【手続補正書】
【提出日】令和3年1月26日(2021.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、（ｉｉｉ）前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞。
【請求項２】
マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
４つのＲＴＳを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
６つのＲＴＳを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項５】
少なくとも１つのＲＴＳが、配列番号１〜３０からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
少なくとも１つのＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが、単一の染色体座位に組み込まれている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記染色体座位が、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨａ、ＭＧＡＴ１、ＧＲＩＫ１、ＮＬ１、ＮＬ２、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロン、又は発現増強及び安定性領域である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
第２のＡｄ遺伝子を更に含み、前記第２のＡｄ遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記第２のＡｄ遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記第２のＡｄ遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項１０又は１１に記載の細胞。
【請求項１３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子を更に含み、前記ＡＡＶ遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記ＡＡＶ遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
ＡＡＶベクターカセットを更に含み、前記ＡＡＶベクターカセットが染色体に組み込まれている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記ＡＡＶベクターカセットが、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ヘルパーウイルスを実質的に含まない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）アデノウイルス（Ａｄ）遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせと、（ｉｉｉ）前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞。
【請求項１９】
（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子とを含み、前記ＲＴＳ及び前記ＡＡＶ遺伝子が染色体に組み込まれている哺乳動物細胞。
【請求項２０】
ａ．６つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、
ｂ．Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、
ｃ．前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターであって、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている、前記プロモーターと、
ｄ．Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子であって、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、前記第２のＡｄ遺伝子と、
ｅ．Ｒｅｐ及びＣａｐを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子であって、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、前記ＡＡＶ遺伝子と、
ｆ．レポーター遺伝子、選択遺伝子又は治療目的遺伝子を含み、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、ＡＡＶベクターカセットと
を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
【請求項２１】
Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子及び前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターと、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子と、Ｒｅｐ及びＣａｐを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子と、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含むＡＡＶベクターカセットとを含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
【請求項２２】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プロデューサー細胞を生産する方法であって、
ａ．少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、
ｂ．（ａ）で用意された前記細胞に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子、第２のＡｄ遺伝子、ＡＡＶベクターカセット又はそれらの組み合わせをコードする交換可能なカセットを含むベクターをトランスフェクトするステップと、
ｃ．染色体に前記交換可能なカセットを組み込むステップと、
ｄ．前記染色体に組み込まれた前記交換可能なカセットを有するｒＡＡＶプロデューサー細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２３】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生産する方法であって、（ｉ）宿主細胞にｒＡＡＶを感染させるステップと、（ｉｉ）ＡＡＶベクターカセットでパッケージングされたｒＡＡＶを生産するステップと、（ｉｉｉ）前記パッケージングされたｒＡＡＶを精製するステップとを含み、前記宿主細胞が、
ａ．少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、
ｂ．Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、
ｃ．前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターであって、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている、前記プロモーターと、
ｄ．Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む第２のＡｄ遺伝子と、
ｅ．Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子と、
ｆ．レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含むＡＡＶベクターカセットと
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
【図１Ａ】図１は、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生産を示す。ＨＥＫ２９３細胞において、プラスミドによる３重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）において、ヘルパーウイルスとの同時感染（ｗｔ  Ａｄ５）による２重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）及びｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。図１Ａは実験計画の概略図を示す。
【図１Ｂ】図１は、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生産を示す。ＨＥＫ２９３細胞において、プラスミドによる３重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）において、ヘルパーウイルスとの同時感染（ｗｔ  Ａｄ５）による２重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）及びｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。図１Ｂは、トランスフェクトしたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞（左）、及びトランスフェクトしたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞からのライセートを感染させたＨＥＫ２９３細胞（右）の、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）シグナルの検出を示す。
【図１Ｃ】図１は、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生産を示す。ＨＥＫ２９３細胞において、プラスミドによる３重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）において、ヘルパーウイルスとの同時感染（ｗｔ  Ａｄ５）による２重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）及びｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。図１Ｃは、ウイルスゲノムＤＮＡのｑＰＣＲ解析による、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３（コントロール）細胞のｒＡＡＶ力価の定量を示す。
【図２】図２はｐＭＦ３０ベクターの図を示す。ＧＳ選択マーカーを担持するＴＥＴ誘導可能なベクターにＥ１Ａが存在する。
【図３】図３はｐＭＦ２３ベクターの図を示す。ＰＡＣ選択マーカーを担持する構成的ベクターにＥ１Ｂが存在する。
【図４】図４は、ｐＸＣ１７．４＿１７Ａｄ５ＰｅｒＰｒｏＫＺベクターの図を示す。Ｑｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：１９０４−１３（２００２）に記載のように、単一のプロモーターからＥ１Ａ及びＥ１Ｂを発現させた（２つの遺伝子の間のウイルス制御領域、並びにＥ１Ａ及びＥ１Ｂコーディング配列の間に位置するウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド４９８〜３６３５）が保持されている）。アノテーションは、Ｑｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７６：１９０４−１３（２００２）に記載される座標と一致する。
【図５Ａ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ａは実験計画の概略図である。
【図５Ｂ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｌ、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂ）プールにおける、Ｅ１Ａに関するゲノムＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。
【図５Ｃ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｌ、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂプールにおける、Ｅ１Ｂに関するゲノムＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。
【図５Ｄ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ｄは、ドキシサイクリンで処理したＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｌ、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂプールにおける、Ｅ１Ａに関するＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。
【図５Ｅ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ｅは、ドキシサイクリンで処理したＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｌ、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂプールにおける、Ｅ１Ｂに関するＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。
【図５Ｆ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。パネルＦは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂプールにおける、Ｅ１Ａ及びβ−アクチンに関する、タンパク質ライセートのウエスタンブロット解析を示す。
【図６】図６は、ｐＲＣ２−ｍｉＲＮＡ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（図６Ａ）、ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（図６Ｂ）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）（図６Ｃ）のベクターの図を示す。
【図７】図７は、部位特異的組込み細胞株であるＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３における、３つの独立して指定可能な部位特異的組込み部位（ＳＳＩＳ）の概略図を示す。図７Ａは、１重又は２重機能レポート／マーカー遺伝子を含むランディングパッド１の配置を示す。レポーター遺伝子は、ＳＶ４０Ｅプロモーターの制御下であり、ＳＶ４０のポリＡ配列を有する。リコンビナーゼにより媒介されるカセット交換（ＲＭＣＥ）のため、不和合性のＦｒｔ部位が、ＳＶ４０プロモーターとｈｐｔ−ｅＧＦＰ遺伝子との間（Ｆｒｔ−Ａ）、及びＳＶ４０ポリＡ配列の５’側（Ｆｒｔ−Ｂ）に位置する。図７Ｂ及び図７Ｃは、ペイロード配列の独立したターゲッティングを可能にする、不和合性のＦｒｔ部位（Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ）及び異なるレポーターを含む下に続くランディングパッドの配置を示す。この場合、Ｆｒｔ部位Ａ〜Ｆは、表２に記載されるいずれかでありうる。
【図８】図８は、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）−ＡＡＶプロデューサー細胞の調製方法の体系的概略図を示す。ＳＳＩＳを用いてアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子（ヘルパー遺伝子）、ＡＡＶ遺伝子（Ｒｅｐ／Ｃａｐ）及びＡＡＶベクターカセット（例えばＩＴＲ−ＧＯＩ−ＩＴＲ）を導入し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）には、更にＡｄ遺伝子（Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ）を誘導性プロモーターと共に他の部位に導入する。この場合、Ｆｒｔ部位Ａ〜Ｆは、表２に記載されるいずれかでありうる。図８Ａは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３宿主の単一部位の配置を示す。Ａｄヘルパー遺伝子はＳＳＩＳで組み込まれ、ＧＯＩ／Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子はプラスミドから一過性に発現される。図８Ｂは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３宿主の２重部位の配置を示す。Ａｄヘルパー及びＲｅｐ／Ｃａｐ遺伝子は２つの別々のＳＳＩＳで組み込まれ、ＧＯＩはプラスミドから一過性に発現される。図８Ｃは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３宿主の３重部位の配置を示す。ヘルパー、Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びＧＯＩ遺伝子は、３つの別々のＳＳＩＳで組み込まれる。いくつかの場合、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子はＳＳＩＳにおいて組み込まれ、発現を強化する。
【図９】図９は、異なる部位におけるＧＯＩ及びＲｅｐ／Ｃａｐ遺伝子の部位特異的組込みを利用した、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）部位特異的組込み（ＳＳＩ）宿主におけるｒＡＡＶ生産の概略図を示す。ｒＡＡＶを生産するため、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主に野生型Ａｄ５を感染させ、ｒＡＡＶ複製のために必要とされるヘルパー遺伝子機能を提供した。
【図１０】図１０は、ＧＯＩベクターの概略図及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主の部位特異的組込みのためのＲｅｐ／Ｃａｐ遺伝子の４つのデザインを示す。全てのベクターには２つのＦｒｔ部位が側面に隣接し、それによりＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主細胞へのＳＳＩの導入が可能となる。図１０Ａは、ベクターｐＬＭＣ３１の構成（ＡＡＶカセットの両末端にＩＴＲが隣接するｅＧＦＰレポーター遺伝子を有するｒＡＡＶベクターをコード）を図式的に示す。本ベクターの選択マーカーはネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩ遺伝子であり、Ｆｒｔ部位はＮＬ１のターゲッティングのために配置される。図１０Ｂは、ベクターｐＬＭＣ３２（ＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をコード）の構成を図式的に示す。このベクターは、Ｒｅｐの５’側に、２つのエンハンサーエレメントを含む、Ｒｅｐ発現を減少させｒＡＡＶ生産を抑制するための、最小ｐ５プロモーター（白い正方形）を含み、またＣａｐの３’側に、Ｃａｐの発現を強化する完全ｐ５プロモーター（白黒の正方形）を含む。図１０Ｃは、ベクターｐＬＭＣ３３（ＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をコード）の構成を図式的に示す。このベクターは、Ｒｅｐの５’側に最小ｐ５プロモーター（白い正方形）を含み、またＣａｐの３’側に、ＴＡＴＡボックスをＧＧＧＧＧＧＧに変異させてプロモーター活性を減少させたｐ５ｍｕｔプロモーター（黒及び灰色の正方形）を含む。図１０Ｄは、ここでもＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をコードするベクターｐＬＭＣ３４の構成を図式的に示す。ベクターは、Ｒｅｐの５’側に野生型ｐ５プロモーター（白及び黒の正方形）を含み、またＣａｐの３’側に変異ｐ５プロモーター（黒及び灰色の正方形）を含む。図１０Ｅは、ここでもＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をコードするベクターｐＬＭＣ３５の構成を図式的に示す。このベクターは、Ｒｅｐの５’側及びＣａｐの３’側に変異ｐ５プロモーター（黒及び灰色の正方形）を含む。ｐＬＭＣ３２からｐＬＭＣ３５の選択マーカーはＧＳ  ｃＤＮＡであり、Ｆｒｔ部位はＦｅｒ１Ｌ４へのターゲッティングのために配置される。
【図１１】図１１は、ウエスタンブロット解析によるＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞におけるＥ１Ａ、Ｒｅｐ及びＣａｐのタンパク質発現を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ＧＯＩ（ｐＬＭＣ３１）及び１つのＲｅｐ−Ｃａｐベクター（ｐＬＭＣ３２〜３５）でトランスフェクション、又はｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で３重トランスフェクトした。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞に野生型Ａｄ５を感染させ、ＧＯＩ（ｐＬＭＣ３１）及び１つのＲｅｐ−Ｃａｐベクター（ｐＬＭＣ３２〜３５）をトランスフェクト、又は野生型Ａｄ５を感染させ、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、タンパク質ライセートをウエスタンブロッティングで解析した。図１１Ａは、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒ、Ｅ１Ａ  ２４３Ｒ及びＥ１Ａ  １７１Ｒの、３つのＥ１Ａアイソフォームのレベルを示す（Ｒａｄｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  １０：ｅ０１４０１２４）。Ｅ１Ａタンパク質レベルは、マウス抗Ｅ１Ａ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３３１８３）を１：１０００に希釈したものを使用して検出した。Ｅ１Ａ、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質アイソフォームの分子量を括弧内に示す。異なるベクターによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３又はＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、Ｅ１Ａタンパク質レベルに変化がなかったが、各Ｅ１Ａアイソフォームのタンパク質レベルは、ＨＥＫ２９３とＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞との間で異なった。図１１Ｂは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質のレベルを示す。マウス抗Ｒｅｐ抗体（ＡＲＰ、０３−６１０６９）を１：１０００に希釈したものを使用して、Ｒｅｐタンパク質レベルを検出した。分子量を括弧内に示す。異なるベクターによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３又はＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、Ｒｅｐ５２タンパク質レベルに変化がなかったが、ｐＬＭＣ３４及びｐＬＭＣ３５によりトランスフェクトした細胞では、Ｒｅｐ７８タンパク質レベルは高かった。図１１Ｃは、マウス抗Ｃａｐ抗体（ＡＲＰ、０３−６１０５８）を１：１０００で希釈したものを用いた、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の３つのＣａｐアイソフォームのレベルを示す。分子量を括弧内に示す。異なるベクターによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、ＶＰ３タンパク質レベルに変化がなく、ＶＰ１及びＶＰ２はＨＥＫ２９３細胞において検出できなかった。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において検出できなかった。図１１Ｄは、マウス抗β−アクチン抗体（ＴＦＳ、ＭＡ５−１５７３）を１：１０００で希釈したものを用いた、β−アクチンローディングコントロールを示す。
【図１２】図１２は、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞により生産されるｒＡＡＶの感染性を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、ＧＯＩ及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）によって３重トランスフェクトした。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞に、Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びＧＯＩをトランスフェクトし、野生型Ａｄ５を感染させた。トランスフェクションの３日後、回収した粗製のｒＡＡＶを等量用い、ＨＥＫ２９３細胞に感染させた。トランスダクションの２日後、緑色蛍光及び明視野イメージを得た。緑色蛍光は、ＧＯＩパッケージングされたｒＡＡＶにより発せられる。図中のスケールバーは５０μｍを表す。３重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社））（上パネル）により生産されるｒＡＡＶの感染性は、トランスフェクトしたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞（第３パネル）により生産されるｒＡＡＶより高かった。特に、ｐＬＭＣ３２〜３５によりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞により生産されるｒＡＡＶの感染性は、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（上パネル）によりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞より高かった。
【図１３】図１３は、ＧＯＩのＳＳＩ及び４つのＲｅｐ−Ｃａｐの構成のうちの１つを有する、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主由来のプールの構築物を示す。プールは、２つの段階で生成した。段階１のパート１において、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主を、ＦＬＰリコンビナーゼベクター（ｐＭＦ４）及び１Ｒｅｐ−Ｃａｐベクター（ｐＬＭＣ３２〜３５）によりトランスフェクトし、次にグルタミンフリーの培地において選択した。段階１のパート２において、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主を、ＦＬＰリコンビナーゼベクター（ｐＭＦ４）、１つのＲｅｐ−Ｃａｐベクター（ｐＬＭＣ３２〜３５）及びＧＯＩベクター（ｐＬＭＣ３１）によりトランスフェクトし、次にジェネテシン（５００μｇ／ｍＬ又は７５０μｇ／ｍＬ）を含むグルタミンフリーの培地において選択した。これらを「Ａ」プールとした。段階２において、「Ａ」プールの４〜７を、ＦＬＰリコンビナーゼ（ｐＭＦ４）及びＧＯＩベクター（ｐＬＭＣ３１）によりトランスフェクトし、次にジェネテシン（４００μｇ／ｍＬ）を含む培地において選択した。これらを「Ｂ」プールとした。
【図１４】図１４は、標的とされるＳＳＩ及び残りの（交換されない）ランディングパッドの検出のためのプライマー部位の概略図を示す。Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置するランディングパッドへの特異的なＲｅｐ／Ｃａｐ組込みを検出するため、プライマーセットＰ５を設計した。予想される生成物のサイズは１５２４ｂｐである。残りのランディングパッドを検出するため、プライマーセットＰ６を設計した。予想される生成物のサイズは４８７ｂｐである。ＮＬ１座位に位置するランディングパッドへの特異的なＧＯＩ組込みを検出するため、プライマーセットＰ７を設計した。予想される生成物のサイズは１４４６ｂｐである。残りのＮＬ１ランディングパッドを検出するため、プライマーセットＰ８を設計した。予想される生成物のサイズは８０９ｂｐである。
【図１５】図１５は、Ｆｅｒ１Ｌ４ランディングパッドへのＲｅｐ／Ｃａｐ組込みについての、ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。ゲノムＤＮＡを、「Ａ」プール、「Ｂ」プール、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主から回収し、次にＰＣＲによってプライマーセット５又は６を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離させた。図１５Ａは、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置するランディングパッドへの特異的なＲｅｐ／Ｃａｐ組込みについての、プライマーセットＰ５を用いたゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。予想される生成物のサイズは１５２４ｂｐである。結果は、「Ａ」プールの４、５、６、７、９、１１、１７、１８、１９、２１及び解析した「Ｂ」プールの全てにおいて、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置するランディングパッドへの特異的なＲｅｐ／Ｃａｐ組込みを示す。予想されるように、特異的なＲｅｐ／Ｃａｐの組込みは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主において検出されなかった。図１５Ｂは、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子の残りのランディングパッドについての、プライマーセットＰ６を用いた、ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。予想される生成物のサイズは４８７ｂｐである。結果は、１８を除く「Ａ」プールの全て、及び全ての「Ｂ」プールにおいて、いくつかの残りのランディングパッド、及びＦｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置するランディングパッドへの不完全なＲｅｐ／Ｃａｐ組込みを示す。より小型のＰＣＲ産物が「Ａ」プールの１９に存在し、すなわち配列の一部の損失を示す。予想されるように、Ｆｅｒ１Ｌ４のランディングパッドは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において増幅されたが、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主においては検出されなかった。
【図１６】図１６は、ＮＬ１ランディングパッドへのＧＯＩ組込みについての、ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。ゲノムＤＮＡを、「Ａ」プール、「Ｂ」プール、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主から回収し、次にＰＣＲによってプライマーセット７又は８を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離させた。図１６Ａは、ＮＬ１ランディングパッドへのＧＯＩ組込みについての、プライマーセットＰ７を用いた、ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。予想される生成物のサイズは１４４６ｂｐである。結果は、「Ａ」プールでなく、「Ｂ」プールの全てのＮＬ１座位に位置するランディングパッドへの特異的なＧＯＩ組込みを示す。予想されるように、特異的なＧＯＩ組込みは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主において検出されなかった。図１６Ｂは、残りのＮＬ１ランディングパッドについての、Ｐ８プライマーセットを用いたゲノムＤＮＡ産物のアガロースゲル解析を示す。予想される生成物のサイズは８０９ｂｐである。結果は、１１を除く「Ａ」プールの全て、及び全ての「Ｂ」プールにおいて、いくつかの残りのランディングパッド、及びＮＬ１遺伝子に位置するランディングパッドへの不完全なＧＯＩ組込みを示す。結果によれば、ＮＬ１ランディングパッドは、「Ａ」プール１１において完全でなく、ＧＯＩはランディングパッドに組み込まれなかった。予想されるように、ＮＬ１のランディングパッドは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において増幅されたが、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主においては検出されなかった。
【図１７】図１７は、ウエスタンブロット解析による、野生型Ａｄ５を感染させたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞におけるＥ１Ａ、Ｒｅｐ及びＣａｐのタンパク質発現を示す。「Ａ」プール及び「Ｂ」プールに３日間野生型Ａｄ５を感染させ、次にＥ１Ａ、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及びβ−アクチンタンパク質発現解析のために回収した。図１７Ａは、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒ、Ｅ１Ａ  ２４３Ｒ及びＥ１Ａ  １７１Ｒの、３つのアイソフォームのレベルを示す。Ｅ１Ａタンパク質レベルは、マウス抗Ｅ１Ａ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３３１８３）を１：１０００に希釈したものを使用して検出した。Ｅ１Ａ、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質アイソフォームの分子量を括弧内に示す。３つ全てのＥ１Ａアイソフォームのレベルは、すべてのプールで同等であり、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞においてわずかに高かった。図１７Ｂは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質のレベルを示す。マウス抗Ｒｅｐ抗体（ＡＲＰ、０３−６１０６９）を１：１０００に希釈したものを使用して、Ｒｅｐタンパク質レベルを検出した。分子量を括弧内に示す。Ｒｅｐ７８は検出できなかった。Ｒｅｐ５２は「Ａ」プール１３及び「Ｂ」プール６、７、８及び１０において検出された（＊で示す）。図１１Ｃは、マウス抗Ｃａｐ抗体（ＡＲＰ、０３−６１０５８）を１：１０００で希釈したものを用いた、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の３つのＣａｐアイソフォームのレベルを示す。分子量を括弧内に示す。ＶＰ１、Ｖｐ２及びＶＰ３は検出されなかった。図１７Ｄは、マウス抗β−アクチン抗体（ＴＦＳ、ＭＡ５−１５７３）を１：１０００で希釈したものを用いた、β−アクチンローディングコントロールを示す。
【図１８】図１８は、ＡＡＶ２  Ｒｅｐ及びＣａｐ  ｍＲＮＡの検出のためのプライマー部位の概略図を示す。プライマーセットＰ１はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８用である。プライマーセットＰ２はＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０用である。プライマーセットＰ３はＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２用である。プライマーセットＰ４は、全Ｒｅｐ及びＣａｐ用である。＊は、ＶＰ３を生産するために用いた代替ＡＣＧコドンを示す。ＡＡＶ２ゲノム構造は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ａｎｄ  Ｍｕｚｙｃｚｋａ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｖｉｒｏｌ．  １：４２７−４５１（２０１４）を参考に調整した。
【図１９】図１９は、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞からの、Ｒｅｐ−Ｃａｐ遺伝子及びＡｄ５ヘルパー遺伝子についてのｍＲＮＡ発現解析を示す。ＨＥＫ２９３細胞は、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）ベクター）により３重トランスフェクトした（黒いバー）。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞は、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２及びｐＡＡＶ−ＧＦＰをトランスフェクトし、野生型Ａｄ５を感染させた（白いバー）。コントロールには、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２によりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３又はＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞を含めた（左上のバー）。ｃＤＮＡを調製し、Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びＡｄヘルパー遺伝子についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析に供した。発現データをβ−アクチンにより内部正規化し、次にＨＥＫ２９３コントロールサンプルと比較した。プライマー配列を図２１に示す。図１９Ａは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８のｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、（それぞれ）〜６倍及び〜５倍の誘導が観察された。図１９Ｂは、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０のｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、（それぞれ）〜１１倍及び〜５倍の誘導が観察された。図１９Ｃは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２のｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、（それぞれ）〜１７倍及び〜４倍の誘導が観察された。図１９Ｄは、全Ｒｅｐ及びＣａｐのｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、（それぞれ）〜２０倍及び〜７倍の誘導が観察された。図１９Ｅは、Ｅ１ＡのｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３において、〜１倍の誘導が観察された。Ｅ１ＡのｍＲＮＡは、コントロールＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において検出されず、トランスフェクション及び野生型Ａｄ５による感染の後、検出された。図１９Ｆは、Ｅ１Ｂ−１９ＫのｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３において、〜１倍の誘導が観察された。Ｅ１Ｂ−１９ＫのｍＲＮＡは、コントロールＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において検出されず、トランスフェクション及び野生型Ａｄ５による感染の後、検出された。図１９Ｇは、Ｅ１Ｂ−５５ＫのｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３において、〜１倍の誘導が観察された。Ｅ１Ｂ−５５ＫのｍＲＮＡは、コントロールＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において検出されず、トランスフェクション及び野生型Ａｄ５による感染の後、検出された。図１９Ｈは、Ｅ２ＡのｍＲＮＡレベルを示す。Ｅ２ＡのｍＲＮＡは、コントロールサンプルにおいては検出できず、３重トランスフェクションの後に存在した。図１９Ｉは、Ｅ４のｍＲＮＡレベルを示す。Ｅ４のｍＲＮＡは、コントロールサンプルにおいては検出できず、３重トランスフェクションの後に存在した。図１９Ｊは、ＶＡＩのｍＲＮＡレベルを示す。ＶＡＩのｍＲＮＡは、コントロールサンプルにおいては検出できず、３重トランスフェクションの後に存在した。図１９Ｋは、ＶＡＩＩのｍＲＮＡレベルを示す。ＶＡＩＩのｍＲＮＡは、コントロールサンプルにおいては検出できず、３重トランスフェクションの後に存在した。観察された全てのｍＲＮＡレベルは、Ｅ４を除き、ＨＥＫ２９３細胞と比較し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）において低かった（図１９Ａ〜Ｋ）。これらのデータは、Ｒｅｐ−ＣａｐのｍＲＮＡ誘導及び発現が、ＨＥＫ２９３細胞と比較し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において低かったことを示す。
【図２０】図２０は、３重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞からのｒＡＡＶの力価を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、及びｐＬＭＣ３２〜３５又はｐＲＣ−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の１つ、及びｐＬＭＣ３１又はｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）ベクターをトランスフェクトした。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞に、野生型Ａｄ５、ｐＬＭＣ３２〜３５又はｐＲＣ−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の１つ、及びｐＬＭＣ３１又はｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）ベクターを感染させた。トランスフェクションの３日後にＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ発現についてのＴａｑＭａｎ−ｑＰＣＲ解析に供した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞により生産されるＡＡＶの力価は、ＨＥＫ２９３細胞におけるよりも低く、ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＬＭＣ３１及びｐＬＭＣ３２〜３５を使用して３重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞により生産される力価は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈベクター（ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用して３重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において顕著に高かった。
【図２１】図２１は、ＴａｑＭａｎ−ｑＰＣＲ及びゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ分析に使用したプライマー配列（それぞれ表示順に配列番号４３〜７４）を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
【表１０】
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