【手続補正書】
【提出日】令和3年4月12日(2021.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞表面グリカンを評価するための方法であって、
（a）複数の細胞を含む試験組成物を、該試験組成物中の細胞の表面から1つまたは複数のグリカンを遊離させる条件下でインキュベーションする工程であって、ここで
(i)該試験組成物中の細胞が、全細胞（whole cell）もしくはインタクトな細胞を含む、および/または(ii)該細胞が生細胞であり、かつ
該インキュベーションがペプチドN-グリコシダーゼ（PNGase）Fの存在下で行われ、かつ
1つまたは複数の該細胞表面グリカンを含む試料が生成される、
工程；ならびに
（b）該試料中に存在するグリカンの有無、アイデンティティ、および/またはレベルを決定する工程であって、それによって該試料の細胞表面グリカンプロフィールを評価する、工程
を含む、方法。
【請求項２】
細胞表面グリカンを評価するための方法であって、
試料中に存在するグリカンの有無、アイデンティティ、および/またはレベルを決定する工程であって、それによって該試料の細胞表面グリカンプロフィールを評価する、工程を含み、
該試料が、複数の細胞を含む試験組成物中に存在する細胞の表面から、1つまたは複数のグリカンを遊離させる条件下での該試験組成物のインキュベーション後に遊離した、1つまたは複数のグリカンを含み、
(i)該試験組成物中の細胞が、全細胞（whole cell）もしくはインタクトな細胞を含み、および/または(ii)該細胞が生細胞であり、かつ
該インキュベーションがペプチドN-グリコシダーゼ（PNGase）Fの存在下で行われる、
方法。
【請求項３】
前記グリカンがN-グリカンである、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記試験細胞組成物が、1×106〜5×106個（両端の値を含む）の細胞を含むか、または前記試験細胞組成物が、1×105個/mL〜1×108個/mL（両端の値を含む）、1×106個/mL〜5×107個/mL（両端の値を含む）、もしくは5×106個/mL〜2.5×107個/mL（両端の値を含む）の濃度の細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記PNGase Fが、フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）のPGNase Fまたは酵素的に活性なその一部もしくは変異体を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記PNGase Fが、SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列または酵素的に活性なその一部もしくは変異体を含むか、あるいはSEQ ID NO:1と少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含むかまたは酵素的に活性なその一部である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記PNGase Fの量が酵素的有効量であり、
該酵素的有効量が、35℃〜39℃、任意で約37℃の温度における12時間以下のインキュベーション後に、1つもしくは複数の天然もしくは非変性糖タンパク質からおよび/または細胞組成物の細胞から、1つまたは複数のN-グリカンを遊離させるのに有効であるか、あるいは
該酵素的有効量が、25℃〜39℃または35℃〜39℃（それぞれ両端の値を含む）、任意で約37℃の温度における、長くても15分〜3時間または30分〜2時間のインキュベーション後に、1つまたは複数のN-グリカンを遊離させるのに有効である、
請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記PNGase Fの酵素的有効量が、前記1つもしくは複数の糖タンパク質に存在するN-グリカンおよび/または前記細胞組成物の表面に存在するN-グリカンのうちの50％超、55％超、60％超、65％超、70％超、75％超、80％超、85％超、90％超、95％超、99％超を遊離させる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記PNGase Fの量が、1単位〜5000単位、1単位〜1000単位、1単位〜500単位、1単位〜250単位、1単位〜100単位、1単位〜50単位、1単位〜25単位、25単位〜5000単位、25単位〜1000単位、25単位〜500単位、25単位〜250単位、25単位〜100単位、25単位〜50単位、50単位〜5000単位、50単位〜1000単位、50単位〜500単位、50単位〜250単位、50単位〜100単位、100単位〜5000単位、100単位〜1000単位、100単位〜500単位、100単位〜250単位、250単位〜5000単位、250単位〜1000単位、250単位〜500単位、500単位〜5000単位、500単位〜1000単位、または1000単位〜5000単位（それぞれ両端の値を含む）である、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記試験組成物のインキュベーションが、5もしくは約5分間〜12もしくは約12時間、30もしくは約30分間〜6もしくは約6時間、または1もしくは約1時間〜3もしくは約3時間（それぞれ両端の値を含む）行われるか、あるいは
前記試験組成物のインキュベーションが、約30分間行われる、
請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記試験組成物のインキュベーションが、25℃〜39℃または35℃〜39℃の温度で行われるか、あるいは
前記試験組成物のインキュベーションが、約37℃の温度で行われる、
請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
試料中に存在するグリカンの有無、アイデンティティ、および/またはレベルを決定する前に、該試料からのグリカンを、検出可能なラベルで標識する工程をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
試料中に存在するグリカンの有無、アイデンティティ、および/またはレベルを決定する前に、該試料からのグリカンを、蛍光ラベルで標識する工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記ラベルが蛍光ラベルであり、該蛍光ラベルが、2-アミノベンズアミド（2-AB）、2-アミノ安息香酸（2-AA）、2-アミノピリジン（PA）、2-アミノアクリドン（AMAC）、2-アミノナフタレントリスルホン酸（ANTS）、および1-アミノピレン-3,6,8-トリスルホン酸（APTS）、3-（アセチルアミノ）-6-アミノアクリジン（AA-Ac）、6-アミノキノリン（6-AQ）、7-アミノメチル-クマリン（AMC）、2-アミノ（6-アミド-ビオチニル）ピリジン（BAP）、9-フルオレニルメトキシカルボニル（FMOC）-ヒドラジド、1,2-ジアミノ-4,5-メチレンジオキシ-ベンゼン（DMB）、もしくはo-フェニレンジアミン（OPD）であるか、またはそれを含む、請求項12または13記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光ラベルが、カルバメート標識基、キノロン蛍光体、および第3級アミンを含む、請求項13または14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記1つまたは複数のグリカンの有無、アイデンティティ、および/またはレベルを決定する前に、前記試料がグリカン精製またはグリカン濃縮に供されるか、または前記試料が固相抽出（SPE）によって行われるグリカン濃縮に供される、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
前記1つまたは複数のグリカンの有無、アイデンティティ、および/またはレベルを決定する工程が、前記試料を質量分析に供することを含む、請求項1〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
前記グリカンの有無、アイデンティティ、および/またはレベルを決定する工程が、前記試料を液体クロマトグラフィー（LC）とそれに続く質量分析とに供することを含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記液体クロマトグラフィーが、親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記質量分析がESI-MSまたはタンデム質量分析（MS/MS）を含む、請求項18または19記載の方法。
【請求項２１】
前記1つまたは複数のグリカンの有無、アイデンティティ、および/またはレベルを決定する工程が、1つまたは複数のグリカン構造を、分岐、単糖間の結合、および/または単糖の位置について分析することを含む、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
前記1つまたは複数のグリカンが、高マンノース型N-グリカン、バイセクト型およびシアリルルイスX N-グリカン、ならびに/またはN-アセチルラクトサミン含有N-グリカンを含む、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が幹細胞を含むか、または前記試験細胞組成物が幹細胞を含む、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
前記幹細胞が、免疫細胞、白血球、末梢血単核球（PBMC）、リンパ球、または未分画T細胞を含む、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞が、CD4＋T細胞および/もしくはCD8＋T細胞であるT細胞を含むか、または前記試験細胞組成物が、CD4＋T細胞および/もしくはCD8＋T細胞であるT細胞を含む、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が組み換え受容体を発現するか、あるいは
前記試験組成物が、
組み換え受容体；または
T細胞受容体もしくはキメラ抗原受容体（CAR）であるかまたはそれを含む組み換え受容体
を発現する細胞を含む、請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
（a）複数の細胞を含む試験細胞組成物からの試料における細胞表面グリカンプロフィールを請求項1〜26のいずれか一項記載の方法に従って評価する工程；および
（b）該試料の細胞表面グリカンプロフィールを参照試料の細胞表面グリカンプロフィールと比較する工程
を含む、細胞組成物をアッセイする方法。
【請求項２８】
前記参照試料が、前記試験細胞組成物を生産するための製造プロセスの異なる段階からの異なる細胞組成物であるか、または該試験組成物が由来するもしくは取得されたソース細胞組成物であり、該製造プロセスの該段階が、任意で該製造プロセスの先行する段階である；あるいは
前記参照試料が、1つまたは複数の試験作用物質もしくは条件の存在下での処理がないこと、または1つもしくは複数の別の試験作用物質もしくは条件の存在下であること以外は、試験細胞組成物またはソース組成物と同じまたは実質的に同じ条件下でインキュベーションまたは処理された組成物に由来する、
請求項27記載の方法。
【請求項２９】
細胞組成物において1つまたは複数の試験作用物質または条件をスクリーニングするための方法であって、
（a）1つもしくは複数の試験作用物質もしくは条件の存在下でインキュベーションもしくは処理されたソース組成物であるかまたは該ソース組成物に由来する試験細胞組成物からの試料における細胞表面グリカンプロフィールを評価する工程、および
（b）該試料の該細胞表面グリカンプロフィールを、1つまたは複数の標的グリカンを含む参照試料の細胞表面グリカンプロフィールと比較する工程
を含む、方法。
【請求項３０】
前記細胞表面グリカンプロフィールが、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法に従って決定される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
前記参照試料が、前記1つまたは複数の試験作用物質もしくは条件の存在下での処理がないこと、または1つもしくは複数の別の試験作用物質もしくは条件の存在下であること以外は、前記試験細胞組成物または前記ソース組成物と同じまたは実質的に同じ条件下でインキュベーションまたは処理された組成物に由来するか、あるいは
前記参照試料が、前記1つまたは複数の試験作用物質または条件の存在下でインキュベーションまたは処理された複数の組成物の間での前記1つまたは複数の標的グリカンの有無、アイデンティティ、および/またはレベルの平均または中央値を含む、
請求項29または30記載の方法。
【請求項３２】
前記1つもしくは複数の試験作用物質または条件が、血清の存在もしくは濃度、培養時間、刺激物質の存在もしくは量、刺激物質のタイプもしくは程度、アミノ酸の存在もしくは量、温度、ソース組成物の供給源もしくは細胞タイプ、ソース組成物における細胞タイプの比もしくは割合、任意でCD4＋/CD8＋細胞比、ビーズの存在もしくは量、細胞密度、静置培養、揺動培養、灌流、ウイルスベクターのタイプ、ベクターコピー数、形質導入アジュバントの存在、凍結保存におけるソース組成物の細胞密度、組み換え受容体の発現の程度、または細胞表現型を調節する化合物の存在を含む、請求項29〜31のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記標的グリカンが、高マンノース型N-グリカン、バイセクト型およびシアリルルイスX N-グリカン、ならびに/またはN-アセチルラクトサミン含有N-グリカンを含むか、あるいは
前記標的グリカンが、還元末端ガラクトース残基を有しないフコシル化バイアンテナ型複合型グリカン、1つの還元末端ガラクトース残基を有するフコシル化バイアンテナ型複合型グリカン、2つの還元末端ガラクトース残基を有するフコシル化バイアンテナ型複合型グリカン、還元末端ガラクトース残基を有しないバイアンテナ型複合型グリカン、1つの還元末端ガラクトース残基を有するバイアンテナ型複合型グリカン、2つの還元末端ガラクトース残基を有するバイアンテナ型複合型グリカン、2つのガラクトース残基および1つのN-アセチルノイラミン酸残基を有するフコシル化バイアンテナ型複合型グリカン、2つのガラクトース残基および2つのN-アセチルノイラミン酸残基を有するフコシル化バイアンテナ型複合型グリカン、2つのガラクトース残基および2つのN-アセチルノイラミン酸残基を有するバイアンテナ型複合型グリカン、5つのマンノース残基を有する高マンノース型グリカン、6つのマンノース残基を有する高マンノース型グリカン、7つのマンノース残基を有する高マンノース型グリカン、8つのマンノース残基を有する高マンノース型グリカン、ならびに/または9つのマンノース残基を有する高マンノース型グリカンを含む、
請求項29〜32のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
前記標的グリカンが、表E1中のグリカンまたはそのサブセットを含む、請求項29〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
前記試料の細胞表面グリカンプロフィールまたは前記1つもしくは複数の標的グリカンのそれぞれが前記参照試料と実質的に同じであることを前記比較が示す場合；および/あるいは、該1つもしくは複数の標的グリカンを含む細胞表面グリカンプロフィールまたは該1つもしくは複数の標的グリカンのそれぞれが、該参照試料における細胞表面グリカンプロフィールまたは該参照試料中に存在する全グリカンに対する該1つもしくは複数の標的グリカンのそれぞれと、20％以下もしくは約20％、15％以下もしくは約15％、10％以下もしくは約10％、または5％以下もしくは約5％しか相違しないことを前記比較が示す場合に、前記1つまたは複数の試験作用物質または条件を、細胞のインキュベーションまたは処理用に選択する工程；または
前記試料の細胞表面グリカンプロフィールまたは前記1つもしくは複数の標的グリカンのそれぞれが前記参照試料と実質的に相違することを前記比較が示す場合；および/あるいは、該1つもしくは複数の標的グリカンを含む細胞表面グリカンプロフィールまたは該1つもしくは複数の標的グリカンのそれぞれが、該参照試料における細胞表面グリカンプロフィールまたは該参照試料中に存在する全グリカンに対する該1つもしくは複数の標的グリカンのそれぞれと、10％超もしくは約10％超、20％超もしくは約20％超、30％超もしくは約30％超、40％超もしくは約40％超、50％超もしくは約50％超、60％超もしくは約60％超、70％超もしくは約70％超、80％超もしくは約80％超、90％超もしくは約90％超、またはそれ以上相違することを前記比較が示す場合に、1つまたは複数のさらなる試験作用物質または条件を使用して前記方法の工程を繰り返す工程
をさらに含む、
請求項29〜34のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
前記試験作用物質が、試験細胞組成物中の1つもしくは複数の細胞の成長、増殖、生存性、分化、活性化、および/もしくは拡大増殖を調節するための候補であるか、または
前記試験細胞組成物が組み換え核酸もしくは組み換え受容体を含む細胞を含む、
請求項29〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
前記組み換え核酸がT細胞受容体もしくはキメラ抗原受容体(CAR)をコードするか、または前記組み換え受容体が、T細胞受容体もしくはキメラ抗原受容体(CAR)であるかまたはそれを含む、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞が幹細胞を含むか、または前記試験細胞組成物が幹細胞を含む、請求項29〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
前記幹細胞が、免疫細胞、白血球、末梢血単核球（PBMC）、リンパ球、または未分画T細胞を含む、請求項29〜38のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞がCD4＋および/もしくはCD8＋T細胞であるT細胞を含むか、または前記試験細胞組成物がCD4＋および/もしくはCD8＋T細胞であるT細胞を含む、請求項29〜39のいずれか一項記載の方法。