【手続補正書】
【提出日】令和3年3月12日(2021.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
2種の抗炎症性サイトカインをコードする改変型ヌクレオチド配列を含み、炎症応答を阻害するために十分なレベルの前記2種の抗炎症性サイトカインを産生する、間葉系幹細胞。
【請求項２】
炎症応答が対照と比べて阻害され、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞である、かつ／または
抗炎症性サイトカインが、IL-4、IL-10、およびIL-22より選択される、
請求項1記載の間葉系幹細胞。
【請求項３】
抗炎症性サイトカインがIL-4およびIL-10である、または
抗炎症性サイトカインがIL-4およびIL-22である、または
抗炎症性サイトカインがIL-10およびIL-22である、
請求項2記載の間葉系幹細胞。
【請求項４】
（i）骨髄、脂肪組織、もしくは臍帯組織に由来する、かつ／または
（ii）抗炎症性サイトカインレベルが、制御性T細胞免疫表現型を誘導するために十分である、かつ／または
（iii）抗炎症性サイトカインレベルが、刺激されたT細胞による炎症性サイトカインの産生を対照と比べて阻害するために十分であり、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞である、
請求項1〜3のいずれか一項記載の間葉系幹細胞。
【請求項５】
抗炎症性サイトカインレベルが、刺激されたT細胞による炎症性サイトカインの産生を対照と比べて阻害するために十分であり、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞であり、かつ
前記炎症性サイトカインが、IFNγ、IL-17A、IL-1β、IL-6、およびTNFαより選択される、かつ／または
前記T細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、γδT細胞、およびT制御性細胞より選択される、
請求項4記載の間葉系幹細胞。
【請求項６】
炎症応答を対照と比べて阻害するために十分なレベルの3種の抗炎症性サイトカインを産生するように改変されており、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞である、かつ／または
ホーミング分子を発現するように改変されており、任意で、前記ホーミング分子が、抗インテグリンα4β7；抗MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；およびGPR15より選択される、もしくはCXCR4、CCR2、CCR9、およびGPR15より選択される、
請求項1〜5のいずれか一項記載の間葉系幹細胞。
【請求項７】
（a）2種のサイトカインの両方をコードするポリヌクレオチド構築物であって、2種のサイトカインのうちの一方をコードする第1のヌクレオチド配列と2種のサイトカインのうちの他方をコードする第2のヌクレオチド配列とに機能的に連結されたプロモーターを含み、任意で、第1および第2のヌクレオチド配列が介在ヌクレオチド配列によって分離されており、任意で、介在配列がIRES配列であるかもしくは2Aペプチドをコードする、ポリヌクレオチド構築物；
（b）2種のサイトカインの両方をコードするポリヌクレオチド構築物であって、（i）2種のサイトカインのうちの一方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第1のプロモーターと（ii）2種のサイトカインのうちの他方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第2のプロモーターとを含むポリヌクレオチド構築物；または
（c）2種のサイトカインのうちの一方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第1のプロモーターを含む第1のポリヌクレオチド構築物と2種のサイトカインのうちの他方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第2のプロモーターを含む第2のポリヌクレオチド構築物
を含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の間葉系幹細胞。
【請求項８】
（a）のプロモーター、（b）の第1および/もしくは第2のプロモーター、ならびに/または（c）の第1および/もしくは第2のプロモーターが、誘導性プロモーターであり、任意で、前記誘導性プロモーターが核内因子κB（NFκB）応答性プロモーターである、請求項7記載の間葉系幹細胞。
【請求項９】
（a）のポリヌクレオチド構築物、（b）のポリヌクレオチド構築物、ならびに/または（c）の第1および/もしくは第2のポリヌクレオチド構築物が、レポーター分子をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項7または8記載の間葉系幹細胞。
【請求項１０】
2種の抗炎症性サイトカインをコードする改変型ヌクレオチド配列を含む間葉系幹細胞の調製物を含む、対象における炎症応答を阻害するための医薬であって、前記間葉系幹細胞の治療的有効量が前記対象に送達され、それにより炎症応答が阻害される、前記医薬。
【請求項１１】
前記調製物が、請求項1〜9のいずれか一項記載の間葉系幹細胞の調製物である、請求項10記載の医薬。
【請求項１２】
前記間葉系幹細胞が、3種の抗炎症性サイトカインを産生するように改変されている、かつ／または
前記対象が炎症性腸疾患の症状を示し、任意で、前記対象が炎症性腸疾患を有すると診断されており、任意で、前記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎もしくはクローン病である、かつ／または
前記治療的有効量が、対象における体重減少を対照と比べて低下させ、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞の調製物である、かつ／または
前記治療的有効量が、対象におけるリポカリン2のレベルを対照と比べて低下させ、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞の調製物である、かつ／または
前記間葉系幹細胞が、ホーミング分子を発現するように改変されており、任意で、前記ホーミング分子が、抗インテグリンα4β7；抗MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；およびGPR15より選択される、もしくはCXCR4、CCR2、CCR9、およびGPR15より選択される、
請求項10または11記載の医薬。
【請求項１３】
間葉系幹細胞が、
（a）2種のサイトカインの両方をコードするポリヌクレオチド構築物であって、2種のサイトカインのうちの一方をコードする第1のヌクレオチド配列と2種のサイトカインのうちの他方をコードする第2のヌクレオチド配列とに機能的に連結されたプロモーターを含み、任意で、第1および第2のヌクレオチド配列が介在ヌクレオチド配列によって分離されており、任意で、介在配列がIRES配列であるかもしくは2Aペプチドをコードする、ポリヌクレオチド構築物；
（b）2種のサイトカインの両方をコードするポリヌクレオチド構築物であって、（i）2種のサイトカインのうちの一方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第1のプロモーターと（ii）2種のサイトカインのうちの他方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第2のプロモーターとを含むポリヌクレオチド構築物；または
（c）2種のサイトカインのうちの一方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第1のプロモーターを含む第1のポリヌクレオチド構築物と2種のサイトカインのうちの他方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第2のプロモーターを含む第2のポリヌクレオチド構築物
を含み、任意で、（a）のプロモーター、（b）の第1および/もしくは第2のプロモーター、ならびに/または（c）の第1および/もしくは第2のプロモーターが、誘導性プロモーターであり、任意で、前記誘導性プロモーターが核内因子κB（NFκB）応答性プロモーターである、請求項10〜12のいずれか一項記載の医薬。
【請求項１４】
エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された核内因子κB（NFκB）応答性プロモーターを含み、任意で、前記エフェクター分子が抗炎症性サイトカインであり、任意で、抗炎症性サイトカインが、IL-4、IL-10、およびIL-22より選択される、改変型ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
エフェクター分子およびホーミング分子をコードする改変型ヌクレオチド配列を含み、炎症応答を阻害するために十分なレベルの前記エフェクター分子および前記ホーミング分子を産生する、間葉系幹細胞であって、任意で、前記エフェクター分子が、IL-4、IL-10、IL-35、PD-L1-Ig、抗TNFα、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、α1アンチトリプシン、IL-22、IL-19、およびIL-20より選択され、かつ任意で、前記ホーミング分子が、抗インテグリンα4β7；抗MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；およびGPR15より選択される、前記間葉系幹細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
エフェクター分子（例えば、抗炎症性サイトカイン）をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された炎症性サイトカインに応答性のプロモーターを含む改変型核酸も、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、改変型核酸は、エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された核内因子κB（NFκB）応答性プロモーターを含む。いくつかの態様において、エフェクター分子は、抗炎症性サイトカインである。例えば、抗炎症性サイトカインは、IL-4、IL-10、およびIL-22より選択され得る。
[本発明1001]
炎症応答を阻害するために十分なレベルの2種の抗炎症性サイトカインを産生するように改変された間葉系幹細胞。
[本発明1002]
炎症応答が対照と比べて少なくとも20％阻害され、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞である、本発明1001の間葉系幹細胞。
[本発明1003]
抗炎症性サイトカインが、IL-4、IL-10、およびIL-22より選択される、本発明1001または1002の間葉系幹細胞。
[本発明1004]
抗炎症性サイトカインがIL-4およびIL-10である、本発明1003の間葉系幹細胞。
[本発明1005]
抗炎症性サイトカインがIL-4およびIL-22である、本発明1003の間葉系幹細胞。
[本発明1006]
抗炎症性サイトカインがIL-10およびIL-22である、本発明1003の間葉系幹細胞。
[本発明1007]
骨髄、脂肪組織、または臍帯組織に由来する、本発明1001〜1006のいずれかの間葉系幹細胞。
[本発明1008]
抗炎症性サイトカインレベルが、制御性T細胞免疫表現型を誘導するために十分である、本発明1001〜1007のいずれかの間葉系幹細胞。
[本発明1009]
抗炎症性サイトカインレベルが、刺激されたT細胞による炎症性サイトカインの産生を対照と比べて少なくとも20％阻害するために十分であり、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞である、本発明1001〜1008のいずれかの間葉系幹細胞。
[本発明1010]
炎症性サイトカインが、IFNγ、IL-17A、IL-1β、IL-6、およびTNFαより選択される、本発明1009の間葉系幹細胞。
[本発明1011]
T細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、γδT細胞、およびT制御性細胞より選択される、本発明1009または1010の間葉系幹細胞。
[本発明1012]
炎症応答を対照と比べて少なくとも20％阻害するために十分なレベルの少なくとも3種の抗炎症性サイトカインを産生するように改変されており、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞である、本発明1001〜1011のいずれかの間葉系幹細胞。
[本発明1013]
ホーミング分子を発現するように改変されている、本発明1001〜1012のいずれかの間葉系幹細胞。
[本発明1014]
ホーミング分子が、抗インテグリンα4β7；抗MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；およびGPR15より選択される、本発明1013の間葉系幹細胞。
[本発明1015]
ホーミング分子が、CXCR4、CCR2、CCR9、およびGPR15より選択される、本発明1014の間葉系幹細胞。
[本発明1016]
（a）2種のサイトカインのうちの一方をコードする第1のヌクレオチド配列と2種のサイトカインのうちの他方をコードする第2のヌクレオチド配列とに機能的に連結されたプロモーターを含む核酸であって、任意で、第1および第2のヌクレオチド配列が介在ヌクレオチド配列によって分離されており、任意で、介在配列がIRES配列であるかもしくは2Aペプチドをコードする、核酸；
（b）（i）2種のサイトカインのうちの一方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第1のプロモーターと（ii）2種のサイトカインのうちの他方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第2のプロモーターとを含む核酸；または
（c）2種のサイトカインのうちの一方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第1のプロモーターを含む第1の核酸と2種のサイトカインのうちの他方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第2のプロモーターを含む第2の核酸
を含む、本発明1001〜1015のいずれかの間葉系幹細胞。
[本発明1017]
（a）のプロモーター、（b）の第1および/もしくは第2のプロモーター、ならびに/または（c）の第1および/もしくは第2のプロモーターが、誘導性プロモーターである、本発明1016の間葉系幹細胞。
[本発明1018]
誘導性プロモーターが核内因子κB（NFκB）応答性プロモーターである、本発明1017の間葉系幹細胞。
[本発明1019]
（a）の核酸、（b）の核酸、ならびに/または（c）の第1および/もしくは第2の核酸が、レポーター分子をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターをさらに含む、本発明1016〜1018のいずれかの間葉系幹細胞。
[本発明1020]
2種の抗炎症性サイトカインを産生するように改変された間葉系幹細胞の調製物の治療的有効量を対象へ送達する工程を含む方法であって、治療的有効量が対象における炎症応答を阻害するために十分である、前記方法。
[本発明1021]
炎症応答が対照と比べて少なくとも20％阻害され、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞の調製物である、本発明1020の方法。
[本発明1022]
抗炎症性サイトカインが、IL-4、IL-10、およびIL-22より選択される、本発明1020または1021の方法。
[本発明1023]
抗炎症性サイトカインがIL-4およびIL-10である、本発明1022の方法。
[本発明1024]
抗炎症性サイトカインがIL-4およびIL-22である、本発明1022の方法。
[本発明1025]
抗炎症性サイトカインがIL-10およびIL-22である、本発明1022の方法。
[本発明1026]
間葉系幹細胞が、骨髄、脂肪組織、または臍帯組織に由来する、本発明1020〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
治療的有効量が、制御性T細胞免疫表現型を誘導するために十分である、本発明1020〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
治療的有効量が、刺激されたT細胞による炎症性サイトカインの産生を対照と比べて少なくとも20％阻害するために十分であり、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞の調製物である、本発明1020〜1027のいずれかの方法。
[本発明1029]
炎症性サイトカインが、IFNγ、IL-17A、IL-1β、IL-6、およびTNFαより選択される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
T細胞が、CD8+T細胞、CD4+T細胞、γδT細胞、およびT制御性細胞より選択される、本発明1028または1029の方法。
[本発明1031]
間葉系幹細胞が、少なくとも3種の抗炎症性サイトカインを産生するように改変されている、本発明1020〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
対象が炎症性腸疾患の症状を示す、本発明1020〜1031のいずれかの方法。
[本発明1033]
対象が炎症性腸疾患を有すると診断されている、本発明1032の方法。
[本発明1034]
炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、本発明1032または1033の方法。
[本発明1035]
治療的有効量が、対象における体重減少を対照と比べて少なくとも20％低下させ、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞の調製物である、本発明1020〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
治療的有効量が、対象におけるリポカリン2のレベルを対照と比べて少なくとも20％低下させ、任意で、対照が未修飾の間葉系幹細胞の調製物である、本発明1020〜1035のいずれかの方法。
[本発明1037]
間葉系幹細胞が、ホーミング分子を発現するように改変されている、本発明1020〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
ホーミング分子が、抗インテグリンα4β7；抗MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；およびGPR15より選択される、本発明1037の方法。
[本発明1039]
ホーミング分子が、CXCR4、CCR2、CCR9、およびGPR15より選択される、本発明1038の方法。
[本発明1040]
間葉系幹細胞が、
（a）2種のサイトカインのうちの一方をコードする第1のヌクレオチド配列と2種のサイトカインのうちの他方をコードする第2のヌクレオチド配列とに機能的に連結されたプロモーターを含む核酸であって、任意で、第1および第2のヌクレオチド配列が介在ヌクレオチド配列によって分離されており、任意で、介在配列がIRES配列であるかもしくは2Aペプチドをコードする、核酸；
（b）（i）2種のサイトカインのうちの一方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第1のプロモーターと（ii）2種のサイトカインのうちの他方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第2のプロモーターとを含む核酸；または
（c）2種のサイトカインのうちの一方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第1のプロモーターを含む第1の核酸と2種のサイトカインのうちの他方をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された第2のプロモーターを含む第2の核酸
を含む、本発明1020〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
（a）のプロモーター、（b）の第1および/もしくは第2のプロモーター、ならびに/または（c）の第1および/もしくは第2のプロモーターが、誘導性プロモーターである、本発明1040の方法。
[本発明1042]
誘導性プロモーターが核内因子κB（NFκB）応答性プロモーターである、本発明1041の方法。
[本発明1043]
エフェクター分子をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された核内因子κB（NFκB）応答性プロモーターを含む、改変型核酸。
[本発明1044]
エフェクター分子が抗炎症性サイトカインである、本発明1043の改変型核酸。
[本発明1045]
抗炎症性サイトカインが、IL-4、IL-10、およびIL-22より選択される、本発明1044の改変型核酸。
[本発明1046]
複数のエフェクター分子を産生するように改変された間葉系幹細胞であって、エフェクター分子のうちの少なくとも2種がインビボで免疫系の異なる細胞型を調節する、前記間葉系幹細胞。
[本発明1047]
（a）少なくとも2種のエフェクター分子をコードする少なくとも1種の改変型核酸を間葉系幹細胞へ送達する工程、または
（b）少なくとも1種のエフェクター分子を各々コードする少なくとも2種の改変型核酸を間葉系幹細胞へ送達する工程
を含む、多機能性免疫調節性細胞を作製する方法であって、各エフェクター分子が、免疫系の異なる細胞型を調節するかまたは細胞の異なる機能を調節する、前記方法。
[本発明1048]
エフェクター分子を産生するよう各々改変された少なくとも2種の間葉系幹細胞を対象へ送達する工程を含む、対象の免疫系の複数の細胞型を調節する方法であって、エフェクター分子のうちの少なくとも2種が免疫系の異なる細胞型を調節する、前記方法。
[本発明1049]
炎症応答を阻害するために十分なレベルのエフェクター分子およびホーミング分子を産生するように改変された、間葉系幹細胞。
[本発明1050]
エフェクター分子が、IL-4、IL-10、IL-35、PD-L1-Ig、抗TNFα、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、α1アンチトリプシン、IL-22、IL-19、およびIL-20より選択される、本発明1049の間葉系幹細胞。
[本発明1051]
ホーミング分子が、抗インテグリンα4β7；抗MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；およびGPR15より選択される、本発明1050の間葉系幹細胞。