【手続補正書】
【提出日】平成16年9月16日(2004.9.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
ヒアルロン酸と光架橋基とが結合した光反応性ヒアルロン酸であって、固形の状態の光反応性ヒアルロン酸を１．０重量％で水性溶媒に溶解して得られる水性溶液が２４℃の温度条件下、５．０ｋｇ／ｃｍ2の加圧下で多孔質フィルター（孔径（ポアサイズ）が０．４５μmで直径が２５ｍｍ）を１分間に２ｍＬ以上通過可能であることを特徴とする光反応性ヒアルロン酸。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
請求項１〜５の何れかに記載の光反応性ヒアルロン酸の水性溶液に紫外線を照射して得られる光架橋ヒアルロン酸溶液であって、濃度１．０重量％で温度２４℃の条件下において、２３ゲージの注射針より水平方向から４５°の斜め下方に向けて０．２ｍＬ／秒の速度で押し出した際、切れることなく３ｃｍ以上の長さのものが注射針先端開口部から垂れ下がる性質を有していることを特徴とする光架橋ヒアルロン酸溶液。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
本発明の第１の要旨は、ヒアルロン酸と光架橋基とが結合した光反応性ヒアルロン酸であって、固形の状態の光反応性ヒアルロン酸を１．０重量％で水性溶媒に溶解して得られる水性溶液が２４℃の温度条件下、５．０ｋｇ／ｃｍ2の加圧下で多孔質フィルター（孔径（ポアサイズ）が０．４５μmで直径が２５ｍｍ）を１分間に２ｍＬ以上通過可能であることを特徴とする光反応性ヒアルロン酸に存する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
本発明の第４の要旨は、前記の光反応性ヒアルロン酸の水性溶液に紫外線を照射して得られる光架橋ヒアルロン酸溶液であって、濃度１．０重量％で温度２４℃の条件下において、２３ゲージの注射針より水平方向から４５°の斜め下方に向けて０．２ｍＬ／秒の速度で押し出した際、切れることなく３ｃｍ以上の長さのものが注射針先端開口部から垂れ下がる性質（高曳糸性）を有していることを特徴とする光架橋ヒアルロン酸溶液に存する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
上記の最も好ましい光架橋基としては、例えば、ケイ皮酸のカルボキシル基にアミノアルコール（H2N−（CH2）n−OH：ｎ=１〜１８、H2N−（CH2−O）m−CH2−OH：ｍ＝１〜９）がエステル結合したケイ皮酸アミノアルキルエステル誘導体、（Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ2）n−ＮＨ2，Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ2−（ＯＣＨ2）m−ＮＨ2：ｎ、ｍは上記と同じ、−Ｐｈはフェニル基を表す）、ジアミン（H2N−（CH2）l−NH2：ｌ＝１〜１０）、ジオール（HO−（CH2）k−OH：ｋ＝１〜１０）が導入された誘導体、（Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ2）l−ＮＨ2，Ｐｈ−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯ−Ｏ−（ＣＨ2）k−ＯＨ：ｌ、ｋ、−Ｐｈは上記と同じ）、アミノ酸（HOOC−（CHR）j−NH2：ｊ＝１〜１０、Ｒはアミノ酸の側鎖を示す）、ペプチド等を置換ケイ皮酸（アミノケイ皮酸）に導入した誘導体（ＯＣ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｐｈ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨＲ）j、ＯＣ−ＣＨ＝ＣＨ−Ｐｈ−ＮＨ−（ペプチド）：Ｒ、ｊは上記と同じ、−Ｐｈ−はフェニレン基を表す）等が挙げられるが、好ましくはケイ皮酸のカルボキシル基にアミノアルコールが導入された誘導体（ケイ皮酸アミノアルキルエステル）であり、アミノアルコールは上記一般式においてｎが１〜１８が好ましく、特に３〜６が好ましく、３〜４が極めて好ましい。特にケイ皮酸アミノアルキルエステルを光架橋基として使用する場合には、アミノアルキルのアミノ基とヒアルロン酸のカルボキシル基とがアミド結合することによって光架橋基がヒアルロン酸に結合される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
上記の様にして調製された光反応性ヒアルロン酸は、場合により、酢酸などの有機酸または無機酸による中和を行った後、エタノール沈殿、エタノール洗浄、乾燥の各処理を適用することにより固体状態として単離することが出来る。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
従って、本発明の光反応性ヒアルロン酸は、その水性溶液中における分子分散特性が高いという物性によって従来の光反応性ヒアルロン酸と明確に区別される。すなわち、本発明の光反応性ヒアルロン酸は、固形の状態の光反応性ヒアルロン酸を１．０重量％で水性溶媒に溶解して得られる水性溶液が２４℃の温度条件下、５．０ｋｇ／ｃｍ2の加圧下で多孔質フィルター（孔径（ポアサイズ）が０．４５μmで直径が２５ｍｍ）を１分間に２ｍＬ以上通過可能であることを特徴とし、このフィルター通過性の高さは上記の分子分散特性の高さを示す。なお、上記フィルター通過性は、多孔質フィルターを通過した前後の水性溶液中の光反応性ヒアルロン酸の濃度を比較することにより確認することが可能であり、上記条件で本発明の光反応性ヒアルロン酸水溶液を通過させた場合、通過前後で水性溶液中の光反応性ヒアルロン酸の濃度の変化がない。そして、斯かる本発明の光反応性ヒアルロン酸は次の様な主要な性質を備えている。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
上記光架橋ヒアルロン酸の代表的な形態としては、不定形状態としては溶液またはゲルであり、定形状態としては、弾性体（シート、フィルム、ペレット、チューブ等）の様々な形態を採り得る。そして、上記の光架橋ヒアルロン酸ゲルは、原料（光反応性ヒアルロン酸の水性溶液）の濃度が１．０〜３．０重量％に高められている場合に一層容易に得ることが出来る。また、上記の弾性体は、高濃度（３．０〜１０重量％）の光反応性ヒアルロン酸に紫外線照射することにより得られる。すなわち、上記の様な高濃度の光反応性ヒアルロン酸の水性溶液を架橋すると、固形状態に近くなり、水性媒体を含有した弾性体となる。なお、ゲルとは、あらゆる溶媒に不溶の三次元網目構造を持つ高分子およびその膨潤体と定義されている（１９８８年１１月２５日、朝倉書店発行「新版高分子辞典」、第１２９頁）が、本明細書においては、温度２４℃の条件下で、２３ゲージの注射針から５．０ｋｇ／ｃｍ2の押出圧により押出可能なものを「溶液」、押出不可能のものを「ゲル」と定義して使用する。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
次に、本発明に係る高曳糸性を有する光架橋ヒアルロン酸溶液について説明する。ここに高曳糸性とは、専ら溶液が有する性質であり、濃度１．０重量％の光架橋ヒアルロン酸溶液とした際、温度２４℃の条件下において、２３ゲージの注射針より水平方向から４５°の斜め下方に向けて０．２ｍＬ／秒の速度で押し出した際、切れることなく３ｃｍ以上の長さのものが注射針先端開口部から垂れ下がる性質を意味する。ヒアルロン酸溶液は、ヒアルロン酸の高分子性により曳糸性を有するとされているが、上記の様な本発明の光架橋ヒアルロン酸溶液の高曳糸性は従来のヒアルロン酸溶液の曳糸性とは著しく異なる。上記の高曳糸性における、注射針先端開口部から垂れ下がる長さは、好ましくは５ｃｍ以上であり、更に好ましくは７ｃｍ以上である。一方、ヒアルロン酸の１．０重量％溶液の場合は、１ｃｍ未満である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
（１）フィルター通過性試験：
５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水によって濃度が１．０重量％に調整された被検物質を調製する。２４℃条件下５．０ｋｇ／ｃｍ2の加圧下で多孔質フィルター（孔径が０．４５μmで直径が２５ｍｍ）に上記の被検物質を通過させ、１分間当たりの通過量（ｍＬ）を測定する。２ｍＬ以上通過した場合を○、２ｍＬ未満通過した場合を△、通過しない場合を×で表す。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
（２）形状試験：
温度２４℃の条件下において、２３ゲージの注射針（２５ｍｍ）を備えた５ｍＬシリンジに被検物質（２４℃）を充填し、５．０ｋｇ／ｃｍ2の押出圧により押し出す。押出可能なものを溶液、押出不可能のものをゲルとする。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
（３）曳糸性評価試験：
５ｍＭリン酸緩衝生理食塩水によって濃度が１．０重量％に調整された被検物質を調製する。温度２４℃の条件下において、２３ゲージの注射針（２５ｍｍ）を備えた５ｍＬシリンジに被検物質（２４℃）を充填し、水平方向から４５°の斜め下方に向けて０．２ｍＬ／秒の速度で押し出す。被検物質が切れることなく注射針から垂れ下がった長さを測定する。長さが７ｃｍ以上の場合を＋＋、長さが３ｃｍ以上で７ｃｍ未満の場合を＋、長さが３ｃｍ未満の場合を−で表した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３９】
（５）架橋率：
架橋率は、１Ｍ水酸化ナトリウム１ｍＬで被検物質１ｇを１時間鹸化した後、得られた溶液を酸性にして酢酸エチルで光架橋基由来物（単量体、二量体）を抽出し、ＨＰＬＣにより解析し、検量線法によって二量体の量を測定する。そして、ヒアルロン酸に導入された光架橋基に対する二量体となった光架橋基のモル数を百分率で算出した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
（６）粘度：
Ｅ型回転粘度計を使用し、３℃×Ｒ１４、１ｒｐｍ（２５℃）の条件で測定し、Ｐａ・ｓで表す。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
実施例１（アミノケイ皮酸誘導体結合ヒアルロン酸）
重量平均分子量約９０万のヒアルロン酸ナトリウム４００ｍｇを水６０ｍＬに溶解させ、ジオキサン３０ｍＬを加えて撹拌した。室温でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド３４ｍｇ／水１ｍＬ、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ  ２９ｍｇ／水１ｍＬ、４−（６−アミノヘキサンアミド）ケイ皮酸エチル塩酸塩（HCl・H2N（CH2）5CONH−Ph−CH=CH−COOCH2CH3：−Ph−はフェニレン基を示す）５１ｍｇ／水１ｍＬを順次に加えて３時間撹拌した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
次いで、ヒアルロン酸換算濃度が０．２〜２．５重量％となる様に、上記のアミノケイ皮酸誘導体導入ヒアルロン酸を５ｍＭリン酸緩衝生理食塩液に溶解した。更に、これら溶液を内径１５ｍｍのパイレックス（登録商標）製ガラス試験管に入れ、また、パイレックス（登録商標）製ガラス板２枚の間隙２ｍｍで挟み込み、水冷式紫外線照射装置（３ｋＷメタルハライドランプ使用）に２０分照射し、架橋体の形状および形状が溶液の場合は曳糸性の有無を調べた。結果を表２に示す。なお、以下の記載において、ＨＡの略語でヒアルロン酸を表すことがある。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
実施例２（ケイ皮酸誘導体導入ヒアルロン酸）
１重量％ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万）水溶液５００ｇに、水／ジオキサン＝２５０ｍＬ／３７５ｍＬの混合溶液を加えて撹拌した。室温でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド８６０ｍｇ／水２ｍＬ（０．６当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ  ７１７ｍｇ／水２ｍＬ（０．３当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩（HCl・H2N（CH2）3OCO−CH=CH−Ph：−Phはフェニル基を示す）９０３ｍｇ／水２ｍＬ（０．３当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を順次に加え、２時間３０分撹拌した。炭酸水素ナトリウム２．５ｇ／水５０ｍＬを加えて一昼夜撹拌した後、塩化ナトリウム３０ｇを加えた。この反応溶液に２Ｌのエタノールを投入し、沈殿物を析出させ、この沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄した後、室温で一晩乾燥させ、５．２４ｇの白色固体（ケイ皮酸３−アミノプロピルエステル導入ヒアルロン酸：「ケイ皮酸誘導体導入ヒアルロン酸」と記載する）を得た。ヒアルロン酸繰り返し二糖単位当たりのケイ皮酸導入率は８．４％であった（表３中のＮｏ．５）。また、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＨＯＳｕ）、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩の当量を変え、表３に示す異なる導入率のケイ皮酸誘導体導入ヒアルロン酸（Ｎｏ．１〜４）を合成した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
次いで、上記Ｎｏ．１〜５のケイ皮酸誘導体導入ヒアルロン酸をヒアルロン酸濃度が１．０重量％となる様に５ｍＭリン酸緩衝生理食塩液に溶解し、フィルター通過性を調べた。結果を表３に示す。なお、対照として、原料のヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量：約９０万）と、炭酸水素ナトリウム（２．５ｇ／水５０ｍＬ）の添加を行わない以外はＮｏ．１−５と同様に調製したケイ皮酸誘導体導入ヒアルロン酸とを対照としてフィルター通過性を調べた。また、原料のヒアルロン酸のフィルター通過性評価は○であった。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
実施例３（種々の架橋ヒアルロン酸）
上記実施例２の１．０重量％濃度のケイ皮酸誘導体導入ヒアルロン酸／リン酸緩衝生理食塩液に水冷式紫外線照射装置により紫外線照射した。結果を表４に示す。 
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
実施例４（アルカリによる影響／時間）
１重量％ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万）水性溶液１Ｌに、水／ジオキサン＝５００ｍＬ／７５０ｍＬの混合溶液を加え撹拌した。室温でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド１．７２１ｇ／水４ｍＬ（０．６当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ  １．４３３ｇ／水４ｍＬ（０．３当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、ケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩（HCl・H2N（CH2）3OCO−CH=CH−Ph：−Phはフェニル基を示す）１．８０７ｇ／水４ｍＬ（０．３当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を順次に加え、２時間３０分撹拌した。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
（１）本発明物質（Ａ）の調製
（ｉ）２．０ｇのヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量１００万）を蒸留水３００ｍＬに溶解し、ジオキサン１５０ｍＬを加え、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド  ３４４ｍｇ（０．６当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ  ２８６ｍｇ（０．３当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、及びケイ皮酸アミノプロピル塩酸塩（HCl・H2N（CH2）3OCO−CH=CH−Ph：−Phはフェニル基を示す）３６２ｍｇ（０．３当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を順次加え、室温で２時間３０分撹拌した。
（ii）その後、炭酸水素ナトリウム１．０ｇを加えて３時間撹拌した。反応液に２．２５Ｍの酢酸水溶液０．２ｍＬを添加して中和した。
（iii）塩化ナトリウム１２ｇを添加し、更にエタノール１Lを加えて光反応性ヒアルロン酸を析出させた。この沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄した後、減圧乾燥して、本発明物質（Ａ）とした。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
（２）本発明物質（Ｂ）の調製
本発明物質（Ａ）の調製工程の（ii）を終了後、１００ｍＬをサンプリングして飽和酢酸ナトリウム／エタノールに投入し、光反応性ヒアルロン酸を析出させた。沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄後、減圧して乾燥し、これを本発明物質（Ｂ）とした。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
（３）対照物質の調製
本発明物質（Ａ）の調製工程の（ｉ）を終了後、１００ｍＬをサンプリングして飽和酢酸ナトリウム／エタノールに投入し、光反応性ヒアルロン酸を析出させた。沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄後、減圧乾燥し、これを対照物質とした。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
実施例６（湿熱処理後の架橋ヒアルロン酸ゲル）
１重量％ヒアルロン酸ナトリウム（重量平均分子量９０万）水性溶液５００ｇに、水／ジオキサン＝２５０ｍＬ／３７５ｍＬの混合溶液を加えて撹拌した。室温でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド８６０ｍｇ／水２ｍＬ（０．６当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、ＥＤＣＩ・ＨＣｌ  ７１７ｍｇ／水２ｍＬ（０．３当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、ケイ皮酸アミノプロピルエステル塩酸塩（HCl・H2N（CH2）3OCO−CH=CH−Ph：−Phはフェニル基を示す９０３ｍｇ／水２ｍＬ（０．３当量／ＨＡ二糖単位（ｍｏｌ／ｍｏｌ））を順次に加え、２時間３０分撹拌した。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
そして、炭酸水素ナトリウム２．５ｇ／水５０ｍＬを加え一昼夜撹拌した後、酢酸０．６７６ｇを加え、塩化ナトリウム３０ｇを加えた。２Ｌのエタノールを投入し、沈殿物を析出させ、この沈殿物を８０％エタノールで２回、エタノールで２回洗浄した後、室温で一晩乾燥させ、４．９３ｇの白色固体を得た。ヒアルロン酸繰り返し二糖単位当たりのケイ皮酸誘導体導入率は８．８％であった。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
次いで、濃度１．５重量％となる様に、上記のケイ皮酸誘導体導入ヒアルロン酸を５ｍＭリン酸緩衝生理食塩液に溶解した後、ガラスシリンジに充填し、そのシリンジを水冷式紫外線照射装置にて１時間紫外線照射した。架橋率２２．２％、粘度１２７Ｐａ・ｓのゲル状物質となった。更に、得られた架橋ヒアルロン酸ゲルを１２１℃、２０分間の湿熱滅菌処理をしたが、上記と同様のゲル状を維持した。粘度１３６Ｐａ・ｓであった。これらの結果は、上記の架橋ヒアルロン酸ゲルが湿熱滅菌処理によっても実質的に分解されることがないことを意味している。