【手続補正書】
【提出日】平成16年4月26日(2004.4.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ、カオトロピック塩、及び界面活性剤と試料とを混合した第1の混合液を所定の温度とし、
前記所定の温度とした後に、前記第1の混合液に、２から１０個の炭素数を有する、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族ケトンのいずれかの化合物を含む溶液を添加して第2の混合液とし、
前記第2の混合液に含まれる核酸を担体に吸着させ、
エタノールを含む溶液を用いて前記担体を洗浄し、
前記担体に吸着した核酸を溶出させて回収することを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項２】
前記化合物は、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プリピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項３】
前記試料は組織であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項４】
前記試料は尿であることを特徴とする請求項１に記載の核酸抽出方法。
【請求項５】
プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と
２から１０個の炭素数を有する、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族ケトンのいずれかの化合物を含む第2の液体と、
核酸を吸着させるための担体と、
エタノールを含む第3の液体と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液とを有することを特徴とする核酸抽出キット。
【請求項６】
前記カオトロピック塩は、ヨウ化カリウム、グアニジン塩酸塩、及びグアニジンチオシアン酸塩の少なくとも１つであることを特徴とする請求項５に記載の核酸抽出キット。
【請求項７】
前記界面活性剤は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート、及びポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテルの少なくとも１つであることを特徴とする請求項５に記載の核酸抽出キット。
【請求項８】
前記化合物は、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プリピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする請求項５に記載の核酸抽出キット。
【請求項９】
前記担体は、シリカ、アルミナ、ゼオライト、及び二酸化チタンの少なくとも１つを材料とすることを特徴とする請求項５に記載の核酸抽出キット。
【請求項１０】
プロテアーゼ、カオトロピック塩、及び界面活性剤と血液とを混合した第1の混合液とを所定の温度とし、
前記所定の温度とした後に、前記第1の混合液に、２から１０個の炭素数を有する、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族ケトンのいずれかの化合物を含む溶液を添加して第2の混合液とし、
前記第2の混合液に含まれる核酸を担体に吸着させ、
エタノールを含む溶液を用いて前記担体を洗浄し、
前記担体に吸着した核酸を溶出させて回収することを特徴とする、血液からの核酸抽出方法。
【請求項１１】
前記化合物は、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プリピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１０に記載の、血液からの核酸抽出方法。
【請求項１２】
プロテアーゼと、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含む第1の液体と
２から１０個の炭素数を有する、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族ケトンのいずれかの化合物を含む第2の液体と、
核酸を吸着させるための担体と、
エタノールを含む第3の液体と、
前記担体に吸着した核酸を、前記担体から遊離させるための溶出液とを有することを特徴とする血液から核酸抽出するためのキット。
【請求項１３】
前記化合物は、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プリピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１２に記載の血液から核酸抽出するためのキット。
【請求項１４】
細胞を分解して第1の混合液を得、
前記第1の混合液に、２から１０個の炭素数を有する、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族ケトンのいずれかの化合物を含む液を添加して第2の混合液を得、
担体を充填した容器に前記第2の混合液を吸引および吐出させ、前記担体に前記第2の混合液に含まれる核酸を吸着させ、
前記担体を充填した容器を洗浄し、
前記担体に吸着した核酸を溶出することを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項１５】
前記洗浄及び前記溶出の少なくともいずれかでは、前記担体を充填した容器に液体を吸引および吐出させることを特徴とする請求項14に記載の核酸抽出方法。
【請求項１６】
前記化合物は、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プリピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１４に記載の核酸抽出方法。
【請求項１７】
細胞を分解して第1の混合液を得、
前記第1の混合液に、２から１０個の炭素数を有する、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族ケトンのいずれかの化合物を含む液を添加して第2の混合液を得、
担体を収めたカラムに前記第2の混合液を移し、
前記カラムから前記第2の混合液を吸引して、前記第2の混合液に含まれる核酸を担体に吸着させ、
前記カラムに洗浄液を注入しかつ前記洗浄液を前記カラムから吸引することにより、前記担体を洗浄し、
前記カラムに溶出液を注入しかつ前記溶出液を前記カラムから吸引することにより、前記担体に吸着した核酸を溶出させることを特徴とする核酸抽出方法。
【請求項１８】
前記化合物は、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プリピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１７に記載の核酸抽出方法。
【請求項１９】
タンパク質分解酵素と、
カオトロピック塩と界面活性剤とを含み、試料に供給される反応液と、
２から１０個の炭素数を有する、脂肪族エーテル、脂肪族エステル、及び脂肪族ケトンのいずれかの化合物を含み、前記試料に供給した反応液に添加される添加液と、
核酸を吸着させる吸着担体と、
前記吸着担体を洗浄する洗浄液と、
核酸が吸着した吸着担体から前記核酸を溶出させる、溶出液とを有することを特徴とする核酸抽出キット。
【請求項２０】
前記化合物は、エチレングリコールジメチルエーテル、エチレングリコールジエチルエーテル、プリピレングリコールジメチルエーテル、プロピレングリコールジエチルエーテル、ジエチレングリコールジメチルエーテル、ジエチレングリコールジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，４―ジオキサン、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、乳酸エチル、ヒドロキシアセトン、アセトン、及びメチルエチルケトンの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１９に記載の核酸抽出キット。
【請求項２１】
プロテイナーゼＫと、
グアジニン塩酸塩とポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートとポリアルキレングリコール誘導体を含む第1の液体と
ジエチレングリコールジメチルエーテルと、
核酸を吸着させるための担体と、
酢酸カリウムとエタノールとを含む第2の液体と、
トリス（ハイドロキシメチル）アミノメタンとエチレンジアミン四酢酸・二ナトリウム塩とを含む第３の液体とを有することを特徴とする核酸抽出キット。
【請求項２２】
前記第1の液体は試料に供給される反応液であり、前記ジエチレングリコールジメチルエーテルは前記試料に供給した反応液に添加される添加液であり、前記第2の液体は前記担体を洗浄する洗浄液であり、前記第3の液体は前記担体から前記核酸を溶出させる溶出液であることを特徴とする請求項２１に記載の核酸抽出キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の核酸の精製分離は、図１に示された方法に基づいて行う。ここでは、特開平１１―１２７８５４号に記載した４つの工程と同様の項目を挙げた。以下に各工程での詳細について述べる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
図２から図５は、図１に挙げた項目に関する、本発明の核酸抽出試薬を用いた全血からの核酸抽出の手順を説明する図である。以下の説明では、ヒト全血１００μＬからの核酸抽出を例とする。図２に示すように、ヒト全血１の中には、赤血球２、白血球３等の成分が含まれており、核酸は主に白血球３内の核４に存在している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
３．試薬
３．１  反応液
反応液は、以下に示すカオトロピック塩、界面活性剤、消泡剤、その他塩成分から構成される。
３．１．１  カオトロピック塩
カオトロピック塩として、以下のいずれかを使用した。
ＫＩ：ヨウ化カリウム
ＧｕＨＣｌ：グアニジン塩酸塩
ＧｕＨＳＣＮ：グアニジンチオシアン酸塩
３．１．２  界面活性剤
界面活性剤として、以下のいずれかを使用した。
Tween20：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート
Tween40：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート
Tween60：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート
Tween80：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート
Tween85：ポリオキシエチレン（２０）ソルビタントリオレート
TritonX-100：ポリオキシエチレン（１０）イソオクチルフェニルエーテル
３．１．３  消泡剤
ＣＥ−４５７：日本油脂株式会社製の消泡剤ディスホーム、ポリアルキレングリコール誘導体
３．１．４  その他の塩
ＥＤＴＡ・２Ｎａ：エチレンジアミン四酢酸・ニナトリウム塩
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
３．２．添加液
添加液には、以下のいずれかの有機溶剤を使用した。
ＥＧＤＭＥ：エチレングリコールジメチルエーテル
ＥＧＤＥＥ：エチレングリコールジエチルエーテル
ＰＧＤＭＥ：プロピレングリコールジメチルエーテル
ＰＧＤＥＥ：プロピレングリコールジエチルエーテル
ＤＩＧＬＹＭＥ：ジエチレングリコールジメチルエーテル
ＤＧＤＥＥ：ジエチレングリコールジエチルエーテル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＸ：１，４―ジオキサン
ＰＧＭＥＡ：プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート
ＥＬ：乳酸エチル
ＨＡＣ：ヒドロキシアセトン
ＡＣ：アセトン
ＭＥＫ：メチルエチルケトン
３．３  洗浄液
洗浄液には、以下のいずれかの組成を用いた。
Ｗ１：２５mmol/l  酢酸カリウム、７０容量％エタノール
Ｗ２：２５mmol/l  酢酸カリウム、５０容量％エタノール
Ｗ３：２５mmol/l  Tris/HCl、５０容量％エタノール
Ｗ４：１０mmol/l  Tris/HCl(pH8.5)、０．１mmol/l  ＥＤＴＡ・２Ｎａ、５０容量％エタノール
３．４  溶出液
溶出液には、以下のいずれかの組成を用いた。
Ｅ１：水（１００％）、ｐＨ８．０
Ｅ２：１０mmol/l Tris/HCl(pH8.5)、０．１mmol/l EDTA・２Ｎａ
Ｅ３：５０mmol/l Tris/HCl(pH8.5)、０．１mmol/l EDTA・２Ｎａ
３．５．酵素
以下のいずれかの酵素を用いた。
protease：タンパク分解酵素プロテアーゼ
proteinase K：アルカリ性プロテイナーゼＫ