【手続補正書】
【提出日】令和3年6月28日(2021.6.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軟骨細胞を含む組成物であって、前記組成物は、少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する、組成物。
【請求項２】
前記インテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、少なくとも４対１、例えば少なくとも５対１など、少なくとも１０対１など、少なくとも１５対１など、少なくとも２０対１など、少なくとも２５対１など、少なくとも３０対１など、少なくとも３５対１など、少なくとも４０対１など、少なくとも４５対１など、少なくとも５０対１など、少なくとも６０対１など、少なくとも７０対１など、少なくとも８０対１など、少なくとも９０対１など、少なくとも１００対１など、少なくとも１５０対１など、少なくとも２００対１などである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、分化された軟骨細胞を含み、前記分化された軟骨細胞が、インテグリンアルファ１０を発現し、インテグリンアルファ１１を実質的に発現せず、かつ／または
前記組成物が、部分的に脱分化された軟骨細胞を含み、前記部分的に脱分化された軟骨細胞が、インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の両方を発現する、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物が、軟骨組織調製物、軟骨細胞を含む組織調製物、単層軟骨細胞の細胞培養物、および三次元軟骨細胞の細胞培養物からなる群から選択され、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞であり、かつ／または
前記組成物が、軟骨組織、組織を含む軟骨細胞、単層軟骨細胞の細胞培養物および三次元軟骨細胞の細胞培養物に由来し、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、混入細胞を実質的に含まず、前記混入細胞が、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリン１０を発現せず、かつ／または
前記組成物が、全組成物または細胞集団のうち、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの軟骨細胞を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記軟骨細胞が、ＣＥＰ−６８／ＣＲＴＡＣ１、ＧＰ−３９軟骨糖タンパク質、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、コラーゲンＩＩＡ、コラーゲンＩＩＢ、アグレカン、アリザリンレッド（ｎｅｇ）、アルシアンブルー、ＣＲＴＡＣ１、ＣＥＰ−６８、ＣＤ１４６、ＣＤ９０、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ６３およびＳｃａ−１からなる群から選択される二次マーカーをさらに発現する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
軟骨細胞を含む組成物の品質を決定するための方法であって、前記品質決定が、以下の基準：
・前記軟骨細胞の同一性、
・前記軟骨細胞の分化状態、
・前記軟骨細胞の純度、および
・前記軟骨細胞の効能
のうちの１つまたは複数を含み、
前記方法が、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前記組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現レベルを分析するステップと；
ｃ）インテグリンアルファ１０の発現レベルをインテグリンアルファ１１の発現レベルと比較するステップと
を含み、
少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、
・前記軟骨細胞組成物中の前記軟骨細胞の軟骨細胞同一性、
・前記軟骨細胞組成物中の前記軟骨細胞の分化状態、
・前記軟骨細胞組成物の純度、および／または
・前記軟骨細胞組成物の前記軟骨細胞の効能
の指標であり、それにより高品質の軟骨細胞組成物の指標となる、
方法。
【請求項８】
高品質の軟骨細胞の集団を単離するための方法であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前記組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を濃縮し、それにより高品質の軟骨細胞の単離集団を得るステップと
を含む、方法。
【請求項９】
高品質の軟骨細胞の集団を製造するための方法であって、
ａ）軟骨細胞を含む候補組成物を用意するステップと；
ｂ）前記組成物中のインテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の発現を分析するステップと；
ｃ）少なくとも４対１のインテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比を有する軟骨細胞を増大させ（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）、それにより高品質の軟骨細胞の集団を製造するステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
前記インテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、少なくとも４対１、例えば少なくとも１０対１など、少なくとも１５対１など、少なくとも２０対１など、少なくとも２５対１など、少なくとも３０対１など、少なくとも３５対１など、少なくとも４０対１など、少なくとも４５対１など、少なくとも５０対１など、少なくとも６０対１など、少なくとも７０対１など、少なくとも８０対１など、少なくとも９０対１など、少なくとも１００対１など、少なくとも１５０対１など、少なくとも２００対１などであり、かつ／または
前記インテグリンアルファ１１の発現が、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大２５％、例えば前記インテグリンアルファ１０の発現の最大２０％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大１５％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大１０％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大５％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大４％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大３％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大２％など、前記インテグリンアルファ１０の発現の最大１％などである、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
インテグリンアルファ１０およびインテグリンアルファ１１の両方の発現が、部分的に脱分化された軟骨細胞組成物の指標であり、かつ／または
インテグリンアルファ１０の発現および実質的に存在しないインテグリンアルファ１１の発現が、分化された軟骨細胞組成物の指標であり、かつ／または
前記軟骨細胞組成物中の最大２０％の前記細胞が、インテグリンアルファ１１を発現し、インテグリンアルファ１０を実質的に発現しないことが、前記軟骨細胞組成物の純度の指標であり、かつ／または
前記軟骨細胞組成物中の最大２０％、例えば最大１５％など、最大１０％など、最大５％など、最大４％など、最大３％など、最大２％など、最大１％など、最大０．５％などの前記細胞が、インテグリンアルファ１１を発現し、インテグリンアルファ１０を実質的に発現しないことが、前記軟骨細胞組成物の純度の指標であり、かつ／または 
インテグリンアルファ１１が、前記軟骨細胞組成物または集団中で実質的に発現されない、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補組成物が、軟骨組織調製物、軟骨細胞を含む組織調製物、単層軟骨細胞の細胞培養物、および三次元軟骨細胞の細胞培養物からなる群から選択され、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞であり、かつ／または
前記候補組成物が、軟骨組織、組織を含む軟骨細胞、単層軟骨細胞の細胞培養物および三次元軟骨細胞の細胞培養物に由来し、前記三次元軟骨細胞の細胞培養物が、スフェロイド、ペレット、細胞シートまたは足場に培養された軟骨細胞である、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現の分析が、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降法、ドットブロット、ｑＰＣＲ、免疫アッセイ、免疫蛍光法、遺伝子発現分析および任意の他の適切な方法からなる群から選択される方法により実行される、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＥＰ−６８／ＣＲＴＡＣ１、ＧＰ−３９軟骨糖タンパク質、ＣＤ４４、ＣＤ１６６、コラーゲンＩＩＡ、コラーゲンＩＩＢ、アグレカン、アリザリンレッド（ｎｅｇ）、アルシアンブルー、ＣＲＴＡＣ１、ＣＥＰ−６８、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ６３、ＣＤ１４６、ＣＤ９０およびＳｃａ−１からなる群から選択される二次マーカーの発現を検出することをさらに含む、請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
細胞によるインテグリンアルファ１０の発現の前記分析が、インテグリンアルファ１０のタンパク質発現を測定することを含み、かつ／または
前記インテグリンアルファ１０タンパク質発現が、抗インテグリンアルファ１０抗体により検出され、かつ／または
細胞によるインテグリンアルファ１１の発現の前記分析が、インテグリンアルファ１１のタンパク質発現を測定することを含み、かつ／または
前記インテグリンアルファ１１タンパク質発現が、抗インテグリンアルファ１１抗体により検出される、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
インテグリンアルファ１０の発現の前記分析が、インテグリンアルファ１０のｍＲＮＡ発現を測定することを含み、かつ／または
インテグリンアルファ１１の発現の前記分析が、インテグリンアルファ１１のｍＲＮＡ発現を測定することを含む、請求項７〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
発現を検出するために用いられる前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体またはその断片である、請求項７〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗インテグリンアルファ１０抗体が、
ａ）アクセション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５８３の下、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマ細胞株により生成されたモノクローナル抗体；または
ｂ）アクセション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２５８３の下、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨに寄託されたハイブリドーマにより生成されたモノクローナル抗体により結合されたエピトープと同じエピトープに結合するために競合する抗体；または
ｃ）インテグリンアルファ１０鎖の細胞外Ｉ−ドメインおよび／もしくは細胞質ドメインに特異的に結合することが可能な、ａ）もしくはｂ）の断片
である、請求項７〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
得られた前記軟骨細胞組成物または集団が、全細胞集団のうち、少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％など、少なくとも９０％など、少なくとも９５％など、少なくとも９８％など、少なくとも９９％など、１００％などの軟骨細胞を含む、請求項７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
得られた前記軟骨細胞組成物または集団が、最大２０％の混入細胞、例えば最大１５％の混入細胞など、最大１０％の混入細胞など、最大５％の混入細胞など、最大４％の混入細胞など、最大３％の混入細胞など、最大２％の混入細胞など、最大１％の混入細胞など、最大０．５％の混入細胞などを含み、前記混入細胞が、インテグリンアルファ１１を発現するがインテグリンアルファ１０を発現しない、請求項７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
インテグリンアルファ１０の発現を誘導する条件下で、軟骨細胞の組成物を育成すること、
インテグリンアルファ１０を発現する細胞を選択すること、および／または
インテグリンアルファ１１を発現する細胞を枯渇させること、をさらに含む、請求項７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
軟骨細胞を含む組成物の軟骨細胞の効能を最適化するための方法であって、インテグリンアルファ１０の発現を誘導することを含む、方法。
【請求項２３】
軟骨細胞の増殖速度を上昇させる方法であって、前記軟骨細胞のインテグリンアルファ１０の発現を誘導することを含む、方法。
【請求項２４】
インテグリンアルファ１１の発現を抑制することをさらに含む、請求項２２および２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
インテグリンアルファ１０の発現細胞の前記誘導が、アスコルビン酸および／または血小板溶解物を含む培地中で実行される、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
それにより得られた前記インテグリンアルファ１０とインテグリンアルファ１１の発現比が、少なくとも４対１、例えば少なくとも５対１など、少なくとも１０対１など、少なくとも１５対１など、少なくとも２０対１など、少なくとも２５対１など、少なくとも３０対１など、少なくとも３５対１など、少なくとも４０対１など、少なくとも４５対１など、少なくとも５０対１など、少なくとも６０対１など、少なくとも７０対１など、少なくとも８０対１など、少なくとも９０対１など、少なくとも１００対１など、少なくとも１５０対１など、少なくとも２００対１などである、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記得られたインテグリンアルファ１１の発現が、前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大２５％、例えば前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大２０％など、前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大１５％など、前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大１０％など、前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大５％など、前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大４％など、前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大３％など、前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大２％など、前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大１％など、前記得られたインテグリンアルファ１０の発現の最大０．５％などである、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ａ）軟骨細胞組成物を品質保証するための；
ｂ）軟骨細胞組成物の一貫性および／もしくは再現性のモニタリングのための；
ｃ）軟骨細胞組成物の効能を予測するための；
ｄ）軟骨細胞組成物を工程内管理するための；
ｅ）軟骨細胞組成物の増大の工程内管理のための；
ｆ）軟骨細胞組成物の放出テストを実行するための；
ｇ）軟骨細胞組成物の効能アッセイを実行するための；および／または
ｈ）軟骨細胞組成物の臨床転帰の予測のための、
請求項７〜２１のいずれか１項に記載の方法の使用。