【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年7月2日(2021.7.2)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】新規なプロモーター及びこれを用いたＬ−アミノ酸の生産方法
【技術分野】
【０００１】
本出願は、新規なプロモーター及びこれを用いたＬ−アミノ酸の生産方法に関するもので、より詳細には、プロモーター活性を有する新規ポリヌクレオチド、これを含むベクター及びコリネバクテリウム属微生物、前記微生物を用いたＬ−アミノ酸の生産方法、発酵組成物の製造方法、及び前記発酵組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸はタンパク質の基本構成単位であって、薬品の原料と食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられる。その中でも、Ｌ−グルタミン酸は発酵によって生産される代表的なアミノ酸であって、特有の独特の味（旨味）を有し、食品分野ではもちろん、医薬品分野、その他の動物飼料の分野などに広く利用されている重要なアミノ酸の一つである。また、グリシンは主に甘味を出して、食品工業で調味料として用いられ、天然調味料と一緒に用いて味を高める。さらに、酸化防止の作用、緩衝作用などにも用いられており、医薬の面では輸液、制酸剤、総合アミノ酸製剤、栄養補給剤として用いられている。
【０００３】
前記アミノ酸を生産する通常の方法としては、主にブレビバクテリウム（Brevibacterium）やコリネバクテリウム（非特許文献１）、その他にも大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus）、放線菌（Streptomyces）、ペニシリウム（Penicillum）属、クレブシエラ（Klebsiella）、エルウィニア（Erwinia）、パントエア（Pantoea）属などの微生物を用いた発酵の方法があり（特許文献１及び２）、また、モノクロロ酢酸法、ストレッカー（Strecker）法などの合成法を介した工業的な方法によっても生産される。
【０００４】
また、アミノ酸を効率的に生産するための多様な研究、例えば、アミノ酸高効率生産の微生物や発酵工程の技術を開発するための努力が成されている。具体的には、コリネバクテリウム属菌株におけるアミノ酸生合性に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、またはアミノ酸生合成に不要な遺伝子を除去することのような目的物質特異的な接近方法が開発され（特許文献３及び４）、このような方法の他に、アミノ酸の生産に関与しない遺伝子を除去する方法、アミノ酸の生産において具体的に機能が知られてない遺伝子を除去する方法も活用されている。しかし、依然として効率的かつ高収率でアミノ酸を生産しうる方法に対する研究の必要性が台頭している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第３、２２０、９２９号
【特許文献２】米国特許第６、６８２、９１２号
【特許文献３】韓国登録特許公報第１０−０９２４０６５号
【特許文献４】韓国登録特許公報第１０−１２０８４８０号
【特許文献５】韓国登録特許公報第１０−０２９２２９９号
【特許文献６】国際公開特許第２００８−０３３００１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Amino Acid Fermentation、Gakkai Shuppan Center ：195-215、1986
【非特許文献２】Karlin ＆ Altschul、 Pro. Natl. Acad. Sci. USA、 90、 5873(1993)
【非特許文献３】Methods Enzymol.、183、 63、 1990
【非特許文献４】Sambrook et al.、supra、 9.50-9.51、 11.7-11.8
【非特許文献５】Appl. Microbiol. Biothcenol.、1999、52:541-545
【非特許文献６】Nat. Protoc.、 2014 Oct;9(10):2301-16
【非特許文献７】Schendzielorz et al.、 2014
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、複数のアミノ酸を同時に生産しうる方法を開発するために努力した結果、本出願のプロモーター活性を有する新規ポリヌクレオチドを開発し、これは菌株のグルタミン酸の生成能は維持しつつ、グリシンの生成能を向上させうることを確認し、本出願を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本出願の一つの目的は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドがＴに置換されるか、５３番目及び５５番目ヌクレオチドがＴに置換されて６０番目ヌクレオチドがＧに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供することにある。
【０００９】
本出願の他の一つの目的は、前記ポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供することにある。
【００１０】
本出願のもう一つの目的は、前記ポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含むコリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【００１１】
本出願のもう一つの目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記の培地から目的物質を回収する段階を含む、目的物質を生産する方法を提供することにある。
【００１２】
本出願のもう一つの目的は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養して発酵する段階を含む、発酵組成物の製造方法を提供することにある。
【００１３】
本出願のもう一つの目的は、前記方法によって製造された発酵組成物を提供することにある。
【発明の効果】
【００１４】
本出願の新規プロモーターは、アミノ酸を生産する微生物に導入されて、微生物のアミノ酸生成量を増加させうる。特に、前記新規プロモーターを用いてアミノ酸を製造する場合、既存の合成法によって製造されたグリシンを発酵法で生産することができ、さらにグルタミン酸とグリシンを同時に生産しうるため、アミノ酸の生産に有用に活用できる。また、発酵物内のグルタミン酸の量とグリシンの量を調節して、発酵物の味と嗜好性を改善させ、発酵液及びこれを用いた調味素材の製品に適用できる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されてもよい。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
【００１６】
前記のような目的を達成するために、本出願の一つの様態は、配列番号１で表されるヌクレオチド配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドがＴに置換されるか、５３番目及び５５番目ヌクレオチドがＴに置換されて６０番目ヌクレオチドがＧに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００１７】
本出願において、用語、「配列番号１で表されるヌクレオチド配列」は、ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼ（Phosphoribosyl-ATP pyrophosphatase：ＨｉｓＥ）をコードする遺伝子のプロモーター配列の一部を意味してもよい。
【００１８】
この時、前記用語、「ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼ」は、、５−ホスホ−α−Ｄ−リボース１−二リン酸（5-phospho-alpha-D-ribose 1-diphosphate）からＬ−ヒスチジンを合成する、ヒスチジン合成経路に関与する酵素を意味し、本明細書で「ＨｉｓＥ」と混用して命名してもよい。前記ヒスチジン合成経路は、合計９つの酵素からなり（ＨｉｓＧ−ＨｉｓＥ−ＨｉｓＩ−ＨｉｓＡ−ＨｉｓＨ−ＨｉｓＢ−ＨｉｓＣ−ＨｉｓＮ−ＨｉｓＤ）、前記ＨｉｓＥは１段階であるＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）の後の２番目の段階を構成する。
【００１９】
本出願において、用語、「プロモーター」は、ポリメラーゼ（polymerase）の結合部位を含み、プロモーター目的遺伝子のｍＲＮＡへの転写開始の活性を有する、コーディング領域の上位（upstream）の非解読されたヌクレオチド配列、すなわち、ポリメラーゼが結合して遺伝子の転写を開始するようにするＤＮＡ領域を意味する。前記プロモーターは、ｍＲＮＡ転写開始部位の５’部位に位置してもよい。この時、前記プロモーターの目的遺伝子は、ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼ（Phosphoribosyl-ATP pyrophosphatase）をコードする遺伝子であってもよいが、これに制限されない。
【００２０】
本出願で、前記配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列からなるプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、「前記ポリヌクレオチド」、「本出願のヌクレオチド配列」、「本出願のポリヌクレオチド」または「ｈｉｓＥＧプロモーター」などで混用して命名してもよく、本明細書では前記記述された用語がすべて用いられてもよい。
【００２１】
本出願のポリヌクレオチドは、前記配列番号１で表されるヌクレオチド配列、すなわち、ｈｉｓＥＧ遺伝子のプロモーター配列が変異されたものであり、具体的には、前記変異は前記配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドがＴに置換されたものであってもよく、５３番目及び５５番目ヌクレオチドがＴに置換されて６０番目ヌクレオチドがＧに置換されたものであってもよい。それに応じて、前記ポリヌクレオチドは配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列からなるもの（consist of）であってもよい。
【００２２】
この時、前記用語、「変異」は、遺伝的または非遺伝的に安定的な表現型的な変化を意味し、本明細書で「突然変異」と混用して命名してもよい。
【００２３】
具体的には、前記ポリヌクレオチドは、変異を含まないポリヌクレオチドに比べて変異された（増加または減少された）プロモーター活性を有してもよい。したがって、前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的遺伝子の発現及び前記目的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を調節（増加または減少）してもよく、さらに目的遺伝子以外の他の遺伝子発現を調節してもよい。
【００２４】
本出願の目的上、前記ポリヌクレオチドは、ｈｉｓＥ遺伝子の発現強化のためのものであってもよい。
【００２５】
また、ｈｉｓＥ及びｈｉｓＧ遺伝子はオペロンで構成されていて、前記ポリヌクレオチドは、ｈｉｓＧ遺伝子の発現強化のための目的をさらに有してもよい。
【００２６】
また、前記ポリヌクレオチドは、グリシンの生成量の増加ためのものであってもよい。
【００２７】
この時、前記「ＨｉｓＧ」は、本出願で「ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase」とも命名され、ヒスチジン合成経路に関与する酵素を意味する。ヒスチジン合成経路は、合計９つの酵素からなり（ＨｉｓＧ−ＨｉｓＥ−ＨｉｓＩ−ＨｉｓＡ−ＨｉｓＨ−ＨｉｓＢ−ＨｉｓＣ−ＨｉｓＮ−ＨｉｓＤ）、前記ＨｉｓＧはその中で１段階を構成する。
【００２８】
また、前記ｈｉｓＥ及びｈｉｓＧ遺伝子はオペロンで構成されるため、本出願のポリヌクレオチドは、ｈｉｓＥだけでなく、ｈｉｓＧ遺伝子の転写を調節しうる。したがって、目的遺伝子はホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼをコードする遺伝子、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００２９】
前記ＨｉｓＥ及びＨｉｓＧ はヒスチジン生成に関与することが知られていたが、グリシン生成との関連性については公知されず、本発明者らによって初めて究明された。特に、前記のようなｈｉｓＥＧ遺伝子のプロモーター変異によるＨｉｓＥ及び／またはｈｉｓＧの過発現によるＨｉｓＥ及び／またはＨｉｓＧ酵素の活性の増加、及びこれに伴うグリシン生成量の増加及びグルタミン酸生成量の維持効果は、本発明者らによって初めて究明された。
【００３０】
この時、前記用語、「グルタミン酸」（L-glutamic acid、L-glutamate）は、アミノ酸の一種であって、非必須アミノ酸に区分される。中枢神経系で最も一般的な興奮性神経伝達物質として知られていて、また、旨味が出るといわれ、このモノナトリウム塩（monosodium glutamate：ＭＳＧ）が調味料として開発され、広く用いられている。一般的に、グルタミン酸を生産する微生物の発酵を介して製造される。グライシン
また、前記用語、「グリシン」（glycine）は、甘味を出す無色結晶のアミノ酸であって、グライシンとも言う。食品の調味料として主に用いられ、医薬の面では輸液、制酸剤、総合アミノ酸製剤、栄養補給剤としても用いられている。一般的に、モノクロロ酢酸法、ストレッカー（Strecker）法などの工業的な合成法によって製造されるが、合成法はＤ型及びＬ型のアミノ酸が混合されて製造されるため、光学分割をしなければならないという不便さがあった。したがって、反応条件がおだやかで短時間に大量の生産が可能であり、工程が環境親和的で、生産物質が生分解性であるなどの多様な利点を有する発酵法でグリシンを製造する必要がある。
【００３１】
具体的には、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列からなるものであってもよい。
【００３２】
また、本出願のヌクレオチド配列は、従来知られている突然変異誘発法、例えば、方向性進化法（direct evolution）及び部位特異的突然変異法（site-directed mutagenesis）などにより変形されてもよい。
【００３３】
したがって、前記ポリヌクレオチドは、前記配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも６０％以上、具体的には、７０％以上、より具体的には、８０％以上、さらに具体的には、８３％以上、８４％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、または９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含んでもよい。前記配列と相同性を有する配列として、実質的に配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列と同一または相応する生物学的活性を有するポリヌクレオチド配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加されたポリヌクレオチド配列を有する場合も、本出願のカテゴリに含まれるのは自明である。
【００３４】
本出願において、用語、「相同性」は、与えられたヌクレオチド配列と一致する程度を意味し、パーセンテージとして示してもよい。本明細書で、与えられたヌクレオチド配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」として示される。前記ヌクレオチド配列に対する相同性は、例えば、文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ [参照：非特許文献２]やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献３）を使用して決定してもよい。これらのアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（参照：http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。
【００３５】
前記「厳しい条件」は、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、非特許文献４）に具体的に記載されている。例えば、相同性が高い遺伝子同士、６０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性を有する遺伝子同士ハイブリッド化し、それより相同性が低い遺伝子同士ハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１ ％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回〜３回洗浄する条件を列挙しうる。混成化は、たとえ混成化の厳格度に応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能としても、２つのヌクレオチドが相補的配列を有することを要求する。前記用語「相補的」は、互いに混成化が可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また実質的に類似のポリヌクレオチド配列だけでなく、全体の配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片を含んでもよい。
【００３６】
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて、当業者によって適切に調節してもよい。ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳格度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は該当技術分野でよく知られている（非特許文献４を参照）。
【００３７】
特に、前記配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列からなる（consist of）という表現は、前記ポリヌクレオチドをプロモーターとして目的遺伝子に連結して用いる時、制限酵素の使用のように目的遺伝子に連結する過程の中で発生しうるヌクレオチドの追加、及び／または削除、及び／または変異などの場合を排除しない。
【００３８】
例えば、配列番号２または配列番号３で表されるヌクレオチド配列からなるプロモーター活性を有する前記ポリヌクレオチドは、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列と厳格な条件下でハイブリッド化され、本出願のプロモーター活性を有するヌクレオチド配列も含んでもよい。
【００３９】
さらに、本出願のポリヌクレオチドは、目的タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結されてもよい。
【００４０】
本出願において、用語、「遺伝子発現調節配列」は、本出願のポリヌクレオチドを含み、これに作動可能に連結されている目的遺伝子を発現させうる配列を意味する。
【００４１】
当業者であれば、プロモーターを含む遺伝子発現調節配列の変異を用いて発現強化を試してみてもよく、例えば、開始コドン配列の変異による発現強化を試してもよい。１つの例として、ＨｉｓＥ酵素の開始コドンがＧＴＧからＡＴＧに置換されたものであってもよい。
【００４２】
本出願において、用語、「作動可能に連結された」（operatively linked）は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドが目的遺伝子の転写を開始及び媒介するように、前記遺伝子配列と機能的に連結されていることを意味する。作動可能な連結は、当業界の公知された遺伝子組換え技術を用いて製造してもよく、部位特異的ＤＮＡ切断及び連結は、当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
【００４３】
さらに、本出願の遺伝子発現調節配列は、遺伝子の転写を実施するためのプロモーターの他に転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列及び転写及び解読の終結を調節するＤＮＡなどをさらに含んでもよい。
【００４４】
例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモーターの他にリボソーム結合部位をさらに含んでもよいが、これに制限されない。本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドは、通常の当業者によって必要に応じて前記のような遺伝子発現調節のための配列を構成してもよい。
【００４５】
本出願で前記目的遺伝子は、微生物で発現を調節しようとする目的タンパク質をコードする遺伝子を意味する。
【００４６】
例えば、グルタミン酸、グリシン及びヒスチジンなどのアミノ酸の生産に関与する遺伝子であってもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、前記遺伝子は、ヒスチジン生合成に関連する酵素をコードする遺伝子であってもよいが、これに制限されるものではない。より具体的には、前記遺伝子は、ＨｉｓＥ及び／またはＨｉｓＧをコードする遺伝子であってもよいが、これに制限されるものではない。例えば、前記ｈｉｓＥ遺伝子及びｈｉｓＧ遺伝子はオペロンを構成してもよく、本出願のポリヌクレオチドはｈｉｓＥ及び／またはｈｉｓＧの転写活性を強化しうる。また、前記ｈｉｓＥ及びｈｉｓＧは内在的遺伝子であるか、外来遺伝子であってもよく、活性調節のための変異を含むものであってもよい。例えば、前記ＨｉｓＧはヒスチジンフィードバック阻害の解除のための変異を含むものであってもよい。前記ＨｉｓＥまたはＨｉｓＧをコードする遺伝子配列は、米国国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースを介して当業者が容易に入手してもよい。
【００４７】
本出願の目的上、前記遺伝子発現調節配列は、ヒスチジン生合成に関連された酵素をコードする遺伝子、具体的には、ｈｉｓＥ及び／またはｈｉｓＧの発現を増加させうる。  本出願のもう一つの様態は、前記ポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを提供する。
【００４８】
前記ポリヌクレオチドは、前述のとおりである。
【００４９】
具体的には、前記目的タンパク質は、ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼ（Phosphoribosyl-ATP pyrophosphatase：ＨｉｓＥ）、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）またはこれらの組み合わせであってもよい。前記目的タンパク質としてＨｉｓＥ及びＨｉｓＧ酵素はこれと相同性のあるタンパク質を含んでもよく、一部のアミノ酸が変異されたタンパク質であってもよい。１つの例として、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）は、配列番号１６で表されるＨｉｓＧアミノ酸配列の２３３番目及び２３５番目のアミノ酸がそれぞれヒスチジン（Ｈ）及びグルタミン（Ｑ）に置換されたものであってもよい。
【００５０】
本出願において、用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的遺伝子を発現させうるように遺伝物質を保有する人為的ＤＮＡ分子であって、前記ポリヌクレオチドまたは適合した遺伝子発現調節配列；及びこれに作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ製造物を意味する。
【００５１】
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で発現可能なものであれば特に制限されず、当業界に知られている任意のベクターを用いて宿主細胞を形質転換させてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。
【００５２】
例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＬＢ３、λＢＬ４、λＩＸＩＩ、λＡＳＨＩＩ、λＡＰＩＩ、λｔ１０、λｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。
【００５３】
また、宿主細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に内在的プロモーターを本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドと交替してもよい。例えば、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣ、ｐＣＥＳ２０８、ｐＸＭＪ１９ベクターなどを用いてもよいが、これに制限されない。
【００５４】
また、前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行ってもよい。
【００５５】
本出願のベクターは、相同組換えによって染色体内に挿入されうるため、前記染色体が挿入されたかどうかを確認するための選別マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、すなわちポリヌクレオチドの挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤（selective agent）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存するか、または他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別しうる。
【００５６】
本出願において、用語、「形質転換」は、前記ポリヌクレオチドまたは遺伝子発現調節配列及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを宿主細胞内に導入し、宿主細胞内で前記遺伝子が発現できるようにすることを意味する。さらに、宿主細胞内で目的遺伝子が発現することさえできれば、形質転換された前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子は、宿主細胞の染色体上に位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらすべての場合を含んでもよい。
【００５７】
前記形質転換する方法は、前記遺伝子発現調節配列及び目的タンパク質をコードする遺伝子を細胞内に導入するすべての方法を含み、宿主細胞に応じて、当分野で公知のように、適合した標準技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。
【００５８】
本出願のもう一つの様態は、前記ポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、コリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００５９】
前記ポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子は、先に説明した通りである。
【００６０】
本出願において、用語、「微生物」は、野生型微生物や、自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり弱化されるなどの原因によって特定機序が弱化されたり増強された微生物をすべて含む概念である。
【００６１】
本出願で、前記微生物は前記ポリヌクレオチドを含んでもよく、具体的には、前記ポリヌクレオチド及び／または前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結されて、目的タンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。または、前記微生物は前記ポリヌクレオチドまたは遺伝子発現調節配列及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターを含んでもよいが、これに制限されない。また、前記ポリヌクレオチド、前記目的タンパク質をコードする遺伝子及びベクターは、形質転換によって前記微生物に導入されてもよいが、これに制限されない。さらに、前記微生物は前記遺伝子が発現できれば、前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子が染色体上に位置するか、染色体外に位置するかとは関係がない。
【００６２】
本出願の目的上、前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含む微生物は、グルタミン酸の生成量が維持され、グリシンの生成量が増加されたものであってもよい。
【００６３】
例えば、前記微生物は、ＨｉｓＥ及び／またはＨｉｓＧの活性が強化されたものであってもよい。
【００６４】
本出願で前記微生物は、本出願のプロモーター活性を有するポリヌクレオチドが導入されてプロモーターとして作動できる微生物であれば、制限なく含まれてもよい。
【００６５】
具体的には、前記微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）またはコリネバクテリウム・フラバム（Corynebacterium flavum）であってもよく、最も具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよいが、これに制限されない。
【００６６】
本出願のもう一つの様態は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記の培地から目的物質を回収する段階を含む、目的物質を生産する方法を提供する。
【００６７】
前記ポリヌクレオチド及び微生物は、前述のとおりである。
【００６８】
本出願で、前記目的物質はアミノ酸であってもよい。具体的には、前記アミノ酸は別に言及しない限り、Ｌ−形態のアミノ酸であってもよく、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、トレオニン、セリン、システイン、グルタミン、メチオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、プロリン、及びこれらの組み合わせで構成された群から選択されてもよいが、これに制限されない。
【００６９】
より具体的には、前記アミノ酸はグルタミン酸、グリシンまたはこれらの組み合わせであってもよいが、これに制限されない。
【００７０】
本出願において、用語、「培養」は、微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願で前記ポリヌクレオチドを含む微生物を用いて目的物質を生産する方法は、当業界に広く知られている方法を用いて行ってもよい。具体的には、前記培養は、バッチ工程、注入バッチまたは反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）で連続式で培養してもよいが、これに制限されるものではない。培養に用いられる培地は、適切な方法で特定菌株の要件を満たす必要がある。コリネバクテリウム菌株に対する培養培地は公知されている（例えば、Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology、 Washington D.C.、 USA、 1981）。
【００７１】
培地中に用いられる糖源としては、ブドウ糖、サッカロース、乳糖、果糖、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などのようなオイル及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸が含まれる。これらの物質は、個別的に、または混合物として用いられてもよく、これに制限されるものではない。
【００７２】
用いられる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、大豆ミール、及び尿素または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源も、個別的に、または混合物として用いてもよく、これに制限されるものではない。
【００７３】
用いられるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウムを含有する塩が含まれてもよい。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記された原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加してもよい。
【００７４】
前記微生物の培養中に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアのような基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で用いて培養物のｐＨを調節してもよい。また、脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を用いて気泡の生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために培養物の内に酸素または酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。
【００７５】
培養物（培地）の温度は、通常２０℃〜４５℃、具体的には、２５℃〜４０℃であってもよい。培養時間は、所望の目的物質の生成量が得られるまで続けてもよいが、具体的には、１０〜１６０時間であってもよい。
【００７６】
培養物（培地）からの目的物質の回収は、当業界に知られている通常の方法によって分離されて回収されてもよい。これらの分離方法には、遠心分離、ろ過、クロマトグラフィー及び結晶化などの方法が用いられる。例えば、培養物を低速遠心分離してバイオマスを除去して得られた上澄み液を、イオン交換クロマトグラフィーを介して分離してもよいが、これに制限されるものではない。別の方法として、培養物（培地）から菌体分離及びろ過工程を行い、別の精製工程なしに目的物質を回収してもよい。別の方法として、前記回収段階は、精製工程をさらに含んでもよい。
【００７７】
本出願のもう一つの様態は、前記コリネバクテリウム属微生物を培地で培養して発酵する段階を含む、発酵組成物の製造方法を提供する。
【００７８】
本出願のもう一つの様態は、前記方法により製造された発酵組成物を提供する。
【００７９】
前記ポリヌクレオチド及び微生物は先に説明した通りであり、前記微生物を培地で培養する段階も前述した通りである。
【００８０】
本出願において、用語、「前記発酵組成物」は、本出願の微生物を培養して得られた組成物を意味する。さらに、前記発酵組成物は、前記微生物を培養した後、適切な後処理工程を経た後、得られた液状または粉末形態の組成物を含んでもよい。この時、適切な後処理工程は、例えば、前記微生物の培養工程、菌体除去工程、濃縮工程、ろ過工程、及び担体混合工程を含んでもよく、追加で乾燥工程をさらに含んでもよい。場合に応じて、前記後処理工程は、精製工程を含まなくてもよい。前記発酵組成物は、本出願の微生物を培養することにより、一定水準のグルタミン酸の含量を維持しつつ、グリシンの含量が増加された組成物を含むことにより、最適な味を出せる。
【００８１】
また、「前記発酵組成物」は、前記の液状または粉末形態の組成物が含まれた調味素材の製品（例えば、スープ用粉末製品、スナックシーズニング製品など）を排除しない。さらに、「前記発酵組成物」は、本出願の微生物を培養して得られた組成物を含みさえすれば、非発酵の工程で得られた物質及び／または非天然の工程で得られた別の物質をさらに混合した場合を排除しない。
【００８２】
以下、本出願の実施例を介してより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのもので、本出願の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００８３】
実施例１．グリシン生成能増加変異株の選別
実施例１-１．ＵＶ調査を介したランダム突然変異の誘発
発酵の目的産物であるグリシンの生成能が向上された変異菌株を選別するために、まず野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum、ＡＴＣＣ１３８６９）を寒天を含む栄養培地に塗抹して、３０℃で１６時間培養した。このように獲得した数百個のコロニーを室温でＵＶを照射して菌株内ゲノム上にランダム突然変異を誘発させた。
【００８４】
実施例１-２．突然変異誘発菌株の発酵力価の実験及び菌株の選別
以後、ランダム突然変異が誘発された前記突然変異菌株を対象に発酵力価実験を実施した。
【００８５】
それぞれのコロニーを栄養培地で継代培養した後、発酵培地で５時間培養した。その後、それぞれの培地に２５％ツイン４０（tween40）を０．４％濃度で追加し、それぞれのコロニーを再び３２時間培養した。
【００８６】
栄養培地：
グルコース１％、肉汁０．５％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母エキス０．５％、寒天２％、ウレア０．２％、ｐＨ７．２
発酵培地：
粗糖６％、炭酸カルシウム５％、硫酸アンモニウム２．２５％、１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０４％、硫酸鉄１０ｍｇ ／Ｌ、ビオチン０．３ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．２ｍｇ／Ｌ
前記条件でそれぞれのコロニーを培養して、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）と同等するか、それ以上のＬ−グルタミン酸を生産する突然変異菌株が選別された。また、選別した突然変異菌株に対してＹＳＩを用いてＬ−グルタミン酸濃度を測定し、ＨＰＬＣを用いてグリシン濃度を測定した。測定したＬ−グルタミン酸及びグリシンの濃度は下記表１に示した。
【００８７】
【表１】
2021517802.tif 000001
【００８８】
表１を参照して、野生型菌株に比べてグルタミン酸の生産量が同等水準またはそれ以上であり、グリシンの生産量が増加した菌株として、「ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ３」、「ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ６」、「ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ１０」及び「ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ２０」を選別した。
【００８９】
実施例２．遺伝子シーケンシングを介した変異の確認
前記突然変異菌株の遺伝子変異を確認するために、前記ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ３、ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ６、ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ１０及びＡＴＣＣ１３８６９−ｇ２０菌株の遺伝子をシーケンシングして野生型菌株と比較した。
【００９０】
その結果、前記ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ３及びＡＴＣＣ１３８６９−ｇ１０菌株がホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼ（Phosphoribosyl-ATP pyrophosphatase：ＨｉｓＥ）をコードする遺伝子のプロモーター領域（promoter region）の特定位置に同一の変異を含んでいることを確認した。また、ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ２０菌株の場合、ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ３及びＡＴＣＣ１３８６９−ｇ１０菌株のＨｉｓＥをコードする遺伝子のプロモーター領域の特定位置に同一の変異の他に１つの変異をさらに含んでいることを確認した。
【００９１】
具体的には、ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ３及びＡＴＣＣ１３８６９−ｇ１０は、配列番号１で表されるプロモーター領域の配列内の５３番目ヌクレオチドであるＡがＴに、５５番目ヌクレオチドであるＧがＴに置換された変異を含んでいることを確認した。ＡＴＣＣ１３８６９−ｇ２０は、配列番号１で表されるプロモーター領域の配列内の５３番目ヌクレオチドであるＡがＴに、５５番目ヌクレオチドであるＧがＴに、６０番目ヌクレオチドであるＴがＧに置換された変異を含んでいることを確認した。配列番号１で表される前記プロモーター領域は、コリネバクテリウム属微生物、より具体的には、野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３８６９、ＡＴＣＣ１４０６７）に共通的に含まれる配列であることを確認した。
【００９２】
したがって、以下実施例３及び４では、前記変異がコリネバクテリウム属微生物のグルタミン酸及びグリシン生成量に影響を与えるかを確認した。
【００９３】
実施例３．変異が導入された菌株の製作及びグリシン生産量の確認
実施例３−１．変異が導入された菌株の製作
前記実施例２を介して確認した変異が導入された変異菌株を製作した。具体的には、前記変異を野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）に導入（配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の５３番目と５５番目ヌクレオチドをＴに置換、あるいは配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の５３番目と５５番目ヌクレオチドをＴに置換及び６０番目ヌクレオチドをＧに置換）するために、ターゲット変異を含む逆方向のオリゴヌクレオチドを７５マー（mer）の長さにデザインした（配列番号４あるいは配列番号５）。
【００９４】
具体的には、前記配列番号４あるいは配列番号５のオリゴヌクレオチド３０μｇをコリネバクテリウム・グルタミカム野生型ＡＴＣＣ１３８６９菌株とＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気パルス法（非特許文献５）で形質転換し、複合液体培地を１ｍｌ添加して、３０℃で３０分間、１６０ｒｐｍで振とう培養した。その後、培養液を氷で１０分間インキュベーション（incubation）して、４℃で１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離した後、上澄み液を除去して菌体を確保した。その後、４℃の１０％グリセロール溶液を１ｍｌ添加して混合した後、４℃で１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、上澄み液を除去して菌体を洗浄した。このように菌体を１回さらに洗浄し、４℃の１０％グリセロール溶液を０．１ｍｌ添加して、次の形質転換のための菌株を準備した。その後、前記のような電気パルス法で前記配列番号４あるいは配列番号５のオリゴヌクレオチドを用いて形質転換する過程を１０回繰り返した後、複合平板培地に塗抹してコロニーを確保した（非特許文献６）。
【００９５】
前記確保したコロニーの遺伝子配列解析を行った結果、菌株に前記のターゲット変異が導入されたことを確認し、変異が導入された前記菌株を「ＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ」、「ＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−３ｍｔ」及び「ＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ」、「ＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−３ｍｔ」と命名した。
【００９６】
実施例３−２．グリシン生産量の確認
前記実施例３−１を介して製作した変異菌株ＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−３ｍｔ及びＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−３ｍｔと、これらの各野生型コリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９及びＡＴＣＣ１３０３２）は、それぞれ実施例１−２と同様の方法で培養した。
【００９７】
培養が完了した後、各培地内のＬ−グルタミン酸の濃度及びグリシンの濃度を測定した。測定したＬ−グルタミン酸及びグリシンの濃度は表２に示した。
【００９８】
【表２】
2021517802.tif 000002
【００９９】
表２に示すように、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ、ＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−３ｍｔ及びＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ、ＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−３ｍｔ菌株が生産したＬ−グルタミン酸の濃度は、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９及びＡＴＣＣ１３０３２菌株が生産したＬ−グルタミン酸濃度と類似していることを確認した。
【０１００】
一方、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９及びＡＴＣＣ１３０３２菌株は、グリシンをそれぞれ１２２及び７３ｍｇ／Ｌ生産したが、ＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ及びＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ菌株はそれぞれ１３４及び９１ｍｇ／Ｌ生産することを確認し、野生型菌株に比べて変異された菌株で生産されたグリシン濃度がより高いことを確認した。また、ＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−３ｍｔ及びＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−３ｍｔ菌株は、グリシンをそれぞれ１４１及び９９ｍｇ／Ｌ生産し、ＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ及びＡＴＣＣ１３０３２：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ菌株に比べても、生産されたグリシンの濃度がもっと高いことを確認した。
【０１０１】
すなわち、前記変異は、微生物のＬ−グルタミン酸の生成能にはほとんど影響を与えずに維持しつつ、グリシン生成能を著しく増加させることを確認した。
【０１０２】
一方、前記ＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−２ｍｔ及びＡＴＣＣ１３８６９：：ｈｉｓＥＧ−ｐｒｏ−３ｍｔ菌株は、２０１８年２月２８日付及び２０１９年３月１４日付でブダペスト条約下の寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に、菌株名「ＣＡ０２−９２０６」及び「ＣＡ０２−９２１５」として国際寄託して「ＫＣＣＭ１２２２６Ｐ」及び「ＫＣＣＭ１２４５７Ｐ」の寄託番号を付与された。
【０１０３】
実施例４．変異が導入されたＫＦＣＣ１１０７４のグルタミン酸及びグリシン生成量の確認
実施例４−１．変異が導入されたベクターの製作
野生型菌株の他に、グルタミン酸の生産能が増加された菌株でも前記変異が同様の効果を示すかどうかを確認するために、グルタミン酸生産菌株として知られているＫＦＣＣ１１０７４菌株（特許文献５）に変異を導入した。
【０１０４】
具体的には、前記菌株が含む配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドをＴに置換、または配列番号１で表されるポリヌクレオチド配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドをＴに置換及び６０番目ヌクレオチドをＧに置換するために遺伝子置換ベクターを製作した。ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ１３８６９ゲノミックＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを介して獲得した。米国国立衛生研究所ジーンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）遺伝子及び周辺の塩基配列に対する情報に基づいて、配列番号６、７、８、９、１０及び１１のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作した。
【０１０５】
ＰＣＲの条件は９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。より具体的には、配列番号６及び７のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドと配列番号８及び９のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドを得た。前記得られた２つの遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＤＺベクター（特許文献３及び６）にインフュージョン酵素を用いて連結することにより、ｈｉｓＥプロモーターを含む１つの遺伝子置換ベクターを製作し、これを「ｐＤＺ−ｈｉｓＥ−ｐｒｏ−２ｍｔ」と命名した。また、配列番号６及び１１のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドと配列番号１０及び９のプライマーを用いて増幅した５００ｂｐのポリヌクレオチドを得た。前記得られた２つの遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＤＺベクター（特許文献３及び６）にインフュージョン酵素を用いて連結することにより、ｈｉｓＥプロモーターを含む１つの遺伝子置換ベクターを製作し、これを「ｐＤＺ−ｈｉｓＥ−ｐｒｏ−３ｍｔ」と命名した。前記のベクター製作のために用いられたプライマー配列情報は、下記表３に示した。
【０１０６】
【表３】
2021517802.tif 000003
【０１０７】
実施例４−２．変異が導入されたＫＦＣＣ１１０７４の製作及びグルタミン酸及びグリシン生成量の確認
前記実施例４−１を介して製作した遺伝子置換ベクターであるｐＤＺ−ｈｉｓＥ−ｐｒｏ−２ｍｔ及びｐＤＺ−ｈｉｓＥ−ｐｒｏ−３ｍｔをＫＦＣＣ１１０７４菌株に電気穿孔法で導入して、変異が導入されたグルタミン酸及びグリシン生産菌株「ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ」及び「ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ」を製作した。具体的には、形質転換（非特許文献５）を介して製作し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した寒天栄養培地から選別した。選別した１次菌株を再び２次交差（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）を経て、ターゲット変異２つ及び３つが導入された菌株をそれぞれ選別した。最終形質転換された菌株の変異（置換）有無は、配列番号６及び９のプライマー対を用いてＰＣＲを行った後にシーケンシングを介して確認した。
【０１０８】
その後、選別した菌株ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ及びＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧを栄養培地に塗抹して３０℃で１６時間培養した。その後、１２１℃で１５分間加圧殺菌された発酵培地２５ｍｌを２５０ｍｌの振とう用三角フラスコに分注して栄養培地で培養された菌株を接種して４８時間培養した。培養条件は、回転数２００ｒｐｍ、温度３７℃、ｐＨ８．０で調節した。前記栄養培地は発酵培地の組成は次のとおりである。
【０１０９】
栄養培地：
グルコース１％、肉汁０．５％、ポリペプトン１％、塩化ナトリウム０．２５％、酵母エキス０．５％、寒天２％、ウレア０．２％、ｐＨ７．２
発酵培地：
粗糖６％、炭酸カルシウム５％、硫酸アンモニウム２．２５％、１リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０４％、硫酸鉄１０ｍｇ ／Ｌ、ビオチン０．３ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．２ｍｇ／Ｌ
培養終了後、ＨＰＬＣを用いた方法を介してＬ−グルタミン酸及びグリシン生産量を測定し、測定結果は、下記表４に示した。
【０１１０】
【表４】
2021517802.tif 000004
【０１１１】
表４に示すように、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ及びＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ菌株が生産したＬ−グルタミン酸の濃度は、変異が導入されないコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４菌株が生産したＬ−グルタミン酸の濃度と類似していることを確認した。
一方、前記ＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ及びＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ菌株が生産したグリシンの濃度は、前記ＫＦＣＣ１１０７４が生産したグリシンの濃度に比べて、それぞれ３３ｍｇ／Ｌ及び４２ｍｇ／Ｌ増加することを確認した。
すなわち、前記変異は微生物のＬ−グルタミン酸の生成能にはほとんど影響を与えずに維持しつつ、グリシン生成能を著しく増加させることを確認した。  
【０１１２】
実施例５．ＨｉｓＧフィードバック抑制の解除変異が導入された菌株の製作及びグルタミン酸及びグリシン生成量の確認
実施例５−１．ｈｉｓＧフィードバック抑制の解除変異が導入されたベクターの製作
前記実施例１−１〜４−２を介してｈｉｓＥＧ遺伝子のプロモーター内の変異によって菌株のグリシン生成能が増加されることを確認し、グリシン生成能の増加に対する効果を極大化するために菌株にヒスチジンフィードバック抑制を解除した変異を導入して、そのグリシン生産能を確認した。 
一方、ｈｉｓＥとｈｉｓＧ遺伝子はオペロンで構成されて、これら遺伝子はヒスチジン生合成経路に関与する遺伝子である。特に、前記ＨｉｓＧは、生産物であるヒスチジンによりフィードバック抑制を受けるためフィードバック抑制が解除された変異を導入してＨｉｓＧの活性を増加させる場合、菌株のグリシン生産能が増加するかどうかを確認した。
具体的には、ｈｉｓＧ遺伝子に文献上に知られているＧ２２３Ｈ及びＴ２３５Ｑ変異（非特許文献７）を導入した。配列番号１６で表されるｈｉｓＧアミノ酸配列の２３３番目及び２３５番目のアミノ酸をそれぞれＨとＱに置換するために、遺伝子置換ベクターを製作した。ベクターを製作するための遺伝子断片は、ＡＴＣＣ１３８６９ゲノミックＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲを介して獲得した。米国国立衛生研究所ジーンバンク（NIH GenBank）に登録されているコリネバクテリウム・グルタミカム（ＡＴＣＣ１３８６９）遺伝子及び周辺の塩基配列に対する情報に基づいて、配列番号１２、１３、１４及び１５のポリヌクレオチドを含むプライマーを製作した。
ＰＣＲの条件は９５℃で５分間変性した後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で１分の重合を３０回繰り返した後、７２℃で５分間重合反応を行った。配列番号１２及び１３のプライマーを用いて増幅した７２２ｂｐのポリヌクレオチドと配列番号１４及び１５のプライマーを用いて増幅した７９８ｂｐのポリヌクレオチドを得た。前記得られた２つの遺伝子断片を制限酵素ＳａｌＩで切断したｐＤＺベクター（特許文献５及び６）にインフュージョン酵素を用いて連結することにより、ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）変異を含むポリヌクレオチドが含まれた１つの１．５ｋｂｐ遺伝子置換ベクターを製作し、これを「ｐＤＺ−ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）」と命名した。前記のベクター製作のために用いられたプライマー配列情報は、下記表５に示した。
【０１１３】
【表５】
2021517802.tif 000005
【０１１４】
実施例５−２．ＨｉｓＧフィードバック抑制の解除変異が導入されたｈｉｓＥプロモーター変異菌株の製作及び評価
前記実施例５−１を介して製作した遺伝子置換ベクター「ｐＤＺ−ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）」をＫＦＣＣ１１０７４菌株に導入してＨｉｓＧフィードバック抑制が解除された「ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）」菌株を製作した。また、前記ベクターをＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧとＫＦＣＣ１１０７４_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ菌株に導入して、本出願の変異が導入された「ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ」と「ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ」菌株を製作した。
【０１１５】
具体的には、前記菌株は形質転換（非特許文献５）を介して製作し、相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株をカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した寒天栄養培地から選別した。選別した１次菌株を再び２次交差（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）を経て、ターゲットＧ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ変異が導入された菌株を選別した。最終的に形質転換された菌株の変異（置換）有無は、配列番号１２及び１５のプライマー対を用いてＰＣＲを行った後にシーケンシングを介して確認した。
【０１１６】
その後、選別した菌株ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）、ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）_Ｐｒｏ（２ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ及びＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ／Ｔ２３５Ｑ）_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧを実施例４−２と同様な方法で培養して、培養が完了された後に各培地内のＬ−グルタミン酸濃度及びグリシン濃度を測定した。測定したＬ−グルタミン酸及びグリシンの濃度は、下記表６に示した。
【０１１７】
【表６】
2021517802.tif 000006
【０１１８】
表６に示すように、ｈｉｓＥＧプロモーター変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ(Ｇ２３３Ｈ/Ｔ２３５Ｑ)_Ｐｒｏ(２ｍｔ)_ｈｉｓＥＧとＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ(Ｇ２３３Ｈ/Ｔ２３５Ｑ)_Ｐｒｏ(３ｍｔ)_ｈｉｓＥＧ菌株が生産したＬ−グルタミン酸の濃度は、ＨｉｓＧフィードバック抑制が解除された変異のみ導入されたＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ(Ｇ２３３Ｈ/Ｔ２３５Ｑ)菌株が生産したＬ−グルタミン酸濃度と類似していることを確認した。
【０１１９】
一方、前記ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ(Ｇ２３３Ｈ/Ｔ２３５Ｑ)_Ｐｒｏ(２ｍｔ)_ｈｉｓＥＧとＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ(Ｇ２３３Ｈ/Ｔ２３５Ｑ)_Ｐｒｏ(３ｍｔ)_ｈｉｓＥＧ菌株が生産したグリシンの濃度は、前記ＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ(Ｇ２３３Ｈ/Ｔ２３５Ｑ)が生産したグリシン濃度に比べて、３１４．３ｍｇ／Ｌ及び３３７．５ｍｇ／Ｌとして著しく増加することを確認した。
【０１２０】
すなわち、前記変異は微生物のＬ−グルタミン酸生成能にはほとんど影響を与えずに維持しつつ、グリシン生成能を著しく増加させることを確認した。
また、このような効果はｈｉｓＥとｈｉｓＧの活性増加により示すことが分かった。
【０１２１】
実施例６．調味素材製品の製造のための発酵組成物の製造
前記のように、本出願のヌクレオチドを含む菌株がＬ−グルタミン酸の生成能にほとんど影響を与えずにグリシンの生成能が増加されることを確認した。したがって、本出願のヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物を用いた発酵組成物を製造した。
【０１２２】
例示的に、基本的によく知られている調味料素材であるグルタミン酸を主成分として製造し、豊かな味の構成を高めるために、他の調味料素材の副産物成分を増加させるために、発酵菌株及び発酵過程を調節した。
【０１２３】
実施例６−１．５Ｌ発酵槽を用いた発酵組成物の製造
具体的に、実施例５で用いた菌株に対して５Ｌ発酵槽を用いた発酵組成物を製造した。
【０１２４】
培養培地の製造に用いられた成分はすべて食品等級に該当する成分だけを用いた。
１次種培地：グルコース１％、酵母抽出物１％、ペプトン１％、硫酸アンモニウム０．１％、塩化ナトリウム０．２５％、リン酸第１カリウム0.１５％、リン酸第２カリウム０．１５％を含有して、ｐＨが８．０である１次種培地を製造した。
【０１２５】
２次種培地：純度９８．５％のオーガニック粗糖４．６％、硫酸マグネシウム０．０５％、酵母抽出物０．５％、リン酸第１カリウム０．２％、硫酸鉄０．００２％、ビオチン１ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩２ｍｇ／Ｌ及びわずかの消泡剤を含有し、ｐＨが７．２である２次種培地を製造した。
【０１２６】
発酵培地：純度９８．５％のオーガニック粗糖４％、硫酸マグネシウム０．０３％、酵母抽出物１％、リン酸０．２２％、水酸化カリウム０．４％、ビオチン０．２ｍｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩０．６ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン０．００２％、硫酸鉄０．００２％、硫酸亜鉛０．００２％、硫酸銅０．０００６％及びわずかの消泡剤を含有し、ｐＨが７．４である発酵培地を製造した。
【０１２７】
前記１次種培地５０ｍｌを５００ｍｌ容量の振とう用三角フラスコに分注し、１２１℃で２０分間加圧殺菌して冷却した後、前記菌株をそれぞれ接種し、回転数２００回／分、温度３０℃で５〜７時間振とう培養した。
【０１２８】
前記２次種培地を１．５Ｌ容量の試験発酵槽に０．２５Ｌ調製して、１２１℃で ２０分間加圧殺菌して冷却させた後、前記１次種培養液を５０ ｍｌ接種した後、回転数９００回／分、３１．５℃で１５時間培養した。
【０１２９】
前記発酵培地を５Ｌ容量の試験発酵槽に０．２５Ｌ調製して、１２１℃で２０分間加圧殺菌して冷却させた後、前記２次種培養液０．２６Ｌを接種した後、回転数９００回／分、３０〜３４℃で培養した。
【０１３０】
前記条件で培養しながら前記コリネバクテリウム・グルタミカムの培養中発酵液のｐＨが７．０〜７．４の範囲になるように２８％アンモニア水を用い、続けて調節した。培養中の残糖の濃度が０．５〜１．５％になると殺菌されたオーガニック粗糖を随時投入して添加された糖の合計が発酵液量に比べて、３０〜３４％になるまで続けて培養した。
【０１３１】
【表７】
2021517802.tif 000007
【０１３２】
その結果、前記表７に示すように、両菌株間のグルタミン酸の生産量はあまり差がなく、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ/ Ｔ２３５Ｑ）_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ菌株が生産した発酵液内のグリシンの含量が著しく増加することを確認した。
【０１３３】
３ｋＬ発酵槽を用いた発酵組成物の場合にも、両菌株間のグルタミン酸の生産量はあまり差がなく、変異が導入されたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１０７４_ｈｉｓＧ（Ｇ２３３Ｈ/ Ｔ２３５Ｑ）_Ｐｒｏ（３ｍｔ）_ｈｉｓＥＧ 菌株はＫＦＣＣ１１０７４菌株に比べて、グルタミン酸の生産量に大きな差がないのに（６４．２ｇ／Ｌ ｖｓ ７３ｇ／Ｌ）グリシンの含量が著しく増加（０．２ｇ／Ｌ vs ３．２ｇ／Ｌ）したことを確認した。
【０１３４】
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、制限的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
2021517802.tif 000008
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【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表されるヌクレオチド配列の５３番目及び５５番目ヌクレオチドがＴに置換されるか、５３番目及び５５番目ヌクレオチドがＴに置換されて６０番目ヌクレオチドがＧに置換された、プロモーター活性を有するポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列からなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、目的タンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結される、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項１または２のポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、ベクター。
【請求項５】
前記目的タンパク質が、ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼ（Phosphoribosyl-ATP pyrophosphatase：ＨｉｓＥ）、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）またはこれらの組み合わせである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチド；及び前記ポリヌクレオチドと作動可能に連結された目的タンパク質をコードする遺伝子を含む、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２または配列番号３のヌクレオチド配列からなる、請求項６に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項８】
前記目的タンパク質が、ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼ（Phosphoribosyl-ATP pyrophosphatase：ＨｉｓＥ）、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）またはこれらの組み合わせである、請求項７に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項９】
前記ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ATP phosphoribosyltransferase：ＨｉｓＧ）が、配列番号１６で表されるＨｉｓＧアミノ酸配列の２３３番目及び２３５番目のアミノ酸がそれぞれヒスチジン（Ｈ）及びグルタミン（Ｑ）に置換された、請求項８に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項１０】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項６〜９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１１】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び前記の培地から目的物質を回収する段階；を含む、目的物質を生産する方法。
【請求項１２】
前記目的物質が、アミノ酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養して発酵する段階を含む、発酵組成物の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により製造された、発酵組成物。