【手続補正書】
【提出日】平成17年2月16日(2005.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表される６’−アミジノ−２’−ナフチル４−グアニジノベンゾエート又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有するトリプターゼ阻害剤。
2003246730.tif 000001
【請求項２】
塩がメシル酸塩である、請求項１に記載のトリプターゼ阻害剤。
【請求項３】
トリプターゼがヒトトリプターゼである、請求項１又は２に記載のトリプターゼ阻害剤。
【請求項４】
６’−アミジノ−２’−ナフチル４−グアニジノベンゾエート又はそのメシル酸塩を有効成分として含有する、疼痛、掻痒症、間質性膀胱炎、過敏性腸症候群、又はＸ線造影剤の副作用としての血管透過性亢進若しくは肺浮腫からなる群から選ばれる疾患の治療又は予防のための治療剤。
【請求項５】
６’−アミジノ−２’−ナフチル４−グアニジノベンゾエート又はそのメシル酸塩を有効成分として含有するプロテイナーゼ活性化型受容体−２抑制剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
また、炎症やＸ線造影剤による副作用とトリプターゼの関係について、次のような報告もなされている。炎症細胞に関しては、肥満細胞、好塩基球、好酸球及び気道上皮細胞の活性化機序について多角的な検討が行われている。まず、Ｘ線造影剤の副作用の発症メカニズムであるが、高浸透圧性Ｘ線造影剤はヒト好塩基球からヒスタミン遊離をひき起こし、さらにこの遊離率は免疫学的刺激によるそれと有意に相関することが明らかになった。アレルギー患者では免疫学的ヒスタミン遊離能が亢進していることはよく知られているので、特にアレルギー患者においてＸ線造影剤の副作用の発生頻度が高い理由は、このような現象に起因している可能性が示唆された。また、代表的なＸ線造影剤であるイオキサグル酸に対するＩｇＥ抗体の検出を行った結果、副作用を示した患者の約３０％にＩｇＥ抗体が検出できた。しかし、その量は非常に僅かであるので、この特異ＩｇＥ抗体の意義については、現在検討中である。Ｘ線造影剤でショック症状を起こした患者の血清中にはトリプターゼの濃度が増加していたので、激しい副作用の際には肥満細胞からメディエーターが遊離されていることを確認した。次に、アスピリン喘息の発症機序であるが、このような患者にアスピリンの負荷試験を行い、経時的に尿を採集して各種のメディエーターの代謝産物を測定したところ、ロイコトリエンＥ４、１１ｂ−ＰＧＦ２ａ及びメチルヒスタミンの有意な増加が認められた。この結果は、アスピリン喘息患者ではアスピリンによって少なくとも肥満細胞からのメディエーター遊離が起きていることを示すと共に、アスピリン喘息の治療にも貢献すると考えられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
一方、最近になってトリプターゼが、ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２（ＰＡＲ−２）に対して特異的な刺激作用を有する事が明らかにされている。そこで、以下、プロテイナーゼ活性化型受容体（ＰＡＲ；ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、特にＰＡＲ−２について述べる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
ところで、ＰＡＲ−２に関して言えば、トリプターゼがｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２（ＰＡＲ−２）に対して特異的な刺激作用を有することが明らかにされているが、今回、本発明者らは、ウシ大動脈由来培養内皮細胞を用いた透過性測定実験によって、トリプターゼが正に顕著なタンパク透過性亢進作用を有し、また、同様の作用がＰＡＲ−２アゴニストのペプチドでも認められることを確認し、更に、このトリプターゼによる透過性亢進作用が６’−アミジノ−２’−ナフチル４−グアニジノベンゾエートによって強力に抑制されることを見出した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
また、本実験系から明らかなとおり、トリプターゼはプロテイナーゼ活性化型受容体（ＰＡＲ−２）を刺激することにより透過性を亢進すると考えられ、一方、ＰＡＲ−２は知覚神経や気管支にも存在し、トリプターゼの刺激により、発痛、痛覚過敏、掻痒、気道収縮が引き起こされることから、６’−アミジノ−２’−ナフチル４−グアニジノベンゾエートのメシル酸塩はトリプターゼ／ＰＡＲ−２系が関与すると考えられる病態、特に、知覚過敏、痛み、掻痒、浮腫、喘息等の治療薬として有用である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
タンパクの透過性の測定には、図２に示した装置を用いた。本装置は、プラスチック製のプレート外容器と、その中に内装できるインサートからなり、該インサートの底部は平面状のポリカーボネート膜（孔径３．０−μｍ、面積１．０ｃｍ２）が装着されている。ポリカーボネート膜にウシ大動脈内皮細胞の培養細胞（４．０×１０４個／ｃｍ２）を播種し、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を培地として、９５％Ｏ２、５％ＣＯ２条件下で４〜５日間培養後透過性実験に供した。なお、培地は２日毎に交換した。透過用タンパクは、エバンスブルーを結合させて標識したウシ血清アルブミン（Ａｂ−ＥＢ）のＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ溶液を用いた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
透過性実験は、インサートに培養したウシ血管内皮細胞をＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液（ｐＨ７．４）でよく洗浄し、プレート内に浸した。プレートにはＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液１．５ｍｌを予め満たし、インサートにはＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ液０．５ｍｌを添加して両者の液面が一致するようにした。所定濃度のトリプターゼ又はＰＡＲ−２アゴニストとしてのＳＬＩＧＫＶを、エバンスブルーを結合したウシ血清アルブミン（Ａｂ−ＥＢ；最終アルブミン濃度は４％、エバンスブルー濃度は０．６７ｍｇ／ｍｌとして使用）とともにインサート内に添加し、外液中に漏出したＡｂ−ＥＢ濃度を測定して（６２０ｎｍにおける吸光度）、タンパク透過性の指標とした。トリプターゼ及びプロテイナーゼ活性化型受容体（ＰＡＲ−２）アゴニストペプチド（ＳＬＩＧＫＶ）による培養血管内皮細胞でのタンパク透過性亢進作用を示すグラフを図３に示す。グラフ中、各値は平均値±Ｓ．Ｅ．を示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
（実施例４：ヨード造影剤によるラット肺における血管透過性亢進に対するメシル酸ナファモスタット及びメシル酸ガベキサートの抑制作用）
ラットをペントバルビタールＮａ（５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内投与により麻酔し、イオキサグル酸（ヘキサブリックス３２０、田辺製薬）（４ｇヨード／ｋｇ）をエバンスブルー生理食塩溶液（２０ｍｇ／ｋｇ）とともに大腿静脈より注入した。注入容量は１６ｍｌ／ｋｇとし、注入速度は１．５ｍｌ／分とした。注入１０分後に放血屠殺し、肺動脈を生理食塩水にて灌流後、肺組織を摘出し、秤量した。肺組織に漏出したエバンスブルーはホルムアミドにより抽出し（４ｍｌ／ｇ組織湿重量）、６２０ｎｍにおける吸光度により定量した。一方、肺組織は６０℃にて２４時間乾燥させた後、乾重量を測定した。血管透過性は肺組織に漏出したエバンスブルーの単位乾燥重量当りの量として表した。また、肺機能について調べる目的で、動脈血中の酸素分圧（ＰａＯ２）、二酸化炭素分圧（ＰａＣＯ２）及びｐＨを、造影剤投与５、１０、２０、４０及び６０分後にｉ−ＳＴＡＴ（ｉ−ＳＴＡＴ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー、米国）を用いて大腿動脈よりモニターした。さらに、肺浮腫を調べる目的で、造影剤投与１時間後にラット肺を摘出し、肺組織水分含量ならびにＮａ＋及びＫ＋含量を測定した。肺水分含量（％）は１００ｘ（湿重量−乾燥重量）／湿重量として表わした。一方、Ｎａ＋及びＫ＋含量は原子吸光光度計（フレーム法）により測定した。結果を図５、６及び７に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
【発明の効果】
６’−アミジノ−２’−ナフチル４−グアニジノベンゾエート又はその薬学的に許容される塩のトリプターゼ阻害作用については、不思議なことに、今日まで報告されていない。驚くべきことに、上記実験結果から明らかなように、６’−アミジノ−２’−ナフチル４−グアニジノベンゾエート又はその薬学的に許容される塩、特に、６’−アミジノ−２’−ナフチル４−グアニジノベンゾエートのメシル酸塩（メシル酸ナファモスタット）は、公知のメシル酸ガベキサート（ＩＣ５０値は１９４ｎＭ）よりも遥かに強力なトリプターゼ阻害作用（ＩＣ５０値は０．０１６ｎＭ）を有することが、ここに初めて明らかとなった。そして、驚くべきことに、メシル酸ナファモスタットの効力はメシル酸ガベキサートの何と１２０００倍以上であった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
一方、トリプターゼが、血管内皮細胞をはじめ、消化管、知覚神経、気管支、等、生体内に広く分布するプロテイナーゼ活性化型受容体（ＰＡＲ−２）を選択的に活性化することによって、気道平滑筋の収縮、知覚神経からのタキキニン遊離を介した発痛、痛覚過敏、掻痒、炎症、浮腫を引き起こすという公知の事実からして、また、トリプターゼが培養血管内皮細胞におけるタンパク透過性を亢進したのと同様に、ＰＡＲ−２アゴニストペプチドも同様の作用を示した本試験結果からして、メシル酸ナファモスタットは、トリプターゼによる培養血管内皮細胞でのタンパク透過性亢進作用を強力、かつ、濃度依存的に抑制することが明らかとなった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
トリプターゼ及びプロテイナーゼ活性化型受容体（ＰＡＲ−２）アゴニストペプチド（ＳＬＩＧＫＶ）による培養血管内皮細胞でのタンパク透過性亢進作用を示すグラフである。