(57)【要約】【課題】本発明は、標的遺伝子の発現を抑制するように設計された少なくとも１の二本鎖オリゴリボヌクレオチド（二本鎖ＲＮＡ）を含む薬剤に関する。【解決手段】本発明によれば、その二本鎖ＲＮＡの１の鎖は、少なくとも一部が標的遺伝子に相補的である。標的遺伝子は下記の群から選択することができる：ガン遺伝子、サイトカイン遺伝子、Ｉｄ蛋白質遺伝子、発生遺伝子、プリオン遺伝子。標的遺伝子は、病原性生物（特に、プラスモディウム）において発現し得る。標的遺伝子はまた、好ましくはヒトに対して病原性であるウイルスまたはウイロイドの一部であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の所定の標的遺伝子の発現を阻害する方法であって、１５から４９の塩基対を有する二本鎖構造のオリゴリボヌクレオチド(ｄｓＲＮＡ)が当該細胞へ導入され、当該ｄｓＲＮＡの一方の鎖は、少なくとも一部が当該標的遺伝子に相補的な、４９以下の連続的ヌクレオチド対を有する領域Ｉを有しており、二本鎖構造内部の相補的領域ＩＩが、二つの分離したＲＮＡ一本鎖により形成されるものである方法であり、手術、治療又は診断目的でヒトの身体で実施しない方法。
【請求項２】
前記のｄｓＲＮＡが、ミセル構造、好ましくはリポソームにより封入されているものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記のｄｓＲＮＡが、天然のウイルスキャプシド、又は化学的若しくは酵素学的に産生された人工のキャプシド、又はそれに由来する構造により封入されているものである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記の標的遺伝子が、真核細胞内で発現されるものである請求項１乃至３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記の標的遺伝子が、以下の群：
癌遺伝子、サイトカイン遺伝子、Id-蛋白質遺伝子、 発生遺伝子、プリオン遺伝子
から選択されるものである請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記の標的遺伝子が、病原性の生物、好ましくはプラスモディウムにおいて発現されるものである請求項１乃至５の何れか一項に記載の方法。  
【請求項７】
前記の標的遺伝子が、ウイルス又はウイロイドの一部であるものである請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記のウイルス又はウイロイドが、ヒトに対して病原性であるウイルス又はウイロイドであるものである請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記のウイルス又はウイロイドが、動物に対して病原性であるか又は植物病原性であるウイルス又はウイロイドであるものである請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記のｄｓＲＮＡの一部が、二本鎖の形態をとるものである請求項１乃至９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記のｄｓＲＮＡの末端が修飾されて、細胞内での分解又は一本鎖への分離が生じないようになっているものである請求項1乃至１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ヌクレオチド対により形成される、前記の相補的領域ＩＩの結合が、少なくとも１の、好ましくは２の更なる化学結合により増大しているものである請求項１乃至１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記の化学結合が、共有若しくはイオン結合、水素結合、 疎水性相互作用、好ましくはファンデルワールス若しくはスタッキング相互作用、又は金属イオン配位により形成されるものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記の化学結合が、前記の相補的領域ＩＩの少なくとも一方、好ましくは両方の末端において生じているものである請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記の化学結合が、一以上の化合物群、好ましくは：
ポリ (オキシホスフィニコオキシ-1,3-プロパンジオール）鎖及び／又はポリエチレングリコール鎖により形成されるものである請求項１２乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記の化学結合が、プリンの代わりに、前記の相補的領域ＩＩにおいて使用されるプリン類縁体により形成されるものである請求項１２乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記の化学結合が、前記の相補的領域ＩＩに導入されたアザベンゼン単位により形成されるものである請求項１２乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記の化学結合が、ヌクレオチドの代わりに、前記の相補的領域ＩＩにおいて使用される分枝したヌクレオチド類縁体により形成されるものである請求項１２乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
以下の群：
メチレンブルー；二官能性基、好ましくはビス(2-クロロエチル)アミン；N-アセチル-N’-(p-グリオキシル-ベンゾイル) シスタミン；4-チオウラシル；ソラレン
の少なくとも１を使用して前記の化学結合を生成するものである請求項１２乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記の化学結合が、前記の二本鎖領域の末端にあるチオホスホリル基により形成されるものである請求項１２乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記の化学結合が、前記の二本鎖領域の末端にある三重らせん結合により形成されるものである請求項１２乃至１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記の相補的領域ＩＩ内の前記のｄｓＲＮＡのヌクレオチドの2’-ヒドロキシル基の少なくとも１つが、化学基、好ましくは2’-アミノ基又は2’-メチル基により置換されているものである請求項１乃至２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記の相補的領域ＩＩの少なくとも１の鎖中の少なくとも １のヌクレオチドが、好ましくは2’-O、4’-C-メチレン架橋により、化学的に修飾された糖環を有する、「ロックされたヌクレオチド」であるものである請求項１乃至２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記のｄｓＲＮＡが、少なくとも１のウイルス外殻蛋白質であって、ウイルス起源のもの、それに由来するもの、又は合成されたものに、結合しているか、会合しているか、又は囲まれているものである請求項１乃至２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記の外殻蛋白質が、ポリオーマウイルス由来であるものである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記の外殻蛋白質が、ポリオーマウイルスのウイルス蛋白質１（ＶＰ1）及び／又はウイルス蛋白質２（ＶＰ２）を含むものである請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
キャプシド又はキャプシドタイプの構造が、外殻蛋白質より形成される場合に、１の側面が当該キャプシド又はキャプシドタイプの構造の内部に面しているものである請求項２４乃至２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記のｄｓＲＮＡ鎖が、前記の標的遺伝子の第一次ＲＮＡ転写産物又はプロセッシングされたＲＮＡ転写産物に相補的であるものである請求項１乃至２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記の細胞が、脊椎動物の細胞、又はヒトの細胞であるものである請求項１乃至２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
互いに異なる少なくとも２つのｄｓＲＮＡを、前記の細胞内に導入し、それぞれのｄｓＲＮＡの１の鎖の少なくとも一部が、それぞれの場合に、少なくとも２つの異なる標的遺伝子のうちの一つに相補的であるものである請求項１乃至２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記の標的遺伝子の１つが、ＰＫＲ遺伝子であるものである請求項１乃至３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記のｄｓＲＮＡが、１５から２１の塩基対からなる請求項１乃至３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記の二本鎖構造が、一本鎖の化学結合によって安定化されているものである請求項１乃至３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
１５から４９の塩基対を有する二本鎖構造を有するオリゴリボヌクレオチド(ｄｓＲＮＡ)の、哺乳類細胞中の所定の標的遺伝子の発現を阻害するための薬剤の製造のための使用であって、当該ｄｓＲＮＡの１の鎖は、少なくとも一部が当該標的遺伝子に相補的な、４９以下の連続的ヌクレオチド対を有する領域Ｉを有しており、二本鎖構造内部の相補的領域ＩＩが、二つの分離したＲＮＡ一本鎖により形成されるものである使用。
【請求項３５】
前記のｄｓＲＮＡが、ミセル構造、好ましくはリポソームにより封入されているものである請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記のｄｓＲＮＡが、天然のウイルスキャプシド、又は化学的若しくは酵素学的に産生された人工のキャプシド、又はそれに由来する構造により封入されているものである請求項３４又は３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記の標的遺伝子が、真核細胞内で発現できるものである請求項３４乃至３６の何れか一項に記載の使用。
【請求項３８】
前記の標的遺伝子が、以下の群：
癌遺伝子、サイトカイン遺伝子、Id-蛋白質遺伝子、発生遺伝子、プリオン遺伝子
から選択されるものである請求項３４乃至３８の何れか一項に記載の使用。
【請求項３９】
前記の標的遺伝子が、病原性の生物、好ましくはプラスモディウムにおいて発現できるものである請求項３４乃至３８の何れか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記の標的遺伝子が、ウイルス又はウイロイドの一部であるものである請求項３４乃至３９の何れか一項に記載の使用。
【請求項４１】
前記のウイルス又はウイロイドが、ヒトに病原性であるウイルス又はウイロイドであるものである請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記のウイルス又はウイロイドが、動物に対して病原性であるか又は植物病原性であるウイルス又はウイロイドであるものである請求項４０に記載の使用。
【請求項４３】
前記のｄｓＲＮＡの一部が、二本鎖の形態をとるものである請求項３４乃至４２の何れか一項に記載の使用。
【請求項４４】
前記のｄｓＲＮＡの末端が修飾されて、細胞内での分解又は一本鎖への分離が生じないようになっているものである請求項３４乃至４３の何れか一項に記載の使用。
【請求項４５】
ヌクレオチド対により形成される、前記の相補的領域ＩＩの結合が、少なくとも１の、好ましくは２の更なる化学結合により増大しているものである請求項３４乃至４４の何れか一項に記載の使用。
【請求項４６】
前記の化学結合が、共有若しくはイオン結合、水素結合、 疎水性相互作用、好ましくはファンデルワールス若しくはスタッキング相互作用、又は金属イオン配位により形成されるものである請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記の化学結合が、前記の相補的領域ＩＩの少なくとも一方、好ましくは両方の末端において生じているものである請求項４５又は４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記の化学結合が、一以上の化合物群、好ましくは：
ポリ (オキシホスフィニコオキシ-1,3-プロパンジオール）鎖及び／又はポリエチレングリコール鎖により形成されるものである請求項４５乃至４７の何れか一項に記載の使用。
【請求項４９】
前記の化学結合が、プリンの代わりに、前記の相補的領域ＩＩにおいて使用されるプリン類似体により形成されるものである請求項４５乃至４７の何れか一項に記載の使用。
【請求項５０】
前記の化学結合が、前記の相補的領域ＩＩに導入されたアザベンゼン単位により形成されるものである請求項４５乃至４７の何れか一項に記載の使用。
【請求項５１】
前記の化学結合が、ヌクレオチドの代わりに、前記の相補的領域ＩＩにおいて使用される分枝したヌクレオチド類縁体により形成されるものである請求項４５乃至４７の何れか一項に記載の使用。
【請求項５２】
以下の群：
メチレンブルー；二官能性基、好ましくはビス(2-クロロエチル)アミン；N-アセチル-N’-(p-グリオキシル-ベンゾイル) シスタミン；4-チオウラシル；ソラレン
の少なくとも１を使用して前記の化学結合を生成するものである請求項４５乃至４７の何れか一項に記載の使用。
【請求項５３】
前記の化学結合が、前記の二本鎖領域の末端にあるチオホスホリル基により形成されるものである請求項４５乃至４７の何れか一項に記載の使用。
【請求項５４】
前記の化学結合が、前記の二本鎖領域の末端にある三重らせん結合により形成されるものである請求項４５乃至４７の何れか一項に記載の使用。
【請求項５５】
前記の二本鎖構造内の前記のｄｓＲＮＡのヌクレオチドの2’-ヒドロキシル基の少なくとも１つが、化学基、好ましくは2’-アミノ基又は2’-メチル基により置換されているものである請求項３４乃至５４の何れか一項に記載の使用。
【請求項５６】
前記の相補的領域ＩＩの少なくとも１の鎖中の少なくとも １のヌクレオチドが、好ましくは2’-O、4’-Cメチレン架橋により、化学的に修飾された糖環を有する、「ロックされたヌクレオチド」であるものである請求項３４乃至５５の何れか一項に記載の使用。
【請求項５７】
前記のｄｓＲＮＡが、少なくとも１のウイルス外殻蛋白質であって、ウイルス起源のもの、それに由来するもの、又は合成されたものに、結合しているか、会合しているか、又は囲まれているものである請求項３４乃至５６の何れか一項に記載の使用。
【請求項５８】
前記の外殻蛋白質が、ポリオーマウイルス由来であるものである請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
前記の外殻蛋白質が、ポリオーマウイルスのウイルス蛋白質１（ＶＰ1）及び／又はウイルス蛋白質２（ＶＰ２）を含むものである請求項５７又は５８に記載の使用。
【請求項６０】
キャプシド又はキャプシドタイプの構造が、外殻蛋白質より形成される場合に、１の側面が当該キャプシド又はキャプシドタイプの構造の内部に面しているものである請求項５７乃至５９の何れか一項に記載の使用。    
【請求項６１】
前記のｄｓＲＮＡの１の鎖が、前記の標的遺伝子の第一次ＲＮＡ転写産物又はプロセッシングされたＲＮＡ転写産物に相補的であるものである請求項３４乃至６０の何れか一項に記載の使用。
【請求項６２】
前記の細胞が、脊椎動物の細胞、又はヒトの細胞であるものである請求項３４乃至６１の何れか一項に記載の使用。
【請求項６３】
互いに異なる少なくとも２つのｄｓＲＮＡを使用し、それぞれのｄｓＲＮＡの１の鎖の少なくとも一部が、それぞれの場合に、少なくとも２つの異なる標的遺伝子の一つに相補的であるものである請求項３４乃至６２の何れか一項に記載の使用。
【請求項６４】
前記の標的遺伝子の１つが、ＰＫＲ遺伝子であるものである請求項３４乃至６３の何れか一項に記載の使用。
【請求項６５】
前記の薬剤を、生物の間質内又は血流内に注射して治療を行うものである請求項３４乃至６４の何れか一項に記載の使用。
【請求項６６】
前記の二本鎖ＲＮＡが、細菌又は微生物内へ取り込まれるものである請求項３４乃至６５の何れか一項に記載の使用。
【請求項６７】
前記のｄｓＲＮＡが、１５から２１の塩基対からなる請求項３４乃至６６の何れか一項に記載の使用。
【請求項６８】
前記の二本鎖構造が、一本鎖の化学結合によって安定化されているものである請求項３４乃至６７の何れか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１および２のプリアンブルに記載される方法に関する。本発明はさらに、二本鎖オリゴリボヌクレオチドの薬剤およびその使用に関し、そして二本鎖オリゴリボヌクレオチドをコードするベクターに関する。 
【背景技術】
【０００２】
そのような方法は、本発明の優先権日に公開されていない国際特許出願公開ＷＯ９９／３２６１９により知られている。この知られている方法は、無脊椎動物の細胞における遺伝子の発現を抑制することを目的としている。この目的のために、二本鎖のオリゴリボヌクレオチドは、標的遺伝子と同一である配列で、少なくとも５０塩基の長さを有する配列を示さなければならない。効率的な抑制を達成するために、同一の配列は、長さが３００塩基対〜１０００塩基対でなければならない。そのようなオリゴリボヌクレオチドは、調製することが複雑である。 
【０００３】
ドイツ国特許ＤＥ１９６３１９１９Ｃ２には、特異的な二次構造を有するアンチセンスＲＮＡであって、それをコードするベクターの形態で存在するアンチセンスＲＮＡが記載されている。このアンチセンスＲＮＡは、ｍＲＮＡの領域に対して相補的であるＲＮＡ分子の形態を取っている。遺伝子発現の抑制が、これらの領域に結合することによって引き起こされる。この抑制は、特に、疾患（例えば、腫瘍疾患またはウイルス感染症）の診断および／または治療のために用いることができる。しかし、その欠点は、アンチセンスＲＮＡを少なくともｍＲＮＡの量と同じくらい多くの量で細胞に導入しなければならないということである。この知られているアンチセンス方法は特に効果的ではない。 
【０００４】
米国特許第５，７１２，２５７号には、ミスマッチの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびｄｓＲＮＡの生物活性なミスマッチのフラグメントを界面活性剤との三成分複合体の形態で含む薬剤が開示されている。この目的に使用されるｄｓＲＮＡは、規定された塩基配列を有しない合成された核酸の一本鎖からなる。この一本鎖は、「非ワトソン・クリック」塩基対形成としても知られる変則的な塩基対形成を生じさせ、これによりミスマッチした二本鎖が生じる。この知られているｄｓＲＮＡは、ＨＩＶなどのレトロウイルスの増幅を抑制するために使用される。ウイルスの増幅は、配列非特異的なｄｓＲＮＡが細胞内に導入されたときに抑制され得る。これにより、ウイルスの増幅を抑制することを目的とするインターフェロンの誘導がもたらされる。この方法の抑制効果または活性は良くない。
抑制すべき線虫遺伝子に対して一方の鎖が部分的に相補的であるｄｓＲＮＡによってこの遺伝子の発現が非常に効率よく抑制されることが、Fire,A.他、NATURE、第３９１巻、８０６頁により知られている。使用されたｄｓＲＮＡの線虫細胞におけるこの特定の活性は、アンチセンス原理のためではなく、おそらくはｄｓＲＮＡの触媒作用的な性質、またはそれによって誘導された酵素に基づいていると考えられる。しかし、この論文には、特に哺乳動物細胞およびヒト細胞における遺伝子発現を抑制することに関する特異的なｄｓＲＮＡの活性については何ら言及されていない。 
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許出願公開ＷＯ９９／３２６１９
【特許文献２】ドイツ国特許ＤＥ１９６３１９１９Ｃ２
【特許文献３】米国特許第５，７１２，２５７号
【特許文献４】ドイツ国特許ＤＥ１９６１８７９７Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、先行技術の欠点を解決することである。特に、本発明は、特定の標的遺伝子の発現の特に効果的な抑制をもたらし得るできる限り効果的な方法、薬剤、または薬剤を調製するための使用を提供することを目的とする。 
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この目的は、請求項１、２、３７、３８ならびに７４および７５の特徴によって達成される。好都合な実施形態は、請求項３〜３６、３９〜７３および７６〜１１２から理解することができる。 
【０００８】
方法に関する発明に従い、標的遺伝子に対して相補的である領域Ｉが４９以下の連続したヌクレオチド対を示すことがそれぞれの場合に提供される。 
【０００９】
本発明により、オリゴリボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチドをコードするベクターが提供される。少なくともこのオリゴリボヌクレオチドの一部は、規定されたヌクレオチド配列を示す。規定されたセグメントは、相補的な領域Ｉに限定されていてもよい。しかし、二本鎖オリゴリボヌクレオチドのすべてが規定されたヌクレオチド配列を示すことも可能である。 
【００１０】
驚くべきことに、相補的な領域Ｉが４９塩基対以下の長さである場合でさえ、標的遺伝子の発現の効果的な抑制が達成され得ることが明らかにされた。そのようなオリゴリボヌクレオチドを提供する手順はあまり複雑ではない。 
【００１１】
特に、長さが５０ヌクレオチド対を越えるｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞およびヒト細胞における特定の細胞機構、例えば、ｄｓＲＮＡ依存性蛋白質キナーゼまたは２−５Ａシステムを誘導する。これにより、規定された配列を示すｄｓＲＮＡによって媒介される干渉作用の消失がもたらされる。その結果、細胞における蛋白質生合成が阻止される。本発明は、特にこの欠点を克服する。 
【００１２】
さらに、鎖長が短いｄｓＲＮＡの細胞内または核内への取込みが、より長い鎖のｄｓＲＮＡよりも著しく促進される。 
【００１３】
ｄｓＲＮＡまたはベクターが、ミセル構造に、特にリポソームにパッケージされて存在することは好都合であることが明らかにされた。ｄｓＲＮＡまたはベクターは、同様に、ウイルスの天然のキャプシドに、あるいは化学的または酵素的に作製された人工的なキャプシドまたはそれに由来する構造体に封入させることができる。上記の特徴により、ｄｓＲＮＡまたはベクターを特定の標的細胞に導入することが可能になる。 
【００１４】
さらなる側面において、ｄｓＲＮＡは、１０塩基対〜１０００塩基対、好ましくは１５塩基対〜４９塩基対を有する。従って、ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子に対して相補的である領域Ｉよりも長くすることができる。相補的な領域Ｉは、末端部に位置させることができ、あるいはｄｓＲＮＡ内に挿入することができる。相補的な領域Ｉをコードするために提供されるそのようなｄｓＲＮＡまたはベクターは、従来的な方法で合成的または酵素的に作製することができる。 
【００１５】
抑制される遺伝子は、真核生物細胞において都合良く発現される。標的遺伝子は下記の群から選択することができる：ガン遺伝子、サイトカイン（cytokin）遺伝子、Ｉｄ蛋白質遺伝子、発生遺伝子、プリオン遺伝子。標的遺伝子は、病原性生物（特に、プラスモディウム）において発現し得る。標的遺伝子はまた、好ましくはヒトに対して病原性であるウイルスまたはウイロイドの一部であり得る。提案された方法は、遺伝子的に決定された疾患（例えば、ガン、ウイルス疾患またはアルツハイマー病）の治療に対する組成物を製造することを可能にする。 
【００１６】
ウイルスまたはウイロイドはまた、動物に対して病原性であるか、または植物病原体であるウイルスまたはウイロイドであり得る。この場合、本発明による方法はまた、動物または植物の病気を処置するための組成物の提供を可能にする。 
【００１７】
さらなる側面において、ｄｓＲＮＡの一部は二本鎖として設計される。二本鎖構造において相補的である領域ＩＩは、２つの異なるＲＮＡ一本鎖によって形成されるか、または環状形態であることが好ましい位相幾何学的に閉環したＲＮＡ一本鎖の自己相補的な領域によって形成される。 
【００１８】
ｄｓＲＮＡの両端は、細胞内での分解または一本鎖への解離が妨げられるように改変することができる。解離は、低濃度または短い鎖長が使用されたときに特に生じる。特に効果的な様式で解離を抑制するために、ヌクレオチド対によりもたらされる相補的な領域ＩＩの密着性（結合）を、少なくとも１つ（好ましくは、２つ）のさらなる化学結合によって増大させることができる。解離を低下させた本発明によるｄｓＲＮＡは、細胞または生物における酵素的および化学的な分解に対するより大きな安定性を示す。 
【００１９】
相補的な領域ＩＩは、特に、本発明によるベクターが使用された場合、ＲＮＡヘアピンループの自己相補的な領域によって形成され得る。分解からの保護を得るために、ヌクレオチドを二本鎖構造間のループ領域において化学的に修飾することが好都合である。 
【００２０】
化学的な結合は、共有結合またはイオン結合、水素結合、疎水性相互作用、好ましくはファンデルワールス相互作用またはスタッキング（重なり）相互作用によって、あるいは金属イオンの配位によって都合良く形成される。特に好都合な側面において、化学的な結合を、相補的な領域ＩＩの少なくとも一方の末端に、好ましくは両端に形成させることができる。 
【００２１】
さらに、化学的な結合を１つまたは２つ以上の結合基によって形成させることは好都合であることが明らかにされた。この場合、結合基は、好ましくはポリ（オキシホスフィニコオキシ−１，３−プロパンジオール）鎖および／またはポリエチレングリコール鎖である。化学的な結合はまた、相補的な領域ＩＩにおいてプリンの代わりに使用されるプリンアナログ（類縁体）によって形成させることができる。化学的な結合を、相補的な領域ＩＩに導入されたアザベンゼン単位によって形成させることもまた好都合である。その上、化学的な結合は、相補的な領域ＩＩにおいてヌクレオチドの代わりに使用される分枝状ヌクレオチドアナログによって形成させることができる。 
【００２２】
化学的な結合を生成させるために下記の基の少なくとも１つを使用することが好都合であることが明らかにされた：メチレンブルー；二官能性基、好ましくは、ビス（２−クロロエチル）アミン；Ｎ−アシル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン；４−チオウラシル；ソラレン。化学的な結合は、さらに、二本鎖領域の両端に提供されたチオホスホリル基によって形成させることができる。二本鎖領域の両端における化学的な結合は、好ましくは三重らせんの結合によって形成される。 
【００２３】
化学的な結合は、好都合なことに、紫外光により誘導させることができる。 
【００２４】
ｄｓＲＮＡのヌクレオチドは改変することができる。これにより、二本鎖ＲＮＡに依存する蛋白質キナーゼ（ＰＫＲ）の細胞内での活性化が妨げられる。有益には、相補的な領域ＩＩにおけるｄｓＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも１つの２’−ヒドロキシル基は、好ましくは２’−アミノ基または２’−メチル基の化学基によって置換される。相補的な領域ＩＩの少なくとも一方の鎖における少なくとも１つのヌクレオチドもまた、好ましくは２’−Ｏ、４’−Ｃメチレン架橋により化学的に修飾された糖の環により固定された（ロックされた）ヌクレオチドであり得る。好都合なことに、数ヌクレオチドが、固定されたヌクレオチドである。 
【００２５】
さらに特に好都合な実施形態は、ｄｓＲＮＡまたはベクターが、ウイルス起源であるか、またはウイルスに由来するか、または合成的に調製された少なくとも１つのウイルス外殻蛋白質に結合するか、会合するか、または囲まれているものを提供する。外殻蛋白質は、ポリオーマウイルスに由来し得る。外殻蛋白質は、ポリオーマウイルスのウイルス蛋白質１（ＶＰ１）および／またはウイルス蛋白質２（ＶＰ２）を含有することができる。そのような外殻蛋白質の使用は、例えば、ドイツ国特許ＤＥ１９６１８７９７Ａ１（この開示は本明細書中に組み込まれる）により知られている。上記の特徴は、細胞内へのｄｓＲＮＡまたはベクターの導入をかなり容易にする。 
【００２６】
キャプシド構造またはキャプシドタイプの構造が外殻蛋白質から形成される場合、一の側面は、好ましくはキャプシド構造またはキャプシドタイプの構造の内部と向き合う。形成された構造は特に安定である。 
【００２７】
ｄｓＲＮＡは、標的遺伝子の一次ＲＮＡ転写物またはプロセシングされたＲＮＡ転写物に対して相補的であり得る。細胞は、脊椎動物細胞またはヒト細胞であり得る。 
【００２８】
互いに異なる少なくとも２つのｄｓＲＮＡ、またはそれらをコードする少なくとも１つのベクターを細胞内に導入することができる。この場合、少なくともそれぞれのｄｓＲＮＡの一方の鎖の一部は、それぞれの場合、少なくとも２つの異なる標的遺伝子の１つに対して相補的である。これにより、少なくとも２つの異なる標的遺伝子の発現を同時に抑制することが可能になる。二本鎖ＲＮＡに依存する蛋白質キナーゼ（ＰＫＲ）の発現を細胞内で抑制するために、標的遺伝子の１つは、好都合にはＰＫＲ遺伝子である。これにより、細胞内におけるＰＫＲ活性の効果的な抑制が可能になる。 
【００２９】
本発明はさらに、特定の標的遺伝子の発現を抑制するための、二本鎖構造を有するオリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の少なくとも１つを有する薬剤を提供する。この場合、ｄｓＲＮＡの一方の鎖は、少なくとも一部が標的遺伝子に対して相補的である領域Ｉを有する。驚くべきことに、そのようなｄｓＲＮＡは、哺乳動物細胞における特定の遺伝子の発現を抑制するための薬剤として好適であることが明らかにされた。一本鎖オリゴリボヌクレオチドの使用との比較において、抑制が、少なくとも１桁低い濃度で既に生じている。本発明による薬剤は非常に効果的である。副作用はほとんど予想され得ない。 
【００３０】
本発明はさらに、特定の標的遺伝子の発現を抑制するための、二本鎖構造を有するオリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の少なくとも１つをコードするための少なくとも１つのベクターを有する薬剤を提供する。この場合、ｄｓＲＮＡの一方の鎖は、少なくとも一部が標的遺伝子に対して相補的である領域Ｉを有する。提案された薬剤は上記の利点を示す。ベクターを使用することによって、特に製造コストを減少させることができる。 
【００３１】
特に好都合な実施形態において、相補的な領域Ｉは、４９以下の連続したヌクレオチド対を有する。驚くべきことに、相補的な領域Ｉが４９塩基対以下の長さである場合でさえ、標的遺伝子の発現の効果的な抑制が達成され得ることが明らかにされた。そのようなオリゴリボヌクレオチドを提供する手順はあまり複雑ではない。 
【００３２】
本発明はさらに、特定の標的遺伝子の発現を抑制するための薬剤を調製するための、二本鎖構造を有するオリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の使用を提供する。この場合、ｄｓＲＮＡの一方の鎖は、少なくとも一部が標的遺伝子に対して相補的である領域Ｉを有する。驚くべきことに、そのようなｄｓＲＮＡは、特定の遺伝子の発現を抑制するための薬剤を調製するために適している。一本鎖オリゴリボヌクレオチドの使用との比較において、抑制が、ｄｓＲＮＡを使用したときには少なくとも１桁低い濃度で既に生じている。従って、本発明による使用により、特に効果的な薬剤の調製が可能になる。 
【００３３】
本発明はさらに、特定の標的遺伝子の発現を抑制するための薬剤を調製するための、二本鎖構造を有するオリゴリボヌクレオチド（ｄｓＲＮＡ）の少なくとも１つをコードするためのベクターの使用を提供する。この場合、ｄｓＲＮＡの一方の鎖は、少なくとも複数のセグメントがこの標的遺伝子に対して相補的である領域Ｉを有する。ベクターの使用により、特に効果的な遺伝子治療が可能になる。 
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
薬剤および使用の好都合な実施形態に関して、上記の特徴の説明が参照される。 
【００３５】
本発明の使用例を、図を参照して下記にさらに詳しく例示する。 
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、Ｔ７ポリメラーゼおよびＳＰ６ポリメラーゼを用いたインビトロ転写のためのプラスミドの概略図を示す。
【図２】図２は、８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動および臭化エチジウムで染色した後のＲＮＡを示す。
【図３】図３は、Instant Imagerによる、７Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動後の放射活性なＲＮＡ転写物の一例を示す。
【図４ａ】図４ａは、マウス繊維芽細胞におけるテキサスレッドおよびＹＦＰの蛍光を示す。
【図４ｂ】図４ａ参照。
【図４ｃ】図４ａ参照。
【図４ｄ】図４ａ参照。
【図４ｅ】図４ａ参照。
【実施例】
【００３７】
使用例１： 
転写抑制を、ヒトＨｅＬａ細胞からの核抽出物を用いたインビトロ転写システムにおける配列相同的なｄｓＲＮＡによって検出した。この実験に対するＤＮＡテンプレートは、ＢａｍＨＩで線状化されたプラスミドｐＣＭＶ１２００であった。 
【００３８】
テンプレートプラスミドの作製： 
図１に示されるプラスミドを、ｄｓＲＮＡの酵素的合成において使用するために構築した。この目的のために、Promega（Madison、米国）によるHelaScribe（登録商標）核抽出物インビトロ転写キットの「陽性コントロールＤＮＡ」をＤＮＡテンプレートとして用いたポリメラーゼ連鎖反（ＰＣＲ）を最初に行った。使用したプライマーの１つには、配列番号１に示されているように、ＥｃｏＲＩ切断部位およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列が含まれた。もう一方のプライマーには、配列番号２に示されているように、ＢａｍＨＩ切断部位およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配列が含まれた。さらに、この２つのプライマーは、３’末端に、ＤＮＡテンプレートと同一である領域、またはＤＮＡテンプレートに対して相補的である領域を有した。ＰＣＲを、Qiagen（Hilden、ドイツ）による「Taq PCR Coreキット」で製造者の説明書に従って行った。１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー、２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、およびテンプレートとしての約１００ｎｇの「陽性コントロールＤＮＡ」を、１００μｌの容量のＰＣＲ緩衝液において用いた。９４℃で５分間加熱することによってテンプレートＤＮＡを最初に変性した後、増幅を、それぞれの場合において、９４℃で６０秒間の変性、プライマーの計算された融解温度よりも５℃低い温度で６０秒間のアニーリング、および７２℃で１．５分間〜２分間の重合の３０サイクルで行った。７２℃で５分間の最後の重合を行った後、反応液の５μｌをアガロースゲル電気泳動により分析した。このように増幅されたＤＮＡフラグメントの長さは４００塩基対であった。３４０塩基対は「陽性コントロールＤＮＡ」に対応した。ＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで加水分解し、そして再び精製した後、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで同様に加水分解されたｐＵＣ１８ベクターとの連結において用いた。その後、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅを形質転換した。得られたプラスミド（ｐＣＭＶ５）は、５’末端にはＴ７プロモーターが隣接し、３’末端にはＳＰ６プロモーターが隣接するＤＮＡフラグメントを有する。プラスミドをＢａｍＨＩで線状化することによって、プラスミドは、長さが３４０ヌクレオチドであり、配列番号３に示される一本鎖ＲＮＡのラン・オフ転写のためにＴ７ＲＮＡポリメラーゼとともにインビトロで用いることができる。プラスミドをＥｃｏＲＩで線状化すれば、プラスミドは、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いたラン・オフ転写のために用いることができ、これにより相補鎖が得られる。本明細書中上記に概略された方法により、長さが２３ヌクレオチドのＲＮＡもまた合成された。この目的に対して、配列番号４に示されるＤＮＡを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩの切断部位を介してｐＵＣ１８ベクターに連結した。 
【００３９】
プラスミドｐＣＭＶ１２００を、ＨｅＬａ核抽出物を用いたインビトロ転写のためのＤＮＡテンプレートとして構築した。この目的のために、HeLaScribe（登録商標）核抽出物インビトロ転写キットに含まれる陽性コントロールＤＮＡの１１９１ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをＰＣＲにより増幅した。増幅フラグメントは、８２８ｂｐの「極初期」ＣＭＶプロモーターと３６３ｂｐの転写可能なＤＮＡフラグメントとを含む。ＰＣＲ産物を「Ｔ突出」連結によりベクターｐＧＥＭ−Ｔに連結した。ＢａｍＨＩ切断部位がフラグメントの５’末端に存在する。プラスミドを、ＢａｍＨＩでの加水分解により線状化して、ラン・オフ転写におけるテンプレートとして使用した。 
【００４０】
相補的な一本鎖のインビトロ転写： 
ｐＣＭＶ５プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩまたはＢａｍＨＩで線状化した。これを、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれ用いた相補的なＲＮＡ一本鎖のインビトロ転写のためのＤＮＡテンプレートとして使用した。Promega（Madison、米国）による「Riboprobeインビトロ転写」システムをこの目的のために用いた。製造者の説明書に従い、２μｇの線状化プラスミドＤＮＡを１００μｌの転写緩衝液において４０ＵのＴ７ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼと３７℃で５時間〜６時間インキュベーションした。続いて、ＤＮＡテンプレートを、２．５μｌのＲＮａｓｅ非含有ＤＮａｓｅ ＲＱ１を加え、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって分解した。転写反応液をＨ2Ｏで３００μｌにしてフェノール抽出により精製した。ＲＮＡを、１５０μｌの７Ｍ酢酸アンモニウム［ｓｉｃ］および１１２５μｌのエタノールを加えることによって沈殿させて、ハイブリダイゼーションに使用されるまで−６５℃で保存した。 
【００４１】
ＲＮＡ二本鎖の作製： 
ハイブリダイゼーションのために、エタノール中に保存され、沈殿させた５００μｌの一本鎖ＲＮＡを遠心分離した。得られたペレットを乾燥し、８０％ホルアミド、４００ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡの存在下、３０μｌのＰＩＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．４）に溶解した。それぞれの場合において、１５μｌの相補的な一本鎖を一緒にして、８５℃で１０分間加熱した。続いて、反応液を５０℃で一晩インキュベーションして、室温に冷却した。 
【００４２】
ほぼ等モル量の２つの一本鎖のみをハイブリダイゼーションにおいて用いた。これは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）が混入物としてｄｓＲＮＡ調製物に含まれたためである。これらのｓｓＲＮＡ混入物を除くために、反応液を、ハイブリダイゼーション後、一本鎖に特異的なリボヌクレアーゼのウシ膵臓ＲＮａｓｅＡおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＮａｓｅＴ１で処理した。ＲＮａｓｅＡは、ピリミジンに特異的なエンドリボヌクレアーゼである。ＲＮａｓｅＴ１は、グアノシンの３’側を優先的に切断するエンドリボヌクレアーゼである。ｄｓＲＮＡは、これらのリボヌクレアーゼの基質ではない。ＲＮａｓｅ処理のために、Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、３００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのＥＤＴＡからなる３００μｌにおける反応液を、濃度が１０ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＡの１．２μｌと、濃度が２９０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅＴ１の２μｌとで処理した。反応液を３０℃で１．５時間インキュベーションした。その後すぐ、これらのＲＮａｓｅを、濃度が２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫの５μｌと、２０％のＳＤＳの１０μｌとを加えて、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって変性させた。ｄｓＲＮＡをフェノール抽出により精製し、エタノールで沈殿させた。ＲＮａｓｅ消化の完全性を確認するために、２つのコントロール反応液を、ハイブリダイゼーション反応液と同様にｓｓＲＮＡを用いて処理した。 
【００４３】
乾燥ペレットを１５μｌのＴＥ緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、８％ゲルでの未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。続いて、アクリルアミドゲルを臭化エチジウム溶液で染色し、水浴で洗浄した。図２には、ＵＶトランスイルミネーターにおいて可視化されたＲＮＡが示されている。レーン１に加えられたセンスＲＮＡ、およびレーン２に加えられたアンチセンスＲＮＡは、レーン３に加えられたハイブリダイゼーション反応液のｄｓＲＮＡとは異なる移動挙動を、選ばれた条件下で示した。レーン４およびレーン５にそれぞれ加えられたＲＮａｓｅ処理されたセンスＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡは、視認されるバンドをもたらさなかった。このことは、一本鎖ＲＮＡが完全に分解されたことを示している。レーン６に加えられたハイブリダイゼーション反応液のＲＮａｓｅ処理ｄｓＲＮＡは、ＲＮａｓｅ処理に対して耐性である。レーン３に加えられたｄｓＲＮＡと比較して、未変性ゲルにおいてより早く移動するバンドは、ｓｓＲＮＡを含まないｄｓＲＮＡに由来する。優勢な主バンドに加えて、より早く移動するより弱いバンドが、ＲＮａｓｅ処理の後に認められる。 
【００４４】
ヒト核抽出物を用いたインビトロ転写試験： 
Promega（Madison、米国）によるHeLaScribe（登録商標）核抽出物インビトロ転写キットを使用して、プラスミドｐＣＭＶ１２００に存在し、かつその「陽性コントロールＤＮＡ」に対して相同的である上記ＤＮＡフラグメントの転写効率を、配列相同性を有するｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ＣＭＶ５）の存在下で測定した。また、配列相同性を有さず、黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）遺伝子に対応するｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ−ＹＦＰ）の影響も調べた。このｄｓＲＮＡは、配列相同性を有するｄｓＲＮＡと同様に作製された。このｄｓＲＮＡの鎖の配列は配列番号５に見出され得る。プラスミドｐＣＭＶ１２００をラン・オフ転写のテンプレートとして使用した。このプラスミドは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識される「極初期」サイトメガロウイルスプロモーターと、転写可能なＤＮＡフラグメントとを有する。転写を、転写に必要な蛋白質をすべて含有するＨｅＬａ核抽出物によって行った。［・−32Ｐ］ｒＧＴＰを転写反応液に加えることによって、放射能標識された転写物が得られた。使用した［・−32Ｐ］ｒＧＴＰは、比活性が４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（１０ｍＣｉ／ｍｌ）であった。転写緩衝液において、３ｍＭのＭｇＣｌ2、それぞれが４００μＭのｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ、１６μＭのｒＧＴＰ、０．４μＭの［・−32Ｐ］ｒＧＴＰ、ならびに実験に依存して、１ｆｍｏｌの線状化プラスミドＤＮＡ、および様々な量のｄｓＲＮＡを反応毎に用いた。各バッチを８．５μｌの容量にＨ2Ｏで作製した。反応液を注意深く混合した。転写を開始させるために、４ＵのＨｅＬａ核抽出物を４μｌの容量で加え、３０℃で６０分間インキュベーションした。反応を、３０℃に暖められた８７．５μｌの停止混合液を加えることによって停止させた。蛋白質を除くために、反応液を、ＴＥ緩衝液（ｐＨ５．０）を飽和させた１００μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１ ｖ／ｖ／ｖ）で処理した。反応液を１分間激しく混合した。相分離のために、反応液を１２０００ｒｐｍで約１分間遠心分離して、上部相を新しい反応容器に移した。それぞれの反応液を２５０μｌのエタノールで処理した。反応液を十分に混合し、ドライアイス／メタノールにおいて少なくとも１５分間インキュベーションした。ＲＮＡを沈殿させるために、反応液を４０℃において１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を捨てた。ペレットを真空下で１５分間乾燥して、１０μｌのＨ2Ｏに再懸濁した。それぞれの反応液を１０μｌの変性ローディング緩衝液で処理した。遊離ＧＴＰを、７Ｍ尿素を含む８％ゲルでの変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、形成された転写物から分離した。ＨｅＬａ核抽出物を用いて転写させたときに形成されたＲＮＡ転写物を、変性ローディング緩衝液中で９０℃で１０分間加熱して、１０μｌ部分を、新しく洗浄したポケットに直ちに加えた。電気泳動を４０ｍＡで行った。転写時に形成された放射活性なｓｓＲＮＡの量を、電気泳動後、Instant Imagerの助けによって分析した。 
【００４５】
図３には、Instant Imagerによって示された、代表的な試験から得られた放射活性なＲＮＡが示されている。下記の転写反応液から得られたサンプルを加えた：
レーン１：テンプレートＤＮＡなし、ｄｓＲＮＡなし；
レーン１：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなし；
レーン３：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、０．５μｇのｄｓＲＮＡ ＹＦＰ；
レーン４：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、１．５μｇのｄｓＲＮＡ ＹＦＰ；
レーン５：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、３μｇのｄｓＲＮＡ ＹＦＰ；
レーン６：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、５μｇのｄｓＲＮＡ ＹＦＰ；
レーン７：テンプレートＤＮＡなし、１．５μｇのｄｓＲＮＡ ＹＦＰ；
レーン８：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなし；
レーン９：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、０．５μｇのｄｓＲＮＡ ＣＭＶ５：
レーン１０：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、１．５μｇのｄｓＲＮＡ ＣＭＶ５：
レーン１１：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、３μｇのｄｓＲＮＡ ＣＭＶ５：
レーン１２：５０ｎｇのテンプレートＤＮＡ、５μｇのｄｓＲＮＡ ＣＭＶ５： 
【００４６】
転写物の量は、ｄｓＲＮＡを含まないコントロール反応液、および配列相同性を有しないｄｓＲＮＡ ＹＦＰを用いた反応液と比較して、配列相同性を有するｄｓＲＮＡの存在下で著しく減少することが明らかにされた。レーン２における陽性コントロールは、放射活性な転写物が、ＨｅＬａ核抽出物を用いたインビトロ転写で形成されたことを示している。この反応液は、ｄｓＲＮＡの存在下でインキュベーションされた転写反応液と比較するために使用される。レーン３〜６は、配列非特異的なｄｓＲＮＡ ＹＦＰの添加は形成された転写物の量に何ら影響しなかったことを示している。レーン９〜１２は、１．５μｇ〜３μｇの間の量の配列特異的なｄｓＲＮＡ ＣＭＶ５の添加は形成された転写物の量を減少させていることを示している。認められた影響が、ｄｓＲＮＡではなく、ｄｓＲＮＡの調製時に偶発に持ち込まれたと考えられる何らかの混入物に基づいているということを除外するために、さらなる対照実験を行った。一本鎖ＲＮＡを上記のように転写し、続いてＲＮａｓｅ処理に付した。ｓｓＲＮＡが完全に分解されたことが、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって明らかにされた。この反応液を、ハイブリダイゼーション反応液のように、フェノール抽出およびエタノール沈殿に付し、続いてＰＥ緩衝液に溶解した。これにより、ＲＮＡを含有しないが、ｄｓＲＮＡと同じ酵素および緩衝液で処理されたサンプルが得られた。レーン８は、このサンプルの添加は転写に対する影響を何ら有していないことを示している。従って、配列特異的なｄｓＲＮＡを添加したときの転写物の減少は、明らかにｄｓＲＮＡ自体の結果であり得る。ヒトの転写システムにおけるｄｓＲＮＡの存在下での遺伝子転写量の減少は、問題とした遺伝子の発現が抑制されたことを示している。この作用は、ｄｓＲＮＡによってもたらされる新規な機構によるものであり得る。 
【００４７】
使用例２： 
これらのインビボ実験に使用される試験システムはマウスの繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）であった。ＹＦＰ遺伝子をマイクロインジェクションによって核内に導入した。ＹＦＰの発現を、配列相同性を有する同時にコトランスフェクションされたｄｓＲＮＡの影響のもとで調べた。このｄｓＲＮＡ ＹＦＰは、３１５ｂｐの長さにわたってＹＦＰ遺伝子の５’領域との相同性を示す。ｄｓＲＮＡ ＹＦＰの鎖のヌクレオチド配列は配列番号５に示される。蛍光顕微鏡による評価を、形成されたＹＦＰの緑黄色蛍光に関して、インジェクションの３時間後に行った。 
【００４８】
テンプレートプラスミドの構築、およびｄｓＲＮＡの調製： 
プラスミドを、Ｔ７およびＳＰ６のインビトロ転写によってＹＦＰ ｄｓＲＮＡを産生するためのテンプレートとして作用するように、使用例１に記載されるのと同じ原理に従って構築した。配列番号６に示されるプライマーＥｃｏ＿Ｔ７＿ＹＦＰおよび配列番号７に示されるプライマーＢａｍ＿ＳＰ６＿ＹＦＰを使用して、所望する遺伝子フラグメントをＰＣＲにより増幅し、上記記載と同様に使用して、ｄｓＲＮＡを調製した。得られたｄｓＲＮＡ ＹＦＰは、配列非特異的なコントロールとして使用例１で使用されたｄｓＲＮＡと同一である。 
【００４９】
配列番号８に示されているＲＮＡの３’末端において、Ｃ１８リンカー基を介して相補的なＲＮＡの５’末端に化学的に連結されたｄｓＲＮＡを調製した（Ｌ−ｄｓＲＮＡ）。この目的のために、ジスルフィド架橋で修飾されたシントンを使用した。３’末端シントンは、ジスルフィド架橋を介して脂肪族リンカー基により３’炭素を介して固体支持体に結合される。１つのオリゴリボヌクレオチド３’末端シントンに対して相補的である相補的なオリゴリボヌクレオチドの５’末端シントンにおいては、５’−トリチル保護基がさらなる脂肪族リンカーおよびジスルフィド架橋を介して結合される。２つの一本鎖の合成、保護基の除去および相補的なオリゴリボヌクレオチドのハイブリダイゼーションを行った後、形成されたチオール基を空間的に接近させる。一本鎖は、その脂肪族リンカーおよびジスルフィド架橋を介して酸化によって互いに結合される。この後、ＨＰＬＣの助けによって精製が行われる。 
【００５０】
細胞培養物の調製： 
細胞を、７．５％ＣＯ2雰囲気のもと、３７℃で、培養皿において、４．５ｇ／ｌのグルコース、１０％のウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭでインキュベーションし、コンフルエンスに達する前に継代した。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡによって剥がした。マイクロインジェクション用に調製するために、細胞をペトリ皿に移し、微小コロニーが形成されるまでさらにインキュベーションした。 
【００５１】
マイクロインジェクション： 
マイクロインジェクションのために、培養皿をインキュベーターから約１０分間取り出した。約５０個の核を、Carl Zeiss（Gottingen、ドイツ）から得られるＡＩＳマイクロインジェクションシステムを使用して、印を付けられた領域内に反応あたり１個づつ注入した。続いて、細胞をさらに３時間インキュベーションした。マイクロインジェクションのために、先端の直径が０．５μｍ未満であるHilgenberg GmbH（Malsfeld、ドイツ）から得られるホウケイ酸塩ガラスキャピラリーを準備した。マイクロインジェクションを、ナリシゲ科学機械（東京、日本）から得られるマイクロマニピュレーターを使用して行った。注入時間は０．８秒であり、圧力は約１００ｈＰａであった。トランスフェクションを、ベクターｐｃＤＮＡ３内にＹＦＰ遺伝子とともに約８００ｂｐのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを含有するプラスミドｐＣＤＮＡ−ＹＦＰを使用して行った。核に注入されたサンプルには、０．０１μｇ／μｌのｐＣＤＮＡ−ＹＦＰと、デキストラン−７０００に結合させたテキサスレッドとが、１４ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＫＰＯ4［ｓｉｃ］（ｐＨ７．５）に含まれた。約１００ｐｌのＲＮＡを、１μＭの濃度で、あるいはＬ−ｄｓＲＮＡの場合には３７５μＭの濃度でさらに加えた。 
【００５２】
細胞を、５６８ｎｍのテキサスレッドの励起波長または４８８ｎｍのＹＦＰの励起波長の光で励起される蛍光顕微鏡で調べた。個々の細胞をデジタルカメラにより記録した。図４ａ〜４ｅにはＮＩＨ３Ｔ３細胞の結果が示されている。図４ａに示される細胞にはセンス−ＹＦＰ−ｓｓＲＮＡが注入され、図４ｂではアンチセンス−ＹＦＰ−ｓｓＲＮＡが注入され、図４ｃではｄｓＲＮＡ−ＹＦＰが注入され、図４ｄではＲＮＡは注入されず、図４ｅではＬ−ｄｓＲＮＡが注入された。 
【００５３】
左側の視野には、それぞれの場合、５６８ｎｍでの励起による細胞の蛍光が示されている。４８８ｎｍの励起における同じ細胞の蛍光が右側に示されている。示された細胞のすべてのテキサスレッドの蛍光は、注入液が核内に問題なく加えられたこと、および注入が成功した細胞は３時間後も依然として生存していたことを明らかにしている。死細胞はテキサスレッドの蛍光をもはや示さなかった。 
【００５４】
図４ａおよび図４ｂのそれぞれの右側視野は、一本鎖ＲＮＡが核内に注入されたとき、ＹＦＰの発現が認められるほど抑制されなかったことを示している。図４ｃの右側視野は、ｄｓＲＮＡ−ＹＦＰを注入した後、ＹＦＰの蛍光がもはや検出できなかった細胞を示している。図４ｄは、コントロールとして、ＲＮＡが注入されなかった細胞を示している。図４ｅに示される細胞は、ＹＦＰ遺伝子に対して配列相同性を有する領域を示すＬ−ｄｓＲＮＡが注入されたためにもはや検出できないＹＦＰの蛍光を示している。この結果は、より短いｄｓＲＮＡでさえ、一本鎖を化学的に結合することによって二本鎖が安定化された場合、哺乳動物における遺伝子発現を特異的に抑制するために使用できることを明らかにしている。 
【００５５】
[参考文献]
2010057514.tif 000002
2010057514.tif 000003
2010057514.tif 000004
【図１】
2010057514.tif 000005
【図２】
2010057514.tif 000006
【図３】
2010057514.tif 000007
【図４ａ】
2010057514.tif 000008
【図４ｂ】
2010057514.tif 000009
【図４ｃ】
2010057514.tif 000010
【図４ｄ】
2010057514.tif 000011
【図４ｅ】
2010057514.tif 000012
【配列表】
2010057514000001.app