【手続補正書】
【提出日】令和2年12月15日(2020.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全長の配列番号１に対して少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼであって、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有し、
１つ以上のアミノ酸置換は、好ましくはリジンまたはアルギニンへの置換を含み、より好ましくはアスパラギン酸またはグルタミン酸から中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンへの置換を含み、
転位効率は、好ましくは突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよびレポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを細胞の集団に導入すること、そして、細胞の集団のゲノムにおけるレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される、
突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項２】
表４からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項３】
ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ−ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を有する、請求項1に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項４】
表１、表２、および／または表３からの１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼであって、好ましくは、配列番号１に従って番号付けした場合、
? Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａ;
? Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌ;
? Ｉ４５２Ｋ;
? Ａ３５８Ｋ;
? Ｖ２９７Ｋ;
? Ｎ８５Ｓ;
? Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａ;
? Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａ; および
? Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ、およびＥ５７８Ｌ
から選択される１つ以上の置換または置換の組合せを含む、請求項1に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項５】
配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、
１つ以上のアミノ酸は、配列番号１に従って番号付けした場合、好ましくはＤ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置し、
近接が、好ましくは約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離であり、さらに好ましくは約７０〜８０アミノ酸の距離である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含む融合トランスポザーゼであって、ＤＮＡ配列特異的結合ドメインは、好ましくは、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＡＡＶ  Ｒｅｐ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含み、さらに好ましくはＴＡＬＥドメインを含む、融合トランスポザーゼ。
【請求項７】
ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号１に対して１００％の同一性を有する、請求項６に記載の融合トランスポザーゼ。
【請求項８】
ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインが、リンカーによって分離されている、請求項６または請求項７に記載の融合トランスポザーゼであって、
リンカーは、好ましくは、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも５０個のアミノ酸を含み、リンカーは好ましくは配列番号９を含む、融合トランスポザーゼ。
【請求項９】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、または請求項６〜８のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
ポリヌクレオチドは、好ましくは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、好ましくは化学的に修飾されたｍＲＮＡ、を含み、
ポリヌクレオチドは、好ましくは、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをさらにコードする、
ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは請求項６〜８のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼを産生する細胞であって、好ましくは、請求項９に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは請求項６〜８のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、導入する工程が、細胞を、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡまたはｍＲＮＡ、好ましくは化学的に修飾されたｍＲＮＡ、を含むポリヌクレオチド、と接触させることを含み、そして、好ましくは、細胞を、トランスポゾンを含有するＤＮＡベクター、好ましくはミニサークルプラスミド、と接触させることを含み、
トランスポゾンは好ましくは２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含み、好ましくは、
- ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、好ましくは、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性または配列番号３と１００％の同一性を有する配列を含む；および／または、２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む；または
- ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む；および／または、２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する配列を含む、方法。
【請求項１３】
カーゴカセットが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
導入する工程が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせを利用して細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法であって、細胞が、対象から単離された初代細胞、好ましくは対象の血液から単離された初代細胞であり、細胞は、好ましくは
− 幹細胞、好ましくは、胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせから選択される幹細胞、または人工多能性幹細胞を含む；または
− 初代免疫細胞、好ましくは、初代白血球、初代Ｔ細胞、好ましくはガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせ、好ましくはＣＤ３＋細胞を含む、そして、
カーゴカセットを含むトランスポゾンは好ましくは導入遺伝子を含み、導入遺伝子は、好ましくは、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする導入遺伝子であり、細胞受容体は、好ましくは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される
方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
[00183]本発明の好ましい実施形態は、本明細書において示され、説明されているが、
このような実施形態が例としてのみ提供されていることは当業者には明らかである。多数の変形、変更、および置換は、ここでは、当業者に、本発明から逸脱することなく、想到される。本明細書中に記載された本発明の実施形態に対する種々の代替物が本発明を実施する際に使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの同等物がそれによって包含されることが意図される。
国際出願時の特許請求の範囲
[項１]  全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼであって、配列番号１のアミノ酸配列を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２]  １つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項１に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項３]  １つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸から中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンへの置換を含む、請求項１または２に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項４]  表４からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項５]  全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ−ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼであって、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項６]  全長の配列番号１に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含み、表１からの１つ以上のアミノ酸置換を有する突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項７]  配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項８]  配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、１つ以上のアミノ酸が、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項９]  近接が、約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である、請求項７または８に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１０]  近接が、約７０〜８０アミノ酸の距離である、請求項７または８に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１１]  突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼのアミノ酸配列が、全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１２]  表２からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１３]  表３からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１４]  配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１５]  配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１６]  配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１７]  配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１８]  配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項１９]  配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２０]  配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２１]  配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２２]  配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２３]  転位効率が、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼおよびレポーターカーゴカセットを含有するＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを細胞の集団に導入すること、そして、細胞の集団のゲノムにおけるレポーターカーゴカセットの転位を検出することを含むアッセイによって測定される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ。
[項２４]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインを含む融合トランスポザーゼであって、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が全長の配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する融合トランスポザーゼ。
[項２５]  ＤＮＡ配列特異的結合ドメインが、ＴＡＬＥドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＡＡＶ  Ｒｅｐ  ＤＮＡ結合ドメイン、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２４に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２６]  ＤＮＡ配列特異的結合ドメインがＴＡＬＥドメインを含む、請求項２４または２５に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２７]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２８]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項２９]  １つ以上のアミノ酸置換が、リジンまたはアルギニンによる置換を含む、請求項２８に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３０]  １つ以上のアミノ酸置換が、アスパラギン酸またはグルタミン酸の、中性アミノ酸、リジンまたはアルギニンでの置換を含む、請求項２８または２９に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３１]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン；挿入ドメイン；Ｚｎ−ＢＥＤドメイン；またはそれらの組み合わせにおいて１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３２]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、表１からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４〜３１のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３３]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、アミノ酸配列の配列番号１を有する野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較して増加した転位効率を有する、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３４]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１と比較して、触媒ドメイン内にまたはそれに近接して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４〜３３のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３５]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１と比較して中性ｐＨで正味電荷を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含み、１つ以上のアミノ酸置換が、配列番号１に従って番号付けした場合、Ｄ２２３、Ｄ２８９、またはＥ５８９に近接して位置する、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３６]  近接が、約８０、７５、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５アミノ酸の距離である、請求項３４または３５に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３７]  近接が、約７０〜８０アミノ酸の距離である、請求項３４または３５に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３８]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、表２からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４〜３７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項３９]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、表３からの１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項２４〜３８のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４０]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項２４〜３９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４１]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項２４〜４０のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４２]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む、請求項２４〜４１のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４３]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋを含む、請求項２４〜４２のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４４]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ２９７Ｋを含む、請求項２４〜４３のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４５]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｎ８５Ｓを含む、請求項２４〜４４のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４６]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項２４〜４５のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４７]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａを含む、請求項２４〜４６のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４８]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、配列番号１に従って番号付けした場合、アミノ酸置換Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌを含む、請求項２４〜４７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項４９]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列が、全長の配列番号１に対して１００％の同一性を有する、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５０]  ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ配列およびＤＮＡ配列特異的結合ドメインが、リンカーによって分離されている、請求項２４〜４８のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５１]  リンカーが、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、または少なくとも５０個のアミノ酸を含む、請求項５０に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５２]  リンカーが配列番号９を含む、請求項５０または５１に記載の融合トランスポザーゼ。
[項５３]  請求項１〜２２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項５４]  請求項２４〜４９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド。
[項５５]  突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項５３または５４に記載のポリヌクレオチド。
[項５６]  突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項５７]  ｍＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項５６に記載のポリヌクレオチド。
[項５８]  突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンをコードする核酸配列を含む、請求項５３〜５７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項５９]  ＤＮＡベクター中に存在する、請求項５３〜５８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
[項６０]  ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項５９に記載のポリヌクレオチド。
[項６１]  請求項１〜４９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを産生する細胞。
[項６２]  請求項５３〜６０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含有する細胞。
[項６３]  請求項１〜２２のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項６４]  請求項２４〜４９のいずれか一項に記載の融合トランスポザーゼ、および融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを細胞に導入する工程を含む方法。
[項６５]  導入する工程が、細胞を、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドと接触させることを含む、請求項６３または６４に記載の方法。
[項６６]  ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項６５に記載の方法。
[項６７]  ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項６５に記載の方法。
[項６８]  ｍＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項６７に記載の方法。
[項６９]  導入する工程が、細胞を、トランスポゾンを含有するＤＮＡベクターと接触させることを含む、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
[項７０]  ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項６９に記載の方法。
[項７１]  導入する工程が、細胞を、トランスポゾンと、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチドの両方を含有するプラスミドベクターと接触させることを含む、請求項６５〜７０のいずれか一項に記載の方法。
[項７２]  導入する工程が、細胞を、精製タンパク質としての突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼと接触させることを含む、請求項６３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
[項７３]  トランスポゾンが、２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項６３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
[項７４]  ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３に記載の方法。
[項７５]  ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号３を含む、請求項７３に記載の方法。
[項７６]  ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
[項７７]  ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号４を含む、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
[項７８]  ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３に記載の方法。
[項７９]  ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号５を含む、請求項７３に記載の方法。
[項８０]  ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項７３、７８、または７９に記載の方法。
[項８１]  ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号６を含む、請求項７３、７８、または７９に記載の方法。
[項８２]  カーゴカセットが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項７３〜８１のいずれか一項に記載の方法。
[項８３]  カーゴカセットがＣＭＶプロモーターを含む、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
[項８４]  カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項７３〜８３のいずれか一項に記載の方法。
[項８５]  カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項７３〜８３のいずれか一項に記載の方法。
[項８６]  導入する工程が、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、カチオン性ポリマー、デンドリマー、リポソーム、微粒子銃、フュージーン、直接音波負荷、細胞圧搾、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、ヌクレオフェクション、またはそれらの任意の組み合わせを利用して細胞をトランスフェクトするステップを含む、請求項６３〜８５のいずれか一項に記載の方法。
[項８７]  導入する工程が、細胞をエレクトロポレートするステップを含む、請求項６３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
[項８８]  細胞が、対象から単離された初代細胞である、請求項６３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
[項８９]  対象がヒトである、請求項８８に記載の方法。
[項９０]  対象が疾患を有する患者である、請求項８８または８９に記載の方法。
[項９１]  対象が癌または腫瘍と診断されている、請求項８８〜９０のいずれか一項に記載の方法。
[項９２]  細胞が対象の血液から単離される、請求項８８〜９１のいずれか一項に記載の方法。
[項９３]  細胞が初代免疫細胞を含む、請求項６３〜９２のいずれか一項に記載の方法。
[項９４]  細胞が初代白血球を含む、請求項６３〜９３のいずれか一項に記載の方法。
[項９５]
細胞が初代Ｔ細胞を含む、請求項６３〜９４のいずれか一項に記載の方法。
[項９６]  初代Ｔ細胞が、ガンマデルタＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９５に記載の方法。
[項９７]  初代免疫細胞がＣＤ３＋細胞を含む、請求項９３〜９６のいずれか一項に記載の方法。
[項９８]  細胞が幹細胞を含む、請求項６３〜９７のいずれか一項に記載の方法。
[項９９]  幹細胞が、以下の細胞からなる群から選択される、請求項９８に記載の方法：
胚性幹細胞、造血幹細胞、表皮幹細胞、上皮幹細胞、気管支肺胞幹細胞、乳腺幹細胞、間葉系幹細胞、腸管幹細胞、内皮幹細胞、神経幹細胞、嗅覚成体幹細胞、神経堤幹細胞、精巣細胞、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項１００]  幹細胞が人工多能性幹細胞を含む、請求項９８に記載の方法。
[項１０１]  カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項７３〜１００のいずれか一項に記載の方法。
[項１０２]  導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１０１に記載の方法：
細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせ。
[項１０３]  導入遺伝子が、以下のものからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項１０１または１０２に記載の方法：
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせ。
[項１０４]  （ａ）トランスポゾン、およびトランスポゾンを認識する請求項１〜４７のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼを細胞に導入し、それによって遺伝子修飾された細胞を生成すること；ならびに
（ｂ）遺伝子修飾された細胞を、治療を必要とする患者に投与すること
を含む治療の方法。
[項１０５]  遺伝子修飾された細胞が、トランスポゾンによって導入された導入遺伝子を含む、請求項１０４に記載の方法。
[項１０６]  患者が癌または腫瘍と診断されている、請求項１０４または１０５に記載の方法。
[項１０７]  投与するステップが、遺伝子修飾された細胞を患者の血管内に輸注するステップを含む、請求項１０４〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
[項１０８]  請求項１〜４９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼ、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項１０９]  請求項１〜４９のいずれか一項に記載の突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド、および突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼによって認識可能なトランスポゾンを含むゲノム編集システム。
[項１１０]  ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするＤＮＡを含む、請求項１０９に記載のシステム。
[項１１１]  ポリヌクレオチドが、突然変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼまたは融合トランスポザーゼをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む、請求項１０９または１１０に記載のシステム。
[項１１２]  ｍＲＮＡが化学的に修飾されている、請求項１１１に記載のシステム。
[項１１３]  トランスポゾンがＤＮＡベクター中に存在する、請求項１０８〜１１２のいずれか一項に記載のシステム。
[項１１４]  ＤＮＡベクターがミニサークルプラスミドを含む、請求項１１３に記載のシステム。
[項１１５]  ポリヌクレオチドおよびトランスポゾンが同じプラスミド中に存在する、請求項１０９〜１１４のいずれか一項に記載のシステム。
[項１１６]  トランスポゾンが、２つの逆位リピート間に配置されたカーゴカセットを含む、請求項１０８〜１１５のいずれか一項に記載のシステム。
[項１１７]  ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号３に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１１８]  ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号３を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１１９]  ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号４に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２０]  ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号４を含む、請求項１１６〜１１８のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２１]  ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが、配列番号５に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、またはと少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１２２]  ２つの逆位リピートのうちの左側逆位リピートが配列番号５を含む、請求項１１６に記載のシステム。
[項１２３]  ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが、配列番号６に対して少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１１６、１２１、または１２２に記載のシステム。
[項１２４]  ２つの逆位リピートのうちの右側逆位リピートが配列番号６を含む、請求項１１６、１２１、または１２２に記載のシステム。
[項１２５]  カーゴカセットが、ＣＭＶ、ＥＦＳ、ＭＮＤ、ＥＦ１α、ＣＡＧＣｓ、ＰＧＫ、ＵＢＣ、Ｕ６、Ｈ１、およびＣｕｍａｔｅからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項１１６〜１２４のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２６]  カーゴカセットがＣＭＶプロモーターを含む、請求項１１６〜１１６のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２７]  カーゴカセットが導入遺伝子を含む、請求項１１６〜１２６のいずれか一項に記載のシステム。
[項１２８]  導入遺伝子が、細胞受容体、免疫学的チェックポイントタンパク質、サイトカイン、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるタンパク質をコードする、請求項１２７に記載のシステム。
[項１２９]  導入遺伝子が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞受容体をコードする、請求項１２７または１２８に記載のシステム。
[項１３０]  カーゴカセットがフォワード方向に存在する、請求項１１６〜１２９のいずれか一項に記載のシステム。
[項１３１]  カーゴカセットがリバース方向に存在する、請求項１１６〜１２９のいずれか一項に記載のシステム。