【手続補正書】
【提出日】令和3年11月9日(2021.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からエキソソームを製造する方法であって：
（ａ）ＭＳＣを機能的に閉鎖されたバイオリアクター中で、ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含む培地中で７５〜９５％コンフルエンシーまで培養すること；
（ｂ）細胞を、さらにＰＬＴを本質的に含まない培地中で培養すること；
（ｃ）前記バイオリアクターからの馴化培地画分を採集すること；及び
（ｄ）前記馴化培地画分からエキソソームを単離すること
を含む、方法。
【請求項２】
各馴化培地画分が、採集後に−８０℃で保存される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記馴化培地画分を解凍し、工程（ｄ）の前にプールする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＳＣが、骨髄由来ＭＳＣとしてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＳＣが脂肪由来ＭＳＣとしてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）の前に、前記バイオリアクターに少なくとも１×１０７個のＭＳＣを播種することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＳＣが、約４００〜５００細胞／ｃｍ２の密度で播種される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記閉鎖されたバイオリアクターが中空繊維バイオリアクターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記中空繊維バイオリアクターが、テルモ細胞増殖システムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）の培地において、ＰＬＴが５％の濃度である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
新鮮な培地が、前記バイオリアクター中の前記ＭＳＣに連続的に添加される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、５％酸素で培養される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）の培養が５〜１０日間である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）の培養が、８日間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＳＣが８０〜９０％コンフルエンシーまで培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＳＣが８５〜９０％コンフルエンシーまで培養される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）の培養が２４〜７２時間である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）の培養が４８時間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）の培地がＰＬＴを含まない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＭＳＣが工程（ａ）と（ｂ）との間で洗浄される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＭＳＣが無血清の規定培地中で培養される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）〜（ｄ）が無血清条件下で行われる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記馴化培地画分が、密封バッグに採集される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記馴化培地画分が２４〜７２時間毎に採集される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記馴化培地画分が４０〜５０時間毎に採集される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記馴化培地画分が４８時間毎に採集される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記馴化培地画分が、それぞれ２００〜３００ｍＬの体積である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記馴化培地画分が１０〜１４日間採集される、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記馴化培地画分が１２日間採集される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも５つの馴化培地画分が採集される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ａ）〜（ｄ）が３週間未満で行われる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
各馴化培地画分が、９×１０１１〜５０×１０１１個のエキソソームを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）で、少なくとも１０×１０１２個のエキソソームが単離される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）で、少なくとも１５×１０１２個のエキソソームが単離される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
単離が、エキソソーム含有ペレットを得るためのプールされた画分の濾過及び限外遠心と前記エキソソーム含有ペレットを緩衝液中に再懸濁することを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
単離が、ポンプ及びヒートシールされた管を使用して、機能的に閉鎖された様式で行われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
濾過が、プールされた画分を０．２μｍフィルターに通すこととしてさらに定義される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
単離が、大きな細胞残屑を除去するための、濾過の前の遠心分離工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
単離が４℃で行われる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記緩衝液が、０．０９Ｍ塩化ナトリウム、０．２３Ｍグルコン酸ナトリウム、０．２７Ｍ酢酸ナトリウム三水和物、５ｍＭ塩化カリウム、及び３ｍＭ塩化マグネシウムを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記緩衝液のｐＨが７．４である、請求項３５又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記緩衝液がＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（登録商標）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記エキソソームに治療剤を搭載することをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療剤が、１つ以上のサイトカイン、化学療法剤、核酸、小分子、又はタンパク質を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸がＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＲＮＡがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
搭載が、前記エキソソームをエレクトロポレーションすることを含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
エレクトロポレーションが、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（登録商標）で実行される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が、工程（ｄ）とエレクトロポレーションとの間で、エキソソームを洗浄すること又は緩衝液を交換することを含まない、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
工程（ｄ）のエキソソームの数に対する搭載されたエキソソームの数が２０％を超えて減少しない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法によって産生されたエキソソームを含む、医薬組成物。
【請求項５３】
癌を治療するための、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
対象がヒトである、請求項５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
エレクトロポレーションされたエキソソームが、前記対象に直接注入される、請求項５３又は５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記対象が、少なくとも第２の抗癌療法を施されることをさらに含む、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記少なくとも第２の抗癌療法が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法を含む、請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の方法によって産生された有効量のＲＮＡ搭載エキソソームを細胞に投与することを含む、ＲＮＡを細胞に送達する方法。
【請求項５９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞が癌細胞又はＴ細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法によって産生された有効量のエキソソームを含有し、それを必要とする対象に投与することによって疾患又は障害を治療するための、医薬組成物。
【請求項６２】
前記エキソソームに、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが搭載されている、請求項６１に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記疾患又は障害が、癌、炎症性障害、又は免疫関連障害である、請求項６１又は６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
前記癌が肺癌である、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
前記エキソソームにＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡが搭載される、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
前記対象がヒトである、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６７】
経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、内視鏡的、経皮的、皮下、局所的、又は直接注射によって投与される、請求項６１〜６６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
静脈内に投与される、請求項６７に記載の医薬組成物。
【請求項６９】
前記対象が、少なくとも第２の療法を施されることをさらに含む、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７０】
前記少なくとも第２の療法が抗癌療法である、請求項６９に記載の医薬組成物。
【請求項７１】
前記抗癌療法が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法である、請求項７０に記載の医薬組成物。
【請求項７２】
治療有効量の請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法で作製されたＭＳＣ由来エキソソームを含有する、免疫介在性炎症性疾患に罹患している対象において該疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項７３】
前記免疫介在性炎症性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、及びクローン病からなる群より選択される、請求項７２記載の医薬組成物。
【請求項７４】
前記ＭＳＣが同種異系である、請求項７２又は７３に記載の医薬組成物。
【請求項７５】
全身的又は局所的に投与される、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７６】
直腸、鼻、頬、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変内、又は頭蓋内経路を介して、又は埋め込み型のリザーバーを介して投与される、請求項７２〜７５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７７】
少なくとも１つのさらなる治療剤と組み合わせて投与される、請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の医薬組成物。