【手続補正書】
【提出日】令和3年6月28日(2021.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）
（ｉ）１つ以上のアニオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のアニオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含み、Ｄ−異性体のポリマー対Ｌ−異性体のポリマーの比が２：１を超える、アニオン性ポリマー組成物、
（ｉｉ）１つ以上のカチオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のカチオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含む、カチオン性ポリマー組成物、
（ｉｉｉ）カチオン性ポリペプチド組成物、および
（ｉｖ）核酸および／またはタンパク質ペイロード
を含むコア、ならびに
（ｂ）該コアを封入している脱落可能層
を含む、ナノ粒子。
【請求項２】
（ａ）
（ｉ）１つ以上のアニオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のアニオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含み、Ｄ−異性体のポリマー対Ｌ−異性体のポリマーの比が２：１未満である、アニオン性ポリマー組成物、
（ｉｉ）１つ以上のカチオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のカチオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含む、カチオン性ポリマー組成物、
（ｉｉｉ）カチオン性ポリペプチド組成物、および
（ｉｖ）核酸および／またはタンパク質ペイロード
を含むコア、ならびに
（ｂ）該コアを封入している脱落可能層
を含む、ナノ粒子。
【請求項３】
（ａ）
（ｉ）１つ以上のアニオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のアニオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含む、アニオン性ポリマー組成物、
（ｉｉ）１つ以上のカチオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のカチオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含む、カチオン性ポリマー組成物、
（ｉｉｉ）カチオン性ポリペプチド組成物、および
（ｉｖ）核酸および／またはタンパク質ペイロード
を含むコア、ならびに
（ｂ）該コアを封入している脱落可能層
を含む、ナノ粒子であって、
該コアがアニオンに対するカチオンの電荷比２〜５で調製される、
ナノ粒子。
【請求項４】
（ａ）
（ｉ）１つ以上のアニオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のアニオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含む、アニオン性ポリマー組成物、
（ｉｉ）１つ以上のカチオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のカチオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含む、カチオン性ポリマー組成物、
（ｉｉｉ）カチオン性ポリペプチド組成物、および
（ｉｖ）核酸および／またはタンパク質ペイロード
を含むコア、ならびに
（ｂ）該コアを封入している脱落可能層
を含む、ナノ粒子であって、
該コアがアニオン性ポリマー組成物と該ペイロードの縮合で生成される、
ナノ粒子。
【請求項５】
（ａ）
（ｉ）１つ以上のアニオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のアニオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含む、アニオン性ポリマー組成物、
（ｉｉ）１つ以上のカチオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよび／または１つ以上のカチオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを含む、カチオン性ポリマー組成物、
（ｉｉｉ）カチオン性ポリペプチド組成物、および
（ｉｖ）核酸および／またはタンパク質ペイロード
を含むコア、
（ｂ）該コアを封入している脱落可能層、ならびに
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、６２、８８、１３７、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、および３０１からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、標的指向リガンド
を含む、ナノ粒子。
【請求項６】
前記第１の標的指向リガンドが前記脱落可能層内に含まれる、請求項５記載のナノ粒子。
【請求項７】
脱落可能層を囲む表面コートをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
第２の標的指向リガンドをさらに含む、請求項６に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記第２の標的指向リガンドが、ＲＶＧ９Ｒ、幹細胞因子（ＳＣＦ）またはその標的指向フラグメント、ＣＤ７０またはその標的指向フラグメント、およびＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）またはその標的指向フラグメントからなる群より選択される、請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記表面コートが細胞透過性ペプチドを含む、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
前記細胞透過性ペプチドが、ＴＡＴ、ＶＰ２２ドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質導入ドメイン、欠損ヒトカルシトニンペプチド、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６８、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６９からなる群より選択される、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記カチオン性ポリマー組成物が、任意でヒストンテールペプチド（ＨＴＰ）または核局在シグナル（ＮＬＳ）を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
前記ＮＬＳが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５１〜１５７および２０１〜２６４のうちのいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
少なくとも一つの標的指向リガンドが、狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）フラグメント、ＡｐｏＥ−トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノフェリチン（ｍｅｌａｎｏｆｅｒｒｉｔｉｎ）、オボトランスフェリチン（ｏｖｏｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｔｉｎ）、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、ＰＳＧＬ−１、ＥＳＬ−１、ＣＤ４４、細胞死受容体−３（ＤＲ３）、ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、Ｍａｃ２−ＢＰ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＣＤ７０、ＳＨ２ドメイン含有タンパク質１Ａ（ＳＨ２Ｄ１Ａ）、エキセンディン−４、ＧＬＰ１、α５β１を標的指向する標的指向リガンド、ＲＧＤ、トランスフェリンリガンド、ＦＧＦフラグメント、コハク酸、ビスホスホネート、ＣＤ９０、ＣＤ４５ｆ、ＣＤ３４、造血幹細胞走化性脂質、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴシン−１−ホスフェート、セラミド−１−ホスフェート、および上記のうちのいずれかの活性標的指向フラグメントからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
少なくとも１つの標的指向リガンドが、前記脱落可能層と相互作用するアンカードメインにコンジュゲートしている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
前記アンカードメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６から選択される、請求項１５に記載のナノ粒子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１】核酸ペイロードの縮合に関する様々なパラメータ（例えば、カチオン：アニオン電荷比）を試験する蛍光アッセイの結果を示す。結果は、例えば、２の電荷比が、Ｃａｓ９をコードするプラスミドとガイドＲＮＡ分子との縮合にうまく機能することを示した。
【図２】生成したナノ粒子コアの粒径とゼータ電位分布を示す。データは、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅｔｒｉｘ  ＺｅｔａＶｉｅｗ  ＮＴＡ装置を用いて得た。ナノ粒子サイズ（ピーク）は１２８．８ｎｍであり、ゼータ電位（ピーク）は＋１０．５ｍＶ（１００％）であった。
【図３】安定化ナノ粒子コア（脱落可能層で封入されたコア）の粒子サイズとゼータ電位分布を示す。データは、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｍｅｔｒｉｘ  ＺｅｔａＶｉｅｗ  ＮＴＡ装置を用いて得た。安定化されたコアは、１１０．６ｎｍのサイズであり、−４２．１ｍＶ（９５％）のゼータ電位を有した。
【図４】ＲＶＧ９Ｒを含む外殻（外側コート）を有するナノ粒子であり、ナノ粒子は９−Ａｒｇペプチド配列（カチオン性アンカードメインとして）に融合した狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）であり、１１５．８ｎｍの特徴的な粒子サイズ、−３．１ｍＶ（１００％）のゼータ電位を有することを示す。最適な外側コーティングは、−５０ｍＶ（シリカコートされたコアへ）から０〜−１０ｍＶ（外殻を追加した後）の間へのゼータ電位の遷移をもたらす。
【図５】核酸ペイロードを送達するために異なるナノ粒子が使用された細胞培養実験の結果を示す。この図では、コアの一部としてポリ（Ｄ−グルタミン酸）を含むナノ粒子（ポリ（Ｌ−アルギニン）付加）と、含まないナノ粒子とを比較している。３行は複製を表す。
【図６Ａ】（パネルＡ〜Ｄ）核酸ペイロードとしてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現ベクターを含むナノ粒子と接触させた神経幹細胞の顕微鏡画像を示す。ナノ粒子のコアは、フルオロフォア（ＦＩＴＣ）でタグ付けされたポリ（Ｌ−アルギニン）（カチオン性ポリマー）を含んでいた。エンドソームと核はそれぞれＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ（赤）とＨｏｅｓｃｈｔ  ３３４２（青）を使って染色した。ナノ粒子（および対照としてのリポフェクタミン３０００）を播種の１６時間後に細胞に導入した。画像化の前に、細胞をＨｏｅｓｃｈｔ  ３３４２およびＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄを共に培養した。パネルＣ〜Ｄは、ナノ粒子コアと核およびエンドソームとの共局在を定量化する棒グラフを提示する。
【図６Ｂ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図６Ｃ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図６Ｄ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図７】（パネルＡ〜Ｂ）核酸ペイロードとしてＧＦＰをコードするｍＲＮＡを含むナノ粒子をトランスフェクトした末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の顕微鏡画像を示す。画像は、ｍＲＮＡ発現が、定義された比で、アニオン性アミノ酸のＤ−異性体のポリマーおよびアニオン性アミノ酸のＬ−異性体のポリマーを有するコアを含むナノ粒子を用いて１６日まで延長され得ることを実証する。この場合、２：１の比のポリ（Ｄ−グルタミン酸）対ポリ（Ｌ−グルタミン酸）を有するナノ粒子コアの使用は、１６日で最大発現であった（パネルＡ＝４日；パネルＢ＝１６日）。
【図８】本発明のナノ粒子の一実施形態例の概略図を示す。
【図９】本発明のナノ粒子の一実施形態例の概略図を示す。この場合、ナノ粒子は多層であり、表面コートされた（すなわち、外殻を含む）第２の脱落可能層、第２の脱落可能層に囲まれた中間層、中間層（追加のペイロードを含む）に囲まれた第１の脱落可能層、で囲まれたコア（第１のペイロードを含む）を有する。
【図１０】（パネルＡ〜Ｂ）主題のナノ粒子の表面コートの送達分子の例示的な構成の概略図を示す。示された送達分子は、ナノ粒子の脱落可能層と静電的に相互作用しているアンカードメインにコンジュゲートした標的指向リガンドを含む。標的指向リガンドは、Ｎ末端またはＣ末端でコンジュゲートし得る（各パネルの左）が、内部位置でもコンジュゲートし得る（各パネルの右）ことに留意されたい。パネルＡの分子はリンカーを含むがパネルＢの分子は含まない。
【図１１−１】標的指向リガンドを評価する際に考慮すべき別々のドメインを強調する、ファミリーＢのＧＰＣＲの残基１７０〜４３２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１３）の概略図を提供する。例えば、アロステリック／親和性Ｎ末端ドメインおよびオルソステリックエンドソームソーティング／シグナル伝達ドメインへの結合。（図は、Ｓｉｕ，Ｆａｉ  Ｙｉｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ４９９．７４５９（２０１３）：４４４−４４９を出典とする）。
【図１１−２】図１１−１の説明を参照のこと。
【図１２−１】核酸の放出を促進および核酸の分解を制限する、親和性が維持され、標的指向リガンドが長いエンドソーム再利用経路に関与するように、標的指向リガンドの挿入および／または置換のための（例えばシステイン残基による）内部アミノ酸位置の同定の一例を提供する。この場合、標的指向リガンドはエキセンディン−４であり、アミノ酸位置１０、１１、および１２は、可能な挿入および／または置換のための部位として同定された（例えば、システイン残基、例えばＳ１１Ｃ突然変異を有する）。図は、三次元空間で回転された、グルカゴン−ＧＣＧＲ（４ＥＲＳ）およびＧＬＰ１−ＧＬＰ１Ｒ−ＥＣＤ複合体（ＰＤＢ：３ＩＯＬ）の既知の結晶構造に対するシミュレートされたエキセンディン−４  Ｓ１１Ｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のアライメント、およびＰＤＢレンダリングを示す。
【図１２−２】図１２−１の説明を参照のこと。
【図１３】三つ組みのＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１−ＨＥＰＡＲＩＮ複合体（ＰＤＢ上の１ｆｑ９）の一部としてのｔｂＦＧＦフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１４）を示す。ＣＫＮＧＧＦＦＬＲＩＨＰＤＧＲＶＤＧＶＲＥＫＳ（強調された）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）は、ＦＧＦＲ１に対する親和性にとって重要であると決定された。
【図１４】ＦＧＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１５）由来のＨＦＫＤＰＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）が、リガンド−受容体オルソステリック活性および親和性に使用できるペプチドであることを決定するために使用されるアラインメントおよびＰＤＢ  ３Ｄレンダリングを提供する。
【図１５】ＦＧＦフラグメント（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１６）由来のＬＥＳＮＮＹＮＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）が、リガンド−受容体オルソステリック活性および親和性に使用できるペプチドであることを決定するために使用されるアラインメントおよびＰＤＢ  ３Ｄレンダリングを提供する。
【図１６】本発明のナノ粒子の一部として使用することができる核局在シグナル（ＮＬＳ）の非限定的な例を提供する（例えば、ＮＬＳ含有ペプチド；ＮＬＳ含有ペプチドの一部として／ＮＬＳ含有ペプチドにコンジュゲートした、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマー、および／またはカチオン性ポリペプチドなど）。図は、Ｋｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．２００９  Ｊａｎ  ２；２８４（１）：４７８−８５を出典とする。［クラス１、上から下へ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０１〜２２１）；クラス２、上から下へ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２２〜２２４）；クラス４、上から下へ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２５〜２３０）；クラス３、上から下へ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３１〜２４５）；クラス５、上から下へ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４６〜２６４）］。
【図１７Ａ】（パネルＡ〜Ｂ）マウス（パネルＡ）およびヒト（パネルＢ）の造血細胞系列の概略図、かつその系列内の様々な細胞について同定されているマーカーを示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａの説明を参照のこと。
【図１８Ａ】（パネルＡ〜Ｂ）細胞の分化かつ／または増殖に影響を与えるために使用することができるｍｉＲＮＡ（パネルＡ）およびタンパク質（パネルＢ）因子の概略図を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａの説明を参照のこと。
【図１９】ペイロード：ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ−ＥＧＦＰ  ｐＤＮＡを含むナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２０Ａ】ペイロード：ＨＢＢ  ｇＲＮＡと複合したＮＬＳ−ＣＡＳ９−ＮＬＳ  ＲＮＰを含むナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２０Ｂ】図２０Ａの説明を参照のこと。
【図２０Ｃ】図２０Ａの説明を参照のこと。
【図２０Ｄ】図２０Ａの説明を参照のこと。
【図２１】ペイロード：ＨＢＢ  ｇＲＮＡを有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２２】ペイロード：ＨＢＢ  ｇＲＮＡを有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２３】ペイロード：ＨＢＢ  ｇＲＮＡと複合したＮＬＳ−ＣＡＳ９−ＮＬＳ  ＲＮＰを有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２４】ペイロード：ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ−ＥＧＦＰ  ｐＤＮＡを有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２５】ペイロード：ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ−ＥＧＦＰ  ｐＤＮＡを有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２６】ペイロード：ＨＢＢ  ｇＲＮＡを有するＮＬＳ−ＣＡＳ９−ＮＬＳのＲＮＰを有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２７】ペイロード：ペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ−ＥＧＦＰ  ｐＤＮＡを有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２８】ペイロード：Ｃｙ５＿ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図２９】ペイロード：ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５  ｓｉＲＮＡ有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図３０】ペイロード：ＨＢＢ  ｇＲＮＡと複合したＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＥＧＦＰ  ＲＮＰを有するナノ粒子の縮合曲線を提供する。
【図３１Ａ】ペイロードとしてＡｌｅｘａ  ５５５  Ｂｌｏｃｋ−ＩＴ  ｓｉＲＮＡを有するナノ粒子を使用した場合に収集されたデータを提供する。
【図３１Ｂ】図３１Ａの説明を参照のこと。
【図３１Ｃ】図３１Ａの説明を参照のこと。
【図３２−１】ペイロードとしてＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＧＦＰとＨＢＢガイドＲＮＡとによって形成されたリボ核タンパク質（ＲＮＰ）を有するナノ粒子を使用した場合に収集されたデータを提供する。
【図３２−２】図３２−１の説明を参照のこと。
【図３２−３】図３２−１の説明を参照のこと。
【図３３−１】ペイロードとしてＣｙ５  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡを有するナノ粒子を使用した場合に収集されたデータを提供する。
【図３３−２】図３３−１の説明を参照のこと。
【図３４−１】ペイロードを有するナノ粒子を使用した場合に収集されたデータを提供する：Ｃｙ５標識されたペプチド核酸（ＰＮＡ）結合部位を有するＶＷＦ−ＥＧＦＰ  ｐＤＮＡ。
【図３４−２】図３４−１の説明を参照のこと。
【図３４−３】図３４−１の説明を参照のこと。
【図３５】カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加し、さらにＲＮＰにカチオン性ポリペプチドを添加することによって蛍光強度が低下することを示すＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図３６】カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加し、さらにｓｉＲＮＡおよびＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄにカチオン性ポリペプチドを添加することによって蛍光強度が変動することを示すＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図３７】カチオン性ポリペプチドヒストンペプチドＨ２Ａを添加し、続いてＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、さらにＨＢＢ  ｇＲＮＡおよびＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを有するＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＥＧＦＰのＲＮＰにＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度が変動することを示すＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図３８】カチオン性ポリペプチドヒストンペプチドＨ４をＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃと一緒に添加し、さらにＨＢＢ  ｇＲＮＡおよびＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを有するＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＥＧＦＰのＲＮＰにＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度が変動することを示すＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図３９】カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、さらにｍＲＮＡにＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度が変動することを示すＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図４０】ヒストンＨ４を添加し、さらにｍＲＮＡにＣＤ４５−ｍＳｉｇｌｅｃ−（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿ｃとＰＬＥ１００とを添加することによって蛍光強度が変動することを示すＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図４１】ヒストンＨ２Ａを添加し、さらにｍＲＮＡにＣＤ４５−ｍＳｉｇｌｅｃ−（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿ｃとＰＬＥ１００とを添加することによって蛍光強度が変動することを示すＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図４２】カチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度が変動することを示すＶＷＦ＿ＥＧＦＰ  ｐＤＮＡとのインターカレーションからのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図４３】ヒストンＨ４を添加し、続いてカチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度が変動することを示すＶＷＦ＿ＥＧＦＰ  ｐＤＮＡとのインターカレーションからのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図４４】ヒストンＨ４を添加し、続いてカチオン性ポリペプチドＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃを添加し、続いてＰＬＥ１００を添加することによって蛍光強度が変動することを示すＶＷＦ＿ＥＧＦＰ  ｐＤＮＡとのインターカレーションからのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ排除アッセイのデータを提供する。
【図４５Ａ】（パネルＡ〜Ｃ）ポリプレックスサイズ分布、シリカコーティングサイズおよびゼータ電位分布、ならびにリガンドコーティング／官能化粒子サイズおよびゼータ電位分布に関するデータを提供する。
【図４５Ｂ−１】図４５Ａの説明を参照のこと。
【図４５Ｂ−２】図４５Ａの説明を参照のこと。
【図４５Ｃ−１】図４５Ａの説明を参照のこと。
【図４５Ｃ−２】図４５Ａの説明を参照のこと。
【図４６】分枝ヒストンペプチドにコンジュゲートするパイロット粒子に関するデータを提供する。
【図４７−１】プロジェクトＨＳＣ．００１．００１に関するデータを提供する（表５参照）。
【図４７−２】図４７−１の説明を参照のこと。
【図４８】プロジェクトＨＳＣ．００１．００２に関するデータを提供する（表５参照）。
【図４９−１】プロジェクトＨＳＣ．００２．０１（標的指向リガンド−ＥＳＥＬＬｇ＿ｍＥＳＥＬ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎ）に関するデータを提供する（表５参照）。
【図４９−２】図４９−１の説明を参照のこと。
【図５０−１】プロジェクトＨＳＣ．００２．０２（標的指向リガンド−ＥＳＥＬＬｇ＿ｍＥＳＥＬ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５０−２】図５０−１の説明を参照のこと。
【図５１−１】プロジェクトＨＳＣ．００２．０３（標的指向リガンド−ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５１−２】図５１−１の説明を参照のこと。
【図５２−１】プロジェクトＨＳＣ．００２．０４（標的指向リガンド−Ｃｙ５ｍＲＮＡ−ＳｉＯ２−ＰＥＧ）に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５２−２】図５２−１の説明を参照のこと。
【図５３−１】プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．８８（標的指向リガンド−ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５３−２】図５３−１の説明を参照のこと。
【図５４−１】プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．８９（標的指向リガンド−ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５４−２】図５４−１の説明を参照のこと。
【図５５−１】プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．９０に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５５−２】図５５−１の説明を参照のこと。
【図５６−１】プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．９１（ＰＬＲ５０）に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５６−２】図５６−１の説明を参照のこと。
【図５７−１】プロジェクトＢＬＯＯＤ．００２．９２（標的指向リガンド−ＣＤ４５＿ｍＳｉｇｌｅｃ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｃ）に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５７−２】図５７−１の説明を参照のこと。
【図５８−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５８−２】図５８−１の説明を参照のこと。
【図５９−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．３に関するデータを提供する（表５参照）。
【図５９−２】図５９−１の説明を参照のこと。
【図６０−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１３に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６０−２】図６０−１の説明を参照のこと。
【図６１−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１４に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６１−２】図６１−１の説明を参照のこと。
【図６２−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１６に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６２−２】図６２−１の説明を参照のこと。
【図６３−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．１８に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６３−２】図６３−１の説明を参照のこと。
【図６４−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．２８に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６４−２】図６４−１の説明を参照のこと。
【図６５−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．２９に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６５−２】図６５−１の説明を参照のこと。
【図６６−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．３１に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６６−２】図６６−１の説明を参照のこと。
【図６７−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．３３に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６７−２】図６７−１の説明を参照のこと。
【図６８】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．４３に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６９−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．４４に関するデータを提供する（表５参照）。
【図６９−２】図６９−１の説明を参照のこと。
【図７０−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．４６に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７０−２】図７０−１の説明を参照のこと。
【図７１−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．４８に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７１−２】図７１−１の説明を参照のこと。
【図７２−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．５８に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７２−２】図７２−１の説明を参照のこと。
【図７３−１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１．５９に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７３−２】図７３−１の説明を参照のこと。
【図７４−１】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８２に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７４−２】図７４−１の説明を参照のこと。
【図７５−１】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８３に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７５−２】図７５−１の説明を参照のこと。
【図７６−１】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８４に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７６−２】図７６−１の説明を参照のこと。
【図７７−１】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８５に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７７−２】図７７−１の説明を参照のこと。
【図７８−１】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８６に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７８−２】図７８−１の説明を参照のこと。
【図７９−１】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．７６に関するデータを提供する（表５参照）。
【図７９−２】図７９−１の説明を参照のこと。
【図８０】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．７７に関するデータを提供する（表５参照）。
【図８１−１】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．７８に関するデータを提供する（表５参照）。
【図８１−２】図８１−１の説明を参照のこと。
【図８２】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．７９に関するデータを提供する（表５参照）。
【図８３】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８０に関するデータを提供する（表５参照）。
【図８４−１】ＣｙｎｏＢＭ．００２試料についての非トランスフェクト対照に関するデータを提供する。
【図８４−２】図８４−１の説明を参照のこと。
【図８４−３】図８４−１の説明を参照のこと。
【図８４−４】図８４−１の説明を参照のこと。
【図８５−１】ＮＬＳ−Ｃａｓ９−ＥＧＦＰ  ＢＣＬ１１ａ  ｇＲＮＡ  ＲＮＰのリポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ送達に関するデータを提供する。
【図８５−２】図８５−１の説明を参照のこと。
【図８５−３】図８５−１の説明を参照のこと。
【図８５−４】図８５−１の説明を参照のこと。
【図８６−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２  ＲＮＰのみ対照に関するデータを提供する（表５参照）。
【図８６−２】図８６−１の説明を参照のこと。
【図８６−３】図８６−１の説明を参照のこと。
【図８７−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８２に関するデータを提供する（表５参照）。
【図８７−２】図８７−１の説明を参照のこと。
【図８７−３】図８７−１の説明を参照のこと。
【図８７−４】図８７−１の説明を参照のこと。
【図８７−５】図８７−１の説明を参照のこと。
【図８８−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８３に関するデータを提供する（表５参照）。
【図８８−２】図８８−１の説明を参照のこと。
【図８８−３】図８８−１の説明を参照のこと。
【図８８−４】図８８−１の説明を参照のこと。
【図８８−５】図８８−１の説明を参照のこと。
【図８９−１】プロジェクトＣＹＮＯＢＭ．００２．８４に関するデータを提供する（表５参照）。
【図８９−２】図８９−１の説明を参照のこと。
【図８９−３】図８９−１の説明を参照のこと。
【図８９−４】図８９−１の説明を参照のこと。
【図８９−５】図８９−１の説明を参照のこと。
【図９０−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８５に関するデータを提供する（表５参照）。
【図９０−２】図９０−１の説明を参照のこと。
【図９０−３】図９０−１の説明を参照のこと。
【図９０−４】図９０−１の説明を参照のこと。
【図９０−５】図９０−１の説明を参照のこと。
【図９１−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８６に関するデータを提供する（表５参照）。
【図９１−２】図９１−１の説明を参照のこと。
【図９１−３】図９１−１の説明を参照のこと。
【図９１−４】図９１−１の説明を参照のこと。
【図９１−５】図９１−１の説明を参照のこと。
【図９２−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７５に関するデータを提供する（表５参照）。
【図９２−２】図９２−１の説明を参照のこと。
【図９２−３】図９２−１の説明を参照のこと。
【図９２−４】図９２−１の説明を参照のこと。
【図９３−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７６に関するデータを提供する（表５参照）。
【図９３−２】図９３−１の説明を参照のこと。
【図９３−３】図９３−１の説明を参照のこと。
【図９３−４】図９３−１の説明を参照のこと。
【図９４−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７７に関するデータを提供する（表５参照）。
【図９４−２】図９４−１の説明を参照のこと。
【図９４−３】図９４−１の説明を参照のこと。
【図９４−４】図９４−１の説明を参照のこと。
【図９５−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７８に関するデータを提供する（表５参照）。
【図９５−２】図９５−１の説明を参照のこと。
【図９５−３】図９５−１の説明を参照のこと。
【図９５−４】図９５−１の説明を参照のこと。
【図９６−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．７９に関するデータを提供する（表５参照）。
【図９６−２】図９６−１の説明を参照のこと。
【図９６−３】図９６−１の説明を参照のこと。
【図９６−４】図９６−１の説明を参照のこと。
【図９７−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８０に関するデータを提供する（表５参照）。
【図９７−２】図９７−１の説明を参照のこと。
【図９７−３】図９７−１の説明を参照のこと。
【図９７−４】図９７−１の説明を参照のこと。
【図９８−１】プロジェクトＣｙｎｏＢＭ．００２．８１に関するデータを提供する（表５参照）。
【図９８−２】図９８−１の説明を参照のこと。
【図９８−３】図９８−１の説明を参照のこと。
【図９８−４】図９８−１の説明を参照のこと。
【図９９】ＣｙｎｏＢＭ．００２  ＲＮＰのみ対照の定性的画像を提供する。
【図１００】プロジェクトＨＳＣ．００４のハイコンテントスクリーニングに関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０１】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１のハイコンテントスクリーニングに関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０２】プロジェクトＴＣＥＬＬ．００１のリポフェクタミンＣＲＩＳＰＲＭＡＸ対照に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０３】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０４】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．２に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０５−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．３に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０５−２】図１０５−１の説明を参照のこと。
【図１０６−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．４に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０６−２】図１０６−１の説明を参照のこと。
【図１０７−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．５に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０７−２】図１０７−１の説明を参照のこと。
【図１０８−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．６に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０８−２】図１０８−１の説明を参照のこと。
【図１０９−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．７に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１０９−２】図１０９−１の説明を参照のこと。
【図１１０−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．８に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１０−２】図１１０−１の説明を参照のこと。
【図１１１−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．９に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１１−２】図１１１−１の説明を参照のこと。
【図１１２−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１０に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１２−２】図１１２−１の説明を参照のこと。
【図１１３−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１１に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１３−２】図１１３−１の説明を参照のこと。
【図１１４−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１２に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１４−２】図１１４−１の説明を参照のこと。
【図１１５−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１３に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１５−２】図１１５−１の説明を参照のこと。
【図１１６−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１４に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１６−２】図１１６−１の説明を参照のこと。
【図１１７−１】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．１５に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１７−２】図１１７−１の説明を参照のこと。
【図１１８】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１についてのネガティブ対照に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１９−１】プロジェクトＢｌｏｏｄ．００２に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１１９−２】図１１９−１の説明を参照のこと。
【図１１９−３】図１１９−１の説明を参照のこと。
【図１２０】プロジェクトＴＣｅｌｌ．００１．２７に関するデータを提供する（表５参照）。
【図１２１−１】タンパク質表面に安定な荷電層を形成するためにアニオン性またはカチオン性ペプチド／材料を添加すべきかどうかを決定することを可能にするＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ（可能なペイロード）の電荷密度プロットを示す。
【図１２１−２】図１２１−１の説明を参照のこと。
【図１２２−１】タンパク質表面に安定な荷電層を形成するためにアニオン性またはカチオン性ペプチド／材料を添加すべきかどうかを決定することを可能にするスリーピングビューティートランスポゾン（可能なペイロード）の電荷密度プロットを示す。
【図１２２−２】図１２２−１の説明を参照のこと。
【図１２３−１】（２ｂ）その後の多層化学の付加、複数の核酸もしくは荷電治療薬の同時送達、または架橋による層安定化の有無を問わず、（２ａ）アンカー−リンカー−リガンドまたは独立型カチオン性アンカーのようなカチオン性アンカーの付加（２）の前にＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ表面上のカチオン性部位に固定する例示的なアニオン性ペプチド（長さ９〜１０アミノ酸、直径約１０ｎｍまでのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ）（１）を示す。
【図１２３−２】図１２３−１の説明を参照のこと。
【図１２４】Ｃａｓ９  ＲＮＰまたは任意の均質または双性イオン的に帯電した表面を含み得るコアテンプレートに基づく添加順序および静電マトリックス組成物の例を示す。
【図１２５−１】ＩＬ２Ｒに結合したＩＬ２のモデル化構造を提供する。
【図１２５−２】図１２５−１の説明を参照のこと。
【図１２６−１】一本鎖ＣＤ３抗体フラグメントのモデル化構造を提供する。
【図１２６−２】図１２６−１の説明を参照のこと。
【図１２７】Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）と複合体したシアロアドヘシンのＮ−末端のモデル化構造を提供する。
【図１２８】幹細胞因子（ＳＣＦ）のモデル化構造を提供する。
【図１２９】ｃＫｉｔ受容体フラグメントの合理的設計中に生成された画像の例を提供する。
【図１３０】ｃＫｉｔ受容体フラグメントの合理的設計中に生成された画像の例を提供する。
【図１３１】ｃＫｉｔ受容体フラグメントの合理的設計中に生成された画像の例を提供する。
【図１３２】合理的に設計されたｃＫｉｔ受容体フラグメントの分析からの円二色性データを提供する。
【図１３３】合理的に設計されたｃＫｉｔ受容体フラグメントの安定化された立体配座のモデリングを示す。
【図１３４−１】ＨＴＰがカチオン性ポリマー骨格の側鎖にコンジュゲートしている分枝ヒストン構造の一例を示す。右側のポリマーは前駆体骨格分子を表し、左側の分子は分枝構造のセグメントの一例である。
【図１３４−２】図１３４−１の説明を参照のこと。
【図１３４−３】図１３４−１の説明を参照のこと。
【図１３４−４】図１３４−１の説明を参照のこと。
【図１３４−５】図１３４−１の説明を参照のこと。
【図１３４−６】図１３４−１の説明を参照のこと。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
ヒストンおよびＨＴＰの例
例として、以下の配列が含まれるが、これらに限定されない。
2020502124.tif 000001
2020502124.tif 000002
2020502124.tif 000003
2020502124.tif 000004
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
本明細書中の１つ以上の天然のまたは修飾されたポリペプチド配列は、末端もしくは間欠性のアルギニン、リジン、またはヒスチジン配列で修飾され得る。一実施形態では、各ポリペプチドは、ナノ粒子コア内に等しいアミンモル濃度で含まれる。この実施形態では、各ポリペプチドのＣ末端は５Ｒ（５アルギニン）で修飾することができる。いくつかの実施形態では、各ポリペプチドのＣ末端は９Ｒ（９アルギニン）で修飾することができる。いくつかの実施形態では、各ポリペプチドのＮ末端は５Ｒ（５アルギニン）で修飾することができる。いくつかの実施形態では、各ポリペプチドのＮ末端は９Ｒ（９アルギニン）で修飾することができる。いくつかの場合では、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンフラグメント（例えば、ＨＴＰ）は、ＦＫＦＬカテプシンＢタンパク質分解性切断ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０６）またはＲＧＦＦＰカテプシンＤタンパク質分解性切断ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０７）とそれぞれ直列に架橋されている。いくつかの場合では、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンフラグメント（例えば、ＨＴＰ）は、５Ｒ（５アルギニン）、９Ｒ（９アルギニン）、５Ｋ（５リジン）、９Ｋ（９リジン）、５Ｈ（５ヒスチジン）、または９Ｈ（９ヒスチジン）カチオン性スペーサードメインによって直列に架橋され得る。いくつかの場合では、１つ以上のＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３および／またはＨ４ヒストンフラグメント（例えば、ＨＴＰ）は、それらのＮ末端でプロタミンにジスルフィド結合している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
（表３）以下の実験で使用される送達分子の特徴。標的指向リガンド名／命名形式：Ａ＿Ｂ＿Ｃ＿Ｄ＿Ｅ＿Ｆ、ここで、Ａ＝受容体名：リガンドが標的指向している受容体の名前、Ｂ＝標的指向リガンド供給源：受容体を標的指向するリガンドの名前（リガンドが野生型でない場合は修飾の接頭辞「ｍ」または「ｒｍ」）、Ｃ＝リンカー名、Ｄ＝荷電ポリペプチド名、Ｅ＝Ｂに基づくリンカー末端、およびＦ＝バージョン番号（同じＷＴに由来するがＡＡ配列が異なる２つの修飾標的指向リガンドを区別するため）。
2020502124.tif 000005
2020502124.tif 000006
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７９】
実施例１０
図１２５．ペプチド工学−ＩＬ２Ｒ標的指向のための新規なＩＬ２模倣フラグメント。インターロイキン２受容体（右）に結合したインターロイキン２（左）（ＰＤＢ：１Ｚ９２）
配列ＡＳＮ（３３）−ＰＲＯ（３４）−ＬＹＳ（３５）−ＬＥＵ（３６）−ＴＨＲ（３７）−ＡＲＧ（３８）−ＭＥＴ（３９）−ＬＥＵ（４０）−ＴＨＲ（４１）−ＰＨＥ（４２）−ＬＹＳ（４３）−ＰＨＥ（４４）−ＴＹＲ（４５）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０３）は、ＩＬ２（ＰＤＢ  １Ｚ９２）から選択され、ＩＬ２受容体α鎖への活性結合の領域と相関する。ＩＬ２ＲとＩＬ２の相互作用モチーフを選択することによる相補的結合の操作：ここで、配列ＣＹＳ（３）−ＡＳＰ（４）−ＡＳＰ（５）−ＡＳＰ（６）−ＭＥＴ（２５）−ＬＥＵ（２６）−ＡＳＮ（２７）−ＣＹＳ（２８）−ＧＬＵ（２９）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０８）は、ＩＬ２受容体からの２つの結合モチーフについて選択される。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８０】
図１２６：ペプチド工学−ＣＤ３を用いた新しい抗体由来の「アクティブバインディングポケット」エンジニアリング概念実証。配列ＴＨＲ（３０）−ＧＬＹ（３１）−ＡＳＮ（５２）−ＰＲＯ（５３）−ＴＹＲ（５４）−ＬＹＳ（５５）−ＧＬＹ（５６）−ＶＡＬ（５７）−ＳＥＲ（５８）−ＴＨＲ（５９）−ＴＹＲ（１０１）−ＴＹＲ（１０２）−ＧＬＹ（１０３）−ＡＳＰ（１０４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０９）はＣＤ３抗体（ＰＤＢ  １ＸＩＷ）から選択され、ＣＤ３イプシロンおよびデルタ鎖への活性結合の領域と相関する。アミノ酸の順序は、より大きいタンパク質によって維持されている三次構造をもはや持たない結合ポケット内のペプチドの二次元平面の結合動力学を反映するために再配列される。この寸法減少は以下の結果をもたらす：ＴＨＲ（５９）−ＳＥＲ（５８）−ＶＡＬ（５７）−ＧＬＹ（５６）−ＬＹＳ（５５）−ＴＹＲ（５４）−ＰＲＯ（５３）−ＡＳＮ（５２）−ＴＨＲ（３０）−ＧＬＹ（３１）−ＴＹＲ（１０１）−ＴＹＲ（１０２）−ＧＬＹ（１０３）−ＡＳＰ（１０４）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０４）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８１】
図１２７：ペプチド工学−ＣＤ４５グリコシル化標的指向のための新規なＳＩＧＬＥＣ誘導体。Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）との複合体中のシアロアドヘシンＮ末端のＰＤＢレンダリング（ＲＣＳ  ＰＤＢ  １ＯＤＡ）。レンダリングにおいてシアロアドヘシンに近いシアロアドヘシンフラグメントを、グリコシル化ＣＤ４５および他の複雑な細胞表面糖タンパク質を標的指向するために利用した。ＴＣＥＬＬ．００１．３のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＰ、同様ににＢＬＯＯＤ．００２．１〜ＢＬＯＯＤ．００２．２の全血リンパ球ゲートのｍＲＮＡでＴ細胞の標的指向に成功した。リガンドの配列は、ＳＮＲＷＬＤＶＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０５）である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８２】
図１２８：ペプチド工学−ｃ−Ｋｉｔ標的指向のための新規なＳＣＦフラグメント。破線の丸−幹細胞因子のシグナルペプチドドメイン（ＲＣＳ  ＰＤＢ  １ＳＣＦ）は、ｃ−Ｋｉｔ活性に必要な二量体ドメインを表す。特定のナノ粒子表面サイズ＋ＳＣＦコーティング密度による細胞取り込みに対するリガンド提示の効果は、ＣｙｎｏＢＭ．００２．７９（約５％の効率）とＣｙｎｏＢＭ．００２．８５（約５６％の効率）との間で比較対照することができる。さらに、Ｅ−セレクチン＋ＳＣＦフラグメント（ＨＳＣ．００４．７３）は高い効率を達成するが、ＳＣＦフラグメントはそれ自体では達成せず（ＨＳＣ．００４．７４）、コントラストがヒトＣＤ３４＋造血幹細胞トランスフェクションの定性的画像と共に表示される。挙動の著しい相違は、エンドサイトーシスの合図を生じさせ、続いて核酸および／またはリボ核タンパク質材料を核内標的指向する際の二量体ペプチドの特定の役割を示唆している。リガンドの配列は、
2020502124.tif 000007
である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８３】
図１２９：ペプチド工学−膜結合ＳＣＦ標的指向のための新規ｃＫｉｔ受容体フラグメント。内皮細胞および骨髄細胞上での造血幹細胞ローリング挙動の挙動を模倣し、全身的トランスフェクション効率を高めるための、ｃ−Ｋｉｔ由来の幹細胞因子標的指向ペプチドの合理的設計（ＣｙｎｏＢＭ．００２．８０を参照）。折り畳みについて評価した配列：名称ＳＣＦＮ、配列：
2020502124.tif 000008
。ＲｏｓｅｔｔａおよびＮＡＭＤシミュレーションパッケージを用いて配列を評価した。Ｒｏｓｅｔｔａ結果：ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ折り畳みのために短縮配列をＲｏｓｅｔｔａに入れた
2020502124.tif 000009
。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８８】
青い鎖は、残基７１〜９４：
2020502124.tif 000010
の範囲の、ＫＩＴ中に存在するより規則的な螺旋を表した。アンカーおよびリンカーを有するＫＩＴ残基７１〜９４のＮＡＭＤシミュレーション：
2020502124.tif 000011
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８９】
鎖がリンカー残基と強く相互作用する構造に収束した。残基７１〜９４については、ＫＩＴ中の他の２つのヘリックスと相互作用することによってヘリックスを安定化させる疎水性残基がある。疎水性残基は、赤（下線）で示されている：
2020502124.tif 000012
。疎水性残基を除去するために配列を変更し、螺旋状の折り畳みを誘導するのを助けるアミノイソ酪酸（Ａｉｂ）で置き換えて、以下の配列に到達した：ＫＩＴ７１９４＿ＡＩＢ１：
2020502124.tif 000013
。Ａｉｂを含む配列をＲｉｎｋ樹脂上で合成し、遊離アミンおよびアシル化アミン（Ａｃ）で単離した。二次構造は円二色性によって調べた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９０】
図１３２：ペプチド工学−ｃＫｉｔ受容体フラグメント（続き）
ＳＣＦ＿ｍｃＫｉｔ＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿ＮおよびＳＣＦ＿ｍｃＫｉｔ（Ａｃ）＿（４ＧＳ）２＿９Ｒ＿Ｎの円二色性リガンド末端のアセチル化は、荷電ポリペプチド末端の電荷を中和するために利用され得る。上：ＫＩＴ７１９４＿ＡＩＢ１のＣＤは、アルファヘリックスおよびＡｉｂ単位を含むヘリックスの二次構造と一致して、２２２付近でわずかに落ち込み、２０８付近で大きな落ち込みを示している。下：ＫＩＴ７１９４＿ＡＩＢ１＿Ａｃは、ＫＩＴ７１９４＿ＡＩＢ１と同じＣＤを示している。時々アシル化は折りたたみを助け得るが、それは必要ではないようである。アセチル化はまた、末端アミンが荷電よりもむしろ中性である必要があるリガンド相互作用を助け得る。完全アンカー−リンカー−ＫＩＴ７１９４＿ＡＩＢ１構築物：
2020502124.tif 000014
。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020502124000001.app