(57)【要約】      （修正有）【課題】Ｔヘルパー及びＣＴＬエピトープを含む合成免疫原性リポペプチド分子、それらの製造方法、一次及び二次免疫応答の発生における使用、並びに特定のＣＴＬエピトープに対する動物被験体のワクチン接種のための使用を提供する。【解決手段】脂質部分が内部リジン又はリジン類似体の末端側鎖基（好ましくは内部ジアミノ酸残基の末端側鎖基）に結合している、高度に可溶性のリポペプチド。好ましくは、内部リジン又はリジン類似体は、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に位置する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープおよび細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ（ただしＴｈエピトープのアミノ酸配列はＣＴＬエピトープのアミノ酸配列とは異なる）；
１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基；および
１個または複数の脂質部分；
を含むリポペプチドであって、
前記脂質部分が、前記内部リジン残基または内部リジン類似体残基に共有結合している、
上記リポペプチド。
【請求項２】
前記１個または複数の脂質部分の各々が、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に共有結合している、請求項１に記載のリポペプチド。
【請求項３】
前記脂質がリジン残基のε−アミノ基に結合している、請求項１または２に記載のリポペプチド。
【請求項４】
脂質部分が結合している前記内部リジン残基が、前記Ｔｈエピトープと前記ＣＴＬエピトープの間に位置する、請求項１から３のいずれか１項に記載のリポペプチド。
【請求項５】
脂質部分が結合している前記内部リジン残基が、前記Ｔｈエピトープ内に位置する、請求項１から３のいずれか１項に記載のリポペプチド。
【請求項６】
前記脂質部分が一般式（ＶＩＩ）：
【化１】
2010132663.tif 000013
（式中、
（ｉ）Ｘは、硫黄、酸素、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、メチレン（−ＣＨ２−）およびアミノ（−ＮＨ−）からなる群から選択され、
（ｉｉ）ｍは、１または２の整数であり、
（ｉｉｉ）ｎは、０〜５の整数であり、
（ｉｖ）Ｒ１は、水素、カルボニル（−ＣＯ−）およびＲ’−ＣＯ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
（ｖ）Ｒ２は、Ｒ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
（ｖｉ）Ｒ３は、Ｒ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は同じでも異なっていてもよい。）
の構造を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項７】
Ｘが硫黄であり、ｍとｎがともに１であり、Ｒ１が水素およびＲ’−ＣＯ−（式中Ｒ’は７〜２５個の炭素原子を有するアルキル基である）からなる群から選択され、Ｒ２およびＲ３がＲ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は７〜２５個の炭素原子を有するアルキル基である）からなる群から選択される、請求項６に記載のリポペプチド。
【請求項８】
Ｒ’が、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイル、デカノイルおよびコレステロールからなる群から選択される、請求項７に記載のリポペプチド。
【請求項９】
前記脂質が、Ｐａｍ１Ｃｙｓ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｃｈｏｌ２Ｌｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２ＣｙｓおよびＯｃｔ２Ｃｙｓからなる群から選択されるリポアミノ酸部分内に含まれる、請求項６から８のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１０】
前記リポアミノ酸部分がＰａｍ２Ｃｙｓである、請求項９に記載のリポペプチド。
【請求項１１】
前記脂質部分が、以下の一般式（ＶＩＩＩ）：
【化２】
2010132663.tif 000014
（式中、
（ｉ）Ｒ４は、（ｉ）７〜２５個の炭素原子からなるα−アシル脂肪酸残基、（ｉｉ）α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸残基、（ｉｉｉ）α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸残基のβ−ヒドロキシエステル、および（ｉｖ）リポアミノ酸残基、からなる群から選択され、
（ｉｉ）Ｒ５は、水素、またはアミノ酸残基の側鎖である。）
を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１２】
前記脂質部分が前記ペプチド部分からスペーサーによって分離されている、請求項１から１１のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１３】
前記スペーサーが、アルギニン、セリンまたは６−アミノヘキサン酸を含む、請求項１２に記載のリポペプチド。
【請求項１４】
前記スペーサーがセリンホモ二量体からなる、請求項１２または１３に記載のリポペプチド。
【請求項１５】
前記内部リジンまたは内部リジン類似体が、免疫原性の低い合成アミノ酸配列内に入れ子状に置かれている、請求項１から１４のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１６】
前記Ｔヘルパーエピトープが、インフルエンザウイルス赤血球凝集素のＴヘルパーエピトープ、またはイヌジステンパーウイルスＦ（ＣＤＶ−Ｆ）タンパク質のＴヘルパーエピトープである、請求項１から１５のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項１７】
前記インフルエンザウイルス赤血球凝集素のＴヘルパーエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のリポペプチド。
【請求項１８】
前記ＣＤＶ−Ｆタンパク質のＴヘルパーエピトープが、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のリポペプチド。
【請求項１９】
前記ＣＴＬエピトープが、ウイルスの免疫原性タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質に由来する、請求項１から１８のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項２０】
ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１９に記載のリポペプチド。
【請求項２１】
前記ＣＴＬエピトープが、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のリポペプチド。
【請求項２２】
ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである、請求項１９に記載のリポペプチド。
【請求項２３】
前記ＣＴＬエピトープが、配列番号１７６で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のリポペプチド。
【請求項２４】
前記ＣＴＬエピトープが、原核生物の免疫原性タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質に由来する、請求項１から１８のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項２５】
前記ＣＴＬエピトープが、リステリア・モノサイトゲネスに由来する、請求項２４に記載のリポペプチド。
【請求項２６】
前記ＣＴＬエピトープが、配列番号１７２で示されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載のリポペプチド。
【請求項２７】
前記ＣＴＬエピトープが、真核生物の免疫原性タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質に由来する、請求項１から１８のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項２８】
前記真核生物が寄生生物である、請求項２７に記載のリポペプチド。
【請求項２９】
前記真核生物が哺乳動物である、請求項２７に記載のリポペプチド。
【請求項３０】
前記ＣＴＬエピトープが、哺乳動物または腫瘍細胞のオボアルブミンタンパク質に由来する、請求項２９に記載のリポペプチド。
【請求項３１】
前記ＣＴＬエピトープが、配列番号１７３で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載のリポペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、配列番号３、配列番号４、配列番号１７４、配列番号１７５、および配列番号１７７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項３３】
未成熟樹状細胞（ＤＣ）上でのＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現をアップレギュレート可能である、請求項１から３２のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項３４】
前記ＤＣがＤ１細胞である、請求項３３に記載のリポペプチド。
【請求項３５】
Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープおよび細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）エピトープ（ただしＴｈエピトープのアミノ酸配列はＣＴＬエピトープのアミノ酸配列とは異なる）；
１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基；
１個または複数の脂質部分；
を含むリポペプチドであって、
前記脂質部分が、前記内部リジン残基または内部リジン類似体残基に共有結合しており、
前記リポペプチドが一般式（ＶＩ）：
【化３】
2010132663.tif 000015
（式中、
一方のエピトープはＴヘルパーエピトープであり、かつ他方のエピトープはＣＴＬエピトープであり、
Ａは、存在しているかまたは存在しておらず、かつ約１〜約６アミノ酸長のアミノ酸スペーサーからなり、
ｎは、１、２、３または４の整数であり、
Ｘは、ＮＨ、ＯおよびＳからなる群から選択される末端側鎖基であり、
Ｙは、存在しているかまたは存在しておらず、かつ約１〜約６アミノ酸長のアミノ酸スペーサーからなり、
Ｚは、脂質部分である。）
を有する、上記リポペプチド。
【請求項３６】
Ａが存在しない、請求項３５に記載のリポペプチド。
【請求項３７】
Ｙが存在し、かつセリンホモ二量体からなる、請求項３５または３６に記載のリポペプチド。
【請求項３８】
Ｚが、Ｐａｍ１Ｃｙｓ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｃｈｏｌ２Ｌｙｓ、Ｓｔｅ２Ｃｙｓ、Ｌａｕ２ＣｙｓおよびＯｃｔ２Ｃｙｓからなる群から選択される、請求項３５から３７のいずれか一項に記載のリポペプチド。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれか一項に記載のリポペプチドおよび薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に免疫学の分野に関し、より詳細には、ペプチド免疫原に対して細胞性応答を発生させる試薬、ならびに被験体の免疫応答を高める前記試薬の使用方法、あるいは被験体のワクチン接種のための前記試薬の使用方法に関する。さらにより詳細には、本発明は、免疫原性活性が増強された新規リポペプチド、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するＴ細胞応答を活性化して、侵襲性病原体または腫瘍細胞に対する細胞媒介性免疫を誘導する能力が増強されたリポペプチドに関する。本発明はまた、薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせた前記リポペプチドを含む製剤およびワクチン組成物、ならびに本発明の製剤およびワクチン組成物の製造および使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１．概記
本明細書は、要約書の後ろに、ＰａｔｅｎｔＩｎ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１を使用して作成されたアミノ酸配列情報を含む。各配列は、配列表中で数値標識とそれに続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２など）によって区別されている。各配列の長さおよび供給源生物は、それぞれ数値標識フィールド＜２１１＞および＜２１３＞中に提供される情報によって示される。本明細書中で参照する配列は、「配列番号」とそれに続く配列識別子によって定義される（例えば、配列番号１は、＜４００＞１と命名された配列である）。
【０００３】
本明細書で使用する「由来する」という用語は、指定された完全体（integer）を特定の供給源から、必ずしもその供給源から直接に得なくても、得ることができることを示すものと解釈すべきである。
【０００４】
本明細書を通して、特別な場合を除いて、「含む（comprise）」、または「含む（comprises）」、「含むこと（comprising）」などの変形形態は、規定されたステップまたは構成要素または整数、あるいはステップまたは構成要素または整数のグループを含むことを意味するが、他のステップまたは構成要素または整数、あるいは構成要素または整数のグループを排除するものではないことを理解されたい。
【０００５】
本明細書に記載する本発明は、具体的に記載されたもの以外の変更形態および改変形態が可能であることを当業者であれば理解しうる。本発明は、このような変更形態および改変形態のすべてを含むと理解すべきである。本発明は、本明細書中で参照するまたは示すステップ、特徴、組成物および化合物のすべてを個々にまたは包括的に含み、前記ステップまたは特徴のあらゆる組合せまたは任意の２つ以上も含む。
【０００６】
本発明は、本明細書に記載する具体例によって範囲が限定されるべきではない。機能的に等価な生成物、組成物および方法が、本明細書に記載する本発明の範囲内にあるのは明らかである。
【０００７】
本願に引用するすべての参考文献を参照により本明細書に援用する。
【０００８】
本発明は、特に示さない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成および免疫学の従来技術を使用して、過度の実験を行うことなく実施される。このような手順は、例えば、参照により本明細書に援用する以下のテキストに記載されている。
【０００９】
2010132663.tif 000002
【００１０】
関連技術の記載
免疫療法またはワクチン接種は、多様な障害、例えば、ある種の感染症、癌などの予防または治療に有用である。しかし、このような治療の適用および成功は、標的ＣＴＬエピトープの免疫原性が低いためにある程度制限を受ける。Ｔ細胞免疫原を提示する合成ペプチドは、単離して送達した場合に弱い免疫しか誘発せず、その結果ワクチン組成物において有効ではない。ＣＴＬエピトープを含む全長タンパク質はＭＨＣクラスＩプロセシング経路に効率的に侵入することはない。さらに、ＣＴＬエピトープは、ＨＬＡが厳密であり、ヒト集団における広範囲のＨＬＡ多型は、ＣＴＬに基づくワクチンが集団内の全ての遺伝子型を広くカバーするものではないことを意味している。
【００１１】
ペプチド免疫原に対する被験体の免疫応答を高めるためにいくつかの技術が使用されている。
【００１２】
例えば完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）などのペプチド免疫原に対して外来的なアジュバント製剤を利用して、ペプチド免疫原に対する被験体の免疫応答を高めることが知られている（すなわち、使用前に免疫原と混合される）。しかし、現在利用可能なアジュバントの多くは、ヒトに使用するには毒性が強すぎるか、単に無効である。さらに、このタイプのアジュバントは、投与直前にペプチド免疫原と予め製剤化することを必要とする。このような製剤は、可溶性が低く、または不溶性であることが多い。
【００１３】
アジュバントとして作用することが知られている脂質部分がペプチド免疫原に共有結合しているリポペプチドは、外来的なアジュバントの不在下で、さもなければ免疫原性の低いペプチドの免疫原性を高めることができる［Jung et al.、Angew Chem、Int Ed Engl 10、872、(1985)；Martinon et al.、J Immunol 149、3416、(1992)；Toyokuni et al.、J Am Chem Soc 116、395、(1994)；Deprez、et al.、J Med Chem 38、459、(1995)；およびSauzet et al.、Vaccine 13、1339、(1995)；Benmohamed et al.、Eur.J.Immunol.27、1242、(1997)；Wiesmuller et al.、Vaccine 7、29、(1989)；Nardin et al.、Vaccine 16、590、(1998)；Benmohamed、et al.Vaccine 18、2843、(2000)；およびObert、et al.、Vaccine 16、161、(1998)］。適切なリポペプチドは、アジュバント製剤に伴う有害な副作用を示さず、リポペプチドに対して抗体と細胞の両方の応答が認められる。
【００１４】
脂質部分に使用される様々な脂肪酸がいくつか知られている。代表的な脂肪酸としては、これらだけに限定されないが、パルミトイル基、ミリストイル基、ステアロイル基およびデカノイル基が挙げられ、より一般的には、あらゆるＣ２〜Ｃ３０飽和、一不飽和または多価不飽和の脂肪アシル基が有用と考えられる。
【００１５】
リポアミノ酸のＮ−パルミトイル−Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システインは、Ｐａｍ３ＣｙｓまたはＰａｍ３Ｃｙｓ−ＯＨとしても知られ（Wiesmuller et al.、Z.Physiol.Chem.364(1983)、p593）、グラム陰性菌の内膜から外膜に及ぶブラウンのリポタンパク質のＮ末端部分の合成品である。Ｐａｍ３Ｃｙｓは、式（Ｉ）の構造を有する：
【化１】
2010132663.tif 000003
【００１６】
Ｍｅｔｚｇｅｒらの米国特許第５，７００，９１０号（１９９７年１２月２３日）は、合成アジュバント、Ｂリンパ球刺激薬、マクロファージ刺激薬または合成ワクチンとして使用されるリポペプチドの調製において中間体として使用されるいくつかのＮ−アシル−Ｓ−（２−ヒドロキシアルキル）システインを記載している。Ｍｅｔｚｇｅｒらは、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−ＯＨの合成におけるこのような化合物の中間体としての使用（Wiesmuller et al.、Z.Physiol.Chem.364、p593、1983）、およびＮ末端にこのリポアミノ酸またはその類似体を含むリポペプチドの使用も教示している。リポペプチドは、その合成過程においてリポアミノ酸部分をペプチド部分にカップリングさせることにより調製される。
【００１７】
Ｐａｍ３Ｃｙｓは、ＣＴＬエピトープペプチドに結合すると、インフルエンザウイルス感染細胞に対してウイルス特異的細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）応答を刺激することができ（Deres et al.、Nature 342、561、1989）、適当な合成Ｂ細胞エピトープのＮ末端に結合すると口蹄疫に対する感染防御抗体を誘発すること（Wiesmuller et al.、Vaccine 7、29、1989；Jung et al.の米国特許第６，０２４，９６４号、2000年2月15日）が示されている。
【００１８】
最近、Ｐａｍ３Ｃｙｓの類似体であるＰａｍ２Ｃｙｓ（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システインまたはＳ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システインとしても知られる）が合成され（Metzger,J.W.、A.G.Beck-Sickinger、M.Loleit、M.Eckert、W.G.Besser、and G.Jung.1995.J Pept Sci 1:184）、マイコプラズマから単離されたマクロファージ活性化リポペプチドＭＡＬＰ−２の脂質部分に相当することが判明した（Sacht,G.、A.Marten、U.Deiters、R.Sussmuth、G.Jung、E.Wingender、and P.F.Muhlradt.1998.Eur J Immunol 28:4207:Muhlradt,P.F.、M.Kiess、H.Meyer、R.Sussmuth、and G.Jung.1998.Infect Immun 66:4804：Muhiradt,P.F.、M.Kiess、H.Meyer、R.Sussmuth、and G.Jung.1997.J Exp Med 185:1951）。Ｐａｍ２Ｃｙｓは式（ＩＩ）の構造を有する：
【化２】
2010132663.tif 000004
【００１９】
Ｐａｍ２Ｃｙｓは、Ｐａｍ３Ｃｙｓよりも強力な脾細胞およびマクロファージの刺激物質であると報告されている（Metzger et al.、J Pept.Sci 1、184、1995；Muhlradt et al.、J Exp Med 185、1951、1997；およびMuhlradt et al.、Infact Immun 66、4804、1998）。
【００２０】
所与のＣＴＬエピトープに対して強力なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を発生させるためには、強いＴヘルパー細胞応答を発生させる必要がある。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、十分なサイトカイン（例えばＩＬ−２など）を分泌し、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進するか、あるいは抗原提示細胞（ＡＰＣ）と相互作用して、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化にさらに高い効力を有するようにすることによって、細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）において機能する。したがって、ＣＴＬエピトープを少なくとも１個のＴヘルパー細胞エピトープとともに投与することが望ましい（Vitiello et al.、J.Clin.Invest 95、341〜349、1995；Livingston et al.、J.Immunol.159、1383〜1392、1997）。これらのエピトープは、ＡＰＣの表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して、Ｔヘルパー細胞により認識される。
【００２１】
ＣＴＬエピトープまたは単離されたエピトープを、一定範囲のＴヘルパーエピトープを有する大きなタンパク質と組み合わせて投与し、個体の集団内でクラスＩＩ対立遺伝子の多様性を適合させることができる。あるいは、乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープ含有ペプチドをＣＴＬエピトープ（１種または複数）とともに投与する。乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープ含有ペプチドは、圧倒的多数がＭＨＣクラスＩＩハプロタイプとして提示されるので、非近交系ヒト集団の大多数において強いＣＤ４＋  Ｔヘルパー応答を誘発する。乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープの例は、破傷風トキソイドペプチド、プラスモディウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）ｐｆｇ２７、乳酸デヒドロゲナーゼおよびＨＩＶｇｐ１２０である（Contreas et al.、Infect.Immun、66、3579〜3590、1998；Gaudebout et al.、J.A.I.D.S.Human Retrovirol 14、91〜101、1997；Kaumaya et al.、J.Mol.Recog.6、81〜94、1993；およびFern and Good J.Immunol.148、907〜913、1992）。また、Ghosh et al.、Immunol 104、58〜66、2001および国際特許出願第PCT/AU00/00070号（WO 00/46390）は、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ−Ｆ）融合タンパク質に由来する乱交雑Ｔヘルパーエピトープを記載している。ある種の乱交雑Ｔヘルパーエピトープは、所与のＣＴＬエピトープに対する強いＣＴＬ応答を誘発し、ある種のハプロタイプに限定された免疫応答を回避することができる（Kaumaya et al.、J.Mol.Recog.6、81〜94、1993）。
【００２２】
ワクチン製剤は、常に、Ｔヘルパー細胞エピトープおよびＣＴＬエピトープを含むポリペプチドの混合物を含むが、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの両方を含む単一ポリペプチドを投与することも知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】米国特許第5,700,910号明細書
【特許文献２】米国特許第6,024,964号明細書
【特許文献３】国際公開第00/46390号パンフレット
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), Vol I, II, およびIIIのテキスト全体
【非特許文献２】DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, テキスト全体
【非特許文献３】Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach  (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, テキスト全体及び特に以下の論文, Gait, pp1-22; Atkinson et al., pp35-81; Sproat et al., pp 83-115; and Wu et al., pp 135-151
【非特許文献４】Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, テキスト全体
【非特許文献５】Animal Cell Culture: Practical Approach, Third Edition (John R.W. Masters, ed., 2000), ISBN 0199637970, テキスト全体
【非特許文献６】Immobilized Cells and Enzymes: A Practical Approach (1986) IRL Press, Oxford, テキスト全体
【非特許文献７】Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)
【非特許文献８】Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.), 全巻
【非特許文献９】J.F. Ramalho Ortigao, “The Chemistry of Peptide Synthesis” In: Knowledge database of Access to Virtual Laboratory website (Interactiva, Germany)
【非特許文献１０】Sakakibara, D., Teichman, J., Lien, E. Land Fenichel, R.L. (1976). Biochem. Biophys. Res. Commun. 73 336-342
【非特許文献１１】Merrifield, R.B. (1963). J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154.
【非特許文献１２】Barany, G. and Merrifield, R.B. (1979) in The Peptides (Gross, E. and Meienhofer, J. eds.), vol. 2, pp. 1-284, Academic Press, New York.
【非特許文献１３】Wunsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Methoden der Organischen Chemie (Muler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, Thieme, Stuttgart.
【非特許文献１４】Bodanszky, M. (1984) Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.
【非特許文献１５】Bodanszky, M. & Bodanszky, A. (1984) The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg.
【非特許文献１６】Bodanszky, M. (1985) Int. J. Peptide Protein Res. 25, 449-474.
【非特許文献１７】Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications).
【非特許文献１８】Jung et al.、Angew Chem、Int Ed Engl 10、872、(1985)
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【非特許文献２９】Deres et al.、Nature 342、561、1989
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【非特許文献３４】Vitiello et al.、J.Clin.Invest 95、341〜349、1995
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【非特許文献４０】Ghosh et al.、Immunol 104、58〜66、2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明に至る研究において、本発明者らは、脂質部分と、免疫応答が望まれるＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの両方を含むポリペプチド部分とを有する高免疫原性リポペプチドの製造方法の改良を試みた。本発明者は、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの両方を含む高免疫原性リポペプチドが、内部リジン残基または内部リジン類似体残基を有する前記エピトープを含む単一ポリペプチド分子を合成し、続いて、脂質部分を、以前に報告されているＮ末端結合とは対照的に、該内部リジン残基または内部リジン類似体残基の側鎖アミノ基に結合させて合成することにより作製しうることを示した。これにより、本発明のリポペプチドは、単一のアミノ酸鎖を用いて簡便に合成することができ、そのため上記両方のエピトープを組み込むための合成後の修飾を行う必要がない。
【００２６】
１個もしくは複数のリジン残基または１個もしくは複数のリジン類似体残基をペプチド合成中にポリペプチド内の所定の位置に置くことによって、脂質の結合部位を容易に指定することができる。したがって、リポペプチド中の脂質部分の位置は、ワクチンまたはアジュバント製剤用最終産物の有用性を高めることを目標に決定しうる。
【００２７】
本発明者らは、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの各アミノ酸配列間に位置する内部リジン残基の側鎖ε−アミノ基または内部リジン類似体残基の末端側鎖基を介して脂質部分が結合すると、脂質がペプチドのＮ末端に結合した線状構造と比較して樹状細胞の成熟が増強されることを見出した。
【００２８】
本発明のリポペプチドによって提供される１つの利点は、これらのリポペプチドを含むワクチン製剤中に外来的なアジュバントを含めることが一般に不要なほどに十分な免疫原性を有することである。
【００２９】
本発明が、Ｔヘルパーエピトープのアミノ酸配列またはＣＴＬエピトープのアミノ酸配列中に存在する内部リジン残基のε−アミノ基または内部リジン類似体残基の末端側鎖基を介した脂質部分の結合を包含することは明白であり、唯一の要件は脂質部分がペプチドのＮ末端にもＣ末端にも結合していないことである。「内部」とは、ＴヘルパーエピトープおよびＣＴＬエピトープを含むポリペプチドのＮ末端またはＣ末端以外の位置を意味する。当業者には知られているとおり、商業ベースでワクチン製剤を製造するためには、ＣＴＬエピトープを含むワクチンの可溶性は極めて望ましい。
【００３０】
脂質部分は、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープのアミノ酸配列間に位置するリジン残基のεアミノ基、またはリジン類似体残基の末端側鎖基を介して結合することが好ましい。
【００３１】
場合によっては、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間の、例えばこれらの間に位置する内部リジンまたはリジン類似体のどちらか一方の側に、１または複数のアミノ酸スペーサーを付加してもよい。
【００３２】
従来の任意のタイプのスペーサーを、脂質部分とポリペプチド部分の間に付加することもできる。本発明において特に好ましいスペーサーは、セリン二量体、三量体、四量体などである。本発明においては、別のスペーサー、例えばアルギニン二量体、三量体、四量体、または６−アミノヘキサン酸を使用することができる。
【００３３】
本明細書に例示するように、本発明者は、脂質部分を合成ペプチド部分内の内部リジン残基の露出したεアミノ基に結合させることによって本発明のリポペプチドを製造した。場合により、脂質部分の付加の前に、露出したεアミノ基にスペーサーを付加してもよい。
【００３４】
本明細書の記載から明らかなように、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）のリポアミノ酸を、内部リジン残基のεアミノ基、または内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接付加することができる。以下からなる群より選択されるリポアミノ酸もまた有用である：（ｉ）Ｐａｍ２Ｃｙｓ（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システインまたはＳ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システインとしても知られる；（ｉｉ）Ｓｔｅ２Ｃｙｓ（Ｓ−［２，３−ビス（ステアロイルオキシ）プロピル］システインまたはジステアロイル−Ｓ−グリセリル−システインとしても知られる）、Ｌａｕ２Ｃｙｓ（Ｓ−［２，３−ビス（ラウロイルオキシ）プロピル］システインまたはジラウロイル−Ｓ−グリセリル−システイン）としても知られる）、およびＯｃｔ２Ｃｙｓ（Ｓ−［２，３−ビス（オクタノイルオキシ）プロピル］システインまたはジオクタノイル−Ｓ−グリセリル−システイン）としても知られる）。
【００３５】
本明細書に例示するとおり、インフルエンザウイルスに対する本発明のリポペプチドは、それらの強力なＣＴＬ媒介型ウイルスクリアランス応答を誘発する能力に反映されるように、外部アジュバントの不在下でウイルス特異的なＣＴＬ応答を誘発し、肺へのＣＴ８＋Ｔ細胞遊走を誘導し、そして未成熟樹状細胞（ＤＣ）上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現をアップレギュレートした。上記リポペプチドの投与後の樹状細胞の成熟の増強は、Ｎ末端に脂質が結合したリポペプチドと比較してＴヘルパーエピトープの提示が増強していたことと一致している。
【００３６】
当業者には明らかなように、ＴヘルパーおよびＣＴＬエピトープの性質は、本発明においては重要でない。構築体のポリペプチド部内の１個または複数の内部リジン残基またはリジン類似体残基のεアミノ基に脂質部分を結合させる新規な手法は、広範な応用分野を有する。したがって、本明細書が提示する結果に基づいて、多様なＴヘルパーエピトープおよびＣＴＬエピトープをリポペプチド構築体に使用できることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、本研究において使用したペプチドおよびリポペプチド構築体の一般構造を示す概略図である。
【図２】図２は、図１に示した構造の脂質部分に結合したペプチド部分の一次アミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、図１の説明に示したリポペプチドで初回免疫し、続いてインフルエンザウイルスを負荷（チャレンジ）したマウスのウイルス負荷の低減を示すグラフである。
【図４】図４ａは、図２の説明に記載したリポペプチドを投与した免疫マウスにおけるリポペプチドにより誘導されるウイルスクリアランスの増強を示すグラフである。図４ｂは、図２の説明に記載したリポペプチドを投与した免疫マウスにおけるＴ細胞活性化の増強を示すグラフである。図４ｃは、図２の説明に記載したリポペプチドに対して応答した樹状細胞の成熟の増強を示すグラフである。
【図５】図５は、それぞれ配列番号１に示すＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープおよび配列番号２に示すＨ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープを含む、Ｘ軸に示した合成免疫原を接種したマウスにおける肺ウイルスクリアランス応答の誘導を示すグラフである。
【図６】図６は、ウイルス負荷中のリポペプチドでワクチン接種したマウスの肺へのＣＴＬ決定基特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の流入の促進を示すグラフである。
【図７】図７は、ウイルス負荷後のリポペプチド接種したマウスの肺へのＣＴＬ決定基特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の流入の促進を示すグラフである。
【図８】図８は、未処理マウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞活性を示すグラフである。
【図９】図９は、リポペプチドを初回投与したマウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞活性を示すグラフである。
【図１０】図１０は、種々のペプチドに基づく免疫原のエピトープ特異的ＣＴＬを誘導する能力を示すグラフである。
【図１１】図１１は、リポペプチドによるインターフェロンγ産生細胞の誘導を示すグラフである。
【図１２】図１２は、図２に示す［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］と称するリポペプチドで免疫したマウスについてのＬ・モノサイトゲネス感染に対する防御の増大を示すグラフである。
【図１３】図１３は、リポペプチドワクチン接種によるＢ１６メラノーマに対する防御を示すグラフである。
【図１４】図１４は、リポペプチド免疫原によるルイス肺癌の治療処置を示すグラフであり、免疫後に腫瘍を有しない動物の割合（％）で表す。
【図１５】図１５は、リポペプチド免疫原によるルイス肺癌の治療処置を示すグラフであり、免疫後の動物の生存により判定した。
【図１６】図１６は、ペプチドおよびリポペプチドに基づく免疫原がヒト樹状細胞上のＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現をアップレギュレートする能力を示すグラフである。
【００３８】
図面の説明
図１は、本研究において使用したペプチドおよびリポペプチド構築体の一般構造を示す概略図である。ペプチド構造は、内部リジン残基（すなわち［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］）または内部リジンなし（すなわち［Ｔｈ］−［ＣＴＬ］）で、並列した線形配列として構築されたＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞エピトープ［Ｔｈ］およびＣＴＬ細胞エピトープ［ＣＴＬ］から構成される。リポペプチドは、分子のほぼ中央における２つのエピトープの間に配置されたリジン残基Ｌｙｓのεアミノ基を介して脂質部分が結合する分枝構造とした（すなわち、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］；［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］；または［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ１Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］）。分枝構造の場合には、脂質に結合する中央に位置するリジン残基をイタリック体（Ｌｙｓ）で示す。場合によっては２つにセリン残基（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）をペプチドと脂質部分の間に付加してもよい。リポペプチドＰａｌ２ＬｙｓＬｙｓ［Ｔｈ］−［ＣＴＬ］の場合には、２つのパルミチン酸残基をＮ末端リジン残基のαおよびεアミノ基に結合し、［Ｔｈ］をアミノ酸配列中の末端から２番目のリジンのεアミノ基に結合した。［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｃｈｏｌ２Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］の場合には、コレステロールの２つの残基をＮ末端リジン残基に結合した。
【００３９】
図２は、図１に示した構造の脂質部分に結合したペプチド部分の一次アミノ酸配列を示す。これらのアミノ酸配列を含む非脂質付加ペプチドを以下のように称する：
（ｉ）［Ｔｈ］：配列番号１に示されるインフルエンザウイルス赤血球凝集素の軽鎖に由来するＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープから構成される；
（ｉｉ）［ＣＴＬ］：インフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４株（ＰＲ８；Ｈ１Ｎ１）の核タンパク質のアミノ酸残基１４７〜１５５からなる主要抗原Ｈ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープから構成される（配列番号２）；
（ｉｉｉ）［Ｔｈ］−［ＣＴＬ］：（ｉ）および（ｉｉ）を有するポリペプチドから構成される。組み合わされたペプチドの配列を配列番号３に示す；
（ｉｖ）［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］：リジン残基（太字下線付の残基）により分離された（ｉ）および（ｉｉ）を有するポリペプチドから構成される。組み合わされたペプチドの配列を配列番号４に示す；
（ｖ）［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］：リジン残基（太字下線付の残基）により分離された、Ｐ２５と称するＣＤＶ−Ｆタンパク質由来のＴヘルパーエピトープ（配列番号２０）およびオボアルブミン由来のＣＴＬエピトープ（配列番号１７３）から構成される。組み合わされたペプチドの配列を配列番号１７４に示す；
（ｖｉ）［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＬＬＯ９１−９９］：リジン残基（太字下線付の残基）により分離された、Ｐ２５と称するＣＤＶ−Ｆタンパク質由来のＴヘルパーエピトープ（配列番号２０）およびリステリア・モノサイトゲネス由来のＣＴＬエピトープ（配列番号１７２）から構成される。組み合わされたペプチドの配列を配列番号１７５に示す；
（ｖｉｉ）［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＨＣＶ］：リジン残基（太字下線付の残基）により分離された、Ｐ２５と称するＣＤＶ−Ｆタンパク質由来のＴヘルパーエピトープ（配列番号２０）およびＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質由来のＣＴＬエピトープ（配列番号１７６）から構成される。組み合わされたペプチドの配列を配列番号１７７に示す。
【００４０】
これらのアミノ酸配列を含むリポペプチドを以下のように称する：
（ｉ）［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］：ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］（すなわち配列番号４）と、該ペプチドの内部リジン（太字下線付の残基）のεアミノ基にコンジュゲートされた式（ＩＩＩ）の脂質から構成される；
（ｉｉ）［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］：ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］（すなわち配列番号４）と、該ペプチドの内部リジン（太字下線付の残基）のεアミノ基にコンジュゲートされた式（ＩＶ）の脂質から構成される；
（ｉｉｉ）［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］：ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＬＬＯ９１−９９］と、該ペプチドの内部リジン（太字下線付の残基）のεアミノ基にコンジュゲートされた式（ＩＶ）の脂質から構成される；
（ｉｖ）［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］：ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］と、該ペプチドの内部リジン（太字下線付の残基）のεアミノ基にコンジュゲートされた式（ＩＶ）の脂質から構成される；
（ｖ）［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＨＣＶ］：ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＨＣＶ］と、該ペプチドの内部リジン（太字下線付の残基）のεアミノ基にコンジュゲートされた式（ＩＶ）の脂質から構成される。
【００４１】
図３は、図１の説明に示したリポペプチドで初回免疫し、続いてインフルエンザウイルスを負荷（チャレンジ）したマウスのウイルス負荷の低減を示すグラフである。マウスに、９ｎｍｏｌのリポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（５０μｌのＰＢＳ中）（それぞれカラム２および３）、あるいは［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］ペプチド（５０μｌのＰＢＳ中）（カラム１）、またはＰＢＳ単独（カラム４）を鼻腔内接種した。ペプチドとリポペプチドの名称は図２の説明のとおりである。免疫の９日後に、マウスをペントレンを用いて麻酔し、３０，０００プラーク形成単位のインフルエンザウイルスサブタイプＨ３Ｎ１（Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／７１（Ｍｅｍ７１）として知られる）を鼻腔内に負荷した。その５日後、マウスの肺を取り出して、ＭＤＣＫ細胞でのプラークアッセイにより感染ウイルスの存在についてアッセイした。各棒グラフは５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群からのウイルス力価の幾何平均力価を表し、誤差棒は平均の標準偏差を表す。棒の上の数値は、ＰＢＳ対照と比較した肺ウイルス力価の低減率（％）を示す。
【００４２】
図４ａは、図２の説明に記載したリポペプチドを投与した免疫マウスにおけるリポペプチドにより誘導されるウイルスクリアランスの増強を示すグラフである。マウスに、９ｎｍｏｌのリポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（５０μｌのＰＢＳ中）（それぞれカラム２および３）、あるいは［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］ペプチド（５０μｌのＰＢＳ中）（カラム１）、またはＰＢＳ単独（カラム４）を接種した。免疫の２８日後に、マウスに３０，０００プラーク形成単位のＭｅｍ７１を負荷した。ペプチドとリポペプチドの名称は図２の説明のとおりである。データは、負荷の５日後における肺ウイルス力価の低減率（％）として表す。データにより、負荷の５日後において、ペプチド単独（カラム１）またはＰＢＳ単独（カラム４）と比較して、リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（カラム２）または［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（カラム３）で免疫したマウスの肺において感染ウイルスの低減の増強が示された。
【００４３】
図４ｂは、図２の説明に記載したリポペプチドを投与した免疫マウスにおけるＴ細胞活性化の増強を示すグラフである。マウスに、９ｎｍｏｌのリポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（５０μｌのＰＢＳ中）（それぞれカラム２および３）、あるいは［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］ペプチド（５０μｌのＰＢＳ中）（カラム１）、またはＰＢＳ単独（カラム４）を接種した。免疫したマウスを免疫の９日後に死滅させ、細気管支−肺胞洗浄（ＢＡＬ）を実施した。３７℃で１時間にわたりペトリ皿でＢＡＬサンプルをインキュベートすることにより接着細胞を取り出した。非接着細胞を取り出し、ＣＤ８およびＣＤ４発現について染色した。細胞をフローサイトメトリーで分析した。リンパ球集団は、前方および側方スキャッタープロファイルに基づいて特定し、１０，０００個のリンパ球を分析した。データは，ＣＤ８＋リンパ球であるＢＡＬ液中の非接着細胞の割合（％）として示す。データにより、負荷の５日後において、ペプチド単独（カラム１）またはＰＢＳ単独（カラム４）と比較して、リポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（カラム２）または［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（カラム３）で免疫したマウスからのＢＡＬサンプル中にはウイルス特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化が増強されたことが示された。ペプチドとリポペプチドの名称は図２の説明のとおりである。
【００４４】
図４ｃは、図２の説明に記載したリポペプチドに対して応答した樹状細胞の成熟の増強を示すグラフである。ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞由来の樹状細胞の系列（Ｄ１細胞）を０．４５ｎｍｏｌ／ｍＬのペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］（カラム１）またはリポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（カラム２）もしくは［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（カラム３）、あるいは陰性対照として培地のみ（カラム４）または陽性対照としてリポ多糖（ＬＰＳ、カラム５）と共に一晩インキュベートした。高レベルの表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する、すなわち成熟状態にあるＤ１細胞の割合（％）をフローサイトメトリーにより測定した。ペプチドとリポペプチドの名称は図２の説明のとおりである。データは、ペプチド単独または培地単独と比較して、ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］または［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］に曝露した後の樹状細胞の表面上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の増大（すなわち、樹状細胞成熟の増強）を示す。
【００４５】
図５は、それぞれ配列番号１に示すＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープおよび配列番号２に示すＨ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープを含む、Ｘ軸に示した合成免疫原を接種したマウスにおける肺ウイルスクリアランス応答の誘導を示すグラフである。５匹のマウスの群をＰＢＳ中９ｎｍｏｌの特定のリポペプチドで鼻腔内免疫した。初回投与後２８日目に、マウスに１０４．５ＰＦＵのＭｅｍ７１インフルエンザウイルスを鼻腔内経路で負荷した。負荷の５日後に採取した肺ホモジネート中の感染ウイルス力価をＭＤＣＫ単細胞層におけるプラーク形成により決定した。各丸は個々のマウスのウイルス力価を、線は群の幾何平均力価を表す。ＰＢＳ対照群に対する平均ウイルス力価の低減率（％）は、データの各カラムの上に示す。
【００４６】
図６は、ウイルス負荷中のリポペプチドでワクチン接種したマウスの肺へのＣＴＬ決定基特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の流入の促進を示すグラフである。リポペプチドは、配列番号１に示すＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープおよび配列番号２に示すＨ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープから構成された。３匹のマウスの群に９ｎｍｏｌの所定のリポペプチドを鼻腔内接種した。初回投与後２８日目に、マウスに１０４．５ＰＦＵのＭｅｍ７１インフルエンザウイルスを鼻腔内経路で負荷した。ＣＴＬ決定基特異的ＩＦＮγ分泌細胞を、負荷の５日後に細胞内サイトカイン産生アッセイによりマウスの肺において計数した。１０，０００個のＣＤ８＋細胞を各試料について分析した。データは、マウスの各群についての平均および標準偏差を表す。
【００４７】
図７は、ウイルス負荷後のリポペプチド接種したマウスの肺へのＣＴＬ決定基特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の流入の促進を示すグラフである。リポペプチドは、配列番号１に示すＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープおよび配列番号２に示すＨ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープから構成された。マウスにＰＢＳ中９ｎｍｏｌの所定のリポペプチドを鼻腔内接種した。接種後９日目に、マウスに１０４．５ＰＦＵのＭｅｍ７１インフルエンザウイルスを鼻腔内経路で負荷した。肺中のＣＴＬ決定基特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を、感染の５日後に、肺由来のリンパ球を抗ＣＤ８抗体およびＣＴＬエピトープを負荷した四量体ＭＨＣクラスＩ複合体で染色することによりマウスの肺において計数した。合計３０，０００個のＣＤ８ Ｔ細胞を分析した。
【００４８】
図８は、未処理マウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞活性を示すグラフである。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ決定基特異的細胞傷害性は、ＣＴＬ決定基で刺激し、高強度ＣＦＳＥで標識した同系脾細胞を用いて測定した。低強度ＣＦＳＥで標識した非刺激脾細胞を対照として用いた。各標的細胞集団の１５×１０６細胞の混合物を未処理マウスに感染の４日後に静脈内投与した。１６時間後にマウスを死滅させ、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ高およびＣＦＳＥ低細胞集団の存在について脾臓を分析した。１×１０６個のリンパ球を各試料について分析した。
【００４９】
図９は、リポペプチドを初回投与したマウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞活性を示すグラフである。マウスに、配列番号１に示すＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープおよび配列番号２に示すＨ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープを含む［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］の９ｎｍｏｌ（ＰＢＳ中）を鼻腔内接種した。２８日目にＭｅｍ７１をマウスに負荷した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ決定基特異的細胞傷害性は、ＣＴＬ決定基で刺激し、高強度ＣＦＳＥで標識した同系脾細胞を用いて測定した。低強度ＣＦＳＥで標識した非刺激脾細胞を対照として用いた。各標的細胞集団の１５×１０６細胞の混合物を、リポペプチドを初回投与したマウスおよび負荷したマウスに感染の４日後に静脈内投与した。１６時間後にマウスを死滅させ、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ高およびＣＦＳＥ低細胞集団の存在について脾臓を分析した。１×１０６個のリンパ球を各試料について分析した。
【００５０】
図１０は、種々のペプチドに基づく免疫原のエピトープ特異的ＣＴＬを誘導する能力を示すグラフである。リポペプチドは、配列番号１に示すＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープおよび配列番号２に示すＨ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープから構成された。３匹のマウスの群にＰＢＳ中の種々のリポペプチドを鼻腔内接種し、２８日目にＭｅｍ７１を負荷した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ決定基特異的細胞傷害性を分析するために、同系脾細胞をＣＴＬ決定基で刺激し、高強度ＣＦＳＥで標識した。抗原特異的溶解は、低強度ＣＦＳＥで標識した同系脾細胞を同時注射することにより調節した。１６時間後にマウスを死滅させ、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ高およびＣＦＳＥ低細胞集団の存在について脾臓を分析した。合計１×１０６個のリンパ球を各試料について分析した。個々のマウスは黒四角で表し、棒は幾何平均力価を示す。
【００５１】
図１１は、リポペプチドによるインターフェロンγ産生細胞の誘導を示すグラフである。マウスの接種には、Ｔヘルパーエピトープおよびリステリア・モノサイトゲネスのＣＴＬエピトープを含み、エピトープの間に配置された内部リジン残基のεアミノ基を介してＰａｍ２Ｃｙｓに結合したペプチド（すなわち図２に例示され、配列番号１７５に基づくペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］）、またはＰａｍ２Ｃｙｓを該リジンのεアミノ基を介して結合したこの構造に基づくリポペプチドを使用した。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｘ軸に示すように、静脈内経路で細菌を接種、あるいは９ｎｍｏｌの脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］もしくは９ｎｍｏｌの非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＬＬＯ９１−９９］（配列番号１７５、図２）のいずれか、またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を皮下接種した。免疫動物から脾細胞を採取し、配列番号１７２に示す配列を有する単離ＣＴＬエピトープ（白抜き棒）または抗原なし（黒棒）でｉｎ ｖｉｔｒｏにて刺激し、存在する（ＩＦＮγ）産生細胞数をその２８日後に測定した。縦座標は１，０００，０００脾細胞当たりのＩＦＮγ産生細胞の数を示す。データは、リポペプチドで免疫したマウスについてＩＦＮγ産生細胞数の増強を示し、これは、非脂質付加ペプチドと比較してリポペプチドのＴ細胞活性化能の増大を示す。
【００５２】
図１２は、図２に示す［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］と称するリポペプチドで免疫したマウスについてのＬ・モノサイトゲネス感染に対する防御の増大を示すグラフである。５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｘ軸に示すように、１，０００細菌を静脈内接種（カラム１）、またはＰＢＳを皮下免疫（カラム２）、または９ｎｍｏｌの［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］ペプチド（カラム３）、または９ｎｍｏｌの非脂質付加［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＬＬＯ９１−９９］ペプチド（配列番号１７５、カラム３）を皮下免疫した。マウスに全細菌を負荷し、肝臓に存在するコロニー形成単位の数を負荷の２８日後に測定した（縦座標）。
【００５３】
図１３は、リポペプチドワクチン接種によるＢ１６メラノーマに対する防御を示すグラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾の基部に、２０ｎｍｏｌの脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］（白丸）、非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］（白三角）、またはＰＢＳ（白四角）を皮下経路でワクチン接種した。続いて、その１４日後に、マウスの背中に２×１０５個のＢ１６−ＯＶＡ細胞（一群ｎ＝６）を皮下接種で負荷し、腫瘍増殖を記載のようにモニターした（Anraku, et al., J Virol. 76; 3791-3799, 2002）。
【００５４】
図１４は、リポペプチド免疫原によるルイス肺癌の治療処置を示すグラフであり、免疫後に腫瘍を有しない動物の割合（％）で表す。マウスに、オボアルブミンをトランスフェクトし、それゆえＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬを発現する（Nelson et al., Immunol. 166:5557-5566, 2001）３×１０４のルイス肺癌細胞を注射した。癌細胞の投与の４日後、動物の尾の基部に２０ｎｍｏｌの脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］（白丸）、非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］（白三角）、またはＰＢＳ（白四角）を皮下経路でワクチン接種した。癌細胞の投与の１１日後に、２回目の同量の免疫原を投与した。動物を腫瘍発生率についてモニターし、腫瘍面積が１００ｍｍ２を超える場合には動物を安楽死させた。
【００５５】
図１５は、リポペプチド免疫原によるルイス肺癌の治療処置を示すグラフであり、免疫後の動物の生存により判定した。マウスに、オボアルブミンをトランスフェクトし、それゆえＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬを発現する（Nelson et al., Immunol. 166:5557-5566, 2001）３×１０４のルイス肺癌細胞を注射した。癌細胞の投与の４日後、動物の尾の基部に２０ｎｍｏｌの脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］（白丸）、非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］（白三角）、またはＰＢＳ（白四角）を皮下経路でワクチン接種した。癌細胞の投与の１１日後に、２回目の同量の免疫原を投与した。動物を生存についてモニターし、腫瘍面積が１００ｍｍ２を超える場合には動物を安楽死させた。
【００５６】
図１６は、ペプチドおよびリポペプチドに基づく免疫原がヒト樹状細胞上のＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現をアップレギュレートする能力を示すグラフである。ヒト単球由来樹状細胞を、培地のみ、ＬＰＳ（５μｇ／ｍＬ）、非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＨＣＶ］（５μｇ／ｍＬ）、またはリポペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＨＣＶ］（５μｇ／ｍＬ）と共に４８時間インキュベートした後、ＦＩＴＣ複合抗体でＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ８６について染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ヒストグラムは、前方および側方スキャッタードットプロットにゲートした生存巨大顆粒細胞を表す。灰色で示すヒストグラムの領域と示す数値は、分析した集団内で高レベルの抗原を発現する細胞の割合に対応する。Ｔヘルパー細胞エピトープは、Ｍｏｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓから同定され、アミノ酸配列ＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬ（配列番号２０）を有し、ＣＴＬエピトープはアミノ酸配列ＤＬＭＧＹＩＰＬＶ（配列番号１７６）を有し、Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質由来のＨＬＡ Ａ２制限ＣＴＬエピトープである。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
リポペプチド
本発明の一態様は、１個または複数の脂質部分にコンジュゲートされたポリペプチドを含む単離リポペプチドを提供する。ここで、
（ｉ）前記ポリペプチドは、
（ａ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列およびＣＴＬエピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、ならびに
（ｂ）内部リジンまたは内部リジン類似体のε−アミノ基または末端側鎖基を介して前記脂質部分の各々が共有結合するための１個または複数の前記内部リジン残基または内部リジン類似体残基、
を含むアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）前記１個または複数の脂質部分の各々は、前記１個または複数の内部リジン残基のε−アミノ基または前記内部リジン類似体残基の末端側鎖基に直接的または間接的に共有結合している。
【００５８】
本明細書で使用する「リポペプチド」という用語は、直接的または間接的にコンジュゲートされた１個または複数の脂質部分と１個または複数のアミノ酸配列とを含む任意の非天然組成物を意味する。前記組成物は、非特異的なコンジュゲートされていない脂質またはタンパク質を実質的に含まない。
【００５９】
「直接的に」とは、脂質部分とアミノ酸配列がリポペプチドにおいて並列していることを意味する。
【００６０】
「間接的に」とは、脂質部分とアミノ酸配列が、１個または複数の炭素含有分子、例えば、１個または複数のアミノ酸残基などを含むスペーサーによって分離されていることを意味する。アミノ酸配列は、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの両方の官能基の要件によって制約される任意の長さにすることができる。
【００６１】
本明細書で使用する、「内部リジン残基」という用語は、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの両方を含むポリペプチド中のリジン残基を意味し、前記リジンは前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基でもＣ末端残基でもない。従って、内部リジン残基は、それがポリペプチドの内部に存在するという条件で、ＴヘルパーエピトープまたはＣＴＬエピトープのいずれかのＣ末端またはＮ末端残基であってもよい。これは、脂質部分が結合する内部リジン残基が、Ｔヘルパー細胞エピトープのアミノ酸配列、またはＣＴＬエピトープのアミノ酸配列中に存在する残基であることを意味する。また内部リジン残基は、ＴヘルパーエピトープともＣＴＬエピトープとも異なることができ、その場合には、内部リジン残基は、ポリペプチドのこれらの２個のエピトープを連結しなければならない。
【００６２】
同様に、「内部リジン類似体残基」という用語は、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの両方を含むポリペプチド中のリジン類似体残基を意味し、前記リジン類似体は前記ポリペプチドのＮ末端アミノ酸残基でもＣ末端残基でもない。リジン残基が「内部」であるかどうかを確認する判定基準は、リジン類似体が内部であるかどうかの判定を準用する。
【００６３】
「リジン類似体」とは、アミノ側鎖を有するアミノ酸類似体または非天然アミノ酸を含めて、脂質部分が結合できる適切な側鎖を有するペプチドの内部に組み込むことができる合成化合物を意味する。好ましいリジン類似体としては、以下の一般式（Ｖ）の化合物などがある：
【化３】
2010132663.tif 000005
【００６４】
〔式中、ｎは０〜３の整数であり、Ｘは、ＮＨ、ＯおよびＳからなる群から選択される、前記内部リジン類似体残基の末端側鎖基である。より好ましくは、ｎは１〜３の整数である。より好ましくは、Ｘは、アミノ基である。特に好ましい実施形態においては、リジン類似体は、２，３ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）および２，５−ジアミノ吉草酸［すなわち、オルニチン（Ｏｒｎ）］からなる群から選択される〕。
【００６５】
当業者は、「ε−アミノ基」という用語の意味を知っているはずである。「末端側鎖基」という用語は、前記類似体のα炭素の遠位にあるリジン類似体の側鎖上の置換基、例えば、Ｄｐｒのβ−アミノ、Ｄａｂのγ−アミノ、Ｏｒｎのδ−アミノなどを意味する。
【００６６】
好ましくは、脂質部分は、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープのアミノ酸配列の間に配置されたリジン残基のεアミノ基を介して、または内部リジン類似体残基の末端側鎖基に、結合する。
【００６７】
Ｔ細胞応答を誘発する本発明のリポペプチドの増強された能力は、未成熟樹状細胞（ＤＣ）、特にＤ１細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現をアップレギュレートする能力、ならびに免疫動物の組織サンプル中のＣＤ８＋Ｔ細胞数の増大によって示された。またウイルス病原体のＣＴＬを用いて免疫した動物の場合、Ｔ細胞応答を誘発する本発明のリポペプチドの増強された能力は、動物の免疫後のウイルスクリアランスの増強によって示される。
【００６８】
リポペプチドは、好ましくは可溶性であり、より好ましくは高度に可溶性である。
【００６９】
当業者には公知のとおり、リジンのεアミノ基は、このアミノ酸の側鎖の末端アミノ基である。内部リジンまたは内部リジン類似体の末端側鎖基を脂質部分への架橋に使用すると、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの両方を組み込んだ共直線アミノ酸配列としてのポリペプチド部分の合成が容易になる。脂質がリジン残基のεアミノ基、またはリジン類似体の末端側鎖基を介して結合したリポペプチドと、ペプチド中のリジンのαアミノ基を介して結合した脂質を有するリポペプチドとの構造上の違いは明白である。
【００７０】
したがって、脂質部分が結合する少なくとも１個の内部リジン残基または内部リジン類似体は、免疫学的に機能するエピトープを分離するようにポリペプチド部分内に位置することが特に好ましい。例えば、内部リジン残基または内部リジン類似体残基は、各エピトープ間のスペーサーおよび／または連結残基として作用することができる。内部リジンまたは内部リジン類似体がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に位置する場合には、ポリペプチドのアミノ酸配列から分枝が形成されるにもかかわらず、脂質部分がこれらのエピトープ間の位置に結合することは言うまでもない。本明細書に例示するように、単一の内部リジン残基を使用してＣＴＬエピトープとＴヘルパーエピトープを分離することができる（例えば、配列番号４）。
【００７１】
本発明は、ＣＴＬエピトープまたはＴヘルパーエピトープとして機能しない第３のアミノ酸配列内に内部リジン残基または内部リジン類似体残基を入れ子のように配置することも明らかに包含する。例えば、内部リジンまたは内部リジン類似体は１または複数の異なるアミノ酸残基と結合しうる。
【００７２】
内部リジンのεアミノ基、または内部リジン類似体の末端側鎖基は、他のアミノ酸のα−アミノ基および側鎖官能基を保護するために使用される化学基と直交性の化学基によって保護することができる。このようにして、内部リジンまたはリジン類似体のεアミノ基または末端側鎖基を選択的に露出させて、εアミノ基または側鎖アミノ基の特異的な脂質含有部分などの化学基を適宜結合させることができる。
【００７３】
Ｆｍｏｃ化学を利用したペプチド合成の場合には、適切な直交性に保護されたリジンのε基は、修飾アミノ酸残基Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−４−メチルトリチル−Ｌ−リジン）によって与えられる。類似の適切な直交性保護側鎖基、例えば、Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎδ−４−メチルトリチル−Ｌ−オルニチン）、Ｆｍｏｃ−Ｄａｂ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎγ−４−メチルトリチル−Ｌ−ジアミノ酪酸）およびＦｍｏｃ−Ｄｐｒ（Ｍｔｔ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎβ−４−メチルトリチル−Ｌ−ジアミノプロピオン酸）が、本明細書で企図される様々なリジン類似体に利用可能である。側鎖保護基Ｍｔｔは、リジンまたはリジン類似体のαアミノ基上に存在するＦｍｏｃ基が除去される条件では安定であるが、トリフルオロ酢酸の１％ジクロロメタン溶液で選択的に除去することができる。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキシ−１−イリデン）エチル−Ｌ−リジン）またはＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロへキシ−１−イリデン）−３−メチルブチル−Ｌ−リジン）も本発明において使用することができる。ここで、Ｄｄｅ側鎖保護基は、ペプチド合成中にヒドラジンで処理して選択的に除去される。
【００７４】
Ｂｏｃ化学を利用したペプチド合成の場合には、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを使用することができる。側鎖保護基Ｆｍｏｃは、ピペリジンまたはＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン）で処理して選択的に除去することができるが、トリフルオロ酢酸を用いてα末端からＢｏｃ基を除去するときには所定の位置に残留する。
【００７５】
好ましくは、ＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープは、単一の内部リジン残基または内部リジン類似体残基を含めて、少なくとも１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸残基によって分離される。
【００７６】
本発明は、ポリペプチド部分に対する複数の脂質部分の付加を明確に企図する。例えば、ポリペプチドは、複数の内部リジン残基および／または複数の内部リジン類似体を含むことができる。複数の内部リジンまたは複数のリジン類似体がより近くに位置する場合には、脂質を付加する際に立体障害が起こり、それによって最終生成物の混合物が製造され、または収率が低下する恐れがある。
【００７７】
この考察に関連して、Ｔヘルパーエピトープを含むアミノ酸配列全体、またはＣＴＬエピトープを含むアミノ酸配列全体が免疫機能を有する必要はない。したがって、前記アミノ酸配列は、前記エピトープを含みながら、Ｔヘルパー細胞活性またはＣＴＬエピトープを含まない配列をさらに有することができる。このような追加の配列が１個または複数の内部リジンまたはリジン類似体残基を含む場合には、このような残基の末端側鎖基は、脂質部分の結合部位として働くことができる。Ｔヘルパー機能およびＣＴＬエピトープ機能を保持することが必須であることは言うまでもない。
【００７８】
脂質部分が結合する内部リジン残基または内部リジン類似体の位置も、脂質部分の結合が、リポペプチドを投与する被験体におけるＴヘルパーエピトープまたはＣＴＬエピトープの免疫機能を妨げないように選択すべきである。例えば、脂質部分の選択によっては、ＣＴＬエピトープ内の前記脂質の結合がＣＴＬエピトープ提示の立体障害になり得る。
【００７９】
内部リジンまたは内部リジン類似体がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に位置する本発明のリポペプチドの一般化された好ましい形態は、一般式（ＶＩ）によって示される：
【化４】
2010132663.tif 000006
【００８０】
〔式中、
エピトープは、ＴヘルパーエピトープまたはＣＴＬエピトープであり、
Ａは、存在しても存在しなくてもよく、約１〜約６アミノ酸長のアミノ酸スペーサーからなり、
ｎは、１、２、３または４の整数であり、
Ｘは、ＮＨ、ＯおよびＳからなる群から選択される末端側鎖基であり、好ましくはＮＨからなり、
Ｙは、存在しても存在しなくてもよく、約１〜約６アミノ酸長のアミノ酸スペーサーからなり、該アミノ酸はセリンであることが好ましく、
Ｚは、脂質部分、好ましくはＰａｍ２ＣｙｓまたはＰａｍ３Ｃｙｓである〕。
【００８１】
Ｔヘルパーエピトープは、特定の標的被験体（すなわち、ヒト被験体、あるいは特定の非ヒト動物被験体、例えば、ラット、マウス、モルモット、イヌ、ウマ、ブタまたはヤギ）において免疫応答を高めるための当業者に公知の任意のＴヘルパーエピトープである。好ましいＴヘルパーエピトープは、少なくとも約１０〜２４アミノ酸長、より一般的には約１５〜約２０アミノ酸長である。
【００８２】
乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープは、化学的に容易に合成され、複数のＴヘルパーエピトープを含むより長いポリペプチドを使用する必要がないので特に好ましい。
【００８３】
本発明のリポペプチドに使用するのに適した乱交雑または許容的Ｔヘルパーエピトープの例は、以下からなる群より選択される：
（１）破傷風トキソイドペプチド（ＴＴＰ）のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ、例えば、ＴＴＰのアミノ酸８３０〜８４３など（Panina-Bordignon et al.、Eur.J.Immun.19、2237〜2242、1989）、
（２）プラスモディウム・ファルシパルムｐｆｇ２７のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ、
（３）乳酸デヒドロゲナーゼのげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ、
（４）ＨＩＶまたはＨＩＶｇｐ１２０エンベロープタンパク質のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ（Berzofsky et al.、J.Clin.Invest.88、876〜884、1991）、
（５）既知のアンカータンパク質のアミノ酸配列から予測される合成ヒトＴヘルパーエピトープ（ＰＡＤＲＥ）（Alexander et al、Immunity 1、751〜761、1994）、
（６）麻疹ウイルス融合タンパク質のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ（ＭＶ−Ｆ；Muller et al.、Mol.Immunol.32、37〜47、1995；Partidos et al.、J.Gen.Virol.、71、2099〜2105、1990）、
（７）イヌジステンパーウイルス融合タンパク質（ＣＤＶ−Ｆ）の少なくとも約１０個のアミノ酸残基、例えば、ＣＤＶ−Ｆのアミノ酸位置１４８〜２８３からの残基を含むＴヘルパーエピトープ（Ghosh et al.、Immunol.104、58〜66、2001；国際公開特許第00/46390号）、
（８）ＭＵＣ１ムチンの細胞外直列型反復ドメインのペプチド配列に由来するヒトＴヘルパーエピトープ（米国特許出願第0020018806号）、
（９）インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＩＶ−Ｈ）のげっ歯類またはヒトＴヘルパーエピトープ（Jackson et al Virol.198、613〜623、1994、および
（１０）口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ−０１カウフボイレン（Kaufbeuren）系統）のＶＰ３タンパク質の残基１７３〜１７６、あるいは別の系統のＦＭＤＶの対応するアミノ酸を含むウシまたはラクダＴヘルパーエピトープ。
【００８４】
当業者には知られているとおり、Ｔヘルパーエピトープは、様々な種の１種類または複数の哺乳動物によって認識されうる。したがって、本明細書に記載のＴヘルパーエピトープの名称は、エピトープが認識される種の免疫系に限定されると考えるべきではない。例えば、げっ歯類Ｔヘルパーエピトープは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、または他のげっ歯類、あるいはヒトまたはイヌの免疫系によって認識される。
【００８５】
より好ましくは、Ｔヘルパーエピトープは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含みうる：
（１）ＩＶ−Ｈ由来のＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ（配列番号１）；
（２）ＩＶ−Ｈ由来のＧＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ（配列番号１４）；
（３）ＭＶ−Ｆ由来のＬＳＥＩＫＧＶＩＶＨＲＬＥＧＶ（配列番号１５）；
（４）ＣＤＶ−Ｆ由来のＴＡＡＱＩＴＡＧＩＡＬＨＱＳＮＬＮ（配列番号１６）；
（５）ＣＤＶ−Ｆ由来のＩＧＴＤＮＶＨＹＫＩＭＴＲＰＳＨＱ（配列番号１７）；
（６）ＣＤＶ−Ｆ由来のＹＫＩＭＴＲＰＳＨＱＹＬＶＩＫＬＩ（配列番号１８）；
（７）ＣＤＶ−Ｆ由来のＳＨＱＹＬＶＩＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥ（配列番号１９）；
（８）ＣＤＶ−Ｆ由来のＫＬＩＰＮＡＳＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬ（配列番号２０）；
（９）ＣＤＶ−Ｆ由来のＬＩＥＮＣＴＫＡＥＬＧＥＹＥＫＬＬ（配列番号２１）；
（１０）ＣＤＶ−Ｆ由来のＡＥＬＧＥＹＥＫＬＬＮＳＶＬＥＰＩ（配列番号２２）；
（１１）ＣＤＶ−Ｆ由来のＫＬＬＮＳＶＬＥＰＩＮＱＡＬＴＬＭ（配列番号２３）；
（１２）ＣＤＶ−Ｆ由来のＥＰＩＮＱＡＬＴＬＭＴＫＮＶＫＰＬ（配列番号２４）；
（１３）ＣＤＶ−Ｆ由来のＴＬＭＴＫＮＶＫＰＬＱＳＬＧＳＧＲ（配列番号２５）；
（１４）ＣＤＶ−Ｆ由来のＫＰＬＱＳＬＧＳＧＲＲＱＲＲＦＡＧ（配列番号２６）；
（１５）ＣＤＶ−Ｆ由来のＳＧＲＲＱＲＲＦＡＧＶＶＬＡＧＶＡ（配列番号２７）；
（１６）ＣＤＶ−Ｆ由来のＦＡＧＶＶＬＡＧＶＡＬＧＶＡＴＡＡ（配列番号２８）；
（１７）ＣＤＶ−Ｆ由来のＧＶＡＬＧＶＡＴＡＡＱＩＴＡＧＩＡ（配列番号２９）；
（１８）ＣＤＶ−Ｆ由来のＧＩＡＬＨＱＳＮＬＮＡＱＡＩＱＳＬ（配列番号３０）；
（１９）ＣＤＶ−Ｆ由来のＮＬＮＡＱＡＩＱＳＬＲＴＳＬＥＱＳ（配列番号３１）；
（２０）ＣＤＶ−Ｆ由来のＱＳＬＲＴＳＬＥＱＳＮＫＡＩＥＥＩ（配列番号３２）；
（２１）ＣＤＶ−Ｆ由来のＥＱＳＮＫＡＩＥＥＩＲＥＡＴＱＥＴ（配列番号３３）；
（２２）ＣＤＶ−Ｆ由来のＳＳＫＴＱＴＨＴＱＱＤＲＰＰＱＰＳ（配列番号３４）；
（２３）ＣＤＶ−Ｆ由来のＱＰＳＴＥＬＥＥＴＲＴＳＲＡＲＨＳ（配列番号３５）；
（２４）ＣＤＶ−Ｆ由来のＲＨＳＴＴＳＡＱＲＳＴＨＹＤＰＲＴ（配列番号３６）；
（２５）ＣＤＶ−Ｆ由来のＰＲＴＳＤＲＰＶＳＹＴＭＮＲＴＲＳ（配列番号３７）；
（２６）ＣＤＶ−Ｆ由来のＴＲＳＲＫＱＴＳＨＲＬＫＮＩＰＶＨ（配列番号３８）；
（２７）ＣＤＶ−Ｆ由来のＴＥＬＬＳＩＦＧＰＳＬＲＤＰＩＳＡ（配列番号３９）；
（２８）ＣＤＶ−Ｆ由来のＰＲＹＩＡＴＮＧＹＬＩＳＮＦＤＥＳ（配列番号４０）；
（２９）ＣＤＶ−Ｆ由来のＣＩＲＧＤＴＳＳＣＡＲＴＬＶＳＧＴ（配列番号４１）；
（３０）ＣＤＶ−Ｆ由来のＤＥＳＳＣＶＦＶＳＥＳＡＩＣＳＱＮ（配列番号４２）；
（３１）ＣＤＶ−Ｆ由来のＴＳＴＩＩＮＱＳＰＤＫＬＬＴＦＩＡ（配列番号４３）；
（３２）ＣＤＶ−Ｆ由来のＳＰＤＫＬＬＴＦＩＡＳＤＴＣＰＬＶ（配列番号４４）；
（３３）ＭＵＣ−１由来のＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＡＰＧＳＴＡＰＰ（配列番号４５）；
（３４）ＭＵＣ−１由来のＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳＳＬ（配列番号４６）；
（３５）ＭＵＣ−１由来のＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＳＬ（配列番号４７）；
（３６）ＭＵＣ−１由来のＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫＫＧ（配列番号４８）；
（３７）ＭＵＣ−１由来のＳＴＡＰＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＫ（配列番号４９）；
（３８）ＦＭＤＶ−ＶＰ３タンパク質由来のＧＶＡＥ（配列番号５０）；
（３９）ＦＭＤＶ−ＶＰ３（残基１７０〜１７９）由来のＴＡＳＧＶＡＥＴＴＮ（配列番号５１）；および
（４０）ＦＭＤＶ由来のＴＡＫＳＫＫＦＰＳＹＴＡＴＹＱＦ（配列番号５２）。
【００８６】
本明細書に開示するＴヘルパーエピトープは、単に例示のためにすぎない。当業者に公知の標準ペプチド合成技術を用いて、本明細書に言及するＴヘルパーエピトープを異なるＴヘルパーエピトープと容易に置換して、本発明のリポペプチドを異なる種での使用に適合させることができる。したがって、標的種において免疫応答を誘発または増大するのに有用であることが当業者に知られている別のＴヘルパーエピトープを除外すべきではない。
【００８７】
別のＴヘルパーエピトープは、詳細な分析によって、適切な配列を特定するための成分タンパク質、タンパク質断片およびペプチドのインビトロでのＴ細胞刺激技術を用いて特定することができる（Goodman and Sercarz、Ann.Rev.Immunol.、1、465、(1983)；Berzofsky、「The Year in Immunology、Vol.2」page 151、Karger、Basel、1986；およびLivingstone and Fathman、Ann.Rev.Immunol.、5、477、1987）。
【００８８】
ＣＴＬエピトープは、好都合には、限定されるものではないが、哺乳動物被験体、または細菌、真菌、原生動物、または前記被験体に感染する寄生生物に由来するＣＴＬエピトープを含むウイルス、原核生物または真核生物の免疫原性タンパク質、リポタンパク質または糖タンパク質のアミノ酸配列に由来する。ＣＴＬエピトープのミモトープは本発明の範囲内に含まれる。
【００８９】
ＣＴＬエピトープは、哺乳動物に投与すると、好ましくはそのエピトープまたはそのエピトープが由来する抗原に対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化することにより、より好ましくはそのエピトープが由来する病原体または腫瘍細胞に対する細胞性免疫を誘発することにより、Ｔ細胞応答を誘発することができる。
【００９０】
ペプチド合成を容易にするために、より短いＣＴＬエピトープが好ましい。ＣＴＬエピトープの長さは、約３０アミノ酸長を超えないことが好ましい。より好ましくは、ＣＴＬエピトープ配列は、約２５アミノ酸残基以下、より好ましくは２０アミノ酸残基未満、さらにより好ましくは約８〜１２アミノ酸残基長からなる。
【００９１】
寄生生物に由来する好ましいＣＴＬエピトープは、リーシュマニア、マラリア、トリパノソーマ症、バベシア症、または住血吸虫病に関連するＣＴＬエピトープであり、例えば、以下からなる群より選択されるＣＴＬエピトープである：プラスモディウム・ファルシパルム、サーカムスポロゾア（Circumsporozoa）、リーシュマニア・ドノヴァニ（leishmania donovani）、トキソプラズマ・ゴンヂ（Toxoplasma gondii）、シストソーマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）、シストソーマ・ジャポニカム（Schistosoma japonicum）、シストソーマ・ヘマトビウム（Schistosoma hematobium）およびトリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brucei）。
【００９２】
Ｐ．ファルシパルムの特に好ましいＣＴＬエピトープは、以下からなる群より選択される抗原に由来する：スポロゾイト周囲タンパク質（ＣＳＰ）、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝段階抗原１（ＬＳＡ１）、メロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ１）、セリン反復配列抗原（ＳＥＲＡ）、およびＡＭＡ−１抗原（Amante, et al. J. Immunol. 159, 5535-5544, 1997; .Chaba et al. Int. J. Immunopharm. 20, 259-273, 1998; Shi et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA) 96, 1615-1620, 1999; Wang et al. Science 282, 476-479, 1998; and Zevering et al. Immunol. 94, 445-454, 1998。Ｌ．ドノバニの特に好ましいＣＴＬエピトープは反復ペプチド（Liew et al., J. Exp. Med. 172, 1359 (1990)）に由来する。Ｔ．ゴンジイの特に好ましいＣＴＬエピトープはＰ３０表面タンパク質（Darcy et al., J. Immunol. 149, 3636 (1992)）に由来する。Ｓ．マンソニの特に好ましいＣＴＬエピトープはＳｍ−２８ＧＳＴ抗原（Wolowxzuk et al., J. Immunol 146:1987 (1991)）に由来する。
【００９３】
好ましいウイルス特異的ＣＴＬエピトープは、ロタウイルス、ヘルペスウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス（例えば、アフトウイルス（Aphthovirus））、呼吸器シンシチウムウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、Ｉ型ウシヘルペスウイルス、ウシ下痢ウイルス、ウシロタウイルス、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、麻疹ウイルス（ＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、肝炎ウイルスなどに由来する。
【００９４】
ＨＩＶ−１の特に好ましいＣＴＬエピトープは、ｅｎｖ、ｇａｇ、またはｐｏｌタンパク質に由来する。インフルエンザウイルスの特に好ましいＣＴＬエピトープは、核タンパク質（Taylor et al., Immunogenetics 26, 267 (1989); Townsend et al., Nature 348, 674(1983)）、マトリックスタンパク質（Bednarek et al., J. Immunol. 147, 4047 (1991)）、またはポリメラーゼタンパク質（Jameson et al., J. Virol. 72, 8682-8689, 1998; およびGianfrani et al., Human Immunol. 61, 438-452, 2000）に由来する。リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の特に好ましいＣＴＬエピトープは糖タンパク質１抗原（Zinkernagel et al. Nature 248, 701-702, 1974）に由来する。サイトメガロウイルスの特に好ましいＣＴＬエピトープは、ｐｐ２８、ｐｐ５０、ｐｐ６５、ｐｐ７１、ｐｐ１５０、ｇＢ、ｇＨ、ＩＥ−１、ＩＥ−２、ＵＳ２、ＵＳ３、ＵＳ６、ＵＳ１１、およびＵＬ１８からなる群より選択される抗原に由来する（例えばDiamond, USSN 6,074,645, June 13, 2000; Longmate et al., Immunogenet. 52, 165-173, 2000; Wills et al., J. Virol. 70, 7569-7579, 1996; Solache et al., J. Immunol. 163, 5512-5518, 1999; Diamond et al., Blood 90, 1751-1767, 1997; Kern et al., Nature Med. 4, 975-978, 1998; Weekes et al., J. Virol. 73, 2099-2108, 1999; Retiere et al., J. Virol. 74, 3948-3952, 2000; and Salquin et al., Eur. J. Immunol. 30, 2531-2539, 2000）。麻疹ウイルスの特に好ましいＣＴＬエピトープは融合糖タンパク質（ＭＶ−Ｆ）、特にその残基４３８〜４４６に由来する（Herberts et al. J. Gen Virol. 82, 2131-2142, 2001）。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）の特に好ましいエピトープは、ＥＢＶの潜在核抗原（ＥＢＮＡ）または潜在膜抗原（ＬＭＰ）、例えばＡ型ＥＢＶに由来するＥＢＮＡ  ２Ａ、ＥＢＮＡ  ３Ａ、ＥＢＮＡ  ４Ａ、もしくはＥＢＮＡ；Ｂ型ＥＢＶに由来するＥＢＮＡ  ２Ｂ、ＥＢＮＡ  ３Ｂ、ＥＢＮＡ  ４Ｂ、もしくはＥＢＮＡ  １４ｂ；ＬＭＰ１；またはＬＭＰ２などに由来する（国際特許出願PCT/AU95/00140（Sep. 16, 1995公開）；国際特許出願PCT/AU97/00328（Nov. 24, 1997公開）；および国際特許出願PCT/AU98/00531（Jan. 10, 1998公開））。
【００９５】
好ましい細菌特異的ＣＴＬエピトープは、パスツレラ（Pasteurella）、アクチノバシラス（Actinobacillus）、ヘモフィルス（Haemophilus）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、マイコバクテリウム・ツベルキュロシス（Mycobacterium tuberculosis）、スタフィロコッカス（Staphylococcus）、ナイセリア・ゴノローエ（Neisseria gonorrhoeae）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、大腸菌（E.coli）、シゲラ（Shigella）などに由来し、かつ／またはこれらに対する抗体を産生することができる。
【００９６】
適切な細菌ＣＴＬエピトープとしては、例えば、マイコバクテリウム・ツベルクロシス６５Ｋｄタンパク質（Lamb et al., EMBO J., 6, 1245 (1987)）；Ｍ．ツベルクロシスＥＳＡＴ−６タンパク質（Morten et al., Infect. Immun. 66, 717-723, 1998）；スタフィロコッカス・アウレウスヌクレアーゼタンパク質（Finnegan et al., J. Exp. Med. 164, 897 (1986)）；大腸菌熱安定エンテロトキシン（Cardenas et al., Infect. Immunity 61, 4629 (1993)）；および大腸菌易熱性エンテロトキシン（Clements et al., Infect. Immunity 53, 685 (1986)）に由来するＣＴＬエピトープが挙げられる。
【００９７】
哺乳動物被験体から得られる好ましいＣＴＬエピトープは、腫瘍ＣＴＬ抗原に由来し、かつ／または腫瘍ＣＴＬ抗原に対するＴ細胞応答を引き起こすことができる。腫瘍特異的ＣＴＬエピトープは、通常、生来または外来のＣＴＬエピトープであり、その発現は腫瘍の発生、成長、存在または再発と相関がある。ＣＴＬエピトープは、正常組織から異常組織を区別するのに有用であるので、治療介入の標的として有用である。ＣＴＬエピトープは当分野で周知である。実際、いくつかの例が詳細に分析され、現在、腫瘍特異的療法を作成する上で大きく注目されている。腫瘍ＣＴＬエピトープの非限定的な例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、メラノーマ抗原（ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ）およびＭＵＣ−１などのムチンに由来するものである。
【００９８】
癌患者に投与するのに好ましいＣＴＬエピトープは、癌を誘導するタンパク質、例えば発癌タンパク質（例：ｐ５３、ｒａｓ等）などに由来するものである。
【００９９】
特に好ましい実施形態においては、ＣＴＬエピトープは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれらから構成される：
（１）ＰＲ８ウイルスのＮＰ由来のＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（配列番号２）；
（２）Ｐ．ファルシパルムＣＳＰのＫＰＫＤＥＬＤＹＥＮＤＩＥＫＫＩＣＫＭＥＫＣＳ（配列番号５３）；
（３）Ｐ．ファルシパルムＣＳＰ由来のＤＩＥＫＫＩＣＫＭＥＫＣＳＳＶＦＮＶＶＮＳ（配列番号５４）；
（４）Ｐ．ファルシパルムＬＳＡ１由来のＫＰＩＶＱＹＤＮＦ（配列番号５５）；
（５）Ｐ．ファルシパルムＭＳＰ１由来のＧＩＳＹＹＥＫＶＬＡＫＹＫＤＤＬＥ（配列番号５６）；
（６）Ｐ．ファルシパルムＡＭＡ−１のＥＦＴＹＭＩＮＦＧＲＧＱＮＹＷＥＨＰＹＱＫＳ（配列番号５７）；
（７）Ｐ．ファルシパルムＡＭＡ−１由来のＤＱＰＫＱＹＥＱＨＬＴＤＹＥＫＩＫＥＧ（配列番号５８）；
（８）ＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質由来のＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭ（配列番号５９）；
（９）ＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質由来のＡＰＴＫＡＫＲＲＶＶ（配列番号６０）；
（１０）ＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質由来のＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫ（配列番号６１）；
（１１）ＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質由来のＴＶＹＹＧＶＰＶＷＫ（配列番号６２）；
（１２）ＨＩＶ−１  ｅｎｖタンパク質由来のＲＰＶＶＳＴＱＬＬ（配列番号６３）；
（１３）ＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質由来のＳＬＹＮＴＶＡＴＬＹ（配列番号６４）；
（１４）ＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質由来のＥＬＲＳＬＹＮＴＶＡ（配列番号６５）；
（１５）ＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質由来のＫＩＲＬＲＰＧＧＫＫ（配列番号６６）；
（１６）ＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質由来のＩＲＬＲＰＧＧＫＫＫ（配列番号６７）；
（１７）ＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質由来のＲＬＲＰＧＧＫＫＫ（配列番号６８）；
（１８）ＨＩＶ−１  ｇａｇタンパク質由来のＧＰＧＨＫＡＲＶＬＡ（配列番号６９）；
（１９）ＨＩＶ−１  ｐｏｌタンパク質由来のＳＰＩＥＴＶＰＶＫＬ（配列番号７０）；
（２０）ＨＩＶ−１  ｐｏｌタンパク質由来のＩＬＫＥＰＶＨＧＶＹ（配列番号７１）；
（２１）ＨＩＶ−１  ｐｏｌタンパク質由来のＡＩＦＱＳＳＭＴＫ（配列番号７２）；
（２２）ＨＩＶ−１  ｐｏｌタンパク質由来のＳＰＡＩＦＱＳＳＭＴ（配列番号７３）；
（２３）ＨＩＶ−１  ｐｏｌタンパク質由来のＱＶＲＤＱＡＥＨＬＫ（配列番号７４）；
（２４）ＨＩＶ−１  ｐｏｌタンパク質由来のＧＰＫＶＫＱＷＰＬＴ（配列番号７５）；
（２５）インフルエンザウイルス核タンパク質由来のＴＹＱＲＴＲＡＬＶ（配列番号７６）；
（２６）インフルエンザ核タンパク質由来のＴＹＱＲＴＲＡＬＶＲＴＧＭＤＰ（配列番号７７）；
（２７）インフルエンザウイルス核タンパク質由来のＩＡＳＮＥＮＭＤＡＭＥＳＳＴＬ（配列番号７８）；
（２８）ＬＣＭＶ  ｇｐ１由来のＫＡＶＹＮＦＡＴＭ（配列番号７９）；
（２９）ＥＢＶ由来のＱＶＫＷＲＭＴＴＬ（配列番号８０）；
（３０）ＥＢＶ由来のＶＦＳＤＧＲＶＡＣ（配列番号８１）；
（３１）ＥＢＶ由来のＶＰＡＰＡＧＰＩＶ（配列番号８２）；
（３２）ＥＢＶ由来のＴＹＳＡＧＩＶＱＩ（配列番号８３）；
（３３）ＥＢＶ由来のＬＬＤＦＶＲＦＭＧＶ（配列番号８４）；
（３４）ＥＢＶ由来のＱＮＧＡＬＡＩＮＴＦ（配列番号８５）；
（３５）ＥＢＶ由来のＶＳＳＤＧＲＶＡＣ（配列番号８６）；
（３６）ＥＢＶ由来のＶＳＳＥＧＲＶＡＣ（配列番号８７）；
（３７）ＥＢＶ由来のＶＳＳＤＧＲＶＰＣ（配列番号８８）；
（３８）ＥＢＶ由来のＶＳＳＤＧＬＶＡＣ（配列番号８９）；
（３９）ＥＢＶ由来のＶＳＳＤＧＱＶＡＣ（配列番号９０）；
（４０）ＥＢＶ由来のＶＳＳＤＧＲＶＶＣ（配列番号９１）；
（４１）ＥＢＶ由来のＶＰＡＰＰＶＧＰＩＶ（配列番号９２）；
（４２）ＥＢＶ由来のＶＥＩＴＰＹＥＰＴＧ（配列番号９３）；
（４３）ＥＢＶ由来のＶＥＩＴＰＹＥＰＴＷ（配列番号９４）；
（４４）ＥＢＶ由来のＶＥＬＴＰＹＫＰＴＷ（配列番号９５）；
（４５）ＥＢＶ由来のＲＲＩＹＤＬＩＫＬ（配列番号９６）；
（４６）ＥＢＶ由来のＲＫＩＹＤＬＩＥＬ（配列番号９７）；
（４７）ＥＢＶ由来のＰＹＬＦＷＬＡＧＩ（配列番号９８）；
（４８）ＥＢＶ由来のＴＳＬＹＮＬＲＲＧＴＡＬＡ（配列番号９９）；
（４９）ＥＢＶ由来のＤＴＰＬＩＰＬＴＩＦ（配列番号１００）；
（５０）ＥＢＶ由来のＴＶＦＹＮＩＰＰＭＰＬ（配列番号１０１）；
（５１）ＥＢＶ由来のＶＥＩＴＰＹＫＰＴＷ（配列番号１０２）；
（５２）ＥＢＶ由来のＶＳＦＩＥＦＶＧＷ（配列番号１０３）；
（５３）ＥＢＶ由来のＦＲＫＡＱＩＱＧＬ（配列番号１０４）；
（５４）ＥＢＶ由来のＦＬＲＧＲＡＹＧＬ（配列番号１０５）；
（５５）ＥＢＶ由来のＱＡＫＷＲＬＱＴＬ（配列番号１０６）；
（５６）ＥＢＶ由来のＳＶＲＤＲＬＡＲＬ（配列番号１０７）；
（５７）ＥＢＶ由来のＹＰＬＨＥＱＨＧＭ（配列番号１０８）；
（５８）ＥＢＶ由来のＨＬＡＡＱＧＭＡＹ（配列番号１０９）；
（５９）ＥＢＶ由来のＲＰＰＩＦＩＲＲＬ（配列番号１１０）；
（６０）ＥＢＶ由来のＲＬＲＡＥＡＧＶＫ（配列番号１１１）；
（６１）ＥＢＶ由来のＩＶＴＤＦＳＶＩＫ（配列番号１１２）；
（６２）ＥＢＶ由来のＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ（配列番号１１３）；
（６３）ＥＢＶ由来のＮＰＴＱＡＰＶＩＱＬＶＨＡＶＹ（配列番号１１４）；
（６４）ＥＢＶ由来のＬＰＧＰＱＶＴＡＶＬＬＨＥＥＳ（配列番号１１５）；
（６５）ＥＢＶ由来のＤＥＰＡＳＴＥＰＶＨＤＱＬＬ（配列番号１１６）；
（６６）ＥＢＶ由来のＲＹＳＩＦＦＤＹ（配列番号１１７）；
（６７）ＥＢＶ由来のＡＶＬＬＨＥＥＳＭ（配列番号１１８）；
（６８）ＥＢＶ由来のＲＲＡＲＳＬＳＡＥＲＹ（配列番号１１９）；
（６９）ＥＢＶ由来のＥＥＮＬＬＤＦＶＲＦ（配列番号１２０）；
（７０）ＥＢＶ由来のＫＥＨＶＩＱＮＡＦ（配列番号１２１）；
（７１）ＥＢＶ由来のＲＲＩＹＤＬＩＥＬ（配列番号１２２）；
（７２）ＥＢＶ由来のＱＰＲＡＰＩＲＰＩ（配列番号１２３）；
（７３）ＥＢＶ由来のＥＧＧＶＧＷＲＨＷ（配列番号１２４）；
（７４）ＥＢＶ由来のＣＬＧＧＬＬＴＭＶ（配列番号１２５）；
（７５）ＥＢＶ由来のＲＲＲＷＲＲＬＴＶ（配列番号１２６）；
（７６）ＥＢＶ由来のＲＡＫＦＫＱＬＬ（配列番号１２７）；
（７７）ＥＢＶ由来のＲＫＣＣＲＡＫＦＫＱＬＬＱＨＹＲ（配列番号１２８）；
（７８）ＥＢＶ由来のＹＬＬＥＭＬＷＲＬ（配列番号１２９）；
（７９）ＥＢＶ由来のＹＦＬＥＩＬＷＧＬ（配列番号１３０）；
（８０）ＥＢＶ由来のＹＬＬＥＩＬＷＲＬ（配列番号１３１）；
（８１）ＥＢＶ由来のＹＬＱＱＮＷＷＴＬ（配列番号１３２）；
（８２）ＥＢＶ由来のＬＬＬＡＬＬＦＷＬ（配列番号１３３）；
（８３）ＥＢＶ由来のＬＬＶＤＬＬＷＬＬ（配列番号１３４）；
（８４）ＥＢＶ由来のＬＬＬＩＡＬＷＮＬ（配列番号１３５）；
（８５）ＥＢＶ由来のＷＬＬＬＦＬＡＩＬ（配列番号１３６）；
（８６）ＥＢＶ由来のＴＬＬＶＤＬＬＷＬ（配列番号１３７）；
（８７）ＥＢＶ由来のＬＬＷＬＬＬＦＬＡ（配列番号１３８）；
（８８）ＥＢＶ由来のＩＬＬＩＩＡＬＹＬ（配列番号１３９）；
（８９）ＥＢＶ由来のＶＬＦＩＦＧＣＬＬ（配列番号１４０）；
（９０）ＥＢＶ由来のＲＬＧＡＴＩＷＱＬ（配列番号１４１）；
（９１）ＥＢＶ由来のＩＬＹＦＩＡＦＡＬ（配列番号１４２）；
（９２）ＥＢＶ由来のＳＬＶＩＶＴＴＦＶ（配列番号１４３）；
（９３）ＥＢＶ由来のＬＭＩＩＰＬＩＮＶ（配列番号１４４）；
（９４）ＥＢＶ由来のＴＬＦＩＧＳＨＶＶ（配列番号１４５）；
（９５）ＥＢＶ由来のＬＩＰＥＴＶＰＹＩ（配列番号１４６）；
（９６）ＥＢＶ由来のＶＬＱＷＡＳＬＡＶ（配列番号１４７）；
（９７）ＥＢＶ由来のＱＬＴＰＨＴＫＡＶ（配列番号１４８）；
（９８）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＳＶＬＧＰＩＳＧＨＶＬＫ（配列番号１４９）；
（９９）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＦＴＳＱＹＲＩＱＧＫＬ（配列番号１５０）；
（１００）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＦＶＦＰＴＫＤＶＡＬＲ（配列番号１５１）；
（１０１）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＦＰＴＫＤＶＡＬ（配列番号１５２）；
（１０２）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号１５３）；
（１０３）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＭＬＮＩＰＳＩＮＶ（配列番号１５４）；
（１０４）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＲＩＦＡＥＬＥＧＶ（配列番号１５５）；
（１０５）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＴＰＲＶＴＧＧＧＧＡＭ（配列番号１５６）；
（１０６）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号１５７）；
（１０７）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＲＬＬＱＴＧＩＨＶ（配列番号１５８）；
（１０８）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＶＩＧＤＱＹＶＫＶ（配列番号１５９）；
（１０９）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＡＬＦＦＦＤＩＤＬ（配列番号１６０）；
（１１０）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ（配列番号１６１）；
（１１１）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＶＬＣＰＫＮＭＩＩ（配列番号１６２）；
（１１２）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＤＩＹＲＩＦＡＥＬ（配列番号１６３）；
（１１３）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＩＬＡＲＮＬＶＰＭＶ（配列番号１６４）；
（１１４）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＥＦＦＷＤＡＮＤＩＹ（配列番号１６５）；
（１１５）ＨＣＭＶ  ｐｐ６５由来のＩＰＳＩＮＶＨＨＹ（配列番号１６６）；
（１１６）ＨＣＭＶ  ＩＥ−１由来のＹＩＬＥＥＴＳＶＭ（配列番号１６７）；
（１１７）ＨＣＭＶ  ＩＥ−１由来のＣＶＥＴＭＣＮＥＹ（配列番号１６８）；
（１１８）ＨＣＭＶ  ＩＥ−１由来のＲＲＩＥＥＩＣＭＫ（配列番号１６９）；
（１１９）ＨＣＭＶ  ｐｐ１５０由来のＴＴＶＹＰＰＳＳＴＡＫ（配列番号１７０）；
（１２０）麻疹ウイルス融合糖タンパク質由来のＲＲＹＰＤＡＶＹＬ（配列番号１７１）；
（１２１）リステリア・モノサイトゲネス由来のＧＹＫＤＧＮＥＹＩ（配列番号１７２）；
（１２２）オボアルブミン由来のＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１７３）；および
（１２３）Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質由来のＤＬＭＧＹＩＰＬＶ（配列番号１７６）。
【０１００】
これまでの記載から、対象リポペプチドのポリペプチド部分が好都合には単一アミノ酸鎖として合成され、それによって、合成後に両方のエピトープを組み込む改変が不要であることが明白である。本明細書において例示するように、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド部分が好ましい：
【化５】
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【０１０１】
命名に関して、配列番号３〜４は、インフルエンザウイルス赤血球凝集素の軽鎖に由来するＴヘルパーエピトープ（すなわち配列番号１）と、インフルエンザウイルスＰＲ８の核タンパク質に由来する主要抗原Ｈ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープ（配列番号２）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。配列番号４において、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号４のＫ１６）。
【０１０２】
配列番号５は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号２０）、およびインフルエンザウイルスＰＲ８の核タンパク質に由来する主要抗原Ｈ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープ（配列番号２）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。このペプチドにおいて、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号５のＫ１８）。
【０１０３】
配列番号６は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号２０）、およびヒトのサイトメガロウイルスの主要抗原ｐｐ６５抗原（すなわちＨＣＭＶ ｐｐ６５抗原）に由来する主要抗原ＨＬＡ Ａ２制限ＣＴＬエピトープ（配列番号１５３）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。このペプチドにおいて、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号６のＫ１８）。
【０１０４】
配列番号７は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号２２）、およびＨＣＭＶ ｐｐ６５抗原に由来する主要抗原ＨＬＡ Ａ２制限ＣＴＬエピトープ（配列番号１５３）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。このペプチドにおいて、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号７のＫ１８）。
【０１０５】
配列番号８は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号１６）、およびＨＣＭＶ ｐｐ６５抗原に由来する主要抗原ＨＬＡ Ａ２制限ＣＴＬエピトープ（配列番号１５３）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。このペプチドにおいて、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号８のＫ１８）。
【０１０６】
配列番号９は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号４０）、およびＨＣＭＶ ｐｐ６５抗原に由来する主要抗原ＨＬＡ Ａ２制限ＣＴＬエピトープ（配列番号１５３）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。このペプチドにおいて、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号９のＫ１８）。
【０１０７】
配列番号１０は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号２０）、およびエプスタインバーウイルスＬＭＰ１抗原（すなわちＥＢＶ ＬＭＰ１；配列番号１２９）に由来する主要抗原ＨＬＡ Ａ２制限ＣＴＬエピトープを含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。このペプチドにおいて、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号１０のＫ１８）。
【０１０８】
配列番号１１は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号２２）、およびＥＢＶ ＬＭＰ１に由来する主要抗原ＨＬＡ Ａ２制限ＣＴＬエピトープ（配列番号１２９）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。このペプチドにおいて、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号１１のＫ１８）。
【０１０９】
配列番号１２は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号１６）、およびＥＢＶ ＬＭＰ１に由来する主要抗原ＨＬＡ Ａ２制限ＣＴＬエピトープ（配列番号１２９）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。このペプチドにおいて、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号１２のＫ１８）。
【０１１０】
配列番号１３は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号４０）、およびＥＢＶ ＬＭＰ１に由来する主要抗原ＨＬＡ Ａ２制限ＣＴＬエピトープ（配列番号１２９）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。このペプチドにおいて、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている（配列番号１３のＫ１８）。
【０１１１】
配列番号１７４は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号２０）、およびオボアルブミンに由来する主要抗原ＣＴＬエピトープ（配列番号１７３）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。好ましくは、脂質は、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている配列番号１７４のＫ１８を介して結合する。
【０１１２】
配列番号１７５は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号２０）、およびリステリア・モノサイトゲネス抗原に由来する主要抗原ＣＴＬエピトープ（配列番号１７２）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。好ましくは、脂質は、さらなる内部リジン残基がＴヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープの間に操作されている配列番号１７５のＫ１８を介して結合する。
【０１１３】
配列番号１７７は、イヌ、マウスおよびヒトにおいて活性を有するイヌジステンパーウイルスに由来するＴヘルパーエピトープ（ＣＤＶ−Ｆ、配列番号２０）、およびＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質に由来する主要抗原ＣＴＬエピトープ（配列番号１７６）を含む合成ペプチドに関し、その内部リジン残基は太字で示すεアミノ基に脂質結合部位を提供する。好ましくは、脂質は配列番号１７７のＫ１８を介して結合する。
【０１１４】
当業者は、配列番号３〜１３、１７４、１７５または１７７のいずれか１個のＴヘルパーエピトープおよび／またはＣＴＬエピトープを、例えば、配列番号１４〜５２のいずれか１個で示されるＴヘルパーエピトープ、配列番号５３〜１７３または１７６のいずれか１個で示されるＣＴＬエピトープなど別のＴヘルパーエピトープまたはＣＴＬエピトープで置換することによって、本明細書に例示するポリペプチド部分に加えて、対象リポペプチドに使用する別のポリペプチド部分を容易に合成することができる。さらに、免疫応答が求められる標的種およびＣＴＬエピトープに応じて、適切なＴヘルパーエピトープとＣＴＬの組合せを選択することは、本明細書の開示から当業者には容易なはずである。
【０１１５】
配列番号３〜１３、１７４、１７５および１７７で示される例示的なポリペプチドを含めて、本明細書に記載するポリペプチド部分のアミノ酸配列は、特定の目的のために、当業者に周知の方法によって、それらの免疫機能に悪影響を及ぼさずに改変することができる。例えば、免疫応答を高めるか、またはペプチドを他の作用物質、特に脂質に結合させるために、特定のペプチド残基を誘導体化するか、または化学的に修飾することができる。ペプチドの全体構造またはＣＴＬ抗原性に支障を与えずにペプチド中の特定のアミノ酸を変えることも可能である。したがって、そのような変化は「保存的」変化と称され、残基の親水性または極性に依拠する傾向にある。側鎖の大きさおよび／または変化も、どの置換が保存的であるかを決定する関連要因である。
【０１１６】
生物学的機能が等価なタンパク質またはペプチドの定義に固有なのは、分子の規定された部分内でなされ、かつ許容される等価レベルの生物活性を有する分子を依然としてもたらし得る変化の数には限りがあるという概念であることを当業者は十分理解しうる。したがって、生物学的機能が等価なペプチドは、特定のアミノ酸を置換することができるペプチドと本明細書では定義される。特定の実施形態は、ペプチドのアミノ酸配列における１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の変更を含む変異体を包含する。異なる置換を含む複数の異なるタンパク質／ペプチドを本発明に従って容易に調製し、使用できることは言うまでもない。
【０１１７】
当業者は、以下の置換、すなわち、（１）アルギニン、リジンおよびヒスチジンを含む置換、（２）アラニン、グリシンおよびセリンを含む置換、ならびに（３）フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンを含む置換が許容できる保存的置換であることを十分承知している。このような保存的置換を組み込んだペプチドは生物学的機能が等価であると本明細書では定義する。
【０１１８】
相互作用性の生物学的機能をタンパク質に付与する上で疎水性親水性アミノ酸指標が重要であることは当分野では一般に理解されている（Kyte & Doolittle、J.Mol.Biol.157、105〜132、1982）。ある種のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸を置換することができ、かつ類似の生物活性を維持できることが知られている。アミノ酸の疎水性親水性指標も、機能的に等価な分子を生成する保存的置換を決定する際に考慮することができる。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、以下の疎水性親水性指標が割り当てられている。イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）。疎水性親水性指標に基づいて変化させる際には、疎水性親水性指標の指数が＋／−０．２以内のアミノ酸置換が好ましい。より好ましくは、置換は、疎水性親水性指標の指数が＋／−０．１以内、より好ましくは約＋／−０．０５以内のアミノ酸を含む。
【０１１９】
類似したアミノ酸の置換は、この場合（例えば、米国特許第４，５５４，１０１号）のように、特にそれによって生成される生物学的機能が等価なタンパク質またはペプチドを免疫学的な実施形態に用いようとする場合には、親水性に基づいて有効に行われることも当分野では十分理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳細に述べられているように、以下の親水性値（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ  ｖａｌｕｅ）が各アミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０＋／−０．１）、グルタミン酸（＋３．０＋／−０．１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５＋／−０．１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。親水性値が類似していることに基づいて変化させる際には、親水性値が互いに好ましくは約＋／−０．２以内、より好ましくは約＋／−０．１以内、さらにより好ましくは約＋／−０．０５以内であるアミノ酸を置換する。
【０１２０】
免疫原として使用するのに適切なペプチドが特定された場合には、ペプチド構造の重要な部分を模倣するように他の立体的に類似した化合物を調製できることも企図される。ペプチドミメティックと称することができるこのような化合物は、本発明のペプチドと同様に使用することができ、したがって機能的に等価なものである。構造上機能的に等価なペプチドは、当業者に公知のモデリング技術および化学設計技術によって製造することができる。このような立体的に類似した構築体はすべて本発明の範囲内にあることを理解されたい。
【０１２１】
改変ペプチドの「同等性」を決定する別の方法は機能的手法である。例えば、適当な変異ペプチドは、ＭＨＣクラスＩ結合エピトープを決定するための推定アルゴリズム、例えばＳＹＦＰＥＩＴＨＩアルゴリズム（University of Tuebingen, Germany）またはＨＬＡペプチド結合予測プログラムのアルゴリズム（BioInformatics and Molecular Analysis Section (BIMAS)、the National Institutes of Health、米国政府）を用いて決定されるようにＭＨＣクラスＩ対立遺伝子と有意なレベルで相互作用するアミノ酸配列を含みうる。かかる変異配列は、ＡＰＣ（例えばＰＢＭＣ分画中または血清の軟膜分画中）の表面上のＭＨＣクラスＩ分子と結合しおよび／または安定化させ、ならびに／あるいは、記憶ＣＴＬ応答を誘導しまたはＩＦＮ−γ産生を誘発し、ならびに／あるいは、標準的な細胞傷害性アッセイにおいてＣＴＬ活性を刺激しうる。かかる機能の決定は当業者であれば容易に行いうる。
【０１２２】
リポペプチドのポリペプチド部分は、メリフィールド（Merrifield）合成方法（Merrifield、J Am Chem Soc、85、2149〜2154、1963）、無数の利用可能な同技術の改良法（例えば、Synthetic Peptides:A User's Guide、Grant、ed.(1992)W.H.Freeman & Co.、New York、pp.382；Jones(1994)The Chemical Synthesis of Peptides、Clarendon Press、Oxford、pp.230）；Barany,G.and Merrifield,R.B.(1979)in The Peptides(Gross,E.and Meienhofer,J.eds.)、vol.2、pp.1〜284、Academic Press、New York；Wunsch,E.、ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Methoden der Organischen Chemie(Muler,E.、ed.)、vol.15、4th edn.、Parts 1 and 2、Thieme、Stuttgart；Bodanszky,M.(1984)Principles of Peptide Synthesis、Springer-Verlag、Heidelberg；Bodanszky,M.& Bodanszky,A.(1984)The Practice of Peptide Synthesis、Springer-Verlag、Heidelberg；Bodanszky,M.(1985)Int J.Peptide Protein Res.25、449〜474などの標準技術を用いて容易に合成される。
【０１２３】
脂質部分は、任意のＣ２〜Ｃ３０飽和、一不飽和または多価不飽和の線状または分枝脂肪アシル基、好ましくはパルミトイル、ミリストイル、ステアロイル、ラウロイル、オクタノイルおよびデカノイルからなる群から選択される脂肪酸基を含むことができる。リポアミノ酸は、本明細書において特に好ましい脂質部分である。本明細書で使用する、「リポアミノ酸」という用語は、アミノ酸残基、例えば、システインもしくはセリン、リジンもしくはその類似体に共有結合した１個または２個または３個以上の脂質を含む分子を指す。特に好ましい実施形態においては、リポアミノ酸はシステインを含み、１個または２個以上のセリン残基を場合によっては含んでいてもよい。
【０１２４】
脂質部分の構造は、得られるリポペプチドの活性に重要ではなく、本明細書において説明するように、パルミチン酸および／またはコレステロールおよび／またはＰａｍ１Ｃｙｓおよび／またはＰａｍ２Ｃｙｓおよび／またはＰａｍ３Ｃｙｓを用いることができる。本発明は、免疫原性を失うことなく、リポペプチドにおいて使用するための一定範囲のほかの脂質部分、例えばラウリン酸、ステアリン酸またはオクタン酸も明らかに包含する。従って、本発明は、別に記載しないかぎりまたは他に必要な状況がないかぎり、脂質部分の構造に限定されるものではない。
【０１２５】
同様に、本発明は、特記しないかぎりまたは他に必要な状況がないかぎり、単一の脂質部分の要件に限定されるものではない。複数の脂質部分をペプチド部分に付加すること、例えばＴヘルパーエピトープないの位置、およびＴヘルパーエピトープとＢ細胞エピトープの間の位置に付加することも明らかに意図している。
【０１２６】
脂質部分は、好ましくは、一般式（ＶＩＩ）の構造の化合物である：
【化６】
2010132663.tif 000008
【０１２７】
〔式中、
（ｉ）Ｘは、硫黄、酸素、ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、メチレン（−ＣＨ２−）およびアミノ（−ＮＨ−）からなる群から選択され、
（ｉｉ）ｍは、１または２の整数であり、
（ｉｉｉ）ｎは、０〜５の整数であり、
（ｉｖ）Ｒ１は、水素、カルボニル（−ＣＯ−）およびＲ’−ＣＯ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
（ｖ）Ｒ２は、Ｒ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
（ｖｉ）Ｒ３は、Ｒ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は、７〜２５個の炭素原子を有するアルキル、７〜２５個の炭素原子を有するアルケニル、および７〜２５個の炭素原子を有するアルキニルからなる群から選択され、前記アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基は、場合によっては、ヒドロキシル基、アミノ基、オキソ基、アシル基またはシクロアルキル基で置換されていてもよい）からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の各々は同じでも異なっていてもよい〕。
【０１２８】
置換基によっては、一般構造ＶＩＩの脂質部分は、完全体Ｒ１およびＲ２に直接的または間接的に共有結合した炭素原子が非対称の右旋性または左旋性（すなわち、ＲまたはＳ）立体配置である鏡像異性分子でもよい。
【０１２９】
好ましくは、Ｘは硫黄であり、ｍおよびｎはともに１であり、Ｒ１は水素およびＲ’−ＣＯ−（式中、Ｒ’は７〜２５個の炭素原子を有するアルキル基である）からなる群から選択され、Ｒ２およびＲ３はＲ’−ＣＯ−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−、Ｒ’−Ｏ−ＣＯ−、Ｒ’−ＮＨ−ＣＯ−およびＲ’−ＣＯ−ＮＨ−（式中、Ｒ’は７〜２５個の炭素原子を有するアルキル基である）からなる群から選択される。
【０１３０】
好ましくは、Ｒ’は、パルミトイル、ミリストイル、ステアロイルおよびデカノイルからなる群から選択される。より好ましくは、Ｒ’はパルミトイルである。
【０１３１】
前記脂質部分の各完全体Ｒ’は同じでも異なっていてもよい。
【０１３２】
特に好ましい実施形態においては、Ｘは硫黄であり、ｍおよびｎはともに１であり、Ｒ１は水素またはＲ’−ＣＯ−（式中、Ｒ’はパルミトイルである）であり、Ｒ２およびＲ３はそれぞれＲ’−ＣＯ−Ｏ−（式中、Ｒ’はパルミトイルである）である。これらの特に好ましい化合物は、上記式（Ｉ）および式（ＩＩ）で示される。
【０１３３】
脂質部分は、以下の一般式（ＶＩＩＩ）を有することができる：
【化７】
2010132663.tif 000009
【０１３４】
〔式中
（ｉ）Ｒ４は、（ｉ）約７〜約２５個の炭素原子からなるα−アシル脂肪酸残基、（ｉｉ）α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸残基、（ｉｉｉ）α−アルキル−β−ヒドロキシ脂肪酸残基のβ−ヒドロキシエステル（エステル基は、好ましくは、８個を超える炭素原子を含む直鎖または分枝鎖である）および（ｉｖ）リポアミノ酸残基、からなる群から選択され、
（ｉｉ）Ｒ５は、水素、またはアミノ酸残基の側鎖である〕。
【０１３５】
好ましくは、Ｒ４は、約１０〜約２０個の炭素原子からなり、より好ましくは約１４〜約１８個の炭素原子からなる。
【０１３６】
Ｒ４がリポアミノ酸残基である場合には、完全体（integer）Ｒ４およびＲ５の側鎖は共有結合を形成することもできる。例えば、Ｒ４が、リジン、オルニチン、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン誘導体、オルニチン誘導体、グルタミン酸誘導体およびアスパラギン酸誘導体からなる群から選択される場合には、アミノ酸または誘導体の側鎖は、アミド結合またはエステル結合によってＲ５に共有結合する。
【０１３７】
好ましくは、一般式ＶＩＩＩで示される構造は、Ｎ，Ｎ’−ジアシルリジン；Ｎ，Ｎ’−ジアシルオルニチン；グルタミン酸のジ（モノアルキル）アミドまたはエステル；アスパラギン酸のジ（モノアルキル）アミドまたはエステル；セリン、ホモセリンまたはトレオニンのＮ，Ｏ−ジアシル誘導体；およびシステインまたはホモシステインのＮ，Ｓ−ジアシル誘導体からなる群から選択される脂質部分である。
【０１３８】
両親媒性分子、特にＰａｍ３Ｃｙｓ（式（Ｉ））の疎水性を超えない疎水性を有する両親媒性分子も好ましい。
【０１３９】
式（Ｉ）、式（ＩＩ）、式（ＶＩ）または式（ＶＩＩＩ）の各脂質部分は、１個または複数のスペーサー分子、好ましくは炭素を含むスペーサー、より好ましくは１個または複数のアミノ酸残基の付加によって、合成中または合成後にさらに改変される。これらを、従来の縮合、付加、置換または酸化反応において末端カルボキシ基を介して脂質構造に付加することが有利である。このようなスペーサー分子の効果は、脂質部分をポリペプチド部分から分離して、リポペプチド産物の免疫原性を増大させることである。
【０１４０】
セリン二量体、三量体、四量体などはこの目的に特に好ましい。
【０１４１】
このようなスペーサーは、改変リポアミノ酸が後でポリペプチドに容易にコンジュゲートされるように末端保護アミノ酸残基を含むことが好ましい。
【０１４２】
この実施形態によって製造される代表的な改変リポアミノ酸は、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）で表され、それぞれ式（Ｉ）および（ＩＩ）にセリンホモ二量体を付加することによって容易に得られる。本明細書に例示するとおり、式（Ｉ）のＰａｍ３Ｃｙｓまたは式（ＩＩ）のＰａｍ２Ｃｙｓは、この目的で、式（ＩＩＩ）のリポアミノ酸Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒまたは式（ＩＶ）のＰａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒとして合成することが有利である。
【化８】
2010132663.tif 000010
【化９】
2010132663.tif 000011
【０１４３】
スペーサーを脂質部分に付加する代わりに、ポリペプチド部分の内部リジン残基のεアミノ基またはリジン類似体の末端側鎖基に、短いペプチド、例えば、セリンホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体などとして、あるいは、アミノ酸残基の連続的付加によってスペーサーを付加し、それによって分枝ポリペプチド鎖を生成することができる。この手法は、スペーサー付加における特異性を得るために、内部リジンまたはリジン類似体上の末端側鎖基の改変された性質を適宜利用する。当然、連続的なスペーサー付加を防止するために、スペーサーの末端アミノ酸残基は、脱保護によって分枝ポリペプチドへの脂質部分のコンジュゲートが容易になるように、好ましくは保護すべきである。
【０１４４】
あるいは、従来の求核置換反応によって、ポリペプチドの非改変εアミノ基にスペーサーを付加することができる。しかし、ポリペプチドが、単一の内部リジン残基、およびブロッキングされたＮ末端を含むアミノ酸配列を含む場合には、この手法に従うことが好ましい。
【０１４５】
脂質部分は、従来の合成手段、例えば、米国特許第５，７００，９１０号および同第６，０２４，９６４号に記載の方法、あるいは、Wiesmuller et al.、Hoppe Seylers Zur Physiol.Chem.364、593(1983)、Zeng et al.、J.Pept.Sci 2、66(1996)、Jones et al.、Xenobiotica 5、155(1975)、またはMetzger et al.、Int.J.Pept.Protein Res.38、545(1991)に記載の方法によって調製される。当業者は、このような方法を容易に改変して、ポリペプチドへのコンジュゲートに使用される所望の脂質を合成することができる。
【０１４６】
本発明のリポペプチドに使用される様々な脂質の組合せも企図される。例えば、１個または２個のミリストイル含有脂質またはリポアミノ酸を、内部リジンまたはリジン類似体残基を介してポリペプチド部分に結合させ、場合によっては、スペーサーによってポリペプチドから分離させ、１個または２個のパルミトイル含有脂質またはリポアミノ酸をカルボキシ末端のリジンアミノ酸残基に結合させてもよい。他の組合せも除外されない。
【０１４７】
本発明のリポペプチドは、診断目的で容易に修飾される。例えば、本発明のリポペプチドは、天然または合成ハプテン、抗生物質、ホルモン、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、ビオチン、アビジン、ポリエチレングリコール、ペプチドのポリペプチド部分（例えば、タフトシン、ポリリジン）、蛍光マーカー（例えば、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣ、ダンシル、ルミノールまたはクマリン）、生物発光マーカー、スピン標識、アルカロイド、生体アミン、ビタミン、毒素（例えば、ジゴキシン、ファロイジン、アマニチン、テトロドトキシン）または錯形成剤を付加することによって修飾される。
【０１４８】
本明細書に例示するとおり、ＣＤ４＋ＴヘルパーエピトープとＣＤ８＋ＣＴＬエピトープの間に位置するリジン残基のεアミノ基を介してコンジュゲートされた式（Ｉ）のＰａｍ３Ｃｙｓ、または式（ＩＩ）のＰａｍ２Ｃｙｓを含む、ＣＴＬ応答を誘導可能な高免疫原性リポペプチドが提供される。
【０１４９】
リポペプチドの調製
本発明の第２の態様は、
（ｉ）以下の（ａ）および（ｂ）：
（ａ）Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）エピトープのアミノ酸配列およびＣＴＬエピトープのアミノ酸配列（前記各アミノ酸配列は異なる）、
（ｂ）１個または複数の内部リジン残基または内部リジン類似体残基とを含むアミノ酸配列、
を含むポリペプチドを製造するステップ、ならびに
（ｉｉｉ）前記１個または複数の脂質部分の各々を直接的または間接的に、前記１個もしくは複数の内部リジン残基のε−アミノ基、または前記１個もしくは複数の内部リジン類似体残基の末端側鎖基に共有結合させて、前記内部リジン残基のεアミノ基に結合した脂質部分を含む、または前記内部リジン類似体残基の末端側鎖基に結合した脂質部分を含むリポペプチドを製造するステップ、
を含む、リポペプチドを製造する方法を提供する。
【０１５０】
この方法はさらに脂質部分の製造も含むことが好ましい。
【０１５１】
本明細書で参照する従来の化学合成は、ポリペプチド部分および脂質部分を製造する好ましい手段である。
【０１５２】
ブロッキング基（例えば、Ｍｔｔ）を末端側鎖基から選択的に除去して内部リジンまたはリジン類似体を改変して、リポアミノ酸を含むアミノ酸残基、スペーサーまたは脂質部分がその位置に付加できるようにすることが好ましい。
【０１５３】
脂質をポリペプチドに結合させる場合には、ポリペプチドの官能基を、これらの基において望ましくない反応が有効な反応速度で確実に起こらないように、ペプチド合成分野で既知の方法で保護することが有利である。
【０１５４】
既知のカップリング法によって、ポリペプチドをポリマー（例えば、メリフィールド樹脂）などの固体担体または可溶性担体上で合成し、スペーサー、アミノ酸または脂質にコンジュゲート可能にする。例えば、リジンまたはリジン類似体（例えば内部リジンのεアミノ基）の末端側鎖基をいくつかの保護基の１個で保護する。（保護基またはマスキング基とも呼ばれる）ブロッキング基を使用して、カップリング反応に関与する活性カルボキシル基を有するアミノ酸のアミノ基を保護し、またはカップリング反応に関与するアシル化アミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基を保護する。カップリングを起こす場合には、ペプチド結合、またはペプチドの別の部分に結合した任意の保護基を切断せずにブロッキング基を除去しなければならない。
【０１５５】
固相ペプチド合成の場合には、伸長するペプチド鎖のアミノブロッキング基の除去に必要な反復処理に安定であり、かつアミノ酸カップリングの繰り返しに必要な反復処理に安定なブロッキング基を使用してアミノ酸側鎖を保護する。また、ペプチドＣ末端を保護するペプチド樹脂の足場（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）は、樹脂からの切断が必要になるまで合成プロセスを通して保護されなければならない。したがって、直交性に保護されたα−アミノ酸を慎重に選択することによって、脂質および／またはアミノ酸が、樹脂に付着したまま伸長するペプチドの所望の位置に付加される。
【０１５６】
好ましいアミノブロッキング基は、容易に除去可能であるが、カップリング反応および他の操作、例えば、側鎖基の修飾などに対する残存条件（ｓｕｒｖｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）に十分安定である。好ましいアミノブロッキング基は、（ｉ）室温常圧の接触水素化によって、またはナトリウムの液体アンモニア溶液および臭化水素酸の酢酸溶液を用いて容易に除去されるベンジルオキシカルボニル基（Ｚまたはカルボベンゾキシ）、（ｉｉ）ｔ−ブトキシカルボニルアジドまたはジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカルボネートを用いて導入され、弱酸、例えば、トリフルオロ酢酸（５０％ＴＦＡのジクロロメタン溶液）、ＨＣｌの酢酸／ジオキサン／酢酸エチル溶液などを用いて除去されるｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、（ｉｉｉ）弱塩基、非加水分解条件下、例えば、第一級または第二級アミン（例えば、２０％ピペリジンのジメチルホルムアミド溶液）を用いて切断される９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、（ｉｖ）２−（４−ビフェニリル）プロピル（２）オキシカルボニル基（Ｂｐｏｃ）、（ｖ）２−ニトロ−フェニルスルフェニル基（Ｎｐｓ）、および（ｖｉ）ジチア−スクシオニル基（Ｄｔｓ）からなる群から選択される。
【０１５７】
側鎖保護基は、合成するペプチドを形成するアミノ酸の官能基側鎖に応じて変わる。側鎖保護基は、一般に、Ｂｚｌ基またはｔＢｕ基に基づいている。側鎖にアルコールまたはカルボン酸を有するアミノ酸は、Ｂｚｌエーテル、Ｂｚｌエステル、ｃＨｅｘエステル、ｔＢｕエーテルまたはｔＢｕエステルとして保護される。Ｆｍｏｃアミノ酸の側鎖を保護するには、理想的には塩基に安定であり弱酸（ＴＦＡ）に不安定なブロッキング基が必要である。例えば、リジンのε−アミノ基は、Ｍｔｔによって保護される（例えば、Ｆｍｏｃ−リジン（Ｍｔｔ）−ＯＨ）。あるいは、酸に対する高い安定性が必要な場合には、ＣＩＺなどのハロゲン化ベンジル誘導体を使用してリジン側鎖を保護する。シスチンのチオール基、ヒスチジンのイミダゾール、またはアルギニンのグアニジノ基は、一般に特別な保護を必要とする。多種多様なペプチド合成用保護基が記載されている（The Peptides、Gross et al.eds.、Vol.3、Academic Press、New York、1981）。
【０１５８】
最も広く用いられている２つの保護方法は、Ｂｏｃ／Ｂｚｌ法およびＦｍｏｃ／ｔＢｕ法である。Ｂｏｃ／Ｂｚｌでは、Ｂｏｃをアミノ保護に使用し、様々なアミノ酸の側鎖をＢｚｌまたはｃＨｅｘを基にした保護基を用いて保護する。Ｂｏｃ基は、触媒水素化条件下で安定であり、多数の側鎖基を保護するためにＺ基とともに直交性に使用される。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕでは、Ｆｍｏｃをアミノ保護に使用し、ｔＢｕを基にした保護基を用いて側鎖を保護する。
【０１５９】
ペプチドは、当分野で周知の方法によって脂質付加される。標準の縮合、付加、置換または酸化（例えば、内部リジンまたはリジン類似体上の末端アミノ基と、導入されるアミノ酸またはペプチドまたはリポアミノ酸カルボキシ末端基とのジスルフィド架橋形成またはアミド結合形成）反応によって、脂質がポリペプチドに付加される。
【０１６０】
別の実施形態においては、免疫原として使用される本発明のペプチドを化学選択的連結または化学結合あるいはオキシム化学によって製造する。このような方法は、当分野では周知であり、個々のペプチド成分を化学手段または組換え手段によって製造し、その後、適切な配置またはコンホメーションまたは順序で化学選択的に連結する（例えば、参照により本明細書に援用するNardin et al.、Vaccine 16、590(1998)；Nardin et al.、J.Immunol.166、481(2001)；Rose et al.、Mol.Immunol.32、1031(1995)；Rose et al、Bioconjug.Chem 7、552(1996)；およびZeng et al.、Vaccine 18、1031(2000)）。
【０１６１】
リポペプチド製剤
リポペプチドは、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤、例えば、水性溶媒、非水性溶媒、塩、防腐剤、緩衝剤などの無毒賦形剤中に有利に処方される。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびエチルオレイン酸エステルなどの注射用有機エステルである。水性溶媒としては、水、アルコール性溶液、水溶液、食塩水溶液、塩化ナトリウムなどの非経口ビヒクル、リンゲルのデキストロースなどがある。防腐剤としては、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどがある。医薬組成物中の様々な成分ｐＨおよび正確な濃度は、当分野の常法に従って調節される。
【０１６２】
リポペプチド製剤への外来的なアジュバントの添加は一般に不要であるが、やはり本発明に包含される。このような外来的なアジュバントとしては、すべての許容される免疫賦活性化合物、例えば、サイトカイン、毒素、合成組成物などがある。例示的なアジュバントとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＢＣＧ、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｕｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称する）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ）１９８３Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称する）、脂質Ａ、ＭＰＬ、細菌から抽出される３成分を含むＲＩＢＩ、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）の２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルジョンなどがある。
【０１６３】
生物反応修飾物質（ＢＲＭ）とリポペプチドを同時投与して、サプレッサーＴ細胞活性をダウンレギュレートすることが望ましい場合もある。例示的なＢＲＭは、シメチジン（ＣＩＭ；１２００ｍｇ／ｄ）（Ｓｍｉｔｈ／Ｋｌｉｎｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）、インドメタシン（ＩＮＤ；１５０ｍｇ／ｄ）（Ｌｅｄｅｒｌｅ、ＮＪ、ＵＳＡ）、低用量シクロホスファミド（ＣＹＰ；７５、１５０または３００ｍｇ／ｍ２）（Ｊｏｈｎｓｏｎ／Ｍｅａｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）などであるが、これらだけに限定されない。
【０１６４】
免疫におけるリポペプチドの使用
本発明の新規リポペプチドは、もっぱら内部リジンまたはリジン類似体の末端側鎖基により脂質部分がコンジュゲートしており、それにより追加のアジュバントを投与しないでＴ細胞応答を増強しうるという点で、ＣＴＬエピトープの公知のリポペプチド複合体とは本質的な面で異なる。したがって、本発明のリポペプチドの特別な有用性は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおけるＴ細胞応答の誘発、合成ワクチン製剤、Ｔ細胞を使用する診断法、ならびに動物およびヒト医療用免疫療法の分野にある。
【０１６５】
より具体的には、本発明のリポペプチドは、動物被験体に投与すると、ＣＴＬ活性化の同等のレベルを得るためにアジュバントを必要とせずに、ＣＴＬエピトープ部分に対するＣＴＬ記憶応答を増強する。さらに、ワクチン投与後には、樹状細胞の成熟の増強、ならびにＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋細胞の誘導を含む他の生物学的作用、そしてウイルス、細胞および腫瘍細胞のクリアランスの増強が観察されている。
【０１６６】
従って、本発明のさらなる態様は、被験体においてそのＣＴＬエピトープが由来する生物に対する細胞媒介性免疫を増強する方法を提供し、該方法は、本発明のリポペプチドまたは該リポペプチドの誘導体もしくは機能的に等価な変異体、あるいは該リポペプチドまたは変異体もしくは誘導体を含むワクチン組成物を、該被験体のＣＴＬおよび／またはＣＴＬ前駆体を活性化するのに十分な時間および条件において該被験体に投与することを含む。
【０１６７】
「ＣＴＬ前駆体」とは、天然Ｔ細胞（すなわち、１以上のＴ細胞レセプターをその表面上に発現し、増殖して、記憶Ｔ細胞またはエフェクターＴ細胞に分化することができるＴ細胞）を意味する。
【０１６８】
好ましくは、リポペプチドまたはワクチンは、寄生生物、細菌もしくはウイルスによる潜伏もしくは活性な感染を有しない被験体または癌に罹患していない被験体に予防目的で、あるいは寄生生物、細菌もしくはウイルスによる潜伏もしくは活性な感染を有する被験体または癌に罹患した被験体に治療目的で投与する。
【０１６９】
本発明において、用語「活性化する」とは、一過性または持続的に、ＣＴＬエピトープが由来する抗原を有する細胞を認識し溶解するＴ細胞の能力が増大されるか、または該抗原のＴ細胞エピトープを認識するＴ細胞の能力が増大されることを意味する。用語「活性化する」とはまた、寄生生物または細菌もしくはウイルスによる潜伏感染の活性化後、あるいは寄生生物または細菌もしくはウイルスによる再感染後、あるいは既に感染した被験体の本発明のリポペプチドまたは組成物による免疫後に、Ｔ細胞集団の再活性化を含むものである。
【０１７０】
当業者であれば、最適Ｔ細胞活性化がＴ細胞レセプター（ＴｃＲ）による抗原／ＭＨＣの同系認識、およびＴ細胞上の種々の細胞表面分子と抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の細胞表面分子との結合を含む共刺激を必要とすることは理解している。共刺激相互作用ＣＤ２８／Ｂ７、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０およびＯＸ４０／ＯＸ４０Ｌが好ましいが、Ｔ細胞活性化に必須ではない。他の共刺激経路も使用しうる。
【０１７１】
ＣＴＬもしくは前駆体ＣＴＬの活性化、またはエピトープ特異的活性のレベルを測定するために、検体中のＣＤ８＋Ｔ細胞数をアッセイする標準的方法を用いうる。好ましいアッセイ形式は、細胞傷害性アッセイ（例えば標準的なクロム放出アッセイなど）、ＩＦＮγ産生のアッセイ（例えばＥＬＩＳＰＯＴアッセイなど）を含む。これらのアッセイ形式は、後述の実施例において詳細に説明する。
【０１７２】
ＭＨＣクラス１四量体アッセイもまた用いることができ、特にＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＴＬエピトープ特異的定量のために用いうる（Altman et al., Science 274:94-96；Ogg et al., Curr. Opin Immunol. 10, 393-396, 1998）。四量体を製造するために、ＭＨＣ分子のカルボキシル末端、例えばＨＬＡ Ａ２重鎖を、特異的なペプチドエピトープまたはポリエピトープと結合させ、それらに好適なリポーター分子（好ましくはフルオロクロム、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン、フィコシアニンまたはアロフィコシアニン）が結合した四量体複合体が形成するように処理する。四量体の形成は、例えばＭＨＣ−ペプチド融合タンパク質をビオチニル化分子として産生し、その後、該ビオチニル化ＭＨＣ−ペプチドと蛍光で標識した脱グリコシル化アビジンをモル比４：１で混合することにより行う。産生した四量体は、ペプチドがＨＬＡ制限である、被験体（例えば、全血またはＰＢＭＣサンプル中）由来のＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセット上のＣＤ８＋Ｔ細胞レセプターの異なるセットに結合する。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞活性化または増殖について必要条件はない。結合後、未結合または非特異的結合四量体を除去するためにＴ細胞を洗浄し、特異的にＨＬＡ−ペプチド四量体と結合したＣＤ８＋細胞数は、標準的なフローサイトメトリー法、例えばＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Becton Dickinson）を用いて容易に定量しうる。四量体はまた、常磁性粒子または磁性ビーズに結合させ、非特異的に結合したリポーターの除去および細胞ソーティングを容易にしうる。かかる粒子は、市販供与源から容易に入手できる（例えば、Beckman Coulter, Inc., SanDiego, CA, USA）。四量体の染色は標識細胞を死滅させない。そのため細胞の完全性はさらなる分析のために維持される。ＭＨＣ四量体により、特異的細胞免疫応答の正確な定量的分析が可能となり、さらには１％未満のＣＤ８＋Ｔ細胞に起こるきわめて希少な自称についても分析可能となる（Bodinier et al., Nature Med. 6, 707-710, 2000；Ogg et al., Curr Opin Immunol. 10, 393-396, 1998）。
【０１７３】
試料中のＣＤ８＋細胞の合計数はまた、例えば、試料を、四量体の検出に使用される種々のリポーター分子と複合したＣＤ８に対するモノクローナル抗体と共にインキュベートすることにより容易に測定しうる。かかる抗体は容易に入手可能である（例えば、Becton Dickinson）。２つのリポーター分子からのシグナルの相対強度は、ＣＤ８＋細胞および四量体結合Ｔ細胞の合計数を定量し、四量体に結合した合計Ｔ細胞の割合を決定するために用いうる。
【０１７４】
ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、サイトカイン（例えばＩＬ−２など）の産生因子としてＣＭＩ中で機能し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進するか、またはＡＰＣと相互作用して、それによりＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化能をより強力にする。サイトカイン産生はＴ細胞活性化の間接的な尺度となる。したがって、サイトカインアッセイをまた用いて、ヒト被験体におけるＣＴＬもしくは前駆体ＣＴＬの活性化、または細胞媒介免疫のレベルを判定しうる。かかるアッセイでは、サイトカイン（例えばＩＬ−２など）を検出するか、またはサイトカインの産生をエピトープ特異的反応性Ｔ細胞のレベルの指標として測定する。
【０１７５】
好ましくは、サイトカインレベルまたはサイトカイン産生を測定するために用いるサイトカインアッセイ形式は、本質的には、本明細書にアッセイの参照として組み入れるPetrovsky and Harrison, J. Immunol. Methods 186, 37-46, 1995により記載されている。
【０１７６】
好ましくは、サイトカインアッセイは全血またはＰＢＭＣまたは軟膜上で行う。
【０１７７】
好ましくは、リポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体またはワクチン組成物を、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の誘導または増強に十分な時間および時間で投与する。
【０１７８】
さらにより好ましくは、リポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体またはワクチン組成物を、被験体において増強させようとする細胞媒介免疫（ＣＭＩ）に十分な時間および条件で投与する。
【０１７９】
「ＣＭＩ」とは、活性化し、クローン増殖したＣＴＬがＭＨＣに制限され、ＣＴＬエピトープに特異的であることを意味する。ＣＴＬは、抗原特異性およびＭＨＣ制限に基づいて分類されている（すなわち、非特異的ＣＴＬと、抗原特異的なＭＨＣ制限ＣＴＬ）。非特異的ＣＴＬは、種々の細胞型（ＮＫ細胞を含む）から構成され、免疫応答の非常に初期に機能し、病原体の量を低減し、その間に抗原特異的応答はまだ確立されている。対照的に、ＭＨＣ制限ＣＴＬは、非特異的ＣＴＬよりも遅く、一般的に抗体産生の前に最適活性を示す。抗原特異的ＣＴＬは、病原体の拡散を阻害または低減し、好ましくは感染を終了させる。
【０１８０】
ＣＴＬ活性化、クローン増殖またはＣＭＩは、全身で、または組織に局所化して誘導しうる。組織に局所化した作用の場合には、その組織への投与に好適に製剤化したワクチン製剤を使用することが好ましい。一方、被験体の全身におけるＣＴＬ活性化、増殖またはＣＭＩの誘導にはそのような厳密な要件はない。
【０１８１】
単独でまたはワクチン組成物のいずれかで、ＣＴＬ活性化、クローン増殖またはＣＭＩを誘発するために投与すべきリポペプチドの有効量は、免疫原性エピトープの性質、投与経路、免疫する被験体の体重、年齢、性別または全身の健康状態、および想定されるＣＴＬ応答の性質に応じて異なりうる。そのような変数はすべて当業者に認識される手段により経験的に決定される。
【０１８２】
リポペプチド、場合により任意の適当なまたは所望の担体、アジュバント、ＢＲＭまたは薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化されたリポペプチドは、注入可能な組成物の形態で簡便に投与される。注入は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内または他の公知の経路でありうる。静脈内注射のためには、１以上の液体および栄養補充薬を含むことが望ましい。
【０１８３】
投与すべき最適量および好ましい投与経路は、動物モデルを用いて、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギまたはブタにリポペプチドを含む製剤を注入し、その後任意の慣用のアッセイを用いてＣＴＬ免疫応答をモニターすることにより確立しうる。
【０１８４】
ヒトＨＬＡ  Ａ＊０２０１アリルのα１およびα２ドメインとマウスＨ−２ＫｂクラスＩ分子のα３ドメインから構成されるキメラヒト−マウスクラスＩ主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）遺伝子座を有するＨＬＡ  Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウス（Vitiello et al., J. Exp. Med. 173, 1007, 1991）の使用は、ＨＬＡ  Ａ２制限ＣＴＬエピトープまたはそれを含むワクチン組成物を含む本発明のリポペプチドに対する応答をｉｎ  ｖｉｖｏで試験するために特に好ましい。
【０１８５】
何らかの理論または作用機構に拘束されるものではないが、本発明者は、リポペプチドの生物学的作用は、それらが樹状細胞を刺激および成熟する能力により発揮されると考えている。リンパ節の排液におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化させる。この理由のため、本発明者は想定されているように直接的にＴ細胞を活性化することが可能ではないと考えている。以下の節では、樹状細胞活性化の概念を理解するために修正している。
【０１８６】
関連する実施形態において、本発明は、被験体の細胞媒介免疫を増強する方法を提供し、該方法は、被験体から採取した細胞、好ましくは樹状細胞と免疫学的に活性な本発明のリポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該リポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物とを、該樹状細胞が成熟するのに十分な時間および条件で、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることを含む。該樹状細胞は、その後、Ｔ細胞のエピトープ特異的活性化を付与することが可能である。
【０１８７】
好ましい実施形態において、本発明は、被験体の細胞媒介免疫を増強する方法を提供し、該方法は、
（ｉ）被験体から採取した樹状細胞と、免疫学的に活性な本発明のリポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該リポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物とを、該樹状細胞が成熟するのに十分な時間および条件で、ｅｘ  ｖｉｖｏで接触させるステップ；ならびに
（ｉｉ）上記被験体に自系でまたは他の被験体に同系で活性化樹状細胞を導入し、Ｔ細胞活性化が起こるようにするステップ、
を含む。
【０１８８】
Ｔ細胞はＣＴＬまたはＣＴＬ前駆細胞でありうる。
【０１８９】
樹状細胞を採取する被験体は、処置しようとする被験体と同じ被験体であってもよいしまたは異なる被験体であってもよい。治療対象の被験体は、病原体、例えば寄生生物、細菌またはウイルスによる潜在または活性感染を保持する被験体、あるいはそのような病原体に対するワクチン接種を受ける必要があるかまたはかかるワクチン接種を受けることが望まれる被験体であれば任意のものであってよい。治療対象の被験体はまた、腫瘍を有し、それを治療してもよい。
【０１９０】
「エピトープ特異的活性」とは、Ｔ細胞が本明細書で上述したように活性化される能力を有するようになる（すなわち、Ｔ細胞が、ＣＴＬエピトープが由来する病原体を有する細胞を認識し溶解するか、または一過性にもしくは持続的に病原体の抗原のＴ細胞エピトープを認識可能である）ことを意味する。従って、Ｔ細胞は、本発明の方法によりＣＴＬ前駆体が病原体を有する細胞を認識して溶解することができ、または一過性もしくは持続的に病原体の抗原のＴ細胞エピトープを認識することができるようになることが特に好ましい。
【０１９１】
上述したようなｅｘ  ｖｉｖｏ用途については、樹状細胞は被験体から採取される生物学的試料、例えば血液、ＰＢＭＣまたはそれから得られる軟膜分画などに含まれることが好ましい。
【０１９２】
本発明の別の態様は、非感染被験体における病原体に対する免疫を提供または増強する方法を提供し、該方法は、該被験体に、免疫学的に活性な本発明のリポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該リポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物を、病原体による将来の感染に対する免疫学的記憶を提供するのに十分な時間および条件で投与するステップを含む。本明細書に記載のほかの実施形態と同様に、病原体は、寄生生物、ウイルスまたは細菌であり、好ましくはＣＴＬエピトープが同定されている本明細書で上述した寄生生物、ウイルスまたは細菌である。
【０１９３】
関連の実施形態において、本発明は、非感染被験体における病原体に対する免疫を増強または付与する方法を提供し、該方法は、該被験体から採取した樹状細胞と、免疫学的に活性な本発明のリポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体、あるいは該リポペプチドまたはその誘導体もしくは変異体を含むワクチン組成物とを、Ｔ細胞に対するエピトープ特異的活性を付与するのに十分な時間および条件で接触させるステップを含む。
【０１９４】
従って、本発明のこの態様は、被験体への予防用ワクチンの投与を提供するものであり、該ワクチンの有効成分（すなわち本発明のリポペプチド）が、非感染個体におけるメモリーＴ細胞を介して免疫学的記憶を誘導する。被験体の細胞媒介免疫を増強するための本明細書に記載するワクチン接種プロトコールの好ましい態様は、同様に被験体における病原体に対する免疫学的記憶の誘導に適合する。
【０１９５】
本発明を、以下の非限定的な実施例および図面を参照してさらに詳細に説明する。マウスにおける本明細書で提供する実施例は、ヒトにおける対応疾患のモデルとして許容されており、当業者であれば、かかるモデルについて本明細書に提示した知見を過度の実験を行うことなくヒト疾患にも拡張可能であることを容易に理解しうる。
【実施例１】
【０１９６】
材料および方法
化学物質
別段の記載がないかぎり、化学物質は、分析グレードまたはそれと同等のグレードであった。Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｏ’ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）およびジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤＩ）を、Ａｕｓｐｅｐ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、ＡｕｓｔｒａｌｉａおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．、Ｃａｓｔｌｅ  Ｈｉｌｌ、Ａｕｓｔｒａｌｉａから入手した。Ｏ’ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）を、Ｂａｃｈｅｍ、（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から入手した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびジエチルエーテルをＭｅｒｃｋ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ．（Ｋｉｌｓｙｔｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から入手した。フェノールおよびトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）をＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｌｋｅ、ＷＩ）から、トリニトロベンジルスルホン酸（ＴＮＢＳＡ）およびジアミノピリジン（ＤＭＡＰ）をＦｌｕｋａから、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデセ−７−エン（ＤＢＵ）をＳｉｇｍａから、パルミチン酸をＦｌｕｋａから入手した。
【０１９７】
ウイルス
本研究で使用したＡ型インフルエンザウイルスは、Ｍｅｍ７１と称するＨ３Ｎ１サブタイプウイルスであり。Ａ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／ｌ／７１（Ｈ３Ｎ２）×Ａ／Ｂｅｌｌａｍｙ／４２（ＨＩＮ１）の遺伝子再集合により誘導されたものである。ウイルスは、１０日の発育鶏卵の尿膜腔において２日間増殖させた。ウイルスを含む尿膜腔液を−７０℃でアリコートとして保存した。感染ウイルス力価は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎（ＭＫＣＫ）細胞（Tannock et al, Infect. Immun. 43, 457-462, 1984）の単層におけるプラーク形成のアッセイにより得、ＰＦＵ／ミリリットルで表す。
【０１９８】
細菌
リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）ＥＧＤは、ウマ血液アガー（ＨＢＡ）プレート上で３７℃にて一晩培養した。細菌は、滅菌ＰＢＳでプラークを洗浄し、濃度を５×１０３細胞／ｍｌに調整した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに１×１０３リステリア細胞を静脈内から感染させた。用量は、ＨＢＡプレート上で連続１０倍希釈でプレートすることにより回顧的にチェックした。
【０１９９】
ペプチド合成
インフルエンザウイルスＣＴＬエピトープを含むペプチド
インフルエンザウイルスに由来するＣＤ８＋Ｔ細胞の最小の決定基および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞の決定基を示すペプチドを組み込んだ一連の免疫原を合成した。配列ＴＹＱＲＴＲＡＬＶを有するペプチドＮＰ（１４７−１５５）（ＣＴＬ決定基はＰＲ８ウイルスのＮＰ中に存在する、配列番号２）は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにより認識される主要なＣＤ８＋Ｔ細胞決定基であり、Ａ型インフルエンザウイルス株に共通している（Bodmer et al, Cell 52, 253-258, 1988; and Sherman et al, J. Exp. Med. 175, 1221-1226, 1992）。配列ＡＬＮＮＲＦＱＩＫＧＶＥＬＫＳ（配列番号１）を有するペプチドＨＡ２（１６６−１８０）は、Ｍｅｍ７１インフルエンザウイルスの赤血球凝集素のＨＡ２鎖内に存在するＣＤ４＋Ｔヘルパー決定基であり、Ｈ３サブタイプの全てのウイルスと交差反応するＣＤ４＋Ｔ細胞を誘発する（Jackson et al, Virology 198, 153-170, 1994）。
【０２００】
Ｌ．モノサイトゲネスＣＴＬエピトープを含むペプチド
Ｌ．モノサイトゲネス由来のアミノ酸配列ＧＹＫＤＧＮＥＹＩ（タンパク質リテリアリシンの残基９１−９９）（すなわち配列番号１７２）およびＣＤＶ−Ｆ由来のＴヘルパーエピトープ（配列番号２０）を有する最小のＣＴＬエピトープを組み込んだ免疫原ペプチドを合成した。
【０２０１】
Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞系により発現されるＣＴＬエピトープを含むペプチド
アミノ酸配列ＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１７３）およびＣＤＶ−Ｆ由来のＴヘルパーエピトープ（配列番号２０）を有するＣＴＬエピトープを組み込んだ免疫原ペプチドを合成した。
【０２０２】
Ｃ型肝炎ウイルスのコアタンパク質由来のＣＴＬエピトープを含むペプチド
アミノ酸配列ＤＬＭＧＹＩＰＬＶ（配列番号１７６）およびＣＤＶ−Ｆ由来のＴヘルパーエピトープ（配列番号２０）を有するＣＴＬエピトープを組み込んだ免疫原ペプチドを合成した。
【０２０３】
一般的手順
合成免疫原をＦｍｏｃ化学を用いる慣用の固相法により構築した。ペプチド合成に使用した一般的手順はJackson et al., Vaccine 18, 355 (1999)により記載されている。ＣＤ４＋ＴエピトープとＣＴＬエピトープとの液体結合を行うために、Ｆｍｏｃ−ｌリジン（Ｍｔｔ）−ＯＨを樹脂結合ペプチドのほぼ中央における２つのエピトープの間に挿入した。ペプチド合成の後、Ｍｔｔ基をジクロロメタン中１％ＴＦＡを用いた３０〜４５分にわたる連続した流れ洗浄により除去した。
【０２０４】
式（Ｉ）の脂質部分の合成
Ｐａｍ３Ｃｙｓを、Zeng et al.、J Pept Sci 2,:66(1996)に記載の方法によって改変されたWeismuller et al.、Hoppe Seylers Z Physiol Chem 364、593(1983)に記載された方法によって調製した。リポアミノ酸Ｐａｍ３Ｃｙｓを、Zeng et al.(上記)によって記載された手順に従ってリジンの露出したε−アミノ基に結合（couple）させる。簡単に説明すると、２倍過剰のＰａｍ３Ｃｙｓ、ＴＢＴＵおよびＨＯＢｔをＤＣＭに溶解し、３倍過剰のＤＩＰＥＡを添加した。次いで、この溶液を、樹脂に結合したペプチドに添加して、リポペプチドを製造した。
【０２０５】
式（ＩＩ）の脂質部分の合成
Ｐａｍ２Ｃｙｓは、３−ブロモ−プロパン−１，２−ジオールを３−クロロ−プロパン−１，２−ジオールの変わりに使用し、濾過ではなく遠心により生成物を回収したことを除いて、Jones et al.、Xenobiotica 5、155(1975)およびMetzger et al.、Int J Pept Protein Res 38、545(1991)に記載の方法によって調製した。
【０２０６】
リポペプチドの合成
本研究で製造したリポペプチドは図１に示す一般構造を有する。種々のリポペプチドに含まれるペプチド部分のアミノ酸配列を図２に示す。Ｐａｍ２Ｃｙｓは、Jones et al.、Xenobiotica 5、155(1975)およびMetzger et al.、Int J Pept Protein Res 38、545(1991)に記載の方法を以下の改変を加えて用いてペプチドに結合させた。
【０２０７】
Ｉ．Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システインの合成：
トリエチルアミン（６ｇ、８．２ｍｌ、５８ｍｍｏｌ）を、Ｌ−システイン塩酸塩（３ｇ、１９ｍｍｏｌ）と３−ブロモ−プロパン−１，２−ジオール（４．２ｇ、２．３６ｍｌ、２７ｍｍｏｌ）の水溶液に添加し、その均一溶液を室温で３日間保持した。その溶液を真空中４０℃で濃縮して白色残渣とし、それをメタノール（１００ｍｌ）とともに煮沸し、遠心分離して、その残渣を水（５ｍｌ）に溶解した。この水溶液をアセトン（３００ｍｌ）に添加し、遠心分離して沈殿物を単離した。この沈殿物を、アセトンを用いて水から数回沈殿させて精製して、白色アモルファス粉末のＳ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システイン（２．４ｇ、１２．３ｍｍｏｌ、６４．７％）を得た。
【０２０８】
ＩＩ．Ｎ−フルオレニルメトキシカルボニル−Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システイン（Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨ）の合成：
Ｓ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）システイン（２．４５ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）を、９％炭酸ナトリウム（２０ｍｌ）に溶解した。フルオレニルメトキシカルボニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．４５ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２０ｍｌ）溶液を添加し、その混合物を２時間攪拌し、次いで水（２４０ｍｌ）で希釈し、ジエチルエーテル（２５ｍｌ×３）で抽出した。その水相を濃塩酸でｐＨ２に酸性化し、次いで、酢酸エチル（７０ｍｌ×３）で抽出した。その抽出物を水（５０ｍｌ×２）および塩化ナトリウム飽和溶液（５０ｍｌ×２）で洗浄し、硫酸ナトリウムで脱水し、蒸発乾固させた。エーテルおよび酢酸エチルから−２０℃で再結晶させて無色粉末（２．８ｇ、６．７ｍｍｏｌ、６３．８％）を得た。
【０２０９】
ＩＩＩ．樹脂に結合したペプチドへのＦｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨのカップリング：
Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ＯＨ（１００ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を、ＤＣＭおよびＤＭＦ（１：１、ｖ／ｖ、３ｍｌ）中でＨＯＢｔ（３６ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）およびＤＩＣＩ（３７ｕｌ、０．２４ｍｍｏｌ）を用いて０℃で５分間活性化した。次いで、その混合物を、樹脂に結合したペプチド（０．０４ｍｍｏｌ、０．２５ｇアミノ−ペプチド樹脂）を含む容器に添加した。２時間振とうした後に、溶液をろ過して除去し、樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦ（各３×３０ｍｌ）で洗浄した。ＴＮＢＳＡ試験を用いて反応終了をモニターした。必要に応じて、カップリングを２回実施した。
【０２１０】
ＩＶ．Ｆｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂の２個のヒドロキシ基のパルミトイル化：
パルミチン酸（２０４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ）、ＤＩＣＩ（１５４ｕｌ、１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（９．７６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ  ２ｍｌおよびＤＭＦ  １ｍｌに溶解した。樹脂に結合したＦｍｏｃ−Ｄｈｃ−ペプチド樹脂（０．０４ｍｍｏｌ、０．２５ｇ）をこの溶液に懸濁し、１６時間室温で振とうした。ろ過して溶液を除去し、次いで樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦで十分洗浄して尿素の残渣を除去した。Ｆｍｏｃ基の除去を２．５％ＤＢＵを用いて実施した（２×５分）。
【０２１１】
すべての樹脂結合ペプチド構築体を、固相支持体から試薬Ｂ（８８％ＴＦＡ、５％フェノール、２％ＴＩＰＳ、５％水）を用いて２時間かけて切断し、Zeng et al.、Vaccine 18、1031(2000)に記載されたように逆相クロマトグラフィーによって精製した。
【０２１２】
分析用逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を、Ｗａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣシステム中に組み込まれたＶｙｄａｃ  Ｃ４カラム（４．６×３００ｍｍ）を用いて実施し、０．１％ＴＦＡ水溶液および０．１％ＴＦＡのＣＨ３ＣＮ溶液を限界溶媒（ｌｉｍｉｔ  ｓｏｌｖｅｎｔ）として用いて流量１ｍｌ／分で展開した。すべての生成物は、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによって主要な単一ピークとして現れ、遅延イオン抽出（ｄｅｌａｙｅｄ  ｉｏｎ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を備えたＢｒｕｋｅｒ  ＢＩＦＬＥＸ装置を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析したところ、予想どおりの質量であった。免疫原の最終定量を、ペプチド構築体中のトリプトファン残基およびチロシン残基の存在を利用して２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって実施した（モル吸光係数６．６×１０３）。
【０２１３】
場合により、２つのセリン残基（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を、ペプチドと脂質部分の間に付加した。この場合、セリン残基は脂質部分を結合する前に二中央のリジン残基のεアミノ基に付加した。
【０２１４】
本研究に使用したペプチドおよびリポペプチドの概要は図１に示す。
【０２１５】
免疫手順
インフルエンザウイルスＣＴＬエピトープを含むペプチド
６〜８週齡の５匹のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの各グループを０日および再度２８日に接種した。皮下（ｓ．ｃ．）接種（１００μｌ容量の生理食塩水／用量）の場合には、９ｎｍｏｌのリポペプチド構築体を生理食塩水中に調製し、非脂質付加ペプチドを一次注射の場合には等容量の完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、二次接種の場合には等容量の不完全フロイントアジュバントのエマルジョンとして処方した。鼻腔内（ｉ．ｎ．）接種の場合には、ペントレン吸入によって麻酔したマウスの鼻孔に９ｎｍｏｌのペプチド（５０μｌの生理食塩水中）を投与した。
【０２１６】
Ｌ．モノサイトゲネスのＣＴＬエピトープを含むペプチド
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、９ｎｍｏｌの非脂質付加ペプチド（［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＬＬＯ９１−９９］）、または脂質付加ペプチド（［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］）（この分子のほぼ中央における２つのエピトープの間に脂質が結合している）、あるいは１０００の細菌を接種した。ペプチドワクチンの場合には接種は皮下で行い、細菌の場合には静脈内に接種した。ＣＴＬエピトープまたは抗原なしでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激の２８日後に、脾臓に存在するインターフェロンγ産生細胞の数を測定した。縦軸は、１，０００，０００脾細胞あたりのインターフェロンγ産生細胞数を示す。
【０２１７】
オボアルブミンのＣＴＬエピトープを含むペプチド
９匹のＣ５７ＢＬ／６マウス（８−１０週齢）のそれぞれを、１００μｌ量の生理食塩水中の２０ｎｍｏｌの脂質付加［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］または非脂質付加［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］ペプチドで皮下に免疫した。脂質付加ペプチドの場合には、脂質をその分子のほぼ中央における２つのエピトープの間に結合した。
【０２１８】
Ｃ型感染ウイルスのコアタンパク質のＣＴＬエピトープを含むペプチド
ヒト単球由来の樹状細胞を、リポペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＨＣＶ］（５μｇ／ｍＬ）と共に４８時間インキュベートした後、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ８６についてＦＩＴＣ複合抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【０２１９】
インフルエンザウイルスによる免疫マウスの負荷（チャレンジ）
既にインフルエンザウイルスのＣＴＬエピトープを含むペプチドで免疫したペントレン麻酔マウスに、１０４．５ＰＦＵの感染性Ｍｅｍ７１インフルエンザウイルスを鼻腔内（ｉｎ）により負荷（チャレンジ）した。各マウスには、５０μｌのウイルスをＰＢＳに希釈した尿膜腔液の形態で投与した。負荷の５日後に、マウスを頚部脱臼により死滅させ、肺を取り出し、１ｍｌ当たり１００Ｕのペニシリン、１００μｇのストレプトマイシン、および３０μｇのゲンタマイシンを添加した１．５ｍｌのハンクス平衡塩溶液を含む容器に無菌で移した。肺ホモジネートは、組織ホモジナイザーを用いて調製し、細胞物質は３００×ｇで５分間遠心することによりペレット化した。上清を取り出し、アリコートに分割し、−７０℃で必要になるまで保存した。肺上清中の感染ウイルス力価は、ＭＤＣＫ細胞の単層におけるプラークアッセイにより測定した（Tannock et al, Infect. Immun. 43I, 457-462, 1984）。
【０２２０】
Ｌ．モノサイトゲネスによる免疫マウスの負荷
９ｎｍｏｌペプチド免疫原もしくはＰＢＳで皮下免疫したマウス、または１０００細菌で静脈内免疫したマウスに、初回免疫の２８日後に細菌を静脈内注射で負荷した。肝臓中に存在する細菌のコロニー形成単位の数を負荷の２８日後に測定した。
【０２２１】
腫瘍細胞による免疫マウスの負荷
メラノーマ負荷
非脂質付加［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］または脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］の接種の１４日後に、各群からの６匹のマウスに、オボアルブミン［Ｂ１６−ＯＶＡ］を発現しそのためＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬを発現する（Bellone, et al, J. Immunol. 165:2651−2656）２×１０５個のメラノーマ細胞を負荷した。注射前に注射部位の周囲の毛を電気カミソリで除去し、腫瘍の拡大の測定を容易にした。成長する腫瘍をモニターし、腫瘍サイズが１５×１５ｍｍになったときに動物を犠牲にした。平均腫瘍面積は、腫瘍負荷後の示す日数において各処置群で計算した。
【０２２２】
ルイス肺癌負荷
マウスに、オボアルブミンをトランスフェクトし、それゆえＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬを発現する（Nelson et al., Immunol. 166:5557-5566, 2001）３×１０４のルイス肺癌細胞を注射した。癌細胞の投与の４日後、動物の尾の基部に２０ｎｍｏｌ脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］、非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］、またはＰＢＳを皮下経路でワクチン接種した。癌細胞の投与の１１日後に、２回目の用量の免疫原を投与した。動物を腫瘍発生率および生存についてモニターし、腫瘍面積が１００ｍｍ２を超える場合には動物を安楽死させた。
【０２２３】
ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の四量体染色
リポペプチド免疫原中のインフルエンザウイルス株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４  （ＰＲ８；Ｈ１Ｎ１）の核タンパク質のアミノ酸残基１４７〜１５５からなるＨ−２Ｋｄ制限ＣＴＬエピトープ（配列番号２に示す）に対し特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｈ−２Ｋｄ糖タンパク質と結合したＣＴＬペプチド（ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ、配列番号２）との四量体複合体を用いて同定した（Bodmer et al, Cell 52: 253-258, 1988；Sherman et al, J. Exp. Med. 175: 1221-1226, 1992）。単量体は、Professor Peter Doherty（Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne）から寄贈されたもので、St. Jude Children’s Research Hospital（Memphis TN, USA）で作製されたものである。四量体は、上記単量体を、ストレプトアビジン−フィコエリトリン（Molecular Probes, Eugene, OR, USA）とモル比４：１でインキュベートすることにより作製した。
【０２２４】
肺からのリンパ球を、最初に２０μＬの正常マウス血清（ＮＭＳ）で５分間室温で処理し、続いて四量体複合体で１：２５の希釈で染色した。この後、アロフィコシアニンと複合した抗ＣＤ８α（５３−６．７）で氷上で３０分かけて染色し、蛍光活性化セルソーター（FACSort, Becton Dickinson, San Jose’s, USA）により分析した。データはＦｌｏｗＪｏ（Tree Star, Inc, CA, USA）で解析した。
【０２２５】
Ｔ細胞培養培地
Ｔ細胞培養培地は、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、３０μｇのゲンタマイシン／ｍｌ、１００μｇのストレプトマイシン／ｍｌ、１００ＩＵのペニシリン／ｍｌ、および１０−４Ｍ ２−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭ１１６４０（CSL Ltd.）からなるものとした。
【０２２６】
細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ
２次エフェクター細胞は、７日前にリポペプチドで皮下に免疫したマウスの鼠径および膝窩リンパ節、または少なくとも２８日前にリポペプチド免疫原で初回免疫したマウスの脾臓細胞のいずれかから生成した。簡単に説明すると、４×１０７のリンパ節細胞または脾細胞を、Ｔｒｉｓ緩衝化塩化アンモニウム（１７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中０．１５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、ｐＨ７．２）で処理して赤血球を枯渇させ、１５ｍｌのＴ細胞培養培地を入れた２５ｃｍ２組織培養フラスコ（Falcon）中で１０７の照射（２，２００ｒａｄ、６０Ｃｏ源）ウイルス感染またはリポペプチドで刺激した同系脾細胞と共に培養した。ウイルス感染脾細胞は、１ｍｌの血清不含ＲＰＭ１中の３，０００赤血球凝集単位の感染性Ｍｅｍ７１またはＰＲ８と共に３７℃で３０分間プレインキュベートし、フラスコに添加する前に１度洗浄した。リポペプチドで刺激した脾細胞は、１００μｇのＣＴＬリポペプチド／ｍｌで３７℃で６０分間プレインキュベートし、またフラスコに添加する前に１度洗浄した。５％ＣＯ２を含む湿潤環境において３７℃で５分培養した後、細胞を３回洗浄し、５１Ｃｒ放出アッセイに用いた。５１Ｃｒ放出アッセイは、既に記載されているようにＰ８１５肥満細胞腫細胞（Ｈ−２ｄ、ＤＢＡ／２）を標的として用いて３連で行った（Harling-McNabb et al, Int. Immunol. 11, 1431-1439, 1999）。
【０２２７】
ｉｎ ｖｉｖｏ細胞傷害性Ｔ細胞アッセイ
種々のペプチドに基づく免疫原がエピトープ特異的ＣＴＬを誘導する能力についてｉｎ ｖｉｖｏで判定した。３匹のマウスの群に、種々のリポペプチド（５０μｌのＰＢＳ中）を鼻腔内に接種し、２８日目にＭｅｍ７１を負荷した。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ決定基特異的細胞傷害性を分析するために、同系脾細胞をＣＴＬ決定基で刺激し、高強度ＣＦＳＥで標識した。低強度ＣＦＳＥ（０．２５μ  ）で標識した非刺激脾細胞を同時に注射することにより抗原特異的溶解を制御した。各標的細胞集団の１５×１０６細胞の混合物を未処理マウスに感染の４日後に静脈内投与した。１６時間後にマウスを死滅させ、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ高およびＣＦＳＥ低細胞集団の存在について脾臓を分析した。１×１０６個のリンパ球を各試料について分析した。
【０２２８】
ＩＦＮγ分泌細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＣＴＬ特異的ＩＦＮγ分泌細胞を、Murali-Krishna et al, Immunity 8, 177-187, 1998のもにから改変したＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより計数した。平底塩化ポリビニルマイクロタイタープレート（９６ウエル、Dynatech）を、５０μｌのラット抗マウスＩＦＮγ抗体（クローンＲ４−１４ａ２）（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。ウエル上の空いている部分は、１０ｍｇウシ血清アルブミン／ｍｌ（ＰＢＳ中）で１時間インキュベートすることによりブロッキングし、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで３回洗浄した。Ｔ細胞培地中の脾臓またはリンパ節細胞の２回希釈物を、非免疫マウス由来の５×１０５の照射（２，２００ｒａｄ、６０Ｃｏ源）同系脾細胞、および１０Ｕの組換えヒトインターロイキン−２（Pharmingen, San Diego, Calif.）／ウエルと共にウエルに添加した。細胞をＣＴＬペプチドの存在下または不在下で（１μｇペプチド／ｍｌの濃度）５％ＣＯ２中で１８時間かけて３７℃でインキュベートした。続いて細胞を溶解し、プレートを最初に蒸留水で次にＰＢＳＴで洗浄して除去した。次に、５０μｌの５００倍希釈のビオチニル化抗（マウスＩＦＮγ）抗体（クローンＸＭＧ１．２、Pharmingen）を添加し、プレートを室温で２時間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、５０μｌのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ（Pharmingen、５ｍｇのウシ血清アルブミン／ｍｌのＰＢＳＴ中に４００倍希釈）を各ウエルに添加した。混合物を次にさらに２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、２−アミノ−２−メチル−１−プロピノールバッファー（Sigma）の１ｍｌ当たり１ｍｇのＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート）を含む１００μｌのＥＬＩＳＰＯＴ基質（Sedgwick et al, J. Immunol. Methods 57, 301-309, 1983）を各ウエルに添加した。青色緑色スポットを現像し、プレートを水で洗浄して乾燥し、スポットを反転顕微鏡を用いて計数した。
【０２２９】
Ｄ１樹状細胞培養
樹状細胞（ＤＣ）を、完全ＩＤＤＭに基づく培地中で培養した。これは、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含みα−チオグリセロールまたはＬ−グルタミン（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｅｎｅｘａ、ＵＳＡ）を含まず、１０％（ｖ／ｖ）熱失活（５６℃、３０分）ウシ胎児血清（ＣＳＬ  Ｌｔｄ．、Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ、Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、ゲンタマイシン（２４μｇ／ｍＬ）、グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（２ｍＭ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１８０μｇ／ｍＬ）および２−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）からなるものとした。ＤＣ産生の場合には、培養ＮＩＨ／３Ｔ３細胞から得られる３０％上清、およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をトランスフェクトしたＡｇ８６５３細胞から得られる上清の形態の５％ＧＭ−ＣＳＦを完全ＩＭＤＭにさらに添加した（ＤＣ培地）。
【０２３０】
未成熟樹状細胞の培養方法は、Winzler et al.、J.Exp Med.185、317(1997)に基づくものであった。ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た脾臓細胞を３ｍｌ  ＤＣ培地中に１．５×１０６細胞／５５ｍｍシャーレ（Ｔｅｃｈｎｏ−Ｐｌａｓ、Ｓ．Ａ．、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）で播き、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培養に使用した装置はすべて発熱性物質を含んでいなかった。培地を４日ごとに交換し、全細胞をシャーレに戻した。１２日目に、懸濁した細胞と弱く接着した細胞の両方を強制的にピペットで回収し、次いで培地を吸引した。この手順をＰＢＳ  ２ｍｌを用いて繰り返した。残りの強く接着した細胞は廃棄した。回収した細胞を遠心分離によってペレットにし、新しいシャーレに再度播いた。引き続き、４日ごとの培地交換と継代の交互サイクルで細胞を維持した。連続培養１カ月後に、浮遊細胞および半接着細胞が出現し、未成熟ＤＣの染色特性を呈し、Ｄ１細胞と呼ばれるようになる。これらの継代条件下で、培養Ｄ１細胞の大多数が、中程度の発現レベルの細胞表面ＭＨＣクラスＩＩ分子を特徴とする未成熟表現型を維持する。
【０２３１】
Ｄ１細胞のフローサイトメトリー分析
Ｄ１細胞（１×１０５細胞／試料）を、ＤＣ培地１ｍｌを含む新しいシャーレに播き、リポペプチド０．００４５ｎｍｏｌとともにインキュベートし、完全ＩＭＤＭ培地に溶解した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）血清型Ｏ１１１：Ｂ４から精製されたリポ多糖（ＬＰＳ；Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）を５μｇ／ｍＬでＤＣ成熟の陽性対照として使用した。終夜インキュベートした後に、細胞を収集し、１％ＦＣＳを含むＰＢＳで１回洗浄した。ＦＣγＲＩＩ／ＩＩＩへの非特異的結合を防止するために、細胞を正常マウス血清２０μＬとともに５分間室温でプレインキュベートした。次いで、細胞をＦＩＴＣ複合モノクローナル抗体１４−４−４Ｓ（ＩｇＧ２ａ、抗ｌ−Ｅｋ，ｄ；Ozato et al.、J.Immunol、124、533、1980）に氷上で３０分間暴露した。Ｔヘルパーエピトープが由来するインフルエンザウイルスの抗原に特異的であるモノクローナル抗体３６／１（Brown et al.、Arch Virol 114、1 1990）をアイソタイプ対照として使用した。すべての抗体を２．５μｇ／ｍＬで使用した。試料を、１％ＦＣＳを含むＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを用いて氷上で１５分間かけて固定した。フローサイトメトリー分析をＦＡＣＳｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＵＳＡ）を用いて実施し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ,Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて分析した。
【０２３２】
ヒト樹状細胞培養
単球由来の樹状細胞の生成
末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）は、Ficoll Paque（Amersham Pharmacia, Swede）勾配分離により、血液ドナー（Red Cross Blood Bank, Melbourne, Australia）から得た軟膜調製物から調製した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、最適量のネズミ抗ＣＤ１４ハイブリドーマ上清（3C10, American Type Culture Collection）と共に氷上で４５分間インキュベートした。２回洗浄後、細胞をさらにヤギ抗ネズミＩｇＧマイクロビーズ（Miltenyi Biotech, Germany）と共に製造業者のプロトコールに従ってインキュベートした。ＣＤ１４＋単球を次に磁石活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）カラムを用いたアフィニティ精製により陽性選択した。未成熟ＤＣは、１０％ＦＣＳ（CSL, Australia）、２ｍｍｏｌ／Ｌグルタミン、２ｍｍｏｌ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、３０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ−１６４０（Gibco, USA）を添加したＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４（それぞれ４０ｎｇ／ｍｌおよび２０ｎｇ／ｍｌ［Schering Plough, USA］）中で単球を培養することにより生成した。細胞を２日ごとに培地を半分量交換しながら使用前に５日間培養した。
【０２３３】
ＤＣ成熟の測定
ペプチドおよびリポペプチドに基づく免疫原がヒト単球由来の樹状細胞上でＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現をアップレギュレートする能力を、５×１０５細胞（ｍｌ当たり）を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４、ならびにＬＰＳ（５μｇ／ｍＬ）、非脂質付加［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］（５μｇ／ｍＬ）、またはリポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］（５μｇ／ｍＬ）のいずれかを添加した培地中で２日間にわたりインキュベートすることにより判定した。表面マーカーの表現型分析は、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｇ４６−６［Ｌ２４３］）、ＣＤ８３（ＨＢ１５ｅ）、ＣＤ８６（カタログ番号２３３１［ＦＵＮ−１］）に対するフルオロクロム複合モノクローナル抗体、および適当なアイソタイプが一致する抗体（ＭＯＰＣ−２１およびＧ１５５−１７８、Becton Dickinson(USA)）による染色により製造業者のプロトコールに従って実施した。次に細胞を洗浄し、１％ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメーターで分析した。ヒストグラムは、前方および側方スキャッタードットプロットにゲートした大きな顆粒細胞を示す。ヒストグラムの灰色領域および関連する数値は、高レベルのＣＤ８３、ＣＤ８６またはＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞集団の割合（％）を特定する。
【実施例２】
【０２３４】
インフルエンザウイルスに由来するＣＴＬエピトープを含むリポペプチドの免疫原性
インフルエンザウイルス由来のＣＴＬエピトープを有するリポペプチド、特に配列番号４に示すアミノ酸配列を含むリポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］を、それらがＣＴＬ媒介ウイルスクリアランスの増強を誘導し、樹状細胞の成熟を増強する能力について試験した。陰性対照として、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する非脂質付加ペプチドを全ての実験で用いた。
【０２３５】
ウイルスクリアランス
リポペプチドは、非脂質付加ペプチドよりもウイルスクリアランスの高いレベルを誘発した（図３、４ａ）。リポペプチドで初回免疫し、９日後に感染性Ｍｅｍ７１ウイルスを負荷したマウスの肺におけるウイルス負荷は、ＰＢＳ単独で免疫したマウスからの試料と比較して９５％（［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］；図３）、または９９％（［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］；図３）低減した。対照的に、非脂質付加ペプチドは、ウイルス負荷の６５％低減しか達成しなかった（［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］；図３）。増強されたウイルスクリアランスはまた、最初の接種後Ｍｅｍ７１ウイルスを負荷したリポペプチド接種動物において観察された。対照的に、ウイルスをクリアランスする能力は、この時点で非脂質付加ペプチドを接種したマウスにおいて有意に低い。
【０２３６】
図４ｂに示すように、ＢＡＬ液に見とめられるＣＤ８＋Ｔ細胞数によりわかるように、図２の説明に示すリポペプチドを投与した免疫マウスにおいては、非脂質付加ペプチドまたはＰＢＳのみを投与したマウスと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化が増強していた。
【０２３７】
樹状細胞の成熟
２次リンパ器官における未処理ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激は、抗原エピトープへの曝露の際にＤＣの成熟に先行していた。この成熟は、ＤＣ表面上でのＭＨＣ生成物および共刺激分子のアップレギュレーションを特徴とする。それゆえ本発明者は、これらのワクチン候補の異なる免疫原性質を説明するために、種々ペプチドおよびリポペプチドが樹状細胞を示差的に活性化するかどうかを判定した。
【０２３８】
未成熟ＤＣ（Ｄ１細胞）の系をペプチドに曝露し、ＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現について染色し、フローサイトメトリーにより分析した実験の結果は、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］ペプチドまたは培地単独と比較して、ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］または［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］への曝露後に樹状細胞の成熟の増強があることを実証している（図４ｃ）。
【０２３９】
ＤＣの成熟を引き起こすには、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］が最も有効であり、非脂質付加ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］が最も有効ではなかった。また、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］は［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］と同程度の有効性であった（図４ｃ）。脂質付加ペプチド  ［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］がクラスＩＩ発現をアップレギュレートする能力は、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）と同様であった。非脂質付加ペプチドは、培養中に自然に行うレベルよりも約２６％高くＤ１細胞の成熟を誘導することができなかった。これらのリポペプチドがＤ１細胞の成熟を誘導する能力は、ＢＡＬにおけるＣＴＬ媒介ウイルスクリアランス応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導する能力を直接反映するものである。
【０２４０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける細胞傷害性およびＴ細胞増殖に対する種々の脂質の作用
種々の脂質（Ｐａｍ１Ｃｙｓ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、パルミチン酸およびコレステロールを含む）をペプチド免疫原に結合させる作用を判定した。
【０２４１】
図５に示すように、Ｐａｍ２Ｃｙｓ含有リポペプチドで初回免疫したマウスの肺におけるウイルス負荷は、他の試験した脂質を含むリポペプチドで初回免疫したマウスよりも低かった。このことは、Ｐａｍ２Ｃｙｓがウイルスに対する防御を付与するのに好ましいことを示唆している。しかしながら、全ての脂質は、ウイルスに対する防御をある程度付与していた。この作用はまた、ＩＦＮγＣＤ８＋Ｔ細胞数に反映されていた（図６）。まとめると、これらのデータは、最大の細胞傷害作用については［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］エピトープ構造であるように、脂質をシステイングリセロール残基に結合することが重要であることを示唆している。
【０２４２】
四量体アッセイにおいては、非脂質付加ペプチドまたはペプチドのＮ末端に脂質を有するリポペプチド（図７に示す構築物Ｐａｌ２ＬｙｓＬｙｓ［Ｔｈ］−［ＣＴＬ］）と比較して、最高の四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞数（肺当たり）が、脂質部分を内部リジン残基のεアミノ基に付加したリポペプチド（たとえば、図７に示すリポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ１Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］、および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｃｈｏｌ２Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］）において観察された。これらのデータはまた、内部リジン残基のεアミノ基への結合による、ペプチドの内部への脂質の配置が、ＣＴＬエピトープの細胞傷害活性の増強に重要であることを実証している。
【０２４３】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ決定基特異的細胞傷害性を分析するために、マウスにＰＢＳ中９ｎｍｏｌの種々のリポペプチドを鼻腔内接種し、２８日目にＭｅｍ７１を負荷した。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＴＬ決定基特異的細胞傷害性はＣＴＬ決定基で刺激し、高強度ＣＦＳＥで標識した同系脾細胞を用いて測定した。低強度ＣＦＳＥで標識した非刺激脾細胞を対照として用いた。各標的細胞集団の細胞の混合物を感染の４日後に静脈内注射した。１６時間後にマウスを死滅させ、フローサイトメトリーによりＣＦＳＥ高およびＣＦＳＥ低細胞集団の存在について脾臓を分析した。合計１×１０６個のリンパ球を各試料について分析した。図８に示すデータは、未処理マウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞活性を示すグラフであり、図９は、配列番号１に示すＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープおよび配列番号２に示すＨ−２ｄ制限ＣＴＬエピトープを含むリポペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］がｉｎ  ｖｉｖｏで有意な細胞傷害性を誘導することを示す。
【０２４４】
図１０に示すように、リポペプチドは、非脂質ペプチドよりも高い活性を有し、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ１Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］、［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］、および［Ｔｈ］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＣＴＬ］と称するリポペプチドにより、非脂質付加ペプチド［Ｔｈ］−Ｌｙｓ−［ＣＴＬ］および試験した他のペプチドと比較して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特異的溶解の顕著な増大がもたらされる。これらのデータは、内部リジン残基のεアミノ基への結合による、ペプチドの内部への脂質の配置がｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＣＴＬエピトープの細胞傷害活性を増強することを実証する。
【実施例３】
【０２４５】
Ｌ．モノサイトゲネス由来のＣＴＬエピトープを含むリポペプチドの免疫原性
Ｌ．モノサイトゲネス由来のＣＴＬエピトープを有するリポペプチド、特に配列番号１７５に示すアミノ酸配列を含むリポペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］を、そのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導する能力、およびＬ．モノサイトゲネスの負荷に対する防御能について試験した。陰性対照として、ＰＢＳ、または配列番号１７５に示すアミノ酸配列を有する非脂質付加ペプチドを全ての実験で用いた。単離された細菌を陽性対照として用いた。
【０２４６】
脾細胞によるＩＦＮγ産生
本研究で試験したリポペプチドは、免疫ＣＴＬエピトープに対して特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導した。これは、非脂質付加ペプチドと比較して脂質付加ペプチドで免疫したマウスに存在するＩＦＮγ産生脾細胞の数の増大により実証される。配列番号１７５に示すアミノ酸配列を含む９ｎｍｏｌの脂質付加ペプチドワクチン［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］で免疫したマウスは、非脂質付加ペプチドまたはＰＢＳ対照を投与したマウスよりも、１０６脾細胞あたりのＩＦＮγ産生細胞数が約１５倍も多かった。このことは、脂質付加ペプチドを投与したマウスにおけるＩＦＮγを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化の増大を示している（図１１）。
【０２４７】
単離された細菌による負荷に対する防御
図１２に示すデータは、脂質付加［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］ペプチドが、全細菌による後続の負荷に対する防御をもたらすことを示している。また、非脂質付加［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＬＬＯ９１−９９］ペプチドで免疫したマウスまたはＰＢＳで免疫したマウス（すなわち非免疫マウス）と比較して、脂質付加［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＬＬＯ９１−９９］ペプチドで免疫したマウスにおいても有意に増強した防御が観察された。
【実施例４】
【０２４８】
腫瘍細胞による負荷に対する防御
メラノーマ細胞による負荷に対する防御
オボアルブミンＣＴＬエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を含有するリポペプチドワクチンがＣＴｌエピトープを発現するメラノーマ細胞（Ｂ１５−ＯＶＡ細胞）に対する防御を誘導する能力を評価した。ＩＦＮγ産生は、オボアルブミンのＣＤＶ−Ｆ  Ｔヘルパーエピトープ（Ｐ２５）およびＣＴＬエピトープ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を含み、そのエピトープの間に位置する内部リジン残基のεアミノ基を介してＰａｍ２Ｃｙｓと結合したリポペプチド（すなわち、図２に例示した［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］、配列番号１７４に基づく）を接種したマウスにおいて測定した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾の基部に、２０ｎｍｏｌの脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］、非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］、またはＰＢＳを皮下経路でワクチン接種した。続いて、その１４日後に、マウスの背中にＢ１６−ＯＶＡ細胞を皮下接種で負荷した。接種した動物から脾細胞を採取し、配列ＳＩＩＮＦＥＫＬを有するＣＴＬエピトープでｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激し、１，０００，０００脾細胞当たりのＩＦＮγ産生細胞を測定した。データは、リポペプチドを接種したマウスについてのＩＦＮγ産生細胞の数の増大を示し（表１）、このことは、非脂質付加ペプチドと比較してリポペプチドのＴ細胞活性化能の増大を示している。
【０２４９】
重要なことに、腫瘍増殖の制御は、非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］またはＰＢＳ単独を免疫したマウスと比較してリポペプチドでの免疫により誘導された（図１３）。［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］で免疫したマウスにおいては１５日間にわたって腫瘍の増殖は観察されなかった。一方、［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］またはＰＢＳ単独で免疫したマウスでは、直径７５ｍｍ２を超える腫瘍が観察された。これらのデータは、非脂質付加ペプチドと比較して、腫瘍に対する防御におけるリポペプチドの防御能を確証するものである。
【表１】
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【０２５０】
ルイス肺腫瘍細胞による負荷に対する防御
動物においてｉｎ ｖｉｖｏでリポペプチドがルイス肺癌発達に対する防御をもたらす能力もまた試験した。マウスに、オボアルブミンをトランスフェクトし、それゆえＣＴＬエピトープＳＩＩＮＦＥＫＬを発現する（Nelson et al., Immunol. 166:5557-5566, 2001）３×１０４のルイス肺癌細胞を注射した。癌細胞の投与の４日後、動物の尾の基部に２０ｎｍｏｌ脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］、あるいは非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＳＩＩＮＦＥＫＬ］、またはＰＢＳを皮下経路でワクチン接種した。癌細胞の投与の１１日後に、２回目の同量の免疫原を投与した。図１４に示すデータは、少ない創傷発達を有する動物の割合（％）が、非脂質付加ペプチドまたはＰＢＳを投与した動物と比較してリポペプチドを投与した動物が有意に高いことを示す。図１５に示すように、リポペプチド免疫原を投与した動物はまた、非脂質付加ペプチドまたはＰＢＳを投与した動物よりも生存期間が長かった。これらのデータはさらに、非脂質付加ペプチドと比較して腫瘍に対する防御についてリポペプチドの防御能を確証するものである。
【実施例５】
【０２５１】
ＣＤＶ−Ｆ ＴヘルパーエピトープおよびＣ型肝炎ウイルス由来のＣＴＬエピトープを含むリポペプチドの投与後のヒト樹状細胞上のＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現の増大
図２の説明に記載したリポペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＨＣＶ］を、ヒト樹状細胞上のＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現をアップレギュレートする能力について試験した。ヒト単球由来樹状細胞を、培地のみ、ＬＰＳ（５μｇ／ｍＬ）、非脂質付加ペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ−［ＨＣＶ］（５μｇ／ｍＬ）、またはリポペプチド［Ｐ２５］−Ｌｙｓ（Ｐａｍ２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）−［ＨＣＶ］（５μｇ／ｍＬ）と共に４８時間インキュベートした後、ＦＩＴＣ複合抗体でＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ８６について染色し、フローサイトメトリーにより分析した。図１６に示すデータは、非脂質付加ペプチドまたはＰＢＳ単独で処置後よりも脂質付加ペプチドで処置した後にその細胞表面上にＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８３およびＣＤ８６を発現する樹状細胞集団の存在する割合が高いことを示す。リポペプチドがヒト細胞の成熟を誘導する能力は直接的に、非脂質付加ペプチドと比較したリポペプチドの免疫原性能力を反映し、免疫原性の可能性ある機構を提示するものである。
【実施例６】
【０２５２】
考察
本研究において、本発明者は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ、ＣＤ８＋ＣＴＬエピトープ、およびそれらに内部リジン残基のεアミノ基を介して結合しているＰａｍ３ＣｙｓまたはＰａｍ２Ｃｙｓから構成される種々のリポペプチド免疫原の構築を説明している。
【０２５３】
免疫応答の発生における脂質部分の正確な性質を示すことは重要ではない。なぜなら、コレステロール、パルミチン酸、Ｐａｍ１Ｃｙｓ、Ｐａｍ２Ｃｙｓ、およびＰａｍ３Ｃｙｓを含む一定範囲の脂質はＴ細胞の増殖および細胞傷害性を誘導するためである。しかしながら、少なくともインフルエンザウイルスに対して使用したリポペプチドの場合には、防御およびＩＦＮγ産生の点では有意な差が観察された。このことは、脂質の構造がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて重要な検討事項である可能性があることを示唆している。特に、少なくともインフルエンザウイルスＣＴＬエピトープを組み込んだワクチンについては、ペプチドの内部リジン残基のεアミノ基と結合したＰａｍ２Ｃｙｓが防御の付与に最も有効であり、このことは、システイングリセロールへの結合が好ましいことを示唆している。
【０２５４】
本発明のリポペプチドは、細菌およびウイルス病原体に対するならびに腫瘍細胞に対する免疫動物のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増強に有効である。ウイルスおよび細菌病原体に対するならびに腫瘍細胞に対する防御において本明細書に記載の自己アジュバントペプチド（self-adjuvanting peptide）が成功を収めたことは、この技術が一般的に広範なワクチン接種プロトコールに適用可能であると予測する合理性を与えるものである。
【０２５５】
脂質部分とペプチド配列の間にセリン残基を挿入することは、得られるＰａｍ２Ｃｙｓ含有免疫原の効力に悪影響を及ぼすものではない。
【０２５６】
リポペプチドは、さらなるアジュバントの不在下で免疫応答を誘発することができ、非経口経路および非経口以外の経路（特に鼻腔内経路）により送達することができる。
【０２５７】
以上をあわせて検討すると、本明細書に提供するデータは、広範な脂質、限定するものではないがＰａｍ２ＣｙｓおよびＰａｍ３Ｃｙｓを含む脂質を、全体的に合成したペプチドのほぼ中央にあるＣＴＬエピトープおよびＴヘルパーエピトープの間に配置することによって、ワクチンの免疫原性が増大することを証明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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