(57)【要約】【課題】  Ｄ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを正確に評価するための方法を提供すること。【解決手段】  蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を、評価対象とする細胞種の別個の細胞にそれぞれ接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が発する蛍光を比較し、両者の蛍光強度の差を、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みとして評価することを特徴とする。【選択図】  図２
2010057484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法であって、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を、評価対象とする細胞種の別個の細胞にそれぞれ接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が発する蛍光を比較し、両者の蛍光強度の差を、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みとして評価することを特徴とする方法。
【請求項２】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法であって、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体との混合物を評価対象とする細胞に接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光を検出することで行うことを特徴とする方法。
【請求項１１】
最大蛍光波長の差を少なくとも２０ｎｍとすることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、スルホローダミンを結合せしめたＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１２または１４記載の方法。
【請求項１７】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、異なる蛍光発色団を分子内に有する２種類以上のＬ−グルコース誘導体を混合して用いることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項２２】
蛍光発色団を分子内に有してなることを特徴とするＬ−グルコース誘導体。
【請求項２３】
Ｌ−マンノースの５つの水酸基をアセチル化し、１位のアセトキシ基を臭素置換し、１，２位にオルトエステル基を導入し、３，４，５位のアセチル基をベンジル基に変換し、１，２位に導入したオルトエステル基を外して１位をメトキシ基に変換するとともに２位を水酸基とし、２位の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル化またはメタンスルホニル化した後、アジド化し、アジド基を水素還元するとともに脱ベンジル化し、最後に１位のメトキシ基を水酸基に変換することで得られるＬ−グルコサミンまたはその塩の２位に蛍光発色団を導入することを特徴とする蛍光発色団を分子内に有してなるＬ−グルコース誘導体の製造方法。
【請求項２４】
Ｌ−マンノースの５つの水酸基をアセチル化し、１位のアセトキシ基を臭素置換し、１，２位にオルトエステル基を導入し、３，４，５位のアセチル基をベンジル基に変換し、１，２位に導入したオルトエステル基を外して１位をメトキシ基に変換するとともに２位を水酸基とし、２位の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル化またはメタンスルホニル化した後、アジド化し、アジド基を水素還元するとともに脱ベンジル化し、最後に１位のメトキシ基を水酸基に変換することを特徴とするＬ−グルコサミンまたはその塩の製造方法。
【請求項２５】
蛍光発色団を分子内に有してなるＬ−グルコース誘導体を製造するためのＬ−グルコサミンまたはその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを正確に評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコース（ブドウ糖）は、哺乳類から大腸菌・酵母に至るまで細胞の生存維持に最も重要なエネルギー源として知られ、特に脳はグルコースを唯一のエネルギー源としている。グルコースにはＤ−グルコースとＬ−グルコースの鏡像異性体が存在するが、このうち生物がエネルギー源として利用できるのはＤ−グルコースのみであり、生きた細胞はＤ−グルコースをグルコーストランスポーターなどの細胞膜中の輸送タンパク質を介して選択的に取り込んで利用する仕組みを持つ。
【０００３】
従来、生物がＤ−グルコースをどのようにして細胞内に取り込んで利用するのかについての研究は、例えばラジオアイソトープで標識したＤ−グルコースやその誘導体（Ｄ−デオキシグルコースなど）を用いて細胞内のラジオアイソトープ量を測定することで行われてきた。しかしながら、この方法は定量性に優れるものの、感度が低いといった問題があることに加え、測定手法上、生きた細胞がＤ−グルコースを取り込む様子をリアルタイムで連続的に観察することができないという欠点を有する。従って、この方法は、生きた細胞のＤ−グルコースの動的な取り込みプロセスの研究には使用することができない。
【０００４】
以上のような状況下、本発明者のグループは、生きた細胞のＤ−グルコースの動的な取り込みプロセスの研究に使用することができる方法として、Ｄ−デオキシグルコースの２位に蛍光発色団としてＮ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を結合せしめた、緑色の蛍光を発する下記の構造式で示される２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＮＢＤＧ）を用いる方法を提案し、その有用性を哺乳動物の各種の細胞を用いて実証した（非特許文献１）。
【０００５】
【化１】
2010057484.tif 000003
【０００６】
この方法は、２−ＮＢＤＧが生きた細胞内に選択的に取り込まれる性質を利用したものであり、取り込みによる蛍光強度の変化を追跡することで細胞のＤ−グルコースの取り込みについての動的活動を定量的に知ることができることから、生物がＤ−グルコースをどのようにして細胞内に取り込んで利用するのかを研究する上での画期的な方法として世界中の研究者に評価され、今や、この研究分野において欠かすことができない標準的なプロトコルとして位置付けられている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yamada K. et al., J. Biol. Chem. 275:22278-22283, 2000
【非特許文献２】Yamada K. et al., Nat. Protoc. 2:753-762, 2007
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
非特許文献１において本発明者のグループは、低親和性（高Ｋｍ値）のグルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ２を発現する代表的な細胞であるインスリン分泌細胞に２−ＮＢＤＧを投与し、蛍光強度の変化から、濃度、時間ならびに温度に依存して２−ＮＢＤＧが細胞内に取り込まれること、そのＫｍ値はＤ−グルコースに対して報告されている値に匹敵することを明らかにした。従って、この方法によれば、高Ｋｍ値のグルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ２を介するＤ−グルコースの取り込みについては定量的な評価が可能であるといえる。けれども、細胞膜の表面や膜中に非特異的や特異的に吸着した２−ＮＢＤＧや、グルコーストランスポーターを介さずに細胞内に非特異的に取り込まれた２−ＮＢＤＧなどが存在する場合、２−ＮＢＤＧの投与によって得られた蛍光強度にはこれらの２−ＮＢＤＧが発する蛍光が含まれていることになる。よって、Ｄ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを正確に評価するためには、このような２−ＮＢＤＧの存在を考慮する必要があり、このことは、多くの細胞に発現する高親和性（低Ｋｍ値）のグルコーストランスポーターであるＧＬＵＴ１や神経細胞に発現するＧＬＵＴ３などを介した２−ＮＢＤＧの取り込みのキネティクスを検討する際には非常に重要となることが考えられる。しかしながら、この点を実験手法にどのように反映させるかについての報告はこれまでに存在しない。
【０００９】
そこで本発明は、Ｄ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを正確に評価するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は上記の点に鑑みて鋭意研究を進めた結果、評価対象とする細胞の２−ＮＢＤＧの投与前後の蛍光強度の差を計測する際、対照として細胞内への特異的な取り込みがなされない蛍光Ｌ−グルコース誘導体を用いるという概念を着想した。
【００１１】
上記の着想に基づく本発明のＤ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法は、請求項１記載の通り、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を、評価対象とする細胞種の別個の細胞にそれぞれ接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が発する蛍光を比較し、両者の蛍光強度の差を、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みとして評価することを特徴とする。
また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項３記載の方法は、請求項２記載の方法において、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項４記載の方法は、請求項２記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項５記載の方法は、請求項４記載の方法において、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項６記載の方法は、請求項１記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項７記載の方法は、請求項６記載の方法において、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項８記載の方法は、請求項６記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項９記載の方法は、請求項８記載の方法において、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、本発明のＤ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法は、請求項１０記載の通り、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体との混合物を評価対象とする細胞に接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光を検出することで行うことを特徴とする。
また、請求項１１記載の方法は、請求項１０記載の方法において、最大蛍光波長の差を少なくとも２０ｎｍとすることを特徴とする。
また、請求項１２記載の方法は、請求項１０記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項１３記載の方法は、請求項１２記載の方法において、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項１４記載の方法は、請求項１０記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項１５記載の方法は、請求項１４記載の方法において、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項１６記載の方法は、請求項１２または１４記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、スルホローダミンを結合せしめたＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項１７記載の方法は、請求項１２記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項１８記載の方法は、請求項１７記載の方法において、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項１９記載の方法は、請求項１４記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を用いることを特徴とする。
また、請求項２０記載の方法は、請求項１９記載の方法において、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコースを用いることを特徴とする。
また、請求項２１記載の方法は、請求項１０記載の方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、異なる蛍光発色団を分子内に有する２種類以上のＬ−グルコース誘導体を混合して用いることを特徴とする。
また、本発明のＬ−グルコース誘導体は、請求項２２記載の通り、蛍光発色団を分子内に有してなることを特徴とする。
また、本発明の蛍光発色団を分子内に有してなるＬ−グルコース誘導体の製造方法は、請求項２３記載の通り、Ｌ−マンノースの５つの水酸基をアセチル化し、１位のアセトキシ基を臭素置換し、１，２位にオルトエステル基を導入し、３，４，５位のアセチル基をベンジル基に変換し、１，２位に導入したオルトエステル基を外して１位をメトキシ基に変換するとともに２位を水酸基とし、２位の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル化またはメタンスルホニル化した後、アジド化し、アジド基を水素還元するとともに脱ベンジル化し、最後に１位のメトキシ基を水酸基に変換することで得られるＬ−グルコサミンまたはその塩の２位に蛍光発色団を導入することを特徴とする。
また、本発明のＬ−グルコサミンまたはその塩の製造方法は、請求項２４記載の通り、Ｌ−マンノースの５つの水酸基をアセチル化し、１位のアセトキシ基を臭素置換し、１，２位にオルトエステル基を導入し、３，４，５位のアセチル基をベンジル基に変換し、１，２位に導入したオルトエステル基を外して１位をメトキシ基に変換するとともに２位を水酸基とし、２位の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル化またはメタンスルホニル化した後、アジド化し、アジド基を水素還元するとともに脱ベンジル化し、最後に１位のメトキシ基を水酸基に変換することを特徴とする。
また、本発明は、請求項２５記載の通り、蛍光発色団を分子内に有してなるＬ−グルコース誘導体を製造するためのＬ−グルコサミンまたはその塩の使用である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、Ｄ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを正確に評価するための方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】２−ＮＢＤＧと２−ＮＢＤＬＧの１Ｈ−ＮＭＲチャートである。
【図２】実施例１における急性単離神経細胞に２−ＮＢＤＧおよび２−ＮＢＤＬＧを投与した際の通常蛍光顕微鏡による取得画像である。
【図３】実施例２における急性単離神経細胞に２−ＮＢＤＧおよび２−ＴＲＬＧを投与した際のリアルタイムレーザースキャン共焦点蛍光顕微鏡による取得画像である。
【図４】同、２−ＴＲＬＧと２−ＮＢＤＧの混合溶液の蛍光スペクトルチャートである。
【図５】実施例４における２−ＮＢＤＧと２−ＮＢＤＬＧを大腸菌の状態評価に適用した結果である。
【図６】実施例７における２−ＮＢＤＧと２−ＴＲＬＧと２−ＮＭＡＬＧの混合溶液の蛍光スペクトルチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＤ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法は、以下の２つの方法に大別することができる。
（１）蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を、評価対象とする細胞種の別個の細胞にそれぞれ接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が発する蛍光を比較し、両者の蛍光強度の差を、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みとして評価する方法。
（２）蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体との混合物を評価対象とする細胞に接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光を検出することで行う方法。
以下、上記の方法のそれぞれを説明する。
【００１５】
（１）蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を、評価対象とする細胞種の別個の細胞にそれぞれ接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が発する蛍光を比較し、両者の蛍光強度の差を、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みとして評価する方法。
【００１６】
この方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体（塩酸塩などのような塩の形態であってもよい）とは、蛍光発色団を分子内に有するＤ−グルコース誘導体であって、Ｌ−グルコースやその誘導体（Ｌ−グルコサミンやＬ−デオキシグルコースなど）との対比において細胞内に特異的に取り込まれる化合物を意味し、具体的には、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体、例えば、非特許文献１や非特許文献２に記載の２−ＮＢＤＧや、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を６位に結合せしめたＤ−デオキシグルコース（６−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−６−デオキシ−Ｄ−グルコース：６−ＮＢＤＧ：Speizer L. et al., Biochim. Biophys. Acta 815:75-84, 1985）などが挙げられる。
【００１７】
蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体（塩酸塩などのような塩の形態であってもよい）は、Ｌ体であるが故、本来的に細胞内への特異的な取り込みがなされないものであり、本発明において、２−ＮＢＤＧなどの蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体の対照となるものである。具体的には、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体、例えば、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコース（２−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｌ−グルコース：２−ＮＢＤＬＧ）や、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を６位に結合せしめたＬ−デオキシグルコース（６−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−６−デオキシ−Ｌ−グルコース：６−ＮＢＤＬＧ）などが挙げられる。
【００１８】
例えば、２−ＮＢＤＬＧは、以下に示すように２−ＮＢＤＧと鏡像異性体の関係にあり、旋光度の符合の違いを除いて、両者の物理化学的特性は同じである。
【００１９】
【化２】
2010057484.tif 000004
【００２０】
従って、２−ＮＢＤＬＧの細胞膜の表面や膜中への非特異的な吸着特性や、グルコーストランスポーターを介さない細胞内への非特異的な取り込まれ方などは、２−ＮＢＤＧのそれらと同一または少なくとも同等であると考えられる。よって、２−ＮＢＤＧの投与によって得られた蛍光強度に、細胞膜の表面や膜中に非特異的に吸着した２−ＮＢＤＧや、グルコーストランスポーターを介さずに細胞内に非特異的に取り込まれた２−ＮＢＤＧなどが発する蛍光が含まれている場合、それらの蛍光強度と少なくとも同等の蛍光強度が対照とする２−ＮＢＤＬＧの投与によっても得られるので、２−ＮＢＤＧが発する蛍光と、２−ＮＢＤＬＧが発する蛍光を比較し、両者の蛍光強度の差を目視や数値化などによって求めることにより、その差を２−ＮＢＤＧの２−ＮＢＤＬＧとの対比における細胞内への特異的な取り込み、即ち、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みとして評価することができる。
【００２１】
なお、この方法においては、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が有する蛍光発色団の化学構造と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が有する蛍光発色団の化学構造の違いによって、両者の物理化学的特性が大きく異なってしまうことは望ましくない。従って、両者の蛍光発色団の化学構造は、完全同一または側鎖として有していてもよい置換基を除いて同一であることが望ましい。
【００２２】
また、この方法は、原理上、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体を、評価対象とする細胞種の別個の細胞にそれぞれ接触させて行うものであるので（１つの細胞に両者を投与したのでは蛍光強度の差を求めることはできない）、それぞれを投与する細胞の活動性は同一または少なくとも同等であることが望ましい。この条件を担保するため、実験中は細胞の活動性を確認することが望ましい。細胞の活動性を確認する方法としては、パッチクランプなどによって細胞膜電位が正常であることを確認する方法や活動電位を測定する方法（神経細胞の場合に好適である）、代謝活性を測定する方法などが挙げられる。蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体のそれぞれを接触させる細胞の数を複数とし（ｎ≧２）、統計処理を行ってもよい。
【００２３】
蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体は、Ｌ−グルコースまたはその誘導体（Ｌ−グルコサミンやＬ−デオキシグルコースなど）に蛍光発色団を導入することにより製造することができる。蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体の製造に有用なＬ−グルコサミンまたはその塩（塩酸塩など）は、例えば、Ｌ−マンノースの５つの水酸基をアセチル化し、１位のアセトキシ基を臭素置換し、１，２位にオルトエステル基を導入し、３，４，５位のアセチル基をベンジル基に変換し、１，２位に導入したオルトエステル基を外して１位をメトキシ基に変換するとともに２位を水酸基とし、２位の水酸基をトリフルオロメタンスルホニル化またはメタンスルホニル化した後、アジド化し、アジド基を水素還元するとともに脱ベンジル化し、最後に１位のメトキシ基を水酸基に変換することで得ることができる。
【００２４】
なお、この方法において使用することができる、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体の組み合わせは、上記の緑色の蛍光を発するＮ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体（２−ＮＢＤＧなど）と、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体（２−ＮＢＤＬＧなど）の組み合わせに限定されるものではなく、青色の蛍光を発する２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体と、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体の組み合わせなどであってもよい。２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体としては、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコース（２−［Ｎ−２−（Ｎ’−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース：２−ＮＭＡＧ）などが挙げられ、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体としては、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコース（２−［Ｎ−２−（Ｎ’−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ］−２−デオキシ−Ｌ−グルコース：２−ＮＭＡＬＧ）などが挙げられる。
【００２５】
（２）蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体との混合物を評価対象とする細胞に接触させ、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光を検出することで行う方法。
【００２６】
この方法において、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体（塩酸塩などのような塩の形態であってもよい）とは、蛍光発色団を分子内に有するＤ−グルコース誘導体であって、Ｌ−グルコースやその誘導体（Ｌ−グルコサミンやＬ−デオキシグルコースなど）との対比において細胞内に特異的に取り込まれる化合物を意味し、具体的には、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体、例えば、非特許文献１や非特許文献２に記載の２−ＮＢＤＧや、Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を６位に結合せしめたＤ−デオキシグルコース（６−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−６−デオキシ−Ｄ−グルコース：６−ＮＢＤＧ：Speizer L. et al., Biochim. Biophys. Acta 815:75-84, 1985）などが挙げられる。
【００２７】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体（塩酸塩などのような塩の形態であってもよい）としては、例えば、スルホローダミン（スルホローダミンＢ、スルホローダミンＧ、スルホローダミン１０１など）を結合せしめたＬ−グルコース誘導体、具体的には、２位にスルホローダミン１０１をスルホンアミド結合せしめたＬ−デオキシグルコース（２−ＴＲＬＧと称する）などが挙げられる。
【００２８】
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体と、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体との混合液として、２−ＮＢＤＧと２−ＴＲＬＧとの混合液を用いた場合を例に挙げると、前者の最大蛍光波長は５４０ｎｍ〜５５０ｎｍ、後者の最大蛍光波長は６００ｎｍ〜６１０ｎｍであるので、両者を混合した溶液についてそれぞれの最大蛍光波長付近の蛍光を検出した場合、２−ＮＢＤＧが発する緑色の蛍光と、２−ＴＲＬＧが発する赤色の蛍光をそれぞれ検出することができ、検出された両方の蛍光を合成することで結果として黄色の蛍光を検出することができる。２−ＮＢＤＧと２−ＴＲＬＧとの混合液を細胞に投与した後、２−ＮＢＤＧが細胞内に特異的に取り込まれると、細胞内から緑色の蛍光が検出される。一方、細胞膜の一部が破壊されている場合や、破壊にまでは至らなくとも膜状態がグルコースやその誘導体が非特異的に取り込まれてしまうような状態にある場合、２−ＮＢＤＧと２−ＴＲＬＧの両方が細胞内に取り込まれると、細胞内から黄色の蛍光が検出される。従って、２−ＮＢＤＧと２−ＴＲＬＧとの混合液を細胞に投与した後の２−ＮＢＤＧが発する緑色の蛍光を検出することで、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みをリアルタイムで正確に評価することができる。
【００２９】
なお、この方法は、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長の違いを利用するものであるので、両者の最大蛍光波長の差が大きいほどその違いを簡易かつ正確に識別することができる。従って、両者の最大蛍光波長には少なくとも２０ｎｍの差があることが望ましい。蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として２−ＮＢＤＧを用いる場合、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）ベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体、具体的には、７−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニル）ベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコース（２−［Ｎ−７−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノスルホニル）ベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｌ−グルコース：２−ＤＢＤＬＧ）を用いることもできる（その蛍光は黄色〜黄緑色であり最大蛍光波長は５７０ｎｍ〜５８０ｎｍである）。また、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＬ−グルコース誘導体、具体的には、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＬ−デオキシグルコース（２−［Ｎ−２−（Ｎ’−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ］−２−デオキシ−Ｌ−グルコース：２−ＮＭＡＬＧ）を用いることもできる（その蛍光は青色であり最大蛍光波長は４５０ｎｍ〜４６０ｎｍである）。
【００３０】
また、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を分子内に有するＤ−グルコース誘導体、具体的には、２−（Ｎ−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ基を２位に結合せしめたＤ−デオキシグルコース（２−［Ｎ−２−（Ｎ’−メチルアミノ）ベンゾイルアミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース：２−ＮＭＡＧ）を用いることもできる（その蛍光は青色であり最大蛍光波長は４５０ｎｍ〜４６０ｎｍである）。この場合、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体としては、２−ＮＢＤＬＧや２−ＴＲＬＧを用いることができる。
【００３１】
また、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光と、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体が発する蛍光の間に強度の違いがある場合、それぞれが発する蛍光の強度が同程度となるように、例えば１：１００〜１００：１（モル比）の範囲で両者の混合比を調整することが望ましい。
【００３２】
なお、この方法においては、蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体が発する蛍光の波長とは異なる波長の蛍光を発する蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として、異なる蛍光発色団を分子内に有する２種類以上のＬ−グルコース誘導体を混合して用いてもよい（例えば２−ＴＲＬＧと２−ＮＭＡＬＧの組み合わせなど）。異なる蛍光発色団を分子内に有する２種類以上のＬ−グルコース誘導体を混合して用いることで、例えば、細胞膜の悪化状態の程度の相違に基づく非特異的に取り込まれるＬ−グルコース誘導体の相違を検出することができ、これにより、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みの評価とともに、細胞膜の悪化状態の程度の評価をあわせて行うことができる。
【００３３】
本発明のＤ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法の実験条件は、公知の条件に準じればよい（必要であれば非特許文献２を参照のこと）。
【００３４】
本発明のＤ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを評価するための方法は、ヒトを含めた哺乳動物のあらゆる部位の細胞（神経細胞など）の他、大腸菌や酵母などの微生物の細胞、植物の細胞、受精卵などを評価対象とすることができ、生物がＤ−グルコースをどのようにして細胞内に取り込んで利用するのかについての研究の発展に寄与する他、Ｄ−グルコースの取り込みの程度の違いに基づいて正常細胞と腫瘍細胞を判別するためや、微生物汚染の予防や対策のため（微生物の計数や状態評価など）といった医療分野や衛生分野などにおいてもその有用性が期待される。なお、Ｄ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みの評価は、上記の２種類の方法のいずれかを選択して行ってもよいが、両方を組み合わせて行えば、より正確な評価を行うことができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００３６】
実施例１：神経細胞への２−ＮＢＤＧおよび２−ＮＢＤＬＧの適用例
１−１：２−ＮＢＤＧの合成
非特許文献１記載の方法に準じて行った。
【００３７】
１−２：２−ＮＢＤＬＧの合成
（Ａ）Ｌ−グルコサミン塩酸塩の合成
以下の経路に従って行った。
【００３８】
【化３】
2010057484.tif 000005
【００３９】
（１）1,2,3,4,6-ペンタ-O-アセチル-L-マンノピラノース(1)の合成
L-(-)-マンノース(9.0 g, 49.96 mmol)をピリジン(120 ml)に溶解し、氷冷した。これに無水酢酸(60 ml)を約15分間かけて滴下した。徐々に室温にもどしながら終夜攪拌した後に反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣にトルエンを加えて共沸する操作を２回繰り返した。残渣に酢酸エチルを加えて溶解し、得られた溶液を飽和NaHCO3水、水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を減圧下よく乾燥させて目的物を得た(粗収量：21.04 g(酢酸エチル等を含むので理論収量を越える、49.96 mmolとして次の反応を行った))。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重クロロホルム、δ、ppm)：6.10 (d, 1H, J=1.9 Hz, H-1), 5.26-5.36 (m, 3H, H-2, H-3, and H-4), 4.29 (dd, 1H, J=5.0 and 12.3 Hz, H-6a), 4.11 (dd, 1H, J=2.4 Hz and 12.3 Hz, H-6b), 4.06 (m, 1H, H-5), 2.19 (s, 3H, Ac), 2.18 (s, 3H, Ac), 2.11 (s, 3H, Ac), 2.06 (s, 3H, Ac), 2.02 (s, 3H, Ac)
【００４０】
（２）2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-L-マンノピラノシル ブロマイド(2)の合成
1,2,3,4,6-ペンタ-O-アセチル-L-マンノピラノース(1)(21.04 g)を脱水ジクロロメタン(150 ml)に溶解し、氷冷した。これに30%HBr/AcOH(27.5 ml)を約10分間かけて滴下した。滴下終了後に氷浴からはずし、室温で３時間攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣にトルエンを加えて共沸する操作を２回繰り返した。残渣に酢酸エチルを加えて溶解し、得られた溶液を飽和NaHCO3水、水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を減圧下よく乾燥させて目的物を得た(粗収量：21.45 g(酢酸エチルおよびトルエンを含むので理論収量を越える、49.96 mmolとして次の反応を行った))。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重クロロホルム、δ、ppm)：6.30 (d, 1H, J=1.5 Hz, H-1), 5.72 (dd, 1H, J=3.6 Hz and 10.3 Hz, H-3), 5.46 (dd, 1H, J=1.5 Hz and 3.6 Hz, H-2), 5.38 (dd, 1H, J=10.3 Hz and 10.3 Hz, H-4), 4.34 (dd, 1H, J=4.9 Hz and 12.5 Hz, H-6a), 4.22 (ddd, 1H, J=2.1 Hz, 4.9 Hz, and 10.3 Hz, H-5), 4.15 (dd, 1H, J=2.1 Hz and 12.5 Hz, H-6b), 2.18 (s, 3H, Ac), 2.11 (s, 3H, Ac), 2.08 (s, 3H, Ac), 2.02 (s, 3H, Ac)
【００４１】
（３）3,4,6-トリ-O-アセチル-β-L-マンノピラノース 1,2-(メチルオルトアセテート)(3)の合成
2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-L-マンノピラノシル ブロマイド(2)(21.45 g)を脱水ジクロロメタン(120 ml)に溶解した。アルゴン雰囲気下で2,6-ルチジン(15.73 ml)/脱水メタノール(120 ml)を約30分間かけて滴下した。アルゴン雰囲気下、室温で終夜攪拌した。24時間後にジクロロメタンで希釈した後、得られた溶液を飽和NaHCO3水、水で順次洗浄した。有機層を減圧濃縮し、得られた残渣にトルエンを加えて共沸する操作を３回繰り返した。残渣をメタノール(100 ml)に溶解し、水(800 ml)を少量ずつ加えて析出した結晶を濾取し、水で洗浄後に減圧下よく乾燥させた(1st, 8.92 g)。続いて(1st)の濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮し、液量を減らした。析出した結晶を濾取し、水で洗浄後に減圧下よく乾燥させ(2nd, 2.62 g)、目的物を得た(総収量：11.54 g(L-(-)-マンノースより３工程の総収率：64 %))。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重クロロホルム、δ、ppm)：5.50 (d, 1H, J=2.8 Hz, H-1), 5.31 (dd, 1H, J=9.4 Hz and 10.0 Hz, H-4), 5.15 (dd, 1H, J=3.9 Hz and 10.0 Hz, H-3), 4.62 (dd, 1H, J=2.8 Hz and 3.9 Hz, H-2), 4.24 (dd, 1H, J=4.9 Hz and 12.2 Hz, H-6a), 4.15 (dd, 1H, J=3.0 Hz and 12.2 Hz, H-6b), 3.69(ddd, 1H, J=3.0 Hz, 4.9 Hz and 9.4 Hz, H-5), 2.13 (s, 3H, Ac), 2.08 (s, 3H, Ac), 2.06 (s, 3H, Ac), 1.75 (s, 3H, Me)
【００４２】
（４）3,4,6-トリ-O-ベンジル-β-L-マンノピラノース 1,2-(メチルオルトアセテート)(4)の合成
3,4,6-トリ-O-アセチル-β-L-マンノピラノース 1,2-(メチルオルトアセテート)(3)(11.52 g)をメタノール(200 ml)に溶解し、5.2M-NaOMeのメタノール溶液(184 μl)を加えた。室温で１時間攪拌した後にアンバーリスト15を加えて中和し、濾過した後、樹脂をメタノールで洗浄し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣を減圧下よく乾燥させた。乾燥させた残渣の全量を乾燥DMF(100 ml)に溶解し、氷冷した。これに水素化ナトリウム(NaH)(60% oil suspension, 7.38 g)を少量ずつ加えた。水素の発生による発泡が収まった後に臭化ベンジル(12.1 ml)を滴下した。徐々に室温に戻しながら終夜攪拌した。反応混合物を氷冷し、過剰のNaHを分解させるため、メタノールを少量ずつ発泡しなくなるまで加えた。クロロホルムを加えて希釈し、得られた溶液を水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣を減圧下よく乾燥させ、フリーザー内で終夜保存した。翌朝、沈殿とオイルに分離した。パスツールピペットを用いてオイル(不要物)を除去した。沈殿（湿重量：17.97 g）をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を得た(収量：11.98 g、収率：74 %)。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重クロロホルム、δ、ppm)：7.22-7.41 (m, 15H, Ph), 5.35 (d, 1H, J=2.5 Hz), 4.79 (ABq, 2H, J=12.4 Hz, CH2-Ph), 4.75 (ABq, 2H, J=11.0 Hz, CH2-Ph), 4.58 (ABq, 2H, J=12.4 Hz, CH2-Ph), 4.40 (dd, 1H, J=2.5 Hz and 4.1 Hz, H-2), 3.92 (dd, 1H, J=9.7 Hz and 9.7 Hz, H-4), 3.69-3.77 (m, 3H, H-3, H-6a, and H-6b), 3.42 (ddd, 1H, J=2.3 Hz, 4.5 Hz, and 9.7 Hz, H-5), 3.29 (s, 3H, OMe), 1.74 (s, 3H, Me)
【００４３】
（５）メチル 3,4,6-トリ-O-ベンジル-α-L-マンノピラノシド(5)の合成
3,4,6-トリ-O-ベンジル-β-L-マンノピラノース 1,2-(メチルオルトアセテート)(4)(11.98 g)を脱水メタノール(240 ml)に溶解し、65℃で加熱攪拌した。これに塩化アセチル(6.73 ml)を滴下した。滴下終了後にオイルバスの設定温度を75℃にして加熱還流した。３時間後にオイルバスのスイッチを切り、終夜攪拌した。反応混合物を減圧濃縮し、得られた残渣にクロロホルムを加えて溶解し、得られた溶液を飽和NaHCO3水、水および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を得た(収量：9.74 g、収率：89 %)。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重クロロホルム、δ、ppm)：7.24-7.36 (m, 15H, Ph), 4.80 (d, 1H, J=1.6 Hz, H-1), 4.69 (ABq, 2H, J=11.9 Hz, CH2-Ph), 4.67 (ABq, 2H, J=11.3 Hz, CH2-Ph), 4.60 (ABq, 2H, J=12.4 Hz, CH2-Ph), 4.03 (m, 1H, H-2), 3.70-3.88 (m, 5H, H-3, H-4, H-5, H-6a and H-6b), 3.37 (s, 3H, OMe), 2.49 (br.d, 1H, J=2.5 Hz, C2-OH)
【００４４】
（６）メチル 3,4,6-トリ-O-ベンジル-2-O-トリフルオロメタンスルホニル-α-L-マンノピラノシド(6)の合成
メチル 3,4,6-トリ-O-ベンジル-α-L-マンノピラノシド(5)(9.74 g)を脱水ジクロロメタン(220 ml)に溶解し、ピリジン(4.24 ml)を加えてアルゴン雰囲気下で−15℃に冷却した。これにトリフルオロメタンスルホン酸無水物(5.29 ml)を加え、室温で攪拌した。１時間後に反応混合物に飽和NaHCO3水を加え、ジクロロメタンで抽出した。有機層を合わせ、飽和NaHCO3水、水および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後に濾過し、濾液を減圧濃縮した。得られた残渣にトルエンを加えて共沸する操作を３回繰り返した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して目的物を得た(収量：12.23 g、収率：98 %)。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重クロロホルム、δ、ppm)：7.10-7.38 (m, 15H, Ph), 5.11 (m, 1H, H-2), 4.90 (d, 1H, J=1.9 Hz, H-1), 4.69 (ABq, 2H, J=12.0 Hz, CH2-Ph), 4.64 (ABq, 2H, J=10.7 Hz, CH2-Ph), 4.61 (ABq, 2H, J=11.7 Hz, CH2-Ph), 4.00 (dd, 1H, J=2.9 Hz and 8.9 Hz, H-3), 3.69-3.84 (m, 4H, H-4, H-5, H-6a and H-6b), 3.40 (s, 3H, OMe)
【００４５】
（７）メチル 2-アジド-3,4,6-トリ-O-ベンジル-2-デオキシ-α-L-グルコピラノシド(7)の合成
メチル 3,4,6-トリ-O-ベンジル-2-O-トリフルオロメタンスルホニル-α-L-マンノピラノシド(6)(12.23 g)を脱水ベンゼン(400 ml)に溶解し、テトラブチルアンモニウム アジド[(n-Bu)4NN3](29.16 g)をアルゴン雰囲気下で加えた。３日後に(n-Bu)4NN3(3.61 g)を追加した。さらに11日間（計14日間）室温で攪拌した。反応混合物をそのままシリカゲルカラムにチャージして、シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよび、調製的薄層クロマトグラフィーを併用することにより精製して目的物を得た(収量：3.58 g、収率：36 %)。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重クロロホルム、δ、ppm)：7.15-7.38 (m, 15H, Ph), 4.87 (ABq, 2H, J=12.4 Hz, CH2-Ph), 4.83 (d, 1H, J=3.5 Hz, H-1), 4.66 (ABq, 2H, J=10.7 Hz, CH2-Ph), 4.57 (ABq, 2H, J=12.4 Hz, CH2-Ph), 3.98 (dd, 1H, J=8.9 Hz and 10.2 Hz, H-3), 3.66-3.80 (m, 4H, H-4, H-5, H-6a, and H-6b), 3.45 (dd, 1H, J=3.5 Hz and 10.4 Hz, H-2), 3.43 (s, 3H, OMe)
【００４６】
（８）メチル 2-アミノ-2-デオキシ-α-L-グルコピラノシド塩酸塩(8)の合成
メチル 2-アジド-3,4,6-トリ-O-ベンジル-2-デオキシ-α-L-グルコピラノシド(7)(1.98 g, 4.04 mmol)をメタノール(70 ml)に溶解し、1M-HCl(4.85 ml)およびパラジウム-黒(500 mg)を加えて、８気圧で加圧接触還元した。22時間後に常圧に戻し、TLCで１スポットに収束したことを確認した後に触媒を濾過した。触媒をメタノールで洗浄し、濾液と洗浄液を合わせて減圧濃縮した。得られた残渣に水を加えて減圧濃縮する操作を２回繰り返した。残渣を水に溶解して凍結乾燥して目的物を得た(粗収量：963 mg(水および塩酸を含むので理論収量を越える、1H-NMR測定に使った残り960 mgを4.03 mmolとして最終脱保護となる次の反応を行った))。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重水、δ、ppm)：4.89 (d, 1H, J=3.7Hz, H-1), 3.75 (dd, 1H, J=2.5 Hz and 12.3 Hz, H-6a), 3.72 (dd, 1H, J=9.2 Hz and 10.5 Hz, H-3), 3.66 (dd, 1H, J=5.2 Hz and 12.3 Hz, H-6b), 3.57 (ddd, 1H, J=2.5 Hz, 5.2 Hz, and 9.8 Hz, H-5), 3.35 (dd, 1H, J=9.2 Hz and 9.8 Hz, H-4), 3.31 (s, 3H, OMe), 3.20 (dd, 1H, J=3.7 Hz and 10.5 Hz, H-2)
【００４７】
（９）L-グルコサミン塩酸塩(L-GlcNH2・HCl)の合成
メチル 2-アミノ-2-デオキシ-α-L-グルコピラノシド塩酸塩(8)(960 mg, 4.03 mmol相当として計算)を6N-HCl(40 ml)に溶解し、100℃で加熱攪拌した。計30時間反応させた後に室温に戻して減圧濃縮した。得られた残渣に水を加えて減圧濃縮する操作を５回繰り返した。残渣を水に溶解して凍結乾燥した。得られた残渣をCHP-20に通し、素通り部分を集めて凍結乾燥し(粗収量：805 mg(3.73 mmol、相当粗収率：93 %))、さらに531 mg(2.46 mmol相当)を順相のHPLC(TSK-Gel Amide-80)により精製し、目的の画分を集めて減圧濃縮した。残渣に水を加えて凍結乾燥する操作を３回繰り返して目的物を得た(収量: 474 mg(2.20 mmol)、収率：83 %)。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重水、δ、ppm)：5.36 [d, 0.7H, J=3.5 Hz, H-1(α体), 4.85 [d, 0.3H, J=8.3 Hz, H-1(β体)], 3.36-3.84 [m, 5H, H-3, H-4, H-5, H-6a, and H-6b(α体およびβ体), 3.21 [dd, 0.7H, J=3.5 Hz and 10.6 Hz, H-2(α体), 2.92 [dd, 0.3H, J=8.3 Hz and 10.6 Hz, H-2(β体)]
(元素分析結果)
計算値:C;33.42(%), H;6.54(%), N;6.50(%)
実測値(１回目):C;33.31(%), H;6.46(%), N;6.36(%)
実測値(２回目):C;33.30(%), H;6.48(%), N;6.36(%)
(20℃における [α]D)
実測値:-72.05(c1.0, H2O)(水に溶解して24時間後)
(参考データ：市販品のD-グルコサミン塩酸塩の20℃における[α]D)
実測値:+72.20(c1.0, H2O)(水に溶解して24時間後)
【００４８】
（Ｂ）２−ＮＢＤＬＧの合成（その１）
【００４９】
【化４】
2010057484.tif 000006
【００５０】
褐色フラスコに4-クロロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール(NBD-Cl)(483 mg)を入れ、メタノール(14.0 ml)に溶解した。アルゴン雰囲気下、L-グルコサミン塩酸塩(280 mg)を0.3M-NaHCO3水(5.57 ml)に溶解したものを加え、室温で攪拌した。24時間後に減圧濃縮によりメタノールを除き、生じた沈殿(NBD-Cl由来の不要物)を濾過した後、沈殿を水で洗浄した。濾液と洗浄液を合わせてHPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥して目的物を得た(収量：102 mg、収率：23 %)
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重水、δ、ppm)：8.52 (d, 1H, J=9.1 Hz, H6’), 6.56 and 6.54 (d x 2, 0.5H x 2, J=9.1 Hz and J=9.1 Hz, H5’), 5.38 [d, 0.5H, J=2.8 Hz, H-1(α体)], 4.89 [d, 0.5H, J=8.1 Hz, H-1 (β体)], 3.50-4.02 (m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6a, and H-6b(α体およびβ体)](図1参照)
ESI-MS：calcd for C12H15N4O8 [M+H]+343.1, found 343.1
【００５１】
（Ｃ）２−ＮＢＤＬＧの合成（その２）
褐色フラスコにL-グルコサミン塩酸塩(40.0 mg)およびNaHCO3(26.0 mg)を入れ、水(800 μl)に溶解した。ここにメタノール(4.0 ml)に溶解した4-フルオロ-7-ニトロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール(NBD-F)(92.0 mg)を加え、アルゴン雰囲気下、浴温(37℃)で２時間攪拌し、その後、さらに室温で40分間攪拌した。減圧濃縮によりメタノールを除き、生じた沈殿(NBD-F由来の不要物)を濾過した後、沈殿を水で洗浄した。濾液と洗浄液を合わせてHPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥して目的物を得た(収量：48.7 mg、収率：76 %)。
【００５２】
１−３：急性単離神経細胞への２−ＮＢＤＧおよび２−ＮＢＤＬＧの適用（通常蛍光顕微鏡による画像取得）
（適用方法）
（Ａ）急性単離神経細胞の調製
(1)マウス脳スライスの作製
生後13-15日令(幼若期)もしくは33-45日令(成熟期)のC57BL/6Jマウスにウレタン深麻酔(i.p. 1.6g/kg)を施行し、常法に従い断頭後、脳を取り出し、冷リンガー液注1)中(0℃)に1-2分浸漬して冷やした後、マイクロスライサー(堂阪Zero1)にて厚さ400μmの冠状断脳スライスを作製した。次いで95%O2-5%CO2を通気したリンガー液が循環するチャンバー(ハーバード社製アクリルインキュベーションチャンバー)中にて室温で1時間回復させた。
(2)脳スライスの酵素処理
蛋白分解酵素Pronase(10mg/60mL)を上記リンガー液に溶解して作製した酵素液(31℃；95%O2-5%CO2通気によりpH7.4に保持したもの)に脳スライスを浸漬して酵素処理を行った(浸漬時間は幼若マウスの脳の場合には18-20分、成熟マウスの脳の場合には50-70分)。所定時間経過後、直ちに室温にて100mLの10mM glucose含有HEPES溶液注2)に脳スライスを浸漬して酵素反応を停止させた。
(3)中脳黒質網様部の分離
底部にシリコンを貼付した60mmプラスチックディッシュに10mM glucose含有HEPES溶液注2)(室温)を満たしておき、上記脳スライスを液中に浸漬した。二本の27G注射針で脳スライスを固定した上、顕微鏡下にて左右の中脳黒質網様部を18G注射針の先端を楕円形にしたものでパンチアウトし、室温で上記HEPES溶液注2)(35mmカルチャーディッシュ)中に保存した。
(4)黒質網様部神経細胞の単離
各種先端径に調整したガラスピペットにてtriturationにより神経細胞を単離し、poly-L-lysineコート注3)したガラスボトムカルチャーディッシュ注4)(35mm)に付着させた。
注1)単離用リンガー液
NaCl 124mM, NaHCO3 26mM, KCl 5mM, KH2PO4 1.24mM, CaCl2 2.4mM, MgSO4・7H2O 1.3mM, Glucose 10mM, 95%O2-5%CO2通気によりpH7.4に保持。
注2)HEPES溶液
NaCl 150mM, KCl 5mM, MgCl2 1mM, CaCl2 2mM, HEPES 10mM, 1M Tris(2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol)溶液にてpH7.4に調整。Glucose 濃度はサンプル調製時は10mM。2-NBDGおよび2-NBDLG溶液はglucose-free溶液を使用。
注3)カバースリップのpoly-L-lysineコート(神経細胞用)
5mgのpoly-L-lysine hydrobromide(SIGMA P6282)を50mLの0.15Mホウ酸(NaOHにてpH 8.4に調整)に溶解したものをストックし、冷蔵保存する。本ストック溶液を0.15Mホウ酸 で1/1000に希釈したものをカバースリップ(13mm x 22mm松浪No.0ガラス)の中心部に滴下し、室温にて20分放置した後、蒸留水ですすぎ、自然乾燥させる。
注4)ガラスボトムカルチャーディッシュの作製
上面をpoly-L-lysineコート注3)した上記ガラスカバースリップを、底部に楕円形穴に空いた35mmカルチャーディッシュ(松浪code D109501)の楕円形穴(5mm x 14mm)に、シリコングリース(Dow Corning111Sealant)を用いて裏面から張り、水が漏れないように固定する。
（Ｂ）2-NBDG溶液および2-NBDLG溶液の調製
(1)凍結乾燥品の調製
HPLCで精製して純度をNMRおよびHPLCで確認し、元素分析で含量を確認した2-NBDG(もしくは2-NBDLG)を秤量し、水に溶解し、1バイアルあたり正味0.5mgが含まれるように分注したものを凍結乾燥し、-20℃以下で遮光保存した。
(2)2-NBDG(もしくは2-NBDLG)溶液の作製
使用時は、上記2-NBDG(もしくは2-NBDLG)バイアル一本全量をglucose-free HEPES溶液注2)7.3mLに溶解することで、終濃度200μMの2-NBDG(もしくは2-NBDLG)溶液とした。
（Ｃ）通常型蛍光顕微鏡を使用した際の2-NBDG(もしくは2-NBDLG)溶液灌流装置および蛍光検出装置
Zeiss倒立型蛍光顕微鏡 Axiovert 135(100W Xenon光源)の加温式XYステージ上(Zeiss Tempcontrol37-2)に載せた自家製灌流チャンバー(非特許文献2)に35mmガラスボトムカルチャーディッシュ注4)をセットし、ディッシュ内にセットされているガラスカバースリップ((A)の方法で神経細胞を載せたもの)上に記録用HEPES溶液を1.3mL/分の速度で灌流した。
灌流液の導入は、メジウムビンから伸ばしたチューブ(ステンレス配管とPharmedチューブを組み合わせ、ガス分圧が変化しないようにした)をペリスタルティックポンプ(Ismatec社 MCPポンプ12 rollers)を用いて、35mmガラスボトムカルチャーディッシュ注4)に導入した。溶液の切り替えはペリスタルティックポンプ直前に配置した3方活栓を使用した。なお上記チューブは、チャンバーに導入する前のステンレス配管部分で温度調節用のニクロム線を通して、チャンバー中での灌流液の温度が36-37℃になるように灌流速度にあわせてあらかじめ直流電源により加温制御した。
35mmガラスボトムカルチャーディッシュ注4)に導入した灌流液は、圧力調整を行った真空ポンプを用いて緩やかに吸引し、吸引口の調整により細胞上にある溶液の液面高を調節し、また色素溶液および極細サーミスタープローブ(Physitemp社IT-23)を用いてあらかじめ流れの均一性と再現性、還流液温度を各実験前に確認した(非特許文献2)。
蛍光検出には、Zeiss社製の標準的な450-490nmの励起用バンドパスフィルター、510nmのダイクロイックミラー、515-565nmのエミッションフィルターを使用し、NDフィルターは使用せず、対物レンズはZeiss Plan Neofluar x20レンズ(NA 0.50)を使用した。コンデンサーにはlong working distanceタイプを使用し、透過光はNDフィルターで強度を調整した。画像取得には浜松ホトニクス社製SITカメラC2400-08および同カメラコントローラーC2400、画像取得ソフトウェアArgus50を使用した。
（Ｄ）2-NBDG溶液および2-NBDLG溶液の投与法および画像取得プロトコル
(1)2-NBDG溶液の投与法と画像取得プロトコル
SITカメラのシャッターを閉じた状態で画像(512X483, 16bit)を取得し、用いたSITカメラに特有のバックグラウンドノイズパターンを取得した(図は省略)。
次いでSITカメラへの光路のシャッターを開け、2-NBDG投与前の細胞の位相差像および自家蛍光像を取得した。
ペリスタルティックポンプ前の三方活栓を2-NBDG溶液側に倒し、200μMの2-NBDG溶液を1分間投与して2-NBDGを取り込ませた後、すみやかに2-NBDGを含まないHEPES溶液に戻して10分間および30分間洗い流した後の蛍光像を取得した。なおこの30分間に細胞形態に変化のないことを30分後に位相差像を取得して確認した。
蛍光画像データ処理法は以下の方法を採用した。
(a)バックグラウンド減算(Background subtraction)
SITカメラへの光路のシャッターを開けて取得した蛍光取得画像を表示する際には、シャッターを閉じた状態で取得したバックグラウンドノイズパターンを差し引いた画像として表示した。
(b)シェーディング補正(Shading Correction)
細胞の無いディッシュに200μMの2-NBDG溶液を流し、実験時と同一の画像取得条件で蛍光画像を取得したものを標準シェーディング補正用スタンダード画像とした。本画像は、光源ムラならびにレンズ・カメラを含めた光学システムの特性に起因する取得蛍光強度の二次元分布の様子を示す。2-NBDGの細胞への投与結果が、上記の光学ムラ等の影響を受けないように、各蛍光取得画像と、上記シェーディング補正用スタンダード画像とを、Argus50のシェーディング補正アルゴリズム注5)に適用し、補正後の蛍光画像をシェーディング補正済み蛍光画像として保存した。
(c)ディッシュ内位置の違いによる洗い流し(wash)の程度の補正
ディッシュのカバースリップ部分の大きさ(5mm x 14mm)は細胞の大きさの1000倍程度あり、観察に供する細胞がディッシュ内のどの位置に存在するかによって、2-NBDG溶液の灌流および洗い流し(wash)の時間経過に若干の差異を生じる。そこで細胞内への2-NBDGの取り込みの程度の評価に対するこうした灌流の部位的差異による影響を軽減するため、以下の補正を行った。すなわちSITカメラで観察している画面のほぼ中央(x,y)=(256, 242)に、30pixel x 30pixelの大きさのエリアを設定し、それぞれの蛍光取得画像について、このエリアの平均蛍光強度B0を検出した。ただし画面中央に細胞が来ないようあらかじめ画像取得時にはxyステージ位置を調整した。次いで各点の蛍光強度B(x,y)をこのB0で割った値B(x,y)/B0をそれぞれの(x,y)の地点における蛍光強度とした。
(d)蛍光強度のガンマによる強調(Enhance)
画像は32回の積算(duration 1sec)により取得した。また2-NBDGによる蛍光画像は、退色を最低限におさえるためにレーザーのExcitation強度を下げているため、部位による強度差がわかりやすいようにガンマ0.3をかけて強調し、画像処理の目的で16bitから8bitに落として表示した。
注5)Argus50のシェーディング補正アルゴリズム
C(x,y) = A(x,y) x [Bmax / B(x,y)]
C(x,y) = 補正後の画像
A(x,y) = 補正前の画像
B(x,y) = シェーディングスタンダード画像
Bmax = B(x,y)の最大輝度
A, Bにはバックグラウンドノイズ分を差し引いた後の画像を使用する。
(2)2-NBDLG溶液の投与法と画像取得プロトコル
2-NBDG溶液の投与法と画像取得プロトコルと全く同じものとした。
【００５３】
（適用結果）
図２に示す。図２から明らかなように、この実験では、２−ＮＢＤＧの投与によっては細胞からの緑色の蛍光が認められたが、２−ＮＢＤＬＧの投与によっては細胞からの緑色の蛍光はほとんど認められなかった。従って、この差は、２−ＮＢＤＧの細胞内への特異的な取り込みに基づくものであると評価することができた。なお、実験中、２−ＮＢＤＧを投与した細胞と２−ＮＢＤＬＧを投与した細胞のパッチクランプを行ってそれぞれの活動電位を調べ、その同等性を確認することで、細胞の活動性の違いが蛍光強度に影響する可能性を排除し、評価の妥当性を確保することができた。以上の結果から、２−ＮＢＤＧの対照として２−ＮＢＤＬＧを投与することで、Ｄ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを正確に評価することができることがわかった。
【００５４】
実施例２：神経細胞への２−ＮＢＤＧおよび２−ＴＲＬＧの適用例
２−１：２−ＮＢＤＧの合成
非特許文献１記載の方法に準じて行った。
【００５５】
２−２：２−ＴＲＬＧの合成
【００５６】
【化５】
2010057484.tif 000007
【００５７】
褐色フラスコにL-グルコサミン塩酸塩(51.9 mg)を入れ、水(300 μl)に溶解し、脱水DMF(1.70 ml)を加えた。アルゴン雰囲気下、これにジイソプロピルエチルアミン(84.1 μl)を加え、さらにスルホローダミン 101 クロリド(30.0 mg)を脱水DMF(1.50 ml)に溶解したものを加えた後、室温で攪拌した。35分後に50%酢酸(6.00 ml)を加え、HPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥した。ここで蛍光試薬のスルホローダミン 101 クロリドはオルトとパラの２種類の異性体の混合物であることから、生成物もまたオルトとパラの２種類の異性体の混合物となり、HPLCにおける保持時間の短いもの(高極性2-TRLG)およびHPLCにおける保持時間の長いもの(低極性2-TRLG)を分離・精製した。
高極性2-TRLGの収量：10.3 mg
低極性2-TRLGの収量： 6.0 mg
総収量：16.3 mg
総収率：44 %
（高極性2-TRLG）
1H-NMR (400 MHz、重メタノール、δ、ppm)：8.57 [d, 0.7H, J=1.7 Hz, H3’of Ph (α体)], 8.49 [d, 0.3H, J=1.7Hz, H3’of Ph (β体)], 8.02 [dd, 0.7H, J=1.7 Hz and 8.0 Hz, H5’ of Ph (α体)], 7.98 [dd, 0.3H, J=1.7 Hz and 8.0 Hz, H5’of Ph (β体)], 7.24 [d, 0.7H, J=8.0 Hz, H6’of Ph (α体)], 7.19 [d, 0.3H, J=8.0 Hz, H6’of Ph (β体)], 6.84 and 6.68 [s x 2, 0.3H x 2, H8’’and H10’’(β体)], 6.73 and 6.55 [s x 2, 0.7H x 2, H8’’and H10’’(α体)], 4.35 [d, 0.3H, J=8.5 Hz, H1 (β体)], 2.60-3.72 [m, 21H, H3, H4, H5, H6a, and H6b, H1’’, H3’’, H5’’, H7’’, H11’’, H13’’, H15’’ and H17’’ (α体およびβ体) ], 2.01 and 1.86 [m, 8H, H2’’, H6’’, H12’’and H16’’ (α体およびβ体) ]
ESI-MS：calcd for C37H42N3O11S2[M+H]+ 768.2, found 768.2
（低極性2-TRLG）
1H-NMR (400 MHz、重メタノール、δ、ppm)：8.58 [d, 0.75H, J=1.8 Hz, H3’of Ph (α体)], 8.54 [d, 0.25H, J=1.8 Hz, H3’of Ph (β体)], 8.02 [dd, 0.75H, J=1.8 Hz and 8.0 Hz, H5’of Ph (α体)], 7.98 [dd, 0.25H, J=1.8 Hz and 8.0 Hz, H5’of Ph (β体)], 7.27 [d, 0.75H, J=8.0 Hz, H6’of Ph (α体)], 7.23 [d, 0.25H, J=8.0 Hz, H6’of Ph (β体)], 6.56 and 6.54 [br.s x 2, 2H, H8’’and H10’’(α体およびβ体)], 4.90 [d, 0.75H, J=3.4 Hz, H1 (α体)], 4.42 [d, 0.25H, J=8.3 Hz, H1 (β体)], 2.60-3.70 [m, 21H, H3, H4, H5, H6a, H6b, H1’’, H3’’, H5’’, H7’’, H11’’, H13’’, H15’’ and H17’’ (α体およびβ体) ], 2.00 and 1.85 [m, 8H, H2’’, H6’’, H12’’and H16’’ (α体およびβ体) ]
ESI-MS：calcd for C37H42N3O11S2[M+H]+ 768.2, found 768.2
【００５８】
２−３：急性単離神経細胞への２−ＮＢＤＧおよび２−ＴＲＬＧの適用（リアルタイムレーザースキャン共焦点蛍光顕微鏡による画像取得）
（Ａ）急性単離神経細胞の調製
実施例１と同様にして行った。
（Ｂ）2-TRLG + 2-NBDG混合溶液の調製
2-TRLGは水に不溶性のため、1.54mgのTRLGを30%アセトニトリル-70%H2O液に溶解してまず2mM 2-TRLG溶液とした後、この2mM溶液10μLを、100μMの2-NBDGを含有するglucose-free HEPES buffer溶液注6)1mLに溶解することで100倍に希釈し、20μM 2-TRLG + 100μM 2-NBDG混合溶液を得た。
注6)100μMの2-NBDGを含有するglucose-free HEPES buffer溶液の調製
実施例1の1-3の(B)の(1)に記載した方法で調製された0.5mgの2-NBDGバイアルに、glucose-free HEPES溶液注2)14.6mLを加えて調製した。 
（Ｃ）リアルタイムレーザースキャン共焦点顕微鏡を使用した場合の2-TRLG + 2-NBDG 混合溶液の投与法および画像取得プロトコル
(1) 20μM 2-TRLG + 100μM 2-NBDG混合溶液の投与法
(a)マイクロピペットの作製
市販の1mm管ガラスキャピラリー(Sutter社B100-75-15)をプラー(Sutter社P-97)で引き、2本の先端を閉じた状態のガラスピペットを作製した。次いでマイクロフォージ(ナリシゲ社製MF-90)を利用して、その白金ヒーター先端部に付着させた小さなガラス球をガラス球が赤くならない程度に加熱し、ガラスピペット先端に瞬間的に接触させると同時にヒーターの加熱を切ることで、先端外径が3-4ミクロン(内径3ミクロン以下1.5ミクロン以上)でかつ先端部が開口したマイクロピペットを得た。
(b)2-TRLG + 2-NBDG混合溶液の充填
(B)で調製した20μM 2-TRLG + 100μM 2-NBDG混合溶液をマイクロチューブの蓋部に100μL取っておき、(a)で作製したマイクロピペット後端部に細いタイゴンチューブ(Tygon)を接続して3方活栓を介して10ccシリンジを接続した。次いでこのマイクロピペットの先端部を、マイクロマニピュレーターを利用して上記混合溶液中に漬け、シリンジで急速に引くことでマイクロピペット先端部に混合溶液を充填した。次にマイクロピペット後端部から、細いシリンジニードル(WPI社製MicroFil)を用いて混合溶液を充填した。
(c)マイクロインジェクタへのマイクロピペットの接続
市販のマイクロインジェクタ(Eppendorf社製Transjector5246)のユニバーサルホルダーに、混合溶液を充填したマイクロピペットを接続した。次いでユニバーサルホルダーを、共焦点顕微鏡ステージ上のマイクロマニピュレーター(ナリシゲ社3次元ジョイスティック方式水圧マニピュレーター)に接続した。細胞を含まないディッシュを用意し、HEPES溶液注2)中にマイクロピペットを漬けて、インジェクションモードで陽圧(1500hPa)をかけて先端部からの色素溶液の吐出を蛍光により確認した。次いでマイクロインジェクタの自動圧力調節機能を利用してマイクロピペットに補正圧をかけることで、マイクロピペット先端部からの混合溶液の漏出、あるいは先端部への外液の吸引が無い状態に保持した。
(d)ガラスピペットの細胞近傍へのアプローチ
神経細胞をガラスボトム部に付着させた35mmガラスボトムカルチャーディッシュ注4)に、3mLのHEPES溶液注2)を加え、更にミネラルオイル(SIGMA M8410)を3mL積層した。次いでこのガラスボトムカルチャーディッシュを共焦点顕微鏡のステージ上のユニバーサルフレーム(Leica 11600234)に固定し、Liveモードで観察しながらマイクロマニピュレーターを操作して、x63レンズの視野内(Zoom1.7)に入るようにマイクロピペットを細胞近傍(ピペット先端部から細胞中心部まで80ミクロンとなるように)に近づけ、ピペットから吐出される蛍光溶液が細胞全体を一様に覆うようなxyz位置にピペットを固定した。
(2)画像取得条件の詳細
Leica製TCS-SP5リアルタイムレーザースキャン共焦点顕微鏡(本体はDMI6000 CS trino)を高速(8000Hz)レゾナントスキャンモードで使用した。
使用レーザーは488nmアルゴンレーザー、出力は15%で使用した。レンズはx63のoilレンズ(HCX PL APO Lambda Blue, NA1.40)を使用し、500nmのダイクロイックミラー(RSP500)を用いた。
緑の波長領域用photomultiplier検出器(PMT1)と赤の波長領域用検出器(PMT2)、これに透過光用検出器(PMTTrans)を加えた合計三つの検出器(チャネル)を同時に使用して、512x512の画素数で画像取得した。検出感度はPMT1(868V)、PMT2(868V)、PMTtrans(245V)とした。なお緑(500-580nm)と赤(580-740nm)の蛍光検出波長領域はEmissionフィルター方式によらず、プリズム分光とスリットを組み合わせた方式(Leica社TCS-SP5の標準)によって最適値を選択した。
緑と赤、ならびに透過光のレーザースキャンは同時に行った。透過光画像取得については微分干渉方式(DIC)を用いるとポラライザーやアナライザーを光路に入れる為の切り替え時間が必要となるため、本スキャン時には単純明視野画像とした。
ズームはレゾナントモードにおける最低値である1.7倍、Pinhole sizeはx63レンズを使用した場合の最大値である6.28を使用した。このpinhole sizeでもz軸方向に細胞内の核と細胞質を実用的に区別し得ることが取得画像で確認された。3回のスキャニングによって平均画像を取得した。
(3)2-TRLG + 2-NBDG混合溶液の投与法
投与は24時間一定室温(24℃)に保持された部屋で行った。
(a)投与前画像の取得
混合溶液投与直前の緑、赤の各波長領域の蛍光像、および透過光像を上記(2)に記した方法で取得した。
(b)混合溶液の投与
20μM 2-TRLG + 100μM 2-NBDG混合溶液を、神経細胞全体を完全に覆うように1500hPaの吐出圧を用いて1分間投与(投与量0.6μL)した。投与液が細胞全体にかかっていることは投与中の緑、赤の各波長領域の蛍光像、および透過光像の取得により毎回かならず確認した。混合溶液の吐出を停止すると、混合溶液は速やかにHEPES溶液全体(3mL)に拡散して5000倍に希釈されるため、1分後には背景の蛍光は無視できる程度となった。また細胞内に取り込まれる量も実験時間内(最長1時間)では装置の検出限界より十分低い濃度であると考えられた。
(c)投与後画像の取得
混合溶液投与停止後、5分おきに緑、赤の各波長領域の蛍光像、および透過光像を(2)に記した方法で取得した。
【００５９】
（適用結果）
図３に投与停止１分後の蛍光取得画像および透過光像を示す。図３から明らかなように、この実験では、２−ＴＲＬＧの細胞内への取り込みに基づく黄色〜赤色の蛍光は認められず、２−ＮＢＤＧによる緑色の蛍光のみが認められることから、この細胞においては、細胞膜の一部が破壊されていたり、膜状態が２−ＮＢＤＧと２−ＴＲＬＧの両方が非特異的に取り込まれてしまうような状態にあったりすることはなく、２−ＮＢＤＧが細胞内に特異的に取り込まれたと評価することができた（例えば細胞膜のヘミチャンネルは開口していると分子量が約１０００以下の分子を通過させるので、分子量が７６８の２−ＴＲＬＧも細胞内に取り込まれるが、２−ＴＲＬＧの取り込みが認められないことはヘミチャンネルを介した分子の取り込みはないことを意味する）。なお、この評価結果の妥当性は、２０μＭの２−ＴＲＬＧと１００μＭの２−ＮＢＤＧの混合溶液を使用すれば、５４０ｎｍ付近の蛍光を検出することで２−ＮＢＤＧが発する緑色の蛍光を、６１０ｎｍ付近の蛍光を検出することで２−ＴＲＬＧが発する赤色の蛍光をそれぞれ検出することができることから裏付けられている（ｐＨ７．４の場合、２−ＮＢＤＧの最大蛍光波長は５４０ｎｍであり、２−ＴＲＬＧの最大蛍光波長は６１０ｎｍである：図４参照）。また、共焦点顕微鏡を用いれば、細胞の内と外を区別できるので、共焦点顕微鏡は本発明において有効な装置であるといえる。
【００６０】
実施例３：２−ＤＢＤＬＧの合成
【化６】
2010057484.tif 000008
【００６１】
褐色フラスコに4-(N,N-ジメチルアミノスルホニル)-7-フルオロ-2,1,3-ベンゾオキサジアゾール(DBD-F)(100 mg)を入れ、メタノール(2.00 ml)およびTHF(2.00 ml)の混合溶媒に溶解した。アルゴン雰囲気下、L-グルコサミン塩酸塩(49.8 mg)を0.3M-NaHCO3水(1.08 ml)に溶解したものを加えた後、室温で攪拌した。48時間後に減圧濃縮によりメタノールを除き、生じた沈殿(DBD-F由来の不要物)を濾過した後、沈殿を水で洗浄した。濾液と洗浄液を合わせてHPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥して目的物を得た(収量：35.8 mg、収率：38 %)。
1H-NMRスペクトル(400 MHz、重水、δ、ppm)：7.82 and 7.84 (d x 2, 0.5H x 2, J=8.3 Hz and 8.3 Hz, H-6’), 6.42 and 6.46 (d x 2, 0.5H x 2, J=8.3 Hz and 8.3 Hz, H-5’), 5.31 [br.d, 0.5H, J=2.7 Hz, H-1(α体)], 4.79 [br.d, 0.5H, J=8.3 Hz, H-1(β体)], 3.43-3.90 [m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6a, and H-6b(α体およびβ体)], 2.65 (s, 6H, Me2NSO2-)
ESI-MS：calcd for C14H21N4O8S [M+H]+405.1, found 405.1
【００６２】
実施例４：大腸菌の状態評価への適用
大腸菌Escherichia coli K12を一晩37℃で振とう培養し、その1mLを遠心分離して集菌し、1mLのPhosphate Buffer Saline (PBS；0.01Mリン酸バッファーと0.137MのNaClの混合液、pH 7.4)に懸濁した。懸濁液の90μLを分取し、これに2-NBDG溶液もしくは2-NBDLG溶液を10μL加えて終濃度50μMとなるように調製した後、37℃にて10分間取り込み反応を行なわせた。反応後、遠心分離した菌体をPBSに再懸濁し、顕微鏡観察し（対物レンズx10）、顕微鏡観察用CCDカメラで記録した。結果を図５に示す。図５から明らかなように、2-NBDGの細胞内への取りこみによる顕著な蛍光は検出することができたが、2-NBDGの測定条件と同じ測定条件では2-NBDLGの細胞内への取り込みによる蛍光は検出することができなかった。なお、生菌に対して70%エタノール処理を室温で10分間行うことで調製した死菌について同様の実験を行った場合、2-NBDGと2-NBDLGのそれぞれの蛍光検出の結果に差は認められなかった（別途の実験より）。
【００６３】
実施例５：２−ＮＭＡＧの合成
【化７】
2010057484.tif 000009
【００６４】
褐色フラスコにD-グルコサミン塩酸塩(215 mg)を入れ、水(1.0 ml)に溶解し、DMF(9.0 ml)を加えた。アルゴン雰囲気下、ここにN-メチルアントラニル酸(別名：2-(メチルアミノ)ベンゼンカルボン酸)(151 mg)と1-ヒドロキシベンゼントリアゾール(135 mg)を加えて氷冷した。さらに1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド(187 μl)を加え、０℃で攪拌した。２時間後に減圧濃縮し、得られた残渣に水を加えて凍結乾燥した。凍結乾燥物に水を加え、水に難溶である試薬由来の不要物を濾過した後、不要物を水で洗浄した。濾液と洗浄液を合わせてHPLCで精製した。目的の画分を集めて凍結乾燥して目的物を得た(収量：140 mg、収率：45%)。
1H-NMRスペクトル(400MHz、重水、δ、ppm)：7.44 (m, 2H, Ar), 6.86 (d, 1H, J=8.2 Hz, Ar), 6.78(dd, 1H, J=7.5 and 7.5 Hz, Ar), 5.29(d, 0.5H, J=3.7Hz, H-1α), 4.80(d, 0.5H, J=8.3Hz, H-1β), 3.48-4.05(m, 6H, H-2, H-3, H-4, H-5, H-6, H-6), 2.78(s, 3H, Me)
ESI-MS: calcd for C14H21N4O8S [M+H]+ 313.1, found 313.1
【００６５】
実施例６：２−ＮＭＡＬＧの合成
Ｄ−グルコサミン塩酸塩のかわりにＬ−グルコサミン塩酸塩を用いること以外は２−ＮＭＡＧの合成方法と同様にして２−ＮＭＡＬＧを合成した。
【００６６】
実施例７：２−ＮＢＤＧと２−ＴＲＬＧと２−ＮＭＡＬＧを混合して使用した場合の有用性
蛍光発色団を分子内に有してなる細胞内に特異的に取り込まれるＤ−グルコース誘導体として２−ＮＢＤＧを、蛍光発色団を分子内に有するＬ−グルコース誘導体として２−ＴＲＬＧと２−ＮＭＡＬＧを１：１：２５（モル比）で混合した溶液を４０５ｎｍのレーザー光で励起した場合の蛍光スペクトルのチャートを図６に示す。図６から明らかなように、この組み合わせによれば、２−ＮＭＡＬＧの最大蛍光波長である４５０ｎｍ付近では２−ＮＭＡＬＧが発する青色の蛍光を、２−ＮＢＤＧの最大蛍光波長である５４０ｎｍ付近では２−ＮＢＤＧが発する緑色の蛍光を、２−ＴＲＬＧの最大蛍光波長である６１０ｎｍ付近では２−ＴＲＬＧが発する赤色の蛍光をそれぞれ検出することができる。２−ＴＲＬＧと２−ＮＭＡＬＧはいずれもＬ−グルコース誘導体であるので、細胞内へは非特異的にしか取り込まれないが、両者の蛍光発色団は大きさ（かさ高さ）が異なることから、例えば、細胞膜の悪化状態の程度が小さい場合には小さな蛍光発色団を有する２−ＮＭＡＬＧのみが取り込まれ、大きな蛍光発色団を有する２−ＴＲＬＧは細胞膜の悪化状態の程度が大きくなってはじめて取り込まれる（別途のモデル実験によって確認済み）。従って、細胞膜の悪化状態の程度の相違に基づく非特異的に取り込まれるＬ−グルコース誘導体の相違を検出することができ、これにより、Ｄ−グルコースのＬ−グルコースとの対比における細胞内への特異的な取り込みの評価とともに、細胞膜の悪化状態の程度の評価をあわせて行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明は、Ｄ−グルコースの細胞内への特異的な取り込みを正確に評価するための方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
2010057484.tif 000010
【図２】
2010057484.tif 000011
【図３】
2010057484.tif 000012
【図４】
2010057484.tif 000013
【図５】
2010057484.tif 000014
【図６】
2010057484.tif 000015