【手続補正書】
【提出日】令和3年6月25日(2021.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．生物活性化合物（ＢＡＣ）であって、該ＢＡＣは、ｐＨ７．５で電荷−３〜＋３を有するホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）又はその変異体である、前記生物活性化合物（ＢＡＣ）と、
ｉｉ．細胞透過剤（ＣＰＡ）であって、該ＢＡＣ及び該ＣＰＡは、直接的に又は二官能性リンカー（ＢＦＬ）を介して連結される、前記細胞透過剤（ＣＰＡ）と
を含む薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）であって、
前記ＣＰＡは、安定化されたペプチド（ＣＰＰ）であって、ステープルしてステープルされたペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチされたペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化されたペプチド（ＣＰＰ）であり、前記ＳｔｉＰ又は前記ＳｔａＰが、立体構造的に隣接するアミノ酸の間において、別の架橋分子の導入による場合と異なり、２つの立体構造的に隣接するアミノ酸の間のラクタムを生じる直接的環化によって、直接的に形成され、該安定化された立体構造は、少なくとも１つの延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを有する、
前記薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）。
【請求項２】
前記ラクタムは、遊離アミン含有アミノ酸とカルボン酸含有アミノ酸との間で形成される、請求項１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項３】
前記ラクタムは、リジンとグルタミン酸又はアスパラギン酸とをクロスリンクさせることによって形成される、請求項２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項４】
各クロスリンクは、２〜２０原子の名目上の連続長さを有する、請求項３に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項５】
前記ＰＭＯは、電気的に中性の電荷を有するＰＭＯであり、ｐＨ７．５で電荷−１〜＋１を有する、請求項1〜４のいずれか１項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項６】
前記ＰＭＯは、内因性又は外因性の遺伝子の発現を改変する、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項７】
前記内因性遺伝子は、神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患又は後天性ウイルス感染症を標的にする、請求項６に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項８】
前記ＢＦＬは、表５の化学物質から選択される化学物質を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項９】
シクロヘキサンスペーサーによって分離されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル反応基及びマレイミド反応基を含有する、アミンからスルフヒドリルへのクロスリンカーを含む、請求項８に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１０】
前記ＢＦＬは、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）である、請求項８又９に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１１】
前記ＢＦＬは、ヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）であり、且つ前記ＣＰＰの末端に組み込まれている、請求項１０に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１２】
前記ＢＦＬは、ＨＮＡであり、且つ前記ＰＭＯは、共有結合による複合を促進するため、４−ホルミル安息香酸を組み込むように修飾されている、請求項１１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１３】
前記ＳＭＣＣは、ＰＥＧ化される、請求項１０に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１４】
前記ＨＮＡは、ＰＥＧ化される、請求項１１又は１２に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１５】
前記ＣＰＡは、前記ＢＦＬの第１の末端に共有結合により連結される、請求項８に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１６】
前記ＢＡＣは、前記ＢＦＬの第２の末端に共有結合により連結される、請求項８に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１７】
１．５ＫＤａより大きいサイズを有する、請求項１に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項１８】
生物活性化合物（ＢＡＣ）の細胞への取り込みを、細胞透過剤（ＣＰＡ）への前記生物活性化合物の複合によって促進して、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）を形成し、そして前記ＤＣＣＰＭを前記細胞に好適な媒体内で提示する方法であって、
前記ＢＡＣは、ｐＨ７．５で電荷−３〜＋３を有するホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）又はその変異体であり、
前記ＣＰＡは、安定化されたペプチド（ＣＰＰ）であって、ステープルしてステープルされたペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチされたペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する前記安定化されたペプチド（ＣＰＰ）であり、
前記ＳｔｉＰ又は前記ＳｔａＰが、立体構造的に隣接するアミノ酸の間において、別の架橋分子の導入による場合と異なり、２つの立体構造的に隣接するアミノ酸の間のラクタムを生じる直接的環化によって、直接的に形成され、該安定化された立体構造は、少なくとも１つの延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを有する、
前記方法。
【請求項１９】
内因性又は外因性の遺伝子の発現の改変を必要とする疾患の治療に用いられる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２０】
神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患又は後天性ウイルス感染症の治療に用いられる、請求項１９に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２１】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に用いられる、請求項１９に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２２】
前記ジストロフィン遺伝子を標的にするＡＯを含む、請求項１９に記載のＤＣＣＰＭ。
【請求項２３】
薬剤、すなわち生物活性化合物（ＢＡＣ）の生物学的利用率を改善する方法であって、
ここで、該ＢＡＣは、ｐＨ７．５で電荷−３〜＋３を有するホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）又はその変異体であり、
前記方法が、前記ＢＡＣを、安定化されたペプチド（ＣＰＰ）に連結することを含み、
ここで、前記ＣＰＡは、安定化されたペプチド（ＣＰＰ）であって、ステープルしてステープルされたペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチされたペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する前記安定化されたペプチド（ＣＰＰ）であり、
前記ＳｔｉＰ又は前記ＳｔａＰが、立体構造的に隣接するアミノ酸の間において、別の架橋分子の導入による場合と異なり、２つの立体構造的に隣接するアミノ酸の間のラクタムを生じる直接的環化によって、直接的に形成され、該安定化された立体構造は、少なくとも１つの延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを有する、
前記方法。
【請求項２４】
薬剤、すなわち生物活性化合物（ＢＡＣ）を、部位であって、その天然状態で前記ＢＡＣに対して難治性である該部位に導入するために用いられる、前記ＢＡＣと細胞透過剤（ＣＰＡ）とを含む剤であって、
ここで、該ＢＡＣは、ｐＨ７．５で電荷−３〜＋３を有するホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）又はその変異体であり、
前記ＢＡＣは、前記ＣＰＰに連結され、
ここで、前記ＣＰＰは、ステープルしてステープルされたペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチされたペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有し、
前記ＳｔｉＰ又は前記ＳｔａＰが、立体構造的に隣接するアミノ酸の間において、別の架橋分子の導入による場合と異なり、２つの立体構造的に隣接するアミノ酸の間のラクタムを生じる直接的環化によって、直接的に形成され、該安定化された立体構造は、少なくとも１つの延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを有する、
前記剤。
【請求項２５】
前記組織は、心臓、脳、筋肉又は肝臓の１つである、請求項２４に記載の剤。
【請求項２６】
内因性又は外因性の遺伝子の発現を改変するように対象を治療する剤であって、請求項１〜１７又は１９〜２２のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭを含む、前記剤。
【請求項２７】
請求項１〜１７又は１９〜２２のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ及び１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物。
【請求項２８】
経口的、非経口的、静脈内又は局所的投与に適応されている、請求項２７に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】改善された薬物送達のためのステープルされた又はステッチされたペプチドを含む化合物
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
より詳細には、細胞透過剤（ＣＰＡ）の使用、より詳細にはさらに、例えば、ｉ）２つのアミノ酸をステープルしてステープルされたＣＰＰ（以下、「ステープルＣＰＰ」ともいう）（ＳｔａＰ）を形成するか、又はｉｉ）３つ以上のアミノ酸をステッチしてステッチされたＣＰＰ（以下、「ステッチＣＰＰ」ともいう）（ＳｔｉＰ）を形成することによって安定化されている細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の使用に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
それは、ペプチドを安定化させるため、オレフィンメタセシスに対する異なる化学を用いる場合の、本出願人の早期の特許出願ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書（ＰＣＴ／ＧＢ２０１６／０５４０２８号明細書」と同義である，以下同じ）と異なる。これらの化学は、ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸の間にクロスリンク又は架橋を提供し、及びクロスリンク又は架橋は、少なくとも２つのアミノ酸の間に環化を提供する。これらの代替化学では、環化は、
ｉ．アルデヒド若しくはケトンとヒドラジン若しくは保護ヒドラジンとの縮合；
ｉｉ．チオール−エンマイケル付加；
ｉｉｉ．ジスルフィド形成；
ｉｖ．ヒュスゲン１，３双極子環化付加；
ｖ．アミンとカルボン酸との間の反応；
ｖｉ．一重項若しくは三重項に基づくカルベン反応；又は
ｖｉｉ．鈴木若しくは薗頭カップリング
の１つ以上によって達成される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
これらの安定化されたＣＰＰ（以下、「安定化ＣＰＰ」ともいう）は、薬剤、すなわち生物活性化合物（ＢＡＣ）に直接的に又は二機能リンカー（ＢＦＬ）を介して複合され、それにより、ＢＡＣは、ＣＰＰによって細胞膜を通して運搬され得る。得られる分子は、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）と称される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
本発明は、少なくとも２つのアミノ酸の間に環化を提供するクロスリンク又は架橋を導入する代替的なステープリング又はステッチング技術に基づき、さらなるＣＰＰを導入する。これらは、限定はされないが、次を含む。
ａ）ヒュスゲン１，３双極子環化付加における官能基、典型的にはアジドリジン及びプロパルギル官能基、例えばα−プロパルギルアラニンを有するアミノ酸の組み込み又は誘導体化。典型的には、これらの反応は、銅又はルテニウムに基づく触媒を用いる環化により、５員環複素環、例えば１，４又は１，５のいずれかの好ましい各置換を伴う１，２，３トリアゾールを得ることができる。アジド及びプロパルギル官能基に加えて、電子欠損型ニトリル及び／又はジアゾアルカンなどの他の基質であっても用いることができる２４；及び
ｂ）例えば、固相合成中での保護基の慎重な選択を利用して、そのペプチド内のグルタミン酸又はアスパラギン酸残基を有するリジンを環化することによる、ラクタム形成のためのタンパク新生アミノ酸の使用２５。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
環化は、ステープル又はステッチが、立体構造的に隣接するアミノ酸の間において、別の「架橋分子」、例えばアリール基、例えば芳香環又はパーフルオロアリール基などの導入による場合と異なり、直接的に形成されることを意味する。この直接的環化は、
ｉ．アルデヒド若しくはケトンとヒドラジン若しくは保護ヒドラジンとの縮合；
ｉｉ．チオール−エンマイケル付加；
ｉｉｉ．ジスルフィド形成；
ｉｖ．ヒュスゲン１，３双極子環化付加；
ｖ．アミンとカルボン酸との間の反応；
ｖｉ．一重項若しくは三重項に基づくカルベン反応；又は
ｖｉｉ．鈴木若しくは薗頭カップリング
の１つ以上によって達成され得る。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
ｉｖ）を用いて、５員複素環は、アジドと電子欠損型ニトリル含有アミノ酸又はプロピニル含有アミノ酸との間で形成される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
ＰＣＴ／英国特許出願公開第２０１６／０５４０２８号明細書では、ＣＰＰは、好ましくは、全炭化水素テザーを有する少なくとも２つの非天然アミノ酸（例えば、α−メチル、α−ペンテニルグリシン）を含み、好ましいステープル又はステッチＣＰＰは、（Ｓ）−ペンテニルアラニン（Ｓ５）若しくはその鏡像異性体（Ｒ５）、Ｓ−オクテニルアラニン（Ｓ８）若しくはその鏡像異性体（Ｒ８）又はそれらの組み合わせ（例えば、Ｒ−オクテニルアラニン／Ｓ−ペンテニルアラニン（Ｒ８／Ｓ５）又はＳ−オクテニルアラニン／Ｒ−ペンテニルアラニン（Ｓ８／Ｒ５））の１つ以上を組み込む。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
安定化された立体構造は、典型的には少なくとも１つのαヘリックス、延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを含む。しかし、それは、選択肢の中に、少なくとも１つのターン（例えば、限定はされないが、α、β、γ、δ又はπ）、βシート若しくはヘアピンを形成するためのいくつかのターン又はαヘリックス、延長された３１０ヘリックス若しくはポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックス、ターン、βシート若しくはヘアピンの１つ以上の組み合わせを含み得る。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
好ましいリンカー化学では、図７ａ〜ｄに例示されるＢＦＬと、ＣＰＰと、ＢＦＬと、ＢＡＣとの間で共有結合を形成するため、シクロヘキサンスペーサー、すなわち４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）によって分かれたＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル及びマレイミド反応基を有するアミン−スルフヒドリルクロスリンカーが用いられる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
【図１ａ】非環化ＣＰＰ（左）及びそれから形成可能な得られる安定化構造の一部（右）の例を図示する。
【図１ｂ】非環化ＣＰＰ（左）及びそれから形成可能な得られる安定化構造の一部（右）の例を図示する。
【図１ｃ】非環化ＣＰＰ（左）及びそれから形成可能な得られる安定化構造の一部（右）の例を図示する。
【図２ａ】ステッチＣＰＡの例を図示する：図２ａは、ペプチド配列内に連続的に配置される直交性アミノ酸の２セットを環化することにより形成される。
【図２ｂ】ステッチＣＰＡの例を図示する：図２ｂは、ペプチド配列内に連続的に配置されない直交性アミノ酸の異なる２セットを環化することにより形成されるステッチＣＰＡを図示する。
【図２ｃ】ステッチＣＰＡの例を図示する：図２ｃは、クロスリンク対象のアミノ酸の２セットが１つのアミノ酸に由来する場合のステッチＣＰＡを図示する。
【図２ｄ】ステッチＣＰＡの例を図示する：図２ｄは、連続的ステッチＣＰＡを形成するためにクロスリンク可能な１つのアミノ酸に由来する２つの代替的なアミノ酸セットを図示する。
【図３】表１に定義されるような異なる官能基を有するＣＰＰ中に組み込まれ得るアミノ酸の構造を図示する。Ｘ及びＸ１によって表される官能基は、ＣＰＡを形成するため、クロスリンク可能であるとともに、バイオコンジュゲーションにおいて使用可能である。
【図４】ＢＦＬの使用を伴わない安定化ＣＰＰのＢＡＣへの直接コンジュゲーションを図示する。
【図５ａ】ＢＦＬの結合性並びにＤＣＣＰＭ及びＤＴＣＰＭの全体構造を図示する。ＢＡＣがアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）又はオリゴヌクレオチド（ＯＮ）である場合の、表５からの非限定例でのＢＦＬの結合性を図示するＤＣＣＰＭの概略図である。
【図５ｂ】ＢＦＬの結合性並びにＤＣＣＰＭ及びＤＴＣＰＭの全体構造を図示する。ＢＡＣがＡＯ又はＯＮである場合、ＣＰＡが１，４置換又は１，５置換のいずれかの１，２，３トリアゾールによって安定化されている場合における、表５からの非限定例でのＢＦＬの結合性を図示するＤＣＣＰＭの概略図である。
【図５ｃ】ＢＦＬの結合性並びにＤＣＣＰＭ及びＤＴＣＰＭの全体構造を図示する。ＢＡＣがＡＯ又はＯＮである場合、ＣＰＡが１，４置換又は１，５置換のいずれかの１，２，３トリアゾールによって安定化されている場合における、表５からの非限定例でのＢＦＬの結合性を図示するＤＣＣＰＭの概略図である。
【図５ｄ】ＢＦＬの結合性並びにＤＣＣＰＭ及びＤＴＣＰＭの全体構造を図示する。オリゴヌクレオチドが送達分子の一部を構成する場合の、表５からの非限定例でのＢＦＬの結合性を図示するＤＴＣＰＭの概略図であり；この技術によって送達されるＢＡＣの非限定的リストとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はタンパク質分子が挙げられる（事実上、ＯＮは、ＢＦＬの一部であり、ＢＡＣに接続する）。
【図６ａ】異なるＢＦＬを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ＤＣＣＰＭの一般的概略図であり、限定はされないが、表５に定義されるＢＦＬの結合性を図示する。
【図６ｂ】異なるＢＦＬを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。チオール含有分子（システイン）で終結され、ヘテロ二官能性タンパク質クロスリンカーのスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）を用いてＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図６ｃ】異なるＢＦＬを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ヒドリジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルミル安息香酸で修飾されているＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図６ｄ】異なるＢＦＬを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。チオール含有分子（システイン）で終結され、ヘテロ二官能性タンパク質クロスリンカーのスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）を用いてＢＡＣに複合された、ラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図７ａ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。２つのタンパク新生アミノ酸の間の環化によりラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰの概略図である。
【図７ｂ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ＣＰＡのＮ末端へのＰＥＧ５の組み込み及びチオール含有分子（システイン）でのその終結を図示する。
【図７ｃ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ヘテロ二官能性リンカーＳＭＣＣのＤＣＣＰＭへの組み込みを図示する。
【図７ｄ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。チオール含有分子（システイン）で終結され、次いでヘテロ二官能性タンパク質クロスリンカーのスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）を用いてＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うＫ−Ｅ安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図８ａ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。２つのタンパク新生アミノ酸の間の環化によりラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰの概略図である。
【図８ｂ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルミル安息香酸修飾ＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図８ｃ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。４−ホルミル安息香酸修飾ＢＡＣの概略図である。
【図８ｄ】リジン及びグルタミン酸残基をクロスリンクし、ラクタムを形成することによって安定化されたＣＰＰを組み込むＤＣＣＰＭのいくつかの好ましい実施形態を図示する。ヒドリジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルミル安息香酸で修飾されているＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うラクタム安定化ＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図９】ＢＡＣに直接的に複合されたラクタム含有ＣＰＰの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図１０ａ】ＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を形成するための、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰのＢＡＣへのコンジュゲーションを図示する概略図である。１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰの概略図である。
【図１０ｂ】ＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を形成するための、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰのＢＡＣへのコンジュゲーションを図示する概略図である。組み込まれたＰＥＧ５を伴い、チオール含有分子（システイン）で終結される、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰの概略図である。
【図１０ｃ】ＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を形成するための、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰのＢＡＣへのコンジュゲーションを図示する概略図である。１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰの概略図であり、ヘテロ二機能性タンパク質クロスリンカーのスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸（ＳＭＣＣ）の組み込みを図示する。
【図１０ｄ】ＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を形成するための、１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰのＢＡＣへのコンジュゲーションを図示する概略図である。ＤＣＣＰＭの一部としての１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰを図示する概略図である。１，２，３トリアゾールは、他の異性体、例えば１，５置換トリアゾールを有し得ることが注目されるべきである。
【図１１ａ】１，４置換トリアゾールを含有するＣＰＰの結合性を図示する。
【図１１ｂ】ヒドラジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルミル安息香酸修飾ＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴うトリアゾールで安定化されたＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図１１ｃ】４−ホルミル安息香酸修飾ＢＡＣの概略図である。
【図１１ｄ】ヒドリジナルニコチン酸（ＨＮＡ）で終結され、次いで４−ホルミル安息香酸で修飾されているＢＡＣに複合された、組み込まれたＰＥＧ５を伴う１，４置換トリアゾールで安定化されたＣＰＰを有するＤＣＣＰＭの好ましい実施形態を図示する概略図である。
【図１２ａ】Ｄ２Ｏにブランク化され、室温で３通りに収集されたＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ、ＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ５−ＣＰ８Ｍ及びＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍの円二色性スペクトルである。ＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ及びＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ５−ＣＰ８Ｍは、ランダムコイルを示し、ＦＩＴＣ−Ｋ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍは、αらせん度を示す。
【図１２ｂ】Ｄ２Ｏにブランク化され、室温で３通りに収集されたＫ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ、Ｋ１Ｅ５−ＣＰ８Ｍ及びＫ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍの円二色性スペクトルである。Ｋ１Ｅ５は、ランダムコイルを示す一方、Ｋ１Ｅ４及びＫ１Ｅ６は、伸長されたＰｉヘリックスを示す。
【図１３ａｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＦＬ１＋細胞のＫ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示し、二元配置分散分析が実施され、相互作用効果が示されなかった。データは、Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣが環化されたとき、ＦＬ１陽性細胞の数において有意差がなかったことを図示する。
【図１３ａｉｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＦＬ１＋細胞のＫ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示し、二元配置分散分析が実施され、相互作用効果が示されなかった。データは、Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣが環化されたとき、ＦＬ１陽性細胞の数において有意差がなかったことを図示する。
【図１３ａｉｉｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＦＬ１＋細胞のＫ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示し、二元配置分散分析が実施された。＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。データは、Ｋ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣが環化されるとき、所与の濃度でのＦＬ１陽性細胞の数において有意な増加があることを図示する。
【図１３ｂｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞のＭＦＩの比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示す。二元配置分散分析が実施され、相互作用効果が示されなかった。
【図１３ｂｉｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞のＭＦＩの比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示す。二元配置分散分析が実施され、相互作用効果が示されなかった。
【図１３ｂｉｉｉ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。Ｋ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ又はＫ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞のＭＦＩの比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示す。二元配置分散分析が実施された。＊は、ｐ＜０．０５を表す。
【図１３ｃ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。（ｉ）Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ対Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣ、（ｉｉ）Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ対Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣ、及び（ｉｉｉ）Ｋ１Ｅ６−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ対Ｋ１Ｅ４−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−ＮＣとともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の陰性対照と比べた、ゲート細胞によって判断される％生細胞比較である。ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示す。データは、未処置対照に正規化されるとき、回収された細胞の％における有意差がないことを示す。
【図１４】Ｋ１Ｅ４、Ｋ１Ｅ５又はＫ１Ｅ６  ＣＰ８Ｍのいずれかに複合されたＰＭＯで処置されたＰＣ３−７０５細胞の顕微鏡写真である。細胞は、トランスフェクション試薬なしに４時間処置され、次に画像が取得された。画像は、ＦＩＴＣ標識ＰＭＯを示すため、明視野対物レンズ又は落射蛍光顕微鏡のいずれかを用いて取得された。その後、画像は、細胞局在化を示すため、マージされた。Ｋ１Ｅ４、Ｋ１Ｅ５又はＫ１Ｅ６  ＣＰ８Ｍ単独のいずれかに複合されたＰＭＯで処置されたＰＣ３−７０５細胞内で細胞内ＰＭＯシグナルが有意であることが明白である。非複合ＰＭＯは、細胞内シグナルを生成しない。
【図１５ａ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＦＬ１＋細胞の、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞との比較である。ｎ＝５、エラーバーは、標準偏差を示す、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。＊ａは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋とすべての他の基との間の相互作用を表し、＊ｂは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とすべての他の基との間の相互作用を表す。データは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋が、他の処置と比べて、種々の濃度にわたり、ＦＬ１＋細胞内での有意な減少を有することを示す。ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋は、他の処置と比べて、種々の濃度にわたり、ＦＬ１＋細胞の数における増加を示す。
【図１５ｂ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞のＭＦＩの比較である。ｎ＝５、エラーバーは、標準偏差を示す。＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表す。所与の濃度のＲＣＭ，１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋、１＋及び２＋間でのＭＦＩにおいて有意差がない。しかし、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋は、より高い濃度＞１μＭでのＭＦＩにおける増加を示す。
【図１５ｃ】ＦＩＴＣ標識ＣＰＡの存在下でインキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞におけるフローサイトメトリーデータである。ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋［ＲＫＦ（Ｓ５ＲＬＦＳ５）］、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋［ＲＩＦ（Ｓ５ＲＬＦＳ５）］、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋［ＩＩＦ（Ｓ５ＲＬＦＳ５）］、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋［ＩＩＦ（Ｓ５ＩＬＦＳ５）］とともに４時間インキュベートされたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の陰性対照と比べた、ゲート細胞によって判断される％生細胞比較である。ｎ＝３、エラーバーは、標準偏差を示す。＊は、ｐ＜０．０５を表す。＊ａは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋とＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋との間の差異を表し、＊ｂは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋とＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋との間の差異を表し、＊ｃは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋との間の差異を表す。データは、最も高い濃度１００μＭにおいて、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋からＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋を比べるときの回収された生細胞の数における有意な減少及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋からＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋を比べるときの細胞の数における増加を示す。同様に、３３μＭにおいて、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋をＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２＋及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋と比べると、％生細胞における減少が示された。他のすべての濃度で、他の有意な効果は、０．０５μＭ以外で認められなかった。０．０５μＭのＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋は、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ−２を上回る生細胞における増加を示した。
【図１６】ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の、４時間のＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−３＋−ＦＩＴＣからＫ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣでの処置と比べるときの％細胞生存度を図示する。ｎ＝３〜４、エラーバーは、標準偏差を示す。＊は、ｐ＜０．００１を表す。Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣからＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋を比べるとき、すべての濃度で生存度における増加が認められた。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
ステープリング及びステッチングによるクロスリンクは、ある特性、例えば溶媒和的立体構造、例えば、限定はされないが、αヘリックス、延長された３１０ヘリックス若しくはポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックス、ターン（例えば、限定はされないが、α、β、γ、δ又はπ）、βシート若しくはヘアピンを形成するためのいくつかのターン又はαヘリックス、延長された３１０ヘリックス若しくはポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックス、ターン若しくはβシートの１つ以上の組み合わせ、溶媒和環境、例えば原形質膜との相互作用、細胞浸透性及び生物学的活性にエネルギー依存的な立体構造上のバイアスを付与することがある。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
好ましいリンカーは、例えば、ＢＡＣ上のアミン基とＣＰＡ末端上のスルフヒドリル（チオール）基（通常、システイン残基）との間を連結することになる。これを達成するための基質の例として、限定はされないが、表５中に例証されるような、ＳＭＣＣ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル）、ＡＭＡＳ（Ｎ−α−マレイミドアセトキシ−オキシスクシンイミドエステル）、ＢＭＰＳ（Ｎ−β−マレイミドプロピル−オキシスクシンイミドエステル）、ＧＭＢＳ（Ｎ−γ−アレイミドブチリル−オキシスクシンイミドエステル）、ＤＭＶＳ（Ｎ−δ−マレイミドバレリル−オキシスクシンイミドエステル）、ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイル−オキシスクシンイミドエステル）及びＬＣ−ＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロン酸））が挙げられる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
ＤＳＧ（グルタル酸ジスクシンイミジル）及びＤＳＣＤＳ（ジスクシンイミジル−シクロヘキシル−１，４−ジエステル）などの他のリンカーは、ＢＡＣの５’−アミノ基をＣＰＡのＮ末端に連結する能力を含むことになる（表５、エントリー９及び１０）。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍは、２１９ｎｍにおける最大であり、１９６ｎｍの最小である延長された３１０ヘリックス／ポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを示す。Ｋ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍは、類似の特徴的な最大及び最小を示す（図１２）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９９】
Ｋ１Ｅ４／５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ及びＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＮＣ−ＦＩＴＣの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞は、平均蛍光強度における２ｌｏｇにわたる有意な増加が、１０μＭを超える濃度でＫ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣペプチドに限って（その非環化対照と比べて）認められることを示した；図１３ｂｉ〜ｂｉｉｉ；ｎ＝４、エラーバーは、標準偏差を示し、二元配置分散分析が実施された。＊は、ｐ＜０．０５を表す。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２００】
Ｋ１Ｅ４／５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ及びＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＮＣ−ＦＩＴＣの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞は、あらゆる濃度範囲にわたり有害な細胞毒性を示さない（０．０５μＭ〜１００μＭ；図１３ｃｉ〜ｉｉｉ）。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣの電荷変異体（図１５ａ；すなわちＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ  ３＋、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ  ２＋、ＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ  １＋及びＲＣＭ１，５−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣ  ０＋）に基づいてＦＩＴＣ標識ペプチドの存在下でインキュベートしたＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞である。図１５ａは、ペプチド用量及び細胞生存度に対する差次的応答を示した。データは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋が、ＦＬ１陽性細胞の２％差〜６０％差の範囲である、３３μＭ未満のすべての濃度でのＦＬ１＋細胞における他の処置と比べての有意な減少を有することを示す。ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋は、１０％の増加から４０％の増加の範囲である種々の濃度にわたってのＦＬ１＋細胞の数における他の処置と比べての増加（０．４１μＭで最大の差異）を示す（ｎ＝５、エラーバーは、標準偏差を示す、＊は、ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、ｐ＜０．００１を表し、＊ａは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−１＋とすべての他の基との間の相互作用を表し、＊ｂは、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−０＋とすべての他の基との間の相互作用を表す）。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０６】
ＨｅＬａ  ｐＬｕｃ  ７０５細胞の、ＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣ−３＋又はペプチドのＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣシリーズのいずれかとともにインキュベートするときの生存度の比較によると、０．０５〜１００μＭの用量範囲でＫ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８Ｍ−ＦＩＴＣが細胞生存度に対する負の影響を全く有しないことが示される（図１６）。Ｋ１Ｅ５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣペプチドに対するＲＣＭ１，５−Ｐ８Ｍ−ＦＩＴＣの比較によると、生存度における、濃度の範囲を７０〜９９％上回る増加が示される。これは、ラクタム化に基づくＣＰＰの臨床解釈において重要な意味を有する。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
ラクタム化の環化化学によって安定化されたＣＰＡは、らせん構造に安定化し、その構造は、αヘリックスでない。Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ及びＫ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍは、延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックス構造を呈する。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
環化及び非環化Ｋ１Ｅ４／５／６−ＣＰ８ＭペプチドのＨＰＬＣ分析によると、６．２２分の非環化ペプチドと類似した保持時間が示された（表８）が、環化プロセス及び結果的に得られる安定化ペプチドは、保持時間における増加を示した（表８）。３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスの推定上の立体構造を有するペプチドは、Ｋ１Ｅ４−ＣＰ８Ｍ＝６．６２分及びＫ１Ｅ６−ＣＰ８Ｍ＝６．５７分という幅広く類似した保持時間を有し、立体構造における変化を同定するためのＨＰＬＣの潜在的使用が強調される。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
閉環メタセシスの環化化学によって安定化されたＣＰＡの減少した電荷変異体は、効率的な細胞侵入ペプチドであり、インビトロで改善された毒性学的特性を有する。これは、この技術に基づくＤＣＣＰＭについての重要な臨床解釈上の意味を有する。
［１］
ｉ．生物活性化合物（ＢＡＣ）と、
ｉｉ．細胞透過剤（ＣＰＡ）であって、ＢＡＣ及びＣＰＡは、直接的に又は二官能性リンカー（ＢＦＬ）を介して連結される、細胞透過剤（ＣＰＡ）と
を含む薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）であって、前記ＣＰＡは、安定化ペプチド（ＣＰＰ）であって、ステープルしてステープルされたペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチされたペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化されたペプチド（ＣＰＰ）であり、前記ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、前記ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸の間にクロスリンク又は架橋を含み、及び前記クロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない前記少なくとも２つのアミノ酸の間に環化を提供する、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）。
［２］
環化は、
ｉ．アルデヒド若しくはケトンとヒドラジン若しくは保護ヒドラジンとの縮合；
ｉｉ．チオール−エンマイケル付加；
ｉｉｉ．ジスルフィド形成；
ｉｖ．ヒュスゲン１，３双極子環化付加；
ｖ．アミンとカルボン酸との間の反応；
ｖｉ．一重項若しくは三重項に基づくカルビン反応；又は
ｖｉｉ．鈴木若しくは薗頭カップリング
の１つ以上によって達成される、項［１］に記載のＤＣＣＰＭ。
［３］
ｉｖ）において、トリアゾールは、アジド又は電子欠損型ニトリル含有アミノ酸とプロピニル含有アミノ酸との間で形成される、項［２］に記載のＤＣＣＰＭ。
［４］
前記アジドは、アジドリジンである、項［３］に記載のＤＣＣＰＭ。
［５］
前記プロピニル含有アミノ酸は、リジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸である、項［３］に記載のＤＣＣＰＭ。
［６］
ｖ）において、ラクタムは、遊離アミン含有アミノ酸とカルボン酸含有アミノ酸との間で形成される、項［２］に記載のＤＣＣＰＭ。
［７］
前記ラクタムは、リジンとグルタミン酸又はアスパラギン酸とをクロスリンクさせることによって形成される、項［６］に記載のＤＣＣＰＭ。
［８］
各クロスリンクは、２〜２０原子の名目上の連続長さを有する、項［１］〜［７］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
［９］
前記安定化されたペプチドは、少なくとも１つのαヘリックス、延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスを含む、項［１］〜［８］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
［１０］
前記安定化されたペプチドは、少なくとも１つのβシート、又はヘアピン、又はターンを含む、項［１］〜［８］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
［１１］
前記安定化されたペプチドは、少なくとも１つのαヘリックス、延長された３１０ヘリックス又はポリ（Ｐｒｏ）ＩＩヘリックスと、１つのβシート、ターン又はヘアピンとを含む、項［９］又は［１０］に記載のＤＣＣＰＭ。
［１２］
前記ＢＡＣは、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）である、項［１］〜［１１］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
［１３］
前記ＯＮは、電気的に低い電荷を保有するＯＮである、項［１２］に記載のＤＣＣＰＭ。
［１４］
前記ＯＮは、電気的に中性の電荷を保有するＯＮである、項［１３］に記載のＤＣＣＰＭ。
［１５］
前記ＯＮは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）若しくはホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）又はその変異体である、項［１３］又は［１４］に記載のＤＣＣＰＭ。
［１６］
前記ＯＮは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯ）である、項［１２］〜［１５］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
［１７］
前記ＯＮは、ハイブリッド化学物質を有するＯＮを含む、表４の化合物から選択される化学物質を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、項［１６］に記載のＤＣＣＰＭ。
［１８］
前記ＢＡＣは、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）である、項［１２］に記載のＤＣＣＰＭ。
［１９］
前記ＢＡＣは、内因性又は外因性遺伝子の発現を改変する、項［１］〜［１７］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
［２０］
前記内因性遺伝子は、神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患又は後天性ウイルス感染症を標的にする、項［１９］に記載のＤＣＣＰＭ。
［２１］
前記ＢＦＬは、表６の化学物質から選択される化学物質を含む、項［１］〜［１９］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
［２２］
シクロヘキサンスペーサーによって分離されるＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル及びマレイミド反応基を含有するアミンからスルフヒドリルへのクロスリンカーを含む、項［２１］に記載のＤＣＣＰＭ。
［２３］
前記ＢＦＬは、４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）である、項［２１］又は［２２］に記載のＤＣＣＰＭ。
［２４］
前記ＢＦＬは、ＨＮＡであり、且つ前記ＣＰＰの末端に組み込まれている、項［２１］に記載のＤＣＣＰＭ。
［２５］
前記ＢＦＬは、ＨＮＡであり、且つ前記ＯＮは、共有結合による複合を促進するため、４−ホルミル安息香酸を組み込むように修飾されている、項［２４］に記載のＤＣＣＰＭ。
［２６］
前記ＳＭＣＣは、ＰＥＧ化される、項［２３］に記載のＤＣＣＰＭ。
［２７］
前記ＨＮＡは、ＰＥＧ化される、項［２４］又は［２５］に記載のＤＣＣＰＭ。
［２８］
前記ＣＰＡは、前記ＢＦＬの第１の末端に共有結合により連結される、項［２１］に記載のＤＣＣＰＭ。
［２９］
前記ＢＡＣは、前記ＢＦＬの第２の末端に共有結合により連結される、項［２１］に記載のＤＣＣＰＭ。
［３０］
１．５ＫＤａより大きいサイズを有する、項［１］に記載のＤＣＣＰＭ。
［３１］
生物活性化合物（ＢＡＣ）の細胞への取り込みを、安定化されたペプチドであって、ステープルしてステープルされたペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチされたペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化されたペプチドである細胞透過剤（ＣＰＡ）への前記生物活性化合物の複合によって促進する方法であって、前記ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、前記ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸の間にクロスリンク又は架橋を含み、及び前記クロスリンク又は架橋は、薬剤担送細胞透過分子（ＤＣＣＰＭ）を形成し、且つ前記ＤＣＣＰＭを前記細胞に好適な媒体内で提示するため、直接的に又は二官能性リンカー（ＢＦＬ）を介して、オレフィンメタセシスによって形成されない前記少なくとも２つのアミノ酸の間に環化を提供する、方法。
［３２］
内因性又は外因性遺伝子の発現の改変を必要とする疾患の治療に用いられる、項［１］〜［３０］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ。
［３３］
神経筋疾患、代謝疾患、がん、加齢性変性疾患又は後天性ウイルス感染症の治療に用いられる、項［３２］に記載のＤＣＣＰＭ。
［３４］
デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に用いられる、項［３２］に記載のＤＣＣＰＭ。
［３５］
前記ジストロフィン遺伝子を標的にするＡＯを含む、項［３４］に記載のＤＣＣＰＭ。
［３６］
薬剤又はＢＡＣの生物学的利用率を改善する方法であって、前記薬剤又はＢＡＣを、安定化されたペプチドであって、ステープルしてステープルされたペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチされたペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化されたペプチドであるＣＰＰに連結することを含み、前記ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、前記ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸の間にクロスリンク又は架橋を含み、及び前記クロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない前記少なくとも２つのアミノ酸の間に環化を提供する、方法。
［３７］
薬剤又はＢＡＣを、部位であって、その天然状態で前記薬剤又はＢＡＣに対して難治性である部位に導入する方法であって、前記薬剤又はＢＡＣを、安定化されたペプチドであって、ステープルしてステープルされたペプチド（ＳｔａＰ）を形成するか又はステッチしてステッチされたペプチド（ＳｔｉＰ）を形成することにより、その上に設けられた立体構造を有する安定化されたペプチドであるＣＰＰに連結することであって、前記ＳｔｉＰ又はＳｔａＰは、前記ペプチドの少なくとも２つのアミノ酸の間にクロスリンク又は架橋を含み、及び前記クロスリンク又は架橋は、オレフィンメタセシスによって形成されない前記少なくとも２つのアミノ酸の間に環化を提供する、連結することと、それを対象に投与することとを含む方法。
［３８］
前記組織は、心臓、脳、筋肉又は肝臓の１つである、項［３７］に記載の方法。
［３９］
内因性又は外因性遺伝子の発現を改変するように対象を治療する方法であって、項［１］〜［３０］又は［３２］〜［３５］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭを投与するステップを含む方法。
［４０］
項［１］〜［３０］又は［３２］〜［３５］のいずれか一項に記載のＤＣＣＰＭ及び１つ以上の薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物。
［４１］
経口的、非経口的、静脈内又は局所的投与に適応されている、項［４０］に記載の組成物。