【手続補正書】
【提出日】平成17年8月1日(2005.8.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
グリコサミノグリカン結合性分子が、抗グリコサミノグリカン抗体又はグリコサミノグリカン結合蛋白質である請求項１〜５の何れか１項に記載のグリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
グリコサミノグリカン結合性分子が、標識物質で直接標識されたものであるか、又は標識物質で間接的に標識されうるものである請求項１〜６の何れか１項に記載のグリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測定方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、又はこれらの分解物に対する抗体を更に含む請求項９記載のグリコサミノグリカン測定用キット。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
４．脂質結合グリコサミノグリカンを構成するグリコサミノグリカンが、分子量３ＫＤａ〜２００ＫＤａのヒアルロン酸であることを特徴とする上記１〜３の何れか１つに記載のグリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測定方法。
５．担持体に固着した脂質結合グリコサミノグリカンとグリコサミノグリカン結合性分子とを反応させる工程を含むことを特徴とする上記１〜４の何れか１つに記載のグリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測定方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
６．グリコサミノグリカン結合性分子が、抗グリコサミノグリカン抗体又はグリコサミノグリカン結合蛋白質である上記１〜５の何れか１つに記載のグリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測定方法。
７．グリコサミノグリカン結合性分子が、標識物質で直接標識されたものであるか、又は標識物質で間接的に標識されうるものである上記１〜６の何れか１つに記載のグリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測定方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
８．担持体表面に脂質結合グリコサミノグリカンを固着した担持体を含むことを特徴とするグリコサミノグリカン又はグリコサミノグリカン結合性分子の測定用キット。
９．測定対象グリコサミノグリカンに脂質を結合させるための試薬と、脂質結合グリコサミノグリカンを固着させるための担持体とを少なくとも含むグリコサミノグリカン測定用キット。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
１０．コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、又はこれらの分解物に対する抗体を更に含む上記９記載のグリコサミノグリカン測定用キット。
１１．担持体表面に脂質結合グリコサミノグリカンを固着した担持体からなることを特徴とするグリコサミノグリカン結合性分子の解析又は検索用プローブ。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
また、本発明において、「グリコサミノグリカン結合性分子」と「グリコサミノグリカン結合性物質」は、同様の概念を表す用語として使用するものとし、具体的には、抗ヘパラン硫酸抗体、抗コンドロイチン硫酸抗体、抗ケラタン硫酸抗体等、グリコサミノグリカン又はそのフラグメントを動物に免疫して得られ、これらに対して特異的な結合親和性を示す免疫グロブリンである抗ＧＡＧ抗体；あるいはヒアルロン酸と結合性を有するヒアルロン酸結合蛋白（ＨＡＢＰ；ヒアルロン酸結合領域）や、ＣＤ４４及び、ヘパラン硫酸／ヘパリンと結合性を有する繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）等、ＧＡＧに対して結合親和性を示すが、抗体ではないＧＡＧ結合蛋白質を包含する。
本発明は、脂質結合グリコサミノグリカン（以下、「Ｌ−ＧＡＧ」とも記す）を、免疫測定用のプレート、ビース、ゲル、チューブ、ストリップ、膜等の担持体に脂質残基をアンカー分子として働かせることにより結合させたプレートを用いて、検体中のＧＡＧ又はＧＡＧ結合性分子を測定する方法及びその測定用キットを提供するものである。また、該Ｌ−ＧＡＧを固着させた担持体は、新規なＧＡＧ結合性分子の解析、検索などに有効なプローブとしても用いられる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本明細書中実施例に於いては、還元末端ラクトン法により、Ｌ−ＧＡＧを作成した。
Ｌ−ＧＡＧを固着させる担持体としては、通常、脂質と疎水的相互作用によって固着しうる疎水性の表面を持つものであれば限定されない。担持体としては、例えば、プレート（ＥＬＩＳＡ等免疫測定用プレート等）、ビーズ、ゲル、チューブ、ストリップ、膜等が挙げられる。材質としては、ポリスチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリアクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース等が挙げられ、特に脂質と疎水結合が可能な、表面が疎水的な材質が好ましい。特に、プレートを担持体として用いる方が測定手技が簡便であり、好ましい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
また、上記ＥＬＩＳＡ法において、（１）抗ＧＡＧ抗体の代わりに標識物質で直接標識された抗ＧＡＧ抗体を使用し、プレート上のＬ−ＧＡＧと結合した標識抗ＧＡＧ抗体を定量する、（２）抗ＧＡＧ抗体の代わりに標識物質で直接標識されたＧＡＧ結合蛋白質を使用し、プレート上のＬ−ＧＡＧと結合した標識ＧＡＧ結合蛋白質を定量する等の方法を採用することもできる。さらに、上記のそれぞれの方法において、直接標識する代わりに、例えば、特異的リガンド：レセプター結合対のリガンドであるビオチンを二次抗体、抗ＧＡＧ抗体、ＧＡＧ結合蛋白質等に結合したものを使用し、プレート上のＬ−ＧＡＧと結合したビオチンを、該結合対のレセプターであるアビジン、ストレプトアビジン等と標識物質を結合したもので検出する間接的な標識法を採用してもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
実施例  ３．  ＣＳ−ＰＥ固着プレートにコンドロイチナーゼを処理した後の抗体反応性（ＣＳ−ＰＥ構成ＣＳの解析）
実施例２と同様にプレートに固着したＣＳ−ＰＥ（サメ軟骨由来、重量平均分子量２０，０００、１０μｇ／ｍｌ；１００μｌ／ｗｅｌｌ）をコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃ−ＡＢＣ）の酵素濃度を変化させて３７℃で１時間処理した後、それぞれ特異性の異なる抗ＣＳ抗体として、抗ＣＳ抗体ＭＯ２２５、抗不飽和６Ｓ二糖抗体  ３Ｂ３、抗不飽和４Ｓ二糖抗体２Ｂ６、抗不飽和０Ｓ二糖抗体１Ｂ５（各１／５００稀釈；いずれも生化学工業（株）製）を用いそれぞれ実施例１と同様に反応させた（図３）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
【発明の効果】
本発明は、担持体に固着したＬ−ＧＡＧとＧＡＧ結合性物質を用いて、検体中の該当するＧＡＧの濃度測定が可能であり、人や動物の血液、尿、髄液、創傷浸潤液などの体液中のＧＡＧ含量の測定が可能となる。体液中のＧＡＧ量は、関節炎、肝炎、腎炎、アルツハイマー、癌、皮膚炎、炎症、分娩時などに変動することが知られており、特定のＧＡＧ濃度を測定することにより、それら疾患などの診断に利用できる。