【手続補正書】
【提出日】令和3年2月4日(2021.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物対象におけるハプロ不全疾患を処置する方法における使用のための、
(i）(a）該細胞の核内に存在する条件下でハプロ不全遺伝子の野生型コピーに機能的に連結されたプロモーター領域またはエンハンサー領域に特異的にハイブリダイズする、ターゲティング領域、および
(b）該細胞の核内に存在する条件下でCRISPRヌクレアーゼに特異的に結合するCRISPRヌクレアーゼ結合領域または該CRISPRヌクレアーゼ結合領域に特異的に結合する領域
を含むガイドRNA、ならびに
(ii）CRISPRヌクレアーゼ
を含む組成物であって、該方法が該対象の細胞を該組成物と接触させる工程を含み、
接触させる工程により、ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む複合体が形成され、該複合体中のガイドRNAのターゲティング領域が、該プロモーターまたはエンハンサーにハイブリダイズされ、
該複合体は触媒的に不活性なCRISPRヌクレアーゼおよび転写活性化ドメインを含み、かつ
該複合体は、該対象におけるハプロ不全疾患を処置するのに十分な量でかつ十分な持続時間にわたって、ハプロ不全遺伝子の野生型コピーの転写を活性化する、
前記組成物。
【請求項２】
接触させる工程が、ガイドRNAまたはCRISPRヌクレアーゼをコードするエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含み；任意で、
(a) 接触させる工程が、ガイドRNAとCRISPRヌクレアーゼとをコードするエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む；または
(b) 接触させる工程が、ガイドRNAをコードするエピソーマルベクターおよびCRISPRヌクレアーゼをコードする第2エピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む、請求項1に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
(a) エピソーマルベクターが非組込み型である；
(b) エピソーマルベクターが非複製型である；
(c) エピソーマルベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである；および/または
(d) エピソーマルベクターが、第1端および第2端を独立して含み、第1端および第2端が、AAV逆方向末端反復配列をそれぞれ独立して含む、請求項1または2記載の使用のための組成物。
【請求項４】
(a) CRISPRヌクレアーゼが、（i）ヌクレアーゼ活性およびニッキング活性を排除するように改変されたヌクレアーゼドメインと、（ii）転写活性化ドメインとを含む；
(b) CRISPRヌクレアーゼが改変を有し、かつ該改変が、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）Cas9のD10およびH840に対応する位置に変異を含む；
(c) CRISPRヌクレアーゼが、D10A,H840A化膿レンサ球菌dCas9を含む；
(d) ガイドRNAがデッドガイド配列（dead guide sequence）を含む；および/または
(e) ガイドRNAが転写活性化結合ドメインを含み、転写活性化結合ドメインが、1つまたは複数の転写活性化ドメインを含む組成物に特異的に結合する、請求項1〜3のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項５】
(a) ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む複合体が、HSF1、VP16、VP64、p65、MyoD1、RTA、SET7/9、VPR、ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300、TETファミリータンパク質のヒドロキシラーゼ触媒ドメイン（例えばTET1ヒドロキシラーゼ触媒ドメイン）、LSD1、CIB1、AD2、CR3、EKLF1、GATA4、PRVIE、p53、SP1、MEF2C、TAX、およびPPARγからなる群より選択される転写活性化ドメインをさらに含む；および/または
(b) CRISPRヌクレアーゼがCRISPRヌクレアーゼ-VP64融合ポリペプチドである、請求項1〜4のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項６】
ガイドRNAがスキャフォールド領域を含み； 
任意で、スキャフォールド領域が、ms2、f6、PP7、com、またはL7aリガンド配列を含む；
さらに任意で、前記複合体中のガイドRNAのスキャフォールド領域が、MCPポリペプチド、COMポリペプチド、PCPポリペプチド、またはL7aポリペプチドに融合された転写活性化ドメインに結合される、請求項1〜5のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項７】
ハプロ不全遺伝子が、SYNGAP1、SETD5、GRIN2A、GRIN2B、ABCC6、ASXL1、NRXN1、SETBP1、CAMTA1、SCN2A、SCN1A、MED13L、ABCA4、CACNA1A、FBN1、CACNA1C、CDKL5、KANSL1、TERT、MYT1L、ZEB2、EHMT1、PNPLA6、BLM、KDM6A、COL1A1、LRP5、MBD5、CHD2、RAI1、TNXA、KMT2A、RYR1、EP300、PKD1、KMT2D、F8、DMD、またはATRである、請求項1〜6のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項８】
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000001
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜7のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項９】
(a) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000002
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする；
(b) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000003
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする；または
(c) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000004
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜7のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
(a) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000005
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする；
(b) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000006
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする；または
(c) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000007
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜7のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
(a) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000008
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする；または
(b) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000009
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜7のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１２】
(a) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000010
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする；
(b) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000011
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする；または
(c) ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000012
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、請求項1〜7のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
(a) 前記細胞が非分裂細胞である；
(b) 前記細胞がニューロンである；
(c) 前記細胞が視床下部細胞である；
(d) 接触させる工程が、視床下部を含んでいる脳の領域への、ガイドRNAおよび/またはCRISPRヌクレアーゼをコードする核酸の注射を含む；
(e) 接触させる工程が、視床下部を含んでいる脳の領域への、ガイドRNAおよび/またはCRISPRヌクレアーゼをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターの注射を含む；
(f) ハプロ不全疾患が、肥満、自閉症、てんかん、知的障害、無虹彩症、および多発性嚢胞腎からなる群より選択される；および/または
(g) ハプロ不全疾患が表1から選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
（I.）標的遺伝子の少なくとも1つの機能的コピーを含むゲノムであって、該機能的コピーが、異種複合体による転写活性化の非存在下では、生物において野生型表現型をもたらすのに十分な対応する遺伝子産物を生産しない、ゲノム、ならびに
(II.）(a）(i.）標的遺伝子の機能的コピーに機能的に連結されたプロモーター領域またはエンハンサー領域に、細胞の核内に存在する条件下で、特異的にハイブリダイズするターゲティング領域と、
(ii.）細胞の核内に存在する条件下でCRISPRヌクレアーゼに特異的に結合するCRISPRヌクレアーゼ結合領域と
を含む、ガイドRNA、および
(b）CRISPRヌクレアーゼ
を含む、異種複合体
を含む、単離された哺乳動物宿主細胞であって、
ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む異種複合体のガイドRNAが、該プロモーターまたはエンハンサーにハイブリダイズされ、
CRISPRヌクレアーゼが触媒的に不活性であり、かつ
該複合体が、該宿主細胞が生物中に存在する場合に野生型表現型を生み出すのに十分な量でかつ十分な持続時間にわたって、標的遺伝子の機能的コピーの転写を活性化する、
前記単離された哺乳動物宿主細胞。
【請求項１５】
前記ゲノムが標的遺伝子の機能的コピーを1つだけ含み； 
任意で、標的遺伝子の1つだけの機能的コピーがハプロ不全遺伝子を含む； 
任意で、ハプロ不全遺伝子が、SYNGAP1、SETD5、GRIN2A、GRIN2B、ABCC6、ASXL1、NRXN1、SETBP1、CAMTA1、SCN2A、SCN1A、MED13L、ABCA4、CACNA1A、FBN1、CACNA1C、CDKL5、KANSL1、TERT、MYT1L、ZEB2、EHMT1、PNPLA6、BLM、KDM6A、COL1A1、LRP5、MBD5、CHD2、RAI1、TNXA、KMT2A、RYR1、EP300、PKD1、KMT2D、F8、DMD、またはATRである； 
さらに任意で、ハプロ不全遺伝子が、表1から選択されるハプロ不全疾患を処置する； 
さらに任意で、ハプロ不全疾患が、肥満、自閉症、てんかん、知的障害、無虹彩症、および多発性嚢胞腎から選択される、請求項14記載の単離された哺乳動物宿主細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
いくつかの態様において、ゲノムは、標的遺伝子の機能的コピーを1つだけ含む。いくつかの態様において、標的遺伝子の1つだけの機能的コピーは、ハプロ不全遺伝子を含む。いくつかの態様において、ゲノムが含む標的遺伝子の機能的コピーは、2つ未満である。
[本発明1001]
哺乳動物対象におけるハプロ不全疾患を処置する方法であって、該対象の細胞を、
(i）(a）該細胞の核内に存在する条件下でハプロ不全遺伝子の野生型コピーに機能的に連結されたプロモーター領域またはエンハンサー領域に特異的にハイブリダイズする、ターゲティング領域、および
(b）該細胞の核内に存在する条件下でCRISPRヌクレアーゼに特異的に結合するCRISPRヌクレアーゼ結合領域または該CRISPRヌクレアーゼ結合領域に特異的に結合する領域
を含むガイドRNA、ならびに
(ii）CRISPRヌクレアーゼ
を含む組成物と接触させる工程を含み、
接触させる工程により、ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む複合体が形成され、該複合体中のガイドRNAのターゲティング領域が、該プロモーターまたはエンハンサーにハイブリダイズされ、
該複合体は触媒的に不活性なCRISPRヌクレアーゼおよび転写活性化ドメインを含み、かつ
該複合体は、該対象におけるハプロ不全疾患を処置するのに十分な量でかつ十分な持続時間にわたって、ハプロ不全遺伝子の野生型コピーの転写を活性化する、
前記方法。
[本発明1002]
接触させる工程が、ガイドRNAまたはCRISPRヌクレアーゼをコードするエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
接触させる工程が、ガイドRNAとCRISPRヌクレアーゼとをコードするエピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
接触させる工程が、ガイドRNAをコードするエピソーマルベクターおよびCRISPRヌクレアーゼをコードする第2エピソーマルベクターと、前記細胞を接触させることを含む、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
エピソーマルベクターが非組込み型である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
エピソーマルベクターが非複製型である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
エピソーマルベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
エピソーマルベクターが、第1端および第2端を独立して含み、第1端および第2端が、AAV逆方向末端反復配列をそれぞれ独立して含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
CRISPRヌクレアーゼが、（i）ヌクレアーゼ活性およびニッキング活性を排除するように改変されたヌクレアーゼドメインと、（ii）転写活性化ドメインとを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記改変が、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）Cas9のD10およびH840に対応する位置に変異を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
CRISPRヌクレアーゼが、D10A,H840A化膿レンサ球菌dCas9を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
ガイドRNAがデッドガイド配列（dead guide sequence）を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
ガイドRNAが転写活性化結合ドメインを含み、転写活性化結合ドメインが、1つまたは複数の転写活性化ドメインを含む組成物に特異的に結合する、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む複合体が、HSF1、VP16、VP64、p65、MyoD1、RTA、SET7/9、VPR、ヒストンアセチルトランスフェラーゼp300、TETファミリータンパク質のヒドロキシラーゼ触媒ドメイン（例えばTET1ヒドロキシラーゼ触媒ドメイン）、LSD1、CIB1、AD2、CR3、EKLF1、GATA4、PRVIE、p53、SP1、MEF2C、TAX、およびPPARγからなる群より選択される転写活性化ドメインをさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
CRISPRヌクレアーゼがCRISPRヌクレアーゼ-VP64融合ポリペプチドである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
ガイドRNAがスキャフォールド領域を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
スキャフォールド領域が、ms2、f6、PP7、com、またはL7aリガンド配列を含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記複合体中のガイドRNAのスキャフォールド領域が、MCPポリペプチド、COMポリペプチド、PCPポリペプチド、またはL7aポリペプチドに融合された転写活性化ドメインに結合される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
ハプロ不全遺伝子が、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1、またはFOXO1である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1020]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000013
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000014
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1022]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000015
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1023]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000016
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1024]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000017
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1025]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000018
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1026]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000019
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1027]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000020
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1028]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000021
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1029]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000022
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1030]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000023
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1031]
ガイドRNAのターゲティング領域が、
2020506948.tif 000024
によってコードされるか、またはそれに特異的にハイブリダイズする、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記細胞が非分裂細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記細胞がニューロンである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記細胞が視床下部細胞である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1035]
接触させる工程が、視床下部を含んでいる脳の領域への、ガイドRNAおよび/またはCRISPRヌクレアーゼをコードする核酸の注射を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1036]
接触させる工程が、視床下部を含んでいる脳の領域への、ガイドRNAおよび/またはCRISPRヌクレアーゼをコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターの注射を含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1037]
ハプロ不全疾患が、肥満、自閉症、てんかん、知的障害、無虹彩症、および多発性嚢胞腎からなる群より選択される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1038]
ハプロ不全疾患が表1から選択される、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1039]
ハプロ不全疾患が肥満である、本発明1037の方法。
[本発明1040]
（I.）標的遺伝子の少なくとも1つの機能的コピーを含むゲノムであって、該機能的コピーが、異種複合体による転写活性化の非存在下では、生物において野生型表現型をもたらすのに十分な対応する遺伝子産物を生産しない、ゲノム、ならびに
(II.）(a）(i.）標的遺伝子の機能的コピーに機能的に連結されたプロモーター領域またはエンハンサー領域に、細胞の核内に存在する条件下で、特異的にハイブリダイズするターゲティング領域と、
(ii.）細胞の核内に存在する条件下でCRISPRヌクレアーゼに特異的に結合するCRISPRヌクレアーゼ結合領域と
を含む、ガイドRNA、および
(b）CRISPRヌクレアーゼ
を含む、異種複合体
を含む、単離された哺乳動物宿主細胞であって、
ガイドRNAに結合したCRISPRヌクレアーゼを含む異種複合体のガイドRNAが、該プロモーターまたはエンハンサーにハイブリダイズされ、
CRISPRヌクレアーゼが触媒的に不活性であり、かつ
該複合体が、該宿主細胞が生物中に存在する場合に野生型表現型を生み出すのに十分な量でかつ十分な持続時間にわたって、標的遺伝子の機能的コピーの転写を活性化する、
前記単離された哺乳動物宿主細胞。
[本発明1041]
前記ゲノムが標的遺伝子の機能的コピーを1つだけ含む、本発明1040の単離された哺乳動物宿主細胞。
[本発明1042]
標的遺伝子の1つだけの機能的コピーがハプロ不全遺伝子を含む、本発明1041の単離された哺乳動物宿主細胞。
[本発明1043]
ハプロ不全遺伝子が、SIM1、レプチン、レプチン受容体、MC4R、SCN2A、SETD5、PAX6、PKD1、MC3R、POMC、STAT3、STAT5、SOCS3、GHR、NPY、NPY1R、NPY2R、NPY5R、PYY、AMPK（PRKAA1、PRKAA2、PRKAB1、PRKAB2、PRKAG1、PRKAG2、PRKAG3）、OXT、JAK2、SHP2、NOS3、NROB2、BRS3、CARTPT、FABP4、HTR2C、IL6、NHLH2、NMU、NPB、NPBWRI、PNPLA2、UCP3、ADIPOQ、APOA5、ARNT2、ASIP、C1QTNF2、C3AR1、CCK、CPT1B、CSF2、DGAT1、DGAT2、GHRL、GHSR、HSD11B1、HTR7、INSIG1、INSIG2、LIPC、NMURI、NMUR2、NPBWR2、NTS、PPARGC1A、PPY、RETN、SIRT1、TGFBR2、WDTC1、またはFOXO1である、本発明1042の単離された哺乳動物宿主細胞。
[本発明1044]
ハプロ不全遺伝子が、表1から選択されるハプロ不全疾患を処置する、本発明1043の単離された哺乳動物宿主細胞。
[本発明1045]
ハプロ不全疾患が、肥満、自閉症、てんかん、知的障害、無虹彩症、および多発性嚢胞腎から選択される、本発明1044の単離された哺乳動物宿主細胞。
[本発明1046]
ハプロ不全疾患が肥満である、本発明1045の単離された哺乳動物宿主細胞。