【手続補正書】
【提出日】令和3年6月29日(2021.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-フェニルアラニン（Phe）およびL-Phe残基と特異的に結合する分子インプリントポリマー（MIP）の製造方法であって、該方法が、下記工程
a) 触媒および酸化剤の存在下で
- 2-メチルプロパ-2-エン酸（MAA）、
- 1,4-ビス(アクリロイル)ピペラジン（DAP）、および
- L-Pheまたはフェニルアラニンモチーフを露出するL-Phe誘導体からなる鋳型分子
を含む混合物を重合させて、架橋インプリントポリマーを得る工程、
b) 必要に応じて、続いて架橋インプリントポリマーを断片化して、第1断片化ポリマーを得て、粒子径が63μm未満のMIPを収集する工程、
c) 所望により、工程b)から得られたポリマー画分を洗浄および乾燥する工程、
d) 工程b)またはc)から得られたポリマー画分を断片化し、粒子径が150〜250 nmの範囲の第2断片化ポリマーを収集する工程、
e) Pheがクロマトグラフィーマトリックスにおけるアフィニティータグを構成するアフィニティークロマトグラフィーに、工程d)から得られた第2断片化ポリマーを供する工程、および
f) 工程e)においてPheに結合するMIPを回収する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程a)における重合混合物が、1.0〜4.0、例えば1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、および約4.0のモル比でMAAと鋳型分子を含有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
鋳型分子が、少なくとも1つのL-Phe残基を含有するペプチド形態のL-Phe誘導体、例えばジペプチドまたはトリペプチドであり、好ましくは
Gly-L-Phe、
Ala-L-Phe、
L-Asp-L-Phe-OMe、
L-Asp-L-Phe、
Gly-Gly-L-Phe、
Ala-Gly-L-Phe、
Gly-Ala-L-Phe、
L-Phe-Gly、
L-Phe-Ala、
L-Phe-L-Phe、
L-Phe-Ala-L-Phe、
L-Phe-Gly-L-Phe
からなる群より選択され、
特に、Gly-L-Pheである、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
工程a)における触媒が、テトラメチルエチレンジアミン、ジメチルピペラジンからなる群より選択され、好ましくはテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）である；および／または工程a)における酸化剤が、ペルオキソ二硫酸アンモニウム、ペルオキソ二硫酸カリウムおよびチオ硫酸ナトリウムからなる群より選択され、好ましくはペルオキソ二硫酸アンモニウム（APS）である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程b)における断片化が、すりつぶし、粉砕、爆発、ハンマー打ち、ボールミル、低温粉砕または衝突均質化を含む；および／または工程d)の断片化が、ボールミルまたはビーズミルで実施される；および／または工程b)において収集されるMIPが、25〜63μmの範囲の粒子径を有する；および／または工程b)が、63μmのカットオフを有する篩を通過できるMIPの収集を伴い、好ましくは、工程b)が、25μmのカットオフを有する篩上に保持されるMIPの収集をさらに伴う、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程c)における洗浄が、有機溶媒で変動pHにて実施される；および／またはMIPが、高圧下での洗浄中に工程c)のHPLCカラムに充填される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
工程d)におけるMIPの収集が、水性溶媒、例えば水中にMIPを懸濁させ、超音波浴中でインキュベートし、遠心分離し、150〜250 nmのMIPを含有する上清を単離することにより実施される；および／または工程d)が、残存鋳型分子からMIPを単離するための洗浄、例えば透析洗浄工程または超遠心分離での洗浄工程を伴う、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程e)におけるアフィニティークロマトグラフィーが、固定クロマトグラフィーマトリックスを用いる充填床クロマトグラフィーカラムで、かつ、MIPが緩衝水性溶媒中に懸濁されたところで実施される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程f)における回収が、クロマトグラフィーマトリックスからのMIPの溶離を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
L-チロシン（Tyr）と特異的に結合するMIPの製造方法であって、該方法が、少なくとも1つのフェニルアラニンモチーフを含むがTyr残基を含まない分子を、重合および架橋中に鋳型分子として用いて製造されたMIPの初期組成物から、L-チロシンと結合するMIPを回収することを含み、
MIPの初期組成物が少なくとも2画分に分離され、Phe含有捕捉プローブと結合するMIPを本質的に含まない画分から、Tyr結合MIPを回収し、
該方法が、下記工程
a) 触媒および酸化剤の存在下で
- 2-メチルプロパ-2-エン酸（MAA）、
- 1,4-ビス(アクリロイル)ピペラジン（DAP）、および
- 請求項1または3で定義される鋳型分子
を含む混合物を重合させて、架橋インプリントポリマーを得る工程、
b) 必要に応じて、続いて架橋インプリントポリマーを断片化して、第1断片化ポリマーを得て、粒子径が63μm未満のその画分を収集する工程、
c) 所望により、工程b)から得られたポリマー画分を洗浄および乾燥する工程、
d) 工程c)から得られたポリマー画分を断片化し、粒子径が150〜250 nmの範囲の第2断片化ポリマーを収集する工程、および
e) 工程d)から得られた第2断片化ポリマーをアフィニティークロマトグラフィーに供する工程であって、
e1) Tyrがクロマトグラフィーマトリックスにおけるアフィニティータグを構成するアフィニティークロマトグラフィーに供する工程、または
e2) Pheがクロマトグラフィーマトリックスにおけるアフィニティータグを構成するアフィニティークロマトグラフィーに供し、Pheに結合していないMIPを回収し、そして、Tyrがクロマトグラフィーマトリックスにおけるアフィニティータグを構成するアフィニティークロマトグラフィーに、Pheに結合していないMIPをさらに供する工程、および
f) 工程e)においてTyrに結合するMIPを回収する工程
を含む、方法。
【請求項１１】
L-フェニルアラニン（Phe）またはL-チロシン（Tyr）と特異的に結合する分子インプリントポリマー（MIP）であって、該MIPが、1,4-ジアクリロイルピペラジン（DAP）と架橋した重合メタクリル酸（MAA）を含んでなり、例えば、MIPが、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法により取得可能であるかまたは取得され、好ましくは、MIPのPheまたはTyrへの結合についてのKDが、10-7未満、例えば10-8未満、9x10-9未満、8x10-9未満、7x10-9未満、6x10-9未満、5x10-9未満、4x10-9未満、3x10-9未満および2x10-9未満であり、最も好ましくは、KDが、約10-9である、分子インプリントポリマー。
【請求項１２】
請求項11に記載の分子インプリントポリマーを含む組成物であって、医薬的に許容される担体および／または希釈液および／または添加剤を含み、経口投与に適用される、組成物。
【請求項１３】
1日当たりの有効量のL-フェニルアラニンと結合するMIPを送達するように、L-フェニルアラニンと結合するMIPまたは該MIPを含む組成物を処置を必要とするヒトに投与することを含む、フェニルケトン尿症の処置のための請求項11に記載のMIPまたは請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
1) L-フェニルアラニンと結合するMIPまたは該MLPを含む組成物を、1日当たりの有効量のL-フェニルアラニンと結合するMIPを送達するように；および／または
2) L-チロシンと結合するMIPまたは該MLPを含む組成物を、1日当たりの有効量のL-チロシンと結合するMIPを送達するように
処置を必要とするヒトに投与することを含む、チロシン血症および／またはアルカプトン尿症の処置のための請求項11に記載のMIPまたは請求項12に記載の組成物。
【請求項１５】
処置が、アルカプトン尿症またはチロシン血症I型のニチシノン処置に対する補助療法として実施される；および／または
1日当たりの有効量が、1〜35 g/ 70 kg体重である；および／または
食事当たりの有効量が、最大でまたは約34 g/ 70 kg、例えば最大でまたは約33、最大でまたは約32、最大でまたは約31、最大でまたは約30、最大でまたは約29、最大でまたは約28、最大でまたは約27、最大でまたは約26、最大でまたは約25、最大でまたは約24、最大でまたは約23、最大でまたは約22、最大でまたは約21、最大でまたは約20、最大でまたは約19、最大でまたは約18、最大でまたは約17、最大でまたは約16、最大でまたは約15、最大でまたは約14、最大でまたは約13、最大でまたは約12、最大でまたは約11、最大でまたは約10、最大でまたは約9、最大でまたは約8、最大でまたは約7、最大でまたは約6、最大でまたは約5、最大でまたは約4、最大でまたは約3、および最大でまたは約2 g/ 70 kgである；および／または
1日当たりの有効量が、20〜45 g/ 70 kg、例えば25〜40 g/ 70 kg、および30〜35 g/ kgである；および／または
1日当たりの有効量が、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75、約76、約77、約78、約79、約80、約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98、約99、約100、約101、約102、約103、約104、および約105 g/ 70 kg体重である、請求項14に記載のMIPまたは組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
逆相エマルション重合からのポリマー粒子の後処理および試験
最初に0.2 mm ZrO2ビーズ、続いて0.1 mm ZrO2ビーズの2工程で、セラミック（ZrO2）マイクロチャンバーを備えたNetzsch Labstar（登録商標）を用いて、洗浄したポリマービーズを湿式ビーズミルにより粉砕した。液相は、NaOHでpH 10.0に調整した50％エタノール水溶液であった。最後の実施後、動的光散乱（Malvern Nanosizer（登録商標））により決定した平均粒子径は170 nmであった。TFFを用いてナノ粒子を洗浄し、L-フェニルアラニンと結合したアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用して、フェニルアラニン結合特性を試験した。逆相エマルション重合からのナノ粒子は、アフィニティークロマトグラフィーでのバルク重合により合成したナノ粒子と同様に行動した。
本発明は、以下の態様および実施態様を含む。
[1]
L-フェニルアラニン（Phe）およびL-Phe残基と特異的に結合する分子インプリントポリマー（MIP）の製造方法であって、該方法が、下記工程
a) 触媒および酸化剤の存在下で
- 2-メチルプロパ-2-エン酸（MAA）、
- 1,4-ビス(アクリロイル)ピペラジン（DAP）、および
- L-Pheまたはフェニルアラニンモチーフを露出するL-Phe誘導体からなる鋳型分子
を含む混合物を重合させて、架橋インプリントポリマーを得る工程、
b) 必要に応じて、続いて架橋インプリントポリマーを断片化して、第1断片化ポリマーを得て、粒子径が63μm未満のMIPを収集する工程、
c) 所望により、工程b)から得られたポリマー画分を洗浄および乾燥する工程、
d) 工程b)またはc)から得られたポリマー画分を断片化し、粒子径が150〜250 nmの範囲の第2断片化ポリマーを収集する工程、
e) Pheがクロマトグラフィーマトリックスにおけるアフィニティータグを構成するアフィニティークロマトグラフィーに、工程d)から得られた第2断片化ポリマーを供する工程、および
f) 工程e)においてPheに結合するMIPを回収する工程
を含む方法。
[2]
工程a)における重合混合物が、5〜30のモル比でMAAとDAPを含有する、[1]に記載の方法。
[3]
工程a)における重合混合物が、1.0〜4.0、例えば1.1、約1.2、約1.3、約1.4、約1.5、約1.6、約1.7、約1.8、約1.9、約2.0、約2.1、約2.2、約2.3、約2.4、約2.5、約2.6、約2.7、約2.8、約2.9、約3.0、約3.1、約3.2、約3.3、約3.4、約3.5、約3.6、約3.7、約3.8、約3.9、および約4.0のモル比でMAAと鋳型分子を含有する、[1]または[2]に記載の方法。
[4]
鋳型分子が、少なくとも1つのL-Phe残基を含有するペプチド形態のL-Phe誘導体である、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]
鋳型分子が、ジペプチドまたはトリペプチドである、[4]に記載の方法。
[6]
鋳型分子が、
Gly-L-Phe、
Ala-L-Phe、
L-Asp-L-Phe-OMe、
L-Asp-L-Phe、
Gly-Gly-L-Phe、
Ala-Gly-L-Phe、
Gly-Ala-L-Phe、
L-Phe-Gly、
L-Phe-Ala、
L-Phe-L-Phe、
L-Phe-Ala-L-Phe、
L-Phe-Gly-L-Phe
からなる群より選択される、[5]に記載の方法。
[7]
鋳型分子が、Gly-L-Pheである、[6]に記載の方法。
[8]
工程a)における触媒が、テトラメチルエチレンジアミン、ジメチルピペラジンからなる群より選択され、好ましくはテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）である、[1]〜[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9]
工程a)における酸化剤が、ペルオキソ二硫酸アンモニウム、ペルオキソ二硫酸カリウムおよびチオ硫酸ナトリウムからなる群より選択され、好ましくはペルオキソ二硫酸アンモニウム（APS）である、[1]〜[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]
工程b)における断片化が、すりつぶし、粉砕、爆発、ハンマー打ち、ボールミル、低温粉砕または衝突均質化を含む、[1]〜[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11]
工程b)において収集されるMIPが、25〜63μmの範囲の粒子径を有する、[1]〜[10]のいずれか一項に記載の方法。
[12]
工程b)が、63μmのカットオフを有する篩を通過できるMIPの収集を伴う、[1]〜[11]のいずれか一項に記載の方法。
[13]
工程b)が、25μmのカットオフを有する篩上に保持されるMIPの収集をさらに伴う、[12]に記載の方法。
[14]
洗浄が、有機溶媒で変動pHにて実施される、[1]〜[13]のいずれか一項に記載の方法。
[15]
MIPが、高圧下での洗浄中に工程c)のHPLCカラムに充填される、[1]〜[14]のいずれか一項に記載の方法。
[16]
工程d)の断片化が、ボールミルまたはビーズミルで実施される、[1]〜[15]のいずれか一項に記載の方法。
[17]
工程d)におけるMIPの収集が、水性溶媒、例えば水中にMIPを懸濁させ、超音波浴中でインキュベートし、遠心分離し、150〜250 nmのMIPを含有する上清を単離することにより実施される、[1]〜[16]のいずれか一項に記載の方法。
[18]
工程d)が、残存鋳型分子からMIPを単離するための洗浄、例えば透析洗浄工程または超遠心分離での洗浄工程を伴う、[1]〜[17]のいずれか一項に記載の方法。
[19]
工程e)におけるアフィニティークロマトグラフィーが、固定クロマトグラフィーマトリックスを用いる充填床クロマトグラフィーカラムで、かつ、MIPが緩衝水性溶媒中に懸濁されたところで実施される、[1]〜[18]のいずれか一項に記載の方法。
[20]
工程f)における回収が、クロマトグラフィーマトリックスからのMIPの溶離を含む、[1]〜[19]のいずれか一項に記載の方法。
[21]
L-フェニルアラニン（Phe）と特異的に結合する分子インプリントポリマー（MIP）であって、1,4-ジアクリロイルピペラジン（DAP）と架橋した重合メタクリル酸（MAA）を含んでなる、MIP。
[22]
MAA残基とDAP残基のモル比が、5〜30である、[21]に記載のMIP。
[23]
[1]〜[20]のいずれか一項に記載の方法により取得可能であるかまたは取得される、[21]〜[22]のいずれか一項に記載のMIP。
[24]
L-Pheへの結合についてのKDが、10-7未満、例えば10-8未満、9x10-9未満、8x10-9未満、7x10-9未満、6x10-9未満、5x10-9未満、4x10-9未満、3x10-9未満および2x10-9未満である、[21]〜[23]のいずれか一項に記載の分子インプリントポリマー。
[25]
KDが、約10-9である、[24]に記載の分子インプリントポリマー。
[26]
[21]〜[24]いずれか一項に記載の分子インプリントポリマーを含む組成物であって、医薬的に許容される担体および／または希釈液および／または添加剤を含み、経口投与に適用される、組成物。
[27]
L-チロシン（Tyr）と特異的に結合するMIPの製造方法であって、少なくとも1つのフェニルアラニンモチーフを含むがTyr残基を含まない分子を、重合および架橋中に鋳型分子として用いて製造されたMIPの初期組成物から、L-チロシンと結合するMIPを回収することを含む、方法。
[28]
鋳型分子が、[1]および[4]〜[7]のいずれか一項に定義されるとおりである、[27]に記載の方法。
[29]
MIPの初期組成物が少なくとも2画分に分離されること、およびPhe含有捕捉プローブと結合するMIPを本質的に含まない画分から、Tyr結合MIPを回収することを含む、[27]または[28]に記載の方法。
[30]
下記工程
a) 触媒および酸化剤の存在下で
- 2-メチルプロパ-2-エン酸（MAA）、
- 1,4-ビス(アクリロイル)ピペラジン（DAP）、および
- [1]および[4]〜[7]のいずれか一項で定義される鋳型分子
を含む混合物を重合させて、架橋インプリントポリマーを得る工程、
b) 必要に応じて、続いて架橋インプリントポリマーを断片化して、第1断片化ポリマーを得て、粒子径が63μm未満のその画分を収集する工程、
c) 所望により、工程b)から得られたポリマー画分を洗浄および乾燥する工程、
d) 工程c)から得られたポリマー画分を断片化し、粒子径が150〜250 nmの範囲の第2断片化ポリマーを収集する工程、および
e) 工程d)から得られた第2断片化ポリマーをアフィニティークロマトグラフィーに供する工程であって、
e1) Tyrがクロマトグラフィーマトリックスにおけるアフィニティータグを構成するアフィニティークロマトグラフィーに供する工程、または
e2) Pheがクロマトグラフィーマトリックスにおけるアフィニティータグを構成するアフィニティークロマトグラフィーに供し、Pheに結合していないMIPを回収し、そして、Tyrがクロマトグラフィーマトリックスにおけるアフィニティータグを構成するアフィニティークロマトグラフィーに、Pheに結合していないMIPをさらに供する工程、および
f) 工程e)においてTyrに結合するMIPを回収する工程
を含む、[27]〜[29]のいずれか一項に記載の方法。
[31]
L-チロシン（Tyr）と特異的に結合する分子インプリントポリマー（MIP）であって、1,4-ジアクリロイルピペラジン（DAP）と架橋した重合メタクリル酸（MAA）を含んでなる、MIP。
[32]
MAA残基とDAP残基のモル比が、5〜30である、[31]に記載のMIP。
[33]
[27]〜[30]のいずれか一項に記載の方法により取得可能であるかまたは取得される、[31]〜[32]のいずれか一項に記載のMIP。
[34]
Tyrへの結合についてのKDが、10-7未満、例えば10-8未満、9x10-9未満、8x10-9未満、7x10-9未満、6x10-9未満、5x10-9未満、4x10-9未満、3x10-9未満および2x10-9未満である、[31]〜[33]のいずれか一項に記載の分子インプリントポリマー。
[35]
KDが、約10-9である、[34]に記載の分子インプリントポリマー。
[36]
[31]〜[34]のいずれか一項に記載の分子インプリントポリマーを含む組成物であって、医薬的に許容される担体および／または希釈液および／または添加剤を含み、経口投与に適用される、組成物。
[37]
処置を必要とするヒトにおけるフェニルケトン尿症の処置方法であって、1日当たりの有効量の[21]〜[24]のいずれか一項に記載のMIPを送達するように、[21]〜[24]のいずれか一項に記載のMIPまたは[26]に記載の組成物を処置を必要とするヒトに投与することを含む、処置方法。
[38]
チロシン血症および／またはアルカプトン尿症の処置方法であって、
1) フェニルアラニンと結合するMIP、好ましくは[21]〜[24]のいずれか一項に記載のMIPまたは[26]に記載の組成物を、1日当たりの有効量の[21]〜[24]のいずれか一項に記載のMIPを送達するように；および／または
2) [31]〜[34]のいずれか一項に記載のチロシンと結合するMIPまたは[36]に記載の組成物を、1日当たりの有効量の[31]〜[34]のいずれか一項に記載のMIPを送達するように
処置を必要とするヒトに投与することを含む、処置方法。
[39]
処置が、アルカプトン尿症またはチロシン血症I型のニチシノン処置に対する補助療法として実施される、[38]に記載の方法。
[40]
1日当たりの有効量が、1〜35 g/ 70 kg体重である、[37]〜[39]のいずれか一項に記載の方法。
[41]
食事当たりの有効量が、最大でまたは約34 g/ 70 kg、例えば最大でまたは約33、最大でまたは約32、最大でまたは約31、最大でまたは約30、最大でまたは約29、最大でまたは約28、最大でまたは約27、最大でまたは約26、最大でまたは約25、最大でまたは約24、最大でまたは約23、最大でまたは約22、最大でまたは約21、最大でまたは約20、最大でまたは約19、最大でまたは約18、最大でまたは約17、最大でまたは約16、最大でまたは約15、最大でまたは約14、最大でまたは約13、最大でまたは約12、最大でまたは約11、最大でまたは約10、最大でまたは約9、最大でまたは約8、最大でまたは約7、最大でまたは約6、最大でまたは約5、最大でまたは約4、最大でまたは約3、最大でまたは約3、および最大でまたは約2 g/ 70 kgである、[40]に記載の方法。
[42]
1日当たりの有効量が、20〜45 g/ 70 kg、例えば25〜40 g/ 70 kg、および30〜35 g/ kgである、[40]に記載の方法。
[43]
1日当たりの有効量が、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約51、約52、約53、約54、約55、約56、約57、約58、約59、約60、約61、約62、約63、約64、約65、約66、約67、約68、約69、約70、約71、約72、約73、約74、約75、約76、約77、約78、約79、約80、約81、約82、約83、約84、約85、約86、約87、約88、約89、約90、約91、約92、約93、約94、約95、約96、約97、約98、約99、約100、約101、約102、約103、約104、および約105 g/ 70 kg体重である、[40]に記載の方法。