【手続補正書】
【提出日】令和3年5月19日(2021.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意選択で、第１、第２、第３または第４の部分のうち一部または全ての間にあるペプチドリンカーを伴って、（ｉ）デアミナーゼ酵素またはその活性部分を含む第１の部分、（ｉｉ）ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであり、ガイドＲＮＡと相互作用できるが、ゲノム編集または塩基事象を強化するのに十分に標的ＤＮＡに結合することもＲループを形成することもないＣａｓ９タンパク質を含む第２の部分、（ｉｉｉ）ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥから選択されるＤＮＡ結合ドメインを含む第３の部分、ならびに任意選択で、（ｉｖ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を含む第４の部分を含むモノマー性融合タンパク質であって、前記ドメイン（ｉ）〜（ｉｖ）が、いずれの順番でもよい、モノマー性融合タンパク質。
【請求項２】
任意選択で、第１、第２または第３の部分のうち一部または全ての間にあるペプチドリンカーを伴って、（ｉ）デアミナーゼ酵素またはその活性部分を含む第１の部分、（ｉｉ）ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであり、ガイドＲＮＡと相互作用できるが、ゲノム編集または塩基事象を強化するのに十分に標的ＤＮＡに結合することもＲループを形成することもないＣａｓ９タンパク質、例えば、ＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９オルソログまたは同様に欠損性の種を含む第２の部分、ならびに（ｉｉｉ）ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥから選択されるＤＮＡ結合ドメインを含む第３の部分を含む融合タンパク質であって、前記ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、いずれの順番でもよい、融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１の部分が、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様１（ＡＰＯＢＥＣ１）、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含む；および／または前記第２の部分が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、もしくはＤ９８６およびＨ８４０もしくはＮ８６３における変異を有するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ、またはＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９オルソログを含み、および任意選択で、前記変異が、Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎの一方もしくは両方、またはＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙであり；および／または前記第２の部分が、ＰｌＣａｓ９、ＣｌＣａｓ９もしくはＮｃＣａｓ９；またはＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩＤ）に対する変異を有するＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９もしくはＣｊＣａｓ９を含み、および任意選択で、前記ＰＩＤに対する前記変異が、表２に示され；および／または前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合アレイを含む、請求項１および２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１から３に記載の精製された融合タンパク質を含む、または請求項２に記載の精製された融合タンパク質およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を含む組成物であって、任意選択で、前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用するガイドＲＮＡをさらに含み、および任意選択で、１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、組成物。
【請求項５】
二部シトシン塩基エディターシステムにおいて有用な融合タンパク質であって、
（ｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、デアミナーゼ酵素もしくはその活性部分に融合された非Ｒループ形成性のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン、好ましくは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）もしくはジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）を含む、第１の融合タンパク質、または
（ｉｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）に融合されたＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質であって、ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであるが、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと相互作用できるＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質を含む、第２の融合タンパク質
を含む融合タンパク質。
【請求項６】
前記第１の融合タンパク質が、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様１（ＡＰＯＢＥＣ１）、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含み；および／または前記第２の融合タンパク質が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、もしくはＤ９８６およびＨ８４０もしくはＮ８６３における変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼもしくは不活性なヌクレアーゼ、または不活性なＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）タンパク質を含み、任意選択で、前記変異が、Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎの一方もしくは両方、またはＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙであり；および／または前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合アレイを含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項５から６に記載の精製された融合タンパク質を含み；任意選択で、前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用するガイドＲＮＡをさらに含み；および／または１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、組成物。
【請求項８】
請求項１から３および５から６に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項１から３および５から６に記載の融合タンパク質を発現する単離された宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１から３および５から６に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む組成物。
【請求項１２】
核酸中の１つまたは複数の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法であって、前記核酸を、請求項１から３または５から６に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むまたはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させるステップを含み；任意選択で、前記核酸が、細胞中にある、方法。
【請求項１３】
細胞中の核酸の標的化された脱アミノ化の方法であって、請求項１から３または５から６に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むもしくはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、前記細胞において発現させるステップ、または前記細胞をそれらと接触させるステップを含み；任意選択で、前記融合タンパク質が、ＲＮＰ、または前記融合タンパク質をコードするｍＲＮＡまたはプラスミドとして送達される、方法。
【請求項１４】
核酸中の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法であって、前記核酸を、請求項２に記載の融合タンパク質、ＵＧＩタンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むまたはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させるステップを含み；任意選択で、前記核酸が細胞中にある、方法。
【請求項１５】
細胞中の核酸の標的化された脱アミノ化の方法であって、請求項２に記載の融合タンパク質、ＵＧＩタンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むもしくはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、前記細胞において発現させるステップ、または前記細胞をそれらと接触させるステップを含み；任意選択で、前記融合タンパク質が、ＲＮＰとして、または前記融合タンパク質をコードするｍＲＮＡもしくはプラスミドとして送達される、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されてきたが、上述の説明は、本発明の範囲を限定するのではなく例示する意図であり、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定されることを理解すべきである。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．二部シトシン塩基エディターシステムにおいて有用な融合タンパク質であって、
（ｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、デアミナーゼ酵素もしくはその活性部分に融合された非Ｒループ形成性のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン、好ましくは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）もしくはジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）を含む、第１の融合タンパク質、または
（ｉｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）に融合されたＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質であって、ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであるが、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと相互作用できるＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質を含む、第２の融合タンパク質
を含む融合タンパク質。
２．前記第１の融合タンパク質が、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様１（ＡＰＯＢＥＣ１）、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含む、上記１に記載の融合タンパク質。
３．前記第２の融合タンパク質が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、もしくはＤ９８６およびＨ８４０もしくはＮ８６３における変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼもしくは不活性なヌクレアーゼ、または不活性なＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）タンパク質を含む、上記１に記載の融合タンパク質。
４．前記変異が、Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎの一方もしくは両方、またはＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙである、上記３に記載の融合タンパク質。
５．前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合アレイを含む、上記１に記載の融合タンパク質。
６．上記１から５に記載の精製された融合タンパク質を含む組成物。
７．前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用するガイドＲＮＡをさらに含む、上記６に記載の組成物。
８．１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、上記６に記載の組成物。
９．上記１から５に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
１０．上記９に記載の核酸を含むベクター。
１１．上記１から５に記載の融合タンパク質を発現する単離された宿主細胞。
１２．上記１から５に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む組成物。
１３．核酸中の１つまたは複数の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法であって、前記核酸を、上記１から５に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むまたはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させるステップを含む方法。
１４．前記核酸が、細胞、好ましくは真核生物細胞中にある、上記１３に記載の方法。
１５．細胞中の核酸の標的化された脱アミノ化の方法であって、上記１から５に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むもしくはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、前記細胞において発現させるステップ、または前記細胞をそれらと接触させるステップを含む方法。
１６．前記融合タンパク質が、ＲＮＰ、ｍＲＮＡまたはプラスミドとして送達される、上記１５に記載の方法。
１７．任意選択で、第１、第２、第３または第４の部分のうち一部または全ての間にあるペプチドリンカーを伴って、（ｉ）デアミナーゼ酵素またはその活性部分を含む第１の部分、（ｉｉ）ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであり、ガイドＲＮＡと相互作用できるが、ゲノム編集または塩基事象を強化するのに十分に標的ＤＮＡに結合することもＲループを形成することもないＣａｓ９タンパク質を含む第２の部分、（ｉｉｉ）ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥから選択されるＤＮＡ結合ドメインを含む第３の部分、ならびに任意選択で、（ｉｖ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を含む第４の部分を含むモノマー性融合タンパク質であって、前記ドメイン（ｉ）〜（ｉｖ）が、いずれの順番でもよい、モノマー性融合タンパク質。
１８．任意選択で、第１、第２または第３の部分のうち一部または全ての間にあるペプチドリンカーを伴って、（ｉ）デアミナーゼ酵素またはその活性部分を含む第１の部分、（ｉｉ）ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであり、ガイドＲＮＡと相互作用できるが、ゲノム編集または塩基事象を強化するのに十分に標的ＤＮＡに結合することもＲループを形成することもないＣａｓ９タンパク質、例えば、ＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９オルソログまたは同様に欠損性の種を含む第２の部分、ならびに（ｉｉｉ）ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥから選択されるＤＮＡ結合ドメインを含む第３の部分を含む融合タンパク質であって、前記ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、いずれの順番でもよい、融合タンパク質。
１９．前記第１の部分が、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様１（ＡＰＯＢＥＣ１）、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含む、上記１７および１８に記載の融合タンパク質。
２０．前記第２の部分が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、もしくはＤ９８６およびＨ８４０もしくはＮ８６３における変異を有するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ、またはＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９オルソログを含む、上記１７または１８に記載の融合タンパク質。
２１．前記変異が、Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎの一方もしくは両方、またはＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙである、上記２０に記載の融合タンパク質。
２２．前記第２の部分が、ＰｌＣａｓ９、ＣｌＣａｓ９もしくはＮｃＣａｓ９；またはＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩＤ）に対する変異を有するＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９もしくはＣｊＣａｓ９を含む、上記１７または１８に記載の融合タンパク質。
２３．前記ＰＩＤに対する前記変異が、表２に示される、上記２２に記載の融合タンパク質。
２４．前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合アレイを含む、上記１７または１８に記載の融合タンパク質。
２５．上記１７から２４に記載の精製された融合タンパク質を含む組成物。
２６．上記１８に記載の精製された融合タンパク質、およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を含むタンパク質を含む組成物。
２７．前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用するガイドＲＮＡをさらに含む、上記２５または２６に記載の組成物。
２８．１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、上記２７に記載の組成物。
２９．上記１７から２４に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
３０．上記２９に記載の核酸を含むベクター。
３１．上記１７から２４に記載の融合タンパク質を発現する単離された宿主細胞。
３２．上記１７または１９から２４に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む組成物。
３３．核酸中の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法であって、前記核酸を、上記１７または１９から２４に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むまたはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させるステップを含む方法。
３４．前記核酸が細胞中にある、上記３３に記載の方法。
３５．細胞中の核酸の標的化された脱アミノ化の方法であって、上記１７もしくは１９から２４に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むもしくはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記細胞において発現させるステップ、または前記細胞をそれらと接触させるステップを含む方法。
３６．前記融合タンパク質が、ＲＮＰとして、または前記融合タンパク質をコードするｍＲＮＡもしくはプラスミドとして送達される、上記３５に記載の方法。
３７．核酸中の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法であって、前記核酸を、上記１８に記載の融合タンパク質、ＵＧＩタンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むまたはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させるステップを含む方法。
３８．前記核酸が細胞中にある、上記３７に記載の方法。
３９．細胞中の核酸の標的化された脱アミノ化の方法であって、上記１８に記載の融合タンパク質、ＵＧＩタンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むもしくはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、前記細胞において発現させるステップ、または前記細胞をそれらと接触させるステップを含む方法。
４０．前記融合タンパク質が、ＲＮＰとして、または前記融合タンパク質をコードするｍＲＮＡもしくはプラスミドとして送達される、上記３９に記載の方法。