【手続補正書】
【提出日】平成17年2月9日(2005.2.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ遺伝子群のクラスII型におけるＤＲＢ１*の遺伝子型を同定することによりう蝕のリスクを検査することを特徴とするう蝕リスク検査方法。
【請求項２】
ＨＬＡ遺伝子群のクラスII型におけるＤＲＢ１*の遺伝子型を同定し、予め確認してある、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを抗原とした場合に該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価の大小から導き出されたう蝕リスクの高低と比較する請求項１に記載のう蝕リスク検査方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
ミュータンス連鎖球菌の一種であるS.mutansの菌体表層物質の中で、分子量約１９万のPAc（Protein Antigen serotype C）と呼ばれるタンパク質抗原がミュータンス連鎖球菌の歯面への初期付着に関連があることがそれを抗原としたモノクローナル抗体を利用した研究から確認された。そして、PAcの中で純粋にミュータンス連鎖球菌の歯面への初期付着に関連がある部分を特定する研究が進められ、Takahashi I. et al.“Immunogenicity and protective effect against oral colonization by Streptococcus mutans of synthetic peptides of a streptococcal surface protein antigen”,J．Immunol, (USA), 1991, 146, p.332-6や、Takahashi I. Infect Immun (USA), Baltimore Md. American Associaton of Immunologists, 1992, 60, p.623-629や、Okahashi N. et al. Mol. Microbiol. (USA), Blackwell Scienctific Publications, 1993, 3, p.221-228などにより、PAc中のα螺旋構造を持つＡ領域（アミノ酸配列：216-464の部分）がS.mutansよる歯面上のコロニー化と接着に強い影響があることが確認され、更に進んでこのPAcのＡ領域の中でより重要な配列が何であるかに関してを本発明者の一人である泉福等が解明したのである（例えば、非特許文献１参照）。その後、PAcのＡ領域の中で抗原としてヒトの免疫系に強く作用する配列は、Y---L--Y（ヒトのＢ細胞エピトープ）、及びL--V-K--A（ヒトの様々なHLA-DR分子と反応する部位）であることが確認され（例えば、非特許文献２，３参照）、この結果から、PAcの以下の特定アミノ酸配列〔ＮＡＫＡＴＹＥＡＡＬＫＱＹＥＡＤＬＡＡＶＫＫＡＮＡＡ（PAc（361-386））が導き出された。その詳細は配列表の配列番号１に示す通りである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
その結果、本発明者等は配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを抗原とし、ミュータンス連鎖球菌の歯面への付着を防ぐ機能となっている口腔粘膜から分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａ（ｓＩｇＡ）の抗体価を測定すれば、う触リスクの検査が正確に行えることを究明した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
しかし、唾液に分泌される配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクに対する分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価を測定することは、免疫機能が完成されていない６歳程度までの乳幼児では検査することができず、また個人の唾液の分泌量の違いから唾液の量が多いヒトと少ないヒトでは測定する分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価を正確に反映することができなかった。更に、唾液分泌量が極度に少ない口腔乾燥症の患者や唾液の分泌が衰えた老人等にも対応できない欠点があった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
前述の配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクに対する抗体を分泌させる機構は、もちろん免疫系遺伝子に関連しているため、唾液中に分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価の違いはヒトの分泌型免疫グロブリン抗体Ａの分泌に関連する特定の遺伝子型により決定されている。従って、個人の遺伝子型を特定することによるう蝕のリスク検査は可能であり、う蝕のリスクの高低、つまりは唾液中に分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価の大小によるヒトの遺伝子型を予め特定しておけば、遺伝子を同定するだけで全てのヒトを対象可能なう蝕リスク検査方法とすることが可能であることを究明して本発明を完成したのである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【発明の実施の形態】
即ち本発明は、ＨＬＡ遺伝子群のクラスII型におけるＤＲ座のＤＲＢ１*の遺伝子型を同定することによりう蝕のリスクを検査することを特徴とするう蝕リスク検査方法であり、より詳しくはＨＬＡ遺伝子群のクラスII型におけるＤＲＢ１*の遺伝子型を同定し、予め確認してある、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを抗原とした場合に該抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価の大小から導き出されたう蝕リスクの高低と比較するう蝕リスク検査方法である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明に係るう蝕リスク検査方法は、先ず被験者の細胞を採取し、そのＤＮＡを抽出して第６染色体短腕上のＨＬＡ遺伝子群を特定する。特定されたＨＬＡ遺伝子群と予め調査により作製された配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクに対する唾液中に分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価の高かった（又は低かった）ＨＬＡ遺伝子群との比較によりう蝕リスクを評価するのである。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
特定されたＨＬＡ遺伝子群と予め調査により作製された配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクに対する唾液中に分泌される分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価の高かった（又は低かった）ＨＬＡ遺伝子群との比較によりう蝕リスクを評価する。例えば、現在確認されている遺伝子型において、う蝕リスクが高い、即ち、分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価が低い遺伝子型としては、DRB1*0101、DRB1*0405、DRB1*0803、DRB1*1302、DRB1*1502、DRB1*0410を二量体の一方に持つ場合が、またう蝕リスクが低い、即ち、分泌型免疫グロブリン抗体Ａの抗体価が高い遺伝子型としては、DRB1*0403、DRB1*0406、DRB1*0401、DRB1*0802、DRB1*0901、DRB1*1202、DRB1*1401、DRB1*1405、DRB1*1501、DRB1*1602を二量体の一方に持つ場合が確認されている。なお、今後の研究によって全ての二量体の組合せが解明されれば、より正確な評価で行うことができるようになる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
本発明に利用する配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを得るためには、このアミノ酸配列を得ることができる手法であれば特に限定されないが、一般的にはアミノ酸シンセサイザーを用いるのが便利である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
＜ＥＬＩＳＡによる唾液分泌抗体の測定＞
（１）抗原としての合成タンパクの合成
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを持つペプチドをステップワイスの固相ペプチド合成法から得た。合成器には、Model 350 Multiple Peptide Synthesizer（製品名：Advanced Chemitech，Louisville社製）を使用し、TSK-GELカラム（30×１）を用いた逆相の高速液体クロマトグラフィー法（10〜45％アセトニトリルをカラムとし、グラジエントに0.1％TFAを使用）にて合成ペプチドの確認を行った。最終精製度は95％以上であった。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
（２）唾液分泌抗体の測定
Ａ）抗体の固相化
前記の方法で合成した合成タンパクを５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９.６）で希釈し、９６穴マイクロプレート（Sumitomo Bakelite社製）の各ｗｅｌｌに１００μＬになるように添加した。これを４℃で一晩静置しPAc（361−386）とｗｅｌｌとを結合させた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
Ｃ）唾液の調整
パラフィンワックスを３分間噛むことにより分泌される刺激唾液を検体とした。唾液検体は回収後、測定開始まで氷中保存した。実験には、唾液を０.５％スキムミルク含有ＰＢＳで２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４倍に希釈したものを作製し、上記のプレートに各１００μＬ添加した。添加後、３７℃で１時間静置した後、ＰＢＳＴで洗浄した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
Ｄ）標識抗体
アルカリフォスファターゼ標識された抗ヒトＩｇＡ抗体（商品名：Anti-Human-IgA，Chemicon International社製）を０.５重量％スキムミルク含有ＰＢＳにて０.３μg/ｍＬに調整し、各ｗｅｌｌに１００μＬ添加し、１時間３７℃で反応させた。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
５人の被験者（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）の唾液中の免疫グロブリンＡの前記合成タンパクに対する抗体価をＥＬＩＳＡで計測し、その結果を図１に示した。その結果、抗体価が高いグループ（この場合はＡ，Ｃ，Ｅ）と低いグループ（この場合はＢ，Ｄ）の２つのグループに分けた。なお、口腔内の実際のミュータンス連鎖球菌の量と抗体価の高低によるグループ間においてう触リスク検査方法の精度は確認されている。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
前述の被験者（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）の口腔粘膜細胞から前述の方法により各人のＨＬＡ−ＤＲＢ１*遺伝子型を同定し、唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの前記合成タンパクに対する抗体価との関係を確認しておく。その結果を表１に示す。このような条件の設定により予め複数の被験者をサンプルとして前述の抗体価が高いグループ（Ａ，Ｃ，Ｅ）と低いグループ（Ｂ，Ｄ）の２つのグループにそれぞれに対応する遺伝子型を確認しておく。なお、ＨＬＡ−ＤＲＢ１*遺伝子型と抗体価に相関があることは確認されている。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
実際のう蝕リスクの検査方法は、前述のように予め確認してある配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクを抗原とした場合にその抗原に対するヒトの唾液中の分泌型免疫グロブリンＡの抗体価の大小から導き出されたう蝕リスクの高低に関する遺伝子型と、被験者から同定された遺伝子型を比較しう蝕リスクを導き出すのである。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
５人の被験者（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ）の唾液中の免疫グロブリンＡの配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列から成る合成タンパクに対する抗体価をＥＬＩＳＡで計測した結果を示す図である。