【手続補正書】
【提出日】平成16年10月8日(2004.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
培養液pHを一定に制御するために添加するアルカリの積算消費モル数に比例したモル数の基質をフィードし、残糖濃度を一定とすることを特徴とする請求項１の嫌気性菌の連続培養法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
この方法では、基質濃度が低い限界値に達すると、代謝活性が低下して酸素消費速度が低下する結果、酸素摂取量が低下して溶存酸素濃度(DO)が上昇する。そこが基質切れのシグナルと判断して基質を追加補填してやれば、発酵は回復し継続する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
しかしながら、嫌気性菌の場合には、元来酸素を消費しないので、原理的にこの方法を採用することはできない。また、好気性菌の連続培養法には、DOに代わってpHの上昇を基質切れのシグナルに用いるpH-auxostatが用いられることもある。嫌気性菌でも、酸の生成に限られずにアルコール生成でも、代謝に伴いpHが低下するので、pHの反転上昇を基質切れのシグナルと見なして、これを基質フィードタイミングとすることが可能なように思える。しかし、実際にこの方法で基質フィードを行うことはできない。それは、嫌気性菌ではpHの反転上昇が起こると直ちに菌が失活し、発酵速度は不可逆的に低下してもはや快復しないからである。すなわち、図１に示すように、嫌気性菌の培養で、pHが下限界に近づいたとき（Ａ）は、残糖濃度が臨界値(critical value)に近づくが、臨界値に達した時点で直ちに糖液をフィードすれば（Ｂ）発酵は継続できるが、図２に示すように、臨界値に達しても糖液をフィードせず放置した場合は菌は失活し、発酵速度は低下して運転を継続できない。これは、嫌気性菌に共通する好気性菌とは異なる特徴である。従って、嫌気性菌では連続培養を実施するための基質フィードの適当な手段が見出されていない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
図３はこの出願の発明を実施するのに好適な培養システムを示したSFD(Schematic Flow Diagram)である。図中において、Ａは発酵槽、Ｂは菌濃縮用クロスフローろ過器、ＣはpH測定制御器、Ｄはアルカリ添加量積算器、Ｅはレーザー濁度測定制御器、P1，P2，P3はペリスターポンプを示している。F1はpH制御のためのアルカリフィード速度、F2はアルカリ添加量から求められる基質フィード速度、F3は濁度制御のために添加される糖を含まない栄養成分培地のフィード速度、F4はF1に等量の培養ろ液引き抜き速度（Ｃによるフィードバック制御）、F5はF2に等量の培養ろ液引き抜き速度（Ｄによるフィードバック制御）、F6はF3に等量の培養液引き抜き速度（Ｅによるフィードバック制御）を示している。なお、速度はいずれも(ml/min)とする。この制御システムでは、発酵槽Ａの液量Ｖを一定に保つために、F1=F4，F2=F5，また、Ｖ一定で発酵槽Ａ内の菌濃度を一定に保つためにF3=F6なる条件を満足させている。このシステムでは、流入量の総量はF1＋F2＋F3、流出量の総量はF4＋F5＋F6で、F1＋F2＋F3＝F4＋F5＋F6の関係にあるから、発酵槽流量をＶとすると、連続発酵の希釈率は次式（１）
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
【実施例】
（実施例１）
使用菌は発明者が独自に分離したLactococcuslactis IO-1(JCM7638)を使用した。種菌は−85℃の凍結保存菌をTGC培地(Difco)に植菌し静置培養したものを用いた。これをグルコース３％、酵母エキス 0.5％、ポリペプトン 0.5％、NaC1 １％からなる培地100mlをErlenmyer Flaskに分注して120℃５分autoclave滅菌したものに接種して８時間培養したものをシードとした。乳酸発酵に用いた培養装置のシステム構成は図３に示したものと同一である。主発酵培地はグルコース ５％、酵母エキス 0.5％、ポリペプトン 0.5％、NaC1 １％で、殺菌条件は同一である。主発酵槽は全容１リッターのガラス製ジャーで、内部にマグネットスターラーのかくはん機を設置し、約400rpmの回転数でゆっくりかくはんしている。ジャー全体をwater bathに浸け、37℃の温水を循環して培養温度を37℃に制御した。ジャーにpH測定用複合ガラス電極を装着し、pH meter（東亜電波製）で測定し、pH6.0（下限）でアルカリ(1N-NaOH)をフィードしてpH制御を行った。グルコースアナライザーで培地の残糖濃度を適時測定し、残糖レベルが3g/lとなった時点でアルカリフィード速度に比例して求めたグルコースフィード速度で培地の添加を行い、連続発酵を開始した。そのときのアルカリフィード速度とグルコースフィード速度との関係については、次のように考慮される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
回分培養で発酵を開始して約12時間後、残糖レベルが約3g/lとなったところで、連続フィードと菌のリサイクルを開始したところ、菌の濃度増加とともに基質フィード速度も徐々に増加して、菌体濃度10.5g/l(DCWとして) に達した。このとき、糖濃度は目標の2g/lより高い4.5g/lであったので、前記の残糖誤差補正項Ｃによって残糖レベルを修正したところ、約３時間で残糖２±0.5g/lに制御できた。それ以降total dilution rate 0.7 1/hで10日約250hの連続運転を行い、残糖レベルを安定して維持でき、L-乳酸濃度は平均45g/lであった。従って、このシステムの生産性は31.5g/l hであった。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
この乳酸を濃縮し90％  L-乳酸液としたところ、混在する糖は対乳酸５％以下であり、ポリ乳酸, 原料として十分の品質であった。
（実施例３）
使用菌はZymomonas mobilis NRRLB-14023である。種菌は一85℃の凍結保存菌をYM培地に植菌し静置培養したものを用いた。これをグルコース100g、酵母エキス10g 、KH2PO4 1g, (NH4)2SO４ 1g、Mg(SO4)・7H2O 0.5gを1Lの脱イオン水に溶解した培地100mlをErlenmyer Flaskに分注して120℃ 5分autoclave滅菌したものに接種して、約８時間培養したものをシードとした。エタノールの連続発酵に用いた培養装置のシステム構成は図３に示すものと同じである。すなわち、主発酵槽は全容約１リッターのガラス製ジャーで、内部マグネットスターラーのかくはん機を設置し約400rpmの回転数でゆっくりかくはんしている。ジャー全体をwater bathに浸け、37℃の温水を循環して温度を制御する。ジャーにpH測定用複合ガラス電極を装着し、pH meter（東亜電波製）で測定し、下限の２点制御を行った。連続運転に入れば、pH上限で基質フィードを行い、pH下限(5.5)でアルカリ(0.5N-NaOH)フィードを行った。また、ジャーにはプロセスオンライン濁度計プローブを設置し、その出力をDDC contro11er(ModelLA-300 工一エスアール) に入力、ジャーの濁度制御を行うシステムを構築した。ジャーから培養液を抜き出し、cross flow型限外ろ過膜(MICROZAPSP103、旭化成)を用いて培養液を循環し、菌の濃縮を行うとともに、ろ過膜外側から除菌液を抜き出してエタノールを含む液を取り出す。一方、濁度コントロールのシステムとしては、殺菌した無糖培地をフィードし、培養液（含菌液）を抜き出した。このとき、水の供給と培養液の抜き出しはペリスタリィックポンプによって同調させた。連結培養では、実施例１と同様、３種類の液を供給し、２種類の液の抜き出しを行う。すなわち、pH下限においてpH制御のためのアルカリ液(0.5N-NaOH)を添加し、実施例１に示した計算式に代わって、次式（５）
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
【発明の効果】
この出願の発明では、菌体を固定化しないで微生物の代謝活性を生菌体として維持し、活性の衰えた菌はwash outさせると共に、新しい菌を再生させる。このようにして、発酵システムの中は一定の代謝活性を有する菌のみで構成されるバイオリアクターが成立する。このようなリアクターでは、濁度制御によって微生物濃度を一定に維持すれば、発酵速度は一定となるので、基質を連続的にフィードして、その速度に対応した速度で生産物を引き抜く連続発酵システムとなる。このとき、希釈率は、アルカリ液をふくむフィード液の容積によって決まるので、たとえば、アルカリ濃度を下げれば、希釈率が大きくなり、最終生産物阻害を低減できる。従って、菌濃度を高くして最終生産物濃度が高くなれば、アルカリ濃度を下げて、希釈率を上げれば最終生産物阻害を低減でき、高い生産速度を維持できる。このようなバイオリアクターはいままでに全く知られていなかったバイオリアクターである。このようなリアクターは反応速度が石油化学の連続反応に近いものとなるので、従来の回分発酵に比べ数十倍の装置生産性が得られる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
臨界値に達しても糖液をフィードせず放置した場合は菌は失活し、発酵は継続できないことを示した模式図である。