【手続補正書】
【提出日】令和3年4月30日(2021.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡアセンブリで使用するための核酸であって、
前記核酸が、少なくとも１つのメチル化保護可能な制限要素を含み、前記メチル化保護可能な制限要素は：
ＩＩＳ型制限酵素認識配列；及び
ＤＮＡメチラーゼ認識配列
を含み、
前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列及び前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、ＤＮＡメチラーゼにより修飾された塩基が前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列と同一ではないか、又は前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列に囲まれておらず、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記ＩＩＳ型制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成する配列とオーバーラップせず、
前記核酸は、前記メチル化保護可能な制限要素の切断部位の反対側に設けられた対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより短縮複合要素が形成され、
前記短縮複合要素の前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列は、前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、および／または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記ＩＩＳ型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、核酸。
【請求項２】
前記核酸が第１および第２のメチル化保護可能な制限要素を含み、
前記核酸は、前記第１および第２のメチル化保護可能な制限要素のそれぞれの切断部位の反対側に設けられた対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより
（Ａ）ｉ）維持された複合要素、または挿入複合要素、およびｉｉ）短縮複合要素；または
（Ｂ）２つの短縮複合要素；
が形成され、
前記維持された複合要素は、前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列が、同じオーバーハングが生じるように対向するメチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列と同じ部位で前記制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記挿入複合要素は、前記メチル化保護可能な制限要素と前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列との間に設けられた機能性配列インサートを含む配置であり、
前記短縮複合要素は、前記短縮複合要素の前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列が、前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、および／または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記ＩＩＳ型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置である、
請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸が、２つのメチル化保護可能な制限要素の切断部位の間に廃棄配列である核酸配列を含む、又は
前記核酸が各末端にメチル化保護可能な制限要素を有する直線化されたベクターである、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記廃棄配列が、選択マーカー、レポーター遺伝子、又は標識を含む、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記メチル化保護可能な制限要素の制限酵素認識配列が、対向する保護不可能な制限酵素認識配列と同じ制限酵素種によって認識される、および／または
各メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列が、同じメチラーゼによって認識される、
請求項１〜４のいずれかに記載の核酸。
【請求項６】
前記メチル化保護可能な制限要素が、配列ＧＡＣＮＮＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮ（ＢｓａＩ／Ｍ．Ｏｓｐ８０７ＩＩ−配列番号：１）、若しくはＧＡＡＧＡＣＧＣＮＮＮＮＮＮ（ＢｐｉＩ／Ｍ２．ＮｍｅＭＣ５８ＩＩ−配列番号２）、若しくはＧＡＡＧＣＴＣＴＴＣＮＮＮＮ（ＬｇｕＩ／Ｍ．ＸｍｎＩ−配列番号３）を含む、又はそれからなる、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸。
【請求項７】
ＤＮＡ断片の瘢痕のないＤＮＡアセンブリの方法であって：
（Ａ）それらの間に廃棄配列を含む第１および第２のメチル化保護可能な制限要素を含む第１の核酸の制限酵素切断によって第１の直線化されたメチル化核酸を提供する、または前記廃棄配列が切り出されたそれらの先に制限酵素切断されたバージョンを提供する、工程であって、
前記第１の核酸の第１および第２のメチル化保護可能な制限要素はそれぞれ、
ＩＩＳ型制限酵素認識配列；及び
ＤＮＡメチラーゼ認識配列
を含み、
前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列及び前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、ＤＮＡメチラーゼにより修飾された塩基が前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列と同一ではないか、又は前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列に囲まれておらず、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記ＩＩＳ型制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成する配列とオーバーラップせず、
前記第１および第２のメチル化保護可能な制限要素は、前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するＤＮＡメチラーゼでメチル化され、
前記第１の核酸は、前記第１および第２のメチル化保護可能な制限要素のそれぞれの切断部位の反対側に設けられた対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより（ｉ）維持された複合要素および（ｉｉ）短縮複合要素がもたらされ、
前記維持された複合要素は、前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列が、同じオーバーハングが生じるように対向するメチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列と同じ部位で前記制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記短縮複合要素は、前記短縮複合要素の前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列が、前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、および／または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記ＩＩＳ型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記第１の核酸は、前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列を認識するＩＩＳ型制限酵素によって制限酵素切断され、それにより、前記第１の直線化されたメチル化核酸が形成され、
前記維持された複合要素及び短縮複合要素が、前記ＤＮＡメチラーゼでメチル化されている、
工程；
前記第１の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されているオーバーハング末端を有するアセンブリのための第１のＤＮＡ断片を提供する工程；
前記アセンブリのための第１のＤＮＡ断片及び第１の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第１のメチル化中間ベクターを形成する工程；
前記第１のメチル化中間ベクターを、前記維持された複合要素及び短縮複合要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列（複数の場合もある）のいずれかを認識するＤＮＡメチラーゼ（複数の場合もある）を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第１の中間ベクターを形成する工程；
上記第１の中間ベクターを単離する工程；
（Ｂ）それらの間に廃棄配列を含む第１および第２のメチル化保護可能な制限要素を含む第２の核酸の制限酵素切断によって第２の直線化されたメチル化核酸を提供する、または前記廃棄配列が切り出されたそれらの先に制限酵素切断されたバージョンを提供する、工程であって、
前記第２の核酸の第１および第２のメチル化保護可能な制限要素はそれぞれ、
ＩＩＳ型制限酵素認識配列；及び
ＤＮＡメチラーゼ認識配列
を含み、
前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列及び前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、ＤＮＡメチラーゼにより修飾された塩基が前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列と同一ではないか、又は前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列に囲まれておらず、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記ＩＩＳ型制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成する配列とオーバーラップせず、
前記第１および第２のメチル化保護可能な制限要素は、前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するＤＮＡメチラーゼでメチル化され、
前記第２の核酸は、前記第１および第２のメチル化保護可能な制限要素のそれぞれの切断部位の反対側に設けられた対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより（ｉ）維持された複合要素および（ｉｉ）短縮複合要素がもたらされ、
前記維持された複合要素は、前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列が、同じオーバーハングが生じるように対向するメチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列と同じ部位で前記制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記短縮複合要素は、前記短縮複合要素の前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列が、前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、および／または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記ＩＩＳ型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記第２の核酸は、前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列を認識するＩＩＳ型制限酵素によって制限酵素切断され、それにより、前記第２の直線化されたメチル化核酸が形成され、
前記維持された複合要素及び短縮複合要素が前記ＤＮＡメチラーゼでメチル化されており、前記第１の直線化されたメチル化核酸の維持された複合要素によって提供されるオーバーハングが、前記第２の直線化されたメチル化核酸のメチル化保護可能な制限要素によって提供されるオーバーハングと配列が異なる工程；
前記第２の直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されているオーバーハング末端を有するアセンブリのための第２のＤＮＡ断片を提供する工程；
前記アセンブリのための第２のＤＮＡ断片及び第２の直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、第２のメチル化中間ベクターを形成する工程；
前記第２のメチル化中間ベクターを、維持された複合要素及び短縮複合要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列（複数の場合もある）のいずれかを認識するＤＮＡメチラーゼ（複数の場合もある）を発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない第２の中間ベクターを形成する工程；
前記第２の中間ベクターを単離する工程；
（Ｃ）前記維持された複合要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列を認識するＩＩＳ型制限酵素、及び前記短縮複合要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列を認識するＩＩＳ型制限酵素で前記第１の中間ベクターを切断し、それにより前記維持された複合要素によって決定される維持されたオーバーハング配列、及びアセンブリのための前記第１のＤＮＡ断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第１の適合ＤＮＡ断片インサートを形成する工程；
（Ｄ）前記維持された複合要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列を認識するＩＩＳ型制限酵素、及び前記短縮複合要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列を認識するＩＩＳ型制限酵素で前記第２の中間ベクターを切断し、それにより前記維持された複合要素によって決定される維持されたオーバーハング配列、及びアセンブリのための前記第２のＤＮＡ断片のネイティブ配列によって決定される対向するネイティブオーバーハング配列を含む第２の適合ＤＮＡ断片インサートを形成する工程；
を含み、
ここで
（ｉ）前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片は、それらが共にライゲートするため配列されるように、それらのネイティブオーバーハング配列が相補的である末端断片であり；又は
（ｉｉ）アセンブリのための１つ以上の中央ＤＮＡ断片が提供され、ここで、前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片は、前記アセンブリにおいて各末端断片であり、前記１つ以上の中央ＤＮＡ断片は、相補的なネイティブオーバーハング配列を介して、前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片の間にライゲートされるように配置され；
さらに、リガーゼで、前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片、又は前記第１及び第２の適合ＤＮＡ断片と１つ以上の中央ＤＮＡ断片と共にライゲートして、各末端に維持されたオーバーハングを有するアセンブルされたＤＮＡ断片を形成する工程を含む、方法。
【請求項８】
前記中央ＤＮＡ断片が、前記第１の適合ＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングに相補的な第１のネイティブオーバーハング配列と、前記第２の適合ＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングに相補的な第２のネイティブオーバーハング配列とを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、アセンブリのために２つ以上の中央ＤＮＡ断片を含み、
前記中央ＤＮＡ断片が、それらが予め決められた順序で一緒にライゲートされ得るように、隣接する中央ＤＮＡ断片のネイティブオーバーハングに相補的なネイティブオーバーハング配列を含み、
前記配列中の最初と最後の中央ＤＮＡ断片が、相補的なネイティブオーバーハング配列を介して、それぞれの第１の適合ＤＮＡ断片及び第２の適合ＤＮＡ断片にライゲートするように配置される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
アセンブリのための中央ＤＮＡ断片が、
それらの間に廃棄配列を含む第１および第２のメチル化保護可能な制限要素を含む核酸の制限酵素切断によって更なる直線化されたメチル化核酸を提供するか、または前記廃棄配列が切り出されたそれらの先に制限酵素切断されたバージョンを提供することであって、
前記核酸の第１および第２のメチル化保護可能な制限要素はそれぞれ、
ＩＩＳ型制限酵素認識配列；及び
ＤＮＡメチラーゼ認識配列
を含み、
前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列及び前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、ＤＮＡメチラーゼにより修飾された塩基が前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列内にあるようにオーバーラップしており、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列と同一ではないか、又は前記ＩＩＳ型制限酵素認識配列に囲まれておらず、
前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列は、前記ＩＩＳ型制限酵素により生成されるオーバーハング末端配列を形成する配列とオーバーラップせず、
前記第１および第２のメチル化保護可能な制限要素は、前記ＤＮＡメチラーゼ認識配列を認識するＤＮＡメチラーゼでメチル化され、
前記核酸は、前記第１および第２のメチル化保護可能な制限要素のそれぞれの切断部位の反対側に設けられた対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列をさらに含み、それにより２つの短縮複合要素がもたらされ、
前記短縮複合要素は、前記短縮複合要素の前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列が、前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列内の部位において、および／または前記切断部位と前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列の認識配列との間のヌクレオチド内で、前記ＩＩＳ型制限酵素が前記核酸を切断するように配置されている、配置であり、
前記核酸は、前記対向するＩＩＳ型制限酵素認識配列を認識するＩＩＳ型制限酵素によって制限酵素切断され、それにより、前記更なる直線化されたメチル化核酸が形成される、
提供すること；
前記更なる直線化されたメチル化核酸のオーバーハング末端にライゲートするように適合されたオーバーハング末端を有するアセンブリのための適合中央ＤＮＡ断片を提供すること；
前記アセンブリのための適合中央ＤＮＡ断片及び更なる直線化されたメチル化核酸を、リガーゼを用いてライゲートして、メチル化中間ベクターを形成すること；
前記メチル化中間ベクターを、前記メチル化保護可能な制限要素のＤＮＡメチラーゼ認識配列のいずれかを認識するＤＮＡメチラーゼを発現しない細菌株に形質転換し、それによりメチル化されていない中間ベクターを形成すること；
前記中間ベクターを単離すること；
前記中間ベクターを、前記メチル化保護可能な制限要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列を認識する制限酵素で切断し、それにより、アセンブリのための中央ＤＮＡ断片のネイティブ配列によって決定される各末端のネイティブオーバーハング配列を含む中央ＤＮＡ断片インサートを形成すること、
によって提供される、
請求項７〜９のいずれかに記載の方法
【請求項１１】
前記アセンブルされたＤＮＡ断片の挿入のため直線化されたデスティネーションベクターを提供する工程を更に含む、請求項７〜１０のいずれかに記載の方法であって、任意選択で、前記直線化されたデスティネーションベクターは、維持された複合要素及び／又は短縮複合要素のＩＩＳ型制限酵素認識配列を認識する同じＩＩＳ型制限酵素で環状デスティネーションベクターを切断することにより提供されてもよい、方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸を含む、組成物。
【請求項１３】
１つ以上の請求項１〜６のいずれかに記載の核酸と、制限酵素及び／又はリガーゼと、を含むキット。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれかに記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１５】
目的のＤＮＡ断片をアセンブルするための請求項１〜６のいずれかに記載の核酸の使用であって、任意選択で、前記使用はｉｎ  ｖｉｔｒｏであってもよい、使用。