【手続補正書】
【提出日】令和2年12月4日(2020.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レバウジオシドＤ４を含むステビオール配糖体組成物を製造する方法であって、配列番号７又は配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼである組換えポリペプチド、及びＵＤＰ−グルコースと共に、レバウジオシドＥを含む基質を反応混合物中でインキュベートすることを含み、それによってレバウジオシドＥが前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼによりレバウジオシドＤ４に変換され、
レバウジオシドＤ４が以下の化学構造を有する、
2020511132.tif 000001

前記方法。
【請求項２】
前記基質が、前記反応混合物中で、ステビオシドのレバウジオシドＥへの変換により提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
スクロース、ＵＤＰ及びＵＤＰ−グルコースの存在下、前記基質及び前記組換えポリペプチドと共に組換えスクロースシンターゼをインキュベートすることをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記組換えスクロースシンターゼが、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ１、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ３及びビグナ・ラディアテ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔｅ）スクロースシンターゼからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記スクロースシンターゼがアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）スクロースシンターゼ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えポリペプチドが、配列番号７のＣ１ｍ２である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えポリペプチドが、配列番号９のＣ１ｍ３である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ステビオール配糖体組成物中のレバウジオシドＤ４をレバウジオシドＭに変換することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
配列番号１のＵＧＴ７６Ｇ１、配列番号３のＣＰ１、及び配列番号１３のＣＲ１から選択される酵素によりレバウジオシドＤ４をレバウジオシドＭに変換する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＨＶ１酵素によりステビオシドをレバウジオシドＥに変換する、請求項２〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号８又は配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むベクターにより形質転換された宿主細胞において、前記組換えポリペプチドを発現させる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロサイナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アルツロボトリス属（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ）、ブレビバクテリア属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、及びクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
甘味料としての使用のために、前記ステビオール配糖体組成物からレバウジオシドＤ４又はレバウジオシドＭを精製することさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
レバウジオシドＤ４又はレバウジオシドＭを甘味料組成物に組み込むことをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
得られたステビオール配糖体組成物を甘味料組成物に組み込むことをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５４】
産業上の利用可能性／技術分野の記述
本開示は、食品、飼料、飲料、および薬理学的な産業における適用性を有する。本開示は、一般に、改変された微生物株によるステビオール配糖体の生合成製造法に関する。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕配列番号７のアミノ酸配列を含む突然変異体ＣＰ１酵素。
〔２〕配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
〔３〕配列番号８のヌクレオチド配列を含む核酸。
〔４〕配列番号８に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸。
〔５〕配列番号９のアミノ酸配列を含む突然変異体ＣＰ１酵素。
〔６〕配列番号９に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
〔７〕配列番号１０のヌクレオチド配列を含む核酸。
〔８〕配列番号１０に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸。
〔９〕配列番号１１のアミノ酸配列を含む突然変異体ＨＶ１酵素。
〔１０〕配列番号１１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
〔１１〕配列番号１２のヌクレオチド配列を含む核酸。
〔１２〕配列番号１２に対して少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸。
〔１３〕配列番号７のアミノ酸配列を有するＣ１ｍ２酵素を産生することができるベクターを含む宿主細胞。
〔１４〕前記宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌、シアノバクテリア藻類及び植物細胞からなる群から選択される、前記〔１３〕に記載の宿主細胞。
〔１５〕前記宿主細胞が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロサイナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アルツロボトリス属（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ）、ブレビバクテリア属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）  コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からなる群から選択される、前記〔１３〕に記載の宿主細胞。
〔１６〕前記宿主細胞が、大豆、菜種、ヒマワリ、ワタ、コーン、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、オート麦、ソルガム、イネ、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、パースニップ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、グラスシード作物、サトウダイコン、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライ麦、アマ、広葉樹、針葉樹、飼料草、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｙｕｌｇａｒｅ）、スイッチグラス（パニクム・ヴィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｇｒａｔｕｍ））、ヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）種、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、及びクランベ・アビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）からなる群から選択される植物から単離された細胞である、前記〔１３〕に記載の宿主細胞。
〔１７〕ステビオール配糖体組成物を製造する方法であって、配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドと共に基質をインキュベートすることを含む方法。
〔１８〕前記組換えポリペプチドが、配列番号７に対して少なくとも８０％の同一性を有するＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼである、前記〔１７〕に記載の方法。
〔１９〕前記基質が、ステビオシド又はレバウジオシドＥ及びこれらの組合せからなる群から選択される、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２０〕前記方法により製造されるステビオール配糖体化合物がレバウジオシドＤ４であり、前記ステビオール配糖体組成物がレバウジオシドＤ４を含む、前記〔１７〕に記載の方法。
〔２１〕前記〔２０〕に記載の方法によって製造されたステビオール配糖体組成物を含む甘味料。
〔２２〕レバウジオシドＤ４を製造する方法であって、配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドと共に基質をインキュベートすることを含む方法。
〔２３〕前記基質が、Ｒｅｂ  Ｅ、ステビオシド、及びこれらの組合せからなる群から選択される、前記〔２２〕に記載の方法。
〔２４〕前記基質及び前記組換えポリペプチドと共に組換えスクロースシンターゼをインキュベートすることをさらに含む、前記〔２３〕に記載の方法。
〔２５〕レバウジオシドＤ４をレバウジオシドＥから合成するための方法であって、
レバウジオシドＥと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）及びウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群から選択される基質と、Ｃ１ｍ２とを含む反応混合物を調製することと、
前記反応混合物を、レバウジオシドＤ４を生成するのに十分な時間にわたってインキュベートすることと
を含み、前記レバウジオシドＥにグルコースが共有結合されて、レバウジオシドＤ４が生成される、方法。
〔２６〕前記反応混合物にスクロースシンターゼを添加することをさらに含む、前記〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ１、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ３及びビグナ・ラディアテ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔｅ）スクロースシンターゼからなる群から選択される、前記〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕前記スクロースシンターゼがアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）スクロースシンターゼ１である、前記〔２７〕に記載の方法。
〔２９〕レバウジオシドＤ４をレバウジオシドＥから合成するための方法であって、
レバウジオシドＥと、スクロース、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）及びウリジン二リン酸グルコース（ＵＤＰ−グルコース）からなる群から選択される基質と、Ｃ１ｍ３とを含む反応混合物を調製することと、
前記反応混合物を、レバウジオシドＤ４を生成するのに十分な時間にわたってインキュベートすることと
を含み、前記レバウジオシドＥにグルコースが共有結合されて、レバウジオシドＤ４が生成される、方法。
〔３０〕前記反応混合物にスクロースシンターゼを添加することをさらに含む、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３１〕前記スクロースシンターゼが、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ１、アラビドプシス属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）スクロースシンターゼ３及びビグナ・ラディアテ（Ｖｉｇｎａ  ｒａｄｉａｔｅ）スクロースシンターゼからなる群から選択される、前記〔３０〕に記載の方法。
〔３２〕前記スクロースシンターゼがアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）スクロースシンターゼ１である、前記〔３１〕に記載の方法。
〔３３〕生成された前記Ｒｅｂ  Ｄ４が７０％を超えて純粋である、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３４〕前記反応混合物にＨＶ１酵素を添加することをさらに含む、前記〔２９〕に記載の方法。
〔３５〕前記反応混合物にＨＶ１酵素を添加することをさらに含む、前記〔２５〕に記載の方法。
〔３６〕配列番号５を含むＧＸＴ６酵素。
〔３７〕配列番号６のヌクレオチド配列を含む核酸。
〔３８〕配列番号５に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド。
〔３９〕配列番号３を含むＣＰ１酵素。
〔４０〕配列番号４のヌクレオチド配列を含む核酸。
〔４１〕配列番号９のアミノ酸配列を有するＣ１ｍ３酵素を産生することができるベクターを含む宿主細胞。
〔４２〕前記宿主細胞が、細菌、酵母、糸状菌、シアノバクテリア藻類及び植物細胞からなる群から選択される、前記〔４１〕に記載の宿主細胞。
〔４３〕前記宿主細胞が、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロサイナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロミセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アルツロボトリス属（Ａｒｔｈｒｏｂｏｔｌｙｓ）、ブレビバクテリア属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ）、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）  コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、及びクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）からなる群から選択される、前記〔４１〕に記載の宿主細胞。
〔４４〕前記宿主細胞が、大豆、菜種、ヒマワリ、ワタ、コーン、タバコ、アルファルファ、小麦、大麦、オート麦、ソルガム、イネ、ブロッコリー、カリフラワー、キャベツ、パースニップ、メロン、ニンジン、セロリ、パセリ、トマト、ジャガイモ、イチゴ、ピーナッツ、ブドウ、グラスシード作物、サトウダイコン、サトウキビ、豆、エンドウ豆、ライ麦、アマ、広葉樹、針葉樹、飼料草、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、イネ（オリザ・サティバ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））、ホルデウム・ウルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｙｕｌｇａｒｅ）、スイッチグラス（パニクム・ヴィルガツム（Ｐａｎｉｃｕｍ  ｖｉｇｒａｔｕｍ））、ヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）種、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、及びクランベ・アビシニカ（Ｃｒａｍｂｅ  ａｂｙｓｓｉｎｉｃａ）からなる群から選択される植物から単離された細胞である、前記〔４１〕に記載の宿主細胞。