【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年12月4日(2020.12.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１９４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１９４】
【図１】培養するとHSC能力が急速に失われることを示す。新鮮に単離したマウスHSC、またはS-clone+IL12/SCF/TPO+0.75％BSAの中でエクスビボで12日間培養したHSCを、致死的な放射線を照射した宿主に移植した後の末梢血分析。培養細胞が、多系統(B細胞、T細胞、骨髄系細胞、顆粒球)の末梢血ドナーキメリズムを生じる能力を保持していないのに対して、新鮮に移植したHSCは、B細胞、T細胞、骨髄系細胞、顆粒球を含む、分析した全血液系統で構成される力強いレベルのドナー末梢血キメリズムを生じることに留意のこと。
【図２】操作されたFgd5-ZsGreenレポーターマウスがHSCを忠実に標識することを示す。Fgd5-ZsGreenレポーターマウスに由来する骨髄細胞を、磁気ビーズを用いてcKit+細胞に関して富化し、ZsGreenの発現および1パネルのマーカー(細胞系(Lineage)(Ter119、CD3、CD4、CD8、B220、Mac1、Gr1、Il7RA)、cKit、Sca1、CD150、CD48)についてフローサイトメトリーによって分析した。示された幹/前駆亜集団についてZsGreen発現が示された。Fgd5-ZsGreen HSCレポーターマウスの構築、特徴付け、および特異性に関するさらなる詳細は、Gazit R, Mandal PK, Ebina W, Ben-Zvi A, Nombela-Arrieta C, Silberstein LE、Rossi DJ. Journal of Experimental Medicine, 211(7):1315-31 (2014)において見つけることができる。
【図３Ａ】図3AはHSCのエクスビボ培養中にFgd5・ZsGr+がHSC能力を標識することを示す。図3Aは概要を示す。Fgd5・ZsGr+HSCをレポーターマウスから単離し、S-clone+IL12/SCF/TPO+0.75％BSAの中で4日間培養した。4日目に、300個のZsGr+細胞および300個のZsGr-細胞を選別し、致死的な放射線を照射したマウスに競合移植した。このことから、図3Bに詳述したようにZsGr+画分では全てのHSC活性が保持されたことが分かる。
【図３Ｂ】図3Bは、HSCのエクスビボ培養中にFgd5・ZsGr+がHSC能力を標識することを示す。図3Bは、ZsGr+細胞およびZsGr-細胞を移植したマウスの末梢血キメリズムおよび末梢血顆粒球キメリズムを図示する。ZsGr+細胞およびZsGr-細胞の系統寄与。データから、ZsGr+細胞しかHSC活性を保持していないことが分かる。
【図４】HSCエクスビボ維持および増大を支持する化合物の低分子スクリーニングの模式図を示す。1)Fgd5・ZsGr+HSCレポーターマウス骨髄を用いてZsGr+HSCを分離した。2)ZsGrレポーターによって標識したHSCの単離。3)6日間のエクスビボ培養後に、培養HSCではDMSO対照を上回ってHSCレポーター発現が維持されることでヒットが明確化されるアッセイ法の開発。4)次いで、ヒット化合物をインビトロアッセイ法およびインビボ移植アッセイ法において機能的に検証した。
【図５】図5Aおよび5Bは、感度アッセイ法の開発を示す。図5Aは、1ウェルにつき合計200個のZsGr+HSC(Fgd5・ZsGreen HSCレポーターマウスに由来する)およびZsGr-HSC(Fgd5Zs+レポーターを有さない野生型マウスに由来する)を様々な比(1:0;1:1;1:10;1:20、1:100、0:1、ZsGr+パーセンテージで示した)で播種し、2日間エクスビボ培養した後にOperetta(Perkin Elmer)を用いて画像化した。1つ1つの細胞をZsGreen検出の閾値より上または下にプロットした。図5Bは、2日間培養した後にZsGreen+細胞のパーセンテージが求められたことを示す。これにより、2日間培養した後に力強くZsGr+シグナルを検出するための分析パラメータおよび感度が確かめられた。
【図６】一次低分子スクリーニングにおいて標的化された経路の内訳を示す。
【図７】図7Aおよび7Bは、様々な低分子および増殖因子ライブラリースクリーニングの初回スクリーニング結果を示す。図7Aは、キナーゼ、エピジェネティック制御因子、およびGタンパク質共役受容体(GPCR)を標的とする低分子、ならびに増殖因子ペプチドライブラリーの4つの異なるライブラリーそれぞれからの、スクリーニングされた化合物、初回ヒット(用量反応を示した)、および検証されたヒット(ZSGr+を定量するためのフローサイトメトリーによる)の数を示す。図7Bは、6点用量反応(10uM、5uM、1uM、0.5uM、0.1uM、0.05uM)からの代表的な結果を図示する。*はヒットを示す。
【図８】DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質(RepSox)、または両方の組み合わせ(C2)の存在下での、7日間または14日間にわたる20個のマウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD34-Flk2-CD150+Fgd5・ZsGr+)のエクスビボ培養を示す。画像を4×倍率で撮った。LSおよびC2の存在下での培養物は均一性がより大きく、分化が少なないことに留意のこと。
【図９】図9Aおよび9Bは、エクスビボで14日間にわたる表現型マウスHSCの増大を示す。20個のマウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD34-Flk2-CD150+Fgd5・ZsGr+)を、DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下で14日間培養した。この方法はZsGr+HSCの維持および増大を支持する。図9Aは、DMSO、およびLSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)の存在下でエクスビボで14日間培養したHSCの代表的なFACSプロットを図示する。これから、C2の存在下では表現型HSCのレベルが増加したことが分かる。図9Bは、エクスビボで14日間培養した後の各条件での細胞系-Sca1+ckit+CD34-Flk2-CD150+Fgd5・ZsGr+HSCの数を図示する。
【図１０】図10A〜10Cは、LSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)がZsGr+マウスHSCの維持および増大を支持することを示す。図10Aは、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下でエクスビボで4.5日間培養した20個のFgd5・ZsGr+HSCの明視野およびZsGr画像を図示する。図10Bは、エクスビボで4.5日間培養した後に残っているZsGr+細胞の頻度を示す。図10Cは、4.5日間培養した後のZsGr+細胞およびZsGr-細胞の数を図示する。
【図１１】図11Aおよび11Bは、14日間培養した、DMSO、LSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)に曝露した精製マウスHSCのコロニー形成アッセイ法の結果を示す。HSCを、DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下で14日間培養し、次いで、培養物の1/300を1mlのMethoCult3434にプレートした。プレートしてから10日後に、生じたコロニーを選別してメチルセルロースに入れた。図11Aはコロニーの数および組成を図示する。図11Bは、14日間培養したHSCによって生じた細胞の総数を図示する。
【図１２】図12A〜12Dは、14日間培養した、DMSO、LSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)に曝露した精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の競合移植の結果を示す。100個の出発マウスHSCから生じた培養物を、DMSO、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、および両方の組み合わせ(C2)の存在下でエクスビボで14日間培養した後に、致死的な放射線を照射したレシピエントに競合移植した。図12Aは、末梢血ドナーキメリズムのグラフを図示する。図12Bは、末梢血ドナー(CD45.2)顆粒球キメリズムのグラフを図示する。図12Cは、個々のレシピエントマウスドナーキメリズムのグラフを図示する。図12Dは、移植後24週目での、B細胞(B220+)、T細胞(CD3+)、および骨髄系細胞(Mac1+)を示したドナー再構成の系統寄与のグラフを図示する。
【図１３Ａ】図13Aは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Aは末梢血ドナーキメリズムを図示する。
【図１３Ｂ】図13Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Bは末梢血ドナー(CD45.2)顆粒球キメリズムを図示する。
【図１３Ｃ】図13Cは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Cは、B細胞(B220+)、T細胞(CD3+)、および骨髄系細胞(Mac1+)を示したドナー再構成の系統寄与を図示する。
【図１３Ｄ】図13Dは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Dは、個々のレシピエントのドナーキメリズムを図示する。
【図１３Ｅ】図13Eは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Eは、移植して20週間後の個々のレシピエントの顆粒球キメリズムを図示する。
【図１３Ｆ】図13Fは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)と共に14日間培養した、精製マウスHSC(細胞系-Sca1+ckit+CD150+CD48-CD34-Fgd5ZsGr+)の限界希釈アッセイ法の結果を示す。1個、5個、20個、50個、または200個の出発マウスHSCから生じた培養物をC2の存在下でエクスビボで14日間培養した後に競合移植した。図13Fは限界希釈頻度の計算を図示する。bioinf.wehi.edu.au/software/elda/ Hu, Y, and Smyth, GK (2009). ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. Journal of Immunological Methods 347, 70-78
【図１４】図14Aおよび14Bは、HSCエクスビボ維持および増大を支持するようにC2(LSD1阻害物質IVおよびTgfβ阻害物質)と相乗作用する化合物の二次低分子スクリーニングを示す。一次スクリーニング(図14A)および(図14B)二次スクリーニングの模式図。二次スクリーニングでは、一次スクリーニングにおいて特定した124個の可能性のあるヒット化合物をC2の存在下で再スクリーニングした(スクリーニング2)。
【図１５】図15A〜15Cは、Tgfβ、ヒストンメチル化、ヒストンアセチル化、p38シグナル伝達、およびWntシグナル伝達を含む関心対象の経路をとする、二次スクリーニングの可能性のあるヒットを示す。図15Aは、二次低分子スクリーニングにおいてヒットを特定するために使用した2つの戦略の概略を図示する(C2は、LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせである)。図15Bは、ZsGreen+HSCパーセンテージに基づいた戦略(戦略1)に従うことによって発見されたヒットを図示する。図15Cは、ZsGreen+HSCの数に基づいた戦略(戦略2)に従うことによって発見されたヒットを図示する。
【図１６】図16Aおよび16Bは、一次スクリーニングにおいて特定し、次いで、C2(LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせ)の存在下で再スクリーニングした化合物の二次スクリーニングのヒットを示す。図16Aは、ZsGreen+HSCパーセンテージに基づいた戦略に従うことによって発見されたヒットを図示する。図16Bは、ZsGreen+HSCの数に基づいた戦略に従うことによって発見されたヒットを図示する。
【図１７】マウスHSCを維持すると以前に報告された化合物を試験した実験の結果を示す。ZsGreen陽性HSCを、dmPGE2(North, Zon, Nature. 2007)、BIO(Ko et al, Stem Cells. 2011)、p38阻害物質(Wang et al, Stem Cells Dev. 2011)、DMSO:陰性対照の存在下で6日間培養する。D2は、エクスビボで2日間維持したZsGr+HSCである。ZsGreen+として特定した細胞(すなわち、HSC)の閾値を矢印で示した。
【図１８】図18Aおよび18Bは、エクスビボでのHSCの維持および増大に向けて候補経路を調整するための仮説駆動(hypothesis driven)戦略を示す。図18Aは、腸幹細胞および造血幹細胞の維持および増殖シグナルの比較による候補標的経路の選択を図示する。図18Bは作用物質/経路モジュレーターの選択を図示する。
【図１９】HSC維持および増大に対する経路モジュレーターの活性を評価するための模式図を示す。Fgd5-ZsGreen+免疫表現型HSC(細胞系-cKit+Sca1+CD150+CD48-Fgd5・ZsGreen+)を選別し、サイトカインのみの存在下で(標準培地)、または7種類の候補経路モジュレーターをさらに加えて(W7培地)培養した。7つの経路を調整する化合物は、A83-01、トラニルシプロミン、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、酢酸ナトリウム(ここでは補充物と呼ぶ)である。14日間培養した後に、細胞免疫表現型のマルチパラメトリック解析をフローサイトメトリーによって行った。
【図２０】エクスビボ培養中に7つの候補経路の組み合わせ調整が免疫表現型HSCを維持しかつ増大させることを示す。50個のマウスHSCを、SCF、TPO、およびIL12を補充し7種類の候補経路モジュレーターを含むまたは含まない無血清培地中で培養した。15日目にフローサイトメトリー分析を行った。7つの経路を調整する化合物は、A83-01、トラニルシプロミン、トリコスタチンA、SB203580、CHIR99021、DMH1、および酢酸ナトリウムである。
【図２１Ａ】図21Aは、エクスビボ培養中に表現型HSCを維持しかつ増大させる能力における各化合物/経路の寄与を示す。50個のマウスHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、化合物が存在せずサイトカインのみ(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で(標準)、または7種類全ての化合物(W7)を加えて、もしくはそれぞれ1種類ずつ化合物(A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA)、SB203580(p38i)、CHIR99021(Chir)、DMH1(DMH)、酢酸ナトリウム(OAC))を取り去って培養した。フローサイトメトリー分析を14日目に行った。(図21A)は、細胞系+細胞への分化(B細胞、T細胞、骨髄系細胞、赤血球、顆粒球の抗原に対する抗体カクテルによって染色した)を示す。この場合、細胞系陽性は破線の右側にある。
【図２１Ｂ】図21Bは、エクスビボ培養中に表現型HSCを維持しかつ増大させる能力における各化合物/経路の寄与を示す。50個のマウスHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、化合物が存在せずサイトカインのみ(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で(標準)、または7種類全ての化合物(W7)を加えて、もしくはそれぞれ1種類ずつ化合物(A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA)、SB203580(p38i)、CHIR99021(Chir)、DMH1(DMH)、酢酸ナトリウム(OAC))を取り去って培養した。フローサイトメトリー分析を14日目に行った。図21Bは、示された条件で50個の出発HSCから14日間培養した後のHSCの絶対数を図示する。
【図２２】図22Aおよび22Bは、構造的に異なるHDAC阻害物質が免疫表現型HSCを維持するのに同等に機能することを示す。化合物が存在せずサイトカインのみ(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で(標準)、または、化合物のカクテル(塩化リチウム、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、アスコルビン酸、A83-01、およびSB203580)ならびに構造的に異なるHDAC阻害物質であるバルプロ酸(VPA)もしくはトリコスタチンA(TSA)のいずれかを付加的に補充して、100個のマウスHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を培養した。図22Aは7日目のフローサイトメトリー分析を図示する。図22Bは、それぞれの反復実験のFgd5-ZsGreen+Sca1+細胞の割合を図示する。
【図２３】エクスビボ培養中に、さらなる化合物を加えると、CD48発現およびSca1発現についてFgd5・ZsGr+HSC細胞の不均一性が低下することを示す。40個のマウスHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、サイトカイン(SCF、TPO、およびIL12)の存在下で、ならびにDNAメチルトランスフェラーゼ阻害物質(RG108)およびG9a阻害物質(UNC0638)のいずれかまたは両方を含む化合物カクテル(塩化リチウム、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、アスコルビン酸、A83-01、およびSB203580、トリコスタチンA)の存在下で12日間培養した。示された培養条件からのFgd5+細胞系-細胞のフローサイトメトリープロットを示した。ヒストグラムは、示された亜集団の割合を示す。
【図２４】DMSO(標準)、またはTgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウムからなる7つの経路を標的とする化合物(組み合わせ)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。10個のHSCを、示された条件で14日間培養し、その後に、致死的な放射線を照射した宿主に(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。移植後の示された時間での末梢血ドナーキメリズムを示した。
【図２５Ａ】図25Aは、DMSO(S:標準)、または7つの経路を標的とする化合物(W7:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。100個のHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、示された条件で14日間培養し、その後に、(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。図25Aは、移植後の示された時点での末梢血ドナーキメリズムを図示する。
【図２５Ｂ】図25Bは、DMSO(S:標準)、または7つの経路を標的とする化合物(W7:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。100個のHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、示された条件で14日間培養し、その後に、(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。図25Bは、移植後の示された時点での顆粒球ドナーキメリズムを図示する。
【図２５Ｃ】図25Cは、DMSO(S:標準)、または7つの経路を標的とする化合物(W7:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で14日間培養したマウスHSCのインビボ機能を示す。100個のHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、示された条件で14日間培養し、その後に、(2×105個のコンジェニックに標識した骨髄細胞に対して)インビボで競合移植した。図25Cは、示された条件で14日間培養したHSCを移植した移植レシピエントの骨髄中のドナーHSCキメリズムを図示する。
【図２６】免疫表現型マウスHSCを維持する/増大させるには4つの経路を調整することで十分なことを示す。50個のHSC(細胞系-、ckit+、Sca1+、CD150+、CD48-、Fgd5ZsGr+)を、DMSOの存在下で、または7種類の化合物からなる最初の一組(Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)から特定した、4つの経路を標的とする化合物(W4:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、およびp38キナーゼ阻害物質SB203580)の存在下で、サイトカインを加えた無血清培地中で14日間培養した。免疫表現型HSC(細胞系-cKit+Sca1+CD48-CD150+Fgd5ZsGreen+CD41-)をフローサイトメトリーによって分析した。
【図２７】CD34+富化臍帯血から初代ヒトHSCを得るための選別戦略を示す。選別したHSCはCD34+細胞系-CD38-CD45RA-CD90+の免疫表現型を有する。
【図２８】図28Aおよび28Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト臍帯血(CB)HSCを維持および増大できることを示す。図28Aは実験計画の模式図を図示する。図28Bは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で14日間プレートした後の培養臍帯血HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-。1ウェルあたり50個の細胞で最初に播種した)のフローサイトメトリーを図示する。CD34+CD45RA-細胞のパーセンテージ(等高線プロット)と、CD90+細胞のパーセンテージ(ヒストグラム)(+/-標準偏差)を示した。
【図２９】図29Aおよび29Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト臍帯血HSCを維持および増大できることを示す。図29Aは、総生細胞に対するHSC(CD34+CD45RA-CD90+として定義した)のパーセンテージを図示する。図29Bは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1 IV阻害物質とRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で50個の臍帯血HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-)を培養した後のHSCの絶対数を図示する。*p<0.05独立t検定。
【図３０】図30Aおよび30Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後にヒト臍帯血HSCの原始的なインビトロコロニー形成能を維持しかつ増大させることを示す。図30Aは、14日間のエクスビボ培養後のウェル全体を表すように調整したコロニーの数および組成を図示する(注:コロニー形成のためにウェルの一部分だけをメソカルト(methocult)に添加した)。図30Bは、14日間の臍帯血HSC培養物からの骨髄系コロニータイプの頻度を図示する。RS、LS、またはC2の中で培養した後に、最も原始的なGEMMコロニー(顆粒球、マクロファージ、赤血球、および巨核球系統で構成されるコロニー)の頻度が高くなったことに留意のこと。
【図３１】図31Aおよび31Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト骨髄HSCを維持および増大できることを示す。図31Aは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で14日間プレートした後の、培養した骨髄由来HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した。1ウェルあたり80個の細胞)のフローサイトメトリーを図示する。CD34+CD45RA-細胞のパーセンテージ(ドットプロット)と、CD90+細胞のパーセンテージ(ヒストグラム)(+/-標準偏差)を示した。図31Bは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で培養した後の免疫表現型HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-)のパーセンテージを図示する。*p<0.05、**p<0.005独立t検定。
【図３２Ａ】図32Aは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト動員末梢血HSCを維持および増大できることを示す。図32Aは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で14日間プレートした後の、培養した動員末梢血HSC(CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した。1ウェルあたり50個の細胞)のフローサイトメトリーを図示する。CD34+CD45RA-細胞のパーセンテージ(等高線プロット)と、CD90+細胞のパーセンテージ(ヒストグラム)(+/-標準偏差)を示した。
【図３２Ｂ】図32Bは、LSD1阻害物質IV(LS)とTgfβ阻害物質RepSox(RS)の組み合わせ(C2)が14日間のエクスビボ培養後に表現型ヒト動員末梢血HSCを維持および増大できることを示す。図32Bは、DMSO、ステムレゲニン1(SR1)、LSD1阻害物質IV(LS)、Tgfβ阻害物質RepSox(RS)、およびLSD1阻害物質IVとRepSoxの組み合わせ(C2)の存在下で14日間培養した後の、免疫表現型HSC(CD34+CD45RA-CD90+)ならびに幹細胞および前駆細胞(CD34+CD45RA-)のパーセンテージを図示する。
【図３３】図33Aおよび33Bは、マウス系において特定した、7つの経路を標的とする化合物を用いると、免疫表現型臍帯血HSCを維持および増大できることを示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、DMSOの存在下で、または7つの経路を標的とする化合物(組み合わせ:Tgfβ阻害物質A83-01、Lsd1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA、p38キナーゼ阻害物質SB203580、BMP阻害物質DMH1、Gsk3β阻害物質Chir99021、および酢酸ナトリウム)の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養した。(図33A)は、フローサイトメトリーによって分析した、培養後の細胞の免疫表現型を示す。(図33B)は、免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の定量を示す。
【図３４】図34Aおよび34Bは、免疫表現型ヒト臍帯血HSCを維持しかつ増大させるには、3つの経路を標的化することで十分なことを示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図34Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。図34Bは、示された条件で培養した免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の定量を図示する。
【図３５】図35Aおよび35Bは、化学物質の最小限の組み合わせとp38阻害物質を加えるとヒト臍帯血HSCの収率が改善することを示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン))の存在下で、またはp38阻害物質(p38i、SB203580)をさらに加えて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図35Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。図35Bは、示された条件で培養した免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量を図示する。
【図３６】低酸素分圧下で培養するとヒト臍帯血HSCの収率が改善することを示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、標準的な組織培養インキュベーター(大気中酸素、21％O2)または低酸素インキュベーター(5％O2)に入れて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)、ならびに3つの経路を標的とする化合物(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))を加えた無血清培地中で12日間培養した。示された条件で培養した免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)を、培養後に定量した。
【図３７Ａ】図37Aは、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図37Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。
【図３７Ｂ】図37Bは、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図37Bは、示された集団のパーセンテージを図示する。
【図３７Ｃ】図37Cは、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。200個の臍帯血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図37Cは、示された条件で12日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の定量を図示する。
【図３８Ａ】図38Aは、マウス細胞を用いて特定した化合物を用いたヒト動員末梢血CD34+細胞のエクスビボ維持および増殖を示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された個々の化学物質または化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(p38i、SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図38Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。
【図３８Ｂ】図38Bは、マウス細胞を用いて特定した化合物を用いたヒト動員末梢血CD34+細胞のエクスビボ維持および増殖を示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された個々の化学物質または化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(p38i、SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図38Bは、示された集団のパーセンテージを図示する。
【図３８Ｃ】図38Cは、マウス細胞を用いて特定した化合物を用いたヒト動員末梢血CD34+細胞のエクスビボ維持および増殖を示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された個々の化学物質または化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、HDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(p38i、SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図38Cは、示された条件で7日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量を図示する(W7:A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA)、SB203580(p38i)、CHIR99021(Chir)、DMH1(DMH)、酢酸ナトリウム(OAC)、およびW3:A83-01(A)、トラニルシプロミン(TC)、トリコスタチンA(TSA))。
【図３９】化学物質の組み合わせを用いてヒト動員末梢血CD34+細胞をエクスビボで培養すると免疫表現型HSCが富化されることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、DMSO、示された個々の化学物質(ステムレゲニン(SR1)、UM171)、または4種類の化合物の組み合わせ(W4:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(トラニルシプロミン)、およびp38阻害物質(SB203580))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。エクスビボで培養する前(無培養)、または示された条件で7日間培養した後の、CD34+富化動員末梢血中の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+)の画分の定量。培養後に、HSCが8倍富化されたことが示される。
【図４０Ａ】図40Aは、ヒト動員末梢血HSCを維持する/増大させる能力についての、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。50個の動員末梢血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、またはp38阻害物質(p38i、SB203580)をさらに加えて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図40Aは、培養後の細胞の免疫表現型を図示する。
【図４０Ｂ】図40Bは、ヒト動員末梢血HSCを維持する/増大させる能力についての、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。50個の動員末梢血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、またはp38阻害物質(p38i、SB203580)をさらに加えて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図40Bは、示された集団のパーセンテージを図示する。
【図４０Ｃ】図40Cは、ヒト動員末梢血HSCを維持する/増大させる能力についての、化学物質の組み合わせと、臍帯血HSCを増大させると以前に報告された化合物との比較を示す。50個の動員末梢血HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD90+CD38-としてFACS精製した)を、ステムレゲニン1(SR1)、UM171、または化学物質の組み合わせ(W3:Tgfβ阻害物質(A83-01)、HDAC阻害物質(トリコスタチンA)、およびLSD1阻害物質(トラニルシプロミン))の存在下で、またはp38阻害物質(p38i、SB203580)をさらに加えて、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で12日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図40Cは、示された条件で12日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量を図示する。
【図４１Ａ】図41Aは、ヒトHSCを効率的にエクスビボで維持する/増大させるために、HDAC1/2特異的阻害物質であるロミデスピンがパン(pan)HDAC阻害物質であるトリコスタチンAに取って代わることができることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、パンHDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、p38阻害物質(p38i、SB203580)、HDAC1/2阻害物質(Rom、ロミデスピン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図41Aは細胞の免疫表現型を図示する。
【図４１Ｂ】図41Bは、ヒトHSCを効率的にエクスビボで維持する/増大させるために、HDAC1/2特異的阻害物質であるロミデスピンがパン(pan)HDAC阻害物質であるトリコスタチンAに取って代わることができることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、パンHDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、p38阻害物質(p38i、SB203580)、HDAC1/2阻害物質(Rom、ロミデスピン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図41Bは、示された集団のパーセンテージを図示する。
【図４１Ｃ】図41Cは、ヒトHSCを効率的にエクスビボで維持する/増大させるために、HDAC1/2特異的阻害物質であるロミデスピンがパン(pan)HDAC阻害物質であるトリコスタチンAに取って代わることができることを示す。3000個のCD34+富化動員末梢血細胞を、示された化学物質の組み合わせ(Tgfβ阻害物質(A、A83-01)、パンHDAC阻害物質(TSA、トリコスタチンA)、LSD1阻害物質(TC、トラニルシプロミン)、p38阻害物質(p38i、SB203580)、HDAC1/2阻害物質(Rom、ロミデスピン))の存在下で、サイトカイン(SCF、TPO、FLT3L、IL3)を加えた無血清培地中で7日間培養し、フローサイトメトリーによって分析した。図41Cは、示された条件で7日間培養した後の免疫表現型HSC(細胞系-CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49F+)の定量を図示する。
【図４２Ａ】図42Aは、エクスビボで14日間培養したヒトCD34+臍帯血細胞の移植結果を示す。致死下の放射線を照射した免疫無防備状態のNSG(Nod-Scid-γ)マウスに、10,000個の出発CD34+臍帯血細胞の培養物を、DMSO、W3(Tgfβ阻害物質A83-01、LSD1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA)、LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせ(C2)、ステムレゲニン1(SR1)、ならびにUM171の存在下でエクスビボで14日間培養した後に移植したか、10,000個の無培養CD34+臍帯血細胞(新鮮)を移植した。(図42A)は末梢血ドナーキメリズムを示す。
【図４２Ｂ】図42Bは、エクスビボで14日間培養したヒトCD34+臍帯血細胞の移植結果を示す。致死下の放射線を照射した免疫無防備状態のNSG(Nod-Scid-γ)マウスに、10,000個の出発CD34+臍帯血細胞の培養物を、DMSO、W3(Tgfβ阻害物質A83-01、LSD1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA)、LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせ(C2)、ステムレゲニン1(SR1)、ならびにUM171の存在下でエクスビボで14日間培養した後に移植したか、10,000個の無培養CD34+臍帯血細胞(新鮮)を移植した。図42Bは、移植後24週目および30週目での末梢血ドナーキメリズムの定量を図示する。
【図４２Ｃ】図42Cは、エクスビボで14日間培養したヒトCD34+臍帯血細胞の移植結果を示す。致死下の放射線を照射した免疫無防備状態のNSG(Nod-Scid-γ)マウスに、10,000個の出発CD34+臍帯血細胞の培養物を、DMSO、W3(Tgfβ阻害物質A83-01、LSD1阻害物質トラニルシプロミン、HDAC阻害物質トリコスタチンA)、LSD1阻害物質IVとTgfβ阻害物質RepSoxの組み合わせ(C2)、ステムレゲニン1(SR1)、ならびにUM171の存在下でエクスビボで14日間培養した後に移植したか、10,000個の無培養CD34+臍帯血細胞(新鮮)を移植した。図42Cは、移植後30週目での移植細胞の系統寄与を図示する。
【図４３】図44〜48Cに図示した結果を得るための実験手順の模式図を図示する。
【図４４】12日間培養した後のFACS分析の結果を図示する。
【図４５】DMSO、W7、またはW3の存在下で300個の出発細胞HSC同等物から12日間培養した後の総生細胞アウトプットのグラフを図示する。
【図４６】図46Aおよび46Bは、DMSO、W7、またはW3の存在下で12日間培養した後の細胞系-IL7R-ckit+Sca1+(LSK)細胞の頻度(図46A)および絶対数(図46B)のグラフを図示する。
【図４７】図47Aおよび47Bは、DMSO、W7、またはW3の存在下で12日間培養した後の細胞系-IL7R-ckit+Sca1+CD48-CD150+HSCの頻度(図47A)および絶対数(図47B)のグラフを図示する。
【図４８】図48A〜48Cは、実験模式図(図48A)、DMSO、W7、またはW3の存在下で12日間培養した200個の出発細胞(HSC)同等物を移植して4週間後のドナー細胞生着のグラフ(図48B)、および系統寄与のグラフ(図48C)を図示する。Mac1+骨髄系細胞、CD3陽性(3)T細胞、およびB220陽性B細胞の系統分析。