(57)【要約】【課題】正確な合焦動作が素早くできる顕微鏡を提供すること。【解決手段】対物レンズ４と、予め決められた複数の観察ポイントを有する被検体２を載置するステージ３と、オートフォーカス装置５と、駆動制御手段７，８と、第Ｎ番目の観察ポイントに、駆動制御手段７，８により対物レンズ４およびステージ３の相対位置が駆動制御された際に、オートフォーカス装置５からフォーカスエラー信号が出力された場合には、既に設定が終了している複数の観察ポイントのフォーカス信号に基づき第Ｎ番目の観察ポイントの光軸方向の相対位置を算出する処理手段１０とを有し、処理手段１０で算出された第Ｎ番目の観察ポイントの光軸方向の相対位置の信号に基づき駆動制御手段７，８が制御される顕微鏡。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対物レンズと、
予め決められた複数の観察ポイントを有する被検体を載置するステージと、
フォーカス用光源、および前記フォーカス用光源からの照射光を前記被検体に照射し、前記被検体からの前記照射光の反射光を受光する受光素子、および前記受光素子で得られた光電信号に基づきフォーカス信号を演算するフォーカス信号演算回路を有するオートフォーカス装置と、
前記被検体上の前記複数の観察ポイント（検鏡部位）が順次、前記対物レンズの観察光路上に来るように前記対物レンズおよび前記ステージの相対位置を駆動制御し、かつ前記オートフォーカス装置により前記観察光路上の前記観察ポイントに合焦するように前記対物レンズおよび前記ステージの光軸方向の相対位置を駆動制御する駆動制御手段と、
第Ｎ番目の前記観察ポイントに、前記駆動制御手段により前記対物レンズおよび前記ステージの相対位置が駆動制御された際に、前記オートフォーカス装置からフォーカスエラー信号が出力された場合には、既に設定が終了している前記複数の観察ポイントのフォーカス信号に基づき前記第Ｎ番目の観察ポイントの前記光軸方向の相対位置を算出する処理手段とを有し、
前記処理手段で算出された前記第Ｎ番目の観察ポイントの前記光軸方向の相対位置の信号に基づき前記駆動制御手段が制御されることを特徴とする顕微鏡。
【請求項２】
前記処理手段は、前記既に設定が終了している前記複数の観察ポイントのうち、前記第Ｎ番目の観察ポイントに隣接する観察ポイントにおける前記光軸方向の相対位置と、任意の１つ以上の観察ポイントにおける前記光軸方向の相対位置とに基づき、前記第Ｎ番目の観察ポイントにおける予測される前記光軸方向の相対位置を算出することを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
前記処理手段は、前記第Ｎ番目の観察ポイントにおける予測される前記光軸方向の相対位置を算出するとき、前記第Ｎ番目の観察ポイントと前記隣接する観察ポイント、及び前記第Ｎ番目の観察ポイントと前記任意の１つ以上の観察ポイントとの距離の逆数を重みとして、前記隣接する観察ポイントにおける前記光軸方向の相対位置と前記任意の１つ以上の観察ポイントにおける前記光軸方向の相対位置との加重平均を計算することを特徴とする請求項２に記載の顕微鏡。
【請求項４】
前記処理手段は、前記加重平均を計算するとき、前記隣接する観察ポイントと前記任意の１つ以上の観察ポイントを最近隣法により選択することを特徴とする請求項３に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、予め決められた複数の観察ポイントを有する被検体、例えばウェルプレート、予め決められた複数の観察ポイントを有するプレパラートや培養容器などを観察する顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば特許文献１の従来技術の生体試料観察システムは、例えば複数のウェルの形成されたウェルプレートに対して、各ウェルの試料を撮像する場合に、ウェルプレート底面の四隅のウェルと中央のウェルとの５つの合焦位置のデータに基づき、その他のウェルに対する撮像装置の焦点位置を算出し、各ウェルの試料を撮像するというものである。
【０００３】
すなわち、本従来技術では、ウェルプレートの５つの撮像面はオートフォーカス装置により求められた合焦位置であるが、その他のウェルに対する撮像装置の焦点位置は推定値となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−３６５３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ウェルプレートの底面では、ある程度の平坦性が保証されているが、若干の波うち（揺らぎ）は存在する。また、ウェルにおいては各ウェルの底面の高さが均一ではない。
【０００６】
したがって、上記従来技術では、ウェルプレートの全てのウェルに対してオートフォーカス装置を作動させて合焦位置を求める動作が必要ないので、全てのウェルの撮像を、素早く行うことができる反面、ウェルの底面の平坦性の影響を受けて正確な合焦位置での撮像が保証できない問題がある。
【０００７】
本発明は、全ての被検体の観察ポイントについて、合焦動作を行うが、その合焦動作の基準位置が過去に求めた複数の合焦位置に基づき決められるので、被検体が傾いていたとしても、正確な合焦動作が素早くできる顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明に係る顕微鏡は、対物レンズと、予め決められた複数の観察ポイントを有する被検体を載置するステージと、フォーカス用光源、および前記フォーカス用光源からの照射光を前記被検体に照射し、前記被検体からの前記照射光の反射光を受光する受光素子、および前記受光素子で得られた光電信号に基づきフォーカス信号を演算するフォーカス信号演算回路を有するオートフォーカス装置と、前記被検体上の前記複数の観察ポイント（検鏡部位）が順次、前記対物レンズの観察光路上に来るように前記対物レンズおよび前記ステージの相対位置を駆動制御し、かつ前記オートフォーカス装置により前記観察光路上の前記観察ポイントに合焦するように前記対物レンズおよび前記ステージの光軸方向の相対位置を駆動制御する駆動制御手段と、第Ｎ番目の前記観察ポイントに、前記駆動制御手段により前記対物レンズおよび前記ステージの相対位置が駆動制御された際に、前記オートフォーカス装置からフォーカスエラー信号が出力された場合には、既に設定が終了している前記複数の観察ポイントのフォーカス信号に基づき前記第Ｎ番目の観察ポイントの前記光軸方向の相対位置を算出する処理手段とを有し、前記処理手段で算出された前記第Ｎ番目の観察ポイントの前記光軸方向の相対位置の信号に基づき前記駆動制御手段が制御されることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、正確な合焦動作が素早くできる顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】第１実施形態に係る顕微鏡の構成を概略的に示す図である。
【図２】第１実施形態に係る顕微鏡の光学系の構成を示す図である。
【図３】第１実施形態に係る顕微鏡での観察に用いるマルチウェルプレートの一例を示す図である。
【図４】図３のマルチウェルプレートを用いた多点観察におけるＺ位置の設定順序例を示す図である。
【図５】図３のマルチウェルプレートを用いた多点観察におけるＺ位置の設定におけるプレートと対物レンズとの位置関係を示し、（ａ）はオートフォーカス可能な範囲を超えている状態、（ｂ）はオートフォーカス可能な状態を表す図である。
【図６】図３のマルチウェルプレートを用いた多点観察におけるＺ位置の設定手順を示すフローチャートである。
【図７】図３のマルチウェルプレートを用いた多点観察におけるＺ位置の設定結果例を示す図である。
【図８】図３のマルチウェルプレートを用いた多点観察におけるＺ位置の他の設定順序例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本願の実施形態に係る顕微鏡について図面を参照して説明する。
【００１２】
（第１実施形態）
まず、本願の第１実施形態に係る顕微鏡の全体的な構成について説明する。なお、全体的な構成は、後述する第２、第３実施形態も同様である。
【００１３】
図１に示すように、第１実施形態の顕微鏡１は、予め決められた複数の観察ポイントを有する被検体（例えばウェルプレート、予め決められた複数の観察ポイントを有するプレパラートや培養容器など）２を載置するステージ３、ステージ３下方に配置された対物レンズ４及びオートフォーカス装置５、ステージ３上方に配置された透過照明装置６を備えている。対物レンズ４は、不図示の電動レボルバに保持された倍率の異なる複数の対物レンズのうちの１つであり、これらの対物レンズは適宜交換が可能である。
【００１４】
また、顕微鏡１は、ステージ３を対物レンズ４の光軸に垂直なＸＹ方向に駆動するためのステージ駆動部７、対物レンズ４をその光軸方向であるＺ方向に駆動するための対物レンズ駆動部８、後述するオフセットレンズを駆動するためのオフセットレンズ駆動部９を備え、それぞれが処理部１０に接続されている。処理部１０には入力部１１が接続されている。なお、以下、顕微鏡１はステージ３がＸＹ方向に移動し、対物レンズ４がＺ方向に移動する構成として説明するが、ステージ３がＸＹＺ方向に移動する構成、対物レンズ４がＸＹＺ方向に移動する構成であってもよい。ステージ駆動部７や対物レンズ駆動部８が、オートフォーカスのための駆動制御手段を構成する。
【００１５】
また、処理部１０は図示しないメモリ、演算部、制御部などから構成される。入力部１１には、図示しないキーボード、対物レンズ切替えスイッチ、オートフォーカス制御開始スイッチ、合焦位置設定開始スイッチなどが設けられている。また符合１２は、手動で対物レンズ４を上下方向（Ｚ方向）に移動させるための上下動ハンドルを示す。
【００１６】
図２に示すように、第１実施形態に係る顕微鏡１の光学系は、予め決められた複数の観察ポイントを有する被検体２の下方に配置された観察光学系１３とオートフォーカス装置５の光学系であるフォーカス用光学系からなり、フォーカス用光学系はフォーカス用照射光学系１４とフォーカス用結像光学系１５からなる。なお、第１実施形態の顕微鏡１での観察に用いる被検体２は、一例として図３に示すようにマルチウェルプレート２ｄとマルチウェルプレート２ｄに保持された水などの媒質に浸された生体試料として後に説明するが、図２では、生体試料２ｂをガラス板２ａ、２ｃで保持したものとして簡単に表している。
【００１７】
観察光学系１３は、被検体２側から光軸に沿って順に、対物レンズ４、ダイクロイックミラー１６、観察用結像レンズ１７を有している。さらに、観察用結像レンズ１７の後方には不図示の接眼レンズが配置されており、この接眼レンズによって観察者は被検体像を観察することができる。なお、観察用結像レンズ１７の後方にＣＣＤを配置して、被検体像をカメラで撮影することもできる。
【００１８】
フォーカス用照射光学系１４は、フォーカス用光源１８からの照射光（例えばＬＥＤ光源からの赤外光）を対物レンズ４を通してステージ３上に載置された被検体２に照射するための光学系であって、フォーカス用光源１８側から光軸に沿って順に、第１コレクタレンズ１９、スリット板２０、第２コレクタレンズ２１、瞳制限マスク２２、ハーフミラー２３、オフセットレンズ２４を有している。
【００１９】
オフセットレンズ２４はダイクロイックミラー１６側から順に、凸レンズ２４ａと凹レンズ２４ｂからなり、凹レンズ２４ｂは当該凹レンズ２４ｂを光軸方向へ駆動するためのオフセットレンズ駆動部９に接続されている。オフセットレンズ２４とオフセットレンズ駆動部９とが、フォーカス用光源１８からの照射光の結像位置を光軸方向にオフセットさせるためのオフセット手段を構成している。
【００２０】
フォーカス用結像光学系１５は、フォーカス用照射光学系１４によって照射された被検体２からの反射光を対物レンズ４を通してＣＣＤなどの受光素子２５により受光するための光学系であって、ハーフミラー２３の反射光路上に配置されたフォーカス用結像レンズ２６を有している。
【００２１】
次に、以上のような構成の顕微鏡１によって、ガラス板２ａと媒質の界面より奥の生体試料２ｂの検鏡部位にオートフォーカスにより合焦させる方法を説明する。
【００２２】
まず、フォーカス用光源１８からの照射光の結像位置が対物レンズ４の焦点に合う状態にしておく（以下この状態におけるフォーカス用光源１８からの照射光の結像位置をオフセットゼロ位置という）。観察者によって入力部１１のオートフォーカス制御開始スイッチが操作されると、フォーカス用照射光学系１４によってスリット板２０を通過したフォーカス用光源１８からの照射光が被検体２に照射され、例えば被検体２の界面からの反射光が受光素子２５により受光され、電気信号に変換される。そして処理部１０は、対物レンズ４の焦点（上記照射光の結像位置）と被検体２の界面との距離に応じて変化する反射光の光電信号に基づいて、対物レンズ駆動部８（駆動制御手段）を制御して界面に合焦させる。なお、上記オートフォーカス装置５は、フォーカス用光源１８、フォーカス用光学系、受光素子２５等と共に、受光素子２５で得られた光電信号に基づきフォーカス信号を演算する図示しないフォーカス信号演算回路を有する。
【００２３】
そしてこの状態から、オフセット手段を用いて、上記照射光の結像位置をオフセットゼロ位置から例えば対物レンズ４側にずらす（オフセットさせる）と、このオフセット位置に界面が合うように制御が行われ、結果として界面より奥の生体試料２ｂの検鏡部位に焦点が合う。
【００２４】
次に、第１実施形態の顕微鏡１によるマルチウェルプレート２ｄを用いた多点観察におけるＺ位置の設定について説明する。被検体２は、図３に示すように、２４ウェルのマルチウェルプレート２ｄとマルチウェルプレート２ｄに保持された水などの媒質に浸された生体試料２ｂとする。
【００２５】
それぞれのウェルに保持された生体試料２ｂの検鏡部位（観察ポイント）にオートフォーカスにより合焦させたときのＺ位置（対物レンズ４の光軸方向位置、フォーカス信号）を設定する際の手順を、図３から図７を参照して説明する。観察者が入力部１１の合焦位置設定開始スイッチをＯＮにすると、処理部１０は、ステージ駆動部７を制御することでステージ３をＸＹ方向に移動し、光軸上（対物レンズ４の観察光路上）に位置決めするウェルを順次切替えながら合焦位置設定を行っていく。ウェルの設定順序は特に限定されないが、一例として、ここでは図４に示すような開始地点（ウェルＢ３）と経路で設定を行うとする。
【００２６】
まず開始地点（ウェルＢ３）でオートフォーカスを行い、合焦位置を設定してから、処理部１０は図６に示すフローを開始する。ステップＳ１では、光軸上に位置決めされたウェルの設定地点が最後の地点であるか否かを判断する。最後の地点であるなら設定を終了し、最後の地点でないならステップＳ２で次の地点に移動し、ステップＳ３でＡＦ（オートフォーカス）をＯＮにする。
【００２７】
ステップＳ４でオートフォーカスがエラーになるか否かを判断し、エラーがないならステップＳ５でピント位置になるまで待機し、ステップＳ６でＺ位置をＸＹ位置と共に登録する。そしてステップＳ１に戻る。ステップＳ４でオートフォーカスがエラーになった場合、ステップＳ７で上下動位置即ちＺ位置（対物レンズ４の光軸方向位置）を計算し、対物レンズ４を移動させる。そしてステップＳ３に戻る。
【００２８】
ステップＳ７で、処理部１０は、例えば第Ｎ番目のウェル（観察ポイント）においてオートフォーカスがエラーになったとき（図５（ａ）参照）、即ちオートフォーカス装置５からフォーカスエラー信号が出力された場合、既に設定が終了しているウェルのうち、第Ｎ番目のウェルに隣接するウェルにおけるＺ位置と任意の１つ以上のウェルにおけるＺ位置とを用いて、第Ｎ番目のウェルにおける予測されるＺ位置を算出し、そのＺ位置に対物レンズ４を移動させる（図５（ｂ）参照）。そして再びオートフォーカスを行い、ＸＹＺ位置を登録する。
【００２９】
このように、処理部１０がオートフォーカスのエラーにも自動的に対処するため、上記の各ステップの作業を繰り返すことにより最後の地点まで自動的に設定を行うことができる。図７は合焦位置の設定結果例の一部を示している。なお、上記の特徴は後述の第２、第３実施形態においても同様である。
【００３０】
オートフォーカスのエラー時にＺ位置を予測するための具体的な計算方法について以下に説明する。
【００３１】
第１実施形態では、処理部１０は、エラーとなった第Ｎ番目のウェルにおける予測されるＺ位置を算出するとき、第Ｎ番目のウェルと上記の隣接するウェル、及び第Ｎ番目のウェルと上記の任意の１つ以上のウェルとの距離の逆数を重みとして、隣接するウェルにおけるＺ位置と任意の１つ以上のウェルにおけるＺ位置との加重平均を計算する。また、処理部１０は、この加重平均を計算するとき、隣接するウェルと任意の１つ以上のウェルを最近隣法により選択する。
【００３２】
例えば、図４に示すようにウェルＢ３から設定を開始し、次の地点Ｂ４までの設定を終え、次の地点Ｃ４でオートフォーカスがエラーになったとする。この場合、Ｃ４に隣接する２つのウェルＢ３、Ｂ４のデータがあるため、これらから線形性を仮定してＣ４におけるＺ位置を計算する。マルチウェルプレート２ｄはウェル間隔が均一であり、Ｂ４とＣ４、Ｂ３とＢ４の間隔は等しい。この間隔を１とすると、Ｂ３とＣ４の距離は√２となる。
【００３３】
Ｃ４からの距離の逆数を重みとし、Ｂ３におけるＺ位置Ｚ(Ｂ,３)とＢ４におけるＺ位置Ｚ(Ｂ,４)との加重平均を計算し、Ｃ４におけるＺ位置Ｚ(Ｃ,４)を予測する。Ｃ４に対するＢ３の重みは１／√２、Ｃ４に対するＢ４の重みは１であるから、
Ｚ(Ｃ,４)＝｛（１／√２）／［（１／√２）＋１］｝×Ｚ(Ｂ,３)＋｛１／［（１／√２）＋１］｝×Ｚ(Ｂ,４)
＝［１×Ｚ(Ｂ,３)＋√２×Ｚ(Ｂ,４)］／（√２＋１）・・・（式１）
を得る。
【００３４】
また、Ｃ４におけるＺ位置を登録後、さらに次の地点Ｃ３でオートフォーカスがエラーになったとする。この場合はＢ３、Ｂ４、Ｃ４のデータがあるため、Ｚ(Ｂ,３)、Ｚ(Ｂ,４)、Ｚ(Ｃ,４)の加重平均を計算し、Ｃ３におけるＺ位置Ｚ(Ｃ,３)を予測する。Ｃ３に対するＢ３の重みは１、Ｃ３に対するＢ４の重みは１／√２、Ｃ３に対するＣ４の重みは１であるから、上述の２点から求める場合と同様に計算すると、
Ｚ(Ｃ,３)＝［√２×Ｚ(Ｂ,３)＋１×Ｚ(Ｂ,４)＋√２×Ｚ(Ｃ,４)］／（２√２＋１）・・・（式２）
を得る。他のウェルでエラーになった場合も同様に計算してＺ位置を予測することができる。
【００３５】
以上のように、第１実施形態によれば、全ての被検体２の観察ポイントについて、合焦動作を行うが、その合焦動作の基準位置が過去に求めた複数の合焦位置に基づき決められるので、被検体が傾いていたとしても、正確な合焦動作が素早くできる顕微鏡１を提供することができる。
【００３６】
（第２実施形態）
次に、本願の第２実施形態に係る顕微鏡について説明する。
【００３７】
第２実施形態は、オートフォーカスのエラー時にＺ位置を予測するための具体的な計算方法のみが第１実施形態と相違する。よってこの相違点のみを説明する。
【００３８】
第２実施形態では、設定３番目でエラーになった場合の予測方法は第１実施形態と同様であるが、４番目以降のウェルでエラーになった場合には、処理部１０は、既に設定が終了しているウェルのうち、エラーになった第Ｎ番目のウェルに隣接する１つのウェルと任意の２つのウェルに関し、マルチウェルプレート２ｄ上の位置及び上述のＺ位置を座標とする３点を通る平面の式を求め、この平面上に第Ｎ番目のウェルに関するマルチウェルプレート２ｄ上の位置及び上述のＺ位置を座標とする１点があると仮定して、第Ｎ番目のウェルにおけるＺ位置を予測する。
【００３９】
第１実施形態と同じく図４の設定順序例で説明する。Ｃ３でオートフォーカスがエラーになったとする。例えばマルチウェルプレート２ｄ上でＢ４を原点としてＢ４→Ｂ３の方向にｘ軸、Ｂ４→Ｃ４の方向にｙ軸をとると、Ｂ３、Ｂ４、Ｃ４、Ｃ３の上記座標は、それぞれ（１，０，Ｚ(Ｂ,３)）、（０，０，Ｚ(Ｂ,４)）、（０，１，Ｚ(Ｃ,４)）、（１，１，Ｚ(Ｃ,３)）となる。これらを用いて、Ｃ３におけるＺ位置Ｚ(Ｃ,３)を予測する。
【００４０】
ここで、ｘｙｚ空間で同一直線上にない３点Ａ：（ｘ１，ｙ１，ｚ１）、Ｂ：（ｘ２，ｙ２，ｚ２）、Ｃ：（ｘ３，ｙ３，ｚ３）を通る平面の式について説明する。平面の式は平面の法線ベクトルから求めることができる。下線を引いてベクトルを表すと、ＡＢ＝（ｘ２−ｘ１，ｙ２−ｙ１，ｚ２−ｚ１）、ＡＣ＝（ｘ３−ｘ１，ｙ３−ｙ１，ｚ３−ｚ１）であり、法線ベクトルの１つは外積ＡＢ×ＡＣである。求める平面上の任意の点をＰ：（ｘ，ｙ，ｚ）とすると、平面の式は内積（ＡＢ×ＡＣ）・ＡＰ＝０で与えられ、
［（ｙ２−ｙ１）（ｚ３−ｚ１）−（ｙ３−ｙ１）（ｚ２−ｚ１）］（ｘ−ｘ１）＋［（ｚ２−ｚ１）（ｘ３−ｘ１）−（ｚ３−ｚ１）（ｘ２−ｘ１）］（ｙ−ｙ１）＋［（ｘ２−ｘ１）（ｙ３−ｙ１）−（ｘ３−ｘ１）（ｙ２−ｙ１）］（ｚ−ｚ１）＝０・・・（式３）
である。
【００４１】
よって、上記Ｂ３、Ｂ４、Ｃ４、そしてＣ３の座標を、（式３）におけるＡ、Ｂ、Ｃ、そしてＰの座標に代入し、Ｚ(Ｃ,３)について解けば、
Ｚ(Ｃ,３)＝Ｚ(Ｂ,３)＋Ｚ(Ｃ,４)−Ｚ(Ｂ,４)・・・（式４）
を得る。
【００４２】
以上の第２実施形態によっても第１実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００４３】
（第３実施形態）
次に、本願の第３実施形態に係る顕微鏡について図８を参照して説明する。
【００４４】
第１、第２実施形態との相違点のみを説明すると、第３実施形態では、図８に示すように、マルチウェルプレート２ｄの右隅から枠をなめるように第１実施形態と同様の方法でＺ位置を設定していき、Ａ６からＡ５までを一通り設定した後、枠内部のＢ２からＣ５までのウェルにおけるＺ位置は、第２実施形態のエラー時と同様の方法で、即ち面の式から計算する。なお、枠部分のウェルにおけるＺ位置を設定する際にエラーになった場合は、エラーになったウェルと同列にある設定済みのウェルのうち、エラーになったウェルに隣接するウェルと他の任意の１つのウェルにおけるＺ位置を用いて、直線の傾きを求めることにより、その直線上にあると仮定されるエラーになったウェルにおけるＺ位置を予測することができる。
【００４５】
以上の第３実施形態によっても第１実施形態と同様の効果を得ることができる。
【００４６】
なお、上述の実施形態は例に過ぎず、上述の構成に限定されるものではなく、本発明の範囲内において適宜修正、変更が可能である。
【符号の説明】
【００４７】
１        顕微鏡
２        被検体
２ｂ      生体試料
２ｄ      マルチウェルプレート
３        ステージ
４        対物レンズ
７        ステージ駆動部
８        対物レンズ駆動部
９        オフセットレンズ駆動部
１０      処理部
１４      フォーカス用照射光学系
１５      フォーカス用結像光学系
１８      フォーカス用光源
２４      オフセットレンズ
２５      受光素子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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