【手続補正書】
【提出日】令和3年2月8日(2021.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え核酸分子を調製する方法であって：
Ａ）： 
ｉ）複数の異なるＤＮＡ挿入であって、各ＤＮＡ挿入の側面に、２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）が位置しており、各ｃＴＡＧが：
ａ）１つ以上のＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含み、各ｃＴＡＧが前記ＤＮＡ挿入のそれぞれに人工的に導入された、１つ以上のＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、複数の異なるＤＮＡ挿入と；
ｉｉ）複数のＤＮＡ挿入の少なくとも２つにおいて存在する前記ｃＴＡＧの少なくとも１つを標的とする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体であって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体が：
ａ）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び
ｂ）前記標的とされるｃＴＡＧの１つに前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを動員することができるガイドＲＮＡ
を含む、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体と；
を含む混合物を、
前記複数のＤＮＡ挿入の少なくとも２つにおける前記標的とされるｃＴＡＧの消化を可能にして、消化されたＤＮＡ末端を生じさせる条件下で
インキュベートすることと、
Ｂ）前記ＤＮＡ挿入と、（Ａ）において生じた、消化されたＤＮＡ末端とを、前記消化されたＤＮＡ末端の共有結合を可能にし、それにより、組換え核酸分子を生成する条件下でインキュベートすることと；
を含み、前記組換え核酸分子は、前記方法においてライゲーションされる前記ＤＮＡ挿入のｃＴＡＧを含み、ライゲーションされたＤＮＡ挿入のそれぞれの側面に、前記インキュベーション工程前にＤＮＡ挿入が有していた同じｃＴＡＧが位置している、方法。
【請求項２】
前記消化されたＤＮＡ末端は、前記消化された末端の共有結合に先立って互いにハイブリダイズすることができる突出配列を有する付着末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記消化されたＤＮＡ末端は、平滑末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記平滑末端はさらに、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼで消化されて、突出配列を有する付着末端が生じ、工程Ｂ）はさらに、前記消化された末端の共有結合に先立って前記突出配列にハイブリダイズすることができる架橋ＤＮＡ配列を加えることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項１、４、又は５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法はさらに：
ｉ）工程Ｂ）に先立って、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体から、前記消化されたｃＴＡＧ配列を分離する工程、及び／又は
ｉｉ）工程Ｂ）に先立って、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体を不活化する工程
を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分離工程は、ＤＮＡ精製工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記不活化工程は、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の熱又は化学物質による不活化を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数のＤＮＡ挿入のそれぞれの前記２つのｃＴＡＧは、ｃＴＡＧ対を形成し、前記ｃＴＡＧ対は、前記方法においてライゲーションされる前記ＤＮＡ挿入の他の全てのｃＴＡＧ対に対して固有である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
各ｃＴＡＧ対における前記ｃＴＡＧの少なくとも１つが、異なるｃＴＡＧ対における少なくとも１つの他のｃＴＡＧと同じである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡ配列編集方法であって、前記方法は：
ａ）
ｉ）ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含むＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトであって、前記マルチクローン部位が、少なくとも２つの異なるクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、前記ＤＮＡ挿入のそれぞれに人工的にＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトに導入されている、少なくとも２つの異なるクローニングタグ、を含み、各ｃＴＡＧが：
ａ）１つ以上のＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含み；前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位の少なくとも１つが、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内で固有である、１つ以上のＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、ＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトと；
ｉｉ）置換ＤＮＡ挿入であって、前記置換ＤＮＡ挿入は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧが側面に位置しており；
ａ）前記第１の挿入ｃＴＡＧは、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの前記互いに異なるｃＴＡＧの１つの前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位を含み、そして前記第２の挿入ｃＴＡＧは、前記ＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの別の異なるｃＴＡＧの前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、置換ＤＮＡ挿入と；
ｉｉｉ）前記第１及び第２の挿入ｃＴＡＧをそれぞれ標的とする第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体であって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体が：
ａ）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び
ｂ）前記標的とされる挿入ｃＴＡＧの１つに前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを動員することができるガイドＲＮＡ；
を含む、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体、
を用意すること、
ここで、（ｉ）及び（ｉｉ）で規定されるＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトと置換ＤＮＡ挿入がそれぞれ、（ｉｉｉ）で規定される第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体と、単一の反応又は別個の反応でインキュベートされ；前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記第１及び第２の挿入ｃＴＡＧ、並びにそれらの対応する互いに異なるｃＴＡＧを切断して、消化されたＤＮＡ末端を生じさせる：そして
ｂ）前記置換ＤＮＡ挿入、及び工程（Ａ）において生じたＤＮＡ末端が消化されたＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを、前記消化されたＤＮＡ末端の共有結合を可能にし、それにより編集されたＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを生成する条件下でインキュベートすることと；を含み、
ここで、編集されたＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、前記方法によって共有結合される置換ＤＮＡ挿入のｃＴＡＧ配列を含み、共有結合した置換ＤＮＡ挿入の側面には、工程（Ａ）のインキュベーションの前に置換ＤＮＡが有していた同じ不ランキングｃＴＡＧが尚も位置している、ＤＮＡ配列編集方法。
【請求項１３】
工程（Ｂ）の前記インキュベーションは、リガーゼを含む、請求項１２に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項１４】
前記方法はさらに：
ｉ）工程（Ｂ）に先立って、前記切断された第１及び第２の挿入ｃＴＡＧ、並びにそれらの対応する互いに異なるｃＴＡＧを前記ＣＲＩＳＰＲ複合体から分離する工程、及び／又は
ｉｉ）工程（Ｂ）に先立って前記ＣＲＩＳＰＲ複合体を不活化する工程
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記分離工程は、ＤＮＡ精製工程を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記不活化工程は、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の熱又は化学物質による不活化を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記消化されたＤＮＡ末端は、前記消化された末端の共有結合に先立って互いにハイブリダイズすることができる突出配列を有する付着末端である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記消化されたＤＮＡ末端は、平滑末端である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記平滑末端はさらに、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼで消化されて、突出配列を有する付着末端が生じ、工程Ｂ）はさらに、前記消化された末端の共有結合に先立って前記突出配列にハイブリダイズすることができる架橋ＤＮＡ配列を加えることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項１２、１９、又は２０のいずれか一項に記載の方法。