【手続補正書】
【提出日】令和3年5月24日(2021.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）を生成する方法であって、
神経外胚葉性分化を誘導するためにトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の阻害剤およびソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）シグナル伝達の活性化因子を含む基礎培地中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養する工程であって、前記基礎培地が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、塩化リチウム（Ｌｉ−Ｃｌ）、ＧＡＢＡ、およびピペコリン酸を欠く、工程
を含み、それによりＢＦＣＮが生成される、方法。
【請求項２】
前記阻害剤が、ＳＭＡＤ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記活性化因子が、スムーズンドタンパク質のアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
培養が、約４〜９日間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤ２７１＋細胞を選択する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を前記活性化因子または阻害剤と接触させる前に、ｍＴｅＳＲ１基礎培地中でコンフルエントになるまで前記細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＳＣが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記培養された細胞が、培養の８日目までにＮｋｘ２．１の均一な発現を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記培養された細胞が、培養の８日目までに記録可能な活動電位を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法を用いて生成されたＢＦＣＮを含む、対象において疾患または障害を治療するための薬学的組成物。
【請求項１１】
前記疾患または障害が、アミロイド形成疾患である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
以下の工程を含む方法を用いて生成された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、対象における前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）の神経細胞興奮性を回復させるための薬学的組成物：
ａ）前記対象から単離したＢＦＣＮを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する工程であって、前記ＢＦＣＮが、前記ＢＦＣＮの神経細胞興奮性の障害を生じさせる、プレセニリン２（ＰＳＥＮ２）における変異を有する、工程；
ｂ）前記ｉＰＳＣにおける前記ＰＳＥＮ２の変異を修復する工程；および
ｃ）請求項１に記載の方法を用いて（ｂ）の前記ｉＰＳＣを培養して、前記変異が修復されたＢＦＣＮを生成する工程。
【請求項１３】
前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）における神経細胞興奮性の低下と関連する疾患もしくは障害の治療または予防のための化合物を同定する方法であって、
ａ）請求項１に記載の方法により生成されたＢＦＣＮまたは神経胚様体（ＮＥＢ）を候補化合物と接触させる工程であって、前記ＢＦＣＮが、前記ＢＦＣＮの神経細胞興奮性の障害を生じさせるプレセニリン２（ＰＳＥＮ２）における変異を含む、接触させる工程；および
ｂ）前記候補化合物との接触後に前記ＢＦＣＮの神経細胞興奮性を検出する工程
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法を用いて生成された、前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）。
【請求項１５】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の阻害剤およびソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）シグナル伝達の活性化因子を有する培地を含む、前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）を生成するためのキットであって、前記基礎培地が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、塩化リチウム（Ｌｉ−Ｃｌ）、ＧＡＢＡ、およびピペコリン酸を欠き、前記阻害剤が、ＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ１９３１８９を含み、前記活性化因子が、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）およびプルモルファミンを含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明はまた、ＢＦＣＮを生成するためのキットを提供する。当該キットは、ＴＧＦ−βシグナル伝達の阻害剤およびＳｈｈシグナル伝達の活性化因子を有する培地を含む。実施形態において、当該培地は、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−β、塩化リチウム（Ｌｉ−Ｃｌ）、ＧＡＢＡ、およびピペコリン酸を含む多能性を支持する因子を欠く、改変されたｍＴｅＳＲ１組成である。実施形態において、当該培地は、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）およびプルモルファミンのような、スムーズンドタンパク質の１つまたは複数のアゴニストと共に、ＳＢ４３１５４２およびＬＤＮ１９３１８９のような、二重のＳＭＡＤ阻害剤を含む。当該キットはまた、場合により、Ｂ２７サプリメント、ＲＯＣＫの阻害剤、ＮＧＦ、およびＢＤＮＦのうちの１つまたは複数を追加したＢｒａｉｎｐｈｙｓ（商標）のような、神経細胞の基礎培地を含んでもよい。実施形態において、当該キットは、ＣＤ２７１＋細胞、並びにＴｕｊ１、ＭＡＰ２、ＢＦ１、Ｎｋｘ２．１、およびｐ７５を陽性発現する細胞の検出用試薬を含む。
[本発明1001]
前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）を生成する方法であって、
神経外胚葉性分化を誘導するためにトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の阻害剤およびソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）シグナル伝達の活性化因子を含む基礎培地中で多能性幹細胞（ＰＳＣ）を培養する工程であって、前記基礎培地が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、塩化リチウム（Ｌｉ−Ｃｌ）、ＧＡＢＡ、およびピペコリン酸を欠く、工程
を含み、それによりＢＦＣＮが生成される、方法。
[本発明1002]
前記阻害剤が、ＳＭＡＤ阻害剤である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記阻害剤が、ＳＢ431542、ＬＤＮ193189、またはそれらの組み合わせである、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記活性化因子が、スムーズンドタンパク質のアゴニストである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記活性化因子が、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、プルモルファミン、またはそれらの組み合わせである、本発明1004の方法。
[本発明1006]
培養が、約4〜9日間行われる、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記阻害剤が、約2日目〜8日目に前記培地中に存在する、本発明1002の方法。
[本発明1008]
ＣＤ271＋細胞を選択する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
選択する工程が、約9〜12日間の培養の後に行われる、本発明1008の方法。
[本発明1010]
神経細胞の基礎培地中で前記ＣＤ271＋細胞を培養して、神経胚様体（ＮＥＢ）を生成する工程をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記ＣＤ271＋細胞を約7日間培養し、それによりＮＥＢを生成する、本発明1010の方法。
[本発明1012]
ａ）前記ＮＥＢを回収する工程；および
ｂ）前記ＮＥＢの細胞を解離させて、前記解離させた細胞を単層として再播種する工程
をさらに含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記再播種された細胞を、前記細胞の生存を維持するため成長因子を有する培地中でさらなる持続期間培養し、前記細胞が、Ｔｕｊ1、ＭＡＰ2、ＢＦ1、Ｎｋｘ2．1、およびｐ75を発現する、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記細胞を前記活性化因子または阻害剤と接触させる前に、ｍＴｅＳＲ1基礎培地中でコンフルエントになるまで前記細胞を培養する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記ＰＳＣがヒト細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記ＰＳＣが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記ｉＰＳＣが、アルツハイマー病（ＡＤ）と診断されたかまたはそれを有するリスクがある対象に由来する、本発明1016の方法。
[本発明1018]
前記ＰＳＣが、プレセニリン2（ＰＳＥＮ2）に変異を有するＢＦＣＮに由来する、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記変異がＰＳＥＮ2Ｎ141Ｉである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記変異が、前記ｉＰＳＣの生成後に修復される、本発明1018の方法。
[本発明1021]
前記変異が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、ＴＡＬＥＮシステム、および相同組換えからなる群より選択される遺伝子編集システムを用いて修復される、本発明1021の方法。
[本発明1022]
前記培養された細胞が、培養の8日目までにＮｋｘ2．1の均一な発現を示す、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記培養された細胞が、培養の8日目までに記録可能な活動電位を示す、本発明1001の方法。
[本発明1024]
前記培養された細胞が、成熟した活動電位を示す、本発明1012の方法。
[本発明1025]
前記培養された細胞が、培養の38日目までに成熟した活動電位を示す、本発明1001の方法。
[本発明1026]
前記培養された細胞が、対照と比較して、Ａβ42／40比の正常化を示す、本発明1020の方法。
[本発明1027]
前記培養された細胞が、対照と比較して、電気生理学的異常の低減を示す、本発明1020の方法。
[本発明1028]
前記電気生理学的異常の低減が、対照と比較して、脱分極電流に応答したスパイクの最大数およびスパイク高の回復を含む、本発明1027の方法。
[本発明1029]
対象において疾患または障害を治療する方法であって、本発明1001の方法を用いて生成されたＢＦＣＮを前記対象に投与することを含み、それにより前記疾患または障害が治療される、方法。
[本発明1030]
前記疾患または障害が、アミロイド形成疾患である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記疾患または障害が、前記対象のＢＦＣＮにおける神経細胞興奮性の低下と関連する、本発明1029の方法。
[本発明1032]
前記疾患または障害が、全身性アミロイドーシス、アルツハイマー病、成人発症型糖尿病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、およびプリオン関連伝達性海綿状脳症からなる群より選択される、本発明1030の方法。
[本発明1033]
前記ＢＦＣＮが、ＰＳＥＮ2変異が修復されたゲノムを含む、本発明1029の方法。
[本発明1034]
前記ＰＳＥＮ2変異がＰＳＥＮ2Ｎ141Ｉである、本発明1033の方法。
[本発明1035]
対象における前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）の神経細胞興奮性を回復させる方法であって、
ａ）前記対象からＢＦＣＮを単離する工程であって、前記ＢＦＣＮが、前記ＢＦＣＮの神経細胞興奮性の障害を生じさせる、プレセニリン2（ＰＳＥＮ2）における変異を有する、単離する工程；
ｂ）（ａ）の前記ＢＦＣＮを使用して人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成する工程；
ｃ）前記ｉＰＳＣにおける前記ＰＳＥＮ2の変異を修復する工程；
ｄ）本発明1001の方法を用いて（ｃ）の前記ｉＰＳＣを培養して、前記変異が修復されたＢＦＣＮを生成する工程；および
ｅ）（ｄ）の前記ｉＰＳＣを前記対象に投与する工程であって、それにより前記対象におけるＢＦＣＮの神経細胞興奮性が回復する、投与する工程
を含む、方法。
[本発明1036]
前記変異がＰＳＥＮ2Ｎ141Ｉである、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記変異が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｃｒｅ／Ｌｏｘシステム、ＴＡＬＥＮシステム、および相同組換えからなる群より選択される遺伝子編集システムを用いて修復される、本発明1035の方法。
[本発明1038]
前記対象が、アルツハイマー病を有するか、または有するリスクがある、本発明1035の方法。
[本発明1039]
前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）における神経細胞興奮性の低下と関連する疾患もしくは障害の治療または予防のための化合物を同定する方法であって、
ａ）本発明1001の方法により生成されたＢＦＣＮまたは神経胚様体（ＮＥＢ）を候補化合物と接触させる工程であって、前記ＢＦＣＮが、前記ＢＦＣＮの神経細胞興奮性の障害を生じさせるプレセニリン2（ＰＳＥＮ2）における変異を含む、接触させる工程；および
ｂ）前記候補化合物との接触後に前記ＢＦＣＮの神経細胞興奮性を検出する工程
を含む、方法。
[本発明1040]
前記変異がＰＳＥＮ2Ｎ141Ｉである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
前記疾患または障害が、アルツハイマー病である、本発明1039の方法。
[本発明1042]
ハイスループットな方法である、本発明1039の方法。
[本発明1043]
本発明1001の方法を用いて生成された、前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）。
[本発明1044]
ゲノムが、組換え導入されたマーカーを有する、本発明1043のＢＦＣＮ。
[本発明1045]
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）シグナル伝達の阻害剤およびソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）シグナル伝達の活性化因子を有する培地を含む、前脳基底部コリン作動性神経細胞（ＢＦＣＮ）を生成するためのキットであって、前記基礎培地が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、塩化リチウム（Ｌｉ−Ｃｌ）、ＧＡＢＡ、およびピペコリン酸を欠き、前記阻害剤が、ＳＢ431542およびＬＤＮ193189を含み、前記活性化因子が、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）およびプルモルファミンを含む、キット。
[本発明1046]
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための試薬をさらに含む、本発明1045のキット。
[本発明1047]
遺伝子編集試薬をさらに含む、本発明1045のキット。
[本発明1048]
遺伝子変異を検出するための試薬をさらに含む、本発明1045のキット。
[本発明1049]
前記変異がＰＳＥＮ2Ｎ141Ｉである、本発明1048のキット。