(57)【要約】      （修正有）【課題】生物学的物質を迅速に特定するための細菌及びウイルスを含む、あらゆる生物学的物質からの特有の塩基組成シグネチャー（ＢＣＳ；base composition signatures）の検出及び特性決定の提供。【解決手段】生物学的物質に由来する核酸の保存配列領域へハイブリダイズして、該生物学的物質をユニークに特定する可変配列領域を纏めて扱うプライマー。核酸増幅と分子量決定の組み合わせにより、細菌、ウイルス、等を含む未知の生物学的物質を検出して特定する方法。この結果が「塩基組成シグネチャー」であり、次いで、これを塩基組成シグネチャーのデータベースに対して合致させ、それにより該生物学的物質を特定する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
未知の生物学的物質（bioagent）を特定する方法であって：
ａ）前記生物学的物質からの核酸を、前記核酸の諸配列へハイブリダイズする少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーに接触させる工程であって、前記諸配列が該生物学的物質の可変核酸配列に隣接している工程；
ｂ）増幅産物を産生するために前記可変核酸配列を増幅する工程；
ｃ）前記増幅産物の分子量を決定する工程；及び
ｄ）前記分子量を、複数の既知生物について工程ａ）〜ｃ）を行うことによって得られる増幅産物の１又はそれを越える分子量と比較する工程であって１つの合致が前記未知の生物学的物質を特定する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
前記少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする前記諸配列が高度に保存されている、請求項１の方法。
【請求項３】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項４】
前記増幅工程が、リガーゼ連鎖反応又は鎖追出増幅を含んでなる、請求項１の方法。
【請求項５】
前記生物学的物質が、細菌、ウイルス、細胞、又は胞子である、請求項１の方法。
【請求項６】
前記核酸がリボソームＲＮＡである、請求項１の方法。
【請求項７】
前記核酸が、ＲＮアーゼＰ又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする、請求項１の方法。
【請求項８】
前記増幅産物が分子量決定に先立ってイオン化される、請求項１の方法。
【請求項９】
さらに、前記生物学的物質から核酸を単離する工程を、前記少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーと前記核酸を接触させる工程に先立って含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１０】
異なるオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して工程ａ）〜ｄ）を行い、そしてその結果を、工程（ｄ）におけるものとは異なる複数の既知生物について工程ａ）〜ｃ）を行うことによって得られる増幅産物の１又はそれを越える分子量と比較する工程をさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１１】
前記１又はそれを越える分子量が分子量のデータベース中に含有される、請求項１の方法。
【請求項１２】
前記増幅産物が、エレクトロスプレーイオン化、マトリックス介助レーザーデソープション、又は高速原子衝突によりイオン化される、請求項１の方法。
【請求項１３】
前記分子量が質量スペクトル法により決定される、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記質量スペクトル法が、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、イオントラップ、四重極、磁気セクター、飛行時間型（ＴＯＦ）、Ｑ−ＴＯＦ、及び三重の四重極からなる群から選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
アデノシン、チミジン、グアノシン、又はシチジンとは異なる分子量を有する、アデニン、チミジン、グアノシン、又はシチジンの類似体の存在下で、工程ｂ）を行う工程をさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマー内の各トリプレットの１及び２位に塩基類似体を含み、前記塩基類似体が、天然塩基に比較して高められた親和性でその相補体へ結合する、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記プライマーが、前記プライマー内の各トリプレットの３位にユニバーサル塩基を含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記塩基類似体が、２，６−ジアミノプリン、プロピンＴ、プロピンＧ、フェノキサジン類、及びＧ−クランプからなる群から選択される、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記ユニバーサル塩基が、イノシン、グアニジン、ウリジン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、ｄＰ、ｄＫ、及び１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イミダゾール−４−カルボキサミドからなる群から選択される、請求項１６の方法。
【請求項２０】
未知の生物学的物質を特定する方法であって：
ａ）前記生物学的物質からの核酸を、前記核酸の諸配列へハイブリダイズする少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーに接触させる工程であって、前記諸配列が可変核酸配列に隣接している工程；
ｂ）増幅産物を産生するために前記可変核酸配列を増幅する工程；
ｃ）前記増幅産物の塩基組成を決定する工程；及び
ｄ）前記塩基組成を、複数の既知生物について工程ａ）〜ｃ）を行うことによって得られる増幅産物の１又はそれを越える塩基組成と比較する工程であって１つの合致が前記未知の生物学的物質を特定する工程
を含んでなる方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする前記諸配列が高度に保存されている、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応を含んでなる、請求項２０の方法。
【請求項２３】
前記増幅工程が、リガーゼ連鎖反応又は鎖追出増幅を含んでなる、請求項２０の方法。
【請求項２４】
前記生物学的物質が、細菌、ウイルス、細胞、又は胞子である、請求項２０の方法。
【請求項２５】
前記核酸がリボソームＲＮＡである、請求項２０の方法。
【請求項２６】
前記核酸が、ＲＮアーゼＰ又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする、請求項２０の方法。
【請求項２７】
前記増幅産物が塩基組成決定に先立ってイオン化される、請求項２０の方法。
【請求項２８】
さらに、前記生物学的物質から核酸を単離する工程を、前記少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーに前記核酸を接触させる工程に先立って含んでなる、請求項２０の方法。
【請求項２９】
異なるオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して工程ａ）〜ｄ）を行い、そしてその結果を、工程（ｄ）におけるものとは異なる複数の既知生物について工程ａ）〜ｃ）を行うことによって得られる増幅産物の１又はそれを越える塩基組成と比較する工程をさらに含んでなる、請求項２０の方法。
【請求項３０】
前記１又はそれを越える塩基組成シグネチャーが塩基組成シグネチャーのデータベースに含有される、請求項２０の方法。
【請求項３１】
前記増幅産物が、エレクトロスプレーイオン化、マトリックス介助レーザーデソープション、又は高速原子衝突によりイオン化される、請求項２０の方法。
【請求項３２】
前記塩基組成シグネチャーが質量スペクトル法により決定される、請求項２０の方法。
【請求項３３】
前記質量スペクトル法が、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、イオントラップ、四重極、磁気セクター、飛行時間型（ＴＯＦ）、Ｑ−ＴＯＦ、及び三重の四重極からなる群から選択される、請求項３２の方法。
【請求項３４】
アデノシン、チミジン、グアノシン、又はシチジンとは異なる分子量を有する、アデニン、チミジン、グアノシン、又はシチジンの類似体の存在下で、工程ｂ）を行う工程をさらに含んでなる、請求項２０の方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記プライマー内の各トリプレットの１及び２位に塩基類似体を含み、前記塩基類似体が、天然塩基に比較して高められた親和性でその相補体へ結合する、請求項２０の方法。
【請求項３６】
前記プライマーが、前記プライマー内の各トリプレットの３位にユニバーサル塩基を含む、請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記塩基類似体が、２，６−ジアミノプリン、プロピンＴ、プロピンＧ、フェノキサジン類、及びＧ−クランプからなる群から選択される、請求項３５の方法。
【請求項３８】
前記ユニバーサル塩基が、イノシン、グアニジン、ウリジン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、ｄＰ、ｄＫ、及び１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イミダゾール−４−カルボキサミドからなる群から選択される、請求項３６の方法。
【請求項３９】
ある個体において単ヌクレオチド多型性を検出する方法であって：
ａ）前記個体から核酸を単離する工程；
ｂ）前記潜在多型性を含んでなる領域に隣接している前記核酸の領域へハイブリダイズする諸オリゴヌクレオチドプライマーに前記核酸を接触させる工程；
ｃ）増幅産物を産生するために前記領域を増幅する工程；
ｄ）前記増幅産物の分子量を決定する工程；及び
ｅ）前記分子量を、前記多型性を有することが分かっている個体における前記領域の分子量と比較する工程であって前記分子量が同一であるならば前記個体が前記多型性を有する工程
を含んでなる方法。
【請求項４０】
前記多型性がある疾患に関連している、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記多型性が血液型抗原である、請求項３９の方法。
【請求項４２】
前記増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項３９の方法。
【請求項４３】
前記増幅工程が、リガーゼ連鎖反応又は鎖追出増幅である、請求項３９の方法。
【請求項４４】
前記増幅産物が質量決定に先立ってイオン化される、請求項３９の方法。
【請求項４５】
前記増幅産物が、エレクトロスプレーイオン化、マトリックス介助レーザーデソープション、又は高速原子衝突によりイオン化される、請求項３９の方法。
【請求項４６】
前記諸プライマーが諸保存配列へハイブリダイズする、請求項３９の方法。
【請求項４７】
前記分子量が質量スペクトル法により決定される、請求項３９の方法。
【請求項４８】
前記質量スペクトル法が、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、イオントラップ、四重極、磁気セクター、飛行時間型（ＴＯＦ）、Ｑ−ＴＯＦ、及び三重の四重極からなる群から選択される、請求項４７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環境、臨床、又は他のサンプルからの生物学的物質の迅速な検出及び特定の方法に関する。本方法は、細菌及びウイルスを含む、あらゆる生物学的物質からの特有の塩基組成シグネチャー（ＢＣＳ；base composition signatures）の検出及び特性決定を提供する。この特有のＢＣＳを使用して、生物学的物質を迅速に特定する。
【背景技術】
【０００２】
迅速かつ明確な微生物の特定が、産業、医療、環境、品質、及び研究上の様々な理由から望まれている。伝統的には、微生物学の研究室が標本の直接検査及び培養を通して感染症の病原体を特定する機能を果たしてきた。１９８０年代中期から、研究者は分子生物学技術の実践的な有用性を繰り返し実証してき、その多くは臨床診断アッセイの基礎となっている。これら技術のなかには、核酸ハイブリダイゼーション分析、制限酵素分析、遺伝子配列分析、及び核酸の分離及び精製が含まれる（例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）。これら方法は、一般に、時間がかかり、長々としている。もう１つの選択肢は、使用する隣接プライマーに基づいて特定の標的ＤＮＡ配列を増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は他の増幅法である。最終的に、検出とデータ分析により、ハイブリダイゼーション事象が分析結果へ変換される。
【０００３】
生物学的物質の検出のための他の技術には、高解像質量スペクトル法（ＭＳ）、低解像ＭＳ、蛍光、放射ヨード化、ＤＮＡチップ、及び抗体技術が含まれる。これら技術はいずれも完全に満足できるものではない。
【０００４】
質量スペクトル法は、分析される分子についての、高質量精度を含む詳細な情報を提供する。それは、容易に自動化できる方法でもある。しかしながら、高解像ＭＳだけでは、未知の、又は生物工学処理された病原体に対して、又は高いバックグラウンドレベルの生物学的物質（「騒乱」バックグラウンド）が存在する環境では、行うことができない。低解像ＭＳは、ある既知の物質のスペクトル線が十分に弱いか、又はサンプル中の他の生きている生物に由来するそれらに十分に近いと、それを検出し得ないことができる。特定プローブの付いたＤＮＡチップは、具体的に予期される生物の存在又は不存在しか決定することができない。何十万もの良性細菌の種が存在し、その中には脅威微生物（threat organisms）に配列が非常に似ているものがあるので、１０，０００プローブの付いたアレイでも、特定の微生物を検出するのに必要とされる幅が不足している。
【０００５】
抗体は、アレイよりもさらに重大な多様性の限界に直面する。多様性を高めるために高度に保存された標的に対して抗体を設計すれば、やはり脅威微生物が良性微生物に非常によく似ているために、偽警告の問題が重大になる。抗体は、相対的に騒乱していない環境において既知の物質を検出できるだけである。
【０００６】
いくつかのグループが、高解像エレクトロスプレーイオン化−フーリエ変換−イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル法（ＥＳＩ−ＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳ）を使用するＰＣＲ産物の検出について記載してきた。正確な質量の精密な測定を、少なくとも１種のヌクレオチドの数についての知見と組み合わせることで、ほぼ１００の塩基対のＰＣＲ二重鎖産物についての全塩基組成の計算が可能になった（Aaserud et al., J. Am. Soc. Mass Spec. 7: 1266-1269, 1996; Muddiman et al., Anal. Chem. 69: 1543-1549, 1997; Wunschel et al., Anal. Chem. 70: 1203-1207, 1998; Muddiman et al., Rev. Anal. Chem. 17: 1-68, 1998）。エレクトロスプレーイオン化−フーリエ変換−イオンサイクロトロン共鳴（ＥＳＩ−ＦＴ−ＩＣＲ）ＭＳを使用して、二本鎖の５００塩基対ＰＣＲ産物の質量を平均分子量を介して決定することができる（Hurst et al., Rapid Commun. Mass Spec. 10: 377-382, 1996）。ＰＣＲ産物の特性決定にマトリックス介助レーザーデソープションイオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトル法を使用することが記載されている（Muddiman et al., Rapid Commun. Mass Spec. 13: 1201-1204, 1999）。しかしながら、ＭＡＬＤＩで観察される約７５ヌクレオチドを超えるＤＮＡの分解により、この方法の有用性は制限された。
【０００７】
米国特許第５，８４９，４９２号は、２つの高度に保存されたセグメントにより囲まれたゲノムＤＮＡの高度に多様なセグメントについて調査すること、この高度に多様な領域のＰＣＲ増幅のためにユニバーサルプライマーを設計すること、ユニバーサルプライマーを使用するＰＣＲ技術により該ゲノムＤＮＡを増幅すること、及び、該遺伝子の配列決定をして該生物の同一性を決定することを含む、系統発生学的に情報に富むＤＮＡ配列の検索方法を記載している。
【０００８】
米国特許第５，９６５，３６３号は、質量スペクトル法の技術を使用して増幅された標的核酸を分析することによって核酸を多型性についてスクリーニングする方法と、これら方法の質量解像度と質量精度を向上させる方法を開示する。
【０００９】
ＷＯ９９／１４３７５号は、予備選択されたＤＮＡタンデムヌクレオチドリピート対立遺伝子を質量スペクトル法により分析するのに使用するための方法、ＰＣＲプライマー、及びキットを記載する。
【００１０】
ＷＯ９８／１２３５５号は、標的核酸を開裂させてその長さを減らすこと、その標的を一本鎖にすること、及びＭＳを使用してこの一本鎖の短縮化標的の質量を決定することによる質量スペクトルの分析により標的核酸の質量を決定する方法を開示する。標的核酸の増幅、その鎖の１つを固体支持体へ結合すること、第二の鎖を放してから、第一の鎖を放して、これをＭＳにより分析することを含んでなる、ＭＳ分析用に二本鎖標的核酸を調製する方法も開示されている。標的核酸調製のためのキットも提供される。
【００１１】
ＷＯ９７／３３０００は、標的核酸を一本鎖ノンランダム長フラグメントのセットへ非無作為的に断片化して、それらの分子量をＭＳにより決定することによって、該標的核酸における突然変異を検出する方法を開示する。
【００１２】
米国特許第５，６０５，７９８号は、特定の核酸の生物学的サンプルにおける存在を診断目的のために検出する、迅速で高精度の質量スペクトル計ベースの方法を記載する。
【００１３】
ＷＯ９８／２１０６６号は、特定の標的核酸の配列を質量スペクトル法により決定する方法を記載する。生物学的サンプルに存在する標的核酸をＰＣＲ増幅及び質量スペクトル検出により検出する方法が開示され、制限部位及びタグを含有するプライマーで標的を増幅すること、その増幅された核酸を伸長して開裂させること、及び伸長された産物の存在を検出することによって、標的核酸をサンプル中に検出する方法であって、野生型と異なる質量のＤＮＡフラグメントの存在が突然変異を示す方法も開示されている。質量スペクトル法を介して核酸を配列決定する方法も記載される。
【００１４】
ＷＯ９７／３７０４１、ＷＯ９９／３１２７８、及び米国特許第５，５４７，８３５号は、質量スペクトル法を使用して核酸を配列決定する方法を記載する。米国特許第５，６２２，８２４、５，８７２，００３、及び５，６９１，１４１号は、エクソヌクレアーゼ媒介の質量スペクトル法による配列決定のための方法、システム、及びキットを記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，８４９，４９２号
【特許文献２】米国特許第５，９６５，３６３号
【特許文献３】ＷＯ９９／１４３７５号
【特許文献４】ＷＯ９８／１２３５５号
【特許文献５】ＷＯ９７／３３０００号
【特許文献６】米国特許第５，６０５，７９８号
【特許文献７】ＷＯ９８／２１０６６号
【特許文献８】ＷＯ９７／３７０４１号
【特許文献９】ＷＯ９９／３１２７８号
【特許文献１０】米国特許第５，５４７，８３５号
【特許文献１１】米国特許第５，６２２，８２４号
【特許文献１２】米国特許第５，８７２，００３号
【特許文献１３】米国特許第５，６９１，１４１号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989
【非特許文献２】Aaserud et al., J. Am. Soc. Mass Spec. 7: 1266-1269, 1996
【非特許文献３】Muddiman et al., Anal. Chem. 69: 1543-1549, 1997
【非特許文献４】Wunschel et al., Anal. Chem. 70: 1203-1207, 1998
【非特許文献５】Muddiman et al., Rev. Anal. Chem. 17: 1-68, 1998
【非特許文献６】Hurst et al., Rapid Commun. Mass Spec. 10: 377-382, 1996
【非特許文献７】Muddiman et al., Rapid Commun. Mass Spec. 13: 1201-1204, 1999
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
このように、特異的かつ迅速であり、核酸の配列決定が必要とされない、生物学的物質を検出及び特定する方法へのニーズが存在する。本発明は、このニーズに対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の１つの態様は、未知の生物学的物質を特定する方法であって、前記方法は、（ａ）該生物学的物質からの核酸を、該核酸の配列へハイブリダイズしかつ可変核酸配列に隣接している少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程；（ｂ）増幅産物を産生するために該可変核酸配列を増幅する工程；（ｃ）該増幅産物の分子量を決定する工程；及び、（ｄ）該分子量を、複数の既知生物について工程（ａ）〜（ｃ）を行うことによって得られる増幅産物の１又はそれを越える分子量と比較する工程であって１つの合致が該未知の生物学的物質を特定する工程を含んでなる。この好ましい態様の１つの側面においては、該少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーはハイブリダイズする配列は高度に保存されている。好ましくは、該増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応を含む。また、該増幅工程は、リガーゼ連鎖反応又は鎖追出増幅 (strand displacement amplification) を含む。この好ましい態様の１つの側面においては、該生物学的物質は、細菌、ウイルス、細胞、又は胞子である。有利には、該核酸はリボソームＲＮＡである。もう１つの側面においては、該核酸はＲＮアーゼＰ又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。好ましくは、該増幅産物は分子量決定に先立ってイオン化される。本方法は、さらに、該生物学的物質から核酸を単離する工程を、該少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーに該核酸を接触させる工程に先立って含むことができる。本方法は、異なるオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して工程（ａ）〜（ｄ）を行って、その結果を、工程（ｄ）におけるものとは異なる複数の既知生物について工程（ａ）〜（ｃ）を行うことによって得られる増幅産物の１又はそれを越える分子量と比較する工程をさらに含むことができる。好ましくは、該１又はそれを越える分子量が分子量のデータベースに含有される。この好ましい態様のもう１つの側面においては、該増幅産物が、エレクトロスプレーイオン化、マトリックス介助レーザーデソープション、又は高速原子衝突によりイオン化される。有利には、該分子量が質量スペクトル法により決定される。好ましくは、該質量スペクトル法は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、イオントラップ、四重極、磁気セクター、飛行時間型（ＴＯＦ）、Ｑ−ＴＯＦ、又は三重の四重極である。本方法は、アデノシン、チミジン、グアノシン、又はシチジンとは異なる分子量を有する、アデニン、チミジン、グアノシン、又はシチジンの類似体の存在下で、工程（ｂ）を行うことをさらに含むことができる。１つの側面においては、該オリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマー内の各トリプレットの１及び２位に塩基類似体又は代替塩基を含み、該塩基類似体又は代替塩基は、天然塩基に比較して高められた親和性でその相補体へ結合する。好ましくは、該プライマーは、該プライマー内の各トリプレットの３位にユニバーサル塩基を含む。該塩基類似体又は代替塩基は、２，６−ジアミノプリン、プロピンＴ、プロピンＧ、フェノキサジン類、及びＧ−クランプであり得る。好ましくは、該ユニバーサル塩基は、イノシン、グアニジン、ウリジン、５−ニトロインドール、��−ニトロピロール、ｄＰ若しくはｄＫ、又は１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イミダゾール−４−カルボキサミドである。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、未知の生物学的物質を特定する方法であって、（ａ）該生物学的物質からの核酸を、該核酸の配列へハイブリダイズしかつ可変核酸配列に隣接している少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程；（ｂ）増幅産物を産生するために該可変核酸配列を増幅する工程；（ｃ）該増幅産物の塩基組成を決定する工程；及び、（ｄ）該塩基組成を、複数の既知生物について工程（ａ）〜（ｃ）を行うことによって得られる増幅産物の１又はそれを越える塩基組成と比較する工程であって１つの合致が該未知の生物学的物質を特定する工程を含んでなる。この好ましい態様の１つの側面においては、該少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーはハイブリダイズする配列が高度に保存されている。好ましくは、該増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応を含む。また、該増幅工程は、リガーゼ連鎖反応又は鎖追出増幅を含む。この好ましい態様の１つの側面においては、該生物学的物質は、細菌、ウイルス、細胞、又は胞子である。有利には、該核酸はリボソームＲＮＡである。もう１つの側面においては、該核酸はＲＮアーゼＰ又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。好ましくは、該増幅産物は分子量決定に先立ってイオン化される。本方法は、さらに、該生物学的物質から核酸を単離する工程を、該少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーに該核酸を接触させる工程に先立って含むことができる。本方法は、異なるオリゴヌクレオチドプライマー対を使用して工程（ａ）〜（ｄ）を行って、その結果を、工程（ｄ）におけるものとは異なる複数の既知生物について工程（ａ）〜（ｃ）を行うことによって得られる増幅産物の１又はそれを越える塩基組成シグネチャーと比較する工程をさらに含むことができる。好ましくは、該１又はそれを越える塩基組成は塩基組成のデータベースに含有される。この好ましい態様のもう１つの側面においては、該増幅産物は、エレクトロスプレーイオン化、マトリックス介助レーザーデソープション、又は高速原子衝突によりイオン化される。有利には、該分子量は質量スペクトル法により決定される。好ましくは、該質量スペクトル法は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、イオントラップ、四重極、磁気セクター、飛行時間型（ＴＯＦ）、Ｑ−ＴＯＦ、又は三重の四重極である。本方法は、アデノシン、チミジン、グアノシン、又はシチジンとは異なる分子量を有する、アデニン、チミジン、グアノシン、又はシチジンの類似体の存在下で工程（ｂ）を行う工程をさらに含むことができる。１つの側面においては、該オリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマー内の各トリプレットの１及び２位に塩基類似体又は代替塩基を含み、該塩基類似体又は代替塩基は、天然塩基に比較して高められた親和性でその相補体へ結合する。好ましくは、該プライマーは、該プライマー内の各トリプレットの３位にユニバーサル塩基を含む。該塩基類似体又は代替塩基は、２，６−ジアミノプリン、プロピンＴ、プロピンＧ、フェノキサジン類、及びＧ−クランプであり得る。好ましくは、該ユニバーサル塩基は、イノシン、グアニジン、ウリジン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、ｄＰ、又はｄＫ、又は１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イミダゾール−４−カルボキサミドである。
【００２０】
本発明は、ある個体において単ヌクレオチド多型性を検出する方法を提供し、前記方法は、（ａ）該個体から核酸を単離する工程；（ｂ）該潜在多型性を含んでなる領域に隣接している該核酸の領域へハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーに該核酸を接触させる工程；（ｃ）増幅産物を産生するために該領域を増幅する工程；（ｄ）該増幅産物の分子量を決定する工程；及び（ｅ）該分子量を、該多型性を有することが分かっている個体における該領域の分子量と比較する工程であって該分子量が同一であるなら該個体が該多型性を有する工程を含んでなる。
【００２１】
この好ましい態様の１つの側面においては、該プライマーは高度保存配列へハイブリダイズする。好ましくは、該多型性はある疾患に関連している。他のやり方では、該多型性は血液型抗原である。好ましい態様の１つの側面においては、該増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応である。また、該増幅工程は、リガーゼ連鎖反応又は鎖追出増幅である。好ましくは、該増幅産物は質量決定に先立ってイオン化される。１つの側面においては、該増幅産物は、エレクトロスプレーイオン化、マトリックス介助レーザーデソープション、又は高速原子衝突によりイオン化される。有利には、該分子量は質量スペクトル法により決定される。好ましくは、該質量スペクトル法は、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、イオントラップ、四重極、磁気セクター、飛行時間型（ＴＯＦ）、Ｑ−ＴＯＦ、及び三重の四重極である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａは、本発明における使用に適している、１６ＳｒＲＮＡ（配列番号３）からの保存領域の例を示すコンセンサス図である。矢印付きの線は、それに対してＰＣＲ用の識別力のあるプライマーの対が設計される領域の例である。各プライマー対のためのラベルは、そのコンセンサス図上の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。大文字の塩基は９５％より多く保存されており；小文字の塩基は９０〜９５％保存されており；黒丸は８０〜９０％保存されており；そして白丸は８０％未満保存されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本発明における使用に適している、１６ＳｒＲＮＡ（配列番号３）からの保存領域の例を示すコンセンサス図である。矢印付きの線は、それに対してＰＣＲ用の識別力のあるプライマーの対が設計される領域の例である。各プライマー対のためのラベルは、そのコンセンサス図上の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。大文字の塩基は９５％より多く保存されており；小文字の塩基は９０〜９５％保存されており；黒丸は８０〜９０％保存されており；そして白丸は８０％未満保存されている。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明における使用に適している、２３ＳｒＲＮＡ（３’−半分、図１Ｃ〜１Ｄ）（配列番号４）からの保存領域の例を示すコンセンサス図である。矢印付きの線は、それに対してＰＣＲ用の識別力のあるプライマーの対が設計される領域の例である。各プライマー対のためのラベルは、そのコンセンサス図上の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。大文字の塩基は９５％より多く保存されており；小文字の塩基は９０〜９５％保存されており；黒丸は８０〜９０％保存されており；そして白丸は８０％未満保存されている。
【図１Ｄ】図１Ｄは、本発明における使用に適している、２３ＳｒＲＮＡ（３’−半分、図１Ｃ〜１Ｄ）（配列番号４）からの保存領域の例を示すコンセンサス図である。矢印付きの線は、それに対してＰＣＲ用の識別力のあるプライマーの対が設計される領域の例である。各プライマー対のためのラベルは、そのコンセンサス図上の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。大文字の塩基は９５％より多く保存されており；小文字の塩基は９０〜９５％保存されており；黒丸は８０〜９０％保存されており；そして白丸は８０％未満保存されている。
【図１Ｅ】図１Ｅは、本発明における使用に適している、２３ＳｒＲＮＡ（５’−半分、図１Ｅ〜１Ｆ）（配列番号４）からの保存領域の例を示すコンセンサス図である。矢印付きの線は、それに対してＰＣＲ用の識別力のあるプライマーの対が設計される領域の例である。各プライマー対のためのラベルは、そのコンセンサス図上の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。大文字の塩基は９５％より多く保存されており；小文字の塩基は９０〜９５％保存されており；黒丸は８０〜９０％保存されており；そして白丸は８０％未満保存されている。
【図１Ｆ】図１Ｆは、本発明における使用に適している、２３ＳｒＲＮＡ（５’−半分、図１Ｅ〜１Ｆ）（配列番号４）からの保存領域の例を示すコンセンサス図である。矢印付きの線は、それに対してＰＣＲ用の識別力のあるプライマーの対が設計される領域の例である。各プライマー対のためのラベルは、そのコンセンサス図上の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。大文字の塩基は９５％より多く保存されており；小文字の塩基は９０〜９５％保存されており；黒丸は８０〜９０％保存されており；そして白丸は８０％未満保存されている。
【図１Ｇ】図１Ｇは、本発明における使用に適している、２３ＳｒＲＮＡドメインＩからの保存領域の例を示すコンセンサス図である。矢印付きの線は、それに対してＰＣＲ用の識別力のあるプライマーの対が設計される領域の例である。各プライマー対のためのラベルは、そのコンセンサス図上の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。大文字の塩基は９５％より多く保存されており；小文字の塩基は９０〜９５％保存されており；黒丸は８０〜９０％保存されており；そして白丸は８０％未満保存されている。
【図１Ｈ】図１Ｈは、本発明における使用に適している、２３ＳｒＲＮＡドメインＩＶからの保存領域の例を示すコンセンサス図である。矢印付きの線は、それに対してＰＣＲ用の識別力のあるプライマーの対が設計される領域の例である。各プライマー対のためのラベルは、そのコンセンサス図上の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。大文字の塩基は９５％より多く保存されており；小文字の塩基は９０〜９５％保存されており；黒丸は８０〜９０％保存されており；そして白丸は８０％未満保存されている。
【図１Ｉ】図１Ｉは、本発明における使用に適している、１６ＳｒＲＮＡドメインＩＩＩからの保存領域の例を示すコンセンサス図である。矢印付きの線は、それに対してＰＣＲ用の識別力のあるプライマーの対が設計される領域の例である。各プライマー対のためのラベルは、そのコンセンサス図上の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。大文字の塩基は９５％より多く保存されており；小文字の塩基は９０〜９５％保存されており；黒丸は８０〜９０％保存されており；そして白丸は８０％未満保存されている。
【図２】図２は、図１Ｃに示される１６ＳｒＲＮＡドメインＩＩＩからの典型的なプライマー増幅領域を示す。
【図３】図３は、ＲＮアーゼＰにおける保存領域を示す概略図である。大文字の塩基は９０％より多く保存され；小文字の塩基は８０〜９０％保存され；黒丸は７０〜８０％保存されている塩基を示し；そして白丸は７０％未満保存されている塩基を示す。
【図４】図４は、ヌクレオチド類似体「タグ」を使用して塩基組成シグネチャーを決定する、塩基組成シグネチャー決定の概略図である。
【図５】図５は、質量タグのホスホロチオエートＡ（Ａ*）がある場合とない場合の Bacillus anthracis（炭疽菌）領域の簡略化された質量スペクトルを示す。２つのスペクトルは、質量タグ含有配列の測定分子量が未修飾配列よりも高いという点で異なる。
【図６】図６は、同じプライマーを使用して増幅したStaphylococcus aureus（黄色ブドウ球菌）（S. aureus １６Ｓ＿１３３７Ｆ）及び Bacillus anthracis（B. anthr. １６Ｓ＿１３３７Ｆ）由来のＰＣＲ産物からの塩基組成シグネチャー（ＢＣＳ）スペクトルを示す。この２つの鎖は、２つの置換（ＡＴ→ＣＧ）だけで異なり、それらはそれらＢＣＳに基づいて明瞭に識別される。
【図７】図７は、２つの配列（B. anthracis 中のＡ14対 B. cereus 中のＡ15）間の単一の差異がＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトル法を使用して容易に検出できることを示す。
【図８】図８は、Bacillus anthracis の胞子コートタンパク質であるｓｓｐＥ５６マーの較正付きＥＳＩ−ＴＯＦである。このシグナルは、他のバチルス種に対して B. anthracis を明白に特定する。
【図９】図９は、B. anthracis の合成１６Ｓ＿１２２８二重鎖（逆向き及び前向きの鎖）のＥＳＩ−ＴＯＦである。この技術は、前向き鎖と逆向き鎖を容易に識別する。
【図１０】図１０は、合成 B. anthracis １６Ｓ＿１３３７の４６塩基対二重鎖のＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳである。
【図１１】図１１は、内部質量標準がある B. anthracis ｓａｓｐＢ遺伝子からの５６マーオリゴヌクレオチド（３スキャン）のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳである。内部質量標準をアステリスクにより示す。
【図１２】図１２は、５ｍＭＴＢＡ−ＴＦＡ緩衝液を有する内部標準のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳであり、トリフルオロ酢酸トリブチルアンモニウムでの電荷除去（stripping）が最も豊富な荷電状態を［Ｍ−８Ｈ+］8-から［Ｍ−３Ｈ+］3-へ低下させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、非ＰＣＲバイオマス検出モード、好ましくは高解像ＭＳと、生物学的物質に由来する核酸の保存配列領域へハイブリダイズしかつ該生物学的物質をユニークに特定する可変配列領域を纏めて扱う「識別力のあるプライマー」を使用するＰＣＲベースのＢＣＳ技術との組み合わせを提供する。高解像ＭＳ技術は、増幅された配列領域の分子量及び塩基組成シグネチャー（ＢＣＳ）を決定するために使用される。次いで、この特有の「塩基組成シグネチャー」（ＢＣＳ）を、同じ増幅された領域中の塩基組成シグネチャーのデータベースに対して合致させるための最大確度検出アルゴリズムへ入力する。本方法は、生物学的物質の検出及び特定のためにＰＣＲベースの増幅技術（特異性を提供する）と分子量検出モード（速度を提供し、増幅された標的配列の核酸配列決定を必要としない）を結びつける。
【００２４】
本方法は、既存の方法に比較して、きわめて迅速で正確な生物学的物質の検出及び特定を可能にする。さらに、この迅速な検出及び特定は、サンプル材料が不純であるときにさえ可能である。このように、本方法は、環境検査（例、水又は他のサンプル中の病原菌ｖｓ非病原菌の検出及び識別）、細菌戦（生物学的物質の即時特定と適正な処置を可能にする）、薬理遺伝学分析と医療診断（突然変異や多型性に基づいた癌診断：薬剤耐性及び感受性試験；遺伝病及び状態のスクリーニング及び／又は診断を含む）を含むがこれらに限定されない多種多様な分野において有用である。本方法は、ビルレンス、病原性、薬剤耐性、及びゲノム配列決定における進行中の生物医学研究に梃入れして、既存の方法に比較して、偽陽性率がより低い、大いに改善された感度、特異性、及び信頼性を提供する方法をもたらす。
【００２５】
本方法は、細菌、ウイルス、真菌、及び毒素を含むあらゆる生物学的物質でも検出して分類するために使用可能である。１例として、その物質が生物学的脅威である場合、入手される情報は、毒素遺伝子、病原性の島、及び抗生物質耐性遺伝子を含む、対抗手段に必要とされる実践的な情報を決定するために使用される。さらに、本方法は、染色体フラグメントスワッピング、分子育種（遺伝子シャッフル）、及び出現感染症を含む、天然の事象又は計画された工学事象を特定するために使用可能である。
【００２６】
細菌は、絶対に必要とされる遺伝子の共通セットを有する。マイコプラズマ、ウレアプラズマ、及びリケッチアのような微小ゲノムを含むすべての細菌種には約２５０の遺伝子が存在する（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 10268, 1996; Science 270: 397, 1995）。これら遺伝子は、翻訳、複製、組換え及び修復、転写、ヌクレオチド代謝、アミノ酸代謝、脂質代謝、エネルギー生産、取込み、分泌等に関わるタンパク質をコードする。これらタンパク質の例は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩβ、伸長因子ＴＵ、熱ショックタンパク質ｇｒｏＥＬ、ＲＮＡポリメラーゼβ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡトポイソメラーゼ、及び伸長因子Ｇである。オペロンもまた本方法を使用して標的化され得る。オペロンの１つの例は、腸疾患発現性大腸菌由来のｂｆｐオペロンである。複数のコア染色体遺伝子を使用して細菌を属若しくは種のレベルで分類し、微生物が潜在脅威を有するかどうかを決定することが可能である。本方法は、ある生物の潜在脅威を確定して対抗手段を指定するために、病原性マーカー（プラスミド又は染色体）及び抗生物質耐性遺伝子を検出するためにも使用することが可能である。
【００２７】
理論的に理想的な生物学的物質検出装置は、そのセンサーに達するあらゆる生物学的物質の完全な核酸配列を特定し、定量し、そして報告するだろう。病原体の核酸成分の完全な配列は、その正体と薬剤耐性若しくは病原性マーカーの存在を含む、その脅威に関するあらゆる関連情報を提供するだろう。この理想はまだ達成されていない。しかしながら、本発明は、塩基組成シグネチャー（ＢＣＳ）を使用して、同じ実践価値のある情報を入手するための簡明な戦略を提供する。ある遺伝子フラグメントの塩基組成は、その配列そのものほど情報に富んではいないが、短い分析対象配列フラグメントを適切に選択すれば、その遺伝子の完全な配列を分析する必要はない。参照配列のデータベースを作成することができる。そうすれば、特有の塩基組成シグネチャーが各配列の索引になるので、該配列の存在をこのシグネチャーの存在から正確に推量することが可能になる。塩基組成シグネチャーの利点は、多重ＰＣＲ（２つ以上のプライマー対が標的配列を同時に増幅するＰＣＲ）を使用する大量並列方式においてそれらが定量的に測定され得ることである。これら複数プライマー増幅領域により、ほとんどの脅威及び偏在するバックグラウンド細菌及びウイルスがユニークに特定される。さらに、クラスター特異的プライマー対は、重要な局所クラスター（例えば、anthracis 群）を識別する。
【００２８】
本発明の文脈において、「生物学的物質」は、生きているか若しくは死んでいるあらゆる生物、又はそのような生物に由来する核酸である。生物学的物質の例には、細胞（ヒト臨床サンプル、細菌細胞、及び他の病原体を含むがこれらに限定されない）、ウイルス、毒素遺伝子、及び生体調節化合物が含まれるがこれらに限定されない。サンプルは、生きていても死んでいても、又は植物状態（例えば、植物性の細菌又は胞子）でもよく、被包化されていても生物工学処理されたものでもよい。
【００２９】
本明細書に使用される「塩基組成シグネチャー」（ＢＣＳ）は、標的遺伝子と供給源生物をユニークに特定する核酸配列の選択されたフラグメントからの正確な塩基組成である。ＢＣＳは、特定遺伝子の特有の索引と考えることができる。
【００３０】
本明細書に使用される「識別力のあるプライマー」は、介在する可変領域に隣接している配列領域へ結合するプライマーである。好ましい態様においては、可変領域に隣接しているこれら配列領域は、異なる生物学的物質の種間で高度に保存されている。例えば、この配列領域は、すべてのバチルス種の間で高度に保存されていることができる。「高度に保存されている」という用語は、この配列領域が、約８０〜１００％、より好ましくは約９０〜１００％、そして最も好ましくは約９５〜１００％の同一性を示すことを意味する。１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡの領域を増幅する識別力のあるプライマーの例を図１Ａ〜１Ｉに示す。１６ＳｒＲＮＡ中の典型的なプライマー増幅領域を図２に示す。矢印は、１６ＳｒＲＮＡドメインＩＩＩ中の可変領域に隣接している高度に保存された領域へ結合するプライマーを表す。この増幅領域は、「１１００〜１１８８」の下にあるステムループ構造である。
【００３１】
本明細書に使用される「合致」は、統計的に有意な確率上の判定若しくは結果を意味する。
【００３２】
本発明の検出法の１つの主たる利点は、それらプライマーが、特定の細菌種や、バチルス又はストレプトマイセスのような属にさえ特異的である必要がないことである。むしろ、それらプライマーは、本明細書に記載の種を含むがそれらに限定されない数百の細菌種にわたって高度に保存された領域を認識する。このように、望まれる細菌を特定するために同一のプライマー対を使用することが可能であるのは、それが、単一の種に特異的であるか、又はいくつかの細菌種に共通した可変領域に隣接している保存領域へ結合し、介在配列の核酸増幅とその分子量及び塩基組成の決定を可能にするからである。例えば、１６Ｓ＿９７１〜１０６２、１６Ｓ＿１２２８〜１３１０、及び１６Ｓ＿１１００〜１１８８領域は、約９００種の細菌において９８〜９９％保存されている（１６Ｓ＝１６ＳｒＲＮＡ、数字は、ヌクレオチドの位置を示す）。本発明の１つの態様においては、本方法に使用されるプライマーが、１又はそれを越えるこれら領域又はその部分へ結合する。
【００３３】
本発明は、非ＰＣＲバイオマス検出モード、好ましくは高解像ＭＳと、保存領域へハイブリダイズしかつ（諸）生物学的物質をユニークに特定する可変領域を纏めて扱う「識別力のあるプライマー」を使用する核酸増幅ベースのＢＣＳ技術との組み合わせを提供する。ＰＣＲの使用が好ましいが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）及び鎖追出増幅（ＳＤＡ）を含む他の核酸増幅技術も使用可能である。高解像ＭＳ技術は、高度に騒乱した環境にあるバックグラウンドスペクトル線からの、生物学的物質スペクトル線の分離を可能にする。次いで、その解像されたスペクトル線をＢＣＳへ翻訳し、１又はそれを越える既知ＢＣＳのスペクトルに対して合致させる最大確度検出アルゴリズムへこれを入力する。好ましくは、この生物学的物質ＢＣＳスペクトルを、膨大な数の生物学的物質からの１又はそれを越えるＢＣＳのデータベースに対して合致させる。好ましくは、このマッチングは、最大確度検出アルゴリズムを使用してなされる。
【００３４】
好ましい態様においては、塩基組成シグネチャーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、好ましくは多重ＰＣＲ、及び質量スペクトル（ＭＳ）法を使用して、大量並行方式で定量的に測定される。ＭＳによる生物学的物質の検出には十分量の核酸が存在しなければならない。大量の精製された核酸又はそのフラグメントを調製するための多種多様な技術が当業者によく知られている。ＰＣＲには、増幅すべき（諸）標的配列に隣接している領域へ結合するオリゴヌクレオチドプライマーの１又はそれを越える対が必要とされる。これらプライマーはＤＮＡの異なる鎖の合成を始動させ、一方のプライマーから他方のプライマーへの方向で合成が起こる。プライマー、増幅すべきＤＮＡ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例、Ｔａｑポリメラーゼ）、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸、及び緩衝液が組み合わされてＤＮＡ合成が始まる。この溶液を加熱によって変性してから、冷却して新たに追加されるプライマーをアニールさせ、別のラウンドのＤＮＡ合成が続く。典型的には、このプロセスを約３０サイクル繰り返して、標的配列の増幅をもたらす。
【００３５】
「識別力のあるプライマー」は、増幅して分析すべき標的配列領域を画定する。１つの態様においては、標的配列がリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子配列である。最小の微生物ゲノムの多くの完全な配列が今や利用可能であるので、「最小の生命」を画定し、それぞれの遺伝子及び生物をユニークに特定する組成シグネチャーを特定する遺伝子のセットを特定することが可能である。ＤＮＡ複製、転写、リボソーム構造、翻訳、及び輸送のようなコア生命機能をコードする遺伝子は細菌ゲノムに広く分布し、ＢＣＳ分析に好ましい領域である。リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子は、有用な塩基組成シグネチャーを提供する領域を含む。コア生命機能に関わる多くの遺伝子と同様に、ｒＲＮＡ遺伝子は、各々の種にとってより特異的である高い可変性の領域が散在する細菌ドメインの全域にわたって並外れて保存されている配列を含有する。これら可変領域を利用して塩基組成シグネチャーのデータベースを組み立てることができる。この戦略は、ｒＲＮＡ遺伝子の小（１６Ｓ）及び大（２３Ｓ）サブユニットの配列の構造ベースのアライメントを創出することを包含する。例えば、Robin Gutell（テキサス大学、オースチン）により創出及び維持され、Institute for Cellular and Molecular Biology のウェブページ（www.rna.icmb.utexas.edu/）で公衆に利用可能であるリボソームＲＮＡデータベースには、１３，０００を超える配列が現時点で存在する。また、アントワープ大学（ベルギー）のウェブページ（www.rrna.uia.ac.be）により創出及び維持されている公衆に利用可能なｒＲＮＡデータベースもある。
【００３６】
これらデータベースを分析して、塩基組成シグネチャーとして有用である領域が決定されている。そのような領域の特徴は：ａ）興味の対象である特定の生物学的物質の種間で、配列増幅プライマー部位として役立つ上流及び下流のヌクレオチド配列に、約８０〜１００％、好ましくは約９５％より高い同一性があること；ｂ）種間で約５％以下の同一性を示す介在可変領域であること；及びｃ）保存領域間で約３０〜１０００ヌクレオチド、好ましくは約５０〜２５０ヌクレオチド以下、そしてより好ましくは約６０〜１００ヌクレオチド以下しか分離がないこと、である。
【００３７】
それらの全体にわたる保存性により、そのフランキングｒＲＮＡプライマー配列は、すべてではなくてもほとんどの細菌種の興味の対象である領域を増幅するための良好な「ユニバーサル」プライマー結合部位として役立つ。数組のプライマーの介在領域は長さ及び／又は組成において変動するので、特有の塩基組成シグネチャーを提供する。
【００３８】
「識別力のあるプライマー」は、合成する必要があるプライマーの数を最小化し、かつ単一のプライマー対を使用して多数の種の検出が可能になるようにできるだけ万能であるように設計することが有利である。これらプライマー対は、これら種の可変領域を増幅するために使用されることができる。これら種間で保存された領域中のどの変動（第三位でのコドンの揺らぎによる）もＤＮＡトリプレットの第三位において起こりやすいので、この位置に対応するヌクレオチドが、本明細書において「ユニバーサル塩基」と言われる、１つより多いヌクレオチドへ結合し得る塩基となるようにオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。例えば、この「揺らぎ」対合の下では、イノシン（Ｉ）がＵ、Ｃ又はＡへ結合し；グアニン（Ｇ）がＵ又はＣへ結合し、そしてウリジン（Ｕ）がＵ又はＣへ結合する。他のユニバーサル塩基の例には、５−ニトロインドール又は３−ニトロピロールのようなニトロインドール類（Loakes et al., Nucleosides and Nucleotides 14: 1001-1003, 1995）、縮重ヌクレオチドのｄＰ又はｄＫ（Hill et al.）、５−ニトロインダゾールを含有する非環式ヌクレオシド類似体（Van Aerschot et al., Nucleosides and Nucleotides 14: 1053-1056, 1995）、又はプリン類似体の１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−イミダゾール−４−カルボキサミド（Sala et al., Nucl. AcidＳｒes. 24: 3302-3306, 1996）が含まれる。
【００３９】
本発明の別の態様においては、「揺らぎ」塩基による幾分弱い結合を補うために、非修飾ヌクレオチドよりも高い親和性で結合するヌクレオチド類似体により各トリプレットの第一及び第二位が占められるように、オリゴヌクレオチドプライマーが設計される。これら類似体の例は、チミンへ結合する２，６−ジアミノプリン、アデニンへ結合するプロピンＴ、及びＧへ結合するプロピンＣ及びフェノキサジン類（Ｇ−クランプを包含する）である。プロピン類は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６４５，９８５号、５，８３０，６５３号、及び５，４８４，９０８号に記載されている。フェノキサジン類は、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５０２，１７７号、５，７６３，５８８号、及び６，００５，０９６号に記載されている。Ｇ−クランプは、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，００７，９９２号、及び６，０２８，１８３号に記載されている。
【００４０】
本方法により検出されることができる細菌性の生物兵器物質には、Bacillus anthracis（炭疽）、Yersinia pestis（肺炎性の疫病）、Franciscella tularensis（野兎病）、Burcella suis、Brucella abortus、Brucella melitensis（波状熱）、Burkholderia mallei（鼻疽）、Burkholderia pseudomalleii（類鼻疽）、Salmonella typhi（チフス熱）、Rickettsia typhii（発疹チフス）、Rickettsia prowasekii（発疹チフス）、及び Coxiella burnetii（Ｑ熱）、Rhodobacter capsulatus、Chlamydia pneumoniae、Escherichia coli、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Bacillus cereus、Clostridium botulinium、Coxiella burnetti、Pseudomonas aeruginnosa、Legionella pneumophila、及び Vibrio cholerae が含まれる。
【００４１】
１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮＡ以外で、細菌の検出のために本発明における使用に適した他の標的領域には、５ＳｒＲＮＡとＲＮアーゼＰが含まれる（図３）。
【００４２】
生物兵器真菌物質には、coccidioides immitis（コクシジオイデス症）が含まれる。
【００４３】
本発明の方法により検出されることができる生物兵器毒素遺伝子には、ボツリヌス中毒、Ｔ−２マイコトキシン、リシン、ブドウエンテロトキシンＢ、志賀毒素、アブリン、アフラトキシン、Clostridium perfringens エプシロン毒素、コノトキシン、ジアセトキシシルペノール、テトロドトキシン、及びサキシトキシンが含まれる。
【００４４】
生物兵器ウイルス脅威物質は、天然痘を除き、ほとんどがＲＮＡウイルス（ポジティブ鎖とネガティブ鎖）である。どのＲＮＡウイルスも関連ウイルスのファミリー（類似種）である。これらウイルスは、迅速に突然変異し、工学処理された株（自然又は故意）である可能性が非常に高い。ＲＮＡウイルスは、ウイルスゲノム（例、ビリオン成分、補助タンパク質）上の保存されたＲＮＡ構造ドメインと、一本鎖ポジティブ鎖ＲＮＡウイルスでは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、二本鎖ＲＮＡヘリカーゼ、キモトリプシン様及びパパイン様のプロテアーゼ、及びメチルトランスフェラーゼを含むコアウイルスタンパク質をコードする保存されたハウスキーピング遺伝子とを有するファミリーに集約される。
【００４５】
（−）鎖ＲＮＡウイルスの例には、アレナウイルス（例、サビアウイルス、ラッサ熱、マチュポ、アルゼンチン出血熱、フレキサル（flexal）ウイルス）、ブンヤウイルス（例、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、ハンターンウイルス、コンゴ−クリミア出血熱、リフトバレー熱）、及びモノネガウイルス目（例、フィロウイルス、パラミクソウイルス、エボラウイルス、マールブルグ、ウマモルビリウイルス）が含まれる。
【００４６】
（＋）鎖ＲＮＡウイルスの例には、ピコルナウイルス（例、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＡ、ヒトエコーウイルス、ヒトエンテロウイルス、ヒトポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ヒトパレコウイルス、ヒトライノウイルス）、アストロウイルス（例、ヒトアストロウイルス）、カルシウイルス（例、チバ・ウイルス、チッタ・ウイルス、ヒトカルシウイルス、ノーワーク・ウイルス）、ニドウイルス目（例、ヒトコロナウイルス、ヒトトロウイルス）、フラビウイルス（例、デングウイルス１−４、日本脳炎ウイルス、キャナサー森林病ウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、ロチオ・ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、西ナイルウイルス、黄熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）、及びトガウイルス（例、チクグニア・ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、マヤロ・ウイルス、オニョン・ニョンウイ、ロスリバー・ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス）が含まれる。Ｃ型肝炎ウイルスは、３４０ヌクレオチドの５’−非翻訳領域、３０１０のアミノ酸を有する９つのタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム、及び２４０ヌクレオチドの３’−非翻訳領域を有する。この５’−ＵＴＲと３’−ＵＴＲは、Ｃ型肝炎ウイルスにおいて９９％保存されている。
【００４７】
１つの態様においては、標的遺伝子が、（＋）鎖ＲＮＡウイルスによりコードされるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ若しくはヘリカーゼ、又は（−）鎖ＲＮＡウイルスからのＲＮＡポリメラーゼである。（＋）鎖ＲＮＡウイルスは二本鎖ＲＮＡであり、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと鋳型としてのポジティブ鎖を使用するＲＮＡ指向性ＲＮＡ合成により複製する。ヘリカーゼはＲＮＡ二重鎖を巻き戻して、一本鎖ＲＮＡの複製を可能にする。これらウイルスには、ピコナウイルス科（例、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス）、トガウイルス科（例、アルファウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス）、アレナウイルス科（例、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラッサ熱ウイルス）、コロナウイルス科（例、ヒト呼吸器ウイルス）、及びＡ型肝炎ウイルスが含まれる。これらタンパク質をコードする遺伝子は、可変領域と、その可変領域に隣接している高度に保存された領域を含む。
【００４８】
好ましい態様においては、（諸）生物学的物質から産生されるＰＣＲ産物の検出スキームは３つの特徴を取込む。第一に、この技術は、複数の（概して約６〜１０）ＰＣＲ産物を同時に検出して差別化する。第二に、この技術は、可能なプライマー部位から生物学的物質をユニークに特定するＢＣＳを提供する。最後に、この検出技術は、迅速で、多数のＰＣＲ反応が並行して実行されることができる。
【００４９】
１つの態様において、本方法は、抗生物質耐性及び／又は毒素遺伝子の細菌種における存在を検出するために使用することができる。例えば、抗生物質耐性プライマーセットと毒素遺伝子プライマーセットを使用することにより、テトラサイクリン耐性プラスミドと一方若しくは両方の炭疽毒素（ｐｘ０１及び／又はｐｘ０２）をコードするプラスミドを含有する Bacillus anthracis を検出することができる。B. anthracis がテトラサイクリン耐性について陽性であれば、異なる抗生物質、例えばキナロンを使用する。
【００５０】
ＰＣＲ産物の質量スペクトル法（ＭＳ）ベースの検出は、追加の利点とともに上記の特徴をすべて提供する。ＭＳは、特有の塩基組成を有する全ての増幅産物がその分子量により特定されるので、本来的には、放射性若しくは蛍光標識の必要がない並行検出スキームである。質量スペクトル法における今日の技術水準は、サンプルの分子内容についての情報を提供するには、フェムトモル量未満の材料でも容易に分析することができるというものである。サンプルの分子量が数百であるか、又は１０万原子量単位（ａｍｕ）若しくはダルトンより多いかにかかわらず、その材料の分子量の正確な評価を速やかに得ることができる。サンプルをガス相へ変換する多様なイオン化技術の１つを使用して、増幅産物から無傷の分子イオンを発生させることができる。これらイオン化法には、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳ）、マトリックス介助レーザーデソープションイオン化（ＭＡＬＤＩ）、及び高速原子衝突（ＦＡＢ）が含まれるがこれらに限定されない。例えば、核酸のＭＡＬＤＩは、核酸のＭＡＬＤＩにおける使用のマトリックスの実施例とともに、ＷＯ９８／５４７５１（Ｇｅｎｅｔｒａｃｅ社）に記載されている。
【００５１】
イオン化すると、１つのサンプルからの様々な電荷のイオンの形成により、いくつかのピークが観察される。単一の質量スペクトルから得られる分子量の多数の読取りを平均化して、生物学的物質の分子量の推定値を得る。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル法（ＥＳＩ−ＭＳ）は、有意な量の断片化を引き起こさずにサンプルの多重荷電分子の分布をもたらすので、１０ｋＤａより大きい分子量を有するタンパク質及び核酸のような非常に高い分子量のポリマーに特に有用である。
【００５２】
本発明の方法に使用される質量検出装置には、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量スペクトル法（ＦＴ−ＩＣＲ−ＭＳ）、イオントラップ、四重極、磁気セクター、飛行時間型（ＴＯＦ）、Ｑ−ＴＯＦ、及び三重の四重極が含まれるがこれらに限定されない。
【００５３】
一般に、本発明において使用できる質量スペクトル技術には、タンデム質量スペクトル法、赤外多光子解離（infrared multiphoton dissociation）、及び熱分解ガスクロマトグラフィー質量スペクトル法（ＰＧＣ−ＭＳ）が含まれるがこれらに限定されない。本発明の１つの態様においては、生物学的物質検出システムが、バイオマスの増加（例えば、飲料水の汚物汚染又は細菌戦病原体の増加）の迅速な検出には、ＰＣＲを伴わない熱分解ＧＣ−ＭＳを使用する生物学的物質検出モードにおいて連続的に操作される。最小の潜在度を達成するために、連続したサンプル流がＰＧＣ−ＭＳ燃焼室へ直に流し込まれる。バイオマスの増加が検出される場合、ＰＣＲ法が自動的に始動される。生物学的物質の存在は、ＰＧＣ−ＭＳにおいて観察される、１００〜７，０００Ｄａの高分子フラグメントの上昇レベルをもたらす。観察される質量スペクトルを閾値レベルと比較し、バイオマスのレベルが予め決定された閾値を超えていると判定された場合、（ＰＣＲとＭＳ、好ましくはＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳを組み合わせる）上記に記載の生物学的物質の分類化が開始される。場合により、警告又は他の方法（換気流の停止、物理的な隔離）もこの検出バイオマスレベルにより始動される。
【００５４】
大きなＤＮＡについての分子量の正確な測定は、ＰＣＲ反応から各鎖へカチオンが付加されること、天然に豊富な13Ｃ及び15Ｎ同位体に由来する同位体ピークが解像されること、及びあらゆるイオンの荷電状態が帰属されることにより限界がある。カチオンは、ＰＣＲ産物を含有する溶液を、フローに対して直交する電場勾配の存在下に酢酸アンモニウムを含有する溶液と接触させるフロースルーチップを使用するインライン透析により除去される。後者の２つの問題は、１００，０００より高い解像力で操作することによって、そして同位体枯渇ヌクレオチド三リン酸をＤＮＡに取込ませることによって対処する。機器の解像力も考慮すべきことである。１０，０００の解像力では、８４マーＰＣＲ産物の［Ｍ−１４Ｈ＋］14-荷電状態からのモデル化シグナルは不良に特性決定され、荷電状態又は正確な質量の帰属は不可能である。３３，０００の解像力では、個々の同位体成分由来のピークが見えてくる。１００，０００の解像力では、同位体ピークがベースラインに対して解像され、イオンの荷電状態の帰属が簡明になる。例えば、（同位体）枯渇培地で微生物を増殖させ、そのヌクレオチドを採取することによって、［13Ｃ，15Ｎ］枯渇三リン酸が得られる（Batey et al., Nucl. AcidＳｒes. 20: 4515-4523, 1992）。
【００５５】
完全な核酸領域の質量測定はほとんどの生物学的物質を決定するのに十分であると考えられるが、タンデム質量スペクトル法（ＭＳn）技術は、分子の同一性若しくは配列に関連するより決定的な情報を提供する可能性がある。タンデムＭＳは、２つ以上の質量スペクトル段階の共役使用を含み、ここでは分離及び検出の両工程が質量スペクトル法に基づく。第一段階を使用して、さらなる構造情報を入手すべきサンプルのイオン若しくは成分を選択する。次いで、選択されたイオンを、例えば、黒体放射、赤外多光子解離、又は衝突活性化を使用して断片化する。例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）により生成したイオンは、ＩＲ多光子解離を使用して断片化することができる。この活性化はグリコシド結合及びリン酸骨格の解離をもたらし、（内部開裂の後で完全な３’末端と５’リン酸を有する）ｗ系列と（完全な５’末端と３’フランを有する）ａ−ベース系列と呼ばれる、２系列のフラグメントイオンを産生する。
【００５６】
次いで、質量スペクトルの第二段階を使用して、これら生じた生成物イオンのフラグメントを検出してその質量を測定する。このようなイオン選択に次ぐ断片化ルーチンは、サンプルの分子配列をほとんど完全に切り裂くように、何度も行うことができる。
【００５７】
類似の塩基組成若しくは質量の２又はそれを越える標的が存在するか、又は一回の増幅反応が２つ以上の生物学的物質参照標準と同じ質量を有する生成物をもたらす場合、それらは、質量修飾「タグ」を使用することによって識別することができる。本発明のこの態様においては、質量の識別を向上させるために、未修飾塩基とは異なる分子量を有するヌクレオチド類似体又は「タグ」（例、５−（トリフルオロメチル）デオキシチミジン三リン酸）が増幅の最中に取込まれる。このようなタグは、例えば、ＷＯ９７／３３０００号に記載されている。これにより、何らかの質量に一致する可能な塩基組成の数がさらに限定される。例えば、５−（トリフルオロメチル）デオキシチミジン三リン酸は、別の核酸増幅反応においてｄＴＴＰの代わりに使用できる。慣用の増幅産物とタグ付き産物の間の質量シフトの測定を使用して、一本鎖のそれぞれにおけるチミジンヌクレオチドの数を定量する。この鎖は相補的であるので、各鎖中のアデノシンヌクレオチドの数も決定される。
【００５８】
もう１つの増幅反応においては、例えば、シチジン類似体の５−メチルシトシン（５−ｍｅＣ）又はプロピンＣを使用して、各鎖中のＧ及びＣ残基の数を決定する。Ａ／Ｔ反応とＧ／Ｃ反応の組み合わせに続く分子量決定により特有の塩基組成が提供される。この方法を図４と表１に纏める。
【００５９】
【表１】
2010057495.tif 000002
【００６０】
質量タグのホスホロチオエートＡ（Ａ*）を使用して、Bacillus anthracis クラスターを識別した。ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより測定すると、B. anthracis（Ａ14Ｇ9Ｃ14Ｔ9）は１４０７２．２６の平均分子量を有し、B. anthracis（Ａ1Ａ*13Ｇ9Ｃ14Ｔ9）は１４２８１．１１の平均分子量を有し、ホスホロチオエートＡは、＋１６．０６の平均分子量を有していた。簡略化したスペクトルを図５に示す。
【００６１】
もう１つの例においては、各鎖の測定分子量がそれぞれ３０，０００．１１５Ｄａと３１，０００．１１５Ｄａであり、ｄＴ及びｄＡ残基の測定数が（３０，２８）と（２８，３０）であると仮定する。この分子量が１００ｐｐｍまで正確であれば、各鎖について可能な７つの可能なｄＧ＋ｄＣの組合せが存在する。しかしながら、測定分子量が１０ｐｐｍまで正確であれば、ｄＧ＋ｄＣの組み合わせは２つだけであり、１ｐｐｍの精度では、各鎖について可能な塩基組成は１つしか存在しない。
【００６２】
質量スペクトル計からのシグナルは、レーダ・シグナル処理において広く使用されているような最大確度検出及び分類アルゴリズムへ入力することができる。この検出処理は、質量−塩基カウントスペースにおいて観測されるＢＣＳの合致審査（matched filtering）を使用し、シグネチャーの検出と既知の無害生物からの減算と、未知の生物学的物質脅威の検出を可能にする。脅威レベルの推定では、新たに観測された生物学的物質のＢＣＳを既知生物のそれや、抗生物質耐性遺伝子又は毒素遺伝子の挿入のような、既知の病原性亢進の形態と比較することにより、それを既知の生物学的物質と比較することもできる。
【００６３】
処理は、観測シグナルと平均バックグラウンドレベルから導かれる対数確度比率を使用する Bayesian 分類化で終了することができる。このプログラムは、天然に存在する生物と環境汚染物質の複合バックグラウンドを含む条件について、偽警告プロットの確率に対して検出の確率が最高になる性能予測を強調する。合致フィルターは、各々の生物学的物質について使用されるプライマーのセットが与えられたシグナル値のアプリオリ予測値からなる。ゲノム配列データベース（例、ＧｅｎＢａｎｋ）を使用して、質量ベースカウント合致フィルターを定める。このデータベースは、既知の脅威物質と両性のバックグラウンド生物を含有する。後者を使用して、バックグラウンド生物により生成されるシグネチャーを見積もってそれを減ずる。既知のバックグラウンド生物の最大確度検出は、合致フィルターとノイズ共分散の連続合計推定値を使用して実行する。バックグラウンドシグナルの強度を見積もって、合致フィルターとともに使用し、シグネチャーを形成してから、これを減じる。この「クリーンアップ」データへ、生物についての合致フィルターとクリーンアップデータのノイズ共分散の連続合計推定値を利用する類似のやり方で、最大確度法を適用する。
【００６４】
１つの態様においては、多数のコア遺伝子からのシグナルを測定することによって各生物を「三角にする」戦略を使用して、偽陰性及び偽陽性のシグナルを抑え、原型又はハイブリッド、又は他のやり方で工学処理された生物学的物質の再構築を可能にする。多数のコア遺伝子の特定の後で、核酸配列データベースからのアライメントを創出する。次いで、保存及び変異の領域についてこのアライメントを分析し、可変領域に隣接している潜在的なプライマー結合部位を特定する。次に、特定のゲノム差異（即ち、塩基組成）に基づいて生物を識別するシグネチャー分析のための増幅標的領域を選択する。例えば、B. anthracis ゲノムから予測されるシグネチャーの不存在下での、B. anthracis に典型的な３つの部分の毒素遺伝子（Bowen, J. E. 及び C. P. Quinn, J. Appl. MIcrobiol. 1999, 87, 270-278）のシグネチャーの検出は、遺伝子工学事象を示唆するであろう。
【００６５】
本方法は、単ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）又は多ヌクレオチド多型性を迅速かつ正確に検出するためにも使用できる。ＳＮＰは、一つの個体から別の固体へ異なるゲノム中の単一の塩基対部位として定義される。この差異は、欠失、挿入又は置換のいずれかとして表現することができ、しばしば疾患状態に関連する。それらは１００〜１０００塩基対ごとに起こるので、ＳＮＰは、ヒトゲノム中で最も頻繁に束縛された (bound) タイプの遺伝マーカーである。
【００６６】
例えば、鎌状赤血球貧血は、グルタミン酸残基ではなくバリンをコードするＡ−Ｔ転位から生じる。オリゴヌクレオチドプライマーを、それらがＳＮＰ部位に隣接しているある配列へ結合するように設計してから、ヌクレオチド増幅とその増幅産物の質量決定をすることができる。鎌状赤血球貧血を有さない個体から生じる産物の分子量は、その疾患を有する個体からの産物のそれとは異なるので、この方法は、２つの個体を識別するために使用できる。このように、本方法は、個体中の既知ＳＮＰを検出し、それによりある疾患又は状態への高められた感受性を診断するか又は判定するために使用することができる。
【００６７】
１つの態様においては、個体から血液を採取し、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＳＮＰ領域に隣接している既知配列に基づいた適切なプライマーを使用して、好ましくはハイスループットスクリーニング方法において、１又はそれを越えるＳＮＰについて同時に試験する。National Center for Biotechnology Information は公衆に利用可能なＳＮＰのデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）を保持している。
【００６８】
本発明の方法は、血液型判定にも使用できる。Ａ，Ｂ又はＯ血液型をコードする遺伝子は、４つの単ヌクレオチド多型性により異なることができる。この遺伝子が配列：ＣＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＴ（配列番号５）を含有すればＡ抗原が生じる。この遺伝子が配列：ＣＧＴＣＧＴＣＡＣＣＧＣＴＡ（配列番号６）を含有すればＢ抗原が生じる。この遺伝子が配列：ＣＧＴＧＧＴ−ＡＣＣＣＣＴＴ（配列番号７）を含有すれば血液型Ｏが生じる（「−」は欠失を示す）。これら配列は、これら領域に隣接している単一プライマー対を設計してから、増幅と質量決定を行うことにより識別することができる。
【００６９】
本発明をその好ましい態様のいくつかに従って具体的に記載してきたが、以下の実施例は、本発明を例示するためだけのもので、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００７０】
実施例１
核酸単離とＰＣＲ
１つの態様においては、質量スペクトル法によるＢＣＳ決定に先立って、標準法を使用して核酸を生物から単離し、ＰＣＲにより増幅する。核酸は、例えば、細菌細胞の界面活性剤溶解、遠心分離、及びエタノール沈殿により単離する。核酸単離法は、例えば、「分子生物学の最新プロトコール」（Ausubel et al.）と「分子クローニング：実験マニュアル」（Sambrook et al.）に記載されている。次いで、下記のような介在可変配列を含有する核酸の保存領域へ結合するプライマーを用いた、ＰＣＲのような標準法を使用してこの核酸を増幅する。
【００７１】
実施例２
質量スペクトル法
ＦＴＩＣＲ計測化：ＦＴＩＣＲ機器は、７テスラの活性遮蔽超伝導磁石、改良式Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ａｐｅｘ  ＩＩ  ７０ｅイオン光軸部分、及び真空チャンバに基づく。この分光計にはＬＥＡＰ  ＰＡＬ自動サンプラーとハイスループットスクリーニングアプリケーション用のカスタム流体制御システムがインターフェースで連結している。サンプルは、約１サンプル／分の速度で９６穴若しくは３８４穴マイクロタイタープレートから直接分析する。Ｂｒｕｃｋｅｒデータ取得プラットフォームには、自動サンプラーを制御する実験室で組み立てた補助ＮＴデータステーションが追加され、精密化タンデムＭＳ実験用に複雑なｒｆ−励起波形（周波数掃引、濾波ノイズ、保存波形逆フーリエ変換（ＳＷＩＦＴ）、等）を産生することが可能な任意波形発生装置を含有する。２０〜３０マー型のオリゴヌクレオチドに典型的な性能特性には、１００，０００（ＦＷＨＭ）より大きい質量解像力、低ｐｐｍ質量測定誤差、及び５０と５０００ｍ／ｚの間の機能可能なｍ／ｚ範囲が含まれる。
【００７２】
改良ＥＳＩ源：サンプルが制限された分析では、分析対象溶液が、３−Ｄマイクロマニピュレータに搭載した内径３０ｍｍの融合シリカＥＳＩ放射源へ１５０ｎＬ／分でデリバリーされる。ＥＳＩイオン光軸部分は、加熱金属キャピラリー、ｒｆ単独ヘキサポール、スキマーコーン、及び補助ゲート電極からなる。６．２ｃｍのｒｆ単独ヘキサポールは、１ｍｍ径のロッドを含み、３８０Ｖｐｐの電圧、５ＭＨｚの周波数で操作する。実験室で組み立てた電子工学シャッターは、データステーションからのＴＴＬパルスにより「開いた」ポジションへトリガーされていなければ、エレクトロスプレープルームが入口キャピラリーに入るのを防ぐために利用することができる。「閉じた」ポジションにある場合、ＥＳＩ放射源とシャッターのフェイスの間には安定したエレクトロスプレープルームが維持される。シャッターアームの背面は、入口キャピラリーとともに真空シールを形成するように位置づけることが可能である弾性シールを含有する。このシールを外すと、シャッターブレードとキャピラリー入口の間にできる１ｍｍの隙間により、シャッターが開いたか又は閉じた位置のいずれかにあるかにかかわらず、外部イオンレザバーにおいて一定の圧力が可能になる。シャッターがトリガーされると、イオンの「時間スライス」が入口キャピラリーに入ることが可能になり、引き続き、外部イオンレザバーに蓄積される。このイオンシャッターの迅速な応答時間（＜２５ｍｓ）により、イオンを注入して外部イオンレザバーに蓄積させることができる、再現性のある、ユーザー決定間隔が提供される。
【００７３】
赤外多光子解離用の装置：１０．６μｍで作動する２５ワットＣＷ  ＣＯ2レーザーを、分光計へインターフェース連結し、オリゴヌクレオチド配列決定と他のタンデムＭＳ応用のために赤外多光子解離を可能にした。アルミニウムの光学ベンチを活性遮蔽超伝導磁石からほぼ１．５ｍのところに位置づけ、レーザービームがこの磁石の中心軸と一直線に並ぶようにする。標準的なＩＲ合致ミラーと運動ミラー取付台を使用して、非焦点３ｍｍレーザービームを、ＦＴＩＣＲ捕獲イオン電池の捕獲電極中の３．５ｍｍ穴に真直ぐ貫通し、スキマーコーンに最終的に衝突する外部イオンガイドのヘキサポール領域に縦方向に貫通するように調整する。このスキームにより、（例えば、注目の種のＳＷＩＦＴ単離の後で）捕獲イオン電池においてｍ／ｚ選択的なやり方で、又は、中性分子との衝突によりＩＲＭＰＤ産生準安定フラグメントイオンが安定化され、フラグメントイオン収量と配列カバレッジの増加をもたらす、外部イオンレザバーの高圧領域でのブロードバンドモードにおいてＩＲＭＰＤが行われることが可能になる。
【００７４】
実施例３
生物学的物質の特定
表１は、９を超えるプライマーセットと約３０の生物についての算出分子量のデータベースの小さな見本を示す。プライマーセットは、ｒＲＮＡアライメントから導いた。ｒＲＮＡコンセンサスアライメントからの領域の例を図１Ａ〜１Ｃに示す。矢印の付いた線は、ＰＣＲ用の識別力のあるプライマー対が設計される領域の例である。このプライマー対は、細菌の配列データベース（現在、１０，０００超の生物）において９５％より多く保存されている。介在領域は長さ及び／又は組成において変化していて、それにより各生物の塩基組成「シグネチャー」（ＢＣＳ）を提供する。増幅領域の全長が約８０〜９０未満になるようにプライマー対を選択した。各プライマー対のラベルは、このコンセンサス図の増幅領域の初めと終わりの塩基番号を表す。
【００７５】
表１の短い細菌データベース見本には、Bacillus anthracis や Yersinia pestis のような多くのよく知られた病原体／細菌戦病原体（太字／赤の活字で示す）だけでなく、Streptomyces のような通常は自然環境に見出される細菌生物もいくつか含まれている。どんなに近縁な生物でも、適正なプライマーの選択により互いから識別することができる。例えば、２つの低いＧ＋Ｃ生物である、Bacillus anthracis と Staph. aureus は、１６Ｓ＿１３３７又は２３Ｓ＿８５５（４ＤａのΔＭ）により規定されるプライマー対を使用して互いから識別することができる。
【００７６】
【表２】
2010057495.tif 000003
【００７７】
図６は、正確な質量の測定へのＥＳＩ−ＦＴ−ＩＣＲ  ＭＳの使用を示す。S. aureus（上）と B. anthracis（下）からの１６ＳｒＲＮＡの１３３７位より始まる４６マーＰＣＲ産物由来のスペクトルを示す。これらデータは、それぞれの５’−３’鎖の［Ｍ−８Ｈ＋］8-荷電状態からのシグナルを含有するスペクトルの領域からのものである。この２つの鎖は２つの（ＡＴ→ＣＧ）置換で異なり、それぞれ、１４２０６．３９６と１４２０８．３７３±０．０１０Ｄａの測定質量を有する。この B. anthracis 産物の前向き及び逆向き鎖の質量から導かれる可能な塩基組成を表３に列挙する。
【００７８】
【表３】
2010057495.tif 000004
【００７９】
【表４】
2010057495.tif 000005
【００８０】
計算された、前向き鎖についての１６の組成と逆向き鎖についての１８の組成の中では、（太字で示した）１対だけが相補的であり、B. anthracis ＰＣＲ産物の現実の塩基組成に対応する。
【００８１】
実施例４
Bacillus anthracis と Bacillus cereus からの領域のＢＣＳ
B. anthracis（Ａ14Ｇ9Ｃ14Ｔ9）と、ＣからＡへの塩基変化を有する B. cereus（Ａ15Ｇ9Ｃ13Ｔ9）からの保存バチルス領域を合成し、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳにかけた。この結果を図７に示す。ここでは、本発明の方法を使用して、この２つの領域が明瞭に識別されている（ＭＷ＝１４０７２．２６対１４０９６．２９）。
【００８２】
実施例５
追加の生物学的物質の特定
本発明の他の実施例においては、表４に示すように、表２に示す３つの１６Ｓプライマーセット（１６Ｓ＿９７１、１６Ｓ＿１２２８、又は１６Ｓ＿１２９４）の１つを使用して、病原体 Vibrio cholera（コレラ菌）を、ΔＭ＞６００Ｄａの Vibrio parahemolyticus（腸炎ビブリオ）から識別することができる。このリストにある２つのマイコプラズマ種（M. genitalium と M. pneumoniae）も、３つのマイコバクテリアと同様に、互いから識別することができる。増幅産物の直接の質量測定が多数の生物を特定して識別することを可能にするのに対し、塩基組成シグネチャーの測定は、近縁生物に対して劇的に高められた解像力を提供する。質量の差異に基づくだけではほとんど互いに識別し得ない Bacillus anthracis と Bacillus cereus のような場合においては、組成分析又は断片化パターンを使用して、この差異を分割する。２つの生物間の一塩基差異は異なる断片化パターンを生じ、B. anthracis の２０位にある不明瞭／未特定の塩基Ｎの存在にもかかわらず、この２つの生物を特定することができる。
【００８３】
表４ａ〜ｂは、病原体をバックグラウンドから識別する、表１からのプライマー対の例を示す。
【００８４】
【表５】
2010057495.tif 000006
【００８５】
表４は、Mycobacterium avium と Streptomyces sp. における領域１６Ｓ＿１１００−１１８８の予測される分子量及び塩基組成を示す。
【００８６】
【表６】
2010057495.tif 000007
【００８７】
表５は、様々な細菌種の１６Ｓ＿１１００−１１８８プライマー増幅反応の塩基組成（一本鎖）結果を示す。この表において繰り返される種（例、Clostridium botulinum；ボツリヌス菌）は、１６Ｓ＿１１００−１１８８領域に異なる塩基組成を有する、異なる菌株である。
【００８８】
【表７】
2010057495.tif 000008
【００８９】
【表８】
2010057495.tif 000009
【００９０】
異なる塩基組成を有する同一の生物は、異なる菌株である。強調されているか又はイタリック体である生物の群は、増幅領域において同一の塩基組成を有する。これら生物のいくつかは、多数のプライマーを使用して識別することができる。例えば、Bacillus anthracis は、プライマーの１６Ｓ＿９７１−１０６２を使用して、Bacillus cereus 及び Bacillus thuringiensis から識別することができる（表６）。特有の塩基組成シグネチャーを生じる他のプライマー対を表６（太字）に示す。非常に類似した脅威生物と遍在する非脅威生物を含有するクラスター（例、anthracis クラスター）は、焦点のプライマー対のセットを用いて高解像で識別される。表６中の既知の生物兵器物質は、Bacillus anthracis、Yersinia pestis、Francisella tularensis、及び Rickettsia prowazekii である。
【００９１】
【表９】
2010057495.tif 000010
【００９２】
B. anthracis と B. cereus の領域１６Ｓ＿９７１における配列を以下に示す。太字で示すのは、本発明の方法を使用して検出できる、この２つの種間の一塩基差異である。B. anthracis は、２０位に不明瞭な塩基を有する。
【００９３】
【化１】
2010057495.tif 000011
【００９４】
実施例６
ｓｓｐＥ５６マーの較正付きＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
ＰＣＲ産物のＥＳＩ−ＭＳ試験において、内部質量標準を使用して得ることができる質量測定精度を図８に示す。質量標準は、B. anthracis 胞子コートタンパク質ｓｓｐＥからの５６マーＰＣＲ産物を含有する溶液へ加えた２０マーホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであった。予測されるＰＣＲ産物の質量により、B. thuringiensis や B. cereus のようなバチルス属の他の種から B. anthracis が識別される。
【００９５】
実施例７
B. anthracis ＥＳＩ−ＴＯＦ合成１６Ｓ＿１２２８二重鎖
B. anthracis １６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド１２２８領域からの予測される前向き及び逆向きＰＣＲ産物の合成類似体をそれぞれ５μＭ含有する水溶液から、ＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを入手した。この結果（図９）は、前向き及び逆向き鎖の分子量を正確に決定し、この２つの鎖を容易に識別できることを示す。［Ｍ−２１Ｈ+］21-と［Ｍ−２０Ｈ+］20-の荷電状態を示す。
【００９６】
実施例８
合成 B. anthracis １６Ｓ＿１３３７  ４６塩基対二重鎖のＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳ
B. anthracis １６ＳｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド１３３７領域からの予測される前向き及び逆向きＰＣＲ産物の合成類似体をそれぞれ５μＭ含有する水溶液から、ＥＳＩ−ＦＴＩＣＲ−ＭＳスペクトルを入手した。この結果（図１０）は、この方法によりこれら鎖の分子量を識別できることを示す。［Ｍ−１６Ｈ+］16-〜［Ｍ−１０Ｈ+］10-の荷電状態を示す。挿入図は、単一の１３Ｃ置換により異なるピーク間の質量差異からイオンの荷電状態を決定することを可能にする、ＦＴＩＣＲ−ＭＳ機器により実現可能となる解像を強調する。
【００９７】
実施例９
B. anthracis のｓａｓｐＢ遺伝子からの５６マーオリゴヌクレオチドの内部質量標準を伴うＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
内部質量標準を含有する B. anthracis のｓａｓｐＢ遺伝子からの合成５６マーオリゴヌクレオチド（５μＭ）について、１．７μＬ／分のＥＳＩで、サンプル消費の関数としてＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳスペクトルを入手した。この結果（図１１）は、より多くのスキャンが合計されるほどノイズに対するシグナルが向上すること、そして標準と生成物が１００スキャン後には見えることを示す。
【００９８】
実施例１０
トリブチルアンモニウム（ＴＢＡ）−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）緩衝液を用いる内部標準のＥＳＩ−ＴＯＦ  ＭＳ
５ｍＭ  ＴＢＡ−ＴＦＡ緩衝液を溶液へ加えた後で、２０マーホスホロチオエート質量標準のＥＳＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを入手した。この緩衝液は、オリゴヌクレオチドから電荷を奪い、最も豊富な荷電状態を［Ｍ−８Ｈ+］8-から［Ｍ−３Ｈ+］3-へシフトさせる（図１２）。
【図１Ａ】
2010057495.tif 000012
【図１Ｂ】
2010057495.tif 000013
【図１Ｃ】
2010057495.tif 000014
【図１Ｄ】
2010057495.tif 000015
【図１Ｅ】
2010057495.tif 000016
【図１Ｆ】
2010057495.tif 000017
【図１Ｇ】
2010057495.tif 000018
【図１Ｈ】
2010057495.tif 000019
【図１Ｉ】
2010057495.tif 000020
【図２】
2010057495.tif 000021
【図３】
2010057495.tif 000022
【図４】
2010057495.tif 000023
【図５】
2010057495.tif 000024
【図６】
2010057495.tif 000025
【図７】
2010057495.tif 000026
【図８】
2010057495.tif 000027
【図９】
2010057495.tif 000028
【図１０】
2010057495.tif 000029
【図１１】
2010057495.tif 000030
【図１２】
2010057495.tif 000031
【配列表】
2010057495000001.app