【手続補正書】
【提出日】令和3年3月12日(2021.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が大腸癌（CRC）もしくは大腸腺腫（CRA）を有するかまたはCRCもしくはCRAを発症するリスクがあるかどうかを決定するために、腸サンプルを検査する方法であって、
該対象から取得した腸サンプルを処理して16S rRNA遺伝子配列データを得ること；および
16S rRNA遺伝子配列データを解析することを含む、該腸サンプル中の1種類または複数種類の微生物および/または操作的分類単位（OTU）のレベルを検出すること
を含み、
該腸サンプル中の2種類以上の微生物および/またはOTUのレベルにおける、対照サンプルと比較した増加により、該対象がCRCもしくはCRAを有するかまたはCRCもしくはCRAを発症するリスクがあることが示され、
該2種類以上の微生物および/またはOTUが、表1に記載される微生物および/またはOTUの群から選択される、方法。
【請求項２】
前記2種類以上の微生物および/またはOTUが、OTU識別子：OTU1167、OTU3191、OTU2573、OTU1044、OTU567およびOTU1873からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記2種類以上の微生物および/またはOTUが、OTU識別子：OTU1167、OTU2790、OTU3191およびOTU1044からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
16S rRNA遺伝子配列データを解析するステップが、腸サンプルから微生物のポリヌクレオチドを抽出すること、腸サンプルから抽出された16S rRNAポリヌクレオチドの配列を決定すること、対象の腸サンプルからの16S rRNA配列をStrainSelectデータベースの参照配列に対してアライメントすること、およびSS-UPを使用してデノボクラスタリングを行うことを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
SS-UPを使用して16S rRNA遺伝子配列データを解析するステップが、微生物および/またはOTUの株レベルの分解能を提供する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
SS-UPを使用して16S rRNA遺伝子配列データを解析するステップが、少なくとも約80％の受信者操作特性曲線下面積（AUROC）を提供する、請求項4または5に記載の方法。
【請求項７】
SS-UPを使用して16S rRNA遺伝子配列データを解析するステップが、QIIME-CRによって提供される種レベルの分解能と比較して、OTUの株レベルの分解能を提供する、請求項4〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
1種類または複数種類の微生物および/またはOTUのレベルを検出するステップが、複数のオリゴヌクレオチドを表1のOTUポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることを含むアッセイを実施することを含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数のオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:1〜660の少なくとも1つに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記1種類または複数種類の微生物および/またはOTUが、OTU1167 (SEQ ID NO:641〜647)、OTU3191 (SEQ ID NO:291〜513)、OTU1873 (648〜654)、OTU2573 (SEQ ID NO:8〜14)、OTU567 (SEQ ID NO:655〜660)、およびOTU1044 (SEQ ID NO:15〜25)からなる群より選択される、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
前記1種類または複数種類の微生物および/またはOTUが、OTU1167 (SEQ ID NO:641〜647)、OTU3191 (SEQ ID NO:291〜513)、OTU2790 (SEQ ID NO:191〜248)、およびOTU1044 (SEQ ID NO:15〜25)からなる群より選択される、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１２】
腸サンプル中の2種類以上の微生物および/またはOTUのレベルにおける、対照サンプルと比較した少なくとも約5％の増加により、対象がCRCもしくはCRAを有するかまたはCRCもしくはCRAを発症するリスクがあることが示される、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
腸サンプル中の1種類または複数種類の微生物および/またはOTUのレベルにおける、対照サンプルと比較した、log2変化倍率スケールで少なくとも約1.2倍の増加により、対象がCRCもしくはCRAを有するかまたはCRCもしくはCRAを発症するリスクがあることが示される、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
腸サンプル中の1種類または複数種類の微生物および/またはOTUのレベルにおける、対照サンプルと比較した少なくとも約2倍の増加により、対象がCRCもしくはCRAを有するかまたはCRCもしくはCRAを発症するリスクがあることが示される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対照サンプルが少なくとも5個体の健康な個体から収集された腸サンプルである、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
腸サンプルが便サンプルである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
便サンプル中の前記2種類以上の微生物のレベルにおける、対照サンプルと比較した増加により、対象がCRCを有するかまたはCRCを発症するリスクがあることが示される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
OTU1167 (SEQ ID NO:641〜647)、OTU3191 (SEQ ID NO:291〜513)、OTU1873 (648〜654)、OTU2573 (SEQ ID NO:8〜14)、OTU567 (SEQ ID NO:655〜660)、およびOTU1044 (SEQ ID NO:15〜25)のそれぞれの、少なくとも1つのOTUに相補的な複数のオリゴヌクレオチドを含む、対象におけるCRCまたはCRAを診断するための診断ツール。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
いくつかの局面では、以下の配列に相補的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む診断ツールが提供される：SEQ ID NO:641〜647 (OTU1167)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:291〜513 (OTU3191)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:191〜248 (OTU2790)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:113〜149 (OTU2589)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:249〜259 (OTU2910)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:514〜546 (OTU3364)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:26〜42 (OTU1169)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:648〜654 (OTU1873)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:92〜98 (OTU2049)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:8〜14 (OTU2573)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:1〜7 (OTU2703)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:260〜290 (OTU295)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:655〜660 (OTU567)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:560〜587 (OTU569)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:588〜640 (OTU969)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:15〜25 (OTU1044)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:43〜49 (OTU1255)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:50〜91 (OTU1926)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:99〜112 (OTU2405)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:150〜190 (OTU2691)の少なくとも各1つずつ、およびSEQ ID NO:547〜559 (OTU467)の少なくとも各1つずつ。他の態様では、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、以下の配列に相補的である：SEQ ID NO:641〜647 (OTU1167)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:291〜513 (OTU3191)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:648〜654 (OTU1873)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:8〜14 (OTU2573)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:655〜660 (OTU567)の少なくとも各1つずつ、およびSEQ ID NO:15〜25 (OTU1044)の少なくとも各1つずつ。さらに他の態様では、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、以下の配列に相補的である：SEQ ID NO:641〜647 (OTU1167)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:291〜513 (OTU3191)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:191〜248 (OTU2790)の少なくとも各1つずつ、SEQ ID NO:8〜14 (OTU2573)の少なくとも各1つずつ、およびSEQ ID NO:15〜25 (OTU1044)の少なくとも各1つずつ。いくつかの態様では、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドのそれぞれの配列は、少なくとも1つのOTU配列の相補体と99％または100％同一である。いくつかの態様では、診断組成物はマイクロアレイである。他の態様では、診断組成物は、本開示の1つまたは複数のOTUを検出するためのポリメラーゼ連鎖反応を実施するための試薬をさらに含むキットである。
[本発明1001]
対象における大腸癌（CRC）または大腸腺腫（CRA）を診断するための方法であって、
該対象由来の腸サンプルを取得すること；
該腸サンプルを処理して16S rRNA遺伝子配列データを得ること；
16S rRNA遺伝子配列データを解析することを含む、該腸サンプル中の1種類または複数種類の微生物および/または操作的分類単位（OTU）のレベルを検出すること；および
該腸サンプル中の2種類以上の微生物および/またはOTUのレベルが対照サンプルと比較して増加している場合、該対象をCRCもしくはCRAがあるまたはCRCもしくはCRAを発症するリスクがあると診断すること
を含み、ここで、該2種類以上の微生物および/またはOTUが、表1に記載される微生物および/またはOTUの群から選択される、方法。
[本発明1002]
前記2種類以上の微生物および/またはOTUが、OTU識別子：OTU1167、OTU3191、OTU2573、OTU1044、OTU567およびOTU1873からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記2種類以上の微生物および/またはOTUが、OTU識別子：OTU1167、OTU2790、OTU3191およびOTU1044からなる群より選択される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
16S rRNA遺伝子配列データを解析するステップが、腸サンプルから微生物のポリヌクレオチドを抽出すること、腸サンプルから抽出された16S rRNAポリヌクレオチドの配列を決定すること、対象の腸サンプルからの16S rRNA配列をStrainSelectデータベースの参照配列に対してアライメントすること、およびSS-UPを使用してデノボクラスタリングを行うことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
SS-UPを使用して16S rRNA遺伝子配列データを解析するステップが、微生物および/またはOTUの株レベルの分解能を提供する、本発明1004の方法。
[本発明1006]
SS-UPを使用して16S rRNA遺伝子配列データを解析するステップが、少なくとも約80％の受信者操作特性曲線下面積（AUROC）を提供する、本発明1004の方法。
[本発明1007]
SS-UPを使用して16S rRNA遺伝子配列データを解析するステップが、QIIME-CRによって提供される種レベルの分解能と比較して、OTUの株レベルの分解能を提供する、本発明1004の方法。
[本発明1008]
1種類または複数種類の微生物および/またはOTUのレベルを検出するステップが、複数のオリゴヌクレオチドを表1のOTUポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることを含むアッセイを実施することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記複数のオリゴヌクレオチドがSEQ ID NO:1〜660の少なくとも1つに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
前記1種類または複数種類の微生物および/またはOTUが、OTU1167 (SEQ ID NO:641〜647)、OTU3191 (SEQ ID NO:291〜513)、OTU1873 (648〜654)、OTU2573 (SEQ ID NO:8〜14)、OTU567 (SEQ ID NO:655〜660)、およびOTU1044 (SEQ ID NO:15〜25)からなる群より選択される、本発明1008の方法。
[本発明1011]
前記1種類または複数種類の微生物および/またはOTUが、OTU1167 (SEQ ID NO:641〜647)、OTU3191 (SEQ ID NO:291〜513)、OTU2790 (SEQ ID NO:191〜248)、およびOTU1044 (SEQ ID NO:15〜25)からなる群より選択される、本発明1008の方法。
[本発明1012]
腸サンプル中の2種類以上の微生物および/またはOTUのレベルが対照サンプルと比較して少なくとも約5％増加している場合、対象はCRCもしくはCRAがあるまたはCRCもしくはCRAを発症するリスクがあると診断される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
腸サンプル中の1種類または複数種類の微生物および/またはOTUのレベルが、対照サンプルと比較して、log2変化倍率スケールで少なくとも約1.2倍増加している場合、対象はCRCもしくはCRAがあるまたはCRCもしくはCRAを発症するリスクがあると診断される、本発明1001の方法。
[本発明1014]
腸サンプル中の1種類または複数種類の微生物および/またはOTUのレベルが、対照サンプルと比較して、少なくとも約2倍増加している場合、対象はCRCもしくはCRAがあるまたはCRCもしくはCRAを発症するリスクがあると診断される、本発明1001の方法。
[本発明1015]
対照サンプルが少なくとも5個体の健康な個体から収集された腸サンプルである、本発明1001の方法。
[本発明1016]
腸サンプルが便サンプルである、本発明1001の方法。
[本発明1017]
便サンプル中の前記2種類以上の微生物のレベルが対照サンプルと比較して増加している場合、対象をCRCがあるまたはCRCを発症するリスクがあると診断することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
OTU1167 (SEQ ID NO:641〜647)、OTU3191 (SEQ ID NO:291〜513)、OTU1873 (648〜654)、OTU2573 (SEQ ID NO:8〜14)、OTU567 (SEQ ID NO:655〜660)、およびOTU1044 (SEQ ID NO:15〜25)のそれぞれの、少なくとも1つのOTUに相補的な複数のオリゴヌクレオチドを含む、対象におけるCRCまたはCRAを診断するための診断ツール。