【手続補正書】
【提出日】令和3年7月9日(2021.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非天然アミノ酸を含有するタンパク質を産生する方法であって、該方法は、
・突然変異体ｔＲＮＡを調製する工程であって、該突然変異体ｔＲＮＡは、
【化１】
2020526197.tif 000001
から選択される非天然核酸塩基を含む非天然ヌクレオチドを含む、表１又は２から選択される突然変異体アンチコドン配列を含む、工程；
・突然変異体ｍＲＮＡを調製する工程であって、該突然変異体ｍＲＮＡは、
【化２】
2020526197.tif 000002
から選択される非天然核酸塩基を含む非天然ヌクレオチドを含む、表１又は２から選択される突然変異体コドン配列を含む、工程；及び
・非天然アミノ酸を含有するタンパク質を、突然変異体ｔＲＮＡ及び突然変異体ｍＲＮＡを利用して合成する工程
を含み、
ここで、前記タンパク質は、半合成生物（ＳＳＯ）において合成され、ＳＳＯは、フェオダクチルム・トリコルヌーツムからのヌクレオシド三リン酸輸送体およびアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記半合成生物は微生物を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記半合成生物は細菌を含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記半合成生物は大腸菌を含む、ことを特徴とする請求項１乃至３の何れか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記非天然核酸塩基は、
【化３】
2020526197.tif 000003
から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記非天然核酸塩基は、
【化４】
2020526197.tif 000004
から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記突然変異体ｍＲＮＡ及び／又は前記突然変異体ｔＲＮＡ中の非天然核酸塩基は、
【化５】
2020526197.tif 000005
から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至４の何れか１つに記載の方法。
【請求項８】
前記突然変異体ｍＲＮＡ中の非天然核酸塩基は、
【化６】
2020526197.tif 000006
である、ことを特徴とする請求項１乃至７の何れか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記突然変異体ｔＲＮＡ中の非天然核酸塩基は、
【化７】
2020526197.tif 000007
である、ことを特徴とする請求項１乃至８の何れか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記非天然ヌクレオチドは更に非天然糖部分を含む、ことを特徴とする請求項１乃至９の何れか１つに記載の方法。
【請求項１１】
前記非天然ヌクレオチドの前記非天然糖部分は、２’位置での修飾：ＯＨ；置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２Ｆ；Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル；Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル；Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル、２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３であって、ここで、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、−Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、−Ｏ（ＣＨ２）ｎ−ＯＮＨ２、及び−Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であってもよく、ｎ及びｍは１〜約１０である、２’位置での修飾；及び／又は、５’位置での修飾：５’−ビニル、５’−メチル（Ｒ又はＳ）、４’位置での修飾、４’−Ｓ、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、及びこれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
突然変異体アンチコドン又は突然変異体コドンは更に非天然バックボーンを含む、ことを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１つに記載の方法。
【請求項１３】
突然変異体アンチコドン及び突然変異体コドンは更に非天然バックボーンを含む、ことを特徴とする請求項１乃至１１の何れか１つに記載の方法。
【請求項１４】
非天然ヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによってｍＲＮＡへと転写中に組み込まれて、前記突然変異体コドンを含有する前記突然変異体ｍＲＮＡを生成する、ことを特徴とする請求項１乃至１３の何れか１つに記載の方法
【請求項１５】
非天然ヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼによってｔＲＮＡへと転写中に組み込まれて、前記突然変異体アンチコドンを含有する前記突然変異体ｔＲＮＡを生成する、ことを特徴とする請求項１乃至１４の何れか１つに記載の方法。
【請求項１６】
前記突然変異体ｔＲＮＡに、非天然アミノ酸残基がチャージされる、ことを特徴とする請求項１乃至１５の何れか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記非天然アミノ酸はｐ−アジド−フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）である、ことを特徴とする請求項１乃至１６の何れか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記非天然アミノ酸は、Ｎ６−［（２−プロピニルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リジン（ＰｒＫ）である、ことを特徴とする請求項１乃至１６の何れか１つに記載の方法。
【請求項１９】
前記突然変異体ｔＲＮＡは、メタノサルシナ・マゼイからのｔＲＮＡの突然変異体である、ことを特徴とする請求項１乃至１８の何れか１つに記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ピロリシルｔＲＮＡシンテターゼである、ことを特徴とする請求項１乃至１９の何れか１つに記載の方法。
【請求項２１】
前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、チロシルｔＲＮＡシンテターゼである、ことを特徴とする請求項１乃至１９の何れか１つに記載の方法。
【請求項２２】
前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノサルシナ・バーケリに由来する、ことを特徴とする請求項１乃至２１の何れか１つに記載の方法。
【請求項２３】
前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、メタノカルドコックス・ヤンナスキイに由来する、ことを特徴とする請求項１乃至２１の何れか１つに記載の方法。
【請求項２４】
ａ．フェオダクチルム・トリコルヌーツムからのヌクレオシド三リン酸輸送体と、
ｂ．
【化８】
2020526197.tif 000008
から選択される非天然核酸塩基を含む突然変異体ｔＲＮＡと、
ｃ．アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼと、
ｄ．
【化９】
2020526197.tif 000009
から選択される非天然核酸塩基を含むｍＲＮＡと
を含む、細胞。
【請求項２５】
前記細胞は更に、ｔＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
前記細胞は更に、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４又は２５に記載の細胞。
【請求項２７】
前記細胞は更に、ｍＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４乃至２６の何れか１つに記載の細胞。
【請求項２８】
前記細胞は更に、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４乃至２７の何れか１つに記載の細胞。
【請求項２９】
前記細胞は更に、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードするオリゴヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項２４乃至２８の何れか１つに記載の細胞。
【請求項３０】
ｔＲＮＡは、ＧＹＴおよびＧＹＣから選択される１つ以上のアンチコドンを含み、ここで、Ｙは前記非天然核酸塩基である、ことを特徴とする請求項２４乃至２９の何れか１つに記載の細胞。
【請求項３１】
ｔＲＮＡはアンチコドンＧＹＴを含む、ことを特徴とする請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
ｔＲＮＡはアンチコドンＧＹＣを含む、ことを特徴とする請求項３０に記載の細胞。
【請求項３３】
非天然核酸塩基Ｙは、
【化１０】
2020526197.tif 000010
である、ことを特徴とする請求項３０乃至３２の何れか１つに記載の細胞。
【請求項３４】
非天然核酸塩基Ｙは、
【化１１】
2020526197.tif 000011
である、ことを特徴とする請求項３０乃至３２の何れか１つに記載の細胞。
【請求項３５】
ｍＲＮＡは、ＡＸＣおよびＧＸＣから選択される１つ以上のコドンを含み、ここで、Ｘは前記非天然核酸塩基である、ことを特徴とする請求項２４乃至３４の何れか１つに記載の細胞。
【請求項３６】
ｍＲＮＡはコドンＡＸＣを含む、ことを特徴とする請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
ｍＲＮＡはコドンＧＸＣを含む、ことを特徴とする請求項３５に記載の細胞。
【請求項３８】
非天然核酸塩基Ｘは、
【化１２】
2020526197.tif 000012
である、ことを特徴とする請求項３５乃至３７の何れか１つに記載の細胞。
【請求項３９】
非天然核酸塩基Ｘは、
【化１３】
2020526197.tif 000013
である、ことを特徴とする請求項３５乃至３７の何れか１つに記載の細胞。
【請求項４０】
ｍＲＮＡは以下の非天然核酸塩基
【化１４】
2020526197.tif 000014
を含み、ｔＲＮＡは以下の非天然核酸塩基
【化１５】
2020526197.tif 000015
を含む、ことを特徴とする請求項２４乃至３２及び３４乃至３８の何れか１つに記載の細胞。
【請求項４１】
突然変異体ｍＲＮＡ及び／又は突然変異体ｔＲＮＡ中の前記非天然核酸塩基は、
【化１６】
2020526197.tif 000016
から選択される、ことを特徴とする請求項２４乃至２９の何れか１つに記載の細胞。
【請求項４２】
突然変異体ｍＲＮＡ中の前記非天然核酸塩基は、
【化１７】
2020526197.tif 000017
である、ことを特徴とする請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
突然変異体ｔＲＮＡ中の前記非天然核酸塩基は、
【化１８】
2020526197.tif 000018
である、ことを特徴とする請求項４１又は４２に記載の細胞。
【請求項４４】
前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはメタノサルシナ・バーケリに由来する、ことを特徴とする請求項２４乃至４３の何れか１つに記載の細胞。
【請求項４５】
前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼはメタノカルドコックス・ヤンナスキイに由来する、ことを特徴とする請求項２４乃至４３の何れか１つに記載の細胞。
【請求項４６】
前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、ピロリシルｔＲＮＡシンテターゼである、ことを特徴とする請求項２４乃至４５の何れか１つに記載の細胞。
【請求項４７】
前記アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、チロシルｔＲＮＡシンテターゼである、ことを特徴とする請求項２４乃至４５の何れか１つに記載の細胞。
【請求項４８】
前記突然変異体ｔＲＮＡはメタノサルシナ・マゼイからのｔＲＮＡの突然変異体である、ことを特徴とする請求項２４乃至４７の何れか１つに記載の細胞。
【請求項４９】
前記細胞は微生物である、ことを特徴とする請求項２４乃至４８の何れか１つに記載の細胞。
【請求項５０】
前記細胞は細菌である、ことを特徴とする請求項２４乃至４８の何れか１つに記載の細胞。
【請求項５１】
前記細胞は大腸菌である、ことを特徴とする請求項２４乃至４８の何れか１つに記載の細胞。
【請求項５２】
非天然アミノ酸を含むタンパク質を細胞内で生成する方法であって、前記方法は、
ヌクレオシド三リン酸輸送体を使用して、請求項２４乃至５１の何れか１つに記載の細胞内に非天然ヌクレオチドを輸送する工程と、
前記細胞に非天然アミノ酸を提供する工程と
を含み、
ここで、前記非天然ヌクレオチドは、非天然オリゴヌクレオチドを含む二本鎖オリゴヌクレオチドの転写中に、ＲＮＡポリメラーゼによって組み込まれて、突然変異体ｍＲＮＡおよび突然変異体ｔＲＮＡを生成し、および、
前記非天然アミノ酸を含むタンパク質は、前記突然変異体ｍＲＮＡの翻訳中に、前記突然変異体ｔＲＮＡを利用して生成される、
方法。
【請求項５３】
前記細胞に輸送された前記非天然ヌクレオチドは、非天然核酸塩基を含む、ことを特徴とする請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記非天然核酸塩基は、
【化１９】
2020526197.tif 000019
である、ことを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記非天然アミノ酸はｐ−アジド−フェニルアラニン（ｐＡｚＦ）である、ことを特徴とする請求項５２乃至５４の何れか１つに記載の方法。
【請求項５６】
前記非天然アミノ酸はＮ６−［（２−プロピニルオキシ）カルボニル］−Ｌ−リジン（ＰｒＫ）である、ことを特徴とする請求項５２乃至５４の何れか１つに記載の方法。