【手続補正書】
【提出日】平成17年1月13日(2005.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のいずれかのタンパク質又はペプチドを有効成分とする、転写抑制を目的とする薬剤。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質又はペプチド、
（２）該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はペプチド、又は
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列の機能部分から成るタンパク質又はペプチド、若しくは
（４）該機能部分において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はペプチド
【請求項２】
前記機能部分が、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３０３〜５０２番目のアミノ酸配列である請求項１に記載の転写抑制を目的とする薬剤。
【請求項３】
肝癌細胞でのみ発現する遺伝子の転写を抑制する下記のいずれかのタンパク質又はペプチドを有効成分とする肝癌の治療薬。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質又はペプチド、
（２）該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はペプチド、又は
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列の機能部分から成るタンパク質又はペプチド、若しくは
（４）該機能部分において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はペプチド
【請求項４】
前記機能部分が、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３０３〜５０２番目のアミノ酸配列である請求項３に記載の肝癌の治療薬。
【請求項５】
前記遺伝子がＩＩ型ヘキソキナーゼ又はピルビン酸キナーゼＭである請求項３又は４に記載の肝癌の治療薬。
【請求項６】
下記のいずれかのペプチド又はタンパク質を特異的に認識することができる抗体を有効成分とする、転写抑制活性を有する薬剤のスクリーニング剤。
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列から成るタンパク質又はペプチド、
（２）該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はペプチド、又は
（３）配列番号１で表されるアミノ酸配列の機能部分から成るタンパク質又はペプチド、若しくは
（４）該機能部分において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列から成り、転写抑制活性を有するタンパク質又はペプチド
【請求項７】
前記機能部分が、配列番号１で表されるアミノ酸配列の３０３〜５０２番目のアミノ酸配列である請求項６に記載のスクリーニング剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
肝癌細胞では専ら亢進した解糖系に依存してエネルギー代謝を行っていることから、ＺＨＸ３が正常肝では肝癌特異的アイソザム遺伝子群の発現を抑制しており、癌化に伴いＺＨＸ３の発現が低下するか、又は、ＺＨＸ３蛋白質が修飾されて活性を失うものと考えられる。従って、ＺＨＸ３の存在を検出する物質や機能を調節する薬剤を開発することにより、肝癌の診断と治療へ応用することができる。
即ち、本発明は、また、上記のタンパク質又はペプチドを有効成分とする、転写抑制を目的とする薬剤である。更に、本発明は、肝癌細胞でのみ発現する遺伝子の転写を抑制する上記いずれかのタンパク質又はペプチドである。この遺伝子はＩＩ型ヘキソキナーゼ又はピルビン酸キナーゼＭであってもよい。また、本発明は、このタンパク質又はペプチドを有効成分とする肝癌の治療薬である。更に、本発明は、このタンパク質又はペプチドを用いて転写抑制因子の欠如に起因する疾患、特に肝癌を治療する方法である。
また、本発明は、上記いずれかのペプチド又はタンパク質を特異的に認識することができる抗体である。更に、本発明は、この抗体を有効成分とする、転写抑制活性を有する薬剤のスクリーニング剤である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
【実施例】
本実施例において、酵母２−ハイブリッドシステム、pDsRed1-C1、X-α-gal、ヒト精巣マラソン−レディｃＤＮＡ、Advantage2PCRキット、ヒトMultiple Tissue Northern Blot及びBlotII、ExpressHybハイブリダイゼーション溶液、及びpEGFP-C1はClontech(Palo Alto、CA)から購入した。pGEX-4T-2、pGEX-5X-1、α-32PdCTP(111TBq/mmol)、グルタチオン−セファロース４Ｂ、及び３５Ｓ−メチオニン(37TBq/mmol)はAmersham Pharmacia Biotech(Cleveland、OH)から購入した。HEK293細胞、ヒト胎児腎細胞系はAmerican Type Culture Collection(Manassas、VA)から購入した。TRIZOL試薬、SuperscriptII、pcDNA3.1His-Cプラスミド、及びLIPOFECTAMINE PLUSはInvitrogen(Groningen、Netherlands)から購入した。ExTaqDNAポリメラーゼ、pT7Blue-T2ベクター、及びBcaBestDNAラベリングキットはTaKaRa BIOMEDICALSから入手した。pGEM-T Easyベクター、T7 TNT Quick-結合転写／翻訳系、pGL3-Control、pRL-CMV、及び二重ルシフェラーゼ分析系はPromega(Madison、WI)から購入した。Big Dye terminator FS cycleシークエンシングキットはApplied Biosystems Japan(Tokyo、Japan)から購入した。TOPP3細胞はStratagene(La Jolla、CA)から入手した。QIAGENプラスミドキットはQIAGEN(Hilden、Germany)から購入した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
ｐＳＧ４２４、ｐＳＧ４２４Ｂ１、５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌ、及びｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１プラスミドは以前に示された。ｐＤＢＤ−ＺＨＸ３（１−９５６）の２．９ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、それぞれ、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）及びｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−９５６）を得た。ｐＤｓＲｅｄ−ＺＨＸ３（ＨＤ２−５）のＢｇｌII／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１のＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（４９８−９０３）を得た。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ１−２）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ１−１５０６）、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（１０９０−ＨＤ２）、及びｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ２）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１又はｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、それぞれ、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−５５５）、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−５０２）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３０３−５５５）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３０３−５０２）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３６４−５５５）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（４９７−５５５）を得た。ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ＺＨＸ３（ＨＤ１）のＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片をｐＳＧ４２４Ｂ１ベクターのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（３０３−３６４）を得た。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
ＨｉｓＣＭＣＳ１（配列番号３２）及びＨｉｓＣＭＣＳ２オリゴヌクレオチド（配列番号３３）をアニーリングし、リン酸化し、そしてｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−ＣのＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩサイト中へサブクローニングし、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２を得た。上記ｐＧＳＴ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）は以前に示された。ｐＧＳＴ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）の４８０ｂｐのＢａｍＨＩ断片をｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２のＢａｍＨＩサイト中へサブクローニングし、ｐＣＭＶ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）を得た。
以上全てのプラスミドのヌクレオチド配列をＤＮＡシークエンサー３１００(Applied Biosystems)を用いて確認した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
試験例７  細胞培養及びＤＮＡトランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞を１０％ウシ胎児血清で補充したDulbecco’s modified Eagles medium中で３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター中で培養した。
ＤＮＡトランスフェクションはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ試薬を用いて行われた。トランスフェクションに使用された全てのプラスミドはＱＩＡＧＥＮプラスミドキットを用いて調製され、続いてＣｓＣｌ勾配超遠心分離を行った。細胞（ウェル当たり５×１０４）をトランスフェクションの前日に２４ウェルプレート中で接種した。上記５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌは既報に従って作製した（Tanaka, T., Inazu. T., Yamada, K., Myint, Z., Keng, V. W., Inoue, Y., Taniguchi, N., and Noguchi, T. (1999) Biochem. J. 339, 111-117 ）。５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌ又はｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌはレポータープラスミドとして使用された。ＺＨＸ３の転写活性の決定のために、１００ｎｇのレポータープラスミド、２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、及び示された量のＧＡＬ４  ＤＢＤ−ＺＨＸ３融合タンパク質発現プラスミドをトランスフェクトした。プラスミドの総量（１５２ｎｇ）を、必要であれば、ｐＳＧ４２４の添加により調節した。ＺＨＸ３のＺＨＸ１とのヘテロ二量体化の、ＺＨＸ３の転写活性への効果の分析のために、１００ｎｇのレポータープラスミド、２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、５０ｎｇのＧＡＬ４  ＤＢＤ融合タンパク質発現プラスミド、及び示された量のヒトＺＨＸ１のニ量体化ドメインの発現プラスミド、ｐＣＭＶ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）をトランスフェクトした。プラスミドの総量（２０２ｎｇ）を、必要であれば、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２の添加により調節した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）−融合タンパク質の観察のために、３００ｎｇの示されたＧＦＰプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクション３時間後、培地を変えた。４８時間後、上記細胞をルシフェラーゼ分析にかけ又はLaser microscope(Olympus)で観察した。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ分析を製造業者の推奨するプロトコル(Promega)に従って行った。ルシフェラーゼ活性をBerthold Lumat model LB 9501(Wildbad、Germany)により決定した。ホタルルシフェラーゼ活性（比較光単位）をウミシイタケルシフェラーゼ活性により正規化した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
非常に興味深いことに、全長ｃＤＮＡは９５６アミノ酸残基のオープンリーディングフレームを有し、そしてそのタンパク質の推定されたアミノ酸配列はＺＨＸ１に加えて２つのＣｙｓ２−Ｈｉｓ２−型Ｚｎｆモチーフ及び５つのＨＤを含む。このアミノ酸配列を配列番号１に示す。発明者らはこのタンパク質をＺＨＸ３と呼ぶ。記号ＺＨＸ３は、ジンクフィンガー及びホメオボックス３の名前から、HUGO Nomenclature Committeeに提示された。図１にこのヒトＺＨＸ３の推測されるアミノ酸配列のヒトＺＨＸ１との比較を示す。
このヒトＺＨＸ３タンパク質は予測された分子量１０４．７キロダルトン及び等電点５．６８を有する。上記ｐＡＤ−Ｇ５８及びｐＡＤ−Ｇ２３がそれぞれＺＨＸ３の１１４〜６４２の及び２４２〜６１５のアミノ酸配列をコードする一方で、上記ＫＩＡＡ０３９５はヒトＺＨＸ３の４９８〜９５６のアミノ酸配列をコードする。転写制御ドメインとして働きうるグルタミン酸−リッチ領域は６７０〜７１０のアミノ酸配列中に存在し、そして推定される核移行シグナルは存在しない。ＺＨＸ３及びＺＨＸ１の間のコード領域におけるヌクレオチド配列及びアミノ酸配列における相同性は、それぞれ４６．９％及び３４．４％であった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
実施例２
本実施例では、ＺＨＸ１のどのドメインがＺＨＸ３との相互作用に必要とされるかという問題を調べるために、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３の間の最小ヘテロ二量体化ドメインのマッピングを行った。酵母株ＳＦＹ５２６を、ＧＡＬ４  ＤＢＤのみを発現するｐＤＢＤ又はＧＡＬ４  ＤＢＤに融合されたＺＨＸ３のアミノ酸残基２４２〜６１５をコードするｐＤＢＤ−Ｇ２３で形質転換した。上記２つの酵母株はレポーター酵母として使用された。ＧＡＬ４  ＡＤのみを発現するｐＡＣＴ２又はＧＡＬ４  ＡＤに融合されたＺＨＸ１のさまざまな切断された形態をコードするいくつかのプラスミドは獲物プラスミドとして使用された。ｐＤＢＤを含むレポーター酵母をこれらの獲物プラスミドで形質転換したとき、それらは低β−ガラクトシダーゼ活性を示した（データは示していない）。さらに、ｐＤＢＤ−Ｇ２３を含むレポーター酵母をｐＡＣＴ２、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（５６５−８７３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（４３０−５６４）又はｐＡＤ−ＺＨＸ１（３４５−４６３）で形質転換したとき、これらの酵母も低β−ガラクトシダーゼ活性を示した（図３）。対照的に、上記酵母をｐＡＤ−ＺＨＸ１（１４２−８７３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−８７３）、ｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−５６４）又はｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）で形質転換したとき、高β−ガラクトシダーゼ活性が観察された。上記ｐＡＤ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）はＺＨＸ１の２７２〜４３２のアミノ酸残基をコードする。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
実施例５
本実施例では、ＺＨＸ３が転写リプレッサーであることを確認するために、哺乳類のワンハイブリッドシステム（試験例７）を用いてＺＨＸ３の転写の役割を決定した。ＧＡＬ４−結合部位の５つのコピーがｐＧＬ３−ＣｏｎｔｒｏｌのＳＶ４０プロモーターの上流に挿入された、上記５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミドを、レポータープラスミドとして使用された（１４）。２つのエフェクタープラスミド、ＧＡＬ４  ＤＢＤのみを発現するｐＳＧ４２４、及びＧＡＬ４  ＤＢＤのＣ末端に融合されたヒトＺＨＸ３の全コード領域を発現するｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）を調製した。図１０及び図１１に示すように、５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３Ｃｏｎｔｒｏｌ及びさまざまな量のｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）をＨＥＫ２９３細胞中に共トラスフェクトしたとき、上記ルシフェラーゼ活性は用量依存的な様式で減少された。上記最高阻害は５０ｎｇのｐＧＡＬ４−ＺＨＸ１（１−９５６）で得られた。対照的に、ＧＡＬ４−結合部位の５つのコピーを欠く上記ｐＧＬ３−ＣｏｎｔｒｏｌをｐＳＧ４２４又はｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）でトラスフェクトしたとき、上記ルシフェラーゼ活性は変化しなかった（図１０）。これらの結果は、上記ＧＡＬ４−ＺＨＸ３融合タンパク質はＧＡＬ４結合部位依存的な様式でルシフェラーゼ活性を減少させることを示し、ＺＨＸ３は転写リプレッサーとしてはたらくことを示す。
発明者らはその後ＺＨＸ３のＺＨＸ１とのヘテロ二量体化はその転写リプレッサー活性に必要であるかどうかの問題を調べた。発明者らは、ＺＨＸ１の２７２〜４２３のアミノ酸配列が発現される、ｐＣＭＶ−ＺＨＸ１（２７２−４３２）を調製した。この領域はＺＨＸ１のＺＨＸ３との二量体化ドメインと一致するが、ＺＨＸ１のリプレッサードメインは含まない（Yamada, K., Kawata, H., Matsuura, K., Shou, Z., Hirano, S., Mizutani, T., Yazawa, T., Yoshino, M., Sekiguchi, T., Kajitani, T., and Miyamoto. K. (2002) Biochem. Biophys. Res. Comm. 279, 368-374 ）。従って、このタンパク質の過剰発現はＺＨＸ１のドミナントネガティブ形として機能する。上記プラスミドを上記分析システムにおいて共トラスフェクトしたとき、上記ルシフェラーゼ活性は用量依存的な様式で増加された（図１１）。対照的に、ｐｃＤＮＡ３．１ＨｉｓＣ−２の共トランスフェクトはルシフェラーゼ活性に全く影響しなかった。これらの結果は、ＺＨＸ３のＺＨＸ１とのヘテロ二量体化はリプレッサー活性の必要条件であることを示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
実施例６
本実施例では、ＧＦＰ−ＺＨＸ３融合タンパク質発現系を使用して、ＺＨＸ３タンパク質の細胞内局在を調べた。このため、ＧＦＰに融合したＺＨＸ３のさまざまな切断された形態を調製した。これらのプラスミドをＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトし、そしてＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を観察した。ＧＦＰタンパク質のみをコードするｐＥＧＦＰ−Ｃ１Ｅ１は細胞全体において観察された（図１３）。対照的に、全長ＺＨＸ３がＧＦＰのＣ末端に融合されたＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−９５６）は核内に局在した。ＺＨＸ３のＮＬＳを決定するために、さまざまなプラスミドをトランスフェクトした。ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−３０３）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３０３−５５５）、及びｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（５５５−９５６）をトランスフェクトしたとき、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−３０３）及びｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３０３−５５５）の両方が核内に局在した。対照的に、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（５５５−９５６）をトランスフェクトしたとき、上記タンパク質は核外に局在した。これらの結果は、ＺＨＸ３は２つのＮＬＳ及び核輸出シグナル（ＮＥＳ）を含むことを示す。最小のＮＬＳｓをマッピングするために、さまざまなプラスミドを構築した。３のプラスミド、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（１−１０７）、ｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（３６４−５５５）、及びｐＧＦＰ−ＺＨＸ３（４９７−５５５）をトランスフェクトしたときのみ、ＺＨＸ３の核局在が観察された。これらの結果は、ＺＨＸ３はＧＦＰ融合タンパク質として核内に局在することができ、そしてＺＨＸ３の２つのＮＬＳはそれぞれ１〜１０７、及び４９７〜５５５のアミノ酸配列に位置することを示す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
ＺＨＸ３の全コード領域が上記ＧＦＰのＣ末端に融合されたとき、それは核内に局在した（図１３）。ＺＨＸ３の２つのＮＬＳ、それぞれ１〜１０７、及び４９７〜５５５のアミノ酸配列があった。その一方で、上記ＧＦＰに融合されたＺＨＸ３の４９８〜９５６のアミノ酸配列は細胞全体ではなく、核外に排他的に局在する。ＧＦＰのみ又はＮＬＳを欠くＧＦＰ−ＺＨＸ１融合タンパク質は細胞全体に局在する（図１３）。このことは、ＺＨＸ３の領域はＮＥＳを含むことを示す。それゆえ、ＺＨＸ３は１つの分子内に２つのＮＬＳ及び１つのＮＥＳを含む、より複雑なタンパク質である。ＺＨＸ１を含む多くの他のタンパク質においては、上記ＮＬＳは塩基アミノ酸残基のクラスターにマッピングされたことが報告されている（非特許文献４等）。この領域はインポルチンαの如き、核輸入タンパク質と関連し、そしてそれから細胞質から核へ移行される（Kaffman, A., and O'Shea, E. K. (1999) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15, 291-339）。しかしながら、ＺＨＸ３の２つのＮＬＳは塩基性領域には局在せず、そして以前に報告されたＮＬＳとは相同性を示さないので、ＺＨＸ３は核へ移行されるための他の分子と関連しうる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
ヒトＺＨＸ３の推測されるアミノ酸配列のヒトＺＨＸ１との比較を示す図である。ＺＨＸ３及びＺＨＸ１のアミノ酸配列を比較する。２つのＺｎｆモチーフ及び５つのＨＤをそれぞれプラスの印及び下線で示す。アステリスクはアミノ酸同一性を示す。破線はそれぞれのタンパク質に対応するアミノ酸配列が存在しないときのギャップを示す。それぞれ、１１４〜６４２、２４２〜６１５、及び４９５〜９５６のヒトＺＨＸ３のアミノ酸配列に対応する、クローンＧ５８及びＧ２３、並びにＫＩＡＡ０３９５の推測されるアミノ酸配列を示す。
【図２】
ヒトＺＨＸ３  ｍＲＮＡの組織分布を示す図である。それぞれのレーンは、示された組織から単離された２μｇのポリＡ＋−ＲＮＡを含む。サイズマーカーはｋｂで左側に示す。レーン１、心臓；レーン２、脳；レーン３、胎盤；レーン４、肺；レーン５、肝臓；レーン６、骨格筋；レーン７、腎臓；レーン８、膵臓；レーン９、脾臓；レーン１０、胸腺；レーン１１、前立腺；レーン１２、精巣；レーン１３、卵巣；レーン１４、小腸；レーン１５、結腸；レーン１６、白血球。
【図３】
酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３間の最小ヘテロ二量体化ドメインの同定を示す図である。ヒトＺＨＸ１及びＧＡＬ４  ＡＤ−ＺＨＸ１融合構築物の図解表示は左側に示す。Ｚｎｆ及びＨＤはそれぞれ、ジンクフィンガーモチーフ及びホメオドメインを示す。＋及び−のシンボルは、ＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したヒトＺＨＸ３の２４２〜４８８のアミノ酸配列を発現する、ｐＤＢＤ−Ｇ２３、及びｐＡＣＴ２の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。
【図４】
酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３間の最小ヘテロ二量体化ドメインの同定を示す図である。ヒトＺＨＸ３及びＧＡＬ４  ＡＤ−ＺＨＸ３融合構築物の図解表示は左側に示す。Ｚｎｆ、ＨＤ、及びＥは、それぞれ、ジンクフィンガーモチーフ、ホメオドメイン、及びグルタミン酸−リッチ領域を示す。＋及び−のシンボルは、ＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したヒトＺＨＸ１の全コード領域を発現する、ｐＤＢＤ−ＺＨＸ１（１−８７３）、及びｐＡＣＴ２の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。
【図５】
酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ１及びＺＨＸ３間の最小ヘテロ二量体化ドメインの同定を示す図である。in vitroで翻訳された３５Ｓ−標識された、全長ヒトＺＨＸ１又はＺＨＸ３を、結合したＧＳＴのみ（レーン１、５、及び８）及びＧＳＴに融合したＺＨＸ３の２４２〜６１５のアミノ酸配列（レーン３）、ヒトＺＨＸ３（レーン６）又はヒトＺＨＸ１（レーン９）タンパク質の全コード配列を含むセファロースビーズとインキュベートした。上記ビーズを激しく洗浄し、そして結合したタンパク質を溶出し、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。相互作用シグナルはオートラジオグラフィーにより検出された。レーン２、４、及び７、他のレーンで示される上記反応に添加されたタンパク質の１０％がのせられた。
【図６】
酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ３の最小ホモ二量体化ドメインの同定を示す図である。ヒトＺＨＸ３及びＧＡＬ４  ＡＤ−ＺＨＸ３融合構築物の図解表示は左側に示す。Ｚｎｆ、ＨＤ、及びＥは、それぞれ、ジンクフィンガーモチーフ、ホメオドメイン、及びグルタミン酸−リッチ領域を示す。＋及び−のシンボルは図３についての説明において示すものと同じものを示す。
【図７】
酵母２−ハイブリッドシステム又はＧＳＴプルダウン分析を用いた、ＺＨＸ３の最小ホモ二量体化ドメインの同定を示す図である。in vitroで翻訳された、３５Ｓ−標識された、全長ヒトＺＨＸ３を、結合したＧＳＴのみ（レーン２）又はＧＳＴに融合したヒトＺＨＸ３タンパク質の全コード配列（レーン３）を含むセファロースビーズとインキュベートした。続く手順は図５についての説明において示されたともの同じである。レーン１、他のレーンで示される上記反応に添加されたタンパク質の１０％がのせられた。
【図８】
酵母２−ハイブリッドシステムを用いたＮＦ−ＹＡ及びＺＨＸ３間の相互作用ドメインのマッピングを示す図である。ヒトＺＨＸ３及びＧＡＬ４  ＡＤ−ＺＨＸ３融合構築物の図解表示は左側に示す。Ｚｎｆ、ＨＤ、及びＥは、それぞれ、ジンクフィンガーモチーフ、ホメオドメイン、及びグルタミン酸−リッチ領域を示す。＋及び−のシンボルは、ＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したＮＦ−ＹＡの活性化ドメインを発現する、ｐＹＡ１−２６９、及びｐＡＣＴ２の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。
【図９】
酵母２−ハイブリッドシステムを用いたＮＦ−ＹＡ及びＺＨＸ３間の相互作用ドメインのマッピングを示す図である。ＮＦ−ＹＡ及びＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したその欠失変異体の図解表示は左側に示す。Ｑ及びＳ／Ｔは、それぞれ、グルタミン−リッチ及びセリン／スレオニン−リッチ領域を示す。ＳＩＤ及びＤＢＤは、それぞれ、サブユニット相互作用及びＤＮＡ結合ドメインを示す。＋及び−のシンボルは、ｐＤＢＤ及び、ＧＡＬ４  ＡＤに融合したヒトＺＨＸ３の２４２〜４８８のアミノ酸配列を発現する、ｐＡＤ−ＺＨＸ３（２４２−４８８）の組み合わせを含む酵母と比較した、それぞれ、β−ガラクトシダーゼ活性の増加した及び変化のない値を示す。
【図１０】
ＺＨＸ３は転写リプレッサーであることを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞を２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、５０ｎｇのＳＶ４０プロモーターダイレクティッド発現ベクター、及び１００ｎｇの５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌ又はｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌレポータープラスミドで共トランスフェクトした。ｐＳＧ４２４及びｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３（１−９５６）は、それぞれ、ＧＡＬ４  ＤＢＤのみ及びＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したヒトＺＨＸ３の全コード配列を発現する。１００％の値は、それぞれ、５０ｎｇのｐＳＧ４２４の存在下におけるレポータープラスミドについてのプロモーター活性に示された。
【図１１】
ＺＨＸ３は転写リプレッサーであることを示す図である。ＨＥＫ２９３細胞を２ｎｇのｐＲＬ−ＣＭＶ、５０ｎｇのＳＶ４０プロモーターダイレクティッド発現ベクター、１００ｎｇの５×ＧＡＬ４−ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌレポータープラスミド、示された量のｐＣＭＶ−ＺＨＸ１（２４２−４３２）発現プラスミドで共トランスフェクトした。プラスミド（２０２ｎｇ）の総量は、必要であれば、ｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２の添加により調節された。１００％の値は、５０ｎｇのｐＳＧ４２４及び５０ｎｇのｐｃＤＮＡ３．１Ｈｉｓ−Ｃ２の存在下におけるレポータープラスミドのプロモーター活性に示された。トランスフェクション４８時間後、上記細胞を回収し、そしてホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を決定した。ホタルルシフェラーゼ活性は全ての実験においてウミシイタケルシフェラーゼ活性により正規化された。それぞれのカラム及び棒は少なくとも５のトランスフェクション実験の平均及び標準偏差を示す。
【図１２】
ＺＨＸ３の最小リプレッサードメインの決定を示す図である。ｐＳＧ４２４及びさまざまなｐＧＡＬ４−ＺＨＸ３構築物は、それぞれ、ＧＡＬ４  ＤＢＤのみ及びＧＡＬ４  ＤＢＤに融合したヒトＺＨＸ３のさまざまな欠失変異体を発現する。条件は図１０についての説明において示されたものと同じである。それぞれのカラム及び棒は少なくとも５のトランスフェクション実験の平均及び標準偏差を示す。
【図１３】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＺＨＸ３の細胞内局在及び核移行シグナルの決定を示す図である。ＧＦＰのみ又はＧＦＰのＣ末端に融合されたさまざまな切断されたＺＨＸ３タンパク質をコードする、発現プラスミド（３００ｎｇ）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、ＧＦＰ融合タンパク質の細胞内局在を観察した。構築物はそれぞれのパネルの上部に示す。
【図１４】
ＺＨＸ３の機能ドメインを示す図である。Ｚｎｆ、ジンクフィンガーモチーフ；ＨＤ、ホメオドメイン；Ｅ、グルタミン酸−リッチ領域；ＤＤ、二量体化ドメイン；ＩＤ、ＮＦ−ＹＡとの相互作用ドメイン；ＲＤ、リプレッサードメイン；ＮＬＳ、核移行シグナル。