(57)【要約】【課題】生体物質からなる改善効果に優れた脳機能改善用組成物、および該組成物を機能性食品として用いる脳機能改善方法を提供する。【解決手段】一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩とアミノ酸を共に含有する組成物を用いることによって、優れた脳機能改善効果が得られる。【化１】2010132599.tif 000007（式中のＲ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩とアミノ酸を共に含有することを特徴とする、脳機能改善用組成物。
【化１】
2010132599.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【請求項２】
グリシン、Ｌ−セリンおよびＬ−トリプトファンから選ばれる一種以上のアミノ酸を共に含有する、請求項１に記載の脳機能改善用組成物。
【請求項３】
グリシンを共に含有する、請求項２に記載の脳機能改善用組成物。
【請求項４】
請求項１から３の何れか一項に記載の脳機能改善用組成物を機能性食品として用いる、脳機能改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩とアミノ酸、特にグリシン、Ｌ−セリンおよびＬ−トリプトファンから選ばれる一種以上のアミノ酸を共に含有する脳機能改善用組成物、並びに該組成物を機能性食品として用いる脳機能改善方法に関する。ピロロキノリンキノン類またはその塩は新たなビタミンとして位置づけられた物質であり、グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トリプトファン等のアミノ酸は生理的にも栄養的にも大変重要な物質である。
【化１】
2010132599.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
【背景技術】
【０００２】
近年、総人口に占める老人の割合が急激に増加しており、それに伴って、加齢に伴う学習・記憶能力の低下や、更には疾病としての認知症の増加が問題になっている。認知症の原因としては、アルツハイマー病に代表される脳変性疾患、脳梗塞や脳出血等による脳血管障害、脳腫瘍、頭部外傷、感染症、代謝性疾患等が挙げられる。特に、高齢化の進展に伴って患者数が著しく増加しているのはアルツハイマー病である。アルツハイマー病は日本では認知症患者の約３０％、米国では４０〜６０％を占めると言われ、急激な短期の記銘力や記憶力の低下、人格障害等を引き起こすことを特徴としており、医療費、介護の面から大きな社会問題になっている。
【０００３】
本病では、脳組織の萎縮や脱落などを伴い、神経伝達物質であるアセチルコリンの減少が起こる。また、本病に特徴的なものとして、大脳皮質や海馬に存在する老人斑、神経原繊維変化があり、老人斑の中心に存在するアミロイドβ蛋白質と神経原繊維変化の構成蛋白質であるタウ蛋白質の両面から発病機構の研究が進められている。これらの発病機構を基に、治療薬の開発も進められており、アセチルコリンエステラーゼ阻害薬等が開発されているが、十分な効果を上げているとは未だ言い難い。即ち、発病後の回復は通常困難であり、対症療法的に進行を遅らせる治療にならざるを得ないのが現状である。
【０００４】
一方、近年、食品成分の機能研究が進み、脳機能に影響を与える成分も見出されており、本病を予防し、かつ進行を抑える機能を食品に求める動きが活発になっており(例えば、特許文献１〜３参照)、更に有効な食品素材の開発が切望されている。
【０００５】
【特許文献１】特開平７−１７８５５号公報
【特許文献２】特開平７−１４３８６２号公報
【特許文献３】特許第３１９５５９４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、脳機能の改善効果に優れた生体物質からなる組成物、および該組成物を機能性食品として用いる脳機能改善方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩と相乗効果を示す生理活性物質につき鋭意研究を重ねた結果、一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩とアミノ酸、特にグリシン、Ｌ−セリンおよびＬ−トリプトファンから選ばれる一種以上のアミノ酸を共に用いることにより、ピロロキノリンキノン類またはその塩単独の場合と比較して脳機能改善効果が著しく高まるという注目すべき新知見を見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
即ち、本発明は、以下の（１）から（４）に示す、ピロロキノリンキノン類またはその塩を含み、さらにアミノ酸を含有することを特徴とする、学習・記憶低下改善等の脳機能改善効果を有する製剤、および機能性食品に関するものである。具体的には、老化またはアルツハイマー病等に随伴する認知性障害による学習記憶能の低下を改善する脳機能改善剤および該改善剤を含有する機能性食品に関するものである。
（１）一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩とアミノ酸を共に含有することを特徴とする、脳機能改善用組成物。
【化２】
2010132599.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。）
（２）グリシン、Ｌ−セリンおよびＬ−トリプトファンから選ばれる一種以上のアミノ酸を共に含有する、（１）に記載の脳機能改善用組成物。
（３）グリシンを共に含有する、（２）に記載の脳機能改善用組成物。
（４）（１）から（３）の何れか一項に記載の脳機能改善用組成物を機能性食品として用いる、脳機能改善方法。
【発明の効果】
【０００９】
一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩とアミノ酸、特にグリシン、Ｌ−セリンおよびＬ−トリプトファンから選ばれる一種以上のアミノ酸を共に含んだ組成物を用いることによって、脳機能障害に伴う学習・記憶能力の低下等を、相乗的に、より効果的に改善することが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ピロロキノリンキノン類またはその塩とアミノ酸を有効成分として含有する脳機能改善剤、および該改善剤を含有する機能性食品に関する。
【００１１】
ピロロキノリンキノンは、１９７９年メタノール資化性菌のメタノール脱水素酵素の補酵素として見出された（Nature, 230, 843-844, 1979、FEBS  Letter, 108, 443-446, 1979）。細菌類以外にも、大豆、空豆、ピーマン、ジャガイモ、パセリ、ホウレンソウなどの食用植物や、酢、茶、ココア、納豆、豆腐等の加工食品からも検出されている（Biochem. Journal, 307, 331-333, 1995）。また、ヒトやラットの生体内にも存在すること（Biochimica et Biophysica Acta, 1156, 62-66, 1992）が報告されている。２００３年にはアミノ酸、リジンの酸化を触媒する酵素（2-アミノアジピン酸 6-セミアルデヒド脱水素酵素）の酸化還元補酵素として機能することが明らかとなり、新しいビタミンと位置付けられている化合物である（Nature, 422, 832, 2003）。
【００１２】
ピロロキノリンキノンおよびその誘導体の作用としては、脳機能改善作用（J. Clin. Biochem. Nutr., 42, 29-34, 2008）の他に、活性酸素除去作用（特開平5-078247号公報）、細胞の増殖促進作用（特開昭61-58584号公報）、アルドース還元酵素阻害作用（特開平6-256191号公報）、メラニン産生抑制および美白作用（特開平8-020512号公報）、紫外線吸収作用（特許第3625493号公報）、神経成長因子産生促進作用（特開平6-211660号公報）等が知られている。
【００１３】
本発明の対象となる一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩において、式中のＲ１、Ｒ２およびＲ３は、同一または異なって、水素原子、フェニル基、または短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基、アルケニル基若しくはアルキニル基を表す。
【００１４】
短鎖長のアルキル基、アラルキル基、アルキルアリール基のアルキル部分としては、例えば直鎖または分枝状の炭素数１〜６のアルキルが挙げられ、より具体的には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が挙げられ、中でもメチルまたはエチルが好ましい。
【００１５】
短鎖長のアラルキル基としては、例えば炭素数７〜１５のアラルキル基が挙げられ、より具体的にはベンジル、フェネチル、ベンズヒドリル、ナフチルメチル等が挙げられる。
【００１６】
短鎖長のアルキルアリールのアリール部分としては、例えば炭素数６〜１４のアリールが挙げられ、より具体的にはフェニル、ナフチル、アントリル等が挙げられる。従って、アルキルアリール基としては、メチルフェニル、エチルフェニル等が挙げられる。
【００１７】
短鎖長のアルケニル基としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルケニル基が挙げられ、より具体的にはビニル、アリル、１−プロペニルメタクリル、クロチル、１−ブテニル、３―ブテニル、２−ペンテニル、４−ペンテニル、２―ヘキセニル、５−ヘキセニル等が挙げられる。
【００１８】
短鎖長のアルキニル基としては、例えば直鎖または分岐状の炭素数２〜６のアルキニルが挙げられ、より具体的にはエチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル等が挙げられる。
【００１９】
上述の一般式（１）においてＲ１、Ｒ２およびＲ３が何れも水素原子である化合物は、有機化学的方法（J. Am.Chem. Soc. 103, 5599-5600, 1991）または発酵法、例えばメタノール資化性を有し、かつ、ピロロキノリンキノンを生産する能力を有する細菌を、炭素源としてメタノールを含有し、鉄化合物の濃度を制御した培養液中で培養することによりピロロキノリンキノンを生産する方法（特開平１−２１８５９７号公報）等により製造することが可能である。
【００２０】
一方、ピロロキノリンキノンのエステル体は、ピロロキノリンキノンより常法のエステル化反応に従って合成することができる。ピロロキノリンキノンのトリエステル体は、例えば、ピロロキノリンキノンまたはその塩を酸性条件下でアルコール類と反応させる方法（特開平３−１２３７８１号公報、特開平３−１４５４９２号公報）、ピロロキノリンキノンまたはその塩を塩基の存在下でハロゲン化アルキル、ハロゲン化アラルキル、ハロゲン化アルキルアルキルアリール、ハロゲン化アルキニルまたはハロゲン化アラアリール等と反応させる方法により合成することができる。また、上記方法によって得られるピロロキノリンキノンのトリエステル体を酸性または塩基性条件下で部分加水分解することで、モノエステル体、ジエステル体を得ることができる。
【００２１】
このようにして得られる一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩
は、カラムクロマトグラフィー、再結晶法または溶媒抽出法等の通常の方法により、反応
液中から分離・精製することができ、それらの同定には、元素分析、ＮＭＲスペクトルト
ル、ＩＲスペクトルまたは質量分析等の各種手段が用いられる。
【００２２】
一般式（１）で示される化合物の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム、トリエタノールアミン、トリメチルアミン等の有機アミン塩、リジン、アルギニン等の塩基性アミノ酸塩等が挙げられる。
【００２３】
一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩は、特に、グリシン、Ｌ−セリンおよびＬ−トリプトファンから選ばれる一種以上のアミノ酸と共に使用するが、それ以外のアミノ酸、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ヒスチジン等のアミノ酸と併せて使用することもできる。
【００２４】
さらに、他の機能性食品素材と組み合わせて使用することもできる。組み合わせ可能な機能性食品素材としてはコエンザイムＱ１０、還元型コエンザイムＱ１０、Ｌ−カルニチン、アセチルＬ−カルニチン、α−リポ酸、ビタミンＢ群等の食品として用いられているビタミン類、カロテノイド類等が例示されるが、これらに限定されるものではなく、さらに任意の有効成分を含有していてもよい。また、それら製剤は、有効成分を薬理学的に許容される一種またはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００２５】
投与する剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、浸剤・煎剤、カプセル剤、シロップ剤、液剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、流エキス剤等の経口剤として好適に用いられる。
【００２６】
経口剤として製剤化する際には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、潤沢剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、希釈剤、緩衝剤、抗酸化剤、細菌抑制剤等の添加剤を用いることができる。
【００２７】
経口投与に適当な、例えば、シロップ剤のような液体調製物である場合は、水、蔗糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ゴマ油、オリーブ油、大豆油等の油類、パラヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、安息香酸ナトリウム等の保存剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加して製剤化することができる。
【００２８】
また、経口投与に適当な、例えば錠剤、散剤および顆粒剤等の場合には、乳糖、ブドウ糖、蔗糖、マンニトール、ソルビトール等の糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシ等の澱粉、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機物、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等の植物末等の賦形剤、澱粉、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、カルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油等の滑沢剤、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルメロース、ゼラチン、澱粉糊液等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤などを添加して製剤化することができる。
【００２９】
また、経口投与に適当な製剤には、一般に飲食品に用いられる添加剤、例えば、食甘味料、着色料、保存料、増粘安定剤、酸化防止剤、発色剤、漂白剤、防かび剤、ガムベース、苦味料、酵素、光沢剤、酸味料、調味料、乳化剤、強化剤、製造用剤、香料、香辛料抽出物等が添加されてもよい。
【００３０】
経口投与に適当な製剤は、そのまま、または例えば、粉末食品、シート状食品、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルト食品、カプセル食品、タブレット状食品、流動食品、ドリンク剤等の形態のものであってもよく、機能性食品以外にも健康食品、栄養補助食品等の飲食品として用いてもよい。
【００３１】
本発明における一般式（１）で示されるピロロキノリンキノン類またはその塩に対するアミノ酸の添加量は、合計量として１〜１００倍重量、好ましくは５〜１００倍重量である。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１
大脳皮質内の神経成長因子（ＮＧＦ）産生促進効果
雄ウィスター系ラット（８週齢）各群３匹に、ピロロキノリンキノン二ナトリウム塩（ＰＱＱ・２Ｎａ塩）のみ、アミノ酸のみ、およびＰＱＱ・２Ｎａ塩とアミノ酸を同時に含む試料を調製し、毎日１回、７日間、金属ゾンデにより経口強制投与した。水、飼料は自由に摂取させた。最終投与２日後にラットからドライアイス上で大脳新皮質を取り出し−８０℃で保存した。
大脳新皮質サンプルをリン酸緩衝生理食塩水（０．９％塩化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．１）を用いて５％（Ｗ／Ｖ）になるように取り、４℃で超音破砕器を用いて破砕した。これを１００，０００Ｇで３０分間遠心して得られた上清の神経成長因子（ＮＧＦ）濃度をＥＩＡにより測定した。
即ち、５０μlの抗マウスβ−ＮＧＦ抗体（約５μｇのＩｇＧ含有）を９６穴マイクロプレートに分注し、３７℃に４時間保った。吸着されない抗体を除去し、洗浄用緩衝液（０．１％牛血清アルブミン、０．４Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．０２％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液）で３回洗浄した。４０μlの標準β−ＮＧＦまたはサンプルを添加し、４℃に１８時間保った。上清を除去し、洗浄用緩衝液で３回洗浄後、β−ガラクトシダーゼでラベルした抗β−ＮＧＦモノクローナル抗体を５０μl加え、３７℃に４時間保った。溶液を除去し、洗浄用緩衝液で３回洗浄後、６０μＭの４−メチルウンベリフェリルβ−ガラクトシド１００μlを加え、室温に１．５時間保った後、０．１Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ１０．３）を加え、反応を停止させた。マイクロプレートリーダーで生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光（励起波長３６０ｎｍ、エミッション波長４５０ｎｍ）を測定し、標準曲線からＮＧＦ濃度を測定した。
結果を表１に示した。グリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トリプトファン単独では、ＮＧＦ濃度上昇効果は認められなかったが、ＰＱＱ・２Ｎａ塩とグリシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トリプトファンを同時に投与した場合、ＰＱＱ・２Ｎａ塩単独と比べ、大脳新皮質中のＮＧＦ濃度が大きく増加した。
【００３３】
【表１】
2010132599.tif 000004
対照群  ：水
試験群１：ＰＱＱ・２Ｎａ塩（２０ｍｇ／ｋｇ）
試験群２：グリシン（２００ｍｇ／ｋｇ）
試験群３：ＰＱＱ・２Ｎａ塩（２０ｍｇ／ｋｇ）＋グリシン（２００ｍｇ／ｋｇ）
試験群４：Ｌ−セリン（２００ｍｇ／ｋｇ）
試験群5：ＰＱＱ・２Ｎａ塩（２０ｍｇ／ｋｇ）＋Ｌ−セリン（２００ｍｇ／ｋｇ）
試験群６：Ｌ−トリプトファン（２００ｍｇ／ｋｇ）
試験群７：ＰＱＱ・２Ｎａ塩(２０ｍｇ/ｋｇ)＋Ｌ−トリプトファン(２００ｍｇ/ｋｇ)
【００３４】
実施例２
雄ウィスター系ラット(９週齢)各群８匹を１０日間予備飼育し、被験試料を１日１回、強制的に摂取させた。摂取４週間後からモーリス水迷路を用いた学習・記憶能力に関する試験を開始した。即ち、円形のプール（直径１５０ｃｍ、深さ４５ｃｍ）の底に、水中に隠れるように円形のプラットホームを置き、ラットにプラットホームの位置を記憶させた。本試験は毎日1試行、計５日間行った。遊泳開始後プラットホームに到達するまでの遊泳時間を測定し、以下の式により学習率を測定した。
学習率＝１００−（Ｘ回日目の到達時間／１回目の到達時間）×１００
【００３５】
結果を表２に示した。回数を重ねるごとに何れの群も学習率は増加した。グリシン単独（試験群２）では対照群と同等の学習率であり学習向上効果は認められなかったがＰＱＱ・２Ｎａ塩と同時に摂取させた場合（試験群３）には、ＰＱＱ・２Ｎａ塩単独摂取（試験群１）以上の相乗的な学習向上効果が認められた。
【００３６】
【表２】
2010132599.tif 000005
対照群  ：水
試験群１：ＰＱＱ・２Ｎａ塩（２０ｍｇ／ｋｇ）
試験群２：グリシン（２００ｍｇ／ｋｇ）
試験群３：ＰＱＱ・２Ｎａ塩（２０ｍｇ／ｋｇ）＋グリシン（２００ｍｇ／ｋｇ）