【手続補正書】
【提出日】平成17年3月10日(2005.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（１）：
【化１】
1999255786.tif 000001
［式（１）中、
Ｒ１は、所望により枝分かれしていてもよい炭素数１−４のアルキル基であり；
Ｒ２は、水素原子又はメチル基であり；そして
ｎは、１−１０の整数である］
で表される構造を有する化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物と高分子化合物又は標識化合物との結合体。
【請求項３】
請求項１に記載の化合物と高分子化合物を結合させることにより抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、以下の式（２）：
【化２】
1999255786.tif 000002
で表される構造を有する化合物に反応性を示す抗体を製造することを特徴とする、式（２）で表される化合物に反応性を示す抗体の製造方法。
【請求項４】
請求項２に記載の結合体を抗原として用いることにより製造された、式（２）で表される化合物に反応性を示す抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項５】
モノクローナル抗体である、請求項４に記載の抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項６】
ＴＣＭ３−１０である、請求項４又は５に記載の抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメント。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項８】
寄託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１６６９８で寄託されている、請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
請求項４ないし６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原と結合可能なそのフラグメントを用いることを特徴とする、式（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｏ−２，６−ジクロロ−ｐ−トリル  Ｏ，Ｏ−ジメチル  ホスホロチオアート（以下、本明細書中「トルクロホスメチル」と言う）のハプテン化合物、抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントに関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本発明は、さらに前記抗原、抗体及び抗原と結合可能なそのフラグメントを用いた免疫学的測定方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、トルクロホスメチルに反応する新規な抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント、及びその作製方法を提供することを目的とする。尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片等を意味する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明は、さらにまた、前記抗体を産生するハイブリドーマを提供することを目的とする。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明は、さらに、前記抗体もしくは抗原と結合可能なそのフラグメント及び／又は前記トルクロホスメチル誘導体と高分子化合物との結合体を使用することを含む、トルクロホスメチルの免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
まず、以下の式（Ｘ１）：
【化６】
1999255786.tif 000003
［式（Ｘ１）中、
Ｌ１及びＬ２はハロゲン原子であり（本明細書中、ハロゲン原子はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを意味する）、同一であっても、又は異なっていてもよい；そして
Ｒ１は先に定義した通りである］
で表されるジハロゲン化チオリン酸エステルに、以下の式（Ｘ２）：
【化７】
1999255786.tif 000004
［式（Ｘ２）中、Ｒ２は先に定義した通りである］
で表される化合物を、有機溶媒中、塩基の存在下で反応させることにより、以下の式（Ｘ３）：
【化８】
1999255786.tif 000005
［式（Ｘ３）中、Ｒ１、Ｒ２及びＬ１（Ｌ２）は先に定義した通りである］
で表される化合物を合成する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
（ａ）免疫用抗原として使用するトルクロホスメチル誘導体と高分子化合物との結合体の作製
（ｂ）動物への免疫
（ｃ）血液の採取、アッセイ、及び抗体産生細胞の調製
（ｄ）ミエローマ細胞の調製
（ｅ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合とハイブリドーマの選択的培養
（ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングと細胞クローニング
（ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドーマの移植によるモノクローナル抗体の調製
（ｈ）調製されたモノクローナル抗体の反応性の測定等。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
トルクロホスメチルの測定は、各種ＥＬＩＳＡ法のうち例えば間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法により、以下のような手順により行うことができる。（ａ）まず、トルクロホスメチル誘導体と高分子化合物との結合体である抗原を担体に固相化する。（ｂ）抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。（ｃ）これに各種濃度のトルクロホスメチルを含む試料及び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びトルクロホスメチルに競合的に結合させて、固相化抗原−抗体複合体及びトルクロホスメチル−抗体複合体を生成させる。（ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することにより、予め作成した検量線から試料中のトルクロホスメチルの量を決定することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
なお、担体に固相化させる抗原としては、抗体を作製したトルクロホスメチル誘導体と高分子化合物との結合体自体のみならず、式（１）で表される他の誘導体と高分子化合物との結合体を用いることもできる。例えば、式（１）で表される化合物でｎの数が相違する抗原を各々抗体作製用と固相化用に用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない、他のトルクロホスメチル類似化合物も、固相化抗原として使用することも可能である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
なお、酵素等の標識物質に結合させるハプテンとしては、間接競合阻害ＥＬＩＳＡ法における固相化抗原の場合と同様に、抗体作製に使用したトルクロホスメチル誘導体のみならず、式（１）で表される他の誘導体を用いることもできる。例えば、式（１）で表される化合物でｎの数が相違する抗原を各々抗体作製用と標識競合用に用いることもできる。さらに、式（１）に含まれない、他のトルクロホスメチル類似化合物も、酵素に結合させるハプテンとして使用可能である。（ｃ）工程においてトルクロホスメチルを含む試料及び酵素結合ハプテンを抗体固相化担体に接触させ、トルクロホスメチルと酵素結合ハプテンとの競合阻害反応により、これらと固相化抗体との複合体が生成する。トルクロホスメチルを含む試料は適当な緩衝液で希釈して使用する。限定されるわけではないが、反応は例えば、室温でおよそ１時間行う。反応終了後、緩衝液で担体を洗浄し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合ハプテンを除去する。洗浄液は、例えばＰＢＳを使用することができる。