【手続補正書】
【提出日】平成16年9月27日(2004.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式(I)に示す構造単位を含み、且つ下記（１）及び（２）に示す性質を有するヘパリン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする医薬。
（１）ヘパリン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析から算出した二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースのモル％が80％以上である。
（２）標準血漿に6μg/mlの濃度で添加した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time;APTT）が50秒を越えない。
構造式(I)
【化１】
1999100322.tif 000001
【請求項２】
下記構造式(I)に示す構造単位を含み、且つ下記（１）及び（２）に示す性質を有するヘパリン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする虚血・再潅流障害抑制剤。
（１）ヘパリン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析から算出した二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースのモル％が80％以上である。
（２）標準血漿に6μg/mlの濃度で添加した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time;APTT）が50秒を越えない。
構造式(I)
【化２】
1999100322.tif 000002
【請求項３】
ヘパリン誘導体の有する性質（１）が下記の通りであることを特徴とする請求項２記載の虚血・再潅流障害抑制剤。
（１）ヘパリン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析から算出した二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースのモル％が85％以上である。
【請求項４】
冠動脈の虚血に伴う心筋組織障害を抑制するための薬剤であることを特徴とする請求項２又は３記載の虚血・再潅流障害抑制剤。
【請求項５】
経皮経管冠動脈形成術又は冠動脈バイパス術を行う際に使用される薬剤であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれか一項に記載の虚血・再潅流障害抑制剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく、鋭意検討を繰り返した結果、特定のヘパリン誘導体が虚血・再潅流直後の組織障害を抑制する活性を有することを見出し、この知見に基づいて本発明に達した。
すなわち、本発明は下記構造式(I)に示す構造単位を含み、且つ下記（１）及び（２）に示す性質を有するヘパリン誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分として含む虚血・再潅流障害抑制剤を要旨とするものである。
（１）ヘパリン分解酵素による分解と高速液体クロマトグラフィーによる分析を組み合わせた二糖分析から算出した二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコースのモル％が80％以上である。
（２）標準血漿に6μg/mlの濃度で添加した際の活性化部分トロンボプラスチン時間（activated partial thromboplastin time;APTT）が50秒を越えない。
構造式(I)
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【化３】
1999100322.tif 000003
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
反応終了後、反応液のpHを4〜5に調節することにより過剰の水素化ホウ素ナトリウムを分解し、次いで1〜2.5M、好ましくは2Mのアルカリ溶液（例えば水酸化ナトリウム溶液、水酸化カリウム溶液、水酸化マグネシウム溶液、水酸化カルシウム溶液など）に再溶解してpH9〜10に調整し、蒸留水に対して透析することによりNACヘパリンの塩を得ることが可能である。
上記NACヘパリンをその薬理学的に許容される塩としてもよく、例えばアルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩）及びアルカリ土類金属塩（マグネシウム塩、カルシウム塩）などが挙げられるが、アルカリ金属塩が好ましく、その中でもナトリウム塩が最も好ましい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
上記反応自体は公知であるが、本発明の虚血・再潅流障害剤の有効成分としての物性を有するヘパリン誘導体は、その反応条件を適宜調整することによって得ることが出来る。具体的にはNACヘパリンは、一般にヘパリン骨格と呼ばれるヘキスロン酸とグルコサミンの繰り返し構造中において、その中のウロン酸残基のうち、２位および３位に硫酸基を有さないウロン酸残基が、前記２位と３位の炭素原子間で開環、即ちそのピラノース環が開裂した構造を有するので、原料ヘパリンの特定位の炭素原子間結合が開裂する反応条件が選定される。また、NACヘパリンの中でも本発明薬剤の成分として有効なものは、NACヘパリンをヘパリン分解酵素により分解して生じる二糖を高速液体クロマトグラフィーで分析する方法によって求めた二糖組成において、2-デオキシ-2-スルファミノ-(4-デオキシ-2-O-スルホ-α-L-threo-hex-4-エノピラノシルウロン酸)-6-O-スルホ-D-グルコース（以下ΔDiHS-tri(U,6,N)Sとも記載する）のモル％が少なくとも80%以上であることが必要であり、85％以上であることが好ましい。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
（１）NACヘパリンのヘパリン分解酵素による消化
新生化学実験講座3、糖質II  54-59頁に記載の方法により、ヘパリンあるいはNACヘパリン1.0mgを2mM酢酸カルシウムを含む20mM酢酸ナトリウム（pH7.0）220μlに溶解して、20mUのヘパリナーゼ、20mUのヘパリチナーゼI及びIIを加えて、37℃、２時間反応させた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
（２）HPLCによる分析
上記（１）による消化を行った後の溶液20μlを、HPLC（医理化、モデル852型）を用いて分析した。イオン交換カラム（Dionex社、CarboPac  PA-1カラム4.0mm×250mm）を使用し、232nmでの吸光度を測定した。流速1ml/分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（50mM→2.5M）を用いる方法に準拠した（Kariya, et al.,Comp.Biochem.Physiol.,103B,473−479,(1992)）。その結果、ΔDiHS-tri(U,6,N)S含量は、原料ヘパリンで64.2%、NACヘパリンで89.7%となった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
試験例３
［分子量測定］
試験例１で得たNACヘパリンの3％溶液10μlをHPLCによるゲルろ過で分析した。カラムはTSKgel-（G4000＋G3000＋G2500）PWXL（東ソー、7.8mm×30cm）を用い、溶離液に0.2M塩化ナトリウムを使用して、1.0ml/分の流速で展開した。NACヘパリンの検出には、示差屈折計（島津製作所、AID-2A）を用いた。平均分子量はヘパリンの分子量標準品を対照にして求めた（Kaneda et al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.,220 ,108-112(1996)）。その結果、試験例１で得たNACヘパリンの分子量は約12,800であることが明らかになった。