【手続補正書】
【提出日】令和3年6月4日(2021.6.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型化膿レンサ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳＰＣａｓ９）と比較して、以下の位置：Ｄ２３、Ｄ１２５１、Ｙ１２８、Ｔ６７、Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及び／又はＱ９２６の１つ以上にてアミノ酸置換を含む、単離ＳＰＣａｓ９ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１３のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離ＳＰＣａｓ９ポリペプチドであって、配列番号１３の以下の位置：Ｄ２３、Ｄ１２５１、Ｙ１２８、Ｔ６７、Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及び／又はＱ９２６の１つ以上にてアミノ酸置換を含む、単離ＳＰＣａｓ９ポリペプチド。
【請求項３】
以下のアミノ酸置換：Ｄ２３Ａ、Ｙ１２８Ｖ、Ｔ６７Ｌ、Ｎ４９７Ａ、Ｄ１２５１Ｇ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、及び／又はＱ９２６Ａの１つ以上を含む、請求項１又は請求項２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、以下のアミノ酸置換：Ｄ２３Ａ／Ｙ１２８Ｖ／Ｄ１２５１Ｇ／Ｔ６７Ｌを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
異種機能ドメインに、場合によってはリンカーが介在して融合する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記リンカーは、前記融合タンパク質の活性に干渉しない、融合タンパク質。
【請求項６】
前記異種機能ドメインは：ＶＰ６４、ＮＦ−カッパＢ  ｐ６５、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサドメイン（ＥＲＤ）、ｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）、ＴＥＴタンパク質、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、又はヒストンデメチラーゼ（ＨＤＭ）、ＭＳ２、Ｃｓｙ４、ラムダＮタンパク質、及びＦｏｋＩからなる群から選択される、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドを含むゲノム編集系。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド、請求項７に記載のゲノム編集系、請求項８に記載の核酸、及び／又は請求項９に記載のベクター、並びに、場合によっては、薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１１】
細胞を変更する方法であって、前記細胞を、請求項１０に記載の組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１２】
患者を処置する方法において用いるための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
配列番号１３と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を含み、且つ配列番号１３の位置Ｄ２３、Ｔ６７、Ｙ１２８、及びＤ１２５１の１つ以上にてアミノ酸置換を有するポリペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリペプチドであって、
（ａ）前記ポリペプチドは、Ｄ２３にてアミノ酸置換を含む；
（ｂ）前記ポリペプチドは、Ｄ２３にてアミノ酸置換を、且つＴ６７、Ｙ１２８、又はＤ１２５１にて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む；
（ｃ）前記ポリペプチドは、Ｄ２３にてアミノ酸置換を、且つＴ６７、Ｙ１２８、又はＤ１２５１にて少なくとも２つのアミノ酸置換を含む；
（ｄ）前記ポリペプチドは、Ｔ６７にてアミノ酸置換を含む；
（ｅ）前記ポリペプチドは、Ｔ６７にてアミノ酸置換を、且つＤ２３、Ｙ１２８、又はＤ１２５１にて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む；
（ｆ）前記ポリペプチドは、Ｔ６７にてアミノ酸置換を、且つＤ２３、Ｙ１２８、又はＤ１２５１にて少なくとも２つの置換を含む；
（ｇ）前記ポリペプチドは、Ｙ１２８にてアミノ酸置換を含む；
（ｈ）前記ポリペプチドは、Ｙ１２８にてアミノ酸置換を、且つＤ２３、Ｔ６７、又はＤ１２５１にて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む；
（ｉ）前記ポリペプチドは、Ｙ１２８にてアミノ酸置換を、且つＤ２３、Ｔ６７、又はＤ１２５１にて少なくとも２つの置換を含む；
（ｊ）前記ポリペプチドは、Ｄ１２５１にてアミノ酸置換を含む；
（ｋ）前記ポリペプチドは、Ｄ１２５１にて置換を、且つＤ２３、Ｔ６７、又はＹ１２８にて少なくとも１つのアミノ酸置換を含む；
（ｌ）前記ポリペプチドは、Ｄ１２５１にてアミノ酸置換を、且つＤ２３、Ｔ６７、又はＹ１２８にて少なくとも２つの置換を含む；又は、
（ｍ）前記ポリペプチドは、Ｄ２３、Ｔ６７、Ｙ１２８、及びＤ１２５１にてアミノ酸置換を含む、
ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１３又は請求項１４に記載のポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが標的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）と接触した場合、オフターゲット編集率が、野生型ＳＰＣａｓ９による標的の観察オフターゲット編集率よりも低く、
任意選択で、前記ポリペプチドによるオフターゲット編集率は、野生型ＳＰＣａｓ９よりも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％低く、
前記オフターゲット編集率は、オフターゲット部位でのインデルのレベル（例えば、割合又はパーセンテージ）を評価することによって測定されてよい、
ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号１３と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を含み、且つ以下のアミノ酸置換：Ｄ２３Ａ、Ｔ６７Ｌ、Ｙ１２８Ｖ、及びＤ１２５１Ｇの１つ以上を含むポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドであって、
（ａ）前記ポリペプチドは、Ｄ２３Ａを含む；
（ｂ）前記ポリペプチドは、Ｄ２３Ａ、並びにＴ６７Ｌ、Ｙ１２８Ｖ、及びＤ１２５１Ｇの少なくとも１つを含む；
（ｃ）前記ポリペプチドは、Ｄ２３Ａ、並びにＴ６７Ｌ、Ｙ１２８Ｖ、及びＤ１２５１Ｇの少なくとも２つを含む；
（ｄ）前記ポリペプチドは、Ｔ６７Ｌを含む；
（ｅ）前記ポリペプチドは、Ｔ６７Ｌ、並びにＤ２３Ａ、Ｙ１２８Ｖ、及びＤ１２５１Ｇの少なくとも１つを含む；
（ｆ）前記ポリペプチドは、Ｔ６７Ｌ、並びにＤ２３Ａ、Ｙ１２８Ｖ、及びＤ１２５１Ｇの少なくとも２つを含む；
（ｇ）前記ポリペプチドは、Ｙ１２８Ｖを含む；
（ｈ）前記ポリペプチドは、Ｙ１２８Ｖ、並びにＤ２３Ａ、Ｔ６７Ｌ、及びＤ１２５１Ｇの少なくとも１つを含む；
（ｉ）前記ポリペプチドは、Ｙ１２８Ｖ、並びにＤ２３Ａ、Ｔ６７Ｌ、及びＤ１２５１Ｇの少なくとも２つを含む；
（ｊ）前記ポリペプチドは、Ｄ１２５１Ｇを含む；
（ｋ）前記ポリペプチドは、Ｄ１２５１Ｇ、並びにＤ２３Ａ、Ｔ６７Ｌ、及びＹ１２８Ｖの少なくとも１つを含む；
（ｌ）前記ポリペプチドは、Ｄ１２５１Ｇ、並びにＤ２３Ａ、Ｔ６７Ｌ、及びＹ１２８Ｖの少なくとも２つを含む；又は
（ｍ）前記ポリペプチドは、Ｄ２３Ａ、Ｔ６７Ｌ、Ｙ１２８Ｖ、及びＤ１２５１Ｇを含む、
ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１６又は請求項１７に記載のポリペプチドであって、
前記ポリペプチドが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的と接触する場合、オフターゲット編集率が、野生型ＳＰＣａｓ９による標的の観察オフターゲット編集率よりも低く、
任意選択で、前記ポリペプチドによるオフターゲット編集率は、野生型ＳＰＣａｓ９よりも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％低く、
前記オフターゲット編集率は、オフターゲット部位でのインデルのレベル（例えば、割合又はパーセンテージ）を評価することによって測定されてよい、
ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１３又は請求項１６に記載のポリペプチド、並びに核局在化配列、細胞膜透過ペプチド配列、及び／又は親和性タグの１つ以上を含む融合タンパク質。
【請求項２０】
異種機能ドメインに、場合によってはリンカーが介在して融合する、請求項１３又は請求項１６に記載のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記リンカーは、前記融合タンパク質の活性に干渉しない、融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項２０に記載の融合タンパク質であって、
（ａ）前記異種機能ドメインは、転写トランス活性化ドメインであり、任意選択で、前記転写トランス活性化ドメインは、ＶＰ６４又はＮＦｋ−Ｂ  ｐ６５に由来してよい；
（ｂ）前記異種機能ドメインは、転写サイレンサ又は転写抑制ドメインであり、任意選択で、前記転写抑制ドメインは、Ｋｒｕｅｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＥＲＦリプレッサドメイン（ＥＲＤ）、又はｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）であってよく、又は前記転写サイレンサは、ヘテロクロマチンタンパク質１（ＨＰ１）であってよい；
（ｃ）前記異種機能ドメインは、ＤＮＡのメチル化状態を修飾する酵素であり、任意選択で、ＤＮＡのメチル化状態を修飾する前記酵素は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）又はＴＥＴタンパク質であってよく、前記ＴＥＴタンパク質は、ＴＥＴＩであってよい；
（ｄ）前記異種機能ドメインは、ヒストンサブユニットを修飾する酵素であり、任意選択で、ヒストンサブユニットを修飾する前記酵素は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）、又はヒストンデメチラーゼであってよい；
（ｅ）前記異種機能ドメインは、生物学的テザーであり、任意選択で、前記生物学的テザーは、ＭＳ２、Ｃｓｙ４、又はラムダＮタンパク質であってよい；又は、
（ｆ）前記異種機能ドメインは、Ｆｏｋｌである、
融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１３〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする単離核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】
細胞の集団を遺伝的に操作する方法であって、
前記細胞内で請求項１３〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド、並びに前記細胞のゲノムの標的核酸上の標的配列と相補的な領域を有するガイド核酸を発現させ、又は前記細胞を前記ポリペプチド及び前記ガイド核酸と接触させることによって、少なくとも複数の前記細胞のゲノムを変更することを含む、方法。
【請求項２６】
二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子の集団を編集する方法であって、
ｄｓＤＮＡ分子を、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド、並びに前記ｄｓＤＮＡ分子の標的配列と相補的な領域を有するガイド核酸と接触させることによって、複数の前記ｄｓＤＮＡ分子を編集することを含む方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の方法であって、
前記ポリペプチドによるオフターゲット編集率は、野生型ＳＰＣａｓ９による標的配列の観察オフターゲット編集率よりも低く、
任意選択で、前記ポリペプチドによるオフターゲット編集率は、野生型ＳＰＣａｓ９よりも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％低く、
前記オフターゲット編集率は、オフターゲット部位でのインデルのレベル（例えば、割合又はパーセンテージ）を評価することによって測定されてよい、
方法。
【請求項２８】
請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法であって、
前記ポリペプチド及び前記ガイド核酸は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）として投与され、任意選択で、前記ＲＮＰは、１×１０−４μＭ〜１μＭ  ＲＮＰの用量にて投与されてよい、
方法。