【手続補正書】
【提出日】令和3年6月29日(2021.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む細胞治療剤の有効性の評価方法：
（１）（ａ）ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とをそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）の第１集団及び第２集団をそれぞれバイアル内に充填するステップと、
（３）前記ステップ（２）の第１集団を不活性化するステップと、
（４）前記ステップ（３）の第１集団を培養するステップと、
（５）前記ステップ（４）の前記第１集団からＴＧＦ−βの濃度を測定するステップと、
（６）前記ステップ（５）で測定されたＴＧＦ−βの濃度に基づいて、細胞組成物の治療剤としての有効性を評価するステップであり、
前記ステップ（６）でのＴＧＦ−βの発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である場合、治療剤として有効であると判断する、方法。
【請求項２】
前記ステップ（３）の不活性化は、放射線照射によるものである、請求項１に記載の方法。 
【請求項３】
前記放射線照射は、ガンマ線、Ｘ線または電子線である、請求項２に記載の方法。 
【請求項４】
前記ステップ（２）のバイアルは、凍結保存液を含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項５】
前記ステップ（２）の凍結保存液は、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）を含む、請求項４に記載の方法。 
【請求項６】
前記ステップ（２）の凍結保存液は、ＤＭＳＯを５〜１５体積％で含む、請求項５に記載の方法。 
【請求項７】
前記ステップ（３）の不活性化は、バイアルを凍結する前または後に行われる、請求項１に記載の方法。 
【請求項８】
前記凍結は、−２０〜−１９６℃で行われる、請求項７に記載の方法。 
【請求項９】
前記ステップ（４）の培養は、凍結されたバイアルを解凍後に行われる、請求項７に記載の方法。 
【請求項１０】
前記解凍は、１５〜４０℃で１〜９０分間放置する、請求項９に記載の方法。 
【請求項１１】
前記ステップ（４）の培養は、６時間〜９６時間行われる、請求項１に記載の方法。 
【請求項１２】
前記治療は、骨関節炎の治療である、請求項１に記載の方法。 
【請求項１３】
前記第２集団のＴＳＰ−１（thrombospondin 1）の発現量を確認するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。 
【請求項１４】
前記ＴＳＰ−１の発現量が３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である場合、治療剤として有効であると判断する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記形質転換した哺乳類細胞は、ｈＣｈｏｎＪｂ＃７である、請求項１に記載の方法。 
【請求項１６】
次のステップを含む骨関節炎治療剤の製造方法：
（１）（ａ）ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とをそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）の第１集団及び第２集団をそれぞれバイアル内の凍結保存液内に充填するステップと、
（３）前記ステップ（２）の第１集団をバイアルを凍結する前または後に不活性化するステップと、
（４）前記ステップ（３）の前記第１集団を解凍するステップと、
（５）前記ステップ（４）の第１集団を培養するステップと、
（６）前記ステップ（５）の第１集団からＴＧＦ−βの発現量を測定するステップと、
（７）前記ステップ（６）で測定されたＴＧＦ−βの発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である細胞を選別するステップ。
【請求項１７】
前記方法は、ステップ（８）として、前記第２集団のＴＳＰ−１（thrombospondin-1）の発現量を測定し、前記ＴＳＰ−１の発現量が３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である細胞を選別するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
骨関節炎の主な症状は、反復的な痛み、関節の強直感、機動力の低下および機能喪失である。臨床的な経過は、通常、徐々に進行していく。ある程度病気が進行するにつれて、関節軟骨の消失と変性によって関節面が不規則になると、痛みの程度が増強し、漸進的な運動障害のために日常生活に大きな支障をきたすことになる。また、関節の変形も起こる。軟骨の成長に関連する調節因子（modulator）及び生化学的因子（biochemical factor）を標的とした研究が進行中である。これらの因子は、骨形成の効果的な刺激因子であるＢＭＰ（bone morphogenetic protein）、及び細胞成長と細胞外基質（extracellular matrix、ＥＣＭ）の形成を刺激するＴＧＦ−β（transforming growth factor beta）を含む。特に、ＴＧＦ−βは、コラーゲン（collagen）とプロテオグリカン（proteoglycan）の合成、軟骨細胞の生長及び組織再生に関与することが知られている。また、ＴＧＦ−βは、免疫抑制および抗炎症機能を有することが知られている。ＥＧＦ（epidermal growth factor）、ＩＧＦ−I（insulin-like growth factor I）、ＢＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）のような他の成長因子もまた軟骨の再生を刺激するが、これらの成長因子は、軟骨の損傷に効果を示さなかった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明の好ましい具現例によると、前記ステップ（２）のバイアルは、凍結保存液を含み、前記凍結保存液は、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明の好ましい具現例によると、前記哺乳類細胞は、軟骨細胞または軟骨前駆細胞であってもよい。形質転換した哺乳類細胞は、ｈＣｈｏｎＪｂ＃７であってもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【図１】図１は、ＴＣ細胞におけるＴＧＦ−β１タンパク質の発現量を示す。
【図２】図２は、細胞生産ｂａｔｃｈごとのＴＧＦ−β１の発現量を確認した結果を示す。
【図３ａ】図３ａは、ＭＩＡ誘導骨関節炎動物モデルに混合細胞及び／又はａｎｔｉ−ＴＧＦ−β１中和抗体（anti-TGF−β1 neutralizing antibody）を処理したときのフォンフレイフィラメント（von Frey filament）テストの結果を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、前記フォンフレイフィラメントの結果をＡＵＣ（area under the curve）で表すものである。
【図４】図４は、ＨＣ及びＴＣ細胞におけるＴＳＰ−１タンパク質の発現量を示す。
【図５】図５は、細胞生産ｂａｔｃｈごとのＴＳＰ−１の発現量を確認した結果を示す。
【図６ａ】図６ａは、ＭＩＡ誘導骨関節炎動物モデルに混合細胞及び／又はａｎｔｉ−ＴＳＰ−１中和抗体を処理したときのフォンフレイフィラメントテストの結果を示す。
【図６ｂ】図６ｂは、前記フォンフレイフィラメントの結果をＡＵＣ（area under the curve）で計数した結果を示す。
【図７ａ】図７ａは、ＭＩＡ骨関節炎動物モデルに様々な値のＴＧＦ−β１発現を示す混合細胞を処理したときのフォンフレイフィラメントテストの結果を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、前記フォンフレイフィラメントの結果をＡＵＣ（area under the curve）で表すものである。
【図７ｃ】図７ｃは、Ｈ＆Ｅ染色組織の分析結果を示す。
【図８ａ】図８ａは、ＴＧＦ−β１の有効最小値を確認するために行った、ＴＧＦ−β１ ９ｎｇ＿混合細胞、１．７ｎｇ＿混合細胞のＶＦＦ ｔｅｓｔの結果を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、ＡＵＣで計数した結果を示す。
【図９ａ】図９ａは、ＴＳＰ−１の有効最小値を確認するために行った、それぞれ異なる値を示すＨＣを用いたＶＦＦ ｔｅｓｔの結果を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、ＡＵＣで計数した結果を示す。
【図９ｃ】図９ｃは、Ｈ＆Ｅ染色組織の分析結果を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
また、前記ＨＣ及びＴＣは、ヒト由来軟骨細胞であって、ＨＣは正常軟骨細胞であり、ＴＣはＴＧＦ−β１が分泌されるように形質転換したｈＣｈｏｎＪｂ＃７である。ＨＣ及びＴＣの作製方法は、［Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１２ Ｆｅｂ；１４（２）：２４７−２５６］、並びに米国特許第７，００５，１２７号および米国特許第７，２８２，２００号に開示されている。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
結論として、本発明に基づいて確立された、（ａ）第１集団であるＴＧＦ−βで形質転換した哺乳類細胞の特定のレベルのＴＧＦ−β発現量と、（ｂ）第２集団である前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の特定のレベルのＴＳＰ−１の発現量に基づいて骨関節炎細胞治療剤の有効性を評価する方法を用いると、個々の細胞治療剤の有効性を治療開始前に確実に判定することができ、均一な治療効果を示すようにすることができる。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
次のステップを含む細胞治療剤の有効性の評価方法：
（１）（ａ）ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とをそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）の第１集団及び第２集団をそれぞれバイアル内に充填するステップと、
（３）前記ステップ（２）の第１集団を不活性化するステップと、
（４）前記ステップ（３）の第１集団を培養するステップと、
（５）前記ステップ（４）の前記第１集団からＴＧＦ−βの濃度を測定するステップと、
（６）前記ステップ（５）で測定されたＴＧＦ−βの濃度に基づいて、細胞組成物の治療剤としての有効性を評価するステップであり、
前記ステップ（６）でのＴＧＦ−βの発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である場合、治療剤として有効であると判断する、方法。
＜２＞
前記ステップ（３）の不活性化は、放射線照射によるものである、＜１＞に記載の方法。 
＜３＞
前記放射線照射は、ガンマ線、Ｘ線または電子線である、＜２＞に記載の方法。 
＜４＞
前記ステップ（２）のバイアルは、凍結保存液を含む、＜１＞に記載の方法。 
＜５＞
前記ステップ（２）の凍結保存液は、ＤＭＳＯ（Dimethyl sulfoxide）を含む、＜４＞に記載の方法。 
＜６＞
前記ステップ（２）の凍結保存液は、ＤＭＳＯを５〜１５体積％で含む、＜５＞に記載の方法。 
＜７＞
前記ステップ（３）の不活性化は、バイアルを凍結する前または後に行われる、＜１＞に記載の方法。 
＜８＞
前記凍結は、−２０〜−１９６℃で行われる、＜７＞に記載の方法。 
＜９＞
前記ステップ（４）の培養は、凍結されたバイアルを解凍後に行われる、＜７＞に記載の方法。 
＜１０＞
前記解凍は、１５〜４０℃で１〜９０分間放置する、＜９＞に記載の方法。 
＜１１＞
前記ステップ（４）の培養は、６時間〜９６時間行われる、＜１＞に記載の方法。 
＜１２＞
前記治療は、骨関節炎の治療である、＜１＞に記載の方法。 
＜１３＞
前記第２集団のＴＳＰ−１（thrombospondin 1）の発現量を確認するステップをさらに含む、＜１＞に記載の方法。 
＜１４＞
前記ＴＳＰ−１の発現量が３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である場合、治療剤として有効であると判断する、＜１３＞に記載の方法。
＜１５＞
前記形質転換した哺乳類細胞は、ｈＣｈｏｎＪｂ＃７である、＜１＞に記載の方法。 
＜１６＞
次のステップを含む骨関節炎治療剤の製造方法：
（１）（ａ）ＴＧＦ−β（Transforming growth factor beta）で形質転換した哺乳類細胞の第１集団と、（ｂ）前記遺伝子で形質転換していない哺乳類細胞の第２集団とをそれぞれ用意するステップと、
（２）前記ステップ（１）の第１集団及び第２集団をそれぞれバイアル内の凍結保存液内に充填するステップと、
（３）前記ステップ（２）の第１集団をバイアルを凍結する前または後に不活性化するステップと、
（４）前記ステップ（３）の前記第１集団を解凍するステップと、
（５）前記ステップ（４）の第１集団を培養するステップと、
（６）前記ステップ（５）の第１集団からＴＧＦ−βの発現量を測定するステップと、
（７）前記ステップ（６）で測定されたＴＧＦ−βの発現量が０．６５ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である細胞を選別するステップ。
＜１７＞
前記方法は、ステップ（８）として、前記第２集団のＴＳＰ−１（thrombospondin-1）の発現量を測定し、前記ＴＳＰ−１の発現量が３１ｎｇ／１０５ｃｅｌｌ／２４ｈｒ以上である細胞を選別するステップをさらに含む、＜１６＞に記載の方法。