【手続補正書】
【提出日】令和3年3月30日(2021.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸分子の検出方法であって、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、核酸プローブ、及び緩衝溶液を、前記標的核酸分子を含む系に添加する工程と、次いで、前記核酸プローブの切断を検出する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｃａｓタンパク質が、コラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有し、前記核酸プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質を前記標的核酸分子に特異的に結合するように誘導する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸プローブが、検出可能な標識を有する一本鎖ＤＮＡを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記標的核酸分子が増幅される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｃａｓ１２タンパク質が、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、Ｌｂ４Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸プローブを検出することが、蛍光検出方法を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸プローブが、蛍光標識を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸プローブが、５’末端に蛍光基ＨＥＸを、３’末端に消光基ＢＨＱ１を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸分子を増幅する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的核酸分子を増幅する工程が、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＰＡ増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐ＤＮＡ増幅、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、転写介在増幅、ローリングサークル増幅、ＨＤＡ、ＳＰＩＡ、ＮＥＡＲ、ＴＭＡ、またはＳＭＡＰ２を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的核酸分子が、プライマーを用いて増幅され、少なくとも１つのプライマーは、ＰＡＭ配列を含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸分子が、病原体にのみ見いだされる配列を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸分子が、ヒトまたは他の種における一塩基多型（ＳＮＰ）部位を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸分子が、遺伝子変異を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ガイドＲＮＡが、長さが１５ｎｔ、１６ｎｔまたは１７ｎｔのｃｒＲＮＡを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
検出系であって、
（ａ）Ｃａｓタンパク質と、
（ｂ）標的核酸分子と、
（ｃ）前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Ｃａｓタンパク質を誘導するガイドＲＮＡと、
（ｄ）一本鎖ＤＮＡを含む核酸プローブと
を含む、検出系。
【請求項１９】
前記Ｃａｓタンパク質が、コラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有する、請求項１８に記載の検出系。
【請求項２０】
前記核酸プローブが、検出可能な標識を含む、請求項１８または１９に記載の検出系。
【請求項２１】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項２２】
前記Ｃａｓ１２タンパク質が、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、Ｌｂ４Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）からなる群から選択される、請求項２１に記載の検出系。
【請求項２３】
前記Ｃａｓ１２タンパク質が、ＬｂＣａｓ１２ａである、請求項２１に記載の検出系。
【請求項２４】
前記核酸プローブが、蛍光標識を含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項２５】
前記核酸プローブが、５’末端に蛍光基ＨＥＸを、３’末端に消光基ＢＨＱ１を含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項２６】
前記標的核酸分子が、標的ＤＮＡである、請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項２７】
前記標的核酸分子が増幅される、請求項２６に記載の検出系。
【請求項２８】
前記標的核酸分子が、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＰＡ増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐ＤＮＡ増幅、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、転写介在増幅、ローリングサークル増幅、ＨＤＡ、ＳＰＩＡ、ＮＥＡＲ、ＴＭＡ、およびＳＭＡＰ２からなる群から選択される方法によって増幅される、請求項２７に記載の検出系。
【請求項２９】
前記標的核酸分子が、プライマーを用いて増幅され、少なくとも１つのプライマーは、ＰＡＭ配列を含む、請求項２７または２８に記載の検出系。
【請求項３０】
前記標的核酸分子が、前記ガイドＲＮＡの結合部位の上流または下流のＰＡＭ配列を含む、請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項３１】
前記ＰＡＭ配列が、前記ガイドＲＮＡの前記標的部位の−２０ｎｔ〜＋２０ｎｔ上流または下流である、請求項３０に記載の検出系。
【請求項３２】
前記標的核酸分子が、病原体にのみ見いだされる配列を含む、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項３３】
前記標的核酸分子が、ヒトまたは他の種における一塩基多型（ＳＮＰ）部位を含む、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項３４】
前記標的核酸分子が、遺伝子変異を含む、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項３５】
前記ガイドＲＮＡが、長さが１５ｎｔ、１６ｎｔまたは１７ｎｔのｃｒＲＮＡを含む、請求項１８〜３４のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項３６】
緩衝液をさらに含む、請求項１８〜３５のいずれか一項に記載の検出系。
【請求項３７】
キットであって、
ｉ）Ｃａｓタンパク質を含む第１の容器であって、前記Ｃａｓタンパク質がコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有する、前記第１の容器と、
ｉｉ）ガイドＲＮＡを含む任意の第２の容器であって、前記ガイドＲＮＡが前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Ｃａｓタンパク質を誘導する、前記第２の容器と、
ｉｉｉ）核酸プローブを含む第３の容器と、
ｉｖ）緩衝液を含む任意の第４の容器と、
を含む、キット。
【請求項３８】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記Ｃａｓ１２タンパク質が、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、Ｌｂ４Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）からなる群から選択される、請求項３８に記載のキット。
【請求項４０】
前記Ｃａｓ１２タンパク質が、ＬｂＣａｓ１２ａである、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
前記核酸プローブが、蛍光標識を含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
前記核酸プローブが、５’末端に蛍光基ＨＥＸを、３’末端に消光基ＢＨＱ１を含む、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４３】
前記標的核酸分子が、標的ＤＮＡである、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
前記核酸プローブが、一本鎖ＤＮＡを含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４５】
前記ガイドＲＮＡが、長さが１５ｎｔ、１６ｎｔまたは１７ｎｔのｃｒＲＮＡを含む、請求項３８〜４４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４６】
標的核酸分子を検出するための検出試薬またはキットの調製におけるＣａｓタンパク質の使用であって、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ａ、またはＣａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａsタンパク質である、使用。
【請求項４７】
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記Ｃａｓ１２タンパク質が、ＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、Ｌｂ４Ｃａｓ１２ａおよびＣａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）からなる群から選択される、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
前記Ｃａｓ１２タンパク質が、ＬｂＣａｓ１２ａである、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
前記標的核酸分子が、病原体にのみ見いだされる配列を含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５１】
前記標的核酸分子が、ヒトまたは他の種における一塩基多型（ＳＮＰ）部位を含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５２】
前記標的核酸分子が、遺伝子変異を含む、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
別の好適な実施形態において、Ｃａｓ１２ｂタンパク質は、ＡａｃＣａｓ１２ｂからなる群から選択される。
本発明の範囲内で、本発明の上述の技術的特徴及び以下に（例えば、実施例において）詳細に説明する技術的特徴を互いに組み合わせて、新たなまたは好ましい技術的解決策を形成できることを理解されたい。長さによる制限のため、ここではこれ以上繰り返さない。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
標的核酸分子の検出方法であって、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、核酸プローブ、及び緩衝溶液を、検出される前記標的核酸分子を含む系に添加し、次いで、前記核酸プローブを検出することを含む、前記方法。
（項目２）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ａであるか、またはＣａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質であり、
前記Ｃａｓ１２ａが、好ましくはＦｎＣａｓ１２ａ、ＡｓＣａｓ１２ａ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｌｂ５Ｃａｓ１２ａ、ＨｋＣａｓ１２ａ、ＯｓＣａｓ１２ａ、ＴｓＣａｓ１２ａ、ＢｂＣａｓ１２ａ、ＢｏＣａｓ１２ａ、またはＬｂ４Ｃａｓ１２ａのうちの１つであり、前記Ｃａｓ１２ａが、好ましくはＬｂＣａｓ１２ａである、
項目１に記載の標的核酸分子の検出方法。
（項目３）
前記ガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡに特異的に結合するように誘導するＲＮＡを指す、項目１に記載の標的核酸分子の検出方法。
（項目４）
前記核酸プローブが一本鎖ＤＮＡであり、前記一本鎖ＤＮＡが好ましくは蛍光標識された一本鎖ＤＮＡであり、前記一本鎖ＤＮＡが好ましくは５’末端を蛍光基ＨＥＸで標識され、３’末端を消光基ＢＨＱ１で標識された蛍光プローブであり、好ましくは
前記核酸プローブの検出方法が好ましくは蛍光検出方法であり、前記蛍光検出方法が、好ましくはマイクロプレートリーダーまたは蛍光分光光度計を用いた検出方法である、
項目１に記載の標的核酸分子の検出方法。
（項目５）
検出される前記標的核酸分子の前記反応系において検出される前記標的核酸分子が、増幅により得られる、項目１〜４のいずれか１項に記載の標的核酸分子の検出方法。
（項目６）
病原微生物、遺伝子変異、または特定の標的ＤＮＡを検出することができる、項目５に記載の標的核酸分子の検出方法。
（項目７）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）を含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
標的核酸分子の検出方法におけるＣａｓタンパク質の使用。
（項目９）
標的ＤＮＡ、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓタンパク質が三元複合体を形成する場合、前記複合体が系内の他の一本鎖ＤＮＡ分子を切断し、好ましくは、前記ガイドＲＮＡが前記標的ＤＮＡに特異的に結合するように前記Ｃａｓタンパク質を誘導するＲＮＡを指す、項目８に記載の使用。
（項目１０）
ガイドＲＮＡ、Ｃａｓタンパク質、及び核酸プローブを含む、標的核酸分子を検出するためのキット。
（項目１１）
標的核酸分子を検出するための検出系であって、
（ａ）Ｃａｓ１２ａであるか、または前記Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である、Ｃａｓタンパク質と、
（ｂ）前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Ｃａｓタンパク質を誘導するガイドＲＮＡと、
（ｃ）一本鎖ＤＮＡである核酸プローブと、を含み、
前記標的核酸分子が、標的ＤＮＡである、前記検出系。
（項目１２）
Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有する前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ｂ（すなわち、Ｃ２ｃ１）からなる群から選択される、項目１１に記載の検出系。
（項目１３）
前記核酸プローブが、検出可能な標識を有する一本鎖ＤＮＡを含む、項目１１に記載の検出系。
（項目１４）
標的核酸分子を検出するためのキットであって、
ｉ）第１の容器、及び前記第１の容器内のＣａｓタンパク質であって、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ１２ａ、または前記Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である、前記第１の容器内のＣａｓタンパク質と、
ｉｉ）任意の第２の容器、及び前記第２の容器内のガイドＲＮＡであって、前記ガイドＲＮＡが前記標的核酸分子に特異的に結合するように前記Ｃａｓタンパク質を誘導する、前記第２の容器内のガイドＲＮＡと、
ｉｉｉ）第３の容器、及び前記第３の容器内の核酸プローブと、
ｉｖ）任意の第４の容器、及び前記第４の容器内の緩衝溶液と、を含み、
前記標的核酸分子が、標的ＤＮＡである、前記キット。
（項目１５）
試料中に標的核酸分子が存在するかどうかを検出するための方法であって、以下の工程：
（ａ）項目１１に記載の標的核酸分子を検出するための検出系を提供する工程であって、前記検出系が、検出される試料をさらに含む、前記提供する工程と、
（ｂ）前記検出系の前記核酸プローブがＣａｓタンパク質によって切断されているかどうかを検出する工程であって、前記切断が、コラテラル一本鎖ＤＮＡのトランス切断である、前記検出する工程と、を含み、
前記核酸プローブが前記Ｃａｓタンパク質によって切断される場合、それは前記試料中の前記標的核酸分子の存在を示し、前記核酸プローブが前記Ｃａｓタンパク質によって切断されない場合、それは前記試料中に前記標的核酸分子が存在しないことを示す、
前期検出するための方法。
（項目１６）
前記核酸を増幅するための方法が、ＰＣＲ増幅、ＬＡＭＰ増幅、ＲＰＡ増幅、リガーゼ連鎖反応、分岐ＤＮＡ増幅、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、転写介在増幅、ローリングサークル増幅、ＨＤＡ、ＳＰＩＡ、ＮＥＡＲ、ＴＭＡ、及びＳＭＡＰ２からなる群から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
標的部位の上流及び下流（−２０ｎｔ〜＋２０ｎｔの範囲、好ましくは−１５ｎｔ〜＋１５ｎｔの範囲、より好ましくは−１０ｎｔ〜＋１０ｎｔの範囲）がＰＡＭ配列を欠く場合、ＰＡＭ導入プライマーを用いて核酸増幅を実施する、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記ＰＡＭ導入プライマーが、５’−３’中に式Ｉ
Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３（Ｉ）
の構造を有し、
式中、
Ｐ１は、５’末端に位置し、前記標的核酸分子の配列に相補的または非相補的である５’セグメント配列であり、
Ｐ２は、ＰＡＭ配列であり、
Ｐ３は、３’末端に位置し、前記標的核酸分子の配列に相補的である３’セグメント配列である、
項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記標的部位の上流及び下流（−２０ｎｔ〜＋２０ｎｔの範囲、好ましくは−１５ｎｔ〜＋１５ｎｔの範囲、より好ましくは−１０ｎｔ〜＋１０ｎｔの範囲）が前記ＰＡＭ配列を含む場合、前記ＰＡＭ配列を含むかまたは含まないプライマーを使用することができ、前記増幅産物が前記ＰＡＭ配列を含む、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
コラテラル一本鎖ＤＮＡ切断に基づいて標的核酸分子を検出するための、検出試薬の調製またはキットにおけるＣａｓタンパク質の使用であって、前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ａであるか、または前記Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓタンパク質である、前記使用。
（項目２１）
前記Ｃａｓ１２ａのものと類似のコラテラル一本鎖ＤＮＡ切断活性を有する前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ１２ｂ（またはＣ２ｃ１）からなる群から選択される、項目２０に記載の使用。