【手続補正書】
【提出日】令和3年10月5日(2021.10.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非多能性細胞をリプログラミングして多能性細胞、その細胞株または集団を生成する方法であって、
（ａ）第１の細胞であって、非多能性細胞である、第１の細胞に、
１つ以上の第１のプラスミドであって、前記第１のプラスミドは、複製起点、および１つ以上のリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の第１のプラスミドのうちの少なくとも１つが、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含み、１つ以上の第１のプラスミドの導入が、リプログラミングプロセスを誘導する、１つ以上の第１のプラスミドと、任意選択的に、
（１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点、またはリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、第２のプラスミド、（２）ＥＢＮＡ  ｍＲＮＡおよび（３）ＥＢＮＡタンパク質、のうちの１つと、を導入することと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）からの細胞を培養して、第２の細胞を生成することであって、前記第２の細胞が、リプログラミング細胞であり、前記リプログラミング細胞は、前記第１の細胞からの形態学的変化を含みかつ本質的にＥＢＮＡを含まず、前記リプログラミング細胞は、
（１）多能性細胞形態と、
（２）内在性ＯＣＴ４発現と、を含まない、第２の細胞を生成することと、
（ｃ）多能性細胞を生成するのに十分な時間、ステップ（ｂ）で得られた前記第２の細胞をさらに培養することと、を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）が、ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドを前記第１の細胞に導入することを含み、前記第２のプラスミドが、複製起点、またはリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
(i)  前記多能性細胞を解離して、単一細胞の解離した多能性細胞を得ること、
(ii)   前記単一細胞の解離した多能性細胞を懸濁させること、
(iii)   １つ以上の多能性マーカーを発現する細胞を選択および単離して、前記マーカーを発現する多能性細胞を濃縮することにより、前記単一細胞の解離した多能性細胞を選別すること、及び
(iv)  ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤の存在下で前記多能性細胞を培養して、多能性を維持することをさらに含み、前記多能性細胞は少なくとも５、１０、１５、または２０継代にわたって多能性を維持すること、
から成る群より選ばれる少なくとも１つをさらに含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
(i)  ステップ（ｂ）における培養が、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つの存在下で培養することを含む、
(ii)  前記第１の細胞が体細胞、前駆細胞、または多分化能細胞である、
(iii)  前記第１の細胞が線維芽細胞であり、前記第２の細胞の前記形態学的変化がＭＥＴ（間葉から上皮への転換）を含む、
(iv)  前記第２の細胞が、ステップ（ａ）のプラスミドを本質的に含まない、
(v)  前記第２の細胞が、ステップ（ａ）における１つ以上の第１のプラスミドの前記導入後、約４〜１０、１２、１４、２１、２５日、またはその間の任意の日数までのリプログラミング細胞を含む、
(vi)  前記多能性細胞は、多能性復帰または自発的分化が低減している、
(vii)  前記多能性細胞が、選択または前記多能性細胞の広範な継代を必要とせずに、前記ステップ（ａ）のプラスミドの前記ポリヌクレオチドを本質的に含まない、
(viii)  前記多能性細胞が、以下の特性
（１）高いクローン性、
（２）遺伝的安定性、および
（３）基底状態の多能性、のうちの少なくとも１つを有する、
及び／又は
(ix)  前記多能性細胞が、胚体外細胞に関連する再活性化遺伝子を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
(i)  前記第２のプラスミドが、高い損失率を有し、かつ／またはＥＢＮＡの発現が一過性かつ一時的である、
(ii)  前記複製起点および／またはＥＢＮＡが、ＥＢＶベースである、
(iii)  前記細胞が、フィーダーフリー条件下にある、
及び／又は
(iv)  前記ＲＯＣＫ阻害剤が、チアゾビビンである、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１つ以上の第１のプラスミドであって、前記第１のプラスミドが、複製起点、および１つ以上のリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の第１のプラスミドのうちの少なくとも１つが、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含む、１つ以上の第１のプラスミドと、任意選択的に、
（１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点またはリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、第２のプラスミド、
（２）ＥＢＮＡ  ｍＲＮＡおよび
（３）ＥＢＮＡタンパク質、のうちの１つと、を非多能性細胞に導入した後に得られるリプログラミング細胞またはその集団であって、
前記リプログラミング細胞は、プラスミドの組み合わせの前記導入前の前記非多能性細胞からの形態学的変化を含み、本質的にＥＢＮＡまたはその誘導体を含まず、
前記リプログラミング細胞は、
（１）多能性細胞形態と、
（２）内在性ＯＣＴ４発現を含まず、
前記リプログラミング細胞は、多能性細胞を生成するのに十分な時間を与えられると、安定したまたは自己持続的多能性を確立することができる、リプログラミング細胞またはその集団。
【請求項７】
(i)  前記リプログラミング細胞が、１つ以上の第１のプラスミドの前記導入後、約４〜１０、１２、１４、２１、２５日、またはその間の任意の日数までのものである、
(ii)  前記リプログラミング細胞が、ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、およびＲＯＣＫ阻害剤のうちの少なくとも１つの存在下で培養される、
(iii)  前記非多能性細胞が線維芽細胞であり、前記リプログラミング細胞の前記形態学的変化がＭＥＴ（間葉から上皮への転換）を含む、
(iv)  前記リプログラミング細胞が第１および／または第２のプラスミドを本質的に含まない、
(v)  前記多能性細胞が、選択または前記多能性細胞の広範な継代を必要とせずに、前記プラスミドの前記ポリヌクレオチドを本質的に含まない、
(vi)  前記多能性細胞が、多能性復帰または自発的分化が低減している、
(vii)  前記多能性細胞が以下の特性
（１）高いクローン性、
（２）遺伝的安定性、および
（３）基底状態の多能性、のうちの少なくとも１つを有する、
及び／又は
(viii)  前記多能性細胞が、胚体外細胞に関連する再活性化遺伝子を含む、
請求項６に記載のリプログラミング細胞またはその集団。
【請求項８】
請求項６又は７に記載のリプログラミング細胞またはその集団を含む組成物。
【請求項９】
ＴＧＦβ阻害剤、ＧＳＫ３阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＲＯＣＫ阻害剤を含む培地をさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
(i)  前記ＲＯＣＫ阻害剤が、チアゾビビンである、
及び／又は
(ii)  前記培地が、フィーダーフリーである、
請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により産生された場合の、単離した多能性細胞または多能性細胞株。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により産生された前記単離した多能性細胞または細胞株を使用して、ゲノム操作した多能性細胞またはその細胞株。
【請求項１３】
請求項１１に記載の単離した多能性細胞もしくは細胞株から、または請求項１２に記載のゲノム操作した多能性細胞もしくは細胞株から再分化した由来非天然細胞。
【請求項１４】
(i)  前記細胞が免疫細胞様であり、前記細胞がＣＤ３４細胞、造血性内皮細胞、造血幹細胞もしくは前駆細胞、造血多分化能前駆細胞、Ｔ細胞前駆細胞、ＮＫ細胞前駆細胞、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または免疫制御性細胞を含む、
及び／又は
(ii)  前記細胞が、その天然の細胞対応物と比較して、以下の特性：ヘテロクロマチンの全体的増加、ミトコンドリア機能の改善、ＤＮＡ損傷応答の増加、テロメアの伸長および短いテロメアの割合の減少、老化細胞の割合の減少、ならびに増殖、生存、持続、または記憶様機能に対するより高い可能性、のうちの少なくとも１つを含む若返り細胞である、
請求項１３に記載の由来非天然細胞。
【請求項１５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により得られた多能性細胞と、任意選択的に１つ以上の追加の治療薬とを含む、治療的使用のための組成物。
【請求項１６】
請求項１２に記載のゲノム操作した多能性細胞または請求項１３又は１４に記載の由来非天然細胞と、任意選択的に１つ以上の追加の治療薬とを含む、治療的使用のための組成物。
【請求項１７】
治療が必要な対象の治療に使用するための請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
細胞ベースの治療に適用するための多能性細胞の製造に使用するための組成物であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により産生された多能性細胞を含む、組成物。
【請求項１９】
前記多能性細胞が同種異系または自己である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法により得られた多能性細胞を含む、医薬使用のためのキット。
【請求項２１】
請求項１２に記載のゲノム操作した多能性細胞または請求項１３又は１４に記載の由来非天然細胞を含む医薬使用のためのキット。
【請求項２２】
非多能性細胞でリプログラミングを開始するためのインビトロシステムであって、前記システムが、
１つ以上の第１のプラスミドであって、前記第１のプラスミドは、複製起点、および１つ以上のリプログラミング因子をコードするがＥＢＮＡまたはその誘導体をコードしないポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の第１のプラスミドのうちの少なくとも１つが、ＯＣＴ４をコードするポリヌクレオチドを含む、１つ以上の第１のプラスミドと、任意選択的に、
（１）ＥＢＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む第２のプラスミドであって、複製起点またはリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを含まない、第２のプラスミド、
（２）ＥＢＮＡ  ｍＲＮＡおよび
（３）ＥＢＮＡタンパク質、のうちの１つと、を含む、インビトロシステム。
【請求項２３】
前記第２のプラスミドが、高い損失率を有し、前記ＥＢＮＡの発現は一過性かつ一時的である、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
(i)  前記システムが、核内でＥＢＮＡ複製および／または連続発現を提供しない、
(ii)  前記システムが、短期間、かつ多能性細胞形態の出現および内在性多能性遺伝子の誘導発現の前に、ＥＢＮＡの一過性／細胞質発現を可能にする、
(iii)  前記システムが、短期間、かつ多能性細胞形態の出現および内在性多能性遺伝子の誘導発現の前に、第１のプラスミドに含まれる１つ以上のリプログラミング因子の一過性／細胞質発現を可能にする、
(iv)  前記複製起点が、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｎａｅウイルス、およびＧａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅウイルスからなる群より選択される、
(v)  前記複製起点が、ＳＶ４０、ＢＫウイルス（ＢＫＶ）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、またはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）からなる群から選択されるものである、
(vi)  前記複製起点が、ＥＢＶの野生型複製起点に対応するか、または由来する、
(vii)  前記ＥＢＮＡが、ＥＢＶベースである、
(viii)  前記１つ以上の第１のプラスミドが、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ、ＬＩＮ２８、ｃ−ＭＹＣ、ＥＣＡＴ１、ＵＴＦ１、ＥＳＲＲＢ、ＨＥＳＲＧ、ＣＤＨ１、ＴＤＧＦ１、ＤＰＰＡ４、ＤＮＭＴ３Ｂ、ＺＩＣ３、およびＬ１ＴＤ１のうちの１つ以上を含むリプログラミング因子をコードするポリヌクレオチドを集合的に含む、
(ix)  リプログラミング因子をコードする前記ポリヌクレオチドが、ポリシストロン性構築物または非ポリシストロン性構築物に含まれる、
(x)  前記ポリシストロン性構築物が、単一のオープンリーディングフレームまたは複数のオープンリーディングフレームを含む、
(xi)  前記システムが、２つ以上の第１のプラスミドを含み、各第１のプラスミドがポリヌクレオチドの少なくとも１つのコピーによりコードされる同じまたは異なるリプログラミング因子を含む、
(xii)  ２つ以上の第１のプラスミドを含む前記システムが、リプログラミング因子の化学量論の制御を提供する、
及び／又は
(xiii)  前記第１のプラスミドが、リプログラミング因子をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを含み、隣接するポリヌクレオチドが自己切断性ペプチドまたはＩＲＥＳをコードするリンカー配列により作動可能に連結される、
請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
(i)  前記自己切断性ペプチドが、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｐ２Ａ、およびＴ２Ａを含む群から選択される２Ａペプチドである、
(ii)  第１のプラスミド構築物に含まれる前記２Ａペプチドが、同じであっても異なっていてもよい、
(iii)  隣接する位置にある２つの２Ａペプチドが異なる、請求項４５〜６１のいずれか一項に記載のシステム。
(iv)  前記第１および前記第２のプラスミドがそれぞれ、リプログラミング因子およびＥＢＮＡの発現のための１つ以上のプロモーターを含み、かつ前記１つ以上のプロモーターがＣＭＶ、ＥＦ１α、ＰＧＫ、ＣＡＧ、ＵＢＣ、および構成的、誘導的、内因的に調節された、または時間特異的、組織特異的もしくは細胞型特異的な他の適切なプロモーターのうちの少なくとも１つを含む、
及び／又は
(v)  前記第１および前記第２のプラスミドがそれぞれ、ＣＡＧプロモーターを含む、
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項２６】
請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のシステムを含むキット。