【手続補正書】
【提出日】令和2年12月18日(2020.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表１から選択される第１の重合酵素に基づく組換え重合酵素であって、前記第１の重合酵素の少なくとも１つのアミノ酸セグメントが、表１から選択される第２の重合酵素に由来する対応するアミノ酸セグメントで置き換えられており、前記第１および第２の重合酵素は互いに異なり、任意選択で、前記組換え重合酵素が、表１の前記第１および／または第２の重合酵素の配列に対して１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換をさらに含む、組換え重合酵素。
【請求項２】
前記第１の重合酵素が、Φ２９ポリメラーゼ（配列番号１）であり、前記第２の重合酵素が、配列番号２から１９のいずれか１つから選択される、請求項１に記載の組換え重合酵素。
【請求項３】
前記第１の重合酵素の少なくとも１から３個の追加のアミノ酸セグメントが、表１の１つまたは複数の重合酵素に由来する対応するアミノ酸セグメントで置き換えられており、表１の前記１つまたは複数の重合酵素が前記第１の重合酵素と異なり、任意選択で、前記対応するアミノ酸セグメントのうちの１つまたは複数が、表１内のそれらの配列に対して１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む、請求項１または２に記載の組換え重合酵素。
【請求項４】
前記セグメントのうちの１つまたは複数が、表１の重合酵素のドメインを含み；および／または
前記アミノ酸セグメントのうちの１つまたは複数が、表１の重合酵素のドメインの一部分を含み；任意選択で、
前記アミノ酸セグメントのうちの１つまたは複数が、表１の重合酵素内の前記ドメインまたはその一部分に隣接する１つまたは複数のアミノ酸を含む、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項５】
少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、または置換が、表１の異なる天然の重合酵素中に見出されるアミノ酸の挿入、欠失、または置換に対応する；および／または、
少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、または置換が、表１の天然の重合酵素中に見出されないアミノ酸の挿入、欠失、または置換に対応する、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項６】
前記１つまたは複数の対応するアミノ酸セグメントが、Ｍ２Ｙポリメラーゼに由来するアミノ酸１から５１、Ｅ．フェシウムポリメラーゼに由来するアミノ酸２７１から３７５、Ｅ．フェシウムポリメラーゼに由来するアミノ酸７２から８９、および／またはＥ．フェシウムポリメラーゼに由来するアミノ酸４４５から４４９からなる群から選択される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項７】
少なくとも１つのアミノ酸の挿入、欠失、または置換が、Φ２９ポリメラーゼ内の位置：Ｍ８、Ｖ５１、Ｎ６２、Ｉ７１、Ｌ１０７、Ｋ１３１、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｇ１９７、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｙ２８１、Ｉ２８８、Ｔ３０１、Ｒ３０６、Ｒ３０８、Ｄ３２５、Ｄ３４１、Ｋ３５４、Ｔ３６８、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ａ４４４、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１から選択される位置に対応する位置にある；および／または、
配列番号１におけるＩ７１、Ｌ１０７、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｇ１９７、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ａ４４４、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１に対応する位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を含む；および／または、
配列番号１におけるＫ１３１、Ｋ１３５、Ｌ１４２、Ｙ１４８、Ｙ２２４、Ｅ２３９、Ｖ２５０、Ｌ２５３、Ｒ３０６、Ｒ３０８、Ｅ３７５、Ａ４３７、Ｅ４６６、Ｄ４７６、Ａ４８４、Ｅ５０８、Ｄ５１０、Ｋ５１２、Ｅ５１５、Ｋ５３９、Ｄ５７０、およびＴ５７１に対応する位置において１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項８】
置換したセグメントの少なくとも１つまたは複数が、エキソヌクレアーゼ領域、パーム領域、ＴＰＲ１領域、フィンガー領域、ＴＰＲ２領域、サム領域、またはそれらのうちのいずれか１つの一部分を含み、任意選択で１つまたは複数の隣接するアミノ酸を含む、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項９】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、表２から５の１つまたは複数のアミノ酸改変を含む組換え重合酵素。
【請求項１０】
前記１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む；または、
前記１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１つのドメイン置換を含む；または、
前記１つまたは複数のアミノ酸改変は、少なくとも１つのドメイン置換および少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項８に記載の組換え重合酵素。
【請求項１１】
表２または表３から選択される配列を有する、請求項９に記載の組換え重合酵素。
【請求項１２】
カップリング基をさらに含み、任意選択で、
前記カップリング基が、前記組換え重合酵素のＣ末端またはＮ末端に連結し、さらに任意選択で、
前記カップリング基が、ビオチン化配列である、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の組換え重合酵素。
【請求項１３】
表面上に固定化され、任意選択で、
前記表面がナノアパーチャを含む、請求項９に記載の組換え重合酵素。
【請求項１４】
請求項９に記載の組換え重合酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項９に記載の組換え重合酵素を含む組成物。
【請求項１６】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、
ｉ）表１または表２の異なる重合酵素に由来するエキソヌクレアーゼ領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるエキソヌクレアーゼ領域；および／または、
ｉｉ）表１または表２の異なる重合酵素に由来するパーム領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるパーム領域；および／または、
ｉｉｉ）表１または表２の異なる重合酵素に由来するＴＰＲ１領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるＴＰＲ１領域；および／または、
ｉｖ）表１または表２の異なる重合酵素に由来するフィンガー領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるフィンガー領域；および／または、
ｖ）表１または表２の異なる重合酵素に由来するＴＰＲ２領域と少なくとも８０％同一であるＴＰＲ２領域；および／または、
ｖｉ）表１または表２の異なる重合酵素に由来するサム領域と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるサム領域を含む、請求項１に記載の組換え重合酵素。
【請求項１７】
表１のアミノ酸配列と少なくとも６０％、６０から７０％、７０から８０％、または少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、請求項１６に記載の２つ以上の領域を含む組換え重合酵素。
【請求項１８】
請求項１乃至１７のいずれか一項に記載の１つまたは複数のポリメラーゼを使用して、シークエンシング反応を実施する工程を含むシークエンシング方法。