【手続補正書】
【提出日】令和3年6月11日(2021.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子組換え型細菌であって、
（ｉ）前記遺伝子組換え型細菌が遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌であり、
（ａ）コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失；
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｃ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡがｃｔｘＡの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列を含むか、
または（ｉｉ）前記遺伝子組換え型細菌が遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌であり、
（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡがＣＴＸΦの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列を含むか、
または（ｉｉｉ）前記遺伝子組換え型細菌が遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌であり、
（ａ）ｒｔｘＡ、ｒｔｘＢ、ｒｔｘＣ、ｒｔｘＤ、ｒｔｘＥ、およびｒｔｘＨからなる群から選択されるＭＡＲＴＸ毒素をコードする１つまたは複数の核酸配列における欠失；（ｂ）ｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびＦｌａＥからなる群から選択される１つまたは複数のフラゲリン遺伝子における欠失；
（ｃ）ｒｅｃＡ遺伝子における欠失；ならびに
（ｄ）前記異種性核酸が構成的プロモーターに作動可能に連結したｃｔｘＢ遺伝子を含む、異種性核酸を含むか、
または（ｉｖ）前記遺伝子組換え型細菌が遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌であり、配列番号７の核酸配列を含む第１の細菌染色体を含むか、
または（ｖ）前記遺伝子組換え型細菌が遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌であり、細菌が、それの親株と比べて、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１３８を有する株と同じ遺伝子における変異を有するか、
または（ｖｉ）前記遺伝子組換え型細菌が遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌であり、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１３８を有するコレラ菌（V. cholerae）株であるか、
または（ｖｉｉ）（ａ）少なくとも１つの毒性遺伝子の欠失；
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｃ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つまたは複数の異種性核酸であって、前記ｇＲＮＡが前記欠失した毒性遺伝子の標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸
を含み、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子が前記ｇＲＮＡと結合して、それにより複合体を形成する能力があり、前記複合体が、前記欠失した毒性遺伝子の核酸配列をターゲットして、切断する能力がある、
遺伝子組換え型細菌。
【請求項２】
前記コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失が、前記細菌のゲノムへ組み込まれたｃｔｘＡ遺伝子内に位置する、および／または前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコア領域の核酸配列における欠失を含む、および／または前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのＲＳ２領域の核酸配列における欠失を含む、および／または前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムの完全な欠失を含む、請求項１の（ｉ）部分に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項３】
前記細菌ゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコピーを事前に含んでいない、および／または前記ＣＴＸΦゲノムの標的核酸配列が、ｒｓｔＲ、ｒｓｔＡ、ｒｓｔＢ、ｐｓｈ、ｃｅｐ、ｏｒｆＵ、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｔｘＡ、およびｃｔｘＢからなる群から選択される遺伝子内に位置する、および／または前記ＣＴＸΦゲノムの標的核酸配列が、ｃｔｘＡ遺伝子内に位置し、好ましくは前記ｇＲＮＡが、核酸配列５’−ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ−３’（配列番号３）を含む、請求項１の（ｉｉ）部分に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項４】
多機能性自己プロセシング毒素内リピート（ＭＡＲＴＸ）毒素をコードする核酸配列における欠失を含み、好ましくは前記ＭＡＲＴＸ毒素をコードする核酸配列が、ｒｔｘＡ、ｒｔｘＢ、ｒｔｘＣ、ｒｔｘＤ、およびｒｔｘＥからなる群から選択される、および／またはＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−ベータをコードする核酸配列における欠失をさらに含み、好ましくは前記ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−ベータをコードする核酸配列が、ｈｕｐＢ遺伝子である、および／またはフラゲリンをコードする核酸における欠失をさらに含み、好ましくは前記フラゲリンをコードする核酸配列がｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびＦｌａＥからなる群から選択される、請求項１の（ｉ）または（ｉｉ）部分および請求項２〜３のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項５】
前記細菌が異種性核酸を含み、前記異種性核酸が、プロモーターに作動可能に連結しているコレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子を含み、好ましくは前記コレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子がｃｔｘＢ遺伝子である、および／または前記プロモーターが誘導性プロモーターである、および／または前記プロモーターがＰｈｔｐｇプロモーターである、請求項１の（ｉ）または（ｉｉ）部分および請求項２〜４のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項６】
ＲｅｃＡタンパク質をコードする核酸配列における欠失を含み、好ましくは前記ＲｅｃＡタンパク質をコードする核酸配列がｒｅｃＡ遺伝子である、請求項１の（ｉ）または（ｉｉ）部分および請求項２〜５のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項７】
前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムの完全な欠失を含むか、または前記細菌ゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦプロファージゲノムのコピーを事前に含んでいない、請求項１の（ｉｉｉ）部分に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項８】
（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡが、ｃｔｘＡの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列
をさらに含み、好ましくは前記ＣＴＸΦの標的核酸配列がｃｔｘＡ遺伝子内に位置し、好ましくは前記ｇＲＮＡが核酸配列５’−ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ−３’（配列番号３）を含む、請求項１の（ｉｉｉ）部分に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項９】
トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、およびクロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列のうちの１つまたは複数における欠失を含み、好ましくは前記トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｄｆｒＡであるか、または前記スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｓｕｌ２であるか、または前記ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｓｔｒＡＢであるか、または前記クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｆｌｏＲである、請求項１の（ｉ）部分、（ｉｉ）部分、（ｉｉｉ）部分および請求項２〜８のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項１０】
Ｅｌ  Ｔｏｒバイオタイプに属する親株に由来する、および／またはＨａｉｔｉ親株に由来する、請求項１の（ｉ）部分、（ｉｉ）部分、（ｉｉｉ）部分および請求項２〜９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項１１】
配列番号５１の核酸配列を含む第２の細菌染色体を含む、請求項１の（ｉｖ）部分に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項１２】
コレラ菌（Vibrio cholerae）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、およびクロストリディオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）からなる群から選択される種である、および／または前記毒性遺伝子が、ｃｔｘＡ、ａｒｏＡ、ａｒｏＱ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ｈｔｒＡ、ｓｓａＶ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＰ、ｓｅｔ、ｓｅｎ、ｖｉｒＧ／ｉｃｓＡ、ｌｕｃ、ａｒｏＡ、ｍｓｂＢ２、ｓｔｘＡ、ｓｔｘＢ、ａｍｐＧ、ｄｎｔ、ｔｃｄＡ、およびｔｃｄＢからなる群から選択される、
請求項１の（ｖｉｉ）部分に記載の遺伝子組換え型細菌。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子組換え型細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
【請求項１４】
対象においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導する方法における使用のための、請求項１の（ｉ）部分、（ｉｉ）部分、（ｉｉｉ）部分、（ｉｖ）部分、（ｖ）部分、または（ｖｉ）部分および請求項２〜１１のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【請求項１５】
コレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株を有する対象を処置する方法における使用のための、請求項１の（ｉ）部分、（ｉｉ）部分、（ｉｉｉ）部分、（ｉｖ）部分、（ｖ）部分、または（ｖｉ）部分および請求項２〜１１のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と共に記載されているが、前述の説明は、本発明を例証することを意図され、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲により定義されることは、理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．（ａ）コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失；
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｃ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡがｃｔｘＡの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列を含む遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２．前記コレラ毒素サブユニットＡをコードする核酸配列における欠失が、前記細菌のゲノムへ組み込まれたｃｔｘＡ遺伝子内に位置する、上記１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３．前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコア領域の核酸配列における欠失を含む、上記１または２に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
４．前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのＲＳ２領域の核酸配列における欠失を含む、上記１〜３のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
５．前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムの完全な欠失を含む、上記１〜４のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
６．（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡがＣＴＸΦの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列を含む遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
７．前記細菌ゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムのコピーを事前に含んでいない、上記６に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
８．前記ＣＴＸΦゲノムの標的核酸配列が、ｒｓｔＲ、ｒｓｔＡ、ｒｓｔＢ、ｐｓｈ、ｃｅｐ、ｏｒｆＵ、ａｃｅ、ｚｏｔ、ｃｔｘＡ、およびｃｔｘＢからなる群から選択される遺伝子内に位置する、上記６または７に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
９．前記ＣＴＸΦゲノムの標的核酸配列が、ｃｔｘＡ遺伝子内に位置する、上記６〜８のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１０．前記ｇＲＮＡが、核酸配列５’−ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ−３’（配列番号３）を含む、上記９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１１．多機能性自己プロセシング毒素内リピート（ＭＡＲＴＸ）毒素をコードする核酸配列における欠失を含む、上記１〜１０のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１２．前記ＭＡＲＴＸ毒素をコードする核酸配列が、ｒｔｘＡ、ｒｔｘＢ、ｒｔｘＣ、ｒｔｘＤ、およびｒｔｘＥからなる群から選択される、上記１１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１３．ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−ベータをコードする核酸配列における欠失をさらに含む、上記１〜１２のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１４．前記ＤＮＡ結合タンパク質ＨＵ−ベータをコードする核酸配列が、ｈｕｐＢ遺伝子である、上記１３に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１５．フラゲリンをコードする核酸における欠失をさらに含む、上記１〜１４のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１６．前記フラゲリンをコードする核酸配列がｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびＦｌａＥからなる群から選択される、上記１５に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１７．前記細菌が異種性核酸を含み、前記異種性核酸が、プロモーターに作動可能に連結しているコレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子を含む、上記１〜１６のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１８．前記コレラ毒素サブユニットＢをコードする遺伝子がｃｔｘＢ遺伝子である、上記１７に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
１９．前記プロモーターが誘導性プロモーターである、上記１７または１８に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２０．前記プロモーターがＰｈｔｐｇプロモーターである、上記１７〜１９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２１．ＲｅｃＡタンパク質をコードする核酸配列における欠失を含む、上記１〜２０のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２２．前記ＲｅｃＡタンパク質をコードする核酸配列がｒｅｃＡ遺伝子である、上記２１に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２３．（ａ）ｒｔｘＡ、ｒｔｘＢ、ｒｔｘＣ、ｒｔｘＤ、ｒｔｘＥ、およびｒｔｘＨからなる群から選択されるＭＡＲＴＸ毒素をコードする１つまたは複数の核酸配列における欠失；（ｂ）ｆｌａＡ、ｆｌａＢ、ｆｌａＣ、ｆｌａＤ、およびＦｌａＥからなる群から選択される１つまたは複数のフラゲリン遺伝子における欠失；
（ｃ）ｒｅｃＡ遺伝子における欠失；ならびに
（ｄ）前記異種性核酸が構成的プロモーターに作動可能に連結したｃｔｘＢ遺伝子を含む、異種性核酸
を含む遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２４．前記細菌のゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦゲノムの完全な欠失を含む、上記２３に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２５．前記細菌ゲノムへ組み込まれたＣＴＸΦプロファージゲノムのコピーを事前に含んでいない、上記２３に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２６．（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｂ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする異種性核酸配列であって、前記ｇＲＮＡが、ｃｔｘＡの標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸配列
をさらに含む、上記２３に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２７．前記ＣＴＸΦの標的核酸配列がｃｔｘＡ遺伝子内に位置する、上記２６に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２８．前記ｇＲＮＡが核酸配列５’−ｃｃｔｇａｔｇａａａｔａａａｇｃａｇｔｃｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇａａａｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃ−３’（配列番号３）を含む、上記２７に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
２９．トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列、およびクロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする核酸配列のうちの１つまたは複数における欠失を含む、上記１〜２８のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３０．前記トリメトプリムに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｄｆｒＡである、上記２９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３１．前記スルファメトキサゾールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｓｕｌ２である、上記２９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３２．前記ストレプトマイシンに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｓｔｒＡＢである、上記２９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３３．前記クロラムフェニコールに対する抵抗性を与える産物をコードする遺伝子がｆｌｏＲである、上記２９に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３４．Ｅｌ  Ｔｏｒバイオタイプに属する親株に由来する、上記１〜３３のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３５．Ｈａｉｔｉ親株に由来する、上記１〜３４のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３６．配列番号７の核酸配列を含む第１の細菌染色体を含む、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３７．配列番号５１の核酸配列を含む第２の細菌染色体を含む、上記３６に記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３８．細菌が、それの親株と比べて、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１３８を有する株と同じ遺伝子における変異を有する、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
３９．ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１２５１３８を有するコレラ菌（V. cholerae）株である、遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
４０．上記１〜３９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
４１．対象においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導する方法であって、上記１〜３９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌、または上記４０に記載の薬学的組成物を前記対象に投与して、それにより、前記対象において前記コレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導することを含む、方法。
４２．前記対象がヒト対象である、上記４１に記載の方法。
４３．前記防御応答が、前記遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌または前記薬学的組成物を対象へ投与してから２４時間以内に誘導される、上記４１または４２に記載の方法。
４４．（ａ）少なくとも１つの毒性遺伝子の欠失；
（ｂ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子をコードする異種性核酸配列；および
（ｃ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つまたは複数の異種性核酸であって、前記ｇＲＮＡが前記欠失した毒性遺伝子の標的核酸配列と相補的であるターゲティングドメインを含む、異種性核酸
を含む遺伝子組換え型細菌であって、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼ分子が前記ｇＲＮＡと結合して、それにより複合体を形成する能力があり、前記複合体が、前記欠失した毒性遺伝子の核酸配列をターゲットして、切断する能力がある、遺伝子組換え型細菌。
４５．コレラ菌（Vibrio cholerae）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、およびクロストリディオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）からなる群から選択される種である、上記４４に記載の遺伝子組換え型細菌。
４６．前記毒性遺伝子が、ｃｔｘＡ、ａｒｏＡ、ａｒｏＱ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、ｈｔｒＡ、ｓｓａＶ、ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ、ｐｈｏＱ、ｇｕａＢ、ｇｕａＡ、ｃｌｐＸ、ｃｌｐＰ、ｓｅｔ、ｓｅｎ、ｖｉｒＧ／ｉｃｓＡ、ｌｕｃ、ａｒｏＡ、ｍｓｂＢ２、ｓｔｘＡ、ｓｔｘＢ、ａｍｐＧ、ｄｎｔ、ｔｃｄＡ、およびｔｃｄＢからなる群から選択される、上記４４または４５に記載の遺伝子組換え型細菌。
４７．上記４４〜４６のいずれかに記載の遺伝子組換え型細菌および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物。
４８．対象においてコレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株に対する防御応答を誘導する方法における使用のための、上記１〜３９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。
４９．コレラ菌（Vibrio cholerae）の毒性株を有する対象を処置する方法における使用のための、上記１〜３９のいずれかに記載の遺伝子組換え型コレラ菌（Vibrio cholerae）細菌。