【手続補正書】
【提出日】令和3年5月13日(2021.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
最初に、NPCを、25,000細胞/cm2で播種し、増殖条件で培養した。増殖培地は、 CHIR 99021(最終濃度3μM、Axon MedChem)、アスコルビン酸(最終濃度200μM、SigmaAldrich)及びPumorphamine(最終濃度0.5μM、Santa Cruz)を基本培地(1:1の比のDMEM及びNeurobasal培地(Invitrogen)、1％ B27、0.05％ N2、2％グルタミン及び2％ Pen/Strep(すべてInvitrogen) に添加することによって調製した。増殖2日後、培地をパターニング培地(アスコルビン酸(最終濃度200μM)、Pumorphamine(最終濃度0.5μM)、GDNF(1 ng/mL, PeproTech)、及びBDNF(2ng/mL, PeproTech)を補充した基本培地)に交換し、さらに2日ごとに培地を交換した。6日後、培地を、成熟培地(アスコルビン酸(200μM)、TGF-β3(1ng/mL、PeproTech)、DBcAMP(100μM、Santa Cruz)、DAPT(5μM、Biomol)、GDNF(1ng/mL)、及びBDNF(2ng/mL)を補充した基本培地)に交換し、2日後に培地を交換した。細胞を4％ PFAで固定し、Hoechst33342(1:4000、Invitrogen)、マウス抗beta3チューブリン/Tuj1一次抗体(1:400、R and D Systems)及びAF488蛍光標識を有する抗マウス二次抗体(1:500、Dianova)で染色した。画像は、Gen5ソフトウェア(バージョン3.03)を有するBioTek Lionheart FX自動顕微鏡(10x対物)を使用して取得した。結果は、配列番号81、190、237、317を有するペプチド配列、及び17及び314の1:1比の混合物を含むバイオマトリックス層上でのニューロン細胞の発生を示す。結果を図16に示す。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
以下のものを含む、本質的に以下のものからなる、又は以下のものからなる、バイオマトリックス層：
・  0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度の負に荷電したポリマー(NCP)；及び
・  一般式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：
PEG-CW−スペーサー−R1−スペーサー−(BX)n        (I)；
（式中、
−  前記スペーサーは、存在しないか、又はジペプチド、トリペプチドもしくはテトラペプチドであり、ここで、前記ジペプチド、トリペプチドもしくはテトラペプチドは、グリシン、アミノプロパン酸、アミノ酪酸、アミノペンタン酸、アミノヘキサン酸、アミノヘプタン酸、アミノオクタン酸及び3-アミノアクリル酸、又はそれらの組み合わせからなり；
−  CWは、存在しないか、又はアミノ酸、システイン及びトリプトファンからなるジペプチドであり；
−  Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸、又はアスパラギン酸から選択され、nは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり；
−  R1は、生体機能的ペプチドを表し、存在しなくてもよく、又は5〜30個のアミノ酸を含むペプチドであり；
−  PEGは、0.1μM〜1,000μMの範囲の濃度で含まれており；
−  R1は、存在する場合、0.1μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれており；
−  (BX)nは、0.4μM〜4,000μMの範囲の濃度で含まれる。）。
（態様２）
前記ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、式(Ia)のもの：
PEG-R1-(BX)n        (Ia)
（式中、B、X及びnは態様1に定義されるとおりである。）
である、態様1記載のバイオマトリックス層。
（態様３）
前記ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、式(Ia)のもの：
PEG-(BX)n        (Ib)
（式中、B、X及びnは態様1に定義されるとおりである。）
である、態様1記載のバイオマトリックス層。
（態様４）
前記式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、PEG及びR1の間、及びR1及び(BX)nの間にリンカー配列をさらに含み、かつ、式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：
PEG-CWGG-R1-GG-(BX)n        (II)
（式中、B、X、n及びR1は態様1に定義されるとおりである。）
である、態様1記載のバイオマトリックス層。
（態様５）
前記式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、PEG及び(BX)nの間にさらなるリンカー配列を含み、かつ、式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：
PEG-CWGG-(BX)n        (IIa)
（式中、B、X、n及びR1は態様1に定義されるとおりである。）
である、態様1記載のバイオマトリックス層。
（態様６）
前記ペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートが、式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び式(Ia)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの混合物、又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート及び式(IIa)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの混合物であり、及び／又は前記混合物において、前記式(I)又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲートの比率が、0.1〜99.9 mol％の範囲である、態様1〜5のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
（態様７）
前記NCPが、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、ヒアルロン酸、ポリスチレン硫酸（PSS）、硫酸化アルギン酸塩、硫酸化ヒアルロン酸、環状デキストラン硫酸、環状デキストランリン酸及びフィチン酸からなる群から選択される、態様1〜6のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
（態様８）
・  Bは、リジン又はアルギニンである；及び／又は
・  Xは、アラニン又はセリンである；及び／又は
・  (BX)nは、表1の配列番号1〜14を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドである；及び／又は
・  R1は、表2の配列番号15〜353を有するペプチドからなる群から選択されるペプチドである、
態様1〜7のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
（態様９）
前記PEGが、場合によってはマレイミド官能化、カルボン酸官能化、アミノ官能化、アジド官能化、又はアルキン官能化されている、starPEG、好ましくは、4腕starPEG、より好ましくは、4 kD〜40 kDの範囲の分子量を有するものである、態様1〜8のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
（態様１０）
式(I)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：NCP、又は式(II)のペプチド−ポリエチレングリコール−コンジュゲート：NCPの比が、1：100及び100：1の間の範囲である、態様1〜9のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
（態様１１）
細胞、オルガノイド(例えば、間葉系球、神経幹細胞塊)、モルフォゲン、又は少なくとも一つの活性医薬成分をさらに含む、態様1〜10のいずれか1項記載のバイオマトリックス層。
（態様１２）
態様1〜11のいずれか1項記載のバイオマトリックス層のビルディングブロックのコンビナトリアルライブラリーであって、以下のものを含む、以下のものから本質的になる、又は以下のものからなるPBSバッファー中の個別のストック溶液：
・  2.5μM〜7.5μMの、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、デキストラン硫酸、及びヒアルロン酸からなる群から選択される、NCP、
・  2.5μM〜7.5μMのPEG、好ましくは、4kD〜40kDの範囲の4腕star-PEG；
・  2.5μM〜7.5μMの配列番号1〜14を有するペプチドからなる群から選択される、(BX)nペプチド、及び
・  2.5μM〜7.5μMの配列番号15〜353を有するペプチドからなる群から選択される、R1ペプチド
を含む、前記ライブラリー。
（態様１３）
態様1〜11のいずれか1項記載の目的特異的なバイオマトリックス層を製造するためのキットであって、態様12記載のバイオマトリックス層のビルディングブロックのストック溶液、及び本発明の目的特異的なバイオマトリックス層を製造するために前記ビルディングブロックを含むこれらのストック溶液を使用するための指示を含む、前記キット。
（態様１４）
態様1〜11のいずれか1項記載の、3nm〜40μMの範囲の厚さを有するバイオマトリックス層を製造する方法であって、以下のステップを含む前記方法：
i)      式(I)：
PEG-R1-(BX)n        (I)、
及び、場合によっては式(Ia)：
PEG-CWGG-R1-GG-(BX)n        (Ia)
のペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲートを調製するステップ
（式中、
−  Bは、リジン又はアルギニンであり、Xは、アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン酸又はアスパラギン酸から選択され、nは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19及び20から選択される整数であり；かつ
−  R1は、生体機能的ペプチドを表し、存在しなくてもよく、又は5〜30個のアミノ酸を含むペプチドである）；
ii)      前記ペプチド−ポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート及びNCPを前記バッファーに最終濃度の100倍の濃度で溶解するステップ；
iii)      好適なバッファー溶液中に、ステップii)の溶液を希釈及び混合するステップ、ここで、式(I)又は式(II)のポリエチレングリコール(PEG)−コンジュゲート及び前記NCPは、各々0.1μM〜250μMの範囲の濃度で前記バッファー溶液に含有される；及び
iv)      ゲル化によってバイオマトリックス層を形成するステップ、
及び、場合により、前記ハイドロゲルが細胞又はオルガノイドを含む場合、以下の付加的なステップ：
v)       前記細胞又はオルガノイドを、上記のステップiv)により得られたバイオマトリックス層上に播種するステップ；及び
vi)      前記バイオマトリックス層及び前記播種された細胞又はオルガノイドをインキュベートし、該バイオマトリックス層への細胞付着を推進するステップ。
（態様１５）
態様1〜11のいずれか1項記載の、3nm〜40μMの範囲の厚さを有するバイオマトリックス層を製造する方法であって、第一のステップにおいて、生体機能的ペプチドR1を持たないバイオマトリックス層を調製し、第二のステップにおいて、生体機能的ペプチドを含むペプチドを添加することにより後修飾を実施し、ここで、前記添加されるペプチドが、R1-(BX)n、CW-R1-GG-(BX)n及びCWGG-R1-GG-(BX)n から選択され、かつ、B、X、n及びR1は態様1に定義されるとおりである、前記方法。
（態様１６）
前記バイオマトリックス層の厚さ、堅さ、多孔度及び細胞による表面カバー度が、調整可能である、態様1〜11のいずれか1項記載のバイオマトリックス層、又は態様14記載の方法。