【手続補正書】
【提出日】令和3年3月5日(2021.3.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
別個の分泌シグナルに融合されている、構造的に同一な組み換えタンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド配列および第２のポリヌクレオチド配列を含む、組み換え宿主細胞であって、
前記第１のポリヌクレオチド配列によってコードされる組み換えタンパク質は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のα接合因子シグナル配列のｐｒｅ領域およびＳ．セレビシエのα接合因子シグナル配列のｐｒｏ領域を含み、配列番号８を含む第１の分泌シグナルまたはその機能的変異体に、作動可能に連結されており、かつ
前記第２のポリヌクレオチド配列によってコードされる組み換えタンパク質は、Ｐ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）のＥＰＸ１シグナル配列のｐｒｅ領域およびＳ．セレビシエのα接合因子シグナル配列のｐｒｏ領域を含み、配列番号１１を含む第２の分泌シグナルまたはその機能的変異体に、作動可能に連結されている、
前記組み換え宿主細胞。
【請求項２】
前記タンパク質がシルクタンパク質である、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項３】
前記タンパク質が配列番号１３を含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項４】
酵母細胞である、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項５】
前記酵母細胞がＰ．パストリスである、請求項４に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項６】
前記組み換えタンパク質がシルクタンパク質の反復単位を含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項７】
前記組み換えタンパク質が配列番号１１０を含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項８】
前記組み換えタンパク質が、配列番号１３〜配列番号１１０からなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項９】
組み換えタンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）培養培地中で請求項１に記載の組み換え宿主細胞を培養して、前記組み換え宿主細胞を含む発酵を得る段階、及び
（ｂ）前記培養培地から前記組み換えタンパク質を抽出する段階
を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞がＰ．パストリスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組み換えタンパク質がシルクタンパク質の反復単位を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の組み換え宿主細胞及び培養培地を含む、発酵。
【請求項１３】
前記宿主細胞がＰ．パストリスである、請求項１２に記載の発酵。
【請求項１４】
前記組み換えタンパク質が、配列番号１３〜配列番号１１０からなる群より選択される配列を含む、請求項１２に記載の発酵。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
従って、必要なものは、組み換え宿主細胞における過剰発現の負の影響を緩和しながら、望ましい組み換えタンパク質の発現の増加を可能にする方法及び組成物である。
[本発明1001]
少なくとも2つの別個の分泌シグナルに作動可能に連結されている組み換えタンパク質をコードする少なくとも2つのポリヌクレオチド配列を含む、組み換え宿主細胞。
[本発明1002]
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、シグナルペプチドを含むがリーダーペプチドを含まない、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1003]
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、シグナルペプチド及びリーダーペプチドを含む、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1004]
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、天然分泌シグナル、または天然分泌シグナルと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1005]
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、組み換え分泌シグナルである、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1006]
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、表1から選択されるシグナルペプチド、または表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体を含む、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1007]
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）であるリーダーペプチド、または配列番号1と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体を含む、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1008]
前記組み換え分泌シグナルが、配列番号1と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有するリーダーペプチド、及び、ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）を含まないシグナルペプチドを含む、本発明1005の組み換え宿主細胞。
[本発明1009]
前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとも1つが、天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）または配列番号7と少なくとも80％のアミノ酸同一性を有する機能的変異体であり、かつ前記別個の分泌シグナルのうちの少なくとももう1つが、天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）または配列番号1と少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体及びｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）ではないシグナルペプチドを含む、組み換え分泌シグナルである、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1010]
天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、配列番号7と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1009の組み換え宿主細胞。
[本発明1011]
天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、1つまたは2つの置換アミノ酸変化を含む天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）である、本発明1009の組み換え宿主細胞。
[本発明1012]
天然ｐｒｅ−αＭＦ（ｓｃ）／ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、配列番号8である、本発明1009の組み換え宿主細胞。
[本発明1013]
天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、配列番号1と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1009の組み換え宿主細胞。
[本発明1014]
天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、1つまたは2つの置換アミノ酸変化を含む天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）である、本発明1009の組み換え宿主細胞。
[本発明1015]
天然ｐｒｏ−αＭＦ（ｓｃ）の前記機能的変異体が、配列番号2である、本発明1009の組み換え宿主細胞。
[本発明1016]
前記シグナルペプチドが表1から選択されるか、または、表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、本発明1009の組み換え宿主細胞。
[本発明1017]
前記シグナルペプチドの前記機能的変異体が、表1から選択されるシグナルペプチドと少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％のアミノ酸同一性を有する、本発明1016の組み換え宿主細胞。
[本発明1018]
前記組み換え分泌シグナルが、配列番号9〜12から選択されるか、または、配列番号9〜12から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも80％のアミノ酸配列同一性を有する機能的変異体である、本発明1009の組み換え宿主細胞。
[本発明1019]
前記機能的変異体が、配列番号9〜12から選択される組み換え分泌シグナルと少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、または少なくとも99％のアミノ酸配列同一性を有する、本発明1018の組み換え宿主細胞。
[本発明1020]
前記ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、前記組み換え宿主細胞のゲノム内に安定的に組み込まれている、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1021]
前記ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、前記組み換え宿主細胞において染色体外に維持されている、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1022]
前記タンパク質が、シルクまたはシルク様タンパク質である、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1023]
前記タンパク質が、配列番号13を含む、本発明1022の組み換え宿主細胞。
[本発明1024]
前記タンパク質が、配列番号13の複数のコピーを含む、本発明1022の組み換え宿主細胞。
[本発明1025]
前記ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが、プロモーターに作動可能に連結されている、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1026]
前記プロモーターが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のｐＧＣＷ14プロモーターである、本発明1025の組み換え宿主細胞。
[本発明1027]
前記プロモーターが、ピキア・パストリスのｐＧＡＰプロモーターである、本発明1025の組み換え宿主細胞。
[本発明1028]
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、本発明1025の組み換え宿主細胞。
[本発明1029]
酵母細胞である、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1030]
出芽酵母細胞である、本発明1029の組み換え宿主細胞。
[本発明1031]
メチロトローフ酵母細胞である、本発明1029の組み換え宿主細胞。
[本発明1032]
ピキア種である、本発明1030の組み換え宿主細胞。
[本発明1033]
ピキア・パストリスである、本発明1032の組み換え宿主細胞。
[本発明1034]
前記組み換え宿主細胞により産生される前記組み換えタンパク質の総収量の少なくとも30重量％の分泌収量である前記組み換えタンパク質を産生する、本発明1001の組み換え宿主細胞。
[本発明1035]
本発明1001〜1034のいずれかの組み換え宿主細胞及び培養培地を含む、発酵。
[本発明1036]
前記組み換え宿主細胞により産生される前記組み換えタンパク質の総収量の少なくとも30重量％を分泌組み換えタンパク質として含む、本発明1035の発酵。
[本発明1037]
前記培養培地が、少なくとも0．5ｇ／Ｌの前記組み換えタンパク質を含む、本発明1035の発酵。
[本発明1038]
組み換えタンパク質を産生するための方法であって、
（ａ）培養培地中で本発明1001〜1034のいずれかの組み換え宿主細胞を培養して、本発明1035〜1037のいずれかの発酵を得る段階、及び
（ｂ）前記培養培地から前記組み換えタンパク質を抽出する段階
を含む、前記方法。