【手続補正書】
【提出日】令和2年12月14日(2020.12.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レスポンスレギュレーターレシーバードメインおよび該レスポンスレギュレーターレシーバードメインのＣ末端に位置するｍｙｂ様ＤＮＡ結合ドメインを含むＳＧＩ１ポリペプチドをコードする遺伝子の減衰を有する突然変異緑藻類生物であって、該光合成生物が、バイオマスを、実質的に同じ条件下で成長または培養させた対照生物よりも多く産生し、該対照光合成生物が、該ＳＧＩ１遺伝子の減衰を有さない、突然変異緑藻類生物。
【請求項２】
実質的に同じ条件下で成長または培養させた対照光合成生物よりも、少なくとも１０％多くの脂質を産生する、請求項１に記載の突然変異光合成生物。
【請求項３】
対照光合成微生物と比べて、減少したクロロフィルを有する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の突然変異光合成生物。
【請求項４】
対照光合成生物と比べて、上昇したクロロフィルａ：ｂ比を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の突然変異光合成生物。
【請求項５】
対照光合成生物と比べて、より高い１４Ｃ  Ｐｍａｘを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の突然変異光合成生物。
【請求項６】
対照生物よりも高いＦｖ／Ｆｍを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の突然変異光合成生物。
【請求項７】
対照生物よりも高いタンパク質含有量を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の突然変異光合成生物。
【請求項８】
対照生物よりも高いｒｕｂｉｓｃｏ活性化酵素含有量を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の突然変異光合成生物。
【請求項９】
対照微生物と比べて、減少した光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１０】
ＰＳＩＩアンテナサイズの断面単位サイズが、対照微生物のＰＳＩＩアンテナの断面単位サイズと比べて、少なくとも２５％減少している、請求項９に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１１】
対照藻類微生物と比べて、上昇したＰｍａｘ（１４Ｃ）を有する、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１２】
Ｐｍａｘ（１４Ｃ）が、対照微生物のＰｍａｘ（１４Ｃ）と比べて、少なくとも１０％上昇している、請求項１１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１３】
対照藻類微生物と比べて、減少した量のクロロフィルｂを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１４】
対照藻類微生物と比べて、少なくとも２０％少ないクロロフィルを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１５】
対照藻類微生物よりも高いタンパク質含有量を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１６】
対照藻類微生物よりも全有機炭素率（パーセント）で少なくとも１０％多いタンパク質を有する、請求項１５に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１７】
対照藻類微生物よりも全有機炭素率（パーセント）で少なくとも２０％多いタンパク質を有する、請求項１６に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１８】
対照藻類微生物と比べて、少なくとも１０個のＬＨＣ遺伝子の発現の低下を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項１９】
対照藻類微生物と比べて、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼアクチベーター（ＲＡ）ポリペプチドの存在量の増加を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の突然変異微生物。
【請求項２０】
リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼアクチベーターポリペプチドが、対照藻類微生物における存在量の少なくとも１．５倍である、請求項１９に記載の突然変異微生物。
【請求項２１】
クロロデンドロン藻綱またはトレボウクシア藻綱の緑藻植物である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２２】
クロロデンドロン藻綱のメンバーであり、任意で、プラシノクラダス（Ｐｒａｓｉｎｏｃｌａｄｕｓ）、スケルフェリア（Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ）、およびテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）からなる群から選択される属の種である、請求項２１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２３】
トレボウクシア藻綱のメンバーであり、任意で、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、オキセノクロレラ（Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ヘベオクロレラ（Ｈｅｖｅｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、マリニクロレラ（Ｍａｒｉｎｉｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、スチココックス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、およびビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）からなる群から選択される属の種である、請求項２１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２４】
パラクロレラ、およびテトラセルミスからなる群から選択される属のメンバーである、請求項２１に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２５】
クロレラ、オキセノクロレラ、ヘベオクロレラ、マリニクロレラ、パラクロレラ、シュードクロレラ、およびテトラクロレラからなる群から選択される属のものである、請求項２３に記載の突然変異藻類微生物。
【請求項２６】
藻類産物の製造方法であって、該産物を産生するために請求項１〜２５のいずれか一項に記載の藻類突然変異体を培養することを含む、方法。
【請求項２７】
培養物から産物を回収することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
産物がバイオマスである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
産物が、１つ以上の脂質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
産物がトリアシルグリセリドである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
培養がバッチ式、半連続式、または連続式である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
培養が、窒素欠乏条件下である、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明のさらに別の態様は、高生産性の藻類突然変異体を選択する方法であって、本方法は、藻類集団の突然変異を誘発することと、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて低クロロフィル細胞を選択することと、選択された低クロロフィル蛍光細胞の単離系統をマルチウェルプレートに分配することと、光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズ、Ｆｖ／Ｆｍについて、マルチウェルプレート中の低クロロフィル蛍光細胞をスクリーニングすることと、野生型細胞と比べて、ＰＳＩＩアンテナサイズの減少、Ｆｖ／Ｆｍの上昇有する少なくとも１つの細胞系を選択して、高生産性突然変異を選択することを含む。本方法は、Ｐｍａｘを測定することを任意でさらに含むことができる。より高い成長速度を有する単離系統は、例えばバッチ培養、半連続培養または連続培養において、祖先系統と比べてより高い生産性についてアッセイすることができる。本方法は、突然変異を同定するために、単離された高生産性突然変異体のゲノムの少なくとも一部分に対してＰＣＲおよび／またはシーケンシングを実施することをさらに含み得る。
[本発明1001]
ＳＧＩ1ポリペプチドをコードする遺伝子の減衰を有する突然変異光合成生物であって、該光合成生物が、バイオマスまたは少なくとも1つのバイオ産物を、実質的に同じ条件下で成長または培養させた対照光合成生物よりも多く産生し、かつ該対照光合成生物が、ＳＧＩ1遺伝子の減衰を有さない、突然変異光合成生物。
[本発明1002]
実質的に同じ条件下で成長または培養させた対照光合成生物よりも、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、もしくは少なくとも100％多くのバイオマス、または少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、もしくは少なくとも100％多くの、少なくとも1つのバイオ産物を産生する、本発明1001の突然変異光合成生物。
[本発明1003]
対照光合成微生物と比べて、減少したクロロフィルを有する、本発明1001の突然変異光合成生物。
[本発明1004]
対照光合成生物と比べて、上昇したクロロフィルａ：ｂ比を有する、本発明1003の突然変異光合成生物。
[本発明1005]
対照光合成生物と比べて、減少した光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズを有する、本発明1001の突然変異光合成生物。
[本発明1006]
対照光合成生物と比べて、より高い14Ｃ  Ｐｍａｘを有する、本発明1001の突然変異光合成生物。
[本発明1007]
対照生物よりも高いＦｖ／Ｆｍを有する、本発明1001の突然変異光合成生物。
[本発明1008]
対照生物よりも高いタンパク質含有量を有する、本発明1001の突然変異光合成生物。
[本発明1009]
対照生物よりも高いｒｕｂｉｓｃｏ活性化酵素含有量を有する、本発明1001の突然変異光合成生物。
[本発明1010]
植物である、本発明1001〜1009のいずれかの突然変異光合成生物。
[本発明1011]
藻類である、本発明1001〜1009のいずれかの突然変異光合成生物。
[本発明1012]
緑藻植物または車軸藻類である、本発明1011の突然変異光合成生物。
[本発明1013]
緑藻綱、クロロデンドロン藻綱、プラシノ藻綱、またはトレボウクシア藻綱の科の緑藻植物である、本発明1012の突然変異藻類微生物。
[本発明1014]
対照微生物と比べて、減少した光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズを有する、本発明1011の突然変異藻類微生物。
[本発明1015]
ＰＳＩＩアンテナサイズの断面単位サイズが、対照微生物のＰＳＩＩアンテナの断面単位サイズと比べて、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、または少なくとも50％減少している、本発明1014の突然変異藻類微生物。
[本発明1016]
対照藻類微生物と比べて、上昇したＰｍａｘ（14Ｃ）を有する、本発明1011の突然変異藻類微生物。
[本発明1017]
Ｐｍａｘ（14Ｃ）が、対照微生物のＰｍａｘ（14Ｃ）と比べて、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、または少なくとも50％上昇している、本発明1016の突然変異藻類微生物。
[本発明1018]
対照藻類微生物と比べて、減少したクロロフィル含有量を有する、本発明1011の突然変異藻類微生物。
[本発明1019]
対照藻類微生物と比べて、減少した量のクロロフィルｂを有する、本発明1018の突然変異藻類微生物。
[本発明1020]
対照藻類微生物と比べて、少なくとも20％少ないクロロフィルを有する、本発明1018の突然変異藻類微生物。
[本発明1021]
対照藻類微生物と比べて、少なくとも20％少ないクロロフィルｂを有する、本発明1019の突然変異藻類微生物。
[本発明1022]
対照藻類微生物よりも高いタンパク質含有量を有する、本発明1001の突然変異藻類微生物。
[本発明1023]
対照藻類微生物よりも全有機炭素率（パーセント）で少なくとも10％多いタンパク質を有する、本発明1022の突然変異藻類微生物。
[本発明1024]
対照藻類微生物よりも全有機炭素率（パーセント）で少なくとも20％多いタンパク質を有する、本発明1023の突然変異藻類微生物。
[本発明1025]
対照藻類微生物と比べて、少なくとも10個のＬＨＣ遺伝子の発現の低下を有する、本発明1001の突然変異藻類微生物。
[本発明1026]
対照藻類微生物と比べて、リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼアクチベーター（ＲＡ）ポリペプチドの存在量の増加を有する、本発明1001の突然変異微生物。
[本発明1027]
リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼアクチベーターポリペプチドが、対照藻類微生物における存在量の少なくとも1．5倍、少なくとも2倍、または少なくとも2．5倍である、本発明1026の突然変異微生物。
[本発明1028]
緑藻植物または車軸藻類である、本発明1001の突然変異藻類微生物。
[本発明1029]
緑藻綱、クロロデンドロン藻綱、プラシノ藻綱、またはトレボウクシア藻綱の科の緑藻植物である、本発明1028の突然変異藻類微生物。
[本発明1030]
緑藻綱のメンバー、任意で、アルテロモナス（Ａｓｔｅｒｏｍｏｎａｓ）、アンキストロデスムス（Ａｎｋｉｓｔｒｏｄｅｓｍｕｓ）、カルテリア（Ｃａｒｔｅｒｉａ）、クラミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）、クロロコッカム（Ｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ）、クロロゴニウム（Ｃｈｌｏｒｏｇｏｎｉｕｍ）、クリソスファエラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｈａｅｒａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、モノラフィディウム（Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ）、ネオクロリス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ）、オエドゴニウム（Ｏｅｄｏｇｏｎｉｕｍ）、ペラゴモナス（Ｐｅｌａｇｏｍｏｎａｓ）、プレウロコッカス（Ｐｌｅｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピロボツリス（Ｐｙｒｏｂｏｔｒｙｓ）、イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）、およびボルボックス（Ｖｏｌｖｏｘ）からなる群から選択される属の種である、本発明1028の突然変異藻類微生物。
[本発明1031]
クロロデンドロン藻綱のメンバー、任意で、プラシノクラダス（Ｐｒａｓｉｎｏｃｌａｄｕｓ）、スケルフェリア（Ｓｃｈｅｒｆｆｅｌｉａ）、およびテトラセルミス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ）からなる群から選択される属の種である、本発明1028の突然変異藻類微生物。
[本発明1032]
プラシノ藻綱のメンバー、任意で、オストレオコッカスまたはミクロモナスの種である、本発明1028の突然変異藻類微生物。
[本発明1033]
トレボウクシア藻綱のメンバーであり、任意で、ボツリオコッカス（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、オキセノクロレラ（Ａｕｘｅｎｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ヘベオクロレラ（Ｈｅｖｅｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、マリニクロレラ（Ｍａｒｉｎｉｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、パラクロレラ（Ｐａｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、シュードクロレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、テトラクロレラ（Ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、エレモスファエラ（Ｅｒｅｍｏｓｐｈａｅｒａ）、フランケイア（Ｆｒａｎｃｅｉａ）、ミクラクチニウム（Ｍｉｃｒａｃｔｉｎｉｕｍ）、ナンノクロリス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｉｓ）、オオキスティス（Ｏｏｃｙｓｔｉｓ）、ピコクロラム（Ｐｉｃｏｃｈｌｏｒｕｍ）、プロトテカ（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａ）、スチココックス（Ｓｔｉｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、またはビリジエラ（Ｖｉｒｉｄｉｅｌｌａ）からなる群から選択される属の種である、本発明1028の突然変異藻類微生物。
[本発明1034]
クロレラ、オキセノクロレラ、ヘベオクロレラ、マリニクロレラ、パラクロレラ、シュードクロレラ、およびテトラクロレラからなる群から選択される属のものである、本発明1028の突然変異藻類微生物。
[本発明1035]
藻類産物の製造方法であって、該産物を産生するために本発明1001の藻類突然変異体を培養することを含む、方法。
[本発明1036]
培養物から産物を回収することをさらに含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
産物がバイオマスである、本発明1035の方法。
[本発明1038]
藻類産物が、1つ以上の脂質、タンパク質、ポリケチド、テルペノイド、色素、抗酸化物質、ビタミン、ヌクレオチド、核酸、アミノ酸、炭水化物、アルコール、ホルモン、サイトカイン、ペプチド、またはポリマーである、本発明1035の方法。
[本発明1039]
産物が、1つ以上の脂質である、本発明1038の方法。
[本発明1040]
産物がトリアシルグリセリドである、本発明1039の方法。
[本発明1041]
藻類産物が、1つ以上のタンパク質である、本発明1038の方法。
[本発明1042]
培養がバッチ式、半連続式、または連続式である、本発明1035の方法。
[本発明1043]
培養が、栄養素豊富条件下である、本発明1035の方法。
[本発明1044]
培養が、窒素欠乏条件下である、本発明1035の方法。
[本発明1045]
それが由来する祖先藻類と比べてより高い生産性を有する突然変異藻類を単離する方法であって、
光独立栄養性の半連続的条件下または連続的条件下で少なくとも30世代にわたって藻類株を培養することと、
培養物から少なくとも1つの株を単離することであって、該少なくとも1つの単離された株が、祖先藻類よりも高い成長速度を有する、単離することと、
それによって、それが由来する祖先藻類と比べてより高い生産性を有する突然変異藻類を単離することと
を含む、方法。
[本発明1046]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも500μＥの強度の光へ曝露することを含む、本発明1045の方法。
[本発明1047]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも600μＥの強度の一定の光へ曝露することを含む、本発明1046の方法。
[本発明1048]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも800μＥの強度の光へ曝露することを含む、本発明1046の方法。
[本発明1049]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも1000μＥの強度の光へ曝露することを含む、本発明1064の方法。
[本発明1050]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも1200μＥの強度の光へ曝露することを含む、本発明1046の方法。
[本発明1051]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも1500μＥの強度の光へ曝露することを含む、本発明1046の方法。
[本発明1052]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも2000μＥの強度の光へ曝露することを含む、本発明1051の方法。
[本発明1053]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、少なくとも2500μＥの強度の光へ曝露することを含む、本発明1052の方法。
[本発明1054]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、5ｘ106細胞／ｍＬ未満の密度で藻類培養物を維持することを含む、本発明1045の方法。
[本発明1055]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、2．5ｘ106細胞／ｍＬ未満の密度で藻類培養物を維持することを含む、本発明1045の方法。
[本発明1056]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、約1．5ｘ106細胞／ｍＬ未満またはそれと同等の密度で藻類培養物を維持することを含む、本発明1045の方法。
[本発明1057]
光独立栄養性の半連続的条件または連続的培養条件が、約1ｘ106細胞／ｍＬ未満またはそれと同等の密度で藻類培養物を維持することを含む、本発明1045の方法。
[本発明1058]
藻類株が、光独立栄養性の半連続的条件または連続的条件下で培養する前に突然変異誘発されている、本発明1045の方法。
[本発明1059]
藻類株が、ＵＶ、化学的突然変異誘発、挿入的突然変異誘発、または標的ゲノム編集を用いて突然変異誘発されている、本発明1054の方法。
[本発明1060]
単離された突然変異藻類のＳＧＩ1遺伝子座の少なくとも一部を増幅するためにＰＣＲを実施することをさらに含む、本発明1045の方法。
[本発明1061]
単離された突然変異藻類のＳＧＩ1遺伝子座の少なくとも一部を配列決定することをさらに含む、本発明1041の方法。
[本発明1062]
単離された突然変異藻類のゲノムを配列決定することをさらに含む、本発明1045の方法。
[本発明1063]
単離された突然変異藻類の生産性をアッセイすることをさらに含む、本発明1045の方法。
[本発明1064]
藻類株が、光独立栄養性の半連続的条件または連続的条件下で少なくとも100世代培養される、本発明1045の方法。
[本発明1065]
高生産性突然変異体を選択する方法であって、
ａ）藻類の集団を突然変異誘発することと、
ｂ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、突然変異誘発された藻類の集団の低クロロフィル蛍光細胞を選択することと、
ｃ）選択された低クロロフィル蛍光細胞の単離系統をマルチウェルプレートに分配することと、
ｄ）選択された低クロロフィル蛍光細胞を光化学系ＩＩ（ＰＳＩＩ）アンテナサイズ、Ｆｖ／Ｆｍについてスクリーニングすることと、
ｅ）野生型細胞と比べて、減少したＰＳＩＩアンテナサイズ、上昇したＦｖ／Ｆｍ、および増加したを有する、少なくとも1つの細胞系を選択することと
を含む、方法。
[本発明1066]
選択された細胞系が、少なくとも20％減少したＰＳＩＩアンテナサイズを有する、本発明1065の方法。
[本発明1067]
選択された細胞系が、少なくとも10％上昇したＦｖ／Ｆｍを有する、本発明1065の方法。
[本発明1068]
選択された細胞系が、少なくとも10％上昇した、本発明1065の方法。
[本発明1069]
上昇したＰｍａｘ（Ｃ）についてスクリーニングすることをさらに含む、本発明1065の方法。
[本発明1070]
生産性アッセイを実施することをさらに含む、本発明1065の方法。
[本発明1071]
単離系統のゲノムの少なくとも一部を配列決定することをさらに含む、本発明1065の方法。