【手続補正書】
【提出日】令和3年3月17日(2021.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め選択された特徴を有するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を同定する方法であって、前記細胞は、前記特徴を有するモノクローナル抗体を分泌しない細胞の集団の中に存在し、前記方法は、
（ａ）
（ｉ）選択されたリンカーとの第１の複合体を形成するために設計されたアンカーをその形質膜外側表面上に発現した不死化細胞を、Ｂ細胞の細胞系譜の細胞と融合させることによって調製された、ハイブリドーマ細胞の集団を、
（ｉｉ）前記アンカーとの第１の複合体を形成し、かつ、単一のハイブリドーマ細胞によって分泌される単一のモノクローナル抗体との第２の複合体を形成するために設計されたリンカーと、
接触させる工程と、
（ｂ）前記リンカーはハイブリドーマ細胞によって分泌されるモノクローナル抗体と第２の複合体を形成し、かつ、前記モノクローナル抗体は、付着した第１及び第２の複合体を介してそれを分泌するハイブリドーマ細胞に結合する条件下で、前記リンカーの存在下で（ａ）の細胞を維持する工程と、
（ｃ）前記モノクローナル抗体の存在、抗原特異性、抗原結合親和性、力価、量、又は、生物学的活性を同定する工程と、
を含み、
前記モノクローナル抗体は前記アンカーによって認識されず、
前記接触は、第１の複合体において前記アンカーと結合することによって、前記リンカーが前記ハイブリドーマ細胞の形質膜外側に付着することを可能にし、
前記モノクローナル抗体は、前記ハイブリドーマ細胞によって分泌され、かつ、アンカー−リンカー−モノクローナル抗体によって形成された細胞結合多重免疫複合体によって結合される、
方法。
【請求項２】
工程（ａ）の後のいずれかの時点で前記ハイブリドーマ細胞を単離することを更に含むか；または（ａ）は、前記細胞を過剰濃度の前記リンカーと接触させることを更に含み、前記過剰は、前記モノクローナル抗体と、これを分泌しない他の細胞との結合に比べて、ハイブリドーマの細胞表面上の第１の複合体と、そのハイブリドーマ細胞によって分泌されるモノクローナル抗体との間の結合の特異性を増加させるか；または（ａ）は、前記分泌されたモノクローナル抗体と同じ種又は型の競合抗体と前記細胞を接触させることを更に含み、前記競合抗体は、異なる又は非特異的な抗原結合特異性を有し、前記競合抗体の存在は、過剰な非結合リンカーを結合することによって、モノクローナル抗体を分泌しない細胞へのそのモノクローナル抗体の結合に比べて、細胞表面上の第１の複合体と、前記細胞によって分泌されるモノクローナル抗体との間の結合の特異性を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）は、第３の複合体において前記モノクローナル抗体が特異的に結合する、検出可能に標識された抗原に前記ハイブリドーマ細胞を接触させることと、第１の複合体アンカー−リンカーによって形成される多重複合体に結合する細胞を形成することとを更に含み、前記リンカーは、前記抗原に結合された前記分泌モノクローナル抗体にも結合し、工程（ｃ）は、細胞結合多成分複合体に会合する前記検出可能な標識を同定又は定量することによって、選択された抗原に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を同定することを含む、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体はヒト抗体であり、前記アンカー分子は選択された非ヒト由来リンカーに特異的なｓｃＦｖを含み、前記リンカーは抗ヒトＩｇ抗体又は該ヒト抗体の抗体結合断片である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
アンカーを含む、核酸分子又はベクターであって、前記アンカーは前記核酸分子を含む細胞の表面上での前記アンカーの発現を指示する調節配列と作動可能に会合し、前記アンカーは、選択されたリンカーと第１の複合体を形成するために設計され、前記リンカーは、前記アンカーによって認識されない標的タンパク質と第２の複合体を形成するために設計される、核酸分子。
【請求項６】
前記アンカーは、
（ａ）前記リンカーに結合する細胞外領域ポリペプチド、
（ｂ）任意的なポリペプチドタグ、及び
（ｃ）内在性膜タンパク質に由来する膜貫通アミノ酸配列
を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
前記細胞外領域ポリペプチド（ａ）は、
ｉ．前記リンカー上の配列に特異的に結合する単鎖抗体可変領域（ｓｃＦｖ）、
ｉｉ．２〜６個のｓｃＦｖから形成されるタンデムｓｃＦｖであって、各々が前記リンカー上の配列に結合するために設計されている、タンデムｓｃＦｖ、
ｉｉｉ．細胞表面上で発現されるとき、１個又は２個の遊離Ｆｖ領域を有するＦａｂ、
ｉｖ．細胞表面上で発現されるとき、１個又は２個の遊離Ｆｖ領域を有する抗体、
ｖ．単一ドメイン抗体、
ｖｉ．ラクダ抗体、又は
ｖｉｉ．アプタマー
を含む、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項８】
前記細胞外領域は、各ｓｃＦｖの重鎖Ｆｖ及び軽鎖Ｆｖ配列を交互に含み、かつ、各鎖の間に介在するスペーサーを含む、請求項７に記載の核酸分子。
【請求項９】
プロモーター、リーダー配列、任意的なエンハンサー、及び、前記アンカーをコードする核酸配列を作動可能に会合させて含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項１０】
選択されたリンカーと第１の複合体を形成するために設計されたアンカーをその形質膜外側表面上に発現する細胞であって、前記リンカーは、前記アンカーによって認識されない標的タンパク質と第２の複合体を形成するために設計されている、細胞であって、以下の少なくとも１つにより特徴づけられている：
（ａ）前記アンカーが、
（ｉ）前記リンカーに結合する細胞外領域ポリペプチド、
（ｉｉ）任意的なポリペプチドタグ、及び
（ｉｉｉ）内在性膜タンパク質に由来する膜貫通アミノ酸配列
を含むか；または、
（ｂ）前記細胞の形質膜外側表面上が、前記アンカー及び前記リンカーを含む第１の免疫複合体であるか；または、
（ｃ）前記リンカーは抗体又は抗体断片であるか；または、
（ｄ）前記（ｃ）の抗体断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ若しくは単鎖Ｆｖ、又は、単一ドメイン抗体と、それらの組換えバージョンとであるか；または、
（ｅ）前記細胞の形質膜外側表面上が、前記リンカーに結合した前記アンカーを含む多重免疫複合体であり、前記リンカーは前記標的タンパク質にも結合するか；または、
（ｆ）前記リンカーは、前記リンカーの非存在下で前記標的タンパク質及び前記アンカーが互いに結合しない条件下で、前記アンカー及び前記標的タンパク質の両方に結合することができるか；または、
（ｇ）前記標的タンパク質は抗体である、
前記細胞。
【請求項１１】
選択されたリンカーと複合体を形成するために設計されたアンカーをその形質膜外側表面上に発現している不死化細胞とＢ細胞の細胞系譜の細胞を融合させることを含む、請求項１に記載の細胞であってハイブリドーマ細胞である細胞、を作製する方法であって、前記リンカーは、Ｂ細胞か、Ｂ細胞の細胞系譜の細胞に由来する細胞か、この方法によって作製されたハイブリドーマ細胞かによって分泌される抗体に結合するために設計され、前記抗体は前記アンカーによって認識されない、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
（ａ）前記抗体はモノクローナル抗体であるか；または、
（ｂ）前記不死化細胞が、選択されたリンカーと第１の複合体を形成するために設計されたアンカーをその形質膜外側表面上に発現し、前記リンカーは、前記アンカーによって認識されない標的タンパク質と第２の複合体を形成するために設計されており、前記不死化細胞が以下の少なくとも１つによって特徴付けられている：
ｉ．前記アンカーが、
Ａ．前記リンカーに結合する細胞外領域ポリペプチド、
Ｂ．任意的なポリペプチドタグ、及び
Ｃ．内在性膜タンパク質に由来する膜貫通アミノ酸配列、を含むか；または、
ｉｉ．前記細胞の形質膜外側表面上が、前記アンカー及び前記リンカーを含む第１の免疫複合体であるか；または、
ｉｉｉ．前記リンカーは抗体又は抗体断片であるか；または、
ｉｖ．前記ｉｉｉ．の抗体断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆｖ若しくは単鎖Ｆｖ、又は、単一ドメイン抗体と、それらの組換えバージョンとであるか；または、
ｖ．前記細胞の形質膜外側表面上が、前記リンカーに結合した前記アンカーを含む多重免疫複合体であり、前記リンカーは前記標的タンパク質にも結合するか；または、
ｖｉ．前記リンカーは、前記リンカーの非存在下で前記標的タンパク質及び前記アンカーが互いに結合しない条件下で、前記アンカー及び前記標的タンパク質の両方に結合することができるか；または、
ｖｉｉ．前記標的タンパク質は抗体である
か；または、
（ｃ）前記Ｂ細胞の細胞系譜の細胞内に由来する核酸配列から発現されるモノクローナル抗体を分泌し、前記不死化細胞によって提供される核酸配列からの前記アンカータンパク質を発現する、ハイブリドーマ細胞が作製される、
前記方法。
【請求項１３】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２４０６２によって指定される、細胞株ＬＣＸ−ＢＧＳ株０３．０６．１７及びその子孫。
【請求項１４】
ウイルス抗原に結合するモノクローナル抗体を同定するための方法であって、
（ａ）ハイブリドーマ細胞の集団を提供する工程であって、各ハイブリドーマ細胞は、選択されたリンカーと第１の複合体を形成するために設計されたアンカーをその形質膜外側上に固定されて含み、前記リンカーは、前記細胞によって分泌されるモノクローナル抗体と第２の複合体を形成するために設計され、前記モノクローナル抗体は、前記アンカーによって認識されない、工程と、
（ｂ）前記ウイルス抗原が前記細胞結合アンカー−リンカー−ｍＡｂ複合体に結合するために十分な時間、前記集団を多価ウイルス抗原と接触させ、細胞結合アンカー−リンカー−ｍＡｂ−ウイルス抗原複合体を生じる工程と、
（ｃ）前記細胞集団によって分泌される更なる免疫グロブリン（Ｉｇ）が、前記結合した多価ウイルス抗原上の他の結合部位に結合し、それによってアンカー−リンカー−ｍＡｂ−ウイルス抗原−Ｉｇの検出可能な免疫複合体を形成することを可能にする工程と、
（ｄ）細胞表面上の前記複合体のサイズ及び位置又は場所に基づいて、前記アンカー−リンカーｍＡｂウイルス抗原−Ｉｇ複合体が結合した細胞を同定することを含む、工程とを含む、方法。
【請求項１５】
前記多価ウイルス抗原は、１個以上の精製ウイルス抗原、全ビリオン、又は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であるか；または、前記同定する工程（ｄ）は、一価ウイルス抗原との接触から生じる（ａ）の前記細胞か、ウイルス抗原と接触しないで生じる（ａ）の前記細胞かを比較することを含むか；または、前記一価ウイルス抗原はＦａｂ断片である、請求項１４に記載の方法。