【手続補正書】
【提出日】令和2年12月2日(2020.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２及び配列番号３から選択される野生型志賀毒素Ａサブユニット配列に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む志賀毒素エフェクターポリペプチドであって、
前記アミノ酸配列と前記野生型志賀毒素Ａサブユニット配列とは、１つ又は２つ以上のアミノ酸置換により異なり、
前記アミノ酸配列が、前記アミノ酸配列内に１回しか出現しないアミノ酸残基を含み、前記１回しか出現しないアミノ酸残基が、
（ｉ）前記野生型志賀毒素Ａサブユニット配列との比較での前記１つ若しくは２つ以上のアミノ酸置換のうちの１つであって、かつ、システイン、リジン、ヒスチジン、セレノシステイン、若しくはピロリン−カルボキシ−リジン残基であるか、又は
（ii）前記野生型志賀毒素Ａサブユニット配列中の位置と同一の位置に前記アミノ酸配列内に１回しか出現しないリジン残基であり、
前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが、細胞内在化、前記ポリペプチドが存在する細胞の小胞体への細胞内の経路決定を指示すること、前記ポリペプチドが存在する細胞のサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、前記ポリペプチドと直接的に又は間接的に連結されているカーゴで細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、及び細胞毒性からなる群から選択される、１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクター機能を示すことができる、
前記志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項２】
１回しか出現しないアミノ酸残基が、野生型志賀毒素Ａサブユニット配列との比較での１つ若しくは２つ以上のアミノ酸置換のうちの１つであって、かつ、システインである、請求項１に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項３】
配列番号５〜１２４及び１１０１〜１１０４のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項２に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項４】
配列番号５〜１２４のいずれか１つを含むか又はそれからなる、請求項３に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項５】
志賀毒素エフェクターポリペプチドが、配列番号９、１１及び１４のいずれか１つを含むか又はそれからなる、請求項４に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項６】
（ｉ）配列番号９、２９又は１１０１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列中の唯一のシステイン残基が、配列番号９、２９又は１１０１の３３位に出現する、前記アミノ酸配列；
（ii）配列番号１１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列中の唯一のシステイン残基が、配列番号１１の４５位に出現する、前記アミノ酸配列；及び
（iii）配列番号１４と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列中の唯一のシステイン残基が、配列番号１４の５４位に出現する、前記アミノ酸配列；
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項７】
１回しか出現しないアミノ酸残基が、
（ｉ）配列番号１若しくは配列番号２で示される野生型志賀毒素Ａサブユニット配列のアミノ酸残基位置１、１１若しくは２７４、又は
（ｉｉ）配列番号３で示される前記野生型志賀毒素Ａサブユニット配列のアミノ酸残基位置１１、２５５、２５７、２７０若しくは２８０、
に本来見られるリジン残基である、
請求項１に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項８】
配列番号１２５〜２３２及び１１０９〜１１４０のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項７に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項９】
（ｉ）配列番号１９７、１９８及び２００のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列中の唯一のリジン残基が、配列番号１９７、１９８及び２００の１位に出現する、前記アミノ酸配列；及び
（ii）配列番号２０１、２０２及び２０５のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列中の唯一のリジン残基が、配列番号２０１、２０２及び２０５の１１位に出現する、前記アミノ酸配列；から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１２５〜２３２のいずれか１つを含むか又はそれからなる、請求項８に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１９７、１９８、２００〜２０２及び２０５のいずれか１つを含むか又はそれからなる、請求項１０に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項１２】
１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクター機能が細胞毒性である、請求項１〜１１のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項１３】
志賀毒素エフェクターが、１０，０００ピコモル濃度以下のＩＣ５０値でリボソーム阻害活性を示すことができる、請求項１２に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項１４】
アミノ酸配列内に１回しか出現しないアミノ酸残基が、その官能基を介して原子又は分子と共有結合で連結されている、請求項１〜１３のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項１５】
原子が、放射性核種であるか、又は
分子が、抗生物質、抗原、抗原性物質、細胞毒性薬剤、放射性核種、溶解度を変化させる薬剤、薬物動態を変化させる薬剤、免疫原性を変化させる薬剤、薬力学的変化をもたらす薬剤、検出促進剤、色素、Ｔ細胞エピトープ、フルオロフォア、免疫原、免疫原性物質、酵素、ジモキシン、脂質、ポリマー、ポリエチレングリコール、血清アルブミン結合剤、小分子化学療法剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、核酸、及び／又はタンパク質−核酸複合体である、請求項１４に記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド。
【請求項１６】
（ａ）（ｉ）請求項１〜１５のいずれか１つ、若しくは
（ii）配列番号２３３〜４７５のいずれか１つからなる志賀毒素エフェクターポリペプチド
から選択される志賀毒素エフェクターポリペプチド、又は
（ｂ）配列番号７６２〜７６７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなるポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、前記アミノ酸配列内に１回しか出現しないアミノ酸残基を含み、前記１回しか出現しない前記アミノ酸残基が、システイン、リジン、ヒスチジン、セレノシステイン、若しくはピロリン−カルボキシ−リジン残基であり、かつ、前記ポリペプチドが、細胞内在化、前記ポリペプチドが存在する細胞の小胞体への細胞内の経路決定を指示すること、前記ポリペプチドが存在する細胞のサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、前記ポリペプチドと直接的に又は間接的に連結されているカーゴで細胞内の経路決定を指示すること、リボソーム機能を阻害すること、及び細胞毒性からなる群から選択される、１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクター機能を示すことができる、前記ポリペプチドと、
（ｃ）少なくとも１つの細胞外標的生体分子に特異的に結合することができる結合領域と
を含む細胞標的化分子。
【請求項１７】
（ａ）（ｉ）に定義された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む請求項１６に記載の細胞標的化分子であって、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが、配列番号５〜１２４及び１１０１〜１１０４のいずれか１つからなる、前記細胞標的化分子。
【請求項１８】
（ａ）（ｉ）に定義された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む請求項１６に記載の細胞標的化分子であって、前記志賀毒素エフェクターポリペプチドが、配列番号１２５〜２３２及び１１０９〜１１４０のいずれか１つからなる、前記細胞標的化分子。
【請求項１９】
（ａ）に定義された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む請求項１６に記載の細胞標的化分子、又は請求項１７若しくは請求項１８に記載の細胞標的化分子であって、リンカーペプチドをさらに含む、前記細胞標的化分子。
【請求項２０】
リンカーペプチドが、配列番号７５７〜７６１及び７６８〜７７２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１９に記載の細胞標的化分子。
【請求項２１】
（ａ）（ｉ）に定義された志賀毒素エフェクターポリペプチドを含む請求項１６に記載の細胞標的化分子、又は請求項１７若しくは請求項１８に記載の細胞標的化分子であって、配列番号７７３〜７８３、７８９、７９１〜７９３、８１８〜８２３、及び１１４１で示されるポリペプチドを含むか又はそれからなる、前記細胞標的化分子。
【請求項２２】
（ｂ）に定義されたポリペプチドを含む請求項１６に記載の細胞標的化分子であって、アミノ酸配列内に１回しか出現しないアミノ酸残基が、システイン残基又はリジン残基である、前記細胞標的化分子。
【請求項２３】
（ｂ）に定義されたポリペプチドを含む請求項１６に記載の細胞標的化分子、又は請求項２２に記載の細胞標的化分子であって、前記ポリペプチドが、
（ｉ）アミノ酸配列内に１回しか出現しないアミノ酸残基が配列番号７６２又は７６３の２５７位におけるシステイン残基である、配列番号７６２又は７６３に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列、又は
（ii）アミノ酸配列内に１回しか出現しないアミノ酸残基が配列番号７６４〜７６７の２５５位におけるリジン残基である、配列番号７６４〜７６７のいずれか１つに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列
を含むか又はそれからなる、前記細胞標的化分子。
【請求項２４】
ポリペプチドが、配列番号７６２〜７６７のいずれか１つを含むか又はそれからなる、請求項２３に記載の細胞標的化分子。
【請求項２５】
配列番号８２４〜８２６のいずれか１つの配列を有するポリペプチドを含むか又はそれからなる、請求項２４に記載の細胞標的化分子。
【請求項２６】
（ｂ）に定義されたポリペプチドを含む請求項１６に記載の細胞標的化分子、又は請求項２２〜２５のいずれか１つの細胞標的化分子であって、１つ又は２つ以上の志賀毒素エフェクター機能が細胞毒性である、前記細胞標的化分子。
【請求項２７】
ポリペプチドが、１０，０００ピコモル濃度以下のＩＣ５０値でリボソーム阻害活性を示すことができる、請求項２６に記載の細胞標的化分子。
【請求項２８】
結合領域が、
シングルドメイン抗体断片、一本鎖可変断片、抗体可変断片、相補性決定領域３断片、拘束ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４ポリペプチド、Ｆｄ断片、抗原結合断片、アルマジロ反復ポリペプチド、フィブロネクチン由来の第１０フィブロネクチンIII型ドメイン、テネイシンIII型ドメイン、アンキリン反復モチーフドメイン、低密度リポタンパク質受容体由来Ａドメイン、リポカリン、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、プロテインＡ由来Ｚドメイン、ガンマ−Ｂクリスタリン由来ドメイン、ユビキチン由来ドメイン、Ｓａｃ７ｄ由来ポリペプチド、Ｆｙｎ由来ＳＨ２ドメイン、ミニタンパク質、若しくはＣ型レクチン様ドメイン足場、又は結合機能性を保持する前述のもののいずれかの遺伝子操作されたあらゆる対応物を含む、請求項１６〜２７のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項２９】
結合領域が、一本鎖可変断片又はシングルドメイン抗体断片を含む、請求項２８に記載の細胞標的化分子。
【請求項３０】
細胞標的化分子からなる参照分子より効率的に細胞内在化を誘導することができるが、いかなる志賀毒素エフェクターポリペプチドも含まない、請求項１６〜２９のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項３１】
結合領域が特異的に結合した細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている細胞に細胞標的化分子を投与すると、前記細胞の死を引き起こすことができる、請求項１６〜３０のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項３２】
メンバーが結合領域が特異的に結合した細胞外標的生体合分子と物理的にカップリングされている第一の細胞集団、及びメンバーが前記結合領域が特異的に結合したいかなる細胞外標的生体分子とも物理的にカップリングされていない第二の細胞集団に細胞標的化分子を投与すると、前記第一の細胞集団のメンバーに対する細胞標的化分子の細胞毒性効果が、前記第二の細胞集団のメンバーに対する細胞毒性効果と比べて少なくとも３倍大きい、請求項３１に記載の細胞標的化分子。
【請求項３３】
細胞又は第一の細胞集団が、細胞外標的生体分子又はその一部分を細胞の外部とカップリングさせる共有結合性及び／又は非共有結合性分子間相互作用によって、前記細胞外標的生体分子と物理的にカップリングされている；又は前記細胞外標的生体分子が、細胞又は第一の細胞集団により発現される膜内在性タンパク質又は表在性膜タンパク質である、請求項３１又は３２に記載の細胞標的化分子。
【請求項３４】
細胞外標的生体分子陽性細胞に対して１，０００ナノモル濃度以下のＣＤ５０値で細胞毒性活性、及び／又は有意なレベルの志賀毒素細胞毒性を示すことができる、請求項３１〜３３のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項３５】
結合領域が、
Ｂ７−Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＤ２０、ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ７９、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＢ２、前立腺特異的膜抗原、Ｃｒｉｐｔｏ、エンドグリン／ＣＤ１０５、線維芽細胞活性化タンパク質、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＣＤ７４、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ−７２、炭酸脱水酵素IX、葉酸結合タンパク質、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、ガングリオシドＬｅｗｉｓ−Ｙ２、ＶＥＧＦＲ、アルファＶベータ３、アルファ５ベータ１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ３、ｃ−ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＬＭＰ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、テネイシン、ＣＤ６４、メソセリン、ＢＲＣＡ１、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、ベータ−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ６、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、前立腺幹細胞抗原、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）ベータ−ヒドロキシラーゼ、ＥｐｈＡ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ−３、ＭＵＣ１、チロシナーゼ関連抗原、ヒトチロシナーゼ関連タンパク質１、ＨＰＶ−Ｅ７、エプスタイン・バーウイルス抗原、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、アルファ−フェトプロテイン抗原、１７−Ａ１、膀胱腫瘍抗原、ＣＤ３８、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ５３、ＣＤ８８、ＣＤ１２９、ＣＤ１８３、ＣＤ１９１、ＣＤ１９３、ＣＤ２４４、ＣＤ２９４、ＣＤ３０５；Ｃ３ＡＲ、ＦｃｅＲＩａ、ガレクチン−９、ｍｒｐ−１４、シグレック−８、シグレック−１０、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ１３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ１２３、ＴＬＲ４、ＩｇＥ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１５、Ｆ４／８０、ＩＬＴ−３、ガレクチン−３、ＣＤ１１ａ−ｃ、ＧＩＴＲＬ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ２８４／ＴＬＲ４、ＣＤ１０７／Ｍａｃ３、ＣＤ１９５／ＣＣＲ５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１６／３２、ＣＤ２８２／ＴＬＲ２、又は前述のもののいずれかのあらゆる免疫原性断片
である細胞外標的生体分子と結合することができる、請求項１６〜３４のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項３６】
志賀毒素エフェクターポリペプチドが、志賀毒素ファミリーのメンバーの天然に存在するＡサブユニットに対する、志賀毒素エフェクター領域の酵素活性を変化させる変異を含み、前記変異が、少なくとも１つのアミノ酸残基欠失又は置換から選択される、請求項１６〜３５のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項３７】
変異が、細胞毒性を低下させるか、又は除去し、
志賀毒素エフェクターポリペプチドが、
細胞内在化を刺激すること、前記ポリペプチドが存在する細胞のゴルジ体への細胞内の経路決定を指示すること、前記ポリペプチドが存在する小胞体への細胞内の経路決定を指示すること、前記ポリペプチドが存在する細胞のサイトゾルへの細胞内の経路決定を指示すること、及び前記ポリペプチドと直接的に又は間接的に連結されているカーゴで細胞内の経路決定を指示すること
のうちの１つ又は２つ以上から選択される志賀毒素エフェクター機能を示すことができる、請求項３６に記載の細胞標的化分子。
【請求項３８】
ポリペプチド内に１回しか出現しないアミノ酸残基と連結されている少なくとも１つの原子又は分子からなる追加の外在性物質又はカーゴをさらに含む、請求項１６〜３７のいずれかに記載の細胞標的化分子。
【請求項３９】
原子が、放射性核種であるか、又は分子が、抗生物質、抗原、抗原性物質、細胞毒性薬剤、放射性核種、溶解度を変化させる薬剤、薬物動態を変化させる薬剤、免疫原性を変化させる薬剤、薬力学的変化をもたらす薬剤、検出促進剤、色素、Ｔ細胞エピトープ、フルオロフォア、免疫原、免疫原性物質、酵素、ジモキシン、脂質、ポリマー、ポリエチレングリコール、血清アルブミン結合剤、小分子化学療法剤、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、核酸、及び／又はタンパク質−核酸複合体である、請求項３８に記載の細胞標的化分子。
【請求項４０】
請求項１〜１５のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び／又は請求項１６〜３９のいずれかに記載の細胞標的化分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
【請求項４１】
請求項１６〜３９のいずれかに記載の細胞標的化分子と、検出促進剤とを含む診断用組成物。
【請求項４２】
請求項１〜１５のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、及び／若しくは請求項１６〜３９のいずれかに記載の細胞標的化分子をコードすることができるポリヌクレオチド、又はその相補体。
【請求項４３】
請求項４２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４４】
請求項４２に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項４３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４５】
請求項１６〜３９のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は前記細胞標的化分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤若しくは担体とを含む医薬組成物を含む、細胞の殺滅剤。
【請求項４６】
細胞とインビトロで接触させる、請求項４５に記載の殺滅剤。
【請求項４７】
細胞とインビボで接触させる、請求項４５に記載の殺滅剤。
【請求項４８】
請求項１６〜３９のいずれかに記載の細胞標的化分子、
前記細胞標的化分子と少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤若しくは担体とを含む医薬組成物、及び／又は請求項４１に記載の診断用組成物を含む、外在性物質の標的発現細胞への送達剤。
【請求項４９】
標的発現細胞とインビトロで接触させる、請求項４８に記載の送達剤。
【請求項５０】
標的発現細胞とインビボで接触させる、請求項４８に記載の送達剤。
【請求項５１】
請求項１６〜３９のいずれかに記載の細胞標的化分子、又は前記細胞標的化分子と、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤若しくは担体とを含む医薬組成物を含む、患者における疾患、障害、又は状態の治療剤。
【請求項５２】
疾患、障害、又は状態が、がん、腫瘍、免疫障害、及び微生物感染からなる群から選択される、請求項５１に記載の治療剤。
【請求項５３】
請求項１〜１５のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、請求項１６〜３９のいずれかに記載の細胞標的化分子、請求項４０に記載の医薬組成物、及び／若しくは請求項４１に記載の診断用組成物を含む、がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染の治療又は予防における使用のための組成物。
【請求項５４】
がん、腫瘍、免疫障害、又は微生物感染の治療又は予防のための医薬品の製造における、請求項１〜１５のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、請求項１６〜３９のいずれかに記載の細胞標的化分子、請求項４０に記載の医薬組成物、及び／若しくは請求項４１に記載の診断用組成物の使用。
【請求項５５】
請求項１〜１５のいずれかに記載の志賀毒素エフェクターポリペプチド、請求項１６〜３９のいずれかに記載の細胞標的化分子、請求項４０に記載の医薬組成物、及び／又は請求項４１に記載の診断用組成物と、追加の試薬及び／又は医薬送達デバイスとを含むキット。