【手続補正書】
【提出日】令和3年3月30日(2021.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料における生物活性の領域を検出する方法であって、該方法は：
ａ）前記生物試料を前記生物活性のレシオメトリック蛍光表示体と接触させる工程；
ｂ）第１の発光波長にて前記生物試料の第１の蛍光輝度画像を、及び第２の発光波長にて前記生物試料の第２の蛍光輝度画像をキャプチャする工程；
ｃ）蛍光比率画像を作成するために前記第１の蛍光画像及び前記第２の蛍光画像を組み合わせる工程；
ｄ）生物活性の領域を検出するための画像分析アルゴリズムを使用して、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせを処理する工程
を含み、前記画像分析アルゴリズムは：
ｉ）前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせのマスク画像を作成するために、蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用し、
ｉｉ）２つ以上のマスク画像が工程（ｉ）で作成されている場合、前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、及び前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像から成る群から選択された２つ以上の画像上でＡＮＤ論理演算を実行し、及び
ｉｉｉ）前記生物活性に対し陽性又は陰性の何れかとして生物試料の分類を提供し、前記分類は、工程（ｉ）に使用された前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの組み合わせ内の関心領域の検出に基づき、該関心領域は、工程（ｉ）に使用された前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの組み合わせの値を超える蛍光比率値又は蛍光輝度値を示すものであり、及び前記画像分析アルゴリズムは更に
ｉｖ）コンピュータメモリーに分類結果を随意に記憶する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせ内の関心領域を表示する工程を更に含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）〜（ｄ）は、経時的に生物活性の変化をモニタリングするために、一連の第１の蛍光輝度画像、第２の蛍光輝度画像、及び蛍光比率画像を提供するべく定められた時間間隔で２回以上繰り返される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の蛍光輝度画像及び前記第２の蛍光輝度画像は内視鏡を使用してキャプチャされ、前記関心領域の表示が内視鏡の位置決めを誘導するために使用される、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
関心領域内の平均蛍光比率又は平均蛍光輝度値は、前記関心領域における生物活性の質的又は定量的な測定を提供する、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
生物試料のレシオメトリック蛍光画像における生物活性の領域を検出するために使用される、蛍光比率及び蛍光輝度閾値の自動最適化のための方法であって、該方法は：
ａ）複数の生物試料を前記生物活性のレシオメトリック蛍光表示体と接触させる工程；
ｂ）前記生物試料の各々に対して、第１の発光波長で第１の蛍光輝度画像を、及び第２の発光波長で第２の蛍光輝度画像をキャプチャする工程；
ｃ）前記生物試料の各々に対して蛍光比率画像を作成するために前記第１の蛍光画像及び前記第２の蛍光画像を組み合わせる工程；
ｄ）第１の蛍光輝度閾値、第２の蛍光輝度閾値、蛍光比率閾値、又はそれらの任意の組み合わせに対する出発値を提供する工程；及び
ｅ）前記生物試料の各々に対して：
ｉ）画像分析アルゴリズムを使用して、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせを処理する工程であって、前記画像分析アルゴリズムは：
前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせのマスク画像を作成するために、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせを使用し、
２つ以上のマスク画像が先の工程で作成されている場合、前記蛍光比率画像のマスク画像、前記第１の蛍光輝度画像のマスク画像、及び前記第２の蛍光輝度画像のマスク画像から成る群から選択された２つ以上の画像上でＡＮＤ論理演算を実行し、及び
随意に、前記蛍光比率画像、前記第１の蛍光輝度画像、前記第２の蛍光輝度画像、又はそれらの任意の組み合わせ内の検出された関心領域が特定の最小サイズよりも大きいことをチェックし、前記検出された関心領域は、前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせの値を超える、蛍光比率値又は蛍光輝度値を示す領域であり、及び
前記画像分析アルゴリズムは更に、関心領域が検出されている場合に前記生物活性に対し陽性として前記生物試料の分類を提供し、又は関心領域が検出されていない場合に前記生物活性に対し陰性として前記生物試料の分類を提供する、工程；
ｉｉ）前記分類が、真陽性、偽陰性、真陰性、又は偽陽性であるかを判定するために、前記画像分析アルゴリズムによって提供される分類を、前記生物試料に対する病理実験室試験結果と比較する工程；
ｉｉｉ）コンピュータメモリーに、真陽性、偽陰性、真陰性、又は偽陽性の分類結果を記憶させる工程；及び
ｆ）以下：
ｉ）前記第２の蛍光輝度閾値及び前記蛍光比率閾値が、前記生物試料の全てが前記画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで固定したまま保持される間の、前記第１の蛍光輝度閾値の漸増的に増加した値、又は
ｉｉ）前記第１の蛍光輝度閾値及び前記蛍光比率閾値が、前記生物試料の全てが前記画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで固定したまま保持される間の、前記第２の蛍光輝度閾値の漸増的に増加した値、又は
ｉｉｉ）前記第１の蛍光輝度閾値及び前記第２の蛍光輝度閾値が、前記生物試料の全てが前記画像処理アルゴリズムによって陰性として分類されるまで固定したまま保持される間の、前記蛍光比率閾値の漸増的に増加した値
により、工程（ｅ）を繰り返す工程；
ｇ）蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、及び第２の蛍光輝度閾値の各セットに対する記憶された分類結果を使用して受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を算出する工程；及び
ｈ）前記蛍光比率閾値、前記第１の蛍光輝度閾値、前記第２の蛍光輝度閾値、又はそれらの任意の組み合わせに対する最適な設定を決定するために、蛍光比率閾値、第１の蛍光輝度閾値、及び第２の蛍光輝度閾値の各セットに対する前記ＲＯＣ曲線下の面積を比較する工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項７】
前記生物試料又は複数の生物試料は、細胞サンプル、エクスビボ組織サンプル、又はインビボの組織サンプルを含む、ことを特徴とする請求項１から６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
検出される前記生物活性は疾患と相関し、前記疾患は、関節炎、アテローム動脈硬化症、癌、前癌、又は炎症である、ことを特徴とする請求項１から７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記癌は乳癌である、ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
検出される前記生物活性は癌性の生物活性と相関する、ことを特徴とする請求項１から７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記癌性の生物活性は、黒色腫、非黒色腫性の皮膚癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、卵巣癌、頸部癌、頭頚部癌、リンパ節、甲状腺癌、神経膠腫、胃腸癌、又は肉腫に関連付けられる、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物試料は、レシオメトリック蛍光表示体を注入された患者から採取した切除後の外科試料であり、前記方法が患者の乳癌を検出するために使用される、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が外科手術と併用される、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
癌の診断のための臨床的感度は７０％を超え、または癌の診断のための臨床的特異性は７０％を超える、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記レシオメトリック蛍光表示体は、以下の構造を有するＳＤＭ−２５である、ことを特徴とする請求項１から１４のいずれか１つに記載の方法。
【化１】
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