【手続補正書】
【提出日】令和3年5月17日(2021.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
【図１】目的標的遺伝子座におけるアデニンを標的として脱アミノ化するための、本発明の実施形態例を示す。
【図２】Ｃｐｆ１とアデノシンデアミナーゼとの融合タンパク質の実施形態例（ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＡｓＣｐｆ１−リンカー−ｈＡＤＡＲ２ｄ（野生型））のアミノ酸配列を示す。
【図３】Ｃｐｆ１とアデノシンデアミナーゼとの融合タンパク質の実施形態例（ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＡｓＣｐｆ１（Ｒ１２２６Ａ）−リンカー−ｈＡＤＡＲ２ｄ（Ｅ４８８Ｑ））のアミノ酸配列を示す。
【図４】Ｃｐｆ１とアデノシンデアミナーゼとの融合タンパク質の実施形態例（ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＡｓＣｐｆ１（Ｄ９０８Ａ）−リンカー−ｈＡＤＡＲ２ｄ（Ｅ４８８Ｑ））のアミノ酸配列を示す。
【図５】Ｃｐｆ１とアデノシンデアミナーゼとの融合タンパク質の実施形態例（ＮＬＳ−ＦＬＡＧ−ＡｓＣｐｆ１（Ｅ９９３Ａ）−リンカー−ｈＡＤＡＲ２ｄ（Ｅ４８８Ｑ））のアミノ酸配列を示す。
【図６】ｈｕＡＤＡＲ２ｄとＳｐＣａｓ９との融合体、ならびにｈｕＡＤＡＲ２ｄとＡｓＣｐｆ１との融合体を示す。ＡからＧへの変換用として、ＡｓＣｐｆ１について４つのコンストラクト、及びＳｐＣａｓ９について４つのコンストラクトを調製した。ＡｓＣｐｆ１のニッカーゼバージョン（Ｒ１２２６Ａ）及びＳｐＣａｓ９のニッカーゼバージョン（Ｎ８６３Ａ）を、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメイン（ＡＤＡＲ）のＮ末端またはＣ末端に融合させた。さらに、ＳｐＣａｓ９からＨＮＨドメインを除去するか、またはＡｓＣｐｆ１からＮｕｃドメインを除去することによって欠失コンストラクトを生成させることで、ＡＤＡＲに対する立体障害を低減させた。
【図７】ＡＤＡＲ融合体のための欠失コンストラクトを示す。ＡｓＣｐｆ１のアミノ酸１０７６〜１２５８をＧＳＧＧリンカーで置き換え、ＳｐＣａｓ９のアミノ酸７６９〜９１８をＧＧＳＧＧＳリンカーで置き換えた。
【図８】ＨＥＫ細胞におけるＡＤＡＲ融合体の発現を示す。異なるＡＤＡＲ融合体コンストラクトまたはＨＮＨ／Ｎｕｃ欠失コンストラクトをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションしてタンパク質発現を確認した。トランスフェクションから２日後に細胞を収集し、ＲＩＰＡ緩衝液を使用してタンパク質を抽出した。細胞溶解液５ｕｌをウエスタンブロットに使用し、このウエスタンブロットでは、Ｆｌａｇタグ（ＳｐＣａｓ９）またはＨＡタグ（ＡｓＣｐｆ１）に対する抗体を使用した。
【図９】ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＲＮＡ標的のＡからＧへの変換をプログラムするためのガイド設計を示す。
【図１０】ＨＥＫ２９３細胞におけるｍＲＮＡ標的のＡからＧへの変換をプログラムした結果を示す。
【図１１】ＨＥＫ２９３細胞におけるヒトＤＮＭＴ１が標的となり、ＡからＧへの塩基編集が生じることを示す。ＡｓＣｐｆ１（Ｒ１２２６Ａ）−ＡＤＡＲ２ｄ融合コンストラクト及びＡｓＣｐｆ１（デルタＮｕｃ）−ＡＤＡＲ２ｄ融合コンストラクトが、ヒトＤＮＭＴ１遺伝子を標的とするガイドＲＮＡと複合体化すると、野生型ＡｓＣｐｆ１対照コンストラクト及びＡＤＡＲ２ｄ対照コンストラクト（配列番号９４及び９５）とは対照的に、ＡからＧへの塩基編集が標的化され、検出可能なレベルで生じることが、それぞれの融合コンストラクトによって示された。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
本発明の方法において使用するための適切なリンカーは、当業者によく知られており、こうしたリンカーには、限定されないが、直鎖または分岐鎖の炭素リンカー、ヘテロ環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが含まれる。しかしながら、本明細書で使用されるように、リンカーは、共有結合（炭素−炭素結合または炭素−ヘテロ原子結合）でもあり得る。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質とアデノシンデアミナーゼとを、それぞれのタンパク質がその必要機能特性を確実に保持する上で十分な距離をとって分離するためにリンカーが使用される。好ましいペプチドリンカー配列は、可動性の広がった立体構造を取り、秩序だった二次構造を取る傾向を示さないものである。ある特定の実施形態では、リンカーは、単量体、二量体、多量体、またはポリマーであり得る化学的部分であり得る。好ましくは、リンカーは、アミノ酸を含む。可動性リンカーにおける典型的なアミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒが含まれる。したがって、特定の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙアミノ酸、Ａｓｎアミノ酸、及びＳｅｒアミノ酸のうちの１つまたは複数が組み合わさったものを含む。他のほぼ中性のアミノ酸（Ｔｈｒ及びＡｌａなど）もまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーの例は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−６２、米国特許第４，９３５，２３３号、及び米国特許第４，７５１，１８０号に開示されている。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーであるＧＧＳ、ＧＧＧＳ、またはＧＳＧを使用することができる。適切な長さを得るために、ＧＧＳリンカー、ＧＳＧリンカー、ＧＧＧＳリンカー、またはＧＧＧＧＳリンカーを、３回反復形態（（ＧＧＳ）３（配列番号１２）、（ＧＧＧＧＳ）３など）、または５回反復形態、６回反復形態、７回反復形態、９回反復形態、もしくは１２回以上反復する形態としてさえ使用することができる。特定の実施形態では、リンカー（（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１）など）を使用することが本明細書では好ましい。（ＧＧＧＧＳ）６（配列番号４）、（ＧＧＧＧＳ）９（配列番号７）、または（ＧＧＧＧＳ）１２（配列番号１４）を代替物として使用することも好ましくあり得る。他の好ましい代替物は、（ＧＧＧＧＳ）１（配列番号１５）、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１６）、（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号２）、（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号３）、（ＧＧＧＧＳ）７（配列番号５）、（ＧＧＧＧＳ）８（配列番号６）、（ＧＧＧＧＳ）１０（配列番号８）、または（ＧＧＧＧＳ）１１（配列番号９）である。さらに別の実施形態では、リンカーとしてＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）が使用される。さらに追加の実施形態では、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーである。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質であり、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）リンカーによってデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインに連結される。別の特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質のＣ末端が、ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）リンカーによってデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインのＮ末端に連結される。さらに、Ｎ末端及びＣ末端のＮＬＳは、リンカー（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶＥＡＳＳＰＫＫＲＫＶＥＡＳ（配列番号１８））としても機能し得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１０８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１０８３】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に３つのコンストラクトをトランスフェクションした。１つは、所定の位置にＵＡＧモチーフを有するルシフェラーゼ（Ｃｌｕｃ）ｍＲＮＡ標的を提供するものである（図９左）。ＴＡＧモチーフを２０ｎｔ領域にわたって配置し、ＡＤＡＲ２ｄに対して多かれ少なかれ潜在的に接近できる１０個の標的を得た（配列番号７４〜８３）。１０個の標的コンストラクトのそれぞれは、プログラムされたＡ→Ｇ変換を含有する、一致するｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡを提供する（図９右）（配列番号８４〜９３）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020520654000001.app
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
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【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
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【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2020520654.tif 000004
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
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