【誤訳訂正書】
【提出日】令和2年11月30日(2020.11.30)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素的方法を使用してレバウディオサイドＪを調製するための方法であって、反応系においてレバウディオサイドＡを、グリコシル供与体と、レバウディオサイドＪを産生するための、ｉ)ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼまたはii)ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組み換え細胞存在下で反応させることを含み、ここで、ｉ)またはii)のＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは配列２のアミノ酸配列を有し、グリコシル供与体がラムノシル供与体である、方法。
【請求項２】
ラムノシル供与体がＵＤＰ−ラムノースである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼがＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
反応系が３５〜４５℃の温度及び７．５〜８．５のｐＨを有する水相を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
水相がリン酸緩衝液である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
反応系が細胞透過剤をさらに含有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
細胞透過剤がトルエンであり、トルエンが１〜３％の体積比濃度を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
組み換え細胞が微生物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
微生物が大腸菌（Escherichia coli）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
樹脂単離によりレバウディオサイドＪを精製することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
樹脂単離により精製されたレバウディオサイドＪが９５％を超える純度を有する、請求項１０に記載の方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００２】
甘味剤は、食品、例えば、飲料及びキャンディーの製造において広範な用途を有する食品添加剤の部類である。それらは、食品製造プロセスにおいて添加されてもよく、あるいは家庭でのベーキングにおいてスクロースの代用物として適切な希釈を通して使用されてもよい。甘味剤としては、天然甘味剤、例えば、スクロース、高果糖コーンシロップ、ハチミツ等、及び人工甘味剤、例えば、アスパルテーム、サッカリン等が挙げられる。ステビオサイドは、植物Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａから抽出された天然甘味剤の部類であり、存在する食品及び飲料において広く使用されている。Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａの抽出物は、レバウディオサイドを含む様々なステビオサイドを含有する。天然に抽出されたステビオサイドは、異なるバッチにわたって成分の大きな違いを有し、その後の精製を必要とする。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
より好ましくは、反応において使用される全ての原料をリアクターに添加して均一に混合した後、撹拌しながら反応のために設定温度で配置する。反応が完了した後、使用要件を満たすことができるレバウディオサイドＪ産生物を精製処理を通して得ることができる。特定の精製方法は、樹脂単離を含む後処理によるものであり、９５％もの高い純度を有するレバウディオサイドＪ産生物を得ることができる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
本発明によって提供される酵素的方法を使用するレバウディオサイドＪを調製する方法は、重要な適用価値を有する。基質レバウディオサイドＡは、酵素的方法を使用することにより大量に得ることができるため、レバウディオサイドＪの産生は、原料の量によって制限されない。このため、製造コストが大幅に削減される。また植物におけるステビオサイドの含有量が低いため、及び異なる構造を有する多くのステビオサイドが存在するため、高い純度を有する産生物を抽出することはむしろ困難である。ステビア葉からレバウディオサイドＪを抽出するための先行技術と比較すると、本発明は、新規のステビオサイドレバウディオサイドＪの研究及び適用を促進する酵素合成方法を採用することによって、より高い純度を有する産生物を提供する。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え大腸菌の発現株を利用することによって、ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え細胞及びＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を調製するためのステップは、以下のとおりである。
ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え大腸菌発現株を、１％の割合に従って４ｍＬの液体ＬＢ培地に接種する。振盪培養を、３７℃で（２００ｒｐｍで）一晩実行する。一晩培養した物質を採取し、１％の割合に従って５０ｍＬのＬＢ液体培地に接種する。ＯＤ６００値が０．６〜０．８に達するまで、振盪培養を、３７℃で（２００ｒｐｍで）一晩実行する。次いで、０．４ｍＭの最終濃度を有するＩＰＴＧを、一晩の振盪培養にわたって２０℃で添加する。誘導が完了した後、細胞を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分）によって回収する。次いで、細胞を５ｍＬの２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で再懸濁して、組み換え細胞を得る。次いで、細胞を氷浴中で超音波的に破壊した。ホモジネートを遠心分離する（８，０００ｒｐｍ、１０分）。また上清を回収し、凍結乾燥粉末を得るために２４時間凍結乾燥させる。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
本発明は、以下の特定の実施例と組み合わせて更に詳述される。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３３】
実施例１：ＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え大腸菌細胞の調製
配列３及び配列４に従って、ＵＧＴ−Ｂ遺伝子断片を遺伝的に合成し、一方で２つの末端にＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ酵素切断部位をそれぞれ付加し、ｐＵＣ５７ベクター（Ｓｕｚｈｏｕ  Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｃｏ．，Ｌｔｄ．製）にライゲーションした。ＵＧＴ遺伝子セグメントを、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅｌ及びＢａｍＨＩで酵素消化した後、セグメントを回収し、精製した。ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換するために、Ｔ４リガーゼを付加して、セグメントをｐＥＴ３０ａの対応する酵素切断部位にライゲーションした。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
実施例２：ＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末の調製
実施例１で調製したＵＧＴ−Ｂを含有する組み換え細胞を、氷浴中で超音波的に破壊した。ホモジネートを遠心分離した（８，０００ｒｐｍ、１０分）。また上澄みを回収し、２４時間凍結乾燥して、ＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を得た。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
１Ｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｇのＵＤＰラムノース、１ｇのレバウディオサイドＡ、１０ｇのＵＧＴ−Ｂの凍結乾燥粉末を反応系に順次添加し、均一に混合した後４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌しながら２４時間にわたって反応させた。反応が完了した後、５００μＬの反応液を等量の無水メタノールに添加し、均一に混合した。次いで、それを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、濾過膜で濾過した後、高性能液体クロマトグラフィを使用して上清を検出した（クロマトグラフ条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ｓｂ−Ｃ１８  ４．６×１５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：アセトニトリル：脱イオン水＝２４％：７６％、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：３０℃）。レバウディオサイドＡの変換率は、９０％を超えた。シリカ樹脂による単離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、０．５２ｇのレバウディオサイドＪを得て、その純度は９５％を超えた。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３９】
１Ｌの０．０５ｍｏｌ／Ｌのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｇのＵＤＰラムノース、１ｇのレバウディオサイドＡ、２０ｍＬのトルエン、４０ｇのＵＧＴ−Ｂ全細胞を反応系に順次添加し、均一に混合した後４０℃の水浴に入れ、３００ｒｐｍで撹拌しながら２４時間にわたって反応させた。反応が完了した後、５００μＬの反応液を取り、遠心分離した。上清を等量の無水メタノールと共に添加し、均一に混合した。次いで、それを８，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、濾過膜で濾過した後、高性能液体クロマトグラフィを使用して上清を検出した（クロマトグラフ条件：カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ｅｃｌｉｐｓｅ  ｓｂ−Ｃ１８  ４．６×１５０ｍｍ、検出波長：２１０ｎｍ、移動相：アセトニトリル：脱イオン水＝２４％：７６％、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：３０℃）。レバウディオサイドＡの変換率は、９０％を超えた。シリカ樹脂による単離及び結晶化などの後処理によって上清を精製した後、０．４９ｇのレバウディオサイドＪを得て、その純度は９５％を超えた。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
上述の実施例は、単に、本発明の技術的概念及び特徴の説明のためのものである。実施例を提供する目的は、当業者が本発明を理解し、それを適宜実施することを可能にすることだけである。本発明の範囲は、これに限定されない。本発明の本質から誘導されるいかなる同等の変更又は修正も、本発明の保護範囲内に包含されるものとする。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
１. 酵素的方法を使用してレバウディオサイドＪを調製するための方法であって、前記方法において、レバウディオサイドＡが、基質として使用され、グリコシル供与体の存在下で、レバウディオサイドＪが、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを含有する組み換え細胞及び／又はそこから調製されたＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの触媒作用下での反応によって産生される、方法。
２. 前記グリコシル供与体が、ラムノシル供与体である、項１に記載の方法。
３. 前記ラムノシル供与体が、ＵＤＰ−ラムノースである、項２に記載の方法。
４. 前記ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼが、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂである、項１に記載の方法。
５. Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂのアミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも６０％一致している、項４に記載の方法。
６. Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも７０％一致している、項５に記載の方法。
７. Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも８０％一致している、項６に記載の方法。
８. Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のＵＧＴ−Ｂの前記アミノ酸配列が、配列表に示される配列２と少なくとも９０％一致している、項７に記載の方法。
９. 前記反応が、水性系中３５〜４５℃の温度及び７．５〜８．５のｐＨで実行される、項１に記載の方法。
１０. 前記反応が、リン酸緩衝液中で実行される、項９に記載の方法。
１１. 前記反応系が、ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼの組み換え細胞及び細胞透過剤を含有する、項９に記載の方法。
１２. 前記細胞透過剤が、トルエンであり、前記反応系中のトルエンの体積比濃度が、１〜３％である、項１１に記載の方法。
１３. 前記反応に使用される全ての原料を反応ケトルに添加して均一に混合した後、撹拌しながら反応のために設定温度で配置する、項９に記載の方法。
１４. 前記組み換え細胞が、微生物細胞である、項１に記載の方法。
１５. 前記微生物が、大腸菌（Escherichia coli）、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）又はピチア・パストリス（Pichia pastoris）である、項１４に記載の方法。