【手続補正書】
【提出日】令和3年7月26日(2021.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階;
（b）前記固定相に、細胞外小胞体が含まれた試料をローディングして、前記疎水性官能基に細胞外小胞体を結合させる段階；
（c）前記固定相において疎水性官能基に結合していない試料の残余物を洗浄する段階；及び
（d）前記固定相から疎水性官能基と結合した細胞外小胞体を溶出させる段階、
を含む、細胞外小胞体分離方法。
【請求項２】
前記（b）段階以前に、前記疎水性官能基を有する固定相を、塩析イオンを含む溶液で洗浄する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項３】
前記塩析イオンの濃度は、前記固定相に細胞外小胞体が結合できるように、固定相の疎水性を調節する濃度であることを特徴とする、請求項２記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項４】
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項３記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項５】
前記（b）段階において、細胞外小胞体が含まれた試料を固定相にローディングする前に、試料に塩析イオンを含む溶液を添加して、試料に含まれた塩析イオンの濃度又は種類を変化させる段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項６】
前記（d）段階において、細胞外小胞体を溶出させる前に、塩析イオンの種類又は濃度を調節して、細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が小さい物質を除去する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項７】
前記細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が小さい物質を除去するための塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍに調節されることを特徴とする、請求項６記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項８】
前記塩析イオンは、硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、フッ素化物、ギ酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、ヨウ化物、チオシアン酸塩、クエン酸塩及び酒石酸塩からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項２記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項９】
前記固定相は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、セファデックスビーズ、シリカビーズ、磁気ビーズ、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、紙、プラスチック、ガラス及び金属センサーチップからなる群から選択される１以上であることを特徴とする請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１０】
前記疎水性官能基は、ブチル基、シアノブチル基、オクチル基、フェニル基及びジフェニル基からなる群から選択される１以上であることを特徴とする請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１１】
前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、バクテリア細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、鼻水、汗、尿、糞便、脳脊髄液、腹水、羊水、気管支洗浄液、胸水、精液、乳、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される１以上であることを特徴とする請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１２】
前記細胞外小胞体分離方法は、前記（b）段階において、細胞外小胞体が含まれた試料を、前記固定相にローディングする前に、前処理する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１３】
前記試料の前処理段階は、遠心分離法、超遠心分離法、ろ過法、限外ろ過法、透析法、脱塩カラムクロマトグラフィー法、音波処理法、密度勾配法、サイズ排除法、イオン交換クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、沈殿法及び水溶液二相系法からなる群から選択される１以上の方法であることを特徴とする、請求項１２記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１４】
前記細胞外小胞体分離方法は、前記（d）段階において溶出された試料中の細胞外小胞体を後処理する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１５】
前記細胞外小胞体の後処理段階は、遠心分離法、超遠心分離法、ろ過法、限外ろ過法、透析法、脱塩カラムクロマトグラフィー法、音波処理法、密度勾配法、サイズ排除法、イオン交換クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、沈殿法及び水溶液二相系法からなる群から選択される１以上の方法であることを特徴とする、請求項１４記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法で分離された、細胞外小胞体。
【請求項１７】
（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階；
（b）前記疎水性官能基が固定された固定相に、細胞外小胞体が含まれた試料をローディングする段階；及び
（c）前記固定相において疎水性官能基に結合していない細胞外小胞体を含む試料を回収する段階を含む、細胞外小胞体分離方法。
【請求項１８】
前記（b）段階の以前に、前記疎水性官能基を有する固定相を、塩析イオンを含む溶液で洗浄する段階をさらに含む、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項１９】
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項１８記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２０】
前記（b）段階において、細胞外小胞体が含まれた試料を固定相にローディングする前に、試料に塩析イオンを含んだ溶液、又は塩析イオンを含まない溶液を添加して、試料に含まれた塩析イオンの濃度又は種類を変化させる段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２１】
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項２０記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２２】
前記塩析イオンは、硫酸塩、リン酸塩、水酸化物、フッ素化物、ギ酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、硝酸塩、ヨウ化物、チオシアン酸塩、クエン酸塩及び酒石酸塩からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２３】
前記固定相は、アガロースビーズ、セファロースビーズ、セファデックスビーズ、シリカビーズ、磁気ビーズ、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜、紙、プラスチック、ガラス及び金属センサーチップからなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２４】
前記疎水性官能基は、ブチル基、シアノブチル基、オクチル基、フェニル基及びジフェニル基からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２５】
前記試料は、哺乳動物細胞培養培地、細菌細胞培養培地、酵母培養培地、組織抽出物、癌組織、血清、血漿、唾液、涙、鼻水、汗、尿、糞便、脳脊髄液、腹水、羊水、気管支洗浄液、胸水、精液、乳、ほこり、淡水、海水、土壌及び発酵食品からなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２６】
前記細胞外小胞体の分離方法は、前記（b）段階において細胞外小胞体が含まれた試料を、前記固定相にローディングする前に、前処理する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２７】
前記試料の前処理段階は、遠心分離法、超遠心分離法、ろ過法、限外ろ過法、透析法、脱塩カラムクロマトグラフィー法、音波処理法、密度勾配法、サイズ排除法、イオン交換クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、沈殿法及び水溶液二相系法からなる群から選択される１以上の方法であることを特徴とする、請求項２６記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２８】
前記細胞外小胞体の分離方法は、前記（c）段階において、回収された試料中の細胞外小胞体を後処理する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項１７記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項２９】
前記細胞外小胞体の後処理段階は、遠心分離法、超遠心分離法、ろ過法、限外ろ過法、透析法、脱塩カラムクロマトグラフィー法、音波処理法、密度勾配法、サイズ排除法、イオン交換クロマトグラフィー法、親和性クロマトグラフィー法、沈殿法及び水溶液二相系法からなる群から選択される１以上の方法であることを特徴とする、請求項２８記載の細胞外小胞体分離方法。
【請求項３０】
請求項１７〜２９のいずれかに記載の方法で分離された細胞外小胞体。
【請求項３１】
（a）固定相に疎水性官能基を固定させる段階；
（b）前記疎水性官能基が固定された固定相に、細胞外小胞体が含まれた試料をローディングする段階；及び
（c）前記固定相から疎水性官能基に結合していない試料を回収する段階、
を含む、細胞外小胞体が含まれた試料から細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法。
【請求項３２】
細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記（b）段階の前に、前記疎水性官能基が固定された固定相を、塩析イオンを含む溶液で洗浄する段階をさらに含むことを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
細胞外小胞体が含まれた試料から細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記（b）段階において細胞外小胞体が含まれた試料を固定相にローディングする前に、試料に塩析イオンが含まれた溶液を添加して、試料に含まれた塩析イオンの濃度又は種類を変化させる段階をさらに含むことを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記塩析イオンの濃度は、０Ｍ〜１０Ｍであることを特徴とする、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質を除去する方法であって、
前記細胞外小胞体より疎水性相互作用の強度が高い物質は、脂質タンパク質であることを特徴とする、請求項３１記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明の用語「塩析イオン（salting-out ion）」とは、溶液中で水への可溶性を減少させ、疎水性相互反応の強度を増加させるためのものであり、水の構造を安定化させるコスモトロピック塩（kosmotropic salt）を指す。これらのコスモトロピック塩は、溶液から溶解性物質の溶解度に影響を与える能力の程度によってホフマイスター系列（Hofmeister series）で表し、陰イオン系列は以下の通りである：ＳＯ４２−＞ＨＰＯ４２−＞ＯＨ−＞Ｆ−＞ＨＣＯＯ−＞ＣＨ３ＣＯＯ−＞Ｃｌ−＞Ｂｒ−＞ＮＯ３−＞Ｉ−＞ＳＣＮ−＞ＣｌＯ４−。陽イオン系列は、以下の通りである：ＮＨ４＋＜Ｒｂ＋＜Ｋ＋＜Ｎａ＋＜Ｃｓ＋＜Ｌｉ＋＜Ｃａ２＋＜Ｍｇ２＋＜Ｂａ２＋。コスモトロピック塩は、ホフマイスター系列に沿って、疎水性粒子に対する塩析イオンとして作用する。本発明の前記塩析イオンは、ホフマイスター系列で水の構造を安定化させる陰イオンとそのカウンター陽イオンとからなるコスモトロピック塩でもある。