【手続補正書】
【提出日】令和3年4月23日(2021.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繋留バイオ分子に付着した２光子蛍光標識の角度パラメータを決定するための方法であって、前記方法は、
（ａ）配向された様式でバイオ分子を平面に付着させることであって、前記バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて既知の部位において標識される、ことと、
（ｂ）第１の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出することと、
（ｄ）第２の偏光を使用する前記第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明することと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出することと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において検出される前記光の第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１の物理的性質と比較し、前記平面に対する前記２光子蛍光標識の角度パラメータを決定することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の物理的性質は、ｐ偏光された光強度Ｉｐであり、前記第２の物理的性質は、ｓ偏光された強度Ｉｓであり、ステップ（ｆ）における比較は、角度パラメータを決定するための方程式
【数１】
2020519866.tif 000001
を解くことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一連の２つ以上の異なるバイオ分子複合体毎にステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すことであって、前記一連の中の前記バイオ分子複合体はそれぞれ、同一の２光子蛍光標識を用いて異なる部位において標識される前記バイオ分子を含む、ことと、前記２つ以上の異なるバイオ分子複合体毎に決定される前記角度パラメータを使用して、前記バイオ分子の構造を決定することとをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオ分子は、タンパク質であり、前記一連の２つ以上の異なるバイオ分子複合体はそれぞれ、単一部位システインまたはメチオニン置換を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記２光子蛍光標識はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
同時に、または続いて、第２の基本周波数の励起光による照明に応じて、ステップ（ｃ）において前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第１の物理的性質、およびステップ（ｅ）において前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出することをさらに含み、前記第２の基本周波数は、前記第１の基本周波数と同一であり得るまたは異なり得る、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｅ）において検出される前記光の第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１の物理的性質と比較し、前記平面に対する前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータを決定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１つ以上の２光子蛍光標識、第２高調波（ＳＨ）活性標識、和周波数（ＳＦ）活性標識、または差周波数（ＤＦ）活性標識、またはそれらの任意の組み合わせの前記角度パラメータのデータを、前記バイオ分子の構造モデルに大域的に適合させることをさらに含み、前記構造モデルは、前記バイオ分子内の前記１つ以上の標識の既知の部位についての情報を備える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオ分子は、タンパク質であり、前記２光子蛍光標識は、非線形活性非天然アミノ酸である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記非線形活性非天然アミノ酸は、明らかに非線形活性ではない非天然アミノ酸に付着される非線形活性部分を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記光の第１および第２の物理的性質は、強度または偏光である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記２光子蛍光標識によって生成される前記光は、集光レンズを使用することなく、低開口数ピンホール構成を使用して検出される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記平面は、支持脂質二重層を備え、前記バイオ分子は、前記支持脂質二重層に付着される、または前記支持脂質二重層の中に挿入される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記励起光は、全内部反射を使用して前記平面に指向される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記２光子蛍光標識はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性であり、
（ｇ）前記第１の基本周波数の励起光と同一であり得るまたは異なり得る第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、前記付着したバイオ分子に付着した前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の強度を同時または連続的に検出することであって、検出は、
（ｉ）前記励起光の第１の偏光状態と、
（ｉｉ）前記励起光の第２の偏光状態と
を使用して実施される、ことと、
（ｈ）ステップ（ｃ）（ｉ）および（ｃ）（ｉｉ）において検出される光強度の比を計算することによって、基板表面への法線に対して第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータを決定することと、
（ｉ）前記２光子蛍光標識の角度パラメータに関する方程式および２光子蛍光に関して計算される光強度比を積分し、前記２光子蛍光方程式を満たす角度パラメータ値対を決定することと、
（ｊ）前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータに関する方程式、および前記第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数（ＤＦ）光に関して計算される前記光強度比を積分し、前記第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数方程式を満たす角度パラメータ値対を決定することと、
（ｋ）ステップ（ｉ）および（ｊ）において識別される前記角度パラメータ値対の交差を決定し、前記２光子蛍光および前記第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数方程式の両方を満たす一意の一対の角度パラメータ値を決定することと
によって、前記標識の角度パラメータを決定することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記角度パラメータは、平均傾転角、配向分布幅、またはそれらの一対の組み合わせを備える、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
バイオ分子の配座変化を検出するための方法であって、前記方法は、
ａ）配向された様式で前記バイオ分子を平面に付着させることであって、前記バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて標識される、ことと、
ｂ）第１の偏光および第２の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明することと、
ｃ）ステップ（ｂ）における前記第１および第２の偏光を伴う照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質および光の第２の物理的性質を検出することと、
ｄ）前記付着したバイオ分子に、（ｉ）既知のリガンドとの接触、（ｉｉ）候補結合パートナとの接触、または（ｉｉｉ）実験条件の変化を受けさせることと、
ｅ）前記第１の偏光および前記第２の偏光を使用する前記第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明することと、
ｆ）ステップ（ｅ）における前記第１および第２の偏光を伴う照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第３の物理的性質および光の第４の物理的性質を検出することと、
ｇ）ステップ（ｆ）において検出される前記光の第３および第４の物理的性質の比を、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１および第２の物理的性質の比と比較することであって、前記光の物理的性質の比の変化は、前記バイオ分子が配座変化を受けたことを示す、ことと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記２光子蛍光の物理的性質は、約０．０１〜約０．２の開口数を有するピンホール検出装置を使用して、レンズを使用することなく検出される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記２光子蛍光標識はまた、第２高調波、和周波数、または差周波数活性であり、第２高調波、和周波数、または差周波数光の物理的性質は、前記２光子蛍光の物理的性質の検出と連続的または同時に検出される、請求項１７〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｆ）において比較される比は、前記第２高調波、和周波数、または差周波数光の物理的性質に対する前記２光子蛍光の物理的性質の比を備える、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオ分子は、タンパク質分子である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記タンパク質分子は、薬剤標的であり、前記既知のリガンドは、既知の薬剤である、または前記候補結合パートナは、薬剤候補である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記２光子蛍光標識は、１つ以上の工学的システイン残基において前記タンパク質分子に付着される、請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記２光子蛍光標識は、前記タンパク質分子に組み込まれた非線形活性非天然アミノ酸である、請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記励起光は、全内部反射を使用して前記平面に送達される、請求項１７〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記バイオ分子は、支持脂質二重層の中への挿入または前記支持脂質二重層への繋留によって前記平面に付着される、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
候補結合パートナを選別し、標的分子の配座を変調させる結合パートナを識別するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記標的分子を基板表面に繋留することであって、前記標的分子は、結合パートナとの接触に応じて配座変化を受ける、前記標的分子の一部に付着される２光子蛍光標識を用いて標識され、前記繋留標的分子は、前記基板表面上に正味の配向を有する、ことと、
（ｂ）第１の基本周波数の励起光を用いて前記繋留標的分子を照明することと、
（ｃ）前記２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出し、基準信号を生成することと、
（ｄ）連続的かつ個別に、前記繋留標的分子を前記１つ以上の候補結合パートナと接触させることと、
（ｅ）前記１つ以上の候補結合パートナ毎に前記第１の基本周波数の励起光による照明に応答して、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出することと、
（ｆ）前記１つ以上の候補結合パートナ毎に前記第２の物理的性質を前記第１の物理的性質と比較することであって、前記第１の物理的性質の値に対する所与の候補結合パートナに関する前記第２の物理的性質の値の変化は、前記候補結合パートナが前記標的分子の配座を変調させることを示す、ことと
を含む、方法。
【請求項２８】
前記光の第１および第２の物理的性質は、前記励起光の２つの異なる偏光の下の前記２光子蛍光標識によって生成される光の強度を備える、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
２光子蛍光は、集光レンズを使用することなく、約０．０１〜約０．２である開口数を有するピンホール開口であって、前記ピンホール開口は、前記第１の基本周波数の励起光が前記基板表面上に入射する点において前記基板表面の直接上方または下方に位置付けられる、ピンホール開口を使用して、収集される、請求項２７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
いくつかの実施形態では、第１の基本周波数および第２の基本周波数は、同一である。いくつかの実施形態では、標識反応は、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤上の天然官能基への非線形活性標識の共有共役を備える。いくつかの実施形態では、天然官能基は、天然アミン基、天然カルボキシル基、または天然スルフヒドリル基から成る。いくつかの実施形態では、標識反応は、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤上の遺伝子操作された官能基への非線形活性標識の共有共役を備える。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された官能基は、遺伝子操作されたアミン基、遺伝子操作されたカルボキシル基、または遺伝子操作されたスルフヒドリル基から成る。いくつかの実施形態では、標識反応は、参照薬剤の特異的領域に結合することが公知である非線形活性標識ペプチドの間の非共有相互作用を備える。いくつかの実施形態では、非線形活性標識ペプチドは、モノクローナル抗体のＦＣ領域に結合することが公知であるペプチドから成る。いくつかの実施形態では、非線形活性標識は、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）部分、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（バダン）部分、または６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）部分から成る。いくつかの実施形態では、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、同一の界面に繋留される。いくつかの実施形態では、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、異なる界面に繋留される。いくつかの実施形態では、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、界面上で固定化されるタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ分子を使用して、界面に繋留される。いくつかの実施形態では、界面は、支持脂質二重層を備え、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、支持脂質二重層に係留される、またはその中に埋め込まれる。いくつかの実施形態では、界面は、支持脂質二重層を備え、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、Ｎｉ−ＮＴＡ部分から成る二重層脂質に結合する、遺伝学的に組み込まれたＨｉｓタグを使用して、支持脂質二重層に繋留される。いくつかの実施形態では、遺伝学的に組み込まれたＨｉｓタグは、６ｘ−Ｈｉｓタグ、７ｘ−Ｈｉｓタグ、８ｘ−Ｈｉｓタグ、９ｘ−Ｈｉｓタグ、１０ｘ−Ｈｉｓタグ、１１ｘ−Ｈｉｓタグ、または１２ｘ−Ｈｉｓタグから成る。いくつかの実施形態では、非線形活性標識バイオ後続薬剤候補および参照薬剤は、全内部反射の使用を通して第１の基本周波数の光を用いて照明される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、第１の基本周波数の励起光が界面上に入射する点において界面の直接上方または下方に位置付けられる、ピンホール開口を使用して収集される。いくつかの実施形態では、２光子蛍光は、集光レンズを使用することなく収集される。いくつかの実施形態では、バイオ後続薬剤候補および参照薬剤に関して測定される光の物理的性質、またはバイオ後続薬剤候補および参照薬剤に関して測定される比の統計的有意差は、０．０５未満のｐ値によって示される。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
繋留バイオ分子に付着した２光子蛍光標識の角度パラメータを決定するための方法であって、前記方法は、
（ａ）配向された様式でバイオ分子を平面に付着させるステップであって、前記バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて既知の部位において標識される、ステップと、
（ｂ）第１の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップと、
（ｄ）第２の偏光を使用する前記第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）における照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）において検出される前記光の第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１の物理的性質と比較し、前記平面に対する前記２光子蛍光標識の角度パラメータを決定するステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記第１の物理的性質は、ｐ偏光された光強度Ｉｐであり、前記第２の物理的性質は、ｓ偏光された強度Ｉｓであり、ステップ（ｆ）における比較は、角度パラメータを決定するための方程式
（数１）
2020519866.tif 000002
を解くステップを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
一連の２つ以上の異なるバイオ分子複合体毎にステップ（ａ）から（ｆ）を繰り返すステップであって、前記一連の中の前記バイオ分子複合体はそれぞれ、同一の２光子蛍光標識を用いて異なる部位において標識される前記バイオ分子を含む、ステップと、前記２つ以上の異なるバイオ分子複合体毎に決定される前記角度パラメータを使用して、前記バイオ分子の構造を決定するステップとをさらに含む、項目１または項目２に記載の方法。
（項目４）
前記バイオ分子は、タンパク質であり、前記一連の２つ以上の異なるバイオ分子複合体はそれぞれ、単一部位システインまたはメチオニン置換を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記バイオ分子は、２つ以上の異なる部位において２つ以上の異なる２光子蛍光標識を用いて標識され、前記２つ以上の異なる２光子蛍光標識のそれぞれによって生成される光の第１の物理的性質および第２の物理的性質は、前記２つ以上の異なる２光子蛍光標識に関して同一である、または異なり得る、基本周波数の光による照明に応じて、ステップ（ｃ）および（ｅ）において同時または連続的に検出され、前記２つ以上の異なる２光子蛍光標識毎に、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１の物理的性質とのステップ（ｅ）において検出される前記光の第２の物理的性質の比較は、前記平面に対する前記２つ以上の異なる２光子蛍光標識のそれぞれの角度パラメータを決定するために使用される、項目１−４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記付着したバイオ分子はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識を用いて既知の部位において標識される、項目１−５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記２光子蛍光標識、および第１の第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識は、前記バイオ分子上の同一の既知の部位に付着した同一の標識である、項目６に記載の方法。
（項目８）
同時に、または続いて、第２の基本周波数の励起光による照明に応じて、ステップ（ｃ）において前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第１の物理的性質、およびステップ（ｅ）において前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップをさらに含み、前記第２の基本周波数は、前記第１の基本周波数と同一である、または異なり得る、項目６または項目７に記載の方法。
（項目９）
ステップ（ｅ）において検出される前記光の第２の物理的性質を、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１の物理的性質と比較し、前記平面に対する前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータを決定するステップをさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
１つ以上の２光子蛍光標識、第２高調波（ＳＨ）活性標識、和周波数（ＳＦ）活性標識、または差周波数（ＤＦ）活性標識、またはそれらの任意の組み合わせの前記角度パラメータのデータを、前記バイオ分子の構造モデルに大域的に適合させるステップをさらに含み、前記構造モデルは、前記バイオ分子内の前記１つ以上の標識の既知の部位についての情報を備える、項目１−９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記バイオ分子の構造モデル化のための構造的制約を提供する、Ｘ線結晶構造解析データ、ＮＭＲデータ、または他の実験データを組み込むステップをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記バイオ分子は、タンパク質であり、前記２光子蛍光標識、または第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識は、非線形活性非天然アミノ酸である、項目１−１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記非線形活性非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
非線形活性部分は、明らかに非線形活性ではない非天然アミノ酸に付着される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記光の第２の物理的性質は、前記光の第１の物理的性質と異なる、項目１−１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
前記光の第１および第２の物理的性質は、同一の偏光を保有するが、異なる規模または強度である、項目１−１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
前記光の第１および前記第２の物理的性質は、異なる偏光を保有する、項目１−１６のいずれか１項に記載の方法。
（項目１８）
前記照明するステップは、前記励起光の偏光を調節するステップを含む、項目１−１７のいずれか１項に記載の方法。
（項目１９）
前記励起光の第１の偏光状態は、その入射面に対するｐ偏光を備え、前記励起光の第２の偏光は、その入射面に対するｓ偏光を備える、項目１−１８のいずれか１項に記載の方法。
（項目２０）
ステップ（ｃ）および（ｅ）における検出するステップは、検出器に到達する、前記２光子蛍光標識、または第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される前記光の偏光を調節するステップを含む、項目１−１９のいずれか１項に記載の方法。
（項目２１）
前記光の第１および第２の物理的性質は、強度または偏光である、項目１−２０のいずれか１項に記載の方法。
（項目２２）
前記２光子蛍光標識によって生成される前記光は、集光レンズを使用することなく、低開口数ピンホール構成を使用して検出される、項目１−２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記低開口数ピンホールは、前記励起光が前記平面上に入射する、前記平面上の点の直接上方および下方に設置される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記平面は、支持脂質二重層を備え、前記バイオ分子は、前記支持脂質二重層に付着される、またはその中に挿入される、項目１−２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記励起光は、全内部反射を使用して前記平面に指向される、項目１−２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記２光子蛍光標識はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性であり、
（ｇ）前記第１の基本周波数の励起光と同一である、または異なり得る、第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、前記付着したバイオ分子に付着した前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の強度を同時または連続的に検出するステップであって、検出は、
（ｉ）前記励起光の第１の偏光状態、および
（ｉｉ）前記励起光の第２の偏光状態、
を使用して実施される、ステップと、
（ｈ）ステップ（ｃ）（ｉ）および（ｃ）（ｉｉ）において検出される光強度の比を計算することによって、基板表面への法線に対して第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータを決定するステップと、
（ｉ）前記２光子蛍光標識の角度パラメータに関する方程式および２光子蛍光に関して計算される光強度比を積分し、前記２光子蛍光方程式を満たす角度パラメータ値対を決定するステップと、
（ｊ）前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識の角度パラメータに関する方程式、および前記第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数（ＤＦ）光に関して計算される前記光強度比を積分し、前記第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数方程式を満たす角度パラメータ値対を決定するステップと、
（ｋ）ステップ（ｉ）および（ｊ）において識別される前記角度パラメータ値対の交差を決定し、前記２光子蛍光および前記第２高調波（ＳＨ）、和周波数（ＳＦ）、または差周波数方程式の両方を満たす一意の一対の角度パラメータ値を決定するステップと、
によって、前記標識の角度パラメータを決定するステップをさらに含む、
項目１−２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
バイオ分子は、前記バイオ分子に付着した前記２光子蛍光標識の配向分布の幅が３５度以下であるように、前記平面に付着される、項目１−２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記角度パラメータは、平均傾転角、配向分布幅、またはそれらの一対の組み合わせを備える、項目１−２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
バイオ分子の配座変化を検出するための方法であって、前記方法は、
ａ）配向された様式で前記バイオ分子を平面に付着させるステップであって、前記バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて標識される、ステップと、
ｂ）第１の偏光および第２の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）における前記第１および第２の偏光を伴う照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質および光の第２の物理的性質を検出するステップと、
ｄ）前記付着したバイオ分子に、（ｉ）既知のリガンドとの接触、（ｉｉ）候補結合パートナとの接触、または（ｉｉｉ）実験条件の変化を受けさせるステップと、
ｅ）前記第１の偏光および前記第２の偏光を使用する前記第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
ｆ）ステップ（ｅ）における前記第１および第２の偏光を伴う照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第３の物理的性質および光の第４の物理的性質を検出するステップと、
（ｆ）ステップ（ｆ）において検出される前記光の第３および第４の物理的性質の比を、ステップ（ｃ）において検出される前記光の第１および第２の物理的性質の比と比較するステップであって、前記光の物理的性質の比の変化は、前記バイオ分子が配座変化を受けたことを示す、ステップと
を含む、方法。
（項目３０）
前記２光子蛍光の物理的性質は、０．２以下である開口数を有する、ピンホール検出装置を使用して検出される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記開口数は、約０．０１〜約０．２である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記２光子蛍光の物理的性質は、レンズを使用することなく検出される、項目２９−３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記２光子蛍光標識はまた、第２高調波、和周波数、または差周波数活性であり、第２高調波、和周波数、または差周波数光の物理的性質は、前記第１および第２の偏光を使用する第２の基本周波数の光を用いた照明の結果として、前記２光子蛍光の物理的性質の検出と連続的または同時に検出される、項目２９−３２のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
ステップ（ｆ）において比較される比は、前記第２高調波、和周波数、または差周波数光の物理的性質に対する前記２光子蛍光の物理的性質の比を備える、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記第２の基本周波数は、前記第１の基本周波数と同一である、項目３３または項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記第１および第２の偏光は、ｓ偏光およびｐ偏光を備える、項目２９−３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記バイオ分子は、タンパク質分子である、項目２９−３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記タンパク質分子は、薬剤標的である、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記既知のリガンドは、既知の薬剤である、または前記候補結合パートナは、薬剤候補である、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記２光子蛍光標識は、１つ以上の工学的システイン残基において前記タンパク質分子に付着される、項目３７−３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４１）
前記２光子蛍光標識は、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）である、項目２９−４０のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記２光子蛍光標識は、前記タンパク質分子に組み込まれた非線形活性非天然アミノ酸である、項目３７−３９のいずれか１項に記載の方法。
（項目４３）
前記非線形非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記励起光は、全内部反射を使用して前記平面に送達される、項目２９−４３のいずれか１項に記載の方法。
（項目４５）
前記バイオ分子は、支持脂質二重層の中への挿入またはそこへの繋留によって前記平面に付着される、項目２９−４４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４６）
候補結合パートナを選別し、標的分子の配座を変調させる結合パートナを識別するための方法であって、前記方法は、
（ａ）前記標的分子を基板表面に繋留するステップであって、前記標的分子は、結合パートナとの接触に応じて配座変化を受ける、前記標的分子の一部に付着される２光子蛍光標識を用いて標識され、前記繋留標的分子は、前記基板表面上に正味の配向を有する、ステップと、
（ｂ）第１の基本周波数の励起光を用いて前記繋留標的分子を照明するステップと、
（ｃ）前記２光子蛍光標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出し、基準信号を生成するステップと、
（ｄ）連続的かつ個別に、前記繋留標的分子を前記１つ以上の候補結合パートナと接触させるステップと、
（ｅ）前記１つ以上の候補結合パートナ毎に前記第１の基本周波数の励起光による照明に応答して、前記２光子蛍光標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、
（ｆ）前記１つ以上の候補結合パートナ毎に前記第２の物理的性質を前記第１の物理的性質と比較するステップであって、前記第１の物理的性質の値に対する所与の候補結合パートナに関する前記第２の物理的性質の値の変化は、前記候補結合パートナが前記標的分子の配座を変調させることを示す、ステップと、
を含む、方法。
（項目４７）
前記光の第１および第２の物理的性質は、前記励起光の２つの異なる偏光の下の光の強度を備え、ステップ（ｆ）は、前記光の２つの強度の比を決定するステップを含み、前記比の変化は、前記候補結合パートナが前記標的分子の配座を変調させることを示す、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記標的分子はまた、第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識を用いて標識される、項目４６に記載の方法。
（項目４９）
前記２光子蛍光標識、および前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識は、同一の標識部分である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
（ｇ）ステップ（ｃ）を実施することと同時に、またはそれに続いて、第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第１の物理的性質を検出するステップであって、前記第２の基本周波数は、前記第１の基本周波数と同一である、または異なり得る、ステップと、
（ｈ）ステップ（ｅ）を実施することと同時に、またはそれに続いて、第２の基本周波数の励起光を用いた照明に応じて、前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される光の第２の物理的性質を検出するステップと、
（ｉ）前記１つ以上の候補結合パートナ毎に前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される前記第２の物理的性質を、前記第２高調波（ＳＨ）活性、和周波数（ＳＦ）活性、または差周波数（ＤＦ）活性標識によって生成される前記第１の物理的性質と比較するステップであって、前記第１の物理的性質の値に対する所与の候補結合パートナに関する前記第２の物理的性質の値の変化はさらに、前記候補結合パートナが前記標的分子の配座を変調させることを示す、ステップと
をさらに含む、項目４８または項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記光の第１および第２の物理的性質は、前記励起光の２つの異なる偏光の下の光の強度を備え、ステップ（ｉ）は、前記光の２つの強度の比を決定するステップを含み、前記比の変化は、前記候補結合パートナが前記標的分子の配座を変調させることを示す、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
前記励起光は、前記表面から完全に内部反射されるような方法で前記基板表面に指向される、項目４６−５１のいずれか１項に記載の方法。
（項目５３）
２光子蛍光は、前記第１の基本周波数の励起光が前記基板表面上に入射する点において前記基板表面の直接上方または下方に位置付けられるピンホール開口を使用して収集される、項目４６−５２のいずれか１項に記載の方法。
（項目５４）
２光子蛍光は、集光レンズを使用することなく収集される、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ピンホール開口の開口数は、０．０１〜０．２である、項目５３に記載の方法。
（項目５６）
前記非線形活性標識は、ピリジルオキサゾール（ＰｙＭＰＯ）部分、６−ブロモアセチル−２−ジメチルアミノナフタレン（バダン）部分、または６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）部分を含む、項目４６−５５のいずれか１項に記載の方法。
（項目５７）
前記標的分子は、遺伝学的に組み込まれたＨｉｓタグを含むタンパク質である、項目４６−５６のいずれか１項に記載の方法。
（項目５８）
前記Ｈｉｓタグは、６ｘ−Ｈｉｓタグ、７ｘ−Ｈｉｓタグ、８ｘ−Ｈｉｓタグ、９ｘ−Ｈｉｓタグ、１０ｘ−Ｈｉｓタグ、１１ｘ−Ｈｉｓタグ、または１２ｘ−Ｈｉｓタグを含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
前記繋留標的分子は、全内部反射の使用を通して前記第１の基本周波数の光を用いて照明される、項目４６−５８のいずれか１項に記載の方法。
（項目６０）
標的タンパク質の構造内でジェネリック薬剤または薬剤候補および参照薬剤によって誘発される配座変化を比較するための方法であって、前記標的タンパク質は、非線形活性標識を用いて標識され、界面上に正味の配向を有するように前記界面に繋留され、前記方法は、
ａ）前記標的タンパク質を前記参照薬剤と接触させるステップであって、前記標的タンパク質は、特異的様式で前記参照またはブランド薬剤と相互作用する、ステップと、
ｂ）表面選択的技法を使用して、前記非線形活性標識によって生成される第１の信号または信号変化を測定することによって、前記標的タンパク質と前記参照薬剤との間の相互作用を検出するステップであって、前記第１の信号または信号変化は、前記参照薬剤に特異的である前記標的タンパク質の構造の配座変化を示す、ステップと、
ｃ）前記標的タンパク質を前記ジェネリック薬剤または薬剤候補と接触させるステップであって、前記標的タンパク質は、特異的様式で前記ジェネリック薬剤または薬剤候補と相互作用する、ステップと、
ｄ）表面選択的技法を使用して、前記非線形活性標識によって生成される第２の信号または信号変化を測定することによって、前記標的タンパク質と前記ジェネリック薬剤または薬剤候補との間の相互作用を検出するステップであって、前記第２の信号または信号変化は、前記ジェネリック薬剤または薬剤候補に特異的である前記標的タンパク質の構造の配座変化を示す、ステップと、
ｅ）前記第２の信号または信号変化を前記第１の信号または信号変化と比較し、前記ジェネリック薬剤または薬剤候補によって前記標的タンパク質において誘発される前記配座変化が、前記参照薬剤によって誘発される変化と同一または実質的に同一であるかどうかを決定するステップと、
を含む、方法。
（項目６１）
前記標的タンパク質は、細胞表面受容体または抗原である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
前記参照薬剤は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、項目６０または項目６１に記載の方法。
（項目６３）
前記ジェネリック薬剤または候補薬剤は、小分子化合物、非抗体阻害性ペプチド、抗体、およびそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、項目６０−６２のいずれか１項に記載の方法。
（項目６４）
前記ジェネリック薬剤または薬剤候補は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、項目６０−６３のいずれか１項に記載の方法。
（項目６５）
前記ジェネリック薬剤は、バイオ後続品である、項目６０−６４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６６）
前記標的タンパク質の構造の配座変化は、リアルタイムで検出される、項目６０−６５のいずれか１項に記載の方法。
（項目６７）
前記非線形活性標識は、前記標的タンパク質の表面上の１つ以上のスルフヒドリル基によって前記標的タンパク質に結合される、項目６０−６６のいずれか１項に記載の方法。
（項目６８）
前記１つ以上のスルフヒドリル基は、工学的スルフヒドリル基である、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性標識または２光子蛍光標識である、項目６０−６８のいずれか１項に記載の方法。
（項目７０）
前記非線形活性標識は、ＰｙＭＰＯマレイミド、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯスクシンイミジルエステル、バダン、およびアクリロダンから成る群から選択される、第２高調波（ＳＨ）活性標識である、項目６０−６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７１）
前記非線形活性標識は、非天然アミノ酸である、項目６０−６９のいずれか１項に記載の方法。
（項目７２）
前記非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である、項目７１に記載の方法。
（項目７３）
生体類似性の決定は、少なくとも第２の構造特性評価または機能分析技法から取得される構造または機能データと組み合わせて、誘発された配座変化の比較に基づいて行われる、項目６０−７２のいずれか１項に記載の方法。
（項目７４）
前記少なくとも第２の構造特性評価または機能分析技法は、円偏光二色性，Ｘ線結晶構造解析、生物学的分析、結合分析、酵素分析、細胞ベースの分析、細胞増殖分析、細胞ベースのレポータ分析、および動物モデル研究から成る群から選択される、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
２つ以上のタンパク質サンプルを比較するための方法であって、前記方法は、
ａ）タンパク質産生プロセスの同一のステップに関して異なる時間に、タンパク質産生プロセスの異なるステップにおいて、同一のタンパク質産生プロセスの別個の工程から、または公称上同一のタンパク質を産生する異なるタンパク質産生プロセスから収集される、２つ以上のタンパク質サンプルを提供するステップと、
ｂ）光学界面の１つ以上の離散領域中で前記１つ以上のタンパク質サンプルからのタンパク質を繋留するステップであって、各サンプルからの前記繋留タンパク質は、非線形活性標識を用いて標識され、前記光学界面において正味の配向を有する、ステップと、
ｃ）基本周波数の光を用いた前記非線形活性標識の照明に応じて生成される、前記１つ以上の繋留タンパク質サンプル毎に基準非線形光学信号を測定するステップと、
ｄ）前記１つ以上の繋留タンパク質サンプルの測定された基準非線形光学信号を、相互と、または参照サンプルに関して測定される基準非線形光学信号と比較するステップであって、規定割合未満である、前記１つ以上の固定化タンパク質サンプルに関して測定される前記基準非線形光学信号の差異、または前記１つ以上のタンパク質サンプルに関して測定される前記基準非線形光学信号と参照サンプルのものとの間の差異は、前記１つ以上のタンパク質サンプルまたは前記参照サンプルのタンパク質が同等構造を有することを示す、ステップと、
を含む、方法。
（項目７６）
前記１つ以上のタンパク質サンプルは、タンパク質産生プロセスの終点において収集され、ステップ（ｄ）における比較は、タンパク質産物の品質管理に使用される、項目７５に記載の方法。
（項目７７）
前記１つ以上のタンパク質サンプルは、タンパク質産生プロセスの１つ以上のステップにおいて収集され、ステップ（ｄ）における比較は、前記タンパク質産生プロセスの最適化に使用される、項目７５に記載の方法。
（項目７８）
前記１つ以上のタンパク質サンプルは、公称上同一のタンパク質を産生する異なるタンパク質産生プロセスから収集され、ステップ（ｄ）における比較は、生体類似性を実証するために使用される、項目７５に記載の方法。
（項目７９）
前記光学界面は、ガラス表面、溶融石英表面、またはポリマー表面から成る群から選択される表面を備える、項目７５−７８のいずれか１項に記載の方法。
（項目８０）
前記光学界面は、支持脂質二重層を備える、項目７５−７９のいずれか１項に記載の方法。
（項目８１）
前記支持脂質二重層はさらに、Ｎｉ／ＮＴＡ−脂質分子を含む、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記１つ以上のタンパク質サンプルのタンパク質は、Ｈｉｓタグを含む、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記基準非線形光学信号またはその変化は、リアルタイムで監視される、項目７５−８２のいずれか１項に記載の方法。
（項目８４）
前記非線形活性標識は、前記タンパク質の表面上の１つ以上のスルフヒドリル基によって前記タンパク質に結合される、項目７５−８３のいずれか１項に記載の方法。
（項目８５）
前記１つ以上のスルフヒドリル基は、工学的スルフヒドリル基である、項目８４に記載の方法。
（項目８６）
前記非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性標識である、項目７５−８５のいずれか１項に記載の方法。
（項目８７）
前記固定化または繋留タンパク質は、それ自体がＳＨＧ活性である、ペプチド、ペプチド模倣薬、または他のリガンドとそれを接触させることによって標識され、前記固定化または繋留タンパク質に結合された前記ＳＨＧ活性リガンドをもたらす、項目７５−８６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８８）
前記非線形活性標識は、ＰｙＭＰＯマレイミド、ＰｙＭＰＯ−ＮＨＳ、ＰｙＭＰＯスクシンイミジルエステル、バダン、およびアクリロダンから成る群から選択される第２高調波（ＳＨ）活性標識である、項目７５−８７のいずれか１項に記載の方法。
（項目８９）
前記非線形活性標識は、前記１つ以上のタンパク質サンプルのタンパク質に遺伝学的に組み込まれた非天然アミノ酸である、項目７５−８８のいずれか１項に記載の方法。
（項目９０）
前記非天然アミノ酸は、Ｌ−Ａｎａｐ、Ａｌａｄａｎ、またはナフタレンの誘導体である、項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記非線形活性標識は、第２高調波（ＳＨ）活性および２光子蛍光の両方であり、ステップ（ｃ）における測定するステップはさらに、基準第２高調波信号および基準２光子蛍光信号の両方を測定するステップを含む、項目７５−９０のいずれか１項に記載の方法。
（項目９２）
ステップ（ｄ）の比較はさらに、前記１つ以上の繋留されるタンパク質サンプルの２光子蛍光基準信号に対する第２高調波の比を、相互と、または参照サンプルのものと比較するステップを含み、規定割合未満の差異は、前記１つ以上のタンパク質サンプルまたは前記参照サンプルのタンパク質が同等の構造を有することを示す、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
繋留バイオ分子に付着した２光子蛍光標識の２光子蛍光を検出するための方法であって、前記方法は、
（ａ）配向された様式でバイオ分子を平面に付着させるステップであって、前記バイオ分子は、２光子蛍光標識を用いて既知の部位において標識される、ステップと、
（ｂ）第１の偏光を使用する第１の基本周波数の励起光を用いて、前記付着したバイオ分子を照明するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）における照明の結果として、前記２光子蛍光標識によって生成される光の物理的性質を検出するステップであって、前記２光子蛍光標識によって生成される前記光は、集光レンズを使用することなく、低開口数ピンホール構成を使用して検出される、ステップと
を含む、方法。
（項目９４）
前記低開口数ピンホールは、前記励起光が前記平面上に入射する、前記平面上の点の直接上方および下方に設置される、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記平面は、支持脂質二重層を備え、前記バイオ分子は、前記支持脂質二重層に付着される、またはその中に挿入される、項目９３に記載の方法。
（項目９６）
前記励起光は、全内部反射を使用して前記平面に指向される、項目９３に記載の方法。
（項目９７）
前記低開口数ピンホールは、０．０１〜０．２の開口数を有する、項目９４に記載の方法。