【手続補正書】
【提出日】令和3年5月17日(2021.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；又は
（ｃ）前記配列番号１のアミノ酸配列の断片若しくは前記配列番号１のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列
を含む、Ｏ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列又はその断片が、モチーフＨＥｂｂＨ（式中、ｂは、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷである）を含み、任意で、前記モチーフが、配列番号１の１８１位〜１８５位に対応する位置において前記ポリペプチド中に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記モチーフが、配列ＨＥＩＧＨ又はＨＥＬＧＨ、好ましくはＨＥＬＧＨを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
（ａ）ａが、アミノ酸Ｖ、Ｔ、又はＧであり；
（ｂ）ｂが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷであり；
（ｃ）ｘが、任意のアミノ酸であり；
（ｄ）ｃが、疎水性アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、又はＹである、モチーフａｂｘＨＥｂｂＨｂｃを含み、
任意で、前記モチーフが、配列ＧＭＡＨＥＬＧＨＧＬ又はＧＶＡＨＥＬＧＨＮＦ、好ましくはＧＭＡＨＥＬＧＨＧＬを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるＨｉｓタグを含み、前記タグが、リンカーによって前記Ｃ末端に連結されていてよく、任意で、前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含むか又は配列番号２のアミノ酸配列からなる；又は
（ｂ）前記ポリペプチドが、溶液中で提供されるか、凍結乾燥されているか、又は固定化されており、任意で、前記ポリペプチドが、シアリダーゼ、好ましくはＡｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物と共に提供され、Ａｍ１７５７が、配列番号１１からなるポリペプチドである及び／又はＡｍ０７０７が、配列番号１４からなるポリペプチドである、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｏ−糖タンパク質を加水分解する方法であって、前記タンパク質を含むサンプルを請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させること及びそれによってＯ−糖タンパク質を加水分解することを含み、任意で、加水分解生成物を検出又は分析することを更に含む方法。
【請求項７】
タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、前記タンパク質を含むサンプルを請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることと、生成された生成物を検出及び／又は分析することとを含み、任意で、切断生成物の有無を使用して前記サンプル中のＯ−糖タンパク質の有無を判定する、並びに／又は前記分析を実施してＯ−グリカン鎖の種類及び／若しくはそのＯ−糖タンパク質への結合位置を同定する、方法。
【請求項８】
前記分析又は検出が、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、又は質量分析によって実施される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質又はサンプルを請求項１〜５に記載のポリペプチドと接触させる前に又は同時に、前記サンプルをシアリダーゼと共にインキュベートし、好ましくは、前記シアリダーゼが、Ａｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物であり、Ａｍ１７５７が、配列番号９〜１１のいずれか１つのポリペプチドである及びＡｍ０７０７が、配列番号１２〜１４のいずれか１つのポリペプチドである、
請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シアリダーゼが、Ａｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物であり、Ａｍ１７５７が、配列番号１１からなるポリペプチドである及び／又はＡｍ０７０７が、配列番号１４からなるポリペプチドである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｏ−グリカン又はＯ−糖タンパク質に結合することができ、Ｏ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドであって、配列番号５若しくは配列番号２０のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１２】
（ａ）Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるＨｉｓタグを含み、前記タグが、リンカーによって前記Ｃ末端に連結されていてよく、任意で、前記ポリペプチドが、配列番号６又は２１のアミノ酸配列を含むか又は配列番号６又は２１のアミノ酸配列からなる；及び／又は
（ｂ）前記ポリペプチドが、溶液中で提供されるか、凍結乾燥されているか、又は固定化されており、任意で、前記ポリペプチドが、シアリダーゼ、好ましくはＡｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物と共に提供され、Ａｍ１７５７が、配列番号９〜１１のいずれか１つのポリペプチドである及びＡｍ０７０７が、配列番号１２〜１４のいずれか１つのポリペプチドである、
、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／又はＯ−糖タンパク質に結合させる方法であって、前記Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／又はＯ−糖タンパク質を含むサンプルを請求項１１又は１２に記載のポリペプチドと接触させることと、任意で、Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／若しくはＯ−糖タンパク質が結合しているかどうかを判定すること、並びに／又は得られた混合物から前記Ｏ−グリカン及び任意の結合している糖タンパク質、前記Ｏ−糖ペプチド、若しくは前記Ｏ−糖タンパク質を分離することとを含み、任意で、Ｏ−グリカン若しくは結合している糖タンパク質、Ｏ−糖ペプチド、又はＯ−糖タンパク質を前記サンプルから単離することを目的とする方法。
【請求項１４】
タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、前記タンパク質を含むサンプルを請求項１１又は１２に記載のポリペプチドと接触させることと、前記タンパク質が前記ポリペプチドに結合しているかどうかを判定することとを含む、方法。
【請求項１５】
サンプル中のＯ−糖ペプチド及び／又はＯ−糖タンパク質を検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルを請求項１１又は１２に記載のポリペプチドと接触させて、Ｏ−糖ペプチド及び／又はＯ−糖タンパク質と前記ポリペプチドとの間で複合体を形成させることと；
（ｂ）任意で、接触させたサンプルから前記ポリペプチドを分離することと；
（ｃ）分離されたポリペプチドがＯ−結合型の糖タンパク質又は糖ペプチドに結合しているかどうかを判定して、前記サンプル中のＯ−結合型の糖ペプチド又は糖タンパク質の有無を判定することと
を含む、方法。
【請求項１６】
（Ａ）前記判定及び／又は分離が、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、レクチンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又は質量分析によって実施される；及び／又は
（Ｂ）結合している物質を、請求項１１又は１２に記載のポリペプチドから、
（ａ）高モル濃度の尿素；
（ｂ）高濃度の洗浄剤；又は
（ｃ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド
を含むバッファで溶出する工程を更に含む、
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。