(57)【要約】      （修正有）【課題】Ａｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストを有効成分として含む、炎症性肝疾患を治療又は予防するための医薬の提供。【解決手段】Ａｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストが、Ａｎｇｐｔｌ３又はαｖβ３インテグリンに結合し、Ａｎｇｐｔｌ３の特異的な結合能を阻害し、αｖβ３インテグリンによって媒介される細胞性応答を調節する。該アンタゴニストは、Ａｎｇｐｔｌ３抗体又は抗αｖβ３インテグリン抗体、又はイムノグロブリン配列に融合したαｖβ３インテグリンのリガンド結合領域を含む又は、Ａｎｇｐｔｌ３のレセプター結合領域を含むイムノアドヘシン。該アンタゴニストはＡｎｇｐｔｌ３のアミノ酸配列に少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むぺプチド。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストを用いて組織を治療することを含んでなる、Ａｎｇｐｔｌ３の過剰発現を特徴とする組織損傷の治療方法。
【請求項２】
組織が肝組織である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組織損傷が炎症に関連している請求項２に記載の方法。
【請求項４】
組織損傷が慢性肝疾患に関連している請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組織損傷が肝腫瘍に関連している請求項２に記載の方法。
【請求項６】
組織が心臓組織である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
組織損傷が炎症に関連している請求項６に記載の方法。
【請求項８】
組織損傷がＡｎｇｐｔｌ３の上昇発現を特徴とする心疾患に関連している請求項６に記載の方法。
【請求項９】
アンタゴニストが抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体、又は抗αｖβ３抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アンタゴニストがイムノアドヘシンである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
必要とする哺乳類対象体に有効量のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストを投与することを含んでなる、哺乳類対象体における慢性肝疾患の治療方法。
【請求項１２】
慢性肝疾患がＡｎｇｐｔｌ３の上昇発現を特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アンタゴニストが抗Ａｎｇｐｔｌ３又は抗αｖβ３抗体である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
対象体に有効量のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストを投与することを含んでなる、哺乳類対象体における、Ａｎｇｐｔｌ３の上昇発現を特徴とする心臓病の治療方法。
【請求項１５】
アンタゴニストが抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体、又は抗αｖβ３抗体である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
必要とする哺乳類対象体に、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する治療有効量のポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含んでなる、急性肝疾患の治療方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列のアミノ酸領域２８１−２９３（Ｐ１, 配列番号１４）、４４２−４６０（Ｐ２, 配列番号１５）、及び４１５−４３０（Ｐ３, 配列番号１７）を有する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列のフィブリノゲンドメインを有する請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
付加的な治療薬の投与をさらに含んでなる請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記アゴニストが、Ａｎｇｐｔｌ３又はαｖβ３に特異的に結合するアゴニスト抗体である請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
必要とする哺乳類対象体に、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する治療有効量のポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含んでなる、急性肝傷害後の肝再生誘発方法。
【請求項２２】
配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する有効量のポリペプチド又はそのアゴニストで組織を治療することを含んでなる、組織における血管新生誘発方法。
【請求項２３】
組織が肝組織である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
組織が心臓組織である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
有効量のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストで組織を治療することを含んでなる、組織における血管透過性の望ましくない亢進の抑制方法。
【請求項２６】
組織が肝組織である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
組織が心臓組織である請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ヒト対象体の心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルを、正常な心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３又はその発現産物のレベルと比べて決定することと、該対象体の心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルが正常な心臓細胞と比べて高い場合、該対象体を危険性があるとして同定することを含んでなる、心臓血管疾患の危険性があるヒト対象体の同定方法。
【請求項２９】
対象体の肝組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルを、正常な肝組織におけるＡｎｇｐｔｌ３又はその発現産物のレベルと比べて決定することと、該対象体の肝組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルが正常な肝細胞と比べて高い場合、該対象体を危険性があるとして同定することを含んでなる、肝損傷の危険性があるヒト対象体の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチド、並びにそのようなタンパク質分子とＡｎｇｐｔｌ３に結合する抗体の作製及び使用方法及び手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
新生血管の増殖は、胚及び生後発育の通常の生理的過程中の必須条件である。先在する毛細血管からの新生血管のこういった増生（血管新生と称される過程）はさらに、充実性腫瘍、糖尿病性網膜症、乾癬、炎症及びリウマチ様関節炎の病理進行において重要な役割を果たす（Ferrara, Recent Prog. Horm. Res. 55:15-35 (2000), discussion 35-6）。
【０００３】
血管新生は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）といった増殖因子に依存するだけでなく、インテグリンを含む細胞接着分子（ＣＡＭ）によっても影響される。特定の接着レセプターをコードする様々な遺伝子の不活性化、又は動物モデルへの遮断抗体の投与は、内皮細胞の血管新生反応に著しい影響を及ぼした（Elicieri及びCheresh, Mol. Med., 4:741-50 (1998)）。
【０００４】
細胞接着タンパク質のインテグリンファミリーは、少なくとも２２の異なるαβヘテロ二量体の組合せで発現される１５のαと８のβサブユニットからなる（Byzova等, Mol. Cell., 6(4):851-60 (2000)）。これらのうち、少なくとも６の組合せ（αｖβ３, αｖβ５, α５β１, α２β１, αｖβ１及びα１β１）が血管新生と関連している（Hynes及びBader, Thromb. Haemost., 78(1):83-7 (1997)；Hynes等, Braz. J. Med. Biol. Res., 32(5):501-10 (1999)）。インテグリンは、細胞隙間及び基底膜に見られる細胞外マトリクスタンパク質への細胞接着と、該タンパク質への転位を容易にする。
【０００５】
インテグリンαｖβ３は、とりわけビトロネクチン、フィブロネクチン、フィブリノゲン、ラミニン、コラーゲン、フォン・ヴィレグブランド因子、オステオポンチン、及びＭＭＰ２（ＰＥＸ）断片を含む多種多様の細胞外マトリクスタンパク質のレセプターである（Eliceiri及びCheresh, Cancer J. Sci. Am. 6 Suppl 3:S245-9 (2000)参照）。その無差別なリガンド結合性にも関わらず、αｖβ３は成体組織では広く発現されず、一部の血管、腸及び子宮の平滑筋細胞に見られる（Brem等, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 35:3466-74 (1994)）。このレセプターは特定の活性化白血球、マクロファージ及び破骨細胞でも発現され、破骨細胞においては骨吸収の間重要な役割を果たす（McHugh等, J. Clin. Invest., 105:433-40 (2000)）。最も顕著には、αｖβ３は低酸素状態に曝された内皮細胞と、血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ-Ａ）といったサイトカインで上方制御される（Suzuma等, Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 39:1029-35 (1998)；Walton等, J. Cell. Biochem.. 78:674-80 (2000)）。インビボで、αｖβ３発現の増加が、腫瘍肉芽組織内の血管細胞で、創傷治癒、黄斑変性及び他の新生血管疾患中に観察された。腫瘍血管新生の様々なインビトロ及びインビボモデルで、モノクローナル抗体又はリガンドアンタゴニストを用いたαｖβ３の阻害によって、血管形成の鈍化がもたらされた（Brooks等, Cell 79:1157-64 (1994)；Eliceiri及びCheresh, Mol. Med. 4:741-50 (1998)）。
【０００６】
腫瘍増殖又は心筋虚血後の側副血管形成といった病的状態における血管新生の調整に関与するメカニズムに焦点を当てた報告は膨大な数に昇るが、肝再生中の血管新生過程の役割は驚いたことに殆ど知られていない。部分的な肝切除（ＰＨ）の後、肝細胞と非実質細胞の双方が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡを発現し（Mochida等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 226:176-9 issn: 0006-291x (1996)）、このことはVEGFが、血管新生を誘発することによって、肝再生で役割を果たし得ることを示す。しかし、ＶＥＧＦに対する中和抗血清によって、傷害後の治癒率は変化しなかったが、増殖型内皮細胞及び肝細胞はこのモデルにおいて減少した（Taniguchi等, J. Histochem. Cytochem. 49:121-30 (2001)）。このことに加えて、血管新生インヒビターＴＮＰ４７０は部分的な肝切除後の創傷治癒を妨げなかった。これは肝再生中、ＴＮＰ４７０感受性血管新生は必要とされないことを示唆する（Tanaka等, Br. J. Surg., 83(10):1444-7 (1996)）。
【０００７】
肝再生、特に肝再生中の血管新生過程に関与する新規な因子を同定する必要がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と配列同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのアゴニストを、Ａｎｇｐｔｌ３の過剰発現を特徴とする組織損傷を治療するために使用することに関する。特に本発明は、組織損傷、好適には肝又は心臓組織損傷の危険性があるヒト対象体の治療（予防を含む）又は同定におけるＡｎｇｐｔｌ３の使用に関する。従って、Ａｎｇｐｔｌ３は肝再生中の血管新生過程の調整に関与すると考えられる。
【０００９】
本発明は、配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニスト又はその哺乳類ホモログを用いた組織治療からなる、Ａｎｇｐｔｌ３の過剰発現を特徴とする組織損傷の治療方法に関する。１つの実施態様で、治療は予防を含み、より特定すると組織損傷の進行の予防を含む。
【００１０】
好適な実施態様で、組織は好ましくはヒト肝組織である。アンタゴニストは好ましくは配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストである。組織損傷は、炎症又は肝腫瘍と関連しているのが好ましい。炎症は、肝硬変、肝線維症、慢性肝炎、ウイルス性肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＧ型、中毒代謝性肝損傷、脂肪肝、肝臓の虚血再灌流傷害、及び敗血症からなる群から選択された慢性肝疾患と関連しているのが好ましい。肝硬変は、アルコール性肝硬変又は原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）である。肝炎は、慢性自己免疫性肝炎、慢性アルコール性肝炎、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される。肝腫瘍は、肝細胞癌、胆管癌、及び肝臓の転移性癌からなる群から選択される。
【００１１】
他の実施態様で、組織は好ましくは心臓組織である。組織損傷は、炎症と関連しているのが好ましい。組織損傷は、Angptl3の発現の上昇を特徴とする心疾患と関連しているのが好ましい。また別の側面では、組織損傷は、その病因が炎症反応を含む心疾患、又はその進行において炎症が危険因子である心疾患と関連している。心疾患は、冠動脈疾患、心筋症、心筋炎、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、及び心筋梗塞からなる群から選択されるのが好ましい。心筋症は、非特異性肥大、及び拡張型心筋症からなる群から選択されるのが好ましい。
【００１２】
他の実施態様で、アンタゴニストは抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体、抗αｖβ３抗体、イムノアドヘシン又は小分子である。抗体は好ましくは、モノクローナル抗体、抗体断片、又はＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片からなる群から選択された単鎖抗体である。モノクローナル抗体は好ましくは、キメラ化、ヒト化又はヒトモノクローナル抗体である。イムノアドヘシンは、少なくとも、免疫グロブリン配列と融合したαｖβ３のリガンド結合領域を有するか、又は少なくとも、免疫グロブリン配列と融合したＡｎｇｐｔｌ３のレセプター結合領域を有する。
【００１３】
また別の側面で、本発明は、必要とする哺乳類対象体に有効量の配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニスト又はその哺乳類ホモログを投与することを含んでなる、哺乳類対象体における慢性肝疾患の治療方法を含む。１つの実施態様で、哺乳類対象体はヒトである。治療は予防を含み、より特定すると肝損傷の進行の予防を含む。投与されるアンタゴニストは配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニスト又は抗体、特に抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体又は抗αｖβ３抗体である。慢性肝疾患はＡｎｇｐｔｌ３の発現の上昇を特徴とする。肝疾患は、肝硬変、肝線維症、慢性肝炎、ウイルス性肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＧ型、中毒代謝性肝損傷、脂肪肝、肝臓の虚血再灌流傷害、及び敗血症からなる群から選択される。
【００１４】
また別の側面で、本発明は、対象体に有効量の配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニスト又はその哺乳類ホモログを投与することを含んでなる、哺乳類対象体における心臓病の治療方法を含む。１つの実施態様で、哺乳類対象体はヒトである。治療は予防を含み、より特定すると心疾患の進行の予防を含む。投与されるアンタゴニストは配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストである。心臓病は、冠動脈疾患、心筋症、心筋炎、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、及び心筋梗塞からなる群から選択される。アンタゴニストは、抗Angptl3抗体又は抗αｖβ３抗体である。
【００１５】
また別の側面で、本発明は、必要とする哺乳類対象体に、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する有効量のポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含んでなる、哺乳類対象体における急性肝疾患の治療方法を含む。１つの実施態様で、哺乳類対象体はヒトである。治療は予防を含み、より特定すると急性肝疾患の進行の予防を含む。ポリペプチドは配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又はそのアゴニストを有する。好適な実施態様で、ポリペプチドは配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列のアミノ酸領域２８１−２９３（Ｐ１、配列番号１４）、４４２−４６０（Ｐ２、配列番号１５）、４１５−４３０（Ｐ３、配列番号１７）を有する。さらに好適な実施態様で、ポリペプチドは配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列のフィブリノゲンドメインを有する。さらに好適な実施態様で、当該方法は付加的な治療薬の投与を含んでなる。付加的な治療薬は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）又は繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である。アゴニストは、Ａｎｇｐｔｌ３又はαｖβ３に特異的に結合するアゴニスト抗体である。
【００１６】
また別の側面で、本発明は、必要とする哺乳類対象体に、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する治療有効量のポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含んでなる、急性肝傷害後の肝再生誘発方法を含む。哺乳類対象体はヒトであるのが好ましい。ヒト対象体は、炎症性肝疾患、例えば慢性、アルコール性又はウイルス性肝炎、敗血症、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、又は原発性又は転移性肝癌であると診断されているか、肝臓に化学的又は機械的傷害を受けているか、又は慢性肝炎、肝硬変、原発性又は転移性肝癌、又は胆嚢癌等、何らかの原因で肝切除を受けている者であってよい。あるいは、患者は、肝傷害を引き起こす化学薬品又は他の環境又は他の因子に曝されていて、そういった傷害が進行する前に処置を受けている者であってよい。予防的処置は厳密に言えば本発明の範囲内である。
【００１７】
また別の側面で、本発明は、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する有効量のポリペプチド又はそのアゴニストで組織を治療することを含んでなる、組織における血管新生誘発方法を含む。１つの実施態様で、組織は、感染過程又は自己免疫過程、機械的又は化学的傷害、又は癌又は転移性癌の結果、損傷を受けた病変肝組織であり得る肝組織又は心臓組織である。予防的処置、より具体的には疾患の進行の予防は厳密に言えば本発明の範囲内である。
【００１８】
また別の側面で、本発明は、有効量の配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニスト又はその哺乳類ホモログを投与することを含んでなる、組織における血管透過性の望ましくない亢進の抑制方法を含む。血管透過性の亢進は、組織損傷後の小血管透過性の亢進であり得て、毒素への露出による血管内皮の壊死に続いて起こり得る。血管透過性の亢進は、炎症、好ましくは慢性炎症と関連する。組織は肝組織又は心臓組織である。予防的処置、より具体的には疾患の進行の予防は、厳密に言えば本発明の範囲内である。
【００１９】
また別の側面で、本発明は、好ましくは深刻な損傷が起こる前に、心臓血管疾患の危険性があるヒト対象体を同定する方法を含む。当該方法は、該対象体の心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルを、該対象体の心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３又はその発現産物のレベルと比べて、正常な心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３又はその発現産物のレベルと比べて決定することと、該対象体の心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルが正常な心臓細胞と比べて高い場合、該対象体を危険性があるとして同定することを含んでなる。心臓細胞サンプルは、心臓血管疾患の危険性が疑われている対象体、好ましくはヒト患者から採取され、配列番号１のヒトＡｎｇｐｔｌ３遺伝子の上方制御を検出するための遺伝子発現変化分析を受け、ここで、危険性のある心臓組織サンプルにおけるＡｎｇｐｔｌ３の発現が、正常な心臓組織から採取された第二の心臓サンプルにおける発現と比較される。遺伝子発現変化分析は、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む周知の技術によって、又はマイクロアレイ技術を用いて実行されてよい。
【００２０】
また別の側面で、本発明は、好ましくは深刻な損傷が起こる前に、肝損傷の危険性があるヒト対象体を同定する方法を含む。当該方法は、該対象体の肝組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルを、正常な肝組織におけるＡｎｇｐｔｌ３又はその発現産物のレベルと比べて決定することと、該対象体の肝組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルが正常な肝組織と比べて高い場合、該対象体を危険性があるとして同定することを含んでなる。肝組織サンプルは、肝疾患の危険性が疑われている対象体、好ましくはヒト患者から採取され、配列番号１のヒトＡｎｇｐｔｌ３遺伝子の上方制御を検出するための遺伝子発現変化分析を受け、ここで、危険性のある肝サンプルにおけるＡｎｇｐｔｌ３の発現が、正常な肝組織から採取された第二の肝サンプルにおける発現と比較される。遺伝子発現変化分析は、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）を含む周知の技術によって、又はマイクロアレイ技術を用いて実行されてよい。
【００２１】
全ての治療への応用（予防を含む）において、Angptl3ポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、さらなる治療薬、例えばさらなる血管新生因子、例えば血管内皮増殖因子（VEGF）又は繊維芽細胞増殖因子（FGF）と組合わせて投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ａｎｇｐｔｌ３のヌクレオチド配列（配列番号１）（ＤＮＡ１６４５１）である。
【図２Ａ】図２Ａは、Ａｎｇｐｔｌ３のアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ａｎｇｐｔｌ３のアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図３Ａ】図３Ａは、Ａｎｇｐｔｌ３（配列番号２）及びアンジオポエチン-１（ＡＮＧ１）及びアンジオポエチン-２（ＡＮＧ２）のドメイン構造の比較である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｇＤエピトープタグ付きヒトＡＮＧ２、ＡＲＰ１、Ａｎｇｐｔｌ３を含む条件付培地又はコントロール培地でインキュベートしたＨＭＶＥＣ細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図４】ｇＤタグ付きＡＮＧ１、ＡＮＧ２、ＡＲＰ１、Ａｎｇｐｔｌ３及びＴｉｅ１レセプター又はＴｉｅ２レセプターをそれぞれコードするプラスミドと同時形質移入された２９３細胞を用いた、同時免疫沈降実験の結果を示す。上清をＴｉｅ１又はＴｉｅ２に対する抗体で免疫沈降し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分解しＰＶＤＦ膜にブロットしたタンパク質を、ｇＤタグ又はＴｉｅレセプターに対する抗体とインキュベートした。
【図５】図５Ａ−Ｃは、Ａｎｇｐｔｌ３のフィブリノゲンドメインのホモロジーモデリングを示す。（Ａ）白色は、ヒトフィブリノゲン（３ＦＩＢ）のγ鎖のＣ末端のｘ線構造の重ね合わせのリボンダイヤグラム、及び緑色は、Ａｎｇｐｔｌ３のフィブリノゲン様ドメインのモデル化構造。α螺旋を円柱として、β鎖を矢印として示す。双方の構造で異なる領域を標識化した。（Ｂ）緑色は、Ａｎｇｐｔｌ３のフィブリノゲン様ドメインのモデル化構造。α５β３に関与する領域Ｐ１、Ｐ２及びＰ３を黄色でハイライトする。（Ｃ）ヒトフィブリノゲン（３ＦＩＢ）（配列番号２７）のγ鎖のＣ末端と、Ａｎｇｐｔｌ３のフィブリノゲン様ドメイン（配列番号２８）と、ヒトアンジオポエチン１（配列番号２９）、２（配列番号３０）及び４（配列番号３１）の配列アラインメント。親水及び荷電残基を青色で示し、芳香族／疎水残基をオレンジ色で示す。コンセンサス配列をアラインメントの下に示し；親水／荷電及び芳香族／疎水変異をそれぞれ、青色とオレンジ色で印を付けた。我々の研究で使用したペプチドに対応する残基を黄色の四角で囲む。番号付けは３ＦＩＢｘ線構造に対応する。
【図６】図６Ａ−Ｃは、Ａｎｇｐｔｌ３が分泌糖タンパク質である証拠を提示する。（Ａ）イムノアフィニティで精製したヒトＡｎｇｐｔｌ３の、クマシー染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲル。（Ｂ）一過性形質移入されたＣＨＯ細胞からの、イムノアフィニティで精製したマウスＡｎｇｐｔｌ３の、銀染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲル。（Ｃ）ＰＮＧａｓｅ-Ｆ処理あり（＋）又はなし（−）での組換えＡｎｇｐｔｌ３タンパク質の分子量の比較。ｇＤタグ付きｈＡｎｇｐｔｌ３の予想分子量は６０ｋＤａである。抗ｇＤ抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
【図７Ａ】図７Ａ−Ｅは、Ａｎｇｐｔｌ３による内皮細胞結合に関与するドメインの機能分析と生物学的反応のメディエーターとしてのαｖβ３インテグリンの同定を示す。（Ａ）ペプチドｐ１、ｐ２及びｐ３（１００μＭ又は２５０μＭ総量）、コントロール（ＮＬ６-ＰＰ２-ｓｃｒ, ２５０μＭ）又はＲＧＤ又はＲＧＥペプチド（２５０μＭ）の組合わせとのプレインキュベーション後、４時間にわたる２００ｎＭ ＭＡでの刺激前に、ＨＭＶＥＣ接着を検査した。２００ｎＭ ＰＭＡの存在下且つペプチドの不在下での接着を１００％の値とした。
【図７Ｂ】（Ｂ）インテグリンαＩＩｂβ３、αｖβ３, αｖβ１又はαｖβ５の何れかを過剰発現している２９３細胞の接着を、２０μｇ／ｍｌ ｈＡｎｇｐｔｌ３又はＢＳＡで被膜したマイクロタイタープレートで検査した。細胞は、３７℃で接着でき、４時間後に定量化できた。
【図７Ｃ】（Ｃ）９６ウェルプレートを、４℃で終夜ｈＡｎｇｐｔｌ３の増加量で被膜し、３７℃で１時間３％ＢＳＡによって非特異的な結合を遮断し、ＨＭＶＥＣ細胞をプレート化する前にウェルをＰＢＳで洗浄した。示したデータは、３つの別個の実験のＳＤと手段である。
【図７Ｄ】（Ｄ）２００ｎＭ ＰＭＡでの刺激前、２５ｍｇ／ｍｌの遮断抗体、抗α５β１（ＪＢＳ５）、抗αｖβ３（ＬＭ６０９）又は抗 αｖβ５（Ｐ１Ｆ６）あり又はなしで、ＨＭＶＥＣをプレインキュベートした。ネガティブコントロールとして、１０ｍＭ ＥＤＴＡの存在下で接着を行った。
【図７Ｅ】（Ｅ）１６時間にわたって２５μｇ／ｍｌ遮断抗体、抗αｖβ３（ＬＭ６０９）又は抗 αｖβ５（Ｐ１Ｆ６）の存在下又は不在下でｈＡｎｇｐｔｌ３で刺激された又は非刺激の（５０μｇ／ｍｌ）ＨＭＣＥＣの転位。
【図８Ａ】図８Ａ−Ｃは、進行中、肝細胞にＡｎｇｐｔｌ３が発現し、病的な肝臓では強く上方制御されることを示す。（Ａ）ヒト多組織ブロット（Clontech）を用いてｈＡｎｇｐｔｌ３のノーザンブロット分析を行い、これにより肝臓及び腎臓におけるｈＡｎｇｐｔｌ３の発現が示された。各レーンは、成体の脳（ＢＲ）、心臓（ＨＴ）、骨格筋（ＳＭ）、結腸（ＣＯ）、胸腺（ＴＨ）、脾臓（ＳＰ）、腎臓（ＫＤ）、肝臓（ＬＩ）、小腸（ＳＩ）、胎盤（ＰＬ）、肺（ＬＵ）及び末梢血白血球（ＰＢＬ）からの２μｇのＲＮＡを含む。
【図８Ｂ】（Ｂ）ｈＡｎｇｐｔｌ３の発現は、肝硬変を患った及びアセトミノフェンで毒性傷害を受けた組織の肝細胞で強く上方制御される。肝臓腫瘍サンプルでは変化が見られなかった。
【図８Ｃ】（Ｃ）胎仔マウスの肝臓のインサイツハイブリダイゼーションは、肝細胞においてＥ１５及びＥ１８でｍＡｎｇｐｔｌ３の発現を示したが、赤血球前駆体、内皮細胞及び巨核球においては見られなかった。
【図９Ａ−Ｄ】図９Ａ−Ｅは、マウス角膜におけるインビボでの血管新生の誘発への、ＣＣＬＦ１の影響を示す。（Ａ）バッファー（コントロール）、（Ｂ）マウスＡｎｇｐｔｌ３（５００ｎｇ）、（Ｃ）ＶＥＧＦ（１００ｎｇ）、（Ｄ）マウスＡｎｇｐｔｌ３（５００ｎｇ）及びＶＥＧＦ（１００ｎｇ）で処置されたハイドロン・ペレット（hydron pellets）の注入後６日目のマウス角膜の代表的な平面顕微鏡写真。
【図９Ｅ】（Ｅ）コントロール、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ）、ｍＡｎｇｐｔｌ３（５００ｎｇ）、ｍＡｎｇｐｔｌ３（５００ｎｇ）及び上述した組合わせに対するインビボでの血管新生反応の概略データ。データは平均±ＳＥとして表され、ｎ＝５動物／群である。コントロールと比較してｐ＜０.００５（ノンパラメトリック値のMann-Whitney検定）。
【図１０Ａ】図１０Ａ−Ｂは、０日目にアデノウイルス感染させ、４日目にＣＣｌ４で処置した後７日目にアスパラギン酸トランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血中濃度によって評価された、ＣＣｌ４誘発肝臓毒性における、マウスＡｎｇｐｔｌ３の保護効果を示す。図１０Ａは、０日目にアデノウイルス感染させ、４日目にＣＣｌ４で処置した後７日目における、検査された全コンストラクトの同等の発現レベルを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、０日目に示されたウイルスベクターで、４日目にＣＣｌ４で処置した後７日目における、マウスの血清中のＡＳＴレベルを示す（Ｐ＜０.０００１）。
【図１１Ａ】図１１Ａ−Ｂは、Ｃ５７／Ｂ１６野生型マウスの肝臓におけるマウスＡｎｇｐｔｌ３の長期発現後の血清ＡＳＴレベルの上昇を示す。図１１Ａは、０日目に示されたウイルスコンストラクトで、４日目にＣＣｌ４で処置した後の様々な時点でのマウスの血清中のＡＳＴレベルを示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、アデノウイルス感染後２週目のＲＡＧ２ノックアウトマウスの血清中のＡＬＴ及びＡＳＴレベルの上昇を示す。結果は平均±ＳＥＭで示す。１群あたりの動物の数は６である（Ｐ＜０.０００１）。
【図１２Ａ】図１２Ａ−Ｄは、Ａｎｇｐｔｌ３発現アデノウイルスベクターの皮内投与に反応した、Ｋ５−Ａｎｇｐｔｌ３トランスジェニックマウス又は野生型ＦＶＢマウスの皮膚における血管露出の増加を示す。図１２Ａは、トランスジェニック及びリットルが同等の野生型コントロールマウスの様々な器官から単離されたＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。皮膚での導入遺伝子発現は、肝臓で検出された内因性Ａｎｇｐｔｌ３発現レベルの約１０％に達した。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、生後様々な時点でトランスジェニック及びリットルが同等の野生型コントロールマウスの皮膚生検から単離されたＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、血管透過性レベルを決定するために、生後１１週目のトランスジェニック及びリットルが同等の野生型コントロールマウスに施されたエバンスブルーアッセイの結果を示す。トランスジェニックマウスは、基本条件において（左側パネル）血管透過性の有意な亢進を示したが、からし油が投与された場合（右側パネル）示さなかった。滲出したエバンスブルー色素の量を、分光光度計を用いて６１０ｎｍで測定し、湿った組織の重量１ｍｇ（下側パネル）あたりの含有色素として示した。結果は平均±ＳＥＭで示し、１群あたりの動物の数は６で、Ｐ＜０.０５である。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、示されたアデノウイルスコンストラクトの１×１０９ Ｐｆｕが皮内注射されたＦＶＢマウスの投与後６日目に行われたエバンスブルーアッセイの結果を示す。Ａｎｇｐｔｌ３（ｐ＜０.０５）又はＶＥＧＦ（ｐ＜０.００５）で処置されたマウスの皮膚は、コントロール処置マウス（ＬａｃＺ）と比較すると、基本条件下で（左側パネル）血管透過性の著しい亢進を示した。滲出したエバンスブルー色素の量を、分光光度計を用いて６１０ｎｍで測定し、湿った組織の重量１ｍｇ（下側パネル）あたりの含有色素として示した。結果は平均±ＳＥＭで示し、１群あたりの動物の数は６で、Ｐ＜０.０５である。
【図１３】図１３は、単離したばかりのマウス肝細胞の、組換えマウスＡｎｇｐｔｌ３（ｍＡｎｇｐｔｌ３）への結合レベルを示す。組換えｍＡｎｇｐｔｌ３、フィブロネクチン又はＢＳＡコントロールの示された濃度で被膜された培養皿への肝細胞接着を示す。非特異的結合を、３７℃で１時間３％ＢＳＡによって遮断し、細胞をプレート化する前にウェルをＰＢＳで洗浄した。示したデータは、３つの独立した実験全体を３回行ったうちの１つの典型的な実験の平均±ＳＤを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
好適な実施態様の詳細な説明
Ａ．定義
「肝疾患」なる用語はここで最も広義に使用され、根底にある原因に関わらず、何らかの種類の肝傷害に関連した任意の肝臓の疾患を表す。よって、肝疾患は、例えば、感染過程又は自己免疫過程、機械的又は化学的傷害、又は癌に起因するものであってよく、それらは全て「肝疾患」なる定義に含まれる。肝臓への化学的傷害は、種々の毒素、例えばアルコール、四塩化炭素、トリクロロエチレン、鉄分の過剰摂取、薬物の過剰摂取、薬物の副作用等によるものであり得る。
【００２４】
「炎症に関連した組織損傷」なる用語及びその文法的な変形は、少なくとも部分的に炎症に起因する、又は炎症反応を伴う任意の組織損傷を表すのに使用される。組織は、例えば肝組織又は心臓組織であってよく、組織損傷は、例えば炎症性肝疾患又は心臓疾患と関連していてよい。
【００２５】
「炎症性肝疾患」なる用語はここで、根底にある原因が感染過程又は自己免疫過程か、肝臓への化学的損傷か、又はその他かに関わらず、その病因が肝臓に炎症細胞の活性と漸増を引き起こす、任意の肝疾患を表すのに使用される。よって、炎症性肝疾患は、非限定的に、アルコール性肝炎及び肝硬変、ウイルス性肝炎、肝臓の虚血再灌流傷害、敗血症、及び原発性胆汁性肝硬変（PBC）を含む。概説に関しては、Lawson等, Toxicol Sci 54:509-16 (2000)参照。
【００２６】
「慢性肝疾患」なる用語はここで、Ａｎｇｐｔｌ３の過剰発現を特徴とする肝疾患を表すのに使用され、非限定的に、肝臓の炎症性疾患、及び肝臓癌を含む。肝臓の炎症性疾患は、例えば肝硬変、例えばアルコール性肝硬変及び原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、肝線維症、慢性肝炎、つまり慢性自己免疫性肝炎、慢性アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ、脂肪症としても知られる）、ウイルス性肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＧ型、中毒代謝性肝損傷、脂肪肝、肝臓の虚血再灌流障害、及び敗血症を含む。肝臓癌は、例えば、肝細胞癌、胆管癌、及び肝臓の転移性癌を含む。
【００２７】
「急性肝疾患」なる用語はここで、その病歴が通常６か月を超えない短期間の肝疾患を表すのに使用される。この定義に含まれるのは、例えば、急性肝炎、つまり急性自己免疫性肝炎及び急性アルコール肝炎、及び急性肝不全である。厳密に言えば、この定義に含まれるのは、Angptl3の過剰発現を特徴としない短期間の任意の肝疾患である。
【００２８】
「心疾患」なる用語はここで、その病因が炎症反応を含む任意の心疾患、又はその進行において炎症が危険因子である任意の心疾患を表すのに使用される。厳密に言えば、この定義に含まれるのは、Ａｎｇｐｔｌ３の過剰発現を特徴とする任意の心疾患である。この定義に包含される心疾患は、非限定的に、冠動脈疾患、心筋症、例えば肥大性心筋症、非特異性肥大及び拡張型心筋症、心筋炎、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞等である。
【００２９】
ここで使用される「アルコール性肝炎」は、過剰アルコール摂取に起因する急性及び慢性肝炎を含み、その範囲は、臨床検査結果の異常性が唯一の疾患の兆候である軽度の肝炎から、黄疸（ビリルビン滞留に起因する黄色の皮膚）、肝性脳症（肝不全に起因する神経機能障害）、腹水（腹部の体液貯留）、出血性食道静脈瘤（食道の静脈炎）、血液凝固異常及び昏睡等の合併症を伴う重度の肝機能障害にわたる。
【００３０】
ここで使用される「ウイルス性肝炎」なる用語は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＧ型肝炎感染による肝炎を表す。
【００３１】
Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）は、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス群からのウイルスであり、一般に、突然の発熱、倦怠感、悪心、食欲不振、及び腹部不快感を特徴とする軽度の疾病を引き起こし、数日で黄疸が生じる。
【００３２】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヘパドナウイルス科の多くは二本鎖のＤＮＡである。ＨＢＶは、ヒトに肝炎を引き起こし、この科の関連ウイルスは、アヒル、地リス及びウッドチャックに肝炎を引き起こす。ＨＢＶゲノムはｐｏｌ、ｅｎｖ、ｐｒｅ−ｃｏｒｅ及びＸの４つの遺伝子を有し、それらは各々、ウイルス性DNAポリメラーゼ、外膜タンパク質、プレコアタンパク質（ウイルスキャプシドへと処理される）及びプロテインＸをコードする。プロテインＸの機能は明らかではないが、宿主細胞遺伝子の活性化と癌の進行に関与し得る。ＨＢＶは、急性及び慢性肝炎を引き起こす。慢性感染される確率は年齢によって決まる。感染した新生児の９０％及び感染した幼児の５０％が慢性感染されることとなる。これに対して、ＨＢＶに感染した免疫適格性のある成体は、約５ないし１０％だけが慢性Ｂ型肝炎を患う。
【００３３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、フラビウイルス科の陽性の一本鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムは約１０,０００ヌクレオチドであり、約３,０００アミノ酸の単一ポリプロテインをコードする。ポリプロテインは、宿主細胞とウイルスプロテアーゼによって、３つの主な構造タンパク質とウイルス複製に必要な複数の非構造タンパク質へと処理される。わずかに異なるゲノム配列を有する複数の異なるＨＣＶ遺伝子型が同定されており、これらは予後及び治療に対する反応における差異と相関する。ＨＣＶに急性感染した個体の約８５％が慢性感染となる。故に、ＨＣＶは慢性（６か月以上続く）肝炎の主要な原因である。一旦慢性感染すると殆どの場合、治療なしでは治らない。稀に、ＨＣＶ感染は臨床的に急性の疾患及びさらには肝不全を引き起こすが、急性感染は殆どの場合、臨床的に検出困難である。
【００３４】
Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ、デルタウイルスとも呼ばれる）は、小さな環状ＲＮＡウイルスである。ＨＤＶは複製障害があるため、他のウイルスの存在がなければ増殖できない。ヒトでは、ＨＤＶ感染はＨＢＶ感染の存在下でのみ発生する。
【００３５】
Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）は、Ａ型肝炎疾患と臨床的に区別できない肝炎を通常引き起こす。症状は、倦怠感、食欲不振、腹痛、関節痛、及び発熱を含む。Ｅ型肝炎は伝染病及び地方病双方の形態で発生し、通常、汚染飲料水と関連している。
【００３６】
Ｇ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）は、ＨＣＶと関連しているが異なった、比較的新しく発見されたフラビウイルス属であり、急性及び慢性肝炎を引き起こし得る。
【００３７】
虚血再灌流傷害は、身体の一領域への血流が一時的に止められ（虚血）、次いで復旧される（再灌流）と起こる。「虚血再灌流傷害」及び「虚血性再灌流傷害」なる用語は、殆ど同じ意味で使われ、細胞の酸素欠乏と関連する初期の損傷と、細胞に酸素が再供給されたときの炎症反応と関連する後続の損傷とを表す。虚血再灌流傷害は、特定の大動脈瘤の治療及び臓器移植といった、特定の外科的処置中に発生し得る。該傷害は、血液供給が遮断された身体部分で発生するか、又は虚血期間中に完全な血液供給がなされた部分で発生し得る。肝臓の虚血再灌流傷害は、例えば肝臓及び胆管の外科的切除によって起こることがあり、急性肝細胞損傷及び壊死を含む肝機能障害等の合併症が臨床的に認められる。
【００３８】
「原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）」は、肝内の小胆管の炎症性破壊を特徴とする疾患である。ＰＢＣは最終的に肝硬変を引き起こす。ＰＢＣの病因は完全にはわかっていないが、自己抗体の存在のために一般に自己免疫性疾患と考えられているが、病原菌等、他の病因も完全に除外されてはいない。ＰＢＣと診断された患者の約９０％は女性で、最も多くは４０から６０歳の間である。
【００３９】
「敗血症」は、肝臓又は胆道を含む身体の任意の部分から発生し得る細菌感染の結果である。敗血症は、特に免疫系の弱った人間においては、生死に関わる状態となることがある。
【００４０】
ここで使用される「血管新生」なる用語は、新たな血管が既存の脈管構造から現れる過程を意味し、その進行には内皮細胞の増生及び運動性の双方が必要である。
【００４１】
「肝硬変」なる用語はここで、線維症と併発された肝内に蔓延した小結節を解剖学的に特徴とする病的な肝臓状態を表す。肝硬変は、慢性アルコール依存症、慢性ウイルス性肝炎、代謝性及び胆道疾患と関連するものを含む殆どの種類の慢性肝疾患が共通して最後に至る状態である。
【００４２】
「Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチド」「Ａｎｇｐｔｌ３タンパク質」及び「Ａｎｇｐｔｌ３」なる用語は、殆ど同じ意味で使われ、天然配列Ａｎｇｐｔｌ３及びＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチド変異体（ここでさらに定義する）を包含する。Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドは様々な源から、例えばヒト組織タイプから又は他の源から単離されるか、組換え及び／又は合成法によって調製されてよい。Ａｎｇｐｔｌ３は以前「ＦＬＳ１３９」「ＮＬ６」又は「ＣＣＦＬ１」とも称されたことに注意されたい。従って、Ａｎｇｐｔｌ３なる記載は何れも、ＦＬＳ１３９、ＮＬ６及びＣＣＦＬ１ポリペプチドを表すものでもある。
【００４３】
「天然配列Ａｎｇｐｔｌ３」又は「天然Ａｎｇｐｔｌ３」は、天然由来のＡｎｇｐｔｌ３分子と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。こういった天然配列Ａｎｇｐｔｌ３は自然から単離できるか、組換え及び／又は合成手段によって産生できる。「天然配列Ａｎｇｐｔｌ３」又は「天然Ａｎｇｐｔｌ３」なる用語は、厳密には、天然に存在する切断又は分泌型（例えば細胞外ドメイン配列）、天然に存在する変異型（例えば選択的にスプライシングされた型）及び天然に存在するＡｎｇｐｔｌ３の対立遺伝子多型を包含する。本発明の１つの実施態様で、天然配列Ａｎｇｐｔｌ３は、配列番号２のアミノ酸１ないし４６０を含む成熟又は完全長配列Ａｎｇｐｔｌ３である。配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドは、アミノ酸１位としてここで指定したメチオニン残基から始まることが示されているが、配列番号２のアミノ酸１位の上流又は下流の何れかに位置する他のメチオニン残基を、Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドの開始アミノ酸残基として使用することも考えられ且つ可能である。また、「天然配列Ａｎｇｐｔｌ３」及び「天然Ａｎｇｐｔｌ３」なる用語は、厳密には、開始メチオニンを持たないポリペプチドを含む。
【００４４】
「Ａｎｇｐｔｌ３変異体」又は「Ａｎｇｐｔｌ３変異体ポリペプチド」なる用語は、殆ど同じ意味で使われ、（ａ）配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドの残基１ないし４６０又はその非ヒト哺乳類ホモログ、又は（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のまた別の特異的由来断片又はその非ヒト哺乳類ホモログ、のアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する、下記に定義する活性Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドを意味する。こういったＡｎｇｐｔｌ３変異体ポリペプチドには、例えば、配列番号２の一又は複数の内部ドメイン内のみならず一又は複数のＮ及び／又はＣ末端においても、一又は複数のアミノ酸残基が付加もしくは欠失されているＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドが含まれる。通常、Ａｎｇｐｔｌ３変異体ポリペプチドは、配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドの残基１ないし４６０又はその非ヒト哺乳類ホモログと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。Ａｎｇｐｔｌ３変異体ポリペプチドは、天然Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチド配列を包含しない。通常、Ａｎｇｐｔｌ３変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３０アミノ酸長、あるいは少なくとも約４０アミノ酸長、あるいは少なくとも約５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約６０アミノ酸長、あるいは少なくとも約７０アミノ酸長、あるいは少なくとも約８０アミノ酸長、あるいは少なくとも約９０アミノ酸長、あるいは少なくとも約１００アミノ酸長、あるいは少なくとも約１５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約２００アミノ酸長、あるいは少なくとも約２５０アミノ酸長、あるいは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。特に好ましいＡｎｇｐｔｌ３変異体は、配列番号２の天然ヒトＡｎｇｐｔｌ３配列のアミノ酸領域２８１ないし１９３、４１５ないし４３０及び４４２−４６０の少なくとも１つ、又は非ヒト哺乳類Ａｎｇｐｔｌ３ホモログの対応領域を保持するか、又はそういった領域内に保守的なアミノ酸置換だけを含む。
【００４５】
「フィブリノゲンドメイン」又は「フィブリノゲン様ドメイン」なる用語は、Ａｎｇｐｔｌ３のアミノ酸配列（配列番号２）における約２３８位から約４６０位のアミノ酸配列を表すのに使用される。
【００４６】
ここで同定されるＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後の、そしていかなる保守的置換も配列同一性の一部と考えないとした、Ａｎｇｐｔｌ３配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、アミノ酸配列同一性％値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが図４Ａ-Ｑに提供されている配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用することによって、後述するように得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック・インコーポレーテッドによって作成され、図４Ａ-Ｑに示したソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559にユーザー向け文書とともに提出済みで、米国著作権登録番号TXU510087で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック・インコーポレーテッド, サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、図４Ａ-Ｑに提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標）V4.0Dでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００４７】
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対してある程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、該アラインメントのＡ及びＢで同一であるとスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。
【００４８】
特に明記しない限り、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて上記のようにして得られる。しかし、％アミノ酸配列同一性値は、また、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.からダウンロードできる。NCBI-BLAST2はいくつかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、該初期値は、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ値＝０.０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62である。
【００４９】
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対してある程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2によって、該アラインメントのＡ及びＢで同一であるとスコアされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。
【００５０】
「Ａｎｇｐｔｌ３変異体核酸配列」とは、下記に定義する活性Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドをコードする核酸分子であり、且つ（ａ）配列番号２のＡｎｇｐｔｌ３アミノ酸配列の残基１ないし４６０又はその非ヒト哺乳類ホモログをコードする核酸配列、又は（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列のまた別の特異的由来断片又はその非ヒト哺乳類ホモログをコードする核酸配列、のいずれかと少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、Ａｎｇｐｔｌ３変異体ポリヌクレオチドは、配列番号２の残基１ないし４６０又はそういったヒトポリペプチドの非ヒト哺乳類ホモログをコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、あるいは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、あるいは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。
【００５１】
通常、Ａｎｇｐｔｌ３変異体核酸配列は、少なくとも約３０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約３００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約６００ヌクレオチド長、あるいは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００５２】
ここで同定されるＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドをコードする核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入した後の、Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドコード化核酸配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェアのような公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長にわたる最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％核酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用することによって、後述するように得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック・インコーポレーテッドによって作成され、ソースコードは米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559にユーザー向け文書とともに提出済みで、米国著作権登録番号TXU510087で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック・インコーポレーテッド, サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIX（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX（登録商標） V4.0Dでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００５３】
ここでの目的のためには、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対してある程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍  
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、該アラインメントのＣ及びＤで同一であるとスコアされたヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。
【００５４】
特に明記しない限り、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて上記のようにして得られる。しかし、％核酸配列同一性値は、また、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov.からダウンロードできる。NCBI-BLAST2はいくつかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、該初期値は、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ値＝０.０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62である。
【００５５】
核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いられる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対してある程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2によって、該アラインメントのＣ及びＤで同一であるとスコアされたヌクレオチドの数であり、ＺはＤの全ヌクレオチド数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることが理解されるであろう。
【００５６】
他の実施態様で、Ａｎｇｐｔｌ３変異体ポリヌクレオチドは、活性Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドをコードする核酸分子であり、該核酸分子は、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で配列番号２の完全長Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイゼーション可能である。Ａｎｇｐｔｌ３変異体ポリペプチドは、Ａｎｇｐｔｌ３変異体ポリヌクレオチドによってコードされるものであってもよい。
【００５７】
上記のように実施されたアミノ酸配列同一性比較における「ポジティブ（陽性）」なる用語は、比較された配列において同一であるアミノ酸残基だけでなく、類似の特性を有している残基も含む。対象のアミノ酸残基に対してポジティブ値をスコアするアミノ酸残基は、対象のアミノ酸残基と同一であるか又は対象のアミノ酸残基の好適な置換であるものである。
【００５８】
ここでの目的のためには、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対するポジティブの％値（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対してある程度の％ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、該アラインメントのＡ及びＢで上述されたようなポジティブ値をスコアするアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％ポジティブは、ＢのＡに対する％ポジティブとは異なることが理解されるであろう。
【００５９】
「抗体」なる用語は最も広義に使用され、特に、例えば、単一の抗Ａｎｇｐｔｌ３モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、多エピトープ特異性を持つ抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体組成物、一本鎖抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体、及び抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体断片（下記参照）を包含する。ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量だけ存在することのある自然に存在し得る突然変異以外は同一である集団、から得られた抗体を表す。
【００６０】
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量だけ存在することのある自然に存在し得る突然変異以外は同一である集団、から得られた抗体を表す。
【００６１】
「抗体断片」は、無傷な抗体の一部を含み、好ましくは該無傷な抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（diabodies）；線状抗体（Zapata等, Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００６２】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる、各々が単一の抗原結合部位を持つ２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を表す名称を持つ残りの「Ｆｃ」断片とを産生する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を持ち、さらに抗原を架橋することができるＦ(ａｂ')２断片が生じる。
【００６３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つＣＤＲが相互作用してＶＨ-ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を決定するのは、この構造においてである。合わせて６つのＣＤＲが抗体に対する抗原結合特異性をもたらす。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体より低い親和性で、ではあるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
【００６４】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が付加されている点でＦａｂ'断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨはここで、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表す。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、最初は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００６５】
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型の一方に分類される。
【００６６】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α，δ，ε，γ及びμと呼ばれている。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造と三次元構造はよく知られている。
【００６７】
「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を表し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖で２つのドメインを対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して２つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えばＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)で、より詳述されている。
【００６８】
「単離された」抗体は、同定され、そして、その自然環境の成分から分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療的使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリー法で測定した場合９５重量％を越えるまで、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは（３）クマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元又は還元条件下においてＳＤＳ−ＰＡＧＥで均一となるまで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００６９】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性と特異性に使用されていることを意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメイン両方の高頻度可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインの、より高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の各可変ドメインは、大部分がβシート構造を取り入れ、３つのＣＤＲにより連結された４つのＦＲ領域を有しており、それらＣＤＲはβシート構造を連結するループを形成するか、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって互いに近接して保持されており、別の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat等, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, 647-669ページ (1991)）。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性への抗体の関与等、様々なエフェクター機能を示す。
【００７０】
ここで使用される場合「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合性を生じる抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４ (Ｌ１)、５０−５６ (Ｌ２)及び８９−９７ (Ｌ３)と、重鎖可変ドメインの残基３１−３５ (Ｈ１)、５０−６５ (Ｈ２)及び９５−１０２ (Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２ (Ｌ１)、５０−５２ (Ｌ２)及び９１−９６ (Ｌ３)と、重鎖可変ドメインの残基２６−３２ (Ｈ１)、５３−５５ (Ｈ２)及び９６−１０１ (Ｈ３)；Clothia及びLesk, J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７１】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。通例、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲからの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖＦＲ残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体能力をさらに洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは殆ど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは殆ど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は最適には、また、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321, 522-525 (1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が、カニクイザルを対象の抗原で免疫化して産生された抗体由来である、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤＴＭ抗体が含まれる。
【００７２】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合する抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外（即ち「異種」）の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的にはレセプター又はリガンドの結合部位を少なくとも含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ等の任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００７３】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長いと適切なアニーリングに必要な温度が高くなり、プローブが短いとそれに必要な温度は低くなる。ハイブリダイゼーションは、一般的に、相補鎖がその融点より低い環境に存在する場合に、変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーション配列の間で所望されるホモロジーの程度が高くなればなるほど、用いることができる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をよりストリンジェントにすることになり、低い温度はストリンジェンシーを低下させることになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明については、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００７４】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度のストリンジェンシー条件」は：（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度を用いるもの、例えば、５０℃において０.０１５Ｍの塩化ナトリウム／０.００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０.１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いるもの、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０.１％ウシ血清アルブミン／０.１％フィコール／０.１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６.５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いるもの；又は（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０.７５ＭのＮａＣｌ、０.０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６.８）、０.１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０.１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０.２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０.１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるもの、によって同定される。
【００７５】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989に記載されているように同定され、上記の条件よりストリンジェンシーの低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７.６）、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長等の因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するか、わかるであろう。
【００７６】
ここで用いられる「エピトープタグ」なる用語は、「タグポリペプチド」と融合したＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、その長さは融合されたポリペプチドの活性を阻害しないように十分に短いものである。タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。好適なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８ないし５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０ないし２０のアミノ酸残基）を有する。
【００７７】
Ａｎｇｐｔｌ３分子に関する「生物学的活性」及び「生物学的に活性な」なる語はここで、天然αｖβ３インテグリンレセプターを介した細胞反応、例えば血管内皮細胞の接着及び／又は転位を調節する及びそれらに特異的に結合する分子能力を示す。この文脈において、「調節」なる語は促進及び阻害の両方を含み、よって、本発明の（天然及び変異）Ａｎｇｐｔｌ３分子は天然αｖβ３インテグリンレセプターのアゴニスト及びアンタゴニストを含む。Ａｎｇｐｔｌ３リガンドの好適な生物学的活性はここで、脈管化（血管新生）の促進及び阻害を含み、そして特に、肝再生中の血管新生過程への関与を含む。
【００７８】
「アゴニスト」なる語は、本発明の天然Ａｎｇｐｔｌ３分子のペプチド及び非ペプチドアナログを示し、そして、それらが天然Ａｎｇｐｔｌ３レセプター（αｖβ３）を介したシグナリング能力を持つ場合はそういった天然Ａｎｇｐｔｌ３分子に特異的に結合する抗体を示す。換言すると、「アゴニスト」なる語は、Ａｎｇｐｔｌ３レセプター（αｖβ３）の生物学的役割との関連で定義される。好適なアゴニストは、上述したように、例えば肝再生中の脈管化（血管新生）の促進といった天然Ａｎｇｐｔｌ３の好適な生物学的活性を持つ。
【００７９】
「アンタゴニスト」なる語は、本発明の天然Ａｎｇｐｔｌ３分子のペプチド及び非ペプチドアナログを示し、そして、Ａｎｇｐｔｌ３又はそのレセプター、αｖβ３への結合能力があるなしに関わらず、それらがＡｎｇｐｔｌ３の生物学的機能を阻害する能力を持つ場合は、抗体を示す。従って、Ａｎｇｐｔｌ３又はそのレセプターに結合する能力を持つアンタゴニストは抗Ａｎｇｐｔｌ３及び抗αｖβ３抗体を含む。好適なアンタゴニストは、血管内皮細胞の接着及び／又は転位のインヒビター、特に、血管新生、特に悪性腫瘍増殖、肝臓の炎症性疾患又は心疾患に関連した血管新生のインヒビターである。
【００８０】
ここで使用される「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての新生細胞の増殖及び増生を示し、全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を示す。
【００８１】
「癌」及び「癌性」なる語は、典型的には調節されない細胞増殖を特徴とする、哺乳類における生理学的状態を指す。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。癌のより特定した例としては、乳癌、前立腺癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌、及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が挙げられる。
【００８２】
ここで使用される「治療」とは、治療的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、標的とする病的状態又は疾患の防止又は遅延（減少）を目的とする。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されるべきものを含む。腫瘍（例えば癌）治療において治療薬剤とは、腫瘍細胞の病変を直接減少するものであってもよいし、又は腫瘍細胞を、他の治療薬剤、例えば放射線療法及び／又は化学療法による治療の影響を受けやすくするものであってよい。
【００８３】
癌の「病変」とは、患者の健康を危うくする全ての現象を含む。これには、限定されるものではないが、異常又は制御不可能な細胞増殖、転移、隣接細胞の正常な機能の阻害、異常なレベルでのサイトカイン又は他の分泌産物の放出、炎症反応又は免疫学的反応の抑制又は悪化等が含まれる。
【００８４】
「慢性」投与とは、緊急モードに対し、初期の治療効果（活性）を長期間に亘って維持するために、連続モードで薬剤を投与することを示す。「間欠」投与とは、中断なく連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる治療である。
【００８５】
治療のための「哺乳類」とは、哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、及び、動物園の、スポーツの又はペット用の動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等を含む。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００８６】
一又は複数のさらなる治療薬剤「と組合わせて」なされる投与には、同時（即時）投与及び任意の順序での連続投与が含まれる。
【００８７】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容され得る担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳類に対して非毒性である。生理学的に許容され得る担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容され得る担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩等のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭを含む。
【００８８】
「リポソーム」は、哺乳類への薬物（例えばＰＲＯ１０２８２ポリペプチド、又はそれに対する抗体）の輸送に有用な、種々のタイプの脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤を含んでなる小胞体である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配向に類似した二層構造に配列される。
【００８９】
「小分子」とは、ここで約５００ダルトン未満の分子量を有するものと定義される。
【００９０】
ここで定義されたＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドの「有効量」とは、所望の生物学的反応を引き起こすことが可能な量である。特にＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチド又はそのアゴニストの「有効量」は好ましくは、αｖβ３Ａｎｇｐｔｌ３レセプターを介した細胞反応、例えば、内皮細胞、例えば血管内皮細胞の接着及び／又は転位、を調節することができる量である。この用語は、血管新生、特に肝再生に関連した血管新生を引き起こすことができる量を含む。
【００９１】
「治療的有効量」は、腫瘍の治療に関して、例えば天然Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドのアンタゴニストが使用される場合、一又は複数の次の効果：（１）遅延化及び完全な増殖停止を含む、腫瘍増殖のある程度の阻害；（２）腫瘍細胞数の減少；（３）腫瘍サイズの縮小；（４）末梢器官への腫瘍細胞の浸潤の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な停止）；（５）転移の阻害（即ち、減少、遅延化又は完全な停止）；（６）抗腫瘍免疫反応の促進、これは、腫瘍の退行又は拒絶をもたらしてもよいが、必ずしも必要ではない；及び／又は（７）疾患に伴う一又は複数の徴候のある程度の軽減、を誘起することのできる量を意味する。腫瘍の治療を目的とした、Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドのアンタゴニストの「治療的有効量」は、経験的に、そして常套手段によって決定することができる。
【００９２】
「血管内皮増殖因子」又は「ＶＥＧＦ」は、低酸素状態によって刺激され腫瘍血管新生に必要とされることが示された、内皮細胞特異的マイトジェンである（Senger等, Cancer 46:5629-5632 (1986)；Kim等, Nature 362:841-844 (1993)；Schweiki等, Nature 359:843-845 (1992)；Plate等, Nature 359:845-848 (1992)）。ここで使用されるこの用語は、全てのＶＥＧＦイソ型を含み、限定するものではないが、ヒトＶＥＧＦ１２１とＶＥＧＦ１６５イソ型を含む。
【００９３】
Ｂ．ヒトＡｎｇｐｔｌ３の非ヒト哺乳類ホモログ
天然ヒトＡｎｇｐｔｌ３の単離は、実施例１とＰＣＴ公報ＷＯ９９／１５６５４に記載されている。Ａｎｇｐｔｌ３ ＤＮＡは、１９９７年９月１８日に、称号FLS139-DNA16451-1078でAmerican Type Culture Collection (ATCC)に寄託されており、ATCC寄託番号209283が付与されている。
【００９４】
他を同定するために、非ヒト哺乳類ホモログ、又はスプライス又は他の天然発生変異体、のライブラリーは、対象の遺伝子又はそれによってコードされたタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えばヒトＡｎｇｐｔｌ３配列又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド）でスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載の標準的な手順で行われてよい。他の天然Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである（Sambrook等, 上掲；Dieffenbach等, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)）。
【００９５】
プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、十分な長さで、疑陽性が最小化されるよう十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野においてよく知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Sambrook等, 上掲に示されている。
【００９６】
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され利用可能な周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は完全長にわたっての（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの）配列同一性は、当該分野で知られた、及びここに記載した方法を用いて決定することができる。
【００９７】
タンパク質コード配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡのプロセシング中間体及び先駆物質を検出するSambrook等, 上掲に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【００９８】
Ｃ．Ａｎｇｐｔｌ３変異体
天然ヒトＡｎｇｐｔｌ３は当該分野で知られており、例えば１９９９年４月１日発行のＰＣＴ公報ＷＯ９９／１５６５４に開示されている。天然完全長配列Ａｎｇｐｔｌ３（配列番号２）又はここに記載したＡｎｇｐｔｌ３アミノ酸配列の種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５,３６４,９３４号等に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として配列番号２の天然配列と比較してＡｎｇｐｔｌ３のアミノ酸配列が変化するＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドをコードする１つ又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は、少なくとも１つのアミノ酸の、天然又は変異Ａｎｇｐｔｌ３配列の１つ又は複数のドメインにおける任意の他のアミノ酸との置換による。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、Ａｎｇｐｔｌ３の配列を、相同の知られたタンパク質分子の配列と比較し、ホモロジーの高い領域内でなされるアミノ酸配列変化数を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の、類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入又は欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に行い、得られた変異体を、完全長の又は成熟した天然配列によって示される活性について試験することにより決定される。
【００９９】
このようにしてＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、Ｎ末端又はＣ末端で切断されてもよく、又は、例えば完全長天然タンパク質と比較した際に、内部残基を欠いていてもよい。ある種の断片は、Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。  
【０１００】
配列番号２の天然ヒトＡｎｇｐｔｌ３のフィブリノゲンドメインのホモロジーモデリングと、実施例５に記載されたような、Ａｎｇｐｔｌ３による内皮細胞結合に関与するドメインの機能分析とが、ここでのＡｎｇｐｔｌ３変異体の設計に役立つ。Ａｎｇｐｔｌ３のフィブリノゲン様ドメインのモデル化構造に基づき、領域Ｐ１:アミノ酸２８１−２９３ (配列番号１４)；Ｐ２:アミノ酸４４２−４６０ (配列番号１５)；及びＰ３:天然ヒトＡｎｇｐｔｌ３ (配列番号２)のアミノ酸４１５−４３０ (配列番号１７)が、αｖβ３結合に関与することがわかった。レセプター結合と、活性化能力及びレセプターを介したシグナリング能力を保持するために、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３領域は、十分に保持されるべきであり、これらの領域では保存的置換のみが行われるべきである。一方、Ａｎｇｐｔｌ３アンタゴニストを設計するためには、１つ又は複数のこれらの領域内でより多くのアミノ酸変化を作製する必要があり得る。Ａｎｇｐｔｌ３変異体の設計は、図５Ｂに示したリボンダイヤグラム、及び図５Ｃに示した配列アラインメントによってさらに支援され、ここで親水及び荷電残基は青色で示され、芳香族／疎水残基はオレンジ色で示されている。
【０１０１】
上述したように、特定の実施態様では、保存的置換が、本発明のＡｎｇｐｔｌ３変異体を作製するのに重要である。このような保存的置換を、表１に好ましい置換として示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１で例示的置換と称されている又は以下にアミノ酸分類に関してさらに記載される、より多くの変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。
2010100624.tif 000003
【０１０２】
Ａｎｇｐｔｌ３変異体ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋構造、（ｂ）標的部位における分子の疎水性又は電荷、又は（ｃ）側鎖の嵩、の維持に対する影響が実質的に異なる置換を選択することによって達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
（２）中性の親水性：cys, ser, thr；
（３）酸性：asp, glu；
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg；
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro；及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe
【０１０３】
非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのクラスのメンバーを他のクラスに交換することを伴うものである。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【０１０４】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発といった当該分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発（Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)）、カセット突然変異誘発（Wells等, Gene, 34: 315 (1985)）、制限的選択突然変異誘発（Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)）又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＡｎｇｐｔｌ３変異体ＤＮＡを作製することもできる。
【０１０５】
Ａｎｇｐｔｌ３断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化によって、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することによって、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによってＡｎｇｐｔｌ３断片を生成することを含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチド断片は、配列番号２の天然Ａｎｇｐｔｌ３と少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１０６】
また、隣接配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である（Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)）。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた位置と露出した位置の両方に見られることが多い（Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)）。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【０１０７】
Ａｎｇｐｔｌ３変異体の作製、天然及び変異体Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドの共有結合修飾、Ａｎｇｐｔｌ３（変異体を含む）に特異的に結合する抗体、及びイムノアドヘシンに関するさらなる詳細は、例えばＷＯ９９／１５６５４に記載されている。
【０１０８】
Ｄ．Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドの用途
実施例で後述されるように、成体組織でのＡｎｇｐｔｌ３の発現分析は、肝臓特異的発現と、疾患肝細胞での、硬変した肝臓での、又は毒性肝傷害後の強い上方制御とを示した。さらに、Ａｎｇｐｔｌ３のインビボ投与の結果、血管透過性の亢進と、肝損傷からの短期的保護効果とが生じたが、Ａｎｇｐｔｌ３の長期発現は肝損傷に関連した。さらに、Ａｎｇｐｔｌ３は、インビボでのラット角膜アッセイ検査では、血管新生を誘発した。疾患肝臓標本において検知された著しい発現と併合した、当該アッセイでのＡｎｇｐｔｌ３による血管増殖の堅牢な誘発は、当該要因が肝再生中の血管新生過程の調整に重要な役割を果たすことを強く示す。
【０１０９】
従って、Ａｎｇｐｔｌ３及び Ａｎｇｐｔｌ３アゴニストは、急性肝疾患の虞がある対象体の治療、予防及び／又は同定と、急性肝傷害後の肝再生及び／又は組織における血管新生の誘発とに役立つと見られる。急性肝傷害は、炎症性肝疾患、例えば慢性、アルコール性又はウイルス性肝炎、肝臓への化学的又は機械的傷害、慢性肝炎、肝硬変、原発性又は転移性肝癌又は胆嚢癌によるものであり得る肝切除に関連するものであり得る。組織での血管新生は、感染性又は自己免疫過程、機械的又は化学的傷害又は癌又は転移性癌の結果負傷した心臓組織又は肝組織に関連し得る。
【０１１０】
従って、Ａｎｇｐｔｌ３アンタゴニストは、Ａｎｇｐｔｌ３の過剰発現を特徴とする組織損傷、慢性肝疾患、及び／又はＡｎｇｐｔｌ３の上昇発現を特徴とする心臓病の治療及び／又は予防に役立つと考えられる。Ａｎｇｐｔｌ３の過剰発現を特徴とする組織損傷は、炎症、非限定的に慢性肝疾患に関連する炎症、に関連する肝組織損傷を含み、その病因は、根底にある原因が感染過程又は自己免疫過程か、肝臓への化学的損傷か、又はその他かに関わらず、肝臓に炎症細胞の活性と漸増を引き起こす。ひいては、Ａｎｇｐｔｌ３の過剰発現を特徴とする肝組織損傷は、肝硬変、例えばアルコール性肝硬変及び原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、肝線維症、慢性肝炎、例えば慢性自己免疫性肝炎、慢性アルコール性肝炎、及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、ウイルス性肝炎Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＧ型、中毒代謝性肝損傷、脂肪肝、肝臓の虚血再灌流障害及び敗血症、及び肝臓癌に関連する損傷、非限定的に肝細胞癌、肝外胆管癌、胆肝癌及び肝臓の転移性癌に関連する損傷を含む。Ａｎｇｐｔｌ３の上昇発現に関連する心臓組織損傷又は心疾患は、その病因が炎症反応を含むか又はその進行において炎症が危険因子であり、非限定的に、冠動脈疾患、心筋症、例えば非特異性肥大及び拡張型心筋症、心筋炎、うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞等を含む。Lawson等, Toxicol Sci 54:509-16 (2000), 上掲参照。
【０１１１】
さらに、Ａｎｇｐｔｌ３アンタゴニストは、組織における血管透過性の望ましくない亢進の阻害に役立つと考えられる。組織は肝臓又は心臓組織であってよい。血管透過性の亢進は、組織損傷後の小血管の透過性の亢進であってよく、毒素への露出による血管内皮の壊死に続いて起こり得るか、又は炎症、例えば慢性炎症と関連し得る。
【０１１２】
さらに、Ａｎｇｐｔｌ３アンタゴニストは、過剰アルコール摂取に起因する慢性アルコール肝炎の予防及び／又は治療に役立つと考えられる。アルコール性肝炎は、臨床検査結果の異常性が唯一の疾患の兆候である軽度の肝炎から、黄疸（ビリルビン滞留に起因する黄色の皮膚）、肝性脳症（肝不全に起因する神経機能障害）、腹水（腹部の体液貯留）、出血性食道静脈瘤（食道の静脈炎）、血液凝固異常及び昏睡等の合併症を伴う重度の肝機能障害にわたり得る。
【０１１３】
肝臓に影響するＴ細胞媒介疾患も、本発明に包含される。Ｔ細胞からの自己免疫性損傷は、細胞毒性Ｔ細胞により直接的に、及びＴヘルパー細胞により間接的に媒介される。その治療がここで意図される自己免疫性疾患は、非限定的に自己免疫性肝炎及び原発性胆汁肝硬変を含む。自己免疫性肝炎（自己免疫性慢性活動性肝炎としても知られる）は、継続的な肝細胞の壊死と炎症を特徴とする慢性疾患であり、治療されないと、通常肝硬変に進行し、最終的には肝不全になる。原発性胆汁肝硬変は、肝内又は胆汁系の自己免疫疾患であり、胆汁分泌の低下に関連する。自己免疫抗体及び肝臓へのＴ細胞媒介組織損傷はこの疾患に関連すると考えられる。
【０１１４】
Angptl3アンタゴニストはまた、肝臓の虚血性再灌流傷害の治療にも役立つ。上述したように、虚血性再灌流傷害は通常、身体の一領域への血流が一時的に止められ（虚血）、次いで復旧される（再灌流）と起こる。該傷害は、血液供給が遮断された身体部分で発生するか、又は虚血期間中に完全な血液供給がなされた部分で発生し得る。肝臓の虚血再灌流傷害は、例えば肝臓及び胆管の外科的切除によって起こることがあり、急性肝細胞損傷及び壊死を含む肝機能障害等の合併症が臨床的に認められる。
【０１１５】
Ａｎｇｐｔｌ３アンタゴニストは、非限定的に、抗体、有機及び無機小分子、ペプチド、ホスホペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、三重螺旋分子等を含み、標的遺伝子産物の発現及び／又は活性を阻害する。
【０１１６】
例えば、アンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイゼーションしてタンパク質翻訳を防止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻害する。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１１７】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。さらなる詳細については、例えば、Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994)及びＰＣＴ公報ＷＯ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日発行）を参照。
【０１１８】
転写阻害に用いられる三重螺旋形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介する三重螺旋形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９７／３３５５１, 上掲を参照。
【０１１９】
ここでのＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチド（そのアゴニスト及びアンタゴニストを含む）が治療薬として使用される場合、それらは、製薬上有用な組成物を調製するための周知の方法に従って作製可能であり、ここでＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドは製薬上許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., (1980)）、調製され保管される。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用量及び濃度でレシピエントに無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１２０】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
【０１２１】
ここで、本発明の治療用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈注射用溶液バッグ又はバイアル内に配される。
【０１２２】
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
【０１２３】
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて異なってよい。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効な用量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効な用量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【０１２４】
Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳類の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に記載されている；例えば、米国特許第４,６５７,７６０号、第５,２０６,３４４号、又は第５,２２５,２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えばある１つの器官又は組織を標的とする投与には、別の器官又は組織を標的とする投与とは異なる方式での輸送が必要となることが予想される。
【０１２５】
例えば、任意の特定の肝疾患の治療に有効な用量を決定する前に、従来の患者の臨床及び実験室評価により疾患の重症度が決定される。例えば毎週、各週、毎月又は各月というふうに定期的に行われる臨床及び実験室評価による肝機能検査によって、治療の利益が評価される。
【０１２６】
Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でのＡｎｇｐｔｌ３ポリペプチドの徐放投与が望まれる場合、Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。徐放のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン-γ（ｒｈＩＦＮ-γ）、インターロイキン-２、及びＭＮ ｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996)；Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993)；Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990)；Cleland, 「Design and production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), pp.439-462；ＷＯ９７／０３６９２、ＷＯ９６／４００７２、ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５,６５４,０１０号。
【０１２７】
これらのタンパク質の徐放製剤は、その生体適合性及び広範囲の生分解特性により、ポリ-乳酸-コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用いて開発された。ＰＬＧＡの分解産物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」 in M. Chasin及び R. Langer （編）, Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
【０１２８】
Ａｎｇｐｔｌ３治療用薬剤を他の治療用投与計画と組合わせることが望ましい場合もある。例えば、Ａｎｇｐｔｌ３ポリペプチド又はそのアゴニストでの治療を、他のアゴニスト因子、例えば血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）又は繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の投与と組合わせることができる。
【０１２９】
Ｅ．製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器とラベルとを具備する。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチック等の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は、通例、本明細書で同定された遺伝子産物の活性を阻害することができる抗癌剤、例えば抗体である。容器上の又は容器に添付されるラベルは、組成物が、選択した状態の診断又は治療のために使用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第二の容器を具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１３０】
Ｆ．診断用使用
Ａｎｇｐｔｌ３は炎症性肝疾患において上方制御されるので、正常組織に対するその過剰発現は、そのような疾患の診断マーカーとしての機能を果たす。
【０１３１】
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来のサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いてもよい。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０１３２】
例えば、抗体断片を含む抗体は、Ａｎｇｐｔｌ３タンパク質の発現の定性的及び定量的検出に使用することができる。上述したように、抗体は、好ましくは、検出可能な例えば蛍光標識を備えており、結合は、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、又は当該分野で知られた他の技術によってモニターすることができる。これらの技術は、特に、増幅遺伝子が細胞表面タンパク質、例えば成長因子をコードする場合に適している。このような結合アッセイは、原則的に上文に記載したようにして行われる。
【０１３３】
Angptl3タンパク質と結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光検査法又は免疫電子顕微鏡によって行うことができる。この目的のために、組織学的標本を患者から取り出し、標識抗体を、好ましくは生物学的試料にその抗体をかぶせることによって、該標本に付与する。この手法は、また、検査する組織のマーカー遺伝子産物の分布を確定することも可能にする。幅広い種々の組織学的方法がインサイツ検出で容易に利用できることは、当業者にとって明らかであろう。
【０１３４】
遺伝子発現変化を定量化するための最も感受的で最も柔軟な定量法の１つは、ＲＴ−ＰＣＲであり、これを使用して、正常及び腫瘍組織で、異なる試料集団において、薬物治療あり又はなしで、ｍＲＮＡレベルを比較し、遺伝子発現パターンを特徴付け、近縁のｍＲＮＡ同士を区別し、そしてＲＮＡ構造を分析することができる。
【０１３５】
第一ステップではｍＲＮＡを標的試料から単離する。開始材料は、典型的には、罹患組織とそれに対応する正常組織からそれぞれ単離された全ＲＮＡである。こうしてｍＲＮＡは、例えば凍結又は保管された、パラフィン包理され及び固定された（ホルマリンで固定された）罹患組織の試料から、同種の正常組織との比較のために抽出できる。ｍＲＮＡ抽出に関する方法は当該分野でよく知られており、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む分子生物学の標準的教科書に開示されている。パラフィン包理組織からRNAを抽出する方法は、例えば、Rupp及びLocker, Lab Invest. 56:A67 (1987)、及びDe Andres等, Bio Techniques 18:42044 (1995)に開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、Qiagen等の民間製造業者の精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを、製造業者の指示書に従って使用して行うことができる。例えば、培養細胞からの全ＲＮＡは、Qiagen RNeasy miniカラムを用いて単離できる。組織試料からの全ＲＮＡは、RNA Stat-60（Tel-Test）を使用して単離できる。
【０１３６】
ＲＮＡはＰＣＲのテンプレートとして機能しないので、ＲＴ-ＰＣＲによる遺伝子発現変化分析の最初のステップはＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写と、それに続くＰＣＲ反応でのその指数関数的な増幅である。２つの最も広く用いられている逆転写酵素はトリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）及びモロニーマウス白血球ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写段階は、通常、発現プロファイリングの環境及び目的に応じて、特異的プライマー、ランダムヘキサマー、又はオリゴ-ｄＴプライマーを使用してプライムされる。例えば、製造者指示書に従い、GeneAmp RNA PCR キット（Perkin Elmer, カリフォルニア, アメリカ合衆国）を使用して抽出ＲＮＡを逆転写することができる。この誘導されたｃＤＮＡは、後のＰＣＲ反応のテンプレートとして使用できる。
【０１３７】
ＰＣＲステップでは、種々の熱安定性ＤＮＡ-依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができるが、典型的には、５’-３’ヌクレアーゼ活性を有するが-３’ -５’ヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いる。従って、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲでは、典型的には、Ｔａｑ又はＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を用いて、その標的アンプリコンに結合したハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、同等の５’ヌクレアーゼ活性を有する任意の酵素を用いることができる。ＰＣＲ反応に特有のアンプリコンを生成するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。三番目のオリゴヌクレオチド、又はプローブを、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計する。このプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長せず、レポーター蛍光色素及び消光蛍光色素で標識される。このレポーター色素のどんなレーザー誘導放射も、プローブ上でこの２つの色素が近接して位置している場合には、消光色素によって消光する。増幅反応の間、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存様式でプローブを切断する。この結果生じたプローブ断片は溶液中で解離し、遊離したレポーター色素からのシグナルは、二番目のフルオロフォアの消光効果とは無関係である。新しい分子が合成される度にレポーター色素の１分子が遊離し、消光しないレポーター色素の検出がデータの定量的な解釈の基礎を示すことになる。
【０１３８】
TaqMan RT-PCRは、例えば、ABI PRIZM 7700TM、Sequence Detection SystemTM（Perkin-Elmer-Applied Biosystems, フォスターシティー, カリフォルニア, アメリカ合衆国）、又はLightcycler（Roche Molecular Biochemicals, マンハイム, ドイツ）等の市販の装置を使用して行うことができる。好ましい実施態様では、５’ヌクレアーゼ手法は、ABI PRIZM 7700TM、Sequence Detection SystemTM等のリアルタイム定量PCR装置で進められる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラ及びコンピューターで構成される。このシステムでは、サーモサイクラー上の９６ウェルフォーマットで試料を増幅する。増幅の間、９６ウェル全てについて、レーザー励起した蛍光シグナルが光ファイバーケーブルを通してリアルタイムで収集され、そしてＣＣＤカメラで検出される。このシステムは、装置を作動し、データを分析するソフトウェアを装備している。
【０１３９】
５’ヌクレアーゼアッセイのデータは最初、Ｃｔ又は閾値サイクルとして表される。上で論じたように、蛍光値は毎サイクルの間に記録され、増幅反応においてそのポイントまでに増幅した産物の総量を表す。蛍光シグナルが極めて重要だとして最初に記録されたポイントが閾値サイクル（Ｃｔ）である。このΔＣｔ値は、罹患組織からの細胞のＲＮＡ発現を正常細胞のそれと比べる場合に、核酸試料中の特定の標的配列の開始コピーの相対数の定量的測定として用いられる。
【０１４０】
エラー及び試料間のばらつきによる効果を最小限にするために、大抵は内部標準を使用してＲＴ−ＰＣＲを行う。理想的な内部標準は、異なる組織間では一定のレベルで発現し、実験上の処理によって影響を受けない。遺伝子発現のパターンを均質化するために最も頻繁に使用されているＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド-３-リン酸-デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）及びβ-アクチンのｍＲＮＡである。
【０１４１】
遺伝子発現変化はまた、マイクロアレイ技術を用いて同定又は確認できる。この方法では、対象のヌクレオチド配列をマイクロチップ基板上にプレートさせるか又は整列させる。次いで、整列させた配列を、対象の細胞又は組織からの特異的ＤＮＡプローブにハイブリッド形成する。
【０１４２】
マイクロアレイ技術の特定の実施態様では、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲで増幅した挿入部分を高密度アレイの基板へ貼り付ける。好ましくは、少なくとも１０,０００ヌクレオチド配列を基板へ貼り付ける。それぞれ１０,０００エレメントがマイクロチップ上に固定化された、マイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適している。蛍光標識したｃＤＮＡプローブは、対象の組織から抽出したＲＮＡの逆転写によって蛍光ヌクレオチドを取り込むことで作製できる。チップへ貼り付けた標識したｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異的にハイブリッド形成する。非特異的に結合したプローブを除くためにストリンジェントに洗浄した後、チップを共焦点レーザー顕微鏡によってスキャンする。各整列したエレメントのハイブリダイゼーションの定量化によって、対応するｍＲＮＡ発生量の評価が可能となる。二色蛍光によって、ＲＮＡの２つのソースから作製した別々の標識したｃＤＮＡプローブを２つ１組でアレイへハイブリッド形成する。従って、各特定の遺伝子に対応する２つのソースからの転写物の相対発生量が、同時に確かめられる。小型化したハイブリダイゼーションのスケールによって、多数の遺伝子に関する発現パターンの簡便で迅速な評価が可能となる。このような方法は、細胞当たり少しのコピーが発現する希な転写物を検出し、及び発現レベルにおいて少なくともおよそ２倍の違いを再現可能に検出するのに必要な感受性を有することが示されている（Schena等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (20): 106-49 (1996)）。核酸のハイブリダイゼーションの方法論とマイクロアレイ技術は当該分野でよく知られている。
【０１４３】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【０１４４】
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【実施例】
【０１４５】
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用指示に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定される細胞の供給源はAmerican Type Culture Collection, マナッサス, ヴァージニアである。
【０１４６】
実施例１
Ａｎｇｐｔｌ３の同定
Ａｎｇｐｔｌ３を、「Instruction Manual: SUPERSCRIPT（商品名）Lambda System for cDNA Synthesis and λ cloning」カタログ番号19643-014, Life Technologies, ゲイサーズバーグ, メリーランド, アメリカ合衆国に記載のプロトコルに従って、Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto,  カリフォルニア, アメリカ合衆国、カタログ番号64018-1から得たヒト胎児肝臓ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーで同定した。特に明記しない限り、全ての試薬もLife Technologiesから得た。全体的な手順は、次の段階：（１）第一鎖の合成；（２）第二鎖の合成；（３）アダプター添加；（４）酵素消化；（５）ｃＤＮＡのゲル単離；（６）ベクターへのライゲーション；及び（７）形質転換に要約できる。
【０１４７】
第一鎖の合成：
Ｎｏｔ１プライマーアダプター（Life Tech.、２μｌ, ０.５ｇ／μｌ）をポリＡ＋ｍＲＮＡ（７μｌ, ５μｇ）を添加した無菌の１.５ｍｌのマイクロ遠心分離チューブに加えた。反応チューブを５分間又はｍＲＮＡの二次構造を変性させるのに十分な時間、７０℃まで温めた。次いで反応物を氷上で冷却し、５Ｘ第一鎖バッファー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ., ４μｌ）、０.１Ｍ ＤＴＴ（２μｌ）及び１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ（Life Tech.、１μｌ）を添加し、次いで恒温にするように３７℃で２分間温めた。Superscript II（商品名）逆転写酵素（Life Tech., ５μl）を添加し、反応チューブをよく混合して３７℃で１時間インキュベートし、氷上において終了した。反応物の最終濃度は次の通りであった：５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８.３）；７５ｍＭのＫＣｌ；３ｍＭのＭｇＣｌ２；１０ｍＭのＤＴＴ；それぞれ５００μＭのｄＡＴＰ, ｄＣＴＰ, ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；５０μｇ／ｍｌのＮｏｔ Ｉプライマーアダプター；５μｇ（２５０μｇ／ｍｌ）のｍＲＮＡ；５０,０００Ｕ／ｍｌのSuperscript II（商品名）逆転写酵素。
【０１４８】
第二鎖の合成：
氷上で、次の試薬を、第一鎖の合成の反応チューブに添加し、反応物をよく混合し、１６℃を越えないように温度に注意しながら１６℃で２時間反応させた：蒸留水（９３μｌ）；５Ｘ第二鎖バッファー（３０μｌ）；ｄＮＴＰ混合物（３μｌ）；１０Ｕ／μｌの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）；１０Ｕ／μｌ大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（４μｌ）；２Ｕ／μｌ大腸菌ＲＮａｓｅ Ｈ（１μｌ）。１０ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（２μｌ）を添加し、反応物をさらに５分間１６℃でインキュベートし続けた。反応物の最終濃度は次の通りであった：２５ｍＭのＴｒｉｓ-Ｈｃｌ（ｐＨ７.５）；１００ｍＭのＫＣｌ；５ｍＭのＭｇＣｌ２；１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４；０.１５ｍＭのβＮＡＤ+；それぞれ２５０μＭのｄＡＴＰ, ｄＣＴＰ, ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ；１.２ｍＭのＤＴＴ；６５Ｕ／ｍｌのＤＮＡリガーゼＩ；２５０ Ｕ／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼ；１３Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ｈ。反応物を氷上に置いて、０.５ＭのＥＤＴＡ（１０μｌ）を添加することにより停止し、次いで、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、１５０μｌ）を通して抽出した。水相を取り出して回収し、５ＭのＮａＣｌ（１５μｌ）及び無水エタノール（−２０℃、４００μｌ）で希釈し、１４,０００×ｇで２分間、遠心分離した。最終産物のＤＮＡペレットから上清を注意深く取り出し、ペレットを７０％エタノール（０.５ｍｌ）に再懸濁し、１４,０００×ｇで２分間、再び遠心分離した。上清を再び取り出し、ペレットをSpeedvacで乾燥した。
【０１４９】
アダプター添加：
次の試薬を、上記の第二鎖の合成のｃＤＮＡペレットに加え、反応物を穏やかにかき混ぜ、１６℃で１６時間インキュベートした：蒸留水（２５μｌ）；５Ｘ ４Ｔ ＤＮＡリガーゼバッファー（１０μｌ）；Ｓａｌ Ｉアダプター（１０μｌ）；Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（５μｌ）。反応物の最終組成物は、次の通りであった：５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７.６）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１ｍＭのＡＴＰ；５％（ｗ／ｖ）ＰＥＧ ８０００；１ｍＭのＤＴＴ；２００μｌ ／ｍｌのＳａｌ Ｉアダプター；１００Ｕ／ｍｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ。反応物をフェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、５０μｌ）を通して抽出し、水相を取り出して回収し、５ＭのＮａＣｌ（８μｌ）及び無水エタノール（−２０℃、２５０μｌ）で希釈した。これを次いで１４,０００×ｇで２０分間、遠心分離し、上清を取り出して、ペレットを０.５ｍｌの７０％エタノールに再懸濁し、１４,０００×ｇで２分間、再び遠心分離した。続いて上清を再び取り出し、最終産物のペレットをSpeedvacで乾燥して、次の手順に進んだ。
【０１５０】
酵素消化：
前の段落のＳａｌ Ｉアダプターで調製したｃＤＮＡに次の試薬を混合し、混合物を３７℃で２時間インキュベートした：ＤＥＰＣ処理水（４１μｌ）；Ｎｏｔ Ｉ制限バッファー（REACT, Life Tech., ５μl)、Ｎｏｔ Ｉ（４０μｌ）。この反応物の最終組成物は次の通りであった：５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ８.０）；１０ｍＭのＭｇＣｌ２；１００ｍＭのＭａＣｌ；１,２００Ｕ／ｍｌのＮｏｔ Ｉ。
【０１５１】
ｃＤＮＡのゲル単離：
ｃＤＮＡを５％アクリルアミドゲルのアクリルアミドゲル電気泳動により、サイズ分画し、分子量マーカーと比較して決定されるような、１ｋｂよりも大きい任意の断片を、ゲルから除去した。次いでｃＤＮＡを、ゲルから０.１×ＴＢＥバッファー（２００μｌ）に電気溶出し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１、２００μｌ）で抽出した。水相を取り出して回収し、１４,０００×ｇで２０分間遠心分離した。上清を、７０％エタノール（０.５ｍｌ）に懸濁したＤＮＡペレットから取り出し、再び１４,０００×ｇで２分間遠心分離した。上清を再び除去し、ペレットをSpeedvacで乾燥し蒸留水（１５μｌ）に再懸濁した。
【０１５２】
ｐＲＫ５ベクターへのｃＤＮＡのライゲーション：
次の試薬をともに加え、１６℃で１６時間インキュベートした：５Ｘ Ｔ４ リガーゼバッファー（３μｌ）；ｐＲＫ５, Ｘｈｏ Ｉ, Ｎｏｔ Ｉ消化ベクター, ０.５μｇ, １μｌ)；前の段落で調製されたｃＤＮＡ（５μｌ）及び蒸留水（６μｌ）。続いて、さらなる蒸留水（７０μｌ）及び１０ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡ（０.１μｌ）を添加し、全ての試薬をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を通して抽出した。水相を取り出して回収し、５ＭのＮａＣｌ（１０μｌ）及び無水エタノール（−２０℃, ２５０μｌ）中に希釈した。次いでこれを１４,０００×ｇで２０分間、遠心分離し、ペレットを７０％エタノール（０.５ｍｌ）に再懸濁し、１４,０００×ｇで２分間、再び遠心分離した。次いでＤＮＡペレットをSpeedvacで乾燥して、次の手順で使用するために蒸留水（３μl）に溶出した。
【０１５３】
バクテリアへのライブラリーライゲーションの形質転換：
前記したように調製した、ライゲートされたｃＤＮＡ／ｐＲＫ５ベクターＤＮＡを、電気コンピテントＤＨ１０Ｂバクテリア（Life Tech., ２０μl）が添加された氷上で冷却した。次いでバクテリアベクター混合物を、メーカーの勧めに従って電気穿孔した。続いてＳＯＣ培地（１ｍｌ）を添加し、混合物を３７℃で３０分インキュベートした。次いで形質転換体をアンピシリンを含む２０の標準１５０ｍｍ ＬＢプレートに蒔き、コロニーが成育するまで１６時間（３７℃）インキュベートした。次いでポジティブコロニーをこすり取り、標準ＣｓＣｌ勾配プロトコルを用いてバクテリアペレットからＤＮＡを単離した（例えば上掲のAusubel等, 2.3.1.）。
【０１５４】
Ａｎｇｐｔｌ３の同定
Ａｎｇｐｔｌ３は、Klein R.D.等, (1996), Proc. Natl. Acad. Sci 93, 7108-7113及びJacobs （１９９６年７月１６日発行の米国特許第５,５６３,６３７号）により報告された方法を含む、当該分野で周知の任意の標準的な方法によって、ヒト胎児肝臓ライブラリーで同定可能である。Klein等及びJacobsによると、新規に分泌された哺乳類の膜結合タンパク質をコードするｃＤＮＡは、レポーター系として酵母転化酵素遺伝子を用いてそれらの分泌リーダー配列を検出することによって同定される。酵素転化酵素は、スクロースのグルコース及びフルクトースへの分解と、ラフィノースのスクロース及びメリビオースへの分解を触媒する。転化酵素の分泌形態は、分泌転化酵素を産生できない酵母細胞が、単一の炭素及びエネルギー源としてスクロースを含む培地上であまり増殖しないように、酵母（Saccharomyces cerevisiae）によってスクロースの利用のために必要とされる。Klein R.D.等, 上掲、及びJacobs, 上掲は双方とも、酵母転化酵素の天然シグナル配列を機能的に置換するために、哺乳類シグナル配列の周知の能力を利用する。哺乳類ｃＤＮＡライブラリーは、非分泌酵母転化酵素をコードするＤＮＡにライゲートされ、該ライゲートされたＤＮＡは、単離され、転化酵素遺伝子を含まない酵母細胞に形質転換される。哺乳類シグナル配列にライゲートされた非分泌酵母転化酵素遺伝子を含む組換え体は、炭素源としてスクロースだけ又はラフィノースだけを含む培地で増殖する能力に基づいて同定される。同定された哺乳類シグナル配列は、次いで、対応する分泌タンパク質をコードする全長クローンを単離するために第二の全長ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用される。クローニングは、例えば、発現クローニングによって、又は当該分野で周知の任意の他の技術によって行われてよい。
【０１５５】
Ａｎｇｐｔｌ３の同定に使用されるプライマーは以下の通りである：
ＯＬＩ１１４ CCACGTTGGCTTGAAATTGA（配列番号３）
ＯＬＩ１１５ CCTCCAGAATTGATCAAGACAATTCATGATTTGATTCTCTATCTCCAGAG（配列番号４）
ＯＬＩ１１６ TCGTCTAACATAGCAAATC（配列番号５）
【０１５６】
Ａｎｇｐｔｌ３のヌクレオチド配列は図１に示されており（配列番号１）、アミノ酸配列は図２Ａ及び２Ｂに示されている（配列番号２）。Ａｎｇｐｔｌ３は、ＴＩＥ２レセプター（ｈ-ＴＩＥ２Ｌ１及びｈ-ＴＩＥ２Ｌ２）及びヒトアンジオポエチン１、２及び４（ＡＮＧ１、ＡＮＧ２、ＡＮＧ４、図５Ｃ）の２つの周知のヒトリガンドと高度の配列ホモロジーを示すヒトフィブリノゲン様ドメイン（図３Ａ及び図５Ａ−Ｃ）を含む。
【０１５７】
Ａｎｇｐｔｌ３のクローンは、ブダペスト条約の条項に従って１９９７年９月１８日にAmerican Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852に寄託されており、ＡＴＣＣ寄託番号２０９２８１が付与されている。
【０１５８】
実施例２
Ａｎｇｐｔｌ３の発現
ヒトＡｎｇｐｔｌ３を、真核細胞の発現ベクターｐＲＫ５ｔｋＮＥＯ及びバキュロウイルスベクターｐＨＩＦ、PharMingen, カリフォルニアから購入したｐＶＬ１３９３の誘導体にクローニングした。プラスミドＤＮＡを、BaculoGoldTM DNA（PharMingen, カリフォルニア）とともにLipofectin（GIBCO-BRL, MD）を用いてSpodoptera frugiperda ("Sf9") 細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １７１１）中に同時形質移入した。４日後、細胞を回収し、５００μｌの上清を用いて２×１０６ Ｓｆ９細胞に感染させ、バキュロウイルスを増幅した。増幅の７２時間後、細胞を回収し、４０時間、１０ｍｌの上清を用いて７.５×１０５ Ｈ５細胞／ｍｌに感染させた。回収、及び０.４５μｍ酢酸セルロースフィルターでの濾過後、上清を精製した。マウスＡｎｇｐｔｌ３を、大規模な一過性形質移入実験で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現させた。ヒトＡｎｇｐｔｌ３を、イムノアフィニティクロマトグラフィーを利用して、懸濁液中で増殖したバキュロウイルスに感染した昆虫細胞から精製した。抗ｇＤ ＦａｂをグリコファーゼＣＰＧ（コントロールされたポアガラス）に結合してカラムを生成した。浄化（１０００×ｇ ５分、その後０.２μｍ濾過）培地を４℃で一晩中ローディングした。２８０ｎｍの流出物で吸収度が基準に戻るまで、カラムをＰＢＳで洗浄し、ｐＨ３.０の５０ｍＭ クエン酸ナトリウムで溶出した。溶出されたタンパク質を、１ｍＭ ＨＣｌに対して透析し（Spectra-pore; MWCO 10,000）、-７０℃で凍結した。一過的に発現されたマウスＡｎｇｐｔｌ３含有ＣＨＯ培養物を、浄化し、１０,０００ ＭＷＣＯ膜（Amicon）を用いて濃縮した。この容積は、ヒトＡｎｇｐｔｌ３について上述したグリコファーゼＣＰＧに結合した抗ｇＤ Ｆａｂカラムを超えた。溶出されたプールを、＜５ｍＳの伝導性まで１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５.０）で希釈し、S Sepharose Fast Flow（Amersham Pharmacia Biotech, ニュージャージー）にローディングした。２８０ｎｍの流出物の吸収度が基準に戻るまで、カラムを１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５.０）で洗浄し、ｐＨ５.０の１０ｍＭ 酢酸ナトリウム中、２０カラム容積勾配０−０.５Ｍ ＮａＣｌで溶出した。０.４５Ｍ−０.５Ｍ ＮａＣｌで溶出した、マウスＡｎｇｐｔｌ３を含む分画をさらに、逆相Ｃ-４クロマトグラフィ（Vydac, カリフォルニア）を用いて精製した。分画を、０.１％トリフルオロ酢酸勾配で酸性化した。６７％アセトニトリルで溶出したマウスｍＡｎｇｐｔｌ３を凍結乾燥し、−７０℃で保存した。精製タンパク質の同定を、Ｎ末端配列分析で確認した。市販のキットでＬＰＳ濃度を確認し、全てのヒト又はマウスＡｎｇｐｔｌ３調製について＜５ Ｅｕ／ｍｌとなるように決定した。
【０１５９】
実施例３
Ａｎｇｐｔｌ３に結合する抗体の調製
この実施例は、Ａｎｇｐｔｌ３に特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
【０１６０】
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、Goding, 上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、本発明の精製されたリガンドホモログ、そのようなリガンドホモログを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えリガンドホモログを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
【０１６１】
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して１−１００μｇの量で皮下又は腹腔内に注入した免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Research, ハミルトン, モンタナ）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫してもよい。抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１６２】
適当な抗体力価を検出した後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、特定のリガンドの静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を回収した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＴＣＣから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ.１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、これをＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害することができる。
【０１６３】
ハイブリドーマ細胞は、抗原に対する反応性についてＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ここでのＴＩＥリガンドホモログに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
【０１６４】
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗ＴＩＥリガンドモノクローナル抗体を含む腹水を生成することができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで増殖させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降とそれに続くゲル排除クロマトグラフィーを用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１６５】
実施例４
内皮細胞結合
アンジオポエチンは、Ｎ末端フィブリノゲン（ＦＢＮ）様ドメインを介して内皮細胞特異的チロシンキナーゼレセプターＴｉｅ２に結合することによって血管新生を調節する分泌因子である。この分泌リガンドのファミリーに存在するＣ末端コイルドコイル・ドメインが、リガンドのオリゴマー化に必要であることがわかった（Procopio等, J. Biol. Chem. 274:30196-201 (1999)）。
【０１６６】
アンジオポエチンと類似して、Ａｎｇｐｔｌ３は、コイルドコイル・ドメインとＣ末端ＦＢＮ様ドメインを伴うＮ末端シグナルペプチドからなる分泌グリコプロテインである（図３Ａ）。
【０１６７】
Ａｎｇｐｔｌ３とアンジオポエチンが構造的に類似していることから、Ｔｉｅ２レセプターを発現する原発性内皮培養細胞と結合する能力について、Ａｎｇｐｔｌ３を検査した。Cell System（カークランド, ワシントン）から購入し、供給者からの推奨に従って１０％ウシ胎仔血清及びマイトジェンを含むＣＳ-Ｃ完全培地で保存したヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）を、エピトープ（ｇＤ）タグ付きＴｉｅ２リガンドアンジオポエチン１及び２（Ａｎｇ１及びＡｎｇ２）、Ａｎｇｐｔｌ３、及びアンジオポエチン関連タンパク質１（ＡＲＰ１）をそれぞれ発現している一過性形質移入された２９３細胞からの条件付培地でインキュベートした。ＡＲＰ１は、コイルドコイル及びフィブリノゲン様ドメインを備えるがＴｉｅ２と結合できない、構造的に関連した分子であり、ネガティブコントロールとして使用した。図３Ｂに示したように、Ａｎｇ２及びＡｎｇｐｔｌ３は、ＡＲＰ１について結合が観察されない条件で、ＨＭＶＥＣと強く結合した。これらの発見は、Ａｎｇｐｔｌ３の内皮細胞への結合が特異的であることを実証し、Ａｎｇｐｔｌ３の結合を媒介する内皮細胞上のレセプターの存在を示した。
【０１６８】
Ｔｉｅ２（アンジオポエチン１、２及び３（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２及びＡｎｇ３）のレセプター）又はＴｉｅ１（Ｔｉｅ２に対する高い配列ホモロジーを有するオーファンレセプター）がＡｎｇｐｔｌ３と結合するか検査するために、それぞれＴｉｅ１及びＴｉｅ２の全長レセプターコンストラクトとともに、エピトープ（ｇＤ）タグ付きＡｎｇ１及びＡｎｇ２、Ａｎｇｐｔｌ３及びＡＲＰ１の発現ベクターを一過的に有する２９３細胞を用いて、免疫沈降実験を行った。添加されたばかりのプロテアーゼインヒビターを含むＲＩＰＡバッファー（１×ＰＢＳ；１％ ＮＰ４０；０.５％ デオキシコール酸ナトリウム；０.１％ ＳＤＳ；ＰＭＳＦ, １００μｇ／ｍｌ；アプロチニン；３０μｌ／ｍｌ；オルトバナジン酸ナトリウム, １μＭ）での溶解によって、全体細胞抽出物を調製した。抽出物を、Ｔｉｅ１又はＴｉｅ２に特異的な抗体（Santa Cruz Biotechnology, サンディエゴ, カリフォルニア）とインキュベートし、得られた免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法で分析した。具体的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分解しＰＶＤＦ膜にブロットしたタンパク質を、ｇＤタグ又はＴｉｅレセプターのそれぞれに対する抗体とインキュベートした。図４に示したように、Ｔｉｅ２のＡｎｇ１及びＡｎｇ２への結合が可能な実験的条件では、Ｔｉｅ１及びＴｉｅ２はＡｎｇｐｔｌ３に結合しなかった。これらの発見は、Ａｎｇｐｔｌ３はＴｉｅ２のリガンドでもＴｉｅ１のリガンドでもないことを実証し、細胞結合実験で観察された強い結合を媒介する内皮細胞上の他のレセプターの存在を示した。
【０１６９】
興味深いことに、細胞を「腫瘍様」状態を模倣する低酸素状態又はＶＥＧＦに曝すと、Ａｎｇｐｔｌ３の結合が有意に増加した（データは示さず）。こういった状態は、内皮細胞上でインテグリン発現を誘発することがこれまでにわかっており（Suzuma等, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 39:1028-35 (1999)）、一方、Ｔｉｅ１及びＴｉｅ２レセプターレベルは変化しないことがわかっている（Mandriota及びPepper, Circ. Res. 83:852-9 (1998)及びOh等, J. Biol. Chem. 274:15732-9 (1999)）。
【０１７０】
実施例５
ＦＢＮ−Ａｎｇｐｔｌ３の分子モデリング
Ａｎｇｐｔｌ３のFBN様ドメインは、ヒトフィブリノゲンのγ鎖のＣ末端と３９.６％の配列同一性を共有する。Ａｎｇｐｔｌ３が内皮細胞に結合する生物学的機能と分子メカニズムを調査するために、ＦＢＮドメインに関するＸ線結晶学とホモロジーモデリング技術によってもたらされた構造情報を用いて、Ａｎｇｐｔｌ３ のＦＢＮ様ドメインのモデルを構築した。ＦＢＮドメインは、３つの明確なドメイン：短い螺旋に挟まれた二重鎖逆平行βシートによって形成されたＮ末端ドメイン；２つの短い螺旋と、その面の一方に対して配列されたヘアピンループとを有する五重鎖逆平行βシートによって形成された中央ドメイン；及び主にループからなる第三のドメイン（図５Ｂ）を備えた独特の折り畳みを有する。
【０１７１】
ＦＢＮ−Ａｎｇｐｔｌ３モデルを構築するために、clustalW（Thompson等, Nucleic Acids Res., 22:4673-80 (1994)）とスレッディング（ProCeryon Biosciences Inc.）を用いて、ＦＢＮ-Ａｎｇｐｔｌ３配列と複数のＦＢＮドメイン構造との間の配列構造アラインメントを実行した。このアラインメントから、モデル構築のテンプレート構造として３ＦＢ（ＰＤＢコード）を選択した。プログラムPROCHECK（Laskowski等, J. Biomol. NMR 8:477-86 (1996)）を用いて、ＰＤＢに寄託された構造の参照データベースと比較したときに平均を上回る立体化学品質である、モデルの幾何学的品質を評価した。最終的なＦＢＮ−Ａｎｇｐｔｌ３モデルは、テンプレートと比較すると全てのＣα原子について１.９５Ａのｒ.ｍ.ｓ.ｄを有した。アミノ酸位置２２０−２２４、２８９−３０６及び３５７−３６３のループ領域にいくつかの違いはあるが、ＦＢＮドメインの全ての折り畳みがＦＢＮ−Ａｎｇｐｔｌ３に保存される（図５Ａ及びＢ）。
【０１７２】
ヒトフィブリノゲンγ鎖の研究により、インテグリンαＭβ２、白血球で主に発現されるインテグリンへの結合に関与する２つの領域の同定がなされた（Ugarova等, J. Biol. Chem. 273:22519-27 (1998)）。線状アミノ酸配列において分離された２つの領域は、ＦＢＮドメインの三次元構造で２つの隣接した逆平行β鎖（Ｐ１, 残基１９０−２０２；Ｐ２, 残基３７７−３９５）を形成する。フィブリノゲンγ鎖（Ｐ３, ３４６−３５８）及びテナシンＣ内の異なる領域もまた、インテグリンαｖβ３への結合に関与することがわかっている（Yokoyama等, J. Biol. Chem. 275:16891-8 (2000)）。本ＦＢＮ-Ａｎｇｐｔｌ３モデルと、ヒトフィブリノゲンγ鎖のＦＢＮドメインは、これらの領域で高度の構造的同一性を共有し（Ｐ１: ３８−５０；Ｐ２: １９９−２１４；Ｐ３: ３４６−３６１）（図５Ａ）、ここでナンバリングは３ＦＩＢ（ＰＤＢコード）のナンバリングに従う。Ａｎｇｐｔｌ３（配列番号２）のアミノ酸ナンバリングに従って、成熟したタンパク質アミノ酸配列で、Ｐ１はアミノ酸２８１−２９３（配列番号１４）に対応し；Ｐ２はアミノ酸４４２−４６０（配列番号１５）に対応し；そしてＰ３はアミノ酸４１５−４３０（配列番号１７）に対応する。
【０１７３】
Ａｎｇｐｔｌ３のＦＢＮ様ドメイン内の領域が結合に責任があるかどうか仮説を検証するために、複数のペプチドを設計し合成した（表２）。Ｐ３配列は、異なるドメイン間のほとんどの構造的多様性を有する領域をコードし、よってレセプター特異性を決定し得る。同一領域由来の複数のスクランブルされ逆転されたペプチドをコントロールペプチドとして用いた（表２）。実施例２で述べたようなバキュロウイルス発現系を用いてアミノ末端ｇＤエピトープタグ付き組換えヒトＡｎｇｐｔｌ３タンパク質を生成した（図６Ａ）。
【０１７４】
製造者の指示に従ってＰＮＧａｓｅ-Ｆ処理を行い（New England Biolabs, マサチューセッツ）、組換えＡｎｇｐｔｌ３のグリコシル化状態を決定した。精製タンパク質（５０ｎｇ）をＳＤＳポリアクリルアミドゲル（10％ Tris-Glycine, Invitrogen, カリフォルニア）で電気泳動し、通常の手順でニトロセルロース膜（Invitrogen, カリフォルニア）に電気転写した。ＰＢＳ中５％ ｗ／ｖ ノンファットミルクの粉末とインキュベートして膜を遮断し、遮断バッファー中１μｇ／ｍｌモノクローナル抗ｇＤ（クローン ５Ｂ６.Ｋ６）抗体と終夜４℃でインキュベートした。膜をＰＢＳ／０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ロバ抗マウス抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, ペンシルバニア）と１時間室温でインキュベートした。製造者のプロトコルに従った化学発光検出によって（Amersham Pharmacia Biotech, ニュージャージー）Ａｎｇｐｔｌ３タンパク質を可視化した。免疫沈降、一過性形質移入及びＦＡＣＳ分析を先述したように実行した（Klein等, Nature 387:717-21 (1997)）。
【０１７５】
ＰＮＧａｓｅとのインキュベーション時のＡｎｇｐｔｌ３バンドの流動性の低下が、組換えタンパク質がグリコシル化されたことを示した（図６Ｃ）。同様の観察が前もってアンジオポエチンについてなされた。図７Ａに示したように、３つ全てのペプチドを接着アッセイに添加することで、Ａｎｇｐｔｌ３への内皮細胞の結合が完全に阻害された。インテグリンαｖβ３は、ＲＧＤ接着配列に照らしてそのリガンドのいくつかを認識することができる。Ａｎｇｐｔｌ３フィブリノゲン様ドメインはこういったＲＧＤ配列をコードしないという我々の観察の裏付けとして、ＲＧＤペプチドの添加はＨＭＶＥＣ接着を部分的にのみ阻止したが、ＲＧＥペプチドによる影響はなかった。この結果は、Ａｎｇｐｔｌ３のαｖβ３との相互作用の一部のみがＲＧＤに依存した形で媒介されることを意味する。結論として、これらのデータは、Ａｎｇｐｔｌ３のＦＢＮ様ドメイン内の３つ全ての領域がレセプター結合部位であることを示す。
表２
2010100624.tif 000004
【０１７６】
実施例６
細胞接着アッセイ
Ａ．インテグリン媒介Ａｎｇｐｔｌ３細胞接着の同定
Ａｎｇｐｔｌ３に結合する潜在的なインテグリンを同定するために、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（MaxiSorp, Nunc, デンマーク）を、組換えＡｎｇｐｔｌ３タンパク質で終夜４℃で被膜し、ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡで１時間３７℃で遮断した。ＩＩｂＩＩＩａ（αＩＩＢβ３）、αｖβ３、αｖβ１及びαｖβ５を含む、異なるインテグリンヘテロ二量体が安定して形質移入された様々な２９３細胞株を、Ａｎｇｐｔｌ３で被膜されたプレートに結合するそれらの能力について検査した。細胞を回収し、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する無血清ＣＳ−Ｃ培地で１０５細胞／ｍｌに希釈した。細胞を、遮断抗体又はペプチドあり又はなしで、１５分間３７℃でプレインキュベートし、その後２００ｎＭ ＰＭＡで刺激した。被膜されたウェルに細胞懸濁液（１０４細胞／ウェル）を加え、プレートを選択した時間３７℃でインキュベートした。非接着細胞をPBS洗浄によって除去し、LandegrenのＰＮＡＧ法（Landegren, U., J. Immunol. Methods, 67:379-388 (1984)）を用いて細胞付着性を測定した。結果は、３つのウェルの平均ＯＤ４０５値で表す。
【０１７７】
検査した安定細胞株のうち、他の細胞株と比較してαｖβ３を発現する細胞が、Ａｎｇｐｔｌ３への付着性の著しい増加を示した（図７Ｂ）。ゆえに、これらの発見は、組換えヒトＡｎｇｐｔｌ３がαｖβ３インテグリンに特異的に結合することを実証する。これは、低酸素状態及びＶＥＧＦに曝された内皮細胞がより効果的にＡｎｇｐｔｌ３に結合したという先の観察と一致する。
【０１７８】
Ｂ．αｖβ３によるＡｎｇｐｔｌ３細胞接着の媒介
インテグリンは、それらのリガンドによって活性化されたとき、細胞接着や細胞移動といった生物学的反応を誘発することが知られている。Ａｎｇｐｔｌ３が原発性ヒト内皮細胞にそういった影響を及ぼすか、及びαｖβ３がこれらの反応を媒介するのに十分かを検査するために実験を設計した。内皮細胞接着アッセイでの検査時、Ａｎｇｐｔｌ３は、インキュベーション後４時間以内に堅牢な用量依存的接着を誘発した（図７Ｃ）。観察されたレベルは、細胞がビトロネクチン、αｖβ３の原型的リガンド、に蒔かれたときに得られたレベルに匹敵した（データは示さず）。
【０１７９】
αｖβ３インテグリンがＡｎｇｐｔｌ３細胞接着を媒介するのに十分か決定するために、遮断抗体又は抑制ペプチドを、細胞接着アッセイで接着を抑制するそれらの能力について検査した。機能遮断抗体を、Ａｎｇｐｔｌ３被膜ウェルとインキュベーションする前に内皮細胞に添加した。α５β１又はαｖβ５に対する機能遮断抗体の存在は、Ａｎｇｐｔｌ３（２０μｇ／ｍｌ）で被膜された培養皿へのＨＭＶＥＣの接着を阻害しなかったが、αｖβ３特異的抗体は接着を完全に遮断した（図７Ｄ）。一般的なコントロールとして、それらのリガンドに結合するインテグリンを排除するＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を、結合実験に加えた。図７Ｄに示したように、二価カチオンへのインテグリン依存性の阻害は、内皮細胞接着を完全に阻止した。
【０１８０】
実施例７
細胞移動アッセイ
内皮細胞上でのインテグリン活性の別の特徴は、リガンド刺激に対するそれらの移動反応であるため、内皮細胞の移動の誘発に及ぼすＡｎｇｐｔｌ３の影響を研究するために移動アッセイを展開した。
【０１８１】
T. V. Byzova等, Exp. Cell Res., 254:299-308 (2000)に記載の移動アッセイでAngptl3を検査した。移動アッセイは８μm孔サイズを有するHTS Multiwell組織培養挿入物（Becton Dickinson, ニュージャージー）を使用する。Ａｎｇｐｔｌ３タンパク質をＰＢＳ中５０ｎｇ／μｌに希釈し、膜フィルタの表面をアンダーコートするために使用した。３％ＢＳＡ／ＰＢＳでプレコートした後、フィルタを５００μｌ 無血清ＣＳ−Ｃ培地、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、に配置した。ＨＭＶＥＣを３回ＰＢＳで洗浄し、回収し、上述したように補完された無血清培地で、１０５細胞／ｍｌで懸濁した。細胞を、遮断抗体（２５μｇ／ｍｌ）あり又はなしで、１５分間３７℃でプレインキュベートし、その後ＰＭＡ（２００ｎＭ）で刺激した。細胞懸濁液（２５０μｌ）を上方チャンバーに加え、５％ ＣＯ２加湿インキュベーター内で細胞を終夜３７℃で移動させた。インキュベーション後、トップウェルに残っている細胞をスワブを用いて除去し、膜の下方表面に移動した細胞をメタノールで固定し、ＹＯ-ＰＲＯ-１ヨウ化物（Molecular Probes）で染色した。移動結果は、Openlabソフトウェア（Improvision, マサチューセッツ）を用いて、細胞／顕微鏡視野の平均数として定量した。
【０１８２】
Ａｎｇｐｔｌ３を内皮細胞に１６ないし２０時間曝した後、ＢＳＡコントロール処理と比較して細胞移動の２.５倍の増加（図７Ｅ）が観察された。最も重要なことだが、このような移動は、αｖβ３に対するアンタゴニスト抗体の投与によって遮断されたのであり、他のインテグリンを遮断するコントロール抗体によって遮断されたのではない。結論として、Ａｎｇｐｔｌ３は、原発性ヒト内皮細胞の移動を潜在的に誘発し、双方の活性はαｖβ３に対するアンタゴニスト抗体によって遮断される。
【０１８３】
実施例８
Ａｎｇｐｔｌ３の組織発現
Ａ．インサイツハイブリダイゼーション
上述したようにインサイツハイブリダイゼーションを行った（Lu, Cell Vision 1:169-176 (1994)）。PCRプライマー
上流：5' Ｔ７プロモーター：GGATTCTAATACGACTCACT ATAGGGC（配列番号６）＋GGCATTCCTGCTGAATGTACC（ｈＡｎｇｐｔｌ３特異的配列、配列番号７）3'及び
下流：5' Ｔ３プロモーター：CTATGAAATT AACCCTCACTAAAGGGA（配列番号８）＋ ACCACACTCATCATGCCACCA（ｈＡｎｇｐｔｌ３特異的配列、配列番号９）3' 
を、ヒトＡｎｇｐｔｌ３の５０６-ｂｐ断片を増幅するために設計し、
上流：5' Ｔ７プロモーター：GGATTCTAATACGACTCACTATAGGGC（配列番号６）＋5' GATGACCTTCCTGCCGACTG（ｍＡｎｇｐｔｌ３特異的配列、配列番号１１）3'及び
下流：Ｔ３プロモーター：CTATGAAATTAACCCTCACTAAAGGGA （配列番号８）＋5' GTCATTCCACCACCAGCCA（ｍＡｎｇｐｔｌ３特異的配列、配列番号１３）。プライマーには、それぞれ増幅産物からセンス又はアンチセンスのリボプローブのインビトロ転写を可能にするために、２７ヌクレオチドＴ７又はＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ開始部位をコードする伸展部が含まれていた。ヒト組織の５μｍ厚切片を脱パラフィン処理し、２０μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで１５分間３７℃で脱タンパクし、２×ＳＳＣでリンスし、段階的エタノール濃度で脱水し、プレハイブリダイゼーションバッファーで１１−４時間インキュベートした。マウス組織を、４μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫで３０分間３７℃で分解し、上述したように処理した。３３Ｐ-ＵＴＰ標識されたセンス及びアンチセンスプローブを終夜５５℃で切片にハイブリッド形成した。２０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅＡで３０分間３７℃でインキュベーションし、次いで０.１×ＳＳＣで２時間５５℃での高度のストリンジェンシー洗浄を行い、段階的エタノール濃度で脱水することによって、非結合プローブを除去した。スライドをＮＢＴ２核軌道乳剤（Eastman Kodak, ニューヨーク）に浸漬し、乾燥剤入りの密封したプラスチックスライドボックスで４週間４℃で露出し、展開し、ヘマトキシリン及びエロシンで対比染色した。
【０１８４】
図８Ｃに示したように、Ｅ１５及びＥ１８マウス胚からの胚期の肝臓の切片に肝細胞特異的発現が観察された。分析した胚期の切片内の巨核球、内皮細胞又は赤血球前駆体でのＡｎｇｐｔｌ３発現はなかった。
【０１８５】
Ｂ．ノーザンブロット分析
成体ヒト組織でのＡｎｇｐｔｌ３発現を研究するために、上述したようにコード配列の５’端を覆う放射標識されたプローブを用いて多組織ノーザンブロット分析を行った。肝臓で独占的に発現されることがわかったマウスオルソログＡｎｇｐｔｌ３での前の観察（Conklin等, Genomics 62:477-82 (1999)）と対照的に、ヒトＡｎｇｐｔｌ３の発現は、成体の肝臓及び腎臓で見出されたが、腎臓で観察されたシグナルは著しく低かった（図８Ａ）。骨格筋組織でいくらかの弱いシグナルが見られたことを除いて、肺及び脳を含む分析した他の成体組織では発現が見られなかった。ヒト及びマウス標本由来の様々な正常及び罹患組織に対するインサイツハイブリダイゼーション実験によって、Ａｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ発現の細胞局在を調査した。組織は、全ての主要な器官、骨髄、病的な肝組織、例えば肝硬変、転移性肝腺癌及びアセトミノフェンが誘発する肝毒性のケースからの切片を含む。図８Ｂに示したように、何らかのバックグラウンド発現が正常な成体肝臓で見られ、ノーザンブロット分析データを裏付けた。分析した肝腫瘍サンプルでの発現に変化はなかったが、例えば肝硬変や毒性傷害後の、炎症と関連した罹患肝臓に由来する切片には強い誘発が観察された。高い倍率で拡大した図に示したように、肝細胞特異的発現が、正常な肝組織と罹患した肝組織の双方で見られた（図８Ｃ）。罹患組織内又はその周辺の間質細胞、リンパ球及び内皮細胞に、発現は検出されなかった。
【０１８６】
要約すれば、これらのデータは、胚発生中のＡｎｇｐｔｌ３に関する肝細胞特異的発現パターンと、炎症と関連した罹患肝臓の様々なケースにおける強い肝細胞特異的上方制御とを実証する。
【０１８７】
Ｃ．遺伝子発現プロファイリング
癌及び非癌を含む正常及び罹患状態を示しているヒト組織のGeneLogicデータベースを用いて、遺伝子発現分析をＡｎｇｐｔｌ３について行った。
【０１８８】
GeneLogic遺伝子発現データベースを用いて、ヒト肝臓切片のインサイツハイブリダイゼーションによって同定された肝疾患状態における発現の増加（図８Ｂ）を確認した。Ａｎｇｐｔｌ３の基礎レベルは、肝臓を除いてほとんどの組織及び器官で低かった。正常状態と病的状態の間のＡｎｇｐｔｌ３の発現レベルの著しい上昇が、肝臓、心臓及び甲状腺で見られた。様々な形態の肝疾患を患っている患者由来のサンプルを用いた、Ａｎｇｐｔｌ３発現についてのより詳細なサブタイプ分析によって、肝硬変中のＡｎｇｐｔｌ３の最も強い発現が確認された。興味深いことに、GeneLogicデータベース分析によって、病的な肝臓だけでなく、冠状動脈性心臓病及び肥大性心筋症といった心臓病においてもＡｎｇｐｔｌ３発現が強く誘発されることが明らかになった。Ａｎｇｐｔｌ３の発現レベルの上昇と関連した疾患形態は、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニン（これらＥＣＭ分子は全て特異的インテグリン形態に結合することが知られている）を含む多種多様の細胞外マトリクスタンパク質からなる線維化組織の形成を共通して有する。
【０１８９】
実施例９
Ａｎｇｐｔｌ３のインビボ血管新生活性についてのアッセイ
Ａｎｇｐｔｌ３がラット角膜でインビボ血管新生反応を誘発できたか検査するために、マウス及びヒトＡｎｇｐｔｌ３（５００ｎｇ）及びヒトＶＥＧＦ（１００ｎｇ）を含有するヒアルロン・ペレットを別個に又は組合わせて上述したように注入した（Xin等, J. Biol. Chem., 274:99116-9121 (1999)）。賦形剤（コントロール、マウス又はヒトＡｎｇｐｔｌ３（５００ｎｇ）、ＶＥＧＦ（１００ｎｇ）、又はマウス又はヒトＡｎｇｐｔｌ３（５００ｎｇ）及びＶＥＧＦ（１００ｎｇ）の組合わせ）を含有するハイドロン・ペレットを、２５０ないし３００ｇの雄Sprague-Dawleyラットの角膜に注入した。全てのハイドロン・ペレットが１００ｎｇのスクラルフェートを含んだ。６日目に、動物を安楽死させ、脈管構造を可視化するためにフルオレセインイソチオシアネート-デキストランを注入した。角膜のホールマウントを除核した眼球から作り、コンピュータ支援画像分析（Image Pro-Plus 2.0, Silver Spring, メリーランド）を用いて新生血管領域について分析した。角膜血管新生アッセイでの検査においてアンジオポエチン１及び２の効果に焦点を合わせた先の報告（Asahara等, Circ. Res. 83:233-40 (1998)）と対照的に、ペレット注入の５日後、組換えＡｎｇｐｔｌ３のみが強い血管新生反応を誘発した。図９Ａ及びＢに示したように、Ａｎｇｐｔｌ３は、組換えヒトタンパク質と比較してわずかに強く血管新生を誘発したが、どちらの反応もＶＥＧＦについて得られたレベルに匹敵した。ＶＥＧＦとの組合わせ処置では、相乗効果ではなく追加効果が観察された（図９Ｂ）。これらの発見は、双方のリガンドが関与する相互依存的シグナル伝達経路を反映するものであり得る（Byzova等, Mol. Cell. 6:852-60 (2000)）。
【０１９０】
実施例１０
Ａｎｇｐｔｌ３のインビボ生物学的活性
Ａ．Ａｎｇｐｔｌ３の静脈内及び皮内投与の一過的保護効果と長期的効果
手段
アデノウイルス生成：AdEasyアデノウイルスベクター系（Stratagene）を用いて原則的に製造者の指示に従い、アデノウイルスＣＭＶ−ｇＤ−ｍＡｎｇｐｔｌ３、ＣＭＶ−ｌａｃＺ及びｍＶＥＧＦ１６４を生成した。マウスＡｎｇｐｔｌ３又はＶＥＧＦをコードする組換えアデノウイルスベクターを、Ａｎｇｐｔｌ３又はＶＥＧＦのコード領域をStratageneからのAd-easyベクター構築キットのポリリンカー部位へクローニングすることによって、構築した。ｍＡｎｇｐｔｌ３又はＶＥＧＦのコード領域は、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶベクターのＮｏｔ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩ部位の間でクローニングした。供給されたｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ-ｌａｃＺとともに、これらのベクターを、ＢＪ５１８３エレクトロコンピテント・バクテリア（Stratagene）で、Ｅ１及びＥ３領域が除かれたＡｄ５ゲノムを含むＡｄＥａｓｙベクターと組換えした。組換えＡｄＥａｓｙプラスミドをホストＨＥＫ２９３細胞に一過性形質移入することによって、第一のウイルスストックを準備した。アデノウイルスストックをＨＥＫ２９３細胞でさらに増幅させ、Virakit Adeno精製キット（Virapur）を用いて精製した。アガロース・オーバーレイ・プラーク・アッセイでアデノウイルス力価を得た。
【０１９１】
１．Ａｎｇｐｔｌ３の短期的静脈内投与の保護効果
毒性傷害からの肝臓保護の短期的分析のために、尾静脈注射によって１２の成体ＢａｌｂＣマウスにアデノウイルスコンストラクトを投与し、用量１×１０９ ＰｆｕのｍＡｎｇｐｔｌ３及びＬａｃＺコード化コントロールウイルス、及び１×１０７ ＰｆｕｓのＶＥＧＦコード化ウイルスで処置した後２日から３週間にわたって肝臓でタンパク質を連続的且つ堅牢に発現させた。アデノウイルスベクターでの処置の５日後、マウスを２つのサブグループ（ｎ=６）に細分し、賦形剤（オリーブオイル）か又はＣＣｌ４（四塩化炭素）、肝損傷を誘発する強い肝細胞毒素、での処置をさらに施した。賦形剤及びＣＣｌ４は双方とも、強制経口投与により４ｍｌ／ｋｇで与えた。４８時間後、動物を屠殺し、血液を集め、組織を回収し分析のために固定した。マウスでのコンストラクトの発現レベルを、アデノウイルス感染の７日後にウェスタンブロット分析によって分析した（図１０Ａ）。
【０１９２】
結果
Ａｎｇｐｔｌ３をコードするアデノウイルスで処置されたマウスからの血清において、肝不全のインジケーターであるアスパラギン酸トランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の血中濃度が有意に２.１倍低下したが、コントロールコンストラクト（Ｐ＜０.０００１）での処置ではいずれの場合も低減しなかったことにより、ＣＣｌ４が誘発する肝細胞壊死に及ぼすＡｎｇｐｔｌ３の保護効果が実証された（図１０Ｂ）。しかして、組換えＡｎｇｐｔｌ３の一時投与は肝臓損傷の治療に有益であり得る。
【０１９３】
２．Ａｎｇｐｔｌ３の長期にわたる静脈内発現による肝臓損傷の誘発
Ａｎｇｐｔｌ３レベルの上昇の長期的効果を評価するために、上述したようにＡｎｇｐｔｌ３をコードするアデノウイルスベクターで処置したマウスを、ウイルス伝播後２週間にわたって、特徴付けた。
【０１９４】
ａ．血液化学分析
肝機能を示す血液化学レベルを、アデノウイルス伝播後２週間にわたって、野生型Ｃ５７Ｂ１６マウスから採取した血清サンプルで測定した。血液学Cell-Cyn 13700と血液化学レベルをCobas Integra 400で決定した。
【０１９５】
図１１Ａに示したように、Ａｎｇｐｔｌ３をコードするアデノウイルスベクターは、血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルの強い上昇を誘発したが、ＬａｃＺ又はアンジオポエチン１（Ａｎｇ１）をコードするコントロールウイルスは上昇を誘発しなかった。血清ＡＬＴ及びＡＳＴレベルの上昇は、四塩化炭素処置で観察されるＡＬＴ及びＡＳＴレベルに匹敵した。従って、Ａｎｇｐｔｌ３活性の阻害は、肝臓の炎症性疾患又は心臓の疾患に対する潜在的治療となり得る。
【０１９６】
免疫系の潜在的寄与をさらに評価するために、Ｂ及びＴ細胞の欠如した免疫障害のあるＲＡＧ２ノックアウトマウスと、Ｂ、Ｔ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の欠如したＳＣＩＤマウスとで、肝機能を示す血液化学レベルを測定した。図１１Ｂに示したように、Ａｎｇｐｔｌ３をコードするアデノウイルスベクターは、ＲＡＧ２マウスでＡＬＴ及びＡＳＴレベルの上昇を誘発した。これはＡｎｇｐｔｌ３によって誘発される肝機能の変化が、無傷の免疫系の存在に関係なく起こることを示唆する。
【０１９７】
ｂ．肝細胞の増生
ＲＡＧ２ノックアウトマウス及びＳＣＩＤマウスにおける、Ａｎｇｐｔｌ３を発現するアデノウイルスベクターでの処置の効果をさらに特徴付けるために、Ａｎｇｐｔｌ３を発現するアデノウイルスベクター又はコントロールアデノウイルスベクターのいずれかで処置されたＲＡＧ２ノックアウトマウス及びＳＣＩＤマウスの、ホルマリンで固定されＢｒｄＵが加えられた様々な器官、例えば腎臓、心臓、肝臓、肺及び小腸での細胞増生を定量化した。アデノウイルス投与（ＩＶ）１４日後のコントロール又はＡｎｇｐｔｌ３処置されたマウスのパラフィン包理された切片上の、細胞周期のＳフェーズにある細胞を検出するＢｒｄＵ染色を行い、細胞増生を測定した。ＢｒｄＵは、用量１００ｍｇ／ｋｇで動物に腹腔内投与し、１時間後に屠殺した。３７℃で０.０５％のトリプシンで２０分間処置し、変性のために７０℃で０.１５Ｍクエン酸三ナトリウム中９５％のホルムアミドで４５分間処置した後、１:１０００の希釈でＩｄＵ／ＢｒｄＵ（Caltag）に対するマウス抗体で終夜４℃で組織を染色した。マウスＩｇＧ（Vector）に対するビオチン化ウマ抗体を二次試薬として用いて、Vectastin ABC Standard Eliteキット（Vector Laboratories）を使用して検出した。マウスアイソタイプ（Zymed）をネガティブコントロールとして使用した。次いで切片をヘマトキシリンで対比染色した。４０ｘ対象を用いて無作為に選択した、１０の独立した分野の標識された核の総数を数えた。各分野は０.０６３ｍｍ２の領域をカバーした。
【０１９８】
表３に示したように、１０倍を超える肝細胞増生の誘発が、Ａｎｇｐｔｌ３を発現するアデノウイルスベクターで処置されたＲＡＧ２ノックアウトマウス及びＳＣＩＤマウスで観察された。
表３：コントロールで処置したものと比較して、Ａｎｇｐｔｌ３で処置したＲＡＧ２ノックアウトマウス及びＳＣＩＤベージュマウスの処置後１４日目の肝臓切片で増加したＢｒｄＵ染色
2010100624.tif 000005
【０１９９】
ｃ．組織学的分析
アデノウイルスベクターで感染させた後１４日目にＣ５７／Ｂ１６から回収した肝臓切片に、組織学的分析を行った。ＬａｃＺをコードするアデノウイルスベクターで処置したコントロールマウスから単離した肝臓との比較において、肝細胞内での細胞増生と炎症性浸潤を示す有糸分裂像の増加が、Ａｎｇｐｔｌ３をコードするアデノウイルスベクターで処置したマウスから単離した肝臓切片に観察された。Ａｎｇｐｔｌ３で処置した動物の肝臓はまた、コントロールで処置した動物の肝臓よりも有意に大きかった。
【０２００】
ｄ．ＦＡＣＳ分析
免疫細胞上に発現したＬＦＡ１及びＭａｃ-１は、インビボＥＬＩＳＡアッセイでの検査時、組換えＡｎｇｐｔｌ３に結合しなかった（Camenisch等, 2002）が、免疫細胞上に発現するインテグリンファミリーの他のメンバーはＡｎｇｐｔｌ３と関与し得る。
【０２０１】
炎症細胞が、CCLF1を発現するアデノウイルスベクターで処置したマウスの肝臓で観察される組織損傷の一因となる可能性を研究するために、細胞タイプ特異的マーカーに染まる様々な系統の存在を調べるためにＦＡＣＳによって末梢血液細胞の量を決定した。ＬａｃＺ又はＡｎｇ１を発現するコントロールアデノウイルスベクターで処置したマウスと、Ａｎｇｐｔｌ３を発現するアデノウイルスベクターで処置したマウスとでは、前駆体（Ｓｃａ１）、Ｔ細胞（ＣＤ４及びＣＤ８）、Ｂ細胞（Ｂ２２０）、マクロファージ（Ｇｒ１／Ｍａｃ１）及び赤血球細胞（Ｔｅｒ１１９）の量に有意な違いがないことがわかった。同様に、処置グループ間で、血清グリセリド及びコレステロールの量にも違いは観察されなかった。
【０２０２】
ｅ．細胞接着分析
肝損傷の媒介に関与する細胞メカニズムをさらに調査するために、Ａｎｇｐｔｌ３で被膜された組織培養皿上の肝細胞及び内皮細胞を用いた細胞接着実験を、実施例６に示した細胞接着アッセイと同様に行った。
【０２０３】
９６ウェル平底プレート（MaxiSorp, Nunc, デンマーク）を、示した濃度のタンパク質で終夜４℃で被膜し、ＰＢＳ中３％ ＢＳＡで１時間３７℃で遮断した。LeCouter等（LeCouter等, 2001）に記載の手段を用いて成体Ｃ５７／Ｂ１６マウスの肝臓から準備した単離したばかりのマウス肝細胞、及び原発性ヒト真皮内皮細胞（ＨＭＶＥＣ）を回収して、２００ｎＭ ＰＭＡの存在下で、１％ ＢＳＡ、１ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有する無血清ＣＳ−Ｃ培地で１０５細胞／ｍｌに希釈した。ＰＭＡの非存在下で、細胞結合に関して定性的に同様の結果が観察された。被膜されたウェルに細胞懸濁液（１０４細胞／ウェル）を加え、プレートを選択した時間３７℃でインキュベートした。非接着細胞をＰＢＳ洗浄によって除去し、LandegrenのPNAG法（Landegren, 1984）を用いて細胞付着性を測定した。結果は、３つのウェルの平均ＯＤ４０５値で表した。
【０２０４】
図１３に示したように、Ａｎｇｐｔｌ３で被膜された皿へのＨＭＶＥＣ接着は、フィブロネクチンで被膜されたプレートについて観察された接着レベルの２０％から５０％の間であった。肝被膜濃度に依存した細胞接着もまた観察した。しかして、肝細胞及び内皮細胞は、Ａｎｇｐｔｌ３で処置されたマウスの肝臓で観察された生物学的効果の媒介に関与し得る。
【０２０５】
３．Ａｎｇｐｔｌ３の皮内投与による血管透過性の亢進
成体マウスで一過性Ａｎｇｐｔｌ３発現によって誘発される血管変化を研究するために、成体ＦＶＢマウスの耳の表皮層に、麻酔をかけて総量１０μｌのアデノウイルス発現ベクター（１×１０-９ ＰＦＵ）を投与し、エバンスブルーアッセイを用いて血管透過性の変化についてさらに分析した。簡単に言うと、最初からエバンスブルーアッセイの間中、マウスに麻酔をかけた。麻酔効果の発現後、１００μｌのエバンスブルー（ＰＢＳ中１％溶液）をマウスに尾静脈注射によって静脈内投与した。エバンスブルー投与の６０分後、１２０ｍｍＨｇの圧力で、ｐＨ３.５のクエン酸バッファー中１％パラホルムアルデヒドを、左心室からマウスに灌流させた。耳を切り離し重さを量った。エバンスブルーを１ｍＬのホルムアミドで耳から抽出した。滲出したエバンスブルーの量を、分光光度計を用いて６１０ｎｍで測定し、組織の湿重量１ｍｇあたりの含有色素として示した。
【０２０６】
結果
ＬａｃＺを発現するコントロールアデノウイルスベクターを投与したマウスでの血管透過性レベルと比較して、Ａｎｇｐｔｌ３又はＶＥＧＦを発現するアデノウイルスベクターを皮内投与したマウスの耳での血管透過性は、エバンスブルーアッセイで測定したところ、投与の６日後に増加が観察された（図１２Ｄ）。
【０２０７】
Ｂ．Ｋ５−ｍＡｎｇｐｔｌ３を発現するトランスジェニックマウスにおける血管透過性の亢進
別の方法で、発育中及び成体で恒常的に発現される角化細胞特異的プロモーターの制御下で、マウスＡｎｇｐｔｌ３を発現するトランスジェニックマウスを作製することによって、皮膚での上昇したＡｎｇｐｔｌ３発現レベルの発生効果を研究した。
【０２０８】
１．初代トランスジェニックマウス
マウスＫ５プロモーターの制御下でＡｎｇｐｔｌ３の発現を可能にするコンストラクトであるＫ５−ｇＤ−ｍＡｎｇ５を用いて、標準的な手順（Filvaroff等, 2002）で初代トランスジェニックマウスを作製した。Ｋ５−ｇＤ−ｍＡｎｇ５コンストラクトを生成するために、Ａｎｇｐｔｌ３からＮｏｔＩ−ＮｏｔＩを取り除き、ｐＮＡＳＳＫ５β  ＮｏｔＩ−ＮｏｔＩ−ＳＡＰに挿入し、Ｋ５−ｇＤ−ｍＡｎｇ５を生じさせた。
【０２０９】
合計１７のトランスジェニック初代株を作製した。以下のプライマーセット：
gD-mAng5.311.F：ATATGCCTTGGCGGATGC（配列番号：３２）；及び
gD-mAng5.578.R：ATGGACAAAATCTTTAAGTCCATGAC（配列番号：３３）
を用いてマウス尾部ＤＮＡ（QIAGEN, サンタクラリタ, カリフォルニア）のＰＣＲによって生後９日目にマウス胎仔の遺伝子型を特定した。
【０２１０】
８週齢で、筋肉、腎臓、肝臓、脾臓、皮膚、脳、胸腺及び腸を含む、複数の組織の生検を採取し、Ａｎｇｐｔｌ３の内因性及び導入遺伝子発現レベルを決定するためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ分析については、内因性及び導入遺伝子転写を測定できるように設計された以下のプローブ及びプライマー：
MMAng5.1165.FP：FAM-CTCCCAGAGCACACAGACCTGATGTTTTTAMRA（配列番号：３４）
MMAng5.1144.F：GCTGGCAATATCCCTGGG（配列番号：３５）
MMAng5.1223.R：AGCTGTCCCTTTGCTCTGTGA（配列番号：３６）
を用いた。
【０２１１】
マウスＫ５プロモーター下でＡｎｇｐｔｌ３を発現するトランスジェニックマウス間での相違の統計的分析をスチューデントのｔ検定によって決定し、Ｐ＜０.０５の値を統計学的に有意差あり、Ｐ＜０.０１の値を非常に有意差ありとした。
【０２１２】
２．継代トランスジェニックマウス
全ての初代トランスジェニックマウスの皮膚生検からの遺伝子発現分析に基づいて、５つの最も高度にＡｎｇｐｔｌ３を発現している初代を同定し、さらにＣ５７／Ｂ１６マウスに交配した。遺伝子型頻度分析によって、導入遺伝子の正常なメンデル遺伝子頻度分布が明らかになり、導入遺伝子発現と関連する有意な生後致死性は観察されなかった。
【０２１３】
ａ．導入遺伝子発現
提示した様々な組織からのＲＮＡを単離し、特に肝臓における、内因性発現に対する導入遺伝子発現の相対的レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲで評価した。
【０２１４】
予想されたように、マウスＡｎｇｐｔｌ３発現レベルの上昇が、トランスジェニック対リットルが同等の野生型コントロールの皮膚で観察された。皮膚でのＡｎｇｐｔｌ３の導入遺伝子発現は、肝臓での内因性Ａｎｇｐｔｌ３発現レベルの約１０％に達した（図１２Ａ）。
【０２１５】
さらに、野生型マウスと比較して、１２週齢のトランスジェニックマウスの肺及び脳において中程度の発現が観察された。従って、肺及び脳での発現は、これらの組織でのＫ５プロモーターの転写活性の増加によるものであり得る。
【０２１６】
ノーザンブロット分析によって成体ヒト腎臓に見られた中程度のＡｎｇｐｔｌ３発現（図８Ａ）の裏付けとして、マウス腎臓ＲＮＡのＴａｑｍａｎ分析によってＡｎｇｐｔｌ３の中程度の内因性発現レベルを明らかにした。
【０２１７】
長期にわたって生後の導入遺伝子発現をモニターするために、３、６及び１１週齢のトランスジェニックマウスの皮膚生検から単離したＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。図１２Ｂに示したように、検査した全発育段階において、一貫したレベルの導入遺伝子発現がトランスジェニックマウスの皮膚で観察された。
【０２１８】
ｂ．血管透過性
導入遺伝子発現データに基づき、１２週齢のトランスジェニック及びリットルが同等の野生型コントロールを選択し、血管新生分子のアンジオポエチンファミリーの構造上関連した２つのメンバーであるＡｎｇ１及びＡｎｇ２について行われた（Maisonpierre等, 1997；Thurston等, 2000；Thurston等, 1999）ような、及び上述したようなエバンスブルーアッセイを用いて血管透過性についてアッセイを施した。血管透過性を上述したようにエバンスブルーアッセイで測定した。エバンスブルー分析を行った１１週齢のトランスジェニック株は双方とも、リットルが同等の野生型株と比較して、基礎レベルの血管透過性が約２ないし３倍と有意に亢進した（図１２Ｃ）。しかし、エバンスブルーアッセイ分析を行う前にマウスにからし油を投与した場合、トランスジェニックマウスとリットルが同等の野生型マウスとの血管透過性の相違はそれほど顕著ではなかった。従って、リットルが同等の野生型マウスに対するトランスジェニックマウスでの血管透過性の亢進は、血管透過性の調節におけるＡｎｇｐｔｌ３の役割を示し得る。
【０２１９】
材料の寄託
上述したように、以下の材料はAmerican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC)に寄託されている：
材料                            ATCC寄託番号          寄託日
Angptl3-DNA16451-1078           209281                1997年9月18日
【０２２０】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則（ブダペスト条約）の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテック・インコーポレーテッドとＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則（特に参照番号８８６ＯＧ６８３の３７ＣＦＲ第１.１４条を含む）に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０２２１】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託された材料の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
【０２２２】
本明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。記載した実施態様は、本発明のある側面の１つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる構築物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された構築物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、本明細書が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、請求の範囲をそれが表す特定の例示に制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここで示され説明された例に加えて、本発明の様々な変形が、上述した説明から当業者には明らかになるであろうし、それらは請求の範囲に含まれる。
【０２２３】
実施態様
１．  Ａｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストを用いて組織を治療することを含んでなる、Ａｎｇｐｔｌ３の過剰発現を特徴とする組織損傷の治療方法。
２．  組織が肝組織である請求項１に記載の方法。
３．  組織損傷が炎症に関連している請求項２に記載の方法。
４．  組織損傷が慢性肝疾患に関連している請求項３に記載の方法。
５．  組織損傷が肝腫瘍に関連している請求項２に記載の方法。
６．  組織が心臓組織である請求項１に記載の方法。
７．  組織損傷が炎症に関連している請求項６に記載の方法。
８．  組織損傷がＡｎｇｐｔｌ３の上昇発現を特徴とする心疾患に関連している請求項６に記載の方法。
９．  アンタゴニストが抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体、又は抗αｖβ３抗体である請求項１に記載の方法。
１０．  アンタゴニストがイムノアドヘシンである請求項１に記載の方法。
１１．  必要とする哺乳類対象体に有効量のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストを投与することを含んでなる、哺乳類対象体における慢性肝疾患の治療方法。
１２．  慢性肝疾患がＡｎｇｐｔｌ３の上昇発現を特徴とする請求項１１に記載の方法。
１３．  アンタゴニストが抗Ａｎｇｐｔｌ３又は抗αｖβ３抗体である請求項１１に記載の方法。
１４．  対象体に有効量のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストを投与することを含んでなる、哺乳類対象体における、Ａｎｇｐｔｌ３の上昇発現を特徴とする心臓病の治療方法。
１５．  アンタゴニストが抗Ａｎｇｐｔｌ３抗体、又は抗αｖβ３抗体である請求項１４に記載の方法。
１６．  必要とする哺乳類対象体に、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する治療有効量のポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含んでなる、急性肝疾患の治療方法。
１７．  前記ポリペプチドが、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列のアミノ酸領域２８１−２９３（Ｐ１, 配列番号１４）、４４２−４６０（Ｐ２, 配列番号１５）、及び４１５−４３０（Ｐ３, 配列番号１７）を有する請求項１６に記載の方法。
１８．  前記ポリペプチドが、配列番号２のヒトAngptl3配列のフィブリノゲンドメインを有する請求項１６に記載の方法。
１９．  付加的な治療薬の投与をさらに含んでなる請求項１６に記載の方法。
２０．  前記アゴニストが、Ａｎｇｐｔｌ３又はαｖβ３に特異的に結合するアゴニスト抗体である請求項１６に記載の方法。
２１．  必要とする哺乳類対象体に、配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する治療有効量のポリペプチド又はそのアゴニストを投与することを含んでなる、急性肝傷害後の肝再生誘発方法。
２２．  配列番号２のヒトＡｎｇｐｔｌ３配列と少なくとも８０％の配列同一性を持つアミノ酸配列を有する有効量のポリペプチド又はそのアゴニストで組織を治療することを含んでなる、組織における血管新生誘発方法。
２３．  組織が肝組織である請求項２２に記載の方法。
２４．  組織が心臓組織である請求項２２に記載の方法。
２５．  有効量のＡｎｇｐｔｌ３のアンタゴニストで組織を治療することを含んでなる、組織における血管透過性の望ましくない亢進の抑制方法。
２６．  組織が肝組織である請求項２５に記載の方法。
２７．  組織が心臓組織である請求項２５に記載の方法。
２８．  ヒト対象体の心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルを、正常な心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３又はその発現産物のレベルと比べて決定することと、該対象体の心臓組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルが正常な心臓細胞と比べて高い場合、該対象体を危険性があるとして同定することを含んでなる、心臓血管疾患の危険性があるヒト対象体の同定方法。
２９．  対象体の肝組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルを、正常な肝組織におけるＡｎｇｐｔｌ３又はその発現産物のレベルと比べて決定することと、該対象体の肝組織におけるＡｎｇｐｔｌ３ ｍＲＮＡ又はその発現産物のレベルが正常な肝細胞と比べて高い場合、該対象体を危険性があるとして同定することを含んでなる、肝損傷の危険性があるヒト対象体の同定方法。
【図１】
2010100624.tif 000006
【図２Ａ】
2010100624.tif 000007
【図２Ｂ】
2010100624.tif 000008
【図３Ａ】
2010100624.tif 000009
【図３Ｂ】
2010100624.tif 000010
【図４】
2010100624.tif 000011
【図５】
2010100624.tif 000012
【図６】
2010100624.tif 000013
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2010100624.tif 000015
【図７Ｃ】
2010100624.tif 000016
【図７Ｄ】
2010100624.tif 000017
【図７Ｅ】
2010100624.tif 000018
【図８Ａ】
2010100624.tif 000019
【図８Ｂ】
2010100624.tif 000020
【図８Ｃ】
2010100624.tif 000021
【図９Ａ−Ｄ】
2010100624.tif 000022
【図９Ｅ】
2010100624.tif 000023
【図１０Ａ】
2010100624.tif 000024
【図１０Ｂ】
2010100624.tif 000025
【図１１Ａ】
2010100624.tif 000026
【図１１Ｂ】
2010100624.tif 000027
【図１２Ａ】
2010100624.tif 000028
【図１２Ｂ】
2010100624.tif 000029
【図１２Ｃ】
2010100624.tif 000030
【図１２Ｄ】
2010100624.tif 000031
【図１３】
2010100624.tif 000032
【配列表】
2010100624000001.app
【外国語明細書】
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