【手続補正書】
【提出日】令和3年11月1日(2021.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
がん型またはがん型の徴候を有する対象由来の無細胞核酸の試験試料における腫瘍遺伝子変異量の指標を提供する方法であって、
（ａ）無細胞核酸の前記試験試料中に存在する変異の数、および無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｂ）前記試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップ
とを含む、方法。
【請求項２】
（ａ）対照試料中に存在する前記変異の数が、平均であり、
（ｂ）前記ビンが、２０％以下、１０％以下もしくは５％以下の幅を有し、および／または
（ｃ）前記試料中に存在する前記変異の数が、閾値を超えているかどうかを決定するステップをさらに含み、前記閾値が、免疫療法に正に応答する傾向がある対象を示すように設定される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）前記正規化するステップが、前記試験試料中の前記変異の数を、前記対照試料中の変異の平均数で除することを含み、
（ｂ）前記正規化するステップが、無細胞核酸の前記試験試料中の変異の前記決定された数から、前記ビン内の前記対照試料中の変異の数の平均を減算することを含み、必要に応じて、前記対照試料中に存在する変異の前記平均数を減じた無細胞核酸の前記試験試料中の前記変異の数を、前記対照試料中に存在する前記変異の数の標準偏差で除し、Ｚスコアを算出するステップをさらに含み、必要に応じて、
（ｉ）前記平均が、平均値であるか、もしくは
（ｉｉ）前記対照試料が、少なくとも２５、５０、１００、２００もしくは５００個の対照試料を含み、
（ｃ）正規化するステップが、少なくとも１０、５０、１００もしくは５００個の対照試料中の変異の数の平均および広がりを決定することと、前記試験試料中の前記平均からの偏差の標準スコアを決定することと、前記標準スコアが閾値数を超えているかどうかを決定することとを含み、必要に応じて、
（ｉ）前記平均が、平均値、中央値もしくは最頻値であり、
（ｉｉ）前記広がりが、分散、標準偏差、もしくは四分位範囲として表され、および／もしくは
（ｉｉｉ）偏差の前記標準スコアが、Ｚスコアである、または
（ｄ）前記正規化するステップが、無細胞核酸の前記試験試料中の変異の前記決定された数を、同じビン内の前記対照試料中に存在する変異の前記平均数で除することをさらに含む、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記正規化するステップが、マイナー対立遺伝子比率の複数のビンに存在する変異の数の値を保存するためにプログラムされたコンピューターにおいて実施され、必要に応じて、前記保存される値が、前記複数のビンのそれぞれに存在する前記変異の数の平均値および標準偏差であり、必要に応じて、少なくとも５０，０００、１００，０００または１５０，０００ヌクレオチドが、前記無細胞核酸のセグメントにおいてシーケンシングされる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記対象における腫瘍遺伝子変異量の標準スコア、および前記標準スコアが、免疫療法に対する応答性と一致して、対照対象に対する閾値を超えているかどうかを決定するステップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
（ａ）が、
（ｉ）前記試験試料中の無細胞核酸分子の配列を決定することと、前記試料中に存在する前記変異の数および前記マイナー対立遺伝子比率を特定するために、得られた配列を対応する参照配列と比較することとを含み、必要に応じて、前記参照配列が、ｈＧ１９またはｈＧ３８であるか、
（ｉｉ）前記試料中に存在するかまたは存在することが疑われる前記型のがんにおいて生じることが既知の所定の変異のパネルの有無を決定することを含み、必要に応じて、前記変異が、コード化タンパク質の配列に影響を及ぼす体細胞変異であるか、または
（ｉｉｉ）アダプターを前記無細胞核酸に連結させることと、前記アダプターに結合するプライマーから前記無細胞核酸を増幅することと、前記増幅された核酸をシーケンシングすることとを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記シーケンシングするステップが、ブリッジ増幅シーケンシング、パイロシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ペアエンドシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたは単分子リアルタイムシーケンシングである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記がん型が、
（ａ）固形腫瘍
（ｂ）腎がん、中皮腫、軟組織がん、原発性ＣＮＳがん、甲状腺がん、肝がん、前立腺がん、膵がん、ＣＵＰ、神経内分泌がん、ＮＳＣＬＣ、胃食道がん、頭頚部がん、ＳＣＬＣ、乳がん、黒色腫、胆管腺がん、婦人科系がん、結腸直腸がんもしくは尿路上皮がん、
（ｃ）白血病もしくはリンパ腫、または
（ｄ）造血器悪性腫瘍
である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
試験試料中の無細胞核酸をシーケンシングすることによって得られたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェース、ならびに
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによる実行の際に、
（ａ）核酸シーケンサーによって得られた前記シーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップと、
（ｂ）前記試験試料由来の前記シーケンシングリードに存在する変異の数、および前記試験試料由来のシーケンシングリード中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｃ）前記試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試験試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップと
を含む方法を実施する、マシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含むコンピューター
を含むシステム。
【請求項１０】
前記核酸シーケンサーが、対象に由来する無細胞ＤＮＡ分子から得られたシーケンシングライブラリーをシーケンシングし、前記シーケンシングライブラリーが、前記無細胞ＤＮＡ分子およびバーコードを含むアダプターを含み、必要に応じて、前記シーケンシングライブラリーが、試料を１つまたは複数の試料から識別する試料バーコードをさらに含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
（ａ）前記コンピューター可読媒体が、メモリー、ハードドライブもしくはコンピューターサーバーを含み、
（ｂ）前記通信ネットワークが、遠距離通信ネットワーク、インターネット、エクストラネット、もしくはイントラネットを含み、
（ｂ）前記通信ネットワークが、分散コンピューティングが可能な１つまたは複数のコンピューターサーバーを含み、必要に応じて、分散コンピューティングが、クラウドコンピューティングであり、および／または
（ｃ）前記コンピューターが、前記核酸シーケンサーから遠隔設置されているコンピューターサーバー上に設置されている、
請求項９または請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記核酸シーケンサーが、
（ａ）前記シーケンシングライブラリーに関するシーケンシングバイシンセシスを実施して、前記シーケンシングリードを得、
（ｂ）前記シーケンシングライブラリーに関するパイロシーケンシング、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーションもしくはシーケンシングバイハイブリダイゼーションを実施して、前記シーケンシングリードを得、
（ｃ）前記シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイを使用して、前記シーケンシングリードを得、および／または
（ｄ）前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングして前記シーケンシングリードを得るためのマイクロウェルのアレイを有するチップを含む、
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１３】
ネットワークを通じて、前記コンピューターと通信する電子ディスプレイであって、（ａ）〜（ｃ）を実施した際の結果を表示するためのユーザーインターフェースを含む電子ディスプレイをさらに含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記ユーザーインターフェースが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）またはウェブベースユーザーインターフェースである、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
前記電子ディスプレイが、パーソナルコンピューターおよび／またはンターネット対応コンピューターにおいて存在し、必要に応じて、前記インターネット対応コンピューターが、前記コンピューターから遠隔した位置に設置されている、請求項１３または請求項１４に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
図１は、Ｘ軸に示したがん型のうちの１つを有する異なる個体由来の試料におけるがん遺伝子変異量に対するＺスコアをプロットしている。Ｚスコアの分布は異なるがん型に対して変化するが、一般的には、ゼロ未満の最頻値で非対称であることが一般的であるが、少数の個体は、高度に正のＺスコアを示している。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
がん型またはがん型の徴候を有する対象由来の無細胞核酸の試験試料における腫瘍遺伝子変異量の指標を提供する方法であって、
（ａ）無細胞核酸の前記試験試料中に存在する変異の数、および無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｂ）前記試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップ
とを含む、方法。
(項目２)
対照試料中に存在する前記変異の数が、平均である、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記ビンが、２０％以下、１０％以下または５％以下の幅を有する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目４)
前記試料中に存在する前記変異の数が、閾値を超えているかどうかを決定するステップをさらに含み、前記閾値が、免疫療法に正に応答する傾向がある対象を示すように設定される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目５)
前記正規化するステップが、前記試験試料中の前記変異の数を、前記対照試料中の変異の平均数で除することを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目６)
前記正規化するステップが、無細胞核酸の前記試験試料中の変異の前記決定された数から、前記ビン内の前記対照試料中の変異の数の平均を減算することを含む、項目１から４に記載の方法。
(項目７)
前記対照試料中に存在する変異の前記平均数を減じた無細胞核酸の前記試験試料中の前記変異の数を、前記対照試料中に存在する前記変異の数の標準偏差で除し、Ｚスコアを算出するステップをさらに含む、項目６に記載の方法。
(項目８)
前記平均が、平均値である、項目７に記載の方法。
(項目９)
正規化するステップが、少なくとも１０、５０、１００または５００個の対照試料中の変異の数の平均および広がりを決定することと、前記試験試料中の前記平均からの偏差の標準スコアを決定することと、前記標準スコアが閾値数を超えているかどうかを決定することとを含む、項目１から４に記載の方法。
(項目１０)
前記平均が、平均値、中央値または最頻値である、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記広がりが、分散、標準偏差、または四分位範囲として表される、項目９に記載の方法。
(項目１２)
偏差の前記標準スコアが、Ｚスコアである、項目９に記載の方法。
(項目１３)
前記正規化するステップが、無細胞核酸の前記試験試料中の変異の前記決定された数を、同じビン内の前記対照試料中に存在する変異の前記平均数で除することをさらに含む、項目１から４に記載の方法。
(項目１４)
前記正規化するステップが、マイナー対立遺伝子比率の複数のビンに存在する変異の数の値を保存するためにプログラムされたコンピューターにおいて実施される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目１５)
前記保存される値が、前記複数のビンのそれぞれに存在する前記変異の数の平均値および標準偏差である、項目１３に記載の方法。
(項目１６)
前記対象における腫瘍遺伝子変異量の標準スコア、および前記標準スコアが、免疫療法に対する応答性と一致して、対照対象に対する閾値を超えているかどうかを決定するステップを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目１７)
（ａ）が、前記試験試料中の無細胞核酸分子の配列を決定することと、前記試料中に存在する前記変異の数および前記マイナー対立遺伝子比率を特定するために、得られた配列を対応する参照配列と比較することとを含む、項目１に記載の方法。
(項目１８)
前記参照配列が、ｈＧ１９またはｈＧ３８である、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記対照試料が、少なくとも２５、５０、１００、２００または５００個の対照試料を含む、項目７に記載の方法。
(項目２０)
少なくとも５０，０００、１００，０００または１５０，０００ヌクレオチドが、前記無細胞核酸のセグメントにおいてシーケンシングされる、項目１５に記載の方法。
(項目２１)
ステップ（ａ）が、前記試料中に存在するかまたは存在することが疑われる前記型のがんにおいて生じることが既知の所定の変異のパネルの有無を決定することを含み、必要に応じて、前記変異が、コード化タンパク質の配列に影響を及ぼす体細胞変異である、項目１に記載の方法。
(項目２２)
ステップ（ａ）が、アダプターを前記無細胞核酸に連結させることと、前記アダプターに結合するプライマーから前記無細胞核酸を増幅することと、前記増幅された核酸をシーケンシングすることとを含む、項目１に記載の方法。
(項目２３)
前記シーケンシングするステップが、ブリッジ増幅シーケンシング、パイロシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、ペアエンドシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシングまたは単分子リアルタイムシーケンシングである、項目１に記載の方法。
(項目２４)
対象を処置する方法であって、
（ａ）無細胞核酸の試験試料中に存在する変異の数、および無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｂ）前記試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップと、
（ｃ）腫瘍遺伝子変異量の前記指標が閾値を超える場合、免疫療法を前記対象に投与するステップ
とを含む、方法。
(項目２５)
各対象における腫瘍遺伝子変異量の指標を決定するために複数の対象で実施され、前記閾値を下回る腫瘍遺伝子変異量の前記指標を有する対象よりも高い比率の、閾値を超えるがん遺伝子変異量の前記指標を有する対象が、前記がんに対する免疫療法を受ける、項目２４に記載の方法。
(項目２６)
前記指標が第１の閾値を超えるすべての対象が免疫療法を受け、前記指標が第２の閾値を下回るすべての対象が免疫療法を受けない、項目２５に記載の方法。
(項目２７)
前記指標が、Ｚスコアである、項目２４または２５に記載の方法。
(項目２８)
前記免疫療法が、チェックポイントインヒビター抗体の投与を含む、項目２４または２５に記載の方法。
(項目２９)
前記免疫療法が、ＰＤ−１、ＰＤ−２、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４０、ＯＸ４０、Ｂ７．１、Ｂ７Ｈｅ、ＬＡＧ３、ＣＤ１３７、ＫＩＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ２７、またはＣＤ４０に対する抗体の投与を含む、項目２４または２５に記載の方法。
(項目３０)
前記免疫療法が、炎症促進性サイトカインの投与を含む、項目２４または２５に記載の方法。
(項目３１)
前記免疫療法が、前記がん型に対するＴ細胞の投与を含む、項目２４または２５に記載の方法。
(項目３２)
前記がん型が、固形腫瘍である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目３３)
前記がん型が、腎がん、中皮腫、軟組織がん、原発性ＣＮＳがん、甲状腺がん、肝がん、前立腺がん、膵がん、ＣＵＰ、神経内分泌がん、ＮＳＣＬＣ、胃食道がん、頭頚部がん、ＳＣＬＣ、乳がん、黒色腫、胆管腺がん、婦人科系がん、結腸直腸がんまたは尿路上皮がんである、項目１から３２のいずれかに記載の方法。
(項目３４)
前記がん型が、造血器悪性腫瘍である、項目１から３２のいずれかに記載の方法。
(項目３５)
前記がん型が、白血病またはリンパ腫である、項目３３に記載の方法。
(項目３６)
がんを有する対象を処置する方法であって、免疫療法剤を前記対象に投与するステップを含み、前記対象が、
（ａ）前記対象由来の無細胞核酸の試験試料中に存在する変異の数、および無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される前記変異に対するマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｂ）前記対象の前記試料中の腫瘍遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップであって、前記対象が、閾値を超える腫瘍遺伝子変異量を有することが決定される、ステップと
によって決定された前記対象のがん遺伝子変異量の前記指標から、免疫療法に対して特定されている、方法。
(項目３７)
がんを有する対象を処置する方法であって、
各対象に対して、前記対象由来の試料の腫瘍遺伝子変異量の指標を受容するステップを含み、腫瘍遺伝子変異量の前記指標が、
（ａ）前記対象由来の試料の無細胞核酸の試験試料中に存在する変異の数、および前記試験試料の無細胞核酸の前記試験試料中で最も多く示される前記変異に対するマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｂ）前記対象の前記試料中の腫瘍遺伝子変異量の前記指標を決定するために、前記試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップと、
（ｃ）免疫療法を、腫瘍遺伝子変異量が閾値を超えることが決定された少なくとも１つの対象に投与するステップと
によって決定される、方法。
(項目３８)
試験試料中の無細胞核酸をシーケンシングすることによって得られたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェース、ならびに
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサーによる実行の際に、
（ａ）核酸シーケンサーによって得られた前記シーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップと、
（ｂ）前記試験試料由来の前記シーケンシングリードに存在する変異の数、および前記試験試料由来のシーケンシングリード中で最も多く示される１つまたは複数の変異に基づくマイナー対立遺伝子比率を決定するステップと、
（ｃ）前記試験試料中のがん遺伝子変異量の指標を決定するために、前記試験試料中に存在する前記変異の数を、同じがん型を有する他の対象由来の対照試料中に存在する変異の数および前記試験試料の前記マイナー対立遺伝子比率を含むマイナー対立遺伝子比率のビン内のマイナー対立遺伝子比率に対して正規化するステップと
を含む方法を実施する、マシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含むコンピューター
を含むシステム。
(項目３９)
前記核酸シーケンサーが、対象に由来する無細胞ＤＮＡ分子から得られたシーケンシングライブラリーをシーケンシングし、前記シーケンシングライブラリーが、前記無細胞ＤＮＡ分子およびバーコードを含むアダプターを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４０)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーに関するシーケンシングバイシンセシスを実施して、前記シーケンシングリードを得る、項目３８に記載のシステム。
(項目４１)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーに関するパイロシーケンシング、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーションまたはシーケンシングバイハイブリダイゼーションを実施して、前記シーケンシングリードを得る、項目３８に記載のシステム。
(項目４２)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイを使用して、前記シーケンシングリードを得る、項目３８に記載のシステム。
(項目４３)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングして前記シーケンシングリードを得るためのマイクロウェルのアレイを有するチップを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４４)
前記コンピューター可読媒体が、メモリー、ハードドライブまたはコンピューターサーバーを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４５)
前記通信ネットワークが、遠距離通信ネットワーク、インターネット、エクストラネット、またはイントラネットを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４６)
前記通信ネットワークが、分散コンピューティングが可能な１つまたは複数のコンピューターサーバーを含む、項目３８に記載のシステム。
(項目４７)
分散コンピューティングが、クラウドコンピューティングである、項目４６に記載のシステム。
(項目４８)
前記コンピューターが、前記核酸シーケンサーから遠隔設置されているコンピューターサーバー上に設置されている、項目３８に記載のシステム。
(項目４９)
前記シーケンシングライブラリーが、試料を１つまたは複数の試料から識別する試料バーコードをさらに含む、項目３９に記載のシステム。
(項目５０)
ネットワークを通じて、前記コンピューターと通信する電子ディスプレイであって、（ａ）〜（ｃ）を実施した際の結果を表示するためのユーザーインターフェースを含む電子ディスプレイをさらに含む、項目３８に記載のシステム。
(項目５１)
前記ユーザーインターフェースが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）またはウェブベースユーザーインターフェースである、項目５０に記載のシステム。
(項目５２)
前記電子ディスプレイが、パーソナルコンピューターにおいて存在する、項目５１に記載のシステム。
(項目５３)
前記電子ディスプレイが、インターネット対応コンピューターにおいて存在する、項目５１に記載のシステム。
(項目５４)
前記インターネット対応コンピューターが、前記コンピューターから遠隔した位置に設置されている、項目５３に記載のシステム。