(57)【要約】      （修正有）【課題】HTLV-1キャリアのATL発症危険性を早期に簡便に判定する方法、その診断薬を提供する。【解決手段】被験者由来の細胞中および血清中のCYP1B1の発現レベルとコントロール細胞中および血清のCYP1B1の発現レベルとを比較し、被験者由来の細胞中のCYP1B1の発現レベルが、有意に増加していることを指標として、被験者がHTLV-1キャリアのATL発症危険性が高いと決定する。その他、CYP1B1蛋白質に対する抗体を利用して、ATL診断薬。【選択図】図２
2010057371.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HTLV-1キャリアの細胞におけるCYP1B1遺伝子の転写産物、もしくは細胞又は血清におけるCYP1B1蛋白質の有無を測定して、健常者におけるCYP1B1遺伝子の転写産物又はCYP1B1蛋白質の発現量に対し被験者の発現量が有意に増加していることをもって成人Ｔ細胞白血病の発症危険性が高いと決定する検出方法。
【請求項２】
ａ）被検者のHTLV-1感染細胞率ｘを測定する工程と、
ｂ）被検者の生体試料における、生体試料のCYP1B1発現レベルYを測定する工程とからなり、
ｃ）工程ａ）の測定結果xが、式１において１％以上で、且つ、工程ｂ）の測定結果Yが式２において3000以上であることを指標として、成人Ｔ細胞白血病の発症危険性が高いと決定する検出方法。
【数１】
2010057371.tif 000016
【数２】
2010057371.tif 000017
【請求項３】
CYP1B1遺伝子又はそのヌクレオチド断片を検出するプライマーを含む成人Ｔ細胞白血病の発症危険性の遺伝子発現検出用診断薬。
【請求項４】
CYP1B1蛋白質又はそのペプチド断片に対する抗体を含む成人Ｔ細胞白血病の発症危険性の検出用診断薬。
【請求項５】
請求項３又は４の診断薬を搭載した成人Ｔ細胞白血病の発症危険性の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（human T-cell leukemia virus type 1 ; 以下、HTLV-1と称する。）キャリアの成人Ｔ細胞白血病（adult T-cell leukemia ; 以下、ATLと称する。）への発症危険性を検出する方法とその診断薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
白血病は、通常のがんと異なり、固形の腫瘍を形成しないため、外科手術が適用できず、以前は治療が困難であった。ところが近年、有効な抗がん剤や治療技術の研究開発が進み、白血病の種類によっては治療することも可能になって来ている。しかし、未だ有効な予防法・治療法もなく、極めて予後が悪い白血病としてATLが知られている。ATLは、HTLV-1がＴ細胞に感染することにより引き起こされるウイルス性白血病である。乳幼児期の授乳などを通じて、生体内のＴリンパ球にHTLV-1が感染することでウイルスキャリアとなるケースが多く知られている。その後、数十年の長い歳月をかけて、ウイルスや宿主細胞の遺伝子に変異が蓄積し、最終的に感染細胞の中のごく一部が異常増殖能を獲得した結果、ATLを発症すると考えられている。しかしながら、HTLV-1の感染からATL発症に至る機構の詳細はいまだ不明であり、それ故に、その発症危険性を検出する方法や診断薬も決定的な決め手がないままである。
【０００３】
CYP1B1（cytochrome P450 family 1,superfamily B, polypeptide 1）は、種々のガンにおいて蛋白質の発現が亢進することが報告されている。非特許文献１には、乳がん、結腸がん、食道がん、リンパ腫、卵巣がん及び横紋筋肉種などの固形がんでCYP1B1が高発現することが示されている。同文献には、急性骨髄性白血病や急性リンパ性白血病においても、CYP1B1が高発現することが報告されている。しかしながら、ATLの発症危険性の検出については、記載がない。 
【非特許文献１】Maecker et al, Blood, 1 November 2003, Vol. 102, No. 9, pp.3287-3294.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ATL発症の機構に関する詳細は未だに明らかではなく、HTLV-1キャリアがATL発症に至る危険性を簡便に、且つ短時間に判断する正確な検出法の確立が待望されている。
【０００５】
本発明の目的は、ATLの発症危険性を簡便に且つ短時間での判断を可能にする正確な検出法を提供することにある。とくに、発症リスクの高いHTLV-1キャリアに対するATL発症危険性の検出・診断薬用のマーカーを見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、HTLV-1キャリアのATL発症に関連する遺伝子発現を明らかにすることができれば、その診断に有用であると考えた。そこで、HTLV-1感染細胞率の高いキャリアサンプルや抗体陽転者前・後サンプルを用いて網羅的遺伝子発現解析を行った。多くの遺伝子発現レベルについて、特定の条件にある細胞の間の差を観察するには、DNAチップを用いるのが有利である。本発明者らは、幅広い遺伝子の中から目的とする遺伝子を探し出すために、約54000の遺伝子転写産物の解析が可能なDNAチップを解析に用いた。更に、HTLV-1感染とATL発症に関連して発現レベルが変動している遺伝子を特異的に見出すために、その変動の差が２倍以上に及ぶものを選択した。その結果、HTLV-1キャリア及びATL患者の細胞で発現レベルが増加している遺伝子CYP1B1の同定に成功し、本発明に到達した。
【０００７】
また、CYP1B1遺伝子によりコードされるCYP1B1蛋白質の検出も、同様にHTLV-1キャリアのATL発症危険性の有力な検査方法となり得る事を知見した。
【０００８】
即ち、本発明は、
項１： HTLV-1キャリアの細胞におけるCYP1B1遺伝子の転写産物、もしくは細胞又は血清におけるCYP1B1蛋白質の有無を測定して、健常者におけるCYP1B1遺伝子の転写産物又はCYP1B1蛋白質の発現量に対し被験者の発現量が有意に増加していることをもって成人Ｔ細胞白血病の発症危険性が高いと決定する検出方法。
項２：
ａ）被検者のHTLV-1感染細胞率ｘを測定する工程と、
ｂ）被検者の生体試料における、生体試料のCYP1B1発現レベルYを測定する工程とからなり、
ｃ）工程ａ）の測定結果xが、式１において１％以上で、且つ、工程ｂ）の測定結果Yが式２において3000以上であることを指標として、成人Ｔ細胞白血病の発症危険性が高いと決定する検出方法。
【数１】
2010057371.tif 000003
【数２】
2010057371.tif 000004
項３：CYP1B1遺伝子又はそのヌクレオチド断片を検出するプライマーを含む成人Ｔ細胞白血病の発症危険性の遺伝子発現検出用診断薬。
項４： CYP1B1蛋白質又はそのペプチド断片に対する抗体を含む成人Ｔ細胞白血病の発症危険性の検出用診断薬。
項５：項３又は４の診断薬を搭載した成人Ｔ細胞白血病の発症危険性の検出用キット。
【０００９】
本発明において、感染細胞率とは、下式によって算出する。
感染細胞率（％）＝被検体DNA中のプロウイルスコピー数（HTLV-1遺伝子pX領域）／被検体細胞数（RNaseP）×100
【００１０】
HTLV-1はウイルス粒子での感染性は著しく悪く、感染細胞により細胞から細胞へという感染様式を取る。このためウイルスがコードする調節遺伝子により感染細胞数を増加させ感染機会を増すと考えられる。HTLV-1プロウイルスの特徴はenvと3'側LTR（Long Terminal Repeat）の間に存在するpX領域である。pX領域はtax,rex, p12, p13, p30, HBZ（HTLV-1 bZIP factor）などの調節遺伝子をコードしている。上式の細胞数定量にはハプロイド（染色体1本）あたり 1 コピーの遺伝子であるRNaseP（Ribonuclease P）遺伝子の測定を行う。
【００１１】
先述の如く、CYP1B1は、乳がん、大腸がん，肺がん、卵巣がん、前立腺がんなど、様々な種類の組織細胞において高発現している。而して、本発明において健常者とは、特殊な病歴を有しないものであって、例えば、HTLV-1キャリアや固形がん罹患者を除く。
【００１２】
本発明において、コントロール細胞とは、HTLV-1非感染細胞であれば、特に限定はないが、ヒトあるいは動物の正常細胞から樹立され、かつ正常であることが明らかな細胞、あるいはHTLV-1キャリアでない健常者由来の細胞、HTLV-1非感染Ｔ細胞リンパ性白血病細胞株などのように、HTLV-1感染やATL発症とは無関係であることが明らかな細胞を指す。HTLV-1感染細胞率１％未満の末梢血単核球のように、低CYP1B1発現の場合もコントロール細胞とみなすことが可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、HTLV-1キャリアのATL発症の危険性を、早期に簡便に信頼性が高く検出することができるようになる。さらに、これまで明確な発症機構が不明で、治療に決め手がなかったATLに対し、その発症危険性の検査を可能にする診断薬が提供され、ATLに関する医療に大いに貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の方法は、HTLV-1キャリアのATL発症への危険性の検査である。上述のように、ATLは、HTLV-1がT細胞に感染することにより引き起こされるウイルス性白血病をいい、HTLV-1感染Ｔ細胞が腫瘍化した疾患である。50歳から60歳代に発症のピークがあり、亜急性から慢性に経過し末期に急激に進行し予後は不良である。腫瘍細胞の起源はT細胞で、リンパ節腫大、肝腫大、脾腫大を認める頻度が高く、しばしば皮膚病変を有するという特徴的な臨床所見を持つ。ここで、HTLV-1はヒトレトロウィルスで、宿主であるヒトのＴ細胞内では核内に移行し、RNAからcDNAを逆転写により生成し、cDNAは宿主ゲノムDNAへインテグレーションする。
【００１５】
本発明者らは、HTLV-1キャリア、健常者及びHTLV-1抗体陽転者の陽転前・後サンプルの末梢血単核球（peripheral bloodmononuclear cell; PBMC）を用いてcDNAマイクロアレイシステムによる網羅的遺伝子発現解析を行った。HTLV-1キャリアにおいて変化が認められた多数の遺伝子発現パターン中から、CYP1B1の発現が亢進しているという発見に基づく。cDNAマイクロアレイシステムによって同定されたCYP1B1は、発症危険性検出の遺伝子標的としての診断上の有用性が認められた。
【００１６】
本発明においては、被験者由来の細胞又は血清中のCYP1B1の発現レベルを測定し、コントロール（健常者）細胞中のCYP1B1の発現レベルと比較し、被験者由来の細胞中のCYP1B1の発現レベルが、コントロール細胞中のCYP1B1の発現レベルより相対的に増加していることを指標として、被験者がATL発症の危険性が高いと決定する。
【００１７】
なお、式１において、pXはHTLV-1プロウイルス遺伝子のtax, rex, p12, p13, p30, HBZなどの調節遺伝子をコードしている領域である。 RNase P は内在性コントロールであり、細胞数定量のために測定を行う。
【００１８】
一方、式２において、GAPDH（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）は、グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素である。
【００１９】
本発明の方法においては、CYP1B1の発現レベルを測定する。ここで、「CYP1B1」とは、アクセッション番号  蛋白質NP_000095の蛋白質自体を指す。また、本明細書においては、「CYP1B1」をコードする遺伝子（GenBank登録番号 NM_000104）をCYP1B1と表示する場合もあり、蛋白質、遺伝子及びmRNAのいずれに対しても互換可能に使用することとする。
【００２０】
ここで、本発明の上記方法に供される細胞は、特に限定はされないが、容易に採取することができる体液由来であることが好ましく、特に血液由来であることが好ましい。発現遺伝子を検出する対象は、細胞であり、好ましくは、末梢血単核球である。発現蛋白質を検出する対象は、細胞又は血清を使用することが出来る。
【００２１】
本発明に適用できるポリメラーゼ連鎖反応には、リアルタイムPCR（Real-time PCR）やRT-PCR（Reverse Transcription PolymeraseChain Reaction；逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）などが含まれる。しばしばリアルタイムPCRはDNA及びmRNAの定量に使うことが出来る。一方、RT-PCRは、mRNAの検出に使用することが出来る。リアルタイムPCR とRT-PCRと組み合わせることにより特定の時間、細胞、組織での遺伝子の発現を定量的に検出することができるので、本発明においても必要に応じて採用できる。
【００２２】
これらのCYP1B1遺伝子の発現レベルは、細胞中の蛋白質をコードする遺伝子のmRNA転写産物を定量することによって測定することも可能である。mRNA転写産物を定量する方法は、特に限定されず、当業者に公知の様々な定量方法の１つまたは組合せを用いることができる。これらの方法には、例えば、ノーザンブロッティング法、リアルタイムPCR法、RT-PCRおよびDNAアレイを用いる方法などやそれらの組合せである。
【００２３】
抗CYP1B1抗体を用いて、特異的蛋白質を検出するための多くの方法が知られており、本発明のCYP1B1蛋白質もしくはペプチド断片を用いることができる。様々な抗体法が本発明の実施に際し、それぞれ単独で用いることができる。必要に応じて、互いを補うために２つ以上の方法を用いることができる。例えばCYP1B1蛋白質を認識する抗体等を用いて、組織、細胞、血液もしくは生体産物の試料、またはそれに由来する試料と接触させ、陽性反応をスクリーニングすることを含む腫瘍細胞の同定法を提供することである。陽性反応は例えば、凝集反応または免疫染色法に代表される色素もしくは蛍光による可視化法、あるいは酵素結合抗体法を利用した放射免疫学的方法などにより定量的に示されうる。
【００２４】
本発明においては、被験者由来の細胞中のCYP1B1蛋白質の発現レベルとコントロール細胞中のCYP1B1の発現レベルとを測定した結果、見出されるCYP1B1の発現レベルに明らかな差異が認められる場合、これを被験者（HTLV-1キャリア）のATL発症の危険性判定の指標にするが、「発現レベルの差異」は、当業者に公知のいずれかの測定手段により測定できるものであって、具体的な基準は適宜設定することができる。基準は特に限定はされないが、例えば、被験者から採取した細胞中において、少なくとも蛋白質の発現レベルが、コントロール細胞中の発現レベルと比較して、2倍程度であれば、明らかに差異があるということができる。
【００２５】
CYP1B1蛋白質の発現レベルは、細胞中の蛋白質自体を測定することによって検出することができる。測定方法は、特に限定されず、当業者に公知の様々な蛋白質の測定方法を用いることができる。例えば、二次元電気泳動を含むゲル電気泳動を組み込んだプロテオーム解析、CYP1B1に対する抗体を使用したウェスタンブロッティング法やELISA法などである。
【００２６】
CYP1B1蛋白質に対する抗体は、免疫反応において、CYP1B1の抗原の刺激により生体内に作られ、CYP1B1蛋白質と特異的に結合する蛋白質またはその改変体をいう。ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体でもどちらでも使用し得るが、特にモノクローナル抗体を好ましく使用し得る。さらに、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばF (ab’)2及びFab断片やその他の組換えにより生産された結合体を含むがそれらに限定されない。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなどに共有結合させてよい。
【００２７】
抗体は、通常、CYP1B1蛋白質あるいは抗原を含むそのペプチド断片を、既知の情報を元に化学的または遺伝子工学的に合成し、適切な動物に投与して免疫することによって生成される方法や細菌に寄生するバクテリオファージを用いて抗体を生成するファージディスプレイ法を挙げることが出来る。
【００２８】
抗体の作製は、当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、CYP1B1蛋白質を構成するポリペプチドの全長または部分断片精製標品、蛋白質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドなどを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。
【００２９】
抗体を生産する場合、投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。CYP1B1蛋白質の断片であるペプチドを用いる場合には、スカシガイヘモシアニンまたはウシチログロブリン等のキャリア蛋白質に共有結合させたものを抗原とすることもできる。その抗原の投与は、１回目の投与の後１〜2週間おきに2〜10回行う。各投与後、3〜7日目に採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法等で確認する。
【００３０】
血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清より、周知技術を用いてポリクローナル抗体を分離、精製することができる。
【００３１】
モノクローナル 抗体の作製もまた当該分野において周知の方法によって得ることができる。例えば、CYP1B1蛋白質またはその抗原性断片に対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、ハイブリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどによって、CYP1B1蛋白質またはその断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。得られたハイブリドーマから、所望の性質のモノクローナル抗体を得て、本発明の診断薬に使用することができる。
【００３２】
CYP1B1蛋白質若しくはその抗原性フラグメントの検出については、様々な方法が提案されている（例えば、特許文献１）。本発明においても、特許文献１に記載されている、免疫組織化学分析、ウェスタンブロット分析あるいはイムノアッセイを好ましく適用することが出来る。免疫組織化学分析は、比較的少数の癌細胞が正常細胞の中心に存在する場合、希釈効果を避ける上で有利である。ウェスタンブロット分析法は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）により蛋白質を分子量に従って分離した後に、イムノブロッティングを行うという方法である。ウェスタンブロット分析用の試料調製方法には、組織のホモジナイズおよび選択的にミクロソーム画分の単離が含まれる。
【特許文献１】特表２００２−５４３７６５号公報
【００３３】
免疫組織化学、ウェスタンブロット分析およびイムノアッセイの原理および実践は周知である。本発明の実施に当たって、当業者は、適当なプロトコルを選択し、免疫組織化学分析、ウェスタンブロット分析またはイムノアッセイを行うことができる（非特許文献２）。
【非特許文献２】Harlow et al, Antibodies - A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor, Cold Spring Harbor, NY(1988)
【００３４】
本発明は、CYP1B1蛋白質又はそのペプチド断片に対する抗体を含む成人Ｔ細胞白血病の発症危険性の検出用診断薬を提供する。診断薬とするには、抗体をそのままあるいはキットの形で緩衝液、使用説明書と共に供することが可能である。
【００３５】
本発明ではさらにまた、HTLV-1キャリアの中から、ATL発症危険性の高い者の検出をより簡易に実施する為に、以下のような遺伝子発現診断薬／キットを作成することも可能である。HTLV-1キャリアのATL発症危険性を検出する為のキットは、CYP1B1の塩基配列に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー、およびこれと同じ配列で、別の領域に含まれる連続する少なくとも１０ヌクレオチド、又はそれらと相補的な塩基配列の少なくとも１０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマーとの対からなる群より選択される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーの対を含んでなる、HTLV-1キャリアのATL発症危険性を検出する為のキットが提供される。すなわち、上記各塩基配列から適宜選択し得るプライマーの対を含んでなる、HTLV-1キャリアおよび／またはATL発症者を検出する為のキットが提供される。本キットに含まれる１つあるいは２つ以上のそれぞれのオリゴヌクレオチド対を、RT-PCR用のプライマー対として用い、細胞中に含まれるCYP1B1 mRNAの発現レベルあるいはcDNA量を測定し、比較することが可能である。
【００３６】
また、例えば、本キットに配するCYP1B1遺伝子を増幅させるプライマーを用いてオリゴヌクレオチドプローブを作成した後、ノーザンブロッティング手法により細胞中に発現するCYP1B1コード遺伝子に対応するRNA量の変化を簡便に調べることが可能である。キットに含まれる他の成分は、緩衝液、発現レベルの比較などに用いるポジティブコントロールなどである。さらに、これらのオリゴヌクレオチドプローブを複数の固体支持体上に固定化したDNAアレイを作成することによって、効率的に検出を行うことも可能である。
【００３７】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。しかしながら、本実施例は、本発明の具体例を示すのみで、本発明は、下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３８】
HTLV-1キャリア及び健常者の末梢血単核球における網羅的遺伝子発現解析
（１）HTLV-1キャリア、健常者及びHTLV-1抗体陽転者の血液検体
インフォームドコンセントにより、宮崎大学医学部免疫感染病態学講座におけるHTLV-1コホート研究（岡山昭彦教授）に同意を得た２名のHTLV-1キャリア、２名の健常者及び１名の抗体陽転者（陽転前後両方）からそれぞれ7 mLの血液を提供受けた。
【００３９】
（２）各血液検体からの末梢血単核球の分離
HTLV-1キャリア、健常者及びHTLV-1抗体陽転者の血液検体より末梢血単核球を分離した。上記検体をEDTA入り採血管または Heparin入り採血管で採取し、等量のPBSを混ぜ、そこから常法によりFicol-Paque PLUS（カタログ番号；17-1440-02 ,GE Healthcare） を用いて末梢血単核球を単離し、液体窒素中にセルバンカー（BLC-1,十慈フィールド株式会社）保存した。
【００４０】
（３）各血液検体由来の末梢血単核球からのTotal RNAの調製
Total RNAの抽出はRNeasy Mini Kit（74104,QIAGEN）および RNase-Free DNase set（79254,QIAGEN）を用いた。上記（２）で調製した約5×10６個の末梢血単核球をそれぞれ遠心し、得られたペレットに、上記キットのBuffer RLTを350 μL加えて20Gの注射針を用いてペレットを完全に溶解した。以下はRNeasy Mini Kitの説明書に従い、total RNAを抽出した。cDNAマイクロアレイ解析に供するtotal RNAは260 nm吸光度と280 nm吸光度の比（A260/A280値）が1.8以上であることを条件とし、本検討に供するtotal RNAはすべてこれを満たすことを確認した。
【００４１】
（４）cDNAマイクロアレイ解析
上記（３）で抽出した各検体のtotal RNA（100 ng）を、GeneChip(R)Two-Cycle Target Labeling and Control Reagents（900494, Affymetrix）を用いてcDNA合成の後、逆転写酵素によりcRNA合成を行った。再度cDNA合成を行うことにより、ビオチン標識したcRNAを合成した。上記により合成した標識化cRNAを94℃で35分間反応させ、断片化した。
【００４２】
上記により合成した断片化cRNAを、Human Genome U133 Plus 2.0array（900470, Affymetrix）に45℃、16時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション終了後、Fludics Station 450（Affymetrix）にてマイクロアレイを洗浄し、フィコエリスリン-ストレプトアビジン試薬（S866, Molecular Probes）を含む蛍光色素溶液に浸し、さらにビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（ヤギ）（BA-0500 ,VectorLabolatories）を含むビオチン化抗体溶液に浸した。再度、フィコエリスリン-ストレプトアビジン試薬を含む蛍光色素溶液に浸すことにより染色を行った。染色終了後、蛍光強度をGeneChip(R) Scanner 3000（Affymetrix）にて測定し、各遺伝子発現をすべて数値化した。以上より得られた遺伝子発現データをGeneSpring v7.3.1（Agilent Technologies）により解析した。
【００４３】
健常者2名に対しHTLV-1キャリア２名で発現の平均値が2倍以上上昇している遺伝子を26遺伝子抽出し、Fold change値の高い上位16遺伝子を表1に示す。またHTLV-1抗体陽転者１名において、陽転前に対し陽転後に発現値が2倍以上上昇した遺伝子を1275遺伝子抽出し、Fold change値の高い上位15遺伝子を表2に示す。
【００４４】
【表１】
2010057371.tif 000005
【００４５】
【表２】
2010057371.tif 000006
【００４６】
上記2種類の遺伝子発現解析において共通して発現上昇する遺伝子を検索したところ、cytochrome P450 family1, superfamily B, polypeptide 1（GenBank登録番号 NM_000104）を同定した。CYP1B1のrelative expression rateに関し、健常者２名、HTLV-1キャリア２名の比較を図1-(a)に、またHTLV-1抗体陽転者１名の陽転前後における比較を図１-(b)に示す。
【００４７】
（５）RT-PCR
上記マイクロアレイ解析に続いて、RT-PCRを行った。
実施例１―（３）と同様にして、total RNAの抽出はRNeasy Mini Kitおよび RNase-Free DNase setを用いた。RNeasy Mini Kitの説明書に従い、total RNAを抽出した。
【００４８】
（６）Total RNAからのcDNA合成
上記（５）で調製したtotal RNA 200 ngを用い、Ex script RT reagent kit（RR035B ,Takara）にて、cDNA合成を行った。上記で得られたtotal RNA (200 ng)に、製造者の説明書に従って5×ExScript buffer、dNTP Mixture、Random 6 mers、ExScript RTase、RNase Inhibitor及び水を加え、全体量を20μLにした。次いで、サーマルサイクラー（PC812 ,ASTEC）にて42℃ 15分間反応させた。更に95℃で2分間反応させ、4℃で反応を完結させた。
【００４９】
（７）cDNAからのPCR
上記（６）で調製したcDNA 2μLを用い、Takara Ex Hot Start Version（RR006A ,Takara）にてPCRを行った。cDNA 2μLに、製造者の説明書に従って10×Ex Taq buffer、dNTP Mixture、別途用意したCYP1B1及びGAPDHのForward プライマー（10μM）、Reverse プライマー（10μM）及び水を加え、全体量を20μLとした。次いで、サーマルサイクラーにてPCR反応を行った。CYP1B1及びGAPDHのプライマー配列とPCRの反応条件を表3に示す。なお、内部コントロールには、GAPDHを用いた。
【００５０】
【表３】
2010057371.tif 000007
【００５１】
（８）考察
表１、表２、表３ 及び図１、図２に示すように、健常者２名に比べHTLV-1キャリア２名でCYP1B1の発現が2〜3倍増加し、HTLV-1抗体陽転者１名の抗体陽転前に比べ陽転後ではCYP1B1の発現が5倍以上増加していた。
【００５２】
[参考例１]
ATL患者のマイクロアレイ解析
（１）健常者及び急性型ATL患者の血液検体
・健常者、ATL患者の血液回収
宮崎大学医学部医の倫理委員会「成人T細胞白血病（ATL）に特異的な細胞因子と腫瘍化の検討について」（承認番号396）に同意したATL患者８名、健常者５名の血液を実験に供した。
【００５３】
（２）急性型ATL患者の血液検体からの末梢血単核球分離
急性型ATL患者はHistopaque-1077（10771 ,Sigma）を用いて製造者の説明書に従い末梢血単核球（白血病細胞80%以上）を単離した。
【００５４】
（３）健常者の血液検体からのCD4陽性T細胞分離
健常者はヒトCD4+ T Cell アイソレーションキット２（130-091-155 ,Miltenyibiotec）を用いてCD4陽性Ｔ細胞を単離した。
【００５５】
（４）各血液検体由来CD4陽性T細胞および末梢血単核球からのtotal RNAの抽出
上記参考例１―（２）及び（３）により調製した約1×106個のCD4陽性T細胞および末梢血単核球をそれぞれ遠心し、得られたペレットにTRIZOL Reagent（15596-026 ,Invitrogen）を1 mL加えて20Gの注射針を用いてペレットを完全に溶解した。次いで、クロロホルムを0.2 mL加えよく混和し、遠心分離によりRNA画分である水層を回収した。約600 μLの水層に等量のイソプロパノール（600 μL）を加え混和し、-20℃で冷却することによりRNAの沈殿を得た。これを75%エタノールで洗浄することにより、total RNAを得た。cDNAマイクロアレイ解析に供するtotal RNAは260 nm吸光度と280 nm吸光度の比（A260/A280値）が1.8以上であることを条件とし、本検討に供するtotal RNAはすべてこれを満たすことを確認した。
【００５６】
（５）cDNAマイクロアレイ解析
実施例１―（４）と同様にして、各検体から100 ngのtotalRNAを用いて、cDNAマイクロアレイ解析を行った。GeneSpring v7.3.1により、CYP1B1の発現変化を検索したところ、図２に示すように、健常者のCD4陽性T細胞に比べ、ATL患者由来末梢血単核球でもCYP1B1遺伝子の発現が高い傾向にあることが示された。
【実施例２】
【００５７】
リアルタイムPCR法による mRNA発現定量
（１）被検体及び末梢血単核球の分離
実施例１―（２）と同様にして、インフォームドコンセントにより宮崎大学医学部免疫感染病態学講座におけるHTLV-1コホート研究（岡山昭彦教授）に同意を得た３２名のHTLV-1キャリア、１０名の健常者の血液検体より末梢血単核球を分離した。そこから常法によりFicol-Paque PLUSを用いて末梢血単核球を単離し、液体窒素中にセルバンカー保存した。
【００５８】
（２）各血液検体由来の末梢血単核球からのtotal RNAの調製
実施例１―（３）と同様にして、total RNAの抽出はRNeasy Mini Kitおよび RNase-Free DNase setを用いた。RNeasy Mini Kitの説明書に従い、total RNAを抽出した。
【００５９】
（３）total RNAからのcDNA合成
実施例１―（６）と同様にして、上記（２）で調製したtotal RNA 200 ngを用い、Ex script RT reagent kitにて、cDNA合成を行った。上記で得られたtotal RNA (200 ng)に、製造者の説明書に従って5×ExScript buffer、dNTP Mixture、Random 6 mers、ExScript RTase、RNase Inhibitor及び水を加え、全体量を20μLにした。次いで、サーマルサイクラーにて42℃ 15分間反応させた。更に95℃で2分間反応させ、4℃で反応を完結させた。
【００６０】
（４）リアルタイムPCR法による mRNA発現定量
Takara perfect real time（RR039 ,Takara）を用いてLight Cycler 2.0（Roche）によりCYP1B1とGAPDHのリアルタイムPCRを行い、mRNAの定量を行った。各サンプルのCYP1B1発現量/GAPDH発現量×100,000の値を求め、CYP1B1発現比の検討を行った。
【００６１】
上記実施例２―（３）で調製したcDNA 2μLに、キットに付属のPremix Ex Taqと、別途用意したCYP1B1及びGAPDHプローブ 10μM、Forward プライマー（10μM）、Reverse プライマー（10μM）及び水を加え、全体量を20μLとした。CYP1B1及びGAPDHのプローブとプライマー配列を表４に示す。リアルタイムPCRの反応条件を表５に示す。なお、内部コントロールには、GAPDHを用いた。
【００６２】
CYP1B1とGAPDHの上記プライマーを用いて増幅産物を作製し、プラスミドDNAにインサートし、標準プラスミドとした。標準プラスミドは、1×10e8/μLを10 ng/μLの酵母RNA（AM7118;アンビオン社）で10倍連続希釈し、1×10e１〜10e7/μLとした。各サンプルのCYP1B1発現量/GAPDH発現量×100,000の値を求め、CYP1B1発現比を比較した。
【００６３】
【表４】
2010057371.tif 000008
【００６４】
【表５】
2010057371.tif 000009
【００６５】
（５）結果と考察
リアルタイムPCRによるCYP1B1発現比を図４に示す。健常者とHTLV-1感染細胞率1％以上のサンプルを比較した結果、感染細胞率1％以上の群でCYP1B1の発現比が有意に高かった。このことからCYP1B1遺伝子発現は、高い感染細胞率で高発現すると推察される。より定量的には、CYP1B1遺伝子の転写産物の発現量が、下式で算出されるYが3,000以上である場合には、ATL発症危険性が高いと判定される。
【数２】
2010057371.tif 000010
【００６６】
[参考例２]リアルタイムPCRによる感染細胞率の測定
（１）感染細胞率の測定の為の各血液検体からの末梢血単核球の分離
実施例１―（２）と同様にして、インフォームドコンセントにより宮崎大学医学部免疫感染病態学講座におけるHTLV-1コホート研究（岡山昭彦教授）に同意を得た３２名のHTLV-1キャリア、１０名の健常者の血液検体より末梢血単核球を分離した。そこから常法によりFicol-Paque PLUSを用いて末梢血単核球を単離し、PBS中に保存した。
【００６７】
（２）感染細胞率の測定のためのDNA抽出
実施例２―（１）により調製した約5×10６個の末梢血単核球に、Cell Lysis Buffer１ｍLを加えて細胞を完全に溶解した。Cell Lysis Bufferは表6に示す。さらにRNase (1 mg/mL) を100μL加え、RNAを分解処理した。次にProtenaseK（10mg/mL）20μLを加え、細胞蛋白質を消化した。この細胞懸濁溶液を55℃で2時間ゆっくりと混和し、常法によりフェノール／クロロホルム抽出を行った。得られたペレットを滅菌水で溶解し、260 nmと280 nmの吸光度の値を測定した。
【００６８】
【表６】
2010057371.tif 000011
【００６９】
（３）感染細胞率の測定のためのリアルタイムPCR 
参考例２（２）で調製したDNAは、65℃で2時間反応させた後濃度測定を行い、約60 ng/μLに調製した。この変性DNAを用い、Takaraperfect real timeを用いてLight Cycler2.0により細胞数の定量とHTLV-1感染細胞率の測定を行った。
【００７０】
細胞数定量にはハプロイド（染色体1本）あたり1 コピーの遺伝子であるRNasePの測定を行った。変性DNA 2μLに、キットに付属のPremix Ex TaqとTaq Man Rnase P Control Reagents（4316844 ,アプライドバイオシステムズジャパン）及び水を加え、全体量を20μLとした。標準は、健常人末梢血単核球からDNAを精製し、10ng/μLの酵母RNAで10倍連続希釈した。1 μg DNAを150,000個細胞由来として計算した。
【００７１】
ウイルス遺伝子の検出にはHTLV-1遺伝子pX領域に位置するプライマーとプローブを用いた。変性DNA５μLに、キットに付属のPremix Ex Taqと別途用意したHTLV-1遺伝子pX領域のプローブ、Forwardプライマー及びReverse プライマーの混合液、及び水を加え、全体量を20μLとした。pXの標準は、上記プライマーを用いて増幅産物を作製し、プラスミドDNAにインサートし、標準プラスミドとした。標準プラスミドは、1×10e8/μLを10ng/μLの酵母RNAで10倍連続希釈し、1×10e1〜10e7/μLとした。
【００７２】
HTLV-1遺伝子pX領域のプローブとプライマー配列およびをに表７にRNaseP及びHTLV-1遺伝子pX領域リアルタイムPCRの反応条件を表８に示す。
【００７３】
【表７】
2010057371.tif 000012
【００７４】
【表８】
2010057371.tif 000013
【００７５】
各サンプルのRNaseP、pXの値を求め、下記の式により感染細胞率xを計算した。
【数１】
2010057371.tif 000014
【００７６】
（４）結果
リアルタイムPCRによる感染細胞率の測定結果を表９に示す。感染細胞率を測定し、HTLV-1感染細胞率1％未満１２名と感染細胞率1％以上２０名に分けた。
【００７７】
【表９】
2010057371.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】健常者２名、HTLV-1キャリア２名、HTLV-1抗体陽転者１名（陽転前後両方）のCYP1B1のrelative expression rateを示す図である。
【図２】DNAマイクロアレイ解析をもとに、RT-PCR法によって健常者とHTLV-1キャリアでのCYP1B1遺伝子発現の比較を示す図である。
【図３】cDNAマイクロアレイ解析によって、健常者のCD4陽性T細胞と急性型ATL患者の末梢血単核球におけるCYP1B1遺伝子発現の比較を示す図である。
【図４】リアルタイムPCRによって、HTLV-1感染細胞率1％未満と1％以上のサンプルにおけるCYP1B1発現比を比較した結果を示す図である。
【図１】
2010057371.tif 000018
【図２】
2010057371.tif 000019
【図３】
2010057371.tif 000020
【図４】
2010057371.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成20年12月19日(2008.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
CYP1B1とGAPDHの上記プライマーを用いて増幅産物を作製し、プラスミドDNAにインサートし、標準プラスミドとした。標準プラスミドは、1×10e8 copies/μLを10ng/μLの酵母RNA（AM7118;アンビオン社）で10倍連続希釈し、1×10e１〜10e7 copies /μLとした。各サンプルのCYP1B1発現量/GAPDH発現量×100,000の値を求め、CYP1B1発現比を比較した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
【表４】
2010057371.tif 000022
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
ウイルス遺伝子の検出にはHTLV-1遺伝子pX領域に位置するプライマーとプローブを用いた。変性DNA５μLに、キットに付属のPremix Ex Taqと別途用意したHTLV-1遺伝子pX領域のプローブ、Forwardプライマー及びReverse プライマーの混合液、及び水を加え、全体量を20μLとした。pXの標準は、上記プライマーを用いて増幅産物を作製し、プラスミドDNAにインサートし、標準プラスミドとした。標準プラスミドは、1×10e8 copies/μLを10ng/μLの酵母RNAで10倍連続希釈し、1×10e1〜10e7 copies /μLとした。