【手続補正書】
【提出日】令和3年6月25日(2021.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞を死滅させるための、又は宿主細胞の成長を低減するための宿主改変(HM)-CRISPR/Casシステムであって、宿主細胞は、クロストリジウム・ディフィシル細胞であり、
(a)宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のための、前記HM-crRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列であって、各crRNAは、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casとともに作動可能であり、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列は、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含む遺伝子操作された核酸配列と、
(b)CASCADE Casと、
(c)Cas3又は宿主細胞においてCas3を発現するためのCas3をコードするヌクレオチド配列又はそのオルソログ若しくは相同体と
を含み、
発現されたHM-crRNAは、宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又は前記オルソログ若しくは相同体と組み合わせることが可能であり、Cas3、オルソログ又は相同体は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減でき、並びに、
Cas3は、タイプI-Bであり、及び、(i)のリピート配列の1つ又は複数が、配列番号151のリピート配列、又は、配列番号151と少なくとも70%同一である配列であるリピート配列を含む、
システム。
【請求項２】
遺伝子操作された核酸が、宿主細胞におけるHM-crRNAの発現のために前記HM-crRNAをコードし、前記宿主細胞は、クロストリジウム・ディフィシル細胞であり、各crRNAが、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、遺伝子操作された核酸が、
(i)1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列が、宿主細胞において宿主細胞標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能であり、標的配列が、CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMのすぐ3'にある、スペーサー配列と
を含み、
Cas3は、タイプI-Bであり、及び、(i)のリピート配列の1つ又は複数が、配列番号151のリピート配列、又は、配列番号151と少なくとも70%同一である配列であるリピート配列を含む、
請求項1に記載のシステムにおいて使用するための遺伝子操作された核酸。
【請求項３】
Cas3が、配列番号275〜286及び273から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項1又は2に記載のシステム又は遺伝子操作された核酸。
【請求項４】
リピート配列が、
(a)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルR20291株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号138〜146及び496〜513、
(b)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル630株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号147〜158、290〜306及び370〜384、
(c)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルATCC45233株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号159〜166、
(d)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBi-9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号167〜175; 
(e)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM120株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号176〜181及び470〜476;
(f)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号182〜187;
(g)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD002株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号188〜194;
(h)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD3株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号195〜201;
(i)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD69株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号202〜209;
(j)任意選択で、宿主細胞が、Cディフィシル2007855株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号351〜369;
(k)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI1株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号385〜419;
(l)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;又は
(m)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCD196株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号435〜452;
(n)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルBI9株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号420〜434;
(o)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルCF5株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号453〜468;又は
(p)任意選択で、宿主細胞が、CディフィシルM68株細胞であり、及び/又はCas3が、前記株のCas3である、配列番号477〜495
から選択されるリピート配列である、請求項1から3のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された核酸。
【請求項５】
標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列により含まれる、又は、
標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子媒介性遺伝子発現カスケードにより含まれる遺伝子により含まれる、
請求項1から4のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された核酸。
【請求項６】
標的配列の転写が、宿主細胞種の細胞において、
(a)σE、
(b)σF、
(c)σG、
(d)σH、
(e)σK、
(f)Spo0A、
(g)SpoIIID、
(h)SpoVT、又は
(i)SpoIIR
によって制御される、請求項1から5のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された核酸。
【請求項７】
標的ヌクレオチド配列が、宿主細胞種においてシグマ因子の転写を直接的若しくは間接的に制御する産物をコードする遺伝子により含まれる、又は、
標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23に列挙される遺伝子から選択される遺伝子若しくはその相同体、オルソログ若しくは機能的同等物により含まれる、又は、
標的配列が、ステージI、II、III、IV若しくはV胞子形成遺伝子により含まれる、若しくは胞子コートタンパク質をコードする、
請求項1から6のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された核酸。
【請求項８】
Cas3及び/又はCASCADE Casが、宿主細胞の内因性Casである、請求項1から7のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された核酸。
【請求項９】
遺伝子操作された核酸が、核酸ベクター、任意選択で、ウイルス、ファージ、ファスミド、プラスミド若しくは接合性プラスミドにより含まれる、及び／又は、
遺伝子操作された核酸のコピーが、複数の担体細菌により含まれ、任意選択で、担体細菌細胞が、ラクトバチルス属細胞である、
請求項1から8のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された核酸。
【請求項１０】
発現されたHM-crRNAが、クロストリジウム・ディフィシル宿主細胞においてCASCADE Cas及びCas3又はその前記オルソログ又は相同体を組み合わせることが可能であり、Cas3が、標的配列を改変するために、前記宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、前記宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減でき、それによって、対象における前記宿主細胞の割合を低減し、対象における宿主細胞感染を処置する、ヒト又は動物対象におけるクロストリジウム・ディフィシル感染の処置又は予防において使用するための請求項1から9のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された核酸。
【請求項１１】
請求項1から10のいずれか一項に記載のシステム又は遺伝子操作された核酸及び薬学的に許容される希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
混合細菌集団を含む、ヒト又は非ヒト動物対象においてクロストリジウム・ディフィシル感染を処置する方法において使用するための医薬組成物であって、集団は、(i)第1の種の細菌細胞の第1の亜集団及び(ii)クロストリジウム・ディフィシル種の複数の宿主細胞を含む細胞の第2の亜集団を含み、第1の種は、前記クロストリジウム・ディフィシル種とは異なり、
各宿主細胞は、
(a)CCW、CCA、CCT、CCC、CCG又はTCAを含む又はからなるPAMと、
(b)前記PAMのすぐ3'にある標的ヌクレオチド配列と、
(c)宿主細胞においてCas3ヌクレアーゼとともに作動可能なCASCADE(抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体)Casをコードする発現可能なヌクレオチド配列と、
(d)前記Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列と
を含み、
第1の細胞は、前記PAMのすぐ3'にある前記標的ヌクレオチド配列を含まず、
(e)医薬組成物は、対象に投与され、宿主改変(HM)cRNAをコードする遺伝子操作された核酸配列の複数コピーを含み、
(f)HM-crRNAは宿主細胞において発現され、
各HM-crRNAは、それぞれの遺伝子操作された核酸配列によってコードされ、それぞれの宿主細胞においてCas3及びCASCADE Casとともに作動可能であり、前記それぞれの遺伝子操作された核酸配列及びCasは、HM-CRISPR/Casシステムを形成し、遺伝子操作された核酸配列は、
(i)配列番号151のリピート配列、又は、配列番号151と少なくとも70%同一である配列を含む、1つ又は複数のリピート配列と、
(ii)前記HM-crRNAの配列をコードするスペーサー配列であって、前記HM-crRNA配列は、宿主細胞において前記宿主細胞標的配列とハイブリダイズして、Casを標的配列にガイドすることが可能である、スペーサー配列と
を含む核酸配列を含み、
発現されたHM-crRNAは、任意選択で、配列番号273及び275〜286から選択されるアミノ酸配列を含む、又は配列番号274のヌクレオチド配列によってコードされるCASCADE Cas及びCas3又はそのオルソログ若しくは相同体と組み合わされ、Cas3は、タイプI-Bであり、Cas3は、標的配列を改変するために、宿主細胞において前記HM-crRNAとともに作動可能であり、それによって、宿主細胞を死滅させるか、又は宿主細胞集団成長を低減させ、それによって、対象における前記宿主細胞集団の割合を低減し、クロストリジウム・ディフィシル感染を処置する、医薬組成物。
【請求項１３】
タイプI-B Casであり、宿主クロストリジウム・ディフィシル細菌細胞の標的ヌクレオチド配列を認識するようにプログラムされ、それによって、プログラムされたヌクレアーゼが、ヌクレオチド配列を改変可能であり、ヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるシグマ因子媒介性遺伝子発現カスケードにより含まれる標的遺伝子により含まれる、請求項1、3から8、及び10のいずれか一項に記載のシステムにおいて使用するためのガイド型ヌクレアーゼ。
【請求項１４】
ヌクレオチド配列が、前記カスケードのシグマ因子をコードする遺伝子により含まれる、又は、
(a)σE、
(b)σF、
(c)σG、
(d)σH、
(e)σK、
(f)Spo0A、
(g)SpoIIID、
(h)SpoVT若しくは
(i)SpoIIR
によって、宿主細胞種の細胞において標的遺伝子の転写が制御される、又は、
ヌクレオチド配列が、
(a)σE、
(b)σF、
(c)σG、
(d)σH、
(e)σK、
(f)Spo0A、
(g)SpoIIID、
(h)SpoVT若しくは
(i)SpoIIR
をコードする遺伝子により含まれる、又は、
標的ヌクレオチド配列が、表12〜17及び23に列挙される遺伝子から選択される遺伝子若しくはその相同体、オルソログ若しくは機能的同等物により含まれる、又は、
標的ヌクレオチド配列が、配列番号220、222、224、226、228、229、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252、254、256、258、259及び260から選択される配列と少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列により含まれる、又は、
標的配列が、配列番号219、221、223、225、227、230、231、233、235、237、239、241、243、245、247、249、251、253、255及び257から選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列をコードする、又は、
標的配列が、spo0A、spoIIID、sigK、sigF、sigH、Spo0A-Pホスファターゼ、spoIIE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIGA、sigE、spoIIR、sigG、SpoIIIA、spoIID、SpoIIQ、SpoIVB若しくはCtpB遺伝子により含まれる、又は、
宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、CディフィシルutxA、毒素A又はCディフィシル毒素B遺伝子により含まれる、又は、
宿主細胞が、Cディフィシル細胞であり、標的配列が、Cディフィシルcdu2、cdu1、tcdD、tcdB、tcdE、tcdA、tcdC、cdd1、cdd2、cdd3又はcdd4遺伝子により含まれるヌクレオチド配列により含まれる、又は、
標的配列が、ステージI、II、III、IV若しくはV胞子形成遺伝子により含まれる、又は胞子コートタンパク質をコードする、
請求項13に記載のヌクレアーゼ。
【請求項１５】
クロストリジウム・ディフィシル宿主細胞に感染又は形質転換可能である核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合性プラスミド)であって、請求項13又は14に記載のヌクレアーゼをコードするベクター。
【請求項１６】
ヌクレアーゼをプログラミングするための1種若しくは複数のcrRNA若しくはガイドRNA(gRNA)と組み合わせた状態にあり、若しくはこのようなcrRNA若しくはgRNAをコードする核酸と組み合わせた状態にあり、任意選択で、前記核酸が、配列番号151のリピート配列、若しくは、配列番号151と少なくとも70%同一である配列であるリピート配列を含む1つ若しくは複数のリピート配列を含み、又は、
Cas3又はベクターが、1種若しくは複数のCASCADE Cas(任意選択で、CasA、B、C、D及びE又はCas1若しくはCas2)をコードする核酸と組み合わせた状態にあり、前記Cas3が、宿主細胞の標的配列を改変するために前記CASCADE Casとともに作動可能である、
請求項13又は14に記載のヌクレアーゼ又は請求項15に記載のベクター。
【請求項１７】
Casヌクレアーゼが、CディフィシルCas3であり、
任意選択で、Cas3が、配列番号273及び275〜286、261、263、287〜289、265、267及び269から選択されるアミノ酸配列又は前記選択された配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項13から16のいずれか一項に記載のヌクレアーゼ又はベクター。
【請求項１８】
細胞の標的配列を認識及び改変するようにヌクレアーゼをガイドするために、宿主クロストリジウム・ディフィシル細菌細胞において請求項13、14、16、及び17のいずれか一項に記載のヌクレアーゼと組み合わせることが可能であるcrRNA又はシングルgRNAをコードする又は含む核酸分子であって、
crRNA又はシングルgRNAが、配列番号151のリピート配列、若しくは、配列番号151のリピート配列と少なくとも70%同一である配列を含む核酸リピート配列によってコードされる配列を含み、宿主細胞が、Cディフィシル細胞である、核酸分子。
【請求項１９】
クロストリジウム・ディフィシル宿主細胞を感染又は形質転換可能である核酸ベクター(任意選択で、バクテリオファージ、ファスミド又は接合性プラスミド)であって、請求項18に記載の核酸を含む、核酸ベクター。
【請求項２０】
ヒト又は動物対象において疾患又は状態の処置又は予防において使用するための組成物であって、宿主細胞によって媒介される疾患又は状態を処置又は予防するために対象に投与するための、請求項1から11及び13から19のいずれか一項に記載のシステム、配列、ベクター、ヌクレアーゼ又は核酸を含む組成物であって、
前記組成物が、宿主細胞が対象のCディフィシル感染を処置するためのものであり、前記宿主細胞が、任意選択で、表18及び19中の株並びに表24中の配列番号275〜286について列挙された株から選択されるCディフィシル株のCディフィシル宿主細胞である、組成物。