【手続補正書】
【提出日】令和3年6月4日(2021.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の表現型を獲得するためにＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、
ａ）同じゲノム株バックグラウンドを有する最初の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップと；
ｂ）ステップａ）の前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ）遺伝的バリエーションのユニークな組合せをそれぞれ含む後続の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記遺伝的バリエーションは、前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に存在する前記遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ）前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ）Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物が前記所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記遺伝的バリエーションを含有する遺伝子の機能および／または同一性が、ステップｃ）で前記遺伝的バリエーションを組み合わせる前に考慮されない、請求項１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項３】
ステップｃ）で組み合わされる少なくとも１つの遺伝的バリエーションが、コードするＤＮＡモジュールの繰り返しセグメントを含有するゲノム領域にない、請求項１または２に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）における遺伝的バリエーションのユニークな組合せをそれぞれ含む前記後続の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物が、
１）前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーに属する個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株にプラスミドを導入するステップであって、前記プラスミドは、選択マーカー、対抗選択マーカー、基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するＤＮＡ断片およびプラスミド主鎖配列を含み、前記ＤＮＡ断片は、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーにも属する別の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に由来する遺伝的バリエーションを有する、ステップと；
２）前記ゲノム中の前記選択マーカーの存在に基づく組込み事象によってＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択するステップと；
３）前記対抗選択マーカー遺伝子の非存在に基づきループアウトされた前記プラスミド主鎖を有するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択するステップと
によって産生され、好ましくは、前記プラスミドが、温度感受性レプリコンを含まず、好ましくは、前記選択が、組み込まれた前記プラスミドの複製なしで実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項５】
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、トランスポゾン変異誘発微生物株多様性ライブラリー、リボソーム結合部位微生物株ライブラリー、抗代謝産物／発酵産物耐性ライブラリー、終結挿入微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのライブラリーを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項６】
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、
ａ）前記最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアルＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたはそのサブセットである；
ｂ）前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアルＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのサブセットである；
ｃ）先行するＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーまたはそのサブセットである；あるいは
ｄ）先行するＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアルＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのサブセットである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項７】
前記ゲノムを撹乱することが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、トランスポゾン変異誘発、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項８】
前記ステップａ）における前記最初の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物が、
ａ）産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む；または
ｂ）Ｓ１Ｇｅｎ１で表される産生株微生物およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する後続の任意の数の微生物世代を含み、ｎは世代の数に対応する、
請求項１〜７のいずれか一項に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項９】
前記ステップｃ）が、プロトプラスト融合技法を使用することによって前記遺伝的バリエーションを迅速に統合することを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１０】
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたは前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、
ａ）プロモータースワップ微生物株ライブラリーであって、好ましくは、前記プロモータースワップ微生物株ライブラリーが、配列番号１〜６９および１７２〜１７５から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのプロモーターを含む、プロモータースワップ微生物株ライブラリー；
ｂ）ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー；
ｃ）ターミネータースワップ微生物株ライブラリーであって、好ましくは、前記ターミネータースワップ微生物株ライブラリーが、配列番号７０〜８０から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのターミネーターを含む、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー；
ｄ）トランスポゾン変異誘発微生物株多様性ライブラリーであって、好ましくは、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたは前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンおよび／または機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンを含み、好ましくは、前記ＧｏＦトランスポゾンが、可溶性タグ、プロモーターおよび／または対抗選択マーカーを含む、トランスポゾン変異誘発微生物株多様性ライブラリー；
ｅ）リボソーム結合部位微生物株ライブラリーを含み、好ましくは、前記リボソーム結合部位微生物株ライブラリーが、配列番号９７〜１２７から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む、リボソーム結合部位微生物株ライブラリー；あるいは
ｆ）抗代謝産物／発酵産物耐性ライブラリーであって、好ましくは、前記抗代謝産物／発酵産物耐性ライブラリーが、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ中でのスピノシン合成に関与する分子に対して耐性のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む、抗代謝産物／発酵産物耐性ライブラリー
を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１１】
前記ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーが、
ａ）参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株および第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を提供するステップであって、前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株は、前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ）前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株または前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のＳＮＰスワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株と前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株との間の前記複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
を含む方法によって生成される、請求項５に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって生成されるＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーであって、前記ライブラリー中の各Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株は、
ａ）前記宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したプロモーターであって、前記プロモーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記プロモーターは、配列番号１〜６９からなる群から選択される配列を有する、プロモーター；
ｂ）前記宿主細胞の内在性遺伝子に連結したターミネーターであって、前記ターミネーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記ターミネーターは、配列番号７０〜８０からなる群から選択される配列を有する、ターミネーター；
ｃ）前記宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したリボソーム結合部位であって、前記リボソーム結合部位は、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記リボソーム結合部位は、配列番号９７〜１２７からなる群から選択される配列を有する、リボソーム結合部位；
ｄ）配列番号１２８〜１３１からなる群から選択される配列を有するトランスポゾンであって、各株中の前記トランスポゾンは、異なるゲノム遺伝子座にある、トランスポゾン；あるいは
ｅ）
１）スピノシン合成経路に関与する分子、
２）ＳＡＭ／メチオニン経路に関与する分子、
３）リシン産生経路に関与する分子、
４）トリプトファン経路に関与する分子、
５）トレオニン経路に関与する分子、
６）アセチル−ＣｏＡ産生経路に関与する分子、ならびに／または
７）デノボまたはサルベージプリンおよびピリミジン経路に関与する分子
に対する前記株の耐性をもたらす遺伝的バリエーション
を含む、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリー。
【請求項１３】
前記最初のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物が、産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株であり、獲得されるべき所望の表現型が、改善された表現型性能であり、好ましくは、
ａ）後続ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加または少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｃ）〜ｄ）を繰り返す；
ｂ）前記改善された表現型性能が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される；または
ｃ）前記改善された表現型性能が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択され、好ましくは、前記目的の産物が、スピノシン、スピノサド、スピネトラム、ゲニステイン、コリンオキシダーゼ、クマミジン化合物、エリスロマイシン、イベルメクチンアグリコン、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、カルボン酸異性体、アルファ−メチルメチオニン、チアリシン、アルファ−ケトビタレート、アスパルテートヒドキシメート、アザセリン、５−フオロインドール、ベータ−ヒドロキシノルバリン、セルレニン、プリン、ピリミジン、およびこれらの類似体からなる群から選択され、好ましくは、前記スピノシンが、スピノシンＡ、スピノシンＤ、スピノシンＪ、スピノシンＬ、またはこれらの組合せである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
前述のハイスループット（ＨＴＰ）方法は、自動化設備（例えば、液体ハンドラーまたはプレートハンドラーマシン）の少なくとも１つのピースを利用して、前記方法の少なくとも１つのステップを実行することができる。本開示のＨＴＰ方法は、方法がより少ない人的資源を用いて大規模で実行され得るので、微生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ種）のゲノム操作のより素早く、かつ労働力がより少ない方法を提供する。例えば、一部の実施形態では、本開示の任意の方法は、複数の株が１つずつではなく同時に創製および／または試験されるように、４８ウェルプレート、９６ウェルプレート、１９２ウェルプレート、３８４ウェルプレートなどで実施される。方法は、自動化設備を使用しない他の方法と比較して多くの時間を節約する。一部の実施形態では、方法は、同じまたはより少ない人的資源が本開示の方法で使用されるときに、自動化設備を使用しない他の方法と比較して、約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、またはそれよりも速い。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
所望の表現型を獲得するためにＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐ．微生物を進化させるゲノム操作のハイスループット（ＨＴＰ）方法であって、
ａ．同じゲノム株バックグラウンドを有する最初の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物のゲノムを撹乱することによって、ユニークな遺伝的バリエーションを有する個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップと；
ｂ．前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップと；
ｃ．遺伝的バリエーションのユニークな組合せをそれぞれ含む後続の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物を提供することによって、後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記遺伝的バリエーションは、前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に存在する前記遺伝的バリエーションから選択される、ステップと；
ｄ．前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を、前記所望の表現型についてスクリーニングおよび選択するステップと；
ｅ．Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物が前記所望の表現型を獲得するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、先行するＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せであるユニークな遺伝的バリエーションを宿す個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む新しいＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが創製される、ステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記遺伝的バリエーションを含有する遺伝子の機能および／または同一性が、ステップ（ｂ）で前記遺伝的バリエーションを組み合わせる前に考慮されない、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目３）
組み合わされる少なくとも１つの遺伝的バリエーションが、コードするＤＮＡモジュールの繰り返しセグメントを含有するゲノム領域にない、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目４）
ステップ（ｃ）における遺伝的バリエーションのユニークな組合せをそれぞれ含む前記後続の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物が、
１）前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーに属する個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株にプラスミドを導入するステップであって、前記プラスミドは、選択マーカー、対抗選択マーカー、基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するＤＮＡ断片およびプラスミド主鎖配列を含み、前記ＤＮＡ断片は、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーにも属する別の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に由来する遺伝的バリエーションを有する、ステップと；
２）前記ゲノム中の前記選択マーカーの存在に基づく組込み事象によってＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択するステップと；
３）前記対抗選択マーカー遺伝子の非存在に基づきループアウトされた前記プラスミド主鎖を有するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択するステップと
によって産生される、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目５）
前記プラスミドが、温度感受性レプリコンを含まない、項目４に記載のＨＴＰ方法。
（項目６）
前記選択ステップ（３）が、組み込まれた前記プラスミドの複製なしで実施される、項目４に記載のＨＴＰ方法。
（項目７）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、トランスポゾン変異誘発微生物株多様性ライブラリー、リボソーム結合部位微生物株ライブラリー、抗代謝産物／発酵産物耐性ライブラリー、終結挿入微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目８）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの完全コンビナトリアルＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目９）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアルＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのサブセットである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１０）
株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する前記後続のＨＴＰ遺伝子設計が、先行するＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアル微生物株ライブラリーである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１１）
前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行するＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーにおける前記遺伝的バリエーションに由来する完全コンビナトリアルＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのサブセットである、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１２）
前記ゲノムを撹乱することが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、トランスポゾン変異誘発、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１３）
前記最初の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物が、産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に由来するユニークな遺伝的バリエーションを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１４）
前記最初の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物が、Ｓ１Ｇｅｎ１で表される産生株微生物およびＳｎＧｅｎｎで表されるこれらに由来する後続の任意の数の微生物世代を含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１５）
前記ステップｃが、プロトプラスト融合技法を使用することによって前記遺伝的バリエーションを迅速に統合することを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１６）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたは前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１７）
前記プロモータースワップ微生物株ライブラリーが、配列番号１〜６９および１７２〜１７５から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのプロモーターを含む、項目１６に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１８）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたは前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目１９）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたは前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、ターミネータースワップ微生物株ライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２０）
前記ターミネータースワップ微生物株ライブラリーが、配列番号７０〜８０から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのターミネーターを含む、項目１９に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２１）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたは前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、トランスポゾン変異誘発微生物株多様性ライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２２）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたは前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンおよび／または機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンを含む、項目２１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２３）
前記ＧｏＦトランスポゾンが、可溶性タグ、プロモーターおよび／または対抗選択マーカーを含む、項目２２に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２４）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたは前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、リボソーム結合部位微生物株ライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２５）
リボソーム結合部位微生物株ライブラリーが、配列番号９７〜１２７から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含む、項目２４に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２６）
前記最初のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーまたは前記後続のＨＴＰ遺伝子設計Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、抗代謝産物／発酵産物耐性ライブラリーを含む、項目１に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２７）
前記抗代謝産物／発酵産物耐性ライブラリーが、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ中でのスピノシン合成に関与する分子に対して耐性のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む、項目２６に記載のゲノム操作のＨＴＰ方法。
（項目２８）
ＳＮＰスワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株および第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を提供するステップであって、前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株は、前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株または前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のＳＮＰスワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株と前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株との間の前記複数の同定された遺伝的バリエーションから選択される単一の遺伝的バリエーションに対応する、ステップと
を含む、方法。
（項目２９）
前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記ゲノムが撹乱されて、前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株内に見出される前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、項目２８に記載のＳＮＰスワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目３０）
前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記ゲノムが撹乱されて、前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株内に見出されない前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、項目２８に記載のＳＮＰスワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目３１）
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株と前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーを一緒に含む、項目２８に記載のＳＮＰスワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目３２）
結果として生じるユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株と前記第２のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株との間のすべての前記同定された遺伝的バリエーションの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットを一緒に含む、項目２８に記載のＳＮＰスワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目３３）
産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法であって、
ａ．親系統Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株およびそれに由来する産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を提供するステップであって、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株は、前記親系統Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株内に存在しない一塩基多型、ＤＮＡ挿入、およびＤＮＡ欠失から選択される複数の同定された遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｂ．前記親系統Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株または前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のいずれかのゲノムを撹乱することによって、最初のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記最初のライブラリー中の各株は、前記親系統Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株と前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株との間の前記複数の同定された遺伝的バリエーション由来のユニークな遺伝的バリエーションを含む、ステップと；
ｃ．参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記最初のＳＮＰスワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に存在する前記バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数の微生物を提供することによって、後続のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリーを創製するステップと；
ｅ．前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記後続の株ライブラリーの個々の株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しいＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目３４）
前記最初のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリーが、前記親系統Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株と前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株との間の前記同定された遺伝的バリエーションのすべてを含む完全コンビナトリアルライブラリーである、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３５）
前記最初のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリーが、参照親系統Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株と前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株との間の前記同定された遺伝的バリエーションのサブセットを含む完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３６）
前記後続のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリーが、前記最初のライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３７）
前記後続のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリーが、前記最初のライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３８）
前記後続のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリーが、先行するライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目３９）
前記後続のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリーが、先行するライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４０）
前記親系統Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記ゲノムが撹乱されて、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株内に見出される前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が付加される、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４１）
前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記ゲノムが撹乱されて、前記親系統Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株内に見出されない前記同定された一塩基多型、ＤＮＡ挿入、またはＤＮＡ欠失の１つまたは複数が除去される、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４２）
前記ゲノムを撹乱することが、ランダム変異誘発、標的とした配列挿入、標的とした配列欠失、標的とした配列置き換え、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つの方法を利用することを含む、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４３）
後続ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４４）
後続ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４５）
ステップｆ）の改善された表現型性能が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４６）
ステップｆ）の改善された表現型性能が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４７）
前記目的の産物が、スピノシン、スピノサド、スピネトラム、ゲニステイン、コリンオキシダーゼ、クマミジン化合物、エリスロマイシン、イベルメクチンアグリコン、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、カルボン酸異性体、アルファ−メチルメチオニン、チアリシン、アルファ−ケトビタレート、アスパルテートヒドキシメート、アザセリン、５−フオロインドール、ベータ−ヒドロキシノルバリン、セルレニン、プリン、ピリミジン、およびこれらの類似体からなる群から選択される、項目４６に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４８）
前記スピノシンが、スピノシンＡ、スピノシンＤ、スピノシンＪ、スピノシンＬ、またはこれらの組合せである、項目４６に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目４９）
前記同定された遺伝的バリエーションが、プロモータースワップライブラリー由来の人工プロモータースワップ遺伝的バリエーションをさらに含む、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目５０）
前記最初のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリー、または後続のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のライブラリーのいずれかの少なくとも１つの微生物株のゲノムを操作して、内在性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ標的遺伝子に作動可能に連結したプロモーターラダー由来の１つまたは複数のプロモーターを含ませるステップをさらに含む、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目５１）
前記株ライブラリーが、プロモータースワップ微生物株ライブラリー、ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー、開始／停止コドン微生物株ライブラリー、最適化配列微生物株ライブラリー、ターミネータースワップ微生物株ライブラリー、トランスポゾン変異誘発微生物株多様性ライブラリー、リボソーム結合部位微生物株ライブラリー、抗代謝産物／発酵産物耐性ライブラリー、終結挿入微生物株ライブラリー、およびこれらの任意の組合せからなる群から選択される少なくとも１つのライブラリーを含む、項目３３に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目５２）
前記株ライブラリーが、
１）配列番号１〜６９から選択される配列を有する少なくとも１つのプロモーターを含むプロモータースワップ微生物株ライブラリー；
２）配列番号７０〜８０から選択される配列を有する少なくとも１つのターミネーターを含むターミネータースワップ微生物株ライブラリー；および
３）配列番号９７〜１２７から選択される配列を有する少なくとも１つのリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含むＲＢＳライブラリー
からなる群から選択される少なくとも１つのライブラリーを含む、項目５１に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を再建および改善するための方法。
（項目５３）
プロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記プロモーターラダー由来のプロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
（項目５４）
前記複数のプロモーターの少なくとも１つが、配列番号１〜６９から選択される配列を有するプロモーターを含む、項目５３に記載のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目５５）
産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法であって、
ａ．基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する複数の標的遺伝子、およびプロモーターラダーを提供するステップであって、前記プロモーターラダーは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のプロモーターを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記プロモーターラダー由来の前記プロモーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記最初のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、前記表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に存在する前記遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物を提供することによって、後続のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップと；
ｅ．参照Ｅ．ｃｏｌｉ株に対する所望の前記表現型性能改善について前記後続のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の新しいプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目５６）
前記後続のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目５７）
前記後続のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目５８）
前記後続のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目５９）
前記後続のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行するプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目６０）
前記後続のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行するプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目６１）
後続のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目６２）
後続のプロモータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目６３）
ステップｆ）の改善された表現型性能が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目６４）
ステップｆ）の改善された表現型性能が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目６５）
前記目的の産物が、スピノシン、スピノサド、スピネトラム、ゲニステイン、コリンオキシダーゼ、クマミジン化合物、エリスロマイシン、イベルメクチンアグリコン、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、カルボン酸異性体、アルファ−メチルメチオニン、チアリシン、アルファ−ケトビタレート、アスパルテートヒドキシメート、アザセリン、５−フオロインドール、ベータ−ヒドロキシノルバリン、セルレニン、プリン、ピリミジン、およびこれらの類似体からなる群から選択される、項目６４に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目６６）
前記スピノシンが、スピノシンＡ、スピノシンＤ、スピノシンＪ、スピノシンＬ、またはこれらの組合せである、項目６５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目６７）
前記プロモーターラダーが、配列番号１〜６９から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのプロモーターを含む、項目５５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのプロモータースワップ方法。
（項目６８）
ターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
（項目６９）
産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法であって、
ａ．基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する複数の標的遺伝子、およびターミネーターラダーを提供するステップであって、前記ターミネーターラダーは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のターミネーターを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ターミネーターラダー由来のターミネーターの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記最初のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に存在する前記遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物を提供することによって、後続のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップと；
ｅ．前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記後続のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しい微生物株のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目７０）
前記後続のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目６９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目７１）
前記後続のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目６９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目７２）
前記後続のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行するターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目６９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目７３）
前記後続のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行するターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目６９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目７４）
後続のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目６９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目７５）
後続のターミネータースワップＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目６９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目７６）
ステップｆ）の改善された表現型性能が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目６９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目７７）
ステップｆ）の改善された表現型性能が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目６９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目７８）
前記目的の産物が、スピノシン、スピノサド、スピネトラム、ゲニステイン、コリンオキシダーゼ、クマミジン化合物、エリスロマイシン、イベルメクチンアグリコン、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、カルボン酸異性体、アルファ−メチルメチオニン、チアリシン、アルファ−ケトビタレート、アスパルテートヒドキシメート、アザセリン、５−フオロインドール、ベータ−ヒドロキシノルバリン、セルレニン、プリン、ピリミジン、およびこれらの類似体からなる群から選択される、項目７７に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目７９）
前記スピノシンが、スピノシンＡ、スピノシンＤ、スピノシンＪ、スピノシンＬ、またはこれらの組合せである、項目７８に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目８０）
前記ターミネーターラダーが、配列番号７０〜８０から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのターミネーターを含む、項目６９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するためのターミネータースワップ方法。
（項目８１）
リボソーム結合部位（ＲＢＳ）Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ．基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する複数の標的遺伝子、およびＲＢＳラダーを提供するステップであって、前記ＲＢＳラダーは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のＲＢＳを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ＲＢＳラダー由来のＲＢＳの１つまたは複数を含む、ステップと
を含む、方法。
（項目８２）
産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法であって、
ａ．基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する複数の標的遺伝子、およびＲＢＳラダーを提供するステップであって、前記ＲＢＳラダーは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株において異なる発現プロファイルを呈する複数のＲＢＳを含む、ステップと；
ｂ．前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に内在する前記標的遺伝子の１つに作動可能に連結した前記ＲＢＳラダー由来のＲＢＳの１つまたは複数を含む、ステップと；
ｃ．参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記最初のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｄ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に存在する前記遺伝的バリエーションからのユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を提供することによって、後続のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップと；
ｅ．前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記後続のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｆ．前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｄ）〜ｅ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、新しい微生物株のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目８３）
前記後続のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目８２に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目８４）
前記後続のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目８２に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目８５）
前記後続のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行するＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目８２に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目８６）
前記後続のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行するＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目８２に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目８７）
後続のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目８２に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目８８）
後続のＲＢＳ  Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｄ）〜ｅ）を繰り返す、項目８２に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目８９）
ステップｆ）の改善された表現型性能が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目８２に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目９０）
ステップｆ）の改善された表現型性能が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目８２に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目９１）
前記目的の産物が、スピノシン、スピノサド、スピネトラム、ゲニステイン、コリンオキシダーゼ、クマミジン化合物、エリスロマイシン、イベルメクチンアグリコン、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、カルボン酸異性体、アルファ−メチルメチオニン、チアリシン、アルファ−ケトビタレート、アスパルテートヒドキシメート、アザセリン、５−フオロインドール、ベータ−ヒドロキシノルバリン、セルレニン、プリン、ピリミジン、およびこれらの類似体からなる群から選択される、項目９０に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目９２）
前記スピノシンが、スピノシンＡ、スピノシンＤ、スピノシンＪ、スピノシンＬ、またはこれらの組合せである、項目９１に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目９３）
前記ＲＢＳラダーが、配列番号９７〜１２７から選択されるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのＲＢＳを含む、項目８２に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目９４）
トランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株多様性ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ）１つまたは複数の基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の細胞の集団にトランスポゾンを導入するステップと；
ｂ）ランダムに組み込まれたトランスポゾンを含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、１つまたは複数のランダムに組み込まれたトランスポゾンを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目９５）
ｃ）前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１つの増大を呈する後続のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーについて選択するステップをさらに含む、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記トランスポゾンが、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムへの前記トランスポゾンのｉｎ  ｖｉｖｏ転位を可能にするトランスポゾンおよびトランスポサーゼタンパク質の複合体を使用して、前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に導入される、項目９４に記載の方法。
（項目９７）
前記トランスポサーゼタンパク質が、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポソームシステムに由来する、項目９４に記載の方法。
（項目９８）
前記トランスポゾンが、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンまたは機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンである、項目９４に記載の方法。
（項目９９）
前記ＧｏＦトランスポゾンが、可溶性タグ、プロモーターおよび／または対抗選択マーカーを含む、項目９４に記載の方法。
（項目１００）
産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法であって、
ａ．トランスポゾン変異誘発により基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムを操作することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、１つまたは複数のトランスポゾンを含む、ステップと；
ｂ．参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記最初のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；
ｃ．前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に存在する前記遺伝的バリエーション由来のユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を提供することによって、後続のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップと；
ｄ．前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記後続のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｅ．前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、微生物株の新しいトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目１０１）
前記後続のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目１００に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１０２）
前記後続のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目１００に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１０３）
前記後続のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行するトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目１００に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１０４）
前記後続のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行するトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目１００に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１０５）
後続のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｃ）〜ｄ）を繰り返す、項目１００に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１０６）
後続のトランスポゾン変異誘発Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｃ）〜ｄ）を繰り返す、項目１００に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１０７）
ステップｅ）の改善された表現型性能が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１００に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１０８）
ステップｅ）の改善された表現型性能が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１００に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１０９）
前記目的の産物が、スピノシン、スピノサド、スピネトラム、ゲニステイン、コリンオキシダーゼ、クマミジン化合物、エリスロマイシン、イベルメクチンアグリコン、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、カルボン酸異性体、アルファ−メチルメチオニン、チアリシン、アルファ−ケトビタレート、アスパルテートヒドキシメート、アザセリン、５−フオロインドール、ベータ−ヒドロキシノルバリン、セルレニン、プリン、ピリミジン、およびこれらの類似体からなる群から選択される、項目１０８に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１１０）
前記スピノシンが、スピノシンＡ、スピノシンＤ、スピノシンＪ、スピノシンＬ、またはこれらの組合せである、項目１０９に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１１１）
前記トランスポゾンが、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンまたは機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンを含む、項目１００に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１１２）
前記ＧｏＦトランスポゾンが、可溶性タグ、プロモーターおよび／または対抗選択マーカーを含む、項目１１１に記載の方法。
（項目１１３）
抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法であって、
ａ）所定の代謝産物および／または発酵産物に対して耐性のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択することによって、複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションの少なくとも１つは、前記所定の代謝産物および／または発酵産物に対して耐性をもたらす、ステップと；
ｂ）前記所定の代謝産物および／または前記発酵産物に対して耐性のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を収集して、前記抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するステップと
を含む、方法。
（項目１１４）
前記所定の代謝産物および／または発酵産物が、スピノシン合成経路に関与する分子、ＳＡＭ／メチオニン経路に関与する分子、リシン産生経路に関与する分子、トリプトファン経路に関与する分子、トレオニン経路に関与する分子、アセチル−ＣｏＡ産生経路に関与する分子、ならびにデノボまたはサルベージプリンおよびピリミジン経路に関与する分子からなる群から選択される、項目１１３に記載の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１１５）
１）前記スピノシン合成経路に関与する前記分子が、スピノシンであって、必要に応じて、各株が、約５０μｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌのスピノシンＪ／Ｌに対して耐性であり；
２）前記ＳＡＭ／メチオニン経路に関与する前記分子が、アルファ−メチルメチオニン（ａＭＭ）またはノルロイシンであって、必要に応じて、各株が、約１ｍＭ〜約５ｍＭのアルファ−メチルメチオニン（ａＭＭ）に対して耐性であり；
３）前記リシン産生経路に関与する前記分子が、チアリシンまたはアルファ−ケトビタレートおよびアスパルテートヒドキシメートの混合物であり；
４）前記トリプトファン経路に関与する前記分子が、アザセリンまたは５−フオロインドールであり；
５）前記トレオニン経路に関与する前記分子が、ベータ−ヒドロキシノルバリンであり；６）前記アセチル−ＣｏＡ産生経路に関与する前記分子が、セルレニンであり；
７）前記デノボまたはサルベージプリンおよびピリミジン経路に関与する前記分子が、プリンまたはピリミジン類似体である、項目１１４に記載の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１１６）
ｂ）前記基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１つの増大を呈する後続のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーについて選択するステップ
をさらに含む、項目１１３に記載の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１１７）
前記後続のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーにおける各株が、スピノシンの合成の増大を呈する、項目１１６に記載の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを生成するための方法。
（項目１１８）
産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法であって、
ａ）複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の各株内で見出されたユニークな遺伝的バリエーションを有する前記複数の個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を含む最初の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを提供するステップであって、前記ユニークな遺伝的バリエーションのそれぞれは、１つまたは複数の遺伝的バリエーションを含み、前記遺伝的バリエーションは、所定の代謝産物または発酵産物に対する耐性をもたらす、ステップと；
ｂ）参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記最初の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、表現型性能改善をもたらすユニークな遺伝的バリエーションを同定するステップと；ｃ）前記先行するステップにおいてスクリーニングされた少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に存在する前記遺伝的バリエーション由来のユニークな遺伝的バリエーションの組合せをそれぞれが含む後続の複数のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を提供することによって、後続の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーを創製するステップと；
ｄ）前記参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に対する表現型性能改善について前記後続の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をスクリーニングおよび選択することによって、追加の表現型性能改善をもたらす遺伝的バリエーションのユニークな組合せを同定するステップと；
ｅ）前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、所望のレベルの表現型性能の改善を呈するまで、線形または非線形様式でステップｃ）〜ｄ）を１回または複数回繰り返すステップであって、各後続の反復により、微生物株の新しい抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが創製され、前記新しいライブラリーにおける各株は、先行するライブラリーの少なくとも２つの個々のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の中から選択される遺伝的バリエーションの組合せである遺伝的バリエーションを含む、ステップと
を含む、方法。
（項目１１９）
前記後続の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目１１８に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２０）
前記後続の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、前記最初の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目１１８に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２１）
前記後続の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行する抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーである、項目１１８に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２２）
前記後続の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーが、先行する抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーの完全コンビナトリアルライブラリーのサブセットである、項目１１８に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２３）
後続の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１０％の増加を呈するまで、ステップｃ）〜ｄ）を繰り返す、項目１１８に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２４）
後続の抗代謝産物／発酵産物耐性Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーのＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能が、前記産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記表現型性能と比較して、測定された表現型変数における少なくとも１倍の増加を呈するまで、ステップｃ）〜ｄ）を繰り返す、項目１１８に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２５）
ステップｅ）の改善された表現型性能が、目的の産物の体積生産性、目的の産物の比生産性、目的の産物の収率、目的の産物の力価、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１１８に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２６）
ステップｅ）の改善された表現型性能が、目的の産物の増大したまたはより効率的な産生であり、前記目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、一次細胞外代謝産物、二次細胞外代謝産物、細胞内コンポーネント分子、およびこれらの組合せからなる群から選択される、項目１２５に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２７）
前記目的の産物が、スピノシン、スピノサド、スピネトラム、ゲニステイン、コリンオキシダーゼ、クマミジン化合物、エリスロマイシン、イベルメクチンアグリコン、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、カルボン酸異性体、アルファ−メチルメチオニン、チアリシン、アルファ−ケトビタレート、アスパルテートヒドキシメート、アザセリン、５−フオロインドール、ベータ−ヒドロキシノルバリン、セルレニン、プリン、ピリミジン、およびこれらの類似体からなる群から選択される、項目１２６に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２８）
前記スピノシンが、スピノシンＡ、スピノシンＤ、スピノシンＪ、スピノシンＬ、またはこれらの組合せである、項目１２７に記載の産生Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能を改善するための方法。
（項目１２９）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞であって、前記プロモーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記プロモーターは、配列番号１〜６９からなる群から選択される配列を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１３０）
前記内在性遺伝子が、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞におけるスピノシンの合成に関与する、項目１２９に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１３１）
前記内在性遺伝子に作動可能に連結した前記プロモーターを有さない参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を有する、項目１２９に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１３２）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーであって、前記ライブラリー中の各Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株は、宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含み、前記プロモーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記プロモーターは、配列番号１〜６９からなる群から選択される配列を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリー。
（項目１３３）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞の内在性遺伝子に連結したターミネーターを含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞であって、前記ターミネーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記プロモーターは、配列番号７０〜８０からなる群から選択される配列を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１３４）
前記内在性遺伝子が、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞におけるスピノシンの合成に関与する、項目１３３に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１３５）
前記内在性遺伝子に作動可能に連結した前記プロモーターを有さない参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を有する、項目１３３に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１３６）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーであって、前記ライブラリー中の各Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株は、宿主細胞の内在性遺伝子に連結したターミネーターを含み、前記ターミネーターは、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記ターミネーターは、配列番号７０〜８０からなる群から選択される配列を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリー。
（項目１３７）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したリボソーム結合部位を含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞であって、前記リボソーム結合部位は、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記リボソーム結合部位は、配列番号９７〜１２７からなる群から選択される配列を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１３８）
前記内在性遺伝子が、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞におけるスピノシンの合成に関与する、項目１３７に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１３９）
前記内在性遺伝子に作動可能に連結した前記ＲＢＳを有さない参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を有する、項目１３７に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１４０）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーであって、前記ライブラリー中の各Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株は、宿主細胞の内在性遺伝子に作動可能に連結したリボソーム結合部位を含み、前記リボソーム結合部位は、前記内在性遺伝子にとって異種であり、前記リボソーム結合部位は、配列番号９７〜１２７からなる群から選択される配列を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリー。
（項目１４１）
トランスポゾンを含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞であって、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞は、前記トランスポゾンなしの参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を有する、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１４２）
前記トランスポゾンが、機能喪失型（ＬｏＦ）トランスポゾンまたは機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンである、項目１４１に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１４３）
前記機能獲得型（ＧｏＦ）トランスポゾンが、プロモーター、対抗選択マーカー、および／または可溶性タグを含む、項目１４２に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１４４）
前記トランスポゾンが、配列番号１２８〜１３１からなる群から選択される配列を含む、項目１４１に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ宿主細胞。
（項目１４５）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーであって、前記ライブラリー中の各Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株は、配列番号１２８〜１３１からなる群から選択される配列を有するトランスポゾンを含み、各株中の前記トランスポゾンは、異なるゲノム遺伝子座にある、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリー。
（項目１４６）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリーであって、前記ライブラリー中の各Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株は、
１）スピノシン合成経路に関与する分子、
２）ＳＡＭ／メチオニン経路に関与する分子、
３）リシン産生経路に関与する分子、
４）トリプトファン経路に関与する分子、
５）トレオニン経路に関与する分子、
６）アセチル−ＣｏＡ産生経路に関与する分子、ならびに／または
７）デノボまたはサルベージプリンおよびピリミジン経路に関与する分子
に対する前記株の耐性をもたらす遺伝的バリエーションを含む、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリー。
（項目１４７）
１）前記スピノシン合成経路に関与する前記分子が、スピノシンであり；
２）前記ＳＡＭ／メチオニン経路に関与する前記分子が、アルファ−メチルメチオニン（ａＭＭ）またはノルロイシンであり；
３）前記リシン産生経路に関与する前記分子が、チアリシンまたはアルファ−ケトビタレートおよびアスパルテートヒドキシメートの混合物であり；
４）前記トリプトファン経路に関与する前記分子が、アザセリンまたは５−フオロインドールであり；
５）前記トレオニン経路に関与する前記分子が、ベータ−ヒドロキシノルバリンであり；６）前記アセチル−ＣｏＡ産生経路に関与する前記分子が、セルレニンであり；
７）前記デノボまたはサルベージプリンおよびピリミジン経路に関与する前記分子が、プリンまたはピリミジン類似体である、
項目１４６に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリー。
（項目１４８）
前記分子が、スピノシンＪ／Ｌであり、各株が、約５０μｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌのスピノシンＪ／Ｌに対して耐性である、項目１４７に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリー。
（項目１４９）
前記分子が、アルファ−メチルメチオニン（ａＭＭ）であり、各株が、約１ｍＭ〜約５ｍＭのａＭＭに対して耐性である、項目１４７に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株ライブラリー。
（項目１５０）
レポーター遺伝子を含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株であって、前記レポーター遺伝子は、
ａ）緑色蛍光レポータータンパク質をコードする遺伝子であって、必要に応じて前記遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ中での発現のためにコドン最適化されており；
ｂ）緑色蛍光レポータータンパク質をコードする遺伝子であって、必要に応じて前記遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ中での発現のためにコドン最適化されており；
ｃ）ベータ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓＡ）タンパク質をコードする遺伝子であって、必要に応じて前記遺伝子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ中での発現のためにコドン最適化されている、
からなる群から選択される、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１５１）
ａ）前記緑色蛍光レポータータンパク質が、配列番号１４３のアミノ酸配列を有し；
ｂ）赤色蛍光レポータータンパク質が、配列番号１４４のアミノ酸配列を有し；
ｃ）前記ｇｕｓＡタンパク質が、配列番号１４５のアミノ酸配列を有する、
項目１５０に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１５２）
ａ）前記緑色蛍光レポータータンパク質をコードする前記遺伝子が、配列番号８１の配列を有し；
ｂ）前記赤色蛍光レポータータンパク質をコードする前記遺伝子が、配列番号８２の配列を有し；
ｃ）前記ｇｕｓＡタンパク質をコードする前記遺伝子が、配列番号８３の配列を有する、項目１５０に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１５３）
前記株が、前記緑色蛍光レポータータンパク質をコードする前記遺伝子、および前記赤色蛍光レポータータンパク質をコードする前記遺伝子の両方を含み、前記緑色蛍光レポータータンパク質および前記赤色蛍光レポータータンパク質の蛍光励起および発光スペクトルが、互いに異なる、項目１５０に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１５４）
前記株が、前記緑色蛍光レポータータンパク質をコードする前記遺伝子、および前記赤色蛍光レポータータンパク質をコードする前記遺伝子の両方を含み、前記緑色蛍光レポータータンパク質および前記赤色蛍光レポータータンパク質の蛍光励起および発光スペクトルが、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の内在性の蛍光と異なる、項目１５０に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１５５）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノム中の１つまたは複数の中立の組込み部位に組み込まれたＤＮＡ断片を含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株であって、前記中立の組込み部位は、配列番号１３２〜１４２から選択される配列を有するゲノム断片内、または配列番号１３２〜１４２のいずれか１つと相同のゲノム断片内の位置の群から選択される、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１５６）
前記組み込まれたＤＮＡ断片なしの参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能と比較して、所望のレベルの表現型性能の改善を有する、項目１５５に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１５７）
前記組み込まれたＤＮＡ断片なしの参照Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の表現型性能と比較して、所望のレベルの改善されたスピノシン産生を有する、項目１５６に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１５８）
前記組み込まれたＤＮＡ断片が、レポータータンパク質をコードする配列を含む、項目１５５に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１５９）
前記組み込まれたＤＮＡ断片が、トランスポゾンを含む、項目１５５に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１６０）
前記組み込まれたＤＮＡ断片が、その対応するインテグラーゼによって認識され得る結合部位（ａｔｔＢ）を含む、項目１５５に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株。
（項目１６１）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムにＤＮＡ断片を組み込む方法であって、前記ＤＮＡ断片は、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記ゲノム中の中立の組込み部位に組み込まれ、前記中立の組込み部位は、配列番号１３２〜１４２から選択される配列を有するゲノム断片内、または配列番号１３２〜１４２のいずれか１つと相同のゲノム断片内の位置の群から選択される、方法。
（項目１６２）
前記ＤＮＡ断片が、その対応するインテグラーゼによって認識され得る結合部位（ａｔｔＢ）を含む、項目１６１に記載のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノムにＤＮＡ断片を組み込む方法。
（項目１６３）
少なくとも２つの親Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に由来する遺伝子変異を迅速に統合するための方法であって、
（１）少なくとも２つの親Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を提供するステップであって、各株は、他の株に存在しないユニークなゲノム変異を含む、ステップと；
（２）前記親株のそれぞれからプロトプラストを調製するステップと；
（３）前記親株由来の前記プロトプラストを融合して、２つの親Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記ゲノムを含む融合プロトプラストを産生するステップであって、各親株の前記ゲノムの間の相同組換えが起こる、ステップと
（４）ステップ（３）で産生した前記融合プロトプラストからＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ細胞を回収するステップと；
（５）第１の親Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株の前記ユニークなゲノム変異を含むＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ細胞について選択するステップと；
（６）第２の親株の前記ユニークなゲノム変異の存在について、ステップ（５）で得られた前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ細胞をジェノタイピングするステップとを含み、
それによって、２つの親Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に由来する前記ユニークなゲノム変異を含む新しいＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株を得る、方法。
（項目１６４）
前記ユニークなゲノム変異の一方が、選択可能マーカーに連結されるが、他方のユニークなゲノム変異が、いかなる選択可能マーカーにも連結されない、項目１６３に記載の方法。
（項目１６５）
ステップ（３）において、前記選択可能マーカーに連結された前記ユニークなゲノム変異をもともと含有する前記株のプロトプラスト：前記選択可能マーカーに連結されない前記ユニークなゲノム変異をもともと含有する前記株のプロトプラストの比が、１：１未満である、項目１６４に記載の方法。
（項目１６６）
前記比が、約１：１０〜約１：１００、またはそれ未満である、項目１６５に記載の方法。
（項目１６７）
ステップ（４）において、プロトプラスト細胞が、寒天のオーバーレイを使用せずに浸透圧的に安定化された培地に蒔かれる、項目１６３に記載の方法。
（項目１６８）
ステップ（５）が、前記ユニークなゲノム変異の１つが、選択薬物に耐性をもたらす選択可能マーカーに連結されるときに、成長している前記細胞において適切な前記選択薬物の抗生物質でオーバーレイすることによってなしとげられる、項目１６３に記載の方法。
（項目１６９）
ステップ（５）が、前記ユニークなゲノム変異のどれも、選択可能マーカーに連結されないときに、ジェノタイピングすることによってなしとげられる、項目１６３に記載の方法。
（項目１７０）
２つより多い株に由来する遺伝子変異が、単一の統合プロセスの間に、ランダムに統合される、項目１６３に記載の方法。
（項目１７１）
ステップ（２）において、前記プロトプラストが、約５０００×ｇの速度で、約５分間遠心分離することによって、最初に収集される、項目１６３に記載の方法。
（項目１７２）
脱脂綿を通して前記プロトプラストを濾過するステップを含まない、項目１６３に記載の方法。
（項目１７３）
前記融合プロトプラストが、上層寒天ではなくＲ２ＹＥ培地上で回収される、項目１６３に記載の方法。
（項目１７４）
前記Ｒ２ＹＥ培地が、０．５Ｍのソルビトールおよび０．５Ｍのマンノースを含む、項目１７３に記載の方法。
（項目１７５）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株における標的化ゲノム編集の方法であって、
ａ）選択マーカー、対抗選択マーカー、編集される前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株のゲノム遺伝子座に対する相同性を有するＤＮＡ断片、およびプラスミド主鎖配列を含むプラスミドを基準Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に導入するステップと；ｂ）前記ゲノム中の前記選択マーカーの存在に基づいて組込み事象を有するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択するステップと；
ｃ）前記対抗選択マーカー遺伝子の非存在に基づきループアウトされた前記プラスミド主鎖を有するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択するステップであって、前記対抗選択マーカーは、ｓａｃＢ遺伝子またはｐｈｅＳ遺伝子である、ステップと
を含む、方法。
（項目１７６）
編集されたゲノムを有する結果として生じたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、前記編集なしの親株と比較して、より良好な性能を有する、項目１７５に記載の方法。
（項目１７７）
前記結果として生じたＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、前記編集なしの親株と比較して、スピノシン産生の増大を有する、項目１７６に記載の方法。
（項目１７８）
前記ｓａｃＢ遺伝子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａのためにコドン最適化されている、項目１７５に記載の方法。
（項目１７９）
前記ｓａｃＢ遺伝子が、配列番号１４６によってコードされるアミノ酸配列に対して９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、項目１７８に記載の方法。
（項目１８０）
前記ｐｈｅＳ遺伝子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａのためにコドン最適化されている、項目１７５に記載の方法。
（項目１８１）
前記ｐｈｅＳ遺伝子が、配列番号１４７または配列番号１４８によってコードされるアミノ酸に対して９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、項目１８０に記載の方法。
（項目１８２）
ドナー微生物細胞から遺伝物質をＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ微生物のレシピエント細胞に移入させる方法であって、
１）必要に応じて、レシピエント細胞を、後期指数期または静止期まで継代培養するステップと；
２）必要に応じて、ドナー細胞を中期指数期まで継代培養するステップと；
３）ドナーおよびレシピエント細胞を組み合わせるステップと；
４）ドナーおよびレシピエント細胞の混合物をコンジュゲーション培地に蒔くステップと；
５）プレートをインキュベートして、細胞をコンジュゲートさせるステップと；
６）ドナー細胞に対して抗生物質選択を適用するステップと；
７）非組込みレシピエント細胞に対して抗生物質選択を適用するステップと；
８）さらにプレートをインキュベートして、組み込まれたレシピエント細胞を成長させるステップと
を含む、方法。
（項目１８３）
前記ドナー微生物細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞である、項目１８２に記載の方法。
（項目１８４）
以下の条件の少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたはそれよりも多くが利用される、項目１８２に記載の方法：
１）レシピエント細胞は、コンジュゲートする前に洗浄される；
２）ドナー細胞およびレシピエント細胞は、約３０℃の温度でコンジュゲートされる；
３）レシピエント細胞は、コンジュゲートする前に少なくとも約４８時間継代培養される；
４）コンジュゲーションのためのドナー細胞：レシピエント細胞の比は、約１：０．６〜１：１．０である；
５）前記ドナー細胞に対する選択のための抗生物質薬は、前記ドナー細胞および前記レシピエント細胞が混合された約１５〜２４時間後に前記混合物に送達される；
６）前記レシピエント細胞に対する選択のための抗生物質薬は、前記ドナー細胞および前記レシピエント細胞が混合された約４０〜４８時間後に前記混合物に送達される；
７）ドナーおよびレシピエント細胞の混合物が蒔かれた前記コンジュゲーション培地は、少なくとも約３時間〜１０時間乾燥される；
８）前記コンジュゲーション培地は、少なくとも約３ｇ／Ｌのグルコースを含む；
９）ドナー細胞の濃度は、約ＯＤ６００＝０．１〜０．６である；
１０）レシピエント細胞の濃度は、約ＯＤ５４０＝５．０〜１５．０である。
（項目１８５）
前記ドナー細胞に対する選択のための前記抗生物質薬が、ナリジクス酸であり、その濃度が、約５０〜約１５０μｇ／ｍｌである、項目１８４に記載の方法。
（項目１８６）
前記ドナー細胞に対する選択のための前記抗生物質薬が、ナリジクス酸であり、その濃度が、約１００μｇ／ｍｌである、項目１８５に記載の方法。
（項目１８７）
前記レシピエント細胞に対する選択のための前記抗生物質薬が、アプラマイシンであり、その濃度が、約５０〜約２５０μｇ／ｍｌである、項目１８４に記載の方法。
（項目１８８）
前記レシピエント細胞に対する選択のための前記抗生物質薬が、アプラマイシンであり、その濃度が、約１００μｇ／ｍｌである、項目１８７に記載の方法。
（項目１８９）
ハイスループットプロセスで実施される、項目１８２に記載の方法。
（項目１９０）
４８ウェルのＱ−ｔｒａｙ上で実施される、項目１８９に記載の方法。
（項目１９１）
前記ハイスループットプロセスが、自動化されている、項目１８９に記載の方法。
（項目１９２）
ドナー細胞およびレシピエント細胞の前記混合物が、液体混合物であり、前記液体混合物のアンプル体積が、ロッキング動作を伴う前記培地に蒔かれ、前記液体混合物が、前記培地の全面積にわたって分散する、項目１９１に記載の方法。
（項目１９３）
前記ドナー細胞によって提供された組み込まれたＤＮＡを有するレシピエント細胞の後続の播種のために、酵母ピンによるコロニーピッキングによって接合完了体を移入する自動化プロセスを含む、項目１９１に記載の方法。
（項目１９４）
前記コロニーピッキングが、ディッピング動作または撹拌動作のいずれかで実施される、項目１９３に記載の方法。
（項目１９５）
コンジュゲートする培地が、約３〜１０ｇ／Ｌのグルコースを含む改変ＩＳＰ４培地である、項目１８４に記載の方法。
（項目１９６）
前記混合物中のドナー細胞またはレシピエント細胞の総数が、約５×１０６〜約９×１０６である、項目１８４に記載の方法。
（項目１９７）
以下の条件の少なくとも４つで実施される、項目１８２に記載の方法：
１）レシピエント細胞は、コンジュゲートする前に洗浄される；
２）ドナー細胞およびレシピエント細胞は、約３０℃の温度でコンジュゲートされる；
３）レシピエント細胞は、コンジュゲートする前に少なくとも約４８時間継代培養される；
４）コンジュゲーションのためのドナー細胞：レシピエント細胞の比は、約１：０．８である；
５）前記ドナー細胞に対する選択のための抗生物質薬は、前記ドナー細胞および前記レシピエント細胞が混合された約２０時間後に前記混合物に送達される；
６）前記混合物中の前記ドナー細胞の量または前記レシピエント細胞の量は、約７×１０６である；ならびに
７）前記コンジュゲーション培地は、約６ｇ／Ｌのグルコースを含む。
（項目１９８）
Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株における標的化ゲノム編集の方法であって、標的としたゲノム遺伝子座で遺伝的バリエーションを含有する無傷のＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株をもたらし、
ａ）プラスミドをＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に導入するステップであって、前記プラスミドは、
ｉ．選択マーカー、
ｉｉ．対抗選択マーカー、
ｉｉｉ．標的遺伝子座で前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａゲノムに組み込まれる遺伝的バリエーションを含有するＤＮＡ断片であって、所望の遺伝的バリエーションに隣接する前記標的ゲノム遺伝子座に対する相同アームを有するＤＮＡ断片、および
ｉｖ．プラスミド主鎖配列を含む、ステップと；
ｂ）前記ゲノム中の前記選択マーカーの存在に基づいて、最初の相同組換えを受け、前記標的遺伝子座に組み込まれた前記遺伝的バリエーションを有するＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択するステップと；
ｃ）前記対抗選択マーカーの非存在に基づいて、前記標的遺伝子座に組み込まれた前記遺伝的バリエーションを有するが、前記プラスミド主鎖をループアウトする追加の相同組換えを受けているＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株について選択するステップと
を含み、前記標的とするゲノム遺伝子座が、コードするＤＮＡモジュールの繰り返しセグメントを含有しないゲノム領域を含む前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａゲノムの任意の領域を含んでいてもよい、方法。
（項目１９９）
前記プラスミドが、温度感受性レプリコンを含まない、項目１９８に記載の方法。
（項目２００）
前記プラスミドが、複製起点を含まない、項目１９８に記載の方法。
（項目２０１）
前記選択ステップ（ｃ）が、前記組み込まれたプラスミドの複製なしで実施される、項目１９８に記載の方法。
（項目２０２）
前記プラスミドが、単一相同組換えベクターである、項目１９８に記載の方法。
（項目２０３）
前記プラスミドが、二重相同組換えベクターである、項目１９８に記載の方法。
（項目２０４）
前記対抗選択マーカーが、ｓａｃＢ遺伝子またはｐｈｅＳ遺伝子である、項目１９８に記載の方法。
（項目２０５）
前記ｓａｃＢ遺伝子またはｐｈｅＳ遺伝子が、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｓｐｉｎｏｓａのためにコドン最適化されている、項目２０４に記載の方法。
（項目２０６）
前記ｓａｃＢ遺伝子が、配列番号１４６によってコードされるアミノ酸配列に対して９０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする、項目２０５に記載の方法。
（項目２０７）
前記ｐｈｅＳ遺伝子が、配列番号１４７または配列番号１４８によってコードされるアミノ酸に対して９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、項目２０５に記載の方法。
（項目２０８）
前記プラスミドが、形質転換によって前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に導入される、項目１９８に記載の方法。
（項目２０９）
前記形質転換が、プロトプラスト形質転換である、項目１９８に記載の方法。
（項目２１０）
前記プラスミドが、コンジュゲーションによって前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に導入され、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、レシピエント細胞であり、前記プラスミドを含むドナー細胞が、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株に前記プラスミドを移入する、項目１９８に記載の方法。
（項目２１１）
前記コンジュゲーションが、前記プラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉドナー細胞に基づく、項目１９８に記載の方法。
（項目２１２）
前記標的遺伝子座が、前記Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株中の目的の化合物の産生に関連する遺伝子座である、項目１９８に記載の方法。
（項目２１３）
結果として生じるＳａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ株が、前記ゲノム編集なしの対照株と比較して、目的の化合物の産生の増加を有する、項目１９８に記載の方法。
（項目２１４）
前記目的の化合物が、スピノシンである、項目２１２または項目２１３に記載の方法。
（項目２１５）
ハイスループット手順として実施される、項目１９８に記載の方法。