(57)【要約】【課題】本発明の課題は、環化核酸の作成方法等を提供することにある。【解決手段】標的核酸をフラグメント化し、次いで、得られる標的核酸フラグメントを、該標的核酸フラグメントの両端に対してそのそれぞれの末端が相補性の一本鎖配列を有する環化アダプター用いて、環化することにより環化核酸を作成することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環化核酸を作成する方法であって、標的核酸をフラグメント化し、次いで、かくして得られる標的核酸フラグメントを、該標的核酸フラグメントの両端に対してそのそれぞれの末端が相補性の一本鎖配列を有する環化アダプター用いて、環化することを含む、上記方法。
【請求項２】
環化アダプターが、一本鎖末端配列の間に、二本鎖となった標的に相補的でない部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
環化アダプターが、二本鎖となった標的に相補的でない部分において制限オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
制限オリゴヌクレオチド配列が、共通の制限オリゴヌクレオチド配列である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
更に、環化標的核酸フラグメントを増幅することを含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
更に、異なる環化アダプターを用いて多くの異なる標的核酸フラグメントを環化し、次いで、標的核酸フラグメントを、同じ一般的制限ヌクレオチドと酵素を用いて、複数の異なる標的核酸フラグメントが平行して増幅されるように、増幅することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
増幅が、ローリングサークル増幅である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
標的核酸を、一つもしくはそれ以上の制限酵素またはＦＬＡＰエンドヌクレアーゼでフラグメント化する、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
環化核酸がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
標的核酸フラグメントを増幅する方法であって、
（i）標的核酸をフラグメント化し、
（ii）かくして得られる標的核酸フラグメントを、該標的核酸フラグメントの両端に対してそのそれぞれの末端が相補性の一本鎖配列を有する環化アダプター用いて、環化し、次いで、
（iii）環化核酸フラグメントを増幅する、
上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本発明は核酸の作製、増幅、検出及び定量に関するものである。特に、本発明は環状核酸の作製、増幅、検出及び定量に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この２０年の間に核酸の増幅は遺伝子異常、遺伝子変異の同定または感染性病原体の同定の一般的技術となった。
【０００３】
核酸を増幅するための方法は多数存在する。それらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及びリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、両者ともに加熱サイクルを必要とする、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ストランド置換増幅（ＳＤＡ）、インベーダー検定、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、及びハイパー−ブランチドＲＣＡ（ＨＲＣＡ）などである。
【０００４】
以下の記述において、本発明はローリングサークル増幅法（非特許文献１）においてよく使用される参考文献、特許文献１乃至５を引用して記述される。しかし、本発明は他の核酸増幅方法、特に他の環状増幅方法においても同等の有用性を見出しうるので、それに限定することは意図していない。本発明に関係する環状核酸は、環状化プローブ、環状化標的核酸、環状レポーター核酸、プラスミド、あるいは環状標的核酸でありうる。本発明は、例えば遺伝子分類、突然変異探索、配列分析、感染性病原体の同定、分子診断、遺伝子分析及び法医学、に使用することができるが、そのほかにタンパクの検出、タンパク−タンパク相互作用、及び生体分子の相互作用の分析にも使用することができる。
【０００５】
本発明は環化核酸を作製する新規方法、及び該環化核酸を増殖し、検出し、または分析することに関係している。分析の目的で環化核酸を作製する方法のいくつかは文献に既知である。南京錠プローブは標的核酸配列の認識の際に環化するオリゴヌクレオチドプローブである（非特許文献２）。プロキシミティープローブリゲーションは、（特許文献６）に記述されているように、標的分子認識の結果として環状化プローブを作製する鋳型となりうる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許５８５４０３３号明細書
【特許文献２】米国特許６１２４１２０号明細書
【特許文献３】米国特許６１４３４９５号明細書
【特許文献４】米国特許６１８３９６０号明細書
【特許文献５】米国特許６２１０８８４号明細書
【特許文献６】国際公開第９９／４９０７９号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉｚａｒｄｉ  Ｐ．Ｍ．，Ｈｕａｎｇ  Ｘ．，Ｚｈｕ  Ｚ．，Ｂｒａｙ−Ｗａｒｄ  Ｐ．，Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｗａｒｄ  Ｄ．Ｃ．「Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９９８年，１９巻  ｐ．２２５−２３２
【非特許文献２】Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｍ，Ｍａｌｍｇｒｅｎ  Ｈ，Ｓａｍｉｏｔａｋｉ  Ｍ，Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉ  Ｍ，Ｃｈｏｗｄｈａｒｙ  ＢＰ，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  Ｕ．「Ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅｓ：ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４年，２６５巻  ｐ．２０８５−２０８８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＲＣＡは環化プローブの線状増幅を生じるので、感度が限定されている。典型的にＲＣＡは１時間当たり各環化プローブの約１０００コピーを生産する。
【０００９】
この核酸増幅過程、特にＲＣＡ過程の感度の改善が本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の開示）
発明の説明
例えばＲＣＡプロセスのような増幅プロセスの感度を改善する一つの方法はこのプロセスの間に生じるシグナルを増加させることである。これは初代のＲＣＡ産物を鋳型にした続く増幅過程を行うことにより達成することができる。そのような続く増幅過程の一つは、初代のＲＣＡ産物をさらに続く増幅過程において増幅されるモノマーの新規作製に回すことによって行われる。したがって、最初の態様において、本発明は以下の段階を含む核酸産物増幅方法に関係している：
−  典型的にＲＣＡにより、初代増幅産物を提供する、この産物は増幅する配列のコンカテマーを含んでいる；
−  増幅産物をモノマー化する；
−  このようにして形成したモノマーをさらに増幅して、第二代増幅産物を形成する。
【００１１】
続く環の増幅の後にモノマーは結合されて環を形成することが望ましいが、その場合に続く増幅はＲＣＡが理想的である（図１）。増幅される配列はプローブ配列またはプローブ配列の部分でありうるし、あるいはｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むことがありうる。
【００１２】
本発明の一態様において、初代増幅産物のモノマー化は制限酵素及び初代増幅産物に相補的なオリゴヌクレオチドを使用して行われ、制限酵素は初代増幅産物／オリゴヌクレオチドのハイブリッドを切断する。
【００１３】
その他に、増幅される配列は、初代増幅産物のモノマー化をすることができる触媒活性配列を含むことができる（Ｄａｕｂｅｎｄｉｅｋ＆Ｋｏｏｌ，１９９７）。
【００１４】
典型的に、初代増幅産物は初代増幅段階において生産され、その段階はポリメラーゼ酵素を使用するが、その方法はポリメラーゼ酵素の不活化段階を含んでいる。重合は等温条件下で行うことが理想的である。
【００１５】
初代増幅産物のモノマー化がオリゴヌクレオチド及び制限酵素を使用して行われる場合には、オリゴヌクレオチドはＲＣＡ反応産物中に存在するモノマーの数よりも過剰に添加される。変性（及び酵素不活化）段階の後にモノマーとハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドの大部分は切断されないであろう。したがって、このハイブリッド形成反応の分子内優先性のために二量体あるいは多量体形成よりも環形成が（実用的濃度において）優先するので、非切断オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成及びリガーゼ処理によりモノマーは優先的に環化するであろう。
【００１６】
この新規に生じた環は次いで、例えば、リゲーションの鋳型となる同じオリゴヌクレオチドにより開始される後続ＲＣＡ段階の鋳型となることができる。したがって、線状増幅と異なり、この方法では（Ｘ1ｘＸ2……ｘＸｎ）倍の増幅を生じるであろう、そしてこの“Ｘ”は各ＲＣＡにおいて合成されるモノマーの数であり、“ｎ”はＲＣＡの消化及び環化の回数である。この方法は環状核酸の最初の複雑な組み合わせを維持するはずであるから、多数の異なる環状核酸の組み合わせをＲＣＡにより増幅する場合に本方法は特別な価値を有するはずである。これは環化反応の分子内優先性によるものであり、そして同時に増幅される他の分子に妨害されることなく、環化された核酸の増幅の各回は連続しておりそして生産的（一つの環−→環の数千コピーを持つ一つの生成物）である故である。さらに、反応の各回は生成物抑制あるいはプライマー制限を受けることがなく、そして重合反応の間により多くのポリメラーゼを必要とすることもない。したがって、本方法は本質的に異なる増幅環の数には無関係であるはずである。この反応産物は一本鎖であり、これはハイブリッド形成プローブにより容易に検出することができる。ＲＣＡ反応の直線性は標的分子の定量的測定に確実な定量性を保障するはずである。
【００１７】
モノマー化は反応に存在する種々のプローブの各々に存在する共通した配列を使用して行うことができる。第二世代のＲＣＡにおいて、切断／環化オリゴヌクレオチドを過剰に添加してあるためにすべてのモノマーは環化するので、生成物が二本鎖になるリスク（下記参照）は少ない。したがって、第二世代ＲＣＡにおいて配列は存在せず、そして第二世代ＲＣＡ産物で合成を開始することができる。また、この多項増幅方法は完全に環状分子に特化しており、他の増幅方法に見られる偽の増幅生成物のリスクは少ない。
【００１８】
分析する遺伝子発現が非常に複雑なパターンを示す場合には、例えば、マイクロアレイを使用してエンドポイント分析を行う必要がある。本発明を使用して、複合した方法において高度な分解能と正確度で遺伝子発現を監視することができる。それぞれ遺伝子産物またはフラグメントに特異的な、いわゆる南京錠プローブのいくつかはｃＤＮＡまたはＲＮＡを鋳型としたリゲーションにより環化される。これらの南京錠プローブは、ＤＮＡマイクロアレイ上でＲＣＡ産物を分析するためにタグ配列をコードすることができる。増幅のその他の方法はＰＣＲを使用するものである。しかし、ＰＣＲは、数回のＰＣＲサイクルの後にＤＮＡ鎖の再アニーリングのためにそれ以上生成物を生じない定常状態に達する生成物阻害反応である。豊富にある転写物は複合増幅反応が終了する以前に増幅を止め、一方少ない転写物は増幅を続けるので、少ない転写物に対して豊富な転写物の定量性をゆがめるであろう。ＰＣＲを使用して定量的エンドポイント測定をする際の問題点はよく知られており、そのためにＰＣＲのリアルタイム分析技術が開発され、少ない数の転写物（〜１−４転写物）を同時に分析することができる（Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【００１９】
本発明を使用して環化した南京錠プローブを増幅することにより、そのようなゆがみは生じない、なぜなら、反応は生成物阻害を受けずにむしろ基質、すなわちデオキシヌクレオチド三燐酸によってのみ制限を受ける。これは一回の反応において非常に多数の転写物の定量を可能にする。
【００２０】
環状配列の第一世代、第二世代そして多分それ以上の世代を複製する方法はプローブ及び標的核酸配列の両者に適用することができる。生成物は配列分析または、例えば以下に記述する方法のいずれかにより分析することができる。ゲノムまたはｃＤＮＡ配列の増幅のための望ましい方式において、最初に標的ＤＮＡを、例えば制限酵素またはＦＬＡＰエンドヌクレアーゼを使用してフラグメントとし、次いで両端において増幅する標的ＤＮＡの末端と相補的な一本鎖配列からなる環化アダプターを使用して環化する。多数の異なるフラグメントを同一の反応において増幅する場合には、類似のサイズのフラグメントを増幅するのが有利であろう。例えばゲノムＤＮＡ検体中の類似サイズの配列をすべて制限フラグメントとして発生させる一つの制限酵素または制限酵素の組み合わせを発見することは不可能であろう。しかし、異なる制限酵素または制限酵素の組み合わせを使用して得られる多分１０個の異なる制限消化産物の少なくとも一つの望むサイズの制限フラグメントに全ての配列が表示されることはありそうである。もっとも有利なのは、二本鎖となった標的に相補的でない部分が一本鎖部分の間に存在し、そしてそれが共通の制限オリゴヌクレオチド配列を含んでいる（図２）。共通の制限オリゴヌクレオチド配列を使用することにより、多数の異なる標的ＤＮＡフラグメントを異なる環化アダプターを使用して環化することができ、しかも次いで同じ共通制限オリゴヌクレオチド及び酵素を使用して増幅することができる。プローブ環化反応と同様に、この標的環化反応は、分子内環化反応が分子間結合反応に優先するので交差反応による産物を生じそうにない。したがって、ＰＣＲのような増幅方法と異なり、複数の異なる標的ＤＮＡフラグメントを平行して増幅することができる。多数の異なるフラグメントを同一反応で増幅する場合には、類似サイズのフラグメントを増幅することが有利である。例えばゲノムＤＮＡ検体中の類似サイズの配列をすべて制限フラグメントとして発生させる一つの制限酵素または制限酵素の組み合せを発見することは不可能であろう。しかし、異なる制限酵素または制限酵素の組み合わせを使用して得られる多分１０個の異なる制限消化産物の少なくとも一つの望むサイズの制限フラグメントに全ての配列が表示されることはありそうである。もし１０００種の異なるＤＮＡが増幅されることになったとしたならば、制限酵素の１０種の異なる組み合せを使用して消化したＤＮＡ検体を使用して多分１０回の異なる反応により増幅することができるであろう。適当な制限消化産物及び対応する環化アダプターは利用可能な配列データベースから推定することができる。増幅したＤＮＡ配列は、限定はしないが、マイクロアレイハイブリッド形成、ミニ配列分析、または今日では複合的能力に限界があるＰＣＲのためのハイスループットに限定されているマス−スペクトロメトリーを含む適当な方法により分析することができる。
【００２１】
モノマー化増幅産物の環化と同じ機構を、プロキシミティー依存核酸相互作用に関係したオリゴヌクレオチドプローブの環状体の発生に使用することができる（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ，１９９５及びＬａｎｄｅｇｒｅｎ＆Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ，２０００）。この検定において、標的分子、例えばタンパクへの二つ以上のプローブの結合は、増幅できそして検出できる結合タンパクの指標となる接着ＤＮＡ鎖を連結反応によって連結することができる。望ましい態様において、過剰の制限オリゴヌクレオチドが、結合するオリゴヌクレオチドプローブの中にある制限酵素が認識する配列を含む二つの同じ配列にハイブリッド形成する。制限消化及び制限酵素の熱不活化の後、切断されたオリゴヌクレオチドは脱離し、優先的分子内ハイブリッド形成反応のために、完全な制限オリゴヌクレオチドがプローブオリゴヌクレオチドの結合及び消化の両端にハイブリッド形成できるようになる。ＤＮＡリガーゼの添加に際して、制限オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドの環化を誘導する連結鋳型として働く（図３）。生成した環は次いで本発明にしたがって増幅される。プロキシミティー依存核酸連結反応の効果として環状ＤＮＡを形成する機構はＰＣＴ  ＷＯ９９／４９０７９に記述されているものとは異なる。プロキシミティープローブは添加したオリゴヌクレオチドの環化の鋳型となる、ＰＣＴ  ＷＯ９９／４９０７９に記述されている方法に対して、本発明においては、プロキシミティープローブの一部が環化する。
【００２２】
一つの望ましい方式において、環化増幅産物は、反応に存在する種々の生成物のそれぞれに特異的な、固相支持体に接着した種々のプライマーにハイブリッド形成する。種々のプライマーは可能な限り類似しないように設計されていることが望ましく、すなわち、それらはいわゆる郵便番号配列またはタグ配列を示し、そしてそれらはアレイに整列することができる。このプライマーは局所ＲＣＡを開始するために使用される。最初の環状核酸よりも環化増幅産物をハイブリッド形成することにより、ハイブリッド形成速度及び感度は数段階改善される。さらに、もし局所ＲＣＡをリアルタイムで監視するならば、経時的シグナル蓄積を非常に広い範囲にわたって検出することができ、特に発現分析に適している。もし検体の複雑さがコピー数及び／または異なる配列の数の差に関して非常に大きいならば、異なるタグ配列との交差ハイブリッド形成を完全に避けることは困難であろう。したがって、オリゴヌクレオチドハイブリッド形成により達成されるよりも、固相支持体に接着したタグ配列プライマーに増幅モノマーの環化の鋳型となるよう要求することにより、郵便番号認識の特異性を増加させることに価値がある。もし異なる標的の数が非常に多いならば、モノマー化操作を多数の異なるタグ配列のそれぞれにおいて特異的切断をすることができるように工夫しなければならない。この目的のために、環化しうる核酸の複雑な混合物中の全ての配列に、独特なタグ配列に隣接してタイプＩＩ制限酵素認識配列を取り付けることができる。タグ配列モチーフ内の特異的切断は、全てのＲＣＡ産物に共通の配列を有するオリゴヌクレオチド及び／または制限切断のための二本鎖基質を形成する短いランダムオリゴヌクレオチド、例えば、ヘキサマーの集団と認識配列を二本鎖にすることにより行われる（図４）。制限消化の後に、モノマーは次いで半分のタグ末端配列を含む南京錠プローブに変換される。さらに、この方法は近接して結合した結合試薬の対を同定するために結合した検出試薬の対と半分のタグを結合させることができる。連結しうる末端が独特の塩基対の半タグ配列を構成する近接連結プローブを使用することにより可能である。このようにして、平滑−または付着末端連結により端を結合することができる（図３）。
【００２３】
反復ＲＣＡは既にＷＯ  ９２／０１８１３及びＵＳ５，７１４，３２０に提案されている。しかし、ＷＯ  ９２／０１８１３において、予め作られた環を使用する続くＲＣＡ反応のための新規のプライマーを作るためにＲＣＡ産物はモノマーに切断されている。ＵＳ５，７１４，３２０においては、単離環状オリゴヌクレオチド鋳型を提供することにより規定した末端を有する選ばれたオリゴヌクレオチドを作るための調製法が記述されている。しかしこの方法は一般的に分析目的または稀な環状ＤＮＡの増幅には適していない、何故ならば典型的に０．１μＭから１ｍＭの単離環状鋳型を必要とするからである。ＵＳ５，７１４，３２０に記述されている方法において、プライマーは１００未満の環状鋳型に対して１モル過剰に供給され、そしてデオキシヌクレオチド三燐酸は１０7未満の環状鋳型に対して１モル過剰に供給される。分析に適用するには、標的分子の量が少ないので、これらのモル比は効果的な開始及び重合のそれぞれを行うには低すぎる。例えば、ゲノムＤＮＡ配列の分析を環化ゲノムＤＮＡまたは環化オリゴヌクレオチドプローブの増幅により行うためには、最初の環化核酸の濃度が低いので、対応するモル比は最初の増幅段階において少なくともそれぞれ１００及び１０7、またはより望ましくはそれぞれ１０００００以上及び１０10、理想的にはそれぞれ約１０7及び１０12である。日本特許出願ＪＰ  ４−３０４９００は環化プローブの検出のためにＲＣＡを使用することを記述している。この出願には、ＲＣＡ産物を続くプローブ連結及びＲＣＡの標的として使用する反復ＲＣＡが記述されている。これに対して、本発明においては、モノマー化ＲＣＡ産物は続く連結及びＲＣＡにおいてプローブとして使用される。この方法の利点は既に検討した。
【００２４】
本発明のその他の態様において、ＲＣＡ産物の直線的シグナル発生増幅を加えることによりＲＣＡから得られるシグナルを増加させる方法を発明した。これにより時間の二乗に比例して増加する環化プローブからのシグナルの増幅を生じる。
【００２５】
最初の方法は、ＲＣＡ産物に相補的プローブの選択的、ハイブリッド形成に依存した分解に基づいている。プローブは分解が検出できるように設計されていることが望ましい。
【００２６】
したがって、そのほかの態様において、本発明は増幅の程度を示すプローブを使用する核酸増幅方法を含んでおり、この方法は以下の段階を含んでいる：
−  信号プローブを提供する、そのプローブは増幅産物に相補的な配列を含む；
−  信号プローブを増幅産物と反応させる；
−  初代増幅産物にハイブリッド形成した信号プローブは選択的に分解する、その分解プローブは初代増幅産物から解離し、さらに別の信号プローブが産物とハイブリッド形成できるようになり、プローブのハイブリッド形成及び分解はプローブから発信される検出信号の変化として現れる。
【００２７】
望ましくは、プローブはヘアピン−ループプローブ、いわゆる分子ビーコン（Ｔｙａｇｉ＆Ｋｒａｍｅｒ，１９９６）で構成され、これは検出しうる信号を選択的に発信する検出しうるマーカーリガンドをその中に含んでいる。マーカーは核酸配列の部分とすることができるし、またはヘアピン構造の中に含まれるリガンドとすることができる。望ましくは、リガンドは核酸の切断に際して核酸から放出される。
【００２８】
プローブの一部が少なくとも部分的にＲＮＡからなるＲＣＡ産物とハイブリッド形成する場合に、ハイブリッド形成の際に酵素ＲＮアーゼＨにより分解されるであろう（Ｄｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ，ｅ．ｇ．ＵＳＰ５０１１７６９，ＵＳＰ５６６０９８８，ＵＳＰ５４０３７１１及びＵＳＰ６１２１００１）。
【００２９】
同じ効果はＲＣＡに使用するデオキシヌクレオチドの一つ以上をチオリン酸デオキシヌクレオチドに置換することにより得られ、それによりＲＣＡ産物をエンドヌクレアーゼ加水分解から保護する。この場合には分子ビーコンは通常のデオキシヌクレオチドから作られるので、二本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる分解を受けるであろう。特に、制限酵素認識部位をビーコンのループ配列の中に設計することができる。チオリン酸化鎖にハイブリッド形成したときに、チオリン酸化されていない鎖を特異的に切断する制限酵素がいくつか知られている。ＲＮアーゼＨ分解プローブに類似して、標的分子が存在するときにのみ切断、したがってプローブからの信号発信を生じるであろう。特異的なエンドヌクレアーゼの代わりに、非特異的二本鎖特異的エンドヌクレアーゼを使用することができ、それによってプローブ中に特異的配列が必要でなくなる。
【００３０】
検出可能な切断産物を作る関連方法はＲＣＡ産物に相補的なプローブ及びＲＣＡ−オリゴヌクレオチド複合体中の配列を認識する制限酵素を添加することである。ＲＣＡ−オリゴヌクレオチド複合体の切断の後に、切断されたプローブはモノマー化ＲＣＡ産物から解離するであろう。次いで完全なオリゴヌクレオチドは切り離されたモノマーの一端にハイブリッド形成することができる、その後そのモノマーの他の端は、相互作用の分子内優先性から、同じオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することになろう。このようにして、制限酵素の新規基質が形成され、そして第二の信号発生切断が生じる。プローブの一端を蛍光分子で標識しそして他端を消去分子で標識することにより、切断及び続く解離の際に信号が発生するであろう。
【００３１】
プローブのハイブリッド形成依存分解は二本鎖特異的エキソヌクレアーゼによっても行うことができる（（Ｃｏｐｌｅｙ＆Ｂｏｏｔ，１９９２），ＵＳＰ６１２１００１）。この場合に、ＲＣＡ産物とハイブリッド形成するプローブはエキソヌクレアーゼの基質となるであろうが、しかしＲＣＡ産物は二本鎖末端を持たないために影響を受けない。分解に際して複合体の融解温度は低下するであろうそしてプローブは完全に分解していなくても解離しやすくなる。こうして配列は他のプローブとハイブリッド形成し、そして分解される。
【００３２】
信号を増強するこの方法はリボ−またはいわゆるＤＮＡ−ザイム（Ｒ／Ｄ−ザイム）によっても行うことができる（例えば、（Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ＆Ｃｅｃｈ，１９９０）＆（Ｃａｒｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。環化核酸の中にＲ／Ｄ−ザイムの相補配列を組み込むことにより、ＲＣＡ産物は活性Ｒ／Ｄ−ザイムを含むであろう。次いでこれを反応混合物中に加えられたプローブを切断するために使用することができる。切断に際して切断されたプローブはＲＣＡ産物から解離し、そして他の切断されていないプローブにハイブリッド形成し切断される場を提供する。Ｒ／Ｄ−ザイムはプローブの切断をしなくても、二つのオリゴヌクレオチドを連結する鋳型となりうるし、下記のように信号を発生することができる（Ｃｕｅｎｏｕｄ＆Ｓｚｏｓｔａｋ，１９９５）。
【００３３】
ＲＣＡ産物とハイブリッド形成したときに構造特異的酵素の基質に類似するようにプローブを設計することもできる。酵素は望ましくは、リゾルバーゼ、組換え酵素またはヌクレアーゼ、例えば、Ｒｕｖ  ＡＢＣ，ホリディー連結リゾルバーゼ、Ｆｌｉｐ組換え酵素、ＦＥＮヌクレアーゼまたはある種のポリメラーゼを含む群から選択される。本発明の一態様では、下流オリゴヌクレオチドが突出した５開始端を持つように縦列にハイブリッド形成する二つのオリゴヌクレオチドを使用する。この構造は数種の異なる酵素、例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、ＴｔｈポリメラーゼまたはＭｊａヌクレアーゼにより切断することができる（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。下流オリゴヌクレオチドは、融解温度が等温ＲＣＡ反応の温度に近くなるように設計される。
【００３４】
したがって、プローブはヘアピンループ構造によって分離された蛍光分子および消去分子を含むことができ、その消去分子は、プローブが結合していないとき及び蛍光分子からの信号を消去分子が消去している完全な立体配座をとっているときには蛍光分子からの信号を消去し、そして結合または分解したプローブは信号を発する（図５）。そのほかには、プローブは信号分子の対を含むことができ、その分子はプローブが完全なときはＦＲＥＴによる信号を発生するが、プローブが分解したときには信号の発生を抑制する。
【００３５】
有利なのは、プローブとハイブリッド形成に依存した検出分子の蓄積の組み合わせにより反応を定温で、しかも低温において行うことができることである。
【００３６】
このように温度は６０℃未満、そして望ましくは５０℃未満でよい。これにより反応を高温に維持する必要性を除去することができるのは有利である。
【００３７】
分解するプローブの代わりに、ＲＣＡ産物の存在を示すプローブを、組み立てることができる。もし二つのオリゴヌクレオチドプローブがＲＣＡ産物上に互いに隣接してハイブリッド形成するように構築するならば、その後それらをリガーゼにより連結することができる。もし二つのオリゴヌクレオチドを、連結して標的から解離する際に安定なステム−ループ構造を形成するように設計するならば、５開始位置にあるドナー分子を他のオリゴヌクレオチドの３開始位置にあるアクセプター分子に非常に近接しておくことが可能である。そして信号を蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）に基づいて発生させることができる。連結したプローブが等温で進行するＲＣＡ反応の温度に近い融解温度を持つように設計することにより、早い回転が可能になる。連結していないプローブは生成した連結プローブよりも大過剰に存在するであろう。そのために標的ＲＣＡ産物とハイブリッド形成する速度が増加し、続いて連結、解離などが、こうして反応は等温で行うことが可能である。
【００３８】
したがって、そのほかの態様において、増幅の程度を示すプローブを使用する核酸増幅の方法が提供されるが、この方法は一対の信号プローブを使用し、このプローブは増幅産物上の標的配列に互いに隣接してハイブリッド形成するように設計され、ハイブリッド形成したときにプローブは連結して連結産物を形成し、これは標的配列から解離し、標的配列から連結産物の解離により別の一対のプローブの標的配列へのハイブリッド形成が可能となり、そして標的配列から解離する際に連結産物が信号を発する。
【００３９】
望ましくは、一対の信号プローブの一つはドナー分子を含み、そして他方はアクセプター分子を含み、そしてプローブは連結産物がヘアピン構造を形成し、その形成の際にドナーとアクセプターの分子間でエネルギー移転ができて信号を発するように設計されている。
【００４０】
その他の態様において、本発明は改良分子ビーコン設計を使用するコンカテマー増幅産物の均一検出を含んでいる。本発明では通常の分子ビーコンは、ビーコン中のＤＮＡ残基の少なくとも一部がポリメラーゼの基質として受け入れられない核酸残基によって置換されていない限り、ＲＣＡ産物が存在せずＤＮＡポリメラーゼが存在するときに信号を発することを発見した、その理由は３’末端（通常は蛍光消去分子を担っている）がポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）作用により分解されているからである。非特異的信号の発生は、ＤＮＡ残基の代わりに２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ残基を含む分子ビーコンを使用することにより完全に避けることができる（図６）。さらに発明者らは、ＲＣＡ産物とハイブリッド形成している通常の分子ビーコンは消去されていることを発見した、何故なら近くに存在するビーコンは容易に相互にステムを形成し（分子間ステム）、消去分子とレポーター蛍光分子を接近させ、ハイブリッド形成していないビーコンの密接（消去）立体配座に極めて類似する（図７）。ＲＣＡ産物にハイブリッド形成する際に、付近に存在するビーコンとステム様構造を取れないようにステムの一部が産物にハイブリッド形成するように南京錠プローブ配列の中にビーコンのステム配列の一つを含ませることにより、これを避けることができる（図７）。このような改良を行うことによりＲＣＡをリアルタイムに監視することができる（図８）。その他には、この配列がループを作ってしまうのを避けるために分子ビーコンの間にあるＲＣＡ産物にハイブリッド形成する第二のプローブを検出反応に加えることができ、これにより分子間のステム形成を抑制する。分子間消去の程度は、図８に使用した２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡビーコンの部分的消去に対してＤＮＡ分子ビーコン版（図９）の完全消去に示されるように異なる分子ビーコン配列により変動しうる。
【００４１】
鎖状化配列にハイブリッド形成し、隣接する分子ビーコンの間に形成する分子間ヘアピン構造は、鎖状化配列の一つのモノマー内にハイブリッド形成する二つの分子ビーコン間のＦＲＥＴを発生するためにも使用することができる。この二つの分子ビーコンは同じステム配列を備えていなければならないが、蛍光団のドナーとアクセプターの位置は二つの分子ビーコンのうち一つでは切り替えられていなければならない。そのような分子ビーコンは一つ置きにハイブリッド形成するであろう、そして隣接同士で分子間ヘアピン構造を形成するが、一つ置きの一つのビーコンの蛍光団は隣の分子ビーコンの蛍光団に極めて接近した位置にあり、二つの蛍光団の間の効果的なＦＲＥＴが可能になる。このようにして、接近した分子ビーコンからの背景蛍光を減少させ、検出感度を増加させることができる。
【００４２】
さらに他の態様において、本発明は、溶液中に遊離している非結合信号プローブの濃度に比較して、増幅産物にハイブリッド形成した信号プローブの濃度を増加させることによりコンカテマー増幅産物の均一な検出を含んでいる。長いコンカテマー増幅産物は溶液中に遊離するとコイルとなりそしてマイクロメーターサイズの球を形成する。ＤＮＡのボールの中に信号プローブが濃縮されるので、産物にハイブリッド形成した信号プローブからの強い信号と結合していないプローブからの比較的拡散した、弱い信号とのコントラストのために、個別の環化プローブからの一つの増幅産物を顕微鏡観察で簡単に検出することができる（図１２）。遺伝子発現を分析する検体の場合には、ＲＣＡ産物のボールの数は直接遺伝子発現に対応する。そのような均一な検出系は、各計数されたＲＣＡ産物は検出された一つの転写分子に対応するので、非常に簡便でありまた正確である。
【００４３】
多項均一分析は一般的に分光学的に分解できる蛍光団の数により制限される。例えばＰＣＲ反応に数種の蛍光標識プローブを添加した場合に、反応中の異なる蛍光団の合計が分析されるので、重複スペクトルが大きな問題となる。しかし、本発明においては、個々のＲＣＡ産物ボールが分析され、スペクトル干渉がないので、非常に類似したスペクトルを持つ蛍光団も分別することができるために、蛍光標識プローブによる個別のＲＣＡ産物の分析は高度な多項性をもって行うことができる。
【００４４】
遺伝子発現分析または多項的遺伝子分類のために、種々の増幅プローブ中に種々の郵便番号を含めることにより、種々の増幅産物に比標識郵便番号オリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させることによる増幅産物の同定を可能にするので、均一検出を多項的にすることができる。比標識は既知技術であり、そして限られた数の原色から多数の混合色を創り出すのに使用されてきた（Ｄａｕｗｅｒｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，及びＮｅｄｅｒｌｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。例えば、二つの原色色素Ａ及びＢを次のように混合する場合には：０％  Ａ及び１００％  Ｂ，２０％  Ａ及び８０％  Ｂ，４０％  Ａ及び６０％，６０％  Ａ及び４０％  Ｂ，８０％  Ａ及び２０％  Ｂ，そして１００％  Ａ及び０％  Ｂ。６種類の混合色が創り出される。もし３原色の色素が同様な比率段階で混合されると、３６種の混合色を区別することができる。郵便番号オリゴヌクレオチドは異なる比率の蛍光色素の混合のいずれかにより容易に標識され、そして種々の郵便番号オリゴヌクレオチドとそれらの混合を結合するか、または異なる色素で標識した郵便番号オリゴヌクレオチドを望む比率で混合する。この標識方法における多項の程度は標識スキームに加える原色の数（ｎ）に依存し、そして標識の精度は比段階数（ｘ）を決定し、これは区別しうる混合色の数ｘ(n-1)を制限する。増幅産物は数千の反復単位で構成されうるので、比標識における精度は極めて高く、そしてわずかな交差ハイブリッド形成郵便番号オリゴヌクレオチドの影響は無視しうるであろう。多数の擬似色を創るために原色の二者択一（オール−オア−ノン）組み合わせを使用するコンビナトリアル標識方法に比較して比標識方法を使用する大きな利点は、色組み合わせに比較して色比を使用することにより多くの混合色を得ることができることである。
【００４５】
本発明のある態様において、最初のＲＣＡの以前に線状プローブを除去することは有利であろう、例えば、残留する非環化プローブはＲＣＡにおいて非特異的信号を発生することが認められている。この問題を解決する試みがＷＯ  ００／３６１４１に記述されており、その中で酵素またはいわゆる捕捉リガンドが残留する線状核酸プローブを除去するために使用されている。
【００４６】
したがって、その他の態様において、本発明は環状プローブを使用する核酸増幅過程の間に（または後に）非環化プローブを除去または不活化する方法に関係している、その中において非環化プローブは連結部分に隔てられた第一及び第二部分を含んでおり、この第一及び第二部分は標的配列上の配列に相補的であり、そしてプローブはプローブの３’末端とプローブの連結部分にある配列との間にヘアピン構造を形成するように設計されており、そして理想的にはこのヘアピン構造のステムは熱安定性を有して、ループと標的配列の間のハイブリッド形成を阻害しないし、ＲＣＡによるプローブの複製も阻害しない。
【００４７】
このステムは合成を開始するために十分安定であるので、非結合プローブを完全なヘアピンに変換し、ＲＣＡ産物上における「第二鎖」の合成を開始することができない。
【００４８】
さらに、ヘアピン形成プローブは、そのプローブ設計は通常に設計されたプローブよりもさらに特異的である点で有利である。通常のプローブ設計では、診断塩基はＤＮＡリガーゼのミスマッチ識別能力の利点を十分に活かすためにプローブ配列の最後の３’位に位置していなければならない。本発明のヘアピンプローブにおいては、この診断塩基はヘアピン形成配列の一部であろう。この配列を、連結温度においてヘアピンと標的にハイブリッド形成する立体配座の間を行ったり来たりするように設計することができる。マッチした配列のプローブは、ミスマッチの配列のプローブよりも長時間標的ハイブリッド形成立体配座をとるであろう。このためにミスマッチプローブのミス連結よりもマッチしたプローブの連結が有利になるであろう。
【００４９】
その他の態様において、本発明は環状プローブを使用する核酸増幅過程の間に（または後に）非環化プローブを除去または不活化する別の方法を提供する、その中において増幅反応の以前にプローブの３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドを過剰に加えるが、このオリゴヌクレオチドは望ましくは５’配列延長を含み、それにより非環化プローブの３’末端は増幅過程の産物に対する相補性を失うであろう。
【００５０】
プローブの３’末端に相補的なオリゴヌクレオチドの過剰を、他の試薬と同時にまたは反応を開始した直後に加えることもできるが、ＲＣＡを開始する以前に系に添加することが望ましい。
【００５１】
本発明によれば、非連結プローブの３’末端はＲＣＡ産物に対する相補性を失っているであろう、そして第二鎖合成を開始することはできないであろう。このような３’除去化合物はＲＣＡを開始するために使用することができる。
【００５２】
その他に、非連結プローブの連結部分が複製される状況を避けるために、３’除去化合物はＤＮＡポリメラーゼの３’エキソヌクレオチド分解活性により取り除くことができず、延長できない３’末端を取り付けることができる。これは特に、南京錠プローブの連結部分に対応するＲＣＡ産物を認識するオリゴヌクレオチドによりＲＣＡ産物を検出しようとする場合に重要である。この場合に一般的プライマーはＲＣＡを開始するための環化プローブに加えることができるであろう。３’除去化合物の限定された長さのために、プライマーを延長するポリメラーゼにより置換されるであろうから、ＲＣＡを阻害しないであろう
2010183916.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明による数世代のローリングサークル複製（ＲＣＡ）の一般的方法を示したものである。
【図２】本発明にしたがって配列を環化しそして増幅するための環化アダプターを使用するゲノム−またはｃＤＮＡの増幅を示したものである。
【図３】プロキシミティー依存連結による本発明にしたがって増幅可能な環化ＤＮＡへの変換を示したものである。
【図４】ＲＣＡ産物の複雑な集合がＩＩ型制限酵素を使用して郵便番号モチーフの中でモノマー化しうるのか、またモノマー化したＲＣＡ産物が特異性とダイナミックレンジを増加させるための郵便番号オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上でハイブリッド形成しそして環化するのかを示したものである。
【図５】分子ビーコンが分解される本発明の増幅方法の図解である。
【図６】分子ビーコンの全てのＤＮＡ残基を２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ残基で置換することによる、ＤＮＡポリメラーゼの存在による非特異的蛍光の蓄積の除去を示すグラフである。
【図７】従来の分子ビーコン設計を使用した場合のＲＣＡ産物にハイブリッド形成した分子ビーコンの分子間消去を図解したものである。
【図８】ＲＣＡ産物の制限切断により分子間ビーコン消去が示され、そして分子ビーコンの改良設計によりＲＣＡのリアルタイムの監視が可能になることを示すグラフである。
【図９】図８と同様に行われたＲＣＡ反応の温度による影響を示すグラフである。ＲＣＡ及びポリメラーゼの熱不活化の後に蛍光はＤＮＡ分子ビーコンから得られる。
【図１０Ａ】例１に記載の第３世代ＲＣＡのリアルタイムモニタリングを示す。
【図１０Ｂ】例１に記載の第３世代ＲＣＡのリアルタイムモニタリングを示す。
【図１１】例２に従って得られる第２世代ＲＣＡ産物に相補的なオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイの地区において記録された蛍光を示す。
【図１２】蛍光標識オリゴヌクレオチドの均一ハイブリッド形成により溶液中に検出された個別のＲＣＡ産物を示し、産物とハイブリッド形成した蛍光標識オリゴヌクレオチドからの強い信号と非結合オリゴヌクレオチドからの比較的拡散した、弱い信号とのコントラストを示している。
【００５４】
発明の詳細な説明
本発明の態様をこれから付属した図を参照して、例示に過ぎないが、詳細に記述する：
【発明を実施するための形態】
【００５５】
図１は、本発明による数世代のローリングサークル複製（ＲＣＡ）の一般的方法を示したものである、１）南京錠プローブは特異的標的核酸鎖とハイブリッド形成する、２）南京錠プローブはＤＮＡリガーゼを使用して環化する、３）環化プローブはＲＣＡにおいて複製される、４）ＲＣＡ産物のモノマーごとに一度存在する制限酵素認識配列に過剰のオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する、５）オリゴヌクレオチド／産物二本鎖を消化する制限酵素を使用してＲＣＡ産物をモノマー化する、６）制限酵素の不活化及びオリゴヌクレオチドフラグメントの変性を生じる加熱段階の後、大部分のモノマーはその両端で完全なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する、７）このモノマーはＤＮＡリガーゼを使用して環化し、そして次いで生成した環は次のサイクルの３−７段階にしたがって処理される；
【００５６】
図２は、本発明にしたがって配列を環化しそして増幅するための環化アダプターを使用するゲノム−またはｃＤＮＡの増幅を示したものである、１）制限酵素を使用してＤＮＡ検体をフラグメントにする、２）フラグメント化したＤＮＡを変性する、３）環化アダプターが特異的標的フラグメントとハイブリッド形成する、４）ＤＮＡリガーゼを使用して標的フラグメントを環化する、５）環化した標的フラグメントをＲＣＡで複製する、６）ＲＣＡ産物のモノマーごとに一回アダプター配列中に存在する制限酵素認識配列に過剰の一般的アダプターオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する、７）オリゴヌクレオチド／産物二本鎖を消化する制限酵素を使用してＲＣＡ産物をモノマー化する、８）制限酵素の不活化及びオリゴヌクレオチドフラグメントの変性を生じる加熱段階の後、大部分のモノマーはその両端で完全なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する、９）そのモノマーはＤＮＡリガーゼを使用して環化し、そして次いで生成した環は次のサイクルの５−９段階にしたがって処理される；
【００５７】
図３はプロキシミティー依存連結による本発明にしたがって増幅可能な環化ＤＮＡへの変換を示したものである、１）一対のプロキシミティープローブ、例えば、オリゴヌクレオチドを付けた抗体が標的タンパクと結合する、２）二つのオリゴヌクレオチドがプロキミティー依存連結反応により結合する、例えば、近接して結合した一対の結合試薬を同定するための半タグ連結を可能にする平滑末端連結により、３）制限酵素認識配列を含みそして連結したオリゴヌクレオチド配列の両方に存在する同じ配列に過剰のオリゴヌクレオチドがハイブリッド形成する、５）オリゴヌクレオチド／産物二本鎖を消化する制限酵素を使用して連結産物を切断する、６）制限酵素の不活化及びオリゴヌクレオチドフラグメントの変性を生じる加熱段階の後、大部分のモノマーはその両端で完全なオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する、７）そのモノマーはＤＮＡリガーゼを使用して環化し、そして次いで生成した環は図１の３−７段階にしたがって処理される；
【００５８】
図４は、ＲＣＡ産物の複雑な集合がＩＩ型制限酵素を使用して郵便番号モチーフの中でモノマー化しうるのか、またモノマー化したＲＣＡ産物が特異性とダイナミックレンジを増加させるための郵便番号オリゴヌクレオチドマイクロアレイ上でハイブリッド形成しそして環化するのかを示したものである、１）郵便番号オリゴヌクレオチドを同定する配列を含むＲＣＡ産物の集合が、例えば、多項南京錠プローブ遺伝子分類または発現分析実験から、または多項プロキミティー依存連結反応から発生した、２）ＩＩ型制限酵素をランダムヘキサマー及びＩＩ型制限酵素認識配列を含む一般的オリゴヌクレオチドとともに加え、３）ヘキサマー及び制限オリゴヌクレオチドを任意に除去し、次いでモノマーは半郵便番号末端配列を持つ南京錠プローブに変換する、４）モノマーを郵便番号オリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリッド形成する、５）ＤＮＡリガーゼを使用して郵便番号オリゴヌクレオチド上でモノマーを環化する、６）郵便番号オリゴヌクレオチドをブライマーとしてＲＣＡにおいてモノマーを増幅する、そして重合は増加するダイナミックレンジ用の均一方式で任意に監視する；
【００５９】
図５は、分子ビーコンが分解される本発明の増幅方法の図解である。
【００６０】
図６は、分子ビーコンの全てのＤＮＡ残基を２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ残基で置換することによる、ＤＮＡポリメラーゼの存在による非特異的蛍光の蓄積の除去を示すグラフであり、一つのＤＮＡ分子ビーコンはＦＡＭ蛍光（上段）で標識し、そして一つの２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ分子ビーコンはＨＥＸ蛍光（下段）で標識されており、それらをΦ２９ＤＮＡポリメラーゼの存在下（四角）または非存在下（丸）に同じ試験管に加えた；
【００６１】
図７は、従来の分子ビーコン設計を使用した場合のＲＣＡ産物にハイブリッド形成した分子ビーコンの分子間消去を図解したものである；
【００６２】
図８は、ＲＣＡ産物の制限切断により分子間ビーコン消去が示され、そして分子ビーコンの改良設計によりＲＣＡのリアルタイムの監視が可能になることを示すグラフである；
【００６３】
図９は、図８と同様に行われたＲＣＡ反応の温度による影響を示すグラフである。ＲＣＡ及びポリメラーゼの熱不活化の後に蛍光はＤＮＡ分子ビーコンから得られる；
【００６４】
図１０は、例１に記載の第３世代ＲＣＡのリアルタイムモニタリングを示す；
【００６５】
図１１は、例２に従って得られる第２世代ＲＣＡ産物に相補的なオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイの地区において記録された蛍光を示す；
【００６６】
図１２は、蛍光標識オリゴヌクレオチドの均一ハイブリッド形成により溶液中に検出された個別のＲＣＡ産物を示し、産物とハイブリッド形成した蛍光標識オリゴヌクレオチドからの強い信号と非結合オリゴヌクレオチドからの比較的拡散した、弱い信号とのコントラストを示している。
【００６７】
例
例１（改良分子ビーコンを使用する第３世代ＲＣＡのリアルタイムモニタリング）
２ｎＭ南京錠プローブ（Ｐ−
2010183916.tif 000003
（Ｐ＝５’リン酸）を１０ｍＭ  ＴｒｉｓＡｃ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＡｃ2，５０ｍＭ  ＫＡｃ，０．１％  ＢＳＡ，１ｍＭ  ＡＴＰ，２００ｍＭ  ＮａＣｌ，及び２０ｍＵ／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの中で、０，１０，４０または１６０ｚｍｏｌの標的オリゴヌクレオチド
2010183916.tif 000004
の存在下に環化した。反応を１５分間３７℃でインキュベートし、次いで５分間６５℃でリガーゼを不活化した。第一世代ＲＣＡは０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡ，２５０μＭ  ｄＮＴＰ，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１  ｐｍｏｌプライマー
2010183916.tif 000005
、及び１ｎｇ／μｌφ２９  ＤＮＡポリメラーゼの中で４５分間３７℃で行った。重合成分を１５μｌのφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，及び２０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4）中で１０μｌ連結反応に加えた。ＤＮＡポリメラーゼを１０分間６５℃で不活化した。５μｌ  ０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡ，３ｐｍｏｌ  ＲＳＡＩ
2010183916.tif 000006
、及びφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液中の１０Ｕ  ＲｓａＩを加えて第一世代ＲＣＡ産物をモノマー化した。反応を６０分３７℃でインキュベートし、次いで１０分間６５℃で酵素を不活化した。５μｌ  ０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡ，１ｍＭ  ＡＴＰ，及び１Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼをφ２９ポリメラーゼ緩衝液中で加えてモノマー化ＲＣＡ産物を環化した。１５分間３７℃でインキュベートして連結を行い、ついで５分間６５℃で酵素を不活化した。第二世代ＲＣＡは１５μｌ重合試薬を３５μｌの環化ＲＣＡ産物に加えて、第一世代ＲＣＡと同じ条件を使用して行った。重合反応は４５分間３７℃で継続した。第二世代のＲＣＡ産物の半分に、０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡを含むφ２９ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液５μｌ中で６ｐｍｏｌ  ＲＳＡＩｃｏｍｐ
2010183916.tif 000007
及び１０Ｕ  ＲｓａＩを加えてモノマー化した。反応を６０分間３７℃でインキュベートし、次いで１０分間６５℃で酵素を不活化した。モノマー化した第二世代のＲＣＡ産物の環化は、モノマー化した第一世代のＲＣＡ産物の環化と同じ方法を使用して行った。第三世代のＲＣＡは、０．１μＭ分子ビーコン
2010183916.tif 000008
の存在下６０分間行った以外は第二世代ＲＣＡと同様に行った。ＡＢＩ  ７７００を使用して反応をリアルタイムに追跡した。
【００６８】
例２．（第二世代ＲＣＡ産物のＤＮＡアレイ上での検出）
２ｎＭ南京錠プローブ（ＷＤ  １２１６Ｇ）を種々の量の標的オリゴヌクレオチド（Ｔ  １２１６Ｇ；０，２５，２５０，または２５００ｚｍｏｌ）の存在下に上記のように環化した。第一世代ＲＣＡは１ｐｍｏｌのプライマーＷＤＰ−Ｆの存在下に上記と同様に１００分間３７℃で行った。１５μｌのφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液中で１０μｌ連結反応に重合成分を加えた。ＤＮＡポリメラーゼを１０分間６５℃で不活化した。φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液中の５μｌ  ０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡ，３ｐｍｏｌ  Ｃｏｍｐ  ＷＤＰ−Ｆ，及び５Ｕ  Ｆｎｕ４Ｈ  １を加えることにより第一世代ＲＣＡ産物をモノマー化した。反応を６０分間３７℃でインキュベートし、次いで１０分間６５℃で酵素を不活化した。５μｌ  ０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡ，１ｍＭ  ＡＴＰ，及び１Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼをφ２９ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液中で加えてモノマー化ＲＣＡ産物を環化した。１５分間３７℃でインキュベートして連結を行い、ついで５分間６５℃で酵素を不活化した。第二世代ＲＣＡは１５μｌ重合試薬を３５μｌの環化ＲＣＡ産物に加えて、第一世代ＲＣＡと同じ条件を使用して行った。重合反応は１００分間３７℃で継続した。０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡを含むφ２９  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液５μｌ中で４．５ｐｍｏｌ  Ｄ−ＲＣＲｃｕｔ及び５Ｕ  Ｆｎｕ４ＨＩを加えることにより第二世代のＲＣＡ産物の半分をモノマー化した。反応を６０分間３７℃でインキュベートし、次いで１０分間６５℃で酵素を不活化した。３０μｌモノマー化第二世代ＲＣＡ産物を、４*ＳＳＣ，０．５２５μＭ  Ｃｏｍｐ  ＷＤ  Ｃｙ５，１０μＭ  ＥＤＴＡ中４５℃で２時間ＤＮＡマイクロアレイとハイブリッド形成させ、０．１ｘＳＳＣ中４５℃で洗い、水ですすぎ、そして最後に乾燥した。Ｃｙ５蛍光信号を蛍光レーザースキャナーで記録した。
【００６９】
例１及び２に記述されているような数世代ＲＣＡの一般的方法の図解は図１に示されている。例１及び２の結果はそれぞれ図１０及び１１に示されている。最初に環状核酸はＲＣＡにおいて複製される。次いで第一世代ＲＣＡ産物は、例えば、ＲＣＡ産物と相補的なオリゴヌクレオチドにより二本鎖となった認識部位で産物を切断する制限酵素を使用することによりモノマー化される。例えば、制限酵素の熱不活化の間にまたはその後に、完全な制限オリゴヌクレオチドは消化されたものを置換するであろう。完全な制限オリゴヌクレオチドがモノマー化ＲＣＡ産物の一端にハイブリッド形成したときに、二番目のハイブリッド形成反応の分子内優先のために、モノマーの他端は同じ制限オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するであろう。次いでモノマーは末端を、例えば、ＤＮＡリガーゼを使用して連結することにより環化することができる。この方法は同じ手順を１回以上反復することができる。
図１０は、例１に記述されている第三世代のＲＣＡのリアルタイムモニタリングを示している。Ａ）発生したときにＲＣＡ産物にハイブリッド形成した分子ビーコンから放射されたＨＥＸ蛍光のリアルタイムの測定。Ｂ）グラフは最初のプローブ環化反応に加えられた標的オリゴヌクレオチドの量との関係を示している、４回繰り返し、そしてこの連結反応の第三世代リアルタイムＲＣＡの最大勾配。エラーバーは標準偏差を示す。
図１１は、例２に従って得られた第二世代ＲＣＡ産物に相補的なオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ地区で記録された蛍光を示す。
【００７０】
例３
オリゴヌクレオチド：使用した南京錠プローブはｐ９０：
2010183916.tif 000009
及びｐ９３：
2010183916.tif 000010
（Ｐ＝５’リン酸）であった。南京錠プローブに対する連結鋳型はｔ４０：
2010183916.tif 000011
であった。ＤＮＡ分子ビーコンはＦＡＭ−ｃｇｃｃｔｃＡＡＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＡＣｇａｇｇｃｇ−ＤＡＢＣＹＬ（ステム部分は小文字）であり、そして２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ分子ビーコンはＨＥＸ−ｃｃｕｃＡＡＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＵＡＣＵＡＣｇａｇｇ−ＤＡＢＣＹＬであった。２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ塩基対の高いハイブリッド安定性の故に２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ分子ビーコンにおいてステムは２塩基対短い。制限消化に使用したオリゴヌクレオチドは  Ｔｓｐ４５１：
2010183916.tif 000012
であった。
【００７１】
例４
南京錠プローブの環化：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸  ｐＨ７．５，１０ｍＭ  酢酸Ｍｇ，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＡＴＰ，１μｇ／μｌ  ＢＳＡ，及び０．２単位／μｌ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中で６００ｎＭ  連結鋳型の存在下に２００ｎＭ南京錠プローブを３７℃で３０分間連結した。
【００７２】
例５
ローリングサークル増幅：重合反応を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4，１０ｍＭジチオトレイトール及び０．２μｇ／μｌ  ＢＳＡ，０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ，及び２ｎｇ／μｌ  Φ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｒ．Ｍ．Ｓａｌａｓから供与された）の中において３７℃で行った。リアルタイムモニタリングのために、１００ｎＭ分子ビーコン及び３００ｎＭ  ＲＯＸ色素の存在下にＲＣＡを行った。蛍光の値は分子ビーコン（ＦＡＭまたはＨＥＸ）及びＲＯＸ対照色素から放射される蛍光の比から得た。温度依存性は温度を１℃上昇させ３０秒間保った後蛍光を測定して得た。
【００７３】
例６
制限消化：２０μｌの１０ｍＭ  Ｂｉｓ  Ｔｒｉｓプロパン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，１ｍＭジチオトレイトール，０．１μｇ／μｌ  ＢＳＡ，１．５μＭ  Ｔｓｐ４５１，及び０．１Ｕ／μｌ  Ｔｓｐ  ４５１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を４０μｌ  ＲＣＡ産物に加え、そして６５℃で４時間インキュベートした。
【００７４】
図に戻って、図６で見ることができるようにＤＮＡポリメラーゼの存在下に生じる蛍光の非特異的蓄積は分子ビーコンのＤＮＡ残基を全て２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ残基で置換することにより除去される。ＦＡＭ蛍光で標識したＤＮＡ分子ビーコン（上段）及びＨＥＸ蛍光団で標識した２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ分子ビーコン（下段）をΦ２９  ＤＮＡポリメラーゼの存在下（四角）及び非存在下（丸）に同じ試験管に加えた。グラフの左側部分は試験管内のリアルタイムに観察した蛍光を示し、右側の部分は６０分後に存在する成分の温度依存性を示す。
【００７５】
図７からは、従来の分子ビーコン設計をしようした場合のＲＣＡ産物にハイブリッド形成した分子ビーコンの分子間消去を見ることができる（上段）。この構造は改良設計を使用することにより避けることができる（下段）。
【００７６】
図８：図７に示された分子間ビーコン消去はＲＣＡ産物の制限切断によって示されており、そして分子ビーコンの改良設計によりＲＣＡのリアルタイム監視が可能である。ＲＣＡをｐ９０（四角）またはｐ９３（丸）南京錠プローブのいずれかを含み、リガーゼがある場合（黒）またはリガーゼが無い場合（グレイ）の連結反応により行った。グラフの左側部分は異なる反応における２’Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡ分子ビーコンからの蛍光をリアルタイム測定したものを示す。右側部分は９０分ＲＣＡの終了時に存在する成分の温度依存性を示す（塗りつぶした記号）。制限消化後の異なる反応成分の温度依存性を重ねてある（中抜き記号）。
【００７７】
ＲＣＡ、そしてポリメラーゼの熱不活化後にＤＮＡ分子ビーコンを加えて蛍光を測定した場合の、図８と同様に行ったＲＣＡ反応の温度依存性を図９に示す。
【００７８】
例７
１００ｎｇのＰｓｔＩ切断ゲノムＤＮＡを９５℃で１２分間変性し、そしてサーマルサイクラー中で１２℃に急速に冷却した。予めアニ―ルしたオリゴヌクレオチド
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及び“ｇＤＮＡａｄａｐｔｅｒ１°”
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を最終濃度２ｎＭになるように変性切断ゲノムＤＮＡに加えた。一つの反応にはリガーゼを加え、もう一つの反応にはリガーゼを加えなかった。連結を１時間室温で、次いで３０分間３７℃で進行させ、次いで６５℃で２０分間リガーゼを熱不活化した。連結反応の５μｌを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4，０．２μｇ／μｌ  ＢＳＡ，０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ，及び１０ｎｇ  Φ２９ポリメラーゼ中３７℃で３時間ローリングサークル増幅にかけた。ＲＣＡ産物の量を定量するために、リアルタイムＰＣＲ反応を容量２５μｌ中１ｘＰＣＲ  ＧＯＬＤ緩衝液（ＡＢＩ），１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ2，０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ，２００ｎＭ
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及び２００ｎＭ
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プライマー，０．６２５Ｕ  Ｔａｑ  ＧＯＬＤポリメラーゼ（ＡＢＩ），３００ｎＭ  ＲＯＸ色素及び０．１５ｘＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）にＲＣＡ反応の２．５μｌを加えて行った。プライマーはゲノムフラグメント及びＲＣＡ産物の両者をＰＣＲ増幅するように設計した。ＰＣＲプログラムは９５℃で１０分間、４５サイクルの９５℃  １５分間及び６０℃  ６０秒であった。ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ増幅単位を解離曲線分析にかけた。Ｃｔ値として示された結果はカッコ内の標準偏差とともに表１に見ることができる。増幅単位の融解温度は８２．６℃であり、これは増幅単位の推定Ｔｍ８３℃によく近似した。Φ２９  ＤＮＡポリメラーゼは一本鎖ＤＮＡ（変性）に対して強いエキソヌクレアーゼ活性を示す；したがって４倍希釈を考慮した場合に、Φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ処理をしない検体に比較して非連結ＤＮＡは４分の１の少ない産物を示す。増幅されるＤＮＡは５４５ｎｔの長さであり、そして１５００ｎｔ／ｍｉｎの速さであるから５００倍の増幅が予想された。４倍希釈を考慮すると、非増幅検体に比較して１２０倍の結果になることが予想されるであろう。デルタＣｔ値６．７５は１１０倍の増幅に相当する。
表１
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【００７９】
例８
環化南京錠プローブｐ９３のＲＣＡ産物の２ｐＭ及び産物に相補的な標的プローブＲＣ１Ｒ（５’−ローダミン−
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の５ｎＭの１ｘＰＢＳ溶液を幅５０マイクロメーター及びチャンネル間空間４０マイクロメーターの二本の微量流体チャンネルに注入した。南京錠プローブの環化及びＲＣＡは例４及び５に従って行った。ＲＣＡを１時間行ったので、ＲＣＡ産物は環化プローブの平均１５００コピーを含む。チャンネル中の結合及び非結合蛍光標識プローブからの蛍光を、４０ｘドライレンズを装着した表在蛍光顕微鏡を使用して画像化した。図１２において、チャンネル中に数個の輝くＤＮＡのボール、並びにやや弱く輝く焦点外の物体が非結合プローブの拡散した蛍光の背景上に認められる。
【００８０】
本発明は、本発明の精神から離れることなく構造及び細部を変更することが可能であり、ここまでに記述した態様に限定されない。
【００８１】
文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成22年7月1日(2010.7.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環化核酸を作成する方法であって、
標的核酸フラグメントを得るために標的核酸をフラグメント化し；
必要に応じて、該標的核酸フラグメントを変性し、一本鎖標的核酸フラグメントとし；
該標的核酸フラグメントに、
（ａ）該標的核酸フラグメントの両末端に各々相補的で、同じ鎖側に存在する２つの一本鎖配列部分；及び、
（ｂ）上記２つの一本鎖末端配列の間に、二本鎖となった標的に相補的でない部分；
を有する環化アダプターをハイブリダイズし；
ＤＮＡライゲースを用いて、該標的核酸フラグメントを環化する；
ことを含む方法。
【請求項２】
環化アダプターが、該二本鎖となった標的に相補的でない部分において制限オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
制限オリゴヌクレオチド配列が、１つの共通の制限オリゴヌクレオチド配列である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
更に、環化標的核酸フラグメントを増幅することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
更に、異なる環化アダプターを用いて多くの異なる標的核酸フラグメントを環化し、次いで、標的核酸フラグメントを、同じ共通の制限ヌクレオチドと酵素を用いて、複数の異なる標的核酸フラグメントが平行して増幅されるように、増幅することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
増幅が、ローリングサークル増幅である、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
標的核酸を、一つもしくはそれ以上の制限酵素またはＦＬＡＰエンドヌクレアーゼでフラグメント化する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
環化核酸がｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
標的核酸フラグメントを増幅する方法であって、
（i）標的核酸フラグメントを得るために標的核酸をフラグメント化し；
（ii）必要に応じて、該標的核酸フラグメントを変性し、一本鎖標的核酸フラグメントとし；
（iii）該一本鎖標的核酸フラグメントを、（ａ）該標的核酸フラグメントの両末端に各々相補的で、同じ鎖側に存在する２つの一本鎖配列部分、及び（ｂ）上記２つの一本鎖末端配列の間に、二本鎖となった標的に相補的でない部分を有する環化アダプターにハイブリダイズし；
（iｖ）ＤＮＡライゲースを用いて、該標的核酸フラグメントを環化し；
（ｖ）環化した標的核酸フラグメントを増幅する；
ことを含む上記方法。