【手続補正書】
【提出日】令和3年1月19日(2021.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、細胞における組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく検出のための方法：
a. 細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；
b. 任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介（LAM）-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程；
d. 工程（c）において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；
ランダムヌクレオチドの近位部；および
3’オーバーハング
を含む、該工程；
e. 工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および／または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程；
f. 任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
【請求項２】
前記組換え事象がV(D)J組換え事象である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、細胞におけるIgレパートリー配列のハイスループットなレパートリーシーケンシングに基づく検出のための方法：
a. 細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；
b. 任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程；
d. 工程（c）において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；
ランダムヌクレオチドの近位部；および
3’オーバーハング
を含む、該工程；
e. 工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、該Igレパートリー配列を含む核酸配列を増幅する工程；
f. 任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
【請求項４】
検出されたレパートリーが、V(D)J組換え事象および／または体細胞超突然変異（SMH）を含む、かつ／または
検出されたレパートリーが、Ig重鎖、Ig軽鎖、V使用頻度、およびCDR3レパートリーを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、発生期Tリンパ球、胚中心から得られた細胞、およびパイエル板から得られた細胞からなる群より選択される、かつ／または
前記方法が、抗原で免疫化された動物から得られた前記細胞を提供する工程をさらに含む、かつ／または
前記方法が、体細胞超突然変異を起こしたV(D)Jエクソンを含む前記細胞を提供する工程をさらに含む、および任意で、前記細胞が、胚中心Bリンパ球またはパイエル板Bリンパ球である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
工程（a）を実施する前に、
動物を抗原で免疫化する工程；および
該動物から細胞を得る工程
をさらに含む、かつ／または
前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、J遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、かつ／または
複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび／または二次遺伝子座特異的プライマーの使用をさらに含む、および任意で、前記複数のプライマーの各々が、異なるV、D、および／またはJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、および任意で、前記複数のプライマーの各々が、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在する各異なるJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、および任意で、集団的に前記複数のプライマーが、JH1、JH2、JH3、またはJH4の各々における1つの配列に特異的にアニーリングする、または、集団的に前記複数のプライマーが、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在するJH、JK、およびJL遺伝子セグメントの各々における少なくとも1つの配列に特異的にアニーリングする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、標的にされた前記遺伝子セグメントの縮重領域に特異的にアニーリングする、かつ／または
工程（a）を実施する前に、ソース細胞またはソース組織を分化させてV(D)J組換えを開始させる工程をさらに含む、および任意で、前記ソース細胞が人工多能性幹細胞である、もしくは前記ソース細胞が初代幹細胞である、かつ／または
工程（a）を実施する前に、前記細胞またはソースが、RAG1/2エンドヌクレアーゼを用いて形質導入されて、V(D)J組換えを開始する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞と、V(D)J組換えまたはSHMを開始させる1つまたはそれ以上の試薬とを接触させる工程をさらに含む、および任意で、V(D)J組換えを開始させる前記試薬がイマチニブである、および任意で、前記細胞が、v-ablウイルスで形質転換されたB細胞である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記再編成事象が、がん遺伝子および／またはRAGオフターゲット切断部位を伴う、かつ／または
前記細胞が、AID発現細胞；がん細胞；RAGエンドヌクレアーゼ発現細胞；または神経系細胞からなる群より選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記一次遺伝子座特異的プライマーが親和性タグを含む、および任意で、工程（c）の産物を親和性精製によって単離する工程をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記親和性タグがビオチンである、および任意で、前記親和性精製が、ビオチンとストレプトアビジンとを結合する工程を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記親和性精製が、工程（c）の産物を基質に結合することを含む、および任意で、前記基質がビーズである、請求項10〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ネステッドPCR工程のために使用される前記プライマーがバーコード配列を含む、かつ／または
前記断片化が、超音波処理または制限酵素消化によって実施される、かつ／または
前記断片化が、ゲノムDNAをランダムに剪断することによって、または高頻度切断制限酵素を用いて実施される、かつ／または
工程（c）の産物をアダプターにライゲーションする工程が、該産物と、同じ遠位部配列およびランダム近位部配列を有するアダプター集団とを接触させる工程を含む、かつ／または
前記アダプターの近位部が3〜10個のヌクレオチド長である、かつ／または
前記アダプターの近位部が5〜6個のヌクレオチド長である、かつ／または
前記アダプターが、遠位部と近位部との間にバーコード配列を含む、かつ／または
工程（e）において産生された前記PCR産物が、シーケンシングの前に選択されたサイズである、かつ／または
前記細胞が工程（a）の前に組織中に存在する、かつ／または
前記シーケンシングが、次世代シーケンシング法を使用して実施される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記アライメントする工程がヒト以外の機械によって実施される、および任意で、前記ヒト以外の機械がコンピュータ実行可能ソフトウェアを備える、または前記アライメントする工程の結果をディスプレイするためのディスプレイモジュールをさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アライメント工程の結果が、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルである、かつ／または
前記細胞が哺乳動物細胞である、かつ／または
ブロッキング消化工程（f）が省略される、かつ／または
末端修復が工程（c）の前に実施されない、かつ／または
前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32または43〜65より選択される配列を含む、かつ／または
前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32および43〜65より選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。