【手続補正書】
【提出日】令和3年9月17日(2021.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトンを生産する組換え体ホスト細胞であって：
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からジカルボン酸（ＤＣＡ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＤＣＡからＣｏＡ活性化されたＤＣＡ（ＤＣＡ−ＣｏＡ）を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；および／または
（ｉ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができる環化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
遺伝子の少なくとも１つが組換え体遺伝子である、組換え体ホスト細胞。
【請求項２】
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
組換え体ホスト細胞が１つ以上の大環状ケトン前駆体を生産する、
請求項１に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項３】
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
組換え体ホスト細胞が１つ以上の大環状ケトンを生産する、
請求項１に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項４】
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；および
（ｉ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができるポリペプチドをコードする遺伝子；
を含み、
組換え体ホスト細胞が１つ以上の大環状ケトンを生産する、
請求項１に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項５】
組換え体ホスト細胞が、１つ以上のムスコン前駆体を酸化することができるポリペプチドをコードする遺伝子座位の欠失を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項６】
１つ以上のムスコン前駆体を酸化することができるポリペプチドをコードする遺伝子座位が、ペルオキシソームアシルＣｏＡオキシダーゼ（ＰＯＸ１）遺伝子を含む、請求項５に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項７】
（ａ）アンテイソ脂肪酸が１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸であり；
（ｂ）イソ脂肪酸がパルミチン酸であり；
（ｃ）ＤＣＡがドデカン二酸、ｎ−ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ｎ−ヘキサデカン二酸、ｎ−メチルヘキサデカン二酸、オクタデカン二酸、ｎ−オクタデカン二酸、ｎ−メチルヘキサデカン酸、またはエイコサン酸であり；
（ｄ）ＣｏＡ活性化されたＤＣＡがヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデカン二酸ＣｏＡである、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項８】
（ａ）アンテイソ脂肪酸が１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、または１６−メチルオクタデカン酸であり；
（ｂ）イソ脂肪酸がパルミチン酸であり；
（ｃ）ＤＣＡがｎ−メチルヘキサデカン酸またはｎ−ヘキサデカン二酸であり；
（ｄ）ＤＣＡ−ＣｏＡがｎ−ヘキサデカン二酸ＣｏＡまたはｎ−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡである、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項９】
（Ｓ）−２−メチル酪酸が少なくとも８０％ｅｅの光学純度を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１０】
（ａ）Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチドが、配列番号３４または３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｂ）３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチドが、配列番号３６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｃ）（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチドが、配列番号３７または３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｄ）（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチドが、配列番号２３または２４のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｅ）（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチドが、配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｆ）アンテイソ脂肪酸からまたはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチドが、配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、または４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｇ）ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチドが、配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドを含み；
（ｈ）ＣｏＡ活性化されたＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；
（ｉ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１１】
１つ以上の大環状ケトン前駆体が、１２−メチルテトラデカン酸、（Ｓ）−１２−メチルテトラデカン酸、１４−メチルヘキサデカン酸、（Ｓ）−１４−メチルヘキサデカン酸、１６−メチルオクタデカン酸、（Ｓ）−１６−メチルオクタデカン酸、ドデカン二酸（ドデカン−１，１２−二酸）、（Ｅ）−２−ドデセン二酸、ｎ−ドデセン二酸、３−ドデセン二酸（二重結合は特定しない）、テトラデカン二酸（テトラデカン−１，１４−二酸）、５−テトラデセン二酸、（５Ｚ）−ｎ−テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸（ヘキサデカン−１，１６−二酸）、７−ヘキサデセン二酸、（７Ｚ）−ｎ−ヘキサデセン二酸、オクタデカン二酸（オクタデカン−１，１８−二酸）、９−オクタデセン二酸、（９Ｚ）−ｎ−オクタデセン二酸、エイコサン二酸、エイコサン酸、９−エイコセン二酸、（９Ｚ）−ヘキサデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−ヘキサデセンジオイルＣｏＡ、オクタデカンジオイル補酵素Ａ、ｃｉｓ−９−オクタデセンジオイルＣｏＡ、ヘキサデカン二酸ＣｏＡ、ｎ−ヘキサデセン二酸ＣｏＡ、オクタデカン二酸ＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブタノイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−二酸、（Ｒ）−３−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１０−メチルドデカン−１，１２−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−二酸、（Ｒ）−（＋）−３−メチルヘキサデカン酸、（Ｒ）−３−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１２−メチルテトラデカン−１，１４−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−二酸、（Ｒ）−３−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１４−メチルヘキサデカン−１，１６−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−３−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｒ）−１６−メチルオクタデカン−１，１８−ジオイルＣｏＡ、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡ、３−メチルヘキサデカン二酸、３−メチルヘキサデカン二酸ＣｏＡ、またはｎ−オクタデセン二酸ＣｏＡである、請求項１、２、または５〜１０のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１２】
１つ以上の大環状ケトンがｌ−ムスコン、ノルムスコン、またはシベトンである、請求項１または３〜１０のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１３】
組換え体ホスト細胞が植物細胞、哺乳類細胞、昆虫細胞、真菌細胞、藻類細胞、古細菌細胞、または細菌細胞である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞と：
（ａ）組換え体ホスト細胞によって生産された１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと；
（ｂ）微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素と；
を含み、
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが少なくとも１ｍｇ／細胞培養物のリットルの濃度で存在する、
細胞培養物。
【請求項１５】
（ａ）組換え体ホスト細胞によって生産された１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせと；
（ｂ）微量金属、ビタミン、塩、イーストナイトロジェンベース（ＹＮＢ）、および／またはアミノ酸を含む補助栄養素と；
を含み、
１つ以上の大環状ケトン前駆体および／または１つ以上の大環状ケトン、ＤＣＡ、ＤＣＡ−ＣｏＡ、アンテイソ脂肪酸、またはそれらの組み合わせが少なくとも１ｍｇ／細胞培養物のリットルの濃度で存在する、
細胞培養物中の増殖した請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換え体ホスト細胞からの細胞培養物ライセート。
【請求項１６】
（ａ）配列番号３４もしくは３５のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、Ｌ−イソロイシンから３−メチル−２−オキソペンタノエートを合成することができるポリペプチド；
（ｂ）配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、３−メチル−２−オキソペンタノエートから（Ｓ）−２−メチルブタナールを合成することができるポリペプチド；
（ｃ）配列番号３７もしくは３８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブタナールから（Ｓ）−２−メチル酪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｄ）配列番号２３もしくは２４のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチル酪酸から（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｅ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、（Ｓ）−２−メチルブチリルＣｏＡからアンテイソ脂肪酸を合成することができるポリペプチド；
（ｆ）配列番号２１、２２、４１、４２、４３、４４、４５、もしくは４６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも６０％の配列同一性を有する、アンテイソ脂肪酸からもしくはイソ脂肪酸からＤＣＡを合成することができるポリペプチド；
（ｇ）配列番号３３のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、ＤＣＡからＤＣＡ−ＣｏＡを合成することができるポリペプチド；
（ｈ）ＤＣＡからムスコンを合成することができるポリペプチド；および／または
（ｉ）ＤＣＡ−ＣｏＡからムスコンを合成することができるポリペプチド、
をコードする核酸分子。
【請求項１７】
核酸分子がｃＤＮＡである、請求項１６に記載の核酸分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｃ】
2021500915.tif 000001