【手続補正書】
【提出日】平成17年5月11日(2005.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
上記操作によって得られた複数のプラスミドクローンを制限酵素Sac I、Bam HI、Hind III、Eco RI、Kpn I、Xba Iを用いて各々消化し、得られた消化ＤＮＡ断片を電気泳動によって可視化し、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡが何種存在するのかを解析した。その結果、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ断片には少なくとも6種類以上の断片が含まれていることが明らかになった。
そこで、この6種類を代表するプラスミドクローンについてその塩基配列を部分的に決定した。塩基配列の決定には、PEアプライドバイオシステム社製の塩基配列解読装置Genetic Analyzer 310と同社のBig Dye Terminator Cycle sequencing FS Lady Reaction Kitを用いた。解読された配列から、上記6種類のクローンは2つのグループに大別できることが明らかになったため、この2つのグループから1クローンずつを選び、その塩基配列の全てを決定した。決定した塩基配列は、配列番号１及び配列番号２で示した。尚、配列番号１及び配列番号２で示した配列を持つDNA断片を各々EG4CLPS3-1、EG4CLPS3-3と命名し、この断片を各々保持するプラスミドベクターpEG4CLPS3-1及びpEG4CLPS3-3を持つ大腸菌を各々寄託番号FERM P-17367及びFERM P-17368で通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所特許微生物寄託センターに寄託した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
〔２〕形質転換用ベクターの作製
上記のようにして得られたEG4CLPS3-1及びEG4CLPS3-3を用いて、アンチセンス４ＣＬ遺伝子とセンス４ＣＬ遺伝子を以下のように作製した。
先ず、植物形質転換用ベクターpBI121（CLONTECH社製）上にあるβ-グルクロニダーゼ（GUS）遺伝子のコード領域を2つの制限酵素Sac IとSma Iで消化することによってベクター上から除き、更に消化したベクターの末端をDNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用いて平滑化した。次に、pEG4CLPS3-1及びpEG4CLPS3-3上にあるEG4CLPS3-1及びEG4CLPS3-3断片を制限酵素Eco RIを用いて各々切り出し、切り出したEG4CLPS3-1及びEG4CLPS3-3断片の両末端をDNA Blunting Kit（宝酒造社製）を用いて平滑化した後に、上記GUS領域が除かれた平滑末端化pBI121ベクターに各々ライゲーションした。この操作により、pBI121上にあるカリフラワーモザイクウィルス(CaMV）35Sプロモーターとノパリン合成遺伝子のターミネーターに挟まれた領域にＰＣＲによって得られたEG4CLPS3-1又はEG4CLPS3-3が正逆両方向に挿入されたベクター計4種が作製できた。ここで正方向とはCaMV35SプロモーターによってEG4CLPS3-1及びEG4CLPS3-3のコード鎖からmRNAが生産（転写）されるようなEG4CLPS3-1及びEG4CLPS3-3の挿入方向を指し、逆方向とはCaMV35Sプロモーターによってナンセンス鎖からmRNAが生産（転写）されるようなEG4CLPS3-1及びEG4CLPS3-3の挿入方向を指している。以下、CaMV35Sプロモーターに対して正方向にEG4CLPS3-1又はEG4CLPS3-3が挿入されたベクター（センス４ＣＬ遺伝子を持つベクター）を各々pSEG3-1及びpSEG3-3、CaMV35Sプロモーターに対して逆方向にEG4CLPS3-1又はEG4CLPS3-3が挿入されたベクター（アンチセンス４ＣＬ遺伝子を持つベクター）を各々pAEG3-1及びpAEG3-3とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
〈110〉Mitsubishi Paper Mills Limited
〈120〉cDNA fragments for 4-coumarate:CoA ligase, antisense- and  sense-4CL genes constructed with the cDNA fragments and transgenic plants with the genes
〈160〉4
〈210〉1
〈211〉690
〈212〉DNA
〈213〉Eucalyptus globulus
〈400〉1
gggacgacgg ggttgccgaa gggggtgatc ctgacgcacc gcaacctgat caccagcata 60
gcgcagcaag tggacggcga gaacccgaac ctccacctga gggcggagga cgtgatgctg 120
tgcgtgttgc cgctgttcca catctactcc ctcaacagcg tgctgctctg ctcgctccgc 180
gccggggcgg gagtgctgct gatgcacaag ttcgagatag ggacgttgct tcggctgatc 240
gagcgccacc gggtgtcggt ggccgcggtg gtgccacctc tggtgctggc cctggccaag 300
aaccccctgg tcgagaagtt cgacctctca tccatccgca tggtgctgtc aggggcggcg 360
ccgctgggca aggagctcga gctcgccctc cagacccgcc ttcccggagc catcttgggc 420
cagggatatg gaatgacgga agcgggaccg gtgctttcta tgtgcttggg gttcgccaag 480
caacccttcc caaccaaatc gggttcgtgc gggacggttg ttcggaatgc agagctcaaa 540
gtcatcgacc ccgagaccgg ttcctccctt ggctacaacc agcccggcga gatatgcatt 600
cgtggccaac aaattatgga aggatacctg aacgaccccg aggcgacttc gatcaccatt 660
gacacggatg gctggctgca cactggcgac 690
〈210〉2
〈211〉690
〈212〉DNA
〈213〉Eucalyptus globulus
〈400〉2
gggacgacgg ggctgccgaa gggggtgatg ctcacgcaca ggggtcaagt gaccagcgtg 60
gcgcagcagg tcgacggaga caaccccaac ttgtacttcc acaaggagga cgtgatcctg 120
tgcacgctcc cgttgttcca catatactcc ctcaactcgg tgatgttctg cgcgctccgt 180
gtcggcgccg ccatcctgat catgcagaag ttcgagatcg tggcgctgat ggagctcgtg 240
cagcggtacc gggtgacggt cctgcccatc gtcccgccga tcgtgctggc gatcgccaag 300
agcgccgagg tggaccggta cgacctgtcg tcgatccgga ccatcatgtc gggtgcggtc 360
ccgatgggga aggagctcga ggacgccgtg cgagccaagc tgccgaatgc caagctcgga 420
cagggctatg ggatgacgga ggcaggcccg gtgctggcaa tgtgcctggc atttgcaaag 480
gagccgttcg agatcaagtc aggcgcgtgc gggaccgtcg tgaggaacgc ggagatgaag 540
atcgtcgacc cggagacagg ggcctcgctc ccgcggaacc aggccggcga gatctgcgtc 600
cggggtcacc agatcatgaa aggttatctg aacgaccccg aagcgaccgc taataccata 660
gacaaagaag ggtggctcca caccggcgat 690
〈210〉3
〈211〉23
〈212〉DNA
〈213〉Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉sequence of the PCR primer for amplification of partial cDNA
fragments that encode 4-coumarate:CoA ligase 
〈400〉3
ggnacnacng gnytnccnaa rgg 23
〈210〉4
〈211〉21
〈212〉DNA
〈213〉Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉sequence of the PCR primer for amplification of partial cDNA
fragments that encode 4-coumarate:CoA ligase 
〈400〉4
rtcnccngtr tgnarccanc c 21