【手続補正書】
【提出日】令和2年12月23日(2020.12.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマー伸長産物の３’末端に組み込まれた３’−Ｏ−リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを検出する方法であって、前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが、核酸塩基、糖部分、および切断可能なブロッキング基を含み、前記方法が、
（ａ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含む前記プライマー伸長産物を提供すること、
（ｂ）（ａ）からの前記プライマー伸長産物および前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する第１の親和性試薬を組み合わせることであって、前記第１の親和性試薬が、前記核酸塩基、前記切断可能なブロッキング基、または両方に、または前記核酸塩基および３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチド伸長産物の３’−ＯＨ部分に結合する、前記組み合わせること、および
（ｃ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１の親和性試薬が前記糖部分を含むエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸塩基が、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）から選択される天然核酸塩基である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の親和性試薬が、
（ｉ）デオキシリボヌクレオチドグアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）を含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからアデニン（Ａ）を含む組み込まれたリバーシブルターミネーター；
（ｉｉ）Ｔ、Ｃ、またはＡを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからＧを含む組み込まれたリバーシブルターミネーター；
（ｉｉｉ）Ｇ、Ｃ、またはＡを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからＴを含む組み込まれたリバーシブルターミネーター；または
（ｉｖ）グアニンＧ、Ｔ、またはＡを含む組み込まれたリバーシブルターミネーターからＣを含む組み込まれたリバーシブルターミネーター
を識別する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸塩基が、アデニンアナログ（Ａ’）、グアニンアナログ（Ｇ’）、チミンアナログ（Ｔ’）またはシトシンアナログ（Ｃ’）であり、かつ、前記第１の親和性試薬が、対応する天然核酸塩基を含む組み込まれたヌクレオチドへの結合と比べて前記アナログを含む組み込まれたヌクレオチドに優先的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の親和性試薬が前記切断可能なブロッキング基に結合する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）において、前記プライマー伸長産物が、異なる結合特異性を有する２、３または４つの親和性試薬と組み合わせられ、かつ、１つの親和性試薬が、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１つの親和性試薬による結合が前記核酸塩基を同定する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｃ）の後に（ｄ）前記切断可能なブロッキング基を除去して３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチドを生じさせることをさらに含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の親和性試薬が抗体またはアプタマーである、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の親和性試薬が、検出可能な標識にコンジュゲートまたは結合されており、かつ、工程（ｃ）における前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記親和性試薬の結合を検出することが、前記検出可能な標識からのシグナルを検出することを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の親和性試薬が標識されておらず、かつ、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出する前記工程が、
（ｉ）前記第１の親和性試薬に１つまたは複数の二次親和性試薬を結合させることであって、前記二次親和性試薬が検出可能な標識を含む、前記結合させることを含み、かつ、
（ｉｉ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出することが、前記検出可能な標識からのシグナルを検出することを含む、
請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の親和性試薬および前記第２の親和性試薬が工程（ｂ）の前に組み合わせられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合が蛍光または化学発光シグナルを検出することによって工程（ｄ）において検出される、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
シークエンシングバイシンセシス反応を行う方法であって、
（ａ）複数の異なる鋳型配列を含む複数の固定化された鋳型核酸を含むＤＮＡアレイを提供する工程であって、異なる鋳型配列は前記アレイ上の異なる位置において固定化されている、提供する工程；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーを前記鋳型核酸にアニールさせる工程であって、前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記鋳型核酸上の予め決定された位置にハイブリダイズする、前記アニールさせる工程；
（ｃ）前記鋳型核酸およびそれにアニールしたプライマーをポリメラーゼおよび４つの異なるリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドと組み合わせる工程であって、各リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが、核酸塩基（Ｎ）、糖部分、および切断可能なブロッキング基を含み、
Ｎが、アデニン（Ａ）またはそのアナログ（Ａ’）、グアニン（Ｇ）またはそのアナログ（Ｇ’）、チミン（Ｔ）またはそのアナログ（Ｔ’）、およびシトシン（Ｃ）またはそのアナログ（Ｃ’）であり、
前記４つの異なるリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの少なくとも１つが非標識であり、
前記組み合わせる工程が、複数の前記オリゴヌクレオチドプライマーが、それぞれ単一のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの組込みにより伸長されてそれぞれ３’端を含む複数のプライマー伸長産物を生じさせる条件下で行われ、前記複数のプライマー伸長産物の一部が、３’端において組み込まれたＡまたはＡ’を含み、前記複数のプライマー伸長産物の一部が、３’端において組み込まれたＴまたはＴ’を含み、前記複数のプライマー伸長産物の一部が、３’端において組み込まれたＧまたはＧ’を含み、かつ、前記複数のプライマー伸長産物の一部が、３’端において組み込まれたＣまたはＣ’を含む、前記組み合わせる工程；
（ｄ）前記複数のプライマー伸長産物を１つまたは複数の第１の親和性試薬と、前記１つまたは複数の第１の親和性試薬のそれぞれが、前記４つの異なる組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの１つのみに結合する条件下で接触させる工程であって、前記第１の親和性試薬が、４つの組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの前記１つの、前記核酸塩基、前記糖部分、前記切断可能なブロッキング基またはこれらの組合せに結合する、前記接触させる工程；
（ｅ）前記１つまたは複数の第１の親和性試薬の結合を検出する工程であって、組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含むプライマー伸長産物への第１の親和性試薬の結合が、前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの前記核酸塩基および前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの前記核酸塩基に相補的な前記鋳型ヌクレオチド（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の前記核酸塩基を同定する、前記検出する工程
を含む、方法。
【請求項１６】
前記４つの異なるリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの全てが非標識である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
核酸をシークエンシングする方法であって、
（ａ）前記核酸を含む核酸鋳型、前記鋳型の部分に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、および式Ｉ：
【化１】
2020508037.tif 000001
（式中、
Ｒ１は３’−Ｏリバーシブル切断可能なブロッキング基であり；
Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつ
Ｒ３は、１つまたは複数のホスフェートからなる）の非標識ＲＴを、前記核酸鋳型に相補的な配列に前記非標識ＲＴを組み込むことによって前記プライマーが伸長するために適切な条件下で接触させ、それにより、前記非標識ＲＴを含む非標識伸長産物を生じさせること；
（ｂ）前記非標識伸長産物を、検出可能な標識を含む親和性試薬と、前記親和性試薬が前記非標識ＲＴに特異的に結合する条件下で接触させて、前記ＲＴを含む標識された伸長産物を生じさせること；および
（ｃ）前記標識された伸長産物中の前記非標識ＲＴを同定して、前記核酸の配列の少なくとも一部分を同定すること
を含む、方法。
【請求項１８】
ＤＮＡアレイであって、
前記アレイ上の異なる位置において固定化された複数の異なる鋳型ＤＮＡ分子であって、前記複数の鋳型ＤＮＡ分子は、それにアニールしたプライマー伸長産物を含み、前記プライマー伸長産物は、Ａ、Ｔ、ＧもしくはＣの核酸塩基またはそのアナログを含む３’リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含む、前記複数の鋳型ＤＮＡ分子；および
前記第１のリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの少なくとも一部に特異的に結合した親和性試薬
を含む、ＤＮＡアレイ。
【請求項１９】
（ａ）式Ｉ：
【化２】
2020508037.tif 000002
（式中、
Ｒ１は３’−Ｏ切断可能なブロッキング基であり；
Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり、リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドのそれぞれの型は異なる核酸塩基を含み；かつ
Ｒ３は、１つまたは複数のホスフェートを含み、
Ｒ１は、独立してリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドのそれぞれの型について選択される）の４つの型の非標識リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチド；
（ｂ）それぞれの第１の親和性試薬がプライマー伸長産物の３’端に組み込まれたときに前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの異なる１つに結合する複数の第１の親和性試薬；および
（ｃ）（ａ）および（ｂ）のためのパッケージング
を含む、キット。
【請求項２０】
前記プライマー伸長産物が複数のプライマー伸長産物を含むＤＮＡアレイ上であり、各プライマー伸長産物が鋳型ＤＮＡにハイブリダイズされる、方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡアレイを前記鋳型ＤＮＡ分子のそれぞれの部分に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、および式Ｉ：
【化３】
2020508037.tif 000003
（式中、
Ｒ１は３’−Ｏ切断可能なブロッキング基であり；
Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつ
Ｒ３は、１つまたは複数のホスフェートからなる）の非標識リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドと、前記プライマーが伸長されて前記複数の前記鋳型ＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な配列に前記非標識リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが組み込まれる条件下で接触させ、それにより、前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含む非標識伸長産物を生じさせること；
（ｂ）前記非標識伸長産物を、検出可能な標識を含む親和性試薬と、前記親和性試薬が前記リバーシブルターミネーターヌクレオチドに特異的に結合する条件下で接触させて、前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含む標識された伸長産物を生じさせること；および
（ｃ）前記標識された伸長産物中の前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを同定して、前記核酸の配列の少なくとも一部分を同定すること
を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
４つのリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが非標識であり、かつ、工程（ｄ）において、４つの第１の親和性試薬が使用され、前記４つの第１の親和性試薬のそれぞれが、前記４つの組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの１つに特異的に結合する、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２２】
４つの異なるリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの少なくとも１つが天然に存在する核酸塩基を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２３】
（ｆ）前記第１の親和性試薬を除去することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
（ｇ）前記切断可能なブロッキング基を除去して３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチドを生じさせること、および
工程（ｃ）〜（ｇ）を２５回またはそれより多いサイクルにわたり繰り返して、前記鋳型中の追加の核酸塩基を同定すること
をさらに含み、工程（ｃ）における前記鋳型核酸にアニールしたプライマーが、先行するサイクルのプライマー伸長産物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の親和性試薬が抗体である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸塩基が、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）から選択される天然核酸塩基である、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記結合が、蛍光または化学発光シグナルを検出することによって工程（ｅ）において検出される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の親和性試薬がアプタマーである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記切断可能なブロッキング基が、アリル、アジドメチル、アミノアルコキシル、２−シアノエチル、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルケニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換ヘテロアルケニル、非置換ヘテロアルケニル、置換ヘテロアルキニル、非置換ヘテロアルキニル、アレニル、シス−シアノエテニル、トランス−シアノエテニル、シス−シアノフルオロエテニル、トランス−シアノフルオロエテニル、シス−トリフルオロメチルエテニル、トランス−トリフルオロメチルエテニル、ビスシアノエテニル、ビスフルオロエテニル、シス−プロペニル、トランス−プロペニル、ニトロエテニル、アセトエテニル、メチルカルボノエテニル、アミドエテニル、メチルスルホノエテニル、メチルスルホノエチル、ホルムイミデート、ホルムヒドロキシメート、ビニロエテニル、エチレノエテニル、シアノエチレニル、ニトロエチレニル、アミドエチレニル、アミノ、シアノエテニル、シアノエチル、アルコキシ、アシル、メトキシメチル、アミノキシル、カルボニル、ニトロベンジル、クマリニル、およびニトロナフタレニルからなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記切断可能なブロッキング基がアジドメチルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ｄ）および工程（ｅ）において、２つ、３つ、または４つの第１の親和性試薬が使用される、請求項１６に記載の方法。
【請求項３２】
前記切断可能なブロッキング基および前記親和性試薬を同じ反応において除去することを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項３３】
切断可能なブロッキング基を除去することなく、第１の親和性試薬が除去される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項３４】
（ｉ）組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの親和性試薬の結合を検出すること；
（ｉｉ）組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの切断可能なブロッキング基を除去することなく、親和性試薬を除去すること；
（ｉｉｉ）親和性試薬の結合を検出することによって同じ組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを再プロービングすること
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ｉ）における親和性試薬および（ｉｉ）における親和性試薬の１つの親和性試薬が抗体であり、（ｉ）における親和性試薬および（ｉｉ）における親和性試薬の１つの親和性試薬がアプタマーである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
複数サイクルのシークエンシングバイシンセシスを行い、それぞれのサイクルは核酸鋳型を、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される異なる核酸塩基をそれぞれ含む式Ｉの４つの異なるリバーシブルターミネーターヌクレオチドと接触させることを含み、４つの異なるリバーシブルターミネーターヌクレオチドの少なくとも１つが非標識ＲＴであり、工程（ａ）の条件が標識および非標識リバーシブルターミネーターヌクレオチドの組込みのために適切である、請求項１７に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも２５サイクルのシークエンシングバイシンセシスを行う、請求項１７または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記４つの異なるリバーシブルターミネーターヌクレオチドの全４つが非標識である、請求項１７または３６に記載の方法。
【請求項３９】
リバーシブルターミネーターヌクレオチドの少なくとも１つが蛍光標識である、請求項１７または３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記切断可能なブロッキング基が、アリル、アジドメチル、アミノアルコキシル、２−シアノエチル、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルケニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換ヘテロアルキル、非置換ヘテロアルキル、置換ヘテロアルケニル、非置換ヘテロアルケニル、置換ヘテロアルキニル、非置換ヘテロアルキニル、アレニル、シス−シアノエテニル、トランス−シアノエテニル、シス−シアノフルオロエテニル、トランス−シアノフルオロエテニル、シス−トリフルオロメチルエテニル、トランス−トリフルオロメチルエテニル、ビスシアノエテニル、ビスフルオロエテニル、シス−プロペニル、トランス−プロペニル、ニトロエテニル、アセトエテニル、メチルカルボノエテニル、アミドエテニル、メチルスルホノエテニル、メチルスルホノエチル、ホルムイミデート、ホルムヒドロキシメート、ビニロエテニル、エチレノエテニル、シアノエチレニル、ニトロエチレニル、アミドエチレニル、アミノ、シアノエテニル、シアノエチル、アルコキシ、アシル、メトキシメチル、アミノキシル、カルボニル、ニトロベンジル、クマリニル、およびニトロナフタレニルからなる群から選択される、請求項１７または３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記切断可能なブロッキング基がアジドメチルである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アレイ上の異なる位置において固定化された鋳型ＤＮＡ分子が、ＤＮＡナノボールまたはブリッジ増幅を使用して製造されるアンプリコンのクローン集団である、請求項１８に記載のＤＮＡアレイ。
【請求項４３】
非標識リバーシブルターミネーターヌクレオチドの型の少なくとも１つの切断可能なブロッキング基がアジドメチルである、請求項１９に記載のキット。
【請求項４４】
プライマー伸長産物の３’末端に組み込まれた３’−Ｏ−リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを検出する方法であって、前記リバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドが、核酸塩基、糖部分、および切断可能なブロッキング基を含み、前記方法が、
（ａ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドを含むプライマー伸長産物を提供すること；
（ｂ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドの前記切断可能なブロッキング基を除去してプライマー伸長産物の３’−ＯＨデオキシリボヌクレオチド部分を生じさせること；および次に
（ｃ）前記（ｂ）からのプライマー伸長産物を前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドに結合する第１の親和性試薬と組み合わせることであって、前記第１の親和性試薬が前記核酸塩基および３’−ＯＨプライマー伸長産物の３’−ＯＨ部分に結合する、前記組み合わせること、および
（ｄ）前記組み込まれたリバーシブルターミネーターデオキシリボヌクレオチドへの前記第１の親和性試薬の結合を検出すること
を含む、方法。
【請求項４５】
前記第１の親和性試薬が抗体またはアプタマーである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸塩基が、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）から選択される天然核酸塩基である、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４７】
核酸をシークエンシングする方法であって、
（ａ）（ｉ）複数の鋳型ＤＮＡ分子を含むＤＮＡアレイを提供することであって、各鋳型ＤＮＡ分子が、プライマー結合部位および核酸の断片を含み、前記複数の鋳型ＤＮＡ分子のそれぞれが、前記アレイの位置において取り付けられている、前記提供すること、
（ｂ）前記ＤＮＡアレイを前記プライマー結合部位に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、および式Ｉ：
【化４】
2020508037.tif 000004
（式中、
Ｒ１は３’−Ｏ切断可能なブロッキング基であり；
Ｒ２は、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびこれらのアナログから選択される核酸塩基であり；かつ
Ｒ３は、１つまたは複数のホスフェートからなる）の非標識リバーシブルターミネーターヌクレオチド（ＲＴ）と、前記プライマーが前記鋳型ＤＮＡ分子のプライマー結合部位にハイブリダイズし、前記少なくとも一部のハイブリダイズされたプライマーが伸長されて前記鋳型ＤＮＡ分子に相補的な配列に前記非標識ＲＴが組み込まれる条件下で接触させ、それにより、前記非標識ＲＴを含む非標識伸長産物を生じさせること；
（ｃ）前記非標識伸長産物を、親和性試薬と、前記親和性試薬が前記組み込まれたＲＴに特異的に結合する条件下で接触させて、前記ＲＴを含む標識された伸長産物を生じさせることであって、前記親和性試薬は検出可能な標識と直接的または間接的に関連付けられる、前記生じさせること；および
（ｄ）前記標識された伸長産物中の前記ＲＴを同定して、前記核酸の配列の少なくとも一部分を同定すること
を含む、方法。
【請求項４８】
（ａ）前記ＤＮＡアレイを、前記鋳型ＤＮＡ分子のそれぞれの部分に相補的な核酸プライマー、ポリメラーゼ、ならびにＲ２がアデニン（Ａ）である第１のＲＴ、Ｒ２がチミン（Ｔ）である第２のＲＴ、Ｒ２がシトシン（Ｃ）である第３のＲＴ、およびＲ２がグアニン（Ｇ）である第４のＲＴを含む式Ｉの非標識ＲＴのセットと、前記プライマーが伸長されて前記複数の前記鋳型ＤＮＡ分子の少なくとも一部に相補的な配列に前記非標識ＲＴが組み込まれる条件下で接触させ、それにより、前記ＲＴを含む非標識伸長産物を生じさせること；
（ｂ）前記非標識伸長産物を親和性試薬のセットと、前記親和性試薬のセットが前記ＲＴに特異的に結合する条件下で接触させて、前記ＲＴを含む標識された伸長産物を生じさせることであって、（ｉ）前記親和性試薬のセットが、前記第１のＲＴに特異的に結合する第１の親和性試薬、前記第２のＲＴに特異的に結合する第２の親和性試薬、前記第３のＲＴに特異的に結合する第３の親和性試薬、および適宜、前記第４のＲＴに特異的に結合する第４の親和性試薬を含み；（ｉｉ）少なくとも前記第１、第２、および第３の親和性試薬が、検出可能な標識を含む、前記生じさせること；および
（ｃ）前記アレイ上の各々の位置において前記ＲＴに結合した前記標識された親和性試薬の前記標識を同定することにより前記標識された伸長産物中の前記ＲＴを同定して、前記核酸の配列の少なくとも一部分を同定すること
を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
（ｄ）前記ＲＴから前記ブロッキング基を除去して３’−ＯＨを生じさせること；および
（ｅ）前記親和性試薬を前記ＲＴから除去すること
をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記アレイ上の異なる位置において固定化された鋳型ＤＮＡ分子が、ＤＮＡナノボールまたはブリッジ増幅を使用して製造されるアンプリコンのクローン集団である、請求項４７〜４９のいずれかに記載の方法。