【手続補正書】
【提出日】令和3年3月17日(2021.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（a）少なくとも1平方μmにつき1分子の密度で基材に隣接して固定化されている複数の分析物を支持する基材を提供する工程；
（b）該基材に隣接して固定化された該複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物にプローブが結合する少なくとも1サイクルにわたり、該基材から少なくとも1つの光学シグナルを得る工程；
（c）該複数の分析物のうちの該1つまたは複数の分析物を同定するために、該少なくとも1つの光学シグナルを処理する工程
を含み、
該複数の分析物のうち少なくとも10%が、該少なくとも1つの光学シグナルのλ / (2*N.A.)未満だけ互いから隔てられている、
複数の分析物を処理または分析するための方法。
【請求項２】
（b）前記複数の分析物のうちの前記1つまたは複数の分析物にプローブが結合する前記少なくとも1サイクルからの前記少なくとも1つの光学シグナルをオーバーレイするように、画像処理モジュールを構成する工程をさらに含み、
（c）該複数の分析物のうちの該1つまたは複数の分析物を同定するために、該少なくとも1つの光学シグナルの該オーバーレイに光学分布モデルを適用する工程をさらに含む、
請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記複数の分析物のうちの前記1つまたは複数の分析物にプローブが結合する前記少なくとも1サイクルについてのフィールド画像から、より高いピクセル密度を有する、前記少なくとも1つの光学シグナルからのオーバーサンプリングされた画像を生成するために、前記画像処理モジュールを使用する工程をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記複数の分析物が、少なくとも1平方μmにつき2分子の密度で前記基材に隣接して固定化されている、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記複数の分析物が、少なくとも1平方μmにつき4分子の密度で前記基材に隣接して固定化されている、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも1つの光学シグナルが、250 nmにつき1ピクセルまたはそれ未満の分解能で光学画像化モジュールにより得られる、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記複数の分析物のうちの少なくとも1つの分析物が核酸分子である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記複数の分析物のうちの少なくとも1つの分析物がタンパク質またはポリペプチドである、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも1つの光学シグナルが蛍光シグナルである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも1つの光学シグナルが複数の光学シグナルである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも1サイクルが複数のサイクルである、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも1平方μmにつき1分子の密度で基材に隣接した固定化された複数の分析物を支持するよう構成された、基材；
該基材に隣接して固定化された該複数の分析物のうちの1つまたは複数の分析物にプローブが結合する少なくとも1サイクルにわたり、該基材から少なくとも1つの光学シグナルを得るように構成された、光学画像化モジュール；および
該複数の分析物のうちの該1つまたは複数の分析物を同定するために、該少なくとも1つの光学シグナルを処理するように構成された、画像処理モジュール
を含み、
該複数の分析物のうち少なくとも10%が、該少なくとも1つの光学シグナルのλ / (2*N.A.)未満だけ互いから隔てられている、
複数の分析物を処理または分析するためのシステム。
【請求項１３】
前記画像処理モジュールが、
前記複数の分析物のうちの前記1つまたは複数の分析物にプローブが結合する前記少なくとも1サイクルにわたり、前記基材からの前記少なくとも1つの光学シグナルをオーバーレイするように、および
該複数の分析物のうちの該1つまたは複数の分析物を同定するために、該少なくとも1つの光学シグナルの該オーバーレイに光学分布モデルを適用するように
構成されている、請求項12記載のシステム。
【請求項１４】
前記画像処理モジュールが、前記複数の分析物のうちの前記1つまたは複数の分析物にプローブが結合する前記少なくとも1サイクルについてのフィールド画像から、より高いピクセル密度を有する、前記少なくとも1つの光学シグナルからオーバーサンプリングされた画像を生成するようにさらに構成されている、請求項13記載のシステム。
【請求項１５】
前記複数の分析物が、少なくとも1平方μmにつき2分子の密度で前記基材に隣接して固定化されている、請求項12記載のシステム。
【請求項１６】
前記複数の分析物が、少なくとも1平方μmにつき4分子の密度で前記基材に隣接して固定化されている、請求項15記載のシステム。
【請求項１７】
前記複数の分析物のうちの少なくとも1つの分析物が核酸分子である、請求項12記載のシステム。
【請求項１８】
前記複数の分析物のうちの少なくとも1つの分析物がタンパク質またはポリペプチドである、請求項12記載のシステム。
【請求項１９】
前記少なくとも1つの光学シグナルが蛍光シグナルである、請求項12記載のシステム。
【請求項２０】
前記少なくとも1つの光学シグナルが複数の光学シグナルである、請求項12記載のシステム。
【請求項２１】
前記少なくとも1サイクルが複数のサイクルである、請求項12記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
いくつかの態様において、標的分析物は、光学画像化装置によって検出される光の回折限界未満の平均中心間距離で、該基材上に固定化される。
[本発明1001]
基材の表面上に高密度で固定化された複数のポリヌクレオチドを配列決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
a.  表面を含む基材を提供する工程であって、表面が、表面上で別々の位置に固定化された複数のポリヌクレオチドを含み、かつ該表面が、合成による配列決定（sequencing by synthesis）のための試薬を含む、工程；
b.  以下を含む各サイクルを含む、単一分子の、合成による配列決定の、複数のサイクルを実施する工程：
i.  該ポリヌクレオチドを、検出可能な標識を含む可逆的ターミネーターヌクレオチドのセットと接触させること；
ii.  該ポリヌクレオチドに組み込まれた各ヌクレオチドからの光学シグナルを検出するために、光学システムを用いて該表面のフィールドを画像化することであって、それにより該サイクルについて該フィールドにおける複数の光学シグナルを検出する、画像化すること；
c.  該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像からの該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する工程；
d.  各光学シグナルについて該ピーク位置をオーバーレイする工程、および該表面上の検出される各組み込まれたヌクレオチドの相対位置を、改善された正確性で決定するために、光学シグナルの各クラスターにおいて光学分布モデルを適用する工程；
e.  該決定された相対位置およびデコンボリューション関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における該光学シグナルをデコンボリューションする工程；
f.  各フィールドおよび各サイクルについて、該ポリヌクレオチドに組み込まれた該検出可能な標識を、該デコンボリューションされた光学シグナルから同定する工程；ならびに
g.  各ポリヌクレオチドの位置で、該複数のサイクルにわたって同定された該検出可能な標識から、基材の表面上に固定化された該複数のポリヌクレオチドを配列決定する工程。
[本発明1002]
前記基材が、同一配列を含むポリヌクレオチドの1,000以下、500以下、100以下、50以下、25以下、20以下、15以下、または10以下のクローンコピーを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ポリヌクレオチドがDNAコンカテマーである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
各サイクルが、前記表面を前記複数の可逆的ターミネーターヌクレオチドと接触させることの後であってかつ前記フィールドを画像化することの前に、未結合のヌクレオチドを除去するために前記表面を洗浄することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
別のサイクルが実施されようとする場合に、前記サイクルが、前記可逆的ターミネーターを切断することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
別のサイクルが実施されようとする場合に、前記サイクルが、前記検出可能な標識を切断することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
可逆的ターミネーターヌクレオチドの前記セットが、それぞれ別個の検出可能な標識を有する少なくとも2つの別個のヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
可逆的ターミネーターヌクレオチドの前記セットが、それぞれ別個の検出可能な標識を有する少なくとも4つの別個のヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
可逆的ターミネーターヌクレオチドの前記セットが、アデニン、シトシン、チミン、およびグアニンを含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
可逆的ターミネーターヌクレオチドの前記セットが、アデニン、シトシン、ウラシル、およびグアニンを含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記ポリヌクレオチドがデオキシリボ核酸またはリボ核酸を含む、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記複数の標的ポリヌクレオチドが約1 kb〜約100 kbの長さを有する、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記複数の標的ポリヌクレオチドが約10 kb〜約50 kbの長さを有する、本発明1001の方法。
[本発明1014]
表面に結合した前記ポリヌクレオチドが、少なくとも10 nmの距離によって隔てられる、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記検出可能な標識が、前記可逆的ターミネーターヌクレオチドの3' -OH基に結合される、本発明1001の方法。
[本発明1016]
検出可能な標識ではない保護基が、前記可逆的ターミネーターヌクレオチドの3' -OHに結合される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記複数の標的ポリヌクレオチドが、別々の位置で前記表面に結合した捕捉プローブへの結合によって固定化される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記複数の標的ポリヌクレオチドが、前記捕捉プローブの配列に相補的な捕捉配列および前記配列決定プライマーの配列に相補的なプライミング配列を含むアダプターに連結される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記捕捉配列が20マーから50マーである、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記プライミング配列が20マーから50マーである、本発明1018の方法。
[本発明1021]
同じ配列を有するポリヌクレオチドのセットを比較することによって、またはデータそれ自体に基づいて、位相誤差を補正するために前のサイクルの回帰を実施する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1022]
前記デコンボリューションが、隣接するポリヌクレオチドからの干渉光学シグナルを、前記隣接するポリヌクレオチド間の中心間距離を用いて、前記決定された相対位置から除去する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記デコンボリューション関数が最近傍変数回帰（nearest neighbor variable regression）を含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記デコンボリューションが、各サイクルにおいて使用される特有の検出可能な各標識から、オーバーラップする波長を分離する工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1025]
前記デコンボリューション関数がクロストーク回帰（cross-talk regression）を含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記デコンボリューション関数が、最近傍変数回帰、平滑化、またはクロストーク補正を含む、本発明1001の方法。
[本発明1027]
前記ポリヌクレオチドが、単一分子の、合成による配列決定のために、前記基材上で離れて配置される、本発明1001の方法。
[本発明1028]
配列決定されようとする別個のポリヌクレオチド配列を含む近接するポリヌクレオチドに結合したプローブからの前記検出可能な標識によって放出される光学シグナルの間にオーバーラップが存在するように、前記ポリヌクレオチドが、前記基材上に高密度に詰め込まれる、本発明1001の方法。
[本発明1029]
前記表面上に固定化された前記ポリヌクレオチドが、平均して、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、本発明1001の方法。
[本発明1030]
前記表面上に固定化された前記ポリヌクレオチドの少なくとも2つが、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記表面上に固定化された前記ポリヌクレオチドの少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が、別の固定化されたポリヌクレオチドから、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、本発明1001の方法。
[本発明1032]
前記光学システムが0.2〜2.0の開口数を含む、本発明1028〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記光学システムが1〜1.1の開口数を含む、本発明1028〜1031のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記放出される光の前記波長が、約400〜450 nm、約450〜500 nm、約500〜550 nm、約550〜600 nm、約600〜650 nm、または約650〜700 nmである、本発明1028〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
固定化されたポリヌクレオチドが、600 nm未満、500 nm未満、400 nm未満、300 nm未満、または200 nm未満の、近接するポリヌクレオチド間の最少の中心間距離を含む、本発明1001の方法。
[本発明1036]
ポリヌクレオチドが、1平方ミクロンにつき分子約4〜25個の平均密度で前記表面上に固定化される、本発明1001の方法。
[本発明1037]
ポリヌクレオチドが、1平方ミクロンにつき分子4個超、6個超、8個超、10個超、15個超、または20個超の平均密度で前記表面上に固定化される、本発明1001の方法。
[本発明1038]
前記表面の前記画像化が、光学システムのナイキスト限界によって決定される場合の臨界サンプリングレートより大きい分解能で実施される、本発明1001の方法。
[本発明1039]
前記表面の前記画像化が、少なくとも2Xナイキストサンプリング周波数の分解能で実施される、本発明1001の方法。
[本発明1040]
前記表面の前記画像化が、画像フィールドの1つの軸に沿って300 nmにつき1ピクセル、またはそれ以上の分解能で実施される、本発明1001の方法。
[本発明1041]
前記表面の前記画像化が、画像フィールドの1つの軸に沿って1ピクセルにつき約162.5 nmの分解能で実施される、本発明1001の方法。
[本発明1042]
各サイクルからの前記フィールド画像のそれぞれから、より高いピクセル密度を有するオーバーサンプリングされた画像を生成する工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1043]
前記オーバーサンプリングされた画像が、前記光学シグナルについての予想される点像分布関数に基づき、各フィールド画像に平滑化を適用することによって生成される、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記フィールド画像もしくは前記オーバーサンプリングされた画像から、光学シグナルピークの位置を含むデータセットを生成する工程をさらに含む、本発明1001または1042の方法。
[本発明1045]
前記ピーク位置をオーバーレイする前記工程が、前記複数のサイクルから、各ポリヌクレオチドについての光学ピーク位置のクラスターを生成するために、複数の前記サイクルについて、各フィールドにおいて検出された前記光学シグナルピークの位置をアラインする工程を含む、本発明1001の方法。
[本発明1046]
前記光学分布モデルがガウス分布である、本発明1001の方法。
[本発明1047]
前記光学分布モデルが点像分布関数である、本発明1001の方法。
[本発明1048]
前記相対位置が、前記フィールドにおける複数の前記ポリヌクレオチドについて決定される、本発明1001の方法。
[本発明1049]
前記相対位置が、10 nm以内のRMSの正確性で決定される、本発明1001の方法。
[本発明1050]
前記フィールドの参照画像に対して相対オフセットを決定するために、異なるサイクルからの前記フィールドの複数の画像をオーバーレイする工程をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1051]
前記参照フィールドにアラインされた前記フィールドのそれぞれについてオフセット値を生成する工程を含む、本発明1050の方法。
[本発明1052]
各フィールド内のポリヌクレオチドの前記相対位置が、前記オフセット値から決定される、本発明1051の方法。
[本発明1053]
そのアラインメントがアラインメント閾値外であるフィールド画像を除外する工程をさらに含む、本発明1052の方法。
[本発明1054]
方法が、前記フィールドの参照画像に対して相対オフセットを決定するために、前記フィールドからの複数の画像をオーバーレイする工程をさらに含み、前記相対位置が、5 nm以内のRMSの正確性で決定される、本発明1001の方法。
[本発明1055]
1平方ミクロンにつき約4〜25個の密度で、表面からの光学シグナルを解像することができる、本発明1001の方法。
[本発明1056]
前記検出可能な標識が光を放出し、かつポリヌクレオチドが、前記検出可能な標識から放出される光の回折限界未満の平均ピッチで前記基材の表面上に固定化される、本発明1001の方法。
[本発明1057]
高密度に詰め込まれた基材の表面上に固定化された分析物の相対位置を正確に決定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
a.  表面を含む基材を提供する工程であって、表面が、表面上で別々の位置に固定化された複数の分析物を含む、工程；
b.  該表面上でのプローブ結合およびシグナル検出の複数のサイクルを実施する工程であって、各サイクルが以下を含む、工程：
i.  該分析物を、プローブセットからの複数のプローブと接触させることであって、該プローブが、検出可能な標識を含み、該プローブのそれぞれが、標的分析物に特異的に結合する、接触させること；および
ii.  該表面上の別々の位置で該分析物に結合した個々のプローブからの複数の光学シグナルを検出するために、光学システムを用いて該表面のフィールドを画像化すること；
c.  該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像からの該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する工程；ならびに
d.  各光学シグナルについて該ピーク位置をオーバーレイする工程、および該表面上の検出される各分析物の相対位置を、改善された正確性で決定するために、光学シグナルの各クラスターにおいて光学分布モデルを適用する工程。
[本発明1058]
a.  前記決定された相対位置およびデコンボリューション関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における前記光学シグナルをデコンボリューションする工程；ならびに
b.  各フィールドおよび各サイクルについて、前記固定化された分析物に結合した、前記検出可能な標識を、前記デコンボリューションされた光学シグナルから同定する工程
をさらに含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記基材上の複数の前記分析物を同定するために、各サイクルにおいて検出される各分析物についての前記検出可能な標識のアイデンティティを用いる工程をさらに含む、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記デコンボリューションが、隣接する分析物からの干渉光学シグナルを、前記隣接する分析物間の中心間距離を用いて、前記隣接する分析物の前記決定された相対位置から除去する工程を含む、本発明1058の方法。
[本発明1061]
前記デコンボリューション関数が最近傍変数回帰を含む、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記デコンボリューションが、各サイクルにおいて使用される特有の検出可能な各標識から、オーバーラップする波長を分離する工程を含む、本発明1058の方法。
[本発明1063]
前記デコンボリューション関数がクロストーク回帰を含む、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記デコンボリューション関数が、最近傍変数回帰、平滑化、またはクロストーク補正を含む、本発明1058の方法。
[本発明1065]
前記分析物が単一分子である、本発明1057の方法。
[本発明1066]
前記単一分子が単一の生体分子である、本発明1065の方法。
[本発明1067]
前記単一分子がポリヌクレオチドである、本発明1065の方法。
[本発明1068]
近接する分析物に結合したプローブからの前記検出可能な標識によって放出される光学シグナルの間にオーバーラップが存在するように、前記分析物が、前記基材上に高密度に詰め込まれる、本発明1057の方法。
[本発明1069]
前記表面上に固定化された前記分析物が、平均して、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、本発明1057の方法。
[本発明1070]
前記表面上に固定化された前記分析物の少なくとも2つが、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、本発明1057の方法。
[本発明1071]
前記表面上に固定化された前記分析物の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が、別の分析物から、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、本発明1057の方法。
[本発明1072]
前記光学システムが0.2〜2.0の開口数を含む、本発明1068〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
前記光学システムが1〜1.1の開口数を含む、本発明1068〜1071のいずれかの方法。
[本発明1074]
前記光の前記波長が、約400〜450 nm、約450〜500 nm、約500〜550 nm、約550〜600 nm、約600〜650 nm、または約650〜700 nmである、本発明1068〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
固定化された分析物が、600 nm未満、500 nm未満、400 nm未満、300 nm未満、または200 nm未満の、近接する分析物間の最少の中心間距離を含む、本発明1057の方法。
[本発明1076]
標的分析物が、1平方ミクロンにつき分子約4〜25個の平均密度で前記表面上に固定化される、本発明1057の方法。
[本発明1077]
標的分析物が、1平方ミクロンにつき分子4個超、6個超、8個超、10個超、15個超、または20個超の平均密度で前記表面上に固定化される、本発明1057の方法。
[本発明1078]
各サイクルが、前記プローブセットからの追加のプローブを用いてステップi) および ii) を繰り返すことをさらに含む、本発明1057の方法。
[本発明1079]
各サイクルが、前記表面を前記複数のプローブと接触させることの後であってかつ前記フィールドを画像化することの前に、前記表面から未結合のプローブを除去することをさらに含む、本発明1057の方法。
[本発明1080]
別のサイクルが実施されようとする場合に、各サイクルが、結合したプローブの前記表面からの除去をさらに含む、本発明1057の方法。
[本発明1081]
少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、または100サイクルが実施される、本発明1057の方法。
[本発明1082]
各サイクルが、前記光学システムを用いて前記表面の複数のフィールドを画像化することを含む、本発明1057の方法。
[本発明1083]
前記表面の前記画像化が、光学システムのナイキスト限界によって決定される場合の臨界サンプリングレートより大きい分解能で実施される、本発明1057の方法。
[本発明1084]
前記表面の前記画像化が、少なくとも2Xナイキストサンプリング周波数の分解能で実施される、本発明1057の方法。
[本発明1085]
前記表面の前記画像化が、画像フィールドの1つの軸に沿って300 nmにつき1ピクセル、またはそれ以上の分解能で実施される、本発明1057の方法。
[本発明1086]
前記表面の前記画像化が、画像フィールドの1つの軸に沿って1ピクセルにつき約162.5 nmの分解能で実施される、本発明1057の方法。
[本発明1087]
各サイクルからの前記フィールド画像のそれぞれから、より高いピクセル密度を有するオーバーサンプリングされた画像を生成する工程をさらに含む、本発明1057の方法。
[本発明1088]
前記オーバーサンプリングされた画像が、前記光学シグナルについての予想される点像分布関数に基づき、各フィールド画像に平滑化を適用することによって生成される、本発明1087の方法。
[本発明1089]
前記フィールド画像もしくは前記オーバーサンプリングされた画像から、光学シグナルピークの位置を含むデータセットを生成する工程をさらに含む、本発明1057または1087の方法。
[本発明1090]
前記ピーク位置をオーバーレイする前記工程が、前記複数のサイクルから、各分析物についての光学ピーク位置のクラスターを生成するために、複数の前記サイクルについて、各フィールドにおいて検出された前記光学シグナルピークの位置をアラインする工程を含む、本発明1057の方法。
[本発明1091]
前記光学分布モデルがガウス分布である、本発明1057の方法。
[本発明1092]
前記光学分布モデルが点像分布関数である、本発明1057の方法。
[本発明1093]
前記相対位置が、前記フィールドにおける複数の前記分析物について決定される、本発明1057の方法。
[本発明1094]
前記相対位置が、10 nm以内のRMSの正確性で決定される、本発明1057の方法。
[本発明1095]
前記フィールドの参照画像に対して相対オフセットを決定するために、異なるサイクルからの前記フィールドの複数の画像をオーバーレイする工程をさらに含む、本発明1057の方法。
[本発明1096]
前記参照フィールドにアラインされた前記フィールドのそれぞれについてオフセット値を生成する工程を含む、本発明1095の方法。
[本発明1097]
各フィールド内の分析物の前記相対位置が、前記オフセット値から決定される、本発明1096の方法。
[本発明1098]
そのアラインメントがアラインメント閾値外であるフィールド画像を除外する工程をさらに含む、本発明1095の方法。
[本発明1099]
前記フィールドの参照画像に対して相対オフセットを決定するために、前記フィールドからの複数の画像をオーバーレイする工程をさらに含み、前記相対位置が、5 nm以内のRMSの正確性で決定される、本発明1090の方法。
[本発明1100]
1平方ミクロンにつき約4〜25個の密度で、表面からの光学シグナルを解像することができる、本発明1057の方法。
[本発明1101]
前記検出可能な標識が光を放出し、かつ前記アレイに結合した標的分析物が、前記検出可能な標識から放出される光の回折限界未満の平均ピッチを含む、本発明1057の方法。
[本発明1102]
基材の表面上に固定化されている、高密度に詰め込まれた複数の分析物を同定するための方法であって、以下の工程を含む、方法：
a.  表面を含む基材を提供する工程であって、表面が、表面上で別々の位置に固定化された複数の分析物を含む、工程；
b.  該表面上でのプローブ結合およびシグナル検出の複数のサイクルを実施する工程であって、各サイクルが以下を含む、工程：
i.  該分析物を、プローブセットからの複数のプローブと接触させることであって、該プローブが、検出可能な標識を含み、該プローブのそれぞれが、標的分析物に特異的に結合する、接触させること；および
ii.  該分析物に結合した個々のプローブからの複数の光学シグナルを検出するために、光学システムを用いて該表面のフィールドを画像化すること；
c.  該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像からの該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する工程；
d.  各光学シグナルについて該ピーク位置をオーバーレイする工程、および該表面上の検出される各分析物の相対位置を、改善された正確性で決定するために、光学シグナルの各クラスターにおいて光学分布モデルを適用する工程；
e.  該決定された相対位置およびデコンボリューション関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における該光学シグナルをデコンボリューションする工程；
f.  各フィールドおよび各サイクルについて、該固定化された分析物に結合した該検出可能な標識を、該デコンボリューションされた光学シグナルから同定する工程；ならびに
g.  該基材上の複数の該分析物のアイデンティティを決定するために、各サイクルにおいて検出される各分析物についての該検出可能な標識のアイデンティティを用いる工程。
[本発明1103]
a.  基材の表面上に固定化された分析物へのプローブ結合の複数のサイクルにわたる、基材のフィールドからの複数の光学シグナルを画像化するように構成される、光学画像化装置；ならびに
b.  以下：
i.  該複数のサイクルの少なくとも2つからの該フィールドの画像からの該複数の光学シグナルのそれぞれからのピーク位置を決定する；
ii.  該複数のサイクルからの光学シグナルの各クラスターに光学分布モデルを適用することにより、該表面上の検出される各分析物の相対位置を、改善された正確性で決定する；および
iii.  該決定された相対位置およびデコンボリューション関数を用いて、各サイクルからの各フィールド画像における該光学シグナルをデコンボリューションする
ように構成される、画像処理モジュール
を含む、複数の分析物のアイデンティティを決定するためのシステム。
[本発明1104]
前記画像処理モジュールが、前記デコンボリューションされた光学シグナルを用いて、前記表面上に固定化された前記分析物のアイデンティティを決定するようにさらに構成される、本発明1103のシステム。
[本発明1105]
前記分析物がそれぞれポリヌクレオチド分子であり、かつ前記アイデンティティが前記ポリヌクレオチド分子の配列を含む、本発明1104のシステム。
[本発明1106]
前記光学画像化装置が、スキャン可能な領域を定義する可動ステージを含む、本発明1103のシステム。
[本発明1107]
前記光学画像化装置が、前記スキャン可能な領域において、回折限界未満で基材の表面をサンプリングするように構成されるセンサーおよび光学拡大力（magnification）を含む、本発明1106のシステム。
[本発明1108]
回折限界未満の中心間の間隔で基材の表面に固定化された分析物を含む、基材
をさらに含む、本発明1103のシステム。
[本発明1109]
前記デコンボリューションが、隣接する分析物からの干渉光学シグナルを、前記隣接する分析物間の中心間距離を用いて、前記隣接する分析物の前記決定された相対位置から除去することを含む、本発明1103のシステム。
[本発明1110]
前記デコンボリューション関数が最近傍変数回帰を含む、本発明1109のシステム。
[本発明1111]
前記デコンボリューションが、各サイクルにおいて使用される特有の検出可能な各標識から、オーバーラップする波長を分離することを含む、本発明1103のシステム。
[本発明1112]
前記デコンボリューション関数がクロストーク回帰を含む、本発明1111のシステム。
[本発明1113]
前記デコンボリューション関数が、最近傍変数回帰、平滑化、またはクロストーク補正を含む、本発明1103のシステム。
[本発明1114]
前記分析物が単一分子である、本発明1103のシステム。
[本発明1115]
前記単一分子が単一の生体分子である、本発明1114のシステム。
[本発明1116]
前記単一分子がポリヌクレオチドである、本発明1114のシステム。
[本発明1117]
近接する分析物に結合したプローブからの前記検出可能な標識によって放出される光学シグナルの間にオーバーラップが存在するように、前記分析物が、前記基材上に高密度に詰め込まれる、本発明1103のシステム。
[本発明1118]
前記表面上に固定化された前記分析物が、平均して、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、本発明1103のシステム。
[本発明1119]
前記表面上に固定化された前記分析物の少なくとも2つが、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、本発明1103のシステム。
[本発明1120]
前記表面上に固定化された前記分析物の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、または90%が、別の分析物から、検出可能な標識によって放出される光の回折限界未満の距離を隔てて配置され、かつ光学システムによって画像化される、本発明1103のシステム。
[本発明1121]
前記光学システムが0.2〜2.0の開口数を含む、本発明1117〜1120のいずれかのシステム。
[本発明1122]
前記光学システムが1〜1.1の開口数を含む、本発明1117〜1120のいずれかのシステム。
[本発明1123]
前記光の前記波長が約400〜450 nm、約450〜500 nm、約500〜550 nm、約550〜600 nm、約600〜650 nm、または約650〜700 nmである、本発明1117〜1122のいずれかのシステム。
[本発明1124]
固定化された分析物が、600 nm未満、500 nm未満、400 nm未満、300 nm未満、または200 nm未満の、近接する分析物間の最少の中心間距離を含む、本発明1103のシステム。
[本発明1125]
標的分析物が、1平方ミクロンにつき分子約4〜25個の平均密度で前記表面上に固定化される、本発明1103のシステム。
[本発明1126]
標的分析物が、1平方ミクロンにつき分子4個超、6個超、8個超、10個超、15個超、または20個超の平均密度で前記表面上に固定化される、本発明1103のシステム。
[本発明1127]
前記光学画像化装置が、光学システムのナイキスト限界によって決定される場合の臨界サンプリングレートより大きい分解能で前記基材を画像化するように構成される、本発明1103のシステム。
[本発明1128]
前記光学画像化装置が、少なくとも2Xナイキストサンプリング周波数の分解能で前記基材を画像化するように構成される、本発明1103のシステム。
[本発明1129]
前記光学画像化装置が、画像フィールドの1つの軸に沿って1ピクセルにつき300 nm以下の分解能で前記基材を画像化するように構成される、本発明1103のシステム。
[本発明1130]
前記光学画像化装置が、画像フィールドの1つの軸に沿って1ピクセルにつき約162.5 nmの分解能で前記基材を画像化するように構成される、本発明1103のシステム。
[本発明1131]
前記画像処理モジュールが、各サイクルからの前記フィールド画像のそれぞれから、より高いピクセル密度を有するオーバーサンプリングされた画像を生成するように構成される、本発明1103のシステム。
[本発明1132]
前記画像処理モジュールが、前記オーバーサンプリングされた画像を生成するために、前記光学シグナルについての予想される点像分布関数に基づき、各フィールド画像に平滑化を適用するように構成される、本発明1131のシステム。
[本発明1133]
前記画像処理モジュールが、前記画像化されたフィールドから、光学シグナルピークの位置を含むデータセットを生成するように構成される、本発明1103または1131のシステム。
[本発明1134]
1平方ミクロンにつき約4〜25個の密度で、表面からの光学シグナルを解像することができる、本発明1057のシステム。
[本発明1135]
標的分析物が、光学画像化装置によって検出される光の回折限界未満の平均中心間距離で、前記基材上に固定化される、本発明1057のシステム。