【手続補正書】
【提出日】令和2年12月4日(2020.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．標的タンパク質バイオマーカーに特異的なバイオマーカー特異的薬剤を試料に適用すること；
ｂ．試料にバイオマーカー特異的薬剤に特異的な第２の結合剤を適用することであって、第２の結合剤は二次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；
ｃ．試料に、チラミドハプテンとコンジュゲートしたチラミド分子を含むチラミド剤を適用することであって、二次酵素が第２の結合剤の位置でチラミドハプテンの試料への付着を触媒する、適用すること；
ｄ．試料にチラミドハプテンに特異的な第３の結合剤を適用することであって、第３の結合剤は三次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；及び
ｅ．試料に検出可能部分を適用することであって、三次酵素が検出可能部分との反応を触媒して検出可能部分を可視化する、適用すること；
を含む、試料中の標的タンパク質バイオマーカーに対するシグナルを増幅する方法であって、それによって検出可能部分が明視野顕微鏡法を用いて点状ドットとして可視化され、点状ドットが標的タンパク質バイオマーカーを示しており、且つ
検出可能部分がチラミドローダミン染料を含む、方法。
【請求項２】
試料が組織試料であり、組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料であってもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
標的タンパク質バイオマーカーがタンパク質、炭水化物、核酸、脂質、翻訳後修飾又はこれらの組み合わせを含むか、又は
標的タンパク質バイオマーカーが分泌分子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
翻訳後修飾がリン酸修飾、ゲラニル修飾、アセチル修飾、ユビキチン修飾、炭水化物修飾、カルバミル修飾又はこれらの組み合わせを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
バイオマーカー特異的薬剤が一次抗体を含み、
一次抗体が天然の未修飾抗体であってもよく及び／又は一次抗体がモノクローナル又はポリクローナルであってもよい、請求項１−４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第２の結合剤が二次抗体を含む、請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
二次酵素がオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ又はペルオキシダーゼを含み、
ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含んでもよい、請求項１−６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
チラミドハプテンがビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ニトロピラゾール（ＮＰ）、ベンゾフラザン（ＢＦ）、ベンゾダザピン（ＢＤ）、ニトロシンアミド（ＮＣＡ）又はジニトロフェニル（ＤＮＰ）を含む、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第３の結合剤が三次抗体を含み、
三次抗体がモノクローナル抗体を含んでもよい、請求項１−８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
チラミドローダミン染料がローダミン１１０、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１（テキサスレッド）又はこれらの組み合わせを含む、請求項１−９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
検出可能部分がＤＡＢ、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー又はテトラゾリウムバイオレットを含む、請求項１−１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
２つ以上の標的タンパク質バイオマーカーが検出及び識別される多重免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイに適用される、請求項１−１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１−１２のいずれか一項に記載の方法を実行するための、スライドホルダー、試薬及びディスペンサーを備える自動システム。
【請求項１４】
プロセッサに接続されたメモリを備えるシステムを更に含み、メモリが、プロセッサによって実行されると、請求項１−１２のいずれか一項に記載の方法のための動作を自動システムに実行させるコンピュータ可読命令を記憶する、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
ディスペンサーがスライドホルダー内のスライド上に試薬を分配するように適合されている、請求項１３又は１４に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４０】
本発明の好ましい実施態様が示され、記載されているが、当業者には、それらに添付の特許請求の範囲を超えない修正がなされてもよいことが容易に明らかである。したがって、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。特許請求の範囲で列挙される参照番号は、例示的且つ特許事務所のレビューを容易にするためだけのものであり、決して限定的ではない。いくつかの実施態様において、この特許出願に提示される図は、角度、寸法比等を含め、縮尺通りに描かれている。いくつかの実施態様において、図は代表的であるのみであり、特許請求の範囲は図の寸法により制限されない。いくつかの実施態様において、語句「含む」を使用する本明細書に記載される発明の説明は、「から成る」として記載することのできる実施態様を含み、したがって、用語「から成る」を使用する本発明の一又は複数の実施態様を主張するためのそのような書面の説明要件が満たされる。
＜さらなる実施態様＞
［実施態様１］
ａ．標的タンパク質バイオマーカーに特異的なバイオマーカー特異的薬剤を試料に適用すること；
ｂ．試料にバイオマーカー特異的薬剤に特異的な第２の結合剤を適用することであって、第２の結合剤は二次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；
ｃ．試料に、チラミドハプテンとコンジュゲートしたチラミド分子を含むチラミド剤を適用することであって、二次酵素が第２の結合剤の位置でチラミドハプテンの試料への付着を触媒する、適用すること；
ｄ．試料にチラミドハプテンに特異的な第３の結合剤を適用することであって、第３の結合剤は三次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；及び
ｅ．試料に検出可能部分を適用することであって、三次酵素が検出可能部分との反応を触媒して検出可能部分を可視化する、適用すること；
を含む、試料中の標的タンパク質バイオマーカーに対するシグナルを増幅する方法であって、それによって検出可能部分が明視野顕微鏡法を用いて点状ドットとして可視化され、点状ドットが標的タンパク質バイオマーカーを示している方法。
［実施態様２］
試料が組織試料である、実施態様１に記載の方法。
［実施態様３］
組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である、実施態様２に記載の方法。
［実施態様４］
標的タンパク質バイオマーカーがタンパク質、炭水化物、核酸、脂質、翻訳後修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様１−３のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様５］
翻訳後修飾がリン酸修飾、ゲラニル修飾、アセチル修飾、ユビキチン修飾、炭水化物修飾、カルバミル修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様４に記載の方法。
［実施態様６］
バイオマーカー特異的薬剤が一次抗体を含む、実施態様１−５のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様７］
一次抗体が天然の未修飾抗体である、実施態様６に記載の方法。
［実施態様８］
一次抗体がモノクローナル又はポリクローナルである、実施態様６又は７に記載の方法。
［実施態様９］
第２の結合剤が二次抗体を含む、実施態様１−８のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様１０］
二次酵素がオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ又はペルオキシダーゼを含む、実施態様１−９のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様１１］
ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む、実施態様１０に記載の方法。
［実施態様１２］
チラミドハプテンがビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ニトロピラゾール（ＮＰ）、ベンゾフラザン（ＢＦ）、ベンゾダザピン（ＢＤ）、ニトロシンアミド（ＮＣＡ）又はジニトロフェニル（ＤＮＰ）を含む、実施態様１−１１のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様１３］
第３の結合剤が三次抗体を含む、実施態様１−１２のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様１４］
三次抗体がモノクローナル抗体を含む、実施態様１３に記載の方法。
［実施態様１５］
検出可能部分が銀又はチラミドローダミン染料を含む、実施態様１−１４のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様１６］
チラミドローダミン染料がローダミン１１０、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１（テキサスレッド）又はこれらの組み合わせを含む、実施態様１５に記載の方法。
［実施態様１７］
検出可能部分がＤＡＢ、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー又はテトラゾリウムバイオレットを含む、実施態様１−１６のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様１８］
２つ以上の標的タンパク質バイオマーカーが検出及び識別される多重免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイに適用される、実施態様１−１７のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様１９］
標的タンパク質バイオマーカーが分泌分子である、実施態様１−１８のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２０］
ａ．標的タンパク質バイオマーカーに特異的なバイオマーカー特異的薬剤を試料に適用すること；
ｂ．試料にバイオマーカー特異的薬剤に特異的なポリクローナル第２結合剤を適用することであって、ポリクローナル第２結合剤は二次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；
ｃ．試料に、チラミドハプテンとコンジュゲートしたチラミド分子を含むチラミド剤を適用することであって、二次酵素が第２の結合剤の位置でチラミドハプテンの試料への付着を触媒する、適用すること；
ｄ．試料にチラミドハプテンに特異的な第３の結合剤を適用することであって、第３の結合剤は三次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；及び
ｅ．試料に検出可能部分を適用することであって、三次酵素が検出可能部分との反応を触媒して検出可能部分を可視化する、適用すること；
を含む、試料中の標的タンパク質バイオマーカーに対するシグナルを増幅する方法であって、それによって検出可能部分が明視野顕微鏡法を用いて点状ドットとして可視化され、点状ドットが標的タンパク質バイオマーカーを示している方法。
［実施態様２１］
試料が組織試料である、実施態様２０に記載の方法。
［実施態様２２］
組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である、実施態様２１に記載の方法。
［実施態様２３］
標的タンパク質バイオマーカーがタンパク質、炭水化物、核酸、脂質、翻訳後修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様２０−２２のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２４］
翻訳後修飾がリン酸修飾、ゲラニル修飾、アセチル修飾、ユビキチン修飾、炭水化物修飾、カルバミル修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様２３に記載の方法。
［実施態様２５］
バイオマーカー特異的薬剤が一次抗体を含む、実施態様２０−２４のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２６］
一次抗体が天然の未修飾抗体である、実施態様２５に記載の方法。
［実施態様２７］
一次抗体がモノクローナル又はポリクローナルである、実施態様２５又は２６に記載の方法。
［実施態様２８］
第２の結合剤が二次抗体を含む、実施態様２０−２７のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様２９］
二次酵素がオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ又はペルオキシダーゼを含む、実施態様２０−２８のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３０］
ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む、実施態様２９に記載の方法。
［実施態様３１］
チラミドハプテンがビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ニトロピラゾール（ＮＰ）、ベンゾフラザン（ＢＦ）、ベンゾダザピン（ＢＤ）、ニトロシンアミド（ＮＣＡ）又はジニトロフェニル（ＤＮＰ）を含む、実施態様２０−３０のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３２］
第３の結合剤が三次抗体を含む、実施態様２０−３１のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３３］
三次抗体がモノクローナル抗体を含む、実施態様３２に記載の方法。
［実施態様３４］
検出可能部分が銀又はチラミドローダミン染料を含む、実施態様２０−３３のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３５］
チラミドローダミン染料がローダミン１１０、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１（テキサスレッド）又はこれらの組み合わせを含む、実施態様３４に記載の方法。
［実施態様３６］
検出可能部分がＤＡＢ、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー又はテトラゾリウムバイオレットを含む、実施態様２０−３５のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３７］
２つ以上の標的タンパク質バイオマーカーが検出及び識別される多重免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイに適用される、実施態様２０−３６のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３８］
標的タンパク質バイオマーカーが分泌分子である、実施態様２０−３７のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様３９］
ａ．組織試料を脱パラフィン化試薬で処理すること；
ｂ．組織試料を抗原回復試薬で処理すること；
ｃ．標的タンパク質バイオマーカーに特異的なバイオマーカー特異的薬剤を組織試料に適用すること；
ｄ．試料にバイオマーカー特異的薬剤に特異的な第２の結合剤を適用することであって、第２の結合剤は二次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；
ｅ．試料に、チラミドハプテンとコンジュゲートしたチラミド分子を含むチラミド剤を適用することであって、二次酵素が第２の結合剤の位置でチラミドハプテンの試料への付着を触媒する、適用すること；
ｆ．試料にチラミドハプテンに特異的な第３の結合剤を適用することであって、第３の結合剤は三次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；及び
ｇ．試料に検出可能部分を適用することであって、三次酵素が検出可能部分との反応を触媒して検出可能部分を可視化する、適用すること；
を含む、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料中の標的タンパク質バイオマーカーに対するシグナルを増幅する方法であって、それによって検出可能部分が明視野顕微鏡法を用いて点状ドットとして可視化され、点状ドットが標的タンパク質バイオマーカーを示している方法。
［実施態様４０］
標的タンパク質バイオマーカーに特異的なバイオマーカー特異的薬剤を適用する前に、組織試料をプロテアーゼで処理することを更に含む、実施態様３９に記載の方法。
［実施態様４１］
標的タンパク質バイオマーカーがタンパク質、炭水化物、核酸、脂質、翻訳後修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様３９又は４０に記載の方法。
［実施態様４２］
翻訳後修飾がリン酸修飾、ゲラニル修飾、アセチル修飾、ユビキチン修飾、炭水化物修飾、カルバミル修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様４１に記載の方法。
［実施態様４３］
バイオマーカー特異的薬剤が一次抗体を含む、実施態様３９−４２のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様４４］
一次抗体が天然の未修飾抗体である、実施態様４３に記載の方法。
［実施態様４５］
一次抗体がモノクローナル又はポリクローナルである、実施態様４３又は４４に記載の方法。
［実施態様４６］
第２の結合剤が二次抗体を含む、実施態様３９−４５のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様４７］
二次酵素がオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ又はペルオキシダーゼを含む、実施態様３９−４６のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様４８］
ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む、実施態様４７に記載の方法。
［実施態様４９］
チラミドハプテンがビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ニトロピラゾール（ＮＰ）、ベンゾフラザン（ＢＦ）、ベンゾダザピン（ＢＤ）、ニトロシンアミド（ＮＣＡ）又はジニトロフェニル（ＤＮＰ）を含む、実施態様３９−４８のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様５０］
第３の結合剤が三次抗体を含む、実施態様３９−４９のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様５１］
三次抗体がモノクローナル抗体を含む、実施態様５０に記載の方法。
［実施態様５２］
検出可能部分が銀又はチラミドローダミン染料を含む、実施態様３９−５１のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様５３］
チラミドローダミン染料がローダミン１１０、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１（テキサスレッド）又はこれらの組み合わせを含む、実施態様５２に記載の方法。
［実施態様５４］
検出可能部分がＤＡＢ、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー又はテトラゾリウムバイオレットを含む、実施態様３９−５３のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様５５］
２つ以上の標的タンパク質バイオマーカーが検出及び識別される多重免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイに適用される、実施態様３９−５４のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様５６］
標的タンパク質バイオマーカーが分泌分子である、実施態様３９−５５のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様５７］
ａ．標的タンパク質バイオマーカーに特異的なバイオマーカー特異的薬剤を試料に適用すること；
ｂ．試料にバイオマーカー特異的薬剤に特異的な第２の結合剤を適用することであって、第２の結合剤は二次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；
ｃ．試料に、チラミドハプテンとコンジュゲートしたチラミド分子を含むチラミド剤を適用することであって、二次酵素が第２の結合剤の位置でチラミドハプテンの試料への付着を触媒する、適用すること；
ｄ．試料にチラミドハプテンに特異的な第３の結合剤を適用することであって、第３の結合剤は三次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；及び
ｅ．試料に検出可能部分を適用することであって、三次酵素が検出可能部分との反応を触媒して検出可能部分を可視化する、適用すること；
を含む、試料中の標的タンパク質バイオマーカーを検出するための定量的免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法であって、それによって検出可能部分が明視野顕微鏡法を用いて点状ドットとして可視化され、点状ドットが標的タンパク質バイオマーカーを示している方法。
［実施態様５８］
試料が組織試料である、実施態様５７に記載の方法。
［実施態様５９］
組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である、実施態様５８に記載の方法。
［実施態様６０］
標的タンパク質バイオマーカーがタンパク質、炭水化物、核酸、脂質、翻訳後修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様５７−５９のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様６１］
翻訳後修飾がリン酸修飾、ゲラニル修飾、アセチル修飾、ユビキチン修飾、炭水化物修飾、カルバミル修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様６０に記載の方法。
［実施態様６２］
バイオマーカー特異的薬剤が一次抗体を含む、実施態様５７−６１のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様６３］
一次抗体が天然の未修飾抗体である、実施態様６２に記載の方法。
［実施態様６４］
一次抗体がモノクローナル又はポリクローナルである、実施態様６２又は６３に記載の方法。
［実施態様６５］
第２の結合剤が二次抗体を含む、実施態様５７−６４のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様６６］
二次酵素がオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ又はペルオキシダーゼを含む、実施態様５７−６５のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様６７］
ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む、実施態様６６に記載の方法。
［実施態様６８］
チラミドハプテンがビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ニトロピラゾール（ＮＰ）、ベンゾフラザン（ＢＦ）、ベンゾダザピン（ＢＤ）、ニトロシンアミド（ＮＣＡ）又はジニトロフェニル（ＤＮＰ）を含む、実施態様５７−６７のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様６９］
第３の結合剤が三次抗体を含む、実施態様５７−６８のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様７０］
三次抗体がモノクローナル抗体を含む、実施態様６９に記載の方法。
［実施態様７１］
検出可能部分が銀又はチラミドローダミン染料を含む、実施態様５７−７０のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様７２］
チラミドローダミン染料がローダミン１１０、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１（テキサスレッド）又はこれらの組み合わせを含む、実施態様７１に記載の方法。
［実施態様７３］
検出可能部分がＤＡＢ、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー又はテトラゾリウムバイオレットを含む、実施態様５７−７２のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様７４］
２つ以上の標的タンパク質バイオマーカーが検出及び識別される多重免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイに適用される、実施態様５７−７３のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様７５］
標的タンパク質バイオマーカーが分泌分子である、実施態様５７−７４のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様７６］
ａ．分泌標的タンパク質バイオマーカーに特異的なバイオマーカー特異的薬剤を試料に適用すること；
ｂ．試料にバイオマーカー特異的薬剤に特異的な第２の結合剤を適用することであって、第２の結合剤は二次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；
ｃ．試料に、チラミドハプテンとコンジュゲートしたチラミド分子を含むチラミド剤を適用することであって、二次酵素が第２の結合剤の位置でチラミドハプテンの試料への付着を触媒する、適用すること；
ｄ．試料にチラミドハプテンに特異的な第３の結合剤を適用することであって、第３の結合剤は三次酵素とコンジュゲートされる、適用すること；及び
ｅ．試料に検出可能部分を適用することであって、三次酵素が検出可能部分との反応を触媒して検出可能部分を可視化する、適用すること；
を含む、試料中の分泌標的タンパク質バイオマーカーの定量的免疫組織化学（ＩＨＣ）の方法であって、それによって検出可能部分が明視野顕微鏡法を用いて点状ドットとして可視化され、点状ドットが分泌標的タンパク質バイオマーカーを示している方法。
［実施態様７７］
試料が組織試料である、実施態様７６に記載の方法。
［実施態様７８］
組織試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料である、実施態様７７に記載の方法。
［実施態様７９］
標的タンパク質バイオマーカーがタンパク質、炭水化物、核酸、脂質、翻訳後修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様７６−７８のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様８０］
翻訳後修飾がリン酸修飾、ゲラニル修飾、アセチル修飾、ユビキチン修飾、炭水化物修飾、カルバミル修飾又はこれらの組み合わせを含む、実施態様７９に記載の方法。
［実施態様８１］
バイオマーカー特異的薬剤が一次抗体を含む、実施態様７６−８０のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様８２］
一次抗体が天然の未修飾抗体である、実施態様８１に記載の方法。
［実施態様８３］
一次抗体がモノクローナル又はポリクローナルである、実施態様８１又は８２に記載の方法。
［実施態様８４］
第２の結合剤が二次抗体を含む、実施態様７６−８３のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様８５］
二次酵素がオキシドレダクターゼ、ヒドロラーゼ又はペルオキシダーゼを含む、実施態様７６−８４のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様８６］
ペルオキシダーゼがホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含む、実施態様８５に記載の方法。
［実施態様８７］
チラミドハプテンがビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、ニトロピラゾール（ＮＰ）、ベンゾフラザン（ＢＦ）、ベンゾダザピン（ＢＤ）、ニトロシンアミド（ＮＣＡ）又はジニトロフェニル（ＤＮＰ）を含む、実施態様７６−８６のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様８８］
第３の結合剤が三次抗体を含む、実施態様７６−８７のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様８９］
三次抗体がモノクローナル抗体を含む、実施態様８８に記載の方法。
［実施態様９０］
検出可能部分が銀又はチラミドローダミン染料を含む、実施態様７６−８９のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様９１］
チラミドローダミン染料がローダミン１１０、ローダミン６Ｇ、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１（テキサスレッド）又はこれらの組み合わせを含む、実施態様９０に記載の方法。
［実施態様９２］
検出可能部分がＤＡＢ、４−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’−アジノ−ジ−［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ−ジアニシジン、４−クロロナフトール（４−ＣＮ）、ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＭＵ−Ｇａｌｌ）、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー又はテトラゾリウムバイオレットを含む、実施態様７６−９１のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様９３］
２つ以上の分泌標的タンパク質バイオマーカーが検出及び識別される多重免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイに適用される、実施態様７６−９２のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様９４］
分泌標的タンパク質バイオマーカー及び１つ以上の更なる標的タンパク質バイオマーカーが検出及び識別される多重ＩＨＣアッセイを可能にする、実施態様７６−９３のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様９５］
自動化されている、実施態様１−９４のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様９６］
自動染色機で実行される、実施態様１−９５のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様９７］
手動である、実施態様１−９４のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様９８］
実施態様１−９４のいずれか一項に記載の方法を実行するための自動染色機。
［実施態様９９］
プロセッサに接続されたメモリを備える自動染色装置であって、メモリが、プロセッサによって実行されると、実施態様１−７５のいずれか一項に記載の方法のための動作を自動染色装置に実行させるコンピュータ可読命令を記憶する、自動染色装置。
［実施態様１００］
実施態様１−９４のいずれか一項に記載の方法を実行するための、スライドホルダー、試薬及びディスペンサーを備える自動システム。
［実施態様１０１］
プロセッサに接続されたメモリを備えるシステムを更に含み、メモリが、プロセッサによって実行されると、実施態様１−６６のいずれか一項に記載の方法のための動作を自動システムに実行させるコンピュータ可読命令を記憶する、実施態様１００に記載のシステム。
［実施態様１０２］
ディスペンサーがスライドホルダー内のスライド上に試薬を分配するように適合されている、実施態様１００又は１０１に記載のシステム。
［実施態様１０３］
ａ．患者の腫瘍から組織切片を調製すること；
ｂ．実施態様１−９７のいずれか一項に記載の標的タンパク質バイオマーカーについて組織切片を組織化学的に染色することであって、標的タンパク質バイオマーカーは点状ドットとして現れる、染色すること、
ｃ．（ｂ）の染色された組織切片のデジタル画像を取得すること；
ｄ．染色された組織切片中の対象領域（ＲＯＩ）を同定し、標的タンパク質バイオマーカーに対応するＲＯＩ中の点状ドットを定量すること；
ｅ．定量化された点状ドットに所定のスコアリング関数を適用すること
を含むワークフロー方法。
［実施態様１０４］
ａ．実施態様１−９７のいずれか一項に記載の第２の標的タンパク質バイオマーカーについて組織切片を染色することであって、標的タンパク質バイオマーカーは点状ドットとして現れる、染色すること
ｂ．（ａ）の染色された組織切片のデジタル画像を取得すること；
ｃ．染色された組織切片中の対象領域（ＲＯＩ）を同定し、標的タンパク質バイオマーカー及び第２の標的タンパク質バイオマーカーに対応するＲＯＩ中の点状ドットを定量すること；
ｄ．定量化された点状ドットに所定のスコアリング関数を適用すること
を更に含む、実施態様１０３に記載の方法。