【手続補正書】
【提出日】令和3年4月30日(2021.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ(i)及び(ii)を含むγδ T細胞を増幅させる方法であって：
(i) 非造血組織から得られたγδ T細胞の集団を提供するステップ；
(ii) 前記γδ T細胞を、効果的な量の
(a) IL-2またはIL-9;
(b) IL-15；および
(c) IL-21
の存在下で少なくとも5日間培養して増幅されたγδ T細胞の集団を生成するステップ；
前記方法は、ステップ(i)の後に、γδ T細胞を非造血細胞から分離して、分離されたγδ T細胞の集団を生成するステップを含み、かつ、ステップ(ii)は、実質的にストロマ細胞との接触のない条件下でのγδ T細胞の培養を含み、
ステップ（ii）は、外因性TCR経路アゴニストのない条件下でのγδ T細胞の培養を含む、方法。
【請求項２】
ステップ(ii)が、さらにIL-4の存在下でのγδ T細胞の培養を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ(ii)が、さらに、前記γδ T細胞を、IL-2と、IL-15と、IL-21、ストロマ細胞由来因子（SDF）、IL-1β、IL-12、IL-18およびIL-33からなる群より選択される少なくとも1つの因子と、の存在下で少なくとも5日間培養して、増幅されたγδ T細胞の集団を生成するステップ；を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ(ii)が、無血清培地でのγδ T細胞の培養を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ(i)の後、分離されたγδ T細胞の集団を生成するために、前記γδ T細胞を非造血細胞から分離する工程をさらに含み、かつ、
ステップ(ii)が以下を含む：
(a) 実質的に腫瘍細胞との接触がない、γδ T細胞の培養；および/または
(b) 実質的に支持細胞との接触がない、γδ T細胞の培養；
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(ii)が無血清培地でのγδ T細胞の培養を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ(iii)が、実質的にストロマ細胞と前記γδ T細胞との接触がない条件下でのγδ T細胞の培養を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
非造血細胞からγδ T細胞を分離するステップが、非造血組織から細胞を放出させるように構築された合成スキャホールド上でのγδ T細胞の培養を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
非造血細胞からγδ T細胞を分離するステップが、IL-2および/またはIL-15の存在下でのγδ T細胞と非造血細胞との培養を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
分離されたリンパ球の集団が分離されたγδ T細胞の集団を含み、前記分離されたγδ T細胞の集団が分離されたVδ1 T細胞の集団を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
(a)前記分離されたγδ T細胞の集団の少なくとも80％が、増幅前のVδ1 T細胞である、及び/又は、
(b)前記分離されたγδ T細胞の集団の10％未満が、増幅前のVδ2 T細胞である、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
αβ T細胞および/またはNK細胞は、前記分離されたγδ T細胞の集団から除去される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
14日間以内の培養で、増幅されたγδ T細胞の集団が、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも20倍の数のγδ T細胞を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
21日間以内の培養で、増幅されたγδ T細胞の集団が、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも50倍の数のγδ T細胞を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増幅されたγδ T細胞の集団が、増幅されたVδ1 T細胞の集団を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
14日間以内の培養で、増幅されたVδ1 T細胞の集団が、増幅前の分離されたVδ1 T細胞の集団と比較して、少なくとも20倍の数のVδ1 T細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
21日間以内の培養で、増幅されたVδ1 T細胞の集団が、増幅前の分離されたVδ1 T細胞の集団と比較して、少なくとも50倍の数のVδ1 T細胞を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非造血組織が皮膚である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
他の実施形態は特許請求の範囲内にある。
（１）以下のステップ：
(i) 非造血組織から得られたγδ T細胞の集団を提供するステップ；  
(ii) 前記γδ T細胞を、効果的な量の
(a) IL-2またはIL-9;
(b) IL-15；および
(c) IL-21
の存在下で少なくとも5日間培養して増幅されたγδ T細胞の集団を生成するステップ；
を含む、γδ T細胞を増幅させる方法。
（２）ステップ(ii)が、さらにIL-4の存在下でのγδ T細胞の培養を含む、（１）に記載の方法。
（３）以下のステップ：
(i) 非造血組織から得られたγδ T細胞の集団を提供するステップ；
(ii) 前記γδ T細胞を、IL-2と、IL-15と、IL-21、ストロマ細胞由来因子（SDF）、IL-1β、IL-12、IL-18およびIL-33からなる群より選択される少なくとも1つの因子と、の存在下で少なくとも5日間培養して、増幅されたγδ T細胞の集団を生成するステップ；  を含む、γδ T細胞を増幅させる方法。
（４）ステップ(ii)が、外因性TCR経路アゴニストの不存在下でのγδ T細胞の培養を含む、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）ステップ(ii)が、無血清培地でのγδ T細胞の培養を含む、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）ステップ(i)の後、分離されたγδ T細胞の集団を生成するために、前記γδ T細胞を非造血細胞から分離する工程をさらに含み、かつ、
ステップ(ii)が以下を含む：
(a) 実質的にストロマ細胞との接触がない、γδ T細胞の培養；
(b) 実質的に腫瘍細胞との接触がない、γδ T細胞の培養；および/または
(c) 実質的に支持細胞との接触がない、γδ T細胞の培養；  
（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）以下のステップ：
(i) 非造血細胞およびγδ T細胞を含む非造血組織を提供するステップ；
(ii) γδ T細胞を非造血細胞から分離して、分離されたγδ T細胞の集団を得るステップ；
(iii) 前記γδ T細胞を、IL-2と、IL-15と、IL-21、SDF、IL-1β、IL-12、IL-18およびIL-33からなる群より選択される因子と、の存在下で少なくとも5日間培養して、増幅されたγδ T細胞の集団を生成するステップ；
を含む、γδ T細胞を増幅させる方法。
（８）前記非造血組織は、ヒトまたは非ヒト動物の対象から得られたものである、（７）に記載の方法。
（９）ステップ(ii)が、IL-2、IL-15およびIL-21の存在下でのγδ T細胞の培養を含む、（７）または（８）に記載の方法。
（１０）ステップ(ii)が無血清培地でのγδ T細胞の培養を含む、（７）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）ステップ(iii)が、実質的にストロマ細胞と前記γδ T細胞との接触がない条件下でのγδ T細胞の培養を含む、（７）〜（１０）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）ステップ(iii)が、外因性TCR経路アゴニストが存在しない条件下でのγδ T細胞の培養を含む、（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法。
（１３）非造血細胞からγδ T細胞を分離するステップが、非造血組織から細胞を放出させるように構築された合成スキャホールド上でのγδ T細胞の培養を含む、（６）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）非造血細胞からγδ T細胞を分離するステップが、IL-2および/またはIL-15の存在下でのγδ T細胞と非造血細胞との培養を含む、（６）〜（１３）のいずれか１項に記載の方法。
（１５）分離されたリンパ球の集団が分離されたγδ T細胞の集団を含み、前記分離されたγδ T細胞の集団が分離されたVδ1 T細胞の集団を含む、（６）〜（１４）のいずれか１項に記載の方法。
（１６）前記分離されたリンパ球の集団の1〜10％が、増幅前のγδ T細胞である、（１５）に記載の方法。
（１７）前記分離されたリンパ球の集団の1〜10％が、増幅前のVδ1 T細胞である、（１５）または（１６）に記載の方法。
（１８）前記分離されたγδ T細胞の集団の少なくとも80％が、増幅前のVδ1 T細胞である、（６）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法。
（１９）前記分離されたγδ T細胞の集団の10％未満が、増幅前のVδ2 T細胞である、（６）〜（１８）のいずれか１項に記載の方法。
（２０）αβ T細胞および/またはNK細胞は、前記分離されたγδ T細胞の集団から除去される、（６）〜（１９）のいずれか１項に記載の方法。
（２１）増幅前に、前記分離されたγδ T細胞の集団が、少なくとも10％のCCR3+細胞、少なくとも10％のCCR4+細胞、少なくとも10％のCCR7+細胞、少なくとも10％のCCR8+細胞、または少なくとも10％のCD103+細胞を含む、（６）〜（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２２）増幅前に、前記分離されたγδ T細胞の集団が、参照となる血液常在性Vδ2 T細胞の集団と比較して、高頻度のCCR3+細胞、CCR4+細胞、CCR7+細胞および/またはCCR8+細胞を含む、（６）〜（２１）のいずれか１項に記載の方法。
（２３）前記分離されたVδ1 T細胞の集団が、参照となる血液常在性Vδ1 T細胞の集団と比較して、高頻度のNKG2D+細胞、CD56+細胞、CD69+細胞および/またはTIM3+細胞を含む、（１４）〜（２２）のいずれか１項に記載の方法。
（２４）14日間以内の培養で、増幅されたγδ T細胞の集団が、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも20倍の数のγδ T細胞を含む、（１）〜（２３）のいずれか１項に記載の方法。
（２５）21日間以内の培養で、増幅されたγδ T細胞の集団が、増幅前の分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも50倍の数のγδ T細胞を含む、（１）〜（２４）のいずれか１項に記載の方法。
（２６）前記増幅されたγδ T細胞の集団が、増幅されたVδ1 T細胞の集団を含む、（１）〜（２５）のいずれか１項に記載の方法。
（２７）14日間以内の培養で、増幅されたVδ1 T細胞の集団が、増幅前の分離されたVδ1 T細胞の集団と比較して、少なくとも20倍の数のVδ1 T細胞を含む、（２６）に記載の方法。
（２８）21日間以内の培養で、増幅されたVδ1 T細胞の集団が、増幅前の分離されたVδ1 T細胞の集団と比較して、少なくとも50倍の数のVδ1 T細胞を含む、（２６）または（２７）に記載の方法。
（２９）増幅されたγδ T細胞の集団がCD27を発現する、（１）〜（２８）のいずれか１項に記載の方法。
（３０）増幅されたγδ T細胞の集団が、分離されたγδ T細胞の集団よりも、高いCD27発現量の中央値を示す、（２９）に記載の方法。
（３１）増幅されたγδ T細胞の集団が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも2倍のCD27発現量の中央値を示す、（３０）に記載の方法。
（３２）増幅されたγδ T細胞の集団が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、高頻度のCD27+細胞を有する、（２９）に記載の方法。
（３３）増幅されたγδ T細胞の集団が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して、少なくとも5％高頻度のCD27+細胞を有する、（３２）に記載の方法。
（３４）増幅されたVδ1 T細胞の集団がCD27を発現する、（２６）〜（２８）のいずれか１項に記載の方法。
（３５）増幅されたVδ1 T細胞の集団が、分離されたVδ1 T細胞の集団よりも、高いCD27発現量の中央値を示す、（３４）に記載の方法。
（３６）増幅されたVδ1 T細胞の集団が、分離されたVδ1 T細胞の集団と比較して、少なくとも2倍のCD27発現量の中央値を示す、（３５）に記載の方法。
（３７）増幅されたVδ1 T細胞の集団が、分離されたVδ1 T細胞の集団と比較して、高頻度のCD27+細胞を有する、（３４）〜（３６）のいずれか１項に記載の方法。
（３８）増幅されたVδ1 T細胞の集団が、分離されたVδ1 T細胞の集団と比較して、少なくとも5％高頻度のCD27+細胞を有する、（３７）に記載の方法。
（３９）増幅されたγδ T細胞の集団が、分離されたγδ T細胞の集団よりも、低いTIGIT平均発現量を示す、（１）〜（３８）のいずれか１項に記載の方法。
（４０）増幅されたγδ T細胞の集団が、分離されたγδ T細胞の集団よりも、少なくとも50％低いTIGIT平均発現量を示す、（３９）に記載の方法。
（４１）増幅されたγδ T細胞の集団が、分離されたγδ T細胞の集団よりも、低頻度のTIGIT+細胞を有する、（３９）または（４０）に記載の方法。
（４２）増幅されたγδ T細胞の集団が、分離されたγδ T細胞の集団よりも、少なくとも20％低頻度のTIGIT+細胞を有する、（４１）に記載の方法。
（４３）増幅されたVδ1 T細胞の集団が、分離されたVδ1 T細胞の集団よりも、低いTIGIT平均発現量を示す、（２６）〜（２８）、または（３４）〜（３８）のいずれか１項に記載の方法。
（４４）増幅されたVδ1 T細胞の集団が、分離されたVδ1 T細胞の集団よりも、少なくとも50％低いTIGIT平均発現量を示す、（４３）に記載の方法。
（４５）増幅されたVδ1 T細胞の集団が、分離されたVδ1 T細胞の集団よりも、低頻度のTIGIT+細胞を有する、（２６）〜（２８）、または（３４）〜（３８）のいずれか１項に記載の方法。
（４６）増幅されたVδ1 T細胞の集団が、分離されたVδ1 T細胞の集団よりも、少なくとも20％低頻度のTIGIT+細胞を有する、（４５）に記載の方法。
（４７）増幅されたγδ T細胞の集団における、CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fasリガンド、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30、およびCD2からなる群から選択される1以上のマーカーの平均発現量が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して高い、（１）〜（４６）のいずれか１項に記載の方法。
（４８）増幅されたγδ T細胞の集団における、CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fasリガンド、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30、およびCD2からなる群から選択される1以上のマーカーを発現する細胞が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して高頻度である、（１）〜（４７）のいずれか１項に記載の方法。
（４９）増幅されたγδ T細胞の集団における、NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1およびCD64からなる群から選択される1以上のマーカーの平均発現量が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して低い、（１）〜（４８）のいずれか１項に記載の方法。
（５０）増幅されたγδ T細胞の集団における、NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1およびCD64からなる群から選択される1以上のマーカーを発現する細胞が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して低頻度である、（１）〜（４９）のいずれか１項に記載の方法。
（５１）増幅されたVδ1 T細胞の集団における、CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fasリガンド、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30、およびCD2からなる群から選択される1以上のマーカーの平均発現量が、分離されたVδ1 T細胞の集団と比較して高い、（２６）〜（２８）、（３４）〜（３８）、（４３）または（４５）のいずれか１項に記載の方法。
（５２）増幅されたγδ T細胞の集団における、CD124、CD215、CD360、CTLA4、CD1b、BTLA、CD39、CD45RA、Fasリガンド、CD25、ICAM-1、CD31、KLRG1、CD30、およびCD2からなる群から選択される1以上のマーカーを発現する細胞が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して高頻度である、（２６）〜（２８）、（３４）〜（３８）、（４３）、（４５）または（５１）のいずれか１項に記載の方法。
（５３）増幅されたγδ T細胞の集団における、NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1およびCD64からなる群から選択される1以上のマーカーの平均発現量が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して低い、（２６）〜（２８）、（３４）〜（３８）、（４３）、（４５）、（５１）または（５２）のいずれか１項に記載の方法。
（５４）増幅されたγδ T細胞の集団における、NKp44、NKp46、ICAM-2、CD70、CD28、CD103、NKp30、LAG3、CCR4、CD69、PD-1およびCD64からなる群から選択される1以上のマーカーを発現する細胞が、分離されたγδ T細胞の集団と比較して低頻度である、（２６）〜（２８）、（３４）〜（３８）、（４３）、（４５）または（５１）〜（５３）のいずれか１項に記載の方法。
（５５）ステップ(iii)が、実質的にストロマ細胞との接触がない、γδ T細胞の培養を含む、（８）〜（５４）のいずれか１項に記載の方法。
（５６）ステップ(iii)が、実質的に支持細胞との接触がない、γδ T細胞の培養を含む、（８）〜（５５）のいずれか１項に記載の方法。
（５７）ステップ(iii)が、実質的に腫瘍細胞との接触がない、γδ T細胞の培養を含む、（８）〜（５５）のいずれか１項に記載の方法。
（５８）前記非造血組織が腫瘍組織ではない、（１）〜（５７）のいずれか１項に記載の方法。
（５９）前記非造血組織が皮膚である、（１）〜（５８）のいずれか１項に記載の方法。
（６０）（１）〜（５９）のいずれかの方法により得られた、増幅されたγδ T細胞。
（６１）分離された集団のγδ T細胞の少なくとも50％がCD27を発現し、実質的にTIGITを発現しない、分離されたγδ T細胞の集団。
（６２）分離された集団のγδ T細胞の少なくとも50％がVδ1を発現する、請求項６１に記載の分離されたγδ T細胞の集団。
（６３）（６０）に記載の増幅されたγδ T細胞、または、（６１）若しくは（６２）に記載の分離されたγδ T細胞の集団を含む、医薬組成物。
（６４）対象における癌または感染症の治療方法に使用するための、（６３）に記載の医薬組成物。
（６５）対象における癌または感染症の治療用薬剤の製造における、（６３）に記載の医薬組成物の使用。
（６６）治療に効果的な量の、（１）〜（５９）のいずれか１項に記載の方法により得られた増幅されたγδ T細胞、請求項６０に記載の増幅されたγδ T細胞、（６１）若しくは（６２）に記載の分離された集団、または、（６３）に記載の医薬組成物を、治療を要する対象に投与するステップを含む、養子T細胞療法により対象を治療する方法。
（６７）増幅されたγδ T細胞の治療に効果的な量は、1投与あたり10×1012細胞未満である、（６６）に記載の方法。
（６８）前記治療を要する対象への1以上の追加の治療剤の投与を含む、（６６）または（６７）に記載の方法。
（６９）前記1以上の追加の治療剤は、免疫療法剤、細胞傷害剤、成長阻害剤、放射線治療剤、血管新生阻害剤、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、（６８）に記載の方法。
（７０）前記1以上の追加の治療剤は、前記増幅されたγδ T細胞と同時に投与される、（６８）または（６９）に記載の方法。
（７１）前記1以上の追加の治療剤は、前記増幅されたγδ T細胞の投与後に投与される、（６８）または（６９）に記載の方法。
（７２）前記追加の治療剤が、免疫療法剤である、（６８）〜（７１）のいずれか１項に記載の方法。
（７３）治療に有効な量の（６３）に記載の医薬組成物を、治療を要する対象に投与するステップを含む、養子T細胞療法により対象を治療する方法。
（７４）前記対象がヒトである、（６６）〜（７３）のいずれか１項に記載の方法。
（７５）前記ヒトがヒト癌患者である、（７４）に記載の方法。
（７６）前記ヒト癌患者が固形癌に対する治療を受けている、（７５）に記載の方法。
（７７）前記ヒトはウイルス感染に対する治療を受けている、（７６）に記載の方法。