【手続補正書】
【提出日】令和3年7月14日(2021.7.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；ならびに
（ｃ）無血清培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養するステップで、それにより
（１）複数の細胞の少なくとも一部に、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させ、
（２）第２のインビトロの細胞クラスター中の一部の細胞をインビトロで非天然膵臓β細胞に分化させ、ここで、非天然膵臓β細胞は、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示し、グルコース負荷に応答した、非天然膵臓β細胞によるインスリンの分泌が、グルコース負荷におけるグルコース濃度に比例する、ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
（ｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、クロモグラニンＡを発現するより高いパーセンテージの細胞を含むか；
（ｉｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するより高いパーセンテージの細胞を含むか；
（ｉｉｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ２を発現するより低いパーセンテージの細胞を含むか；または
（ｉｖ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ９を発現するより低いパーセンテージの細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２のインビトロの細胞クラスターが、
（ｉ）ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、少なくとも約３５％の細胞；
（ｉｉ）クロモグラニンＡを発現する、少なくとも約７０％の細胞；
（ｉｉｉ）ＳＯＸ２を発現する、最大で約２％の細胞；または
（ｉｖ）ＳＯＸ９を発現する、最大で約１０％の細胞、を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
解離させることが、第１の細胞クラスターの酵素による解離を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
解離させることが、第１の細胞クラスターをトリプシンと接触させることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
無血清培養培地が、約３０ｒｐｍ〜約６０ｒｐｍの予め決定された速度で撹拌される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）非天然膵臓β細胞が、１つまたは複数の結晶性インスリン顆粒を含むか；
（ｂ）非天然膵臓β細胞が、以下の遺伝子：ＩＮＳ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、およびＺＮＴ８を発現するか；または
（ｃ）非天然膵臓β細胞が、ソマトスタチンとグルカゴンの少なくとも一方を発現しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
非天然膵臓β細胞が、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
非天然膵臓β細胞が、遺伝子改変されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
無血清培養培地が、外因性甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、アクチビン受容体様キナーゼ−５（Ａｌｋ５）阻害剤、又は両方を含まない、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
無血清培養培地が、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の外因性阻害剤を含まない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
無血清培養培地が、外因性細胞外マトリックス分子を含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
第１の細胞クラスターが、低温保存から回復される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
培養する前に、所定期間にわたり、複数の細胞を低温保存することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
培養する前に、複数の細胞を低温保存から回復することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第２のインビトロの細胞クラスターが、最大で第１の細胞クラスターの５０％の直径を有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
第２のインビトロの細胞クラスターが、約１００μｍから約２００μｍの直径を有する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第２のインビトロの細胞クラスターの少なくとも約９０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
第２のインビトロの細胞クラスターの少なくとも約４０％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
第２のインビトロの細胞クラスターの最大で約１．５％の細胞が、ＳＯＸ２を発現する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
第２のインビトロの細胞クラスターの最大で約５％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
第２のインビトロの細胞クラスターの最大で約２％の細胞が、Ｋｉ６７を発現する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、少なくとも１．２５倍高いインスリン含量を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標が、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
第２のインビトロの細胞クラスターが、１０ｍＭより大きい高いグルコース濃度に応答して、二相性インスリン分泌を示す、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
第２のインビトロの細胞クラスターが、グルカゴンを発現する少なくとも１つの細胞またはソマトスタチンを発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
第１の細胞クラスター中のＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する細胞の少なくとも約９５％が、第２のインビトロの細胞クラスター中に保持される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法で生成されたインビトロの細胞クラスター。
【請求項２９】
請求項２８に記載のインビトロの細胞クラスターを含む、必要とする対象において疾患の処置に使用するための組成物。
【請求項３０】
請求項２８に記載のインビトロの細胞クラスターを含むデバイスであって、対象に植え込まれると、インスリンを産生および放出するように構成される、デバイス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１８】
[0271]本開示の好ましい実施形態を本明細書に示し記載したが、このような実施形態は単に一例として提供されるに過ぎないことは、当業者にとって明白であると予想される。本開示が、明細書内に提供される具体的な実施例によって限定されることは、意図されない。上述の明細書を参照しながら本開示を説明してきたが、本明細書に記載の実施形態の説明および例示は、限定的な意味で解釈されることを意図しない。当業者であれば、この時点で多数のバリエーション、変更、および置換を本開示から逸脱することなく想起するものと予想される。さらに、本開示の全ての態様は、様々な条件および可変値によって決まる、本明細書に記載された具体的な描写、配置または相対的比率に限定されないことが理解されるべきである。本開示の実施において本明細書に記載される本開示の実施形態の様々な代替例が採用され得ることが理解されるべきである。したがって、本開示は、任意のこのような代替例、改変、バリエーションまたは均等物も網羅することが予期される。以下の特許請求の範囲は、本開示の範囲を定義することに加え、これらの特許請求の範囲内に含まれる方法および構造ならびにそれらの均等物が、それに網羅されることが意図される。
本明細書は以下の発明の態様を包含する。
［１］  グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含むインビトロの細胞クラスターであって、細胞クラスターは、ソートされていない細胞クラスターであり、細胞クラスターは、
（ａ）ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞；
（ｂ）クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞；
（ｃ）ＳＯＸ２を発現する最大で約２％の細胞；または
（ｄ）ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞
を含む、細胞クラスター。
［２］  蛍光タンパク質を含まない少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含むインビトロの細胞クラスターであって、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示し、細胞クラスターは、
（ａ）ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞；
（ｂ）クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞；
（ｃ）ＳＯＸ２を発現する最大で約２％の細胞；または
（ｄ）ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞
を含む、細胞クラスター。
［３］  少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞が、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す非天然膵臓β細胞である、［１］に記載の細胞クラスター。
［４］  ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する少なくとも約３５％の細胞を含む、［１］から［３］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［５］  ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する少なくとも約４０％または少なくとも約６０％の細胞を含む、［１］から［４］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［６］  クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％の細胞を含む、［１］から［５］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［７］  クロモグラニンＡを発現する少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の細胞を含む、［１］から［６］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［８］  細胞クラスター中最大で約２％の、ＳＯＸ２を発現する細胞を含む、［１］から［７］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［９］  ＳＯＸ２を発現する最大で約１．５％、最大で約１％、または最大で約０．５％の細胞を含む、［１］から［８］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１０］  ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％の細胞を含む、［１］から［９］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１１］  ＳＯＸ９を発現する最大で約５％、最大で約３％、または最大で約２％の細胞を含む、［１］から［１０］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１２］  Ｋｉ６７を発現する最大で約２％、最大で約１％、最大で約０．５％、または最大で約０．１％の細胞を含む、［１］から［１１］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１３］  インビトロの細胞クラスターが、約１５０μｍの直径を有する、［１］から［１２］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１４］  インビトロの細胞クラスターが、約５０μｍから約２５０μｍの直径を有する、［１］から［１２］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１５］  インビトロの細胞クラスターが、約１００μｍから約２００μｍの直径を有する、［１］から［１４］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１６］  インビトロの細胞クラスターが、第１のグルコース濃度への応答として、第２のグルコース濃度への場合と比較してより高いインスリン分泌を示し、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い、［１］から［１５］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１７］  インビトロの細胞クラスターが、グルカゴンを発現する少なくとも１つの細胞またはソマトスタチンを発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む、［１］から［１６］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１８］  インビトロの細胞クラスターが、第１の濃度のＫ＋に応答して、インスリン分泌を示す、［１］から［１７］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１９］  インビトロの細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、［１］から［１８］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［２０］  第２のインビトロの細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、［１］から［１８］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［２１］  （ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、１つまたは複数の結晶性インスリン顆粒を含むか；
（ｂ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、以下の遺伝子：ＩＮＳ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、およびＺＮＴ８を発現するか；または
（ｃ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、ソマトスタチンとグルカゴンの少なくとも一方を発現しない、［１］または［３］から［２０］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［２２］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、［１］または［３］から［２１］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［２３］  グルコース負荷に応答した、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞によるインスリンの分泌が、グルコース負荷におけるグルコース濃度に比例する、［１］または［３］から［２２］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［２４］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、遺伝子改変されている、［１］または［３］から［２３］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［２５］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞におけるインスリン発現の指標であるシグナルポリペプチドをコードする、外因性核酸配列を含まない、［１］または［３］から［２４］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［２６］  非天然膵臓β細胞におけるシグナルポリペプチドの発現が、インスリンプロモーターによって駆動される、［２５］に記載の細胞クラスター。
［２７］  シグナルポリペプチドが、蛍光タンパク質を含む、［２５］に記載の細胞クラスター。
［２８］  培養培地中に［１］から［２７］のいずれかに記載の少なくとも１つの細胞クラスターを含む組成物。
［２９］  培養培地が、無血清である、［２８］に記載の組成物。
［３０］  再凝集培養培地が、トリヨードチロニンを含まない、［２８］または［２９］に記載の組成物。
［３１］  再凝集培養培地が、外因性甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含まない、［２８］から［３０］のいずれかに記載の組成物。
［３２］  再凝集培養培地が、アクチビン受容体様キナーゼ−５（Ａｌｋ５）阻害剤を含まない、［２８］から［３１］のいずれかに記載の組成物。
［３３］  培養培地が、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の外因性阻害剤を含まない、［２８］から［３２］のいずれかに記載の組成物。
［３４］  培養培地が、外因性細胞外マトリックス分子を含まない、［２８］から［３３］のいずれかに記載の組成物。
［３５］  細胞クラスターが、培養培地中で懸濁した状態にある、［２８］から［３４］のいずれかに記載の組成物。
［３６］  培養培地が、少なくとも３０ｒｐｍの予め決定された速度で撹拌される、［２８］から［３５］のいずれかに記載の組成物。
［３７］  培養培地が、少なくとも６０ｒｐｍの予め決定された速度で撹拌される、［２８］から［３６］のいずれかに記載の組成物。
［３８］  培養培地が、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を含む、［２８］から［３７］のいずれかに記載の組成物。
［３９］  ＭＣＤＢ１３１基礎培地は、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充されている、［３８］に記載の組成物。
［４０］  培養培地が、ＣＭＲＬｓ培地を含む、［２８］から［３９］のいずれかに記載の組成物。
［４１］  少なくとも１つの細胞クラスターおよび培養培地を含有するバイオリアクターをさらに含む、［２８］から［４０］のいずれかに記載の組成物。
［４２］  バイオリアクターが、スピナーフラスコを含む、［４１］に記載の組成物。
［４３］  （ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋細胞を含む細胞の集団を、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）シグナル伝達経路阻害剤、甲状腺ホルモン（ＴＨ）シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１種のソニック−ヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、γ−セクレターゼ阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される因子を含む培養培地中で、少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターに分化させるステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；ならびに
（ｃ）再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、
（ｉ）少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するか；
（ｉｉ）少なくとも約７０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現するか；
（ｉｉｉ）最大で約２％の細胞が、ＳＯＸ２を発現するか；または
（ｉｖ）最大で約１０％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップ
を含む方法。
［４４］  （ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；ならびに
（ｃ）再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、
（ｉ）少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するか；
（ｉｉ）少なくとも約７０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現するか；
（ｉｉｉ）最大で約２％の細胞が、ＳＯＸ２を発現するか；または
（ｉｖ）最大で約１０％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップ
を含む方法。
［４５］  上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー由来の少なくとも１種の増殖因子が、ベータセルリンを含む、［４３］に記載の方法。
［４６］  （ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップであって、解離させることは、複数の細胞をフローサイトメトリーに供することを含まない、ステップ；ならびに
（ｃ）無血清再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップ
を含み、
（ｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、クロモグラニンＡを発現するより高いパーセンテージの細胞を含むか；
（ｉｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するより高いパーセンテージの細胞を含むか；
（ｉｉｉ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ２を発現するより低いパーセンテージの細胞を含むか；または
（ｉｖ）第２のインビトロの細胞クラスターは、第１の細胞クラスターと比較して、ＳＯＸ９を発現するより低いパーセンテージの細胞を含む、方法。
［４７］  （ａ）少なくとも１つのＮＫＸ６．１＋およびＣ−ペプチド＋細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップであって、解離させることは、複数の細胞をフローサイトメトリーに供することを含まない、ステップ；ならびに
（ｃ）再凝集培養培地中で、（ｂ）からの複数の細胞を培養し、複数の細胞の少なくとも一部に、第２のインビトロの細胞クラスターを形成させるステップ
を含み、第２のインビトロの細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み；
（ｉ）少なくとも約３５％の細胞が、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するか；
（ｉｉ）少なくとも約７０％の細胞が、クロモグラニンＡを発現するか；
（ｉｉｉ）最大で約２％の細胞が、ＳＯＸ２を発現するか；または
（ｉｖ）最大で約１０％の細胞が、ＳＯＸ９を発現する、方法。
［４８］  第２のインビトロの細胞クラスターが、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む、［４３］から［４６］のいずれかに記載の方法。
［４９］  解離させることが、第１の細胞クラスターの酵素による解離を含む、［４３］から［４８］のいずれかに記載の方法。
［５０］  解離させることが、第１の細胞クラスターをトリプシンと接触させることを含む、［４３］から［４９］のいずれかに記載の方法。
［５１］  再凝集培養培地が、無血清である、［４３］から［４５］または［４７］から［５０］のいずれかに記載の方法。
［５２］  再凝集培養培地が、予め決定された速度で撹拌される、［４３］から［５１］のいずれかに記載の方法。
［５３］  予め決定された速度が、少なくとも３０ｒｐｍまたは少なくとも６０ｒｐｍである、［５２］に記載の方法。
［５４］  再凝集培養培地が、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を含む、［４３］から［５３］のいずれかに記載の方法。
［５５］  ＭＣＤＢ１３１基礎培地は、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が補充されている、［５４］に記載の方法。
［５６］  再凝集培養培地が、ＣＭＲＬｓ培地を含む、［４３］から［５３］のいずれかに記載の方法。
［５７］  再凝集培養培地が、ＭＣＤＢ１３１基礎培地を含む、［４３］から［５６］のいずれかに記載の方法。
［５８］  （ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、１つまたは複数の結晶性インスリン顆粒を含むか；
（ｂ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、以下の遺伝子：ＩＮＳ、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６−１、およびＺＮＴ８を発現するか；または
（ｃ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、ソマトスタチンとグルカゴンの少なくとも一方を発現しない、［４７］から［５７］のいずれかに記載の方法。
［５９］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷、第２のグルコース負荷、および第３のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、［４７］から［５８］のいずれかに記載の方法。
［６０］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞が、遺伝子改変されている、［４７］から［５９］のいずれかに記載の方法。
［６１］  グルコース負荷に応答した、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞によるインスリンの分泌が、グルコース負荷におけるグルコース濃度に比例する、［４７］から［６０］のいずれかに記載の方法。
［６２］  再凝集培養培地が、トリヨードチロニンを含まない、［４３］から［６１］のいずれかに記載の方法。
［６３］  再凝集培養培地が、外因性甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含まない、［４３］から［６２］のいずれかに記載の方法。
［６４］  再凝集培養培地が、アクチビン受容体様キナーゼ−５（Ａｌｋ５）阻害剤を含まない、［４３］から［６３］のいずれかに記載の方法。
［６５］  再凝集培養培地が、外因性トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含まない、［４３］から［６４］のいずれかに記載の方法。
［６６］  再凝集培養培地が、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の外因性阻害剤を含まない、［４３］から［６５］のいずれかに記載の方法。
［６７］  再凝集培養培地が、外因性細胞外マトリックス分子を含まない、［４３］から［６６］のいずれかに記載の方法。
［６８］  第１の細胞クラスターが、低温保存から回復される、［４３］から［６７］のいずれかに記載の方法。
［６９］  第１の細胞クラスターを低温保存から回復することをさらに含む、［４３］から［６８］のいずれかに記載の方法。
［７０］  培養する前に、所定期間にわたり、複数の細胞を低温保存することをさらに含む、［４３］から［６９］のいずれかに記載の方法。
［７１］  培養する前に、複数の細胞を低温保存から回復することをさらに含む、［７０］に記載の方法。
［７２］  第２のインビトロの細胞クラスターが、最大で第１の細胞クラスターの５０％の直径を有する、［４３］から［７１］のいずれかに記載の方法。
［７３］  第２のインビトロの細胞クラスターが、最大で第１の細胞クラスターの３０％の直径を有する、［４３］から［７２］のいずれかに記載の方法。
［７４］  第２のインビトロの細胞クラスターが、約１５０μｍの直径を有する、［４３］から［７３］のいずれかに記載の方法。
［７５］  第２のインビトロの細胞クラスターが、約５０μｍから約２５０μｍの直径を有する、［４３］から［７３］のいずれかに記載の方法。
［７６］  第２のインビトロの細胞クラスターが、約１００μｍから約２００μｍの直径を有する、［４３］から［７５］のいずれかに記載の方法。
［７７］  クロモグラニンＡを発現する第２のインビトロの細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージが、クロモグラニンＡを発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージより、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、または少なくとも１．５倍大きい、［４３］から［７６］のいずれかに記載の方法。
［７８］  第２のインビトロの細胞クラスターが、クロモグラニンＡを発現する少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％の細胞を含む、［４３］から［７７］のいずれかに記載の方法。
［７９］  ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する第２のインビトロの細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージが、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージより、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７５倍、または少なくとも２倍大きい、［４３］から［７８］のいずれかに記載の方法。
［８０］  第２のインビトロの細胞クラスターが、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、または少なくとも約６０％の細胞を含む、［４３］から［７９］のいずれかに記載の方法。
［８１］  第２のインビトロの細胞クラスターにおける、ＳＯＸ２を発現する細胞のパーセンテージが、第１の細胞クラスターにおける、ＳＯＸ２を発現する細胞のパーセンテージの最大で２分の１、最大で３分の１、最大で５分の１、または最大で１０分の１である、［４３］から［８０］のいずれかに記載の方法。
［８２］  第２のインビトロの細胞クラスターが、ＳＯＸ２を発現する最大で約２％、最大で約１．５％、最大で約１％、または最大で約０．５％の細胞を含む、［４３］から［８１］のいずれかに記載の方法。
［８３］  ＳＯＸ９を発現する第２のインビトロの細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージが、ＳＯＸ９を発現する第１の細胞クラスターにおける細胞のパーセンテージの最大で２分の１、最大で３分の１、最大で５分の１、または最大で１０分の１である、［４３］から［８２］のいずれかに記載の方法。
［８４］  第２のインビトロの細胞クラスターが、ＳＯＸ９を発現する最大で約１０％、最大で約５％、最大で約３％、または最大で約２％の細胞を含む、［４３］から［８３］のいずれかに記載の方法。
［８５］  第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、Ｋｉ６７を発現するより低いパーセンテージの細胞を有する、［４３］から［８４］のいずれかに記載の方法。
［８６］  第２のインビトロの細胞クラスターが、Ｋｉ６７を発現する最大で約２％、最大で約１％、最大で約０．５％、または最大で約０．１％の細胞を含む、［４３］から［８５］のいずれかに記載の方法。
［８７］  第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高いインスリン含量を有する、［４３］から［８６］のいずれかに記載の方法。
［８８］  第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍または少なくとも１．５倍高いインスリン含量を有する、［４３］から［８７］のいずれかに記載の方法。
［８９］  第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標が、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い、［４３］から［８８］のいずれかに記載の方法。
［９０］  第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の濃度のＫ＋に応答して、インスリン分泌を示す、［４３］から［８９］のいずれかに記載の方法。
［９１］  第２のインビトロの細胞クラスターが、１０ｍＭより大きい高いグルコース濃度に応答して、二相性インスリン分泌を示す、［４３］から［９０］のいずれかに記載の方法。
［９２］  第２のインビトロの細胞クラスターが、グルカゴンを発現する少なくとも１つの細胞またはソマトスタチンを発現する少なくとも１つの細胞をさらに含む、［４３］から［９１］のいずれかに記載の方法。
［９３］  第１の細胞クラスター中のＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドの両方を発現する細胞の少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％が、第２のインビトロの細胞クラスター中に保持される、［４３］から［９２］のいずれかに記載の方法。
［９４］  第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高い酸素消費速度を有する、［４３］から［９３］のいずれかに記載の方法。
［９５］  第２のインビトロの細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２５倍または少なくとも１．５倍高い酸素消費速度を有する、［４３］から［９４］のいずれかに記載の方法。
［９６］  第２のインビトロの細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、［４３］から［９５］のいずれかに記載の方法。
［９７］  第２のインビトロの細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、［４３］から［９６］のいずれかに記載の方法。
［９８］  ［４３］から［９７］のいずれかに記載の方法によって生成されるインビトロの細胞クラスター。
［９９］  ［１］から［２７］または［９８］のいずれかに記載のインビトロの細胞クラスターを含むデバイスであって、対象に植え込まれると、インスリンを産生および放出するように構成される、デバイス。
［１００］  半透膜をさらに含み、半透膜は、デバイス中に細胞クラスターを保持し、細胞クラスターによって分泌されたインスリンの通過を許容するように構成される、［９９］に記載のデバイス。
［１０１］  細胞クラスターが、半透膜によって封入される、［１００］に記載のデバイス。
［１０２］  半透膜が、多糖またはポリカチオンで作製される、［１００］または［１０１］に記載のデバイス。
［１０３］  半透膜が、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料で作製される、［１００］から［１０２］のいずれかに記載のデバイス。
［１０４］  半透膜が、アルギネートを含む、［１００］から［１０３］のいずれかに記載のデバイス。
［１０５］  細胞クラスターが、半透膜によって取り囲まれたアルギネートコアを含むマイクロカプセル中に封入される、［１００］から［１０４］のいずれかに記載のデバイス。
［１０６］  疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防する方法であって、［１］から［２７］または［９８］のいずれかに記載の細胞クラスターまたはその一部を対象に投与するステップを含む、方法。
［１０７］  疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防する方法であって、［９９］から［１０５］のいずれかに記載のデバイスを対象に植え込むステップを含む、方法。
［１０８］  対象が、代謝性疾患を有するか、または発症する高いリスクを有する、［１０６］または［１０７］に記載の方法。
［１０９］  対象が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および１．５型糖尿病からなる群から選択される糖尿病を有する、［１０６］から［１０８］のいずれかに記載の方法。
［１１０］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
［１１１］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
［１１２］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
［１１３］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現し、細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の約２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
［１１４］  細胞クラスター中の細胞の少なくとも約９０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現する、［１１０］または［１１２］に記載の細胞クラスター。
［１１５］  細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、［１１１］または［１１３］に記載の細胞クラスター。
［１１６］  細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、［１１０］または［１１２］に記載の細胞クラスター。
［１１７］  細胞クラスターが、第１および第２のグルコース負荷が逐次的にかかる場合、第１のグルコース負荷および第２のグルコース負荷に対して、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、［１１１］または［１１３］に記載の細胞クラスター。
［１１８］  細胞クラスターが、対象に移植される場合、移植後の１４日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、［１１２］または［１１３］に記載の細胞クラスター。
［１１９］  細胞クラスターが、約３００μｍ未満の直径を有する、［１１０］から［１１８］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１２０］  直径が、約１００μｍ未満である、［１１９］に記載の細胞クラスター。
［１２１］  細胞クラスター中の細胞の約１０％未満が、生存可能ではない、［１１０］から［１２０］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１２２］  細胞クラスターが、グルコース負荷にさらされる場合、グルコースによって刺激されたカルシウムフラックス応答を示す、［１１０］から［１２１］のいずれかに記載の細胞クラスター。
［１２３］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示し、細胞クラスターは、対象に移植される場合、移植後の約２８日以内に、対象におけるグルコース負荷に対して、インビボでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター。
［１２４］  ［１１０］から［１１８］のいずれかに記載の細胞クラスターおよび足場を含む組成物。
［１２５］  足場が、生分解性の足場である、［１２４］に記載の組成物。
［１２６］  （ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ｂ）からの複数の細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用して、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップを含み、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、方法。
［１２７］  （ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ａ）からの複数の細胞を、
（ｉ）血清；ならびに
（ｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤のうち１つ
を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用して、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップを含み、第２の細胞クラスターは、非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、方法。
［１２８］  培地が、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤をさらに含む、［１２７］に記載の方法。
［１２９］  培地が、トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤をさらに含む、［１２８］に記載の方法。
［１３０］  甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤が、トリヨードチロニンである、［１２６］または［１２８］に記載の方法。
［１３１］  培地中のトリヨードチロニンの濃度が、約０．１μＭから約１０μＭである、［１３０］に記載の方法。
［１３２］  トランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤が、アクチビン受容体様キナーゼ−５阻害剤である、［１２６］または［１２９］に記載の方法。
［１３３］  培地中のアクチビン受容体様キナーゼ−５阻害剤の濃度が、約１μＭから約５０μＭである、［１３２］に記載の方法。
［１３４］  培地が、ヒト血清、ヒト血小板溶解産物、ウシ胎児血清、および血清代替物からなる群から選択される血清をさらに含む、［１２６］に記載の方法。
［１３５］  培地が、約５％から約１５％の血清を含む、［１２７］または［１３４］に記載の方法。
［１３６］  培地が、約１０％の血清を含む、［１３５］に記載の方法。
［１３７］  培地が、Ｃｏｎｎｏｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  １０６６補充膵島培地（ＣＭＲＬＳ）またはＭＣＤＢ１３１基礎培地をさらに含む、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１３８］  培地が、細胞外マトリックス分子をさらに含む、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１３９］  細胞外マトリックス分子が、ヘパリンである、［１３８］に記載の方法。
［１４０］  細胞外マトリックス分子が、ラミニンである、［１３８］に記載の方法。
［１４１］  第２の細胞クラスターが、フローサイトメトリーによる測定によれば、第１の細胞クラスターと比較して、クロモグラニンＡを発現するより高いパーセンテージの細胞を含む、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１４２］  第２の細胞クラスターが、フローサイトメトリーによる測定によれば、第１の細胞クラスターと比較して、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現するより高いパーセンテージの細胞を含む、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１４３］  第２の細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より少ない生存不能な細胞を含む、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１４４］  複数の細胞の一部が、第２の細胞クラスターを形成することができず、第２の細胞クラスターを形成することができない複数の細胞の一部の約１０％未満は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１４５］  第２の細胞クラスターの直径が、第１の細胞クラスターの直径未満である、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１４６］  インビトロでグルコース負荷にさらされる場合、第２の細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標が、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１４７］  インビボでグルコース負荷にさらされる場合、第２の細胞クラスターが、第１の細胞クラスターと比較して、より高い刺激指標を示し、刺激指標が、第２のグルコース濃度と比較した場合の、第１のグルコース濃度に応答して分泌されたインスリンの比率に等しく、第１のグルコース濃度は、第２のグルコース濃度より高い、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１４８］  （ｂ）からの複数の細胞が、スピナーフラスコ中で培養される、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１４９］  （ｂ）からの複数の細胞が、インビトロで１つまたは複数の幹細胞から生成される、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１５０］  （ｂ）からの複数の細胞が、１つまたは複数の人工多能性幹細胞から生成される、［１４９］に記載の方法。
［１５１］  （ｂ）からの複数の細胞が、培地中で、少なくとも１日間培養される、［１２６］または［１２７］に記載の方法。
［１５２］  複数の細胞が、培地中で、少なくとも４日間培養される、［１５１］に記載の方法。
［１５３］  疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防するための方法であって、［１］、[２]、［３］、［４］のいずれかに記載の細胞クラスターまたはその一部を含む組成物を対象に投与するステップを含む、方法。
［１５４］  対象が、ヒトである、［１５３］に記載の方法。
［１５５］  対象が、糖尿病を有するか、または糖尿病を発症する高いリスクを有する、［１５３］または［１５４］に記載の方法。
［１５６］  糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、１．５型糖尿病、または前糖尿病である、［１５５］に記載の方法。
［１５７］  投与するステップが、組成物を、腎被膜下に、肝臓中に、または膵臓中に投与することを含む、［１５３］に記載の方法。
［１５８］  第２の細胞クラスターを低温保存し、それによって低温保存した第２の細胞クラスターを産生することをさらに含む、［１５３］または［１５４］に記載の方法。
［１５９］  低温保存した第２の細胞クラスターを融解させ、それによって少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む融解した第２の細胞クラスターを産生することをさらに含む、［１５８］に記載の方法。
［１６０］  （ｉ）融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）融解した第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、［１５９］に記載の方法。
［１６１］  ［１２６］から［１６０］のいずれかに記載の方法で使用するためのシステムであって、磁気撹拌プレートと、第１の細胞クラスターからの複数の細胞を含むスピナーフラスコとを含み、磁気撹拌プレートおよびスピナーフラスコは、第１のクラスターからの複数の細胞を撹拌し、それによって複数の細胞の少なくとも一部を使用してインビトロで第２の細胞クラスターを形成するように構成される、システム。
［１６２］  疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ａ）からの複数の細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部を使用して、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップであって、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、ステップ；ならびに
（ｄ）第２の細胞クラスターまたはその一部を含む組成物を対象に投与するステップ
を含む、方法。
［１６３］  疾患の処置または予防を必要とする対象における疾患を処置または予防するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ｂ）からの複数の細胞を、
（ｉ）血清；ならびに
（ｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤またはトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤
を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部から、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップであって、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、ステップ；ならびに
（ｄ）第２の細胞クラスターまたはその一部を含む組成物を対象に投与するステップ
を含む、方法。
［１６４］  ［１］から２７または［９８］または［１１０］から［１２３］のいずれかに記載の細胞クラスターまたはその一部および少なくとも１種の医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
［１６５］  液体組成物である、［１６４］に記載の医薬組成物。
［１６６］  カプセルである、［１６５］に記載の医薬組成物。
［１６７］  カプセルが、ゲルカプセルである、［１６６］に記載の医薬組成物。
［１６８］  カプセルが、リポソームである、［１６６］に記載の医薬組成物。
［１６９］  少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスターが、
（ａ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターを得るステップ；
（ｂ）第１の細胞クラスターから、複数の細胞を解離させるステップ；
（ｃ）（ｂ）からの複数の細胞を、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤およびトランスフォーミング増殖因子βシグナル伝達経路阻害剤を含む培地中で培養し、それによって、複数の細胞の少なくとも一部から、インビトロで第２の細胞クラスターを形成するステップを含み、第２の細胞クラスターは、少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含み、（ｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、および／または（ｉｉ）第２の細胞クラスター中の細胞の少なくとも約４０％は、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現する、プロセスによって調製される、細胞クラスター。
［１７０］  （ｉ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約７０％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、クロモグラニンＡを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター、および（ｉｉ）緩衝液を含むキット。
［１７１］  （ｉ）少なくとも１つの非天然膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、細胞クラスター中の細胞の少なくとも約２５％が、フローサイトメトリーによる測定によれば、ＮＫＸ６．１およびＣ−ペプチドを発現し、細胞クラスターは、グルコース負荷にさらされる場合、インビトロでのグルコースによって刺激されたインスリン分泌応答を示す、細胞クラスター、および（ｉｉ）緩衝液を含むキット。