【手続補正書】
【提出日】令和3年11月1日(2021.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の集団におけるバリアントヌクレオチドを識別するための方法であって、
（ａ）一方または両方の末端に一本鎖オーバーハングを有する二本鎖分子を含む核酸の集団を、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質と接触させるステップであって、前記タンパク質が、一方または両方の末端において、３’オーバーハングを消化し、５’オーバーハングを相補的な核酸で充填して、二本鎖平滑末端化核酸を生成する、ステップと、
（ｂ）シーケンシングされた核酸を得るために、前記二本鎖平滑末端化核酸の配列を決定するステップと、
（ｃ）参照配列におけるそれぞれの指定位置について、
（ｉ）前記指定位置を含む、シーケンシングされた核酸のサブセットを識別し、
（ｉｉ）前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のシーケンシングされた核酸を識別する、ステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の（ｉｉ）における前記シーケンシングされた核酸が、前記コールをサポートするそれぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在をコールするステップであって、ただし、指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在は、
（ｉ）前記バリアントが、前記参照ヌクレオチドと比較して、ＣからＴまたはＧからＡへの変動である場合、および
（ｉｉ）前記バリアントヌクレオチドが、
（１）前記指定位置の周囲のヌクレオチドコンテキスト、および／または
（２）前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の５’末端から、前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の距離、または前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の３’末端から、前記指定位置における前記ＧからＡへの変動の距離
に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される場合には、コールされないことを除く、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）の（ｉｉ）が、
（ａ）前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内の核酸の数を識別し、ステップ（ｄ）の（ｉ）および（ｉｉ）で指定される場合を除き、前記変動を有する前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の数が閾値に合致すると、それぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在がコールされ、必要に応じて、前記閾値は、前記変動が、前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の少なくとも１％で存在することであり、および／または
（ｂ）前記指定位置が参照ヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の数を識別することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）が、
（ａ）前記二本鎖平滑末端化核酸の両方の鎖の配列を決定することを含み、必要に応じて、ステップ（ｃ）が、少なくとも１つの指定位置について行われ、前記変動を有する前記サブセット内の前記シーケンシングされた核酸が、前記二本鎖平滑末端化核酸のシーケンシングされた核酸の両方の鎖の配列を含み、および／または
（ｂ）鎖の両方の末端から配列を決定することを含む、
請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）前記バリアントヌクレオチドが、前記サブセット内のシーケンシングされた核酸において５’末端の規定される近接度内にある前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の出現、または前記サブセット内のシーケンシングされた核酸において３’末端の規定される近接度内にある前記指定位置における前記ＧからＡへの変動の出現に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類され、必要に応じて、前記５’末端へ前記規定される近接度が、前記５’末端まで２０ヌクレオチド以内であるか、またはそれよりも少ない数のヌクレオチド以内であるとして規定され、前記３’末端への前記規定される近接度が、前記３’末端まで２０ヌクレオチド以内であるか、またはそれよりも少ない数のヌクレオチド以内であるとして規定され、
（ｂ）前記ＣからＴまたはＧからＡへの変動が、少なくとも、前記周囲のコンテキストがＴＣＧからＴＴＧまたはＣＧＡからＣＡＡであることに基づいて、脱アミノ化エラーとして分類され、
（ｃ）前記バリアントヌクレオチドは、前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の５’末端から、前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の平均距離が、前記指定位置における前記参照ヌクレオチドの平均距離よりも小さいこと、または前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の３’末端から、前記指定位置における前記ＧからＡへの変動が、前記指定位置における前記参照ヌクレオチドの平均距離よりも小さいことに基づいて、脱アミノ化エラーとして分類され、および／または
（ｄ）前記指定位置における前記ＣからＴへの変動は、その出現が、前記指定位置が前記５’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第１の比率において少なくとも５０％である場合に、脱アミノ化エラーとして分類されるか、または前記指定位置における前記ＧからＡへの変動は、その出現が、前記指定位置が前記３’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第２の比率において少なくとも５０％である場合に、脱アミノ化エラーとして分類され、必要に応じて、
（ｉ）前記指定位置における前記ＣからＴへの変動は、前記変動が、前記指定位置が前記５’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第１の比率において、前記サブセット内の他のシーケンシングされた核酸におけるよりも少なくとも２倍の出現を有することに基づいて、脱アミノ化エラーとして分類されるか、もしくは
（ｉｉ）前記指定位置における前記ＧからＡへの変動は、前記変動が、前記指定位置が前記３’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第２の比率において、前記サブセット内の他のシーケンシングされた核酸におけるよりも少なくとも２倍の出現を有することに基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記二本鎖平滑末端化核酸を、バーコードを含むアダプターに連結させること、前記アダプターに結合するプライマー分子からプライミングされる前記核酸を増幅させることをさらに含み、
ステップ（ｂ）が、増幅した核酸分子の配列を決定すること、および前記増幅した核酸分子の配列をファミリーにグループ分けすることであって、ファミリーのメンバーが、前記核酸上の同じ開始点および終止点ならびに同じバーコードを有し、前記ファミリーについて、そのそれぞれのメンバーの配列から、複数の位置のそれぞれにおけるコンセンサスヌクレオチドを決定することを含み、必要に応じて、前記５’末端に連結されるバーコードを含む前記アダプターが、前記３’末端に連結されるバーコードを含む前記アダプターとは異なる、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記無細胞核酸が、がんを有するかまたはがんを有することに一致する徴候または症状を有する対象の体液に由来し、必要に応じて、前記体液が、血液、血漿、唾液、尿、および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質が、クレノウである、および／または前記バリアントヌクレオチドが、単一バリアント（ＳＮＶ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記参照配列が、ヒトゲノムの配列であり、必要に応じて、前記参照配列が、（ｉ）ヒト染色体の配列である、および／または（ｉｉ）前記参照配列が、前記ヒトゲノムの非連続領域を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記コールされるバリアントヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、がんと関連していることが既知である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
がんを有するかまたはがんを有することが疑われる対象の集団の試料に由来する核酸集団に行われ、前記集団内の対象が、その後に、前記個々の対象においてどのバリアントヌクレオチドがコールされたかに応じて、異なる処置を受容する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
脱アミノ化エラーとして分類されるバリアントヌクレオチドが、前記コールされたバリアントヌクレオチドのうちの少なくとも１％または少なくとも１０％である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
バリアントの存在は、少なくとも５個のバリアントヌクレオチドが脱アミノ化エラーとして分類される場合、コールされない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記脱アミノ化エラーの頻度が、少なくとも１％または少なくとも１０％である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸シーケンサーによって生成されたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェースと、
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサによる実行の際に、
（ａ）前記核酸シーケンサーによって生成された前記シーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップであって、前記核酸シーケンサーが、対象に由来する無細胞ＤＮＡ分子から生成されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングし、前記シーケンシングライブラリーが、前記無細胞ＤＮＡ分子およびバーコードを含むアダプターを含む、ステップと、
（ｂ）参照配列におけるそれぞれの指定位置について、
（ｉ）前記指定位置を含む、シーケンシングリードのサブセットを識別し、
（ｉｉ）前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている、前記サブセット内のシーケンシングリードを識別する、ステップと、
（ｃ）前記変動を有する前記サブセット内の前記シーケンシングリードが、前記コールをサポートするそれぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在をコールするステップであって、ただし、指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在は、
（ｉ）前記バリアントが、前記参照ヌクレオチドと比較して、ＣからＴまたはＧからＡへの変動である場合、および
（ｉｉ）前記バリアントヌクレオチドが、
（１）前記指定位置の周囲のヌクレオチドコンテキスト、および／または
（２）前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の５’末端から、前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の距離、または前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の３’末端から、前記指定位置における前記ＧからＡへの変動の距離に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される場合には、コールされないことを除く、ステップと
を含む方法を実施するマシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターと
を含む、システム。
【請求項１５】
（ａ）前記核酸シーケンサーをさらに含む、
（ｂ）前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーにシーケンシングバイシンセシスを行って、前記シーケンシングリードを生成する、
（ｃ）前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーにパイロシーケンシング、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーション、またはシーケンシングバイハイブリダイゼーションを行って、前記シーケンシングリードを生成する、
（ｄ）前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイを使用して、前記シーケンシングリードを生成する、
（ｅ）前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングして前記シーケンシングリードを生成するための、マイクロウェルのアレイを有するチップを含む、
（ｆ）前記コンピューター可読媒体が、メモリー、ハードドライブ、またはコンピューターサーバーを含む、
（ｇ）前記通信ネットワークが、遠隔通信ネットワーク、インターネット、エクストラネット、またはイントラネットを含む、
（ｈ）前記通信ネットワークが、分散コンピューティングの可能な１つまたは複数のコンピューターサーバーを含み、必要に応じて、分散コンピューティングが、クラウドコンピューティングである、
（ｉ）前記コンピューターが、前記核酸シーケンサーから遠隔設置されているコンピューターサーバー上に設置されている、
（ｊ）前記シーケンシングライブラリーが、試料を、１つまたは複数の試料と区別する試料バーコードをさらに含む、および／または
（ｋ）ネットワークを通じて前記コンピューターと通信する、電子ディスプレイであって、（ａ）〜（ｃ）を実施した際の結果を表示するためのユーザーインターフェースを含む、電子ディスプレイをさらに含み、必要に応じて、
（ｉ）前記ユーザーインターフェースが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）またはウェブベースユーザーインターフェースであるか、もしくは
（ｉｉ）前記電子ディスプレイが、パーソナルコンピューターにおいて存在する、および／もしくは、前記電子ディスプレイが、インターネット対応コンピューターにおいて存在し、必要に応じて、前記インターネット対応コンピューターが、前記コンピューターから遠隔した位置に設置されている、
請求項１４に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６６】
この事例では、５つのファミリーのうちの１つ（２０％）のみが、そのシーケンシングリードの３’末端から２０塩基以内に見かけのＧからＡへの置換を有する。２０％は、変異を脱アミノ化エラーとして分類するための５０％のカットオフを上回っていない。したがって、見かけのＧからＡへの置換は、真実の変異として分類される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
核酸の集団におけるバリアントヌクレオチドを識別するための方法であって、
（ａ）一方または両方の末端に一本鎖オーバーハングを有する二本鎖分子を含む核酸の集団を、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質と接触させるステップであって、前記タンパク質が、一方または両方の末端において、３’オーバーハングを消化し、５’オーバーハングを相補的な核酸で充填して、二本鎖平滑末端化核酸を生成する、ステップと、
（ｂ）シーケンシングされた核酸を得るために、前記二本鎖平滑末端化核酸の配列を決定するステップと、
（ｃ）参照配列におけるそれぞれの指定位置について、
（ｉ）前記指定位置を含む、シーケンシングされた核酸のサブセットを識別し、
（ｉｉ）前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のシーケンシングされた核酸を識別する、ステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の（ｉｉ）における前記シーケンシングされた核酸が、前記コールをサポートするそれぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在をコールするステップであって、ただし、指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在は、
（ｉ）前記バリアントが、前記参照ヌクレオチドと比較して、ＣからＴまたはＧからＡへの変動である場合、および
（ｉｉ）前記バリアントヌクレオチドが、
（１）前記指定位置の周囲のヌクレオチドコンテキスト、および／または
（２）前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の５’末端から、前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の距離、または前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の３’末端から、前記指定位置における前記ＧからＡへの変動の距離に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される場合には、コールされないことを除く、ステップと
を含む、方法。
(項目２)
ステップ（ｃ）の（ｉｉ）が、前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内の核酸の数を識別し、ステップ（ｄ）の（ｉ）および（ｉｉ）で指定される場合を除き、前記変動を有する前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の数が閾値に合致すると、それぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在がコールされる、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記バリアントヌクレオチドが、前記サブセット内のシーケンシングされた核酸において５’末端の規定される近接度内にある前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の出現、または前記サブセット内のシーケンシングされた核酸において３’末端の規定される近接度内にある前記指定位置における前記ＧからＡへの変動の出現に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される、項目１に記載の方法。
(項目４)
ステップ（ｃ）の（ｉｉ）が、前記指定位置が参照ヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の数を識別することをさらに含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目５)
ステップ（ｂ）が、前記二本鎖平滑末端化核酸の両方の鎖の配列を決定することを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目６)
ステップ（ｃ）が、少なくとも１つの指定位置について行われ、前記変動を有する前記サブセット内の前記シーケンシングされた核酸が、前記二本鎖平滑末端化核酸のシーケンシングされた核酸の両方の鎖の配列を含む、項目５に記載の方法。
(項目７)
ステップ（ｂ）が、鎖の両方の末端から配列を決定することを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目８)
前記二本鎖平滑末端化核酸を、バーコードを含むアダプターに連結させること、前記アダプターに結合するプライマー分子からプライミングされる前記核酸を増幅させることをさらに含み、
ステップ（ｂ）が、増幅した核酸分子の配列を決定すること、および前記増幅した核酸分子の配列をファミリーにグループ分けすることであって、ファミリーのメンバーが、前記核酸上の同じ開始点および終止点ならびに同じバーコードを有し、前記ファミリーについて、そのそれぞれのメンバーの配列から、複数の位置のそれぞれにおけるコンセンサスヌクレオチドを決定することを含む、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目９)
前記核酸の集団が、対象の無細胞核酸を含む試料に由来する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目１０)
前記無細胞核酸が、がんを有するかまたはがんを有することに一致する徴候または症状を有する対象の体液に由来する、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記体液が、血液、血漿、唾液、尿、および脳脊髄液からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
(項目１２)
前記指定位置における前記ＣからＴへの変動は、その出現が、前記指定位置が前記５’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第１の比率において少なくとも５０％である場合に、脱アミノ化エラーとして分類されるか、または前記指定位置における前記ＧからＡへの変動は、その出現が、前記指定位置が前記３’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第２の比率において少なくとも５０％である場合に、脱アミノ化エラーとして分類される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目１３)
前記指定位置における前記ＣからＴへの変動は、前記変動が、前記指定位置が前記５’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第１の比率において、前記サブセット内の他のシーケンシングされた核酸におけるよりも少なくとも２倍の出現を有することに基づいて、脱アミノ化エラーとして分類されるか、または前記指定位置における前記ＧからＡへの変動は、前記変動が、前記指定位置が前記３’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第２の比率において、前記サブセット内の他のシーケンシングされた核酸におけるよりも少なくとも２倍の出現を有することに基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される、項目１２に記載の方法。
(項目１４)
前記閾値は、前記変動が、前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の少なくとも１％で存在することである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目１５)
前記ＣからＴまたはＧからＡへの変動が、少なくとも、前記周囲のコンテキストがＴＣＧからＴＴＧまたはＣＧＡからＣＡＡであることに基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目１６)
前記５’末端へま前記規定される近接度が、前記５’末端まで２０ヌクレオチド以内であるか、またはそれよりも少ない数のヌクレオチド以内であるとして規定され、前記３’末端への前記規定される近接度が、前記３’末端まで２０ヌクレオチド以内であるか、またはそれよりも少ない数のヌクレオチド以内であるとして規定される、項目３に記載の方法。
(項目１７)
前記５’末端への前記規定される近接度が、前記５’末端まで２０ヌクレオチド以内であるとして規定され、前記３’末端への前記規定される近接度が、前記３’末端まで２０ヌクレオチド以内であるとして規定される、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記タンパク質が、クレノウである、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目１９)
ステップ（ｃ）および（ｄ）が、これらのステップを実行するコンピューターにより作動されるシステムなどにおいて行われる、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目２０)
前記参照配列が、ヒトゲノムの配列である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目２１)
前記参照配列が、ヒト染色体の配列である、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
前記参照配列が、前記ヒトゲノムの非連続領域を含む、項目２０に記載の方法。
(項目２３)
前記コールされるバリアントヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、がんと関連していることが既知である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目２４)
がんを有するかまたはがんを有することが疑われる対象の集団の試料に由来する核酸集団に行われ、前記集団内の対象が、その後に、前記個々の対象においてどのバリアントヌクレオチドがコールされたかに応じて、異なる処置を受容する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目２５)
脱アミノ化エラーとして分類されるバリアントヌクレオチドが、前記コールされたバリアントヌクレオチドのうちの少なくとも１％である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目２６)
脱アミノ化エラーとして分類されるバリアントヌクレオチドが、前記コールされたバリアントヌクレオチドのうちの少なくとも１０％である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目２７)
バリアントの存在は、少なくとも５個のバリアントヌクレオチドが脱アミノ化エラーとして分類される場合、コールされない、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目２８)
前記核酸の集団が、固形組織に由来する、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目２９)
前記体液が、血漿である、項目１１に記載の方法。
(項目３０)
前記５’末端に連結されるバーコードを含む前記アダプターが、前記３’末端に連結されるバーコードを含む前記アダプターとは異なる、項目８に記載の方法。
(項目３１)
前記脱アミノ化エラーの頻度が、少なくとも１％である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目３２)
前記脱アミノ化エラーの頻度が、少なくとも１０％である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目３３)
前記バリアントヌクレオチドは、前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の５’末端から、前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の平均距離が、前記指定位置における前記参照ヌクレオチドの平均距離よりも小さいこと、または前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の３’末端から、前記指定位置における前記ＧからＡへの変動が、前記指定位置における前記参照ヌクレオチドの平均距離よりも小さいことに基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目３４)
前記バリアントヌクレオチドが、単一バリアント（ＳＮＶ）である、先行する項目のいずれかに記載の方法。
(項目３５)
核酸においてバリアントヌクレオチドを識別する方法であって、
（ａ）一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸を、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質と接触させるステップであって、それによって、二本鎖平滑末端化核酸を産生するステップと、
（ｂ）前記二本鎖平滑末端化核酸の配列を決定するステップと、
（ｃ）前記決定した配列を参照配列と比較するステップであって、前記決定した配列が、前記決定した配列の５’末端の２０ヌクレオチドまたはそれ未満以内の少なくとも１つの指定位置における少なくとも１つのＣからＴへの変動、または前記決定した配列の３’末端の２０ヌクレオチドまたはそれ未満以内における少なくとも１つのＧからＡへの変動を含む、ステップと、
（ｄ）前記核酸の配列を、前記決定した配列としてコールするステップであって、ただし、ＣからＴへの変動が前記決定した配列の５’末端の２０ヌクレオチドまたはそれ未満以内に存在するか、またはＧからＡへの変動が前記決定した配列の３’末端の２０ヌクレオチドまたはそれ未満以内に存在する前記位置のうちの少なくとも１つにおいて、前記参照配列を占有しているヌクレオチドが、前記指定位置でコールされることを除く、ステップと
を含む、方法。
(項目３６)
前記ＣからＴまたはＧからＡへの変動が、ＴＣＧからＴＴＧまたはＣＧＡからＣＡＡの周囲コンテキストにおいて生じる、項目３５に記載の方法。
(項目３７)
核酸の集団においてバリアントヌクレオチドを識別する方法であって、
（ａ）少なくとも１つが一方または両方の末端に一本鎖オーバーハングを有する二本鎖分子である、オーバーラップする配列の核酸の集団を、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質と接触させるステップであって、前記タンパク質が、３’オーバーハングを消化し、５’オーバーハングを充填して、二本鎖平滑末端化核酸を生成する、ステップと、
（ｂ）前記二本鎖平滑末端化核酸を、バーコードを含むアダプターに連結させ、前記アダプターに結合するプライマー分子からプライミングされる前記核酸を増幅させるステップと、
（ｃ）増幅した核酸分子の配列を決定し、前記増幅した核酸分子の配列をファミリーに分類し、ファミリーのメンバーが、前記核酸上の同じ開始点および終止点ならびに同じバーコードを有し、前記ファミリーについて、そのそれぞれのメンバーの配列から、コンセンサス配列を決定するステップと、
（ｄ）参照配列におけるそれぞれの指定位置について、前記指定位置を含むコンセンサス配列を有するファミリーのサブセットを決定するステップであって、前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のコンセンサス配列を識別する、ステップと、
（ｅ）前記バリアントヌクレオチドを有する前記サブセット内の前記コンセンサス配列が前記コールをサポートする指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在をコールするステップであって、ただし、指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在は、
（ｉ）前記バリアントヌクレオチドが、前記参照ヌクレオチドと比較して、ＣからＴまたはＧからＡへの変動である場合、および
（ｉｉ）前記バリアントヌクレオチドが、
（１）前記指定位置の周囲のヌクレオチドコンテキスト、および／または
（２）前記５’末端から、前記サブセット内のコンセンサス配列の前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の距離、または前記３’末端から、コンセンサス配列の前記指定位置における前記ＧからＡへの変動の距離に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される場合
には、コールされないことを除く、ステップと
を含む、方法。
(項目３８)
ステップ（ｃ）の（ｉｉ）が、前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内の核酸の数を識別し、ステップ（ｄ）の（ｉ）および（ｉｉ）で指定される場合を除き、前記変動を有する前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の数が閾値に合致するとき、それぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在がコールされる、項目３７に記載の方法。
(項目３９)
核酸の集団において偽陽性バリアントヌクレオチドを識別するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つが一方または両方の末端に一本鎖オーバーハングを有する二本鎖分子である、配列がオーバーラップする核酸の集団を、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するタンパク質と接触させるステップであって、前記タンパク質が、一方または両方の末端において、３’オーバーハングを消化し、５’オーバーハングを相補的な核酸で充填して、二本鎖平滑末端化核酸を生成する、ステップと、
（ｂ）シーケンシングされた核酸を得るために、前記二本鎖平滑末端化核酸の配列を決定するステップと、
（ｃ）参照配列におけるそれぞれの指定位置について、前記指定位置を含むシーケンシングされた核酸のサブセットを識別し、そして前記指定位置が参照ヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のシーケンシングされた核酸、および前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の数を識別する、ステップと、
（ｄ）前記指定位置にＣからＴまたはＧからＡへの変動指定位置でＣからＴまたはＧからＡへの変動を有する前記シーケンシングされた核酸が、前記コールに合致してサポートするそれぞれの指定位置における偽陽性バリアントヌクレオチドの存在をコールするステップであって、そして前記変動が、
（１）前記指定位置の周囲のヌクレオチドコンテキスト、および／または
（２）前記指定位置が前記５’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第１の比率内のシーケンシングされた核酸における前記ＣからＴへの変換の過剰出現、もしくは前記指定位置が前記３’末端の規定される近接度内にある、前記サブセットの第２の比率内のシーケンシングされた核酸における前記ＧからＡへの変換の過剰出現に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される、ステップと
を含む、方法。
(項目４０)
ステップ（ｃ）の（ｉｉ）が、前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内の核酸の数を識別し、ステップ（ｄ）の（ｉ）および（ｉｉ）で指定される場合を除き、前記変動を有する前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の数が閾値に合致するとき、それぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在がコールされる、項目３９に記載の方法。
(項目４１)
参照配列内の指定位置における「Ｃ」から「Ｔ」または「Ｇ」から「Ａ」へのバリアントのマイナー対立遺伝子頻度を、前記指定位置にマッピングされるシーケンシングされた核酸の集団において決定する方法であって、マイナー対立遺伝子頻度が、前記バリアントを含む前記指定位置にマッピングされるシーケンシングされた核酸の数（「バリアント数」）を、前記指定位置にマッピングされるシーケンシングされた核酸の総数と比較し、前記方法が、脱アミノ化エラーの確率について、前記指定位置におけるＴまたはＡバリアントの数を調節するステップを含み、エラーの確率が、「Ｔ」の場合には分子の５’末端からおよび「Ａ」の場合には分子の３’末端からの前記バリアントの距離の関数である、方法。
(項目４２)
シーケンシングされたポリヌクレオチドの５’末端から選択された距離内に位置する「Ｔ」バリアント、またはシーケンシングされた核酸の３’末端から選択された距離内に位置する「Ａ」バリアントが、前記バリアント数にカウントされない、項目４１に記載の方法。
(項目４３)
シーケンシングされたポリヌクレオチドの５’末端から選択された距離内に位置する「Ｔ」バリアントの、シーケンシングされた核酸の５’末端から前記選択された距離外に位置する「Ｔ」バリアントに対する比が、所定の比を上回る（例えば、５０％を上回る）場合、またはシーケンシングされた核酸の３’末端から選択された距離内に位置する「Ａ」バリアントの、シーケンシングされた核酸の３’末端から前記選択された距離外に位置する「Ａ」バリアントに対する比が、所定の比を上回る（例えば、５０％を上回る）場合、すべての「Ｔ」バリアントは、前記バリアント数からディスカウントされる、項目４１に記載の方法。
(項目４４)
前記バリアント数が、それぞれの「Ｔ」バリアントまたはそれぞれの「Ａ」バリアントが、真のバリアントである確率の合計として決定される、項目４１に記載の方法。
(項目４５)
先行する項目のいずれかに記載の方法によって、がんマーカーを有することが決定された対象に、前記がんマーカーにより特徴付けられるがんを処置するのに有効な治療介入を投与することを含む、方法。
(項目４６)
項目１から４５のいずれか１項に記載の方法を行うことによって、対象の無細胞核酸における１つまたは複数のバリアントヌクレオチドの同一性に関するデータを受容するステップと、
前記１つまたは複数のバリアントヌクレオチドから、がんマーカーの存在を決定するステップと、
前記がんマーカーにより特徴付けられるがんを処置するのに有効な治療介入を投与するステップとを含む、方法。
(項目４７)
核酸シーケンサーによって生成されたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェースと、
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサによる実行の際に、
（ａ）前記核酸シーケンサーによって生成された前記シーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップと、
（ｂ）参照配列におけるそれぞれの指定位置について、
（ｉ）前記指定位置を含む、シーケンシングリードのサブセットを識別し、
（ｉｉ）前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている、前記サブセット内のシーケンシングリードを識別する、ステップと、
（ｃ）前記変動を有する前記サブセット内の前記シーケンシングリードが、前記コールをサポートするそれぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在をコールするステップであって、ただし、指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在は、
（ｉ）前記バリアントが、前記参照ヌクレオチドと比較して、ＣからＴまたはＧからＡへの変動である場合、および
（ｉｉ）前記バリアントヌクレオチドが、
（１）前記指定位置の周囲のヌクレオチドコンテキスト、および／または
（２）前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の５’末端から、前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の距離、または前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の３’末端から、前記指定位置における前記ＧからＡへの変動の距離に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される場合には、コールされないことを除く、ステップと
を含む方法を実施するマシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターと
を含む、システム。
(項目４８)
ステップ（ｃ）の（ｉｉ）が、前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内の核酸の数を識別し、ステップ（ｄ）の（ｉ）および（ｉｉ）で指定される場合を除き、前記変動を有する前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の数が閾値に合致すると、それぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在がコールされる、項目４７に記載のシステム。
(項目４９)
核酸シーケンサーによって生成されたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェースと、
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサによる実行の際に、
（ａ）前記核酸シーケンサーによって生成された前記シーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップと、
（ｂ）前記決定した配列を、参照配列と比較するステップであって、前記決定した配列が、前記決定した配列の５’末端の２０ヌクレオチドまたはそれ未満以内の少なくとも１つの指定位置における少なくとも１つのＣからＴへの変動、または前記決定した配列の３’末端の２０ヌクレオチドまたはそれ未満以内における少なくとも１つのＧからＡへの変動を含む、ステップと、
（ｃ）前記核酸の配列を前記決定した配列としてコールするステップであって、ただし、ＣからＴへの変動が前記決定した配列の５’末端の２０ヌクレオチドまたはそれ未満以内に存在するか、またはＧからＡへの変動が前記決定した配列の３’末端の２０ヌクレオチドまたはそれ未満以内に存在する前記位置のうちの少なくとも１つにおいては、前記参照配列を占有しているヌクレオチドが、前記指定位置でコールされることを除く、ステップとを含む方法を実施するマシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターとを含む、システム。
(項目５０)
核酸シーケンサーによって生成されたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェースと、
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサによる実行の際に、
（ａ）前記核酸シーケンサーによって生成された前記シーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップと、
（ｂ）前記シーケンシングリードの配列をファミリーにグループ分けするステップであって、ファミリーのメンバーが、前記核酸上の同じ開始点および終止点ならびに同じバーコードを有し、前記ファミリーについて、そのそれぞれのメンバーの配列から、コンセンサス配列を決定する、ステップと、
（ｃ）参照配列におけるそれぞれの指定位置について、前記指定位置を含むコンセンサス配列を有するファミリーのサブセットを決定し、前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている、前記コンセンサス配列を識別するステップと、
（ｄ）前記バリアントヌクレオチドを有する前記サブセット内の前記コンセンサス配列がそれぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在をコールするステップであって、ただし、前記コールをサポートするが、指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在は、
（ｉ）前記バリアントヌクレオチドが、前記参照ヌクレオチドと比較して、ＣからＴまたはＧからＡへの変動である場合、および
（ｉｉ）前記バリアントヌクレオチドが、
（１）前記指定位置の周囲のヌクレオチドコンテキスト、および／または
（２）５’末端から、前記サブセット内のコンセンサス配列内の前記指定位置における前記ＣからＴへの変動の距離、または３’末端から、コンセンサス配列の前記指定位置における前記ＧからＡへの変動の距離に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される場合には、コールされないことを除く、ステップと
を含む方法を実施するマシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターとを含む、システム。
(項目５１)
ステップ（ｃ）が、前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のコンセンサス配列の数を識別し、ステップ（ｄ）の（ｉ）および（ｉｉ）で指定される場合を除き、前記変動を有する前記サブセット内のコンセンサス配列の数が閾値に合致すると、それぞれの指定位置におけるバリアントヌクレオチドの存在がコールされる、項目５０に記載のシステム。
(項目５２)
核酸シーケンサーによって生成されたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェースと、
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサによる実行の際に、
（ａ）前記核酸シーケンサーによって生成された前記シーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップと、
（ｂ）参照配列におけるそれぞれの指定位置について、前記指定位置を含むシーケンシングリードのサブセットを識別し、前記指定位置が参照ヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のシーケンシングされた核酸、および前記指定位置がバリアントヌクレオチドによって占有されている前記サブセット内のシーケンシングされた核酸の数を識別する、ステップと、
（ｃ）前記指定位置でＣからＴまたはＧからＡへの変動を有する前記シーケンシングされた核酸が前記コールをサポートするそれぞれの指定位置における偽陽性バリアントヌクレオチドの存在をコールするステップであって、前記変動が、
（１）前記指定位置の周囲のヌクレオチドコンテキスト、および／または
（２）前記指定位置が５’末端の規定される近接度内にある、前記サブセットの第１の比率内のシーケンシングされた核酸における前記ＣからＴへの変換の過剰出現、もしくは前記指定位置が３’末端の規定される近接度内にある前記サブセットの第２の比率内のシーケンシングされた核酸における前記ＧからＡへの変換の過剰出現に基づいて、脱アミノ化エラーとして分類される、ステップとを含む方法を実施するマシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターとを含む、システム。
(項目５３)
核酸シーケンサーによって生成されたシーケンシングリードを、通信ネットワークを通じて受容する通信インターフェースと、
前記通信インターフェースと通信するコンピューターであって、１つまたは複数のコンピュータープロセッサと、前記１つまたは複数のコンピュータープロセッサによる実行の際に、
（ａ）前記核酸シーケンサーによって生成された前記シーケンシングリードを、前記通信ネットワークを通じて受容するステップと、
（ｂ）脱アミノ化エラーの確率に基づいて前記シーケンシングリードにおけるＴまたはＡバリアントの数を調節するステップであって、エラーの確率が、「Ｔ」の場合には分子の５’末端からおよび「Ａ」の場合には前記分子の３’末端からの前記バリアントの距離の関数である、ステップとを含む方法を実施するマシン実行可能コードを含むコンピューター可読媒体とを含む、コンピューターとを含む、システム。
(項目５４)
前記核酸シーケンサーをさらに含む、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目５５)
前記核酸シーケンサーが、対象に由来する無細胞ＤＮＡ分子から生成されたシーケンシングライブラリーをシーケンシングし、前記シーケンシングライブラリーが、前記無細胞ＤＮＡ分子およびバーコードを含むアダプターを含む、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目５６)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーにシーケンシングバイシンセシスを行って、前記シーケンシングリードを生成する、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目５７)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーにパイロシーケンシング、単分子シーケンシング、ナノポアシーケンシング、半導体シーケンシング、シーケンシングバイライゲーション、またはシーケンシングバイハイブリダイゼーションを行って、前記シーケンシングリードを生成する、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目５８)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーに由来するクローン単一分子アレイを使用して、前記シーケンシングリードを生成する、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目５９)
前記核酸シーケンサーが、前記シーケンシングライブラリーをシーケンシングして前記シーケンシングリードを生成するための、マイクロウェルのアレイを有するチップを含む、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目６０)
前記コンピューター可読媒体が、メモリー、ハードドライブ、またはコンピューターサーバーを含む、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目６１)
前記通信ネットワークが、遠隔通信ネットワーク、インターネット、エクストラネット、またはイントラネットを含む、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目６２)
前記通信ネットワークが、分散コンピューティングの可能な１つまたは複数のコンピューターサーバーを含む、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目６３)
分散コンピューティングが、クラウドコンピューティングである、項目６４に記載のシステム。
(項目６４)
前記コンピューターが、前記核酸シーケンサーから遠隔設置されているコンピューターサーバー上に設置されている、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目６５)
前記シーケンシングライブラリーが、試料を、１つまたは複数の試料と区別する試料バーコードをさらに含む、項目６４に記載のシステム。
(項目６６)
ネットワークを通じて前記コンピューターと通信する、電子ディスプレイであって、（ａ）〜（ｃ）を実施した際の結果を表示するためのユーザーインターフェースを含む、電子ディスプレイをさらに含む、項目４７から５３のいずれか１項に記載のシステム。
(項目６７)
前記ユーザーインターフェースが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）またはウェブベースユーザーインターフェースである、項目６６に記載のシステム。
(項目６８)
前記電子ディスプレイが、パーソナルコンピューターにおいて存在する、項目６６に記載のシステム。
(項目６９)
前記電子ディスプレイが、インターネット対応コンピューターにおいて存在する、項目６６に記載のシステム。
(項目７０)
前記インターネット対応コンピューターが、前記コンピューターから遠隔した位置に設置されている、項目６９に記載のシステム。