(57)【要約】【課題】  アレルギー疾患や大腸性潰瘍炎など炎症性腸疾患を初めとする自己免疫疾患等の免疫病の予防・治療に資する微生物及びその成分の効率的な選抜方法を提供すること。【解決手段】  ラクトコッカス属乳酸球菌などの微生物を、腸上皮細胞株と共培養し、カスパーゼ−１活性及びＩＬ−１８産生誘導能により選抜することを特徴とする、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からＩＬ−１０産生を誘導するラクトコッカス属乳酸球菌又はその成分の選抜方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検菌を、腸上皮細胞株と共培養し、カスパーゼ−１活性の誘導能が低く、かつインターロイキン−１８産生誘導能が高い細胞を誘導することを特徴とする、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導する微生物株、又は該微生物由来の免疫調節性機能を有する成分の選抜方法。
【請求項２】
被検菌が、ラクトコッカス属乳酸球菌である請求項１記載の微生物株、又は該微生物由来の免疫調節性機能を有する成分の取得方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節性機能を誘導する微生物株、例えば乳酸菌類、又は該微生物由来の免疫調節性機能を有する成分の取得方法に関し、詳しくは、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導し、免疫調節性機能を付与するラクトコッカス属乳酸球菌などの微生物又は該微生物由来の成分の選抜方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫恒常性の維持は、健康を保つ上で根本的な条件のひとつである。
ここで、「健康な状態における免疫恒常性とは何か」を考慮する際に、免疫関連遺伝子の機能発現、すなわち免疫細胞の分化・機能成熟が環境因子により大きく左右されるという事実が重要である。
【０００３】
特に、皮膚の２００倍もの面積を持つ消化管は、外部環境に対する主要な作用面であり、従って消化管における外部環境の代表である腸内細菌、食物成分などは、生体にとって量的に主たる環境因子である。体内における免疫細胞の過半が消化管に存在することを考えると、消化管は、多種多様、かつ大量の非自己成分に常に曝される生体防御システムの最前線であると言える。
これに関連して、近年顕著な増加が社会問題となっている食物アレルギー疾患や大腸性潰瘍炎など炎症性腸疾患を初めとする自己免疫疾患等の免疫病の急増、ひいてはアレルギー体質や生活習慣病の発症等に、腸内環境に対する生体応答が反映されている可能性があると指摘されている（非特許文献１参照）。
【０００４】
ここで、免疫恒常性の維持においては、免疫調節性（制御性）細胞が重要である。免疫調節性細胞は、免疫応答のバランスを司る細胞群のうち、過剰な免疫応答を抑制する、いわゆる自己防御機構を構築する細胞群の総称である。近年、この免疫調節性細胞の分化・機能成熟機構が徐々に明らかにされつつあり、とりわけ消化管で効率良く誘導されていることが明らかとなってきた（非特許文献２参照）。
【０００５】
消化管には、上述のように夥しい量の環境因子が存在するので、これら非自己成分に対し過剰応答しないためのシステムを免疫調節性細胞が担っていることから、腸内における免疫調節性細胞の誘導メカニズムの解析が免疫病の予防・治療につながるとして注目されている。
その過程で、消化管はトレランス誘導に適した環境にあること、かつ消化管に存在する免疫細胞の多くは活性化された状態にあることが明らかとなってきた。免疫恒常性維持のために、消化管では免疫調節性細胞が「積極的に」誘導され、活性化されるのであるとしたら、その現象を支える環境要因が消化管にあると考えられる。
【０００６】
消化管ではインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＴＧＦ−βといった抑制性サイトカインが豊富に存在することが知られている。本発明者らは、インターロイキン（ＩＬ−１８）が環境分子として重要であることを既に明らかにしている（非特許文献３参照）。
例えば、デキサメタゾン等の化学物質が、免疫調節性細胞を誘導するとして、医薬品の開発が進められている（非特許文献４参照）。
【０００７】
一方、消化管における免疫調節性細胞を誘導する微生物及びその成分の検索も進められている。特に食品成分として用いられている微生物であれば、上記デキサメタゾン等の化学物質のように安全性に問題がなく経口摂取が可能であり、いわゆるプロバイオティクス（宿主の健康維持に有益に働く生きた微生物）として免疫病の予防・治療用の食品への応用も期待されている。
【０００８】
ここで、乳酸菌は、代表的なプロバイオティクスとして微生物の中でも安全性が高く、かつ発酵食品や生分解樹脂製造など食品関連産業応用の蓄積がある。乳酸菌は、発酵乳等の形で体内に摂取されることにより、整腸作用や血清コレステロール低下作用、免疫賦活作用等、乳酸菌の機能性に基づく様々な生理的効用を発揮することが知られている（非特許文献５参照）。
しかし、免疫調節性細胞を誘導する微生物及びその成分についての研究は、端緒についたばかりであり、その検索・評価方法もまだ確立されたものがない。このため、免疫調節性細胞を誘導する微生物及びその成分は、乳酸菌の中にも見出されていなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Kalliomaki M et al．Lancet 2001；357：1076．
【非特許文献２】Tsuji NM et al，Immunology 2001；103：458，Int Immunol 2003；15:525．
【非特許文献３】２００２年度日本免疫学会総会・学術集会記録  p256
【非特許文献４】Barrat FJ et al. JEM 2002; 195 :603
【非特許文献５】Fuller，R．J Appl．Bacteriol．1989；66：365．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、以上のような背景に基づき、アレルギー疾患や大腸性潰瘍炎など炎症性腸疾患を初めとする自己免疫疾患等の免疫病の予防・治療に資する微生物及び該乳酸球菌由来の成分を提供すること、前記微生物又は成分の効率的な選抜方法を提供すること、及び、免疫恒常性を保つ上で重要な役割を担う免疫調節性細胞を前記微生物又は成分を用いて効率的に誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は上記目的を達成するために、鋭意検討を重ねた。その過程で、微生物の中でも安全性が高く、かつ発酵食品や生分解樹脂製造など食品関連産業応用の蓄積がある乳酸菌の中に、マウスの骨髄由来樹状細胞及び脾臓細胞からのＩＬ−１０産生を強力にサポートするラクトコッカス属乳酸球菌の存在を見出した。
また、一般に、無菌マウスでは、免疫寛容状態が成立しないなど免疫制御能が低いことが知られているが、炎症性サイトカインの１つであるＩＬ−１８は、微生物成分で誘導されることから、微生物及びその成分が免疫調節性細胞の機能成熟に重要であることが強く示唆される。未熟型ＩＬ−１８を活性型ＩＬ−１８へ変換する酵素のひとつとしてカスパーゼ−１が知られているが、驚くべきことに、前記ラクトコッカス属乳酸球菌は、腸上皮細胞株において、カスパーゼ−１非依存的にＩＬ−１８を産生する特徴を有することが明らかとなり、ＩＬ−１８及びカスパーゼ−１活性により免疫調節性細胞誘導物質を効率よく検索できることを見出し、本発明に到達した。
本発明は、係る知見に基づくものである。
【００１２】
請求項１に係る本発明は、被検菌を、腸上皮細胞株と共培養し、カスパーゼ−１活性の誘導能が低く、かつインターロイキン−１８産生誘導能が高い細胞を誘導することを特徴とする、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導する微生物株、又は該微生物由来の免疫調節性機能を有する成分の選抜方法である。
請求項２に係る本発明は、被検菌が、ラクトコッカス属乳酸球菌である請求項１記載の微生物株、又は該微生物由来の免疫調節性機能を有する成分の選抜方法である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のラクトコッカス属乳酸球菌などの微生物及び該微生物由来の成分は、アレルギー疾患や大腸性潰瘍炎など炎症性腸疾患を初めとする自己免疫疾患等の免疫病の予防・治療に資する。また、ヒト・家畜・ペット等哺乳動物の免疫恒常性維持（健康維持）に資する。
即ち、本発明の微生物、特にラクトコッカス属乳酸球菌及び該乳酸球菌由来の成分は、安全性が高く経口摂取が可能であることから、食品又は食品素材、並びに動物飼料の有効成分として利用することにより体内で効率的に免疫調節性細胞を誘導することができる点で有用である。
また、本発明の選抜方法によれば、免疫恒常性を保つ上で重要な役割を担う免疫調節性細胞を効率的に誘導する微生物又は成分、例えばラクトコッカス属乳酸球菌を選抜することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】各種微生物における骨髄由来樹状細胞からのＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図２】各種微生物における脾臓細胞からのＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図３】各種微生物（代表的菌株）における脾臓細胞からのＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図４】各種微生物（代表的菌株）による脾臓細胞増殖活性（ｃｐｍｘ１０３）への影響を示す図である。
【図５】各微生物における腸上皮細胞からのＩＬ−１８産生量（ｐｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図６】各微生物による腸上皮細胞のＩＬ−１８一定産生量あたりのカスパーゼ−１活性（ｐｍｏｌ）を示す図である。
【図７】各種死菌体を経口摂取したマウス脾臓細胞からのＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図８】各種微生物を経口摂取したマウスにおける脾臓細胞増殖活性（ｃｐｍｘ１０４）を示す。
【図９】ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ−１株の場合のＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を、骨髄由来細胞について示した図である。
【図１０】ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ−１株の場合のＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を、脾臓細胞について示した図である。
【図１１】ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株の場合のＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を、骨髄由来細胞について示した図である。
【図１２】ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株の場合のＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を、脾臓細胞について示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について説明する。
本発明は、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導するラクトコッカス属乳酸球菌、又は該乳酸球菌由来の免疫調節性機能を有する成分を提供する。
【００１６】
ここで、哺乳類としては、マウス、ラット、ハムスター等の実験動物のほか、ヒトや、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ等の家畜を挙げることができる。
樹状細胞とは、免疫担当細胞の１つであり、例えば、マウス等の哺乳類の骨髄細胞の初代短期培養細胞として得ることができる。具体的には例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの骨髄細胞を採取した後、Ｂ２２０、Ｔｈｙ−１抗原陽性の群を除去し、ＧＭ−ＣＦＳ、ＴＮＦ−α等のサイトカインを添加したＲＰＭＩ培地や、ＤＭＥＭ培地等で常法により培養し、浮遊細胞として得られる群（成熟型）を用いることができる。また、末梢血中の単球細胞（モノサイト）にインターロイキン−４（ＩＬ−４）、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＦＳ等のサイトカインを添加して本発明に適した樹状細胞を得ることもできる。
【００１７】
ここで、培養期間は、例えばＧＭ−ＣＦＳを添加したＲＰＭＩ培地を用いる場合は、８日間以上、好ましくは８〜１５日培養とすることができる。８日未満であるとＢ細胞等の混入のおそれがあり、また１５日を超えると、細胞増殖能の低下が見られ、採取できる細胞数が少なくなるためである。
【００１８】
一方、脾臓細胞とは、免疫臓器のひとつである脾臓に由来する細胞を意味し、樹状細胞、マクロファージ等の抗原提示細胞の他、Ｔ細胞や抗体産生細胞となるＢ細胞の集合体を意味する。脾臓細胞は、例えば、哺乳類の脾臓の初代培養細胞として得ることができる。
具体的には例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓細胞を採取した後、赤血球を除去し、１０％  ウシ胎児血清等の血清を添加したＲＰＭＩ培地や、ＤＭＥＭ培地等に必要に応じてコンカナバリンＡを添加して常法により培養し、浮遊細胞として得られる群を用いることができる。
培養期間については、例えば１０％  ウシ胎児血清等の血清を添加したＲＰＭＩ培地を用いる場合は、２〜７日培養とすることができる。２日未満であるとＩＬ−１０産生誘導機能が十分に発現されないおそれがあり、また７日を超えると、初代培養細胞の機能低下が見られるためである。
このような樹状細胞や脾臓細胞としては、哺乳類から直接採取した細胞を利用することもできるし、あらかじめ株化された細胞を利用することもできる。
【００１９】
ラクトコッカス属乳酸球菌とは、ラクトコッカス属に属しＬ型乳酸生産能を有する球菌を意味し、生菌体であっても良く、また死菌体であっても良い。
このような本発明のラクトコッカス属乳酸球菌としては、例えば、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス（Lactococcus lactis subsp．lactis）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス（Lactococcus lactis subsp．cremoris）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス（Lactococcus lactis subsp．lactis biovar diacetylactis）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ホルディニア（Lactococcus lactis subsp．hordniae）を挙げることができる。
ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティスとしては、５２７株（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２１６である。）、７１２株（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３５である。）、Ｇ５３株、Ｇ５０株（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４１５である。）及びＨ４５株を挙げることができ、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリスとしては、Ｃ６０株、ＨＰ株、及びＭＬ株を挙げることができ、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティスとしては、Ｎ７株（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２１７である。）、８Ｗ株（日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号は、ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１６５である。）、及びＤＲＣ−１株を挙げることができる。これらのラクトコッカス属乳酸球菌は、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  畜産草地研究所（茨城県つくば市）や理化学研究所（埼玉県和光市）から入手することができる。
【００２０】
このようなラクトコッカス属乳酸球菌のうち、とりわけＩＬ−１０産生誘導効率が高い菌株である点で、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ−１株、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株が好ましい。
ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ−１は、独立行政法人  農業生物資源研究所の農業生物資源ジーンバンクに寄託されており、その受託番号はＭＡＦＦ−４００２０６である。また、その性質についてはPowell I．B．et al．FEMS Microbiol．Lett．1990；72：209.に記載されている。
また、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株は、日本国茨城県つくば市東１−１−１  中央第６の独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５９である。
【００２１】
また、本発明のラクトコッカス属乳酸球菌由来の免疫調節性機能を有する成分とは、上記のようなラクトコッカス属乳酸球菌の菌体を構成する成分であって、免疫調節性機能を有する成分を意味し、生菌体の成分であっても、また死菌体の成分であっても良い。
このような本発明のラクトコッカス属乳酸球菌由来の成分としては、上記のようなラクトコッカス属乳酸球菌を構成する多糖類等の成分であって、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導する機能を有するものを挙げることができる。
そして、本発明の成分は、ラクトコッカス属乳酸球菌の生菌体又は死菌体から、通常用いられる抽出・精製方法を用いて得ることができる。
尚、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導する機能を有するラクトコッカス属乳酸球菌の成分と同様の多糖類等の成分は、ラクトコッカス属乳酸球菌以外の微生物（例えば、藻類）にも存在する可能性が高く、これらの微生物の成分も、同様にして利用することができる。
【００２２】
このような本発明のラクトコッカス属乳酸球菌は、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞から効率よくインターロイキン−１０産生を誘導するので、インターロイキン−１０誘導能により選抜することにより効率よく取得することができる。
即ち、本発明は、被検菌であるラクトコッカス属乳酸球菌を、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞と共培養し、インターロイキン−１０産生誘導能が高い菌株を選抜することを特徴とする哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導するラクトコッカス属乳酸球菌の取得方法である。
【００２３】
本発明の取得方法は、被検菌を、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞と共培養し、インターロイキン−１０産生誘導能が高い菌株を選抜することを特徴とする。
ここで、哺乳類の樹状細胞、及び脾臓細胞については、それぞれ上記の本発明の説明中において述べた通りである。
【００２４】
被検菌としては特に制限はなく、例えばラクトコッカス属乳酸球菌としては、ラクトコッカス属に属する乳酸球菌であれば特に限定はなく、例えば、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ホルディニアを用いることができる。これらの微生物は、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  畜産草地研究所（茨城県つくば市）や理化学研究所（埼玉県和光市）から入手することができる。
これらのラクトコッカス属乳酸球菌は、生菌体であっても、死菌体であっても良い。あらかじめ乳酸菌の培養の常法に従って任意の条件で培養した後、死菌体の場合は加熱等の手段により殺菌し、１〜２回、好ましくは２回、生理食塩水や滅菌水などで洗浄して、本発明の目的に用いることができる。
【００２５】
共培養の際の培養条件は、細胞が生育できる条件であれば特に限定されない。例えば、血清を添加したＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地等を用いて、５％ＣＯ２存在下、３７℃で樹状細胞の場合１５〜３０時間、好ましくは２０〜２５時間、脾臓細胞の場合４０〜５５時間、好ましくは４５〜５０時間培養する。
インターロイキン−１０産生誘導能が高い菌株の選抜は、ＩＬ−１０産生量を測定するための方法を利用して行うことができる。このような方法としては例えば、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法、エライザ）の他、細胞内ＩＬ−１０染色後フローサイトメーターで測定する方法、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられる。ＥＬＩＳＡにより測定する場合には、ＯｐｔＥＩＡマウスＩＬ−１０測定キット（ファーミンジェン社製）を用い、プロトコールに従って行うことができる。
【００２６】
本発明の取得方法によれば、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導するラクトコッカス属乳酸球菌などの微生物、又は該微生物由来の免疫調節性機能を有する成分を効率よく取得することができる。従って、取得されたラクトコッカス属乳酸球菌は、本発明のラクトコッカス属乳酸球菌として用いることができる。
【００２７】
一方、本発明のラクトコッカス属乳酸球菌のインターロイキン−１０産生誘導は、内因性ＩＬ−１８に部分的に依存するが、カスパーゼ−１の活性化には依存しない。従って、ＩＬ−１８及びカスパーゼ−１の活性測定を組み合わせることにより、かかるＩＬ−１０産生誘導能を有するラクトコッカス属乳酸球菌などの微生物を選抜することができる。このような選抜方法を提供するのが、請求項１に係る本発明である。
即ち、請求項１に係る本発明は、被検菌を、腸上皮細胞株と共培養し、カスパーゼ−１活性の誘導能が低く、かつインターロイキン−１８産生誘導能が高い細胞を誘導することを特徴とする、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導する微生物株、又は該微生物由来の免疫調節性機能を有する成分の選抜方法を提供するものである。
【００２８】
被検菌については、哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導する活性成分が含まれるかどうか解析したいものであれば特に限定されず、ラクトコッカス属乳酸球菌などの微生物やその成分などがある。哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導するラクトコッカス属乳酸球菌については、前記した本発明の説明において述べた通りである。
腸上皮細胞株としては、哺乳類のものであれば特に限定されず、また、ヒト腫瘍細胞由来腸上皮細胞株であるＣａｃｏ−２細胞の他、ＨＴ−２９等株化されたものであっても良い。例えば、Ｃａｃｏ−２細胞を用いる場合は、常法によりあらかじめ培養したものを共培養に供することができる。即ち、トリプシン／ＥＤＴＡを含むＲＰＭＩ培地で３０〜４０℃、５〜１５分処理して浮遊細胞とした後、ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地に懸濁して１０〜１４日培養後、ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で微生物菌体を懸濁したものと共培養したものを用いることができる。
【００２９】
請求項１に係る本発明の選抜方法においては、例えば、ラクトコッカス属乳酸球菌などの微生物を、腸上皮細胞株と共培養するが、その際の培養条件は、腸上皮細胞株が生育できる条件であれば特に限定されない。例えば、Ｃａｃｏ−２細胞の場合、ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地、ＤＭＥＭ培地等を用いて、５％ＣＯ２存在下、３０〜４０℃で１５〜３０時間、好ましくは２０〜２５時間培養する。
【００３０】
請求項１に係る本発明の選抜方法においては、上記共培養の後、カスパーゼ−１活性の誘導能が低く、かつインターロイキン−１８産生誘導能が高い細胞を誘導する。即ち、カスパーゼ−１の誘導能及びインターロイキン−１８産生誘導能を測定して、それぞれが低い、又は高い細胞を誘導する。
カスパーゼ−１の誘導能の測定には、蛍光ラベルしたオリゴペプチド（例えば、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の５´末端にアセチル基を付加し、３´末端をＭＣＡで蛍光標識したオリゴペプチド（ペプチド研究所、カスパーゼ−１活性測定試薬））及び蛍光分光光度計を用いることができる。
【００３１】
遠心分離により沈殿した細胞を界面活性剤を添加したバッファーで溶解し、溶液中のカスパーゼ−１活性を、蛍光ラベルしたオリゴペプチド（配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の５´末端にアセチル基を付加し、３´末端をＭＣＡで蛍光標識したオリゴペプチド：ペプチド研究所、カスパーゼ−１活性測定試薬）及び蛍光分光光度計を用いて測定した。
インターロイキン−１８産生誘導能の測定には、ＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法、エライザ）が挙げられる。ＥＬＩＳＡにより測定する場合には、ＩＬ−１８測定キット（ＭＢＬ社）を用い、プロトコールに従って行うことができる。
【００３２】
こうして、カスパーゼ−１活性の誘導能が低く、かつインターロイキン−１８産生誘導能が高い微生物株、又はその成分を選抜することができる。選抜された微生物株、又はその成分は、被検菌の中から哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導する機能を有する。
ラクトコッカス属乳酸球菌については、既に説明した通りである。
このようにして選抜された微生物株、又はその成分は、カスパーゼ−１活性の誘導能は低いものの、他のＩＬ−１８誘導試薬（リポポリサッカライド（ＬＰＳ）等）活性は高い値を示す。
尚、内因性ＩＬ−１８とＩＬ−１０との関係について詳細は不明であるが、本発明者らがＩＬ−１８欠損マウス由来の樹状細胞をラクトコッカス  ラクティスと共培養したところ、産生されるＩＬ−１０量は顕著に低下したことから、両者の間には何らかの調節関係があることが示唆される。
【００３３】
このように、請求項１に係る本発明によれば、効率よく免疫調節性細胞を誘導する、即ちＩＬ−１０産生誘導性微生物またはその成分を選抜することができる。
一方、本発明のラクトコッカス属乳酸球菌は、乳酸菌の一種であるため、食品として経口投与が可能であり、消化管において免疫調節性を発揮するプロバイオティクスとして有用である。
即ち、本発明の食品又は食品素材、並びに本発明の動物飼料は、本発明のラクトコッカス属乳酸球菌を有効成分として含有する。
【００３４】
本発明の食品又は食品素材において、ラクトコッカス属乳酸球菌の含有量は、ヒトの場合、体重１ｋｇあたり菌体重量で０．５〜１ｍｇ／日程度の投与で十分な効果が奏され、上記の菌体量を１日１回もしくは数回に分けて摂取すれば良い。
また、本発明の動物飼料の対象となる動物の種類及び年齢としては、特に限定はなく、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ等の家畜の他、マウス等の実験動物とすることができる。ラクトコッカス属乳酸球菌の含有量は、体重１ｋｇあたり菌体重量で０．５〜１ｍｇ／日程度の投与で十分な効果が奏され、上記の菌体量を１日１回もしくは数回に分けて給餌すれば良い。
【００３５】
本発明の食品又は食品素材、並びに本発明の動物飼料の製造方法について特に制限はなく、形態についても凍結乾燥粉末、噴霧乾燥粉末、液体への懸濁など、使用目的に応じて適宜決定すればよい。ラクトコッカス属乳酸球菌は牛乳中でもよく生育するため、スターター等として使用して製造された発酵食品、発酵飼料とすることもできる。
更に、本発明のラクトコッカス属乳酸球菌は、経口投与が可能であり、消化管において免疫調節性を発揮するプロバイオティクスとして有用であるという特性を生かして、医薬品としての応用も可能である。
更にまた、トウモロコシやイモを発酵して乳酸を製造し、これをポリマー化して製造される生分解プラスチックへの応用も可能である。
【実施例】
【００３６】
以下において、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
実施例１（樹状細胞におけるＩＬ−１０の産生誘導能）
ラクトコッカス属乳酸球菌を含む各種微生物の死菌体を、骨髄由来樹状細胞と共培養し、ＩＬ−１０産生誘導能が高い菌株の選抜を行った。
微生物としては、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  畜産草地研究所（茨城県つくば市）に保存されているもの及び理化学研究所（埼玉県和光市）または発酵研究所（大阪府大阪市）から入手したエンテロコッカス属乳酸菌（ＩＦＯ１２９６４株、ＩＦＯ１３７１２株、ＦＨ８株）、ロイコノストック属乳酸菌（Ｄ４株及びＤ４８株）、ラクトバチルス属乳酸菌（ＪＣＭ１１３２株）、ラクトコッカス属乳酸球菌（ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス（５２７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２１６）、７１２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３５）、Ｇ５３株及びＨ４５株）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス（Ｃ６０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５９）、ＨＰ株及びＭＬ株）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス（Ｎ７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２１７）、８Ｗ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１６５）及びＤＲＣ−１株（ＭＡＦＦ−４００２０６））の計１６株を用いた。
これらの供試微生物は、予め常法に従い一昼夜培養した。培養後の微生物を７０℃３０分間加熱して殺菌し、微生物の死菌体として以下の操作に供した。
一方、比較対照として、免疫修飾物質を無添加の群（Ｍｅｄ）、及び微生物の死菌体の代わりに免疫賦活微生物成分の代表とされるＬＰＳ（大腸菌由来ＬＰＳ（シグマ社製））を用いて以下の操作を行った。
【００３８】
一方、骨髄由来樹状細胞は、マウスから以下のようにして取得した。まず、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの骨髄細胞を採取した後、Ｂ２２０，Ｔｈｙ−１抗原陽性の群を除去し、ＧＭ−ＣＦＳを添加したＲＰＭＩ培地（ローズウェル・パーク・メモリアル・インスティチュート）で１０日間培養した。
得られた樹状細胞を、２４ウェルプレートに、５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、血清（１０％  ウシ胎児血清：ＦＣＳ，シグマ社）を添加したＲＰＭＩ培地を用いて２４時間、３７℃の条件で培養した。
【００３９】
次に、上記微生物の死菌体を０．８５％食塩水で２回洗浄し、血清を添加したＲＰＭＩ培地に懸濁した後、２５ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように２４ウェルプレートに接種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で２４時間の条件で樹状細胞と共培養した。
共培養終了後、培養上清を遠心分離によって分離し、上清中に含まれるＩＬ−１０をＥＬＩＳＡ（固相酵素免疫測定法、エライザ）によって測定した。ＩＬ−１０測定に際しては、ＯｐｔＥＩＡマウスＩＬ−１０測定キット（ファーミンジェン社製）を用い、プロトコールに従って行った。
各種微生物における骨髄由来樹状細胞からのＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）の結果を、図１に示す。
【００４０】
図１に示されるように、供試微生物のうち８株について高いＩＬ−１０産生量が見出され、これらはいずれもラクトコッカス属乳酸球菌であったことから、これらのラクトコッカス属乳酸球菌は骨髄由来樹状細胞からＩＬ−１０産生を誘導することが明らかとなった。
特に、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株及びラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチルラクティス  ＤＲＣ−１株の２株は、非常に顕著なＩＬ−１０産生量が見出されたことから、骨髄由来樹状細胞からのＩＬ−１０産生誘導能にきわめて優れていることが示された。
一方、比較対照として、免疫賦活微生物成分の代表とされるＬＰＳを添加した場合は、ＩＬ−１０産生誘導能は観察されなかった。
【００４１】
実施例２（脾臓細胞におけるＩＬ−１０の産生誘導能）
ラクトコッカス属乳酸球菌を含む各種微生物の死菌体を脾臓細胞と共培養し、ＩＬ−１０産生誘導能が高い菌株の選抜を行った。
供試微生物については、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  畜産草地研究所（茨城県つくば市）に保存されているもの及び理化学研究所（埼玉県和光市）から入手したエンテロコッカス属乳酸菌（ＦＨ８株）、ロイコノストック属乳酸菌（Ｄ４株及びＤ４８株）、ラクトバチルス属乳酸菌（ＪＣＭ１１３２株及びＢＹ株）、ラクトコッカス属乳酸球菌（ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス（Ｇ５０株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８４１５）、５２７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２１６）、７１２株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１５２３５）、Ｇ５３株及びＨ４５株）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス（Ｃ６０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５９）、ＨＰ株及びＭＬ株）、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス（Ｎ７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２１７）、８Ｗ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１６５）及びＤＲＣ−１株（ＭＡＦＦ−４００２０６））の計１６株を用いて、培養した微生物の死菌体を調製して以下の操作に供した。
【００４２】
一方、脾臓細胞は、マウスから以下のようにして取得した。まず、ＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓細胞から赤血球を除去し、ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後、血清（１０％ＦＣＳ）を添加した同培地に懸濁し、４ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように２４ウェルプレートに播種した。更に、コンカナバリンＡを最終濃度２μｇ/ｍｌになるように添加して、２日間、３７℃の条件で培養した。
【００４３】
次に、上記微生物の死菌体を０．８５％食塩水で２回洗浄し、血清を添加したＲＰＭＩ培地に懸濁した後、４ｘ１０７ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように２４ウェルプレートに接種し、５％ＣＯ２存在下、３７℃で４８時間の条件で脾臓細胞と共培養した。
その後、実施例１と同様にしてＥＬＩＳＡ法にてＩＬ−１０産生量を測定した。
尚、比較対照（Ｍｅｄ）として、微生物を接種しない他は同様にして培養及びＩＬ−１０測定を行った。
各種微生物における脾臓細胞からのＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）の結果を、図２に示す。
【００４４】
図２に示されるように、供試微生物のうち１１株について高いＩＬ−１０産生量が見出され、これらはいずれもラクトコッカス属乳酸球菌であったことから、これらのラクトコッカス属乳酸球菌は脾臓細胞からもＩＬ−１０産生を誘導することが明らかとなった。
特に、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  ５２７株、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株及びＭＬ株、並びにラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチルラクティス  ＤＲＣ−１株の４株は、非常に顕著なＩＬ−１０産生量が見出されたことから、骨髄由来樹状細胞からのＩＬ−１０産生誘導能にきわめて優れていることが示された。
一方、比較対照として、免疫賦活微生物成分の代表とされるＬＰＳを添加した場合は、ＩＬ−１０産生誘導能は観察されなかった。
【００４５】
実施例３（バイスタンダー抑制試験）
ラクトコッカス属乳酸球菌の死菌体の脾臓細胞からのＩＬ−１０産生誘導能とバイスタンダー（脾臓細胞増殖活性）抑制との関係について検討した。
ラクトコッカス属乳酸球菌としては、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５９）、及びラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ−１株（ＭＡＦＦ−４００２０６）を用いた。また、比較対照として、ラクトバチルス属乳酸菌（ＪＣＭ１１３２株及びＢＹ株）を用いた。これらの供試微生物は、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  畜産草地研究所（茨城県つくば市）に保存されているもの及び理化学研究所（埼玉県和光市）から入手した。各種微生物について、実施例１と同様にして微生物の死菌体を調製した。
【００４６】
ＢＡＬＢ／ｃ系マウスから実施例２と同様の条件で調製した脾臓細胞を、上記微生物の死菌体と実施例２の条件で共培養した（第一次培養）。４８時間後、それらの細胞を採取し、遠心分離で上清を除いた後、新しいＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ添加）に懸濁した。
次に、新たに調製したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの脾臓細胞から、赤血球を除去し、ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後、血清（１０％ＦＣＳ）を添加した同培地に懸濁し、３ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ウェル／１ｍｌになるように２４ウェルプレートに播種した。更に、コンカナバリンＡを最終濃度２μｇ/ｍｌとなるように添加した（下段の培養）。一方、各ウェルに、０．４５μｍの膜で仕切られたカルチャーインサートを装填し、その中（上段の培養）に前記の微生物の死菌体と前培養を行った脾臓細胞を２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ウェル／５００μｌの分量添加し、液性因子のみが膜を通過できる状態で、２日間、３７℃の条件で共培養を行った（第二次培養）。
【００４７】
６４時間後に、下段の細胞（新しく準備した脾臓細胞）を採取し、遠心分離により上清を除いて、新しいＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ）１ｍｌに懸濁した。これを０．１ｍｌずつ９６ウェルプレートに播種し、０．１μＣｉの３［Ｈ］−チミジンをパルスした。１６時間後にセルハーベスターを用いてファイバーフィルター上に細胞を採取したものを液体シンチレーターに浸し、放射能の取り込みをシンチレーションカウンターで測定した。
【００４８】
尚、比較対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）として、微生物成分を接種しない他は同様にして培養及びＩＬ−１０測定を行った。
図３は、各種微生物における脾臓細胞からのＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図４は、各種微生物による脾臓細胞増殖活性（ｃｐｍｘ１０３）への影響を示す図である。尚、図３及び図４中の＊＊は、Ｃｏｎｔｒｏｌと比較して有意差（ｐ＜０．０１）があった旨を示し、＊は、Ｃｏｎｔｒｏｌと比較して有意差（ｐ＜０．０５）があった旨を示す。
【００４９】
図３及び図４から明らかなように、実施例２で顕著なＩＬ−１０産生量が観察されたラクトコッカス属乳酸球菌を第一次培養で加えたものについては、培養上清中に高いＩＬ−１０産生が観察された（図３）と同時に、第二次培養下段の脾臓細胞増殖活性が抑制されていた（図４参照）。
【００５０】
このバイスタンダー抑制試験は、免疫調節性細胞の評価方法として広く用いられるもので、本実施例においても上述のように脾臓細胞増殖活性が抑制されていたことから、ラクトコッカス属乳酸球菌の死菌体により脾臓細胞から免疫調節性細胞が誘導されたものと考えられる。
また、ＩＬ−１０は、強い細胞増殖抑制活性を有するが、本実施例において観察された細胞増殖抑制も、免疫調節性細胞から誘導されたＩＬ−１０の細胞増殖抑制活性が重要な役割を果たしていると考えられる。
【００５１】
実施例４（腸上皮細胞からの免疫調節性細胞の誘導によるＩＬ−１０産生誘導性ラクトコッカス属乳酸球菌の選抜）
ラクトコッカス属乳酸球菌が、消化管の最前線に位置する腸上皮細胞へ及ぼす効果を解析した。
ラクトコッカス属乳酸球菌としては、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  Ｎ７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１８２１７）、ＤＲＣ−１株（ＭＡＦＦ−４００２０６）及び８Ｗ株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１４１６５）を用いた。また、比較対照として、ラクトバチルス属乳酸菌（ＪＣＭ１１３２株）を用いた。これらの供試微生物は、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  畜産草地研究所（茨城県つくば市）に保存されているもの及び理化学研究所（埼玉県和光市）から入手した。これらのそれぞれについて、実施例１と同様に培養して微生物の死菌体を調製した。
更に比較対照として、微生物の代わりに、免疫賦活微生物成分の代表とされるＬＰＳ（大腸菌由来ＬＰＳ（シグマ社製））を１μｇ／ｍｌとなるように添加して以下の処理を行った。
【００５２】
腸上皮細胞として、ヒト腫瘍細胞由来腸上皮細胞株であるＣａｃｏ−２細胞を用いた。即ち、コンフルエント培養のＣａｃｏ−２細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡを含むＲＰＭＩ培地で３７℃、１０分処理して浮遊細胞とした。ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地に懸濁し、４ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるよう２４ウェルプレートに播種した。上清は一日おきに新しいＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ）と置換し、１０〜１４日後にコンフルエントになった培養（２ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ウェル）の上清をすべて除き、新しいＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ）で微生物菌体を１ｘ１０８ｃｅｌｌｓ／ウェル／１ｍｌに懸濁したものを各ウェルに添加した。
２４時間後、遠心分離により培養上清を採取し、上清中のＩＬ−１８量をＥＬＩＳＡ法で測定した（ＭＢＬ社、ＩＬ−１８測定キット）。手順及び条件はキットに添付のプロトコールに従った。
【００５３】
また、遠心分離により沈殿した細胞を界面活性剤を添加したバッファーで溶解し、溶液中のカスパーゼ−１活性を、蛍光ラベルしたオリゴペプチド（配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列の５´末端にアセチル基を付加し、３´末端をＭＣＡで蛍光標識したオリゴペプチド：ペプチド研究所、カスパーゼ−１活性測定試薬）及び蛍光分光光度計を用いて測定した。
図５に各微生物における腸上皮細胞からのＩＬ−１８産生量（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図６に各微生物による腸上皮細胞のＩＬ−１８一定産生量あたりのカスパーゼ−１活性（ｐｍｏｌ）を示す。
【００５４】
実施例１〜３で顕著なＩＬ−１０産生能を示したラクトコッカス属乳酸菌を腸上皮細胞株と共培養すると、他の微生物やＬＰＳと共培養した場合に比べて、高いＩＬ−１８産生誘導能が示されたが（図５参照）、ＩＬ−１８一定産生量あたりのカスパーゼー１活性は、低く抑えられていた（図６参照）。すなわち、ラクトコッカス属乳酸菌によって腸上皮細胞から誘導されるＩＬ−１８産生は、カスパーゼ−１に依存しないという特徴が明らかとなった。
尚、このようにラクトコッカス属乳酸菌（ラクトコッカス  ラクティス）がカスパーゼ−１非依存性にＩＬ−１８産生を誘導し、かつ高いＩＬ−１０産生を誘導することは、樹状細胞の実験系でも確認された。すなわち、カスパーゼ−１遺伝子欠損マウス由来の樹状細胞は、ラクトコッカス属乳酸菌（ラクトコッカス  ラクティス）の刺激に対してＩＬ−１８を産生することができた。
以上の結果より、ラクトコッカス  ラクティスはカスパーゼー１非依存性にＩＬ−１８を産生し、樹状細胞、脾臓細胞よりＩＬ−１０産生を誘導すること、脾臓細胞との共培養により免疫調節性細胞を発現させることが見出された。
【００５５】
実施例５（乳酸球菌を経口投与した際のin vivoにおける効果）
以上の実施例１〜４において明らかにされたＩＬ−１０産生誘導機能が、ラクトコッカス属乳酸球菌の死菌体を経口投与した際にin vivoで再現されるか否かを解析した。
ラクトコッカス属乳酸球菌としては、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ−１株（ＭＡＦＦ−４００２０６）及び、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５９）を用いた。これらの供試微生物は、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  畜産草地研究所（茨城県つくば市）に保存されているものを用いた。これらのそれぞれについて、実施例１と同様に培養して微生物の死菌体を調製した。
【００５６】
これらのラクトコッカス属乳酸球菌の死菌体を、６週齢から８週齢のＮＣ／Ｎｇａ系マウス５頭に、毎日１回、１０日間連続経口投与した。
すなわち、それぞれの死菌体を０．８５％食塩水に懸濁して乾燥菌体重量で１ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、一回一頭あたり２００μｌ（乾燥菌体重量にすると２００μｇ）を経口ゾンデを用いて胃内投与した。１０回投与後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を調製した。
マウスからの脾臓細胞の取得は、以下の手順で行った。まず、ＮＣ／Ｎｇａ系マウスの脾臓細胞から赤血球を除去し、ＲＰＭＩ培地で２回洗浄した後、血清（１０％ＦＣＳ）を添加した同培地に懸濁し、５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように４８ウェルプレートに播種した。更に、コンカナバリンＡを最終濃度２μｇ／ｍｌになるように添加して、２日間、３７℃の条件で培養した。
その後、実施例１と同様にしてＥＬＩＳＡ法にてＩＬ−１０産生量を測定した。
【００５７】
また、脾臓細胞増殖活性を測定した。
すなわち、４８時間後の培養液を０．１ｍｌずつ９６ウェルプレートに播種し、実施例３と同様にして０．１μＣｉの３［Ｈ］−チミジンをパルスした。１６時間後にセルハーベスターを用いてファイバーフィルター上に細胞を採取したものを液体シンチレーターに浸し、放射能の取り込みをシンチレーションカウンターで測定した。
【００５８】
尚、比較対照（ｓａｌｉｎｅ）として、微生物を含まない０．８５％食塩水を経口投与したＮＣ／Ｎｇａ系マウスの群について、同様に培養、ＩＬ−１０測定及び脾臓細胞培養活性の測定を行った。
図７は、各種死菌体を経口摂取したマウス脾臓細胞からのＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を示し、図８は、各種微生物を経口摂取したマウスにおける脾臓細胞増殖活性（ｃｐｍｘ１０４）を示す。尚、図７及び図８中の＊＊＊は、ｓａｌｉｎｅと比較して有意差（ｐ＜０．００１）があった旨を示し、＊＊は、ｓａｌｉｎｅと比較して有意差（ｐ＜０．０１）があった旨を示す。
【００５９】
図７から明らかなように、ラクトコッカス属乳酸球菌の死菌体を経口投与したマウスの脾臓細胞においては、比較対照に対し有意に高いレベルのＩＬ−１０産生能が見出された。このような高いＩＬ−１０産生能は、消化管においてラクトコッカス乳酸球菌の死菌体を取り込んだ樹状細胞が脾臓細胞に移動した結果であるか、死菌体成分が直接脾臓細胞に到達した結果であろうと推測される。
【００６０】
また、図８から明らかなように、ラクトコッカス属乳酸球菌の死菌体を経口投与したマウスの脾臓細胞増殖活性は、比較対照に対し有意に低下していた。このような脾臓細胞増殖活性の低下は、ＩＬ−１０産生能の結果を考慮すると、培養中に脾臓細胞から免疫調節性細胞が誘導された（ＩＬ−１０が増強された）ことによる結果であると考えられる。尚、１０日間の死菌体経口摂取期間中に、マウス体内のＴ細胞が不応答性又は抑制性の性質を獲得したことによる影響があると推察される。
このことから、ラクトコッカス属乳酸球菌を経口摂取した場合にも、ＩＬ−１０産生誘導機能が保持され、かつ、脾臓細胞から免疫調製性細胞が誘導されたことが、in vivoにおいて実際に確認された。
【００６１】
実施例６（乳酸菌体熱水抽出画分のＩＬ−１０産生促進機能の解析）
上記実施例の結果から、ラクトコッカス属乳酸球菌の死菌体が哺乳類の樹状細胞又は脾臓細胞からインターロイキン−１０産生を誘導することが明らかとなった。そこで、本実施例においては、該乳酸球菌中の免疫調節性機能を有する成分の存在を明らかにすることを目的とした。
ラクトコッカス属乳酸球菌としては、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ−１株（ＭＡＦＦ−４００２０６）及び、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５９）を用いた。これらの供試微生物は、独立行政法人  農業・食品産業技術総合研究機構  畜産草地研究所（茨城県つくば市）に保存されているものを用いた。
【００６２】
これらのラクトコッカス属乳酸球菌の熱水抽出画分を調製した。尚、熱水で抽出される菌体成分は多糖類であると考えられる。
すなわち、上記ラクトコッカス属乳酸球菌を３回０．８５％生理食塩水で洗浄し、上清を除いた後、１／１０量の精製水に縣濁し、１００℃で５時間加熱した。加熱後、５０，０００ｇ、３０分の遠心で残渣を沈殿後、上清を採取した。更に、分子量カットフィルターつきの遠心濃縮用チューブを用い、分子量３０，０００以上の高分子画分（フラクション１：Ｆｒ１）とそれ以下の画分（フラクション２：Ｆｒ２）を得た。尚、濃縮率２０倍で調製したため、菌の培養液から考えた最終濃縮率は約２００倍となった。
【００６３】
この熱水抽出物を１０％となるように骨髄由来樹状細胞及び脾臓細胞の各細胞培養系に添加した。
骨髄由来樹状細胞としては、ＢＡＬＢ／ｃ系マウス由来の１０日間培養後の細胞群を用いた。細胞群を１ｘ１０５／ｗｅｌｌとなるように９６穴プレートに播種し、Ｆｒ１、Ｆｒ２、あるいは実施例１と同様にして得たラクトコッカス属乳酸球菌の死菌体（ｈｅａｔ−ｋｉｌｌｅｄ  ＤＲＣ−１、ｈｅａｔ−ｋｉｌｌｅｄ  Ｃ６０）５ｘ１０６を添加して２４時間培養した。培養上清について実施例１と同様にＩＬ−１０産生を測定した。
脾臓細胞としては、ＮＣ／Ｎｇａ系マウスの脾臓細胞から赤血球を除去後２回洗浄したものを用いた。この脾臓細胞を５ｘ１０５／ｗｅｌｌとなるように９６穴プレートに播種し、Ｆｒ１、Ｆｒ２あるいは実施例１と同様にして得たラクトコッカス属乳酸球菌の死菌体５ｘ１０６を添加して９６時間培養した。培養上清については実施例１と同様にＩＬ−１０産生を測定した。
尚、比較対照（ｍｅｄｉｕｍ）として、Ｆｒ１、Ｆｒ２及び微生物活性成分を添加しない他は同様にして培養及びＩＬ−１０測定を行った。
【００６４】
図９及び１０には、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  ラクティス  バイオバラエティー  ジアセチラクティス  ＤＲＣ−１株（ＭＡＦＦ−４００２０６）の場合のＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を、骨髄由来細胞、脾臓細胞のそれぞれについて示す。
また、図１１及び１２には、ラクトコッカス  ラクティス  サブスピーシーズ  クレモリス  Ｃ６０株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８５５９）の場合のＩＬ−１０産生量（ｐｇ／ｍｌ）を、骨髄由来細胞、脾臓細胞のそれぞれについて示す。
尚、図９〜１２中の＊＊は、ｍｅｄｉｕｍと比較して有意差（ｐ＜０．０１）があった旨を示し、＊は、ｍｅｄｉｕｍと比較して有意差（ｐ＜０．０５）があった旨を示す。
【００６５】
図９〜１２から明らかなように、いずれの細胞においても、Ｆｒ１を添加した場合に比較対照と比べて有意に高いＩＬ−１０産生能が観察された。Ｆｒ１は熱水抽出画分から精製されたものであるから、多糖類画分を含むものと考えられる。
このことから、ラクトコッカス属乳酸球菌由来の分子量３万以上の高分子画分、すなわち多糖類画分が、免疫調節性機能、すなわちＩＬ−１０産生誘導促進機能を有する成分であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
本発明のラクトコッカス属乳酸球菌、及び該乳酸球菌由来の成分は、アレルギー疾患や大腸性潰瘍炎など炎症性腸疾患を初めとする自己免疫疾患等の免疫病の予防・治療に資する。また、ヒト・家畜・ペット等哺乳動物の免疫恒常性維持（健康維持）に資する。
即ち、本発明のラクトコッカス属乳酸球菌、及び該乳酸球菌由来の成分は、安全性が高く経口摂取が可能であることから、食品又は食品素材、並びに動物飼料の有効成分として利用することにより、体内で効率的に免疫調節性細胞を誘導することができる点で有用である。
また、本発明の取得方法によれば、上述のようなラクトコッカス属乳酸球菌を効率的に取得することができる。
更に、本発明の選抜方法によれば、ラクトコッカス属乳酸球菌の他に、免疫調節性細胞を効率的に誘導する微生物株とその成分を選抜することができる。
【符号の説明】
【００６７】
図３及び図４中の＊＊は、Ｃｏｎｔｒｏｌと比較して有意差（ｐ＜０．０１）があった旨を示し、＊は、Ｃｏｎｔｒｏｌと比較して有意差（ｐ＜０．０５）があった旨を示す。
図７及び図８中の＊＊＊は、ｓａｌｉｎｅと比較して有意差（ｐ＜０．００１）があった旨を示し、＊＊は、ｓａｌｉｎｅと比較して有意差（ｐ＜０．０１）があった旨を示す。
図９〜１２中の＊＊は、ｍｅｄｉｕｍと比較して有意差（ｐ＜０．０１）があった旨を示し、＊は、ｍｅｄｉｕｍと比較して有意差（ｐ＜０．０５）があった旨を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2010183913000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年6月8日(2010.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
被検菌が、ラクトコッカス属乳酸球菌である請求項１記載の微生物株、又は該微生物由来の免疫調節性機能を有する成分の選抜方法。