【手続補正書】
【提出日】令和3年5月6日(2021.5.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）間に位置する核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスゲノムであって、
前記核酸配列が、
（ｉ）第１のセンス鎖配列をコードする第１の領域と、
（ｉｉ）第１のアンチセンス鎖配列をコードする第２の領域と、
（ｉｉｉ）第２のセンス鎖配列をコードする第３の領域と、
（ｉｖ）第２のアンチセンス鎖配列をコードする第４の領域とを含み、
前記第１および第２のセンス鎖配列ならびに第１および第２のアンチセンス鎖配列が、それぞれ少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
前記第１のアンチセンス鎖配列が、第１の標的遺伝子によって産生されるｍＲＮＡに相補的であり、
前記第２のアンチセンス鎖配列が、第２の標的遺伝子によって産生されるｍＲＮＡに相補的であり、
前記第１のセンス鎖配列と前記第１のアンチセンス鎖配列とが、少なくとも４ヌクレオチド長の相補性の領域を共有し、
前記第２のセンス鎖配列と前記第２のアンチセンス鎖配列とが、少なくとも４ヌクレオチド長の相補性の領域を共有し、
任意選択で、前記核酸配列が、
第３のセンス鎖配列をコードする第５の領域と、
第３のアンチセンス鎖配列をコードする第６の領域とを含み、
前記第３のセンス鎖配列が、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
前記第３のアンチセンス鎖配列が、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
前記第３のアンチセンス鎖配列が、第３の標的遺伝子によって産生されるｍＲＮＡに相補的であり、
前記第３のセンス鎖配列と前記第３のアンチセンス鎖配列とが、少なくとも４ヌクレオチドの相補性の領域を共有し、
任意選択で、前記核酸配列が、
第４のセンス鎖配列をコードする第７の領域と、
第４のアンチセンス鎖配列をコードする第８の領域とを含み、
前記第４のセンス鎖配列が、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
前記第４のアンチセンス鎖配列が、少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、
前記第４のアンチセンス鎖配列が、第４の標的遺伝子によって産生されるｍＲＮＡに相補的であり、
前記第４のセンス鎖配列と前記第４のアンチセンス鎖配列とが、少なくとも４ヌクレオチドの相補性の領域を共有する、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスゲノム。
【請求項２】
前記第１の標的遺伝子が、前記第２の標的遺伝子と同じである、または
前記第１の標的遺伝子が、前記第２の標的遺伝子と同じではなく、
任意選択で、
前記第３の標的遺伝子が、前記第１の標的遺伝子、前記第２の標的遺伝子、または、前記第１の標的遺伝子および前記第２の標的遺伝子の両方と同じである、または
任意選択で、
前記第４の標的遺伝子が、前記第１の標的遺伝子、前記第２の標的遺伝子、前記第３の標的遺伝子、前記第１の標的遺伝子および前記第２の標的遺伝子、前記第１の標的遺伝子および前記第３の標的遺伝子、前記第２の標的遺伝子および前記第３の標的遺伝子、または、前記第１の標的遺伝子および前記第２の標的遺伝子および前記第３の標的遺伝子、と同じである、
請求項１に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項３】
少なくとも１つのセンス鎖配列と少なくとも１つのアンチセンス鎖配列との間の相補性の領域が、少なくとも１２ヌクレオチド長であり、任意選択で、１４〜２１ヌクレオチド長であり、任意選択で、１９ヌクレオチド長である、
請求項１または２に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項４】
各センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列が、独立に３０ヌクレオチド長以下であり、任意選択で、１９〜２４ヌクレオチド長であり、任意選択で、１９〜２１ヌクレオチド長であり、任意選択で、１９ヌクレオチド長であり、任意選択で、２０ヌクレオチド長であり、任意選択で、２１ヌクレオチド長であり、または任意選択で、２２ヌクレオチド長である、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項５】
前記第１のセンス鎖配列および前記第１のアンチセンス鎖配列または前記第２のセンス鎖配列および前記第２のアンチセンス鎖配列の少なくとも１つが、少なくとも１ヌクレオチドまたは少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバハングを含み、
任意選択で、前記第３のセンス鎖配列および前記第３のアンチセンス鎖配列が、少なくとも１ヌクレオチドまたは少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバハングを含み、
任意選択で、前記第４のセンス鎖配列および前記第４のアンチセンス鎖配列が、少なくとも１ヌクレオチドまたは少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバハングを含む、
請求項４に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項６】
次の少なくとも１つである：
（ｉ）前記第１の領域が、前記第１のセンス鎖配列の５’にあるプロモータ、およびそれに続く前記第１のセンス鎖配列をコードする配列を含み、かつ
前記第２の領域が、前記前記第１のアンチセンス鎖配列をコードする配列、およびそれに続く前記第１のアンチセンス鎖配列の３’にあるプロモータターミネータを含み；
（ｉｉ）前記第３の領域が、前記第２のセンス鎖配列の５’にあるプロモータ、およびそれに続く前記第２のセンス鎖配列をコードする配列を含み、かつ
前記第４の領域が、前記第２のアンチセンス鎖配列をコードする配列、およびそれに続く前記第２のアンチセンス鎖配列の３’にあるプロモータターミネータを含み；
（ｉｉｉ）任意選択で、前記第５の領域が、前記第３のセンス鎖配列の５’にあるプロモータ、およびそれに続く前記第３のセンス鎖配列をコードする配列を含み、かつ
前記第６の領域が、前記第３のアンチセンス鎖配列をコードする配列、およびそれに続く前記第３のアンチセンス鎖配列の３’にあるプロモータターミネータを含み；または
（ｉｖ）任意選択で、前記第７の領域が、前記第４のセンス鎖配列の５’にあるプロモータ、およびそれに続く前記第４のセンス鎖配列をコードする配列を含み、かつ
前記第８の領域が、前記第４のアンチセンス鎖配列をコードする配列、およびそれに続く前記第４のアンチセンス鎖配列の３’にあるプロモータターミネータを含む、
請求項１〜５のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項７】
少なくとも１つのプロモータが、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータであり、かつ
少なくとも１つのプロモータターミネータが、Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータターミネータであり；
任意選択で、前記少なくとも１つのＰｏｌ  ＩＩＩプロモータが、Ｕ３、Ｕ６、Ｕ７、７ＳＫ、Ｈ１、またはＭＲＰ、ＥＢＥＲ、セレノ−システインｔＲＮＡ、７ＳＬ、アデノウイルスＶＡ−１、またはテロメラーゼ遺伝子プロモータであり、かつ
前記少なくとも１つのＰｏｌ  ＩＩＩプロモータターミネータが、Ｕ３、Ｕ６、Ｕ７、７ＳＫ、Ｈ１、またはＭＲＰ、ＥＢＥＲ、セレノ−システインｔＲＮＡ、７ＳＬ、アデノウイルスＶＡ−１、またはテロメラーゼ遺伝子プロモータターミネータであり；または
任意選択で、前記少なくとも１つのＰｏｌ  ＩＩＩプロモータが、Ｈ１プロモータであり、かつ
前記少なくとも１つのＰｏｌ  ＩＩＩプロモータターミネータが、Ｈ１プロモータターミネータである、
請求項６に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項８】
前記ＡＡＶウイルスゲノムが、単一特異的ポリシストロン性ＡＡＶウイルスゲノムまたは二特異的ポリシストロン性ＡＡＶウイルスゲノムである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項９】
前記第１の領域と前記第２の領域とが、第１のｓｉＲＮＡ二本鎖分子をコードし、かつ
前記第３の領域と前記第４の領域とが、第２のｓｉＲＮＡ二本鎖分子をコードし；
前記第１および第２のｓｉＲＮＡ二本鎖分子が、異なる標的遺伝子を標的とし、または
前記第１および第２のｓｉＲＮＡ二本鎖分子が、同じ標的遺伝子を標的とし；
任意選択で、
前記第５の領域と第６の領域とが、第３のｓｉＲＮＡ二本鎖分子をコードし、
前記第３のｓｉＲＮＡ二本鎖分子が、前記第１のｓｉＲＮＡ二本鎖、前記第２のｓｉＲＮＡ二本鎖、または、前記第１のｓｉＲＮＡ二本鎖分子および前記第２のｓｉＲＮＡ二本鎖分子の両方と同じ遺伝子を標的とし；
任意選択で、
前記第７の領域と第８の領域とが、第４のｓｉＲＮＡ二本鎖分子をコードし、
前記第４のｓｉＲＮＡ二本鎖分子が、前記第１のｓｉＲＮＡ二本鎖分子、前記第２のｓｉＲＮＡ二本鎖分子、前記第３のｓｉＲＮＡ二本鎖分子、前記第１のｓｉＲＮＡ二本鎖分子および前記第２のｓｉＲＮＡ二本鎖分子、前記第１のｓｉＲＮＡ二本鎖分子および前記第３のｓｉＲＮＡ二本鎖分子、前記第２のｓｉＲＮＡ二本鎖分子および前記第３のｓｉＲＮＡ二本鎖分子、または前記第１のｓｉＲＮＡ二本鎖分子および前記第２のｓｉＲＮＡ二本鎖分子および前記第３のｓｉＲＮＡ二本鎖分子、と同じ遺伝子を標的とする、
請求項１〜８のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項１０】
前記ＡＡＶウイルスゲノムの前記核酸配列が、第１の分子足場領域および第２の分子足場領域を含み、
前記第１の分子足場領域が、
（ａ）第１のステム−ループ構造を形成する第１のステムおよび第１のループであって、前記第１のステム−ループ構造の配列が、５’から３’に、
（ｉ）第１の５’ステムアームであって、前記第１の５’ステムアームが第１の５’スペーサ配列および前記第１のセンス鎖配列を含み、前記第１の５’スペーサ配列が前記第１のセンス鎖配列の５’に位置する、第１の５’ステムアーム；
（ｉｉ）４〜３０ヌクレオチド長の第１のループ領域；
（ｉｉｉ）第１の３’ステムアームであって、前記第１の３’ステムアームが前記第１のアンチセンス鎖配列および第１の３’スペーサ配列を含み、前記第１の３’スペーサ配列が前記第１のアンチセンス鎖配列の３’に位置する、第１の３’ステムアーム；
を含む、第１のステムおよび第１のループ；
（ｂ）前記第１のセンス鎖配列の５’に位置する第１の５’フランキング領域であって、前記第１の５’フランキング領域が、第１の５’フランキング配列および前記第１の５’スペーサ配列を含む、第１の５’フランキング領域；および
（ｃ）前記第１のアンチセンス鎖配列の３’に位置する第１の３’フランキング領域であって、前記第１の３’フランキング領域が、第１の３’スペーサ配列および第１の３’フランキング配列を含む、第１の３’フランキング領域；
をコードする第１の分子足場核酸配列を含み、
前記第２の分子足場領域が、
（ａ）第２のステム−ループ構造を形成する第２のステムおよび第２のループであって、前記第２のステム−ループ構造の配列が、５’から３’に、
（ｉ）第２の５’ステムアームであって、前記第２の５’ステムアームが第２の５’スペーサ配列および前記第２のセンス鎖配列を含み、前記第２の５’スペーサ配列が前記第２のセンス鎖配列の５’に位置する、第２の５’ステムアーム；
（ｉｉ）４〜３０ヌクレオチド長の第２のループ領域；
（ｉｉｉ）第２の３’ステムアームであって、前記第２の３’ステムアームが前記第２のアンチセンス鎖配列および第２の３’スペーサ配列を含み、前記第２の３’スペーサ配列が前記第２のアンチセンス鎖配列の３’に位置する、第２の３’ステムアーム；
を含む、第２のステムおよび第２のループ；
（ｂ）前記第２のセンス鎖配列の５’に位置する第２の５’フランキング領域であって、前記第２の５’フランキング領域が、第２の５’フランキング配列および前記第２の５’スペーサ配列を含む、第２の５’フランキング領域；および
（ｃ）前記第２のアンチセンス鎖配列の３’に位置する第２の３’フランキング領域であって、前記第２の３’フランキング領域が、第２の第１の３’スペーサ配列および第２の３’フランキング配列を含む、第２の３’フランキング領域；
をコードする第２の分子足場核酸配列を含み、
任意選択で、前記ＡＡＶウイルスゲノムの前記核酸配列が、
（ａ）第３のステム−ループ構造を形成する第３のステムおよび第３のループであって、前記第３のステム−ループ構造の配列が、５’から３’に、
（ｉ）第３の５’ステムアームであって、前記第３の５’ステムアームが第３の５’スペーサ配列および前記第３のセンス鎖配列を含み、前記第３の５’スペーサ配列が前記第３のセンス鎖配列の５’に位置する、第３の５’ステムアーム；
（ｉｉ）４〜３０ヌクレオチド長の第３のループ領域；
（ｉｉｉ）第３の３’ステムアームであって、前記第３の３’ステムアームが前記第３のアンチセンス鎖配列および第３の３’スペーサ配列を含み、前記第３の３’スペーサ配列が前記第３のアンチセンス鎖配列の３’に位置する、第３の３’ステムアーム；
を含む、第３のステムおよび第３のループ；
（ｂ）前記第３のセンス鎖配列の５’に位置する第３の５’フランキング領域であって、前記第３の５’フランキング領域が、第３の５’フランキング配列および前記第３の５’スペーサ配列を含む、第３の５’フランキング領域；および
（ｃ）前記第３のアンチセンス鎖配列の３’に位置する第３の３’フランキング領域であって、前記第３の３’フランキング領域が、第３の第１の３’スペーサ配列および第３の３’フランキング配列を含む、第３の３’フランキング領域；
をコードする第３の分子足場核酸配列を含む第３の分子足場領域を含み、
任意選択で、前記ＡＡＶウイルスゲノムの前記核酸配列が、
（ａ）第４のステム−ループ構造を形成する第４のステムおよび第４のループであって、前記第４のステム−ループ構造の配列が、５’から３’に、
（ｉ）第４の５’ステムアームであって、前記第４の５’ステムアームが第４の５’スペーサ配列および前記第４のセンス鎖配列を含み、前記第４の５’スペーサ配列が前記第４のセンス鎖配列の５’に位置する、第４の５’ステムアーム；
（ｉｉ）４〜３０ヌクレオチド長の第４のループ領域；
（ｉｉｉ）第４の３’ステムアームであって、前記第４の３’ステムアームが前記第４のアンチセンス鎖配列および第４の３’スペーサ配列を含み、前記第４の３’スペーサ配列が前記第４のアンチセンス鎖配列の３’に位置する、第４の３’ステムアーム；
を含む、第４のステムおよび第４のループ；
（ｂ）前記第４のセンス鎖配列の５’に位置する第４の５’フランキング領域であって、前記第４の５’フランキング領域が、第４の５’フランキング配列および前記第４の５’スペーサ配列を含む、第４の５’フランキング領域；および
（ｃ）前記第４のアンチセンス鎖配列の３’に位置する第４の３’フランキング領域であって、前記第４の３’フランキング領域が、第４の第１の３’スペーサ配列および第４の３’フランキング配列を含む、第４の３’フランキング領域；
をコードする第４の分子足場核酸配列を含む第４の分子足場領域を含む、
請求項１〜９のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項１１】
少なくとも１つの５’フランキング領域が、表１０から選択された５’フランキング領域配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、
任意選択で、
少なくとも１つの５’フランキング領域が、表１０から選択された５’フランキング領域ヌクレオチド配列を含む、
請求項１０に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項１２】
少なくとも１つのループ領域が、表１１から選択されたループ領域配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、
任意選択で、
少なくとも１つのループ領域が、表１１から選択されたループ領域ヌクレオチド配列を含む、
請求項１０または１１に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項１３】
少なくとも１つの３’フランキング領域が、表１２から選択された３’フランキング領域配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含み、
任意選択で、
少なくとも１つの３’フランキング領域が、表１２から選択された３’フランキング領域ヌクレオチド配列を含む、
請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノム。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノムと、ＡＡＶカプシドとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ウイルス粒子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組換えＡＡＶウイルス粒子と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１６】
細胞における１つ以上の標的遺伝子の発現を阻害する方法で使用するための組成物であって、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノムを含むｒＡＡＶウイルス粒子、請求項１４に記載のｒＡＡＶウイルス粒子、または請求項１５に記載の医薬組成物を含み、
前記方法が、有効量の前記組成物を細胞に投与することを含み、
任意選択で、前記標的遺伝子が前記細胞内で機能獲得効果を引き起こすものであり、
任意選択で、前記細胞が中型有棘ニューロン、皮質ニューロン、運動ニューロン、またはアストロサイトである、組成物。
【請求項１７】
前記標的遺伝子の発現が阻害または抑制され、
任意選択で、前記標的遺伝子の発現が、約３０％〜約７０％阻害または抑制され、または、
任意選択で、前記標的遺伝子の発現が、約５０％〜約９０％阻害または抑制される、
請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
対象の疾患を治療する方法で使用するための組成物であって、
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノムを含むｒＡＡＶウイルス粒子、請求項１４に記載のｒＡＡＶウイルス粒子、または請求項１５に記載の医薬組成物を含み、
前記方法が、前記組成物の治療有効量を対象に投与することを含み、
任意選択で、前記疾患が、中枢神経系（ＣＮＳ）の疾患である、組成物。
【請求項１９】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）粒子を作製する方法であって、
ウイルス複製細胞を、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のウイルスゲノムを含むポリヌクレオチドと接触させることを含み、
前記方法が、任意選択で、
１）例えばＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞に、ペイロード領域、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するコンストラクト、ならびにヘルパーコンストラクトを同時にコトランスフェクトするステップ、
２）ウイルスゲノムを含むＡＡＶ粒子を回収および精製するステップ、を含む、方法。