【手続補正書】
【提出日】令和3年3月29日(2021.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
【図１】金マイクロキャビティ・アレイ・プラットフォームのためのナノスフェアリソグラフィ製造プロセスの例を示す。
【図２】キャビティアレイ基板の大量生産のためのフォトリソグラフィ製造プロセスの模式図である。
【図３Ａ】ある範囲の市販のフォトレジスト溶液についての、膜厚（μｍ）とスピン速度（ｒｐｍ）との間の関係を示すグラフである。
【図３Ｂ】フォトリソグラフィにより大量生産された金キャビティのＳＥＭおよび共焦点画像を示す。
【図３Ｃ】異なる分析物（例えば、サイズが５〜２０μｍの細胞およびサイズが１〜５μｍの細菌）を捕捉するためのアレイの微調整を示すために、キャビティ孔径を変化させたフォトリソグラフィにより製造されたキャビティのＳＥＭ画像を示す。
【図４Ａ】フォトレジスト・キャビティ・アレイの上面を修飾するのに使用されるポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）スタンプの作製プロセスの模式図であり、ＰＤＭＳスタンプ（各正方形間の距離が５μｍの１０×１０μｍの正方形）を使用してガラス基板上にスタンプしたＣｙ３ラベルＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）の共焦点画像例を示し、発光画像を、５４０ｎｍのＨｅＮｅレーザー励起により、４０×油浸対物レンズ（ＮＡ１．４）を使用して記録した。
【図４Ｂ】ＡＢスタンプの再現性を示す、抗体スタンプされた平面電極表面の共焦点画像（上側）および３つの独立したグラム陰性抗体スタンプされた電極のインピーダンススペクトルを示す。
【図４Ｃ】ＰＤＭＳスタンプを使用してフォトリソグラフィキャビティアレイ基板表面上にスタンプされたＣｙ３ラベルＢＳＡの共焦点画像例を示し、発光画像を、５４０ｎｍのＨｅＮｅレーザー励起により、４０×油浸対物レンズ（ＮＡ１．４）を使用して記録した。
【図４Ｄ】明確に目視可能なキャビティアレイの細孔と、細孔開口部の周りのＣｙ３ラベルＢＳＡ鋳型とを示す共焦点画像を示し、スタンピングの成功が確認できる。
【図５Ａ】細菌捕捉および検出のための電極が挿入された、本教示の一態様に係るバイナリ応答装置のイメージを示す。
【図５Ｂ】本教示に係る流体中の分析物を検出する方法の工程を示すフローチャートである。
【図６】図５Ａのバイナリ応答装置上のラベル付き検査サイトを示す。
【図７Ａ】装置を構成する層を示す、本教示の代替的な態様に係るバイナリ応答装置の構成を示す展開３Ｄ図である。
【図７Ｂ】組み立てられた装置の３Ｄ表現のための三測図により補足される、図７Ａの装置の概観を示す。
【図７Ｃ】図７Ｂに示される装置の３つの同一の検査サイトのうちの１つの２Ｄ模式図を示す。
【図７Ｄ】（ｉ）〜（ｘ）は、本発明に係る方法のイベントシーケンスを示す模式図であり、（ｉ）は予め装填された状態のチャンバを示し、（ｉｉ）は新鮮な全血サンプルおよび試薬の充填を示し、（ｉｉｉ）は検出チャンバへのサンプルの通過および廃棄チャンバへのサンプル流の継続を示し、（ｉｖ）は廃棄チャンバへの血液の完全な移動を示し、（ｖ）は角速度の増加により洗浄工程バルブが破裂可能な状態に置かれることを示し、（ｖｉ）は装置の７番目の層上のチャネルを介した洗浄チャンバから検出チャンバへの洗浄液の移動を示し、（ｖｉｉ）は廃棄チャンバへの洗浄液の完全な移動を示し、（ｖｉｉｉ）は角速度のさらなる増加が電解質バルブを破裂可能な状態に置くことを示し、（ｉｘ）は装置の７番目の層上のチャネルを介した洗浄チャンバから検出チャンバへの電解質溶液の移動を示し、（ｘ）は電解質溶液の検出チャンバへの完全な移動を示す。
【図８】細菌捕捉および検出のための電極が挿入された多重装置のイメージを示す。
【図９】細菌捕捉および検出のための電極が挿入された多重装置上のラベル付き検査サイトを示す。
【図１０】細菌捕捉および検出のための電極が挿入された多重装置のイメージを示す。
【図１１Ａ】抗体吸着キャビティアレイ表面での病原体捕捉の模式図である。
【図１１Ｂ】単体の病原体および病原体のコロニーを示す、抗体吸着キャビティアレイ表面での病原体捕捉の模式図であり、病原体は、キャビティのサイズに応じて、１つのサンプル中において、キャビティを横切って結合するか、またはマイクロキャビティ（チャンバ）中で結合するか、のいずれかまたはその両方である。
【図１２】グラム陽性修飾アレイ表面でのスタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus)病原体の捕捉成功によるインピーダンスの顕著な変化を示すインピーダンススペクトルである。
【図１３】微少流体インキュベーションチャンバ内での１０分間のインキュベーション時間および２分間の読み取り時間を使用した、患者全血サンプルから、ＰＤＭＳスタンプを使用したフォトリソグラフィキャビティアレイ基板表面への、高度に選択的な病原体の捕捉をとらえた共焦点画像を示す。
【図１４】微少流体インキュベーションチャンバ内で１０分間のインキュベーション時間および２分間の読み取り時間を使用し、スタフィロコッカス・アウレウス(S. aureus)病原体が、スパイクされた健康な全血サンプルから、ＰＤＭＳスタンプを使用したフォトリソグラフィキャビティアレイ基板表面上へ捕捉できたことに伴うインピーダンスの顕著な変化を示すインピーダンススペクトル（上側）を示し、ナイキストプロット（上側）およびボードプロット（下側）は両方とも、病原体捕捉による顕著な変化を示す。
【図１５】図１４に提示したものを強調し、抗体修飾キャビティアレイ基板上への病原体の捕捉成功のＳＥＭ画像を示し、細胞捕捉は、キャビティ内部を「塞ぎ」またはマイクロキャビティの開口部を横切って遮断している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０３】
この例示的な構成におけるバイナリ応答ディスク２００は、３つの別個の検査サイト２０２を含む。この構造は、これらのサイトが完全に同一となり得るようにミラーリングされる。このサイトは、サンプルチャンバ２０３、洗浄チャンバ２０４、および電解質チャンバ２０５を含む。装置の装填を容易にするために、リザーバの頂部に通気孔が配置されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
図５Ａ、図５Ｂ、および図６を参照して、２ｍｌの全血サンプルをサンプルチャンバ２０３（チャンバＡ）に装填する。サンプルは、単純なマイクロチャネルを介して、電極チャンバ２０６（チャンバＤ）に直接流れる。１０Ｈｚのスピン速度を装置に適用して、液体を電極チャンバ内にゆっくりと移す。ここで、単純なサイフォン技術を用いて、規定された期間、インキュベーションチャンバ内にサンプルを収容させる。本教示に係る装置に使用されるインキュベーション時間は、約７〜１０分間である。本教示のこの態様による装置が４Ｈｚまで減速すると、サンプルは、毛管作用によりサイフォニングを開始する。電極チャンバ２０６の右側に配置された廃棄チャンバ２０７（チャンバＥ）に液体が移動できるように、ディスクの角周波数を増加させる。ついで、ディスクを、３０Ｈｚの周波数に設定する。これが、洗浄工程マイクロチャネル内に配置された溶解性フィルム（ＤＦ）タブを電極チャンバ２０６（チャンバＤ）内へと破裂させることによって、洗浄工程（チャンバＢ）をトリガし、廃棄チャンバへと直ちに移すことができる。ここで、スピン速度を、１０Ｈｚに下げる。洗浄バッファーは、廃棄物チャンバＤＦタブを破裂させることになる廃棄チャンバ２０７の第２のセクションに溢れ出す。これにより、下部チャネルの空気圧が低下し、ＤＦタブを破裂可能な状態にする。ついで、装置を３０Ｈｚの周波数で回転させ、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）（チャンバＣ）を電極チャンバ２０６（チャンバＤ）内へと導く。そこでＰＢＳはさらなる検査目的のために留まることになる。装置（ディスク）を、スピンスタンド機構から取り外し、ついで、検出のためにポテンシオスタットに取り付ける。この工程は、スピンスタンドに組み込むことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
この例では、５ｍｌの全血サンプルを血液分離チャンバ４０３に装填する。血液が装填されると、あるスピン速度がかけられる。血液の分離には６〜９分かかり得る。準備が整うと、ディスクの回転速度を上げて、血液分離チャンバのＤＦタブを濡らし、破裂させる。血漿がチャンバのそれぞれを満たし１４個の電極インキュベーションチャンバを通るゆっくりと安定した流れが可能となるように、スピン速度を下げる。長いマイクロチャネルが、最終電極チャンバを廃棄チャンバに接続している。廃棄チャンバ４０４への血漿の流量は、既知の幅のチャネルを使用して制御する。このチャネルのサイズを大きくすると、サンプルの出口流量が多くなる。インキュベーション時間は、７〜９分の幅で変動する。溶解性フィルム（ＤＦ）タブが廃棄チャンバ内に配置されている。一旦破裂すると、下部チャネルの空気圧が解放され、洗浄チャンバのＤＦタブは、ここで破裂可能な状態になる。スピン速度を上げて、電極チャンバの真上に位置する洗浄バッファーリザーバ４０５を破裂させる。一連の下部チャネルが、洗浄バッファーリザーバ４０５を電極チャンバ４０１に連結している。スピン速度を下げると、洗浄バッファーが、各電極チャンバ４０１を通って廃棄チャンバ４０４に流入する。装置を、スピンスタンド機構から取り外し、ついで、検出のためにポテンシオスタットに取り付ける。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置内に動作可能に受け入れられる流体中の分析物を検出するための回転可能な微少流体装置(200)であって、
前記微少流体装置は、
流体サンプルが流入する入口と電極チャンバ（206）に連通する出口と、を有するサンプル入口チャンバ（203）を有し、
前記電極チャンバは基準電極出力、対電極出力、及び少なくとも一つの作用電極出力を提供して受け入れた流体サンプル中の前記分析物の存在を示すインピーダンスを提供する電極構造を有し、前記電極チャンバは洗浄液と電解質溶液をそれぞれ受け取る洗浄液チャンバと電解質溶液チャンバとそれぞれ連通しており、
前記装置が一連の角周波数で回転するとき、流体はサンプル入口チャンバ、洗浄液チャンバ、及び電解質溶液チャンバを順に流れて電極チャンバへ流入する,
前記装置において、
前記電極構造は、基板内に画定され、前記電極チャンバ内にキャビティアレイ（500）を形成する１つ又は複数のチャンバ（503）への入口を画定する第１の表面を有する該基板を含み、前記キャビティアレイの前記チャンバの表面は、前記基板の第２の表面を画定し、前記第１の表面が、少なくとも１種の分析物の選択的標的化及び捕捉のための捕捉剤を有し、少なくとも1つの分析物を有する流体を電極チャンバへ動作可能に導入し、続いて分析物を捕捉することにより、前記キャビティアレイの前記チャンバのうちの少なくとも１つのチャンバへの前記入口を遮断する前記第１の表面によって前記分析物が保持され、
前記電極構造によって提供される前記微少流体装置の前記応答特性が、前記キャビティアレイの前記チャンバのうちの前記少なくとも１つのチャンバへの前記入口の前記遮断により動作可能に変化することにより、前記流体中の前記分析物の存在の指標となる、
微少流体装置。
【請求項２】
前記第１の表面が、分析物の非特異的捕捉を阻害するように選択的に修飾されている、請求項１に記載の微少流体装置（200）。
【請求項３】
前記分析物が生物細胞であり、病原体、ガン細胞、または他の希少細胞を含む、請求項１または２に記載の微少流体装置（200）。
【請求項４】
前記基板の前記第１の表面が、前記表面上に捕捉剤を固定化することにより修飾され、前記捕捉剤が、抗体、タンパク質、核酸、または合成受容体からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微少流体装置(200)。
【請求項５】
前記捕捉剤が、前記第１の表面上への湿式化学堆積、低温プラズマ堆積、またはソフトスタンピングにより、前記第１の表面上に固定化され、
選択的には、前記捕捉剤が、前記１つ又は複数のチャンバの入口周囲の前記第１の表面上に位置する、請求項４に記載の微少流体装置（200）。
【請求項６】
前記基板内に画定された前記チャンバの表面が、曲面を画定し、
選択的には、前記基板内に画定された前記１つ又は複数のチャンバが、１００ｎｍ〜１０μｍの範囲の直径または幅を有し、前記１つ又は複数のチャンバが、前記チャンバの前記直径の０．０５〜０．９５倍の深さを有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の微少流体装置(200)。
【請求項７】
前記チャンバは、前記チャンバ間の間隔が検出対象の前記分析物の前記選択的捕捉のために最適化されるように、横方向に離間し、
選択的には、前記チャンバ間の前記離間またはピッチが、前記チャンバの前記直径または幅の０〜１００倍である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の微少流体装置（200）。
【請求項８】
前記病原体が、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、および真菌からなる群から選択される、請求項３〜７のいずれか一項に記載の微少流体装置。
【請求項９】
各チャンバの内面が分子マーカーの検出のために修飾されており、前記電極構造により提供される前記微少流体装置の前記応答特性が、前記チャンバのうちの少なくとも１つのチャンバへの放出されたマーカーの結合によって動作可能に変化することにより、前記捕捉された細胞の特性の指標となり、
前記分子マーカーが、低分子、核酸、またはタンパク質を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の微少流体装置。
【請求項１０】
各チャンバ(503)の前記内面が、捕捉剤により機能化され、前記捕捉剤が、ＤＮＡまたはＲＮＡ捕捉鎖、抗体、または合成捕捉剤からなる群から選択される、請求項９に記載の微少流体装置。
【請求項１１】
前記微少流体装置の前記応答特性は、分析物の捕捉および後続のマーカー放出時に動作可能に変化することにより前記流体中の分析物の存在を示す、、請求項９または１０に記載の微少流体装置。
【請求項１２】
前記流体が、液体サンプル、全血サンプル、尿、汗、血漿もしくは他の画分、間質液、脳脊髄液、液化食品サンプルからなる群から選択される、またはスワブ表面から抽出される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の微少流体装置。
【請求項１３】
前記装置が、約２個／ｍｌの濃度で細胞を検出可能である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の微少流体装置。
【請求項１４】
流体サンプル中の分析物を検出する方法であって、
（ｉ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微少流体装置にサンプルを導入する工程と、
（ｉｉ）流体流を誘引する工程と、
（ｉｉｉ）分析物を捕捉する工程と、
（ｉｖ）前記微少流体装置の応答特性の変化を測定することにより、前記流体中の前記分析物の存在を検出する工程と、を含む、
方法。
【請求項１５】
前記分析物が、病原体、細胞、小胞、またはエキソソームを含む、請求項１４に記載の方法。