【手続補正書】
【提出日】平成17年1月14日(2005.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】      明細書
【発明の名称】乳酸菌の製造法
【特許請求の範囲】
【請求項１】(1)炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム及びヒドロタルサイトから選ばれる1種または2種以上、(2)単糖類または二糖類、(3)ペプトン、及び4)麹、麹エキス、胚芽培地、酵母、及び酵母エキスから選ばれる1種または2種以上、を含む混合物を液体培地に用い攪拌培養することを特徴とする乳酸菌の培養法。
【請求項２】炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム及びヒドロタルサイトから選ばれる1種または2種以上を用いる場合、(1)炭酸マグネシウムまたはヒドロタルサイトは１％（ｗ／ｗ）以上、炭酸カルシウムは２％（ｗ／ｗ）以上、(2)単糖類または二糖類は４％（ｗ／ｗ）以上、(3)ペプトンとして３％（ｗ／ｗ）以上、(4)麹、麹エキス、胚芽培地、酵母、または酵母エキスから選ばれる1種または２種以上を０.５％（ｗ／ｗ）以上添加して構成した液体培地を用いることを特徴とする請求項１記載の培養法。
【請求項３】請求項１又は２の方法で培養した後、培地に酸を添加して培地ｐＨを４〜6に調整することによって炭酸塩を溶解した後、乳酸菌菌体を培地と分離して回収し、凍結真空乾燥することを特徴とする乳酸菌末の製造法。
【請求項４】麹菌あるいは麹菌エキスの生成菌が糸状菌であることを特徴とする請求項１および２記載の乳酸菌の培養法および請求項３記載の乳酸菌末の製造法。
【請求項５】糸状菌がアスペルギルス・オリゼーであることを特徴とする請求項４記載の乳酸菌の培養法あるいは乳酸菌末の製造法。
【請求項６】乳酸菌がエンテロコッカス  フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウム、ラクトバチルス・カゼイから選ばれる菌種あるいは２種以上を組み合わせて培養することを特徴とする請求項１,２,３,４および５記載の乳酸菌の培養法あるいは乳酸菌末の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、乳酸菌醗酵技術の分野に属し、乳酸菌の液体培養系における新規培養方法と、その乳酸菌末の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】
液体培地に乳酸菌などの微生物を接種し、培地ｐHなどを制御しながら培養し、生育の停止した定常期状態に到達後、菌体を培地から分離して回収する方法を回分培養法（バッチ・カルチャー）と呼ぶ。この方法は、培養中に生ずる培地の栄養素の減少および乳酸など分泌物の増加に起因する培地環境変化のために、乳酸菌の増殖が生育途中で抑制され易いことが特徴である。浜田小弥太らは、「Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ等について１ｍｌ中１０１０に近い菌数を得るに至り、これに従前に知られてきた種々の発育促進物質を加えても、もはや増収とならず菌数増加もこのあたりが限度でないかと考える」と記載している（北原覚雄編、乳酸菌の研究、東京大学出版会、１９６６年、４９４頁）。  
【０００３】
当時から今日まで乳酸菌の液体培養法において菌体増大化に寄与する成分の研究がなされているが、例えば、にんじん抽出物（特公昭３７−３５３６号）、ホーレン草抽出物（特公昭３７−３５３５号）、紅茶抽出物（特公昭３７−３５３４号）、アスペルギルス培養濾液（特公昭３６−１４２７７号）、蚕蠕抽出物（特公昭３７−１５２９２号）、塩化カルシウム（特開平７−９９９６８号）などが開示されている。この様な乳酸菌の発育促進剤を用いる回分培養法では、菌体を培地１ｍｌ当たり１００億以上の状態に至った報告がない。但し、回分培養法で乳酸菌数を高めることは、乳製品を製造する上でのスターターカルチャーとしての有用性を高めることになり、その最適培養条件の研究が鋭意行なわれている。  
【０００４】
炭酸カルシウムを乳酸菌の保存用寒天培地に０.５％前後添加することは古くから行われて来ている（根井外喜男編、微生物の保存法、東京大学出版会、１９７７年、２０８頁）。炭酸カルシウムの添加意義は、培養中に乳酸菌が培地に分泌する乳酸によって培地ｐHが酸性側へ低下するのを防ぐ'中和作用'と解析されている（北原覚雄編、乳酸菌の研究、東京大学出版会、１９６６年、３７１頁）。炭酸カルシウムの添加濃度は、液体培地に１％未満添加した例は多数あり、それ以上の濃度で添加した例としては、酢酸菌寒天培地に１〜２％添加（根井外喜男編、微生物の保存法、東京大学出版会、１９７７年、１７３頁）、炭酸カルシウム１.０％、プロテオースペプトン０.５％、バクト胆汁塩０.１％、チオ硫酸ソーダ３.０％で構成されたサルモネラ増殖用  Ｂａｃｔｏ  Ｔｅｔｒａｔｈｉｏｎａｔｅ  Ｂｒｏｔｈ  Ｂａｓｅ  （Ｄｉｆｃｏ  Ｍａｎｕａｌ，１０版、９４６頁）、あるいは上記と同様に乳酸による培地ｐＨの低下を防ぐ目的で炭酸カルシウムを１.５％添加した特開平８−１１６８７２号公報などの例に限定される。
【０００５】
炭酸マグネシウムは、乳酸菌の液体培地成分として使用した例が全く報告されていない。この理由は、炭酸マグネシウムを液体培地に少量でも添加すると、培地ｐＨが乳酸菌の通常の増殖培地ｐＨ７〜６よりも容易にアルカリ化し、培地褐変の促進や菌の増殖阻害が見込まれる為と考えられる。事実、特開平８−１１６８７２号公報において記載されている様に、乳を窒素源および炭素源とする乳酸菌スターター用培養基を改良する目的で、乳酸の中和に適した難溶性炭酸塩の選択を行ない、炭酸マグネシウムを添加すると培養基ｐＨを乳酸菌の最適生育ｐＨ範囲から逸脱させるとの理由で除外されていることからも明らかである。
【０００６】
一方、液体培地に乳酸菌などの微生物を接種し、培養液中に生ずる培地栄養素の減少や代謝産物の増加などの培地環境変化をモニタリングし、不足栄養素の補給や代謝産物のろ過除去など適切な制御を加えることで菌体数や生産物の収率を最大化させる培養方法を流加培養法と呼ぶ（田口、永井編、微生物培養工学、共立出版、１９８５年）。以下に流加培養法の例を挙げる：乳酸を効率良く産生・回収する方法として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＡＨＵ１２５６株を１％酵母エキス、１％ポリペプトン、２％Ｄ−グルコース、および３.５％リン酸一水素二カリウムから成る液体培地（ｐＨ７.０）でフィルターーベッドータイプ  リアクターと呼ぶ装置で効率良く乳酸を生産した例（Ｏｈａｒａ，Ｈ.ら：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７６巻、７３−７５頁、１９９３年）、乳酸菌の菌数を増加させた例として、アルミナセラミック製ろ過膜を装備した培養装置を用い、初発培地の主基質としてグルコース０.６％、酵母エキス０.２％およびポリペプトン１.０％を用いてＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓを培養し、その培養期間中、グルコース１.２％および酵母エキス０.４％で構成した新鮮培養液を間欠的に供給し、菌体をセラミック膜の槽内に留めたまま培養液をろ過分離することで、菌体濃度を高めたこと（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｔ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８２巻、２６４−２７１頁、１９９６年）、大豆煮汁または米ヌカ煮汁を用いて増殖させた乳酸菌の菌数を更に増加させる為、培養中に生じた乳酸によって培地ｐＨが低下したことに対し、炭酸カルシウムを５.０％添加することで酸性化した培地ｐＨを７.０に調整し、この後も培養〜炭酸カルシウムによる培地ｐＨ調整を数回継続することで高菌数化を図る方法（特開平８−５６６５１号）が報告されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の一つは、液体回分培養系において生きた乳酸菌菌体を工業的に安価に効率良く生産できる技術を提供することにある。また、本発明の別の目的は、その生産技術を利用することにより高菌数の乳酸菌末を得ることにある。
【０００８】
【発明を解決するための手段】
昔から各社が導入している微生物の液体培養設備は、通常、回分培養法で行う為の生産設備であって、流加培養で行なうためには新たな設備を必要とする。本発明者らは、液体培地において乳酸菌を効率的に増殖させる方法について鋭意研究を重ねた結果、回分培養法においても増大化を実現できる方法を見出した。すなわち、本発明は、乳酸菌を液体培養するにあたり、以下に示す４つの栄養素を添加した液体培地で攪拌培養することにより菌数を増大化させる。  
【０００９】
本発明の液体培地に用いる４つの栄養素およびその添加量は、(1)炭酸マグネシウム、炭酸カルシウムまたはヒドロタルサイトを１種、または２種以上の混合物を、炭酸マグネシウムまたはヒドロタルサイトを単独で用いる場合には１％（ｗ／ｗ）以上、そして炭酸カルシウムを単独で用いる場合には２％（ｗ／ｗ）以上、(2)単糖類または二糖類を４％（ｗ／ｗ）以上、(3)ペプトンを３％（ｗ／ｗ）以上、および4)麹または麹エキスあるいは酵母または酵母エキスの１種、または２種以上の混合物を０.５％（ｗ／ｗ）以上である。  
【００１０】
本発明の乳酸菌の増殖方法は、乳酸菌数を増大化させる点において種々の技術へと応用展開され得るが、その好適な例として乳酸菌末の製造がある。かくして、本発明は、乳酸菌を上述した液体培養条件によって増大状態に至らしめた後、培地に酸を添加して液体培地ｐHを４〜６に調整することによって難溶性炭酸塩を溶解した後、乳酸菌菌体を培地と分離して回収することができる。その場合菌体と安定化剤を混合しても良いし、凍結真空乾燥して更に粉状化することによっても乳酸菌末をうることができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の方法の特徴を更に詳しく説明する。
本発明は、乳酸菌数の増大化液体培養方法を提供する目的で、古くから用いられてきたペプトン、グルコース、酵母エキスなどの培地成分およびそれらの濃度範囲の検討に加え、無機塩の最適化を図る目的で炭酸カルシウムに着目し、鋭意検討して来た。そして、炭酸カルシウムに上回る効果を発揮する物質として炭酸マグネシウムを見出し、本発明を完成するに至った。本発明における乳酸菌の培地原料として以下のものが例示されるが、これ等に限定されるものでない。
【００１２】
１）難溶性炭酸塩として、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、あるいはヒドロタルサイト[分子式、Ｍｇ６Ａｌ２（ＯＨ）１６ＣＯ３・４Ｈ２Ｏ、ヒドロタルサイトあるいは合成ヒドロタルサイトの名称で市販]が例示される。炭酸マグネシウムまたはヒドロタルサイトを単独で添加する場合には１重量％以上、炭酸カルシウムを単独で添加する場合には２重量％以上の添加で効果が出るが、好ましくは２〜１３重量％の範囲である。両者の混合あるいは他の無機塩類との混合状態で使用してもさしつかえない。炭酸マグネシウムの本質は含水塩基性炭酸マグネシウムまたは含水正炭酸マグネシウムであり、酸化マグネシウム（ＭｇＯ）を４０.０〜４４.０％含み、その分子式は（ＭｇＣＯ３）４・Ｍｇ（ＯＨ）２・５Ｈ２Ｏである。
【００１３】
２）単糖類として、グルコース（以下Ｇｌｃと呼ぶ）、マンノース、フルクトース、ガラクトース、などの六炭糖の他、リボースなど五炭糖も例示される。こららの単糖類は４重量％以上の添加量で効果が出るが、好ましくは５〜１５重量％の範囲である。これらの糖類は、培地褐変を防ぐ目的で他の培地成分と別滅菌し、接種時に混合することが望ましい。なお、ガラクトースは、炭酸カルシウム添加培地では菌数の増大化効果を示すが、炭酸マグネシウム添加培地では効果を示さない。
【００１４】
３）ペプトンとして、大豆ペプチド（ハイニュートＳＭＰ、ハイニュートＲ、ハイニュートＳ、ハイニュートＳＭＳ，ハイニュートＰＭなど、不二製油（株）製）、あるいはポリペプトン（牛乳カゼイン酵素分解物、日本製薬（株）製）、トリプチケース  ペプトン（米国ＢＢＬ社製）、ポリペプトン  ペプトン（牛乳カゼイン製ペプトンと肉製ペプトンの混合物、米国ＢＢＬ社製）、ポリペプトンＳ（脱脂大豆酵素分解物、日本製薬（株）製）、フィトン（米国ＢＢＬ社製）、ソイトン（Ｄｉｆｃｏ社製），ポリペプトンＰ１（動物肉酵素分解物、日本製薬（株）製）、チオトン（米国ＢＢＬ社製）、プロテオースペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）、ポリペプトンＹ（卵黄たんぱく質酵素分解物、日本製薬（株）製）などが例示される。３重量％以上の添加量で効果が出るが、好ましくは５〜１３重量％の範囲である。ペプトン代替としてハイニュートを使用した例は、不二製油（株）の「大豆ペプチドの微生物生育促進資料」に多数開示されているが、その中で１％以上の濃度で用いた例としてＹＰＤ培地（Ｇｌｃ１％、ハイニュート２％、および酵母エキス２％）およびＳａｂｏｕｒａｕｄ培地（Ｇｌｃ４％、ハイニュート１％）が挙げられ、２％以下の濃度で使用されている。
【００１５】
４）麹および酵母の混合物として強力わかもと（以下ＷＴと呼ぶ。わかもと製薬（株）製一般用医薬品）が例示される。麹としては、糸状菌アスペルギルス・オリゼーを胚芽培地で固体培養して得た培養物（以下、ＡＫと呼ぶ）、あるいは乳酸菌を胚芽培地で固体培養して得た培養物（以下、ＬＦＫと呼ぶ）を例示され、これらの麹から採取したエキス、あるいはＡＫやＬＦＫ製造に使用する胚芽培地、酵母末もしくは酵母エキスを単独または混合物を０.５重量％以上の添加で効果が出るが、好ましくは２〜５重量％の範囲である。これらの中で最適な成分は、ＡＫであり単独で用いることにより最も高い効果が出る。なお、麹や胚芽培地を用いる場合、水に対する不溶性残渣を除いたエキスを調製して用いることにより、高濃度状態でも用いることが可能となり、更に不溶性残渣を凍結乾燥粉末中に持ち込まない分、一層望ましい。  
【００１６】
なお、１）〜４）の添加物は上記の濃度範囲より多く添加できることは申すまでもないが、その場合に留意すべき点は、〔1〕培地の加圧滅菌中に発泡が生じるので注意を要すること（これを避ける目的で、滅菌前に培地の予熱によって発泡させておくことが望ましい）、〔2〕炭酸マグネシウムを単独で用いる場合には培地ｐHがアルカリ性になり過ぎること、あるいは培地浸透圧が高くなり過ぎるので注意を要すること、〔3〕培地の褐色化が進み易いこと、〔4〕培地原料費が高くなり過ぎること、〔5〕麹エキスおよび酵母エキスを用いれば問題がないが、ＷＴ、ＡＫ、ＬＦＫ、胚芽培地あるいは酵母末を培地成分として用いる場合には菌体量に対する不溶性固形分の割合が高くなるため、これらの不溶性残渣は凍結乾燥菌末に対して倍散剤としての意義はあるものの、凍結乾燥時の乳酸菌の菌体濃度を低くしてしまうことなどが挙げられる。
【００１７】
５）本発明において、乳酸菌の培養条件としては培地を攪拌振盪することが必須である。この点を確保さえすれば、培養温度、培養時間、嫌気的あるいは好気的いずれでにおいても使用する菌株にとって最も好都合な培養条件を設定すれば、本発明の効果を十分確認できる。
例えば、炭酸塩の添加量を本発明の下限付近に設定し、タンク培養中、大気の代わりに炭酸ガスを用いて培地をバブリングすることによっても本発明の効果は充分に確認できる。
【００１８】
６）本発明に使用し効果を確認できる乳酸菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍやＥ.  ｆａｅｃａｌｉｓに属する菌種であれば何れでもよく、これらは分類学的に以前Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓと呼ばれていた都合より、現在でも本名称を使用している場合もあり、いずれの名称の菌株であっても良い。従って、本実施例では、市販生菌製剤ＷＴで使用しているＳ.  ｆａｅｃａｌｉｓ（以下、Ｓｆと呼ぶ）を用いた他、Ｅ.  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＪＣＭ５８０３株、Ｅ.  ｆａｅｃｉｕｍ  ＩＦＯ３１２８株も用いた。  更に、本発明に適用できる他の菌種としては、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  （実施例にはＮＲＩＣ１９１７株を使用）などが例示される。上記の菌株を親株とする育種菌株を用いても本発明の効果を充分確認できることは申すまでもなく、又これらの菌株を混合して培養する共生系液体培養であっても良い。  
【００１９】
本発明の液体培養によって乳酸菌を増大化できる理論的背景を述べる：  乳酸菌の液体培養系において培地に分泌された乳酸によって培地ｐＨが低下するなどの理由で乳酸菌の生育が抑制され易いことに着目し、Ｃ源及びＮ源を豊富に添加して生育の旺盛化を促す一方、乳酸産生を抑制する要因も加えて培養することによって増大化を図ることが'乳酸菌の増大化液体培養法'に対する当初の考えであった。
【００２０】
乳酸産生を抑制すると乳酸菌が増大化するメカニズムは、(1)Ｓｆの様なホモ乳酸醗酵菌を用いてＧｌｃを炭素源とする液体培養を行なった場合、振盪培養と静置培養との間で見出された顕著な違いから推察される（北原覚雄編著、乳酸菌の研究、東京大学出版会、４０３−４０７頁、１９６６年）。即ち、静置培養ではいずれの菌株も乳酸以外の生産物をほとんど造らないが、振盪培養によって培地の酸素濃度を高くすることによって乳酸産生量が低下し、その代わり酢酸やアセトインを著量産生するように変化した。酢酸の生合成過程においてＡＴＰが新たに生成され、生育のエネルギー源として用いられ、この好気的条件において生育が促進された。従って、液体培地を好気的に振盪することで菌体内への酸素供給量を高めることが増大化の必須因子（＝増大化要因―Ａ）と想定された。  
【００２１】
その他、(2)Ｓｆの様なホモ乳酸醗酵菌は、通常の培養条件では、Ｇｌｃ１モル当たり、２モルの乳酸と２モルのＡＴＰを産生する。ところが、ホモ乳酸醗酵菌であっても生育上限付近のアルカリｐＨ域では、乳酸産生が減少し、その分のギ酸、酢酸、エタノールなどが増加する言わば'ヘテロ乳酸醗酵'が行なわれるように変化し、この過程においてＡＴＰが生成する。こうして過剰に生じたエネルギーがアルカリｐＨ域における旺盛な生育を可能にすることが報告されている（Ｒｈｅｅ，Ｓ.Ｋ.およびＰａｃｋ，Ｍ.Ｙ.：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１４４巻、２１７−２２１頁、１９８０年）。  従って、液体培地ｐＨを菌株の生育上限域付近に設定することが増大化の必須因子（＝増大化要因―Ｂ）と想定された。  
【００２２】
この他、生育に必要な栄養素の供給源として、(１）単糖類、(２）ペプトン、及び(３）麹、麹エキス、胚芽培地、酵母、または酵母エキスの単独またはこれらを含む混合物を組み合わせて液体培地に出来るだけ高濃度添加する（＝増大化要因―Ｃ）。  
【００２３】
本発明の液体培養条件において、増大化要因―Ｃは生育を旺盛化する要因であり、その効果に付随して乳酸産生を促進してしまう。そこで、培養系に乳酸産生を抑制する要因―Ａ及びーＢの両者を負荷して乳酸産生を抑え気味にしながら培養する。この方法を創案することによって現実に高菌数化出来たのであり，現在のところ以上が本発明の液体培養条件における高菌数化メカニズムであろうとの作業仮説を立てている。    
【００２４】
【実施例】
比較例１．「公知の液体培地に難溶性炭酸塩を添加してＳｆを回分培養しても増大化しない」
ＢＬ液体培地に、炭酸カルシウムを５重量％添加してＳｆの培養を行なっても、菌数が若干増加する程度の効果であり、またこの程度の菌数増加は同濃度の硫酸マグネシウムを添加しても見られたことから、炭酸カルシウムの特異的作用に由来する菌数増加とは云い難い。  更に、炭酸カルシウムをＢＬ培地に５％添加しても、本発明の特徴であるＳｆの高い耐熱性および高い培地乳酸濃度も全く見られなかった。  
一方、高濃度の炭素源および窒素源を含む米ヌカ培地や大豆粉培地に、炭酸カルシウムや炭酸マグネシウムを２〜５重量％添加してＳｆの培養を行なったが、本発明に匹敵するほどの添加濃度に依存した増大化効果が全く見られず、本発明の特徴の一つである高い乳酸産生効果も見られなかった。  
【００２５】
実験方法：ＢＬ液体培地１０ｍｌにＳｆを一白金耳量接種し、３０℃で一夜振盪培養した。この定常期の菌液０.１ｍｌを表１に示した組成の液体培地１０ｍｌ（綿栓付き５０ｍｌ試験管）に接種し（菌数、０.２１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ）、３０℃・２４時間振盪培養した（振盪速度３００回／分）。得られた菌液の到達菌数、耐熱性、および培地の乳酸濃度を試験例１に記載した方法で分析した。  
米ヌカ培地および大豆粉培地の調製法：  特開平８−５６６５１号において開示された方法に準拠して調製した。即ち、コーヒーミルで粉末にした米ヌカおよび脱脂大豆を３０％（ｗ/ｗ）の割合で脱イオン水に懸濁し、５０℃で１時間加温処理した。  その後、９０００ｒｐｍ・５分間遠心分離して上清画分を回収し、これをガーゼ４枚重ねてろ過した。得られたろ液に炭酸塩を添加した後、オートクレーブ滅菌して培地とした。
ＢＬ液体培地：BL寒天培地、「ニッスイ」日水製薬（株）製、５.８ｇを脱イオン水１００ｍｌに懸濁し、産業用ティシュー、キムワイプS-200、（株）クレシア製でろ過して寒天を除き、２０分間オートクレーブ滅菌して調製した。
【００２６】
【表１】
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【００２７】
試験例１.「本発明の液体培養法の特徴、その１：  Ｇｌｃ資化後も培地に分泌した乳酸を新たに資化することによって生育を続行することによって増大化状態に至る」
【００２８】
本発明の液体培地および公知の液体培地としてＢＬ液体培地を用いてＳｆを培養し、その経時的変化を解析した。表２に示す様に、本発明の液体培地における乳酸菌の増殖パターンをＢＬ液体培地の場合と比較すると両者の違いが顕著であり、本発明の特徴を次のように要約できる：
１）本発明の液体培地でＳｆを培養すると、菌体数は培地１ｍｌ当たり５００億  〜７００億に至り、ＢＬ液体培地に比べて約２０倍も増大化した。
２）本発明の培養条件で最大菌数に到達するまでの培養過程において、Ｓｆは培養１４時間目までは資化し易いＧｌｃを優先的に消費した。培地からＧｌｃを消費し尽くした１９時間目以降、培地に分泌され蓄積してきた乳酸濃度が減少に転じ、乳酸を資化するようになった。こうして、培地ｐHもアルカリ側へ移行し、やがて２７時間目で菌数が最大値に至った。
【００２９】
一方、ＢＬ液体培地では、培地のＧｌｃが消費された１９時間目で最大菌数３０億に到達した。それ以降の培養の継続でも菌数が増加しなかった他、培地に分泌された乳酸濃度の減少および培地ｐHのアルカリ化現象も見られなかった。
なお本発明の培養で見出された特徴と類似する現象は、培地のＧｌｃ濃度をあらかじめ低濃度に設定した場合、培地の炭素源として添加した乳酸が資化され、そして培地から乳酸消失に伴い培地ｐＨがアルカリ化したことがＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓで報告されている（Ｈｕ，Ｇ，および  Ｓａｎｄｈａｍ，Ｈ.Ｊ.：  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｏｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１７巻、７２９−７４３頁、１９７２年）。このことから、本発明の培養において、最大菌数に至る過程で発生した乳酸量の減少は、菌体がＧｌｃに代わる新たな炭素源して乳酸を資化した現象と示唆される。
【００３０】
１）耐熱性は、本発明の条件では培養４〜８時間目の対数増殖期で低く（０.０４％以下）、培養２０〜２７時間目の定常期で高かった（４０％以上）。そして、最大菌数に至った２７時間目を超えて培養を継続した場合、３０時間目以降から急激に耐熱性が低くなった（２０％以下〜数％）。一方、ＢＬ液体培地では、同様に対数増殖期の培養４〜８時間目で低く（０.０４％以下）、最大菌数に到達した１９時間目は高い耐熱性であったが（３３％）、更に培養を継続しても１０〜１２％とほぼ一定の耐熱性が維持された。
本発明の培地で乳酸菌を培養すると、定常期の到達最大菌密度付近では高い耐熱性が得られる。その要因の一つは、ペプトンを高濃度添加することであり、Ｇｌｃを資化し終えた後も増殖するためにペプトンの栄養素を資化する。従って、最大菌数に到達した後、急激に耐熱性が低下する理由は、培地からペプトンの栄養素が減った為と推察される（表５参照）。
【００３１】
培養条件：  ＢＬ液体培地１０ｍｌにＳｆを一白金耳量接種し、３０℃で一夜振盪培養した。この定常期の菌液１.０ｍｌを液体培地５０ｍｌ（綿栓付５００ｍｌ三角フラスコ使用）に接種し（接種菌数、０.１５ｘ１０８個/ｍｌ）、３０℃で２００ｒｐｍの振盪条件で培養した。表２に示した各培養時間においてサンプリグし、その時点の培地ｐＨ、到達菌数、耐熱性および乳酸濃度などを分析した。なお、Ｇｌｃは他の培地成分と別に滅菌し、接種前に他の培地成分と混合した。  
本発明の液体培地組成（重量％）：８.４３％炭酸マグネシウム、８.０％Ｇｌｃ、１２.０％ハイニュートＳＭＰおよび３.２％ＷＴ。
【００３２】
分析方法：
到達菌数の測定法は、培養液０.５ｍｌを下記の組成のリン酸バッファー４.５ｍｌで１０倍ずつ段階希釈し、その０.１ｍｌをＳＣＤ寒天培地「ダイゴ」（日本製薬（株）製）２〜３枚ずつ塗沫した。このプレートを３７℃で２４〜４０時間培養し、プレート上に生成した集落数を測定し、その平均値を液体培地１ｍｌ当たりに換算し、ｃｆｕと表現した（ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）。リン酸バッファーの組成：塩化ナトリウム７ｇ、リン酸二カリウム５.３１ｇ、リン酸一カリウム２.６５ｇ、ツイーン８０  ２.０ｇおよび脱イオン水で最終液量を１０００ｍｌ（ｐH６.８）に調整。
１） 培地に分泌された乳酸の濃度は、培養液に含まれるＬ−乳酸を特異的に定量分析する乳酸定量分析用試薬キット、Ｆ―キットＬ―乳酸（（株）Ｊ.Ｌ.インターナショルより購入）を用いて測定した。  
２） D−グルコースの培地濃度の測定は、市販のグルコース定量分析用試薬キット、F−キットD−グルコース（（株）Ｊ.Ｌ.インターナショルより購入）を用いて行った。
３） 耐熱性は、到達菌数の測定時にリン酸バッファー（ｐH６.８）で段階希釈した液を６０℃、１５分間処理後、ＳＣＤ寒天培地に０.１ｍｌを塗沫し、熱処理後の生存菌数を測定した。耐熱性は熱未処理に対する菌数残存率％で表した。
【００３３】
【表２】
2004057020.tif 000002
【００３４】
試験例２  「本発明の液体培養の特徴、その２：  増大化に及ぼす無機塩類の特異性」
本発明の液体培養条件において、高濃度の無機塩を添加した場合のＳｆ増大化に及ぼす特異性を検討し、得られた結果を表３に示した。  
【００３５】
その結果、無機塩に関する特徴として以下の点が判明した：
１）ＷＴを３.２％、ＧｌｃおよびハイニュートRを各々１０％もの高濃度で培地に添加した場合、無機塩を添加しなくても１２０ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌもの高い菌数が得られた。  従来の回分培養法ではこの程度の菌数が到達し得る上限であり、添加物を追加しても菌数を更に増加させ得なかった。  本発明者らは、この培地条件に対して、更に高濃度の無機塩添加による増大効果を検討した。  その結果、表３.に示した様に、炭酸カルシウムを６.００％あるいは炭酸マグネシウムを５.０６％もの高濃度添加した場合、更に増大することを見出した。  この他の無機塩としては、炭酸水素カリウムが無添加の条件に比べ菌数を若干高めたが、塩化カルシウムなどいずれも無添加の条件に比べて低い到達菌数となった。  
【００３６】
２）特徴的なことは、難溶性の性質を有する硫酸カルシウム（石膏）、炭酸マグネシウム、あるいは炭酸カルシウムを添加した場合、いずれも耐熱性が無添加の場合とほぼ同様の５０％前後であった。一方、塩化ナトリウムなどの水溶性無機塩を添加した場合、いずれも耐熱性が低下した。  これら難溶性の無機塩を添加した場合、難溶性の性質のおかげで菌体に及ぼす作用が少ないおかげで耐熱性の低下を防止したと考えられるが、これら難溶性無機塩であっても添加濃度が高過ぎれば耐熱性を低下させる場合も見られた。  
【００３７】
３）培地の乳酸濃度は、培養後も培地ｐHが高い状態を維持し、そして菌数が高いと云う両条件を満たした場合に高かった。  その中で、難溶性の炭酸マグネシウムを添加した場合が最も高い乳酸濃度となり、重質あるいは軽質いずれも同じ効果であった。一方、炭酸マグネシウムと同じマグネシウム塩であっても水溶性の塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムは、無機塩無添加に比べて、到達菌数のみならず乳酸濃度も低かった。  ちなみに、菌数当たりの乳酸濃度（ｍｇ／億）は、塩化ナトリウム（０.７０）、塩化マグネシウム（０.３２）、炭酸マグネシウム（０.１４）、炭酸カルシウム（０.１１）、硫酸マグネシウム（０.０９３）の順に高く、本発明の液体培地の基本組成に塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムを添加しても乳酸産生の促進効果があるとは認められなかった。
【００３８】
培養条件：ＢＬ液体培地１０ｍｌにＳｆを一白金耳量接種し、３０℃で一夜振盪培養した。  この定常期の菌液０.１ｍｌを液体培地１０ｍｌ（綿栓付５０ｍｌ試験管）に接種し（接種菌数０.２５ｘ１０８個/ｍｌ）、３０℃で２１時間培養した。振盪速度は３００回／分と設定した。  グルコースは他の成分と別に滅菌し、接種前に残りの成分と混合した。
液体培地組成（重量％）：０.６M無機塩類、１０.０％Ｇｌｃ、１０.０ハイニュートRおよび３.２％ＷＴ。
【００３９】
【表３】
2004057020.tif 000003
【００４０】
試験例３  「本発明の液体培養の特徴、その３：  Ｇｌｃおよびペプトンに対する補充培地栄養素の特異性は菌種により異なる」
本発明の液体培養条件における補充栄養素の特異性に関して、表４に示した結果より、
以下の特徴が見出された：
１）増大化に及ぼす補充栄養素の特異性は使用する菌種により異なることが判明した。  Ｓｆで効果が見られた成分はＷＴの他、ＡＫ、ＬＦＫ、胚芽培地、酵母末あるいは酵母エキスであった。  一方、Ｌ.  ｃａｓｅｉ  ＮＲＩＣ１９１７株に対して効果が見られた成分は、ＡＫおよび胚芽培地のみに限定された。  ＡＫを添加した場合、ＳｆとＬ.  ｃａｓｅｉの両菌株ともほぼ同じ到達菌数であった。  
【００４１】
２）酵母末の添加はＬ.  ｃａｓｅｉ  ＮＲＩＣ１９１７株の増大化に対し抑制的に作用し、更に酵母エキスもＳｆの場合に比べ高い効果が見られなかった。  酵母末の添加による抑制作用は、至適成分のＡＫが共存しても起こると予想された。  このことは、ＷＴを添加した場合、ＡＫほどの効果が見られなかった。  ＷＴは、ＡＫ５０％の他に酵母末３７％およびＬＦＫ１０％で構成されており、含有する酵母末によってＡＫの増大化効果が抑制されたと推察される。
【００４２】
３）Ｓｆの増殖は胚芽培地に比べてＬＦＫを添加した方が促進的に作用したが、Ｌ.ｃａｓｅｉ  ＮＲＩＣ１９１７株の増殖はＬＦＫも胚芽培地と全く同じ到達菌数であった。ＬＦＫは胚芽培地においてＳｆを固体培養した麹であり、固体培養中に同菌株に対する増殖促進物質を分泌しており、そしてこの物質は異種のＬ.  ｃａｓｅｉ菌株に対して増殖促進作用を及ぼさない性質と推察された。  
【００４３】
培養条件：ＢＬ液体培地１０ｍｌにＳｆおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＮＲＩＣ１９１７株を各々一白金耳量接種し、３０℃で一夜振盪培養した。  これら定常期の菌液０.１ｍｌを液体培地１０ｍｌ（綿栓付５０ｍｌ試験管）に接種し、３０℃でＳｆを２０時間、Ｌ.  ｃａｓｅｉ  ＮＲＩＣ１９１７株を２７時間振盪培養した（振盪速度３００回／分）。なお、グルコースは他の培地成分とは別に滅菌し、接種する直前に他の成分と混合した。補充栄養素として使用した胚芽培地は、アスペルギルス・オリゼーおよび乳酸菌を固体培養して得たＡＫあるいはＬＦＫの培地であり、脱脂米胚芽と脱脂小麦胚芽の混合物である。  
液体培地（重量％）：共通成分として５％炭酸カルシウム、１０％Ｇｌｃおよび５％ハイニュートＳを添加する他、補充栄養素を３.２％添加した。なお、補充栄養素も添加し、オートクレーブ滅菌後の培地ｐＨは次の通りである：無添加、７.５３；ＷＴ、７.０９；ＡＫ、７.０６；ＬＦＫ、７.２９；胚芽培地、７.４７；酵母末、７.１２；酵母エキス、６.６４。
【００４４】
【表４】
2004057020.tif 000004
【００４５】
試験例４  「本発明の液体培養の特徴、その４：  増大化は嫌気的培養条件よりも好気的な方が適」
増大化に及ぼす好気的および嫌気的振盪培養による影響に関し、表５に示した結果から、以下の特徴が判明した：  
１）好気的培養条件の方が嫌気的条件に比べて高菌数化した。ただし、嫌気的条件でも２７０ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌもの高い到達菌数になったことから、酸素があると生育し難い偏性嫌気性乳酸菌でもその属や種を問わず本発明の培養条件によって増大化し得ることを示唆する。
【００４６】
２）Ｓｆを液体培養によって増大化させるには、好気的および嫌気的いずれもの培養条件であっても、(1)炭酸マグネシウムおよび炭酸カルシウム混合物、(2)Ｇｌｃ、(3)ハイニュートＳ、および(4)ＷＴより構成された４要素が液体培地組成の必須要件であることが分かった。ちなみに、到達菌数が高いことおよび培地ｐＨがアルカリ性に近いことの両条件を満たす程、培地乳酸濃度も高くなった。
【００４７】
３）高い耐熱性を確保するためには、培地成分としてＧｌｃおよびハイニュートの両者が高濃度添加されていることが必要であり、特にペプトンの添加が重要である事が分った。
【００４８】
培養条件：ＢＬ液体培地１０ｍｌにＳｆを一白金耳量接種し、３０℃で一夜振盪培養した。  この定常期の菌液０.１ｍｌを液体培地１０ｍｌ（綿栓付５０ｍｌ試験管）に接種し（接種菌数、０.３５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ）、綿栓して好気的培養条件とする一方、炭酸ガスを封入しゴム栓して嫌気的培養条件とした。  両者を３０℃で２０時間振盪培養した（振盪速度３００回／分）。  なお、グルコースは他の培地成分と一緒に滅菌した。
【００４９】
【表５】
2004057020.tif 000005
【００５０】
試験例５  「本発明の液体培養の特徴、その５：  増大化にとって培養時の振盪が必須要件。炭酸カルシウム単独添加時の各種培地成分の濃度範囲。」
本発明の培養条件において高菌数化に及ぼす必須因子の解析を行ない、表６−２.に示した試験例の結果から、以下のことが判明した：  
【００５１】
１）本発明の培地組成を用いて静置培養した場合、１００ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌに届かない程の低い菌数であった。ちなみに、本発明の培地組成から逸脱した条件では、培地Ｎｏ.２２や２３の様に、振盪培養よりも静置培養の方が高い到達菌数になった例も見られた。
【００５２】
乳酸菌（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）を振盪することにより好気的に培養した場合、静置培養した場合に比べて、ＮＡＤＨオキシダーゼ活性が顕著に高いことが報告され、この酵素が酸素に対する終末電子受容体として働く為、振盪によって液体培地の酸素濃度を培地へ補給することによって酸素を消費しＡＴＰを生産し易くしてやり、その結果菌体濃度が増加することが報告されている（Ｃｏｎ，Ａ.ら：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３２巻、１７８９−１７９６頁、１９８６年）。  従って、本発明における振盪必須性の要因は、(1)水不溶性の炭酸カルシウムにとって培地を振盪することで培地における均一性を確保し易くなること、そして(2)ＮＡＤＨオキシダーゼ活性の増大化が考えられる。
【００５３】
２）本発明の培地組成では、振盪培養によって高い菌密度に到達した。静置培養によって低い菌密度であったにもかかわらず、振盪培養よりも培地乳酸濃度が高かった場合がＮｏ.１５、１７および２０で見られた。  培地ｐＨは静置培養の方が振盪培養よりも酸性側にシフトしており、菌体当たりの乳酸などの有機酸産生量は静置培養の方が高く、静置培養の方が嫌気的雰囲気の高いおかげて乳酸産生が活発化したと推察された。
【００５４】
３）ＷＴの添加量は３.２％が至適であり、それより高い濃度を添加すると、到達菌数が低下した。
４）炭酸カルシウムの添加濃度を増やすほど、Ｓｆの到達菌数が高くなった。
５）炭酸カルシウムおよびＧｌｃと共に、ペプトンとしてポリペプトンおよび補充栄養素として酵母エキスを用いても増大化した。
６）ガラクトースを炭酸カルシウム添加系においてＧｌｃの代わりに添加した場合、到達菌数は２００ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌとＧｌｃと同様の増大状態に至ったものの、振盪培養後の培地ｐＨが培養前の培地ｐＨよりもアルカリ側に若干ではあるがシフトしていた。培地乳酸濃度から逆算すると、約０.２程度ｐＨが酸性側にシフトすべきであるので、培養中にアルカリ物質が分泌されたと思われた。
【００５５】
培養条件：  ＢＬ液体培地１０ｍｌにＳｆを一白金耳量接種し、３０℃で一夜振盪培養した。この定常期の菌液０.１ｍｌを表６−１.に示した組成の液体培地１０ｍｌ（５０ｍｌ試験管）に接種した（接種菌数０.３５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ）。  試験管に綿栓をして好気的に３０℃・２０時間培養したが、その際、振盪（振盪速度３００回／分）と静置の両条件で行った。  両培養条件とも培養を終了した後、直ちに到達菌数を測定した。  Ｄ−グルコースおよびガラクトース（Ｇａｌ）は他の培地成分と別に滅菌し、接種する前に混合した。更に、公知の液体培地としてブリッグス変法培地を用いた[培地組成：２.０％Ｇｌｃ,１.５％ポリペプトン、０.６％酵母エキス、０.５％塩化ナトリウム、０.１％レオドールＴＷ１２０、０.０５％可溶性澱粉、０.０５％L―システイン塩酸塩、０.２％軽質炭酸カルシウム、２０％トマトジュース、７.５％肝臓エキス]
【００５６】
【表６−１】
2004057020.tif 000006
【００５７】
【表６−２】
2004057020.tif 000007
【００５８】
試験例６  「本発明の液体培養の特徴、その５：  炭酸マグネシウム単独添加系における各種培地成分の有効濃度範囲」
本発明の培養条件において高菌数化に及ぼす必須因子の解析を更に行ない、表６および７に示した試験結果から、増大化に必要な４つの培地成分の濃度範囲を以下の様に設定した：
(1) 炭酸マグネシウムや炭酸カルシウムは、各々２％以上の添加で増大化の効果が見られた。なお、これらの塩類を１３％より高濃度添加すると、培養タンクの底部への沈殿、培地滅菌中あるいは培養中の発泡現象などによって取り扱いが難しかった。  
(2) 単糖類はいずれでも使用する菌株が資化し得るものであればいずれでも良く、Ｇｌｃの場合、４％以上の添加で増大化の効果が見られた。なお、Ｇｌｃを１５％より高濃度添加すると、培地の褐色化が大きくなり、凍結乾燥菌末への処理が難しくなった。
(3) ハイニュートは、３％以上の添加で増大化の効果が見られた。なお、ハイニュートを１３％以上もの高濃度添加すると、培地コストが大きくなり望ましくなかった。
(4) ＷＴは、０.５％以上の添加で増大化の効果が見られ、その至適濃度は３.２％であった。  なお、５％より添加量を増やすと不溶性残渣が多くなり取り扱いが難しくなり、その場合には麹エキスを使用すれば問題なかったものの、麹エキス製造費が増える問題があった。  
【００５９】
培養条件：  ＢＬ液体培地１０ｍｌにＳｆを一白金耳量接種し、３０℃で一夜振盪培養した。  この定常期の菌液０.５ｍｌをを表７.に示した組成の培地５０ｍｌ（綿栓付５００ｍｌ三角フラスコ）に接種し（接種菌数０.３８ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ）、３０℃・１９時間・２００ｒｐｍで振盪培養した。  Ｇｌｃは他の成分と別滅菌した。  
【００６０】
【表７】
2004057020.tif 000008
【００６１】  
試験例７  「本発明の液体培養の特徴、その５：  増大化に及ぼす糖質の特異性」
Ｓｆが資化して乳酸を産生できる糖質を選択し（ＢＥＲＧＥＹ'ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、  Ｖｏｌｕｍｅ  ２，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，１０６４頁、１９８６年）、増大化に及ぼす糖質の範囲を解析した。その結果、炭酸カルシウム添加条件では増大化に有効であったガラクトースが無効となった他、グリセリンおよびマンニトールが無効であったことを除けば、いずれの糖も増大化した。中でも、Ｇｌｃなどの六炭糖が最も高い効果を示し、二糖類ではマルトースが高い効果を示した。
【００６２】
試験方法
ＳｆをＢＬ液体培地５０ｍｌに一白金耳量を接種し、好気的に３０℃・１２０ｒｐｍの振盪条件で８時間培養した。到達菌数は３２ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであり、その時の培地ｐＨは４.６９であった。この定常期初期の菌液０.１ｍｌを１０ｍｌの本培養用培地に接種し、３０℃で１８時間振盪（３００回／分）しながら培養を行なった。本培養用の培地は、下記の糖類を８.０％添加したが、いずれも別滅菌し接種直前に他の成分と混合し、その共通成分（重量％）は次の通り：４.２２％炭酸マグネシウム、６.０％ハイニュートＳＭＰ、および３.２％ＷＴ（綿栓付き５０ｍｌ試験管）  
【００６３】
【表８】
2004057020.tif 000009
【００６４】
試験例８「本発明の液体培養の特徴、その６：  Ｓｆの増大化に及ぼすマルトースの同時滅菌・別滅菌、発育相、および炭酸マグネシウムの添加・無添加の影響」
Ｓｆの増大化に及ぼすマルトースの同時滅菌・別滅菌、発育相、および炭酸マグネシウムの添加・無添加の影響を検討し、その結果を表９に示した。マルトースを別滅菌した培地の方が同時滅菌した培地に比べて滅菌後の培地ｐＨが高くなり、ｐＨがアルカリ変化した分、別滅菌の培地の方が増大化し易いことが分った。更に、褐変物質（メラノイジン）が滅菌中に生成すると、菌が資化し得る糖の絶対量が減少する分、乳酸生成量が減少すると見込まれる。  
炭酸マグネシウムを添加した培養条件における到達菌数は、種菌の発育相に影響せず、マルトースを別滅菌した培地の方が同時滅菌培地に比べて高く、培地の乳酸濃度も別滅菌培地の方が同時滅菌培地よりも著しく高かった。一方、炭酸マグネシウムを添加しない培養条件では、到達菌数は別滅菌培地の方が同時滅菌した培地よりも若干ではあるが高くなったが、逆に培地乳酸濃度は別滅菌培地の方が同時滅菌培地より約５０％前後に減少した。  
【００６５】
試験方法
ＳｆをＢＬ液体培地１０ｍｌに一白金耳量を接種し、好気的に３０℃・６.５時間振盪培養し、対数増殖期の菌体を調製した。その到達菌数は３.６ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであり、その時の培地ｐＨは６.２３であった。この対数増殖期の菌液０.１ｍｌを１０ｍｌの本培養用培地に接種し、３０℃で１８時間振盪培養を行なった。  同様にＳｆをＢＬ液体培地に接種し、好気的に３０℃で２１.５時間振盪培養し、定常期の菌体を調製した。その到達菌数は１４.５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであり、その時の培地ｐＨは４.３２であった。この定常期の菌液０.１ｍｌを１０ｍｌの本培養用培地に接種し、３０℃で２０時間振盪培養を行なった。更に、上記の定常期の菌液をリン酸バッファー（ｐＨ６.８）で１０倍希釈し、室温で３時間放置した後、この菌液０.１ｍｌを１０ｍｌの本培養用培地に接種し、３０℃で１７時間振盪培養を行なった。本培養用の培地は、マルトース一水和物を８.０％（ｗ/ｗ）添加したが、別滅菌の場合には、別滅菌したものを接種直前に他の成分と混合し、同時滅菌の場合には他の成分と一緒に滅菌し、その他の共通成分（重量％）は次の通り：４.２２％炭酸マグネシウム（添加、無添加の別を表９に示した）、６.０％ハイニュートＳＭＰ、および３.２％ＷＴ（綿栓付き５０ｍｌ試験管）。振盪速度、３００回転／分。
【００６６】
【表９】
2004057020.tif 000010
【００６７】
試験例９「本発明の液体培養の特徴、その７：  Ｓｆの増大化に必要なヒドロタルサイト濃度」
本発明の液体培養条件において、合成ヒドロタルサイトの有効濃度下限を検討し、その結果を表１０に示した。合成ヒドロタルサイトは、添加濃度が１.０％以上において増大化に効果を示し、それに付随して培地乳酸濃度も高くなった。
【００６８】
試験方法
ＳｆをＢＬ液体培地１０ｍｌに一白金耳量を接種し、好気的に３０℃・３００回転の振盪条件で２１.５時間培養し、定常期の菌体を調製した。その到達菌数は１４.５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであり、その時の培地ｐＨは４.３２であった。この定常期の菌液０.１ｍｌを１０ｍｌの本培養用液体培地に接種し、３０℃で２０時間振盪（速度、３００回転／分）しながら培養を行なった。本培養用の液体培地の共通成分（重量％）は次の通り：６.０％ハイニュートＳＭＰ、８.０％Ｇｌｃ、３.２％ＷＴおよび合成ヒドロタルサイト（綿栓付き５０ｍｌ試験管）  Ｇｌｃは別滅菌したものを接種直前に他の成分と混合した。
【００６９】
【表１０】
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【００７０】
試験例１０  「麹エキスを用いたＳｆの増大液体培養および凍結乾燥菌末の製造」
１.液体培養
前培養は、１.０％Ｇｌｃ、１.０％ポリペプトンおよび１.０％酵母エキス１％から構成されるＧＰＹ液体培地１０ｍｌ（綿栓付き５０ｍｌ試験管）にＳｆを一白金耳量接種し、３７℃・２４時間静置培養した。ＷＴエキスは、ＷＴを脱イオン水で１０％懸濁し３０分間煮沸処理した後、９０００ｒｐｍ・１０分間遠心分離して上清画分を回収し、これをＷＴエキス（１０％）として用いた。  本発明の培地組成（重量％）は、４.２％軽質炭酸マグネシウム、８.０％Ｇｌｃ、６.０％ハイニュートＳＭＰおよび３.２％ＷＴエキスである。但し、Ｇｌｃは他の成分と別にオートクレーブで滅菌し、接種する前に他の成分と混合した（培地液量、２００ｍｌ及び１００ｍｌ）。  比較例としてＢＬ液体培地を用いた（培地液量、１８６ｍｌ及び９６ｍｌ）。
本培養は、本発明の培地および比較例の培地それぞれ２００ｍｌ（２Ｌ−綿栓付き坂口フラスコ）及び１００ｍｌ（１Ｌ−綿栓付き坂口フラスコ）に前培養したＳｆの菌液を０.３８ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌの菌数になるように接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。振盪速度は毎分１５０往復であった。
【００７１】
その結果、本発明培地の到達菌数は、培地液量２００ｍｌの場合の到達菌数が４０５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ、そして培地液量１００ｍｌの場合の到達菌数が４６５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。本発明の液体培養によって得られた総菌数は１２７，５００ｘ１０８ｃｆｕであり、比較例として用いたＢＬ培地で培養した場合よりも２２.２倍高く得られた。ＢＬ液体培地における到達菌数は、培地液量１８６ｍｌの場合の到達菌数が１７ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ、そして培地液量９６ｍｌの場合の到達菌数が２７ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであり、培養によって得られた総菌数は５，７５４ｘ１０８ｃｆｕであった。
【００７２】
２.凍結乾燥末の製造
凍結乾燥末の調製は以下の通りである：  各培養液のｐＨを１Ｎ塩酸でｐＨ５.０に調整して難溶性の炭酸マグネシウムを溶解した後、９０００ｒｐｍ・５分間遠心分離して菌体沈殿画分を回収した。菌体は、リン酸バッファー（ｐＨ６.８）で懸濁し、遠心分離して回収する操作を２度行い、洗浄した。その後、安定化剤（組成：１０％スクムミルクおよび１％グルタミン酸ソーダ）で菌体を懸濁した。本発明培地の培養物の場合、安定化剤の菌懸濁液５０ｍｌ中、その８ｍｌを安定化剤で更に２倍希釈して凍結乾燥した結果、白色の凍結乾燥粉末が１.９５ｇ得られ、１２，９００ｘ１０８ｃｆｕ／ｇの菌数となり、その耐熱性が２６.０％であった。  更に、残った全量（４２ｍｌ）を凍結乾燥した結果、白色の凍結乾燥粉末が６.４９ｇ得られ、２３，４００ｘ１０８ｃｆｕ／ｇの菌数となり、その耐熱性が１７.２％であった。従って、２００ｍｌと１００ｍｌの培地を用いて遠心洗浄〜凍結乾燥工程を経た菌数歩留は１３８％であった。本発明の液体培養物を凍結乾燥して得られた菌末の総菌数は１７７，０２１ｘ１０８ｃｆｕであり、比較例よりも２６.４倍も高い菌数が得られた。ＢＬ培地の培養物の場合、安定化剤の菌懸濁液９.２ｍｌ中、６.２ｍｌを凍結乾燥した結果、白色の凍結乾燥粉末が０.９６ｇ得られ、５，１８０ｘ１０８ｃｆｕ／ｇの菌数であり、その耐熱性は２３.３％であった。残った３ｍｌを更に安定化剤で約３.３倍希釈して凍結乾燥した結果、白色の凍結乾燥粉末が１.１０ｇ得られ、１，５７０ｘ１０８ｃｆｕ／ｇの菌数となり、その耐熱性が３０.９％であった。従って、２００ｍｌ培地と１００ｍｌ培地をプールし、全工程を経た菌数歩留は１１６％であり、ＢＬ液体培養物を凍結乾燥得られた菌末の総菌数は６，７００ｘ１０８ｃｆｕであった。
【００７３】
試験例１１.  「ジャーファーメンターを用いたＳｆの増大液体培養」
ＢＬ液体培地５０ｍｌにＳｆを一白金耳量接種し、１３０ｒｐｍで３０℃一夜振盪培養した。  
この液種１０ｍｌを本発明の液体培地１０００ｍｌに接種し、所定の培養を行なった。得られた結果を表１１に示した。攪拌しない条件では到達菌数が半分程度となり、ジャーの底に沈殿物が存在する状態で培養する状態となった。到達菌数は、本発明の液体培地組成において攪拌を行なって培養した場合、大気あるいは炭酸ガスの通気いずれにおいても同じとなった。一方、培地の乳酸濃度は、炭酸ガスを通気した嫌気的攪拌培養条件の方が大気を通気した好気的攪拌培養に比べて顕著に高かくなった。  
【００７４】
本発明の液体培地組成（重量％）：４.２２％炭酸マグネシウム、８.０％Ｇｌｃ、６.０％ハイニュートＳＭＰ、３.２％ＷＴ（Ｇｌｃは他の培地成分と一緒に滅菌した。滅菌後の培地ｐＨは８.０７であった。）  
ジャーファーメンター：東京理科器械（株）製  ジャー  ファーメンターＭＢＦ、内容量２.５Ｌ培養条件：３０℃・２４時間培養。攪拌速度、５００ｒｐｍ。通気量、１ｖｖｍ
【００７５】
【表１１】
2004057020.tif 000012
【００７６】
試験例１２  「Ｅ.  ｆａｅｃａｌｉｓＪＣＭ５８０３株の増大液体培養 ＆ 凍結乾燥菌末の製造」
１. 液体培養
ＢＬ液体培地１０ｍｌ（シリコ栓付き試験管）にＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ  ＪＣＭ５８０３株を一白金耳量接種し、３０℃一夜振盪培養した。  到達菌数は３９.５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。その菌液０.５ｍｌを表９に示した２種類の組成の液体培地５０ｍｌ（綿栓付き５００ｍｌ三角フラスコ）へ接種し、３０℃・振盪速度１３０ｒｐｍで２４時間培養した。  なお、Ｇｌｃは他の成分と一緒にオートクレーブ滅菌した。培養後の分析結果を表１２に示した。本発明の培地２種類ではいずれも到達菌数が４００ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌおよび３２５ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌとなり高菌数化した。ちなみに、ＢＬ液体培地では液種の調製に用いた１０ｍｌ液体培地における到達菌数に比べて５０ｍｌの培地を用いた本培養では約３０％と減少した。本菌株は、ＢＬ液体培地で好気的振盪培養を行なうと、試験例で用いたＳｆに比べ酸素供給量が多いと増殖が阻害され易い傾向があると推察された。
【００７７】
【表１２】
2004057020.tif 000013
【００７８】
２. 凍結乾燥
上記２種類の培養液４０.０ｍｌを１Ｎ塩酸で各々ｐＨ５.０に調整して不溶性炭酸塩を可溶化した後、９０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して菌体を回収し、リン酸バッファー（ｐＨ６.８）３０ｍｌで懸濁した。  再び、９０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して菌体を回収して洗浄菌体とした。安定化剤（組成：１０％スキムミルク  ＆  １％グルタミン酸ソーダ；コッホ滅菌３０分処理済み）１５ｍｌで菌体を懸濁し、１００ｍｌ−ナスフラスコに全量を移し、凍結真空乾燥を一夜行なった。得られた凍結乾燥末を評価し、その結果を表１３に示した。  ２種類の本発明の培地はＢＬ液体培地に比べて、凍結乾燥して得られたＳｆの総菌数が炭酸マグネシウム含有培地で５.４８倍及び炭酸カルシウム含有培地で２.００倍も高かった。
【００７９】
【表１３】
2004057020.tif 000014
【００８０】
試験例１３.  「Enterococcus faecium IFO3128の液体培養、及び凍結乾燥菌末の製造」
１.液体培養
種菌は、シリコ栓付き試験管にＢＬ液体培地１０ｍｌを入れ、２０分間オートクレーブ滅菌した後、表１４に記した菌株を一白金耳量接種し、３００回転／分の振盪条件で３０℃・２０時間培養して調製した。各培養液の菌数測定は、菌液をリン酸バッファー（ｐＨ６.８）で１０倍ずつ希釈した後、その０.１ｍｌをＢＬ寒天培地に２枚ずつ塗沫し、３７℃で好気培養してコロニーを形成させて行なった。得られた結果を表１４に示した。  
【００８１】
【表１４】
2004057020.tif 000015
【００８２】
上記の種菌０.５ｍｌをシリコ栓付き５００ｍｌ−三角フラスコに入れた液体培地５０ｍｌに接種し、３０℃で１２０ｒｐｍの振盪条件で２０時間培養した。得られた培養液は、種菌と同様の条件で菌数測定を行い、結果を表１５に示したが、比較例に比べて本発明の液体培地では菌数が増大となり、特に炭酸マグネシウムを添加した培地の方が炭酸カルシウムを添加培地よりも増大化した。
【００８３】
組成Ａ.  ＢＬ液体培地（比較例）
組成Ｂ.  ３.２％ＷＴエキス、６.０％ハイニュートＳＭＰ、８％Ｇｌｃ、４.２２％炭酸マグネシウム
組成Ｃ.  ３.２％ＷＴエキス、５.０％ハイニュートＳＭＰ、１０％Ｇｌｃ、５.０％炭酸カルシウム
※ ＷＴエキスの調製：ＷＴを脱イオン水で１０重量％になるように懸濁し３０分間煮沸処理した後、９０００ｒｐｍ・１０分間遠心分離して上清画分を回収し、１０％ＷＴエキスとした。
【００８４】
【表１５】
2004057020.tif 000016
【００８５】
２.凍結乾燥
培地組成がＢとＣの培養液４０.０ｍｌを１Ｎ塩酸で各々ｐＨ５.０に調整して難溶性炭酸塩を可溶化した後、９０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して菌体を回収し、リン酸バッファー（ｐＨ６.８）３０ｍｌで懸濁した。  再び、９０００ｒｐｍ、５分間遠心分離して菌体を回収して洗浄菌体とした。  安定化剤（組成：１０％スキムミルク  ＆  １％グルタミン酸ソーダ；コッホ滅菌３０分処理済み）１０ｍｌで洗浄菌体を懸濁し、その全量を１００ｍｌ−ナスフラスコに入れ、凍結真空乾燥を一夜行なった。得られた凍結乾燥末の重量及び菌数を表１６に示した。いずれの菌株においても、本発明の液体培養条件で得られた菌液を凍結乾燥すると、顕著に高い菌数の凍結乾燥菌末が得られた。
【００８６】
【表１６】
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【００８７】
試験例１４.  「乳酸桿菌の増大化液体培養および凍結乾燥菌末の製造」
１. 液体培養
ＢＬ液体培地１０ｍｌ（シリコ栓付き５０ｍｌ試験管）にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｃａｓｅｉ  ＮＲＩＣ１９１７株を一白金耳量接種し、３０℃で一夜振盪培養した（振盪速度、３００回転／分）。  到達菌数は３１ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。その定常期の菌液０.５ｍｌを本発明の液体培地５０ｍｌ（培地組成（重量％）：５.０％炭酸カルシウム、１０.０％Ｇｌｃ、５.０％ハイニュートＳＭＰ、および３.２％ＷＴ；綿栓付き５００ｍｌ三角フラスコ）へ接種し、３０℃・振盪速度１３０ｒｐｍで３０時間培養した。なお、Ｇｌｃは他の成分と一緒にオートクレーブ滅菌した。培養後の到達菌数は１５２ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌであり、培地乳酸濃度は３８.９ｍｇ／ｍｌであった。  
【００８８】
２. 凍結乾燥
上記の培養液４０.０ｍｌを１Ｎ塩酸でｐＨ５.０に調製して難溶性の炭酸カルシウムを溶解した後、９０００ｒｐｍ・５分間遠心分離して菌体を回収した。菌体は、リン酸バッファー（ｐＨ６.８）３０.０ｍｌで懸濁し、９０００ｒｐｍ・５分間遠心分離して菌体を回収して洗浄した。この洗浄菌体を安定化剤（組成；１０％スキムミルクおよび１％グルタミン酸ソーダ；コッホ滅菌３０分処理済み）１５.０ｍｌで懸濁し、全量を１００ｍｌ―ナスフラスコに移し、凍結真空乾燥を一夜行った。得られた凍結乾燥菌末は、重量が３.１５ｇ、菌数が６７５ｘ１０８ｃｆｕ／ｇであった。
【００８９】
【発明の効果】
、(1)炭酸マグネシウム、炭酸カルシウムまたはヒドロタルサイトの単独またはこれらを含む無機塩混合物(2)単糖類または二糖類、(3)ペプトン、(4)麹、麹エキス、胚芽培地、酵母、または酵母エキスの単独またはこれらを含む混合物を液体培地に用い、乳酸菌を攪拌培養すると菌数の増大した乳酸菌培養物がえられることが判明した。