【手続補正書】
【提出日】令和3年3月4日(2021.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、
(i)組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を培地に接種することと、
(ii)前記培地中で前記CHO細胞を約36℃〜約38℃の温度で培養することと、
(iii)(a)接種から少なくとも1日後、栄養補助剤の組合せであって、
1つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む、第１の動物由来成分を含まない(ADCF)栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、L-グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び2-メルカプトエタノールを含まない、第１の動物由来成分を含まない(ADCF)栄養補助剤、及び
1つ以上のアミノ酸を含む第２のADCF栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、L-グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、2-メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する、第２のADCF栄養補助剤
を含む、前記組合せを(ii)の細胞培養物に添加すること、又は、
(b)少なくとも1つの栄養補助剤を前記細胞培養物に添加し、且つ約20μM〜約200μMのZn2+を添加することと、
(iv)前記接種から約80時間〜約150時間後、(iii)の細胞培養物の温度を約30℃まで低下させることと、
(v)(iv)の細胞培養物から組換えアルカリホスファターゼを少なくとも1つのクロマトグラフィーステップによって単離することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記培地は、EX-CELL(登録商標)302無血清培地、CD DG44培地、BD SELECT(商標)培地、SFM4CHO培地又はそれらの組合せから成る群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記培地は、SFM4CHO培地及びBD SELECT(商標)培地の組合せを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記培地は、SFM4CHO培地及びBD SELECT(商標)培地の組合せを、90/10、80/20、75/25、70/30、60/40又は50/50から選択される比で含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記第１及び第２の栄養補助剤の組合せは、
(a)ボーラス投与で；
(b)1分〜2時間の範囲の期間にわたって；
(c)接種から1〜3日後に；
(d)3つ以上の異なる時点で；
(e)2〜6つの異なる時点で；
(f)4又は5つの異なる時点で；
(g)接種から1〜3日後及び接種から3〜5日後に；
(h)接種から1〜3日後、接種から3〜5日後、接種から5〜7日後、接種から7〜9日後及び接種から9〜11日後に；又は
(i)接種から約2日後、及び接種から約4日後、接種から約6日後、接種から約8日後、及び接種から約10日後に；
添加される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
(a)前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の約0.5％〜約4％(w/v)の濃度で添加される；
(b)前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の0.05％〜0.8％(w/v)の濃度で添加される；
(c)前記第１の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の5％〜20％(w/v)の濃度で添加される；及び/又は
(d)前記第２の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の0.5％〜2％(w/v)の濃度で添加される、
請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
(a)前記第１の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の12％(w/v)の濃度で添加される；
(b)前記第２の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の1.2％(w/v)の濃度で添加される；
(c)前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の2％(w/v)の濃度で添加される；及び/又は
(d)前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の0.2％(w/v)の濃度で添加される、
請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記第１の栄養補助剤は、CELL BOOST(商標)7aであり、且つ前記第２の栄養補助剤は、CELL BOOST(商標)7bである、請求項１記載の方法。
【請求項９】
(iv)の前記温度低下は、
(a)前記接種から約80時間〜120時間後；
(b)前記接種から約90時間〜100時間後；又は
(c)前記接種から約96時間後、
である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
(a)少なくとも約20μM〜約200μMの濃度で亜鉛を前記培地中に提供すること；
(b)約30、50、60、90、150又は200μMの濃度で亜鉛を前記培地中に提供すること；又は
(c)約90μMの濃度で亜鉛を前記培地中に提供すること、
をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
(a)ステップ(v)が、接種から10又は14日後に行われる；
(b)ステップ(v)が、収集清澄化、限外濾過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組合せの少なくとも1つを含む；及び/又は
(c)ステップ(ii)が、CHO細胞を約36.5℃〜約37.5℃の温度で培養することを含む、
請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
ステップ(ii)が、CHO細胞を約37℃の温度で培養することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
組換えアルカリホスファターゼ活性を測定すること、及び/又は積分生細胞濃度(IVCC)を決定することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することが、pNPPに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸(PPi)加水分解アッセイのうちの少なくとも1つを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
組換えアルカリホスファターゼが、無機ピロリン酸(PPi)加水分解アッセイにおけるKcat及びKm値のうちの少なくとも1つにおいて増加を示す、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
IVCCが、ステップ(iii)及び(iv)の不在下で生産される組換えアルカリホスファターゼのIVCCと比べて約3.0倍〜約6.5倍、増加される、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
組換えアルカリホスファターゼは、W−sALP−X−Fc−Y−Dn−Z
(式中、
Wは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Xは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Yは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Zは、不在又は少なくとも1つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Fcは、結晶化可能領域断片であり、
Dnは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組合せであり、ここで、n＝10又は16であり、且つ
前記sALPは、可溶性アルカリホスファターゼである)
の構造を含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
以下の少なくとも1つである、請求項１７記載の方法：
(a)前記sALPが、C末端の糖脂質アンカー(GPI)を有しないアルカリホスファターゼ（ALP）の活性のあるアンカー型を含む；
(b)前記アルカリホスファターゼ(ALP)が、組織非特異的アルカリホスファターゼ（TNALP）である；
(c)前記sALPが、配列番号１のL1−S485に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる；
(d)前記sALPが、配列番号１のL1−S485に示される配列を含む；
(e)前記sALPが、無機ピロリン酸(PPi)の切断を触媒する能力がある；
(f)n＝10である；
(g)W及びZは、前記ポリペプチドに不在である；
(h)前記Fcが、CH2ドメイン、CH3ドメイン及びヒンジ領域を含む；
(i)前記Fcが、IgG-1、IgG-2、IgG-3及びIgG-4から成る群より選択される免疫グロブリンの定常ドメインである；
(j)前記Fcが、免疫グロブリンIgG-1の定常ドメインである；
(k)前記Fcが、配列番号１のD488−K714に示される配列を含む；
(l)前記組換えアルカリホスファターゼが、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる；
(m)前記組換えアルカリホスファターゼが、配列番号１に示される配列を含み、且つその二量体である；又は
(n)前記組換えアルカリホスファターゼが、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドによってコードされ、前記高ストリンジェンシー条件は、6×SSC、5×デンハート試薬、0.5％SDS及び100mg/mlの変性断片化されたサケ精子DNAにおける68℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション；並びに室温で10分間の2×SSC及び0.5％SDSでの洗浄、室温で10分間の2×SSC及び0.1％SDSでの洗浄、及び65℃で5分間、3回の0.1×SSC及び0.5％SDSでの洗浄を含む。
【請求項１９】
前記組換えアルカリホスファターゼが、配列番号１に対する少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記組換えアルカリホスファターゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む、請求項１９記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６２】
上の本明細書に記述されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれの個別の刊行物、特許又は特許出願が、その全体が詳細且つ個別に参照により援用されるように示されるのと同程度に参照により本明細書に援用される。本開示の上記方法の様々な修正形態及び変更形態、医薬組成物及びキットは、特許請求される本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく当業者に明白になるであろう。本開示は、具体的な実施形態と関連して記載されているが、さらなる修正形態が可能であり、特許請求される本発明がかかる具体的な実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されるであろう。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、
（ｉ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと、
（ｉｉ）前記培地中で前記ＣＨＯ細胞を約３６℃〜約３８℃、約３６．５℃〜約３７．５℃、特に約３７℃の温度で培養することと、
（ｉｉｉ）接種から少なくとも１日後、栄養補助剤の組み合わせであって、
（ａ）１つ以上のアミノ酸、ビタミン、塩、微量元素、ポロクサマー及びグルコースを含む、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド及び２−メルカプトエタノールを含まない、第１の動物由来成分を含まない（ＡＤＣＦ）栄養補助剤、及び
（ｂ）１つ以上のアミノ酸を含む第２のＡＤＣＦ栄養補助剤であって、ヒポキサンチン、チミジン、インスリン、Ｌ−グルタミン、増殖因子、ペプチド、タンパク質、加水分解物、フェノールレッド、２−メルカプトエタノール及びポロクサマーを欠如する、第２のＡＤＣＦ栄養補助剤
を含む組み合わせを（ｉｉ）の細胞培養物に添加することと、
（ｉｖ）前記接種から約８０時間〜１２０時間後、（ｉｉｉ）の前記細胞培養物の温度を約３０℃まで低下させることと、
（ｖ）（ｉｖ）の前記細胞培養物から前記組換えアルカリホスファターゼを少なくとも１つのクロマトグラフィーステップによって単離することと
を含む方法。
（２）前記培地は、ＥＸ−ＣＥＬＬ（登録商標）３０２無血清培地、ＣＤ  ＤＧ４４培地、ＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、（１）に記載の方法。
（３）前記培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを含む、（１）に記載の方法。
（４）前記培地は、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地及びＢＤ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）培地の組み合わせを、９０／１０、８０／２０、７５／２５、７０／３０、６０／４０又は５０／５０から選択される比、特に７５／２５の比で含む、（１）〜（３）のいずれか一に記載の方法。
（５）前記栄養補助剤の組み合わせは、ボーラス投与で添加される、（１）〜（４）のいずれか一に記載の方法。
（６）前記栄養補助剤の組み合わせは、１分〜２時間の範囲の期間にわたって添加される、（１）〜（５）のいずれか一に記載の方法。
（７）前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後に添加される、（１）〜（６）のいずれか一に記載の方法。
（８）前記栄養補助剤の組み合わせは、３つ以上の異なる時点で添加される、（１）〜（７）のいずれか一に記載の方法。
（９）前記栄養補助剤の組み合わせは、２〜６つの異なる時点で添加される、（１）〜（８）のいずれか一に記載の方法。
（１０）前記栄養補助剤の組み合わせは、４又は５つの異なる時点で添加される、（１）〜（９）のいずれか一に記載の方法。
（１１）前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後及び接種から３〜５日後に添加される、（１）〜（１０）のいずれか一に記載の方法。
（１２）前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後、接種から３〜５日後、接種から５〜７日後、接種から７〜９日後及び接種から９〜１１日後に添加される、（１）〜（１１）のいずれか一に記載の方法。
（１３）前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から約２日後、及び接種から約４日後、接種から約６日後、及び接種から約８日後、及び接種から約１０日後に添加される、（１）〜（１２）のいずれか一に記載の方法。
（１４）前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の約０．５％〜約４％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）〜（１３）のいずれか一に記載の方法。
（１５）前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）〜（１４）のいずれか一に記載の方法。
（１６）前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の０．０５％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）〜（１５）のいずれか一に記載の方法。
（１７）前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）〜（１６）のいずれか一に記載の方法。
（１８）前記第１の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の５％〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）〜（１７）のいずれか一に記載の方法。
（１９）前記第１の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の１２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）〜（１８）のいずれか一に記載の方法。
（２０）前記第２の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の０．５％〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）〜（１９）のいずれか一に記載の方法。
（２１）前記第２の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）〜（２０）のいずれか一に記載の方法。
（２２）前記第１の栄養補助剤は、ＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ａであり、且つ前記第２の栄養補助剤は、ＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である、（１）〜（２１）のいずれか一に記載の方法。
（２３）（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約８０時間〜１５０時間後である、（１）〜（２２）のいずれか一に記載の方法。
（２４）（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約９０時間〜１００時間後である、（１）〜（２３）のいずれか一に記載の方法。
（２５）（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約９６時間後である、（１）〜（２４）のいずれか一に記載の方法。
（２６）少なくとも約２０μＭ〜約２００μＭのＺｎ2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、（１）〜（２５）のいずれか一に記載の方法。
（２７）約３０、５０、６０、９０、１５０又は２００μＭのＺｎ2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、（１）〜（２６）のいずれか一に記載の方法。
（２８）約９０μＭのＺｎ2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、（１）〜（２７）のいずれか一に記載の方法。
（２９）（ｖ）は、接種から１４日後に行われる、（１）〜（２８）のいずれか一に記載の方法。
（３０）（ｖ）は、接種から１０日後に行われる、（１）〜（２９）のいずれか一に記載の方法。
（３１）前記クロマトグラフィーステップは、収集清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、（１）〜（３０）のいずれか一に記載の方法。
（３２）組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む、（１）〜（３１）のいずれか一に記載の方法。
（３３）前記活性は、ｐＮＰＰに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイの少なくとも１つから選択される方法から選択される、（３２）に記載の方法。
（３４）組換えアルカリホスファターゼＫcat及びＫm値の少なくとも１つは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイにおいて増加する、（３３）に記載の方法。
（３５）積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を決定することをさらに含む、（１）〜（３４）のいずれか一に記載の方法。
（３６）前記ＩＶＣＣは、ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の不在下での前記方法と比べて約３．０倍〜約６．５倍だけ増加される、（３５）に記載の方法。
（３７）前記組換えアルカリホスファターゼは、Ｗ−ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−Ｄn−Ｚ（式中、
Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、
Ｄnは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び
前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含む、（１）〜（３６）のいずれか一に記載の方法。
（３８）前記ｓＡＬＰは、Ｃ末端の糖脂質アンカー（ＧＰＩ）を有しないアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性のあるアンカー型を含む、（３７）に記載の方法。
（３９）前記アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）である、（３７）又は（３８）に記載の方法。
（４０）前記ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、（３７）〜（３９）のいずれか一に記載の方法。
（４１）前記ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含む、（３７）〜（４０）のいずれか一に記載の方法。
（４２）前記ｓＡＬＰは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の切断を触媒する能力がある、（３７）〜（４１）のいずれか一に記載の方法。
（４３）ｎ＝１０である、（３７）〜（４２）のいずれか一に記載の方法。
（４４）Ｗ及びＺは、前記ポリペプチドに不在である、（３７）〜（４３）のいずれか一に記載の方法。
（４５）前記Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む、（３７）〜（４４）のいずれか一に記載の方法。
（４６）前記Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである、（３７）〜（４５）のいずれか一に記載の方法。
（４７）前記Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ−１の定常ドメインである、（３７）〜（４６）のいずれか一に記載の方法。
（４８）前記Ｆｃは、配列番号１のＤ４８８−Ｋ７１４に示される配列を含む、（３７）〜（４７）のいずれか一に記載の方法。
（４９）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、（３７）〜（４８）のいずれか一に記載の方法。
（５０）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含み、且つその二量体である、（３７）〜（４９）のいずれか一に記載の方法。
（５１）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドによってコードされ、前記高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌの変性断片化されたサケ精子ＤＮＡにおける６８℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄、室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄、及び６５℃で５分間、３回の０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄を含む、（３７）〜（５０）のいずれか一に記載の方法。
（５２）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む、（１）〜（５１）のいずれか一に記載の方法。
（５３）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含む、（１）〜（５２）のいずれか一に記載の方法。
（５４）組換えアルカリホスファターゼを生産する方法であって、
（ｉ）組換えアルカリホスファターゼを発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培地に接種することと、
（ｉｉ）前記培地中で前記ＣＨＯ細胞を約３６℃〜約３８℃、約３６．５℃〜約３７．５℃、特に約３７℃の温度で培養することと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つの栄養補助剤を細胞培養物に添加し、且つ約２０μＭ〜約２００μＭのＺｎ2+、特に約３０μＭのＺｎ2+〜１００μＭのＺｎ2+、特に約９０μＭのＺｎ2+を添加することと、
（ｉｖ）前記接種から約８０時間〜約１２０時間後、（ｉｉｉ）の前記細胞培養物の温度を約３０℃まで低下させることと、
（ｖ）（ｉｖ）の前記細胞培養物から前記組換えアルカリホスファターゼを少なくとも１つのクロマトグラフィーステップによって単離することと
を含む方法。
（５５）前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む、（１）〜（５４）のいずれか一に記載の方法。
（５６）前記栄養補助剤の組み合わせは、ボーラス投与で添加される、（１）に記載の方法。
（５７）前記栄養補助剤の組み合わせは、１分〜２時間の範囲の期間にわたって添加される、（１）に記載の方法。
（５８）前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後に添加される、（１）に記載の方法。
（５９）前記栄養補助剤の組み合わせは、３つ以上の異なる時点で添加される、（１）に記載の方法。
（６０）前記栄養補助剤の組み合わせは、２〜６つの異なる時点で添加される、（１）に記載の方法。
（６１）前記栄養補助剤の組み合わせは、４又は５つの異なる時点で添加される、（１）に記載の方法。
（６２）前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後及び接種から３〜５日後に添加される、（１）に記載の方法。
（６３）前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から１〜３日後、接種から３〜５日後、接種から５〜７日後、接種から７〜９日後及び接種から９〜１１日後に添加される、（１）に記載の方法。
（６４）前記栄養補助剤の組み合わせは、接種から約２日後、及び接種から約４日後、接種から約６日後、及び接種から約８日後、及び接種から約１０日後に添加される、（１）に記載の方法。
（６５）前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の約０．５％〜約４％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）に記載の方法。
（６６）前記第１の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（６５）に記載の方法。
（６７）前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の０．０５％〜０．８％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）に記載の方法。
（６８）前記第２の栄養補助剤の各添加物は、前記培地の０．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（６７）に記載の方法。
（６９）前記第１の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の５％〜２０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）に記載の方法。
（７０）前記第１の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の１２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（６９）に記載の方法。
（７１）前記第２の栄養補助剤の全添加物は、前記培地の０．５％〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（１）に記載の方法。
（７２）前記第２の栄養補助剤の前記全添加物は、前記培地の１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で添加される、（７１）に記載の方法。
（７３）前記第１の栄養補助剤は、ＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ａであり、且つ前記第２の栄養補助剤は、ＣＥＬＬ  ＢＯＯＳＴ（商標）７ｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）である、（１）に記載の方法。
（７４）（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約８０時間〜１５０時間後である、（１）に記載の方法。
（７５）（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約９０時間〜１００時間後である、（７４）に記載の方法。
（７６）（ｉｖ）の前記温度低下は、前記接種から約９６時間後である、（７５）に記載の方法。
（７７）少なくとも約２０μＭ〜約２００μＭのＺｎ2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（７８）約３０、５０、６０、９０、１５０又は２００μＭのＺｎ2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、（７７）に記載の方法。
（７９）約９０μＭのＺｎ2+の前記培地中の亜鉛濃度を提供することをさらに含む、（７８）に記載の方法。
（８０）（ｖ）は、接種から１４日後に行われる、（１）に記載の方法。
（８１）（ｖ）は、接種から１０日後に行われる、（１）に記載の方法。
（８２）前記クロマトグラフィーステップは、収集清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、ウイルス不活性化、親和性捕捉及びそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、（１）に記載の方法。
（８３）組換えアルカリホスファターゼ活性を測定することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（８４）前記活性は、ｐＮＰＰに基づくアルカリホスファターゼ酵素アッセイ及び無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイの少なくとも１つから選択される方法から選択される、（８３）に記載の方法。
（８５）組換えアルカリホスファターゼＫcat及びＫm値の少なくとも１つは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）加水分解アッセイにおいて増加する、（８４）に記載の方法。
（８６）積分生細胞濃度（ＩＶＣＣ）を決定することをさらに含む、（１）に記載の方法。
（８７）前記ＩＶＣＣは、ステップ（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の不在下での前記方法と比べて約３．０倍〜約６．５倍だけ増加される、（８６）に記載の方法。
（８８）前記組換えアルカリホスファターゼは、Ｗ−ｓＡＬＰ−Ｘ−Ｆｃ−Ｙ−Ｄn−Ｚ（式中、
Ｗは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｘは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｙは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｚは、不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
Ｆｃは、結晶化可能領域断片であり、
Ｄnは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸又はそれらの組み合わせであり、ここで、ｎ＝１０又は１６であり、及び
前記ｓＡＬＰは、可溶性アルカリホスファターゼである）
の構造を含む、（１）に記載の方法。
（８９）前記ｓＡＬＰは、Ｃ末端の糖脂質アンカー（ＧＰＩ）を有しないアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性のあるアンカー型を含む、（８８）に記載の方法。
（９０）前記アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）である、（８８）に記載の方法。
（９１）前記ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、（８８）に記載の方法。
（９２）前記ｓＡＬＰは、配列番号１のＬ１−Ｓ４８５に示される配列を含む、（８８）に記載の方法。
（９３）前記ｓＡＬＰは、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の切断を触媒する能力がある、（８８）に記載の方法。
（９４）ｎ＝１０である、（８８）に記載の方法。
（９５）Ｗ及びＺは、前記ポリペプチドに不在である、（８８）に記載の方法。
（９６）前記Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む、（８８）に記載の方法。
（９７）前記Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである、（８８）に記載の方法。
（９８）前記Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ−１の定常ドメインである、（８８）に記載の方法。
（９９）前記Ｆｃは、配列番号１のＤ４８８−Ｋ７１４に示される配列を含む、（８８）に記載の方法。
（１００）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによってコードされる、（８８）に記載の方法。
（１０１）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含み、且つその二量体である、（８８）に記載の方法。
（１０２）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含むポリペプチドをコードする第３のポリヌクレオチドに対して完全に相補的な配列と比べて、高ストリンジェンシー条件下で第２のポリヌクレオチドにハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドによってコードされ、前記高ストリンジェンシー条件は、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌの変性断片化されたサケ精子ＤＮＡにおける６８℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション、並びに室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄、室温で１０分間の２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄、及び６５℃で５分間、３回の０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳでの洗浄を含む、（８８）に記載の方法。
（１０３）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に対する少なくとも９０％の配列同一性を含む、（１）に記載の方法。
（１０４）前記組換えアルカリホスファターゼは、配列番号１に示される配列を含む、（１０３）に記載の方法。
（１０５）前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む、（１）に記載の方法。
（１０６）前記組換えアルカリホスファターゼは、アスホターゼアルファを含む、（５４）に記載の方法。