(57)【要約】【課題】簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができる標的核酸の検出方法を提供する。【解決手段】核酸プローブにおけるエチニル基と標識化合物のアジド基との反応によって、または核酸プローブにおけるアジド基と標識化合物のエチニル基との反応によって、予め共有結合的に複数の標識部分を核酸プローブに導入したマルチラベル化核酸プローブを用い、対象物中に存在する標的核酸と核酸部分により特異的に結合させ、標識部分により標的核酸を検出する。または、核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズさせた後、核酸プローブにおけるエチニル基と標識化合物のアジド基との反応によって、または核酸プローブにおけるアジド基と標識化合物のエチニル基との反応によって、共有結合的に複数の標識部分を導入することにより、標識部分により標的核酸を検出する。【選択図】図６
2010132578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチニル基またはアジド基を有することを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【請求項２】
請求項１に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
下記式（１）で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【化１】
2010132578.tif 000025
（式（１）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項３】
請求項１に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
下記式（２）で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【化２】
2010132578.tif 000026
（式（２）中、Ｘ１およびＸ２のうち少なくとも１つは、エチニル基またはアジド基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項４】
請求項１に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
下記式（３）で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【化３】
2010132578.tif 000027
（式（３）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項５】
請求項１に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体であって、
下記式（４）で示されることを特徴とするヌクレオシド三リン酸誘導体。
【化４】
2010132578.tif 000028
（式（４）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【請求項６】
構成単位として、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸であることを特徴とする核酸プローブ。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸プローブにおけるエチニル基と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応、または、
請求項６に記載の核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基との反応、
により、複数の標識部分が導入されていることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
【請求項８】
請求項７に記載のマルチラベル化核酸プローブであって、
前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
【請求項９】
請求項８に記載のマルチラベル化核酸プローブであって、
前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることを特徴とするマルチラベル化核酸プローブ。
【請求項１０】
標的核酸の検出方法であって、
請求項７〜９のいずれか１項に記載のマルチラベル化核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合している前記マルチラベル化核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【請求項１１】
標的核酸の検出方法であって、
請求項６に記載の核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、
前記核酸プローブにおけるエチニル基と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基とを反応させて、または、前記核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基とを反応させて、複数の標識部分を導入し、結合している前記核酸プローブを、前記標識部分により検出することを特徴とする標的核酸の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、マルチラベル化核酸プローブおよび標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
何らかの標識が施されたＲＮＡプローブなどの核酸プローブを用い、細胞レベルにおけるＤＮＡやＲＮＡの発現パターンを検出、可視化することによって、生命現象に関する数多くの疑問点を解明することが可能となる。細胞レベルでの遺伝子発現パターンを可視化するこのような手法をｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ＩＳＨ）と言うが、この際に使用されるプローブの標識法は大別して、「放射性同位体標識法」（例えば、非特許文献１参照）、「蛍光抗体標識法」、「酵素抗体標識法」に分類される。歴史的には、放射性同位体を取り込ませた核酸プローブが先に確立したが、近年その取り扱いが制限されてきたこともあって、放射性同位体元素を用いない蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法が注目されている。
【０００３】
これらの手法のうち、現在主流となっている蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法は、核酸プローブ作製時に抗原やビオチンでラベル化しておき、それらを標的核酸にハイブリダイズした後、酵素もしくは蛍光物質によって標識された抗体やアビジンを用いて免疫染色法により検出するといった手法である。
【０００４】
これらの蛍光抗体標識法や酵素抗体標識法において、酵素や蛍光色素は抗原−抗体反応により核酸プローブと結合している。この抗原−抗体反応は一般に反応特異性が高いとされているが、生体試料を用いた場合には非特異的結合が生じてしまうことが多く、バックグラウンドノイズの原因となっている。また、抗原抗体反応により生成する結合は共有結合ではないため、その結合は強固ではない。
【０００５】
例えば、酵素抗体標識法を利用した核酸プローブとしては、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）などの抗体認識部位で修飾したヌクレオチド誘導体を複数個ランダムに導入した抗原マルチラベル化核酸プローブが知られている。この抗原マルチラベル化核酸プローブと標的核酸とのｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーションの後、抗体認識部位を認識する酵素標識化抗体との抗原−抗体反応を行い、酵素アルカリホスファターゼとのハイブリッドによる発色反応を利用して検出を行う。しかしながら、酵素標識された抗体が非常に高価であること、抗原−抗体反応に伴う操作の煩雑化や非特異的吸着などによるバックグラウンドの増加など、幾つかの問題を有している。
【０００６】
一方、アルキンとアジド化合物が［３＋２］型の付加環化反応を起こし、１，２，３−トリアゾール環を形成するＨｕｉｓｇｅｎ環化反応に代表される、いわゆる「クリックケミストリ」が知られている。クリックケミストリによれば、簡単かつ短時間に複数の化合物を結合させることができる（例えば、非特許文献２参照）。
【０００７】
例えば、特許文献１には、標識部分を有するアルキン誘導体とアジド基を有するデオキシヌクレオチド誘導体とのクリックケミストリを利用して、マイクロアレイを用いてｍＲＮＡの検出を行うことが記載されている。
【０００８】
また、特許文献２には、標識部分を有するアジドとエチニル基を有するデオキシヌクレオチド誘導体とのクリックケミストリを利用して、ＤＮＡの検出を行うことが記載されている。特許文献２の方法は、エチニル基を有するデオキシヌクレオチド誘導体を細胞内でそのままＤＮＡに取り込ませて、標識部分を有するアジドと反応させて、細胞内で合成されたＤＮＡ鎖を細胞内で検出するものであり、ＩＳＨ法に利用することはできない。
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００６／０１４７９６３号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００７／０２０７４７６号明細書
【非特許文献１】Ｈａｒｐｅｒ  Ｍ  Ｅ，Ｍａｒｓｅｌｌｅ  Ｌ  Ｍ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９（１−２）、ｐ７３−８０（１９８６）
【非特許文献２】Ｂｒｅｉｎｂａｕｅｒ  Ｒ，Ｋｏｈｎ  Ｍ、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、４（１１）、ｐ１１４７−１１４９（２００３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新規なヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブ、および簡便かつ高感度に標的核酸を検出することができるマルチラベル化核酸プローブ、その核酸プローブまたはマルチラベル化核酸プローブを用いた標的核酸の検出方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、エチニル基またはアジド基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体である。
【００１２】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（１）で示されるものであることが好ましい。
【化１】
2010132578.tif 000003
（式（１）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００１３】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（２）で示されるものであることが好ましい。
【化２】
2010132578.tif 000004
（式（２）中、Ｘ１およびＸ２のうち少なくとも１つは、エチニル基またはアジド基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００１４】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（３）で示されるものであることが好ましい。
【化３】
2010132578.tif 000005
（式（３）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００１５】
また、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が、下記式（４）で示されるものであることが好ましい。
【化４】
2010132578.tif 000006
（式（４）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００１６】
また、本発明は、構成単位として、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブである。
【００１７】
また、本発明は、前記核酸プローブにおけるエチニル基と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応、または、前記核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基との反応、により、複数の標識部分が導入されているマルチラベル化核酸プローブである。
【００１８】
また、前記マルチラベル化核酸プローブにおいて、前記標識部分が、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つであることが好ましい。
【００１９】
また、前記マルチラベル化核酸プローブにおいて、前記酵素が、超好熱菌由来の酵素であることが好ましい。
【００２０】
また、本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記マルチラベル化核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合している前記マルチラベル化核酸プローブを、前記標識部分により検出する標的核酸の検出方法である。
【００２１】
また、本発明は、標的核酸の検出方法であって、前記核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、前記核酸プローブにおけるエチニル基と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基とを反応させて、または、前記核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基とを反応させて、複数の標識部分を導入し、結合している前記核酸プローブを、前記標識部分により検出する標的核酸の検出方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明では、共有結合的に複数の標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブを簡易に得るための新規なヌクレオシド三リン酸誘導体、核酸プローブを提供することができる。
【００２３】
また、本発明では、ターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズする前に、核酸プローブにおけるエチニル基と標識化合物のアジド基との簡易な反応、または核酸プローブにおけるアジド基と標識化合物のエチニル基との簡易な反応によって、予め共有結合的に複数の標識部分を核酸プローブに導入することにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することが可能なマルチラベル化核酸プローブを提供することができる。
【００２４】
また、本発明では、予め共有結合的に複数の標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブを用いることにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することが可能な標的核酸の検出方法を提供することができる。
【００２５】
また、本発明では、核酸プローブをターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズさせた後、核酸プローブにおけるエチニル基と標識化合物のアジド基との簡易な反応、または核酸プローブにおけるアジド基と標識化合物のエチニル基との簡易な反応によって、共有結合的に複数の標識部分を導入することにより、簡便かつ高感度に標的核酸を検出することが可能な標的核酸の検出方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の実施の形態について以下説明する。本実施形態は本発明を実施する一例であって、本発明は本実施形態に限定されるものではない。
【００２７】
本発明者らは、核酸プローブに複数の標識部分を共有結合的に導入する手法として、アルキンとアジド化合物が［３＋２］型の付加環化反応を起こし、１，２，３−トリアゾール環を形成するＨｕｉｓｇｅｎ環化反応に代表される、いわゆる「クリックケミストリ」に着目した。クリックケミストリによれば、簡単かつ短時間に複数の化合物を結合させることができる。このクリックケミストリを用いて、複数の標識部分を導入したマルチラベル化核酸プローブの創製を行う。
【００２８】
具体的には、例えば、図１に示す、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）に、アジドが反応可能なエチニル基を有する置換基を結合させたヌクレオシド三リン酸誘導体であるアルキン化ＵＴＰを合成し、図２に示すように、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際にアルキン化ＵＴＰを取り込ませることによって、アルキンが複数箇所導入されたアルキン化ＲＮＡを調製する。その後、標識部分を導入した、アジド基などのエチニル基と反応する部分を有する化合物と結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる。
【００２９】
また、アジド基を有する置換基を結合させたヌクレオシド三リン酸誘導体を合成し、図３に示すように、核酸プローブとなるＲＮＡを調製する際に取り込ませることによって、アジド基が複数箇所導入されたアジド化ＲＮＡを調製してもよい。その後、標識部分を導入した、エチニル基などのアジド基と反応する部分を有する化合物と結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎ（ｎは２以上の整数）であるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる。
【００３０】
図２，図３では、１つのアジド基を有する標識化合物、または１つのエチニル基を有する標識化合物を用いて反応を行う例を示しているが、図４のような複数のアジド基を有する標識化合物、または複数のエチニル基を有する標識化合物を用いて反応を行ってもよい。
【００３１】
このマルチラベル化核酸プローブは、ターゲットとなる標的核酸にハイブリダイズした後、直ちに検出反応を行うことができる。アルキンとアジド基の化学反応は反応特異性が高く、結合が強固なため、抗原−抗体反応と比較して、反応時間の短縮などの操作の大幅な簡素化、バックグラウンドの低下、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件の最適化の容易化、コストの抑制などが見込まれる。
【００３２】
＜ヌクレオシド三リン酸誘導体＞
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、エチニル基またはアジド基を有する。エチニル基またはアジド基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体としては、エチニル基またはアジド基を有する、ウリジン三リン酸（ｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＵＴＰ）誘導体、アデノシン三リン酸（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＡＴＰ）誘導体、グアノシン三リン酸（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＧＴＰ）誘導体、シチジン三リン酸（ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＣＴＰ）誘導体、デオキシウリジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＵＴＰ）誘導体、デオキシアデノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＡＴＰ）誘導体、デオキシグアノシン三リン酸（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＧＴＰ）誘導体、デオキシシチジン三リン酸（ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＣＴＰ）誘導体などが挙げられる。本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体において、エチニル基またはアジド基は、例えば、ウラシル、アデニン、グアニン、シトシンの部分に直接または置換基を介して結合されている。
【００３３】
これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰまたはそれらの各種誘導体から得ることができる。
【００３４】
また、これらのヌクレオシド三リン酸誘導体は、ウリジン、ウリジンの一リン酸（ＵＭＰ）および二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン、アデノシンの一リン酸（ＡＭＰ）および二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン、グアノシンの一リン酸（ＧＭＰ）および二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン、シチジンの一リン酸（ＣＭＰ）および二リン酸（ＣＤＰ）、デオキシウリジン、デオキシウリジンの一リン酸（ｄＵＭＰ）および二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシアデノシン、デオキシアデノシンの一リン酸（ｄＡＭＰ）および二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシグアノシン、デオキシグアノシンの一リン酸（ｄＧＭＰ）および二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシシチジン、デオキシシチジンの一リン酸（ｄＣＭＰ）および二リン酸（ｄＣＤＰ）ならびにそれらの各種誘導体から得てもよい。
【００３５】
例えば、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジンのリン酸化酵素などによるリン酸化（例えば、生物工学会誌，８５（９），ｐ３９７−３９９（２００７）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８７（６），ｐ７３２−７３８（１９９９）など参照）や、プロトンスポンジ存在下でのオキシ塩化リンなどによるリン酸化（例えば、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２９（３６），ｐ４５２５−４５２８（１９８８）など参照）などによって、それらの三リン酸体を得ることができる。
【００３６】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（１）で示され、アジドが反応可能なエチニル基、またはエチニル基が反応可能なアジド基を有するウリジン三リン酸誘導体である。
【化５】
2010132578.tif 000007
（式（１）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００３７】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（２）で示され、アジドが反応可能なエチニル基、またはエチニル基が反応可能なアジド基を有するアデノシン三リン酸誘導体である。
【化６】
2010132578.tif 000008
（式（２）中、Ｘ１およびＸ２のうち少なくとも１つは、エチニル基またはアジド基を有する置換基で残りは水素原子を表し、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００３８】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（３）で示され、アジドが反応可能なエチニル基、またはエチニル基が反応可能なアジド基を有するシチジン三リン酸誘導体である。
【化７】
2010132578.tif 000009
（式（３）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００３９】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体は、例えば、下記式（４）で示され、アジドが反応可能なエチニル基、またはエチニル基が反応可能なアジド基を有するグアノシン三リン酸誘導体である。
【化８】
2010132578.tif 000010
（式（４）中、Ｘは、エチニル基またはアジド基を有する置換基、Ｗは水素原子またはヒドロキシル基を表す。）
【００４０】
Ｘで表されるエチニル基を有する置換基としては、特に制限はないが、例えば、エチニル基や、エチニル基を有する直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基が挙げられ、合成のし易さなどを考慮して決めればよい。具体的には、例えば、下記式（５），（６）で表される置換基などが挙げられる。
【化９】
2010132578.tif 000011
（式（５）中、ＹおよびＺは、それぞれ独立して２価の連結基を表す。）
【化１０】
2010132578.tif 000012
（式（６）中、ＹおよびＺは、それぞれ独立して２価の連結基を表す。）
【００４１】
ＹおよびＺで表される２価の連結基としては、それぞれ独立して、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの炭素数１〜４８のアルキレン基、エテニレン基、プロペニレン基、ブテニレン基などの炭素数２〜４８のアルケニレン基、エチニレン基、プロピニレン基などの炭素数２〜４８のアルキニレン基、例えば−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ−または−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｎ−（ｎは繰り返し数であり、ｎ＝２，４，８，１２，２４などの整数）基などのオキシアルキレン基などが挙げられる。これらのうち、Ｙはエテニレン基、Ｚはエチレン基であることが好ましい。式（１）で示されるヌクレオシド三リン酸誘導体において、Ｗがヒドロキシル基、Ｘが式（５）で表される置換基で、Ｙがプロペニレン基、Ｚがエチレン基であるヌクレオシド三リン酸誘導体が、図１に示すアルキン化ＵＴＰである。
【００４２】
Ｙ，Ｚを適宜選択することにより、エチニル基とＵＴＰとを連結するリンカー部位の構造を最適化し、例えば柔軟なリンカー部位を導入することで、アジド誘導体のアクセスを向上することができる。
【００４３】
また、Ｘで表されるアジド基を有する置換基としては、特に制限はないが、例えば、アジド基や、アジド基を有する直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基が挙げられ、合成のし易さなどを考慮して決めればよい。
【００４４】
本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体の一例であるアルキン化ＵＴＰの調製方法の一例を図５に示す。これは、本実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体の調製方法の一例であって、これに限定されるものではない。
【００４５】
まず、４−ペンチン酸などの末端にエチニル基を有するカルボン酸のカルボキシル基にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ：ＮＨＳ）基などを導入し、活性化しておく（ＮＨＳ化アルキン）。そして、アミノアリルＵＴＰなどの末端をアミノ化した置換基を有するＵＴＰと、ＮＨＳ化アルキンとを縮合することにより、アルキン化ＵＴＰを得ることができる。
【００４６】
アルキン化ＵＴＰの精製は、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）などにより行うことができる。また、アルキン化ＵＴＰの同定は、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ、ＮＭＲ、ＩＲなどにより行うことができる。また、ＨＰＬＣにより、生成物の確認および収率を求めることができる。
【００４７】
＜核酸プローブ＞
本実施形態に係る核酸プローブは、構成単位として、前記ヌクレオシド三リン酸誘導体を調製したのち、このヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸であり、核酸部分が、検出対象である標的核酸の標的分子特異的配列の全部または一部に相補的な配列を有するものである。
【００４８】
核酸には、ＤＮＡ、ＰＮＡおよびＲＮＡが含まれる。核酸の配列および長さには特に制限はない。長さに関しては、例えば少なくとも２０ｍｅｒ程度であればよい。
【００４９】
例えば、アルキン化ＵＴＰなどのエチニル基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を基質として、ＲＮＡポリメラーゼ活性のある酵素を用いて複数のアルキン化ＵＴＰを取り込ませて、アルキン（エチニル基）が複数箇所に導入され、所望の配列を有する核酸プローブであるアルキン化ＲＮＡ（図２）を調製することができる。
【００５０】
また、例えば、アジド基を有するヌクレオシド三リン酸誘導体を基質として、ＲＮＡポリメラーゼ活性のある酵素を用いて取り込ませて、アジド基が複数箇所に導入され、所望の配列を有する核酸プローブであるアジド化ＲＮＡ（図３）を調製することができる。
【００５１】
＜マルチラベル化核酸プローブ＞
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位であるヌクレオシド三リン酸誘導体のアルキン（エチニル基）と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応により、複数の標識部分が導入されているものである。例えば、アルキン（エチニル基）が複数箇所に導入された核酸プローブであるアルキン化ＲＮＡに、標識蛍光色素を導入したアジド化合物、標識酵素を導入したアジド化合物などを結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる（図２）。核酸プローブにおけるエチニル基と標識化合物のアジド基との簡易な反応によって、簡単かつ短時間に複数の化合物を結合させることができる。
【００５２】
また、本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブは、上記核酸プローブにおける構成単位であるヌクレオシド三リン酸誘導体のアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基（アルキン）との反応により、複数の標識部分が導入されているものである。例えば、アジド基が複数箇所に導入された核酸プローブに、標識蛍光色素を導入したアルキン化合物、標識酵素を導入したアルキン化合物などを結合させることによって、ＲＮＡと標識部分が１：ｎであるマルチラベル化核酸プローブを創製することができる（図３）。
【００５３】
ＲＮＡと標識部分との比率ｎは、２以上であれば特に制限はなく、適宜調整することができるが、ｎが大きいほど検出感度が高くなり好ましい。ただし、ｎが大きすぎると、標的核酸とのハイブリダイゼーションの効率が低下する場合がある。
【００５４】
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブにおいて、エチニル基とアジド基との反応により得られる連結部は、１，２，３−トリアゾール環を形成することにより構成されている。
【００５５】
標識部分を導入したアジド化合物としては、特に制限はなく、例えば、下記式（７）で表される。
【化１１】
2010132578.tif 000013
（式（７）中、Ｒは、標識部分を少なくとも１つ含む置換基であり、ｎは１以上である。ｎは、例えば、１〜３０である。）
【００５６】
標識部分を導入したアルキン化合物としては、特に制限はなく、例えば、下記式（８）で表される。
【化１２】
2010132578.tif 000014
（式（８）中、Ｒは、標識部分を少なくとも１つ含む置換基であり、ｍは１以上である。ｍは、例えば、１〜３０である。）
【００５７】
標識化合物におけるアジド基またはエチニル基の導入率は、アジド基またはエチニル基を導入する際のアジド化試薬またはアルキン化試薬の化学量論比を変えることなどにより制御することができる。
【００５８】
Ｒで表される標識部分を少なくとも１つを含む置換基としては、特に制限はないが、例えば、標識部分それ自体や、標識部分を少なくとも１つを含む直鎖、分岐、環状の飽和または不飽和のアルキル基、アミノアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基を含む置換基が挙げられ、合成のし易さなどを考慮して決めればよい。具体的には、例えば、下記式（９）で表される置換基などが挙げられる。
【化１３】
2010132578.tif 000015
（式（９）中、Ａは、標識部分を表し、ｎは１〜２４を表す。）
【００５９】
標識部分としては、酵素、蛍光色素、放射性同位体を含む化合物、磁気的に検出可能な標識（例えば、磁性ナノ粒子）、熱的に検出可能な標識（例えば、温度応答性高分子）、電気的に検出可能な標識（例えば、フェロセン部位を有する高分子）などが挙げられ、検出感度、取り扱い性などの点から、酵素および蛍光色素のうち少なくとも１つが好ましい。
【００６０】
蛍光色素としては、選択された波長の紫外光、可視光などの放射線による照射に応答して蛍光または燐光を発する物質であればよく、特に制限はないが、例えば、蛍光色素としてフルオレセイン、ローダミン、ダンシル、カルボシアニン誘導体など、あるいは蛍光タンパク質として緑色蛍光タンパク質とその変異体などが挙げられる。
【００６１】
放射性同位体としては、例えば、重水素（２Ｈ）、三重水素（３Ｈ）、１０Ｂ、１１Ｂ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどが挙げられる。
【００６２】
酵素としては、発色反応などを利用して検出を行うことができる性質を有するものであればよく特に制限はない。例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼなどが挙げられる。これらのうち、高い触媒活性と安定性の観点から、アルカリホスファターゼあるいはペルオキシダーゼが好ましい。
【００６３】
マルチラベル化核酸プローブと標的核酸の間でより厳密に塩基配列特異的な二本鎖形成を行うためには、比較的高温（例えば、７０℃以上）の条件下で行うことがあるため、常温菌由来の酵素を利用すると活性の損失が懸念される。そこで、標的酵素としては、超好熱菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来アルカリホスファターゼ（ＰｆｕＡＰ）が好ましい。超好熱菌は一般の生物がほとんど生育できない極限環境で生育することができる微生物であるため、超好熱菌由来のタンパク質は非常に高い耐熱性を有している。さらに、熱に対する耐性だけでなく、一般的に、変性剤、有機溶媒、ｐＨなどに対する耐性も常温菌由来酵素に比べて極めて高いことから、ＰｆｕＡＰを使用することによって、酵素の失活を伴わない厳密な二本鎖形成を達成することができると考えられる。
【００６４】
本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブの好ましい態様の一つは、ＰｆｕＡＰとアルキン化ＲＮＡまたはアジド化ＲＮＡとの複合体である。このような複合体は、安定な酵素であるＰｆｕＡＰと、安定な分子であるＲＮＡが、１，２，３−トリアゾール環という安定な共有結合で連結されているため、複合体全体としても安定性であるというメリットがある。
【００６５】
核酸プローブにおける構成単位であるヌクレオシド三リン酸誘導体のアルキン（エチニル基）と、標識部分を導入したアジド化合物との反応、またはヌクレオシド三リン酸誘導体のアジド基と、標識部分を導入したアルキン化合物との反応は、例えば、硫酸銅などをアスコルビン酸のような適当な還元剤で１価の状態にした銅触媒を用いて、ＴＢＳなどの溶媒中、ｐＨ５〜９、４〜９０℃の温度で、３０分〜２４時間程度の反応時間で行うことができる。また、触媒を用いずに、ｐＨ５〜９、１５〜９０℃の温度で、３０分〜２４時間程度の反応時間で行ってもよい。
【００６６】
アルキン（エチニル基）を有するアルキン化ＲＮＡにおけるアルキンの数に対する、標識部分を導入したアジド化合物におけるアジド基の数の比率（［アジド基数］／［アルキン基数］）、または、アジド基を有するアジド化ＲＮＡにおけるアジド基の数に対する、標識部分を導入したアルキン化合物におけるアルキンの数の比率（［アルキン基数］／［アジド基数］）は、１／１００〜１００の範囲が好ましく、１／１０〜１０の範囲がより好ましく、１／２〜２の範囲がさらに好ましい。
【００６７】
蛍光色素部分を導入したアジド化合物、アルキン化合物は、例えば、蛍光タンパク質の表面に存在するカルボキシル基を活性エステル化し、ここにアミノ化されたアジド化合物を導入したり、活性エステル化されたアルキン化合物を調製し、これにより蛍光タンパク質の表面に存在するアミノ基を修飾することで調製することができる（例えば、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３１３６−３１３８（２００７）参照）。
【００６８】
酵素部分を導入したアジド化合物、アルキン化合物は、例えば、酵素の表面に存在するカルボキシル基を活性エステル化し、ここにアミノ化されたアジド化合物を導入したり、活性エステル化されたアルキン化合物を調製し、これにより酵素の表面に存在するアミノ基を修飾することで調製することができる（例えば、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２４，２６６−２７２（２００８）参照）。
【００６９】
このような高い反応率が達成できる方法により得られたマルチラベル化核酸プローブ溶液には、未反応の核酸プローブ（例えば、遊離のアルキン化ＲＮＡ）がほとんど存在せず、以下で詳述する、標的核酸の検出にそのまま用いたとしても、マルチラベル化核酸プローブと未反応分子との競合が実質的に生じないか、生じたとしても目的とする検出の結果には実質的な影響を与えないほど少ないと考えられる。したがって、マルチラベル化核酸プローブ溶液を精製することなく、直接検出へと利用できるメリットがある。
【００７０】
＜標的核酸の検出方法＞
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、構成単位として上記ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブにおけるアルキン（エチニル基）と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基との反応、または、核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基との反応により、複数の標識部分が導入されているマルチラベル化核酸プローブであって、標識部分が容易に検出可能な性質を有し、かつ核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものであるマルチラベル化核酸プローブを準備し、マルチラベル化核酸プローブと対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させ、結合しているマルチラベル化核酸プローブを、標識部分により検出する工程を含む（図６参照）。
【００７１】
本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、標的核酸の定性、定量、識別、染色、局在化の調査などの目的で用いることができる。
【００７２】
この方法においては、上記マルチラベル化核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。この方法において、標的核酸を含む標的分子は、核酸、比較的低分子の有機化合物（ＡＴＰ）、タンパク質、ペプチド、金属イオン、複雑な構造を持つ多量体、ウイルスなどでありうる。検出対象は、（ｉ）ＤＮＡ転写膜、または（ｉｉ）細胞もしくは個体組織切片などである。
【００７３】
検出対象が（ｉ）の場合、標的核酸は、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡまたはゲノム断片ＤＮＡなどであり、（ｉｉ）の場合、標的核酸は、細胞または個体組織中に含まれる核酸（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）などである。本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（標識部分）を配置することにより、検出感度の向上が可能になる。
【００７４】
この方法においては、標的核酸に、マルチラベル化核酸プローブを供し、標的核酸とマルチラベル化核酸プローブの標的核酸相補的配列を有する部分とをハイブリダイズさせるが、このハイブリダイズのための条件は、当業者であれば、用いる核酸部分の長さ、塩基配列などに応じて、適宜設計することができる。
【００７５】
また、本実施形態に係る標的核酸の検出方法は、核酸部分が標的核酸に特異的に結合可能な塩基配列を有するものである、構成単位として上記ヌクレオシド三リン酸誘導体が複数個導入されている核酸である核酸プローブと、対象物中に存在する標的核酸とを核酸部分により特異的に結合させた後、核酸プローブにおけるアルキン（エチニル基）と、アジド基を有し標識部分を含む標識化合物のアジド基とを反応させて、または、核酸プローブにおけるアジド基と、エチニル基を有し標識部分を含む標識化合物のエチニル基とを反応させて、容易に検出可能な性質を有する複数の標識部分を導入したアジド化合物またはアルキン化合物を結合させ、結合している核酸プローブを、標識部分により検出する工程を含む（図７参照）。
【００７６】
この方法においては、上記核酸プローブが用いられるが、核酸部分は、標的核酸に特異的に結合可能な核酸配列を有するものとする。また、標識部分は、容易に検出可能な性質を有するものである。
【００７７】
本方法は、従来法、例えばジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識化プローブを用いる方法に比較して、種々の点で優れている。例えば、ＤＩＧ法では、核酸プローブのＤＩＧ修飾および標識化された抗ＤＩＧ抗体が必要であり、それに伴う煩雑な洗浄操作が必要となるが、本実施形態に係る核酸プローブを用いれば、ＤＩＧ標識化プローブおよび標識化抗ＤＩＧ抗体が不要になるため、試薬、手間および時間を大幅に削減することが可能となる。また、１つの認識部位（核酸）に対して複数のシグナル増幅部位（標識部分）を配置することにより、検出感度の向上が可能になる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例および比較例を挙げ、本発明をより具体的に詳細に説明するが、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００７９】
本実施例では、Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法への応用を目指して、酵素マルチラベル化ＲＮＡの開発を行った。酵素ラベル化の手法としては、酵素部分を有するアジドとエチニル基とのクリックケミストリを利用した。アジドと反応するアルキン（エチニル基）を導入したアルキン化ＵＴＰを合成し、ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによる転写反応によってアルキン化ＲＮＡを調製した。さらに、アジド基を有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を調製し、アジドとエチニル基とのＨｕｉｓｇｅｎ環化反応によるマルチラベル化核酸プローブを調製し、その性能をドットブロットによって評価した。
【００８０】
（実施例１）
＜アルキン化ＵＴＰの合成・精製＞
アルキン化ＵＴＰの合成スキームは、図５に示す通りである。
【００８１】
まず１００ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、５０ｍＭ  ４−ペンチン酸を、室温（調製した日は２７℃）でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４ｍＬ中で２０時間反応させることにより、ＮＨＳ化アルキン（５０ｍＭ）を調製した。その後、２５ｍＭのＮＨＳ化アルキンと５ｍＭのａｍｉｎｏａｌｌｙｌ  ＵＴＰとを、１００ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）とＤＭＦの混合溶媒（ｖ／ｖ＝１／１）０．３２ｍＬ中において２５℃で１２時間反応させた。反応終了後、サンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１０倍希釈し、ＨＰＬＣ（日本分光製）（高速液体クロマトグラフ・ポンプ：ＴＲＩ  ＲＯＴＡＲ−Ｖ型、バリアブル・ループ・インジェクタ：ＶＬ−６１３型、紫外可視分光検出器：ＵＶＩＤＥＣ−１００−ＩＶ型）によって精製を行った。ＨＰＬＣの測定条件は表１の通りとした。生成物の同定は、レーザイオン化飛行時間型質量分析装置であるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ（島津製作所製  ＡＸＩＭＡ（登録商標）−ＣＦＲ  Ｐｌｕｓ）によって行った。なお、サンプル調製手順は、まず、試料１μＬをＭＡＬＤＩ用試料プレートの上に滴下し、次にその上から、マトリックス溶液としてα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液（５０％アセトニトリル溶液、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む）を滴下し、その後、風乾して、得られた試料プレートをＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ装置のイオン源内に導入して計測した。
【００８２】
アルキン化ＵＴＰを合成した後、表１に示す条件で逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を図８に示す。保持時間１３．８１３分のピークを回収してＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析を行った（図９参照）。その結果、６１７．９９のピークが確認され、理論分子量の６１８．０４と良く一致した結果が得られたため、アルキン化ＵＴＰの合成が示された。また、得られた生成物の量より反応率を算出すると約６７％であった。
【００８３】
【表１】
2010132578.tif 000016
【００８４】
＜核酸プローブ（アルキン化ＲＮＡ）の調製＞
核酸プローブ（アルキン化ＲＮＡ）をＴ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いて、表２の反応条件で調製した（配列番号１）。反応は、３７℃で２時間反応させて行った。アルキン化ＵＴＰの導入量を０％、４０％、８０％と変えて核酸プローブの調製を行った。
【００８５】
【表２】
2010132578.tif 000017
【００８６】
転写反応後、マイクロチップ型電気泳動装置（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）で確認を行ったところ、図１０に示すように、ＲＮＡ転写反応時のアルキン化ＵＴＰの導入量が増加するに伴い、高分子側へバンドがシフトし、アルキンの導入量の調整が可能であることがわかった。
【００８７】
＜アジド化ＡＰの調製＞
（１）ＮＨＳ化アジドの調製
まず、１００ｍＭのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、和光純工業株式会社製）、１００ｍＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、キシダ化学株式会社製）、５０ｍＭのＯ−（２−Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ）−Ｏ−［２−（ｄｉｇｌｙｃｏｌｙｌ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］ｈｅｐｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ（シグマ・アルドリッチ社製）を、室温（調製した日は２０℃）でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、キシダ化学株式会社製）２ｍＬ中で２０時間反応させることにより、Ｏ−（２−Ａｚｉｄｏｅｔｈｙｌ）−Ｏ−［２−（ｄｉｇｌｙｃｏｌｙｌ−ａｍｉｎｏ）ｅｔｈｙｌ］ｈｅｐｔａｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌをＮＨＳ化した（ＮＨＳ化アジド）。
【００８８】
【化１４】
2010132578.tif 000018
【００８９】
（２）アジド化ＡＰの調製
１０ｍＭのＮＨＳ化アジドと、５ｍｇ／ｍＬ（１００μＭ）の大腸菌由来アルカリホスファターゼ（ＡＰ、和光純薬工業株式会社製）とを、５０ｍＭ  ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）中において、室温（調製した日は２０℃）で一晩（１６時間）反応させ、アジド化されたＡｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（アジド化ＡＰ）を得た。なお、ＡＰをアジド化する際、ＡＰ（８μＭ）と反応させるＮＨＳ化アジドの量を等量（８μＭ）、１０倍量（８０μＭ）、１００倍量（８００μＭ）と３段階に設定した。以下、下記の通り表記する。
１倍量のＮＨＳ化アジドでアジド化したＡＰ      ：  １×アジド化ＡＰ
１０倍量のＮＨＳ化アジドでアジド化したＡＰ    ：  １０×アジド化ＡＰ
１００倍量のＮＨＳ化アジドでアジド化したＡＰ  ：  １００×アジド化ＡＰ
【００９０】
反応後、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で精製し、１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）にバッファ交換した。限外濾過カラム（アミコンウルトラ-４  ３０Ｋ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濃縮後、ＢＣＡ法で各アジド化ＡＰの濃度を定量した。
【００９１】
【表３】
2010132578.tif 000019
【００９２】
（３）ＢＣＡ法によるアジド化ＡＰ濃度の定量
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、シグマ・アルドリッチ社製）を０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの６段階に水で希釈したものと、各アジド化ＡＰを水で５倍希釈したものを、９６穴プレート（ポリソープ、Ｎｕｎｃ社製）にそれぞれ１０μＬずつ添加し、そこにビシンコニン酸溶液（シグマ・アルドリッチ社製）と硫酸銅溶液（Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、シグマ・アルドリッチ社製）を５０：１で混合した調製液を２００μＬ添加して、３７℃で３０分反応させた。反応終了後、プレートリーダ（Ｐｏｗｅｒ  Ｗａｖｅ  Ｘ、ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）で５６２ｎｍの吸光度を測定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄの結果より検量線を作成して各アジド化ＡＰの濃度を定量した結果、１×アジド化ＡＰは２．２ｍｇ／ｍＬ、１０×アジド化ＡＰは２．２９ｍｇ／ｍＬ、１００×ＡＰは２．２３ｍｇ／ｍＬであった。
【００９３】
（４）活性測定
各アジド化ＡＰを１０ｍＭホウ酸緩衝液で２．８μＭに希釈したものを、ＡＰの基質である１ｍＭ  ４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム・６水和物（以下ｐ−ＮＰＰ、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０で調製）９９０μＬに１０μＬ添加し（アジド化ＡＰの終濃度２８ｎＭ）、２５℃で８０秒間反応させ、ｐ−ＮＰＰがＡＰによって脱リン酸化されて生じるｐ−ニトロフェノールの４１０ｎｍの吸光度を測定することによって、ＡＰの酵素活性を評価した。対照サンプルとしてアジド化してないＡＰも測定した。
【００９４】
各アジド化ＡＰの酵素活性の測定結果を図１１に示す。１×アジド化ＡＰおよび１０×アジド化ＡＰはアジド化によって活性の低下は見られなかったが、１００×アジド化ＡＰは活性が対照実験（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の約６０％に低下した。
【００９５】
＜アルキン化ＢＳＡとのクリックケミストリによるアジド化の確認＞
（１）アルキン化ＢＳＡの調製
まず、１００ｍＭ  Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、和光純工業株式会社製）、１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、キシダ化学株式会社製）、５０ｍＭ  ４−ペンチン酸（シグマ・アルドリッチ社製）を撹拌しながら室温（調製した日は２０℃）で２０時間反応させることにより、ＮＨＳ化アルキンを調製した。その後、７．５μＭ  ＢＳＡと１ｍＭ  ＮＨＳ化アルキンを１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）中で室温（調製した日は２０℃）下で１６時間撹拌した。反応後はＰＤ−１０カラムで精製し、限外濾過カラムで濃縮した後、ＢＣＡ法でアルキン化ＢＳＡの濃度を定量した。
【００９６】
（２）ＢＣＡ法によるアルキン化ＢＳＡ濃度の定量
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、シグマ・アルドリッチ社製）を０．１ｍｇ／ｍＬ〜１．０ｍｇ／ｍＬの６段階に水で希釈したものと、アルキン化ＢＳＡを水で５倍希釈したものを、９６穴プレート（ポリソープ、Ｎｕｎｃ社製）にそれぞれ１０μＬずつ添加し、そこにビシンコニン酸溶液（シグマ・アルドリッチ社製）と硫酸銅溶液（Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、シグマ・アルドリッチ社製）を５０：１で混合した調製液を２００μＬ添加して３７℃で３０分反応させた。反応終了後、プレートリーダ（Ｐｏｗｅｒ  Ｗａｖｅ  Ｘ、ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）で５６２ｎｍの吸光度を測定した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄの結果より検量線を作成してアルキン化ＢＳＡの濃度を定量した結果、４．６５ｍｇ／ｍＬであった。
【００９７】
（３）クリックケミストリによるアジド化の確認
各アジド化ＡＰ（１×アジド化ＡＰ、１０×アジド化ＡＰ、１００×アジド化ＡＰ）１０μｇ、アルキン化ＢＳＡ  １０μｇ、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）１ｍＭ、Ｔｒｉｓ[（１−ｂｅｎｚｙｌ−１Ｈ−１，２，３−ｔｒｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ]ａｍｉｎｅ（ＴＢＴＡ、シグマ・アルドリッチ社製）０．１ｍＭ、アスコルビン酸ナトリウム  １ｍＭの条件の下、ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ７．７）中で２５℃、１６時間反応させた。反応後、１２％アクリルアミドゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色で染色した。
【００９８】
アルキンＢＳＡとのクリック反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１２に示す。１０×アジド化ＡＰと１００×アジド化ＡＰを用いてクリック反応した場合、アルキンＢＳＡのバンドとアジド化ＡＰのバンドが薄くなり、高分子側へスメアリングしていた。また、スメアリングはＮＨＳアジドの添加量に伴って、より高分子側にシフトしており、１００×アジド化ＡＰを用いた場合では電気泳動で流れずにＷｅｌｌに保持されている産物も得られた。これより、ＮＨＳ化アジドの添加量に伴ってＡＰがアジド化していることが確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥレベルでは、１×アジド化ＡＰのアジド化は確認できなかった。
【００９９】
（４）ＴＮＢＳ法によるＡＰのアジド化率の算出
１０ｍＭ各ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．８）で０．５ｍｇ／ｍＬ(１０μＭ)に希釈したアジド化ＡＰ  ５０μＬ、４％炭酸水素ナトリウム溶液  ５０μＬ、０．１％  ２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＴＮＢＳ）溶液５０μＬを９６穴プレート（ポリソープ、Ｎｕｎｃ社製）に入れ、４０℃で２時間振盪しながら反応させた後、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）５０μＬと１Ｍ塩酸２５μＬを添加して反応を停止した。その後、プレートリーダ（Ｐｏｗｅｒ  Ｗａｖｅ  Ｘ、ＢＩＯ−ＴＥＫ  ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴＳ社製）で３４０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１００】
ＴＮＢＳ法の結果を図１３に示す。ＡＰをアジド化する際のＮＨＳ化アジドの添加量に伴って３４０ｎｍの吸光値が低下している。これらの結果より、アジド化していないＡＰをコントロールとしてアジド化率を算出すると、１×アジド化ＡＰは約１．０％、１０×アジド化ＡＰは約８．７％、１００×アジド化ＡＰは約３５．５％となった。
【０１０１】
＜Ｈｕｉｓｇｅｎ環化反応によるマルチラベル化核酸プローブの調製＞
それぞれ調製したアルキン化ＲＮＡとアジド化ＡＰとを、Ｈｕｉｓｇｅｎ環化反応により結合させ、マルチラベル化核酸プローブを調製した。アルキン化ＲＮＡとして、アルキン化ＵＴＰ導入量が０％（Negative control）、４０％、８０％（それぞれ、４０％アルキン化ＲＮＡ、８０％アルキン化ＲＮＡと表記）のものを用い、アジド化ＡＰとして、１×アジド化ＡＰ、１０×アジド化ＡＰ、１００×アジド化ＡＰを用いた。反応条件を表４に示す。反応は、２５℃で６時間あるいは１６時間反応させて行った。サブマリン型電気泳動装置によるアガロース電気泳動の結果を図１４に示す。
【０１０２】
【表４】
2010132578.tif 000020
【０１０３】
アルキンが導入されたアルキン化ＲＮＡとアジド化ＡＰを用いて反応を行った時、１０×アジド化ＡＰは８０％アルキン化ＲＮＡと、１００×アジド化ＡＰは４０％および８０％アルキン化ＲＮＡとの反応において、高分子側にスメアーした。このように、アルキンが導入されたアルキン化ＲＮＡとアジド化ＡＰとの間でＨｕｉｓｇｅｎ環化反応が起こっており、ラベル化が確認された。また、より多くのアルキンでラベル化された核酸プローブ（４０％＜８０％）を、より多くのアジド基で修飾された酵素（１×＜１０×＜１００×アジド化ＡＰ）と反応させると、より多くのクリック産物を得ることができることが分かり、また、反応時間を長く（６ｈｒ＜１６ｈｒ）してもより多くのクリック産物が得られることが分かる。
【０１０４】
＜ドットブロットによる検出感度の評価＞
ドットブロットにより、Ｈｕｉｓｇｅｎ環化反応により調製したマルチラベル化核酸プローブの検出感度の評価を行った。なお、ハイブリダイセーション時の各種溶液組成およびプロトコールは、市販の検出キットＡｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）に準拠した。ターゲットＲＮＡとして、プローブと相補的なＲＮＡ（センス鎖）を用いた。
【０１０５】
評価は、検出用メンブレンの作製、プレハイブリダイゼーション（５５℃、３０分）、ハイブリダイゼーション（５５℃、１６時間）、メンブレン洗浄を行った後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴで検出を行った（２５℃、４時間）。
【０１０６】
（１）センス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡの調製
ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにより転写を行うことによって、センス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡを調製した。標的核酸（ターゲット）としては、マウス中にて発現パターンが既知であるＳｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）というタンパク質をコードするｍＲＮＡ（ｓｈｈ）をモデルとした。そこでまず、ＳＨＨをコードした遺伝子を含むプラスミドをテンプレートとしてＰＣＲを行い、長さ約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。この際、上流にはＴ３プロモータ、下流にはＴ７プロモータが含まれるようにプライマ設計を施した。次に得られたＰＣＲ産物を基に、Ｔ３  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（センス鎖（Ｓ）  調製用）を用いてＲＮＡ合成を行い、Ｔ３  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで転写反応を行ってセンス鎖配列を調製した（配列番号２）。同様にＴ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アンチセンス鎖（ＡＳ）  調製用）を用いてＲＮＡ合成を行い、Ｔ７  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅにで転写反応を行ってアンチセンス鎖配列を合成した（配列番号３）。条件は以下の表３に示す。反応は３７℃で２時間行い、得られたセンス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖はエタノール沈殿によって回収し、ＴＥバッファ２０μＬで縣濁した。ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒとＤＴＴを添加し、ＲＮａｓｅによる分解を抑えた。
【０１０７】
【表５】
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【０１０８】
（２）ＲＮＡ濃度の測定
転写反応後、Ｎａｎｏ  ＤｒｏｐにてＲＮＡ濃度を測定した。その結果、センス鎖は１０１９ｎｇ／μＬ、アンチセンス鎖は８１５ｎｇ／μＬであった。
【０１０９】
（３）検出用メンブレンの作製
まず、ターゲットとなるセンス鎖ＲＮＡ、アンチセンス鎖ＲＮＡを１００ｆｇ／μＬ〜５０ｎｇ／μＬの７段階の濃度に滅菌水を用いて希釈したものを、それぞれ１μＬずつプラスのチャージを持つメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）にアプライした。その後、８０℃で２時間ベーキングした。
【０１１０】
（４）ハイブリダイゼーション
上記検出用メンブレンの作製で作製したメンブレンをキットに添付されているハイブリダイゼーションバッファに移し、５５℃で３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上述したマルチラベル化核酸プローブを濃度が５０ｎｇ／ｍＬとなるように添加して５５℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。
【０１１１】
（５）メンブレン洗浄
ハイブリダイゼーション後、メンブレンをＷａｓｈＩバッファ（表６）に移し、５５℃で振とうしながら１５分洗浄した。この操作を２回繰り返した。その後、ＷａｓｈＩＩバッファ（表７）にて洗浄した。この操作を２回繰り返した。
【０１１２】
【表６】
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【０１１３】
【表７】
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【０１１４】
（６）検出
ＮＴＭＴｘバッファ（表８）で室温、５分間洗浄したメンブレンをＳｔａｉｎｉｎｇ溶液（３７５μｇ／ｍＬ  ＮＢＴ＋１８８μｇ／ｍＬ  ＢＣＩＰ  ｉｎ  ＮＴＭＴｘ）に移し、室温で４時間、遮光下で発色させた。結果を図１５に示す。なお、ＮＢＴとは、Ｎｉｔｒｏ  ｂｌｕｅ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅの略称であり、ＢＣＩＰは、５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｓａｌｔのことである。
【０１１５】
【表８】
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【０１１６】
このように、Ｈｕｉｓｇｅｎ環化反応により調製したマルチラベル化プローブを用いてドットを検出することができた。まず、クリック反応の反応時間を６時間あるいは１６時間として調製した場合、４０％アルキン化ＲＮＡと１００×アジド化ＡＰの組み合わせにおいて１００ｐｇ／μＬのドットまで検出することができた。図１５より、クリック反応の時間を延ばすとより高分子量の産物が多く得られているが、検出限界に差は見られず、シグナル強度がやや向上した。同条件下における市販のＡｌｋｐｈｏｓＤｉｒｅｃｔの検出限界が１ｎｇ／μＬ程度であった（図１６参照）ので、市販プローブと同等以上の性能を有していると言える。一方、４０％と８０％アルキン化ＲＮＡとの比較においては、８０％アルキン化ＲＮＡを用いた方が検出感度が向上し、４０％アルキン化ＲＮＡと１００×アジド化ＡＰの組み合わせにおいて１０ｐｇ／μＬのドットまで検出することができた。マルチラベル化核酸プローブにおける標識部分の導入量を調整することにより、検出感度とアンチセンス（ＡＳ）鎖に対する非特異的なシグナルの生成とのバランスをとることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】本発明の実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体の構造の一例（アルキン化ＵＴＰ）を示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブの調製方法の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブの調製方法の他の例を示す概略図である。
【図４】本発明の実施形態に係るマルチラベル化核酸プローブの調製方法の他の例を示す概略図である。
【図５】本発明の実施形態に係るヌクレオシド三リン酸誘導体の一例であるアルキン化ＵＴＰの合成方法の一例を示す図である。
【図６】本発明の実施形態に係る標的核酸の検出方法の一例を示す概略図である。
【図７】本発明の実施形態に係る標的核酸の検出方法の他の例を示す概略図である。
【図８】本発明の実施例１において、アルキン化ＵＴＰを合成した後、逆相ＨＰＬＣを行った際の結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例１において合成したアルキン化ＵＴＰのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１０】アルキン化ＵＴＰの割合を変化させてアルキン化ＲＮＡを調製した場合の、分子量変化について、マイクロチップ型電気泳動装置にて電気泳動を行った結果を示す図である。
【図１１】各アジド化ＡＰの酵素活性の測定結果を示す図である。
【図１２】各アジド化ＡＰとアルキンＢＳＡとのクリック反応後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図１３】各アジド化ＡＰのＴＮＢＳ法による測定結果を示す図である。
【図１４】アルキン化ＲＮＡとアジド化ＡＰとをＨｕｉｓｇｅｎ環化反応により結合させた反応物のアガロース電気泳動の結果を示す図である。
【図１５】調製したマルチラベル化核酸プローブによるＩＳＨの検出感度の評価結果を示す図である。
【図１６】Ａｌｋｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔキットにより調製された酵素ラベル化核酸プローブによるＩＳＨの検出感度の評価結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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