【手続補正書】
【提出日】令和3年2月8日(2021.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離され、かつ精製されたコラゲナーゼを含む組成物であって、中性プロテアーゼを本質的に含まない、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、前記組成物１ｍｇあたり約１００ｎｇ未満、約７５ｎｇ未満、約５０ｎｇ未満または約２５ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記コラゲナーゼが、クロストリジウム・ヒストリチクムから単離および精製されたものである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む、請求項１〜３いずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、おおよそ１：１の質量比で存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
クロストリジウム・ヒストリチクム由来の単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩ調製物であって、中性プロテアーゼを本質的に含まない、コラゲナーゼＩ調製物。
【請求項７】
前記コラゲナーゼＩ調製物が、検出可能な量の中性プロテアーゼを含まない、請求項６に記載のコラゲナーゼＩ調製物。
【請求項８】
前記コラゲナーゼＩ調製物が、前記コラゲナーゼＩ調製物の１ｍｇあたり約１０００ｎｇ未満または約５００ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項６に記載のコラゲナーゼＩ調製物。
【請求項９】
クロストリジウム・ヒストリチクム由来の単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩＩ調製物であって、中性プロテアーゼを本質的に含まない、コラゲナーゼＩＩ調製物。
【請求項１０】
前記コラゲナーゼＩＩ調製物が、検出可能な量の中性プロテアーゼを含まない、請求項９に記載のコラゲナーゼＩＩ調製物。
【請求項１１】
前記コラゲナーゼＩＩ調製物が、前記コラゲナーゼＩＩ調製物の１ｍｇあたり約１０００ｎｇ未満または約５００ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項９に記載のコラゲナーゼＩＩ調製物。
【請求項１２】
クロストリジウム・ヒストリチクムからコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを単離し、かつ精製するための方法であって、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの精製の間、金属レベルを制御することを含む、方法。
【請求項１３】
低レベルの、ニッケル、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、および鉛からなる群より選択される金属の存在下で、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ニッケルが、約２．０ｐｐｍ未満、約１．２ｐｐｍ未満、約１．０ｐｐｍ未満、約０．９ｐｐｍ未満、約０．８ｐｐｍ未満、約０．７ｐｐｍ未満、約０．６ｐｐｍ未満、約０．５ｐｐｍ未満、約０．４ｐｐｍ未満、約０．３ｐｐｍ未満、約０．２ｐｐｍ未満、約０．１ｐｐｍ未満、約０．０９ｐｐｍ未満、約０．０８ｐｐｍ未満、約０．０７ｐｐｍ未満、約０．０６ｐｐｍ未満、約０．０５ｐｐｍ未満、約０．０４ｐｐｍ未満、約０．０３ｐｐｍ未満、約０．０２ｐｐｍ未満、または約０．０１ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記亜鉛が、約８０ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約２５ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、約５ｐｐｍ未満、約３ｐｐｍ未満または約１ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１２〜１４いずれかに記載の方法。
【請求項１６】
約１．２ｐｐｍ未満のニッケルおよび／または約８４．４ｐｐｍ未満の亜鉛の存在下で、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製することを含む、請求項１２〜１５いずれかに記載の方法。
【請求項１７】
コラゲナーゼを単離および精製する方法であって、
コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの精製の間に金属レベルを制御すること：および
中性プロテアーゼの画分からコラゲナーゼの複数の高度に純粋な画分を分離すること
を含む、方法。
【請求項１８】
前記コラゲナーゼがコラゲナーゼＩであり、かつ前記方法が、中性プロテアーゼの画分からコラゲナーゼＩの画分を分離することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コラゲナーゼがコラゲナーゼＩＩであり、かつ前記方法が、中性プロテアーゼの画分からコラゲナーゼＩＩの画分を分離することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法が、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩの高度に純粋な画分を混合することを含み、混合物が混合物１ｍｇあたり５０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを有する、請求項１７〜１９いずれかに記載の方法。
【請求項２１】
低レベルの、ニッケル、亜鉛、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、および鉛からなる群より選択される金属の存在下で、コラゲナーゼを精製することを含む、請求項１７〜２０いずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記ニッケルが約２．０ｐｐｍ未満、約１．２ｐｐｍ未満、約１．０ｐｐｍ未満、約０．９ｐｐｍ未満、約０．８ｐｐｍ未満、約０．７ｐｐｍ未満、約０．６ｐｐｍ未満、約０．５ｐｐｍ未満、約０．４ｐｐｍ未満、約０．３ｐｐｍ未満、約０．２ｐｐｍ未満、約０．１ｐｐｍ未満、約０．０９ｐｐｍ未満、約０．０８ｐｐｍ未満、約０．０７ｐｐｍ未満、約０．０６ｐｐｍ未満、約０．０５ｐｐｍ未満、約０．０４ｐｐｍ未満、約０．０３ｐｐｍ未満、約０．０２ｐｐｍ未満、または約０．０１ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１７〜２１いずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記亜鉛が約８０ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約２５ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、約５ｐｐｍ未満、約３ｐｐｍ未満または約１ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項１７〜２２いずれかに記載の方法。
【請求項２４】
約１．２ｐｐｍ未満のニッケルおよび／または約８４．４ｐｐｍ未満の亜鉛の存在下で、コラゲナーゼを精製することを含む、請求項１７〜２３いずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記分離工程が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で各画分を試験することと、前記ゲル上で検出可能な量の中性プロテアーゼを含まない画分のみをプールすることと、を含む、請求項１７〜２４いずれかに記載の方法。
【請求項２６】
クロストリジウム・ヒストリチクムからコラゲナーゼを単離および精製する方法であって、
（ａ）コラゲナーゼの複数の高度に純粋な画分を中性プロテアーゼの画分から分離することと、
（ｂ）前記コラゲナーゼの高度に純粋な画分をプールすることと、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼＩである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記コラゲナーゼが、コラゲナーゼＩＩである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記分離工程が、ザイモグラフィーを用いて中性プロテアーゼの存在について各画分を試験することを含み、かつ前記プール工程が、ザイモグラフィーゲル上で検出可能な量の中性プロテアーゼを含まないコラゲナーゼを含有する画分のみをプールすることを含む、請求項２６〜２８いずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記コラゲナーゼが中性プロテアーゼを本質的に含まない、請求項２６〜２９いずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記コラゲナーゼが、１ｍｇあたり１００ｎｇ未満、７５ｎｇ未満、５０ｎｇ未満、２５ｎｇ未満、２０ｎｇ未満または１０ｎｇ未満の中性プロテアーゼを含む、請求項２６〜３０いずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記コラゲナーゼが、約１．２ｐｐｍ未満のニッケルおよび／または約８４．４ｐｐｍ未満の亜鉛の存在下で精製される、請求項２６〜３１いずれかに記載の方法。
【請求項３３】
クロストリジウム・ヒストリチクムからコラゲナーゼＩを単離および精製するためのプロセスであって、
ａ．クロストリジウム・ヒストリチクムを発酵させる工程と、
ｂ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む粗発酵液を回収する工程と、
ｃ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程と、ここで前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程は、
ｉ．前記粗発酵液をアニオン交換フィルターで濾過する工程、
ｉｉ．約８０ｐｐｍ未満の亜鉛および約１．２ｐｐｍ未満のニッケルを含む硫酸アンモニウムを用いて、工程（ｃ）（ｉ）からの濾液を沈殿させる工程、
ｉｉｉ．工程（ｃ）（ｉｉ）からの沈殿産物を再懸濁する工程、
ｉｖ．工程（ｃ）（ｉｉｉ）からの再懸濁液を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供する工程、
ｖ．イオン交換クロマトグラフィーを用いて、前記工程（ｃ）（ｉｖ）の濾液から前記コラゲナーゼＩとコラゲナーゼＩＩとを分離する工程、および
ｖｉ．前記工程（ｃ）（ｖ）の濾液を画分で収集する工程、
を含む、
ｄ．工程（ｃ）（ｖｉ）からの各画分中の収集されたコラゲナーゼＩＩの総量を推定する工程と、
ｅ．工程（ｃ）（ｖｉ）からの各画分中の収集されたコラゲナーゼＩの量を推定する工程と、
ｆ．プールされたコラゲナーゼＩの量が工程（ｄ）で推定された前記コラゲナーゼＩＩの量とほぼ同じになるまで、前記画分中のコラゲナーゼＩのピークから前記画分中のコラゲナーゼＩの末尾に向かってコラゲナーゼＩを含有する画分をプールする工程と、
を含む、プロセス。
【請求項３４】
クロストリジウム・ヒストリチクムからコラゲナーゼＩおよび／またはコラゲナーゼＩＩを単離および精製するためのプロセスであって、
ａ．クロストリジウム・ヒストリチクムを発酵させる工程と、
ｂ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む粗発酵液を回収する工程と、
ｃ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程と、ここで、前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程が、
ｉ．前記粗発酵液をアニオン交換フィルターで濾過する工程、
ｉｉ．遷移金属を実質的に含まない硫酸アンモニウムを用いて、工程（ｃ）（ｉ）からの濾液を沈殿させる工程、
ｉｉｉ．工程（ｃ）（ｉｉ）からの沈殿産物を再懸濁する工程、
ｉｖ．工程（ｃ）（ｉｉｉ）からの再懸濁液を疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムに供する工程、
ｖ．イオン交換クロマトグラフィーを用いて、前記工程（ｃ）（ｉｖ）の濾液からコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを分離する工程、ならびに
ｖｉ．前記工程（ｃ）（ｖ）の濾液を画分で収集する工程、
を含む、
ｄ．中性プロテアーゼからコラゲナーゼＩの複数の高度に純粋な画分を分離する工程および／または中性プロテアーゼからコラゲナーゼＩＩの複数の高度に純粋な画分を分離する工程と、
ｅ．前記コラゲナーゼＩの高度に純粋な画分をプールする工程および／または前記コラゲナーゼＩＩの高度に純粋な画分をプールする工程と、
を含む、プロセス。
【請求項３５】
前記分離工程（ｄ）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で各画分を試験することを含み、かつ前記プール工程（ｅ）が、前記ゲル上で検出可能な量の中性プロテアーゼを含まないコラゲナーゼＩを含有する画分のみおよび／または前記ゲル上で検出可能な量の中性プロテアーゼを含まないコラゲナーゼＩＩを含有する画分のみをプールすることを含む、請求項３４に記載のプロセス。
【請求項３６】
クロストリジウム・ヒストリチクムから単離され、かつ精製されたコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む組成物を作製するための方法であって、前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩが、約１対１の質量比を有し、かつ前記組成物が、逆相高速液体クロマトグラフィーにより判定された場合に少なくとも９５面積％純粋であり、
ａ．クロストリジウム・ヒストリチクムを発酵させる工程と、
ｂ．コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを含む粗発酵液を回収する工程と、
ｃ．濾過およびカラムクロマトグラフィーを介して粗回収液からコラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程と、ここで、前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製する工程は、約８０ｐｐｍ未満の亜鉛レベルおよび約１．２ｐｐｍ未満のニッケルレベルを有する硫酸アンモニウム溶液を用いて前記コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを処理することを含み、
を含む、方法。
【請求項３７】
低レベルの、アルミニウム、ヒ素、カルシウム、カドミウム、クロム、銅、鉄、マグネシウム、および鉛からなる群より選択される金属の存在下で、コラゲナーゼＩおよびコラゲナーゼＩＩを精製することをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ニッケルが、約１．０ｐｐｍ未満、約０．９ｐｐｍ未満、約０．８ｐｐｍ未満、約０．７ｐｐｍ未満、約０．６ｐｐｍ未満、約０．５ｐｐｍ未満、約０．４ｐｐｍ未満、約０．３ｐｐｍ未満、約０．２ｐｐｍ未満、約０．１ｐｐｍ未満、約０．０９ｐｐｍ未満、約０．０８ｐｐｍ未満、約０．０７ｐｐｍ未満、約０．０６ｐｐｍ未満、約０．０５ｐｐｍ未満、約０．０４ｐｐｍ未満、約０．０３ｐｐｍ未満、約０．０２ｐｐｍ未満、または約０．０１ｐｐｍ未満からなる群より選択される量で存在する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記亜鉛が、約８０ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約２５ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、約５ｐｐｍ未満、約３ｐｐｍ未満または約１ｐｐｍ未満の量で存在する、請求項３７または３８に記載の方法。