【手続補正書】
【提出日】令和3年1月14日(2021.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テルペンまたはテルペノイド産物の生産方法であって、
上流のメチルエリスリトールリン酸経路（ＭＥＰ経路）を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を生産し、かつ、下流合成経路を介してＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換する細菌株を提供することであって、
１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸（ＨＭＢＰＰ）中間体への炭素フラックスの増加をもたらすようにＩｓｐＧ活性とＩｓｐＨ活性のバランスを調整すると同時に、ＭＥＰ経路のフラックス及びテルペンまたはテルペノイドの生産性をフィードバック及び低減する量でのＨＭＢＰＰの蓄積を防止するように、前記細菌株でＩｓｐＧ及びＩｓｐＨを過剰発現させ、前記株は場合により、前記ＭＥＰ経路を介した電子の供給及び／または伝達、及び／またはテルペンもしくはテルペノイド産物への電子の供給及び／または伝達を増強する１つ以上の遺伝子改変を含む前記細菌株を提供することと、前記テルペンまたはテルペノイド産物を生産する前記細菌株を培養することとを含む、前記方法。
【請求項２】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．から選択される細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌株がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨが、組換えｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子を前記細菌株に導入することによって過剰発現される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記組換えＩｓｐＨの活性及び／または発現が、前記組換えＩｓｐＧの活性及び／または発現よりも高い、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記組換えＩｓｐＨの前記発現が、前記組換えＩｓｐＧの前記発現よりも高い、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組換えＩｓｐＨ及びＩｓｐＧが、オペロンから発現し、前記オペロン内で前記ＩｓｐＧ遺伝子の前にＩｓｐＨ遺伝子が位置する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組換えＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の発現が、前記ｉｓｐＧ及び／またはｉｓｐＨの組換え遺伝子の前記プロモーター強度、遺伝子コピー数、及び／またはリボソーム結合部位配列を変更することによってバランスが調整される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記組換えｉｓｐＧ及びｉｓｐＨ遺伝子を含まない親株の場合よりも実質的に多くＨＭＢＰＰが細胞に蓄積されることがない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えｉｄｉ遺伝子の発現または活性が、テルペンまたはテルペノイドの生産量が増加するように調整される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌株が、前記ＭＥＰ経路を介した電子の供給及び／または伝達、及び／またはテルペンもしくはテルペノイド産物への電子の供給及び／または伝達を増強し、場合によりピルビン酸を酸化する及び／またはフェレドキシンを還元する１つ以上の遺伝子改変を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌株がオキシドレダクターゼの過剰発現を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記オキシドレダクターゼがピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＦＯＲがＹｄｂＫである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌株が組換えＹｄｂＫ遺伝子を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記株が、テルペノイド化合物を生産するための１つ以上のＰ４５０酵素を含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
フラボドキシン、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン、及びフェレドキシンレダクターゼのうちの１つ以上の過剰発現をさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
Ｄｘｒ、Ｄｘｓ、ＩｓｐＤ、ＩｓｐＥ、及びＩｓｐＦの発現または活性に対する、前記ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨの発現または活性のバランスを調整し、培養物中のＭＥｃＰＰ代謝産物を減少させる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記細菌株が、ＰＤＨを介在したピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換を低減または排除する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細菌株が変異型ａｃｅＥを発現し、前記変異がＧ２６７Ｃである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細菌株がａｃｅＥの欠失または不活性化を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌株が、１つ以上の非天然のｆｄｘ及び／またはｆｌｄＡホモログを過剰発現する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｆｄｘホモログが、Ｈｍ．ｆｄｘ１（Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｄｅｓｔｉｃａｌｄｕｍ）、Ｐａ．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｃｖ．ｆｄｘ（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｖｉｎｏｓｕｍ）、Ｃａ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃｐ．ｆｄｘ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、Ｅｖ２．ｆｄｘ（Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａ  ｓｈａｐｏｓｈｎｉｋｏｖｉｉ）、Ｐｐ１．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、及びＰｐ２．ｆｄｘ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、または前記のいずれかの誘導体から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｆｌｄＡホモログが、Ａｃ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）、Ａｖ．ｆｌｄＡ２（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、及びＢｓ．ｆｌｄＡ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはその誘導体から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記テルペンまたはテルペノイド産物が、ファルネセン、アモルファジエン、アルテミシン酸、アルテミシニン、ビサボロール、ビサボレン、アルファ−シネンサール、ベータ−ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ゲラニオール、リモネン、メントール、メントン、ミルセン、ヌートカトン、ヌートカトール、パチョリ、ピペリトン、ローズオキシド、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド（レバウジオシドＤまたはレバウジオシドＭを含む）、タキサジエン、チモール、及びバレンセンから選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
培養段階が、細菌バイオマスが生成される第１段階と、それに続くテルペンまたはテルペノイド生産段階とを含む流加法である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養物が少なくとも約１００Ｌである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養物が微好気条件下に維持される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記テルペンまたはテルペノイド産物を回収することをさらに含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
工業製品または消費者製品を製造する方法であって、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法に従って生産された前記テルペンまたはテルペノイドを前記工業製品または消費者製品に組み込むことを含む、前記方法。
【請求項３１】
前記工業製品または消費者製品が、香味製品、芳香製品、甘味剤、化粧品、洗浄製品、洗剤もしくは石鹸、または害虫駆除製品である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記工業製品または消費者製品が、食品、飲料、食感改良剤、医薬品、タバコ製品、栄養補助食品、口腔衛生製品、または化粧品である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌株または細胞が、ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）のうちの１つ以上を過剰発現する、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）前駆体からの産物の生産量を増加させる１つ以上の遺伝子改変を有する細菌株であって、前記細菌株が、ＭＥＰ経路を介してイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を産生し、かつ前記ＭＥＰ経路が１つ以上の過剰発現遺伝子を含み、前記株は、下流合成経路を介して前記ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰをテルペンまたはテルペノイド産物に変換し、前記遺伝子改変が、
（ａ）ＨＭＢＰＰ中間体の蓄積を防止するようにＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の発現または活性のバランスを調整する、前記ＩｓｐＧ及びＩｓｐＨ酵素の組換えまたは改変、
（ｂ）前記ＭＥＰ経路を介した電子の供給及び／または伝達、及び／またはテルペンもしくはテルペノイド産物への電子の供給及び／または伝達を増強する酵素をコードする遺伝子の組換えまたは改変であって、場合によりＹｄｂＫ遺伝子の過剰発現及び場合により非天然ｆｄｘ及び／またはｆｌｄＡホモログによる過剰発現である、前記遺伝子の組換えまたは改変、
（ｃ）ａｃｅＥまたはａｃｅＥ酵素複合体の不活性化もしくは欠失、または発現もしくは活性の低減、ならびに場合により
（ｄ）テルペンまたはテルペノイド生産量を高めるように活性を調整する、ｉｄｉ遺伝子の組換えまたは改変を含む、前記細菌株。
【請求項３５】
前記細菌株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．、及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．から選択される細菌である、請求項３４に記載の細菌株。
【請求項３６】
前記細菌株がＥ．ｃｏｌｉである、請求項３５に記載の細菌株。
【請求項３７】
前記細菌株が、場合によりオペロンとして発現される、組換え遺伝子としてｄｘｓ、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、及びｉｄｉを発現する、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項３８】
前記組換えＩｓｐＨの発現が、前記組換えＩｓｐＧの発現よりも高い、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項３９】
前記組換えｉｓｐＨ及びｉｓｐＧが、オペロンとして発現し、前記オペロン内でｉｓｐＨがｉｓｐＧの前に位置する、請求項３８に記載の細菌株。
【請求項４０】
組換えｉｄｉ遺伝子の発現または活性が、前記プロモーター強度、遺伝子コピー数、オペロン内の位置、またはリボソーム結合部位を場合により変更することにより、テルペンまたはテルペノイド生産量を増加させるように調整されている、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項４１】
前記細菌株がオキシドレダクターゼの過剰発現を含む、請求項３４〜４０のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項４２】
前記オキシドレダクターゼがピルビン酸：フラボドキシンオキシドレダクターゼ（ＰＦＯＲ）である、請求項４１に記載の細菌株。
【請求項４３】
前記ＰＦＯＲがＹｄｂＫである、請求項４２に記載の細菌株。
【請求項４４】
前記株が、ピルビン酸を酸化する及び／またはフェレドキシンを還元する酵素を含み、場合により組換えＹｄｂＫ遺伝子であり、場合により前記染色体に組み込まれるか、またはプラスミドから発現される、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項４５】
前記株が、前記テルペノイド化合物の生産のための１つ以上のＰ４５０酵素を含む、請求項４４に記載の細菌株。
【請求項４６】
フラボドキシン、フラボドキシンレダクターゼ、フェレドキシン、及びフェレドキシンレダクターゼのうちの１つ以上の過剰発現をさらに含む、請求項４４または４５に記載の細菌株。
【請求項４７】
前記細菌株が、ＰＤＨを介在したピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの変換を低減または排除する、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項４８】
前記細菌株が変異型ａｃｅＥを発現し、前記変異がＧ２６７Ｃである、請求項４７に記載の細菌株。
【請求項４９】
前記細菌株がａｃｅＥの欠失または不活性化を有する、請求項４８に記載の細菌株。
【請求項５０】
前記細菌株が、１つ以上の非天然のｆｄｘ及び／またはｆｌｄＡホモログを過剰発現する、請求項３４〜４９のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項５１】
前記テルペンまたはテルペノイド産物が、ファルネセン、アモルファジエン、アルテミシン酸、アルテミシニン、ビサボロール、ビサボレン、アルファ−シネンサール、ベータ−ツジョン、カンファー、カルベオール、カルボン、シネオール、シトラール、シトロネラール、クベボール、ゲラニオール、リモネン、メントール、メントン、ミルセン、ヌートカトン、ヌートカトール、パチョリ、ピペリトン、ローズオキシド、サビネン、ステビオール、ステビオールグリコシド（レバウジオシドＤまたはレバウジオシドＭを含む）、タキサジエン、チモール、及びバレンセンから選択される少なくとも１つの化合物を含む、請求項３４〜５０のいずれか１項に記載の細菌株。
【請求項５２】
前記細菌株が、ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰＳ）、ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰＳ）、及びゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）のうちの１つ以上を過剰発現する、請求項３４〜５１のいずれか１項に記載の細菌株。