【手続補正書】
【提出日】平成16年7月14日(2004.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
下記の工程（ａ）及び（ｂ）を包含することを特徴とする請求項８記載のフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方法。
（ａ）  フルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの含有物を、コンドロイチンポリ硫酸固定化アフィニティークロマトグラフィーを行い分画すること
及び
（ｂ）  工程（ａ）で得られる吸着画分を、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヘパリン結合担体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、該酵素を選択的に吸着させ、溶出すること。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
請求項９記載の分離方法において、更に工程（ｂ）で得られる溶出物を分子ふるいにより精製することを特徴とするフルクトース−１，６−ビスリン酸アルドラーゼの分離方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
【従来の技術】
ヘパリンは、ウロン酸残基とグルコサミン残基から成る二糖単位の連なったヘパリン骨格を有し、そのウロン酸残基の２位水酸基並びにグルコサミン残基の２位アミノ基及び６位水酸基が様々な程度に硫酸化されているグリコサミノグリカンの一種である。この物質は一般にアンチトロンビンIII結合部位を有し（FEBS Lett.(1980)117, 203-206）、ATIIIとの結合の結果としてトロンビン活性を阻害して抗凝固活性を発現するため、古くから透析治療薬等の成果を向上させるための医薬品として盛んに用いられてきた。また、ヘパリンがリポプロテインリパーゼと相互作用すること（J. Biol. Chem.(1981)256, 12893-12898）、塩基性繊維芽細胞増殖因子と親和性を有すること（J. Cell Biol.(1990)111, 1651-1659）など、様々な生理活性物質と相互作用することが明らかになってきた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
上記のようにヘパリンは様々な物質と親和性を有することから、ヘパリンと生理活性物質の結合に関与する構造の解明が着目されつつあり、またATIII結合部位に由来する抗凝固作用を低減させた上で、生理活性物質との相互作用を増強させることを目的として、ヘパリンポリマーの脱硫酸化を中心とした化学修飾が盛んに行われている（J. Carbohydr.Chem.(1993)12, 507-521；Carbohydr. Res.,193, 165-172(1989)；Carbohydr. Res.46,87-95(1976)；Can. J. Chem.,67, 1449(1989)；米国特許第5,296,471号）。また、ヘパリンを硫酸化及び脱硫酸化等の手法を用いて修飾することによりヘパリン誘導体が創作されているが、そのヘパリン誘導体の中には生理活性物質と親和性を有するものがあるので、生理活性物質と親和性を有したり、あるいは生理活性物質の活性を制御し得るヘパリン誘導体の探索が行われている。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
本発明における上記ヘパリンの二糖体組成は、後述する実施例に記載の二糖分析法による測定値から算出したものであり、また分子量は実施例に記載の分子量測定法による測定値である。二糖体組成は試験法１に記載の酵素消化による二糖分析により得られる特定が可能な構造をもつ不飽和二糖の量［ΔＤｉＨＳ−０Ｓ、ΔＤｉＨＳ−６Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ＮＳ、ΔＤｉＨＳ−ＵＳ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，６）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓのモル％の合計］を１００％として、上記特定の構造をもつ二糖の割合を示したものであり、当該数値は酵素消化前のヘパリンの構成糖における硫酸化の位置を反映するものである。
なお、本願明細書において、二糖体組成の表記は、下記を意味する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンと担体とを結合させる方法としては以下の方法が挙げられる。選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン中の還元末端部に存在しうるアルデヒド基とアミノアガロースゲルのアミノ基を結合する方法としては、シッフ塩基を形成した後、NaB(CN)H3等の還元剤を作用させ、アルキルアミノ架橋を生成させる。この方法としては、例えば公知の一般的な方法で行うことが可能であり、Sakaiらの方法（J. Chromatogr.,400, 123(1987)）等が挙げられる。
また、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリン中ウロン酸残基中のカルボキシル基とアミノアガロースゲルのアミノ基を結合する方法としては、該カルボキシル基を１−エチル−３−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（ＥＤＣ）等のカルボジイミド試薬により活性化して酸アミド結合(-CONH-)の架橋を生成させる方法である。しかし、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンの立体構造上、担体としてより結合力が強いと考えられる前者の結合方法が好ましい。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
試験法２
［分子量測定］
ヘパリンの３％溶液１０μｌをＨＰＬＣによるゲルろ過で分析した。カラムはＴＳＫｇｅｌ−（Ｇ４０００＋Ｇ３０００＋Ｇ２５００）ＰＷXL（東ソー、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用い、溶離液に０．２Ｍ塩化ナトリウムを使用して、１．０ｍｌ／分の流速で展開した。ヘパリンの検出には、示差屈折計（島津製作所、ＡＩＤ−２Ａ）を用いた。平均分子量はヘパリンの分子量標準品を対照にして求めた（Kaneda et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.,220 ,108-112(1996)）。標準ヘパリンの分子量の測定は光散乱法を用いて行った（Nagasawa et al., J. Biochem.,81 ,989-993(1977)）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
試験例３
［ＮＭＲ分析］
13Ｃ−ＮＭＲは、ＧＥ社製ＱＥ３００型ＮＭＲスペクトロメーターを用い、１００％Ｄ2Ｏ置換を行った試料につき１０％濃度のＤ2Ｏ溶液を調製したうえ、ＴＳＰを０ｐｐｍとした時のケミカルシフトが５１．６６ｐｐｍのメタノールを内部標準とし、測定温度８０℃、パルス幅６０°、積算回数９０，０００回の条件にて実施した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
また、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンを13Ｃ−ＮＭＲにより分析した（図３）。その結果、二糖体組成同様、選択的６−Ｏ−硫酸化ヘパリンは従来のヘパリンでは得られなかった、グルコサミン残基にＮ−硫酸基が存在せず、６−Ｏ−硫酸を多く有するヘパリンであることが明らかになった。また、当該ヘパリンをアフィニティークロマトグラフィーの担体に結合する場合、特異的な結合を有するヘパリンはΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｕ，Ｎ）Ｓ及びΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓのモル％はそれぞれ全て３％以下であることが好ましい。