【手続補正書】
【提出日】令和3年11月8日(2021.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴＲＫＢ）タンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物であって、前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物。
【請求項２】
前記ＴＲＫＢタンパク質が、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを含む、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
前記細胞外ドメインが、配列番号６０に表記されている配列を含む、請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記細胞外ドメインの全体が、欠失されて前記オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座の前記セグメントによってコードされ、必要に応じて、前記細胞外ドメインのコード配列が、配列番号７２に表記されている配列を含む、請求項２または３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性シグナルペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項６】
前記シグナルペプチドが、配列番号５１または５５に表記されている配列を含む、請求項５に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
前記シグナルペプチドの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６３または６７に表記されている配列を含む、請求項５または６に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメインを含む、いずれかの先行する請求項に記載の非ヒト動物。
【請求項９】
前記膜貫通ドメインが、配列番号５３または５７に表記されている配列を含む、請求項８に記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
前記膜貫通ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６５または６９に表記されている配列を含む、請求項８または９に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメインを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記細胞質ドメインが、配列番号５４または５８に表記されている配列を含む、請求項１１に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
前記細胞質ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号６６または７０に表記されている配列を含む、請求項１１または１２に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢシグナルペプチド、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメイン、および内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメインを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
前記シグナルペプチドが、配列番号５１に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインが、配列番号５３に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインが、配列番号５４に表記されている配列を含む、または
前記シグナルペプチドが、配列番号５５に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインが、配列番号５７に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインが、配列番号５８に表記されている配列を含む、
請求項１４に記載の非ヒト動物。
【請求項１６】
前記シグナルペプチドの全体、前記膜貫通ドメインの全体、および前記細胞質ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、
必要に応じて、前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６３に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６５に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号６６に表記されている配列を含む、または
必要に応じて、前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６７に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６９に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号７０に表記されている配列を含む、
請求項１４または１５に記載の非ヒト動物。
【請求項１７】
前記ＴＲＫＢタンパク質が、キメラ非ヒト動物／ヒトＴＲＫＢタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項１８】
前記細胞外ドメインが、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインであり、前記膜貫通ドメインが、内在性ＴＲＫＢタンパク質膜貫通ドメインであり、前記細胞質ドメインが、内在性ＴＲＫＢタンパク質細胞質ドメインである、請求項１７に記載の非ヒト動物。
【請求項１９】
前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号４または５に表記されている配列を含む、請求項１７または１８に記載の非ヒト動物。
【請求項２０】
前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１２または１３に表記されている配列を含む、請求項１９に記載の非ヒト動物。
【請求項２１】
前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してヘテロ接合性である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項２２】
前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してホモ接合性である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項２３】
哺乳動物である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項２４】
齧歯類である、請求項２３に記載の非ヒト動物。
【請求項２５】
ラットまたはマウスである、請求項２４に記載の非ヒト動物。
【請求項２６】
前記ラットである、請求項２５に記載の非ヒト動物。
【請求項２７】
前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号５に表記されている配列を含む、請求項２６に記載の非ヒト動物。
【請求項２８】
前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１３に表記されている配列を含む、請求項２７に記載の非ヒト動物。
【請求項２９】
前記マウスである、請求項２５に記載の非ヒト動物。
【請求項３０】
前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号４に表記されている配列を含む、請求項２９に記載の非ヒト動物。
【請求項３１】
前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１２に表記されている配列を含む、請求項３０に記載の非ヒト動物。
【請求項３２】
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価する方法であって、
（ａ）前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を請求項１〜３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物に投与するステップと、
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を評価するステップとを含む、方法。
【請求項３３】
ステップ（ａ）が、前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を前記非ヒト動物に注射するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ｂ）が、対照非ヒト動物と比べて、体重、体組成、代謝および移動運動のうち１種または複数または全種の変化を評価するステップを含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
体組成の変化を評価する前記ステップが、対照非ヒト動物と比べて、除脂肪量および／または体脂肪量を評価するステップを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
代謝の変化を評価する前記ステップが、食物消費および／または水消費の変化を評価するステップを含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｂ）が、対照非ヒト動物と比べて、ＴＲＫＢリン酸化、および／またはＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を評価するステップを含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）が、神経保護活性を評価するステップを含む、請求項３２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｂ）が、神経保護活性を評価するステップを含み、前記非ヒト動物が、ラットである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ステップ（ｂ）が、網膜神経節細胞生存度を評価するステップを含む、請求項３２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
網膜神経節細胞生存度が、視神経傷害後の完全視神経切断モデルにおいて評価される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
網膜神経節細胞生存度が、視神経挫滅モデルにおいて評価される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が、抗原結合性タンパク質である、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗原結合性タンパク質が、ヒトＴＲＫＢアゴニスト抗体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が、小分子である、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記小分子が、ヒトＴＲＫＢアゴニストである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（Ｉ）
（ａ）前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むように多能性非ヒト動物細胞のゲノムを改変するステップ、
（ｂ）前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む前記遺伝子改変された多能性非ヒト動物細胞を識別または選別するステップ、
（ｃ）前記遺伝子改変された多能性非ヒト動物細胞を非ヒト動物宿主胚に導入するステップ、および
（ｄ）前記非ヒト動物宿主胚を代理母に移植し、懐胎させるステップ、または
（ＩＩ）
（ａ）前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むように非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを改変するステップ、
（ｂ）前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む前記遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を選別するステップ、および
（ｃ）前記遺伝子改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植し、懐胎させるステップ
を含む、方法。
【請求項４８】
トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴＲＫＢ）タンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物細胞であって、前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物細胞。
【請求項４９】
トロポミオシン受容体キナーゼＢ（ＴＲＫＢ）タンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を生成するための標的化ベクターを含む組成物であって、
前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされ、
前記標的化ベクターが、前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列を標的化する５’相同性アーム、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列を標的化する３’相同性アームに挟まれた前記オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含むインサート核酸を含む、
組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７２】
さらに、ＴｒｋＢアゴニスト抗体（Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ）はヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスにおいて神経保護効果を有しなかった。５月齢の雄ヒトＴＲＫＢホモ接合性マウス（ＭＡＩＤ７１３９、７５％  Ｃ５７ＢＬ／６、２５％  １２９）を用いた。各群で５〜６匹のマウスを用いた。ヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスに、Ｈ４Ｈ９７８０Ｐ（１眼あたり４０μｇ）またはアイソタイプ対照抗体（ＲＥＧＮ１９４５、１眼あたり４０μｇ）を、視神経切断後３日目および１０日目に硝子体内投与した（１μＬ）。切断の１４日後に網膜を切除し、ＲＧＣを染色した。図１７Ａおよび図１７Ｂに示すように、ＴｒｋＢアゴニスト抗体は、ヒトＴＲＫＢホモ接合性ラットで見られた神経保護効果とは対照的に、ヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスにおいて神経保護効果を有しなかった。図１７Ｃに、切断後１４日目にＨ４Ｈ９７８０Ｐまたはアイソタイプ対照抗体を与えたヒトＴＲＫＢホモ接合性マウスの体重を示す。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物であって、前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物。
(項目２)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインを含む、項目１に記載の非ヒト動物。
(項目３)
前記細胞外ドメインが、配列番号６０に表記されている配列を含む、項目２に記載の非ヒト動物。
(項目４)
前記細胞外ドメインの全体が、欠失されて前記オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座の前記セグメントによってコードされ、必要に応じて、前記細胞外ドメインのコード配列が、配列番号７２に表記されている配列を含む、項目２または３に記載の非ヒト動物。
(項目５)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性シグナルペプチドを含む、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目６)
前記シグナルペプチドが、配列番号５１または５５に表記されている配列を含む、項目５に記載の非ヒト動物。
(項目７)
前記シグナルペプチドの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６３または６７に表記されている配列を含む、項目５または６に記載の非ヒト動物。
(項目８)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメインを含む、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目９)
前記膜貫通ドメインが、配列番号５３または５７に表記されている配列を含む、項目８に記載の非ヒト動物。
(項目１０)
前記膜貫通ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６５または６９に表記されている配列を含む、項目８または９に記載の非ヒト動物。
(項目１１)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメインを含む、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目１２)
前記細胞質ドメインが、配列番号５４または５８に表記されている配列を含む、項目１１に記載の非ヒト動物。
(項目１３)
前記細胞質ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、必要に応じて、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号６６または７０に表記されている配列を含む、項目１１または１２に記載の非ヒト動物。
(項目１４)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、内在性ＴＲＫＢシグナルペプチド、内在性ＴＲＫＢ膜貫通ドメイン、および内在性ＴＲＫＢ細胞質ドメインを含む、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目１５)
前記シグナルペプチドが、配列番号５１に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインが、配列番号５３に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインが、配列番号５４に表記されている配列を含む、または
前記シグナルペプチドが、配列番号５５に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインが、配列番号５７に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインが、配列番号５８に表記されている配列を含む、
項目１４に記載の非ヒト動物。
(項目１６)
前記シグナルペプチドの全体、前記膜貫通ドメインの全体、および前記細胞質ドメインの全体が、内在性ＴｒｋＢ配列によってコードされ、
必要に応じて、前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６３に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６５に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号６６に表記されている配列を含む、または
必要に応じて、前記シグナルペプチドのコード配列が、配列番号６７に表記されている配列を含み、前記膜貫通ドメインのコード配列が、配列番号６９に表記されている配列を含み、前記細胞質ドメインのコード配列が、配列番号７０に表記されている配列を含む、
項目１４または１５に記載の非ヒト動物。
(項目１７)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、キメラ非ヒト動物／ヒトＴＲＫＢタンパク質である、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目１８)
前記細胞外ドメインが、ヒトＴＲＫＢ細胞外ドメインであり、前記膜貫通ドメインが、内在性ＴＲＫＢタンパク質膜貫通ドメインであり、前記細胞質ドメインが、内在性ＴＲＫＢタンパク質細胞質ドメインである、項目１７に記載の非ヒト動物。
(項目１９)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号４または５に表記されている配列を含む、項目１７または１８に記載の非ヒト動物。
(項目２０)
前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１２または１３に表記されている配列を含む、項目１９に記載の非ヒト動物。
(項目２１)
前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してヘテロ接合性である、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目２２)
前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座に関してホモ接合性である、項目１〜２０のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目２３)
哺乳動物である、いずれかの先行する項目に記載の非ヒト動物。
(項目２４)
齧歯類である、項目２３に記載の非ヒト動物。
(項目２５)
ラットまたはマウスである、項目２４に記載の非ヒト動物。
(項目２６)
ラットである、項目２５に記載の非ヒト動物。
(項目２７)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号５に表記されている配列を含む、項目２６に記載の非ヒト動物。
(項目２８)
前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１３に表記されている配列を含む、項目２７に記載の非ヒト動物。
(項目２９)
マウスである、項目２５に記載の非ヒト動物。
(項目３０)
前記ＴＲＫＢタンパク質が、配列番号４に表記されている配列を含む、項目２９に記載の非ヒト動物。
(項目３１)
前記ＴＲＫＢタンパク質をコードする前記遺伝子改変されたＴｒｋＢ遺伝子座のコード配列が、配列番号１２に表記されている配列を含む、項目３０に記載の非ヒト動物。
(項目３２)
ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価する方法であって、
（ａ）前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を項目１〜３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物に投与するステップと、
（ｂ）前記非ヒト動物における前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬の活性を評価するステップとを含む、方法。
(項目３３)
ステップ（ａ）が、前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬を前記非ヒト動物に注射するステップを含む、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
ステップ（ｂ）が、対照非ヒト動物と比べて、体重、体組成、代謝および移動運動のうち１種または複数または全種の変化を評価するステップを含む、項目３２または３３に記載の方法。
(項目３５)
体組成の変化を評価する前記ステップが、対照非ヒト動物と比べて、除脂肪量および／または体脂肪量を評価するステップを含む、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
代謝の変化を評価する前記ステップが、食物消費および／または水消費の変化を評価するステップを含む、項目３４または３５に記載の方法。
(項目３７)
ステップ（ｂ）が、対照非ヒト動物と比べて、ＴＲＫＢリン酸化、および／またはＭＡＰＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を評価するステップを含む、項目３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
ステップ（ｂ）が、神経保護活性を評価するステップを含む、項目３２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
(項目３９)
ステップ（ｂ）が、神経保護活性を評価するステップを含み、前記非ヒト動物が、ラットである、項目３８に記載の方法。
(項目４０)
ステップ（ｂ）が、網膜神経節細胞生存度を評価するステップを含む、項目３２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
(項目４１)
網膜神経節細胞生存度が、視神経傷害後の完全視神経切断モデルにおいて評価される、項目４０に記載の方法。
(項目４２)
網膜神経節細胞生存度が、視神経挫滅モデルにおいて評価される、項目４０に記載の方法。
(項目４３)
前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が、抗原結合性タンパク質である、項目３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目４４)
前記抗原結合性タンパク質が、ヒトＴＲＫＢアゴニスト抗体である、項目４３に記載の方法。
(項目４５)
前記ヒトＴＲＫＢ標的化試薬が、小分子である、項目３２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目４６)
前記小分子が、ヒトＴＲＫＢアゴニストである、項目４５に記載の方法。
(項目４７)
項目１〜３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞に、
（ｉ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を含む外因性修復鋳型であって、前記インサート核酸が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含む、外因性修復鋳型、ならびに
（ｉｉ）前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤
を導入するステップであって、ゲノムが、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むように改変される、ステップと、
（ｂ）改変された前記非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入するステップと、
（ｃ）前記宿主胚を代理母に移植して、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生させるステップと
を含む、方法。
(項目４８)
前記多能性細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓ９タンパク質、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するガイドＲＮＡである、項目４７または４８に記載の方法。
(項目５０)
ステップ（ａ）が、前記非ヒト動物多能性細胞に、前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入するステップをさらに含む、項目４９に記載の方法。
(項目５１)
前記外因性修復鋳型が、少なくとも１０ｋｂの長さの大型の標的化ベクターである、または前記外因性修復鋳型が、その前記５’相同性アームおよび前記３’相同性アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである大型の標的化ベクターである、項目４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
(項目５２)
項目１〜３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物１細胞期胚に、
（ｉ）内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列にハイブリダイズする５’相同性アーム、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列にハイブリダイズする３’相同性アームに挟まれたインサート核酸を含む外因性修復鋳型であって、前記インサート核酸が、オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含む、外因性修復鋳型、ならびに
（ｉｉ）前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の標的配列を標的化するヌクレアーゼ剤
を導入するステップであって、ゲノムが、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含むように改変される、ステップと、
（ｂ）改変された前記非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、前記遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む遺伝子改変されたＦ０世代非ヒト動物を産生させるステップと
を含む、方法。
(項目５３)
前記ヌクレアーゼ剤が、Ｃａｓ９タンパク質、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するガイドＲＮＡである、項目５２に記載の方法。
(項目５４)
ステップ（ａ）が、前記非ヒト１細胞期胚に、前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的化する第２のガイドＲＮＡを導入するステップをさらに含む、項目５３に記載の方法。
(項目５５)
ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物細胞であって、前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物細胞。
(項目５６)
ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされる、非ヒト動物ゲノム。
(項目５７)
ＴＲＫＢタンパク質をコードする遺伝子改変された内在性ＴｒｋＢ遺伝子座を生成するための標的化ベクターであって、
前記ＴＲＫＢタンパク質が、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインを含み、前記細胞外ドメインの全体または一部が、欠失されてオルソロガスヒトＴＲＫＢ配列に置き換えられた前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座のセグメントによってコードされ、
前記標的化ベクターが、前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における５’標的配列を標的化する５’相同性アーム、および前記内在性ＴｒｋＢ遺伝子座における３’標的配列を標的化する３’相同性アームに挟まれた前記オルソロガスヒトＴＲＫＢ配列を含むインサート核酸を含む、
標的化ベクター。