【手続補正書】
【提出日】令和3年7月16日(2021.7.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、細胞のゲノムDNAのスカーレス編集のための方法：
(a)(i) 第1のドナーポリヌクレオチドの細胞中への導入であって、第1のドナーポリヌクレオチドが、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットおよび任意で細胞のゲノムDNAにおける標的配列に対する意図した編集を含む配列に隣接する、該ゲノムDNAにおける標的配列に該第1のドナーポリヌクレオチドをターゲティングするための第1の左ホモロジーアームおよび第1の右ホモロジーアームを含む、導入；および
(ii) 第1のガイドRNA（gRNA）およびCas9の細胞中への導入であって、第1のガイドRNAが、Cas9が第1のガイドRNAと第1の複合体を形成するように、細胞のゲノムDNAにおける改変されるべきゲノム標的配列に対して相補的な配列を含み、該ガイドRNAが、第1の複合体を標的配列に方向づけ、Cas9が、細胞のゲノムDNAにおける標的配列において二本鎖切断（DSB）を作り出し、第1のドナーポリヌクレオチドにおいて第１の左ホモロジーアームおよび第１の右ホモロジーアームにより隣接される配列が、Cas9媒介相同組換え修復（HDR）によって、該標的配列においてゲノムDNA中に組み込まれて、遺伝子改変細胞を生成する、導入
を含む、第1のCas9媒介相同組換え修復（HDR）段階を行う工程；
(b) 少なくとも1つの選択マーカーの陽性選択に基づいて、遺伝子改変細胞を単離する工程；
(c)(i) 第2のドナーポリヌクレオチドの、工程（b）の遺伝子改変細胞中への導入であって、第2のドナーポリヌクレオチドが、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットを含まず、且つ、工程（a）における第1のドナーポリヌクレオチドにおける第１の左ホモロジーアームおよび第１の右ホモロジーアームにより隣接される配列が該意図する編集を含まない場合には、該意図する編集をさらに含む配列に隣接する、細胞のゲノムDNAにおける標的配列に該第2のドナーポリヌクレオチドをターゲティングするための第2の左ホモロジーアームおよび第2の右ホモロジーアームを含む、導入； 
(ii) 第2のガイドRNA（gRNA）およびCas9ヌクレアーゼの、工程（b）の遺伝子改変細胞中への導入であって、Cas9が、第2のガイドRNAと第2の複合体を形成し、該第2のガイドRNAが、第2の複合体を、該遺伝子改変細胞におけるゲノムDNAにおける標的配列に方向づけ、Cas9が、ゲノムDNAにおける標的配列において二本鎖切断（DSB）を作り出し、かつ第2のドナーポリヌクレオチドにおいて第2の左ホモロジーアームおよび第2の右ホモロジーアームにより隣接される配列が、Cas9媒介HDRによって、該標的配列においてゲノムDNA中に組み込まれ、それにより、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットをCas9媒介HDRによって改変ゲノムDNAから置き換え、遺伝子改変細胞を産生する、導入
を含む、第2のCas9媒介相同組換え修復（HDR）段階を行う工程；ならびに
(d) 少なくとも1つの選択マーカーの陰性選択に基づいて、該意図した編集を含む遺伝子改変細胞を単離する工程であって、該少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットが欠失している、工程。
【請求項２】
前記第1のドナーポリヌクレオチドにおける第1の左ホモロジーアームおよび第1の右ホモロジーアームにより隣接される配列が、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットおよびゲノムDNAにおける標的配列に対する意図した編集を含み、且つ前記第2のドナーポリヌクレオチドにおける第2の左ホモロジーアームおよび第2の右ホモロジーアームにより隣接される配列が、該意図した編集を含まない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第1のドナーポリヌクレオチドにおける第１の左ホモロジーアームおよび第１の右ホモロジーアームにより隣接される配列中に含まれる意図した編集が、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセット内またはその近くに位置づけられる、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記第1のドナーポリヌクレオチドにおける第1の左ホモロジーアームおよび第1の右ホモロジーアームにより隣接される配列が、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットを含むが、ゲノムDNAにおける標的配列に対する意図した編集を含まず、且つ前記第2のドナーポリヌクレオチドにおける第2の左ホモロジーアームおよび第2の右ホモロジーアームにより隣接される配列が、該意図した編集を含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記意図した編集が、細胞のゲノムDNAにおける遺伝子中に変異を導入する、請求項1乃至4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記変異が、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記意図した編集が、細胞のゲノムDNAにおける遺伝子から変異を除去する、請求項1乃至4のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記意図した編集が、細胞のゲノムDNAにおける遺伝子の不活性化を結果としてもたらす、請求項1乃至4のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
一方のアレルが、ゲノムDNAにおいて改変される、請求項1乃至8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
両方のアレルが、ゲノムDNAにおいて改変される、請求項1乃至9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも1つの選択マーカーが、蛍光マーカーである、請求項1乃至10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記陽性選択が、単一アレル編集を含むかまたは両アレル編集を含むかを決定するために、選択マーカーの蛍光強度を測定する工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記陰性選択が、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットが除去されているかを決定するために、選択マーカーの蛍光強度を測定する工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、真核生物、原核生物、または古細菌生物由来である、請求項1乃至13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、細胞株由来である、請求項1乃至16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、不死化細胞である、請求項1乃至16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞が、がん性である、請求項1乃至13のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、インビトロである、請求項1乃至19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、K562細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群より選択される、請求項1乃至14のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも1つの選択マーカーが、細胞表面マーカー、薬物耐性遺伝子、レポーター遺伝子、および自殺遺伝子からなる群より選択される、請求項1乃至10のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞表面マーカーが、切断型CD8、NGFR、切断型CD19（tCD19）、CCR5、およびABO抗原からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞表面マーカーが、細胞機能にとって不可欠ではない、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
第1のHDR段階から生成された遺伝子改変細胞が、選択マーカーに特異的に結合する結合物質を用いた陽性選択によって単離される、請求項22記載の方法。
【請求項２６】
前記結合物質が、選択マーカーに特異的に結合する抗体、抗体模倣物、またはアプタマーを含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、およびscFv断片からなる群より選択される、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
前記抗体が、抗tCD19抗体、抗CD8抗体、および抗NGFR抗体からなる群より選択される、請求項26または27記載の方法。
【請求項２９】
前記結合物質が、固体支持体上に固定化される、請求項25乃至28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記固体支持体が、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、スライド、ゲル、膜、またはマイクロタイタープレートウェルである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットが、UbCプロモーター、mCherryをコードするポリヌクレオチド、T2Aペプチドをコードするポリヌクレオチド、切断型CD19（tCD19）をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む、請求項1乃至30のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記第2のドナーポリヌクレオチドにおける第2の左ホモロジーアームおよび第2の右ホモロジーアームにより隣接される配列中に含まれる意図した編集が、遺伝子改変細胞におけるゲノムDNAにおける選択マーカーを置き換えるためのレポーター遺伝子である、請求項4記載の方法。
【請求項３３】
前記レポーター遺伝子が、mOrangeである、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
第1のドナーポリヌクレオチド、第2のドナーポリヌクレオチド、第1のガイドRNA、第2のガイドRNA、またはCas9のうちの1つまたは複数が、ベクターによって提供される、請求項1乃至33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
第1のドナーポリヌクレオチド、第1のガイドRNA、およびCas9が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、請求項34または35記載の方法。
【請求項３７】
第2のドナーポリヌクレオチド、第2のガイドRNA、およびCas9が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、請求項34または35記載の方法。
【請求項３８】
第1のドナーポリヌクレオチドが、ランダムに組み込まれるかまたはエピソーム性である選択マーカーの発現を阻害する短鎖ヘアピン型RNA（shRNA）をコードする少なくとも1つの発現カセットをさらに含む、請求項1乃至37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
第1のドナーポリヌクレオチドが、shRNAをコードする発現カセットのペアを含み、該ペアの第1の発現カセットが、第1の左ホモロジーアームの5'に位置し、かつ該ペアの第2の発現カセットが、第1の右ホモロジーアームの3'に位置する、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
前記shRNAが、ゲノム中にランダムに組み込まれている選択マーカーを発現するクローンの選択を低減させる、請求項38または39記載の方法。
【請求項４１】
前記二本鎖切断（DSB）が、非遺伝子破壊性二本鎖切断である、請求項1乃至40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
前記二本鎖切断が、前記少なくとも1つの選択マーカーの発現に影響を及ぼさない、請求項1乃至41のいずれか一項記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
本発明のこれらのおよび他の態様は、本明細書における開示を考慮して、当業者に容易に見出されるであろう。
[本発明1001]
以下の工程を含む、細胞のゲノムDNAのスカーレス編集のための方法：
(a)(i) 第1のドナーポリヌクレオチドの細胞中への導入であって、第1のドナーポリヌクレオチドが、細胞のゲノムDNAにおける改変されるべき標的配列に対する意図した編集を含む配列に隣接する第1の左ホモロジーアームおよび第1の右ホモロジーアームと、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットとを含む、導入；および
(ii) 第1のガイドRNAおよびCas9の細胞中への導入であって、第1のガイドRNAが、Cas9が第1のガイドRNAと第1の複合体を形成するように、細胞のゲノムDNAにおける改変されるべきゲノム標的配列に対して相補的な配列を含み、該ガイドRNAが、第1の複合体をゲノム標的配列に方向づけ、Cas9が、細胞のゲノムDNAにおいて二本鎖切断を作製し、第1のドナーポリヌクレオチドが、Cas9媒介相同組換え修復（HDR）によってゲノムDNA中に組み込まれて、遺伝子改変細胞を生成する、導入
を含む、第1のCas9媒介相同組換え修復（HDR）段階を行う工程；
(b) 少なくとも1つの選択マーカーの陽性選択に基づいて、遺伝子改変細胞を単離する工程；
(c)(i) 第2のドナーポリヌクレオチドの遺伝子改変細胞中への導入であって、第2のドナーポリヌクレオチドが、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットの欠失を含む以外はCas9媒介HDRによるゲノムDNA中への第1のドナーポリヌクレオチドの組み込みによって改変されるような標的ゲノム配列に対して相補的な配列に隣接する、第2の左ホモロジーアームおよび第2の右ホモロジーアームを含む、導入； 
(ii) 第2のガイドRNAおよびCas9ヌクレアーゼの細胞中への導入であって、Cas9が、第2のガイドRNAと第2の複合体を形成し、該第2のガイドRNAが、第2の複合体を改変標的ゲノム配列に方向づけ、Cas9が、改変ゲノムDNAにおいて二本鎖切断を作製し、かつ第2のドナーポリヌクレオチドが、Cas9媒介HDRによってゲノムDNA中に組み込まれ、それにより、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットをCas9媒介HDRによって改変ゲノムDNAから除去する、導入
を含む、第2のCas9媒介相同組換え修復（HDR）段階を行う工程；ならびに
(d) 少なくとも1つの選択マーカーの陰性選択に基づいて、意図した編集を含む遺伝子改変細胞を単離する工程であって、該少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットが欠失している、工程。
[本発明1002]
前記意図した編集を含む配列が、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセット内またはその近くに位置づけられる、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記意図した編集が、細胞のゲノムDNAにおける遺伝子中に変異を導入する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記変異が、挿入、欠失、および置換からなる群より選択される、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記意図した編集が、細胞のゲノムDNAにおける遺伝子から変異を除去する、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記意図した編集が、細胞のゲノムDNAにおける遺伝子の不活性化を結果としてもたらす、本発明1001の方法。
[本発明1007]
一方のアレルが、ゲノムDNAにおいて改変される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
両方のアレルが、ゲノムDNAにおいて改変される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記少なくとも1つの選択マーカーが、蛍光マーカーである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記遺伝子改変細胞が、単一アレル編集を含むかまたは両アレル編集を含むかを決定するために、蛍光強度を測定する工程をさらに含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記細胞が、真核生物、原核生物、または古細菌生物由来である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記細胞が哺乳動物である、本発明1011の方法。
[本発明1013]
前記細胞がヒトである、本発明1012の方法。
[本発明1014]
前記細胞が細胞株由来である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記細胞が不死化細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記細胞ががん性である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記細胞がインビトロまたはインビボである、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記細胞が、K562細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記少なくとも1つの選択マーカーが、細胞表面マーカー、薬物耐性遺伝子、レポーター遺伝子、および自殺遺伝子からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記細胞表面マーカーが、切断型CD8、NGFR、切断型CD19（tCD19）、CCR5、およびABO抗原からなる群より選択される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
前記細胞表面マーカーが、細胞機能にとって不可欠ではない、本発明1019の方法。
[本発明1022]
第1のHDR段階から生成された遺伝子改変細胞が、選択マーカーに特異的に結合する結合物質を用いた陽性選択によって単離される、本発明1019の方法。
[本発明1023]
前記結合物質が、選択マーカーに特異的に結合する抗体、抗体模倣物、またはアプタマーを含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組換え断片、Fab断片、Fab'断片、F(ab')2断片、Fv断片、およびscFv断片からなる群より選択される、本発明1023の方法。
[本発明1025]
前記抗体が、抗tCD19抗体、抗CD8抗体、および抗NGFR抗体からなる群より選択される、本発明1022の方法。
[本発明1026]
前記結合物質が、固体支持体上に固定化される、本発明1022の方法。
[本発明1027]
前記固体支持体が、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、スライド、ゲル、膜、またはマイクロタイタープレートウェルである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
前記少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットが、UbCプロモーター、mCherryをコードするポリヌクレオチド、T2Aペプチドをコードするポリヌクレオチド、切断型CD19（tCD19）をコードするポリヌクレオチド、およびポリアデニル化配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1029]
第1のドナーポリヌクレオチド、第2のドナーポリヌクレオチド、第1のガイドRNA、第2のガイドRNA、またはCas9のうちの1つまたは複数が、ベクターによって提供される、本発明1001の方法。
[本発明1030]
前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、本発明1001の方法。
[本発明1031]
第1のドナーポリヌクレオチド、第1のガイドRNA、およびCas9が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、本発明1029の方法。
[本発明1032]
第2のドナーポリヌクレオチド、第2のガイドRNA、およびCas9が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、本発明1029の方法。
[本発明1033]
第1のドナーポリヌクレオチドが、ランダムに組み込まれるかまたはエピソーム性である選択マーカーの発現を阻害する短鎖ヘアピン型RNA（shRNA）をコードする少なくとも1つの発現カセットをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1034]
第1のドナーポリヌクレオチドが、shRNAをコードする発現カセットのペアを含み、該ペアの第1の発現カセットが、第1の左ホモロジーアームの5'に位置し、かつ該ペアの第2の発現カセットが、第1の右ホモロジーアームの3'に位置する、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記shRNAが、ゲノム中にランダムに組み込まれている選択マーカーを発現するクローンの選択を低減させる、本発明1033の方法。
[本発明1036]
前記二本鎖切断が、非遺伝子破壊性二本鎖切断である、本発明1001の方法。
[本発明1037]
前記二本鎖切断が、前記少なくとも1つの選択マーカーの発現に影響を及ぼさない、本発明1001の方法。
[本発明1038]
以下を含む、スカーレスゲノム編集システム：
(a) 細胞のゲノムDNAにおける改変されるべき標的配列に対する意図した編集を含む配列に隣接する第1の左ホモロジーアームおよび第1の右ホモロジーアームと、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットとを含む、第1のドナーポリヌクレオチド；
(b) 少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットの欠失を含む以外は第1のドナーポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列に隣接する、第2の左ホモロジーアームおよび第2の右ホモロジーアームを含む、第2のドナーポリヌクレオチド；
(c) Cas9ヌクレアーゼ；
(d) Cas9ヌクレアーゼと複合体を形成し、該複合体を標的配列に方向づけることができる、第1のガイドRNA；ならびに
(e) Cas9ヌクレアーゼと複合体を形成し、該複合体を、Cas9媒介相同組換え修復（HDR）によるゲノムDNA中への第1のドナーポリヌクレオチドの組み込みによって改変されるような標的ゲノム配列に方向づけることができる、第2のガイドRNA。
[本発明1039]
前記少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットが、SEQ ID NO:1の配列またはSEQ ID NO:1の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含み、第1のドナーポリヌクレオチドを、少なくとも1つの選択マーカーの発現に適している条件下で、前記Cas9媒介HDRによって標的配列で細胞のゲノムDNA中に組み込むことができ、かつ、Cas9媒介HDRによって標的部位で細胞のゲノムDNA中に組み込まれた第1のドナーポリヌクレオチドを有する細胞を、発現カセットによってコードされる該少なくとも1つの選択マーカーの陽性選択により、特定することができる、本発明1038のスカーレスゲノム編集システム。
[本発明1040]
第2のドナーポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:2の配列またはSEQ ID NO:2の配列に対して少なくとも95％の同一性を有する配列を含むポリヌクレオチドを含み、第2のドナーポリヌクレオチドを、少なくとも1つの選択マーカーをコードする発現カセットを除去するために、Cas9媒介HDRによって標的部位で細胞の改変ゲノムDNA中に組み込むことができる、本発明1038のスカーレスゲノム編集システム。
[本発明1041]
第1のドナーポリヌクレオチド、第2のドナーポリヌクレオチド、第1のガイドRNA、第2のガイドRNA、またはCas9のうちの1つまたは複数が、ベクターによって提供される、本発明1038のスカーレスゲノム編集システム。
[本発明1042]
前記ベクターが、プラスミドまたはウイルスベクターである、本発明1038のスカーレスゲノム編集システム。
[本発明1043]
第1のドナーポリヌクレオチド、第1のガイドRNA、およびCas9が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、本発明1038のスカーレスゲノム編集システム。
[本発明1044]
第2のドナーポリヌクレオチド、第2のガイドRNA、およびCas9が、単一のベクターまたは複数のベクターによって提供される、本発明1038のスカーレスゲノム編集システム。
[本発明1045]
第1のドナーポリヌクレオチドが、ランダムに組み込まれるかまたはエピソーム性である選択マーカーの発現を阻害する短鎖ヘアピン型RNA（shRNA）をコードする少なくとも1つの発現カセットをさらに含む、本発明1038のスカーレスゲノム編集システム。
[本発明1046]
第1のドナーポリヌクレオチドが、shRNAをコードする発現カセットのペアを含み、該ペアの第1の発現カセットが、第1の左ホモロジーアームの5'に位置し、かつ該ペアの第2の発現カセットが、第1の右ホモロジーアームの3'に位置する、本発明1038のスカーレスゲノム編集システム。
[本発明1047]
本発明1038のスカーレスゲノム編集システムを含む、宿主細胞。
[本発明1048]
本発明1038のスカーレスゲノム編集システム、およびゲノムDNAのスカーレス編集を行うための説明書を含む、キット。
[本発明1049]
本発明1047の宿主細胞を含む、キット。