【手続補正書】
【提出日】令和3年9月30日(2021.9.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロでの食道オルガノイド（ＥＯ）の製造方法であって、
ａ．前腸前培養を形成するために胚体内胚葉をＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ活性化因子、ＦＧＦ活性化因子、およびレチノイン酸（ＲＡ）と第１の期間接触させる工程であって、前記前腸前培養はＳＯＸ２およびＨＮＦ１Ｂを発現し、前記前腸前培養はＰＲＯＸ１とＨＮＦ６を実質的に発現しない、前記接触させる工程と、
ｂ．前記前腸前培養物をＢＭＰ阻害剤およびＥＧＦ活性化因子と背側前前腸（「ｄＡＦＧ」）スフェロイドを形成するのに十分な第２の期間接触させる工程であって、前記ｄＡＦＧはＳＯＸ２およびＴＰ６３を発現するがＰＤＸ１、ＰＡＸ９、またはＮＫＸ２．１を発現しない、前記接触させる工程と、
ｃ．前記ｄＡＦＧを食道オルガノイド（ＥＯ）の形成を可能にするのに十分な第３の期間ＥＧＦで培養する工程と、
を含む、製造方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記ＢＭＰ阻害剤は、ノギン、ドルソモルフィン、ＬＤＮ１８９、ＤＭＨ−１、およびそれらの組み合わせから選択される、方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の方法において、前記ＢＭＰ阻害剤はノギンである、方法。
【請求項４】
請求項１〜３いずれか１項に記載の方法において、前記ＢＭＰ阻害剤は、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、方法。
【請求項５】
請求項１〜４いずれか１項に記載の方法において、前記ＷＮＴ活性化因子は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７ａ、Ｗｎｔ７ｂ、Ｗｎｔ８ａ、Ｗｎｔ８ｂ、Ｗｎｔ９ａ、Ｗｎｔ９ｂ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｗｎｔ１１、Ｗｎｔ１６、ＧＳＫβ阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、ＬＹ２０９０３１４、ＳＢ−２１６７６３からなる群から選択される１またはそれ以上の分子から選択される、方法。
【請求項６】
請求項１〜５いずれか１項に記載の方法において、前記Ｗｎｔ経路活性化因子の濃度は、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度である、方法。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか１項に記載の方法において、前記ＦＧＦ活性化因子は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１またはそれ以上の分子から選択される、方法。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか１項に記載の方法において、前記ＦＧＦ活性化因子は、ＦＧＦ４またはＦＧＦ１０、または両方である、方法。
【請求項９】
請求項１〜８いずれか１項に記載の方法において、前記ＦＧＦ活性化因子の濃度は、約５０〜約１５００ｎｇ／ｍｌの間の濃度である、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか１項に記載の方法において、前記工程ｃの前記ｄＡＦＧは、ＦＧＦ活性化因子でさらに培養される、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法において、前記第１の期間は、約３日±２４時間である、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１いずれか１項に記載の方法において、前記第２の期間は、３日±２４時間である、方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２いずれか１項に記載の方法において、前記第３の期間は、約２１日〜約９０日である、方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３いずれか１項に記載の方法において、前記胚体内胚葉が、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、および人工多能性幹細胞から選択される前駆細胞に由来する、方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４いずれか１項に記載の方法において、前記胚体内胚葉は、多能性幹細胞を、成長因子のＴＧＦ−βスーパーファミリーのＢＭＰサブグループ：Ｎｏｄａｌ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ｂ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、およびそれらの組み合わせであるアクチビンから選択される１またはそれ以上の分子と接触させることに由来する、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５いずれか１項に記載の方法において、前記工程ｃは、広範なＳＯＸ２上皮発現、前記ＥＯの前記基底細胞層におけるｐ６３の発現、およびＫＲＴ８の発現によって特徴付けられるような期間で行われる、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５いずれか１項に記載の方法において、前記工程ｃは、前記ＥＯがＫＲＴ８を欠く重層上皮の形成、局所ケラチンを発現する重層扁平上皮の形成、および／またはＫＲＴ１３、ＫＲＴ１４、およびＩＮＶの発現によって特徴づけられるような期間で行われる、方法。
【請求項１８】
請求項１７記載の方法において、前記ＫＲＴ１３およびＩＮＶの発現は、前記ＥＯの基底層上で起こり、ＫＲＴ１４の発現は前記ＥＯの基底層で起こる、方法。
【請求項１９】
請求項１〜１８いずれか１項に記載の方法であって、さらに、工程ａ）の前記前腸前培養物または工程ｂ）のスフェロイドを、コラーゲン、基底膜マトリックス、またはそれらの組み合わせから選択されるマトリックスと接触させる工程を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９いずれか１項に従って製造された食道組織を含む組成物であって、前記食道組織は、神経支配および／または血管がないことを特徴とする、組成物。
【請求項２１】
ヒト食道オルガノイド（ＨＥＯ）組成物であって、前記ＨＥＯ組成物は、１またはそれ以上の粘膜下腺、移行帯、脈管構造、免疫細胞、または粘膜下層を実質的に含まない、組成物。
【請求項２２】
重層扁平上皮を作製する方法であって、
ａ．前駆細胞を放出するために請求項１〜１９いずれかに記載の方法によって製造されたＥＯを酵素的に解離する工程であって、前記ＥＯは３週間〜１０週間の年齢である、前記解離する工程と、
ｂ．前記前駆細胞を単層に拡大する工程と、および
ｃ．非角質化重層扁平上皮を生じるのに十分な期間、コラーゲン被覆膜上の前記重層扁平上皮に前記前駆細胞を再分化する工程であって、前記非角質化重層扁平上皮は、ケラチンおよびＩＶＬ、ＣＲＮＮ、およびＦＬＧから選択される１またはそれ以上のマーカーを発現する、前記再分化する工程と、
を含む方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法によって製造された重層扁平上皮において、前記重層扁平上皮は、シートの形態で実質的に組織化された食道細胞を含む、重層扁平上皮。
【請求項２４】
それを必要とする個体における食道の疾患を治療する際に使用の請求項２０記載の食道組織を含む組成物。
【請求項２５】
請求項２４記載の使用の食道組織を含む組成物において、前記食道の疾患は閉鎖症、アカラシア、好酸球性食道炎、バレット食道、食道癌、またはそれらの組み合わせから選択される、組成物。
【請求項２６】
請求項１〜１９いずれか１項記載の方法であって、さらに、前記ＥＯにおいてＣＤＸ２を誘導するまたはＢＭＰを活性化する工程を含み、前記ＥＯはバレット化生疾患モデルである、方法。
【請求項２７】
請求項１〜１９いずれか１項記載の方法であって、さらに、ＣＣＬ２６およびＣＡＰＮ１４の発現を増加させ、ＣＲＮＮおよびＩＶＬの発現を減少させるのに十分な時間、ＩＬ−１３と前記ＥＯを接触させる工程を含み、前記ＥＯは好酸球性食道炎疾患モデルである、方法。
【請求項２８】
食道疾患状態を治療することができる活性剤を同定する方法であって、試験剤を請求項２６または２７記載の方法によって製造された疾患モデルと、前記疾患モデルにおいて生理学的変化を誘発するのに十分な時間接触させる工程と、および前記疾患モデルにおける前記生理学的変化の存在または不在を検出する工程と、を含む方法。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法において、前記生理学的変化の存在または不在を検出する工程は、好酸球性食道炎のためのＣＣＬ２６とＣＡＰＮ１４の発現の減少とＣＲＮＮとＩＶＬの発現の増加を検出する工程と、または、バレット化生のためのＳＯＸ２、ｐ６３、ＫＲＴ１３、ＣＲＮＮ、ＩＶＬなどの食道遺伝子発現の増加および腸遺伝子の喪失を検出する工程と、を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
食道は、口腔および咽頭から胃への食物の通過を積極的に促進する。成層扁平上皮、筋肉層、およびストレッチを感知して蠕動を制御する腸神経系で構成される。食道閉鎖症などの先天性疾患は、管腔の狭窄または不連続をもたらす遺伝子変異によって引き起こされる。食道癌、好酸球性食道炎、アカラシアおよびその他の運動障害など、他の病気は晩年に食道に影響を与える。気管および食道の障害は人間に蔓延しており、マウスで正確にモデル化することは困難である。前述の病状の有病率にもかかわらず、マウスとヒトの食道との間の組織構造には実質的な違いがあるため、当技術分野では研究のためのヒトの食道組織モデルが必要である。本開示は、当技術分野における前述の必要性の１つまたは複数に対処する。
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては、以下のものがある（国際出願日以降国際段階で引用された文献及び他国に国内移行した際に引用された文献を含む）。
（先行技術文献）
（特許文献）
（特許文献１）  米国特許出願公開第２０１７／０２４０８６６号明細書
（特許文献２）  米国特許出願公開第２０１２／０１３５５１９号明細書
（特許文献３）  米国特許出願公開第２０１３／０２１７００５号明細書
（特許文献４）  米国特許出願公開第２０１６／０２３７４０１号明細書
（特許文献５）  国際公開第２０１７／１９２９９７号
（非特許文献）
（非特許文献１）  ＪＯＨＡＮＮＥＳＳＯＮ  ａｔ  ａｌ． "ＦＧＦ４  ａｎｄ  Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈＥＳＣｓ  ｉｎｔｏ  ＰＤＸ１−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｆｏｒｅｇｕｔ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｉｎ  ａ  Ｔｉｍｅ−  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍａｎｎｅｒ．"  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，１１  Ｍａｒｃｈ  ２００９  （１１．０３．２００９）．Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，ｅ４７９４，Ｐｇｓ．１−１３．ｅｎｔｉｒｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ
（非特許文献２）  ＴＲＩＳＮＯ  ａｔ  ａｌ．"Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｏｒｇａｎｏｉｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｌｉｎｅａｔｅ  Ｓｏｘ２  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ，"  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２０  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１８  （２０．０９．２０１８），Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．４，Ｐｇｓ．５０１−５１５．ｅｎｔｉｒｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ
（非特許文献３）  ＡＭＥＲＩ  ｅｔ  ａｌ．"ＦＧＦ２  Ｓｐｅｃｉｆｉｅｓ  ｈＥＳＣ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ  Ｅｎｄｏｄｅｒｍ  ｉｎｔｏ  Ｆｏｒｅｇｕｔ／Ｍｉｄｇｕｔ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍａｎｎｅｒ，"  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，０１  Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１０  （０１．０１．２０１０），Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１，Ｐｇｓ．４５−５６．ｅｎｔｉｒｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ
（非特許文献４）  ＤＥＷＡＲＤ  ｅｔ  ａｌ．"Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｎｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ，"  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２３  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１４  （２３．１０．２０１４），Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．２，Ｐｇｓ．７０１−７１１．ｅｎｔｉｒｅ  ｄｏｃｕｍｅｎｔ