【手続補正書】
【提出日】令和3年6月23日(2021.6.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
【図５７−１】ｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２  ＲＮＡ編集の設計パラメーターの特徴付けＡ）野生型Ｃａｓ１３ｂ及び触媒的に不活性なＨ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ  Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）を標的とするＧｌｕｃのノックダウン効率。Ｂ）タイリングＣｌｕｃ標的化ガイドで試験した、野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインまたは機能亢進Ｅ４８８Ｑ変異体ＡＤＡＲ２触媒触媒ドメインのいずれかに融合したｄＣａｓ１３ｂによるルシフェラーゼ活性回復の定量化。Ｃ）ＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼＷ８５Ｘ（配列番号７３７−７４５）を標的とする３０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｄ）ＰＰＩＢ（配列番号７４６−７５３）を標的とする５０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性の回復に対するリンカーの選択の影響。Ｆ）ＲＥＰＡＩＲｖ１（配列番号７５４及び７５５）によるルシフェラーゼ活性回復に対する標的アデノシンの反対側の塩基同定の影響。値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図５７−２】ｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２  ＲＮＡ編集の設計パラメーターの特徴付けＡ）野生型Ｃａｓ１３ｂ及び触媒的に不活性なＨ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ  Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）を標的とするＧｌｕｃのノックダウン効率。Ｂ）タイリングＣｌｕｃ標的化ガイドで試験した、野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインまたは機能亢進Ｅ４８８Ｑ変異体ＡＤＡＲ２触媒触媒ドメインのいずれかに融合したｄＣａｓ１３ｂによるルシフェラーゼ活性回復の定量化。Ｃ）ＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼＷ８５Ｘ（配列番号７３７−７４５）を標的とする３０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｄ）ＰＰＩＢ（配列番号７４６−７５３）を標的とする５０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性の回復に対するリンカーの選択の影響。Ｆ）ＲＥＰＡＩＲｖ１（配列番号７５４及び７５５）によるルシフェラーゼ活性回復に対する標的アデノシンの反対側の塩基同定の影響。値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図５７−３】ｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２  ＲＮＡ編集の設計パラメーターの特徴付けＡ）野生型Ｃａｓ１３ｂ及び触媒的に不活性なＨ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ  Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）を標的とするＧｌｕｃのノックダウン効率。Ｂ）タイリングＣｌｕｃ標的化ガイドで試験した、野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインまたは機能亢進Ｅ４８８Ｑ変異体ＡＤＡＲ２触媒触媒ドメインのいずれかに融合したｄＣａｓ１３ｂによるルシフェラーゼ活性回復の定量化。Ｃ）ＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼＷ８５Ｘ（配列番号７３７−７４５）を標的とする３０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｄ）ＰＰＩＢ（配列番号７４６−７５３）を標的とする５０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性の回復に対するリンカーの選択の影響。Ｆ）ＲＥＰＡＩＲｖ１（配列番号７５４及び７５５）によるルシフェラーゼ活性回復に対する標的アデノシンの反対側の塩基同定の影響。値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図５７−４】ｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２  ＲＮＡ編集の設計パラメーターの特徴付けＡ）野生型Ｃａｓ１３ｂ及び触媒的に不活性なＨ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ  Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）を標的とするＧｌｕｃのノックダウン効率。Ｂ）タイリングＣｌｕｃ標的化ガイドで試験した、野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインまたは機能亢進Ｅ４８８Ｑ変異体ＡＤＡＲ２触媒触媒ドメインのいずれかに融合したｄＣａｓ１３ｂによるルシフェラーゼ活性回復の定量化。Ｃ）ＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼＷ８５Ｘ（配列番号７３７−７４５）を標的とする３０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｄ）ＰＰＩＢ（配列番号７４６−７５３）を標的とする５０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性の回復に対するリンカーの選択の影響。Ｆ）ＲＥＰＡＩＲｖ１（配列番号７５４及び７５５）によるルシフェラーゼ活性回復に対する標的アデノシンの反対側の塩基同定の影響。値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図５７−５】ｄＣａｓ１３−ＡＤＡＲ２  ＲＮＡ編集の設計パラメーターの特徴付けＡ）野生型Ｃａｓ１３ｂ及び触媒的に不活性なＨ１３３Ａ／Ｈ１０５８Ａ  Ｃａｓ１３ｂ（ｄＣａｓ１３ｂ）を標的とするＧｌｕｃのノックダウン効率。Ｂ）タイリングＣｌｕｃ標的化ガイドで試験した、野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインまたは機能亢進Ｅ４８８Ｑ変異体ＡＤＡＲ２触媒触媒ドメインのいずれかに融合したｄＣａｓ１３ｂによるルシフェラーゼ活性回復の定量化。Ｃ）ＣｙｐｒｉｄｉｎｉａルシフェラーゼＷ８５Ｘ（配列番号７３７−７４５）を標的とする３０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｄ）ＰＰＩＢ（配列番号７４６−７５３）を標的とする５０ｎｔガイドのＡ→Ｉ編集のガイド設計及びシーケンシング定量化。Ｅ）ＲＥＰＡＩＲｖ１によるルシフェラーゼ活性の回復に対するリンカーの選択の影響。Ｆ）ＲＥＰＡＩＲｖ１（配列番号７５４及び７５５）によるルシフェラーゼ活性回復に対する標的アデノシンの反対側の塩基同定の影響。値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
本発明の方法において使用するための適切なリンカーは、当業者によく知られており、こうしたリンカーとしては、限定されないが、直鎖または分岐鎖の炭素リンカー、ヘテロ環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが挙げられる。しかしながら、本明細書で使用される場合、リンカーは、共有結合（炭素−炭素結合または炭素−ヘテロ原子結合）であってもよい。特定の実施形態では、標的化ドメイン及びアデノシンデアミナーゼを、それぞれのタンパク質がその必要機能特性を確実に保持する上で十分な距離をとって隔てるためにリンカーが使用される。好ましいペプチドリンカー配列は、可塑性の広がった立体構造を取り、秩序だった二次構造を取る傾向を示さないものである。特定の実施形態では、リンカーは、単量体、二量体、多量体、またはポリマーであり得る化学的部分であってもよい。好ましくは、リンカーは、アミノ酸を含む。可塑性リンカーにおける典型的なアミノ酸としては、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、及びＳｅｒが挙げられる。したがって、特定の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙアミノ酸、Ａｓｎアミノ酸、及びＳｅｒアミノ酸のうちの１つ以上が組み合わさったものを含む。他のほぼ中性のアミノ酸（Ｔｈｒ及びＡｌａなど）もまた、リンカー配列において使用され得る。リンカーの例は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５），Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−６２；米国特許第４，９３５，２３３号；及び米国特許第４，７５１，１８０号に開示されている。例えば、ＧｌｙＳｅｒリンカーであるＧＧＳ、ＧＧＧＳ、またはＧＳＧを使用してもよい。適切な長さを得るために、ＧＧＳリンカー、ＧＳＧリンカー、ＧＧＧＳリンカー、またはＧＧＧＧＳリンカーを、３回反復形態（例えば（ＧＧＳ）３（配列番号１２）、（ＧＧＧＧＳ）３）、または５回反復形態、６回反復形態、７回反復形態、９回反復形態、もしくは１２回（配列番号１３）以上反復する形態として使用してもよい。特定の実施形態では、リンカー、例えば（ＧＧＧＧＳ）３が好ましくは本明細書で用いられる。（ＧＧＧＧＳ）６（ＧＧＧＧＳ）９または（ＧＧＧＧＳ）１２を代替物として使用することも好ましい場合がある。他の好ましい代替物は、（ＧＧＧＧＳ）１（配列番号１４）、（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号１５）、（ＧＧＧＧＳ）４、（ＧＧＧＧＳ）５、（ＧＧＧＧＳ）７、（ＧＧＧＧＳ）８、（ＧＧＧＧＳ）１０、または（ＧＧＧＧＳ）１１である。さらに別の実施形態では、リンカーとしてＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＱＳＧＡＬＴＲＨＱＲＴＨＴＲ（配列番号１１）が使用される。さらに追加の実施形態では、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーである（配列番号９１９）。本発明はまた、ＡＤ機能化組成物を使用して、標的化された脱アミノ化による疾患または疾患を引き起こすバリアントを治療または予防する方法に関する。例えば、Ａの脱アミノ化は、病原性Ｇ→ＡまたはＣ→Ｔ点変異を含む転写物によって引き起こされる疾患を改善し得る。本発明で治療または予防され得る疾患の例としては、がん、マイヤー・ゴーリン症候群、セッケル症候群４、ジュベール症候群５、レーバー先天性黒内障１０；シャルコー・マリー・ツース病、２型；シャルコー・マリー・ツース病、２型；アッシャー症候群、２Ｃ型；脊髄小脳性運動失調２８；脊髄小脳性運動失調２８；脊髄小脳性運動失調２８；長ＱＴ症候群２；シェーグレン・ラーソン症候群；遺伝性フルクトース尿症；遺伝性フルクトース尿症；神経芽細胞腫；神経芽細胞腫；カルマン症候群１；カルマン症候群１；カルマン症候群１；異染性白質ジストロフィーが挙げられる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８４】
いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、配列番号７０４に定義されるようなｈＡＤＡＲ１−Ｄの野生型アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１−Ｄ配列に１つ以上の変異を含み、その結果、ｈＡＤＡＲ１−Ｄの編集効率及び／または基質編集優先性が特定の要件に応じて改変される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】１２６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【１２６２】
図９６〜９７に示すように、多数のＶ３５１、Ｔ３７５、Ｒ４５５変異体がＣ→Ｕ脱アミノ化活性を触媒する能力について試験して、Ｃ→Ｕ活性を有する特定のＶ３５１変異体をさらに検証した。図９５に示す構築物ガイド対で使用されるガイド配列を以下に示す。
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