【手続補正書】
【提出日】令和3年1月29日(2021.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物であって、前記キメラＴｆＲポリペプチドが、前記動物の天然ＴｆＲポリペプチドのトランスフェリン結合部位と、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインとを含む、前記非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項２】
前記異種頂端ドメインが、
（ａ）配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、
（ｂ）配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、または
（ｄ）配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項３】
前記キメラＴｆＲポリペプチドが、
（ａ）配列番号３との少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、または
（ｂ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、
請求項１または２に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４】
キメラＴｆＲポリペプチドの前記異種頂端ドメインをコードし、
（ａ）配列番号２との少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する、
（ｂ）配列番号２との少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有する、または
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項５】
前記キメラＴｆＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、マウスＴｆＲ遺伝子のエクソン及びイントロン、ならびに、マウスＴｆＲ遺伝子の頂端ドメインに取って代わるように前記マウスＴｆＲ遺伝子の第４のエクソンの後に配置された異種頂端ドメインをコードする核酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項６】
（ａ）前記動物がげっ歯類であり、任意で前記げっ歯類がマウスもしくはラットである、
（ｂ）前記動物のゲノムが、前記キメラＴｆＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、
（ｃ）前記キメラＴｆＲポリペプチドが、前記動物の脳で発現される、
（ｄ）脳、肝臓、腎臓、もしくは肺組織において、前記動物が、対応する同種の野生型動物の同じ組織におけるＴｆＲの発現レベルの２０％以内のキメラＴｆＲポリペプチドのレベルを発現する、
（ｅ）前記動物が、対応する同種の野生型動物における赤血球数、ヘモグロビンのレベル、もしくはヘマトクリットのレベルの２０％以内の赤血球数、ヘモグロビンのレベル、もしくはヘマトクリットのレベルを含む、かつ／または
（ｆ）前記動物が、（ｉ）前記キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸配列についてホモ接合性である、もしくは（ｉｉ）前記キメラＴｆＲポリペプチドをコードする核酸配列についてヘテロ接合性である、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項７】
キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現する、非ヒト動物由来の宿主細胞であって、前記キメラＴｆＲポリペプチドが、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインと、前記動物の天然ＴｆＲポリペプチドのトランスフェリン結合部位とを含む、宿主細胞。
【請求項８】
（ａ）前記異種頂端ドメインが、
（ｉ）配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する、
（ｉｉ）配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する、
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、もしくは
（ｉｖ）配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号９のアミノ酸配列を含む、または
（ｂ）前記宿主細胞が、前記宿主細胞内の前記異種頂端ドメインをコードし、
（ｉ）配列番号２との少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する、
（ｉｉ）配列番号２との少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有する、もしくは
（ｉｉｉ）配列番号２のヌクレオチド配列を含む
ポリヌクレオチドを含む、
請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
（ａ）前記宿主細胞がマウス細胞であり、任意で前記宿主細胞内の前記頂端ドメインをコードするポリヌクレオチドが、マウスＴｆＲ遺伝子の第４のエクソンの後に配置されている、
（ｂ）前記宿主細胞がエクスビボにあり、任意で前記宿主細胞が胚性幹細胞である、かつ／または
（ｃ）前記宿主細胞のゲノムが、前記動物の天然ＴｆＲポリペプチドの頂端ドメインの欠失を含む、
請求項７または８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
血液脳関門を通過する頂端ドメイン結合ポリペプチド（ＡＤＢＰ）をスクリーニングまたはモニタリングする方法であって、
（ａ）ＡＤＢＰを、請求項１〜６のいずれか１項に記載の動物に投与するステップと、
（ｂ）前記動物の脳内の前記ＡＤＢＰの存在または活性を測定するステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
前記ＡＤＢＰが、エフェクター分子と結合しており、任意で前記エフェクター分子が、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドであり、任意で前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）前記測定するステップが、
（ｉ）前記動物の脳または脳組織を、前記エフェクター分子に結合する薬剤と接触させることと、脳内に存在する前記エフェクター分子のレベルを決定することとを含むか、もしくは
（ｉｉ）前記エフェクター分子の薬力学的（ＰＤ）効果を測定することを含む、かつ／または
（ｂ）前記エフェクター分子が、脳内の標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
キメラＴｆＲポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト単一細胞胚を生成する方法であって、前記胚の内因性ＴｆＲ遺伝子の頂端ドメインを、配列番号１との少なくとも８０％の同一性を有する異種頂端ドメインで置換することを含み、任意で
（ａ）前記頂端ドメインを置換することが、相同組換えによって実施される、
（ｂ）前記方法が、Ｃａｓ９タンパク質と、少なくとも１つのｓｇＲＮＡと、前記異種頂端ドメインをコードする核酸配列を含むドナーＤＮＡとを接触させることを含み、前記異種頂端ドメインコード配列が、前記胚のゲノム内の前記内因性ＴｆＲ遺伝子の前記頂端ドメインを置換するように、前記異種頂端ドメインは、左の相同アーム及び右の相同アームと隣接している、
（ｃ）前記異種頂端ドメインが、前記胚での発現のためにコドン最適化されている、かつ／または
（ｄ）前記胚がマウス胚であり、任意で前記ドナーＤＮＡが、内因性マウスＴｆＲ遺伝子の第４のエクソンの後に配置される、
、前記方法。
【請求項１４】
非ヒトトランスジェニック動物を生成する方法であって、
（ａ）請求項１３に記載の方法によって得ることができる胚を、前記胚と同じ動物種の偽妊娠雌に対して移植するステップと、
（ｂ）前記雌より生まれた子孫から非ヒトトランスジェニック動物を選択するステップであって、前記動物は、前記キメラＴｆＲポリペプチドを発現する、ステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
キメラＴｆＲポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物を生成する方法であって、
（ａ）配列番号１との少なくとも８０％の同一性を有する頂端ドメインをコードするポリヌクレオチドを、非ヒト動物の胚細胞内に導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、内因性ＴｆＲ頂端ドメインをコードする内因性ＴｆＲ遺伝子の領域を標的とし、かつ配列番号１との少なくとも８０％の同一性を有する前記頂端ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記内因性頂端ドメインをコードする前記内因性ＴｆＲ遺伝子の前記領域を置換する、ステップと、
（ｂ）前記細胞またはその子孫を前記非ヒトトランスジェニック動物へと発達させるステップと
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
[本発明1001]
非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位と、配列番号1と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインとを含むキメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
[本発明1002]
前記異種頂端ドメインが、配列番号1のアミノ酸配列を含む、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1003]
前記異種頂端ドメインが、配列番号7、配列番号8、または配列番号9のアミノ酸配列を含む、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1004]
前記非ヒト哺乳動物トランスフェリン結合部位が、天然マウストランスフェリン結合部位である、本発明1001〜1003のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1005]
前記キメラＴｆＲポリペプチドが、配列番号3との少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1001〜1004のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1006]
前記キメラＴｆＲポリペプチドが、配列番号3のアミノ酸配列を含む、本発明1005のポリヌクレオチド。
[本発明1007]
前記キメラＴｆＲポリペプチドの前記異種頂端ドメインをコードする前記核酸配列の領域が、配列番号2との少なくとも70％のヌクレオチド配列同一性を有する、本発明1001のポリヌクレオチド。
[本発明1008]
前記キメラＴｆＲポリペプチドの前記異種頂端ドメインをコードする前記核酸配列の領域が、配列番号2のヌクレオチド配列を含む、本発明1007のポリヌクレオチド。
[本発明1009]
前記キメラＴｆＲをコードする前記ポリヌクレオチドが、マウストランスフェリン受容体遺伝子のエクソンとイントロンとを含み、かつ前記異種頂端ドメインをコードする前記核酸配列が、マウストランスフェリン受容体遺伝子の頂端結合ドメインに取って代わるように前記マウストランスフェリン受容体遺伝子の第4のエクソンの後に配置されている、本発明1001〜1008のいずれかのポリヌクレオチド。
[本発明1010]
本発明1001〜1009のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされるキメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチド。
[本発明1011]
本発明1001〜1009のいずれかのポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
[本発明1012]
マウス細胞である、本発明1011の宿主細胞。
[本発明1013]
キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現する宿主細胞であって、前記キメラＴｆＲポリペプチドが、（ａ）ＴｆＲポリペプチドの内因性頂端ドメインに代わる異種頂端ドメインと、（ｂ）内因性トランスフェリン結合部位とを含む、宿主細胞。
[本発明1014]
前記異種頂端ドメインが、配列番号1と少なくとも80％同一のアミノ酸配列を有する、本発明1013の宿主細胞。
[本発明1015]
前記異種頂端ドメインが、配列番号1のアミノ酸配列を含む、本発明1013の宿主細胞。
[本発明1016]
前記細胞内の前記異種頂端ドメインをコードする核酸配列が、配列番号2のヌクレオチド配列を含む、本発明1013、1014、または1015のいずれかの宿主細胞。
[本発明1017]
マウス細胞である、本発明1013〜1016のいずれかの宿主細胞。
[本発明1018]
前記細胞内の前記頂端ドメインをコードする前記核酸配列が、マウストランスフェリン受容体遺伝子の第4のエクソンの後に配置されている、本発明1017の宿主細胞。
[本発明1019]
エクスビボにある、本発明1011〜1018のいずれかの宿主細胞。
[本発明1020]
胚性幹細胞である、本発明1019の宿主細胞。
[本発明1021]
前記宿主細胞のゲノムが、内因性ＴｆＲの頂端ドメインの欠失を含む、本発明1011〜1020のいずれかの宿主細胞。
[本発明1022]
キメラＴｆＲポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物であって、前記キメラＴｆＲポリペプチドが、前記非ヒトトランスジェニック動物にとって内因性であるＴｆＲポリペプチドの頂端ドメインに取って代わる異種頂端ドメインを含む、前記非ヒトトランスジェニック動物。
[本発明1023]
前記非ヒトトランスジェニック動物のゲノムが、前記非ヒトトランスジェニック動物の天然ＴｆＲの頂端ドメインに代わる異種頂端ドメインを含む、本発明1022の非ヒトトランスジェニック動物。
[本発明1024]
本発明1011〜1021のいずれかの宿主細胞を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
[本発明1025]
げっ歯類である、本発明1022、1023、または1024のいずれかの非ヒトトランスジェニック動物。
[本発明1026]
マウスである、本発明1025の非ヒトトランスジェニック動物。
[本発明1027]
ラットである、本発明1025の非ヒトトランスジェニック動物。
[本発明1028]
前記キメラＴｆＲについてホモ接合性である、本発明1022〜1027のいずれかの非ヒトトランスジェニック動物。
[本発明1029]
前記キメラＴｆＲについてヘテロ接合性である、本発明1022〜1027のいずれかの非ヒトトランスジェニック動物。
[本発明1030]
キメラＴｆＲに結合する頂端ドメイン結合ポリペプチド（ＡＤＢＰ）をスクリーニングする方法であって、
候補ＡＤＢＰを、本発明1010のキメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップと、
前記キメラＴｆＲポリペプチドに結合する候補ＡＤＢＰの量を決定するステップと
を含む、方法。
[本発明1031]
前記候補ＡＤＢＰを前記キメラＴｆＲポリペプチドと接触させる前記ステップが、前記ＡＤＢＰを、前記キメラＴｆＲポリペプチドを発現する宿主細胞と接触させることを含む、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記候補ＡＤＢＰを前記キメラＴｆＲポリペプチドと接触させる前記ステップが、前記ＡＤＢＰを、前記キメラＴｆＲポリペプチドを発現する内皮と接触させることを含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
前記内皮が血液脳関門内皮である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記キメラＴｆＲポリペプチドに結合する前記候補ＡＤＢＰの量が、イムノアッセイによって決定される、本発明1030〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
前記キメラＴｆＲポリペプチドに結合する前記候補ＡＤＢＰの量が、表面プラズモン共鳴によって決定される、本発明1030の方法。
[本発明1036]
前記接触させるステップが、インビボで実施される、本発明1030〜1034のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記候補ＡＤＢＰが、エフェクター分子と結合している、本発明1030〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
前記エフェクター分子が、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記エフェクター分子がポリペプチドである、本発明1038の方法。
[本発明1040]
前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
キメラＴｆＲに結合するＡＤＢＰの量を測定する方法であって、
ＡＤＢＰを、本発明1010のキメラＴｆＲポリペプチドと接触させるステップと、
前記キメラＴｆＲポリペプチドに結合したＡＤＢＰの量をイムノアッセイまたは表面プラズモン共鳴によって決定するステップと
を含む、方法。
[本発明1042]
血液脳関門を通過するＡＤＢＰをスクリーニングする方法であって、
（ａ）配列番号1との少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する頂端ドメインに結合するＡＤＢＰを、本発明1022〜1029のいずれかの非ヒトトランスジェニック動物に投与するステップと、
（ｂ）前記非ヒトトランスジェニック動物の脳内の前記ＡＤＢＰの存在または活性を測定するステップと
を含む、方法。
[本発明1043]
前記ＡＤＢＰが、エフェクター分子と結合している、本発明1042の方法。
[本発明1044]
前記エフェクター分子が、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、本発明1044の方法。
[本発明1046]
前記決定するステップが、定量的イムノアッセイを実施することを含む、本発明1042〜1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記測定するステップが、前記動物の脳または脳組織を、前記エフェクター分子に結合する薬剤と接触させることと、脳内に存在する前記エフェクター分子のレベルを決定することとを含む、本発明1043の方法。
[本発明1048]
前記測定するステップが、前記エフェクター分子の薬力学的（ＰＤ）効果を測定することを含む、本発明1042の方法。
[本発明1049]
前記エフェクター分子が、抗ＢＡＣＥ1抗体またはその抗原結合フラグメントであり、かつ前記測定するステップが、脳内の可溶性ＡＢｅｔａ40のレベルを測定することを含む、本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記エフェクター分子が、脳内の標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、本発明1043の方法。
[本発明1051]
血液脳関門を通過するＡＤＢＰをモニタリングする方法であって、
（ａ）配列番号1との少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する頂端ドメインに結合するＡＤＢＰを、本発明1022〜1029のいずれかの非ヒトトランスジェニック動物に投与するステップと、
（ｂ）前記非ヒトトランスジェニック動物の脳内の前記ＡＤＢＰの存在または活性を測定するステップと
を含む、方法。
[本発明1052]
前記ＡＤＢＰが、エフェクター分子と結合している、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記エフェクター分子が、小分子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはポリペプチドである、本発明1052の方法。
[本発明1054]
前記ポリペプチドが、抗体またはその抗原結合フラグメントである、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記決定するステップが、定量的イムノアッセイを実施することを含む、本発明1051〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記決定するステップが、前記エフェクター分子を、前記エフェクター分子に結合する薬剤と接触させることと、脳内に存在する前記エフェクター分子のレベルを決定することとを含む、本発明1055の方法。
[本発明1057]
前記エフェクター分子が、脳内の標的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、本発明1052の方法。
[本発明1058]
前記測定するステップが、前記標的に結合する前記エフェクター分子のＰＤ効果を測定することを含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記エフェクター分子が、抗ＢＡＣＥ1抗体またはその抗原結合フラグメントであり、かつ前記測定するステップが、脳内の可溶性ＡＢｅｔａ40のレベルを測定することを含む、本発明1057の方法。
[本発明1060]
キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト単一細胞胚を生成する方法であって、前記非ヒト単一細胞胚の内因性ＴｆＲの頂端ドメインを、配列番号1との少なくとも80％の同一性を有する異種頂端ドメインで置換することを含む、方法。
[本発明1061]
前記頂端ドメインを置換することが、相同組換えによって実施される、本発明1060の方法。
[本発明1062]
前記方法が、Ｃａｓ9タンパク質と、少なくとも1つのｓｇＲＮＡと、前記異種頂端ドメインをコードする核酸配列を含むドナーＤＮＡとを接触させることを含み、
前記異種頂端ドメインコード配列が、前記非ヒト単一細胞胚のゲノム内の前記内因性ＴｆＲの前記頂端ドメインを置換するように、前記異種頂端ドメインは、左の相同アーム及び右の相同アームと隣接している、
本発明1060または1061の方法。
[本発明1063]
前記異種頂端ドメインが、前記非ヒト単一細胞胚での発現のためにコドン最適化されている、本発明1060〜1062のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記非ヒト単一細胞胚がマウス胚である、本発明1060〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記ドナーＤＮＡが、マウストランスフェリン受容体遺伝子の第4のエクソンの後に配置される、本発明1064の方法。
[本発明1066]
非ヒトトランスジェニック動物を生成する方法であって、
（ａ）本発明1060〜1065のいずれかのトランスジェニック非ヒト単一細胞胚を、前記非ヒト単一細胞胚と同じ動物種の偽妊娠雌に対して移植するステップと、
（ｂ）前記雌より生まれた子孫から非ヒトトランスジェニック動物を選択するステップであって、前記非ヒトトランスジェニック動物は、内因性ＴｆＲの頂端ドメインが配列番号1との少なくとも80％の同一性のアミノ酸配列を有する異種頂端ドメインで置換されたキメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを含む、ステップと
を含む、方法。
[本発明1067]
キメラトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物を生成する方法であって、
（ａ）配列番号1との少なくとも80％の同一性を有する頂端ドメインをコードするポリヌクレオチドを、動物の胚細胞内に導入するステップであって、前記ポリヌクレオチドが、内因性ＴｆＲ頂端ドメインをコードする内因性ＴｆＲ遺伝子の領域を標的とし、かつ配列番号1との少なくとも80％の同一性を有する前記頂端ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記内因性頂端ドメインをコードする前記内因性ＴｆＲ遺伝子の前記領域を置換する、ステップと、
（ｂ）前記細胞またはその子孫を非ヒトトランスジェニック動物へと発達させるステップと
を含む、方法。
前述の概略な記載及び以下の詳細な記載は、例示的及び説明的であり、請求される本発明のさらなる説明を提供することが意図される。他の目的、利点、及び新規の特徴は、本発明の以下の詳細な記載から当業者には容易に明らかになるであろう。