(57)【要約】【課題】感度を向上させたセンサを提供する。【解決手段】センサは、シリコンからなる表面を有する基材と、前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる複数の繊維状突起物と、前記繊維状突起物上にそれぞれ形成された複数の機能性分子受容体もしくは反応基と、を備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリコンからなる表面を有する基材と、
前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる複数の繊維状突起物と、
前記繊維状突起物上にそれぞれ形成された複数の機能性分子と、
を備えたセンサ。
【請求項２】
前記繊維状突起物の長さは、１〜２００μｍの範囲である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項３】
前記繊維状突起物の間隔は、０．０１〜１０μｍの範囲である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項４】
前記繊維状突起物の太さは、０．０１〜１０μｍの範囲である、請求項１に記載のセンサ。
【請求項５】
前記繊維状突起物は、互いに絡みあうように密集している、請求項１に記載のセンサ。
【請求項６】
前記繊維状突起物が形成されている領域面は、前記基材の露出面よりも高い親水性あるいは保水性を有する、請求項１に記載のセンサ。
【請求項７】
前記基材上には凹部が形成され、前記凹部の底面もしくは側壁面の少なくとも一方には、前記繊維状突起物が形成されている、請求項１に記載のセンサ。
【請求項８】
前記基材の前記シリコンからなる表面は、複数の領域に区分けされ、それぞれの前記領域毎に前記複数の繊維状突起物が形成されている、請求項１に記載のセンサ。
【請求項９】
基材のシリコンからなる表面の任意の領域に、有機ポリマーからなるシード層を形成するステップと、
前記基材を、酸素を含有する雰囲気下で加熱して、前記シード層が形成された領域に、それぞれ前記基材の表面と直接接合した二酸化珪素からなる複数の繊維状突起物を形成するステップと、
前記繊維状突起物と機能性分子とを結合させるステップと、
を含む、センサの製造方法。
【請求項１０】
前記繊維状突起物を形成するステップの後に、
前記繊維状突起物にそれぞれ保護基を結合させるステップと、
前記繊維状突起物から前記保護基を脱保護するステップと、
前記保護基が脱保護された前記繊維状突起物と前記機能性分子とを結合させるステップと、
をさらに含む、請求項９に記載のセンサの製造方法。
【請求項１１】
前記機能性分子は少なくとも第一のモノマーと第二のモノマーとが結合したポリマーであって、
前記繊維状突起物と前記機能性分子とを結合させるステップでは、
保護基が結合された前記第一のモノマーと、保護基が脱保護された前記繊維状突起物とを結合させるステップと、
前記第一のモノマーから、結合された保護基を脱保護するステップと、
前記保護基が脱保護された前記第一のモノマーと、前記保護基が結合された前記第二のモノマーとを結合させるステップと、
を含む、請求項１０に記載のセンサの製造方法。
【請求項１２】
シリコンからなる表面を有する基材と、
前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる繊維状突起物と、
を備え、
前記繊維状突起物上に複数の核酸鎖を固定し、前記核酸鎖の核酸配列を測定するシークエンサー。
【請求項１３】
前記核酸鎖は、前記繊維状突起物上で同一の配列を持つ複数の核酸鎖が同一領域に固定されている、請求項１２に記載のシークエンサー。
【請求項１４】
シリコンからなる表面を有する基材と、
前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる繊維状突起物と、
を備え、
前記繊維状突起物上に核酸鋳型を固定して、前記核酸鋳型を鋳型として核酸を増幅し、増幅された核酸鎖の配列を測定するシークエンサー。
【請求項１５】
シリコンからなる表面を有する基材と、
前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる繊維状突起物と、
を備え、
前記基材上には凹部が形成され、前記凹部の底面もしくは側壁面の少なくとも一方には、前記繊維状突起物が形成されている請求項１２又は１４に記載のシークエンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡセンサ等の各種センサおよびセンサの製造方法と、ＤＮＡなどの核酸配列を測定するシークエンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のセンサとして、例えば図２０に示すようなＤＮＡセンサがある。このＤＮＡセンサは、基板１と、この基板１上に固定された機能性分子、すなわちＤＮＡプローブ２とからなる。このＤＮＡプローブ２は、リガンド分子である相補的ＤＮＡ３と二本鎖を形成するものであり、このＤＮＡプローブ２に各種ＤＮＡ３を含んでいる可能性のある、血液、唾液、河川水、等の被験体材料を暴露した後、二本鎖形成の有無を検知することで、これらの被験体材料中に検知対象のＤＮＡ３が存在しているかどうかを検出出来る。
【０００３】
分析方法としては、例えば予め暴露する各種ＤＮＡ３に蛍光物質４を標識しておき、それぞれを前述のＤＮＡプローブ２と反応させた後、この反応領域の蛍光を測定することによって、ＤＮＡプローブ２と相補的ＤＮＡ３との二本鎖形成領域を検出する方法がある。
このようなＤＮＡセンサに類似する例は、下記の特許文献１、２に開示されている。
その他ＤＮＡなどの核酸配列（塩基配列）を測定するシークエンサーに関する例は、下記の特許文献３に開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平４‐５０５７６３号公報
【特許文献２】特開２００７‐２８５９２７号公報
【特許文献３】特表２００２‐５２５１２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来のセンサでは、センサの感度が低くなることがあった。その理由は、機能性分子の形成密度が低かったからである。すなわち、従来は所定領域に十分な量の機能性分子（ＤＮＡプローブ２）を固定するのが難しく、したがって機能性分子２とリガンド分子（ＤＮＡ３）との結合により発する信号も少なかった。その結果、センサが感知する信号も少なくなり、センサの感度が低下していた。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、感度を向上させたシークエンサーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係るセンサは、シリコンからなる表面を有する基材と、
前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる複数の繊維状突起物と、
前記繊維状突起物上にそれぞれ形成された複数の機能性分子と、
を備える。
【０００８】
さらに本発明に係るシークエンサーは、シリコンからなる表面を有する基材と、
前記基材のシリコンからなる表面に直接接合した、二酸化珪素からなる繊維状突起物と、を備え、
前記繊維状突起物上に複数の核酸鎖を固定し、前記核酸鎖の核酸配列を測定する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るセンサによれば、センサの感度を向上させることができる。その理由は、基材上に機能性分子を高密度に固定することができるからである。すなわち本発明は、上述の繊維状突起物により基材の表面積が増え、狭いスペースにも機能性分子を高密度に形成することができる。したがって、各機能性分子とリガンド分子との反応を十分得ることができ、大きな信号として検出することができる。その結果、センサの感度を向上させることができる。
【００１０】
さらに本発明に係るシークエンサーによれば、核酸配列の測定精度を高めることができる。その理由は、単位領域における核酸の密度を増大することができるからである。すなわち本発明は、基板上に複数の繊維状突起物を形成し、この繊維状突起物上で核酸を増幅させるため、支持体の表面積が増え、一領域における核酸の増幅量が多くなる。そしてその結果、核酸コロニー全体から検出できる信号が大きくなる。その結果、核酸配列の測定精度を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の実施の形態１におけるセンサの断面図
【図２】同センサの要部拡大断面図
【図３】同センサの繊維状突起物のＳＥＭ写真
【図４】同センサの製造方法を説明するための断面図
【図５】同断面図
【図６】同断面図
【図７】同断面図
【図８】同センサの製造方法を摸式的に説明するための断面図
【図９】同断面図
【図１０】同断面図
【図１１】同断面図
【図１２】同断面図
【図１３】（ａ）〜（ｃ）同センサの要部を模式的に示す断面図
【図１４】本発明の実施の形態１における繊維状突起物のＸ線分光分析結果を示す図
【図１５】本発明の実施の形態２におけるセンサの断面図
【図１６】本発明の実施の形態３におけるシークエンサーの断面図
【図１７】（ａ）〜（ｆ）同実施の形態３におけるシークエンサーを用いて核酸を増幅する工程を示す図
【図１８】（ａ）（ｂ）同実施の形態３におけるシークエンサーを用いて核酸配列を測定する工程を示す図
【図１９】本発明の実施の形態４におけるシークエンサーの断面図
【図２０】従来のＤＮＡセンサの断面図
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（実施の形態１）
実施の形態１では、本発明の一実施の形態としてＤＮＡセンサを例に挙げ説明する。
図１の断面図に示すように、ＤＮＡセンサはシリコンからなる基板５を基材としている。この基板５の表面は、複数の領域６〜８に区分けされており、これらの領域６〜８毎に、それぞれ一端が基板５に直接接合した二酸化珪素からなる複数の繊維状突起物９が形成されている。ここで、「直接接合」とは、基板５上に繊維状突起物９が直接形成され、基板５と繊維状突起物９を構成する原子または分子が直接結合している状態を指し、通常は分子間が共有結合をしている状態である。本実施の形態１では、基板５の表面の珪素原子と繊維状突起物９中の珪素原子とが、雰囲気中の酸素原子を介して共有結合している。またこれらの繊維状突起物９の表面には、シランカップリング剤が付着し、これによりマトリクス状のコーティング層（図示せず）が形成されている。そして本実施の形態１では、これらのコーティング層にリンカー分子（図示せず）が含まれており、このリンカー分子を土台に、図２に示すように、複数のＤＮＡプローブ１０が接合されている。
【００１３】
なお、本実施の形態１では、シリコン基板５上の領域６〜８毎に異なる機能性分子、すなわちＤＮＡプローブ１０を接合している。すなわち、ＤＮＡプローブ１０は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）のモノマーが種々の順番で配列されたポリマーであるが、本実施の形態１では、上述の領域６〜８毎に、この配列を変えたＤＮＡプローブ１０を形成した。
【００１４】
なお、本実施の形態１では、基板５としては、単結晶シリコンからなるシリコン基板５を用いたが、表面がシリコンで形成されていればよく、このシリコンは単結晶、多結晶、アモルファス等の状態であってもよい。また、例えば表面および裏面がシリコンで、両面の間に二酸化珪素層が形成された、いわゆるＳＯＩ基板を用いても良い。また本実施の形態の基板５は、厚み約４００μｍの基板５を用いた。基板５の厚みは１ｍｍ以下が適している。
【００１５】
さらに本実施の形態１では、繊維状突起物９の長さは全長で１〜５００μｍ、太さを０．０１μｍ〜１０μｍとし、複数の繊維状突起物９の間隔を０．０１〜１０μｍとした。
また、この繊維状突起物９は、図３に示すように、より表面積を大きくするため、細かくうねったりカールしたりするまで成長させたものであり、一本一本は縮れた形状であって、互いに絡み合った状態で密集している。さらに自由な方向へ枝分かれしているものが混在していてもよい。繊維状突起物９が互いに絡み合い、複数の枝分かれをしていることで、繊維状突起物９が強固に構成される。
また本実施の形態１の繊維状突起物９は、アモルファスの二酸化珪素からなり、これにより単結晶の二酸化珪素と比較して折れにくい構成となっている。なお、この繊維状突起物９が形成された領域をＸ線分光分析で測定すると、図１４に示すように、２θ／ｄｅｇｒｅｅ＝約４７°の領域にあるＳｉ(１１０)のピークを除き大きなピークはなく、繊維状突起物９はアモルファスの二酸化珪素からなると考えられる。
【００１６】
なお、本実施の形態１では、繊維状突起物９の表面とＤＮＡプローブ１０との結合をより容易にするため、繊維状突起物９の表面に、リンカー分子を含むシランカップリング剤を付着させているが、これらのシランカップリング剤およびリンカー分子は必須の構成ではない。
なお、シランカップリング剤は繊維状突起物９表面の結合性を向上させるものであり、ポリ−Ｌ−リシンなど、シランカップリング剤以外の組成からなるものを用いてもよい。
またリンカー分子は、ＤＮＡプローブ１０の土台となるものであり、例えばアリルアセチレン、エチルグリコールオリゴマー、ジアミン、アミノ酸等やこれらの混合物が挙げられる。なお、上述のシランカップリング剤自体がリンカー分子となる場合もある。
【００１７】
次に、本実施の形態１のＤＮＡセンサの製造方法を説明する。
（ａ）はじめに、図４に示すように基板５を領域に区分けし、これらの領域の境界部分を二酸化珪素やフォトレジストなどの樹脂からなる保護膜１１で覆う。なお、図４〜７では図１に示す領域６〜８のいずれか一つのみ示している。
（ｂ）次に、ＣＦ４、ＣＨＦ３、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８、の少なくともいずれか一つのガスをプラズマ中で分解し、シリコン基板５表面に導入すると、図５に示すように、基板５表面にシード層１２が形成される。
このシード層１２は、Ｃ、Ｆ元素またはＣ、Ｆ、Ｈ元素を含んだ有機ポリマーからなる層であり、プラズマＣＶＤ法を用いて、前述のＣＦ４、ＣＨＦ３、Ｃ２Ｆ６、Ｃ３Ｆ８、Ｃ４Ｆ８等のフッ化炭素系のガスをプラズマ中で分解することによって形成できる。
なお、上記ガスをプラズマ中で分解するにはＩＣＰ（Inductive Coupled Plasma誘導結合プラズマ）を用いるとガスの分解度が高くなり、シード層１２の均一な形成が行われやすい。
なお、シード層１２によって後の工程で形成される繊維状突起物９を均一に形成するには、シリコン基板５表面は純粋なシリコンからなることが望ましいが、極薄い自然酸化膜が形成された状態でもよい。
【００１８】
（ｃ）次に、図６に示すように、保護膜１１を、薬剤を用いた化学的処理によって除去する。なお、本実施の形態１のように、プラズマＣＶＤ法で形成したシード層１２は比較的耐薬剤性が強いため、保護膜１１のみを選択的に除去することができる。
（ｄ）その後、基板５を、低酸素雰囲気下にて、１０００〜１１５０℃で焼成すると、図７に示すように、基板５の表面（図５のシード層１２が形成された領域）に、二酸化珪素からなる繊維状突起物９が形成される。この方法によれば、この繊維状突起物９は、基板５のシリコン表面と直接接合した状態となり、耐熱性に優れるとともに、剥がれにくくなる。またこの繊維状突起物９は、基板５がシード層１２を核に成長するものであるため、他の物質が混在しにくく、不純物の少ない組成となる。
【００１９】
なお、この焼成工程では、シード層１２が形成されていないシリコン基板５表面には、繊維状突起物９は形成されない。
ここでこの焼成工程では、Ｃ、ＦまたはＣ、Ｆ、Ｈの各原子からなるシード層１２は焼失していると考えられ、親水性を阻害する要因とはならない。
なお、繊維状突起物９は、金属触媒を用いて形成することも可能である。その場合は、はじめに基板５表面に、蒸着やスパッタ等によって、金属触媒層を形成する。触媒として使用する金属としては、Ａｕ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ等が望ましく、金属触媒層の厚さとしては、数ｎｍ程度である。
次に、金属触媒層を形成した上記基板５を、低酸素雰囲気下にて、１０００〜１１５０℃で焼成すると、基板５の表面に、二酸化珪素からなる繊維状突起物９が形成される。この方法においても、この繊維状突起物９は、基板５のシリコン表面と直接接合した状態となり、耐熱性に優れるとともに、剥がれにくくなる。またこの繊維状突起物９は、基板５がシード層１２を核に成長するものであるため、他の物質が混在しにくく、不純物の少ない組成となる。
なお、低酸素雰囲気とは、窒素、アルゴン等の雰囲気あるいは真空雰囲気からなる。
なお、繊維状突起物９を、金属触媒を用いて上記方法により形成した場合は、繊維状突起物９に金属触媒が担持されていてもよい。
【００２０】
次に、図８〜１３を用いて、上述の繊維状突起物９とＤＮＡプローブ（図２の１０）とを結合させる方法について説明する。なお、図８〜図１３は、説明を容易にするため、各構成要素で縮尺を変え、模式的に表したものである。
（ａ）図８に示すように、基板５の表面を、シランカップリング剤を含むコーティング層１３で被覆する。このコーティング層１３には、その反応基を保護基で修飾されたリンカー分子（図示せず）が結合している。すなわち本実施の形態１では、前述の保護基は、リンカー分子およびコーティング層１３を介して繊維状突起物９の表面と結合している。この保護基は、本実施の形態１では、光に反応して脱保護可能な物質を用いた。保護基の例としては、オルト−ニトロベンジル誘導体、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、シンナモイル誘導体などが挙げられる。なお、リンカー分子を用いない場合は、保護基と繊維状突起物９の反応基とを結合させればよい。
【００２１】
（ｂ）次に、図９に示すように、基板５上の複数の領域６〜８の内、一部の領域７、８のみ露出するように、マスク１４で基板５の表面をマスキングする。
（ｃ）次いで、マスク１４の上方から基板５の表面に光を照射すると、保護基が除去され（脱保護）、リンカー分子の反応基が露呈する。図９で示すコーティング層１３Ａのリンカー分子は、保護基が除去され、反応基が露呈した状態である。ここで、照射光としては、保護基を脱保護可能な所定波長の光を用いる。
（ｄ）その後、シリコン基板５上に、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）のいずれかのヌクレオチドモノマー１５を含む溶液を注入すると、図１０に示すように、露呈したリンカー分子の反応基と前述のモノマー１５とが結合する。
【００２２】
なお、本実施の形態１では、リンカー分子を介して保護基と繊維状突起物９とが結合しているが、リンカー分子を用いず、保護基を直接繊維状突起物９と結合させている場合は、保護基が脱保護された繊維状突起物９の反応基とモノマー１５とが結合する。
ここで、本実施の形態１では、このモノマー１５は、光反応性の保護基で修飾されたものを用いた。この保護基は、リンカー分子の保護基と同じ物質でもよく、別の物質でもよい。
【００２３】
（ｅ）次に、図１１に示すように、また別のマスク１６をして、一部の領域６、７のみ露出させる。この露出させる領域６、７は、先の工程でモノマー１５を結合させた領域と同じでもよい。そしてこの領域６、７に、所定波長の光を照射して、領域７のモノマーおよび領域６のコーティング層のリンカー分子の保護基をそれぞれ脱保護する。なお図１１では、保護基が脱保護されたコーティング層１３Ａとモノマー１５Ａとを示す。
（ｆ）そして、図１２に示すように、前述のモノマー１５を固定する工程と同じく、保護基で修飾されたモノマー１７の溶液を注入し、領域７の保護基が脱保護されたモノマー１５Ａ、および領域６の保護基が脱保護されたリンカー分子と結合させる。
このように、異なるマスクを用い、四種のヌクレオチドモノマーをそれぞれ結合させる工程を繰り返すと、領域６〜８毎に異なる種類のＤＮＡプローブ１０を形成することができる。
【００２４】
なお、図１３（ａ）は領域６、図１３（ｂ）は領域７、図１３（ｃ）は領域８の繊維状突起物９表面に形成されたＤＮＡプローブ１０を、それぞれ模式的に示したものである。このＤＮＡプローブ１０を構成するヌクレオチドモノマーの数は、特に限定されないが、１０個〜３０個程度（長さ０．００３〜０．０１μｍ程度）が二本鎖形成に適している。またマスクの組み合わせにより、多種の配列のＤＮＡプローブ１０も迅速に形成することができる。
【００２５】
また本実施の形態１では、保護基として光反応性保護基を用いたが、例えば電流や電解、イオンビームなどにより脱保護可能な物質を用いてもよい。この場合、保護基を脱保護する工程では、それぞれ電流や電解、イオンビームを印加すればよい。
なお、本実施の形態１では、前述のように保護基を用いて反応領域を制御し、モノマーを重合させる方法を用いたが、例えばモノマーを、フォトリソ技術を用いて所定領域に積層する方法を用いても良い。
【００２６】
また、上記実施の形態１では、基板５の所定領域６〜８に選択的に繊維状突起物９を形成する方法として、予め基板５表面に保護膜（図４の１１）を形成する方法を例に挙げたが、その他の方法であってもよい。例えば先にシリコン基板５上の全域に繊維状突起物９を形成し、その後繊維状突起物９を残したい領域６〜８を、樹脂等の保護膜で覆い、繊維状突起物９を除去したい領域の繊維状突起物９を、ＨＦやＢＨＦなど通常の薬剤を用いてエッチングして除去し、その後保護膜を除去すればよい。この場合は、露出した面に前述の熱酸化膜は形成されない。
【００２７】
なお、保護膜を除去する方法としては、溶剤などの化学的処理によって保護膜を除去することが望ましい。それは、機械的処理に比べ、化学的処理の方が、微細な繊維状突起物９が壊れにくいからである。
【００２８】
このように形成したＤＮＡセンサは、例えば予め蛍光物質などで標識したＤＮＡとＤＮＡプローブ１０とで二本鎖を形成させたり、あるいは形成された二本鎖に蛍光物質を挿入したりすることによって、二本鎖形成の有無を光で測定することができる。その他、二本鎖形成の有無は、光以外にも、電流や電圧の変化、あるいは表面の粗さなどで測定することができる。
【００２９】
以下に本実施の形態１における効果を説明する。
本実施の形態１ではセンサの感度を向上させることができる。その理由は、機能性分子であるＤＮＡプローブ１０を高密度に形成することができるからである。すなわち本発明は、上述の繊維状突起物９により基板５の表面積が増え、狭いスペースにも受容体を高密度に形成することができる。したがって、各ＤＮＡプローブ１０と相補的ＤＮＡ（リガンド分子）との反応を十分得ることができ、大きな信号として検出することができる。そしてその結果、センサの感度を向上させることができる。
【００３０】
また本実施の形態１では、繊維状突起物９が二酸化珪素で構成されているため、その表面は基板５の表面と比較して、よりヒドロキシル化されている。したがって、リンカー分子などとの化学物質との結合性が高まり、ＤＮＡプローブ１０をより高密度に固定することができる。
【００３１】
また、繊維状突起物９が形成されている領域は、基板５の露出面（繊維状突起物９が形成されていない面）と比較して、高い親水性および保水性を有している。したがって、この基板５上に極性溶媒を供給する場合、極性溶媒は繊維状突起物９との親和性が高いため、ＤＮＡプローブ１０の形成領域において気泡の発生を抑制することができる。すなわち本実施の形態１では、例えば基板５上にモノマー溶液を注入したり、あるいは測定液を注入したりする工程において、気泡が発生しにくい。そしてその結果、ＤＮＡプローブ１０をより高密度に形成し、あるいは測定を高精度に行うことができる。なお親水性、保水性の少なくとも一方を有していれば、気泡の低減に寄与する。
【００３２】
さらに、本実施の形態１では、ＤＮＡプローブ１０を繊維状突起物９上に形成しているため、このＤＮＡプローブ１０が固定される領域は、フラットな面と比較して反射率が低くなる。したがって、例えば蛍光で分析する場合、基板５からの反射光にはシリコン原子に光を照射した場合に生じる励起光が混じり、蛍光検出の際にノイズ要因となることがあるが、本発明では繊維状突起物９に遮られて前記励起光が低減できるので結果としてノイズを低減することができる。
【００３３】
（実施の形態２）
本実施の形態２と実施の形態１との主な違いは、図１５に示すように、基板５の形状である。すなわち本実施の形態２では、予め基板５の表面にウエットエッチングあるいはドライエッチングなどにより凹部１８を形成し、その凹部１８の底面に繊維状突起物９を形成したものである。これにより本実施の形態２では、各領域６〜８の繊維状突起物９が、各領域６〜８を越えて成長するのを抑制することができる。すなわち、表面拡散の抑制により、繊維状突起物９の成長方向が抑制される。従って、繊維状突起物９が形成される領域の形状精度を向上することができる。
さらに本実施の形態２では、例えば基板５上にモノマー溶液を注入したり、あるいは測定液を注入したりする工程において、モノマー溶液や測定液の拡散を防ぐことができる。従って、センサの検査感度が向上する。
なお、本実施の形態２では、繊維状突起物９を凹部１８の底面および側壁面に形成したが、凹部１８の底面のみ、または側壁面のみに形成してもよい。
なお、凹部１８の窪みの深さは繊維状突起物９が形成されている層の厚みよりも深くすることで、拡散を抑制しやすいため好ましい。より好ましくは、凹部１８の窪みの深さは繊維状突起物９が形成されている層の厚みよりも数十μｍ以上深くすることがよい。なお、凹部１８の範囲は目的に応じて適宜選択することができる。
なお、その他の実施の形態１と同様の構成および効果については説明を省略する。
なお、上記実施の形態２では、センサとしてＤＮＡセンサを例に挙げ、機能性分子はＤＮＡプローブとしたが、機能性分子をＲＮＡにしてもよい。ＲＮＡもＤＮＡと同様に、保護基を用いて容易に所定領域に形成することができる。
【００３４】
（実施の形態３）
本実施の形態３では、ＤＮＡなどの核酸配列（塩基配列）を測定するシークエンサーについて説明する。
図１６に示すように、本実施の形態３のシークエンサーも、実施の形態１のＤＮＡセンサと同様に、基材としての基板１９と、この基板１９の領域２０〜２２上に選択的に形成された複数の繊維状突起物２３を有している。本実施の形態３では、各領域２０〜２２内における複数の繊維状突起物２３の間隔（根元部分における間隔）を１〜１０μｍとし、太さを０．０１μｍ〜１０μｍとした。また繊維状突起物２３の長さは全長で１〜５００μｍ程度である。
【００３５】
また、この繊維状突起物２３は、実施の形態１と同様に、より表面積を大きくするため、細かくうねったりカールしたりするまで成長させたものであり、一本一本は縮れた形状であって、互いに絡み合った状態で密集している。さらに自由な方向へ枝分かれしているものが混在していてもよい。これにより外圧に対しても応力負荷を分散しやすく、機械的強度の強い構造となる。
また本実施の形態３の繊維状突起物２３は、実施の形態１と同様にアモルファスの二酸化珪素からなり、単結晶の二酸化珪素と比較して折れにくい構成となっている。
【００３６】
このような繊維状突起物２３の製造方法については、実施の形態１に示すＤＮＡセンサと同様であり、まず基板１９上で、プラズマＣＶＤ法を用いてフッ化炭素系のガスをプラズマ中で分解し、Ｃ、Ｆ元素またはＣ、Ｆ、Ｈ元素を含んだ有機ポリマーからなるシード層を形成する。低酸素雰囲気下にて、１０００〜１１５０℃で焼成することで形成できる。なお、繊維状突起物２３は、金属触媒を用いて形成することも可能である。詳細については、実施の形態１と同様である為説明を省略する。
【００３７】
次に、本実施の形態３のシークエンサーを用いた核酸増幅方法について説明する。
（ａ）はじめに、核酸配列（塩基配列）を測定したいＤＮＡまたはＲＮＡ（以下核酸という）をＥｃｏＲＩやＨｈａＩなどの酵素を用いてランダムに分断し、図１７（ａ）に示す核酸断片２４を形成する。核酸断片２４の長さは、後述する配列読み出し工程における読み出し精度にもよるが、通常１０から４０００塩基対の長さである。この核酸断片２４は一本鎖または二本鎖の形態のいずれでもよい。
（ｂ）次に、この核酸断片２４の一端にオリゴヌクレオチド配列Ｙ１を含むアダプター２５、他端にオリゴヌクレオチド配列Ｚ１を含むアダプター２６を結合させ、図１７（ａ）に示すような核酸鋳型Ｔ１を形成する。なお、オリゴヌクレオチド配列とは、いくつかの塩基対からなる短いヌクレオチド配列の配列を指し、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）あるいはウラシル（Ｕ）の塩基を構成要素とする。
オリゴヌクレオチド配列Ｙ１およびオリゴヌクレオチド配列Ｚ１は、５〜１００程度のヌクレオチドで構成されることが好ましい。また本実施の形態３では、核酸鋳型Ｔ１の最も末端にオリゴヌクレオチド配列Ｙ１およびＺ１を結合させたが、末端近傍（好ましくは、核酸鋳型Ｔ１の５’末端、あるいは３’末端から０から１００ヌクレオチド以内）であれば支持体１と接合できる。
【００３８】
（ｃ）さらに本実施の形態３では、複数のコロニープライマーＸ１およびＸ２を準備する。このコロニープライマーＸ１は、オリゴヌクレオチド配列Ｚ１とハイブリタイズ可能な配列を有し、コロニープライマーＸ２は、コロニープライマーＸ１の伸長により形成された核酸鋳型（後述のＴ２）のオリゴヌクレオチド配列（後述のＺ２）とハイブリタイズ可能な配列を有する。すなわちコロニープライマーＸ２は、オリゴヌクレオチド配列Ｙ１と対応する配列を有する。
（ｄ）次に本実施の形態３では支持体１の繊維状突起物２３のＯＨ基をＡＴＳ（アミノプロピルトリエトキシシラン）などで誘導し、繊維状突起物２３表面を、二官能性結合剤により官能化する。
【００３９】
（ｅ）そしてこの官能化された繊維状突起物２３表面に、コロニープライマーＸ１、Ｘ２と核酸鋳型Ｔ１を含む溶液を提供し、図１７（ｂ）に示すように、コロニープライマーＸ１、Ｘ２と核酸鋳型Ｔ１のそれぞれの５’末端を繊維状突起物２３表面と共有結合させる。なお、図１７（ｂ）の斜線部分は、繊維状突起物２３を示す。ここで本実施の形態３では、アミド結合により繊維状突起物２３表面とコロニープライマーＸ１、Ｘ２および核酸鋳型Ｔ１を結合したが、その他の結合としては、エステル結合やチオール結合などの共有結合なども挙げられる。
【００４０】
（ｆ）次に、図１７（ｃ）に示すように、繊維状突起物２３に結合した核酸鋳型Ｔ１およびコロニープライマーＸ１を誘導し、核酸鋳型Ｔ１のオリゴヌクレオチド配列Ｚ１（アダプター２６）とコロニープライマーＸ１とを、ハイブリダイゼーションさせる。この時の誘導条件としては、例えば約６５℃の温度に供することが挙げられる。
（ｇ）その後、図１７（ｄ）に示すように、適切な温度条件および核酸ポリメラーゼ（例えばＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素分子、またはＲＮＡポリメラーゼなど）の存在下、４種のヌクレオチド前駆体、すなわち４種のデオキシヌクレオシド３リン酸〔デオキシアデノシン３リン酸(以下ｄＡＴＰと略)、デオキシグアノシン３リン酸(以下、ｄＧＴＰと略)、デオキシシチジン３リン酸(以下、ｄＣＴＰと略)、デオキシチミジン３リン酸（以下、ｄＴＴＰと略）〕を基質として核酸を合成する。
（ｈ）このように核酸ポリメラーゼが、コロニープライマーＸ１をその３’末端から核酸鋳型Ｔ１を鋳型として伸長させ、このプライマー伸長が完了したら、最初の核酸鋳型Ｔ１に相補な第２の核酸鎖、すなわち核酸鋳型Ｔ２が生成する。
（ｉ）その後、例えば加熱することにより、図１７（ｅ）に示すように、繊維状突起物２３上には、分離された２つの核酸鎖（核酸鋳型Ｔ１、Ｔ２）が固定化された状態となる。
【００４１】
（ｊ）そして図１７（ｆ）に示すように、最初に固定化された核酸鋳型Ｔ１、およびコロニープライマーＸ１が伸長して形成された核酸鎖（核酸鋳型Ｔ２）は、いずれも核酸鋳型として機能する。すなわち、核酸鋳型Ｔ１及び核酸鋳型Ｔ２は、他の固定化されたコロニープライマーＸ１あるいはコロニープライマーＸ２とハイブリタイズし、それぞれプライマー伸長が起こり、核酸鎖が分離して、繊維状突起物２３に固定化された核酸鎖を増幅していく。このように核酸鎖が増幅され、核酸コロニーは生成される。なお本実施の形態３では、この核酸コロニーは、最初の核酸鋳型Ｔ１に対応する配列であるものと、この核酸鋳型Ｔ１に相補的（すなわち核酸鋳型Ｔ２に対応）な配列であるものを含む。
【００４２】
以上のように、支持体１上の他の領域でも同様に、ランダムに分断された核酸を鋳型にして、二種類の核酸鎖からなる核酸コロニーを形成できる。この核酸コロニーは、たとえば１０μｍ未満の小さい間隔で形成することによって、より小型化に寄与する。
【００４３】
次に、上述のように核酸を増幅させた後には、核酸配列を測定することができる。
本実施の形態３では、核酸コロニーを構成する二種類の核酸鎖のうち、核酸鋳型Ｔ１の配列について測定する。この時、例えば核酸鋳型Ｔ１に相補的な核酸鎖は、繊維状突起物２３から切り離せばよい。すなわち、核酸鋳型Ｔ２はコロニープライマーＸ１を介して繊維状突起物２３と結合しているため、コロニープライマーＸ１を制限酵素などで繊維状突起物２３から切り離すことができる。これにより、図１８（ａ）に示すように、核酸鋳型Ｔ１に対応する核酸鎖のみからなる核酸コロニーを構成することができる。
【００４４】
次に、核酸鋳型Ｔ１の３’末端側のオリゴヌクレオチド配列Ｚ１とハイブリタイズできるプライマー２７と、修飾された四種のヌクレオチド前駆体（図１８（ａ）に示すＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）、および核酸ポリメラーゼを含む溶液を繊維状突起物２３上に流す。この時、四種のヌクレオチド前駆体をそれぞれ異なる励起光を発するように、種々の蛍光物質で修飾しておく。するとこの蛍光物質は、ヌクレオチド前躯体がハイブリタイズする瞬間に、レーザ光によって励起され、蛍光発色する。この時、一つの核酸コロニーでは四種のヌクレオチド前躯体のうち一種が結合するため、核酸コロニーによってそれぞれの波長の発色を確認する事ができる。次に図１８（ｂ）に示すように、再び繊維状突起物２３上に四種のヌクレオチド前躯体と酵素とを流し込むことによって、次のヌクレオチド前躯体がプライマー２７から伸長して核酸鋳型Ｔ１にハイブリタイズし、特異な波長で発色する。
【００４５】
このようにプライマー２７が伸長し、３’末端側から核酸鋳型Ｔ１と相補的な核酸配列が形成されていく過程では、核酸鋳型Ｔ１のヌクレオチド配列によって種々の順番で発色がおこる。したがって、この発色をレコードすることによって、核酸コロニー毎に、核酸鋳型のヌクレオチド配列を読み取ることができ、それぞれの拡散断片の配列が明らかとなる。
【００４６】
なお、上記図１８（ａ）において、ヌクレオチド前駆体に、一つのハイブリタイズ反応が起こった後に続けて伸長反応が起こらないように化学修飾しておけば、一本鎖上の一つのヌクレオチド配列を確実に決定できる。つまり、この後に化学修飾物質を除去し、再び化学修飾されたヌクレオチド前駆体を流すことで、反応を一つ一つ確実に決定できる。
【００４７】
ここで核酸鋳型は、配列を測定したい核酸を予め多数準備し、それらをランダムに分断して形成しておけば、核酸断片の配列だけでなく、もとの核酸の配列まで分析することができる。本実施の形態３では、支持体１を複数の領域に区分けし、この区分けされた領域に選択的に繊維状突起物２３を形成するとともに、領域毎にそれぞれ核酸コロニーを形成している。したがって、表１に示すように、それぞれの領域の核酸コロニーから読み取った配列を比較し、同じ配列部分があればその部分を重複するように並べることによって、少しずつ元の核酸の全体配列を読み取っていくことが出来る。
【００４８】
【表１】
2010183900.tif 000003
【００４９】
本実施の形態３における効果を以下に説明する。
本実施の形態３では、単位領域における核酸の密度が増し、核酸配列の測定精度を高めることができる。その理由は、基板１９上に複数の繊維状突起物２３を形成し、この繊維状突起物２３上で核酸を増幅させたからである。これにより本実施の形態３では、支持体１の表面積が増え、一領域における核酸の増幅量が多くなる。そしてその結果、核酸コロニー全体から検出できる信号が大きくなり、核酸配列の測定精度を高めることができる。
【００５０】
また、本実施の形態３では、繊維状突起物２３が二酸化珪素で構成されているため、その表面は基板１９の表面と比較して、よりヒドロキシル化されている。したがって、核酸鋳型やコロニープライマーなどを結合するための化学物質との結合性が高まり、より高密度に核酸鋳型およびコロニープライマーを固定することができる。
【００５１】
また、図１６に示すように、繊維状突起物２３が形成されている領域２０〜２２は、基板１９の露出面（繊維状突起物２３が形成されていない面）と比較して、高い親水性を有している。したがって、この基板１９上に極性溶媒を供給する場合、極性溶媒は繊維状突起物２３との親和性が高いため、核酸鋳型Ｔ１およびコロニープライマーＸ１、Ｘ２の形成領域において気泡の発生を抑制することができる。したがって測定も高精度に行うことができる。
【００５２】
さらに、本実施の形態３では、核酸鋳型Ｔ１を繊維状突起物２３上に形成したため、この核酸鋳型Ｔ１が固定される領域は、フラットな面と比較して反射率が低くなる。したがって、例えば蛍光で分析する場合、基板１９からの反射光にはシリコン原子に光を照射した場合に生じる励起光が混じり、蛍光検出の際にノイズ要因となることがあるが、本発明では繊維状突起物２３に遮られて前記励起光が低減できるので結果としてノイズを低減することができる。
【００５３】
なお、本実施の形態３では、各領域２０〜２２に複数の繊維状突起物２３を形成したが、各領域２０〜２２に一つの繊維状突起物２３を形成してもよい。この場合も、基板１９の表面積は増え、核酸をより増幅させることができる。
【００５４】
また本実施の形態３では、繊維状突起物２３上で核酸鋳型Ｔ１を鋳型にして、固定化された核酸を増幅したが、核酸鎖の固定方法はこれ以外でもよい。例えば、予め増幅した核酸を繊維状突起物２３上に流し、それぞれを結合させ、固定してもよい。このように本実施の形態３の繊維状突起物２３を用いたシークエンサーは、種々の核酸の固定に用いられる。そしてそれぞれの方式のシークエンサーにおいて、繊維状突起物２３によって基板１９の表面の表面積が大きくなっているため、単位領域で固定できる核酸の数が増え、測定できる信号も大きくなる。したがって、核酸配列の測定精度を高めることができる。
【００５５】
更に、本実施の形態３では、核酸配列の測定方法として、固定された核酸鎖（核酸鋳型）とヌクレオチド前躯体とのハイブリタイズによる蛍光を分析する方法を例に挙げたが、この測定方法は一例であり、種々の方法を用いることができる。例えば固定された核酸鎖とヌクレオチド前駆体とのハイブリタイズ反応によって変化する電磁場状態を、光、あるいは電気的な信号の変化として配列を測定する方法などもある。
【００５６】
（実施の形態４）
本実施の形態４と実施の形態３との主な違いは、図１９に示すように、基板１９の形状である。すなわち本実施の形態４では、予め基板１９の表面にウエットエッチングあるいはドライエッチングなどにより凹部２８を形成し、その凹部２８の底面に繊維状突起物２３を形成したものである。これにより本実施の形態４では、各領域２０〜２２の繊維状突起物２３が、領域２０〜２２を越えて成長するのを抑制することができる。すなわち、表面拡散の抑制により、繊維状突起物２３の成長方向が抑制される。従って、繊維状突起物２３が形成される領域の形状精度を向上することができる。したがって、領域２０〜２２毎に各核酸コロニーを形成することができ、信号を高精度に測定できる。さらに本実施の形態４では、例えば基板５上にモノマー溶液を注入したり、あるいは測定液を注入したりする工程において、モノマー溶液や測定液の拡散を防ぐことができる。従って、センサの検査感度が向上する。
【００５７】
なお、本実施の形態４では、繊維状突起物２３を凹部２８の底面および側壁面に形成したが、凹部２８の底面のみ、または側壁面のみに形成してもよい。
なお、凹部１８の窪みの深さは繊維状突起物９が形成されている層の厚みよりも深くすることで、拡散を抑制しやすいため好ましい。より好ましくは、凹部１８の窪みの深さは繊維状突起物９が形成されている層の厚みよりも数十μｍ以上深くすることがよい。なお、凹部１８の範囲は目的に応じて適宜選択することができる。
なお、その他の実施の形態１と同様の構成および効果については説明を省略する。その他の実施の形態３と同様の構成および効果については説明を省略する。
なお、上記実施の形態１〜４では、基材として平板状の基板を用いたが、例えば球形やキューブ形など、種々の形状の基材を用いてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明に係るセンサは、ＤＮＡセンサとして用いることができる。また、ＤＮＡセンサ以外にも、タンパク質センサや糖センサ、抗原抗体センサ等の各種センサに用いることが出来る。これら各種センサに用いるには、それぞれ検出したいリガンド分子を捕捉可能な受容体や反応性物質を繊維状突起物表面に結合させ、リガンド分子との結合を測定するセンサや、あるいは機能性分子として、測定したいリガンド分子を繊維状突起物表面に結合させ、これらの受容体や反応性物質と反応させるセンサが挙げられる。機能性分子がポリマーであれば、保護基を用いてモノマーを所定領域に重合できる。さらに本発明のシークエンサーでは、ＤＮＡなどの核酸配列を高精度に測定することができる。
【符号の説明】
【００５９】
５  基板
６、７、８  領域
９  繊維状突起物
１０  ＤＮＡプローブ（機能性分子）
１１  保護膜
１２  シード層
１３  コーティング層
１３Ａ  コーティング層
１４  マスク
１５  モノマー
１５Ａ  モノマー
１６  マスク
１７  モノマー
１８  凹部
１９  基板
２０〜２２  領域
２３  繊維状突起物
２４  核酸断片
２５  アダプター
２６  アダプター
２７  プライマー
２８  凹部
【図１】
2010183900.tif 000004
【図２】
2010183900.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図３】
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【図１４】
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