【手続補正書】
【提出日】令和3年2月3日(2021.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テルペンまたはテルペノイド産物の生産方法であって、
上流のメチルエリスリトール経路（ＭＥＰ）を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する細菌株を提供することと；
前記テルペンまたはテルペノイド産物を生産する前記細菌株を培養することとを含み、解糖系に入る炭素の１％超がＭＥＰ炭素になる、前記方法。
【請求項２】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．から選択される細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌種が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｍｏｂｉｌｉｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａから選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌株がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記テルペンまたはテルペノイド産物が、アビエタジエン、アビエチン酸、アルファ−グアイエン、アルファ−シネンサール、アモルファジエン、アルテミシン酸、ベータ−ビサボレン、ベータ−ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、セラストロール、セロプラストール、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ククルビタン、フォルスコリン、ガスカルジン酸、ゲラニオール、ハスレン、レボピマル酸、リモネン、ルペオール、メントール、メントン、モグロサイド、ヌートカトン、ヌートカトール、オフィオボリンＡ、パチョリ、ピペリトン、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、ロツンドン、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド、タキサジエン、チモール、ウルソール酸、及びバレンセンから選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ユビキノン生合成経路が下方制御される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記株が、ＩｓｐＢの発現または活性の低減を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＩｓｐＢの発現が改変型リボソーム結合配列（ＲＢＳ）によって低減される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ｉｓｐＢ遺伝子のシャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列が、ＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣであるか、またはＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣの１もしくは２ヌクレオチドが変更されたその修飾体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記株が、変更されたｉｓｐＢプロモーターまたはｉｓｐＢ  ＲＮＡ分解速度を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記株が、増加した分解速度を有するＩｓｐＢタンパク質をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記株が、酵素活性を低下させる１つ以上のアミノ酸変化を有するＩｓｐＢタンパク質；または前記細菌株で活性が低下するＩｓｐＢオルソログを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記株が、ｉｓｃオペロンの誘導性発現または構成的発現を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ｉｓｃＲ遺伝子が、場合により前記ＲＢＳに対する改変によって、全体的にもしくは部分的に欠失されるか、または不活性化されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｉｓｃＲ遺伝子が誘導性プロモーターまたは構成的プロモーターで置換されている、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記株が、ｒｙｈＢの欠失または不活性化を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記株が、場合によりｄｘｒを含む組換え遺伝子またはオペロンによる補完によって、Ｄｘｒを過剰発現する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記株が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｄｘｒと比較して活性が増加している修飾Ｄｘｒ酵素またはＤｘｒオルソログを有し、ここで前記オルソログは場合によりＢｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ  ＤＲＬ（配列番号８）またはその誘導体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記株が、場合によりＩｓｐＥを発現する組換え遺伝子またはオペロンによる補完によって、ＩｓｐＥ、修飾ＩｓｐＥ、及び／またはＩｓｐＥオルソログを過剰発現する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記株が、場合によりＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨを発現する組換え遺伝子またはオペロンによる補完によって、ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨを過剰発現する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記株が、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨと比較して活性が増加している修飾ＩｓｐＧ及び／またはＩｓｐＨ酵素またはオルソログを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩｓｐＧ酵素が以下の変異、Ｌ２０５Ｖ、Ａ２１０Ｓ、Ｇ２１２Ｔ、及びＡ２１３Ｉのうち１つ、２つ、３つ、またはすべてを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌株が、オペロン／モジュールとして発現させたｄｘｓ及びｉｄｉ；またはオペロンもしくはモジュールとして発現させたｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉのうち、少なくとも１つの追加コピーを有する、請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記株が、テルペンもしくはテルペノイド力価の増加またはＭＥＰ炭素の増加を促進するｐｇｉ変異を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
培養物が少なくとも約１００Ｌであるり、前記培養物中のＤＯＸ、ＭＥ、またはＭＥｃＰＰの蓄積を監視することを含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記テルペンまたはテルペノイド産物を回収することをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記テルペンまたはテルペノイド産物を有機相、疎水相、または水相から回収する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工業製品または消費者製品を製造する方法であって、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法に従って生産された前記テルペンまたはテルペノイドを前記工業製品または消費者製品に組み込むことを含む、前記方法。
【請求項２９】
前記工業製品または消費者製品が、着香製品、芳香製品、甘味剤、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または害虫駆除製品である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記工業製品または消費者製品が、食品、飲料、食感改良剤、医薬品、タバコ製品、栄養補助食品、口腔衛生製品、または化粧品である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＭＥＰ炭素を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する細菌株であって、前記細菌株は、前記ＭＥＰ経路を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介して前記ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換し、前記遺伝子改変が、
（１）ＩｓｐＢの発現または活性を低下させる改変；
（２）テルペンまたはテルペノイドの生産に使用される条件下で前記ｉｓｃオペロン内の残りの前記遺伝子の発現を誘導するための、前記ｉｓｃＲ遺伝子、及び誘導性または構成的プロモーターのすべてまたは一部の欠失または不活性化；
（３）ｒｙｈＢの欠失または不活性化；
（４）ＤＯＸ及び／またはＭＥが約２ｇ／Ｌを超えてまたは約１ｇ／Ｌを超えて蓄積しないような、ＭＥＰ酵素の発現または活性の変更またはバランス調整；
（５）場合によりｉｓｐＤ、ｉｓｐＥ、及び／またはｉｓｐＦを含むｄｘｒ遺伝子と、ｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨ遺伝子とを含むＭＥＰ経路の補完；
（６）テルペノイド力価またはＭＥＰ炭素の増加を促すｐｇｉ（グルコース−６−リン酸イソメラーゼ）の変異から選択される、前記細菌株。
【請求項３２】
前記株が、少なくともｄｘｒ遺伝子及びｉｓｐＥ遺伝子によるＭＥＰ経路の補完を含む、請求項３１に記載の細菌株。
【請求項３３】
前記ｄｘｒ遺伝子が、配列番号４または配列番号８と少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項３１または３２に記載の細菌株。
【請求項３４】
前記ｉｓｐＢ  ＲＢＳが改変されている、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項３５】
前記ｉｓｐＢのシャイン−ダルガノ（ＳＤ）配列が、ＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣであるか、またはＣＧＴＧＣＴもしくはＣＧＴＧＣＣから１もしくは２ヌクレオチドが変更されたＳＤ配列である、請求項３４に記載の細菌株。
【請求項３６】
前記細菌株が、酵素活性を増加させるように修飾されたＩｓｐＧまたはＩｓｐＨ酵素による補完を含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項３７】
前記ＩｓｐＧ酵素が、Ｌ２０５Ｖ、Ａ２１０Ｓ、Ｇ２１２Ｔ、及びＡ２１３Ｉから選択される、１つ、２つ、３つ、またはすべての修飾を有する、請求項３６に記載の細菌株。
【請求項３８】
前記株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．から選択される細菌である、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項３９】
前記細菌株がＥ．ｃｏｌｉである、請求項３８に記載の細菌株。
【請求項４０】
前記細菌株が、オペロン／モジュールとして発現させたｄｘｓ及びｉｄｉ；またはオペロンもしくはモジュールとして発現させたｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉのうち、少なくとも１つの追加コピーを有する、請求項３１〜３９のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項４１】
前記テルペンまたはテルペノイド産物が、アビエタジエン、アビエチン酸、アルファ−グアイエン、アルファ−シネンサール、アモルファジエン、アルテミシン酸、ベータ−ビサボレン、ベータ−ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、セラストロール、セロプラストール、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ククルビタン、フォルスコリン、ガスカルジン酸、ゲラニオール、ハスレン、レボピマル酸、リモネン、ルペオール、メントール、メントン、モグロサイド、ヌートカトン、ヌートカトール、オフィオボリンＡ、パチョリ、ピペリトン、ロツンドン、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド、タキサジエン、チモール、ウルソール酸、及びバレンセンから選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項３１〜４０のいずれか１項に記載の細菌株。