【手続補正書】
【提出日】令和3年5月24日(2021.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物宿主細胞における発現のための、異種遺伝子に作動可能に連結したキメラ合成プロモーターであって、長さが６０〜９０ヌクレオチドであり、ラムダファージｐＲプロモーターの遠位部分、それぞれ長さが６ヌクレオチドであるラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの可変−３５および−１０領域、ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターのコア部分、ならびにラムダファージｐＲプロモーターの５’ＵＴＲ／リボソーム結合部位（ＲＢＳ）部分からなる、キメラ合成プロモーター。
【請求項２】
前記ラムダファージｐＲプロモーターの前記遠位部分、前記ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの前記可変−３５および−１０領域、前記ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの前記コア部分、ならびに前記ラムダファージｐＲプロモーターの前記５’ＵＴＲ／リボソーム結合部位（ＲＢＳ）部分の核酸配列が、表１．５に見出される核酸配列から選択される、請求項１に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項３】
微生物宿主細胞における発現のための、異種遺伝子に作動可能に連結したキメラ合成プロモーターであって、長さが６０〜９０ヌクレオチドであり、ラムダファージｐＲプロモーターの遠位部分、それぞれ長さが６ヌクレオチドであるラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの可変−３５および−１０領域、ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターのコア部分ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ａｃｓ遺伝子のプロモーターの５’ＵＴＲ／リボソーム結合部位（ＲＢＳ）部分からなる、キメラ合成プロモーター。
【請求項４】
前記ラムダファージｐＲプロモーターの前記遠位部分、前記ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの前記可変−３５および−１０領域、前記ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの前記コア部分、ならびに前記Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｃｓ遺伝子の前記プロモーターの前記５’ＵＴＲ／リボソーム結合部位（ＲＢＳ）部分の核酸配列が、表１．５に見出される核酸配列から選択される、請求項３に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項５】
配列番号１３２〜１５２、１５９〜１６０、１６２、１６５、１７４〜１７５、１８８、１９０、１９９〜２０１または２０７から選択される核酸配列からなる、請求項１から２までのいずれか一項に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項６】
配列番号１５３〜１５８、１６１、１６３〜１６４、１６６〜１７３、１７６〜１８７、１８９、１９１〜１９８または２０２〜２０６から選択される核酸配列からなる、請求項３から４までのいずれか一項に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項７】
前記微生物宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１から４までのいずれか一項に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項８】
前記異種遺伝子が、表２に見出される目的のタンパク質産物をコードする、請求項７に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項９】
前記異種遺伝子が、リシン生合成経路の一部である、リコピン生合成経路の一部である、生物学的製剤をコードするまたは生物学的製剤を生成するための経路内の遺伝子である、請求項７に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項１０】
前記リシン生合成経路の一部である前記異種遺伝子が、ａｓｄ遺伝子、ａｓｋ遺伝子、ｈｏｍ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｄａｐＤ遺伝子、ｄｄｈ遺伝子、ａｒｇＤ遺伝子、ｄａｐＥ遺伝子、ｄａｐＦ遺伝子、ｌｙｓＡ遺伝子、ｌｙｓＥ遺伝子、ｚｗｆ遺伝子、ｐｇｉ遺伝子、ｋｔｋ遺伝子、ｆｂｐ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、ｐｃｋ遺伝子、ｄｄｘ遺伝子、ｐｙｃ遺伝子またはｉｃｄ遺伝子から選択される、請求項９に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項１１】
前記リコピン生合成経路の一部である前記異種遺伝子が、ｄｘｓ遺伝子、ｉｓｐＣ遺伝子、ｉｓｐＥ遺伝子、ｉｓｐＤ遺伝子、ｉｓｐＦ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＡ遺伝子、ｉｓｐＢ遺伝子、ｃｒｔＥ遺伝子、ｃｒｔＢ遺伝子、ｃｒｔＩ遺伝子、ｃｒｔＹ遺伝子、ｙｍｇＡ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｅｌｂＡ遺伝子、ｇｄｈＡ遺伝子、ａｐｐＹ遺伝子、ｅｌｂＢ遺伝子、またはｙｍｇＢ遺伝子から選択される、請求項９に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項１２】
前記生物学的製剤が、ヒューマリン（ｒｈインスリン）、イントロンＡ（インターフェロンアルファ２ｂ）、ロフェロン（インターフェロンアルファ２ａ）、ヒューマトロープ（ソマトロピンｒｈ成長ホルモン）、ニューポジェン（フィルグラスチム）、ベタフェロン（インターフェロンベータ−１ｂ）、リスプロ（速効型インスリン）、ラピリシン（レテプラーゼ）、インフェルゲン（インターフェロンアルファコン−１）、グルカゴン、ベロムン（タソネルミン）、オンタック（デニロイキンジフチトクス）、ランタス（長時間作用型インスリングラルギン）、キネレット（アナキンラ）、ナトレコール（ネシリチド）、ソマバート（ペグビソマント）、カルシトニン（組換えカルシトニン  サケ）、ルセンティス（ラニビズマブ）、プレオタクト（ヒト副甲状腺ホルモン）、クリステクサ（ｒｈ尿酸オキシダーゼ、ＰＥＧ化）、ニベスチム（フィルグラスチム、ｒｈＧＣＳＦ）、ボラキサゼ（グルカルピダーゼ）、またはプレオス（副甲状腺ホルモン）から選択される、請求項９に記載のキメラ合成プロモーター。
【請求項１３】
配列番号１３２〜２０７から選択される核酸配列を有するキメラ合成プロモーターに作動可能に連結した異種遺伝子。
【請求項１４】
表２に見出される目的のタンパク質産物をコードする、請求項１３に記載の異種遺伝子。
【請求項１５】
リシン生合成経路の一部である、リコピン生合成経路の一部である、生物学的製剤をコードするまたは生物学的製剤を生成するための経路内の遺伝子である、請求項１３に記載の異種遺伝子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
一部の実施形態では、生物学的製剤は、ヒューマリン（ｒｈインスリン）、イントロンＡ（インターフェロンアルファ２ｂ）、ロフェロン（インターフェロンアルファ２ａ）、ヒューマトロープ（ソマトロピンｒｈ成長ホルモン）、ニューポジェン（フィルグラスチム）、ベタフェロン（インターフェロンベータ−１ｂ）、リスプロ（速効型インスリン）、ラピリシン（レテプラーゼ）、インフェルゲン（インターフェロンアルファコン−１）、グルカゴン、ベロムン（タソネルミン）、オンタック（デニロイキンジフチトクス）、ランタス（長時間作用型インスリングラルギン）、キネレット（アナキンラ）、ナトレコール（ネシリチド）、ソマバート（ペグビソマント）、カルシトニン（組換えカルシトニン  サケ）、ルセンティス（ラニビズマブ）、プレオタクト（ヒト副甲状腺ホルモン）、クリステクサ（ｒｈ尿酸オキシダーゼ、ＰＥＧ化）、ニベスチム（フィルグラスチム、ｒｈＧＣＳＦ）、ボラキサゼ（グルカルピダーゼ）、またはプレオス（副甲状腺ホルモン）から選択される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
所望の表現型を獲得するためにＥ．ｃｏｌｉ微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、
ａ．同じゲノム株バックグラウンドを有する最初の複数のＥ．ｃｏｌｉ微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップと；
ｂ．前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々の株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．それぞれが遺伝的バリエーションのユニークな組合せを含む後続の複数のＥ．ｃｏｌｉ微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記遺伝的バリエーションは、先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株に存在する遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉ株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．Ｅ．ｃｏｌｉ微生物が前記所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを内包する個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、タンパク質可溶性タグ微生物株ライブラリー、タンパク質分解タグ微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目３）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目４）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、少なくとも１つのバイシストロン設計（ＢＣＤ）調節配列を含有するプロモータースワップ微生物株ライブラリーを含む、項目１または２に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目５）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目６）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、
ａ．キメラ生合成酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドであって、前記キメラ生合成酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて調節経路に関与する酵素を含み、前記酵素に、ＤＮＡ結合部位に結合することができるＤＮＡ結合ドメインが翻訳的に融合する、少なくとも１つのポリヌクレオチド；および
ｂ．前記ＤＮＡ結合部位を含む少なくとも１つのＤＮＡ足場配列
を含む微生物株ライブラリーを含む、項目１または２に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目７）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目８）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーのサブセットである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目９）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１０）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計Ｅ．ｃｏｌｉ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル株ライブラリーのサブセットである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１１）
前記ゲノムを撹乱するステップが、ランダム変異誘発、標的配列挿入、標的配列欠失、標的配列の置換、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１２）
前記最初の複数のＥ．ｃｏｌｉ微生物が、工業生産Ｅ．ｃｏｌｉ株に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１３）
前記最初の複数のＥ．ｃｏｌｉ微生物が、Ｓ１Ｇｅｎ１で表される工業生産株微生物およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する任意の数の後続の微生物世代を含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１４）
ＳＮＰスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．参照Ｅ．ｃｏｌｉ株および第２のＥ．ｃｏｌｉ株を提供するステップであって、前記第２のＥ．ｃｏｌｉ株は、前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株または前記第２のＥ．ｃｏｌｉ株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初のＳＮＰスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々の株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株と前記第２のＥ．ｃｏｌｉ株との間の前記複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
を含む、方法。
（項目１５）
前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記ゲノムが撹乱されて、前記第２のＥ．ｃｏｌｉ株内に見出される前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、項目１４に記載のＳＮＰスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１６）
前記第２のＥ．ｃｏｌｉ株の前記ゲノムが撹乱されて、前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株内に見出されない前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、項目１４に記載のＳＮＰスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１７）
ユニークな遺伝的バリエーションを有する結果として生じる前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株が、前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株と前記第２のＥ．ｃｏｌｉ株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを一緒に含む、項目１４から１６までのいずれか一項に記載のＳＮＰスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１８）
ユニークな遺伝的バリエーションを有する結果として生じる前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株が、前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株と前記第２のＥ．ｃｏｌｉ株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを一緒に含む、項目１４から１６までのいずれか一項に記載のＳＮＰスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１９）
産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、
ａ．親系統Ｅ．ｃｏｌｉ株およびそれに由来する産生Ｅ．ｃｏｌｉ株を提供するステップであって、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株は、前記親系統株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．前記親系統Ｅ．ｃｏｌｉ株または前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株のいずれかのゲノムを撹乱して、最初のＥ．ｃｏｌｉ株のライブラリーを創製するステップであって、前記最初のライブラリーにおける各株は、前記親系統Ｅ．ｃｏｌｉ株と前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株との間の前記複数の同定された遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｃ．参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記最初のライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株に存在する遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＥ．ｃｏｌｉ微生物を提供することによって、Ｅ．ｃｏｌｉ株の後続のライブラリーを創製するステップと；
ｅ．前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記後続のライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．Ｅ．ｃｏｌｉ株が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、微生物株の新しいライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目２０）
前記最初のＥ．ｃｏｌｉ株のライブラリーが、前記親系統Ｅ．ｃｏｌｉ株と前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株との間の前記同定された遺伝的バリエーションのすべてを含む完全コンビナトリアルライブラリーである、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２１）
前記最初のＥ．ｃｏｌｉ株のライブラリーが、前記親系統Ｅ．ｃｏｌｉ株と前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株との間の前記同定された遺伝的バリエーションのサブセットを含む完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２２）
前記後続のＥ．ｃｏｌｉ株のライブラリーが、前記最初のライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２３）
前記後続のＥ．ｃｏｌｉ株のライブラリーが、前記最初のライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２４）
前記後続のＥ．ｃｏｌｉ株のライブラリーが、先行するライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２５）
前記後続のＥ．ｃｏｌｉ株のライブラリーが、先行するライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２６）
前記親系統Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記ゲノムが撹乱されて、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株内に見出される前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２７）
前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記ゲノムが撹乱されて、前記親系統Ｅ．ｃｏｌｉ株内に見出されない前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２８）
前記ゲノムを撹乱するステップが、ランダム変異誘発、標的配列挿入、標的配列欠失、標的配列の置換、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、項目１９から２５までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目２９）
後続のライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３０）
後続のライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３１）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３２）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３３）
前記同定された遺伝的バリエーションが、プロモータースワップライブラリー由来の人工プロモータースワップ遺伝的バリエーションをさらに含む、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３４）
前記最初のＥ．ｃｏｌｉ株のライブラリー、または
後続のＥ．ｃｏｌｉ株のライブラリー
のいずれかの少なくとも１つの微生物株のゲノムを、内在性Ｅ．ｃｏｌｉ標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターラダー由来の１つまたは複数のプロモーターを含むように操作するステップ
をさらに含む、項目１９に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３５）
プロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記プロモーターラダー由来の前記プロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
（項目３６）
前記複数のプロモーターの少なくとも１つが、バイシストロン設計（ＢＣＤ）調節配列を含む、項目３５に記載のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目３７）
産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法であって、
ａ．基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記プロモーターラダー由来の前記プロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記最初のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉ株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株に存在する遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＥ．ｃｏｌｉ微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップと；
ｅ．前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記後続のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉ株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．Ｅ．ｃｏｌｉ株が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、微生物株の新しいプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目３８）
前記後続のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目３７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目３９）
前記後続のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目３７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目４０）
前記後続のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行するプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目３７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目４１）
前記後続のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行するプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目３７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目４２）
後続のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目３７から４１までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目４３）
後続のプロモータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目３７から４１までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目４４）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目４５）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目４６）
ターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ターミネーターラダー由来の前記ターミネーターの１つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
（項目４７）
産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法であって、
ａ．基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ターミネーターラダー由来の前記ターミネーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記最初のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉ株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株に存在する遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＥ．ｃｏｌｉ微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップと；
ｅ．前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記後続のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉ株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．Ｅ．ｃｏｌｉ株が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、微生物株の新しいターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目４８）
前記後続のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目４７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目４９）
前記後続のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目４７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目５０）
前記後続のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行するターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目４７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目５１）
前記後続のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行するターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目４７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目５２）
後続のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目４７から５１までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目５３）
後続のターミネータースワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目４７から５１までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目５４）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目４７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目５５）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目４７に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目５６）
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞における生合成経路由来の生合成酵素を共局在化させるためのシステムであって、
ａ．酵素反応に関与する２種またはそれよりも多くのキメラ酵素タンパク質であって、各キメラ酵素タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン部分とカップリングした酵素部分を含む、２種またはそれよりも多くのキメラ酵素タンパク質；および
ｂ．
ｉ．少なくとも１つの核酸スペーサーによって分離された２つまたはそれよりも多くの異なるＤＮＡ結合部位をそれぞれが含む１つまたは複数のサブユニット
を含むＤＮＡ足場
を含み、
前記キメラ酵素タンパク質は、そのそれぞれが、前記ＤＮＡ足場内の少なくとも１つのＤＮＡ結合部位に結合する、該キメラ酵素タンパク質とカップリングしたＤＮＡ結合ドメイン部分によって前記ＤＮＡ足場に補充される、
システム。
（項目５７）
前記キメラ酵素タンパク質の前記ＤＮＡ結合ドメイン部分が、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含み、前記ＤＮＡ足場の前記ＤＮＡ結合部位が、対応するジンクフィンガー結合配列を含む、項目５６に記載のシステム。
（項目５８）
前記２種またはそれよりも多くのキメラ酵素タンパク質のそれぞれの前記酵素部分が、そのそれぞれのＤＮＡ結合ドメイン部分と、ポリペプチドリンカー配列を介してカップリングしている、項目５６に記載のシステム。
（項目５９）
前記２種またはそれよりも多くのキメラ酵素タンパク質のそれぞれの前記酵素部分が、そのそれぞれのＤＮＡ結合ドメイン部分と、そのアミノ末端またはそのカルボキシ末端を介してカップリングしている、項目５６に記載のシステム。
（項目６０）
前記２種またはそれよりも多くのキメラ酵素タンパク質が、アミノ酸生合成経路の酵素を含む、項目５６に記載のシステム。
（項目６１）
ａ．作動可能に連結したプロモーター；
ｂ．第１のリボソーム結合部位（ＳＤ１）；
ｃ．第１のシストロン配列（Ｃｉｓ１）；
ｄ．第２のリボソーム結合部位（ＳＤ２）
を順に含むバイシストロン設計調節（ＢＣＤ）配列であって、
標的遺伝子配列（Ｃｉｓ２）に作動可能に連結している、ＢＣＤ配列。
（項目６２）
ＳＤ１およびＳＤ２がそれぞれＮＮＮＧＧＡＮＮＮの配列を含む、項目６１に記載のＢＣＤ。
（項目６３）
ＳＤ１とＳＤ２が異なる、項目６１に記載のＢＣＤ。
（項目６４）
Ｃｉｓ１が停止コドンを含み、Ｃｉｓ２が開始コドンを含み、前記Ｃｉｓ１停止コドンと前記Ｃｉｓ２開始コドンが少なくとも１ヌクレオチド重複している、項目６１に記載のＢＣＤ。
（項目６５）
ＳＤ２がＣｉｓ１内に完全に組み込まれている、項目６１に記載のＢＣＤ。
（項目６６）
２種の標的遺伝子タンパク質を宿主生物において発現させるための方法であって、
ａ．前記宿主生物に、第１の標的遺伝子タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記第１のポリヌクレオチドは、第１の項目６１に記載のバイシストロン設計調節（ＢＣＤ）配列に作動可能に連結している、ステップと；
ｂ．前記宿主生物に、第２の標的遺伝子タンパク質をコードする第２のポリヌクレオチドを導入するステップであって、前記第２のポリヌクレオチドは、第２の項目６１に記載のＢＣＤに作動可能に連結している、ステップと
を含み、
前記第１および第２のＢＣＤは、それらのそれぞれのＣｉｓ１配列以外は同一であり、前記標的遺伝子タンパク質は、前記宿主生物においてそれぞれ第１および第２の発現レベルで発現される、方法。
（項目６７）
前記第１の発現レベルが前記第２の発現レベルの１．５倍以内である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記第１および第２のポリヌクレオチドが、前記宿主細胞において、前記第１および第２のポリヌクレオチドが同一のＢＣＤによって発現される対照宿主細胞と比較して低レベルの相同組換えを受ける、項目６６に記載の方法。
（項目６９）
タンパク質可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する複数の標的遺伝子、および可溶性タグラダーを提供するステップであって、前記可溶性タグラダーは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株において異なる可溶性プロファイルを呈する複数の可溶性タグを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記可溶性タグラダー由来の前記可溶性タグの１つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
（項目７０）
産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのタンパク質可溶性タグスワップ方法であって、
ａ．基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する複数の標的遺伝子、および可溶性タグラダーを提供するステップであって、前記可溶性タグラダーは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株において異なる発現プロファイルを呈する複数の可溶性タグを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記可溶性タグラダー由来の前記可溶性タグの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記最初の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉ株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株に存在する遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＥ．ｃｏｌｉ微生物を提供することによって、後続の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップと；
ｅ．前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記後続の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉ株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．Ｅ．ｃｏｌｉ株が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、微生物株の新しい可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリー内の各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目７１）
前記後続の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目７０に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための可溶性タグスワップ方法。
（項目７２）
前記後続の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目７０に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための可溶性タグスワップ方法。
（項目７３）
前記後続の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行する可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目７０に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための可溶性タグスワップ方法。
（項目７４）
前記後続の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行する可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目７０に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための可溶性タグスワップ方法。
（項目７５）
後続の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目７０から７４までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための可溶性タグスワップ方法。
（項目７６）
後続の可溶性タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目７０から７４までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための可溶性タグスワップ方法。
（項目７７）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目７０から７４までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための可溶性タグスワップ方法。
（項目７８）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次的細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目７０から７４までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための可溶性タグスワップ方法。
（項目７９）
タンパク質分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する複数の標的遺伝子、および分解タグラダーを提供するステップであって、前記分解タグラダーは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株において異なる溶解性プロファイルを呈する複数の分解タグを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記分解タグラダー由来の前記分解タグの１つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
（項目８０）
産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するためのタンパク質分解タグスワップ方法であって、
ａ．基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する複数の標的遺伝子、および分解タグラダーを提供するステップであって、前記分解タグラダーは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株において異なる発現プロファイルを呈する複数の分解タグを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株を含む最初の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップであって、前記複数の個々のＥ．ｃｏｌｉ株の各株内にユニークな遺伝的バリエーションが見出され、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｅ．ｃｏｌｉ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記分解タグラダー由来の前記分解タグの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記最初の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉ株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと、
ｄ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株に存在する遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＥ．ｃｏｌｉ微生物を提供することによって、後続の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーを創製するステップと；
ｅ．前記参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する表現型性能改善について前記後続の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの個々のＥ．ｃｏｌｉ株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．Ｅ．ｃｏｌｉ株が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、微生物株の新しい分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリー内の各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＥ．ｃｏｌｉ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目８１）
前記後続の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目８０に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための分解タグスワップ方法。
（項目８２）
前記後続の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、前記最初の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目８０に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための分解タグスワップ方法。
（項目８３）
前記後続の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行する分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目８０に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための分解タグスワップ方法。
（項目８４）
前記後続の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーが、先行する分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目８０に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための分解タグスワップ方法。
（項目８５）
後続の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目８０から８４までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための分解タグスワップ方法。
（項目８６）
後続の分解タグスワップＥ．ｃｏｌｉ株ライブラリーのＥ．ｃｏｌｉ株の表現型性能が、前記産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目８０から８４までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための分解タグスワップ方法。
（項目８７）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目８０から８４までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための分解タグスワップ方法。
（項目８８）
ステップｆ）の表現型性能の改善が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次的細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目８０から８４までのいずれか一項に記載の産生Ｅ．ｃｏｌｉ株の表現型性能を改善するための分解タグスワップ方法。
（項目８９）
微生物宿主細胞における発現のための、異種遺伝子に作動可能に連結したキメラ合成プロモーターであって、長さが６０〜９０ヌクレオチドであり、ラムダファージｐＲプロモーターの遠位部分、それぞれ長さが６ヌクレオチドであるラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの可変−３５および−１０領域、ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターのコア部分、ならびにラムダファージｐＲプロモーターの５’ＵＴＲ／リボソーム結合部位（ＲＢＳ）部分からなる、キメラ合成プロモーター。
（項目９０）
前記ラムダファージｐＲプロモーターの前記遠位部分、前記ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの前記可変−３５および−１０領域、前記ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの前記コア部分、ならびに前記ラムダファージｐＲプロモーターの前記５’ＵＴＲ／リボソーム結合部位（ＲＢＳ）部分の核酸配列が、表１．５に見出される核酸配列から選択される、項目８９に記載のキメラ合成プロモーター。
（項目９１）
微生物宿主細胞における発現のための、異種遺伝子に作動可能に連結したキメラ合成プロモーターであって、長さが６０〜９０ヌクレオチドであり、ラムダファージｐＲプロモーターの遠位部分、それぞれ長さが６ヌクレオチドであるラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの可変−３５および−１０領域、ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターのコア部分ならびにＥ．ｃｏｌｉ  ａｃｓ遺伝子のプロモーターの５’ＵＴＲ／リボソーム結合部位（ＲＢＳ）部分からなる、キメラ合成プロモーター。
（項目９２）
前記ラムダファージｐＲプロモーターの前記遠位部分、前記ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの前記可変−３５および−１０領域、前記ラムダファージｐＬおよびｐＲプロモーターの前記コア部分、ならびに前記Ｅ．ｃｏｌｉ  ａｃｓ遺伝子の前記プロモーターの前記５’ＵＴＲ／リボソーム結合部位（ＲＢＳ）部分の核酸配列が、表１．５に見出される核酸配列から選択される、項目９１に記載のキメラ合成プロモーター。
（項目９３）
配列番号１３２〜１５２、１５９〜１６０、１６２、１６５、１７４〜１７５、１８８、１９０、１９９〜２０１または２０７から選択される核酸配列からなる、項目８９から９０までのいずれかに記載のキメラ合成プロモーター。
（項目９４）
配列番号１５３〜１５８、１６１、１６３〜１６４、１６６〜１７３、１７６〜１８７、１８９、１９１〜１９８または２０２〜２０６から選択される核酸配列からなる、項目９１から９２までのいずれかに記載のキメラ合成プロモーター。
（項目９５）
前記微生物宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、項目８９から９２までのいずれかに記載のキメラ合成プロモーター。
（項目９６）
前記異種遺伝子が、表２に見出される目的のタンパク質産物をコードする、項目９５に記載のキメラ合成プロモーター。
（項目９７）
前記異種遺伝子が、リシン生合成経路の一部である遺伝子である、項目９５に記載のキメラ合成プロモーター。
（項目９８）
前記異種遺伝子が、ａｓｄ遺伝子、ａｓｋ遺伝子、ｈｏｍ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｄａｐＤ遺伝子、ｄｄｈ遺伝子、ａｒｇＤ遺伝子、ｄａｐＥ遺伝子、ｄａｐＦ遺伝子、ｌｙｓＡ遺伝子、ｌｙｓＥ遺伝子、ｚｗｆ遺伝子、ｐｇｉ遺伝子、ｋｔｋ遺伝子、ｆｂｐ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、ｐｃｋ遺伝子、ｄｄｘ遺伝子、ｐｙｃ遺伝子またはｉｃｄ遺伝子から選択される、項目９７に記載のキメラ合成プロモーター。
（項目９９）
前記異種遺伝子が、リコピン生合成経路の一部である遺伝子である、項目９５に記載のキメラ合成プロモーター。
（項目１００）
前記異種遺伝子が、ｄｘｓ遺伝子、ｉｓｐＣ遺伝子、ｉｓｐＥ遺伝子、ｉｓｐＤ遺伝子、ｉｓｐＦ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＡ遺伝子、ｉｓｐＢ遺伝子、ｃｒｔＥ遺伝子、ｃｒｔＢ遺伝子、ｃｒｔＩ遺伝子、ｃｒｔＹ遺伝子、ｙｍｇＡ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｅｌｂＡ遺伝子、ｇｄｈＡ遺伝子、ａｐｐＹ遺伝子、ｅｌｂＢ遺伝子、またはｙｍｇＢ遺伝子から選択される、項目９９に記載のキメラ合成プロモーター。
（項目１０１）
前記異種遺伝子が、生物学的製剤をコードするまたは生物学的製剤を生成するための経路内の遺伝子である、項目９５に記載のキメラ合成プロモーター。
（項目１０２）
前記生物学的製剤が、ヒューマリン（ｒｈインスリン）、イントロンＡ（インターフェロンアルファ２ｂ）、ロフェロン（インターフェロンアルファ２ａ）、ヒューマトロープ（ソマトロピンｒｈ成長ホルモン）、ニューポジェン（フィルグラスチム）、ベタフェロン（インターフェロンベータ−１ｂ）、リスプロ（速効型インスリン）、ラピリシン（レテプラーゼ）、インフェルゲン（インターフェロンアルファコン−１）、グルカゴン、ベロムン（タソネルミン）、オンタック（デニロイキンジフチトクス）、ランタス（長時間作用型インスリングラルギン）、キネレット（アナキンラ）、ナトレコール（ネシリチド）、ソマバート（ペグビソマント）、カルシトニン（組換えカルシトニン  サケ）、ルセンティス（ラニビズマブ）、プレオタクト（ヒト副甲状腺ホルモン）、クリステクサ（ｒｈ尿酸オキシダーゼ、ＰＥＧ化）、ニベスチム（フィルグラスチム、ｒｈＧＣＳＦ）、ボラキサゼ（グルカルピダーゼ）、またはプレオス（副甲状腺ホルモン）から選択される、項目９９に記載のキメラ合成プロモーター。
（項目１０３）
配列番号１３２〜２０７から選択される核酸配列を有するキメラ合成プロモーターに作動可能に連結した異種遺伝子。
（項目１０４）
表２に見出される目的のタンパク質産物をコードする、項目１０３に記載の異種遺伝子。
（項目１０５）
リシン生合成経路の一部である遺伝子である、項目１０３に記載の異種遺伝子。
（項目１０６）
ａｓｄ遺伝子、ａｓｋ遺伝子、ｈｏｍ遺伝子、ｄａｐＡ遺伝子、ｄａｐＢ遺伝子、ｄａｐＤ遺伝子、ｄｄｈ遺伝子、ａｒｇＤ遺伝子、ｄａｐＥ遺伝子、ｄａｐＦ遺伝子、ｌｙｓＡ遺伝子、ｌｙｓＥ遺伝子、ｚｗｆ遺伝子、ｐｇｉ遺伝子、ｋｔｋ遺伝子、ｆｂｐ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、ｐｃｋ遺伝子、ｄｄｘ遺伝子、ｐｙｃ遺伝子またはｉｃｄ遺伝子から選択される、項目１０５に記載の異種遺伝子。
（項目１０７）
リコピン生合成経路の一部である遺伝子である、項目１０３に記載の異種遺伝子。
（項目１０８）
ｄｘｓ遺伝子、ｉｓｐＣ遺伝子、ｉｓｐＥ遺伝子、ｉｓｐＤ遺伝子、ｉｓｐＦ遺伝子、ｉｓｐＧ遺伝子、ｉｓｐＨ遺伝子、ｉｄｉ遺伝子、ｉｓｐＡ遺伝子、ｉｓｐＢ遺伝子、ｃｒｔＥ遺伝子、ｃｒｔＢ遺伝子、ｃｒｔＩ遺伝子、ｃｒｔＹ遺伝子、ｙｍｇＡ遺伝子、ｄｘｒ遺伝子、ｅｌｂＡ遺伝子、ｇｄｈＡ遺伝子、ａｐｐＹ遺伝子、ｅｌｂＢ遺伝子、またはｙｍｇＢ遺伝子から選択される、項目１０７に記載の異種遺伝子。
（項目１０９）
生物学的製剤をコードするまたは生物学的製剤を生成するための経路内の遺伝子である、項目１０３に記載の異種遺伝子。
（項目１１０）
前記生物学的製剤が、ヒューマリン（ｒｈインスリン）、イントロンＡ（インターフェロンアルファ２ｂ）、ロフェロン（インターフェロンアルファ２ａ）、ヒューマトロープ（ソマトロピンｒｈ成長ホルモン）、ニューポジェン（フィルグラスチム）、ベタフェロン（インターフェロンベータ−１ｂ）、リスプロ（速効型インスリン）、ラピリシン（レテプラーゼ）、インフェルゲン（インターフェロンアルファコン−１）、グルカゴン、ベロムン（タソネルミン）、オンタック（デニロイキンジフチトクス）、ランタス（長時間作用型インスリングラルギン）、キネレット（アナキンラ）、ナトレコール（ネシリチド）、ソマバート（ペグビソマント）、カルシトニン（組換えカルシトニン  サケ）、ルセンティス（ラニビズマブ）、プレオタクト（ヒト副甲状腺ホルモン）、クリステクサ（ｒｈ尿酸オキシダーゼ、ＰＥＧ化）、ニベスチム（フィルグラスチム、ｒｈＧＣＳＦ）、ボラキサゼ（グルカルピダーゼ）、またはプレオス（副甲状腺ホルモン）から選択される、項目１０９に記載の異種遺伝子。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３３】
本開示のプロモーターの非網羅的なリストを、以下の表１および／または表１．４に提供する。プロモーター配列のそれぞれは、異種プロモーターまたは異種プロモーターポリヌクレオチドと呼ぶことができる。
【表１】
2020524490.tif 000001
【表１．４−１】
2020524490.tif 000002
【表１．４−２】
2020524490.tif 000003
【表１．４−３】
2020524490.tif 000004
【表１．４−４】
2020524490.tif 000005
【表１．４−５】
2020524490.tif 000006
【表１．５−１】
2020524490.tif 000007
【表１．５−２】
2020524490.tif 000008