【手続補正書】
【提出日】令和3年10月29日(2021.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＶウイルスベクターの製造方法であって、
ａ．接着細胞を培養すること；
ｂ．前記接着細胞に１つ又は複数のプラスミドをトランスフェクトして前記ＡＡＶウイルスベクターの産生を可能にすること；
ｃ．前記接着細胞を溶解させて前記ＡＡＶウイルスベクターを単離すること；
ｄ．前記（ｃ）の細胞ライセートを酸性化及び清澄化すること；
ｅ．前記（ｄ）の産物を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製すること；
ｆ．前記（ｅ）の産物をタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いてろ過すること；
ｇ．前記（ｆ）の産物を塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液中で超遠心すること；及び
ｈ．前記（ｇ）の産物から前記ＡＡＶウイルスベクターを回収すること
を含む方法。
【請求項２】
ａ．前記ＡＡＶがＡＡＶ９である、及び／又は
ｂ．前記ＡＡＶが自己相補的（ｓｃＡＡＶ）である、及び／又は
ｃ．前記接着細胞がＨＥＫ２９３細胞であり、場合により、ステップ（ａ）が、細胞培養培地の連続循環を提供することができる大規模バイオリアクターに前記細胞を播種することを含み、好ましくは前記播種密度が約８，０００〜１２，０００細胞／ｃｍ２である、及び／又は
ｄ．トランスフェクションステップ（ｂ）が、アデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＨＥＬＰ）、並びにＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子及びＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドを前記接着細胞に接触させることを含み、場合により前記ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子がｒｅｐ２であり、前記ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子がｃａｐ９であり、及び／又は
ｅ．トランスフェクションステップ（ｂ）が、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＭｅＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はＳＯＤ１  ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドを前記接着細胞に接触させることを含み、場合により、
ｉ．ＳＭＮ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む前記プラスミドが、修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及びＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、及び／又は
ｉｉ．前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、
ｆ．前記ＡＡＶウイルスベクターが配列番号１を含む、及び／又は
ｇ．トランスフェクションステップが、トランスフェクション剤ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を前記接着細胞に接触させることを含む、及び／又は
ｈ．トランスフェクションステップが、血清、カルシウム、グルタミンのいずれも含有しないトランスフェクション培地を前記接着細胞に接触させることを含む、及び／又は
ｉ．溶解するステップが、ベンゾナーゼ及びＴＷＥＥＮを補足した溶解緩衝液を使用することを含む、及び／又は
ｊ．ステップ（ｃ）の細胞ライセートを前記（ｄ）の酸性化ステップ前に凍結することを更に含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞培養ライセートからのＡＡＶウイルスベクターの精製方法であって、
ａ．前記細胞ライセートを酸性化及び清澄化するステップ；
ｂ．前記（ａ）の産物を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）を用いて精製するステップ；
ｃ．前記（ｂ）の産物をタンジェンシャルフローろ過でろ過するステップ；
ｄ．前記（ｃ）の産物を２〜４Ｍ塩化セシウム（ＣｓＣｌ）緩衝液を用いて超遠心するステップ；
ｅ．前記（ｄ）の産物から前記ＡＡＶウイルスベクターを収集するステップ；及び
ｆ．前記（ｅ）の産物をタンジェンシャルフローろ過でろ過するステップ
を含む方法。
【請求項４】
ａ．酸性化ステップが、前記細胞ライセートを約３．０〜４．０のｐＨに酸性化することを含む、及び／又は
ｂ．前記超遠心が４０，０００〜５０，０００ｒｐｍで実施される、及び／又は
ｃ．前記ＣｓＣｌ緩衝液が約３Ｍ  ＣｓＣｌ、トリス、ＭｇＣｌ２、及びポロキサマー１８８を含み、約ｐＨ７．５〜８．５である、及び／又は
ｄ．前記細胞ライセートが酸性化ステップの前にＴｗｅｅｎと共にインキュベートされる、及び／又は
ｅ．前清澄化ステップが、前記細胞ライセートをデプスフィルタでろ過することを含む、及び／又は
ｆ．前記ＣＥＸがスルホニル樹脂を含む、及び／又は
ｇ．少なくとも１つのＴＦＦステップが、３００ｋＤａ  ＭＷの分子量カットオフのセルロース膜を使用することを含む、及び／又は
ｈ．空のウイルスカプシドの数が、前記超遠心した細胞ライセートから前記ＡＡＶウイルスベクターを収集した後の総ウイルスカプシドの７％未満、５％未満、３％未満、又は１％未満である、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ａ．２回目のＴＦＦステップ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターが、トリス、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、及びポロキサマー１８８を含む溶液中に貯蔵され、ｐＨが約ｐＨ７．５〜８．５である、及び／又は
ｂ．２回目のＴＦＦ後に収集される前記ＡＡＶウイルスベクターが、約３０μｇ／ｇ未満又は約２０μｇ／ｇ未満のＣｓＣｌを含有する、及び／又は
ｃ．２回目のＴＦＦ後に収集されるＡＡＶウイルスベクターの濃度が約３×１０１３ｖｇ／ｍｌ以上である、
請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
ａ．産生されるＡＡＶ収率が、製造バッチ当たり５×１０１５ｖｇ超、又は８×１０１５ｖｇ超又は１×１０１６ｖｇ超である、及び／又は
ｂ．前記ＡＡＶベクターが、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＭｅＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はＳＯＤ１  ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法により製造される、ＡＡＶ９ウイルスベクターを含む医薬組成物。
【請求項８】
以下のうちの少なくとも１つ：
ａ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、
ｂ．約３０μｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、
ｃ．約２０〜８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、
ｄ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、
ｅ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留プラスミドＤＮＡ、
ｆ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、
ｇ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、
ｈ．約ｐＨ７．７〜８．３、
ｉ．約３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、
ｊ．容器当たり約６００個未満の≧２５μｍサイズの粒子、
ｋ．容器当たり約６０００個未満の≧１０μｍサイズの粒子、
ｌ．約１．７×１０１３〜２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、
ｍ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８〜８．４×１０１０ＩＵの感染力価、
ｎ．１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００〜３００μｇの全タンパク質、
ｏ．約７０〜１３０％の相対効力、及び
ｐ．約５％未満の空のカプシド
を含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ａ．１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）；
ｂ．約７％未満の空のウイルスカプシド；
ｃ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約１００ｎｇ／ｍＬ未満の宿主細胞タンパク質；
ｄ．１×１０１３ｖｇ／ｍＬ当たり約５×１０６ｐｇ／ｍＬ未満の残留宿主細胞ＤＮＡ
を含む医薬組成物であって；
前記１〜８×１０１３ＡＡＶ９ウイルスベクターゲノム／ｍＬの少なくとも約８０％が機能性である、医薬組成物。
【請求項１０】
ａ．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＭｅＣＰ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はＳＯＤ１  ｓｈＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む、及び／又は
ｂ．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが、修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、修飾ＳＶ４０後期１６ｓイントロン、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナル、及び非修飾ＡＡＶ２  ＩＴＲを含む、及び／又は
ｃ．前記ＡＡＶ９ウイルスベクターが配列番号１を含む、及び／又は
ｄ．組成物が、１．７〜２．３×１０１３ＡＡＶ９ｖｇ／ｍＬを含む、及び／又は
ｅ．組成物が、水性医薬製剤であり、場合により
ｉ．前記水性医薬製剤が、トリス緩衝液、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、及びポロキサマー１８８を含む、及び／又は
ｉｉ．前記水性医薬製剤が保存剤を含まない、
請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２のＳＭＮタンパク質をコードする、請求項１０ａ又は１０ｂに記載の医薬組成物。
【請求項１２】
（i）前記トリス緩衝液濃度が約１０〜３０ｎＭである、
（ii）前記製剤のｐＨが約７．７〜約８．３である、
（iii）前記ＭｇＣｌ２濃度が約０．５〜１．５ｍＭである、
（iｖ）前記ＮａＣｌ濃度が約１００〜３００ｍＭである、
（ｖ）前記製剤が、約０．００５％ｗ／ｖのポロキサマー１８８を含む、又は
（ｖi）前記水性医薬製剤が、３９０〜４３０ｍＯｓｍ／ｋｇのオスモル濃度を有する、請求項１０ｅ（ｉ）又は１０ｅ（ｉｉ）に記載の組成物。
【請求項１３】
それを必要としている患者におけるＩ型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療のための請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物であって、前記患者が、
ａ．９ヵ月齢以下であり；
ｂ．少なくとも約２．６ｋｇの体重であり；
ｃ．両アレル性ＳＭＮ１ヌル突然変異又は欠失を有し；及び
ｄ．ＳＭＮ２の少なくとも１つの機能性コピーを有する、組成物。
【請求項１４】
ａ．前記ウイルスベクターが約１〜２．５×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量で投与される、及び／又は
ｂ．前記患者が約８．５ｋｇ以下の体重である、及び／又は
ｃ．前記患者がＳＭＮ２遺伝子の少なくとも１つのコピーのエクソン７にｃ．８５９Ｇ＞Ｃ置換を有しない、及び／又は
ｄ．前記組成物が６ヵ月齢より前に、又は筋緊張低下、運動技能遅滞、定頸不全、円背姿勢及び関節過度可動性から選択される１つ以上のＳＭＡ症状が発生する前に前記患者に投与される、及び／又は
ｅ．前記ウイルスベクターが、約５〜２０ｍＬ／ｋｇ、約１０〜２０ｍＬ／ｋｇ、又は約５．５〜６．５ｍＬ／ｋｇのトリス緩衝生理食塩水で投与される、及び／又は
ｆ．有効性がＣＨＯＰ−ＩＮＴＥＮＤ尺度を用いて決定される、及び／又は
ｇ．２．６〜３．０ｋｇの体重の患者について１６．５ｍＬの用量、３．１〜３．５ｋｇの体重の患者について１９．３ｍＬの用量、３．６〜４．０ｋｇの体重の患者について２２．０ｍＬの用量、４．１〜４．５ｋｇの体重の患者について２４．８ｍＬの用量、４．６〜５．０ｋｇの体重の患者について２７．５ｍＬの用量、５．１〜５．５ｋｇの体重の患者について３０．３ｍＬの用量、５．６〜６．０ｋｇの体重の患者について３３．０ｍＬの用量、６．１〜６．５ｋｇの体重の患者について３５．８ｍＬの用量、６．６〜７．０ｋｇの体重の患者について３８．５ｍＬの用量、７．１〜７．５ｋｇの体重の患者について４１．３ｍＬの用量、７．６〜８．０ｋｇの体重の患者について４４．０ｍＬの用量、及び８．１〜８．５ｋｇの体重の患者について４６．８ｍＬの用量からなる群より選択される用量容積で投与される、及び／又は
ｈ．前記組成物が、髄腔内又は静脈内注入によってそれを必要としている患者に投与され、場合により、前記ウイルスベクターが約４５〜７５分かけて注入される、
請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
生存運動ニューロン（ＳＭＮ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、且つｐＨ７．７〜８．３、で２０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％ｗ／ｖポロキサマー１８８中約２．０×１０１３ｖｇ／ｍＬの濃度で製剤化された約５．５ｍＬ又は約８．３ｍＬのＡＡＶ９ウイルスベクターを含むバイアルを含むキット。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか一項に記載により製造される、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物又は製剤であって、疾患発症を伴う又は伴わない脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）Ｉ型小児患者の治療のための組成物。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載により製造される、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又は請求項７〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む、Ｉ型脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の治療のためのキット。
【請求項１８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載により製造される、ＳＭＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８３】
本試験においては、先行ベクターバッチ（以下、先行バッチ）を使用して、０．９％生理食塩水を使用した０（ゼロ）用量（未治療群）を含む５つの異なる用量レベルで薬物製品（以下、サンプルバッチ）を投与したときのＳＭＡΔ７マウスの生存期間中央値（日）の間の線形相関を決定した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８５】
先行バッチ参照標準の線形回帰曲線を薬物製品サンプルバッチ線形回帰曲線と比較することにより、薬物製品サンプルバッチの相対効力を確立した。これは、各線形回帰線（即ち、参照標準及び試験物質）のｙ切片及び傾きの比を用いることにより達成された。パーセント相対効力計算は、以下の式（１）に記述される：  ％ＲＰ＝［（試験物質のｙ切片／傾き）÷（参照標準のｙ切片／傾き）］×１００（１）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８８】
Δ７マウスモデルを使用して、薬物製品を含めたＳＭＡ療法の有効性を実証した。ＴＦＦ３緩衝溶液（媒体）治療対照動物は信頼できるベースライン対照を提供し、それからの生存期間中央値の増加として製品効力を測定することができる。薬物製品による開発作業では、投与用量（ｖｇ／ｋｇ）を対数変換して、治療されたＳＭＡΔ７新生仔マウスの生存期間中央値（日数単位）に対してプロットしたとき線形相関でマウスモデルの生存に影響を及ぼすドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いたゲノム力価によって決定される３つの用量（媒体治療用量を除く）が同定された。低力価、中間力価、及び高力価標準については、表１１の標準力価（ｖｇ／ｍＬ）を参照のこと。加えて、検量線ゼロ点並びに陰性対照の両方にＴＦＦ緩衝液（媒体）溶液が使用される。≧４０日の生存期間を実証する用量（生存期間中央値の倍増を実証する用量より高い）もまた、陽性対照として含めた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９５】
参照標準用量反応曲線の受入れ限界
投与用量（ｖｇ／ｍＬ）に対して生存期間中央値（日）をプロットする参照標準線形用量反応曲線について、アッセイ適合性判定基準が決定されることになる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５６】
第１相臨床試験に使用したＡＶＸＳ−１０１に関して同等性試験を完了した。評価は、ネーションワイド小児（Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ）で製造された第１相臨床薬物製品ロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３及びＡｖｅＸｉｓで製造されたＡＶＸＳ−１０１薬物製品ロット６００１５６を使用して実施した。加えて、工程Ｂロット６００１５６及び６００３０７を使用して製造の一貫性を判定した。同等性評価（工程Ａ対工程Ｂ）及び製造の一貫性（工程Ｂロット６００１５６対６００３０７）の両方について、本試験では、新規改良された工程及び分析的方法を用いてＡＶＸＳ−１０１臨床試験材料のアイデンティティ、品質、純度を判定し、同等性及び製造の一貫性のロバストな評価を可能にした。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５７】
定量的品質特性に関して統計的分析を実施した。比較は工程ＡロットＮＣＨＡＡＶ９ＳＭＮ０６１３と工程Ｂロット６００１５６との間でペアワイズで実施した。工程Ａと比べて工程Ｂの方が、より高純度でより多量のウイルスベクターを産生した良好な方法であった。例えば、工程Ａと比較したとき、工程Ｂによって産生されたウイルスベクターは、感染力価が高く、ゲノム力価（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｉｅｒ）が８％高く、１０μｍ径超のサブビジブル粒子が９２％少なく、２５μｍ径超のサブビジブル粒子が５０％少なく、空のカプシドが１００％少なく、及び残留ｈｃＤＮＡが１１％少なかった。結果は全て、各品質特性の試験限界と比べて一貫性があった。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９６】
本試験においては、先行ベクターバッチ（以下、先行バッチ）を使用して、０．９％生理食塩水を使用した０（ゼロ）用量（未治療群）を含む５つの異なる用量レベルで薬物製品を投与したときのＳＭＡΔ７マウスの生存期間中央値（日）の間の線形相関を決定した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９８】
これは、各線形回帰線（即ち、参照標準及び試験物質）のｙ切片及び傾きの比を用いることにより達成された。パーセント相対効力計算は、以下の式（１）に記述される：
％ＲＰ＝［（試験物質のｙ切片／傾き）÷（参照標準のｙ切片／傾き）］×１００（１）
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４００
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０１】
Δ７マウスモデルを使用して、薬物製品を含めたＳＭＡ療法薬の有効性を実証した。未治療又は生理食塩水治療対照動物は信頼できるベースライン対照を提供し、それからの生存期間中央値の増加として製品効力を測定することができる。薬物製品による開発作業では、投与用量（ｖｇ／ｋｇ）を対数変換して、治療されたＳＭＡΔ７新生仔マウスの生存期間中央値（日数単位）に対してプロットしたとき線形相関でマウスモデルの生存に影響を及ぼすドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いたゲノム力価によって決定される３つの用量（媒体治療用量を除く）が同定された。低力価、中間力価、及び高力価標準については、表２６の標準力価（ｖｇ／ｍＬ）を参照のこと。加えて、検量線ゼロ点並びに陰性対照の両方にＴＦＦ緩衝液（媒体）溶液が使用される。≧４０日の生存期間を実証する用量（生存期間中央値の倍増を実証する用量より高い）もまた、陽性対照として含めた。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０８】
参照標準用量反応曲線の受入れ限界
投与用量（ｖｇ／ｍＬ）に対して生存期間中央値（日）をプロットする参照標準線形用量反応曲線について、アッセイ適合性判定基準が決定されることになる。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１７−２】
2021502123.tif 000001
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１８】
2021502123.tif 000002
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１９】
2021502123.tif 000003
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２０】
2021502123.tif 000004