【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年5月12日(2021.5.12)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】サイズが制御された微粒子の調製
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガスが充填された微小胞などのサイズが制御された微粒子を、特に、フローフォーカシング装置を用いて調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガスが充填された微小胞は、造影超音波（ＣＥＵＳ）撮像として知られる超音波撮像技術における適切な造影剤として一般に用いられる。これらの微小胞のガスは、典型的に、例えば、乳化剤、油類、増粘剤または糖類を含む、安定化エンベロープ内にトラップまたはカプセル化される。これらの安定化された気泡（適切な生理学的溶液内に分散される）は、典型的にそれらの調製に用いられる安定化材料に依存して、様々な専門用語で当該分野において一般に呼ばれて；これらの用語は、例えば、「マイクロスフェア」、「微小気泡」、「マイクロカプセル」または「マイクロバルーン」を含み、本明細書において包括的に「ガスが充填された微小胞」（または短縮して「微小胞」）と呼ばれる。
【０００３】
特定の興味は、ガスが充填された微小胞の水性懸濁液であり、ガスの気泡は、ガスと液体の界面に置かれた安定化両親媒性材料（典型的にリン脂質）を伴う非常に薄いエンベロープ（フィルム）によって、ガス／液体界面において境界が作られている。これらの懸濁液は、典型的に、粉末化された両親媒性材料、例えば凍結乾燥された事前に形成されたリポソームまたは凍結乾燥または噴霧乾燥された脂質溶液を、空気または任意の他のガスと、それから、水性担体と、撹拌しながら接触させて、ガスが充填された微小胞の懸濁液を生産することによって調製されて、それから、好ましくはその調製後すぐに投与され得る。安定化層は、上記のリン脂質に加えて、脂肪酸のような他の両親媒性材料も含んでよい。
【０００４】
参考文献１は、ガスが充填された微小胞の生産のための代替方法を開示し、疎水性液体、典型的には油を、両親媒性材料の水性分散中で乳化して、液体が充填された微小滴のエマルションを得るステップを含み；それからエマルションが凍結乾燥されて、凍結乾燥された残渣は続いてガスおよび水性溶媒の存在下で再構成されて、微小気泡懸濁液を形成する。
【０００５】
液体が充填された微小滴（短縮して「微小滴」）を含む水性エマルションは、薬物担体としても用いられ得る。疎水性薬物または親水性薬物は、両親媒性材料によって被覆された液滴に組み込まれ得る。１つ目の場合では、両親媒性材料は、液滴の周りに単一層を形成する。２つ目の場合では、二重の両親媒性材料の層（リポソーム）が水性液滴の周りに形成される。相対的に低い沸点Ｔｂを有する液体（例えばパーフルオロペンタンＴｂ＝２９Ｃ）が充填された微小滴、または、例えば低沸点を有する油中のナノ小滴を含む薬物の（ナノ）エマルションが充填された微小滴は、超音波を用いた薬物輸送用途において大きな潜在性を有する。超音波は、インビボ適用において液滴の気化を引き起こすために用いられ得て、それにより、それらのペイロードを放す。
【０００６】
調製の従来法は一般に、相対的に高い多分散性指数（ＰＤＩ）でのサイズ分布を有する微小胞または微小滴（両方とも本明細書において「微粒子」として定義される）懸濁液を提供して、微粒子の集団の標準偏差「ｓ」および平均サイズ「ｎ」の間の比：ＰＤＩ＝ｓ／ｎ＊１００％として数学的に定義される。例えば、典型的な調製方法は、約２〜３マイクロメートルの平均直径および約６０％のＰＤＩを有する微粒子を与え得る。相対的に高いＰＤＩ（例えば６０％）を有する微粒子、特に、ガスが充填された微小胞は、実際の撮像技術の大部分に一般に良好に適合するが、そのようなＰＤＩは、それでもなお、前記撮像技術にさらに最適化され得る。さらに、特定の治療的超音波適用のために、ＰＤＩを最小限にすることが望ましくあり得る。
【０００７】
したがって、いわゆる「サイズが制御された」または「単分散」微粒子、すなわち、ガスが充填された微小胞または液体が充填された微小滴の製剤を調製するための方法が開発されていて、ここでＰＤＩは、１０％よりも低く、好ましくは５％よりも低く、さらにより好ましくは２％よりも低い。
【０００８】
単分散微粒子を調製するための適切な方法は、典型的にＴ接合またはフローフォーカシング装置を用いることによって、例えばマイクロ流体技術の使用を含む。手短にいうと、フローフォーカシング装置では、第一の流体の構成要素（例えばガスまたは油）の流れは、狭いオリフィスを通る第二の流体の構成要素の流れによって集められる。典型的に、第二の流体の構成要素は、エンベロープ形成材料（典型的に、リン脂質および／または脂肪酸を含む、脂質などの界面活性剤）を含む液体の流体であり、第一の流体の構成要素をトラップして所望の微粒子を形成して（ガスが充填された微小胞または液滴の形態で）、前記エンベロープ形成材料によって合体および分離に対して安定化される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本出願人は、しかしながら、特に、高い流速下で（例えば１０５微粒子／秒またはそれよりも高い、高い形成速度を達成する必要がある）、形成されたばかりの微粒子は、相対的に高い運動エネルギーで衝突し得て、そのような衝突は、微粒子の合体をもたらし得ることを観察した。そのような合体の結果は、形成された微粒子の寸法が、例えば、所望の微粒子体積の２、３、およびｎ倍までの体積に無作為に変化し得ることである。したがって、微粒子集団のサイズおよびＰＤＩは、無制御になり得る。
【００１０】
ここで本出願人は、マイクロ流体方法に従って、調製される微粒子の合体を制限するために適用され得る適切な調製条件を見いだした。
【００１１】
一般論として、本出願人は、微粒子が形成されるゾーンに近い温度を制御することによって、特に、微粒子の安定化エンベロープを形成する両親媒性材料（単数または複数）の遷移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）温度（Ｔｍ）付近またはそれよりも上の温度に微粒子を供することによって、合体現象が実質的に減少され得ることを観察した。
【００１２】
さらに、本出願人は、両親媒性材料の遷移温度よりも低い、形成された懸濁液のその後の冷却は、微粒子の所望の制御されたサイズおよびＰＤＩを維持するのを有利にさらに助け得ることを観察した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第一の態様によれば、本発明は、両親媒性材料の層によって安定化された微粒子の懸濁液を調製するための方法に関し：
−第一の流体流、および、別個に、前記両親媒性材料を含む液体流を提供するステップ；
−前記の第一の流体流および前記の液体流を、それぞれの取水路を通して接触ゾーンに向けて方向付けるステップ（ここで、前記のそれぞれの流れは接触する）；
−前記の第一の流体流および前記の液体流を、接触ゾーンから、校正されたオリフィスを通して方向付けて、前記微粒子を含む懸濁液を得るステップ；および
−前記微粒子を含む前記懸濁液を、排水路に向けて方向付けるステップ；を含み、
ここで、前記排水路の最初の部分は、両親媒性材料の遷移温度に対して２０％低い温度よりも低くない温度（℃）で維持される。
【００１４】
好ましくは、排水路の最初の部分は、両親媒性材料の遷移温度に対して１０％低い温度よりも低くない温度（℃）で維持される。
【００１５】
排水路の前記の最初の部分は、好ましくは、少なくとも微粒子の水性懸濁液の流れが実質的に定常速度に到達するゾーンまで、校正されたオリフィスの出口から伸長する。
【００１６】
好ましい実施態様では、懸濁液は、校正されたオリフィスから排水路へ、校正されたチャネルを通って流れる。
【００１７】
校正されたオリフィス（およびチャネル）および排水路の形状に応じて、前記の最初の部分は、校正されたオリフィス（またはチャネル）の出口から少なくとも０．１ｍｍ、好ましくは少なくとも１ｍｍ、より好ましくは少なくとも２ｍｍ、伸長してよい。前記の最初の部分の長さは、マイクロ流体装置の排水路の全長まで、例えば校正されたオリフィスの出口から１００ｍｍであってよい。
【００１８】
好ましい実施態様によれば、前記の第一の流体流は、ガスであり、前記微粒子は、ガスが充填された微小胞である。
【００１９】
好ましくは、接触ゾーンおよび校正されたオリフィスもまた、所望の温度で維持される。そのような場合は、校正されたオリフィスと排水路との間の任意選択の校正されたチャネルもまた、好ましくは前記温度で維持される。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、得られた懸濁液は、微粒子の形成後、相対的に短い期間内に両親媒性材料の遷移温度よりも低い温度まで冷却される。例えば、懸濁液は、微粒子の形成から１０秒以内、好ましくは５秒以内、さらにより好ましくは２秒以内に冷却される。好ましくは、懸濁液は、Ｔｍよりも少なくとも５％低い、より好ましくは少なくとも１０％低い、例えばＴｍの５０％に至るまでの温度（℃）で冷却される。好ましい実施態様では、例えば、室温よりも高いＴｍを有する両親媒性材料については、特に、微粒子懸濁液が室温で保管される場合、冷却温度は室温（例えば２２℃）である。特定の実施態様では、懸濁液がより低い温度（例えば１０℃）で保管される場合、冷却温度はより低くてもよく、例えば保管温度に対応する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】フローフォーカシング装置のコア部分の略図である。
【図２】本発明のフローフォーカシングプロセスに有用なチップの例示的な略図（上面図）を示す。
【図３】本発明のプロセスに有用な装置の例示的な略図を示す。
【図４】本発明に係る、ガスが充填された微小胞の形成中の温度制御の実験的結果を図解する。
【図５】本発明に係る、他の両親媒性材料を用いた、ガスが充填された微小胞の形成中の温度制御の実験的結果を図解する。
【図６】ガスが充填された微小胞の懸濁液に対する冷却効果の実験的結果を図解する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
図１は、本発明のプロセスに有用なフローフォーカシング装置（チップ）のコア部分１００の略図を示す。チップは、第一の流体流１０１’を供給するための第一の供給チャネル１０１、および、両親媒性材料を含む液体流を供給するための２つのさらなる供給チャネル１０２ａおよび１０２ｂを備える。
【００２３】
第一の流体流（好ましくはガス）および２つの液体流は、接触ゾーン１０３に向かって方向付けられて、それから、図１において点線として示される校正されたオリフィス１０４を通る。
【００２４】
図１に図解されるように、校正されたオリフィスは、好ましくはオリフィスと同一の横断面を有する校正されたチャネル１０４’に接続されて、今度は排水路１０６の最初の部分１０５に接続される。代替の実施態様（図示せず）では、校正されたオリフィス１０４は、排水路１０６の最初の部分１０５に直接的に接続された、すなわち校正されたチャネルが中間にない、ノズルであってよい。
【００２５】
微粒子１０３’は、校正されたオリフィス内に形成されて、校正されたチャネル１０４’を通って、排水路１０６の最初の部分１０５へ方向付けられる。排水路の水力直径は、一般に、校正されたオリフィスの水力直径よりも大きく、典型的に、校正されたオリフィスの最初の直径から排水路１０６の最後の直径へ増大して、回収チューブ（図示せず）の水力直径に実質的に対応して、密封されたバイアルなどのコンテナーにフローフォーカシング装置を接続する。
【００２６】
本出願人によって観察されたように、水力直径の増大（特に、高い製造速度、例えば約１０５微粒子／ｓまたはそれよりも高い）に起因して、流れの速度は、校正されたオリフィスの出口での相対的に高い速度から、懸濁液の定常状態の速度まで劇的に低減する（すなわち、典型的に、排水路および回収チューブにおける下流で到達する）。この負の速度勾配は、校正されたオリフィスから出る微粒子が、排水路の最初の部分において実質的により低い速度で流れている微粒子に衝突するのを生じさせ得る。微小胞の温度が十分に高くない場合、これらの衝突は、微粒子の無制御な崩壊を引き起こし得て、製剤の多分散性を望ましくなく増大させる結果を伴う。
【００２７】
本出願人によって発見されたように、そのような望ましくない合体現象は、装置の排水路の最初の部分１０５において、好ましくは接触ゾーン１０３および校正されたオリフィス１０４においても、微粒子の温度を制御することによって実質的に減少され得る。
【００２８】
特に、本発明によれば、排水路の最初の部分は、好ましくは、液体流内に含まれる両親媒性材料のＴｍに対して２０％低い温度よりも低くない温度で維持されて、微粒子の安定化エンベロープを形成する。より好ましくは、前記温度は、両親媒性材料のＴｍに対して１０％低い温度よりも低くない。一般に、Ｔｍよりも過度に高い温度を有する必要はないが、そのような温度は、両親媒性材料の熱分解耐性と互換性で、必要に応じて高くてよく；例えば、温度は、両親媒性材料のＴｍよりも２０％まで高くてよく、好ましくは１０％まで高くてよい。好ましい実施態様では、前記温度は、両親媒性材料のＴｍ、またはわずかにそれより上である（例えば５℃まで、より高い）。温度制御は、微粒子の水性懸濁液の流れが実質的な定常速度にまだ到達していない排水路のゾーンにおいて、例えば、絶対速度勾配が約１０ｓ−１よりも高い場合に、特に有用である。チップの形状に応じて、前記ゾーンは、校正されたオリフィスから約０．１ｍｍ〜１００ｍｍ、好ましくは１．０〜５０ｍｍ、より好ましくは２．０〜３０ｍｍの長さ、伸長してよい。
【００２９】
有利に、温度は、上記に規定のパラメーターを、接触ゾーンおよび校正されたオリフィス（存在する場合は、校正されたチャネル）にも適用することによって同様に制御され得る。
【００３０】
本出願人によって観察されたように、制御された温度は、形成された微粒子間の合体の実質的な減少を提供する。
【００３１】
合体のパーセンテージは、フローフォーカシング装置の排水路において光学顕微鏡を用いて得られた画像由来のサイズ分布のピークから、合体した微粒子の合計数を計算することによって決定され得て、例えば以下による：
−最初に形成された微粒子Ｖｉの体積の２倍と等しい体積を有する微粒子（サイズ分布の２番目のピーク）の合計数に因子２を掛ける（合体した微粒子は２つの微粒子から生じたので）；および
−この数を、最初の体積の３倍を有する微粒子（サイズ分布の３番目のピーク）の合計数に因子３を掛けたものに加えて、そして、測定されたサイズ分布のｎ番目のピークまで同様にする。
合体のパーセンテージは、したがって、合体した微粒子の合計数を、生産された微粒子の合計数によって標準化することによって計算され得る。
【数１】
2019526551.tif 000001
【００３２】
一般に、約１０％未満、好ましくは約５％未満、さらにより好ましくは約１％以下の合体パーセンテージ、例えば０．０１％の合体パーセンテージまでが望ましい。
【００３３】
加えて、装置が運転される流速もまた、微粒子の合体に影響し得る。特に、いわゆる「滴下」レジームの下では、流速が相対的に低く（例えば、約６００μｍ２の校正されたオリフィスに関して約４５μＬ／分）、微粒子サイズが典型的により大きいので（典型的に、校正されたオリフィスの横断面に対応する）、合体現象は相対的に減少する。他方で、いわゆる「噴射」レジームの下では、増大された流速は（例えば、約６００μｍ２の校正されたオリフィスに関して５５μＬ／分またはそれよりも高い）、低減された微粒子サイズと関連して（典型的に、流速が速ければ速いほど、微粒子はより小さくなる）、形成される微粒子の合体の増大を決定する。しかしながら、滴下レジームの下での微粒子の形成速度は約１０２−１０４微粒子／秒であるが、噴射レジームでは、そのような形成速度は、典型的に１０５微粒子／秒以上に増大される。したがって、たとえ合体の観点から不利であるとしても、高い流速は、産業スケールでの微粒子の許容できる形成速度を達成するために必要である（参考文献２）。
【００３４】
実験部分に詳細に示されるように、温度を両親媒性材料のＴｍまたはその付近に維持することによって、合体の減少が、（熱が加えられない場合に必要な、より高い濃度と比較して）実質的により低い濃度の両親媒性材料を用いることによって観察される。
【００３５】
フローフォーカシング装置は、当技術分野で知られている任意のものであってよく、例えば、（参考文献３などを参照）に記載される。好ましくは、フローフォーカシング装置は、例えば参考文献４に記載のもののようなチップを備える。
【００３６】
図２の概略図に関して、チップ２００は、第一の取水路２０１（それを通って第一の流体（好ましくはガス）の流れが供給される）、および、２つの取水路２０２’および２０２”（それを通って液体流が供給される）を備えてよい。前記取水路のそれぞれは、それぞれのチューブを通ってそれぞれのリザーバーに接続される（図示せず）。チップは、それぞれのチューブを通って、微粒子の懸濁液を回収するように適合されたコンテナー（図示せず）に接続された、排水路２０３をさらに備える。校正されたオリフィスに近い、取水路２０１ａおよび２０２ａの最後の部分の横断面は、チャネル２０１ｂおよび２０２ｂの残部に対して実質的に減少される。この最後の部分２０１ａおよび２０２ａの横断面は、２５〜１・１０４μｍ２、好ましくは２００〜１・１０３μｍ２に変化してよく、有利に、校正されたオリフィスの横断面に実質的に対応する。取水路の最初の部分の横断面は、１・１０３〜１・１０６μｍ２、好ましくは１・１０４〜１・１０５μｍ２に変化してよく、一方で、それらの長さは、５０ｍｍ〜１ｍｍ、好ましくは２ｍｍ〜５ｍｍに変化してよい。同様に、排水路の最初の部分２０３ａの横断面（図１における校正されたチャネルに対応する）もまた相対的に減少して；その断面は、一般に、調製される微粒子の所望の直径に従って校正される（例えば参考文献４を参照）。例えば、５μｍの平均直径を有する単分散微粒子を調製するために、校正されたオリフィスおよび校正されたチャネルは、約２５０〜２５００μｍ２の断面積を有する。有利に、取水路および排水路の横断面は実質的に同様であり、それらのそれぞれの最後および最初の部分も同様である。校正されたチャネル２０３ａの長さは、約０．０５ｍｍ〜約１０ｍｍ、好ましくは１ｍｍ〜５ｍｍに変化してよく、一方で、排水路の全長は、１００ｍｍまで、好ましくは５０ｍｍまで、より好ましくは３０ｍｍまでであってよい。典型的に、チップは、石英ガラス、溶融シリカの両半分、または任意のプラスチック（例えばポリ（メチルメタクリレート））材料から作られる。チャネルは、所望の深さおよび幅の全体に関して、それぞれの半分の内側表面を、乾燥または湿潤のいずれかでエッチングすることによって生産され得る。例えば、表面は、１４μｍの一定の深さで、接触ゾーンに近いそれぞれの校正された部分に関しては１５〜２０μｍの幅で、残部部分に関しては０．５〜１．０ｍｍの幅で、エッチングされ得る。本発明のプロセスでの使用に適切な市販されるチップは、例えば、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｒｏｙｓｔｏｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）またはＭｉｃｒｏｎｉｔ（Ｅｎｓｃｈｅｄｅ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から利用可能である。
【００３７】
好ましい実施態様によれば、形成された微粒子の単分散性を維持するために、懸濁液はそれから、好ましくは回収ゾーン内の懸濁液の流れが実質的に定常速度に到達した時点で、両親媒性材料のＴｍよりも下の温度まで急速に冷却されてよい。
【００３８】
図３に関して、フローフォーカシング装置のコア部分を備えるユニット３００（例えば図２に記載のチップ）は、例えば恒温浴を用いて、上述のように、両親媒性材料のＴｍに近いまたはわずかにそれよりも上の所望の温度で維持され得る。第一の流体流および両親媒性材料を含む液体流は、それぞれのリザーバー３０１および３０２からユニット３００へ、それぞれの供給チューブ（例えば１００〜１０００μｍ、好ましくは１５０〜２５０μｍの内径を有する）を介して、ユニット３００に供給される。排出チューブ３０３は、ユニット３００の排水路（図示せず）を、適切な回収コンテナー３０４、例えば密封されたバイアルに接続する。本出願人によって観察されたように、微粒子の形成から数秒以内に、好ましくは懸濁液の流れが実質的に定常速度に到達したらすぐに、微粒子の懸濁液の冷却を始めることが有利である。典型的に、前記冷却は、微小胞の形成から１８０秒以内、好ましくは６０秒以内、より好ましくは１０秒以内、さらにより好ましくは２秒以内に開始され得る。フローフォーカシング装置の形状に応じて、定常の流れは一般に、微粒子の形成後、数ミリ秒以内または実にそれ未満で到達されて；冷却はしたがって、微粒子の形成後、１ミリ秒から始まって適用され得る。典型的に、微粒子の懸濁液は、形成の数ミリ秒後よりも短い時間以内にユニット３００の出口に到達するので、冷却は、ユニット３００を出る排出チューブの最初の部分に有利に適用され得る。したがって、ガスが充填された微粒子の懸濁液の温度を、微小胞の安定化エンベロープを形成する両親媒性材料のＴｍよりも下に減少させるために、排出チューブの最初の部分は、適切な冷却手段３０５、例えば熱交換器によって、有利に冷却に供される。冷却に供される排出チューブの最初の部分の長さは、例えばユニット３００の加熱温度、適用される冷却の有効性、接触時間などに依存して、例えば１ｃｍ〜１００ｃｍ、好ましくは５ｃｍ〜１０ｃｍ変化し得る。
【００３９】
遷移温度
本明細書において、両親媒性材料の遷移温度（Ｔｍ）を指す場合、前記温度は、単一の両親媒性構成要素または両親媒性構成要素の混合物のいずれかを指してよい。
【００４０】
特に、安定化エンベロープを形成する両親媒性材料が、異なる両親媒性構成要素の混合物である場合は、前記Ｔｍは、一般に、前記の両親媒性構成要素の混合物のＴｍと呼ばれる。両親媒性材料の混合物については、測定されるＴｍは一般に、混合物の個々の構成要素のＴｍのモル比加重平均に相当する。
【００４１】
脂質の遷移温度Ｔｍは、規則正しいゲル相から乱れた液体結晶相への脂質の物理的状態における変化を反映する。ゲル相では、脂質の炭化水素鎖は完全に伸びて、ぎっしり詰まっている。液相では、炭化水素鎖はランダムに配向されて流動性である。
【００４２】
水性脂質混合物のＴｍは、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いることによって有利に測定され得る。熱量測定または熱分析は、時間と温度の関数として、制御された雰囲気内で、材料の遷移に関与する熱の流れの測定を可能にする。ＤＳＣは、一定の速度（℃／分）でサンプルを加熱または冷却することによって、サンプルと不活性参照との間の熱の流れの違いを測定する。リン脂質を含む両親媒性材料（純粋または混合）のＴｍの測定は、例えば、ＤＳＣ−Ｑ２０００装置（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ  ＵＳＡ）を用いることによって行われ得る。パラメーター、例えば、遷移が開始してそのピークに到達する温度、遷移のエンタルピーが、Ｔｍを決定するために測定される。測定の詳細は、実験部分に提供される。
【００４３】
両親媒性材料
本発明の方法での使用に適切な両親媒性材料は、例えば、リン脂質；リゾリン脂質；脂肪酸類、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸またはオレイン酸；ポリマーを保有する脂質、例えば、キチン、ヒアルロン酸、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、「ペグ化脂質」とも呼ばれる；スルホン化モノ−  ジ−、オリゴ−または多糖類を保有する脂質；コレステロール、コレステロール硫酸またはヘミこはく酸コレステロール；ヘミこはく酸トコフェロール；エーテルを含む脂質またはエステル結合脂肪酸；重合脂質；リン酸ジアセチル；リン酸ジセチル；セラミド類；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル類（例えば、ポリオキシエチレン脂肪酸ステアリン酸）、ポリオキシエチレン脂肪族アルコール類、ポリオキシエチレン脂肪族アルコールエーテル類、ポリオキシエチル化ソルビタン脂肪酸エステル類、グリセロールポリエチレングリコールリシノール酸、エトキシ化大豆ステロール類、エトキシ化ヒマシ油またはエチレンオキシド（ＥＯ）およびプロピレンオキシド（ＰＯ）ブロック共重合体；コレステロールグルクロニド、ラノステロールグルクロニド、７−デヒドロコレステロールグルクロニド、エルゴステロールグルクロニド、コレステロールグルコン酸、ラノステロールグルコン酸、またはエルゴステロールグルコン酸を含む、糖酸類のステロールエステル類；ラウリルグルクロニド、ステアロイルグルクロニド、ミリストイルグルクロニド、ラウリルグルコン酸、ミリストイルグルコン酸、またはステアロイルグルコン酸を含む、アルコール類および糖酸類のエステル；スクロースラウリン酸、フルクトースラウリン酸、スクロースパルミチン酸、スクロースステアリン酸、グルクロン酸、グルコン酸またはポリウロン酸を含む、脂肪酸類と糖類のエステル類；サルササポゲニン、スミラゲニン、ヘデラゲニン、オレアノール酸、またはジギトキシゲニンを含む、サポニン類；グリセロールモノパルミテート、グリセロールモノステアレート、グリセロールモノミリステートまたはグリセロールモノラウレートを含む、脂肪酸とのグリセロールまたはグリセロールモノエステル類；ｎ−デシルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、セチルアルコール、またはｎ−オクタデシルアルコールを含む、長鎖アルコール類；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；ジガラクトシル−ジグリセリド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクト−ピラノシド；６−（５−コレステン−３β−イルオキシ）ヘキシル−６−アミノ−６−デオキシル−１−チオ−β−Ｄ−マンノ−ピラノシド；１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）オクタデカン酸；Ｎ−［１２−（（（７’−ジエチルアミノクマリン−３−イル）カルボニル）メチルアミノ）−オクタデカノイル］−２−アミノパルミチン酸；Ｎ−スクシニルジオレイルホスファチジルエタノールアミン；１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール；１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−３−スクシニルグリセロール；１，３−ジパルミトイル−２−スクシニル���リセロール；１−ヘキサデシル−２−パルミトイルグリセロ−ホスホエタノールアミンまたはパルミトイルホモシステイン；アルキルアミン類またはアルキルアンモニウム塩類、以下を含む、少なくとも１つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）、アルキル鎖、例えば、Ｎ−ステアリルアミン、Ｎ、Ｎ’−ジステアリルアミン、Ｎ−ヘキサデシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアミン、Ｎ−ステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジステアリルアンモニウム塩化物、Ｎ−ヘキサデシルアンモニウム塩化物、Ｎ，Ｎ’−ジヘキサデシルアンモニウム塩化物、ジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）；第３級または第４級アンモニウム塩類、以下を含む、１つまたは好ましくは２つの（Ｃ１０−Ｃ２０）、好ましくは（Ｃ１４−Ｃ１８）、アシル鎖（（Ｃ３−Ｃ６）アルキレン橋を通してＮ原子に連結される）、例えば、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、１，２−オレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアロイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＤＡＰ）；およびそれらの混合物または組み合わせを含む。
【００４４】
好ましい実施態様によれば、微粒子のエンベロープを形成する化合物の少なくとも１つは、任意の他の上記に挙げた材料と混合されていてもよいリン脂質である。この説明によれば、用語「リン脂質」は、任意の両親媒性リン脂質化合物を包含することが意図されて、その分子は、特に、最終的な微小胞の懸濁液におけるガスと水の界面において、材料の安定化フィルムを（典型的に、モノ分子層の形態で）形成することが可能である。したがって、これらの材料は、当該分野において、「フィルム形成リン脂質」とも呼ばれる。
【００４５】
両親媒性リン脂質化合物は、典型的に、少なくとも１つのリン酸基および少なくとも１つ、好ましくは２つの、脂溶性長鎖炭化水素基を含む。
【００４６】
適切なリン脂質の例は、脂肪酸の１つまたは好ましくは２つの（等しい、または異なる）残基およびリン酸とグリセロールのエステルを含み、ここで、リン酸残基は、次々に、例えば、コリン（ホスファチジルコリン−ＰＣ）、セリン（ホスファチジルセリン−ＰＳ）、グリセロール（ホスファチジルグリセロール−ＰＧ）、エタノールアミン（ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥ）、イノシトール（ホスファチジルイノシトール）などの親水性基に結合される。脂肪酸のただ１つの残基とリン脂質のエステルは、一般に、当該分野において、リン脂質の「リゾ」形態または「リゾリン脂質」と呼ばれる。リン脂質内に存在する脂肪酸残基は一般に、典型的に１２〜２４個の炭素原子、好ましくは１４〜２２個を含む長鎖脂肪酸類であり；脂肪族鎖は、１つまたは複数の不飽和を含んでよく、または、好ましくは完全に飽和である。リン脂質に含まれる適切な脂肪酸の例は、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。好ましくは、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸およびアラキジン酸のような飽和脂肪酸が例示される。
【００４７】
リン脂質のさらなる例は、ホスファチジン酸類、すなわち、脂肪酸とグリセロール−リン酸のジエステル類；スフィンゴミエリン類のようなスフィンゴ脂質類、すなわち、脂肪酸とのグリセロールジエステルの残基がセラミド鎖によって置換されているホスファチジルコリンアナログ；カルジオリピン類、すなわち、脂肪酸と１，３−ジホスファチジルグリセロールのエステル類；ガングリオシドＧＭ１（またはＧＭ２）またはセレブロシド類のような、糖脂質類；糖脂質；スルファチド類およびグリコスフィンゴリピド類である。
【００４８】
本明細書において用いられる、用語「リン脂質」は、単独または混合物としてのいずれかで用いられ得る、天然起源、半合成または合成的のいずれかで調製された産物を含む。
【００４９】
天然起源のリン脂質の例は、天然レシチン類（ホスファチジルコリン（ＰＣ）誘導体）、例えば、典型的に、大豆または卵黄レシチン類である。
【００５０】
半合成リン脂質の例は、天然起源レシチン類の部分的または完全に水素化された誘導体である。好ましいリン脂質は、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジ−エステル類である。
【００５１】
好ましいリン脂質の例は、例えば、ジラウロイル−ホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイル−ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジアラキドイル−ホスファチジルコリン（ＤＡＰＣ）、ジステアロイル−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイル−ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１，２ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（エチル−ＤＳＰＣ）、ジペンタデカノイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＤＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイル−ホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイル−ホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、１−オレイル−２−パルミトイル−ホスファチジルコリン（ＯＰＰＣ）、ジラウロイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＬＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジアラキドイルホスファチジル−グリセロール（ＤＡＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジオレオイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジアラキドイルホスファチジン酸（ＤＡＰＡ）およびそのアルカリ金属塩類、ジミリストイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアラキドイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＡＰＥ）、ジリノレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジアラキドイルホスファチジルセリン（ＤＡＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジパルミトイルスフィンゴミエリン（ＤＰＳＰ）、およびジステアロイルスフィンゴミエリン（ＤＳＳＰ）、ジラウロイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＬＰＩ）、ジアラキドイルホスファチジルイノシトール（ＤＡＰＩ）、ジミリストイルホスファチジルイノシトール（ＤＭＰＩ）、ジパルミトイルホスファチジルイノシトール（ＤＰＰＩ）、ジステアロイルホスファチジルイノシトール（ＤＳＰＩ）、ジオレオイル−ホスファチジルイノシトール（ＤＯＰＩ）である。
【００５２】
適切なリン脂質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のような親水性ポリマーが、それに結合することによって改変されたリン脂質をさらに含む。好ましいポリマー改変リン脂質は、「ペグ化リン脂質」、すなわち、ＰＥＧポリマーに結合したリン脂質を含む。ペグ化リン脂質の例は、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン類（短縮して「ＰＥ−ＰＥＧ」）、すなわち、親水性エタノールアミン部分が可変の分子量（例えば３００〜２００００ダルトン、好ましくは５００〜５０００ダルトン）のＰＥＧ分子に結合されたホスファチジルエタノールアミン類、例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ（またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＥ−ＰＥＧまたはＤＯＰＥ−ＰＥＧ）である。例えば、ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００は、約２０００の平均分子量を有するＰＥＧポリマーがそれに付着したＤＰＰＥを指す。
【００５３】
特に好ましいリン脂質は、ＤＡＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＳおよびエチル−ＤＳＰＣである。最も好ましいのは、ＤＰＰＧ、ＤＰＰＳおよびＤＳＰＣである。
【００５４】
リン脂質の混合物、例えば、ＤＳＰＳ、ＤＰＰＳ、ＤＳＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＧ、ＤＰＰＧ、エチル−ＤＳＰＣおよび／またはエチル−ＤＰＰＣと、ＤＰＰＥおよび／またはＤＳＰＥ（ペグ化誘導体を含む）、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣおよび／またはＤＡＰＣの混合物も用いられ得る。
【００５５】
例えば、リン脂質の混合物は、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジン酸誘導体およびペグ化ホスファチジルエタノールアミン、例えばＤＳＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＡＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＡ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＧ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＧ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧを含んでよい。
【００５６】
本発明の実施態様によれば、リン脂質は、微小胞の安定化エンベロープの主な構成要素であり、ガスが充填された微小胞のエンベロープを形成する構成要素の合計量の少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも７５％の量である。一部の好ましい実施態様では、エンベロープの実質的に全体（すなわち少なくとも９０％ｗ／ｗ）は、リン脂質から形成され得る。
【００５７】
リン脂質は、任意の上記に挙げた両親媒性化合物との混合で好適に用いられ得る。したがって、例えば、コレステロール、エルゴステロール、植物ステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、没食子酸プロピルまたはパルミチン酸アスコルビルのような脂質類、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸およびそれらの誘導体またはブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または他の非リン脂質化合物のような脂肪酸は、前述のリン脂質の１つまたは複数に、例えば、好ましくは０〜５０重量％の範囲、より好ましくは２５％までの比率で、任意選択で添加されてもよい。例えば、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＧ／パルミチン酸、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／パルミチン酸、ＤＳＰＣ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ／ステアリン酸、ＤＰＰＣ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ／ステアリン酸、ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／ステアリン酸またはＤＰＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ／ステアリン酸を含む、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｉｌｐｉｄ）および脂肪酸を含む両親媒性材料の混合物が有利に用いられ得る。
【００５８】
本発明の方法によって調製される微粒子は、任意選択で標的化リガンドを含んでもよい。
【００５９】
用語「標的化リガンド」は、生体内の任意の生物学的または病理学的部位に向かう、本発明の組成物の微粒子の標的化活性（例えば選択的結合を含む）を有する、またはそれを促進することが可能な、任意の化合物、部分または残基をその意味の中に含む。標的化リガンドが関係し得る標的は、組織、例えば、心筋組織（心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）および心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ）を含む）、膜質組織（内皮および上皮を含む）、薄膜、結合組織（間質組織を含む）または腫瘍；血塊；および受容体、例えば、ペプチドホルモン、神経伝達物質、抗原、補体断片、および免疫グロブリンに関する細胞表面受容体、および、ステロイドホルモンに関する細胞質受容体を含む。
【００６０】
標的化リガンドは、合成、半合成、または天然起源であってよい。標的化リガンドとして作用し得る材料または物質は、例えば、限定されないが、抗体、抗体フラグメント、受容体分子、受容体結合分子、糖タンパク質およびレクチンを含む、タンパク質；オリゴペプチドおよびポリペプチドを含むペプチド；ペプチド模倣薬；単糖類および多糖類を含む、糖類；ビタミン類；ステロイド類、ステロイドアナログ類、ホルモン類、補助因子、生物活性剤およびヌクレオシド、ヌクレオチド、および、ポリヌクレオチドを含む遺伝物質を含む。
【００６１】
標的化リガンドは、それ自体が両親媒性化合物（微小胞の他の構成要素と混合される）、または、微粒子の形成に用いられる両親媒性分子（例えばリン脂質）に結合された化合物であってよい。
【００６２】
好ましい一実施態様では、標的化リガンドは、共有結合を通して、微粒子の安定化エンベロープを形成している両親媒性分子（例えばリン脂質）に結合され得る。所望の標的化リガンドを共有結合するために、微粒子エンベロープを形成している両親媒性化合物の少なくとも一部は、したがって、適切な反応性部分を含み、相補官能性を含む標的化リガンドは、公知技術に従って、例えば微粒子の両親媒性構成要素を含む分散にそれを加えることによって、それに結合される。好ましくは、両親媒性化合物は、以前に述べられたもののような親水性ポリマーを保有する脂質、好ましくはペグ化リン脂質である。この場合では、標的化リガンドは、親水性ポリマー上の適切な反応性部分に連結される。両親媒性化合物は、微小胞を調製する前に所望の標的化リガンドと組み合わせられ得て、そのようにして得られた組み合わせは、微小胞の調製のために用いられ得る。あるいは、微小胞は、最初に製造されてよく、それは、標的化リガンドの対応する相補部分と相互作用することが可能な適切な部分を有する化合物（脂質またはポリマー改変脂質）を含み；その後に、所望の標的化リガンドが微小胞懸濁液に加えられて、微小胞上の対応する相補部分に結合する。代替の実施態様によれば、標的化リガンドは、物理的および／または静電気相互作用を介して微粒子と適切に関連されてもよい。
【００６３】
液体流
本発明の方法で用いられる液体は、例えば５．０〜２０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは７．５〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度で、好ましくは水性担体中に分散された、両親媒性材料（上記に定義）を含む。
【００６４】
好ましくは生理的に許容できる適切な水性担体は、水（好ましくは滅菌水）、生理食塩水などの水溶液（注入のための最終産物が低張でないように有利に平衡化され得る）、または、１つまたは複数の浸透圧調節物質の溶液を含む。浸透圧調節物質は、塩類または糖類、糖アルコール類、グリコール類または他の非イオン性ポリオール材料（例えばグルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなど）、キトサン誘導体、例えば、カルボキシメチルキトサン、トリメチルキトサンまたはゲル化化合物、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルスターチまたはデキストランを含む。
【００６５】
代替の実施態様では、特に、第一の流体流がガスである場合、治療的疎水性物質を微小胞内に取り込むためにさらなる油相が加えられ得る。この目的を達成するために、２つのさらなる導管が、例えば参考文献５によって説明されるように所望の油相を供給するために、装置において提供されてよい。形成された、ガスが充填された微小胞は、したがって、ガスと両親媒性材料の安定化層との間の界面に置かれた油のフィルムを有し、それは、所望の治療的薬剤とともにローディングされ得る。適切な油類は、室温で液体である任意の生体適合性の油を含んでよく、例えば、飽和または不飽和（Ｃ２−Ｃ１８）アルキル鎖とグリセロールのモノ−、ジ−またはトリ−エステル（ホモ−またはヘテロ−アルキルエステル類を含む）、例えば、グリセロールモノブチリン、グリセロールモノリノール酸、１，２−ジヘキサノイルグリセロール、１，２ジオクタノイルグリセロール、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロール、トリアセチン、トリブチリン、トリカプロイン、トリカプリリン、トリカプリン、およびそれらの混合物；または天然の油類、例えば、大豆油、オリーブ油、ベニバナ種子油、ヒマワリ種子油、ピーナッツ油およびそれらの混合物を含む。
【００６６】
第一の流体流
好ましい実施態様によれば、第一の流体流は、ガスまたはその前駆体である。
【００６７】
本発明のプロセスにおいて、任意の生体適合性ガス、ガス前駆体またはそれらの混合物が、微小胞の調製のために用いられ得る（以降、「微小胞形成ガス」としても定義される）。
【００６８】
ガスは、例えば、空気；窒素；酸素；二酸化炭素；水素；亜酸化窒素；希ガスまたは不活性ガス、例えば、ヘリウム、アルゴン、キセノンまたはクリプトン；低分子量炭化水素（例えば、７個までの炭素原子を含む）、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン、イソブタン、ペンタンまたはイソペンタンのようなアルカン、シクロブタンまたはシクロペンタンのようなシクロアルカン、プロペン、ブテンまたはイソブテンのようなアルケン、または、アセチレンのようなアルキン；エーテル；ケトン；エステル；ハロゲン化ガス、好ましくはフッ素化ガス、例えば、またはハロゲン化、フッ素化またはパーフルオロ化低分子量炭化水素（例えば、７個までの炭素原子を含む）；または任意の前述の混合物を含んでよい。ハロゲン化炭化水素が用いられる場合、前記化合物内のハロゲン原子の好ましくは少なくとも一部、より好ましくは全て、フッ素原子である。
【００６９】
フッ素化ガスが好ましく、特にパーフルオロ化ガスが好ましい。フッ素化ガスは、少なくとも１つのフッ素原子を含む材料、例えば、フッ素化炭化水素類（１つまたは複数の炭素原子およびフッ素を含む有機化合物）；六フッ化硫黄；フッ素化、好ましくはパーフルオロ化、ケトン類、例えば、パーフルオロアセトン；および、フッ素化、好ましくはパーフルオロ化、エーテル類、例えば、パーフルオロジエチルエーテルを含む。好ましい化合物は、パーフルオロ化ガス、例えば、ＳＦ６またはペルフルオロカーボン類（パーフルオロ化炭化水素類）、すなわち、全ての水素原子がフッ素原子によって置換されている、特に安定したガスが充填された微小胞の懸濁液を形成することが知られる、炭化水素類である。
【００７０】
用語ペルフルオロカーボンは、飽和、不飽和、および環状ペルフルオロカーボン類を含む。生体適合性の、生理的に許容できるペルフルオロカーボン類の例は：パーフルオロアルカン類、例えば、パーフルオロメタン、パーフルオロエタン、パーフルオロプロパン類、パーフルオロブタン類（例えば、場合によりペルフルオロ−イソブタンなどの他の異性体との混合で、ペルフルオロ−ｎ−ブタン）、パーフルオロペンタン類、パーフルオロヘキサン類またはパーフルオロヘプタン類；パーフルオロアルケン類、例えば、パーフルオロプロペン、パーフルオロブテン類（例えばパーフルオロブト−２エン）またはパーフルオロブタジエン；パーフルオロアルキン類（例えばパーフルオロブト−２−イン）；およびパーフルオロシクロアルカン類（例えばパーフルオロシクロブタン、パーフルオロメチルシクロブタン、パーフルオロジメチルシクロブタン類、パーフルオロトリメチルシクロブタン類、パーフルオロシクロペンタン、パーフルオロメチルシクロペンタン、パーフルオロジメチルシクロペンタン類、パーフルオロシクロヘキサン、パーフルオロメチルシクロヘキサンおよびパーフルオロシクロヘプタン）である。好ましい飽和ペルフルオロカーボン類は、例えば、ＣＦ４、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０、Ｃ５Ｆ１２およびＣ６Ｆ１４を含む。
【００７１】
任意の上記のガスの混合物を任意の比で用いることも有利であり得る。例えば、混合物は、従来のガス、例えば、窒素、空気または二酸化炭素、および、安定した微小胞懸濁液を形成するガス、例えば、六フッ化硫黄または上記に示されたとおりのペルフルオロカーボンを含んでよい。適切なガス混合物の例は、例えば参考文献６に見られ得る。以下の組み合わせが特に好ましい：ガス（Ａ）および（Ｂ）の組み合わせであって、ガス（Ｂ）は、以前に例示されたものの中で選択されるフッ素化ガスであり（それらの混合物を含む）、（Ａ）は、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物から選択される。ガス（Ｂ）の量は、混合物の合計の約０．５％〜約９５％ｖ／ｖ、好ましくは約５％〜８０％存在してよい。
【００７２】
特に好ましいガスは、任意選択で空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合物との混合での、ＳＦ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ１０またはそれらの混合物である。
【００７３】
特定の状況では、ガス状物質への前駆体（すなわち、インビボでガスに変換されることが可能な材料）を含むことが望ましくあり得る。好ましくは、ガス状前駆体およびそれに由来するガスは、生理的に許容できる。ガス状前駆体は、ｐＨ活性化、光活性化、温度活性化等され得る。例えば、特定のペルフルオロカーボン類は、温度活性化ガス状前駆体として用いられ得る。これらのペルフルオロカーボン類、例えば、パーフルオロペンタンまたはパーフルオロヘキサンは、室温（または薬剤が生産および／または保管される温度）よりも高いが体温よりも低い液相／気相遷移温度を有し；したがって、それらは、液相／気相転移を受けて、ヒトの体内でガスに変換され得る。
【００７４】
代替の実施態様によれば、第一の流体流の構成要素は液体であってよい。
【００７５】
一実施態様では、前記液体は、水と実質的に非混和性である。適切な液体は、例えば、参考文献１に挙げたものであり、例えばアルカン類、例えば分岐または好ましくは直鎖（Ｃ５−Ｃ１０）アルカン類、例えばペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン；アルケン類、例えば（Ｃ５−Ｃ１０）アルケン類、例えば１−ペンテン、２−ペンテン、１−オクテン；シクロ−アルカン類、例えば（Ｃ５−Ｃ８）−シクロアルカン類（１つまたは２つのメチル基によって置換されてよい）、例えばシクロペンタン、シクロヘキサン、シクロオクタン、１−メチル−シクロヘキサン；芳香族炭化水素類、例えば、ベンゼンおよび１つまたは２つのメチルまたはエチル基によって置換されたベンゼン誘導体、例えばベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、１，２−ジメチルベンゼン、１，３−ジメチルベンゼン；アルキルエーテル類およびケトン類、例えば、ジ−ブチルエーテルおよびジ−イソプロピルケトン；ハロゲン化炭化水素類またはエーテル類、例えば、クロロホルム、四塩化炭素、２−クロロ−１−（ジフルオロメトキシ）−１，１，２−トリフルオロエタン（エンフルラン）、２−クロロ−２−（ジフルオロメトキシ）−１，１，１−トリフルオロエタン（イソフルラン）、テトラクロロ−１，１−ジフルオロエタン、および特にパーフルオロ化炭化水素類またはエーテル類、例えば、パーフルオロペンタン、パーフルオロヘキサン、パーフルオロヘプタン、パーフルオロメチルシクロヘキサン、パーフルオロオクタン、パーフルオロノナン、パーフルオロベンゼンおよびパーフルオロデカリン、メチルパーフルオロブチルエーテル、メチルパーフルオロイソブチルエーテル、エチルパーフルオロブチルエーテル、エチルパーフルオロイソブチルエーテル；およびそれらの混合物を含む。
【００７６】
あるいは、前記液体は、例えばグリセロールのエステル類を含む生体適合性の油、または上記に挙げた天然油類であってよい。
【００７７】
第一の流体流の構成要素の沸騰温度に応じて、前記構成要素は、懸濁液の製造工程および／またはその後の保管の間に、異なる相遷移を経過し得る。
【００７８】
例えば、構成要素が相対的に低い沸点を有する場合（例えば室温よりもわずかに上）、それは室温で液体として供給され得て、それから、Ｔｍよりも高い加熱のためガス（または蒸気）へ変換されて、続いて再び液体で、最終的な微粒子において室温で保管される。あるいは、液体の構成要素は、ガスまたは蒸気としてそれを供給するためにその沸点よりも上（例えばＴｍまたはその付近）で加熱されてよく；室温での微粒子の冷却の際に、それから構成要素は凝縮して、したがって液体が充填された微小滴を提供する。
【００７９】
一実施態様によれば、校正された液体が充填された微小滴の生じた懸濁液は、凍結乾燥されたケークを得るためにその後の凍結乾燥プロセスを受けてよく、それから、例えば参考文献１に説明されるように、ガス（上記に例示したものなど）の雰囲気下でバイアル内に保管されてよい。ケークはそれから、適切な水性の液体を用いて穏やかな撹拌によって再構成されて、ガスが充填された微小胞の懸濁液を得ることができる。このケークにおいて、溶解保護剤（例えば参考文献１に例示されるものの１つ）が懸濁液へ、液体流または微小滴の形成された水性懸濁液へ直接添加され得る。
【００８０】
使用
本発明の方法によって調製される微粒子は、特に超音波および磁気共鳴を含む様々な診断および／または治療的技術において用いられ得る。
【００８１】
診断技術は、前臨床および臨床研究目的のための撮像を含む、ガスが充填された微小胞の使用が動物（ヒトを含む）の体の一部または部分の可視化を高めるのを可能にする任意の方法を含む。様々な撮像技術が、例えば、基本およびハーモニックＢモード撮像、振幅変調、パルスまたは転相撮像および基本およびハーモニックドップラー撮像を含む、超音波適用において用いられ得て；必要に応じて三次元撮像技術が用いられ得る。
【００８２】
診断使用のための微小胞は、例えばそれらのそれぞれの組成、撮像される組織または臓器および／または選択される撮像技術に依存して、患者のｋｇあたり約０．０１〜約１．０μＬのガスの濃度で（例えば注入によって）投与され得る。この一般的な濃度範囲は、もちろん、特定の撮像適用に応じて、例えば、振幅変調およびパルス反転撮像のような、非常に低い投与量でシグナルが観察され得る場合、変化し得る。
【００８３】
あり得る他の診断撮像適用は、シンチグラフィー、光撮像、および、Ｘ線位相コントラスト撮像を含むＸ線撮像を含む。
【００８４】
治療的技術は、患者の治療（上記に定義）の任意の方法を含み、それ自体として（例えば超音波が介在する治療  虚血性脳卒中、凝血溶解など）または治療的薬剤と組み合わせて（例えば、遺伝子治療またはワクチンとしての使用における、例えば、選択部位または組織への生体活性化合物の送達のため）、微粒子の使用を含み、それ自体によって、または、様々な物理的方法（例えば超音波が介在する送達を含む）による特定の活性化の際に、生物学的効果をインビトロおよび／またはインビボで与える要因となり、または与えることが可能である。
【００８５】
治療的処置のための微小胞は、例えばそれらのそれぞれの組成、治療される対象のタイプ、治療される組織または臓器および／または適用される治療的方法に依存して、典型的に、患者のｋｇあたり約０．０１〜約５．０μＬのガスの濃度で投与されてよい。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するのを助ける。
【実施例】
【００８６】
2019526551.tif 000002
【００８７】
実施例１
両親媒性材料の水性分散の調製
異なる相遷移温度（Ｔｍ）を有する両親媒性材料の２つの混合物を用いた：
Ｍ１：ＤＳＰＣ：ＤＰＰＡ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（Ｔｍ＝５５℃）
Ｍ２：ＤＰＰＣ：ＤＰＰＡ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００（Ｔｍ＝４４℃）
両方とも、８：１：１のモル比。
【００８８】
材料を、両親媒性材料の完全な溶解まで、６０℃での撹拌下で、２０ｍｇ／ｍＬの濃度において上記モル比で、２：１（体積比）クロロホルム／メタノール混合物に加えた。それから、減圧下で溶媒を蒸発させて、得られたフィルムを減圧下で一晩乾燥させた。それから、乾燥された材料を、撹拌下で３０分間、６０℃にて、グリセロール、プロピレングリコール、および水の混合物（ＧＰＷ、５：５：９０の体積比）中に、（「微小胞の調製」の部分に詳述される５〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度で）再分散させた。ＴＲＩＳバッファー（２０ｍＭ）を添加してｐＨ値を７に調節した。それから、チップ超音波処理器（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）を用いて分散を超音波処理して、材料を均質に分散させた。それから調製物を、ポリカーボネートフィルター（０．４５μｍポアサイズ）を用いて濾過して、室温まで冷却してガスを抜いた。
【００８９】
遷移温度の測定
両親媒性材料（純粋なＤＰＰＣまたはＤＳＰＣ、および、ＤＰＰＣ：ＤＰＰＡ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００またはＤＳＰＣ：ＤＰＰＡ：ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００の混合物）の遷移温度を、Ｔｚｅｒｏアルミニウム坩堝を備える工業用示差走査熱量計ＤＳＣ−Ｑ２０００（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ  ＵＳＡ）を用いて決定した。温度および熱の流れを含むシステム校正を、インジウム金属（融解エンタルピー２８．７１Ｊ／ｇ±０．５Ｊ／ｇ；融解開始温度１５６．６℃±０．２５℃）を用いて行なった。
【００９０】
ＧＰＷ／ＴＲＩＳにおける両親媒性材料（純粋または混合）の分散を、ＤＳＣ測定のために上述の手順に従って調製した（それぞれ約３０μＬ、濃度１０ｍｇ／ｍＬ）。
【００９１】
ＤＳＣ測定は、２０℃〜８０℃の温度範囲にわたって２℃／分の一定温度速度で加熱することによって行なわれた。窒素を５０ｍＬ／分の流速でガス抜きとして用いた。
【００９２】
結果を以下の表に示す：
2019526551.tif 000003
【００９３】
実施例２
ガスが充填された微小胞の調製
市販のチップホルダー（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，パートナンバー：３００００２４、３０００１０９、３００００２１）内に乗せられた市販のマイクロ流体フローフォーカシング装置（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、小液滴チップ、１４μｍエッチング深さ、パートナンバー３２００１３６）を用いて微小胞を合成して、チップからガスおよび液体供給チューブへの漏れを防いだ接続を可能にした（Ｐｅｅｋ  Ｕｐｃｈｕｒｃｈ，１／１６インチ  Ｏ．Ｄ、１５０μｍ  Ｉ．Ｄ．）。微小胞形成チャネルは、１７μｍの幅および１３５μｍの長さを有した。全体的なチャネル深さは１４μｍであった。チップおよびそのホルダーを、２０倍拡大対物（Ｏｌｙｍｐｕｓ，ＬＭＰＬＡＮ  ２０ｘ）およびＣＣＤカメラ（Ｌｕｍｅｎｅｒａ，ＬＭ１５６Ｍ）を備える倒立顕微鏡上に乗せられた光学的に透明な温度制御された水浴内に置いた。シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  ＰＨＤ４４００）を用いて液体並行流の速度を制御した。ガス（ＳＦ６）を、圧力センサー（Ｏｍｅｇａ，ＤＰＧ１０００Ｂ−３０Ｇ）に接続された調圧装置（Ｏｍｅｇａ，ＰＲＧ１０１−２５）を用いて圧力制御した。個々の微小胞は、記録された光学画像から自動的に検出されて、Ｍａｔｌａｂソフトウェア（Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）を用いてＰＣ上で、オフラインでそれらのサイズを測定した。２つの異なる液体並行流の速度を試験して（４５μＬ／分または５５μＬ／分）、それぞれ、滴下レジーム下で、またはより好ましい噴射レジーム下で、フローフォーカシング装置を運転した。
【００９４】
微小胞懸濁液を密封されたバイアル内に集めて、室温で保管した。
【００９５】
形成された微小胞を加熱する効果
図４ａ〜４ｅは、５〜１５ｍｇ／ｍＬの範囲の両親媒性材料の濃度で（それぞれ図４ａ〜４ｅ）、マイクロ流体チップ（図２に示されるものと同様）を含む恒温浴の異なる温度で、上記のように調製されたＤＳＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００懸濁液（Ｔｍ５５℃）の液体並行流を用いて得られた結果を示す。四角（■）は、滴下レジーム下で行なわれた実験を示し、一方で、三角（▲）は、より好ましい噴射レジーム下で行なわれた実験を示す。
【００９６】
これらの図において観察され得るように、微小胞の合体のパーセンテージ（Ｃ［％］）は、噴射レジームと比較して滴下レジームにおいて一般により低い。加えて、滴下および噴射レジーム下の両方とも、温度を上げることにより合体を減少させる有利な効果が明らかである。特に、噴射レジームを考慮すると、７．５ｍｇ／ｍＬの濃度に関して（図４ｂ）、両親媒性の混合物のＴｍ（５５℃）、またはそれよりも高くまで温度を上げることは、約１０％またはそれよりも少ない微小胞の合体をもたらす。さらに噴射レジームに焦点を合わせると、両親媒性材料のＴｍまたはそれよりも高く同様に加熱することは、１０ｍｇ／ｍＬの両親媒性材料の濃度に関して１％未満の合体を提供する（図４ｃ）。両親媒性材料の濃度を１５ｍｇ／ｍＬに増大することによって（図４ｅ）、同様の結果を室温で得ることができる。この場合、両親媒性材料の濃度は、５０％増大される必要があることに注意する。
【００９７】
これらの結果は、したがって、両親媒性材料のＴｍ付近に温度を維持することによって、（より低い温度での同一の調製に関して測定される、より高い合体と比較して）合体効果の減少を得ることができることを示す。結果は、温度を両親媒性材料のＴｍ付近に維持することにより、（熱が加えられない場合に必要とされるより高い濃度と比較して）実質的により低い濃度の両親媒性材料を用いて同様のパーセンテージの合体が得られ得ることをさらに示す。
【００９８】
図５は、１０ｍｇ／ｍＬの両親媒性材料の濃度で、恒温浴の異なる温度で、上記のように調製されたＤＰＰＣ／ＤＰＰＡ／ＤＰＰＥ−ＰＥＧ５０００懸濁液（Ｔｍ４４℃）の液体並行流を用いて得られた結果を示す。上述の結果と同様に、この場合においても、１％またはそれよりも少ない合体が、両親媒性材料のＴｍに近いまたはそれよりも高い温度に加熱した場合に得られる。
【００９９】
懸濁液を下流冷却する効果
微小胞の分散度に対する下流冷却の効果を評価するために、異なる冷却条件が試験された。
【０１００】
セットアップＡ（早期冷却の懸濁液）によれば、懸濁液は、微小胞形成の３ｍｓ後に（２０℃で）熱交換器を通過して、懸濁液の温度をＴｍよりも下へ、特に室温に、急に減少させた。したがって、恒温浴内のチップから出るチューブは、チップの出口からおよそ０．５ｍｍ後に熱交換器を通過した。
【０１０１】
セットアップＢ（後期冷却の懸濁液）によれば、懸濁液は、微小胞形成の３分後にようやく、同じ熱交換器を通過した。したがって、この２つ目の構成では、チップから出るチューブは、１ｍｍの内径を有するチューブによって置き換えられて、このチューブは、およそ２０ｃｍの長さを恒温浴内に維持されて、それから、熱交換器を通過した。
【０１０２】
両方のセットアップは、５５、６５および７５μＬ／分の流速で試験されて、結果をそれぞれ、図６ａ、６ｂおよび６ｃに示す（Ｘ軸＝直径（ｍｍ）、Ｙ軸＝数による微小胞の相対カウント）。図６ａ〜６ｃでは、破線は、後期冷却の調製のサイズ分布を示し、一方で、実線は、早期冷却の調製のサイズ分布を示す。これらの図から、早期冷却の懸濁液のＰＤＩは、対応する後期冷却の懸濁液のものと比較してより低いことが明らかである。さらに、これらの図から、微小胞の平均サイズは、流速の増大に伴い低減することが理解され得る。
【０１０３】
同様の結果が、両親媒性材料の他の混合物、特に、以前に例示された両親媒性材料の組み合わせによって得られ得る。
【０１０４】
引用文献
2019526551.tif 000004
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質を含む両親媒性材料の層によって安定化された、ガスが充填された微小胞の懸濁液を調製する方法であって、
前記方法は：
−第一の流体流、および、別個に、前記両親媒性材料を含む液体流を提供するステップ；
ここで前記第一の流体流はガスである
−前記の第一の流体流および前記の液体流を、それぞれの取水路を通して接触ゾーンに向けて方向付けるステップ；
−前記の第一の流体流および前記の液体流を、前記接触ゾーンから、校正されたオリフィスを通して方向付けて、前記微小胞を含む懸濁液を得るステップ；および
−前記微小胞を含む前記懸濁液を、排水路に向けて方向付けるステップ；
を含み、
ここで、前記排水路の最初の部分は、前記両親媒性材料の遷移温度に対して２０％低い温度よりも低くない制御された温度（℃）で維持される、
方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記の制御された温度（℃）は、前記両親媒性材料の遷移温度に対して１０％低い温度よりも低くない温度である、
方法。
【請求項３】
請求項１および２のいずれか一項に記載の方法であって、
前記の最初の部分は、水性懸濁液が前記排水路において実質的に定常速度に到達するのに十分な長さ伸長する、
方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、
前記の最初の部分は、前記の校正されたオリフィスから０．１ｍｍ〜１００ｍｍ伸長する、
方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、
前記の最初の部分は、前記の校正されたオリフィスから１ｍｍ〜５０ｍｍ伸長する、
方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、
前記の最初の部分は、前記の校正されたオリフィスから２ｍｍ〜３０ｍｍ伸長する、
方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法であって、
前記の接触ゾーンおよび前記の校正されたオリフィスもまた、前記の制御された温度で維持される、
方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか一項に記載の方法であって、
前記微小胞を含む前記懸濁液は、その後、前記両親媒性材料の前記遷移温度よりも低い温度で冷却される、
方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記の冷却は、前記微小胞の形成から６０秒以内に生じる、
方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、
前記冷却は、前記微小胞の形成から５秒以内に生じる、
方法。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記懸濁液は、前記両親媒性材料の前記遷移温度よりも少なくとも５％低い温度（℃）で冷却される、
方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記懸濁液は、前記両親媒性材料の前記遷移温度よりも少なくとも１０％低い温度（℃）で冷却される、
方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法であって、
前記リン脂質は、ホスファチジルコリン、エチルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールまたはスフィンゴミエリンの脂肪酸ジエステルから選択される、
方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ガスは、フッ素化ガスを含む、
方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、
前記ガスは、ガス（Ａ）および（Ｂ）の混合であって、ここでガス（Ｂ）は、フッ素化ガスであり、ガス（Ａ）は、空気、酸素、窒素、二酸化炭素またはそれらの混合から選択される、
方法。