【手続補正書】
【提出日】令和3年7月30日(2021.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する方法であって、
（ａ）非ヒト動物に、前記標的ゲノム遺伝子座のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを導入するステップであって、前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡをコードするＲＮＡまたはＤＮＡとして導入され、
前記非ヒト動物が、１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含む、ステップ；および
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座の前記改変を評価するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記ガイドＲＮＡが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達によって導入され、必要に応じて、前記ＡＡＶが、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９であり、ステップ（ｂ）が、肝臓において前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ８であり、ステップ（ｂ）が、肝臓において前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ガイドＲＮＡの前記非ヒト動物への投与経路が、静脈内注射、実質内注射、腹腔内注射、点鼻、または硝子体内注射である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）において外因性ドナー核酸が導入され、前記外因性ドナー核酸が、前記標的ゲノム遺伝子座と組み換わるように設計されており、必要に応じて、前記外因性ドナー核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記非ヒト動物が、ラットまたはマウスである、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記非ヒト動物が、前記マウスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（Ｉ）前記標的ゲノム遺伝子座が標的遺伝子を含み、ステップ（ｂ）が、前記標的遺伝子の発現または前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を測定することを含む；ならびに／あるいは
（ＩＩ）ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から単離された１つまたは複数の細胞中の前記標的ゲノム遺伝子座を配列決定することを含む；ならびに／あるいは
（ＩＩＩ）ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から標的器官または組織を単離すること、および前記標的器官または組織中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む；ならびに／あるいは
（ＩＶ）ステップ（ｂ）が、前記標的器官または組織内の２つまたはそれより多い異なる細胞型中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む；ならびに／あるいは
（Ｖ）ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から非標的器官または組織を単離すること、および前記非標的器官または組織中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｃａｓタンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、前記ポリアデニル化シグナルが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、前記Ｃａｓ発現カセット中の前記ポリアデニル化シグナルが、組織特異的様式で切り出されているか、または肝臓中で切り出されている、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記リコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非ヒト動物が、組織特異的プロモーターまたは表２に記載のプロモーターのうちの１つに作動可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ発現カセットをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｃａｓタンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、前記ポリアデニル化シグナルが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、前記方法が、リコンビナーゼを、組織特異的様式で前記非ヒト動物に導入するステップをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記リコンビナーゼが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって導入される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含み、前記Ｃａｓ発現カセットが、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた前記Ｃａｓタンパク質のコード配列および前記蛍光タンパク質コード配列を含むマルチシストロン性核酸を含む、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記マルチシストロン性核酸が、介在Ｐ２Ａペプチドコード配列によって隔てられた前記Ｃａｓタンパク質のコード配列および緑色蛍光タンパク質コード配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含まない、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｃａｓタンパク質がタンパク質タグを含む、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃａｓ発現カセットの５’末端が、３’スプライシング配列をさらに含む、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｃａｓ発現カセットが、内因性プロモーターまたは外因性の構成的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｃａｓ発現カセットが、
（Ｉ）配列番号１３、１６、１９、または２２に記載の配列を含むタンパク質をコードする；
（ＩＩ）配列番号２８、２９、３０、または３１に記載の配列を含む；あるいは
（ＩＩＩ）配列番号１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、または２１に記載の配列を含む、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｃａｓ発現カセットが、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記セーフハーバー遺伝子座が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座であり、前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに組み込まれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてヘテロ接合性である、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてホモ接合性である、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記非ヒト動物が、マウスであり、
前記ガイドＲＮＡが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達によって導入され、
前記ＡＡＶが、静脈内注射によって前記非ヒト動物に送達されるＡＡＶ８であり、
前記Ｃａｓ発現カセットが内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結されており、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって、（ｉ）３’スプライシング配列；および（ｉｉ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓ９タンパク質のコード配列を含み、
前記Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１９に記載の配列を含み、
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の肝臓中での前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、請求項１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を最適化する方法であって、
（Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目の請求項１から２６のいずれかに記載の方法を実施するステップ；
（ＩＩ）変数を変更し、第２の非ヒト動物において変更された前記変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）に記載の方法を実施するステップ；および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における前記標的ゲノム遺伝子座の改変と、ステップ（ＩＩ）における前記標的ゲノム遺伝子座の改変とを比較し、より高い有効性、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性のうちの１つまたは複数を有する標的ゲノム遺伝子座の改変をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。
【請求項２８】
（Ｉ）前記ガイドＲＮＡが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達によって導入され、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記ＡＡＶ血清型である；
（ＩＩ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記ガイドＲＮＡを前記非ヒト動物に導入する投与経路である；
（ＩＩＩ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡの濃度または量である；
（ＩＶ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡである；
（Ｖ）前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記外因性ドナー核酸を前記非ヒト動物に導入する送達方法である；
（ＶＩ）前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記外因性ドナー核酸を前記非ヒト動物に導入する投与経路である；
（ＶＩＩ）前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸の濃度または量である；
（ＶＩＩＩ）前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡの濃度または量である；あるいは
（ＩＸ）ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物。
【請求項３０】
前記非ヒト動物が、ラットまたはマウスである、請求項２９に記載の非ヒト動物。
【請求項３１】
前記非ヒト動物が、前記マウスである、請求項３０に記載の非ヒト動物。
【請求項３２】
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項３３】
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｃａｓタンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、前記ポリアデニル化シグナルが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、前記Ｃａｓ発現カセット中の前記ポリアデニル化シグナルが、組織特異的様式で切り出されているか、または肝臓中で切り出されている、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項３４】
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記リコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼである、請求項３３に記載の非ヒト動物。
【請求項３５】
前記非ヒト動物が、組織特異的プロモーターまたは表２に記載のプロモーターのうちの１つに作動可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ発現カセットをさらに含む、請求項３４に記載の非ヒト動物。
【請求項３６】
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含み、前記Ｃａｓ発現カセットが、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた前記Ｃａｓタンパク質のコード配列および前記蛍光タンパク質コード配列を含むマルチシストロン性核酸を含む、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項３７】
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記マルチシストロン性核酸が、介在Ｐ２Ａペプチドコード配列によって隔てられた前記Ｃａｓタンパク質のコード配列および緑色蛍光タンパク質コード配列を含む、請求項３６に記載の非ヒト動物。
【請求項３８】
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含まない、請求項２９から３５のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項３９】
前記Ｃａｓタンパク質がタンパク質タグを含む、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項４０】
前記Ｃａｓ発現カセットの５’末端が、３’スプライシング配列をさらに含む、請求項２９から３９のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項４１】
前記Ｃａｓ発現カセットが、内因性プロモーターまたは外因性の構成的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２９から４０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項４２】
前記Ｃａｓ発現カセットが、
（Ｉ）配列番号１３、１６、１９、または２２に記載の配列を含むタンパク質をコードする；
（ＩＩ）配列番号２８、２９、３０、または３１に記載の配列を含む；あるいは
（ＩＩＩ）配列番号１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、または２１に記載の配列を含む、請求項２９から４１のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項４３】
前記Ｃａｓ発現カセットが、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる、請求項２９から４２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項４４】
前記セーフハーバー遺伝子座が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座であり、前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに組み込まれる、請求項４３に記載の非ヒト動物。
【請求項４５】
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてヘテロ接合性である、請求項２９から４４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項４６】
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてホモ接合性である、請求項２９から４４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項４７】
前記非ヒト動物が、マウスであり、
前記Ｃａｓ発現カセットが内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結されており、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって、（ｉ）３’スプライシング配列；および（ｉｉ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓ９タンパク質のコード配列を含み、
前記Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１９に記載の配列を含む、請求項２９から４６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項４８】
１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物細胞。
【請求項４９】
相同アームによって挟まれたＣａｓ発現カセットを含む標的化ベクターであって、前記Ｃａｓ発現カセットが、１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含み、前記相同アームが、ゲノム組込みを容易にするための所望の標的ゲノム遺伝子座との組換えを方向付けるのに好適である、標的化ベクター。
【請求項５０】
請求項２９から４７のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製するための方法であって、
（Ｉ）（ａ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含むＣａｓ発現カセットを含むように、非ヒト動物の多能性細胞のゲノムを改変するステップ；
（ｂ）前記Ｃａｓ発現カセットを含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；
（ｃ）遺伝子改変された多能性細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および
（ｄ）非ヒト動物代理母に前記非ヒト動物宿主胚を埋め込み、懐胎させるステップ；あるいは
（ＩＩ）（ａ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含むＣａｓ発現カセットを含むように非ヒト動物の１細胞期胚のゲノムを改変するステップ；
（ｂ）前記Ｃａｓ発現カセットを含む遺伝子改変された１細胞期胚を選択するステップ；および
（ｃ）非ヒト動物代理母に前記遺伝子改変された１細胞期胚を埋め込み、懐胎させるステップ
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、ＡＡＶ血清型である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、ガイドＲＮＡを非ヒト動物に導入する投与経路である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入されるガイドＲＮＡの濃度または量である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入されるガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡの形態または配列）である。一部のそのような方法では、方法は、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、外因性ドナー核酸を非ヒト動物に導入する送達方法である。一部のそのような方法では、方法は、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、外因性ドナー核酸を非ヒト動物に導入する投与経路である。一部のそのような方法では、方法は、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸の濃度または量である。一部のそのような方法では、方法は、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸の濃度または量と比較した、非ヒト動物に導入されるガイドＲＮＡの濃度または量である。一部のそのような方法では、ステップ（ＩＩ）における変更された変数は、非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸（例えば、外因性ドナー核酸の形態）である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を試験する方法であって、
（ａ）非ヒト動物に、前記標的ゲノム遺伝子座のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計されたガイドＲＮＡを導入するステップであって、
前記非ヒト動物が、１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含み、
前記ガイドＲＮＡが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達によって導入される、ステップ；および
（ｂ）前記標的ゲノム遺伝子座の前記改変を評価するステップ
を含む、方法。
（項目２）
前記ＡＡＶが、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９であり、ステップ（ｂ）が、肝臓において前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＡＡＶがＡＡＶ８である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ＡＡＶの前記非ヒト動物への投与経路が、静脈内注射、実質内注射、腹腔内注射、点鼻、または硝子体内注射である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
ステップ（ａ）において外因性ドナー核酸が導入され、前記外因性ドナー核酸が、前記標的ゲノム遺伝子座と組み換わるように設計されている、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記外因性ドナー核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記非ヒト動物が、ラットまたはマウスである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記非ヒト動物がマウスである、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記標的ゲノム遺伝子座が標的遺伝子を含み、ステップ（ｂ）が、前記標的遺伝子の発現または前記標的遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を測定することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から単離された１つまたは複数の細胞中の前記標的ゲノム遺伝子座を配列決定することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から標的器官または組織を単離すること、および前記標的器官または組織中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
ステップ（ｂ）が、前記標的器官または組織内の２つまたはそれより多い異なる細胞型中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物から非標的器官または組織を単離すること、および前記非標的器官または組織中で前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｃａｓタンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、前記ポリアデニル化シグナルが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、前記Ｃａｓ発現カセット中の前記ポリアデニル化シグナルが、組織特異的様式で切り出されている、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記Ｃａｓタンパク質のコード配列の上流の前記ポリアデニル化シグナルが、肝臓中で切り出されている、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記リコンビナーゼ認識部位を認識するリコンビナーゼが、Ｃｒｅリコンビナーゼである、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記非ヒト動物が、組織特異的プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅリコンビナーゼコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣｒｅリコンビナーゼ発現カセットをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子が、表２に記載のプロモーターのうちの１つに作動可能に連結されている、項目１７または１８に記載の方法。
（項目２０）
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｃａｓタンパク質のコード配列の上流にポリアデニル化シグナルをさらに含み、前記ポリアデニル化シグナルが、リコンビナーゼ認識部位によって挟まれ、前記方法が、リコンビナーゼを、組織特異的様式で前記非ヒト動物に導入するステップをさらに含む、項目１から１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記リコンビナーゼが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介性送達または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介性送達によって導入される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記Ｃａｓ発現カセットが、介在内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または介在２Ａペプチドコード配列によって隔てられた前記Ｃａｓタンパク質のコード配列および前記蛍光タンパク質コード配列を含むマルチシストロン性核酸を含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記Ｃａｓ発現カセット中の前記マルチシストロン性核酸が、介在Ｐ２Ａペプチドコード配列によって隔てられた前記Ｃａｓタンパク質のコード配列および緑色蛍光タンパク質コード配列を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記Ｃａｓ発現カセットが、蛍光タンパク質コード配列をさらに含まない、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記Ｃａｓタンパク質がタンパク質タグを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２７）
前記Ｃａｓ発現カセットの５’末端が、３’スプライシング配列をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２８）
前記Ｃａｓ発現カセットが、内因性プロモーターに作動可能に連結されている、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
前記Ｃａｓ発現カセットが、外因性の構成的プロモーターに作動可能に連結されている、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記Ｃａｓ発現カセットが、配列番号１３、１６、１９、または２２に記載の配列を含むタンパク質をコードする、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３１）
前記Ｃａｓ発現カセットが、配列番号２８、２９、３０、または３１に記載の配列を含む、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記Ｃａｓ発現カセットが、配列番号１、１２、１４、１５、１７、１８、２０、または２１に記載の配列を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記Ｃａｓ発現カセットが、セーフハーバー遺伝子座に組み込まれる、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３４）
前記セーフハーバー遺伝子座が、Ｒｏｓａ２６遺伝子座である、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記Ｃａｓ発現カセットが、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに組み込まれる、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてヘテロ接合性である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記非ヒト動物が、前記Ｃａｓ発現カセットについてホモ接合性である、項目１から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記非ヒト動物が、マウスであり、
前記ＡＡＶが、静脈内注射によって前記非ヒト動物に送達されるＡＡＶ８であり、
前記Ｃａｓ発現カセットが内因性Ｒｏｓａ２６プロモーターに作動可能に連結されており、前記Ｒｏｓａ２６遺伝子座の第１のイントロンに挿入され、５’から３’に向かって、（ｉ）３’スプライシング配列；および（ｉｉ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓ９タンパク質のコード配列を含み、
ステップ（ｂ）が、前記非ヒト動物の肝臓中での前記標的ゲノム遺伝子座の改変を評価することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ゲノム遺伝子座を改変するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼの能力を最適化する方法であって、
（Ｉ）第１の非ヒト動物において１回目の前記項目のいずれかに記載の方法を実施するステップ；
（ＩＩ）変数を変更し、第２の非ヒト動物において変更された前記変数を用いて２回目のステップ（Ｉ）に記載の方法を実施するステップ；および
（ＩＩＩ）ステップ（Ｉ）における前記標的ゲノム遺伝子座の改変と、ステップ（ＩＩ）における前記標的ゲノム遺伝子座の改変とを比較し、より高い有効性、より高い精度、より高い一貫性、またはより高い特異性のうちの１つまたは複数を有する標的ゲノム遺伝子座の改変をもたらす方法を選択するステップ
を含む、方法。
（項目４０）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記ＡＡＶ血清型である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記ガイドＲＮＡを前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡである、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記外因性ドナー核酸を前記非ヒト動物に導入する送達方法である、項目３９に記載の方法。
（項目４５）
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記外因性ドナー核酸を前記非ヒト動物に導入する投与経路である、項目３９に記載の方法。
（項目４６）
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸の濃度または量である、項目３９に記載の方法。
（項目４７）
前記方法が、外因性ドナー核酸を導入するステップを含み、ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される外因性ドナー核酸の濃度または量と比較した、前記非ヒト動物に導入される前記ガイドＲＮＡの濃度または量である、項目３９に記載の方法。
（項目４８）
ステップ（ＩＩ）における前記変更された変数が、前記非ヒト動物に導入される前記外因性ドナー核酸である、項目３９に記載の方法。
（項目４９）
１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物。
（項目５０）
１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物細胞。
（項目５１）
１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含む、ゲノムに組み込まれたＣａｓ発現カセットを含む非ヒト動物ゲノム。
（項目５２）
相同アームによって挟まれたＣａｓ発現カセットを含む標的化ベクターであって、前記Ｃａｓ発現カセットが、１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含み、前記相同アームが、ゲノム組込みを容易にするための所望の標的ゲノム遺伝子座との組換えを方向付けるのに好適である、標的化ベクター。
（項目５３）
項目４９に記載の非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含むＣａｓ発現カセットを含むように、非ヒト動物の多能性細胞のゲノムを改変するステップ；
（ｂ）前記Ｃａｓ発現カセットを含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップ；
（ｃ）遺伝子改変された多能性細胞を、非ヒト動物宿主胚に導入するステップ；および
（ｄ）代理母に前記非ヒト動物宿主胚を埋め込み、懐胎させるステップ
を含む、方法。
（項目５４）
項目４９に記載の非ヒト動物を作製するための方法であって、
（ａ）１つまたは複数の核局在化シグナルをさらに含むＣａｓタンパク質のコード配列を含むＣａｓ発現カセットを含むように非ヒト動物の１細胞期胚のゲノムを改変するステップ；
（ｂ）前記Ｃａｓ発現カセットを含む遺伝子改変された１細胞期胚を選択するステップ；および
（ｃ）代理母に前記遺伝子改変された１細胞期胚を埋め込み、懐胎させるステップ
を含む、方法。