【手続補正書】
【提出日】令和3年4月2日(2021.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法であって、
前記ライゲーションが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼによって触媒され；
各一本鎖ポリヌクレオチドが、５’末端でのライゲーションを防止するために前記５’末端でブロックされており；
各アダプターが、前記アダプターがライゲーションされる前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含み、３’末端でのライゲーションを防止するために前記３’末端でブロックされており；かつ
前記アダプターの５’末端が、前記ｓｓＤＮＡリガーゼによって前記一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、
それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る、
方法。
【請求項２】
前記ライゲーションステップ前に、試料から一本鎖ポリヌクレオチドの前記ライブラリーを得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、生物学的試料であり、必要に応じて、（１）前記生物学的試料が、いかなる処理も行わずに被験体から直接得られているか；（２）前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、亜硫酸水素塩変換に供されていないか；または（３）前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、部分的なもしくは完全な亜硫酸水素塩変換に供されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的試料が、疾患または状態、例として、がんまたは新生物を有するか、またはそれを有する疑いのある被験体からのものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料が、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ｓｓＤＮＡリガーゼが、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））、古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼである、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
各一本鎖ポリヌクレオチドの前記ブロックが、その５’末端でのライゲーションを防止するための脱リン酸化を含む、または
各アダプターの前記ブロックが、その３’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび／またはヘキサエチレングリコールを含む、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
各アダプターが、前記５’末端において、前記ＵＭＩ配列に対して５’側であるジヌクレオチド配列、例として、ＧＡ（５’〜３’）、ＧＧ（５’〜３’）、ＡＡ（５’〜３’）またはＡＧ（５’〜３’）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
各アダプター中の前記ＵＭＩ配列が、約６〜約１５核酸残基の長さであり、例えば、前記ＵＭＩ配列が、１２ｍｅｒである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ライゲーション反応が、密集剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ６０００、デキストランおよび／またはフィコールの存在下で行われる、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
直鎖状一本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含む、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ／または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、１組のプライマー；および
標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）にハイブリダイズ可能なプライマーであって、必要に応じて、配列番号４〜１５２９からなる群より選択される配列もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマーを使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを増幅し、
それによって、前記標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ること
をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
各々が前記標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーが、使用され、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有し、必要に応じて、前記複数のプライマーが、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的配列の前記配列情報が、変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、コピー数多型（ＣＮＶ）またはエピジェネティック変化を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、請求項１２から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
被験体における疾患もしくは状態、例えば、がんまたは新生物の診断および／または予後、被験体の処置、例えば、がんまたは新生物処置に対する応答性を予測すること、前記疾患／状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに／または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１から１０のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリー、
請求項１１に記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリー、
請求項１２から１４のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリー、あるいは
請求項１５または１６に記載の方法によって生成されたシークエンシングライブラリー。
【請求項１８】
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼ；
複数のアダプターであって、各アダプターが、３’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、前記アダプターの５’末端が、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能であり、各アダプターが、前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む、複数のアダプター
を含む、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキット。
【請求項１９】
配列番号４〜１５２９からなる群より選択される任意の１つもしくは複数の配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー、
配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、配列番号４〜１５２９のうちの約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー組、
配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、配列番号４〜１５２９のうちの約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲、およびＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）またはその一部を含むプライマーを含むプライマー組、あるいは
配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、配列番号４〜１５２９のうちの約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列もしくはその数値範囲もしくは部分範囲、ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）もしくはその一部を含むプライマー、および／またはＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１）もしくはその一部を含むポリヌクレオチドを含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
当技術分野の上記の問題を克服するための解析技術の改善が要求されている。本開示は、この、および他の関連する要求に取り組む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
１組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法であって、
前記ライゲーションが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼによって触媒され；
各一本鎖ポリヌクレオチドが、５’末端でのライゲーションを防止するために前記５’末端でブロックされており；
各アダプターが、前記アダプターがライゲーションされる前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含み、３’末端でのライゲーションを防止するために前記３’末端でブロックされており；かつ
前記アダプターの５’末端が、前記ｓｓＤＮＡリガーゼによって前記一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、
それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る、
方法。
（項目２）
前記ライゲーションステップ前に、試料から一本鎖ポリヌクレオチドの前記ライブラリーを得るステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記得るステップが、前記試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させることを含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記試料が、生物学的試料であり、必要に応じて、（１）前記生物学的試料が、いかなる処理も行わずに被験体から直接得られるか；（２）前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、亜硫酸水素塩変換に供されていないか；または（３）前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、部分的なもしくは完全な亜硫酸水素塩変換に供されている、項目２または３に記載の方法。
（項目５）
前記生物学的試料が、疾患または状態、例として、がんまたは新生物を有するか、またはそれを有する疑いのある被験体からのものである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記生物学的試料が、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせである、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記一本鎖ポリヌクレオチドが、約２０〜約４００核酸残基の長さである、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記ｓｓＤＮＡリガーゼが、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））、古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼである、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
各一本鎖ポリヌクレオチドの前記ブロックが、その５’末端でのライゲーションを防止するための脱リン酸化を含む、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
各アダプターの前記ブロックが、その３’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび／またはヘキサエチレングリコールを含む、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
各アダプターが、前記５’末端において、前記ＵＭＩ配列に対して５’側であるジヌクレオチド配列、例として、ＧＡ（５’〜３’）、ＧＧ（５’〜３’）、ＡＡ（５’〜３’）またはＡＧ（５’〜３’）を含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
各アダプター中の前記ＵＭＩ配列が、約６〜約１５核酸残基の長さであり、例えば、前記ＵＭＩ配列が、１２ｍｅｒである、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記ライゲーション反応が、密集剤の存在下で行われる、項目１から１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記密集剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ６０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
直鎖状一本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含む、項目１から１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記変換が、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ／または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマーを使用する、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを増幅および／または精製することをさらに含む、項目１５または１６に記載の方法。
（項目１８）
前記精製が、約５０ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、前記精製が、必要に応じて、ビーズベースまたはカラムベースであり、前記精製が、一方が前記直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ／または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、１組のプライマー；および
標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）にハイブリダイズ可能なプライマーであって、必要に応じて、配列番号４〜１５２９からなる群より選択される配列もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマーを使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを増幅し、
それによって、前記標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ること
をさらに含む、項目１５から１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
各々が前記標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーが、使用され、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有し、必要に応じて、前記複数のプライマーが、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記標的配列の前記配列情報が、変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、コピー数多型（ＣＮＶ）またはエピジェネティック変化を含む、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記変異が、点変異、挿入、欠失、インデル、逆位、トランケーション、融合、転座、増幅またはそれらの任意の組み合わせを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーが、全ゲノムライブラリーではない、項目１９から２２のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーを精製することをさらに含む、項目１９から２３のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記精製が、ビーズベースであり、約１５０ヌクレオチドを超える長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、前記精製が、一方が前記直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
前記シークエンシングステップが、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記結合ステップが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行われる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記シークエンシングの変換率（シークエンシングリードを生ずる、前記ライブラリーにおける一本鎖ポリヌクレオチドの割合）が、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％である、項目２６に記載の方法。
（項目３０）
被験体における疾患もしくは状態の診断および／または予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、前記疾患／状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに／または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用される、項目２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記疾患または状態が、がんまたは新生物であり、前記処置が、がんまたは新生物処置である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
項目１から１４のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリー。
（項目３３）
項目１５から１８のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリー。
（項目３４）
項目１９から２５のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリー。
（項目３５）
項目２６から３１のいずれかに記載の方法によって生成されたシークエンシングライブラリー。
（項目３６）
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼ；
複数のアダプターであって、各アダプターが、３’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、前記アダプターの５’末端が、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能であり、各アダプターが、前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む、複数のアダプター
を含む、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキット。
（項目３７）
試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて前記一本鎖ポリヌクレオチドを得るための変性試薬をさらに含む、項目３６に記載のキット。
（項目３８）
前記ｓｓＤＮＡリガーゼが、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））、古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼである、項目３６または３７に記載のキット。
（項目３９）
前記一本鎖ポリヌクレオチドの５’ホスフェート基を除去するための脱リン酸化試薬をさらに含む、項目３６から３８のいずれか一項に記載のキット。
（項目４０）
各アダプターが、その３’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび／またはヘキサエチレングリコールを含む、項目３６から３９のいずれか一項に記載のキット。
（項目４１）
各アダプターが、その５’末端において、ジヌクレオチド配列、例として、ＧＡ（５’〜３’）、ＧＧ（５’〜３’）、ＡＡ（５’〜３’）またはＡＧ（５’〜３’）を含む、項目３６から４０のいずれか一項に記載のキット。
（項目４２）
各アダプター中の前記ＵＭＩ配列が、約６〜約１５核酸残基の長さであり、例えば、前記ＵＭＩ配列が、１２ｍｅｒである、項目３６から４１のいずれか一項に記載のキット。
（項目４３）
ライゲーション反応のための密集剤をさらに含む、項目３６から４２のいずれか一項に記載のキット。
（項目４４）
前記密集剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ６０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む、項目１３に記載のキット。
（項目４５）
前記一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するための、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ／または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマーをさらに含む、項目３６から４４のいずれかに記載のキット。
（項目４６）
プライマーダイマーを除去するための試薬をさらに含む、項目４５に記載のキット。
（項目４７）
標的配列の配列情報を含む増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物を得るための、前記標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）に特異的な配列を含むプライマーであって、必要に応じて、配列番号４〜１５２９からなる群より選択される配列もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマーをさらに含む、項目４５または４６に記載のキット。
（項目４８）
複数のプライマーを含み、各々が前記標的配列に特異的な配列を含み、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有し、必要に応じて、前記複数のプライマーが、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む、項目４７に記載のキット。
（項目４９）
前記増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物をシークエンシングするための、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードをさらに含む、項目４７または４８に記載のキット。
（項目５０）
各構成成分のための別々のバイアルおよび／または前記構成成分を使用するための指示をさらに含む、項目３６から４９のいずれか一項に記載のキット。
（項目５１）
被験体から循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料を得るための指示および／または前記試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料もしくはそれらの任意の組み合わせから一本鎖ポリヌクレオチドを得るための指示をさらに含む、項目５０に記載のキット。
（項目５２）
ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１）またはその一部、例えば、約１８〜２２個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチド。
（項目５３）
Ｎ１〜Ｎｉが、任意の核酸残基、例えば、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ｉが、約４〜約２５の整数である、Ｎ１．．．ＮｉＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧまたはその一部を含む、項目５２に記載のポリヌクレオチド。
（項目５４）
Ｎが、任意の核酸残基、例えば、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである、ＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号２）またはその一部、例えば、約３２〜３６個のヌクレオチド残基を含む一部を含む、項目５２または５３に記載のポリヌクレオチド。
（項目５５）
ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）またはその一部、例えば、約１２〜２０個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチド。
（項目５６）
配列番号４〜１５２９からなる群より選択される任意の１つもしくは複数の配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー。
（項目５７）
配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、配列番号４〜１５２９のうちの約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー組。
（項目５８）
配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、配列番号４〜１５２９のうちの約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲、および
ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）またはその一部を含むプライマー
を含むプライマー組。
（項目５９）
配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、配列番号４〜１５２９のうちの約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列もしくはその数値範囲もしくは部分範囲、
ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）もしくはその一部を含むプライマー、および／または
ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１）もしくはその一部を含むポリヌクレオチド
を含むキット。