【手続補正書】
【提出日】令和3年2月25日(2021.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の核酸を得ることであって、ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸であること；
（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；
（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含むこと；
（ｄ）非ライゲーション一本鎖第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせることにより、前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを除去すること；
（ｅ）前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；および
（ｆ）前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記リン酸化ライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし、それにより、核酸のライブラリーを得ること
を含む、方法。
【請求項２】
前記第２アダプターの５’末端がリン酸化されていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２アダプターが基体に付着されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記基体がビーズまたはフローセルを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記キャプチャープローブが溶液中にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記キャプチャープローブが、前記第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含み、必要に応じて、前記キャプチャープローブの３’末端が保護基を含み、必要に応じて、前記キャプチャープローブの５’末端が保護基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化することが、前記ライゲーション一本鎖核酸をキナーゼと接触させることを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）〜（ｆ）を単一反応体積で実施し、必要に応じて、工程（ｂ）〜（ｆ）を単一反応容器で実施する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１アダプターおよび／または第２アダプターがシーケンシングプライマー結合部位を含み、必要に応じて、前記シーケンシングプライマー結合部位がＰ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体、あるいはアダプターインデックスを含み、必要に応じて、前記第１アダプターインデックスが前記第２アダプターインデックスと異なり、必要に応じて、前記アダプターインデックスが、前記複数の核酸の供給源を示す、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記保護基が３’スペーサーＣ３またはジデオキシヌクレオチドを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記リガーゼが一本鎖核酸リガーゼを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
体積排除剤の存在下で、前記第１アダプターのライゲーションおよび／または前記第２アダプターのライゲーションを実施し、前記体積排除剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ヘタスターチ、フィコールおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択され、必要に応じて、少なくとも約３７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む反応体積で、前記第１ライゲーション工程および／または第２ライゲーション工程を実施する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数の核酸の平均核酸サイズが約２００ヌクレオチド未満であり、必要に応じて、前記複数の核酸が低品質核酸供給源から得られ、前記複数の核酸が固定サンプルから得られる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
核酸の前記ライブラリーを増幅することをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸の前記ライブラリーからシーケンスデータを得ることをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
いくつかの実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つの反応容器と、シーケンシングデータを得るための検出器とを含むシステムを含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
核酸ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の核酸を得ることであって、ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸であること；
（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；
（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含むこと；
（ｄ）前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；および
（ｅ）前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記リン酸化ライゲーション一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし、それにより、核酸のライブラリーを得ること
を含む、方法。
（項目２）
前記第２アダプターの５’末端がリン酸化されていない、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第２アダプターが基体に付着されている、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記基体がビーズまたはフローセルを含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
工程（ｅ）の前に、非ライゲーション一本鎖第１アダプターを除去することを含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせることを含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記キャプチャープローブが、前記第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記キャプチャープローブの３’末端が保護基を含む、項目６または７に記載の方法。
（項目９）
前記キャプチャープローブの５’末端が保護基を含む、項目６〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを消化することを含む、項目５に記載の方法。
（項目１１）
前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを消化することが、前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼと接触させることを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを消化することが、前記非ライゲーション一本鎖第１アダプターを５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼおよび５’デアデニラーゼと接触させることを含む、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化することが、前記ライゲーション一本鎖核酸をキナーゼと接触させることを含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
核酸ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の核酸を得ることであって、ここで、前記複数の核酸は二本鎖核酸であること；
（ｂ）前記二本鎖核酸を５’エキソヌクレアーゼと接触させて、一本鎖３’オーバーハングを有する複数の改変二本鎖核酸を得ること；
（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記改変二本鎖核酸の３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含むこと；（ｄ）前記第１アダプターにライゲーションされた前記改変二本鎖核酸を脱ハイブリダイズさせて、複数の一本鎖核酸を得ること；および
（ｅ）前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記一本鎖核酸の５’末端にライゲーションし、それにより、核酸のライブラリーを得ること
を含む、方法。
（項目１５）
前記第２アダプターの５’末端がリン酸化されていない、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
核酸ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の核酸を得ることであって、ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸であること；
（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；
（ｃ）リガーゼの存在下で、第１アダプターを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含むこと；
（ｄ）前記ライゲーション第１アダプターをキャプチャープローブとハイブリダイズさせること；
（ｅ）前記キャプチャープローブを伸長させ、前記リガーゼの存在下で、第２アダプターを前記伸長キャプチャープローブの３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記第２アダプターの３’末端は保護基を含み、それにより、核酸のライブラリーを得ること
を含む、方法。
（項目１７）
前記伸長キャプチャープローブから前記ハイブリダイズライゲーション第１アダプターを除去することを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記キャプチャープローブが基体に付着されている、項目１６または１７に記載の方法。
（項目１９）
前記基体がビーズまたはフローセルを含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記キャプチャープローブがキャプチャープローブインデックスを含む、項目１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記キャプチャープローブが切断可能リンカーを含む、項目１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記切断可能リンカーを切断することを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
核酸ライブラリーを調製する方法であって、
（ａ）複数の核酸を得ることであって、ここで、前記複数の核酸は一本鎖核酸であること；
（ｂ）前記一本鎖核酸の５’末端を脱リン酸化すること；
（ｃ）リンカーを前記一本鎖核酸の３’末端にライゲーションすることであって、ここで、前記リンカーは第１アダプターおよび第２アダプターを含み、前記リンカーの３’末端は保護基を含むこと；
（ｄ）前記ライゲーション一本鎖核酸の５’末端をリン酸化すること；
（ｅ）前記リン酸化核酸の３’末端を脱保護し、ライゲーションにより前記脱保護核酸を環状化することであって、それにより、環状核酸のライブラリーを得ること
を含む、方法。
（項目２４）
前記リンカーが、前記第１アダプターと前記第２アダプターとの間に切断可能部位を含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記切断可能リンカーにおける切断により、前記環状核酸を線状化することをさらに含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記切断可能部位がウラシル残基を含む、項目２４または２５に記載の方法。
（項目２７）
前記環状核酸をウラシル特異的切除試薬と接触させることを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ウラシル特異的切除試薬が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩから選択される酵素を含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
少なくともプライマーを前記第１アダプターまたは前記第２アダプターにハイブリダイズさせることを含む方法により、前記環状核酸を増幅することをさらに含む、項目２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記増幅することが、ＰＣＲおよびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）から選択される、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記増幅することが、前記環状核酸を、テンプレート中のウラシル残基との接触により線状生成物を形成するポリメラーゼと接触させることを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記一本鎖核酸の５’末端の脱リン酸化が、前記一本鎖核酸をホスファターゼと接触させることを含む、項目２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
工程（ｂ）〜（ｅ）を単一反応体積で実施する、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
工程（ｂ）〜（ｅ）を単一反応容器で実施する、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記第１アダプターおよび／または第２アダプターがシーケンシングプライマー結合部位を含む、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記第１アダプターがＰ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記第２アダプターがＰ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３８）
前記第１アダプターおよび／または第２アダプターがアダプターインデックスを含む、項目１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記第１アダプターインデックスが前記第２アダプターインデックスと異なる、項目３８に記載の方法。
（項目４０）
前記アダプターインデックスが、前記複数の核酸の供給源を示す、項目３８または３９に記載の方法。
（項目４１）
前記保護基が３’スペーサーＣ３またはジデオキシヌクレオチドを含む、項目１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記リガーゼが一本鎖核酸リガーゼを含む、項目１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
体積排除剤の存在下で、前記第１アダプターのライゲーションおよび／または前記第２アダプターのライゲーションを実施する、項目１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記体積排除剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ヘタスターチ、フィコールおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
少なくとも約３７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む反応体積で、前記第１ライゲーション工程および／または第２ライゲーション工程を実施する、項目４３に記載の方法。
（項目４６）
少なくとも約６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む反応体積で、前記第１ライゲーション工程および／または第２ライゲーション工程を実施する、項目４３に記載の方法。
（項目４７）
前記複数の核酸がＲＮＡを含む、項目１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記複数の核酸がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む、項目１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記複数の核酸の平均核酸サイズが約２００ヌクレオチド未満である、項目１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記複数の核酸が低品質核酸供給源から得られる、項目１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記複数の核酸が固定サンプルから得られる、項目５０に記載の方法。
（項目５２）
核酸の前記ライブラリーを増幅することをさらに含む、項目１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
核酸の前記ライブラリーからシーケンスデータを得ることをさらに含む、項目１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
項目１〜５３のいずれか一項に記載の方法により調製される、核酸ライブラリー。
（項目５５）
第１アダプターであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含み、Ｐ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む第１アダプター；
リガーゼ；ならびに
構成要素であって、体積排除剤、キナーゼ、ホスファターゼ、５’リン酸依存性エキソヌクレアーゼ、５’デアデニラーゼ、テンプレート中のウラシル残基との接触により線状生成物を形成するポリメラーゼ、ウラシル特異的切除試薬、および第２アダプターであって、Ｐ７配列、Ｐ５配列またはその相補体もしくは逆相補体を含む第２アダプターからなる群より選択される構成要素
を含む、キット。
（項目５６）
リンカーが前記第１および前記第２アダプターを含む、項目５５に記載のキット。
（項目５７）
複数の核酸；
第１アダプターであって、ここで、前記第１アダプターの３’末端は保護基を含む
第１アダプター；
リガーゼ；および
体積排除剤
を含む反応体積を含む、反応容器。
（項目５８）
前記複数の核酸が一本鎖核酸である、項目５７に記載の反応容器。
（項目５９）
前記第１アダプターが前記複数の一本鎖核酸の３’末端にライゲーションされており、それにより、複数の改変一本鎖核酸を形成する、項目５８に記載の反応容器。
（項目６０）
非ライゲーション第１アダプターがキャプチャープローブにハイブリダイズされている、項目５９に記載の反応容器。
（項目６１）
前記キャプチャープローブが、前記第１アダプターの少なくとも一部に相補的な配列を含む、項目６０に記載の反応容器。
（項目６２）
前記複数の核酸が、３’オーバーハングを有する二本鎖核酸である、項目５７に記載の反応容器。
（項目６３）
前記第１アダプターが、３’オーバーハングを有する前記複数の二本鎖核酸の３’末端にライゲーションされており、それにより、複数の改変二本鎖核酸を形成する、項目６２に記載の反応容器。
（項目６４）
第２アダプターをさらに含む、項目５７〜６３のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目６５）
前記第２アダプターの５’末端がリン酸化されていない、項目６４に記載の反応容器。
（項目６６）
脱リン酸化剤を含む、項目５７〜６５のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目６７）
前記脱リン酸化剤がホスファターゼを含む、項目６６に記載の反応容器。
（項目６８）
前記ホスファターゼが不活性化されている、項目６７に記載の反応容器。
（項目６９）
前記体積排除剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ヘタスターチ、フィコールおよびポリビニルピロリドンからなる群より選択される、項目５７〜６８のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目７０）
前記反応体積が少なくとも約３７％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む、項目６９に記載の反応容器。
（項目７１）
前記反応体積が少なくとも約６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧを含む、項目６９に記載の反応容器。
（項目７２）
前記第１アダプターおよび／または第２アダプターがシーケンシングプライマー結合部位を含む、項目６４〜７１のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目７３）
前記第１アダプターおよび／または第２アダプターがアダプターインデックスを含む、項目６４〜７２のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目７４）
前記第１アダプターインデックスが前記第２アダプターインデックスとは異なる、項目７３に記載の反応容器。
（項目７５）
前記アダプターインデックスが、前記複数の一本鎖核酸の供給源を示す、項目７３に記載の反応容器。
（項目７６）
前記保護基が３’スペーサーＣ３またはジデオキシヌクレオチドを含む、項目５７〜７５のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目７７）
前記保護基が３’スペーサーＣ３を含む、項目５７〜７６のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目７８）
前記リガーゼが一本鎖核酸リガーゼを含む、項目５７〜７７のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目７９）
前記複数の核酸がＲＮＡを含む、項目５７〜７８のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目８０）
前記複数の核酸がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む、項目５７〜７８のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目８１）
前記複数の一本鎖核酸が低品質核酸供給源から得られる、項目５７〜８０のいずれか一項に記載の反応容器。
（項目８２）
前記複数の核酸が固定サンプルから得られる、項目８１に記載の反応容器。
（項目８３）
項目５７〜８２のいずれか一項に記載の反応容器を含む、フローセル。
（項目８４）
項目５７〜８２のいずれか一項に記載の反応容器と、シーケンシングデータを得るための検出器とを含む、システム。