(57)【要約】【課題】Ｔ細胞調節遺伝子およびその使用方法を提供すること。【解決手段】免疫機能の調節および細胞の生存に関連するタンパク質の、遺伝子座および対応するファミリーを提供する。これらの遺伝子は、保存されたＩｇＶドメインおよびムチンドメインを有する、細胞表面タンパク質をコードする。ＴＩＭファミリーを含有する遺伝子座は、一般的に、喘息を含む免疫不全に関連する。さらに、このＴＩＭ遺伝子ファミリーは、ヒトの第５染色体の領域内に位置付けられ、これは、悪性腫瘍および骨髄形成異常症候群において、共通して欠失される。遺伝子配列における多型は、気道の過剰応答性およびアレルギー性炎症の発達、ならびにＴ細胞のＩＬ−４およびＩＬ−１３の産生に関連する。これらのタンパク質は、ヒトＡ型肝炎細胞レセプターのｈＨＡＶｃｒ−１を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物のＴＩＭ遺伝子配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
前記哺乳動物のＴＩＭ遺伝子配列が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４の対立遺伝子２、３、４、５および６からなる群より選択されるヒト配列である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記哺乳動物のＴＩＭ遺伝子配列が、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４からなる群より選択されるマウス配列である、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のうちのいずれ１つに記載される、少なくとも２０ヌクレオチドの連続配列を含む、単離された核酸。
【請求項５】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、または３６のうちのいずれ１つに記載される配列を含む、単離された核酸。
【請求項６】
ＴＩＭ遺伝子多型の検出のためのプローブを含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
請求項６に記載のプローブの２つ以上を含む、オリゴヌクレオチドのアレイ。
【請求項８】
請求項１に記載の核酸組成物を含む細胞。
【請求項９】
少なくとも５０重量％のタンパク質を含む精製ポリペプチド組成物であって、該タンパク質が、請求項１に記載の核酸またはそのフラグメントの産物として存在する、組成物。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５に記載の配列を含む、請求項９に記載の精製ポリペプチド。
【請求項１１】
哺乳動物のＴＩＭポリペプチドに特異的な、抗体。
【請求項１２】
個体において喘息に対する素因を検出するための方法であって、該方法が、以下：
少なくとも１つの素因性のＴＩＭの多型の存在について該個体を分析する工程であって、ここで、該素因性の多型の存在が、該喘息に対する罹患率の増大を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記分析工程が、前記個体のゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡと、請求項６に記載の１つまたは複数のプローブとの間の特異的な結合の検出を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析工程が、前記個体由来の細胞またはタンパク質と、請求項１１に記載の抗体との間の特異的な結合の検出を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＩＭ遺伝子のノックアウトを含む、ＴＩＭ遺伝獅機能についての非ヒトトランスジェニック動物モデル。
【請求項１６】
ＴＩＭ機能を調節する、生物学的に活性な薬剤についてのスクリーニングの方法であって、該方法が、以下：
以下のいずれか１つと、生物学的に活性な薬剤の候補を混ぜる工程：
（ａ）  哺乳動物のＴＩＭポリペプチド；
（ｂ）  哺乳動物のＴＩＭポリペプチドをコードする核酸を含有する、細胞；または
（ｃ）  ＴＩＭ遺伝子機能についての非ヒトトランスジェニック動物モデル；および
ＴＩＭ機能に対する該薬剤の効果を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項１７】
前記生物学的に活性な薬剤が、ＴＩＭの発現を下方制御または上方制御する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的に活性な薬剤が、前記ＴＩＭポリペプチドの活性を阻害するかまたは上昇させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
個体において免疫不全を診断または段階付けするための方法であって、該方法が、以下：
少なくとも１つの素因性のＴＩＭの多型の存在について該個体を分析する工程であって、ここで、該素因性の多型の存在が、該免疫不全に対する罹患率の増大を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
個体において癌を診断または段階付けするための方法であって、該方法が、以下：
少なくとも１つの素因性のＴＩＭの多型の存在について該個体を分析する工程であって、ここで、該素因性の多型の存在が、癌治療に対する耐性の増大を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２１】
個体において癌を診断または段階付けするための方法であって、該方法が、以下：
少なくとも１つの素因性のＴＩＭ−１発現プロフィールの存在について該個体を分析する工程であって、ここで、該ＴＩＭ−１の発現プロフィールが、癌治療に対する耐性の増大を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
個体において癌を診断または段階付けするための方法であって、該方法が、以下：
少なくとも１つの素因性のＴＩＭ−４発現プロフィールの存在について該個体を分析する工程；ここで、該ＴＩＭ−４の発現プロフィールが、癌治療に対する耐性の増大を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
個体において免疫学的障害を処置するための方法であって、該方法が、以下：
ＴＩＭポリペプチドの機能を調節する薬剤を、該個体に投与する工程、  を包含する、方法。
【請求項２４】
前記ＴＩＭポリペプチドが、ＴＩＭ−１またはＴＩＭ−４である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤が、ＴＩＭ−１に特異的な抗体または抗体フラグメントである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤が、ＴＩＭ−１機能を阻害する化合物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫学的障害が喘息である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫学的障害がアレルギーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫学的障害が湿疹である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫学的障害が自己免疫疾患である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記薬剤が、ＴＩＭ−４に特異的な抗体または抗体フラグメントである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記薬剤が、ＴＩＭ−４の機能を阻害する化合物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
個体において悪性腫瘍を処置するための方法であって、該方法が、以下：
ＴＩＭポリペプチドの機能を調節する薬剤を、該個体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記ＴＩＭポリペプチドがＴＩＭ−１である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記薬剤が、ＴＩＭ−１に特異的な抗体または抗体フラグメントである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記薬剤が、ＴＩＭ−１の機能を阻害する化合物であり、そして化学療法剤または放射線治療の効果を増強する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＴＩＭポリペプチドがＴＩＭ−４である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記薬剤が、ＴＩＭ−４に特異的な抗体または抗体フラグメントである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記薬剤が、ＴＩＭ−４の機能を阻害する化合物であり、そして化学療法剤または放射線治療の効果を増強する、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞調節遺伝子およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫系の驚異的な複雑性は、その最大の威力である。１０１２−１２１４の潜在的な抗体特異性、様々な調節細胞およびエフェクター細胞間の精密な相互作用、ＭＨＣ抗原によるＴ細胞応答の制限；これら全てが宿主の感染性因子および外来性と考えられる他の抗原に対して効率的に応答する能力に寄与する。しかし、この多様性はその欠点を有する。誤りが起こる：応答の標的が正常な自己タンパク質であることが判明し得る；炎症性応答が誤調節される；そして正常な応答が、移植片および移植細胞に対して望ましくなく向けられる。これらの状況下で、その系の複雑性は診断および治療を非常に困難にする。
【０００３】
免疫応答の間にＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生されるサイトカインのプロフィールが、免疫応答の結果を発生および調節するエフェクター機能の性質を決定する。Ｔｈ１−優位の応答におけるＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生は、激しい細胞媒介性免疫、ＩｇＧ２ａの誘導およびＩｇＥ合成の阻害、および細胞内病原体に対する抵抗性と関連する。対照的に、Ｔｈ２−優位の応答におけるＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０の産生は、体液性免疫および自己免疫病理からの保護と関連する。アレルゲン特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ２−サイトカインの過剰産生は、アレルギー疾患および喘息の発生を引き起こし得、一方Ｔｈ１細胞は、様々な炎症誘発性疾患と関連していた。
【０００４】
免疫関連疾患に対する１つのアプローチは、免疫療法である。免疫療法は、適当に用いた場合に有効であることが証明され、そして免疫学的介入の進歩は有効性をさらに改善すると希望される。代わりのアプローチは、サイトカインを使用して免疫応答をシフトさせようと試みた。マクロファージおよび樹状細胞によって産生されるヘテロダイマーのサイトカイン、ＩＬ−１２は、未処置およびメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞において、Ｔｈ１サイトカイン合成の発生を強力に推進する。ＩＬ−１３およびＩＬ−４のような他のサイトカインが、Ｔ細胞のＴｈ２型への分化と関連していた。
【０００５】
喘息、アレルギー性鼻炎、およびアトピー性皮膚炎を含むアトピーは、遺伝的に感受性の個体において、環境的に誘発された免疫応答の結果として起こる、複雑な形質である。全てのアトピー性疾患の罹患率は、過去２０年間の間に産業化諸国において劇的に増加した。喘息は小児期の最もよくある慢性疾患であり、そして合衆国において１５００万人以上に影響を与え、１年あたり１１０億ドルを越える直接治療コストをもたらす。疫学的研究が、喘息罹患率の増加は、産業化社会における衛生状態の変化および感染（例えば結核またはＡ型肝炎）の頻度低下に起因することを示唆した。しかし、喘息罹患率の増加を引き起こす特定の分子的経路、および喘息感受性を与える遺伝的多型はあまり理解されていない。
【０００６】
喘息の発現は、非相加的な方法でお互いに相互作用する、複数の環境的および遺伝的因子によって影響され、喘息感受性遺伝子の同定を複雑にしている。喘息感受性は、いくつかの染色体領域と連結されたが、分解能は５−１０ｃＭより低く、そこには通常数百の候補遺伝子が存在する。さらに、どの単一遺伝子における遺伝的変異の効果も、おそらく喘息の病因全体では中程度の効果しか有さないので、そして遺伝子−遺伝子および遺伝子−環境相互作用が分析を混乱させるので、ポジショナルクローニングに対して応答性の領域に推定感受性遺伝子を位置決めすることは、精密化が困難であることが判明した。それにもかかわらず、喘息感受性は第５染色体、第６染色体、第１１染色体、第１４染色体、および第１２染色体に連結した。これらのうち、染色体５ｑ２３−３５が、それはＩＬ−９、ＩＬ−１２ｐ４０、β−アドレナリンレセプター、およびＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の遺伝子を含むＩＬ−４サイトカインクラスターを含む多くの候補遺伝子（１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）を含むので、最も注目を集めた。しかし、５ｑの連結領域の大きなサイズがその分析を複雑にし、そしてこの部位からの喘息遺伝子はまだ決定的に同定されていない。
【０００７】
（関連する出版物）
ヒトＡ型肝炎ウイルス細胞レセプターの遺伝配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、登録番号ＸＭ＿０１１３２７において見出し得る。関連する配列が、Ｇｅｎｂａｎｋ、登録番号ＢＡＢ５５０４４において提供される。非特許文献１は、Ｔｈ１細胞に発現する細胞表面分子を記載する。特許文献１、２および３は、マウスＴＩＭ−３対立遺伝子に対応する配列に関連する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５７２１３５１号
【特許文献２】米国特許第６２０４３７１号
【特許文献３】米国特許第６２８８２１８号
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｏｎｎｅｙら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：４３６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、Ｔ細胞調節遺伝子およびその使用方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の要旨）
免疫機能および細胞の生存に関連するポリペプチドをコードする遺伝子ファミリーの遺伝配列が提供される。これらの遺伝子は、本明細書中でＴ細胞免疫グロブリンドメインタンパク質およびムチンドメイン（ＴＩＭ）タンパク質と呼ぶ、保存されたＩｇＶおよびムチンドメインを有する細胞表面分子をコードする。ＴＩＭファミリーを含む遺伝子座は、喘息を含む免疫機能不全と遺伝的に関連する。さらに、ＴＩＭ遺伝子ファミリーは、悪性腫瘍および脊髄形成異常症候群において通常欠失しているヒト第５染色体の領域に位置している。ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４において多型が同定され、それはＴｈ１／Ｔｈ２分化および気道過剰応答性（ＡＨＲ）と関連し得る。
【００１２】
核酸組成物を使用してコードされたタンパク質を産生し、それを機能的研究のために、治療薬として、および関連する生理学的経路の研究において採用し得る。核酸、抗体などを含むＴＩＭ特異的結合因子は、アトピーおよび喘息に対する遺伝的感受性を決定する診断薬として、そして癌治療に対する腫瘍抵抗性を評価する診断薬として有用である。ＴＩＭ阻害薬は、免疫機能不全、および悪性腫瘍を含む細胞生存の障害の処置において治療薬として有用である。
【００１３】
（実施形態の詳細な説明）
喘息に対する感受性を含む、免疫機能に関連する遺伝配列が提供される。マウスＴｉｍ−１、Ｔｉｍ−２、Ｔｉｍ−３およびＴｉｍ−４の配列、およびヒトの対応する配列が、本明細書中で提供される。主要な多型の配列も提供される。遺伝配列は、欠失を含むこれらの多型は、スプライシング改変体ではなく、真の多型であることを示す。ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３配列の改変体は、気道過剰応答性およびアレルギー性Ｔ細胞応答と関連しており、そして他の改変体はこれらの応答に対する保護に関連する。
【００１４】
ＴＩＭ遺伝子ファミリーメンバーの細胞外ドメインは、２つのドメイン（ＩｇＶドメインおよびムチンドメイン）を含む。このＩｇ／ムチン構造はＭＡｄＣＡＭ（粘膜ａｄｄｒｅｓｓｉｎ細胞接着分子）においても見出され、これは２つのＩｇドメインおよび１つのムチンドメインを含む；しかし、ＴＩＭとＭＡｄＣＡＭとの間には低いレベルの相同性しか存在しない。同程度の相同性が、ＴＩＭ−１およびＴＯＳＯ（ＮＰ＿００５４４０．１  ＧＩ：４８８５６４１）、ＴＩＭ−１のように活性化Ｔ細胞に発現し、そしてＴ細胞をＦａｓによるアポトーシスから保護するタンパク質の間にも存在する。
【００１５】
Ｔ細胞は遺伝子のＴＩＭファミリーを発現し、それはＣＤ４Ｔ細胞の分化を決定的に調節する。Ｔｈ１細胞は優先的にＴＩＭ−３タンパク質を発現し、一方Ｔｈ２細胞は選択的にＴＩＭ−１タンパク質を発現する。ＴＩＭ−１は、気道過剰応答性と連結し、そしてＴＩＭ−３は自己免疫疾患と連結し、従って分化するリンパ細胞における発現パターンおよびリンパ細胞におけるＴＩＭ−１発現の動態は、これら分子の機能を反映する。
【００１６】
本発明の別の局面において、ＴＩＭ遺伝子座における遺伝子型を決定することによって、個体の喘息およびアトピー性疾患の発生に対する感受性を決定する方法が提供される。スクリーニングは、例えば、本明細書中で提供された、または他の方法で決定されたＴＩＭ−１対立遺伝子、ＴＩＭ−３対立遺伝子またはＴＩＭ−４対立遺伝子のいずれか１つにおける多型を分析し得る。そのような多型をスクリーニングする方法、例えばＳＳＣＰ分析、サイズ多型等が提供される。
【００１７】
本発明の別の局面において、Ｔｉｍ遺伝子またはポリペプチド機能を調節する生物学的に活性な薬剤をスクリーニングする方法が提供され、ここでその方法は、生物学的に活性な候補因子を、以下のもののいずれか１つと組み合せる工程：（ａ）Ｔｉｍポリペプチド；（ｂ）Ｔｉｍポリペプチドをコードする核酸を含む細胞；または（ｃ）以下の１つを含むＴｉｍ遺伝子機能の非ヒトトランスジェニック動物モデル：（ｉ）Ｔｉｍ遺伝子のノックアウト；（ｉｉ）外来性および安定に遺伝するＴｉｍ遺伝子配列；または（ｉｉｉ）リポーター遺伝子に作動可能に連結したＴｉｍプロモーター配列；および当該因子のＴｉｍ機能に対する効果を決定することを含む。
【００１８】
ＴＩＭポリペプチドの活性を、免疫機能を指示するために調節し得る。ＴＩＭ−１はＴｈ２細胞に優先的に発現し、そしてＴＩＭ−１活性を調節する薬剤は、アレルギー、喘息等を含むＴｈ２に関連する疾患の治療に有用である。ＴＩＭ−３はＴｈ１細胞において優先的に発現し、そしてＴＩＭ−３活性を調節する薬剤は、自己免疫疾患、移植片拒絶等を含む炎症誘発性免疫疾患の治療に有用である。
【００１９】
（目的の状態）
アトピー性疾患は、遺伝的に素因のある個体において、環境的に誘発された免疫応答の結果として発現する複雑な遺伝的形質である。アトピー性または非アトピー性の個体はどちらも同じ環境因子にさらされるが、アトピー性個体を非アトピー性個体と区別する遺伝的差異が、ある個体においてアトピー性疾患を引き起こし、気管、皮膚または胃腸管におけるアレルギー性炎症、および上昇した血清ＩｇＥ、好酸球増加、およびぜん鳴、くしゃみ、またはじんましんの症状によって明らかになる。それに加えて、アレルギー性炎症応答は、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９およびＩＬ−１３を産生するＴｈ２リンパ球の存在によって特徴付けられ、それは好酸球、肥満細胞、好塩基球およびＩｇＥを産生するＢ細胞の増殖、分化、および／または補充を増強する。
【００２０】
目的のアレルゲンは、イチゴ、ピーナッツ、乳タンパク質、卵白等のような食物に見出される抗原を含む。他の目的のアレルゲンは、草の花粉、動物の鱗屑、イエダニの糞等のような、様々な空気で運ばれる抗原を含む。分子的にクローニングされたアレルゲンは、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｙｏｎｙｓｓｉｎｕｓ（Ｄｅｒ  Ｐ１）；ライグラス花粉由来のＬｏｌ  ｐｌ−Ｖ；ｊｕｍｐｅｒ  ａｎｔ  Ｍｙｒｍｅｃｉａ  ｐｉｌｏｓｕｌａ由来の毒液；Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａハチ毒液ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）および抗原５Ｓ；スズメバチＶｅｓｐｕｌａ  ｍａｃｕｌｉｆｒｏｎｓおよびクロスズメバチＤｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ  ｍａｃｕｌａｔａ由来のホスホリパーゼを含む多くの昆虫毒液；カバ花粉、ブタクサ花粉、Ｐａｒｏｌ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓの主要なアレルゲン）、および交差応答性アレルゲンＰａｒｊｌ（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ由来）を含む多くの花粉タンパク質、およびＯｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ、Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｓｐ．、ｇｒａｍｉｎｅａｅ等を含む他の大気中花粉を含む。他の目的のアレルゲンは、吸血節足動物、例えばカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｐ．、Ａｅｄｅｓ  ｓｐ．、Ｃｕｌｉｓｅｔａ  ｓｐ．、Ｃｕｌｅｘ  ｓｐ．）；ハエ（Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ  ｓｐ．、Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）特にブユ、メクラアブおよびヌカカ；ダニ（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｅｒ  ｓｐ．、Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｓｐ．、Ｏｔｏｂｉｕｓ  ｓｐ．）；ノミ、例えばＸｅｎｏｐｓｙｌｌａ、ＰｕｌｅｘおよびＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ  ｆｅｌｉｓ属を含むＳｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ目を含む、Ｄｉｐｔｅｒａによって引き起こされるアレルギー性皮膚炎を引き起こすものである。特異的アレルゲンは、多糖、脂肪酸部分、タンパク質等であり得る。
【００２１】
多くの相互作用／上位アトピー遺伝子における多型は、アレルギー性障害への感受性を増強させると考えられる。ゲノム範囲での走査が、アレルギーおよび喘息の様々なパラメーターを特定の遺伝子の多型ＤＮＡマーカー、通常ＤＮＡの反復配列（ジ−、トリ−およびテトラ−ヌクレオチドリピートを含むマイクロサテライト）と連結させることによって、責任遺伝子を同定しようとした。これらの研究は、アトピーの病因に関与する可能性があるとしていくつかの染色体領域を同定したが、分解能は５−１０ｃＭにすぎず、そこには典型的には数百の候補遺伝子が存在する。それにもかかわらず、２つ以上のこれらゲノム範囲での走査研究によって、喘息感受性が、染色体５ｑ２３−３１、染色体６ｐ２１、染色体１１ｑ１３、および染色体１２ｑ（９−１３）と連結された。
【００２２】
喘息は、本明細書中で定義されるように、ある期間にわたる個体における可逆的な気流の制限である。喘息は、気道壁における好酸球、肥満細胞、好塩基球、およびＣＤ２５＋Ｔリンパ球のような細胞の存在によって特徴付けられる。様々な伝達および生物学的エフェクター性質を有するサイトカインの活性に起因して、これらの細胞間には密接な相互作用が存在する。ケモカインは細胞を炎症部位に引き寄せ、そしてサイトカインはそれらを活性化して、炎症および粘膜への損傷を引き起こす。過程の慢性化と共に、基底膜の肥厚および繊維症のような２次的な変化が起こる。その疾患は、様々な刺激に対する気道過剰応答性の増加および気道の炎症によって特徴付けられる。喘息と診断された患者は、一般的にある時間にわたってぜん鳴、喘息発作、およびメタコリンチャレンジに対する陽性応答、すなわち約４ｍｇ／ｍｌ以下のメタコリンチャレンジに対してＰＣ２０を含む複数の徴候を有する。診断ガイドラインを、例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｔｈｍａ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｐａｎｅｌ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｓｔｈｍａ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９１、Ｐｕｂ．Ｎｏ．９１−３０４２において見出し得る。
【００２３】
喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、アトピー性皮膚炎（湿疹）および食物アレルギーは、同じ家族内で起こる疾患であり、共通の遺伝的メカニズムを示唆する。これらのアトピー性疾患はきわめて罹患率が高く、一般人口の２０−４０％に影響し、そして主要な公衆衛生問題となっている。これら疾患の経済的コストは莫大である。喘息単独で、１９９６年の推定健康管理コストは１４０億ドルであった。それに加えて、全てのアトピー性疾患の罹患率は、まだ明らかでない理由のために、過去２０年間の間に産業化諸国において劇的に増加した。数字が最も正確である、産業化諸国における喘息の罹患率は、１９８２年から倍増し、そして２０２０年までに罹患率が再び倍増すると予測される。
【００２４】
Ｔｈ１型Ｔ細胞に関連する炎症誘発性疾患は、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、Ｉ型糖尿病等のような自己免疫疾患を含む。（ＲＡ）は世界人口の０．８％に影響する、慢性自己免疫炎症性滑膜炎である。ＲＡの現在の治療は、免疫機能を非特異的に抑制または調節する治療薬を利用する。最近開発されたＴＮＦαアンタゴニストを含むそのような治療は、根本的に治癒力のあるものではなく、そして疾患の活性は治療の中断後すぐに戻る。全身性免疫抑制または調節を引き起こさない、根本的に治癒力のある治療の非常に大きな臨床的ニーズが存在する。
【００２５】
ＩＦＮガンマを分泌し得るミエリン−自己応答性Ｔ細胞の定量的増加が、ＭＳおよびＥＡＥの病因に関連し、ＭＳ患者の末梢血における自己免疫誘導剤／ヘルパーＴリンパ球が、ＭＳ患者における脱髄過程を開始および／または調節し得ることを示唆する。その明白な疾患は、筋肉の虚弱、腹部反射の喪失、視覚の欠損、および感覚異常と関連する。前駆症状の期間中、リンパ球の脳脊髄液への浸透、炎症および脱髄が存在する。
【００２６】
ＩＤＤＭは、インスリン分泌β細胞の破壊および明らかな高血糖を引き起こす、細胞媒介性自己免疫疾患である。Ｔリンパ球がランゲルハンス島に侵入し、そしてインスリン産生β細胞を特異的に破壊する。β細胞の涸渇により、血液中のグルコースレベルを調節できなくなる。疾患の進行を、家族歴および遺伝的分析によって感受性であると診断された個体においてモニターし得る。最も重要な遺伝的効果は、主要組織適合性遺伝子座（ＩＤＤＭ１）の遺伝子で見られるが、インスリン遺伝子領域（ＩＤＤＭ２）を含む他の遺伝子座も、疾患との連結を示す（Ｄａｖｉｅｓら、前出およびＫｅｎｎｅｄｙら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：２９３−２９８を参照のこと）。
【００２７】
（遺伝子ファミリー）
提供されるＴＩＭファミリー遺伝子およびそのフラグメント、コードするタンパク質、ゲノム調節領域、および特異的抗体は、喘息を発現するまたは抵抗する素因のある個体の同定に、および予防的および治療的目的のためにインビボで遺伝子活性を調節するために有用である。コードされたタンパク質は、特異的抗体を惹起する免疫原として、タンパク質の変化した形式を含む、活性または発現を模倣または調節する組成物の薬剤スクリーニングにおいて、および治療薬として有用である。
【００２８】
ＴＩＭファミリー遺伝子は、介在遺伝子なしに、ＴＩＭ−４、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３の順番で、ヒト第５染色体上でお互いにすぐ隣接している。ヒト第５染色体のこのセグメントは、悪性腫瘍および脊髄形成異常症候群におけるような形成異常細胞集団でよく欠失する（Ｂｏｕｌｔｗｏｏｄら（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４５：８８−９８を参照のこと）。第５染色体、第１２染色体、および第１９染色体上にＴＩＭ偽遺伝子が存在する。ＴＩＭ−４以外の各ＴＩＭタンパク質は、明らかな予測されるチロシンシグナル伝達モチーフを含む。ＴＩＭ−１の細胞質領域は、２つのチロシン残基を含み、そして高度に保存されたチロシンキナーゼリン酸化モチーフ、ＲＡＥＤＮＩＹを含む。拡大領域、ＳＲＡＥＤＮＩＹＩＶＥＤＲＰは、予測されるＩｔｋリン酸化およびＥＧＦレセプターリン酸化部位を含む。
【００２９】
マウスＴｉｍ１遺伝子は、３０５アミノ酸の膜タンパク質をコードする。ＴＩＭ−１の細胞質領域は、２つのチロシン残基を含み、そして高度に保存されたチロシンキナーゼリン酸化モチーフ、ＲＡＥＤＮＩＹを含む。ＴＩＭ−１のムチンドメインは、複数のＯ−結合グリコシル化部位を有し、そして免疫グロブリンドメインに２つのＮ−結合グリコシル化部位が見出される。
【００３０】
同様の３０５アミノ酸膜タンパク質であるマウスＴＩＭ−２は、マウスＴＩＭ−１に対して６４％の同一性、ラットＫＩＭ−１に対して６０％の同一性、そしてｈＨＡＶｃｒ−１に対して３２％の同一性を有する。ＴＩＭ−１と同様、ＴＩＭ−２は２つの細胞外Ｎ−結合グリコシル化部位および、多くのＯ−結合グリコシル化部位を有するセリン、スレオニンリッチなムチンドメインを有する。ＴＩＭ−２はまた、細胞内チロシンキナーゼリン酸化モチーフ、ＲＴＲＣＥＤＱＶＹを有する。
【００３１】
Ｔｉｍ３は、マウスにおいて２８１アミノ酸の膜タンパク質、そしてヒトにおいて３０１アミノ酸のタンパク質をコードし、それらは複数の細胞外グリコシル化部位および細胞内チロシンリン酸化モチーフを有する、同様の膜貫通糖タンパク質構造を有する。ＴＩＭ−３においてムチンドメインはＴＩＭ−１およびＴＩＭ−２におけるほど顕著ではないが、Ｔ細胞に発現したＴＩＭ−３はＡＰＣのリガンドと相互作用し、そしてＡＰＣ活性化を変化させる。ＴＩＭ−３は４つのＮ−結合および５つのＯ−結合グリコシル化部位を有し、ＴＩＭ−３は、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−２と同様、多くグリコシル化されており、そして抗原提示細胞のような他の細胞に存在するリガンドと相互作用し得ることを示唆する。
【００３２】
Ｔｉｍ４は、マウスにおいて３４４アミノ酸のタンパク質、そしてヒトにおいて３７８アミノ酸のタンパク質をコードする。予測されるＴＩＭ−４はまた、高度に保存されたシステイン残基を有するＩｇＶ様ドメイン、スレオニンリッチなムチンドメイン、および短い細胞内テイルを有し、他のＴＩＭタンパク質の一般的な膜糖タンパク質構造モチーフを共有する。
【００３３】
マウス配列の多型を、ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ／ＤＢＡ株に関して配列表で提供する。ＴＩＭ−１において、これらの多型は３つのアミノ酸の差異およびＨＢＡ／ＤＢＡにおける１５個のアミノ酸欠失をコードする。７つの予測されるアミノ酸の差異がＴＩＭ−３で同定された。ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４における多型は、シグナルおよびムチン様ドメインに位置し、一方ＴＩＭ−３で同定された多型はＩｇドメインに集中している。
【００３４】
ヒトＴｉｍ１のコード領域における改変体を、配列表および図８で提供する。変異は、６５％の染色体で観察される挿入（多型１と名称をつける）、１５７ｉｎｓＭＴＴＴＶＰ、および６５％の染色体で観察される欠失（多型５）、１８７△Ｔｈｒを含む。他の多型は、Ｔ１４０Ａ（多型７）；Ｖ１６１Ａ（多型２）；Ｖ１６７Ｉ（多型３）；Ｔ１７２Ａ（多型４）；Ｎ２５８Ｄ（多型６）である。多型４は、４０％の染色体で観察され、そして他の多型はそれぞれ≦５％の染色体で観察された。これら変異のほとんどは（２−６）、最初のムチンをコードするエキソンであるエキソン３に位置し、そして全ての改変体はゲノムレベルで起こり、そしてスプライシング改変体ではない。Ｔｉｍ１と喘息感受性との間の関連は、ダニ感受性小児喘息の、Ｔｉｍ１から約０．５メガベースであるマーカー、Ｄ５Ｓ８２０に対する有意な連結（平均ＬＯＤスコア＝４．８）の報告によってさらに支持される。
【００３５】
ヒト組織において、４．４ｋｂのＴＩＭ−１  ｍＲＮＡがほとんど全ての組織に存在するが、ほとんどにおいてかすかなものである。５．５ｋｂのバンドが結腸および肝臓で観察された。７．５ｋｂのバンドが脾臓、胸腺、および末梢血白血球で観察され、そしてより小さい４．４ｋｂのバンドがいくつかの臓器で観察された。ＴＩＭ−１  ｍＲＮＡは、異なる細胞集団において、代わりの（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）５’非翻訳領域とともに発現する。低酸素および虚血が、上皮細胞においてＴＩＭ−１の発現を誘導し、そして照射がＴＩＭ遺伝子ファミリーｍＲＮＡの発現を誘導する。ＴＩＭ遺伝子は腫瘍標本において発現している。ヒトＴＩＭ−４  ｍＲＮＡは、神経膠芽腫組織において発現し、そしてそれはまた分裂促進物質で刺激した、または照射末梢血単球において検出される。
【００３６】
１つの局面において、本発明は、ＴＩＭ−１タンパク質、ＴＩＭ−２タンパク質、ＴＩＭ−３タンパク質もしくはＴＩＭ−４タンパク質、またはそれらのホモログもしくは改変体をコードする配列を含む、天然に存在する染色体以外の単離核酸分子を提供し、その改変体は気道過剰応答性およびアレルギー性Ｔ細胞応答に対する感受性と関連し得る。その核酸を、同一源または異種由来の宿主細胞において発現するために、ベクターおよび／または調節配列に作動可能に連結し得る。そのような宿主細胞は、コードされたタンパク質の産生に有用であり得る。本発明の別の局面において、ＴＩＭ−１タンパク質、ＴＩＭ−２タンパク質、ＴＩＭ−３タンパク質もしくはＴＩＭ−４タンパク質、またはそれらのホモログもしくは改変体の精製ポリペプチドが提供され、その改変体は気道過剰応答性およびアレルギー性Ｔ細胞応答に対する感受性と関連し得る。別の局面において、ＴＩＭ−１ポリペプチド、ＴＩＭ−２ポリペプチド、ＴＩＭ−３ポリペプチドもしくはＴＩＭ−４ポリペプチドに結合する抗体または他の特異的結合メンバーが提供される。
【００３７】
ヒトおよびマウスＴＩＭ配列の配列が、以下のように配列表で提供される：
【００３８】
【表１】
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ＴｉｍポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡあるいはそのフラグメントであり得る。プローブ、ポリペプチドの産生等のための目的のフラグメントは、１つ以上の多型残基を含み得る。Ｔｉｍ遺伝子という用語は、特定のＴｉｍポリペプチド、イントロンのいずれか１つをコードするオープンリーディングフレーム、ならびにコード領域を越えて約１ｋｂまでの、しかしあるいはどちらかの方向にさらに遠くまで、発現の調節に関与する隣接する５’および３’非コードヌクレオチド配列を意味することが意図される。その遺伝子を、染色体外での維持または宿主への組込みのために適切なベクターに導入し得る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、Ｔｉｍ遺伝子配列は、配列表に示されるようなヒトＴＩＭ−１対立遺伝子１以外、および／またはマウスＴＩＭ−３  ＤＢＡ対立遺伝子以外である。
【００４０】
本明細書中で使用される「ｃＤＮＡ」という用語は、ネイティブの成熟ｍＲＮＡ種で見出される配列エレメントの配置を共有する全ての核酸を含むよう意図され、ここで配列エレメントはエキソンならびに３’および５’非コード領域である。通常ｍＲＮＡ種は連続的なエキソンを有し、間にあるイントロンは核ＲＮＡスプライシングによって除去されてＴｉｍタンパク質をコードする連続的なオープンリーディングフレームを作製する。
【００４１】
目的のゲノム配列は、列挙した配列で規定されたような、天然染色体において通常存在する全てのイントロンを含む、開始コドンおよび停止コドンの間に存在する核酸を含む。それはさらに、成熟ｍＲＮＡで見出される３’および５’非翻訳領域を含み得る。それはさらに、約１ｋｂ、しかしあるいはより長い、転写領域の５’または３’末端のいずれかの隣接したゲノムＤＮＡを含む、プロモーター、エンハンサー等のような、特異的転写配列および翻訳調節配列を含み得る。ゲノムＤＮＡを１００ｋｂｐまたはより小さいフラグメントとして単離し得る；そして本質的に側面の染色体配列を含まない。
【００４２】
５’領域の配列、ならびにさらに５’上流配列および３’下流配列を、エンハンサー結合部位を含むプロモーターエレメントのために利用し得、それはＴｉｍ遺伝子が発現する組織における発現を提供する。組織特異的発現は、発現パターンを決定するために、およびネイティブの発現パターンを模倣するプロモーターを提供するために有用である。プロモーター領域に天然に存在する多型は、天然の発現における変異、特に疾患と関連し得るものを決定するために有用である。あるいは、突然変異をプロモーター領域に導入して、実験的に定義されたシステムにおいて変化した発現の効果を決定し得る。転写因子の結合に関与する特異的ＤＮＡモチーフを同定する方法、例えば公知の結合モチーフに対する配列類似性、ゲル遅延研究等が、当該分野で公知である。例えば、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら（１９９５）Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １：１９４−２０５；Ｍｏｒｔｌｏｃｋら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：３２７−３３；ならびにＪｏｕｌｉｎおよびＲｉｃｈａｒｄ−Ｆｏｙ（１９９５）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２３２：６２０−６２６を参照のこと。
【００４３】
調節配列を使用して、特に異なる組織または発達段階におけるＴＩＭ発現の転写または翻訳調節に必要なシス作用配列を同定し得、そしてＴＩＭ発現を調節または媒介するシス作用配列およびトランス作用因子を同定し得る。そのような転写調節領域または翻訳調節領域を、野生型または変化したＴＩＭまたは他の目的のタンパク質の、培養細胞、または胚、胎児組織もしくは成人組織における発現を促進するために、および遺伝子治療のためにＴＩＭ遺伝子に操作可能に連結し得る。
【００４４】
本発明の核酸組成物は、本ポリペプチドの全てまたは一部をコードし得る。伝統的な方法によってオリゴヌクレオチドを化学的に合成することによって、制限酵素消化によって、ＰＣＲ増幅等によって、ＤＮＡ配列のフラグメントを得ることができる。ほとんどの場合、ＤＮＡフラグメントは少なくとも１５ｎｔ、通常少なくとも１８ｎｔ、より通常には少なくとも約５０ｎｔである。そのような小さいＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションスクリーニング等のプライマーとして有用である。より大きなＤＮＡフラグメント、すなわち１００ｎｔより大きなものは、コードされたポリペプチドの産生に有用である。ＰＣＲのような増幅反応で使用するために、１対のプライマーを使用する。プライマー配列の正確な組成は、本発明に決定的にではないが、ほとんどの適用に関して、プライマーは、当該分野で公知であるように、ストリンジェントな条件下で本配列にハイブリダイズする。少なくとも約５０ｎｔ、好ましくは少なくとも約１００ｎｔの増幅産物を産生する１対のプライマーを選択することが好ましい。プライマー配列を選択するためのアルゴリズムは一般的に公知であり、そして市販のソフトウェアパッケージで入手可能である。増幅プライマーはＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズし、そしてお互いに向かって初回刺激する。
【００４５】
ＴＩＭ遺伝子は、実質的な純度で、一般的にインタクトな哺乳動物染色体以外として単離され、そして得られる。通常、ＤＮＡは、ＴＩＭ配列またはそのフラグメントを含まない他の核酸配列を実質的に含まないで得られ、一般的に少なくとも約５０％、通常少なくとも約９０％の純度であり、そして典型的には「組換え体」であり、すなわち天然に存在する染色体で通常関連しない１つ以上のヌクレオチドに隣接する。
【００４６】
ＤＮＡ配列を様々な方法で使用する。それらを、ＴＩＭ関連遺伝子を同定するプローブとして使用し得る。哺乳動物ホモログは本配列と実質的な配列類似性、すなわち本ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列と少なくとも７５％、通常少なくとも９０％、より通常には少なくとも９５％の配列同一性を有する。配列類似性を、保存されたモチーフ、コード領域、隣接領域等のような、より大きな配列のサブセットであり得る参照配列に基づいて計算する。参照配列は通常、少なくとも約１８ｎｔ長、より通常には少なくとも約３０ｎｔ長であり、そして比較される完全な配列まで伸長し得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０で記載されたＢＬＡＳＴのような、配列分析のためのアルゴリズムが、当該分野で公知である。
【００４７】
配列類似性を有する核酸を、低いストリンジェンシー条件下例えば５０℃で１０×ＳＳＣ（０．９Ｍの生理食塩水／０．０９Ｍのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションによって検出し、そして５５℃で１×ＳＳＣでの洗浄にかけた場合に結合したままにする。配列同一性をストリンジェントな条件下、例えば５０℃またはより高く、および０．１×ＳＳＣ（９ｍＭの生理食塩水／０．９ｍＭのクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーションによって決定し得る。プローブ、特にＤＮＡ配列の標識プローブを使用することによって、ホモログまたは関連遺伝子を単離し得る。相同的遺伝子の供給源はあらゆる種、例えば霊長類種、特にヒト；ラットおよびマウスのようなげっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、酵母、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ、Ｃａｅｎｈｏｒａｂｄｉｔｉｓ等であり得る。
【００４８】
そのＤＮＡをまた、生物学的標本における遺伝子の発現を同定するために使用し得る。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような特定のヌクレオチド配列の存在に関して細胞をプローブする方法は、文献においてよく確立されており、そしてここで詳述する必要はない。ｍＲＮＡを細胞サンプルから単離する。ｍＲＮＡを、逆転写酵素を用いてＲＴ−ＰＣＲによって増幅し、相補的ＤＮＡ鎖を形成し得、続いて本ＤＮＡ配列に特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応増幅を行なう。あるいは、ｍＲＮＡサンプルをゲル電気泳動によって分離し、適当な支持体、例えばニトロセルロース、ナイロン等に移動させて、そして次いでプローブとして本ＤＮＡのフラグメントを用いてプローブする。オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、および固体チップ上に整列したＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションのような他の技術も有用であり得る。本配列にハイブリダイズするｍＲＮＡの検出は、サンプルにおけるＴＩＭ遺伝子の発現を示す。
【００４９】
本核酸配列を、特にそれらを細胞内で使用する場合、例えば遺伝子切断等のために核酸切断薬剤（例えば鉄またはクロムのようなキレート化金属）を結合させることによって、多くの目的のために修飾し得る。
【００５０】
隣接プロモーター領域およびコード領域を含むＴＩＭ遺伝子座の配列を、当該分野で公知の様々な方法で突然変異させて、プロモーターの強さ、コードされるタンパク質の配列等における標的化変化を産生し得る。ＤＮＡ配列またはそのような変異の産物は、本明細書中で提供される配列と本質的に同様である、すなわち少なくともそれぞれ１ヌクレオチドまたはアミノ酸が異なる、そして少なくとも２つ、しかし約１０以下のヌクレオチドまたはアミノ酸が異なり得る。配列変化は、置換、挿入または欠失であり得る。欠失はさらに、ドメインまたはエキソンの欠失のような、より大きな変化を含み得る。他の目的の修飾は、例えばＦＬＡＧシステム、ＨＡ等を用いたエピトープタグ化を含む。細胞レベル下での局在の研究のために、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質を使用し得る。そのような変異遺伝子を使用して、ＴＩＭポリペプチドの構造−機能相関を研究し得るかまたはその機能もしくは調節に影響を与えるタンパク質の性質を変化させ得る。例えば、構成的に活性な転写因子、または転写を活性化することなくＴＩＭ  ＤＮＡ標的部位に結合するドミナントネガティブに活性なタンパク質を、この方法で作成し得る。
【００５１】
クローニングされた遺伝子のインビトロ突然変異生成技術は公知である。変異を調査するプロトコルの例は、Ｇｕｓｔｉｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：２２（１９９３）；Ｂａｒａｎｙ、Ｇｅｎｅ  ３７：１１１−２３（１９８５）；Ｃｏｌｉｃｅｌｌｉら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １９９：５３７−９（１９８５）；およびＰｒｅｎｔｋｉら、Ｇｅｎｅ  ２９：３０３−１３（１９８４）において見出され得る。部位特異的突然変異生成の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９  １５．３−１５．１０８頁；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｇｅｎｅ  １２６：３５−４１（１９９３）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：５９２−６（１９９２）；ＪｏｎｅｓおよびＷｉｎｉｓｔｏｒｆｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２：５２８−３０（１９９２）；Ｂａｒｔｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：７３４９−５５（１９９０）；ＭａｒｏｔｔｉおよびＴｏｍｉｃｈ、Ｇｅｎｅ  Ａｎａｌ  Ｔｅｃｈ  ６：６７−７０（１９８９）；およびＺｈｕ  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １７７：１２０−４（１９８９）において見出され得る。
【００５２】
アレイは、１つのサンプルにおいて多くのポリヌクレオチドをアッセイし得るハイスループット技術を提供する。本発明の１つの局面において、１つ以上のＴＩＭ遺伝子、タンパク質、または抗体を含む、好ましくはこれらの配列全てを含むアレイを構築し、そのアレイはさらにＴ細胞、単球等で上方制御または下方制御されることが公知の他の配列を含み得る。この技術を、差次的発現、または遺伝子型同定を試験する道具として使用し得る。ポリヌクレオチドプローブを、二次元マトリックスまたは結合したプローブを有するアレイに、基質（例えばガラス、ニトロセルロース等）に配置することによって、アレイを作成し得る。プローブを、共有結合または、疎水性相互作用のような非特異的相互作用のいずれかによって基質に結合し得る。アレイの構築技術およびそれらのアレイを使用する方法は、例えばＳｃｈｅｎａら（１９９６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３（２０）：１０６１４−９；Ｓｃｈｅｎａら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０（５２３５）：４６７−７０；Ｓｈａｌｏｎら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６（７）：６３９−４５；ＵＳＰＮ５，８０７，５２２、ＥＰ７９９８９７；ＷＯ９７／２９２１２；ＷＯ９７／２７３１７；ＥＰ７８５２８０；ＷＯ９７／０２３５７；ＵＳＰＮ５，５９３，８３９；ＵＳＰＮ５，５７８，８３２；ＥＰ７２８５２０；ＵＳＰＮ５，５９９，６９５；ＥＰ７２１０１６；ＵＳＰＮ５，５５６，７５２；ＷＯ９５／２２０５８；およびＵＳＰＮ５，６３１，７３４に記載されている。
【００５３】
アレイにおいて利用されるプローブは、様々な型であり得、そして例えば比較的短い長さの（例えば２０マーまたは２５マー）合成プローブ、ｃＤＮＡ（全長または遺伝子のフラグメント）、増幅ＤＮＡ、ＤＮＡのフラグメント（例えば制限酵素によって産生される）および逆転写ＤＮＡを含み得る。あつらえたアレイおよび一般的なアレイの両方を、差次的発現レベルの検出に利用し得る。あつらえたアレイを、特定の前もって選択したｍＲＮＡ遺伝子配列の部分配列またはそれらから調製した増幅産物にハイブリダイズするプローブを用いて調製し得る。
【００５４】
アレイを、例えば遺伝子の差次的発現を調査するために、および遺伝子機能を決定するために使用し得る。例えば、アレイをＴＩＭ遺伝子における差次的発現、または多型配列の発現を検出するために使用し得る。アレイの例示的な使用が、例えばＰａｐｐａｌａｒａｄｏら（１９９８）Ｓｅｍ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌ．８：２１７；およびＲａｍｓａｙ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４０においてさらに記載されている。さらに、アレイを用いた検出方法の多くのバリエーションが、当該分野の技術の範囲内および本発明の範囲内である。例えば、プローブを固体支持体に固定化するよりも、試験サンプルを固体支持体に固定化し得、それを次いでプローブと接触させる。発現分析におけるマイクロアレイの使用に関するさらなる議論は、例えばＤｕｇｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１：１０−１４（１９９９）；Ｂｏｗｔｅｌｌ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１：２５−３２（１９９９）；ＢｒｏｗｎおよびＢｏｔｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１：３３−３７（１９９９）；Ｃｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１：３８−４１（１９９９）；ＤｅｂｏｕｃｋおよびＧｏｏｄｆｅｌｌｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１：４８−５０（１９９９）；Ｂａｓｓｅｔｔ，Ｊｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１：５１−５５（１９９９）；およびＣｈａｋｒａｖａｒｔｉ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２１：５６−６０（１９９９）において見出され得る。
【００５５】
薬理遺伝学は、個人の遺伝子型およびその個人の治療薬に対する代謝または反応能力の間の連関である。代謝または標的感受性における差異が、薬物の生物活性投与量および血液濃度の間の関係を変化させることによって、重篤な毒性または治療の失敗を引き起こし得る。過去数年間の間に、多くの研究が代謝酵素または薬物標的における多型と応答および毒性両方との間に強い関係を確立した。これらの関係を使用して、治療投与量を個別化し得る。
【００５６】
多型対立遺伝子の遺伝子型決定を使用して、個人が特定の治療レジメンによく応答するかどうかを評価する。多型配列をまた、薬物スクリーニングアッセイにおいて使用して、候補治療剤の投与量および特異性を決定する。候補ＴＩＭ多型を標的治療でスクリーニングして、喘息治療における有効性に影響があるかどうかを決定する。薬物スクリーニングアッセイを、上記で記載したように行なう。典型的には２つまたはそれ以上の異なる配列多型を、治療への応答に関して試験する。
【００５７】
本遺伝子を、完全なＴＩＭタンパク質、またはそのポリペプチドフラグメント、特に機能的ドメイン；結合部位等に対応するフラグメントを、および本ポリペプチドの他のタンパク質またはその一部との融合を含んで、合成するために採用し得る。発現のために、誘導的または構成的であり得る、転写開始領域および翻訳開始領域を提供する、発現カセットを使用し得、ここでコード領域は転写開始領域ならびに転写停止領域および翻訳停止領域の転写調節下に作動可能に連結される。発現宿主で機能的な様々な転写開始領域を使用し得る。
【００５８】
ＴＩＭポリペプチドのフラグメントである、特に目的のポリペプチドは、ＴＩＭポリペプチドの特定のドメインを含み、ここでドメインは例えば細胞外ドメイン、または細胞外ドメイン中のドメイン：ムチンドメインおよび／もしくはＩｇドメインを含み得る。ドメインはまた、細胞質ドメイン、例えばチロシンキナーゼリン酸化モチーフ、ＲＡＥＤＮＩＹ、または拡大領域、ＳＲＡＥＤＮＩＹＩＶＥＤＲＰを含むフラグメントを含み得る。可溶性スプライス改変体によってコードされるポリペプチドもまた目的のものである。Ｉｇドメインの配列は以下のとおりである：ヒトＴＩＭ−１  Ｉｇドメイン、配列番号第１７、１９、２１、２３、２５、２７番、残基２１−１２６；ヒトＴＩＭ−３  Ｉｇドメイン、配列番号第２９および３１番、残基２２−１３１；ヒトＴＩＭ−４  Ｉｇドメイン、配列番号第３３および３５番、残基２５−１３３；マウスＴＩＭ−１  Ｉｇドメイン、配列番号第１および３番、残基２１−１２９；マウスＴＩＭ−２  Ｉｇドメイン、配列番号第７番、残基２２−１２８；マウスＴＩＭ−３  Ｉｇドメイン、ＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子、配列番号第９番、残基２２−１３２；マウスＴＩＭ−３  Ｉｇドメイン、ＤＢＡ／２対立遺伝子、配列番号第１１番、残基２２−１３２；マウスＴＩＭ−４  Ｉｇドメイン、配列番号第１３および１５番、残基２５−１３５。
【００５９】
機能的に等価なポリペプチドが有用であり得、ここで等価なポリペプチドは、サイレントな変化を引き起こす、アミノ酸残基の欠失、付加、または置換を含み得、従って経路遺伝子産物に対して異なって発現される機能的に等価なものを産生する。アミノ酸置換を、関与する残基の極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性、および／または両親媒性の性質における類似性に基づいて行ない得る。本明細書中で使用される「機能的等価物」は、ＴＩＭ遺伝子によってコードされるポリペプチドと本質的に同様のインビボ活性を示し得るタンパク質を指す。
【００６０】
ポリペプチドを、発現の目的によって、伝統的な方法によって原核生物または真核生物で発現し得る。タンパク質の大規模産生のために、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような単細胞有機体、または脊椎動物、特に哺乳動物のようなより高等な有機体の細胞、例えばＣＯＳ７細胞を、発現宿主細胞として使用し得る。多くの状況において、ＴＩＭ遺伝子を哺乳動物細胞で発現することが望ましくあり得、ここでＴＩＭ遺伝子は、天然のフォールディングおよび翻訳後修飾から利益を受ける。特異的ペプチドエピトープ、ドメイン等を含む小さいペプチドをまた、研究室で合成し得、ここでペプチドは通常少なくとも約８アミノ酸の長さ、より通常には少なくとも約２０アミノ酸の長さ、完全なドメインまで、そして全長タンパク質である。ペプチドは、タンパク質の多型領域を含み得る。融合タンパク質も含まれ、ここでＴＩＭタンパク質の全てまたはフラグメントを、異種由来のポリペプチド、例えばグリーン蛍光タンパク質、抗体Ｆｃ領域、ポリヒスチジン等に融合する。
【００６１】
哺乳動物宿主細胞において、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等を含む、多くのウイルスに基づく発現システムを使用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合には、目的のコード配列をアデノウイルス転写／翻訳調節コントロール複合体、例えば後期プロモーターおよび３つに分かれた（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲーションし得る。このキメラ遺伝子を次いでインビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入し得る。ウイルスゲノムの重要でない領域（例えばＥ１領域またはＥ３領域）における挿入は、生存可能であり、そして感染宿主において差次的に発現されるタンパク質または経路遺伝子タンパク質を発現し得る組換えウイルスを生じる。
【００６２】
遺伝子の効率的な翻訳のために、特異的な開始シグナルも必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む完全な遺伝子が、適切な発現ベクターに挿入される場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要でないかもしれない。しかし、配列をコードする遺伝子の一部しか挿入されない場合には、外来性の翻訳制御シグナルを提供しなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成どちらも、様々な起源であり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター等を含むことによって増強され得る。
【００６３】
発現宿主を使用することによって、ポリペプチドを大量に入手可能なら、ポリペプチドを伝統的な方法によって単離および精製し得る。発現宿主の溶解物を調製し得、そして溶解物をＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、または他の精製技術を用いて精製し得る。精製ポリペプチドは、一般的には少なくとも約８０％純粋、好ましくは少なくとも約９０％純粋、そして１００％純粋までおよび１００％純粋を含み得る。純粋は、他のタンパク質、および細胞の破片を含まないことを意味する。
【００６４】
ポリペプチドを、直接的または間接的いずれかで標識し得る。１２５Ｉのような放射性同位体；基質に曝露した場合に検出可能な比色定量シグナルまたは光を産生する酵素標識システム；および蛍光標識を含むがこれに限らない、様々な適当な標識システムのいずれかを使用し得る。間接的な標識は、目的のポリペプチドに特異的に結合する、標識抗体のようなタンパク質の使用を含む。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメントを含むがこれに限らない。
【００６５】
（特異的結合メンバー）
本明細書中で使用される場合、「特異的結合メンバー」または「結合メンバー」という用語は、特異的な結合対、すなわち２つの分子、通常２つの異なる分子のメンバーを指し、ここで分子の１つ（すなわち第１の特異的結合メンバー）が、化学的または物理的手段で他の分子（すなわち第２の特異的結合メンバー）に特異的に結合する。特異的結合対の相補的なメンバーは、リガンドおよびレセプター；またはレセプターおよびカウンターレセプター（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と呼ばれることもある。本発明の目的のために、例えばアッセイが公知の結合対の結合を妨害する化合物を検出することに向けられる場合、２つの結合メンバーはお互いに結合することが公知であり得る。あるいは、目的の化合物の結合パートナーであることが予想される候補化合物を使用し得る。
【００６６】
目的の特異的結合対は、炭水化物およびレクチン；相補的ヌクレオチド配列；ペプチドリガンドおよびレセプター；エフェクターおよびレセプター分子；ホルモンおよびホルモン結合タンパク質；酵素補助因子および酵素；酵素インヒビターおよび酵素；脂質および脂質結合タンパク質等を含む。特異的結合対は、もとの特異的結合メンバーのアナログ、誘導体、およびフラグメントを含み得る。例えば、レセプターおよびリガンド対は、ペプチドフラグメント、化学的に合成したペプチド模倣物、標識タンパク質、誘導体化タンパク質等を含み得る。
【００６７】
好ましい実施形態において、特異的結合メンバーは抗体である。「抗体」または「抗体部分」という用語は、エピトープに適合およびエピトープを認識する特異的な形状を有する任意のポリペプチド鎖を含む分子構造を含むように意図され、ここで１つ以上の非共有結合相互作用が、分子構造とエピトープとの間の複合体を安定化する。ＴＩＭタンパク質の１つに特異的に結合する抗体を、抗ＴＩＭと呼ぶ。原型の抗体分子は免疫グロブリンであり、そして全ての供給源、例えばヒト、げっ歯類、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、他の哺乳動物、ニワトリ、他の鳥類等由来の、全ての型の免疫グロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が、「抗体」であると考えられる。本発明で利用される抗体は、ポリクローナル抗体であり得るが、細胞培養によってまたは組換え的に複製し得、そしてその抗原性を抑制するために修飾し得るので、モノクローナル抗体が好ましい。
【００６８】
ポリクローナル抗体を、標準的なプロトコルによって、産生動物にポリペプチドまたはインビボで発現したｃＤＮＡであり得る抗原性組成物を注射することによって産生し得る。例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと。タンパク質全体、またはタンパク質のより大きな部分を利用する場合、産生動物をタンパク質および適切なアジュバント（例えばフロイント、完全フロイント、水中油型エマルジョン等）で免疫することによって抗体を産生し得る。より小さいペプチドを利用する場合、ペプチドをより大きな分子に結合して免疫刺激性の結合物を作成することが有利である。そのような利用のために市販で入手可能な、よく利用される結合タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）を含む。多型残基のような特定のエピトープに対して抗体を産生するために、全長配列由来のペプチドを利用し得る。免疫原を、好ましくは前もって決定した１回またはそれ以上の追加免疫を含むスケジュールによって、動物宿主に注射し、そして動物は定期的に採血される。次いでポリクローナル抗体をそのような抗血清から、例えば適切な固体支持体に結合したポリペプチドを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製し得る。
【００６９】
あるいは、モノクローナル抗体に関しては、接種動物の脾臓由来のような、刺激免疫細胞を単離することによって、ハイブリドーマを形成し得る。次いでこれらの細胞を、骨髄腫細胞または形質転換細胞のような不死化細胞と融合し、それらを細胞培養中で無限に複製し得、それによって不死の、免疫グロブリン分泌細胞株を産生する。利用される不死細胞株は、好ましくはある栄養素の利用に必要な酵素に欠損があるものが選択される。多くのそのような細胞株（骨髄腫など）が当業者に公知であり、そして例えばチミジンキナーゼ（ＴＫ）またはヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を含む。これらの欠損は、それらの例えばヒポキサンチンアミノプテリンチミジン培地（ＨＡＴ）上で増殖する能力によって融合細胞を選択することを可能にする。
【００７０】
好ましくは、利用される不死融合パートナーは、免疫グロブリンを分泌しない株由来である。得られた融合細胞、またはハイブリドーマを、非融合細胞ではなく融合細胞の生存を可能にする条件下で培養し、そしてできたコロニーを、望ましいモノクローナル抗体の産生に関してスクリーニングする。大量の抗体を産生するために、そのような抗体を産生するコロニーをクローニング、発展、および増殖させる。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（その開示は本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００７１】
次いで、クローンをマウスの腹腔に注射し、そこから腹水を回収することによって、分泌ハイブリドーマ由来の大量のモノクローナル抗体を産生し得る。好ましくはプリスタン、または他の腫瘍プロモーターで初回刺激され、そして化学的にまたは照射によって免疫抑制されたマウスは、当該分野で公知の様々な適当なかぶのいずれかであり得る。腹水をマウスから回収し、そしてモノクローナル抗体をそこから、例えばＣＭセファロースカラムまたは他のクロマトグラフィー手段によって精製する。あるいは、ハイブリドーマをインビトロで、または懸濁培養として培養し得る。バッチ、連続培養、または他の適当な培養処理を利用し得る。次いでモノクローナル抗体を培養培地または上清から回収する。
【００７２】
それに加えて、抗体または抗原結合フラグメントを、遺伝的操作によって産生し得る。この技術において、標準的なハイブリドーマ手順と同様、抗体産生細胞を望ましい抗原または免疫原で感作する。免疫脾臓細胞またはハイブリドーマから単離されたメッセンジャーＲＮＡを鋳型として使用して、ＰＣＲ増幅を用いてｃＤＮＡを作成する。それぞれ最初の抗原特異性を維持する、１つの重鎖遺伝子および１つの軽鎖遺伝子を含むベクターのライブラリーを、増幅免疫グロブリンｃＤＮＡの適当な部分を発現ベクターへ挿入することによって産生する。コンビナトリアルライブラリーを、重鎖遺伝子ライブラリーと軽鎖遺伝子ライブラリーを組み合せることによって構築する。これは、重鎖および軽鎖を同時発現するクローンのライブラリーを生ずる（Ｆａｂフラグメントまたは抗体分子の抗原結合フラグメントに類似する）。これらの遺伝子を有するベクターを、宿主（例えば細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または他の適当なタンパク質産生宿主細胞）に同時トランスフェクトする。抗体遺伝子の合成がトランスフェクトされた宿主で誘導されると、重鎖および軽鎖タンパク質は自己集合して、抗原または免疫原を用いたスクリーニングによって検出され得る活性な抗体を産生する。
【００７３】
キメラ抗体を、主にヒトドメインを有する抗体を産生するために、マウス（または他の動物由来の）ハイブリドーマクローンから得たマウス可変軽鎖領域および重鎖領域（ＶＫおよびＶＨ）を、ヒト定常軽鎖領域および重鎖領域と組み合せることによる組換え手段によって作成し得る。そのようなキメラ抗体の産生は当該分野で周知であり、そして標準的な手法で達成し得る（例えばその全体が本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，６２４，６５９号によって記載されたように）。ヒト化抗体を、さらによりヒト様の免疫グロブリンドメインを含み、そして動物由来抗体の相補性決定領域のみを含むように、遺伝子工学的に操作する。これは、モノクローナル抗体可変領域の超可変ループの配列を注意深く調査し、そしてそれらをヒト抗体鎖の構造に適合させることによって達成される。表面的には（ｆａｃｉａｌｌｙ）複雑であるが、その過程は実際には単純である。例えば、その全体が本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，１８７，２８７号を参照のこと。
【００７４】
あるいは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を、ヒト免疫グロブリンを産生するように遺伝的に変化させた動物から産生し得る。そのような動物を産生する、およびそこから抗体を得る技術は、その全体が本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，１６２，９６３号および同第６，１５０，５８４号に記載されている。
【００７５】
あるいは、一本鎖抗体（下記で記載されるようなＦｖ）を、ヒト可変領域を含むファージライブラリーから産生し得る。米国特許第６，１７４，７０８号を参照のこと。一本鎖抗毒素、ＬＭＢ−７［Ｂ３（Ｆｖ）−ＰＥ３８］のクモ膜下投与は、ラットモデルにおいて癌性髄膜炎を治療することが示された。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２、２７６５−９、それらはその全体が本明細書中で参考として援用される。
【００７６】
免疫グロブリン全体（またはその組換え対応物）に加えて、エピトープ結合部位を含む免疫グロブリンフラグメント（例えばＦａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または他のフラグメント）が、本発明において抗体分子として有用である。そのような抗体フラグメントを、ペプシン、パパイン、または他のプロテアーゼ切断によって免疫グロブリン全体から産生し得る。「フラグメント」または最低限の免疫グロブリンを、組換え免疫グロブリン技術を利用して設計し得る。例えば、本発明において使用する「Ｆｖ」免疫グロブリンを、可変軽鎖領域を、可変重鎖領域にペプチドリンカー（例えばポリグリシンまたはアルファヘリックスまたはベータシートモチーフを形成しない別の配列）を介して結合することによって産生し得る。
【００７７】
Ｆｖフラグメントは、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）および可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）のヘテロダイマーである。例えば、ＩｇＧ全体に存在する重鎖および軽鎖ドメインのヘテロダイマーを、ジスルフィド結合によって連結する。ＶＨおよびＶＬがペプチドリンカーによって連結された組換えＦｖは、典型的には安定である。これらは、特異性および親和性を維持することが見出された、そして腫瘍の画像化および腫瘍治療のための組換え抗毒素を作成するのに有用であることが見出された一本鎖Ｆｖである。しかし、研究者らは、いくつかの一本鎖Ｆｖは抗原に対して減少した親和性を有し、そしてペプチドリンカーは結合を妨害し得ることを発見した。その全体が本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，１４７，２０３号において記載されたように、ＶＨおよびＶＬ領域間のジスルフィド結合の安定化を含む、改善したＦｖも作成された。これら最低限の抗体のいずれかを、本発明において利用し得、そしてＨＡＭＡ反応を避けるためにヒト化されたものが、本発明の実施形態において使用するのに好ましい。
【００７８】
それに加えて、化学的リンカー、蛍光色素、酵素、基質、化学発光部分等のような検出可能な部分またはストレプトアビジン、アビジン、もしくはビオチン等のような特異的結合部分を加えた、誘導体化免疫グロブリンを、本発明の方法および組成物において利用し得る。便利さのために、「抗体」または「抗体部分」という用語を、全体を通して一般的に脳腫瘍タンパク質標的のエピトープに特異的に結合する分子を指すために使用するが、その用語は、上記で記載したような、全ての免疫グロブリン、誘導体、フラグメント、組換えまたは遺伝子操作免疫グロブリン、および修飾免疫グロブリンを含む。
【００７９】
候補抗体を、あらゆる適当な標準的な方法によって、活性に関して試験し得る。最初のスクリーニングとして、抗体を免疫原に対する結合に関して試験し得る。２番目のスクリーニングとして、抗体を、対立遺伝子間、およびＴＩＭファミリーメンバー間の交差応答性に関してスクリーニングし得、そしてＴＩＭ機能の阻害活性に関して試験し得る。これらのスクリーニングに関して、候補抗体を検出のために標識し得る。ＴＩＭタンパク質の生物学的活性を変化させる抗体を、機能的形式でアッセイし得る。
【００８０】
（診断）
ＴｉＭ多型に関連する喘息またはアトピーの診断を、患者由来のあらゆる簡便なサンプル、例えば生検材料、血液サンプル、頬からの擦過等の、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列および／またはハイブリダイゼーション分析によって行なう。ＴＩＭと関連し得る喘息を有する患者由来の核酸サンプルを、ＴＩＭにおける素因を与える多型の存在に関して分析する。典型的な患者の遺伝子型は、少なくとも１つの染色体上に、少なくとも１つの素因を与える変異を有する。遺伝子産物の活性または発現に影響を与え、そして喘息に対する増加した感受性を与える多型ＴＩＭ配列の存在は、素因を与える多型と考えられる。喘息中性配列と比較して、素因を与える多型の存在に関してＤＮＡまたはｍＲＮＡを分析することによって、個人をスクリーニングする。目的の特異的な配列は、臨床的気管支過剰応答性を引き起こす、または他の方法で喘息と関連するあらゆる多型を含み、コード領域配列、スプライシングに影響を与えるイントロン配列、またはタンパク質の活性および発現に影響を与えるプロモーターもしくはエンハンサー配列における挿入、置換および欠失を含むがこれに限らない。特定のＴＩＭ多型の例を、実施例で提供する。
【００８１】
スクリーニングはまた、タンパク質の機能的特徴または抗原性特徴に基づき得る。ＴＩＭタンパク質において、素因を与える多型を検出するように設計されたイムノアッセイを、スクリーニングで使用し得る。多くの多様な変異が特定の疾患表現型を引き起こす場合、機能的タンパク質アッセイが、有効なスクリーニング手段であることが示された。
【００８２】
ＴＩＭコード領域またはコントロール領域における候補配列多型が疾患と関連するかどうかを決定するために、生化学的研究を行ない得る。例えば、ＴＩＭの発現に影響を与えるプロモーター配列またはエンハンサー配列の変化は、喘息に対する素因を与え得る。候補異型対立遺伝子の発現レベルを、当該分野で公知の様々な方法によって、正常対立遺伝子の発現レベルと比較する。プロモーターまたはエンハンサーの強さを決定する方法は、発現した天然タンパク質の定量；簡便な定量を提供するβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等のようなリポーター遺伝子と共に異型コントロールエレメントをベクターに挿入すること、等を含む。コードされたＴＩＭタンパク質の活性を、野生型タンパク質との比較によって決定し得る。
【００８３】
特定の配列の存在に関して核酸を分析する多くの方法が利用可能である。大量のＤＮＡが入手可能である場合、ゲノムＤＮＡを直接使用する。あるいは、目的の領域を適当なベクターにクローニングして、そして分析のために十分な量を増殖させる。気管細胞のような、ＴＩＭ遺伝子を発現する細胞を、ｍＲＮＡの供給源として使用し得、それを直接分析し得るか、または分析のためにｃＤＮＡに逆転写し得る。核酸を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような従来の技術によって増幅して、分析に十分な量を提供し得る。ポリメラーゼ連鎖反応の使用はＳａｉｋｉら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７に記載されており、そして現在の技術の概説を、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９、１４．２−１４．３３頁において見出し得る。増幅をまた、多型に特異的なプライマーを使用することによって、多型が存在するかどうかを決定するために使用し得る。あるいは、多型を検出する手段としてオリゴヌクレオチドライゲーションを利用する、様々な方法が当該分野で公知であり、例えばＲｉｌｅｙら（１９９０）Ｎ．Ａ．Ｒ．１８：２８８７−２８９０；およびＤｅｌａｈｕｎｔｙら（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５８：１２３９−１２４６を参照のこと。
【００８４】
検出可能な標識を増幅反応に含み得る。適当な標識としては、蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７，−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射活性標識（例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ）等が挙げられる。標識は２段階システムであり得、ここで増幅ＤＮＡを高親和性結合パートナー（例えばアビジン、特異的抗体等）を有する、ビオチン、ハプテン等に結合し、ここで結合パートナーが検出可能な標識に結合する。標識を、１つまたは両方のプライマーに結合し得る。あるいは、増幅産物に標識を組み込むために、増幅に使用するヌクレオチドのプールを標識する。
【００８５】
サンプル核酸、例えば増幅またはクローン化フラグメントを、当該分野で公知の多くの方法の１つによって分析する。核酸を、ジデオキシまたは他の方法によって配列決定し得、そして塩基配列を中性ＴＩＭ配列と比較する。サザンブロット、ドットブロット等による、異型配列とのハイブリダイゼーションもまた、その存在を決定するために使用し得る。ＵＳ５，４４５，９３４またはＷＯ９５／３５５０５において記載されたように、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対するコントロールおよび異型配列のハイブリダイゼーションパターンも、異型配列の存在を検出する手段として使用し得る。一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ミスマッチ切断検出、およびゲルマトリックスにおけるヘテロ二本鎖分析を使用して、電気泳動移動度の変化としてＤＮＡ配列変異によって産生される高次構造の変化を検出する。あるいは、多型が制限エンドヌクレアーゼの認識部位を産生または破壊する場合（制限フラグメント長多型、ＲＦＬＰ）、サンプルをエンドヌクレアーゼで消化し、そして産物をサイズ分画して、フラグメントが消化されたかどうかを決定する。分画を、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動（特にアクリルアミドまたはアガロースゲル）によって行なう。
【００８６】
ＵＳ５，４４５，９３４またはＷＯ９５／３５５０５において記載されたように、固体支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイに対するコントロールおよび異型配列のハイブリダイゼーションパターンを、異型配列の存在を検出する手段として使用し得る。本発明の１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドのアレイが提供され、ここでアレイの別々の位置が、ＴＩＭ遺伝子座のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの少なくとも一部と相補的である。そのようなアレイは一連のオリゴヌクレオチドを含み得、それらの各々は、核酸（例えばＴＩＭ遺伝子座由来のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ等）に特異的にハイブリダイズし得る。
【００８７】
ＴＩＭ多型に特異的な抗体を、スクリーニングイムノアッセイに使用し得る。中性ＴＩＭの減少または増加、および／または喘息関連多型の存在は、喘息がＴＩＭに関連することを示す。ＴＩＭ関連喘息を有すると疑われる患者からサンプルを採取する。本明細書中で使用される場合、サンプルとしては、気管洗浄液、血液、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液等のような生物学的液体；臓器または組織培養由来の液体；および生理学的組織から抽出された液体が挙げられる。そのような液体の誘導体および画分もその用語に含まれる。生検サンプル、例えば気管擦過等が特に興味深い。サンプル中の細胞数は、一般的に少なくとも約１０３、通常少なくとも１０４、より通常には少なくとも約１０５である。固体組織の場合には細胞を分離し得るか、または組織切片を分析し得る。あるいは細胞の溶解物を調製し得る。
【００８８】
診断を、多くの方法によって行ない得る。異なる方法は全て、ＴＩＭに素因を与える多型を有すると疑われる患者の細胞における、正常ＴＩＭまたは異常ＴＩＭの欠如または存在または変化した量を決定する。例えば、検出は、従来の方法に従って行なわれる、細胞または組織学的切片の染色を利用し得る。目的の抗体を細胞サンプルに加え、そしてエピトープへの結合を可能にするのに十分な時間、通常少なくとも約１０分間インキュベートする。抗体を、放射性同位体、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または直接検出のための他の標識で標識し得る。あるいは、２次抗体または試薬を使用して、シグナルを増幅する。そのような試薬は、当該分野で周知である。例えば、一次抗体をビオチンに結合し、２次試薬として西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンを加え得る。最終的な検出は、ペルオキシダーゼの存在下で色を変化する基質を使用する。抗体結合の欠如または存在を、分離細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡、ラジオグラフィー、シンチレーションカウンター等を含む様々な方法によって決定し得る。
【００８９】
診断の代替方法は、溶解物中における抗体とＴＩＭとの間の結合のインビトロ検出に依存する。サンプルまたはその画分におけるＴＩＭ結合の濃度の測定を、様々な特異的アッセイによって達成し得る。従来のサンドイッチ型アッセイを使用し得る。例えば、サンドイッチアッセイは、まずＴＩＭ特異的抗体を不溶性表面または支持体に結合し得る。ＴＩＭ特異的抗体が試薬および本発明の方法全体と適合性がある限り、結合の特定の方式は重要ではない。ＴＩＭ特異的抗体はプレートに共有結合的にまたは非共有結合的に、好ましくは非共有結合的に結合し得る。
【００９０】
他のイムノアッセイが当該分野で公知であり、そして診断薬としての使用を見出し得る。オークターロニープレートは、抗体結合の簡単な決定を提供する。ウェスタンブロットを、タンパク質ゲルまたはフィルター上のタンパク質スポットに対して、望ましいようにＴＩＭに特異的な検出システムを用いて、サンドイッチアッセイに関して記載したような標識方法を簡便に用いて、行ない得る。
【００９１】
ＴＩＭ遺伝子は、例えば発現の発達および組織特異的パターンの決定において、ＴＩＭ発現を分析するために、およびインビトロおよびインビボで発現を調節するために、有用である。遺伝子の導入に有用なベクターとしては、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。特に関心のあるのは、哺乳動物細胞において一時的にまたは安定に維持される、レトロウイルスベースのベクター（例えばマロニルマウス白血病ウイルスおよび改変ヒト免疫不全ウイルス；アデノウイルスベクター等）である。細胞ゲノムへの遺伝子のトランスフェクションおよび／または組込みのために、広く様々なベクターを採用し得る。あるいは、マイクロインジェクションは、遺伝子の適当な宿主細胞への導入のために融合等を利用し得る。例えば、Ｄｈａｗａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１５０９−１５１２およびＳｍｉｔｈら（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３２６８−３２７１を参照のこと。
【００９２】
発現ベクターは、機能的ｍＲＮＡを産生するように指向された転写開始領域を有する。天然の転写開始領域または外来性転写開始領域を利用し得る。プロモーターを、インビトロで組換え方法によって、または配列の染色体への相同的組込みの結果として導入し得る。β−アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、メタロチオネイン応答要素（ＭＲＥ）、テトラサイクリン−誘導性プロモーター構築物等を含む、多くの強力なプロモーターが、当該分野で公知である。
【００９３】
発現ベクターは一般的に、核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近くに位置する簡便な制限部位を有する。転写開始領域、標的遺伝子またはそのフラグメント、および転写終止領域を含む転写カセットを調製し得る。転写カセットを、様々なベクター（例えばプラスミド；レトロウイルス（例えばレンチウイルス）；アデノウイルス；等）に導入し得、ここでベクターは細胞内で、一時的にまたは安定に、通常少なくとも約１日間、より通常には少なくとも約数日から数週間の間、維持され得る。
【００９４】
アンチセンス分子を使用して、細胞内でＴＩＭの発現を下方制御する。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、特に天然核酸から化学的修飾を有する合成ＯＤＮ、またはそのようなアンチセンス分子をＲＮＡとして発現する核酸構築物であり得る。アンチセンス配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、そして標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、様々なメカニズムによって、例えば翻訳のために利用可能なｍＲＮＡの量を減少させることによって、ＲＮアーゼＨの活性化によって、または空間的障害によって、遺伝子発現を阻害する。１つの、または組み合わせのアンチセンス分子を投与し得、ここで組み合せは複数の異なる配列を含み得る。
【００９５】
アンチセンス分子を、適当なベクターにおいて標的遺伝子配列の全てまたは一部を発現することによって産生し得、ここで転写開始は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として産生されるように指向される。あるいは、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に少なくとも約７ヌクレオチド長、通常少なくとも約１２ヌクレオチド長、より通常には少なくとも約２０ヌクレオチド長であり、かつ約５００ヌクレオチド長より短く、通常約５０ヌクレオチド長より短く、より通常には約３５ヌクレオチド長より短く、ここで長さは阻害の効率、交差応答性の欠如を含む特異性、等によって支配される。７〜８塩基長の短いオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の強力かつ選択的なインヒビターであり得ることが見出された（Ｗａｇｎｅｒら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４０−８４４を参照のこと）。
【００９６】
（トランスジェニック動物）
本発明の核酸を使用して、遺伝的に改変された非ヒト動物、または細胞株における部位特異的遺伝子改変を産生し得る。用語「トランスジェニック」は、ＴＩＭ遺伝子活性の欠失または他のノックアウトを有する、宿主細胞において安定に遺伝する外来性ＴＩＭ遺伝子を有する、またはリポーター遺伝子に操作可能に連結した外来性ＴＩＭプロモーターを有する、遺伝的に修飾された動物を含むように意図される。トランスジェニック動物を、相同的組換えによって作成し得、ここでＴＩＭ遺伝子座は変化する。あるいは、核酸構築物をゲノム中に無作為に組み込む。安定な組込みのためのベクターは、プラスミド、レトロウイルスおよび他の動物ウイルス、ＹＡＣ、等を含む。トランスジェニック哺乳動物（例えばウシ、ブタ、ヤギ、ウマ等）および特にげっ歯類（例えばラット、マウス等）に特に関心がある。
【００９７】
「ノックアウト」動物は、遺伝的に操作して、内因性ＴＩＭ機能を本質的に減少させるか、または排除する。「ノックアウト」を達成するために、異なるアプローチを使用し得る。天然ＴＩＭホモログの全てまたは一部の染色体欠失を誘導し得る。非コード領域、特にプロモーター領域、３’調節配列、エンハンサーの欠失、またはＴＩＭ遺伝子の発現を活性化する遺伝子の欠失。機能的ノックアウトもまた、天然ＴＩＭ遺伝子の発現をブロックするアンチセンス構築物を導入することによって達成し得る（例えば、ＬｉおよびＣｏｈｅｎ（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８５：３１９−３２９を参照のこと）。
【００９８】
外来性ＴＩＭ遺伝子を有するトランスジェニック動物を作成し得る。外来性遺伝子は、通常動物宿主とは異なる種由来であるか、またはそうでなければコード配列または非コード配列で変化している。導入遺伝子は、野生型遺伝子、天然に存在する多型、または遺伝的に操作した配列（例えばコードまたは非コード領域に欠失、置換または挿入を有する以前に記載したもの）であり得る。導入配列は、ＴＩＭポリペプチドをコードし得るか、またはリポーター遺伝子に操作可能に連結したＴＩＭプロモーターを利用し得る。導入遺伝子がコード配列である場合、それは通常構成的または誘導的であり得るプロモーター、および宿主動物における発現に必要な他の調節配列に操作可能に連結される。
【００９９】
目的の特異的構築物としては、ＴＩＭ発現をブロックするアンチセンスＴＩＭ、ドミナントネガティブＴＩＭ変異体の発現、およびＴＩＭ遺伝子の過剰発現が挙げられるがこれに限らない。ｌａｃＺのような検出可能なマーカーを、ＴＩＭ遺伝子座に導入し得、ここでＴＩＭ発現のアップレギュレーションは、表現型にいて容易に検出される変化を引き起こす。
【０１００】
ＴＩＭ機能および調節の研究において、改変細胞または動物が有用である。例えば、候補薬剤の喘息に対する効果を決定するために、機能研究、薬剤スクリーニング等において動物を使用し得る。ＴＩＭ遺伝子において一連の小さな欠失および／または置換を作成して、ＤＮＡ結合、転写調節等における異なるエキソンの役割を決定し得る。それが通常産生されない細胞においてＴＩＭタンパク質の発現を提供することによって、細胞の動きに変化を誘導し得る。これらの動物はまた、喘息の遺伝モデル（例えば優性対劣性）；異なる対立遺伝子の相対的効果、およびＴＩＭとゲノムの他の場所にある他の喘息遺伝子との間の相乗的効果を調査するのに有用である。
【０１０１】
相同的組換えのためのＤＮＡ構築物は、望ましい遺伝的改変を有するＴＩＭ遺伝子の少なくとも一部を含み、そして標的遺伝子座と相同的な領域を含む。無作為な組込みのためのＤＮＡ構築物は、組換えを媒介する相同的な領域を含む必要はない。簡便に、ポジティブおよびネガティブセレクションのためにマーカーを含む。相同的組換えによって標的化遺伝子改変を有する細胞を産生する方法は、当該分野で公知である。哺乳動物細胞をトランスフェクトする様々な技術に関して、Ｋｅｏｗｎら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５２７−５３７を参照のこと。
【０１０２】
本発明の動物モデルと組み合せて、薬剤スクリーニングを行ない得る。多くの哺乳動物遺伝子が、酵母およびより下等な動物にホモログを有する。そのようなホモログの生理的役割および他のタンパク質との相互作用の研究は、生物学的機能の理解を促進し得る。遺伝的相補性に基づくモデルシステムに加えて、酵母は、Ｃｈｉｅｎら（１９９１）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．８８：９５７８−９５８２において記載される、ツーハイブリッドシステムによって、タンパク質−タンパク質相互作用を研究する強力な手段であることが示された。ツーハイブリッドシステム分析は、ＴＩＭタンパク質による転写活性化を調査するために特に関心がある。
【０１０３】
（化合物スクリーニング）
ＴＩＭに結合する、ＴＩＭの作用を調節または模倣するリガンドまたは基質を同定し得る。調査の領域は、免疫障害、喘息、癌、虚血−再灌流障害、およびストレスに対する細胞反応に関連する他の疾患の処置の開発である。薬剤スクリーニングは、影響された細胞におけるＴＩＭ機能の阻害、置換、または増強を提供する薬剤を同定する。例えば、ＴＩＭ機能を逆転または阻害する薬剤は、Ｔｈ２サイトカインのレベルを減少することによって、喘息における気管支応答性を減少し得、そしてＴＩＭインヒビターは、アポトーシスを誘導する放射線処置および化学療法剤処置の効果を増強することによって、癌治療に対する腫瘍の感受性を増強し得る。特に関心があるのは、ヒト細胞に対して低い毒性を有する薬剤のスクリーニングアッセイである。この目的のために、標識インビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ、タンパク質−ＤＮＡ結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合のイムノアッセイ等を含む、広範な様々なアッセイを使用し得る。精製タンパク質をまた、３次元結晶構造の決定のために使用し得、それを分子間相互作用、転写調節等のモデル化に使用し得る。
【０１０４】
本明細書中で使用される場合、用語「薬剤」は、シグナルチロシンキナーゼインヒビター、またはインテグリン結合部位のペプチドインヒビターのような、ＴＩＭの生理学的機能を変化させるまたは模倣する能力を有する、任意の分子（例えばタンパク質または医薬）を記載する。一般的に、複数のアッセイ混合物を、異なる薬剤濃度で並行して走らせ、様々な濃度に対する差次的反応を得る。典型的には、これら濃度のうち１つはネガティブコントロール（すなわち濃度ゼロまたは検出レベル以下の濃度）として供する。
【０１０５】
候補薬剤は、多くの化学的クラスを含むが、典型的にはそれらは有機分子、好ましくは５０以上および約２，５００ダルトン以下の分子量を有する、小さい有機化合物である。候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、そして典型的には少なくとも１つのアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの化学官能基を含む。候補薬剤は、多くの場合１つまたはそれ以上の上記の官能基で置換された、環状炭素または複素環構造および／または芳香族または多環芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、サッカライド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、その誘導体、構造的アナログまたは組み合せを含むがこれに限らない生物分子中に見出される。
【０１０６】
候補薬剤を、合成または天然化合物のライブラリーを含む広範な様々な供給源から得る。例えば、広範な多様な有機化合物および生物分子の無作為および指向合成のために、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多くの手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物形式の天然化合物のライブラリーが入手可能または容易に産生される。さらに、天然または合成的に産生されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に改変し、そしてコンビナトリアルライブラリーを産生するために使用し得る。公知の医薬品に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の指向性または無作為化学的修飾を行なって、構造的アナログを産生し得る。
【０１０７】
スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、１つまたはそれ以上の分子を標識に結合し得、ここで標識は直接または間接的に検出可能なシグナルを提供し得る。様々な標識としては、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子（例えば磁気粒子）等が挙げられる。特異的結合分子は、ビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよび抗ジゴキシン等のような対を含む。特異的結合メンバーに関しては、相補的メンバーを通常、公知の手順に従って、検出を提供する分子で標識する。
【０１０８】
様々な他の試薬をスクリーニングアッセイに含み得る。これらは、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤等のような試薬を含み、それらは最適なタンパク質−タンパク質結合を促進するおよび／または非特異的またはバックグラウンド相互作用を減少するために使用される。プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤、等のような、アッセイの効率を改善する試薬を使用し得る。成分の混合物を、必要な結合を提供するいずれかの順序で加える。インキュベーションを任意の適切な温度、典型的には４℃〜４０℃の間で行なう。インキュベーション時間を、最適な活性のために選択するが、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するために最適化し得る。典型的には０．１時間〜１時間の間が十分である。
【０１０９】
目的の他のアッセイは、ＴＩＭ機能を模倣する薬剤を検出する。例えば、候補薬剤を、機能的ＴＩＭを欠く細胞に加え、そして機能的アッセイにおいてＴＩＭを再生する能力に関してスクリーニングする。
【０１１０】
（治療方法）
ＴＩＭ遺伝子またはタンパク質の活性を調節する薬剤（特にポリペプチドの活性または遺伝子の発現を阻害または上方制御する薬剤）は、治療または予防的介入点を提供する。発現を直接調節する薬剤（例えば発現ベクター、標的ポリペプチドに特異的なアンチセンス）；およびタンパク質に作用する薬剤（例えば特異的抗体およびそのアナログ、触媒活性をブロックする小さい有機分子）等を含む、多くの薬剤が、この活性を調節するのに有用である。
【０１１１】
核酸を特定の細胞に選択的に伝達するための方法を設計し得る。そのような細胞の例としては、Ｔ細胞等が挙げられる。目的の細胞に発現ベクターを選択的に発現する、特定の処置方法を設計する。神経細胞における選択的発現を達成する１つの技術は、コード配列を、主に免疫系細胞で活性なプロモーター（例えばＩＬ−２プロモーター、Ｔ細胞抗原レセプタープロモーター等）に操作可能に連結することである。あるいは、またはそれに加えて、核酸を、核酸を目的の細胞に標的化する薬剤と共に投与し得る。例えば、核酸を、細胞表面抗原に特異的に結合する抗体と共に投与し得る。リポソームを利用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合する基質を、リポソームに結合して、リポソームを神経細胞に標的化し、そして取り込みを促進し得る。
【０１１２】
アンチセンス分子を使用して、細胞における発現を下方制御し得る。アンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）（特に天然核酸から化学的修飾を有する合成ＯＤＮ）またはそのようなアンチセンス分子をＲＮＡとして発現する核酸構築物であり得る。アンチセンス配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、そして標的遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、様々なメカニズムによって、例えば翻訳のために利用可能なｍＲＮＡの量を減少することによって、ＲＮアーゼＨの活性化、または空間的障害を介して、遺伝子発現を阻害する。アンチセンス分子を１つまたは組み合せて投与し得、ここで組み合せは複数の異なる配列を含み得る。
【０１１３】
アンチセンス分子を、適当なベクターにおける、標的遺伝子配列の全てまたは一部の発現によって産生し得、ここで転写開始は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として産生されるように指向される。あるいは、アンチセンス分子は合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に少なくとも約７ヌクレオチド長、通常少なくとも約１２ヌクレオチド長、より通常には少なくとも約２０ヌクレオチド長であり、そして約５００ヌクレオチド長より短い、通常約５０ヌクレオチド長より短い、より通常には約３５ヌクレオチド長より短く、ここで長さは阻害の効率、交差応答性の欠如を含む特異性等によって支配される。７〜８塩基長の短いオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の強力かつ選択的なインヒビターであり得ることが見出された（Ｗａｇｎｅｒら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４０−８４４を参照のこと）。
【０１１４】
内因性センス鎖ｍＲＮＡ配列の特異的領域を、アンチセンス配列と相補的になるように選択する。オリゴヌクレオチドの特異的配列の選択は、経験的な方法を使用し得、ここでいくつかの候補配列を、インビトロまたは動物モデルにおいて、標的遺伝子の発現阻害に関してアッセイする。配列の組み合せも使用し得、ここでｍＲＮＡ配列のいくつかの領域をアンチセンス相補性のために選択する。
【０１１５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、当該分野で公知の方法によって化学的に合成し得る（Ｗａｇｎｅｒら（１９９３）前出、およびＭｉｌｌｉｇａｎら、前出を参照のこと）。好ましいオリゴヌクレオチドは、その細胞内安定性および結合親和性を増加させるために、天然ホスホジエステル構造から化学的に改変される。多くのそのような改変が文献において記載され、それはバックボーン、糖または複素環塩基の化学を変化させる。
【０１１６】
バックボーン化学の有用な変化は、ホスホロチオエート；架橋していない酸素がどちらも硫黄で置換されたホスホロジチオエート；ホスホラミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）である。アキラルなホスフェート誘導体としては、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホネート、および３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）が挙げられる。ペプチド核酸は、リボースホスホジエステルバックボーン全体を、ペプチド結合で置換する。安定性および親和性を増強するために、糖の改変も使用する。デオキシリボースのα−アノマーを使用し得、ここで塩基は、天然β−アノマーに関して転位する。リボース糖の２’−ＯＨを、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成するように変化させ得、それは親和性を損なうことなく分解に対する抵抗性を提供する。複素環塩基の改変は、適当な塩基対形成を維持しなければならない。いくつかの有用な置換は、デオキシチミジンのためにデオキシウリジン；デオキシシチジンのために５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンを含む。５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピニル−２’−デオキシシチジンは、それぞれデオキシチミジンおよびデオキシシチジンを置換した場合に、親和性および生物学的活性を増加させることが示された。
【０１１７】
所望の薬理学的活性を有する化合物を、生理学的に受容可能なキャリア中で、ＴＩＭ機能の欠損に起因する喘息の処置のために宿主に投与し得る。その化合物をまた、ＴＩＭ機能を増強するために使用し得る。治療薬を、経口、局所的、非経口的（例えば皮下）腹腔内、ウイルス感染に従って、血管内等の様々な方法で、に投与し得る。吸入処置が特に興味深い。導入の方法によって、その化合物を様々な方法で処方し得る。処方中の治療的に活性な化合物の濃度は、約０．１〜１００重量％で変化し得る。
【０１１８】
薬学的組成物を、顆粒、錠剤、丸剤、坐剤、カプセル、懸濁液、軟膏、ローション等のような、様々な形式で調製し得る。経口および局所使用のために適当な薬学的等級の有機または無機キャリアおよび／または希釈剤を使用して、治療的に活性な化合物を含む組成物を作成し得る。当該分野で公知の希釈剤としては、水性媒体、植物油および動物油ならびに脂肪が挙げられる。安定化剤、湿潤剤および乳化剤、浸透圧を変化させる塩、または適当なｐＨ値を生じさせる緩衝液、および皮膚浸透増強剤を、補助剤として使用し得る。
【０１１９】
本発明は、変化し得るので、特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種または属、および記載された試薬に制限されないことが理解される。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであり、そして添付の請求によってのみ制限される、本発明の範囲を制限することを意図しないことが理解される。
【０１２０】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他に規定しなければ、複数の指示対象を含む。従って、例えば「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のそのような細胞を含み、そして「配列（ｔｈｅ  ａｒｒａｙ）」への言及は、１つまたはそれ以上のアレイおよび当業者に公知のその等価物を含む等である。本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、明らかに他に示されなければ、本発明が属する当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。
【０１２１】
本明細書中で言及された全ての出版物は、例えばここで記載される発明と関連して使用され得る、その出版物で記載された、細胞株、構築物および方法論を記載および開示する目的のために、本明細書中で参考文献に組み込まれる。上記および本文全体で議論された出版物は、本出願の提出日より前にそれらが開示されたためだけに提供される。本明細書中で何物も、以前の発明によって発明者がそのような開示に先立つ権利がないという承認として解釈されない。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１ａは、ＨＢＡマウスはＢＡＬＢ／ｃマウスよりも有意に少ないＩＬ−４を産生することを示す。１５０μｇのＫＬＨで免疫したマウスのリンパ節細胞を回収し、Ｂ−細胞を涸渇し、そして１０μｇ／ｍｌのＫＬＨを含むｃＤＭＥで培養した。９６時間後に上清を回収、そしてＥＬＩＳＡによってＩＬ−４レベルに関して評価した。データの全範囲を表すＩＬ−４レベルのボックスプロット（各グループにおいてｎ＝１０）を示し、ボックスは上位および下位の四分位数（ｑｕａｒｔｉｌｅｓ）を含み、データセットの中央値を各ボックスの中に示す。ＢＡＬＢ／ｃ細胞および（ＢＡＬＢ／ｃ×ＨＢＡ）Ｆ１細胞によって産生されたＩＬ−４レベルは、ＨＢＡのＩＬ−４レベルより有意に高い（Ｐ＜０．０００１（スチューデントｔ検定））。図１ｂは、ＨＢＡマウスはＢＡＬＢ／ｃマウスより有意に少ないＩＬ−１３およびＩＬ−１０を産生することを示す。示したデータは、各実験グループにおける１０匹の個々のマウス由来のリンパ節細胞培養によって産生されたサイトカインの平均値、±Ｓ．Ｄ．である。ＨＢＡのＩＬ−１３レベルおよびＩＬ−１０レベルは、ＢＡＬＢ／ｃまたは（ＢＡＬＢ／ｃ×ＨＢＡ）Ｆ１のどちらの値より低かった（Ｐ＜０．０００１）（ＩＬ−５対ＢＡＬＢ／ｃ、Ｐ＜０．０５）（ＨＢＡ  ＩＦＮ−γ対ＢＡＬＢ／ｃ、Ｐ＜０．００１）。図１ｃは、アレルゲン誘発気道過剰応答性は、ＨＢＡマウスよりもＢＡＬＢ／ｃマウスで有意に大きいことを示す。肺気流の障害を測定し、そして示したデータは、様々なメタコリン濃度における各グループの感作マウス間で平均したｐｅａｋ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐａｕｓｅ（Ｐｅｎｈ）値、±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。（ＢＡＬＢ×ＨＢＡ）Ｆ１は、ＢＡＬＢ／ｃ表現型を示し、一方（ＢＡＬＢ×ＤＢＡ）Ｆ１マウスはＤＢＡ／２様の表現型を示す。
【図２】図２は、ＨＢＡ第１１染色体の領域は、ＤＢＡ／２から受け継がれたことを示す。ＨＢＡ第１１染色体は、ＳＳＬＰマーカーによって表される、ｈｂａ−α２およびｅｓ−３の間の、ＤＢＡ由来の２つの領域を含む。ＤＢＡ／２遺伝子型を有するＨＢＡ第１１染色体の領域を、左の図において（青色で）強調する。マーカー（左）は、Ｄ１１Ｍｉｔ２３０に対して遠位の２−５ｃＭの分解能を提供する。マウス第１１染色体が５ｑ２３−３５と高度に保存されたシンテニーの領域を有する場合、さらなるマーカーがＢＡＬＢ／ｃおよびＤＢＡ／２間の情報を与える多型によって同定され、この領域において０．０１−２ｃＭの分解能を与えた（右カラムのマーカー）。一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）マーカーを、ＳＳＬＰマーカーと区別するために緑色で示し、そして赤色で表示された目的の特定の遺伝子の位置も示す。本発明者らのマーカー地図の配置がＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ＲｅｐｏｒｔｓおよびＭＩＴ連結地図と異なる場合、本発明者らの地図は以前の連結および物理的地図と一致する。
【図３】図３ａは、Ｎ２マウスによるＩＬ−４産生は、Ｆ１およびＨＢＡ表現型に対応するピークを有する双峰分布であることを示す。複数の実験において組換えＮ２マウスの相対的表現型を評価する方法として、本発明者らは複数の実験からのデータの整理統合を可能にする指数化関数（ｉｎｄｅｘｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を利用した。柱状グラフは、（ＢＡＬＢ×ＨＢＡ）Ｆ１、ＨＢＡホモ接合体、および示した組換えハプロタイプを有するＮ２マウスのＩＬ−４指数値の、双峰分布を示す。Ｆ１およびＨＢＡハプロタイプと関連する分布は独特である（Ｐ＜０．０００１、対応あるスチューデントｔ検定）。図３ｂは、ＩＬ−４の調節はＫｉｍ１ｓｓｃｐと共に分離することを示す。組換えＮ２ハプロタイプを、ＩＬ−４指数値によって、高ＩＬ−４表現型（指数＜０．３５）および低ＩＬ−４表現型（指数＞０．６５）と関連するグループへ分類した。ボックスの各カラムは、組換えハプロタイプを示す。Ｄ１１Ｍｉｔ２６９からＤ１１Ｍｉｔ１５４までの間の遺伝子座におけるこれらハプロタイプの対立遺伝子に、遺伝子型によって明暗をつけた（濃い＝Ｆ１；薄い＝ＨＢＡ）。高ＩＬ−４産生は、４つのハプロタイプと分離し（左）、そして低ＩＬ−４産生は４つのハプロタイプと分離する（右）。ＩＬ−４表現型はＫｉｍ１ｓｓｃｐと連結する。図３ｃは、Ｎ２マウスのＡＨＲは、Ｆ１およびＨＢＡ表現型に対応するピークを持つ双峰分布であることを示す。Ｐｅｎｈ値から計算した指数値を示す。柱状グラフは、Ｎ２マウスのＡＨＲ指数値の双峰分布を示す。（ＢＡＬＢ×ＨＢＡ）Ｆ１、ＨＢＡホモ接合体、および組換えハプロタイプを示す。Ｆ１およびＨＢＡハプロタイプと関連する分布は別個である（Ｐ＜０．０００１、対応あるスチューデントｔ検定）。図３ｄは、ＡＨＲ調節遺伝子座は、Ｄ１１Ｍｉｔ２２およびＤ１１Ｍｉｔ２７１間のＩＬ−４調節遺伝子座と同時分離することを示す。組換えＮ２ハプロタイプを、ＡＨＲ指数値によって、高ＡＨＲ表現型（指数＜０．３５）、および低ＡＨＲ表現型（指数＞０．６５）と関連するグループへ分類した。ボックスの各カラムは、組換えハプロタイプを示す。Ｄ１１Ｍｉｔ２６９からＤ１１Ｍｉｔ１５４間の遺伝子座におけるこれらハプロタイプの対立遺伝子に、遺伝子型によって明暗をつける（濃い＝Ｆ１；薄い＝ＨＢＡ）。高ＡＨＲは、４つのハプロタイプと分離し（左）、そして低ＡＨＲ産生は３つのハプロタイプと分離する（右）。ＡＨＲ調節遺伝子座は、Ｄ１１Ｍｉｔ２７１およびＤ１１Ｍｉｔ２２間のＫｉｍ１ｓｓｃｐと連結する。
【図４】図４は、Ｔａｐｒを含むマウス第１１染色体の区間は、５ｑ３３と高度に相同的である。Ｔａｐｒ遺伝子座の周囲の複合地図を構築するために、本発明者らはマウス連結、戻し交配、および照射ハイブリッド地図から入手可能な情報を統合し、そしてヒトゲノムの現在の地図において、高度に保存されたシンテニーの領域を同定した（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｖ３、ＵＣＳＣ、２００１年３月）。マウス第１１染色体（左）の物理的地図に位置するＥＳＴを、その登録番号で表示し、そしてヒト第５染色体（右）のＥＳＴに対応する、遺伝子に対する相同性によって整列させた（中央）。ＫＩＡＡ０１７１およびＳｇｄ間の公知の遺伝子を全て示す。
【図５Ａ】図５Ａは、新規ＴＩＭ遺伝子ファミリーおよびＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３における主要な多型の同定、マウスＴＩＭ−１およびマウスＴＩＭ−２のクローニング、遺伝子ファミリーのメンバー、マウスＴＩＭ遺伝子ファミリーメンバーの配列を示す。陰をつけたボックスは、２つのマウスＴＩＭ遺伝子間の同一性を示す。ｃｏｎＡ刺激脾臓細胞由来の全ＲＮＡを、Ｇｉｂｃｏ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを用いて逆転写した。全長Ｔｉｍ−３  ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を増幅し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ試薬で精製し、そしてＢｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって直接配列決定した。Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−２  ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−ＸＬクローニング試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＴＯＰ１０細胞にクローニングした。プラスミドを、標準的なアルカリ溶解プロトコールを用いて精製した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡプラスミドを、記載したように配列決定した。マウスＴＩＭ−１、ラットＫＩＭ−１、およびＨＡＶｃｒ−１の相同性。マウスＴＩＭ−１との同一性を、陰をつけたボックスによって表示する。おおよそのシグナル部位を白い反転した三角形によって表示し、そしてＩｇドメイン／ムチンドメイン境界を黒い菱形で示す。予測される膜貫通ドメインに下線を引く。ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ  ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３間の主要な多型を有するＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３配列を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、新規ＴＩＭ遺伝子ファミリーおよびＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３における主要な多型の同定、マウスＴＩＭ−１およびマウスＴＩＭ−２のクローニング、遺伝子ファミリーのメンバー、マウスＴＩＭ遺伝子ファミリーメンバーの配列を示す。陰をつけたボックスは、２つのマウスＴＩＭ遺伝子間の同一性を示す。ｃｏｎＡ刺激脾臓細胞由来の全ＲＮＡを、Ｇｉｂｃｏ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを用いて逆転写した。全長Ｔｉｍ−３  ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を増幅し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ試薬で精製し、そしてＢｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって直接配列決定した。Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−２  ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−ＸＬクローニング試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＴＯＰ１０細胞にクローニングした。プラスミドを、標準的なアルカリ溶解プロトコールを用いて精製した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡプラスミドを、記載したように配列決定した。マウスＴＩＭ−１、ラットＫＩＭ−１、およびＨＡＶｃｒ−１の相同性。マウスＴＩＭ−１との同一性を、陰をつけたボックスによって表示する。おおよそのシグナル部位を白い反転した三角形によって表示し、そしてＩｇドメイン／ムチンドメイン境界を黒い菱形で示す。予測される膜貫通ドメインに下線を引く。ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ  ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３間の主要な多型を有するＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３配列を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、新規ＴＩＭ遺伝子ファミリーおよびＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３における主要な多型の同定、マウスＴＩＭ−１およびマウスＴＩＭ−２のクローニング、遺伝子ファミリーのメンバー、マウスＴＩＭ遺伝子ファミリーメンバーの配列を示す。陰をつけたボックスは、２つのマウスＴＩＭ遺伝子間の同一性を示す。ｃｏｎＡ刺激脾臓細胞由来の全ＲＮＡを、Ｇｉｂｃｏ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩを用いて逆転写した。全長Ｔｉｍ−３  ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を増幅し、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ試薬で精製し、そしてＢｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｅ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって直接配列決定した。Ｔｉｍ−１およびＴｉｍ−２  ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ−ＸＬクローニング試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＴＯＰ１０細胞にクローニングした。プラスミドを、標準的なアルカリ溶解プロトコールを用いて精製した。ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡプラスミドを、記載したように配列決定した。マウスＴＩＭ−１、ラットＫＩＭ−１、およびＨＡＶｃｒ−１の相同性。マウスＴＩＭ−１との同一性を、陰をつけたボックスによって表示する。おおよそのシグナル部位を白い反転した三角形によって表示し、そしてＩｇドメイン／ムチンドメイン境界を黒い菱形で示す。予測される膜貫通ドメインに下線を引く。ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ  ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３間の主要な多型を有するＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３配列を示す。
【図６】図６は、ＴａｐｒはＣＤ４  Ｔ細胞のＩＬ−４およびＩＬ−１３応答を調節することを示す。ＢＡＬＢ／ｃ  ＤＯ１１．１０マウス由来のＴ細胞は、ＨＢＡ  ＤＯ１１．１０マウス由来のＴ細胞よりも、抗原に応答してより高いレベルのＩＬ−４およびＩＬ−１３を産生する。脾臓ＣＤ４＋細胞を、抗ＣＤ４磁気ビーズを用いてポジティブセレクションによって単離し、そして次いで骨髄由来のＤＣおよびＯＶＡと同時培養した。７日後、細胞を再刺激した。２次培養の１８−２４時間後に上清を回収した。データは、増加するＯＶＡ濃度において検出された平均サイトカインレベル、±Ｓ．Ｄ．を示す。初回抗原刺激および分化の間の、精製ＣＤ４Ｔ細胞におけるＴＩＭ−１  ｍＲＮＡの発現の検出。
【図７】図７は、ヒトおよびマウスＴＩＭタンパク質配列の配列アラインメントを示す。
【図８】図８は、ヒトＴＩＭ−１における多型を示す。
【図９】図９は、ヒトＴＩＭ−１のＳＳＣＰ多型分析を示す。
【実施例】
【０１２３】
以下の実施例は、本発明の作成および使用方法の完全な開示および記載を当業者に提供するために述べられ、そして本発明として考えられるものの範囲を制限することを意図しない。使用された数（例えば量、温度、濃度等）に関して、正確さを保証するために努力がなされたが、いくらかの実験誤差およびずれは許されるべきである。他に示されなければ、割合は重量による割合、分子量は平均分子量、温度は摂氏、そして圧は大気またはその付近である。
【０１２４】
（実験）
喘息感受性遺伝子に関してヒト５ｑ２３−３５領域を分析するために、発明者らはいくつかの潜在的な利点を提供するマウスモデルを利用した。環境の変化を調節し得、複数の表現型を同時に試験し得、そして同系交配株をアレルゲンで感作して、ヒト喘息の基本的な特徴である気道過剰応答性（ＡＨＲ）を発現し得る。発明者らは、ヒト染色体５ｑに相同的な小さな染色体領域でのみ異なる、類遺伝子性の同系交配マウス株を利用し、それによってこの領域を、領域外の遺伝的変異の非存在下で研究することを可能にした。ポジショナルクローニングは、Ｔ細胞膜タンパク質（Ｔｉｍ）をコードする新規遺伝子ファミリー、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＴＩＭ−５、ＴＩＭ−６、およびＴＩＭ−７を明らかにし、このうちＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３およびＴＩＭ−４の主要な配列異型が、Ｔａｐｒと完全に同時分離する。
【０１２５】
ＩＬ−４産生および気道過剰応答性は、ＨＢＡマウスで減少される。発明者らは、個々のＤＢＡ／２染色体から受け継がれた別々のゲノム間隔を有する、ＢＡＬＢ／ｃゲノムバックグラウンドで産生された類遺伝子性マウスを調査した。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｔｈ２に偏った、増強したＡＨＲを伴うアトピーに似た免疫反応を発現し、一方ＤＢＡ／２マウスは、ＡＨＲの発現に対して保護する、減少されたＩＬ−４反応を発現する。これら類遺伝子性株のいくつかを、抑制されたＴｈ２応答性に関してスクリーニングすることによって、発明者らは１つの類遺伝子性株、Ｃ．Ｄ２  Ｅｓ−Ｈｂａ（ＨＢＡ）を同定し、これはヒト５ｑ２３−３５に相同的な、ＤＢＡ／２マウスから受け継がれた第１１染色体の部分を含んでいた。図１ａは、免疫コントロールＢＡＬＢ／ｃマウスからのリンパ節細胞が、予測される通り、高レベルのＩＬ−４を産生することを示し、Ｔｈ２に偏った免疫反応を発現するＢＡＬＢ／ｃマウスの傾向を確認した。対照的に、ＨＢＡマウス由来のリンパ節細胞は、ＤＢＡ／２マウスで観察されるものと同様の、有意に低いレベルのＩＬ−４を産生した。それに加えて、ＨＢＡマウスはＢＡＬＢ／ｃマウスと比較して、有意に少ないＩＬ−１３およびＩＬ−１０、そしていくらか低いレベルのＩＬ−５を産生し、一方ＩＦＮ−γの産生は図１ｂに示すように増加した。これらの結果は、ヒト５ｑ２３−３５との保存されたシンテニーの大きな領域を有する、ＨＢＡ第１１染色体のＤＢＡ／２由来の領域は、抗原特異的ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１０産生を減少し、ＩＦＮ−γ産生を増強し、そしてＢＡＬＢ／ｃサイトカイン表現型をＤＢＡ／２サイトカイン表現型へ転換する遺伝子を含むことを示した。
【０１２６】
ＨＢＡマウスを、Ｔｈ２に偏った免疫反応と関連する、抗原誘発性気道過剰応答性（ＡＨＲ）を発現する能力に関して調査した。アレルゲンによる感作およびチャレンジ時に、コントロールＢＡＬＢ／ｃマウスは高いＡＨＲを発現し、一方同様に免疫したＨＢＡ類遺伝子性マウスは、ＤＢＡ／２マウス同様、メタコリンに反応して通常の気道応答性を示した（図１ｃ）。集合的に、これらの結果は、第１１染色体上の単一の遺伝子座における遺伝的変異が、Ｔｈ２サイトカイン産生およびＡＨＲの両方を調節することを強く示唆し、従って発明者らは、ＨＢＡマウスにおける関連する遺伝的決定基を、単一遺伝子座、Ｔ細胞および気道表現型レギュレーター（Ｔａｐｒ）と仮に呼ぶ。
【０１２７】
本出願人らは（ＢＡＬＢ／ｃ×ＨＢＡ）Ｆ１マウスもまた調査し、それはＢＡＬＢ／ｃマウス同様、高レベルのＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１０を産生し（図１ａおよび１ｂ）、そして上昇した抗原誘発ＡＨＲを発現した（図１ｃ）。これらの結果は、第１１染色体のＤＢＡ／２対立遺伝子が、ＩＬ−４合成を調節する他の遺伝子と独立して、劣性な様式でＩＬ−４産生およびＡＨＲを低減したことを示す。対照的に、（ＢＡＬＢ／ｃ×ＤＢＡ／２）Ｆ１マウスは、低レベルのＩＬ−４を産生し、そして免疫化に対して通常の気道応答性を有しており（図１）、ＤＢＡゲノムの他の領域由来の遺伝子座もＩＬ−４産生および抗原誘発ＡＨＲを調節すること、そしてＤＢＡ／２対立遺伝子は、全体として優性な様式でＩＬ−４産生およびＡＨＲを制限するように機能することを示す。これらの結果は、アトピー性形質の多遺伝子、複雑な性質を強調し、そして喘息表現型にもまた影響を与える複数の上位遺伝子からの干渉なしに、単一遺伝子座を単離および特徴づけするために、類遺伝子性株を使用する潜在的な利点を示す。
【０１２８】
ＡＨＲおよびＩＬ−４応答性を調節する遺伝子座、Ｔａｐｒの遺伝的マッピング。以前に、ＨＢＡマウスの類遺伝子性領域が、２つの第１１染色体マーカー、ヘモグロビン−α２（ｈｂａ−α２）およびエステラーゼ−３（ｅｓ−３）遺伝子座を含む、３６のゲノム範囲のマーカーで詳細に描写された。第１１染色体の外側、ＨＢＡゲノムは、ＢＡＬＢ／ｃから受け継がれた。ＤＢＡ／２およびＢＡＬＢ／ｃマウス間で多型であることが公知の２５個の単純配列長多型（ＳＳＬＰ）マーカーを用いたより正確な分析が、ＨＢＡマウスはＤＢＡ／２から第１１染色体の２つの部分を受け継いだことを示した（図２、左カラム）。近位領域は、染色体５ｑ２３−３５と相同性を有する２０ｃＭの部分を含んでおり、それはヒト喘息連鎖研究で関係した遺伝子座を、喘息のマウスモデルで同定し得る可能性を提供した。
【０１２９】
ＴＨ２−ＡＨＲ調節遺伝子座、Ｔａｐｒをより高い分解能でマッピングするために、（ＢＡＬＢ／ｃ×ＨＢＡ）Ｆ１マウスを、ＨＢＡマウスと戻し交配してＮ２動物を産生した。この戻し交配アプローチを用いて、ＨＢＡ親によって寄与される対立遺伝子のセットを前もって決定し、そしてＦ１親によって寄与される対立遺伝子のセットを遺伝子型決定によって評価し得る。従って、類遺伝子性領域に情報を得られるハプロタイプを産生する組換えの発生を、Ｎ２マウスにおいて検出し得、そしてＴａｐｒの類遺伝子性間隔における遺伝子座への連鎖を評価するために使用し得る。Ｔａｐｒの劣性性質のために、本出願人らは、これら戻し交配由来のＮ２マウスを試験して、ＨＢＡ  Ｔａｐｒ表現型を与えるのに十分なＨＢＡ由来遺伝子の最低限のホモ接合体領域を同定した。２，０００を超えるＮ２動物を産生し、そして遺伝子型決定した。ＳＳＬＰマーカーを用いて、本出願人らは情報を得られる組換え発生を有するＮ２マウスを選択し、そしてこれらのＮ２マウスを、カサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）による免疫化に反応してＩＬ−４を産生する能力に関して表現型決定した。この一次分析において、本出願人らは、関連する遺伝子座が、近位類遺伝子性領域、Ｄ１１Ｍｉｔ１３５とＤ１１Ｍｉｔ２６０との間に存在することを決定した。より高い分解能でＴａｐｒをマッピングするために、２２のさらなるマーカーを同定し、そして関心のある領域で０．１−１ｃＭの分解能を提供するために利用した。
【０１３０】
数ヶ月にわたって行なわれたＩＬ−４サイトカイン分析の結果を正確に比較するために、各実験のＩＬ−４指数を各Ｎ２マウスに関して生成し、（Ｂ−ｘ／Ｂ−Ｈ）、ここでＢ＝ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の細胞によるＩＬ−４産生、Ｈ＝ＨＢＡマウス由来の細胞によるＩＬ−４産生、そしてｘ＝評価されるＮ２マウス由来の細胞によるＩＬ−４産生である。ＩＬ−４の高い濃度（ＢＡＬＢ／ｃ様）は、０に近い指数値で表され、そしてＩＬ−４の低い濃度（ＨＢＡ様）は、１．０に近い指数値で表される。“Ｂ”および“Ｈ”値は、本出願人らが試験した、情報を得られる組換えを有する３−６匹のＮ２マウスのグループそれぞれに関して、３−５匹のコントロールマウスで確立された。指数値は、二方式分布になり（図３ａ）、そこで非組換えＨＢＡ遺伝子型を有するＮ２マウスに関連する表現型指数は、非組換え（ＢＡＬＢ／ｃ×ＨＢＡ）Ｆ１遺伝子型を有するＮ２マウスに関連する表現型指数よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０００１、対の学生のｔ−試験）。
【０１３１】
独特の遺伝子型を有するマウスに関して、これは連鎖分析において重要であるので、本出願人らは数ヶ月を費やして、サイトカイン産生およびＡＨＲの単回測定が適当であることを保証した。まず、関心のある組換えを有するＮ２マウスをそれぞれ試験するのと同時に、本出願人らは、遺伝子型が厳密にＨＢＡまたはＦ１（ＢＡＬＢ×ＨＢＡ）である、各“組換えＮ２”の“非組換え”同胞も試験した。さらに、本出願人らは、その特定のＮ２遺伝子型を有する個々のマウスをより多く有するために、関心のある組換えを有するＮ２マウスのいくらかを、ＨＢＡマウスに戻し交配することによって、さらなるＮ３マウスを繁殖させた。全ての値は所定の遺伝子型を有する試験した個々のマウスの値の平均であった。この方法で、本出願人らは、サイトカイン産生およびＡＨＲの測定、ならびに本出願人らは生物学的システムで固有の変動性によるアッセイの変動を克服したことを確信する。
【０１３２】
組換えハプロタイプを受け継いだＮ２マウスに関連するＩＬ−４値は、二方式分布で分離したので（図３ａ）、高ＩＬ−４反応を調節する遺伝子座は、マーカーＤ１１Ｍｉｔ２７１およびＤ１１Ｍｉｔ２２の間に位置することを示し得た（図３ｂ）。さらに、高レベルのＩＬ−４産生が、Ｋｉｍ１ｓｓｃｐに存在するＢＡＬＢ／ｃ対立遺伝子を有する全てのマウスで観察され、そして低レベルのＩＬ−４産生が、Ｋｉｍ１ｓｓｃｐにおいてホモ接合体ＨＢＡ遺伝子型を有する全てのマウスで観察された。従って、Ｔａｐｒは、Ｋｉｍ１ｓｓｃｐ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｋｉｍ−１）のマウスホモログ中のイントロンマーカーと非組換え性である。対照的に、Ｔａｐｒは他の全てのマーカーから、少なくとも１つの組換えを有して分離される。ＴａｐｒおよびＫｉｍ１ｓｓｃｐが共に分離するという事実は、Ｔａｐｒ遺伝子座がＫｉｍ１ｓｓｃｐの非常に近くに位置するか、または区別できないことを示した。Ｄ１１Ｍｉｔ２７１とＤ１１Ｍｉｔ２２との間の組換えハプロタイプ頻度に基づいて、本出願人らは組換え頻度を０．００３９と計算し、それは、Ｔａｐｒ遺伝子座は小さい０．３−０．５ｃＭ領域に位置することを示す。本出願人らはまた、ＴａｐｒとＩＬ−４との間の組換え頻度を０．０８と計算した。従って、ＴａｐｒはＩＬ−４サイトカインクラスターから５−１０ｃＭ離れた場所に位置するが、これは、ヒトアトピーおよび喘息に連鎖する５ｑ２３−３５と高度に保存されたシンテニーを有するマウスゲノムの領域内にある。
【０１３３】
相似アプローチを用いて、本出願人らは、情報を得られる組換えハプロタイプを有するマウスにおいて、アレルゲン誘発ＡＨＲ表現型の分離を調査した。指数化ＡＨＲ値を用いて、Ｎ２マウスは明らかに親の表現型を示し、それは感作Ｎ２マウスのグループにおけるＡＨＲ指数値の柱状グラフにおいて、二方式分布を生成した（図３ｃ）。１，０００を超えるＮ２マウスに関連するＡＨＲ表現型の分離を分析することによって、本出願人らは、ＡＨＲ反応を調節する遺伝子座も、マーカーＤ１１Ｍｉｔ２７１とＤ１１Ｍｉｔ２２との間に位置し（図３ｄ）、そしてＡＨＲ表現型はＫｉｍ１ｓｓｃｐと非組換えであることを示した。従って、本出願人らは、ＩＬ−４応答性およびＡＨＲはどちらも、Ｔａｐｒ遺伝子座と同時分離することを示し、それは同じ遺伝子座がＩＬ−４発現およびＡＨＲをどちらも調節することを示唆する（図３）。
【０１３４】
これらの発見はさらに、Ｔａｐｒ遺伝子座は、以前に「候補」アトピー感受性遺伝子または喘息感受性遺伝子と考えられていた、ＩＬ−４サイトカインクラスターおよびクラスター内のサイトカイン遺伝子に対して５ｃＭを超えてｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃであることを示す。本出願人らのマッピング結果はまた、Ｔａｐｒは、ＩＬ−１２ｐ４０遺伝子およびＴＨ１−ＩＬ１２調節遺伝子座、Ｔｐｍを含むマウス第１１染色体の領域のどちらとも遺伝的に分離することを確立した。
【０１３５】
マウスおよびヒトホモログは、Ｔａｐｒをヒト５ｑ３３に固定する（ａｎｃｈｏｒ）。Ｔａｐｒ遺伝子座の周囲に複合マップを構築するために、本出願人らは、Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＧＤ）連鎖、戻し交配、および照射ハイブリッド地図から入手可能な情報を統合し、そしてヒトゲノムの地図において保存されたシンテニーの領域を同定した。現在の照射ハイブリッドマップは、公知の遺伝子またはｕｎｉｇｅｎｅクラスターと広範囲の相同性を有する、いくつかの発現配列タグ（ＥＳＴ）を含む、Ｄ１１Ｍｉｔ２７１およびＤ１１Ｍｉｔ２２の近くに存在するマーカーを、マウスゲノムの物理的地図に配置する。本出願人らはさらに、これらのマーカーおよびその関連するＥＳＴを、公知の遺伝子クラスターに対する、以前には同定されていない類似性に関して調査した。本出願人らは、ヒトゲノムに対する比較のために、これらのマーカーを骨組みに集合させた。このアプローチを用いて、本出願人らは、特定の照射ハイブリッドマーカーと以下のヒト遺伝子との間に有意な類似性を発見した：ＫＩＡＡ０１７１、Ａｄａｍ−１９、Ｓｏｘ−３０、Ｐｉｒ−１２１、Ｃｒｓｐ９（Ｃｒｓｐ３３）、およびｈＨＡＶｃｒ−１（ｈＨＡＶｃｒ−１）。図４は、一旦本出願人らがこれらの遺伝子を本出願人らの側面に位置するマーカー間のマウスゲノムの物理的地図に固定したことを示す。本出願人らは、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒにおいてそれらの遺伝子の位置決定をし得る。
【０１３６】
この領域におけるマウスおよびヒトゲノム間の高度の保存は、Ｔａｐｒ遺伝子座のヒト５ｑ３３．２に対する連鎖を示す。図４に示すように、本出願人らは、ヒト地図のこの領域における全ての公知の遺伝子およびＥＳＴを同定した。ヒトｈＨＡＶ−ｃｒおよびＫｉｍ−１のマウスホモログの近くにある特に関心のある遺伝子は、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ（Ｉｔｋ）およびＳＰ−１転写因子（Ｃｒｓｐ９）の補調節因子を含み、これらはどちらもＴ細胞の分化に関与することが知られている。本出願人らは、これら候補遺伝子由来のコード領域を配列決定し、そしてＩＴＫまたはＣＲＳＰ−９のどちらにも多型を発見しなかった。
【０１３７】
新規Ｔ細胞表面タンパク質ファミリーのＴａｐｒ領域への位置決定。ラットＫｉｍ１のマウスホモログは、０．４ｃＭ領域内に位置し、そしてＴａｐｒと密接に連鎖するので、本出願人らは公共に利用可能なデータベースを調査し、そしていくらかの配列類似性を有するＥＳＴのクラスターを発見した。それらは部分的な適用範囲しか提供せず、そして大きな変異部分を含んでいた。Ｋｉｍ−１の最も近いヒトホモログは、ヒトＡ型肝炎ウイルス細胞レセプター、ｈＨＡＶ−ｃｒであり、そしてヒトゲノムのｔＢＬＡＳＴ検索は、おそらく遺伝子ファミリーのメンバーである、Ｋｉｍ−１の２つのさらなるホモログもまた、ヒト第５染色体およびマウス第１１染色体に位置することを示唆した。
【０１３８】
ｃｏｎＡ刺激脾臓細胞由来のｃＤＮＡを使用して、本出願人らはＫｉｍ１の２つのマウスオルソログを同定およびクローニングした。本出願人らはそれらをＴｉｍ１およびＴｉｍ２と名付け、図５Ａに示すようにＴａｐｒ領域に位置する。ＴＩＭ−３は、３番目の、より関連が遠い、ＫＩＭ−１のオルソログである。
【０１３９】
この遺伝子ファミリーの３つのメンバーは全て、刺激Ｔ細胞によって発現され、そして３つの形式は全てマウス第１１染色体／ヒト第５染色体のＴａｐｒ領域に位置し、ここでそれらは、免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン、ムチンドメイン、およびリン酸化部位を有する細胞内尾部を含む、共通の構造モチーフを有する細胞表面糖タンパク質をコードする。これらタンパク質の細胞機能は未知であるので、本出願人らはその遺伝子を、Ｔ細胞、免疫グロブリンドメイン、ムチンドメイン（Ｔｉｍ）遺伝子ファミリーのメンバーと呼ぶ。マウスＴｉｍ１は、ラットＫｉｍ１およびアフリカミドリザルおよびヒトで同定されたＨＡＶｃｒ−１のマウスホモログである。Ｔｉｍ２は、本研究以前にはどの有機体においても同定されたことのない、以前には未知の遺伝子である。
【０１４０】
マウスＴｉｍ１遺伝子は、３０５アミノ酸膜タンパク質をコードし、それはラットＫＩＭ−１と７８％の全体同一性、そしてヒトＨＡＶｃｒ−１と３５％の同一性を有する。図５Ｂに示した、マウスＴＩＭ−１、ラットＫＩＭ−１、ヒトＨＡＶｃｒ−１およびアフリカミドリザルＨＡＶｃｒ−１を用いたギャップ多重配列アライメント（ｇａｐｐｅｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）は、これらの種におけるＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶｃｒ−１タンパク質間の相同性の程度を示す。ＴＩＭ−１の細胞質領域は、２つのチロシン残基を含み、そして高度に保存されたチロシンキナーゼリン酸化モチーフ、ＲＡＥＤＮＩＹを含み、それはＴＩＭ−１の予測されるＩｔｋ部位およびＥＧＦＲキナーゼ部位、ＳＲＡＥＤＮＩＹＩＶＥＤＲＰと一体である。ＴＩＭ−１のムチンドメインは、複数のＯ−結合糖鎖付加部位を有し、そして免疫グロブリンドメインに２つのＮ−結合糖鎖付加部位が見出される。
【０１４１】
同様の３０５アミノ酸膜タンパク質であるＴＩＭ−２は、マウスＴＩＭ−１と６４％の同一性、ラットＫＩＭ−１と６０％の同一性、およびｈＨＡＶｃｒ−１と３２％の同一性を有する（図５Ａ、Ｂ）。ＴＩＭ−１と同様、ＴＩＭ−２は２つの細胞外Ｎ−結合糖鎖付加部位、および多くのＯ−結合糖鎖付加部位を有するセリン、スレオニン−リッチなムチンドメインを有する。ＴＩＭ−２もまた、細胞内チロシンキナーゼリン酸化モチーフ、ＲＴＲＣＥＤＱＶＹを有する。
【０１４２】
Ｔｉｍ３は、複数の細胞外糖鎖付加部位および細胞内チロシンリン酸化モチーフを有する、同様の膜貫通糖タンパク質構造を有する２８１アミノ酸膜タンパク質をコードする。ＴＩＭ−３においては、ムチンドメインはＴＩＭ−１およびＴＩＭ−２におけるほど顕著ではないが（図５Ａ）、Ｔ細胞に発現したＴＩＭ−３は、おそらくＡＰＣ上のリガンドと相互作用し、そしてＡＰＣ活性化を変化させる。ＴＩＭ−３は、４つのＮ−結合糖鎖付加部位、および５つのＯ−結合糖鎖付加部位を有し、ＴＩＭ−３は、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−２と同様、高度に糖鎖付加されており、そして抗原提示細胞のような他の細胞に存在するリガンドと相互作用し得ることを示唆する。
【０１４３】
Ｔｉｍ４は、マウスでは３４４アミノ酸のタンパク質、ヒトでは３７８アミノ酸のタンパク質をコードする。予測されるＴＩＭ−４はまた、高度に保存されたシステイン残基を有するＩｇＶ様ドメイン、スレオニン−リッチなムチン様ドメイン、および短い細胞内尾部を有して、他のＴＩＭタンパク質の一般的な膜糖タンパク質構造モチーフを共有する。しかし、ＴＩＭ−４は、他のＴＩＭタンパク質に存在するリン酸化チロシンモチーフを欠き、従って他のＴＩＭタンパク質の機能を調節し得る。
【０１４４】
各ＴＩＭ  Ｉｇドメインは、細胞接着、生存、および腫瘍形成、ならびにヘルパーＴ細胞の分化の調節に関与しているＴＩＭのような膜貫通タンパク質である、オステオポンチンで見出されるＳＶＶＹＧＬＲモチーフに似た、予測されるインテグリン結合モチーフを共有する。このインテグリン結合モチーフは、アルファ（９）特異性およびアルファ（４）特異性を示す。
【０１４５】
３つのＴｉｍ遺伝子に関するＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ／ＤＢＡコード領域の配列比較は、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、およびＴＩＭ−４における主要な多型を明らかにしたが、ＴＩＭ−２ではなかった。ＴＩＭ−１において、これらの多型は３つのアミノ酸の違いおよびＨＢＡ／ＤＢＡにおける１５のアミノ酸欠失をコードする。７つの予測されるアミノ酸の違いがＴＩＭ−３において同定された（図５Ｃ）。ゲノム配列が、欠失を含むこれらの多型は、スプライシング異型ではなく、真の多型であることを確認する。他のマウス株におけるＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３のゲノム部分のさらなる配列決定によって、本出願人らは、低減されたＴＨ２およびＡＨＲ反応を発現する傾向がある点でＤＢＡ／２と類似の株であるＣ５７／ＢＬ６もまた、Ｔｉｍ１およびＴｉｍ３のＨＢＡ／ＤＢＡ対立遺伝子を有することを発見した。ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４の多型は、シグナルおよびムチン様ドメインに位置し、一方ＴＩＭ−３において同定された多型は、Ｉｇドメインに集中している（図５Ｃ）。Ｉｇおよびムチンドメインを有する糖タンパク質において、どちらかのドメインにおける異型は、ＭＡｄＣＡＭ−１で示されたように、レセプター−リガンド相互作用に影響し得る。ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４の予測される切断部位はシグナル配列における多型によって変化しないが、多型が切断の効率および／またはレセプターの細胞表面への往来に影響し得ることが可能である。これらのＴｉｍ配列および多型は、免疫反応、およびヒトにおけるＨＡＶウイルス病原性に重要である。
【０１４６】
本出願人らのＮ２戻し交配由来のゲノムＤＮＡサンプルの分析は（図３）、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３多型はＴａｐｒと完全に同時分離することを示した。これらの観察はＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、または両方における変化がＡＨＲおよびＴＨ２による炎症の変化をどの程度担うか識別しないが、本出願人らはヒトＴＩＭ−１（ｈＨＡＶｃｒ−１）および／またはＴＩＭ−３における多型は、喘息感受性とヒト染色体５ｑとの間の強力な関連の基礎となることを示唆する。この考えは、ヒトＴｉｍ１のコード領域における主要な異型が、ヒトゲノムおよびＥＳＴデータベースの調査で明らかであるという事実によって支持される。これらヒトｃＤＮＡ異型と、以前に記載されたサルＨＡＶｃｒ−１の異型およびここで同定されたマウス異型との比較は、ＴＩＭ−１の予測されるタンパク質配列において広範囲の変異が存在することを示す（図５Ｂ、Ｃ）。この高い変異の程度が、ＴＩＭ−１およびそのファミリーメンバーを、喘息感受性候補遺伝子として最も綿密に研究されたサイトカインおよびサイトカインレセプターのような、他の多くの候補遺伝子と区別する。それに加えて、Ｔｉｍ１と喘息感受性との間の関連は、ダニ感受性小児喘息の、Ｔｉｍ１およびＴｉｍ３から約０．５メガベースであるマーカー、Ｄ５Ｓ８２０に対する有意な連鎖（平均ＬＯＤスコア＝４．８）の報告によってさらに支持される（図４）。
【０１４７】
上記の遺伝的多型に加えて、選択的スプライシングによって生じる、ＴＩＭ遺伝子におけるいくつかの発現多型が存在する。ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−２、およびＴＩＭ−４  ｍＲＮＡの選択的スプライシングは、いくつかのＴＩＭ異型を産生し、それらのいくつかは分泌される、可溶性形式のＴＩＭレセプターである。これらのスプライシング異型は、代わりの（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）５’非翻訳領域を有するＴＩＭスプライシング異型と共に、ＴＩＭタンパク質の細胞特異的、および状態特異的発現パターンに寄与し得る。
【０１４８】
Ｔ細胞はＴａｐｒに影響を与える。Ｔａｐｒ遺伝子座の機能をよりよく理解するために、本出願人らは、Ｔａｐｒの対立遺伝子異型が、Ｔ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）の機能に影響を与えるかどうか決定した。これらの実験のために、本出願人らは、ＨＢＡバックグラウンドを有する（ＨＢＡ  ＤＯ１１．１０）卵白アルブミン（ＯＶＡ）−特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニックマウス（Ｔｇ）を産生し、本出願人らはそれらをＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドを有する（ＢＡＬＢ／ｃ  ＤＯ１１．１０）ＴＣＲ−Ｔｇマウスと比較した。これら株のどちらか由来の精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡおよびＢＡＬＢ／ｃまたはＨＢＡ骨髄のいずれか由来の樹状細胞（ＤＣ）と同時培養し、そして産生されたサイトカインを評価した。照射脾臓細胞および他の組織は、高レベルのＴＩＭ遺伝子を発現することが発見されたので、この実験のためにＡＰＣとして照射脾臓細胞は使用しなかった。
【０１４９】
ＢＡＬＢ／ｃ  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞は、抗原提示細胞の供給源とは独立した方式で、ＨＢＡ  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞より高レベルのＩＬ−４およびＩＬ−１３を産生した（図６Ａ）。それに加えて、一次または二次刺激いずれかの間のＡＰＣの供給源にかかわらず、ＣＤ４  Ｔ細胞の供給源が、各抗原濃度において産生されたＩＬ−４／ＩＬ−１３の量を決定した。細胞型の各組み合わせの培養上清において、同等レベルのＩＬ−１２が検出され、さらにＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ  ＤＣ機能は同様であることを示した。さらに、ＢＡＬＢ  ＤＯ１１．１０およびＨＢＡ  ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞は、同等レベルのＩＬ−２を産生し、そして２次培養中にＯＶＡに反応して同様のレベルの増殖を示し、ＨＢＡおよびＢＡＬＢ／ｃ  Ｔ細胞は同様に活性化されるが、それらが産生するＴｈ２サイトカインのレベルがかなり異なることを示した。
【０１５０】
本出願人らは図６Ｂにおいて、本出願人らのＤＯ１１．１０／ＤＣシステムにおける１次培養の最初の１２時間以内に、本出願人らはＴＩＭ−１のｍＲＮＡがＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ  ＣＤ４＋  Ｔ細胞の両方によって発現されることを発見したことを示す。１次刺激から４日以内に、本出願人らはＢＡＬＢ／ｃ  ＤＯ１１．１０の上清において有意なレベルのＩＬ−１３を発見し、そしてＨＢＡ  ＤＯ１１．１０の上清においては検出しない。この違いは、３６時間においてｍＲＮＡレベルで検出可能である（図６Ｂ）。１２および３６時間の間に、ＩＬ−１３  ｍＲＮＡの発現はＨＢＡ  ＣＤ４  Ｔ細胞において低減され、一方ＩＬ−１３の発現はＢＡＬＢ／ｃ  ＣＤ４  Ｔ細胞において維持される。従って、抗原に対する１次反応の間に、ＢＡＬＢ／ｃ  ＣＤ４  Ｔ細胞は、ＨＢＡ  ＣＤ４  Ｔ細胞よりも強力なＴｈ２反応を発現する。本出願人らの発見は、Ｔａｐｒは、１次抗原特異的反応の間にヘルパーＴ細胞の分化を調節することを示し、そして本出願人らはこれらの反応の最も初期段階の間に、ＣＤ４  Ｔ細胞においてＴＩＭ−１の発現を検出する。
【０１５１】
成熟Ｔｈ１およびＴｈ２サブセットへの分化後に、ヘルパーＴ細胞は、Ｔｈ１細胞はＴＩＭ−３を発現し、一方Ｔｈ２細胞は選択的にＴＩＭ−１を発現するように、ＲＴ−ＰＣＲによって傾倒されたＴＩＭ発現を示す。全てのＴ細胞集団は弱いＴＩＭ−４発現を示す。ＴＩＭ−１によるＩｔｋシグナルがＴｈ２分化を促進するようであるが、ＴＩＭタンパク質によるＥＧＦＲシグナルが、エフェクターおよび特にメモリーＴ細胞集団における細胞生存を増強するようである。ＩｔｋはＴ細胞および肥満細胞にのみ発現されるので、ＴＩＭ−１に対するＩｔｋキナーゼ活性は免疫細胞、特に喘息およびアレルギーに関与するものに制限される。しかし、ＥＧＦＲのような他のタンパク質チロシンキナーゼが、虚血上皮細胞、照射脾臓細胞、および腫瘍細胞を含む、他の組織によって発現されるＴＩＭタンパク質の機能に関与する。
【０１５２】
これらの研究において、本出願人らは、喘息の基本的な特徴であるＴｈ２サイトカイン産生および抗原誘発ＡＨＲの発現を調節する遺伝子座である、Ｔａｐｒをマッピングした。本出願人らは、繰り返しアトピーおよび喘息に連鎖されてきたヒトゲノムの領域である、ヒト染色体５ｑに相同的な染色体部分を有する、間隔特異的類遺伝子性マウス（ＨＢＡ）を用いて、Ｔａｐｒを位置決定した。この領域はまた、脊髄形成異常および腫瘍性細胞発生異常と関連する５ｑ症候群に繰り返し連鎖された。複雑な形質をより単純な、あるいは単一の遺伝子、形質に変換するこの類遺伝子性マウス戦略を用いて、本出願人らはＴａｐｒの間隔を０．４ｃＭ間隔まで狭め、この領域におけるいくつかの候補遺伝子を配列決定し、そしてＴＩＭ遺伝子ファミリーをポジショナルクローニングした。
【０１５３】
ＴＩＭ遺伝子ファミリーは、以前に記載されたことがない。本出願人らは、全長ｃＤＮＡ配列を同定およびクローニングし、そしてＨＢＡマウスと比較してＢＡＬＢ／ｃのＴＩＭ−１タンパク質において有意な多型を発見した。本出願人らは、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３のＢＡＬＢ／ｃ配列は、ＡＨＲおよびアレルギー性Ｔ細胞反応に対する感受性に関連し、一方ＨＢＡ配列は、これらの反応に対する保護に関連することを見出した。ＴＩＭ−３は、分化したＴＨ１によって選択的に発現される。多型Ｔｉｍ３異型とＴａｐｒとの関連は、ＴＩＭ−３がＴＨ１およびＴＨ２細胞機能を調節し得ることを示唆する。しかし、Ｔｉｍ３における変異をまた、Ｔｉｍ４またはＴｉｍ１に緊密に連鎖したハプロタイプに帰し得る。
【０１５４】
本出願人らは、いくつかの理由により、ＴＩＭ−１は免疫系の調節において（特に喘息およびアレルギー性疾患に関して）、およびストレス（低酸素、栄養素の欠損、照射、化学療法等）に対する反応における上皮および造血細胞の生存の調節において、非常に重要な役割を果たしていると考える。まず、Ｔｉｍ１は、Ｔｉｍ３と同様、Ｔａｐｒ効果が起こる可能性が最も高い時である、１次抗原刺激の間にＣＤ４  Ｔ細胞に発現される。Ｔ細胞は、ＡＨＲの発現および喘息の病因に決定的な役割を果たし、本出願人らの結果は、Ｔａｐｒは、ＩＬ−１３の産生および続くＴ細胞分化を調節することによって、Ｔｈ２反応に対する初期のＣＤ４の傾倒を増強することによって、喘息に影響を与えることを示唆する。２番目に、乳児または小児期におけるヒトでのＨＡＶ感染は、喘息およびアレルギーの発現と逆比例して関連する。本出願人らは、ＨＡＶのＴＩＭ−１／ＨＡＶｃｒ−１との相互作用が、Ｔ細胞サイトカイン産生を変化させ得、そうでなければアトピーおよび喘息に罹患しやすい個人において、偏ったＴｈ１／Ｔｈ２バランスを逆行または予防でき得ることを示唆する。麻疹ウイルスレセプターであるＳＬＡＭは、ウイルス相互作用によって変化し得る方式でＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調節する、別のＴ細胞表面糖タンパク質の例である。麻疹ウイルスに関するＳＬＡＭ、またはＨＩＶに関するＣＤ４、ＣＣＲ５、およびＣＸＣＲ４のような、いくつかのウイルスレセプターは、宿主自身の免疫系のレセプターであるので、感染が成功しない場合でも、ウイルスレセプターによるシグナル伝達は、サイトカインの放出および疾患の発現を引き起こし得る。
【０１５５】
３番目に、ＴＩＭ−１における多型は、本出願人らが観察する、異なる型のヘルパーＴ細胞反応と関連する。従って、ＴＩＭ−１の異型はそれ自身、免疫異常のいかなる公知の環境的原因も存在しない場合に起こる、遺伝的Ｔｈ１／Ｔｈ２素因に寄与し得る。霊長類におけるＨＡＶレセプターは、高度に変異することが公知であり、そして本出願人らは、ヒトＴＩＭ−１／ｈＨＡＶｃｒ−１の多型対立遺伝子は、本出願人らがマウスで同定したものと同様、Ｔｈ２の偏りおよび喘息感受性における変異に関連し得ることを提案する。ウイルスレセプターとして作用し、そして感染に対する感受性を変化させる細胞表面分子の遺伝子における変異はまれなことではなく、従ってＴＩＭ−１およびＴＩＭ遺伝子ファミリーの他のメンバーにおける有意な遺伝的変異は、サイトカインのもののような他の遺伝子における変異よりも観察される可能性がより高い。なぜ喘息感受性対立遺伝子がヒト遺伝子プールにおいて優勢であり得るのかは明らかではないが、ＴａｐｒとＨＡＶｃｒとの関連は、喘息感受性対立遺伝子の残存に関して興味深い説明を提供する。ヒトの進化の間に、Ｔｉｍ遺伝子ファミリーのある対立遺伝子が、アトピー性疾患および他の免疫異常に対する抵抗性を与え得たが、それらの抵抗性対立遺伝子の選択は、ウイルス病原体に対する抵抗性を与える代替対立遺伝子の選択と平衡に達したのかもしれない。
【０１５６】
まとめると、本出願人らの研究は、強力な候補喘息感受性遺伝子を位置決定し、そしてこの複雑な遺伝的形質の調査における内在する困難を克服する、類遺伝子性マウス戦略の最初の成功した利用を提示する。本出願人らは、ヒト染色体５ｑに対して相同的な領域に存在する、以前には未知の遺伝子ファミリーを同定し、そしてそれはＴｈ細胞の分化および喘息感受性において主要な役割を果たす。ヒトにおける以前の研究は、ヒト染色体５ｑにおいていくつかの候補遺伝子を同定したが、本出願人らの研究で同定されたＴｉｍ１遺伝子産物はまた、ＨＡＶ感染と喘息感受性の低減との間の逆比例関係に関する説明を提供する。
【０１５７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｈ）の部分集団は、区別できるパターンのサイトカインを産生し、そしてこれはＴｈ細胞間の機能的不均一性の概念を導いた。１型Ｔｈ細胞（Ｔｈ１）は、インターロイキン２（ＩＬ−２）および／またはインターフェロンγを産生し、遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を誘発し、そしてマクロファージを活性化する。一方２型Ｔｈ細胞（Ｔｈ２）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を産生し、そして特にＩｇＥ産生および好酸球性炎症に重要であり、そして細胞による免疫を抑制し得る。Ｔｈ２細胞は、アトピーの病因において中枢の役割を果たすと考えられる。いくつかの因子が、特定の免疫反応の間に、Ｔヘルパー細胞がＴｈ２に対してＴｈ１へ分化するかどうかを決定する。これらは、サイトカイン環境、ＴＣＲシグナルの強さおよび／または抗原密度、ならびに副刺激経路を含むが、必ずしもこれに限らない。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞のＴｈ１またはＴｈ２サブセットへの分化は、アトピー、自己免疫疾患、感染性疾患、および移植片拒絶の結果に深い影響を有する。
【０１５８】
非アトピー性の個人をアレルギー性疾患の発現から保護し、そしてアトピー性個人でアレルギー性反応を阻害し得る、免疫反応の特定の特徴はあまり理解されていない。いくつかのシステムにおいて、Ｔｈ１細胞はＴｈ２細胞を交差調節するので、アレルゲン特異的Ｔｈ１細胞が、アレルギー性疾患および喘息を調節すると考えられた。Ｔｈ１細胞はＴｈ２細胞の発達および増殖を阻害し、そしてＩｇＥ産生はＩＬ−４およびＩＦＮ−γによって相互に調節される。これは、アレルギーからの保護は、阻害性アレルゲン特異的Ｔｈ１細胞の発達によることを示唆する。非アレルギー性個人の末梢血由来のアレルゲン特異的Ｔ細胞クローンは、Ｔｈ１サイトカインを産生することが示された。これらの観察はまた、喘息の衛生状態仮説を支持し、それは感染、特にＴｈ１反応を誘発するものの罹患率が、公衆衛生基準の改善ならびにワクチンおよび抗生物質の使用によって、西洋化社会において減少したことを示唆する。結果として、Ｔｈ２反応およびアトピーが、Ｔｈ１による反応の非存在下で、より激しくそして迅速に発現する。
【０１５９】
本明細書中で同定されたＴＩＭ遺伝子はまた、候補癌遺伝子である。ＴＩＭ遺伝子による細胞株のトランスフェクションは、細胞死への抵抗性を与え、そしてＴＩＭ−１において記載された予測されるＥＧＦＲキナーゼモチーフは、この細胞生存が調節される可能なメカニズムを提供する。さらに、ＴＩＭ−１は、細胞をＦａｓによるアポトーシスから保護するタンパク質である、ＴＯＳＯと有意な程度の配列同一性（約２０％）および構造的類似性（ＩｇＶドメイン、ムチン／シンデカンドメイン、膜貫通ドメイン、および同様のリン酸化チロシンモチーフを有する細胞内ドメインを有する膜貫通糖タンパク質）を示す。ＴＩＭ遺伝子と同様、ＴＯＳＯはおそらく癌遺伝子であり、造血系悪性腫瘍および固形腫瘍において頻繁な変化を有するゲノムの領域に位置する。
【０１６０】
（方法）
動物。Ｃ．Ｄ２  Ｅｓ−ＨＢＡを含む類遺伝子性株を、ＤＢＡ／２ＮをＢＡＬＢ／ｃＡｎＰｔバックグラウンドに、イントログレス的に（ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ）戻し交配することによって産生した。ＢＡＬＢ／ｃＢｙ、ＤＢＡ／２Ｊ、および（ＢＡＬＢ／ｃ×ＤＢＡ／２）Ｆ１マウス（ＣＢｙＤ２Ｆ１／Ｊ）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得、一方ＢＡＬＢ／ｃＡｎおよびＤＢＡ／２ＮをＴａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｓ．から得た。（ＢＡＬＢ／ｃ×ＨＢＡ）Ｆ１マウスを、ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪとＨＢＡとの間の交配によって産生した。Ｎ２マウスを、（ＢＡＬＢ／ｃ×ＨＢＡ）Ｆ１をＨＢＡに対して戻し交配することによって産生した。本出願人らの組換えＮ２動物の分析において、可能な場合にはいつも、組換えマウスを非組換え同胞と共に試験した。多数のアッセイにおいて個々のＮ２遺伝子型を調査するために、本出願人らは、選択されたＮ２マウスをＨＢＡに対して戻し交配してＮ３マウスを産生することによって、選択された組換えハプロタイプを保存し、それを遺伝子型決定して組換えＮ２ハプロタイプを有するマウスを選択した。ＯＶＡペプチド３２３−３３９（ｐＯＶＡ３２３−３３９）を認識するＴＣＲに関してトランスジェニックであり、そしてＢＡＬＢ／ｃ（４３）に対して戻し交配した、ＤＯ１１．１０マウスは、Ｄｒ．Ｄｅｎｎｉｓ  Ｌｏｈによって親切に提供され、そして本出願人らの施設で繁殖させた。ＨＢＡ  ＤＯ１１．１０マウスを、ＤＯ１１．１０をＨＢＡに対して戻し交配することによって産生した。ＤＯ１１．１０マウスを、ＴＣＲ−Ｔｇに関してＦＡＣＳ分析によって選択し、そして遺伝子型決定してＤ１１Ｍｉｔ１３５とＤ１１Ｍｉｔ１６８との間のＨＢＡ対立遺伝子に関して選択した。Ｔｈｅ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅが、全ての動物プロトコールを承認した。
【０１６１】
遺伝子型決定。Ｄ１１Ｍｉｔ１４０とＤ１１Ｍｉｔ２６９との間に存在する全ての利用可能な「Ｄ１１Ｍｉｔ−」マーカーならびに、Ｄ１１Ｍｉｔ２７１およびＤ１１Ｍｉｔ２２付近の全ての照射ハイブリッドマーカーを、ＤＢＡ／２とＢＡＬＢ／ｃとの間のあらゆる多型に関して試験することによって、Ｔａｐｒ遺伝子座周囲のさらなるマーカーを同定した。ＭＩＴ  ＭａｐＰａｉｒプライマーを、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から得、そして全ての他のプライマーを、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ、ＣＡ）において合成した。ＰＣＲを以前に記載したように行い、そしてＳＳＬＰ多型を４−５％のＭｅｔａｐｈｏｒアガロース（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で分離した。ＳＳＣＰに関して分析される産物を、３３Ｐ−ｄＣＴＰを用いて増幅し、Ｓｅｑｕｉ−Ｇｅｎ  ＧＴ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いて、４０Ｗおよび４℃で変性アクリルアミドゲルにおいて分離した。
【０１６２】
免疫化プロトコール。サイトカイン産生アッセイにおいて研究されたマウスを、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中のＫＬＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて初回抗原刺激した（Ｄｅｋｒｕｙｆｆら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４９、３４６８−７６（１９９２））。気道過剰応答性の測定のために、マウスを０日目に硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）と複合体化したＯＶＡで腹腔内（ｉ．ｐ．、５０μｇ）に、そして７、８、および９日目の軽い麻酔後、鼻腔内（ｉ．ｎ．、５０μｌのＰＢＳ中５０μｇのＯＶＡ）に免疫化した。コントロールマウスには、ミョウバン単独のｉ．ｐ．注射および鼻腔内ＰＢＳを与えた。吸入メタコリンに対する気道過剰応答性を、最後のＯＶＡ鼻腔内投与の２４時間後（１０日目）に測定した。
【０１６３】
気道応答性の測定。気道応答性を、以前に記載されたように（Ｈａｎｓｅｎら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０３、１７５−８３（１９９９））、身体全体の体積記録器（Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｒｏｙ、ＮＹ）においた意識のあるマウスからの、メタコリン誘発気流障害によって評価した。
【０１６４】
細胞培養。ＫＬＨで初回抗原刺激したマウス由来のリンパ節細胞を、以前に記載されたように調製した（Ｙｅｕｎｇら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１、４１４６−５２（１９９８））。トランスジェニックＤＯ１１．１０  ＣＤ４  Ｔ細胞を、抗ＣＤ４磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）とのインキュベーション後、ＭＡＣＳカラムを用いてポジティブに選択した。２×１０４細胞／ウェルを、９６穴丸底プレートにおいて２５０μｇ／ｍｌのＯＶＡおよび１×１０４細胞／ウェルの骨髄由来樹状細胞と共に培養した。７日後、ＤＯ１１．１０  Ｔ細胞を洗浄し、そして新しい抗原提示細胞および示した濃度の抗原で再刺激した。初代ＤＯ１１．１０培養の抗原濃度を、再刺激の間に滴定した。骨髄由来樹状細胞を、以前に記載されたように、いくらか改変して調製した；５×１０６の骨髄細胞を、直径９ｃｍの組織培養皿で、２０−２５Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含む１０ｍｌの培地と共に培養した。ゆるく接着した細胞を、培養６日目に２番目の皿に移動させた；４日以内に、移したこれらの細胞を樹状細胞の供給源として使用した。
【０１６５】
サイトカインＥＬＩＳＡ。ＥＬＩＳＡを、Ｍａｃａｕｌａｙら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０、１６９４−７００（１９９８）；およびＭａｃａｕｌａｙら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８、４１７１−９（１９９７）において以前に記載されたように行なった。
【０１６６】
モノクローナル抗体。ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ分析のためのモノクローナル抗体を、硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィーによって、腹水液から精製した。抗クローンタイプ（ｃｌｏｎｏｔｙｐｅ）抗体ＫＪ１−２６．１は、Ｄｒ．Ｐｈｉｌｉｐｐａ  Ｍａｒｒａｃｋ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｅｗｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒによって寛大に提供され、そして抗体を、ＦＡＣＳの前に、標準的なプロトコールによってＦＩＴＣと結合体化した。
【０１６７】
（実施例２）
（ヒトＴｉｍ配列の同定）
Ｔｈ２応答およびアレルゲン誘発気道過剰応答性の発達に対して保護を与える遺伝子座にあるＴＩＭ遺伝子ファミリーのポジショナルクローニングは、Ｔｈ２により駆動される応答およびアトピー性疾患の調節に関する我々の理解を非常に改善する機会を与える。それに加えて、ＴＩＭ−３はマウスＴｈ１細胞に特異的に発現し、そして抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂは実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の重症度の増加を引き起こす。これは、Ｔヘルパーサブセット調節におけるその遺伝子ファミリーの重要性を強調する。
【０１６８】
マウスＴｉｍ−３およびＴｉｍ−４のオルソログであるヒトＴｉｍ  ｃＤＮＡを、ＰＣＲによってクローニングした。ＴＩＭ−１のヒトオルソログを、Ａ型肝炎ウイルスの細胞レセプターである、ＨＡＶｃｒ−１としてクローニングした。ＴＩＭファミリー遺伝子は、ヒト第５染色体において、ＴＩＭ−４、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３の順番で、介在する遺伝子無しにお互いにすぐ隣接している。第１２および１９染色体にＴＩＭ偽遺伝子が存在する。その遺伝子ファミリーメンバーは中程度にしか関連していない。タンパク質配列およびＴｉｍ遺伝子ファミリー間の関係を、図７に示す。
【０１６９】
ＴＩＭ遺伝子ファミリーメンバーの細胞質ドメインは、マウスオルソログとヒトオルソログとの間で最も保存されたドメインであり、例えばヒトＴＩＭ−３細胞質ドメインとマウスＴＩＭ−３細胞質ドメインとの間で７７％の同一性である。対照的に、ＴＩＭ−３全体はヒトおよびマウス間で６３％しか同一でない。各ＴＩＭ遺伝子は、明らかな予測されるチロシンシグナル伝達モチーフを含む。ＴＩＭ−１の細胞質領域は、２つのチロシン残基および高度に保存されたチロシンキナーゼリン酸化モチーフ、ＲＡＥＤＮＩＹを含む。ＳＲＡＥＤＮＩＹＩＶＥＤＲＰの拡大した領域は、ＩｔｋおよびＥＧＦレセプターリン酸化に対する推定部位を含む。Ｉｔｋは、ホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）をリン酸化し、そしてそれによってＴ細胞活性化およびヘルパーＴ細胞分化に関与するシグナル伝達事象のカスケードを引き起こすことが知られている。さらに、Ｉｔｋシグナル伝達はＴｈ１／Ｔｈ２分化に影響を与え、そしてＩｔｋ−／−マウスは強いＴｈ２応答を発達しない。ＥＧＦレセプターキナーゼ活性は、細胞の生存および細胞死に対する耐性と関連する。同様に、ＴＩＭ−３は、細胞質ドメインに別個の保存されたチロシンリン酸化モチーフおよびＳＨ２結合モチーフを含む。これは、ＴＩＭのそのリガンドとの相互作用が、細胞内シグナル伝達経路に携わること、および各ＴＩＭはこのシグナル伝達において別々であることを示唆する。
【０１７０】
ＴＩＭタンパク質の細胞外ＩｇＶドメインはまた、α（９）β（１）インテグリン、α（４）β（１）インテグリン、およびα（４）β（７）インテグリンによる接着に関与する、オステオポンチンのＳＶＶＹＧＬＲモチーフと類似の推定インテグリン結合モチーフを含む。３００．１９株のＴＩＭ−１をトランスフェクトしたプレＢ細胞は、トランスフェクトされていない３００．１９細胞と比較して、細胞培養において高度の接着性および生存増加を示す。ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−２をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞もまた、トランスフェクトされていないＣＨＯ細胞と比較して、生存の増強を示す。これらの結果は、ＴＩＭタンパク質が細胞接着および死を調節することを示す。
【０１７１】
ヒトＴｉｍ１遺伝子およびＴｉｍ３遺伝子における遺伝子多型。ヒトＴｉｍ１遺伝子に存在するＳＮＰまたはヌクレオチド多型および欠失／挿入を同定する。ＳＮＰはゲノムにおいて非常にありふれており、３００−６００塩基対ごとに起こるので、Ｔｉｍ１のコード領域のみを分析した。さらに、よくある遺伝子変異も重要であるようである。最初に、３０−４０人の個人（６０−８０本の染色体）から取ったＴ細胞由来のｃＤＮＡを配列決定する。検出力の計算は、６０染色体のコード領域において標的配列を調査することが、１％より大きい個体群頻度を有するＳＮＰを容易に検出し、そして５％以上の個体群頻度を有する対立遺伝子を検出する機会を９０％より多く有することを示す。従って、配列の異型に関して３０−４０人の個人をスクリーニングすることは、個体群中に存在する、ほとんどのよくある、機能的に関連する、非保存的なＤＮＡ異型を捕捉する。
【０１７２】
物理的にきわめて接近したＤＮＡ異型／ＳＮＰは、多くの場合強力な依存関係（すなわち連鎖不均衡）を示すので、ＤＮＡ異型のグループ（ＳＮＰハプロタイプ）が一緒に受け継がれるかどうかを決定し、そしてこれらＳＮＰの一部のみのスクリーニングがハプロタイプの同定に十分であるかどうかを決定した。様々な染色体の大きな領域の分析は、別個のハプロタイプブロック（数十から数百キロベース）が一般的に存在し、それぞれが見かけの組換え部位によって時々断続された、限られた多様性を有することを示す。ハプロタイプを発見するために、ｃＤＮＡを配列決定し、そして複数の個人で繰り返し見られる配列変異の組み合わせを探す。
【０１７３】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は３８人のドナー由来であり、そしてインビトロでＰＨＡ（７．５μｇ／ｍｌ）を用いて２４および７２時間、またはコンカナバリン（Ｃｏｎｃａｖａｌｉｎ）Ａ（２μｇ／ｍｌ）を用いて２４時間刺激した。ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）を、刺激の最後の６時間に加えた。次いで細胞を回収し、そしてＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。配列決定のためのｃＤＮＡ鋳型を得るために、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造会社のプロトコールによって、ＲＮＡを逆転写した。このｃＤＮＡを用いて、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔｔｍ  高忠実度ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、Ｔｉｍ  ｃＤＮＡの全長をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲプライマーは以下のものであった：（配列番号３７）ＧＴＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＧＧＣＧＴＡ（順向き）、（配列番号３８）ＴＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＡＣＣＡ（順向き）、ＣＣＡＣＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＧＡＣＴ（逆向き）、（配列番号３９）ＡＴＧＣＣＡＣＧＧＡＣＴＡＡＧＡＣＣ（逆向き）。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出試薬を用いて精製し、そしてＴｉｍ１に関して４つの内部配列決定プライマーを用いて、そしてＴｉｍ３に関して２つの内部配列決定プライマーを用いて配列決定した。
【０１７４】
活性化Ｔ細胞から全ＲＮＡを取り、そしてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩおよびオリゴｄＴを用いてそれを転写することによって、全長Ｔｉｍ１  ＲＴ−ＰＣＲ産物を、これらの個人においてクローニングした。Ｔｉｍ１  ｃＤＮＡを、Ｅｘｐａｎｄ高忠実度ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて増幅して、Ｔｉｍ１コード領域にまたがる１ｋｂの産物を産生し、それをＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。次いでこの精製産物をＴＯＰＯ  ｐＥＦ６ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、続いてＴＯＰ１０コンピテント細菌を形質転換した。細菌コロニーを、アンピシリン選択を用いてＬＢプレートで増殖させた。単一のコロニーを取り、そしてＱｉａｇｅｎミニプレップキットを用いてプラスミドプレップを行った。ＨｉｎｄＩＩＩ消化を用いた制限マッピングを用いて、正しい方向で挿入を含むプラスミドを選択した。次いでこれらのプラスミドを、３つの異なるプライマー（順向き（Ｔ７）、内部および逆向き（ＢＧＨ））を用いて配列決定し、そしてその配列をＮＣＢＩヒトＴＩＭ参照配列とＳｅｑＭａｎプログラムにおいて整列させた。
【０１７５】
３５人の個人由来の染色体（７０個の染色体）からＴｉｍ１を配列決定した後、Ｔｉｍ１におけるいくつかの多型を同定し、それらを図８に示す。これらの多型に１−７の番号をつける（左カラム）。ＮＣＢＩデータベースに記載されているヒトＴＩＭ−１の全配列（ＮＭ＿０１２２０６）を、参照ポイントとして図８で提供する。この配列は、コード領域における複数の優勢な配列多型の存在のために、配列決定した染色体の２０％以下に存在する。６個のさらなる配列異型が同定され、図８に示す、そして全ての多型は、マウスでもそうであるように、ムチンの細胞外ドメインで観察されたが、特定の変異はマウスで見られるものと異なっていた。重要なことに、これら異型の間に、様々な組み合わせで、限られた程度の関連が存在する。最も明らかな変異は、６５％の染色体で観察された、多型１（１５７ｉｎｓＭＴＴＴＶＰ）と名付けられた挿入、および６５％の染色体で観察された、多型５（１８７△Ｔｈｒ）の欠失である。多型４は４０％の染色体で観察され、そして他の多型はそれぞれ≦５％の染色体で観察された。特に、これら異型（２−６）のほとんどは、最初のムチンをコードするエキソンであるエキソン３内に位置し、そして全ての異型はゲノムレベルで存在し、そしてスプライシング異型ではない。
【０１７６】
ｍＲＮＡのこの配列分析に基づいて、より多数の患者／コントロールからのゲノムＤＮＡを分析するより迅速な方法が開発された。図８に示した配列中に見られる変異に関して個人をスクリーニングするために、ＤＮＡをまず１５０ＰＣＲ産物における単純配列長多型（ＳＳＬＰ）に関して試験し、それは主要な挿入（多型１）および欠失（多型５）を検出し得る。
【０１７７】
それに加えて、他の多型（２−４、６および７）を遺伝子型決定および新規多型を同定するために、ＰＣＲ産物の一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析を用いる、比較的単純なアッセイを開発した。十分に最適化された条件において、ＳＳＣＰ分析は９０％より多くの単一ヌクレオチド置換および全ての長さ多型を検出する。この分析のために、Ｔｉｍ遺伝子の各エキソンを増幅するＰＣＲプライマーを同定し、そして標準的な非変性ＳＳＣＰゲル電気泳動法を用いて異型を区別し得る（図９）。各エキソンの高分解能ＳＳＣＰ分析のために、ＡＢＩ  ３７７  ＤＮＡ配列と共に非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する。蛍光末端標識プライマーを合成および精製する。ハイスループット遺伝子型決定処理の間に検出された新規ＳＳＣＰパターンは、新規異型を同定する。この方法を用いて、患者およびコントロールの遺伝子型を迅速に分析する。
【０１７８】
Ｔｉｍ３遺伝子を、本質的に同じ方法論を用いて分析した。活性化Ｔ細胞由来のｍＲＮＡを配列決定して、Ｔｉｍ３多型、およびＴｉｍ１とＴｉｍ３との間の長い範囲のハプロタイプを同定する。Ｔｉｍ３  ｃＤＮＡを示す６０個の染色体を配列決定した後、Ｔｉｍ３は、これがマウスゲノムにおける場合と同様に、多型性であることが見出された。しかし、１つの多型のＬｅｕ１４０Ａｒｇのみが優勢であり、示される染色体の約１２％に見出される。
【０１７９】
（実施例３）
（Ｔｉｍ配列の発現）  マウスＴＩＭ−３タンパク質は、Ｔｈ１クローンに発現するが、未処理（ナイーブな）Ｔ細胞またはＴｈ２細胞には発現しない。ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を用いると、ＴＩＭ−３タンパク質は、１回または２回のＴｈ１指向性分化後のＴｈ１細胞に発現しなかったが、３回およびそれ以上のＴｈ１への刺激後に発現した。ＴＩＭ−３  ｍＲＮＡ発現がいくらか早期に検出された。ＴＩＭ−３遺伝子発現がヒトにおいて同じであるかどうかを決定するために、ヒトＴｈ１細胞におけるＴＩＭ−３  ｍＲＮＡ発現およびＴＩＭ−１  ｍＲＮＡ発現を、ＩＬ−１２および抗ＩＬ−４  ｍＡｂの存在下で抗原を用いた刺激によって作製した破傷風毒素特異的Ｔ細胞を用いて試験した。ＴＩＭ−１と喘息の関連を考慮して、ヒトＴｈ２細胞におけるＴＩＭ−１  ｍＲＮＡ発現およびＴＩＭ−３  ｍＲＮＡ発現を試験した。Ｔｈ２細胞株を、アレルゲン、ＩＬ−４、および抗ＩＬ−１２  ｍＡｂによるインビトロ刺激によって、アレルギー性ドナーから産生した。ＲＮＡをＰＣＲによってＴＩＭ遺伝子発現に関して分析した。
【０１８０】
ＴＩＭ−３はＴｈ１分化の後一般的に発現していたが、ＴＩＭ−１は消失した。逆に、ＴＩＭ−３はどのＴｈ２にも発現しなかったが、ＴＩＭ−１は全てのＴｈ２細胞に発現した。おそらく、この混合した集団はＴｈ１メモリー細胞およびＴｈ２メモリー細胞をどちらも含むために、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３はどちらも、Ｔｈ１細胞株およびＴｈ２細胞株を誘導するために使用したドナー由来の、単球除去した未刺激末梢血単核細胞に発現する。これらの結果は、Ｔｈ２に発現するＴＩＭ−１およびＴｈ１に発現するＴＩＭ−３の相互関係を示唆する。このＴＩＭ−１およびＴＩＭ−３間の相互関係は、マウスにおいても観察された。
【０１８１】
ヒト組織において、４．４ｋｂのＴＩＭ−１  ｍＲＮＡは腎臓および精巣に非常に強力に発現した。４．４ｋｂ  ｍＲＮＡは、ほとんど全ての組織に存在したが、ほとんどにおいてかすかであった。５．５ｋｂのバンドが結腸および肝臓で観察された。７．５ｋｂのバンドが脾臓、胸腺、および末梢血白血球で観察され、そして４．４ｋｂより小さいバンドがいくつかの臓器で観察された。これらの結果は、ｈＴＩＭ−１はほとんどのヒト組織においてあるレベルで発現しており、そして７．５ｋｂのメッセージが、免疫学的目的のある組織においてｈＴＩＭ−１をコードし得ることを示唆する。しかし、ＴＩＭ−１のラットホモログであるＫｉｍ−１（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｊｕｒｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１）の発現は、虚血性障害時に腎臓において増加する。発現分析において使用したＭＴＮブロットは、死体から抽出したｍＲＮＡから調製したので、腎臓におけるＴＩＭ−１発現の増加を再分析した。正常腎臓生検から得た腎臓ＲＮＡにおいて、ＴＩＭ−１の過剰発現は見られなかった。従って、腎臓および精巣で観察されたＴＩＭ−１の高レベルの発現は、組織障害により起こるＴＩＭ−１発現のアップレギュレーションによるものであった可能性がある。損傷した腎臓は、流入する炎症性細胞を、破壊的なＴｈ１応答より、より保護的なＴｈ２応答へ向けるタンパク質を発現し得る。
【０１８２】
（実施例４）
（ＴＩＭリガンドおよび抗体）
抗体の産生。マウスＴＩＭ−１に対するモノクローナル抗体の産生は、異なる組織、細胞株およびマウス株におけるＴＩＭ−１の細胞表面発現を調査することを可能にする。マウスＴＩＭ−１の対立遺伝子の両方を、高タンパク質発現のためにベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｐＥＦ６−ＴＯＰＯ）にクローニングした。ラットを両方のＴｉｍ１  ｃＤＮＡ構築物で免疫および追加免疫し、細胞表面分子に対する抗体を迅速に産生した。ｃＤＮＡワクチン接種を用いるこの方法は、Ｔｉｍ１  ｃＤＮＡはＡＰＣによって取り込まれ、それがＴＩＭ−１を細胞表面分子として発現するので、細胞表面エピトープに対するｍＡｂの産生に有利である。ＢＡＬＢ／ｃ  ＴＩＭ−１およびＨＢＡ  ＴＩＭ−１の両方と同等によく（ＴＩＭ−１の免疫グロブリンドメインのような、ＴＩＭ−１の保存されたドメインに結合することによって）結合するｍＡｂを産生するために、ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ  Ｔｉｍ１  ｃＤＮＡをどちらも（ｐＥＦ６−ｍＴＩＭｂａｌｂおよびｐＥＦ６−ｍＴＩＭｈｂａ）を各ラットに注射した。
【０１８３】
Ｔｉｍ１  ｃＤＮＡ免疫ラットのさらなる追加免疫を、ｐＥＦ６−ｍＴＩＭ−１−ＧＦＰ発現構築物で安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞で行なった。高レベルのマウスＴＩＭ−１を発現するＣＨＯトランスフェクタントを、ＦＡＣＳによって分類し、そしてラットに注射した。別のｍＴＩＭ−１を発現する細胞を、プレＢ細胞株３００．１９をｐＥＦ６−ｍＴＩＭ−１発現構築物で安定にトランスフェクトすることによって産生した。この株を使用して、ラット血清および抗ＴＩＭ−１抗体のため融合後のハイブリドーマを、フローサイトメトリーによってスクリーニングする。非免疫ラット由来のコントロール血清と比較して、ラット血清（および２次ＦＩＴＣ−ヤギ抗ラットＩｇ）の、安定なｐＥＦ６−ｍＴＩＭ１トランスフェクト３００．１９細胞への結合によって検出されるような、抗ＴＩＭ−１に対して高いポリクローナル力価を有するラットを産生した。非トランスフェクト細胞またはＴＩＭ−２でトランスフェクトした細胞では応答性が存在しないので、この染色は、ＴＩＭ−１に特異的である。
【０１８４】
ラット脾臓を取出し、そして脾臓細胞を骨髄腫細胞株（ＳＰ／２）と融合してハイブリドーマを産生した。ハイブリドーマ上清を、ＴＩＭ−１トランスフェクト３００．１９細胞株を使用してスクリーニングし、モノクローナル抗ＴＩＭ−１を産生するハイブリドーマクローンを同定する。ＴＩＭ−１に対する（そして他のＴＩＭタンパク質ではない）ｍＡｂの特異性を、ＴＩＭ−２トランスフェクト細胞、およびｍＴＩＭ−３トランスフェクト細胞またはＴＩＭ−３  Ｉｇ融合タンパク質を用いて確認する。
【０１８５】
抗体染色。Ｔｈ１細胞株およびＴｈ２細胞株を、ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ  ＤＯ１１．１０脾臓細胞両方から調製した。ＴＩＭ−１  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲは、標準的な偏向性条件下で２回の抗原による再刺激後、ＴＩＭ−１はＴｈ２株に発現するがＴｈ１株には発現しないことを示した。Ｔｈ２偏向性条件下で抗原／ＡＰＣによる２回の刺激後のＤＯ１１．１０Ｔ細胞は、ポリクローナルラット抗ＴＩＭ−１抗血清で染色された。これらのＴｈ２細胞は高レベルのＴＩＭ−１を発現した。
【０１８６】
Ｔｈ２株におけるＴＩＭ−１の選択的な発現を示すこれらの実験を、抗Ｔｉｍ−１  ｍＡｂおよびノーザンブロットを用いて定量および確認する。ＢＡＬＢおよびＨＢＡ由来のＤＯ１１．１０細胞を、抗原およびＡＰＣと共に培養し、そして標準的な偏向条件（抗ＩＬ−１２＋ＩＬ−４または抗ＩＬ−４＋ＩＬ−１２）の下で１、２、および３週間再刺激する。刺激の各週後に、細胞を抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂで染色する。様々な時点において刺激細胞を回収することによって、Ｔｈ１サブセットまたはＴｈ２サブセットへの分化を受けたＴ細胞におけるＴＩＭ−１発現の動態を決定する。Ｔｉｍ−１表面発現がＴ細胞活性化後に変化するかどうかを決定するために、本発明者らはまた、いくらかの細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激することによって、抗原刺激の各回の１週間後に、休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞におけるＴＩＭ−１発現を比較する。活性化細胞を、細胞内サイトカイン発現に関して染色し、Ｔ細胞のＴｈサブセット分化を検証する。あるいは、刺激の各回の後に、ＰＭＡ＋イオノマイシンで活性化されたＴ細胞から回収したｍＲＮＡを用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロットを使用して、ｍＲＮＡ産生の相対的レベルを決定する。
【０１８７】
ＴＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質。ＴＩＭ−１ポリペプチドおよびマウス免疫グロブリンのＦｃ領域との間の融合タンパク質である、ＢＡＬＢ／ｃ  ＴＩＭ−１−ｍＩｇＧ２ａを調製した。ベクターを、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃにおいて、Ｆｃレセプターへの結合を最小にする変異を含むように、遺伝子操作した。ＴＩＭ−１融合タンパク質を、ＴＩＭ−１機能の特徴付けにおいて利用する。ＴＩＭ−１  Ｉｇ融合タンパク質は、ＴＩＭ−１リガンドに結合することによってＴＩＭ−１機能を阻害すること、およびＴＩＭ−１／ＴＩＭ−１リガンド相互作用を妨害することが予測される。
【０１８８】
ヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃフラグメントに融合したＴＩＭ−１のシステインリッチな免疫グロブリンドメインおよびムチン様領域の２／３を含む、精製したＤ１ｍｕｃ−Ｆｃ融合タンパク質（ＩｇＶｍｕｃ−ｈＩｇ）を、ゲルに流した。このタンパク質をＣＨＯ細胞に発現させ、そしてＩｇＶｍｕｃ−ｈＩｇタンパク質を、ＣＨＯ上清からプロテインＡアガロースカラムを用いて精製した。精製ＩｇＶｍｕｃ−ｈＩｇ融合タンパク質は、約２ｌｏｇのＨＡＶ伝染性を中和する。それに加えて、ＩｇＶｍｕｃ−ｈＩｇによるＨＡＶの処理は、ＨＡＶ粒子の沈降に大きなシフトを引き起こし、ＩｇＶｍｕｃ−ｈＩｇはウイルスゲノムの非外被化（ｕｎｃｏａｔｉｎｇ）を誘発したことを示す。一方、ムチンドメインを含まないＩｇ様領域のみを含む融合タンパク質（ＩｇＶ−ｈＩｇ）は、それを引き起こさなかった。このＨＡＶ中和化システムおよびＩｇＶｍｕｃ−ｈＩｇ融合タンパク質を使用して、ＴＩＭ−１／ＨＡＶレセプター対立遺伝子の機能を分析する。
【０１８９】
マクロファージの拡大および活性化に対する抗ＴＩＭ−３  ｍＡｂのインビボ効果に基づいて、ＴＩＭ−３リガンドは、骨髄株の細胞に発現するという仮説をたてた。１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４および８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを用いて、確立されたプロトコールによって、血液単球から樹状細胞（ＤＣ）を調製した。ＤＣを、細胞を２日間、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１０００Ｕ／ｍｌ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍｌ）を補充したＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍｌ）中に再プレートすることによって成熟させた。成熟ＤＣは、ｈＴＩＭ−３−Ｉｇで陽性に染色されたが、ドナー間で変動性が存在し、成熟ＤＣはＴＩＭ−３のＩｇＶドメインに対するリガンドを発現することを示唆する。骨髄由来内皮細胞は非常に弱く染色され、そしてＢ細胞株はＴＩＭ−３−Ｉｇで染色されなかった。
【０１９０】
Ｔｉｍ１／ｈｕｈａｖｃｒ−１の細胞質内尾部は比較的短いが、それはマウス、ラット、ヒトおよびサル間で高度に保存された配列（ＲＡＥＤＮＩＹＩ）を含み、そしてそれはリン酸化され、そして他のシグナル伝達分子との相互作用によってシグナル伝達し得る。Ｔ細胞においてＲＡＥＤＮＩＹＩモチーフに結合し得る、最も可能性ある候補分子は、チロシンキナーゼＩｔｋである。インターロイキン２誘導性チロシンキナーゼのＩｔｋは、Ｔｅｃファミリーの非レセプタータンパク質チロシンキナーゼであり、それはＴ細胞の活性化を引き起こす細胞内シグナル伝達事象に役割を果たす。Ｔｅｃファミリーメンバーは、保存されたＳＨ３、ＳＨ２、および多くのキナーゼファミリーに共通の触媒ドメインを含むが、それらはこの領域外の独特の配列によって区別される。ＩｔｋはホスホリパーゼＣ−γ（ＰＬＣ−γ）をリン酸化し、そしてＴ細胞活性化およびヘルパーＴ細胞分化に関与するシグナル伝達事象のカスケードを引き起こすことが知られている。Ｉｔｋシグナル伝達の非存在下で、Ｔｈ２細胞は発達しない。これらの結果は、ＴＩＭ−１／ｈｕｈａｖｃｒ−１が、Ｉｔｋによってシグナル伝達し、それによってＣＤ４  Ｔ細胞におけるサイトカインの発達を変化させ得ることを示唆する。
【０１９１】
（実施例５）
（ＴＩＭノックアウトマウス）
ノックアウト構築物を、Ｔｉｍ１欠損マウスの作出において使用し、それはＴＩＭ−１分子の非存在下で免疫反応の発達を分析することを可能にする。別のアプローチにおいて、ＴＩＭ−１−Ｉｇ融合タンパク質または抗ＴＩＭ−１モノクローナル抗体を用いて、Ｔｉｍ１＋／＋（野生型）マウスにおけるＴＩＭ−１の機能を阻害する。Ｔｉｍ１ノックアウトマウスおよび抗ＴＩＭ−１  ｍＡｂアプローチは、Ｔ細胞分化および喘息の病因におけるＴＩＭ−１の役割の評価に関して相補的である。
【０１９２】
Ｔｉｍ１のＨＢＡマウスゲノム配列は、エキソン４における組み込まれたＬ１レトロウイルスエレメントのために、ＢＡＬＢ／ｃ配列と比較して、エキソン４の欠失を有する。１つのエキソンの短縮がＴＩＭ−１機能を低減する場合、Ｔｉｍ１ノックアウトマウスの作出によるＴＩＭ−１機能の全ての欠失は、そのようなマウスのＴｈ２応答を生じる能力を著しく制限するはずである。ＴＩＭ−１  ＫＯマウスを、ｃｒｅ−ｌｏｘ技術およびＢＡＬＢ／ｃ  ＥＳ細胞を用いて、ＴＩＭ−１のエキソン１およびエキソン２を欠失させることによって作出し、それはＴＩＭ−１の細胞表面発現を排除するはずであり、それによってＴｈ２細胞およびＡＨＲの発達におけるＴＩＭ−１機能の重要性を示す。
【０１９３】
適当な標的化構築物を作製するために、ＴＩＭ遺伝子ファミリーのメンバーを含む特異的ＢＡＣを、高密度フィルターセットを用いて、Ｃ５７／ＢＩ６  ＢＡＣライブラリー（ＲＰＣＩ−２３）をスクリーニングすることによって同定した。これらのＢＡＣクローンを使用して、Ｔｉｍ遺伝子ファミリーを含む約３５０ｋｂのゲノム領域をカバーする、５００ｋＢのコンティーグおよび物理的地図を作成した。完全なＴｉｍ１遺伝子を含む１つの特異的ＢＡＣ、ＲＰＣＩ−２３−２２２Ｆ８を、ＴＩＭ標的化構築物を作製するために選択した。標的構築物は、プロモーター領域、シグナルエキソン、およびＩｇＶエキソン（エキソン１および２）を含む４ｋｂの領域を、この領域をはさむ５’および３’アームによる相同的組換えによって、欠失させる。標的化構築物の相同的アームは、ＢＡＬＢ／ｃおよびＨＢＡ（Ｃ５７ＢＩ／６）のＤＮＡの両方と相同的であるので、この標的化ベクターを、Ｃ５７ＢＩ／６またはＢＡＬＢ／ｃのＥＳ細胞のいずれでも使用し得る。構築物をＥＳ細胞に導入し、それをＰＣＲおよびサザンブロットによって、標的化対立遺伝子に関してスクリーニングする。
【０１９４】
標的化ベクターのｐＬＯＸは、３つのｌｏｘＰ部位を含み、そして標的化ＥＳ細胞においてｃｒｅリコンビナーゼを発現することによって、組換えは標的化領域の３つの形式を形成し、そのうち２つの対立遺伝子のＡおよびＢを、Ｔｉｍ１  ＫＯマウスを作出するために使用する。選択されたＥＳ細胞クローンを、胚盤胞に導入してキメラマウスを産生し、そしてノックアウトの生殖細胞系列の遺伝のために繁殖させる。尾部ＤＮＡを、ノックアウトの遺伝に関して分析する。まず対立遺伝子Ａを使用し、そこでｃｒｅ／ｌｏｘ組換えは一番外側のｌｏｘＰ部位を使用して、ＴＩＭ−１のエキソン１およびエキソン２に加えてＴＫおよびネオマイシンの選択カセットを欠失させた。ＴＩＭ−１ゲノム標的化領域からｎｅｏおよびＴＫのカセット全体を除去することは、同じファミリーの他の遺伝子にきわめて近接するｎｅｏの転写に対して、２次的に生じ得る人工産物を混同するのを防ぐ。あるいは、もし対立遺伝子Ａが致死的または混乱させる表現型を産生する場合、標的化対立遺伝子Ｂを用いてマウスを作出し、それにおいてｎｅｏおよびＴＫのカセットが欠失し、そしてＴＩＭ−１領域がｌｏｘ−ｐ部位によって挟まれる。この条件付き標的化アプローチの使用は、Ｔ細胞特異的プロモーターの調節下にあるｃｒｅリコンビナーゼを発現するマウスにおいて、Ｔｉｍ−１のＴ細胞特異的欠失を可能にするはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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