【手続補正書】
【提出日】令和3年10月1日(2021.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位特異的塩基編集のための操作された組成物であって、
（ａ）標的化ドメインと、
（ｂ）アデノシンデアミナーゼまたはその触媒ドメインと、を含み、前記アデノシンデアミナーゼが、活性をシチジンデアミナーゼに変換するように修飾される、組成物。
【請求項２】
前記アデノシンデアミナーゼが、Ｅ３９６、Ｃ４５１、Ｖ３５１、Ｒ４５５、Ｔ３７５、Ｋ３７６、Ｓ４８６、Ｑ４８８、Ｒ５１０、Ｋ５９４、Ｒ３４８、Ｇ５９３、Ｓ３９７、Ｈ４４３、Ｌ４４４、Ｙ４４５、Ｆ４４２、Ｅ４３８、Ｔ４４８、Ａ３５３、Ｖ３５５、Ｔ３３９、Ｐ５３９、Ｖ５２５、及びＩ５２０から選択される１つ以上の位置で変異されるか、
前記アデノシンデアミナーゼが、Ｅ４８８、Ｖ３５１、Ｓ４８６、Ｔ３７５、Ｓ３７０、Ｐ４６２、及びＮ５９７から選択される１つ以上の位置で変異されるか、または
前記アデノシンデアミナーゼが、Ｅ４８８Ｑ、Ｖ３５１Ｇ、Ｓ４８６Ａ、Ｔ３７５Ｓ、Ｓ３７０Ｃ、Ｐ４６２Ａ、及びＮ５９７Ｉから選択される１つ以上の変異を含む、
請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、ヒト、頭足類、またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａアデノシンデアミナーゼタンパク質もしくはその触媒ドメインであるか、または前記標的化ドメインに共有結合または非共有結合で連結される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、ｈＡＤＡＲ２−Ｄアミノ酸配列のグルタミン酸４８８、または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置における変異を含むように修飾されている、請求項１から３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
位置４８８または相同ＡＤＡＲタンパク質における対応する位置の前記グルタミン酸残基が、グルタミン残基によって置き換えられるか（Ｅ４８８Ｑ）、または 前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、変異Ｅ４８８Ｑを含む変異されたｈＡＤＡＲ２ｄまたは変異Ｅ１００８Ｑを含む変異されたｈＡＤＡＲ１ｄである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記標的化ドメインが、触媒的に不活性なＣａｓ１３タンパク質、または前記触媒的に不活性なＣａｓ１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記触媒的に不活性なＣａｓ１３タンパク質が、触媒的に不活性なＣａｓ１３ａ、触媒的に不活性なＣａｓ１３ｂ、または触媒的に不活性なＣａｓ１３ｃであるか、または表１、２、３、または４のいずれかに列挙される細菌種からなる群から選択される細菌種に由来するＣａｓ１３ヌクレアーゼから得られる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
直接反復配列に連結されるガイド配列を含むガイド分子、または前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
目的の標的座位におけるアデニンを修飾するのに適した、操作された非天然型のシステムであって、請求項６に記載の組成物と、
（ｃ）直接反復配列に連結されるガイド配列を含むガイド分子、または前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列
とを含み、
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記Ｃａｓ１３タンパク質もしくは前記ガイド分子に共有結合または非共有結合で連結されるか、または送達後にそれらに連結するように適合されており、
前記ガイド配列が、アデニンを含む標的ＲＮＡ配列とハイブリダイズしてＲＮＡ二本鎖を形成することができ、前記ガイド配列が、前記アデニンに対応する位置で非対合シトシンを含み、形成された前記ＲＮＡ二本鎖においてＡ−Ｃミスマッチをもたらす、システム。
【請求項１０】
目的の標的ＲＮＡ配列におけるアデニンを修飾する方法であって、前記標的ＲＮＡに、請求項９に記載のシステムを送達することを含み、
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記ＲＮＡ二本鎖において前記アデニンを脱アミノする、方法：ただし、ヒトを処置する方法は除く。
【請求項１１】
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記死んだＣａｓ１３タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、リンカーによって前記死んだＣａｓ１３タンパク質に融合される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンカーが、（ＧＧＧＧＳ）3-11、ＧＳＧ5もしくはＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲであるか、または前記リンカーがＸＴＥＮリンカーである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、アダプタータンパク質に連結され、前記ガイド分子または前記死んだＣａｓ１３タンパク質が、前記アダプタータンパク質に結合することができるアプタマー配列を含む、請求項１０から１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アダプター配列が、ＭＳ２、ＰＰ７、Ｑβ、Ｆ２、ＧＡ、ｆｒ、ＪＰ５０１、Ｍ１２、Ｒ１７、ＢＺ１３、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、ＭＸ１、ＴＷ１８、ＶＫ、ＳＰ、ＦＩ、ＩＤ２、ＮＬ９５、ＴＷ１９、ＡＰ２０５、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、７ｓ、及びＰＲＲ１から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記死んだＣａｓ１３タンパク質の内部ループに挿入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ａタンパク質であり、前記Ｃａｓ１３ａが、２つのＨＥＰＮドメインにおいて、特に、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ  ｗａｄｅｉに由来するＣａｓ  １３ａタンパク質の位置Ｒ４７４及びＲ１０４６またはＣａｓ１３ａオーソログのそれらに対応するアミノ酸位置で１つ以上の変異を含むか、
前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ｂタンパク質であり、前記Ｃａｓ１３ｂが、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ  ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ４３７６７に由来するＣａｓ１３ｂタンパク質の位置Ｒ１１６、Ｈ１２１、Ｒ１１７７、もしくはＨ１１８２のうちの１つ以上、またはＣａｓ１３ｂオーソログのそれらに対応するアミノ酸位置において変異を含むか、または
前記Ｃａｓ１３タンパク質が、Ｃａｓ１３ｂタンパク質であり、前記Ｃａｓ１３ｂが、Ｂｅｒｇｅｙｅｌｌａ  ｚｏｏｈｅｌｃｕｍ  ＡＴＣＣ  ４３７６７に由来するＣａｓ１３ｂタンパク質のＲ１１６Ａ、Ｈ１２１Ａ、Ｒ１１７７Ａ、またはＨ１１８２Ａのうちの１つ以上、もしくはＣａｓ１３ｂオーソログのそれらに対応するアミノ酸位置において変異を含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ガイド配列が、前記標的配列と前記ＲＮＡ二本鎖を形成することができる約２０〜約５３ｎｔ、約２５〜約５３ｎｔ、約２９〜約５３ｎｔ、または約４０〜約５０ｎｔの長さを有する、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記非対合Ｃと前記ガイド配列の５’末端との間の距離が、２０〜３０ヌクレオチドであるか、
前記ガイド配列が、前記標的ＲＮＡ配列における異なるアデノシン部位に対応する２つ以上のミスマッチを含むか、または２つのガイド分子が使用され、各々が、前記標的ＲＮＡ配列における異なるアデノシン部位に対応するミスマッチを含むか、
前記Ｃａｓ１３タンパク質及び任意選択で前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、１つ以上の異種核局在化シグナル（複数可）（ＮＬＳ）を含むか、または
前記方法が、前記目的の標的配列を決定することと、前記標的配列に存在する前記アデニンを最も効率的に脱アミノする前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを選択することと、を含む、
請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記目的の標的ＲＮＡ配列が、細胞内にある、請求項１０〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が、真核細胞、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、植物細胞、動物、植物、インビトロにおけるＲＮＡポリヌクレオチドに含まれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記成分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が、リボ核タンパク質複合体または１つ以上のポリヌクレオチド分子として前記細胞に送達される、請求項１０〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上のポリヌクレオチド分子が、成分（ａ）及び／または（ｃ）をコードする１つ以上のｍＲＮＡ分子を含むか
１つ以上のベクター内に含まれるか、または
前記Ｃａｓ１３タンパク質、前記ガイド分子、及び前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを発現するように動作可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み、任意選択で、前記１つ以上の調節エレメントが誘導性プロモーターを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つ以上のポリヌクレオチド分子または前記リボ核タンパク質複合体が、粒子、小胞、または１つ以上のウイルスベクターを介して送達される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記粒子が、脂質、糖、金属またはタンパク質を含むか、
前記粒子が、脂質ナノ粒子を含むか
前記小胞が、エクソソームまたはリポソームを含むか、または
前記１つ以上のウイルスベクターが、アデノウイルス、１つ以上のレンチウイルス、または１つ以上のアデノ関連ウイルスのうちの１つ以上を含む、
請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法が、１つ以上の標的ＲＮＡ配列の操作によって細胞、細胞株または生物を修飾する、請求項１０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記目的の標的ＲＮＡにおける前記アデニンの前記脱アミノが、病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ点変異を含有する転写産物によって引き起こされる疾患を治療する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患が、Ｍｅｉｅｒ−Ｇｏｒｌｉｎ症候群、Ｓｅｃｋｅｌ症候群４、Ｊｏｕｂｅｒｔ症候群５、Ｌｅｂｅｒ先天性黒内障１０、２型Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ−Ｔｏｏｔｈ病、２型Ｃｈａｒｃｏｔ−Ｍａｒｉｅ−Ｔｏｏｔｈ病、２Ｃ型Ｕｓｈｅｒ症候群、脊髄小脳失調症２８、脊髄小脳失調症２８、脊髄小脳失調症２８、ＱＴ延長症候群２、Ｓｊｏｇｒｅｎ−Ｌａｒｓｓｏｎ症候群、遺伝性果糖尿症、遺伝性果糖尿症、神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、Ｋａｌｌｍａｎｎ症候群１、Ｋａｌｌｍａｎｎ症候群１、Ｋａｌｌｍａｎｎ症候群１、異染性白質ジストロフィー、Ｒｅｔｔ症候群、筋萎縮性側索硬化症１０型、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群、または表５に列挙される疾患、または中途終結疾患から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾が、生物の妊孕性に影響するか、
前記修飾が、前記標的ＲＮＡ配列のスプライシングに影響するか、
前記修飾が、アミノ酸変化を導入し、がん細胞における新たな抗原の発現を引き起こす転写産物における変異を導入するか、
前記標的ＲＮＡが、マイクロＲＮＡ内に含まれるか、
前記目的の標的ＲＮＡにおける前記アデニンの前記脱アミノが、遺伝子の機能の獲得または機能の欠失を引き起こすか、または
前記目的の標的ＲＮＡにおける前記アデニンの前記脱アミノが、がん細胞によって発現される遺伝子の機能の獲得または機能の欠失を引き起こす、
請求項２６から２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１０から２９の何れか一項に記載の方法から得られる修飾された細胞、または前記修飾された細胞の後代であって、前記細胞が、前記方法を受けていない対応する細胞と比較して、前記目的の標的ＲＮＡにおける前記アデニンに代わるヒポキサンチンまたはグアニンを含む、修飾された細胞または後代。
【請求項３１】
請求項３０に記載の修飾された細胞を含む、非ヒト動物または植物。
【請求項３２】
請求項３０に記載の修飾された細胞を含み、前記修飾された細胞の存在が、患者における疾患を治療する、細胞治療剤。
【請求項３３】
請求項１に記載の（ａ）および（ｂ）をコードする配列を含む１以上のポリヌクレオチドを含む、目的の標的座位におけるアデニンを修飾するのに適した、操作された非天然型のベクターシステム。
【請求項３４】
ａ）前記ガイド配列を含む前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結される第１の調節エレメントと、
ｂ）前記触媒的に不活性なＣａｓ１３タンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結される第２の調節エレメントと、
ｃ）前記第１または第２の調節エレメントの制御下にあるか、または第３の調節エレメントに動作可能に連結されるアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列と、を含む１つ以上のベクターを含み、
アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が第３の調節エレメントに動作可能に連結される場合、前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、発現後に前記ガイド分子または前記Ｃａｓ１３タンパク質に連結するように適合され、
成分（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）は、前記システムの同じまたは異なるベクター上に位置する、請求項３３に記載の操作された非天然型のベクターシステム。
【請求項３５】
請求項３３又は３４に記載のシステムを含む、インビトロもしくはエクスビボ宿主細胞もしくはその後代、または細胞株もしくはその後代。
【請求項３６】
前記細胞が、真核細胞、動物細胞、ヒト細胞、または植物細胞、治療用Ｔ細胞、または抗体産生Ｂ細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞もしくはその後代または細胞株、またはその後代。
【請求項３７】
前記シトシンが、グアノシンに５’隣接しないか、
前記アデノシンデアミナーゼが、ＡＤＡＲ、任意選択でｈｕＡＤＡＲ、任意選択で（ｈｕ）ＡＤＡＲ１または（ｈｕ）ＡＤＡＲ２であるか、
前記Ｃａｓ１３、好ましくはＣａｓ１３ｂが、切断され、好ましくはＣ末端切断され、好ましくは、前記Ｃａｓ１３が、対応する野生型Ｃａｓ１３の切断された機能的バリアントであるか、
前記アデノシンデアミナーゼが、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼであるか、または、
前記アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインが、前記ＡＤＡＲの１つ以上の変異、好ましくは本明細書に記載の変異、例えば、図４３Ａ〜４３Ｄ、４４、４５、４６Ａ〜４６Ｂ、４７Ａ〜４７Ｂのいずれかに提供される変異、またはＡＤＡＲホモログまたはオーソログにおける対応する変異を含むように修飾されている、
請求項１０から２９の何れか一項に記載の方法。