【手続補正書】
【提出日】令和3年2月3日(2021.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡは、
ａ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であるか；
ｂ）Ｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であるか；
ｃ）非欠失ＨＦＰＨ領域（例えば、ヒト非欠失ＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的であり；
ｄ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜Ｃｈｒ１１：５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であるか；
ｅ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜Ｃｈｒ１１：５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であるか；
ｆ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜５，２４９，９２７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であるか；
ｇ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜５，２５４，８５１、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であるか；
ｈ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，１３９〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であるか；又は
ｉ）これらの組み合わせである
標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記標的化ドメインは、配列番号１〜配列番号７２又はその断片のいずれか１つを含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記標的化ドメインは、
ａ）配列番号６７、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６３又はその断片のいずれか１つ；
ｂ）配列番号６７、配列番号６、配列番号８、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４８、配列番号５１若しくはその断片のいずれか１つ；
ｃ）配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５４若しくはその断片のいずれか１つ；又は
ｄ）配列番号６７
を含む、請求項２に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸を含む、請求項２又は３に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの前記１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、
ａ）前記記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸であるか、
ｂ）前記記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸であるか、又は
ｃ）前記記載される標的化ドメイン配列の５’又は３’核酸のいずれも含まない、
請求項４に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項６】
前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列からなる、請求項２〜５のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項７】
デュアルガイドＲＮＡ分子又はシングルガイドＲＮＡ分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項８】
（ａ）配列番号１９５；
（ｂ）配列番号２３１；又は
（ｃ）１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）又は（ｂ）のいずれか
を含み、（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列は、前記標的化ドメインの３’側、任意選択で前記標的化ドメインの直ちに３’側に配置される、請求項７に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項９】
（ａ）配列番号１７４；
（ｂ）配列番号１７５；又は
（ｃ）配列番号１７６
の配列を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１０】
（ａ）配列番号１７７を含むｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含むｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１７７を含むｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含むｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１７８を含むｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含むｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１７８を含むｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含むｔｒａｃｒ
を含む、請求項１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１１】
ａ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞に導入されると、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成され；かつ／又は
ｂ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞に導入されると、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域において前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的な配列との間に形成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１２】
前記インデルは、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まず、任意選択で、前記インデルは、非欠失ＨＰＦＨ又は転写因子結合部位のヌクレオチドを含まない、請求項１１に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞の集団に導入されると、インデルは、前記集団の前記細胞の少なくとも約１５％において、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１４】
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムが細胞に導入されると、
（ａ）胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞又はその子孫において増加し、任意選択で、胎児ヘモグロビンの前記発現は、前記ｇＲＮＡ分子が導入されていない細胞の集団又はその子孫の集団における胎児ヘモグロビンの発現のレベルと比較して、少なくとも約１５％増加し；
（ｂ）前記細胞又はその子孫は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生し；
（ｃ）オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず；かつ／又は
（ｄ）オフターゲットインデルは、前記細胞の集団の前記細胞の約５％超において検出されない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１５】
前記細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、任意選択で、前記細胞は、異常ヘモグロビン症に罹患している患者から得られる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１６】
前記細胞は、
ａ）ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣであるか、又は
ｂ）前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、
請求項１５に記載のｇＲＮＡ分子。
【請求項１７】
ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子；
ｂ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
ｃ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
ｄ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；又は
ｅ）上記ａ）〜ｄ）のいずれかのもの及び鋳型核酸；又は
ｆ）上記ａ）〜ｄ）のいずれかのもの及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
を含む組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の第１のｇＲＮＡ分子を含み、Ｃａｓ９分子をさらに含む組成物であって、前記Ｃａｓ９分子は、活性又は不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９であり、任意選択で、前記Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５又はそれと少なくとも９５％の配列相同性を有する配列を含む、組成物。
【請求項１９】
前記Ｃａｓ９分子は、
（ａ）配列番号２３３；
（ｂ）配列番号２３４；
（ｃ）配列番号２３５；
（ｄ）配列番号２３６；
（ｅ）配列番号２３７；
（ｆ）配列番号２３８；
（ｇ）配列番号２３９；
（ｈ）配列番号２４０；
（ｉ）配列番号２４１；
（ｊ）配列番号２４２；
（ｋ）配列番号２４３；又は
（ｌ）配列番号２４４
を含む、請求項１７又は１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ａ）前記第１のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に存在し、かつ／または
ｂ）前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にＲＮＰ中にあり、前記ＲＮＰの各々は、約１０μＭ未満、例えば約３μＭ未満、例えば約１μＭ未満、例えば約０．５μＭ未満、例えば約０．３μＭ未満、例えば約０．１μＭ未満の濃度であり、任意選択で、前記ＲＮＰの前記濃度は、約２μＭであるか又は約１μＭであり、任意選択で、前記組成物は、細胞、例えばＨＳＰＣの集団をさらに含む、
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸配列を含むベクターであって、任意選択で、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド及びＲＮＡベクターからなる群から選択されるベクター。
【請求項２３】
細胞を前記細胞内の標的配列で又はその近傍で改変する方法であって、前記細胞を、
ａ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子；
ｂ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
ｃ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
ｄ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
ｅ）上記ａ）〜ｄ）のいずれか及び鋳型核酸；
ｆ）上記ａ）〜ｄ）のいずれか、及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸；
ｇ）請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物；又は
ｈ）請求項２２に記載のベクター
と接触させるステップを含む方法。
【請求項２４】
ａ）前記細胞は、動物細胞であり、任意選択で、前記細胞は、異常ヘモグロビン症に罹患している患者から得られるものであり；
ｂ）前記細胞は、ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣであり；
ｃ）前記細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置されるものであり；
ｄ）前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されるものであり、かつ／又は
ｅ）前記細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）細胞の集団の少なくとも約１５％が改変されている細胞の集団をもたらし；
（ｂ）前記改変は、赤血球系統の分化細胞への分化能を有する細胞をもたらし、前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンのレベルの増加を呈し；
（ｃ）前記改変は、分化細胞の集団への分化能を有する細胞の集団をもたらし、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団と比較してＦ細胞の割合が増加しており；かつ／又は
（ｄ）前記改変は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞への分化能を有する細胞をもたらし、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生する、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法によって改変された細胞又は請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞。
【請求項２７】
表７−２に記載されるインデルを含む細胞であって、任意選択で、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まない細胞。
【請求項２８】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子を含む細胞。
【請求項２９】
Ｃａｓ９分子をさらに含む、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
幹細胞増殖剤と接触されている、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３１】
前記幹細胞増殖剤は、
ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール）との組み合わせ）
である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
ａ）動物細胞、例えば哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり；任意選択で、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる細胞であり；
ｂ）ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣであり；
ｃ）骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されている細胞（例えば、細胞の集団）であり、かつ／または
ｄ）細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である細胞である、
請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３】
請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の細胞を含む細胞の集団であって、前記集団の前記細胞の少なくとも約５０％は、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載の細胞である、細胞の集団。
【請求項３４】
分化細胞の集団への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、同じタイプの修飾されていない細胞の集団と比較してＦ細胞の割合が増加している、請求項３３に記載の細胞の集団。
【請求項３５】
請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の細胞又は細胞の集団及び薬学的に許容可能な媒体を含む組成物。
【請求項３６】
細胞を調製する方法であって、
（ａ）細胞を提供するステップ；
（ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中において前記細胞をエキソビボで培養するステップ；及び
（ｃ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の組成物、請求項２１に記載の核酸配列又は請求項２２に記載のベクターを前記細胞に導入するステップ
を含む方法。
【請求項３７】
ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞は、分化細胞への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、ステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞と比較して増加した胎児ヘモグロビンを産生する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記幹細胞増殖剤は、
ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）
である、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含み、任意選択で、前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含み；任意選択で、前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）及び存在する場合にはヒトＩＬ−６をそれぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、任意選択でそれぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１ｎＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度、任意選択で約１μＭ〜約１００ｎＭの範囲の濃度、任意選択で約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭの範囲の濃度、任意選択で約５００ｎＭの濃度、例えば５００ｎＭの濃度又は約７５０ｎＭの濃度、例えば７５０ｎＭの濃度で含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
ステップ（ａ）で提供される前記細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化される、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法によって得ることが可能な細胞。
【請求項４３】
請求項４２に記載の細胞であって、
（ａ）前記細胞の集団の前記細胞の少なくとも約４０％は、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを含み；
（ｂ）前記細胞は、赤血球系統の分化細胞への分化能を有し、前記分化細胞は、胎児ヘモグロビンのレベルの増加を呈し；
（ｃ）前記細胞の集団は、分化細胞の集団への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、非改変細胞の集団と比較してＦ細胞の割合が増加しており；
（ｄ）前記細胞は、分化細胞への分化能を有し、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラムの胎児ヘモグロビンを産生し；
（ｅ）オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず；
（ｆ）オフターゲットインデルは、前記細胞の集団の前記細胞の約５％超において検出されず；かつ／又は
（ｇ）前記細胞又はその子孫は、移植後の１６週間超において、それを移植される患者で検出可能である、
細胞。
【請求項４４】
ａ）異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる細胞であり；
ｂ）ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣであり；
ｃ）骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されている細胞（例えば、細胞の集団）であり；かつ／又は
ｄ）細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である細胞である、
請求項４２又は４３に記載の細胞。
【請求項４５】
医薬として使用するための、請求項２６〜３２もしくは４２〜４４のいずれか一項に記載の細胞、請求項３３もしくは３４に記載の細胞の集団、又は請求項１７〜２０もしくは３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
患者における異常ヘモグロビン症、例えばβ−サラセミア又は鎌状赤血球病を治療するための医薬組成物であって、請求項２６〜３２もしくは４２〜４４のいずれか一項に記載の細胞、請求項３３もしくは３４に記載の細胞の集団、又は請求項１７〜２０もしくは３５のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項４７】
患者の胎児ヘモグロビン発現を増加させるための医薬組成物であって、請求項２６〜３２もしくは４２〜４４のいずれか一項に記載の細胞、請求項３３もしくは３４に記載の細胞の集団、又は請求項１７〜２０もしくは３５のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項４８】
ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、請求項２６〜３４又は４２〜４４のいずれか一項に記載の細胞、例えばヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、請求項２６〜３４又は４２〜４４のいずれか一項に記載のＣＤ３４＋細胞を含む、請求項４６又は４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記細胞若しくは細胞の集団又はその子孫は、任意選択で、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを検出することによって検出されるとき、投与後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超において、前記患者、例えばヒト患者で検出可能であり、任意選択で、前記インデルは、表７−２に挙げられるインデルから選択され；任意選択で、投与後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超における参照細胞集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）での前記インデルの検出のレベルは、投与の直前の前記細胞の集団における前記インデルの検出のレベルと比較して５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下で低下する、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにあるものを含め、本明細書に記載される方法のある態様において、細胞は、動物細胞であり、例えば、細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えば、細胞は、造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）（例えば、ＨＳＰＣの集団）であり、例えば、細胞は、ＣＤ３４＋細胞であり、例えば、細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である。本明細書に記載される方法の実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置される。本明細書に記載される方法の実施形態において、細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、動員末梢血又は臍帯血から単離されている。本明細書に記載される方法の実施形態において、細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来、例えば自己由来である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
前述の方法の態様及び実施形態のいずれかにおけるものを含め、細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法の態様において、ステップ（ａ）で提供される細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８９】
「造血幹細胞」（ＨＳＣ）は、本明細書で使用されるとき、自己複製して、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基球）、赤血球（例えば、網赤血球、赤血球）、栓球（例えば、巨核芽球、血小板産生巨核球、血小板）、及び単球（例えば、単球、マクロファージ）を含むより成熟した血球細胞に分化する能力を有する未熟血球細胞を指す。本明細書全体を通じて、ＨＳＣは、幹細胞と同義的に記載される。当該技術分野において、かかる細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含むことも又は含まないこともあることが公知である。ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する未熟細胞である。ＣＤ３４＋細胞は、上記に定義した幹細胞特性を有する細胞のサブ集団を占めると考えられる。ＨＳＣが、原始的前駆細胞（例えば、多能性前駆細胞）及び／又は特異的造血系統（例えば、リンパ系前駆細胞）にコミットした前駆細胞を生じさせることができる多能性細胞であることは、当該技術分野において周知である。特異的造血系統にコミットした幹細胞は、Ｔ細胞系統、Ｂ細胞系統、樹状細胞系統、ランゲルハンス細胞系統及び／又はリンパ系組織特異的マクロファージ細胞系統のものであり得る。さらに、ＨＳＣは、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）及び短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）も指す。ＳＴ−ＨＳＣは、ＬＴ−ＨＳＣよりも高活性且つ高増殖性である。しかしながら、ＬＴ−ＨＳＣは、無制限の自己複製を有する（すなわち、これは、成人期を通して生存する）一方、ＳＴ−ＨＳＣは、自己複製が限られている（すなわち、これは、限られた期間のみ生存する）。本明細書に記載される方法のいずれにおいても、これらのＨＳＣのいずれを使用することもできる。ＳＴ−ＨＳＣは、高増殖性であり、したがってＨＳＣ及びその子孫の数が急速に増加するため、任意選択でＳＴ−ＨＳＣが有用である。造血幹細胞は、任意選択で血液製剤から入手される。血液製剤には、造血起源の細胞を含む身体又は身体の臓器から得られた製剤が含まれる。かかる供給源には、未分画骨髄、臍帯、末梢血（例えば、動員末梢血、例えば、Ｇ−ＣＳＦ又はＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）などの動員剤で動員したもの、又はＧ−ＣＳＦ及びＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）の組み合わせ）、肝臓、胸腺、リンパ液及び脾臓が含まれる。前述の粗製又は未分画血液製剤の全ては、造血幹細胞特徴を有する細胞を当業者に公知の方法で富化することができる。ある実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋細胞として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋細胞として特徴付けられる。実施形態において、ＨＳＣは、ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−細胞として特徴付けられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９２】
「富化された」は、細胞集団との関連で使用されるとき、１つ以上のマーカー、例えばＣＤ３４＋の存在に基づき選択された細胞集団を指す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
「ＣＤ３４＋細胞が富化された」は、細胞集団がＣＤ３４マーカーの存在に基づき選択されていることを意味する。したがって、選択方法後の細胞集団中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージは、ＣＤ３４マーカーに基づく選択ステップ前の初期細胞集団中のＣＤ３４＋細胞のパーセンテージよりも高い。例えば、ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４＋細胞を富化した細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は少なくとも９０％を占め得る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９０】
本方法のさらなる実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を例えば上記に記載される供給源から提供した後、細胞の集団をＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）について富化するステップをさらに含む。本方法の実施形態において、前記富化後、細胞、例えばＨＳＰＣの集団は、ＣＤ３４−細胞を実質的に含まない。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９５】
本方法のさらなる実施形態において、本方法は、ＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）の集団を例えば上記に記載される供給源から提供した後、細胞の集団がＨＳＰＣ（例えば、ＣＤ３４＋細胞）に関して富化されることをさらに含む。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０５０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０５０６】
ＤＮＡ修復経路阻害剤
理論によって拘束されるものではないが、特定の標的配列において所与のｇＲＮＡ分子によって作り出されるインデルのパターンは、細胞内の活性ＤＮＡ修復機構（例えば、非相同末端結合、マイクロホモロジー媒介末端結合等）の各々の産物であると考えられる。理論によって拘束されるものではないが、編集しようとする細胞を、所望のインデルを生じないＤＮＡ修復経路の阻害剤と接触させることにより、特に有利なインデルを選択又は富化し得ると考えられる。したがって、本発明のｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、方法及び他の態様は、かかる阻害剤と組み合わせて実施し得る。かかる阻害剤の例としては、例えば、国際公開第２０１４／１３０９５５号パンフレット（この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるものが挙げられる。実施形態において、阻害剤はＤＮＡＰＫｃ阻害剤、例えばＮＵ７４４１である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７３６】
１２４．細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置される、実施形態１１５〜１２３のいずれかに記載の方法。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０９７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０９７５】
均等物
当業者は、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、又はルーチンに過ぎない実験を用いて確認することができるであろう。本発明は具体的な態様を参照して開示されているが、本発明の他の態様及び変形形態が当業者によって本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、かかる態様及び均等な変形形態の全てを含むものと解釈されることが意図される。
本発明は次の実施態様を含む。
［１］
ｔｒａｃｒとｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ分子であって、前記ｃｒＲＮＡは、
ａ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，０９４〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｂ）Ｃｈｒ１１：５，２５５，０２２〜５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｃ）非欠失ＨＦＰＨ領域（例えば、ヒト非欠失ＨＰＦＨ領域）の標的配列に相補的であり；
ｄ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜Ｃｈｒ１１：５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｅ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜Ｃｈｒ１１：５，２５５，１６４、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｆ）Ｃｈｒ１１：５，２４９，８３３〜５，２４９，９２７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｇ）Ｃｈｒ１１：５，２５４，７３８〜５，２５４，８５１、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；
ｈ）Ｃｈｒ１１：５，２５０，１３９〜５，２５０，２３７、−鎖、ｈｇ３８におけるゲノム核酸配列内の標的配列に相補的であり；又は
ｉ）これらの組み合わせ
である標的化ドメインを含む、ｇＲＮＡ分子。
［２］
前記標的化ドメインは、配列番号１〜配列番号７２又はその断片のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、上記［１］に記載のｇＲＮＡ分子。
［３］
前記標的化ドメインは、配列番号６７、配列番号１、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５８、配列番号６２、配列番号６３又はその断片のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、上記［２］に記載のｇＲＮＡ分子。
［４］
前記標的化ドメインは、
ａ）配列番号６７、配列番号６、配列番号８、配列番号２８、配列番号３４、配列番号４８、配列番号５１若しくはその断片；又は
ｂ）配列番号１、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号５４若しくはその断片
のいずれか１つを含む、例えばそれからなる、上記［２］に記載のｇＲＮＡ分子。
［５］
前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸を含む、例えばそれからなる、上記［２］〜［４］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［６］
前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの前記１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の３’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸である、上記［５］に記載のｇＲＮＡ分子。
［７］
前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの前記１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の５’末端に配置された１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸である、上記［５］に記載のｇＲＮＡ分子。
［８］
前記記載される標的化ドメイン配列のいずれか１つの前記１７、１８、１９又は２０個の連続する核酸は、前記記載される標的化ドメイン配列の５’又は３’核酸のいずれも含まない、上記［５］に記載のｇＲＮＡ分子。
［９］
前記標的化ドメインは、前記記載される標的化ドメイン配列からなる、上記［２］〜［８］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［１０］
前記標的化ドメインは、配列番号６７を含む、例えばそれからなる、上記［１］〜［９］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［１１］
デュアルガイドＲＮＡ分子である、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［１２］
シングルガイドＲＮＡ分子である、上記［１］〜［１０］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［１３］
（ａ）配列番号１９５；
（ｂ）配列番号２３１；又は
（ｃ）１、２、３、４、５、６又は７個のウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを３’末端にさらに含む上記（ａ）又は（ｂ）のいずれか
を含み、（ａ）〜（ｃ）のいずれかの配列は、前記標的化ドメインの直ちに３’側、任意選択で前記標的化ドメインの直ちに３’側に配置される、上記［１２］に記載のｇＲＮＡ分子。
［１４］
配列：
（ａ）配列番号１７４；
（ｂ）配列番号１７５；又は
（ｃ）配列番号１７６
を含む、例えばそれからなる、上記［１］に記載のｇＲＮＡ分子。
［１５］
（ａ）配列番号１７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｂ）配列番号１７７を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；
（ｃ）配列番号１７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号２２４を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ；又は
（ｄ）配列番号１７８を含む、例えばそれからなるｃｒＲＮＡ及び配列番号７３を含む、例えばそれからなるｔｒａｃｒ
を含む、例えばそれからなる、上記［１］に記載のｇＲＮＡ分子。
［１６］
ａ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、インデルは、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成され；及び／又は
ｂ）前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞に導入されると、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失は、ＨＢＧ１プロモーター領域において前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、ＨＢＧ２プロモーター領域において前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間に形成される、上記［１］〜［１５］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［１７］
前記インデルは、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まず、任意選択で、前記インデルは、非欠失ＨＰＦＨ又は転写因子結合部位のヌクレオチドを含まない、上記［１６］に記載のｇＲＮＡ分子。
［１８］
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞の集団に導入されると、インデルは、前記集団の前記細胞の少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％において、前記ｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的な標的配列に又はその近傍に形成される、上記［１］〜［１７］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［１９］
前記ｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、本明細書に記載されるとおりのＲＮＰ）が細胞（例えば、細胞の集団）に導入されると、
（ａ）胎児ヘモグロビンの発現は、前記細胞又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫において増加され、任意選択で、胎児ヘモグロビンの前記発現は、前記ｇＲＮＡ分子が導入されていない細胞の集団又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫の集団における胎児ヘモグロビンの発現のレベルに対して、少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約２５％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約３５％、例えば少なくとも約４０％だけ増加され；
（ｂ）前記細胞又は細胞の集団又はその子孫、例えばその赤血球系子孫、例えばその赤血球細胞子孫は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生し；
（ｃ）オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず、例えば、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部に形成されず；及び／又は
（ｄ）例えば、次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデル、例えば前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲットインデルは、前記細胞の集団の前記細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超において検出されない、上記［１］〜［１８］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［２０］
前記細胞は、哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり（又は細胞の集団は、それを含み）、任意選択で、前記細胞は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、上記［１６］〜［１９］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［２１］
前記細胞は、ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣである（又は細胞の集団は、それを含む）、上記［２０］に記載のｇＲＮＡ分子。
［２２］
前記細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、上記［１６］〜［２１］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子。
［２３］
１）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）及びＣａｓ９分子；
２）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
３）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
４）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子（第１のｇＲＮＡ分子を含む）をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；又は
５）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸；又は
６）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸
を含む組成物。
［２４］
上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子を含み、Ｃａｓ９分子をさらに含む組成物であって、任意選択で、前記Ｃａｓ９分子は、活性又は不活性化膿レンサ球菌（ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９であり、任意選択で、前記Ｃａｓ９分子は、配列番号２０５又はそれと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列相同性を有する配列を含む、組成物。
［２５］
前記Ｃａｓ９分子は、
（ａ）配列番号２３３；
（ｂ）配列番号２３４；
（ｃ）配列番号２３５；
（ｄ）配列番号２３６；
（ｅ）配列番号２３７；
（ｆ）配列番号２３８；
（ｇ）配列番号２３９；
（ｈ）配列番号２４０；
（ｉ）配列番号２４１；
（ｊ）配列番号２４２；
（ｋ）配列番号２４３；又は
（ｌ）配列番号２４４
を含む、例えばそれからなる、上記［２３］又は［２４］に記載の組成物。
［２６］
前記第１のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子は、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）中に存在する、上記［２３］〜［２５］のいずれかに記載の組成物。
［２７］
エレクトロポレーションに好適な媒体中に製剤化される、上記［２３］〜［２６］のいずれかに記載の組成物。
［２８］
前記ｇＲＮＡ分子の各々は、本明細書に記載されるＣａｓ９分子と共にＲＮＰ中にあり、前記ＲＮＰの各々は、約１０μＭ未満、例えば約３μＭ未満、例えば約１μＭ未満、例えば約０．５μＭ未満、例えば約０．３μＭ未満、例えば約０．１μＭ未満の濃度であり、任意選択で、前記ＲＮＰの前記濃度は、約２μＭであるか又は約１μＭであり、任意選択で、前記組成物は、細胞、例えばＨＳＰＣの集団をさらに含む、上記［２３］〜［２７］のいずれかに記載の組成物。
［２９］
上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸配列。
［３０］
上記［２９］に記載の核酸を含むベクターであって、任意選択で、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノプラスミド及びＲＮＡベクターからなる群から選択されるベクター。
［３１］
細胞（例えば、細胞の集団）を前記細胞内の標的配列で又はその近傍で改変する（例えば、核酸の構造（例えば、配列）を改変する）方法であって、前記細胞（例えば、細胞の集団）を、
１）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子；
２）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
３）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子；
４）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の１つ以上のｇＲＮＡ分子をコードする核酸及びＣａｓ９分子をコードする核酸；
５）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸；
６）上記１）〜４）のいずれか及び鋳型核酸をコードする配列を含む核酸；
７）上記［２３］〜［２８］のいずれかに記載の組成物；又は
８）上記［３０］に記載のベクター
と接触させる（例えば、それに導入する）ステップを含む方法。
［３２］
前記細胞は、動物細胞、例えば哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり；任意選択で、前記細胞は、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、上記［３１］に記載の方法。
［３３］
前記細胞は、ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣである、上記［３１］又は［３２］に記載の方法。
［３４］
前記細胞は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化された細胞の集団を含む組成物中に配置される、上記［３１］〜［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５］
前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されている、上記［３１］〜［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６］
前記細胞は、前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、上記［３１］〜［３５］のいずれかに記載の方法。
［３７］
ａ）前記改変は、前記１つ以上のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルをもたらし；及び／又は
ｂ）前記改変は、前記ＨＢＧ１プロモーター領域において前記１つ以上のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、前記ＨＢＧ２プロモーター領域において前記１つ以上のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間において、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失をもたらし、任意選択で、前記欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない、上記［３１］〜［３６］のいずれかに記載の方法。
［３８］
（ａ）細胞の集団であって、前記集団の少なくとも約１５％、例えば少なくとも約１７％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％、例えば少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約５５％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約７５％は、改変されている、例えばインデルを含む、細胞の集団をもたらし、任意選択で、前記インデルは、表７−２に挙げられるインデルから選択され、任意選択で、前記集団の前記細胞は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まず；
（ｂ）前記改変は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（例えば、細胞の集団）をもたらし、前記分化細胞は、例えば、非改変細胞（例えば、細胞の集団）に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し；
（ｃ）前記改変は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有する細胞の集団をもたらし、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高い割合）を有し；及び／又は
（ｄ）前記改変は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有する細胞（例えば、細胞の集団）をもたらし、前記分化細胞は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、上記［３１］〜［３７］のいずれかに記載の方法。
［３９］
上記［３１］〜［３８］のいずれかに記載の方法によって改変された細胞又は上記［３１］〜［３８］のいずれかに記載の方法によって得ることが可能な細胞。
［４０］
表７−２に記載されるインデルを含む細胞であって、任意選択で、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まない細胞。
［４１］
上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子、又は上記［２３］〜［２８］のいずれかに記載の組成物、上記［２９］に記載の核酸、又は上記［３０］に記載のベクターを含む細胞。
［４２］
分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの細胞に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し、任意選択で、前記分化細胞（例えば、赤血球系統の細胞、例えば赤血球細胞）は、例えば、ｇＲＮＡ分子を含むように修飾されていない同じタイプの分化細胞に対して少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、上記［３９］〜［４１］のいずれかに記載の細胞。
［４３］
幹細胞増殖剤と接触されている、上記［３９］〜［４２］のいずれかに記載の細胞。
［４４］
前記幹細胞増殖剤は、
ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール）との組み合わせ
である、上記［４３］に記載の細胞。
［４５］
細胞、例えば上記［３９］〜［４４］のいずれかに記載の細胞であって、
ａ）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列における又はその近傍におけるインデル；及び／又は
ｂ）前記ＨＢＧ１プロモーター領域において上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、前記ＨＢＧ２プロモーター領域において上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間における、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失
を含み、任意選択で、前記欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない、細胞、例えば上記［３９］〜［４４］のいずれかに記載の細胞。
［４６］
動物細胞、例えば哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり；任意選択で、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、上記［３９］〜［４５］のいずれかに記載の細胞。
［４７］
ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣである、上記［３９］〜［４６］のいずれかに記載の細胞。
［４８］
前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されている、上記［３９］〜［４７］のいずれかに記載の細胞。
［４９］
前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、上記［３９］〜［４８］のいずれかに記載の細胞。
［５０］
上記［３９］〜［４９］のいずれかに記載の細胞を含む細胞の集団であって、任意選択で、前記集団の前記細胞の少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、例えば少なくとも約７０％、例えば少なくとも約８０％、例えば少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％）は、上記［３９］〜［４９］のいずれかに記載の細胞である、細胞の集団。
［５１］
分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、同じタイプの修飾されていない細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約１７％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高い割合）を有し；任意選択で、前記分化細胞の集団の前記Ｆ細胞は、１細胞当たり平均で少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生する、上記［５０］に記載の細胞の集団。
［５２］
１）少なくとも１ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ；
２）少なくとも２ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ；
３）少なくとも３ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ；
４）少なくとも４ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ；又は
５）２ｅ６〜１０ｅ６のＣＤ３４＋細胞／前記細胞が投与される前記患者の体重ｋｇ
を含む、上記［５０］又は［５１］に記載の細胞の集団。
［５３］
前記集団の前記細胞の少なくとも約４０％、例えば少なくとも約５０％、（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％）は、ＣＤ３４＋細胞であり、任意選択で、前記集団の前記細胞の少なくとも約１０％、例えば少なくとも約１５％、例えば少なくとも約２０％、例えば少なくとも約３０％は、ＣＤ３４＋ＣＤ９０＋細胞である、上記［５０］〜［５２］のいずれかに記載の細胞の集団。
［５４］
臍帯血、末梢血（例えば、動員末梢血）又は骨髄に由来し、例えば骨髄に由来する、上記［５０］〜［５３］のいずれかに記載の細胞の集団。
［５５］
哺乳類細胞、例えばヒト細胞を含み、例えばそれからなり、任意選択で、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、上記［５０］〜［５４］のいずれかに記載の細胞の集団。
［５６］
（ｉ）前記細胞の集団が投与される患者に対して自己由来であるか、又は（ｉｉ）前記細胞の集団が投与される患者に対して同種異系由来である、上記［５０］〜［５５］のいずれかに記載の細胞の集団。
［５７］
細胞の集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、例えば上記［５０］〜［５６］のいずれかに記載の細胞の集団であって、表７−２に記載されるとおりのインデルパターンを含み、任意選択で、表７−２に記載される前記インデルパターンの前記インデルは、前記集団の前記細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％において検出可能である、細胞の集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、例えば上記［５０］〜［５６］のいずれかに記載の細胞の集団。
［５８］
上記［３９］〜［５７］のいずれかに記載の細胞又は細胞の集団を含む組成物であって、任意選択で、薬学的に許容可能な媒体、例えば凍結保存に好適な薬学的に許容可能な媒体を含む組成物。
［５９］
異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、上記［３９］〜［５７］のいずれかに記載の細胞若しくは細胞の集団又は上記［５８］に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
［６０］
哺乳類における胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、上記［３９］〜［５７］のいずれかに記載の細胞若しくは細胞の集団又は上記［５８］に記載の組成物を患者に投与するステップを含む方法。
［６１］
前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミア又は鎌状赤血球病である、上記［６０］に記載の方法。
［６２］
細胞（例えば、細胞の集団）を調製する方法であって、
（ａ）細胞（例えば、細胞の集団）（例えば、ＨＳＰＣ（例えば、ＨＳＰＣの集団））を提供するステップ；
（ｂ）幹細胞増殖剤を含む細胞培養培地中において前記細胞（例えば、前記細胞の集団）をエキソビボで培養するステップ；及び
（ｃ）上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子、上記［１］〜［２２］のいずれかに記載の第１のｇＲＮＡ分子をコードする核酸分子、上記［２３］〜［２８］のいずれかに記載の組成物、上記［２９］に記載の核酸又は上記［３０］に記載のベクターを前記細胞に導入するステップ
を含む方法。
［６３］
ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞（例えば、分化細胞の集団）、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球系統の細胞の集団）、例えば赤血球細胞（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、例えば、ステップ（ｃ）に供されていない同じ細胞に対して増加した胎児ヘモグロビンを産生する、上記［６２］に記載の方法。
［６４］
前記幹細胞増殖剤は、
ａ）（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミン；
ｂ）メチル４−（３−ピペリジン−１−イルプロピルアミノ）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−７−カルボキシレート；
ｃ）４−（２−（２−（ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−９−イソプロピル−９Ｈ−プリン−６−イルアミノ）エチル）フェノール；
ｄ）（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オール；又は
ｅ）これらの組み合わせ（例えば、（１ｒ，４ｒ）−Ｎ１−（２−ベンジル−７−（２−メチル−２Ｈ−テトラゾール−５−イル）−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−４−イル）シクロヘキサン−１，４−ジアミンと、（Ｓ）−２−（６−（２−（ｌＨ−インドール−３−イル）エチルアミノ）−２−（５−フルオロピリジン−３−イル）−９Ｈ−プリン−９−イル）プロパン−ｌ−オールとの組み合わせ）
である、上記［６２］又は［６３］に記載の方法。
［６５］
前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）を含み、任意選択で、前記細胞培養培地は、ヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含み；任意選択で、前記細胞培養培地は、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）及び存在する場合にはヒトＩＬ−６をそれぞれ約１０ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の濃度、任意選択でそれぞれ約５０ｎｇ／ｍＬの濃度、例えば５０ｎｇ／ｍＬの濃度で含む、上記［６２］〜［６４］のいずれかに記載の方法。
［６６］
前記細胞培養培地は、幹細胞増殖剤を約１ｎＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度、任意選択で約１μＭ〜約１００ｎＭの範囲の濃度、任意選択で約５００ｎＭ〜約７５０ｎＭの範囲の濃度、任意選択で約５００ｎＭの濃度、例えば５００ｎＭの濃度又は約７５０ｎＭの濃度、例えば７５０ｎＭの濃度で含む、上記［６２］〜［６５］のいずれかに記載の方法。
［６７］
ステップ（ｂ）の前記培養は、ステップ（ｃ）の前記導入前の培養期間を含み、任意選択で、ステップ（ｃ）の前記導入前の前記培養期間は、少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約１２日の期間であり、例えば約１日〜約６日の期間であり、例えば約１日〜約３日の期間であり、例えば約１日〜約２日の期間であり、例えば約２日の期間である、上記［６２］〜［６６］のいずれかに記載の方法。
［６８］
ステップ（ｂ）の前記培養は、ステップ（ｃ）の前記導入後の培養期間を含み、任意選択で、ステップ（ｃ）の前記導入後の前記培養期間は、少なくとも１２時間であり、例えば約１日〜約１２日の期間であり、例えば約１日〜約６日の期間であり、例えば約２日〜約４日の期間であり、例えば約２日の期間であり、又は約３日の期間であり、又は約４日の期間である、上記［６２］〜［６７］のいずれかに記載の方法。
［６９］
前記細胞の集団は、少なくとも３倍、例えば少なくとも４倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍だけエキソビボで増殖される、上記［６２］〜［６８］のいずれかに記載の方法。
［７０］
ステップ（ｃ）の前記導入は、エレクトロポレーションを含む、上記［６２］〜［６９］のいずれかに記載の方法。
［７１］
ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、ヒト細胞（例えば、ヒト細胞の集団）である、上記［６２］〜［７０］のいずれかに記載の方法。
［７２］
ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離される、上記［７１］に記載の方法。
［７３］
（ｉ）ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄から単離され、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の骨髄から単離され、任意選択で、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病又はサラセミアであり、任意選択で、前記サラセミアは、βサラセミアであり；又は
（ｉｉ）ステップ（ａ）で提供される前記細胞（例えば、細胞の集団）は、末梢血から単離され、例えば異常ヘモグロビン症に罹患している患者の末梢血から単離され、任意選択で、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病又はサラセミアであり、任意選択で、前記サラセミアは、βサラセミアであり；任意選択で、前記末梢血は、動員末梢血であり、任意選択で、前記動員末梢血は、Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ、Ｇ−ＣＳＦ又はこれらの組み合わせを用いて動員される、上記［７２］に記載の方法。
［７４］
ステップ（ａ）で提供される前記細胞の集団は、ＣＤ３４＋細胞に関して富化される、上記［６２］〜［７３］のいずれかに記載の方法。
［７５］
ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、凍結保存される、上記［６２］〜［７４］のいずれかに記載の方法。
［７６］
ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、
ａ）前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列における又はその近傍におけるインデル；及び／又は
ｂ）前記ＨＢＧ１プロモーター領域において前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列と、前記ＨＢＧ２プロモーター領域において前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的（例えば、前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに少なくとも９０％相補的、例えば前記ｇＲＮＡ標的化ドメインに完全に相補的）な配列との間における、配列を含む、例えば実質的に全ての前記配列を含む欠失
を含み、任意選択で、前記インデル、例えば欠失は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドを含まない、上記［６２］〜［７５］のいずれかに記載の方法。
［７７］
（ａ）ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞の集団の前記細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％は、前記第１のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを含み、任意選択で、前記インデルは、表７−２に挙げられるインデルから選択され、任意選択で、前記集団の細胞は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まず；
（ｂ）ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、非改変細胞（例えば、細胞の集団）に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し；
（ｃ）ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞の集団は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高い割合）を有し；
（ｄ）ステップ（ｃ）の前記導入後、前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生し；
（ｅ）ステップ（ｃ）の前記導入後、オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず、例えば、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部に形成されず；及び／又は
（ｆ）ステップ（ｃ）の前記導入後、例えば、次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデル、例えば前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲットインデルは、前記細胞の集団の前記細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超において検出されない、上記［６２］〜［７６］のいずれかに記載の方法。
［７８］
上記［６２］〜［７７］のいずれかに記載の方法によって得ることが可能な細胞（例えば、細胞の集団）。
［７９］
細胞、例えば改変された細胞、例えば上記［７８］に記載の細胞であって、
（ａ）前記細胞の集団の前記細胞の少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％は、上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを含み、任意選択で、前記インデルは、表７−２に挙げられるインデルから選択され、任意選択で、前記集団の細胞は、５，２５０，０９２〜５，２４９，８３３、−鎖（ｈｇ３８）間に配置されたヌクレオチドの欠失を含まず；
（ｂ）前記細胞（例えば、細胞の集団）は、赤血球系統の分化細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞は、例えば、非改変細胞（例えば、細胞の集団）に対して胎児ヘモグロビンの増加したレベルを呈し；
（ｃ）前記細胞の集団は、分化細胞の集団、例えば赤血球系統の細胞の集団（例えば、赤血球細胞の集団）への分化能を有し、前記分化細胞の集団は、例えば、非改変細胞の集団に対してＦ細胞の増加した割合（例えば、Ｆ細胞の少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％又は少なくとも約４０％高い割合）を有し；
（ｄ）前記細胞（例えば、細胞の集団）は、分化細胞、例えば赤血球系統の細胞（例えば、赤血球細胞）への分化能を有し、前記分化細胞（例えば、分化細胞の集団）は、１細胞当たり少なくとも約６ピコグラム（例えば、少なくとも約７ピコグラム、少なくとも約８ピコグラム、少なくとも約９ピコグラム、少なくとも約１０ピコグラム、又は約８〜約９ピコグラム、又は約９〜約１０ピコグラム）の胎児ヘモグロビンを産生し；
（ｅ）オフターゲットインデルは、前記細胞において形成されず、例えば、例えば次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデルは、前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部に形成されず；
（ｆ）例えば、次世代シーケンシング及び／又はヌクレオチド挿入アッセイによって検出可能なとおりのオフターゲットインデル、例えば前記ＨＢＧ１及び／又はＨＢＧ２プロモーター領域の外部のオフターゲットインデルは、前記細胞の集団の前記細胞の約５％超、例えば約１％超、例えば約０．１％超、例えば約０．０１％超において検出されず；及び／又は
（ｇ）前記細胞又はその子孫は、任意選択で、上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを検出することによって検出されるとき、移植後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超において、それを移植される患者で検出可能であり、任意選択で、前記インデルは、表７−２に挙げられるインデルから選択される、細胞、例えば改変された細胞、例えば上記［７８］に記載の細胞。
［８０］
動物細胞、例えば哺乳類細胞、霊長類細胞又はヒト細胞であり、例えばヒト細胞であり；任意選択で、異常ヘモグロビン症、例えば鎌状赤血球病又はサラセミア、例えばβ−サラセミアに罹患している患者から得られる、上記［７８］又は［７９］に記載の細胞。
［８１］
ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＨＳＰＣ、任意選択でＣＤ３４＋ＣＤ９０＋ＨＳＰＣである、上記［７８］〜［８０］のいずれかに記載の細胞。
［８２］
前記細胞（例えば、細胞の集団）は、骨髄、末梢血（例えば、動員末梢血）又は臍帯血から単離されている、上記［７８］〜［８１］のいずれかに記載の細胞。
［８３］
前記細胞を投与される患者にとって自己由来又は同種異系由来である、上記［７８］〜［８２］のいずれかに記載の細胞。
［８４］
異常ヘモグロビン症を治療する方法であって、上記［３９］〜［５７］又は［７８］〜［８３］のいずれかに記載の細胞又は細胞の集団を含む組成物をヒト患者に投与するステップを含む方法。
［８５］
ヒト患者の胎児ヘモグロビン発現を増加させる方法であって、上記［３９］〜［５７］又は［７８］〜［８３］のいずれかに記載の細胞又は細胞の集団を含む組成物を前記ヒト患者に投与するステップを含む方法。
［８６］
前記異常ヘモグロビン症は、β−サラセミア又は鎌状赤血球病である、上記［８４］に記載の方法。
［８７］
前記ヒト患者は、前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、上記［３９］〜［５７］又は［７８］〜［８３］のいずれかに記載の細胞、例えば前記ヒト患者の体重１ｋｇ当たり少なくとも約２ｅ６個の、上記［３９］〜［５７］又は［７８］〜［８３］のいずれかに記載のＣＤ３４＋細胞を含む組成物が投与される、上記［８４］〜［８６］のいずれかに記載の方法。
［８８］
前記細胞若しくは細胞の集団又はその子孫は、任意選択で、上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子の前記標的化ドメインに相補的なゲノムＤＮＡ配列に又はその近傍にインデルを検出することによって検出されるとき、投与後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超において、前記ヒト患者で検出可能であり、任意選択で、前記インデルは、表７−２に挙げられるインデルから選択され；任意選択で、投与後の１６週間超、２０週間超又は２４週間超における参照細胞集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞）での前記インデルの検出のレベルは、投与の直前の前記細胞の集団における前記インデルの検出のレベルに対して５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下だけ低下される、上記［８４］〜［８７］のいずれかに記載の方法。
［８９］
薬剤として使用するための、上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、上記［２３］〜［２８］又は［５８］のいずれかに記載の組成物、上記［２９］に記載の核酸、上記［３０］に記載のベクター、上記［３９］〜［５７］又は［７８］〜［８３］のいずれかに記載の細胞又は細胞の集団。
［９０］
薬剤の製造に使用するための、上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、上記［２３］〜［２８］又は［５８］のいずれかに記載の組成物、上記［２９］に記載の核酸、上記［３０］に記載のベクター、上記［３９］〜［５７］又は［７８］〜［８３］のいずれかに記載の細胞又は細胞の集団。
［９１］
疾患の治療に使用するための、上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、上記［２３］〜［２８］又は［５８］のいずれかに記載の組成物、上記［２９］に記載の核酸、上記［３０］に記載のベクター、上記［３９］〜［５７］又は［７８］〜［８３］のいずれかに記載の細胞又は細胞の集団。
［９２］
疾患の治療に使用するための、上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、上記［２３］〜［２８］又は［５８］のいずれかに記載の組成物、上記［２９］に記載の核酸、上記［３０］に記載のベクター、上記［３９］〜［５７］又は［７８］〜［８３］のいずれかに記載の細胞又は細胞の集団であって、前記疾患は、異常ヘモグロビン症であり、任意選択で、前記異常ヘモグロビン症は、鎌状赤血球病又はサラセミア（例えば、β−サラセミア）である、上記［１］〜［２２］のいずれかに記載のｇＲＮＡ分子、上記［２３］〜［２８］又は［５８］のいずれかに記載の組成物、上記［２９］に記載の核酸、上記［３０］に記載のベクター、上記［３９］〜［５７］又は［７８］〜［８３］のいずれかに記載の細胞又は細胞の集団。