【手続補正書】
【提出日】令和3年9月6日(2021.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＯＸ１０を含む少なくとも１種の神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団を形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
【請求項２】
ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種の頭蓋プラコード系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
【請求項３】
ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、およびこれらの組合せからなる群より選択される１種または複数の三叉神経プラコード系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞の集団が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
【請求項４】
ＴＦＡＰ２Ａを含む少なくとも１種のｏｒｅ非神経外胚葉系統マーカーを発現するｉｎ
ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団を（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
【請求項５】
前記細胞が、約６００ｎＭから約１．５μＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１または３に記載の集団。
【請求項６】
前記細胞が、約１０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項２に記載の集団。
【請求項７】
前記細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤に曝露される、請求項４に記載の集団。
【請求項８】
前記幹細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤、および約０．０１ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの間の濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１から７のいずれか一項に記載の集団。
【請求項９】
前記細胞が、約１０ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に約２日間曝露され、続いて、約５ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項４、７および８のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１０】
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１１】
ＢＭＰシグナル伝達の前記活性化剤が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１２】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ誘導体、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、請求項１、３、５および８から１１のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１３】
ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、請求項２、６、および８から１２のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１４】
ＦＧＦシグナル伝達の前記阻害剤が、ＳＵ５４０２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、請求項４、７、および８から１３のいずれか一項に記載の集団。
【請求項１５】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、少なくとも１種の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１６】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１７】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１８】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項１９】
前記細胞が、約６００ｎＭから約１．５μＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１５または１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、約１０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤に曝露される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記幹細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤、および約０．０１ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの間の濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記幹細胞が、約１０ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に約２日間曝露され、続いて、約５ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、請求項１８、２１および２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、請求項１５から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１５から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、請求項１５、１７、１９、および２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、請求項１６、２０、および２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＦＧＦシグナル伝達の前記阻害剤が、ＳＵ５４０２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、請求項１８、２１、および２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記少なくとも１種の神経堤系統マーカーが、ＳＯＸ１０を含む、請求項１５、１９、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つの頭蓋プラコード系統マーカーが、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１６、２０、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーが、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、およびこれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７、１９、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種の非神経外胚葉系統マーカーが、ＴＦＡＰ２Ａを含む、請求項１８、２１、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記分化細胞の集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、請求項１５から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を含む組成物。
【請求項３５】
医薬組成物であり、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
対象における神経変性障害および／または下垂体障害を処置するための請求項３４もしくは３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
神経変性障害および／または下垂体障害を処置するための医薬の製造における、請求項１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞、または請求項３４もしくは３５に記載の組成物の使用。
【請求項３９】
下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、請求項３８に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
ある特定の実施形態では、下垂体障害は、下垂体機能低下障害である。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
ＳＯＸ１０を含む少なくとも１種の神経堤系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団を形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
（項目２）
ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種の頭蓋プラコード系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
（項目３）
ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、およびこれらの組合せからなる群より選択される１種または複数の三叉神経プラコード系統マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞の集団が、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
（項目４）
ＴＦＡＰ２Ａを含む少なくとも１種のｏｒｅ非神経外胚葉系統マーカーを発現するｉｎ
ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化した細胞集団が、幹細胞の集団を（ａ）ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＦＧＦシグナル伝達の１種または複数の阻害剤に曝露するステップとを含む方法に従って幹細胞の集団から誘導され、分化した細胞の前記集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団。
（項目５）
前記細胞が、約６００ｎＭから約１．５μＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、項目１または３に記載の集団。
（項目６）
前記細胞が、約１０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、項目２に記載の集団。
（項目７）
前記細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤に曝露される、項目４に記載の集団。
（項目８）
前記幹細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤、および約０．０１ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの間の濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、項目１から７のいずれか一項に記載の集団。
（項目９）
前記細胞が、約１０ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に約２日間曝露され、続いて、約５ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、項目４、７および８のいずれか一項に記載の集団。
（項目１０）
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、項目１から９のいずれか一項に記載の集団。
（項目１１）
ＢＭＰシグナル伝達の前記活性化剤が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目１から１０のいずれか一項に記載の集団。
（項目１２）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ誘導体、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、項目１、３、５および８から１１のいずれか一項に記載の集団。
（項目１３）
ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、項目２、６、および８から１２のいずれか一項に記載の集団。
（項目１４）
ＦＧＦシグナル伝達の前記阻害剤が、ＳＵ５４０２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、項目４、７、および８から１３のいずれか一項に記載の集団。
（項目１５）
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、少なくとも１種の神経堤系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目１６）
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の頭蓋プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目１７）
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、およびＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目１８）
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞の集団をＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１種または複数の阻害剤、および少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るＢＭＰシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に少なくとも約２または３日間曝露するステップと、少なくとも１種の非神経外胚葉系統マーカーを発現する分化細胞の細胞集団を得るために、前記細胞をＷｎｔシグナル伝達の１種または複数の活性化剤に曝露して、ステップとを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法。
（項目１９）
前記細胞が、約６００ｎＭから約１．５μＭの間の濃度でＷｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、項目１５または１７に記載の方法。
（項目２０）
前記細胞が、約１０ｎｇ／ｍＬから約２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤に曝露される、項目１８に記載の方法。
（項目２２）
前記幹細胞が、約１μＭから約２０μＭの間の濃度でＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤、および約０．０１ｎｇ／ｍｌから約３０ｎｇ／ｍｌの間の濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、項目１５から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記幹細胞が、約１０ｎｇ／ｍｌまたは約２０ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に約２日間曝露され、続いて、約５ｎｇ／ｍｌの濃度でＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤に曝露される、項目１８、２１および２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
ＴＧＦβ／アクチビン−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１種または複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子を含む、項目１５から２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
ＢＭＰシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される、項目１５から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
Ｗｎｔシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ、それらの誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、項目１５、１７、１９、および２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
ＦＧＦシグナル伝達の前記１種または複数の活性化剤が、ＦＧＦ２、その誘導体、およびそれらの混合物を含む、項目１６、２０、および２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
ＦＧＦシグナル伝達の前記阻害剤が、ＳＵ５４０２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群より選択される小分子である、項目１８、２１、および２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記少なくとも１種の神経堤系統マーカーが、ＳＯＸ１０を含む、項目１５、１９、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記少なくとも１つの頭蓋プラコード系統マーカーが、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、クリスタリンアルファＢ、およびこれらの組合せからなる群より選択される、項目１６、２０、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記少なくとも１種の三叉神経プラコード系統マーカーが、ＳＩＸ１、ＰＡＸ３、およびこれらの組合せからなる群より選択される、項目１７、１９、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記少なくとも１種の非神経外胚葉系統マーカーが、ＴＦＡＰ２Ａを含む、項目１８、２１、および２２から２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記分化細胞の集団の約２０％未満が、ＦＯＸＧ１、ＰＡＸ６、ＳＩＸ１、およびこれらの組合せからなる群より選択される少なくとも１種のマーカーの検出可能なレベルを発現する、項目１５から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
項目１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を含む組成物。
（項目３５）
医薬組成物であり、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、項目３４に記載の組成物。
（項目３６）
対象における神経変性障害および／または下垂体障害を処置する方法であって、項目１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞、または項目３４もしくは３５に記載の組成物を、前記対象に投与するステップを含む方法。
（項目３７）
前記下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
神経変性障害および／または下垂体障害を処置するための医薬の製造における、項目１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞、または項目３４もしくは３５に記載の組成物の使用。
（項目３９）
下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、項目３８に記載の使用。
（項目４０）
神経変性障害および／または下垂体障害の処置における使用のための、項目１から１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞。
（項目４１）
下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、項目４０に記載の使用のための細胞。
（項目４２）
神経変性障害および／または下垂体障害の処置における使用のための、項目３４または３５に記載の組成物。
（項目４３）
下垂体障害が、下垂体機能低下障害である、項目４２に記載の使用のための組成物。
４．図面の簡単な説明
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用するＴＦＡＰ２ＡノックアウトｈＥＳＣの生成を示す。（Ａ、Ｂ）２種のガイドＲＮＡを使用してＴＦＡＰ２Ａにおけるフレームシフト欠失を誘導し、陽性クローンをシークエンシングして欠失の程度および性質を決定した。図１２Ａは、配列番号５を開示する。図１２Ｂは、出現する順番にそれぞれ、配列番号６および６〜１２を開示する。（Ｃ）ＴＦＡＰ２Ａの発現の消失は、野生型細胞と比較して、ＴＦＡＰ２Ａの発現を誘引できなかった、高いＢＭＰの存在下での短い３日の誘導を使用して確認した。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用するＴＦＡＰ２ＡノックアウトｈＥＳＣの生成を示す。（Ａ、Ｂ）２種のガイドＲＮＡを使用してＴＦＡＰ２Ａにおけるフレームシフト欠失を誘導し、陽性クローンをシークエンシングして欠失の程度および性質を決定した。図１２Ａは、配列番号５を開示する。図１２Ｂは、出現する順番にそれぞれ、配列番号６および６〜１２を開示する。（Ｃ）ＴＦＡＰ２Ａの発現の消失は、野生型細胞と比較して、ＴＦＡＰ２Ａの発現を誘引できなかった、高いＢＭＰの存在下での短い３日の誘導を使用して確認した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｅは、ＳＩＸ１ノックインレポーター株の生成を示す。（Ａ）ｅＧＥＰ含有レポーターカセットを使用する内因性ＳＩＸ１ストップコドンのＴＡＬＥＮベースの標的化の略図。図２５Ａは、配列番号１３を開示する。（Ｂ）ＳＩＸ１ホモロジーアームのすぐ外側のゲノム領域にアニーリングするプライマーを使用する標的化クローンのＰＣＲスクリーニング。クローン番号６を選択し、この研究に使用した。（Ｃ）正常なメス（ＸＸ）核型を示すＨ９  ＳＩＸ１Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰクローン番号６の核型。（Ｄ）ＧＦＰに対して陽性および陰性を選別したプラコード条件下で６日間分化したＳＩＸ１Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰ細胞におけるＳＩＸ１の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、同じ実験からのＧＡＰＤＨおよび無選別細胞に対して正規化され、２つの技術的反復データを有する単一実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｅ）内因性ＳＩＸ１（赤）および内因性ＳＩＸ１プロモーター（緑）の制御下でのＧＦＰについて染色する１１日目の下垂体細胞の免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。
【図２５Ｂ−Ｅ】図２５Ａ〜２５Ｅは、ＳＩＸ１ノックインレポーター株の生成を示す。（Ａ）ｅＧＥＰ含有レポーターカセットを使用する内因性ＳＩＸ１ストップコドンのＴＡＬＥＮベースの標的化の略図。図２５Ａは、配列番号１３を開示する。（Ｂ）ＳＩＸ１ホモロジーアームのすぐ外側のゲノム領域にアニーリングするプライマーを使用する標的化クローンのＰＣＲスクリーニング。クローン番号６を選択し、この研究に使用した。（Ｃ）正常なメス（ＸＸ）核型を示すＨ９  ＳＩＸ１Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰクローン番号６の核型。（Ｄ）ＧＦＰに対して陽性および陰性を選別したプラコード条件下で６日間分化したＳＩＸ１Ｈ２Ｂ：：ＧＦＰ細胞におけるＳＩＸ１の発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。値は、同じ実験からのＧＡＰＤＨおよび無選別細胞に対して正規化され、２つの技術的反復データを有する単一実験の平均＋／−ＳＥＭとしてプロットされている。（Ｅ）内因性ＳＩＸ１（赤）および内因性ＳＩＸ１プロモーター（緑）の制御下でのＧＦＰについて染色する１１日目の下垂体細胞の免疫蛍光分析。スケールバー：５０μｍ。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
【図２７−１】図２７は、実施例２の単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ実験で使用されたプライマーのリストを示す。図２７は、出現する順番にそれぞれ、「ＦＰ」配列を配列番号２１〜５４として、「ＲＰ」配列を配列番号５５〜８８として開示する。
【図２７−２】図２７は、実施例２の単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲ実験で使用されたプライマーのリストを示す。図２７は、出現する順番にそれぞれ、「ＦＰ」配列を配列番号２１〜５４として、「ＲＰ」配列を配列番号５５〜８８として開示する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７８】
【図３３】図３３Ａは、単一細胞ｑ−ＲＴ  ＰＣＲの結果および単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲを使用する単一細胞におけるホルモン転写物の定量化についての免疫蛍光検証を示す。下垂体条件下で分化した１５日目および３０日目の免疫蛍光分析。細胞は、前駆体マーカーであるＨＥＳＸ１および一過的副腎皮質刺激ホルモン分泌細胞マーカーであるＮＥＵＲＯＤ１について共染色された。スケールバー：５０μｍ。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８８】
【図４３Ａ】図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。図４３Ａは、配列番号５を開示する。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。図４３Ｂは、出現の順番でそれぞれ、配列番号１４、１５、１４、１６、１４、１７、１４、１８、１４、１９、１４および２０を開示する。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ  ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０  ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ  ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー  ５０μｍ。
【図４３Ｂ】図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。図４３Ａは、配列番号５を開示する。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。図４３Ｂは、出現の順番でそれぞれ、配列番号１４、１５、１４、１６、１４、１７、１４、１８、１４、１９、１４および２０を開示する。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ  ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０  ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ  ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー  ５０μｍ。
【図４３Ｃ−Ｄ】図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。図４３Ａは、配列番号５を開示する。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。図４３Ｂは、出現の順番でそれぞれ、配列番号１４、１５、１４、１６、１４、１７、１４、１８、１４、１９、１４および２０を開示する。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ  ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０  ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ  ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー  ５０μｍ。
【図４３Ｅ−Ｆ】図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。図４３Ａは、配列番号５を開示する。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。図４３Ｂは、出現の順番でそれぞれ、配列番号１４、１５、１４、１６、１４、１７、１４、１８、１４、１９、１４および２０を開示する。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ  ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０  ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ  ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー  ５０μｍ。
【図４３Ｇ−Ｈ】図４３Ａ〜４３Ｈは、ＴＦＡＰ２Ａノックアウト細胞の検証および特徴付けを示す。（Ａ）ＴＦＡＰ２Ａを標的化するガイドＲＮＡの概略図。図４３Ａは、配列番号５を開示する。（Ｂ）可能性のある３つのクローンのシークエンシング結果は、２つがフレームシフト変異（ＡＰ２Ａ．１０およびＡＰ２Ａ．１１）を有したこと、およびその他のクローン（ＡＰ２Ａ．４）が一方の対立遺伝子にフレームシフト変異および他方の対立遺伝子に９ｂｐを保有することを示す。図４３Ｂは、出現の順番でそれぞれ、配列番号１４、１５、１４、１６、１４、１７、１４、１８、１４、１９、１４および２０を開示する。（Ｃ）３日間、２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４で処理した異なるＥＳクローンにおけるＴＦＡＰ２Ａの免疫蛍光染色。（Ｄ）３日のＢＭＰ４処理後にウエスタンブロットを行って変異株におけるタンパク質発現の損失を検証した。（Ｅ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＯＸ１０陽性細胞の免疫蛍光。（Ｆ）１２日目のＴＦＡＰ２Ａ発現が欠如しているＳＩＸ１陽性細胞の免疫蛍光。（Ｇ）野生型と比較したＴＦＡＰ２Ａ  ＫＯ細胞からのＮＮＥの誘導中のＫＲＴ１６およびＷＩＳＰ１の発現の定量的ＰＣＲ分析。（Ｈ）ほとんど重なりを示さない、Ｓｏｘ１０  ＧＦＰおよびＳｉｘ１−Ｈ２Ｂ  ＧＦＰと組み合わせたＴＦＡＰ２Ｃの免疫蛍光染色。スケールバー  ５０μｍ。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８４】
ＰＡＸ６およびＳＩＸ１  Ｈ２Ｂ  ＧＦＰレポーター株の生成
ドナープラスミドを構築し、Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用してｐＵＣ１９にクローニングした。ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｒｇｅｔｅｒソフトウェア（Cermak  et  al.,  2011;  Doyle  et  al.,  2012）を使用してＴＡＬＥＮ配列を予測した。ＰＡＸ６  ＴＡＬＥＮ：ＴＧＴＣＣＴＧＴＡＴＴＧ  ＴＡＣＣＡＣＴ（配列番号１）およびＴＧＴＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＣＣＴＴＧＴ（配列番号２）  ＳＩＸ１  ＴＡＬＥＮ：ＴＣＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＣＣＣＣＴＣＡ（配列番号３）およびＴＴＧＧＧＧＴＣＣＴＡＡＧＴＧＧＧＧＡ（配列番号４）。ＴＡＬＥＮ  Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ）（Sanjana  et  al.,  2012）を使用してＴＡＬＥＮを生成し、記載するとおりに実施した。ドナープラスミド（２０ｕｇ）およびＴＡＬＥＮペア（それぞれ５ｕｇ）をＨ９  ｈＥＳＣ（３２〜３６継代）にヌクレオフェクトした（Ｂ−０１６プログラムを使用するＬｏｎｚａ  Ｋｉｔ  Ｖ）。ヌクレオフェクトした細胞を、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤を加えたＫＳＲ培地中のＭＥＦフィーダー層上に播種した。４８時間後、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を添加して陽性クローンについて選択した。次いで、ピューロマイシン耐性クローンを単離し、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲを使用して標的化を確認した。さらなる検証は、方向付けられた分化、およびＰＡＸ６またはＳＩＸ１抗体どちらかでのＧＦＰの共標識を含んだ。
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２Ａ−Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２Ａ−Ｂ】
2021500008.tif 000001
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２５Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２５Ａ】
2021500008.tif 000002
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２７−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２７−１】
2021500008.tif 000003
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３Ａ】
2021500008.tif 000004
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４３Ｂ】
2021500008.tif 000005