(57)【要約】      （修正有）【課題】イグサの品種識別に利用し得るＤＮＡマーカーを同定し、イグサ産業における品種識別の判断材料を提供すること。【解決手段】第一の特定の塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマー。さらに、上記塩基配列とは異なる第二の塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマー。また、イグサの品種識別に利用し得るＤＮＡマーカーを用いるキット。該キットは、前記第一の塩基配列の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列の相違を判別するために用いられるＰＣＲプライマー、または第二の塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーを備える。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片。
【請求項２】
配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、該プライマーは、ＣＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＣ（配列番号１２）に由来し得る配列を含む、プライマー。
【請求項３】
配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、該プライマーは、ＧＣＡＣＡＴＴＣＧＧＧＣＧＡＴＴＡＣ（配列番号１４）に由来し得る配列を含む、プライマー。
【請求項４】
前記プライマーの融解温度が３４℃〜８０℃である、請求項１から３のいずれかに記載のプライマー。
【請求項５】
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する方法であって、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程を包含する、方法。
【請求項６】
前記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、請求項５に記載の方法：
（ａ）請求項２に記載のプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または上記塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【請求項７】
前記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、請求項５に記載の方法：
（ａ）請求項３に記載のプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【請求項８】
前記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、請求項５に記載の方法：
（ａ）請求項２に記載のプライマーと、請求項３に記載のプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【請求項９】
前記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、請求項５に記載の方法：
（ａ）プライマーとして、Ｐｓｔ１０９Ｌ−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＣ（配列番号１５），およびＰｓｔ１０９Ｒ−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１６）を用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【請求項１０】
イグサまたはイグサ製品から試料ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、請求項２に記載のプライマーを備える、キット。
【請求項１２】
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、請求項３に記載のプライマーを備える、キット。
【請求項１３】
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、請求項２に記載のプライマーおよび請求項３に記載のプライマーを備える、キット。
【請求項１４】
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、プライマーとして、Ｐｓｔ１０９Ｌ−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＣ（配列番号１５）、およびＰｓｔ１０９Ｒ−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１６）を備える、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イグサ品種識別に関し、より詳細には、イグサ主要栽培品種のうち、最も優良な品質を持ち産業価値の高い品種「ひのみどり」と他の品種を識別するためのＤＮＡマーカーおよび該マーカーを標的としてイグサ主要栽培品種から品種「ひのみどり」を識別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イグサは主に栄養繁殖で増殖・栽培されており、これまで育成された品種は、栄養系品種である。
【０００３】
従来、イグサの品種特性は茎長（草丈）、茎の太さ、幹茎色（茎の色）、茎数（一株あたりの茎の数）花序着生率（着花の頻度）、先枯程度（先端部分の枯れの程度）など産業上の品質に関わる特徴で表されてきた。しかし、これらの特性は量的形質であって、生育環境の変化に応じてそれらの形質も変化するため、一定の栽培環境における品種の特徴を説明することはできても、確実に品種を識別するマーカーとしては利用できなかった。このため、いったん入手経路が不確実になるとどの品種であるのか断定することは困難であった。その結果、いくつかの品種が混ざって製品の均一性が失われたり、あるいは優良品種の盗難、不法栽培を防止・規制することができなかった。
【０００４】
近年の分子生物学的技術の適用に関しては、九州農業試験場と熊本県農業研究センターい業研究所が平成９〜１０年に「ＲＡＰＤ法によるイグサ品種識別」について共同研究を行った。しかし、ＤＮＡ多型率が極めて低い結果となり、実用的な品種識別マーカーは全く得られなかった。このため、イグサの品種を識別することは極めて困難であった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、イグサの品種識別に利用しうるＤＮＡマーカーを同定し、イグサ産業における品種識別の判断材料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を行った結果、イグサ主要栽培品種１６品種をＳＮＰ分析法に供することにより、これら品種のゲノムＤＮＡ断片の中から、優良イグサ品種「ひのみどり」に特異的なＤＮＡ断片を同定することに成功した。本発明者らにより同定された、このようなＤＮＡ断片に含まれる特異的な塩基配列は、イグサ品種から品種「ひのみどり」を識別するための重要なＤＮＡマーカーとなる。特に、制限酵素ＨｐａＩＩおよびＰｓｔＩを用いてクローニングされたゲノムＤＮＡ断片は、その特異性が顕著である（品種「ひのみどり」では検出されず、他のイグサ品種では明確に検出された）ことから、イグサ品種識別のためのＤＮＡマーカーとして好適である。本発明は、イグサ品種の識別に成功しうる実用的なＤＮＡマーカーを同定したものである。
【０００７】
即ち、本発明は、イグサ主要栽培品種のうち、最も優良な品質を持ち産業価値の高い品種「ひのみどり」と他の品種を識別するための方法に関し、より詳しくは、下記（１）から（２７）に記載の発明を提供するものである。
【０００８】
（１）配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片。
【０００９】
（２）配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片。
【００１０】
（３）配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、該プライマーが、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、該オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１に示す塩基配列の一部であって、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を含む領域、または該領域の該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列に由来し得、但し、該プライマーは、該配列番号１の３３３〜３３４位に示される塩基配列またはこれに対応する対応鎖の塩基配列には由来せず、ＡＡまたはＴＴの塩基配列を含み、ここで該ＡＡまたはＴＴの塩基配列は、該プライマーの３’末端領域内に位置する、プライマー。
【００１１】
（４）配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマー対であって、該プライマーの各々は、独立して、少なくとも１０ヌクレオチドの連続する配列を含むオリゴヌクレオチドであり、鋳型となる二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が配列番号１に示され、ここで該少なくとも１０ヌクレオチドの連続する配列の一方は、配列番号１に示す塩基配列において、該配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列より５’側にある領域の配列に由来し得、かつ該少なくとも１０ヌクレオチドの連続する配列の他方は、該配列番号１に示す塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列において、該配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列に対応する塩基配列より５’側にある領域の配列に由来し得、それによって配列番号１に示す塩基配列の一部であって、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を含む領域の増幅を可能にする、プライマー対。
【００１２】
（５）配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、配列番号１に示す塩基配列の一部であって、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列に隣接する領域の塩基配列、または該領域の該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列に特異的にハイブリダイズし得、そして該プライマーは少なくとも１０ヌクレオチドである、プライマー。
【００１３】
（６）配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、該プライマーは、ＣＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＣ（配列番号１２）に由来し得る配列を含む、プライマー。
【００１４】
（７）配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、該プライマーは、ＧＣＡＣＡＴＴＣＧＧＧＣＧＡＴＴＡＣ（配列番号１４）に由来し得る配列を含む、プライマー。
【００１５】
（８）前記プライマーの融解温度が３４℃〜８０℃である、項１から７のいずれかに記載のプライマー。
【００１６】
（９）イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する方法であって、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程を包含する、方法。
【００１７】
（１０）前記配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列の相違を検出することによる、項９に記載の方法。
【００１８】
（１１）前記配列番号１の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列の相違の検出が、下記工程を包含する、項１０に記載の方法：
（ａ）項３に記載のプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００１９】
（１２）前記配列番号１の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列の相違の検出が、下記工程を包含する、項１０に記載の方法：
（ａ）項４に記載のプライマー対を用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；
（ｂ）該増幅産物を検出する工程；および
（ｃ）該増幅産物の塩基配列を決定する工程。
【００２０】
（１３）上記増幅産物の塩基配列を決定する工程（ｃ）が、前記増幅産物を項５に記載のプライマーとハイブリダイズさせ、該プライマーの３’側に標識アデニンまたは標識グアニンを取り込ませてプライマー伸長反応を行う工程、および該標識アデニンまたは標識グアニンの取り込みを検出する工程を包含する、項１２に記載の方法。
【００２１】
（１４）イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する方法であって、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程を包含する、方法。
【００２２】
（１５）前記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、項１４に記載の方法：
（ａ）項６に記載のプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００２３】
（１６）前記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、項１４に記載の方法：
（ａ）項７に記載のプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００２４】
（１７）前記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、項１４に記載の方法：
（ａ）項６に記載のプライマーと、項７に記載のプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００２５】
（１８）前記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、項１３に記載の方法：
（ａ）プライマーとして、Ｐｓｔ１０９Ｌ−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ
ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＣ（配列番号１５），およびＰｓｔ１０９Ｒ−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１６）を用いて、イグサから抽出したＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００２６】
（１９）イグサまたはイグサ製品から試料ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【００２７】
（２０）イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、項３に記載のプライマーを備える、キット。
【００２８】
（２１）該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列にハイブリダイズする少なくとも１つの別のプライマーをさらに備える、項２０に記載のキット。
【００２９】
（２２）イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、項４に記載のプライマー対を備える、キット。
【００３０】
（２３）項５に記載のプライマーをさらに備える、項２２に記載のキット。
【００３１】
（２４）イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、項６に記載のプライマーを備える、キット。
【００３２】
（２５）イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、項７に記載のプライマーを備える、キット。
【００３３】
（２６）イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、請求項６に記載のプライマーおよび項７に記載のプライマーを備える、キット。
【００３４】
（２７）イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、プライマーとして、Ｐｓｔ１０９Ｌ−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ
ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＣ（配列番号１５）、およびＰｓｔ１０９Ｒ−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１６）を備える、キット。
・本願はさらに、以下を提供し得る：
・（項目１）
配列番号１に示すヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片。
・（項目２）
配列番号１１に示すヌクレオチド配列からなるＤＮＡ断片。
・（項目３）
配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、上記プライマーが、少なくとも１０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドであり、当該オリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１に示す塩基配列の一部であって、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を含む領域、または当該領域の上記塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列に由来し得、但し、上記プライマーは、当該配列番号１の３３３〜３３４位に示される塩基配列またはこれに対応する対応鎖の塩基配列には由来せず、ＡＡまたはＴＴの塩基配列を含み、ここで当該ＡＡまたはＴＴの塩基配列は、上記プライマーの３’末端領域内に位置する、プライマー。
・（項目４）
配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマー対であって、上記プライマーの各々は、独立して、少なくとも１０ヌクレオチドの連続する配列を含むオリゴヌクレオチドであり、鋳型となる二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が配列番号１に示され、ここで上記少なくとも１０ヌクレオチドの連続する配列の一方は、配列番号１に示す塩基配列において、当該配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列より５’側にある領域の配列に由来し得、かつ上記少なくとも１０ヌクレオチドの連続する配列の他方は、当該配列番号１に示す塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列において、当該配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列に対応する塩基配列より５’側にある領域の配列に由来し得、それによって配列番号１に示す塩基配列の一部であって、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を含む領域の増幅を可能にする、プライマー対。
・（項目５）
配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、配列番号１に示す塩基配列の一部であって、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列に隣接する領域の塩基配列、または当該領域の上記塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列に特異的にハイブリダイズし得、そして上記プライマーは少なくとも１０ヌクレオチドである、プライマー。
・（項目６）
配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、当該プライマーは、ＣＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＣ（配列番号１２）に由来し得る配列を含む、プライマー。
・（項目７）
配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別するためのプライマーであって、当該プライマーは、ＧＣＡＣＡＴＴＣＧＧＧＣＧＡＴＴＡＣ（配列番号１４）に由来し得る配列を含む、プライマー。
・（項目８）
上記プライマーの融解温度が３４℃〜８０℃である、項目１から７のいずれかに記載のプライマー。
・（項目９）
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する方法であって、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程を包含する、方法。
・（項目１０）
上記配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または当該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列の相違を検出すること
による、項目９に記載の方法。
・（項目１１）
上記配列番号１の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または当該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列の相違の検出が、下記工程を包含する、項目１０に記載の方法：
（ａ）項目３に記載のプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、当該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または当該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）当該増幅産物を検出する工程。
・（項目１２）
上記配列番号１の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または上記塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列の相違の検出が、下記工程を包含する、項目１０に記載の方法：
（ａ）項目４に記載のプライマー対を用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；
（ｂ）当該増幅産物を検出する工程；および
（ｃ）当該増幅産物の塩基配列を決定する工程。
・（項目１３）
上記増幅産物の塩基配列を決定する工程（ｃ）が、上記増幅産物を項目５に記載のプライマーとハイブリダイズさせ、当該プライマーの３’側に標識アデニンまたは標識グアニンを取り込ませてプライマー伸長反応を行う工程、および当該標識アデニンまたは標識グアニンの取り込みを検出する工程を包含する、項目１２に記載の方法。
・（項目１４）
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する方法であって、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程を包含する、方法。
・（項目１５）
上記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、項目１４に記載の方法：
（ａ）項目６に記載のプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、当該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または上記塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）当該増幅産物を検出する工程。
・（項目１６）
上記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、項目１４に記載の方法：
（ａ）項目７に記載のプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、当該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または当該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）当該増幅産物を検出する工程。
・（項目１７）
上記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、項目１４に記載の方法：
（ａ）項目６に記載のプライマーと、項目７に記載のプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）当該増幅産物を検出する工程。
・（項目１８）
上記配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程が、以下の工程を包含する、項目１３に記載の方法：
（ａ）プライマーとして、Ｐｓｔ１０９Ｌ−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ
ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＣ（配列番号１５），およびＰｓｔ１０９Ｒ−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１６）を用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）当該増幅産物を検出する工程。
・（項目１９）
イグサまたはイグサ製品から試料ＤＮＡを抽出する工程をさらに包含する、項目１１から１３、および１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
・（項目２０）
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、項目３に記載のプライマーを備える、キット。
・（項目２１）
当該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または当該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズする少なくとも１つの別のプライマーをさらに備える、項目２０に記載のキット。
・（項目２２）
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、項目４に記載のプライマー対を備える、キット。
・（項目２３）
項目５に記載のプライマーをさらに備える、項目２２に記載のキット。
・（項目２４）
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、項目６に記載のプライマーを備える、キット。
・（項目２５）
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、項目７に記載のプライマーを備える、キット。
・（項目２６）
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、項目６に記載のプライマーおよび項目７に記載のプライマーを備える、キット。
・（項目２７）
イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別するためのキットであって、プライマーとして、Ｐｓｔ１０９Ｌ−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ
ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＣ（配列番号１５）、およびＰｓｔ１０９Ｒ−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１６）を備える、キット。
【発明の効果】
【００３５】
本発明により、イグサの主要品種を識別するための実用的なＤＮＡマーカーが提供された。また、該ＤＮＡマーカーを指標としたイグサ品種の識別方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】クローンＨｐａＩＩ０１の塩基配列を示す図である。
【図２】「ひのみどり」ではホモ接合、その他の品種ではヘテロ接合となっている領域のクロマトグラムを示す図である。
【図３】実施例２のＰＣＲ−ＣＴＰＰ法に使用したプライマーセットの配置を示す図である。
【図４】実施例２の融解曲線分析の結果を示す図である。
【図５】実施例２のＰＣＲ−ＣＴＰＰ産物の電気泳動写真である。
【図６】実施例３において用いたプライマーセットを示す図である。
【図７】実施例３によるＳＮＰの検出の結果を示す図である。
【図８】イグサ品種「ひのみどり」ゲノムＤＮＡをＰｓｔＩで消化したライブラリより単離したクローンであるＰｓｔ１０９の塩基配列を示す図である。
【図９】実施例４によるＰＣＲ増幅の結果を示す電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
・以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００３８】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。必要に応じて、プライマーは、デオキシイノシン残基で置換された塩基を含む。
【００３９】
用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００４０】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本件明細書においてヌクレオチドを１文字表記する場合、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを示す。
【００４２】
本明細書において、「断片」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。断片の長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上（例えば、５００〜１０００もの長さのヌクレオチド長も含まれ得る）のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００４３】
本明細書において使用する場合、用語「プライマー」とは、適切な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸およびポリメライゼーション剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）の存在下）で、適切な緩衝液中で、そ
して適切な温度において、鋳型指向性のＤＮＡ合成を開始する点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存する。本発明のプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチドである。プライマーは、代表的には、４０ヌクレオチド未満であり得、好ましくは、３０ヌクレオチド未満であり得る。さらに好ましくは、本発明のプライマーは、長さが２０〜２９ヌクレオチドの範囲であり得る。短いプライマー分子は、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、一般により低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列に完全にマッチする必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的であるべきである。用語「プライマー部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的である鋳型核酸の配列をいう。用語「プライマー対」とは、増幅される核酸配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅されるその配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一組のプライマーをいう。
【００４４】
本明細書において使用する場合、「１塩基多型」とは、遺伝子の塩基配列が一ヶ所だけ異なる状態、およびその部位をいう。本明細書において、「１塩基多型」は、「ＳＮＰ」および「ＳＮＰｓ」と互換可能に使用される。
【００４５】
本明細書において使用する場合、「多型判別用プライマー」とは、そのプライマーを用いたＰＣＲなどの核酸増幅反応によって、その増幅産物の有無から多型部位の遺伝子型を判別するために使用されるプライマーを意味する。
【００４６】
また、本明細書においては、核酸増幅反応として、例示的に用語「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いているが、本発明の実施のためにＰＣＲ以外の核酸増幅反応も使用可能である。従って、本発明のプライマーが使用されるのは、ＰＣＲに限定されない。
【００４７】
本明細書において、「プライマー」の３’末端から塩基を数える場合、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」とは、３’末端の塩基をいう。従って、例えば、配列番号６の配列（５’−ＡＧＴＴＴＴＧＴＴＧＧＡＴＴＴＡＡＴＴＧＴＴＡＡＡＧＧＡＡ−３’）を有するプライマーにおいて、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」は「Ａ」であり、「プライマーの３’末端から３番目の塩基」は「Ｇ」である。
【００４８】
本明細書において、「プライマーの３’末端からＸ番目の塩基に対応する塩基」とは、プライマーが鋳型核酸とハイブリダイズした場合に、そのプライマーの３’末端から数えてＸ番目の位置の塩基がハイブリダイズする位置に存在する塩基をいう。また、プライマーの設計において、「（ある）塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列」とは、前者の（ある）塩基配列にハイブリダイズ(またはアニール）する（例えば、相補的な）塩基配列を
いい、前者の（ある）塩基配列が、ＧＧである場合、「（ある）塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列」とはＣＣであり得る。
【００４９】
本明細書において、（ある）塩基配列に「対応する対応鎖」とは、当該（ある）塩基配列とＤＮＡ二本鎖を形成するもう一方の鎖をいう。「対応する対応鎖」の塩基配列は、当該（ある）塩基配列に対して相補的である（例えば、ａに対してｔ、ｔに対してａ、ｇに対してｃ、ｃに対してｇである）ことが当業者には理解され得る。
【００５０】
本発明のプライマーを用いるＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡの調製は、周知の種々の方法（例えば、ＣＴＢＡ法、ボイル法など）によって、細胞および組織などからＤＮＡ(好まし
くは、ゲノムＤＮＡ）を調製することによって、行われ得る。
【００５１】
鋳型核酸としてＤＮＡ断片を使用する場合、鋳型核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを消化することによって、あるいはＰＣＲの使用によって、調製され得る。プライマーまたはプローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの化学合成の分野において公知の方法（非限定的例として、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９〜１８６２（１９８１））によって記載されるホスホロアミダイト法、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８５（１９８１））によって提供されるトリエステル法（両方を本明細書において参考として援用する）によって化学的に合成される。これらの合成は、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）において記載されるような自動合成機を使用し得る。オリゴヌクレオチドの精製は、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．およびＲｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ、２５５：１３７〜１４９（１９８３））に記載されるように、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって行われ得る。次に、所望される場合、二本鎖断片は、適切な相補的な一本鎖の対を適切な条件下でアニールすることによってか、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成することによって、得られ得る。核酸プローブのための特定の配列が与えられる場合、相補的鎖もまた同定され、そして含まれることが理解される。その相補的鎖は、標的が二本鎖核酸である場合、同等に良く作用する。
【００５２】
合成オリゴヌクレオチドの配列または任意の核酸断片の配列は、ジデオキシチェーンターミネーション法またはマクサム−ギルバート法のいずれかを使用して得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８９）、本明細書において参考として援用する）。このマニュアルを、本明細書において、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」という；「Ｚｙｓｋｉｎｄら（１９８８）」。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ）。
【００５３】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ」とは、オルソロガス遺伝子ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。
【００５４】
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｗｉｌｅｙ、  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
【００５５】
本発明は、イグサ品種のうち品種「ひのみどり」に特異的なゲノムＤＮＡの塩基配列を含むゲノムＤＮＡ断片を提供する。このようなゲノムＤＮＡ断片は、品種「ひのみどり」に特異的に存在しない塩基配列を含むものであっても、品種「ひのみどり」に特異的に存在する塩基配列を含むものであってもよい。当該ゲノムＤＮＡ断片は、約５００〜１，０００塩基対の断片長を有することが望ましい。この長さは、１ｐａｓｓで配列決定を行うのに適した断片長である。当該ゲノムＤＮＡ断片は、例えば、以下のように、ランダムクローニングおよびＰＣＲダイレクトシーケンシングを行うことにより、同定され得る：
１．制限酵素で消化した「ひのみどり」のゲノムＤＮＡをサイズ分画し、５００〜１０００塩基対の断片をクローニングする；
２．クローニングしたＤＮＡの塩基配列を決定し、決定された塩基配列をもとにプライマーを設計する；
３．設計されたプライマーを使用して、多数のイグサ品種（ひのみどりを含む、少なくとも８品種、好ましくは、代表的な下記の表１に示すイグサ１６品種を含む）のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、全ての品種で増幅断片が得られたものについて、増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定する。これら増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を比較することにより、（ひのみどり以外の）他の品種には共通に存在し，なおかつ品種「ひのみどり」に特異的に存在しないＤＮＡの点突然変異（例えば、１塩基多型）が検出される。上記ランダムクローニングにおいて用いられる制限酵素としては、４塩基（ＣＣＧＧ）を認識切断する制限酵素ＨｐａＩＩあるいは６塩基（ＣＴＧＣＡＧ）を認識切断する制限酵素ＰｓｔＩが挙げられる。
【００５６】
上記のようにして同定されたゲノムＤＮＡ断片の形態の一つは、図１（配列番号１）に示すゲノムDNA断片である。この断片において、比較品種においてはＡ／Ｇヘテロ接合型であるのに対し品種「ひのみどり」ではＧ型ホモ接合型となっている（図２中のＰｏｓｉｔｉｏｎ２３０−２３１の箇所）。上記のようにして同定されたゲノムＤＮＡ断片の別の形態は、図８（配列番号１１）に示すゲノムＤＮＡ断片である。これらのゲノムＤＮＡ断片の塩基配列は、イグサ品種識別のための優れたＤＮＡマーカーとなる。
【００５７】
本発明は、イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する方法を提供する。イグサ品種間で「ひのみどり」を識別することは、上記ＤＮＡマーカーを検出することによって実施され得る。
【００５８】
本発明は、イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する方法であって、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程を包含する、方法を提供する。
【００５９】
本発明はまた、イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する方法であって、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程を包含する、方法を提供する。
【００６０】
本発明の方法のある実施形態では、品種識別を行うことを望むイグサまたはイグサ製品において、配列番号１の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列の相違を検出する工程を包含する。
【００６１】
本発明の品種「ひのみどり」の識別方法の一つの態様は、上述したランダムクローニングおよびＰＣＲダイレクトシーケンシングを利用した方法である。即ち、品種識別を行うことを望むイグサにおいて、そのゲノムＤＮＡを制限酵素で消化してクローニングし、クローンの塩基配列を決定してプライマーを設計し、続いてＰＣＲダイレクトシーケンシングに供し、他の品種に共通に存在し、かつ品種「ひのみどり」には特異的に存在しない点
突然変異を検出する。
【００６２】
ランダムクローニングにおける制限酵素としてＨｐａＩＩを使用してこのＰＣＲダイレクトシーケンシングにおいて、検出の対象とするゲノムＤＮＡ断片は、配列番号１の３３３〜３３４位における、比較品種においてはＡ／Ｇヘテロ接合型であるのに対し、品種「ひのみどり」ではＧ型ホモ接合型（すなわち、ＧＧ）であるゲノムＤＮＡ断片である。品種識別の対象としたイグサにおいて、Ｇ型ホモ接合型（すなわち、ＧＧまたは対応する鎖中のＣＣ）であるゲノムＤＮＡ断片が検出されれば、このイグサは、品種「ひのみどり」であると判定され得る。逆に、このＤＮＡ断片が検出されなければ、あるいは、Ａ／Ｇヘテロ接合型であるゲノムＤＮＡ断片が検出されれば、品種「ひのみどり」ではないと判定され得る。
【００６３】
本発明の品種「ひのみどり」の識別方法の他の一つの態様は、核酸増幅反応（好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応）を利用した方法である。この方法については以下に説明する。
【００６４】
本発明は、品種「ひのみどり」を識別するためのプライマーを提供する。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、本発明のプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチドである。プライマーは、代表的には、４０ヌクレオチド未満であり得、好ましくは、３０ヌクレオチド未満であり得る。さらに好ましくは、本発明のプライマーは、長さが２０〜２９ヌクレオチドの範囲であり得る。
【００６５】
１つの局面において、このプライマーは、配列番号１に示される塩基配列の相違を判別するために用いられるＰＣＲプライマーである。１つの局面において、本発明のプライマーにおいては、そのオリゴヌクレオチドの配列は、配列番号１に示す塩基配列の一部であって、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を含む領域、または該領域の該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列に由来し得、但し、該配列番号１の３３３〜３３４位に示される塩基配列またはこれに対応する対応鎖の塩基配列には由来せず、ＡＡまたはＴＴの塩基配列を含む。このＡＡまたはＴＴの塩基配列は、当該プライマーの３’末端領域内に位置する。このプライマーを、本明細書中以下においては、便宜的に、プライマー１と称する。プライマー１は、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基がＡ／Ｇヘテロ接合型である、イグサ比較品種のゲノムＤＮＡ断片にアニールして伸長する条件（例えば、以下の実施例２または３と実質的に同等の増幅反応条件）下で、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基がＧ型ホモ接合型（すなわちＧＧ）である、品種「ひのみどり」のゲノムＤＮＡ断片にアニールして伸長し得ない。
【００６６】
本明細書において、プライマー１の「３’末端領域」とは、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基がＡ／Ｇヘテロ接合型であるイグサ比較品種のゲノムＤＮＡ断片にはアニールして伸長する条件下で、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基がＧ型ホモ接合型である品種「ひのみどり」のゲノムＤＮＡ断片にはアニールして伸長し得ないように設計される限りの、プライマーの３’末端側にある領域をいう。好ましくは、プライマー１の「３’末端領域」とは、プライマー１の３’末端から１番目の塩基から６番目の塩基に及ぶ領域である。
【００６７】
例えば、「プライマー１の『３’末端から１番目の塩基から６番目の塩基』中にＡＡまたはＴＴの塩基配列を含む」とは、長さが１７ヌクレオチドのプライマーの場合、このプライマー１は、５’から３’の順に表記して、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＡ、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＡＸ、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＡＸＸ、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＡＸＸＸ、またはＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＡＸＸＸＸ（ここで、ＡＡはＴＴでもあり得る）の塩基配列を有するプライマーであり得る。
【００６８】
本明細書において、特定の領域（例えば、配列番号１に示す塩基配列の領域）に「由来し得る」とは、当該領域の対応する対応鎖にハイブリダイズ可能であるように設計される塩基配列を有することをいう。上記プライマー１中のＡＡ以外の領域は、配列番号１の３３３〜３３４位の５’側または３’側のいずれかの領域の対応する対応鎖にハイブリダイズ可能であるような塩基配列を有し得る。好ましくは、上記プライマー１中のＡＡ以外の塩基は、本プライマーがアニールするのに対応する、配列番号１の３３３〜３３４位の５’側または３’側のいずれかの領域の対応する対応鎖中の塩基に相補的である。好ましいプライマー１は、プライマーの３’末端から１番目の塩基および２番目の塩基にＡＡを含む（すなわち、長さが１７ヌクレオチドのプライマー１の場合、５’から３’の順に表記して、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＡＡで表される）。より好ましくは、ＡＡの５’末端側の配列は、配列番号１の３３３〜３３４位に隣接する塩基配列の対応する対応鎖の塩基配列に完全に相補的である。
【００６９】
好ましいプライマーの一例としては、下記の実施例２に示されるＩＦ  Ａプライマー（５’−ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＴＡＡ  ＡＧＧ    ＡＡ−３’（配列番号６））が挙げられる。このプライマーは、ＳＮＰの位置（配列番号１の３３３〜３３４位に相当する）以外は、配列番号１に示す塩基配列の一部であって、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を含む領域に由来し得る配列を有し、そしてＡＡを３’末端から１番目および２番目の塩基として有する。上記プライマーは、該領域の該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列にも由来し得、このような配列を有するプライマーとしては、例えば、５’−ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  Ｔｔｔ  ＣＣ−３’（配列番号１７）（「ｔｔ」の部分がＳＮＰの位置に相当する）のような配列を有するプライマーもまた挙げられ得る。
【００７０】
本発明はまた、以下に説明するような、配列番号１に示される塩基配列の相違を判別するために用いられるＰＣＲプライマー対を提供する。当該プライマー対の各々のプライマーの長さは上記ＰＣＲプライマーと同様であり得る。当該プライマーの各々は、独立して、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１７ヌクレオチド、なおより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも２２ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、なおさらにより好ましくは少なくとも２７ヌクレオチドの連続する配列を含むオリゴヌクレオチドである。鋳型となる二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が配列番号１に示される。上記連続する配列の一方は、配列番号１に示す塩基配列において、該配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列より５’側にある領域の配列に由来し得、かつ上記連続する配列の他方は、配列番号１に示す塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列において、該配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列に対応する塩基配列より５’側にある領域の配列に由来し得る。これらプライマーがハイブリダイズするプライマー部位は、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を含む領域および対応する対応鎖の塩基配列を増幅し得る、配列番号１に示される塩基配列および対応する対応鎖における任意の部位であり得る。従って、当該プライマー対は、配列番号１のヌクレオチド配列全体にて示されるゲノムＤＮＡ断片または配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を含む当該ゲノムＤＮＡ断片の一部の領域およびこれらの対応する対応鎖を増幅可能なプライマー対である。好ましくは、上記プライマーの塩基は、本プライマーがアニールするのに対応する部位の塩基に相補的である。プライマー対中の両プライマーがそれぞれ対応する部位にアニールし、伸長反応を生じさせることにより、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を含む、上記部位間の領域および当該領域の対応する対応鎖を増幅し得る。また、このプライマー対の一方のプライマーはホスホロチオエート修飾され得る。
【００７１】
本発明はまた、以下に説明するような、配列番号１に示される塩基配列の相違を判別するために用いられるＰＣＲプライマーを提供する。当該プライマーの長さは上記ＰＣＲプライマーと同様であり得る。このプライマーは、配列番号１に示す塩基配列の一部であって、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列に隣接する領域の塩基配列、または該領域の該塩基配列に対応する対応鎖の塩基配列に特異的にハイブリダイズし得る。このプライマーを、本明細書中以下においては、便宜的に、プライマー２と称する。プライマー２は、好ましくは、その３’末端から１番目の塩基を、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列に隣接する領域、すなわち、配列番号１の３３２位または配列番号１の３３５位に対応する鎖中の塩基に相補的な塩基とするプライマーである。
【００７２】
好ましくは、本発明のプライマーは、プライマーの３’末端の塩基と相補的な塩基を有する鋳型のみを増幅し得る。従って、本発明のプライマーを用いたＰＣＲ反応において、増幅産物が検出される場合には、鋳型中の、プライマー３’末端に対応する位置の塩基は、プライマー３’末端と相補的な塩基である。
【００７３】
本発明はまた、配列番号１１の２８番目の塩基Ｃから５４番目の塩基Ｃまでの塩基配列（ＣＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＣ（配列番号１２））に由来し得る配列を有するプライマー（Ｌプライマーとも称する）および、４０９番目の塩基Ｇから４２７番目のＣまでの塩基配列（ＧＴＡＡＴＣＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＣ（配列番号１３））に対応する対応鎖の配列に由来し得るプライマー（Ｒプライマーとも称する）を提供する。慣用の増幅反応条件下で、Ｌプライマーは、配列番号１１の２８番目の塩基Ｃから５４番目の塩基Ｃまでの塩基配列（ＣＧＴＧＣＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＧＡＡＴＣ（配列番号１２））に対応する対応鎖の配列、そしてＲプライマーは、４０９番目の塩基Ｇから４２７番目のＣまでの塩基配列（ＧＴＡＡＴＣＧＣＣＣＧＡＡＴＧＴＧＣ（配列番号１３））を認識して伸長反応を生じさせる配列を有し得る。Ｌプライマーは、配列番号１２に示される塩基配列と少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは１００％同一である配列を有する。Ｒプライマーは、配列番号１３に対応する逆方向の配列ＧＣＡＣＡＴＴＣＧＧＧＣＧＡＴＴＡＣ（配列番号１４）と、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは１００％同一である配列を有する。上記ＬプライマーおよびＲプライマーとしてはそれぞれ、例えば、後述の実施例４に記載のＰｓｔＬプライマーおよびＰｓｔＲプライマーが好適に使用され得る。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明のプライマーのＴｍは、３４℃〜８０℃であり得る。好ましくは５０℃以上、なお好ましくは、５５℃以上、より好ましくは、６０℃以上であり、そして、６５℃以上、７０℃以上のＴｍを有するプライマーも使用可能である。
【００７５】
本発明の一実施形態において、本発明のイグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する方法における、上記配列番号１の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列の相違を検出する工程は、下記工程を包含する：（ａ）プライマー１と、少なくとも１つの別のプライマーであって、該配列番号１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００７６】
このような設計のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖法によれば、品種識別の対象となるイグサにおいて、品種「ひのみどり」に特異的に存在しない塩基配列が存在する場合のみ、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅産物が検出される。従って、この増幅産物の有無を検出することにより、品種識別の対象となるイグサが、品種「ひのみどり」であるか否かを判定することができる。
【００７７】
本方法の一実施形態では、ＰＣＲ−ＣＴＰＰ法（Ｃｏｎｆｒｏｎｔｉｎｇ  Ｔｗｏ−Ｐａｉｒ  Ｐｒｉｍｅｒｓ）（Ｈａｍａｊｉｍａ  Ｎ，Ｓａｉｔｏ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｏ  Ｋ，Ｔａｊｉｍａ  Ｋ．Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｆｒｏｎｔｉｎｇ  ｔｗｏ−ｐａｉｒ  ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．２００２  Ｍａｙ；４（２）：１０３−７．およびＷａｔｅｒｆａｌｌ  ＣＭ，Ｃｏｂｂ  ＢＤ．ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＰＣＲ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００２  Ｊｕｌ；３３（１）：８０，８２−４，８６）が利用され得る。ＰＣＲ−ＣＴＰＰ法では、下記実施例にて例示されるように、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を挟み込む領域またはその対応する対応鎖を増幅するように選択されたオリゴヌクレオチドプライマー対（ＯＦおよびＯＲ）および配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を３’末端領域に含む領域またはその対応する対応鎖のオリゴヌクレオチドに由来するプライマー対（ＩＦ−ＡおよびＩＲ−ＣＣ）が設計され得、ＯＦ／ＩＲ−ＣＣのプライマー対とＩＦ−Ａ／ＯＲのプライマー対によって、それぞれに対応する対立遺伝子「ＡＡ／ＴＴ」と「ＧＧ／ＣＣ」の認識を行い得る。ここで使用され得るＯＦプライマー、ＯＲプライマー、ＩＦ−Ａプライマー、およびＩＲ−ＣＣプライマーは、ＯＦおよびＯＲに関しては、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を挟み込む領域またはその対応する対応鎖を増幅し得るものであれば、そしてＩＦ−ＡおよびＩＲ−ＣＣに関しては、配列番号１の３３３〜３３４位に示す塩基配列を３’末端領域に含む領域またはその対応する対応鎖のオリゴヌクレオチドに由来する（但し、ＩＦ−Ａに関しては、配列番号１の３３３〜３３４位がＡＡである）（ＩＦとＩＲとが逆の場合も同様である（但しＴＴ））ものであれば、実施例に例示される配列に限定されない。
【００７８】
「ひのみどり」の識別は、例えば、融解曲線分析または電気泳動による増幅産物のバンドの検出によって行われ得る。ＰＣＲ−ＣＴＰＰ法では、例えば、ＯＦ／ＩＲ−ＣＣによる増幅産物が生じる一方で、ＩＦ−Ａ／ＯＲによる増幅産物が生じなかったことをもって、ＰＣＲの失敗とも区別して、「ひのみどり」の識別を決定し得る。融解曲線分析では、ＤＮＡ鎖の乖離に伴う蛍光強度の減衰を観察することにより増幅産物の融解温度の違いを検出し、この違いにより識別できる。増幅産物の電気泳動において、上記の各プライマー対による増幅産物バンドの有無を検出することによってもまた、識別できる。
【００７９】
本方法の一実施形態では、また、アンプリコン長多型（Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＡＬＰ））法が利用され得る。この方法では、同じプライマー対を使用して異なる品種のＤＮＡを鋳型に用いて増幅反応を行うと、鋳型の配列に依存して異なる大きさの増幅産物を生じ得る。増幅反応により生じた増幅産物のサイズの比較により、「ひのみどり」の識別を決定し得る。
【００８０】
一実施形態では、上記配列番号１の３３３〜３３４位に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列の相違を検出する工程は、（ａ）本発明の上記プライマー対を用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；（ｂ）該増幅産物を検出する工程；および（ｃ）該増幅産物の塩基配列を決定する工程を包含する。
【００８１】
例えば、この方法においては、まず、イグサ品種に共通に存在する塩基配列を挟み込むように設計された一対のオリゴヌクレオチドをプライマーとして、品種識別を行うことを望むイグサ由来のゲノムＤＮＡを鋳型に、ポリメラーゼ連鎖反応を行い、次いで、該ポリメラーゼ連鎖反応による増幅産物を検出する。この方法においては、さらに、増幅産物の塩基配列を決定する工程を含むことができる。増幅産物の塩基配列の決定には、当該分野で周知の任意の方法が使用され得る。
【００８２】
一実施形態において、上記方法における増幅産物の塩基配列を決定する工程は、前記増幅産物をプライマー２とハイブリダイズさせ、当該プライマーの３’側に標識アデニンまたは標識グアニンを取り込ませてプライマー伸長反応を行う工程、および該標識アデニンまたは標識グアニンの取り込みを検出する工程を包含し得る。本実施形態では、品種「ひのみどり」と他のイグサ品種の塩基配列の相違点に隣接するプライマー（例えば、プライマー２）を使用するプライマー伸長反応による増幅産物の種類および有無を判定することにより塩基の違いを決定し得、従って、品種「ひのみどり」か他の品種かを識別し得る。増幅産物の種類および有無の判定は、比色法あるいは蛍光測定法により行い得る。例えば、ＳｕｒｅＳｃｏｒｅＴＭキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）あるいはＴａｑｍａｎ（量的ＰＣＲ検出）システム（Ｒｏｃｈｅ社）を利用すれば、比色法あるいは蛍光測定法により増幅産物の種類および有無を判定することが可能である。比色法あるいは蛍光測定法は、もちろん他の同等の機能を有するシステムもまた使用し得る。これらのシステムによれば、電気泳動の手間も省けるため短時間で品種識別を行うことが可能であり、税関や植物検疫の検査への実用化に好適である。アデニンおよびグアニンの標識は、例えば、放射性物質、蛍光物質などによって標識され得る。これにより、品種識別の対象となるイグサが、品種「ひのみどり」であるか否かを、塩基配列を基に直接的かつ確実に判別することが可能となる。
【００８３】
本発明の方法の一実施形態における、配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程は、一実施形態において、以下の工程を包含する：
（ａ）Ｌプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、該配列番号１１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００８４】
本発明の方法の一実施形態における、配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程はまた、別の実施形態において、以下の工程を包含する：
（ａ）Ｒプライマーと、少なくとも１つの別のプライマーであって、該配列番号１１に示すゲノムＤＮＡの塩基配列または該塩基配列に対応するＤＮＡの塩基配列にハイブリダイズするプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００８５】
本発明の方法の一実施形態における、配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程はまた、別の実施形態において、以下の工程を包含する：
（ａ）Ｌプライマーと、Ｒプライマーとを用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００８６】
本発明の方法の一実施形態における、配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程はまた、別の実施形態において、以下の工程を包含する：
（ａ）プライマーとして、Ｐｓｔ１０９Ｌ−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＣ（配列番号１５），およびＰｓｔ１０９Ｒ−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１６）を用いて、イグサの試料ＤＮＡを増幅させる工程；および
（ｂ）該増幅産物を検出する工程。
【００８７】
本方法の好ましい実施形態では、また、アンプリコン長多型（Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＡＬＰ））法が利用され得る。この方法では、同じプライマー対を使用して異なる品種のＤＮＡを鋳型に用いて増幅反応を行うと、鋳型
の配列に依存して異なる大きさの増幅産物を生じ得る。増幅反応により生じた増幅産物のサイズの比較により、「ひのみどり」の識別を決定し得る。例えば、下記の実施例４では、図９に示すように、品種「ひのみどり」では約３２０ｂｐの位置に１本のバンド、他の１５品種では約３２０ｂｐと約５００ｂｐの位置に２本のバンドが示され、品種「ひのみどり」とその他の１５品種の間でＡｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＡＬＰ）を明らかに示している。本方法は実施例の記載に限定されないが、本方法において実施例４に示される結果と実質的に同等の結果を示し得るプライマーは、配列番号１１に示される塩基配列に存在する多型を判別する工程において使用され得る。。「実質的に同等の結果である」とは、下記の実施例４と実質的に同等の条件下で増幅反応を行ったとき、他のイグサ品種では、約３２０ｂｐと約５００ｂｐの２つの増幅産物が検出され、品種「ひのみどり」では、約３２０ｂｐの１つの増幅産物のみが示されることであるが、「ひのみどり」特異的な結果が示される限り、この増幅産物の大きさは必ずしも正確に一致し得なくてもよいことを意味する。プライマーは、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的であれば、鋳型の正確な配列に完全にマッチする必要はない。このようなプライマーの設計は、本明細書にて開示された配列番号１１の配列情報のような本明細書の記載に基づいて、当業者によって実施され得る。プライマーの設計においては、商業的に入手可能なまたは公に利用可能なプログラムもまた用い得る。
【００８８】
上述したように、本明細書においては、核酸増幅反応として、例示的に用語「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いているが、本発明の実施のためにＰＣＲ以外の核酸増幅反応も使用可能である。好ましくは、増幅工程において、ＰＣＲが使用され得る。
【００８９】
本発明におけるＰＣＲ反応において使用される鋳型としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用される鋳型は、天然から単離された状態であっても、単離された後に酵素などによって処理されたものあってもよい。鋳型を処理する酵素としては、逆転写酵素、制限酵素、ポリメラーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９０】
本発明において使用されるプライマーは、例えば、放射性物質、蛍光物質などによって標識されていてもよい。
【００９１】
ＰＣＲ産物を検出する方法としては、電気泳動、リアルタイムＰＣＲ検出装置が挙げられるがこれに限定されない。
【００９２】
ＰＣＲ反応のためには、周知または市販の種々の酵素を使用しうる。また、ＰＣＲ反応の条件は周知である。
【００９３】
本発明の識別方法は、イグサまたはイグサ製品からＤＮＡを抽出する工程をさらに包含し得る。本発明の識別方法にて品種を識別するための供試材料としては、イグサの植物体（例えば、茎）および加工されたイグサ製品（例えば、畳）のいずれもが用いられ得る。このような材料から当業者に周知の方法（例えば、上述したＣＴＢＡ法、ボイル法など）によってＤＮＡが抽出され得る。例えば、畳表製品からのサンプルの採取は、「裏毛」からとることになり得るが、イグサ植物体の株基と先端部とを見分けて、先端部から抽出することが望ましい。株基は原草を乾燥させる際に熱源に近い位置にあるため、DNAの分解が進んでいることが多い。しかし、本明細書中のいずれの方法も２００〜３００塩基対程度の短い配列を標的としたPCR法に基づき得るので、株基のようなDNAの断片化したサンプルにも適用可能である。また、一つの畳表製品が単一の品種である保証は無いため、一つの製品について16〜32点程度のサンプリングを行うことが望ましい。
【００９４】
本発明はまた、イグサまたはイグサ製品が品種「ひのみどり」であるか否かを識別する
ためのキットを提供する。本キットは、一実施形態においては、プライマー１を備える。本キットの別の実施形態では、上記プライマー対を備える。このキットはさらに、プライマー２を備え得る。本キットは、別の実施形態においては、Ｌプライマーを備える。本キットは、別の実施形態においては、Ｒプライマーを備える。本キットは、別の実施形態においては、ＬプライマーおよびＲプライマーを備える。本キットは、別の実施形態においては、プライマーとして、Ｐｓｔ１０９Ｌ−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＣ（配列番号１５），およびＰｓｔ１０９Ｒ−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１６）を備える。
【００９５】
本キットはさらに、「ひのみどり」を識別するための手順を記載した説明書もまた備え得る。本キットはさらに、上述したような「ひのみどり」の識別方法において好適に使用するために用いられ得る他の任意の成分もまた備え得る。
【００９６】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９７】
（実施例１）
（イグサの品種識別に利用可能なＤＮＡマーカーの同定）
（１）試料の調製
表１．供試した品種
品種ID     品種名
1     ひのみどり
2     下増田在来
3      しらぬい
4      岡山3号
5     岡山みどり
6      さざなみ
7      きよなみ
8      ふくなみ
9      岡山F系
10      くまがわ
11      文政在来
12     筑後みどり
13      高須在来
14      千丁在来
15      あさなぎ
16      大原四号
品種ID     品種名
材料は“ひのみどり“を含むイグサ品種１６品種（上記の表１）よりＣＴＡＢ法によって抽出したゲノムＤＮＡである。イグサの粉砕物０．１ｇに臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）緩衝液〔１％ＣＴＡＢ、０．１〜０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム）、０．５％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０５Ｍ  トリス−塩酸  ｐＨ８．０〕０．５ｍｌを添加して、５６℃で１時間保温した。つぎにＰＣＩ処理として、０．５ｍｌのＰＣＩ（０．２５ｍｌフェノール、０．２４ｍｌクロロホルム、０．０１ｍｌイソアミルアルコール）を添加して、２０分間振揺混合した。さらにＣＩＡ処理として、１５，０００ｒｐｍ、１０℃で１０分間超遠心分離した後、１ｍｌのＣＩＡ（０．９６ｍｌクロロホルム、０．０４ｍｌイソアミルアルコール）を添加して１０分間振揺混合した。１５，０００ｒｐｍ、２０℃で１０分間超遠心分離した後、イソプロパノール沈澱によりゲノムＤＮＡを濃縮洗浄して乾燥し、０．２ｇ／ｌになるようにＲＮａｓｅＡ（リボ核酸分解酵素Ａ）緩衝液（７ｇ／ｌ  ＲＮａｓｅＡ、１０ｍＭ  トリス−塩酸ｐＨ７．９、５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール）に溶解して、３７℃で２時間保温した。そして、該ＰＣＩ処理、該ＣＩＡ処理を行い、２０℃で１５分間超遠心分離した後、エタノール沈殿を行いＤＮＡを乾燥させた。
【００９８】
（２）制限断片のクローン化
上記工程により得られたゲノムＤＮＡ，５マイクログラムを制限酵素ＨｐａＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりサイズ分画し、８００ｂｐ−１，０００塩基対の制限断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋に結合し，大腸菌に形質転換を行いゲノミックライブラリを作成した。
【００９９】
（３）クローン化したゲノムＤＮＡの塩基配列の決定
上記工程により得られたクローン化イグサ・ゲノムＤＮＡの塩基配列を決定した。すなわち，抽出したプラスミドＤＮＡ５００ナノグラムを鋳型とし、ｐ７あるいはｐ８プライマーを使用してサイクルシーケンス反応を行い、ＤＮＡシーケンサを使用して挿入断片の
塩基配列約８００塩基対を決定した（図１）。図１には、このクローンＨｐａＩＩ０１の塩基配列を示す（配列番号１）。
【０１００】
（４）プライマーの設計およびゲノムＤＮＡの増幅
上記工程により決定されたイグサ・ゲノムＤＮＡの塩基配列をもとにプライマー設計ソフトウエアＰｒｉｍｅｒ３を使用して，標的配列の大きさを７００−８００塩基対としてプライマー設計を行った。プライマーの配列は、以下の通りである：０１Ｕ：５’−ＣＴＡ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＡＡＴ  ＣＧＴ  ＡＣＡ  ＣＣＴ  Ａ−３’（配列番号３）、０１Ｌ：５’−ＧＣＧ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＡＴＡ  ＡＴＣ  ＴＴＡ
Ｇ−３’（配列番号２）（図１中、各々、ボールドフェイスで示される領域にアニールする）。これらプライマーを用いて、実施例１で抽出した各種イグサ品種のＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い，アガロースゲル電気泳動により単一のバンドとして増幅されることを確認した。
【０１０１】
（５）ＰＣＲダイレクトシーケンス
上記工程により得られたＰＣＲ産物を鋳型に，上記工程で設計されたプライマー０１Ｌを使用してサイクルシーケンス反応を行い、ＤＮＡシーケンサを使用してＰＣＲ産物の塩基配列約８００塩基対を決定した。この工程において，品種「ひのみどり」ではＧＧ／ＧＧ型のホモ接合，他の１５品種ではＧＧ／ＡＡのヘテロ接合の領域があることが明らかとなった（図２）。図２は、「ひのみどり」ではホモ接合、その他の品種ではヘテロ接合となっている領域のクロマトグラムを示す。上段は「ひのみどり」，下段は岡山３号である。この図では、Ｐｏｓｉｔｉｏｎ２３０−２３１で「ひのみどり」がＧＧ／ＧＧであるのに対して，“岡山３号“ではＧＧ／ＡＡ接合（図中、配列は、ＮＮとして表される；当該箇所において、ＡのクロマトグラムとＧのクロマトグラムとが重なっている）となっている。
【０１０２】
（実施例２）
（ＳＮＰプライマーを用いた「ひのみどり」の識別（ＰＣＲ−ＣＴＰＰ法））
実施例１にて見出されたホモ接合／ヘテロ接合の多型をＰＣＲで検出するため，４種類のプライマー（ＯＦ：  ５’−ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＴＴＧ  ＧＧＣ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＡＡＧ  ＡＴＴ  Ａ−３’（配列番号４），ＯＲ：  ５’−ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＧＣＣ  ＣＣＡ
ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  Ｇ−３’（配列番号５），ＩＦ＿Ａ：  ５’−ＡＧＴ  ＴＴＴ  ＧＴＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ  ＡＡＴ  ＴＧＴ  ＴＡＡ  ＡＧＧ    ＡＡ−３’（配列番号６），ＩＦ＿ＣＣ：  ５’−ＴＴＧ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＴＣＴ  ＧＡＴ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＣＣ−３’（配列番号７））を設計し（図３），ＰＣＲ−ＣＴＰＰ法（Ｃｏｎｆｒｏｎｔｉｎｇ  Ｔｗｏ−Ｐａｉｒ  Ｐｒｉｍｅｒｓ）（Ｈａｍａｊｉｍａ  Ｎ，Ｓａｉｔｏ  Ｔ，Ｍａｔｓｕｏ  Ｋ，Ｔａｊｉｍａ  Ｋ．Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｆｒｏｎｔｉｎｇ  ｔｗｏ−ｐａｉｒ  ｐｒｉｍｅｒｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．２００２  Ｍａｙ；４（２）：１０３−７．；およびＷａｔｅｒｆａｌｌ  ＣＭ，Ｃｏｂｂ  ＢＤ．ＳＮＰ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＰＣＲ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００２  Ｊｕｌ；３３（１）：８０，８２−４，８６）を利用した多型検出を行った。図３は、ＰＣＲ−ＣＴＰＰに使用したプライマーセットの配置図を示す。ＳＮＰの位置は灰色の背景のボールドフェイスで示した（ＯＦプライマーおよびＯＲプライマーのそれぞれがアニールし得る領域を、アンダーラインつきのボールドフェイスにて示す。ＩＦ−Ａプライマーの配列を上段に示した配列に示す。ＩＲ＿ＣＣプライマーがアニールし得る領域を枠つきの配列にて示す。増幅産物はそれぞれＯＦ／ＯＲセット；１９３ｂｐ、ＯＦ／ＩＲ＿ＣＣセット；１６３ｂｐ、ＩＦ−Ａ／ＯＲセット；８１ｂｐである）。ＰＣＲの標的配列の大きさは、ＯＦ／ＩＲ−ＣＣ断片が８１ｂｐ、またＩＦ−Ａ／ＯＲ断片が１６３ｂｐである。ＰＣＲの反応体積２０μｌ中にＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＴＭ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ溶液  １０μｌ，０．１５ｍＭ  ＯＦ  プライマー、０．１５ｍＭ  ＩＲ−ＣＣプライマー，０．４ｍＭ  ＯＲプライマー、０．４ｍＭ  ＩＦ−Ａプライマー、１２０ｎｇ  ゲノムＤＮＡを含む反応液を調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲの増幅条件は、９５℃  １５分  １回；９４℃  １０秒、４５℃  ２０秒、７０℃  ２０秒  ６０回とし、融解曲線分析は７０℃  ５０秒保持、０．４℃／秒で５５℃まで降下、０．０５℃／秒で５５℃から８５℃まで上昇させ、温度上昇中に蛍光光度を測定することで行った。反応後のＤＮＡ溶液は３％アガロースゲル、１×ＴＢＥバッファー中で電気泳動を行い、ＥｔＢｒ染色後トランスイルミネータ上で写真撮影した。
【０１０３】
融解曲線分析の結果を図４に示した。横軸に測定時の温度、縦軸に符号を逆転させた蛍光強度の差を割り当てたグラフである。図４の各グラフ１〜１６は、以下に示す通りである：１．ひのみどり、２．下増田在来、３．しらぬい、４．岡山３号、５．岡山みどり、６．さざなみ、７．きよなみ、８．ふくなみ、９．岡山Ｆ系、１０．くまがわ、１１．文政在来、１２．筑後みどり、１３．高須在来、１４．千丁在来、１５．あさなぎ、１６．大原四号。ＤＮＡ鎖の乖離に伴う蛍光強度の減衰が大きくなる温度にピークが現れることから、増幅産物の融解温度の違いを検出できる。品種「ひのみどり」では、７３℃にピークを持つ単峰分布の融解曲線が得られたが、その他の１５品種ではいずれも７０℃と７３℃にピークを持つ二峰分布の融解曲線が得られたことから、融解曲線分析による品種識別が可能であった。また、ＰＣＲから融解曲線分析終了までの所要時間は１時間４０分程度であった。
【０１０４】
電気泳動の結果を図５に示した。両端のバンドは分子量を表し、各レーン１〜１６は以下の通りである：１．ひのみどり、２．下増田在来、３．しらぬい、４．岡山３号、５．岡山みどり、６．さざなみ、７．きよなみ、８．ふくなみ、９．岡山Ｆ系、１０．くまがわ、１１．文政在来、１２．筑後みどり、１３．高須在来、１４．千丁在来、１５．あさなぎ、１６．大原四号。品種「ひのみどり」では、ＯＦ／ＯＲプライマーセットに由来する１９３ｂｐのバンドとＯＦ／ＩＲ＿ＣＣプライマーセットに由来する１６５ｂｐのバンドのみが検出されたが（図５、レーン１）、それ以外の品種（図５、レーン２〜１６）では，これら２本のバンドの他に、さらにＩＦ−Ａ／ＯＲに由来する８１ｂｐのバンドが検出された。この８１ｂｐのバンドの有無によって、ＰＣＲ産物の電気泳動によっても品種“ひのみどり”をその他のイグサ品種から識別することが可能であった。
【０１０５】
（実施例３）
（ＳＮＰプライマーを用いた「ひのみどり」の識別）
実施例１により同定された点突然変異を含むように標的配列を８０塩基対から１７５塩基対としてＰＣＲ用プライマーを設計し、あわせて点突然変異に隣接するＳＮＰプライマーを設計した。なお、ＰＣＲプライマーのうち一方は後述のエクソヌクレアーゼ処理に備えてホスホロチオエート修飾した。プライマーの概要を図６に示す。
【０１０６】
実施例１に由来するゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物をエクソヌクレアーゼで分解し一本鎖ＤＮＡとして、シグナル検出用タイタープレートにあらかじめ固定したＳＮＰプライマーとハイブリダイズさせた。続いて、プライマー伸長反応を行い、フルオロセイン標識グアニンあるいはビオチン標識アデニンをＳＮＰプライマーの３’側に取り込ませた。ＰＣＲの条件は以下のとおりである：２０ｕｌの反応溶液中に以下の組成を含む：１×Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ  ｂｕｆｆｅｒ，２００μＭ  ｄＮＴＰ，０．３μＭ  ｐｒｉｍｅｒｓ，０．５Ｕ  ａｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ６０ｎｇ  ＤＮＡ。ＰＣＲの反応サイクルは、９６℃  １０分、（９６℃  １分、４６℃  ３０秒、７２℃  ４０秒）を３０サイクル、７２℃  １分である。
【０１０７】
フルオロセイン標識グアニンとパーオキシダーゼ標識抗フルオロセイン抗体反応させ，比色法によりパーオキシダーゼ標識抗フルオロセイン抗体を検出し、グアニン残基の同定を行った。続いて、ビオチン標識アデニンとアルカリフォスファターゼ標識アビジンを反応させ，比色法によりアルカリフォスファターゼ標識アビジンを検出し、アデニン残基の同定を行った。ここでは、ＳｕｒｅＳｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて比色測定を行った。
【０１０８】
この比色測定の結果を図７に示す。図７において、左の図は、品種についての各ウェルの位置を示し、そして中央の写真は、Ｇ型の結果を、そして右の写真はＡ型の結果を示す。その塩基を有すると発色する。ＡＡコントロールは、Ａ型でのみ反応して着色し、ＡＧコントロールはＧ型およびＡ型の両方で反応して着色し、ＧＧコントロールは、Ｇ型でのみ反応して着色した。この着色結果を参照することにより、塩基配列がＧＧ、ＡＧ、ＡＡのいずれかであるか判定可能である。ウェル１にて示される品種「ひのみどり」のみがＧ型でのみ反応し、Ａ型では反応しなかった。他の品種はいずれもＧ型およびＡ型の両方で着色した。この結果より、品種「ひのみどり」を識別可能であった。
【０１０９】
（実施例４）
（Ａｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＡＬＰ）によるイグサ品種「ひのみどり」の識別）
材料は「ひのみどり」を含むイグサ品種１６品種（上記の表１）よりＣＴＡＢ法によって抽出したゲノムＤＮＡである（実施例１と同様）。方法は、まずイグサ品種「ひのみどり」ゲノムＤＮＡをＰｓｔＩで消化したライブラリより単離したクローンであるＰｓｔ１０９の塩基配列を決定し，プライマーセット（Ｐｓｔ１０９Ｌ−ＣＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＴＣ（配列番号１５），Ｐｓｔ１０９Ｒ−ＧＣＴ  ＴＧＣ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＴＴＡ  Ｃ（配列番号１６））を設計した（図８；図中の下線を付したボールドフェイスの領域は、これらプライマーの位置を示す（上方がＰｓｔ１０９Ｌであり、下方がＰｓｔ１０９Ｒに相当する））。ＤＮＡの増幅はＰＣＲの反応体積２０μｌ中に０．５Ｕ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ），２μｌ  １０×  Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ，２００ｍＭ  ｄＮＴＰ，各０．２ｍＭ  プライマー，６０ｎｇ  ゲノムＤＮＡを含む反応液を調製し，ＡＢＩ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲの増幅条件は、９６℃  ２分  １回；変性  ９６℃  １０秒，アニーリング５２〜５５℃  ２０秒，伸長反応  ７２℃  ４０秒  ３５回とした。反応後のＤＮＡ溶液は２％アガロースゲル，１ｘＴＢＥバッファー中で電気泳動を行い、ＥｔＢｒ染色後トランスイルミネータ上で写真撮影した。このプライマーを使用して１６品種間の当該領域をＰＣＲで増幅した。
【０１１０】
電気泳動の結果を図９に示した。両端のバンドは分子量を表し、各レーン１〜１６は以下の通りである：１．ひのみどり、２．下増田在来、３．しらぬい、４．岡山３号、５．岡山みどり、６．さざなみ、７．きよなみ、８．ふくなみ、９．岡山Ｆ系、１０．くまがわ、１１．文政在来、１２．筑後みどり、１３．高須在来、１４．千丁在来、１５．あさなぎ、１６．大原四号。結果，図９に示すように、品種「ひのみどり」では約３２０ｂｐの位置に１本のバンド、他の１５品種では約３２０ｂｐと約５００ｂｐの位置に２本のバンドを示した。このプライマーは品種「ひのみどり」とその他の１５品種の間でＡｍｐｌｉｃｏｎ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ（ＡＬＰ）を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
ＤＮＡマーカーを指標としたイグサ品種の識別方法が提供された。本発明のイグサ品種
の識別方法は、ＤＮＡ情報の品種間での違いを反映しているため、従来のような量的形質で識別する方法とは異なり、イグサの生育環境に影響されることはない。また、簡単に再現性の高い結果が得られるので、品種識別の誤認の可能性は低く、正確な品種判定を簡便・高速に実施できる。従って、本発明は、イグサの品種識別に多大な貢献をしうるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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