【手続補正書】
【提出日】令和3年1月15日(2021.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドリソソーム標的化コンジュゲートであって、
抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む標的化成分であって、ここで該標的化成分は標的細胞のエンドリソソーム区画内より低い解離定数で細胞外空間において標的細胞の細胞表面分子に結合するように構成されている、標的化成分と、
抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインにコンジュゲート化されたカーゴ分子を含む、カーゴ成分と
を含み、
ここで前記標的化成分は前記カーゴ成分に直接又は間接的に融合しており、
前記標的化成分は、エンドリソソーム区画に進入すると細胞表面分子から解離するように構成されており、そして
前記エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、前記標的細胞のエンドリソソーム区画に前記カーゴ分子を送達するように構成されている、エンドリソソーム標的化複合体。
【請求項２】
前記標的化成分は、酸性エンドリソソームｐＨにおけるより低い解離定数で中性近辺のｐＨにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項３】
前記標的化成分は、エンドリソソームＣａ2+濃度におけるより低い解離定数で細胞外Ｃａ2+濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項４】
前記標的化成分は、酸性エンドリソソームｐＨにおけるより低い解離定数で中性近辺のｐＨにおいて細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインである、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項５】
前記標的化成分は、エンドリソソームＣａ2+濃度におけるより低い解離定数で細胞外Ｃａ2+濃度において細胞表面分子に結合するように構成される、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項６】
前記カーゴ成分は、抗体Ｆｃ領域又は抗体Ｆｃフラグメントのドメインを含む、抗体、抗体フラグメント又は抗体ドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項７】
前記抗体Ｆｃ領域又は抗体ＦｃフラグメントのドメインはヒトＩｇＧ１に由来する、請求項６に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項８】
前記カーゴ成分はアルブミン分子又はアルブミンのドメインを含む、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項９】
前記標的化成分はＨＥＲ２特異的抗体のＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントを含み、ここで該Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントの重鎖可変ドメインは、Ｓｅｒ５５のヒスチジンへの突然変異及びＧｌｙ５７のグルタミン酸への突然変異を有する、請求項２に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１０】
前記標的化成分はＨＥＲ２特異的抗体のＦａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントを含み、ここで該Ｆａｂフラグメント又はｓｃＦｖフラグメントにおいて重鎖可変ドメインはＳｅｒ１０３のヒスチジンへの突然変異を有し、軽鎖可変ドメインはＴｙｒ５５のヒスチジンへの突然変異を有する、請求項２に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１１】
前記カーゴ分子は細胞傷害性薬物である請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１２】
前記カーゴ分子は画像化標識である、請求項１に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１３】
エンドリソソーム標的化コンジュゲートであって、
抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む標的化成分であって、ここで該標的化成分は標的細胞の細胞表面分子に結合するように構成されている標的化成分と、
抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインにコンジュゲート化されたカーゴ分子を含むカーゴ成分と
を含み、
ここで前記標的化成分は標的細胞のエンドリソソーム区画内におけるより低い解離定数で細胞外空間においてカーゴ成分に結合するように構成されており、
前記標的化成分は、エンドリソソーム区画に進入すると細胞表面分子から解離するように構成されており、そして
前記エンドリソソーム標的化コンジュゲートは、標的細胞のエンドリソソーム区画にカーゴ分子を送達するように構成されている、エンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１４】
前記標的化成分は酸性エンドソームｐＨにおけるより低い解離定数で中性近辺のｐＨにおいてカーゴ区画に結合するように構成されている、請求項１３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１５】
前記標的化成分はエンドリソソームＣａ2+濃度におけるより低い解離定数で細胞外Ｃａ2+濃度においてカーゴ成分に結合するように構成されている、請求項１３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１６】
癌の処置のためのエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える方法であって、
請求項１の標的化成分を選択する段階であって、ここで該標的化成分は、選ばれたタイプの腫瘍標的細胞上の細胞表面分子に選択的に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含み、ここで前記標的化成分は、エンドリソソーム区画におけるより低い解離定数で細胞外空間において細胞表面分子に結合するように構成されている、段階と、
請求項１のカーゴ成分を選択する段階であって、ここでカーゴ分子は、選ばれたタイプの腫瘍標的細胞の成長を抑制するための薬効を有する、細胞傷害性薬物を含む、段階と、
前記カーゴ成分に直接又は間接的に融合した前記標的化成分を含む、エンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える段階と
を含む、方法。
【請求項１７】
癌の処置のためのエンドリソソーム標的化コンジュゲートを与える方法であって、
請求項１３の標的化成分を選択する段階であって、ここで該標的化成分は、選ばれたタイプの腫瘍標的細胞上の細胞表面分子に選択的に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、ナノボディー、タンパク質、タンパク質フラグメント又はタンパク質ドメインを含む、段階と、
請求項１３のカーゴ成分を選択する段階であって、ここでカーゴ分子は、選ばれたタイプの腫瘍標的細胞の成長を抑制するための薬効を有する、細胞傷害性薬物を含む、段階とを含み、ここで
前記標的化成分は第１のタンパク質ドメインをさらに含むように改変され、
前記カーゴ成分は第２のタンパク質ドメインをさらに含むように改変され、そして
第１のタンパク質ドメインは、エンドリソソーム区画におけるより低い解離定数で細胞外空間において第２のドメインに結合するように構成されている、
方法。
【請求項１８】
前記標的化成分は、ヒト表皮成長因子受容体２に結合するように構成される、抗体、抗体フラグメント、抗体ドメイン又はナノボディーを含む、請求項１又は１３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８又はそれらの相同体の少なくとも１つのアミノ酸配列を有する、１個以上のタンパク質を含む、請求項１又は１３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【請求項２０】
前記カーゴ分子は標的細胞の挙動を改変する薬物その他の薬剤である、請求項１又は１３に記載のエンドリソソーム標的化コンジュゲート。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
ファージディスプレーベクター、ｐＨＥＮ１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．Ｄ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．，Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｈｕｄｓｏｎ，Ｐ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．  （１９９１）  Ｍｕｌｔｉ−ｓｕｂｕｎｉｔ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｐｈａｇｅ：  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  （Ｆａｂ）  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ．  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４１３３−４１３７）中でペルツズマブｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、標準的な分子生物学の方法を用いてペルツズマブのためのＦａｂフラグメント発現ベクターを修飾し、重鎖及び軽鎖可変ドメイン遺伝子の間にリンカーペプチド［（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）3Ｇｌｙ2Ｓｅｒリンカー］を挿入し、続いてｓｃＦｖ遺伝子をｐＨＥＮ１中に再クローニングした。ＣＤＲｓ中にランダムに突然変異した残基を有する突然変異ペルツズマブｓｃＦｖｓのライブラリを作成するために、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。各オリゴヌクレオチドに関し、ＤＮＡ配列を５’から３’への方向で示す、ＣＤＲＨ１Ｂａｃｋ，  ＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＡＮＮＢＮＮＢＮＮＢＡＴＧＧＡＴＴＧＧＧＴＧＡＧＡＣＡＧＧＣＴ  （配列番号４９）、ＣＤＲＨ１Ｆｏｒ，  ＴＧＴＧＡＡＴＧＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＡＧＣ  （配列番号５０）、ＣＤＲＨ２Ｂａｃｋ，  ＴＧＧＧＴＧＧＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＴＣＣＴＮＮＢＮＮＢＮＮＢＮＮＢＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＧＡＴＴＣ  （配列番号５１）、ＣＤＲＨ２Ｆｏｒ，  ＡＧＧＡＴＴＣＡＣＡＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＡ  （配列番号５２）、ＣＤＲＨ３Ｂａｃｋ，  ＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＴＡＧＡＡＡＴＣＴＧＮＮＢＣＣＴＮＮＢＴＴＣＮＮＢＴＴＣＧＡＴＮＮＢＴＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＡＣＡＣＴＧ  （配列番号５３）、  ＣＤＲＨ３Ｆｏｒ，  ＣＡＧＡＴＴＴＣＴＡＧＣＡＣＡＧＴＡＧＴＡ  （配列番号５４）、  ＣＤＲＬ２−１Ｂａｃｋ，  ＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＡＣＴＣＴＮＮＢＴＣＴＮＮＢＡＧＡＮＮＢＡＣＡＧＧＡＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＡ  （配列番号５５）、ＣＤＲＬ２−１Ｆｏｒ，  ＡＧＡＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＧＧ  （配列番号５６）、ＣＤＲＬ２−２Ｂａｃｋ，  ＧＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＴＡＡＧＣＴＧＣＴＧＮＮＢＮＮＢＮＮＢＧＣＴＴＣＴＴＡＣＡＧＡＴＡＣＡＣＡＧＧＡ  （配列番号５７）、及びＣＤＲＬ２−２Ｆｏｒ５，  ＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＧＧＡＧＣＣＴＴＴＣＣ  （配列番号５８）。当業者に既知の分子生物学法を用い、ｓｃＦｖｓ遺伝子のライブラリを作成し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１（Ｌｕｃｉｇｅｎ，カタログ番号６０５０２）のエレクトロポレーションを用いてそれぞれの標的とされるＣＤＲに関する約５ｘ１０7個の突然変異体のライブラリを作成した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
マウス異種移植片モデルにおけるＨＥＲ２−ＡＤＣｓによる腫瘍成長の抑制
ＨＥＲ２−ＡＤＣｓ（ＷＴ−ＭＭＡＥ、ＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥ）の薬物動態学の分析は、ＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスにおけるＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥの生体内持続性がＷＴ−ＭＭＡＥのものに類似であることを示す（図７Ａ、ｎ＝グループ当たり５匹のマウス）。ＡＤＣｓを１２５−Ｉで放射性標識し、マウス中に注入し（グループ当たり５匹のマウス）、示される時点に血液中及び全身レベルにおける残留放射能を決定した。ＭＤＡ−ＭＢＡ−ＭＢ−４５３異種移植片（中程度のＨＥＲ２発現レベル）を保有するＢＡＬＢ／ｃ  ＳＣＩＤマウスにおけるＡＤＣｓを用いる治療研究は、処置においてＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥがＷＴ−ＭＭＡＥ又はＴ−ＤＭ１より有効であることを示す（図７Ｂ）。１７日及び３８日（実験１、矢印により示す）又は２４日及び４５日（実験２、矢印により示す）における２回の２ｍｇ／ｋｇのＡＤＣの投薬を用いて、マウスを処置した。エラーバーは標準偏差を示し、処置の終了点における統計的に有意な差（ＳＧ−ＭＭＡＥ対ＷＴ−ＭＭＡＥ又はＴ−ＤＭ１、ＹＳ−ＭＭＡＥ対ＷＴ−ＭＭＡＥ又はＴ−ＤＭ１）を*により示す（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ−検定、ｐ＜０．０５、ｎ＝グループ当たりに５−８匹のマウス）。まとめて、データはＳＧ−ＭＭＡＥ及びＹＳ−ＭＭＡＥが好ましい薬物動態学を有し、且つ腫瘍成長の低下においてそれらの親であるＷＴペルツズマブ及び臨床的に承認されたＨＥＲ２特異的ＡＤＣであるＴ−ＤＭ１より有効でもあることを示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５Ｂ】
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