(57)【要約】【課題】突然変異誘発、発現、親和性の選択、増幅の工程をくり返すことによる新規な結合タンパク質の開発。【解決手段】ミクロタンパク質で遺伝子パッケージの外表面タンパク質に由来するアミノ酸を含み、そのキメラタンパク質が遺伝子パッケージの外表面上に提示されていることを特徴とする、キメラタンパク質のライブラリーの作製。【選択図】図１
2010183908.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の標的物質に対し望ましい結合活性を有する新規結合タンパク質を作製する方法であって、
ア）遺伝子パッケージの集団を準備する工程であって、その遺伝子パッケージは特定のポテンシャル結合ドメインの１コピー以上をそのキメラ外表面タンパク質の一部として提示しており、該ポテンシャル結合ドメインは該遺伝子パッケージの表面と自然に会合することなく、該集団は集合的に複数の異なるポテンシャル結合ドメインを提示しており、該複数における多様性は親結合ドメインの１以上ただし全てではないアミノ酸位置の少なくとも部分的なランダムな多様性によって生じることを特徴とする工程と、
イ）そのパッケージを標的物質と接触させる工程、及び
ウ）標的物質に対するアフィニティーに応じてそのパッケージを分離する工程
を含む方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、遺伝子パッケージがファージである方法。
【請求項３】
請求項２の方法であって、ファージがＤＮＡファージである方法。
【請求項４】
請求項２の方法であって、ファージが繊維状ファージである方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、親結合ドメインの１以上ただし全てではないアミノ酸位置の少なくとも部分的なランダムな多様性が、あらかじめ定められている方法。
【請求項６】
請求項１の方法であって、遺伝子パッケージが細菌細胞である方法。
【請求項７】
請求項７の方法であって、細菌細胞が大腸菌である方法。
【請求項８】
請求項１の方法であって、集団が少なくとも１０５の異なるポテンシャル結合ドメインを提示していることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１の方法であって、その集団が少なくとも１０６の異なるポテンシャル結合ドメインを提示していることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１の方法であって、その集団が少なくとも１０７の異なるポテンシャル結合ドメインを提示していることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１の方法であって、その集団が少なくとも１０８の異なるポテンシャル結合ドメインを提示していることを特徴とする方法。
【請求項１２】
ファージまたは細胞のライブラリーであって、それぞれが特定のポテンシャル結合ドメインの１コピー以上をそのキメラ外表面タンパク質の一部として提示しており、該ポテンシャル結合ドメインは該ファージまたは細胞の表面と自然に会合することなく、そのライブラリーは集合的に複数の異なるポテンシャル結合ドメインを提示しており、該複数における多様性は親結合ドメインの１以上ただし全てではないアミノ酸位置の少なくとも部分的なランダムな多様性によって生じることを特徴とするライブラリー。
【請求項１３】
請求項１２のライブラリーであって、少なくとも１０５の異なるポテンシャル結合ドメインを提示していることを特徴とするライブラリー。
【請求項１４】
請求項１２のライブラリーであって、少なくとも１０６の異なるポテンシャル結合ドメインを提示していることを特徴とするライブラリー。
【請求項１５】
請求項１２のライブラリーであって、少なくとも１０７の異なるポテンシャル結合ドメインを提示していることを特徴とするライブラリー。
【請求項１６】
請求項１２のライブラリーであって、少なくとも１０８の異なるポテンシャル結合ドメインを提示していることを特徴とするライブラリー。
【請求項１７】
特定の標的物質に対し望ましい結合活性を有する新規結合タンパク質を作製する方法であって、
エ）遺伝子パッケージの集団を準備する工程であって、その遺伝子パッケージは特定のポテンシャル結合ドメインの１コピー以上をそのキメラ外表面タンパク質の一部として提示しており、該ポテンシャル結合ドメインは該遺伝子パッケージの表面と自然に会合することなく、該集団は集合的に複数の異なるポテンシャル結合ドメインを提示しており、該複数における多様性は親結合ドメインの１以上のアミノ酸位置の少なくとも部分的なランダムな多様性によって生じることを特徴とする工程と、
オ）そのパッケージを標的物質と接触させる工程、及び
カ）標的物質に対するアフィニティーに応じてそのパッケージを分離する工程
を含む方法。
【請求項１８】
ファージまたは細胞のライブラリーであって、それぞれが特定のポテンシャル結合ドメインの１コピー以上をそのキメラ外表面タンパク質の一部として提示しており、該ポテンシャル結合ドメインは該ファージまたは細胞の表面と自然に会合することなく、そのライブラリーは集合的に複数の異なるポテンシャル結合ドメインを提示しており、該複数における多様性は親結合ドメインの１以上のアミノ酸位置の少なくとも部分的なランダムな多様性によって生じることを特徴とするライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は新規な小型結合たんぱく質の開発に関するものであり、特にマイクロタンパク質の突然変異誘発、発現、親和性の選択、そして増幅という工程をくり返すことによる新規な結合たんぱく質の開発に関するものである。この工程に於て、小型タンパク質の結合領域をコードしている遺伝子（予め定められた限定数コドンのランダムな突然変異誘発により得られた）該遺伝子は、遺伝子要素と融合している。その遺伝子要素は、ウイルス（特に線状ファージ）あるいは細胞の外表面に表示されている細胞群発現の結果としての混合物を生成する。親和性の選択は、ウイルスあるいは細胞が融合細胞を含んでいるゲノムを識別するために利用されている。融合細胞はクロマトグラフィー的な目標と結合するタンパク質に符号を付ける。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質のアミノ酸配列はその三次元（３Ｄ）構造を決定する。このことはまたタンパク質の機能を決定する。ポリペプチド鎖の幾らかの残基はタンパク質の三次元構造の決定上他に比して重要な役割を演じる。従ってその結合能力は、共有結合ではないが密着した結合であり、目標分子と特異的に結合する。「タンパク質工学」はタンパク質配列の順序を操作する技術である。即ち、その結合の特性を変えることである。
【０００３】
タンパク質結合に影響を及ぼしている因子は知られているが、新規の表面デザインは困難であることが分かっている。Quiochoその他(QUI087)は次のように示唆している。即ち、現在のタンパク質工学の方法では、自然に発生するタンパク質が持っている優れた結合特性を持ったタンパク質を作り出すことは困難であろう。
【０００４】
しかしながら、すくつかの成功の実績はある。例えば、Wilkinsonら(WILK84)は、Ｔｈｒ５１からＰｒｏの変異をもつBacillus ste−arothermophilus チロシントランスファーＲＮＡシンセターゼの突然変異体は、ＡＴＰに対する親和性が１００倍増加したことが示されていると報告している。
【０００５】
組換型ＤＮＡ技術の発達に伴い、天然タンパク質に遺伝子の符号を付して突然変異させ、突然変異した遺伝子を発現することによりタンパク質の突然変異体を作ることができるようになった。いくつかの突然変異誘発の方法が知られている。一つは「タンパク質手術」(DILL87)であり、選出された遺伝子内に１個もしくはそれ以上の数の予め定められた突然変異を導入することである。完全に予定された配列の唯一のポリペプチドが発現され、その結合が評価される。
【０００６】
それと対照的な方法は、放射線や種々の化学物質のような比較的不特定の突然変異誘発剤を利用するランダムに突然変異体を生成するものである。Hoその他(HOCJ85ならびにLehtovaars、EP  Appln．285、123を参照のこと。
【０００７】
核酸合成工程の適切なサイクルで各塩基の混合物を利用して予め定められヌクレオチドをランダムに変えることができる。(OLIP86とOL87)。混合物中の塩基の配合割合は、各コドンの位置に従ってアミノ酸の出現輝度をきめ、退化ＤＮＡ集団群から発現されたポリペプチド中に発生する。(REUD88a、VERS86a、VERS86b)。ＤＮＡをコードする異なったアミノ酸の存在率が異なる点については言及していない。
【０００８】
Ferenciとその共同研究者は、E．Coliのマルトース運搬タンパク質LamBのクロマトグラフィ単離に関し一連の論文を発表している。(FERE82a、FERE82b、FERE83、FERE84、CLUN84、HEIN87、及び上記の論文)突然変異体は不特定の化学的突然変異誘発物質で自発的にまたは誘発的に生成された。突然変異誘発のレベルが選ばれ、単一点突然変異または二つの残基が一箇所に挿入されるように選ばれた。多種突然変異は探索されないし発見もされることもなかった。
【０００９】
従来のＬａｍＢ基質マルトースと澱粉に対する親和性の度合いに変動が見られる一方、天然のＬａｍＢによって結合されないターゲットとしての分子に対する親和性の選択はなかった、また多種突然変異は探索されないし発見されることもなかった。文献FERE84は、親和性のクロマトグラフィ的な選択技術が他の「表面に存在している重要なバクテリア酸素」同様な突然変異体の発生に応用できる、また細胞内のバクテリアタンパク質を細胞表面に配置転換する突然変異を選択することができると考えている。しかしながら、Ferenciのいう突然変異体表面のタンパク質は、バクテリアの表面タンパク質と外生または非相同一の結合領域とのキメラではない。
【００１０】
Ferenciはまた、構造遺伝子をクローン化したり、タンパク質構造、活性部位もしくは配列を知る必要はないと論じている。しかしながら、この発明による方法は、クローン化された構造遺伝子を特に利用することにある。キメラの外面上で既定されたポテンシャル結合タンパク質に符号を付している遺伝子をクローン化することなしに構造し発現することはできない。
【００１１】
Ferenciは突然変異を特殊な座に限ることはしなかった。置換は特殊の部位に特殊のアミノ酸型が望ましいということで制限されず、むしろ突然変異誘発物の性質によって制限されている。本発明においては、タンパク質の構造、活性部位や配列の知識が適切な予測に利用される。その知識は、残基がタンパク質を不当に不安定することなく結合活動に最も大きく影響するかの予測の補佐をし、また突然変異誘発はこれらの部位に集中される。Ferenciは、表面残基が好ましく変えられるべきだとは示唆していない。従って、Ferenciの選択機構はここに公開された方法に比して有効性を欠くものである。
【００１２】
複数の研究員達は突然変異を起こしていない異種の抗原のエピトープをバクテリアまたはファージの表面に位置付けし、天然のバクテリアもしくはファージの表面タンパク質に融合させ、エピトープが抗体に認められたことを実証した。このように、Charbitら(CHAR86a、b)は、ポリオウイルスのＶＰ１をコートしたタンパク質のＣ３エピトープをE．ColiのＬａｍＢ外被膜タンパク質に遺伝的に挿入し、Ｃ３エピトープがバクテリアの細胞表面に晒されたことを免疫学の観点から断定した。Charbitら(CHAR87)は同様に、ＬａｍＢのキメラと肝炎ＢウイルスのｐｒｅＳ２領域のＡ（もしくはＢ）エピトープを生成した。
【００１３】
キメラのＬａｃＺ／ＯｍｐＢタンパク質は、E．Coliに発現されており、融解に依存して、外被膜もしくはペリプラズム位置付けられている(SJLH77)。キメラＬａｃＺ／ＯｍｐＡ表面タンパク質もまたE．Coli細胞の表面に発現され表示されている(WEIN83)。その他は、E．coli型１線毛(HEDE89)やバクテロイド結節型１線毛(JENN89)のような他のバクテリア表面タンパク質の細胞キメラの表面に発現され表示されている。上記の例では、突然変異が誘発された遺伝形質は挿入されていない。
【００１４】
DulbeccoDULB86)は異種抗原エピトープをウイルス表面タンパク質に組み込む処理方法を示唆している。それによって発現されたキメラタンパク質は、異なったエピトープが抗体に近付き得るような方法でウイルスの表面に表示される。1985年に、Smith(SMIT85)はEcoRIエンドヌクリアーゼ遺伝子の非機能セグメントをバクテリアオファージＦ１の遺伝子ＩＩＩに「位相で」挿入したと報告している。遺伝子ＩＩＩタンパク質は感染に必要なマイナーコートのタンパク質である。Smithは組換型ファージがEcoRIエンドヌクレアーゼに反して産出された不動の抗体によって吸着され、また酸で抽出し得ることを論証している。De  la  Cruz(DELA88)は、Plasmodium  Falciparumからのcircumpsporozo−iteタンパク質の繰り返し領域のフラグメントが、遺伝子IIタンパク質への挿入物としてＭ１３の表面に発現していると述べている。彼等は組換え型ファージがウサギにおいて抗原でもあり免疫原でもあり、このような組換え型ファージはＢエピトープ遺伝地図作製に利用し得ることを明らかにした。研究者達は、同様な組み換え型ファージがＴエピトープ遺伝地図作製やワクチン開発に利用し得ることを示唆している。
【００１５】
これらの研究者達は挿入された物質の突然変異誘発を示唆していないし、また挿入された物質が抗体の抗原結合サイト以外の受容体に特別に結合する能力をキメラタンパク質に授与している完璧な結合ドメインでもない。
【００１６】
McCaffertyら(MCCA90)は、抗体のFvフラグメントがpIIIタンパク質のＮ末端への溶解を発現している。Fvフラグメントは突然変異されていない。
【００１７】
ParmleyとSmith(PARMS88)は、エピトープライブラリーが展示し得る全てのヘキサペプチドを築き得るし、抗体と結合するエピトープを分離したことを示唆している。エピトープライブラリーの論議において、著者達は異種アミノ酸の代表のバランスをとることが望ましいとは示唆していない。彼等はまた挿入が外生タンパク質の完全なドメインをコードすべきであるとは議論していない。エピトープは構造化タンパク質に対する非構造化ペプチドであると考えられている。
【００１８】
ScottとSmith(SCOT90)並びにCwirlaら(CWIR90)は、エピトープライブラリーを作製した。その中で、ターゲット抗体のためのポテンシャルヘキサペプチドエピトープは、エピトープをコードして、ｆｄファージの遺伝子ＩＩＩと共に、ファージに感染した細胞に融合された遺伝子を発現し、退化オレゴヌクレオチドの融合によってランだけに突然変異するとしている。これらの細胞は表面にエピトープを表示した融合ファージを作り出した。固定された抗体に結合されたファージは酸とともに溶出された。これら二つの研究において、融合された遺伝子は野生型pＩＩＩ配列から可変領域を区別するためのスペーサー領域をコードしているセグメントを形作っていた。それによって変えられたアミノ酸は近隣在のpＩＩＩ配列に拘束されない。
【００１９】
Devlinら(DEVL90)は、同様に、Ｍ13ファージを使って、ストレプトアビジンに認知されたランダム１５の残基エピトープを選別した。ここでもスペーサーが、キメラファージタンパク質の残余からランダムペプチドを除去するために利用された。したがって、これらの文献は、突然変異を起こした残溜基（残基、以下同じ）の配座レパトリーを拘束しているとは論議していない。
【００２０】
ScottとSmith、Cwirlaら、並びにDevlinらの持つもう一つの問題は、各位置におけるアミノ酸の資料採取が非常に片寄っているライブラリーを製作したことである。可変領域をコードしている退化オリゴヌクレオチドのデザインにおける彼等の最大の関心は全２０のアミノ酸が各位置にコードされ得ることを確実にすることだった。彼等の第二の関心は停止信号が起きる回数を最小限にすることだった。従って、ScottとSmith並びにCwirlaらは、ＮＮＫ（Ｎ＝Ｇ，Ａ，Ｔ，Ｃの同等の配合、Ｋ＝ＣとＧの同等の配合）を用い、Devlinらは、ＮＮＳ（Ｓ＝ＧとＣの同等の配合）を使った。最も優待されたアミノ酸と最も優待されないアミノ酸の回数比を減少しようとはしなかったし、酸性アミノ酸と基性アミノ酸の発生率を同等のものとしようとはしなかった。
【００２１】
Devlinらは、いくつかの親和性の選択をしたストレプトアビジン結合ペプチドを特性付けたが、これらペプチドの親和性係数を計測しなかった。Cwirlaらは、ペプチドの親和性係数を決定したが、最高のヘキサペプチドが親和性(350−300nM)であったということを発見して失望させられた。その親和性、即ちその「概略値」は、ターゲット抗体により認知された天然のメットーエンケファリンエピトープ(7nM)のそれよりも弱いものだった。Cwirlaらは、高い親和性をもったペプチド産生ファージが酸溶出の際も結合したままで存在していると推測している。その理由は、ファージ（pＩＩＩの約コピーを運搬している)と二価のターゲットIgG問の複数価の相互作用よるものであるかも知れない。
【００２２】
ScottとSmithは、ターゲット抗体に対する親和性（Ａ２）が基準ミオヘムエリトリンエピトープ（５０ｎＭ）のされと同等であるペプチドを発見し得た。しかしながら、ScottとSmithは、多分、融合ファージのターゲットに対する付加逆転結合によって、いくつかの親和性の高いペプチドが失われてしまったことに関して懸念を示している。
【００２３】
Lamら(LAM91)は、固体の支持体の上に非生物学的合成によるペンタペプチドライブラリーを作り上げた。彼等は、およそ等モルの割合のランドムペンタペプチドの多様性を獲得することを開示するかたわら、ジスルフィドの架橋形成を消滅するために故意にシステインを除外した。
【００２４】
Ladner，GlickそしてBirdは、WO88/0633（公告1988年9月7日、さらにUS特許出願07/021,046優先権を持ってGenex  Corpに委託した）（ＬＧＢ）で、一本鎖抗体の結合領域をコードするＤＮＡを換え、ＳＣＡＤ／遺伝子パッケージＶキメラがファージの外面に提示されるようにＳＣＡＤ遺伝子をランダファージの遺伝子パッケージＶ遺伝子にサブクローン化し、そして親和性クロマトグラフィーで抗原に結合するファージを選択することにより、種々の一本鎖抗体ドメイン（ＳＣＡＤ）を特定の抗原に結合させるためスクリーンしてもよいと述べている。そこで述べられている唯一の抗原はウシの成長ホルモンである。他の結合性物質、ターゲット、担体有機物、その他の外面タンパク質については論議していない。また突然変異の程度や方法についても何の言及もしていない。さらに、融合の正確な構造についても論議しておらず、好結果をもたらす融合を見極める方法、またＳＣＡＤが提示されない場合にとるべき方法についても言及していない。
【００２５】
LadnerとBirdはWO88/0661（公告1988年9月7日）で、一本鎖の「擬二量化」リプレッサー（ＤＮＡ結合タンパク質）が、推定上のリンカーペプチドを突然変異させ、ひき続いて不斎性リプレッサーのデザイン用の認識要素辞書を作成するのに突然変異と選択を使うことができるかも知れないという、生体内選択により生成できるかも知れないと示唆している。レプレッサーは有機体の外面に提示されない。
タンパク質を安定化するジスルフィド結合の構成を促すためのシステインに換え得るタンパク質中の残基を見極める方法は、PantolianoとLadnerのU．S．特許第4、903、773号(PANT90)、PantolianoとLadner(PANT87)、PaboとSuchenek(PABO86)、MAT89、並びにSAUE86に示されている。
【００２６】
Ladnerら、WO90/02809は、バクテリア、ファージ、または胞子のセミ人造外面タンパク質の領域として提示されている既知のタンパク質のセミランダム突然変異誘発（「変化」）、さらに理想の結合特性を持った突然変異体の親和性選択について記述している。特に極小のタンパク質でWO90/02809に言及されているものは、クラムビン（３：４０、４：３２、１６：２６ジスルフィド；４６ＡＡｓ）オボムコイドの第三領域（８：３８、１６：３５と２４：５６ジスルフィド；５６ＡＡＳ）さらにＢＰＴＩ（５：５５、１４：３８、３０：５１ジスルフィド；５８ＡＡｓ）である。WO90/02809もまた、およそ同等の割合でその位置にある２０の善アミノ酸の混合を入手できる「変化」コドンに関する方法を記述している。
Bassら(BASS90)は、ヒト成長ホルモンをＭ１３ファージの遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合した。彼は、ｈＧＨとその他の「大型タンパク質」が突然変異し「結合選択」が利用できるかも知れないと示唆している。
【００２７】
［発明の開示］
ポリペプチドはペプチド結合によって結合された同種または異種のアミノ酸の一本鎖からなる重合体である。線形ペプチドは、各アルファカーボンの主要な一本鎖結合のまわりの内部回転により大多数の異なった配座を取り上げることができる。これらの回転は最小限に干渉するグリシンと最大限に干渉するバリン、イソロイシン、特にプロリンを持った側グループによって異なった程度で妨げられる。２０の残基を持つポリペプチドは種々の内部回転によって決められた１０２０異種配座を持つこともある。
【００２８】
タンパク質はポリペプチドであり、鎖に隣接した位置にかならずしも存在しないアミノ酸の問の安定性相互作用の結果として、明確な配座に折り畳まれている。このおりたたみ（フォルディング）は普通その生物学的活動にとって本質的なものである。４０から６０の残基、もしくはそれ以上に長いポリペプチドにとって、水素結語、塩橋、また疎水性の相互作用のような非共有的勢力は特種褶曲または配座を安定化するために十分である。ポリペプチドの構成要素は高温、もしくは低いか高いｐＨのような変性剤によって乱されないかぎり、少なくともその配座に保持されている。そこでポリペプチドは褶曲を解消し、また「融合する」ペプチドが小型であればあるほど、その配座は環境によって決められる可能性が大きくなる。小型な制約をあまり受けないペプチドが生物学的活性を持つとしたら、ペプチドリガントは、その受容体に近接するまで、その本質において、ランダムコイル状態で存在する。受容体は、非好意的代替配座がファンデルワールスや他の非共有的相互作用によって疎外されるので一個もしくは数個のコンフォメーションをとるペプチドのみを受け入れる。
【００２９】
小型ポリペプチドは、大型ペプチドに比して、治療剤または診断剤として利用される場合、下記を含み（しかも下記に限られることなく）ポテンシャルに有利である。すなわち
ａ）組織への浸透が良い
ｂ）循環系より消去が速い（造影剤にとっては重要である）
ｃ）抗体原性が低い、そして
ｄ）多数の活動が高い
さらに、ポリペプチド、特に４０より少数の残基を持っているポリペプチドは科学的合成により入手できる有利性がある。３０以下のポリペプチドは特に優先される。このようにして、好みのターゲットを結合する小型ポリペプチドを識別するために突然変異と親和性選択の組み合わせを理由し得ることは好ましいことである。
【００３０】
しかしながら、このサイズのポリペプチドの大多数は結合分子としての優位性を持っていない。Oliveraら(OLIV90a)によると、「このサイズのペプチドは普通多数の配座の中で均衡に分類されている（固定した配座をもつためには、タンパク質は普通もっと大型でなければならない）。」ターゲット分子とのペプチドの特殊な結合は、結合位置を補足する配座を取り上げるペプチドを必要とする。一つの残基に三つの等エネルギーの配座（即ち、ベータストランド、アルファヘリックス、そしてリバースターン）を持ったデカペプチドのために、およそ６・１０４の総合的に可能な配座がある。これらの配座が、拘束を受けていないデカペプチドのために同等の確率性があると仮定して、たった一つの可能性を持った配座が結合位置に結合されたならば、ターゲットに対するペプチドの親和性は、もしそれが単一の効果的な配座に拘束される場合、およそ６・１０４高くなると期待できる。このようにして、正確な配座に拘束されているデカペプチドに対して、拘束をうけていないデカペプチドは低い親和性を提示することが期待される。拘束を受けていないデカペプチドの他の配座の一つが意図されたターゲット以外の物質と堅く結合した中の一つであるかも知れないので、それは低い特殊性を提示する可能性がある。それはプロテアーゼのために結合部位を提供する可能性があるので、その結果として、それはプロテアーゼによって分解されやすくなるかも知れない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
この発明は上記の種々の問題を克服し、望ましい結合の特性を持った新規なミニタンパク質を識別することによって、小型ポリペプチドの持つ優位性を保持している。ミニタンパク質は小型ポリペプチドであり、非共有的勢力のみの結果として安定した配座を持つためには小型すぎるが、安定した配座に共有的に架橋を形成して（即ち、ジスルフィド結合によって）、それによって、拘束を受けていない同等サイズのポリペプチドよりも大きいタンパク質分子のより典型的な生物学的活動を持つことになる。この発明が特に懸念しているミニタンパク質は、二つの種類に別けられる。即ち、ａ）アミノ酸４０以下のジスルフィド結合ミクロタンパク質、とｂ）アミノ酸６０以下の金属イオン配置されたミニタンパク質である。
【００３２】
この発明は、所望の結合特性を持った新規なタンパク質を特定する突然変異遺伝子の構造、発現、そして選択、ならびにそれらミニタンパク質自体に関するものであり、またポテンシャルな「ターゲット」物質に対するミニタンパク質を提示するために利用される突然変異体「遺伝子パッケージ」の「ライブラリー」に関するものである。「ターゲット」はタンパク質であることが多いが、タンパク質である必要はない。ターゲットは有機物質や無機物質は勿論、他の生物学的あるいは合成的高分子でもよい。
【００３３】
既述の特許出願、WO90/02809は、安定したタンパク質が好ましい結合特性を持った新規なタンパク質を識別するために突然変異された可能性があると一般的にのべている。この目的のために有用であると特殊に識別されている適切な「親」タンパク質には三つのタンパク質が含まれて入る。即ち、ＢＰＴＩ（５８残留基）（残基、以下同じ）、オボムコイドの第三ドメイン（５６残基）、そしてクラムビン（４６残基）である。これらのタンパク質は、非近隣在アミノ酸間の非共有的相互作用が意義を持つようになる、４０から６０の残基を持っている。これら三つのタンパク質はまた分子の安定性を高める働きをする三つのジスルフィド結合を持っている。
【００３４】
特許出願、WO90/02809のとこにも、４０以下の残基を持ったポリペプチドに関して、また特に一個もしくは二個のジスルフィド結合を持ったポリペプチドが、突然変異の変動のための「足場」として働き十分に安定性と持たせることについての特別な承認は見いだされない。これらの「ミニタンパク質」は、すくなくとも、以前にも指摘したように、利用価値は大である。
【００３５】
特許出願、WO90/02809はまた、異なった架橋形成（Ｃｕ：ＣＹＳ、ＨＩＳ、ＨＩＳ、ＭＥＴ）を持ったタンパク質、アズリンの利用を示唆している。しかしながら、アズリンは１２８のアミノ酸を持っているので、ミニタンパク質とは考えられない。この発明は、金属イオン調整している架橋形成と特徴としているアミノ酸数６０以下のミニタンパク質の利用に関するものである。
【発明の効果】
【００３６】
この発明によって、抗体の抗原結合サイト以外のターゲットに特別に結合し得るタンパク質が提供された。タンパク質は、抗体によって結合され得るので、単なる「結合タンパク質」とは考えられない。（後述の「結合タンパク質」の定義を参照してください）。アミノ酸数が６から８より多いアミノ酸配列が大多数であるが、一つの免疫原担体と結合する場合、免疫反応を引き出し、いかなるランダムポリペプチドも、その基質に対して最小限の親和性と特殊性に関する「結合タンパク質」の厳格な定義を満足させ得る。それは、多数のランダムポリペプチドを次々にテストすることによってのみ、（そして、通常の場合には、配列変動の程度と性質をコントロールして、すなわち、安定した構造を持つドメインとのポテンシャルな結合のための残基にそれを制限し、選択された残基が、安定性よりむしろ結合に影響を及ぼすようにすることによってのみ）この問題は解決される。上記事項に続く「請求の範囲」記載の事項は、この明細書中に組み込んで望ましい実施例とする。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】サソリ毒性（Brookhavenタンパク質データ銀行登録ISN3）残基２０から４２までの主鎖を示す図である。ＣＹＳ２５とＣＹＳ４１はジスルフィド形成を示している。天然タンパク質においては、これらのグループは他のシステインにジスルフィドを形成するが、主鎖モーションはガンマ硫黄を受け入れられる幾何学にもたらすよう義務づけられている。ＧＬＹ以外の残基は一次コードでベータカーボンに標識されている。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
［実施例］
１．序文
この発明の基本原理は強制される進化の一つである。自然界において、進化は、遺伝子的変動、有益な形質、それに選出された個々の生殖の組み合わせの結果として起こるものであり、その性質のために集団は豊かになるのである。この発明は、ミニタンパク質の突然変異体である異種ではあるが関連性のあるポテンシャルな結合ドメインをコードするＤＮＡ分子の一つの混合を作り出しているコントロールされたＤＮＡのランダム突然変異誘発（「変化」）(Variegation)をとうして遺伝子的変動を成し遂げられている。この発明は望ましい結合特質を持つ新規なタンパク質を明白にする突然変異した遺伝子を分離するものであり、次の方法をとる。すなわち、１）突然変異した遺伝子各々の生成物が、遺伝子を含む複製遺伝子パッケージ（ＧＰ）（細胞、胞子、またはウイルス）の外面に提示されるように、操作を行い、２）親和性選択を利用して、すなわち、ターゲット物質に結合させるための選択を利用して、そのターゲット物質に改善された結合性を持ったタンパク質を特定化する遺伝子を含むパッケージに対して、パッケージの集団を増大させるのである。最後に、増大は、提示されたタンパク質によって、生殖の目的でターゲットと結合した遺伝子を含むパッケージのみを許容することにより成し遂げられる。進化は、選択がターゲット物質のために提供されているということで「強制」であり、またその特種コドンが自然に起きる回数よりも高い回数で突然変異するということで「強制」である。
【００３９】
提示戦略は、第一に、親和性分子（抗体であるかも知れない）が入手可能である。安定した、構成を持ったドメイン（「初期ポテンシャル結合ドメイン」、ＩＰＢＤ）を提示するための遺伝子パッケージを変えることにより完成される。変更が成功するか否かは、変えられた遺伝子パッケージが親和性分子と結合するか否かを決定することによって簡単に計測される。
【００４０】
ＩＰＢＤは、広範な突然変異誘発を許容するということで選ばれた。ＩＰＢＤはパッケージの表面に提示され、親和性選択に従属され、遺伝子をコードしているＩＰＢＤは多数の突然変異誘発の特殊なパターンに従属されていることが知られている。ここで使われている「変化」(variegation)は、各々の単一のポテンシャルな結合ドメイン（ＩＰＢＤの突然変異体）を提示する遺伝子パッケージの集団の生産に通じる。しかしながら、その「変化」は異種ではあるが、構造的に関連を持つポテンシャルな結合ドメイン（ＰＢＤｓ）の一群を全体的に提示する。各遺伝子パッケージは、その特殊なパッケージの表面に提示されたＰＢＤをコードするｐｂｄ遺伝子のバージョンを運んでいる。親和性の選択は、所望の結合特性を持ったＰＢＤｓを保持する遺伝子パッケージを識別するために利用され、またこれらの遺伝子パッケージは増幅され得る。親和性選択と増幅による一度もしくは数度の同位体濃縮のサイクルの後、成功結合ドメイン（ＳＢＤｓ）をコードしているＤＮＡは選択されたバッケージから回収される。
【００４１】
必要に応じて、ＳＢＤ支持パッケージからのＤＮＡは、「親のポテンシャル結合ドメイン」（ＰＰＢＤ）としての変化の最終ラウンドのＳＢＤを利用して、ＰＢＤｓの次の世代へと「変化」していく。そして満足な結果が得られるまでその操作は続けられる。ＩＰＢＤとＰＢＤｓの第一世代間の構造的ならびに進化的関係の故に、ＩＰＢＤもまた「親のポテンシャル結合ドメイン」（ＰＰＢＤ）と考えられている。
【００４２】
ミクロタンバタ質が変化される場合、親の分子に共有的に架橋している残基は変化されず、それによって配座を安定化する。たとえば、ミクロタンバタ質と結合したジスルフィドの変化の形において、ある種のシステインは不変であるので、発現そして提示の状況の下では、共有架橋形式（即ち、システインの一つもしくは数個のペアーの問にジスルフィド結合）を作り、そして過敏に変動する線型中間アミノ駿によって取り入れられる配座を十分に拘束している。言い換えるならば、拘束された足場は、広範にランダム化されたポリペプチドに組み込まれる。
【００４３】
所望結合特性を持ったミクロタンパク質が一旦特性付けられると、それは組換型ＤＮＡ技術によるのみでなく、非生物学的合成の方法でも再生し得る。
【００４４】
上記請求範囲のとして記載の目的のために、タンパク質Ｐは、「結合タンパク質」であ、抗体可変ドメイン以外の、少なくとも一つの分子とイオンあるいは原子種Ａにつき、解離定数ＫＤ（Ｐ，Ａ）＜１０−６moles/1iter（望ましくは、＜１０−７moles/1iter）。
【００４５】
上記（１）の「抗体の可変ドメイン」の排除は、明確にするために意図されており、一つのタンパク質は、それは抗原であるということのみで、「結合タンパク質」とは考えられない。
【００４６】
最大型のタンパク質は、ドメイン(ROSS81)と呼ばれる識別し得る胞子の中に組み込まれている。タンパク質ドメインは、種々の方法で定義されている。安定性に重要性を置いている「ドメイン」の定義は、「高温もしくはカオトロピック(chaotropic)エージェントのような乱し勢力の表に全体の構造を保持している」が好意的であるが、原子コーディネートとタンパク質配列の同相は完全に無視されない。
【００４７】
タンパク質のドメインが、選ばれたターゲットと特殊に結合するためのタンパク質の能力に対して第一に責任をとる場合、それは、ここでは、「結合ドメイン」（ＢＤ）と呼ぶこととする。
【００４８】
「換えられたＤＮＡ」(variegated DNA)(vgDNA)とは、同等もしくは類似した長さのＤ
ＮＡ分子の混合のことであり、アライメントが行われた場合には、異なった複数のアミノ酸を各コドンにコードする数個のコドンで様々であるが、それは他のコドンの位置に単一のアミノ酸のみをコードする。換えられたＤＮＡにおいては、コドンは可変であり、与えられた可変のコドンがコードする異なったアミノ酸発生の領域と頻度が、ＤＮＡのシンセサイザによって前もって決定されているということが知られている。たとえ、その混合の中にある個々のＤＮＡ分子配列、一つのプリオリ(priori)を知るために、その合成方法を他が知ることを許容しなくてもである。換えられたＤＮＡの指定された可変のコドンの数は、望ましくは２０以下であり、最も望ましい数は５から１０である。各可変のコドンにコードされたアミノ酸の混合はコドンによって異なる。
【００４９】
換えられたＤＮＡが導入された遺伝子パッケージの集団「換えられた」と言える。
【００５０】
この発明の目的として、「ポテンシャル結合タンパク質」（ＰＢＰ）とは、換えられたＤＮＡの集団にあるＤＮＡ分子の一つの種によってコードされたタンパク質を指している。その中にある変動の領域は、ターゲット物質のための結合ドメインとして働く可能性を持ったポリペプチドの一個もしくはそれ以上のセグメントを一つもしくはそれ以上後続してコードする場合に現れる。
【００５１】
「キメラタンパク賃」（chimeric  protein）とは、第一のアミノ酸配列が、第一のタンパク質のドメインとは異なったドメインを持ち、第一のタンパク質とは十分に同族体ではないドメインを定義している第二のアミノ酸配列と熔融することである。キメラタンパク質は、第一タンパク質を提示している一つの有機体の中に見いだされる（異種のタンバク質にも見いだされるが）異種のドメインを現しているのかも知れない。もしくはそれは異種の有機物によって提示されたタンパク質構造の「種問」（in-terspecies）、「属間」（intergeneric）その他の融解であるかも知れない。
【００５２】
この発明に関わるキメラタンパク質の一つのアミノ酸配列は、ここに定義される「遺伝子パッケージ」（遺伝子パッケージ）の外面タンパク質から典型的に誘導される。その表面にＰＢＤを提示している一つは遺伝子パッケージ（ＰＢＤ）である。単一で提示された場合、第二のアミノ酸配列はタンパク質（もしくはドメイン）の特徴を持っているが、識別し得るドメインとしてキメラタンパク質に組み込まれているものの一つである。それは、第一のアミノ酸配列（介入しているスペーサーを持った、もしくは持たないで）のアミノもしくはカルボキシーターミナルに出現するか、もしくは第一のアミノ酸表列を中断する。第一のアミノ酸配列は遺伝子パッケージの表面タンパク質に確実に相当するか、もしくは調節される。すなわち結合ドメインの提示を容易にするためである。
【００５３】
ＩＩ．ミクロンその他のミニタンパク質
この発明においては、ジスルフィド結合ミクロタンパク質と金属含有ミニタンパク質は顕微戦術を検証する初期ポテンシャル結合ドメイン（ＩＰＢＤｓ）として、また所望のターゲット結合特徴を持ったＢＤを入手しようと実際に望んでいるＰＰＢＤｓとして利用される。特別に明示されない限り、もしくは文脈によって必要とされない限り、ＩＰＢＤｓに対する引用はmutatis  mutandisに適用されるものであり、ＰＰＢＤｓも同様である。
【００５４】
上記事項に続く「請求の範囲」の目的のために、ミクロタンパク質は、およそ６基から４０基の残基を持っている。ミクロタンパク質はミニタンパク質のサブセットであり、それらは、およそ６０基以下の残基を持っている。ミクロタンパク質はミニタンバタ質のサブセットを構成するので、便宜上ミニタンパク質という語彙がジスルフィド結合ミクロタンパク質ならびに金属調整ミニタンパク質の両方に対し、必要に応じて引用される。
【００５５】
ＩＰＢＤは既知の結合活動を持ったミニタンパク質であり、もしくは既知の結合活動を持ってはいないが、結合活動（裂けめ、溝、その他）に寄与する第二位もしくはそれより高い構成を持っているものの一つである。ＩＰＢＤが既知の結合活動を持っている場合には、ターゲット物質に対する特殊の親和性を持つ必要はない。ＩＰＢＤは、天然に発生するミニタンパク質とその配列が同一のものである必要はない。それは、既知のミニタンパク質の配列と「十分に相当する」アミノ酸配列と「同族体」であるかも知れないし、もしくはそれは完全に人工的なものかも知れない。
【００５６】
配列が「十分に相当する」していると考えられるか否かを決定するためには、次の事項を考える必要がある。すなわち、配列が、基準演算規則に従って最善にフィットするよう調節されている場合の配列の類似程度、架橋（すなわち、ジスルフィド結合）の連結性パターンにおける類似点、Ｘ線回折分析もしくはＮＭＲによって表示される場合、類似の三次元構成を持っているタンパク質の度合い、そして配列されているタンパク質が類似の生物学的活動を持っていることに対する度合い。この文脈の関連で、セリンプロテアーゼ阻害剤の中で、配列の３０パーセントが相同である一組のメンバーがあり同族体であると認証されているタンパク質のグループがある。
【００５７】
ＩＰＢＤの候補は次の基準を満足させる必要がある。すなわち、
１）ドメインは、意図された使用の状態下で安定に保たれて存在する（ドメインは、挿入されるタンパク質の全部を包含する。すなわち、アルファコノトクシンＧＩ(OLIV90a)、もしくはＣＭ  Ｉ−ＩＩＩ(MCWH89)、
２）アミノ酸配列の知識は手に入れることができる、そして
３）ＩＰＢＤに対する特殊なそして高い親和性を持っている分子は手に入れることができる。これは、ＡｆＭ（ＩＰＢＤ）と省略される。
【００５８】
ＩＰＢＤ（ＡｆＭ（ＩＰＢＤ））に対する親和性を持っている分子の単一の種属が手に入るとしたら、それは下記の事項に利用されるだろう。すなわち、ａ）遺伝子パッケージ表面のＩＰＢＤの検出、
ｂ）マトリックス上の親和性分子の提示レベルと密度の最適化、そして、c）親和性分離操作の効率と敏感性の決定。ＡｆＭ（ＩＰＢＤ）の二つの種族が手に入るとするならば、一つは高いそしてもう一つは中間のＩＰＢＤに対する親和性を選ぶのである。高い親和性を持った種属は初期検出と、効率と敏感性を決定するために利用されるだろう。そして中間の親和性を持った種属は最適化を知るために利用されるだろう。
【００５９】
ＩＰＢＤそれ自体が既知の結合タンパク質ではない場合には、もしくは、その天然のターゲットが浄化されない場合には、ＩＰＢＤに対して作られた抗体が親和性分子として利用されるかも知れない。この目的のための抗体の利用は、抗体が最後のターゲットであると考えるべきではない。
【００６０】
数多くのＩＰＢＤ候補があるが、その候補のために上記の情報が全部入手できるし、入手するのは適当に実際的である。たとえば、ＣＭＴＩ−ＩＩＩ（２９残基）（ＣＭＴＩ−夕イプの阻害剤は、OTLE87、FAVE89、WIEC85、WIEC85、MCWH89、BODE89、HOLA89aとｂに述べられている）、熱に対して安定しているエンテロトキシン（E．coliのＳＴ−１ａ）（１８残基）（GUAR89、BHAT86、SEXI85、SHIM87、TAKA85、TAKE90、THOM85aとｂ、TOSH85、DALL90、DWAR89、GARI87、GUZM89、GUZM90、HOUG84、KUBO89、KUPE90、OKAM87、OKAM88、そしてOKAM90）、アルファコノトキシンＧＩ（１３残基）(HASH85、ALMQ89)、ミューコノトキシンＧＩＩＩ（２２残基）(HIDO90)、そして、コナスキングコングミクロタンパク質（２７残基）(WOOD90)を含んでいる。構成に関する情報はＸ線もしくはニュートロン回折研究、ＮＭＲ、科学薬剤架橋もしくはラベル、関連を持ったタンパク質の既知の構造からのモデル、もしくは論理的計算である。３Ｄ構成情報はＸ繰回折、ニュートロン回折もしくはＮＭＲが推薦できる。その理由はこれらの方法は既定された限界内に原子の殆ど全部を位置づけることができる。表１３（元の表番号５０）が所望される幾つかのＩＰＢＤｓを挙げている。
【００６１】
突然変異はＰＢＤの安性を減少するかも知れない。したがって、選ばれたＩＰＢＤはできるならば、高い溶解温度、すなわち少なくとも摂氏５０度であることが望ましい、そして広いｐＨ領域で安定していることが望ましい。すなわち８．０から３．０の間が望ましく、１１．０から２．０の間が最も望ましい。それによってＳＢＤｓが突然変異により選ばれたＩＰＢＤから引き出され、結合を通しての選択が十分な安定性を保持する。望ましくは、種々のＰＢＤｓを作り出しているＩＰＢＤの代替物が、ドメインの融点を摂氏ではほぼ４０度以下に下げないことである。ミニタンパク質は、一つもしくはそれ以上のジスルフィドのような共有的な架橋を持っていることが役に立つことであり、それらが十分に安定性を確保するだろう。
【００６２】
試験管内で、ジスルフィドの橋は空気の酸化の結果としてポリペプチド中に自然に形成され得る。生体内でのことは勿論それ以上に複雑である。ごく少数の細胞内のタンパク質はジスルフィドの橋を持っているが、多分それは強い還元の環境がグルタチオンシステムによって保持されているためであろう。ジスルフィドの橋は、動きまわるタンパク質に普通存在しているし、もしくはヘビの毒素やその他の毒素（たとえば、コノトキシン、カリブドトキシン(charybdotoxin)バクテリア性エンテロトキシン）、ペプチドホルモン、消化酵素、補足タンパク質、免疫グロプリン、リゾチーム、プロテアーゼ阻害剤（ＢＰＴＩとそのホモローグ、ＣＭＴＩ−ＩＩＩ（キューキュビットマキシマ（Cucurbit maxima）トリプシン阻害剤ＩＩＩ）そしてそのホモローグ、ヒルジン、その他）そしてミルクのタンパク質のような細胞内の場で動いているタンバタ質に存在している。
【００６３】
強硬な細胞内鎖のループを閉ざすジスルフィド結合は、ペプチシン、チオレドキシン、インシュリンＡ鎖、絹のフィブロイン、そしてリボアミドデヒドロゲナーゼの中で発見されている。橋架けをしているシステイン残基は、ポリペプチド鎖にそった一つから四つの残基によって隔離されている。モデルビルデイング、Ｘ繰回折分析、そしてＮＭＲ研究は、そのようなループのアルファカーボンパスは、通常平らであり頑強であることを示している。
【００６４】
免疫グロプリンの中に２種類のジスルィドの橋がある。一つは保存された細胞内橋で、アミノ酸残基を６０から７０持っており、殆どすべての免疫グロプリンのドメインに繰り返して発見される。互いに競いあっているベータシート間に深く埋められているこれらの橋は、溶剤から守られており、そして変性剤の存在下でのみ普通還元され得る。その他のジスルフィドの橋は主に細胞内の結合であり、分子の表面に存在している。これらの橋は溶斉に接近可能であり、また比較的簡単に還元される。(STEI85)。この発明によるミクロタンパク質のジスルフィドの橋は、より小型の鎖間隔を持っているシステイン問の内鎖のつながりである。
【００６５】
ミクロタンパク質が複数のジスルフィド結合を持っている場合には、少なくとも二つのシステインの群れであることが望ましい。すなわち、それらは鎖に直接隣接しているか、もしくは単一のアミノ酸（−Ｃ一Ｘ−Ｃ−）で隔離されていることが望ましい。いずれの場合でも、二つのシステインの群れは、立体障害という理由のために相互に一対となることは不可能である。そしていくつかの実現可能な位相は還元される。
【００６６】
１６の残基を持つポリペプチドの３個から８個のアミノ酸を連結している一つの内鎖ジスルフィド橋は、４のスパンを持っていると言えよう。４から１２のアミノ酸がジスルフィド結合している場合には、それらは７の第二のスパンを形成する。両方で、四つのシステインがポリペプチドを四つのシステイン内セグメント（１−２、５−７、９−１１、そして１３−１６）に分割する。（Ｃｙｓ３とＣｙｓ４問にはセグメントが存在しないと言うことを観察してください。）クロスリンクしたミクロタンパク質の連結のパターンはクロスリンクの終端の相対的位置の単純なものである。たとえば、二つのジスルフィド結合を持ったミクロタンパク質にとって、連結のパターン「１−３、２−４」は次のことを意味している。すなわち、第一のクロスリンクのシステインは第三のクロスリンクのシステイン（最初の配列における）と結合したジスルフィドであり、第二のクロスリンクのシステインは第四のそれと結合している。
【００６７】
クロスリンクがミニタンパク質の配座の自由を拘束する度合、そしてそれがミニタンパク質を安定化する度合は、種々の方法で概算することができるであろう。それらは下記の方法を含んでいる。すなわち、吸収分光学（アミノ酸が埋められているか晒されているかを検出する）、円形二色性学（タンパク質のらせん含有の一般図を提供する）、核磁気共鳴映像（特殊な化学的環境における数個の核を示す、それと同時に核の移動性を示す）、タンパク質結晶のＸ線もしくはニュートロン回折分析等である。ミニタンパク質の安定性は、温度、ｐＨ、その他の機能として種々の波長で吸収の変化をモニターすることによって確実なものとすることができるであろう。埋められた残基はタンパク質が組み込みから解放される時に晒されることになる。同様に、変性状態の結果としてのミニタンパク質の解除は、ＮＭＲライン位置と幅に変化をもたらす。円形二色性（ＣＤ）スペクトルは配座に対して極度に敏感である。
【００６８】
この発明による換えられたジスルフィド結合のミクロタンパク質は、いくつかのクラスに分けられる。すなわち、
クラスＩミクロンタンパク質は、ジスルフィド結合を形成するために相互作用し得る一組のシステインを特徴としているものであり、その結合はおよそ９以下の残基のスパンを持っている。このジスルフィドの橋は、望ましくは、少なくとも二つの残基のスパンを持っていることであり、これはジスルフィドの幾何学的機能である。間隔が二つもしくは三つの残基である場合には、一つの残基は、望ましくは、橋を架けている残基の緊張を少なくするためにグリシンが適当である。間隔の上限はそれほど精密でなくともよいが、通常、間隔が大きければ大きいほど、ジスルフィド結合によって線状の中間アミノ酸残基に課せられる配座の拘束物が少なくなる。
【００６９】
このようなペプチドの主な鎖が許される自由は極端に少ないが、緊張はない。ジスルフィドが形成される時に放出されるフリーエネルギーは、システインをともにもたらす配座に閉じ込められた時、主な鎖によって失われたフリーエネルギーを越えるものである。ジスルフィド生成時のフリーエネルギーの喪失によって、サイドグループの近位末端は相互に固定された関係を保持している。ターゲットに結合された場合には、ドメインは、正しい配座に入るためにフリーエネルギーを消費する必要はない。ドメインは、他の配座にジャンプして、ターゲットではないものと結合することはできない。
【００７０】
４から５のスパンを持ったジスルフィド橋が特に望ましい。スパンが６になると拘束の影響が減少する。この場合、少なくとも封鎖された残基の一つが主鎖の幾何学的形状に制限を課すアミノ酸であることが望ましい。プロリンは最大の制限を課し得る。バリンとイソロイシンは主鎖により少ない制限を課し得る。この拘束を課している非システイン残基の好ましい位置は不変システインの一つに隣接することである。しかしながら、それはたの橋を架けている残基の一つであるかも知れない。スパンが７の場合には、主鎖配座を制限している二つのアミノ酸を加えることが望ましい。これらのアミノ酸は７つの位置のどれでも良い。しかし望ましくは、システインは直接隣接している二つの橋を架けている残基である。スパンが８もしくは９の場合には、拘束しているアミノ酸を増やしても良い。
【００７１】
クラスＩミクロタンパクが４０までのアミノ酸を保持し得るとしも、アミノ酸の数は２０以下の方が望ましい。
ジスルフィド結合のクラスＩミクロタンパク質は溶剤に晒される。そのために、遺伝子パッケージの換えられた集団を晒すことを避けなければならない。その遺伝子パッケージの換えられた集団は、ジスルフィドを破壊する試薬液にクラスＩミクロタンパク質を提示する。
【００７２】
クラスＩＩミクロタンパク質は、９以上のアミノ酸のスパンを持った単一のジスルフィド結合を特徴としているものである。橋を架けているアミノ酸は、配座を安定化するために役立つ二次的構造を形成する。望ましくはこれらの中間アミノ酸が、下記に示された概要のようなヘヤピン超二次的構造を形成することである。
【化１】
2010183908.tif 000003
【００７３】
既知のタンパク式に関する研究をもとに、アルファヘリックス、ベータストランド、もしくはリバースターンに見出される特殊残基、もしくは特殊ジプペチドまたはトリペプチドの性向を計算することができる。これらの二次的構造の中のアミノ酸残基の通常の発生回数がCREI84の表６−４に記載されている。アミノ酸配列からの二次的構造の予想についての詳細な取扱に関しては、SCHU79の第６章を参照のこと。
【００７４】
適切なヘヤピン構造をデザインするためには、三次元配座が知られているタンパク質から実際の構造をコピーすることができるし、発生回数データを利用してデザインすることもできるし、上記二つの方法を統合してデザインすることもできる。望ましくは、一つもしくはそれ以上の実際の構造をモデルとして用い、そして発生回数データはその構造の邪魔をすることなく製造できる構造を決定するのに使うのである。
【００７５】
望ましくは、三つ以下のアミノ酸がシステインとアルファヘリックスもしくはベータストランドの始めもしくは終わりの間に介在することである。
もっと複雑な構造（ダブルヘヤピンのようなもの）も可能である。
【００７６】
クラスＩＩＩａミクロタンパク質は、二つのジスルフィドの結合を特徴としている。これらもまた、選択的に、上記クラスＩＩミクロタンパク質に関連して記述した二次的構造を特徴としている。二つのジスルフィド結合では三つの位相が可能である。お望みならば複数のジスルフィド結合可能の位相が、熱に対して安定性を示すエンテロトキシンＳＴ−ＩＡに存在する一群のシステインによって結合されるかも知れない。
【００７７】
クラスＩＩＩｂミクロタンパク質は、三つもしくはそれ以上のジスルフィド結合を特徴としている。そして望ましくは、前述したように、少なくとも一群のシステインを持つことである。
【００７８】
金属フィンガーミニタンパク質。この発明はまた、ジスルフィド結合によるクロスリンク以外のミニタンパク質に関わるものである。すなわち、フィンガータンパク質のアナログである。フィンガータンパク質は、フィンガー構造によって特徴づけられている。その構造の中で、金属イオンが四面体設置を形成している二つのＣｙｓと二つのＨｉｓ残基によって調整されている。金属イオンは、亜鉛（ＩＩ）であることが主であるが、時として、鉄、銅、コバルト、その他であることもある。「フィンガー」は、多数の配列（ＰｈｅもしくはＴｙｒ）−（１  ＡＡ）−Ｃｙｓ−（２−４  ＡＡｓ）−Ｃｙｓ−（３ＡＡｓ）−Ｐｈｅ−（５  ＡＡｓ）−Ｌｅｕ−（２  ＡＡｓ）−Ｈｉｓ（３  ＡＡＳ）−Ｈｉｓ−（５  ＡＡＳ）である。（BERG88，GIBS88）。フィンガータンパク質は、典型的にフィンガーモチーフの多数の繰り返しを持っており、一つのフィンガーは亜鉛イオンの存在中に織り込まれていることが知られている。（FRAN87，PARR88）。二つのフィンガーがＤＮＡ結合に必要か否かはまだ議論の余地がある。この発明は、一つもしくは二つのフィンガーを持ったミニタンパク質に関わるものである。サイドグループの他の組み合わせは多価金属イオンに関連を持つクロスリンクの形成に導くものである。たとえば、Ｓｕｍｍｅｒｓ（SUMM91）は、一つの１８−アミノ酸ミニタンパク質がＨＩＶ−１−Ｆ１のカプシド（ｃａｐｓｉｄ）タンパク質で発見されたと報告している。それは亜鉛原子と結合している三つのシステインと一つのヒスチジンを持っていた。ターゲットは必ずしも核酸でなければならないことはないと言うことを理解すべきである。
【００７９】
Ｇ．修飾されたＰＢＳｓ
下記のタンパク質のある種のサイドグループを選択的に修飾し得るいくつかの酵素と化学的試薬液がある。それらは、ａ）タンパク質−チロジンキナーゼ、ＥＩＩｍａｎｓ試液、メチルトランスフェラーゼ（メチラートＧＬＵのサイドグループ）、セリンキナーゼ、プロリン  ヒドロキシアーゼ、ＧＬＵをＧＬＡに変換するビタミンＫ依存酵素、無水マレイン酸、そしてアルキル化剤を含んでいる。これらの酵素もしくは試薬液の一つをもった遺伝子パッケージ（ＰＢＤ）の換えられた集団の取扱は、選ばれた酵素もしくは試薬液によって影響されたサイドグループを修飾する。遺伝子パッケージを破壊しない酵素もしくは試薬液は、非常に望ましいものである。サイドグループのそのような調整は提示されたＰＢＤｓの結合特性に直接影響を及ぼす。親和性分離の方法を利用して、予め定められたターゲットと結合する  修飾された遺伝子パッケージを我々は強化しようとしている。活性結合ドメインは、全部遺伝的に規定されているのではないから、各強化の場で形態発生後の修飾を繰り返す必要がある。この方法は、これらのＳＢＤｓの化学的合成を心に描いているので、ミニタンパク質ＩＰＢＤｓにとっては特に適切である。
【００８０】
ＩＩＩ．変化戦術−−望ましい多様性を持ったポテンシャル結合ドメインを入手するための突然変異誘発
ＩＩＩ．Ａ．一般的事項
数個のドメインの突然変異によって入手し得る異なったアミノ酸配列が大きく、発見し得る量で提示し得るいくつかの異なったドメインと比較された時、強制的進化の有効性は残基が多様性を持つように注意深く選択することによって大きく高められる。先ず、結合活動（すなわち、表面にある残基）に影響を及ぼす可能性のある既知のタンパク質の残基そしてその安定性を不必要に低下させない既知のタンパク質の残基は識別された。これらの残基をコードしているコドンの全部もしくは一部は、ＤＮＡの換えられた集団を作り出すために次々に換えられていく。次々に一つのターゲット分子に触れる表面に十分に近く存在する残基のグループは、同時変化のために、用意されたセットである。ＤＮＡの換えられた集団は種々なポテンシャル結合ドメインを提示するために利用される。そして興味のあるターゲットとの結合をなしとげる能力が評価される。
【００８１】
この発明による方法は、上記のようにして、さらに、生産され高度に変えられた集団の性格において、そして新規の結合タンパク質が選ばれると言うことからも、他の方法に比して傑出している。我々は、提示されたポテンシャル結合ドメインが、効果的で組織だてられた方法で関連性を持った隣接しているアミノ酸配列の「配列スペース」を抜き取るよう強制する。四つのゴールが、ここで利用される様々な変化を導く。望ましくは、１）大多数（すなわち、１０７）の変形が利用可能となる、２）高い歩合の可能性変化が検出し得る量で現れる、３）望ましい変化の現れの頻度が相対的に一定している、そして４）変動が限られた数のアミノ酸残基にのみ発生する。最も望ましくは、変動がポテンシャル結合ドメインの表面の共通領域方向に導かれたサイドグループを持つ残基に発生することである。
【００８２】
この方法は、遺伝子を修飾する放射線やヒドロキシルアミンのような無差別的突然変異誘発剤の単純な使用とは区別されるべきである。無差別突然変化誘発剤の使用では、突然変異の部位はコントロールされることもなく、非常に片寄っている。多くの突然変異は、結合ドメインの部分ではない残基に影響を及ぼしている。化学的突然変異誘発物質がゲノム全体に導かれた場合ほとんどの突然変異は、ポテンシャル結合ドメインをコードしているそのものより他の遺伝子に発生する。さらに、合理的レベルの突然変異誘発においては、調整されたコドンが単一ベース変化よって特徴づけられる可能性があるので、限られたそして片寄った可能性の領域のみが探求される。同様に、遠隔（ｒｅｍｏｔｅ）はランダムされない配列の突然変異誘発物質であるオリゴヌクレオチドを利用する特殊部位突然変異誘発技術の利用である。これらの専門技術は多数の変形の生産と検査に関わってはいない。注意を集めているランダム突然変異誘発の専門技術は知られているが、変動分布をコントロールすることの重要性は見逃されている。
【００８３】
ポテンシャル結合ドメインは最初アミノ酸レベルでデザインされる。一度、どの残基が突然変異誘発されるかを識別すれば、そしてどの突然変異がその部位で行われるかを識別すれば、種々のＰＢＤｓをコードしている換えられたＤＮＡをデザインすることができる。コードされたＰＢＤｓによって、ＰＢＤがターゲットに対する親和性を持っていればそれは検出されるという合理的な確立を保証する。勿論、数多くの入手した独立した形質転換物そして親和性分離専門技術は、変化の単一ラウンド内で可能な変化の度合に制限を課すだろう。
【００８４】
タンパク質中に多様性を作り出すために様々な方法がある。（RICH86、CARU85、そしてOLIP86参照のこと。）一つの極端は、出来るかぎりのタンパク質の中のほんの少数の残基を換えていることである。（なかんずく、CARU85、CARU87、RICH86、そしてWHAR86参照のこと。）この方法を「集束突然変異誘発」（Ｆｏｃｕｓｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ぶことにする。典型的な「集束突然変異誘発」戦略は、一セット５から７までの残基を取り出し、１３から２０までの可能性で各々を変える。突然変異誘発の他のプラン（「拡散突然変異誘発」）は、より制限された選択のセットを通してより多数の残基を替えることである。（VERS86aとPAKU86を参照のこと。）採用した変化（variegation）のパターンはこれらの極端な例の中間に存在する。すなわち、２０のアミノ酸を通して二つの残基が替えられ、たった二つの可能性を通してあと二つが替えられ、そして５番目は２０のアミノ酸の１０が換えられた。
【００８５】
同時に換えられるコドンの数は制限されない。しかしながら、可能なＰＢＤ配列が、すくなくとも一つの遺伝子パッケージによって真実に提示されると言う合理的な確立を生み出す突然変異誘発戦略を採用することが望ましい。望ましくは、ｖｇＤＮＡによってコードされたミューテイン（mutein）そして各換えられた部位における最も好まれないアミノ酸から成っているミューテインがライブラリー中で少なくとも独立した形質変換物によって提示される確立は、少なくとも０．５０であり、望ましくは０．９０である。（より好まれるアミノ酸から成るミューテインは、勿論、その同じライブラリー中に発生する可能性がある。）
【００８６】
望ましくは、変化は、１０倍以下の異なったＤＮＡ配列（さらに望ましくは、３倍以下の）による異なった１０６−１０７のアミノ酸配列を提示する典型的な形質転換物集団をもたらすことである。
【００８７】
アルファヘリクス（helices）とベータストランド（strands）を持っていないクラスＩミクロタンパク質に関しては、いかなる突然変異の場においても、望ましくは、各々が４から８の非システインコドンを替え、それによって、それらの各々がポシブルな２０のアミノ酸の中少なくとも８をコードすることである。各コドンの変化はその部位に特別に変えられ得る。望ましくは、システインがポテンシャル代替物の一つではない、たとえシステインがその中に含まれていたとしても。
【００８８】
ミニタンパク質が金属フィンガータンパク質である場合には、典型的な変化戦術においては、二つのＣｙｓと二つのＨｉｓ残基、そしてオプションとしての前述のＰｈｅ／Ｔｙｒ、ＰｈｅとＬｅｕ残基は不変であり、そして複数（普通５から１０）の他の残基は換えられる。
【００８９】
ミクロタンパク質が、一つもしくはそれ以上のアルファヘリクスとベータストランドを特徴としているタイプである場合には、いかなる与えられた部位における第二次的構造を破壊しないものを取り入れることが望ましい。各可変のアミノ酸における可能性の数は限られているので、可変アミノ酸の全数は選択過程における抜粋有効性を替えることなく大きくなるであろう。
【００９０】
クラスＩＩＩミクロタンパク質にとって、望ましくは、２０以下、さらに望ましくは５から１０のコドンが変化することである。しかしながら、拡散誘発物質が利用される場合には、変化させられたコドンの数は多くなり得る。
【００９１】
変化が通常指定された可変コドンにおいて一つのアミノ酸が他との代替に関係するような場合には、アミノ酸の挿入もしくは消滅に関連する可能性もある。
【００９２】
ＩＩＩ．Ｂ．換えられる残基の識別
さて、換えられるＩＰＢＤの残基の選択を助ける原理について考えよう。礎になる理論は、構成されたタンパク質のみが特殊結合を提示すると言うことである。すなわち、上記のタンパク質が、他の大多数を除外して特殊な化学的物質と結合することができる。このようにして、換えられる残基は、基礎的なＩＰＢＤ構造の保存と言う目的をもって選択される。褶曲構造からＰＢＤをしめだす代替物質は、遺伝子パッケージが無差別に結合する遺伝子を担動する原因となるので、それらは簡単に集団から取り去ることができる。溶液に晒されたアミノ酸代替物質は、内部座にある代替物質である三次元構造に影響を及ぼすことはあまりない。（PAKU86、REID88a、EISE85、SCHU79、169-171ページ、そしてCREJ84、２３９−２４５、３１４−３１５ページを参照のこと）。内部残基は往々にして保存され、そしてアミノ酸タイプは、タンパク質構造が破壊されるかも知れないリスクなしに意義ある異なったタイプに換えることは不可能である。しかしながら、ＩからＬにもしくはＦからＹへのような内的残基の保守的変化は見逃される。そのような保守的変化は、隣接タンパク質残基の配置ならびに原動力に微妙に影響し、そしてそのような「繊細な調節」はＳＢＤが一度見いだされると有用となる。挿入および削除はどこよりもループ内でより容易に許容される。（THOR88）。
【００９３】
ＩＰＢＤに関するデータならびに変化サイクルにおいて変化する残基を決定するのに役に立つターゲットに関するデータは次を含む。すなわち、１）構造、もしくは少なくともＩＰＢＤ表面にある残基のリスト、２）ＩＰＢＤにホモローグの配列のリスト、そして３）ターゲット分子のモデルもしくはターゲットのスタンドイン、である。
【００９４】
ＩＩＩ．Ｃ．各親残基のための代替物セットの決定
換えるための残基を選択してから、各可変残基に許容するアミノ酸の領域が決定される。全レベルの変化は、各変化した残基における変形体の数である。各変形した残基は、２から２０の異なった可能性物質を産出し、変化の異なったスキームを持っている。特定の変化されたコドンによってポテンシャルにコードされたアミノ酸セットは、「代替セット」と呼ばれる。
【００９５】
Milligen7500のようなＤＮＡ合成剤をコントロールしているコンピュータは、オリゴｎｔ塩基（すなわち、ｎｔホスホラミジット−−phorphoram−idites）を利用して、二つもしくはそれ以上のリザーバ（reservoir）からｎｔｓ配合の役割を持ったオリゴｎｔ塩基を合成することができる。あるいはｎｔ基剤は他の比率で混合され、「汚れたビン」と野ばれる合成のためのリザーバの一つに入れられる。コドンの各ヌクレオチド部位にある基剤の「混合物」は、そのコドンによってコードされた異なったアミノ酸の相対的発生頻度を決定する。
【００９６】
簡単に変化されたコドンは、ヌクレオチド部位が退化でありものであり、等モル比で混合された二つもしくはそれ以上の基の混合から入手されるものである。これらの混合は基準化された「あいまいなヌクレオチド」コードによってこの明細書に記述されている。このコードの中に、たとえば、退化コドン「ＳＮＴ」の中の、「Ｓ」はＧとＢ基の等モルの混合物であり、「Ｎ」は全四基の等モルの混合物であり、「Ｔ」は単一の不変基チミジンである。
【００９７】
複雑に変化させられたコドンは、二つもしくはそれ以上の塩基の等モルの混合ではなく、一つの塩基によって、少なくとも、三つの部位の中の一つが充たされたものである。
【００９８】
簡単に変化されたコドンでも複雑に変化されたものでも、望ましい代替セットを作ることができる。特殊アミノ酸もしくはアミノ酸のクラスが適切であることを表示している情報がない場合には、発見し得るレベル以上のミニタンパク質の表示は不経済なので、同等の確立をもった全アミノ酸を代替するよう努力している。一つのコドン（ＮＮＮ）の各部位にある四つのｎｔｓの同等量は、各アミノ酸がコードしているコドンの数に比例して存在するアミノ酸分布を産出する。この分布は、一つの酸の残基に対して二つの基本的残基を与えると言う不利な点を持っている。さらに、ＷもしくはＭの６倍ものＲ、Ｓ、そしてＬが発生する。五つのコドンがこの分布で合成されたら、Ｌ、Ｒ、そしてＳのいくつかの組み合わせをコードしている２４３配列の各々は、ＷとＭのいくつかの組み合わせをコードしている３２配列の各々より７７７６倍豊富である。発見し得るレベルで五つのＷｓプレゼントを持つためには、７７７６以上の折りたたみで、各（Ｌ、Ｒ、Ｓ）配列プレゼントを持たなければならない。
【００９９】
特殊なアミノ酸残基は、いくつかの方法で定義されたポリペプチドの三次元構造に影響を及ぼすことができる。すなわち、
ａ）ポリペプチドの主鎖の柔軟性に影響を及ぼす、
ｂ）疎水性グループを加える、
ｃ）電荷グループを加える、
ｄ）原子結合を許す、
ｅ）ジスルフィド、金属イオンとのきレーション、もしくは生体代行機器グループとの結合などのクロスリンクを形成する。
【０１００】
Lundeen（LUND86）は、三次元構造として知られているタンパク質に存在するヘリクス、ベータストランド、ターン、そしてコイルのアミノ酸の頻度の表を作成し、遊離チオールグループを持っているＣＹＳｓと半シスチンを区別した。遊離ＣＹＳはヘリックスに最も数多く発見され、半シスチンはベータシートに最も数多く発見されたと報告されている。しかしながら、半シスチンはヘリクスに定期的に発見されている。Peaseら（PEAS90）は、二つのシスチンを持つペプチドを構造した。各々の一つの端は真実に安定したアルファヘリックスにある。アパアミンは同様な構造を持っている。（WEMM83,PEAS88）。
【０１０１】
柔軟性：
ＧＬＹは二つの水素がＣαに付着した最も小さいアミノ酸である。ＧＬＹはＣβを持っていないので、ＧＬＹは主鎖に最大柔軟性を委ねる。このようにして、ＧＬＹはリバースターンに頻繁に発生する。ＰＲＯ、ＡＳＰ、ＳＥＲ、そしてＴＨＲに特に頻繁に発生する。
ＡＬＡ、ＳＥＲ、ＣＹＳ、ＡＳＰ、ＡＳＮ、ＬＥＵ、ＭＥＴ、ＰＨＥ、ＴＹＲ、ＴＲＰ、ＡＲＧ、ＨＩＳ、ＧＬＵ、ＧＬＮそしてＬＹＳ等のアミノ酸は、枝なしベータを持っている。勿論、サイドグループであるＳＥＲ、ＡＳＰそしてＡＳＮは、主鎖と水素結合を頻繁に行い、それによって、勢力的に、他に望ましくない配座を主鎖に付けることができる。ＶＡＬ、ＩＬＥそしてＴＨＲは、延長された主鎖配座をより望ましいものとしている枝分かれベータカーボンを持っている。このようにして、ＶＡＬとＩＬＥはベータシートの中に最も頻繁に見られる。ＴＨＲのサイドグループが容易に主鎖と水素結合を形成することができるので、ベータシートに存在する傾向は少ない。
【０１０２】
プロリン主鎖は巡回サイドグループによって特に制約される。ファイ角度は、常に６０度に近い。大多数のプロリンはタンパク質の表面で発見される。
【０１０３】
電荷：
ＬＹＳとＡＲＧは、各々１０．４もしくは１２．０以下のｐＨにおいて単一正電荷を保持する。いかなる場合でも、各々４と５のアミノ酸を持ったメチレングループは、疎水性相互作用が可能である。ＡＲＧのグアニジニュームグループは、ＬＹＳのアミノ酸グループがたった三つの水素を同時に寄与できないのに、五つの水素を同時に寄与することができる。さらにまた、これらのグループの幾何学は異なっているので、これらのグループは時として交換され得ない。
【０１０４】
ＡＳＰとＧＬＵは、各々−４．５と４．６以上のｐＨにおいて単一負電荷を保持する。ＡＳＰが一つのメチレングループしか持っていないので、いくつかの疎水相互作用が可能である。ＡＳＰの幾何学は主鎖窒素と水素結合を形成する役を演ずる。その窒素はリバースターンの中に頻繁に発見されるＡＳＰと一貫しており、ヘリクスの初頭にある。ＧＬＵは、アルファヘリクスの中に頻繁に発見され、特にこれらヘリクスのアミノ酸末端位置に発見される。その理由は、サイドグループの負電荷がヘリックス双極子と安定化のための相互作用を持つためである。（NICH88、SALI88）。
【０１０５】
ＨＩＳは、生理学的領域、ｖｉｚ．６．２におけるイオン化ｐＫを持っている。このｐＫは、電荷されたグループの近接位置で、もしくは水素授与者もしくは受納者の近接位置で換えられ得る。ＨＩＳは亜鉛、銅、そして鉄のような金属イオンと結合することができる。
【０１０６】
水素結合：
電荷されたアミノ酸の他に、ＳＥＲ、ＴＨＲ、ＡＳＮ、ＧＬＮ、ＴＹＲそしてＴＲＰは水素結合に参与することができる。
【０１０７】
クロスリンク：
最も重要なクロスリンク形式は、チオールのＣＹＳ残基間で形成されたジスルフィド結合である。適切な酸化環境の中でこれらの結合は自然に形式される。これらの結合はタンパク質もしくはミニタンパク質の特殊な配座を非常に安定したものとすることができる。酸化されたチオール試薬液と還元されたチオール試薬液の混合液が存在する場合、最も安定した配座の支配を許容する変換作用が行われる。タンパク質とペプチドの中のジスルフィドに関しては、KATZ90、MATS89、PERR84、PERR86、SAUE86、WELL86、JANA89、HORV89、KISH85、そしてSCHN86を参照すること。
【０１０８】
特殊な酵素を必要としないで形成される他のクロスリンクは下記のとおりである。すなわち、
１）（ＣＹＳ）４：Ｆｅ  ルブレドキシン（CREI84、376ページ）
２）（ＣＹＳ）４：Ｚｎ  アスパルテート  トランスカルバミラーゼ（CREI84、376ページ）とＺｎ−フィンガー（HARD90）
３）（ＨＩＳ）２（ＭＥＴ）（ＣＹＳ）：Ｃｕ  アズリン（CREI84、376ページ）と基本「ブルー」Ｃｕキューカンバータンパク質（GUSS88）
４）（ＨＩＳ）４：Ｃｕ  ＣｕＺｎ過酸化ジスムターゼ
５）（ＣＹＳ）４：（Ｆｅ４Ｓ４）  フェレドキシン（CREI84、376ページ）
６）（ＣＹＳ）２（ＨＩＳ）２：Ｚｎ  ジンク−フィンガー（GIBS88、SUMM91）
７）（ＣＹＳ）３（ＨＩＳ）：Ｚｎ  ジンク−フィンガー（GAUS87、GIBS88）
（ＨＩＳ）２（ＭＥＴ）（ＣＹＳ）：Ｃｕを持っているクロスリンクは、ＨＩＳとＭＥＴがＣｕなしにクロスリンクを形成できないと言うポテンシャルな優位性を持っている。
【０１０９】
簡単に換えられたコドン
次の簡単に換えられたコドンは、それらがアミノ酸の相対的なバランスのとれたセットをコードするので有用である。すなわち、
１）ＳＮＴは次のセット（Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ）をコードする、すなわち
ａ）１の酸性（Ｄ）と１の塩基性（Ｒ）
ｂ）脂肪族（Ｌ、Ｖ）と芳香疎水族（Ｈ）の両方
ｃ）大型（Ｌ、Ｒ、Ｈ）と小型（Ｇ、Ａ）サイドグループ
ｄ）堅固（Ｐ）と柔軟（Ｇ）アミノ酸
ｅ）１度コードされたアミノ酸
２）ＲＮＧは次のセット（Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｇ）をコードする、すなわち
ａ）１の酸性と２の塩基性（最適のものではなく許容されるもの）
ｂ）親水性物と疎水性物
ｃ）１度コードされたアミノ酸
３）ＲＭＧは次のセット（Ｔ、Ｋ、Ａ、Ｅ）をコードする、すなわち
ａ）１の酸性、１の塩基性、１の中性の親水性物
ｂ）３の希望されたアルファヘリクス
ｃ）１度コードされたアミノ酸
４）ＶＮＴは次のセット（Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ）をコードする、すなわち
ａ）１の酸性と１の塩基性
ｂ）全クラス：電荷物、中性親水性物、疎水性物、堅固物と柔軟物、その他
ｃ）１度コードされたアミノ酸
５）ＲＲＳは次のセット（Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｇ２）をコードする、すなわち
ａ）２の酸性物質と２の塩基性
ｂ）２の中性親水性物
ｃ）２度コードされた単一のグリシン
６）ＮＮＴは次のセット（Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ）をコードする、すなわち
ａ）１５の異なったアミノ酸を提供する１６のＤＮＡ配列。セリンのみが繰り返され、他は同じ量で存在する。（これはライブラリーの極度に有効な抜き取りを許容する。）
ｂ）これらは同数の酸とベースのアミノ酸である（ＤとＲ一つ宛）
ｃ）アミノ酸の全主要クラスが存在する。すなわち、酸性、塩基性、脂肪性疎水性物質、芳香疎水性物質、そして中性疎水性物質
７）ＮＮＧは次のセット（Ｌ２、Ｒ２、Ｓ、Ｗ、Ｐ、Ｑ、Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｇ、ストップ）をコードする、すなわち
ａ）アルファヘリクス（Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｑ、Ｋ、Ｅ、そして、Ｓ、Ｒ、Ｔに対してより少ない程度で）の配座を好む残基の構成で優位なもの
ｂ）１３の異なったアミノ酸をコードする（ＶＨＧは、ＮＮＧによってコードされたセットのサブセットをコードする。それは、同等の酸と塩基性を持った、９の中で５がアルファヘリックスを好む、９の異なったＤＮＡの中にある９のアミノ酸をコードする）
【０１１０】
初期の変化のためにＮＮＴが、大多数の場合、好まれる。しかしながら、アミノ酸がアルファヘリックスに組み込まれるのをコドンがコードする場合には、ＮＮＧがＮＮＴより好まれる。
【０１１１】
下記に、効率に関して数個の簡単な変化を分析する。それによって、ライブラリーは抜き取りを行うことができる。
【０１１２】
（ＮＮＫ）６によってコードされたランダムヘキサペプチドのライブラリーが報告されている。（SCOT90、CWIR90）。表１４−２１（元の表番号１３０）は、そのようなライブラリーの期待された行為を示している。ＮＮＫは、ＰＨＥ、ＴＹＲ、ＣＹＳ、ＴＲＰ、ＨＩＳ、ＧＬＮ、ＩＬＥ、ＭＥＴ、ＡＳＮ、ＬＹＳ、ＡＳＰ、そしてＧＬＵ（アルファセット）のために単一コドンを作成し、ＶＡＬ、ＡＬＡ、ＰＲＯ、ＴＨＲ、そしてＧＬＹ（ファイセット）の各々のために二つのコドンを作成し、ＬＥＵ、ＡＲＧ、とＳＥＲ（オメガセット）の）の各々のために三つのコドンを作成する。表１４（元の表番号１３０Ａ）に示されているように、これらのセット各々からのアミノ酸の数に従って、64,000,000の可能配列を２８のクラスに分割した。最大クラスは、１４．６パーセントにほぼ等しい可能配列を持ったファイオメガ四つのアルファである。選択は別として、一クラスの全配列は、生産される同一の可能性を持っている。表１５（元の表番号１３０Ｂ）は、（ＮＮＫ）６ライブラリーから取られた任意のＤＮＡ配列が、定義されたクラスの一つに属しているヘキサペプチドをコードする確立を示している。たったの６．３パーセントにほぼ等しいＤＮＡ配列がこのファイオメガ四つのアルファクラスに属していることに注意して下さい。
【０１１３】
表１６（元の表番号１３０Ｃ）は、数個の独立した配座（すなわち、１０６、３・１０６、１０７、３・１０７、１０８、３・１０８、１０９、３・１０９）を持っているライブラリーのために各クラスにある期待された数の配列をしめしている。１０６独立した配座（ＩＴｓ）では六つのオメガクラスの５６パーセントを見ることを期待しているが、６つのアルファクラスのたったの０．１パーセントにすぎない。見られた大多数の配列は、１０パーセント以下がサンプルされたクラスから来ている。たとえば、二つのファイ二つのオメガ二つのアルファのクラスからのペプチドが、ターゲットと結合するためにライブラリーを分割することによって単離されることを考えてください。単離配列に関連付けられているペプチドに関してどの位の知識を持っているか考えてください。たった４パーセントの二つのファイ二つのオメガ二つのアルファのクラスがサンプルされただけなので、オメガセットからのアミノ酸が事実オメガセットからの中で最上だと結論を下すことはできない。ポジション２にＬＥＵがあるかも知れないが、ＡＲＧもしくはＳＥＲのほうがいいかも知れない。オメガ６のクラスのペプチドを単離したとしても、より良いクラスのメンバーがライブラリーにはなかったと言う注意をひくチャンスがある。
【０１１４】
１０７ＩＴｓのライブラリーで、数クラス完全にサンプルされたのを見たことがある。しかし、アルファ６つのクラスは、たったの１．１パーセントしかサンプルされていない。７．６・１０７ＩＴｓで、全アミノ酸配列の５０パーセントの提示を期待している。しかし、三つもしくはそれ以上のアミノ酸のアルファセットを持っているクラスは、あまり沢山サンプルされていない。（ＮＮＫ）６ライブラリーのサンプリングを完成するためには、および３．１０９ＩＴｓ、今までに報告されている最大の（ＮＮＫ）６ライブラリーの１０倍のものが必要とされる。
【０１１５】
表２２−２５（元の表番号１３１）は、（ＮＮＴ）４（ＮＮＧ）２によってコードされたライブラリーの期待値を示している。存在度の期待値は、コドンの順とは関係なく、もしくは不変化コドンをグループ別集団にすることにも関係がない。ライブラリーは、０．１３３倍のアミノ酸配列をコードしているが、そこにはたった０．０１６５倍のＤＮＡ配列しかない。このようにして、５．０・１０７ＩＴｓ（すなわち、（ＮＮＫ）６のために必要とされるものより６０倍も少ない）は、ライブラリーのほとんど完全に近いサンプリングをしている。その結果は（ＮＮＴ）６のものは幾分か良いものであり、そして（ＮＮＧ）６のものは、幾分かではあるが、それ程悪いものでもない。制御因子は、アミノ酸配列に対するＤＮＡ配列の比率である。
【０１１６】
表２６（元の表番号１３２）は、コドンＮＮＫ、ＮＮＴ、そしてＮＮＧのための＃ＤＮＡ配列／＃ＡＡ配列の比率を示している。ＮＮＫとＮＮＧのためには、Ｐｆファージの中の遺伝子ＩＩＩが「ストップ減失と推測される」と言う語句によって示されているように、ＰＢＤが重要な遺伝子の部分として提示されていると推測している。そのような重要な遺伝子が利用されることはいかなる場合においても必要とはされていない。重要でない遺伝子が利用される場合には、分析方法は少し換えられるだろう。ＮＮＴとＮＮＧをサンプルすることは幾分か効果的ではなくなるであろう。（ＮＮＴ）６が（ＮＮＫ）５より３．６倍多数のアミノ酸配列を提供し、１．７倍少ないＤＮＡ配列を必要としていることを見てください。（ＮＮＴ）７が（ＮＮＫ）６の二倍ものアミノ酸配列を提供しているが、ＤＮＡ配列は３．３倍少ないものとなっていることを見て下さい。
【０１１７】
このようにして、特別な部位で、全２０のアミノ酸を入手するために簡単な混合を利用することは可能であるが、これらの簡単な混合はコードされたアミノ酸のセットが非常に歪められたものとなる。この問題は複雑に変化されたコドンを利用して解決することができる。
【０１１８】
複雑に変化されたコドン
全２０のアミノ酸を許容し、最も好まれているアミノ酸（ｍｆａａ）の存在度の比率に対する最小限に好まれているアミノ酸（ｌｆａａ）の存在度の最大比率を産出しているコドン内のｎｔ分布（「ｆｘｓ」）は、酸性そしてベースのアミノ酸の同等に存在する拘束があるとしても、できるだけ少数のストップコドン、そして、便宜上、第三の塩基がＴもしくはＧであり、表８（元の表番号１０Ａ）に示されておるように、そして存在度が示されているアミノ酸の各タイプをコードしているＤＮＡ分子を産出する。他の複雑な変化されたコドンは一つもしくはそれ以上の配座を緩和することによって入手し得る。
【０１１９】
この化学作用は、等概然的である酸性とベースのアミノ酸を持った全２０のアミノ酸をコードし、最も好まれたアミノ酸（セリン）は、最小限に好まれるアミノ酸（トリプトファン）と同じ頻度で、たったの２．４５４回コードされている。「ｆｘｓ」ｖｇコドンは、ＮＮＫもしくはＮＮＳがたった一つのコドンを提供しているアミノ酸［Ｆ、Ｙ、Ｃ、Ｗ、Ｈ、Ｑ、Ｉ、Ｍ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ］の中のいくつかを持っているペプチドに対してサンプリングを最大に改善する。このサンプリングの利点は、ライブラリーが相対的に小さい場合に最大に顕著なものとなる。酸性とベースの同等性の条件を見逃し、ストップコドンを過小評価する結果は表９（元の表番号１０Ｂ）に示されている。
【０１２０】
ＮＮＴコドンの利点は、この特許登録のどこででも議論されている。最適化されないＮＮＴはたった１６のＤＮＡ配列によってコードされた１５のアミノ酸を提供している。表１０（元の表番号１０Ｃ）に示されている分布をもってＮＮＴを改善することができる。それはほとんど同等量で５のアミノ酸（ＳＥＲ、ＬＥＵ、ＨＩＳ、ＶＡＬ、ＡＳＰ）を提供する。さらに８のアミノ酸（ＰＨＥ、ＴＹＲ、ＩＬＥ、ＡＳＮ、ＰＲＯ、ＡＬＡ、ＡＲＧ、ＧＬＹ）は、ＳＥＲの存在度７８パーセントで存在している。ＴＨＲとＣＹＳはＳＥＲの存在度の半分に存続している。ジスルフィド結合ミクロタンパク質のためのＤＮＡを変化させる場合、ＣＹＳの普及度を減少することが望ましい。この分布は高いレベルで見られる１３のアミノ酸を許容し、ストップを付与しない。最適化されたｆｘｓ分布は高い普及度でたった１１のアミノ酸を許容する。
【０１２１】
ＮＮＧコドンもまた最適化され得る。表１１（元の表番号１０Ｄ）はほぼ最適化された「（ＡＬＡ）は［ＡＲＧ］とほぼ等しい」ＮＮＧコドンを示している。この変化に下に、四つの同等に最も好まれているアミノ酸：ＬＥＵ、ＡＲＧ、ＡＬＡ、とＧＬＵがある。このセットの中には一つの酸性と一つのベースがあることに注意して下さい。二つの同等に最も好まれていないアミノ酸：ＴＲＰとＭＥＴがある。ｉｆａａとｍｆａａの比率は０．５２５８である。このコドンが６回繰り返された場合、ＴＲＰとＭＥＴで全体を作られたペプチドは最も好まれたアミノ酸で全体を作られたペプチドは２パーセントの共通性を持っている。これを「最適化されたＮＮＧ  ｖｇＤＡＮにおける（ＴＲＰ／ＭＥＴ）６の普及度」と呼ぶことにしている。
【０１２２】
「汚れたビン」方法でｖｇＤＮＡを合成する場合には、限られた数の混合のみを利用するのが時として望ましい。一つの非常に有益な混合物は「最適化されたＮＮＳ混合」と呼ばれている。その中で、ｆｘｓ混合の最初の二つのポジション：Ｔ１＝０．２４、Ｃ１＝０．１７、Ａ１＝０．３３、Ｇ１＝０．２６を平均し、第二ポジションは第一ポジションと同一で、Ｃ３＝Ｇ３＝０．５である。この分布は、５パーセント以上のアミノ酸  ＡＲＧ、ＳＥＲ、ＬＥＵ、ＧＬＹ、ＶＡＬ、ＴＨＲ、ＡＳＮ、とＬＹＳを提供し、さらに４パーセント以上のアミノ酸  ＡＬＡ、ＡＳＰ、ＧＬＵ、ＩＬＥ、ＭＥＴとＴＹＲを提供している。
【０１２３】
さらに複雑さを増して換えられたコドンは、興味あるものである。このコドンは、最初の二つのポジションの最適化されたＮＮＴコドンと同一であり、第三ポジションではＴ：Ｇ：：９０：１０を持っている。このコドンは５．５パーセント以上のアミノ酸（ＡＬＡ、ＩＬＥ、ＡＲＧ、ＳＥＲ、ＡＳＰ、ＬＥＵ、ＶＡＬ、ＰＨＥ、ＡＳＮ、ＧＬＹ、ＰＲＯ、ＴＹＲ、とＨＩＳ）を提供する。４．３パーセントのＴＨＲと３．９パーセントのＣＹＳは、ＮＮＫ（３．１２５パーセント）のＬＦＡＡｓよりさらに一般的である。残り５つのアミノ酸は、１パーセント以下で存在している。このコドンは、全アミノ酸が存在していると言う特徴を持っていて、二つ以上の低存在度のアミノ酸を持っている配列は希少である。このコドンを利用してＳＢＤを単離する場合には、最初の１３のアミノ酸が各ポジションでテストされることは理論的に確かである。最適化されたＮＮＧを基とした、同様なコドンが利用され得る。
【０１２４】
表１２（元の表番号１０Ｅ）は、最適化されたＮＮＳ（もしくはＮＮＫ）コドンのいくつかの特性を示している。三つの同等に最も好まれているアミノ酸：ＡＥＲＧ、ＬＥＵ、ＳＥＲがあることに注意して下さい。１２の同等に最も好まれていないアミノ酸：ＰＨＥ、ＩＬＥ、ＭＥＴ、ＴＹＲ、ＨＩＳ、ＧＬＮ、ＡＳＮ、ＬＹＳ、ＡＳＰ、ＧＬＵ、ＣＹＳとＴＲＰも存在する。五つのアミノ酸（ＰＲＯ、ＴＨＲ、ＡＬＳ、ＶＡＬ、ＧＬＹ）がその間にある。ＮＮＳの６回の繰り返しは、［ＡＲＧ、ＬＥＵ、とＳＥＲ］からなる配列とたったの０．１パーセント前後同相のアミノ酸［ＰＨＥ、ＩＬＥ、ＭＥＴ、ＴＹＲ、ＨＩＳ、ＧＬＮ、ＡＳＮ、ＬＹＳ、ＡＳＰ、ＧＬＵ、ＣＹＳ、そしてＴＲＰ］からなる配列を提供する。これは、最適化されたＮＮＧ６  ｖｇＤＡＮにおける（ＴＲＰ／ＭＥＴ）６の普遍度よりほぼ２０倍低いのみならず、この低普遍度は１２のアミノ酸に適用する。
【０１２５】
拡散誘発
拡散誘発は、タンパク質のいかなる部位にも、またいかなる場合にも利用し得るが、ターゲットに結合しようとする物質が設定された場合が最も適切である。拡散誘発は、少量の一つもしくはそれ以上の他の活性化されたｎｔｓを持ったＤＮＡ合成（すなわち、ｎｔホスホラミジット−−ｎｔ−phosphoramidites）のために活性化された各々の純粋なｎｔｓをスパイクする（無効にする）ことによって遂行され得る。望ましくは、スパイクのレベルは、最終製品のぼんの少量の部分が（たとえば、０．０００１パーセントの１パーセント）最初のＤＮＡ配列を含むくらいの量にする。これは、単一の、ダブルの、三重の、そしてそれ以上の誘発の発生を確かなものとするが、根本となる配列の回収は可能性のある成果である。
【０１２６】
ＩＩＩ．Ｄ．重要なシステインを持ったミクロタンパク質の変化に関連している特殊考察
いくつかの望ましい簡単なもしくは複雑な変化されたコドンが、システインを含むアミノ酸セットをコードする。これは、数個のコードされた結合ドメインが、不変のジスルフィド結合システイン以外に、一つもしくはそれ以上のシステインを特徴とすることを意味している。例えば、各ＮＮＴコードされたポジションには、１６チャンスの内１回、システインを入手できる可能性がある。六つのコドンが換えられる場合には、付加システインを含むドメインの分数値は０．３３である。奇数のシステインが複雑化された状態を引き起こす。PerryとWetzel（PERR84）を参照のこと。一方、多数のジスルフィドを含んでいるタンパク質は、ジスルフィド、すなわち、トリプシンを形成しないシステインを含んでいる。一対になっていないシステインの可能性は、いくつかの方法で取り扱かうことができる。
【０１２７】
すなわち、第一に、変化させられたファージ集団は、スルホリンク（SulfoLink）（Pierce Chemical Company，Ｒockford， Illinois，61105からのカタログ番号は44895  H）のような遊離したチオールを強固に結合している不動試液を無視される可能性がある。Pierceからのもう一つの製品は、TNB-Thiol Agarose（カタログ番号は20409  H）。BioRadはこの目的のためにAffi-Gel 401（カタログ番号153-4599）を販売している。
【０１２８】
第二に、下記のようなシステインを除外している変化を利用することができる。すなわち、
ＮＨＴ−−［Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ］を提供する。
ＶＮＳ−−［Ｌ２、Ｐ２、Ｈ、Ｑ、Ｒ３、Ｉ、Ｍ、Ｔ２、Ｎ、Ｋ、Ｓ、Ｖ２、Ａ２、Ｅ、Ｄ、Ｇ２］を提供する
ＮＮＧ−−［Ｌ２、Ｓ、Ｗ、Ｐ、Ｗ、Ｒ２、Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｆ、Ｇ、ストップ］を提供する
ＳＮＴ−−［Ｌ，Ｐ，Ｈ，Ｒ，Ｖ，Ａ，Ｄ，Ｇ］を提供する
ＲＮＧ−−［Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｖ、Ａ、Ｅ、Ｇ］を提供する
ＲＭＧ−−［Ｔ、Ｋ、Ａ、Ｅ］を提供する
ＶＮＴ−−［Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ］を提供する、
もしくは
ＲＲＳ−−［Ｎ、Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｇ２］を提供する。
【０１２９】
しかしながら、これらのスキームの各々は、ＮＮＴと比較して、一つもしくはそれ以上の不利なものを持っている。すなわち、ａ）より少数のアミノ酸が許容される、ｂ）アミノ酸は平均して提供されていない、ｃ）酸性とベースのアミノ酸は恐らく同等ではあり得ない、もしくは、ｄ）ストップコドンが発生する。しかしながら、ＮＮＧ、ＮＨＴ、そしてＶＮＴはＮＮＴと同様有用である。ＮＮＧは１３の異なったアミノ酸と一つのストップシグナルをコードする。たった二つのアミノ酸が１６回の混合の中に二度現れる。
【０１３０】
第三に、予め定められたターゲットに結合する集団を豊かにすることができ、そして余分のシステインのために、選択された配列（のpost hoc−−前後即因果関係）を評価できる。配座を拘束するために提供されているシステインより多数のシステインを含んでいるものは、完全に有用である。デザインされた以外のジスルフィドのつながりが発生する可能性がある。単離されたＤＮＡ配列によって定義された結合ドメインは、いずれにせよ適切ではないと言うのではない。単離されたドメインの適切性は化学的に合成されたペプチドの化学的そして生物化学的な評価によって最善に決定される。
【０１３１】
最後に、エルマン試液、ヨードアセテート、もしくはヨウ化メチルのような試液で遊離チオールをブロックすることができる。その試液は特に遊離チオールと結合し、そしてジスルフィドとは作用しない、そして集団中の調整されたファージをそのままにしておく。ブロックするための薬剤はミクロタンパク質の結合特質を換えてしまう可能性があることを知るべきである。このようにして、異なった結合ドメインが発見されるかも知れないと言う期待を持ってブロックするための種々の薬剤を利用しても良い。チオールをブロックされた遺伝子パッケージの換えられた集団は結合のためには画分される。単離された結合ミクロタンパク質のＤＮＡ配列が奇数のシステインを含んでいる場合、合成手段は奇数のチオールが適切にブロックされている、各ポシブルなつながりを持っているミクロタンパク質を提供するために利用されている。ニシウチ（NISH82、NISH86、そしてここに引用されている論文）は、各チオールが異なった型のブロックしているグループで保護されている、複数のシステインを含んでいるペプチド合成の方法を開示している。これらのグループは、選択的に除去することができるので、ジスルフィドの対号が統御され得る。一つのチオールがブロックされたままで残るか、もしくはブロックから解かれて異なった試液と再びブロックされるという改変したスキームの利用を考えている。
【０１３２】
ＩＩＩ．Ｅ．第二番目そして後続の変化のラウンドの計画
この発明による方法は、予め定められたターゲットに対する高い親和性を持っている結合ドメインのアミノ酸配列に関する情報の効果的収集を許容する。単一ラウンドの変化や親和性濃縮化から非常に有用な結合ドメインが入手できたとしても、最高で可能な親和性と特殊性を勝ち取るためには、多数のラウンドが必要であると考えている。
【０１３３】
初めての変化のラウンドでターゲットとのなんらかの結合をしたとしても、ターゲットに対する親和性はまだ低すぎ、ＳＢＤｓの変化によってさらに改善が成されるだろう。望ましくは、工程は進歩的であることである。すなわち、各変化のサイクルは、前のサイクルが生産したものより、次の変化サイクルのためにより良い出発点を作り出す。変化のレベルをそうなるようにセットして、ｐｐｂｄそしてｐｐｂｄ配列に関連した多数の配列が検出可能な量で存在していて、進歩的な工程を確かなものとしている。
【０１３４】
変化のレベルがそのように高く、ｐｐｂｄ配列がそのように低いレベルで存在しているので、ＰＰＢＤを提示する変換体がないと言うような識別可能な機会がある、また次のラウンドの最高ＳＢＤはＰＰＢＤより悪いものが出てくる可能性もある。必要以上に高い変化レベルでは、各誘発のラウンドは前のラウンドから独立していて、進歩の保障はない。この方法は、価値ある結合タンパク質まで導いてくれる可能性がある。しかしこのレベルの変化での実験の繰り返しは進歩的な結果をもたらさない。過多の変動は望ましいものではない。
【０１３５】
進歩性は全部もしくは無と言う性質のものではない。前の変化サイクルから得たデータのほとんどが保持され、ＰＰＢＤ表面に関連した多数の異なった表面が生産される時、その工程が進歩的なのである。
【０１３６】
先の変化サイクルにおける変化のレベルが正しく選ばれれば、正しく換えられた残基に存在するために選択されたアミノ酸が、最善に決定されるものである。他の残基に環境は変わるので、それらを再び変えることは適切である。同時に変えられるものよりもっと多くの興味ある残基があるので、今だかつて変えられたことのないもの（優位性が最も高い）、もしくは、一つまたはそれ以上のサイクルのために変えられなかったもののいずれかの残基の選出を続けていくかも知れない。
【０１３７】
ＮＮＴもしくはＮＮＧの換えられたコドンの利用は、換えられたライブラリーのきわめて有効なサンプリングに通じている。その理由は、（異なったアミノ酸配列）と（異なったＤＮＡ配列）比率が、ＮＮＫに対するそれよりも、もしくは最適化されたＶｇコドン（ｆｘｓ）に対するそれよりも、ずっとユニティに近いものであるから。いずれにせよ数個のアミノ酸は各ケースで省略される。ＮＮＴそしてＮＮＧ両方ともアミノ酸の重要な（疎水性、親水性、酸性、ベース、中性の疎水性、小型、大型）のメンバーを許容する。結合ドメインを選択した後、後続の変化そして選択は高度の親和性もしくは特殊性を達成することが望ましいことであろう。この第二の変化の間、先の変化によって見逃されたアミノ酸の可能性が検討されるであろう。
【０１３８】
いくつかの例が役に立つことと思う。ＮＮＴを利用して、ＰＲＯを入手したと仮定しよう。このアミノ酸は、ＮＮＴでもＮＮＧでも使用可能である。ＰＲＯはセット［ＰＲＯ、ＬＥＵ、ＶＡＬ、ＴＨＲ、ＡＬＡ、ＡＲＧ、ＧＬＹ、ＰＨＥ、ＴＹＲ、ＣＹＳ、ＨＩＳ、ＩＬＥ、ＡＳＮ、ＡＳＰ、ＳＥＲ］からの最高のアミノ酸であると言うことは論理的に確かである。［ＰＲＯ、ＴＲＰ、ＧＬＮ、ＭＥＴ、ＬＹＳ、ＧＬＵ］を含んだセットを次に試してみよう。ＮＮＧによって許容されたこのセットは望ましいセットである。
【０１３９】
目的物質の代わりにＨＩＳを入手したとしたらどうなるのだろう。ヒスチジンは芳香族であり、かなり疎水性であり、そとてイミダゾールリングと結合し、またイミダゾールリングから水素結合を形成することができる。トリプトファンは疎水性であり、そして芳香族であり、そして適当なアクセプタに水素を授与することができ、またＮＮＴコドンによって除去される。メチオニンもまた除外され、そして疎水性である。このようにして、一つの望ましいコースは、［ＨＩＳ、ＧＬＮ、ＡＳＮ、ＬＹＳ、ＴＹＲ、ＣＹＳ、ＴＲＰ、ＡＲＧ、ＳＥＲ、ＧＬＹ、＜ストップ＞］を許容する変化されたコドンＨＤＳを利用することである。
【０１４０】
変化の第一ラウンドが完全に不成功に終わる場合には、異なったパターンの変化が利用されるべきである。たとえば、一つ以上の相互作用がドメイン内で定義され得る場合には変化の次のラウンドにある換えられた残基が、最初の変化内で確定されたセット以外のセットからでなければならない。故障が繰り返されるような場合には、異なったＩＰＢＤに変えることもできる。
【０１４１】
ＩＶ．提示戦略：「遺伝子パッケージ」の表面に異種結合ドメインを提示する
ＩＶ．Ａ．遺伝子パッケージに対する一般必要条件
多数の異なってはいるが関連を持ったポテンシャル結合ドメインの提示を手に入れるためには、複製し得る遺伝子パッケージの不均一パッケージを生成することである。この遺伝子パッケージの各々は、興味あるターゲットのためにポテンシャルな結合ドメインをコードしている第一ＤＮＡ配列と提示方法をコードしている第二ＤＮＡ配列を含んでいるハイブリッド遺伝子から成っている。このようにして、外表面のタンパク質は、遺伝子パッケージにとって天然のものではあるが、ポテンシャル結合ドメイン（もしくは、それが関連している親結合ドメイン）とは自然に関連を持たない。そのポテンシャル結合ドメインは、キメラタンパク質相当物質（もしくは、その処理された形）をその外表面に提示する遺伝子パッケージの基である。
【０１４２】
望ましい結合特性を具現している集団の構成要素は非常に小型なもの、たとえば１０６より小さいものであるかもしれない。この集団の構成要素が一度、非結合構成要素から切り離されると、それは増幅されることが可能でなければならない。可変の細胞を培養することは、遺伝子物質の最も勢力的に増幅されたもの、そして望ましいものである。遺伝子メッセージは試験管内、すなわち、ＰＣＲによって増幅される。しかしながら、これは最も望ましい方法ではない。
【０１４３】
望ましくは、遺伝子パッケージが下記のものであることである。すなわち、１）ポテンシャル結合ドメインをコードしている理論的機構で遺伝子的に変えられたもの、２）培養で保持され増幅されたもの、３）親和性分離中、ターゲット物質と相互作用を行うことの出来るポテンシャルな結合タンパク質ドメインを提示するよう操作されたもの、そして４）親和性は分離されているが、回収し得る形で提示された結合ドメインをコードしている遺伝子情報を持っているもの。望ましくは、遺伝子パッケージが親和性分離の後も可能性を持っていることである。望ましい遺伝子パッケージは栄養バクテリア細胞、バクテリア胞子、そして特にバクテリアＤＮＡウイルスである、真核生物（eukaryote）のウイルスは遺伝子ペッケージとして利用され得るだろう。しかしそれらは望ましいものではない。
【０１４４】
遺伝子パッケージがバクテリア細胞である場合、もしくはペリプラズム的に組み立てられたファージである場合、提示の手段は二つの要素を持っている。第一要素は、最初の発現物質を細胞（パッケジがファージの場合には宿主細胞）の内皮膜に導く分泌シグナルである。この分泌シグナルは、処理された、成熟した、ポテンシャルな結合タンパク質を作り出すためにシグナルぺプチドによって分割される。第二要素は、パッケージがその外表面に処理されたタンパク質を収集するよう導いている外表面運搬シグナルである。望ましくは、この外表面運搬シグナルが遺伝子パッケージに天然にある表面タンパク質から誘導されることである。
【０１４５】
たとえば、望ましい実験例において、ハイブリッド遺伝子は、一つのシグナル配列（すなわち、バクテリアｐｈｏＡもしくはｂｌａ遺伝子のシグナル配列、もしくはＭ１３ファージ遺伝子ＩＩＩのシグナル配列）に操作可能につながっているか、また、繊状ファージ（すなわち、Ｍ１３）のコートタンパク質（すなわち、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質）をコードしているＤＮＡに操作可能につながっているポテンシャルな結合ドメインをコードしているＤＮＡから成っている。発現物質は、宿主細胞の内皮膜（リピッド二重膜）まで運搬される。そこでシグナルペプチドは処理されたハイブリッドタンパク質を去るよう分割される。このハイブリッドタンパク質のコートタンパク質のような要素のＣ−終端は、リピッド二重膜に捕られてしまう。それ故ハイブリッドタンパク質はペリプラズムの部分から逃れない。（これは、野生タイプコートタンパク質の典型的なものである。）未完成ファージ粒子の単一ストランドＤＮＡは、ペリプラズムの部分に入っていき、それは、野生タイプのコートタンパク質とハイブリッドタンパク質をリピド二重膜から収集する。ハイブリッドタンパク質は、このようにして、その外表面に晒されたポテンシャルな結合ドメインを去り、繊状ファージの表面被覆に  組み込まれる。（このようにして、宿主バクテリア細胞ではなく、繊状ファージが、この実験例「複製可能な遺伝子パッケジ」である。）
【０１４６】
分泌シグナルがポテンシャル結合ドメインの提示のために必要である場合には、特別に望ましい実験例においては、ハイブリッド遺伝子が発現されたバクテリア細胞は「分泌許容」系統の細胞である。
【０１４７】
遺伝子パッケージがバクテリア胞子、もしくはコートが細胞内で組み立てられたファージ（ファイＸ１７４もしくはラムダのような）である場合には、宿主バクテリア細胞の内皮膜に発言物質を導いている分泌シグナルは必要ではない。この場合には、発現手段は、単なる外表面運搬シグナルであり、典型的には胞子もしくはファージコートタンパク質の誘導物である。
【０１４８】
数個の遺伝子パッケージのための望ましいＯＳＰｓは、表７（元の表番号２）に示されている。このセクションのｏｓｐ−ｉｐｂｄの融合に関しては、必要な変更を加えて、ｏｓｐ−ｐｂｄとｏｓｐ−ｓｂｄ融合にも適用されるべきである。
【０１４９】
ＩＶ．Ｂ．遺伝子パッケージとしてのファージの利用：
ＩＰＢＤがジスルフィド結合ミクロタンパク質である場合には、ＩＰＢＤｓは細胞内に折りたたまれないので（これらのタンパク質は、ファージが細胞から解放された後これらのタンパク質は細胞内に折りたたまれる可能性がある）、ペリプラズム的に組み立てられたファージが望ましいものとされている。ＩＰＢＤが大型もしくは溶解し得ない配合団（Ｆｅ４Ｓ４群のような）を必要とする場合には、細胞内で組み立てられたファージが望ましいものとされている。その理由は、配合団はペリプラズムに欠けているので、分泌されるとＩＰＢＤが折りたたまれないかも知れないからである。
【０１５０】
変化が導入される場合には、多数の汚染が、それらの表面に異なったＰＢＤの少なくとも数個のコピーを持っている一つのＰＢＤのための遺伝子を担っているハイブリッド遺伝子パッケージを生成することができる。それは、低い多数の汚染（ＭＯＩ）をもたらした状態下でファージを持った汚染細胞によってこの可能性を最小限度に食い止めることが望ましい。
【０１５１】
損なわれない成熟したファージとの関連を持つ酵素活動がほとんどないので、そして代謝的に不活性な成熟したファージ粒子を示している、遺伝子はバクテリア宿主外では不活性なので、バクテリオファージは優れた候補である。
【０１５２】
与えられたバクテリオファージのために、望ましいＯＳＰは、普通、大多数のコピーのファージ表面に存在している一つである。それにも関らず、Ｍ１３ｇＩＩＩタンパク質（１のファージに対して５のコピー）のようなＯＳＰは、ＰＢＤの提示の原因となるＯＳＰとして優れた選択であるかも知れない。
【０１５３】
野生タイプのｏｓｐ遺伝子が保存されることは望ましいことである。ｉｐｂｄ遺伝子断片は、第二コピー受容体ｏｓｐ遺伝子に挿入されるか、もしくは新規に操作されたｏｓｐ遺伝子に挿入され可能性がある。ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子は調整されたプロモーターの制御の下に置かれることが望ましい。
【０１５４】
ｉｐｂｄ遺伝子の断片を挿入するために、ユーザは候補ＯＳＰ遺伝子の中にサイトを選択しなければならない。大多数のバクテリオファージのコートは、高度に規制されている。このようなバクテリオファージにおいては、ウイルス粒子（virion）の中の他のタンパク質と相互作用をする親ＯＳＰの残基を、操作されたＯＳＰ−ＩＰＢＤ融合の中に保持することは重要なことである。Ｍ１３  ｇＩＩＩのために、最後の１００の残基（BASS90）（もしくは、たとえそれより少ない数としても）を保持すれば十分であるかも知れないが、Ｍ１３  ｇＶＩＩＩのために、全部の成熟したタンパク質を保持することは望ましい。そのような打ち切られたｇＩＩＩタンパク質は、ｇＩＩＩタンパク質がファージ汚染性に対して必要とされるように、完全なｇＩＩＩタンパク質と並んで発現されるであろう。
【０１５５】
Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｉｆ１、Ｉｋｅ、Ｘｆ、Ｐｆ１、そしてＰｆ３を含んでいる繊状ファージは、特別に興味をひくものである。主要なコートタンパク質は、遺伝子ＩＩＩによってコードされている。５０アミノ酸成熟遺伝子ＶＩＩＩコートタンパク質は、７３アミノ酸プリコート（ITOK79）として合成されている。第一２３アミノ酸は、未完成ポリペプチドが細胞内皮膜に挿入される原因となっている典型的な単一配列を構成している。
【０１５６】
一つのE.Coliシグナルぺプチド（ＳＰ−Ｉ）は、アミノ酸１８、２１、そして２３を承認し、幾分か少ない程度ではあるが、残基２２、そしてプリコート（KUHN85a、KUHN85b、OLIV87）の残基２３と２４との間のカットを承認している。シグナル配列を取り除いた後で、成熟したコートのアミノ終端は、内皮膜のペリプラスム側に位置させられる。カルボキシ終端は細胞質側に存在する。成熟した５０アミノ酸コートタンパク質のおよそ３０００コピーが内皮膜に並行して参加している。
【０１５７】
遺伝子ＶＩＩＩの配列は知られており、アミノ酸の配列は，ｌａｃＵＶ５プロモーターを利用して、そしてＬａｃＩｑ抑制体とともに利用されて、合成遺伝子にコードされ得る。ｌａｃＵＶ５プロモーターはＩＰＴＧに誘発される。成熟した遺伝子ＩＩＩタンパク質は、円形ｓｓＤＮＡの周囲の被覆を形成する。三次元構造のｆ１ウイルス粒子は、中程度の解像度で知られている。遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のアミノ終端はウイルス粒子の表面にあり、そしてそのために、ポテンシャル結合ドメインの望ましい接続サイトである。遺伝子ＶＩＩＩのいくつかの調整が行われた、そしてそれらは下記に記載されている。Ｍ１３コートの二次元構造は、三次元構造に含蓄的である。成熟したＭ１３遺伝子ＶＩＩＩタンパク質はたった一つのドメインを持っている。
【０１５８】
下記から成る三点遺伝子を構造した。すなわち、
１）内皮膜をとうして分泌の部分（２）と（３）を導いているシグナル配列をコードしているＤＮＡ、
２）成熟したＢＰＴＩ配列をコードしているＤＮＡ、そして
３）成熟したＭ１３  ｇＶＩＩＩをコードしているＤＮＡ。
この遺伝子はＭ１３ファージの表面に活力ある形でＢＰＴＩが現れる原因となる。
Ｍ１３プリコート（ＳＣＨＡ７８）のアミノ酸配列はＡＡ＿ｓｅｑ１と呼ばれ、下記のとおりである。すなわち、
【表１】
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Ｍ１３ＣＰに新規のタンパク質ドメインを挿入する最善のサイトは、矢印で示してあるように、Ａ２３の後である。その理由は、ＳＰ−ＩがＡ２３の後プリコートされたタンパク質を裂開するからである。分泌され得るタンパク質は、そのアミノ終端で成熟したＭ１３ＣＰと連結されて出現する。成熟したＭ１３ＣＰのアミノ終端はウイルス粒子の外表面に位置されているから、導入されたドメインは、ウイルス粒子の外側に提示されるであろう。Ｍ１３ＣＰが資質２重膜に出現する機構が今だ解明されていないと言うことは、ｂｐｔｉの直接遺伝子ＶＩＩＩへの挿入が機能的融合タンパク質を生成しないのかも知れないと言う可能性を提起する。融合のシグナル配列を他に、たとえば、ｐｈｏＡ配列（ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ．．．．．．．．）（MARK91）に変えることが必要なのかも知れない。Marksら（MARK86）は、ｐｈｏＡシグナルぺプチドが成熟したＢＰＴＩをE.coliペリプラズムに導くことができることを示した。
【０１５９】
ＩＰＢＤを提示するもう一つの方法は、一部もしくは全部の遺伝子ＩＩＩを含んでいるキメラ遺伝子のドメインとしてそれを提示することである。この遺伝子はＭ１３のマイナーコートタンパク質の一つをコードする。遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ、とＩＸもまたマイナーコートタンパク質をコードする。これらのマイナータンパク質の各々は、一つの完全な成熟したウイルス粒子につきおよそ五つのコピーの中に存在する。そしてそれらは形態発生もしくは汚染に関係している。これにひき比べてメージャーコートタンパク質は、一つに完全な成熟したウイルス粒子につき２５００以上のコピーの中に存在する。遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ、とＩＸタンパク質は、成熟したウイルス粒子の末端に存在する。これら三つのタンパク質は、後転移的に操作されない。（RASC86）。
【０１６０】
単一ストランドの円形ファージＤＮＡは、遺伝子ＩＩタンパク質のおよそ５つのコピーと関連を持ち、ＤＮＡがらせん形被覆のタンパク質の中に閉じ込められるような方法で皮膜と関連を持ったコートタンパク質のパッチを通って押し出される。（WEBS78）。ＤＮＡは一対を基礎にはしていない（それはウイルスゲノムに厳めしい厳格は制限を課すことになる）。むしろベースは配列から独立して互いに挿入する。
【０１６１】
Smith（SMIT85）とdelaCruzら（DELA88）は、遺伝子ＩＩＩへの挿入は新規なタンパク質ドメインが完全に成熟したウイルス粒子の外表面に発現する原因となることを示している。ミニタンパク質の遺伝子は、SmithとdelaCruzらによって利用されたサイトの遺伝子ＩＩＩ、他のドメインの境界線に対応している、もしくはタンパク質の表面ループに対応している一つのコドンにある遺伝子ＩＩＩ、もしくは成熟したタンパク質のアミノ終端にある遺伝子ＩＩＩに融合されるかも知れない。
【０１６２】
全参考文献に記載されている実験では、単一の調整された遺伝子ＩＩＩのｆｄを含んでいるベクターが利用されている。このようにして、ｇＩＩＩの全五つのコピーは同一の方法で調整される。遺伝子ＩＩＩは、かなり大型（1272b.p. もしくはファージゲノムの約２０パーセント）であり、そして遺伝子全体の複製はファージへ安定的に挿入されるかどうかは確かではない。さらにｇＩＩＩのタンパク質の全五つのコピーは完全に成熟したウイルス粒子の一つの端に存在している。二価のターゲット分子（抗体のような）が五価のファージと結合する場合には、結果としてもたらされた複雑性は逆に戻すことは不可能であろう。ターゲットに結合された遺伝子パッケージの逆戻りのできない場合は、ターゲットに対して最大の親和性を持っている新規なポリペプチドをコードしている遺伝子配列を担っている遺伝子パッケージの親和性同位体濃縮に大幅に干渉する。
【０１６３】
逆戻りのできない複雑性の発生の可能性を減少するために、ＩＩＩのカルボキシ末端部分をコードする第二の合成遺伝子を利用することができるかも知れない。遺伝子ＩＩＩタンパク質のカルボキシ末端部分は、ファージの中にそれを組み入れる原因となる。たとえば、（コドン３９８によって特定されたアルギニンからはじめて）最後の２９残基はファージへ溶解タンパク質が組み込まれる原因となるに十分であるかも知れない。
代替的に、成熟したｇＩＩＩタンパク質、すなわち、遺伝子ＩＩＩの最後の１５０から１６０までのアミノ酸の最後の胞子ドメインを含むかも知れない。たとえば、下記からなる（５フィートから３フィートまで）一つの遺伝子を操作できるかも知れない。すなわち、
１）プロモーター（望ましくは制御されたもの）、
２）リボゾーム結合のサイト、
３）イニシエーションコドン、
４）分泌の（５）と（６）の部分を内皮膜をとうして導いている機能的シグナルペプチド、
５）ＩＰＢＤをコードしているＤＮＡ，
６）Ｍ１３タンパク質の残基２７５から４２４までをコードしているＤＮＡ、
７）変換ストップコドン、そして、
８）（任意に）転写ストップシグナル。
野生タイプの遺伝子ＩＩＩを残しておくので、いくつかの変換されない遺伝子ＩＩＩが存在するであろう。代替的に、ＯＳＰとして遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を利用するかも知れない、そしてｏｓｐ：ｉｐｂｄ溶解を制御するかも知れないので、溶解タンパク質の一つもしくは数個のコピーがファージの上に発現する。
【０１６４】
Ｍ１３遺伝子ＶＩ、ＶＩＩ、とＩＸタンパク質は、変換後は操作されない。これらのタンパク質がファージの中に組み込まれるルートは、いまだ報告されていない。これらのタンパク質は普通の形態生成そしてファージの感染性のために必要である。これらの分子（遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、そして遺伝子ＩＸタンパク質）が：ａ）細胞質から、ｂ）ペリプラズムから、もしくはｃ）脂質二重膜の内部から、ファージに接続しているかどうかは、知られていない。下記の一つを利用してファージ表面にＩＰＢＤを導入するためにこれらのタンパク質の一つを利用し得る。すなわち、
１）ｉｐｂｄ：：ｐｍｃｐ、
２）ｐｍｃｐ：：ｉｐｂｄ、
３）シグナル：：ｉｐｂｄ：：ｐｍｃｐ、そして
４）シグナル：：ｐｍｃｐ：：ｉｐｂｄ。
そこでｉｐｂｄは、最初のポテンシャル結合ドメインのための発現にコードしているＤＮＡを表示しており、ｐｍｃｐは、ファージマナーコートタンパク質ＶＩ、ＶＩＩそしてＩＸの一つのためにコードしているＤＮＡを表示しており、シグナルは、ｐｈｏＡシグナル（ＭＫＱＳＴＩＡＬＡＬＬＰＬＬＦＴＰＶＴＫＡ）のような機能的分泌シグナルペプチドを表示しており、そして「：：」は、枠内遺伝子融合を表示している。表示された融合は、知られたプロモータ、望ましくは、ＩａｃＵＶ５、ｔａｃ、もしくはｔｒｐのような規制されたプロモータの下流に置かれる。融合（１）と（２）は、マイナーコートタンパク質が細胞質からファージに接続される場合、もしくは脂質二重膜への自律的挿入によって接続される場合が適切である。融合（１）は、マイナーコートタンパク質のアミノ終端が遊離している場合に適切であり、融合（２）は、カルボキシ終端が遊離している場合に適切である。融合（３）と（４）は、マイナーコートタンパク質がペリプラズムからファージに接続する場合、もしくは脂質二重膜の内部からファージに接続する場合に適切である。融合（３）は、マイナーコートタンパク質が遊離している場合に適切であり、溶解（４）は、カルボキシ端末が遊離している場合に適切である。
【０１６５】
同様な構造が他の線状ファージで作製可能である。ｐｆ３は、ＩｎｃＰ−１プラスミドをかくまっているシュードモナス  アエルゲノサ（Pseudomonas aerugenosa）細胞を感染する良く知られた線状ファージである。ＰＦ３のメージャーコートタンパク質は、その分泌を導くシグナルペプチドを持たないのが通常である。その配列は残基ＡＳＰ７、ＡＲＧ３７、ＬＹＳ４０、そしてＰＨＥ４４−ＣＯＯを電荷する。その配列は晒されているアミノ終端と一貫している。このようにして、Ｐｆ３の表面にＩＰＢＤＴの発現をもたらすために、下記よりなる三点遺伝子を構成した。すなわち、
１）枠内で（３）に融合しているシュードモナス  アエルゲノサ（ＩＰＢＤの分泌をもたらすととして望ましく知られている）における分泌をもたらすものとして知られているシグナル配列、
２）枠内で（３）に融合している、ＩＰＢＤをコードしている一つの遺伝子断片、
３）成熟したＰｆ３コートタンパク質をコードしているＤＮＡ。
【０１６６】
任意的に、１から１０までのアミノ酸のフレキシブルなつながりをコードしているＤＮＡもしくは一つの特殊なプロテアーゼ（すなわち、因子Ｘａ）のために承認サイトを形成しているアミノ酸は、ｉｐｂｄ遺伝子断片とＰｆ３コートタンパク質遺伝子の間に導入される。この三点遺伝子は、Ｐｆ３に導入されるために、他のＰｆ３遺伝子の発現を干渉しない。遺伝子組み換えの可能性を削減するために、第（３）部分は野生タイプの遺伝子に相対的な多数の沈黙の突然変異を持つようデザインされている。シグナル配列が分裂されるとしても、ＩＰＢＤはペリプラズムの中にあり、そして成熟したコートタンパク質はアンカーとしてまたファージ組立てシグナルとして作用する。この融合タンパク質が、野生タイプのコートタンパク質によって許容されたルートとは別のルートによって脂質二重膜の中で休息をとることは問題ではない。
【０１６７】
W090/02809に記載されているように、バクテリオファージ  ファイ  Ｘ１７４のようなファージ、ラムダもしくはＴ４のような大型ＤＮＡファージ、そしてＲＮＡファージでさえ、適切な適応と調整をもって遺伝子パッケージとして利用されるかも知れない。
【０１６８】
ＩＶ．Ｃ．遺伝子パッケージとしてのバクテリア細胞
下記の良く特徴づけられたバクテリア系統の一つを選択しても良い。すなわち、１）培養で育てられたもの、２）その表面にＰＢＤｓを提示するために操作されたもの、そして３）親和性選択を相容性であるもの。
【０１６９】
バクテリア細胞の内での望ましい遺伝子パッケージは、Salmonella typhimurium、Bacillus subtilis、Pseudomonas aeruginosa、Vibrio choleae、Klebsiella pneumonia、Neisseria  gonorrhoese、Neisseria meningitidis、Bacteroides nodosus、Moraxella bovisそして特にEscherichia coliである。ポテンシャル結合ミニタンパク質はキメラバクテリアの外表面タンパク質（ＯＳＰ）への挿入物として発現されるかも知れない。全バクテリアはそれらの外表面にタンパク質を展示する。E.coliは、望ましいバクテリア遺伝子パッケージであり、そしてそのために、ＬａｍＢが望ましいＯＳＰである。
【０１７０】
大多数のバクテリアタンパク質は、細胞質の中に存在するが、他は、ペリプラズムの場（プラズマ皮膜とグラムーマイナスバクテリアの細胞壁間に存在する）に運搬される、もしくは、細胞の外表面に送られるかそこに固定される。さらにその他のバクテリアタンパク質は細胞を取り巻いている媒体の中に出される（分泌される）。細胞によって認識されるタンパク質、そしてそれが細胞質の外に搬出される原因となり、細胞表面に顕現される原因となるタンパク質の特質は、「外表面運搬シグナル」と呼ぶこととする。
【０１７１】
グラムー陰性のバクテリアはＯＳＰｓのサブセットを形成する外皮膜タンパク質（ＯＭＰ）を持っている。多数のＯＭＰｓには皮膜の一部もしくはそれ以上のスパンがある。ＯＭＰｓを外皮膜に局在させるシグナルは、成熟したタンパク質のアミノ酸配列の中にコードされる。バクテリアの外皮膜タンパク質は、シグナルペプチドと呼ばれているものを含んだ前駆物質形態で最初発現される。前駆物質タンパク質は内皮膜に運搬され、そしてシグナル  ペプチド部分（moiety）はペリプラズムの場の中に押出される。そこで、それは「シグナルペプチダーゼ」によって裂開され、そして残余の「成熟」したタンパク質はペリプラズムに入ることができる。そこで一度、他の細胞内機構が成熟したタンパク質の中の構造を認識し、その適切な部位は外皮膜にあると言うことを表示し、そしてそれをその部位に運搬する。
【０１７２】
リーダーもしくは一つのタンパク質からのシグナルペプチドのためにコードするＤＮＡは、キメラ遺伝子を形成するために、他のタンパク質、タンパク質ＸのためにコードしているＤＮＡ配列に接続され、そのキメラ遺伝子の提示は、タンパク質Ｘがペリプラズムにおいて遊離して発現する原因となっていることは良く知られている。バクテリア系統（LISS85、STAD89）輸出許容の利用は、シグナル配列融合が望ましいタンパク質を細胞表面に導く確率性を増大する。
【０１７３】
ＯＳＰ−ＩＰＢＤ融合タンパク質は、外皮膜の部分が高度に規制されていないので、グラムー陰性のバクテリアの外皮膜の中で構造化の役割をする必要はない。大型ＯＳＰｓのために一つもしくはそれ以上のサイトが存在するだろう。そしてそのサイトでｏｓｐが打ち切られ、そしてｐｂｄに融合されるので、融合を発現している細胞は細胞表面のＩＰＢＤｓを提示するだろう。ｏｍｐ遺伝子の断片と一つのｘ遺伝子の断片との融合は、外皮膜に発現しているＸまで導いて行く。（CHAR88bとc、BENS84、CLEM81）。そのような融合が形成される場合には、ＤＮＡ配列の中のｘのためにｉｐｂｄを代替することによって一つのｏｓｐ−ｉｐｂｄをデザインすることができる。さもなければ、成功したＯＭＰ−ＩＰＢＤ融合が、融合した遺伝子を発現しながら、そしてＩＰＢＤ提示の表現型のための終結体遺伝子パッケージをテストしながら、最高のｏｍｐの断片を一つのｉｐｂｄに融合することによって、望ましく探し求められる。ＩＰＢＤが提示される可能性を最大限にするために、ｏｍｐとｉｐｂｄ間の融合のポイントもしくは二つ以上のポイントを取るために、ＯＭＰに関する使用可能データを利用する。（可橈性のあるリンカーをコードしているスペーサーＤＮＡは、（リンカーは、ＧＬＹ、ＳＥＲ、とＡＳＮからなる）提示を容易ならしめるためにｏｓｐとｉｐｂｄから誘導された断片間に設置されることができる）。代替的に、数ケ所のサイトでｏｓｐを打ち切り、もしくは可変の長さのｏｓｐ断片を生産する方法で、そしてｏｓｐ断片をｉｐｂｄに融合し、融合を発現している細胞はふるい分けられもしくは選択されて、細胞の表面にはＩＰＢＤｓが提示する。Freudlら（FREU89）は、あるサイズ以上のＯＳＰｓ（ｏｍｐＡのような）の断片が外皮膜に組み込まれていることを示した。もう一つの代替方法は、ｏｍｐ断片とｉｐｂｄの融合におけるランダムＤＮＡの短いセグメントを含むことである、そしてＩＰＢＤ提示の表現型を表示しているメンバーのために結果としてもたらされた変化された集団を篩い分けるか、選択する。
【０１７４】
E.coliにおいては、ＬａｍＢタンパク質は良く理解されたＯＳＰであり、利用され得る。E.coli ＬａｍＢタンパク質は、S.typhimurium、V.cholerae、とK.pneumoniaに機能的な形で発現されているので、E.coli ＬａｍＢへの一つの融合としてこれらの種属のいずれにもＰＢＤｓの集団を提示することができる。K.pneumoniaは、ＬａｍＢと同様なマルトポリン（maltoporin）を発現する（WEHM89）、そしてこれもまた利用し得る。P.aeruginosaでは、Ｄ１タンパク質（ＬａｍＢの一つの同族体）が利用し得る。（TRIA88）。
【０１７５】
ＬａｍＢは、機能的なＮ−ターミナル配列が存在している場合には、外皮膜まで運搬される。さらに、成熟した配列の最初の４９アミノ酸が成功をもたらす運搬のために必要とされる。（BENS84）。他のＯＳＰｓに関しては、E.coliのＬａｍＢは、後に除外される典型的なシグナル配列で合成される。ＬａｍＢタンパク質と他の外皮膜タンパク質ＯｍｐＣ，ＯｍｐＦそしてＰｈｏＥの部分間の同相は、ＬａｍＢアミノ酸（３９から４９まで）と他のタンパク質の配列間の同相を含めて、検出されている。（NIKA84）。これらのサブ配列は外皮膜に運搬されるタンパク質と名付けられるかもしれない。
【０１７６】
ＬａｍＢのアミノ酸配列は知られている。（CLEM81）。そして一つのモデルは、それがどのような方法で他の皮膜にそれ自体を固定するかを開発したものである。（他も含めて、BENZ88bによって調査された。）モルトース（麦芽糖）とファージ結合ドメインの部位もまた知られている。（HEIN88）。この情報を利用して、バクテリアの外皮膜に提示するキメラのＯＳＰを提供してＬａｍＢに組み込まれるかも知れないＰＢＤ挿入によっていくつかの戦略が識別されるかも知れない。
【０１７７】
ＰＢＤｓがＬａｍＢのようなキメラのトランス皮膜タンパク質によって提示されなけばならない場合、ＰＢＤは細胞の表面に通常発見されるループに挿入され得る。（BECK83、MANO86比較のこと）。代替的に、一つの５フィート  セグメントのｏｓｐ遺伝子をｉｐｂｄ遺伝子断片に融合するかも知れない。融合部位はＯＳＰの表面に哂されたループに相当する場所を選択し、そしてＯＳＰのカルボキシ終端のタンパク質は除外される。ＬａｍＢにおいては、６０までのアミノ酸が結果としての異形のエピトープ（epitope）の提示を持って挿入されているのかも知れない。（CHAR88bとc）。ＯｍｐＣ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＥ、とＰｈｏＥの構造特徴が非常に似ているので、これらのタンパク質から同様な働きを期待する。
【０１７８】
ＬａｍＢは、結合タンパク質として特徴付けられるかも知れないが、この発明の中では一つのＯＳＴＳを提供するために利用されると言うことに注意してください。その結合ドメインは変化されていない。
【０１７９】
ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＰｈｏＥとピリンのような他のバクテリアの外表面タンパク質は、ＬａｍＢとその同族体の場合に利用されるかも知れない。ＯｍｐＡは、それが非常に豊富に存在しているので、そしてその同族体が広範なグラム−マイナス  バクテリア種属の中で知られているので、特別に興味のあるものである。Bakerら（BAKE87）はE.coliの外皮膜の中のタンパク質組み込みを調査し、そして残基１９−３２、６２−７３，１０５−１１８、と１４７−１５８が細胞表面に晒されていることを予告しているＯｍｐＡ位相的モデルを引用している。（VOGE86）。およそコドン１１１で、もしくはおよそコドン１５２で断片をコードしている一つのｉｐｂｄの挿入は、細胞表面にＩＰＢＤが提示される原因となっているようだ。ＯｍｐＡに関しては、MACI88とMANO88も参照のこと。シュードモナス  アエルゲノサのポリンタンパク質Ｆは、クローンされ、E.coliのＯｍｐＡに配列ホモロジイを持っている。（DUCH88）。このホモロジイはプロリンタンパク質Ｆに表面を晒した残基の予測を許容するには十分ではないけれど、ＯｍｐＡの位相モデルを決定するために利用された方法がポリンタンパク質Ｆにも利用されるかも知れない。一つのＯＳＰのようにＯｍｐＡを利用することに関連した研究はBECK80とMACI88に含まれている。
【０１８０】
MisraとBenson（MISR88a、MISR88b）は、残基ＧＬＹ１６４とＬＥＵ２５０は細胞表面に晒されている、またその他も含めて、と言うことを予告しているE.coli ＯｍｐＣの位相モデルを開示している。このようにして、E.coli  ｏｍｐＣ細胞のおよそコドン１６４での、もしくはおよそコドンの２５０での、もしくはS.thyphimurium  ｏｍｐＣ遺伝子の同位のコドンでの、一つのｉｐｂｄ遺伝子断片の挿入は、ＩＰＢＤが細胞表面に発現する原因となるかも知れない。他のバクテリア種属のｏｍｐＣ遺伝子が利用されるかも知れない。ＯｍｐＣに関連した研究はCATR87とCLIC88を含まれている。
【０１８１】
E.coliのＯｍｐＦは、一つの極めて豊富なＯＳＰ、１０４コピーに等しいかまたは大きい細胞である。Pagesら（PAGE90）は、七つの表目を晒したセグメントを表示しているＯｍｐＦのモデルを発表している。一つのｉｐｂｄ遺伝子断片の融合は、一つの挿入として、もしくはｏｍｐＦの３フィート部分を代替するものとしても、表示された領域の一つには機能的なｏｍｐＦ：：ｉｐｂｄ遺伝子を生成する可能性がある。そしてその発現は細胞の表面にＩＰＢＤを提示するように導いている。特に、約コドン１１１、１７７、２１７、もしくは２４５での融合は機能的なｏｍｐＦ：：ｉｐｂｄ遺伝子を導くに違いない。ＯｍｐＦに関しては、REID86b、PAGE88、BENS88、TOMM82、SODE85を合わせて参照のこと。
【０１８２】
ピリ繊毛タンパク質は、ピリエートされた（piliated）細胞はこれらのタンパク質の多数のコピーを発現するので、またいくつかの他種（N.gonorrhoeae、P.aeruginosa、Moraxella bovis、Bacteroides、nodosus、とE.coli）は関連したピリンを発現するので特に興味深いものである。Getzoffとその協力者たち（GETZ88、PAGE87、SOME85）は、淋菌性ピリ繊毛のモデルを構造し、そしてその淋菌性ピリ繊毛のタンパク質は、タバコ  モザイクウイルスタンパク質とミオヘムエリトリンに機構が似ている四つのらせん束を形成すると予告している。このモデルでは、アミノ終端とカルボキシ終端との両方が晒されている。アミノ終端はメチル化されている。Elleman（ELLE88）は、Bacteroides nodosusと他の種のピリンを調査し、抗原型の差異はピリンタンパク質の差異関係があるのかも知れない、そして最大変動Ｃ終端領域に発生していると述べている。ピリンタンパク質のアミノ終端部分は高度に保存されている。Jenningsら（JENN89）は、口蹄病（アフトーザ）（残基１４４−１５９）のウイルスの断片を、淋菌性ピリンと高度に同相のB.nodosus型４線毛タンパク質に接種した。P.aerubinosaの中の３フィート終端融合の発現が、生物菌種の中に導かれ、融合タンパク質の検出可能な量を生成していると言うことを彼等は発見した。Jenningsらは、異種エピトープを変化させなかった。また彼等はいかなる変動も示唆していない、彼等は、最後のピリン残基と「柔軟性のあるリンカー」を提供している異種エピトープの最初の残基との間に一つのＧＬＹ−ＧＬＹリンカーを挿入した。このようにして、ＩＰＢＤを接着する望ましい部位は、カルボキシ終端であることが分かった。Jenningsらによってテストされた特殊な内部融合（JENN89）は、P.aeruginosaに致死的であるように見えたけれども、その束の晒されたループもまた利用され得るだろう。ピリンに関しては、MCKE85とORND85も参照すること。
【０１８３】
Judd（JUDD86、JUDD85）は、N.gonorrhoeaeのタンパク質ＩＡを研究し、そしてアミノ終端が晒されていることを発見した。このようにして、N.gonorrhoeae表面にＩＰＢＤを提示する手段として成熟したＰ．ＩＡのアミノ終端にもしくは近隣にＩＰＢＤを接着することができる。
【０１８４】
E.coliのＰｈｏＥ位相の一つのモデルは、van del Leyら（VAND86）によって開示されている。このモデルは、八つのループが晒されていることを予告している。これらループの一つへのＩＰＢＤの挿入は、細胞表面にＩＰＢＤが提示される結果を導くらしい。残基１５８、２０１、２３８、そして２７５は、ＩＰＢＤの挿入のための望ましい部位である。
【０１８５】
他の利用し得るＯＳＰｓは、通常少量で発見される栄養素の受容物質であるE.coli BtuB、FepA、IutA、FecAそしてFhuE（GUDM89）を含んでいる。これら全タンパク質の遺伝子は、配列されているが、位相モデルはまだ利用可能ではない。Gudmunsdottirら（GUDM89）は、ＢｔｕＢ面のある種の残基、ペリプラズムを開示することにより、そしてウイルスＢｔｕｂ：：ＦｅｐＡ融合の機能性を決定することによってＢｔｕＢとＦｅｐＡのためのそのようなモデルの構造をはじめた。Carmelら（CARM90）は、ＦｈｕＡに対する同様な性質の研究を報告している。全ナイセリア属は、そでに識別されている。そして多数の場合にはクローンされている鉄分運搬のための外表面タンパク質を発現している。MORS87とMORS88も参照のこと。
【０１８６】
多数のグラム陰性バクテリアは、一つもしくはそれ以上の燐酸リパーゼ（ph−ospholipase）を発現している。E.coli燐酸リパーゼＡ、ｐｌｄＡ遺伝子の産物は、de Geusら（DEGE84）によってクローンされ配列された。彼等はタンパク質が後移転的処理なしに細胞表面に発現していることを発見した。一つのｉｐｂｄ遺伝子断片は、終端に接続することもできるし、タンパク質の中でループをコードしていると思われている部位で挿入され得る。その燐酸リパーゼＡは、シグナル配列を除去することなく外表面に到着し、そのシグナル配列は、このルートを許容するＰｌｄＡ：：ＩＰＢＤ融合タンパク質を承認しない。このようにして、一つのＰｌｄＡ：：ＩＰＢＤもしくはＩＰＢＤ：：ＰｌｄＡ融合が適切なシグナル配列を付加することによってペリプラズムの中に分泌される原因となるかも知れない。このようにして、一つのｉｐｂｄ断片が一つのＰｌｄＡの終端に単純な二次融合をしたことに加えて、下記の構造はテストされるべきである。すなわち、
１）ｓｓ：：ｉｐｂｄ：：ｐｌｄＡ
２）ｓｓ：：ｐｌｄＡ：：ｉｐｂｄ
ＰｌｄＡ：：ｉＰＢＤタンパク質が一度ペリプラズムの中で遊離すると、それがどのようにしてそこに行ったか覚えていないし、そしてそれが他の表面に位置される結果となったＰｌｄＡの構造特徴は同じ目的部位への融合を導くであろう。
【０１８７】
ＩＶ．Ｄ．遺伝子パッケージとしてのバクテリア胞子：
バクテリア胞子は遺伝子パッケージ候補として望ましい特徴を持っている。胞子は、化学的そして物理的エージェントに対して、栄養バクテリア細胞もしくはファージより以上に抵抗力がある。そしてそのために多数の親和性選択状態の利用を許容する。また、バチルス（桿状菌Bacillus）胞子は活性的に代謝しないし、その表面のタンパク質を換えることもない。バチルス胞子、そしてさらに特殊に、B.subtilis胞子は、それ故に、望ましいスポロイダル（sporoidal）遺伝子パッケージである。WO90/02809に詳細にわたって説明してあるように、異種の結合ドメインは、B.subtilis cotCもしくはcotD遺伝子によってコードされているような外表面タンパク質に導入されるかも知れない。
【０１８８】
通常、遺伝子パッケージとして細胞、胞子、もしくはウイルスを利用することが望ましいこととされている、そのために外表面タンパク質は、すでに識別されたＩＰＢＤを提示するよう操作され得る。しかしながら、WO90/02809に説明したように、この発明はそのような遺伝子パッケージに限られることなく、外表面運搬シグナルとして、変化と選択技術によって生成されるかも知れない。
【０１８９】
Ｖ．Ｅ．  遺伝子構造と発現の考察
（ｉ）ｐｂｄ−ｏｓｐ遺伝子は下記のものであろう。すなわち、ａ）完全に合成されたもの、ｂ）天然と合成ＤＮＡの複合、もしくはｃ）天然ＤＮＡ断片の複合。重要な点は、ｐｂｄセグメントが、前述のように、多数のそして多様なＰＢＤｓ家族をコードするために容易に変化されたと言うことである。合成されたｉｐｂｄセグメントは、それが制限サイトの設置に関して最大のコントロールを許容されているので望ましいものである。その３フィートの側面にあるｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子に隣接している領域に補足として存在する核分子、そして換えられないｏｓｐ−ｉｐｂｄの部分に補足として存在する核分子は、配列作りのために必要とされる。
【０１９０】
遺伝子の規制を行う部分の配列は天然の規制要素の配列から取られている。すなわち、ａ）プロモーター、ｂ）Shine-Dalgarno配列、そしてｃ）転写のターミネーター。規制要素は天然の規制領域の交感配列の知識からもデザインされ得る。これらの規制要素の配列はコードを行う領域に接続されている。規制部位はまた都合の良い調整を許容する規制領域に挿入されているか、もしくは隣接して存在する。
【０１９１】
親和性分離の重要な機能は、ターゲットのために高度の親和性を持っているＰＢＤｓ（ＩＰＢＤから誘導された）を支えている遺伝子パッケージを、ターゲットのために低い親和性を持っているＰＢＤｓを支えている遺伝子パッケージから分離することである。遺伝子パッケージの溶出量が遺伝子パッケージ表面のＰＢＤｓの数に依存している場合には、低い親和性、遺伝子パッケージ（ＰＢＤw）を持った多数のＰＢＤｓを支えている一つの遺伝子パッケージは、高度の親和性、ＰＢＤｓ（ＰＢＤz）をもった少数のＰＢＤｓを支えている一つの遺伝子パッケージとともに溶出するかもしれない。ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子の規制は、望ましくは、大多数のパッケージが親和性に従って良い分離に影響を及ぼすために十分なＰＢＤを提示するようにすることである。ｏｓｐ−ｐｂｄの発現のレベルをコントロールする規制し得るプロモーターの利用は、変化された集団の特徴的な働きを細心に調整することを許容する。
【０１９２】
栄養バクテリア細胞における操作された遺伝子合成誘発は、ｌａｃＵＶ５、ｔｒｐＰ、もしくはｔａｃ（MANI82）のような規制されたプロモーターの利用をとうして行われてきた。合成されたタンパク質の量を規制する要素は、十分に良く理解されているので、広範な種類の不均一なタンパク質がE.coli、B.subtilisそして他の宿主細胞の中に、すくなくとも適度の量で、生成され得る。（BETT88）。望ましくは、ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子のためのプロモーターは、一つの小さい化学的誘発物による規制に従うことである。たとえば、ｌａｃプロモーター、そしてハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）プロモーターはイソプロピルチオガラクトシド（isopropylthiogalactoside（ＩＰＴＧ）で規制し得る。構成された遺伝子のためのプロモーターは、天然ｏｓｐ遺伝子からはくる必要はない。いかなる規制し得るバクテリアのプロモーターでも利用できる。非漏洩性のプロモーターが望ましい。
【０１９３】
この発明は、遺伝子デザインの単一の方法に限られたものではない。ｏｓｐ−ｉｐｂｄ遺伝子は全体（in toto）を合成する必要はない。遺伝子の部分は天然のものから入手できるかも知れない。突然変化をｐｂｄＤＮＡ配列の特定なサイトに容易にそして正確に導いて行くかぎり、正確な遺伝子融合を生成するためにいかなる操作方法を利用してもかまわない。
【０１９４】
合成される遺伝子のコードしてある部分は、タンパク質のレベルでデザインされ、それからＤＮＡでコードされる。遺伝子コードの曖昧な表現は、変化されたコドンにおけるアミノ酸の様々な分布を生成するために、組み替えの可能性を最小限にするために、そして宿主細胞においてのコドンの利用が下手に変換されるのを減少するために、限定されたサイトの最適な配置を許容するように操作される。
【０１９５】
Ｖ．Ｆ  構造の考察
ｉｐｂｄ−ｏｓｐ遺伝子をコードするためのアミノ酸配列のデザインは、いくつかの構造の考察と関係している。デザインは各型の遺伝子パッケージによって幾分か変換する。バクテリアにおいては、ＯＳＰｓは重要な要素ではなく、従って、ＯＳＰドメインの融合は、その親としての機能のいずれをも、外皮膜に宿らせること以外は要求事項は何もない。
【０１９６】
ＯＳＰがＰＢＤドメインのオリエンテーションを規制しないことが望ましい。これはＰＢＤ内に規制がないと言うことと間違えて考えてはいけない。Cwirlaら（CWIR90）、ScottとSmith（SCOT90）、そしてDevlinら（DEVL90）は、ファージが提示されているランダムペプチドの中の可変残基はファージＯＳＰからの影響を受けてはいけないと説いている。中程度から高度の配座制限を持っている結合ドメインは、高度の特殊性を開示するだろう、そして高度の親和性もまた可能であると説いている。このようにして、良く定義された枠内に発現するアミノ酸を特定する変化のためのコドンの選択は規制されている。サイドグループの性質は、数多いアミノ酸の組み合わせの置替によって極度に広範な領域をとうして換えられる。与えられたクラスの大多数のＰＢＤｓの主鎖配座は、極めて似たものである。しかしながら、ＯＳＰに関連したＰＢＤの動きは規制されてはいけない。このようにして、ＰＢＤとＯＳＰの間に柔軟性のたるリンカーを入れることは往々にして適切である。このような柔軟性のあるリンカーは、柔軟性のある領域を持っていることが知られているし、天然に存在しているタンパク質から取ることができる。たとえば、Ｍ１３のｇＩＩＩタンパク質は、アミノ終端ドメインに高度の自由を許容すると考えられているし、グリシンを豊かに含んでいる領域を持っている。そのような柔軟性のあるリンカーもまたデザインし得るかも知れない。アミノ酸ＧＬＹ、ＡＮＡ、ＳＥＲとＡＳＰが豊かに含まれているポリペプチドのセグメントは柔軟性が増大するようにできるかも知れない。多数のグリシンは特に望ましい。
【０１９７】
ＬａｍＢ、ＯｍｐＡ、もしくはＭ１３  ｇＩＩＩタンパク質のようなＯＳＰの表面ループにＰＢＤを挿入することを選択した場合には、ＰＢＤがＯＳＰの終端に接続されるときには発生しないいくつかの考察をする。このようなケースにおいては、ＯＳＰはＰＢＤにいくつかの制限的影響を及ぼしている。ＰＢＤの終端はある程度固定された位置に置かれている。高度に変化されたＤＮＡ配列を、表面に晒されたループをコードしているコドンに、そして特殊結合表現型を持っている細胞のために選択されたコドンにｏｓｐ遺伝子に挿入し得る。識別されたアミノ酸配列が（いかなる方法によってでも）合成される場合には、ＯＳＰの拘束は失われ、そしてペプチドは、ターゲットに対してより低い親和性を持ち、そしてより低い特殊性を持つようになる。TanとKaiser（TANN77）は、ＢＰＴＩの全アミノ酸を含んでいるＢＰＴＩの合成モデルを発見した、そしてそのモデルは、ＢＰＴＩよりほぼ１０7くらい高いトリプシンのための一つのＫdを持っているトリプシンと接触している。このようにして、変化されたアミノ酸は、構造的制約がPBDによって提供されている一つのＰＢＤの部分であることが最も望ましい。
【０１９８】
ＬａｍＢに挿入された異物エピトープに隣接しているアミノ酸はこれらのエピトープの免疫特質に影響を及ぼすことが知られている。（VAND90）。ＬａｍＢ、ＯｍｐＡ、もしくは同様なＯＳＰｓのループに挿入されているＰＢＤｓがループのアミノ酸によって、また一般的にＯＳＰによって影響されるだろうということを期待している。ＰＢＤの適切な提示を入手するためには、ＯＳＰとＰＢＤの間に一つもしくはそれ以上のリンカーアミノ酸を加える必要があるかも知れない。そのようなリンカーは、天然タンパク質から獲得しえるし、もしくはアミノ酸の構成行動の知識を基にしてデザインし得るかも知れない。ＧＬＹ、ＳＥＲ、ＡＳＮ、ＡＳＰ、ＡＲＧ、そしてＴＨＲを豊かに持った配列が適切である。いずれの接合部位にもある一つから五つのアミノ酸は、ＯＳＰとＰＢＤ間の望ましい柔軟性を分与するだろう。
【０１９９】
ｉｐｂｄ遺伝子のファージｏｓｐ遺伝子への挿入の望ましいサイトは、下記の中の一つである。すなわち、ａ）ＩＰＢＤが元の形に折り畳まれるところ、ｂ）ＯＳＰドメインがその元の形に折り畳まれるところ、そしてｃ）二つのドメイン間に干渉がないところ。
【０２００】
一つのＯＳＰのアミノもしくはカルボキシ終端を表示しているファージのモデルが溶液に晒されているような場合には、成熟したＯＳＰの晒された終端は、ｉｐｂｄ遺伝子の挿入のための良い候補となる。低い解像度の三次元モデルで十分である。
【０２０１】
三次元モデルがない場合には、成熟したＯＳＰのアミノとカルボキシ終端がｉｐｂｄ遺伝子の挿入のための最善の候補である。構造的融合は、ドメイン間の望ましくない相互作用を回避するために、ＩＰＢＤそしてＯＳＰドメイン間の付加的残基を必要とするかも知れない。ＩＰＢＤもしくはＯＳＰに対するタンパク質同族体の特殊配列をコードしているランダムＤＮＡもしくはＤＮＡは、もし必要ならば、ｏｓｐ断片とｉｐｂｄ断片間に挿入され得る。
【０２０２】
ＯＳＰ内のドメイン境界にある融合は、機能的な融合を入手するための良い方法でもある。Ｓｍｉｔｈは、不均質ＤＮＡをｆ１の遺伝子ＩＩＩにサブクローンしている時、そのような境界を研究した。（SMIT85）。
【０２０３】
ＩＰＢＤの提示を促すために適当なＯＳＰドメインを識別する基準は、ＩＰＢＤを識別するために利用されたものとは幾分か異なっている。一つのＯＳＰを識別する場合、最小限のサイズはそれほど重要ではない。なぜならば、ＯＳＰドメインは最後の結合分子の中には出願しないし、各変化ラウンドに繰り返して遺伝子を合成することは必要ではないから。主なデザインに関する懸念は下記のものを含んでいる。すなわち、ａ）ＯＳＰ：：ＩＰＢＤ融合はＩＰＢＤの提示を促す、ｂ）最初の遺伝子の構造は合理的に便宜であること、そして、ｃ）ｏｓｐ：：ｉｐｂｄ遺伝子は遺伝的に安定しており、そして安易に操作できること。ドメインを識別するためにいくつかの方法がある。原子を利用した調整に依存する方法は、JaninとChothia（JAN185）によって研究された。これらの方法は、アルファとカーボン（Ｃa）間の距離、平面の分割（ROSE85と比較のこと）、もしくは埋められた表面（RASH84）のマトリックスを利用する。Cho−thiaとその協力者達は、ドメイン構造（彼等の定義に従った）を持った多数の天然タンパク質の働きの相関関係を研究した。Rashinは、テルモリシン（thermo−lysin）の残基２０６から３１６までからなるドメインの安定性を正しく予告した（VITA84、RASH84）。
【０２０４】
多数の研究者は、安定したドメインを隔離し、そして確認するために部分的なタンパク質分解とタンパク質配列の分析を利用した。（たとえば、VITA84、POTE83、SCOT87a、とPABO79を参照のこと）。Paboらは、コリファージ  ラムダからのｃＩ抑制体が二つのドメインを含んでいる一つの表示として熱量測定を利用した。彼等は、ドメイン境界の場所を決定するのに部分的タンパク質分解を利用した。
【０２０５】
たった一つの利用し得る構造に関するデータが候補ＯＳＰのアミノ酸配列である場合には、ターンとループを予測する配列を利用することができる。いくつかのループとターンが正しく予告される高度の確率性がある。（ChouとFasman（CHOU74）と比較のこと）。これらの部位はまたｉｐｂｄ遺伝子断片の挿入のための候補でもある。
【０２０６】
バクテリアＯＳＰｓにおける、主要な考察は下記を含む。すなわち、ＰＢＤが提示されること、そしてｂ）キメラのタンパク質に毒性がないこと。
【０２０７】
ＯＳＰｓの位相的モデルから、ＯＳＰのアミノもしくはカルボキシ終端が晒されているかどうかを決定することができる。その場合には、これらはｏｓｐ断片のｉｐｂｄ断片への融合のための優れた選択である。
【０２０８】
ｌａｍＢ遺伝子は配列され、そして様々なプラスミドに利用し得る。（CLEM81、CHAR88aとb）。ｌａｍＢ断片と他の多数の遺伝子との多数の融合は、E.coliのタンパク質の輸出の研究に利用されている。様々な研究から、Charbitら（CHAR88aとb）は、ｌａｍＢの残基が下記であることを特定する一つのモデルを提案している。すなわち、ａ）被膜に着床されている、ｂ）ペリプラズムと直面している、そしてｃ）細胞表面と直面している。成熟したタンパク質のアミノ酸のためのモデルの番号付けを我々は取り入れている。このモデルによると、外表面のループのいつくかが定義されている。それらは下記のとおりである。すなわち、１）８８から１１１までの残基、２）１４５から１６５までの残基、そして３）２３６から２５１までの残基。
【０２０９】
ＬａｍＢに着床されたミニタンパク質について考えてください。たとえば、Ｇ1ＮＸＣＸ5ＸＸＸＣＸ10ＳＧ12をコードしているＤＮＡをｌａｍＢのコドン１５３と１５４間に挿入することは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の表面に発現されている様々なｌａｍＢに導くであろう。Ｇ1、Ｎ2、Ｓ11そしてＧ12は、ミニタンパク質に十分なオリエンテーションの自由を許容するよう供給される、そしてそれはターゲットと最大限に相互作用がし得る。親和性の同位体濃縮を利用して（たとえば、蛍光的にラベルを貼られたターゲット経由でＦＡＣＳと関係して、多分数ラウンドの濃縮化をとうして）、予め定められたターゲットに対する高度の親和性を示している一つの特殊なＬａｍＢ誘導物を発現している一つのストランド（たとえば、ＢＥＳＴと名ずけられた）を入手できるかも知れない。ＢＥＳＴからの３から１０までの挿入された残基の配列を持っている一つのオクタペプチドは、ＢＥＳＴで見られたものと似ている親和性を特殊性を持っているに違いない。その理由は、オクタペプチドは、ＬａｍＢ誘導物と分離されたミニタンパク質に非常に似ている配座の中にアミノ酸を保持している内部構造を持っているから。
【０２１０】
一つもしくはそれ以上の新しいドメインをタンパク質に融合することは、親タンパク質の能力と異なった細胞から輸出される新しいタンパク質の能力を生成するかも知れない。野生タイプコートタンパク質のシグナルペプチドは、真正のペプチドのために機能するかも知れないが、融合を直接輸出することは不可能である。Ｓｅｃ依存のパスウエイを利用するためには、異なったシグナルペプチドが必要かも知れない。このようにしてキメラのＢＰＴＩ／Ｍ１３遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を発現し、そして提示するためには、異種構造のシグナルペプチド（ｐｈｏＡのそれ）を利用する必要があることを発見した。
【０２１１】
ターゲットに対する高度の親和性を持っているペプチドを提示する遺伝子パッケージは、ターゲットから、特に多原子価のターゲットから溶出することは非常に困難なことであるかも知れない。（堅固に結合されたバクテリアは現場で容易に増殖することができる。）ファージに関しては、特殊なプロテアーゼのための裂開のサイト（血液凝固要素Ｘａのような）を融合ＯＳＰタンパク質の中に導入することができるので、結合ドメインは遺伝子パッケージから裂開されることができる。そのような裂開は、全てのそれに起因しているファージが同一のＯＳＰｓを持ち、それによって同様に汚染的であり、ポリペプチド提示ファージさえも、裂開なしに親和性マトリックスから溶出され得るという利点を持っている。この段階は、そうしない限り失われてしまったかも知れない価値ある遺伝子の回収を許容している。知っている限りにおいて、情報を持っている遺伝子パッケージを回収する手段として、特殊なプロテアーゼを利用すること、もしくは汚染度合いの異なったファージの集団を同一の汚染度を持ったファージの中に変換することについて開示したものはいないし、示唆した人もいない。
【０２１２】
ＩＶ．Ｇ．遺伝子挿入の合成
この発明は、特殊なＤＮＡ合成もしくは構成の方法もしくは戦略に限られたものではない。従来のＤＮＡ合成は、変化されたＤＮＡ（混成プローブの生産のために現在利用されているものと似ている）の生成のための適切な試液調整で利用されるかも知れない。
【０２１３】
ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子は、適当に変換した遺伝子パッケージによって提示され得るように示されているｏｓｐ−ｉｐｂｄのようなｖｇＤＮＡが存在している親遺伝子の中に挿入することによって創造されるかもしれない。この発明は、特殊なｖｇＤＮＡ導入方法、たとえば、カセット誘発もしくは単一ストランドのオリゴヌクレオチドで導かれた誘発、に限られたものではない。
【０２１４】
ＩＶ．Ｈ．操作できるクローニングベクター
操作できるクローニングベクター（ＯＣＶ）は、キメラのｉｐｂｄ−ｏｓｐもしくはｉｐｂｄ−ｏｓｐ遺伝子を遺伝子パッケージの中に導入するために利用される複製核酸である。遺伝子パッケージがウイルスである場合には、それはそれ自体ＯＣＶとして働くかも知れない。細胞や胞子のためには、ＯＣＶはプラスミド、ウイルス、ファージミド、もしくは染色体であるかも知れない。
【０２１５】
ＩＶ．Ｉ．細胞の変換：
遺伝子パッケージが細胞の場合には、遺伝子パッケージの集団は適当なＯＣＶｓで細胞を変換することによって生成される。遺伝子パッケージがファージの場合には、ファージは遺伝子的に操作され、そして増幅のために適当な宿主細胞に感染（tramsfect）する。遺伝子パッケージが胞子の場合には、胞子形成可能な細胞が通常の代謝の状態でＯＣＶと変形される、そして胞子形成が誘発され、それによってＯＳＰ−ＰＢＤｓが提示されるようになる。この発明はＤＮＡとともに細胞変換をする一つの方法に限られてはいない。
【０２１６】
形質転換された細胞は、最初、プラスミド遺伝子の発現を許容している非選択的状態の下で成長する。それから変形しなかった細胞を殺すために選択される。形質転換した細胞は、誘発の適切なレベルでｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子を発現するよう誘発される。ＩＰＢＤもしくはＰＢＤｓ担っている遺伝子パッケージは、手近の遺伝子パッケージに適当な方法で収穫される、一般的には、遺伝子パッケージを造粒する遠心分離の方法と、滅菌培地（細胞）もしくは緩衝剤（胞子もしくはファージ）の中での再懸濁の方法である。提示戦略が成功したか否か（遺伝子パッケージ全体が「テスト」ＩＰＢＤをそこに提示する）、もしくは親和性選択が成功したか否か（遺伝子パッケージ様々な異なったＰＢＤｓをそこに提示する）の確認のために、それらの準備は整った。
【０２１７】
ＩＶ．Ｊ．提示戦略の確認：
収穫されたパッケージは、ＩＰＢＤが表面に存在するか否かを決定するためにテストされる。遺伝子パッケージ表面にあるＩＰＢＤの存在を調べるいかなる遺伝子パッケージテストにおいても、イオンもしくはＩＰＢＤの安定性のために重要であると知られている補足因子もしくはＡｆＭ（ＩＰＢＤ）が適当なレベルで含まれているかを調べる。テストは、下記によって行われる。すなわち、ａ）親和性のラベルを付すことによって、ｂ）酵素応用で、ｃ）分光光度的に、ｄ）親和性分離で、もしくはｅ）親和性沈降反応によって行われる。この段階でのＡｆＭ（ＩＰＢＤ）は、ＩＰＢＤ分子に対する強度の親和性（望ましくはＫd＜１０-11Ｍ）そしてｗｔ遺伝子パッケージに対する少量の親和性もしくは無親和性を持っているものを取り上げる。
【０２１８】
Ｖ．ターゲット結合突然変異体の親和性選択
Ｖ．Ａ．一般的な親和性分離技術
親和性分離は、提示機構が働いているか否かを確認するために初めてこの発明で利用された。すなわち、キメラの外表面タンパク質が発現されて、そして遺伝子パッケージの表面に運搬されたか否かを調べるもので、挿入された結合ドメインがターゲット物質に受容され得るように方向付けられている。この目的のために利用された場合には、結合ドメインは特別なターゲットのための既知の結合ドメインであり、そのターゲットは親和性分離工程において利用される親和性分子である。たとえば、一つの提示機構は、挿入される遺伝子パッケージの外表面タンパク質をコードしている遺伝子の中にＢＰＴＩをコードするＤＮＡを挿入することにより確認し得るかもしれないし、通常ＢＰＴＩによって結合されている無水トリプシンとの結合をテストすることによって確認され得るかも知れない。
【０２１９】
遺伝子パッケージがターゲットと結合している場合には、対応結合ドメインが遺伝子パッケージによってたしかに提示されているという確認を持つことができる。結合ドメインを提示しているパッケージ（そしてそこでターゲットと結合している）は、結合していないものから分離される。
【０２２０】
一度、提示機構が確認されると、様々な異なったポテンシャル結合ドメインを提示している遺伝子パッケージの変化された集合を利用することが可能となり、そして一つもしくはそれ以上のターゲットとの結合がうまく行われているか否かを決定するための親和性分離技術を利用することが可能となる。このターゲットは、提示された結合ドメイン、すなわち、一つの新しいターゲットとの結合のために選ばれ得るもの、に対して親である既知の結合ドメインによって結合されたものである必要はない。
【０２２１】
「親和性分離手段」という言葉は、下記に限られることなく、下記を含むものである。すなわち、ａ）親和性カラムクロマトグラフィ、ｂ）親和性マトリックス物質からの一括溶出、ｃ）一つのプレートに接着された親和性物質からの一括溶出、ｄ）細胞選別を活性化した蛍光、そしてｅ）ターゲット物質の存在下における電気泳動、を含む。「親和性物質」とは、浄化されるべき物質、「検体」（analyte）と呼ばれる物質に対する親和性を持った物質を意味することに使われた。大多数の場合には、親和性物質を検体との関係は逆に戻すことができるので、検体は一度不純物が洗い去られると親和性物質から遊離され得るものである。
【０２２２】
Ｖ．Ｂ．親和性クロマトグラフィ、一般
親和性カラムクロマトグラフィ、なにかの容器に保持された親和性マトリクス物質からのバッチ溶出、そしてプレートからのバッチ溶出は、非常に類似しているので、これらは今後、「親和性クロマトグラフィ」として取り扱うこととする。
【０２２３】
親和性クロマトグラフィが利用されると、
１）ターゲット物質の分子は、適当に大きいサイズでなければならない、そして親和性分離のために適当な堅固な支持に対して利用される化学的反応性がなければならない、
２）マトリックスへのアプリケーションの後、ターゲット物質は水と反応しないことがのぞましい、
３）マトリックスへのアプリケーションの後、ターゲット物質は特殊ではない方法でタンパク質と結合したり劣化したりしてはいけない、そして
４）ターゲット物質の分子は、ターゲット結合のための十分な、変化されない表面（リンカーに接続されている原子を除いて、普通、少なくとも５００Å2の）を許容する一つのマトリックスに対する物質を接続するために十分に大きくなければならない。
【０２２４】
親和性クロマトグラフィは、望ましい分離手段ではあるが、ＦＡＣＳ、電気泳動法、もしくはその他の方法も利用され得る。
【０２２５】
この発明は、望ましい結合特質を持ったタンパク質をコードする細胞もしくはウイルスを担っている遺伝子のために集団を濃縮するバクテリア参謀、もしくはバクテリアウイルス（もしくは他の遺伝子パッケージ）の親和性分離に利用するためのものである。
【０２２６】
Ｖ．Ｃ．ターゲット物質
この発明は、一つもしくはそれ以上のターゲット物質を結合する結合ドメイン、または一つもしくはそれ以上のターゲット物質との結合に失敗する結合ドメインのための選択に利用され得る。もちろん、特殊性は、結合分子がターゲット物質の限られたセットに強固に結合するための能力であるが、識別されなければならない最初のセットからターゲット物質の他のセットにより微弱に結合する場合、または全然結合しない場合もある。
【０２２７】
ターゲット物質は、ポリペプチド、脂肪質、ポリヌクレア酸、そして多糖類のような有機高分子であるが、それらに限られることはない。しかしながら、この発明は上述の識別されたターゲット物質のいずれにも限られてはいない。ただ一つの限定は、ターゲット物質が親和性分離に適当であるということである。このようにして、水溶液の中で安定しているほとんど全ての分子はターゲットとして利用し得る。
【０２２８】
ヒト好中球（neutrophil）エラスターゼ（ＨＮＥ）のようなセリンプロテアーゼは、ポテンシャルターゲット物質でも特に興味をひくクラスである。セリンプロテアーゼは生きている有機物の中で［ウビキトース］（ubiquitous）であり、消化、血液凝固、フィブリノリシス（fibrinolysis）、免疫反応、生殖、そしてペプチドホルモンの後移行操作のような工程で重要な役割を演じるものである。これらの酵素が演じる役割は重要であるが、制御されない、もしくは適当でないタンパク質分解活動は時として非常な破壊力を持つものである。
【０２２９】
Ｖ．Ｄ．固定化もしくはターゲット物質への標識
クロマトグラフィ、ＦＡＣＳ、もしくは電気泳動に関しては、ターゲット物質を第二の化学構成要素に共有的に結合させる必要があるかも知れない。クロマトグラフィにとっては、第二の構成要素はヒトのマトリックスであり、ＦＡＣＳにとって第二の構成要素は蛍光色素であり、そして電気泳動にとっては、第二の構成要素は強力に電荷された分子である。多くの場合には、ターゲット物質はすでに下記の望ましい性質を持っているのでカップリングは必要ではない。すなわち、ａ）固定化、ｂ）蛍光、もしくはｃ）電荷。その他の場合には、化学的もしくは物理的カップリングが必要である。
【０２３０】
親和性分離において利用される固定されたもしくは標識された類似体を準備するために利用される実際上のターゲット物質は必要ではない。むしろ、ターゲット物質の中の適当に反応する類似体がより以上に便利かも知れない。反応する機能的グループを持っていないところのターゲット物質は、ハロゲンのような強力な試薬液の利用をとうして一つの反応する機能グループをまず生成することによって固定化することができるかも知れない。ある場合には、事実上のターゲット物質の反応的グループが、乱されることなく存在させられたターゲット分子の一部を占領しているかも知れない。その場合には、付加の機能的なグループが合成化学によって導入されるかも知れない。
【０２３１】
固定化の一般的な方法として、二つの方法が広範に利用されている。第一の方法は、興味ある化合物をビオチン化（biotinylate）することである。それからビオチン化された誘導物を固定化されたアビディンに結合する。第二の方法は、ターゲット物質に抗体を生成し、様々な方法で抗体を固定化し、それからターゲット物質を固定化された抗体に結合することである。抗体の利用はより大型のターゲット物質のために適当である。小型ターゲット（たとえば、１０もしくはそれ以下の非水素原子からなるもの）は、抗体によって完全に覆没されてしまうので、ほんの少量のターゲットがターゲット抗体合成物に晒される。
【０２３２】
抗体に依存しない疎水性分子の非共有固定化もまた利用され得るかも知れない。２、３、３−トリメチールデカンのような化合物は、アルギン酸ナトリウムのようなマトリックス前駆物質と混合され、そしてその混合物は硬化用の溶液まで押し出される。その結果として生成されたビーズは、２，３，３−トリメチールデカンを全体に散布され、そして表面に晒されている。
【０２３３】
他の固定化の方法は、特殊化学的機能性の存在に依存している。一つのポリペプチドは−ＮＨ2  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ；Ｌｙｓｉｎｅｓ）、−ＣＯＯＨ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ；Ａｓｐａｒｔｉｃ  Ａｃｉｄｓ；Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄｓ、−ＯＨ（Ｓｅｒｉｎｅｓ；Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅｓ；Ｔｙｒｏｓｉｎｅｓ）、そして−ＳＨ（Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）を表示する。アミノ酸のサイド鎖の反応性に関しては、ＣＲＥＩ８４参照のこと。一つの多糖類は、糖のバックボーンを持っているＤＮＡがそうであるように、遊離した−ＯＨグループを持っている。
【０２３４】
支持物質として利用される適当なマトリックスには、ポリスチレン、ガラス、アガローズ、そしてその他のクロマトグラフィの支持物が含まれ、そしてそれらはビーズ、シート、コラム、ウエル、そしてその他の望ましい形態に生成される。
選択工程の初期の段階で、ターゲット物質の比較的高度の集中が結合を容易にするためにマトリックスに利用され、ターゲット集中は、後に削減されて、より高度の親和性ＳＢＤｓが選ばれる。
【０２３５】
Ｖ．Ｅ．より低い親和性のＰＢＤを支えている遺伝子パッケージの溶出
遺伝子パッケージ集団は、タンパク質結合のために利用される予定だったものと互換され得る状態の下で親和性マトリックスに適用される、そしてその集団は、カラム上いくらかの溶質のグラジエントの推移によって画分される。ターゲットに対する親和性を持っているＰＢＤｓのためにプロセスは濃縮され、そしてそのために、ターゲットに対する親和性が、利用された溶質によってより少なく影響される。濃縮された画分は、溶出物がより大きく集中されてカラムから溶出する可変の遺伝子パッケージを含んでいるものである。
【０２３６】
溶出物は、提示されたＰＢＤｓと固定化されたターゲット物質間の非共有相互作用を弱めることができる。のぞましくは、溶出物が遺伝子パッケージを破壊しないこと、そして成功裡のミニタンパク質を対応している遺伝子メッセージが、ＰＣＲのような試験管内の方法によるよりもむしろ遺伝子パッケージを再生産することによって最も都合よく増幅されることである。ポテンシャルな溶出物のリストには、塩（Ｎａ＋、ＮＨ4＋、Ｒｂ＋、ＳＯ4−−、クエン酸塩、Ｋ＋、Ｌｉ＋、Ｃｓ＋、ＨＳＯ4−、ＣＯ3−−、Ｃａ＋＋、Ｓｒ＋＋、Ｃｌ−、ＰＯ4−−−、ＨＣＯ3−、Ｍｇ＋＋、Ｂａ＋＋，Ｂｒ−、ＨＰＯ4−−そして酢酸塩）、酸、熱、ターゲットと結合すると知られている化合物、そして水溶性ターゲット物質（もしくはその類似物質）が含まれている。
【０２３７】
溶出されない遺伝子パッケージは、溶出状態に抵抗するターゲット物質のために十分に高い親和性を持っている結合ドメインをコードしているＤＮＡを含んでいる。そのような成功裡の結合ドメインをコードしているＤＮＡは、様々な方法で回収し得る。望ましくは、結合遺伝子パッケージは、溶出状態の変化によって容易に溶出される。代替的に、現場で遺伝子パッケージを培養することができるかも知れない。もしくはフェノール（もしくは他の適当な溶剤）を持ったマトリックスでターゲットに含まれているものを抽出し、そしてＰＣＲによるＤＮＡもしくは組み替え型ＤＮＡ技術によるＤＮＡを増幅することができるかも知れない。さらに、特定のプロテアーゼのためのサイトが提示ベクターの中に操作されている場合には、特定のプロテアーゼは遺伝子パッケージからの結合ドメインを裂開するために利用される。
マトリックスその他に対する非特異の結合は、親和性分離技術の中でよく知られている技術によって識別され、もしくは還元されるかも知れない。
【０２３８】
Ｖ．Ｆ．パッケージの回収
親和性カラムへの結合を提示しているパッケージの回収は、いくつかの方法で成し遂げることができるだろう。すなわち、
１）上記のようにグラジエントでカラムから溶出した画分を集めること。カラムに対する高度の親和性を持ったＰＢＤｓをコードしている遺伝子のためにより濃縮された遺伝子パッケージを含んでいるグラジエントの中に後で溶出している画分を集めること。
２）水溶液の形でターゲット物質をカラムを溶出する。
３）栄養媒体を持ったマトリックスを水に浸し、そして現場で望ましいパッケージを育てる。
４）マトリックスの部分を削除し、そして成長媒体を接種するためにそれらを利用する。
５）ターゲットをマトリックスに接着しているつながりを化学的もしくは酵素的に劣化するので、ターゲットに結合している遺伝子パッケージはさらに溶出する、もしくは
６）パッケージを劣化し、そしてフェノールもしくは他の適当な溶剤でＤＮＡを回収する。回収されたＤＮＡは遺伝子パッケージを再生する細胞を変換するために利用される。
【０２３９】
上述の方法を組み合わせて利用することができる。親和性マトリックスから回収したいものは、遺伝子パッケージそのものではなく、その中にある情報である。生存能力を持った遺伝子パッケージの回収が強く望まれるが、遺伝子物質の回収が重要なのである。細胞、胞子、もしくはビリオンが逆戻り出来ないようにマトリックスと結合しているが、破壊されていない場合には現場の細胞分割、萌芽、もしくは感染をとうして情報を回収することができる。パッケージのタンパク質分解退化とＤＮＡ回収はのぞましくない。
【０２４０】
Ｖ．Ｇ．濃縮されたパッケージの増幅
選択された結合形質を持った生命力のある遺伝子パッケージは、適当な媒体での培養によって増幅される、もしくは、ファージの場合には、そのように培養された宿主に感染する。遺伝子パッケージがクロマトグラフィによって不活性化された場合には、ｏｓｐ−ｐｂｄ遺伝子を担っているＯＣＶは、遺伝子パッケージから回収され、そして新しい、生命力を持った宿主に導入される。
【０２４１】
Ｖ．Ｈ．推定ＳＢＤｓの特徴：
一つのもしくはそれ以上のクローンの分離されたもののために、ｏｓｐ断片なしに、各々のＳＢＤが一つの遊離したタンパク質として生産され得るような発現ベクターの中にｓｂｄ遺伝子断片をサブクローンするかも知れない。結合の強さの物理的測定は、適当な方法によって各々遊離したＳＢＤタンパク質のためにできるかも知れない。
結合がまだ十分ではないと分かった場合には、次を変換するＳＢＤ（新しいＰＰＢＤ）の残基を決定する。結合が十分である場合には、新規の望ましい結合タンパク質をコードしている遺伝子を支えている発現ベクターをもつことになる。
【０２４２】
Ｖ．Ｉ．合同選択：
物質Ａと結合するが物質Ｂとは結合しない分子、もしくは物質ＡとＢ両方に結合する分子、どちらでも代替的にもしくは同時に結合する分子の選択に関して記述した方法の親和性分離を調整しても良い。
【０２４３】
Ｖ．Ｊ．アンタゴニスト技術
一つの酵素もしくは受容者に対するアンタゴニストを用意することは望ましいことだろう。天然の基剤もしくは作用物質か、活性サイトに達することを妨げている分子を生成することによって成し遂げられる。活性サイトに直接結合する分子は、作用物質かアンタゴニストであるだろう。このようにして、下記の戦略を採用した。酵素と受容者を指定物質ＴＥＲ（ターゲット酵素もしくはレセプター）の下であると考えている。
【０２４４】
大多数のＴＥＲｓのために活性サイトを封鎖する化学的インヒビターが存在する。通常これらの化学薬剤は、高度な毒性のために研究の道具としてのみ有用である。二つの親和性マトリックスを用意した。すなわち、一つは活性ＴＥＲを、他の一つは封鎖されたＴＥＲを利用した。変化された遺伝子パッケージ（ＰＢＤ）ｓの集団をつくり、酵素の両方の型に結合するＳＢＰｓを選択し、それによって、活性サイトと結合しないＳＤＰｓを入手した。ＳＢＤｓは酵素表面の異なった部位との結合を発見するだろうと期待している。一対のｓｂｄ遺伝子は一つの介入しているペプチド  セグメントと融合している。たとえば、ＳＢＤ−１とＳＢＤ−２はターゲット酵素に対して高度の親和性を示している結合ドメインであり、そしてそのために結合は競争的ではなく、その遺伝子ｓｂｄ−１：：ｌｉｎｋｅｒ：：ｓｂｄ−２は、ターゲットに対して高度の親和制示すだろう一つの２−ドメインをコードしている。様々なＳＢＤｓと様々なリンカーを持っているいくつかの融合を生成する。そのような化合物は、ターゲット酵素に対して一つの敵対物質であるという理論的な確立性を持っている。
【０２４５】
ＶＩ．成功する結合ドメイン及び対応ＤＮＡの開発
ＳＢＤは組替型ＤＮＡ技術で生成し得るが、一つのＩＰＢＤとしてミニタンパク質利用から本来付与されている利点は、誘導されたＳＢＤがまたミニタンパク質のように行動するだろう、そして化学的合成に手段で入手し得るだろうということである。（「化学的合成」という言葉は、ここで使われているように、細胞なしの環境での酵素剤の使用も含まれている。）
【０２４６】
この発明の方法を利用することによって得られるミニタンパク質は、天然には発生していないアミノ酸そしてアミノ酸以外のグループを含んでいる一連の同族体のための先導化合物として考えられることを理解しなければならない。たとえば、一連のメンバーの各々は、そのＤ鏡像異性体によって置換された一つのアミノ酸を持っている一連の同族体を合成することができる。また、ベータ  アラニン、アミノ酪酸、３−ヒドロキシプロリン、２−アミノアジピン酸、Ｎ−エチルアスーラジン、ノルバリン、その他のような構成要素を含んでいる同族体を生成することができる、そしてそれらは、安定性や毒性などのような興味ある結合そして他の特質のためにテストされ得るだろう。
【０２４７】
ペプチドは、溶液もしくは支持物質の中で化学的に合成されるかもしれない。段階的な合成を断片縮合の様々な組み合わせが利用され得るだろう。
合成作用中は、アミノ酸サイド鎖は分枝を回避するよう保護することが望ましい。いくつかの異なった保護基が、システインのチオールグループの保護のために有用である。それらは下記を含む。すなわち、
１）４−メトキシベンジル（ＭＢｚ１；Ｍｏｂ）（NISH82；ZAFA88）、ＨＦで除去し得る。
２）アセタミドメチル（Ａｃｍ）（NISH82；NISH86；BECK89c）、ヨードで除去し得る。水銀イオン（すなわち、水銀アセテート）。硝酸銀。そして
３）Ｓ−ｐａｒａ−メトキシベンジル（HOUG84）。
【０２４８】
他のチオール保護基は、Greeneの「有機合成における保護グループ」（1981）のような標準の文献著作の中で見つけられる。
【０２４９】
ポリペプチド鎖が一度合成されるとジスルフィド結合も形成されなければならない。可能な酸化剤は、空気（HOUGH84；NISH86）フェリシアン化合物（NISH82；HOUG84）、ヨード（NISH82）、そして過ギ酸（HOUG84）である。温度、ｐＨ、溶液、そしてカオトロピーの化学物質は、酸化工程に影響を及ぼすかもしれない。
【０２５０】
複数のジスルフィド結合をもった大多数のミクロタンパク質は、生物学的に活性のある形で化学的に合成されている。それらは下記を含む。すなわち、コノトキシンＧ１（１３ＡＡ、４Ｃｙｓ）（NISH82）、熱安定エンテロトマシンＳＴ（１８ＡＡ、６Ｃｙｓ）（HOUG84）、ＳＴの擬似体（BHAT86）、オメガーコノトキシンＧＶＩＡ（２７ＡＡ、６Ｃｙｓ）（NISH82；RIVI87b）、オメガーコノトキシンＭＶＩＩＡ（２７ＡＡ、６Ｃｙｓ）（OLIV87b）、アルファーコノトキシンＳＩ（１３ＡＡ、４Ｃｙｓ）（ZAFA88）、ミューコノトキシンＩＩＩａ（２２ＡＡ、６Ｃｙｓ）（BECK89c；CRUZ89；HATA90）を含む。時として、ポリペプチドは自然に折り畳まれているので、正しいジスルフィド結合を形成する。他の時には、各一対のシステインのために、異なった除去可能な保護グループの利用によって助力しなければならない。
【０２５１】
この発明による成功結合ドメインは、大型タンパク質を単独でもしくは部分として、ターゲット物質の単離もしくは検出を含んだ目的、結合タンパク質が適当であることを確かめるための目的のために利用される。この目的をさらに助長するためには、新規な結合タンパク質が直接的にもしくは間接的に共有的に、もしくは非共有的に、ラベルに、担体に、もしくは支持体に結合され得るかもしれない。
【０２５２】
薬剤として利用される場合には、新規な結合タンパク質は、適当な担体、もしくは補助剤と混合されても良い。
【０２５３】
例１
Ａクラスミクロタンパク質のデザインおよび突然変異誘発物質
単一のジスルフィドによって配座が拘束された結合ドメインのライブラリーを入手するためには、下記のミクロタンパク質属をコードしているＤＮＡを適当なＯＳＰをコードしている遺伝子に挿入する。すなわち、
Ｘ１−Ｃ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｃ−Ｘ６
｜ ｜
｜ ｜部分がジスルフィド結合を表示している。ジスルフィドは通常ポリペプチド鎖に連続しているシステイン間には形成されない。上記にＸｎで表示された残基の一つもしくはそれ以上は新規な結合を手に入れるために大きく換えられている。Ｘ１を前置にする、もしくはそれ以上のアミノ酸がある、しかしながら、Ｘ１の前もしくはＸ６の後の残基は、図表に表わされたジスルフィド橋によって意義深くは拘束されない、そしてこれらの遠隔の橋のない残基を換えることは有利ではない。最後のＸ残基は、遺伝子パッケージのＯＳＰと連結されている。
【０２５４】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、そしてＸ６は独立して変換され得る、すなわち、変化の一つの異なったスキームが各部位で利用されることができる。Ｘ１そしてＸ６は最小限に拘束された残基であり、他の部位より変化が少ない。
【０２５５】
Ｘ１とＸ６は、例えば、アミノ酸（Ｅ、Ｋ、Ｔ、そしてＡ）の一つになることができ、このセットのアミノ酸は下記の理由のために望ましいものである。すなわち、
ａ）正電荷の、負電荷の、そして中性のアミノ酸の可能性が供給されている、
ｂ）これらのアミノ酸は、コドンＲＭＧ（Ｒ＝等モルのＡとＧ、Ｍ＝等モルのＡとＣ）
そして
ｃ）これらのアミノ酸はシグナルぺプチターゼによって適切な工程が許容される。
【０２５６】
一つの望ましい実験例では、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４そしてＸ５は、代替セット（Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、そしてＧ）をコードしているコドンＮＮＴによって各々コードされることにより初めて変化される。
【０２５７】
ＮＮＴコドンよりＮＮＴコドンの方が有利であることは、換えられたコドンの数が増加するに従って徐々にはっきりしてくるからである。五つのコドンがＮＮＴコドンかＮＮＫコドンかのいずれかによって換えられたライブラリーを表８から１２（元の表番号１０）と表１４から２１（元の表番号１３０）で比較してある。ＮＮＴは１５の異なったアミノ酸をコードし、たった１６のＤＮＡ配列をコードしている。このようにして、１．１３９・１０７のアミノ酸配列、ストップなし、そしてたった１．６７８・１０７のＤＮＡ配列がある。１０８の独立した変換体のライブラリーは、全可能性配列の９９パーセントを含んでいる。ＮＮＫライブラリーは、６．４・１０７配列を含んでいるが、完全なサンプリングはもっと多数の独立した変換体を必要とする。
【０２５８】
この配列は、天然のＭ１３遺伝子ＩＩＩプロモーターとシグナル配列を利用してＭ１３の遺伝子ＩＩＩタンパク質との融合として提示される。残基１６から２３までのＭ１３遺伝子ＩＩＩタンパク質の配列は、Ｓ１６ＨＳＡＥＴＶＥ２３であり、シグナルぺプチターゼ−ＩがＳ１６の後を裂開する。このセグメントは下記と置換される。すなわち、
Ｓ１６ＧＡ１８ＡＥＧＸ１ＣＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＣＸ６ＳＹＩＥＧＲＶＩＥＴＶＥ。
【０２５９】
Ｈ１７Ｓ１８がＧＡと換えられていることは感染のためのファージを拘束していないということに注意してください。ＰＢＤと成熟したＩＩＩタンパク質問に一つのボビンＦ．Ｘａ認識／裂開サイト（ＹＩＥＧＲ／ＶＩ）を挿入することは有用である。これはＰＢＤに対する位置決めの自由を許容するのみならず、遺伝子パッケージからのＰＢＤの裂開をも許容する。
【０２６０】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ５、そしてＸ６が、ＮＮＴ（Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｖ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、そしてＧを許容している）によってコードされている一つのファージライブラリー、そしてＸ３とＸ４が、ＮＮＧ（Ｌ、Ｓ、Ｗ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｍ、Ｔ、Ｋ、Ｖ、Ａ、Ｅ、そしてＧを許容している）によってコードされている一つのファージライブラリーは、ＴＮ２と名付けられている。このライブラリーは、およそ１．５×１０７ＤＮＡ配列によってコードされているおよそ８．５５×１０６ミクロタンパク質を提示する。ＮＮＧは、これらの第三と第四の部位で少なくとも部分的にシステイン可能性を排除するために、第三と第四の可変部位（ジスルフィドが閉じ込められたループの中央部位）で利用される。
【０２６１】
Devlinらは１０７変換体を篩い分けた。その各々は、ストレプトアビジンをもった親和性のための１０１２ランダムペンタデカペプチドを提示し得る。そして彼等は、八つのユニークな配列（「Ａ」−「Ｉ」）を持った２０のストレプトアビジン結合ファージ単離物質を発見した。全単離物質はＨＰ；１５／２０、ＨＰＱ；そして６／２０、ＨＰＱＦを含んでいたが、それらはペンタデカペプチド内の異なった部位にあった。最も頻繁に出合った単離物質は、システインが完全に欠けているＤ（５）、Ｉ（４）、そしてＡ（３）であった。しかしながら、二つのプラスの単離物質、「Ｅ」（１）と「Ｆ」（２）は、一対の配置されたシステインが含まれていたので、ジスルフィド結合の形成が可能であった。これらの単離物質の配列は、表２９（元の表番号８２０）に示されている。
【０２６２】
ＴＮ２ライブラリーは、ストレプトアビジン結合活動発現の可能性を持っているために、Devlinの「Ｅ」そして「Ｆ」に極めて類似している一つの推定のミクロタンパク質、ＨＰＱを入れるべきだったことを認識している。ＨＰＱは、ＴＮ２ライブラリーの全メンバーに共通のＡＥＧアミノ酸終端配列から成っており、四つのスパンでジスルフィド橋を形成し得る可能性を持っている配列ＰＣＨＰＱＦＣＱによって随従され、一つのセリン（Ｓ）と一つのボビン因子Ｘａ認識サイトによって随従される。（ＹＩＥＧＲ／ＩＶ）（表２９（元の表番号８２０）参照のこと）。パイロット実験は、ストレプトアビジンとＨＰＱを担っているファージとの結合がDevilinの「Ｆ」単離物質のそれと比べ得るものであり、両方ともそのマージンはバックグラウンド（１．７×）の上にあった。したがって、固定されたストレプトアビジンに対するＴＮ２のライブラリーを篩にかけた。
【０２６３】
ストレプトアビジンは、１ｍｇにつき、特殊な活動１４．６ユニット（１ユニットは、１μｇのバイオチンを結合する）を持った遊離タンパク質（Pierce）として利用し得る。０．０１パーセントのアジ化物を含んでいるＰＢＳにおいて１ｍｌに付き１ｍｇのストック溶液が作られる。ＳｔｒＡｖストックの１００μｌが、１ｍｍｕｌｏｎ（＃４）プレートの２５０μｌ容積のウエルに付加され、摂氏４度で一晩培養される。ストックは除去され、そして１ｍｇ／ｍＬの濃度でＢＳＡを含んでいるＰＢＳの２５０μｌと置換され、そしてさらに１時間摂氏４度で保たれる。ファージ結合アッセイの中で利用する前に、ウエルは、０．１パーセントのツイーン（tween）を含んでいるＰＢＳの２５０μＬで５回手早く洗浄する。
【０２６４】
各ＳｔｒＡｖが塗布されたウエルに、一つの知られた量（ＴＮ２ライブラリーの１０１１ｐｆｕ’ｓ）のファージを含んだ１００μｌの結合緩衝液を加える。室温で１時間培養を続け、その後、非結合ファージを除去し、０．１％ツイーンＰＢＳで手早く１０回洗浄する。それからさらに、ＰＨが７、６、と５のクエン酸緩衝液で洗浄して、非特殊な結合を除去する。結合ファージは、ｍＬ  ＢＳＡに付き１ｍｇと１ＭトリスｐＨ８の６０μｌを持った中和剤とを含んでいる２５０μｌのｐＨ２クエン酸緩衝液で溶出させる。溶出物は、結合、洗浄、そして溶出のその後のラウンドに利用される新規のファージストックを生成するバクテリア細胞に感染させるために利用された。能力強化サイクルは、さらに３度繰り返され（全部で３度）、その後多数の個々のファージはクローンの単離物として配列に加えられ、またテストされた。各ステップに存在するファージの数は、適当に希釈され、E. coliを含んでいるＦ’のローンにプレートされて、プラーク形成ユニット（ｐｆｕ’ｓ）として決定される。
【０２６５】
表３０（元の表番号８３８）は、ＳｔｒＡｖに結合するために発見されたペプチド配列と最後の（ラウンド３）ファージプールから取られたランダムピックの頻繁度を示している。
【０２６６】
検査された全推定ミクロタンパク質のインターシステインセグメントは、ＨＰＱモチーフを含んでいた。最初のシステイン前の可変残基は、｛Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ｝のいずれかを含むことができた。選択された残基は｛Ｙ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｎ｝であった、そしてファージＨＰＱはＰを持っている。第二システイン後の可変残基もまた｛Ｆ、Ｓ、Ｙ、Ｃ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｄ、Ｇ｝を持つことができた。選択された残基は｛Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｖ｝であった、そしてファージＨＰＱはＱを持っている。比較的よくない結合ファージＨＰＱは多分Ｐ４もしくはＱ１３もしくはその両方のためかも知れない。
【０２６７】
対照実験において、ＴＮ２ライブラリーは、上記に示された同一の方法でスクリーンされた、そしてそれは、封鎖エージェントＢＳＡであるターゲットタンパク質を持っている。結合、融合、そして増幅の三つのラウンドの後、１６のランダムファージプラックが選取され、配列された。半数のクローンには挿入（８／１６）が見られなかった。そして残余のものには、表３１（元の表番号８３９）に示されている配列があった。このコレクションにはなんのコンセンサスもない。
【０２６８】
ファージに関連性を持ったミクロタンパク質、ＨＰＱ６を提示した。ＣＨＰＱＦＣのＣＨＰＱＦＰＲＣとの交替を除いては、それはＨＰＱと同一である（表２９（元の表番号８２０）を参殿のこと）。提示された場合、ＨＰＱ６は、ＨＰＱもしくはDevlinの「Ｆ」単離体のいずれよりもストレプトアビジンに対するより実質的に強力な親和性を持っていた。（Devilinの「Ｅ」単離体は研究されなかった。）ジチオスレイトル（ｄｉｔｈｉｏ−ｔｈｒｅｉｔｏｌ）（ＤＴＴ）での操作は、ストレプトアビジンとのＨＰＱ６ファージ結合（しかしファージをコントロールしていない）を著しく減少した、そしてそれは提示されたペプチドの中に存在する一つのジスルフィド橋は、良い結合に必要であるということを示唆している。ＴＮ２ライブラリーのスクリーニングの結果を検討して、ファージＨＰＱ６の結合は、Ｐ４を｛Ｙ、Ｈ、Ｌ、Ｄ、Ｎ｝の一つと代替することによって、もしくはＱ１３を｛Ｐ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｖ｝の一つと代替することによってさらに改善され得るだろう。
【０２６９】
例ＩＩ
Ａ  ＣＨＳ：：ＨＥＬＩＸ：：ＴＵＲＮ：：ＳＴＲＡＮＤ：：ＣＹＳ  ＵＮＩＴ
親クラス２ミクロタンパク賃は、多分天然に発生しているクラス２ミクロタンパク質である。それはまた、クラス２のミクロタンパク質の基準を満足させるために、その構造が満足し、もしくは一部変更されるかも知れない一つの大型タンパク質のドメインであるかもしれない。一部変更は、一つのシステイン（もしくは一対のシステインを）ヘアピン構造のベースに導入するような簡単なものかも知れない、そしてそうすることによって、ヘアピンはジスルフィド結合で閉鎖されるであろう。もしくは、ヘアピン構造を達成するために、中間残基の一部変更に関して、もっと手の込んだ方法で閉鎖されるであろう。その親クラス２のミクロタンパク質もまた二つもしくはそれ以上の天然に発生しているタンパク質、すなわち、一つのタンパク質のアルファヘリッタスと第二のタンパク質のベータストランドからの構造の混成となるであろう。
【０２７０】
一つのポテンシャルな利用法のミクロタンパク質モチーフは、各一つのヘリックス、ターン、リターンのストランドを取り囲んでいるジスルフィドのループ構成することである。そのような構造はデザインされ得るし、もしくは既知の三次元構造のタンパク質から入手することができるだろう。サソリの神経毒素、変形物質３、（ALMA83a、ALMA83b）（以後ＳｃｏｒｐＴｘと称する）は、図１に示されている構造を含んでいる、そしてそれは一つのヘリッタス（残基Ｎ２２からＮ３３まで）、一つのターン（残基３３から３５まで）、そして一つのリターン（残基３６から４１まで）から成っている。ＳｃｏｒｐＴｘは、残基１２−６５、１６−４１、２５−４６、そして２９−４８を接続するジスルフィドを含んでいる。ＣＹＳ２５そしてＣＹＳ４１は、非常に近く、主鎖を乱すことなくジスルフィドによって結合され得る。図１はＣＹＳ２５とＣＹＳ４１との結合を示している。さらに、ＣＹＳ２９は、ＧＬＮに換えられている。
【０２７１】
一つのジスルフィドは、２５から４１までの間を形成し、そして示されているヘリックスは形成すると期待している。示されているアミノ酸配列は、この構造と高度な適合性を持っている。ＧＬＹ３５、ＧＬＹ３６、そしてＧＬＹ３９の存在は、ジスルフィド形成のためにＣＹＳ４１の周りで必要である変化の便宜を図るために、ターンそして引き伸ばされたストランドに十分な可撓性を与えている。
【０２７２】
この構造の検査から（Brookhaven Protein Data Bankの1SN3に見いだされるように）、下記の残基のセットは変化のために望ましいものであろうと考える。即ち、
【表２】
2010183908.tif 000005
【０２７３】
ポジション２７、２８、３１、３２、２４、そして２３は、ヘリックスの一面を構成している。これらの各々の部位において、下記の変化しているコドンを拾いあげた。すなわち、ａ）親のアミノ酸を含んでいるもの、ｂ）ヘリックスが望ましくしている残基の優位性を持っている残基のセットを含んでいるもの、ｃ）広範な種類のアミノ酸を提供しているもの、そしてｄ）できるだけ平均した分布に導くもの。ポジション３４は、ターンの部分である。残基３４のサイドグループは、残基２７、２８、３１、３２、２４そして２３のサイドグループと接触する分子と相互作用し得る。このようにして、ここに変化を許容し、そしてターンと適合性のあるアミノ酸を提供する。示された変化は、８．８５・１０６ＤＮＡ配列によってコードされた６．６５・１０６３アミノ酸配列に導く。
【表３】
2010183908.tif 000006
【０２７４】
ポジション２６、２７、３０、３１、そして３２は、集団の中のヘリックス好意的アミノ酸の能力強化を図るために換えられる。残基３７と３８は、リターン  ストランドの中にあるので、他の変化コドンを採用する。この変化は４．４３・１０６３アミノ酸配列と７．０８・１０６ＤＮＡ配列を許容するこのようにして、このスキームを具体化する一つのライブラリーは、すこぶる効果的にサンプルを取ることができる。
【０２７５】
例ＩＩＩ
クラス３ミクロタンパク質のデザインと突然変異誘発物質
二つのジスルフイド結合を持った親ミクロタンパク質
二つのジスルフイド結合を持ったミクロタンパク質は、αコノトキシン、すなわち、ＧＩ、ＧＩＡ、ＧＩＩ、ＭＩ、そしてＳＩをモデルとすることができるかも知れない。これらは、下記の保存された構造を持っている。すなわち、
【化２】
2010183908.tif 000007
【０２７６】
Hashimotoら（HASH85）は、αコノトキシンＧＩ、ＧＩＩ、そしてＭＩの２４の類似体の合成について報告している。ＧＩ（ポジション２、３、７、そして１３にあるＣＹＳ）のための番号付けのスキームを利用して、橋本らは、タンパク質が毒性になることを許容する４、８、１０、そして１２での改変を報告している。Almquistら（ALMQ89）は、（ｄｅｓ−ＧＬＵ１）αコノトキシンＧＩと２０の類似体を合成した。彼等は、ＰＲＯ５の代わりにＧＬＹを代替して、二つの異性体、多分異なったジスルフィド結合に関連しているもの、を立ち上がらせたと報告した。彼等は、タンパク質が毒性であることを許容したいくつかの代替物質を残基８から１１までの間で発見した。Zafarallaら8ZAFA88）は、ポジション９におけるＰＲＯ代替は活性タンパク質を提供するということを発見した。引用された各々のグループは化学反応のためにアッセイとして生体内毒性飲みを利用した。そのような研究から、活性タンパク質は親の三次元構造を持っているということは推論できるが、不活性のタンパク質親の三次元構造に欠けているということは推論できない。
【０２７７】
Pardiら（PARD89）は、アルファコノトキシンＧＩはＮＭＲによってベノム（venom）から入手できると断定した。小林ら、（KOBA89）は，ＭＭＲからの合成アルファコノトキシンＧＩ三次元構造を報告した、このデータはPARD89のデータを合致している。Pardiらの図５を引用している。
【０２７８】
残基ＧＬＵ１は、既知の類似体もしくは同族体のＧＬＵ、ＡＲＧ、そしてＩＬＥの便宜を図ることで知られている。望ましい変化コドンは、アミノ酸セット（Ｌ２Ｒ２ＭＶＳＰＴＡＱＫＥＷＧ＜ストップ＞）を許容するＮＮＧである。Pardiらの図５から、ＧＬＵｌのサイドグループは、残基９から１２までから成るストランドとして同一の領域に投影するということが分かる。残基２と３はシステインであり、変化されることはない。残基４のサイドグループは、残基９から１２までから（point away）（注意をそらせる）する。このようにして、後続のラウンドまでこの残基変換を据え置く。ＰＲＯ５は、適切なジスルフィドが形成されるための原因になる必要があるかも知れない。ＧＬＹが代替された場合には、ペプチドはここで二つの形態に織り込まれるが、いずれにも毒性はない。ＰＲＯ５が変換することを許容されるが、第１ラウンドではのぞましく考えられない。
【０２７９】
ＡＬＡ６における置換は報告されていない。一つの望ましいコドンはＡＬＡ、ＴＨＲ、ＬＹＳ、そしてＧＬＵ（小型疎水性物質、小型親水性物質、プラス、そしてマイナス）を生じるＲＭＧである。ＣＹＳ７は変換しない。ＡＬＡ８を持っている同族体タンパク質には毒性があるが、ＧＬＹ８はそのまま残しておくことを望む。ポジション９の種々アミノ酸を持っている同族体タンパク質には毒性がある。このようにして、ＦＳ２ＹＣＬＰＨＲＩＴＮＶＺＤＧを許容する一つのＮＮＴ変化コドンを利用する。第四ＣＹＳの後ポジション１４で、ＡＬＡ、ＴＨＲ、ＬＹＳ、もしくはＧＬＵ（ＲＭＧコドン経由で）を許容する。この変化は、１．６８・１０７ＤＮＡ配列によってコードされた１．０５３・１０７アミノ酸配列を許容する。２．０・１０７、３．０・１０７、そして５．０・１０７の独立した変換体を持っているライブラリーは、各々許容された配列のほぼ７０パーセント、ほぼ８３パーセント、そしてほぼ９５パーセントを提示するだろう。他の変化もまた適当である。αコノトキシンに関しては、特にALMQ89、CRVZ85、GRAY83、GRAY84、そしてPARD89を参照のこと。
【０２８０】
親のミクロタンパク質は、Peaseら（PEAS90）によって指定された「ハイブリッドＩ」そして「ハイブリッドＩＩ」のタンパク質の一つを代替し得るかも知れない。PEAS90の図４と比較すること。いずれのタンパク質のためにも変わる残基の望ましいセットの一つは、下記から成るものである。すなわち、
【表４】
2010183908.tif 000008
これは、１．２６・１０７ＤＮＡ配列によってコードされた９．５５・１０６アミノ酸配列を提供する。５．０・１０７変換体から成っている一つのライブラリーは、全可能配列の９８．２パーセントの発現を許容する。各々の部位において、親アミノ酸は許容される。
【０２８１】
ポジション５で、一つのターンと互換性を持つアミノ酸を提供する。ポジション６で、ＩＬＥとＶＡＬは枝分かれしたベータ炭素を持て、そして鎖をうねにしている理由から、ＩＬＥとＶＡＬを許容する。ポジション７で、ヘリックスのアミノ酸終端でしばしば発現するＡＳＰ、ＡＳＮ。そしてＳＥＲを許容する。ポジション８と９で、ヘリックス固有の部分であるという理由で、異なっている電荷と疎水生物（hydrophobicities）を持っているいくつかのヘリッタス友好アミノ酸（ＡＬＡ、ＬＥＵ、ＭＥＴ、ＧＬＮ、ＧＬＵ、そしてＬＹＳ）を許容する。ポジション１０はヘリックスのずっと離れた端にあるので、小型セット（ＡＬＡ、ＴＨＲ、ＬＹＳ、そしてＧＬＵ）を許容する。このセットは、三つのヘリックス友好アミノ酸、並びに、極めてよく許容されているが、プラス、マイナス、中性の親和性を許容するＴＨＲを含んでいる。１２と１６のサイドグループは、既に記述された残基として同一の領域の中に投射する。これらの部位において、ヘリックスに友好的なアミノ酸に対してゆがみを持っている多種多様なアミノ駿を許容する。
【０２８２】
親のミクロタンパク質は、残基９−２４そして３１−４０のアプロチニン（aprotinin）から成り、そして二つのジスルフィド（Ｃｙｓ９−Ｃｙｓ２２そしてＣｙｓ１４−Ｃｙｓ３８）を持っている一つのポリペプチドと代替されても良いだろう。そのようなポリペプチドは、アルファコノトキシンのような同じジスルフィド結合位相を持っており、そしてその二つの橋は各々１２と１７のスパンを持っているものである。
【０２８３】
残基２３、２４、そして３１は、アミノ酸残基セット（Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｒ、Ｔ、Ａ）をコードするために変化されるので、必要な幾何学のターンを好む一つの配列が発見される。Ｐｌ領域におけるＢＰＴＩに類似した安定した構造の中に折り畳まれているミクロタンパク質を提示している遺伝子パッケージを豊かにする親和性分子をしてトリプシンもしくは無水性トリプシンを利用する。
【０２８４】
三つのジスルフィド結合親ミクロタンパク質
イモガイ（cone snail）（Conus）は、長さが１０−３０アミノ酸で、そしてジスルフィド結合が特に豊かである毒性コノトキシン（conotoxins）を生成する、それらは、従って、原形のミクロタンパク質である。三つのジスルフィド結合を持った新規なミクロタンパク質は、ミュー（ＧＩＩＩＡ、ＧＩＩＩＢ、ＧＩＩＩＣ）もしくはオメガ（ＣＶＩＡ、ＧＶＩＢ、ＧＶＩＣ、ＧＶＩＩＡ、ＧＶＩＩＢ、ＭＶＩＩＡ、ＭＶＩＩＧその他）コノトキシンをモデルにすることができるだろう。ミューコノトキシンは下記の保存された構造を持っている、すなわち、
【化３】
2010183908.tif 000009
【０２８５】
μ-コノトキシンの非三次元構造はすでに開示されている。日高ら（HIDA90）は、ジスルフィドの関連性を樹立した。下記のダイアグラムは、ジオグラフトキシンＩ（geograph-toxinＩ）（ミューコノトキシンＧＩＩＩＡとしても知られている）を示す。
【化４】
2010183908.tif 000010
Ｒ１９からＣ２０までの接続はＱ１４からＣ１５までのストランドにいくことができる。一つの望ましい変化の形態は一つのループの残基を換えることである。最も長いループが５つのアミノ酸のみを含んでいるので、ループを形成しているシステインと接続している残基を換えることも適切である。たとえば、残基５から９、それに２、１１、１９、そして２２を加えて換えることができるかも知れない。もう一つの有用な変化は、残基１１−１４そして１６−１９を、８つのアミノ酸を通して、換えることであろう。μ―コノトキシンに関しては、BECK89b、BECK89c、CRUZ89、そしてHIDA90を参照のこと。
【０２８６】
Ω―コノトキシンは下記のように表示されるであろう。すなわち、
【化５】
2010183908.tif 000011
キングコングペプチドは、Ω―コノトキシンと同じジスルフィドの取り合わせを持っているが異なった生物学的活動を持っている。Woodwardら（WOOD90）は、C. textileから三つの同族体タンパク質の配列を報告している。成熟した毒素ドメイン内でシステインのみが保存されている。システインの面間隔は完全に保存されているが、他のポジションは三つの全配列の同一のアミノ酸を持っていない、そしてほんの少数のポジションが一対のようなものを示している。このようにして、全ポジションは（システインを除いて）一つの安定したジスルフィド構造を、形成するだろうところの高い可能性を持って自由に代替されるだろうと結論している。Ω―コノトキシンに関しては、HILL89とSUNＸ87を参照のこと。
【０２８７】
親の結合ドメインとして利用し得るかも知れない他のミクロタンパク質は、キューキュビットマキシマ（Cucurbit maxima）トリプシン阻害物質Ｉ（ＣＭＴＩ−Ｉ）である。ＣＭＴＩ−ＩＩＩもまた適当である。これらは夏南瓜、ズキーニ、そしてキュウリからの阻害物質を含んでいるカボチャ属のセリンプロテアーゼ阻害物質のメンバーである。（WIEC85）。McWherterら（MCWH89）は、ヒト白血球エラスターゼとカテプシンＧ．に対する親和性を持っているカボチャ種属プロテアーゼ阻害物質の合成配列された変形物質について記述している。勿論、この属のいかなるメンバーも利用され得るだろう。
【０２８８】
ＣＭＴＩ−Ｉは、三つのジスルフィド結合によって固定された配座の中に保持されている、たった２９のアミノ酸から成っていることが知られている最小タンパク質の一つである。その構造は、Ｘ線回折（BODE89）とＮＭＲ（HOLA89aとb）の両方を利用して、Bodeとその協力者達によって研究されている。ＣＭＴＩ−Ｉは俵状をしており、それはヘリッタスもしくはベータシートを持っていない、しかしそれはターンから成り、そして短いポリペプチドの延長で接続している。ジスルフィドのペアリングは、Ｃｙｓ３−Ｃｙｓ２０、Ｃｙｓ１０−Ｃｙｓ２２、そしてＣｙｓ１６−Ｃｙｓ２８である。Bodeらによって研究されたＣＭＴＩ−Ｉ：trypsin合成物の中で、２９の阻害物質残基のうち１３は、トリプシンと直接的な関連を持っている。それらの大多数は、化学反応サイト結合Ａｒｇ５（Ｐ１−）ＩＩｅ６を含んでいる重要な結合セグメントＶａ１２（Ｐ４）｝Ｇｌｕ９（Ｐ４’）の中に存在している、そして他のスリンプロテイナーゼ阻害物質にも見られた一つの配座一座の中に存在している。
【０２８９】
ＣＭＴＩ−Ｉは、ほぼ１．５・１０−１２Ｍのトリプシンのための一つのＫ１を持っている。McWherterらは、ＨＬＥ特殊性を授与するためにＰ１における「中程度に量の多い疎水性グループ」の代替物質を示唆した。彼等は、ＨＬＥに対する検出可能な結合を与える残基（ＨＡＬ、ＩＬＥ、ＬＥＵ、ＡＬＡ、ＰＨＥ、ＭＥＴ、そしてＧＬＹ）の広範なセットを発見した。カテプシンＧに関しては、彼等は、真に望ましい量の多い（特に芳香属Ｋ）サイドグループを予期していた。彼等は、ＰＨＥ、ＬＥＵ、ＭＥＴ、そしてＡＬＡがそれらの基準に従って機能的であることを発見した。彼等は、ＴＲＰ、ＴＬＲ、もしくはＨＩＳをテストしていない。（ＡＬＡは第二に小さい利用可能なサイドグループを持っているということに注意してください。）
【０２９０】
最初の望ましい変化戦略は、残基ＡＲＧ１、ＶＡＬ２、ＰＲＯ４、ＡＲＧ５、ＩＬＥ、ＬＥＵ７、ＭＥＴ８、ＧＬＵ９、ＬＹＳ１１、ＨＩＳ２５、ＧＬＹ２６、ＴＬＹ２７、そしてＧＬＹ２９の一部もしくは全部を換えることである。たとえば、ターゲットがＨＮＥである場合には、下記の可能性を持っているＤＮＡを合成することができる。すなわち、
【表５】
2010183908.tif 000012
これは、およそ１．０３・１０７ＤＮＡ配列によってコードされたほぼ５．８１・１０６アミノ酸を許容する。５．０・１０７の独立した変換体から成る一つの・ライブラリーは、可能性のある配列のほぼ９９パーセントを提供する。他の変化スキームもまた利用され得る。
これに属する他の阻害物質は下記を含んでいる。すなわち、
Citrullus vulgarisからのトリプシン阻害物質Ｉ（OTLE87）、
Bryonia dioicaからのトリプシン阻害物質ＩＩ（OTLE87）、
Cucurbita maximaからのトリプシン阻害物質Ｉ（OTLE87の）、
Cucurbita maximaからのトリプシン阻害物質ＩＩＩ（OTLE87の）、
Cucurbita maximaからのトリプシン阻害物質ＩＶ（OTLE87）、
Cucurbita pepoからのトリプシン阻害物質ＩＩ（OTLE87の）、
Cucurbita pepoからのトリプシン阻害物質ＩＩＩ（OTLE87の）、
Cucumis sativusからのトリプシン阻害物質ＩＩｂ（OTLE87の）、
Cucumis sativusからのトリプシン阻害物質ＩＶ（OTLE87の）、
Ecballiumelaterriumからのトリプシン阻害物質ＩＩ（FAVE89）
そして
Momordica repensからの阻害物質ＣＭ−１（OTLE87の）
【０２９１】
初期ポテンシャル結合ドメインとして利用され得る他のミクロタンパク質は、いくらかの腸内毒素誘発物質のE. coli、Citrobacter freundii、そしてその他のバクテリアから誘発された熱安定性をもった腸内毒素である。これらのミクロタンパク質は、E. coliから分泌されることが知られており、十分な安定性を持っている。これらのタンパク質の合成、クローニング、発現、そして特質に関しては、下記を参照すること。すなわち、BHAT86、SEKI85、SHIM87、TAKA85、THOM85aとb、YOSH85、DALL90、DWAR89、GARI87、GUZM89、GUZM90、HOUG84、KUBO89、KUPE90、OKAM87、OKAM88、そしてOKAM90。
【０２９２】
例ＩＶ
ＣＵ（ＩＩ）、一つのシステイン、二つのヒスチジン、そして一つのメチオニンから成る一つのクロスリンクを持っているミニタンパク質
下記のような配列は、すなわち、ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＧＬＹ−ＭＥＴ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＧＬＹ−ＣＹＳそしてＣＹＳ−ＡＳＮ−ＧＬＹ−ＭＥＴ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−ＨＩＳ−ＡＳＮ−ＧＬＹ−ＨＩＳは、ダイアグラムに示してあるような構造を形成するためにＣｕ（ＩＩ）との結合を容易にする。
【化６】
2010183908.tif 000013
【０２９３】
鎖に沿ってＨＩＳ、ＭＥＴ、ＨＩＳ、そしてＣＹＳの他の取り合わせもまた同様な構造を形成するようである。ポジション２と３そしてポジション１２と１３にあるアミノ酸ＡＳＮ−ＧＬＹは、それらが一緒になり、そして金属と結合するために十分な柔軟性を持った金属結合配位子を担っているアミノ酸を授与する。他の接続配列も利用し得るかも知れない、すなわち、ＧＬＹ−ＡＳＮ、ＳＥＲ−ＧＬＹ、ＧＬＹ−ＰＲＯ、ＧＬＹ−ＰＲＯ−ＧＬＹ、もしくはＰＲＯ−ＧＬＹ−ＡＳＮ利用し得るかもしれない。また、第一と第二もしくは第三と第四の金属結合さ残留期を結ぶループの中に一つもしくはそれ以上の残基を換えることも可能である。例えば、
【化７】
2010183908.tif 000014
Ｘａａ４で種々アミノ酸のためにダイアグラムされた構造を形成するに違いない。それはサイドグループのＸａａ４とＸａａ６が一緒に近在し、ミニタンパク質の表面に存在していることが期待できる。
【０２９４】
変化したアミノ酸は、保持されているので、それらの柔軟性は限られている。このクロスリンクは、ジスルフィドリンケージからは幾分か異なっている。Ｃアルファ４とＣアルファ１１間の分離は、一つのシステインのＣアルファｓの分離より大きいものである。さらに、金属イオンを持った残基１から４そして１１から１４までの相互作用は、残基４から１１までのジスルフィドより、残基５から１０までの動きをより以上に規制することが期待されている。単一のジスルフィド結合は、結合した残基のアルファ炭素に強力な遠隔拘束を働かすが、たとえば、主鎖におけるＮからＣまでのベクターにはきわめて少量の方向的拘束しか働かせない。
【０２９５】
望ましい配列にとって、残基５から１０までのサイドグループは、ターゲットと特殊な相互作用を形成する。他の可変アミノ酸、たとえば、４、５、７、もしくは３などは適当である。大きなスパンは、次の場合に利用され得るかも知れない。すなわち、包括された配列が、ポリペプチド主鎖の配座の自由を規制しているアルファヘリックスもしくは他の第二義的は構造を形成するための高度のポテンシャルを持っているセグメントを含んでいる場合である。四つのＣＹＳｓを持っているミニタンパク質は三つの特殊なベアリングを形成することができるが、二つのＨＩＳｓ、一つのＭＥＴ、そして一つのＣＹＳを持っているミニタンバタ質は、Ｃｕとたった二つの特殊な合成物しか形成できない。これら二つの構造は、Ｃｕをとおしての鏡面対称によって関係づけられている。二つのＨＩＳｓは識別可能であるので、構造は異なっている。
【０２９６】
そのような金属含有のミニタンパク質が線状ファージに提示される場合には、ファージを生成している細胞は適切な金属イオンの存在する中で成長し得る、もしくはファージは、それらが細胞から分離された後にのみ金属に晒され得る。
【０２９７】
例Ｖ
ＺＮ（ＩＩ）と四つのシステインから成る一つのクロスリンクを持っているミニタンパク質
例ＸＶに示されているものに類似したクロスリンクは、亜鉛フィンガータンパク質
（GIBS88、GAUS87、PARR88、FRAN87、CHOW87、そしてHARD90）によって例示されている。亜鉛フィンガーの一属は、Ｚｎ＋＋（PARR88、FRAN87、CHOW87、EVAN88、BERG88、CHAV88）を結合する保持されたポジションの中に二つのＣＹＳと二つのＨＩＳ残基を持っている。Gibsonら（GIBS88）は、亜鉛フィンガーを形成すると考えられているいくつかの配列を研究し、これらの化合物のための三次元モデルを提案している。これらの配列の大部分は保持されたポジションに二つのＣＹＳと二つのＨＩＳ残基をもっているが、あるものは三つのＣＹＳと一つのＨＩＳ残基をもっている。Gaussら（GAUS87）もまた亜鉛を結合している三つのＣＹＳと一つのＨＩＳ残基を持っている亜鉛フィンガータンパク質を報告している。Hardら（HARD90）は、各々が四つのＣＹＳ残基を持っている二つの亜鉛フィンガーから成る一つのタンパク質の三次元構造を報告している。これらの亜鉛結合タンパク質の全ては、還元細胞内環境の中で安定している。
【０２９８】
一つのＣＹＳ：：亜鉛クロスリンクミニタンパク質の一つの望ましい例は、HARD90の図１に示されている配列の残基４４０から４６１で成っている。残基４４４から４５６は変化され得るかも知れない。そのような一つの変化は下記のとおりである。
【表６】
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これは、同数のアミノ酸配列をコードしている３．７７・１０７ＤＮＡ配列に導く。１．０・１０８独立変換体を持っている一つのライブラリーは許容された配列の９３パーセントを提示するだろう。２．０・１０８独立変換体は、許容された配列の９９．５パーセントを提示するだろう。
【０２９９】
【表７】
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【０３００】
【表８】
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【０３０１】
【表９】
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【０３０２】
【表１０】
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【０３０３】
【表１１】
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【０３０４】
【表１２】
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【０３０５】
【表１３】
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【０３０６】
【表１４】
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【０３０７】
【表１５】
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【０３０８】
【表１６】
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【０３０９】
【表１７】
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【０３１０】
【表１８】
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【０３１１】
【表１９】
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【０３１２】
【表２０】
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【０３１３】
【表２１】
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【０３１４】
【表２２】
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【０３１５】
【表２３】
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【０３１６】
【表２４】
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【０３１７】
【表２５】
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【０３１８】
【表２６】
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【０３１９】
【表２７】
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【０３２０】
【表２８】
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【０３２１】
【表２９】
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【０３２２】
【表３０】
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【０３２３】
【表３１】
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【表３２−１】
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【表３２−２】
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【表３２−３】
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【表３２−４】
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【表３２−５】
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【表３２−６】
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【表３２−７】
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【表３２−８】
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【表３２−９】
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【表３２−１０】
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【表３２−１１】
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【表３２−１２】
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【表３２−１３】
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【表３２−１４】
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【表３２−１５】
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【表３２−１６】
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【表３２−１７】
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【表３２−１８】
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【表３２−１９】
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【図１】
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