【手続補正書】
【提出日】令和3年4月12日(2021.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析のために核酸を調製する方法であって、
（ａ）５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’プルーフリーディング活性を提供する１つまたは複数の酵素ならびに４つの標準ヌクレオチドタイプの作用により試料中の一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸を平滑末端とするステップであって、５’末端を有する一本鎖オーバーハングが、前記ポリメラーゼ活性による相補鎖の伸長のための鋳型として働き、３’末端を有する一本鎖オーバーハングが、前記プルーフリーディング活性により消化されて平滑末端化核酸を生じる、ステップと、
（ｂ）前記平滑末端化核酸を前記試料の他の成分から分離せずに、３’−５’プルーフリーディング機能のないポリメラーゼの作用により前記平滑末端化核酸の末端に尾部を付加するステップであって、これにより平滑末端化核酸の３’末端へのヌクレオチドの非鋳型特異的付加が実施され、Ａが優先的に、次にＧが優先的に、次にＣまたはＴが付加される、ステップと；
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記核酸を３’末端に単一ヌクレオチドＴオーバーハングを有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターおよび３’末端に単一ヌクレオチドＣオーバーハングを有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターにアニールするステップと；
（ｄ）前記核酸を前記アダプターにライゲーションするステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の後、前記１つまたは複数の酵素を変性させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料を、前記１つまたは複数の酵素、前記４つの標準ヌクレオチドタイプおよび３’−５’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼと接触させるステップをさらに含み、必要に応じて、前記試料を、前記１つまたは複数の酵素、前記４つの標準ヌクレオチドタイプおよび３’−５’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼと一緒に接触させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）よりも高い温度で実施され、必要に応じて、ステップ（ａ）が、周囲温度で実施され、ステップ（ｂ）が、６０℃を超える温度で実施される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）前記１つまたは複数の酵素が、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼであり、必要に応じて、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’プルーフリーディング活性を有する前記ポリメラーゼが、Ｔ４ポリメラーゼまたはクレノウ大断片であり、および／または
（ｉｉ）３’−５’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼが、熱安定性ポリメラーゼであり、前記方法が、ステップ（ａ）の後、前記試料の温度を上げるステップであって、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’プルーフリーディング活性を有する前記ポリメラーゼを不活化するステップをさらに含む、
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｅ）前記アダプターにライゲーションされた前記核酸を増幅するステップと；（ｆ）前記核酸を分析するステップとをさらに含み、必要に応じて、
（ｉ）ステップ（ａ）〜（ｅ）が、単一チューブで実施されるか、
（ｉｉ）前記試料中の利用可能な二本鎖核酸の少なくとも７０％が分析されるか、
（ｉｉｉ）ステップ（ｆ）が、前記アダプターにライゲーションされている前記核酸をシーケンシングすることを含み、必要に応じて、前記シーケンシングすることで、ステップ（ｃ）または（ｄ）においてオーバーハングを形成したヌクレオチドをシーケンシングするか、
（ｉｖ）前記分析するステップが、体細胞または生殖系列バリアントを検出するか、
（ｖ）前記分析するステップが、コピー数変異を検出するか、または
（ｖｉ）前記分析するステップが、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を検出する、
請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料を、前記ライゲーションするステップでの前記３’末端へのヌクレオチドの非鋳型特異的付加を受けなかった平滑末端化二本鎖核酸とライゲーションする少なくとも部分的に二本鎖の平滑末端化アダプターと接触させるステップをさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）３’−５’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼであるか、
（ｉｉ）少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）が、単一チューブで実施されるか、
（ｉｉｉ）少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）では、前記試料から成分が除去されないか、
（ｉｖ）単一ヌクレオチドＴを有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの単一ヌクレオチドＣを有するものに対するモル比が、４：１〜２：１であり、必要に応じて、平滑末端化アダプターの尾部付加アダプターに対するモル比が、１：５〜１：５００であるか、および／または
（ｖ）前記試料中の前記二本鎖核酸の少なくとも７０％が、アダプターにつながっている、
請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
二本鎖ＤＮＡをアダプタータグ付きＤＮＡに変換する方法であって、
（ａ）二本鎖ＤＮＡ分子の集団を少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの集団と接触させるステップであって、
（ｉ）二本鎖ＤＮＡ分子の前記集団が、単一ヌクレオチドＡオーバーハングを含むＤＮＡ分子および単一ヌクレオチドＧオーバーハングを含むＤＮＡ分子を含み、単一ヌクレオチドＡオーバーハングは、前記集団中で単一ヌクレオチドＧオーバーハングよりも豊富であり（例えば、１０倍、１００倍、１０００倍）、
（ｉｉ）少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの前記集団が、単一ヌクレオチドＴオーバーハングを含むアダプターおよび単一ヌクレオチドＣオーバーハングを含むアダプターを含む、ステップと；
（ｂ）前記アダプターを前記ＤＮＡ分子にライゲーションするステップであって、これによりアダプタータグ付きＤＮＡを生成するステップと
を含む、方法。
【請求項１０】
（ｉ）二本鎖ＤＮＡ分子の前記集団が、単一ヌクレオチドＣオーバーハングを含むＤＮＡ分子、単一ヌクレオチドＴオーバーハングを含むＤＮＡ分子および平滑末端のうちの少なくとも１つをさらに含み、
（ｉｉ）少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの前記集団が、単一ヌクレオチドＧオーバーハングを含むアダプター、単一ヌクレオチドＡオーバーハングを含むアダプターおよび平滑末端のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも部分的に二本鎖のアダプターが、ＮＧＳ（「次世代シーケンシング」）プライマー結合部位およびＤＮＡバーコードを含み、必要に応じて、
試料インデックスバーコードを含む増幅プライマーおよびフローセル支持体に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように適合されたヌクレオチド配列を使用して前記アダプタータグ付きＤＮＡを増幅するステップ
をさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの前記集団が、複数の異なるＤＮＡバーコードを含み、必要に応じて、二本鎖ＤＮＡ分子の両末端に付着可能なバーコード組合せの数が、前記集団中で二本鎖ＤＮＡ分子の数よりも少なく、例えば、５〜１０，０００の間の異なる組合せである、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）前記アダプターが、Ｙ型アダプターであるか、および／または
（ｉｉ）核酸集団が、無細胞核酸集団、好ましくは無細胞ＤＮＡである、
請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料が、体液試料であり、必要に応じて、前記試料が、全血、血清、または血漿である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が、がんを有すると疑われる対象由来である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
上または下に引用されるすべての特許申請、ウェブサイト、他の出版物、および受託番号などは、あたかもそれぞれ個々の項目が参照によりそのように組み込まれることが明確におよび個別に示されている場合と同じ程度にあらゆる目的のためにその全体が参照により組み込まれる。配列の異なるバージョンが異なる時期の受託番号に関連している場合、本出願の有効出願日にその受託番号に関連しているバージョンを意味する。有効出願日とは、実際の出願日よりも早期、または該当する場合、受託番号に言及する優先権出願の出願日を意味する。同様に、出版物、またはウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時期に公表される場合、他の方法で示されていなければ、出願の有効出願日の直近に公表されたバージョンを意味する。本発明のいかなる特長、ステップ、要素、実施形態、または態様も、明確に他の方法で示されていなければ、他のいずれとも組み合わせて使用することが可能である。本発明は、明快さおよび理解を目的に図表および実施例によりある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変更および改変を実行してもよいことは明らかである。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
分析のために核酸を調製する方法であって、
（ａ）５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’プルーフリーディング活性を提供する１つまたは複数の酵素ならびに４つの標準ヌクレオチドタイプの作用により試料中の一本鎖オーバーハングを有する二本鎖核酸を平滑末端とするステップであって、５’末端を有する一本鎖オーバーハングが、前記ポリメラーゼ活性による相補鎖の伸長のための鋳型として働き、３’末端を有する一本鎖オーバーハングが、前記プルーフリーディング活性により消化されて平滑末端化核酸を生じる、ステップと、
（ｂ）前記平滑末端化核酸を前記試料の他の成分から分離せずに、３’−５’プルーフリーディング機能のないポリメラーゼの作用により前記平滑末端化核酸の末端に尾部を付加するステップであって、これにより平滑末端化核酸の３’末端へのヌクレオチドの非鋳型特異的付加が実施され、Ａが優先的に、次にＧが優先的に、次にＣまたはＴが付加される、ステップと；
（ｃ）ステップ（ｃ）の前記核酸を３’末端に単一ヌクレオチドＴまたはＣオーバーハングを有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターにアニールするステップと；
（ｄ）前記核酸を前記アダプターにライゲーションするステップと
を含む、方法。
(項目２)
ステップ（ａ）の後、前記１つまたは複数の酵素を変性させるステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記試料を、前記１つまたは複数の酵素、前記４つの標準ヌクレオチドタイプおよび３’−５’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼと接触させるステップをさらに含む、項目１または２に記載の方法。
(項目４)
前記試料を、前記１つまたは複数の酵素、前記４つの標準ヌクレオチドタイプおよび３’−５’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼと一緒に接触させる、項目３に記載の方法。
(項目５)
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）よりも高い温度で実施される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目６)
ステップ（ａ）が、周囲温度で実施され、ステップ（ｂ）が、６０℃を超える温度で実施される、項目５に記載の方法。
(項目７)
前記１つまたは複数の酵素が、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’プルーフリーディング活性を有するポリメラーゼである、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目８)
３’−５’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼが、熱安定性ポリメラーゼであり、前記方法が、ステップ（ａ）の後、前記試料の温度を上げるステップであって、５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’プルーフリーディング活性を有する前記ポリメラーゼを不活化するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目９)
（ｅ）前記アダプターにライゲーションされた前記核酸を増幅するステップと；（ｆ）前記核酸を分析するステップとをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目１０)
前記試料を、前記ライゲーションするステップでの前記３’末端へのヌクレオチドの非鋳型特異的付加を受けなかった平滑末端化二本鎖核酸とライゲーションする少なくとも部分的に二本鎖の平滑末端化アダプターと接触させるステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目１１)
５’−３’ポリメラーゼ活性および３’−５’プルーフリーディング活性を有する前記ポリメラーゼが、Ｔ４ポリメラーゼまたはクレノウ大断片である、項目７に記載の方法。
(項目１２)
３’−５’プルーフリーディング機能のない前記ポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼである、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目１３)
少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）が、単一チューブで実施される、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目１４)
少なくともステップ（ａ）〜（ｄ）では、前記試料から成分が除去されない、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目１５)
ステップ（ａ）〜（ｅ）が、単一チューブで実施される、項目９に記載の方法。
(項目１６)
単一ヌクレオチドＴを有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの単一ヌクレオチドＣを有するものに対するモル比が、４：１〜２：１である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目１７)
平滑末端化アダプターの尾部付加アダプターに対するモル比が、１：５〜１：５００である、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
前記試料中の前記二本鎖核酸の少なくとも７０％が、アダプターにつながっている、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目１９)
前記試料中の利用可能な二本鎖核酸の少なくとも７０％が分析される、項目９に記載の方法。
(項目２０)
ステップ（ｆ）が、前記アダプターにライゲーションされている前記核酸をシーケンシングすることを含む、項目９に記載の方法。
(項目２１)
前記シーケンシングすることで、ステップ（ｃ）または（ｄ）においてオーバーハングを形成したヌクレオチドをシーケンシングする、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
二本鎖ＤＮＡをアダプタータグ付きＤＮＡに変換する方法であって、
（ａ）二本鎖ＤＮＡ分子の集団を少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの集団と接触させるステップであって、
（ｉ）二本鎖ＤＮＡ分子の前記集団が、単一ヌクレオチドＡオーバーハングを含むＤＮＡ分子および単一ヌクレオチドＧオーバーハングを含むＤＮＡ分子を含み、単一ヌクレオチドＡオーバーハングは、前記集団中で単一ヌクレオチドＧオーバーハングよりも豊富であり（例えば、１０倍、１００倍、１０００倍）、
（ｉｉ）少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの前記集団が、単一ヌクレオチドＴオーバーハングを含むアダプターおよび単一ヌクレオチドＣオーバーハングを含むアダプターを含む、ステップと；
（ｂ）前記アダプターを前記ＤＮＡ分子にライゲーションするステップであって、これによりアダプタータグ付きＤＮＡを生成するステップと
を含む、方法。
(項目２３)
（ｉ）二本鎖ＤＮＡ分子の前記集団が、単一ヌクレオチドＣオーバーハングを含むＤＮＡ分子、単一ヌクレオチドＴオーバーハングを含むＤＮＡ分子および平滑末端のうちの少なくとも１つをさらに含み、
（ｉｉ）少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの前記集団が、単一ヌクレオチドＧオーバーハングを含むアダプター、単一ヌクレオチドＡオーバーハングを含むアダプターおよび平滑末端のうちの少なくとも１つをさらに含む、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記少なくとも部分的に二本鎖のアダプターが、ＮＧＳ（「次世代シーケンシング」）プライマー結合部位およびＤＮＡバーコードを含む、項目２２または２３に記載の方法。
(項目２５)
前記少なくとも部分的に二本鎖のアダプターの前記集団が、複数の異なるＤＮＡバーコードを含む、項目２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
(項目２６)
二本鎖ＤＮＡ分子の両末端に付着可能なバーコード組合せの数が、前記集団中で二本鎖ＤＮＡ分子の数よりも少なく、例えば、５〜１０，０００の間の異なる組合せである、項目２５に記載の方法。
(項目２７)
試料インデックスバーコードを含む増幅プライマーおよびフローセル支持体に固定されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするように適合されたヌクレオチド配列を使用して前記アダプタータグ付きＤＮＡを増幅するステップ
をさらに含む、項目２４に記載の方法。
(項目２８)
前記アダプターが、Ｙ型アダプターである、項目２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２９)
前記試料が、体液試料である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目３０)
前記試料が、全血、血清、または血漿である、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
核酸集団が、無細胞核酸集団、好ましくは無細胞ＤＮＡである、項目２２から３０のいずれか一項に記載の方法。
(項目３２)
前記試料が、がんを有すると疑われる対象由来である、前記項目のいずれかに記載の方法。
(項目３３)
前記分析するステップが、体細胞または生殖系列バリアントを検出する、項目９に記載の方法。
(項目３４)
前記分析するステップが、コピー数変異を検出する、項目９に記載の方法。
(項目３５)
前記分析するステップが、単一ヌクレオチド変異（ＳＮＶ）を検出する、項目９に記載の方法。
(項目３６)
前記項目のいずれかに記載の方法により生成される適合された核酸の集団であって、複数の核酸分子を含み、そのそれぞれが、核酸断片とアダプターの間にＡ／ＴまたはＧ／Ｃ塩基対を有するバーコードを含むアダプターが両側に隣接している前記核酸断片を含む、集団。
(項目３７)
前記複数の核酸分子が、少なくとも１００，０００分子である、項目３６に記載の集団。
(項目３８)
Ａ／Ｔ塩基対のＧ／Ｃ塩基対に対する比が、２：１〜４：１の間である、項目３６または３７に記載の集団。
(項目３９)
前記集団中の核酸分子の少なくとも９９％が、異なるバーコードを有するアダプターが隣接している核酸断片を有する、項目３６から３８のいずれか一項に記載の集団。
(項目４０)
それぞれＴおよびＣ単一ヌクレオチド３’尾部を有する少なくとも部分的に二本鎖のアダプターであって、前記尾部を除いて互いに同一であるアダプターの対を含むキット。
(項目４１)
前記アダプターが、配列番号１および２、ならびに３および２のオリゴヌクレオチドを含むＹ型アダプターである、項目４０に記載のキット。
(項目４２)
Ｔ４ポリメラーゼまたはクレノウ大断片、およびＴａｑポリメラーゼ、ならびに４つの標準ヌクレオチドタイプをさらに含む、項目４０または４１に記載のキット。