【手続補正書】
【提出日】令和3年6月16日(2021.6.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗腫瘍Ｔ細胞の増殖方法であって、
ａ）被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異アミノ酸配列を含む、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な、常磁性を有する粒子を提供する工程と；
ｂ）生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と；
ｃ）前記抗原提示細胞によって前記粒子の貪食作用が可能になる条件下で、前記粒子と前記抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；
ｄ）被験体からの生存可能なＴ細胞を含むＴ細胞サンプルを提供する工程と；
ｅ）前記抗原提示細胞により提示された抗原に応答して抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、前記Ｔ細胞サンプルと、前記粒子と接触した前記抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ａ）の関連ポリペプチドコンストラクトを有する粒子が滅菌洗浄に供され、関連ポリペプチドコンストラクトを有する無菌又は滅菌粒子をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｆ）前記Ｔ細胞サンプルから粒子を除去する工程、及び／又は
（ｇ）前記Ｔ細胞サンプルからの粒子及び抗原提示細胞を除去する工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原提示細胞が前記被験体からのものである、請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは、１つ以上の共有結合ペプチドを含み、該１つ以上の共有結合ペプチドは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、請求項１乃至請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは、１つ以上の共有結合ペプチドを含み、該１つ以上の共有結合ペプチドは、被験体のがんで発現することが知られているか、又は疑われる変異アミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは３つ以上の共有結合ペプチドを含む、請
求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍新生抗原コンストラクトの各ペプチドが１０〜２５個のアミノ酸を含む、請求項５乃至請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
２つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトが前記粒子と密接に関連し、各腫瘍新生抗原コンストラクトが同じポリペプチド配列を有するか、又は異なるポリペプチド配列を有する、請求項１乃至請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１乃至請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法で増殖した抗腫瘍Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項１乃至請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞サンプルがＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞サンプルが腫瘍である、請求項１乃至請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞が食細胞である、請求項１乃至請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記がんが固形がんである、請求項１乃至請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記がんは、乳がん、結腸がん、肝臓がん、肺がん（非小細胞及び小細胞）、肺カルチノイド腫瘍、膵臓がん、前立腺がん、卵巣がん及び膀胱がんから選択される固形がんである、請求項１乃至請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記粒子が５．６μｍ未満の最大寸法を有する、請求項１乃至請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記粒子が約１μｍの最大寸法を有する、請求項１乃至請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記粒子が実質的に球形である、請求項１７又は請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記滅菌洗浄又は変性洗浄が、関連ポリペプチドを有する粒子を、少なくともｐＨ１３の高ｐＨにさらすことを含む、又は、前記滅菌洗浄は、関連ポリペプチドを有する粒子を、ｐＨ２未満の低ｐＨにさらすことを含む、請求項２乃至請求項１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記滅菌洗浄又は変性洗浄が、関連ポリペプチドを有する粒子を、少なくとも９０℃の高温にさらすことを含む、請求項２乃至請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記滅菌洗浄又は変性洗浄は、関連ポリペプチドを有する粒子を、尿素及び塩酸グアニジンからなる群から選ばれる滅菌剤／変性剤にさらすことを含む、請求項２乃至請求項２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記粒子がポリマー粒子である、請求項３乃至請求項２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子がポリスチレン粒子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトが前記粒子に共有結合している、請求項１乃至請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトが、金属キレートを介して前記粒子に結合している、請求項１乃至請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原提示細胞及び前記Ｔ細胞サンプルが同じ被験体に由来する、請求項１乃至請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原提示細胞及び前記Ｔ細胞サンプルが、同じ被験体のＰＢＭＣサンプルに由来する、請求項１乃至請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記洗浄された粒子、前記抗原提示細胞及び前記Ｔ細胞サンプルが同時に接触される、請求項１乃至請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
例えば、抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を関連する参照と比較することにより、参照と比較してサンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度が高いことは、１つ以上の腫瘍新生抗原決定基がサンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化をもたらすという結論を示す、前記Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を決定する工程
を、工程（ｅ）がさらに含む、請求項１乃至請求項２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度を決定することは、前記サンプル中の活性化Ｔ細胞の割合を決定することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔ細胞サンプル中の抗腫瘍Ｔ細胞活性化の程度の決定が、ＥＬＩＳｐｏｔ又はＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔ技術を使用して実施される、請求項３０又は請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１乃至請求項３２のいずれか一項に記載の方法により産生される抗腫瘍Ｔ細胞を含む組成物。
【請求項３４】
前記抗腫瘍Ｔ細胞がＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
被験体のがんの治療に使用するための請求項３３又は請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、及び任意で、被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含む、腫瘍新生抗原コンストラクトであって、
好ましくは、腫瘍新生抗原コンストラクトのがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含む各アミノ酸配列は、５〜５０個のアミノ酸、好ましくは１０〜２５個のアミノ酸を含む；そして好ましくは、それぞれ任意に存在する、腫瘍新生抗原コンストラクトの被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列は、５〜５０個のアミノ酸、好ましくは１０〜２５個のアミノ酸を含む、腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項３７】
２つ以上の共有結合ペプチド（例えば、３つ、４つ、５つ、又は６つの共有結合ペプチド）を含み、各ペプチドは被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含み（好ましくは、被験体のがんに関連していることが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む各ペプチド）、そして、前記ペプチドは直接結合されているか、スペーサー部分を介して結合されている、請求項３６に記載の腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項３８】
前記ペプチドはスペーサー部分を介して結合され、前記スペーサー部分は１〜１５個のアミノ酸（好ましくは１〜５個のアミノ酸）の短い配列であり、好ましくは前記スペーサー部分はモチーフＶＶＲを含み（例えば、前記スペーサー部分は配列ＶＶＲを有する）、又は前記スペーサー部分はモチーフＧＧＳを含む（例えば、前記スペーサー部分は配列ＧＧＳを有する）、請求項３７に記載の腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項３９】
腫瘍新生抗原コンストラクトは３つの共有結合ペプチドを含み、好ましくは各ペプチドは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、請求項３７又は請求項３８に記載の腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項４０】
腫瘍新生抗原コンストラクトの被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含む各アミノ酸配列は、非腫瘍細胞の配列と比較して配列中に単一の置換変異アミノ酸を有し、そして変異アミノ酸のＣ末端に隣接するアミノ酸の数は８個、９個、１０個、１１個又は１２個のアミノ酸であり、変異アミノ酸のＮ末端に隣接するアミノ酸の数は８個、９個、１０個、１１個、又は１２個のアミノ酸である、請求項３６乃至請求項３９のいずれか一項に記載の腫瘍新生抗原コンストラクト。
【請求項４１】
１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する、常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子であって、
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは、被験体のがんに関連することが知られているか、又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか、又は疑われる変異又は非変異アミノ酸配列を含むか、又は
前記腫瘍新生抗原コンストラクトは、請求項３６乃至請求項４０のいずれか一項で定義される腫瘍新生抗原コンストラクトである貪食可能な粒子。
【請求項４２】
前記粒子は、５．６μｍ未満、好ましくは４μｍ未満、より好ましくは３μｍ未満、さらにより好ましくは０．５μｍ〜２μｍ、又は最も好ましくは約１μｍの最大寸法を有し、及び／又は、前記粒子は実質的に球形である、請求項４１に記載の常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子。
【請求項４３】
前記腫瘍新生抗原決定基が前記粒子に共有結合している、請求項４１又は請求項４２に記載の常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子。
【請求項４４】
請求項４１乃至請求項４３のいずれか一項に記載の常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子と、Ｔ細胞集団の増殖に使用するのに適した試薬とを含むキット。
【請求項４５】
常磁性又は超常磁性の貪食可能な粒子、ペプチドを貪食可能な粒子に連結するための連結試薬、及びＴ細胞集団の増殖に使用するのに適した試薬を含むキット。
【請求項４６】
腫瘍新生抗原コンストラクトを設計するための説明書、及び／又は１つ以上の腫瘍新生抗原性コンストラクト、及び／又は１つ以上の新生抗原エピトープ、及び必要に応じて、腫瘍新生抗原コンストラクト、例えば異なるクローニング及び発現条件用に調整された、すぐに使用可能なベクターを生成するための試薬をさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
工程（ｅ）の直後に：
ａ１）被験体のがんに関連することが知られているか又は疑われる少なくとも１つの変異アミノ酸を含むアミノ酸配列、又は被験体のがん細胞で発現することが知られているか又は疑われる変異アミノ酸配列を含む、１つ以上の密接に関連する腫瘍新生抗原コンストラクトを有する第２の貪食可能な粒子を提供する工程と；
ｂ１）第２の生存可能な抗原提示細胞を提供する工程と；
ｃ１）前記抗原提示細胞によって前記粒子の貪食作用が可能になる条件下で、前記第２の粒子と前記第２の抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と；そして
ｅ１）前記抗原提示細胞によって提示された抗原に応答する抗腫瘍Ｔ細胞の特異的活性化を可能にする条件下で、前記Ｔ細胞サンプルと、前記第２の粒子と接触した前記第２の抗原提示細胞とを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させる工程と
をさらに含む、請求項１乃至請求項３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ａ１）における１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを有する第２の貪食可能な粒子は、工程（ａ）における１つ以上の腫瘍新生抗原コンストラクトを有する貪食可能な粒子と同じである；及び／又は工程（ｂ１）の第２の生存可能な抗原提示細胞は、工程（ｂ）の生存可能な抗原提示細胞と同じである、請求項４７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
【図１】図１は、Ｔ細胞活性化に対する粒径の影響を示す。オボアルブミン感作マウスの脾細胞を用いた増殖アッセイ（チミジン取り込み）。５．６μｍ、１μｍ、及び０．２μｍの直径の異なるサイズの粒子に連結したオボアルブミンの比較である。Ｐ値はスチューデントのｔ検定を使用して決定され、ｐ＜０．０５が見出されたときに記載された。ひげ線はＳＤを示す。
【図２Ａ】図２は、新生抗原ペプチドＮＡ１−９をともなう刺激によるＴ細胞の増殖を示す。図２Ａは、培養中の細胞数の経時変化を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、％ＣＤ４＋／総Ｔ細胞を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＣＤ４におけるＴ−ｂｅｔ発現を示す。
【図２Ｄ】、
【図２Ｅ】図２Ｄは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるグランザイムＢとパーフォリンの発現を示す。
【図３】図３は、新生抗原コンストラクトをともなう刺激によるＴ細胞の増殖を示す。Ｔ細胞（黒丸）、ＣＤ４＋Ｔ細胞の総数（黒四角）、及び増殖中のＣＤ４＋細胞（白丸）におけるの割合を示す。
【図４Ａ】図４は、新生抗原コンストラクトをともなう刺激によるＴ細胞の増殖を示す。図４Ａは、培養中の細胞数の経時変化を示す（赤線：パーソナライズされたペプチド、ピンク及びオレンジ線：同じタンパク質で予測される変異（ＮＡ１、３、４及び５）を持つ予測ペプチドのコントロール培養）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、％ＣＤ４＋／総Ｔ細胞を示す。
【図４Ｃ−１】、
【図４Ｃ−２】、
【図４Ｃ−３】、
【図４Ｃ−４】、
【図４Ｃ−５】、及び
【図４Ｃ−６】図４Ｃは、ＣＤ４  Ｔ細胞に対してＢａｒｎｅｓ−Ｈｕｔ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ（Ｂａｒｎｅｓ−Ｈｕｔ確率的近傍埋め込み）（ＢＨ−ＳＮＥ）アルゴリズムを使用して実行された分析を視覚化したものであり、サンプル内のすべての細胞は、選択されたマーカーのセット：ＣＤ２８、ＣＤ５７、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ−３、パーフォリン（Ｐｅｒｆｏｒｉｎ）、グランザイム  Ｂ（Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ）（ＧＺＢ）、Ｋｉ−６７及びＰＤ−１による発現強度の類似性により、２次元マップにクラスター化される。
【図５Ａ】図５Ａは、抗原連結粒子と３７℃で１８時間インキュベートした後の、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ、又は１μｍ）の細胞内貪食抗原連結粒子を含むＰＢＭＣの共焦点顕微鏡画像である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、手動カウントにより評価した、３７℃で１８時間のインキュベーション後のＰＢＭＣにおける２つのサイズ（４．５μｍ又は２．８μｍ）の抗原連結粒子の取り込みを示すグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、体積計算（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定を使用して計算）により評価した、３７℃で１８時間のインキュベーション後のＰＢＭＣにおける３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子の取り込みを示すグラフである。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例３ｂ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝２）からのＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ産生レベルの相対的な増加を示すグラフである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例３ｂ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝１）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ２２産生レベルの相対的な増加を示すグラフである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、実施例３ｂ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝１）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ１７産生レベルの相対的な増加を示すグラフである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、実施例３ｂ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝１）からのＰＢＭＣにおけるＩＦＮγとＩＬ１７のデュアルサイトカイン産生の相対的な増加を示すグラフである。
【図６Ｅ】図６Ｅは、実施例３ｂ（ｉｖ）のＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイで評価された、非刺激細胞と比較した、３つのサイズ（４．５μｍ、２．８μｍ又は１μｍ）の抗原連結粒子で刺激されたＣＭＶ感受性の健康なドナー（ｎ＝１）からのＰＢＭＣにおけるＩＬ２２とＩＬ１７のデュアルサイトカイン産生の相対的な増加を示すグラフである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
５個の結合ペプチドを含む腫瘍新生抗原コンストラクトの構造は次のとおりであり得る：
−［エピトープ配列１］−［リンカー部分］−［エピトープ配列２］−［リンカー部分］−［エピトープ配列３］−［リンカー部分］−［エピトープ配列４］−［リンカー部分］−［エピトープ配列５］。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
血液悪性腫瘍の例には、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、急性赤芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性単球性白血病、成熟を伴う急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、侵攻性ＮＫ細胞白血病、未分化大細胞リンパ腫、及び形質細胞腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、Ｂ細胞白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、慢性特発性骨髄線維症、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性好中球性白血病、髄外白血病、有毛細胞白血病、肝脾Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、血管内大型Ｂ細胞リンパ腫、ケーラー病、リンパ腫様肉芽腫症、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、骨髄腫、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、形質細胞白血病、原発性滲出性リンパ腫、及びワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる。