【手続補正書】
【提出日】令和2年12月22日(2020.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の担体−タンパク質抗原接合体を含む組成物であって、該複数の担体−タンパク質抗原接合体が少なくとも１４個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含み、該抗原が肺炎連鎖球菌の莢膜多糖であり、
（ａ）各別個の担体タンパク質−抗原接合体中の莢膜多糖が肺炎連鎖球菌の異なる血清型由来のものであり；
（ｂ）担体タンパク質−抗原接合体の担体タンパク質が、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも３つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含むポリペプチドであり、ここで、該莢膜多糖がｎｎＡＡと接合しており；
（ｃ）肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆの各々に対する莢膜多糖を含む別個の担体タンパク質−抗原接合体があり；
（ｄ）血清型２、６Ｃ、８、９Ｎ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ｂ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８からなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の莢膜多糖を含む少なくとも１つの追加の別個の担体タンパク質−抗原接合体があり；
（ｅ）組成物中のすべての血清型多糖類と担体タンパク質との全体的な（重量単位）比率が少なくとも０．８である、
組成物。
【請求項２】
複数の担体−タンパク質抗原接合体が少なくとも２０個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
血清型２、６Ｃ、８、９Ｎ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ｂ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆ、および３８からなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来の莢膜多糖を含む少なくとも７つの追加の別個の担体タンパク質−抗原接合体がある、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
少なくとも１４個の別個の担体タンパク質−抗原接合体が
（ａ）肺炎連鎖球菌血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの各々を含む別個の担体タンパク質−抗原接合体がある少なくとも２０個または２１個の別個の担体タンパク質−抗原接合体；または
（ｂ）肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆの各々を含む別個の担体タンパク質−抗原接合体がある少なくとも２４個の担体タンパク質−抗原接合体
を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
ｎｎＡＡが連結部分を介してｎｎＡＡと接合しており、該肺炎連鎖球菌莢膜多糖がシクロオクチン基を含み、アジド基を含むｎｎＡＡに接合しているかまたは該肺炎連鎖球菌莢膜多糖がアジド基を含み、シクロオクチン基を含むｎｎＡＡに接合している、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
各別個の担体タンパク質−抗原接合体が同じ担体タンパク質を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
組成物中に約２５％（重量）未満の総遊離多糖類がある、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
ポリぺプチド内のｎｎＡＡが２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
ポリぺプチド内のｎｎＡＡがｐＡＭＦである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
担体タンパク質がコリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質ＤおよびＣＲＭ１９７からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質由来のＴ細胞活性化エピトープを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
担体タンパク質が配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
担体タンパク質が配列番号１と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
担体タンパク質が配列番号１による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と置換される少なくとも３つのｎｎＡＡを含み、ここで該ｎｎＡＡが配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３またはＫ５２７と交換される、請求項１１または１２に記載の組成物。
【請求項１４】
担体−タンパク質抗原接合体の担体タンパク質が少なくとも４つのｎｎＡＡまたは４〜６つのｎｎＡＡを含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
担体タンパク質が１）Ｋ２５、Ｋ３４、Ｋ３８およびＫ４０からなる群由来の１つの残基、２）Ｋ２１３およびＫ２１５からなる群から選択される１つの残基ならびに３）Ｋ２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３およびＫ５２７からなる群から選択される２〜４つの残基のとおり、配列番号１中でリジン残基で置換されている、請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
すべての血清型多糖類と担体タンパク質との全体的な（重量単位）比率が少なくとも０．９、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４または少なくとも１．５である、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
抗原が式ＸＩまたはＸＩａによる担体タンパク質に連結され、
【化１】
2020504760.tif 000001
式中、
Ｒ１がＨ、ホルミル、または担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｒ２がＯＨまたは担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
ＷがＣまたはＮであり、
ｙが少なくとも１であり、
ｎが少なくとも１であり、
Ｘが莢膜多糖の少なくとも１つのポリオールである、
請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物に含まれる担体−タンパク質抗原接合体を製造する方法であって、
（ａ）担体タンパク質をコードする核酸と、担体タンパク質をコードする核酸に少なくとも３つのｎｎＡＡを組み込むためのｔＲＮＡを含む反応混合物を産生することを含む、無細胞抽出物ベースのタンパク質合成によって担体タンパク質を製造し、ここで、ｎｎＡＡは少なくとも２つの抑制コドン部位が組み込まれ、担体タンパク質をコードする核酸が第１のバイオ直交性反応性部分および少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含む少なくとも３つのｎｎＡＡを含み；
（ｂ）抗原における部位に第２のバイオ直交性反応性部分を組み込むことにより誘導体化された抗原を産生し、ここで、該第２のバイオ直交性反応性部分は第１のバイオ直交性反応性部分と反応でき；そして
（ｃ）担体タンパク質と誘導体化された抗原を反応させて、担体−タンパク質抗原接合体を製造する
ことを含む、方法。
【請求項１９】
担体タンパク質が４〜６つのｎｎＡＡを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉ）工程（ｃ）がシクロオクチン反応性基とアジド基の間の歪み促進アジド−アルキン負荷環化を含む；
（ii）工程（ａ）で産生された担体タンパク質が可溶性画分および不溶性画分を含み、可溶性画分と不溶性画分との比率が少なくとも４０％（ｗ／ｗ）である；
（iii）工程（ａ）の無細胞抽出物ベースのタンパク質合成を２５℃以下で行う；
（iv）ｔＲＮＡの濃度が少なくとも２０μＭである；および／または
（ｖ）工程（ｃ）で形成された担体−タンパク質抗原接合体における多糖類と担体タンパク質との比率（重量単位）が（Ａ）約０．９〜約３．０（ｗ／ｗ）である、（Ｂ）１を超えるまたは（Ｃ）１．０〜２．８である、
請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
可溶性画分と不溶性画分との比率が少なくとも６０％である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）の無細胞抽出物ベースのタンパク質合成を２０℃以下で行う、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＣＲＭ１９７由来のＴ細胞活性化エピトープを含み、配列番号１による天然ポリペプチド内に天然に生じるアミノ酸と置換される２〜９のｎｎＡＡを含み、ここで、ｎｎＡＡが配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３またはＫ５２７と交換される、担体タンパク質。
【請求項２４】
ｎｎＡＡがアジド部分を含む、請求項２０に記載の担体タンパク質。
【請求項２５】
一種のｎｎＡＡのみを含む、請求項２０または２１に記載の担体タンパク質。
【請求項２６】
ｎｎＡＡがパラ−アジド−Ｐｈｅ（「ｐＡＦ」）、パラ−アジド−メチル−Ｐｈｅ（「ｐＡＭＦ」）、パラ−フルオロ−Ｐｈｅ、パラ−アセチル−Ｐｈｅまたはパラ−ベンゾイル−Ｐｈｅである、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
４〜６つのｎｎＡＡを含む、請求項２３〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
担体タンパク質が配列番号９のアミノ酸配列を含みここで、各ＸがｎｎＡＡを表す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＸがｐＡＭＦを表す、請求項８に記載の方法。
【請求項３０】
ｐＨ７．４のトリス緩衝液中、２０℃で少なくとも５０ｍｇ／Ｌの溶解度を有する、請求項２３〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
（ｉ）抗原が血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２３Ｆ、２、６Ｃ、８、９Ｎ、１０Ａ、１２Ｆ、１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１６Ｆ、１７Ｆ、２０、２０Ａ、２０Ｂ、２２Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、２４Ｂ、３１、３３Ｆ、３４、３５Ｂ、３５Ｆおよび３８からなる群から選択される肺炎連鎖球菌由来の莢膜多糖類である；および
（ii）担体タンパク質が莢膜多糖類がｎｎＡＡに共役している、請求項２３〜２９の何れかに記載の担体タンパク質である、
担体タンパク質−抗原接合体。
【請求項３２】
接合が請求項１７に記載の連結部を含む、請求項３１に記載の担体タンパク質−抗原接合体。
【請求項３３】
対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発するための医薬組成物であって、非経口投与に好適な賦形剤中に、請求項１〜１９のいずれかに記載の組成物または請求項２１もしくは請求項３２に記載の接合体を前記対象に投与することを含む、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
別の関連する実施形態では、ポリペプチド抗原接合体を生成するための方法であって、少なくとも１つのアルキニル基を第１の化学ハンドルとして内部に組み込み、第２の化学ハンドルとしてアジド基を持つ、少なくとも１つのｎｎＡＡ、および好ましくは少なくとも２つのｎｎＡＡを含むポリペプチドと抗原を反応させることによって抗原を活性化し、それによってポリペプチドと抗原との間の非触媒共有結合生体接合反応を可能にすることを含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、アルキニル基を拘束して、例えば、ジアリール歪みシクロオクチンなどの環構造において、反応性を増加させる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
別の実施形態では、本開示は、少なくとも１４、２０、２１、２４、または２５個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む組成物であって、抗原が、莢膜多糖であり、（ａ）各別個の担体タンパク質−抗原接合体中の莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌の異なる血清型由来のものであり、（ｂ）担体タンパク質−抗原接合体の担体タンパク質が、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも２つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含むポリペプチドを含み、（ｃ）莢膜多糖がｎｎＡＡと接合している、組成物を提供する。この実施形態の好ましい型では、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープは、配列番号１によるＣＲＭ１９７由来のものであり、ポリペプチドは、配列番号１と少なくとも８０％または９５％の配列同一性を有し、（ｉ）ポリペプチドは、２〜９つのｎｎＡＡを含み、（ｉｉ）ポリペプチドは、４〜６つのｎｎＡＡを含み、かつ／または（ｉｉｉ）少なくとも１つのｎｎＡＡは、（ａ）ＣＲＭ１９７のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、Ｋ５２７、（ｂ）配列番号１のＦ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、もしくはＦ５３２、または（ｃ）配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、Ｋ５２７、Ｆ１３、Ｆ５４、Ｆ１２４、Ｆ１２８、Ｆ１４１、Ｆ１６８、Ｆ２５１、Ｆ３９０、Ｆ５３１、もしくはＦ５３２からなる群から選択されるアミノ酸産基と置換される。先の実施形態の好ましい型は、少なくとも１４、２０、２１、２４、または２５個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む組成物を含み、各別個の担体タンパク質−抗原接合体は、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖から個別に選択される抗原、別個の担体タンパク質−抗原接合体のうちの２４個の莢膜多糖が、肺炎連鎖球菌血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および３３Ｆ由来のものである少なくとも２４個の別個の担体タンパク質−抗原接合体の組成物、別個の担体タンパク質−抗原接合体のうちの少なくとも１つの莢膜多糖が、６Ｃ、７Ｃ、１３、１５Ａ、１５Ｃ、１６、１６Ｆ、２３Ａ、２３Ｂ、２４Ｆ、３１、３４、３５Ｂ、３３Ｆ、３５Ｆ、３７、および３８からなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来のものである少なくとも２５個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む組成物、ならびに別個の担体タンパク質−抗原接合体のうちの少なくとも１つの莢膜多糖が、１５Ａおよび３５Ｂ、または代替的に、２０Ａ、２０Ｂ、および２４Ｂからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型由来のものである少なくとも２５個の別個の担体タンパク質−抗原接合体を含む組成物を含む。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１５】
７．配列変異体
本開示の改善された担体タンパク質は、ポリペプチドの１つ以上のＴ細胞エピトープの免疫原性機構が保存される限り、ポリペプチド内の任意の位置で置換される１つ以上のｎｎＡＡを含む。改善された担体タンパク質を既知の担体に基づかせる場合、通常、担体の特性に悪影響を与える機会を最小限に抑えるために、ｎｎＡＡのうちのいくつかまたはすべてを既知の担体における既存の天然に生じるアミノ酸と置換することが好ましい。しかしながら、ｎｎＡＡは、開始担体配列への追加として内部に、または終端に挿入され得ることが理解される。いくつかの実施形態では、改善された担体タンパク質（例えば、ｅＣＲＭ）中の少なくとも１つのｎｎＡＡは、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質の１つ以上の領域内に存在しない。別の実施形態では、増強された免疫原性ポリペプチド中のｎｎＡＡは、Ｔ細胞エピトープを含むタンパク質の１つ以上の領域内に存在しない。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
好ましい実施形態では、化学ハンドルを介してポリペプチドを抗原に接合するための方法は、以下のとおりである。抗原は、少なくとも１つの第１の化学ハンドルを内部に組み込むように活性化され、ここで第１の化学ハンドルは、ポリペプチド中のｎｎＡＡの第２の化学ハンドルに接合することができる。活性化抗原は、第１および第２の化学ハンドルが抗原−ポリペプチド接合体を形成するように反応する条件下で、第２のハンドルを持つ少なくとも１つのｎｎＡＡを含有するポリペプチドと組み合わされる。そのように可能にされる反応は、非触媒共有結合生体接合反応である。「第１の化学ハンドル」として機能する抗原の反応性部位は、好ましくはアルキニル基であり、アルキニル基は、反応性を増加させる分子環境に組み込まれ得る。例えば、アルキニル基は、環、例えば、ジアリール歪みシクロオクチンなどのシクロオクチニル環に組み込まれ得る。ｎｎＡＡ残基によって提供されるポリペプチド中の好ましい反応性部位、すなわち、「第２の化学ハンドル」は、アジド基である。当該技術分野で知られているように、この場合の反応は、以下でさらに詳細に考察される、「歪み促進アジド−アルキン負荷環化」（ＳＰＡＡＣ）として当該技術分野で参照される［３＋２］負荷環化である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１０】
一実施形態では、抗原は、（例えば、最初に、増強された担体タンパク質もしくは抗原を反応性リンカーと組み合わせ、次に、増強された担体タンパク質−リンカーもしくは抗原−リンカー付加物を、それぞれ抗原もしくは増強された担体タンパク質と組み合わせることによって）間接的に増強された担体タンパク質に接合される。別の実施形態では、抗原は、（例えば、増強された担体タンパク質および抗原を含む２つの成分を１つの反応で一緒に組み合わせることによって）直接増強された担体タンパク質に接合される。接合体がリンカーを含む場合、任意の好適な基を使用することができる。例えば、接合体は、アジピン酸、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、β−プロピオンアミド、ニトロフェニル−エチルアミン、ハローアシルハロゲン化物、グリコシド連結、６−アミノカプロン酸、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、Ｃ４〜Ｃ１２部分などから選択されるリンカーを含み得る。例えば、ジアリールシクロオクテンなどのジアリールシクロオクチン部分の残基を含む、上記で考察されるＤＢＣＯ基およびＤＩＦＯ基から生じるリンカーはまた、使用され得る。リンカーは、一般的に、担体に付着されるのではなく、接合のために抗原に付着されるであろう。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
ＣｕＡＡＣ：いくつかの実施形態では、抗原は、銅（Ｉ）触媒アルキン−アジド負荷環化（ＣｕＡＡＣ）によって増強された担体タンパク質に接合される。この実施形態の１つの変形例では、増強された担体タンパク質はプロパルギル含有ｎｎＡＡを含み、抗原はアジド基を含む。この実施形態の別の変形例では、増強された担体タンパク質はアジド含有ｎｎＡＡを含み、抗原はプロパルギル基を含む。生体分子のＣｕＡＡＣ接合に好適な条件は、例えば、Ｐｒｅｓｏｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１１；３（４）：１５３−１６２に見出され、それらのすべてが、Ｃｕ２＋の付加を伴う。いくつかの実施形態では、反応は、ＴＨＰＡなどのＣｕ配位リガンドの付加によって加速される。いくつかの実施形態では、反応は、Ｃｕ２＋の酸化状態を維持するために還元剤の付加によって加速される。好適な還元剤は、アスコルビン酸ナトリウム、ＤＴＴ、またはＴＣＥＰを含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
ＳＰＡＡＣ：いくつかの実施形態では、抗原は、歪み促進アジド−アルキン負荷環化（ＳＰＡＡＣ）によって増強された担体タンパク質に接合される。これらの実施形態の１つの変形例では、増強された担体タンパク質はアジド含有ｎｎＡＡを含み、抗原はシクロオクチン基を含む。これらの実施形態の別の変形例では、増強された担体タンパク質はシクロオクチン含有ｎｎＡＡを含み、抗原はアジド基を含む。ＳＰＡＡＣは追加の触媒または補助因子を必要としないため、この反応は、蒸留水、０．９％生理食塩水、ＰＢＳ、または生理的緩衝液中で行うことができる。一実施形態では、増強された担体タンパク質および抗原は、１．２０：１（ｗ／ｗ）の質量比率で組み合わされる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９３】
緩衝化された多糖類溶液に、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロホウ酸（ＣＤＡＰ、アセトニトリル中の１００ｍｇ／ｍＬの溶液由来）のＸモル当量（多糖類の繰り返し単位まで、Ｘはスクリーニングによって判定される）を、激しく攪拌しながら加える。ＣＤＡＰを加えた５分後に、０．５モル当量のジベンゾシクロオクタン−アミンリンカー（ＤＭＳＯ原液由来の）を加えた。さらに１時間後、グリシンを加えて、任意の未反応シアン酸エステルをクエンチする。代替的に、過ヨウ素酸塩またはＴＥＭＰＯ／ＮＣＳ化学を使用して、ＣＰＳを改変し得る。次に、誘導体化された多糖類を、透析またはＵＦ／ＤＦを介して精製する。アントロン比色分析を使用して、多糖類の濃度を測定し、３０９ｎｍでの吸光度を使用して、ジベンゾシクロオクチンの濃度を測定する。これらの２つの値を組み合わせて、ジベンジシクロオクチン官能基で誘導体化された多糖類の百分率の推定値を得ることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９４】
表２のものなど、最適なｅＣＲＭタンパク質と誘導体化された多糖類とを混合することによって、接合体を調製した。１８時間の培養後、１モル当量のアジ化ナトリウムを加え、任意の未反応ジベンゾシクロオクチン官能基をクエンチする。次に、透析またはＵＦ／ＤＦを介して接合体を精製し、未反応ｅＣＲＭタンパク質を除去する。次に、接合体を分析して、多糖類の濃度（比色分析）、タンパク質の濃度（比色分析）を判定し、遊離／非接合単糖類百分率を計算する。ＳＥＣ−ＭＡＬＳを使用して、分子量を測定する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９６】
本明細書に記載される実施形態は、例示のみの方法によって提供され、実施形態に対する様々な代替例は、本明細書に記載される実施形態を実践する際に除外されない。
さらに、本発明は次の態様を包含する。
１. ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも２つの非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）残基を含む担体タンパク質であり、（ｉ）前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ、およびＣＲＭ１９７からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含み、（ｉｉ）前記抗原が、前記ｎｎＡＡ残基と接合している、接合体。
２. 前記担体タンパク質が、４〜９個のｎｎＡＡ残基を含む、項１に記載の接合体。
３. 少なくとも１つのｎｎＡＡが、天然担体タンパク質中のリジンと置換される、項１または２に記載の接合体。
４. 前記担体タンパク質が、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有する、項１〜３のいずれかに記載の接合体。
５. 少なくとも１つのｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、またはＫ５２７と置換される、項４に記載の接合体。
６. 前記担体タンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列を含む、項１〜５のいずれかに記載の接合体。
７. 前記少なくとも１つのｎｎＡＡが、２位のアミノ置換基と、３位のアジド含有置換基、１，２，４，５−テトラジニル置換基、またはエチニル含有置換基とを持つ２，３−二置換プロパン酸である、項１〜６のいずれかに記載の接合体。
８. 前記ｎｎＡＡが、２−アミノ−３−（４−アジドフェニル）プロパン酸（ｐＡＦ）、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸（ｐＡＭＦ）、２−アミノ−３−（５−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）ピリジン−２−イル）プロパン酸、２−アミノ−３−（６−（アジドメチル）ピリジン−３−イル）プロパン酸、２−アミノ−５−アジドペンタン酸、および２−アミノ−３−（４−（アジドメチル）フェニル）プロパン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、項１〜７のいずれかに記載の接合体。
９. 前記抗原が、トリアゾール連結部分を介して前記ｎｎＡＡと接合している、項１〜８のいずれかに記載の接合体。
１０. ポリペプチドおよび抗原を含む接合体であって、前記ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも１つの非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む担体タンパク質であり、前記抗原が、前記ｎｎＡＡと接合し、さらに、前記少なくとも１つのｎｎＡＡ残基が、式ＸＩＩの構造を有するアミノ酸に対応し、
【化４６】
2020504760.tif 000002
式中、Ａｒが、任意選択的に少なくとも１つのヘテロ原子を含有する５員または６員芳香族環を含み、Ｗ５が、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、−ＮＨ−、−Ｏ−、および−Ｓ−から選択され、Ｑ１が、ゼロまたは１であり、Ｗ６が、アジド、任意選択的に低級アルキル基とＣ置換される１，２，４，５−テトラジニル、およびエチニルから選択され、その結果、前記ポリペプチド中の前記ｎｎＡＡ残基が、式ＸＩＩＩの構造を有し、
【化４７】
2020504760.tif 000003
式中、Ｒ３が、ＯＨまたは前記担体タンパク質のアミノ酸残基であり、Ｒ４が、Ｈまたは前記担体タンパク質のアミノ酸残基である、接合体。
１１. Ｗ６がアジドであり、Ａｒがフェニレンであり、またはＡｒが、窒素ヘテロ原子および任意選択的に、Ｎ、Ｏ、およびＳから選択される少なくとも１つの追加のヘテロ原子を含有し、Ｑ１が１であり、かつ／またはＷ５が低級アルキレンである、項１０に記載の接合体。
１２. 前記抗原が、式ＸＩまたはＸＩａによる前記担体タンパク質に連結され、
【化４８】
2020504760.tif 000004
式中、
Ｒ１が、Ｈ、ホルミル、または前記担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｒ２が、ＯＨまたは前記担体タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸であり、
Ｗが、ＣまたはＮであり、
ｙが、少なくとも１であり、
ｎが、少なくとも１であり、
Ｘが、莢膜多糖の少なくとも１つのポリオールである、項１〜１１のいずれかに記載の接合体。
１３. 前記抗原が、細菌莢膜多糖、例えば、肺炎連鎖球菌、髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ菌、化膿連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、およびポルフィロモナス・ジンジバリスからなる群から選択される細菌由来の莢膜多糖である、項１〜１２のいずれかに記載の接合体。
１４. 前記抗原が、１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される肺炎連鎖球菌血清型の莢膜多糖である、項１２に記載の接合体。
１５. 多糖類と担体タンパク質との比率（ｗ／ｗ）が、１を上回る、項１〜１４のいずれかに記載の接合体。
１６. 前記ポリペプチドが、３つ以上のｎｎＡＡ残基を含み、前記接合体が、少なくとも５００ｋＤａの分子量を有する、項１〜１５のいずれかに記載の接合体。
１７. 前記ポリペプチドが、（ａ）ＣＲＭ１９７であるか、または配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、（ｂ）３〜９つのｎｎＡＡ残基を含む、項１５に記載の接合体。
１８. 前記接合体が、タンパク質−抗原−タンパク質連結を通して架橋される、項１〜１７のいずれかに記載の接合体。
１９. 前記接合体が、少なくとも９００ｋＤａの分子量を有する、項１〜１８のいずれかに記載の接合体。
２０. 分子量が９００ｋＤａ〜５ＭＤａである、項１９に記載の接合体。
２１. 接合体を生成するための方法であって、
ａ．非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）の第２の化学ハンドルに接合することができる第１の化学ハンドルを含む複数の官能基を含む活性化抗原を提供することと、
ｂ．前記第１および第２の化学ハンドルが反応して抗原−ポリペプチド接合体を形成する条件下で、前記ｎｎＡＡのうちの少なくとも１つを含むポリペプチドと前記活性化抗原を組み合わせることであって、前記ポリペプチドが、少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含む、組み合わせることと、
ｃ．前記接合体を含む組成物を回収することと、を含む、方法。
２２. 前記第１の化学ハンドルが、アルキン基を含み、かつ／または前記第２の化学ハンドルがアジド基を含む、項２１に記載の方法。
２３. 前記抗原が、プロパルギル、ＤＩＦＯ、ＤＢＣＯ、ＤＢＣＯ−ＮＨ２、およびＤＢＣＯ（ＰＥＧ）ｎ−ＮＨ２からなる群から選択される官能基を含む第２の試薬と反応されている、項２１または２２に記載の方法。
２４. （ｉ）前記抗原が、式Ｖ、式ＶＩ、もしくは式ＶＩａの構造を含み、
【化４９】
2020504760.tif 000005
式中、Ｌ１が、結合、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ（Ｌ１２）−、−Ｏ（Ｌ１２）−、もしくは−Ｓ（Ｌ１２）−であり、
Ｌ２が、結合、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｌ１２−、−Ｓ（＝Ｏ）２Ｌ１２であり、
Ｌ１２が、Ｌ２２もしくはＬ２２ＮＨ−であり、
Ｌ２２が、Ｃ１−１０アルキルまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−１０−であり、
Ｕ１が、前記抗原の少なくとも１つの部分であるか、
または（ｉｉ）前記抗原が、式ＶＩＩもしくは式ＶＩＩａの構造を含み、
【化５０】
2020504760.tif 000006
式中、Ｘが、多糖類の少なくとも１つのポリオールであり、
ｎが少なくとも１であるか、
または（ｉｉｉ）前記抗原が、式ＶＩＩｂもしくは式ＶＩＩｃの構造を含み、
【化５１】
2020504760.tif 000007
式中、Ｘが、多糖類の少なくとも１つのアミノ糖のアミンであり、
ｎが少なくとも１であるか、
または（ｉｖ）前記抗原が、構造Ａ−Ｘのｚ部分を含み、式中、
Ａが、
【化５２】
2020504760.tif 000008
であり、
Ｘが、多糖類の少なくとも１つのポリオールであり、
ｎが、少なくとも１であり、
ｚが１を上回るか、
または（ｖ）前記抗原が式ＶＩＩＩの構造を含み、
【化５３】
2020504760.tif 000009
式中、Ｌ２２が、結合、アルキル、またはポリ（アルキルオキシ）であり、
Ｕ１が、抗原の少なくとも１つの部分であるか、
または（ｖｉ）前記抗原が、式ＩＸの構造を含み、
【化５４】
2020504760.tif 000010
式中、Ｕ１が、抗原の少なくとも１つの部分であるか、
または（ｖｉｉ）前記抗原が、式ＩＸａの構造を含み、
【化５５】
2020504760.tif 000011
式中、Ｌ２２が、Ｃ１−１０アルキルまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−１０−であり、
Ｕ１が、抗原の少なくとも１つの部分であるか、項２１または項２２に記載の方法。
２５. 項１〜２０のいずれかに記載の接合体を生成するための、項２１〜２４のいずれかに記載の方法。
２６. 抗原がＴ細胞依存性免疫反応を提供する担体タンパク質と接合している、タンパク質−接合体ワクチンを作製する改善された方法であって、前記改善が、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含むポリペプチドを前記担体タンパク質として用いることを含み、前記非天然アミノ酸が、バイオ直交性反応性部分を含み、それを通じて前記抗原が前記ポリペプチドに接合される、改善された方法。
２７. 少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープおよび少なくとも２つの非天然アミノ酸（「ｎｎＡＡ」）残基を含む担体タンパク質であって、（ｉ）前記担体タンパク質が、コリネバクテリウム・ジフテリア菌毒素、破傷風菌テタノスパスミン、ヘモフィルス・インフルエンザ菌タンパク質Ｄ、およびＣＲＭ１９７からなる群から選択されるタンパク質由来の少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含む、担体タンパク質。
２８. 配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ配列番号１内に天然に生じるアミノ酸と置換される少なくとも１つのｎｎＡＡを含む、担体タンパク質であって、前記少なくとも１つのｎｎＡＡが、配列番号１のＫ２５、Ｋ３４、Ｋ３８、Ｋ４０、Ｋ２１３、Ｋ２１５、Ｋ２２８、Ｋ２４５、Ｋ２６５、Ｋ３８６、Ｋ５２３、またはＫ５２７と置換され、前記ｎｎＡＡが、連結部分を含む、担体タンパク質。
２９. 免疫原性多糖類−タンパク質接合体を調製するための担体タンパク質であって、前記タンパク質が、（ｉ）少なくとも１つのＴ細胞活性化エピトープを含み、（ｉｉ）少なくとも１つのｎｎＡＡを含み、かつ（ｉｉｉ）ｐＨ７．４のトリス緩衝液中、２０℃で少なくとも５０ｍｇ／Ｌの溶解度を有する、担体タンパク質。
３０. 項２６〜２８のいずれかに記載の担体タンパク質を生成するためのプロセスであって、
（ａ）前記担体タンパク質をコードする核酸であって、複数の抑制コドンを含む、核酸を提供することと、
（ｂ）前記非天然アミノ酸、前記抑制コドンに相補的であるｔＲＮＡ、およびアミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素を含む無細胞抽出物と前記核酸を組み合わせることによって反応混合物を作出することと、
（ｃ）前記担体タンパク質中の各抑制コドンに対応する部位に前記非天然アミノ酸を選択的に組み込むのに十分な条件下で、前記（ｂ）の前記反応混合物を培養することと、を含む、プロセス。
３１. 前記非天然アミノ酸が、４−アジドメチル−フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）であり、前記（ｂ）のｔＲＮＡが、ｐＡＭＦで荷電されることができる、項３０に記載の方法。
３２. 約１０℃〜約３０℃の温度で維持された無細胞発現混合物中に少なくとも２つのｎｎＡＡを含むポリペプチドの合成のための方法であって、生成された前記ポリペプチドが、可溶性画分および不溶性画分の両方を含み、前記可溶性画分と前記不溶性画分との比率が、少なくとも３０％（ｗ／ｗ）である、方法。
３３. 前記温度が、（ｉ）約２０℃を上回るか、または（ｉｉ）約２０℃を下回り、例えば、前記温度が、約１４℃〜約１８℃である、項３２に記載の方法。
３４. 項１〜１９に記載の複数の接合体を含む組成物であって、前記複数の接合体の各々が、異なる抗原を含む、組成物。
３５. 血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２つ以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される１４個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される１５個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２０個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２１個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２４個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１３、１４、１５Ｂ、１６、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４Ｆ、３１、および３３Ｆからなる群から選択される２５個以上の異なる肺炎球菌血清型由来の莢膜多糖の接合体、
血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５、Ｘ、およびＹからなる群から選択される４つ以上の異なる髄膜炎菌血清群由来の莢膜多糖の接合体、または
血清型Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５、およびＫ６からなる群から選択される２つ以上の異なるポルフィロモナス・ジンジバリス血清型由来の莢膜多糖の接合体を含む、項３４に記載の組成物。
３６. 対象における抗原に対する免疫防御性抗体反応を誘発する方法であって、非経口投与に好適な賦形剤で、項１〜２０のいずれかに記載の接合体または項３４もしくは項３５に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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