【手続補正書】
【提出日】令和3年4月12日(2021.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬に使用するための配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長にわたって少なくとも５９％の配列類似性を有する光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項２】
前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長に対し少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは９９％の配列類似性を有する； 及び／又は
前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長に対し少なくとも３８％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも４８％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項３】
光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１の位置Ｅ４、Ｈ４８、Ｓ５５、Ｗ７３、Ｄ７６、Ｓ８０、Ａ８７、Ｐ２０９、Ｃ２１２、Ｋ２１４、及びＤ２２０で突然変異していない；及び／又は光駆動内向きプロトンポンプが、Ｎ末端で切断されていない、請求項１又は２に記載の光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項４】
前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）、２（ＨｒｖＸｅＲ１）、９（ＨｒｖＸｅＲ）、１０（ＡｌｋＸｅＲ）、１１（ＡｌｋＸｅＲ１）、１２（ＡｌｋＸｅＲ２）、１３（ＡｌｋＸｅＲ３）、１４（ＡｌｋＸｅＲ４）、及び１５（ＡｌｋＸｅＲ５）を含み、好ましくは、からなり；特に、前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項５】
（ｉ）前記光駆動内向きプロトンポンプが、ｐＨ６〜ｐＨ８の間； 好ましくはｐＨ５〜ｐＨ９の間で活動的である； 及び／又は
（ｉｉ）前記光駆動内向きプロトンポンプの最大吸収が、５６０ｎｍ〜５８０ｎｍの間である、
（ｉｉｉ）２０℃、ｐＨ７．５、５３２ｎｍの波長で５ｎｓの持続時間のパルス及び３ｍＪ／パルスのエネルギーの供給で、１００：２：３の比のＤＭＰＣ：ＭＳＰ１Ｅ３：光駆動内向きプロトンポンプのモル比を示すプロテオナノディスクで測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプの光サイクルが、５０ｍｓ未満、好ましくは４５ｍｓ未満、より好ましくは４０ｍｓ未満、より好ましくは３５ｍｓ未満、さらにより好ましくは、２７ｍｓ等の３０ｍｓ未満である； 及び／又は
（ｉｖ）ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭ グルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプが、２５０ｓ−１超、好ましくは３００ｓ−１超、より好ましくは３７０ｓ−１超、より好ましくは３８０ｓ−１超、より好ましくは３９０ｓ−１超、例えば４００ｓ−１の代謝回転速度を有する； 及び／又は
（ｖ）ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプが、４０Ｈｚを超える周波数、好ましくは５０Ｈｚを超える周波数、より好ましくは６０Ｈｚを超える周波数、さらにより好ましくは７０Ｈｚを超える周波数、最も好ましくは、８０Ｈｚを超える周波数で活動電位を誘発することができる； 及び／又は
（ｖｉ）ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプが、３ｍｓのλ＝５３２ｎｍのパルス幅及び２３ｍＷ／ｍｍ２の強度で誘発され得る、
請求項１〜４の何れか１項に記載の光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトであって、前記核酸配列が、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている、核酸コンストラクト。
【請求項７】
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプをコードする核酸配列又は請求項６に記載の核酸コンストラクトを含む発現ベクターであって、前記核酸配列が、ヒト細胞での発現のために最適化されており； 特に、前記ベクターは、ウイルスベクターであり； 及び／又は前記前記光駆動内向きプロトンポンプのコード配列が、神経細胞特異的なヒトプロモーター、好ましくは、ヒトシナプシンプロモーターの制御下にある、発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプを発現する哺乳動物細胞であって、ただし、前記哺乳動物細胞が、ヒト胚細胞又はヒトの生殖細胞系列の遺伝的同一性を改変することができる細胞ではない、哺乳動物細胞。
【請求項９】
請求項６に記載の核酸コンストラクト又は請求項７に記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、
（ａ）海馬細胞、視細胞、杆体細胞； 網膜錐体細胞； 網膜神経節細胞； 双極ニューロン； 神経節細胞； 疑似単極ニューロン； 多極ニューロン； 錐体ニューロン； プルキンエ細胞； 又は顆粒細胞； 又は
（ｂ）神経芽腫細胞腫細胞、特に、ＮＧ１０８−１５； ＨＥＫ２９３細胞； ＣＯＳ細胞； ＢＨＫ細胞； ＣＨＯ細胞； 骨髄腫細胞； 又はＭＤＣＫ細胞、
である請求項９に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプを含むリポソーム。
【請求項１２】
医薬に使用するための請求項６に記載の核酸コンストラクト、請求項７に記載の発現ベクター、請求項８〜１０の何れか１項に記載の哺乳動物細胞、又は請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
聴力の回復、視力の回復における使用、又はアルカローシス、神経損傷、脳損傷、脳卒中、又はパーキンソン病及びアルツハイマー病等の変性神経障害の治療又は軽減における使用のための、請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプ、請求項６に記載の核酸コンストラクト、請求項７に記載の発現ベクター、請求項８〜１０の何れか１項に記載の哺乳動物細胞、又は請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１４】
請求項８〜１０の何れか１項に記載の細胞を含む、非ヒト哺乳動物であって、好ましくは、前記細胞が、内因性の細胞である； ただし、人間や動物に対して何れかの動物の苦しみを上回る利益を実質的にもたらさない可能性がある動物は、除外される、非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】
（ｉ）電気的に興奮可能な細胞の光刺激のために、
（ｉｉ）プロトン濃度勾配に対して膜上でプロトンを輸送するために、
（ｉｉｉ）細胞、細胞画分、小胞、又はリポソームの内部を酸性化又はアルカリ化するために、又は
（ｉｖ）又は光遺伝学ツールとしての、
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプの非治療的、又はｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。