【手続補正書】
【提出日】平成17年2月24日(2005.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
上記方法によれば、蛍光標識化合物は、蛍光物質とポリマーとからなり、蛍光標識化合物の分子量が減少すると、蛍光標識化合物の分子運動は速くなる。これに伴って、蛍光偏光度が低下する。従って、蛍光偏光度の変化と分子量の変化との関係を利用して、分子量の変化を測定することができる。このような分子量の変化の測定は、例えば、生分解性プラスチックを分解する微生物および酵素の活性の測定に利用することができる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
生分解性プラスチックには通常、高重合度のポリマーが用いられ、その水に対する溶解度は非常に低いが、後に詳述するように、ポリマーの重合度が低くなると、その水に対する溶解度は上昇する。すなわち、生分解性プラスチックを構成するポリマーの水に対する溶解度は、重合度に従って低下する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
蛍光物質の濃度が１０−１２Ｍ以上であれば、その水溶液の蛍光偏光度の測定が可能である。したがって、１０−１２Ｍ以上に水に溶解することができる重合度のポリマーを蛍光標識して分子量変化の測定に用いればよいことになる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
ポリマー分解酵素の活性は、これまで、（ａ）分解産物の比色定量する、（ｂ）ポリマー懸濁液の濁度の減少を測定する、（ｃ）フィルム状のポリマーの重量減少を測定する、あるいは、（ｄ）ゲル濾過クロマトグラフィなどを用いてポリマー分子の低下を測定する、などの方法で測定されてきた。（ａ）の方法は分解産物が比色定量可能な濃度に増加するまで酵素反応を続ける必要があり、（ｂ）〜（ｄ）の方法は、分解の前後の測定値に有意な差が現れるまで反応を続ける必要があり、いずれの場合も活性の測定には長時間を要する。これに対して、本発明の方法は、従来法に比べて極めて短時間に分子量変化を測定する方法を提供することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
上記方法によれば、生分解性プラスチックを構成する分子量が比較的小さなポリマーに蛍光物質を結合させることによって、上記蛍光標識化合物は、溶媒に対する溶解度が高くなる。そのため、例えば、生分解性プラスチックの分解に関する酵素活性を測定するための溶液において、有効基質濃度は高くなり、その結果、反応の活性は高くなる。このように反応の活性を高くすることにより、活性測定の結果を得るまでの時間を短縮することができる。その結果、生分解性プラスチックを分解する微生物および酵素に関する研究において、反応の活性測定の結果を短時間で得ることができる分子量変化の分析方法を提供することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
蛍光偏光度の測定は、上記のように、蛍光の垂直成分（縦方向の蛍光強度）と水平成分の強度（横方向の蛍光強度）とを測定することによって行われ、それぞれの成分の蛍光強度の測定原理は、通常の蛍光光度計での蛍光強度の測定原理と同じである。例えば、Panvera社のBeacon（詳細は、http://www.invitrogen.co.jp/products/pdf/2003-55-CB.pdf 参照）なら、蛍光分子の濃度が１０-12Ｍ（１ｐＭ）以上あれば、蛍光偏光度の測定が可能である。なお、単位の記号である「Ｍ」は、「ｍｏｌ／ｌ」を示している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
高分子を分解する酵素は、分子の末端から順に分解するexo型と、分子のどの部分にも作用できるendo型に大別される。exo型およびendo型の酵素の説明を図６に示す。また、exo型およびendo型の酵素の反応はそれぞれ０次反応および２次反応であり、それぞれの説明を図７に示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
蛍光色素（蛍光物質）には多くの種類があるが、官能基特異的な種々の誘導体が市販されているフルオロセイン系が最も便利である。フルオロセインもしくはその誘導体は約４ｎｓの蛍光寿命を持ち、生分解性プラスチックを構成するポリマーの１つであるポリ乳酸を標識する場合なら、分子量約２０００〜１００００のポリマーを標識するのが適当である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
ポリ乳酸（重量平均分子量5000, Nacalai Tesque社, code 28345-24）１００ｍｇを、１ｍｌの蒸留水に懸濁し遠心分離して上清を捨てる操作を３回繰り返し、乳酸及び低重合度のポリ乳酸を除去した。減圧乾燥した沈殿物５０ｍｇを０．１ｍｌのクロロホルムに溶解し、4-ジメチルアミノピリジンの１２ｍｇ／ｍｌクロロホルム溶液を１０ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミドの０．２１ｍｇ／ｍｌクロロホルム溶液を０．１ｍｌ、５−アミノアセトフルオロセイン（5-(aminoacetamido)fluorescein, Molecular Probe社, code A-1363)の８．１ｍｇ／ｍｌクロロホルム溶液を０．１ｍｌ加え、３７℃で２時間反応させた。蒸留水を加えて混合し、遠心分離して水相を除去する操作を5回繰り返した。溶媒相に窒素ガスを吹き付けてクロロホルムを除去した後、再度クロロホルム０．１ｍｌに溶解し、ゲル濾過クロマトグラフィにより精製した。即ち、クロロホルムで平衡化したTSK-GEl G4000HHR (7.8 mm×30 cm, Tosho)に試料５０μｌを注入して０．１ｍｌ／ｍｌの流速で展開し、蛍光を持つ高分子画分（分子量5000付近）を回収した。回収した画分のクロロホルムを、窒素ガス吹き付けにより除去し、冷暗所に保存した。これにより、フルオロセイン標識されたポリ乳酸（蛍光標識化合物）約３０ｍｇを得た。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
図１４は、３種類の土壌サンプルから得た抽出液のポリ乳酸分解活性を比較したものである。土壌（１）（soil（１））及び土壌（２）（soil（２））の抽出液には有意な酵素活性は認められなかったが、ポリ乳酸粒子を埋めて４ヶ月放置した土壌（３）（soil（３））の抽出液には、有意な分解酵素活性が認められた。土壌（３）を界面活性剤であるTween 20を含む緩衝液で抽出した試料には、土壌１ｋｇ当たり１０ｍｇのproteinase Kに相当するポリ乳酸分解酵素活性が検出された。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
図１６は、重量平均分子量１２５０のポリ乳酸を標識した蛍光標識化合物に、proteinase Kを作用させた際の蛍光偏光度の経時変化を示している。なお、実験はｐＨ７．５で行ったため、酵素を入れない場合もゆっくりとした分解、すなわち、蛍光偏光度の低下が見られるが、proteinase Kを添加すると、Proteinase Kの濃度と共に、蛍光偏光度の低下は早くなった。横軸の単位は秒で、５分程度で乳酸の分解を見ることができた。この蛍光偏光度は０次反応と見なすことができるので、その反応速度定数を求めた。