【手続補正書】
【提出日】平成17年6月8日(2005.6.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】微小粒子固相上に固定化された物質の測定法
【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定用標識物質を含む被検物質が固定化された微小粒子固相を、分散液中にあらかじめ分散させた後、エンハンサーを含むエンハンサー含有溶液と混合して、被検物質を測定することを特徴とする測定法。
【請求項２】
被検物質が、固相上に形成、固定またはトラップされた複合体と、この複合体を測定するための測定用標識物質からなり、前記複合体は、抗原、抗体、DNA、生理作用物質、病原関連物質および腫瘍マーカーのいずれかの物質と、この物質に対する特異的結合物質とからなることを特徴とする請求項１に記載の測定法。
【請求項３】
微小粒子固相が直径０．１〜１０μｍの磁性ビーズである請求項１または２に記載の測定法。
【請求項４】
微小粒子固相が直径０．１〜１０μｍのラテックス粒子である請求項１または２に記載の測定法。
【請求項５】
測定用標識物質を含む被検物質が酵素、発光物質または蛍光物質であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１に記載の測定法。
【請求項６】
測定用標識物質を含む被検物質がアルカリホスファターゼまたはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１に記載の測定法。
【請求項７】
測定用標識物質が酵素であり、前記エンハンサー含有溶液が酵素基質を含有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１に記載の測定法。
【請求項８】
測定用標識物質が酵素であり、前記分散液が酵素基質を含有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１に記載の測定法。
【請求項９】
酵素基質がジオキセタン誘導体であることを特徴とする請求項７または８に記載の測定法。
【請求項１０】
エンハンサーが界面活性剤であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１に記載の測定法。
【請求項１１】
分散液がエンハンサーを含有しないか、または被検物質が固定化された微小粒子固相の均一な分散を妨害する濃度では含まないことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１に記載の測定法。
【請求項１２】
測定用標識物質を含む被検物質が固定化された微小粒子固相を分散させるための分散液、およびエンハンサーを含むエンハンサー含有溶液を含むことを特徴とする被検物質測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、ヒトの臨床検査、獣医検査、食品衛生検査など多くの分野で利用される技術に関する。詳しくは、測定用標識物質を含む被検物質が固定された微小粒子固相と被検物質測定用試薬溶液とを混合して被検物質を測定する方法および該測定のために使用する試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、ヒトの臨床検査をはじめとして獣医検査、食品検査など多くの分野で、抗原、抗体、ＤＮＡ、生理作用物質、病原関連物質、腫瘍マーカーなど種々の物質の測定は、該物質とそれらに対する特異結合物質との複合体を固相上に形成、固定またはトラップさせ、固相上の複合体を測定することにより実施されてきた。固相上の複合体を測定するためには、抗原抗体結合、ＤＮＡハイブリッド結合、ビオチン−アビジン結合、イオン結合など様々な結合を介して複合体に固定された酵素、蛍光物質、発光物質、ラジオアイソトープなどの測定用標識物質が広く使われている。複合体を形成、固定またはトラップするための固相としてマイクロプレート、ポリチレン球、ガラス球、ポリスチレンチューブの内面の他、ラテックス粒子、磁性ビーズなどの微小粒子固相が使われている。固相上の複合体および測定用標識物質を含む被検物質の測定は、測定用試薬溶液と固相とを接触させた後、測定用標識物質の種類に対応したシグナルを測定することにより実施されている。例えば、測定用標識物質が酵素の場合には、酵素が固定された固相と酵素基質を含む測定用試薬溶液とを接触させた後、測定用試薬溶液の吸光度、発光強度、蛍光強度、磁気共鳴度などが測定される。また、測定用標識物質が蛍光物質、発光物質の場合にはそれらの蛍光物質、発光物質が固相とそれらの蛍光測定、発光測定に最も適した組成の測定用試薬溶液と接触させて、蛍光強度の測定が行われる。この際、測定用標識物質を含む被検物質が固定された固相と測定用試薬溶液との接触が瞬時に均一となることが正確で再現性のある高感度測定に必要である。殊に固相が微小粒子固相の場合には、測定用試薬溶液との均一な混合が微小粒子固相の凝集により妨げられることがあり、測定の正確度、再現性および／または感度を低下させることが問題である。
【０００３】
【発明が解決しょうとする課題】
微小粒子状の固相上に固定された測定用標識物質を含む被検物質の正確度、再現性および／または感度のより高い測定を可能にすることを課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
測定用標識物質を含む被検物質が固定された微小粒子固相を、分散液中にあらかじめ分散させた後、エンハンサーを含むエンハンサー含有溶液と混合して被検物質を測定することにより課題を解決した。
つまり、本発明は
１．測定用標識物質を含む被検物質が固定化された微小粒子固相を、分散液中にあらかじめ分散させた後、エンハンサーを含むエンハンサー含有溶液と混合して、被検物質を測定することを特徴とする測定法。
２．被検物質が、固相上に形成、固定またはトラップされた複合体と、この複合体を測定するための測定用標識物質からなり、前記複合体は、抗原、抗体、DNA、生理作用物質、病原関連物質および腫瘍マーカーのいずれかの物質と、この物質に対する特異的結合物質とからなることを特徴とする前記１に記載の測定法。
３．微小粒子固相が直径０．１〜１０μｍの磁性ビーズである前記１または２に記載の測定法。
４．微小粒子固相が直径０．１〜１０μｍのラテックス粒子である前記１または２に記載の測定法。
５．測定用標識物質を含む被検物質が酵素、発光物質または蛍光物質であることを特徴とする前記１〜４のいずれか１に記載の測定法。
６．測定用標識物質を含む被検物質がアルカリホスファターゼまたはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼであることを特徴とする前記１〜４のいずれか１に記載の測定法。
７．測定用標識物質が酵素であり、前記エンハンサー含有溶液が酵素基質を含有することを特徴とする前記１〜６のいずれか１に記載の測定法。
８．測定用標識物質が酵素であり、前記分散液が酵素基質を含有することを特徴とする前記１〜６のいずれか１に記載の測定法。
９．酵素基質がジオキセタン誘導体であることを特徴とする前記７または８に記載の測定法。
１０．エンハンサーが界面活性剤であることを特徴とする前記１〜９のいずれか１に記載の測定法。
１１．分散液がエンハンサーを含有しないか、または被検物質が固定化された微小粒子固相の均一な分散を妨害する濃度では含まないことを特徴とする前記１〜１０のいずれか１に記載の測定法。
１２．測定用標識物質を含む被検物質が固定化された微小粒子固相を分散させるための分散液、およびエンハンサーを含有するエンハンサー含有溶液を含むことを特徴とする被検物質測定用試薬キット。
からなる。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明は、測定用標識物質を含む被検物質が固定された微小粒子状固相と測定用試薬溶液とを接触させた後シグナルを計測して被検物質を測定する方法に適用することができる。
本発明において使用する固相は、好ましくは直径０．１〜１０μｍの微小粒子状固相であって、それらの材質、形状、製造方法などにより限定されない。例えば、市販のラテックス粒子、好ましくは磁性ビーズなどであるが、これらに限定されない。
【０００６】
本発明における測定用標識物質は例示により限定されないが、酵素、蛍光物質、発光物質など、免疫測定、ＤＮＡ測定などにおいて測定用標識として使用される物質が例示される。酵素としてはアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなどが、蛍光物質としてはフルオレセイン、ローダミンなどまたはそれらの誘導体が、発光物質としてはアクリジニウム、エクオリンなどまたはそれらの誘導体などがそれぞれ例示される。
【０００７】
測定用標識物質が微小粒子状固相上の複合体に固定化される方法、固定された状態に制限はないので、測定用標識物質は種々の方法で種々の状態に固定される。例示により限定されないが、例えば測定用標識物質は種々の物質、種々の結合を介して微小粒子状固相上の複合体に固定される。つまり、測定用標識物質は、抗原、抗体、ホルモン、病原関連物質、腫瘍マーカー、アビジン、ＤＮＡ、ストレプトアビジン、ビオチンこれらのフラグメント、これらの誘導体、抗原−抗体結合、イオン結合、ＤＮＡハイブリッド結合、ビオチン−アビジン結合、ビオチン−ストレプトアビジン結合、ハプテン−抗ハプテン抗体結合などを介して微小粒子状固相上の複合体に固定される。これらは、種々の物質の免疫測定、ＤＮＡの測定などにおいて使用される物質、結合である。
【０００８】
上記のように種々の方法で微小粒子状固相に固定化された被検物質を正確に、しかも再現性よく測定するためには、微小粒子状固相が被検物質の測定用試薬溶液中に凝集することなく均一に分散されていることが必要である。しかし、被検物質の測定用試薬溶液の中には、被検物質測定のために種々の物質が含まれている。例えば、ジオキセタン誘導体を基質として測定するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼの測定用試薬溶液の中には、界面活性剤または界面活性剤様作用物質がエンハンサーとして含まれる。これにより、いったん集積された微小粒子状固相の測定用試薬溶液中への均一な分散が妨げられ、正確度、再現性および／または感度の高い被検物質の測定が妨害される。
【０００９】
本発明においては、分散液中に測定用標識物質を含む被検物質が固定化された微小粒子状固相を均一に分散させた後、被検物質の測定用試薬溶液と混合することにより、測定用試薬溶液中に含まれる微小粒子状固相の均一な分散を妨げる物質の効果を減弱することにより、正確度、再現性および／または感度の高い被検物質の測定を実施する。
分散液には、該固相が凝集することなく均一に分散され、正確度、再現性または／および感度の高い被検物質の測定に支障がない限り、特に制約はない。種々の物質または物質群、例えば被検物質を測定するための酵素基質、各種のタンパク質、脂質、糖質、各種血清などを含むまたは含まない既知のまたは今後開発される液、溶液または緩衝液が例示されるが、例示に限定されるものではない。ｐＨ、イオン強度なども制限はなく、分散液は単なる水でも良い。ただし、被検物質を固定化した微小粒子固相の均一な分散を妨げ、正確度、再現性または／および感度の高い被検物質の測定を妨害するエンハンサーを、該分散または／および該測定を妨害する濃度では、分散液が含まないことが重要である。該分散液の使用方法にも、該固相が例えば凝集することなく分散され被検物質が正確に、しかも再現性よくまた高感度に測定しうる限り、特に制約ない。該固相を攪拌、振とうなど、どのようにして該分散液中に分散させてもよい。該分散液の体積は測定用試薬液の体積より小さいことが好ましいが、大きくてもよい。該分散時の温度も通常２０〜４０℃であるが、特に限定されない。
本発明における測定用試薬溶液は、正確度、再現性および／または感度の高い被検物質の測定のために、上記の分散液に分散させた微小粒子固相とシグナルを計測する前に混合、接触させる溶液であり、したがって、該測定を可能にする物質を、該測定を可能にする濃度で含有する。例示により限定されないが、測定用試薬溶液が、酵素基質およびエンハンサーを含む場合が例示される。しかし、分散液中にすでに酵素基質が添加されている場合には、測定用試薬溶液の中には酵素基質が必ずしも含まれる必要はない。つまり、酵素基質は、いずれの段階で１回または２回以上添加してもよい。エンハンサーの添加でも同様であり、酵素基質、エンハンサーの濃度に制限はなく、酵素基質または／およびエンハンサーを含む測定用試薬の数、添加回数にも制限はない。上記の分散液中に分散させた微小粒子固相とエンハンサーを含む測定用試薬溶液を混合し、さらに酵素基質を含む測定用試薬溶液と混合してもよいが、酵素反応をより早く始めるためには、酵素基質はエンハンサーと同時かまたはエンハンサーより前に添加することが好ましい。
測定用標識物質を含む被検物質を固定化した微小粒子固相を分散液中に分散させ、測定用試薬溶液と混合した後のシグナルの測定は、公知の方法または今後開発される方法により実施することができる。該微小粒子固相の濃度が低く、シグナルの測定に支障がない場合には、そのままシグナルを測定することができるが、該微小粒子固相の濃度が高く、消光などによりシグナルの測定が困難な場合は、該微小粒子固相を集積した後に、シグナルを測定することもできる（特願２００１−１８９４１９）。
【００１０】
本発明は、上記に説明した測定方法の実施のための固相、試薬等におよび、また、該固相および緩衝液、ブロッキング液、洗浄液、基質液、抗体、ハプテン等に例示される本発明に使用する少なくとも１の固相および／または試薬を含む測定キットにもおよぶ。さらに、本発明は、上記に説明した測定方法の実施のための固相、試薬および自動化ソフトを含む測定システムにもおよぶ。以上は例示により説明したが、本発明はこれらの例示により限定されるものではない。
【００１１】
【実施例】
以下実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。
【００１２】
【実施例１】
この実施例では、ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）および抗ＨＢｓＡｇ抗体を少なくとも含む複合体並びにアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を含む被検物質を固定した磁性ビーズについてＡＬＰの発光を測定する方法において、該磁性ビーズを予めＡＬＰ活性測定用試薬溶液以外の緩衝液により分散することの効果を示す。
【００１３】
（材料と方法）
・磁性ビーズ
ＭＧ２１０（直径１．７μｍ、比重１．３）
ＪＳＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ
・アルカリホスファターゼ（以下ＡＬＰと記載）
Ｏｒｉｅｎｔａｌ  Ｙｅａｔ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ
・モノクローナル抗体
抗ヒトＢ型肝炎ウイルス表面抗原（以下ＨＢｓＡｇと記載）ＩｇＧ−６４９および８５ならびに抗２，４−ジニトロフェニル基（以下ＤＮＰと記載）ＩｇＧ−１７５３
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｏｂｅ、
Ｊａｐａｎ
・ＤＮＰビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’とＡＬＰ−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’
ＤＮＰ化ビオチン化ウシ血清アルブミン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’−６４９（ＤＮＰ−ビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’）とＡＬＰ−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’−８５（ＡＬＰ−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’）をマレイミド基とチオール基の反応を使う公知の方法（Ｅ．  Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２７，  Ｓ．  Ｐｉｌｌａｉ，  Ｐ．Ｃ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  ｐｐ．１４１−１７６，  １９９９）により調製した。
・ブロッキング液
０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｇ／Ｌウシ血清アルブミン、１０ｇ／Ｌシュークロース、１ｇ／Ｌ  ＮａＮ３ を含む１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０
・抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズ
磁性ビーズにモノクローナル抗ＤＮＰＩｇＧ−１７５３をＪＳＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの指示書に従って不溶化し、ブロッキング液で洗浄した後、４℃で同液中に保存した。
・ＤＮＰ−ビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’、ＡＬＰ−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’、ＨＢｓＡｇ、抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズおよびストレプトアビジン不溶化磁性ビーズの希釈液
ＴＥＡ緩衝液
・ＴＥＡ緩衝液
１ｍＭ  ＭｇＣｌ２ 、０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２ 、１ｇ／Ｌ  ウシ血清アルブミン、０．５ｇ／Ｌ  ＮａＮ３ を含む０．１Ｍトリエタノラミン・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．６
・ＡＬＰ用洗浄液
０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｇ／Ｌ  ＮａＮ３ を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４
・インキュベーション温度
非競合的転移固相測定法の全工程におけるインキュベーション温度は３７℃とした。
・ＤＮＰ−ビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’の抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズへの結合
１００ｐｍｏｌ／ｍＬのＤＮＰ−ビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’、２５μＬとＴＥＡ緩衝液で洗浄した抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズ、０．５ｍｇを１０分間インキュベートした後、磁性ビーズを１０秒間の磁気分離により分離し、上清を吸引除去した後、ＡＬＰ用洗浄液２００μＬで１０秒間の磁気分離により１回洗浄し、ＴＥＡ緩衝液８０μＬで懸濁した。
・ＨＢｓＡｇのＤＮＰ−ビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’結合抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズへの結合
２．５ＩＵ／ｍＬのＨＢｓＡｇ２０μＬと上記の洗浄したＤＮＰ−ビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’結合抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズを２分間インキュベートした後、該磁性ビーズをＡＬＰ用洗浄液２００μＬで１０秒間の磁気分離により１回洗浄した。
・ＡＬＰ−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’のＨＢｓＡｇ結合ＤＮＰ−ビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’結合抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズへの結合
４．８ｐｍｏｌ／ｍＬのＡＬＰ−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’、１００μＬと上記の洗浄したＨＢｓＡｇ結合ＤＮＰ−ビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’結合抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズを１分間インキュベートした後、ＡＬＰ用洗浄液２００μＬで１０秒間の磁気分離により１回洗浄した。
・リン緩衝液
０．５ｇ／Ｌ  ＮａＮ３ を含む０．１Ｍ  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５
・ストレプトアビジン
ＴｙｐｅＩＩ、Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ，  Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ
・ＤＮＰ−Ｌｙｓ液
３ｍＭ  εＮ−２．４−ジトロフェニル−Ｌ−リジンを含むＴＥＡ緩衝液
・ストレプトアビジン不溶化磁性ビーズ
ビオチン化ウシ血清アルブミンを、公知の方法（Ｅ．  Ｉｓｈｉｋａｗａ，  Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２７，  Ｓ．  Ｐｉｌｌａｉ，  Ｐ．Ｃ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  ｅｄｓ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，  ｐｐ．１４１−１７６，  １９９９）により調製し、これをＪＳＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの指示書にしたがって磁性ビーズに不溶化した後、３０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンをリン酸緩衝液に溶解して反応させ、リン酸緩衝液で１回洗浄、ブロッキング液中に４℃で保存した。
・免疫複合体の抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズからの溶出
上記のＤＮＰ−ビオチン−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’、ＨＢｓＡｇ、ＡＬＰ−抗ＨＢｓＡｇ  Ｆａｂ’の３者からなる免疫複合体を結合させた抗ＤＮＰＩｇＧ不溶化磁性ビーズとＤＮＰ−Ｌｙｓ液１００μＬを０．５分間インキュベートした後、該磁性ビーズを磁石により１５秒間集積した上清を溶出液とした。
・免疫複合体のストレプトアビジン不溶化磁性ビーズヘの結合
上記溶出液とストレプトアビジン不溶化磁性ビーズ０．５ｍｇを１分間インキュベートした後、該磁性ビーズを磁石により１０秒間集積し、上清を除去した後、ＡＬＰ用洗浄液２００μＬ中に該磁注ビーズを分散させ、再び１０秒間磁石により集積して直ちに上清を除去することにより１回洗浄した。
・ＡＬＰ発光基質液
ＣＤＰ−ｓｔａｒ  ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｕｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＩＩ、Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ
・ＡＬＰ分散液
１Ｍ  ジエタノラミン・ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ１０．０
・発光測定装置
Ｌｕｍｉｃｏｕｎｔｅｒ２５００、Ｍｉｃｒｏｔｅｃ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．、Ｃｈｉｂａ、Ｊａｐａｎ
・ＡＬＰ結合磁性ビーズのＡＬＰ活性の測定
測定１：上記の洗浄したＡＬＰ結合磁性ビーズを、３０μＬの分散液中に分散し、基質液１００μＬと混合し、３７℃、２．７５分間インキュベートした後、該磁性ビーズを磁石で集積した上清の０．１秒間の発光量を同時に５例測定した。
測定２：上記の洗浄したＡＬＰ結合磁性ビーズを、分散液３０μＬと基質液１００μＬの混合液１３０μＬ中に分散し、３７℃、２．７５分間インキュベートした後、該磁性ビーズを磁石で集積した上清の０．１秒間の発光量を同時に５例測定した。
【００１４】
（結果）
実施例１の結果を表１に示す。
ＡＬＰ結合磁性ビーズを基質とエンハンサーを含まない分散液中に予め分散させた後、基質とエンハンサーを含む基質液と混合してＡＬＰ活性を測定したときの発光強度は９２，８９２、再現性はＣＶ２．８％（５例）であった。基質液と分散液の混合液中に直接分散させてＡＬＰ活性を測定したときの発光強度は６３，２２８、再現性ＣＶは１９．４％と非常に高かった。つまり、ＡＬＰ結合磁性ビーズを、エンハンサーを含まない分散液で予め分散した後、基質とエンハンサーを含む測定用試薬溶液と混合して発光強度を測定することにより、シグナルとしての発光強度、したがって感度も再現性もともに、分散液を使用しないで該磁性ビーズを酵素基質とエンハンサーを含む測定用試薬溶液と直接混合した場合に比べて格段に改善された。
【００１５】
【実施例２】
この実施例では、実施例１と同様の磁性ビーズについてＡＬＰの発光を測定する方法において、エンハンサーより前に酵素基質を添加することの効果を示す。
【００１６】
（材料と方法）
以下に示す材料と方法の他は、実施例１のそれらと同じである。
・基質液
基質としてのＣＤＰ−ｓｔａｒのみを含む溶液、トロピックス社。
・エンハンサー液
エンハンサーとしてのＳａｐｐｈｉｒｅＩＩのみを含む溶液、トロピックス社。
・ＡＬＰ結合磁性ビーズのＡＬＰ活性の測定
測定１：洗浄したＡＬＰ結合磁性ビーズを、分散液３０μＬと基質液９０μＬの混合液中に分散し、その１５秒後に実施例１で添加したＡＬＰ発光基質液（基質ＣＤＰ−ｓｔａｒ とエンハンサーＳａｐｐｈｉｒｅＩＩを含む）の代わりにエンハンサー液１０μＬを添加し、実施例１と同様にインキュベートし、発光強度を測定した。
測定２：エンハンサー液１０μＬを測定１における添加より２分１５秒遅れで添加した以外は、測定１と同様にして測定した。
【００１７】
（結果）
実施例２の結果を表２に示す。
エンハンサーを基質の添加より遅れて添加し、エンハンサーの添加から発光測定までの時間を短縮することにより、発光強度は、１２１，５００から７９，０９０に低下した。この結果は、エンハンサーを可及的早期に添加することにより高いシグナル、つまり高い感度が得られることを示すと同時に、エンハンサー非存在下でも酵素反応が進むことを示しているので、エンハンサーを添加することができない早い段階で、例えば分散液添加の段階で基質を添加することにより、それだけ高いシグナルを得ることができることをも示している。
【００１８】
【表１】
2004020344.tif 000001
【００１９】
【表２】
2004020344.tif 000002