【手続補正書】
【提出日】令和2年12月3日(2020.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、
中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることであって、前記中胚葉誘導培地が、心室中胚葉を生成するために充分なＢＭＰ成分および有効量のアクチビン成分を含む、前記インキュベートすること、およびその後に、
好適な培地中で前記インキュベートされた細胞を培養して、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を生成させること
を含む、方法。
【請求項２】
前記アクチビン成分の濃度が前記ＢＭＰ成分の濃度より高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アクチビン成分に対する前記ＢＭＰ成分の比が、約０．３〜１：１、約０．５：１、または約０．８：１である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アクチビン成分の濃度が、ＣＤ２３５ａを発現する中胚葉細胞のレベルを測定すること、およびこれをＲＡＬＤＨ２を発現する中胚葉細胞のレベルに対して比較することにより決定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記アクチビン成分の濃度が、ＲＡＬＤＨ２を発現する中胚葉細胞と比較してより多くのＣＤ２３５ａを発現する中胚葉細胞を結果として優先的にもたらす濃度を決定することにより選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アクチビン成分が、約４ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌの量で加えられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記アクチビン成分の濃度が６〜２０ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＢＭＰ成分の濃度が約３ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＢＭＰ成分の濃度が５ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記アクチビン成分の濃度が１２ｎｇ／ｍｌである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＢＭＰ成分がＢＭＰ４である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アクチビン成分がアクチビンＡである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
生成された心筋細胞の前記集団の少なくとも一部分が、心臓の修復を必要とする対象を治療する際に使用するためのものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
心臓の修復を必要とする前記対象が、心不全のリスクがある、心不全を患っているかつ／または心筋梗塞の発症を患っている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療が、心筋梗塞の発症の前、間または後に為される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、
中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることであって、前記中胚葉誘導培地が、心房中胚葉を生成するために充分なＢＭＰ成分および有効量のアクチビン成分を含む、前記インキュベートすること、およびその後に、
レチノイン酸成分を前記細胞に加えることであって、前記レチノイン酸成分を前記加えることが、中胚葉誘導培地中での前記インキュベーションの間または後に行われる、前記加えること、および、
心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団が生成されるように前記インキュベートされた細胞を培養すること
を含む、方法。
【請求項１７】
前記レチノイン酸成分が、前記細胞がＲＡＬＤＨ２陽性かつＣＤ２３５ａ陰性である時に加えられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アクチビン成分に対する前記ＢＭＰ成分の比が約１．５対１またはそれより高い、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アクチビン成分に対する前記ＢＭＰ成分の比が３：２である、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＢＭＰ成分が約３ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＢＭＰ成分が約３ｎｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アクチビン成分が約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約６ｎｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アクチビン成分が約２ｎｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記レチノイン酸成分がトランスレチノイン酸またはレチノールである請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記レチノイン酸成分が５０ｎｍ〜５μΜの濃度で加えられる、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記レチノイン酸成分が５００ｎＭの濃度で加えられる、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＢＭＰ成分がＢＭＰ４である、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記アクチビン成分がアクチビンＡである、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＢＭＰ成分が１日後に前記中胚葉誘導培地に加えられる、請求項１６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記アクチビン成分が１日後に前記中胚葉誘導培地に加えられる、請求項１６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記レチノイン酸成分が前記方法の約３〜５日目に加えられる、請求項１６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
追加のＢＭＰ成分が前記方法の３日目に前記中胚葉誘導培地に加えられない、請求項１６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ＦＧＦ阻害剤が前記方法の３日目に前記中胚葉誘導培地に入れられない、請求項１６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記中胚葉誘導培地中で前記多能性幹細胞をインキュベートする前に、凝集および／または胚様体形成のために好適な培地中で前記多能性幹細胞をインキュベートすることをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法により製造された細胞が、潜在的な治療用化合物をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて利用される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団であって、ペースメーカー細胞を本質的に含まない、集団。
【請求項３７】
ペースメーカー細胞を欠いている、請求項３６に記載の集団。
【請求項３８】
患者における心不全または心筋梗塞を治療するための医薬組成物であって、請求項３６または３７に記載の心筋細胞の集団および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項３９】
心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約５０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心房心筋細胞、または少なくとももしくは約９０％の心房心筋細胞を含む、集団。
【請求項４０】
請求項１６〜３５のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られた、請求項３９に記載の心筋細胞の集団。
【請求項４１】
心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約５０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心室心筋細胞、または少なくとももしくは約９０％の心室心筋細胞を含む、集団。
【請求項４２】
ペースメーカー細胞を本質的に含まない、またはペースメーカー細胞を欠いている、請求項４１に記載の集団。
【請求項４３】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られた、請求項４１または４２に記載の集団。
【請求項４４】
心臓の修復を必要とする対象を治療するための組成物であって、前記組成物は、請求項３６、３７、および４１〜４３のいずれか１項に記載の心筋細胞の集団を含み、前記組成物は、前記対象に投与されることを特徴とする、組成物。
【請求項４５】
前記対象が、心不全のリスクがある、心不全を患っているかつ／または心筋梗塞の発症を経験している、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記心筋梗塞が前記対象の心室中のものである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
心臓の修復を必要とする対象の治療において使用するための組成物であって、請求項３６、３７、および４０〜４２のいずれか１項に記載の心筋細胞の集団を含む組成物。
【請求項４８】
心臓の修復を必要とする対象を治療するための医薬の調整における、請求項３６、３７、および４１〜４３のいずれか１項に記載の心筋細胞の集団の使用。
【請求項４９】
中胚葉細胞の集団中の心房中胚葉を検出する方法であって、ＲＡＬＤＨ２を検出することを含み、ＲＡＬＤＨ２の存在が心房中胚葉を指し示す、方法。
【請求項５０】
中胚葉細胞の集団中の心室中胚葉を検出する方法であって、ＣＤ２３５ａを検出することを含み、ＣＤ２３５ａの存在が心室中胚葉を指し示す、方法。
【請求項５１】
洞房結節のペースメーカー細胞または心外膜細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、
中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることであって、前記中胚葉誘導培地が、ＡＬＤＨ＋／ＣＤ２３５−中胚葉を生成するために充分な量のＢＭＰ成分およびアクチビン成分をさらに含む、前記インキュベートすること、およびその後に、
ＷＮＴ、ＦＧＦｉおよびＢＭＰの１つまたは複数を含む好適な培地中で前記インキュベートされた細胞を培養して、洞房結節のペースメーカー細胞または心外膜細胞が濃縮された心筋細胞の集団を生成させること
を含む、方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の方法により製造された心筋細胞の集団。
【請求項５３】
試験化合物または剤の潜在的な心毒性をスクリーニングまたは評価する方法であって、先行する細胞集団の請求項のいずれかに記載の心筋細胞の集団を前記試験化合物に曝露するステップ、ならびに、生存能力、収縮性、電位の変化および／または細胞の他の機能を評価するステップを含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本開示の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な説明および特定の例は、本開示の好ましい実施形態を指し示すとはいえ、説明のためにのみ与えられるものであることが理解されるべきであり、本開示の精神および範囲内での様々な変更および改良がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるであろう。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団であって、ペースメーカー細胞を本質的に含まない、集団。
（項目２）
ペースメーカー細胞を欠いている、項目１に記載の集団。
（項目３）
患者における心不全または心筋梗塞を治療するための医薬組成物であって、項目１または２に記載の心筋細胞の集団および薬学的に許容される担体を含む、組成物。
（項目４）
心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、
中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることであって、前記中胚葉誘導培地が、心室中胚葉を生成するために充分なＢＭＰ成分および有効量のアクチビン成分を含む、前記インキュベートすること、およびその後に、
好適な培地中で前記インキュベートされた細胞を培養して、心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を生成させること
を含む、方法。
（項目５）
前記アクチビン成分の濃度が前記ＢＭＰ成分の濃度より高い、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記アクチビン成分に対する前記ＢＭＰ成分の比が、約０．３〜１：１、約０．５：１、または約０．８：１である、項目４または５に記載の方法。
（項目７）
前記アクチビン成分の濃度が、ＣＤ２３５ａを発現する中胚葉細胞のレベルを測定すること、およびこれをＲＡＬＤＨ２を発現する中胚葉細胞のレベルに対して比較することにより決定される、項目４〜６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
前記アクチビン成分の濃度が、ＲＡＬＤＨ２を発現する中胚葉細胞と比較してより多くのＣＤ２３５ａを発現する中胚葉細胞を結果として優先的にもたらす濃度を決定することにより選択される、項目４〜７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
前記アクチビン成分が、約４ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌの量で加えられる、項目４〜８のいずれか１項に記載の方法。
（項目１０）
前記アクチビン成分の濃度が６〜２０ｎｇ／ｍｌである、項目４〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１１）
前記ＢＭＰ成分の濃度が約３ｎｇ／ｍｌ〜約２０ｎｇ／ｍｌである、項目４〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＢＭＰ成分の濃度が５ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌである、項目４〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１３）
前記アクチビン成分の濃度が１２ｎｇ／ｍｌである、項目４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記ＢＭＰ成分がＢＭＰ４である、項目４〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記アクチビン成分がアクチビンＡである、項目４〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（項目１６）
生成された心筋細胞の前記集団の少なくとも一部分が、心臓の修復を必要とする対象を治療するために使用される、項目４〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（項目１７）
心臓の修復を必要とする前記対象が、心不全のリスクがある、心不全を患っているかつ／または心筋梗塞の発症を患っている、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記治療が、心筋梗塞の発症の前、間または後に為される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、
中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることであって、前記中胚葉誘導培地が、心房中胚葉を生成するために充分なＢＭＰ成分および有効量のアクチビン成分を含む、前記インキュベートすること、およびその後に、
レチノイン酸成分を前記細胞に加えることであって、前記レチノイン酸成分を前記加えることが、中胚葉誘導培地中での前記インキュベーションの間または後に行われる、前記加えること、および、
心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の集団が生成されるように前記インキュベートされた細胞を培養すること
を含む、方法。
（項目２０）
前記レチノイン酸成分が、前記細胞がＲＡＬＤＨ２陽性かつＣＤ２３５ａ陰性である時に加えられる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記アクチビン成分に対する前記ＢＭＰ成分の比が約１．５対１またはそれより高い、項目１９または２０に記載の方法。
（項目２２）
前記アクチビン成分に対する前記ＢＭＰ成分の比が３：２である、項目１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
（項目２３）
前記ＢＭＰ成分が約３ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
（項目２４）
前記ＢＭＰ成分が約３ｎｇ／ｍｌの量で存在する、項目１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
（項目２５）
前記アクチビン成分が約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約６ｎｇ／ｍｌの量で存在する、項目１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目２６）
前記アクチビン成分が約２ｎｇ／ｍｌの量で存在する、項目１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（項目２７）
前記レチノイン酸成分がトランスレチノイン酸またはレチノールである項目１９〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（項目２８）
前記レチノイン酸成分が５０ｎｍ〜５μΜの濃度で加えられる、項目１９〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（項目２９）
前記レチノイン酸成分が５００ｎＭの濃度で加えられる、項目１９〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（項目３０）
前記ＢＭＰ成分がＢＭＰ４である、項目１９〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（項目３１）
前記アクチビン成分がアクチビンＡである、項目１９〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（項目３２）
前記ＢＭＰ成分が１日後に前記中胚葉誘導培地に加えられる、項目１９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３３）
前記アクチビン成分が１日後に前記中胚葉誘導培地に加えられる、項目１９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
（項目３４）
前記レチノイン酸成分が前記方法の約３〜５日目に加えられる、項目１９〜３３のいずれか１項に記載の方法。
（項目３５）
追加のＢＭＰ成分が前記方法の３日目に前記中胚葉誘導培地に加えられない、項目１９〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目３６）
ＦＧＦ阻害剤が前記方法の３日目に前記中胚葉誘導培地に入れられない、項目１９〜３５のいずれか１項に記載の方法。
（項目３７）
前記中胚葉誘導培地中で前記多能性幹細胞をインキュベートする前に、凝集および／または胚様体形成のために好適な培地中で前記多能性幹細胞をインキュベートすることをさらに含む、項目４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
（項目３８）
前記方法により製造された細胞が、潜在的な治療用化合物をスクリーニングするためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて利用される、項目４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
（項目３９）
心房心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約５０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心房心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心房心筋細胞、または少なくとももしくは約９０％の心房心筋細胞を含む、集団。
（項目４０）
項目１８〜３８のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られた、項目３９に記載の心筋細胞の集団。
（項目４１）
心室心筋細胞が濃縮された心筋細胞の単離された集団であって、少なくとももしくは約５０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約６０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約７０％の心室心筋細胞、少なくとももしくは約８０％の心室心筋細胞、または少なくとももしくは約９０％の心室心筋細胞を含む、集団。
（項目４２）
ペースメーカー細胞を本質的に含まない、またはペースメーカー細胞を欠いている、項目４１に記載の集団。
（項目４３）
項目４〜１７のいずれか１項に記載の方法にしたがって得られた、項目４１または４２に記載の集団。
（項目４４）
心臓の修復を必要とする対象を治療する方法であって、前記対象に項目１、２、または４１〜４３のいずれか１項に記載の心筋細胞の集団を投与することを含む、方法。
（項目４５）
前記対象が、心不全のリスクがある、心不全を患っているかつ／または心筋梗塞の発症を経験している、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記心筋梗塞が前記患者の心室中のものである、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
心臓の修復を必要とする対象の治療において使用するための、項目１、２、または４０〜４２のいずれか１項に記載の心筋細胞の集団。
（項目４８）
心臓の修復を必要とする対象を治療するための医薬の調整における、項目１、２、または４１〜４３のいずれか１項に記載の心筋細胞の集団の使用。
（項目４９）
中胚葉細胞の集団中の心房中胚葉を検出する方法であって、ＲＡＬＤＨ２を検出することを含み、ＲＡＬＤＨ２の存在が心房中胚葉を指し示す、方法。
（項目５０）
中胚葉細胞の集団中の心室中胚葉を検出する方法であって、ＣＤ２３５ａを検出することを含み、ＣＤ２３５ａの存在が心室中胚葉を指し示す、方法。
（項目５１）
洞房結節のペースメーカー細胞または心外膜細胞が濃縮された心筋細胞の集団を製造する方法であって、
中胚葉誘導培地中で多能性幹細胞をインキュベートすることであって、前記中胚葉誘導培地が、ＡＬＤＨ＋／ＣＤ２３５−中胚葉を生成するために充分な量のＢＭＰ成分およびアクチビン成分をさらに含む、前記インキュベートすること、およびその後に、
ＷＮＴ、ＦＧＦｉおよびＢＭＰの１つまたは複数を含む好適な培地中で前記インキュベートされた細胞を培養して、洞房結節のペースメーカー細胞または心外膜細胞が濃縮された心筋細胞の集団を生成させること
を含む、方法。
（項目５２）
項目５１に記載の方法により製造された心筋細胞の集団。
（項目５３）
試験化合物または剤の潜在的な心毒性をスクリーニングまたは評価する方法であって、先行する細胞集団の項目のいずれかに記載の心筋細胞の集団を前記試験化合物に曝露するステップ、ならびに、生存能力、収縮性、電位の変化および／または細胞の他の機能を評価するステップを含む、方法。