(57)【要約】【課題】  醗酵法により生産したヒアルロン酸の分子量低下を抑制し、高分子量のヒアルロン酸を製造する方法を提供することを主な目的とする。【解決手段】  ヒアルロン酸を含む培養液に、有機溶媒を添加してヒアルロン酸を沈殿させることにより、沈殿したヒアルロン酸は微生物菌体や培養液成分を含むにも関わらず、長期間、安定に保存することが可能であり、後に続く精製工程を経て精製された高分子量のヒアルロン酸を製造することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロン酸を含む培養液に有機溶媒を添加することを含むヒアルロン酸の製造方法。
【請求項２】
有機溶媒を添加する前に培養液の加熱処理を行う請求項１記載の方法。
【請求項３】
有機溶媒が、炭素数１〜３の有機溶媒である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
有機溶媒が、イソプロピルアルコール、エチルアルコール、メチルアルコール及びアセトンからなる群から選ばれる少なくとも一種である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ヒアルロン酸を含む培養液が、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物を培養して得られるものである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物が、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）である請求項５記載の方法。
【請求項７】
ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）が、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）ＭＫ−５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）である請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかの方法で製造した粗ヒアルロン酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、ヒアルロン酸は、ニワトリの鶏冠等からの抽出法により製造されているが、高分子量の生体成分等の夾雑物が多く、高純度に精製されたものはコスト高になる。これらの問題点を解決するため、醗酵法によりヒアルロン酸を製造することが行われている。
【０００３】
醗酵法によって製造されるヒアルロン酸は、前記抽出法と比較して均一条件で製造されるため、製品の品質が一定に保たれることから、産業上の利用価値は大きい。
【０００４】
醗酵法においては、高分子量のヒアルロン酸を取得する目的で、通常、培養液を加熱等で殺菌する方法が採用される。しかし、加熱処理を行い、培養中に発現したヒアルロニダーゼ活性を失活させても、３０℃の温度下で７日間経過するとヒアルロン酸が分解され分子量が低下する。よって、培養終了後、速やかに培養液を処理する必要がある。
【０００５】
上記問題点を解決するために、例えば、培養液を希釈して濾過により菌体および不溶分を除去した後、限外濾過により低分子物質を除去し、さらに凍結乾燥によって高分子量の製品を得る方法（特許文献１参照）、培養液を１０℃以下に冷却し、遠心分離により菌体を除去した後、１０℃以下に冷却したエチルアルコールで沈澱処理し、さらに真空乾燥によって高分子量の製品を得る方法（特許文献２参照）等が知られている。
【０００６】
しかしながら、上記いずれの方法も、低温条件下で培養液を処理する必要がある。また、大量の培養液を速やかに処理することができる精製設備を保有している場合は可能であるが、培養設備に対して精製設備の能力が劣る場合には、培養液を長期保存せざるを得なくなり、その結果、保存中に分子量低下を招き、安定的に高分子量のヒアルロン酸を得ることができない。
【特許文献１】特開平１−６７１９６号公報
【特許文献２】特許第３６３２１９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、醗酵法により生産したヒアルロン酸の分子量低下を抑制し、高分子量のヒアルロン酸を製造する方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、従来技術の問題点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、ヒアルロン酸を含む培養液に、有機溶媒を添加してヒアルロン酸を沈殿させることにより、沈殿したヒアルロン酸は微生物菌体や培養液成分を含むにも関わらず、長期間保存することが可能であり、後に続く精製工程を経て精製された高分子量のヒアルロン酸を製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、ヒアルロン酸を含む培養液に有機溶媒を添加することを含む、ヒアルロン酸の製造方法である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ヒアルロン酸を含む培養液に有機溶媒を添加することにより得られる粗ヒアルロン酸結晶を長期間保存することができ、さらに保存した結晶を再溶解し、精製操作を行うことにより、安定的に高分子量のヒアルロン酸を製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明のヒアルロン酸の製造方法について詳細に説明する。
【００１２】
１．醗酵法によるヒアルロン酸の生産
＜微生物＞
本発明において醗酵法で使用するヒアルロン酸生産能を有する微生物としては、培養によりヒアルロン酸を生産する微生物であれば限定されない。遺伝子工学的手法によりヒアルロン酸生産能を獲得した微生物も使用することができる。
【００１３】
このような微生物の中でも、自然界から分離されるストレプトコッカス属等の微生物が好ましい。また、自然界から分離されるストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属等の微生物を紫外線やＮＴＧ（Ｎ−メチル−Ｎ´−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）、メチルエタンスルホン酸等で処理して、ヒアルロニダーゼ非生産菌や非溶血性に改良した変異微生物も好適に使用することができる。工業的に安価で高品質な製品を安定に製造するためには、変異微生物を利用することが好ましい。
【００１４】
ストレプトコッカス属に属する微生物の中でも、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）がより好ましく、ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）ＭＫ−５（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）が更に好ましい。当該菌株は、特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７として寄託されている。
【００１５】
＜醗酵＞
本発明では、上記の微生物を培養することによって培養液中にヒアルロン酸を得ることができる。培養のための培養液は、微生物がヒアルロン酸を生成することができれば限定されないが、例えば、グルコース、シュクロース等の炭素源、ポリペプトン−Ｎ、酵母エキス等の窒素源、グルタミン酸、グルタミン等の遊離アミノ酸の窒素源、ビタミン、無機塩等、タンニン等のフェノール性水酸基を有するヒアルロニダーゼ阻害剤を用いた培地を挙げることができる。
【００１６】
このような培養液は、１２１℃、２０分間滅菌後、または、一部若しくは全部の成分を精密濾過による非加熱滅菌することにより使用することができる。
【００１７】
培養条件も限定されるものではないが、ｐＨを約６〜８、好ましくはｐＨを約７〜７．５、温度を３０〜４０℃程度、より好ましくは３３〜３７℃程度に制御して、好気的に培養すればよい。培養時間も限定されず、培養液の量、所望のヒアルロン酸の量に応じて適宜選択することができる。
【００１８】
２．培養液に有機溶媒を添加する工程
本発明では、上記のようにして得られたヒアルロン酸を含む培養液に、有機溶媒を添加することによりヒアルロン酸を沈殿させる。このとき、培養液にはヒアルロン酸を産生した微生物も含まれており、当該微生物も一緒に沈殿することになる。
【００１９】
使用される有機溶媒は、炭素数１〜３の有機溶媒であり、好ましくは、イソプロピルアルコール、エチルアルコール、メチルアルコール及びアセトンからなる群から選ばれる少なくとも一種である。これらの有機溶媒は、単独で使用することもできるし、複数を混合して使用することもできる。
【００２０】
当該有機溶媒の使用量は、培養液中における最終濃度が４０ｖ／ｖ％〜９０％ｖ／ｖ％、好ましくは６０ｖ／ｖ％〜８０ｖ／ｖ％になるように添加すればよい。培養液に有機溶媒を添加することによりヒアルロン酸を含む沈殿物を取得し、その沈殿物を長期保存した場合でも、産生したヒアルロン酸の低分子化が起こらず、精製等により高分子量のヒアルロン酸を得ることができる。
【００２１】
有機溶媒が添加さらた溶液は、添加した有機溶媒の沸点以下、通常、２０℃〜５０℃程度に維持した状態に保つ。
【００２２】
３．加熱処理
本発明ではまた、有機溶媒の添加を行う前に、加熱処理を行うことができる。この加熱処理を行うことにより、ヒアルロン酸回収率を向上させることができる。加熱処理の条件としては、例えば、５５〜８０℃程度で２０〜６０分程度、好ましくは、６０〜７０℃程度で２０〜３０分程度である。
【００２３】
４．粗ヒアルロン酸の回収
上記工程で得られたヒアルロン酸及び微生物を含む沈殿物（以下、粗ヒアルロン酸）を回収することができる。回収する方法は、ヒアルロン酸が効率良く得ることができれば特に限定されない。例えば、濾過、遠心分離等の方法を挙げることができる。これらの中でも、濾過が好ましい。濾過の方法も特には限定されず、例えば、濾布を用いた濾過、平膜を用いた濾過、中空糸膜を用いた濾過、限外濾過膜を用いた濾過等が挙げられる。また、回収した粗ヒアルロン酸を乾燥させてもよい。乾燥させることにより、より長期間安定保存することができる。乾燥の条件も所望のヒアルロン酸が得ることができれば限定されない。例えば、加熱乾燥、真空乾燥、凍結乾燥等により乾燥することができる。加熱乾燥する際の温度は、４０〜８０℃程度、好ましくは、６０〜７０℃程度がよい。乾燥時間は、粗ヒアルロン酸の量などに応じて適宜選択すればよい。さらに、乾燥した粗ヒアルロン酸を粉砕することもできる。この工程により、再溶解する時の溶解時間を短縮するという効果を得ることができる。粉砕の条件は所望のヒアルロン酸を得ることができれば限定されず、当業者が適宜選択することができる。例えば、粉砕機（ミル）を使用して粒径０．１ｍｍ〜１ｍｍ程度に成形すればよい。上記のごとく回収した粗ヒアルロン酸は、続く精製工程まで安定に保存することができる。
【００２４】
５．ヒアルロン酸の精製
本発明では、上記の方法により得られた粗ヒアルロン酸を精製することができる。
【００２５】
上記の粗ヒアルロン酸は、ヒアルロン酸と菌体が混在しているが、このような粗ヒアルロン酸を水に再溶解した後、活性炭処理、合成吸着剤処理、キレート処理、イオン交換処理、濾過処理等を行うことにより菌体などを除去し、精製ヒアルロン酸を得ることができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明する。
【００２７】
＜実施例１＞
工程１．ストレプトコッカス・ズーエピデミカス（ＦＥＲＭ  Ｐ−２１４８７）の培養
グルコース６（ｗ／ｖ）％、ポリペプトン−Ｎ（大日本製薬株式会社製）１．５（ｗ／ｖ）％、酵母エキス（オリエンタル酵母工業製）０．５％、硫酸マグネシウム７水塩０．０１（ｗ／ｖ）％、リン酸水素２ナトリウム０．０５（ｗ／ｖ）％、グルタミン酸ナトリウム０．０５（ｗ／ｖ）％、食塩０．３（ｗ／ｖ）％、アデカプルロニックＬ−６１（ＡＤＥＫＡ社製）０．０１（ｗ／ｖ）％の組成の培地を３０Ｌのジャーファーメンターに２０Ｌ入れ、１２１℃、２０分間滅菌した。
【００２８】
そこに、前培養した該菌を１（ｖ／ｖ）％接種し、２０（ｗ／ｖ）％水酸化ナトリウムにてｐＨを７．４に連続的に制御しながら３７℃で２４時間通気攪拌培養した。
【００２９】
ポリペプトン−Ｎおよび酵母エキスは、１２１℃、２０分間滅菌した孔径０．４５ミクロンのセルロース混合エステルタイプメンブレンフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製）を装着したタンク付きステンレスフォルダー（ＡＤＶＡＴＥＣ社製）を用いて加圧濾過により非加熱滅菌して、培養開始時に一度に添加した。また、グルコースは１２１℃、２０分間別滅菌して、培養開始時に一度に添加した。
【００３０】
工程２．培養液の処理
前記工程１で培養した培養液（ヒアルロン酸含有液）を６０℃、３０分間熱処理した。
【００３１】
工程３．粗ヒアルロン酸ナトリウム結晶の取得
前記工程２で調整したヒアルロン酸含有液２０Ｌに、６ｇの食塩を溶解し、さらにエチルアルコールを２８L（最終濃度６０％アルコール溶液）溶解し、沈殿析出を行った。その後、直径１５０ｍｍのＮｏ１の定性濾紙（ＡＤＶＡＴＥＣ社製）を用いて濾過により回収し、６０℃で加熱乾燥し、ロータリーカッターミルＶＲＲＣ−３（有限会社バーリージャパン）で粉砕・造粒し、粒径０．５ｍｍの粗ヒアルロン酸ナトリウム結晶２４０ｇを得た。
【００３２】
得られた粗ヒアルロン酸ナトリウム結晶を３０℃で保存して、７日間毎に再溶解して粘度を測定した。再溶解は粗ヒアルロン酸ナトリウム結晶５ｇを純水２００ｍｌに溶解して、ローターＮｏ３、回転数１２ｒｐｍに設定したＢ型粘度計で粘度を測定した。その結果、１ヶ月間の保存においても粘度の低下は観られなかった。結果を表１に示した。
【００３３】
＜実施例２〜４＞
実施例１で、エチルアルコールに替わってメチルアルコール、イソプロピルアルコール、アセトンをそれぞれ用いた以外は実施例１と同様の操作を実施した。結果は、エチルアルコールを用いた場合と同様、粘度の低下は観られなかった。結果を表１に示した。
【００３４】
＜比較例１＞
実施例１で工程２まで実施した培養液を２５℃で保存した。保存７日目から粘度の低下が観られた。結果を表１に示した。
【表１】
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