【手続補正書】
【提出日】令和2年5月1日(2020.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】Ｌ−リジンを生産する組換え菌、その構築方法およびＬ−リジンの生産方法
【技術分野】
【０００１】
本発明は微生物の発酵分野に関するものであり、具体的に、Ｌ−リジンを生産する組換え菌、その構築方法およびＬ−リジンの生産方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−リジンは人間に９種類の必須アミノ酸の１つであり、生体の代謝バランスを調整し、成長と発育を促進するなど様々な生理機能を持ち、食品、飼料や医薬分野に広く応用されている。飼料業界では、リジンは豚や家禽の成長の第１制限性アミノ酸である。飼料にＬ−リジンを添加すると、飼料の中のアミノ酸とタンパク質の利用率を高め、飼料の栄養価を改善し、家畜の成長を促進することができる。食品業界では、Ｌ−リジンは主に栄養強化剤と消臭剤に使われている。医薬分野では、Ｌ−リジンは複合アミノ酸製剤の主成分の１つである。現在、リジン工業はグルタミン酸に次ぐ第２のアミノ酸工業であるため、Ｌ−リジンの工業生産研究は重要な意義を持っている。
【０００３】
現在、Ｌ−リジンは主に微生物直接発酵法で生産されている。リジン生産菌の発酵生産の性能は発酵法の生産コストに影響する重要な要素である。
【０００４】
リジン高産菌株の育成方法は主に伝統的な誘導法と代謝工学的改造がある。
【０００５】
誘導スクリーニングによって得られた菌株は大量の負効果の突然変異を蓄積して、菌株の成長の遅緩、環境耐性の低下や栄養需要の高まりなどの問題を引き起こす。これらの欠陥は菌株の工業化への応用を制限している。
【０００６】
図１に示すように、コリネバクテリウム・グルタミクムリジンの合成代謝経路において、リジンの合成前駆体はトリカルボン酸サイクル（ＴＣＡ回路）のオキサロ酢酸であり、オキサロ酢酸はアミノ基転移でアスパラギン酸を生成し、リジン合成経路に入る。したがって、従来の技術では、リジン生産菌株に対する代謝工学的改造は主にリジン端末合成経路、合成前駆体を提供する解糖系、ＴＣＡ回路、および補因子ＮＡＤＰＨを提供するペントースリン酸経路の鍵遺伝子の修飾に集中している。具体的には、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｙｃ遺伝子）の発現を強化し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子（ｐｃｋ遺伝子）の発現を弱化するなどの方法によって、オキサロ酢酸の合成を高め、リジンの蓄積を高める。しかし、今まで、アスパラギン酸の供給に影響を与える視点からリジン生産菌株に対して代謝工学的改造を行う従来の技術はまだない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は前期の研究に、アスパラギン酸の供給もリジンの合成に影響する重要な要素であることを発見した。アスパラギン酸の合成を向上させることで、リジンの大量合成の前駆体物質の供給を保証し、菌株リジンの合成効率を向上させることができる。アスパラギン酸の代謝過程において、アスパラギン酸はアスパラギンシンテターゼを経てアスパラギンを触媒生成し、アスパラギンはまたアスパラギナーゼの触媒加水分解を経てアスパラギン酸とアンモニアを生成する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の目的は、リジン酸生産菌株に対して代謝工学的改造を行うことによって、Ｌ−リジンを生産する組換え菌を提供することである。
【０００９】
本発明は、Ｌ−リジンを生産する組換え菌であって、前記組換え菌は、出発菌に比べて、向上されたアスパラギナーゼ（ＥＣ  ３．５．１  ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）の発現および／または活性を有し、前記出発菌はリジンを蓄積できる菌株である。
【００１０】
好ましくは、前記組換え菌により、前記組換え菌は、少なくとも２つのコピーされたアスパラギナーゼ符号化遺伝子を有し、および／または前記組換え菌のアスパラギナーゼ符号化遺伝子の発現が高転写または高発現活性の調節因子によって媒介される。好ましくは、前記調節因子は、強力プロモーターである。より好ましくは、前記強力プロモーターは、前記出発菌のＰｔｕｆプロモーターである。
【００１１】
好ましくは、前記組換え菌により、前記組換え菌は、出発菌に比べて、低下されたホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ）の発現および／または活性を有する。前記低下されたホモセリンデヒドロゲナーゼの発現は、（Ａ）前記組換え菌のホモセリンデヒドロゲナーゼ符号化遺伝子を失活させる、（Ｂ）前記組換え菌のホモセリンデヒドロゲナーゼ符号化遺伝子の発現が低転写または低発現活性の調節因子によって媒介される少なくとも１つの方法で実現される。前記低下されたホモセリンデヒドロゲナーゼの活性は、前記組換え菌のホモセリンデヒドロゲナーゼの５９番目のバリンがアラニンに突然変異される方法で実現され、前記組換え菌のホモセリンデヒドロゲナーゼ符号化遺伝子は、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示される。
【００１２】
好ましくは、前記による組換え菌の中に、前記組換え菌は、出発菌に比べて、向上されたピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｙｃ）の発現および／または活性を有する。好ましくは、前記向上されたピルビン酸カルボキシラーゼの発現は、下記方法のすくなくとも一つによって実現される：（Ｃ）前記組換え菌は、少なくとも２つのコピーされたピルビン酸カルボキシラーゼ符号化遺伝子を有する、（Ｄ）前記組換え菌のピルビン酸カルボキシラーゼ符号化遺伝子の発現が高転写または高発現活性の調節因子によって媒介される。前記向上されたピルビン酸カルボキシラーゼの活性は、前記ピルビン酸カルボキシラーゼの４５８番目のプロリンがセリンに突然変異する方法で実現され、前記組換え菌のピルビン酸カルボキシラーゼ符号化遺伝子は、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示されるようなものである。
【００１３】
好ましくは、前記による組換え菌の中に、前記組換え菌は、出発菌に比べて、低下されたホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）の発現および／または活性を有する。好ましくは、前記組換え菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ符号化遺伝子を失活させ、および／またはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ符号化遺伝子の発現が低転写または低発現活性の調節因子によって媒介される。より好ましくは、前記失活は、前記組換え菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ符号化遺伝子をノックアウトすることである。
【００１４】
好ましくは、前記による組換え菌の中に、前記組換え菌は、出発菌に比べて、向上されたジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）の発現および／または活性を有する。好ましくは、前記組換え菌は、少なくとも２つのコピーされたジヒドロジピコリン酸レダクターゼ符号化遺伝子を有し、および／またはジヒドロジピコリン酸レダクターゼ符号化遺伝子の発現が高転写または高発現活性の調節因子によって媒介される。より好ましくは、前記調節因子は、強力プロモーターである。最も好ましくは、前記強力プロモーターは、前記出発菌のＰｔｕｆプロモーターである。
【００１５】
好ましくは、前記による組換え菌の中に、前記組換え菌は、出発菌に比べて、向上されたアスパラギン酸キナーゼ（ｌｙｓＣ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ｄｄｈ）および／またはジアミノヘプタナートデカルボキシラーゼ（ｌｙｓＡ）の発現および／または活性を有する。好ましくは、前記組換え菌は、少なくとも２つのコピーされたアスパラギン酸キナーゼ符号化遺伝子、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ符号化遺伝子および／またはジアミノヘプタナートデカルボキシラーゼ符号化遺伝子を有し、および／またはアスパラギン酸キナーゼ符号化遺伝子、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ符号化遺伝子および／またはジアミノヘプタナートデカルボキシラーゼ符号化遺伝子の発現が高転写または高発現活性の調節因子によって媒介される。より好ましくは、前記調節因子は、強力プロモーターである。最も好ましくは、前記強力プロモーターは、前記出発菌のＰｔｕｆプロモーターである。
【００１６】
または、好ましくは、前記による組換え菌の中に、前記出発菌は、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バチルス属、ビフィズス菌属およびラクトバシラス属のうちから選ばれる１本の細菌または酵母から選ばれる１本の真菌である。
【００１７】
前記コリネバクテリウム属の細菌はコリネバクテリウム・グルタミクムＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、コリネバクテリウム・北京Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｅｋｉｎｅｎｓｅ、コリネバクテリウム・エフィシエンスＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ、コリネバクテリウム・クレナツムＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｒｅｎａｔｕｍ、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、コリネバクテリウム・アミノゼンＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ、コリネバクテリウム・リリウムＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｌｉｕｍ、コリネバクテリウム・カルーナＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｌｌｕｎａｅおよびコリネバクテリウム・ハーキュリスＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈｅｒｃｕｌｉｓのうちから選ばれる１本の細菌である。
【００１８】
前記ブレビバクテリウム属の細菌はブレビバクテリウム・フラバムＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｆｌｖｕｍ、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍおよびブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓのうちから選ばれる１本の細菌である。
【００１９】
前記バチルス属の細菌はバシラス・リケニフォルミスＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、バチルス・サブティリスＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびバチルス・プミルスＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓのうちから選ばれる１本の細菌である。
【００２０】
前記ビフィズス菌属の細菌はビフィドバクテリウム・ビフィドゥムＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ、ビフィドバクテリウム・ロングムＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、ビフィドバクテリウム・ブレーベＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅおよびビフィドバクテリウム・アドレッセンティスＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓのうちから選ばれる１本の細菌である。
【００２１】
前記ラクトバシラス属の細菌は好酸性乳酸桿菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、ラクトバチルス・カゼイＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、ラクトバチラス・デルブルッキー・サブスピーシスＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐおよびラクトバチルス・ファーメンタムＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍのうちから選ばれる１本の細菌である。
【００２２】
前記酵母の真菌は、カンジダ・ユチリスＣａｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、サッカロマイセス・セレビシエＳａｃｈａｒｍｙｃｅｓｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａ、ピキア酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｅｓおよびハンセニューラ・ポリモルファＨａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａのうちから選ばれる１本の真菌である。
【００２３】
本発明は、更に前記組換え菌の構築方法を提供し、その中に、前記出発菌におけるアスパラギナーゼの発現および／または活性を向上させるステップを含む。具体的には、前記出発菌におけるアスパラギナーゼの発現および／または活性を向上させることは、下記方法の少なくとも１つによって実現される：（Ｅ）前記出発菌におけるアスパラギナーゼ符号化遺伝子のコピー数を増やす、（Ｆ）前記出発菌におけるアスパラギナーゼ符号化遺伝子の調節因子を高転写または高発現活性の調節因子に置き換える。
【００２４】
好ましくは、前記構築方法は、前記出発菌におけるホモセリンデヒドロゲナーゼの発現および／または活性を低下させるステップをさらに含む。
【００２５】
好ましくは、前記構築方法は、前記出発菌におけるピルビン酸カルボキシラーゼの発現および／または活性を向上させるステップをさらに含む。
【００２６】
好ましくは、前記構築方法は、前記出発菌におけるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの発現および／または活性を低下させるステップをさらに含む。具体的には、前記出発菌におけるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの発現および／または活性を低下させることは、下記方法の少なくとも一つによって実現したされる：（Ｇ）前記出発菌染色体のホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ符号化遺伝子を失活させ、前記失活はノックアウトであることが好ましく、（Ｈ）前記出発菌におけるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ符号化遺伝子の調節因子を低転写または低発現活性の調節因子に置き換える。
【００２７】
好ましくは、前記構築方法は、前記出発菌におけるジヒドロジピコリン酸レダクターゼの発現および／または活性を向上させるステップをさらに含む。具体的には、前記出発菌におけるジヒドロジピコリン酸レダクターゼの発現および／または活性を向上させることは、下記方法の少なくとも一つによって実現される：（Ｉ）前記出発菌におけるジヒドロジピコリン酸レダクターゼ符号化遺伝子のコピー数を増やす、（Ｊ）前記出発菌におけるジヒドロジピコリン酸レダクターゼの調節因子を高転写または高発現活性の調節因子に置き換える。
【００２８】
または、好ましくは、前記構築方法は、前記出発菌におけるアスパラギン酸キナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはジアミノヘプタナートデカルボキシラーゼの発現および／または活性を向上させるステップをさらに含む。具体的には、前記出発菌におけるアスパラギン酸キナーゼ、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼおよび／またはジアミノヘプタナートデカルボキシラーゼの発現および／または活性を向上させることは、下記方法の少なくとも一つによって実現される：（Ｌ）前記出発菌におけるアスパラギン酸キナーゼ符号化遺伝子、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ符号化遺伝子および／またはジアミノヘプタナートデカルボキシラーゼ符号化遺伝子のコピー数を増やす、（Ｍ）前記出発菌におけるアスパラギン酸キナーゼ符号化遺伝子、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ符号化遺伝子、および／またはジアミノヘプタナートデカルボキシラーゼ符号化遺伝子の調節因子を高転写または高発現活性の調節因子に置き換える。
【００２９】
また、本発明はＬ−リジンの生産方法であって、前記組換え菌を発酵培養するステップを含む。
【発明の効果】
【００３０】
本発明に係るＬ−リジンを生産する組換え菌は、発酵培養することによって収量を重ね合わせて高める効果が認められ、Ｌ−リジンの収量を著しく向上させた。４８時間発酵したリジンの生産強度は０．０５〜５Ｇ／Ｌ／Ｈで、発酵が終了する時のリジンの収量は１〜３００Ｇ／Ｌである。
【００３１】
本発明は、アスパラギナーゼの発現を強化することにより、リジンの合成前駆体であるアスパラギン酸の供給を高める代謝工学的改造策を初めて提案し、リシンの収量を著しく向上させ、細菌の発酵によるリジンの生産に実際に利用されることができる。本発明は新たなリジンの発酵収量を高める方法を開発しかつ実践的に証明し、収量を重ね合わせて高める効果を観察できた。、従って、本発明は細菌発酵によるリジンの生産に実際的に利用されることができ、応用を広めるのに便利である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】コリネバクテリウム・グルタミクムのリジン合成と代謝の経路を示す図である。
【図２】組換えプラスミドＹＺ０２２を示す図である。
【図３】組換えプラスミドＹＺ０２３を示す図である。
【図４】組換えプラスミドＹＺ０２５を示す図である。
【図５】組換えプラスミドＹＥ０１９を示す図である。
【図６】組換えプラスミドＹＺ０３７を示す図である。
【図７】組換えプラスミドＹＺ０３９を示す図である。
【図８】組換えプラスミドＹＺ０３５を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の方案およびその様々な態様の利点をよく理解するために、以下、添付図面および実施形態を参照しながら本発明の具体的な実施形態をより詳細に説明するが、以下に説明する具体的な実施形態および実施例は、説明のためだけであって、本発明を限定するものではない。
【００３４】
本発明は、Ｌ−リジンを生産する組換え菌に関し、その中に、組換え菌は、出発菌に比べて、向上されたアスパラギナーゼの発現および／または活性を有し、出発菌はリジンを蓄積できる菌株である。
【００３５】
向上されたアスパラギナーゼの発現および／または活性は、符号化遺伝子のコピー数の増加、より効果的な強力プロモーターで天然のプロモーターの置換、および活性化の増加を目的とする人工的な突然変異を含むさまざまな要因に基づくことができる。具体的には、遺伝子のコピー数は、内因性および／または外因性対立遺伝子の導入および／または増幅によって増加することができる。遺伝子プロモーターの置換について、例えば、内因性および／または外因性プロモーターを導入すること、使用するプロモーターは、その下流構造の遺伝子の発現を効果的に強化するための有効的な活性を有すること、などを含む。
【００３６】
ある実施形態では、組換え菌は少なくとも２つのコピーされたアスパラギナーゼ符号化遺伝子を有する。具体的には、組換え菌は、その核ＤＮＡにおいて、内因性由来のアスパラギナーゼ符号化遺伝子の１つのコピーのほかに、内因性および／または外因性由来の１つまたは複数のアスパラギナーゼ符号化遺伝子のコピーを有する。より具体的には、アスパラギナーゼ符号化遺伝子のヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３９に示すようになることができる。
【００３７】
ある一実施形態では、組換え菌のアスパラギナーゼ符号化遺伝子の発現が高転写または高発現活性の調節因子によって媒介される。好ましくは、調節因子は、強力プロモーターである。より好ましくは、強力プロモーターは、出発菌のＰｔｕｆプロモーターである。具体的には、組換え菌の核ＤＮＡの中のアスパラギナーゼ符号化遺伝子の上流に有効な内因性と／または外因性強力プロモーターがあるため、アスパラギナーゼ符号化遺伝子の発現を効果的に向上させる。
【００３８】
本発明に記載の「出発菌」（または「出発菌株」ともいう）は、本発明の遺伝子改造策に用いられる初期菌株を指す。この菌株は天然に存在する菌株であっても良いし、誘発突然変異や遺伝子工学による改造などの方法で育成した菌株であっても良い。
【００３９】
本発明に記載の「失活」とは改造される対象に応じて変化することにより、一定の効果を達することを指し、特定部位の突然変異、挿入失活および／またはノックアウトを含むが、これらに限られない。
【００４０】
本発明に記載の遺伝子ノックアウト、遺伝子挿入、プロモーター置換や特定部位の突然変異の方法は、担体がターゲット遺伝子を改造するホモロジーアームを携帯して相同組換えすることにより実現する。
【００４１】
本発明に記載のある遺伝子に導入することまたはある遺伝子のコピー数を増やすことは、当該遺伝子を含む組換えプラスミドを構築し、そしてまた組換えプラスミドを出発菌に導入することによって実現されてもよいし、あるいはある遺伝子を出発菌染色体の適切な部位に直接挿入することによって実現されてもよい。
【００４２】
本発明では、高転写または高発現活性の調節因子の一例を示したが、高転写または高発現活性の調節因子については、本発明には特に制限されず、プロモーター遺伝子の発現を強化することさえできればよい。本発明に使用可能な調節因子は、出発菌のＰ４５、Ｐｅｆｔｕ、Ｐｓｏｄ、ＰｇｌｙＡ、Ｐｐｃｋ、Ｐｐｇｋプロモーターなどが挙げられるが、これらに限られない。低転写または低発現活性の調節因子についても、本発明には特に制限されず、プロモーター遺伝子の発現を低減することさえできればよい。
【００４３】
以下の実施形態で使用する実験方法は、特に説明しない限り、従来の方法である。以下の実施形態で使用する材料、試薬などは、特に説明しない限り、ビジネスルートから入手できるものである。
【００４４】
特に指摘しない限り、実施形態で使用される技術的手段は、当業者がよく知っている従来の手段であり、「分子クローン実験ガイド（第３版）」（科学出版社）、「微生物学実験（第４版）」（高等教育出版社）および対応機器や試薬のメーカー説明書などを参照することができる。実施例において使用される機器と試薬は市販の常用機器、試薬である。以下の実施例における定量試験は、いずれも３回の繰り返し実験を設定し、その結果は平均値をとる。
【００４５】
実施例１  リジンシャーシ工学菌の構築
【００４６】
本実施形態は、コリネバクテリウム・グルタミクム野生型ＡＴＣＣ１３０３２を出発菌株とし、特定部位の突然変異ｈｏｍ（ホモセリンデヒドロゲナーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ１９８８７．１）遺伝子により、分岐経路のスレオニン合成経路の代謝流量を弱め、特定部位の突然変異ｐｙｃ（ピルビン酸カルボキシラーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ１９３９４．１）遺伝子により、リジン合成前駆体であるオキサロ酢酸の供給を高め、ｐｃｋ（ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ２０８８８．１）遺伝子をノックアウトするとともにｐｙｃ＊とｄａｐB（ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ２０３１４．１）遺伝子のコピー数を増やし、プラスミド過剰発現ｌｙｓＣ（アスパラギン酸キナーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ１８８２２．１）、ｄｄｈ（ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ２１２７９．１）、ｌｙｓＡ（ジアミノヘプタナートデカルボキシラーゼ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＦ１９８８４．１）遺伝子により、リジンの合成経路をさらに強化し、産リジンのシャーシ工学菌を構築する。
【００４７】
（１）染色体ｈｏｍ遺伝子の特定部位の突然変異
【００４８】
Ｇｅｎｂａｎｋにおけるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｈｏｍ遺伝子およびその上下流の配列に基づいてそれぞれプライマーを設計する。
【００４９】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、突然変異部位にプライマーを設計して、突然変異部位の上流と下流の２つの部分のｈｏｍ遺伝子をそれぞれ増幅する。Ｐ１とＰ２をプライマーとしてｈｏｍ遺伝子の上半分を増幅し、Ｐ３とＰ４をプライマーとしてｈｏｍ遺伝子の下半分を増幅する。また、純化された上記ＰＣＲ産物をテンプレートとし、Ｐ１とＰ４をプライマーとして、重合と長ＰＣＲ技術（ＳＯＥ）を採用して増幅し、１６３８ｂｐのＰＣＲ産物を得て、この産物には第５９位のバリンがアラニン（Ｖ５９Ａ突然変異）に突然変異されたｈｏｍ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）が含まれている。
【００５０】
上記１６３８ｂｐのＰＣＲ産物をＸｂａＩとＥｃｏＲＩでダブルダイジェストした後、同じダブルダイジェスト処理を経た相同組換え担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ（ AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION （ＡＴＣＣ）から購入、品番８７０９７）と連結する。連結された産物を化学的な転換法を採用して大腸菌ＤＨ５αに転換して、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ平板の上で転換体をスクリーニングし、転換体を継代培養して三世代の後に、Ｐ５とＰ６をプライマーとして、コロニーＰＣＲを採用して転換体を鑑定し、正確と鑑定された転換体に対してプラスミドを抽出し、プラスミドをＸｂａＩとＥｃｏＲＩでダブルダイジェスト鑑定を行い、１６３８ｂｐを得たものは陽性とする。
【００５１】
陽性プラスミドをシークエンシングし、結果として、このプラスミドは配列表のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示すヌクレオチドを担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入して得られた組換えプラスミドであり、ＹＥ０１９と名付けて、その構成は図５に示す。
【００５２】
【表１】
2021500914.tif 000001
【００５３】
シークエンシングで正確と測定された相同組換えプラスミドＹＥ０１９をコリネバクテリウム・グルタミクム野生型ＡＴＣＣ１３０３２の中に電気転換する。カナマイシン耐性の正の選択を通じて組換えプラスミドが染色体の上に統合されたコロニーを得る。蔗糖の負の選択を通じて、相同組換えが２回発生した陽性コロニーを得る。Ｐ５とＰ６をプライマーとして、陽性コロニーをＰＣＲ増幅鑑定を行い、正確と鑑定された組換え菌を得て、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０００と名付ける。
【００５４】
当該組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、結果として、コリネバクテリウム・グルタミクム野生型ＡＴＣＣ１３０３２の中のｈｏｍ遺伝子をＶ５９Ａのｈｏｍ遺伝子に置換えることに成功し、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０００の構築が成功した。
【００５５】
（２）染色体ｐｙｃ遺伝子の特定部位の突然変異
【００５６】
Ｇｅｎｂａｎｋにおけるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｐｙｃ遺伝子およびその上下流の配列に基づいてそれぞれプライマーを設計する。
【００５７】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、突然変異部位にプライマーを設計して、突然変異部位の上流と下流の２つの部分のｐｙｃ遺伝子をそれぞれ増幅する。Ｐ７とＰ８をプライマーとしてｐｙｃ遺伝子の上半分を増幅し、Ｐ９とＰ１０をプライマーとしてｐｙｃ遺伝子の下半分を増幅する。また、純化された上記ＰＣＲ産物をテンプレートとし、Ｐ７とＰ１０をプライマーとして、重合伸長ＰＣＲ技術（ＳＯＥ）を採用して増幅し、３４２３ｂｐのＰＣＲ産物を得て、この産物には、第４５８位のプロリンがセリン（Ｐ４５８Ｓ突然変異）に突然変異されたｐｙｃ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８）、即ちｐｙｃ＊遺伝子が含まれている。
【００５８】
上記３４２３ｂｐのＰＣＲ産物をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩでダブルダイジェストした後、同じダブルダイジェストで処理された相同組換え担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ（ American Type Culture Collection （ＡＴＣＣ）から購入、品番８７０９７）と連結する。連結された産物は化学的な転換法を採用して大腸菌ＤＨ５αに転換して、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ平板の上で転換体をスクリーニングし、転換体を継代培養して三世代の後に、Ｐ１１とＰ１２をプライマーとして、コロニーＰＣＲを採用して転換体を鑑定し、正確と鑑定された転換体に対してプラスミドを抽出し、プラスミドをＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩでダブルダイジェスト鑑定を行い、３４２３ｂｐを得たものは陽性とする。
【００５９】
陽性プラスミドをシークエンシングし、結果として、このプラスミドは配列表のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．８に示すヌクレオチドを担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入して得られた組換えプラスミドであり、ＹＺ０３７と名付けて、その構成は図６に示す。
【００６０】
【表２】
2021500914.tif 000002
【００６１】
シークエンシングで正確と測定された相同組換えプラスミドＹＺ０３７をコリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０００に電気転換する。カナマイシン耐性の正の選択を通じて組換えプラスミドが染色体の上に統合されたコロニーを得る。蔗糖の負の選択を通じて、相同組換えが2回発生した陽性コロニーを得る。Ｐ１１とＰ１２をプライマーとして陽性コロニーをＰＣＲ増幅鑑定を行い、正確と鑑定された組換え菌を得て、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１００７と名付ける。
【００６２】
当該組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、結果として、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０００の中のｐｙｃ遺伝子をＰ４５８Ｓ突然変異のｐｙｃ＊遺伝子に置換えることに成功し、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１００７の構築が成功した。
【００６３】
（３）ｐｃｋ遺伝子のノックアウトとｐｙｃ＊−ｄａｐＢのコピーの増加
【００６４】
Ｇｅｎｂａｎｋにおけるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｐｃｋ遺伝子およびその上下流の配列に基づいてそれぞれプライマーを設計する。
【００６５】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、Ｐ１３とＰ１４をプライマーとして、ｐｃｋ遺伝子の上流部分の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１５）を増幅し、Ｐ１５とＰ１６をプライマーとして、ｐｃｋ遺伝子のプロモーターを増幅し、Ｐ２１とＰ２２をプライマーとして、ｐｃｋ遺伝子の下流部分の配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１６）を増幅する。純化された上記ＰＣＲ産物をそれぞれｐｙｃ＊−ｄａｐＢオペロンの上下流ホモロジーアームとして、コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムに統合されるとき、ｐｃｋをノックアウトする目的が達成できる。
【００６６】
（２）で構築された点突然変異付きのｐｙｃ＊遺伝子とコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをそれぞれテンプレートとして、プライマーを設計し、それぞれｐｙｃ＊とｄａｐＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１７）を増幅する。ＮＣＢＩデータベースから関連する遺伝子配列の塩基情報を取得し、６対のプライマーを設計し、ｐｙｃ＊−ｄａｐＢ遺伝子の断片を構築する（表３）。
【００６７】
【表３】
2021500914.tif 000003
【００６８】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、それぞれＰ１３とＰ１４、Ｐ１５とＰ１６、Ｐ１７とＰ１８、Ｐ１９とＰ２０、Ｐ２１とＰ２２をもって、長さ７５０ｂｐ、２４４ｂｐ、３４２３ｂｐ、８９６ｂｐおよび７６７ｂｐの遺伝子を増幅し、それぞれはｐｃｋ遺伝子の上流部分の配列、ｐｙｃ遺伝子のプロモーターサブ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５７）、ｐｙｃ＊遺伝子配列、ｄａｐＢ遺伝子配列およびｐｃｋ遺伝子の下流部分の配列である。
【００６９】
純化された上記ＰＣＲ産物を大腸菌クローン担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢと混合して、ＮＥｂｕｉｌｄｅｒ（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）を利用して連結組立を行い、その後、大腸菌ＤＨ５αに転換し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ平板の上で転換体をスクリーニングし、転換体を継代培養して三世代の後に、Ｐ２３とＰ２４をプライマーとして、コロニーＰＣＲを採用して転換体を鑑定し、正確と鑑定された転換体に対してプラスミドを抽出する。
【００７０】
陽性プラスミドをシークエンシングし、結果として、このプラスミドはｐｙｃ＊−ｄａｐＢを担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入して得られた組換えプラスミドであり、ＹＺ０３９と名付けて、その構成は図７に示す。
【００７１】
シークエンシングで正確と測定された相同組換えプラスミドＹＺ０３９をコリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１００７に電気転換する。カナマイシン耐性の正の選択を通じて組換えプラスミドが染色体の上に統合されたコロニーを得る。蔗糖の負の選択を通じて、相同組換えが２回発生した陽性コロニーを得る。陽性コロニーをＰ２３とＰ２４をプライマーとしてＰＣＲ増幅鑑定を行い、正確と鑑定された組換え菌を得て、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１００９と名付ける。
【００７２】
当該組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、結果として、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１００７中のｐｃｋ遺伝子をノックアウトするとともにｐｙｃ＊−ｄａｐＢ遺伝子断片を挿入することに成功し、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１００９の構築が成功した。
【００７３】
（４）ｌｙｓＣ、ｄｄｈ、ｌｙｓＡ遺伝子のコピーの増加
【００７４】
Ｇｅｎｂａｎｋにおけるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のｌｙｓＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３０）、ｄｄｈ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３１）、ｌｙｓＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３２）遺伝子およびその上下流の配列に基づいてそれぞれプライマーを設計する。
【００７５】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、プライマーを設計し、ｌｙｓＣ、ｄｄｈ、ｌｙｓＡ遺伝子をそれぞれ増幅する。
【００７６】
【表４】
2021500914.tif 000004
【００７７】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをテンプレートとして、それぞれＰ２５とＰ２６、Ｐ２７とＰ２８、Ｐ２９とＰ３０をもって、長さ１２６６ｂｐ、９６３ｂｐおよび１３３８ｂｐの遺伝子を増幅する。
【００７８】
純化された上記ＰＣＲ産物を大腸菌クローン担体ｐＸＭＪ１９と混合して、ＮＥｂｕｉｌｄｅｒ（ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ）を利用して連結組立を行い、その後、大腸菌ＤＨ５αに転換し、クロロマイセチン（２０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ平板の上で転換体をスクリーニングし、転換体を継代培養して三世代の後に、Ｐ２５とＰ３０をプライマーとして、コロニーＰＣＲを採用して転換体を鑑定し、正確と鑑定された転換体に対してプラスミドを抽出する。
【００７９】
陽性プラスミドをシークエンシングし、結果として、このプラスミドはｌｙｓＣ、ｄｄｈ、ｌｙｓＡを担体ｐＸＭＪ１９に挿入して得られた組換えプラスミドであり、ＹＺ０３５と名付けて、その構成は図８に示す。
【００８０】
シークエンシングで正確と測定された相同組換えプラスミドＹＺ０３５をコリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１００９に電気転換する。Ｐ２５とＰ３０をプライマーとして耐性平板の上で成長できる陽性コロニーをＰＣＲ増幅鑑定を行い、正確と鑑定された組換え菌を得て、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０１０と名付ける。
【００８１】
この組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、結果として、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１００９に遊離プラスミドＹＺ０３５を導入することに成功し、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０１０の構築が成功した。
【００８２】
実施例２  リジンシャーシ工学菌におけるアスパラギナーゼ符号化遺伝子ＮＣｇｌ２０６２のプロモーター置き換え
【００８３】
Ｇｅｎｂａｎｋにおけるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のＮＣｇｌ２０６２遺伝子プロモーターの上下流配列とＰｔｕｆプロモーター（SEQ ID No.40)に基づいてそれぞれプライマーを設計する。
【００８４】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、Ｐ３１とＰ３２をプライマーとして、ＮＣｇｌ２０６２遺伝子プロモーターの上流ホモロジーアームをＰＣＲ増幅し、Ｐ３３とＰ３４をプライマーとして、プロモーターＰｔｕｆを増幅し、Ｐ３５とＰ３６をプライマーとして、ＮＣｇｌ２０６２遺伝子プロモーターの下流ホモロジーアームを増幅する。純化された上記ＰＣＲ産物をテンプレートとし、Ｐ３１とＰ３６をプライマーとして、重合伸長ＰＣＲ技術（ＳＯＥ）を採用して増幅し、１８００ｂｐのＰＣＲ産物を得て、この産物は置き換えプロモーターＰｔｕｆおよび置き換えられたプロモーターの上下流ホモロジーアームを含む断片である。
【００８５】
上記１８００ｂｐのＰＣＲ産物をＸｂａＩとＥｃｏＲＩでダブルダイジェストした後、同じダブルダイジェストで処理された相同組換え担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ（AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION(ＡＴＣＣ）から購入、品番８７０９７）と連結する。連結された産物は化学的な転換法を採用して大腸菌ＤＨ５Αに転換され、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ平板の上で転換体をスクリーニングし、転換体を継代培養して三世代後、Ｐ３１とＰ３６をプライマーとして、コロニーＰＣＲを採用して転換体を鑑定し、１８００ｂｐを得られれば陽性転換体とし、正確と鑑定された転換体に対してプラスミドを抽出し、プラスミドに対してＸｂａＩとＥｃｏＲＩでダブルダイジェスト鑑定を行い、１８００ｂｐを得たものは陽性とする。
【００８６】
陽性プラスミドをシークエンシングし、結果として、このプラスミドは上下流ホモロジーアームが含まれる強力プロモーターＰｔｕｆを担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入して得られた組換えプラスミドであり、ＹＺ０２２と名付けて、その構成は図２に示す。
【００８７】
【表６】
2021500914.tif 000005
【００８８】
シークエンシングで正確と測定された相同組換えプラスミドＹＺ０２２をコリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０１０に電気転換する。カナマイシン耐性の正の選択を通じて組換えプラスミドが染色体の上に統合されたコロニーを得る。蔗糖の負の選択を通じて、相同組換えが２回発生した陽性コロニーを得る。陽性コロニーをＰ３１とＰ３６をプライマーとしてＰＣＲ増幅鑑定を行い、１８００ｂｐを得たものは組換え菌とし、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０３６と名付ける。
【００８９】
当該組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、結果として、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０１０の中のＮＣｇｌ２０６２プロモーターをコリネバクテリウム・グルタミクム内因性の強力Ｐｔｕｆに置き換えることに成功し、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０３６の構築が成功した。
【００９０】
実施例３  リジンシャーシ工学菌におけるアスパラギナーゼ符号化遺伝子ＮＣｇｌ２０６２のコピーの増加
【００９１】
Ｇｅｎｂａｎｋにおけるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のＮＣｇｌ２０６２遺伝子およびその上下流配列に基づいてプライマーを設計する。
【００９２】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、Ｐ３７とＰ３８をプライマーとし、目的挿入部位の上流配列をＰＣＲ増幅してＮＣｇｌ２０６２遺伝子の増加したコピーの上流ホモロジーアームとする、Ｐ３９とＰ４０をプライマーとして、ＮＣｇｌ２０６２遺伝子を増幅し、Ｐ４１とＰ４２をプライマーとして、目的挿入部位の下流配列を増幅してＮＣｇｌ２０６２遺伝子の増加したコピーの下流ホモロジーアームとする。純化された上記ＰＣＲ産物をテンプレートとし、Ｐ３７とＰ４２をプライマーとして、重合伸長ＰＣＲ技術（ＳＯＥ）を採用して増幅し、２７７８ｂｐのＰＣＲ産物を得て、この産物は目的挿入部位の上下流ホモロジーアームおよびＮＣｇｌ２０６２ 遺伝子を含む断片である。
【００９３】
上記２７７８ｂｐのＰＣＲ産物をＸｂａＩとＮｈｅＩでダブルダイジェストした後、同じダブルダイジェストで処理された相同組換え担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ（ AMERICAN TYPE CULTURE COLLECTION （ＡＴＣＣ）から購入、品番８７０９７）と連結する。連結された産物は化学的な転換法を採用して大腸菌ＤＨ５αに転換して、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ平板の上で転換体をスクリーニングし、転換体を継代培養して三世代の後に、Ｐ３７とＰ４２をプライマーとして、コロニーＰＣＲを採用して転換体を鑑定し、２７７８ｂｐを得られれば陽性転換体であり、正確と鑑定された転換体に対してプラスミドを抽出し、プラスミドをＸｂａＩとＮｈｅＩでダブルダイジェスト鑑定を行い、２７７８ｂｐを得たものは陽性とする。
【００９４】
陽性プラスミドをシークエンシングし、結果として、このプラスミドは目的挿入部位の上下流ホモロジーアームを含み、およびＮＣｇｌ２０６２遺伝子を担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入して得られた組換えプラスミドであり、ＹＺ０２３と名付けて、その構成は図３に示す。
【００９５】
【表７】
2021500914.tif 000006
【００９６】
シークエンシングで正確と測定された相同組換えプラスミドＹＺ０２３をコリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０１０の中に電気転換する。カナマイシン耐性の正の選択を通じて組換えプラスミドが染色体の上に統合されたコロニーを得る。蔗糖の負の選択を通じて、相同組換えが２回発生した陽性コロニーを得る。Ｐ３７とＰ４２をプライマーとして陽性コロニーをＰＣＲ増幅鑑定を行い、２７７８ｂｐを得たものは組換え菌とし、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０３９と名付ける。
【００９７】
当該組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、結果として、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０１０の目的部位にコピーされたＮＣｇｌ２０６２ 遺伝子を挿入することに成功し、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０３９の構築が成功した。
【００９８】
実施例４  リジンシャーシ工学菌におけるアスパラギナーゼ符号化遺伝子ＮＣｇｌ２０６２のノックアウト
【００９９】
Ｇｅｎｂａｎｋにおけるコリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２のＮＣｇｌ２０６２遺伝子およびその上下流配列に基づいてプライマーを設計する。
【０１００】
コリネバクテリウム・グルタミクムＡＴＣＣ１３０３２ゲノムＤＮＡをテンプレートとし、Ｐ４３とＰ４４をプライマーとして、ＮＣｇｌ２０６２遺伝子の上流ホモロジーアームをＰＣＲ増幅し、Ｐ４５とＰ４６をプライマーとして、ＮＣｇｌ２０６２遺伝子の下流ホモロジーアームを増幅する。純化された上記ＰＣＲ産物をテンプレートとし、Ｐ４３とＰ４６をプライマーとして、重合伸長ＰＣＲ技術（ＳＯＥ）を採用して増幅し、１６００ｂｐのＰＣＲ産物を得て、この産物はＮＣｇｌ２０６２遺伝子上下流ホモロジーアームを含む断片である。
【０１０１】
上記１６００ｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩでダブルダイジェストした後、同じダブルダイジェストで処理されたた相同組換え担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢ（AMERICAN  TYPE  CULTURE  COLLECTION（ＡＴＣＣ）から購入、品番８７０９７）と連結する。連結された産物は化学的な転換法を採用して大腸菌ＤＨ５αに転換して、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ平板の上で転換体をスクリーニングし、転換体を継代培養して三世代の後に、Ｐ４３とＰ４６をプライマーとして、コロニーＰＣＲを採用して転換体を鑑定し、１６００ｂｐを得られれば陽性転換体であり、正確と鑑定された転換体に対してプラスミドを抽出し、プラスミドに対してＥｃｏＲＩとＮｈｅＩでダブルダイジェスト鑑定を行い、１６００ｂｐを得たものは陽性とする。
【０１０２】
陽性プラスミドをシークエンシングし、結果として、このプラスミドはＮＣｇｌ２０６２遺伝子の上下流ホモロジーアームを含む断片を担体ｐｋ１８ｍｏｂｓａｃＢに挿入して得られた組換えプラスミドであり、ＹＺ０２５と名付けて、その構成は図４に示す。
【０１０３】
【表８】
2021500914.tif 000007
【０１０４】
シークエンシングで正確と測定された相同組換えプラスミドＹＺ０２５をコリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０１０の中に電気転換する。カナマイシン耐性の正の選択を通じて組換えプラスミドが染色体の上に統合されたコロニーを得る。蔗糖の負の選択を通じて、相同組換えが２回発生した陽性コロニーを得る。Ｐ４３とＰ４６をプライマーとして陽性コロニーをＰＣＲ増幅鑑定を行い、１６００ｂｐを得たものは組換え菌とし、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０３８と名付ける。
【０１０５】
当該組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングし、結果として、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０１０からＮＣｇｌ２０６２遺伝子をノックアウトすることに成功し、コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０３８の構築が成功した。
【０１０６】
実施例５  コリネバクテリウム・グルタミクムリジン工学菌のリジン発酵生産における応用
【０１０７】
それぞれ振盪レベルと３Ｌ発酵槽レベルにおいて、実施例２〜４で構築された産Ｌ−リジンコリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０３６、ＥＰＣＧ１０３８、ＥＰＣＧ１０３９および出発菌株ＥＰＣＧ１０１０を培養することによって、Ｌ−リジンを生産する方法は以下の通りである。
【０１０８】
（１）振盪発酵：
【０１０９】
コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０３６、ＥＰＣＧ１０３８、ＥＰＣＧ１０３９およびＥＰＣＧ１０１０を下記の種子培地５０ｍｌを含む５００ｍｌの三角フラスコの中に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで８〜９時間振動培養する。その後、５ｍｌの各種子培養液を下記の発酵培地５０ｍｌを含む５００ＭＬのバッフルフラスコの中に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで４２〜４６時間振動培養する。発酵培養６ｈ時に最終濃度１ｍｍｏｌ／Ｌのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加入して目的遺伝子の誘導発現を行う。間欠的に濃アンモニアを追加して発酵液のｐＨを７．０〜７．２の間に制御し、殘糖の状況に応じて、濃度４００ｇ／Ｌのグルコース母液を追加し、発酵液殘糖を５〜１０ｇ／Ｌに制御する。
【０１１０】
（２）３Ｌ発酵槽発酵：
【０１１１】
コリネバクテリウム・グルタミクムＥＰＣＧ１０３６、ＥＰＣＧ１０３８、ＥＰＣＧ１０３９およびＥＰＣＧ１０１０を下記の種子培地１００ｍｌを含む１０００ｍｌの三角フラスコの中に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで８〜９時間振動培養する。その後、各種子培養液を下記の発酵培地９００ｍｌを含む３Ｌ発酵槽の中に接種し、３７℃、０．０１ＭＰａタンク圧で４２〜４６時間培養する。種子液を体積含有率１０％で最終濃度１０μｇ／ｍｌのクロロマイセチンを含む発酵培地の中に接種する。採用する発酵槽は３Ｌ発酵槽であり、定速度プログラマポンプを内蔵し、定速度で材料を補充することが実現できる。発酵の過程中に蠕動ポンプを通じて６００ｇ／Ｌのグルコースを追加し、発酵システムでのグルコースの濃度を５〜１０ｇ／Ｌに制御するとともに、加熱マントルおよび冷却水を通じて発酵温度を３０℃に維持するように制御し、空気を入れて溶存酸素を提供し、回転速度と溶存酸素信号がカスケード制御して溶存酸素を３０％に維持し、濃アンモニアを追加してｐＨをコントロールし、約６．９に維持する。発酵が５２ｈ連続で行う。ＯＤ６００＝４〜５になる時、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド、最終濃度は０．１ｍｍｏｌ／Ｌ）を加入して、組換えプラスミドが携帯している遺伝子の発現を誘導する。
【０１１２】
種子培地と発酵培地は以下の通りである。
【０１１３】
種子培地（ｐＨ  ７．０）
【０１１４】
ショ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素３．５ｇ、リン酸二水素カリウム４ｇ、リン酸水素二カリウム１０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、ビオチン０．２ｍｇ、ビタミンＢ１１．５ｍｇ、D-パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ（１リットル蒸留水に溶ける）。
【０１１５】
発酵培地（ｐＨ  ７．０）
【０１１６】
グルコース４０ｇ、糖蜜２０ｇ、リン酸０．４ｇ、硫酸アンモニウム１５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８７ｇ、ビオチン０．８８ｍｇ、ビタミンＢ１６．３ｍｇ、D-パントテン酸カルシウム６．３ｍｇ、ニコチンアミド４２ｍｇ（１リットル蒸留水に溶ける）。
【０１１７】
（３）リジンの収量の測定
【０１１８】
ＨＰＬＣ方法：
【０１１９】
１、流動相：
【０１２０】
有機相：メタノール：アセトニトリル：水＝４５：４５：１０（Ｖ／Ｖ）；
【０１２１】
水相：１２．４３６ｇ  ＮＡＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏは２Ｌの超純水に溶解し、ＮＡＯＨでＰＨを７．８に調整する。
【０１２２】
２、溶離手順：
【０１２３】
2021500914.tif 000008
【０１２４】
リジン標準品で標準濃度の溶液を調製し、濃度はそれぞれ０．２ｇ／Ｌ、０．４ｇ／Ｌ、０．８ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌで、ピーク面積に基づいて標準曲線を描き、発酵液中のリジン濃度を以下のように計算する。
【０１２５】
【表９】
2021500914.tif 000009
【０１２６】
振盪発酵実験の結果は、アスパラギナーゼの遺伝子の発現を強化すると、リジンの収量が著しく向上し、この遺伝子をノックアウトすると、リジンの収量が明らかに減少したことを明示した。
【０１２７】
振盪発酵の結果に対応して、３Ｌ発酵槽レベルの発酵では、アスパラギナーゼ符号化遺伝子のコピーをひとつ追加すると、リジンの収量は５９．４８％向上し、アスパラギナーゼ符号化遺伝子プロモーターを強力プロモーターに置き換えると、リジンの収量は１４．８３％向上したが、アスパラギナーゼ符号化遺伝子をノックアウトすると、リジンの収量は２７．３９％減少した。
【０１２８】
実施例６  コリネバクテリウム・北京１．５６３におけるアスパラギナーゼ符号化遺伝子ＮＣｇｌ２０６２の発現の強化
【０１２９】
リジンを蓄積できるコリネバクテリウム・北京ＡＳ１．５６３を出発菌株として、アスパラギナーゼ遺伝子の発現がリジン酸の蓄積に与える影響を分析する。
【０１３０】
（１）ＮＣｇｌ２０６２遺伝子の強力プロモーターの置き換え
【０１３１】
実施例２で構築された組換え担体ＹＺ０２２を、コリネバクテリウム・北京ＡＳ１．５６３（中国工業微生物菌種保蔵管理センター、ＣＩＣ１０１７８）の中に変換することによって、ＮＣｇｌ２０６２遺伝子プロモーターを強力プロモーターＰｔｕｆに置き換えることを実現する。
【０１３２】
カナマイシン耐性の正の選択を通じて組換えプラスミドが染色体の上に統合されたコロニーを得る。蔗糖の負の選択を通じて、相同組換えが２回発生した陽性コロニーを得る。陽性コロニーをＰ３１とＰ３６をプライマーとしてＰＣＲ増幅鑑定を行い、１８００ｂｐを得たものを組換え菌とし、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＰ１００８と名付ける。
【０１３３】
当該組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、結果として、コリネバクテリウム・北京ＡＳ１．５６３中のＮＣｇｌ２０６２のプロモーターをコリネバクテリウム・グルタミクム内因性強力プロモーターＰｔｕｆに置換えることに成功し、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＰ１００８の構築が成功した。
【０１３４】
（２）ＮＣｇｌ２０６２遺伝子のコピーの増加
【０１３５】
実施例３で構築された組換え担体ＹＺ０２３を、コリネバクテリウム・北京ＡＳ１．５６３に転換して、ＮＣｇｌ２０６２遺伝子のコピーの増加を実現する。
【０１３６】
カナマイシン耐性の正の選択を通じて組換えプラスミドが染色体の上に統合されたコロニーを得る。蔗糖の負の選択を通じて、相同組換えが２回発生した陽性コロニーを得る。Ｐ３７とＰ４２をプライマーとして陽性コロニーをＰＣＲ増幅鑑定を行い、２７７８ｂｐを得たものは組換え菌とし、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＰ１００９と名付ける。
【０１３７】
当該組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、結果として、コリネバクテリウム・北京ＡＳ１．５６３の目的部位にＮＣｇｌ２０６２遺伝子のコピーをひとつ挿入することに成功し、コリネバクテリウム・北京ＣＰ１００９の構築が成功した。
【０１３８】
（３）コリネバクテリウム・北京ＡＳ１．５６３におけるアスパラギナーゼ符号化遺伝子ＮＣｇｌ２０６２のノックアウト
【０１３９】
実施例４で構築された組換え担体ＹＺ０２５を、コリネバクテリウム・北京ＡＳ１．５６３の中に転換することによって、ＮＣｇｌ２０６２遺伝子のノックアウトを実現する。
【０１４０】
カナマイシン耐性の正の選択を通じて組換えプラスミドが染色体の上に統合されたコロニーを得る。蔗糖の負の選択を通じて、相同組換えが２回発生した陽性コロニーを得る。Ｐ４３とＰ４６をプライマーとして陽性コロニーをＰＣＲ増幅鑑定を行い、１６００ｂｐを得たものは組換え菌とし、コリネバクテリウム・グルタミクムＣＰ１０１０と名付ける。
【０１４１】
当該組換え菌からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンシングを行い、結果として、コリネバクテリウム・北京ＡＳ１．５６３からＮＣｇｌ２０６２遺伝子をノックアウトすることに成功し、コリネバクテリウム・北京ＣＰ１０１０の構築が成功した。
【０１４２】
実施例７  コリネバクテリウム・北京リジン工学菌のリジン発酵生産における応用
【０１４３】
それぞれ振盪レベルと３Ｌ発酵槽レベルで実施例６に構築された産Ｌ−リジンコリネバクテリウム・北京ＣＰ１００８、ＣＰ１００９、ＣＰ１０１０および出発菌株ＡＳ１．５６３を培養することによって、Ｌ−リジンを生産する方法は以下の通りである。
【０１４４】
（１）振盪発酵：
【０１４５】
コリネバクテリウム・北京ＣＰ１００８、ＣＰ１００９、ＣＰ１０１０およびＡＳ１．５６３を下記の種子培地５０ｍｌを含む５００ｍｌの三角フラスコの中に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで８〜９時間振動培養する。その後、５ｍｌの各種子培養液を下記の発酵培地５０ｍｌを含む５００ｍｌのバッフルフラスコの中に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで４２〜４６時間振動培養する。間欠的に濃アンモニアを追加して発酵液のｐＨは７．０〜７．２の間に制御し、殘糖の状況に応じて、濃度４００ｇ／Ｌのグルコース母液を追加し、発酵液殘糖を５〜１０ｇ／Ｌに制御する。
【０１４６】
（２）３Ｌ発酵槽発酵：
【０１４７】
コリネバクテリウム・北京ＣＰ１００８、ＣＰ１００９、ＣＰ１０１０およびＡＳ１．５６３を下記の種子培地１００ｍｌを含む１０００ｍｌの三角フラスコ中に接種し、３０℃、２２０ｒｐｍで８〜９時間振動培養する。その後、各種子培養液を下記の発酵培地９００ｍｌを含む３Ｌ発酵槽の中に接種し、３７℃、０．０１ＭＰａタンク圧で４２〜４６時間培養する。採用する発酵槽は３Ｌ発酵槽であり、定速度プログラマポンプを内蔵し、定速度で材料を補充することが実現できる。発酵の過程中に蠕動ポンプを通じて６００ｇ／Ｌのグルコースを追加し、発酵システムでのグルコースの濃度を５〜１０ｇ／Ｌに制御するとともに、加熱マントルおよび冷却水を通じて発酵温度を３０℃に維持するように制御し、空気を入れて溶存酸素を提供し、回転速度と溶存酸素信号がカスケード制御して溶存酸素を３０％に維持し、濃アンモニアを追加してｐＨをコントロールし、約６．９に維持する。発酵が５２ｈ連続で行う。
【０１４８】
種子培地と発酵培地は以下の通りである。
【０１４９】
種子培地（ｐＨ  ７．０）
【０１５０】
ショ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母抽出物５ｇ、尿素３．５ｇ、リン酸二水素カリウム４ｇ、リン酸水素二カリウム１０ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．５ｇ、ビオチン０．２ｍｇ、ビタミンＢ１１．５ｍｇ、D-パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ（１リットルの蒸留水に溶ける）。
【０１５１】
生産培地（ｐＨ  ７．０）
【０１５２】
グルコース４０ｇ、糖蜜２０ｇ、リン酸０．４ｇ、硫酸アンモニウム１５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．８７ｇ、ビオチン０．８８ｍｇ、ビタミンＢ１６．３ｍｇ、D-パントテン酸カルシウム６．３ｍｇ、ニコチンアミド４２ｍｇ（１リットルの蒸留水に溶ける）。
【０１５３】
培養が完了した後、ＨＰＬＣ分析を行い、菌株生産のＬ−リジンの含有量を測定する。コリネバクテリウム・北京ＣＰ１００８、ＣＰ１００９、ＣＰ１０１０およびＡＳ１．５６３におけるＬ−リジン濃度は表１０に示す。
【０１５４】
【表１０】
2021500914.tif 000010
【０１５５】
上記の表から、振盪レベルにおいても、３Ｌ発酵槽レベルにおいても、改造菌株の間では大きな違いが見られる。
【０１５６】
振盪発酵と発酵槽発酵の違いの傾向は一致している。即ち、アスパラギナーゼ遺伝子の発現を強化した後、リジンの収量が増加した。それに応じて，この遺伝子をノックアウトした後，リジンの収量は明らかに減少した。
【０１５７】
発酵槽の発酵産酸データについては、ＣＰ１００８はＡＳ１．５６３に比べて、リジンの収量は８６．６％向上し、ＣＰ１００９はＡＳ１．５６３に比べて、リジンの収量は３６．３％向上した。一方、ＣＰ１０１０はＡＳ１．５６３に比べて、リジンの収量は２９．５％減少した。
【０１５８】
最後に、上記の実施例は、実施形態に限定されるものではなく、本発明の例示を明確に説明するためにのみなされていることを説明すべきである。当業者にとっては、上記の説明をもとに、他の異なる形態の変化や変動が可能である。ここではすべての実施形態を列挙することはできないし、必要もない。これによってもたらす明らかな変化または変動は、本発明の保護範囲にある。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2021500914.tif 000011
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2021500914.tif 000012