(57)【要約】      （修正有）【課題】相補鎖置換複製活性を有し、且つ、熱安定性の高いＤＮＡポリメラーゼを提供する。【解決手段】バシラス属またはジェオバシラス属由来の特定のアミノ酸配列を有するタンパク質、前記タンパク質において、Ｎ末端から１〜５１個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したタンパク質もしくは前記タンパク質において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質。【選択図】図３
2010183842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなることを特徴とするＤＮＡポリメラーゼ。
（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、Ｎ末端から１〜５１個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）いずれか記載のタンパク質の有するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
【請求項２】
６３℃〜７１．２℃の範囲における少なくともいずれかの温度において、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項３】
前記ＤＮＡポリメラーゼ活性が、相補鎖置換複製酵素活性を含む請求項１または２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４】
前記ＤＮＡポリメラーゼ活性が、逆転写酵素活性を含む請求項１から３のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項５】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している請求項１から４のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している請求項１から５のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかであることを特徴とするＤＮＡ。
（ａ）配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列との相同性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡであり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡであり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【請求項９】
請求項８に記載のＤＮＡを含む組み換えベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１１】
請求項１０に記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
【請求項１２】
鋳型核酸と、プライマーと、請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼとを、一定温度で反応させることを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項１３】
請求項１から７のいずれか一項に記載のＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅キット。
【請求項１４】
バシラス属またはジェオバシラス属由来の細菌からＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローン化する方法であって、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を含むことを特徴とする方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２〜４のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子断片とｍｕｔＭ遺伝子断片とを含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｂ）前記工程（ａ）で増幅した前記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で決定した前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーと、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅されたＤＮＡ断片をクローン化する工程
【請求項１５】
前記（ｃ）工程において、前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーが、配列番号８〜１０のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーであり、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーが、配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーである請求項１４記載のクローン化する方法。
【請求項１６】
請求項８に記載のＤＮＡの塩基配列またはその相補的な塩基配列において、連続する５〜５０塩基のＤＮＡからなり、且つ、ジェオバシラス属由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と特異的にハイブリダイズすることを特徴とするプライマー。
【請求項１７】
請求項８に記載のＤＮＡの塩基配列またはその相補的な塩基配列が、配列番号１５で表される塩基配列またはその相補的な塩基配列である請求項１６記載のプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なＤＮＡポリメラーゼ、それをコードするＤＮＡおよび前記ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは、ライフサイエンスの分野で最も汎用的な酵素の一つであり、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法をはじめとして、種々の技術に必須の酵素である。このようなＤＮＡポリメラーゼは、数多くの種類が販売されており、それぞれのポリメラーゼは、例えば、反応条件、酵素活性について特徴を持っている。最もよく知られている大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩは、鋳型ＤＮＡとプライマーとから鋳型と相補的な配列を合成する５’→３’ポリメラーゼ活性と共に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。これら３つの酵素活性は、各々異なる構造ドメインと関連することが知られている。すなわち、Ｎ末端側の５’→３’エキソヌクレアーゼドメイン、中央部の３’→５’エキソヌクレアーゼドメインおよびＣ末端側のポリメラーゼドメインである（例えば、非特許文献１参照）。前記ＤＮＡポリメラーゼＩをズブチリシンで処理して得られる７５ｋＤの大きな断片（ラージフラグメント）は、クレノウフラグメントとも呼ばれ、前記３つの活性のうち５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。このため、クレノウフラグメントは、ジデオキシ法シークエンス反応や、５’突出末端の平滑化反応等に有用である。現在では、ＤＮＡポリメラーゼＩのＮ末端側小断片を含まない組換えタンパク質として発現、精製されて、市販されている。
【０００３】
ＤＮＡの増幅技術としては、一般的にＰＣＲ法が利用されているが、複雑な温度制御が必要であること、これらの複雑な温度制御を行うためのサーマルサイクラーが必要であること、反応時間が数時間かかること等の問題点がある。そこで、ＰＣＲ法に代わる新たなＤＮＡの増幅技術として、近年、ＬＡＭＰ(Loop-mediated  Isothermal  Amplification)法（例えば、非特許文献２参照）、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法（例えば、特許文献１参照）、三谷らの方法（例えば、特許文献４、特許文献５、特許文献６、非特許文献３参照）等が開発されている。これらの方法は、等温での増幅反応が可能であるため、ＰＣＲのような複雑な温度制御や、それを実行するサーマルサイクラーが不要である。他方、等温での増幅反応のためには、相補鎖置換複製活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、特許文献２、特許文献３参照）が必須となっている。この相補鎖置換複製活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、現在、市場で入手できる種類が少なく、至適温度等の反応条件が限られており、あるいは、反応時間が長いという点等が指摘されている。このため、これらのＤＮＡ増幅方法を用いる検査・診断薬等の開発を制限している。
【０００４】
【特許文献１】特開平１０−３１３９００号公報
【特許文献２】特許第２９７８００１号公報
【特許文献３】特開平０９−２２４６８１号公報
【特許文献４】国際公開ＷＯ２００４／０４００１９号パンフレット
【特許文献５】国際公開ＷＯ２００５／０６３９７７号パンフレット
【特許文献６】国際公開ＷＯ２００１／０３０９９３号パンフレット
【非特許文献１】Kornberg,  A.,  Baker  TA.  DNA  Replication,  W.H.  Freeman  and  Company,  New  York,  1992.
【非特許文献２】Notomi,  T.  et  al.,  Nucleic  Acids  Research,  2000,  Vol.  28,  No.  12,  e63
【非特許文献３】Mitani  et  al.,  Nature  Methods,  2007,  Vol.  4,  No.  3,  257-262
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、ＳＤＡ法に用いられているＤＮＡポリメラーゼは、比較的低温で作用するため、前記増幅反応において、鋳型ＤＮＡとプライマーとのアニーリングの厳密性が低い。このため、副反応物が生じて増幅反応の特異性が低下することや、長い目的配列の増幅が難しい等の問題点が指摘されている。従って、本発明は、これらの問題点を解決するために、相補鎖置換複製活性を有し、且つ熱安定性の高い新たなＤＮＡポリメラーゼを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ジェオバシラス・カルドキシロシリティカス(Geobacillus caldoxylosilyticus)より、通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性および相補鎖置換複製活性を有し、且つ、熱安定性の高い、新規なＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを単離し、これを用いて新規耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得ることにより本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、第一の視点において、本発明は、少なくとも以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかのタンパク質からなるＤＮＡポリメラーゼを含む。
（ａ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号１６で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｃ）配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、Ｎ末端から１〜５１個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したタンパク質
（ｄ）前記（ａ）〜（ｃ）いずれか記載のタンパク質の有するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質
なお、「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは１〜５個程度である。
【０００８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、６３℃〜７１．２℃の範囲における少なくともいずれかの温度において活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼである。
【０００９】
つぎに、第二の視点において、本発明は、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかであることを特徴とするＤＮＡを含む。
（ａ）配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｄ）前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列との相同性が８０％以上の塩基配列からなるＤＮＡであり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）前記（ａ）または（ｂ）に記載の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡであり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
【００１０】
上記（ｄ）において、ストリンジェントな条件とは、以下に詳細に説明するが、例えば、６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄条件があげられる。このような条件下、例えば、前記塩基配列の一部または全部からなるプローブを用いて、目的生物の遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって、このようなＤＮＡを取得することができる。
【００１１】
また、本発明は、別の視点において、本発明のＤＮＡを含む組み換えベクターを提供する。前記ベクターは、例えば、宿主細胞に導入した際、前記宿主細胞内で、本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を産生し得る組換えベクターであって、前記組換えベクターは、前記宿主細胞内における発現制御配列に機能的に結合されていることが好ましい。本発明において、機能的に結合、機能的に配置とは、それが意図する機能を発揮しうる状態で結合（連結）または配置されていることを意味する。さらに、本発明は、本発明の組換えベクターを含む形質転換体、および、前記形質転換体を培養し、得られる培養物からＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とするＤＮＡポリメラーゼの製造方法も提供する。
【００１２】
本発明は、さらに異なる視点において、前記本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いる核酸増幅法を提供する。前記核酸増幅法は、鋳型核酸と、プライマーと、本発明のＤＮＡポリメラーゼとを、一定温度で反応させることを特徴とする。本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含む核酸増幅キットも提供する。この本発明の核酸増幅キットにより、本発明の核酸増幅方法を、簡便且つ容易に実施できる。
【００１３】
本発明は、別の視点において、バシラス属（Bacillus）またはジェオバシラス属（Geobacillus）由来の細菌からＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローン化する方法を提供する。前記方法は、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２〜４のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子断片とｍｕｔＭ遺伝子断片とを含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｂ）前記工程（ａ）で増幅した前記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で決定した前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーと、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅されたＤＮＡ断片をクローン化する工程
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌であるジェオバシラス属（Geobacillus）より単離されたものであるため、例えば、相補鎖置換複製酵素活性を持つ従来のＤＮＡポリメラーゼよりも高温度の反応条件で活性を有する。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼによれば、相補鎖置換複製酵素活性を持つ従来のＤＮＡポリメラーゼよりも、速い速度で核酸の増幅を行うことができる。このような性質から、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＰＣＲ等のように複数回にわたる温度変化の工程や温度変化のための特有の機器を必要としない等温増幅法に用いることができる。そして、本発明のＤＮＡポリメラーゼによれば、例えば、従来の酵素と比較して、より高温での反応が可能となるため、より正確に効率良く増幅反応を行うことができる。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、逆転写活性を有してもよく、この場合、例えば、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成でき、従来の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の代替法に利用することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ジェオバシラス属（Geobacillus）の微生物から単離することができ、好ましくは、ジェオバシラス・カルドキシロシリティカス(Geobacillus caldoxylosilyticus)から、さらに好ましくは、Geobacillus caldoxylosilyticus  DSM12041株から単離できる。本菌株は、ＤＳＭＺ社（Deutsche  Sammlung  von  Mikroorganismen  und  Zellkulturen  GmbH（German  Collection  of  Microorganisms  and  Cell  Cultures)）より購入可能である（http://www.dsmz.de/index.htm）。なお、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、以下、「本発明のＤＮＡポリメラーゼ（またはＤＮＡポリメラーゼＩ）」、「本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ」または「本発明のタンパク質」という場合もある。
【００１６】
本発明において、例えば、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術等の一般的方法は、当該技術分野の標準的な参考書籍を参照して実施できる。これらには、例えば、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual  第３版（Sambrook  &  Russell、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、2001）；Current  Protocols  in  Molecular  biology（Ausubelら編、John  Wiley  &  Sons、1987）；Methods  in  Enzymologyシリーズ（Academic  Press）；PCR  Protocols:  Methods  in  Molecular  Biology（Bartlett  &  Striling編、Humana  Press、2003）；Antiboides：A  Laboratory  Manual（Harlowら  &  Lane編、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、1987）等が含まれる。また、本明細書において参照される試薬およびキット類等は、例えば、Sigma社、Aldrich社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社、Qiagen社、Promega社、Roche  Diagnostics社、Becton-Dickinson社、TaKaRa（タカラバイオ株式会社）等の市販業者から入手可能である。
【００１７】
＜本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびこれをコードするＤＮＡ＞
近縁のバシラス属微生物では、一般に、ＤＮＡポリメラーゼＩをコードする遺伝子（ｐｏｌＡ）の上流にｐｈｏＲ遺伝子が、下流にｍｕｔＭ遺伝子が保存されている。そこで、例えば、保存されている遺伝子の塩基配列を決定し、これに基づいてｐｏｌＡクローニング用プライマーを設計し、遺伝子増幅を行うことによって、例えば、バシラス属またはジェオバシラス属のＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子（ｐｏｌＡ）を単離することができる。以下に具体例を示すが、本発明はこれには制限されない。
【００１８】
第一の具体例としては、まず、バシラス属微生物のＤＮＡポリメラーゼＩにおいて保存されているアミノ酸配列から、逆翻訳によりプライマー（例えば、フォワードプライマー）を設計する。他方、ｍｕｔＭの保存領域から、プライマー（例えば、リバースプライマー）を設計する。そして、これらのプライマーセットを用いて、目的の細菌（例えば、ジェオバシラス属微生物）のゲノムＤＮＡを鋳型として、遺伝子増幅を行う。次いで、増幅産物の塩基配列を決定し、その情報からｐｏｌＡを増幅するためのプライマーを設計し、ゲノムＤＮＡについて遺伝子増幅を行う。これによって、ｐｏｌＡを含むＤＮＡを得ることができる。
【００１９】
本発明は、このようなプライマーを用いて、バシラス属やその近縁微生物（例えば、ジェオバシラス属細菌）からＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を単離する方法を含む。本発明の方法は、下記（ａ）〜（ｄ）の工程を含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマーと、配列番号２〜４のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子断片とｍｕｔＭ遺伝子断片とを含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｂ）前記工程（ａ）で増幅した前記ＤＮＡ断片の塩基配列を決定する工程
（ｃ）前記工程（ｂ）で決定した前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーと、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとを用い、前記細菌から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅する工程
（ｄ）前記工程（ｃ）で増幅されたＤＮＡ断片をクローン化する工程
【００２０】
プライマーの長さは、制限されず、種々の実験条件によって適宜調節可能であるが、例えば、１５〜５０塩基長、好ましくは１８〜４０塩基長、最も好ましくは２５〜３５塩基長である。また、前記（ｃ）工程において、前記ＤＮＡ断片のセンス鎖の部分配列からなるプライマーとしては、例えば、配列番号８〜１０のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーがあげられる。また、前記ＤＮＡ断片のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとしては、配列番号５〜７のいずれかに記載の塩基配列からなるプライマーがあげられる。これらのプライマーは、例えば、アミノ酸のコドン使用を考慮して、特定の塩基について縮重した混合プライマーであってもよい。
【００２１】
また、第二の具体例としては、例えば、保存されているｐｈｏＲおよびｍｕｔＭの塩基配列からプライマーを設計する方法があげられる。例えば、まず、保存されているｐｈｏＲおよびｍｕｔＭの塩基配列を決定し、これに基づいて、各遺伝子（ｐｈｏＲおよびｍｕｔＭ）を増幅するための、一対または複数対のプライマーを設計する。次いで、得られた増幅産物をクローン化し、塩基配列を決定する。前述のように、種々のバシラス属微生物のゲノム構造から、ｐｈｏＲ、ｐｏｌＡおよびｍｕｔＭの３つの遺伝子は、いずれも同一方向に転写されることが知られている。そこで、例えば、ｐｈｏＲ遺伝子配列のセンス鎖の部分配列からなるプライマーと、ｍｕｔＭ遺伝子配列のアンチセンス鎖の部分配列からなるプライマーとを用い、目的の細菌（例えば、ジェオバシラス属微生物）から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅を行う。そして、増幅されたＤＮＡ断片をクローン化することにより、ｐｏｌＡ遺伝子を含むＤＮＡを取得することができる。
【００２２】
プライマーの長さは、制限されず、種々の実験条件によって適宜調節可能であるが、例えば、１５〜５０塩基長、好ましくは１８〜４０塩基長、最も好ましくは２５〜３５塩基長である。
【００２３】
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性として、通常の鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性および相補鎖置換複製酵素活性を有し、例えば、さらに、逆転写酵素活性を有する。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、さらに３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有していてもよい。本発明のＤＮＡポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有すれば、例えば、基質を取り込む際のエラーをより減少することが可能である。本発明のＤＮＡポリメラーゼの至適温度は、例えば、公知の相補鎖置換複製酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの至適温度（例えば、２０〜３７℃）より高温度である。具体的には、例えば、３７〜８０℃の反応温度でも活性を有し、好ましくは６３〜７１．２℃の反応温度でも活性を有する。従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、相補鎖置換複製酵素活性を有する従来のＤＮＡポリメラーゼよりも高温度の反応条件で用いることができる。このため、例えば、前述のようなＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、三谷らの方法等の等温増幅法等において、鋳型ＤＮＡとプライマーとのより厳密なアニーリング条件下で使用することが可能である。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素活性を有する場合、例えば、ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成でき、従来のＲＴ−ＰＣＲの代替法にも利用できる。
【００２４】
本発明は、前述のようにして得られるＤＮＡポリメラーゼであるタンパク質および前記ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを包含する。
【００２５】
配列番号１３に、本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列の一例を、配列番号１４に、本発明のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の一例を示す。なお、本発明は、これらの配列に限定されない。
【００２６】
さらに、本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端側アミノ酸残基を欠失させたＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼ、および、それをコードするＤＮＡも包含する。欠失させるＮ末端側のアミノ酸残基数は、例えば、得られるＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼが相補鎖置換複製酵素活性を有する限りにおいて、特に限定されない。具体例としては、前記Ｎ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、例えば、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントに対応する活性を有するものが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、Ｎ末端から１〜５１個の任意の個数の連続するアミノ酸残基が欠失したタンパク質があげられる。Ｎ末端から欠失するアミノ酸の残基数が相対的に多い場合に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失する可能性が相対的に高いと考えられる。本発明の一例として、大腸菌のクレノウフラグメントに対応するＮ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１５に、前記Ｎ末端欠失ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列番号１６に、それぞれ示す。このように、本発明のＤＮＡポリメラーゼが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失する場合、例えば、遺伝子増幅を行う際に、得られた増幅産物の分解を防止できるという利点を有する。
【００２７】
さらに、本発明は、前記ＤＮＡポリメラーゼであって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質、および、前記タンパク質をコードするＤＮＡを包含する。種々のＤＮＡポリメラーゼＩについて、各アミノ酸配列を比較すると、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素には、酵素タンパク質の中央部に３つの共通配列モチーフが存在することが知られている。これらのモチーフを除去した酵素を作製することができる、例えば、市販の好熱性細菌由来のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している（Aliotta,  J.M.  et  al.,  Genetic  Analysis:  Biomolecular  Engineering,  Vol.  12,  pp.  185-195,  1996）。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼは、例えば、核酸増幅反応に用いた際、プライマーの３’末端を分解することがない。このため、プライマー濃度の低下が十分に防止されることによって、核酸増殖速度がより速くなるという利点がある。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼは、例えば、点突然変異の検出への使用に適している。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているＤＮＡポリメラーゼによれば、例えば、プライマーが３’側から分解されることを十分に防止できることから、プライマーは、鋳型ＤＮＡの変異箇所を十分に識別することができる。
【００２８】
一方、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の発現には、例えば、活性中心のカルボキシル基に配位する２つの金属イオンが重要であることが示唆されている。そこで、例えば、このようなアミノ酸を活性中心に導入することによって、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の低いＤＮＡポリメラーゼについて、前記酵素活性を増強することも可能である(Park,  Y.  et al.,  Mol  Cells.  Vol.  7,  No.3,  pp.419-24,  1997)。
【００２９】
また、本発明のＤＮＡには、例えば、前述のいずれかのＤＮＡに対して相補的な配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも含まれる。ここで「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ＭのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣとは、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸ナトリウムからなる。ストリンジェンシーの選択のため、例えば、洗浄工程における塩濃度や温度を適宜最適化することができる。また、当業者であれば、ストリンジェンシーを上げるために、例えば、ホルムアミドやＳＤＳ等を添加することも技術常識である。
【００３０】
また、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１３で表される塩基配列からなるＤＮＡと、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、例えば、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、且つ、ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを含む。また、本発明のＤＮＡは、この他に、例えば、配列番号１５で表される塩基配列からなるＤＮＡと、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算したときに、例えば、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有しており、且つ、ＤＮＡポリメラーゼの活性を有するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しているタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡも含む。さらに、本発明は、前記ＤＮＡに対するＲＮＡ、例えば、前記ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ、若しくは、アンチセンスＲＮＡ等も含む。
【００３１】
さらに、本発明のＤＮＡは、例えば、配列番号１３または１５に表される塩基配列の縮重変異体も含む。また、本発明は、前述のＤＮＡの相補的な配列からなるＤＮＡも含む。
【００３２】
遺伝子に変異を導入する方法は、制限されないが、例えば、Ｋｕｎｋｅｌ法またはギャップ二重鎖(Gapped  duplex)法等の公知手法またはこれに準ずる方法によって行うことができる。また、例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えば、Mutant-K(TAKARA社製）、Mutant-G(TAKARA社製）等)、LA  PCR  in  vitro  Mutagenesis  シリーズキット（TAKARA社）等を利用することもできる。
【００３３】
さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、前述のいずれかのタンパク質の有するアミノ酸配列において、例えば、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質を含む。「１または数個のアミノ酸」とは、例えば、全長アミノ酸残基数の多くとも５〜１０％程度をいい、例えば、１〜５０個程度、好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、最も好ましくは１〜５個程度である。
【００３４】
ＤＮＡポリメラーゼの活性測定方法は、制限されず、当業者に周知の種々の方法により測定することができる。ＤＮＡポリメラーゼ活性のうち鋳型依存性のＤＮＡ複製酵素活性は、例えば、文献（Seville  M.  et  al.  Biotechniques  Vol.21,  pp.664-668  (1996)）等に記載されている蛍光定量的な測定方法を用いることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性のうち相補鎖置換複製酵素活性は、例えば、前述の非特許文献１（Kornberg,  A.,  Baker  TA.  DNA  Replication,  W.H.  Freeman  and  Company,  New  York,  1992.）等に記載されている測定方法を用いることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性のうち逆転写酵素活性は、例えば、市販キット（例えば、EnzChek（商標）  Reverse  Transcriptase  Assay  Kit  (E-22064)  Molecular  Probes  (Invitrogen社製)）を使用し、そのプロトコールに従って測定できる。
【００３５】
さらに、本発明の他の実施形態において、本発明のＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、配列番号１４もしくは１６に示したアミノ酸配列からなるタンパク質、または、前記アミノ酸配列と、例えば、少なくとも５０％、好ましくは７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％以上の相同性を有するタンパク質からなり、且つ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するタンパク質が提供される。タンパク質の相同性（ホモロジー）の程度は、通常、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、前記両アミノ酸配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は、種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定できる（Altschul  SF  J  Mol  Biol  1990  Oct  5;  215(3):403-10）。
【００３６】
＜本発明のプライマーおよびプローブ＞
つぎに、本発明は、生物からＤＮＡポリメラーゼを単離するために用いるプライマーおよびプローブを包含する。本発明のプライマーおよび本発明のプローブは、前述の本発明のＤＮＡの断片であり、塩基の数は、例えば、５〜５０である。塩基数の下限は、例えば、５以上であり、好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上であり、塩基数の上限は、例えば、５０以下であり、好ましくは３０以下であり、より好ましくは２５以下である。また、好ましい範囲の具体例としては、例えば、１０〜５０であり、より好ましくは１０〜３０、より好ましくは１５〜２５である。増幅させる塩基配列の長さは、特に制限されない。本発明のプライマーの具体例としては、例えば、配列番号１〜１０のいずれかに表されるプライマーがあげられ、いずれか１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。中でも、配列番号８〜１０で表される少なくとも１つのプライマーをフォワードプライマーとして、配列番号５〜７で表される少なくとも１つのプライマーをリバースプライマーとして、それぞれ組み合わせて使用することが好ましい。
【００３７】
＜本発明の組換えベクター＞
本発明の組換えベクターは、前述のように、本発明のＤＮＡを含む。本発明の組換えベクターは、例えば、適当なベクターに本発明のＤＮＡを連結(挿入)することにより得られる。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、例えば、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えば、ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）等が挙げられる。ファージＤＮＡとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）等が挙げられる。さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等を用いることもできる。
【００３８】
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等があげられる。本発明のＤＮＡは、例えば、それがコードするタンパク質が発現されるように、前記ベクターに組み込まれることが好ましい。そこで、本発明におけるベクターには、例えば、プロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等）の他に、所望により、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等を連結することもできる。前記選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
【００３９】
＜本発明の形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のように、本発明の組換えベクターを含む。本発明の形質転換体は、例えば、本発明のタンパク質を発現し得るように、本発明のＤＮＡを宿主に導入することにより得られる。形質転換は、例えば、簡便で効率が良いことから、多くの場合、ベクターを用いて行われる。本発明においては、本発明の組換えベクターを宿主に導入することによって得られる。ここで、宿主としては、本発明のタンパク質を発現できるものであれば、特に限定されるものではない。前記宿主としては、例えば、大腸菌(Escherichia coli)等のエッシェリヒア属、バシラス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)等のリゾビウム属に属する細菌等が挙げられる。また、この他に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、さらに、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞等も挙げられる。あるいは、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
【００４０】
形質転換方法としては、制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法(Cohen,  S.N.  et  al.  (1972)  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.,  USA  69,  2110-2114)、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法等があげられる。
【００４１】
＜本発明のＤＮＡポリメラーゼの製造方法）
本発明のＤＮＡポリメラーゼは、例えば、本発明の形質転換体を培養し、得られる培養物からタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を採取することにより得ることができる。「培養物」とは、例えば、培養上清の他、培養細胞若しくは培養菌体、または、細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する。また、「本発明の形質転換体を培養する方法」は、例えば、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われ、その条件等は、例えば、宿主の種類等に応じて適宜決定できる。
【００４２】
培養後、本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）が、菌体内または細胞内に生産される場合には、例えば、菌体または細胞を破砕することにより前記タンパク質を抽出する。また、本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）が、菌体外または細胞外に生産される場合には、例えば、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により前記培養液から菌体または細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を、単独で、または、適宜組み合わせて用いることによって、前記培養物から本発明のタンパク質（ＤＮＡポリメラーゼ）を精製することができる。前記単離精製の方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があげられる。また、例えば、精製のために、発現するタンパク質にタグ配列を付加している場合には、前記精製工程の間または後に、プロテアーゼ処理等により、前記タグ配列を除去することもできる。
【００４３】
＜抗体＞
本発明は、さらに、本発明のＤＮＡポリメラーゼに対する抗体をも含む。前記「抗体」には、例えば、好適な任意のフラグメントまたは誘導体も含まれる。このような広義の抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体（diabody）（融合した同一のＦｖフラグメントの２つのコピー）、単鎖抗体、および、２以上の抗体フラグメントから形成される多重特異性（multi-specific）抗体等が含まれる。前記抗体は、例えば、本発明のＤＮＡポリメラーゼの精製に用いることができる。前記抗体の製造方法は、制限されず、例えば、従来公知の方法により製造できる。
【００４４】
＜本発明の核酸増幅法およびキット＞
さらに、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸を増幅する方法を含む。本発明の核酸増幅方法においては、ＤＮＡポリメラーゼとして本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用することが特徴であり、その他の構成や工程は制限されない。前記核酸増幅方法としては、例えば、公知のＰＣＲ法（例えば、特許第２５０２０４１号、第２５４６５７６号および第２７０３１９４号公報等参照）、ＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、Trends  in  Biothechnology  Vol.10,  pp.146-153,  1992参照）、三谷らの方法（国際公開ＷＯ０１／０３０９９３号パンフレット、国際公開ＷＯ２００４／０４００１９号パンフレット、国際公開ＷＯ２００５／０６３９７７号パンフレット参照）、ＬＡＭＰ法（例えば、非特許文献１参照）、ＳＤＡ法（例えば、特許文献１）、ＩＣＡＮ（登録商標）(Isothermal  and  Chimeric  primer-initiated  Amplification  of  Nucleic  acid)法（例えば、国際公開ＷＯ００／５６８７７号パンフレット参照）、ＮＡＳＢＡ(Nucleic  Acid  Sequence  Based  Amplification)法（例えば、特許第２６５０１５９号公報参照）等が挙げられる。本発明は、制限されず、例えば、これらのいずれの増幅方法にも適用できるが、中でも、特に、三谷らの方法（ＳＭＡＰ法（Smart  Amplification  Process）法ともいう）、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ（登録商標）法等の等温増幅法に適している。これらの遺伝子増幅法において、前述のように、従来用いられているＤＮＡポリメラーゼに代えて、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。すなわち、本発明の核酸増幅方法の一実施形態（等温増幅法）として、例えば、鋳型核酸と、プライマー（例えば、少なくとも２種類のプライマー）と、本発明のＤＮＡポリメラーゼとを一定温度で反応させる方法があげられる。
【００４５】
さらに、本発明は、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含有する核酸増幅キットを含む。本発明の核酸増幅キットは、前述のいずれかの核酸増幅方法に適応させたキットであり、本発明の核酸増幅キットによれば、例えば、容易且つ簡便に、前述の本発明の核酸増幅方法を行うことができる。本発明の核酸増幅キットは、本発明のＤＮＡポリメラーゼを含んでいればよく、その他の構成等は制限されない。その他の構成等は、前述の核酸増幅方法に応じて適宜決定できる。本発明の拡散増幅キットは、本発明のＤＮＡポリメラーゼの他に、例えば、プライマー、ｄＮＴＰｓ、トリス塩酸緩衝液等の各種緩衝液、硫酸マグネシウム、ベタイン等を含んでもよい。前記プライマーは、例えば、少なくとも２種類のプライマーが好ましく、例えば、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含むプライマーセットがあげられる。
【００４６】
本発明を以下の実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４７】
［ジェオバシラス・カルドキシロシリティカス(Geobacillus caldoxylosilyticus)ＤＮＡポリメラーゼＩ遺伝子（ｐｏｌＡ）のクローニング］
G.  caldoxylosilyticus  DSM12041の培養菌体より、定法によりゲノムＤＮＡを調製した。次いで、バシラス属の他種のｐｏｌＡの遺伝子構造より、下流にｍｕｔＭが保存されていることから、ｐｏｌＡおよびｍｕｔＭの保存領域から、以下に示すプライマーを合成した。
【００４８】
ｐｏｌＡクローニング用ＰＣＲプライマー
BD3F（Fwd）：5'-GAKCCNAAYYTRCAAAAYATHCC-3'（配列番号１）
【００４９】
ｍｕｔＭクローニング用ＰＣＲプライマー
mutMRev1(x288)：5'-AAAGAGGTGCATCGTTCCRAAYT-3'（配列番号２）
mutMRev2(x324)：5'-TCBACATADATRTTBCCVAGYCC-3'（配列番号３）
mutMRev3(x864)：5'-CCBCKYCCBCCAACRACHRTYTT-3'（配列番号４）
【００５０】
なお、前記配列中において、Ｒは、グアニンまたはアデニンのプリン塩基を、Ｙは、チミンまたはシトシンのピリミジン塩基を、Ｍは、アデニンまたはシトシンを、Ｋは、グアニンまたはチミンを、Ｓは、グアニンまたはシトシンを、Ｗは、アデニンまたはチミンを、Ｄは、アデニンまたはグアニンまたはチミンを、Ｈは、アデニンまたはシトシンまたはチミンを、Ｖは、アデニンまたはグアニンまたはシトシンを、Ｎは、４種類（グアニン、アデニン、シトシン、チミン）のいずれかの塩基をそれぞれ表す。また、括弧内の数字は組み合わせによる種類数を表す。また、Fwdは、正方向（フォワード）プライマー、Revは、逆方向（リバース）プライマーを示す。なお、以下の配列についても同様である。
【００５１】
前記調製したゲノムＤＮＡを鋳型として、正方向（Ｆｗｄ）プライマーおよび逆方向（Ｒｅｖ）プライマーの各組み合わせによりＰＣＲを行って、ＤＮＡを増幅させた。増幅したＤＮＡ断片を、クローニングキット（インビトロジェン社製、TOPO  TA  PCRクローニングキット）を用いて、プラスミドベクターにクローニングした。具体的には、正方向プライマーとしてBD3Fを、逆方向プライマーとして、mutMRev1、mutMRev2およびmutMRev3のいずれかを、それぞれ用いて、ｐｏｌＡの部分配列およびｍｕｔＭの部分配列を含むＤＮＡ断片（約１〜２ｋｂ）を増幅した。そして、ベクターにクローニングした前記増幅ＤＮＡ断片について、塩基配列を決定した。ｐｏｌＡおよびｍｕｔＭを含むと推測される前記ＤＮＡ断片の塩基配列より、ｐｏｌＡ遺伝子をクローン化するための下記プライマーを合成した。
【００５２】
GcaR2（Rev）：5'-AGAGTGCGGCGAATCGTTTCTACT-3'  （配列番号５）
GcaR3（Rev）：5'-TTGCTGCAGCCGCTTTACTTCTTC-3'  （配列番号６）
GcaR4（Rev）：5'-GCTGCAGCCGCTTTACTTCTTCTT-3'  （配列番号７）
FPR1（Fwd）：5'-TCGAGCTCTCATTGGAGGAT-3'  （配列番号８）
FPR2（Fwd）：5'-TGCTGAAGCAATTTGGTACG-3'  （配列番号９）
FPR3（Fwd）：5'-TCGAGCAAATCAATGGGAAC-3'  （配列番号１０）
【００５３】
調製した前記ゲノムＤＮＡを鋳型とし、FPR1〜FPR3のいずれかの正方向プライマーとGcaR2、GcaR3およびGcaR4のいずれかの逆方向プライマーとを組み合わせ、ＰＣＲによりＤＮＡを増幅させた。増幅したＤＮＡ断片を、クローニングキット（インビトロジェン社製、TOPO  TA  PCRクローニングキット）を用いて、プラスミドベクターにクローニングした。そして、ベクターにクローニングした前記増幅ＤＮＡ断片について、塩基配列を決定した。ここで決定された塩基配列ならびに前記塩基配列がコードするアミノ酸配列を、配列番号１３および配列番号１４にそれぞれ示す。
【００５４】
決定した塩基配列に基づいて、下記プライマーを合成し、大腸菌（E.  coli）のクレノウフラグメントのＮ末端と同等位置に相当するＤＮＡ断片を、ＰＣＲにより増幅した。なお、下記プライマーの設計により、増幅するＤＮＡ断片の５’末端側にＮｄｅＩ認識配列を、３’末端側にＢａｍＨＩ認識配列を、それぞれ導入した。
【００５５】
GcaLF1  NdeI（Fwd）:
5'-GAGACATATGGTCGAGGAAGTAAGCGAGTCGG-3'    （配列番号１１）
R1BamS2  BamHI（Rev）:
5'-GAGAGGATCCAGAGTGCGGCGAATCGTTTCTACT-3'  （配列番号１２）
【００５６】
増幅したＤＮＡ断片を、クローニングキット（インビトロジェン社製、TOPO  TA  PCRクローニングキット）を用いて、プラスミドベクターにクローニングした。そして、前記ＤＮＡ断片をクローニングしたプラスミドベクターとプラスミドベクターｐＹＳＮとを、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、両者を混合して、連結した。これによって、Ｎ末端欠失型ＧｃａＤＮＡポリメラーゼ（以下、「ΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼ」、「ＧｃａＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント」ともいう）の発現プラスミドｐｄＮＧｃａを構築した。ΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列、ならびに、前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を、配列番１６および配列番号１５にそれぞれ示す。
【実施例２】
【００５７】
［Ｎ末端欠失型ＡａｃＤＮＡポリメラーゼの発現および精製］
（１）培養、発現および粗抽出液の調製
ｐｄＮＧｃａを有する大腸菌ＤＨ５αを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌにて、３７℃で一晩培養し、これを前培養液とした。この前培養液５ｍｌを、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃、２００ｒｐｍで振盪培養（Orbital  Shaking  Incubator,  FIRSTEK  OSI-502LD）を行った。培養液のＯＤ６００ｎｍ値が０．５付近となった時点で、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加した。さらに、３７℃、２００ｒｐｍで１〜２時間振盪培養した。続いて、培養液を遠沈管に移し、４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、沈殿を得た。この沈殿を１×ＰＢＳ  ３０ｍｌに懸濁し、再度、４，０００×ｇ、１０分間の遠心分離を行い、菌体を洗浄した。沈殿を１×ＰＢＳ  ２５ｍｌに懸濁し、１回あたり１０秒間として合計６回、超音波による細胞の破砕を行った（MISONIX  Astrason  Ultrasonic  processor  XL）。超音波破砕後の試料を、１５，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。この上清に、３０％ポリエチレンイミン溶液を終濃度０．１％となるように添加して混合し、氷中で３０分間放置した後、１５，０００×ｇ、３０分間の遠心分離を行い、上清を得た。得られた上清を粗抽出液とした。
【００５８】
（２）陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製強陰イオン交換カラムＨｉＴｒａｐＱとを用いて、イオン交換クロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）と１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールとの混合液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述の粗抽出液をアプライした後、非吸着画分を前記ランニングバッファーで洗浄した。約１５カラム容量の０〜１Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮・脱塩し、これを陰イオン交換画分とした。
【００５９】
（３）ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ヘパリンアフィニティーカラムＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎとを用いて、ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィーを行った。ランニングバッファーとして、前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに同じ溶液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述の陰イオン交換画分をアプライした後、非吸着画分を前記ランニングバッファーで洗浄した。約２２カラム容量の０〜１Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配により吸着画分を溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。前記回収画分を限外濾過膜を用いて、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ塩化ナトリウムとの混合液にバッファー置換を行い、さらに濃縮して、これをヘパリン画分とした。
【００６０】
（４）ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  １０ＸＴ高速液体クロマトグラフィーシステムとＧＥヘルスケア社製ゲルろ過カラムＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ  ｇｒａｄｅとを用いて、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー行った。ランニングバッファーとして、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と０．２Ｍ塩化ナトリウムとの混合液を用いた。流速１ｍｌ／分でカラムを平衡化し、前述のヘパリン画分をアプライした後、前記ランニングバッファーで溶出した。溶出画分は、１ｍｌごとに分画し、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥに供してタンパク質バンドを確認した。そして、該当する分子量のタンパク質バンドを有する画分を回収した。前記回収画分を限外濾過膜を用いて濃縮し、保存バッファーにバッファー交換を行った。これを精製酵素標品とした。なお、前記保存バッファーの組成は、５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０％グリセロールとした。
【実施例３】
【００６１】
［ＤＮＡポリメラーゼ活性測定］
インビトロジェン社製Picogreen  dsDNA定量試薬を用いて、Seville  M.  et  al.  Biotechniques  Vol.21,  pp.664-668  (1996)を参考に、前記精製酵素標品のＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した。具体的には、前記Picogreen  dsDNA定量試薬とＴＥ緩衝液とを、体積比１：３４５となるように混合した。そして、この混合液１７３μｌを、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰおよび前記精製酵素標品の混合物２７μｌに添加した。この反応液を所定の温度（６０℃、６５℃、７０℃）で５分間放置した後、励起波長４８０ｎｍ、測定波長５２０ｎｍにて蛍光を測定した。この際、単位が既知である市販のクレノウフラグメント（市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ；ＮＥＢ社製）についても同様に蛍光測定を行い、その測定値より、相対値としての酵素単位を算出した。以下に測定の一例を示す。なお、標準曲線は、測定ごとに作成し、反応温度は６５℃とした。市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ社製、以下同様）を標準として、Picogreen  dsDNA定量試薬により、各希釈倍での蛍光強度を測定した。この結果を表１に示す。
【００６２】
【表１】
2010183842.tif 000003
【００６３】
これらの結果をプロットし、１次直線に回帰したところ、次の式を得た。回帰曲線を図１に示す。下記式において、ｘは、ポリメラーゼ活性のユニット、ｙは、蛍光強度を示す。また、ＤＮＡポリメラーゼ活性は、６５℃において３０分間に１０ｎｍｏｌのｄＮＴＰを酸不溶性画分に取り込む酵素量を１ｕｎｉｔとする。
ｙ＝３３．７２５ｘ＋９６．５６８  (Ｒ２＝０．９９５２)
【００６４】
また、測定した精製酵素標品（ΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼ）は、反応温度６０℃における蛍光強度が、平均２７３．５５２(１回目２６８．０１２、２回目２７９．０９１)、６５℃における蛍光強度が、平均３０４．８３７(１回目３１６．１７８、２回目２９３．４９５)、７０℃における蛍光強度が、平均２５４．２９８(１回目２７０．３９０、２回目２３８．２０５)を示した。このため、前記回帰直線式より、６０℃では約５．２５ｕｎｉｔ、６５℃では約６．１８ｕｎｉｔ、７０℃では約４．６８ｕｎｉｔと算出された。この結果から、実施例２で得られた精製酵素標品は、ＤＮＡポリメラーゼであることが確認できた。以下、精製酵素標品を、ΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼともいう。
【実施例４】
【００６５】
［相補鎖置換型複製活性測定］
前述の非特許文献２（Notomi,  T.  et  al.,  Nucleic  Acids  Research,  2000,  Vol.  28,  No.  12,  e63）に記載された方法に従って、活性測定を行った。まず、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ、０．８μＭ  ＦＩＰ、０．８μＭ  ＢＩＰ、０．２μＭ  Ｆ３、０．２μＭ  Ｂ３の各合成ＤＮＡ、１Ｍベタイン、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１％トリトンＸ−１００、２−４ｍＭ硫酸マグネシウムの混合物２０μｌを調製した。これを９５℃で５分間放置し、次いで、氷上で５分間放置した。これに前述の精製酵素標品５μｌを加えて所定の反応温度（６３℃〜７４℃）で１時間放置した後、アガロースゲル電気泳動に供した。この際、単位が既知であるＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を同様にして電気泳動に供した。そして、精製酵素標品の電気泳動後の精製物のバンドの濃さと、単位が既知のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼの電気泳動後の精製物のバンドの濃さとを比較することにより、相対値としての酵素単位を算出した。なお、ブランクとして、前記精製酵素標品に代えて、前記トリス塩酸緩衝液を添加したものについても電気泳動を行った。また、ネガティブコントロールとして、鋳型ＤＮＡを添加しないものについても電気泳動を行った。これらの結果を、図２に示す。
【００６６】
図２は、所定の温度で増幅させた遺伝子増幅産物の電気泳動写真である。同図において、レーン１および１９は、分子量マーカー（λ−ＳｔｙＩ）の結果であり、レーン２、５および１８は、ブランクの結果であり、レーン４は、ネガティブコントロールの結果（w／ｏ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）である。レーン３は、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を用いた結果であり、レーン６〜１７は、前記精製酵素標品（ΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼ）を用いた結果である。なお、図中に、各レーンにおける反応温度（℃）を記載する。
【００６７】
図２に示すように、精製酵素標品、すなわち、実施例２で得られたΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼは、相補鎖置換型複製活性を有することが確認された。また、さらに、高温領域（約７１．２℃までの高温領域）で、前記活性が確認された。このように、高温領域での活性が認められることから、ΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼは、高温で安定な酵素であることがわかる。
【実施例５】
【００６８】
［等温増幅］
三谷らの方法（例えば、特許文献４（特許第３８６７９２６）、特許文献５参照）に従い、核酸の等温増幅を行った。下記組成を有する反応液１０μｌを調製し、これを６５℃で６０分間反応させた。この反応を、Ｍｘ３０００Ｐ（商品名、Stratagene社製）を用いて、リアルタイムでモニタリングした。比較例としては、ΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼに代えて、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）を、下記反応液において終濃度０．６４ユニット／μｌとなるように添加し、同様にしてリアルタイムでモニタリングを行った。これらの結果を図３に示す。
【００６９】
【表２】
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【００７０】
プライマー配列
ＥＮＺＯ：5’-CGCTGCACATGGCCTGGGGCCTCCTGCTCA-3’      （配列番号１７）
ＳＭＡＰ：5’-TTTATATATATATAAACCCCTGCACTGTTTCCCAGA-3’（配列番号１８）
Ｌｏｏｐ：5’-ATCCGGATGTAGGATC-3’                    （配列番号１９）
Outer  forward：5’-GATGGTGACCACCTCGAC-3’            （配列番号２０）
Outer  reverse：5’-TGTACCCTTCCTCCCTCG-3’            （配列番号２１）
【００７１】
図３は、等温増幅をリアルタイムでモニタリングした、サイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフである。同図において、■が、ΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼを用いた実施例５−１の結果、▲が、■の２倍濃度のΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼを用いた実施例５−２の結果、●が、市販ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いた比較例の結果である。同図に示すように、ΔＮ  ＧｃａＤＮＡポリメラーゼを用いた実施例５−１（■）によれば、市販のＢｓｔＤＮＡポリメラーゼを用いた比較例（●）よりも速く目的配列が増幅された。さらに、実施例５−２（▲）に示すように、酵素濃度を増加させることによって、目的配列の増幅がより一層促進された。なお、増幅物の塩基配列を決定したところ、目的配列が増幅されていることが確認できた。核酸増幅の分野においては、分刻みで増幅時間を短縮することが望まれている。したがって、本発明のＧｃａＤＮＡポリメラーゼによれば、従来のＤＮＡポリメラーゼを用いた等温増幅法よりも、十分な短縮化を図ることができるといえる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定に使用した標準曲線を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の一実施例において、ＧｃａＤＮＡポリメラーゼおよび市販ＤＮＡポリメラーゼを用いて、６３℃〜７４℃における相補鎖置換複製酵素活性を測定した結果を示す電気泳動写真である。
【図３】図３は、本発明のその他の実施例において、ＧｃａＤＮＡポリメラーゼおよび市販ＤＮＡポリメラーゼを用いて、等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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