【手続補正書】
【提出日】令和3年1月8日(2021.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナーであって、前記複数の一次結合パートナーのそれぞれが、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つプローブ鎖に連結される、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合されたタンパク質又はペプチドを含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された前記第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子が、５’−３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、前記第１のドメインが、前記第２のドメインに結合され、及び前記第３のドメインが、前記一次結合パートナーの１つの前記プローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された前記第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖が、異なる検出可能な分子に連結され、且つ前記一次結合パートナーの１つの架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、前記標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
【請求項２】
（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナーであって、前記複数の一次結合パートナーのそれぞれが、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合されたタンパク質又はペプチドを含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）前記第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、複数のプローブ鎖、及び複数の触媒分子であって、各プローブ鎖が、（ｉ）前記一次結合パートナーの１つの前記架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含み、各触媒分子が、５’−３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、前記第１のドメインが、前記第２のドメインに結合され、及び前記第３のドメインが、前記プローブ鎖の１つに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、複数のプローブ鎖、及び複数の触媒分子を第２の反応混合物中で組み合わせることによって生成されたプローブ鎖に結合されたコンカテマーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む第３の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された前記第３の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖が、異なる検出可能な分子に連結され、且つ前記一次結合パートナーの１つの前記架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、前記標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
【請求項３】
（ａ）複数のタンパク質又はペプチド標的を含有するサンプルと、複数の一次結合パートナーであって、前記複数の一次結合パートナーのそれぞれが、タンパク質又はペプチド標的に特異的に結合し、且つ架橋鎖に連結される、複数の一次結合パートナーとを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合されたタンパク質又はペプチドを含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）前記第１の反応混合物と、複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖が、（ｉ）前記一次結合パートナーの１つの前記架橋鎖に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された一次結合パートナーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）前記第２の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子が、５’−３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、前記第１のドメインが、前記第２のドメインに結合され、及び前記第３のドメインが、前記プローブ鎖の１つに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ一次結合パートナーに結合された核酸コンカテマーを含む第３の反応混合物を生成すること、
（ｄ）ステップ（ｂ）で生成された前記第３の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖が、異なる検出可能な分子に連結され、且つ前記一次結合パートナーの１つの前記架橋鎖に対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｅ）任意選択的に、前記標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
【請求項４】
前記一次結合パートナーが、抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記触媒分子及び／又は架橋鎖が、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡから構成される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
各触媒分子の前記第１のドメインが、同じ触媒分子の前記第２のドメインに結合され、各触媒分子の前記第２のドメインが、同じ触媒分子の前記第３のドメインと同一の配列を含み、及び／又は各触媒分子の前記第１のドメインが、同じ触媒分子の前記第２のドメインに対して完全に相補的な配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
各触媒分子が、同じ触媒分子の前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間に位置する、重合を終結させるストッパー分子又は修飾をさらに含み、
任意選択的に、重合を終結させる前記ストッパー分子又は修飾が、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、１８原子ヘキサエチレングリコール、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン、コレステリル−ＴＥＧ、３−シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）、ｉｓｏ−ｄＧ、及びｉｓｏ−ｄＣから選択され、前記ストッパー分子が、グアニンであり、且つ前記触媒分子が、アデニン、チミン、及びシトシンから構成されるか、あるいは前記ストッパー分子が、シトシンであり、且つ前記触媒分子が、アデニン、チミン、及びグアニンから構成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
各触媒分子が、前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間に位置するループドメインをさらに含む触媒ヘアピン分子である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）複数の核酸標的を含有するサンプルと、複数のプローブ鎖であって、各プローブ鎖が、（ｉ）前記核酸標的の１つに対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含む、複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された分子標的を含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された前記第１の反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子であって、各触媒分子が、５’−３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、前記第１のドメインが、前記第２のドメインに結合され、及び前記第３のドメインが、前記プローブ鎖の１つの前記不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された前記第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖が、異なる検出可能な分子に連結され、且つ前記プローブ鎖の１つの前記不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、前記標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
【請求項１０】
（ａ）複数のプローブ鎖と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子とであって、各プローブ鎖が、（ｉ）複数の核酸標的の核酸標的に対して相補的な不対５’標的ドメイン、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインを含み、各触媒分子が、５’−３’方向に第１のドメイン、第２のドメイン、及び第３のドメインを含み、前記第１のドメインが、前記第２のドメインに結合され、及び前記第３のドメインが、前記プローブ鎖の１つの前記不対３’プライマードメインに対して相補的な不対３’トーホールドドメインである、複数のプローブ鎖と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び複数の触媒分子とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された核酸コンカテマーを含む第１の反応混合物を生成すること、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された前記第１の反応混合物と、複数の核酸標的を含有するサンプルとを組み合わせ、且つ分子標的に結合された核酸コンカテマーを含む第２の反応混合物を生成すること、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された前記第２の反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖が、異なる検出可能な分子に連結され、且つ前記プローブ鎖の１つの前記不対３’プライマードメインに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成すること
を含み、及び
（ｄ）任意選択的に、前記標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、多重化標的検出方法。
【請求項１１】
前記プローブ鎖及び／又は触媒分子が、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡから構成される、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
各触媒分子の前記第１のドメインが、同じ触媒分子の前記第２のドメインに結合され、各触媒分子の前記第２のドメインが、同じ触媒分子の前記第３のドメインと同一の配列を含み、及び／又は各触媒分子の前記第１のドメインが、同じ触媒分子の前記第２のドメインに対して完全に相補的な配列を含む、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
各触媒分子が、同じ触媒分子の前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間に位置する、重合を終結させるストッパー分子又は修飾をさらに含み、
任意選択的に、重合を終結させる前記ストッパー分子又は修飾が、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）、１８原子ヘキサエチレングリコール、アデニル化、アジド、ジゴキシゲニン、コレステリル−ＴＥＧ、３−シアノビニルカルバゾール（ＣＮＶＫ）、ｉｓｏ−ｄＧ、及びｉｓｏ−ｄＣから選択され、任意選択的に、前記ストッパー分子が、グアニンであり、且つ前記触媒分子が、アデニン、チミン、及びシトシンから構成されるか、あるいは前記ストッパー分子が、シトシンであり、且つ前記触媒分子が、アデニン、チミン、及びグアニンから構成される、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
各触媒分子が、前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間に位置するループドメインをさらに含む触媒ヘアピン分子であり、任意選択的に、各触媒ヘアピン分子が、２５〜３００ヌクレオチド長を有するＤＮＡの一本鎖から構成される、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
各プローブ鎖が、１０〜５０ヌクレオチド長を有し、及び／又は各プローブ鎖の前記標的ドメインが、５〜２５ヌクレオチド長を有し、及び／又は各プローブ鎖の前記プライマードメインが、５〜２５ヌクレオチド長を有し、及び／又は前記シグナル鎖のそれぞれが、１０〜３０ヌクレオチド長を有する、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記シグナル鎖の前記検出可能な分子が、フルオロフォアである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記鎖置換ポリメラーゼが、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｓｕ  ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントから選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のプローブ鎖が、２〜１０，０００の前記プローブ鎖を含み、
前記複数の触媒分子が、２〜１０，０００の前記触媒分子を含み、及び
前記複数のシグナル鎖が、２〜１０，０００の前記シグナル鎖を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルが、細胞サンプル又は組織サンプルである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
タンデム反復配列のコンカテマーが結合される核酸標的を含むサンプルであって、検出可能な標識に連結されたシグナル鎖が、前記コンカテマーの各配列に結合される、サンプル。
【請求項２１】
一次結合パートナーが結合されるタンパク質標的を含むサンプルであって、前記一次結合パートナーが、タンデム反復配列のコンカテマーに連結され、及び検出可能な標識に連結されたシグナル鎖が、前記コンカテマーの各配列に結合される、サンプル。
【請求項２２】
（ａ）複数の核酸標的を含有するサンプルと、第１の複数のプローブ鎖であって、前記第１の複数のものの各プローブ鎖が、（ｉ）前記核酸標的の１つに対して相補的な不対５’標的ドメインａ、及び（ｉｉ）不対３’プライマードメインｂを含む、第１の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合された分子標的を含む反応混合物を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）で生成された前記反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第１の複数の触媒分子であって、前記第１の複数のものの各触媒分子が、５’−３’方向にドメインａ1、ドメインｘ、ドメインａ2、ドメインｂ1、ドメインｂ1*、ドメインａ2*、ドメインｘ*、ドメインａ1*、ドメインｂ2*、及びドメインａ3*を含み、ドメインａ1、ドメインｘ、ドメインａ2、及びドメインｂ1が、それぞれドメインｂ1*、ドメインａ2*、ドメインｘ*、及びドメインａ1*に結合し、且つドメインｂ2*及びドメインａ3*が、前記第１の複数のものの前記プローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第１の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分子標的に結合された第１の複数の核酸コンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で生成された前記反応混合物と、第２の複数のプローブ鎖であって、前記第２の複数のものの各プローブ鎖が、（ｉ）前記触媒分子のドメインｘに対して相補的な不対５’ドメインｘ*、及び（ｉｉ）前記触媒分子のドメインｂ１及びｂ2*に対して相補的な不対３’プライマードメインｂを含む、第２の複数のプローブ鎖とを組み合わせ、且つプローブ鎖に結合されたコンカテマーを含む反応混合物を生成することと、
（ｄ）ステップ（ｃ）で生成された前記反応混合物と、ｄＮＴＰ、鎖置換ポリメラーゼ、及び第２の複数の触媒分子であって、前記第２の複数のものの各触媒分子が、５’−３’方向にドメインａ1、ドメインｘ、ドメインａ2、ドメインｂ1、ドメインｂ1*、ドメインａ2*、ドメインｘ*、ドメインａ1*、ドメインｂ2*、及びドメインａ3*を含み、ドメインａ1、ドメインｘ、ドメインａ2、及びドメインｂ1が、それぞれドメインｂ1*、ドメインａ2*、ドメインｘ*、及びドメインａ1*に結合し、且つドメインｂ2*及びドメインａ3*が、前記第１の複数のものの前記プローブ鎖に対して相補的な不対３’トーホールドドメインを形成する、第２の複数の触媒分子とを組み合わせ、且つ分岐コンカテマーを生成することと
を含む、多重化標的検出方法。
【請求項２３】
（ｅ）ステップ（ｄ）で生成された前記反応混合物と、複数のシグナル鎖であって、各シグナル鎖が、異なる検出可能な分子に連結され、且つ前記第１及び／又は第２の複数のプローブ鎖の前記プローブ鎖の前記不対３’プライマードメインｂに対して相補的なドメインを含む、複数のシグナル鎖とを組み合わせ、且つ複数のシグナル鎖によって標識されたコンカテマーを生成することをさらに含み、及び任意選択的に、前記標識コンカテマーを画像化することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。