【手続補正書】
【提出日】平成17年7月12日(2005.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
ＨＴＬＶ−１のｐ２１抗原と、請求項２〜４のいずれか１に記載のコンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原とが不溶性担体に感作された抗ＨＴＬＶ−１抗体検出用試薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヒトＴ細胞向性ウイルス１型（以下単に「ＨＴＬＶ−１」という。）の検出に使用される抗原および抗ＨＴＬＶ−１抗体検出用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＨＴＬＶ−１はレトロウイルス科（オンコウイルス族）の一つであり、主としてＣＤ４陽性患者に感染し、その細胞を腫瘍化させる。ＨＴＬＶ−１の感染経路としては、輸血、母乳を介する母児間、精液を介する性交感染が知られており、これらの感染経路を遮断することが重要である。ＨＴＬＶ−１の感染の確認は、血清中に抗ＨＴＬＶ−１抗体の存在を確認することにより行われる。その方法として、酵素免疫測定法（ＥＩＡ 法）、粒子凝集法（ＰＡ法）、蛍光抗体法（ＩＦ法）、ウエスタンブロット法（ＷＢ法）などが用いられている。
【０００３】
抗ＨＴＬＶ−１抗体の内、感染防御に最も重要と考えられている抗体は、抗エンベロープ抗体といわれており、該抗体を測定するために、遺伝子工学的に大腸菌で発現させたエンベロープ抗原を用いた方法(Science, Vol.226, pp.1094 (1984)；Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America,Vol.81, pp.6202(1984))や、合成ペプチド抗原を用いた方法(The Journal of Biological Chemistry, Vol.264, No. 28, pp.16343(1989)；特開平3-503284号公報;特開平8-73496号公報)が報告されている。しかし、これらのペプチドを使用しても感度的に満足のいく測定法とは成り得ておらず、すべてのＨＴＬＶ−１感染者の抗体を漏れなく検出できていないのが現状である。
【０００４】
【特許文献１】
特開平８−７３４９６号公報
【特許文献２】
特許番号第２６５０２１７号公報
【非特許文献】
Sysmex Journal Web Vol.2 No.1(2001)p.4-7
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、より感度良く抗ＨＴＬＶ−１抗体を検出するために使用する抗原ペプチドまたはタンパク質および測定試薬を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、
１．以下に示すいずれかのヒトＴ細胞向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）の抗原ペプチド；
１）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する抗原ペプチド。
２）上記１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、該ペプチド単独で、若しくは他の抗原ペプチドと組み合わせて用いることにより抗ＨＴＬＶ−１抗体検出能を有する抗原ペプチド、
２．ＨＴＬＶ−１のｐ１９抗原またはｇｐ４６抗原をキャリアータンパク質と結合してなるコンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原、
３．キャリアータンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である前項２に記載のコンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原、
４．上記ｐ１９抗原およびｇｐ４６抗原に含まれるアミノ酸配列が各々配列番号２および配列番号３に記載のアミノ酸配列である前項２または３に記載のコンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原、
５．前項１に記載のアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−１の抗原ペプチドに、ＨＴＬＶ−１のｐ１９抗原およびｇｐ４６抗原を組み合わせて使用することを特徴とする抗ＨＴＬＶ−１抗体検出方法、
６．上記ｐ１９抗原およびｇｐ４６抗原に含まれるアミノ酸配列が各々配列番号２および配列番号３に記載のアミノ酸配列である前項５に記載の抗ＨＴＬＶ−１抗体検出方法、
７．ＨＴＬＶ−１のｐ２１抗原に、前項２〜４のいずれか１に記載のコンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原を組み合わせて使用することを特徴とする抗ＨＴＬＶ−１抗体検出方法、
８．前項１に記載のアミノ酸配列を有するＨＴＬＶ−１の抗原ペプチド、ＨＴＬＶ−１のｐ１９抗原およびｇｐ４６抗原が不溶性担体に感作された抗ＨＴＬＶ−１抗体検出用試薬、
９．ｐ１９抗原およびｇｐ４６抗原がコンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原である前項８に記載の抗ＨＴＬＶ−１抗体検出用試薬、
１０．上記ｐ１９抗原およびｇｐ４６抗原に含まれるアミノ酸配列が各々配列番号２および配列番号３に記載のアミノ酸配列である前項８または９に記載の抗ＨＴＬＶ−１抗体検出用試薬、
１１．ＨＴＬＶ−１のｐ２１抗原と、前項２〜４のいずれか１に記載のコンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原とが不溶性担体に感作された抗ＨＴＬＶ−１抗体検出用試薬、からなる。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明に使用するＨＴＬＶ−１抗原ペプチドは、抗ＨＴＬＶ−１抗体に反応しうるペプチドであって、各ペプチドは単独または組み合わせて使用しても機能を発揮しうるが、各抗原ペプチドは組み合わせて使用することで、より正確に抗ＨＴＬＶ−１抗体を検出することができる。各抗原ペプチドは、エンベロープ領域またはコア領域に存在する蛋白質を構成するアミノ酸配列を含むものである。各抗原は、ｐ２１抗原、ｐ１９抗原、ｇｐ４６抗原と表すことができる。より具体的には、各抗原のアミノ酸配列は次に表すことができる。
【０００８】
１）ｐ２１抗原（配列番号１）
MVRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQGIHHHHHHVDPGPMALASGKSLLHEVDKDISQLTQAIVKNHKNLLKIAQYAAQNRRGLDLLFWEQGGLCKALQEQCCFLNITNSHVSILQERPPLENRVLTGWGLNWDLGLSQWAR
２）ｐ１９抗原（配列番号２） 
NH2- KKDSDPQIPPPYVEPTAPQVL -COOH
３）ｇｐ４６抗原（配列番号３）
NH2- KKNTEPSQLPPTAPPLLPHSNLDHILEPSI-COOH
【０００９】
さらに、ｐ２１抗原に関し、配列番号１で表されるアミノ酸配列のうち、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列からなるペプチドであって、該ペプチド単独で、若しくは他の抗原ペプチドと組み合わせて用いることにより抗ＨＴＬＶ−１抗体検出能を有する抗原ペプチドも本発明の範囲に含まれる。
【００１０】
本発明の抗原ペプチドは、遺伝子組換えにより、あるいは合成法により得ることができる。遺伝子組換え法は、大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞、動物細胞等の自体公知の宿主を利用した遺伝子組換え技術による発現システムや無細胞タンパク質合成法により、得ることができる。また、ペプチド合成は、自体公知の方法により合成して得ることができる。例えば固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法により得ることができる。また抗原ペプチドの担体への吸着を容易にするために抗原ペプチドのＮ端にリジンなどを付加することも自由である。
【００１１】
アミノ酸の欠失、置換、付加あるいは挿入の手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（ＰＣＲ）を単独または適宜組み合わせて、例えば、Molecular Cloning; A Laboratory Manual、第２版、Sambrookら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、1989年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、1988年；［ＰＣＲテクノロジー、DNA増幅の原理と応用]、Ehrlich,HE.編 ストックプレス、1989年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばUlmerの技術(Science(1983) 219: 666)を利用することができる。
【００１２】
抗原は、上記のｐ２１抗原、ｐ１９抗原およびｇｐ４６抗原を２種以上、好ましくは３種を担体に感作することができる。また、ｐ１９抗原およびｇｐ４６抗原は、コンジュゲートしてコンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原ペプチドとして使用することができる。コンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原ペプチドは、計１００μＬの緩衝液に、ｐ１９抗原およびｇｐ４６抗原を適当な混合比で加え、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グルタルアルデヒドとともに３０℃で３０分程度コンジュゲート反応させ、得ることができる。
【００１３】
本発明のペプチドを利用した抗ＨＴＬＶ−１抗体の検出は免疫測定法によることができる。この免疫測定法としては、例えば酵素免疫測定法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、凝集法、ウエスタンブロット法、化学発光免疫測定法、など常用されている方法のいずれも適用することができる。一例として、凝集法の一種であるカウンティングイッムノアッセイ法（Counting Immunoassay法 ：以下「ＣＩＡ法」という。） を利用する場合について説明する。ＣＩＡ法による測定は、Sysmex Journal Vol.20 No.1, 77-86(1997)に記載の方法により行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【００１４】
測定系は、抗原ペプチド、抗原ペプチドを感作する担体、被検試料、緩衝液等により構成される。
抗原ペプチド感作用担体の例として、有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球及び細胞膜片などが挙げられる。有機高分子粉末としては、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストランなどが例示でき、好ましくはラテックス粒子が広く利用される。ラテックスとしては、例えばポリスチレン、ポリスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリルニトリル−ブタジエンスチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等が挙げられる。用いるラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度あるいは測定機器により０．０５〜１．０μｍ、好ましくは０．３〜０．８５μｍのものが適宜選択される。無機物質粉末としては、シリカ、アルミナ、あるいは金、チタン、鉄、ニッケル等の金属片などが例示される。
【００１５】
担体への抗原感作量は、担体１ｍｇあたり１００μｇまでの範囲で必要に応じて自由に設定することができる。好ましくは、上記抗原ペプチドおよび／またはコンジュゲートＨＴＬＶ−１抗原ペプチドと非特異反応抑制のためのブロッキング剤として使用する蛋白質とあわせて合計１００μｇまでの範囲で設定することができる。ブロッキング剤は、抗原を感作した後または抗原と同時に担体に固定することができる。
【００１６】
測定方法は、公知の方法に従い、用いられる不溶性担体の大きさもしくは濃度、反応時間を設定することにより、散乱光強度、吸光度または透過光強度の増加もしくは減少を測定することにより行うことができ、これらの方法を２種以上併用してもよい。
【００１７】
本発明は、上記免疫測定方法に使用する免疫測定用試薬キットにも及ぶ。
【００１８】
【実施例】
以下、本発明の内容を実施例を用いて具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００１９】
（実施例１）ＣＩＡ法によるＨＴＬＶ−１の検出
本実施例では、抗ＨＴＬＶ−１抗体陽性の市販のパネル血清を使用してＣＩＡ法でのＨＴＬＶ−１の確認を行った。抗原ペプチドｐ１９および抗原ペプチドｇｐ４６は合成法により作成し、抗原ペプチドｐ２１は大腸菌を宿主とした遺伝子組換え法により得た。
【００２０】
（抗原ペプチドの感作）
粒径０．８μｍのラテックス粒子懸濁液（５ｍｇのラテックス担体を含む）１ｍＬに、以下のＨＴＬＶ−１抗原ペプチドを加え、３７℃で１時間静置した。その後、ラテックス粒子を洗浄し、各抗原を感作した。
１）抗原ペプチドｐ１９：ペプチド３μｇをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１７．１μｇとコンジュゲートさせたもの、
２）抗原ペプチドｇｐ４６：ペプチド４μｇをＢＳＡ２２．９μｇとコンジュゲートさせたもの、
３）抗原ペプチドｐ２１：ペプチド２μｇ
４）３種の抗原ペプチド：上記１）〜３）の割合で混合したもの
【００２１】
（測定）
測定は、ＨＴＬＶ−１抗体の測定をシスメックス社製測定装置（ＰＡＭＩＡ−５０）を用いて行った。
反応プレートのウェルに、ラテックス凝集反応用緩衝液を８０μｌ、各抗ＨＴＬＶ−１抗体陽性試料を１０μｌおよび上記調製したラテックス粒子を含む溶液を１０μｌを添加し、４５℃で反応させた。反応を開始して約１５分後に１９μｌの反応混合物を装置のチャンバ内の９５０μｌのシース液に加えて５１倍に稀釈した。稀釈により、凝集反応を停止させ、その後、凝集度を光学検出部で検出した（Ｔ２％）。判定は以下の式１に示す式に従い、カットオフインデックス（ＣＯＩ）値を算出して行った。カットオフインデックスが１以上を陽性と判定した。また、式１の結果がマイナスになる場合は、ＣＯＩ値を０とした。本実施例において、単独感作ラテックスにおけるカットオフ値は、〔陰性コントロール反応量〕＋１．０％（つまり式１の分母が１．０）とした。また、ＨＴＬＶ−１ ｐ１９単独感作ラテックス、ＨＴＬＶ−１ ｇｐ４６単独感作ラテックス、ＨＴＬＶ−１ ｐ２１単独感作ラテックスにおける陰性コントロールの反応量は、それぞれ、０．９２、１．００、０．８２％であった。３種混合感作ラテックスにおいては、陰性コントロールの反応量は１．２２％、カットオフコントロールの反応量は３．６４％であった。
【００２２】
【式１】
2004115412.tif 000001
【００２３】
（結果）
その結果、表１に示すように、検体4および検体7では、各抗原を単独でラテックスに感作した場合には陰性と判断されたが、３種の抗原を組み合わせた場合には、全ての検体について抗ＨＴＬＶ−１抗体が陽性と判断された。
【００２４】
【表１】
2004115412.tif 000002
【００２５】
【発明の効果】
以上説明したように本発明のＨＴＬＶ−１抗原ペプチドを組み合わせて担体に感作させ、免疫測定法を行うことで、簡便に感度良く抗ＨＴＬＶ−１抗原抗体の有無を検出することが可能となった。