【手続補正書】
【提出日】令和3年6月14日(2021.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるがんを処置するための形質導入されたＴ細胞を製造する方法であって、
ＣＤ５の発現を抑制するように、前記対象から単離されたＴ細胞を改変すること
を含む方法。
【請求項２】
ベクターが前記Ｔ細胞に挿入され、前記ベクターはＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、前記Ｔ細胞が前記ＣＤ５抗原認識ドメインを発現する条件下で、コード及び発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ベクターが前記Ｔ細胞に挿入され、前記ベクターは、ＣＤ５遺伝子またはＣＤ５  ｍＲＮＡの開裂、切れ目を作る、もしくは発現のブロックのための配列を標的とするガイドＲＮＡをコードし、
前記ガイドＲＮＡが、ＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記形質導入されたＴ細胞が、必要に応じてＩＬ−２と組み合わせて、有効量で対象に投与されるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
対象におけるがんを処置するための形質導入されたＴ細胞を製造する方法であって、
ＣＤ５の発現を抑制するように、前記対象から単離されたＴ細胞を改変すること；および
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することであって、前記ベクターはＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、前記Ｔ細胞が前記ＣＤ５抗原認識ドメインを発現して形質転換されたＴ細胞を提供する条件下で、コード及び発現する、挿入すること；
を含み、
前記形質導入されたＴ細胞は、必要に応じてＩＬ−２と組み合わせて、有効量で前記対象に投与されるものであり、
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離されたＴ細胞を改変することは、ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ベクターは、ＣＤ５遺伝子またはＣＤ５  ｍＲＮＡの開裂、切れ目を作る、もしくは発現のブロックのための配列を標的とするガイドＲＮＡをコードし、
前記ガイドＲＮＡが、ＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む、方法。
【請求項６】
対象におけるがんを処置するための形質導入されたＴ細胞を製造する方法であって、
ＣＤ５の発現を抑制するように、前記対象から単離されたＴ細胞を改変すること；および
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することであって、前記ベクターはＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、前記Ｔ細胞が前記ＣＤ５抗原認識ドメインを発現して形質導入されたＴ細胞を提供する条件下で、コード及び発現する、挿入すること；
を含み、
前記形質導入されたＴ細胞は、必要に応じてＩＬ−２と組み合わせて、有効量で前記対象に投与されるものであり、
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離されたＴ細胞を改変することは、ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ベクターは、ＣＤ５遺伝子またはＣＤ５  ｍＲＮＡの開裂、切れ目を作る、もしくは発現のブロックのための配列を標的とするＣａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡをコードし、
前記ガイドＲＮＡが、ＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む、方法。
【請求項７】
対象におけるがんを処置するための形質導入されたＴ細胞を製造する方法であって、
ＣＤ５の発現を抑制するように、前記対象から単離されたＴ細胞を改変すること；および
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することであって、前記ベクターはＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、前記Ｔ細胞が前記ＣＤ５抗原認識ドメインを発現して形質導入されたＴ細胞を提供する条件下で、コード及び発現する、挿入すること；
を含み、
前記形質導入されたＴ細胞は、必要に応じてＩＬ−２と組み合わせて、有効量で前記対象に投与されるものであり、
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離されたＴ細胞を改変することは、ｍＲＮＡを前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ｍＲＮＡは、ＣＤ５遺伝子またはＣＤ５  ｍＲＮＡの開裂、もしくは切れ目を作るための配列を標的とするガイドＲＮＡをコードし、
前記ガイドＲＮＡが、ＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む、方法。
【請求項８】
対象におけるがんを処置するための形質導入されたＴ細胞を製造する方法であって、
ＣＤ５の発現を抑制するように、前記対象から単離されたＴ細胞を改変すること；および
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することであって、前記ベクターはＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、前記Ｔ細胞が前記ＣＤ５抗原認識ドメインを発現して形質導入されたＴ細胞を提供する条件下で、コード及び発現する、挿入すること；
を含み、
前記形質導入されたＴ細胞は、必要に応じてＩＬ−２と組み合わせて、有効量で前記対象に投与されるものであり、
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離されたＴ細胞を改変することは、ｍＲＮＡを前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ｍＲＮＡは、ＣＤ５遺伝子またはＣＤ５  ｍＲＮＡの開裂、もしくは切れ目を作るための配列を標的とするＣａｓヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡをコードし、
前記ガイドＲＮＡが、ＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む、方法。
【請求項９】
対象におけるがんを処置するための形質導入されたＴ細胞を製造する方法であって、
ＣＤ５の発現を抑制するように、前記対象から単離されたＴ細胞を改変すること；および
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することであって、前記ベクターはＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、前記Ｔ細胞が前記ＣＤ５抗原認識ドメインを発現して形質導入されたＴ細胞を提供する条件下で、コード及び発現する、挿入すること；
を含み、
前記形質導入されたＴ細胞は、必要に応じてＩＬ−２と組み合わせて、有効量で前記対象に投与されるものであり、
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離されたＴ細胞を改変することは、ベクターまたはｍＲＮＡを前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ベクターまたはｍＲＮＡは、ＣＤ５  ｍＲＮＡ発現を抑制することができる短いヘアピンＲＮＡをコード及び発現する、方法。
【請求項１０】
対象におけるがんを処置するための形質導入されたＴ細胞を製造する方法であって、
ＣＤ５の発現を抑制するように、前記対象から単離されたＴ細胞を改変すること；および
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することであって、前記ベクターはＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、前記Ｔ細胞が前記ＣＤ５抗原認識ドメインを発現して形質導入されたＴ細胞を提供する条件下で、コード及び発現する、挿入すること；
を含み、
前記形質導入されたＴ細胞は、必要に応じてＩＬ−２と組み合わせて、有効量で前記対象に投与されるものであり、
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離されたＴ細胞を改変することは、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＣＤ５  ｍＲＮＡ発現を抑制することができる、方法。
【請求項１１】
形質導入されたＴ細胞の有効量が、前記対象へのリンパ球除去レジメンの投与後に、前記対象に投与されるものであり、
前記リンパ球除去レジメンが、非骨髄破壊的である、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＤ５抗原認識ドメインは、
【化７】
2020525537.tif 000001
（配列番号８）を含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
【化８】
2020525537.tif 000002
（配列番号８）を含むポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１５】
プロモーターと作動可能に組み合わせた請求項１４に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１３に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１７】
膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び、シグナル伝達ドメインを含む、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
未編集ジャーカットＴ細胞と比較して、すべてのＭＯＩでのＣＤ５編集Ｔ細胞におけるＶＬＲ−ＣＡＲ、及び、ｓｃＦｖ−ＣＡＲタンパク質発現の増大
未編集Ｔ細胞株、及び、ＣＤ５編集Ｔ細胞株に、５のＭＯＩで、抗ＣＤ５  ｓｃＦｖ  ＣＡＲを形質導入した。フローサイトメトリーを使用して、形質導入の５日後に、ＣＡＲ発現の尺度であるＧＦＰ、及び、ＣＤ５−Ｆｃ細胞表面発現を測定した。ＧＦＰ発現で測定した同様のレベルの形質導入（図７Ａは、未編集細胞を示し、及び、図７Ｂは、編集したＴ細胞を示す）で、ＣＤ５編集Ｔ細胞は、非発現細胞でのＣＡＲ発現と比較して、少なくとも２倍のＣＡＲ発現の増加を実証する（図７Ｃ）。加えて、１、１０、及び、２０のＭＯＩで、ＣＤ５  ＶＬＲ  ＣＡＲ、及び、ＣＤ５  ｓｃＦｖ  ＣＡＲレンチウイルスベクターを形質導入した未編集、及び、ＣＤ５編集Ｔ細胞から全細胞溶解物を単離した。ＣＡＲタンパク質の発現を、抗ＣＤ３ゼータ抗体を使用したウェスタンブロットで測定し、未編集Ｔ細胞でのＣＡＲタンパク質発現と比較して、ＣＤ５編集Ｔ細胞でのＣＡＲタンパク質発現が大きかったことを確認した。内因性ＣＤ３ゼータを１８ｋＤａで検出し、そして、当該ＣＡＲ構築物でのＣＤ３ゼータは、ＣＤ５  ＶＬＲ  ＣＡＲ、及び、ＣＤ５  ｓｃＦｖ  ＣＡＲにおいて、それぞれ、４８及び５５ｋＤａである（図８Ａ及び８Ｂ）。内因性ＣＤ３ゼータに対するバンドの強度の定量は、未編集ジャーカットＴ細胞でのタンパク質発現と比較して、すべてのＭＯＩで、ＣＤ５編集Ｔ細胞におけるＶＬＲ−ＣＡＲ、及び、ｓｃＦｖ−ＣＡＲタンパク質発現の増大を示す（図８Ｃ）。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
がんを処置する方法であって：
対象からＴ細胞を単離し；
Ｔ細胞抗原の発現を抑制するように、前記単離したＴ細胞を改変し；
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入し、前記ベクターは、Ｔ細胞抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、形質導入したＴ細胞を提供する前記抗原認識ドメインを前記Ｔ細胞が発現する条件下で、コードし、及び、発現し、前記Ｔ細胞抗原の発現の抑制は、Ｔ細胞と比較して、前記Ｔ細胞での前記Ｔ細胞抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現を増大させ、前記Ｔ胞抗原の発現は、変化しておらず、または、抑制されておらず；及び
有効量の形質導入したＴ細胞を前記対象に対して、任意に、ＩＬ−２と組み合わせて、前記対象に対して投与することを含む、前記方法。
（項目２）
前記Ｔ細胞抗原が、ＣＤ５、ＣＤ７、または、ＣＤ３である、項目１に記載の方法。
（項目３）
がんを処置する方法であって：
対象からＴ細胞を単離し；
ＣＤ５の発現を抑制するように、前記単離したＴ細胞を改変し；
ベクターを前記Ｔ細胞に挿入し、前記ベクターは、ＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体を、形質導入したＴ細胞を提供する前記ＣＤ５抗原認識ドメインを前記Ｔ細胞が発現する条件下で、コードし、及び、発現する；及び
有効量の形質導入したＴ細胞を前記対象に対して、任意に、ＩＬ−２と組み合わせて、前記対象に対して投与することを含む、前記方法。
（項目４）
ＣＤ５の発現の抑制が、Ｔ細胞と比較して、前記Ｔ細胞でのＣＤ５抗原認識ドメインを含むキメラ抗原受容体の発現を増大させ、ＣＤ５の発現は、変化しておらず、または、抑制されていない、項目３に記載の方法。
（項目５）
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離したＴ細胞の改変は、ベクターを前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ベクターは、前記ＣＤ５遺伝子、または、ＣＤ５  ｍＲＮＡの開裂、切れ目を作る、または、発現のブロックのための配列を標的とするＣａｓヌクレアーゼ、及び、ガイドＲＮＡをコードし、及び、発現する、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記ガイドＲＮＡが、ＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離したＴ細胞の改変は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、前記ＣＤ５遺伝子、または、ＣＤ５  ｍＲＮＡにおける切れ目を開裂するための配列を標的とするガイドＲＮＡとを、前記Ｔ細胞に挿入することを含む、項目３に記載の方法。
（項目８）
前記ガイドＲＮＡが、ＡＧＣＧＧＴＴＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号５）を含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離したＴ細胞の改変は、ベクターまたはｍＲＮＡを前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ベクターまたはｍＲＮＡは、ＣＤ５  ｍＲＮＡ発現を抑制することができる短いヘアピンＲＮＡをコードし、及び、発現する、項目３に記載の方法。
（項目１０）
ＣＤ５の発現を抑制するように前記単離したＴ細胞の改変は、二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、前記Ｔ細胞に挿入することを含み、前記ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＣＤ５  ｍＲＮＡ発現を抑制することができる、項目３に記載の方法。
（項目１１）
前記Ｔ細胞を、前記対象の自己末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から得る項目３に記載の方法。
（項目１２）
前記対象への有効量の形質導入したＴ細胞の投与は、前記対象へのリンパ球除去レジメンの投与の後である、項目３に記載の方法。
（項目１３）
前記リンパ球除去レジメンが、非骨髄破壊的である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記リンパ除去レジメンが、シクロホスファミド、フルダラビン、または、それらの組み合わせの投与を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記ＣＤ５抗原認識ドメインは、
【化７】
2020525537.tif 000003
（配列番号８）を含む、項目３に記載の方法。
（項目１６）
【化８】
2020525537.tif 000004
（配列番号８）を含むポリペプチド。
（項目１７）
項目１６に記載のポリペプチドをコードする核酸。
（項目１８）
プロモーターと作動可能に組み合わせた項目１７に記載の核酸を含むベクター。
（項目１９）
項目１６に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質。
（項目２０）
膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び、シグナル伝達ドメインを含む、項目１９に記載の融合タンパク質。