【手続補正書】
【提出日】令和3年11月2日(2021.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメイン、（ｉｉ）シチジンデアミナーゼドメイン、および（ｉｉｉ）ウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）を含む、融合蛋白質。
【請求項２】
ウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）が、（ｉ）ウラシル修飾酵素、（ｉｉ）ウラシル塩基除去酵素、または、（ｉｉｉ）ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素、または、それらの任意の変異型である、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
ウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）が、
（ｉ）ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ウシ、アカゲザル、チンパンジー、ゴリラ、またはヤツメウナギからの、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）活性を有する、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素である、および／または、
（ｉｉ）配列番号４８（ＵＤＧ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＵＤＧである、任意に、ウラシル結合蛋白質が、配列番号４８（ＵＤＧ）のアミノ酸配列を含む、および／または、
（ｉｉｉ）配列番号５３（ＳＭＵＧ１）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＳＭＵＧ１である、任意に、ウラシル結合蛋白質が、配列番号５３（ＳＭＵＧ１）のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
ウラシル結合蛋白質が、以下：
（ａ）配列番号４９（ＵｄｇＸ）のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＵｄｇＸ、任意に、ウラシル結合蛋白質が、配列番号４９（ＵｄｇＸ）のアミノ酸配列を含む、
（ｂ）配列番号５０（ＵｄｇＸ＊）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＵｄｇＸ＊、任意に、ウラシル結合蛋白質が、配列番号５０（ＵｄｇＸ＊）のアミノ酸配列を含む、および、
（ｃ）配列番号５１（ＵｄｇＸ＿Оｎ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＵｄｇＸ＿Оｎ、任意に、ウラシル結合蛋白質が、配列番号５１（ＵｄｇＸ＿Оｎ）のアミノ酸配列を含む、
から選択されるＵＤＧの変異型である、請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
融合蛋白質が、構造：ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼドメイン］−［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨを含み、ここで各々の“］−［  ”の例が、任意のリンカーを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
シチジンデアミナーゼドメインおよびｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、リンカーを介して融合されている、任意に、リンカーが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、および／または、
ｎａｐＤＮＡｂｐドメインおよびＵＢＰドメインが、リンカーを介して融合されている、任意に、リンカーが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
融合蛋白質が、（ｉｖ）核酸ポリメラーゼドメイン（ＮＡＰ）をさらに含む、任意に、核酸ポリメラーゼドメインが、（ａ）真核生物の核酸ポリメラーゼドメインである、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼドメインである、（ｃ）損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する、（ｄ）損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである、（ｅ）Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、およびポリメラーゼエタからである、または、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミューおよびニューからなる真核生物のポリメラーゼの群から選択される、（ｆ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、または、（ｇ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
融合蛋白質が、構造：
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼドメイン］−［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］−［ＵＢＰ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼドメイン］−［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］−［ＮＡＰ］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼドメイン］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；または、
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼドメイン］−［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；を含み、ここで、“  ］−［  ”のどの場合も、任意のリンカーを含む、請求項７に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
ｎａｐＤＮＡｂｐドメインが、Ｃａｓ９ドメインを含む、任意に、（ｉ）Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、または、（ｉｉ）Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
Ｃａｓ９ドメインが、
（ｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である、任意に、（ａ）Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）が、配列番号１０、１３、１６または２１のいずれか１つに少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、（ｂ）ｎＣａｓ９が、配列番号１０、１３、１６または２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、または、
（ｉｉ）Ｃａｓ９ドメインがヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である、任意に、（ａ）ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）が、配列番号７、８、９または２２のいずれか１つに少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、または、（ｂ）ｄＣａｓ９が、配列番号７、８、９または２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメイン、および（ｉｉ）シチジンデアミナーゼドメイン、および（ｉｉｉ）核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）ドメインを含む融合蛋白質。
【請求項１２】
核酸ポリメラーゼドメインが、（ａ）真核生物の核酸ポリメラーゼドメインである、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼドメインである、（ｃ）損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する、（ｄ）損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである、（ｅ）Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパおよびポリメラーゼエタからである、または、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミューおよびニューからなる真核生物のポリメラーゼの群から選択される、（ｆ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、（ｇ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポ蛋白質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼからのデアミナーゼである、任意に、  ＡＰＯＢＥＣファミリーデアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、およびＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼからなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
シチジンデアミナーゼドメインが、（ｉ）配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、（ｉｉ）配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、（ｉｉｉ）配列番号９３のＷ９０Ｙ、Ｒ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナミナーゼにおける１つ以上の対応する変異、を含むラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）デアミナーゼである、（ｉｖ）  配列番号９１のＷ９０Ｙ、Ｑ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナミナーゼにおける１つ以上の対応する変異、を含むヒトＡＰＯＢＥＣ１（ｈＡＰＯＢＥＣ１）デアミナーゼである、（ｖ）配列番号７７のＷ２８５Ｙ、Ｒ３２０Ｅ、およびＲ３２６Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナミナーゼにおける１つ以上の対応する変異、を含むヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）デアミナーゼである、（ｖｉ）活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である、（ｖｉｉ）Petromyzon marinusからのシチジンデアミナーゼ１（ｐｍＣＤＡ１）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
Ｃａｓ９ドメインが、（ｉ）配列番号４〜２６のいずれか１つに少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、（ｉｉ）Ｃａｓ９ニッカーゼを含む、または（ｉｉｉ）ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９を含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）ドメイン、および（ｉｉ）塩基除去酵素（ＢＥＥ）を含み、任意に、塩基除去酵素が、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）塩基除去酵素である、融合蛋白質。
【請求項１７】
塩基除去酵素が、配列番号４８に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、および配列番号４８のアミノ酸残基１５６においてＡを含む、任意に、塩基除去酵素が、配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の融合蛋白質。
【請求項１８】
塩基除去酵素が、チミン（Ｔ）塩基除去酵素である、任意に、塩基除去酵素が、配列番号４８に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含み、および配列番号４８のアミノ酸残基２１３においてＤを含む、さらに任意に、塩基除去酵素が、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項１６または１７に記載の融合蛋白質。
【請求項１９】
融合蛋白質が、（ｉｉｉ）核酸ポリメラーゼドメイン（ＮＡＰ）をさらに含む、任意に、核酸ポリメラーゼドメインが、（ａ）真核生物の核酸ポリメラーゼドメインである、（ｂ）ＤＮＡポリメラーゼドメインである、（ｃ）損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する、（ｄ）損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである、（ｅ）Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、およびポリメラーゼエタからである、または、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミューおよびニューからなる真核生物の核酸ポリメラーゼの群から選択される、（ｆ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、（ｇ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２０】
融合蛋白質が、構造：
「ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン」−［ＢＥＥ］−［ＮＡＰ］；
［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］−［ＮＡＰ］−［ＢＥＥ］；
［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］−［ＢＥＥ］；
［ＮＡＰ］−［ＢＥＥ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］；
［ＢＥＥ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］−［ＮＡＰ］；または
［ＢＥＥ］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐドメイン］を含み、
ここで、“  ］−［  ”のどの場合も、任意のリンカーを含む、請求項１９に記載の融合蛋白質。
【請求項２１】
以下：
（ｉ）配列番号４〜４０のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第１のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第２のアミノ酸配列；および
（ｉｉｉ）配列番号４８〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第３のアミノ酸配列を含む、任意に、
（ｉｖ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第４のアミノ酸配列をさらに含む、融合蛋白質。
【請求項２２】
（ｉ）配列番号４〜４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第１アミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第２のアミノ酸配列、および、
（ｉｉｉ）配列番号４８〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第３のアミノ酸配列を含み、任意に、
（ｉｖ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む第４のアミノ酸配列をさらに含む、融合蛋白質。
【請求項２３】
核酸分子および請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含む、複合体であって、任意に、核酸分子が、（ｉ）ＲＮＡである、（ｉｉ）ｇＲＮＡである、または、（ｉｉｉ）ｓｇＲＮＡである、複合体。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、または、請求項２３に記載の複合体を含む、医薬組成物であって、任意に、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、前記医薬組成物。
【請求項２５】
核酸分子を請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合蛋白質に、または請求項２３に記載の複合体に、または、請求項２４に記載の医薬組成物に、接触することを含む、方法であって、
任意に、核酸分子が、ＤＮＡ分子である、
さらに任意に、核酸分子が、ゲノムのＤＮＡ分子である、
in vitroまたはex vivoまたは非ヒト動物においてin vivoで実施される、前記方法。
【請求項２６】
二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集する方法であって、方法が：
二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質およびガイド核酸を含む複合体と、または、請求項２４に記載の医薬組成物と、接触すること、ここで、標的領域が、標的核酸塩基対を含み；
それにより、前記標的領域の鎖分離を誘導すること；
それにより、標的領域の単一鎖において、シトシンまたはチミンを切除すること；および、
それにより、シトシンまたはチミンを、シトシンまたはチミンとは異なる第２核酸塩基と置き換えること；を含み、
in vitroまたはex vivoまたは非ヒト動物においてin vivoで実施される、前記方法。
【請求項２７】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２９】
（ｉ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、（ｉｉ）請求項２３に記載の複合体、または、（ｉｉｉ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする核酸分子を含む、細胞であって、
任意に、細胞が、in vitroまたはex vivoに存在する、前記細胞。
【請求項３０】
疾患または障害を有するまたは有することが疑われる対象を処置する方法において使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項２３に記載の複合体、請求項２４に記載の医薬組成物、請求項２７に記載のポリヌクレオチド、または請求項２８に記載のベクター、または、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法であって、方法が：
二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質およびガイド核酸を含む複合体に接触させること、ここで、標的領域が標的核酸塩基対を含む；
それにより、前記標的領域の鎖分離を誘導すること；
それにより、標的領域の単一鎖における前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基へ変換すること；
それにより、二本鎖のＤＮＡ配列から前記第２核酸塩基を切除して、脱塩基の部位を産生すること；
それにより、前記標的領域の１つの鎖だけを切ること；および
それにより、第４の核酸塩基に相補的な第５の核酸塩基を、脱塩基の部位の中へ挿入し、意図される編集された塩基対を生成すること；を含み、
ここで、脱塩基の部位に反対の第３の核酸塩基が、第４の核酸塩基によって置き換えられ、
in vitroまたはex vivoまたは非ヒト動物においてin vivoで実施される、前記方法。
【請求項３２】
２０％未満から１％未満までのインデル形成を引き起こす、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
意図される編集された塩基対を生成する効率が、（ｉ）少なくとも５％、または、（ｉｉ）１０％〜５０％である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
意図される編集された塩基対に対する意図されない編集された塩基対の比が２：１〜１０：１である、および／または、
意図される編集された塩基対に対するインデル形成の比が、２：１〜２００：１である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の上流である、任意に、意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である、または、意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の下流である、任意に、意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集する方法における使用のための組成物であって、方法が：
二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質およびガイド核酸を含む複合体と、接触すること、ここで、標的領域が、標的核酸塩基対を含み；
それにより、前記標的領域の鎖分離を誘導すること；
それにより、標的領域の単一鎖において、シトシンまたはチミンを切除すること；を含む、前記方法。