(57)【要約】【課題】免疫原性は保持するが、改善された安定性を有する修飾多糖（特に修飾Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清型Ａ多糖）を提供すること。【解決手段】免疫原性は保持するが、改善された安定性を有する修飾多糖（特に修飾Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ血清型Ａ多糖）。代表的に、修飾多糖は、莢膜多糖またはそれらのオリゴ糖フラグメントをＣＤＩといった二機能性試薬と反応させ、その後ジメチルアミンといったアミノ化合物と反応させることにより調製される。このような結合体から調製される修飾多糖−タンパク質結合体およびワクチンもまた記載されている。本発明は、対応する天然の莢膜糖の少なくとも１つの単糖単位のヒドロキシル基の位置における保護基を含む修飾莢膜糖を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用された全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、多糖の化学の分野にあり、修飾糖、修飾糖調製のプロセスおよび、結合体化した誘導体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）に関する。特に、本発明は、水中において改善された安定性を有する修飾糖に関する。
【背景技術】
【０００３】
多糖は、重要な生物学的分子であり、疾患の予防および処置のための医薬産業において広く使用されている。例えば、莢膜多糖は、莢膜細菌（例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、およびＨｉｂ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型）に対するワクチンとして長年使用されてきた。
【０００４】
特に小児においてこれら多糖の免疫原性を高めるために、結合体化ワクチン（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）が開発された。結合体化ワクチンは、キャリアタンパク質［例えば、参考文献１、２、３］に結合体化した莢膜多糖を含む。結合体は、Ｔ−独立抗原をＴ依存抗原に変得える。
【０００５】
多様な多糖の問題は、水中における安定性の乏しさである。水中における多糖の安定性は、糖単位を繋いでいるＯ−グリコシド結合の性質に依存する。水中における安定性の乏しさは、Ｏ―グリコシド結合が、酸またはグリコシダーゼの存在下で簡単に加水分解されることに起因する。血清型Ａ髄膜炎菌の莢膜多糖は、水中において乏しい安定性をもつ多糖の一例である。
【０００６】
多糖の安定性は、結合体化ワクチンの生産において、特に問題である。多糖−タンパク質結合体を調製するために、多糖に化学官能基を操作する必要がある。その操作によって、多糖がタンパク質と連結され得る。多糖は、タンパク質に直接的に連結され得る［特許文献１［２］、特許文献２［４］］かまたは、リンカー基を介して連結され得る。多様な種類のリンカー基が多糖をタンパク質に連結するために提案されている［例えば、特許文献３［３］、特許文献４［５］］。
【０００７】
化学的な試薬（特に酸）への多糖の露出は、望ましくないグリコシド結合の切断、そしてその結果、多糖の断片化を引き起こし得る。このような断片化は、非常に好ましくなく、多糖−タンパク質結合体の合成における収量の損失の原因となる。
【０００８】
一般的に、このように不安定な多糖は、上の問題を回避するための試薬および条件の慎重な選択を必要とする。しかし、この選択は、多糖の操作に使用可能な試薬を制限し、従って、多糖とキャリアタンパク質との間に形成され得る結合の範囲も制限される。さらに、これら多糖の不安定性は、工業規模でワクチンを調製するのに使用され得る粗野な手順の開発が困難であることを意味する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第４，７６１，２８３号明細書
【特許文献２】米国特許第４，３５６，１７０号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８８２，３１７号明細書
【特許文献４】米国特許第４，６９５，６２４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
莢膜糖を修飾する方法を提供し、不安定性の問題を被ることなく抗原性を維持することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、莢膜糖の単糖単位でのヒドロキシル基の修飾が改善された安定性を提供するという発見に基づいている。本発明のプロセスにより入手される修飾糖は、対応する天然の糖よりも加水分解に対して安定である。
【００１２】
（本発明の修飾糖）
本発明は、対応する天然の莢膜糖の少なくとも１つの単糖単位のヒドロキシル基の位置における保護基を含む修飾莢膜糖を提供する。
【００１３】
用語「修飾莢膜糖」は、適切な修飾により天然の莢膜糖から入手され得る糖を意味する。従って、天然の莢膜糖における単糖単位の繰り返しの基本的な配列は、本発明の修飾莢膜糖において保持されている。
【００１４】
用語「糖」は、オリゴ糖（例えば、２〜３９単糖単位を含む）と多糖（例えば、４０もしくはそれ以上の単糖単位を含む）との両方を包含する。細菌で天然に見られるように、天然の莢膜糖は通常、多糖の形態をとる。多糖は、より短いオリゴ糖を与えるように操作され得る。オリゴ糖は、天然の多糖の精製および／またはサイズ処理（例えば、緩やかな酸での加水分解によって、加熱によって、サイジングクロマトグラフィーによって、など）により入手され得る。
【００１５】
代表的に、本発明の修飾糖は、オリゴ糖である。オリゴ糖は上で記載した任意のサイズ処理の方法によって多糖から入手され得る。
【００１６】
本発明の修飾莢膜糖は、天然の莢膜糖から入手され得る。しかし、本発明は、天然の莢膜糖から入手される修飾糖に限定されない。本発明の修飾莢膜糖は、完全な合成または部分的な合成といった他の方法によって、入手され得る。
【００１７】
保護基を有する単糖単位の数は、本発明において変化し得る。例えば、対応する莢膜糖の全てのまたは実質的に全ての単糖単位が保護基を有し得る。あるいは、対応する莢膜糖の少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の単糖単位が保護基を有し得る。対応する莢膜糖の少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０の単糖単位が保護基を有し得る。
【００１８】
同様に、単糖単位での保護基の数も変化し得る。例えば、単糖単位での保護基の数は、１、２、３、４、５、または６であり得る。好ましくは、１〜４、さらに好ましくは１〜２であり得る。
【００１９】
１つの実施形態において、保護基を有する単糖単位の少なくとも１つは、非末端単糖単位である。用語「非末端単糖単位」は、オリゴ糖／多糖鎖での末端単糖単位の中の１つでない単糖単位を意味する。
【００２０】
本発明は、修飾莢膜糖を包含し、末端単糖単位および非末端単糖単位の全てのヒドロキシル基の位置が保護基を有し得る。しかし、本発明の修飾莢膜糖において少なくとも１つの遊離なヒドロキシル基もしくはアミノ基が存在することが好ましい。修飾莢膜糖のさらなる反応のため（例えば、キャリア分子への結合のため）のハンドルを提供するため、遊離なヒドロキシル基またはアミノ基が、有利である。修飾糖が遊離なヒドロキシル基を含む場合、遊離ヒドロキシル基は、好ましくは、アノマーヒドロキシル基であり、好ましくは末端アノマーヒドロキシル基である。修飾糖が遊離なアミノ基を含む場合は、遊離なアミノ基は好ましくは、アノマーヒドロキシル基に由来する。アミノ基は、還元アミノ化（例えば、ＮａＢＨ３ＣＮ／ＮＨ４Ｃｌを使用して）によりアノマーヒドロキシル基から容易に入手される。
【００２１】
用語「アミノ基」は、−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｅ基を含む。Ｅは、窒素保護基である。代表的な窒素保護基の例は、以下に記載される。
【００２２】
用語「保護基」は、ヒドロキシル基の反応性をブロックする任意の基を意味する。当業者は、種々の型の保護基を認識する。ヒドロキシル基に対する好ましい保護基は、ヒドロキシル基の誘導体化反応を介して直接入手し得る基である。すなわち、ヒドロキシル基の水素原子を他の基で置換する。保護基として働く適切なヒドロキシル基の誘導体は、例えば、カルバミン酸塩、スルホン酸塩、炭酸塩、エステル、エーテル（例えば、シリルエーテルまたはアルキルエーテル）およびアセタールである。このような保護基の幾つかの特定の例は、アリル、Ａｌｏｃ、ベンジル、ＢＯＭ、ｔ−ブチル、トリチル、ＴＢＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ、ＰＭＢ、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＭＴＭ、およびＴＨＰである。
【００２３】
しかし、保護基は、ヒドロキシル基の誘導体化反応を介して直接入手される必要はない。保護基は、完全にヒドロキシ置換を置換し得る。例えば、保護基は、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−１２アルキル、Ｃ５−１２アリール、Ｃ５−１２アリール−Ｃ１−５アルキル、ＮＲ１Ｒ２（Ｒ１およびＲ２は以下で定義するものである）、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＣｌ３などである。
【００２４】
好ましくは、保護基は、電子吸引性基である。仮説理論によって束縛されるのは望まないが、グリコシド結合での糖ヒドロキシル基の分子内求核攻撃からの補助に起因して（すなわち、環状中間体の形成によって）、グリコシド結合は加水分解に対して不安定であると考えられている。ヒドロキシル基の求核性が大きいほど、分子内求核攻撃の傾向は高い。電子吸引性保護基は、酸素孤立電子対の非局在化の効果を有する。従って、酸素の求核性を減少させ、分子内求核攻撃の傾向を減少させる。
【００２５】
好ましくは、保護基は以下の式のものである：
−Ｏ−Ｘ−Ｙ  または  −ＯＲ３
ここで、Ｘは、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、またはＳＯ２である；
Ｙは、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ１−１２アルコキシ、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ５−１２アリールまたはＣ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルであり、それぞれは、必要に応じて、別個に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、もしくはＣＣｌ３から選択される、１、２または３つの基で置換され得る；またはＹは、ＮＲ１Ｒ２である；
Ｒ１およびＲ２は別個にＨ、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ５−１２アリール、Ｃ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルから選択される；またはＲ１およびＲ２はＣ３−１２飽和複素環基を形成するように結合され得る；
Ｒ３は、Ｃ１−１２アルキルまたはＣ３−１２シクロアルキルであり、それぞれは、必要に応じて、別個に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、もしくはＣＣｌ３から選択される、１、２または３つの基で置換され得る；またはＲ３は、Ｃ５−１２アリールまたはＣ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルであり、それぞれは、必要に応じて、別個に、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１−６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、もしくはＣＣｌ３から選択される１、２、３、４または５つの基で置換され得る。
【００２６】
好ましくは、Ｒ３がＣ１−１２アルキルまたはＣ３−１２シクロアルキルである場合、上で定義したように、Ｒ３は、１、２、または３つの基で置換される。
【００２７】
式−Ｏ−Ｘ−Ｙ  または  −ＯＲ３の保護基は、標準的な誘導体化工程（例えば、ヒドロキシル基とアシルハロゲン化物、ヒドロキシル基とアルキルハロゲン化物、ヒドロキシル基とスルホン酸ハロゲン化物などの反応）によりヒドロキシル基から調製され得る。従って、好ましくは、−Ｏ−Ｘ−Ｙでの酸素原子は、ヒドロキシル基の酸素原子である。一方、−Ｏ−Ｘ−Ｙでの−Ｘ−Ｙ基は、好ましくは、ヒドロキシル基の水素原子を置換する。
【００２８】
あるいは、保護基は、置換反応（例えば、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ型置換）を介して入手され得る。これらのヒドロキシル基からの保護置換の調製方法および他のヒドロキシル基からの保護置換の調製方法は周知である。
【００２９】
さらに好ましくは、保護基は、−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３［６］または−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２である。
【００３０】
さらに好ましくは、保護基は、式−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２のカルバミン酸塩基である。ここで、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ１−６アルキルから独立して選択される。さらに好ましくは、Ｒ１およびＲ２は共にメチルである。すなわち、保護基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＭｅ２である。
【００３１】
カルバミン酸塩保護基は、グリコシド結合における安定化効果を有し、緩やかな条件下で調製され得る。カルバミン酸保護塩基を提供するための糖の操作工程の１例は、以下で記載されている。しかし、本発明は本明細書中で例示された工程によって調製される修飾糖に限定されない。さらに、本発明の修飾糖の調製のための工程は当業者には容易に理解される。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「アルキル」は、直鎖状の形態と分岐形態の両方のアルキル基を指す。アルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−から選択される１つ、２つ、または３つのヘテロ原子で中断され得る。アルキル基はまた、１つ、２つ、もしくは３つの２重結合および／または３重結合によっても中断され得る。しかし、用語「アルキル」は通常、ヘテロ原子の中断、または２重結合もしくは３重結合の中断を有さないアルキル基を指す。Ｃ１−１２アルキルと言及した場合、アルキル基は１〜１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）。を含み得ることを意味する同様に、Ｃ１−６アルキルと言及した場合、アルキル基は、１〜６の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６）を含み得ることを意味する。
【００３３】
用語「シクロアルキル」は、シクロアルキル、ポリシクロアルキル、およびシクロアルケニル基ならびにこれらとアルキル基との組み合わせ（例えば、シクロアルキルアルキル）含む。シクロアルキル基は、−Ｏ−、−ＮＨ−または−Ｓ−から選択される１つ、２つ、または３つのヘテロ原子で中断され得る。しかし、用語「シクロアルキル」は通常、ヘテロ原子の中断を有さないシクロアルキル基を指す。シクロアルキル基の例として、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘキシルメチルおよびアダマンチル基が挙げられる。Ｃ３−１２シクロアルキルと言及した場合、シクロアルキル基は、３〜１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含み得ることを意味する。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「アリール」は、フェニルまたはナフチルといった芳香族基を指す。Ｃ５−１２アリールと言及した場合、アリール基は、５〜１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含み得ることを意味する。
【００３５】
用語「Ｃ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキル」は、ベンジル、フェニルエチル、およびナフチルメチルといった基を指す。
【００３６】
Ｒ１およびＲ２がＣ３−１２飽和複素環基の形成のために連結される場合、Ｒ１およびＲ２は窒素原子と共に、３〜１２の間の任意の数の炭素原子（例えば、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２）を含む飽和複素環基を形成することを意味する。飽和複素環基は、窒素原子以外に１つまたは２つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、ＯまたはＳ）を含み得る。Ｃ３−１２飽和複素環基の例は、ピロリジニル、ピペリジニル、モルフォリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニルおよびアジリジニル、である。
【００３７】
上で記載した全ての実施形態において、好ましくは、修飾莢膜糖は、リン酸ジエステル結合を有する修飾莢膜糖である。さらに好ましくは、修飾莢膜糖は、修飾Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖である。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖は、加水分解に対して特に不安定である。
【００３８】
修飾莢膜糖が修飾Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖である場合、好ましくは、保護基は、対応するＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖の４位および／または３位、さらに好ましくは４位に存在する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖の４位および／または３位の保護基は、加水分解に対する安定性の改善に特に効果的であることが示されている。
【００３９】
本発明はまた、以下の式の糖を提供する：
【００４０】
【化５】
2010132925.tif 000002
【００４１】
ここでＴは以下の式（Ａ）または（Ｂ）である：
【００４２】
【化６】
2010132925.tif 000003
【００４３】
ｎは１から１００の整数である；
各Ｚ基は、−ＯＨまたは上で定義された保護基から別個に選択される；ならびに
各Ｑ基は、−ＯＨまたは上で定義された保護基から別個に選択される；
Ｗは、−ＯＨまたは上で定義された保護基から選択される；
Ｖは、−ＮＨ２、−ＮＨＥ、−ＮＥ１Ｅ２、−ＯＨまたは−Ｏ−Ｄから別個に選択される；ここでＥ、Ｅ１およびＥ２は同じもしくは異なり得る窒素保護基であり、そしてＤは酸素保護基である；
さらに、Ｑ基の約７％より多く（例えば、８％、９％、１０％、またはそれより多く）が保護基である；
好ましくは、ｎは、１５〜２５の整数である。
【００４４】
ｎ＋２Ｚ基の各々は、互いに同じまたは異なり得る。同様に、ｎ＋２Ｑ基の各々は、互いに同じまたは異なり得る。
【００４５】
好ましくは、Ｖは、−ＮＨ２または−ＮＨＥである。
【００４６】
適切な窒素保護基は、シリル基（例えば、ＴＭＳ、ＴＥＳ、ＴＢＳ、ＴＩＰＳ）、アシル誘導体（例えば、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（ＺまたはＣｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル（Ｔｒｏｃ））、スルホニル誘導体（例えば、ａ−トリメチルシリルエタノスルホニル（ＳＥＳ））、スルフェニル誘導体、Ｃ１−１２アルキル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル、アリール、９−フェニルフルオレニルなどである。好ましい窒素保護基は、Ｆｍｏｃである。
【００４７】
Ｅ１、Ｅ２として使用され得る二価窒素保護基としては、環状イミド誘導体（例えば、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ジチアスクシンイミド、Ｎ−２，３−ジフェニルマレイミド）、イミン誘導体（例えば、Ｎ−１，１−ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ−ベンジリデネアミン、Ｎ−ｐ−メトキシベンジリデネンアミン、Ｎ−ジフェニルメチエンアミン）、エナミン誘導体（例えば、Ｎ−（５，５−ジメチル−３−オキソ−１−シクロヘキセニル）アミン）などが挙げられる。好ましい二価窒素保護基はＮ−フタリミジルである。
【００４８】
適切な酸素保護基には、エステル、エーテル（例えば、シリルエーテルまたはアルキルエーテル）およびアセタールが挙げられる。特定の例として、アリル、アセチル、Ａｌｏｃ、ベンジル、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｔ−ブチル、トリチル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、パラメトキシベンジル（ＰＭＢ）、ＭＥＭ、メトキシメチル（ＭＯＭ）、ＭＴＭおよびテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）が挙げられる。
【００４９】
すべてのＺ基は、ＯＨであり得る。あるいは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％または６０％のＺ基がＯＡｃであり得る。好ましくは、約７０％のＺ基がＯＡｃであり、残りのＺ基は、ＯＨまたは上で定義されたような保護基である。
【００５０】
少なくとも約７％のＱ基は、保護基である。好ましくは、少なくとも、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％のＱ基が保護基である。あるいは、全てのＱ基が保護基であり得る。
【００５１】
本発明はまた以下の式の糖部分を含む分子を提供する：
【００５２】
【化７】
2010132925.tif 000004
【００５３】
ここで、Ｔは以下の式（Ａ）または（Ｂ）である：
【００５４】
【化８】
2010132925.tif 000005
【００５５】
ｎ、Ｚ、ＱおよびＷは、上で定義された通りであり、Ｌは、Ｏ、ＮＨ、ＮＥ、ＳまたはＳｅである。
【００５６】
Ｌの遊離共有結合は、任意の適切な部分（例えば、−Ｈ、−Ｅ、リンカー、タンパク質キャリアなど）へ連結され得る。好ましくは、Ｌは、ＮまたはＯである。Ｌは、Ｎであり得るか、二価リンカーに連結され得るか、二価保護基に連結され得るか、二価タンパク質キャリアへ連結され得る。
【００５７】
（修飾糖の産生のためのプロセス）
本発明は莢膜糖の修飾のためのプロセスを提供する。このプロセスは、以下の工程を包含する：
（ａ）単糖単位において少なくとも１つのヒドロキシル基を有する莢膜糖を提供する工程；および
（ｂ）前記の少なくとも１つのヒドロキシル基を保護基に変換する
工程。保護基は、上で定義された保護基のうちいずれかであり得る。
【００５８】
莢膜糖は、天然の莢膜糖（オリゴ糖または多糖）であり得る。代替的に、例えば、莢膜糖は、デ−Ｏ−アセチル化莢膜糖および／または末端アミノ基（例えば、還元アミノ化により得られた）を有する莢膜糖であり得る。
【００５９】
保護基が−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２であるとき、糖の修飾の好ましいプロセスは、工程（ｂ）が以下の過程を含む場合である：
（ｂ１）有機溶媒中で、莢膜糖を二機能性試薬と反応させる工程；および
（ｂ２）工程（ｂ１）の生成物を式（Ｉ）のアミノ化合物と反応させる工程であって、
ＨＮＲ１Ｒ２                （Ｉ）
ここでＲ１およびＲ２は上で記載された通りである、工程。
【００６０】
用語「二機能性試薬」は、（ｉ）工程（ｂ１）において、糖のヒドロキシル基との結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）のための第１の求電子性炭素原子を提供する工程；および（ｉｉ）工程（ｂ２）で使用されるアミノ基との結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）のための第２の求電子性炭素原子を提供する工程の二重の機能を実行し得る任意の試薬を意味する。通常、第２の求電子性炭素原子は、工程（ｂ）で第１の求電子性炭素原子から再生される。二機能性試薬は、多糖とアミノ化合物との間の−Ｃ（Ｏ）−結合を提供する。
【００６１】
本発明で使用される二機能性試薬には、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、カルボニルジ−１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）、カルボニルジ−１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＣＤＢ）、ジフェニルカルボネート、臭化シアン、ホスゲンまたはトリホスゲンが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、これらと同じ機能を実行し得る他の二機能性試薬を認識する。
【００６２】
好ましい二機能性試薬は、ＣＤＩである。ＣＤＩは、例えば、ホスゲンまたは臭化シアンに比べて緩やかな試薬であるという利点を有している。特に、ＣＤＩを使用した共役反応は、ＨＣｌまたはＨＢｒといったヒドロハロンゲン化ガスを産生しない。ＨＣｌまたはＨＢｒガスの大気への回避を避けるために、反応チャンバー排気口の洗浄が必要となる。このため、これらガスの産生は望ましくない。さらに、ＨＣｌまたはＨＢｒガスの産生は、糖の感受性官能基に影響し得、糖の分解または断片化による収量の損失を招く。
【００６３】
好ましくは、工程（ｂ１）で使用される有機溶媒は、非プロトン性の溶媒である。非プロトン性の溶媒は、当業者に周知であり、イオン性水素原子を含まない。ヒドロキシル基の求核性を増強することにより、糖のヒドロキシル基と二機能性試薬との反応を、促進することから、これらの溶媒は有利である。適切な非プロトン性の溶媒には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホラストリアミド（ＨＭＰＴ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、またはヘキサメチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。ＤＭＳＯが好ましい。
【００６４】
本発明のプロセスの工程（ｂ２）において、工程（ｂ１）の生成物は、修飾多糖を形成するためにアミノ化合物と反応させられる。本発明のプロセスにおいて使用されるアミノ化合物は、上で定義されたように式（Ｉ）のものである。好ましくは、式（Ｉ）において、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ１−６アルキルから独立して選択される。さらに好ましくは、Ｒ１およびＲ２は共にメチルである。
【００６５】
本発明で使用され得る適切なアミノ化合物は、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、Ｎ−エチルメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ−メチルプロピルアミン、Ｎ−エチルプロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、Ｎ−メチルブチルアミン、Ｎ−エチルブチルアミン、Ｎ−プロピルブチルアミン、Ｎ−メチルシクロペンチルアミン、Ｎ−エチルシクロペンチルアミン、シクロヘキシルアミン、Ｎ−メチルシクロヘキシルアミン、Ｎ−エチルヘキシルアミン、ベンジルアミン、Ｎ−エチルベンジルアミン、Ｎ−メチルベンジルアミン、イソブチルアミン、ｔｅｒｔ−ブチルアミン、シクロペンチルアミン、ジベンジルアミン、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン、イミダゾリジン、アゼチジン、アジリジン、アニリン、Ｎ−メチルアニリンおよびＮ−エチルアニリンである。これら化合物は、塩の形態（例えば、塩酸塩）で使用され得る。
【００６６】
好ましくは、本発明で使用されるアミノ化合物は、第２級アミンである。さらに好ましくは、アミンはジメチルアミンである。
【００６７】
本発明の好ましいプロセスは、以下のスキーム１で例示される：
【００６８】
【化９】
2010132925.tif 000006
【００６９】
このスキームにおいて、糖（例えば、ＭｅｎＡ多糖またはオリゴ糖）はまず、ＤＭＳＯ溶媒中でＣＤＩを使用して、単糖単位の少なくとも１つのヒドロキシル基を介して活性化される。結果として生じるイミダゾールカルバミン酸塩中間体は、修飾糖を得るために、アミンＲ１Ｒ２ＮＨ（例えば、ジメチルアミン）により捕捉される。
【００７０】
あるいは、修飾糖は、莢膜糖での１つ以上のヒドロキシル基を式ＸＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２の試薬と反応させることによって１工程のプロセスにおいて調製され得る。ここでＸは、脱離基であり、Ｒ１およびＲ２は上で定義されているものである。適切な脱離基には、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＦ３、−ＯＣ６Ｆ５または−ＣＣｌ３が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
あるいは、本発明の修飾莢膜糖は、例えば、適切な単糖単位からの合成方法によって調製され得る。代表的に、修飾莢膜糖の生合成は、適切な単糖単位との間のグリコシド結合（例えば、リン酸ジエステル結合）の形成し、次いで上で記載した任意の方法で生じた糖を修飾する工程を包含する。あるいは、同じ修飾莢膜糖を提供するために、単糖単位は、グリコシド結合の形成前に修飾され得る。
【００７２】
好ましくは、本発明の修飾莢膜糖は、オリゴ糖である。天然の莢膜多糖から出発して、修飾莢膜オリゴ糖は２つの方法のいずれかにより入手され得る（１）莢膜多糖の修飾とその後の、修飾オリゴ糖を形成するための、修飾多糖のサイズ処理；または（２）莢膜多糖のサイズ処理とその後の修飾オリゴ糖を形成するために生じたオリゴ糖の修飾。両方の方法は、本発明内に包含されている。しかし、末端ヒドロキシル基が、後の修飾オリゴ糖のキャリア分子（例えば、タンパク質）への結合に利用されることを確実にするので、最初の方法が好ましい。
【００７３】
本発明はまた、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖の修飾のためのプロセスを提供する。このプロセスは以下の工程を包含する：
（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖を提供する工程
（ｂ）前記多糖をサイズ処理して、オリゴ糖を提供する工程；および
（ｃ）上で定義したように、オリゴ糖の少なくとも１つのヒドロキシル基を保護基に変換する工程。このプロセスの工程（ｂ）は、必要に応じて公知の誘導体化の工程を工程（ｃ）の前に伴い得る。例えば、公知の誘導体化の工程は、生じた−ＮＨ２基および／またはデ−Ｏ−アセチル化の保護を伴う還元的アミノ化を包含する。
【００７４】
本発明はまた、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖の修飾のためのプロセスを提供する。このプロセスは以下の工程を包含する：
（ａ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖を提供する工程；
（ｂ）上で定義したように、多糖の少なくとも１つのヒドロキシル基を保護基に変換する工程；および
（ｃ）結果として生じる多糖をサイズ処理してオリゴ糖を提供する工程。このプロセスの工程（ｃ）は、必要に応じて公知の誘導化工程を伴い得る。例えば、公知の誘導体化の工程は、結果として生じた−ＮＨ２基および／またはデ−Ｏ−アセチル化の保護を伴う還元的アミノ化を包含する。
【００７５】
上で定義した任意のプロセスはその後に、混入物（例えば、低分子量混合物）を除去する工程が伴い得る。
【００７６】
（莢膜糖の出発物質）
本発明の修飾莢膜糖は、天然の莢膜糖から入手され得る。用語「天然の莢膜糖」は、細菌（グラム陽性とグラム陰性の両方）（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のカプセルにおいて見出され得る糖を含有するポリマー（例えば、糖のポリマー、糖酸、アミノ糖、多価アルコール、糖アルコール、および糖リン酸など）を指す。さらに、「天然の莢膜糖」は、多糖とオリゴ糖の両方を含む。天然の莢膜オリゴ糖は、天然の多糖のサイズ処理により入手され得る。
【００７７】
天然の莢膜糖の「ヒドロキシル基の位置」は、ヒドロキシル基を有する天然の莢膜糖での位置である。しかし、グリコシド結合における位置またはヒドロシ基を有するそれらの残基の位置を含めない（例えば、リン酸結合の一部であるヒドロキシル基はヒドロキシル基の位置を占めない）。また、末端単糖単位でのアノマーヒドロキシル基により占められている位置も含まない。天然の莢膜糖でのアセトキシ（ＡｃＯ）基が存在する位置もまた、ヒドロキシル基の位置ではない。
【００７８】
天然の莢膜糖は、リン酸ジエステル結合で連結した糖単位を含み得る。リン酸ジエステル結合を含む糖は、加水分解に対し不安定である。
【００７９】
好ましくは、天然の莢膜糖および本発明の修飾莢膜糖は、哺乳動物（例えば、ヒト）において免疫原性である。哺乳動物は成人または小児であり得る。
【００８０】
好ましくは、天然の莢膜糖は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹを含む）、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（血清型１、４、５、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆを含む）、およびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ型、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよび／またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の多糖（またはそれらのオリゴ糖フラグメント）である。
【００８１】
本発明はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの任意の血清型へ適用され得るが、血清型Ａ（「ＭｅｎＡ」）由来の莢膜糖を使用することが好ましい。ＭｅｎＡ莢膜糖は、水溶液において特に不安定である。この不安定性は、この分子において化学的な操作（例えば、キャリアタンパク質への結合）を実行するためには、特別な手順を使用する必要があることを意味する。しかし、本発明に従って修飾されたＭｅｎＡ糖は、水溶液において有利に安定であることが見出されている。
【００８２】
ＭｅｎＡ莢膜多糖｛→６）−Ｄ−ＭａｎｐＮＡｃ（３／４ＯＡｃ）−α−（１→ＯＰＯ３→｝は、以下に示す反復単位を有するα１−６リン酸ジエステル結合によって共に連結されているＮ−アセチルマンノースアミン残基からなる。
【００８３】
【化１０】
2010132925.tif 000007
【００８４】
上での記載と一致して、４位の９３％がヒドロキシル基の位置であり、３位の３０％がヒドロキシル基の位置である。末端１−ヒドロキシル基もまた、ヒドロキシル基を占めている。末端１−ヒドロキシル基は、末端アノマーヒドロキシル基である。−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−基の部分であるヒドロキシル基は、ヒドロキシル基の位置ではない。
【００８５】
（糖−タンパク質結合）
本発明の修飾糖は、糖に対して適用される任意の一般的な下流のプロセス（例えば、誘導体化、結合、断片化など）の対象であり得る。免疫原性を高めるために、本発明の修飾糖は、好ましくは、キャリアタンパク質に結合される。キャリアタンパク質への結合は、小児用のワクチン［７］に対して特に有用であり、周知の技術である［例えば、参考文献８〜１６などで総説されている］。
【００８６】
従って、本発明は、タンパク質と本発明の修飾糖の結合体を提供する。タンパク質は、糖に直接結合し得るか、または、リンカーが使用され得る。任意の適切なリンカー化学が使用され得る。修飾多糖の改善された安定化は、有意に広範囲な結合の使用を可能にする。
【００８７】
上で定義したように、修飾莢膜糖が後のキャリアタンパク質との結合のためのハンドルとして使用され得る少なくとも１つの遊離なヒドロキシル基またはアミノ基を有することが好ましい。
【００８８】
遊離なヒドロキシル基を選択的に有する修飾莢膜糖は、莢膜糖のヒドロキシル基をブロック化することにより、または、全てのヒドロキシル基がブロックされている修飾莢膜糖を選択的に非ブロック化することにより入手され得る。あるいは、遊離なヒドロキシル基は、修飾莢膜糖のサイズ処理によって明らかにされ得る。好ましくは、少なくとも１つの遊離なヒドロキシル基は、末端アノマーヒドロキシル基である。末端アノマーヒドロキシル基は、修飾莢膜糖をサイズ処理することにより明らかにされ得るので、末端アノマーヒドロキシル基は、遊離なヒドロキシル基として好ましい。
【００８９】
遊離のアミノ基を持つ修飾莢膜糖は、末端アノマーヒドロキシル基の還元性アミノ化によって入手され得る。必要に応じて、結果として生じる−ＮＨ２基の保護を伴う。還元性アミノ化反応は、本発明の修飾工程の前または後に行われ得る。生じた−ＮＨ２基は、ヒドロキシル基／保護基の存在下において選択的に保護／脱保護され得ることから、好ましくは、還元性アミノ化反応は、本発明の修飾工程の前に行われる。
【００９０】
タンパク質への直接的な結合は、例えば、参考文献２および参考文献４で記載されているように、タンパク質での還元性アミノ化を伴う多糖の酸化を含み得る。
【００９１】
リンカー基を介した結合は、例えば、参考文献３および参考文献５で記載されている手順のような任意の公知の手順を使用して作製される。好ましい結合の種類は、カルバミン酸結合形成のためのタンパク質との反応を伴うＣＤＩ［１７、１８］と修飾糖の遊離ヒドロキシル基の反応により形成され得るカルボニルリンカーである。別の好ましい結合の種類は、アジピン酸（例えばジイミド活性化を使用して）と修飾糖での遊離−ＮＨ２基との共役により形成され得、次いで、タンパク質が生じた糖−アジピン酸中間体と共役するアジピン酸リンカーである［１２、１９、２０］。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド［２１］、ニトロフェニル−エチルアミン［２２］、ハロアシルハライド［２３］、グリコシド結合［２４］、６−アミノカプロン酸［２５］、ＡＤＨ［２６］、Ｃ４からＣ１２部分［２７］などが挙げられる。
【００９２】
結合は、以下を含み得る：アノマー末端の第１級ヒドロキシル基への還元、必要に応じた第１級ヒドロキシル基の保護／脱保護；ＣＤＩカルバミン酸中間体の形成のための第１級ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応；およびＣＤＩカルバミン酸中間体とタンパク質のアミノ基との共役。
【００９３】
スキーム２は、本発明に従った莢膜糖のキャリアタンパク質への結合方法の２つの異なる例を示している。最初の例において、タンパク質は、末端ヒドロキシル基を介して結合されている。第２の例において、タンパク質は、末端アミノ基を介して結合している。
【００９４】
【化１１】
2010132925.tif 000008
【００９５】
好ましいキャリアタンパク質は、細菌毒素素または細菌トキソイド（例えば、ジフテリアトキソイドまたは破傷風トキソイド）である。これらは、一般に結合ワクチンで使用される。ＣＲＭ１９７ジフテリアトキソイドが特に好ましい［２８］。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ外膜タンパク質［２９］、合成ペプチド［３０、３１］、熱ショックタンパク質［３２、３３］、百日咳タンパク質［３４、３５］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のタンパク質Ｄ［３６］、サイトカイン［３７］、リンフォカイン［３７］、ホルモン［３７］、成長因子［３７］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ由来の毒素Ａまたは毒素Ｂ［３８］、鉄取り込みタンパク質［３９］などが挙げられる。キャリアタンパク質の混合を使用することも可能である。
【００９６】
結合の後、遊離な糖および結合した糖は、分離され得る。多くの適切な方法が存在する（例えば、疎水性クロマトグラフィー、接線限外濾過、ダイアフィルトレーションなど）（参考文献４０、４１なども参照）。
【００９７】
単一のキャリアタンパク質は、複数の異なる糖を保有し得る［４２］。
【００９８】
（薬学的組成物および方法）
本発明は、（ａ）本発明の修飾糖および／または本発明の結合体、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、を含む薬学的組成物を提供する。
【００９９】
結合体が存在する場合、組成物もまた遊離なキャリアタンパク質を含み得る［４３］。
【０１００】
「薬学的に受容可能なキャリア」は、組成物を受容する個体に対して、それ自身は有害な抗体の産生を誘導しない任意のキャリアを含む。適切なキャリアは、代表的に大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸重合体、アミノ酸コポリマー、トレハロース［４４］、脂質凝集体（例えば、油滴またはリポソーム）、および不活性化ウィルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。ワクチンはまた、希釈液（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）も含み得る。さらに、補助的な物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が存在し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の完全な考察は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓで利用可能である。
【０１０１】
代表的に、組成物は、液体溶液または懸濁液いずれかの注射可能な物質として調製される；溶液に適した固形、懸濁液に適した固形、注射前の液体ビヒクルもまた調製され得る。増強されたアジュバントの効果のために、調製物はまた、乳化され得るかまたは、リポソームに包まれ得る。一般的に、組成物の直接的な送達は、非経口的である（例えば、皮下への注射、腹腔内への注射、静脈内への注射、もしくは筋内への注射いずれかによって、または、組織の間質性空間への送達）。組成物はまた、損傷へ投与され得る。他の投与方法には、経口投与および肺への投与、直腸（坐薬）、さらには経皮的な（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用または経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）な適用［例えば、参考文献４５］、針、および皮下噴射器が挙げられる。投薬処置は、単回投与計画または複数回投与計画（例えば、ブースター投与を含む）であり得る。
【０１０２】
好ましくは、本発明の組成物は、滅菌され、緩衝化され、そして／または発熱物質を含まない。
【０１０３】
好ましくは、組成物は、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）である。糖または糖−タンパク質結合体に基づくワクチンは、当該分野で周知である。
【０１０４】
免疫原性組成物は、免疫学的に有効な量の糖抗原を含み、必要に応じて他の特定の成分も含む。「免疫学的に有効な量」は、処置または予防に有効な量の個体への投与を意味し、投与は、単回投与もしくは連続投与の一部としてのいずれかである。この量は、処置される個体の健康状態および体調、年齢、処置される個体の分類学的な群（例えば、ヒトでない霊長類、霊長類など）、合成抗体に対する個体の免疫系の能力、所望する防御の程度、ワクチンの処方、処置する医者の医学的な状況判断、ならびに他の関連する因子に依存して変化する。この量は、定期的な試行を経て決定され得る比較的広い範囲となることが期待される。投薬処置は、単回投与計画または、複数回投与計画（例えば、ブースター投与を含む）であり得る。ワクチンは、他の免疫調節性の薬剤と共に投与され得る。
【０１０５】
免疫原性の組成物は、アジュバントを含み得る。組成物の効果を増強する好ましいアジュバントには：（Ａ）アルミニウム化合物、例えば、水酸化アルミニウム（例えば、オキシヒドロキサイド）、リン酸化アルミニウム（例えば、ヒドロキシホスフェート、正リン酸塩）、硫酸アルミニウムなど［例えば、参考文献４６の第８章および第９章を参照］、または任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶質、無定形など）をとり、好ましくは吸着的な、異なるアルミニウム化合物の混合物；（Ｂ）ＭＦ５９（５％  Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％  Ｓｐａｎ８５、マイクロフリューダイザーを使用してミクロン以下の粒子に処方された）［参考文献４６の第１０章を参照、また参考文献４７を参照］；（Ｃ）リポソーム［参考文献４６の第１３章および第１４章を参照］；（Ｄ）さらなる界面活性剤を欠いてもよい［４８］ＩＳＣＯＭ［参考文献４６の第２３章を参照］；（Ｅ）１０％  Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．４％  Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含み、ミクロン以下の乳濁液にマイクロフリューダイズ化されているか、または、より大きな粒子サイズの乳濁液を作製するためにボルテックスされているかのいずれかであるＳＡＦ［参考文献４６第１２章を参照］；（Ｆ）２％  Ｓｑｕａｌｅｎｅ、０．２％  Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群からの１種以上の細菌細胞壁成分を含むＲｉｂｉＴＭアジュバントシステム（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）；（Ｇ）サポシンアジュバント（例えば、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとしても知られているＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）［参考文献４６第２２章を参照］；（Ｈ）キトサン（例えば４９）；（Ｉ）完全Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント（ＣＦＡ）および不完全Ｆｒｅｕｎｄのアジュバント（ＩＦＡ）；（Ｊ）サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えばインターフェロン−ａ）、マクロファージコロニー刺激因子、腫瘍壊死因子など）［参考文献４６の第２７章および第２８章を参照］；（Ｋ）生分解性および非毒性である物質（例えば、ポリ（ａ−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシブチル酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微粒子（すなわち、直径が約１００ｎｍ〜約１５０ｉｍの粒子、さらに好ましくは、直径が約２００ｎｍ〜約３０ｉｍ、さらに最も好ましくは、直径が約５００ｎｍ〜約１０ｉｍ）；（Ｌ）モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）または３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）［例えば、参考文献４６の第２１章を参照］；（Ｍ）３ｓＭＰＬと例えば、ＱＳ２１および／または水中油乳濁液の配合［５０］；（Ｎ）ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド［５１］、すなわち、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、必要に応じてシトシンおよび／またはＣＩモチーフの場所に５−メチルシトシンが使用される、；（Ｏ）ポリオキシ��チレンエーテルまたはポリオキシエチレンエステル［５２］；（Ｐ）オクトキシノールの組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤［５３］、または少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトオキシノール）と組み合わせたポリオキソエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤［５４］；（Ｑ）免疫賦活性のオリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）およびサポニン［５５］；（Ｒ）免疫賦活剤および金属塩の粒子［５６］；（Ｓ）サポニンおよび水中油（乳濁液［５７］；（Ｔ）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて＋ステロール）［５８］；（Ｕ）Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン（「ＬＴ」）、またはそれらの解毒変異体（例えば、Ｋ６３変異体またはＲ７２変異体）［例えば、参考文献５９の第５章を参照］；（Ｖ）コレラ毒素（「ＣＴ」）、またはそれらの解毒変異体［例えば、参考文献５９の第５章を参照］；および（Ｗ）モノホスホリル脂質Ａ模倣物（例えば、アミノアルキルグルコサミドリン酸誘導体（例えば、ＲＣ−５２９）［６０］）；（Ｘ）ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；（Ｙ）生物粘着剤［６１］（例えば、エステル化ヒアルロン酸微粒子［６２］、またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖、およびカルボキシメチルセルロースの誘導体から成る群から選択される粘膜付着剤；あるいは（Ｚ）組成物の効果を増強するために免疫賦活性な因子として機能する他の物質［参考文献４６の第７章を参照］。ミョウバン（特にリン酸アルミニウムおよび／または水酸化物）が好ましいアジュバントである。
【０１０６】
ムラミルペプチドには、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられる。
【０１０７】
一旦処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接的に投与され得る。処置される被験体は、動物であり得る；特にヒト被験体が処置され得る。ワクチンは、小児およびティーンエイジャーを予防接種するために特に有用である。
【０１０８】
本発明に従うワクチンは、予防的（すなわち感染を防止する）または処置的（すなわち、感染後の疾患を処置する）のいずれかであり得る。しかし、代表的には、予防的である。
【０１０９】
修飾糖と同様に、組成物は、さらなる抗原性成分を含み得る。例えば、組成物は、１つ以上のさらなる糖（本発明に従って修飾されているか修飾されていないかに関わらず）を含み得る。例えば、組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃ、血清型Ｗ１３５、および血清型Ｙ由来の糖（例えば、修飾ＭｅｎＡ糖に加えて）を含み得る。代表的に、これらはキャリアタンパク質に結合される。またＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの異なる血清型由来の糖が、同じまたは異なるキャリアタンパク質に結合され得る。混合物が、血清型Ａおよび血清型Ｃの両方由来の莢膜糖を含む場合、好ましくは、ＭｅｎＡ糖：ＭｅｎＣ糖の比（ｗ／ｗ）は１より大きい（例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１またはより高い）。ＭｅｎＡ成分の改善された免疫原性は、ＭｅｎＣ成分に対して過剰に存在（質量／投与）する場合に観察されている［６３］。
【０１１０】
組成物はまた、タンパク質抗原を含み得る。
【０１１１】
本発明の組成物に含まれ得る抗原には以下が挙げられる：
−Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ由来の抗原（例えば、ＣａｇＡ［６４〜６７］、ＶａｃＡ［６８、６９］、ＮＡＰ［７０、７１、７２］、ＨｏｐＸ［例えば、７３］、ＨｏｐＹ［例えば、７３］および／または尿素加水分解酵素、
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、参考文献７４〜８０に記載のもの、タンパク質「２８７」（以下を参照）および誘導体（例えば、「ＡＧ２８７」）が特に好ましい）
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃ由来の外膜小胞（ＯＭＶ）調製物（例えば、参考文献８１、８２、８３、８４などで開示されているもの）
−Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ｃ由来の糖抗原（例えば、参考文献８５で開示されている血清型Ｃ由来のオリゴ糖）（参考文献８６も参照）
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｏｎｉａｅ由来の糖抗原［参考文献８７、８８、８９］
−Ａ型肝炎ウィルス由来の抗原（例えば、不活性化ウィルス）［参考文献９０、９１］
−Ｂ型肝炎ウィルス由来の抗原（例えば、表面抗原および／またはコア抗原）［参考文献９１、９２］
−Ｃ型肝炎ウィルス由来の抗原［参考文献９３］
−Ｂｏｒｄｅｔａｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、百日咳ホロトキシン（ＰＴ）およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）、必要に応じてパータクチンおよび／または細胞凝集源２および３の組み合わせ［例えば、参考文献９４および９５］
−ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド）［例えば、参考文献９６の第３章］（例えば、ＣＲＭ１９７変異体［例えば、９７］）
−破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）［参考文献９６の第４章］
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅＢ由来の糖抗原［例えば、８６］
−Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ由来の抗原［例えば、７４、７５、７６］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原［例えば、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４］
−Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の抗原［例えば、１０５］
−Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１０６］
−ポリオ抗原［例えば、１０７、１０８］（例えば、ＩＰＶまたはＯＰＶ）
−狂犬病抗原［例えば、１０９］（例えば、凍結乾燥不活性化ウィルス［例えば、１１０、ＲａｂＡｖｅｒｔＴＭ］）
−はしか、おたふく風邪、および／または風疹抗原［例えば、参考文献９６の第９章、第１０章、および第１１章］
−インフルエンザ抗原［例えば、参考文献９６の第１９章］（例えば、赤血球
および／またはノイラミニダーゼ表面タンパク質）
−Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ由来の抗原［例えば、１１１］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、１１２、１１３］
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）由来の糖抗原
−Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）由来の抗原［例えば、１１３、１１４、１１５］
−Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来の抗原［例えば、１１６］
−Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ由来の抗原［例えば、１１７、１１８、１１９］
−フラビウィルス科（フラビウィルス属）におけるウィルス（例えば、黄熱病ウィルス、日本脳炎ウィルス、デング熱ウィルスの４つの血清型、ダニ媒介の脳炎ウィルス、ウェストナイルウィルス）由来の抗原
−ペスチウィルス抗原（例えば、古典的なブタ熱ウィルス由来、ウシウィルス性の下痢ウィルス由来、および／またはボーダー病ウィルス由来）
−パルボウィルス抗原（例えば、パラボウィルスＢ１９由来）
−プリオンタンパク質（例えば、ＣＪＤプリオンタンパク質）
−アミロイドタンパク質（例えば、βペプチド）［１２０］
−癌抗原（例えば、参考文献１２１の表１に列挙しているもの、または参考文献１２２の表３および表４に列挙しているもの）
組成物は、１つ以上のこれらのさらなる抗原を含み得る。
【０１１２】
毒性のタンパク質抗原は、必要な場合に解毒され得る（例えば、化学的方法および／または遺伝学的方法による百日咳毒素の解毒［９５］）。
【０１１３】
ジフテリア抗原が組成物に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原も含まれることが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原も含まれることが好ましい。
【０１１４】
好ましくは、抗原はアルミニウム塩に吸着される。
【０１１５】
代表的に、組成物での抗原は、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般的に、任意の所定の抗原の濃度は、抗原に対する免疫応答を誘発するために十分である。
【０１１６】
本発明の組成物においてタンパク質抗原の使用の代替えとして、抗原をコードする核酸が使用され得る［例えば、参考文献１２３〜１３１］。従って、本発明の組成物のタンパク質成分は、タンパク質をコードする核酸によって置き換えられ得る（好ましくは、例えば、プラスミドの形態のＤＮＡ）。
【０１１７】
本発明はまた、哺乳動物において抗体応答を惹起するための方法を提供する。この方法は、哺乳動物への本発明の薬学的組成物の投与を包含する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。ヒトは成人であり得るが、好ましくは小児である。好ましくは、抗体応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａによる感染に対して保護的である。
【０１１８】
本発明はまた、哺乳動物を免疫するための方法を提供する。この方法は、哺乳動物への本発明の薬学的組成物の投与を包含する。
【０１１９】
本発明はまた、医薬として使用するための本発明の修飾糖、または本発明の結合体を提供する。
【０１２０】
本発明はまた、莢膜細菌により引き起こされる疾患の予防または処置のための医薬製造における、本発明の修飾糖の使用、または本発明の結合体の使用を提供する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａにより引き起こされる疾患には、髄膜炎、敗血病、および淋病が挙げられる。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅにより引き起こされる疾患には、中耳炎、気管支炎、肺炎、蜂巣炎、心膜炎、および髄膜炎が挙げられる。肺炎球菌により引き起こされる疾患には、髄膜炎、敗血症、および肺炎が挙げられる。従って、細菌髄膜炎の予防および／または処置が好ましい。
【０１２１】
（定義）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」との両方を意味する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘ単独から成り得るし、または何かさらなるものを含み得る（例えばＸ＋Ｙ）。
【０１２２】
数値ｘに関しての用語「約」は、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１２３】
糖環は開環型および閉環型で存在し得ると理解される。閉環型は、本明細書中での構造式において示されている。開環型もまた本発明によって包含されている。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、３７℃、４９℃、および５７℃でインキュベーションした後のＭｅｎＡサンプルのａｖＤＰを時間（ｈ）の関数としてプロットしたものを示す。
【図２】図２は、３７℃、４９℃、および５７℃でインキュベーションした後のＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡサンプルのａｖＤＰを時間（ｈ）の関数としてプロットしたものを示す。
【図３】図３は、５７℃で０時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間インキュベーションしたＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡサンプルの３１Ｐ  ＮＭＲ  ２４２．９  ＭＨｚスペクトルの積層プロットを示す。いくつかのシグナル表示が示されている。
【図４】図４は、比色分析の比較をするためのａｖＤＰ  ｖｓ．時間の図および３１ＰＮＭＲの分析方法を示す。
【図５】図５は、長時間２℃〜８℃にあった天然のＭｅｎＡ糖および修飾ＭｅｎＡ糖のａｖＤＰを示す。
【図６】図６は、２９８ＫでのＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡの標識された１Ｈ  ＮＭＲ  ６００  ＭＨｚスペクトルを示す。いくつかの設定が示されている。
【図７】図７は、ＭｅｎＡ、ＭｅｎＡ−ＣＤＩおよびＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡオリゴ糖をコーティング剤として使用して実施した競合的ＥＬＩＳＡテストの結果を示す。競合剤の濃度は、１００〜１０−７ｍｇ／ｍｌの範囲である。
【図８】図８は、ＭｅｎＡオリゴ糖の結合のための反応のスキームを図示する。
【図９】図９は、活性化修飾ＭｅｎＡの２５℃における６００  ＭＨｚ  １Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。いくつかのシグナル表示が示されている。
【図１０Ａ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、活性化ＭｅｎＡの２５℃でのヘテロ相関１Ｈ、１３ＣＮＭＲスペクトルを示す。図１０Ａと図１０Ｂとの両方において、Ｘ軸は、おおよそ左は５．７ｐｐｍから右は１．８ｐｐｍまでと走っている。図１０Ａにおいて、Ｙ軸は、おおよそ上は１４５ｐｐｍから下は１８５ｐｐｍまで走る；図１０ＢにおいてＹ軸は、おおよそ上は５ｐｐｍから下は１０５ｐｐｍまで走っている。
【図１０Ｂ】図１０Ａおよび図１０Ｂは、活性化ＭｅｎＡの２５℃でのヘテロ相関１Ｈ、１３ＣＮＭＲスペクトルを示す。図１０Ａと図１０Ｂとの両方において、Ｘ軸は、おおよそ左は５．７ｐｐｍから右は１．８ｐｐｍまでと走っている。図１０Ａにおいて、Ｙ軸は、おおよそ上は１４５ｐｐｍから下は１８５ｐｐｍまで走る；図１０ＢにおいてＹ軸は、おおよそ上は５ｐｐｍから下は１０５ｐｐｍまで走っている。
【図１１】図１１は、活性化修飾ＭｅｎＡ  ＤＰ４および活性化した天然なＭｅｎＡ  ＤＰ４（ＣＤＩおよびＤＭＡによる化学的修飾を有さない）の重ね合わせた１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１２】図１２は、活性化修飾ＭｅｎＡの２５℃における２４３  ＭＨｚ  ３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１３】図１３および図１４は、４週間にわたって３７℃で置いた結合体の加水分解に起因する遊離な糖の出現を示す。修飾糖は、四角として示され、天然な糖は、中抜きの三角で示される。
【図１４】図１３および図１４は、４週間にわたって３７℃で置いた結合体の加水分解に起因する遊離な糖の出現を示す。修飾糖は、四角として示され、天然な糖は、中抜きの三角で示される。
【図１５】図１５は、４週間の間、種々のｐＨで３７℃で置いた結合体の加水分解に起因する遊離な糖の出現を示す。それぞれの対の左カラムは天然の糖を示す。
【図１６】図１６は、ロット３、ロット５、およびロット００２０１１結合体（左から右）により誘導された抗−ＭｅｎＡ−ｐＳ  ＩｇＧの力価を示す。バーは、９５％の信頼限界を示す。
【図１７】図１７は、ＭｅｎＡの修飾結合体およびＭｅｎＡの非修飾結合体（ロット３、５、および００２０１１）での免疫化からのプール血清のＩｇＧのサブクラスの分析を示す。値は、ＯＤ４０５ｎｍに１０００をかけた値である。
【図１８】図１８は、競合剤としてＭｅｎＡ  ｐＳを使用した競合的ＥＬＩＳＡの結果を示す。Ｙ軸は、ＯＤ４０５ｎｍ値に１０００をかけた値を示す。Ｘ軸は、血清希釈の逆数を示す。非修飾ＭｅｎＡオリゴ糖は、丸で示されている；修飾糖は四角（ロット３）および三角（ロット５）で示されている。中抜きのシンボルは、競合剤である多糖無しでのデータを示している；塗り潰したシンボルは、競合剤である多糖の存在下でのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
（発明を実施する形態）
（ＭｅｎＡオリゴ糖の修飾）
莢膜多糖はＭｅｎＡから精製され、ＭｅｎＡオリゴ糖を得るために加水分解された。多糖（２ｇ）が、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７５）中、１０ｍｇ／ｍＬの多糖濃度で５０℃、約４時間で加水分解された［８６］。加水分解の後、溶液はロータリーエバポレーションによって乾燥された。
【０１２６】
オリゴ糖は、スキーム１で示された反応スキームを使用して活性化された。オリゴ糖は、１０ｍｇ／ｍＬの糖濃度になるようＤＭＳＯ中に溶解された。１：２０のオリゴ糖：ＣＤＩのモル比に従って、２１．２６２ｇのＣＤＩ（ＳｉｇｍａＴＭ）を次いで加え、反応混合物を、室温で１６時間攪拌した。生じたＭｅｎＡ−ＣＤＩ化合物は、８０：２０（ｖ／ｖ）アセトン：ＤＭＳＯ混合物における選択的な沈殿、その後の遠心分離により精製された。活性化反応の効率は、遊離イミダゾールと結合イミダゾールの比を決定することにより、約６７．９％と算出された。
【０１２７】
第２の反応工程において、ＭｅｎＡ−ＣＤＩオリゴ糖は、約１０ｍｇ／ｍＬの糖濃度でＤＭＳＯ中に可溶化された。１：１００のＭｅｎＡ−ＣＤＩ単位：ＤＭＡのモル比に従って、３６．２８８ｇの９９％ジメチルアミン塩酸塩（ＳｉｇｍａＴＭ）を加え、反応混合物を、室温で１６時間攪拌した。反応生成物を凍結乾燥し、１０ｍｇ／ｍＬ水溶液に再び溶解した。
【０１２８】
オリゴ糖調製由来の低分子量反応試薬（特に、ジメチルアミン（ＤＭＡ））を除くため、透析の工程は３．５ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標））を通して実施された。４つの透析の工程が実施された：（ｉ）１６時間ｖｓ．２Ｌの１Ｍ塩化ナトリウム（透析因子１：２０）、（ｉｉ）１６時間ｖｓ．２Ｌの０．５Ｍ塩化ナトリウム（透析因子１：２０）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）１６時間ｖｓ．２ＬのＷＦＩ（透析因子１：２０）。精製を改善するために、透析の工程はまた、１ｋＤａ  ＭＷＣＯ膜（ＣｅｎｔｒｉｃｏｎＴＭ）を通しても実施された。
【０１２９】
精製されたＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡ生成物は、２５ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（ＦｌｕｋａＴＭ）中ｐＨ６．５で緩衝化された。
【０１３０】
ＭｅｎＡおよびＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡ生成物の安定性は、平均の重合の度合い（ａｖＤＰ）を決定するための比色分析方法およびＮＭＲ方法を使用して評価された。サンプルは、２５ｍＭ  Ｈｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）中、ガラスバイアル中で３つの温度（３７℃、４９℃、または５７℃）のうちの１つで９６時間インキュベートされた。そして、インキュベーション期間の終わりで、サンプルは４℃で保存された。
【０１３１】
（比色分析安定性研究）
化学的ａｖＤＰは、［Ｐｔ］／［Ｐｍｅ］の比によって表わされる。ここで、［Ｐｔ］は、全てのリン濃度であり、［Ｐｍｅ］は、全末端モノエステルリン酸の濃度である。［Ｐｔ］は、参考文献１３２で記載されているように、比色分析で決定された。［Ｐｍｅ］は、ポテト酸脱リン酸酵素［１３３］での酵素反応により放出される無機リン酸Ｐｉの測定により決定される。
【０１３２】
図１および図２は、ＭｅｎＡおよびＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡのａｖＤＰＳを時間（ｔ）の関数として示す。
【０１３３】
糖加水分解の速度定数（ｋ）（ａｖＤＰの低下として図１および図２で見られる）は、参考文献１３４で記載されているように分析された。２つの異なる局面が分析された：
−標準的な動態方程式におけるａｖＤＰおよびｔの関数としてのｋ；次いで
−Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ等式における頻度因子（Ａ）活性化エネルギー（ΔＧａ）および温度（Ｔ）の関数としてのｋ。
【０１３４】
加水分解は、良好な一次の速度式で、完全に進行したと想定した。
【０１３５】
【数１】
2010132925.tif 000009
【０１３６】
ここで、ｔ＝０でａｖＤＰ０＝ａｖＤＰ
対数的な形式は：
ｌｎａｖＤＰ＝ｌｎａｖＤＰ０−ｋｔ
であり、ｋは、ｌｎａｖＤＰ＝ｆ（ｔ）プロットの傾きとして定義される。
【０１３７】
Ａｒｈｅｎｉｕｓ等式は、種々の温度値での速度定数と加水分解反応についての活性化エネルギーとの間の相関を示す：
ｋ＝Ａｅｘｐ（−△Ｇａ／ＲＴ）
ｌｎｋ＝ｌｎＡ−△Ｇａ／ＲＴ
ここでＲ＝８．３１４×１０−３ＫＪ／ｍｏｌ  Ｋ
ΔＧａは、温度の逆数（１／Ｔ）の関数であるｌｎｋをプロットすることにより得られる直線の傾きから算出される。本研究において、本発明者らは、活性化エンタルピーおよび活性化エントロピーからの単一寄与の分離をせずに、加水分解反応の全ての活性化エネルギーだけを分析した（ΔＧａ＝ΔＨａ＋ＴΔＳａ）。
【０１３８】
表１は、比色分析のａｖＤＰのデータおよび種々の温度での加水分解反応の速度定数をまとめる：
【０１３９】
【表１】
2010132925.tif 000010
【０１４０】
３７℃、４９℃および５７℃で得られた速度定数のＡｒｒｈｅｎｉｕｓプロットは、２５ｍＭ  Ｈｉｓ緩衝液（ｐＨ６．５）における加水分解反応の活性化エネルギーは、ＭｅｎＡに対しては５０．１ＫＪ／ｍｏｌ（１２．０Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、そしてＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡに対しては９４．９ＫＪ／ｍｏｌ（２２．７Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であることを示す。Ａｒｒｈｅｎｉｕｓプロットの直線最小二乗回帰により概算される標準誤差は、ΔＧａ値に対して±５．０ＫＪ／ｍｏｌ（±１．２Ｋｃａｌ／ｍｏｌ）である。従って、本発明の修飾多糖は、対応する非修飾糖の約２倍安定である。
【０１４１】
（ＮＭＲ安定性研究）
比色分析方法により得たａｖＤＰを検証するために、３１Ｐ  ＮＭＲ分析実験が実施された。ａｖＤＰデータは、ＰｍｅシグナルとＰｉｎ  ｃｈａｉｎシグナルとの間の集積比により算出される（図３を参照）。
【０１４２】
１Ｈおよび３１Ｐ  ＮＭＲサンプルは、１０〜１５ｍＭ濃度の溶液を得るため、０．７５ｍｌの９９．９％Ｄ２Ｏ（ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ）中で、凍結乾燥されたオリゴ糖を溶解することで調製された。すべての実験において、５ｍｍ  ＷｉｌｍａｄＴＭ  ＮＭＲチューブが使用された。ＮＭＲスペクトルは、２９８Ｋで、ＢＧＵ単位を備えるＢｒｕｋｅｒＴＭ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＲＸ  ６００ＭＨｚで記録された。自己遮蔽されたｚ−勾配を有する５ｍｍ  ＴＢＩ三重共鳴プローブが使用された。データ処理のために、Ｂｒｕｋｅｒ  ＸＷＩＮＮＭＲ３．０ソフトウェアが使用された。１Ｈ標準スペクトル獲得条件は、４回の走査、６００Ｈｚのスペクトルウィンドウ上で３２ｋのデータポイントを収集することである。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、０．１Ｈｚ線広がり関数（ｌｉｎｅ  ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）に適用された後、Ｆｏｕｒｉｅｒ変換され、１．９１ｐｐｍでの酢酸陰イオン共鳴または、１重水素化水の４．７２ｐｐｍでの共鳴に関して参照された。３１Ｐ標準スペクトル獲得条件は、１２８回の走査、３０００Ｈｚのスペクトルウィンドウ上で３２ｋのデータポイントを収集することである。２．０Ｈｚ線広がり関数（ｌｉｎｅ  ｂｒｏａｄｅｎｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎ）が使用された。
【０１４３】
図４で示すように、比色分析方法および３１Ｐ  ＮＭＲ方法は、わずかな低下変換のみが明らかだが、全ての温度の値に対して一致している（ｌｎ  ａｖＤＰ＝ｆ（ｔ）の影響なし）。
【０１４４】
比色分析方法分析および３１Ｐ  ＮＭＲ方法分析の結果は、表２で要約されている：
【０１４５】
【表２】
2010132925.tif 000011
【０１４６】
Ｐｍｅスペクトルの形による分析を改善することによって、２つの異なる分子種が現れることが観察される（図３参照）。低い速度定数の速さは、上昇フィールドシグナルについて明らかである。
【０１４７】
低い温度（例えば、代表的な保管温度である２〜８℃）で得られたデータの外挿によって、これらデータの時間尺度を２年、外挿することが可能である（図５を参照）。
【０１４８】
これら検査によって、得たＭｅｎＡおよびＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡの安定化における結果の比較により、修飾生成物の安定性の有意な上昇が観察される。より長い時間尺度への外挿は２年間のその生成物の分布を許容するよう、ＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡの分解が、有意に減少したことを示す。
【０１４９】
（構造的特徴）
図６は、２９８ＫでのＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡサンプルの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、指示的なシグナル割り当て（ｉｎｄｉｃａｔｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌ  ａｓｓｉｇｎｍｌｎｔ５）と共に示している。ＮＭＲプロファイルは、ＭｅｎＡオリゴ糖とＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡオリゴ糖との間の高度な類似性を示す。遊離なＤＭＡの１Ｈ−メチルＤＮＡシグナルが、２．６ｐｐｍ〜３ｐｐｍスペクトル領域において観察される。２．７３ｐｐｍのピークは、溶液での残留試薬としての遊離なＤＭＡの１Ｈ−メチルに対応する。２．９１ｐｐｍのピークは、オリゴ糖鎖への１Ｈ−メチルＤＭＡ結合として、暫定的に割り当てられる。
【０１５０】
３１Ｐ  ＮＭＲプロファイルは、ＭｅｎＡオリゴ糖と類似している。Ｐｍｅシグナルの短い低磁場シフト変動だけが観察される（図３を参照）。
【０１５１】
従って、本発明の修飾糖は、対応する天然の多糖に構造的に類似している。この類似性は、抗原性および免疫性が影響されていないことを示す。
【０１５２】
（競合的ＥＬＩＳＡアッセイ）
競合的ＥＬＩＳＡアッセイが、ＭｅｎＡオリゴ糖、ＭｅｎＡ−ＣＤＩオリゴ糖、およびＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡオリゴ糖を、特定の抗体を置換するその能力と共に相関するよう使用された。競合剤の濃度（ｍｇ／ｍＬ）の関数としての阻害％のプロットが、図７に示されている。すべてのサンプルは、１０−１ｍｇ／ｍＬの競合剤濃度で約１００％の阻害に到達するという、類似した挙動を示した。
【０１５３】
この結果は、本発明を使用する糖の修飾が、抗原性の損失を生じないことを確証している。
【０１５４】
（結合）
修飾ＭｅｎＡ糖（ＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡ）は、図８に要約されているプロセスによりＣＲＭ１９７タンパク質に結合される。結合のプロセスにおける標準的な工程は：
−オリゴ糖フラグメントを得るための、ＭｅｎＡ多糖の加水分解の工程
−オリゴ糖フラグメントのサイズ処理の工程
−サイズ処理されたオリゴ糖での末端アルデヒド基の還元アミノ化工程
−ＣＤＩ反応の前の、Ｆｍｏｃ基による末端−ＮＨ２基の保護工程
−ＤＭＡ反応中の−ＮＨ２基の内因性の脱保護工程
−ＳＩＤＥＡ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸アジピン酸）による末端−ＮＨ２基の活性化工程
−ＣＲＭ１９７タンパク質への共有的な付着工程
である。
【０１５５】
（ａ）加水分解）
ＭｅｎＡ多糖は５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．７５）中、７３℃で、約３時間で加水分解した。総有機リンとモノエステルリン酸との間の比（ｗ／ｗ）によって決定される平均的な重合度合い（ＤＰ）（約１５）のオリゴ糖を得るために、加水分解を調節した。
【０１５６】
（ｂ）サイズ処理）
この工程は、加水分解プロセスの間に生じるオリゴ糖の定義された集団を選択する。上で得られた加水分解生成物を、保持液部分での長い長さの鎖を除くために、３０ｋＤａのカットオフ膜を通した限外濾過（５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）のダイアフィルトレーションの１２倍容積）した。
【０１５７】
（ｃ）還元末端での第１級アミノ基の導入）
酢酸アンモニウムを、サイズ処理されたオリゴ糖溶液に、最終濃度が３００ｇ／Ｌとなるよう加えた。それから、シアンホウ化水素を最終濃度７３ｇ／Ｌまで加えた。ｐＨを６．５±０．２に調節した後、混合物を、３７℃で５日間、インキュベートした。
【０１５８】
次いで、アミノ−オリゴ糖を、０．５Ｍ  ＮａＣｌの１３倍容積を使用して３ｋＤａのカットオフ膜を通した限外ろ過により精製した。この工程は、短い長さの糖鎖（ＤＰ＜６〜７）を除去し、約１５の最終的な平均重合度合いがを与える。
【０１５９】
保持液部分を、４倍容積の１０ｍＭ  ＴＡＢ（テトラブチル臭化アンモニウム）でダイアフィルトレーションし、次いで、Ｎａ＋をＴＡＢ＋と交換するために、７倍容積の水でダイアフィルトレーションした。正の有機イオンは、ＤＭＳＯ（次の誘導体化の工程に必要）における糖の安定性を約１０ｇ／Ｌへと改善する。
【０１６０】
精製されたオリゴ糖を、水を除去するためにロータリーエバポレーターにより乾燥し、次いで、約１０ｇ／Ｌの濃度でＤＭＳＯ溶媒に溶解した。
【０１６１】
精製されたアミノ−オリゴ糖溶液を、Ｃｈｅｎ［１３２］の手順によりリン含有量に対して分析し、Ｈａｂｂｅｂ［１３５］の手順により導入されたアミノ基の量を分析した。
【０１６２】
短い鎖の糖の除去のための限外ろ過の代替方法として、Ｑセファロース高速カラムが使用された。しかし、その結果ＳＰ−セファロース（ＰｈａｒｍａｃｉａＴＭ）カラムへのさらなる交換のプロセスが、Ｎａ＋／ＴＡＢ＋変換に影響するために必要となる。
【０１６３】
（ｄ）Ｆｍｏｃ試薬での末端アミノ基の保護）
アミノ−オリゴ糖を、モル比−ＮＨ２：Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ＝１：２０に従って、Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ（Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ（Ｓｉｇｍａ））と反応させた。混合物を、室温で攪拌しながら一晩インキュベートし、アセトン（８０％ｖ／ｖ最終濃度）で沈殿させた。沈殿物を、遠心により収集し、未反応のＦｍｏｃ−ＯＳｕ試薬を除去するために、アセトンで数回洗浄した。
【０１６４】
（ｅ）ＣＤＩおよびＤＭＡ試薬での安定化反応）
保護されたアミノ−オリゴ糖を、ＤＭＳＯ中１０ｇ／Ｌで溶解し、ＣＤＩ：総リンのモル比が２０：１となるようＣＤＩに加えた。混合物を、室温で攪拌しながら一晩インキュベートし、アセトン（８０％ｖ／ｖ最終濃度）で沈殿させた。沈殿物を、遠心により収集し、未反応のＣＤＩ試薬を除去するために、アセトンで数回洗浄した。
【０１６５】
得られた生成物を、ＤＭＳＯ中１０ｇ／Ｌで溶解し、ＤＭＡ：総リンのモル比が２０：１であることに従って、エタノール中のＤＭＡの溶液（約５．６Ｍ）に加えた。混合物を、室温で攪拌しながら一晩インキュベートし、アセトン（８０％ｖ／ｖ最終濃度）で沈殿させた。沈殿物を、遠心により収集し、未反応のＤＭＡ試薬を除去するために、アセトンで数回洗浄した。
【０１６６】
次いで、精製されたオリゴ糖を、微量の有機溶媒を除去するために真空下で乾燥させた。
【０１６７】
（ｆ）クロマトグラフィーのイオン交換）
乾燥したオリゴ糖を、水中に１０ｇ／Ｌで溶解し、ＴＡＢ＋／Ｎａ＋変換を実施するために、１Ｍ  ＮａＣｌで平衡化されたＳＰ−セファロース高速（ＰｈａｒｍａｃｉａＴＭ）カラムに充填した。次いで、カラムを、樹脂に吸着した微量の生成物を回復するために、５倍のカラム容積（ＣＶ）の水で洗浄した。次いで、オリゴ糖を、ロータリーエバポレーターで乾燥し、水を除去した。
【０１６８】
（ｇ）活性化エステルの誘導体化）
乾燥した生成物を、水中に４０ｍＭアミノ基濃度で溶解し、次いで、９倍のＤＭＳＯを加えた。その後、ＴＥＡ（トリエチルアミン）を最終濃度２００ｍＭで加えた。生じた溶液に、最終濃度４８０ｍＭで、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシコハク酸ジエステル（ＳＩＤＥＡ）を加えた。
【０１６９】
室温で２時間攪拌しながら、反応を維持した。次いで、活性化オリゴ糖を、アセトン（最終濃度８０％ｖ／ｖ）で沈殿させた。沈殿物を、遠心により収集し、未反応のＳＩＤＥＡを除去するために、アセトンで数回洗浄した。
【０１７０】
次いで、精製されたオリゴ糖を、溶媒を除去するために真空下で乾燥させた。
【０１７１】
オリゴ糖構造へ導入された活性化エステル基の量を、参考文献１３６で記載されているように、比色分析方法により決定した。
【０１７２】
活性化オリゴ糖を、上記したように１Ｈ  ＮＭＲにより分析し、化学的修飾を確証した。以前の実験で確立されたプロトンＮＭＲプロファイルを、生成物の幾つかのロットを評価するために使用した。糖のシグナルは、１Ｄ（図９）および２Ｄヘテロ−相関（１Ｈ、１３Ｃ；図１０Ａおよび図１０Ｂ）ＮＭＲスペクトルの検査により割り当て、修飾ＭｅｎＡの特徴であると示した。
【０１７３】
約５ｍｇのそれぞれのサンプルを７５０μＬのＤ２Ｏに溶解し、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ６００  ＭＨｚスペクトロメーターでスペクトルを記録した。
【０１７４】
ＣＨ３ＤＭＡ基とＨ１糖環の比の検査は、７０％〜７５％の間の安定化した反応収量を提供する。
【０１７５】
修飾糖のプロトンプロファイルは維持されており、Ｏ−アセチルの状態および高次構造に関する実質的な修飾は、ＮＭＲ分析からは明らかではない。しかし、カルバミン酸基は、局所的な磁場を変化させる。従って、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルの割り当ては、複雑である。
【０１７６】
図１１において、修飾ＭｅｎＡオリゴ糖および天然のＭｅｎＡオリゴ糖の、上書きスペクトルが示されている。Ｃ３およびＣ４環の位置でのカルバミン酸基は、他の核（例えば、Ｈ１）よりも近いために、Ｈ３、Ｈ４およびＨ２シグナルの低磁場シフト変動が、明らかである。他の変動は、スペクトルから示唆されるが、それらの割り当ては完全に確かではない。
【０１７７】
図１２は、化学的誘導体化が、３１Ｐ  ＮＭＲスペクトルでのいかなる変化も引き起こさないことを示している。
【０１７８】
（ｈ）ＣＲＭ１９７への結合）
乾燥した活性化オリゴ糖を、１２：１のエステル基：タンパク質のモル比に従って、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の４５ｍｇ／ｍＬのＣＲＭ１９７溶液に加えた。室温で一晩、攪拌しながら、反応を維持した。次いで、得られた結合体を、５０倍容積の１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を使用した３０ｋＤａのカットオフ膜を通した限外ろ過により精製した。生成物を無菌ろ過し、ワクチンの処方まで−２０℃で保存した。
【０１７９】
精製された結合体を、タンパク質の含有量（マイクロＢＣＡ  タンパク質アッセイ）、糖の含有量（比色分析的なリンの決定）、遊離な糖の含有量（クロマトグラフィー分析）、ＨＰＬＣプロファイル（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ４０００ＳＷＸＬ  ７．５ｍｍ  ＩＤｘ３０ｃｍ上で）、ＮＭＲプロファイルおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥについて分析した。
【０１８０】
（結合体の時間依存的な安定性）
ＭｅｎＡ−ＣＤＩ−ＤＭＡオリゴ糖のＣＲＭ１９７結合体の安定性は、３７℃で４週間保存している間の加水分解による溶液での遊離な糖の出現をモニタリングし、非修飾ＭｅｎＡオリゴ糖のＣＲＭ結合体と比較して評価した。
【０１８１】
遊離な（すなわち非結合体化）糖は、非結合体化鎖を単離するためのＩＳＯＬＵＴＥＴＭ  Ｃ４カートリッジカラム（ＩＳＴＴＭ）での逆相クロマトグラフィー、を使用し、次いでＨＰＡＥ−ＰＡＤクロマトグラフィーで浸透した糖により決定した。
【０１８２】
糖の総量（すなわち結合体化および非結合体化の両方）は、Ｎ−アセチルマンノースアミンホスフェートの定量的分析のための方法により決定する。この方法は、パルス電流測定器を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）を使用する［１３７］。
【０１８３】
非結合体化糖の、糖の総量への比はパーセンテージ（％ＦＳ）で表現されている。
【０１８４】
第１の実験において、％ＦＳは以下（図１３）のように生じ：
【０１８５】
【表３】
2010132925.tif 000012
【０１８６】
第２の実験において、結果は以下（図１４）のようであった：
【０１８７】
【表４】
2010132925.tif 000013
【０１８８】
修飾ＭｅｎＡオリゴ糖の結合体は、対応する天然の結合体よりも、高い温度で、加水分解に対して明らかに抵抗性である。例えば、３７℃で２８日後、放出された糖のパーゼンテージは、修飾オリゴ糖では、６．４％であり、対して天然な糖では２３．５％である。
【０１８９】
修飾ＭｅｎＡ糖を使用したロットからロットの一貫性の試験のためのさらなる研究において、３７℃で８週間、結合体からの遊離な糖の出現をモニタリングした。これらの３つのロットの結果は以下の通りであった：
【０１９０】
【表５】
2010132925.tif 000014
【０１９１】
従って、修飾結合体は、延長された期間にわたって安定である。通常以上の温度においても、１２％未満の遊離な糖のレベルは、許容限界内である。
【０１９２】
（結合体のｐＨ依存的な安定性）
修飾ＭｅｎＡオリゴ糖の結合体および非修飾ＭｅｎＡオリゴ糖の結合体の安定性を、３７℃で２８日間保存した後、ｐＨ６．０〜８．０の間の異なるｐＨでの遊離な糖の出現をモニタリングすることにより試験した。修飾（ロット５）オリゴ糖および非修飾（ロットＲＳ０４０１０１）オリゴ糖を比較した。また、０〜２８日の間での遊離な糖（Ａ％ＦＳ）の上昇は以下（図１５）の様である：
【０１９３】
【表６】
2010132925.tif 000015
【０１９４】
従って、ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５の間で修飾ＭｅｎＡ結合体は、天然のＭｅｎＡオリゴ糖の結合体よりも、かなり低い加水分解反応速度を示す。カルバミン酸安定化基が除去されるｐＨ８．０では、その効果はそれほど顕著ではない。
【０１９５】
（修飾結合体の免疫原性）
精製された修飾ＭｅｎＡオリゴ糖のＣＲＭ１９７結合体を、修飾が、糖の免疫原性を除去しないことを立証するために、マウスを免疫するよう使用した。
【０１９６】
０．５ｍｌ容積における１０μｇの糖の単一ヒト投与量（ＳＨＤ）を与えるように、ワクチンを処方した。２種類の処方物が作製された：液体処方物および凍結処方物。両方が、最終的な投薬形態において０．６ｍｇＡｌ３＋／ｍｌでリン酸アルミニウムアジュバントを含む。アジュバントの水性懸濁液を、凍結処方物を再構成するために使用した。
【０１９７】
修飾オリゴ糖結合体の溶液処方物を、天然の（すなわち、非修飾の）オリゴ糖結合体の凍結処方物と比較した。
【０１９８】
マウスをＳＨＤの１／５で免疫した。それぞれの免疫の前にワクチンを生理食塩水で希釈した。免疫化群あたり１０匹のＢａｌｂ／ｃマウス（メス、６〜８週齢）に、時間０、次いで４週間後に０．５ｍｌのワクチンを皮下注射した。第１の免疫の前および６週間目（前および後−ＩＩ血清）に血液を採取し、血清を−７０℃で保存した。
【０１９９】
（抗多糖力価）
いくつかの小さい変化を伴った動物血清分析に適応させたＭｅｎＡヒト血清分析［１３８］のためのＣＤＣ手順に従って、特定の抗ＭｅｎＡ多糖総ＩｇＧ抗体を、免疫された動物の血清において測定した。
【０２００】
それぞれ個々のマウス血清を、滴定曲線により二連で分析した。免疫化群についてＧＭＴを算出した。抗ＭｅｎＡ多糖力価は、ＭＥＵの計算のために使用されるＲｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｌｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄに基づいたソフトウェアを装備するＭｏｕｓｅ  Ｅｌｉｓａ  Ｕｎｉｔｓ（ＭＥＵ）で表現した。
【０２０１】
ＩｇＧのサブクラス分析を、アルカリホスファターゼ抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂまたはＩｇＧ３（Ｚｙｍｅｄ）をＥＬＩＳＡの手順における第２の結合体として使用して、プールした免疫化群の後−ＩＩ血清で実施した。力価は、基質発色の３０分後のプールされた後−ＩＩ血清の１：３２００希釈で得られるＯＤ４０５ｎｍとして表現した。
【０２０２】
図１６は、ＭｅｎＡ修飾結合体の２つのロット（ロット３および５）により誘導され、リン酸アルミニウムアジュバントを使用した非修飾ＭｅｎＡ結合体（ロット００２０１１）と比較した、抗ＭｅｎＡ−ｐＳ  ＩｇＧ力価（ＧＭＴ）を示す。両方の修飾結合体は、非修飾ＭｅｎＡ結合体によって誘導される力価と非常に類似した力価を誘導した。
【０２０３】
図１７は、修飾ＭｅｎＡ結合体および非修飾ＭｅｎＡ結合体での免疫化からのプールされた血清（１：３２０００で希釈）のＩｇＧサブクラスの分析を示す。全ての血清における最も代表的なサブクラスは、ＩｇＧ１である。ＩｇＧ１は、Ｔ−依存的な抗原がタンパク質として提示された場合、マウスで主に誘導されるサブクラスである。生来、ＭｅｎＡ莢膜糖は、Ｔ独立抗原であり、免疫学的記憶を誘導し得ない。この結果は、結合体がその目的を達成していることを示す。
【０２０４】
抗ＭｅｎＡ  ｐＳ力価の特異性は、最終濃度２５μｇ／ｍｌでＭｅｎＡ  ｐＳを競合剤として使用する競合的ＥＬＩＳＡによって決定した。図１８で示すように、修飾結合体および非修飾結合体により誘導される力価の非常に良好な抑制が存在する。これは、全ての結合体が、抗ＭｅｎＡ  ｐＳ特異的な力価を誘導し得ることを示す。
【０２０５】
（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａに対する血清殺菌アッセイ（ＳＢＡ））
結合体での免疫化により誘導される抗体の機能を、細菌の補体−媒介性溶解を測定するために、インビトロ殺菌アッセイにおいて分析した。
【０２０６】
免疫化された群のそれぞれについてのプールされた後−ＩＩ血清を用いた。アッセイでの使用の前に５６℃で、３０分間、血清を不活性化した。２５％子ウサギ補体を、補体の原料（Ｐｅｌ  Ｆｒｅｅｚｅ）として使用した。殺菌力価は、細菌の５０％の死滅を生じる血清の希釈の逆数として表現した。２つの血清型Ａ株に対する活性を試験した：Ｆ８２３８およびＦ６１２４。
【０２０７】
力価は以下のようであった：
【０２０８】
【表７】
2010132925.tif 000016
【０２０９】
従って、全ての３つの結合体は、両方の株に対して良好な殺菌力価を誘導する。また、修飾オリゴ糖により誘導された力価は、天然の糖構造を使用して得た力価に比べて有意に低くは無い。しかし、有利なことには、修飾オリゴ糖は、天然のオリゴ糖よりも有意に安定である。従って、本発明は、天然のＭｅｎＡ莢膜糖の免疫原性を保持するが、保存の間の加水分解に対し改善された抵抗性を提供する抗原を提供する。
【０２１０】
本発明は、例としてのみ上記されており、本発明の範囲および趣旨内にありつつ、改変がなされることが、理解される。
【０２１１】
（参考文献（その内容は、本明細書中に参考として援用される））
【０２１２】
【表８−１】
2010132925.tif 000017
【０２１３】
【表８−２】
2010132925.tif 000018
【０２１４】
【表８−３】
2010132925.tif 000019
【０２１５】
【表８−４】
2010132925.tif 000020
【産業上の利用可能性】
【０２１６】
本発明の好ましい実施形態によれば、例えば以下の修飾莢膜糖、組成物、方法などが提供される：
（項目１）
対応する天然の莢膜糖の少なくとも１つの単糖単位におけるヒドロキシル基の位置での保護基を含む、修飾莢膜糖。
（項目２）
項目１に記載の修飾莢膜糖であって、前記少なくとも１つの単糖単位が、非末端単糖単位である、修飾莢膜糖。
（項目３）
項目１または２に記載の修飾莢膜糖であって、少なくとも１つの遊離ヒドロキシル基またはアミノ基を含む、修飾莢膜糖。
（項目４）
項目３に記載の修飾莢膜糖であって、前記少なくとも１つの遊離ヒドロキシル基が、末端アノマーヒドロキシル基である、修飾莢膜糖。
（項目５）
項目１に記載の修飾莢膜糖であって、前記保護基が、電子吸引性基である、修飾莢膜糖。
（項目６）
項目１または２に記載の修飾莢膜糖であって、前記保護基が以下の式であり：
−Ｏ−Ｘ−Ｙ          または        −ＯＲ３
ここで、Ｘは、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、またはＳＯ２である；
Ｙは、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ１〜１２アルコキシ、Ｃ３〜１２シクロアルキル、Ｃ５〜１２アリールまたはＣ５〜１２アリール−Ｃ１〜６アルキルであり、必要に応じて、それぞれは、別個にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、またはＣＣｌ３から選択される１、２、または３つの基で置換され得る；あるいは、Ｙは、ＮＲ１Ｒ２である；
Ｒ１およびＲ２は、別個に、Ｈ、Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ３〜１２シクロアルキル、Ｃ５〜１２アアリール、Ｃ５〜１２アリール−Ｃ１〜６アルキルから選択される；または、Ｒ１およびＲ２は、Ｃ３〜１２飽和複素環基を形成するために連結され得る；
Ｒ３は、Ｃ１〜１２アルキルまたはＣ３〜１２シクロアルキルであり、必要に応じて、それぞれは、別個にＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２（Ｃ１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、またはＣＣｌ３から選択される１、２、または３つ基で置換され得る；あるいはＲ３は、Ｃ５〜１２アリールまたはＣ５〜１２アリール−Ｃ１２アルキルであり、必要に応じてそれぞれは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ（Ｃ１〜６アルキル）、ＣＮ、ＣＦ３、またはＣＣｌ３から選択される１、２、３、４、または５つの基で置換され得る、
修飾莢膜糖。
（項目７）
項目３に記載の修飾莢膜糖であって、前記保護基が、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２または−ＯＣ（Ｏ）ＣＦ３である、修飾莢膜糖。
（項目８）
項目４に記載の修飾莢膜糖であって、前記保護基が、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２であり、さらにＲ１およびＲ２が、別個に、Ｃ１〜６アルキルから選択される、修飾莢膜糖。
（項目９）
項目５に記載の修飾莢膜糖であって、Ｒ１およびＲ２の両方が、メチルである、修飾莢膜糖。
（項目１０）
項目１〜９のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖であって、少なくとも１０％の前記単糖単位が、保護基を含む、修飾莢膜糖。
（項目１１）
項目１〜１０のいずれか１項に記載の修飾莢膜糖であって、前記対応する莢膜糖が、ホスホジエステル結合により連結している単糖単位を含む、修飾莢膜糖。
（項目１２）
項目１１に記載の修飾莢膜糖であって、前記対応する莢膜糖が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖である、修飾莢膜糖。
（項目１３）
項目１２に記載の修飾莢膜糖であって、前記保護基が、前記対応するＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖の任意の４位および／または３位にある、修飾莢膜糖。
（項目１４）
項目１２に記載の修飾莢膜糖であって、前記保護基が、前記対応するＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ糖の任意の４位にある、修飾莢膜糖。
（項目１５）
オリゴ糖である、項目１〜１４に記載の修飾莢膜糖。
（項目１６）
以下の式の糖であって
【化１】
2010132925.tif 000021
ここで、Ｔは以下の式（Ａ）または（Ｂ）である：
【化２】
2010132925.tif 000022
ｎは、１〜１００の整数である；
各Ｚ基は、別個に、ＯＨまたは項目５〜９に定義されたような保護基から選択される；そして
各Ｑ基は、ＯＨまたは項目５〜９に定義されたような保護基から別個に選択される；
Ｗは、ＯＨまたは項目５〜９に定義されたような保護基から選択される；
Ｖは、−ＮＨ２または−ＮＨＥ、から選択され、ここでＥは、窒素保護基である；
さらに、該Ｑ基の約７％より多くが保護基である、
糖。
（項目１７）
項目１６に記載の糖であって、前記Ｚ基の少なくとも５０％がＯＡｃである、糖。
（項目１８）
項目１６または１７に記載の糖であって、ｎが１５〜２５の整数である、糖。
（項目１９）
項目１６〜１８に記載の糖であって、前記Ｑ基の少なくとも１０％が、保護基である、糖。
（項目２０）
莢膜糖を修飾するプロセスであって、以下：
（ａ）単糖単位に少なくとも１つのヒドロキシル基を有する莢膜糖を提供する工程；および
（ｂ）前記の少なくとも１つのヒドロキシル基を保護基へ変換する工程
を包含する、プロセス。
（項目２１）
項目２０に記載のプロセスであって、前記保護基が、項目５〜９のいずれか１項に定義された通りである、プロセス。
（項目２２）
項目２０または２１に記載のプロセスであって、前記保護基は、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ１Ｒ２であって、工程（ｂ）は以下：
（ｂ１）有機溶媒中で該莢膜糖を二機能性試薬と反応させる工程；および
（ｂ２）工程（ｂ１）の生産物を式（Ｉ）のアミノ化合物ＨＮＲ１Ｒ２と反応させる工程であって：
ここでＲ１およびＲ２は、項目３、５および６のいずれかの１項に定義された通りである、工程
を包含するプロセス。
（項目２３）
項目２２に記載のプロセスであって、前記有機溶媒が、非プロトン性溶媒である、プロセス。
（項目２４）
項目２３に記載のプロセスであって、前記非プロトン性溶媒が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ホルムアミド、ヘキサメチルホスホラミド（ＨＭＰＡ）、ヘキサメチルリン酸トリアミド（ＨＭＰＴ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）またはジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）から選択される、プロセス。
（項目２５）
項目２３または２４に記載のプロセスであって、前記非プロトン性溶媒が、ＤＭＳＯである、プロセス。
（項目２６）
項目２２〜２５に記載のプロセスであって、前記二機能性試薬が、１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、カルボニルジ１，２，４−トリアゾール（ＣＤＴ）、カルボニルジ１，２，３−ベンゾトリアゾール（ＣＤＢ）、ジフェニルカルボネート、臭化シアン、ホスゲン、またはトリホスゲンから選択される、プロセス。
（項目２７）
項目２６に記載のプロセスであって、前記二機能性試薬が、ＣＤＩである、プロセス。
（項目２８）
項目２０〜２７に記載のプロセスであって、前記修飾莢膜糖が、修飾莢膜オリゴ糖である、プロセス。
（項目２９）
項目２８に記載のプロセスであって、工程（ａ）における前記莢膜糖が、対応する天然の莢膜多糖のサイズ処理によって入手可能な莢膜オリゴ糖である、プロセス。
（項目３０）
項目２８に記載のプロセスであって、工程（ａ）における前記莢膜糖が、天然の莢膜多糖であって、前記プロセスがさらに、工程（ｂ）の生成物がサイズ処理され、これにより修飾莢膜オリゴ糖を提供する工程（ｃ）を包含する、プロセス。
（項目３１）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖を修飾するためのプロセスであって、以下：
（ａ）天然のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖を提供する工程；
（ｂ）オリゴ糖を提供するために、該多糖のサイズ処理する工程；および
（ｃ）項目２１〜２７いずれか１項に従って、オリゴ糖の少なくとも１つのヒドロキシル基を保護基へ変換する工程
を包含する、プロセス。
（項目３２）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖を修飾するためのプロセスであって、以下：
（ａ）天然のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清型Ａ多糖を提供する工程；
（ｂ）項目２１〜２７いずれか１項に従って、該多糖の少なくとも１つのヒドロキシル基を保護基へ変換する工程；
（ｃ）生じた多糖をサイズ処理する工程
を包含する、プロセス。
（項目３３）
項目１〜１９に記載の修飾莢膜糖を調製するためのプロセスであって、総合的な合成プロセスが、２つ以上の単糖単位の間のグリコシド結合を形成する工程を含包する、プロセス。
（項目３４）
項目２０〜３３いずれか１項に記載のプロセスによって入手可能である、修飾莢膜糖。
（項目３５）
項目２０〜３３いずれか１項に記載のプロセスによって得られた、修飾莢膜糖。
（項目３６）
項目１〜１９、３４または３５のいずれか１項に記載の修飾糖の、糖−タンパク質結合体。
（項目３７）
項目３６に記載の結合体であって、前記タンパク質が、細菌毒素または細菌トキソイドである、結合体。
（項目３８）
項目３７に記載の結合体であって、前記細菌毒素または細菌トキソイドが、ジフテリア毒素またはジフテリアトキソイドである、結合体。
（項目３９）
項目３７に記載の結合体であって、前記細菌毒素または細菌トキソイドが、ＣＲＭ１９７である、結合体。
（項目４０）
以下の式の糖部分を含む、分子であって：
【化３】
2010132925.tif 000023
ここで、Ｔは、以下の式（Ａ）または（Ｂ）である：
【化４】
2010132925.tif 000024
ｎは、１〜１００の整数である；
各Ｚ基は、別個に、ＯＨまたは項目５〜９に定義されるような保護基から選択される；そして
各Ｑ基は、別個にＯＨまたは求項５〜９に定義されるような保護基から選択される；
Ｗは、ＯＨまたは項目５〜９に定義されるような保護基から選択される；
Ｖは、−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｅ、から選択され、ここでＥは、窒素保護基である；
Ｌは、Ｏ、ＮＨ、ＮＥ、ＳまたはＳｅである；
さらに、該Ｑ基の約７％より多くが保護基である、
分子。
（項目４１）
（ａ）項目１〜１９、３４または３５のいずれか１項に記載の修飾糖および／または項目３６〜３９のいずれか１項に記載の糖−タンパク質結合体および／または項目４０に記載の分子、ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、を含む、薬学的組成物。
（項目４２）
項目４１に記載の組成物であって、さらに１種類以上のＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹ由来の糖抗原を含み、必要に応じて前記糖は、オリゴ糖であり、必要に応じてキャリアタンパク質に結合させられる、組成物。
（項目４３）
項目４１または４２に記載の組成物であって、ワクチンアジュバントをさらに含む、組成物。
（項目４４）
項目４３に記載の組成物であって、前記アジュバントが、リン酸アルミニウムである、組成物。
（項目４５）
項目４１〜４４のいずれか１項に記載の組成物であって、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにより引き起こされる疾患に対するワクチンである、組成物。
（項目４６）
哺乳動物において、抗体応答を惹起させるための方法であって、哺乳動物に項目４１〜４５のいずれか１項に記載の薬学的組成物を投与する工程を包含する、方法。
（項目４７）
医薬としての使用のための、項目１〜１８のいずれか１項に記載の修飾糖。
（項目４８）
医薬としての使用のための、項目３６〜３９のいずれかに１項に記載の結合体。
（項目４９）
医薬としての使用のための、項目４０に記載の分子。
（項目５０）
１種類以上の莢膜細菌により引き起こされる疾患の予防または処置のための医薬の製造における、項目１〜１９、３４または３５のいずれか１項に記載の修飾糖、または項目３６〜３９のいずれか１項に記載の結合体または、項目４０に記載の分子の使用。
（項目５１）
項目５０に記載の使用であって、前記疾患が、細菌性髄膜炎である、使用。
【図１】
2010132925.tif 000025
【図２】
2010132925.tif 000026
【図４】
2010132925.tif 000027
【図５】
2010132925.tif 000028
【図７】
2010132925.tif 000029
【図８】
2010132925.tif 000030
【図１０Ａ】
2010132925.tif 000031
【図１０Ｂ】
2010132925.tif 000032
【図１２】
2010132925.tif 000033
【図１３】
2010132925.tif 000034
【図１４】
2010132925.tif 000035
【図１６】
2010132925.tif 000036
【図１７】
2010132925.tif 000037
【図１８】
2010132925.tif 000038
【図３】
2010132925.tif 000039
【図６】
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【図９】
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【図１１】
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【図１５】
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