【手続補正書】
【提出日】令和2年12月18日(2020.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる程度の修飾を有する核酸を含む核酸集団を解析する方法であって、
前記核酸集団を、前記修飾を有する核酸と優先的に結合する作用物質と接触させるステップと、
前記作用物質と結合している第１のプールの核酸を、前記作用物質と結合していない第２のプールの核酸から分離するステップであって、前記第１のプールの核酸が、前記修飾について過剰提示され、前記第２のプール中の前記核酸が、前記修飾について提示不足である、ステップと、
前記第１のプールおよび／または第２のプール中の前記核酸を、前記第１のプールおよび前記第２のプール中の前記核酸を区別する１種または複数の核酸タグと連結して、タグが付けられた核酸の集団を産生するステップと、
標識された核酸を増幅するステップであって、前記核酸および連結されたタグが増幅される、ステップと、
増幅された核酸および連結されたタグの配列データをアッセイするステップであって、前記アッセイするステップによって、前記タグを解読するための配列データを得て、配列データがアッセイされた前記核酸が、前記第１または前記第２のプール中の鋳型から増幅されたか否かを明らかにする、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記タグを解読して、配列データがアッセイされた前記核酸が、前記第１または前記第２のプール中の鋳型から増幅されたか否かを明らかにするステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記作用物質と結合している核酸を洗浄するステップと、前記第１および第２のプールに対して中間の程度に複製後修飾を有する核酸を含む第３のプールとして洗浄物を回収するステップとをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
配列データをアッセイするステップの前に、前記増幅された標識された核酸が、標的配列について濃縮される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
アッセイするステップの前に、前記プールからの前記タグが付けられた核酸を組み合わせるステップを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸集団が、体液試料に由来する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸集団が、無細胞核酸集団である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記体液試料が、がんを有すると疑われる対象に由来する、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記修飾が、核酸のタンパク質との結合である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が、ヒストンまたは転写因子である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾が、ヌクレオチドへの複製後修飾である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記複製後修飾が、メチル化シトシンであり、前記作用物質の核酸との結合の程度が、前記核酸中のシトシンメチル化の程度とともに増大する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記複製後修飾が、５−メチル−シトシンであり、前記作用物質の核酸との結合の程度が、前記核酸中の５−メチル−シトシンの程度とともに増大する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記作用物質が、磁気ビーズとコンジュゲートされたメチル結合ドメイン（ＭＢＤ）である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記配列データが、体細胞または生殖系列変異の存在を示す、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
参照による援用
本明細書において言及されるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願が、参照により組み込まれると具体的に、個別に示されるかのように同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＲＮＡから選択される核酸のうち少なくとも２種の形態を含む核酸集団を解析する方法であって、前記少なくとも２種の形態の各々が、複数の分子を含み、前記方法が、
（ａ）核酸の前記形態のうち少なくとも１種を、前記形態を互いに区別するために少なくとも１種のタグ核酸と連結するステップと、
（ｂ）その少なくとも１種が少なくとも１種の核酸タグに連結された核酸の前記形態を増幅するステップであって、前記核酸および連結された核酸タグが増幅されて増幅された核酸を産生し、そのうち前記少なくとも１種の形態から増幅されたものにタグが付けられている、ステップと、
（ｃ）その少なくとも一部にタグが付けられている前記増幅された核酸の配列データをアッセイするステップであって、前記アッセイするステップによって、前記増幅された核酸の前記タグ核酸分子を解読するのに十分な配列情報を得て、前記集団中の核酸の前記形態を明らかにし、配列データがアッセイされた前記タグ核酸分子に連結された前記増幅された核酸の元の鋳型を提供する、ステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記増幅された核酸の前記タグ核酸分子を解読して、前記集団中の核酸の前記形態を明らかにし、配列データがアッセイされた前記タグ核酸分子に連結された前記増幅された核酸の元の鋳型を提供するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記形態のうち少なくとも１種を、その他の形態のうち１種または複数に対して濃縮するステップをさらに含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記集団中の核酸の各形態の前記分子の少なくとも７０％がステップ（ｂ）において増幅される、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
少なくとも３種の形態の核酸が前記集団中に存在し、前記形態のうち少なくとも２種が、前記３種の形態の各々を互いに区別する異なるタグ核酸形態に連結されている、項目１または２に記載の方法。
（項目６）
前記集団中の前記少なくとも３種の形態の核酸の各々が、異なるタグに連結されている、項目５に記載の方法。
（項目７）
同一形態の各分子が、同一の同定タグを含むタグに連結されている、項目１または２に記載の方法。
（項目８）
同一形態の分子が、異なる種類のタグに連結されている、項目１または２に記載の方法。
（項目９）
ステップ（ａ）が、前記集団を、タグが付けられたプライマーを用いる逆転写に付すステップを含み、前記タグが付けられたプライマーが、前記集団中のＲＮＡから作製されたｃＤＮＡ中に組み込まれる、項目１または２に記載の方法。
（項目１０）
前記逆転写が、配列特異的である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記逆転写がランダムである、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ｃＤＮＡと二本鎖を形成しているＲＮＡを分解するステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
（項目１３）
一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡから分離するステップと、核酸タグを前記二本鎖ＤＮＡにライゲーションするステップとをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目１４）
前記一本鎖ＤＮＡが、１種または複数の捕捉用プローブとのハイブリダイゼーションによって分離される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅを用いて一本鎖ＤＮＡを環状化するステップと、核酸タグを前記二本鎖ＤＮＡにライゲーションするステップとをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目１６）
アッセイするステップの前に、異なる形態の核酸を含むタグが付けられた核酸をプールするステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記核酸集団が、体液試料に由来する、項目１から１６に記載の方法。
（項目１８）
前記体液試料が、血液、血清または血漿である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記核酸集団が、無細胞核酸集団である、項目１または２に記載の方法。
（項目２０）
前記体液試料が、がんを有すると疑われる対象に由来する、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
前記配列データが、体細胞または生殖系列変異の存在を示す、項目１から２０に記載の方法。
（項目２２）
前記配列データが、コピー数変異の存在を示す、項目１から２１に記載の方法。
（項目２３）
前記配列データが、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、挿入欠失または遺伝子融合の存在を示す、項目１から２２に記載の方法。
（項目２４）
異なる程度の修飾を有する核酸を含む核酸集団を解析する方法であって、
前記核酸集団を、前記修飾を有する核酸と優先的に結合する作用物質と接触させるステップと、
前記作用物質と結合している第１のプールの核酸を、前記作用物質と結合していない第２のプールの核酸から分離するステップであって、前記第１のプールの核酸が、前記修飾について過剰提示され、前記第２のプール中の前記核酸が、前記修飾について提示不足である、ステップと、
前記第１のプールおよび／または第２のプール中の前記核酸を、前記第１のプールおよび前記第２のプール中の前記核酸を区別する１種または複数の核酸タグと連結して、タグが付けられた核酸の集団を産生するステップと、
標識された核酸を増幅するステップであって、前記核酸および連結されたタグが増幅される、ステップと、
増幅された核酸および連結されたタグの配列データをアッセイするステップであって、前記アッセイするステップによって、前記タグを解読するための配列データを得て、配列データがアッセイされた前記核酸が、前記第１または前記第２のプール中の鋳型から増幅されたか否かを明らかにする、ステップと
を含む方法。
（項目２５）
前記タグを解読して、配列データがアッセイされた前記核酸が、前記第１または前記第２のプール中の鋳型から増幅されたか否かを明らかにするステップを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記修飾が、核酸のタンパク質との結合である、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２７）
前記タンパク質が、ヒストンまたは転写因子である、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２８）
前記修飾が、ヌクレオチドへの複製後修飾である、項目２５または２６に記載の方法。
（項目２９）
前記複製後修飾が、５−メチル−シトシンであり、前記作用物質の核酸との結合の程度が、前記核酸中の５−メチル−シトシンの程度とともに増大する、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記複製後修飾が、５−ヒドロキシメチル−シトシンであり、前記作用物質の核酸との結合の程度が、前記核酸中の５−ヒドロキシメチル−シトシンの程度とともに増大する、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記複製後修飾が、５−ホルミル−シトシンまたは５−カルボキシル−シトシンであり、前記作用物質の結合の程度が、前記核酸中の５−ホルミル−シトシンまたは５−カルボキシル−シトシンの程度とともに増大する、項目２７に記載の方法。
（項目３２）
前記作用物質と結合している核酸を洗浄するステップと、前記第１および第２のプールに対して中間の程度に複製後修飾を有する核酸を含む第３のプールとして洗浄物を回収するステップとをさらに含む、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３３）
アッセイするステップの前に、前記第１および第２のプールからタグが付けられた核酸をプールするステップを含む、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３４）
前記作用物質が、５−メチル結合ドメイン磁気ビーズである、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３５）
前記核酸集団が、体液試料に由来する、項目２４から３４に記載の方法。
（項目３６）
前記体液試料が、血液、血清または血漿である、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記核酸集団が、無細胞核酸集団である、項目２５または２６に記載の方法。
（項目３８）
前記体液試料が、がんを有すると疑われる対象に由来する、項目３５に記載の方法。
（項目３９）
前記配列データが、体細胞または生殖系列変異の存在を示す、項目２５から３８に記載の方法。
（項目４０）
前記配列データが、コピー数変異の存在を示す、項目２５から３９に記載の方法。
（項目４１）
項目２５から３９のいずれかに記載の方法であって、前記配列データが、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）、挿入欠失または遺伝子融合の存在を示し、
ｉｖ）核酸であって、前記核酸および前記連結されたタグが増幅され、ＮＧＳ機器を用いて分子タグが付けられた分割物をアッセイする、核酸と、
ｖ）前記タグを解読するための配列データを作成するためのソフトウェアモジュールと、
ｖｉ）前記タグを解読して、配列データがアッセイされた前記核酸が、前記第１または前記第２のプール中の鋳型から増幅されたか否かを明らかにするために前記配列データを解析するためのソフトウェアモジュールと。