【手続補正書】
【提出日】令和2年12月11日(2020.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞の遺伝物質を改変する方法であって、（ｉ）第１のプロモーターの制御下、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入するステップであって、前記発現したＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７７％の同一性の配列、またはその活性断片を含む、ステップ、（ｉｉ）第２のプロモーターの制御下、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを前記細胞に導入するステップであって、前記ガイドＲＮＡが、前記細胞のゲノムにおいて所望の標的遺伝子座に含まれている核酸配列を認識する核酸配列を有する、ステップ、および（ｉｉｉ）相同組換え（ＨＲ）オリゴヌクレオチドを前記細胞に導入する、ステップを含む、方法。
【請求項２】
真核細胞の遺伝物質を改変する方法であって、（ｉ）第１のプロモーターの制御下、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入するステップであって、前記発現したＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７７％の同一性の配列、またはその活性断片を含む、ステップ、および（ｉｉ）前記第１のプロモーターまたは別個の第２のプロモーターの制御下、前記細胞のゲノムにおいて所望の標的遺伝子座に含まれている核酸配列を認識する核酸配列を有するガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびさらには前記第１もしくは前記第２のプロモーター、または別個の第３のプロモーターの制御下のＨＲオリゴヌクレオチドを前記細胞に導入するステップを含む、方法。
【請求項３】
前記ＨＲオリゴヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡＨＲオリゴヌクレオチドであり、任意選択で、ガイドＲＮＡ依存性ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９エンドヌクレアーゼカッティング後の相同組換えにより、前記細胞のゲノムに挿入するためのポリヌクレオチド配列を含み、好ましくは、
（ａ）前記第１のプロモーターが構成的プロモーターであり、および／または
（ｂ）前記第１のプロモーターが誘導性プロモーターであり、および／または
（ｃ）前記第２のプロモーターが構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり、および／または
（ｄ）前記第３のプロモーターが構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞に、熱ショックにより、前記発現プラスミドおよび／または前記ＨＲオリゴヌクレオチドが導入される、ならびに／または
前記細胞が、２６℃〜６０℃、好ましくは３１℃〜６０℃、より好ましくは３５℃〜６０℃、さらにより好ましくは３４℃〜４１℃、例えば３７℃の範囲の温度で維持される、および／もしくは成長する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ポリヌクレオチド発現ベクターを含む宿主生物の標的遺伝子座における遺伝物質を改変するための前記ポリヌクレオチド発現ベクターであって、
ａ）ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ヌクレアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７７％の同一性の配列、またはその活性断片を含む、ポリヌクレオチド配列、
ｂ）ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列であって、前記ガイドＲＮＡが、前記標的遺伝子座に含まれる核酸配列を認識する核酸配列を有する、ポリヌクレオチド配列、
ｃ）前記生物においてその発現を駆動するように（ａ）および（ｂ）のポリヌクレオチド配列に対して方向付けられた第１のプロモーター
を含むポリヌクレオチド発現ベクター。
【請求項６】
（ａ）の配列が前記プロモーターの３’側にあり、（ｂ）の配列が（ｂ）の配列の３’側にある、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記第１のプロモーターが誘導性プロモーターであり、任意選択で
前記誘導性プロモーターが、セロビオースにより誘導可能なβ−グルコシダーゼプロモーターまたは３−メチルベンゾエートにより誘導可能なＰｍプロモーターから選択される、請求項５または請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
前記第１のプロモーターまたは別個の第２のプロモーターの制御下、相同組換え（ＨＲ）オリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載のベクター。
【請求項９】
前記ＨＲオリゴヌクレオチドを制御する前記第２のプロモーターが、構成的プロモーターであり、任意選択で
前記構成的プロモーターがＰ３である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ＨＲオリゴヌクレオチドのアームが、前記宿主生物における目的の標的の上流および下流それぞれでの組換えを可能にする核酸配列を含み、好ましくは、
前記目的の標的が、標的配列を含み、より好ましくは、前記目的の標的が遺伝子である、請求項８または請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記ＨＲオリゴヌクレオチドが、その上流と下流のアームとの間に挿入エレメントをさらに含み、好ましくは、
前記挿入エレメントが目的の遺伝子であり、任意選択で、前記宿主生物における前記目的の遺伝子の発現をもたらすような作動方向にある好適なプロモーターを伴う、請求項８から１０のいずれかに記載のベクター。
【請求項１２】
前記目的の標的が、標的配列の３’に位置する前記ＰＡＭ配列５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’、任意選択で、標的配列に由来する少なくとも２、３、４、５、６またはそれより多いヌクレオチドを含む、請求項１０または請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１から１２のいずれかに記載のベクター。
【請求項１４】
生物の遺伝物質を改変するインビトロの方法であって、請求項５から７のいずれかのベクターである第１の発現ベクター、およびプロモーターの制御下、相同組換え（ＨＲ）オリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターを前記生物に導入するステップを含む方法。
【請求項１５】
原核生物の遺伝物質を改変するインビトロの方法であって、請求項８から１３のいずれかの発現ベクターを前記生物に導入するステップを含む方法。
【請求項１６】
前記生物が、第１の温度である期間、培養され、次に、前記ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９配列の前記プロモーターの誘導前または誘導中に、第２の温度で培養され、好ましくは、
前記第１の温度が６０℃以下であり、前記第２の温度が少なくとも５５℃であるより高い温度であり、好ましくは、
前記第１の温度が５５℃以下であり、前記第２の温度が５５℃より高い、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記生物が原核生物であり、好ましくは、
前記原核生物が、
（ａ）好熱性細菌、例えば、ゲオバチルス・サーモグルコシダンス（Geobacillus thermoglucosidans）である、または
（ｂ）前記原核生物が、少なくとも４０℃、好ましくは少なくとも４５℃の成長最適温度を有する細菌、例えばバチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）またはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である、または
（ｃ）前記原核生物が土壌細菌、好ましくは腐栄養性土壌細菌、例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である、請求項１４から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項５から１３のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された原核細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
本開示は以下の［１］から［３４］を含む。
［１］真核細胞の遺伝物質を改変する方法であって、（ｉ）第１のプロモーターの制御下、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドを上記細胞のゲノムに組み込むステップであって、上記発現したＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７７％の同一性の配列、またはその活性断片を含む、ステップ、（ｉｉ）第２のプロモーターの制御下、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターで上記細胞を形質転換するステップであって、上記ガイドＲＮＡが、上記細胞のゲノムにおいて所望の標的遺伝子座に含まれている核酸配列を認識する核酸配列を有する、ステップ、および（ｉｉｉ）修復オリゴヌクレオチドで上記細胞を形質転換する、ステップを含む、方法。
［２］真核細胞の遺伝物質を改変する方法であって、（ｉ）第１のプロモーターの制御下、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をコードするポリヌクレオチドを上記細胞のゲノムに組み込むステップであって、上記発現したＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７７％の同一性の配列、またはその活性断片を含む、ステップ、および（ｉｉ）上記第１のプロモーターまたは別個の第２のプロモーターの制御下、上記細胞のゲノムにおいて所望の標的遺伝子座に含まれている核酸配列を認識する核酸配列を有するガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびさらには上記第１もしくは上記第２のプロモーター、または別個の第３のプロモーターの制御下の修復オリゴヌクレオチドで上記細胞を形質転換するステップを含む、方法。
［３］上記修復オリゴヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ修復オリゴであり、任意選択で、ガイドＲＮＡ依存性ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９エンドヌクレアーゼカッティング後の相同組換えにより、上記細胞のゲノムに挿入するためのポリヌクレオチド配列を含む、上記［１］または上記［２］に記載の方法。
［４］上記第１のプロモーターが構成的プロモーターである、上記［１］または上記［２］に記載の方法。
［５］上記第１のプロモーターが誘導性プロモーターである、上記［１］または上記［２］に記載の方法。
［６］上記第２のプロモーターが構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、上記［１］から［５］のいずれかに記載の方法。
［７］上記第３のプロモーターが構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターである、上記［２］から［６］のいずれかに記載の方法。
［８］上記細胞が、熱ショックにより、上記発現プラスミドおよび／または上記修復オリゴで形質転換される、上記［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［９］上記細胞が、２６℃〜６０℃、好ましくは３１℃〜６０℃、より好ましくは３５℃〜６０℃、さらにより好ましくは３４℃〜４１℃、例えば３７℃の範囲の温度で形質転換される、および／または形質転換後に成長する、上記［１］から［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］上記真核細胞が、酵母、例えばサッカロマイセス（Saccaharomyces）属種である、上記［１］から［９］のいずれかに記載の方法。
［１１］ポリヌクレオチド発現ベクターを含む宿主生物の標的遺伝子座における遺伝物質を改変するためのポリヌクレオチド発現ベクターであって、
ａ）ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド配列であって、上記ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ヌクレアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７７％の同一性の配列、またはその活性断片を含む、ポリヌクレオチド配列、
ｂ）ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド配列であって、上記ガイドＲＮＡが、上記標的遺伝子座に含まれる核酸配列を認識する核酸配列を有する、ポリヌクレオチド配列、
ｃ）上記生物においてその発現を駆動するように（ａ）および（ｂ）のポリヌクレオチド配列に対して方向付けられた第１のプロモーター
を含むポリヌクレオチド発現ベクター。
［１２］（ａ）の配列が上記プロモーターの３’側にあり、（ｂ）の配列が（ｂ）の配列の３’側にある、上記［１１］に記載のベクター。
［１３］上記第１のプロモーターが誘導性プロモーターである、上記［１１］または上記［１２］に記載のベクター。
［１４］上記誘導性プロモーターが、セロビオースにより誘導可能なβ−グルコシダーゼプロモーターまたは３−メチルベンゾエートにより誘導可能なＰｍプロモーターから選択される、上記［１３］に記載のベクター。
［１５］上記第１のプロモーターまたは別個の第２のプロモーターの制御下、相同組換え（ＨＲ）断片をコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、上記［１］から［１４］のいずれかに記載のベクター。
［１６］上記ＨＲ断片を制御する上記第２のプロモーターが、構成的プロモーターである、上記［１５］に記載のベクター。
［１７］上記構成的プロモーターがＰ３である、上記［１６］に記載のベクター。
［１８］上記ＨＲ断片のアームが、上記宿主生物における目的の遺伝子座の上流および下流それぞれでの組換えを可能にする核酸配列を含む、上記［１５］から［１７］のいずれかに記載のベクター。
［１９］上記目的の遺伝子座が、標的配列を含む、上記［１８］に記載のベクター。
［２０］上記ＨＲ断片が、その上流と下流のアームとの間に挿入エレメントをさらに含む、上記［１５］から［１９］のいずれかに記載のベクター。
［２１］上記挿入エレメントが目的の遺伝子であり、任意選択で、上記宿主生物における上記目的の遺伝子の発現をもたらすような作動方向にある好適なプロモーターを伴う、上記［２０］に記載のベクター。
［２２］上記目的の遺伝子座が、標的配列の３’に位置する上記ＰＡＭ配列５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’、任意選択で、標的配列に由来する少なくとも２、３、４、５、６またはそれより多いヌクレオチドを含む、上記［１８］から［２１］のいずれかに記載のベクター。
［２３］上記目的の遺伝子座が遺伝子である、上記［１］から［２２］のいずれかに記載のベクター。
［２４］上記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、上記［１］から［２３］のいずれかに記載のベクター。
［２５］生物の遺伝物質を改変する方法であって、上記［１１］から［１４］のいずれかのベクターである第１の発現ベクター、およびプロモーターの制御下、相同組換え（ＨＲ）断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む第２の発現ベクターで上記生物を形質転換するステップを含む方法。
［２６］原核生物の遺伝物質を改変する方法であって、上記［１５］から［２４］のいずれかの発現ベクターで上記生物を形質転換するステップを含む方法。
［２７］上記形質転換された生物が、第１の温度である期間、培養され、次に、上記ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９配列の上記プロモーターの誘導前または誘導中に、第２の温度で培養される、上記［１６］に記載の方法。
［２８］上記第１の温度が６０℃以下であり、上記第２の温度が少なくとも５５℃であるより高い温度である、上記［２５］から［２７］のいずれかに記載の方法。
［２９］上記第１の温度が５５℃以下であり、上記第２の温度が５５℃より高い、上記［２８］に記載の方法。
［３０］上記生物が原核生物である、上記［２５］から［２９］のいずれかに記載の方法。
［３１］上記原核生物が、好熱性細菌、例えば、ゲオバチルス・サーモグルコシダンス（Geobacillus thermoglucosidans）である、上記［３０］に記載の方法。
［３２］上記原核生物が、少なくとも４０℃、好ましくは少なくとも４５℃の成長最適温度を有する細菌、例えばバチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）またはシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である、上記［３０］に記載の方法。
［３３］上記原核生物が土壌細菌、好ましくは腐栄養性土壌細菌、例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）である、上記［３０］に記載の方法。
［３４］上記［１１］から［２４］のいずれかに記載の発現ベクターで形質転換された原核細胞。
発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：好熱性細菌であるゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＩＩＣ型系からＲＮＡ−ガイドＤＮＡ−エンドヌクレアーゼを発見して、特徴付けた。発明者らは、驚くべきことに、幅広い温度範囲にわたる、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性を示し、熱安定性に対するｓｇＲＮＡ−構造の重要性を実証し、幅広い温度範囲にわたる、ｉｎ  ｖｉｖｏでのゲノム編集に、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を適用した。