【手続補正書】
【提出日】令和3年7月21日(2021.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数種のラムノリピド（ＲＬ）を含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
（ａ）  ラムノリピド産生微生物を培養培地中で培養するステップであって、前記１種または複数種のラムノリピドが、少なくとも１．５ｇＲＬ／Ｌ／時の速度で得られ、前記培養培地が、
ｉ．少なくとも２種の炭素源であって、第１の炭素源が甘味剤であり、第２の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である、少なくとも２種の炭素源；
ｉｉ．少なくとも１種の窒素源；
ｉｉｉ．少なくとも１種のリン源；
ｉｖ．少なくとも１種のマグネシウム源；
ｖ．少なくとも１種のカリウム源；
ｖｉ．少なくとも１種の硫黄源；
ｖｉｉ．少なくとも１種の塩化物源；および
ｖｉｉｉ．少なくとも１種のナトリウム源
を含み、
前記培養培地中で、前記１種または複数種のラムノリピドが、少なくとも１日にわたり培養されて、前記１種または複数種のラムノリピドと前記ラムノリピド産生微生物とを含む第１の発酵培地を得るステップと、
（ｂ）  ステップ（ａ）で得られた前記第１の発酵培地の少なくとも７０％を除去するステップと、
（ｃ）  （ｂ）で除去した前記第１の発酵培地を、ステップ（ａ）に示される組成を有する培養培地と交換するステップと、
（ｄ）  ステップ（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回繰り返して、前記１種または複数種のラムノリピドと前記ラムノリピド産生微生物とを含む次の発酵培地を得るステップと
を含み、
前記方法により少なくとも４０ｇＲＬ／Ｌの力価が得られる、方法。
【請求項２】
前記ラムノリピド産生微生物が、ステップ（ａ）で１日〜４日にわたり培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２０ｍｇ／Ｌ以下の濃度の微量栄養素組成物を、ステップ（ａ）の前記培養培地に、１日あたりの総発酵容量の０．１％ｖ／ｖで添加するステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記発酵培地が、ステップ（ｂ）で、撹拌の間に空気流を維持しながら除去される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記発酵培地が、ステップ（ｂ）で、撹拌の間に酸素富化空気を用いて空気流を維持しながら除去される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）と（ｂ）との間に沈降ステップがない、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１種または複数種のラムノリピドを生産する方法であって、
ラムノリピド産生微生物を、炭素源が甘味剤および中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である少なくとも２種の炭素源、少なくとも１種の窒素源、少なくとも１種のリン源、少なくとも１種のマグネシウム源、少なくとも１種のカリウム源、少なくとも１種の硫黄源、少なくとも１種の塩化物源、および少なくとも１種のナトリウム源を含む培養培地中で、少なくとも１日にわたり培養するステップを含み、
前記１種または複数種のラムノリピドが、少なくとも１．５ｇＲＬ／Ｌ／時の速度で得られ、
前記方法により少なくとも４０ｇＲＬ／Ｌの力価が得られる、方法。
【請求項８】
前記培養培地が微量栄養素を含まない、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培養するステップが、半連続発酵法、バッチ発酵法、またはフェドバッチ発酵法を使用して実施される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
培養するステップが、請求項１に記載の半連続発酵法を使用して実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラムノリピド産生微生物が、シュードモナス属（Pseudomonas）微生物である、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記培養培地が、０．１〜２．０重量％ｗ／ｖの甘味剤を前記培養培地中に含み、３〜１５重量％の油を前記培養培地中に含む、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記甘味剤が未精製甘味剤であり、前記油が植物油である、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１４】
前記未精製甘味剤が、樹液、１種もしくは複数種の根、果実、１種もしくは複数種の種子、１種もしくは複数種の木、または１種もしくは複数種の動物に由来する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記甘味剤が、糖蜜、米もしくは大麦麦芽シロップ、花蜜、ヤーコンシロップ、テンサイシロップ、およびソルガムシロップからなる群より選ばれる少なくとも１種であり、
前記油が、ダイズ油、ベニハナ油、ラッカセイ油、ヘンプシード油、ジャトロファ油、ココナッツ脂肪、カラバッシュ油、アマニ油、コーン油、ポピーシード油、イブニングプリムローズ油、オリーブ油、パーム核油、ヤシ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、小麦胚芽油、ココナッツ油、および中鎖トリグリセリド油からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１６】
前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも３種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が甘味剤であり、少なくとも１種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１７】
前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも３種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が未精製甘味剤であり、少なくとも１種の炭素源が中鎖トリグリセリド含有油である、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１８】
前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも４種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油であり、少なくとも２種の炭素源が甘味剤である、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも４種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも１種の炭素源が中鎖トリグリセリド含有油であり、１種の炭素源が長鎖トリグリセリド含有油であり、少なくとも２種の炭素源が未精製甘味剤である、請求項１または７に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養培地が、
ｉｘ．乳化剤
をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記培養培地が、乳化剤をさらに含む、請求項７から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記１種または複数種のラムノリピドを前記培養培地から単離するステップをさらに含む、請求項７から１２のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
[実施例９]
０．５％の未硫化サトウキビ廃糖蜜を用いる、中鎖および長鎖トリグリセリド油のＲＬ発酵
発酵条件、培地および栄養素組成物は、それぞれ中鎖および長鎖トリグリセリド油を表す４％のココナッツ油および４％のキャノーラ油が、０．５％の糖蜜を有する供給原料として使用されることを除いて、実施例７に示されるものと同じである。発酵は、８８ｇ／ＬのＲＬ濃度の場合、３２時間で完了し、したがって、ＲＬ生産率は、２．８ｇ／Ｌ／時である。
参考文献
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10.  Giani, C., et al. Pseudomonas aeruginosa and its use in a process for the biotechnological preparation of L-rhamnose. US5501966 A, 1996.
11.  Li, A.-h., et al., Rhamnolipid Production by Pseudomonas Aeruginosa GIM 32 Using Different Substrates Including Molasses Distillery Wastewater. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2011. 163(5): p. 600-611.
12.  Gong, Z., Y. Peng, and Q. Wang, Rhamnolipid production, characterization and fermentation scale-up by Pseudomonas aeruginosa with plant oils. Biotechnology Letters, 2015. 37(10): p. 2033-2038.
13.  Zhu, L., et al., Enhanced rhamnolipids production by Pseudomonas aeruginosa based on a pH stage-controlled fed-batch fermentation process. Bioresource Technology, 2012. 117: p. 208-213.
なお、本発明には、以下の実施形態が包含される。
［１］１種または複数種のラムノリピド（ＲＬ）を含む複数の発酵物を生産する半連続方法であって、
（ａ）  ラムノリピド産生微生物を、少なくとも１種の炭素源が甘味剤でありかつ少なくとも１種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である少なくとも２種の炭素源、少なくとも１種の窒素源、少なくとも１種のリン源、少なくとも１種のマグネシウム源、少なくとも１種のカリウム源、少なくとも１種の硫黄源、少なくとも１種の塩化物源、および少なくとも１種のナトリウム源を含む培養培地中で、任意で乳化剤の存在下で、少なくとも約１日にわたり培養して、１種または複数種のラムノリピド（ＲＬ）を含むラムノリピドと少なくとも１種のラムノリピド産生微生物とを含む第１の発酵培地を得るステップと、
（ｂ）  ステップ（ａ）で得られた前記第１の発酵培地の少なくとも約７０％を除去するステップと、
（ｃ）  （ｂ）で除去した前記第１の発酵培地を、ステップ（ａ）に示される組成を有する培養培地と交換するステップと、
（ｄ）  ステップ（ａ）〜（ｃ）を少なくとも１回繰り返して、ラムノリピドと少なくとも１種のラムノリピド産生微生物とを含む次の発酵培地を得るステップと
を含む、方法。
［２］前記培養するステップ（ａ）により少なくとも約１．７ｇＲＬ／Ｌ／時が得られ、および／または前記方法により少なくとも約４０ｇＲＬ／Ｌが得られる、前記［１］に記載の方法。
［３］前記ラムノリピド産生微生物が、ステップ（ａ）で約１日〜約４日にわたり培養される、前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］１種または複数種の微量栄養素を微量栄養素溶液１Ｌあたり２０ｍｇ以下の濃度で含む組成物を、ステップ（ａ）の前記培養培地に、１日あたりの総発酵容量の０．１％ｖ／ｖで添加するステップをさらに含む、前記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］前記発酵培地が、ステップ（ｂ）で、撹拌の間に空気流を維持しながら除去される、前記［１］から［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］前記発酵培地が、ステップ（ｂ）で、撹拌の間に酸素富化空気を用いて空気流を維持しながら除去される、前記［５］に記載の方法。
［７］ステップ（ａ）と（ｂ）との間に沈降ステップがない、前記［１］から［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］１種または複数種のラムノリピドを生産する方法であって、ラムノリピド産生微生物を、炭素源が甘味剤および中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である少なくとも２種の炭素源、少なくとも１種の窒素源、少なくとも１種のリン源、少なくとも１種のマグネシウム源、少なくとも１種のカリウム源、少なくとも１種の硫黄源、少なくとも１種の塩化物源、少なくとも１種のナトリウム源、および任意で乳化剤を含む培養培地中で、少なくとも約１日にわたり培養して、少なくとも約４０ｇ／Ｌのラムノリピド力価を、および／または少なくとも約１．５ｇＲＬ／Ｌ／時の速度で得るステップと、任意で前記１種または複数種のラムノリピドを前記培養培地から単離するステップとを含む、方法。
［９］前記培養培地が微量栄養素を含まない、前記［８］に記載の方法。
［１０］前記培養するステップが、半連続発酵法、バッチ発酵法またはフェドバッチ発酵法を使用して実施される、前記［８］または［９］に記載の方法。
［１１］培養するステップが、請求項１に記載の半連続発酵法を使用して実施される、前記［１０］に記載の方法。
［１２］前記ラムノリピド産生微生物が、シュードモナス属（Pseudomonas）微生物である、前記［８］から［１１］のいずれか一項に記載の方法。
［１３］前記培養培地が、約０．１〜約２．０重量％ｗ／ｖの各甘味剤を前記培養培地中に含み、および／または約３〜１５重量％の各油を前記培養培地中に含む、前記［１０］に記載の方法。
［１４］前記甘味剤が未精製甘味剤であり、および／または前記油が植物油である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［１５］前記未精製甘味剤が、樹液、１種もしくは複数種の根、果実、１種もしくは複数種の種子、１種もしくは複数種の木、または１種もしくは複数種の動物に由来する、前記［１４］に記載の方法。
［１６］前記甘味剤が、糖蜜、米もしくは大麦麦芽シロップ、花蜜、ヤーコンシロップ、テンサイシロップ、ソルガムシロップのうちの少なくとも１種であり、および／または前記油が、ダイズ油、ベニハナ油、ラッカセイ油、ヘンプシード油、ジャトロファ油、ココナッツ脂肪、カラバッシュ油、アマニ油、コーン油、ポピーシード油、イブニングプリムローズ油、オリーブ油、パーム核油、ヤシ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマワリ油、グレープシード油、クルミ油、小麦胚芽油、ココナッツ油もしくは中鎖トリグリセリド油のうちの少なくとも１種である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［１７］前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも３種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が甘味剤であり、少なくとも１種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［１８］前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも３種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が未精製甘味剤であり、少なくとも１種の炭素源が中鎖トリグリセリド含有油である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［１９］前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも４種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも２種の炭素源が中鎖または長鎖トリグリセリド含有油であり、少なくとも２種の炭素源が甘味剤である、前記［１］または［８］に記載の方法。
［２０］前記ラムノリピド産生微生物が、少なくとも４種の炭素源を含む培養培地中で培養され、少なくとも１種の炭素源が中鎖トリグリセリド含有油であり、１種の炭素源が長鎖トリグリセリド含有油であり、少なくとも２種の炭素源が未精製甘味剤である、前記［１］または［８］に記載の方法。