【手続補正書】
【提出日】令和3年1月6日(2021.1.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ＩＬ−１ＲＡＰを標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞及びその使用
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子であって、上記ＣＡＲは、ヒト化抗ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、少なくとも刺激領域を含む細胞内シグナル伝達領域とを有する抗体又は抗体断片を有している、単離核酸分子、該核酸分子でコードされるポリペプチド、及び上記抗体又は抗体断片を有する単離キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）分子に関する。
【０００２】
本発明はまた、ＣＡＲをコードする核酸分子を有するベクター、及び該ベクターを有するＴ細胞に関する。
【０００３】
本発明はまた、哺乳類における増殖性疾患を治療するための、ＣＡＲ分子を発現する上記Ｔ細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａとしても知られている））は、分化能を喪失することなく顆粒球細胞株の増殖が増加することを特徴とする骨髄増殖性疾患である。
【０００５】
ＣＭＬは造血幹細胞の疾患であり、フィラデルフィア染色体２２ｑ−と名付けられた短縮化した２２番染色体を伴うｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）転座から生じる。上記転座によって９番染色体のＡＢＬ１遺伝子と２２番染色体のＢＣＲ遺伝子とが並置され、ＢＣＲ−ＡＢＬ１転写物及びチロシンキナーゼ活性が高い融合タンパク質をコードするＢＣＲ−ＡＢＬ１融合遺伝子が生じる。ＣＭＬの分子的原因が十分に理解されているとして、遺伝子転座が生じるメカニズムは知られていない。
【０００６】
ＣＭＬの発生率は、大きな地理的な差又は人種差はなく、１０〜１５件／１０６／年である。診断時の年齢中位数は欧州で６０〜６５歳だが、人口の若い国々ではかなり低くなる。小児のＣＭＬは稀である。
【０００７】
ＣＭＬの診断は概して単純明快である。ほとんどの場合は、特徴的な血球数に基づいて診断できる。末梢血又は骨髄細胞においてフィラデルフィア染色体２２ｑ−若しくはＢＣＲ−ＡＢＬ１転写物、又は両方を同定することで診断を確認できる。
【０００８】
２０００年代初頭より前は、インターフェロン・アルファ（ＩＦＮα）及び造血幹細胞移植がＣＭＬにおける唯一有効な治療法であった。ＨＬＡ適合ドナーが存在する場合、造血幹細胞の同種移植が適格患者に対する唯一治癒の可能性のある治療法だと考えられていた。このような同種移植は、悪性度が高い血液疾患の大半の治療で採用されている養子免疫療法という手法である。その原理は、特定のＴ受容体を介した細胞傷害性Ｔエフェクターの活性に依存した免疫移入である。しかしながら、これらのリンパ球に特異的な細胞傷害活性は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系の分子を用いた腫瘍抗原の提示によって制限される。このような移植手順の死亡率及び同種移植後の再発リスクは、依然としてこのような免疫療法の大きな賭けである。
【０００９】
移植関連の死亡毒性にも関わらず、同種幹細胞移植の移植片対白血病の免疫学的効果、更にはドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）の有効性が、依然として、治癒とはいかなくとも疾患の長期寛解を達成できる唯一の治療法であることがよく知られている。
【００１０】
２０００年代初頭から、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）が発見され、慢性期ＣＭＬの治療に広く使用されるようになったことで、当該血液疾患の予後がかなり変化して、９０％を超える生存率が達成された。ＣＭＬにおける造血幹細胞の同種移植の適応は、現在、ＴＫＩに不耐性／抵抗性を示す患者及びＣＭＬの進行期（移行期又は急性転化期）に限定されている。
【００１１】
２０１７年における第一選択治療としては、他の代替治療も採用できるものの、チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の使用が依然として選択される治療法である。ＴＫＩ療法では、ほとんどの患者が正常な造血を回復する。しかしながら、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、又はポナチニブのようなＴＫＩは、ＣＭＬ患者に対して全生存期間及びクオリティ・オブ・ライフの点で多くをもたらしたものの、これらの薬剤がＣＭＬを治癒させる能力は限定的である。
【００１２】
また、不耐性及び毒性、妊娠に対する潜在的なリスク、又は医療資金提供機関の医療経済的目的としての考慮から、ＴＫＩの中止を検討することとなる。
【００１３】
イマチニブの多施設治験において、分子遺伝学的検出限界以下の白血病であるＣＭＬ患者では（２年を超える期間の）イマチニブ治療を中止した。登録患者６９名について、これらの患者６９名のうち４２名（６１％）で再発した。１２ヶ月の時点で、これらの患者６９名について分子遺伝学的検出限界以下の白血病が持続している確率は４１％であった。この失敗は、ＴＫＩが静止状態のＣＭＬ幹細胞を根絶できないことに起因する。
【００１４】
近年、分子遺伝学的完全奏効患者においてイマチニブを中止する試みを検討するフランスの研究ＳＴＩＭ１（ｎ＝１００名の患者）が２０１７年に更新された。ＴＫＩ中止後の分子遺伝学的再発率は、平均期間２．５ヶ月で６１％であり、これらの再発患者において疾患の髄質蓄積が持続していることが明らかとなった。
【００１５】
実際に、現在のＴＫＩは根治療法というよりは抑制的治療であるため、ＴＫＩの長期継続投与を必要とし、予期しない未知の有害事象が発生する可能性がある。また、ＣＭＬ若年患者へのＴＫＩ長期投与は将来的な課題となり得る。
【００１６】
従って、持続性ＴＫＩ耐性ＣＭＬ静止前駆物質を除去する必要がある。遺伝的手法は、がん細胞の免疫的な認識及び除去を向上させるのに有望な手段を提供する。有望な方針の一つとして、免疫エフェクター細胞を遺伝子操作して、細胞傷害性を腫瘍細胞へリダイレクトするキメラ抗原受容体を発現させることが挙げられる。
【００１７】
近年、腫瘍エスケープのメカニズムを迂回可能とする細胞工学の進歩のおかげで、最新世代のＣＡＲ（キメラ抗原受容体）−Ｔ細胞が登場している。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、免疫グロブリン可変断片と融合したＴＣＲの定常部で構成されたキメラＴＣＲを発現するＴリンパ球である。標的の認識はＨＬＡでは制限されないため、あらゆる種類の腫瘍マーカーを標的とすることができる。
【００１８】
新規な免疫療法のなかでも、細胞表面の腫瘍関連抗原に対するこれらのＣＡＲ−Ｔ細胞は、難治性／再発性のＡＬＬ（急性リンパ性白血病）（ＣＤ１９）又はＣＬＬ（慢性リンパ性白血病）（ＣＤ１９）患者だけでなく、固形腫瘍や血液学分野における前臨床研究において、主にはＭＭ（多発性骨髄腫）（ＣＤ３８、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）、ＣＤ４４ｖ６、又はＣＳ１）、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）（ＣＤ３３又はＣＤ１２３）、Ｔ細胞悪性腫瘍（ＣＤ５）、又はリンパ腫（ＣＤ３０）においても予期せぬ成功を見せている。
【００１９】
ＣＭＬにおいて、遺伝子発現のプロファイリング研究により、正常なＣＤ３４＋／ＣＤ３８−造血幹細胞では発現されないが白血病性のものでは発現される細胞表面バイオマーカー（ＩＬ−１ＲＡＰ又はＩＬ−１Ｒ３）が明らかとなった。また、ＩＬ−１ＲＡＰの発現は腫瘍量やＣＭＬ疾患の臨床相と相関している。
【００２０】
ＩＬ−１ＲＡＰ（インターロイキン−１受容体アクセサリータンパク質、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ４０５９）は、ＩＬ−１シグナル伝達に関与するＩＬ−１及びＩＬ３３受容体の共受容体であり、炎症及び増殖に関わるＭＡＰキナーゼ、ｐ３８、ＮＦ−κＢ等の遺伝子等、各種のシグナル伝達経路を活性化する。このタンパク質は腫瘍細胞表面で発現される。従って、ＩＬ−１ＲＡＰは有望な腫瘍関連抗原である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本出願人は、このＩＬ−１ＲＡＰ抗原を用いることで、がん又は腫瘍、特にＣＭＬの患者に投与される遺伝子改変ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製できることを見出した。
【００２２】
標的ＩＬ−１ＲＡＰを用いて、ＣＭＬの原因である造血幹細胞Ｐｈｉ＋を標的とする細胞性ＣＡＲ−Ｔを開発することで、血液疾患の前駆体を本質的に標的とするＴＫＩに加えて、又はその代わりに、血液疾患の原因を根絶する手段となる。
【００２３】
このような新規治療手段は以下に適用できる。
・ＴＫＩ中止後に再発する患者
・同種移植（移植片対白血病、同種幹細胞移植、ドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ））後に再発した患者
・ＴＫＩ下で最適以下の奏効を示す非適格患者
・再発のリスクが大きい移行期／急性転化期ＣＭＬ患者
・若年又は小児ＣＭＬ患者
【００２４】
一実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドであって、上記ＣＡＲは、標的抗原に結合する細胞外領域、膜貫通領域、及び１つ以上の細胞内シグナル伝達領域を有している、ポリヌクレオチドが提供される。本明細書中、一実施形態では、ＣＡＲを有するベクターで遺伝子改変されたＴ細胞が検討される。本明細書中、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＣＡＲ改変Ｔ細胞という。
【００２５】
本発明は、特定の実施形態において、がんの治療に使用するための、本明細書で検討されるＣＡＲを発現するよう遺伝子改変された細胞を検討している。本明細書中、「遺伝子操作された」又は「遺伝子改変された」という語は、追加の遺伝子材料をＤＮＡ又はＲＮＡとして細胞中の全遺伝子材料に付加することを意味する。
【００２６】
「＃Ｅ３Ｃ３」及び「＃Ａ３Ｃ３」という語は同一であると理解され、＃Ｅ３Ｃ３は＃Ａ３Ｃ３を表すために自由に使用でき、その逆も同様である。
【００２７】
本発明の他の目的、特徴、態様、及び利点は、以下の説明、図面、及び実施例を参照することでより明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ウェスタンブロットにおける＃Ｅ３Ｃ３ｍＡｂの使用を表す。白血病細胞株ＫＵ８１２、ＫＧ−１、Ｎａｌｍ−２０、Ｊｕｒｋａｔ、及びＲａｊｉを使用した。ＩＬ−１ＲＡＰ  ｃＤＮＡ変異体でトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞株をコントロールとして使用した。アクチンはタンパク質ローディングコントロールとして検出した。ラインａ：ＩＬ−１ＲＡＰ（７２ｋＤＡ）の検出、ラインｂ：コントロールアクチン（４３ｋＤＡ）の検出、＊：弱いシグナル。
【図２】ＥＬＩＳＡ法による＃Ｅ３Ｃ３ｍＡｂを用いたＩＬ−１ＲＡＰ組換えタンパク質の認識を表す（ｂ）。ＢＳＡをネガティブコントロールとする（ａ）。
【図３】ＣＭＬポジティブ患者２名の末梢血（ＰＭ）又は骨髄（ＢＭ）に対する診断時（Ｄｉａｇ）又はイマチニブ（ＩＭ）治療後の免疫表現型検査を表す。ＩＬ−１ＲＡＰ（＃Ｅ３Ｃ３）をＣＤ３４＋及びＣＤ３８−蛍光染色と併用した。各種のｍＡｂの蛍光色素結合アイソタイプコントロールｍＡｂを体系的に使用した。
【図４】蛍光ｍＡｂで染色した（ａ）ＫＵ８１２細胞株及び（ｂ）Ｒａｊｉ細胞株を表す（左図：抗マウスＦｃ−ＩｇＧ、中図：ＩＬ−１ＲＡＰ（＃Ｅ３Ｃ３））。核染色ＤＡＰＩにより対比染色し、蛍光染色と重ね合わせた（右図、マージ）。
【図５】凍結組織アレイを用いた特異的な組織結合を表す。（ａ）ＩＬ−１ＲＡＰ高発現（ＫＵ８１２）又は（ｂ）ネガティブ発現（Ｒａｊｉ）細胞株をそれぞれポジティブ又はネガティブコントロールとして使用した。以下の組織を試験した。ａ：リンパ節、ｂ：結腸、ｃ：小腸、ｄ：胎盤、ｅ：胃、ｆ：肺、ｇ：脾臓、ｈ：前立腺。
【図６】安全カセットｉＣＡＳＰ９、＃Ｅ３Ｃ３ｍＡｂの一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、及び細胞表面発現マーカーΔＣＤ１９を有するＳＩＮレンチウイルスコンストラクトの設計を表す。３つの導入遺伝子は２Ａペプチド切断配列で分離され、ＥＦ１プロモーター＋ＳＰ１６３エンハンサー配列で制御されている。
【図７】ＩＬ−１ＲＡＰ形質導入Ｔ細胞の細胞成分画分に対するウェスタンブロッティングを表す。ａ：全ライセート、ｂ：膜、ｃ：細胞質、ｄ：核。（１）ＣＡＲ関連ＣＤ３ζ（５５ｋＤａ）、（２）内在性ＣＤ３ζ（１６ｋＤａ）、（３）ＣＤ４５（１４７ｋＤａ）、（４）ラミン（６８ｋＤａ）、（５）ＧＡＰＤＨ（３５ｋＤａ）。
【図８】ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ形質導入ＣＥＭ  Ｔ細胞株又は初代Ｔ細胞のいずれかのＦＡＣＳ分析検出を表す。ビオチン＋／ＣＤ１９＋ＣＥＭ又はＴ細胞のパーセンテージ（ａ）を、標識ビオチン組換えタンパク質の量（ｂ）に対してプロットした。
【図９】化学誘導二量体形成物質（１０ｎＭ  ＣＩＤ）暴露後のｉＣＡＳＰ９／ＡＰ１９０３自殺系カセットの安全スイッチを表す。（ａ）２９３Ｔ細胞、（ｂ）ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ２９３Ｔ細胞。
【図１０】非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）と比較した、２４時間又は４８時間ＣＩＤ暴露後のＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の除去を表す（＊＊＊  ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。
【図１１】アイソフォーム１（ｖ１）及びアイソフォーム３（ｖ５）のフローサイトメトリー（１１Ａ）及びウェスタンブロット（１１Ｂ）を表す。（ａ）アクチン、（ｂ）ＩＬ−１ＲＡＰ−ｖ１又はｖ５（７２ｋＤａ）、（１）全細胞Ｋ５６２タンパク質、（２）Ｋ５６２培養液の培地上清。
【図１２】（ａ）Ｋ５６２、（ｂ）Ｋ５６２−ｖ１、（ｃ）Ｋ５６２−ｖ５、又は（ｄ）ＫＵ８１２細胞株の存在下、ＣＦＳＥで染色したＣ０、Ｍｏｃｋ、又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の共培養により、ＩＬ−１ＲＡＰ標的発現細胞により誘発されるＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の増殖能を表す（ｐ＜０．００１、ｎ＝４）。
【図１３】（ａ）Ｃ０、（ｂ）Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞、又は（ｃ）ＣＡＲＴ細胞と共培養した後の上清中のＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインの測定を表す。
【図１４】ＩＬ−１ＲＡＰ＋（Ｋ５３２−Ｖ１、ＫＵ８１２）発現標的細胞に対して、共培養したＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞に適用したＣＤ１０７ａ＆ｂ脱顆粒アッセイを表す。エフェクターはモネンシンで処理し、ＣＤ１０７ａ及びＣＤ１０７ｂ  ｍＡｂを用いて３７℃で１時間染色した。５時間後、ＣＤ１０７ａ及びＣＤ１０７ｂ染色についてフローサイトメトリーによりＣＤ３＋／ＣＤ１９＋／ＣＤ８＋細胞を分析した。ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ活性化をコントロールとして使用した（ｐ＜０．００１、ｎ＝４）。
【図１５】蛍光（ｅＦｌｕｏｒ）及び７−ＡＡＤ染色により、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞のインビトロでのＩＬ−１ＲＡＰ依存性細胞溶解能を表す。非形質導入又はｍｏｃｋ形質導入Ｔ細胞をコントロールとして使用した（ｐ＜０．００１、ｎ＝４）。
【図１６】マウス試験を表す。Ａ／ＮＳＧマウスＫ５６２異種移植モデル。２日目〜２８日目の各種マウス群のＢ／ＢＬＩ分析。
【化１】
2021503952.tif 000001
左図：未処理、中：Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞、右図：ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞。
【図１７】ＣＭＬ患者の初代ＩＬ−１ＲＡＰ＋循環細胞に対するインビトロ毒性を表す。左：Ｅｕｒｏｐｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ（ＥＡＣ）法及び推奨法に従ったＢＣＲ−ＡＢＬ１転写物比（国際的尺度での％）の動的定量。ＲＭ３．０、ＲＭ４．０、ＲＭ４．５、及びＲＭ５．０は、それぞれ３、４、４．５、及び５Ｌｏｇの低下に相当する分子遺伝学的奏効レベルを表す。ＩＭ４００：イマチニブ４００ｍｇ／日、ＤＡＳ１００：ダサチニブ１００ｍｇ／日、ＢＯＳ４００：ボスチニブ４００ｍｇ／日、ＮＩＬ６００：ニロチニブ６００ｍｇ／日。右：ＣＭＬ患者のＰＢＭＣの形質導入効率に関するＣＤ３＋／ＣＤ１９＋染色及びフローサイトメトリー分析。
【図１８】ｅＦｌｕｏｒで標識したエフェクターＣ０、Ｍｏｃｋ−Ｔ、又はＣＡＲ  Ｔ細胞とＫＵ８１２細胞とを様々なＥ：Ｔ比で共培養した後のＦＳＣ＋／７−ＡＡＤ−ゲート内の持続性ＫＵ８１２生細胞のグラフを表す。ＦＳＣ＋／７−ＡＡＤ−ゲート内の持続性ＫＵ８１２生細胞のグラフを表す。
【図１９】ＣＭＬ患者の初代ＩＬ−１ＲＡＰ＋循環細胞に対するインビトロ毒性を表す。全死滅標的のパーセンテージを二重試験で算出。結果は平均±ＳＤで表す。
【図２０】ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞又はＭｏｃｋ  Ｔ細胞の、それぞれの様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でのＣＭＬ自家移植に対する細胞傷害性を表す。異なるＣＭＬ患者３名に対して実施した３つの独立した試験の集計結果。コントロール細胞（Ｃ０）から算出したＣＤ３４＋／ＩＬ−１ＲＡＰ＋生細胞の残存率を示す。＊＊ｐ＜０．０１。
【図２１】生存しており、実際に各種ＴＫＩで２０年以上（最小１６年、最大２１年）治療している又は治療していないＣＭＬ患者（ｎ＝３）のＰＢＭＣから得た自己ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞を、それぞれの自家末梢血幹細胞移植片の凍結保存物（ＰＢＳＣ、診断時に採取、２０年以上前）とともにインビトロで共培養した。ＣＭＬ患者、末梢血幹細胞自家移植特性。φ：未治療、ＩＦＮγ：インターフェロンγ；ＩＭ：イマチニブ；ＤＡＳ：ダサチニブ；ＮＩＬ：ニロチニブ；ＰＯＮ：ポナチニブ；ＢＯＳ：ボスチニブ。
【図２２Ａ】組織マイクロアレイを表す。１器官あたり３名の個々のドナーから得た９０個の組織コア（３０器官）（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ、米国メリーランド州ロックビル）を含む、アメリカ食品医薬品局標準の凍結組織アレイの代表的な＃Ａ３Ｃ３染色。ＵｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ、米国）を用いて免疫染色を検出した。ＮＤＰ．ｖｉｅｗ  ２．０ソフトウェアで画像を取得し、分析した。分析した３名のうち少なくとも１名において＃Ａ３Ｃ３ｍＡｂによりある程度の染色を示した組織を表示する（スケールバー：１００μｍ）。ＩＬ−１ＲＡＰ高発現（ＫＵ８１２）又はネガティブ発現（Ｒａｊｉ）細胞株をそれぞれポジティブ又はネガティブコントロールとして使用した。
【図２２Ｂ】ＨＭＥＣ−１皮膚内皮細胞株のＩＬ−１ＲＡＰ  Ｒ＆Ｄ（赤）又は＃Ａ３Ｃ３（青）染色を表す。アイソタイプＩｇＧ１（灰色）を重ねて示す。ＲＦＩは両方の染色について示す。
【図２３Ａ】健常造血細胞に対するＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の効果及び自殺遺伝子ｉＣＡＳＰ９安全カセットの効率を表す。健常ドナー（ｎ＝５）の末梢血細胞（左）又は骨髄細胞（右）に対するＩＬ−１ＲＡＰ細胞表面発現を表す。ＳＳＣ−Ａ／ＣＤ４５＋により、リンパ球（低ＳＳＣ−Ａ）、単球（ＣＤ３３＋）、顆粒球（高ＳＳＣ−Ａ）、又はＨＳＣ（ＣＤ３３−／ＣＤ３４＋）として亜集団を識別できた。ＲＦＩはアイソタイプ染色から算出し、各ウインドウに示した。
【図２３Ｂ−１】全ヒト臍帯血細胞の代表的な（３つのうち１つ）ＩＬ−１ＲＡＰ染色を表す。全ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−、及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋ＨＳＣ臍帯血亜集団についてＩＬ−１ＲＡＰ染色を示す。
【図２３Ｂ−２】全ヒト臍帯血細胞の代表的な（３つのうち１つ）ＩＬ−１ＲＡＰ染色を表す。全ＣＤ３４＋、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−、及びＣＤ３４＋／ＣＤ３８＋ＨＳＣ臍帯血亜集団についてＩＬ−１ＲＡＰ染色を示す。
【図２３Ｃ】健常ドナー（ｎ＝５）の臍帯血（ＣＢ、ｎ＝５）又は骨髄（ＢＭ）におけるＣＤ３４＋細胞中のＩＬ−１ＲＡＰポジティブ細胞を、ＣＭＬ患者のＢＭ（ｎ＝１０）又は末梢血（ＰＢ、ｎ＝１０）から得たＣＤ３４＋細胞と比較して表す。
【図２３Ｄ】左：各種のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比の自己非形質導入Ｔ細胞又はＭｏｃｋ若しくはＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の存在下で培養したＳＳＣ−Ａ／ＣＤ４５＋顆粒球（Ｇ）、単球（Ｍ）、及びリンパ球（Ｌ）亜集団のドットプロットを表す。右：自己Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞（破線）又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（実線）とともに２４時間共培養した非形質導入自己Ｔ細胞（Ｃ０）で標準化した、リンパ球（四角）、単球（円）、及び顆粒球（三角）中の生存細胞の相対パーセンテージを表す。
【図２３Ｅ】各種のＥ：Ｔ比のＭｏｃｋ（黒、破線）又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（白、実線）の存在下、単球（四角）、ＫＵ８１２（円）、又はＫ５６２（三角）亜集団中の生存細胞の相対パーセンテージを表す。パーセンテージは、５０００蛍光ビーズサイトメトリー取得に基づきＴｒｕｃｏｕｎｔチューブを用いて測定した絶対細胞数により算出した。
【図２３Ｆ】左：ＣＩＤ  ＡＰ１９０３誘導細胞死の絶対数に対するゲーティング戦略及び分析を表す。非形質導入（Ｃ０）又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を培地のみ又は培地＋ＣＩＤ（２０ｎＭ、２４時間）に暴露した。５０００個の蛍光ビーズを取得してから定量を行った。致死効率をコントロール細胞（未処理細胞）で標準化した。細胞致死を以下の通り算出した。死細胞％＝［１−（ＡＰ１９０３処理細胞中の生細胞の絶対数／未処理細胞中の生細胞の絶対数）］×１００。（Ｄ）死亡率の絶対パーセンテージ。Ｃ０又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ（ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋でゲーティング）Ｔ細胞のＣＩＤ暴露２４時間又は４８時間。右：結果は３つの独立した試験の平均である。＊＊ｐ＜０．００１。
【図２３Ｇ】腹腔内ＡＰ１９０３（白棒）治療の２４時間後の腫瘍（ＣＭＬ  ＫＵ８１２、静注）異種移植ＮＳＧモデルに注射したＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ  Ｔ細胞の絶対定量を表す（ｎ＝３のマウス／群）。コントロールＴ細胞（Ｃ０）を注入したマウスをコントロールとして使用した（ｎ＝２のマウス／群）。＊＊ｐ＜０．０１。細胞数は末梢血１ｍｌあたりで示す。
【図２４】ヒト−ＣＤ３４＋臍帯血細胞生着／ＮＯＧマウスモデル（ｈｕ−ＮＯＧ）において自己ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞のＨＳＣ及び／又は免疫細胞に対する特異的な毒性を検討するための、免疫安全実験ヒトＣＤ３４＋生着ＮＯＧマウスモデルを表す。簡潔に言うと、１０×１０Ｅ６個の自己ＣＡＲＴ細胞又はコントロールＴ細胞（Ｃ０）（マウスＰＢＭＣ、脾臓、又は骨髄から細胞選別したヒトＣＤ４５＋から得た）を注入した。注入後の各時点（５日目、８日目、及び１５日目）において、サイトメトリーにより成熟免疫細胞（ｈＣＤ３＋、ｈＣＤ１９＋、ｈＣＤ５６＋、ｈＣＤ１４＋、ｈＣＤ１１ｂ＋）のモニタリングを評価した。ＣＡＲＴ細胞注入前の−７日目に取得した基準免疫表現型から倍率変化を算出し、末梢血採取時（−９日目）と比較した。非形質導入（Ｃ０、白棒）又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞（黒棒）注入の３日目、８日目、及び１５日目の各種免疫担当細胞亜集団の倍率変化は、末梢血採取時（−９日目）と比較した。後眼窩試料から採取した末梢血で細胞数をカウントし、−７日目を基準として倍率変化を算出した。ｎ．ｓ：非有意。
【図２５】３つの異なる臍帯血から採取し、単独培養（白棒）又はそれぞれの自己非形質導入（Ｃ０、灰棒）若しくはＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞（黒棒）とともに共培養したＣＤ３４＋ＨＳＣのコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＭ）試験（Ｇｉａｖｒｉｄｉｓ、２０１８、＃１８６１）を表す。
【図２６】上図：形質導入２９３Ｔ細胞に対するＣＩＤ効果の光学顕微鏡による評価を表す。下図：ＣＩＤ  ＡＰ１９０３暴露後のＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞のフローサイトメトリー分析を表す。ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲを発現する又はしないＧＭＴＣ混合物及び非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）に対するＣＩＤ暴露（２０ｎＭ、２４時間、濃灰色）後又は非暴露（薄灰色）でのフローサイトメトリー分析。ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋染色により、ＣＡＲを発現するＧＭＴＣを識別できた。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下の表に配列識別子をまとめる。
【００３０】
【表１−１】
2021503952.tif 000002
【００３１】
【表１−２】
2021503952.tif 000003
【００３２】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、ＣＤ８α、４−１ＢＢ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、及びＩＣａｓｐ９遺伝子のヒンジ領域の配列は、Ｇｅｎｂａｎｋで入手できる。
【００３３】
本発明の実施においては、そうでないということが特に明示されない限り、当該技術分野の範囲内にある化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、及び細胞生物学の従来の方法が採用され、これらの多くを説明のため以下に記載する。これらの方法は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；及びＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の学術誌の論文を参照されたい。
【００３４】
特に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験においては、本明細書で記載したのと類似又は同等の方法及び材料を使用できるが、本明細書には組成、方法、及び材料の好ましい実施形態を記載している。
【００３５】
当業者に理解されるように、また本明細書のどこかで記載する通り、完全抗体は２つの重鎖と２つの軽鎖とを有する。各重鎖は可変領域と第１、第２、及び第３定常領域とで構成され、各軽鎖は可変領域と定常領域とで構成される。哺乳類の重鎖はα、δ、ε、γ、及びμに分類され、哺乳類の軽鎖はλ又はκに分類される。α、δ、ε、γ、及びμ重鎖を有する免疫グロブリンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ａ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに分類される。完全抗体は「Ｙ字」型を形成する。Ｙ字の幹部は、互いに結合した２つの重鎖の第２及び第３定常領域（ＩｇＥ及びＩｇＭの場合、更に第４定常領域）で構成され、ヒンジ部で（鎖間）ジスルフィド結合が形成される。γ、α、及びδ重鎖は、３つのタンデム型（直列型）Ｉｇ領域で構成された定常領域と、柔軟性を付与するヒンジ領域とを有する。μ及びε重鎖は、４つの免疫グロブリン領域で構成された定常領域を有する。第２及び第３定常領域は、それぞれ「ＣＨ２領域」及び「ＣＨ３領域」ともいう。Ｙ字の各腕部は、可変領域と、可変領域に結合した単一重鎖の第１定常領域と、単一軽鎖の定常領域とを有する。軽鎖及び重鎖の可変領域は抗原結合を担う。
【００３６】
軽鎖及び重鎖の可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」ともいわれる３つの超可変領域で分断された「フレームワーク」領域を有する。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ（Ｗｕ，ＴＴ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１３２（２）：２１１−５０，（１９７０）；Ｂｏｒｄｅｎ，Ｐ．ａｎｄ  Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．，ＰＮＡＳ，８４：２４４０−２４４３（１９８７）；（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１参照）の配列、又はＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ．  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６（４）：９０１−９１７（１９８７），Ｃｈｏｉｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３（１９８９））の構造等といった従来の方法によって定義又は同定できる。
【００３７】
異なる軽鎖又は重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒト等の種内では比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域は、構成する軽鎖及び重鎖の組み合わさったフレームワーク領域であり、３次元空間にＣＤＲを配置及び配列させるよう機能する。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のＣＤＲは、典型的には、Ｎ末端から順に番号が付けられてＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３といわれ、また典型的には、個々のＣＤＲが位置する鎖によって特定される。従って、抗体の重鎖の可変領域に位置するＣＤＲはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３といわれ、抗体の軽鎖の可変領域に位置するＣＤＲはＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３といわれる。特異性の異なる（すなわち、異なる抗原に対して異なる結合部位を有する）抗体は、異なるＣＤＲを有する。
【００３８】
「ＶＨ」又は「ＶＨ」とは、免疫グロブリン重鎖の可変領域を意味しており、本明細書で開示される抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は他の抗体断片のものを含む。
【００３９】
「ＶＬ」又は「ＶＬ」とは、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を意味しており、本明細書で開示される抗体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、又は他の抗体断片のものを含む。
【００４０】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一クローンによって、又は単一抗体の軽鎖及び重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に知られている方法、例えば、骨髄腫細胞を免疫脾臓細胞と融合させてハイブリッド抗体形成細胞を作製することで得られる。モノクローナル抗体はヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００４１】
本明細書中、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という冠詞は、当該冠詞の文法的対象が１つであること又は１つより多いこと（すなわち、少なくとも１つであること）を意味する。
【００４２】
本明細書中、「約」又は「およそ」という語は、基準となる分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量、又は長さに対して３０％、２５％、２０％、２５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％分変動する分量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量、又は長さを意味する。特定の実施形態において、「約」又は「およそ」という語は、数値の前に使用した場合、その値±１５％、１０％、５％、又は１％の範囲であることを示す。
【００４３】
本明細書を通じて、文脈上別段の解釈が必要とされない限り、「有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、及びｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、記載された工程若しくは要素、又は工程若しくは要素の群を包含することを意味しており、他の任意の工程若しくは要素、又は工程若しくは要素の群を除外することは意味していないと解釈される。
【００４４】
本明細書を通じて、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「ある実施形態」、「追加実施形態」、「更なる実施形態」、又はそれらの組み合わせとは、当該実施形態に関して記載された特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。
【００４５】
本発明の目的のために、「同一性」又は「相同性」は、比較ウインドウ中の２つのアライメント配列を比較することで算出される。配列をアライメントすることで、比較ウインドウ中の２つの配列に共通する位置（ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を決定できる。次いで、共通する位置の数を比較ウインドウ中の全位置数で割り、１００を掛けることで、相同性のパーセンテージが得られる。配列同一性のパーセンテージの決定は、手動で、又はよく知られたコンピュータープログラムを用いて実施できる。
【００４６】
本発明は、細胞傷害性を腫瘍細胞へリダイレクトするキメラ抗原受容体を発現するよう設計されたベクターで遺伝子操作された免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書中、該遺伝子操作された受容体をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）という。ＣＡＲは、標的抗原（腫瘍抗原等）に対する抗体に基づいた特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内領域と組み合わせることで、特異的な抗腫瘍細胞性免疫活性を示すキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書中、「キメラ」という語は、由来の異なる種々のタンパク質又はＤＮＡの一部分で構成されていることを表す。
【００４７】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単離核酸分子であって、上記ＣＡＲは、抗ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、少なくとも刺激領域を有する細胞内シグナル伝達領域とを有する抗体又は抗体断片を有しており、上記抗ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）アミノ酸配列番号６との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列番号７との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸配列番号８との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する軽鎖と、
（ｉｉ）アミノ酸配列番号１２との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列番号１３との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸配列番号１４との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する重鎖と
を有している、単離核酸分子に関する。
【００４８】
ＣＡＲの主な特性は、免疫エフェクター細胞特異性をリダイレクトすることで、増殖、サイトカイン産生、貪食、又は主要組織適合性（ＭＨＣ）とは独立して標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を引き起こし、モノクローナル抗体、可溶性リガンド、又は細胞特異的共受容体の細胞特異的標的化能を活用することができることである。
【００４９】
本明細書中、「結合領域」、「細胞外結合領域」、「抗原特異的結合領域」、及び「細胞外抗原特異的結合領域」という語は互換的に使用され、対象である標的抗原と特異的に結合できる能力をＣＡＲに付与する。結合領域は、生物学的分子（細胞表面受容体、腫瘍タンパク質、脂質、多糖等の細胞表面標的分子、又はそれらの成分等）を特異的に認識して結合できる能力を有する任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、又はペプチドを有していてもよい。結合領域には、対象である生物学的分子に対する任意の天然、合成、半合成、又は組換え生成された結合パートナーが含まれる。本明細書中、「特異的結合親和性」、「特異的に結合する」、「特異的に結合した」、「特異的な結合」、又は「特異的に標的とする」という語は、バックグラウンド結合よりも結合親和性が高い分子間の結合を表す。結合領域（又は結合領域を有するＣＡＲ又は結合領域を含む融合タンパク質）は、親和性又はＫａ（すなわち、１／Ｍ単位の特定の結合相互作用の平衡会合定数）が例えば約１０５Ｍ−１以上で標的分子と結合又は会合する場合、標的分子と「特異的に結合する」。本開示に係る結合領域ポリペプチド及びＣＡＲタンパク質の親和性は、競合ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）のような従来の方法で容易に測定できる。
【００５０】
上記抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、又はヒト化抗体である。
【００５１】
ある好ましい実施形態において、上記抗体は、腫瘍細胞上の表面タンパク質と特異的に結合するヒト化抗体（ヒト化モノクローナル抗体等）である。「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ラット、又は合成）免疫グロブリン由来の１種以上のＣＤＲとを有する免疫グロブリンである。従って、恐らくはＣＤＲを除くヒト化免疫グロブリンの全ての部分が、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応部分と実質的に同一である。ヒト化又は他のモノクローナル抗体は、抗原結合又は他の免疫グロブリン機能に対して実質的に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換を追加で有することができる。ヒト化抗体は、遺伝子操作によって構築できる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書を参照）。
【００５２】
抗体にはその抗原結合断片が含まれ、例えば、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、及び抗原結合を担う全長抗体の一部が挙げられる。また、上記用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ結合抗体（バイスペシフィック抗体等）、及びそれらの抗原結合断片等の遺伝子操作形態も含む。
【００５３】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域を有し、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中にいずれかの配向（ＶＬ−ＶＨ又はＶＨ−ＶＬ等）で存在している。
【００５４】
一本鎖抗体は、所望の標的に特異的なハイブリドーマのＶ領域遺伝子からクローニングしたものであってもよい。このようなハイブリドーマの作製はルーチン化されている。可変領域重鎖（ＶＨ）及び可変領域軽鎖（ＶＬ）をクローニングするのに採用される方法は、例えばＯｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，１９８９；８６：３８３３−３８３７に記載されている。
【００５５】
一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬ領域間にポリペプチドリンカーを更に有し、これによりｓｃＦｖは抗原結合に対して所望の構造を形成できる。
【００５６】
本明細書で検討されるＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のリンカーを有していてもよい。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１〜約２５アミノ酸、約５〜約２０アミノ酸、約１０〜約２０アミノ酸、又は任意の介在アミノ酸長である。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又はそれ以上のアミノ酸長である。
【００５７】
リンカーの具体例としては、グリシン重合体（Ｇ）ｎ、グリシン−セリン重合体（Ｇｉ＿ｓＳｉ＿５）ｎ（式中、ｎは１、２、３、４、又は５以上の整数）、グリシン−アラニン重合体、アラニン−セリン重合体、及び当該分野で知られている他の可動性リンカーが挙げられる。グリシン及びグリシン−セリン重合体は相対的に不定形であるため、本明細書に記載したＣＡＲ等の融合タンパク質の領域間で中立テザーとして機能できる。グリシンはアラニンと比べても非常に多くのｐｈｉ−ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりも制限がはるかに少ない（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１  １１７３−１４２（１９９２）を参照）。当業者に認識される通り、特定の実施形態におけるＣＡＲの設計には、可動性リンカーや、所望のＣＡＲ構造が得られるようにそれより可動性の低い構造を与える１つ以上の部分が含まれるように、全体又は一部が可動性であるリンカーが含まれていてもよい。
【００５８】
特定の実施形態において、上記リンカーはＶＨ領域とＶＬ領域との間にある。
【００５９】
特定の実施形態において、上記リンカーは、配列番号５のアミノ酸配列を有する又はそれで構成される。
【００６０】
一実施形態において、上記ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域は、配列番号４の軽鎖可変領域のアミノ酸配列において１、２、又は３個以上３０、２０、又は１０個以下の改変を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域と、配列番号２の重鎖可変領域のアミノ酸配列において１、２、又は３個以上３０、２０、又は１０個以下の改変を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域とを有するｓｃＦｖである。
【００６１】
上記ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域は、（ｉ）アミノ酸配列番号６との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列番号７との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸配列番号８との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する軽鎖可変領域と、（ｉｉ）アミノ酸配列番号１２との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列番号１３との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸配列番号１４との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する重鎖可変領域とを有するｓｃＦｖであることが好ましい。
【００６２】
一般に、ＣＡＲの結合領域には１つ以上の「ヒンジ領域」が続いており、これが抗原結合領域をエフェクター細胞表面から離して配置することで、適切な細胞／細胞接触、抗原結合、及び活性化を可能とするという役割を果たす。ＣＡＲは、一般に、結合領域と膜貫通領域との間に１つ以上のヒンジ領域を有する。ヒンジ領域は、天然、合成、半合成、又は組換え源のいずれかに由来するものであってもよい。
【００６３】
上記抗ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域は、ヒンジ領域によって膜貫通領域と接続していることが好ましい。
【００６４】
一実施形態において、上記ヒンジ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ配列又はその同一性が９５〜９９％である配列を有する。
【００６５】
更なる実施形態において、上記ヒンジ領域は、ＩｇＧ４のヒンジ配列又はその同一性が９５〜９９％である配列を有する。更なる実施形態において、上記ヒンジ領域は、ＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４のＣＨ２−ＣＨ３領域又はその同一性が９５〜９９％である配列を有していてもよい。
【００６６】
更なる実施形態において、上記ヒンジ領域は、ＣＤ８α又はその同一性が９５〜９９％である配列を有する。
【００６７】
「膜貫通領域」は、細胞外結合部と細胞内シグナル伝達領域とを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の細胞膜にアンカリングするＣＡＲの一部である。上記膜貫通領域は、天然、合成、半合成、又は組換え源のいずれかに由来するものであってもよい。
【００６８】
コード化ＣＡＲは、好ましくは、Ｔ細胞受容体のα、β、又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４からなる群より選択されるタンパク質、より好ましくはＣＤ２８の膜貫通領域を有する。
【００６９】
特定の実施形態において、本明細書で検討されるＣＡＲは細胞内シグナル伝達領域を有する。「細胞内シグナル伝達領域」とは、標的抗原に結合している有効ＣＡＲのメッセージを免疫エフェクター細胞の内部へと伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、及び細胞傷害活性（ＣＡＲ結合標的細胞への細胞傷害性因子の放出等、細胞外ＣＡＲ領域との抗原結合とともに引き起こされる細胞応答を含む）を引き起こすのに関与するＣＡＲの一部を意味する。
【００７０】
「エフェクター機能」という語は、細胞の特殊化した機能を意味する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性、あるいはサイトカインの分泌を含む援助又は活性であってもよい。従って、「細胞内シグナル伝達領域」という語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、且つ細胞に特殊化した機能を実行するよう指示するタンパク質の一部を意味する。通常は細胞内シグナル伝達領域全体を使用できるが、多くの場合、領域全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達領域の切断部を使用する場合、エフェクター機能シグナルを伝達しさえすれば、そのような切断部を領域全体の代わりに使用してもよい。「細胞内シグナル伝達領域」という語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達領域の切断部を有することを意味する。
【００７１】
ＴＣＲのみを介して生成されたシグナルは、Ｔ細胞を完全に活性化させるには不十分であり、二次又は共刺激シグナルも必要であることが知られている。従って、Ｔ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達領域、すなわち、ＴＣＲ（ＴＣＲ／ＣＤ３複合体等）を介して抗原依存的な一次活性化を開始する一次シグナル伝達領域と、抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供する共刺激シグナル伝達領域とによって媒介されるといえる。好ましい実施形態において、本明細書で検討されるＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達領域」を有する細胞内シグナル伝達領域を有する。
【００７２】
実施形態において、上記単離核酸分子は、少なくとも１つの共刺激領域を有する細胞内シグナル伝達領域をコードしていてもよい。従って、この実施形態において、上記細胞内シグナル伝達領域は少なくとも１つの共刺激領域を有する。
【００７３】
本明細書中、「共刺激シグナル伝達領域」又は「共刺激領域」という語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達領域を意味する。共刺激分子は、抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子であり、抗原との結合時にＴリンパ球の効率的な活性化及び機能に必要な二次シグナルを提供する。
【００７４】
上記機能的細胞内シグナル伝達領域の少なくとも１つの共刺激領域は、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＣＤ３ζ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群より選択される１種以上のタンパク質から得られることが好ましい。
【００７５】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）から得られた共刺激領域は、４−１ＢＢの共刺激領域のアミノ酸配列との同一性が９５〜９９％である配列を有することがより好ましい。
【００７６】
ＣＤ３ζから得られた共刺激領域は、ＣＤ３ζの共刺激領域のアミノ酸配列との同一性が９５〜９９％である配列を有することがより好ましい。
【００７７】
別の実施形態において、上記細胞内シグナル伝達領域は、４−１ＢＢから得られた共刺激領域及び／又はＣＤ３ζから得られた共刺激領域を有する。
【００７８】
特定の好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達領域と１つ以上の共刺激シグナル伝達領域とを有する。上記細胞内一次シグナル伝達領域及び共刺激シグナル伝達領域は、膜貫通領域のカルボキシル末端に任意の順序で直列に連結していてもよい。
【００７９】
本発明の核酸分子でコードされた単離ポリペプチド分子もまた検討され、更には、抗ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達領域とを有する抗体又は抗体断片を有する単離ＣＡＲ分子であって、上記抗ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）アミノ酸配列番号６との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列番号７との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸配列番号８との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する軽鎖と、
（ｉｉ）アミノ酸配列番号１２との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列番号１３との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸配列番号１４との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する重鎖とを有している、単離ＣＡＲ分子も検討される。
【００８０】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、そうでないということが明示されない限り、また従来の意味に従って、すなわちアミノ酸の配列として、互換的に使用される。ポリペプチドは特定の長さに限定されず、例えば、全長のタンパク質配列又はタンパク質全長の断片を有していてもよく、糖鎖付加、アセチル化、リン酸化等のポリペプチドの翻訳後修飾や、当該分野で知られている他の修飾（天然及び非天然いずれも）を含んでいてもよい。
【００８１】
ポリペプチドは、よく知られている様々な組換え及び／又は合成法のいずれかを採用して調製できる。本明細書で検討されるポリペプチドは、具体的には、本開示のＣＡＲ、あるいは本明細書で開示されるＣＡＲにおいて１個以上のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換された配列を包含する。
【００８２】
本明細書中、「単離ペプチド」又は「単離ポリペプチド」等は、ペプチド又はポリペプチド分子を細胞環境から及び細胞の他の成分との会合からインビトロで単離及び／又は精製することを意味する。同様に、「単離細胞」は、インビボ組織又は器官から得られた細胞であって、実質的に細胞外マトリクスを含まない細胞を意味する。
【００８３】
本明細書中、「ベクター」という語は、別の核酸分子を導入又は輸送できる核酸分子を意味する。導入された核酸は、一般に、ベクター核酸分子と連結（例えば、該分子に挿入）されている。ベクターは、細胞における自律増殖を指示する配列を含んでいてもよく、宿主細胞ＤＮＡへの組込みを可能とするのに十分な配列を含んでいてもよい。
【００８４】
本発明はまた、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を有するベクターであって、該ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はレトロウイルスベクターから選択され、好ましくはレンチウイルスベクターである、ベクターを提供する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本発明のベクターは、プロモーター、好ましくはＥＦ−１αプロモーターを有する。
【００８６】
レトロウイルスは遺伝子導入用の一般的なツールである。特定の実施形態において、レトロウイルスは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを細胞に導入するのに使用される。本明細書中、「レトロウイルス」という語は、そのゲノムＲＮＡを直鎖二本鎖ＤＮＡコピーへ逆転写した後、そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムへ共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを意味する。ウイルスは、宿主ゲノムへ組み込まれてしまえば、「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスはＲＮＡポリメラーゼＩＩのテンプレートとして作用し、新しいウイルス分子を産生するのに必要な構造タンパク質及び酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を指示する。
【００８７】
従って、本発明のベクターで形質導入したＴ細胞は、安定的な長期間持続するＣＡＲ介在性Ｔ細胞応答を引き起こすことができる。
【００８８】
特定の実施形態において、上記Ｔ細胞は、本発明に係るＣＡＲをコードするレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクター等）で形質導入される。
【００８９】
本明細書中、「レンチウイルス」という語は、複雑レトロウイルスの群（又は属）を意味する。レンチウイルスの例としては、特に限定されないが、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶタイプ１及びＨＩＶタイプ２等）、ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）、ヤギ関節炎・脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
【００９０】
「レンチウイルスベクター」という語は、構造的及び機能的遺伝要素又はその一部（主にレンチウイルスに由来するＬＴＲ等）を含むウイルスベクター若しくはプラスミドを意味する。
【００９１】
「自己不活型（ＳＩＮ）」ベクターとは、Ｕ３領域として知られている右側（３’）ＬＴＲエンハンサー／プロモーター領域が、１回目のウイルス複製以降のウイルス転写を妨げるように（欠失又は置換等により）改変されている複製欠損ベクター（レトロウイルス又はレンチウイルスベクター等）を意味する。
【００９２】
一実施形態において、ＳＩＮベクターバックボーンが好ましい。
【００９３】
使用するベクターは、ＥＦ−１αプロモーター等のプロモーターを更に有することが好ましい。
【００９４】
本明細書中、「プロモーター」という語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の認識部位を意味する。ＲＮＡポリメラーゼは、該プロモーターに作動可能に連結したポリヌクレオチドを開始及び転写する。特定の実施形態において、標的抗原を発現する細胞へＴ細胞をリダイレクトするのに十分なレベルで、Ｔ細胞において安定的な長期間のＣＡＲ発現を可能とするプロモーターからＣＡＲを有するポリヌクレオチドを発現することが望ましい場合がある。
【００９５】
本発明はまた、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子又は本発明のベクターを有する細胞であって、好ましくは、ヒトＴ細胞等のＴ細胞であり、より好ましくはヒトＣＤ８＋Ｔ細胞等のＣＤ８＋Ｔ細胞である細胞を提供する。好ましい実施形態において、本発明の細胞（Ｔ細胞等）は、その膜で本発明のＣＡＲを発現する。
【００９６】
特定の実施形態において、本明細書に記載された免疫エフェクター細胞のインビトロ操作又は遺伝子改変に先立って、対象から細胞源を取得する。特定の実施形態において、膜で本発明のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞はＴ細胞を含む。Ｔ細胞は、特に限定されないが、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍等、様々な細胞源から得ることができる。ある実施形態において、Ｔ細胞は、沈降（例えばＦＩＣＯＬＬ（商標）分離）等の当業者に知られている各種方法を用いて対象から採取した血液単位から得ることができる。一実施形態において、個体の循環血の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞等のリンパ球、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含む。一実施形態において、アフェレーシスによって採取した細胞は、洗浄により血漿画分を除去し、細胞を適当な緩衝液又は培地に配置して、その後の処理を実施してもよい。
【００９７】
ある実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離等によって単球を枯渇させることで、末梢血単核細胞から単離される。ポジティブ又はネガティブ選択法によって、ＣＤ４又はＣＤ８のようなマーカーを１つ又は複数発現するＴ細胞の特定の亜集団を更に単離できる。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブに選択された細胞に特徴的な表面マーカーに対する抗体を組み合わせることで達成できる。
【００９８】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを内部に有するポリヌクレオチド又は細胞は、誘導性自殺遺伝子等の自殺遺伝子を利用して、直接毒性（すなわち、同種投与状況における移植片対宿主病）及び／又は遺伝子改変細胞の制御されない増殖のリスクを低減する。特定の態様において、上記自殺遺伝子は、上記ポリヌクレオチド又は細胞を内部に有する宿主に対して免疫原性ではない。使用できる自殺遺伝子の一例としては、誘導性カスパーゼ−９（ｉＣＡＳＰ９）、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、ＣＤ２０、切断型ＥＧＦＲ、カスパーゼ−８、又はシトシンデアミナーゼが挙げられる。カスパーゼ−９は、特定の化学誘導二量体形成物質（ＣＩＤ）を用いて活性化できる。他の系は、代謝プロドラッグ（ガンシクロビル）によって又は結合抗体（リツキシマブ、シツキシマブ）によって活性化できる。
【００９９】
本明細書には、Ｔ細胞がＣＡＲを発現するようにエクスビボで遺伝子改変され、ＣＡＲ  Ｔ細胞がそれを必要とするレシピエントに注入される細胞治療の１種が開示されている。注入された細胞は、レシピエント、好ましくはヒトにおいて腫瘍細胞を死滅させることができる。抗体療法とは異なり、ＣＡＲ  Ｔ細胞はインビボで複製できるので、長期間持続し、腫瘍を持続的に制御できる。
【０１００】
また、ＣＡＲは、抗体由来受容体が結合する際にエフェクターＴ細胞を任意の細胞表面分子に対してリダイレクト及び活性化させることができ、ＭＨＣの制限からは独立している。
【０１０１】
本発明の遺伝子改変Ｔ細胞は、患者自身のＴ細胞（自己）から構築されるが、骨髄又は末梢造血幹細胞同種移植の関係（ドナーリンパ球輸注）で同種遺伝子改変Ｔ細胞を得るために他の同種ドナーに由来するものであってもよい。本発明に係るＣＡＲ分子を発現する上記Ｔ細胞は、哺乳類、好ましくはヒトの増殖性疾患を治療するのに有用であり、該疾患は細胞表面ＩＬ−１ＲＡＰ発現と関連している。
【０１０２】
好ましくは、上記Ｔ細胞は、抗ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域を有する抗ＩＬ−１ＲＡＰ  ｓｃＦｖである抗原結合領域、ＣＤ２８タンパク質の膜貫通領域、共刺激４−１ＢＢシグナル伝達領域、及びＣＤ３ζシグナル伝達領域を有するＣＡＲ分子を発現し、上記抗ＩＬ−１ＲＡＰ結合領域は、
（ｉ）アミノ酸配列番号６との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列番号７との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸配列番号８との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する軽鎖と、
（ｉｉ）アミノ酸配列番号１２との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、アミノ酸配列番号１３との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸配列番号１４との同一性が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を有する重鎖とを有する。
【０１０３】
本発明はまた、薬剤として使用される本発明に係る細胞（Ｔ細胞等）を提供する。
【０１０４】
本発明はまた、哺乳類、好ましくはヒトにおける増殖性疾患の治療に使用される本発明に係る細胞（Ｔ細胞等）を提供する。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、上記増殖性疾患は、ＩＬ−１ＲＡＰ発現に関連する疾患である。
【０１０６】
上記ＩＬ−１ＲＡＰ発現に関連する疾患は、脊髄形成異常症、骨髄異形成症候群、又は前白血病等のがん、悪性腫瘍、又は前がん状態から選択されることが好ましい。
【０１０７】
成人の腫瘍／がん及び小児の腫瘍／がんも含まれる。
【０１０８】
上記疾患は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（「ＢＡＬＬ」）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（「ＴＡＬＬ」）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）等の１種以上の急性白血病；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等の１種以上の慢性白血病からなる群より選択される血液がんであることがより好ましい。
【０１０９】
より好ましい実施形態において、上記疾患は慢性骨髄性白血病である。
【０１１０】
第一選択において、ＣＭＬの治療ではＴＫＩを使用する。しかしながら、治療を中止すると半分以上の患者が再発するので、ＴＫＩの使用では上記疾患は治癒しないことが分かる。
【０１１１】
従って、ＩＬ−１ＲＡＰに特異的なＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、少なくとも１種のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）によって既に治療されたヒトにおいてＣＭＬを治療する方法において有用である。
【０１１２】
従って、ＩＬ−１ＲＡＰに特異的なＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、少なくとも１種のチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）と組み合わせて哺乳類の増殖性疾患を治療する方法において有用であることが好ましい。
【０１１３】
使用するＴＫＩは、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ボスチニブ、及びポナチニブであってもよい。
【０１１４】
従って、ＩＬ−１ＲＡＰに特異的なＣＡＲ分子を発現するＴ細胞は、移植片対白血病、同種幹細胞移植、又はドナーリンパ球輸注（ＤＬＩ）を既に受けたヒトにおいてＣＭＬを治療する方法において有用である。
【０１１５】
本明細書中、「治療」とは、疾患の症状若しくは病理、又は病態に対して有益な又は望ましい効果を含むものであり、治療される疾患又は異常、例えばがんの１種以上の測定可能なマーカーのごくわずかな低下であってもよい。治療は、場合によっては疾患又は異常の症状の低減又は寛解のいずれかを含んでいてもよく、疾患又は異常の進行の遅延を含んでいてもよい。「治療」は、必ずしも疾患若しくは異常又はその関連症状が完全に根絶又は治癒することを指していない。
【０１１６】
従って、本開示は、投与を必要とする対象に本発明のＴ細胞を治療有効量投与することを含むＣＭＬの治療又は予防を提供する。
【０１１７】
本明細書に開示されたＴ細胞は、単独で投与してもよく、希釈剤及び／又は他の成分（ＩＬ−２等のサイトカインや細胞集団等）と組み合わせて医薬品組成物として投与してもよい。簡潔に言うと、医薬品組成物は、医薬的又は生理学的に許容される１種以上の担体、希釈剤、又は賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載される標的細胞集団を含んでいてもよい。該組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン、マンニトール等の炭水化物；タンパク質；グリシン等のポリペプチド又はアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオン等のキレート剤；アジュバント（水酸化アルミニウム等）；及び保存料を含んでいてもよい。本明細書中、「医薬的に許容される」という表現は、適切な医学的判断の範囲内において、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応等の問題又は合併症を起こすことなく、合理的なリスク・ベネフィット比に見合った形で、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適している化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を意味するのに用いられる。
【０１１８】
本発明はまた、本発明に係る細胞（Ｔ細胞等）を含む組成物（医薬品組成物等）を提供する。
【０１１９】
本発明の組成物は、血管内（静脈内又は動脈内）、腹腔内、又は筋肉内投与等の非経口投与用に処方されることが好ましい。
【０１２０】
本明細書中、「非経口投与された」とは、経腸及び局所投与以外の（通常は注射による）投与方法を意味しており、特に限定されないが、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、嚢下、くも膜下、脊髄内、及び胸骨内の注射及び注入を含む。
【０１２１】
一実施形態において、本明細書で検討されるＣＡＲ改変Ｔ細胞又は組成物は、腫瘍、リンパ節、体循環、又は感染部位へ直接注射することで対象に投与される。
【０１２２】
一実施形態において、本発明は、がんであると診断された対象から免疫エフェクター細胞を除去し、本明細書で検討されるＣＡＲをコードする核酸を有するベクターで該免疫エフェクター細胞を遺伝子改変することで改変免疫エフェクター細胞の集団を得、該改変免疫エフェクター細胞の集団を同対象に投与することによって、同対象を治療するのに有用である。好ましい実施形態において、上記免疫エフェクター細胞はＴ細胞を含む。
【０１２３】
投与の分量及び頻度、並びにＴＫＩ等の従来のＣＭＬ治療との考えられる組合せの順序は、患者の状態、患者の疾患の種類及び重症度等の要因により決定されるが、適当な用量は、動物モデル、最終的には臨床試験で決定してもよい。
【０１２４】
遺伝子改変した治療細胞の「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに幹細胞及び前駆細胞が個体において所望の応答を引き起こす能力等の要因に応じて変動してもよい。また、治療有効量は、ウイルス又は形質導入治療細胞の有毒又は有害作用よりも治療上有益な効果が上回るようなものである。一般的に、本明細書に記載したＴ細胞を含む医薬品組成物は、細胞１０４〜１０９個／ｋｇ体重、好ましくは１０５〜１０６個／ｋｇ体重（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の用量で投与してもよいといえる。
【０１２５】
以下の実施例を参照して、本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は単なる例示に過ぎず、特に明示されない限り、限定的なものではない。
【０１２６】
＜実施例１：患者の試料、健常ドナーの血液試料、細胞株＞
診断時及びＴＫＩ治療後の経過観察時に、患者からＣＭＬ試料コレクションを確立した。末梢血単核細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｖｅｌｉｚｙ−Ｖｉｌｌａｃｏｕｂｌａｙ、フランス）を用いたフィコール密度勾配遠心分離により、フランス血液センター（仏国ブザンソン）で収集した健常ドナーの匿名血液試料から単離した。ヒト腫瘍細胞株ＫＵ８１２（ＣＲＬ−２０９９）、Ｋ５６２（ＣＣＬ−２４３）、又は上皮細胞株２３９Ｔ（ＣＲＬ−３２１６）、ＨＴ１０８０（ＣＣＬ−１２１）は、ＡＴＣＣ（登録商標）コレクション（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、仏国モルスアイム）由来である。
【０１２７】
＜実施例２：モノクローナル抗体作製＞
標準的なハイブリドーマ法により、マウス抗ｈＩＬ−１ＲＡＰモノクローナル抗体を作製した。
【０１２８】
簡潔に言うと、ＩＬ−１ＲＡＰの細胞外部分（ＮＭ＿００２１８２．２、ＮＣＢＩ）及びヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、仏国リール）で構成された組換え融合タンパク質を用いて、足蹠（ｎ＝３）又は腹腔内（ｎ＝５）のいずれかでＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を免疫化した。リンパ節又は脾臓細胞及び血液試料を採取し、細胞をマウス骨髄腫細胞株と融合した後、ＩＬ−１ＲＡＰポジティブ細胞株（ＫＵ８１２）及びネガティブ細胞株（Ｒａｊｉ、ＫＧ１）に対してＦＡＣＳ分析（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によりスクリーニングした。
【０１２９】
ハイブリドーマのスクリーニングにより、ＩＬ−１ＲＡＰポジティブ細胞株（ＫＵ８１２又はＫＧ−１、それぞれＡＭＬ又はＰｈｉ＋ｐ２１０ＣＭＬ）とネガティブ細胞株（Ｔｏｍ−１、ＮＡＬＭ−２０、Ｊｕｒｋａｔ、又はＲａｊｉ、それぞれＰｈｉ＋  ｐ１９０  Ｂ−ＡＬＬ、Ｐｈｉ−Ｂ−ＡＬＬ、Ｔ−ＡＬＬ、又はバーキットリンパ腫）とを識別する５つのモノクローナル抗体サブクローンを選択することができた。
【０１３０】
・抗体の分子キャラクタリゼーション
Ｗａｎｇ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０００；２３３，ｐｐ１６７−７７）のプロトコルに従い、ＦＲ１並びに重鎖及び軽鎖の定常領域に特異的な縮重プライマーで得られたクローン化ＰＣＲ増幅産物のサンガーシークエンシングによって、分子キャラクタリゼーションを実施した。Ｂｒｏｃｈｅｔ  Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００８，３６，ｐｐ５０３−８）に従い、Ｖ−ＱＵＥＳＴオンラインツールを用いて、ＩＭＧＴ（登録商標）データベースに対して共通ヌクレオチド配列をアライメントすることにより、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃ遺伝子再構成及びＣＤＲ３領域を同定できた。分子サンガーシークエンシングにより、５つのモノクローナル抗体は全て同一であり、同じＣＤＲ３ヌクレオチド配列を有していることが分かった。サイトメトリーによる相対蛍光強度（ＲＦＩ）が最も高かったことから、モノクローナル抗体サブクローン（＃Ｅ３Ｃ３）を選択した。
【０１３１】
ウェスタンブロッティング法、組換えＩＬ−１ＲＡＰタンパク質に対するＥＬＩＳＡ、免疫組織化学的検査、共焦点顕微鏡観察、正常組織（ＦＤＡ正常ヒト器官組織アレイ、コア９９個／３３部位／７５症例）及びＣＭＬ患者の一次試料の組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）により、選択した抗体（クローン＃Ｅ３Ｃ３）を特徴付けた。
【０１３２】
・細胞成分画分のウェスタンブロッティング
超音波処理により、実施例１で列挙した細胞の全細胞画分、細胞成分画分、又は分泌タンパク質画分を得、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ、スイス）を添加したＲＩＰＡ溶解・抽出緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に懸濁させた。ＩＬ−１ＲＡＰ  ｃＤＮＡ変異体１（ＮＭ＿００２１８２．２、ＮＣＢＩ）でトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞株をコントロールとして使用した。アクチンはタンパク質ローディングコントロールとして検出した。ＩＬ−１ＲＡＰ、ＣＡＲ、又はβ−アクチン発現に対して、それぞれ一次ＩＬ−１ＲＡＰ＃Ｅ３Ｃ３（１：１０３に希釈）、ＣＤ３ζ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、クローン＃８Ｄ３）、又はβ−アクチン（１：１０３、クローンＡＣ１５、＃Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかを用いて、ＰＤＶＦ膜に移したタンパク質を１晩プローブした。二次ポリクローナル抗体ヒツジ抗マウスＩｇＧ（＃５１５−０３５−０６２、Ｊａｃｋｓｏｎ、米国）を用いて免疫検出染色を実施した。カメラ及びＢｉｏ−１Ｄソフトウェア（Ｖｉｌｂｅｒ−Ｌｏｕｒｍａｔ、仏国コレジアン）を用いて検出した。ウェスタンブロットにおいて＃Ｅ３Ｃ３モノクローナル抗体を使用すると、ＫＵ８１２が示される（図１）。
【０１３３】
・ＥＬＩＳＡによる組換えＩＬ−１ＲＡＰタンパク質のインビトロ検出
抗ヒトＦｃ抗体をプラスチック製ＥＬＩＳＡプレートの底に被覆した。ヒト抗体にロードしたＩＬ−１ＲＡＰタンパク質をマウス及びヒトＩＬ−１ＲＡＰ（＃Ｅ３Ｃ３）抗体でプローブした後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で被覆した抗マウスＦＣ抗体により検出した。
【０１３４】
ＥＬＩＳＡにより、＃Ｅ３Ｃ３モノクローナル抗体がＩＬ−１ＲＡＰ組換えタンパク質を認識することが確認された（図２）。
【０１３５】
・ＣＭＬ患者の初代細胞に対するフローサイトメトリー分析
マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識ＩＬ−１ＲＡＰ抗体クローン＃Ｅ３Ｃ３を含むＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＣＤ１１７のパネルを用いて、ＣＭＬ患者の造血幹細胞をトラッキングした。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１９を含む抗体パネルを用いて、形質導入細胞を染色して、ヘルパー又は細胞傷害性ＧＭＴＣを識別した。ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ９５、ＣＣＲ７モノクローナル抗体のパネルを用いて、ナイーブ、セントラル、又はメモリーＴ細胞サブセットを分析した。ＣＡＮＴＯ  ＩＩサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、仏国ルポンドクレ）を用いて細胞を採取し、ＤＩＶＡ６．１ソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、仏国ルポンドクレ）を用いて分析した。
【０１３６】
イマチニブ（ＴＫＩ）治療を受けた又は受けていないＣＭＬポジティブ患者２名の末梢血又は骨髄に対して免疫表現型検査を実施した。ＩＬ−１ＲＡＰ（＃Ｅ３Ｃ３）をＣＤ３４＋及びＣＤ３８−の蛍光染色と併用した。各種モノクローナル抗体の蛍光色素結合アイソタイプコントロールモノクローナル抗体を体系的に使用した。
【０１３７】
抗体パネルにおいて＃Ｅ３Ｃ３モノクローナル抗体を組み込むことで、診断時又はイマチニブ１２ヶ月後の患者の骨髄又は末梢血中において、ＩＬ−１ＲＡＰ＋白血病を発現する幹細胞ＣＤ３４＋ＣＤ３８＋又はＣＤ３４＋ＣＤ３８−亜集団を識別することができた（図３）。
【０１３８】
・共焦点顕微鏡観察
サイトスピンでスライドグラス（ＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔＴＭ  Ｐｌｕｓ、４９５１ＰＬＵＳ４、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に集めたＫＵ８１２細胞株及びＲａｊｉ細胞株に対して、共焦点顕微鏡観察で評価した。簡潔に言うと、上記細胞を蛍光モノクローナル抗体である抗マウスＦｃ−ＩｇＧ；ＩＬ−１ＲＡＰ（＃Ｅ３Ｃ３）で染色し、ＱＩｍａｇｉｎｇ製Ｒｅｔｉｇａ２０００Ｒカメラを取り付けたＯｌｙｍｐｕｓ製ＢХ５１顕微鏡で分析した。４０倍の対物レンズを使用し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）でデジタル化したデジタル画像を取得した。核染色ＤＡＰＩ（２−（４−アミジノフェニル）−６−インドールカルバミジン二塩酸塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、フランス）により対比染色を実施し、蛍光染色と重ね合わせた。
【０１３９】
共焦点顕微鏡観察により、ＩＬ−１ＲＡＰ発現に相当する細胞膜染色が明示された（図４）。
【０１４０】
・インサイツ検出
特異的又は非標的組織結合を検討するために、１器官あたり３名の個々のドナーから得た９０個の組織コア（３０器官）を含むＦＤＡ標準凍結組織アレイ（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ、米国ロックビル）を上述した通りインキュベートした。ＵｌｔｒａＶｉｅｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｖｅｎｔａｎａ、米国）を用いて免疫染色を検出した。ＮＤＰ．ｖｉｅｗ２ソフトウェアで画像を取得し、分析した。ＩＬ−１ＲＡＰ高発現（ＫＵ８１２）又はネガティブ発現（Ｒａｊｉ）細胞株をそれぞれポジティブ又はネガティブコントロールとして使用した。染色強度は以下の通り等級を付けた：ネガティブ（０）、弱染色（１＋）、中染色（２＋）、又は強染色（３＋）。ＩＬ−１ＲＡＰ高発現（ＫＵ８１２）又はネガティブ発現（Ｒａｊｉ）細胞株をそれぞれポジティブ又はネガティブコントロールとして使用した。
【０１４１】
＃Ｅ３Ｃ３モノクローナル抗体を用いてＩＬ−１ＲＡＰ発現を検討した。リンパ節、結腸、小腸、胎盤、胃、及び前立腺という６組織のみの主に上皮又は内皮細胞において、様々な強度の染色が検出された（図５）。
【０１４２】
＜実施例３：レンチウイルスコンストラクト＞
ＶＤＪ又はＶＪ再構成の分子シークエンシング及びＣＤＲ３ヌクレオチド配列決定に基づき、実施例１の＃Ｅ３Ｃ３  ＩＬ−１ＲＡＰハイブリドーマ由来の合成的に作製された一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）をＳＩＮ−ｐＳＤＹバックボーンにクローニングして、ＣＡＲレンチウイルスコンストラクト（ｐＳＤＹ−ｉＣ９−ＩＬ−１ＲＡＰＣＡＲ−ｄＣＤ１９）を調製した（Ｒｏｓｓｏｌｉｌｌｏ  Ｐ，Ｗｉｎｔｅｒ  Ｆ，Ｓｉｍｏｎ−Ｌｏｒｉｅｒｅ  Ｅ，Ｇａｌｌｏｉｓ−Ｍｏｎｔｂｒｕｎ  Ｓ，Ｎｅｇｒｏｎｉ  Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｏｌｕｔｉｏｎ：ＨＩＶ−ｄｒｉｖｅｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．，ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，２０１２；８（８）：ｅ１００２９０４）。
【０１４３】
簡潔に言うと、安全カセットｉＣＡＳＰ９と、＃Ｅ３Ｃ３モノクローナル抗体の一本鎖可変領域断片と、モニタリング及び有望な細胞選択のための細胞表面発現マーカーΔＣＤ１９とを有するＳＩＮレンチウイルスコンストラクトを構築した。これら３種の導入遺伝子はいずれも、ＥＦ１プロモーター及びＳＰ１６３エンハンサー配列（マウスＶＥＧＦ遺伝子の５’ＵＴＲの一部、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号＃Ｕ４１３８３）の制御下、２Ａペプチド切断配列で隔てられている。
【０１４４】
図６に示す通り、上記コンストラクトは、自殺安全カセットｉＣＡＳＰ９（化学誘導性カスパーゼ９）、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ、及び細胞表面選択マーカーΔＣＤ１９（シグナル伝達しない細胞内部を切断したＣＤ１９）という３つの異なる部分を有しており、これらは、２つの異なる２Ａリボソームスキップ配列（Ｐ２Ａ及びＴ２Ａ）で隔てられており、ＳＰ１６３エンハンサー及びＥＦ１ａ（伸長因子１プロモーターα）プロモーターの制御下にある。ＥＦ１ａプロモーター及びＳＰ１６３エンハンサーの制御下、ＣＤ２８−４．１ＢＢ−ＣＤ３ｚシグナル伝達鎖を用いて、＃Ｅ３Ｃ３免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）配列の可変領域で構成されたｓｃＦｖをインフレームでクローニングする。ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲは一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）を有し、この断片は、リーダー配列（Ｌ）と結合し、ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）でタグ付けされ、２つの共刺激領域（改変膜貫通及び細胞内シグナル伝達ＣＤ２８及び４−１ＢＢ）とＣＤ３ｚ細胞内シグナル伝達領域とで構成されたＴ細胞活性化領域にヒンジ領域を介して接続されている。Ｍｏｃｋ  Ｔは、ＩＬ−１ＲＡＰ  ｓｃＦｖを含まない同様のコンストラクトで構成されている。
【０１４５】
＜実施例４：ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の作製＞
製造業者の指示書に従い、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、フランス）を用いて、健常ドナーの末梢血単核細胞から得たＣＤ３＋Ｔリンパ球を活性化した後、磁気カラム（ＭＡＣＳ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、仏国パリ）で単離した。２日目に、活性化したＴ細胞を上清（ＳＮ）と接触させて２０００ｇ、１０℃で９０分間スピノキュレーション（ｓｐｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）して形質導入した。フローサイトメトリー分析によって形質導入効率を測定して、ΔＣＤ１９細胞表面マーカー発現を同定した。形質導入から４日後、ＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、仏国パリ）で標識したＣＤ１９ポジティブ細胞をＭＡＣＳカラムで磁気的に分離した。単離したＣＤ１９発現細胞を、８％ヒト血清を添加した５００ＵＩ／ｍＬのｒｈＩＬ−２（プロロイキン、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を含むＸ−ｖｉｖｏ完全培地（Ｌｏｎｚａ、スイス国バーゼル）で増殖させ、凍結保存した。実験的には、Ｔ  Ｃｅｌｌ  ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬と、ヒトＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はＩＬ−７＋ＩＬ−１５を添加したＴｅｘＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、仏国パリ）とを使用した。
【０１４６】
＜実施例５：ドナーＴ細胞のレンチウイルス形質導入＞
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）エンベロープ（ｐＭＤＧ）をコードするヘルパープラスミドと、ＧＡＧ／ＰＯＬ（ｐｓＰＡＸ２）パッケージングプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ、それぞれ＃１２２５９及び＃１２２６０、Ｔｒｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、スイス国ローザンヌ）とを用いたＣａＣｌ２法でサブコンフルエントな２９３Ｔ細胞の一過性同時導入を行うことによって、レンチウイルスベクター上清ストックを作製した。４８時間及び７２時間後にウイルス上清を回収し、ＰＥＧ及び低速遠心分離（３０００ｇ、一晩）により濃縮してから、使用するまで−８０℃で保管した。ＩＬ−１ＲＡＰ  ｓｃＦｖを含まない同レンチウイルスコンストラクト（Ｍｏｃｋ）をコントロールとして使用した。ＳＮの段階希釈液を用いた２９３Ｔ許容細胞の形質導入により、レンチウイルス上清の力価測定を確立した。
【０１４７】
フローサイトメトリーで形質導入効率を測定した。開始細胞数に応じて上清力価測定から感染多重度（ＭＯＩ）を差し引いた。
【０１４８】
レンチウイルス上清を用いたインビトロ作製プロセスによって、Ｍｏｃｋ又はＣＡＲ  ＩＬ−１ＲＡＰ上清についてそれぞれＭＯＩ＝２で初代Ｔ細胞を形質導入することができる。
【０１４９】
・ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ発現のウェスタンブロット分析
ＩＬ−１ＲＡＰ形質導入Ｔ細胞の膜又は細胞質細胞亜画分（超遠心後に得られたもの）から抽出したタンパク質又は全タンパク質ライセートを、マウス抗ヒトＣＤ３ｚ抗体でプローブした。細胞成分画分へのウェスタンブロッティングにより、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲがＣＤ３ｚシグナル伝達（予測される内在性ＣＤ３ｚシグナルが１６ＫＤａであるのに対して、５５ＫＤａのシグナル）と関連することが分かった（図７）。
【０１５０】
・フローサイトメトリーによる分析
Ｔ細胞表面でのＣＡＲ発現について、組換えＩＬ−１ＲＡＰビオチン化タンパク質を用いて分析し、二次抗ビオチン抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、クローン＃Ｂｉｏ３−１８Ｅ７）を用いたフローサイトメトリーにより検出した。Ｍｏｃｋ又はＣＡＲ  ＩＬ−１ＲＡＰのいずれかでＣＥＭ細胞株又は初代Ｔ細胞を形質導入した。次いで、ビオチンで標識した組換えＩＬ−１ＲＡＰの量を増やしながら、各量の存在下で細胞をインキュベートした。抗ビオチン蛍光抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーで分析した。ビオチン＋／ＣＤ１９＋ＣＥＭ又はＴ細胞のパーセンテージを標識ビオチン組換えタンパク質の量に対してプロットした。サイトメトリー分析のドットプロットは、最大値を含む代表的な染色に対して示したす。非形質導入細胞（Ｃ０）又はＭｏｃｋ  Ｔ細胞をコントロールとして使用する。
【０１５１】
ビオチン化ＩＬ−１ＲＡＰタンパク質の段階希釈液（２０ｎｇ〜２．４ｐｇ／ｍｌ）を用いた追加分析及びＦＡＣＳ分析によって、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ形質導入ＣＥＭ  Ｔ細胞株又は初代Ｔ細胞のいずれかを検出できる。１回の実験から、最大のＣＥＭ（８５．８％）又は初代（６８．５％）ＧＭＴＣを動員するためには、それぞれ１．２５ｎｇ及び０．１５ｎｇという異なる量の組換えタンパク質が必要であることを示すことができる（図８）。
【０１５２】
ＣＥＭの細胞表面では初代Ｔ細胞よりも多くのＣＡＲが発現される。また、Ｅ：Ｔ共培養系に多量（１０００倍＞血漿濃度）の非標識組換えＩＬ−１ＲＡＰタンパク質を添加すると、エフェクター細胞傷害性が顕著に阻害される。
【０１５３】
これらの実験から、ＣＡＲは細胞表面にアドレッシングされること、及びＩＬ−１ＲＡＰタンパク質のＣＡＲ特異的な認識及び結合が起こることが確認された。
【０１５４】
＜実施例６：自殺遺伝子ｉＣＡＳＰ９安全カセットの効率＞
形質導入細胞（ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ２９３Ｔ）又は非形質導入細胞（２９３Ｔ）を、培地のみ（−化学誘導二量体形成物質（ＣＩＤ））又は２０ｎＭのＣＩＤ  ＡＰ１９０３を含む培地で２４時間培養した。光学顕微鏡観察によって、培養液中の生細胞又は死細胞の存在及び構造を画像化できる（×４０）。
【０１５５】
光学顕微鏡観察により、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲで形質導入した２９３Ｔ細胞培養液はＣＩＤに対して感受性を有することが分かる（図９）。
【０１５６】
ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲを発現する又はしないＧＭＴＣ細胞混合物及び非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）に対するＣＩＤ暴露（２０ｎＭ、２４時間）後又は非暴露（薄灰色）でのフローサイトメトリー分析。ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋染色により、ＣＡＲを発現するＧＭＴＣをそれ以外から識別できる。
【０１５７】
非形質導入細胞（Ｃ０）又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞をいずれも培地のみ又は培地＋ＣＩＤ（２０ｎＭ、２４時間）に暴露した。
【０１５８】
正確な細胞死は、まず、製造業者の指示書（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＩＭ３６１４）に従い、アネキシン−Ｖ／７−ＡＡＤゲーティング後にフローサイトメトリーで評価した。蛍光分析は、ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋ポジティブ細胞に対してゲーティングした。５０００個の蛍光ビーズを取得してから定量化した。致死効率をコントロール細胞（未処理細胞）に対して標準化した。細胞致死を以下の通り算出した。死細胞％＝［１−（ＡＰ１９０３処理細胞中の生細胞の絶対数／未処理細胞中の生細胞の絶対数）］×１００。Ｃ０又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ（ＣＤ３＋／ＣＤ１９＋でゲーティング）細胞のＣＩＤ暴露２４時間又は４８時間。結果を３つの独立した実験の平均±ＳＤで表す。＊＊＊：ｐ＜０．００１（図１０）。
【０１５９】
サイトメトリー分析から、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲを発現する（ＣＤ１９＋）又はしない（ＣＤ１９−）Ｔ細胞の混合集団を２４時間ＣＩＤ暴露した後、ＣＤ１９−ＣＤ３＋細胞のみが存続したことが分かる。より正確には、アポトーシスの定量的ＡｎｎＶ／７ＡＡＤアッセイにより、非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）（２４時間又は４８時間でそれぞれ１．２８％及び６．１３％）と比較して、それぞれ２４時間又は４８時間ＣＩＤ暴露後に８４．１１％及び８８．９３％のＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞が除去されることが分かった（ｐ＜０．００１、ｎ＝３）。
【０１６０】
＜実施例７：ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞のＩＬ−１ＲＡＰ依存性増殖及びサイトカイン分泌＞
ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の増殖性、ひいては機能性を分析するために、天然ＩＬ−１ＲＡＰ発現細胞株ＫＵ８１２に加えて、変異体１（ｖ１）又は５（ｖ５）転写物からそれぞれ翻訳された膜型（アイソフォーム１）又は可溶型（アイソフォーム３）ＩＬ−１ＲＡＰのいずれかを発現する欠損ＭＨＣクラスＩ細胞株Ｋ５６２を作製した。膜型（ｍｂ）又は可溶型（ｓ）ＩＬ−１ＲＡＰ発現細胞株を得るために、Ｋ５６２細胞をそれぞれ変異体１（アイソフォーム１、ＮＭ＿００２１８２．２）又は変異体５（アイソフォーム２、ＮＭ＿００１１６７９３０）ＯＲＦクローン（ｐＣＭＶ６−ＡＣ−ＧＦＰベクター、Ｏｒｉｇｅｎ、又はｐＥＺ−Ｍ６１、Ｇｅｎｅ  Ｃｏｐｏｅｉａ）でトランスフェクトした。次いで、安定したｍｂ−又はｓ−ＩＬ−１ＲＡＰ発現Ｋ５６２細胞をｐＬｅｎｔｉ  ＣＭＶ  Ｖ５−ＬＵＣ  Ｂｌａｓｔ（Ａｄｄｇｅｎｅ、プラスミド＃２１４７４）で形質導入した。
【０１６１】
これらの細胞に対してウェスタンブロッティング分析を実施した。簡潔に言うと、プロテアーゼインヒビターカクテル（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ；Ｒｏｃｈｅ、スイス国バーゼル）を添加したＲＩＰＡ緩衝液で超音波処理した後、トランスフェクトＫ５６２細胞株から全細胞（総細胞）又は分泌タンパク質（培地上清）画分を得た。タンパク質２０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけた後、ＰＶＤＦ膜に電気泳動転写した。ＩＬ−１ＲＡＰ発現のために膜を一次ＩＬ−１ＲＡＰ＃Ｅ３Ｃ３（１：１０３に希釈）で一晩プローブした。タンパク質ローディング評価として、β−アクチンｍＡｂ染色（１：１０３、クローンＡＣ１５、＃Ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。二次ポリクローナル抗体ヒツジ抗マウスＩｇＧ（＃５１５−０３５−０６２、Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて免疫検出染色を実施した。カメラ及びＢｉｏ−１Ｄソフトウェア（Ｖｉｌｂｅｒ−Ｌｏｕｒｍａｔ、仏国コレジアン）を用いて化学発光検出を評価した。
【０１６２】
フローサイトメトリー及びウェスタンブロッティングによって、これらの実験から、アイソフォーム１（ｖ１）は細胞表面でよく発現されること、及びアイソフォーム３（ｖ５）はＫ５６２−ｖ５の培養上清で検出されるが、−ｖ１では検出されないことが確認された（図１１Ａ及びＢ）。
【０１６３】
Ｋ５６２−ｖ１（暗）及びＫＵ８１２（明）をＩＬ−１ＲＡＰ抗体（赤いヒストグラム）で染色し、非標識細胞（青いヒストグラム）と比較した。ソフトウェアで得られた相対蛍光強度を報告する。
【０１６４】
興味深いことに、トランスフェクトしたＫ５６２−ｖ１のＩＬ−１ＲＡＰ発現は、天然ＩＬ−１ＲＡＰ発現ＫＵ８１２細胞株より高い（蛍光強度比（ＲＦＩ）＝１０．５７対３３．４６）（図１１Ａ及びＢ）。
【０１６５】
＜実施例８：ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の増殖能＞
ＩＬ−１ＲＡＰ標的発現細胞に誘発されるＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の増殖能を測定するために、Ｋ５６２、Ｋ５６２−ｖ１、Ｋ５６２−ｖ５、又はＫＵ８１２細胞株の存在下、ＣＦＳＥ染色したＣ０、Ｍｏｃｋ、又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞を共培養した（エフェクター／標的比Ｅ：Ｔ＝１：１）。
【０１６６】
Ｃ０又はＭｏｃｋ細胞と比較して、エフェクターＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞は、ＩＬ−１ＲＡＰ細胞表面発現Ｋ５６２−ｖ１（７６．１％±１０．９）及びＫＵ８１２細胞（８１．６％±６．１６）の存在に対してのみ応答して顕著に分裂したが、Ｋ５６２−ｖ５（２７．３％±９．０３）又は培地のみ（１８．８％±７．０２）に対しては最低レベルであった（ｐ＜０．００１、ｎ＝４）。
【０１６７】
Ｅ：Ｔ比を１：５とした以外は同様にして、どのようにしてＣＡＲＴ細胞がＩＬ−１ＲＡＰ＋標的細胞の存在下でＩＦＮ−γを産生できるのかを細胞内ＩＦＮ−γ産生染色により評価した。
【０１６８】
Ｃ０又はＭｏｃｋ細胞ではなく、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ  ＣＤ８＋又はＣＤ８−細胞が、ＩＬ−１ＲＡＰ発現標的細胞Ｋ５６２−ｖ１（ＣＤ８＋：２３．７±０．７１％、ＣＤ８−：１４．８±３．５８％）及びＫＵ８１２（ＣＤ８＋：２２．３±２．３９％、ＣＤ８−：１３．１±２．７９％）（ｐ＜０．００１、ｎ＝４）に対して排他的にＩＦＮ−γを産生した（図１２）。
【０１６９】
＜実施例９：サイトカインのプロファイル＞
ＣＡＲＴ細胞により産生されたサイトカインのプロファイルを決定するために、ヒトＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−ａ、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１７Ａの分泌を定量化できるヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙ（ＣＢＡ）Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を製造業者の指示書に従って使用した。簡潔に言うと、標的細胞の存在下（比１：１）又は非存在下（コントロール）、ビーズ及びＰＥ結合抗サイトカイン抗体を用いて、１×１０５個のＣＡＲＴ細胞の一晩培養液の上清を３時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、標準化フローサイトメトリーアッセイにより取得した。ＦＣＡＰ  ＡｒｒａｙａソフトウェアＶｅｒｓｉｏｎ３．０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデータを分析した。標的細胞から回収した上清のみをコントロールとして使用した。ＩＬ−１ＲＡＰを発現する標的（Ｋ５６２−ＩＬ−１ＲＡＰ＋ｖ１、ＫＵ８１２）又は発現しない標的（Ｋ５６２）の存在下又は非存在下（培地、ＰＭＡ／Ｉｏｎｏ）、非形質導入、Ｍｏｃｋ−、又はＣＡＲ  ＩＬ−１ＲＡＰ  Ｔ細胞の培養上清の代表的なキャプチャービーズ蛍光分析。ＩＬ−１ＲＡＰポジティブ細胞培養上清をエフェクターと共培養するために、上清を１／３に希釈した。培地及びＰＭＡ／Ｉｏｎｏは、それぞれネガティブ及びポジティブコントロールとして使用する。
【０１７０】
最後に、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞を刺激するとＴｈ１様サイトカインプロファイル分泌が示されることの確認に加えて、Ｃ０、Ｍｏｃｋ、又はＣＡＲＴ細胞（Ｅ：Ｔ＝１：１）と共培養した後の上清中のＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトカインを測定した。
【０１７１】
ＩＬ−１ＲＡＰ細胞表面発現Ｋ５６２−ｖ１及びＫＵ８１２細胞のみがサイトカイン分泌を誘発でき、ＩＦＮｇ及びＩＬ−２を強く分泌し、ＴＮＦａを中程度に分泌し、ＩＬ−４、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０を弱く分泌するが、ＩＬ−１７は分泌することなく、幾分特定のＴｈ１プロファイルへ向いたものとなっている（図１３）。
【０１７２】
＜実施例１０：ＩＬ−１ＲＡＰ依存性ＣＡＲ細胞傷害性及びＩＬ−１ＲＡＰ発現腫瘍標的細胞株の溶解＞
ＣＤ１０７脱顆粒アッセイでＴ細胞介在性細胞傷害活性を分析した。各種Ｅ：Ｔ細胞比で２０〜２４時間インキュベートすることにより、生腫瘍細胞に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性を評価した。ＩＬ−１ＲＡＰ＋（Ｋ５３２−Ｖ１、ＫＵ８１２）発現標的細胞に対してＥ：Ｔ比＝１：５で共培養したＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞に実施したＣＤ１０７ａ＆ｂ脱顆粒アッセイから、ＩＬ−１ＲＡＰ特異的Ｔ細胞のＣＤ８−（主にＣＤ４＋）及びＣＤ８＋区画の両方においてＣＤ１０７ａ＆ｂの顕著な細胞表面動員が見られたが、細胞表面ＩＬ−１ＲＡＰ−（Ｋ５６２、Ｋ５６２−ｖ５）発現細胞では見られず、また、細胞ドナーのＭｏｃｋ又は非形質導入（Ｃ０）細胞では、認識可能な脱顆粒は見られなかった（ｐ＜０．００１、ｎ＝４）（図１４）。
【０１７３】
ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲ発現Ｔ細胞のインビトロでのＩＬ−１ＲＡＰ依存性細胞溶解能を測定するために、蛍光（ｅＦｌｕｏｒ）染色及び７−ＡＡＤ染色を用いて、それぞれＣＡＲＴ細胞及び生細胞を識別した。
【０１７４】
ＩＬ−１ＲＡＰ＋（Ｋ５６２−ｖ１及びＫＵ８１２）標的細胞とＩＬ−１ＲＡＰ−（Ｋ５６２、Ｋ５６２−ｖ５）標的細胞との間で７−ＡＡＤ−／ｅＦｌｕｏｒ−ゲートにおいて細胞が消失することを特徴とする統計的に有意な溶解活性（ｐ＜０．００１、ｎ＝４）が見られる。非形質導入又はＭｏｃｋ形質導入Ｔ細胞をコントロールとして使用した（図１５）。
【０１７５】
＜実施例１１：異種移植マウスモデル（インビボ試験）（図１６）＞
エフェクターＣＡＲ  Ｔ細胞を注射して又はしないで、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１ＷｊＩ／ＳｚＪ）マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、フランス）にＬｕｃ＋、ＩＬ−１ＲＡＰ＋腫瘍細胞株を移植した。マウス生存率に加え、循環ＣＡＲＴ細胞及び腫瘍量をサイトメトリー又は生物発光分析のいずれかで毎週分析した。
【０１７６】
簡潔に言うと、移植前に、３．５Ｇｙの線量で２４時間、亜致死的にマウスに放射線照射した（ｎ＝５／群）。その後、２×１０６個のＩＬ−１ＲＡＰ＋、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ＋、ＧＦＰ＋発現細胞株Ｋ５６２−ｖ１（Ｋ５６２−ｖ１ＩＬ−１ＲＡＰ＋／ＧＦＰ＋／Ｌｕｃ＋）を６〜８週齢のＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州バーハーバー）に尾静脈内（ｉ．ｖ）注射で移植した。腫瘍注射から４日後に１×１０Ｅ６〜５×１０Ｅ６個のＭｏｃｋ  Ｔ又はＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞を１度だけ静注した。また、Ｋ５６２−ｖ１ＩＬ−１ＲＡＰ＋／ＧＦＰ＋／Ｌｕｃ＋を注射したがＴ細胞では未処理であるマウス群をコントロールとして使用した。Ｋ５６２−ｖ１ＩＬ−１ＲＡＰ＋／ＧＦＰ＋／Ｌｕｃ＋腫瘍量を追跡するために、毎週、イソフルラン麻酔下で、５０ｍｇ／ｇのＤ−ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ、仏国リヨン）をマウスに腹腔内注射してから１０分後、ＮｉｇｈｔＯｗｌ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、仏国トワリー）で画像化した。ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞のインビボでのＩＬ−１ＲＡＰ発現細胞除去能を評価した。
【０１７７】
結果から、腫瘍生着後（Ｄ４）、大きさが減少して（Ｄ４〜Ｄ９）完全に除去された（＞Ｄ９）と認識されるまで、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞（Ｅ：Ｔ＝１：１）がＫ５６２−ｖ１ＩＬ−１ＲＡＰ＋／Ｌｕｃ＋腫瘍を標的とすることができることが分かる。
【０１７８】
それに対して、未処理又はＭｏｃｋ  Ｔ細胞処理マウスにおいて腫瘍増殖が確認され、マウスが死亡したが（Ｄ２８においていずれの群でも２／３）、ＣＡＲＴ細胞処理群ではマウスの死亡は見られない。興味深いことに、未処理又はＭｏｃｋ  Ｔ細胞処理群の生存マウスでは、ＣＡＲＴ細胞の非存在下で腫瘍が増殖し続ける。
【０１７９】
＜実施例１２：ＣＭＬ患者の初代ＩＬ−１ＲＡＰ発現細胞に対するインビトロ細胞傷害性＞
４年にわたる４種のＴＫＩを用いた５つの治療ライン（図１７上）に対する初代ＴＫＩ耐性ＣＭＬ患者（常にＢＣＲ−ＡＢＬ（ＩＳ）比＞１０％）から、形質導入効率９５．５％でＣＡＲＴ細胞を作製できた（図１７下）。ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞は、Ｅ：Ｔ比＝３：１で９５％の効率でＩＬ−１ＲＡＰ＋ＫＵ８１２細胞に対して用量依存的細胞傷害活性を示したのに対して、Ｃ０又はＭｏｃｋ  Ｔ細胞ではそれぞれ１８％及び２１％のアロ反応性細胞傷害性が示された（図１８）。これは、健常ドナーから得られたＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞と同等であった。また、ＣＭＬ患者ＰＢＭＣに対する自己ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の共培養では、２４時間後にＩＬ−１ＲＡＰ＋／ＣＤ３４＋細胞の特異的な溶解（ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞では７６．６５±９．２％であるのに対して、Ｃ０又はＭｏｃｋ  Ｔ細胞ではそれぞれ４．１６±４．３％及び２．７８±１．７２％）が示された（図１９）。
【０１８０】
また、ＴＫＩを含む長期治療下又は非治療下のＣＭＬ患者（ｎ＝３）から得られた自己ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞（形質導入効率：８５．３３±８．８％）は（図２１）、それぞれの初期長期凍結保存（＞２０年）末梢血幹細胞自家移植に対するものであり、７９．７８±１０．７％の効率でＣＤ３４＋／ＩＬ−１ＲＡＰ＋細胞を死滅させた（図２０）。
【０１８１】
＜実施例１３：ｉＣＡＳＰ９安全スイッチで保護されたＩＬ−１ＲＡＰ−ＣＡＲＴ細胞は健常造血細胞に対して大きな有害作用は示さない＞
オフターゲット毒性を予測するために、＃Ａ３Ｃ３ｍＡｂを使用して、３０個の正常ヒト組織の組織マクロアッセイ（ＴＭＡ）によりＩＬ−１ＲＡＰ発現を検討した。染色は、リンパ節、前立腺、骨格筋、胃、結腸及び小腸、並びに膵臓という６組織のみにおいて、炎症性又は壊死性要素を除いて様々な強度レベルで検出された（図２２Ａ及び表２）。興味深いことに、微小血管ＨＭＥＣ−１内皮細胞株は、我々の＃Ａ３Ｃ３  ＩＬ−１ＲＡＰ  ｍＡｂでは認識されず（図２２Ｂ）、Ｒ＆Ｄ  ＩＬ−１ＲＡＰ  ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｅｆ＃８９４１２）では細胞表面発現が明確に検出されるため、異なるエピトープが認識されたものと思われる。
【０１８２】
健常造血系の標的化に関して、ｍＡｂ＃Ａ３Ｃ３では健常ドナーの骨髄（図２３Ａ、Ｃ）又は正常臍帯血（図２３Ｂ、Ｃ）においてＨＳＣは検出されないとして（ＲＦＩ＜１．２、ｎ＝５）、健常ドナーの末梢血の２／５及び骨髄の３／５において、単球亜集団の弱い染色（ＲＦＩ＜２）が確認された（図２３Ａ）。次いで、ＰＢＭＣ及び自己ＣＡＲＴ細胞を様々なＥ：Ｔ比で共培養することで、単球のインビトロ感受性を検討した。Ｅ：Ｔ比＝１：１では、単球の一部のみが標的とされ、４１．４５％の単球が生存したままであったが（図２３Ｄ、右、表３）、リンパ球、顆粒球、及びＫ５６２  ＩＬ−１ＲＡＰネガティブ細胞株は、高いＥ：Ｔ比でも、影響を受けなかった（図２２Ｄ）。興味深いことに、上記Ｅ：Ｔ比では、白血病細胞の９４．７７％が死滅した（図２３Ｅ）。
【０１８３】
【表２−１】
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【０１８４】
【表２−２】
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【０１８５】
【表２−３】
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【０１８６】
【表３】
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【０１８７】
これらの結果はｈＣＤ３４生着マウスモデル（ｈｕ−ＮＯＧ）においてインビボで確認され、単球は１５日目で減少したが（４１±２５％、ｎ＝３、ｐ＝ｎ．ｓ）、ｈＣＤ３４＋細胞由来の他のヒト免疫担当細胞はＣＡＲＴ細胞の影響を受けないことが明らかとなった（図２４）。健常ＣＤ３４＋臍帯血ＨＳＣと自己ＣＡＲＴ細胞とのインビトロ共培養後に造血幹細胞培養アッセイを実施したところ（ｎ＝３）、ＨＳＣは影響を受けないことが確認された（図２５）。これらの結果は、造血系に対するわずかな副作用を伴うＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞免疫療法と一致する。
【０１８８】
潜在毒性を制限するために、化学誘導二量体形成物質（ＣＩＤ、１０ｎＭ）に暴露してからｉＣＡＳＰ９／ＡＰ１９０３自殺系カセットの安全スイッチの機能性を評価した。まず、光学顕微鏡観察から、ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲで形質導入した２９３Ｔ細胞培養はＣＩＤに感受性があることを示した（図２６、上）。サイトメトリー分析から、ＣＤ１９＋及びＣＤ１９−ＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の混合集団において、ＣＩＤ暴露２４時間後にＣＤ１９−ＣＤ３＋細胞のみが存続していた（図２６、下）。より正確には、アポトーシスの定量アッセイにおいて、ＣＩＤ暴露２４時間又は４８時間後にそれぞれＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の８４．１１％及び８８．９３％が除去されたのに対して、非形質導入Ｔ細胞（Ｃ０）では、２４時間又は４８時間でそれぞれ１．２８％及び６．１３％であった（ｐ＜０．００１、ｎ＝３、図２３Ｆ）。最後に、ＮＳＧマウスモデルでの安全スイッチのインビボ評価から、ＡＰ１９０３の腹腔内投与後にＩＬ−１ＲＡＰ  ＣＡＲＴ細胞の８７±７．３２％（ｐ＜０．０１、ｎ＝３）が除去されるが、ＰＢＳ投与後には影響を受けず、コントロールＴ細胞（Ｃ０）ではいずれの治療の影響も受けないことが分かった（図２３Ｇ）。