(57)【要約】【課題】腸管免疫調節作用を有する乳酸菌の新規株を提供する。【解決手段】腸管免疫調節作用を有するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌は、例えばマンニトールを唯一の炭素源とする培地を用いて山廃酒母から分離される。特に、ラクトコッカス・ラクティスＫＬＢ−Ｍ８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６０３）は、腸管のパイエル板細胞からのＩｇＡ抗体分泌を促進させる作用が強く、高い腸管免疫賦活活性を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
山廃酒母から分離した、腸管免疫調節作用を有するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌。
【請求項２】
マンニトールを唯一の炭素源とする培地を用いて山廃酒母から単離した請求項１に記載の乳酸菌。
【請求項３】
ラクトコッカス・ラクティスＫＬＢ−Ｍ８株（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−６０３）である乳酸菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腸管免疫を賦活させる作用を有するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌の新規株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの腸管は、摂取した食物を消化・吸収する器官であると同時に、有害な細菌や病原菌、ウイルスなどが経口的に体内へ侵入するのを防ぐ免疫組織である。腸管で誘導される主要な免疫応答の１つが、免疫グロブリンの一種であるイムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）抗体の分泌である。ＩｇＡ抗体は、病原菌の腸管粘膜からの侵入阻止、毒素の中和、アレルゲンの侵入阻止などに働き、その分泌増加は、腸管免疫の賦活化を意味する。腸管におけるＩｇＡ抗体産生で重要な役割を果たす組織の１つがパイエル板である。また、ＩｇＡ抗体の分泌を促進する細胞間伝達物質（サイトカイン）として、インターロイキン（ＩＬ）−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０が知られている。
【０００３】
特に乳酸菌は、プロバイオティクス即ち「腸管フローラを改善することによって、宿主に有益な作用をもたらす生きた微生物」として、その整腸作用や免疫賦活作用が注目されている。例えば、パイエル板細胞におけるＩｇＡ産生を強力に誘導できるビフィズス菌の菌株及びそれを含有する免疫賦活用組成物が知られている（特許文献１を参照）。また、しば漬けに生息する植物性乳酸菌の中から、免疫調節作用を有するラクトバチルス・ペントーサスに属する新規株が分離されている（特許文献２を参照）。更に、すんき漬などから分離した、植物由来のラクトバチルス属に属する乳酸菌、植物由来のロイコノストック属に属する乳酸菌、及び植物由来のペディオコッカス属に属する乳酸菌のうち少なくとも１以上の乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物を有効成分とする腸管免疫活性化剤が知られている（特許文献３を参照）。これら乳酸菌の生菌、死菌又はその菌体処理物は、動物由来の動物性乳酸菌に比べて十分な腸管免疫活性化作用やパイエル板細胞のＩｇＡ抗体産生促進作用を有することが認められた。
【０００４】
【特許文献１】再表２００６−８７９１３号公報
【特許文献２】特開２００５−３３３９１９号公報
【特許文献３】特開２００７−３０８４１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
清酒醸造に使用する生もと系の山廃酒母には、清酒酵母以外に、硝酸還元菌や乳酸菌、その他様々な微生物の変遷が見られる。山廃酒母に生息する乳酸菌は、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc
mesenteroides）とラクトバチルス・サケ（Lactobacillus sake）の２種類がよく知られている。しかしながら、山廃酒母の詳細な乳酸菌叢は、少なくとも本願発明者らが知る限り、今日まで十分に明らかにされていない。山廃酒母から分離した乳酸菌の機能、効能についても、十分な研究がなされていない。
【０００６】
そこで、本発明の目的は、山廃酒母から分離される乳酸菌の中から、腸管免疫の調節作用などの有用な生理活性を有する菌株を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、山廃酒母から１３２株の乳酸菌を分離し、それらの腸管免疫調節作用を研究した。その結果、これら乳酸菌の中から、ラクトコッカス・ラクティスに属する菌株などに高い腸管免疫賦活作用があることを見出し、本発明に至ったものである。
【０００８】
本発明によれば、山廃酒母から分離した、腸管免疫調節作用を有するラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）に属する乳酸菌が提供される。
【０００９】
本発明のラクトコッカス・ラクティスに属する乳酸菌は、腸管のパイエル板細胞からのＩｇＡ抗体分泌を促進させる作用を有する。従って、本乳酸菌を生菌、死菌又は菌体処理物などのいかなる形態でも経口的に摂取すれば、腸管免疫を活性化させることができ、それにより、生体に悪影響を及ぼし得る病原菌などの体内への侵入を抑制し、様々な疾病予防にも寄与するという効果が得られる。
【００１０】
本発明の乳酸菌は、マンニトールを唯一の炭素源とする培地を用いることによって、山廃酒母から効果的に単離することができる。
【００１１】
より具体的に、本発明の乳酸菌は、独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６０３で寄託された、ラクトコッカス・ラクティスＫＬＢ−Ｍ８株である。このラクトコッカス・ラクティスＫＬＢ−Ｍ８株は、高い腸管免疫賦活活性を有するので好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下に、添付図面を参照しつつ、本発明の好適な実施例を詳細に説明する。
【００１３】
本発明の乳酸菌は、清酒醸造に用いる山廃酒母に生息する乳酸菌から所望の菌株を分離することによって得られる。清酒醸造における仕込み８日目頃又は１４日目頃の山廃酒母は、特に乳酸菌が増殖しているので好ましい。乳酸菌株の分離は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、山廃酒母を乳酸菌分離用寒天培地に添加して培養し、コロニーを形成したものを選択する。
【００１４】
乳酸菌単離用の培地には、乳酸菌検出用の中川培地、マンニトール又はソルビトールを唯一の炭素源とする乳酸菌分離用培地（ＭＲＳ培地）を使用することができる。特に高い腸管免疫賦活活性を有するラクトコッカス・ラクティスに属する乳酸菌は、マンニトールを唯一の炭素源とするＭＲＳ培地を用いることによって、より選択的に分離される。
【００１５】
分離した乳酸菌の種類は、１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を解析することによって同定される。中川培地で単離したものには、ロイコノストック・シトレウム（Leuconostoc
citreum）、ラクトバチルス・サケが含まれていた。マンニトールを唯一の炭素源とするＭＲＳ培地から単離したものには、ラクトコッカス・ラクティスが含まれていた。ソルビトールを唯一の炭素源とするＭＲＳ培地には、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus
plantarum）が含まれていた。これら乳酸菌の中でラクトバチルス・サケ以外のものは、これまで山廃酒母からの検出が報告されていなかったものである。
【００１６】
本発明の乳酸菌は、腸管のパイエル板細胞からのＩｇＡ抗体分泌を促進させることにより、腸管免疫を調節する作用を有する。その中で特に高い腸管免疫賦活活性を有するものは、ラクトコッカス・ラクティスＫＬＢ−Ｍ８株であり、上述したようにマンニトールを唯一の炭素源とするＭＲＳ培地を用いて山廃酒母から分離される。この菌株は、独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−６０３で寄託されている。
【００１７】
これら本発明の乳酸菌は、生菌、死菌、又は有機溶媒などで抽出したような菌体処理物のいずれかの形態であっても良い。本発明の乳酸菌をいかなる形態でも経口的に摂取することによって、腸管免疫を活性化させることができる。これにより、生体に悪影響を及ぼし得る病原菌やウィルスなどが体内へ侵入するのを抑制し、様々な疾病予防にも寄与するという効果が得られる。
【実施例】
【００１８】
（実施例１）
清酒醸造用の山廃酒母から上述した方法を用いて分離した１３２種の乳酸菌について、マウスのパイエル板細胞からのＩｇＡ抗体の分泌を促進させる菌株を、以下のin
vitro試験により探索した。分離した前記１３２株の乳酸菌は、ＭＲＳ培地で１日培養した後、集菌し、生理食塩水で洗浄し、ホルムアルデヒドを加えて一晩３０℃でインキュベートし、更に生理食塩水で洗浄して、試験に供した。
【００１９】
６週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスの解剖を行い、小腸のパイエル板を摘出した。パイエル板内の免疫担当細胞を抽出し、１×１０６個の細胞を９６穴プレートに播きこんだ。そこに、上述したようにホルムアルデヒド処理した前記１３２株の乳酸菌の死菌体を１×１０８cells／mlとなるように添加し、１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）を含むＲＰＭＩ（Roswell
Park Memorial Institute）培地で培養した。
【００２０】
培養開始から７２時間後、培養上清を回収した。前記培養上清中にパイエル板細胞から分泌されたＩｇＡ抗体、ＩＬ（インターロイキン）−５、ＩＬ−６をＥＬＩＳＡ法で測定した。対照として、前記乳酸菌を添加しないもの（control）と、ＬＰＳ（リポポリサッカライド）を０．２５ｍｇ／ｍｌとなるように添加したもの（ＬＰＳ）とについても、同様の測定を行った。前記１３２株の中から比較的高い免疫賦活活性を示す乳酸菌（Ｍ１〜Ｍ１５）について、それらの結果を前記対照と共に図１〜図３に示す。
【００２１】
図１に示すように、乳酸菌を添加しない対照（control）と比べてＩｇＡ抗体の濃度を有意に（約１．４倍）増加させた菌株は、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ１５であった。また、有意とまで言えないが、Ｍ１、Ｍ９、Ｍ１０、Ｍ１１、Ｍ１２の菌株も、ＩｇＡ抗体の分泌を増加させる傾向があった。
【００２２】
次に、ＩｇＡ抗体の分泌誘導機構を調べるために、ＩｇＡ抗体の誘導物質であるＩＬ−５とＩＬ−６とを、上述したように各菌株Ｍ１〜Ｍ１５及び両対照についてＥＬＩＳＡ法で測定した。図２は、ＩＬ−５分泌量の測定結果を示している。同図に示すように、ＩＬ−５は、ＬＰＳの添加によって対照（control）の１２倍以上に増加した。ところが、Ｍ１〜Ｍ１５の中に、その添加によって対照（control）から有意に増加した菌株は無かった。しかしながら、Ｍ７、Ｍ８、Ｍ９株はＩＬ−５を増加させる傾向を示した。
【００２３】
図３は、ＩＬ−６分泌量の測定結果を示している。同図に示すように、ＩＬ−６は、ＬＰＳ及びすべての菌株Ｍ１〜Ｍ１５の添加によって対照（control）から増加した。特にＭ８株は、その添加によるＩＬ−６の分泌促進が顕著であった。Ｍ８株は、ＩｇＡ抗体分泌量及びＩＬ−５分泌量の増加においても高い値を示しており、特に腸管免疫の賦活に有用な菌株と判断される。
【００２４】
本実施例の結果から、山廃酒母から分離した乳酸菌の中に、腸管免疫を司るパイエル板細胞からのＩｇＡ抗体の分泌を促進させることにより腸管免疫賦活作用を示す菌株が含まれることは明らかである。そのような菌株では、図１〜図３を対比すると、ＩｇＡ抗体の分泌量とＩＬ−５、ＩＬ−６の分泌量との間に高い相関性が認められる。これから、乳酸菌によるパイエル板細胞からのＩＬ−５、ＩＬ−６の分泌増加がＩｇＡ抗体の分泌を促進するという、免疫賦活の作用機構も明らかとなった。
【００２５】
（実施例２）
実施例１において特に高い免疫賦活活性を示したＭ８株を用いて、以下のin vivo試験を行った。このＭ８株が、上述したように独立行政法人産業技術総合研究所・特許生物寄託センターに寄託したラクトコッカス・ラクティスＫＬＢ−Ｍ８株（以下、ＫＬＢ−Ｍ８株と称す）である。
【００２６】
５週齢のオスＢＡＬＢ／ｃマウスを無作為に４匹ずつ対照群と乳酸菌摂取群との２群に分け、１週間予備飼育した。予備飼育期間中、前記両群のマウスには、標準的なラボダイエットと飲用水とを自由に摂取させた。その後、対照群には、２％スキムミルクを含む飲用水を自由に摂取させた。乳酸菌摂取群には、２％スキムミルクを含む飲用水にＫＬＢ−Ｍ８株の加熱死菌体を１×１０８cells／mlとなるように加えたものを自由に摂取させた。尚、ラボダイエットは、予備飼育後の試験期間中も引き続き、乳酸菌摂取群と対照群共に同様に自由に摂取させた。
【００２７】
乳酸菌を与え始めてから７日後に、前記両群のマウスを解剖した。各個体毎に小腸のパイエル板を摘出し、パイエル板内の免疫担当細胞を抽出した。この細胞を、それぞれＬＰＳを０，１，５，２０μｇ／ml添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（１０％ＦＢＳ含有）で７２時間培養し、培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡ法を用いて、培養上清中にパイエル板細胞から分泌されたＩｇＡ抗体量を測定した。その結果を図４に、ＬＰＳ濃度毎に棒グラフで示す。
【００２８】
同図に示すように、乳酸菌摂取群のＩｇＡ抗体量は、特にＬＰＳ濃度が０または１μｇ／mlの場合、対照群の１．３倍以上であった。本実施例では、全体として、乳酸菌摂取群のＩｇＡ抗体量と対照群のそれとの間に、有意と言える程度の差は認められなかった。しかしながら、いずれのＬＰＳ濃度でも、乳酸菌摂取群のＩｇＡ抗体量が対照群を上回った。
【００２９】
本実施例の結果から、ＫＬＢ−Ｍ８株の摂取によって、小腸のパイエル板免疫担当細胞が刺激され、ＩｇＡ抗体を産生しやすい状態へ穏やかに変化したと言うことができる。このようにＩｇＡ抗体産生能力が増加したということは、腸管免疫の賦活化を表している。従って、山廃酒母由来の乳酸菌ラクトコッカス・ラクティスＫＬＢ−Ｍ８株は、in
vivo刺激に対しても、その腸管免疫賦活作用が証明された。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】パイエル板免疫担当細胞に乳酸菌Ｍ１〜Ｍ１５株の死菌体を添加して培養した培養上清中のＩｇＡ抗体分泌量を対照と共に示す線図である。
【図２】図１と同じ培養上清中のＩＬ−５分泌量を対照と共に示す線図である。
【図３】図１と同じ培養上清中のＩＬ−６分泌量を対照と共に示す線図である。
【図４】本発明の乳酸菌を含む飲料を７日間摂取させたマウスのパイエル板免疫担当細胞の、ＬＰＳ存在下または非存在下でのＩｇＡ抗体生産性を、本発明の乳酸菌を摂取していないマウスと対照して、それぞれ平均値を棒グラフで、最大値−最小値の幅を棒グラフ上に上下の「ひげ」を結ぶ線分で示す線図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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