【手続補正書】
【提出日】令和3年5月28日(2021.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５６】
参考文献
１．Ｓｕｋｕｍａｒ，Ｎ．，Ｂｏｕｌｅ，Ｊ．Ｂ．＆Ｅｘｐｅｒｔ−Ｂｅｚａｎｃｏｎ，Ｎ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．．．．Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ．．．（２０００）．ｄｏｉ：１０．１１０７／Ｓ０９０７４４４９０００１２９７Ｘ
２．Ｄｅｌａｒｕｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ：ｍｕｒｉｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．２１，４２７−４３９（２００２）。
３．Ｍｏｚｚａｒｅｌｌｉ，Ａ．＆Ｒｏｓｓｉ，Ｇ．Ｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｒｙｓｔａｌ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ．．．（１９９６）。
４．Ｗａｎｇ，Ａ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｌｅｆｔ−ｈａｎｄｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｅｌｉｃａｌ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｔ  ａｔｏｍｉｃ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２８２，６８０−６８６（１９７９）。
５．Ｒｅｐａｓｋｙ，Ｊ．Ａ．Ｅ．，Ｃｏｒｂｅｔｔ，Ｅ．，Ｂｏｂｏｉｌａ，Ｃ．＆Ｓｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｇ．Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｎ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖ（Ｄ）Ｊ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，５４７８−５４８８（２００４）。
６．Ｔｈａｉ，Ｔ．Ｈ．，Ｐｕｒｕｇｇａｎａｎ，Ｍ．Ｍ．，Ｒｏｔｈ，Ｄ．Ｂ．＆Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｊ．Ｆ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｎｄ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）。
７．Ａｎｄｒａｄｅ，Ｐ．，Ｍａｒｔｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｊｕａｒｅｚ，Ｒ．，Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  Ｓａｒｏ，Ｆ．＆Ｂｌａｎｃｏ，Ｌ．Ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｕ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｂａｌａｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ＮＨＥＪ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６，１６２０３−１６２０８（２００９）。
８．Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＣＤＤ／ＳＰＡＲＣＬＥ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｖｉａ  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  ｄｏｍａｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４５，Ｄ２００−Ｄ２０３（２０１７）。
９．Ｍａｒｃｈｌｅｒ−Ｂａｕｅｒ，Ａ．＆Ｂｒｙａｎｔ，Ｓ．Ｈ．ＣＤ−Ｓｅａｒｃｈ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｌｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２，Ｗ３２７−３１（２００４）。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
１つ以上のヌクレオチドを核酸の３’末端に付加させる方法における改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の使用であって、前記酵素が突然変異ＢＲＣＡ−１  Ｃ末端（ＢＲＣＴ）ドメインを含むことを特徴とする、前記使用。
（態様２）
前記ターミナルトランスフェラーゼ酵素がＤＮＡポリメラーゼＸファミリー由来のものである、態様１に記載の使用。
（態様３）
前記ターミナルトランスフェラーゼ酵素が、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ＤＮＡポリメラーゼλ（Ｐｏｌλ）及びＤＮＡポリメラーゼμ（Ｐｏｌμ）、例えばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）から選択される、態様１または態様２に記載の使用。
（態様４）
前記ＢＲＣＴドメインが、欠失、置換または挿入から選択される１つ以上の突然変異を含有する、態様１〜３のいずれか１項に記載の使用。
（態様５）
前記酵素が、
切断型ＢＲＣＴドメイン、例えば、Ｎ末端側が切断されたＢＲＣＴドメインを含む、態様１〜３のいずれか１項に記載の使用。
（態様６）
前記ＢＲＣＴドメインが存在していない、態様１〜３のいずれか１項に記載の使用。
（態様７）
前記方法が核酸合成である、態様１〜６のいずれか１項に記載の使用。
（態様８）
核酸合成方法であって、
（ａ）初発開始因子配列を提供するステップ、
（ｂ）態様１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の存在下で可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を前記開始因子配列に付加させるステップ、
（ｃ）前記開始因子配列から全ての試薬を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）で前記開始因子配列に付加した前記可逆的遮断ヌクレオチドから遮断基を切断するステップ、及び
（ｅ）前記切断剤を除去するステップ
を含む、前記方法。
（態様９）
ステップ（ｂ）〜（ｅ）を繰り返すことによって１つより多くのヌクレオチドが付加する、態様８に記載の方法。
（態様１０）
前記ヌクレオチドが、式（Ｉ）の化合物：
（化１）
2020521508.tif 000001
〔ここで、
Ｒ０は、ヒドロキシル保護基を表し、
Ｒ２は、水素、ヒドロキシル、−Ｎ３、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル、−Ｏ−（２−シアノエチル）、−Ｏ−アジドメチル、−アミノキシ、または−Ｏ−アリルを表し、
Ｘは、水素または１つ以上のリン酸基を表し、
Ｗは、塩基を表す〕
で遮断されている、態様８または態様９に記載の方法。
（態様１１）
前記可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸が前記ヌクレオチドの糖部分の３’位置において３’−Ｏ−２−（シアノエトキシ）メチル、３’−Ｏ−（２−シアノエチル）、３’−Ｏ−アジドメチル、３’−アミノキシ、または３’−Ｏ−アリル基のいずれかによって遮断されている、態様８または態様９に記載の方法。
（態様１２）
前記可逆的遮断ヌクレオチドが、前記ヌクレオチドの塩基部分の任意の位置において式（ＩＩ）の化合物：
（化２）
2020521508.tif 000002
〔ここで、
Ｒ１及びＲ２は、独立してＨまたはＯＨもしくはその保護誘導体を表し、
Ｘは、水素または１つ以上のリン酸基を表し、
Ｗは、塩基を表し、
Ｙは、切断可能リンカーを表し、
Ｚは、遮断基または担体部分を表す〕
によって遮断されている、態様８または態様９に記載の方法。
（態様１３）
前記初発開始因子配列が５〜１００ヌクレオチドの長さ、または１０〜９０ヌクレオチドの長さ、または５〜２０ヌクレオチドの長さである、態様８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（態様１４）
前記改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素が固体担体上に固定されている、態様８〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（態様１５）
前記改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素が液相中にある、態様８〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（態様１６）
交互相ポリマー合成方法であって、
（ａ）切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたモノマーを提供するステップ、
（ｂ）長さ（Ｎ）のポリマーを提供するステップ、
（ｃ）態様１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を提供して前記ポリマーを前記固定化モノマーに連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結ポリマーを生み出すステップ、
（ｄ）未連結のポリマーを全て除去するステップ、及び
（ｅ）長さ（Ｎ＋１）の前記固定化連結ポリマーを前記担体部分から切断するステップ
を含む、前記方法。
（態様１７）
核酸合成方法であって、
（ａ）切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を提供するステップ、
（ｂ）長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供するステップ、
（ｃ）態様１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加して前記開始因子核酸配列を前記固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰに連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を生み出すステップ、
（ｄ）未連結の開始因子核酸配列を全て除去するステップ、及び
（ｅ）長さ（Ｎ＋１）の前記固定化連結配列を前記担体部分から切断するステップ
を含む、前記方法。
（態様１８）
核酸合成方法であって、
（ａ）切断可能リンカーを介して担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）またはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を提供するステップと、
（ｂ）長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供するステップと、
（ｃ）前記開始因子核酸配列に対して相補的でありかつハイブリダイズすることができる核酸捕捉鎖配列を提供するステップであって、前記捕捉鎖の３’末端がステップ（ａ）の前記ｄＮＴＰ／ＮＴＰと同じ担体部分に固定されている前記ステップと、
（ｄ）態様１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加して前記開始因子核酸配列を前記固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰに連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を生み出すステップと、
（ｅ）どの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度よりも高い反応温度を提供するステップと、
（ｆ）未連結の開始因子核酸配列を全て除去するステップと、
（ｇ）どの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度よりも低い反応温度を提供するステップと、
（ｈ）長さ（Ｎ＋１）の前記固定化連結配列を前記担体部分から切断するステップと、
（ｉ）どの捕捉鎖／開始因子配列二本鎖の融解温度よりも高い反応温度を提供して前記捕捉鎖／開始因子配列二本鎖を分離するステップと
を含む、前記方法。
（態様１９）
核酸合成方法であって、
（ａ）切断可能リンカーを介して移動相担体部分に固定されたデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）もしくはヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、または窒素塩基を介して可逆的停止剤もしくは遮断部分を含有しているｄＮＴＰ／ＮＴＰを提供するステップ、
（ｂ）切断可能リンカーを介して固相担体部分に固定された長さ（Ｎ）の開始因子核酸配列を提供するステップ、
（ｃ）態様１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を添加して前記移動相固定化ｄＮＴＰ／ＮＴＰを前記固相固定化開始因子核酸配列に連結して長さ（Ｎ＋１）の固定化連結配列を生み出すステップ、
（ｄ）未連結の開始因子核酸配列を全て除去するステップ、及び
（ｅ）前記移動相担体部分を長さ（Ｎ＋１）の前記固定化連結配列から切断するステップ
を含む、前記方法。
（態様２０）
マイクロ流体装置内で実施される、態様８〜１９のいずれか１項に記載の方法。
（態様２１）
マイクロ流体装置内で実施される核酸合成方法であって、
（ａ）マイクロ流体装置内の表面に結合した初発開始因子配列を提供するステップ、
（ｂ）態様１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素の存在下で可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸を前記開始因子配列に付加させるステップ、
（ｃ）前記開始因子配列から全ての試薬を除去するステップ、
（ｄ）ステップ（ｂ）において前記開始因子配列に付加した前記可逆的遮断ヌクレオチドから前記遮断基を切断剤の存在下で切断するステップ、及び
（ｅ）前記切断剤を除去するステップ
を含む、前記方法。
（態様２２）
前記マイクロ流体装置が連続流マイクロ流体装置、液滴に基づくマイクロ流体装置、デジタル式マイクロ流体装置、プログラマブルデジタル式マイクロ流体装置、マイクロアレイ装置（例えばＤＮＡチップ）、光流体工学装置、及び音響液滴吐出（ＡＤＥ）装置から選択される、態様２０または態様２１に記載の方法。
（態様２３）
キットであって、
態様１〜６のいずれか１項に記載の改変型ターミナルトランスフェラーゼ酵素を、場合によって開始因子配列、マイクロ流体装置またはチップ、１つ以上の可逆的遮断ヌクレオチド三リン酸、無機ピロホスファターゼ、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の精製済み組換え無機ピロホスファターゼ、及び切断剤から選択される１つ以上の構成要素と組み合わせて含み、
さらに場合によって、態様８〜２２のいずれか１項に記載の方法に従って前記キットを使用するための説明書を一緒に含む、
前記キット。
（態様２４）
核酸合成方法における態様２３に記載のキットの使用。