【手続補正書】
【提出日】令和2年12月22日(2020.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸編集のための医薬の製造における
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列
の使用であって、ここで、核酸編集は、PCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、PCSK9をコードするポリヌクレオチドにおけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらすために好適な条件下で（ｉ）および（ｉｉ）と接触させることを含み；任意に、ここで、ガイドヌクレオチド配列は、表３において列記されるガイドヌクレオチド配列から選択され；および／または、ここで、ガイドヌクレオチド配列は、表６において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号９３８〜１１２３）から選択される、
前記使用。
【請求項２】
核酸編集のための医薬の製造における
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、アポリポタンパク質Ｃ３（APOC3）タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列
の使用であって、ここで、核酸編集は、APOC3をコードするポリヌクレオチドを、APOC3をコードするポリヌクレオチドにおけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらすために好適な条件下で（ｉ）および（ｉｉ）と接触させることを含み；任意に、ここで、ガイドヌクレオチド配列は、表１５において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号１８５６〜１９０６）から選択される、
前記使用。
【請求項３】
核酸編集のための医薬の製造における
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、低密度リポタンパク質受容体（LDL-R）タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列
の使用であって、ここで、核酸編集は、LDL-Rをコードするポリヌクレオチドを、LDL-Rをコードするポリヌクレオチドにおけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらすために好適な条件下で（ｉ）および（ｉｉ）と接触させることを含み；任意に、ここで、ガイドヌクレオチド配列は、配列番号１７９２〜１７９９から選択される、
前記使用。
【請求項４】
核酸編集のための医薬の製造における
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、誘導性のLDL受容体分解剤（IDOL）タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン（Ｃ）塩基にターゲティングするガイドヌクレオチド配列
の使用であって、ここで、核酸編集は、IDOLをコードするポリヌクレオチドを、IDOLをコードするポリヌクレオチドにおけるシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変更をもたらす、融合タンパク質による標的Ｃ塩基の脱アミノ化をもたらすために好適な条件下で（ｉ）および（ｉｉ）と接触させることを含み；任意に、ここで、ガイドヌクレオチド配列は、配列番号１７８８〜１７９１から選択される、
前記使用。
【請求項５】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質が、ニッカーゼであり；任意に、ニッカーゼが、Cas9ニッカーゼであり；さらに任意に、Cas9ニッカーゼが、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異またはＨ８４０Ａ変異に対応する変異を含み；さらに任意に、Cas9ニッカーゼが、配列番号１におけるＤ１０Ａ変異に対応する変異を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1ドメイン、無能化Cpf1ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノートドメイン、およびそのバリアントからなる群より選択され；任意に、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメインであり；さらに任意に、dCas9ドメインのアミノ酸配列が、配列番号１におけるＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａに対応する変異を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
（ｉ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1（dCpf1）ドメインまたは無能化Cpf1ドメインを含み；任意に、dCpf1ドメインまたは無能化Cpf1ドメインが、AcidaminococcusまたはLachnospiraceaeの種からのものであり；あるいは、
（ｉｉ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノート（dAgo）ドメインを含み；任意に、dAgoドメインが、Natronobacterium gregoryi（dNgAgo）からのものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
シトシンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質Ｂ−mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼを含み；任意に、シトシンデアミナーゼが、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、およびAPOBEC4からなる群より選択され；または、シトシンデアミナーゼが、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）、またはpmCDA1を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
シトシンデアミナーゼが、配列番号２７１〜２９２および３０３のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み；任意に、シトシンデアミナーゼが、配列番号２７１〜２９２および３０３のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
（ｉ）の融合タンパク質が、Gamタンパク質をさらに含み；任意に、Gamタンパク質が、配列番号２０３０〜２０５８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み；さらに任意に、Gamタンパク質が、配列番号２０３０〜２０５８のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
（ｉ）の融合タンパク質が、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）ドメインをさらに含み；任意に、UGIドメインが、配列番号３０４のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み；任意に、UGIドメインが、配列番号３０４のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
シトシンデアミナーゼドメインが、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのＮ末端に融合しており；任意に、UGIドメインが、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのＣ末端に融合している、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
シトシンデアミナーゼ、ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン、およびUGIドメインが、それぞれ、任意のリンカーを介して共に融合しており；任意に、融合タンパク質が、構造ＮＨ２−［シトシンデアミナーゼドメイン］−［任意のリンカー配列］−［ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン］−［任意のリンカー配列］−［UGIドメイン］−ＣＯＯＨを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
リンカーが、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１９９８）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３０８）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号３０９）、（ＧＧＳ）ｎ、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３１０）、または（ＸＰ）ｎモチーフ、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ここでｎは、独立して１〜３０の整数であり、ここでＸは、任意のアミノ酸であり；任意に、リンカーが、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号３１０）を含み；任意に、リンカーが（ＧＧＳ）ｎであり、ここでｎは、１、３、または７である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
融合タンパク質が、配列番号１０または２９３〜３０２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み；任意に、融合タンパク質が、配列番号１０または２９３〜３０２のうちのいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
ＣからＴへの変更が、PCSK9をコードするポリヌクレオチドのコード配列において起こり；任意に、ＣからＴへの変更が、PCSK9タンパク質における変異をもたらす、請求項１および５〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
PCSK9タンパク質における変異が、
ｉ）機能喪失型変異であり；任意に、変異が、表３において列記される変異から選択され；または
ｉｉ）PCSK9タンパク質の折りたたみを不安定化し；任意に、変異が、表４において列記される変異から選択され；さらに任意に、ガイドヌクレオチド配列が、表４において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号５７９〜９３７）から選択される、
請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
機能喪失型変異が、短縮化された、または非機能的なPCSK9タンパク質をもたらすPCSK9コード配列中の未成熟停止コドンを導入し；
任意に、未成熟停止コドンが、ＴＡＧ（Amber）、ＴＧＡ（Opal）、またはＴＡＡ（Ochre）であり；
さらに任意に、
（ｉ）未成熟停止コドンが、コード鎖上のＣの脱アミノ化を介するＣＡＧからＴＡＧへの変更から生じ、
（ｉｉ）未成熟停止コドンが、コード鎖上のＣの脱アミノ化を介するＣＧＡからＴＧＡへの変更から生じ、
（ｉｉｉ）未成熟停止コドンが、コード鎖上のＣの脱アミノ化を介するＣＡＡからＴＡＡへの変更から生じ、
（ｉｖ）未成熟停止コドンが、相補鎖上のＣの脱アミノ化を介するＴＧＧからＴＡＧへの変更から生じ、
（ｖ）未成熟停止コドンが、相補鎖上のＣの脱アミノ化を介するＴＧＧからＴＧＡへの変更から生じ、または
（ｖｉ）未成熟停止コドンが、コード鎖上のＣの脱アミノ化および相補鎖上のＣの脱アミノ化を介する、ＣＧＧからＴＧＡへ、またはＣＧＡからＴＡＡへの変更から生じる、
請求項１および５〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
１つ以上のタンデムな未成熟停止コドンが導入され；
任意に、変異が、Ｗ１０Ｘ−Ｗ１１Ｘ、Ｑ９９Ｘ−Ｑ１０１Ｘ、Ｑ３４２Ｘ−Ｑ３４４Ｘ、およびＱ５５４Ｘ−Ｑ５５５Ｘからなる群より選択され、ここでＸは、停止コドンであり；
任意に、未成熟停止コドンが、構造不安定化変異の後に導入され；
任意に、不安定化する変異が、Ｐ５３０Ｓ／Ｌ、Ｐ５８１Ｓ／Ｌ、およびＰ６１８Ｓ／Ｌからなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
未成熟停止コドンが、Ｑ５３１Ｘ、Ｒ５８２Ｘ、およびＱ６１９Ｘからなる群より選択され、ここでＸが停止コドンであり；
任意に、未成熟停止コドンを導入するために用いられるガイドヌクレオチド配列が、配列番号９３８〜１１２３から選択され、およびここで、構造不安定化変異を導入するために用いられるガイドヌクレオチド配列が、配列番号５７９〜９３７から選択される、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ＣからＴへの変更が、PCSK9をコードするポリヌクレオチドの非コード領域におけるスプライス部位において起こり；
任意に、
（ｉ）ＣからＴへの変更が、イントロン−エクソン接合部において起こり；
（ｉｉ）ＣからＴへの変更が、スプライスドナー部位において起こり；または
（ｉｉｉ）ＣからＴへの変更が、スプライスアクセプター部位において起こり；
（ｉｖ）ＣからＴへの変更が、開始コドン（ＡＵＧ）中のＧ塩基と対形成している塩基において起こる、
請求項１および５〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
ＣからＴへの変更が、PCSK9のmRNA成熟を防止するか、またはPCSK9の発現を抑止し；任意に、ガイドヌクレオチド配列が、表８において列記されるガイドヌクレオチド配列（配列番号１１２４〜１３０９）から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
（ａ）PAM配列が、変更されているＣの３’に位置し；
（ｂ）PAM配列が、変更されているＣの５’に位置し；
任意に、PAM配列が、ＮＧＧ、ＮＧＡＮ、ＮＧＮＧ、ＮＧＡＧ、ＮＧＣＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＧＧＮＧ、ＮＧＲＲＮ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、およびＮＡＡＡＣからなる群より選択され、ここで、Ｙはピリミジンであり、Ｒはプリンであり、およびＮは任意の核酸塩基である、
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
PAM配列が、ＮＮＴ、ＮＮＮＴ、およびＹＮＴからなる群より選択され、ここで、Ｙはピリミジンであり、およびＮは任意の核酸塩基であり；
および／または、標的Ｃ塩基の３’に位置するPAM配列は存在せず；
および／または、標的Ｃ塩基の５’に位置するPAM配列は存在せず；
および／または、標的Ｃ塩基の３’または５’に位置するPAM配列は存在しない、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変異が、ＰＣＳＫ９をコードするポリヌクレオチド中に導入される、請求項１および５〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
ガイドヌクレオチド配列が、RNA（gRNA）である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
ガイドヌクレオチド配列が、ssDNA（gDNA）である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
接触させることが、in vitroで行われ；任意に、使用が、培養細胞中で行われる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
接触させることが、非ヒト動物において、in vivoで行われ；任意に、動物が、哺乳動物であり；さらに任意に、哺乳動物がげっ歯類である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項３１】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、アポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項３２】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、アポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに
（ｉｖ）（ｉ）の融合タンパク質を、低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項３３】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（PCSK9）タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、アポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；
（ｉｖ）（ｉ）の融合タンパク質を、低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列；ならびに
（ｖ）（ｉ）の融合タンパク質をLDL受容体タンパク質の誘導性分解剤をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項３４】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、アポリポタンパク質Ｃ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項３５】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項３６】
以下：
（ｉ）（ａ）ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン；および（ｂ）シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）（ｉ）の融合タンパク質を、誘導性のLDL受容体分解剤タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイドヌクレオチド配列
を含む、組成物。
【請求項３７】
（ｉｉ）のガイドヌクレオチド配列が、配列番号３３６〜１３０９から選択され；
および／または（ｉｉｉ）のガイドヌクレオチド配列が、配列番号１８０６〜１９０６から選択され；
および／または（ｉｖ）のガイドヌクレオチド配列が、配列番号１７９２〜１７９９から選択され；
および／または（ｖ）のガイドヌクレオチド配列が、配列番号１７８８〜１７９１から選択される、
請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸およびガイドヌクレオチド配列を含み；任意に、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む、組成物。
【請求項３９】
LDL受容体により媒介されるLDLコレステロールのクリアランスをブーストする用途のための；または、対象における循環コレステロールレベルを低下させる用途のための、請求項３０〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
状態を処置する用途のための、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の組成物であって、任意に、状態が、高コレステロール血症、上昇した総コレステロールレベル、上昇した低密度リポタンパク質（LDL）レベル、上昇したLDL−コレステロールレベル、低下した高密度リポタンパク質レベル、脂肪肝、冠動脈心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、２型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、またはこれらの組み合わせである、前記組成物。