【手続補正書】
【提出日】令和3年5月13日(2021.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクスビボ増殖用および対象への移植用の解凍した臍帯血ユニットを選択するための方法であって、前記解凍した臍帯血ユニット中の細胞の生存率を確認することと、生存率が６０％〜８５％のユニットを選択した後に前記臍帯血ユニットをＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分とＣＤ／１３３−／ＣＤ３４−画分とに分離することで、エクスビボ増殖と前記対象への移植に適した解凍した臍帯ユニットを選択することを含む、方法。
【請求項２】
（ａ）選択した、前記エクスビボ増殖と前記対象への移植に適した解凍臍帯血ユニットを（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分に分離する工程と、
（ｂ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である前記第１の選択血液細胞画分において、次の分離後のパラメータ：
（ｉ）総細胞数が２０×１０５〜７５×１０５個、
（ｉｉ）生存率が７０％〜８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ１３３＋細胞が７０％〜８５％、
（ｉｖ）ＣＤ３４＋細胞が７０％〜８５％、
（ｖ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択後収率が０．０２〜１％、
（ｖｉ）細胞１０００個当たりのＣＦＵが１５〜７５個、及び
（ｖｉｉ）内毒素が３Ｅｕ／ｍｌ未満、
を確認する工程と、
（ｃ）前記パラメータに従って、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋画分である前記第１の選択血液細胞画分を選択又は除外して、エクスビボ増殖と前記対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する工程とを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ａ）の分離は、ＣＤ１３３＋用の免疫磁気ビーズによる選択を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分は、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．５％未満である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分は、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋細胞が０．０１％未満である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分は、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む免疫細胞を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
対象への移植用の臍帯血ユニットを調製するための方法であって、
（ａ）前記対象への移植に適した、解凍後の単一の臍帯血ユニットを、（ｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分と、（ｉｉ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む第２の未選択血液細胞画分とに分離する工程と、
（ｂ）細胞増殖可能な条件下において、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む前記第１の選択血液細胞画分をエクスビボ培養する工程であって、前記条件は、栄養素、血清、並びに幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を含むサイトカイン、並びに１．０ｍＭ〜１０ｍＭのニコチンアミドを供給することを含む、方法。
【請求項８】
前記工程（ａ）で分離した、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む前記第１の選択血液細胞画分（ｉ）は、エクスビボ増殖と前記対象への移植に適したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分であり、前記ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分は請求項２又は３に記載の方法に従って選択したものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
移植に適した前記単一の臍帯血ユニットは、次の凍結保存前パラメータ：
（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞が少なくとも７％、
（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種において、前記対象とＨＬＡ適合、
（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が１．８×１０９〜３．０×１０９個、及び
（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり１．５×１０７〜３．０×１０７個、
によって特徴付けられる、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記血清はＦＢＳを１０％含み、前記サイトカインは幹細胞因子、トロンボポエチン、ＦＬｔ３リガンド及びＩＬ−６の各々を５０ｎｇ含み、且つ前記ニコチンアミドを５．０ｍＭで供給する、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記エクスビボ培養を１８〜２５日間行う、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
培養１９〜２３日後に、前記エクスビボ培養したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分を回収することを更に含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
培養２１日後に、前記エクスビボ培養したＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む第１の選択血液細胞画分を回収することを更に含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択細胞を含む前記エクスビボ培養した第１の選択血液細胞画分と、ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む前記第２の未選択血液細胞画分とを、別々に凍結保存することを更に含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対象への移植用の、ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋選択臍帯血細胞を含むエクスビボ培養臍帯血細胞画分を選択する方法であって、
（ａ）エクスビボ増殖後のエクスビボ培養臍帯血画分において次のパラメータ：
（ｉ）総生細胞数が少なくとも８×１０８個、
（ｉｉ）細胞生存率が７０％〜８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ３４＋細胞が少なくとも７％、
（ｉｖ）総ＣＤ３４＋細胞数が少なくとも５．６×１０７個、
（ｖ）総ＣＤ１３３＋細胞数が少なくとも３．０×１０７個、
（ｖｉ）ＣＤ１３３＋／ＣＤ３８−細胞数が少なくとも８×１０５個、
（ｖｉｉ）培養マイコプラズマ又は細菌、酵母又はカビの成長なし、
を確認する工程と、
（ｂ）前記パラメータに従って前記エクスビボ培養臍帯血画分を選択又は除外し、選択した前記エクスビボ培養臍帯血画分が黄色がかっていて、混濁〜不透明な色を呈し、白い凝集塊や異物粒子を含まないものであり、対象への移植に適したエクスビボ培養ＣＤ１３３＋／ＣＤ３４＋臍帯血画分を選択する工程と
を含む方法。
【請求項１６】
エクスビボ増殖後のエクスビボ培養臍帯血画分において次のパラメータ：
（ｖｉｉ）総ＣＤ１４＋細胞数が８×１０７〜１５×１０８個、
（ｖｉｉｉ）総ＣＤ１５＋細胞数が２×１０８〜２×１０９個、
（ｉｘ）総ＣＤ１１ｂ＋細胞数が８×１０７〜８×１０９個、
（ｘ）総ＣＤ１（ａ＋ｃ）＋細胞数が３．２×１０７〜３×１０８個、
をさらに確認する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記エクスビボ培養臍帯血画分は、次の凍結保存前パラメータ：
（ｉ）総ＣＤ３４＋細胞数が８×１０６〜１５×１０６個、
（ｉｉ）６種のＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−ＡとＨＬＡ−Ｂ、低解像度）座位及びＨＬＡクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１、高解像度）座位の内の少なくとも４種で前記対象とＨＬＡ適合、
（ｉｉｉ）凍結保存前の総有核細胞数が１．８×１０９〜３．０×１０９個、
（ｉｖ）凍結保存前の総有核細胞数が対象重量１キログラム当たり１．５×１０７〜３．０×１０７個、
に従ってエクスビボ増殖用に選択した臍帯血ユニットから培養されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
対象への移植用のＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む未選択臍帯血細胞画分を選択する方法であって、
（ａ）ＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を選択した後、未培養の臍帯血画分において次のパラメータ：
（ｉ）総生細胞数が少なくとも４×１０８個、
（ｉｉ）細胞生存率が７０〜８５％、
（ｉｉｉ）ＣＤ３＋細胞数が少なくとも２．４×１０７個、
（ｉｖ）細菌、酵母又はカビの成長なし、
を確認する工程と、
（ｂ）前記パラメータに従って、前記未選択臍帯血細胞画分を選択又は除外して、対象への移植に適したＣＤ１３３／ＣＤ３４陰性細胞を含む未選択臍帯血細胞画分を選択する工程と
を含む方法。
【請求項１９】
赤く不透明な色を呈し、凝集塊や異物粒子を含まない未選択臍帯血細胞画分を選択する工程を更に含む、請求項１７又は１８に記載の方法。