【手続補正書】
【提出日】令和3年3月23日(2021.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）ドメイン；（ii）シチジンデアミナーゼドメイン；（iii）第1のウラシルグリコシラーゼ阻害因子（UGI）ドメイン；および（iv）第2のウラシルグリコシラーゼ阻害因子（UGI）ドメインを含む、融合蛋白質。
【請求項２】
第1のUGIドメインおよび／または第2のUGIドメインが、配列番号134と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含み；任意に、第1のUGIドメインおよび／または第2のUGIドメインが、配列番号134によって規定されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
融合蛋白質が、構造：
NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[napDNAbpドメイン]-[第1のUGIドメイン]-[第2のUGIドメイン]-COOH；
NH2-[第1のUGIドメイン]-[第2のUGIドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[napDNAbpドメイン]-COOH；
NH2-[napDNAbpドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[第1のUGIドメイン]-[第2のUGIドメイン]-COOH；
NH2-[第1のUGIドメイン]-[第2のUGIドメイン]-[napDNAbpドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-COOH；
NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[第1のUGIドメイン]-[第2のUGIドメイン]-[napDNAbpドメイン]-COOH；または
NH2-[napDNAbpドメイン]-[第1のUGIドメイン]-[第2のUGIドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-COOH；
を含み、
ここで、「]-[」の各場合が、任意のリンカーを含む、請求項1または2に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
核局在配列（NLS）をさらに含み；任意にここで、NLSが二分NLSであり；さらに任意にここで、NLSが、アミノ酸配列：PKKKRKV（配列番号614）、MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(配列番号615)またはKRTADGSEFEPKKKRKV（配列番号740）を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
(1)シチジンデアミナーゼドメインおよびnapDNAbpドメインが、リンカーを介して連結されている、および／または(2)第1のUGIドメインおよびNLSが、リンカーを介して連結されている、および／または(3)第2のUGIドメインおよびNLSが、リンカーを介して連結されている、および／または(4)napDNAbpドメインおよび第1のUGIドメインが、リンカーを介して連結されている、および／または(5)napDNAbpドメインおよび第2のUGIドメインが、リンカーを介して連結されている、および／または(6)第1のUGIドメインおよび第2のUGIドメインが、リンカーを介して連結されている、請求項4に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
融合蛋白質が、構造：NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[napDNAbpドメイン]-[第1のUGIドメイン]-[第2のUGIドメイン]-[NLS]-COOHを含み、ここで「]-[」の各場合が、任意のリンカーを含み；
任意に、第2のUGIドメインおよびNLSが、アミノ酸配列SGGS（配列番号606）を含むリンカーを介して連結されており；任意に、napDNAbpドメインおよび第1のUGIドメインが、アミノ酸配列SGGS（配列番号606）を含むリンカーを介して連結されており；または
napDNAbpドメインおよび第1のUGIドメインが、アミノ酸配列SGGS(GGS)n（配列番号612）を含むリンカーを介して連結されており、ここでnが、2であり；任意に、第1のUGIドメインおよび第2のUGIドメインが、アミノ酸配列SGGS(GGS)n（配列番号612）を含むリンカーを介して連結されており、ここでnが、2であり；
さらに任意に、シチジンデアミナーゼドメインおよびnapDNAbpドメインが、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号604）またはSGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(配列番号605)を含むリンカーを介して連結されている、
請求項4または5に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）ドメインが、CasX、CasY、Cpf1、Cpf1ニッカーゼ、dCpf1、C2c1、C2c2、C2c3、Cas9、dCas9、Cas9ニッカーゼ、またはアルゴノート(Ago)蛋白質である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
napDNAbpドメインが、(i)配列番号6、7、37、または38と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、または(ii)配列番号7または38のアミノ酸配列を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
napDNAbpドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Staphylococcus aureus Cas9（SaCas9d）蛋白質またはStaphylococcus aureus Cas9ニッカーゼ（SaCas9n）蛋白質であり；任意にここで、SaCas9dタンパク質またはSaCas9nタンパク質が、(i)配列番号33〜36のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、または(ii)配列番号34または35のアミノ酸配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
（i）核酸によってプログラム可能なDNA結合蛋白質（napDNAbp）ドメイン；（ii）シチジンデアミナーゼドメイン；および（iii）ウラシルグリコシラーゼ阻害因子（UGI）ドメインを含む、融合蛋白質であって、ここで、napDNAbpドメインは、CasX、CasY、Cpf1、dCpf1、Cpf1ニッカーゼ、Cpf1変異体蛋白質、C2c1、C2c2、C2c3、またはアルゴノート(Ago)蛋白質である、前記融合蛋白質。
【請求項１１】
napDNAbpドメインが、
(a)CasY蛋白質であり；任意にここで、CasY蛋白質が、(i)配列番号31と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、または(ii)配列番号31のアミノ酸配列を含む；
(b)Cpf1、dCpf1、Cpf1ニッカーゼ、またはCpf1変異体蛋白質であり；任意にここで、Cpf1ニッカーゼまたは変異体蛋白質が、(i)配列番号10〜24のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列を含み；任意にここで、アミノ酸配列が、配列番号10〜16のいずれか1つと少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一である、または(ii)配列番号10〜24のいずれか1つのアミノ酸配列を含む；
(c)C2c1蛋白質であり；任意にここで、C2c1蛋白質が、(i)配列番号26と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、または(ii)配列番号26のアミノ酸配列を含む；
(d)C2c2蛋白質であり；任意にここで、C2c2蛋白質が、(i)配列番号27と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、または(ii)配列番号27のアミノ酸配列を含む；
(e)C2c3蛋白質であり；任意にここで、C2c3蛋白質が、(i)配列番号28と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、または(ii)配列番号28のアミノ酸配列を含む；
(f)アルゴノート蛋白質であり；任意にここで、アルゴノート蛋白質が、(i)配列番号25と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、または(ii)配列番号25のアミノ酸配列を含む；あるいは
(g)CasX蛋白質であり；任意にここで、CasX蛋白質が、(i)配列番号29または30と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一であるアミノ酸配列、または(ii)配列番号29または30のアミノ酸配列を含む、
請求項10に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
napDNAbpドメインが、Cpf1ニッカーゼ(nCpf1)であり；任意に、napDNAbpドメインが、Lachnospiraceae種からのCpf1ニッカーゼ（LbCpf1）または、Acidaminococcus種からのCpf1ニッカーゼ(AsCpf1)である、請求項10または11に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
融合蛋白質が、構造：
NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[napDNAbpドメイン]-[UGIドメイン]-[UGIドメイン]-COOH；
NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[napDNAbpドメイン]-[UGIドメイン]-COOH；
NH2-[UGIドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[napDNAbpドメイン]-COOH；
NH2-[UGIドメイン]-[UGIドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[napDNAbpドメイン]-COOH；
NH2-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[UGIドメイン]-[napDNAbpドメイン]-COOH；
NH2-[napDNAbpドメイン]-[UGIドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-COOH；
NH2-[napDNAbpドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-[UGIドメイン]-COOH；
NH2-[UGIドメイン]-[napDNAbpドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-COOH；または
NH2-[UGIドメイン]-[UGIドメイン]-[napDNAbpドメイン]-[シチジンデアミナーゼドメイン]-COOH； 
を含み、
ここで、「]-[」の各場合が、任意のリンカーを含む、請求項10〜12のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
リンカーのいずれか1つが、アミノ酸配列SGGS(GGS)n(配列番号612)、 (GGGS)n(配列番号613)、(GGGGS)n(配列番号607)、(G)n(配列番号608)、(EAAAK)n(配列番号609)、(GGS)n(配列番号610)、(SGGS)n(配列番号606)、SGSETPGTSESATPES(配列番号604)、SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(配列番号605)、(XP)n(配列番号611)、またはそれらの組み合わせを含み、ここでnが、独立して1から30までの間の整数（両端含む）であり、およびXが、いずれかのアミノ酸である、請求項4〜9および13のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
シチジンデアミナーゼドメインが：
(i)アポリポ蛋白質B mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼからのデアミナーゼであリ；任意にここで、APOBECファミリーデアミナーゼが、APOBEC1デアミナーゼ、APOBEC2デアミナーゼ、APOBEC3Aデアミナーゼ、APOBEC3Bデアミナーゼ、APOBEC3Cデアミナーゼ、APOBEC3Dデアミナーゼ、APOBEC3Fデアミナーゼ、APOBEC3Gデアミナーゼ、およびAPOBEC3Hデアミナーゼからなる群から選択される;
(ii)配列番号49〜84のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含む；
(iii)配列番号49〜84のいずれか1つのアミノ酸配列を含む;
(iv)配列番号76のW90Y、R126E、およびR132Eからなる群から選択される1つ以上の変異、または別のAPOBECデアミナーゼの対応する1つ以上の変異を含む、ラットAPOBEC1（rAPOBEC1）デアミナーゼである；
(v)配列番号74のW90Y、Q126E、およびR132Eからなる群から選択される1つ以上の変異、または別のAPOBECデアミナーゼの対応する1つ以上の変異を含む、ヒトAPOBEC1（hAPOBEC1）デアミナーゼである；
(vi)配列番号60のW285Y、R320E、およびR326Eからなる群から選択される1つ以上の変異、または別のAPOBECデアミナーゼの対応する1つ以上の変異を含む、ヒトAPOBEC3G（hAPOBEC3G）デアミナーゼである；
(vii)活性化誘導デアミナーゼ（AID）である;または
(viii) Petromyzon marinusからのシチジンデアミナーゼ1（pmCDA1）である、
請求項1〜14のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
核局在配列（NLS）をさらに含み；任意にここで、NLSが二分NLSであり；さらに任意にここで、NLSが、アミノ酸配列：PKKKRKV（配列番号614）、MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC(配列番号615)、またはKRTADGSEFEPKKKRKV（配列番号740）を含む、請求項10〜15のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１７】
融合蛋白質が、2つ、3つ、4つ、または5つのUGIドメインを含み；任意にここで、各UGIドメインが、UDG活性を阻害することができる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１８】
請求項1〜9のいずれか一項に記載の融合蛋白質と、融合蛋白質のnapDNAbpドメインに結合したガイドRNAとを含む、複合体であって、任意にここで、ガイドRNAは、配列番号618の核酸配列を含む、前記複合体。
【請求項１９】
請求項10〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質と、融合蛋白質のnapDNAbpドメインに結合したガイドRNAとを含む、複合体。
【請求項２０】
ガイドRNAが、10〜100ヌクレオチド長であり、および標的配列に対して相補的である少なくとも10個の一続きのヌクレオチドの配列を含み；任意にここで、標的配列が、DNA配列であり；任意にここで、標的配列が、原核生物のゲノム中または真核生物のゲノム中にあり；さらに任意にここで、標的配列が、哺乳動物のゲノム中にあり；さらに任意にここで、哺乳動物が、ヒトであり；またはここで、哺乳動物が、マウスまたはラットである、請求項18または19に記載の複合体。
【請求項２１】
請求項10、11および13〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質と、融合蛋白質のnapDNAbpドメインに結合したガイドDNAとを含む、複合体。
【請求項２２】
請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドであって、任意に、ガイドRNAまたはガイドDNAをさらにコードする、前記ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項22に記載のポリヌクレオチドを含むベクターであって、任意にここで、ベクターが、ポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、前記ベクター。
【請求項２４】
請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項18〜21のいずれか一項に記載の複合体、請求項22に記載のポリヌクレオチド、または請求項23に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２５】
請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項18〜21のいずれか一項に記載の複合体、請求項22に記載のポリヌクレオチド、請求項23に記載のベクター、または請求項24に記載の細胞を含む、医薬組成物であって、任意に、薬学的に許容し得る添加剤をさらに含む、前記医薬組成物。
【請求項２６】
薬物として用いるための、請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項18〜21のいずれか一項に記載の複合体、請求項22に記載のポリヌクレオチド、請求項23に記載のベクター、請求項24に記載の細胞、または請求項25に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
疾患、異常、または状態の処置のための薬物の製造において用いるための、請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項18〜21のいずれか一項に記載の複合体、請求項22に記載のポリヌクレオチド、請求項23に記載のベクター、請求項24に記載の細胞、または請求項25に記載の医薬組成物であって、任意にここで、疾患、異常、または状態が、ヒト対象中にあり；さらに任意にここで、疾患、異常、または状態が、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角化症（EHK）、4J型シャルコー・マリー・トゥース病、神経芽腫（NB）、フォン・ヴィレブランド病（vWD）、先天性ミオトニー、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症（DCM）、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、HIV、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（CINCA）、デスミン関連ミオパチー（DRM）、あるいは、変異体PI3KCA蛋白質、変異体CTNNB1蛋白質、変異体HRAS蛋白質、または変異体p53蛋白質に関連する新生物性疾患である、前記融合蛋白質、複合体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または医薬組成物。
【請求項２８】
核酸分子を、請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質およびガイドRNAに接触させること（ここで、ガイドRNAが、生物のゲノム中の標的配列に対して相補的でありかつ標的塩基対を含む少なくとも10個の一続きのヌクレオチドの配列を含み）；または
核酸分子を、請求項18〜21のいずれか一項に記載の複合体に接触させること（任意にここで、核酸分子が、DNAであり；さらに任意にここで、核酸分子が、二本鎖DNAであり；さらに任意にここで、核酸分子が、疾患または異常に関連する標的配列を含み；さらに任意にここで、標的配列が、疾患または異常に関連する点変異を含み；さらに任意にここで、複合体の活性が、点変異の修正をもたらす）、
を含む方法であって、ここで、方法が、in vitroでもしくはex vivoで、またはin vivoで非ヒト動物に行われる、前記方法。
【請求項２９】
標的配列が、疾患または異常に関連するT→C点変異を含み、およびここで、変異体C塩基の脱アミノ化が、疾患または異常に関連しない配列をもたらし；任意にここで、標的配列が、蛋白質をコードし、およびここで、点変異が、コドン内にあり、野生型コドンと比較して、変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらし；さらに任意にここで、変異体Cの脱アミノ化が、変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらし；さらに任意にここで、変異体Cの脱アミノ化が、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす、
請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
リボヌクレオ蛋白質（RNP）複合体を生成するための方法であって、方法が、
（i）核酸塩基編集因子を、水溶液中でRNAと複合体化させ、それによって、水溶液中で核酸塩基編集因子およびRNAを含む複合体を形成すること；および
（ii）（i）の複合体をカチオン性脂質に接触させること
を含み；
任意にここで、核酸塩基編集因子が、請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質であり、および／またはここで、（i）の複合体が、請求項18〜21のいずれか一項に記載の複合体である、前記方法。
【請求項３１】
（i）の核酸塩基編集因子およびRNAが、1:1から1:1.5までのモル比で複合体化させられ；任意に、（i）の水溶液中の複合体が、1:2から2:1までである体積比で、（ii）のカチオン性脂質に接触させられ；さらに任意に、核酸塩基編集因子が、水溶液中において10μMから100μMまでの濃度であり；さらに任意に、RNAが、sgRNAであり；さらに任意に、カチオン性脂質が、Lipofectamine（登録商標）2000、Lipofectamine（登録商標）3000、Lipofectamine（登録商標）MessengerMAX、Lipofectamine（登録商標）LTX、およびLipofectamine（登録商標）RNAiMAXからなる群から選択されるLipofectamine（登録商標）である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
核酸塩基編集因子を精製するための方法であって、方法が、
（i）細胞において核酸塩基編集因子を発現させること、ここで核酸塩基編集因子が、アフィニティータグを含み；
（ii）（i）の細胞を溶解し、それによって溶解物を創出すること；および
（iii）溶解物をアフィニティークロマトグラフィーに付し、それによって、精製された核酸塩基編集因子を含む溶出物を生成すること
を含み、
任意にここで、核酸塩基編集因子が、請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質である、
前記方法。
【請求項３３】
請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項18〜21のいずれか一項に記載の複合体、請求項22に記載のポリヌクレオチド、請求項23に記載のベクター、または請求項25に記載の医薬組成物を、対象の内耳へ送達することを含む方法であって、ここで、対象が、非ヒト動物である、前記方法。
【請求項３４】
二本鎖DNA配列の核酸塩基対を編集するための方法であって、方法が、
二本鎖DNA配列の標的領域を、核酸塩基編集因子およびガイド核酸を含む複合体に接触させること（ここで標的領域は、標的核酸塩基対を含む）；およびそれによって
該標的領域の鎖分離を誘導すること；
標的領域の一本鎖中の該標的核酸塩基対の第1の核酸塩基を、第2の核酸塩基に変換すること；
該標的領域の一方の鎖だけを切ること；および
第1の核酸塩基に相補的な第3の核酸塩基を、第2の核酸塩基に相補的な第4の核酸塩基で置き換えること；
を含み；
ここで、方法が、二本鎖DNA配列中に20%未満のインデル形成を引き起こし；および
ここで、核酸塩基編集因子が、(i)Cas9、dCas9、またはCas9ニッカーゼドメイン、または(ii)CasX、CasY、Cpf1、dCpf1、Cpf1ニッカーゼ、C2c1、C2c2、C2c3、またはアルゴノートドメインを含み；任意にここで、核酸塩基編集因子が、Cas9ニッカーゼドメインを含み；さらに任意にここで、核酸塩基編集因子が、第1のUGIドメインおよび第2のUGIドメインを含み、
ここで、方法が、in vitroでもしくはex vivoで、またはin vivoで非ヒト動物に行われる、前記方法。
【請求項３５】
方法が、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、または1%未満のインデル形成を引き起こし；任意にこれによって、第2の核酸塩基が、第4の核酸塩基に相補的である第5の核酸塩基と置き換えられ、それによって、意図される編集された塩基対を創出し；さらに任意にここで、意図される編集された塩基対を創出する効率が、少なくとも5%であり；さらに任意にここで、意図される編集された塩基対を創出する効率が、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、または少なくとも50%であり；さらに任意にここで、意図される編集された塩基対：意図されない編集された塩基対の比が、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、または8:1である、請求項34に記載の方法
【請求項３６】
切られる一本鎖が、ガイド核酸にハイブリダイズさせられ；任意に、切られる一本鎖が、第1の核酸塩基を含む鎖に対向し；任意にここで、第1の塩基が、シトシンであり；さらに任意に、第2の塩基が、ウラシルであり；さらに任意に、意図される編集された塩基対が：
(a)PAM部位の上流にあり；任意にここで、意図される編集された塩基対が、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド上流にあり；または
(b)PAM部位の下流にあり；任意にここで、意図される編集された塩基対が、PAM部位の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド下流にあり；
さらに任意にここで、方法が、古典的PAM部位を要求せず；さらに任意にここで、標的領域が、標的核酸塩基対を含む標的ウィンドウを含み；任意にここで、標的ウィンドウが、1〜10ヌクレオチドを含み；またはここで、標的ウィンドウが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ヌクレオチド長である、
請求項34または35に記載の方法。
【請求項３７】
核酸塩基編集因子が、請求項1〜17のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含む、請求項34〜36のいずれか一項に記載の方法。