(57)【要約】      （修正有）【課題】麹菌を用いてアクリルアミドを分解する方法およびアクリルアミド分解システムを提供する。【解決手段】麹菌がＡ．ｏｒｙｚａｅ  ＫＢＮ１０１０株またはＡ．ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．１００株である。前記麹菌を固定化する。食品中のアクリルアミドを分解する。これらの菌株を利用してアクリルアミドを分解するアクリルアミド分解システム。菌に栄養や酸素を供給することにより活性の低下を抑えつつアクリルアミドの分解を行う。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリルアミド分解能を有する麹菌を用いてアクリルアミドを分解する方法。
【請求項２】
前記麹菌がＡ．ｏｒｙｚａｅ  ＫＢＮ１０１０株またはＡ．ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．１００株である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記麹菌が固定化されている、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
食品中のアクリルアミドを分解するものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法を用いる、アクリルアミド分解システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いてアクリルアミドを分解する方法およびこの方法を用いるアクリルアミド分解システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
アクリルアミドは、アクリル基（ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−）とアミド基（−ＣＯ−ＮＨ−）をもつ有機化合物で、常温では無臭白色の結晶で、水やアルコールに溶けやすい性質である。室温や暗所では安定であるが、加熱や紫外線によって重合し、ポリアクリルアミドになる。工業的にはアクリルニトリルから加水分解により合成され、化学架橋剤や漆くいに使用され、ポリアクリルアミドは水処理剤、土壌凝固剤、漏水防止剤、紙力増強剤、アクリル系熱硬化性塗料原料、化粧品原料、バイオテクノロジー関係の研究室等などの多くの分野で使用されている。
【０００３】
しかし、アクリルアミドの摂取は健康への悪影響が懸念され、多くの人々が不安を持っている。アクリルアミドは人への皮膚障害、言語障害、末梢神経炎、小脳性失調等を起こし、中毒症状は主に神経症状と肝障害である。国際がん研究機関は、アクリルアミドを「ヒトに対しておそらく発がん性がある物質（２Ａ）」に分類している。その理由には、アクリルアミドが細胞の中のＤＮＡを傷付ける作用を持っていることが複数の試験から確認され、ヒトが食品から極微量にアクリルアミドを摂取し続けた場合にも、この作用が原因となってがんを引き起こす可能性があると考えられている。動物試験では、アクリルアミドの摂取量が増えると発がん率も増えることが報告され、ヒトでの研究では、食品からアクリルアミド摂取量が増えると子宮内膜がんと卵巣がんの発がんリスクを高くなることが報告されている。
【０００４】
工業原料であるアクリルアミドが、２００２年、日常的に摂取する食品や加熱加工食品に含まれることが報告された。各種食品を対象に分析が行われ、ポテトチップス、フライドポテト等のスナック、小麦を原料とするビスケット・焼き菓子、コーヒーやほうじ茶等や、家庭やレストラン等で調理された食品からもアクリルアミドが検出されたことが報告された。ノルウェーでの調査ではアクリルアミド食品別の摂取率は、コーヒーが最も多く約３割であり、次いで、ポテトチップス、パンの順であり、これらの合計で約６〜７割であることが示されている。日本では現在調査が進められている。
【０００５】
食品中でアクリルアミドが生成するメカニズムについても研究が進められている。食品原材料に含まれているアミノ酸の一種であるアスパラギンと果糖やブドウ糖等の還元糖とが、調理中の加熱よりアミノカルボニル反応を起こし、その過程でアクリルアミドが生成すると考えられている。しかし、アスパラギンや還元糖以外の食品成分が原因物質となっている可能性や、アミノカルボニル反応以外の反応経路からもアクリルアミドが生成することが報告されている。また、脂質が分解して生成するアクロレインの酸化による経路や、アスパラギン酸から生成したアクリル酸がアンモニアと反応して生成する経路、セリンやシステインといったアミノ酸から生成した乳酸がアンモニアと反応して生成する経路、アスパラギンの酵素的脱炭酸反応により生成した３−アミノプロパンアミドが脱アミノ反応する経路等も報告されている。
【０００６】
現在までに食品中のアクリルアミドの低減方法も研究され、食品原材料に含まれているアスパラギンの低減（例えば特許文献１、２参照）、加熱加工方法の工夫、（例えば特許文献３、４参照）、反応性の低いアミノ酸や糖質を使用した方法、原料の保存方法が報告されている。しかし、生成原因や経路が複雑であるために、アクリルアミド濃度を低減できない食品もあり、製造業者にとっては大きな課題である。
【０００７】
一方、加熱加工中の生成制御による低減方法以外には、加熱加工後に、生成したアクリルアミドを分解する方法が考えらえる。対象は食品ではない場合、アクリルアミドの分解に微生物を用いる方法が公知であり、例えば、ブレビバクテリウム・アンモニジェニスＡＴＣＣ１６４１（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ１６４１）、メチロフィラス・メチロトロファスＡＳ−１  （Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＳ−１  ＮＣＩＢ１０５１５）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ）がある（特許文献５〜７参照）。また、アミダーゼ遺伝子のクローニングも報告されている。例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ロドコッカス・ロドクラウスＩＦＯ  １５５６４（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ  ＩＦＯ  １５５６４）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１）、ブレビバクテリウムＲ３１２（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｒ３１２）、コマモナス・テストステロリ  ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ    ５−ＭＧＡＭ−４Ｄ）、シュードノカルディア・サーモフィラＪＣＭ３０９５（Ｐｓｅｄｏｎｏｃａｒｄｉａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  ＪＣＭ３０９５）がある（特許文献８〜１３参照）。さらに、アミダーゼの製造についても報告がある。例えば、ロドコッカス  ＮＣＩＭＢ４０８８９  やＮＣＩＭＢ４０７５５（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ＮＣＩＭＢ４０８８９、ＮＣＩＭＢ４０７５５）（特許文献１４参照）である。
【０００８】
このように種々の微生物において、アミダーゼ及びアミダーゼ遺伝子が知られていることから、これらの微生物酵素を用いて加工食品、とりわけ加熱食品中のアクリルアミドを分解低減することは可能であろう。しかし、上記微生物や他の遺伝子組み換え微生物は安全性という観点からは問題があり、食品への応用は困難である。食品工業に利用可能な安全性の高い微生物からアクリルアミドを高分解する菌を見つけ出すことができれば、食品、とりわけ加熱加工食品中のアクリルアミド分解に利用し得る可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２００５−１９２４３６号公報
【特許文献２】特表２００６−５０００７１号公報
【特許文献３】特開２００７−２３６２７３号公報
【特許文献４】特表２００８−５１１３２４号公報
【特許文献５】特許７９０１１３８９号
【特許文献６】米国特許第５１８８９５２号／ＥＵ特許０２７２０２６号
【特許文献７】国際公開第９９／００７７４８号
【特許文献８】国際公開第０６／４０３４５号
【特許文献９】特開平９−９９７３号公報
【特許文献１０】特開２００４−１０５１５２号公報
【特許文献１１】米国特許第５２６０２０８号
【特許文献１２】米国特許出願公開２００４／０２２５１１６号
【特許文献１３】特開２００６−３４０６３０号公報
【特許文献１４】米国特許第５９６２２８４号／  ＥＵ特許０９８８３７５号／国際公開第９９／００７８３８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の解決課題は、安全性が高く、食品に使用しても問題のない微生物を用いてアクリルアミドを分解する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、驚くべきことに、伝統的に様々な食品の製造に用いられている麹菌のなかにアクリルアミド分解能の高い菌株を見出し、これらの菌株を利用してアクリルアミドを分解する方法およびアクリルアミド分解システムを完成させた。
【００１２】
すなわち、本発明は：
（１）アクリルアミド分解能を有する麹菌を用いてアクリルアミドを分解する方法、
（２）前記麹菌がＡ．ｏｒｙｚａｅ  ＫＢＮ１０１０株またはＡ．ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．１００株である、（１）記載の方法、
（３）前記麹菌が固定化されている、（１）または（２）記載の方法、
（４）食品中のアクリルアミドを分解するものである、（１）〜（３）のいずれか１つに記載の方法、
（５）（１）〜（４）のいずれか１つに記載の方法を用いる、アクリルアミド分解システム、
を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、アクリルアミド高含有物、例えば食品、とりわけコーヒー、ほうじ茶などの液状食品に含まれるアクリルアミドを、安全かつ効率的に分解することができる。また、本発明は、麹菌の生菌体を用いるので、アクリルアミド分解酵素を用いる場合と異なり、菌に栄養や酸素を供給することにより活性の低下を抑えつつアクリルアミドの分解を行うことができるという利点を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、流動床バイオリアクターの概略図である。
【図２】図２は、３種の麹菌の胞子懸濁液を用いた流動床バイオリアクターにおけるアクリルアミド分解能を示す。縦軸は測定されたアクリルアミド量、横軸は実験開始後の経過日数を示す。
【図３】図３は、３種の麹菌の胞子懸濁液を用いたバッチ式反応器におけるアクリルアミド分解能を示す。縦軸は測定されたアクリルアミド量、横軸は実験開始後の経過日数を示す。
【図４】図４は、包括固定化された３種の麹菌を用いたバッチ式反応器におけるアクリルアミド分解能を示す。縦軸は測定されたアクリルアミド量、横軸は実験開始後の経過日数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、１の態様において、アクリルアミド分解能を有する麹菌を用いてアクリルアミドを分解する方法を提供する。本発明において、アクリルアミド分解能を有する麹菌であれば、いずれの種類の麹菌でも使用することができる。麹菌は、伝統的に酒類、味噌、醤油などの食品の製造に利用されており、安全性の点で問題がない。また、麹菌によりアクリルアミドを分解する際の生成物にも有害なものは認められない。
【００１６】
麹菌の種類としてはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｓａｍｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔａｍａｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  Ｇｌａｕｃｕｓなどが例示される。以下において、「Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ」を「Ａ．」と略記することがある。
【００１７】
本発明の方法に用いる麹菌は、アクリルアミド分解能を有するものであればよいが、アクリルアミド分解能が高いものが好ましいことはいうまでもない。アクリルアミド分解能の高い菌株は、公知の方法を用いてスクリーニングすることができるが、例えば、特願２００８−１９９６４６に記載されたスクリーニング方法を用いてもよい。あるいは、本発明の方法に使用する前に、適当濃度（例えばｐｐｍオーダー）のアクリルアミドを含有する培地にて麹菌を培養することにより、アクリルアミド分解能を誘導してもよい。本発明の方法に用いるアクリルアミド分解能の高い麹菌株としては、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  ＫＢＮ１０１０株（株式会社ビオック）またはＡ．ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．１００株（株式会社樋口松之助商店）などが挙げられる。
【００１８】
本発明の方法に使用するアクリルアミド分解能を有する麹菌は１種類であってもよく、あるいは２種類以上であってもよい。
【００１９】
本発明の方法は、試料（例えば、コーヒー、ほうじ茶などの液状食品など）を麹菌と接触させることにより実施することができる。麹菌は、十分な菌体量になるまで予め培養してから試料と接触させてもよく、胞子の状態で試料と接触させてもよい。麹菌の培養は、例えばＹＰＤ、ＰＤＡなどの公知の培地にて、公知の好気的培養条件下にて行うことができる。好気的培養には、通気、撹拌または振盪を行うことが好ましく、これらの手段・方法も公知である。
【００２０】
本発明によりアクリルアミドを分解する場合の反応条件は、麹菌のアクリルアミド分解が適切に行われる条件であればよく、当業者が適宜選択することができる。例えば、約１５〜約３７℃、例えば室温において、ｐＨ無調整、あるいはｐＨ約５〜約７において、バブリング、撹拌、振盪などにより好気的条件に保ちながら、アクリルアミドの分解を行うことができる。本発明の方法は、バッチ式、連続フロー式いずれの形態でも行うことができる。上述のごとく、麹菌の菌体あるいは胞子をそのまま使用してもよいが、食品との分離の容易さ、あるいは連続的または繰り返しプロセスの使用を考慮すると、麹菌を固定化して本発明に使用することが好ましい。
【００２１】
麹菌の固定化は公知の方法にて行うことができる。麹菌の固定化法に適した方法として、包括法および結合法が例示される。包括法は、アルギン酸カルシウム、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、カッパ−カラギーナン、ゲランガム、アガロース、セルロース、デキストランのごとき合成および天然ポリマー、光架橋性樹脂プレポリマー、ウレタンプレポリマーのごときプレポリマー等のマトリクス中に菌体を取り込ませる方法である。結合法は、焼結ガラス、多孔質セラミックス、キトサン、セライト、シリカゲル、ゼオライト、活性炭、各種スポンジ等の水不溶性担体に菌体を固着させる方法である。麹菌を膜状担体に固定化してもよい。膜の材料としてはセルロース膜、ナイロンネット、ポリウレタンフォーム膜、不織布、天然繊維を用いた布などが例示される。これらの固定化麹菌を１種類、あるいは２種類以上用いることができる。
【００２２】
本発明の１実施態様として、例えば、アルギン酸ナトリウムに包括固定化した麹菌のビーズをカラムに充填し、公知のバイオリアクターにて使用してもよい。バイオリアクターとしては、流動床リアクター、固定膜型リアクター、浮遊式増殖リアクター、中空糸型リアクターなどが例示されるがこれらに限定されない。反応は試料を適当な流速にて連続的にリアクターに供給して行うこともできる。麹菌が好気性であるので、適宜バブリングを行うことが好ましい。試料によって、あるいはプロセスによって、２つ以上のリアクターを組み合わせて使用することが好ましい場合もある。
【００２３】
使用に伴って麹菌のアクリルアミド分解能が低下あるいは生菌数が減少してきた場合、麹菌（固定化されていれば担体とともに）を栄養培地に移して好気的に培養することにより菌体の活性および生菌体量を確保あるいは復活させることができる。かかる培養の際にアクリルアミドを適量（例えばｐｐｍオーダー）添加して培養してアクリルアミド分解能を誘導してもよい。かくして得られた麹菌あるいは固定化麹菌を再度本発明の方法に使用することができる。
【００２４】
本発明の方法を用いてアクリルアミドが分解されたことを調べるために、当業者間で一般的なアクリルアミドの質量分析方法を用いることができる。質量分析方法は、本発明の実施前後におけるアクリルアミドの質量を測定することができればいずれの方法であってもよい。例えば、ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ、ＧＣ−ＭＳで測定する方法や誘導体化ＧＣ−ＭＳで分析する方法などを用いてもよい。
【００２５】
本発明は、さらなる態様において、麹菌を用いてアクリルアミドを分解するためのシステムを提供する。該システムは、必須構成要素として、好ましくは、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  ＫＢＮ１０１０株やＡ．ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．１００株などの麹菌、好ましくは固定化麹菌を含む。その他の構成要素は、必要に応じて、例えば、反応容器、試料を微生物と接触させるためのバイオリアクター装置などを含んでもよい。
【００２６】
以下に実施例を示して本発明を具体的かつ詳細に説明するが、実施例は本発明を限定するものと解してはならない。
【実施例１】
【００２７】
（麹菌によるアクリルアミド分解能の解析）
本発明者らは、特願２００８−１９９６４６に記載されるごときスクリーニング方法により、アクリルアミド高分解能を有するとされる候補の株を選別した。該候補株として、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．１００株、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  ＫＢＮ１０１０株およびＡ．ｏｒｙｚａｅ  Ｍ−０１株（以下において、各々、Ｎｏ．１００、ＫＢＮ１０１０およびＭ−０１ということがある）を実験に用いた。実験に使用したＡ．ｏｒｙｚａｅ  Ｍ−０１株はアクリルアミド分解能が認められない株として選定されたものである。また、Ａ．ｏｒｙｚａｅ  Ｎｏ．１００株およびＡ．ｏｒｙｚａｅ  Ｍ−０１株は、株式会社樋口松之助商店より分譲された。Ａ．ｏｒｙｚａｅ  ＫＢＮ１０１０株は、株式会社ビオックより分譲された。これらの菌株を用いてアクリルアミド分解を調べた。
【００２８】
Ａ．胞子懸濁液の調製
３種の菌を各々、ＰＤＡ培地に植菌し、３０℃のインキュベーターで培養を行った。次いで、滅菌された０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００を５ｍｌ添加し、胞子懸濁液を調製した。この胞子懸濁液を１×１０７細胞／ｍｌの菌数になるように滅菌水で希釈した。
【００２９】
Ｂ．包括固定化麹菌の作製
次に、菌を包括固定するために、２％アルギン酸ナトリウム水溶液を調製した。アルギン酸ナトリウム２ｇを、７０〜８０ｍｌの熱湯に溶解し（溶けにくい場合は、オートクレーブ処理（１ｋｇ／ｃｍ２、１分間）するとよい。ただし処理時間が長いと高分子が分解し、ゲル化したとき、ゲルが弱く球状に形成しにくくなる。）、アルギン酸ナトリウム溶液を室温に冷却し、水を加え、１００ｍｌとした。前記胞子懸濁液１ｍｌと２％アルギン酸ナトリウム水溶液９ｍｌを１５ｍｌファルコンチューブに入れ、気泡が出来ないように混合した。この混合液を５ｍｌピペットで吸い取り、０．５％塩化カルシウム水溶液を２０ｍｌ入れた４５ｍｌファルコンチューブに滴下させて３０分間放置し、塩化カルシウムを除き、３種の固定化麹菌を作製した。
【００３０】
流動床バイオリアクターを用いたアクリルアミド分解能の解析
上記Ａのごとく調製した３種の麹菌の胞子懸濁液を、リアクターに詰め、濃度が１０ｐｐｍになるようにアクリルアミドを添加したほうじ茶を流した。ほうじ茶（日本茶販売株式会社ＩＮの「ファミリーサイズほうじ茶ティーバッグ」を使用）は、沸騰した湯にほうじ茶パックを１Ｌに対して２つ加え、手で触れるくらい冷めるまで放置し、ＨＣｌおよびＮａＯＨを用いてｐＨ５．５に調節したものを使用した。リアクターには、ＥＹＥＬＡ東京理科機械株式会社製の定量送液ポンプ（マイクロチューブポンプ）を使用し、以下の条件で実験を行った。また、図１において、５から６に向けて出入口の各々に０．２μｍフィルターを取り付け、滅菌エアレーションを行うとともに胞子または菌体の流出を防止した。
・リアクター流量                    ：約１５０ｍｌ/ｈ
・温度                              ：室温（２２〜２３℃）
・リアクター１つに対するほうじ茶の量：８０ｍｌ
【００３１】
初日、１日後、２日後、３日後のほうじ茶をサンプリングし、０．４５μｍフィルターでろ過を行い、ＨＰＬＣで測定した。なお、初日のサンプリングはほうじ茶をリアクターに充填後、３０分経過してから行われた。その結果、３日後に、Ｍ−０１では、アクリルアミド量がほとんど変化していないのに対して、Ｎｏ．１００およびＫＢＮ１０１０では、アクリルアミド量が初日と比較して４倍近く減少した（図２）。このことは、Ｎｏ．１００およびＫＢＮ１０１０が高いアクリルアミド分解能を有し、本発明での使用に適することを示す。
【００３２】
バッチ式反応器を用いたアクリルアミド分解能の解析
上記のごとく調製した３種の麹菌の胞子懸濁液（上記Ａ）または固定化麹菌（上記Ｂ）を、アクリルアミド含量が１０ｐｐｍになるように調製したほうじ茶とともに１００ｍｌ容器（以下、バッチ式反応器という）に入れた。反応の条件は以下のとおりである。
・容器                              ：１００ｍｌ容器
・温度                              ：３０℃
・ほうじ茶の量                      ：８０ｍｌ
・バッチ式                          ：１００ｒｐｍロータリー振とう培養
【００３３】
初日、１日後、２日後、３日後のほうじ茶をサンプリングし、０．４５μｍフィルターでろ過を行い、ＨＰＬＣで測定した。その結果、Ｎｏ．１００およびＫＢＮ１０１０は、バッチ式反応器を用いた場合にも流動床リアクターを用いた場合と同様にアクリルアミド分解能が高いことがわかった（図３）。さらに、Ｎｏ．１００およびＫＢＮ１０１０に包括固定化を施すと、測定１日目から著しくアクリルアミド量が減少した（図４）。このことから、Ｎｏ．１００およびＫＢＮ１０１０は、包括固定化されると、アクリルアミド分解速度が上昇し、分解能も向上することがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
本発明により、食品の醸造などに使用されている微生物を用いてアクリルアミドを分解する方法が提供されるので、食品などの分野、例えば、アクリルアミドを多く含有するといわれるポテトチップ、コーヒー、タバコなどの製造分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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