【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年3月26日(2021.3.26)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３つのアンビセンスなゲノムセグメントであって、
第１のゲノムセグメントは、Ｚタンパク質をコードするコード領域及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするコード領域を含み、
第２のゲノムセグメントは、核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域及び第１の制限酵素部位を含み、かつ
第３のゲノムセグメントは、糖タンパク質をコードするコード領域及び第２の制限酵素部位を含む、
前記ゲノムセグメント
を含む遺伝子組み換えされたピチンデウイルス。
【請求項２】
前記第２のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、前記第１の制限酵素部位は、前記複数のクローニング部位の一部である、請求項１に記載のウイルス。
【請求項３】
前記第３のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、前記第２の制限酵素部位は前記複数のクローニング部位の一部である、請求項１に記載のウイルス。
【請求項４】
前記第２のゲノムセグメントは、前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパク質をコードするコード領域を更に含む、請求項１に記載のウイルス。
【請求項５】
前記第３のゲノムセグメントは、前記第２の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含む、請求項１に記載のウイルス。
【請求項６】
前記第２のゲノムセグメントは前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパク質をコードするコード領域を更に含み、かつ、前記第３のゲノムセグメントは前記第２の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含む、請求項１に記載のウイルス。
【請求項７】
前記第１及び前記第２のタンパク質は、抗原及び検出可能なマーカーから選択される、請求項４、５、または６に記載のウイルス。
【請求項８】
前記抗原は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、または真核細胞病原体により発現されるタンパク質である、請求項７に記載のウイルス。
【請求項９】
前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質は異なっている、請求項６に記載のウイルス。
【請求項１０】
前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質は同一である、請求項６に記載のウイルス。
【請求項１１】
前記核タンパク質は、前記核タンパク質のエキソリボヌクレアーゼ活性を低下させる少なくとも１つの変異を含み、前記変異は、配列番号３のアミノ酸３８０におけるアスパラギン酸、配列番号３のアミノ酸３８２におけるグルタミン酸、配列番号３のアミノ酸５２５におけるアスパラギン酸、配列番号３のアミノ酸５２０におけるヒスチジン、及び配列番号３のアミノ酸４５７におけるアスパラギン酸から選択され、前記アスパラギン酸、グルタミン酸、またはヒスチジンは、アラニンで置換されている、請求項１に記載のウイルス。
【請求項１２】
請求項１に記載の３つのゲノムセグメントを含む感染性ウイルス粒子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の単離した感染性ウイルス粒子を含む組成物。
【請求項１４】
Ｚタンパク質をコードするコード領域及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするコード領域を含む第１のゲノムセグメントをコードする第１のベクターであって、前記第１のゲノムセグメントはアンチゲノム性である、前記第１のベクター、
核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域及び第１の制限酵素部位を含む第２のゲノムセグメントをコードする第２のベクターであって、前記第２のゲノムセグメントはアンチゲノム性である、前記第２のベクター、ならびに
糖タンパク質をコードするコード領域及び第２の制限酵素部位を含む第３のゲノムセグメントをコードする第３のベクターであって、前記第３のゲノムセグメントはアンチゲノム性である、前記第３のベクター
を含む、
ベクターの集合体。
【請求項１５】
前記ベクターはプラスミドである、請求項１４に記載の集合体。
【請求項１６】
前記プラスミドはＴ７プロモーターを更に含む、請求項１４に記載の集合体。
【請求項１７】
前記第２のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、前記第１の制限酵素部位は前記複数のクローニング部位の一部である、請求項１４に記載の集合体。
【請求項１８】
前記第３のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、前記第２の制限酵素部位は前記複数のクローニング部位の一部である、請求項１４に記載の集合体。
【請求項１９】
前記第２のゲノムセグメントは、前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパク質をコードするコード領域を更に含む、請求項１４に記載の集合体。
【請求項２０】
前記第３のゲノムセグメントは、前記第２の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含む、請求項１４に記載の集合体。
【請求項２１】
前記第２のゲノムセグメントは前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパク質をコードするコード領域を更に含み、かつ、前記第３のゲノムセグメントは前記第２の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含む、請求項１４に記載の集合体。
【請求項２２】
前記第１及び前記第２のタンパク質は、抗原及び検出可能なマーカーから選択される、請求項１９、２０、または２１に記載の集合体。
【請求項２３】
前記抗原は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、もしくは真核細胞病原体により発現したタンパク質、またはその断片である、請求項２２に記載の集合体。
【請求項２４】
前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質は異なっている、請求項２１に記載の集合体。
【請求項２５】
前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質は同一である、請求項２１に記載の集合体。
【請求項２６】
請求項１４に記載のベクターの集合物を細胞内に導入すること、ならびに
前記細胞を、発現に好適な条件下にて培地内でインキュベーションすること及び前記第１、第２、及び第３のゲノムセグメントをパッケージングすること
を含む、遺伝子組み換えされたピチンデウイルスの作製方法。
【請求項２７】
前記培地から感染性ウイルス粒子を単離することを更に含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞はＴ７ポリメラーゼを発現する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
３つのベクターを含む遺伝子組み換えされたピチンデウイルスを作製するためのリバースジェネティクス系であって、
第１のベクターは、Ｚタンパク質をコードするコード領域及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするコード領域を含む第１のゲノムセグメントをコードし、前記第１のゲノムセグメントはアンチゲノム性である、前記第１のベクター
第２のベクターは、核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域及び第１の制限酵素部位を含む第２のゲノムセグメントをコードし、前記第２のゲノムセグメントはアンチゲノム性である、前記第２のベクター
第３のベクターは、糖タンパク質をコードするコード領域及び第２の制限酵素部位を含む第３のゲノムセグメントをコードし、前記第３のゲノムセグメントはアンチゲノム性である、前記第３のベクター
を含む、
前記リバースジェネティクス系。
【請求項３０】
各プラスミドはＴ７プロモーターを含む、請求項２９に記載のリバースジェネティクス系。
【請求項３１】
請求項２９に記載のゲノムセグメントの前記３つのベクターをｅｘ  ｖｉｖｏの細胞内に導入することと、
前記３つのゲノムセグメントの転写及び各ゲノムセグメントのコード領域の発現に好適な条件下にて前記ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞をインキュベーションすること
とを含む、リバースジェネティクス系の使用方法。
【請求項３２】
前記細胞により作製した感染性ウイルス粒子を単離することを更に含み、各感染性ウイルス粒子は前記３つのゲノムセグメントを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記導入することは、細胞に前記３つのゲノムセグメントをトランスフェクションすることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記導入することは、前記細胞を、前記３つのゲノムセグメントを含む感染性ウイルス粒子を前記細胞と接触させることを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞は脊椎動物細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記脊椎動物細胞は哺乳動物細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記脊椎動物細胞はトリ細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記トリ細胞はトリ胚線維芽細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１２に記載の感染性ウイルス粒子を含み、
前記第２のゲノムセグメントは、前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１の抗原をコードするコード領域を更に含み、かつ、前記第３のゲノムセグメントは、前記第２の制限酵素切断部位に挿入される第２の抗原をコードするコード領域を更に含む
対象において免疫応答を生み出すための組成物。
【請求項４１】
前記対象は脊椎動物である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記脊椎動物は哺乳類である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記哺乳類はヒトである、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記脊椎動物はトリである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４５】
前記免疫応答は体液性免疫応答を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４６】
前記免疫応答は細胞性免疫応答を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４７】
前記抗原はウイルス性病原体、原核細胞病原体、または真核細胞病原体により発現されたタンパク質、またはその断片であり、前記対象は、前記ウイルス性病原体、前記原核細胞病原体、または前記真核細胞病原体に曝されるリスクを有する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項１２に記載の感染性ウイルス粒子の少なくとも２つの集団を含み、
前記第２のゲノムセグメントは、前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１の抗原をコードするコード領域を更に含み、かつ、前記第３のゲノムセグメントは、前記第２の制限酵素切断部位に挿入される第２の抗原をコードするコード領域を更に含み、
感染性ウイルス粒子の各集団は異なる抗原をコードする、
対象において免疫応答を生み出すための組み合わせ物。
【請求項４９】
前記ウイルス性病原体が、アフトウイルス属の一員、ペスチウイルス属の一員、アルテリウイルス科の一員、コロナウイルス、オルソミクソウイルス科の一員、Ａｓｆａｒｉｒｉｄａｅ科の一員、パラミクソウイルス科の一員からなる群から選択される、請求項８に記載のウイルス、請求項２３に記載の集合体、または請求項４７に記載の組成物。
【請求項５０】
前記アフトウイルス属の一員が、口蹄疫ウイルスＦＭＤＶであり、前記ペスチウイルス属の一員が、ウシウイルス性下痢症ウイルスであり、前記アルテリウイルス科の一員が、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスＰＲＲＳＶであり、前記コロナウイルスが、ブタ流行性下痢ウイルスＥＰＤＶ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、およびＭＥＲＳ−ＣｏＶから選択され、前記オルソミクソウイルス科の一員が、インフルエンザウイルスであり、前記Ａｓｆａｒｉｒｉｄａｅ科の一員が、アフリカブタコレラウイルスであり、前記パラミクソウイルス科の一員が、ニューカッスル病ウイルスである、請求項４９に記載のウイルス、請求項４９に記載の集合体、または請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記原核細胞病原体が、グラム陰性病原体またはグラム陽性病原体であり、
前記グラム陰性病原体が、腸内細菌科の一員、カンピロバクター種、パスツレラ科の一員、フソバクテリア科の一員、セラチア種、ボルデテラ種、エンテロバクター種、レプトスピラ種、アクチノバシラス種、ヘモフィルス種、およびアエロモナス種からなる群から選択され、
あるいは、前記グラム陽性病原体が、ミクロコッカス科の一員、デイノコッカス科の一員、およびクロストリジウム種からなる群から選択される、
請求項８に記載のウイルス、請求項２３に記載の集合体、または請求項４７に記載の組成物。
【請求項５２】
前記原核細胞病原体が、グラム陰性病原体またはグラム陽性病原体であり、
前記腸内細菌科の一員が、大腸菌族、サルモネラ種、クレブシェラ種およびエンテロバクター種から選択され、前記カンピロバクター種が、カンピロバクター・ジェジュニであり、前記パスツレラ科の一員が、Ｐ・ムルトシダ及びマンヘミア・ヘモリチカから選択され、前記フソバクテリア科の一員が、Ｆ．ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ、Ｆ．ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ、及びＦ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍから選択され、
あるいは前記ミクロコッカス科の一員が、黄色ブドウ球菌であり、前記デイノコッカス科の一員が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉから選択される、
請求項５１に記載のウイルス、請求項５１に記載の集合体、または請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記原核細胞病原体が、グラム陰性病原体またはグラム陽性病原体であり、
前記クレブシェラ種が、肺炎桿菌である、
請求項５２に記載のウイルス、請求項５２に記載の集合体、または請求項５２に記載の組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ピチンデウイルスのリバースジェネティクス系及び使用方法
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願番号第６２／０５３，４４３号（２０１４年９月２２日出願）の利益を主張し、本明細書に参考として組み込まれている。
政府の資金提供
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により拠出された第ＡＩ０８３４０９号の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に特定の権利を有する。
配列表
【０００３】
本出願は、４５ＫＢのサイズを有し、２０１５年９月２２日に作成された「２０１５−０９−２２−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という題のＡＳＣＩＩテキストファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより米国特許商標局に電子的に提出された配列表を含有する。配列表の電子的出願により、電子的に提出された配列表は、３７  ＣＦＲ  §１．８２１（ｃ）により必要とされる紙のコピー、及び§１．８２１（ｅ）により必要とされるＣＲＦの両方として機能する。配列表に含有される情報は、本明細書に参考として組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
アレナウイルス科としては、反対方向に合計で４つの遺伝子をコードするゲノムを有する、２つにセグメンテーションされた、エンベロープを有するＲＮＡウイルスのグループが挙げられる（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ｐ．１７９１−１８２７．Ｉｎ  Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ（ｅｄ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。大型（Ｌ）ゲノムセグメントから作製されるＺタンパク質は、ウイルス出芽を仲立ちし、ウイルスＲＮＡ合成もまた制御するマトリックスタンパク質を含有する、小型ＲＩＮＧドメインである。Ｌセグメントでもまたコードされる大型Ｌタンパク質（約２００ｋＤａ）は、ウイルスＲＮＡ合成に必要な、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）タンパク質である。小型（Ｓ）セグメントでコードされる糖タンパク質（ＧＰＣ）は、翻訳後に安定したシグナルペプチド（ＳＳＰ）、受容体結合Ｇ１タンパク質、及び膜貫通Ｇ２タンパク質にプロセシングされる。Ｓセグメントの核タンパク質（ＮＰ）はウイルス性ゲノムＲＮＡをカプシド形成し、ウイルスＲＮＡ合成に必要であり、宿主の先天性免疫応答もまた抑制する。
【０００５】
アレナウイルスは、齧歯類を主な自然宿主とする人畜共通のＲＮＡウイルスである（概要については、ＭｃＬａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９５（Ｐｔ  １）：１−１５を参照のこと）。ヒトは、齧歯類の排泄物と、皮膚の損傷部位から直接接触すること、齧歯類の排泄物で汚染された食物を食べること、または汚れたエアゾールを吸入することによりアレナウイルスに感染する可能性がある。ほんのわずかのアレナウイルスのみが、ヒトの病気を引き起こす可能性がある（概要については、ＭｃＬａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ９７：８１−９２を参照のこと）。例えば、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）は中枢神経系の病気を引き起こす可能性がある一方で、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）及び他のいくつかのアレナウイルスは、終末ショック（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｈｏｃｋ）及び死を潜在的にもたらす可能性がある出血熱を引き起こす可能性がある。これらのウイルス感染を治療するための選択肢は限定的である。唯一利用可能な抗ウイルス薬剤（リバビリン）は幾分かの有益な効果を示すが、これは多くの副作用を有し、症状がインフルエンザに似ており潜行性であるため、病気が多くの場合誤って診断されるにもかかわらず、感染の直後に投与されなければならない。
病原性アレナウイルスを取り扱うための高い封じ込めの必要条件（ＢＳＬ−４）、及び非ヒト霊長類を取り扱うのに伴うコストのために、限定的なワクチン研究のみが行われてきた。これらの病原性アレナウイルスに対しては現在、ＦＤＡが認可していないが、アルゼンチン出血熱を引き起こすフニンウイルスに対する適応外使用にのみ利用可能なＣａｎｄｉｄ  ＃１を除いて、ワクチンは存在しない。従来のＢＳＬ−２実験室でのアレナウイルス複製及び病因を研究するための、いくつかの安全かつ便利なシステム（ピチンデウイルスモデル系等）が開発されてきた（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２，Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１７１  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｅ６５−７４，Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３３：９７−１０３，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６：９７９４−９８０１，ＭｃＬａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：６６３５−６６４３）。ピチンデウイルス（ＰＩＣＶ）はコロンビアのコメネズミから単離した。ピチンデウイルスはヒトにおいては病気を引き起こさないが、モルモットでは出血熱のような症状を引き起こす可能性があるため、アレナウイルスが誘発した出血熱を研究するのに理想的な代理モデルである。血清学的証拠は、ヒトにおいては非常に少ない血清学的有病率を示唆している（感染した齧歯類の環境と密接な関係があり、生きている、または働いている８２人のヒトのうち２人と、１３人の実験室作業者のうち６人が抗ＰＩＣＶ血清陽性を示したが、明らかな病気はなかった）（Ｔｒａｐｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ２０：６３１−６４１，Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ９：８２１−８２３）。したがって、一般的なヒト集団においては、ヒトにおいて２〜５％の血清学的有病率を示す極めて典型的なアレナウイルスであるＬＣＭＶとは対照的に、ＰＩＣＶに対する既存の免疫は僅かであるか、ないし存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ｐ．１７９１−１８２７．Ｉｎ  Ｋｎｉｐｅ  ＤＭ，Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ（ｅｄ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  ｅｄ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ
【非特許文献２】ＭｃＬａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９５（Ｐｔ  １）：１−１５
【非特許文献３】ＭｃＬａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ９７：８１−９２
【非特許文献４】Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２
【非特許文献５】Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１７１  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｅ６５−７４
【非特許文献６】Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３３：９７−１０３
【非特許文献７】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６：９７９４−９８０１
【非特許文献８】ＭｃＬａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：６６３５−６６４３
【非特許文献９】Ｔｒａｐｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ２０：６３１−６４１
【非特許文献１０】Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ９：８２１−８２３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
遺伝子組み換えされたピチンデウイルスを本明細書において提供する。一実施形態では、ウイルスは３つのアンビセンス（ａｍｂｉｓｅｎｓｅ）ゲノムセグメントを含む。第１のゲノムセグメントは、Ｚタンパク質をコードするコード領域、及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするコード領域を含む。第２のゲノムセグメントは、核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域、及び第１の制限酵素部位を含む。第３のゲノムセグメントは、糖タンパク質をコードするコード領域、及び第２の制限酵素部位を含む。一実施形態では、ＮＰタンパク質は、配列番号：３に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、核タンパク質は、核タンパク質のエキソリボヌクレアーゼ活性を低下させる少なくとも１つの変異を含み、この変異は、およそアミノ酸３８０におけるアスパラギン酸、およそアミノ酸３８２におけるグルタミン酸、およそアミノ酸５２５におけるアスパラギン酸、およそアミノ酸５２０におけるヒスチジン、及びおよそアミノ酸４５７におけるアスパラギン酸から選択され、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはヒスチジンは任意の他のアミノ酸で置換されている。一実施形態では、糖タンパク質は、糖タンパク質の活性を変える少なくとも１つの変異を含み、この変異は、およそアミノ酸２０におけるアスパラギン、及びおよそアミノ酸４０４におけるアスパラギンから選択され、アスパラギンは任意の他のアミノ酸で置換されている。Ｄ、Ｅ、またはＨは任意の他のアミノ酸で置換されている。
【０００８】
一実施形態では、第２のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、上記第１の制限酵素部位は上記複数のクローニング部位の一部である。第２のゲノムセグメントは、上記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパク質をコードするコード領域を更に含んでもよい。一実施形態では、第３のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、上記第２の制限酵素部位は上記複数のクローニング部位の一部である。一実施形態では、第３のゲノムセグメントは、上記第１の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含んでもよい。一実施形態では、第２のゲノムセグメントは、上記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパク質をコードするコード領域を更に含み、かつ、第３のゲノムセグメントは、上記第１の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含む。一実施形態では、上記第１のタンパク質及び上記第２のタンパク質は、抗原及び検出可能なマーカーから選択される。一実施形態では、抗原は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、または真核細胞病原体により発現されるタンパク質である。上記第１のタンパク質及び上記第２のタンパク質は、同一でも異なっていてもよい。
【０００９】
ベクターの集合体もまた、本明細書において提供する。一実施形態では、ベクターはプラスミドである。一実施形態では、集合体は、Ｚタンパク質をコードするコード領域、及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするコード領域を含む第１のゲノムセグメントをコードする第１のベクターであって、上記第１のゲノムセグメントはアンチゲノム性（ａｎｔｉｇｅｎｏｍｉｃ）である第１のベクターと、核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域及び第１の制限酵素部位を含む第２のゲノムセグメントをコードする第２のベクターであって、上記第２のゲノムセグメントはアンチゲノム性である第２のベクターと、糖タンパク質をコードするコード領域及び第２の制限酵素部位を含む第３のゲノムセグメントをコードする第３のベクターであって、上記第３のゲノムセグメントはアンチゲノム性である第３のベクターを含む。一実施形態では、ＮＰタンパク質は、配列番号：３に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１０】
一実施形態では、第２のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、上記第１の制限酵素部位は上記複数のクローニング部位の一部である。第２のゲノムセグメントは、上記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパク質をコードするコード領域を更に含んでもよい。一実施形態では、第３のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、上記第２の制限酵素部位は上記複数のクローニング部位の一部である。一実施形態では、第３のゲノムセグメントは、上記第１の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含んでもよい。一実施形態では、第２のゲノムセグメントは、上記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパク質をコードするコード領域を更に含み、かつ、第３のゲノムセグメントは、上記第１の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含む。一実施形態では、上記第１のタンパク質及び上記第２のタンパク質は、抗原及び検出可能なマーカーから選択される。一実施形態では、抗原は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、または真核細胞病原体により発現されるタンパク質である。上記第１のタンパク質及び上記第２のタンパク質は、同一でも異なっていてもよい。
【００１１】
方法もまた提供する。一実施形態では、方法は、本明細書に記載した遺伝子組み換えされたピチンデウイルスを作製することを含む。本方法は、本明細書で記載されるベクターの集合体を細胞内に導入すること、ならびに、ウイルス粒子内で発現するのに好適な条件下にて、細胞を培地内でインキュベーションすること及び第１、第２、及び第３のゲノムセグメントをウイルス粒子内にパッケージングすることを含む。本方法は、培地から感染性ウイルス粒子を単離することもまた含んでよい。
【００１２】
遺伝子組み換えされたピチンデウイルスを作製するためのリバースジェネティクス系であって、上記系は３つのベクターを含む、リバースジェネティックス系もまた、本明細書において提供する。第１のベクターは、Ｚタンパク質をコードするコード領域及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするコード領域を含む第１のゲノムセグメントをコードし、上記第１のゲノムセグメントはアンチゲノム性であり、第２のベクターは、核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域及び第１の制限酵素部位を含む第２のゲノムセグメントをコードし、上記第２のゲノムセグメントはアンチゲノム性であり、かつ、第３のベクターは、糖タンパク質をコードするコード領域及び第２の制限酵素部位を含む第３のゲノムセグメントをコードし、上記第３のゲノムセグメントはアンチゲノム性である。一実施形態では、ＮＰタンパク質は、配列番号：３に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１３】
一実施形態では、方法は、本明細書で記載されるゲノムセグメントの３つのベクターを細胞内に導入することと、３つのゲノムセグメントの転写及び各ゲノムセグメントのコード領域の発現に好適な条件下にて上記細胞をインキュベーションすることを含むリバースジェネティクス系を使用することを含む。一実施形態では、本方法は、細胞から作製した感染性ウイルス粒子を単離することもまた含み、各感染性ウイルス粒子は上記３つのゲノムセグメントを含む。一実施形態では、導入することは、細胞を上記３つのゲノムセグメントでトランスフェクションすることを含む。一実施形態では、導入することは、細胞を、上記３つのゲノムセグメントを含む感染性ウイルス粒子と接触させることを含む。一実施形態では、細胞は脊椎動物細胞等のｅｘ  ｖｉｖｏのものである。
【００１４】
一実施形態では、脊椎動物細胞はヒト細胞等の哺乳動物細胞であってよいか、または、脊椎動物細胞はニワトリの胚線維芽細胞等のトリ細胞であってよい。
【００１５】
一実施形態では、方法は、対象において免疫応答を生み出すことを含む。本方法は、対象に本明細書で記載される感染性ウイルス粒子を投与することを含み、ここで、第２のゲノムセグメントは第１の抗原をコードするコード領域を含み、かつ、第３のゲノムセグメントは第２の抗原をコードするコード領域を更に含む。一実施形態では、細胞は脊椎動物細胞等のｅｘ  ｖｉｖｏのものである。一実施形態では、脊椎動物細胞はヒト細胞等の哺乳動物細胞であってよいか、または脊椎動物細胞はトリ細胞であってよい。免疫応答としては、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはこれらの組み合わせを挙げてよい。一実施形態では、抗原は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、もしくは真核細胞病原体により発現したタンパク質、またはこれらの断片である。対象は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、または真核細胞病原体に曝されていてよいか、または曝されるリスクがある。一実施形態では、投与することは、感染性ウイルス粒子の少なくとも２つの集団を投与することを含み、感染性ウイルス粒子の各集団は異なる抗原をコードする。
【００１６】
本明細書で記載される感染性ウイルス粒子、及び本明細書で記載される感染性ウイルス粒子を含む組成物もまた、本明細書において提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
３つのアンビセンスなゲノムセグメントであって、  
第１のゲノムセグメントは、Ｚタンパク質をコードするコード領域及びＬ  ＲｄＲｐタ
ンパク質をコードするコード領域を含み、
第２のゲノムセグメントは、核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域及び第１の
制限酵素部位を含み、かつ
第３のゲノムセグメントは、糖タンパク質をコードするコード領域及び第２の制限酵素
部位を含み、かつ  
前記ＮＰタンパク質は、配列番号：３に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配
列を含む、前記ゲノムセグメント
を含む遺伝子組み換えされたピチンデウイルス。
（項目２）
前記第２のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、前記第１の制限酵素部
位は、前記複数のクローニング部位の一部である、項目１に記載のウイルス。
（項目３）
前記第３のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、前記第２の制限酵素部
位は前記複数のクローニング部位の一部である、項目１に記載のウイルス。
（項目４）
前記第２のゲノムセグメントは、前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタン
パク質をコードするコード領域を更に含む、項目１に記載のウイルス。
（項目５）
前記第３のゲノムセグメントは、前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第２のタン
パク質をコードするコード領域を更に含む、項目１に記載のウイルス。
（項目６）
前記第２のゲノムセグメントは前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパ
ク質をコードするコード領域を更に含み、かつ、前記第３のゲノムセグメントは前記第１
の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含む、
項目１に記載のウイルス。
（項目７）
前記第１及び前記第２のタンパク質は、抗原及び検出可能なマーカーから選択される、
項目４、５、または６に記載のウイルス。
（項目８）
前記抗原は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、または真核細胞病原体により発現さ
れるタンパク質である、項目７に記載のウイルス。
（項目９）
前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質は異なっている、項目６に記載のウイ
ルス。
（項目１０）
前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質は同一である、項目６に記載のウイル
ス。
（項目１１）
前記核タンパク質は、前記核タンパク質のエキソリボヌクレアーゼ活性を低下させる少
なくとも１つの変異を含み、前記変異は、およそアミノ酸３８０におけるアスパラギン酸
、およそアミノ酸３８２におけるグルタミン酸、およそアミノ酸５２５におけるアスパラ
ギン酸、およそアミノ酸５２０におけるヒスチジン、及びおよそアミノ酸４５７における
アスパラギン酸から選択され、前記アスパラギン酸、グルタミン酸、またはヒスチジンは
、任意の他のアミノ酸で置換されている、項目１に記載のウイルス。
（項目１２）
前記糖タンパク質は、前記糖タンパク質の活性を変える少なくとも１つの変異を含み、
前記変異はおよそアミノ酸２０におけるアスパラギン、及びおよそアミノ酸４０４におけ
るアスパラギンから選択され、前記アスパラギンは任意の他のアミノ酸で置換されている
、項目１に記載のウイルス。
（項目１３）
項目１に記載の３つのゲノムセグメントを含む感染性ウイルス粒子。
（項目１４）
項目１３に記載の単離した感染性ウイルス粒子を含む組成物。
（項目１５）
Ｚタンパク質をコードするコード領域及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするコード
領域を含む第１のゲノムセグメントをコードする第１のベクターであって、前記第１のゲ
ノムセグメントはアンチゲノム性である、前記第１のベクター、
核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域及び第１の制限酵素部位を含む第２のゲ
ノムセグメントをコードする第２のベクターであって、前記第２のゲノムセグメントはア
ンチゲノム性である、前記第２のベクター、ならびに
糖タンパク質をコードするコード領域及び第２の制限酵素部位を含む第３のゲノムセグ
メントをコードする第３のベクターであって、前記第３のゲノムセグメントはアンチゲノ
ム性である、前記第３のベクター  
を含み、
前記ＮＰタンパク質は、配列番号：３に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配
列を含む
ベクターの集合体。
（項目１６）
前記ベクターはプラスミドである、項目１５に記載の集合体。
（項目１７）
前記プラスミドはＴ７プロモーターを更に含む、項目１５に記載の集合体。
（項目１８）
前記第２のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、前記第１の制限酵素部
位は前記複数のクローニング部位の一部である、項目１５に記載の集合体。
（項目１９）
前記第３のゲノムセグメントは複数のクローニング部位を含み、前記第２の制限酵素部
位は前記複数のクローニング部位の一部である、項目１５に記載の集合体。
（項目２０）
前記第２のゲノムセグメントは、前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタン
パク質をコードするコード領域を更に含む、項目１５に記載の集合体。
（項目２１）
前記第３のゲノムセグメントは、前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第２のタン
パク質をコードするコード領域を更に含む、項目１５に記載の集合体。
（項目２２）
前記第２のゲノムセグメントは前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１のタンパ
ク質をコードするコード領域を更に含み、かつ、前記第３のゲノムセグメントは前記第１
の制限酵素切断部位に挿入される第２のタンパク質をコードするコード領域を更に含む、
項目１５に記載の集合体。
（項目２３）
前記第１及び前記第２のタンパク質は、抗原及び検出可能なマーカーから選択される、
項目２０、２１、または２２に記載の集合体。
（項目２４）
前記抗原は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、もしくは真核細胞病原体により発現
したタンパク質、またはその断片である、項目２３に記載の集合体。
（項目２５）
前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質は異なっている、項目２２に記載の集
合体。
（項目２６）
前記第１のタンパク質及び前記第２のタンパク質は同一である、項目２２に記載の集合
体。
（項目２７）
項目１５に記載のベクターの集合体を細胞内に導入すること、ならびに
前記細胞を、発現に好適な条件下にて培地内でインキュベーションすること及び前記第
１、第２、及び第３のゲノムセグメントをパッケージングすること
を含む、遺伝子組み換えされたピチンデウイルスの作製方法。
（項目２８）
前記培地から感染性ウイルス粒子を単離することを更に含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記細胞はＴ７ポリメラーゼを発現する、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
項目２７に記載の、単離した感染性ウイルス粒子。
（項目３１）
項目３０に記載の単離した感染性ウイルス粒子を含む組成物。
（項目３２）
３つのベクターを含む遺伝子組み換えされたピチンデウイルスを作製するためのリバー
スジェネティクス系であって、  
第１のベクターは、Ｚタンパク質をコードするコード領域及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質
をコードするコード領域を含む第１のゲノムセグメントをコードし、前記第１のゲノムセ
グメントはアンチゲノム性である、前記第１のベクター
第２のベクターは、核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域及び第１の制限酵素
部位を含む第２のゲノムセグメントをコードし、前記第２のゲノムセグメントはアンチゲ
ノム性である、前記第２のベクター  
第３のベクターは、糖タンパク質をコードするコード領域及び第２の制限酵素部位を含
む第３のゲノムセグメントをコードし、前記第３のゲノムセグメントはアンチゲノム性で
ある、前記第３のベクター
を含み、
前記ＮＰタンパク質は、配列番号：３に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配
列を含む
前記リバースジェネティクス系。
（項目３３）
各プラスミドはＴ７プロモーターを含む、項目３２に記載のリバースジェネティクス系
。
（項目３４）
項目２７に記載のゲノムセグメントの前記３つのベクターを細胞内に導入することと、
前記３つのゲノムセグメントの転写及び各ゲノムセグメントのコード領域の発現に好適
な条件下にて前記細胞をインキュベーションすること
とを含む、リバースジェネティクス系の使用方法。
（項目３５）
前記細胞により作製した感染性ウイルス粒子を単離することを更に含み、各感染性ウイ
ルス粒子は前記３つのゲノムセグメントを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記導入することは、細胞に前記３つのゲノムセグメントをトランスフェクションする
ことを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記導入することは、前記３つのゲノムセグメントを含む感染性ウイルス
粒子を前記細胞と接触させることを含む、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
前記細胞はｅｘ  ｖｉｖｏである、項目３４に記載の方法。
（項目３９）
前記細胞は脊椎動物細胞である、項目３４に記載の方法。
（項目４０）
前記脊椎動物細胞は哺乳動物細胞である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記哺乳動物細胞はヒト細胞である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記脊椎動物細胞はトリ細胞である、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
前記トリ細胞はトリ胚線維芽細胞である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
対象に、項目１３または３０に記載の感染性ウイルス粒子を投与すること
を含み、
前記第２のゲノムセグメントは、前記第１の制限酵素切断部位に挿入される第１の抗原
をコードするコード領域を更に含み、かつ、前記第３のゲノムセグメントは、前記第１の
制限酵素切断部位に挿入される第２の抗原をコードするコード領域を更に含む
対象において免疫応答を生み出す方法。
（項目４５）
前記対象は脊椎動物である、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記脊椎動物は哺乳類である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記哺乳類はヒトである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記脊椎動物はトリである、項目４４に記載の方法。
（項目４９）
前記免疫応答は体液性免疫応答を含む、項目４４に記載の方法。
（項目５０）
前記免疫応答は細胞性免疫応答を含む、項目４４に記載の方法。
（項目５１）
前記抗原はウイルス性病原体、原核細胞病原体、または真核細胞病原体により発現され
たタンパク質、またはその断片であり、前記対象は、前記ウイルス性病原体、前記原核細
胞病原体、または前記真核細胞病原体に曝されるリスクを有する、項目４４に記載の方法
。
（項目５２）
前記投与することは、少なくとも２つの感染性ウイルス粒子の集団を投与することを含
み、感染性ウイルス粒子の各集団は異なる抗原をコードする、項目４４に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】２プラスミドＰＩＣＶのリバースジェネティクス系の図（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２）。
【図２】３つにセグメンテーションされた感染性ＰＩＣＶ−ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰを生成するための、３プラスミド系。
【図３】ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰウイルスの性質決定。Ａ５４９またはＢＨＫ−２１細胞をｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰウイルスで２４時間感染させ、感染した細胞にてＧＦＰの発現を検出した。ウイルスの上清を回収し、ＢＨＫ−２１細胞の新鮮な培養物を感染させるために使用した。ここでもＧＦＰの発現が検出された。
【図４】高いｍｏｉ（ｍｏｉ＝０．５）及び低いｍｏｉ（ｍｏｉ＝０．０１）での、ＢＨＫ−２１細胞におけるｒＰ２、ｒＰ１８、３つにセグメンテーションされたウイルスであるｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ、及びｒＰ１８ｔｒｉ−ＲＬｕｃのウイルス増殖の比較。
【図５】インフルエンザＨＡまたはＮＰ抗原を有する３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶの生成。
【図６】ｒＰ１８ｔｒｉベースのワクチンベクターから発現したＧＦＰレポーター遺伝子生成物、及びインフルエンザＨＡまたはＮＰタンパク質の発現の検出。
【図７】ｒＰ１８ｔｒｉベースのインフルエンザワクチンは、マウスに防御免疫を付与する。１ｅ５：１×１０５；２ｅ４：２×１０４；ＩＰ：腹腔内。
【図８】ｒＰ１８ｔｒｉベースのインフルエンザワクチンにより誘導したＨＡＩ力価。
【図９】異なるワクチン接種経路により、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡウイルスにより誘導したＨＡＩ力価。ＩＮ：鼻孔内；ＩＭ：筋肉内；ＩＰ：腹腔内。
【図１０】異なるワクチン接種経路の後での、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡにより付与された防御。
【図１１】ＮＰ四量体分析による、ＮＰ特異的ＣＴＬ応答の分析。
【図１２】異なるワクチン接種経路の後で誘発されたＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の反応速度。
【図１３】ワクチンは長期的な免疫及び防御を付与した。ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡワクチンベクターによる追加免疫の１または２ヶ月後で、Ｃ５７ＢＬ６マウスに、１０ＬＤ５０のＡ／ＰＲ／８で抗原投与した。Ａ．１回目投与後１４日目及び３０日目（ｄｐｐ）、追加免疫後の３０日目及び６０日目（ｄｐｂ）におけるＨＩ力価。Ｂ．６ｄｐｉでの肺でのウイルス力価。Ｃ．体重減少（％）。Ｄ．Ｈ＆Ｅ染色した肺の部分。
【図１４】ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡワクチンベクターの初回投与により付与された防御。Ａ．異なる用量のｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡワクチン接種の後での、中和抗体の力価。Ｂ．体重減少（％）。Ｃ．Ｈ＆Ｅ染色した肺の部分。
【図１５】プラークサイズ、ならびにｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＮＰ及びｒＰ１８ｔｒｉ−ＮＰ／ＨＡからのＨＡ及びＮＰの発現。
【図１６】二重抗原（ＨＡ及びＮＰ）を発現するベクターにより誘発されたＴ細胞及び体液性応答。Ａ．ワクチン接種後７日目における、マウス血液でのＮＰ３３６四量体＋  ＣＤ４４＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞についての例示的なＦＡＣＳプロット。Ｂ．初回投与の７日後、及び追加免疫の７日後に四量体染色により試験した、末梢血におけるＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合。Ｃ．異なる時点で収集した血清のＨＩアッセイを使用して、ウイルス中和抗体の力価を測定した。
【図１７】インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＰの両方を発現するｒＰ１８ｔｒｉベースのワクチンにより付与した防御。Ａ．ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＧＦＰ、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＮＰまたはｒＰ１８ｔｒｉ−ＮＰ／ＨＡのいずれかの初回投与−追加免疫によりワクチン接種した動物からの、染色した肺部分。Ｂ．肺におけるウイルス力価。Ｃ．ＰＲ８抗原投与の後の体重減少（％）。
【図１８】Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２インフルエンザウイルス亜型の両方のＨＡタンパク質を発現する、ｒＰ１８ｔｒｉベースのベクターワクチンにより誘発した、Ｃ５７ＢＬ６マウス及びＢａｌｂ／ｃマウスにおける体液性応答。ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＧＦＰ、または１０４ｐｆｕのｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡ、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡ３及びｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＨＡ３のいずれかを、初回投与と追加免疫の期間を２週間にして、マウスに筋肉内投与により２回接種した。追加免疫の２週間後に血清サンプルを収集し、ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）及びＸ３１（Ｈ３Ｎ２）を抗原投与したウイルスに対するＨＩ力価を分析した。Δは初回投与の２週間後のＨＩ力価を表し、●は追加免疫の２週間後のＨＩ力価を表す。左パネル：Ｃ５７ＢＬ６マウスでのＨＩ力価。右パネル：Ｂａｌｂ／ｃマウスでのＨＩ力価。
【図１９】二重インフルエンザウイルス抗原投与に対する防御。１０４ｐｆｕ／ｍＬのｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＨＡ３をマウスにワクチン接種した。ウイルス抗原投与の５ないし６日後に、肺におけるウイルス力価を測定した。Ａ．グラフは、ＰＲ８またはＸ３１インフルエンザウイルスのいずれかにより抗原投与した際のウイルス力価を示す。Ｂ．１０ＬＤ５０のＡ／ＰＲ／８または１０５ｐｆｕのＸ３１で抗原投与した後の体重減少。Ｃ．１０ＬＤ５０のＡ／ＰＲ／８ウイルス、及び１０５ｐｆｕのＸ３１で抗原投与の６日後に回収した肺の、Ｈ＆Ｅで染色した部分。
【図２０】ｒＰ１８ｔｒｉベクターは、追加免疫の後により強いＣＴＬ応答を誘発する。
【図２１】組み換えＮＰ  ＲＮａｓｅ変異ウイルスは、感染した細胞にてＩ型  ＩＦＮの産生を誘導した。（Ａ）それぞれ５つの触媒残基におけるアラニン置換変異は、ＰＩＣＶ  ＮＰの、センダイウイルスにより誘導されるＩＦＮβ活性化を抑制する能力を消滅させた（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，  Ｎａｔｕｒｅ  ４６８：７７９−７８３）。２９３Ｔ細胞に、空のベクターまたはそれぞれのＮＰプラスミドと共に、ＩＦＮβプロモーターに向けたＬＵＣプラスミド及びβガラクトシダーゼプラスミドを導入し、続いてセンダイウイルス感染をさせた。ＬＵＣ活性を測定し、βガラクトシダーゼ活性によるトランスフェクション効率に対して正規化した。示す結果は、３つの独立した実験の平均である。ＷＴ（ｒＰ２及びｒＰ１８）ならびに変異ＰＩＣＶ  ＮＰタンパク質の発現を、抗ｍｙｃ抗体を使用したウェスタンブロッティングにより検出した。（Ｂ）組み換えＰＩＣＶ  ＲＮａｓｅ変異ウイルスは、ウイルス感染の際に多量のＩ型  ＩＦＮを産生した。Ａ５４９細胞を、モック感染させるか、またはＭＯＩが１の、例示的組み換えＰＩＣＶウイルスで感染させた。１２ｈｐｉ及び２４ｈｐｉで上清を収集し、ＵＶ処理してウイルス粒子を不活性化させ、ｒＮＤＶ−ＧＦＰベースの生物学的アッセイに通してＩＦＮの量を測定した。例示的なＧＦＰ画像（Ｂ）、及び３つの独立した実験からの標準偏差を含む平均のＧＦＰ値（Ｃ）を示す。
【図２２】ＮＰ  ＲＮａｓｅ活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＩＦＮコンピテント細胞におけるＰＩＣＶ複製、及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＩＣＶ感染のために必要である。（Ａ）ＩＦＮ欠失ベロ及びＩＦＮコンピテントＡ５４９細胞における、ウイルスの増殖速度。０．０１のＭＯＩにて、細胞をそれぞれのウイルスで感染させた。感染後異なる時間において、上清のウイルス力価をプラークアッセイにより定量化した。示す結果は、３つの独立した実験の平均である。（Ｂ）それぞれの組み換えＰＩＣＶウイルスで感染させたモルモット（ｎ＝６）の生残割合（左パネル）及び正規化した体重（右パネル）。ＧｒａｐｈＰａｄプリズム５ソフトウエアを使用して、ログランク（マンテル−コックス）χ２試験を使用して、生き残り曲線の統計的分析を行った。＊＊＊、ｐ＜０．００１。＊＊、ｐ＜０．０１。各動物の体重を毎日監視し、０日目に対して正規化した。示す結果は、各群に対して正規化した体重の平均である。
【図２３】ＰＩＣＶ  ＮＰ  ＲＮａｓｅ変異体は強いＩＦＮ応答を誘発し、ウイルス感染の確立をブロックした。モルモットに、１×１０４ｐｆｕのそれぞれの組み換えウイルス（ウイルス群あたりｎ＝３匹の動物）を１及び３日目に腹腔内感染させた。（Ａ）１及び３ｄｐｉにおける、肝臓及び脾臓でのウイルス力価。（Ｂ）１日目における、腹腔細胞でのＩ型ＩＦＮ、及び選択的インターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の量を、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。プライマー配列を要請に応じて提供する。各点は、１匹の動物を表す。ステューデントのｔ検定により統計的分析を行った。
【図２４】二重抗原インフルエンザＨＡ及びＮＰを発現するｒＰ１８ｔｒｉの生成。（Ａ）Ｓ１及びＳ２セグメントにおける、インフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）Ａ／ＰＲ８の二重抗原ＨＡ及びＮＰを発現するｒＰ１８ｔｒｉベクター、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ、及びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐの概略図。ＩＧＲ：遺伝子間領域。（Ｂ）ｒＰ１８ｔｒｉの二重抗原ベクターは、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）により示されるように、ＨＡ及びＮＰの両方を発現する。（Ｃ）ＢＨＫ−２１細胞において二重抗原を発現する組み換えウイルスの増殖曲線分析。
【図２５】ワクチンベクターを発現するＨＡ／ＮＰ二重抗原は、マウスにおいて防御免疫を誘導することができる。Ｃ５７ＢＬ６マウスのグループ（ｎ＝３）に１×１０４ｐｆｕの、対応するｒＰ１８ｔｒｉベクターを２回投与し、１０×ＭＬＤ５０（中央致死量）の、マウスに馴化したインフルエンザＡ／ＰＲ８ウイルスを鼻孔内（ＩＮ）抗原投与した。体重（Ａ）、ならびに３及び６ｄｐｉでのウイルスの肺での力価（Ｂ）を示す。
【図２６】Ｈ１／Ｈ３二重抗原ベクターは、バランスのとれたＨＡ中和抗体を誘導する。（Ａ）ｅＧＦＰ及びＨ１  ＨＡ（ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｈ１）、ｅＧＦＰ及びＨ３  ＨＡ（ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｈ３）、ならびにＨ１及びＨ３（ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ３／Ｈ１）を発現するｒＰ１８ｔｒｉベクターの概略図。（Ｂ）ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ３／Ｈ１は、Ｈ１及びＨ３  ＨＡ亜型の両方に対するバランスの取れた中和抗体を誘導する。Ｃ５７ＢＬ６（上面）及びＢａｌｂ／ｃマウス（底面）のグループを、ＩＭ経路によりそれぞれｒＰ１８ｔｒｉベクター（ｎ≧３）で２回免疫付与した。初回投与及び追加免疫の１４日後に収集した血液を、Ａ／ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）及びＡ／ｘ３１（Ｈ３Ｎ２）に対する中和抗体の量について、ＨＡＩアッセイにより定量化した。
【図２７】異なるＨＡ亜型を用いたプライム・ブースト法によるヘテロ亜型中和抗体の誘導。（Ａ）Ａ／ＰＲ８（ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ１）からのＨ１  ＨＡ、またはＡ／ｘ３１（ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ３）からのＨ３  ＨＡのいずれかと共にＡ／ＰＲ８  ＮＰを発現する、ｒＰ１８ｔｒｉベクターの概略図。（Ｂ）追加免疫の際にＮＰ特異的ＣＴＬは増加した。Ｃ５７ＢＬ６マウスにｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ１を初回投与し、１４日間の間隔で、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ３で追加免疫し、再びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ１で追加免疫した。初回投与（ｄｐｐ）、１回目の追加免疫（ｄｐｂ）、及び２回目の追加免疫（ｄｐｂ２）の７日後でのＮＰ特異的エフェクターＴ細胞を、確立したＮＰ四量体分析により定量化した。（Ｃ）初回投与及び追加免疫後の、Ａ／ＰＲ８（Ｈ１）、Ａ／ｘ３１（Ｈ３）、及びＡ／ＷＳＮ（ヘテロ亜型Ｈ１）に対する中和抗体を、ＨＡＩアッセイにより定量化した。
【図２８】ｒＰ１８ｔｒｉベクターは、経口経路により体液性及びＴ細胞応答の両方を誘発することができる。ＢＬ６マウスの群を、経口摂食によりｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ（ｎ＝３）ベクターまたはｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ（ｎ＝４）のいずれかで２回免疫付与した。初回投与または追加免疫の後の異なる日数における、ＮＰ特異的エフェクターＴ細胞（Ａ）及びＨ１特異的中和抗体（Ｂ）を示す。ｄｐｐ：初回投与後の日数；ｄｐｂ：追加免疫後の日数。
【図２９】不活性化ｒＰ１８ｔｒｉベクターは、体液性及びＴ細胞応答の両方を誘発することができる。ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇベクター（ｎ＝３）、過酸化水素不活性化ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ（ｎ＝３）、及び生きたｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ（ｎ＝１）でそれぞれ、Ｃ５７ＢＬ６マウスのグループを２回免疫付与した。免疫付与後の異なる日数におけるＮＰ特異的エフェクターＴ細胞（左パネル）及び中和抗体（右）を示す。ｄｐｐ：初回投与後の日数；ｄｐｂ：追加免疫後の日数。
【図３０】ｒＰ１８ｔｒｉベクターはモルモットにおいて病原性を示さず、ＷＴ  ｒＰ１８ウイルスの致死性抗原投与から動物を防御することができる。（Ａ）ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇはモルモットにおいて悪性の感染を引き起こさない。Ｈａｒｔｌｅｙモルモットの群（ｎ＝３）を、モック感染させる（ＰＢＳ）か、ＩＰ経路によりＷＴ  ｒＰ１８（１×１０４ｐｆｕ）またはｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ（１×１０６ｐｆｕ）で感染させた。体重を毎日監視し、０日目に対して正規化した（左パネル）。直腸温度が右側に表示される。（Ｂ）ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇで免疫付与したモルモットは致死量のｒＰ１８抗原投与を防御した。モルモットの群（ｎ＝３）を、ＩＰ経路によりＰＢＳまたはｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ（１×１０４ｐｆｕ）のいずれかで感染させ、１４日後に１×１０４ｐｆｕのＷＴ  ｒＰ１８ウイルスを抗原投与した。正規化した体重（左パネル）及び直腸温（右パネル）を示す。３９．５℃を上回る温度は発熱状態であると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
遺伝子改変ピチンデウイルスを作製するためのリバースジェネティクス系を、本明細書において提供する。本明細書で記載される遺伝子改変ピチンデウイルスベースのリバースジェネティクス系は、他のアレナウイルス系に優る複数の利点を有する。ピチンデウイルスはヒトで病気を引き起こすことが知られておらず、ピチンデウイルスは実験室の設定において、無症候性ヒト感染症を引き起こす可能性があるという証拠が存在する。例えば、ウイルスを取り扱う実験室職員の４６％は血清陽性であるが、明確な病気を示さない（Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｋｎｉｐｅ  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ（ｅｄｓ），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．５ｔｈ  ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ．ｐｐ．１７９１−１８２７）。Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．により報告されたヒト感染症の研究で使用された親ウイルスと比較して、本明細書で記載される改変ピチンデウイルスは更に弱毒化されている。改変ピチンデウイルスは、細胞培養での連続継代の間で遺伝子的に安定している。一般的なヒト集団はピチンデウイルスに予め曝されているということが知られておらず、このピチンデウイルスベクターに対する既存の免疫を欠いているため、ワクチン開発の理想的なベクターとなる。本明細書で使用する場合、「遺伝子改変（された）」及び「遺伝子組み換え（された）」とは、改変され、いかなる自然設定においても発見されないピチンデウイルスを意味する。例えば、遺伝子改変ピチンデウイルスは、制限エンドヌクレアーゼ部位等の外来性ポリヌクレオチドが導入されているピチンデウイルスである。遺伝子改変ピチンデウイルスの別の例は、３つのゲノムセグメントを含むように改変されているピチンデウイルスである。
【００１９】
この改変ピチンデウイルス用のリバースジェネティクス系は、２つないし３つのゲノムセグメントを含む。第１のゲノムセグメントは、１つはＺタンパク質をコードし、第２のものはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ  ＲｄＲｐ）をコードする、２つのコード領域を含む。第２のゲノムセグメントは、核タンパク質（ＮＰ）をコードするコード領域を含み、複数のクローニング部位等の少なくとも１つの制限酵素部位を含んでよい。第３のゲノムセグメントは、糖タンパク質をコードするコード領域を含み、複数のクローニング部位等の少なくとも１つの制限酵素部位を含んでよい。「コード領域」とは、タンパク質をコードし、適切な調節配列の制御下においた際にコードしたタンパク質を発現する、ヌクレオチド配列である。   本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」は、ペプチド結合により結合した２つ以上のアミノ酸のポリマーを広範に意味する。用語「タンパク質」は、ジスルフィド結合、イオン結合、もしくは疎水性相互作用により結合した２つ以上のタンパク質を含有する分子、または、多量体（例えば二量体、四量体）として共有結合もしくは非共有結合により結合したタンパク質の複合体もまた含む。したがって、用語「ペプチド」「オリゴペプチド」及び「ポリペプチド」は全てタンパク質の定義に含まれ、これらの用語は同じ意味で用いられる。これらの用語は特定の長さのアミノ酸のポリマーを意味せず、また、タンパク質が組み換え技術、化学もしくは酵素合成を使用して作製されたか、または天然に存在するかを示唆するかまたは区別することも目的としていないと理解されるべきである。
【００２０】
Ｚタンパク質、Ｌ  ＲｄＲｐ、ＮＰタンパク質、及び糖タンパク質は、ピチンデウイルスによりコードされるものである。Ｚタンパク質は、ウイルス出芽の仲立ちをし、ウイルスＲＮＡ合成もまた制御するマトリックスタンパク質を含有する小型ＲＩＮＧドメインである。ピチンデウイルスからのＺタンパク質の一例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＵ３９９１０．１で入手可能な配列（配列番号：１）である。Ｌ  ＲｄＲｐタンパク質は、ウイルスＤＮＡ合成に必要なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。ピチンデウイルスからのＬ  ＲｄＲｐタンパク質の一例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＵ３９９１１．１で入手可能な配列（配列番号：２）である。ＮＰタンパク質はウイルスゲノムＲＮＡをカプシド形成し、ウイルスＲＮＡ合成に必要であり、宿主の先天性免疫応答もまた抑制する。ピチンデウイルスからのＮＰタンパク質の一例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＵ３９９０９．１で入手可能な配列（配列番号：３）である。糖タンパク質は、翻訳後に安定したシグナルペプチド（ＳＳＰ）、受容体結合Ｇ１タンパク質、及び膜貫通Ｇ２タンパク質にプロセシングされる。ピチンデウイルスからの糖タンパク質の一例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＢＵ３９９０８．１で入手可能な配列（配列番号：４）である。
【００２１】
Ｚタンパク質、Ｌ  ＲｄＲｐタンパク質、ＮＰタンパク質、及び糖タンパク質の他の例としては、ピチンデウイルスによりコードされたタンパク質、例えば配列番号：１、２、３、及び／または４と構造が類似したタンパク質が挙げられる。２つのポリペプチドの構造的類似性は、２つのポリペプチド（例えば、候補ポリペプチドと本明細書で記載される参照ポリペプチド）の残基をアライメントし、これらの配列の長さに沿って同一のアミノ酸の数を最適化することによって決定することができる；同一のアミノ酸の数を最適化するために、いずれかまたは両方の配列におけるギャップをアライメントさせる（ただし、各配列のアミノ酸はそれでもなお適切な順序を維持しなければならない）。参照ポリペプチドは、配列番号：１、２、３、または４等の、本明細書で記載されるポリペプチドであってよい。候補ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較されるポリペプチドである。候補ポリペプチドは、例えばマウス等の動物の細胞から単離されてよいか、または組み換え技術を使用して作製されることができるか、もしくは化学的もしくは酵素を用いて合成することができる。候補ポリペプチドは、ピチンデウイルスのゲノムに存在するヌクレオチド配列から推定されてよい。
【００２２】
本明細書で別途記載されるように改変される場合を除いて、アミノ酸配列のペアワイズ比較分析は、Ｔａｔｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ，１７４，２４７−２５０（１９９９））に記載され、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手可能なｂｌａｓｔｐ  ｓｕｉｔｅ−２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ検索アルゴリズムであるＢｌａｓｔｐプログラムを使用して実施することができる。一般的なパラメーター：予想閾値＝１０、ワードサイズ＝３、ショートクエリ＝オン、スコアリングパラメーター：マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップコスト＝存在：１１  伸長：１、組成物調節＝条件的組成物スコアマトリックス調節等の、全てのｂｌａｓｔｐ  ｓｕｉｔｅ−２ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ検索パラメーターについての初期値を使用してよい。あるいは、ＧＣＧパッケージ（バージョン１０．２，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴアルゴリズムを使用してポリペプチドを比較してよい。
【００２３】
２つのアミノ酸配列の比較において、構造的類似性は％「同一性」と呼ばれてよいか、または％「類似性」と呼ばれてよい。「同一性」とは、同一のアミノ酸の存在を意味する。「類似性」とは、同一のアミノ酸の存在だけでなく、保存的置換の存在も意味する。本明細書で記載されるポリペプチドのアミノ酸に関する保存的置換は、そのアミノ酸が属する部類の他の構成要素から選択されてよい。例えば、特定のサイズまたは特徴（例えば電荷、疎水性及び親水性）を有するアミノ酸の群に属するアミノ酸は、タンパク質の活性、特に生物活性と直接関係しないタンパク質の領域を変更することなく別のアミノ酸と置き換えることができることが、タンパク質生化学の技術分野においては既知である。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。保存的置換としては、例えば、正電荷を維持する、ＬｙｓのＡｒｇへの置換（及びその逆）；負電荷を維持する、ＧｌｕのＡｓｐへの置換（及びその逆）；遊離−ＯＨを維持する、ＳｅｒのＴｈｒへの置換；ならびに、遊離−ＮＨ２を維持する、ＧｌｎのＡｓｎへの置換が挙げられる。
【００２４】
当業者は、Ｚタンパク質の保存領域を識別するための、ＣｌｕｓｔａｌＷ等の速やかに利用可能なアルゴリズムを使用することにより、配列番号：１で記載されるＺタンパク質を、ラッサウイルス（Ｏ７３５５７．４）、ＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（ＡＡＸ４９３４３．１）、及びフニンウイルス（ＮＰ＿８９９２１６．１）等の他のアレナウイルスからのＺタンパク質と比較することができることを理解するであろう。ＣｌｕｓｔａｌＷは、生物学的に有意義な異なる配列の複数の配列アライメントを作製する、核酸類またはタンパク質用の複数の配列アライメントプログラムである（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，ＣｌｕｓｔａｌＷ  ａｎｄ  ＣｌｕｓｔａｌＸ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２３（２１）：２９４７−２９４８）。この情報を使用することで、当業者は速やかに、配列番号：１等のＺタンパク質に対するある種の保存的置換は、ポリペプチドの活性を低下させないという妥当な予想を行うことができるであろう。
【００２５】
当業者は、Ｌ  ＲｄＲｐタンパク質の保存領域を識別するための、ＣｌｕｓｔａｌＷ等の速やかに利用可能なアルゴリズムを使用して、配列番号：２で記載したＬ  ＲｄＲｐタンパク質を、ラッサウイルス（ＡＡＴ４９００２．１）、ＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（ＡＡＸ４９３４４．１）、及びフニンウイルス（ＮＰ＿８９９２１７．１）等の他のアレナウイルスからのＬ  ＲｄＲｐタンパク質と比較することができることを理解するであろう。この情報を使用することで、当業者は速やかに、配列番号：２等のＬ  ＲｄＲｐタンパク質に対するある種の保存的置換は、ポリペプチドの活性を低下させないという妥当な予想を行うことができるであろう。
【００２６】
当業者は、ＮＰタンパク質の保存領域を識別するための、ＣｌｕｓｔａｌＷ等の速やかに利用可能なアルゴリズムを使用して、配列番号：３で記載したＮＰタンパク質を、ラッサウイルス（Ｐ１３６９９．１）、ＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（ＡＡＸ４９３４２．１）、及びフニンウイルス（ＮＰ＿８９９２１９．１）等の他のアレナウイルスからのＮＰタンパク質と比較することができることを理解するであろう。この情報を使用することで、当業者は速やかに、配列番号：３等のＮＰタンパク質に対するある種の保存的置換は、ポリペプチドの活性を低下させないという妥当な予想を行うことができるであろう。
【００２７】
当業者は、糖タンパク質の保存領域を識別するための、ＣｌｕｓｔａｌＷ等の速やかに利用可能なアルゴリズムを使用して、配列番号：４で記載した糖タンパク質を、ラッサウイルス（Ｐ０８６６９）、ＬＣＭＶ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（ＡＡＸ４９３４１．１）、及びフニンウイルス（ＮＰ＿８９９２１８．１）等の他のアレナウイルスからの糖タンパク質と比較することができることを理解するであろう。この情報を使用することで、当業者は速やかに、配列番号：４等の糖タンパク質に対するある種の保存的置換は、ポリペプチドの活性を低下させないという妥当な予想を行うことができるであろう。
【００２８】
したがって、本明細書で使用する場合、ピチンデウイルスＺタンパク質、Ｌ  ＲｄＲｐタンパク質、ＮＰタンパク質、または糖タンパク質は、参照アミノ酸配列に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列類似性を有するものを含む。あるいは、本明細書で使用する場合、ピチンデウイルスＺタンパク質、Ｌ  ＲｄＲｐタンパク質、ＮＰタンパク質、または糖タンパク質は、参照アミノ酸配列に少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するものを含む。別段の定めがある場合を除き、「ピチンデウイルスＺタンパク質」、「ピチンデウイルスＬ  ＲｄＲｐタンパク質」、「ピチンデウイルスＮＰタンパク質」、及び「ピチンデウイルス糖タンパク質」とは、それぞれ配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、及び配列番号：４に少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するタンパク質を意味する。
【００２９】
それぞれ配列番号：１、２、３、または４のアミノ酸配列に構造的類似性を有するピチンデウイルスＺタンパク質、Ｌ  ＲｄＲｐタンパク質、ＮＰタンパク質、または糖タンパク質は、生物活性を有する。本明細書で使用する場合、「生物活性」とは、感染性ウイルス粒子を作製する、Ｚタンパク質、Ｌ  ＲｄＲｐタンパク質、ＮＰタンパク質、または糖タンパク質の活性を意味する。感染性ウイルス粒子の生合成において果たすこれらのタンパク質のそれぞれの生物学的役割は既知であり、各タンパク質の生物活性を測定するためのアッセイも既知である。
【００３０】
一実施形態では、ＮＰタンパク質は１つ以上の変異を含んでよい。ＮＰタンパク質での変異は、引き続き感染性ウイルス粒子を作製する機能を維持するが、ピチンデウイルスが感染した細胞により、ある種のサイトカイン産生を抑制する能力が低下しているＮＰタンパク質をもたらし得る。サイトカイン産生を抑制する能力が低下したピチンデウイルスは、ウイルスによりコードされる抗原に対する免疫応答を向上させるのに有用であることが見込まれている。変異の例としては、残基３８０におけるアスパラギン酸、残基３８２におけるグルタミン酸、残基４５７におけるアスパラギン酸、残基５２５におけるアスパラギン酸、及び残基５２０におけるヒスチジンが挙げられる。当業者は、これらの変異の正確な位置は、ＮＰタンパク質での小さな挿入または欠失の存在に応じて異なるＮＰタンパク質の間で変化する可能性があり、したがって変異の正確な位置はおよそのものであり、１、２、３、４、または５個のアミノ酸で変化する可能性があることを認識するであろう。
【００３１】
一実施形態では、ＮＰタンパク質での変異は、残基３８０、３８２、４５７、５２５、及び／または５２０における、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはヒスチジンの、任意の他のアミノ酸との置換であってよい。一実施形態では、変異は、残基３８０、３８２、４５７、５２５、及び／または５２０におけるアスパラギン酸、グルタミン酸、またはヒスチジンの保存的置換であってよい。一実施形態では、変異は、残基３８０、３８２、４５７、５２５、及び／または５２０における、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはヒスチジンの、グリシンまたはアラニンとの置換であってよい。一実施形態では、ＮＰタンパク質は、残基３８０、３８２、４５７、５２５、または５２０の１、２、３、または４個の変異を含んでよく、一実施形態において、ＮＰタンパク質は５つの残基全てにおける変異を含んでよい。
【００３２】
一実施形態では、糖タンパク質は、１つ以上の変異を含んでよい。糖タンパク質での変異は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス拡散を低下させる糖タンパク質をもたらし得る。変異の例としては、残基２０におけるアスパラギン、及び／または残基４０４におけるアスパラギンが挙げられる。当業者は、これらの変異の正確な位置は、糖タンパク質での小さな挿入または欠失の存在に応じて異なる糖タンパク質の間で変化する可能性があり、したがって変異の正確な位置はおよそのものであり、１、２、３、４、または５個のアミノ酸で変化する可能性があることを認識するであろう。
【００３３】
一実施形態では、糖タンパク質での変異は、アスパラギン残基２０及び／または４０４の、任意の他のアミノ酸との置換であってよい。一実施形態では、変異は、アスパラギン残基２０及び／または４０４の保存的置換であってよい。一実施形態では、変異は、アスパラギン残基２０及び／または４０４の、グリシンまたはアラニンとの置換であってよい。
【００３４】
本明細書に記載したタンパク質はまた、タンパク質をコードするポリヌクレオチドの観点から識別されてもよい。したがって、本開示は、本明細書に記載したタンパク質をコードするか、または標準的なハイブリダイゼーション条件下において、本明細書に記載したタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションするポリヌクレオチド、及びかかるポリヌクレオチド配列の補体を提供する。本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを意味し、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む。ポリヌクレオチドは、例えばコード配列、及び調節配列等の非コード配列を含む、異なる機能を有するヌクレオチド配列を含んでよい。ポリヌクレオチドは天然源から直接入手することができるか、または組み換え、酵素、もしくは化学技術を使用して調製することができる。ポリヌクレオチドはトポロジーが線状または環状であることができる。ポリヌクレオチドは、例えば、発現もしくはクローニングベクター等のベクターの一部、または断片であることができる。ポリヌクレオチドの例は、ゲノムセグメントである。
【００３５】
Ｚタンパク質をコードするポリヌクレオチドの例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ５２９７４７．１で入手可能な配列（配列番号：５）のヌクレオチド８５〜３７２であり、Ｌ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドの例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ５２９７４７．１で入手可能な配列（配列番号：５）のヌクレオチド４４３〜７０２７の補体であり、ＮＰタンパク質をコードするポリヌクレオチドの例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ５２９７４６．１で入手可能な配列（配列番号：６）のヌクレオチド１６５３〜３３３８の補体であり、かつ、糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドの例は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＥＦ５２９７４６．１で入手可能な配列（配列番号：６）のヌクレオチド５２〜１５７８である。それぞれ配列番号：１、２、３、または４により表される、Ｚタンパク質、Ｌ  ＲｄＲｐタンパク質、ＮＰタンパク質、または糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号：５または６で開示されるヌクレオチド配列に限定されず、遺伝暗号の縮退の結果としてかかるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの部類もまた含むと理解されるべきである。例えば、天然のヌクレオチド配列配列番号：５は、アミノ酸配列配列番号：１を有するタンパク質、及びアミノ酸配列配列番号：２を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の部類の構成要素のみである。選択したタンパク質の配列をコードするヌクレオチド配列の部類は大きいが有限であり、各部類の各構成要素のヌクレオチド配列は、標準遺伝暗号を参照することにより当業者により速やかに測定されることができる。ここで、異なるヌクレオチドの三塩基組（コドン）は、同じアミノ酸をコードすることが知られている。
【００３６】
本明細書で使用する場合、本明細書に記載したポリヌクレオチドへの参照、及び／または１つ以上の配列番号の核酸配列への参照は、識別した参照ポリヌクレオチド配列に少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００３７】
本文脈中、「配列同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間での同一性を意味する。配列同一性は一般に、２つのポリヌクレオチドの塩基をアライメント（例えば、候補配列のヌクレオチド配列と、例えば配列番号：１、２、３、または４のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列をアライメント）して、これらの配列の長さに沿って同一のヌクレオチドの数を最適化することにより測定される；共有されているヌクレオチドの数を最適化するために、いずれかまたは両方の配列におけるギャップをアライメントさせる（ただし、各配列のヌクレオチドはそれでもなお適切な順序を維持しなければならない）。候補配列は、既知の配列、例えば、配列番号：５または６等から選択される適切なヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と比較される配列である。例えば、２つのポリヌクレオチド配列は、Ｔａｔｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，１９９９；１７４：２４７−２５０により記載され、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／のワールドワイドウェブで入手可能なＢＬＡＳＴ  ２検索アルゴリズムのＢｌａｓｔｎプログラムを使用して比較することができる。マッチ用報酬（ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ｍａｔｃｈ）＝１、ミスマッチ用ペナルティ＝−２、オープンギャップペナルティ＝５、伸長ギャップペナルティ＝２、ギャップｘ＿ｄｒｏｐｏｆｆ＝５０、予想＝１０、ワードサイズ＝１１、及びフィルターオン等の、ＢＬＡＳＴ  ２検索パラメーター用の初期値を使用してよい。
【００３８】
一実施形態では、第２及び／または第３のゲノムセグメントは、それぞれ独立して１つの制限酵素切断部位、または２つ以上の制限酵素切断部位を有する「複数のクローニング部位」を含んでよい。
【００３９】
一実施形態では、第２及び／または第３のゲノムセグメントは、それぞれ独立して、抗原等のタンパク質をコードする、更なるコード領域を含んでよい。したがって、第２のゲノムセグメントは、核タンパク質をコードするコード領域を含み、抗原をコードする第２のコード領域を含んでよい。同様に、第３のゲノムセグメントは、糖タンパク質をコードするコード領域を含み、抗原をコードする第２のコード領域を含んでよい。第２及び第３のゲノムセグメントは、同一の抗原、または異なる抗原をコードしてよい。第２のゲノムセグメント及び第３のゲノムセグメントの両方において、この第２のコード領域は、複数のクローニング部位に存在する制限酵素切断部位等の、存在する制限酵素切断部位に挿入されてよい。第２のゲノムセグメント、及び／または第３のゲノムセグメントに存在し得る第２のコード領域は、限定を意図するものではない。
【００４０】
一実施形態では、第２のコード領域は、対象において免疫応答を誘発することができる抗原として有用なタンパク質をコードしてよい。実施例１、２、及び３は、本明細書にて開示したリバースジェネティクス系及びウイルスの効果を示すため、モデル抗原としての、インフルエンザ核タンパク質及びインフルエンザヘマグルチニンの使用を示し、したがって、抗原の同一性は限定を意図するものではない。抗原の一例は、原核細胞、真核細胞（例えば菌類、酵母菌、もしくは原生動物等）、もしくはウイルスによりコードされる完全長タンパク質、またはこれらの断片である。一実施形態では、タンパク質は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、または真核細胞病原体等の病原体により自然に発現するタンパク質であってよい。原核細胞、真核細胞、またはウイルスによりコードされる抗原タンパク質は、当業者に既知である。抗原の別の例は、改変により１つ以上のエピトープを含むタンパク質である。一実施形態では、タンパク質は、腫瘍細胞により発現するタンパク質であってよいか、または腫瘍環境に存在する。
【００４１】
抗原を入手し得る原核細胞病原体の例としては、グラム陰性病原体及びグラム陽性病原体が挙げられる。グラム陰性病原体の例としては、腸内細菌科の一員（例えば、大腸菌族またはサルモネラ族の一員である腸内細菌科の一員）等の腸病原体が挙げられる。腸病原体の例としては、腸内細菌科の一員、ビブリオ科（例えばコレラ菌等）の一員、及びカンピロバクター種（例えばカンピロバクター・ジェジュニ等）が挙げられる。腸内細菌科の好ましい一員の例としては、例えば、大腸菌、赤痢菌種、サルモネラ種、プロテウス種、クレブシェラ種（例えば肺炎桿菌）、セラチア種、及びエルシニア種が挙げられる。大腸菌株の例としては、例えば、大腸菌血清型（ｓｃｒｏｔｙｐｅｓ）Ｏ１ａ、Ｏ２ａ、Ｏ７８、及びＯ１５７、０１０４、０１１１、０２６、０１１３、０９１等の異なるＯ：Ｈ血清型、Ｋ８８＋、Ｆ４＋、Ｆ１８ａｂ＋、及びＦ１８ａｃ＋等の腸管毒素原性大腸菌の溶血性株、ならびに９８７Ｐ、Ｆ４１、及びＫ９９等の非溶血性株が挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「株」とは、異なる遺伝子型及び／または表現型を有する、微生物種の一員を意味する。大腸菌のその他の例としては、ヒトにおいて食品媒介性、及び水媒介性の病気を引き起こす下痢性大腸菌の５つのカテゴリー：腸病原性（ＥＰＥＣ）、腸管出血性（ＥＨＥＣ）、腸内毒素原性（ＥＴＥＣ）、腸管組織侵入性（ＥＩＥＣ）、及び腸管凝集付着性（ＥＡＥＣ）株が挙げられる。他のグラム陰性微生物としては、パスツレラ科の一員、好ましくはＰ・ムルトシダ及びマンヘミア・ヘモリチカ等のパスツレラ種、ならびに、緑膿菌を含むシュードモナス種等のシュードモナス科の一員が挙げられる。更に他のグラム陰性微生物としては、ボルデテラ種、バークホルデリア種、クラミジア種、エンテロバクター種、ヘリコバクター（Ｈｅｌｏｂａｃｔｅｒ）種、ヒストフィリウス（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ）種、モラクセラ種、レジオネラ種、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｉａ）種、リケッチア種、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｎｅｍａ）種、ナイセリア種、アクチノバシラス種、ヘモフィルス種、マイコバクテリア（Ｍｙｘｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、スポロキトファガ種、コンドロコッカス（Ｃｈｏｎｄｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、サイトファーガ種、フレキシバクター種、フラボバクテリウム種、アエロモナス種が挙げられる。エルシニア種の例としては、ペスト菌、Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、及びＹ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａが挙げられる。フソバクテリア科に属するフゾバクテリウム種の例としては、Ｆ．ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ（亜種のＦ．ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ及びＦ．ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ  ｓｕｂｓｐ．ｆｕｎｄｕｌｉｆｏｒｍｅを含む）、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｆ．ｃａｎｉｆｅｌｉｎｕｍ、Ｆ．ｇｏｎｉｄｉａｆｏｒｍａｎｓ、Ｆ．ｍｏｒｔｉｆｅｒｕｍ、Ｆ．ｎａｖｉｆｏｒｍｅ、Ｆ．ｎｅｃｒｏｇｅｎｅｓ、Ｆ．ｒｕｓｓｉｉ、Ｆ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、ならびにＦ．ｖａｒｉｕが挙げられる。
【００４２】
グラム陽性病原体の例としては、黄色ブドウ球菌等のブドウ球菌種を含むミクロコッカス科の一員が挙げられる。他のグラム陽性病原体としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｔｉａｅ等のデイノコッカス科の一員が挙げられる。抗原を入手できる他のグラム陽性微生物としては、バチルス種、クロストリジウム種、コリネバクテリウム種、エリシペロトリックス種、リステリア種、抗酸菌種が挙げられる。他のグラム陽性病原体としては、コリネバクテリウム科、エンテロコッカス科、ミクロコッカス科、マイコバクテリア科、ノカルジア科、及びペプトコッカス科の一員が挙げられ、放線菌種、ビフィズス菌種、腸球菌種、真正細菌種、キトコッカス（Ｋｙｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、乳酸菌種、ミクロコッカス種、モビルンカス種、マイコバクテリア種、ペプトストレプトコッカス種、及びプロピオニバクテリウム種、ガードネレラ種、マイコプラズマ、ノカルディア（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）種、ストレプトミセス種、ボレリア種、及びバチルス種等のかかる細菌種を含む。
【００４３】
病原性原生動物の例としては、腸内原生動物、泌尿生殖器原生動物、全身性原生動物、及び腸管外原生動物が挙げられる。具体例としては、例えば、赤痢アメーバ、ランブル鞭毛虫、クリプトスポリジウム・パルバム、Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ  ｂｅｌｌｉ、Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ  ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ、微胞子虫門の一員、トリコモナス原虫、熱帯熱原虫、トキソプラズマ・ゴンディ、サブクラスＣｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓの一員（例えば、Ｅ．アセルブリナ、Ｅ．ネカトリックス、Ｅ．テネラ等のアイメリア属の一員）、線虫、吸虫、ならびに条虫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
ウイルス性病原体の例としては、ラブドウイルス科の一員（水疱性口炎ウイルスＶＳＶ等）、アフトウイルス属の一員（口蹄疫ウイルスＦＭＤＶ等）、ペスチウイルス属の一員（ウシウイルス性下痢症ウイルス等）、アルテリウイルス科の一員（ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスＰＲＲＳＶ等）、コロナウイルス（ブタ流行性下痢ウイルスＥＰＤＶ、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ、ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）、トロウイルス属の一員（ウマトロウイルス等）、オルソミクソウイルス科の一員（インフルエンザウイルス等）、レオウイルス科の一員（ロタウイルス、ブルータング病ウイルス、トリレオウイルス等）、サーコウイルス科の一員、ヘルペスウイルス科の一員、レトロウイルス科の一員（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＬＶ、ＢＬＶ、ＲＳＶ等）、Ａｓｆａｒｉｒｉｄａｅ科の一員（アフリカブタコレラウイルス等）、フラビウイルス属の一員（デング熱ウイルス、黄熱ウイルス等）、パラミクソウイルス科の一員（ニューカッスル病ウイルス及び呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ等）、ならびに、アレナウイルス属の一員（ＬＣＭＶラッサウイルス（旧世界）複合体及びタカリベウイルス（新世界）複合体等）が挙げられるが、これらに限定されない。アレナウイルス属の一員の特異的非限定的例としては、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ピチンデウイルス、ラッサウイルス、Ｍｏｐｅｉａウイルス、フニンウイルス、Ｇｕａｎａｒｉｔｏウイルス、ルジョウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、及びホワイトウォーターアロヨウイルスが挙げられる。
【００４５】
一実施形態では、第２のコード領域によりコードされるタンパク質はインフルエンザウイルスからのもの、例えば核タンパク質、ヘマグルチニン、またはその一部であってよい。核タンパク質は、Ａ／ＰＲ８  ＮＰ（例えばＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４０９８２．１）を含むがこれらに限定されない任意の亜型であってよい。ヘマグルチニンは、Ｈ１及びＨ３を含むがこれらに限定されない任意の亜型であってよい。
【００４６】
第２のコード領域によりコードされるタンパク質は、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはこれらの組み合わせをもたらすタンパク質であってよい。一実施形態では、第２及び第３のゲノムセグメントの第２のコード領域によりコードされるタンパク質は、少なくとも６個のアミノ酸の長さを有する。抗原は、コード領域が発現する細胞に対して異種性であってよい。第２及び第３のゲノムセグメントに存在し、抗原をコードする第２のコード領域のヌクレオチド配列は、標準的な遺伝暗号を参照することにより、当業者により速やかに決定されることができる。第２及び第３のゲノムセグメントに存在し、抗原をコードする第２のコード領域のヌクレオチド配列を改変して、抗原が発現する細胞のコドン使用バイアスを反映してよい。ピチンデウイルスが発現するほぼ全ての細胞の使用バイアスは、当業者に既知である。
【００４７】
一実施形態では、第２のコード領域は、検出可能なマーカー（例えば、各種方法により容易に検出される分子）として有用なタンパク質をコードしてよい。例としては、蛍光性ポリペプチド（例えば緑色、黄色、青色、または赤色蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ならびに、それらの蛍光、酵素活性、または免疫特性により検出可能な他の分子（例えばｃ−ｍｙｃ、ｆｌａｇ、６ｘｈｉｓ、ＨｉｓＧｌｎ（ＨＱ）金属結合ペプチド、及びＶ５エピトープ）が挙げられる。
【００４８】
第２及び／または第３のゲノムセグメントが、抗原をコードするコード領域を含む場合、コード領域のヌクレオチドの最大サイズは、第２のゲノムセグメント及び第３のゲノムセグメントの合計のサイズを考慮することにより決定される。２つのゲノムセグメントの合計のサイズは、３．４キロベース（ｋｂ）以下、３．５ｋｂ以下、３．６ｋｂ以下、３．７ｋｂ以下、３．８ｋｂ以下、３．９ｋｂ以下、４．０ｋｂ以下、４．１ｋｂ以下、４．２ｋｂ以下、４．３ｋｂ以下、４．４ｋｂ以下、または４．５ｋｂ以下であってよい。
【００４９】
ピチンデウイルスはアレナウイルスであり、アレナウイルスの１つの特徴は、アンビセンスなゲノムであるということである。本明細書で使用する場合、「アンビセンスな」とは、センスとアンチセンス部分の両方を有するゲノムセグメントを意味する。例えば、本明細書で記載されるピチンデウイルスの第１のゲノムセグメントはアンビセンスであり、センス方向にＺタンパク質をコードし、アンチセンス方向にＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードする。したがって、第１のゲノムセグメントの２つのコード領域の１つはセンス方向にあり、もう一方はアンチセンス方向にある。第２及び／または第３のゲノムセグメントが、抗原をコードする第２のコード領域を含む場合、抗原をコードするコード領域は、第２のゲノムセグメントのＮＰタンパク質、及び第３のゲノムセグメントの糖タンパク質と比較してアンチセンス方向にある。
【００５０】
各ゲノムセグメントはまた、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’ＵＴＲをコードするヌクレオチドも含む。これらのＵＴＲは、各ゲノムセグメントの末端に位置している。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲとして有用なヌクレオチドは、ピチンデウイルスに存在するヌクレオチドであり、当業者は速やかに入手可能である（例えば、Ｂｕｃｈｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ：Ｋｎｉｐｅ  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ（ｅｄｓ），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．５ｔｈ  ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ．ｐｐ．１７９１−１８２７を参照）。一実施形態では、Ｚタンパク質及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするゲノムセグメントは、５’ＣＧＣＡＣＣＧＧＧＧＡＵＣＣＵＡＧＧＣＡＵＣＵＵＵＧＧＧＵＣＡＣＧＣＵＵＣＡＡＡＵＵＵＧＵＣＣＡＡＵＵＵＧＡＡＣＣＣＡＧＣＵＣＡＡＧＵＣＣＵＧＧＵＣＡＡＡＡＣＵＵＧＧＧ（配列番号：８）である５’ＵＴＲ配列、及びＣＧＣＡＣＣＧＡＧＧＡＵＣＣＵＡＧＧＣＡＵＵＵＣＵＵＧＡＵＣ（配列番号：９）である３’ＵＴＲを含む。一実施形態では、ＮＰタンパク質または糖タンパク質をコードするゲノムセグメントは、５’ＣＧＣＡＣＣＧＧＧＧＡＵＣＣＵＡＧＧＣＡＵＡＣＣＵＵＧＧＡＣＧＣＧＣＡＵＡＵＵＡＣＵＵＧＡＵＣＡＡＡＧ（配列番号：１０）である５’ＵＴＲ配列、及び５’ＣＧＣＡＣＡＧＵＧＧＡＵＣＣＵＡＧＧＣＧＡＵＵＣＵＡＧＡＵＣＡＣＧＣＵＧＵＡＣＧＵＵＣＡＣＵＵＣＵＵＣＡＣＵＧＡＣＵＣＧＧＡＧＧＡＡＧＵＧＣＡＡＡＣＡＡＣＣＣＣＡＡＡ（配列番号：１１）である３’ＵＴＲ配列を含む。これらの配列内での改変が可能であり、末端の２７〜３０ヌクレオチドはゲノムセグメント間で非常に保存されている。
【００５１】
各ゲノムセグメントはまた、Ｚタンパク質をコードするコード領域とＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするコード領域との間、核タンパク質をコードするコード領域と少なくとも１つの第１の制限酵素部位との間、及び糖タンパク質をコードするコード領域と少なくとも１つの第２の制限酵素部位との間に位置する遺伝子間領域も含む。遺伝子間領域として有用なヌクレオチドは、ピチンデウイルスに存在するヌクレオチドであり、当業者は速やかに入手可能である。一実施形態では、Ｚタンパク質及びＬ  ＲｄＲｐタンパク質をコードするゲノムセグメントのＩＧＲ配列は、５’ＡＣＣＡＧＧＧＣＣＣＣＵＧＧＧＣＧＣＡＣＣＣＣＣＣＵＣＣＧＧＧＧＧＵＧＣＧＣＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣＣＣＡＵＧＧＧＧＣＣＧＧＵＵＧＵＵ（配列番号：１２）を含む。一実施形態では、ＮＰタンパク質または糖タンパク質をコードするゲノムセグメントのＩＧＲ配列は、５’ＧＣＣＣＵＡＧＣＣＵＣＧＡＣＡＵＧＧＧＣＣＵＣＧＡＣＧＵＣＡＣＵＣＣＣＣＡＡＵＡＧＧＧＧＡＧＵＧＡＣＧＵＣＧＡＧＧＣＣＵＣＵＧＡＧＧＡＣＵＵＧＡＧＣＵ（配列番号：１３）を含む。
【００５２】
一実施形態では、各ゲノムセグメントはベクター内に存在する。一実施形態では、ベクター内のゲノムセグメントの配列はアンチゲノム性であり、一実施形態において、ベクター内のゲノムセグメントの配列はゲノム性である。本明細書で使用する場合、「アンチゲノム性」とは、ウイルスゲノムとは反対方向にタンパク質をコードするゲノムセグメントを意味する。例えば、ピチンデウイルスはアンチセンスＲＮＡウイルスである。しかし、各ゲノムセグメントはアンビセンスであり、センス及びアンチセンス方向の両方にタンパク質をコードする。「アンチゲノム性」とは、センス方向を意味し、一方で「ゲノム性」とはアンチセンス方向を意味する。
【００５３】
ベクターは、別のポリヌクレオチドが結合して、結合したポリヌクレオチドの複製をもたらすような複製ポリヌクレオチド（例えばプラスミド、ファージ、またはコスミド）である。ゲノムセグメントを含有するベクターの構築、及び抗原をコードするポリヌクレオチドの挿入を含むゲノムセグメントの構築には、当該技術分野において既知の標準的なライゲーション技術を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）  ｏｒ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）を参照のこと。更なるクローニング（ポリヌクレオチドの増幅）のためにベクターを提供できる（即ち、クローニングベクター）か、またゲノムセグメントによりコードされたＲＮＡの発現のためにベクターを提供できる（即ち、発現ベクター）。用語「ベクター」とは、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、または人工染色体ベクターを含むが、これらに限定されない。通常、ベクターは原核細胞及び／または真核細胞内で複製することができる。一実施形態では、ベクターは真核細胞内ではなく、原核細胞内で複製する。一実施形態では、ベクターはプラスミドである。
【００５４】
ベクターの選択は、得られる構築物の種々の所望の特性、例えば選択マーカー、ベクター複製速度等に依存する。本明細書のベクターをクローニングまたは発現させるのに好適な宿主細胞は、原核生物または真核細胞である。
【００５５】
発現ベクターは所望により、ゲノムセグメントに作用可能に結合した調節配列を含む。用語「作用可能に結合した」とは、構成要素を所望の様式で機能させる関係とするように構成要素を並置することを意味する。調節配列はゲノムセグメントに、調節配列と適合性のある条件下にてゲノムセグメントの発現が達成されるように結合した場合に、「作用可能に結合」している。１つの調節配列はプロモーターであり、これはＲＮＡポリメラーゼに結合し下流（３’方向の）ゲノムセグメントの転写を開始させる調節シグナルとして機能する。使用するプロモーターは構造性プロモーターまたは誘導性プロモーターであることができる。本発明は任意の特定のプロモーターの使用に限定されず、多種多様のプロモーターが知られている。一実施形態では、Ｔ７プロモーターが使用される。別の調節配列は、ゲノムセグメントの下流に位置する転写ターミネーターである。プロモーターにて転写を開始するＲＮＡポリメラーゼの転写を停止するように機能する任意の転写ターミネーターを使用してよい。一実施形態では、プロモーターがＴ７プロモーターである場合、Ｔ７転写ターミネーターもまた使用される。一実施形態では、ＲＮＡ分子のプロセシングを補助するためにリボザイムが存在する。ゲノムセグメントをコードする配列の後、かつ転写ターミネーターの前にリボザイムが存在してよい。リボザイムの例は、肝炎Δウイルスリボザイムである。肝炎Δウイルスリボザイムの一例は、５’ＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＴＡＧＣＣＡＴＣＣＧＡＧＴＧＧＡＣＧＡＣＧＴＣＣＴＣＣＴＴＣＧＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧＴＣＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＣＣＧＡＣＣＣ（配列番号：１４）である。
【００５６】
ベクター内に存在するゲノムセグメントの転写により、ＲＮＡ分子が得られる。３つのゲノムセグメントのそれぞれが細胞内に存在する場合、ゲノムセグメントのコード領域が発現し、ゲノムセグメントのそれぞれの１つのコピーを含有するウイルス粒子が作製される。本明細書で記載されるリバースジェネティクス系の３つのゲノムセグメントは、２つの一本鎖アンビセンスＲＮＡのセグメンテーションしたゲノムを有するアレナウイルスである、ピチンデウイルスをベースにしている。リバースジェネティクス系が感染性ウイルスを複製して作製する能力は通常、細胞内でのアンビセンスＲＮＡの存在を必要とする一方で、本明細書で記載されるゲノムセグメントは、この補体（即ち補体ＲＮＡ）、及び２つのＲＮＡ配列の対応するＤＮＡ配列もまた含む。
【００５７】
宿主細胞を形質転換するのに使用するポリヌクレオチドは所望により、通常は、増殖培地内の化合物を不活性化するか、もしくは検出する、またはこの化合物により検出される分子をコードする１つ以上のマーカー配列を含む。例えば、マーカー配列を含めることにより、形質転換細胞に抗生物質への耐性をもたらすことができるか、またはマーカー配列は形質転換細胞に化合物特異的な代謝を付与することができる。マーカー配列の例としては、カナマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、及びネオマイシンに対する耐性をもたらす配列がある。
【００５８】
本明細書においては、本明細書で記載されるウイルス粒子、または本明細書で記載される３つのゲノムセグメントを含む組成物もまた提供される。かかる組成物は通常、製薬上許容できる担体を含む。本明細書で使用する場合、「製薬上許容できる担体」としては、薬学的投与において適合性がある生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング材、抗菌及び抗カビ剤、等張化剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。更なる活性化合物もまた、組成物に組み込まれることができる。
【００５９】
本明細書に記載される組成物はワクチンと呼ばれてもよい。本明細書で使用する場合、用語「ワクチン」とは、動物への投与の際に、本明細書で記載されるゲノムセグメントの１つによりコードされる抗原に対する免疫応答をレシピエントが開始する可能性を増加させる組成物を意味する。
【００６０】
組成物は、製薬当業者に周知の方法により調製してもよい。一般に、組成物は意図する投与経路に適合性があるように処方することができる。   投与は全身または局所投与であってよい。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、筋肉内）、経腸（例えば経口）、及び局所（例えば皮膚上、吸入、経粘膜）投与が挙げられる。本発明の化合物の経腸投与に関して適切な投薬形態としては、錠剤、カプセルまたは液体を挙げてよい。非経口的投与に関して適切な投薬形態としては、静脈内投与を挙げてよい。局所投与に関して適切な投薬形態としては、鼻内噴霧、定量吸入器、ドライパウダー吸入または噴霧化を挙げてもよい。
【００６１】
溶液または懸濁液としては、以下の成分を挙げることができる：投与用水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液またはリン酸塩緩衝液等の緩衝液；ナトリウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、及びマグネシウムイオン等の電解質、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張度調節剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基により調節可能である。組成物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは分割投与用バイアルに密封することができる。
【００６２】
組成物は、滅菌水溶液（水溶性）または分散液、及び滅菌溶液または分散液の即席調製用滅菌粉末を含むことができる。静脈内投与に関して、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等が挙げられる。組成物は通常滅菌されており、かつ、注射用途に好適な場合は、注射針通過性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が容易となるような程度に流体でなければならない。組成物は、製造及び保管条件下において安定してなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用を克服して保管されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコール等）、ならびにこれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒とすることができる。微生物の作用を防ぐことは、種々の抗菌及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等により達成可能である。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖、ポリアルコール（マンニトール、ソルビトール等）、塩化ナトリウムを含むのが好ましい。組成物中に吸収を遅らせる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることにより、注射可能な組成物の吸収を遅らせることができる。
【００６３】
滅菌溶液は、必要量の活性化合物（例えば本明細書で記載されるウイルス粒子）を、上で挙げた成分の１つまたはそれらの組み合わせと共に適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製することができる。通常、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒及び任意の他の適切な成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことにより調製される。無菌注射可能な溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法としては、予め滅菌した溶液から、活性成分の粉末及び任意の追加の所望成分を得る真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられる。
【００６４】
口腔用組成物は通常、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療用投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と共に組み込み、錠剤、トローチ剤、またはカプセル（例えばゼラチンカプセル）の形態で使用することが可能である。マウスウォッシュとして使用するための流体担体を使用してもまた、口腔用組成物を調製することができる。薬学的に適合性のある結合剤、及び／またはアジュバントを、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、トローチ剤等は、以下の成分、または類似の性質を持つ化合物のいずれか：微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン等の結合剤；デンプンもしくはラクトース等の賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の滑剤；スクロースもしくはサッカリン等の甘味剤；または、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジフレーバリング等の香味剤を含有することができる。
【００６５】
吸入による投与に関して、活性化合物は、好適な噴射剤（例えば二酸化炭素等の気体）を含有する圧縮容器もしくは散布器、またはネブライザからのエアゾールスプレーの形態で送達される。
【００６６】
全身投与は経粘膜または経皮的方法とすることもできる。経粘膜または経皮投与に関して、バリアを浸透するのに好適な浸透剤を製剤で使用する。かかる浸透剤は当該技術分野において一般に既知であり、例えば、経粘膜投与に関しては界面活性剤、胆汁塩、及びフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧または座薬を使用することにより達成することができる。経皮投与に関して、活性化合物は当該技術分野において一般に既知の軟膏、蝋膏、ゲル、またはクリームに配合される。
【００６７】
活性化合物は、化合物が体から急速に取り除かれることを防ぐ担体、インプラント等の制御放出配合物を用いて調製してよい。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸等の生分解性・生体適合性ポリマーを使用することができる。標準的な技術を使用してかかる配合物を調製することができる。リポソーム懸濁液もまた、製薬上許容できる担体として使用可能である。当業者に知られている方法に従ってこれらを調製することができる。
細胞培養アッセイ及び動物研究から入手したデータを、動物で使用する広範な用量を配合するのに使用することができる。かかる化合物の用量は、毒性がほぼないか全くないＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。用いた投薬形態、及び利用した投与経路に応じて、用量はこの範囲内で変動し得る。
【００６８】
組成物を一度投与して免疫応答を得ることができるか、追加免疫として更に１回以上投与をして免疫応答を強化し、抗原に対する免疫の可能性を高めることが長く持続する。当業者は、病気または疾患の重症度、以前の治療、総体的な健康及び／または対象の年齢、ならびに存在する他の病気を含むがこれらに限定されない特定の因子が、対象を効果的に治療するのに必要な用量及びタイミングに影響を与え得ることを理解するであろう。
【００６９】
本明細書においては、ゲノムセグメントの使用方法もまた提供される。一実施形態では、方法は、感染性ウイルス粒子を作製することを含む。かかる方法としては、本明細書で記載される３つのゲノムセグメント（第１のゲノムセグメント、第２のゲノムセグメント、及び第３のゲノムセグメント）のそれぞれを含む細胞を提供すること、ならびに、各ゲノムセグメントの完全長ゲノムＲＮＡ分子を生成するのに好適な条件下にて細胞を培養することが挙げられるが、これらに限定されない。各ゲノムセグメントの完全長ゲノムＲＮＡはアンチゲノム性である。各ゲノムセグメントの完全長ゲノムＲＮＡ分子を作製することにより、各ウイルス遺伝子産物の転写及び翻訳、ならびにウイルスゲノムの増幅がもたらされ、感染性後代ウイルス粒子が生成される。本明細書で使用する場合、「感染性ウイルス粒子」とは、好適な真核細胞、例えば哺乳動物細胞（例えばマウス細胞もしくはヒト細胞）またはトリ細胞と相互作用することにより、３つのゲノムセグメントの細胞内への導入、及び３つのゲノムセグメントの細胞内への転写をもたらすウイルス粒子を意味する。本方法は、細胞内に、３つのゲノムセグメントをコードするベクターを導入することもまた含んでよい。感染性ウイルス粒子を上清中に放出させ、細胞上で培養することにより単離及び更に増幅してよい。本方法は、細胞、または細胞と細胞破片の混合物からウイルス粒子を単離することを含んでよい。本方法は、過酸化水素処理等の標準的な方法を使用して、ウイルス粒子を不活性化することを含んでよい。本明細書で記載される３つのゲノムセグメントを含有する、感染性または不活性化ウイルス粒子もまた提供する。
【００７０】
一実施形態では、方法は、細胞内での抗原の発現を含む。かかる方法としては、細胞内に、本明細書で記載される３つのゲノムセグメントを導入することが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、導入することは、感染性または不活性化ウイルス粒子を導入することによる。第２及び／または第３のゲノムセグメントは、抗原をコードする第２のコード領域を含んでもよい。第２及び第３のゲノムセグメントは、同じ抗原をコードしてよいか、またはこれらは異なる抗原をコードしてよい。２種類以上のウイルス粒子を投与してよい。例えば、各集団が異なる抗原をコードする場合に、２つのウイルス粒子の集団を投与してよい。本実施形態において、一回投与は、細胞内での複数の抗原の発現をもたらすことができる。細胞は、好適な真核細胞、例えば哺乳動物細胞（例えばマウス細胞もしくはヒト細胞）、またはトリ細胞である。一実施形態では、トリ細胞はトリ胚線維芽細胞である。細胞はｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏであってよい。３つのゲノムセグメントは、細胞を、３つのゲノムセグメントを含有する感染性ウイルス粒子と接触させることにより、またはゲノムセグメントを含むベクターを細胞内に導入することにより導入されてよい。本方法は更に、第２及び／または第３のゲノムセグメントに存在する１つまたは２つの第２のコード領域を含む３つのゲノムセグメントに存在するコード領域の発現に好適な条件下にて、細胞をインキュベーションすることを含む。本明細書で使用する場合、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」とは、動物の体から取り除かれた細胞を意味する。ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞としては、例えば、一次細胞（対象から最近取り除かれ、組織培地において限定的な増殖が可能な細胞）、及び培養細胞（例えば、組織培地内で長時間培養可能な細胞）が挙げられる。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」とは、対象の体内にある細胞を意味する。
【００７１】
一実施形態では、方法は、動物に免疫付与すること含む。かかる方法としては、動物に、本明細書で記載される３つのゲノムセグメントを含有する、感染性または不活性化ウイルス粒子を投与することが挙げられるが、これらに限定されない。第２及び／または第３のゲノムセグメントは、抗原をコードする第２のコード領域を含んでもよい。第２及び第３のゲノムセグメントは、同じ抗原をコードしてよいか、またはこれらは異なる抗原をコードしてよい。２種類以上のウイルス粒子を投与してよい。例えば、各集団が異なる抗原をコードする場合に、２つのウイルス粒子の集団を投与してよい。本実施形態において、一回投与により、複数の病原体に対する動物のワクチン接種をもたらすことができる。動物は、哺乳類またはトリ等の脊椎動物を含む、免疫付与が必要な任意の動物であってよい。動物は例えば、トリ（例えばニワトリもしくはシチメンチョウ等）、ウシ（例えばウシ種の構成要素等）、ヤギ（ｃａｐｒｉｎｅ）（例えばヤギ（ｇｏａｔ）等）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）（例えばヒツジ（ｓｈｅｅｐ）等）、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）（例えばブタ（ｓｗｉｎｅ）等）、バイソン（例えばバッファロー等）、コンパニオンアニマル（例えばネコ、イヌ、及びウマ等）、ネズミ科の構成要素（例えばラットもしくはマウス等）、モルモット、またはヒトとすることができる。一実施形態では、動物は、ウイルス性病原体、原核細胞病原体、または真核細胞病原体により引き起こされるか、またはこれらと関係のある病気等の感染症に曝されるリスクのある動物であってよい。一実施形態では、動物は、癌等の非感染症と関係のある抗原に対して免疫付与を行う必要がある動物であってよい。例えば、抗原は、癌細胞を標的化して取り除く免疫応答を動物に開始させることを補助する抗原であってよい。免疫応答は、体液性応答（例えば、免疫応答は抗原に対応する抗体の作製を含む）、細胞応答（例えば、食細胞、抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球の活性化、及び抗原に応答したサイトカインの放出）、またはこれらの組み合わせであってよい。
【００７２】
別の実施形態では、方法は、動物の特定の状態の１つ以上の症状を治療することを含む。一実施形態では、状態は、ウイルスまたは微生物による感染により引き起こされる。本明細書で使用する場合、用語「感染」とは、対象の体内にウイルスまたは微生物が存在すること、及びこれらが増殖することを意味する。感染は臨床的に不顕性であるか、またはウイルスまたは微生物により引き起こされる病気と関連する症状をもたらすことができる。感染は初期段階、または後期段階であることができる。別の実施形態において、状態は癌等の病気により引き起こされる。本明細書で使用する場合、用語「病気」とは、特徴的な症状、または一連の症状が発現した対象の一部、臓器、もしくは系、またはこれらの組み合わせの通常の構造または機能からの逸脱または中断の全てを意味する。本方法は、本明細書に記載される有効量の組成物を、状態、または状態の症状を有するか、またはこれらを有するリスクのある動物に投与すること、及び、状態の少なくとも１つの症状が変化、好ましくは低下したか否かを測定することを含む。
【００７３】
状態と関係する症状の治療は予防的とすることができるか、あるいは状態が進展した後に開始することができる。本明細書で使用する場合、用語「症状」とは、病気の感染により引き起こされる状態の対象における客観的な証拠を意味する。本明細書で言及される状態に関係する症状、およびかかる症状の評価は日常的なものであり、当該技術分野において既知である。予防的、例えば対象が状態の症状を発現する前に開始される治療は、本明細書において、状態が進展する「リスクを有する」対象の治療と呼ばれる。したがって、組成物の投与は、本明細書で記載される状態の発生の前、その間、またその後にて実施することができる。状態が進展した後に開始される治療は、状態の１つにおける症状の重症度の低下、または症状の完全な除去をもたらし得る。本発明の本態様において、「有効量」とは、状態の症状の発現を予防する、状態の症状の重症度を低下させる、及び／または症状を完全に除去するのに有効な量である。
【００７４】
動物に免疫付与するためのキットもまた、本明細書において提供する。キットは、本明細書に記載したウイルス粒子を、そこには、第２及び／または第３のゲノムセグメントはそれぞれ独立して抗原をコードするコード領域が含まれ、少なくとも１回の免疫付与に十分な量で、好適なパッケージ材料の中に含む。一実施形態では、キットは、２種類以上のウイルス粒子を含んでよい。例えば、キットは、１種または２種の抗原をコードするあるウイルス粒子、及び、１種または２種の他の抗原をコードする第２のウイルス粒子を含んでよい。所望により、本発明を実施するのに必要な緩衝液及び溶液等の他の試薬もまた含まれる。パッケージされたウイルス粒子を使用するための取扱説明書もまた、通常は含まれる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、語句「パッケージ材料」とは、キットの内容物を収容するのに使用される１つ以上の物理的構造物を意味する。パッケージ材料は、好ましくは滅菌した汚染物質非含有環境を提供する既知の方法により構築される。パッケージ材料は、動物の免疫付与のための使用可能なウイルス粒子を示すラベルを有する。更に、パッケージ材料は、動物に免疫付与するためにキット内の材料をどのように用いるのかを示す取扱説明書を含有する。本明細書で使用する場合、用語「パッケージ」とは、固定の限界内にウイルス粒子を保持することができる、固体マトリックス、またはガラス、プラスチック、紙、ホイル等の材料を意味する。したがって、例えば、パッケージは、適量のウイルス粒子を含有するのに使用されるガラス瓶とすることができる。「使用のための取扱説明書」は通常、ウイルス粒子の量、投与経路等を記載する有形の表現物を含む。
【００７６】
用語「及び／または」とは、一覧に記載した構成要素の１つもしくは全て、または一覧に記載した任意の２つ以上の構成要素を意味する。
【００７７】
単語「好ましい」および「好ましくは」とは、特定の状況下において特定の利点を与え得る本発明の実施形態を指す。しかし、同じ、または他の状況下において、他の実施形態もまた好ましい場合がある。更に、１つ以上の好ましい実施態様の詳細説明は、有用でない他の実施形態を示唆するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を除外することを意図するものではない。
【００７８】
用語「含む」及びその変形形態は、これらの用語が明細書及び特許請求の範囲で現れる箇所において制限的な意味を有しない。
【００７９】
特に断らない限り、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「少なくとも１つの」は同じ意味で用いられ、１つ、または２つ以上を意味する。
【００８０】
本明細書においてはまた、 終末点による数の範囲の詳細説明は、その範囲内に包含される全ての数を含む（例えば、１〜５は１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５等を含む）。
【００８１】
個々の工程を含む、本明細書にて開示した任意の方法に関して、これらの工程は任意の実行可能な順番で実施してよい。かつ適宜、２つ以上の工程の任意の組み合わせを同時に実施してよい。
【００８２】
本発明の上記概要は、本発明の開示したそれぞれの実施形態、または各実施を記載することを意図するものではない。以下に続く説明は、例示的実施形態をより詳細に示す。明細書全体のいくつかの場所において、実施例の一覧により案内を行い、これらの実施例は種々の組み合わせにより使用することができる。それぞれの事例において、引用した一覧は例示的グループのみとして機能し、排他的な一覧として解釈されるべきではない。
【００８３】
本発明は、以下の実施例により説明される。特定の実施例、材料、量、及び手順は、本明細書において以下に記述する本発明の精神及び範囲に従って広く解釈されるものであると理解されなければならない。
実施例１
インフルエンザウイルス抗原を有するアレナウイルス系ワクチンベクターは、致死性インフルエンザウイルスの抗原投与に対してマウスに長期間の防御を付与する。
【００８４】
ピチンデウイルス（ＰＩＣＶ）は、ウイルス性出血熱感染症を研究するためのモデルウイルスとして使用されてきている非病原性アレナウイルスである。ウイルスの大型（Ｌ）及び小型（Ｓ）ＲＮＡセグメントをコードする２つのプラスミドからの感染性ＰＩＣＶウイルスを生成するためのリバースジェネティクス系が以前に開発された（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２）。現在の研究において、３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶ系と呼ばれる、３つの別のプラスミドから感染性の組み換えＰＩＣＶウイルスを作製するための第２世代リバースジェネティクス系が作られた。これらの組み換えウイルスは、ウイルス性遺伝子産物の全て、及び２つの外来性遺伝子をコードする３つのウイルス性ゲノムＲＮＡセグメントを有する。この、３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶシステムは、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ８株の血球凝集（ＨＡ）及び核タンパク質（ＮＰ）を送達するための新規のワクチンベクターとして使用することができる。これらの組み換えウイルスで免疫付与されたマウスは、高濃度のＨＡ中和抗体及びウイルス感染に対するＮＰ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応により余力のある動物の生残によって明示されるように、致死性インフルエンザウイルスの抗原投与に対して防御されている。これらの３つにセグメンテーションされた組み換えＰＩＣＶウイルスは強力な抗ＰＩＣＶベクター免疫を誘導しないため、交差反応免疫を誘導するために初回投与−追加免疫ワクチン接種法により、これらを理想的な候補にする。まとめると、複数の外来性抗原を発現し、ｉｎ  ｖｉｖｏで強力な体液性及び細胞介在性免疫を誘導し、かつ抗ベクター免疫をほとんど誘導しないことが可能な新規の生残ワクチンベクターが開発されている。
導入
【００８５】
我々は、プラスミドを適切な哺乳類細胞内にトランスフェクションして感染性ＰＩＣＶウイルスを生成するための、唯一利用可能なリバースジェネティクス系を開発した（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２）。この系は、それぞれＰＩＣＶゲノム配列の上流及び下流に位置する改変バクテリオファージＴ７制御性（プロモーター／ターミネーター）シグナル配及び肝炎Δリボザイム列から完全長ゲノムＬ及びＳ  ＲＮＡを生成するための２つのプラスミドから構成される。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＢＳＲＴ７−５：ＢＨＫ−Ｔ７として知られている）を構造的に発現するベビーハムスターの腎臓上皮細胞内にトランスフェクションした際に、ＰＩＣＶのＬ及びＳ  ＲＮＡセグメントが生成され、これらから、Ｌポリメラーゼ及びＮＰ核タンパク質を含む全てのＰＩＣＶウイルス性遺伝子産物が、ウイルスゲノムを増幅し、感染性後代ウイルス粒子を生成するために転写及び翻訳される。感染性ＰＩＣＶウイルスが上清に放出され、単離され、アフリカミドリザル上皮（ベロ）細胞で培養することで更に増幅される。
【００８６】
本明細書に記載されるように ３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶ系と呼ばれる、３つの別のプラスミドから感染性の組み換えＰＩＣＶウイルスを作製するための第２世代リバースジェネティクス系が開発されている。これらの組み換えウイルスは、ウイルス性遺伝子産物の全て、及び２つの外来性遺伝子をコードする３つのウイルス性ゲノムＲＮＡセグメントを有する。この、３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶ系は、インフルエンザウイルスのウイルス性抗原等の他のウイルス性抗原を送達するための新規のワクチンベクターとして使用することができる。簡単に要約すると、インフルエンザウイルスＡ／ＰＲ８株の血球凝集（ＨＡ）または核タンパク質（ＮＰ）を発現する、３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶウイルスが作製されており、これらの３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶワクチンベクターは、免疫付与マウスにおいて抗ＰＩＣＶベクター免疫をほとんど起こさず、インフルエンザ特異的中和抗体及び、強力なインフルエンザ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の強力な産生といった、強力な体液性及び細胞介在性免疫を誘導することができ、これにより、このベクターは長期間にわたる交差反応免疫を誘導するための初回投与−追加免疫ワクチン接種戦略の理想的な候補となる。したがって、我々が開発した本明細書で記載されるこの新規のＰＩＣＶ系ワクチンベクターは、安全性、強力かつ耐久力のある細胞性及び体液性免疫応答の誘導、予め免疫が存在していないこと、ならびに抗ベクター免疫の欠如といった理想的なウイルスベクターに必要な全ての基準を満たしている。
材料及び方法
【００８７】
ＧＰＣまたはＮＰ遺伝子のいずれかを置き換える複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を有する、改変ピチンデウイルスＰ１８  Ｓ  ＲＮＡセグメントをコードするプラスミドの構築。
【００８８】
ＰＩＣＶ用のリバースジェネティクス系は、アンチゲノム（ａｇ）センス方向にＬ及びＳ  ＲＮＡセグメントをコードする２つのプラスミドをＢＨＫ−Ｔ７細胞内へトランスフェクションすることにより以前に開発されていた（図１）（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２）。オーバラップポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用して、Ｓ  ａｇＲＮＡコードプラスミド内で、ウイルス性糖タンパク質（ＧＰＣ）または核タンパク質（ＮＰ）遺伝子のいずれかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を複数のクローニング部位（ＭＣＳ）で置き換えた。得られたプラスミド（図２Ａ）のＰ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＭＣＳ及びＰ１８Ｓ−ＭＣＳ／ＮＰは、外来性遺伝子（例えばレポーター遺伝子及び／またはウイルス性抗原）のクローニングの便宜上、これらのプラスミド内に導入された制限酵素配列（Ｎｈｅ  Ｉ−Ｍｆｅ  Ｉ−Ａｃｃ６５Ｉ−Ｋｐｎ  Ｉ−  ＥｃｏＲ  Ｖ−Ｘｈｏ  Ｉ−Ｓｐｈ  Ｉ）を有するＭＣＳを含有する。
【００８９】
ＧＦＰレポーター遺伝子、インフルエンザＨＡまたはＮＰ遺伝子の、Ｐ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＭＣＳベクター内へのサブクローニング。ＰＣＲを使用して、Ａ／ＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）株由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子、及びインフルエンザＨＡまたはＮＰ遺伝子を、それぞれＮｈｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉ部位の間のベクターＰ１８Ｓ−ＧＦＰ／ＭＣＳの中にサブクローニングした。Ａ／ＰＲ８ヘマグルチニンのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０１７．１に見出すことが可能であり、Ａ／ＰＲ８核タンパク質のアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０１９．１に見出すことが可能である。組み換えプラスミド構築物はＤＮＡ塩基配列決定法により確認された。得られたプラスミド（図５）はそれぞれ、Ｐ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＧＦＰ、Ｐ１８Ｓ−ＧＰＣ／Ｈ１、及びＰ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＮＰと呼ばれている。
ＧＦＰ、インフルエンザＨＡまたはＮＰを発現する３つにセグメンテーションされた組み換えピチンデウイルスの回収。
【００９０】
ＢＳＲＴ７−５（ＢＨＫ−Ｔ７として知られている）細胞を、完全長Ｐ１８  Ｌ  ａｇＲＮＡセグメントを発現する３つのプラスミドで、Ｐ１８ＳセグメントをＧＰＣ（Ｐ１８Ｓ−ＭＣＳ／ＮＰ）の代わりにＭＣＳで、及び、Ｐ１８ＳセグメントをＮＰ（Ｐ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＧＦＰ、Ｐ１８Ｓ−ＧＰＣ／Ｎ１、またはＰ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＮＰ）の代わりにＧＦＰ、ＨＡ、またはＮＰでトランスフェクションすることにより、プラスミドから組み換えウイルスを回収した（図２Ｂ及び図５）。組み換えＰＩＣＶを生成する手順は、先に記載したもの（図１Ｂ）と実質的に同一である（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２）。手短に言えば、ＢＨＫ−Ｔ７細胞を８０％コンフルエンスまで増殖させ、トランスフェクションの４時間前に細胞を洗浄し、抗生物質非含有培地でインキュベーションした。トランスフェクションに関し、各プラスミド（２ｕｇ）を２５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに希釈し、室温で１５分間インキュベーションした。１０ｕＬのリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む等体積のＯｐｔｉ−ＭＥＭを加え、混合物を室温で２０分間インキュベーションした。インキュベーションの後、細胞をプラスミドでトランスフェクションし、４時間後に培地をもう一度置き換え、リポフェクタミンを取り除いた。トランスフェクションの４８時間後、細胞の上清をプラークアッセイのために収集した。個々のプラークから増殖したウイルスを使用して、ＢＨＫ−２１細胞上で増殖したストックを調製し、−８０℃で保管した。
３つにセグメンテーションされた組み換えＰＩＣＶベクターで感染した細胞内でのインフルエンザ抗原の発現の検出。
【００９１】
カバーガラス上で増殖したＢＨＫ−２１細胞に、野生型ピチンデウイルス（ＰＩＣＶ）、またはインフルエンザＨＡ（ｒＰＩＣＶ−ＨＡ）もしくはＮＰ遺伝子（ｒＰＩＣＶ−ＮＰ）のいずれかを発現する組み換えＰＩＣＶウイルスを感染させた。ウイルス感染の２４時間後、４％パラホルムアルデヒドを用いて、室温で１５分間かけて細胞を固定し、続いてリン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した。次に、細胞を１２分間０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００内でインキュベーションし、続いて一次抗体（マウス抗ＮＰインフルエンザＡ）により１時間インキュベーションした。次に、細胞を洗浄し、二次抗体（抗マウスａｌｅｘａ  ｆｌｏｕｒ−６４７）で室温で１時間インキュベーションした。
マウスの免疫付与及び抗原投与。
【００９２】
６〜８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、環境順化のため少なくとも１週間収容した。ＢＳＬ−２を備えた動物用施設で、マイクロアイソレーターケージの中にマウスを入れた。腹腔内経路により、総体積が１００ｕＬのｒＰＩＣＶウイルス１００，０００ｐｆｕをマウスに注射した。最後の追加免疫の１４日後に、１０ＬＤ５０（１０，０００ｐｆｕ）のマウスに馴化したインフルエンザＡ／ＰＲ８株を経鼻でマウスに抗原投与した。
四量体染色によるウイルス特異的ＣＴＬの分析。
【００９３】
単細胞の脾細胞を入手し、ＡＣＫ細胞溶解緩衝液を使用して赤血球（ＲＢＣ）を溶解した。次にＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％  ＦＢＳ）で２回、脾細胞を洗浄した。室温で１時間、ＮＰ３６６−３７４エピトープＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列番号：７）を含むＣＤ８−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＣＤ３−ＡＰＣ及びＨ−２Ｄｂ−ＰＥ四量体により細胞（１×１０５）を染色した。インキュベーション後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、標識した細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ＦｌｏＪｏソフトウエアを使用してＦＡＣＳデータを分析した。
血球凝集阻害アッセイ。
【００９４】
各免疫付与の１４日後に血液を収集し、血清を回収した。５体積の受容体破壊酵素（Ｓｉｇｍａ）を用いて一晩処理することにより血清から非特異的阻害剤を取り除き、続いて５６℃で４５分間インキュベーションし、酵素及び血清を不活性化した。次に、各血清サンプルを２５ｕＬのＰＢＳ中で連続希釈し、その後４ＨＡ単位のＡ／ＰＲ８を含有する等体積のＰＢＳと混合した。室温で１５分間インキュベーションした後、０．５％のシチメンチョウＲＢＣ（５０μＬ）を加え、凝集評価の前に４℃で１時間、混合物をインキュベーションした。凝集を阻害した最後の希釈の逆数として力価を記録した。
肺でのウイルス力価の測定。
【００９５】
マウスでのインフルエンザＡ／ＰＲ８の複製を評価するために、抗原投与の６日後に肺を収集し、重量を量りＬ１５培地内で均質化した。組織ホモジェネートを１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、単一層のＭａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞上の１２ウェルプレート内でウイルスを滴定した。
結果
１．ＧＦＰレポーター遺伝子を発現する３つにセグメンテーションされた組み換えピチンデウイルスの生成。
【００９６】
３つにセグメンテーションされたアレナウイルス系は最初、ｄｅ  ｌａ  Ｔｏｒｒｅ  ｇｒｏｕｐによりＬＣＭＶに関して報告された（Ｅｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６：３４７３−３４７８）。この会社は、１つが完全長Ｌセグメント、２つがＧＰＣまたはＮＰのいずれかを欠失したＳセグメントである３つのＲＮＡセグメントをパッケージングしている、感染性組み換えＬＣＭＶを生成した。我々は以前、ピチンデウイルス（ＰＩＣＶ）用のリバースジェネティクス系を開発している（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２）。ＰＩＣＶは、ヒトにおいて非病原性であるプロトタイプのアレナウイルスである。この系は、ＢＳＲＴ７−５（ＢＨＫＴ７として知られている）細胞内にトランスフェクションした際（図１）に、ＰＩＣＶのＬ及びＳセグメントを発現する２つのプラスミドから構成される。
【００９７】
現在の研究では、１つがＧＰＣの欠失を有し、他方がＮＰ遺伝子の欠失を含有するＳセグメントである、２つの異なるＳ  ＲＮＡセグメントを作製する３つのプラスミドから構成される第２世代のＰＩＣＶリバースジェネティクス系（図２）が生成されている。欠失したウイルス性遺伝子の代わりに、我々は複数のクローニング部位（ＭＣＳ）を挿入した（図２Ａ）。次に我々は、ＧＦＰレポーター遺伝子を、Ｐ１８  Ｓ２セグメント内の欠失したＧＰＣの位置で、ＭＣＳ内のＮｈｅ  Ｉ／Ｋｐｎ  Ｉ部位を使用してサブクローニングし、１つが完全長Ｐ１８  Ｌセグメント上でウイルス性Ｚ及びＬ遺伝子をコードするプラスミド、ならびに、ウイルス性ＧＦＰ遺伝子のみ、またはＮＰ及びＧＦＰレポーター遺伝子の両方のいずれかを発現する別の２つのＳ１及びＳ２プラスミド（即ち、Ｐ１８  Ｓ１−ＭＣＳ及びＰ１８  Ｓ２−ＧＦＰ）の３つのプラスミドをトランスフェクションしたＢＳＲＴ７−５細胞の上清から感染性ウイルスを生成した（図２Ｂ）。保管ウイルスを、プラーク精製したウイルスから調製した。全てのプラークは蛍光顕微鏡の下で緑色に見え、このことは、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰウイルスの回収に成功したことを示している。ベロ細胞（データは示さず）に加え、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰウイルス感染は、ＢＨＫ−２１及びＡ５４９等の他の許容細胞内でＧＦＰを発現し（図３）、ＢＨＫ−２１標的細胞の新鮮な培養物を感染させる際にＧＦＰを発現した感染性後代ウイルスをより多く放出した（図３）。このことは、細胞培養物内でのｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰウイルスの安定性及び完全性を示している。経時的研究は、ＧＦＰが感染の１２時間後に強力に発現し、上清中のｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰウイルスの濃度が約１６ｈｐｉで急激に増加すると、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰの完全な生活環は約１６時間であったことを示した（図４）。予備実験において、ＰＩＣＶ−ｔｒｉ−ＧＦＰウイルスベクターは、細胞培養においてニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ細胞株）を感染することができたことが発見された（データは示さず）。
【００９８】
２つ及び３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶのウイルス増殖を、０．０１の感染多重度（ｍｏｉ）にてＢＨＫ−２１上でｒＰ２、ｒＰ１８、及びｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰの増殖曲線分析を実施することにより比較した。予想通り、既知の毒性ｒＰ１８ウイルスはｒＰ２よりも、約０．５ｌｏｇのウイルス力価でわずかに早く、そして良好に増殖した。３つにセグメンテーションされたｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰウイルスは、約１から１．５ｌｏｇ低いウイルス力価にも関わらず、ｒＰ２及びｒＰ１８ウイルスと類似の速度で増殖した（図４）。まとめると、３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶウイルスは、２つにセグメンテーションされたｒＰ２及びｒＰ１８  ＰＩＣＶウイルスと比較して、増殖速度が遅くなり、及び力価が低下したようにみえる。
【００９９】
ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰウイルスの安定性を測定するために、即ち、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養することにより、ゲノム組み換えによりＧＦＰ遺伝子を失っている、２つにセグメンテーションされた野生型ウイルスの復帰変異体を選択するか否かを試験するために、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰをＢＨＫ−２１細胞培養液内で連続的に継代させ、種々の継代でプラークアッセイを実施し、それぞれのプラークにおけるＧＦＰの発現を調査した。試験した任意の継代（２３継代まで）において、全てのプラークは依然として高いＧＦＰレポーター遺伝子濃度を表し、このことは、ＧＦＰレポーター遺伝子は、細胞培養液内で大規模に継代した後でも、感染性ウイルス粒子内で安定して維持されることができることを示唆している。
２．  インフルエンザウイルス抗原を発現する、３つにセグメンテーションされた組み換えピチンデウイルスの生成。
【０１００】
インフルエンザウイルス  Ａ／ＰＲ８／Ｈ１Ｎ１株のＨＡ及びＮＰ遺伝子をそれぞれ、Ｐ１８  Ｓ２プラスミドのＭＳＣ内に分子的にクローニングした（図５）。ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡ及びｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰウイルスをそれぞれ生成するために、得られたＰ１８  Ｓ２−ＨＡ及びＰ１８  Ｓ２−ＮＰを、別々に、完全長Ｐ１８Ｌ及びＰ１８Ｓ１−ＧＦＰと共にＢＨＫ−Ｔ７細胞内にトランスフェクションした。
【０１０１】
組み換えウイルスがＰ１８Ｓ２−ＧＦＰセグメント上にＧＦＰレポーター遺伝子を有していたために、感染した細胞（即ちプラーク）は全て、蛍光顕微鏡の下で緑色であった（図６）。更に、感染後２４時間（ｈｐｉ）にて、ベロ細胞内で特異的抗ＨＡ及び抗ＮＰ抗体を使用した免疫蛍光アッセイによりＨＡ及びＮＰタンパク質の発現を検出した（図６）。これらを合わせると、我々は、３つにセグメンテーションされたウイルスを作製して、細胞感染の際に、ＧＦＰレポーター遺伝子及び２つの異なるインフルエンザウイルス性抗原（ＨＡ及びＮＰ）を含む、異なる外来性遺伝子を発現することができることを示した。
３．ｒＰ１８ｔｒｉベースのインフルエンザワクチンは、マウスにおいて防御免疫を誘導する。
【０１０２】
我々の実験室での以前の研究では、マウスを異なる経路で、高用量でのＰＩＣＶで感染させても、ＰＩＣＶが感染の４日後（ｄｐｉ）までに取り除かれるため病気を引き起こさないことが示された（データは示さず）。ここで、我々は、ｒＰ１８ｔｒｉベースのワクチンベクターがマウスで防御免疫を誘導可能か否かを実験した。Ｃ５７ＢＬ６マウスをモック感染させるか、低用量（５０ｐｆｕ）のＡ／ＰＲ８を鼻腔内で、またはそれぞれ１×１０５ｐｆｕのｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡ、及びｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰウイルスで腹腔内経路で感染させた。１４日目、及び２８日目に、マウスを同じ用量の同じウイルスで２回追加免疫した。中和抗体の力価測定のために、初回投与後、及び追加免疫後の異なる時点で血液サンプルを収集した。２回目の追加免疫の１４日後に、既知の致死量のＡ／ＰＲ８（１０ｘＭＬＤ５０）をマウスに抗原投与し、２１日目まで体重及び病徴を監視した。以前にＰＢＳまたはｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ免疫付与を受けた、抗原投与された動物は全て７ｄｐｉまでに死亡したが、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡのワクチン接種を受けたマウスは全て、致死性インフルエンザウイルスの感染から完全に防御された。ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰをワクチン接種した３匹のマウスのうち２匹が生き残った（図７）。ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡのワクチン接種に関して、抗原投与したマウスは体重を維持した一方、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰ群の２つの生存マウスは、初期段階でわずかな体重減少を示したものの、速やかに回復した（データは示さず）。死亡率のデータと一致して、ＨＡまたはＮＰをワクチン接種したマウスは、ＰＢＳまたはベクターのみを接種したマウスと比較して、３ｄｐｉにおいて肺の病理学的変化が最少であった。同様に、３ｄｐｉにおける肺でのウイルス力価もまた、防御と相関した。動物にモック、またはｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰベクターのみをワクチン接種した場合、Ａ／ＰＲ８ウイルスは３ｄｐｉにてマウスの肺の中で非常に多く複製した。対照的に、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡワクチン接種群においてはウイルス力価は検出されず、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰ群においてはウイルス力価は著しく低下した。
【０１０３】
これらを合わせると、これらの結果は、ｒＰ１８ｔｒｉベースのワクチンベクターは、マウスでの致死性インフルエンザウイルス感染から防御免疫を誘導することができることを示唆している。以前のインフルエンザワクチン研究に一致して、ＨＡワクチン接種はインフルエンザウイルスから生じた病気からの完全な防御を引き起こすことができるが、ＮＰワクチン接種は通常、病気の重症度を低下させ、かつｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス複製を制御することにより、部分的な防御をもたらす。
４．ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡワクチンは、マウス内で高い中和抗体力価を誘導する。
【０１０４】
ワクチン接種したマウスから収集した末梢血内で、異なる時点（初回投与の１４日後、１回目の追加免疫の７日及び１４日後、ならびに２回目の追加免疫の１４日後）にて血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価を測定した（図８）。ＧＦＰもＮＰもＨＡ特異的中和抗体を誘導することが予想されなかったため、予想通り、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ及びｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰ群からのＨＡＩ力価はバックグラウンドの濃度を超過しなかった。対照的に、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡワクチン接種群からのＨＡＩ力価は初回投与の１４日後に４０の濃度に達し、２回目投与後に実質的に増加した（図８）。このことは、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡワクチンがｉｎ  ｖｉｖｏで高濃度の中和抗体力価を誘導することができることを示唆している。≧４０の閾値ＨＡＩ力価が成功の、即ち、インフルエンザのリスクを５０％低下させる尺度として使用されるため（抗体保有力価）（Ｒｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  １２：５１９−５３６）、ＨＡＩデータは、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡの単回投与は防御を付与するのに十分であり得ることを示唆している。
【０１０５】
異なるワクチン接種経路により生成したＨＡＩ力価を比較した（図９）。腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または鼻孔内（ｉ．ｎ．）経路により、１回の初回投与及び１回の追加免疫により、マウスにｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡをワクチン接種した。全体的に比較的高いＨＡＩ力価が示したように、免疫付与の３つの経路全てにおいて、著しいレベルの体液性応答を惹起した。しかし、ｉ．ｍ及びｉ．ｐ注射経路における血清のＨＡＩ力価は、ｉ．ｎ群の力価より比較的高いようである。この結果に関係なく、これらのＨＡＩ力価は、ＰＲ８インフルエンザウイルスの致死性抗原投与に対する完全な防御を付与するには十分高かった。図１０に示すように、ワクチン接種した動物において著しい体重減少は見られなかった。
５．ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰワクチンは、マウスにおいて強いＣＴＬ応答を誘導する。
【０１０６】
ＮＰは細胞内ウイルス性タンパク質であり、ウイルスに対してＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導することが知られている。ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰワクチンがＣＴＬ応答を誘導可能か否かは、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰの腹腔内初回投与及び追加免疫の後の異なる時点において、脾臓細胞及びＰＢＭＣのＮＰ特異的四量体分析を行うことにより調査された。図１１（上）に示すように、ＮＰ特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４４＋  Ｔ細胞は初回投与の７日後であっても、低用量のＰＲ８感染に（高くはないにせよ）匹敵する程度に、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰをワクチン接種した群において検出された。細胞の数は追加免疫の７日後に更に増加し、追加免疫の１４日後でも依然として存在した（図１１中央）。我々は、ＣＴＬ応答における異なる播種経路の効果を発見した。図１２に示すように、ｉ．ｍ．及びｉ．ｐ．経路の両方が、ｉ．ｎ．経路の感染よりも強いＣＴＬ応答を誘導した。これらを合わせると、我々のデータは、ｒＰ１８ｔｒｉベースのベクターはｉｎ  ｖｉｖｏで強いＣＴＬ応答を誘導することができ、筋肉内及び腹腔内経路は強いＣＴＬ応答の誘導において、鼻孔内経路よりもよいことを示している。ｉ．ｍ経路が最適の体液性及びＴ細胞応答を誘発したため、後の実験はｉ．ｍ経路での免疫付与に続けて実施した。
６．ｒＰ１８ｔｒｉベースのワクチンは長期間効果のある免疫を引き起こすことができるのか？
【０１０７】
ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡワクチンベクターが長期間の免疫を誘導する潜在能力を評価した。４週間の間隔でＣ５７ＢＬ６マウスを２回免疫付与し、２回目の免疫付与の４週間または８週間後のいずれかに、致死量のＡ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを抗原投与した。初回投与の１４日及び３０日後、ならびに追加免疫の３０日及び６０日後にＨＡＩについて分析した血清サンプルは、強い中和抗体力価を示した（図１３Ａ）。抗原投与したウイルスＡ／ＰＲ／８は、モックワクチン接種したマウスの肺の中で十分に複製したが、ワクチン接種の４週間後に抗原投与したワクチン接種マウスの肺では、検出可能なウイルス力価は見られなかった。しかし、ワクチン接種の８週間後に抗原投与した免疫付与マウスの肺では著しく低いウイルス力価が見られた（図１３Ｂ）。図１３Ｃに示すように、ワクチン接種の４週間または８週間後のいずれかに抗原投与したｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡ免疫付与マウスでは著しい体重減少が見られなかったため、完全な防御が観察された。一貫して、免疫付与したマウスの肺では、著しい病理学的変化は見られなかった（図１３Ｄ）。総じて、免疫及び防御の水準は、免疫付与の２週間後に見られる水準に匹敵した。
ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡでの１回の免疫付与は、致死性Ｈ１Ｎ１抗原投与に対する防御を誘導した。
【０１０８】
筋肉内経路により、Ｃ５７ＢＬ６マウスにｒＰ１８ｔｒｉＧＦＰ−ＨＡを免疫付与した。驚いたことに、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡの単回投与が、マウス適合Ａ／ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１）ウイルスでの致死性感染に対する完全な防御を誘導した。図１４Ｂに示すように、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰをワクチン接種した対照マウスは、抗原投与の後、安楽死が必要となるまで体重が減少し続けた。この結果はまた、１０３ｐｆｕのｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡベクターを最少量投与することによる１回の免疫付与が、強力な血球凝集阻害（ＨＩ）Ａｂ応答を惹起し、防御を付与するのに十分であったことも示した（図１４Ａ）。抗原投与後に５〜６日間実施した肺断面の組織学的分析により、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡをワクチン接種したマウスにおける炎症の著しい低下が明らかとなったが、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰをワクチン接種したマウスは、炎症性細胞の肺の中への多量の浸潤、肺の鬱血、及び肺胞内浮腫を示した（図１４Ｃ）。
二重インフルエンザウイルスタンパク質抗原を発現するｒＰ１８ｔｒｉベースのウイルスの生成及び性質決定
【０１０９】
インフルエンザＨＡ及びＮＰ、またはＨＡ１及びＨＡ３を発現するｒＰ１８ｔｒｉベースのベクターを得るために、それぞれのインフルエンザウイルス遺伝子をコードするＤＮＡをプラスミドベクターＰ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＭＣＳ及びＰ１８Ｓ−ＭＣＳ／ＮＰの中に適宜挿入した。ＲＴ−ＰＣＲで増幅したＨＡ１、ＮＰ及びＨＡ３をクローニングし、各クローンの配列を確認した。得られたプラスミドをＰ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＨＡ１、Ｐ１８Ｓ−ＮＰ１／ＮＰ及びＰ１８Ｓ−ＨＡ３／ＮＰとして設計した。次に、二重抗原（インフルエンザＨＡ１及びＮＰ１）を発現する組み換えウイルスを、完全長Ｐ１８  Ｌ  ａｇＲＮＡセグメント、Ｐ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＨＡ１及びＰ１８Ｓ−ＮＰ１／ＮＰを発現する３つのプラスミドを同時にトランスフェクションすることにより救出した。同時に、スワップインフルエンザ遺伝子を含む、３つにセグメンテーションした類似の組み換えウイルスもまた、完全長Ｐ１８  Ｌ  ａｇＲＮＡセグメント、Ｐ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＮＰ１及びＰ１８Ｓ−ＨＡ１／ＮＰと同時にトランスフェクションすることにより生成した。同様に、完全長Ｐ１８  Ｌ  ａｇＲＮＡセグメント、Ｐ１８Ｓ−ＧＰＣ／ＨＡ１及びＰ１８Ｓ−ＨＡ３／ＮＰを発現する３つのプラスミドを同時にトランスフェクションすることにより、二重抗原（インフルエンザＨＡ１及びＨＡ３）を発現する組み換えウイルスを救出した。
【０１１０】
興味深いことに、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＮＰはｒＰ１８ｔｒｉ−ＮＰ／ＨＡよりも低い力価を有し、ベロ細胞内でより小さいプラークを形成した（図１５Ａ）。しかし、インフルエンザウイルスタンパク質抗原の発現量は、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＮＰ／ＨＡと比較してｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＮＰの中で高かった（図１５Ｂ）。
複数のインフルエンザウイルスタンパク質抗原（ＨＡ及びＮＰ）をコードするｒＰ１８ｔｒｉベースのベクターは、免疫付与したマウス内で体液性及びＴ細胞応答の両方を誘導した。
【０１１１】
インフルエンザウイルスＨＡ及びＮＰの両方をコードするｒＰ１８ｔｒｉベースのベクターは、１０４ｐｆｕ／ｍＬのｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＮＰまたはｒＰ１８ｔｒｉ−ＮＰ／ＨＡベクターのいずれかを免疫付与したマウスにおいて、強力な体液性及びＴ細胞応答を誘導することに成功した。マウスの末梢血及び脾臓を使用して、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ四量体を使用した、免疫優性ＮＰ３３６エピトープに対するＴ細胞応答のレベルを監視した。抗ＮＰ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、免疫付与したマウスの末梢血及び脾細胞で検出された。免疫付与の７日後に、マウスではＮＰ特異的Ｔ細胞の割合が著しく増加した（図１６Ａ）。四量体陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞は追加免疫の７日後にピークを迎え、追加免疫の１４日後まで静止水準を維持した（図１６Ｂ）。両方のワクチン候補もまた、初回投与の１４日後、及び追加投与の１４日後に収集した血清において血球凝集阻害力価により評価した強い体液性応答を惹起した。ＨＩ力価は、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＮＰを免疫付与したマウスにおける追加免疫後に増加したが、かかる上昇は、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＮＰ／ＨＡを免疫付与したマウスでは観察されなかった（図１６Ｃ）。
【０１１２】
これらを合わせると、ｒｔｒｉＰ１８−ＨＡ／ＮＰワクチンは、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＮＰ／ＨＡワクチンと比較して強い免疫応答を惹起した。より高いｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＮＰの免疫応答のレベルは、インフルエンザウイルス抗原のより高い発現量に起因する可能性がある（図１５Ｂ）。しかしながら、ベクターワクチンｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＮＰ及びｒＰ１８ｔｒｉ−ＮＰ／ＨＡの両方が、Ａ／ＰＲ／８インフルエンザウイルスの致死性抗原投与に対する完全な防御を付与した。免疫付与したマウスでは、病徴は観察されなかった。図１７Ａに示すように、ワクチン候補のいずれかを免疫付与したマウスの肺において、著しい組織構造の変化は検出されなかった。対照的に、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰをワクチン接種したマウスの肺において、炎症性細胞の浸潤が観察された。肺でのウイルス力価を分析し、感染の３日後及び６日後における、抗原投与したウイルスの複製を測定した。モックワクチン接種したマウスは高いウイルス力価を示したが、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ／ＮＰ及びｒＰ１８ｔｒｉ−ＮＰ／ＨＡをワクチン接種したマウスは６日目に検出可能な力価を示さず、各群の３匹のマウスの中の１匹は、感染の３日後にそれぞれ、３×１０３ｐｆｕ／ｍＬ及び５×１０３ｐｆｕ／ｍＬの力価を示した（図１７Ｂ）。ワクチン候補のいずれかをワクチン接種したマウスでは、体重減少は見られなかった（図１７Ｃ）。
複数のインフルエンザ抗原（ＨＡ１及びＨＡ３）をコードするｒＰ１８ｔｒｉベースのベクターは、二重抗原投与に対する防御を誘導した。
【０１１３】
異なる群のＣ５７ＢＬ６雌マウスを、Ｈ１亜型ウイルスのＨＡのみをコードするｒｔｒｉＰ１８ベースのベクター（ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ１）、もしくはＨ３亜型のＨＡのみをコードするｒｔｒｉＰ１８ベースのベクター（ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ３）、またはＨ１亜型とＨ３亜型の両方のＨＡをコードするｒｔｒｉＰ１８ベースのベクター（ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ１／ＨＡ３）ワクチンのいずれかを２回投与することで免疫付与した。結果は、ＨＡ１及びＨＡ３をコードするｒｔｒｉＰ１８ベースのベクターの最初の投与は、ＰＲ８及びＸ３１に対する強力なＨＩ力価により明らかになったように、コードされたインフルエンザウイルス性抗原の両方に対する抗体応答を誘導したことを示した。ワクチンの２回目の投与は、抗体応答を更に増強した。興味深いことに、ＨＡ１及びＨＡ３の両方をコードするｒＰ１８ｔｒｉによる、ＰＲ８（Ｈ１）及びＸ３１（Ｈ３）に対して誘導したＨＩ力価は、ＨＡ１またはＨＡ３のみをコードするｒｔｒｉＰ１８ベースのベクターにより誘導されたＨＩ力価に相当した（図１８Ａ）。Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、同様の結果が得られた（図１８Ｂ）。致死量のＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）またはＸ３１（Ｈ３Ｎ２）ウイルスによる抗原投与に際し、ＨＡ１及びＨＡ３の両方をコードするｒＰ１８ｔｒｉベースのベクター（ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ１／ＨＡ３）を免疫付与したマウスは、両方のウイルス抗原投与に対して防御された。抗原投与したウイルスの複製を防ぐｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ１／ＨＡ３の防御効果を、ウイルス抗原投与の５日後に評価した。抗原投与したウイルスであるＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）及びＸ３１（Ｈ３Ｎ２）は、モックワクチン接種したマウスの肺の中では、それぞれ１０５及び１０４ｐｆｕ／ｍＬの平均力価で十分に複製した。体重減少が見られず、免疫付与したマウスのいずれにおいても、肺の中で検出可能なウイルス力価が見られなかったため、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＡ１／ＨＡ３の免疫付与は、両方のウイルス抗原投与をしたマウスを防御した（図１９Ａ及びＢ）。
ｒＰ１８ｔｒｉベースのインフルエンザワクチンは、抗ベクター免疫を誘導しなかった。
【０１１４】
生きているウイルスベクターの認知された弱点は抗ベクター免疫であり、これは、同じベクターにより誘導される免疫応答を低下させ、初回投与−追加免疫ワクチン接種法での使用を排除する。通常の集団において、ＰＩＣＶには予め免疫がほとんど存在しないか、または全く存在しない（Ｔｒａｐｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９７１，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ  ２０：６３１−６４１）。同じベクターの初回投与−追加免疫により抗体量及びＣＴＬ応答レベルを測定することにより、ＰＩＣＶベクターに対する抗ベクター免疫の効果を我々は測定した。驚くべきことに、ｒＰＩＣＶｔｒｉベクターに対する抗ベクター免疫の証拠は発見されなかった。図８に示すように、同じベクターによる追加免疫はＨＡＩ力価を実質的に更に増加させ、このことは、ＨＡ特異的体液性応答が２回目、及び３回目の追加免疫の後でさえも体液性応答を増加させたことを示唆している。ＣＴＬ応答についても同様の結果が観察された。脾臓及びＰＢＭＣの両方において、ＮＰ特異的ＣＤ８及びＣＤ４４  Ｔ細胞が追加免疫後に増加した（図２０）。これらを合わせると、我々のデータは、ｒＰＩＣＶベクターは強力な抗ベクター免疫を誘導せず、したがって初回投与−追加免疫ワクチン法で繰り返し使用可能であることを示唆している。
要約
【０１１５】
対象の２つまでの外来性遺伝子をコード可能な、３つにセグメンテーションされた組み換えＰＩＣＶウイルスを生成するための、新規のＰＩＣＶリバースジェネティクス系が開発されてきている。これらのｒＰ１８ｔｒｉベースの組み換えウイルスは、標的細胞内で、ＧＦＰレポーター遺伝子と共にインフルエンザＨＡ及び／またはＮＰ遺伝子を発現することができる。マウスで試験をすると、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＨＡウイルスは高濃度のＨＡ特異的中和抗体を誘導することができる一方、ｒＰ１８ｔｒｉ−ＧＦＰ／ＮＰは強力なＮＰ特異的ＣＴＬ応答を誘導することができる。更に、二重インフルエンザウイルス性抗原のＨＡ及びＮＰを発現するｒＰ１８ｔｒｉベースのベクターは、Ａ／ＰＲ８の致死性抗原投与に対する免疫付与マウスにおける完全な防御を付与した体液性及びＴ細胞応答の両方を誘導することに成功した。更に重要なことに、２つの異なるインフルエンザウイルス亜型、即ちＰＲ８（Ｈ１Ｎ１）及びＸ３１（Ｈ３Ｎ２）のＨＡを発現するｔｒｉＰ１８ベースのベクターは、両方のウイルス抗原投与に対する防御を付与し、このことは、病原性インフルエンザウイルスに対するこれらの新規のワクチンベクターの実力及び融通性を示している。ＰＩＣＶベクターに対する既存の免疫は存在しないこと、及び、３つにセグメンテーションされたＰＩＣＶウイルスを免疫付与した動物は抗ＰＩＣＶベクター免疫をほとんど生成せず、初回投与−追加免疫ワクチン接種法が必要とされる場合におけるワクチン接種の反復の際に、これらの動物が、強力で長期間続く交差反応性免疫を誘導する理想的なベクターワクチンプラットフォームとなることを述べておくのもまた大事である。
実施例２
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのアレナウイルス感染における、ＮＰエキソリボヌクレアーゼの生物学的役割。
【０１１６】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）抑制において、アレナウイルスＮＰ  ＲＮａｓｅ活性は重要であるものの、この生物学的役割は十分に特性決定されていない。ＲＮａｓｅ触媒変異を有する組み換えピチンデウイルスは高濃度のＩＦＮを誘導してＩＦＮコンピテント細胞内では不十分に増殖し、モルモットに感染すると、刺激された強力なＩＦＮ応答では生産的に複製を行うことができず、野生型復帰変異体が生成された。したがって、ＮＰ  ＲＮａｓｅ活性は、アレナウイルス感染の初期におけるＩＦＮ抑制、及び生産的複製の確立に必要不可欠である。
【０１１７】
アレナウイルスは、いくつかの出血熱（ＨＦ）誘起作用物質（例えばラッサウイルス−ＬＡＳＶ）を含むが、予防用または治療用手段は限られている（ＭｃＬａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ９７：８１−９２，ＭｃＬａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ９５：１−１５）。アレナウイルスの病因は高いウイルス血症、及び一般的な免疫抑制と関係があり、このメカニズムは不十分にしか理解されていない。ウイルスＮＰは、そのエキソリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）機能によりＩ型ＩＦＮの抑制を効果的に仲立ちすることができることが示されている（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：１６９４９−１６９５９，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓｏｂｒｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８１：１２６９６−１２７０３，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓｏｂｒｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８０：９１９２−９１９９，Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  ４６８：７７９−７８３，Ｈａｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８：２３９６−２４０１，Ｈａｓｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４４２１１）。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏで宿主の免疫抑制を仲立ちするＮＰ  ＲＮａｓｅ活性の役割は、十分に特性決定されていない。本研究では、モルモットでのピチンデウイルス（ＰＩＣＶ）感染を、アレナウイルス出血熱（ＨＦ）の代理モデル（Ａｒｏｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４５：２２８−２３５，Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２）として使用し、ウイルス感染、及び宿主でのＩＦＮ応答におけるＮＰ  ＲＮａｓｅの役割と特性を決定する。ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）レポーターアッセイによると、ＲＮａｓｅ触媒残基（Ｄ３８０Ａ、Ｅ３８２Ａ、Ｄ５２５Ａ、Ｈ５２０Ａ、及びＤ４５７Ａ）のそれぞれにおける１個のアラニン置換は、ＮＰの、センダイウイルスが誘導するＩＦＮβ活性化を抑制する能力を破壊して（図２１Ａ）、これは、ＬＡＳＶ  ＮＰを用いた我々の以前の観察（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，  Ｎａｔｕｒｅ  ４６８：７７９−７８３）を強固なものにしている。我々が開発したｒＰ１８  ＰＩＣＶリバースジェネティクス系（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２）を使用して、我々は、配列決定により確認した個々のＲＮａｓｅ変異を有する組み換えウイルスを生成することに成功した。モルモットにおいて毒性感染を引き起こすＷＴ  ｒＰ１８、及び無毒性感染を引き起こすＰＩＣＶ  ｒＰ２と共に、５つのＲＮａｓｅ変異を使用して、ＭＯＩ＝１にてヒトの気道上皮Ａ５４９細胞を感染させた。ｒＮＤＶ−ＧＦＰ生物学アッセイにより、１２ｈｐｉ及び２４ｈｐｉにおけるＩ型ＩＦＮの産生を定量化した（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７：１５０１−１５１１）。多量のＧＦＰ発現により示されるように、ｒＰ２及びｒＰ１８の両方が、モック感染と類似して低量のＩＦＮを産生した（図２１Ｂ）。両方の株のＮＰタンパク質が機能的ＲＮａｓｅドメインをコード���るため、このことは驚くべきことではなく、ＩＦＮ産生を抑制するこれらの能力に違いはないようである（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ  １５３：１２４１−１２５０）。対照的に、大幅に低下したＧＦＰの発現より示されるように、ＲＮａｓｅ変異体はより多くのＩＦＮを産生した（図２１Ｂ）。したがって、ウイルス感染した細胞におけるＩ型ＩＦＮを効果的に阻害するために、ＮＰ  ＲＮａｓｅ活性は必要である。
【０１１８】
ｍｏｉ＝０．０１において、ＩＦＮ欠失ベロ細胞及びＩＦＮコンピテントＡ５４９細胞にて、ウイルス増殖速度を測定した。ＷＴ  ｒＰ１８よりも約０．５〜１ｌｏｇ低いにも関わらず、５つの変異体は全て、ベロ細胞内で十分に複製し、４８ｈｐｉで１０６ｐｆｕ／ｍＬに達した（図２２Ａ、左）。はっきりと対照的に、これらのＲＮａｓｅ変異ウイルスはＡ５４９細胞内ではほとんど増殖しなかった（図２２Ａ、右）。我々の結果は、ＮＰ  ＲＮａｓｅ活性は基本的なウイルス生活環には必要不可欠ではないが、ＩＦＮコンピテント細胞における生産的ウイルス複製のために必要であることを示唆しており、これは、ＬＡＳＶ二重変異体（Ｄ３８９Ａ／Ｇ３９２Ａ）に関する最近公開されたデータ（Ｃａｒｎｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：１２０９３−１２０９７）に一致する。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス病原性を比較するために、前述のようにそれぞれのウイルス１ｘ１０４ｐｆｕを、６匹のＨａｒｔｌｅｙ非近交モルモットに腹腔内感染させた（Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：６３５７−６３６２，Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４３３：９７−１０３，ＭｃＬａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：６６３５−６６４３）。全ての手順が、ミネソタ大学の動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）により認可された。体重及び病気の徴候について、動物を１８日間毎日監視し、ノモグラムと比較して３０％を超える体重減少、または体重減少の継続と共に、直腸温が３８℃以下になる等の所定の終末点（瀕死）に達した際に安楽死させた。予想通り、ｒＰ２に感染した動物は生き残りウイルスを取り除いたが、ｒＰ１８に感染した動物は早くから熱を出し、７ｄｐｉから著しい体重の減少が始まったことが示され、１３ｄｐｉまでに終末点に達した（図２２Ｂ）。ＲＮａｓｅ変異ウイルスは、様々な病気の結果を引き起こした（図２２Ｂ及び表１）。Ｅ３８２Ａ変異ウイルスに感染した動物は全て、体重減少のいかなる証拠もなく生残したが、３つの他の変異ウイルス（Ｄ５２５Ａ、Ｈ５２０Ａ、及びＤ４５７Ａ）のそれぞれに感染した動物は、様々な程度での衰弱が見られた（図２２Ｂ）。しかし、Ｄ３８０Ａに感染した動物の大部分は、ｒＰ１８よりもしばらく経った時点において感染により死んだ。ＷＴ復帰変異体が発生したか否かを測定するために、エンドポイントにおいてウイルス血症の程度を測定し、ウイルスを配列決定した（表１）。予想通り、瀕死の動物は全て、高いウイルス血症が関係していたが、生き残った動物は全て、ウイルス感染は非常に低く、検出できない程度であった。例外なく、変異体に感染した動物から単離したウイルスを、ＷＴ  ＮＰ配列に復帰させた（表１）。同時に実施した他の変異ウイルスに感染した動物から単離したウイルスは、依然として予想した変異を含有していたため、これはＰＣＲの汚染、または配列決定でのエラーでは非常に起こりにくいことである（データは示さず）。それ故、我々は、病気の表現型はＷＴ復帰変異体を含むＷＴウイルスにより引き起こされ、病気の重症度は、復帰突然変異がｉｎ  ｖｉｖｏでどれほど速く生じるかによって測定されると考えている（１８日目において生残している動物は、わずかな量をＷＴウイルスを有していることが分かった）。我々の結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアレナウイルス感染における、ＮＰ  ＲＮａｓｅ活性の必要不可欠な役割を強く示唆している。
【表１−１】
2017529084.tif 000001
【表１−２】
2017529084.tif 000002
１  動物が終末点に到達した際、または感染後１８日目における安楽死の時に収集した血液中でのウイルス力価。  
２  動物が終末点に到達した際、または感染後１８日目における安楽死の時に動物から単離したウイルスの配列。  
３  ｒＰ２に感染した群の動物は６匹全て、感染後１８日目において、検出可能なウイルス血症が存在せずに生き残った。
４  ＮＤ、プラークアッセイにより検出不可能
【０１２０】
感染した動物における、初期のウイルス感染におけるＲＮａｓｅの役割、及び宿主先天性免疫応答を調査するために、ウイルスの拡散を監視し、１ｄｐｉ及び３ｄｐｉにおける、元々の抗ウイルス遺伝子を定量化した。１日目において、ｒＰ１８に感染した動物の肝臓及び脾臓の中で、ならびに、ｒＰ２及びＲＮａｓｅ変異ウイルスに感染したいくつかの動物の肝臓の中で、僅かな量でウイルスが検出された（図２３Ａ）。３日目において、ｒＰ１８及びｒＰ２の両方が、肝臓と脾臓の両方で比較的多く複製された。対照的に、ＲＮａｓｅ変異ウイルスは、肝臓からはなくなり、いくつかの脾臓のみでごく微量検出されたようであった（図２３Ａ）。１日目における、腹腔細胞内での代表的な先天性免疫応答遺伝子、ＩＦＮ−α１、ＩＦＮ−β１、ＩＳＧ１５、ＩＲＦ７、ＲＩＧ−Ｉ、及びＭＤＡ５を、定量的リアルタイムＰＣＲにより定量化した（図２３Ｂ）。これらの遺伝子は、ＷＴウイルス（ｒＰ２及びｒＰ１８）ではなくＲＮａｓｅ変異ウイルスにより非常に活性化され、このことは、アレナウイルスにより誘導されるｉｎ  ｖｉｖｏでの生来性の免疫抑制にＮＰ  ＲＮａｓｅが必要であることを示している。
【０１２１】
まとめると、組み換えＰＩＣＶ  ＲＮａｓｅ変異体を使用した我々の研究は、Ｉ型ＩＦＮの抑制、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルス複製におけるＮＰ  ＲＮａｓｅの重要な役割を確認しただけでなく、初期の先天性免疫抑制における重要な役割に関する決定的な証拠ももたらし、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける増殖性感染の確立を可能にした。ＮＰ  ＲＮａｓｅに依存するＩＦＮ抑制のメカニズムがアレナウイルス間で保存されている（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８８：１６９４９−１６９５９）ことを考慮すると、我々の結果は、他のアレナウイルス病原体にも当てはめることが可能であり、ＮＰ  ＲＮａｓｅが抗ウイルスの開発のための理想的標的であることを示唆している。
実施例３
アレナウイルス系ワクチンベクターは２つの抗原を送達し、それぞれの抗原に対する免疫を付与する。
１．二重インフルエンザ抗体ＨＡ及びＮＰを発現する生きたｒＰ１８ｔｒｉワクチンベクターの生成。
【０１２２】
実施例１は、複製能のある、３つにセグメンテーションされたｒＰＩＣＶ系（ｒＰ１８ｔｒｉ）、及びこのｒＰ１８ｔｒｉベクターを使用して、インフルエンザＨＡ（Ｈと略される）またはＮＰ抗原（Ｐ）のいずれかを発現させることを開示し、ベクターはマウスにおいて強力な抗体及びＣＴＬ応答を誘導することが開示された。１つのｒＰ１８ｔｒｉヴィリオン粒子を使用してＨＡ及びＮＰ遺伝子の両方を送達できるか否かを測定するために、Ｓ１及びＳ２ウイルスゲノムＲＮＡセグメントを生成して、それぞれインフルエンザＨＡ及びＮＰ遺伝子をコードした。トランスフェクション反応において異なる組み合わせのプラスミドを使用することにより、我々は生きたワクチンベクターのｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ及びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐを生成することに成功した。これらは図２４Ａに示すように、異なるＳセグメント上でＨＡ及びＮＰ遺伝子をコードする。対照ベクターとして、Ｓ１及びＳ２セグメントの両方でｅＧＦＰレポーター遺伝子をコードするｒＰ１８ｔｒｉベクター（ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｇ）もまた生成した。抗原の発現を測定するために、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｇ、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ、及びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐにそれぞれ、ベロ細胞を感染させた。２４ｈｐｉにて、マウス抗ＨＡ及び抗ＮＰ抗体をそれぞれ使用したＩＦＡにより、細胞におけるＨＡ及びＮＰの発現を調査し、その後、ＰＥコンジュゲート化抗マウス抗体を用いて検出した。ＨＡ及びＮＰタンパク質の両方発現は、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ及びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐに感染した細胞で検出されたが、ベクター対照ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｇに感染した細胞では検出されなかった。ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ感染よりも、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐ感染によりＨＡ及びＮＰを発現する細胞の数が少ないのは、感染で使用したウイルス力価が低いことが原因である（図２４Ｂ）。後で行った、ｍｏｉが０．０１におけるＢＨＫ−２１細胞のウイルス増殖分析は、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ及びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐは類似の反応速度で複製し、ベクター対照ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｇよりも＜０．５ｌｏｇ低いことを示唆している（図２４Ｃ）。
２．ＨＡ／ＮＰ二重抗原ワクチンベクターはマウスにおいて防御免疫を誘導することができる。
【０１２３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの生きたｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ及びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐベクターの防御免疫を試験するために、我々は、マウスの群（ｎ≧３）を１ｘ１０４ｐｆｕのｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｇ対照ベクター、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ、またはｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐに、ＩＭ経路により感染させ、１４日後に同じベクターを追加免疫させ、ワクチン接種の１４日後に、致死量のマウス適合Ａ／ＰＲ８インフルエンザウイルス（１０×ＭＬＤ５０）を抗原投与した。対照ベクターを免疫付与したマウスは全て、６日目までに感染して死んだが、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／ＨまたはｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐを受けたマウスは全て、いかなる病気の徴候も体重減少もなく抗原投与から生き延びた（図２５Ａ）。３及び６ｄｐｉで、肺の中で高いウイルス力価（２〜１０×１０５ｐｆｕ／ｇ）を有した、対照ベクターを免疫付与したマウスと比較して、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／ＨまたはｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ／Ｐを免疫付与したマウス（各群においてｎ＝３）は６ｄｐｉにて検出可能なウイルスは見られず、３匹のうち１匹のみが、３ｄｐｉにおいて比較的少量のウイルスを有した（＜５×１０３ｐｆｕ／ｇ）（図２５Ｂ）。我々のデータは、ウイルスベクターを発現する二重抗原は、インフルエンザウイルスに対して強力な、ＨＡ特異的中和抗体により付与される防御免疫を誘導することができることを示唆している。
３．ＨＩ／Ｈ３二重抗原ベクターは、バランスの取れたＨＡ中和抗体を誘導する。
【０１２４】
２つの異なるＨＡ亜型を使用して、同じ効率で中和抗体を誘導できるか否かを測定した。この目的に向かって、我々は、Ａ／ｘ３１（インフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２亜型）のＨ３  ＨＡ遺伝子をＳ２セグメントにクローニングし、完全長Ｌセグメント、及びＡ／ＰＲ８のＨ１  ＨＡをコードするＳ１セグメントでトランスフェクションした際に、生きたｒＰ１８ｔｒｉ−Ｈ３／Ｈ１ベクターを生成することができた（図２６Ａ）。対照として、それぞれｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｈ１またはｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｈ３と呼ばれる、Ｓ２セグメント上でｅＧＦＰを、そしてＳ１セグメント上でＨ１またはＨ３のいずれかをコードするｒＰ１８ｔｒｉベクターもまた生成した（図２６Ａ）。これらの免疫原性を試験するために、Ｃ５７ＢＬ６マウスの群（群あたりｎ＝３）を、ＩＭ経路により１４日の間隔で、それぞれ３つのベクターを初回投与及び追加免疫をした。Ａ／ＰＲ８／Ｈ１Ｎ１及びＡ／ｘ３１／Ｈ３Ｎ２に対する中和抗体の量に関して、初回投与及び追加免疫の１４日後に収集した血液を測定した（図２６Ｂ、上面）。単一のＨＡ亜型をコードするｒＰ１８ｔｒｉベクターであるｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｈ１及びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｈ３はそれぞれ、追加免疫の投与と共に増加する、強力なホモ亜型中和抗体を誘導したが、初回投与または追加免疫後に、検出可能な量の交差反応性抗体は誘導しなかった。ｒＰ１８ｔｒｉ−ＨＩ／Ｈ３二重抗原ベクターは、追加免疫投与の際に増加したＨ１及びＨ３中和抗体の両方を誘導し、各中和抗体の濃度は、対応する単一抗原ベクターにより誘導された抗体力価に相当した（図２６Ｂ、上面）。同様の発見がＢａｌｂ／ｃマウスから得られた（図２６Ｂ、下面）。これらを合わせると、我々のデータは、ＨＩ／Ｈ３二重抗原ベクターは、マウスにおいて両方の抗原に対してバランスの取れた中和抗体を誘導するということを強く示唆している。換言すれば、一方、または他のＨＡ抗原に対して中和抗体を産生することにおいて偏好（偏り）はない。
４．異なるＨＡ亜型を用いた初回投与及び追加免疫法によるヘテロ亜型中和抗体の誘導。
【０１２５】
最近の調査では、初回投与−追加免疫ワクチン接種、または連続感染により、広範にわたる中和抗体を生成することができることが示されている（Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２９：１０６０−１０６４，Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ４：１４７ｒａ１１４，Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５：１９８ｒａ１０７，Ｗｒａｍｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０８：１８１−１９３，Ｋｒａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８６：１０３０２−１０３０７，Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０７：９８−１０５，Ｍａｒｇｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８７：４７２８−４７３７）。ｒＰ１８ｔｒｉベクターは追加免疫投与の際に免疫応答を増加させるので、異なるＨＡ亜型による初回投与−追加免疫法を使用して、交差反応免疫を誘導することができるか否かを試験した。この目的に向けて、生きたｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ１及びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ３ベクターを生成した。これらはそれぞれ、Ｈ１（Ａ／ＰＲ８）またはＨ３（ｘ３１）ＨＡのいずれかと共にＴ細胞応答を誘発することが知られている、保存ウイルスタンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４０９８２．１を参照）であるＡ／ＰＲ８  ＮＰを、それぞれコードする（図２７Ａ）。マウスに、毎回１４日の間隔で、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ１を初回投与し、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ３を追加免疫し、再びｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ１を追加免疫した。予想通り、ＮＰ特異的ＣＴＬが初回投与後（７ｄｐｐ）に検出され、追加免疫投与の際（７ｄｐｂ）に著しく増加し、第２の追加免疫投与の後でも、依然として高い濃度（３〜５％）で維持された（図２７Ｂ）。各投与の１４日後に血液を収集し、Ａ／ＰＲ８、Ａ／ｘ３１、及びＡ／ＷＳＮに対する中和抗体の濃度を調査した。相同ウイルスＡ／ＰＲ８（Ｈ１）及びＡ／３１（Ｈ３）に特異的な中和抗体は、同一のＨＡ抗原を曝露した際に非常に誘導され、異種ＨＡの追加免疫によっては通常高められなかった。一方、ヘテロ亜型ウイルスＡ／ＷＳＮ（Ｈ１）に対する中和抗体は、追加免疫投与の際に安定的に増加した（図２７Ｃ）。免疫付与したこれらのマウスは、ヘテロ亜型ウイルスＡ／ＷＳＮの致死的抗原投与の後で生残の著しい向上を示した（図２７Ｄ）。これらを合わせると、我々のデータは、ｒＰ１８ｔｒｉベクターを使用した異種ＨＡ亜型による初回投与−追加免疫により、交差反応性中和抗体を誘導することができ、ヘテロ亜型インフルエンザウイルス抗原投与に対する交差防御を引き起こすことができることを示唆している。
５．ｒＰ１８ｔｒｉベクターは、経口経路により体液性及びＴ細胞応答の両方を誘発することができる。
【０１２６】
ｒＰ１８ｔｒｉベクターが、経口経路により便利に投与することが可能か否かを測定するために、経口摂食により、Ｃ５７ＢＬ６マウスに、１ｘ１０４ｐｆｕのｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇベクター（ｎ＝３）またはｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈ（ｎ＝４）を免疫付与し、４２日後に同じベクターを用いて追加免疫した。初回投与、及び追加免疫の７日後におけるＮＰ四量体陽性エフェクターＴ細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈ）を、確立したＮＰ四量体分析により測定した。初回投与の７日後に、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈを免疫付与した３匹の試験マウスのうち２匹が、ＮＰ＋ＣＤ８＋ＣＤ４４ｈｉｇｈ細胞を有し（１．２４％及び０．５５％）、これは、ベクターを免疫付与したマウスで見られるバックグラウンドレベル（０．１３％及び０．０９％）よりも明らかに高かった。ＮＰ特異的エフェクター細胞は追加免疫の７日後に、免疫付与したマウス４匹全てにおいて、５．７〜７．１％の範囲で著しく増加した（図２８Ａ）。同様のパターンが中和抗体で観察された。免疫付与した４匹のマウスのうち２匹が、初回投与の１４日後に正のＨＡＩ力価（ＨＡＩ＝２０）を示した。初回投与の４２日後に、マウス４匹全てが、平均４０のＨＡＩ力価を示した。追加免疫投与の後、８０〜１６０の範囲で、マウス４匹全てにおいてＨＡＩ力価が著しく増加した（図２８Ｂ）。これらを合わせると、我々のデータは、追加免疫投与の後、経口経路でｒＰ１８ｔｒｉベクターは高レベルの体液性及びＴ細胞応答の両方を誘導することができることを強く示唆している。
６．不活性化ｒＰ１８ｔｒｉベクターは、体液性及びＴ細胞応答の両方を誘発することができる。
【０１２７】
不活性化ｒＰ１８ｔｒｉベクターがワクチン免疫を誘導可能か否かを測定した。生きたワクチンベクター、または過酸化水素処理したｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈワクチンベクター（即ち不活性化ワクチンベクター）を使用して、３４日間隔で２回投与により、マウスを免疫付与した。初回投与の直後（初回投与の７日後、７ｄｐｐ）において、中和抗体もＮＰ特異的Ｔ細胞も検出されなかった。しかし、不活性化ワクチンベクターを追加免疫投与した後（追加免疫の７日後、７ｄｐｂ）には、高濃度のＮＰ特異的エフェクターＴ細胞が検出された（図２９、左）。初回投与の３４日後（３４ｄｐｐ）では、マウス３匹全てにおいて低濃度の中和抗体が検出され（ＨＡＩ＝２０）、不活性化ワクチンベクターを追加免疫投与の後（追加免疫の１４日後、１４ｄｐｂ）、４０〜８０の範囲で著しく増加した（図２９、右）。化学的に不活性なｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈワクチンベクターにより誘導されたＴ細胞及び体液性応答の水準は、生きたワクチンベクターにより誘導された水準より著しく低いことは注目に値する。しかしながら、不活性化ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈは依然として、追加免疫投与後に体液性及びＴ細胞応答を両方誘導することができるということは、ワクチンプラットフォームとしてこのウイルスベクターは、生きたワクチン及び不活性化ワクチンの両方として融通が利くことを示唆している。
７．モルモットモデルにおいて、ｒＰ１８ｔｒｉベクターは毒性Ｐ１８ウイルスに対して防御免疫を誘導する。
【０１２８】
ＷＴ  Ｐ１８ウイルスは、モルモットでピチンデウイルス（ＰＩＣＶ）の連続継代を行った後で入手し、動物において出血熱のような病気を引き起こす。ＷＴ  Ｐ１８ウイルスは、ヒトにおいてラッサ熱ウイルス感染症の病因を研究するための安全な代理モデルとして使用されている（Ｊａｈｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ３２：８７２−８８０，Ａｒｏｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４５：２２８−２３５，Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １１７１  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｅ６５−７４）。ＷＴ  Ｐ１８ウイルスと比較して、３つにセグメンテーションされたｒＰ１８ｔｒｉベクターはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、少なくとも１ｌｏｇ少なく増殖する。我々は、モルモットにおけるｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇベクターの病原としての可能性もまた測定した。１ｘ１０４ｐｆｕのｒＰ１８ウイルスに感染したモルモットは初期に発熱を始め、感染の７日後に体重が急激に減少し、１４日目までに終末点に到達した（図３０Ａ）。対照的に、１×１０６ｐｆｕのｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ（ｒＰ１８対照より１００倍高い力価）で感染したモルモットでは、モック感染した動物と同様の体重増加が見られ、１日を超えて発熱は経験しなかった（図３０Ａ）。
【０１２９】
この非病原性ｒＰ１８ｔｒｉベクターがモルモットでの致死性ｒＰ１８抗原投与に対する防御免疫を誘導可能か否かを測定した。モルモットに、モック感染としてリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、または１ｘ１０４ｐｆｕのｒＰ１８ｔｒｉ−ＧのいずれかをＩＰ経路で注射し、１４日後、致死量のｒＰ１８ウイルスを抗原投与した。ＰＢＳを免疫付与したモルモット（ｎ＝３）はすぐに発熱して著しく体重が減少し、全ての動物は、１１日目までに所定の終末点に到達した（図３０Ｂ）。対照的に、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇを免疫付与したモルモット（ｎ＝３）は、測定可能な体重減少がなく、完全に防御された（図３０Ｂ）。中和抗体が抗原投与の際に成長していないため、ＰＩＣＶに対する防御免疫は、Ｔ細胞応答により仲立ちされるようである。以前の研究は、異なるアレナウイルス、例えばＬＣＭＶ及びＰＩＣＶ、ラッサ及びモペイアウイルス、フニン及びタカリベ複合体ウイルス間での交差防御、ならびに、非病原性アレナウイルスが生きたワクチンとして調査されたことを示している（Ｏｌｓｃｈｌａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９：ｅ１００３２１２を確認のこと）。我々は、防御Ｔ細胞エピトープをＰＩＣＶタンパク質の中に組み込むｒＰ１８ｔｒｉベクターは、他のアレナウイルス病原体に対して交差防御免疫（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を誘導することができることを提示する。２つまでの更なる抗原をコードする能力を有するため、ｒＰ１８ｔｒｉベクターは、アレナウイルス病原体及び他の所望の病原体（１つまたは複数）の両方に対する二重（または三重）ワクチンベクターとして開発することができる。
【０１３０】
まとめると、３つのＲＮＡセグメントがあり、２つの外来性タンパク質抗原をコードする新規のピチンデウイルス（ＰＩＣＶ）ベースの生きたウイルスベクターｒＰ１８ｔｒｉを開発した。ウイルスベクターはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで減衰した。モデル抗原としてインフルエンザＨＡを使用することで、ｒＰ１８ｔｒｉ−Ｇ／Ｈはマウスにおいて、長期間にわたる防御免疫を誘導することができる。ｒＰ１８ｔｒｉベクターは、マウス及びモルモットにおいて強力な体液性応答を、そして高レベルのウイルス特異的エフェクターＴ細胞を誘導することができる。ｒＰ１８ｔｒｉベクターにより誘導された抗体及びＴ細胞応答は、追加免疫のワクチン接種により著しく増加し、４回適用した後でさえも高いレベルであった。これは、初回投与−追加免疫ワクチン接種法にとって理想的な、この生きたウイルスベクターの独自の特徴である。ベクターは、筋肉内（ＩＭ）、腹腔内（ＩＰ）、鼻孔内（ＩＮ）、及び経口等の種々の経路により投与されてよい。異なるインフルエンザウイルス株からの異なるＨＡタンパク質を用いた初回投与及び追加免疫はヘテロ亜型免疫を誘導した。したがって、万能のインフルエンザワクチンを開発する可能性が存在する。化学的に不活性化したｒＰ１８ｔｒｉ−Ｐ／Ｈは、追加免疫投与の後で体液性応答とＣＴＬ応答の両方を誘導した。ｒＰ１８ｔｒｉベクターは毒性ｒＰ１８ウイルスに対して防御免疫を誘導したため、ラッサ熱ウイルス等の他の病原性アレナウイルスに対する交差反応性ワクチン、及び、他の病原体の組み合わせに対する二重（三重）ワクチンの開発の可能性が存在する。
【０１３１】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願及び広報、ならびに電子的に入手可能な資料（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑ等におけるヌクレオチド配列の提出、ならびに、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ等におけるアミノ酸配列の提出、ならびにＧｅｎｂａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈を付けたコード領域からの翻訳）は、それら全体が参考として組み込まれる。広報の中で参照された補助資料（補助用の表、補助用の図、補助用の資料及び方法、ならびに／または補助用の実験データ）も同様に、それら全体が参考として組み込まれる。本出願の開示と、参考として本明細書に組み込まれているいかなる文書の開示との間に何か矛盾が存在する場合は、本出願の開示が優先するものとする。前述の詳細の説明及び実施例は、理解を明確にさせるためだけに与えられている。これらから不必要な限定が解釈されるべきではない。本発明は、図示及び記載した厳密な詳細に限定されず、当業者に明確な変化形態が、特許請求の範囲により規定される本発明に含まれる。
【０１３２】
特に断りのない限り、本明細書及び本特許請求の範囲で使用される、構成成分の量、分子量等を表す全ての数字は、全ての場合において、用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、これらに反する別段の記載がなければ、明細書及び特許請求の範囲に記述されている数値パラメーターは、本発明により得られることが追求される所望の特性に応じて変化し得る概算である。控えめに言っても、また、特許請求の範囲への均等論の適用を制限しようとする試みとしてでもなく、各数値パラメーターは少なくとも、報告される有効数字の数の観点から、そして通常の端数計算技術を適用することにより解釈されるべきである。
【０１３３】
本発明の広範な範囲を説明する数の範囲及びパラメーターは概算であるにも関わらず、特定の実施例で説明される数値は、できる限り正確に報告される。しかし、数値は全て、それぞれの試験測定で見出された標準偏差から必然的に得られる範囲を本来的に含有する。
【０１３４】
全ての表題は、読者の便宜のためのものであり、そのような規定がない限り、表題に続く文章の意味を制限するために使用されるべきではない。