【手続補正書】
【提出日】令和3年1月29日(2021.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたはカニクイザルの単量体トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）アピカルドメインを含む単離された組換えＴｆＲコンストラクトであって、
前記ＴｆＲのプロテアーゼ様ドメインまたは螺旋ドメインを含まず、かつ
保存されたエピトープまたは抗原を提示し、かつ／または天然のヒトＴｆＲのアピカルドメインのおよその３次元構造を保持するか、もしくは約２未満の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を有する、
前記ＴｆＲコンストラクト。
【請求項２】
前記３次元構造がＸ線結晶解析により測定される、請求項１に記載のＴｆＲコンストラクト。
【請求項３】
Ｎ末端からＣ末端に向かって
（ａ）ＴｆＲアピカルドメインのＣ末端フラグメントを含む第１のポリペプチドと、
（ｂ）任意選択的なリンカーと、
（ｃ）前記ＴｆＲアピカルドメインのＮ末端フラグメントを含む第２のポリペプチドと
を含み、
前記第１のポリペプチド、前記任意選択的なリンカー、及び前記第２のポリペプチドが直列に融合されている、
ＴｆＲコンストラクト。
【請求項４】
（ａ）前記第１のポリペプチドの最後のアミノ酸が前記第２のポリペプチドの最初のアミノ酸と融合されている、かつ／または
（ｂ）前記ＴｆＲアピカルドメインの前記Ｃ末端フラグメントが、２５〜５５個のアミノ酸を含み、かつ／もしくは前記ＴｆＲアピカルドメインの前記Ｎ末端フラグメントが、７５〜１２０個のアミノ酸を含む、かつ／または
（ｃ）前記第１のポリペプチドが、TISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSE（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２７）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくは前記第１のポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２７の配列に対して最大７個のアミノ酸の変化を有する配列を含む、かつ／または
（ｄ）前記第２のポリペプチドが、DKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQT（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２８）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むか、もしくは前記第２のポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２８の配列に対して最大１６個のアミノ酸の変化を有する配列を含む、かつ／または
（ｅ）前記ＴｆＲアピカルドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７または１０８の配列を含む、
請求項３に記載のＴｆＲコンストラクト。
【請求項５】
アレナウイルスに結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＴｆＲコンストラクト。
【請求項６】
（Ａ）
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２７の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む前記第１のポリペプチドと、
（ｂ）前記任意選択的なリンカーと、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２８の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む前記第２のポリペプチドと
を含む、または
（Ｂ）
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２７の配列に対して最大７個のアミノ酸の変化を有する配列を含む前記第１のポリペプチドと、
（ｂ）前記任意選択的なリンカーと、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２８の配列に対して最大１６個のアミノ酸の変化を有する配列を含む前記第２のポリペプチドと
を含む、
請求項３〜５のいずれか１項に記載のＴｆＲコンストラクト。
【請求項７】
（ａ）前記第１のポリペプチドがＣ末端において、SKNVKLTVSNVLKEIKILNIFGVIK（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２９）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性もしくは最大５個のアミノ酸の変化を有する配列、もしくはそのフラグメントを更に含み、任意で前記フラグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３０〜４３３のいずれか１つの配列を有する、
（ｂ）前記第２のポリペプチドがＣ末端において、KFPIVNAELSFFGHAHLGTGDPYTP（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３４）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性もしくは最大５個のアミノ酸の変化を有する配列、もしくはそのフラグメントを更に含み、任意で前記フラグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３５〜４３８のいずれか１つの配列を有する、
（ｃ）前記第１のポリペプチドがＮ末端において、GFPSFNHTQFPPSRSSGLPNIPVQ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３９）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性もしくは最大５個のアミノ酸の変化を有する配列、もしくはそのフラグメントを更に含み、任意で前記フラグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４０〜４４３のいずれか１つの配列を有する、
（ｄ）前記第２のポリペプチドがＮ末端において、SKVWRDQHFVKIQVKDSAQNSVIIV（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４４）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性もしくは最大５個のアミノ酸の変化を有する配列、もしくはそのフラグメントを更に含み、任意で前記フラグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４５〜４４８のいずれか１つの配列を有する、
（ｅ）前記第１のポリペプチドが、SSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCRMVTSESKNVKLTVSN  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４９）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性もしくは最大１０個のアミノ酸の変化を有する配列を含む、かつ／または
（ｆ）前記第２のポリペプチドが、DSAQNSVIIVDKNGRLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLYTPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVNAELS（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５０）の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性または最大２０個のアミノ酸の変化を有する配列を含む、
請求項３〜６のいずれか１項に記載のＴｆＲコンストラクト。
【請求項８】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４９の配列を有する前記第１のポリペプチドと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５０の配列を有する前記第２のポリペプチドとを含み、前記第１のポリペプチドのＣ末端が前記第２のポリペプチドのＮ末端に融合されている、または
（ｂ）SSGLPNIPVQTISRAAAEKLFGNMEGDCPSDWKTDSTCKMVTSENKSVKLTVSN（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５１）の配列を有する前記第１のポリペプチドと、DSAQNSVIIVDKNGGLVYLVENPGGYVAYSKAATVTGKLVHANFGTKKDFEDLDSPVNGSIVIVRAGKITFAEKVANAESLNAIGVLIYMDQTKFPIVKADLS（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５２）の配列を有する前記第２のポリペプチドとを含み、前記第１のポリペプチドのＣ末端が前記第２のポリペプチドのＮ末端に融合されている、
請求項３〜７のいずれか１項に記載のＴｆＲコンストラクト。
【請求項９】
（ａ）前記リンカーがアミノ酸１〜１０個の長さであり、任意で前記リンカーが、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、もしくはＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５３）である、または
（ｂ）前記リンカーがタンパク質のループドメインを含み、任意で前記タンパク質のループドメインのＮ末端とＣ末端との間の距離が５Å未満である、
請求項３〜８のいずれか１項に記載のＴｆＲコンストラクト。
【請求項１０】
（ａ）精製ペプチドを更に含み、任意で前記精製ペプチドが、前記ＴｆＲコンストラクトのＮ末端もしくはＣ末端に融合されている、
（ｂ）切断ペプチドを更に含み、任意で前記切断ペプチドが、前記ＴｆＲコンストラクトのＮ末端もしくはＣ末端に融合されている、かつ／または
（ｃ）可溶性である、
請求項１〜９のいずれか１項に記載のＴｆＲコンストラクト。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴｆＲコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１２に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１４】
ＴｆＲのアピカルドメインに結合する物質を同定する方法であって、
（ａ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＴｆＲコンストラクトを前記物質と接触させる工程と、
（ｂ）前記物質が前記ＴｆＲコンストラクトに結合するかどうかを決定する工程と
を含み、任意で、
（ｉ）前記物質が、ポリペプチドもしくはタンパク質である、
（ｉｉ）前記物質が、改変Ｆｃポリペプチドもしくは改変Ｆｃポリペプチド二量体である、
（ｉｉｉ）前記物質が抗体である、かつ／または
（ｉｖ）前記決定する工程（ｂ）が、ＥＬＩＳＡもしくは表面プラズモン共鳴によって行われる、
前記方法。
【請求項１５】
請求項３〜１０のいずれか１項に記載のＴｆＲコンストラクトを作製する方法であって、直列に融合された第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチドとを含む遺伝子を発現させることを含み、前記第１のポリヌクレオチドが前記ＴｆＲアピカルドメインの前記Ｃ末端フラグメントをコードし、前記第２のポリヌクレオチドが前記ＴｆＲアピカルドメインの前記Ｎ末端フラグメントをコードする、前記方法。
【請求項１６】
（ａ）発現されると、前記ＴｆＲアピカルドメインのＮ末端フラグメントの最初のアミノ酸が前記ＴｆＲアピカルドメインのＣ末端フラグメントの最後のアミノ酸と一次配列で連結されるように、前記第１のポリヌクレオチドと前記第２のポリヌクレオチドとが直列に融合される、
（ｂ）前記遺伝子が、任意選択的なタンパク質リンカーをコードする任意選択的なリンカーポリヌクレオチドを更に含み、発現されると、前記ＴｆＲアピカルドメインのＮ末端フラグメントの最初のアミノ酸が前記リンカーの最後のアミノ酸と一次配列で連結され、前記リンカーの最初のアミノ酸が前記ＴｆＲアピカルドメインのＣ末端フラグメントの最後のアミノ酸と一次配列で連結される、
（ｃ）発現されると、発現されたタンパク質が環状構造の形となるように、前記遺伝子が、直列な前記第１のポリヌクレオチド、前記任意選択的なリンカーポリヌクレオチド、及び前記第２のポリヌクレオチドをコードする、かつ／または
（ｄ）前記発現されたタンパク質を精製して前記ＴｆＲコンストラクトを得ることを更に含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の方法に従って作製された、ＴｆＲコンストラクト。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９、１１０、３０１、４６８、および４６９のうちのいずれか１つと少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、任意でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９、１１０、３０１、４６８、および４６９のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＴｆＲコンストラクト。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
更なる態様において、本明細書では、（ａ）上記のパラグラフに記載されるポリペプチドと、（ｂ）治療または診断物質とを含む結合体であって、血液脳関門を通過して輸送されることが可能な結合体が提供される。いくつかの実施形態では、治療または診断物質の脳への取り込みは、ポリペプチドの非存在下での治療または診断物質の取り込みに対して少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍増加する。
[本発明1001]
単量体のトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）アピカルドメインを含む単離された組換えＴｆＲコンストラクトであって、前記ＴｆＲのプロテアーゼ様ドメインまたは螺旋ドメインを含まない、前記ＴｆＲコンストラクト。
[本発明1002]
保存されたエピトープまたは抗原を提示し、かつ／または天然のヒトＴｆＲのアピカルドメインのおよその3次元構造を保持するか、もしくは約2未満の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を有する、本発明1001のＴｆＲコンストラクト。
[本発明1003]
前記3次元構造がＸ線結晶解析により測定される、本発明1001または1002のＴｆＲコンストラクト。
[本発明1004]
（ａ）ＴｆＲアピカルドメインの第1の部分の配列を含む第1のポリペプチドと、
（ｂ）任意選択的なリンカーと、
（ｃ）前記ＴｆＲアピカルドメインの第2の部分の配列を含む第2のポリペプチドと
を含み、
完全長のＴｆＲ配列に対して、前記ＴｆＲアピカルドメインの前記第1の部分の配列が前記ＴｆＲアピカルドメインの前記第2の部分の配列のＣ末端側であり、
前記第1のポリペプチド、前記任意選択的なリンカー、及び前記第2のポリペプチドが直列に融合されている、
ＴｆＲコンストラクト。
[本発明1005]
前記第2の部分の最後のアミノ酸が前記第1の部分の最初のアミノ酸と融合されている、本発明1004のＴｆＲコンストラクト。
[本発明1006]
前記第1のポリペプチドが、完全長ＴｆＲアピカルドメインのＣ末端フラグメントを含み、前記第2のポリペプチドが、前記完全長ＴｆＲアピカルドメインのＮ末端フラグメントを含む、本発明1004または1005のＴｆＲコンストラクト。
[本発明1007]
前記第1のポリペプチドが、
2020508053.tif 000001
の配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する配列を含む、本発明1004〜1006のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1008]
前記第1のポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：427の配列に対して最大7個のアミノ酸の変化を有する配列を含む、本発明1004〜1006のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1009]
前記第2のポリペプチドが、
2020508053.tif 000002
の配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する配列を含む、本発明1004〜1008のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1010]
前記第2のポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：428の配列に対して最大16個のアミノ酸の変化を有する配列を含む、本発明1004〜1008のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1011]
前記ＴｆＲアピカルドメインが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：107または108の配列を含む、本発明1001〜1010のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1012]
アレナウイルスに結合する、本発明1001〜1011のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1013]
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：427の配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する配列を含む前記第1のポリペプチドと、
（ｂ）前記任意選択的なリンカーと、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：428の配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有する配列を含む前記第2のポリペプチドと
を含む、本発明1004〜1012のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1014]
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：427の配列に対して最大7個のアミノ酸の変化を有する配列を含む前記第1のポリペプチドと、
（ｂ）前記任意選択的なリンカーと、
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：428の配列に対して最大16個のアミノ酸の変化を有する配列を含む前記第2のポリペプチドと
を含む、本発明1004〜1012のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1015]
前記第1のポリペプチドがＣ末端において、配列
2020508053.tif 000003
に対して少なくとも90％の配列同一性もしくは最大5個のアミノ酸の変化を有する配列、またはそのフラグメントを更に含む、本発明1004〜1014のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1016]
前記第2のポリペプチドがＣ末端において、配列
2020508053.tif 000004
に対して少なくとも90％の配列同一性もしくは最大5個のアミノ酸の変化を有する配列、またはそのフラグメントを更に含む、本発明1004〜1015のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1017]
前記第1のポリペプチドがＮ末端において、配列
2020508053.tif 000005
に対して少なくとも90％の配列同一性もしくは最大5個のアミノ酸の変化を有する配列、またはそのフラグメントを更に含む、本発明1004〜1016のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1018]
前記第2のポリペプチドがＮ末端において、配列
2020508053.tif 000006
に対して少なくとも90％の配列同一性もしくは最大5個のアミノ酸の変化を有する配列、またはそのフラグメントを更に含む、本発明1004〜1017のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1019]
前記第1のポリペプチドが、配列
2020508053.tif 000007
に対して少なくとも90％の配列同一性または最大10個のアミノ酸の変化を有する配列を含む、本発明1004〜1018のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1020]
前記第2のポリペプチドが、配列
2020508053.tif 000008
に対して少なくとも90％の配列同一性または最大20個のアミノ酸の変化を有する配列を含む、本発明1004〜1019のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1021]
前記第1のポリペプチドが前記第2のポリペプチドと直列に直接融合されている、本発明1004〜1020のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1022]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：449の配列を有する前記第1のポリペプチドと、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：450の配列を有する前記第2のポリペプチドとを含み、前記第1のポリペプチドのＣ末端が前記第2のポリペプチドのＮ末端に融合されている、本発明1004〜1021のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1023]
2020508053.tif 000009
の配列を有する前記第1のポリペプチドと、
2020508053.tif 000010
の配列を有する前記第2のポリペプチドと
を含み、前記第1のポリペプチドのＣ末端が前記第2のポリペプチドのＮ末端に融合されている、本発明1004〜1021のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1024]
前記リンカーがアミノ酸1〜10個の長さである、本発明1004〜1020、1022、及び1023のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1025]
前記リンカーが、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、またはＧＧＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：453）である、本発明1024のＴｆＲコンストラクト。
[本発明1026]
前記リンカーがタンパク質のループドメインを含む、本発明1004〜1020、1022、及び1023のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1027]
前記タンパク質のループドメインのＮ末端とＣ末端との間の距離が5Å未満である、本発明1026のＴｆＲコンストラクト。
[本発明1028]
精製ペプチドを更に含む、本発明1001〜1027のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1029]
前記精製ペプチドが、前記ＴｆＲコンストラクトのＮ末端またはＣ末端に融合されている、本発明1028のＴｆＲコンストラクト。
[本発明1030]
切断ペプチドを更に含む、本発明1001〜1029のいずれかのＴｆＲコンストラクト。
[本発明1031]
前記切断ペプチドが、前記ＴｆＲコンストラクトのＮ末端またはＣ末端に融合されている、本発明1030のＴｆＲコンストラクト。
[本発明1032]
本発明1001〜1031のいずれかのＴｆＲコンストラクトをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
[本発明1033]
本発明1032のポリヌクレオチドを含むベクター。
[本発明1034]
本発明1032のポリヌクレオチドまたは本発明1033のベクターを含む宿主細胞。
[本発明1035]
ＴｆＲのアピカルドメインに結合する物質を同定する方法であって、
（ａ）本発明1001〜1031のいずれかのＴｆＲコンストラクトを前記物質と接触させる工程と、
（ｂ）前記物質が前記ＴｆＲコンストラクトに結合するかどうかを決定する工程と
を含む、前記方法。
[本発明1036]
前記物質が、ポリペプチドまたはタンパク質である、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記物質が、改変Ｆｃポリペプチドまたは改変Ｆｃポリペプチド二量体である、本発明1035または1036の方法。
[本発明1038]
前記物質が抗体である、本発明1035または1036の方法。
[本発明1039]
前記決定する工程（ｂ）が、ＥＬＩＳＡまたは表面プラズモン共鳴によって行われる、本発明1035〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
組換えＴｆＲアピカルドメインコンストラクトを作製する方法であって、直列に融合された第1のポリヌクレオチドと第2のポリヌクレオチドとを含む遺伝子を発現させることを含み、前記第1のポリヌクレオチドが完全長のＴｆＲアピカルドメインのＣ末端フラグメントをコードし、前記第2のポリヌクレオチドが前記完全長のＴｆＲアピカルドメインのＮ末端フラグメントをコードする、前記方法。
[本発明1041]
発現されると、前記ドメインのＮ末端フラグメントの最初のアミノ酸が前記ドメインのＣ末端フラグメントの最後のアミノ酸と一次配列で連結されるように、前記第1のポリヌクレオチドと前記第2のポリヌクレオチドとが直列に融合される、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記遺伝子が、任意選択的なタンパク質リンカーをコードする任意選択的なリンカーポリヌクレオチドを更に含み、発現されると、前記ドメインのＮ末端フラグメントの最初のアミノ酸が前記リンカーの最後のアミノ酸と一次配列で連結され、前記リンカーの最初のアミノ酸が前記ドメインのＣ末端フラグメントの最後のアミノ酸と一次配列で連結される、本発明1040または1041の方法。
[本発明1043]
発現されると、発現されたタンパク質が環状構造の形となるように、前記遺伝子が、直列な前記第1のポリヌクレオチド、前記任意選択的なリンカーポリヌクレオチド、及び前記第2のポリヌクレオチドをコードする、本発明1040〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記発現されたタンパク質を精製して前記単離された組換えＴｆＲアピカルドメインコンストラクトを得ることを更に含む、本発明1040〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
本発明1040〜1044のいずれかの方法に従って作製された、単離された組換えヒトＴｆＲアピカルドメインコンストラクト。
[本発明1046]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：109、110、及び301のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、単離された組換えＴｆＲアピカルドメインコンストラクト。
[本発明1047]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：109、110、及び301のうちのいずれか1つと少なくとも約90％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された組換えＴｆＲアピカルドメインコンストラクト。