【手続補正書】
【提出日】平成16年5月17日(2004.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
配列番号１４に示すアミノ酸配列において、アミノ酸番号３９は、好ましくは中性アミノ酸、より好ましくはセリン又はアラニンであり、アミノ酸番号６７は、好ましくは中性アミノ酸、より好ましくはスレオニン又はアラニンであり、アミノ酸番号６８は、好ましくは疎水性アミノ酸、より好ましくはロイシン又はバリンであり、アミノ酸番号７４は、好ましくはメチオニン又はイソロイシンであり、アミノ酸番号１０１は、好ましくは塩基性アミノ酸、より好ましくは、リジン又はアルギニンであり、アミノ酸番号１３０は、好ましくは水酸基含有アミノ酸、より好ましくはセリン又はスレオニンであり、アミノ酸番号１３２は、好ましくはリジン又はアスパラギンであり、アミノ酸番号１４３は、好ましくは疎水性アミノ酸、より好ましくはバリン又はイソロイシンであり、アミノ酸番号２７７は、好ましくは酸性アミノ酸、好ましくはグルタミン酸又はアスパラギン酸である。なお、ここで、塩基性アミノ酸とは、好ましくはヒスチジン、リジン及びアルギニンを意味し、酸性アミノ酸とは、好ましくはグルタミン酸及びアスパラギン酸を意味し、中性アミノ酸とは、酸性でも塩基性でもないアミノ酸即ち通常の生体環境で電荷を有さないアミノ酸、好ましくはグリシン、アラニン、セリン、スレオニンを意味し、疎水性アミノ酸とは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン及びこれらと同等の疎水性を有するアミノ酸、好ましくは、バリン、ロイシン及びイソロイシンを意味する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
(iii)オリゴヌクレオチドプライマーの合成
ＨＳ２ＳＴの部分的アミノ酸配列に基づき、ＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプライマーを作成する。アミノ酸配列のうち、なるべくコドンの縮重が少ない部位を用いることが好ましい。このようなプライマーの例を、図１に示す（センスプライマー：配列番号１０、１１；アンチセンスプライマー：配列番号１２、１３）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
＜１＞チャイニーズハムスターのヘパラン硫酸２−Ｏ−硫酸基転移酵素の調製およびアミノ酸配列の分析
J. Biol. Chem. 271, 7645-7653(1996)に記載の方法により２回目の３’，５’−ＡＤＰ−アガロースカラムからの溶出画分として部分精製したＨＳ２ＳＴを得た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行うために、２８μｇのＨＳ２ＳＴを１０％トリクロロ酢酸により沈殿させ、アセトンで２回洗浄した。この沈殿は、５％（Ｖ／Ｖ）の２−メルカプトエタノールを含むローディングバッファーで１００℃、３分間還元およびＳＤＳ化した後、Laemmli（Laemmli, U. K.(1970) Nature 227, 680-685）の方法に従って１０％のポリアクリルアミドゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離されたタンパク質を、１０％メタノールを含有するｐＨ１１の１０ｍＭ  ３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルフォン酸（ＣＡＰＳ）溶液中、２００ｍＡで２時間３０分、ＰｒｏＢｌｏｔｔのＰＶＤＦ膜（アプライド バイオシステム製）に転写した。転写したタンパク質をAebersoldらの方法（Aebersold, R.H., Leavitt, J., Saavedra, R.A., Hood, L.E., and Kent, S.B.H.(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,6970-6974）に従ってPonceau Sで染色した。４５ｋＤａ以下の領域のバンドを切り出し、Iwamatsuの方法（Iwamatsu, A.(1992) Electrophoresis 13, 142-147）を改変した方法によってＰＶＤＦ膜上で変性させＳ−カルボキシメチル化した。膜に転写されたタンパク質は、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、５％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル、１ｍｇ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む８Ｍ  グアニジン塩酸塩溶液３００μｌ中で室温で１時間還元した。そこに３ｍｇのヨード酢酸を含む１Ｎ  ＮａＯＨ溶液１２μｌを加え、暗所に１５分間置いた。この膜を蒸留水で洗浄し、その後０．１％  ＳＤＳを含有する２％アセトニトリルで洗浄した。膜上のＳ−カルボキシメチル化したタンパク質は、１ｍｇのメチオニンを含む１００ｍＭの酢酸に溶解した０．５％  ポリビニルピロリジン（ＰＶＰ−４０）  ３００μｌ中で室温で３０分間インキュベートし、１０％（Ｖ／Ｖ）  アセトニトリルで洗浄した。膜を細かく切断し、５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解した０．３ＵのＮ−グリカナーゼで３７℃１５時間処理した。その後、ｉｎ  ｓｉｔｕ逐次的消化を、１０％（Ｖ／Ｖ）  アセトニトリルを含むｐＨ９．０の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中に酵素：基質（ｍｏｌ：ｍｏｌ）が１：５０となるように溶解したエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃにより３７℃で１５時間行い、続いて１０％（Ｖ／Ｖ）  アセトニトリルを含むｐＨ７．５の２０ｍＭ  炭酸水素アンモニウムと２５ｍＭ  ＣａＣｌ2を含むｐＨ７．８の反応液中に酵素：基質（ｍｏｌ：ｍｏｌ）が１：５０となるように溶解したエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎにより４０℃で２４時間行うことにより行った。この消化産物を回収してフィルターにかけ、凍結乾燥した。１％（Ｖ／Ｖ）  アセトニトリルを含む移動相Ａ（０．０６％（Ｖ／Ｖ）  トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））１８μｌにこの凍結乾燥物を溶解し、逆相カラム（０．３×１５０ｍｍ）でキャピラリーＨＰＬＣを行った。ペプチドの溶出は流速３．３μｌ／ｍｉｎ、１００分間で２％〜１００％までの移動相Ｂ（０．０５２％  ＴＦＡを含む８０％  アセトニトリル）の濃度勾配により行った。ペプチドの画分は２１４ｎｍの吸光度をモニターしながら手作業で回収し、ＰＶＤＦ膜の小片にブロットした。アミノ酸配列決定はモデル４７６Ａプロテインシークエンサー（アプライド バイオシステムス(Applied Biosystems)）で行った。表１に結果を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
（２）ＰＣＲ反応
ＣＨＯ細胞からオリゴｄＴ（oligo-(dT)）セルロースクロマトグラフィーを使用する常法により採取したポリ(A)+ＲＮＡを逆転写反応の鋳型として、オリゴｄＴをプライマーとしてｃＤＮＡの一本鎖を合成し、これをＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲは、１μＭの末端プライマー１ｓと２ａの混合物（又は１ｓｉと２ａｉ）、２μｌの逆転写反応液、それぞれ２００μＭの４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、および１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼ（パーキン−エルマー(Perkin-Elmer）製）を含む混合液５０μｌで行った。増幅は以下のように行った。はじめの３サイクルでは解離反応は９４℃で１分、アニーリングは６０℃で２分、伸長反応は７２℃で２分とし、３サイクルごとに５０℃までアニーリングの温度のみを２℃ずつ低くし、最終的にはアニーリングの温度が４８℃の条件で１７サイクル行った。その後、さらに１５分間伸長反応を行った。この操作によって生じた増幅物質をアガロースゲル電気泳動により解析すると、増幅された約９０ｂｐのＤＮＡのバンドが検出された。１ｓと２ａよりも３’末端よりにそれぞれ９ｂｐと３ｂｐシフトしているプライマー１ｓｉと２ａｉを利用してＰＣＲを行った結果でも、ほぼ同じ大きさのＤＮＡ断片が生じた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
配列番号：14
配列の長さ：356
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Met Gly Leu Leu Arg Ile Met Met Pro Pro Lys Leu Gln Leu Leu Ala
1               5                  10                  15
Val Val Ala Phe Ala Val Ala Met Leu Phe Leu Glu Asn Gln Ile Gln
20                  25                  30
Lys Leu Glu Glu Ser Arg Xaa Lys Leu Glu Arg Ala Ile Ala Arg His
35                  40                  45
Glu Val Arg Glu Ile Glu Gln Arg His Thr Met Asp Gly Pro Arg Gln
50                  55                  60
Asp Ala Xaa Xaa Asp Glu Glu Glu Asp Xaa Val Ile Ile Tyr Asn Arg
65                  70                  75                  80
Val Pro Lys Thr Ala Ser Thr Ser Phe Thr Asn Ile Ala Tyr Asp Leu
85                  90                  95
Cys Ala Lys Asn Xaa Tyr His Val Leu His Ile Asn Thr Thr Lys Asn
100                 105                 110
Asn Pro Val Met Ser Leu Gln Asp Gln Val Arg Phe Val Lys Asn Ile
115                 120                 125
Thr Xaa Trp Xaa Glu Met Lys Pro Gly Phe Tyr His Gly His Xaa Ser
130                 135                 140
Tyr Leu Asp Phe Ala Lys Phe Gly Val Lys Lys Lys Pro Ile Tyr Ile
145                 150                 155                 160
Asn Val Ile Arg Asp Pro Ile Glu Arg Leu Val Ser Tyr Tyr Tyr Phe
165                 170                 175
Leu Arg Phe Gly Asp Asp Tyr Arg Pro Gly Leu Arg Arg Arg Lys Gln
180                 185                 190
Gly Asp Lys Lys Thr Phe Asp Glu Cys Val Ala Glu Gly Gly Ser Asp
195                 200                 205
Cys Ala Pro Glu Lys Leu Trp Leu Gln Ile Pro Phe Phe Cys Gly His
210                 215                 220
Ser Ser Glu Cys Trp Asn Val Gly Ser Arg Trp Ala Met Asp Gln Ala
225                 230                 235                 240
Lys Tyr Asn Leu Ile Asn Glu Tyr Phe Leu Val Gly Val Thr Glu Glu
245                 250                 255
Leu Glu Asp Phe Ile Met Leu Leu Glu Ala Ala Leu Pro Arg Phe Phe
260                 265                 270
Arg Gly Ala Thr Xaa Leu Tyr Arg Thr Gly Lys Lys Ser His Leu Arg
275                 280                 285
Lys Thr Thr Glu Lys Lys Leu Pro Thr Lys Gln Thr Ile Ala Lys Leu
290                 295                 300
Gln Gln Ser Asp Ile Trp Lys Met Glu Asn Glu Phe Tyr Glu Phe Ala
305                 310                 315                 320
Leu Glu Gln Phe Gln Phe Ile Arg Ala His Ala Val Arg Glu Lys Asp
325                 330                 335
Gly Asp Leu Tyr Ile Leu Ala Gln Asn Phe Phe Tyr Glu Lys Ile Tyr
340                 345                 350
Pro Lys Ser Asn
355