【手続補正書】
【提出日】平成16年7月21日(2004.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５４】
非還元性糖質を生成させる工程において、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、マルトトリオース生成アミラーゼ、マルトテトラオース生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼ、マルトヘキサオース生成アミラーゼ、澱粉枝切り酵素、シクロマルトデキストリン・グルカノトランスフェラーゼ及び／又はα−グルコシダーゼをさらに作用させる請求項５２又は５３に記載の糖質の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
この発明による当該非還元性糖質生成酵素の製造方法における培養条件は、使用する微生物に応じて、それぞれの微生物の生育に適した条件が適宜に選択される。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４５０）などのアルスロバクター属に属する微生物を使用する場合、培養温度は通常、２０乃至５０℃、望ましくは、２５乃至３７℃、培養ｐＨは通常ｐＨ４乃至１０、望ましくは、ｐＨ５乃至９、培養時間は１０乃至１５０時間から選ばれ、好気条件下で培養される。一方、当該非還元性糖質生成酵素をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入してなる形質転換体を使用する場合、宿主の微生物種やベクターの種類にもよるが、培養温度は通常、２０乃至６５℃、培養ｐＨは通常、ｐＨ２乃至９、培養時間は通常、１乃至６日間から選ばれ、好気条件下で培養される。斯くして得られる培養物は、通常、主としてその菌体画分に当該酵素を含有する。一方、枯草菌などを宿主として得た形質転換体を培養する場合には、形質転換に用いるベクターの種類によっては、斯かる培養物は、主としてその上清画分に当該酵素を含有する場合もある。以上のようにして得られる培養物における当該酵素の含量は、用いる微生物の種類や培養条件などにもよるが、通常、培養物１ｍｌ当たりに換算すると０．０１乃至１，０００単位である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
この発明による当該トレハロース遊離酵素の製造方法における培養条件は、使用する微生物に応じて、それぞれの微生物の生育に適した条件が適宜に選択される。例えば、アルスロバクター・スピーシーズＳ３４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６４５０）などのアルスロバクター属に属する微生物を使用する場合、培養温度は通常、２０乃至５０℃、望ましくは、２５乃至３７℃、培養ｐＨは通常ｐＨ４乃至１０、望ましくは、ｐＨ５乃至９、培養時間は１０乃至１５０時間から選ばれ、好気条件下で培養される。一方、当該トレハロース遊離酵素をコードするＤＮＡを宿主微生物に導入してなる形質転換体を使用する場合、宿主の微生物種やベクターの種類にもよるが、培養温度は通常、２０乃至６５℃、培養ｐＨは通常、ｐＨ２乃至９、培養時間は通常、１乃至６日間から選ばれ、好気条件下で培養される。斯くして得られる培養物は、通常、主としてその菌体画分に当該酵素を含有する。一方、枯草菌などを宿主として得た形質転換体を培養する場合には、形質転換に用いるベクターの種類によっては、斯かる培養物は、主としてその上清画分に当該酵素を含有する場合もある。以上のようにして得られる培養物における当該酵素の含量は、用いる微生物の種類や培養条件などにもよるが、通常、培養物１ｍｌ当たりに換算すると０．０１乃至３，０００単位である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
合一した溶液を１０ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、その透析内液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。この上清を回収し、約４０ｍｌの陰イオン交換樹脂（東ソー株式会社製、商品名『ＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓゲル』）を用いるイオン交換カラムクロマトグラフィーに供した。溶出は、通液に伴い０Ｍから０．２Ｍまで直線的に濃度が上昇する食塩水溶液で行った。カラムからの溶出物を分画採取し、各画分の非還元性糖質生成酵素活性を測定した。その結果、約０．１５Ｍ食塩で溶出された画分に顕著な当該酵素活性が認められ、これらの画分を合一した。合一した液を、引き続き、約３８０ｍｌの『ウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル』（フランス、セプラコル社製）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーに供し、顕著な当該酵素活性の認められた画分を回収した。以上の、精製の各工程における非還元性糖質生成酵素の酵素活性量、比活性、収率を表２に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
表４に示すように、実施例２によるこの発明の非還元性糖質生成酵素は、中温域以外に至適温度を有する公知の酵素のうちではリゾビウム・スピーシーズＭ−１１由来の酵素と最も高い５６．９％というアミノ酸配列の相同性を示した。この結果は、この発明の非還元性糖質生成酵素が、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して５７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を通常は含有することを意味している。また、アミノ酸配列の比較結果から、実施例２による当該酵素と上記の４種類の公知の酵素は、配列表における配列番号２及び３に示すアミノ酸配列を共通して含有していることが判明した。実施例２による当該酵素は、配列表における配列番号１のアミノ酸配列における第８４乃至８９番目及び第２７７乃至２８２番目のアミノ酸からなる部分に見られるとおり、配列番号２及び３のアミノ酸配列を部分アミノ酸配列として含有している。上記で比較の対象とした４種類の酵素も、いずれも、それぞれ対応する部分にこれらの部分アミノ酸配列を含有している。実施例２による当該酵素ならびに比較の対象とした酵素がいずれも共通して還元性澱粉部分分解物から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する作用を有していることから、上記で見出された配列表における配列番号２及び３に示す部分アミノ酸配列が斯かる作用の発現に関わっていることが示唆された。したがってこの結果は、この発明の非還元性糖質生成酵素が、配列表における配列番号２及び３に示すアミノ酸配列を含有するとともに中温域に至適温度を有することにより特徴づけられることを示している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
【発明の効果】
以上説明したように、この発明は、中温域に至適温度を有し、望ましくは、酸性域に至適ｐＨを有する、新規な非還元性糖質生成酵素ならびにトレハロース遊離酵素の発見に基づくものである。この発明の両酵素は、例えば、斯かる酵素を産生する微生物の培養によりその所望量を得ることができる。また、この発明による両酵素をコードするそれぞれのＤＮＡは、組換え型蛋白質としての両酵素の製造に極めて有用であり、当該ＤＮＡを導入してなる形質転換体を用いる場合にも、この発明の両酵素の所望量を得ることができる。この発明の両酵素は、トレハロースをはじめとするトレハロース構造を有する非還元性糖質の中温域・酸性域での製造に有利に用いることができる。とりわけ、中温域・酸性域に至適条件を有する他の糖質関連酵素との併用により糖質を製造する際には、目的の糖質を極めて効率的に得ることができる。しかも、この発明の両酵素はアミノ酸配列まで明らかにされた酵素であり、飲食物や医薬品への配合使用を前提とする当該非還元性糖質の製造に安心して使用し得る。斯くして得られる非還元性糖質ないしは斯かる非還元性糖質を含む低還元性糖質は、温和で上品な甘味を有し、そして、何よりも、糖質中の還元性基を有しないか又は大幅に低減しているので、着色や変質の懸念なく飲食物、化粧品、医薬品を始めとする組成物一般に有利に配合使用できる実益がある。