【手続補正書】
【提出日】令和3年9月3日(2021.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)アルゴノートポリペプチド配列と(ii)核酸巻き戻し因子とを含み、中温で標的ポリヌクレオチド配列中に切断を生成する、核酸編集システム。
【請求項２】
前記核酸巻き戻し因子が、核酸巻き戻しポリペプチド配列を含む、請求項1に記載の核酸編集システム。
【請求項３】
前記アルゴノートポリペプチド配列が、約19℃〜約40℃の温度で前記標的ポリヌクレオチド配列中に切断を生成する、請求項1または2に記載の核酸編集システム。
【請求項４】
前記アルゴノートポリペプチド配列が、約37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中に切断を生成する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸編集システム。
【請求項５】
前記アルゴノートポリペプチド配列が中温生物に由来する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸編集システム。
【請求項６】
前記アルゴノートポリペプチド配列が、クロストリジウム（Clostridium）に由来する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸編集システム。
【請求項７】
前記アルゴノートポリペプチド配列が、パエニバチルス・ボレアリス（Paenibacillus borealis）、デイノコッカス（Deinococcus）sp. YIM 77859、カロスリックス（Calothrix）sp. PCC7103、クロストリジウム目細菌（Clostridiales bacterium）NK3B98、サーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongatus）BP-1、ヒフォモナス（Hyphomonas）sp. T16B2、クロオコッキディオプシス・サーマリス（Chroococcidiopsis thermalis）、クロストリジウム（Clostridium）、クロストリジウム・ディスポリカム（Clostridium disporicum）、ロドピレルラ・マイオリカ（Rhodopirellula maiorica）SM1、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・サウディエンセ（Clostridium saudiense）、クロストリジウム・ボルテアエ（Clostridium bolteae）、クロストリジウム・サルタゴフォルメ（Clostridium sartagoforme）、およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）からなる群より選択される生物に由来する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の核酸編集システム。
【請求項８】
前記標的ポリヌクレオチド配列に結合するガイド核酸をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の核酸編集システム。
【請求項９】
前記ガイド核酸が、ガイドDNAまたはガイドRNAである、請求項8に記載の核酸編集システム。
【請求項１０】
前記アルゴノートポリペプチド配列が、前記標的ポリヌクレオチド配列内に一本鎖切断または二本鎖切断を生成する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸編集システム。
【請求項１１】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、二本鎖DNA（dsDNA）である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の核酸編集システム。
【請求項１２】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、一本鎖DNA（ssDNA）である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の核酸編集システム。
【請求項１３】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、真核細胞中にある、請求項1に記載の核酸編集システム。
【請求項１４】
前記アルゴノートポリペプチド配列および前記核酸巻き戻しポリペプチド配列が、ポリペプチド融合構築物の部分を規定する、請求項2に記載の核酸編集システム。
【請求項１５】
細胞を請求項1〜14のいずれか一項に記載の核酸編集システムと接触させる工程を含む、ゲノム編集のエクスビボ方法。
【請求項１６】
請求項1〜14のいずれか一項に記載の核酸編集システムを含む、細胞。
【請求項１７】
それを必要とする対象において疾患を治療する方法において使用するための、請求項16に記載の細胞。
【請求項１８】
エクスビボの核酸編集のための核酸編集システムの使用であって、
該核酸編集システムが、(i)アルゴノートポリペプチド配列、(ii)核酸巻き戻しポリペプチド配列、および(iii)ガイド核酸を含み、
標的ポリヌクレオチド配列と接触させると、該核酸巻き戻しポリペプチド配列が該標的ポリヌクレオチド配列を巻き戻し、該ガイドが該標的ポリヌクレオチド配列に結合し、かつ該アルゴノートポリペプチド配列が中温で該標的ポリヌクレオチド配列内に切断を生成する、
使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１８】
本明細書では、RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドと任意の調節ドメインポリペプチド（RDP）とを含む遺伝子編集集合分子（Assembled Genetic Editing Molecule:AGEM）であって、RHDCポリペプチドが中温で核酸を切断し、ここで、核酸切断活性がガイド核酸によって方向付けられ、かつRHDCポリペプチドが核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている、遺伝子編集集合分子が提供される。場合により、RHDCポリペプチドはアルゴノートポリペプチドである。場合により、アルゴノートは、MjAgo、TtAgo、HlaAgo、DmcAgo、MsAgo、TsAgo、およびPfAgoからなる群より選択される。場合により、RHDCポリペプチドはSEQ ID NO:59〜160からなる群より選択される配列を含む。場合により、RDPはRad51ポリペプチドまたはリコンビナーゼである。場合により、核酸巻き戻しポリペプチドはdCas9ドメインを含む。
[本発明1001]
原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とを含む、ポリペプチド構築物であって、
該RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、かつ該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されている、該ポリペプチド構築物。
[本発明1002]
前記RHDCポリペプチド配列または前記核酸巻き戻しポリペプチド配列のうちの少なくとも一方が中温生物に由来する、本発明1001のポリペプチド構築物。
[本発明1003]
前記RHDCポリペプチド配列が、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、本発明1001のポリペプチド構築物。
[本発明1004]
前記RHDCポリペプチド配列が、約19℃、約20℃、約21℃、約22℃、約23℃、約24℃、約25℃、約26℃、約27℃、約28℃、約29℃、または約30℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、本発明1001のポリペプチド構築物。
[本発明1005]
前記RHDCポリペプチド配列が、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、本発明1001のポリペプチド構築物。
[本発明1006]
前記中温生物が原核生物である、本発明1002〜1005のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1007]
前記原核生物が、バクテロイデス門（bacteroidetes）、プロテオバクテリア門（proteobacteria）、アシドバクテリア門（acidobacteria）、アクチノバクテリア門（actinobacteria）、ファーミキューテス門（firmicutes）、シアノバクテリア門（cyanobacteria）、スピロヘータ門（spirochaetes）、デイノコックス門（deinococcus）、ベルコミクロビア門（verrucomicrobia）、プランクトミセス門（planctomycetes）、バルネオラ門（balneolaeota）、およびクロロフレクサス門（chloroflexi）からなる群より選択される科に由来する、本発明1006のポリペプチド構築物。
[本発明1008]
前記RHDCポリペプチド配列が、P-element induced WImpy testis（PIWI）遺伝子、RuvC、Cas、Sir2、Mrr、TIR、PLD、REase、制限エンドヌクレアーゼ、DExD/H、スーパーファミリーIIヘリカーゼ、RRXRR、DUF460、DUF3010、DUF429、DUF1092、COG5558、OrfB＿IS605、ペプチダーゼ＿A17、リボヌクレアーゼH様ドメイン、3'-5'エキソヌクレアーゼドメイン、3'-5'エキソリボヌクレアーゼRv2179c様ドメイン、バクテリオファージμ、トランスポザーゼ、DNA指向性DNAポリメラーゼ、ファミリーB、エキソヌクレアーゼドメイン、エキソヌクレアーゼ、RNase T/DNAポリメラーゼIII、yqgF遺伝子、HEPN、RNase LSドメイン、LsoA触媒ドメイン、KENドメイン、RNaseL、Ire1、RNaseドメイン、RloC、またはPrrCのうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされるポリペプチドに由来する、本発明1001〜1007のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1009]
前記RHDCポリペプチド配列が、防御、ストレス応答、CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）、アルゴノート、またはDNA修復に関与する遺伝子のうちの少なくとも1つに隣接するオペロン中に位置する遺伝子によってコードされるポリペプチドに由来する、本発明1001〜1008のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1010]
前記RHDCポリペプチド配列がアルゴノートドメイン配列である、本発明1009のポリペプチド構築物。
[本発明1011]
前記RHDCポリペプチド配列が、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む、本発明1001〜1010のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1012]
前記RHDCポリペプチド配列と前記核酸巻き戻しポリペプチド配列とに融合された追加の機能的ポリペプチド配列をさらに含む、本発明1001〜1011のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1013]
前記核酸巻き戻しポリペプチドが原核生物起源または古細菌起源である、本発明1001〜1012のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1014]
前記核酸巻き戻しポリペプチドが、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、Cas、またはそれらの組合せを含む、本発明1001〜1013のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1015]
前記Casが触媒不活性（catalytically dead）Casまたは部分不活性（partially dead）Cas（ニッカーゼ）である、本発明1014のポリペプチド構築物。
[本発明1016]
前記触媒不活性Casが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、およびCasRXの触媒不活性誘導体からなる群より選択される、本発明1015のポリペプチド構築物。
[本発明1017]
ATPase配列をさらに含む、本発明1001〜1016のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1018]
前記RHDCポリペプチド配列と前記核酸巻き戻しポリペプチド配列とがリンカー配列によって融合されている、本発明1001〜1017のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1019]
前記リンカーがポリペプチドリンカーであり、該ポリペプチドリンカーが、1つのGSGSGS配列もしくは複数コピーのGSGSGS、非荷電アミノ酸、αヘリックスドメイン、または、リガンド誘導性コンフォメーション変化を伴うペプチドを含む、本発明1018のポリペプチド構築物。
[本発明1020]
前記リンカーがポリペプチドリンカーである、本発明1019のポリペプチド構築物。
[本発明1021]
前記核酸巻き戻しポリペプチド配列と前記RHDCポリペプチド配列が同じフレームで発現される、本発明1001〜1020のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1022]
前記ガイドDNAに結合する、本発明1001〜1021のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1023]
前記ガイドDNAが約1塩基対長〜約30塩基対長である、本発明1001〜1022のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1024]
前記ガイドDNAが前記標的ポリヌクレオチド配列に相補的である、本発明1001〜1023のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1025]
前記標的ポリヌクレオチド配列が遺伝子配列を含む、本発明1024のポリペプチド構築物。
[本発明1026]
細胞に導入された場合に前記遺伝子配列中の破壊をもたらす、本発明1001〜1025のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1027]
前記破壊が二本鎖切断または一本鎖切断を含む、本発明1026のポリペプチド構築物。
[本発明1028]
前記RHDCポリペプチド配列が、ファーミキューテス（firmicutes）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1029]
前記RHDCポリペプチド配列が、クロストリジウム（Clostridium）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1030]
前記クロストリジウム・アルゴノートドメインが、クロストリジウム・ディスポリカム（Clostridium disporicum）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1029のポリペプチド構築物。
[本発明1031]
前記RHDCポリペプチド配列が、サーモアクチノミセス（Thermoactinomyces）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1032]
前記サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインが、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1031のポリペプチド構築物。
[本発明1033]
前記RHDCポリペプチド配列が、メチロバクター（Methylobacter）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1034]
前記メチロバクター・アルゴノートドメインが、メチロバクター・ウィッテンバリー（Methylobacter whittenburyi）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1033のポリペプチド構築物。
[本発明1035]
前記RHDCポリペプチド配列が、サーモシネココッカス（Thermosynechococcus）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、本発明1001〜1027のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1036]
前記サーモシネココッカス・アルゴノートドメインが、サーモシネココッカス・エロンゲーツ（Thermosynechococcus elongates）アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1035のポリペプチド構築物。
[本発明1037]
アルゴノートポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列との合成融合体を含み、該アルゴノートポリペプチド配列が中温で標的核酸を切断する、ポリペプチド構築物。
[本発明1038]
前記アルゴノートポリペプチド配列または前記核酸巻き戻しポリペプチド配列のうちの少なくとも一方が中温生物に由来する、本発明1037のポリペプチド構築物。
[本発明1039]
前記アルゴノートポリペプチド配列が約19℃〜40℃で前記標的核酸を切断する、本発明1037または本発明1038のポリペプチド構築物。
[本発明1040]
前記アルゴノートポリペプチド配列が、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で前記標的核酸を切断する、本発明1039のポリペプチド構築物。
[本発明1041]
前記アルゴノートポリペプチド配列が37℃で前記標的核酸を切断する、本発明1040のポリペプチド構築物。
[本発明1042]
前記アルゴノートポリペプチド配列が古細菌アルゴノートポリペプチド配列である、本発明1037〜1041のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1043]
前記アルゴノートポリペプチド配列が、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む、本発明1037〜1041のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1044]
前記アルゴノートポリペプチド配列と前記核酸巻き戻しポリペプチド配列とがリンカー配列によって融合されている、本発明1037〜1043のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1045]
本発明1001〜1044のいずれかのポリペプチド構築物を含む、エクスビボ細胞。
[本発明1046]
本発明1001〜1044のいずれかのポリペプチド構築物をコードする、核酸。
[本発明1047]
本発明1001〜1044のいずれかのポリペプチド構築物を含む、組成物。
[本発明1048]
細胞を本発明1001〜1044のいずれかのポリペプチド構築物と接触させる工程を含む、ゲノム編集の方法。
[本発明1049]
（a）本発明1001〜1044のいずれかのポリペプチド構築物と、
（b）その使用説明書と
を含む、キット。
[本発明1050]
容器をさらに含む、本発明1049のキット。
[本発明1051]
RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とを含む、ポリペプチド構築物であって、
該RHDCポリペプチド配列が、中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断して、切断された核酸を生成し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されており、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が該切断された核酸に核酸配列を挿入する、該ポリペプチド構築物。
[本発明1052]
RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と調節ドメインポリペプチド（RDP）配列とを含む、ポリペプチド構築物。
[本発明1053]
核酸巻き戻しドメイン配列をさらに含む、本発明1051または1052のポリペプチド構築物。
[本発明1054]
前記核酸巻き戻しドメイン配列が、触媒不活性Cas、ヘリカーゼ、またはトポイソメラーゼを含む、本発明1053のポリペプチド構築物。
[本発明1055]
前記RDP配列が、Rad51ポリペプチド、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、または、生殖細胞修復に関与するドメインである、本発明1052〜1054のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1056]
前記RHDCポリペプチド配列が、ファーミキューテス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、本発明1051〜1055のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1057]
前記RHDCポリペプチド配列が、クロストリジウム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、本発明1051〜1054のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1058]
前記クロストリジウム・アルゴノートドメインが、クロストリジウム・ディスポリカム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1057のポリペプチド構築物。
[本発明1059]
前記RHDCポリペプチド配列が、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、本発明1051〜1054のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1060]
前記サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインが、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1059のポリペプチド構築物。
[本発明1061]
前記RHDCポリペプチドが、メチロバクター・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、本発明1051〜1054のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1062]
前記メチロバクター・アルゴノートドメインが、メチロバクター・ウィッテンバリー・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1061のポリペプチド構築物。
[本発明1063]
前記RHDCポリペプチドが、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断する、本発明1051〜1054のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1064]
前記サーモシネココッカス・アルゴノートドメインが、サーモシネココッカス・エロンゲーツ・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1063のポリペプチド構築物。
[本発明1065]
アルゴノートポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とを含む、ポリペプチド構築物であって、
該アルゴノートポリペプチド配列が中温で核酸を切断し、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された該核酸に核酸配列を挿入する、該ポリペプチド構築物。
[本発明1066]
前記アルゴノートポリペプチド配列または前記核酸巻き戻しポリペプチド配列のうちの少なくとも一方が中温生物に由来する、本発明1065のポリペプチド構築物。
[本発明1067]
前記アルゴノートポリペプチド配列が19℃〜40℃で核酸を切断する、本発明1065または1066のポリペプチド構築物。
[本発明1068]
前記アルゴノートポリペプチド配列が、約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、または約39℃で核酸を切断する、本発明1067のポリペプチド構築物。
[本発明1069]
前記アルゴノートポリペプチド配列が37℃で核酸を切断する、本発明1068のポリペプチド構築物。
[本発明1070]
前記アルゴノートポリペプチド配列が古細菌アルゴノートポリペプチド配列である、本発明1065〜1069のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1071]
前記アルゴノートポリペプチド配列が、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、RNase、リコンビナーゼ、フリッパーゼ、トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む、本発明1065〜1070のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1072]
前記アルゴノートポリペプチド配列と前記核酸巻き戻しポリペプチド配列とがリンカーによって接続されている、本発明1065〜1071のいずれかのポリペプチド構築物。
[本発明1073]
本発明1051〜1072のいずれかのポリペプチド構築物を含む、エクスビボ細胞。
[本発明1074]
本発明1051〜1072のいずれかのポリペプチド構築物をコードする、核酸。
[本発明1075]
本発明1051〜1072のいずれかのポリペプチド構築物を含む、組成物。
[本発明1076]
細胞を本発明1051〜1072のいずれかのポリペプチド構築物と接触させる工程を含む、ゲノム編集の方法。
[本発明1077]
細胞を、
i.RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列、
ii.核酸巻き戻し因子配列、
iii.ガイド核酸、および
iv.調節ドメインポリペプチド（RDP）配列
を含む核酸編集システムと接触させる工程を含み、該接触させる工程が該細胞における核酸の編集をもたらす、方法。
[本発明1078]
前記RHDC配列、前記核酸巻き戻し因子配列、および前記RDP配列がタンパク質複合体中に存在する、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記タンパク質複合体が、前記ガイド核酸と会合して誘導型編集複合体を形成する、本発明1078の方法。
[本発明1080]
前記ガイド核酸がガイドDNAである、本発明1077〜1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
前記ガイド核酸がガイドRNAである、本発明1077〜1079のいずれかの方法。
[本発明1082]
RHDCドメインがアルゴノートに由来する、本発明1077〜1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
前記核酸巻き戻し因子配列が、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、Cas、またはそれらの組合せを含む、本発明1077〜1082のいずれかの方法。
[本発明1084]
前記Casが触媒不活性Casまたは部分的触媒不活性Casである、本発明1083の方法。
[本発明1085]
前記RDP配列が、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、生殖細胞修復ドメイン、DNA修復タンパク質、またはそれらの組合せを含む、本発明1077〜1084のいずれかの方法。
[本発明1086]
前記RDP配列が前記核酸編集の全部または一部を制御する、本発明1077〜1085のいずれかの方法。
[本発明1087]
前記ガイド核酸が前記細胞中の核酸に相補的である、本発明1077〜1086のいずれかの方法。
[本発明1088]
前記細胞中の核酸が疾患関連抗原をコードする、本発明1087の方法。
[本発明1089]
前記疾患が、心疾患、糖尿病、がん、神経学的疾患、精神疾患、遺伝性疾患、またはそれらの組合せである、本発明1088の方法。
[本発明1090]
前記RDP配列を使用しない対応する核酸編集方法と比較してエネルギー要求量が低く、かつ、
予め決められた量のATPを前記核酸編集システムに供給してATP使用量を編集後の（［ATP］-［ADP］）/［修飾されたDNA］に基づいて算出することでATP使用量の差を算出することによって、該エネルギー要求量が求められる、
本発明1077〜1089のいずれかの方法。
[本発明1091]
前記RDP配列を含む前記核酸編集システムを用いた場合に、エネルギーレベルが、該RDP配列を使用しない相当する核酸編集システムと比較して約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約15％、約20％、または最大25％低減する、本発明1077〜1090のいずれかの方法。
[本発明1092]
ゲノム編集修復を非相同末端結合よりも相同組換え修復に偏らせる、本発明1077〜1091のいずれかの方法。
[本発明1093]
前記細胞のゲノムにトランスジーンを導入する工程をさらに含む、本発明1077〜1092のいずれかの方法。
[本発明1094]
前記導入する工程が非ウイルス性に行われる、本発明1093の方法。
[本発明1095]
前記導入する工程がウイルス性に行われる、本発明1093の方法。
[本発明1096]
前記細胞が初代細胞または組換え細胞である、本発明1077〜1095のいずれかの方法。
[本発明1097]
前記細胞がヒト細胞である、本発明1077〜1096のいずれかの方法。
[本発明1098]
前記核酸編集システムが前記細胞にエレクトロポレートされる、本発明1077〜1097のいずれかの方法。
[本発明1099]
前記方法によって編集された細胞を、それを必要とする対象に導入する工程をさらに含む、本発明1077〜1098のいずれかの方法。
[本発明1100]
前記RHDCポリペプチド配列が、ファーミキューテス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で核酸を切断する、本発明1077〜1099のいずれかの方法。
[本発明1101]
前記RHDCポリペプチド配列が、クロストリジウム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記核酸を切断する、本発明1077〜1099のいずれかの方法。
[本発明1102]
前記クロストリジウム・アルゴノートドメインが、クロストリジウム・ディスポリカム・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1101の方法。
[本発明1103]
前記RHDCポリペプチド配列が、サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記核酸を切断する、本発明1077〜1099のいずれかの方法。
[本発明1104]
前記サーモアクチノミセス・アルゴノートドメインが、サーモアクチノミセスsp CDFアルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1103の方法。
[本発明1105]
前記RHDCポリペプチド配列が、メチロバクター・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記核酸を切断する、本発明1077〜1099のいずれかの方法。
[本発明1106]
前記メチロバクター・アルゴノートドメインが、メチロバクター・ウィッテンバリー・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1105の方法。
[本発明1107]
前記RHDCポリペプチド配列が、サーモシネココッカス・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含み、37℃で前記核酸を切断する、本発明1077〜1099のいずれかの方法。
[本発明1108]
前記サーモシネココッカス・アルゴノートドメインが、サーモシネココッカス・エロンゲーツ・アルゴノートドメインまたはその機能的フラグメントもしくは機能的変異体を含む、本発明1107の方法。
[本発明1109]
SEQ ID NO:161〜252のいずれか1つに対して少なくとも60％の同一性を含む、単離された核酸配列。
[本発明1110]
SEQ ID NO:161〜252のいずれか1つに対して少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％の同一性をさらに含む、本発明1109の単離された核酸配列。
[本発明1111]
本発明1109または1110の単離された核酸配列を含む、細胞。
[本発明1112]
本発明1108または1109の単離された核酸配列によってコードされるタンパク質を含む、細胞。
[本発明1113]
ガイド核酸をさらに含む、本発明1111または本発明1112の細胞。
[本発明1114]
調節ドメインポリペプチド（RDP）をさらに含む、本発明1111または1112の細胞。
[本発明1115]
SEQ ID NO:20〜38のいずれか1つに対して少なくとも60％の同一性を含む、単離されたポリペプチド配列。
[本発明1116]
SEQ ID NO:20〜38のいずれか1つに対して少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも100％の同一性をさらに含む、本発明1114の単離されたポリペプチド配列。
[本発明1117]
本発明1115または1116の単離されたポリペプチド配列を含む、細胞。
[本発明1118]
ガイド核酸をさらに含む、本発明1117の細胞。
[本発明1119]
調節ドメインポリペプチド（RDP）配列をさらに含む、本発明1117または1118の細胞。
[本発明1120]
細胞の集団を、本発明1001〜1044または本発明1051〜1072のいずれかのポリペプチド構築物と接触させる工程を含み、該接触させる工程の後に該集団の少なくとも約5％がゲノム破壊を含む、ゲノム編集の方法。
[本発明1121]
前記接触させる工程の後に、前記集団の少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、または少なくとも約60％が前記ゲノム破壊を含む、本発明1120の方法。
[本発明1122]
細胞の集団を、本発明1001〜1044または本発明1051〜1072のいずれかのポリペプチド構築物をコードする単離されたポリ核酸と接触させる工程を含み、該接触させる工程の後に、該集団の少なくとも約5％がゲノム破壊を含む、ゲノム編集の方法。
[本発明1123]
前記接触させる工程の後に、前記集団の少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、または少なくとも約60％が前記ゲノム破壊を含む、本発明1122の方法。
[本発明1124]
a.ゲノム配列をCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）タンパク質で巻き戻し、それによって、巻き戻されたゲノム配列を生成する工程と、
b.該巻き戻されたゲノム配列を中温性RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと接触させることによって該巻き戻されたゲノム配列にゲノム破壊を導入し、それによってゲノムを編集する工程と
を含む、ゲノム編集の方法。
[本発明1125]
前記CRISPRタンパク質が触媒不活性Casまたは部分不活性Cas（ニッカーゼ）である、本発明1124の方法。
[本発明1126]
前記触媒不活性Casが、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、xCas9、CasX、CasY、およびCasRXの触媒不活性誘導体からなる群より選択される、本発明1125の方法。
[本発明1127]
前記CasがdCas9である、本発明1124〜1126のいずれかの方法。
[本発明1128]
前記RHDCポリペプチドが、RuvC、HNH、RNase H、PIWI、またはそれらの組合せから選択されるポリペプチドを含む、本発明1124〜1127のいずれかの方法。
[本発明1129]
調節ドメインポリペプチド（RDP）をさらに含む、本発明1124〜1128のいずれかの方法。
[本発明1130]
前記RDPが、Rad51、リコンビナーゼ、エピジェネティックモジュレーター、または、生殖細胞修復に関与するドメインを含む、本発明1129の方法。
[本発明1131]
前記ゲノム配列が初代細胞中または組換え細胞中に存在する、本発明1124〜1130のいずれかの方法。
[本発明1132]
前記ゲノム配列がヒト細胞中に存在する、本発明1124〜1131のいずれかの方法。
[本発明1133]
本発明1048、1076、1077、1120、1122、または1124のいずれかの方法によって編集された細胞を投与する工程を含む、それを必要とする対象において疾患を処置する方法。
[本発明1134]
前記疾患が、心疾患、糖尿病、がん、神経学的疾患、免疫学的疾患、精神疾患、遺伝性疾患、またはそれらの組合せである、本発明1133の方法。
[本発明1135]
前記投与する工程の後に前記疾患の程度が約10％〜約50％低減する、本発明1133または1134の方法。
[本発明1136]
本発明1048、1076、1077、1120、1122、または1124のいずれかの方法によって編集された細胞を投与する工程を含む、それを必要とする対象において疾患を安定化する方法。
[本発明1137]
前記安定化が、前記投与する工程の後の前記対象における疾患のレベルの5％未満の変化を含む、本発明1136の方法。
[本発明1138]
原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とをコードする、核酸構築物であって、
該RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、かつ該RHDCポリペプチド配列が、該核酸構築物によってコードされるポリペプチドにおいて該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されている、該核酸構築物。
[本発明1139]
RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とをコードする、核酸構築物であって、
該RHDCポリペプチド配列によってコードされるタンパク質が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、該RHDCポリペプチド配列が、該核酸構築物によってコードされるポリペプチドにおいて該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されており、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された該核酸に核酸配列を挿入する、該核酸構築物。
[本発明1140]
原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチドと核酸巻き戻しポリペプチドとを含むポリペプチド構築物を含む、細胞であって、
RHDCポリペプチド配列が中温で核酸を切断し、ここで、核酸切断活性がガイドDNAによって束縛され、かつ該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチドに融合されている、該細胞。
[本発明1141]
RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とを含むポリペプチド構築物を含む、細胞であって、
該RHDCポリペプチド配列によってコードされるポリペプチドが中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチドに融合されており、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された該核酸に核酸配列を挿入する、該細胞。
[本発明1142]
原核生物RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列とをコードする核酸構築物を含む、細胞であって、
RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、かつ該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されている、該細胞。
[本発明1143]
RNase H様ドメイン含有（RHDC）ポリペプチド配列と核酸巻き戻しポリペプチド配列と核酸挿入ポリペプチド配列とをコードする核酸構築物を含む、細胞であって、
該RHDCポリペプチド配列が中温で標的ポリヌクレオチド配列中の核酸を切断し、ここで、該標的ポリヌクレオチド配列がガイドDNAによって結合され、該RHDCポリペプチド配列が該核酸巻き戻しポリペプチド配列に融合されており、かつ該核酸挿入ポリペプチド配列が、切断された該核酸に核酸配列を挿入する、該細胞。