【手続補正書】
【提出日】令和3年2月19日(2021.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリケチドを生成する方法であって、
キイロタマホコリカビ由来のDiPKSポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程であって、
ポリケチドシンターゼ酵素が、マロニル-CoAから少なくとも1つの種のポリケチドを生成するためのものであり、ポリケチドが、構造I:
【化１】
2020507352.tif 000001
を有し、構造Iにおいて、R1が、ペンチル基であり、R2が、H、カルボキシル、又はメチルであり、R3が、H、カルボキシル、又はメチルである、工程と、
酵母細胞培養物をもたらすために前記酵母細胞を増殖させる工程と
を含み、
DiPKSポリケチドシンターゼ酵素が、少なくとも1つの種のポリケチドのメチル化を防止するために、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素のC-Metドメインの活性部位における活性を低減する変異を含み、その結果、水素R2基及び水素R3基を有する少なくとも1つの種のポリケチドを生じ、
DiPKSポリケチドシンターゼは、DiPKSG1516Rポリケチドシンターゼを含み、
第1のポリヌクレオチドは、配列番号10の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ酵素に関するコード配列を含む、方法。
【請求項２】
酵母細胞が、DiPKSの活性を増加させるために、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチドを含み、
場合によっては、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが、A.ニデュランス由来のNpgAホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素を含み、
場合によっては、第2のポリヌクレオチドが、配列番号8の塩基1170から2201によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するA.ニデュランス由来のNpgAホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素のコード配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ポリケチドシンターゼ酵素は、より長鎖のケチル-CoAを用いずにマロニル-CoAから少なくとも1つの種のポリケチドを合成するための活性部位を含み、
場合によっては、少なくとも1つの種のポリケチドは、オリベトール、オリベトール酸、メチル-オリベトール、又はメチル-オリベトール酸のうちの少なくとも1つを含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
R2が、カルボキシルであり、R3が、Hであり、
R2が、メチルであり、R3が、Hであり、又は
R2が、カルボキシルであり、R3が、メチルである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
酵母細胞が、利用可能なマロニル-CoAを増加させる遺伝子改変を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
遺伝子改変が、Maf1の発現の増加を含み、
場合によっては、酵母細胞が、配列番号6の塩基936から2123によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するMaf1のコード配列を含む第2のポリヌクレオチドを含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
遺伝子改変が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル-CoAシンターゼの細胞質発現を含み、
場合によっては、酵母細胞が、配列番号2の塩基3938から5893によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.エンテリカ由来のAcsL641Pのコード配列、及び配列番号2の塩基1494から2999によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のAld6のコード配列を含む第2のポリヌクレオチドを含む、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子改変が、マロニル-CoAシンターゼの発現の増加を含み、
場合によっては、酵母細胞が、S.セレビシエ由来のAcc1S659A;S1167Aのコード配列を含む第2のポリヌクレオチドを含み、
場合によっては、第2のポリヌクレオチドが、Acc1S659A; S1167A酵素のコード配列を含み、該酵素の一部が、配列番号5の塩基9から1716によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質部分と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有する、請求項5に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子改変が、ステロール生合成の活性化因子の発現の増加を含み、
場合によっては、酵母細胞が、配列番号7の塩基975から3701によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のUpc2E888Dのコード配列を含む第2のポリヌクレオチドを含む、請求項5に記載の方法。
【請求項１０】
酵母細胞培養物から少なくとも1つの種のポリケチドを抽出する工程を更に含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも1つの種のポリケチドを生成するための酵母細胞であって、ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチド、及び
方法の請求項1から10のいずれか一項において提供される酵母細胞に関連して規定される酵母細胞、第1のポリヌクレオチド、又は第2のポリヌクレオチドのうちの1つ以上についての特徴を含む、酵母細胞。
【請求項１２】
少なくとも1つの種のポリケチドの生成のために酵母細胞を形質転換する方法であって、ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチドを酵母細胞株へと導入する工程を含み、
酵母細胞、第1のポリヌクレオチド、又は第2のポリヌクレオチドのうちの1つ以上についての特徴が、方法の請求項1から10のいずれか一項において提供される酵母細胞に関連して規定される、方法。
【請求項１３】
配列番号10の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有する、DiPKSG1516Rポリケチドシンターゼのコード配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号10の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ。
【請求項１５】
アミノ酸残基1516のグリシン残基の代わりにアミノ酸残基1516に荷電アミノ酸を有する、配列番号13の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列同一性を有する一次構造を有するキイロタマホコリカビのポリケチドシンターゼ(DiPKS)酵素。
【請求項１６】
アミノ酸残基1516がアルギニンである、請求項15に記載のDiPKSポリケチドシンターゼ。
【請求項１７】
アミノ酸残基1516がアスパラテートであって、アミノ酸残基1518がアラニンである、請求項15に記載のDiPKSポリケチドシンターゼ。