【手続補正書】
【提出日】令和3年3月25日(2021.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９９】
さらなる調査により、新規のサイズ加重法の使用による非罹患及びトリソミー罹患常染色体比間の分離の増大は、現行法と比較して、トリソミー分析の点で13.2％のトリソミーサンプル胎児画分の有効増幅に相当することが実証された。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
胎児の染色体異常を検出する方法であって:
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ；
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ；
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ；
(c)標的染色体の標的領域に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、リファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ；
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ；
(e)前記比又は差に基づいて、前記標的染色体の胎児の異常の存在を決定するステップ、を含む、前記方法。
（態様２）
前記胎児の染色体異常が、異数性、重複、転座、突然変異(例えば、点突然変異)、置換、欠失、一塩基多型(SNP)、染色体異常、コピー数多型(CNV)、エピジェネティック変化、及びDNA逆位から選択される遺伝的変異である、態様1記載の方法。
（態様３）
前記標的染色体が、13番染色体、18番染色体、21番染色体、X染色体、又はY染色体である、態様1記載の方法。
（態様４）
前記胎児の染色体異常が、胎児の染色体異数性である、態様1〜3のいずれか1項記載の方法。
（態様５）
前記胎児の染色体異数性が、13トリソミー、18トリソミー、又は21トリソミーである、態様4記載の方法。
（態様６）
前記胎児の染色体異数性が、21トリソミー(ダウン症候群)である、態様5記載の方法。
（態様７）
前記胎児の染色体異常が、例えば、1Mbまで、5Mbまで、10Mbまで、又は20Mbまで、あるいは20Mb超の、染色体挿入又は欠失である、態様1〜6のいずれか1項記載の方法。
（態様８）
前記標的染色体が、染色体内の領域であり、前記リファレンス染色体が、該標的染色体と同じ染色体内の領域である、態様1〜7のいずれか1項記載の方法。
（態様９）
前記胎児の染色体異常を含有する疑いがあるゲノムの領域についてのサンプルの富化ステップを付加的に含む、態様1〜8のいずれか1項記載の方法。
（態様１０）
態様1〜9のいずれか1項記載の方法であって、付加的に:
(i)標的染色体の標的領域に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(ii)1以上のリファレンス染色体内の1以上の標的領域に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(iii)ステップ(i)で得られた値を合計することにより、合計標的加重カウント(Nctarget)を算出するステップ；
(iv)ステップ(ii)で得られた値を合計することにより、合計リファレンス加重カウント(Nc)を算出するステップ；
(v)ステップ(iii)及びステップ(iv)で得られたNctarget値及びNc値間の比又は差を算出するステップ；及び
(vi)前記比又は差に基づいて、前記標的染色体の胎児異常の存在を決定するステップ、を含む、前記方法。
（態様１１）
妊娠中の女性被験者内の胎児の性別を予測する方法であって：
(a)妊娠中の女性被験者から得られた生体サンプル内から核酸を単離するステップ;
(b1)最適胎児画分について120bp及び135bpの間の核酸断片サイズ値を選択するステップ；
(b2)ステップ(b1)で選択した断片サイズ値の20bp以内のサイズを有する核酸断片を単離するステップ；
(c)性染色体に整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、1以上のリファレンス染色体に整列する前記断片の第2の数を決定するステップ；
(d)前記第1の数及び前記第2の数の間の比又は差を算出するステップ；
(e)前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか否かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む、前記方法。
（態様１２）
付加的に：
(i)性染色体に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(ii)1以上のリファレンス染色体に整列する各断片を、各断片サイズ(s)が胎児起源である確率(w)を算出することにより、サイズ加重するステップ；
(iii)ステップ(i)で得られた値を合計することにより、合計標的加重カウント(Nctarget)を算出するステップ；
(iv)ステップ(ii)で得られた値を合計することにより、合計リファレンス加重カウント(Nc)を算出するステップ；
(v)ステップ(iii)及びステップ(iv)で得られたNctarget値及びNc値間の比又は差を算出するステップ；及び
(vi)1以上の前記リファレンス染色体と比較して過剰又は等価の断片がX染色体に整列するか、又はY染色体が存在するか非存在かに基づいて、前記胎児の性別を決定するステップ、を含む、態様11記載の方法。
（態様１３）
前記生体サンプルが、母体の血液、血漿、血清、又は尿である、態様1〜12のいずれか1項記載の方法。
（態様１４）
前記生体サンプルが、母体血漿である、態様13記載の方法。
（態様１５）
前記ステップ(a)における単離のステップが、核酸断片のライブラリーの調製を含む、態様1〜14のいずれか1項記載の方法。
（態様１６）
前記ライブラリーの調製が、DNA末端修復、アダプターライゲーション、クリーンアップ、及びPCRの逐次的なステップを含む、態様15記載の方法。
（態様１７）
単離ステップ(b2)が、ステップ(b1)において選択した断片サイズ値の5bp以内のような、ステップ(b1)において選択した断片サイズ値の10bp以内のサイズを有する核酸断片についての富化を含む、態様1〜16のいずれか1項記載の方法。
（態様１８）
単離ステップ(b2)が、ゲルベースのサイズ選択、特に自動ゲルベースサイズ選択のような、サイズ選択を使用する富化を含む、態様1〜17のいずれか1項記載の方法。
（態様１９）
単離ステップ(b2)が、インシリコのサイズ選択を使用する富化を含む、態様1〜17のいずれか1項記載の方法。
（態様２０）
ステップ(c)が、アラインメントに先立って、ステップ(b2)で単離された断片のシークエンシング、又は前記断片をデジタルPCRに供するステップを最初に含む、態様1〜19のいずれか1項記載の方法。
（態様２１）
前記シークエンシングが、以下のものから選択される次世代シークエンシングシステム：Life Technologies社のIon Torrent Personal Genome Machine (Ion Torrent PGM)、又はPIもしくはPIIチップを用いるIon Proton、及びさらにそれらの派生的装置及びコンポーネント；又は、Roche 454(すなわち、Roche 454 GS FLX)、Applied Biosystems社のSOLiDシステム(すなわち、SOLiDv4)、Illumina社のNextSeq, GAIIx, HiSeq 2000 及びMiSeqシークエンサー、Pacific Biosciences社のPacBio RS及びSanger社の3730xl及びQIAGEN社のGeneReaderを含む、態様20記載の方法。
（態様２２）
前記シークエンシングが、Quant studioデジタルPCRシステム(ThermoFisher)及びRainDrop PlusデジタルPCRシステム(RainDance technologies)から選択されるデジタルPCRシステムを含む、態様20記載の方法。
（態様２３）
アラインメントステップ(c)に先立って、得られた配列データからの重複リードを圧縮するステップを付加的に含む、態様1〜22のいずれか1項記載の方法。
（態様２４）
ステップ(c)が、標的染色体の領域にユニークに整列する前記断片の第1の数を決定し、かつ、リファレンス染色体内の1以上の標的領域にユニークに整列する前記断片の第2の数を決定することを含む、態様23記載の方法。
（態様２５）
前記アラインメントステップ(c)を、IONA(登録商標)、Bowtie2又はBWA-SWソフトウェア、又はMaximal Exact Matching技術を利用するソフトウェア、例えばBWA-MEM又はCUSHAW2ソフトウェアによって実行する、態様1〜24のいずれか1項記載の方法。
（態様２６）
前記サンプル内の胎児DNAの量に基づいて、マッチしたヒットの数を正規化又は調整するステップを付加的に含む、態様1〜25のいずれか1項記載の方法。