【手続補正書】
【提出日】令和3年8月2日(2021.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化により、同様の条件での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化と比べてアルカロイド生成物の生成を増大させる方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換され、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、同様の条件での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化と比べて（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの生成が増大し、
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、オキシダーゼ成分およびレダクターゼ成分を含み、および
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼのオキシダーゼ成分が、第1の分子を含み、および前記同一の遺伝子操作された分割型エピメラーゼのレダクターゼ成分が、第2の分子を含み、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記オキシダーゼ成分は、前記同一の遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記レダクターゼ成分と分離されている、
方法。
【請求項２】
前記融合型エピメラーゼが、野生型エピメラーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの親エピメラーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記オキシダーゼ成分と同じ配列を有するオキシダーゼドメインを含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記オキシダーゼ成分をコードしている第1の核酸が第1の翻訳開始部位を有し、前記レダクターゼ成分をコードしている第2の核酸が第2の翻訳開始部位を有する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記オキシダーゼ成分が、SEQ ID NO.17と少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記オキシダーゼ成分が、SEQ ID NO.17と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含む、DNA配列
にコードされた配列を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記レダクターゼ成分が、SEQ ID NO.18と少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
前記レダクターゼ成分が、SEQ ID NO.18と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で前記融合型エピメラーゼよりも少なくとも1％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも5％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化によりアルカロイド生成物を生成する方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換され、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼはオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含み、前記オキシダーゼ成分はSEQ ID NO.17と少なくとも80％の配列同一性を有し、前記レダクターゼ成分はSEQ ID NO.18と少なくとも80％の配列同一性を有し、および
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼのオキシダーゼ成分が、第1の分子を含み、および前記同一の遺伝子操作された分割型エピメラーゼのレダクターゼ成分が、第2の分子を含み、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記オキシダーゼ成分は、前記同一の遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記レダクターゼ成分と分離されている、
方法。
【請求項１７】
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
前記オキシダーゼ成分をコードしている第1の核酸が第1の翻訳開始部位を有し、前記レダクターゼ成分をコードしている第2の核酸が第2の翻訳開始部位を有する、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
前記オキシダーゼ成分が、SEQ ID NO.17と少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
前記オキシダーゼ成分が、SEQ ID NO.17と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項16記載の方法。
【請求項２３】
前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列
にコードされた配列を含む、請求項16記載の方法。
【請求項２４】
前記レダクターゼ成分が、SEQ ID NO.18と少なくとも85％の配列同一性を有する、請求項16記載の方法。
【請求項２５】
前記レダクターゼ成分が、SEQ ID NO.18と少なくとも90％の配列同一性を含む、請求項16記載の方法。
【請求項２６】
前記レダクターゼ成分が、SEQ ID NO.18と少なくとも95％の配列同一性を有する、請求項16記載の方法。
【請求項２７】
前記第1の分子が、正味のオキシダーゼ活性を有し、および前記第2の分子が、正味のレダクターゼ活性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
前記第1の分子の生成物が、前記第2の分子の基質を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
前記第1の分子が、正味のオキシダーゼ活性を有し、および前記第2の分子が、正味のレダクターゼ活性を有する、請求項16記載の方法。
【請求項３０】
前記第1の分子の生成物が、前記第2の分子の基質を含む、請求項16記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
[本発明1001]
遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化により、同様の条件での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化と比べてアルカロイド生成物の生成を増大させる方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換される、
方法。
[本発明1002]
前記融合型エピメラーゼが野生型エピメラーゼである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記融合型エピメラーゼが前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの親エピメラーゼである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記オキシダーゼ成分と同じ配列を有するオキシダーゼドメインを含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼがオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも80％相同な配列を含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも95％相同な配列を含む、本発明1007の方法。
[本発明1011]
前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含む、DNA配列
にコードされた配列を含む、本発明1007の方法。
[本発明1012]
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、本発明1007の方法。
[本発明1013]
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも95％相同な配列を含む、本発明1007の方法。
[本発明1014]
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で前記融合型エピメラーゼよりも少なくとも1％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも3％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼにより、同様の条件下で野生型融合型エピメラーゼよりも少なくとも5％多い前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが生成される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
遺伝子操作された宿主細胞内での遺伝子操作された分割型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへのエピマー化によりアルカロイド生成物を生成する方法であって、
前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと前記遺伝子操作された宿主細胞内で接触させ、それによりアルカロイド生成物の生成を増大させる工程
を含み、
ここで、前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドを前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼと接触させることにより、前記遺伝子操作された宿主細胞内で前記（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドが前記（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドに変換され、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼはオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含み、前記オキシダーゼ成分はSEQ ID NO.17と少なくとも80％相同な配列を含み、前記レダクターゼ成分はSEQ ID NO.18と少なくとも80％相同な配列を含む、
方法。
[本発明1018]
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの活性を高める1つまたは複数の変異を含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼが、局在変異、シトクロムP450レダクターゼ相互作用変異および到達性変異からなる群より選択される1つまたは複数の変異を含む、本発明1017の方法。
[本発明1020]
前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼがオキシダーゼ成分とレダクターゼ成分を含む、本発明1017の方法。
[本発明1021]
前記オキシダーゼ成分が、1つまたは複数の変異を含むDNA配列にコードされた配列を含み、該変異の各々が、SEQ ID NO.17内の16位、17位、37位、50位、64位、69位、70位、110位、128位、155位、232位、234位、244位、293位、303位、328位、354位、387位、393位、427位および477位からなる群より選択される位置に対応するコドン位置に存在する、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも85％相同な配列を含む、本発明1020の方法。
[本発明1023]
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも90％相同な配列を含む、本発明1020の方法。
[本発明1024]
前記オキシダーゼ成分がSEQ ID NO.17と少なくとも95％相同な配列を含む、本発明1020の方法。
[本発明1025]
前記オキシダーゼ成分が、
野生型配列と比べて、75位、160位、191位、256位、359位、366位および500位からなる群より選択されるSEQ ID NO.17内のアミノ酸位置に対応するコドン位置に1つまたは複数のコドン置換を含むDNA配列
にコードされた配列を含む、本発明1020の方法。
[本発明1026]
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも85％相同な配列を含む、本発明1020の方法。
[本発明1027]
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも90％相同な配列を含む、本発明1020の方法。
[本発明1028]
前記レダクターゼ成分がSEQ ID NO.18と少なくとも95％相同な配列を含む、本発明1020の方法。
[本発明1029]
前記オキシダーゼ成分をコードしている第1の核酸が第1の翻訳開始部位を有し、前記レダクターゼ成分をコードしている第2の核酸が第2の翻訳開始部位を有する、本発明1007または1020の方法。
[本発明1030]
前記第1の核酸が前記第2の核酸と分離されている、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記第1の核酸が前記第2の核酸と同じ核酸である、本発明1029の方法。
[本発明1032]
前記オキシダーゼ成分が第1のメッセンジャーRNAにコードされており、前記レダクターゼ成分が第2のメッセンジャーRNAにコードされている、本発明1007または1020の方法。
[本発明1033]
前記オキシダーゼ成分が第1の分子を含み、前記レダクターゼ成分が第2の分子を含み、ここで、前記第1の分子は前記第2の分子と分離されている、本発明1007または1020の方法。
[本発明1034]
（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換を、同様の条件下での融合型エピメラーゼを介する（S）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドの（R）-1-ベンジルイソキノリンアルカロイドへの変換と比べて増大させる、遺伝子操作された分割型エピメラーゼ
を含む、遺伝子操作された宿主細胞。
[本発明1035]
前記融合型エピメラーゼが野生型エピメラーゼである、本発明1034の遺伝子操作された宿主細胞。
[本発明1036]
前記融合型エピメラーゼが前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの親エピメラーゼである、本発明1034の遺伝子操作された宿主細胞。
[本発明1037]
前記融合型エピメラーゼが、前記遺伝子操作された分割型エピメラーゼの前記オキシダーゼ成分と同じ配列を有するオキシダーゼドメインを含む遺伝子操作された融合型エピメラーゼである、本発明1034の遺伝子操作された宿主細胞。
参照による組み入れ
本明細書において言及した刊行物、特許および特許出願はすべて、参照により、あたかも個々の各刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられて具体的に個々に示されているのと同程度に、本明細書に組み入れられる。