact ccgctggtcg aaaagcagat ctcggcgctg    600
gccgaaaaga acggcgtcga ccaggaaacc gccgcgcgcg aactgctcag cgaaaagcag    660
ccgtcgctgc aattcgtcac gcccgaacaa ctgggcggca cggccgtctt cctggcctcc    720
gatgccgccg cgcaaatcac cggcacgacc gtctccgtcg atggcggctg gacggcgcgc    780
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
<210>  3
<211>  26
<212>  DNA
<213>  artificial DNA
<400>  3
cccgaattca tgctcaaagg aaaagt     26
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
<210>  4
<211>  30
<212>  DNA
<213>  artificial DNA
<400>  4
gggaagaagc tttcagcgcg ccgtccagcc       30