【手続補正書】
【提出日】令和2年12月11日(2020.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
様々な異なる細胞を含むサンプルから、複数の異なる細胞表面マーカーによって区別された細胞のスパースサブセットを単離するための、浮力による分離方法であって、
ａ）サンプルを容器に入れる工程、
ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第１の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、
ｃ）第１抗体と第１細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第１抗体を第１細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、
ｄ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第１の柔軟なシェルマイクロバブルおよび第１の柔軟なシェルマイクロバブルに結合した細胞の第１サブセットを分離することを可能にする工程、
ｅ）サンプルにおける細胞の第１サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程、
ｆ）単離された細胞の第１セットが浮揚しなくなるように、第１の柔軟なシェルマイクロバブルを破壊する工程、
ｇ）気体を包囲する内部気泡壁と、細胞の第１サブセットに含まれる細胞の第２サブセットの第２細胞表面マーカーに結合することができる第２抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第２の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、
ｈ）第２抗体と第２細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第２抗体を少なくとも一つの第２細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、
ｉ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第２の柔軟なシェルマイクロバブルおよび第２の柔軟なシェルマイクロバブルに結合した細胞の第２サブセットを分離することを可能にする工程、および
ｊ）細胞の第１サブセットにおける細胞の第２サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程
を含む、浮力による分離方法。
【請求項２】
第１および第２の細胞表面マーカーは、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ３およびＣＤ２８のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｋ）単離された細胞の第２サブセットが浮揚しなくなるように、第２の柔軟なシェルマイクロバブルを破壊する工程、および
ｌ）細胞の第３サブセットのために、標的されていなかった標的細胞表面マーカーに結合することができる使用されていなかった抗体に共役した追加の柔軟なシェルマイクロバブルを利用することにより、工程ｇ）から工程ｋ）までを繰り返す工程
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞表面マーカーは、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋であり、細胞のスパースサブセットは、ナイーブＴ細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
細胞のｎ番目のサブセットのために、標的されていなかった標的細胞表面マーカーに結合することができる使用されていなかった抗体に共役した追加の柔軟なシェルマイクロバブルを利用することにより、工程Ｉ）を繰り返すことをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
容器の底部から廃棄物を除去することを含む、容器から廃棄物を除去する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
望ましくない細胞をそれぞれのマイクロバブルと結合させ、容器の上部に浮揚させ、容器の上部から、これらのそれぞれのマイクロバブルに結合した望ましくない細胞を除去することによって、望ましくない細胞としての廃棄物を容器から除去することにより、ネガティブ選択で容器から廃棄物を除去する工程をさらに含み、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
容器内でプランジャを移動させることを含む、容器から廃棄物を除去する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
容器内でプランジャを移動させることを含む、容器から廃棄物を除去する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
柔軟なシェルマイクロバブルが受ける圧力を増加させることを含む、第１、第２およびその後の柔軟なシェルマイクロバブルを破壊する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
容器内でプランジャを移動させることを含む、マイクロバブルが受ける圧力を増加させることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞のスパースサブセットは、Ｔ細胞を含んでおり、
ｍ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備えるリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルを、細胞のスパースサブセットに加える工程、
ｏ）Ｔ細胞のスパースサブセットを活性化および増殖するために、十分な時間スパンにわたってＴ細胞およびリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルをインキュベートする工程、
ｐ）組換えＭＨＣに結合したユニークなペプチド、および抗ＣＤ２８または組換えＣＤ８０やＣＤ８６のような補助刺激分子と組み合わせることで、特異的Ｔ細胞の活性化を達成する工程、および
ｑ）抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８または組み換えＣＤ８０やＣＤ８６のような補助刺激分子と組み合わせることで、非特異的Ｔ細胞活性化を達成する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプルは、ヒトもしくは動物の血液、他のヒトもしくは動物の体液、または人工緩衝液からのＴ細胞、Ｂ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮細胞、幹細胞、および癌細胞のうちの１つまたはそれらの組合せのような様々な異なる細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
様々な異なる細胞を含むサンプルから細胞のスパースサブセットを単離することは、ポジティブ選択、ネガティブ選択、またはその両方の逐次的組合せによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法を実行するためのシステムであって、
内部容器空間を画定する内壁を有する容器（３）、
内壁と密封的に接続され、内壁に対して可動なプランジャ（５）、
内部空間を周囲空間に接続させ、気体、液体および固体材料を内部空間に送り込んだり内部空間から送り出したりすることを可能にする、開閉可能な弁（８、９）を備えたポート、および
内部容器空間における柔軟なマイクロバブル（２）
を含み、
前記マイクロバブル（２）は、気体を包囲する内部気泡壁と、液体サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える、
システム。
【請求項１６】
プランジャ（５）は、凹状、凸状または平坦状のうちの１つの形状を有する前面を備える、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
プランジャ（５）は、凸状、凸状または平坦状を想定するような形状に変更するように適した調整可能な前面を有し、
システムは、システムの使用中に前面の形状を変更するための調整機構をさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
容器（３）は、滅菌状態である、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
容器（３）は、サンプルの細胞（４）および生物学的因子を生存可能な状態に維持するように適した滅菌溶液を含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
プランジャ（５）を動かすように構成された機械的プランジングシステムをさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２１】
プランジングシステムは、自動化またはコンピュータ化されている、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２２】
ａ）気体を包囲する内部気泡壁と、単離されたＴ細胞上で細胞接触依存性のジュクスタクリンシグナル伝達を達成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、および
ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、
を含む、単離されたＴ細胞を活性化および増殖するための方法。
【請求項２３】
リガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に共役したマイクロバブルであり、
単離されたＴ細胞の活性化および増殖は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ）細胞療法のような養子細胞移入のためのインビトロＴ細胞調製のために用いられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
リガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルは、ペプチド／ＭＨＣおよび抗ＣＤ２８に共役したマイクロバブルであり、
単離されたＴ細胞の活性化および増殖は、養子細胞移入のためのインビトロＴ細胞調製のために用いられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
単離された細胞の活性化または阻害化のために、十分な時間スパンにわたって、前記細胞およびリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルをインキュベートする工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明の第一態様によれば、様々な異なる細胞を含むサンプルから、複数の異なる細胞表面マーカーによって区別された細胞のスパースサブセットを単離するための、浮力による分離方法であって、ａ）サンプルを容器に入れる工程、ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、液体サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第１の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、ｃ）第１抗体と第１細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第１抗体を第１細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、ｄ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第１の柔軟なシェルマイクロバブルおよび第１の柔軟なシェルマイクロバブルに結合した細胞の第１サブセットを分離することを可能にする工程、ｅ）サンプルにおける細胞の第１サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程、ｆ）単離された細胞の第１セットが浮揚しなくなるように、第１の柔軟なシェルマイクロバブルを破壊する工程、ｇ）気体を包囲する内部気泡壁と、細胞の第１サブセットに含まれる細胞の第２サブセットの第２細胞表面マーカーに結合することができる第２抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第２の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、ｈ）第２抗体と第２細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第２抗体を少なくとも一つの第２細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、ｉ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第２の柔軟なシェルマイクロバブルおよび第２の柔軟なシェルマイクロバブルに結合した細胞の第２サブセットを分離することを可能にする工程、およびｊ）細胞の第１サブセットにおける細胞の第２サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程を含む、浮力による分離方法が作成される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明の第三態様によれば、ａ）気体を包囲する内部気泡壁と、単離されたＴ細胞上で細胞接触依存性のジュクスタクリンシグナル伝達を達成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、およびｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、を含む、単離されたＴ細胞を活性化および増殖するための方法が作成される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
さらなる実施形態は、以下の段落に示される。
１．様々な異なる細胞を含むサンプルから、複数の異なる細胞表面マーカーによって区別された細胞のスパースサブセットを単離するための、浮力による分離方法であって、
ａ）サンプルを容器に入れる工程、
ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、サンプルに含まれる細胞の第１サブセットの第１細胞表面マーカーに結合することができる第１抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第１の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、
ｃ）第１抗体と第１細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第１抗体を第１細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、
ｄ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第１の柔軟なシェルマイクロバブルおよび第１の柔軟なシェルマイクロバブルに結合した細胞の第１サブセットを分離することを可能にする工程、
ｅ）サンプルにおける細胞の第１サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程、
ｆ）単離された細胞の第１セットが浮揚しなくなるように、第１の柔軟なシェルマイクロバブルを破壊する工程、
ｇ）気体を包囲する内部気泡壁と、細胞の第１サブセットに含まれる細胞の第２サブセットの第２細胞表面マーカーに結合することができる第２抗体に共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備える第２の柔軟なシェルマイクロバブルを加える工程、
ｈ）第２抗体と第２細胞表面マーカーとの間の相互作用を可能にして、第２抗体を少なくとも一つの第２細胞表面マーカーに結合させるように、十分な時間スパンにわたってインキュベートする工程、
ｉ）サンプルの残り部分から、浮揚により、第２の柔軟なシェルマイクロバブルおよび第２の柔軟なシェルマイクロバブルに結合した細胞の第２サブセットを分離することを可能にする工程、および
ｊ）細胞の第１サブセットにおける細胞の第２サブセット以外の細胞を含む、廃棄物を容器から除去する工程
を含む、浮力による分離方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
３．ｋ）単離された細胞の第２サブセットが浮揚しなくなるように、第２の柔軟なシェルマイクロバブルを破壊する工程、および
ｌ）細胞の第３サブセットのために、標的されていなかった標的細胞表面マーカーに結合することができる使用されていなかった抗体に共役した追加の柔軟なシェルマイクロバブルを利用することにより、工程ｇ）から工程ｋ）までを繰り返す工程
をさらに含む、実施形態１による方法。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
４．細胞表面マーカーは、ＣＤ８＋、ＣＤ６２Ｌ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋であり、細胞のスパースサブセットは、ナイーブＴ細胞である、実施形態３による方法。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８５】
９．柔軟なシェルマイクロバブルが受ける圧力を増加させることを含む、第１、第２およびその後の柔軟なシェルマイクロバブルを破壊する工程をさらに含む、前記の実施形態のいずれかの方法。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８７】
１１．  細胞のスパースサブセットは、Ｔ細胞を含んでおり、
ｍ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟なシェルを備えるリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルを、細胞のスパースサブセットに加える工程、
ｏ）Ｔ細胞のスパースサブセットを活性化および増殖するために、十分な時間スパンにわたってＴ細胞およびリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルをインキュベートする工程、
ｐ）組換えＭＨＣに結合したユニークなペプチド、および抗ＣＤ２８または組換えＣＤ８０やＣＤ８６のような補助刺激分子と組合せることで、特異的Ｔ細胞の活性化を達成する工程、および
ｑ）抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８または組み換えＣＤ８０やＣＤ８６のような補助刺激分子と組合せることで、非特異的Ｔ細胞活性化を達成する工程
を含む、前記の実施形態のいずれかの方法。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
２１．ａ）気体を包囲する内部気泡壁と、単離されたＴ細胞上で細胞接触依存性のジュクスタクリンシグナル伝達を達成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程、および
ｂ）気体を包囲する内部気泡壁と、Ｔ細胞と免疫学的シナプスを形成することができるリガンドに共役した外部気泡壁とを有する柔軟な脂質シェルを備えるリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルを、単離されたＴ細胞に加える工程
を含む、単離されたＴ細胞を活性化および増殖するための方法。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
２２．リガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８に共役したマイクロバブルであり、
単離されたＴ細胞の活性化および増殖は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ）細胞療法のような養子細胞移入のためのインビトロＴ細胞調製のために用いられる、実施形態２１の方法。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
２３．リガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルは、ペプチド／ＭＨＣおよび抗ＣＤ２８に共役したマイクロバブルであり、
単離されたＴ細胞の活性化および増殖は、養子細胞移入のためのインビトロＴ細胞調製のために用いられる、実施形態２１の方法。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
２４．単離された細胞の活性化または阻害化のために、十分な時間スパンにわたって、前記細胞およびリガンド提示柔軟なシェルマイクロバブルをインキュベートする工程をさらに含む、実施形態２１〜２３のうちの１つによる方法。