【手続補正書】
【提出日】令和3年3月10日(2021.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチドの集団を伸長させる方法において、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドをアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）とインキュベートするステップであって、前記ＡＴＯは、
（ａ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカーを有する３’末端；
（ｂ）３’ランダム配列；
（ｃ）少なくとも１つのウラシルヌクレオチド；および
（ｄ）前記ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列； 
を有し、前記標的ポリヌクレオチドが前記ＡＴＯの３’ランダム配列にハイブリダイズする、ステップ；
（ｉｉ）前記ＡＴＯを鋳型として使用して、標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を実行し、それによって３’ユニバーサル配列を有する修飾標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
（ｉｉｉ）ｄＵ−グリコシラーゼ活性を有する酵素で処理するステップ；および
（ｉｖ）前記修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップであって、該第１のＣＳの作成は、前記修飾標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用する３’ユニバーサル配列からのポリメラーゼ伸長を含む、ステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記第１のＣＳを作成するためのポリメラーゼ伸長が、３’ユニバーサル配列にハイブリダイズしたプライマーの伸長による、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記３’ユニバーサル配列にハイブリダイズしたプライマーの伸長が、線形増幅として繰り返される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のＣＳが請求項１に記載の方法を用いて伸長されて、３’ユニバーサル配列を有する修飾された第１の相補配列が生成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のＣＳがＤＮＡリガーゼを用いて伸長されて、該第１のＣＳにアダプターが連結され、修飾された第１のＣＳが生成される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、それによって第２のＣＳを形成することをさらに含み、第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズした前記プライマーは、３’標的特異的部分、または５’ユニバーサル配列、あるいは３’標的特異的部分と５’ユニバーサル配列の両方を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）が、３〜３６「Ｎ」塩基の３’ランダム配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ユニバーサル配列が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能することができる配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＡＴＯが５’ステム部分配列を含み、該５’ステム部分配列は、前記ユニバーサル配列の一部または全部に相補的であるかまたは部分的に相補的であり、それによってステムループ構造を形成することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＡＴＯが、５’から３’の順序で、５’ステム部分、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、プライミング部位配列、一本鎖オーバーハング３’ランダム配列、およびブロッカーを有する３’末端を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステムループ構造が、Ｃ３スペーサー、トリエチレングリコールスペーサー、１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサー、または１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）から選択されるコピー不能なリンケージを含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記３’末端が、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシヌクレオチド、Ｃ３スペーサー、リン酸、ジデオキシヌクレオチド、アミノ基、および逆向きデオキシチミジン（inverted deoxythymidine）からなる群より選択される部分でブロックされている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＴＯが、一旦標的ポリヌクレオチドにコピーされると一意の識別子（ＵＩＤ）のための鋳型として機能する他のランダム配列を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのキットであって、アダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、ｄＵ−グリコシラーゼ活性を有する酵素、およびＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーを含み、前記ＡＴＯは、
（ａ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカーを有する３’末端；
（ｂ）３’ランダム配列；
（ｃ）少なくとも１つのウラシルヌクレオチド；および
（ｄ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列；
を有する、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
ユニバーサル配列は、二本鎖または部分的に二本鎖であってもよい。ユニバーサル配列を二本鎖領域として保護することにより、標的ポリヌクレオチドおよびＡＴＯのランダム化された３’末端とのハイブリダイゼーションが防止される。一実施形態では、ＡＴＯは、ユニバーサル配列の全部または一部に相補的または部分的に相補的な５’ステム部分配列を含み、それはステムループ構造またはスプリットステムループ構造を形成することができる。ＡＴＯ分子は、５’から３’の順序で、５’ステム部分、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、プライミング部位配列、および３’ランダム／縮重配列、ランダム／縮重配列と特異的配列との混合、または配列特異的配列を含むことができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、ループ部分、またはステムの一部およびループの一部、またはステムに位置してよい。ループ部分は、コピー不能なリンケージを含んでいてよい。あるいは、ループ部分は、コピー不能なリンケージを含まなくてもよい。あるいは、ステム部分は、コピー不能なリンケージを含んでもよい。ステム部分の５’が追加配列を含む場合、コピー不能なリンケージがステム部分と追加配列との間に存在してよい。あるいは、ステム部分は、コピー不能なリンケージを含まなくてもよい。別の実施形態において、５’ステム部分はコピー不能なリンケージを含む。コピー不能なリンケージは、Ｃ３スペーサーホスホロアミダイト、またはトリエチレングリコールスペーサー、または１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサー、または１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）の群から選択することができるが、これらに限定されない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２３】
１４．ＡＴＯが、５’から３’の順に、５’ステム部分、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、プライミング部位配列、および３’ ランダム／縮重配列を含む、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２４】
１５．ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がループ部分に位置する、箇条１３に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６４７】
【表２】
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最後に、本発明の好ましい実施態様を項分け記載する。
［実施態様１］
一本鎖３’末端を有する標的ポリヌクレオチドの集団を伸長させる方法において、
（ｉ）標的ポリヌクレオチドをアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）とインキュベートするステップであって、前記ＡＴＯは、
（ａ）３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを伸長不能にするブロッカーを有する３’末端；および
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列
を有し、前記標的ポリヌクレオチドがＡＴＯの３’ランダム配列にハイブリダイズする、ステップ；
（ｉｉ）前記ＡＴＯを鋳型として使用して、標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ伸長を実行し、それによって３’ユニバーサル配列を有する伸長標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
を含む、方法
［実施態様２］
（ｉｉｉ）前記修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補配列（ＣＳ）を作成するステップをさらに含み、第１のＣＳの作成が、修飾標的ポリヌクレオチドを鋳型として使用する３’ユニバーサル配列からのポリメラーゼ伸長を含む、実施態様１に記載の方法。
ことができる。
［実施態様３］
前記第１のＣＳの作成するためのポリメラーゼ伸長は、
（ａ）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むＡＴＯ上で伸長させることにより生成された修飾標的ポリヌクレオチド中の二本鎖ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域からのＲＮＡポリメラーゼを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写；
（ｂ）自己プライミングによる３’ステムループ構造の伸長；または
（ｃ）３’ユニバーサル配列にハイブリダイズしたプライマーの伸長
のいずれかである、実施態様２に記載の方法。
［実施態様４］
修飾標的ポリヌクレオチドの第１の相補鎖（ＣＳ）を作成する前または後に、過剰のＡＴＯが除去または消化される、実施態様２または３に記載の方法。
［実施態様５］
前記第１のＣＳが実施態様１に記載の方法を用いて伸長され、３’ユニバーサル配列を有する伸長された第１の相補配列が生成される、実施態様２〜４のいずれかに記載の方法。
［実施態様６］
前記第１のＣＳがＤＮＡリガーゼを用いて伸長されて該第１のＣＳにアダプターが連結される、実施態様２〜４のいずれかに記載の方法。
［実施態様７］
前記第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、それによって第２のＣＳを形成することをさらに含み、第１のＣＳまたは修飾された第１のＣＳにハイブリダイズした前記プライマーは、３’標的特異的部分または５’ユニバーサル配列、あるいは３’標的特異的部分と５’ユニバーサル配列の両方を含む、実施態様２〜４のいずれかに記載の方法。
［実施態様８］
工程（ｉｉ）で用いられるポリメラーゼが３’→５’ エキソヌクレアーゼ活性を有する、実施態様１〜７のいずれかに記載の方法。
［実施態様９］
一本鎖核酸の集団からシーケンシングライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）実施態様１に記載の方法を実行して３’ユニバーサル配列を有する伸長された標的ポリヌクレオチドを作成するステップ；
（ｂ）実施態様２に記載の方法を実行して第１の相補配列を作成するステップ；
（ｃ）５’ユニバーサル配列および３’ユニバーサル配列を有する第２の相補配列を作成するステップであって、５’ユニバーサル配列と３’ユニバーサル配列は異なりかつ互いに対して相補的ではないステップ、および
（ｄ）前記２つのユニバーサル配列を標的とするプライマーを用いて前記第１の相補配列および第２の相補配列を増幅し、それによって異なる配列の既知のユニバーサル末端を有する二本鎖ヌクレオチド断片のシーケンシングライブラリーを調製するステップ
を含む、方法。
［実施態様１０］
一本鎖３’末端を有する標的ポリヌクレオチドがＲＮＡまたはＤＮＡであり、該ＤＮＡまたはＲＮＡが、ＦＦＰＥサンプル、循環セルフリー核酸、またはバイサルファイトで処理したサンプルに由来する、実施態様１〜９のいずれかに記載の方法。
［実施態様１１］
ポリヌクレオチドを伸長させるためのアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）であって、
（ａ）３〜３６「Ｎ」塩基の３’ランダム配列；
（ｂ）ＡＴＯを拡張不能にするブロッカーを有する３’末端；
（ｃ）ランダム配列の５’にあるユニバーサル配列；
（ｄ）任意選択で、ＡＴＯを３’エキソヌクレアーゼ切断に対して耐性にする修飾ヌクレオチドまたはリンケージ；および
（ｅ）ＡＴＯを分解可能にする部分
を含む、アダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
［実施態様１２］
前記分解可能にする部分がウラシルヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは制限酵素認識配列である、実施態様１１に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
［実施態様１３］
ＡＴＯを３’エキソヌクレアーゼ切断に対して耐性にする修飾ヌクレオチドまたはリンケージがホスホロチオアートリンケージである、実施態様１１または実施態様１２に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
［実施態様１４］
前記ユニバーサル配列が、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとして機能することができる配列を含む、実施態様１１〜１３のいずれかに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
［実施態様１５］
ＡＴＯが５’ステム部分配列を含み、該５’ステム部分配列は、前記ユニバーサル配列の一部または全部に相補的または部分的に相補的であり、それによってステムループ構造を形成することができる、実施態様１１〜１４のいずれかに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）。
［実施態様１６］
ＡＴＯが、５’から３’の順序で、５’ステム部分、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列、プライミング部位配列、一本鎖オーバーハング３’ランダム配列、およびブロッカーを有する３’末端を含む、実施態様１５に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
［実施態様１７］
前記ステムループ構造がコピー不能なリンケージを含む、実施態様１５または実施態様１６に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
［実施態様１８］
前記コピー不能なリンケージが、Ｃ３スペーサー、トリエチレングリコールスペーサー、１８原子ヘキサエチレングリコールスペーサー、または１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）である、実施態様１７に記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。
［実施態様１９］
３’末端が、少なくとも１つのリボヌクレオチド、少なくとも１つのデオキシヌクレオチド、Ｃ３スペーサー、リン酸、ジデオキシヌクレオチド、アミノ基、および逆向きデオキシチミジン（inverted deoxythymidine）からなる群より選択される部分でブロックされている、実施態様１１〜１８のいずれかに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド。 
［実施態様２０］
実施態様１１〜１８のいずれかに記載のＡＴＯ、および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを含む、ポリヌクレオチドを伸長させるための組成物。
［実施態様２１］
ＡＴＯが実施態様１１〜１９のいずれかに記載されるものである、実施態様１〜１０のいずれかに記載の方法。
［実施態様２２］
実施態様１１〜１９のいずれかに記載のアダプター鋳型オリゴヌクレオチド（ＡＴＯ）、３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、およびＮＧＳプラットフォームに適合するプライマーを含む、ポリヌクレオチドのライブラリーを作成するためのキット。