【手続補正書】
【提出日】平成17年7月26日(2005.7.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、組換えＤＮＡ手法にて調製されたヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質、または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾または付加されたアミノ酸配列からなり、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法。
【請求項２】
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、以下の（ｃ）〜（ｇ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｇ）上記（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）記載のＤＮＡ断片の上流にさらにＳＤ配列を含んでなるＤＮＡ断片
【請求項３】
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、組換えＤＮＡ手法にて得られたヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する菌体から調製した粗酵素液を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法。 
【請求項４】
デオキシヌクレオシドが２’−デオキシヌクレオシドである、請求項１〜３項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項５】
粗酵素液が、無細胞抽出液である、請求項３項に記載の製造法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
このように、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼはデオキシヌクレオシドの酵素合成に有用な酵素であるものの、ラクトバシラス属に属する乳酸菌体由来の無細胞抽出液などを酵素源としてそのまま使用する従来法では以下のような問題点が指摘されていた。
（１）乳酸菌は一般に生育が悪く、大量の菌体を調製することが困難である。
（２）ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼは菌体内酵素であるため、乳酸菌を破砕する必要がある。しかし、乳酸菌の細胞壁は硬く、しかも菌体内でのヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの発現量も低く、結果としてヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの抽出効率は非常に低い。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記問題点を解決すべく、遺伝子工学的手法でヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼを大量に生産させ、これをデオキシヌクレオシドの合成に使用することにより上記問題を解決できるのではないかと考え、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの組換えＤＮＡ手法による生産を試みた。しかし、従来、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼ遺伝子に関する報告はなされておらず、試行錯誤を繰り返した結果、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝子のクローニングに成功し、この遺伝子を用いて発現させた特定のヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を用いることにより、上記従来法の欠点を克服し、効率的にデオキシヌクレオシドを合成できることを見出し、本発明を完成させた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
すなわち、本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、組換えＤＮＡ手法にて調製されたヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、（ａ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質、または（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、修飾または付加されたアミノ酸配列からなり、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に関するものである。     
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
また、本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、以下の（ｃ）〜（ｇ）に記載のいずれかのＤＮＡ断片の塩基配列によりコードされるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に関するものである。
（ｃ）配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる酵素タンパク質をコードするＤＮＡ断片、
（ｄ）配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｅ）配列番号２で示される塩基配列において、１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなるＤＮＡ断片、
（ｆ）上記（ｄ）に記載のＤＮＡ断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ断片、
（ｇ）上記（ｄ）、（ｅ）または（ｆ）記載のＤＮＡ断片の上流にさらにＳＤ配列を含んでなるＤＮＡ断片
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
さらに、本発明は、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩを用いて塩基受容体とデオキシ糖残基供与体とからデオキシヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩとして、組換えＤＮＡ手法にて得られたヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する菌体から調製した粗酵素液を使用することを特徴とする、デオキシヌクレオシドの製造法に関するものである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本発明においては、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を生産することができる限りにおいて、配列番号２で示される塩基配列中の１個もしくは複数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された遺伝子、またはそれらの遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする遺伝子も利用することができる。なお、ここでいうストリンジェントな条件下とは、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは塩化ナトリウム８．７６ｇ、クエン酸ナトリウム４．４１ｇを１リットルの水に溶かしたもの）、０．１％ｗ／ｖ Ｎ−ラウロイルザルコシン・ナトリウム塩、０．０２％ ｗ／ｖ ＳＤＳ、０．５％ ｗ／ｖブロッキング試薬を含む溶液を用い、６０℃で２０時間程度反応温度条件下でハイブリダイゼーション反応を行なうことを意味する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質を異種微生物内で大量生産させるために使用する発現制御シグナルとしては、人為的制御が可能で、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質の生産量を飛躍的に上昇させるような強力な転写開始並びに翻訳開始シグナルを用いることが望ましい。このような転写開始シグナルとしては、宿主として大腸菌を用いる場合には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター（Proc．Natl．Acad．Sci．USA.,80，21(1983）、Gene，20，231(1982））、ｔｒｃプロモーター(J．Biol．Chem．，260，3539(1985））などを、酵母を宿主とする場合にはグリセルアルデヒド-3-ホスフェート・デヒドロゲナーゼ（J．Biol．Chem．，254，2078(1980））や抑制性酸性ホスファターゼ(Nucl．Acids Res.，11，1657(1983））などの遺伝子の発現制シグナルを例示することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
得られた形質転換体は、当該微生物が増殖可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化したヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有するタンパク質の産生を誘導して菌体内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法に従って行えばよい。例えば、大腸菌を宿主として使用する場合、培地として２ｘＹＴ培地（Methods in Enzymology，100，20（1983））、ＬＢ培地、Ｍ９ＣＡ培地（Molecular Cloning、前述）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、２０〜４０℃の培養温度で必要により通気攪拌しながら培養することができる。また、ベクターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけるプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラスミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナマイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
培養中にヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質の産生を誘導する必要がある場合には、用いたプロモーターで常用されている方法で該遺伝子の発現を誘導する。例えば、ｌａｃプロモーターやｔａｃプロモーターを使用した場合には、培養中期に発現誘導剤であるイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド（以下、ＩＰＴＧと略称する）を適当量添加する。また、使用するプロモーターが構成的に転写活性を有する場合には、特に発現誘導剤を添加する必要はない。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
このようにして調製した培養物から膜分離あるいは遠心分離処理などにより菌体を回収する。
回収した菌体は、菌体それ自体をヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質として利用することも可能であるが、回収した菌体を適当な緩衝液に懸濁し、超音波処理、フレンチプレス処理などにより物理的に菌体を破砕するか、あるいはリゾチーム処理など酵素的に溶菌させ、菌体残さを遠心分離により除去して無細胞抽出液を調製し、この無細胞抽出液をヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質として利用する方が好適である。この無細胞抽出液内にはヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質が過剰に存在しているため、特に精製処理を施さなくとも酵素源として利用可能である。さらに、熱処理、硫安塩析処理、透析処理、エタノールなどの溶媒処理、各種クロマトグラフィー処理などの酵素精製に通常使用されている処理を単独で、または数種組み合わせて得られる粗精製物または精製物をヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質として利用してもかまわない。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
【発明の効果】
乳酸菌体から調製したものを酵素源としてデオキシヌクレオシドを合成する従来法の場合、菌体からのヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼの存在量が低いことに加え、抽出効率も悪いため目的とする酵素活性が極めて低く、大量の酵素量を必要とし、また基質濃度も高くできないため、結果としてデオキシヌクレオシドの合成効率が極めて低く、到底実用的な方法とはなり得ない。さらに、混在する他の酵素による副反応によりデオキシヌクレオシドの収率が低下してしまうという問題も内在していた。
しかしながら、本発明によれば、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を有する酵素タンパク質を効率的に生産でき、活性の高い酵素タンパク質を大量に取得することができるため、少量の酵素タンパク質量で充分であり、基質濃度も高くでき、短時間で効率よくデオキシヌクレオシド、特に２’−デオキシヌクレオシドを合成できるきわめて実用的な方法である。
また、後述実施例に示すように、無細胞抽出液などの粗精製の酵素タンパク質を用いても副反応はほとんど観察されず、従来法の問題点を克服した方法でもある。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、反応液１００μｌ中（５０ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、０．２ｍＭｄＡＴＰ、０．２ｍＭｄＧＴＰ、０．２ｍＭｄＣＴＰ、０．２ｍＭｄＴＴＰ、乳酸菌染色体ＤＮＡ  ０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２ｍＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ  ２．５ユニット）をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを用いて、熱変性（９４℃、３０秒）、アニーリング（４０℃、３０秒）、伸長反応（７２℃、３０秒）のステップを２８回繰り返すことにより行った。
サザンハイブリダイゼーション用のプローブは、上記ＰＣＲ条件でｄＮＴＰにＤＩＧ標識ＵＴＰを含む混合液を使用して作製した。乳酸菌染色体ＤＮＡは種々の制限酵素で分解し電気泳動後、常法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。この結果から、図１のような制限酵素地図が得られた。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
図１のとおり、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ｎｄｔ２  ｇｅｎｅ）は乳酸菌染色体ＤＮＡのＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩの３．２ｋｂ断片に存在することが判明した。そこで乳酸菌染色体のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物の２．３〜４．０ｋｂ断片を回収して、これをｐＵＣ１８のＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ消化物とライゲーションしたものを鋳型ＤＮＡとしてＰＣＲを行った。プライマーはプライマー（Ｂ）とシーケンス用プライマーＭ４（ＴａＫａＲａ）を使用し、先の条件で、９４℃・３０秒、４０℃・３０秒、７２℃・１２０秒のサイクルを３０回繰り返した。得られたＤＮＡ断片はＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後、クローニングベクターｐＨＳＧ３９８に組み込んだ。このプラスミドをｐ３９８−５ＳＨと命名した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
（３）形質転換体の培養と酵素の調製
上記の組換えベクターを保持する大腸菌形質転換体を、１００μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールまたはアンピシリンを含有する２ｘＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養した。４×ｌ０8個／ｍｌに達した時点で、培養液に終濃度０．０５ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で４時間振盪培養を続けた。培養終了後、遠心分離（９，０００×ｇ、１０分間）により培養菌体を回収し、１０ｍｌの緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．８）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕機にて処理して、さらに遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分間）により菌体残渣を除去した。このようにして得られた上清画分を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液におけるヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性を対照菌（ｐＨＳＧ３９８を保持する大腸菌ＪＭ１０９）と共に下記表に示す。なお、ヌクレオシド・デオキシリボシルトランスフェラーゼＩＩ活性は、５ｍＭのデオキシアデノシンとシトシン、またはチミジンとシトシンを基質にして測定した。反応液に無細胞抽出液を加えて反応を開始し、１分間煮沸することにより酵素を失活させた。３７℃におけるデオキシシチジンの生成量を高速液体クロマトグラフィーにより定量し、３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのデオキシシチジンを生成する活性を１単位（ユニット）とした。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
【表１】
2001046097.tif 000001
＊ 1 unit = 1μmole deoxycytidine-production from deoxyuridine/min at 37℃
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
【実施例２】
２’−デオキシシチジンの合成（２）
１ｍＭの２’−デオキシアデノシンと１ｍＭのシトシンを含む水溶液１ｍｌに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を２００倍希釈したものを６μ１添加（９ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で１２分反応させた。２’−デオキシシチジンの生成率を測定した結果、０．２ｍＭの２’−デオキシシチジン（対２’−デオキシアデノシン比２０％）が合成された。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
【実施例３】
２’−デオキシシチジンの合成（３）
１３３ｍＭの２’−デオキシウリジンと１３３ｍＭのシトシンを含む水溶液１．５Ｌに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．４５ｍ１添加（９ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で１８時間反応させた。２’−デオキシシチジンの生成率を測定した結果、７２ｍＭの２’−デオキシシチジン（対２’−デオキシウリジン比５４％）が合成されていることが確認された。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
【実施例４】
チミジンの合成
１００ｍＭの２’−デオキシウリジンと１００ｍＭのチミンを含む水溶液５ｍｌに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を２．８μ１添加（０．９ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で１８時間反応させた。チミジンの生成率を測定した結果、４８ｍＭのチミジン（対２’−デオキシウリジン比４８％）が合成された。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
【実施例５】
２’−デオキシアデノシンの合成
１００ｍＭの２’−デオキシウリジンと１００ｍＭのアデニンを含む水溶液５ｍＬに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．０５ｍｌ添加（１５ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で２０時間反応させた。２’−デオキシアデノシンの生成率を測定した結果、対２’−デオキシウリジン比７７％で２’−デオキシアデノシンが合成された。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
【実施例６】
２’−デオキシグアノシンの合成（１）
１００ｍＭの２’−デオキシウリジンと１００ｍＭのグアニンを含む水溶液５ｍＬに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．０５ｍｌ添加（１５ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で２０時間反応させた。２’−デオキシグアノシンの生成率を測定した結果、対２’−デオキシウリジン比３０％で２’−デオキシグアノシンが合成された。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
【実施例７】
２’−デオキシグアノシンの合成（２）
１０ｍＭの２’−デオキシアデノシンと１０ｍＭのグアニンを含む水溶液５ｍＬに、実施例１で調製された形質転換体ＪＭ１０９［ｐＴｒｃ−Ｔ２Ｆ４］由来の無細胞抽出液を０．００５ｍｌ添加（１５ｕｎｉｔ／Ｌ反応液）して、３７℃で２０時間反応させた。２’−デオキシグアノシンの生成率を測定した結果、対２’−デオキシアデノシン比３０％で２’−デオキシグアノシンが合成された。なお、反応液から２’−デオキシイノシンは検出されなかった。