(57)【要約】【課題】柔らかい納豆を製造するような能力を有する納豆菌を提供し、該納豆菌を用いた柔らかい納豆の製造方法、及び該製造方法により製造された柔らかい納豆を提供する。【解決手段】納豆菌のｓｏｆＡ遺伝子ならびにｓｏｆＢ遺伝子を取得し、該遺伝子を増幅させて、該遺伝子がコードするタンパク質を増強させることにより育種した納豆菌を開発し、該納豆菌を用いて製造した納豆は柔らかく、例えば、硬度が０．２０〜０．６５Ｎの納豆を提供することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
【請求項２】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
【請求項３】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされた塩基配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
【請求項５】
以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
【請求項６】
以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、塩基番号２０８２〜２４５９の塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、塩基番号２０８２〜２４５９の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、塩基番号２０８２〜２４５９の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、塩基番号２０８２〜２４５９の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされた塩基配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
柔らかい納豆を製造する機能に関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能を増強させることを特徴とするバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌の育種方法。
【請求項８】
柔らかい納豆を製造する機能に関与する遺伝子が請求項２又は請求項３に記載の遺伝子であることを特徴とする請求項７に記載のバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌の育種方法。
【請求項９】
柔らかい納豆を製造する機能に関与する遺伝子が請求項５又は請求項６に記載の遺伝子であることを特徴とする請求項７に記載のバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌の育種方法。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれか1項に記載の方法により育種されたことを特徴とする柔らかい納豆を製造する機能が増強されたバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌。
【請求項１１】
バシラス・サチリスＳＯＦＡＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＡＨ）株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９９６）であることを特徴とする請求項１０に記載の納豆菌。
【請求項１２】
バシラス・サチリスＳＯＦＢＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＢＨ）株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９９７）であることを特徴とする請求項１０に記載の納豆菌。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の納豆菌を用いることを特徴とする納豆の製造方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の納豆の製造方法により製造されたことを特徴とする柔らかい納豆。
【請求項１５】
請求項１３に記載の納豆の製造方法により製造され、硬度が０．２０〜０．６５Ｎであることを特徴とする請求項１４に記載の柔らかい納豆。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造された柔らかい納豆に関し、さらに詳細には、発酵の進行に伴い納豆を柔らかくする機能に関与する遺伝子、該遺伝子を用いた納豆菌の育種方法、該育種方法により育種された納豆菌、及び該納豆菌を用いて製造された柔らかい納豆に関する。
【背景技術】
【０００２】
納豆は、大豆の煮豆を原料とし、納豆菌の発酵によって生産される伝統食品である。
納豆の品質の良し悪しを規定する因子の一つとして、硬さ(柔らかさ)があり、近年では柔らかい納豆が好まれる傾向がある。
【０００３】
柔らかい納豆を製造するために、例えば、柔らかく煮上がる特性を有する大豆を選別して用いたり、大豆の蒸煮強度を強めて柔らかく煮上げた煮豆を用いたりして、柔らかい納豆を製造しようとする試みが行われているが、柔らかく煮上がる特性を有する大豆を安定して調達することが難しかったり、大豆の蒸煮強度を強めた場合は豆色が黒くなりかえって品質低下をきたすなどの問題があった。
【０００４】
このような中で、他の発酵性能は従来の納豆菌と遜色がなく、かつ、柔らかい納豆を製造する能力を有する納豆菌が取得できれば、糸引性、旨み、色調、香りなどの他の特性は遜色のない柔らかい納豆を安定して製造できることが期待できる。
このような柔らかい納豆を製造する能力を有する納豆菌については、中国のドウチから分離したバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＦＰ８４３株などが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
このような納豆菌を用いて納豆を製造すれば柔らかい納豆は製造可能であるが、一方、納豆は発酵に用いた納豆菌の特性に応じて品質が著しく変化することが知られており、例えば、上記のバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＫＦＰ８４３株を用いて製造された納豆は糸引性が悪いことが知られている。
柔らかさ以外の品質は、従来の納豆菌を用いて製造された納豆と全く変わらない納豆を製造するには、従来から使用されてきた納豆菌を柔らかい納豆を製造できる能力を有するように改良することが望ましいと考えられる。
【０００６】
しかし、従来から使用されて来た納豆菌を柔らかい納豆を製造できる能力を有するように改良する方法については全く不明であり、例えば、柔らかい納豆を製造する機能や、該機能に関与する遺伝子などについても、解明する必要があった。
【非特許文献１】日本食品科学工学会誌、５２巻、１０号、ｐ．４５４−４６１、２００５年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来の納豆菌を、柔らかい納豆を製造する能力を有する納豆菌に育種改良するために、柔らかい納豆を製造する機能に関与する遺伝子を見出し、該遺伝子を用いて従来の納豆菌を柔らかい納豆を製造する能力を有するように改良する方法及び該方法によって育種された柔らかい納豆を製造する納豆菌を提供し、該納豆菌を用いた柔らかい納豆の製造方法、及び該製造方法により製造された柔らかい納豆を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子を、通常の納豆菌中に見出した。
【０００９】
具体的には、本発明者は、納豆菌の類縁菌である枯草菌１６８株のゲノムには存在せず、納豆菌にのみ存在する遺伝子群を解析し、これらの遺伝子群の中から、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードする２種類の遺伝子を見出すことができ、該遺伝子を、それぞれ、ｓｏｆＡ遺伝子（以下、ｓｏｆＡと称する場合もある）及びｓｏｆＢ遺伝子（以下、ｓｏｆＢと称する場合もある）と命名した。
【００１０】
そして、これらの遺伝子を納豆菌中で増幅し、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質を増強させることによって、柔らかい納豆を製造する能力を有する納豆菌を開発することが可能であることを見出して、本発明を完成した。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能、発酵が進むに従い納豆を柔らかくする機能に関与するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（２）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（３）以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされた塩基配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（４）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質。
（Ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（５）以下の（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）に示されるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（Ｂ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（Ｃ）配列表の配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質。
（６）以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）又は（Ｄ）に示されるＤＮＡ。
（Ａ）配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、塩基番号２０８２〜２４５９の塩基配列からなるＤＮＡ。
（Ｂ）配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、塩基番号２０８２〜２４５９の塩基配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｃ）配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、塩基番号２０８２〜２４５９の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ｄ）配列表の配列番号３に示される塩基配列のうち、塩基番号２０８２〜２４５９の塩基配列において、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされた塩基配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００１２】
（７）柔らかい納豆を製造する機能に関与する遺伝子がコードするタンパク質の機能を増強させることを特徴とするバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌の育種方法。
（８）柔らかい納豆を製造する機能に関与する遺伝子が上記（２）又は（３）に記載の遺伝子であることを特徴とする上記（７）に記載のバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌の育種方法。
（９）柔らかい納豆を製造する機能に関与する遺伝子が上記（５）又は（６）に記載の遺伝子であることを特徴とする上記（７）に記載のバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌の育種方法。
（１０）上記（７）〜（９）のいずれか１つに記載の方法により育種されたことを特徴とする柔らかい納豆を製造する機能が増強されたバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌。
（１１）バシラス・サチリスＳＯＦＡＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＡＨ）株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９９６）であることを特徴とする上記（１０）に記載の納豆菌。
（１２）バシラス・サチリスＳＯＦＢＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＢＨ）株（ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９９７）であることを特徴とする上記（１０）に記載の納豆菌。
（１３）上記（１０）〜（１２）のいずれか１つに記載の納豆菌を用いることを特徴とする納豆の製造方法。
（１４）上記（１３）に記載の納豆の製造方法により製造されたことを特徴とする柔らかい納豆。
（１５）上記（１３）に記載の納豆の製造方法により製造され、硬度が０．２０〜０．６５Ｎであることを特徴とする上記（１４）に記載の柔らかい納豆。
【発明の効果】
【００１３】
本発明により、柔らかい納豆を製造する能力を有する納豆菌が提供され、その納豆菌を用いて納豆を生産することにより、柔らかい納豆の製造が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明で用いる納豆菌には特に制限はないが、通常納豆工業で使用されている発酵能力に優れた納豆菌や、自然界から分離取得された納豆菌、およびさらに改良を重ねた、優れた納豆菌を用いるのが望ましい。
【００１５】
納豆菌は、枯草菌バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に分類されているが、粘質物（糸引物質）などの納豆としての特徴をつくり出すことができ、納豆発酵での主体をなす細菌であって、また生育にビオチンを要求するとされるなどの特性を有していることなどから、バシラス・ナットウ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ）として分類されたり、枯草菌の変種としてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｖａｒ．  ｎａｔｔｏあるいはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ｎａｔｔｏ）などと、枯草菌と区別して分類する場合もある。
【００１６】
納豆菌としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｔｔｏ  ＩＦＯ３００９株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＩＦＯ３３３５株、同ＩＦＯ３３３６株、同ＩＦＯ３９３６株、同ＩＦＯ１３１６９株などがあるほか、各種の納豆菌が広く使用できる。
【００１７】
具体的には、市販納豆から分離したＯ−２株や該株の形質転換効率向上性変異株であるｒ２２株（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）が挙げられ、また市販の納豆種菌である高橋菌（Ｔ３株、東京農業大学菌株保存室）や宮城野菌（宮城野納豆製作所）など各種の納豆菌が適宜使用可能である。
【００１８】
本発明のタンパク質としては、柔らかい納豆を製造する機能に関与する遺伝子がコードするタンパク質である。具体的には、配列表の配列番号２（図３）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質があげられ、さらに配列表の配列番号２（図３）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質に関する。
【００１９】
また、配列表の配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質があげられ、さらに配列表の配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質に関する。
【００２０】
本発明のタンパク質の取得・調製方法は特に限定されず、天然由来のタンパク質でも、化学合成したタンパク質でも、遺伝子組換え技術により作製した組み換えタンパク質の何れでもよい。天然由来のタンパク質を取得する場合には、かかるタンパク質を発現している細胞からタンパク質の単離・精製方法を適宜組み合わせて本発明のタンパク質を取得することができる。
【００２１】
化学合成により本発明のタンパク質を調製する場合には、例えば、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、ｔＢｏｃ法(t−ブチルオキシカルボニル法)等の化学合成法に従って本発明のタンパク質を合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して本発明のタンパク質を合成することもできる。
【００２２】
また、遺伝子組換え技術により本発明のタンパク質を調製する場合には、該タンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡを好適な発現系に導入することにより本発明のタンパク質を調製することができる。
【００２３】
これらの中でも、比較的容易な操作でかつ大量に調製することが可能な遺伝子組換え技術による調製が好ましい。なお、遺伝子組換え技術によって本発明のタンパク質を調製する場合に、かかるタンパク質を細胞培養物から回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出を行った後、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法が用いられ、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーが用いられる。
【００２４】
特に、アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、これらのタンパク質の精製物を得ることができる。
【００２５】
さらに、配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなるタンパク質、又は、配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を例示した配列表の配列番号１（図１及び図２）又は配列番号３（図４及び図５）に示される塩基配列の情報に基づいて当業者であれば適宜調製又は取得することができる。
【００２６】
例えば、配列表の配列番号１（図１及び図２）又は配列番号３（図４及び図５）に示される塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、あるいは該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによって、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に属する納豆菌より、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。このホモログＤＮＡの全長ＤＮＡをクローニング後、発現ベクターに組み込み適当な宿主で発現させることにより、該ホモログＤＮＡによりコードされるタンパク質を製造することができる。
【００２７】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して、常法に従って行うことができる。
【００２８】
さらに、上記本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させて融合タンパク質とすることもできる。マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、ＨＲＰ等の酵素、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰ等の蛍光物質などを具体的に挙げることができ、またペプチドタグとしては、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ等のエピトープタグや、ＧＳＴ、マルトース結合タンパク質、ビオチン化ペプチド、オリゴヒスチジン等の親和性タグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した本発明のタンパク質の精製や、本発明のタンパク質の検出や、本発明のタンパク質に対する抗体の定量や、その他当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００２９】
また、本発明のＤＮＡとしては、配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位とされたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号１（図１及び図２）又は配列番号３（図４及び図５）に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列又は塩基番号２０８２〜２４５９に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡ、配列表の配列番号１（図１及び図２）又は配列番号３（図４及び図５）に示される塩基配列のうち、塩基番号１９３７〜２３６２の塩基配列又は塩基番号２０８２〜２４５９の塩基配列の一部から作製したプライマー又はプローブとしての機能を有する塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡなどがあげられる。
【００３０】
このように、本発明の柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡは、コードされるタンパク質の機能が損なわれない限り、１又は複数の位置で１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加された、あるいは逆位とされたタンパク質をコードするものであってもよい。
【００３１】
このような柔らかい納豆を製造する機能を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸を欠失、置換、挿入又は付加し、あるいは逆位として塩基配列を改変することによっても取得することができる。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。さらに、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることが知られているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、納豆菌全般の株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００３２】
上記「１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列を意味する。
【００３３】
また、上記「１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個の任意の数の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列を意味する。なお、本発明において、「置換、欠失、挿入、付加又は逆位」とは、アミノ酸及び塩基のいずれの場合にあっても、「置換、欠失、挿入、付加、逆位から選ばれる少なくともひとつ」を意味する。
【００３４】
例えば、これら１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加又は逆位された塩基配列からなるＤＮＡ（変異ＤＮＡ）は、上記のように、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列表の配列番号１又は配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し、変異原となる薬剤を接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらＤＮＡに変異を導入することにより、変異ＤＮＡを取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ: Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， ２ｎｄ  Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．，１９８９）やカレントプロトコールズ・イン・モレキュラーバイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ ＆  Ｓｏｎｓ （１９８７−１９９７））等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加又は逆位されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
【００３５】
上記「配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列」とは、配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列との相同性が８５％以上であれば特に制限されるものではなく、例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上であることを意味する。
【００３６】
上記「ストリジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、５０〜７０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。
【００３７】
また、上記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸をプローブとして使用し、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００３８】
ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．，１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。例えば、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の相同性を有するＤＮＡが挙げることができ、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の相同性を有するＤＮＡを好適に例示することができる。
【００３９】
本発明のＤＮＡの取得方法や調製方法は特に限定されるものでなく、本明細書中に開示した配列表の配列番号１（図１及び図２）又は配列番号３（図４及び図５）に示される塩基配列情報又は配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いて当該ＤＮＡが存在することが予測されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより目的のＤＮＡを単離したり、常法に従って化学合成により調製することができる。
【００４０】
例えば、納豆菌から、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、次いで、このライブラリーから、本発明の遺伝子ＤＮＡに特有の適当なプローブを用いて所望クローンを選抜することにより、本発明の遺伝子ＤＮＡを取得することができる。また、これらの納豆菌からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法は、例えば、モレキュラークローニング第２版に記載の方法等、当業者により常用される方法を挙げることができる。
【００４１】
本発明のＤＮＡは、その塩基配列が明らかとなったので、例えば、鋳型として納豆菌ｒ２２株のゲノムＤＮＡを用い、該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプライマーに用いるポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ反応）によって、または該塩基配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるハイブリダイゼーションによっても得ることができる。なお、染色体ＤＮＡは、常法により取得できる。
【００４２】
オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、市販されている種々のＤＮＡ合成機を用いて常法に従って合成できる。また、ＰＣＲ反応は、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）製のサーマルサイクラーＧｅｎｅ  Ａｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００を用い、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）やＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）などを使用して常法に従って行なうことができる。
【００４３】
本発明のＤＮＡは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換、挿入、付加又は逆位とされるように塩基配列を改変することによって取得され得る。また、上記のような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異処理によっても取得することができる。
【００４４】
また、一般的にタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なることがしられているので、実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡは、納豆菌の株、変異体、変種から得ることが可能である。
【００４５】
具体的には、納豆菌、又は変異処理した納豆菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１（図１及び図２）に記載の塩基配列のうち塩基番号１９３７〜２３６２、もしくは配列表の配列番号３（図４及び図５）に記載の塩基配列のうち塩基番号２０８２〜２４５９からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。
【００４６】
また、上記配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加若しくは逆位されたアミノ酸配列からなり、かつ、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２（図３）又は配列番号４（図６）に示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ柔らかい納豆を製造する機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどからなる本発明の変異遺伝子又は相同遺伝子としては、配列表の配列番号１（図１及び図２）又は配列番号３（図４及び図５）に示される塩基配列又はその一部を有するＤＮＡ断片を利用し、他の納豆菌等から、該ＤＮＡのホモログを適当な条件下でスクリーニングすることにより単離することができる。その他、前述の変異ＤＮＡの作製方法により調製することもできる。
【００４７】
例えば、既存の納豆菌、又は変異処理した納豆菌、これらの自然変異株若しくは変種から、例えば配列表の配列番号１に示される塩基配列、又はその一部から作製したプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっても、該タンパク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡが得ることができる。
【００４８】
育種の方法のひとつとしては、柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子を遺伝子組換えにより増幅し、これらタンパク質の発現を増強させる方法がある。
【００４９】
また、このような遺伝子組換え法を納豆菌で利用するには、納豆菌への遺伝子導入のための形質転換系が必要であるが、本発明では、形質転換能が向上した納豆菌を利用した実用的なレベルの形質転換系を利用して該遺伝子破壊用ＤＮＡを納豆菌に効率良く導入し、目的の遺伝子欠損株を育種することが出来たのである。
【００５０】
また、納豆菌の遺伝子組換え系の一つとしては、ファージベクターを利用した形質導入法（例えば、アプライド・アンド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、６３巻、ｐ．４０８７〜４０８９、１９９７年参照）が既に開発されており、本発明ではこの方法も利用される。
【００５１】
また、例えばｐＨＹ３００ＰＬＫなどの多コピー数プラスミドベクターに対して当該遺伝子を連結し、既存のコンピテンス形質転換法（例えば、フェムス・マイクロバイオロジカル・レター（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．）、２３６巻、ｐ.１３〜２０、２００４年参照）を利用して納豆菌に導入して当該遺伝子を増幅させる方法も有効である。
【００５２】
さらに、本発明においては、当該遺伝子の上流域にあるプロモーター領域を、遺伝子組換えや自然変異などによって発現を向上させるように改良することも有効である。
なお、上記のような遺伝子組換え技術以外によっても、すなわち、既に目的遺伝子の発現が増強され、該遺伝子がコードするタンパク質の発現が増強している納豆菌を自然界から選抜するいわゆるスクリーニング法や、薬剤変異法などによってこれらの遺伝子の発現を増強させるなどの、従来から実施されているような他の方法によっても育種が可能である。
【００５３】
目的の柔らかい納豆を製造する能力を有する納豆菌の取得は、以下のとおりにして実施することが可能である。すなわち、分離納豆菌や育種した納豆菌を含むサンプルを滅菌水等に懸濁し、適当な濃度に希釈した後、標準寒天培地（栄研化学社製）にプレーティングし、３７℃で一夜培養し、生じたコロニーを分離する。
さらに、選択したコロニーをＳＧ培地（例えば、特開平１０−２１５８６１号公報参照）に塗布後、３７℃一夜培養し、粘質物を多量につくっており、糸引き性が強いと思われる納豆菌を選択する。
得られたコロニーより、常法に従い胞子液を作成して（例えば、特開平１０−２１５８６１号公報参照）、納豆製造用の種菌とすることができる。
【００５４】
目的の納豆菌の選抜は、以下のようにして実施することが出来る。すなわち、育種、選択した納豆菌を種菌に用いて納豆を製造し、まず糸引き性の弱い納豆しか製造できない納豆菌を除外する。次に、既存の納豆菌バシラス・サチリス  ｒ２２株（以下、ｒ２２株と称する場合もある。）（例えば、特開２０００−２８７６７６号公報参照）を用いて生産した納豆を対照とし、それよりも柔らかな納豆が製造できる納豆菌を選択することができる。さらに、選択した納豆菌を用いて製造した納豆の品質の評価を行い、硬さ以外の品質指標に関しても優れた納豆菌を選抜することができる。
【００５５】
納豆の製造は、常法通り行えばよい。例えば、浸漬した大豆を水切りし、０．１８ＭＰａで１８分間蒸煮して得た蒸煮大豆１ｇあたり１０００から４０００個の胞子を植菌し、４０ｇずつＰＳＰトレーにいれ、薄い被膜で表面を覆い、蓋をした後に、バッチ式納豆発酵室へ入れ、室温３７〜４２℃、高湿度下で発酵を行う。発酵終了後、熟成させた後、出来上がった納豆の品質を評価する。
【００５６】
なお、納豆の硬度は常法（例えば、特開２００４−２４１９７号公報参照）に従って測定して確認することができる。
例えば、硬度計としては、直径１．５ｍｍのプランジャーを装着したデジタルホースゲージ（形式：ＦＧＣ−０．２、日本電産シンポ社製）を、電動式縦型簡易試験スタンド（形式：ＦＧＳ−５０Ｖ−Ｌ、日本電産シンポ社製）に、プランジャー部を下方にしてセットしたものなどが用いられる。
【００５７】
そして、まず測定すべき納豆を１５〜２５℃に温めた後、豆粒を潰さないように箸で良くほぐし、任意の一粒を上記の電動式縦型簡易試験スタンドの台上におき、その後、該デジタルホースゲージを６０ｍｍ／分の速度で降下させ、プランジャーで豆粒の中心を突き刺すように押潰す。プランジャーが豆粒底面から１±０．２ｍｍのところまで降下したところで、デジタルホースゲージの降下を停止し、この時の表示値（単位：ニュートン（Ｎ）、ピーク値）が記録される。
【００５８】
以下、同様にして合計１４粒について表示値を計測した後、最上位２つ、及び、最下位２つの表示値を除いた１０粒分の表示値の平均をとって、納豆の硬度（Ｎ）を求めることができる。
このようにして測定される納豆の好ましい硬度（Ｎ）は、０．２０〜０．６５Ｎ程度、より好ましいのは０．４０〜０．６０Ｎ程度のものが望まれる。
硬度が０．２０Ｎ未満となると納豆は柔らかくなり過ぎてしまい、あまり好まれなくなるし、０．６５Ｎよりも大きいと硬過ぎるので好まれない。
【００５９】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであり、本発明によれば、例えば実施例に記載したように、ｓｏｆＡ遺伝子を遺伝子組換え技術によって納豆菌中で増幅し、該遺伝子がコードする柔らかい納豆を製造する機能を有するタンパク質の発現を増強して、柔らかい納豆を製造する能力を有する新規納豆菌の育種に成功したものであって、その一つをバシラス・サチルス  ＳＯＦＡＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＡＨ）株と命名した。
【００６０】
バシラス・サチルス  ＳＯＦＡＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＡＨ）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２００８年（平成２０年）８月２０日付けで受領されており、その受領番号はＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９９６である。
【００６１】
また、例えば、ｓｏｆＢ遺伝子を遺伝子組換え技術によって納豆菌中で増幅し、該遺伝子がコードする柔らかい納豆を製造する機能を有するタンパク質の発現を増強して新規納豆菌の育種に成功したものであって、バシラス・サチルス  ＳＯＦＢＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＢＨ）株と命名した。
【００６２】
バシラス・サチルス  ＳＯＦＢＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＢＨ）株は、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２００８年（平成２０年）８月２０日付けで受領されており、その受領番号はＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９９７である。
【００６３】
このようにして選抜された柔らかい納豆を製造できる優れた納豆菌の納豆生産への利用は、従来から実施されている方法を採用すれば良く、特に制限がない。
例えば、納豆は丸大豆を原料として製造されたいわゆる丸大豆納豆が一般的であるが、一部には予め挽割った大豆を原料とする挽割り納豆もある。
【００６４】
丸大豆納豆の製造方法は、原料である丸大豆を冷水に十数時間浸漬した後、蒸煮釜で加圧蒸気を用いて加圧蒸煮（０．１５〜０．２０ＭＰａ）して得られた蒸煮大豆に対して、高温状態（７０〜１００℃）で納豆菌を接種し混合した後、所定の容器に充填してから発酵室に搬入し、室温３７〜４２℃で所定時間（１５〜２０時間程度）発酵させた後、５℃前後で冷蔵熟成（１２〜７２時間程度）して完成させるのが一般的である。
【００６５】
また、挽割り納豆の場合は、予め挽割った大豆を水に浸漬する以外は、通常の丸大豆納豆の場合と同様の方法で製造される。
【００６６】
このような従来の納豆の製造方法において、本発明では発酵工程で用いる納豆菌を、前記方法によって選抜した優れた納豆菌に代えて使用することによって製造することができる。このようにして、従来の納豆と比べ柔らかい納豆が製造可能となる。
【実施例】
【００６７】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。
【００６８】
（実施例１）
（１）使用菌株等
納豆菌ｒ２２株は、市販納豆から分離された親株Ｏ−２株の形質転換能を高めた変異株であり、親株Ｏ−２株をニトロソグアニジン（ＮＴＧ）を用いて化学変異処理することにより取得された株である（例えば、特開２０００−２２４９８２号公報参照）。
【００６９】
培地は、納豆試験法（例えば、「納豆試験法」、光琳出版、ｐ．８５−９７、１９９０年参照）に記載のＬＢ培地（１％  ポリペプトン、０.５％  酵母エキス、１％  塩化ナトリウム）、胞子形成培地（０．０６８％  ＫＨ２ＰＯ４、０．０５３５％  ＮＨ４Ｃｌ、０．０１０６％  Ｎａ２ＳＯ４、０．００００６％  ＦｅＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．００１２６％  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．９３４％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２３８％  グルタミン酸ナトリウム一水和物、０．０２５％  ＣａＣｌ２、０．１５２％  酵母エキス、１ｍｇ／ｍｌ  ビオチン）、Ｓｐｉｚｉｚｅｎらの形質転換培地（０．５％  グルコース、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５％  酵母エキス、０．６％  ＫＨ２ＰＯ４、１．４％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．１％  クエン酸ナトリウム二水和物、０．２％  硫安、０．１μｇ／ｍｌ  ビオチン）を用いた。ただし、必要な場合は、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）を添加した。
【００７０】
スペクチノマイシン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＮｏ．Ｘ０２５８８）はそれぞれ、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ間にクローニングしたものを用いた。テトラサイクリン耐性遺伝子は、大腸菌−枯草菌シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造社製）からＰＣＲにより増幅して用いた。
【００７１】
（２）候補遺伝子の検索
柔らかい納豆を製造する機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子は、枯草菌には存在せずに、納豆菌固有に存在する遺伝子群の中にあるとの仮定のもとに、納豆菌ｒ２２株の全ゲノム配列と、ＧｅｎＢａｎｋに登録されているＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｔｒ．１６８株のゲノム配列（登録番号ＮＣ０００９６４）とを比較し、その結果合計５７２個の納豆菌固有の遺伝子を見出した。
【００７２】
これらの納豆菌固有の遺伝子群の中から、ｓｏｆＡ遺伝子（以下、単にｓｏｆＡと称する場合もある）及びｓｏｆＢ遺伝子（以下、単にｓｏｆＢと称する場合もある）と命名した遺伝子を候補遺伝子とし、以下の実験に供した。
【００７３】
なお、ｓｏｆＡは配列表の配列番号１（図１及び図２）に示す塩基配列を有し、この内塩基番号１９３７〜２３６２にかけて配列表の配列番号２（図３）に示すアミノ酸配列のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの存在が確認された。
【００７４】
ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦなどの塩基配列及びアミノ酸配列データベースについてホモロジー検索した結果、ｓｏｆＡはＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ． ＷＣＨ７０のＭａｒＲ ｆａｍｉｌｙに属する転写制御因子であるＴｒｍＢ遺伝子とアミノ酸配列で７８％の相同性を有していることが分かった。
【００７５】
ＭａｒＲ  ｆａｍｉｌｙに属する転写制御因子は、薬剤耐性や酸化ストレス応答に関与するとされているが（例えば、「トレンズ・イン・マイクロバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）」、７巻、ｐ．４１０−４１３、１９９９年参照）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ． ＷＣＨ７０のＴｒｍＢ遺伝子が柔らかい納豆を製造する機能に関与していることについては、全く知られていない。
【００７６】
ｓｏｆＡも納豆菌の遺伝子の転写を制御する機能を有していることが推定される、納豆菌の柔らかい納豆を製造する機構については全く知られていないことから、ｓｏｆＡがどのような遺伝子の転写を制御しているのかに関しては全く不明である。
【００７７】
また、ｓｏｆＢは配列表の配列番号３（図４及び図５）に示す塩基配列を有し、この内塩基番号２０８２〜２４５９にかけて配列表の配列番号４（図６）に示すアミノ酸配列のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの存在が確認された。
【００７８】
ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦなどの塩基配列、アミノ酸配列データベースについてホモロジー検索した結果、ｓｏｆＢと塩基配列で１５％以上、アミノ酸配列で１５％以上の相同性を有する遺伝子は検索されず、ｓｏｆＢは納豆菌固有の遺伝子であることが確認された。なお、ｓｏｆＢが納豆を柔らかくする機構においてどのような機能を果たしているかについても、全く不明である。
【００７９】
（３）ｓｏｆＡ及びｓｏｆＢの欠損株の調製
以下の方法により、ｓｏｆＡ及びｓｏｆＢのそれぞれを欠損させるための遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を作製し、納豆菌に導入してコンピテンス法により相同組換えを起こさせて、ｓｏｆＡ及びｓｏｆＢそれぞれの欠損株を作製した。
【００８０】
ｉ）遺伝子欠損用ＤＮＡ断片の作製
（Ａ）ｓｏｆＡ欠損用ＤＮＡ断片の調製
以下に記載のごとく、染色体上のｓｏｆＡをスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換してｓｏｆＡを欠損させるために、ｓｏｆＡ欠損用ＤＮＡ断片を、図２７に示すごとく、ＰＣＲを組み合わせた以下の方法により構築した。
【００８１】
まず、スペクチノマイシン耐性遺伝子を増幅するために、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列(登録番号Ｘ０２５８８)を基に、プライマー１（５´−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴＧＴＡＧ−３´、配列表の配列番号５及び図７参照）及びプライマー２（５´−ＣＴＣＧＡＧＴＡＡＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡＧＣＧＴＴＣＴＣ−３´、配列表の配列番号６及び図８参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製し、これらプライマーを用いて、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ間にスペクチノマイシン耐性遺伝子をクローニングしたものを鋳型にし、ＰＣＲにより増幅した。
【００８２】
また、ｓｏｆＡの上流を増幅するためにプライマー３（５´−ＴＴＧＣＴＣＡＴＴＣＧＴＣＧＣＡＴＴＡＴＣ−３´、配列表の配列番号７及び図９参照）及びプライマー４（５´−ＣＴＡＣＡＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＡＴＡＡＴＣＣＧＴＡＴＴＧＣＣ−３´、配列表の配列番号８及び図１０参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
さらに、ｓｏｆＡの下流を増幅するためにプライマー５（５´−ＧＡＡＡＴＴＡＧＡＧＡＡＣＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＧＴＡＧＧＧＡＡＧＣＴＡＡＡＣＡＡＴＧＧＣ−３´、配列表の配列番号９及び図１１参照）及びプライマー６（５´−ＣＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＡＧＧ−３´、配列表の配列番号１０及び図１２参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
【００８３】
これらをプライマーとして、またｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型に用いて、常法どおりＰＣＲを行い、スペクチノマイシン耐性遺伝子の増幅断片の５´末端３７塩基（下線部）と相補する塩基配列を３´側に有するｓｏｆＡの上流部分及びスペクチノマイシン耐性遺伝子の増幅断片の３´末端３８塩基（下線部）と相補する塩基配列を５´側に有するｓｏｆＡの下流部分の断片を増幅した。
【００８４】
次に、プライマー３及びプライマー６の２種のプライマーを用いて、ｓｏｆＡの上流部分、下流部分及びスペクチノマイシン耐性遺伝子の増幅断片の混合物を鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動して生じたバンドのうち、約５ｋｂのバンドをアガロースから回収した。
【００８５】
ＰＣＲ産物の内部配列を基に、プライマー７（５´−ＣＧＡＣＣＴＣＣＡＴＧＴＡＧＡＣＧＧＴＴＧ−３´、配列表の配列番号１１及び図１３参照）及びプライマー８（５´−ＧＧＣＡＡＧＣＡＧＣＴＣＧＡＴＡＴＣＴＣＣ−３´、配列表の配列番号１２及び図１４参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製し、これらのプライマーを用いて、上記の回収したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物をｓｏｆＡ欠損用ＤＮＡ断片として、形質転換に用いた。
【００８６】
（Ｂ）ｓｏｆＢ欠損用ＤＮＡ断片の調製
以下に記載のごとく、染色体上のｓｏｆＡをスペクチノマイシン耐性遺伝子と置換してｓｏｆＢを欠損させるために、ｓｏｆＢ欠損用ＤＮＡ断片を、図２８に示すごとく、ＰＣＲを組み合わせた以下の方法により構築した。
【００８７】
まず、テトラサイクリン耐性遺伝子を増幅するために、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている塩基配列（登録番号Ｄ００９４６）を基に、プライマー９（５´−ＴＡＡＡＧＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴＧＴＡＧＣＴＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＡＡ−３´、配列表の配列番号１３及び図１５参照）及びプライマー１０（５´−ＡＧＴＡＡＴＡＡＡＧＣＧＴＴＣＴＣＴＡＡＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧ−３´、配列表の配列番号１４及び図１６参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製し、これらのプライマーを用いて、大腸菌−枯草菌シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫを鋳型にし、ＰＣＲにより増幅した。
【００８８】
また、ｓｏｆＢの上流を増幅するためにプライマー１１（５´−ＴＣＣＡＡＡＡＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＡＴＡＣ−３´、配列表の配列番号１５及び図１７参照）及びプライマー１２（５´−ＴＡＣＡＧＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＡＣＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴＡＣＧＴＡＴＴＧ−３´、配列表の配列番号１６及び図１８参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
さらに、ｓｏｆＢの下流を増幅するためにプライマー１３（５´−ＧＡＡＡＴＴＡＧＡＧＡＡＣＧＣＴＴＴＡＴＴＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＡＣＴＣＧＡＧＴＣＣＴＴＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＴＣＣＧＴＣ−３´、配列表の配列番号１７及び図１９参照）及びプライマー１４（５´−ＴＧＧＧＡＴＧＡＴＣＴＡＡＣＣＧＡＡＧＧＣ−３´、配列表の配列番号１８及び図２０参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した。
【００８９】
これらをプライマーとして、またｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型に用いて、常法どおりＰＣＲを行い、テトラサイクリン耐性遺伝子の増幅断片の５´末端２３塩基（下線部）と相補する塩基配列を３´側に有するｓｏｆＢの上流部分及びテトラサイクリン耐性遺伝子の増幅断片の３´末端２４塩基（下線部）と相補する塩基配列を５´側に有するｓｏｆＢの下流部分の断片を増幅した。
【００９０】
次に、プライマー１１及びプライマー１４の２種のプライマーを用いて、ｓｏｆＢの上流部分、下流部分及びテトラサイクリン耐性遺伝子の増幅断片の混合物を鋳型としてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動して生じたバンドのうち、約５．５ｋｂのバンドをアガロースから回収した。
【００９１】
ＰＣＲ産物の内部配列を基に、プライマー１５（５´−ＴＣＣＣＣＡＴＴＡＡＡＡＴＣＡＣＣＴＴＧＣ−３´、配列表の配列番号１９及び図２１参照）及びプライマー１６（５´−ＡＧＡＣＧＣＣＴＧＣＧＧＡＣＡＣＴＡＡＴＣ−３´、配列表の配列番号２０及び図２２参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製し、これらプライマーを用いて、上記の回収したＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物をｓｏｆＡ欠損用ＤＮＡ断片として、形質転換に用いた。
【００９２】
ｉｉ）形質転換
ＰＣＲにより得たＤＮＡ断片を用いて、Ｓｐｉｚｉｚｅｎらの形質転換培地を用いたコンピテンス法によりｒ２２株を形質転換した。形質転換株の選択は、ｓｏｆＡを欠損させた株を取得する場合はスペクチノマイシン耐性を指標とし、また、ｓｏｆＢを欠損させた株を取得する場合はテトラサイクリン耐性を指標に行った。
【００９３】
多数得られたスペクチノマイシン耐性の形質転換株、及びテトラサイクリン耐性の形質転換株のうち、それぞれ８株ずつを選択した。ＬＢ培地で３７℃、１２０ｒｐｍで終夜培養した後にゲノムＤＮＡを回収し、プライマー７及びプライマー８、またはプライマー１５及びプライマー１６を用いてＰＣＲにより増幅し、適当な制限酵素で処理した後の切断パターンから、ｓｏｆＡ遺伝子及びｓｏｆＢ遺伝子が欠損していることを確認した。
そのうちのそれぞれ１株ずつを選択し、ΔＳＯＦＡ株及びΔＳＯＦＢ株と命名した。
【００９４】
（３）納豆試作・柔らかさの評価
上記のごとくにして取得したΔＳＯＦＡ株とΔＳＯＦＢ株について、それぞれ常法により胞子形成培地を用いて胞子液を作製し、常法に従い納豆を製造した後、納豆の品質及び納豆の硬さについて評価した。納豆の評価に際しては、同じ蒸煮条件、発酵条件でｒ２２株を用いて製造した納豆を対照とした。
ΔＳＯＦＡ株およびΔＳＯＦＢ株を用いて製造した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検査の結果、外観、糸引きの強さ、ともに、ｒ２２株を用いて製造した対照と同等のものであった。
【００９５】
次に、納豆の硬さを硬度計で測定した。
すなわち、硬度計は、直径１．５ｍｍのプランジャーを装着したデジタルホースゲージ（形式：ＦＧＣ−０．２、日本電産シンポ社製）を、電動式縦型簡易試験スタンド（形式：ＦＧＳ−５０Ｖ−Ｌ、日本電産シンポ社製）に、プランジャー部を下方にしてセットしたものを用いた。
そして、まず測定すべき納豆を１５〜２５℃に温めた後、豆粒を潰さないように箸で良くほぐし、任意の一粒を上記の電動式縦型簡易試験スタンドの台上においた。
その後、該デジタルホースゲージを６０ｍｍ／分の速度で降下させ、プランジャーで豆粒の中心を突き刺すように押潰した。プランジャーが豆粒底面から１±０．２ｍｍのところまで降下したところで、デジタルホースゲージの降下を停止し、この時の表示値（単位：ニュートン（Ｎ）、ピーク値）を記録した。
【００９６】
以下、同様にして合計１４粒について表示値を計測した後、最上位２つ、及び、最下位２つの表示値を除いた１０粒分の表示値の平均をとって、納豆の硬度（Ｎ）を求めた。表１に硬度（Ｎ）を示す。
【００９７】
【表１】
2010057422.tif 000002
【００９８】
ΔＳＯＦＡ株やΔＳＯＦＢ株で納豆を製造すると、ｒ２２株で製造した場合に比べて、硬い納豆が製造できた。
ΔＳＯＦＡ株やΔＳＯＦＢ株は、それぞれｓｏｆＡやｓｏｆＢが欠損した納豆菌であり、従って、ｓｏｆＡ及びｓｏｆＢは、それぞれ柔らかい納豆を製造する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子であると推定された。
【００９９】
（実施例２）
（１）使用菌株等
大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ、枯草菌ベクターｐＨＹ３００ＰＬＫは宝酒造社製を用いた。
【０１００】
（２）ｓｏｆＡ増強株の調製
ｓｏｆＡ増強株は、ｓｏｆＡ全長の約４３０塩基及びその上流の約１２０塩基を保有するベクターを構築し、該ベクターを以下の方法で納豆菌に導入して作製した。
【０１０１】
ｉ）ベクター構築
プライマー１７（５´−ＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＧＡＡＡＧＣＡＴＣＣＡＡＴＧＧＧ−３´、配列表の配列番号２１及び図２３参照）及びプライマー１８（５´−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＴＧＣＣＡＴＴＧＴＴＴＡＧＣ−３´、配列表の配列番号２２及び図２４参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した後、これらをプライマーとして用い、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型に用いて、常法どおりＰＣＲを行い、ｓｏｆＡのオープンリーディングフレーム全長（４２６塩基）及びその上流域(１２４塩基)を増幅すると共に、下線部で示した位置に制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩの認識サイトをそれぞれ導入した。
この増幅したＤＮＡをクローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングし、ｐＳＯＦＡ１を得た。ｐＳＯＦＡ１を制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断後、アガロース電気泳動して生じた２本のバンドのうち、短いほうのバンド（約５００塩基）をアガロースから回収し、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで切断した枯草菌の多コピー数ベクターであるｐＨＹ３００ＰＬＫに挿入した。得られたプラスミドをｐＳＯＦＡ２と命名し、以下の実験に供した。
【０１０２】
ｉｉ）形質転換
大腸菌ＤＨ５αを宿主として用いて調製したプラスミドｐＳＯＦＡ２を用いて、納豆菌ｒ２２株を、常法どおりプロトプラスト法により形質転換した。
形質転換株の選択は、テトラサイクリン耐性を指標に行った。複数得られた形質転換株からプラスミドを回収してｐＳＯＦＡ２が保持されていることを確認し、これらのうちの１株をＳＯＦＡＨ株とした。
【０１０３】
ＳＯＦＡＨ株をテトラサイクリンを含むＬＢ培地で３０℃、１５０ｒｐｍでＯＤ６６０が０．４となるまで培養した後に、常法どおりプラスミドを回収し、制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、２６０及び２８０ｎｍの各波長の吸光度から核酸濃度、純度を測定し、ｐＳＯＦＡ２が多コピー存在することを確認した。
【０１０４】
ＳＯＦＡＨ株及びｒ２２株をテトラサイクリンを含む、又は含まないＬＢ培地で３７℃、１５０ｒｐｍでＯＤ６６０が０．４となるまで培養した後に、常法どおりＲＮＡを抽出した後、ｓｏｆＡの内部配列をターゲットとするＲＴ−ＰＣＲを行い、電気泳動時のバンド強度を比較することにより、ＳＯＦＡＨ株がｒ２２株に比べてｓｏｆＡを高発現していることを確認した。
【０１０５】
ここに得られたＳＯＦＡＨ株を、バシラス・サチリスＳＯＦＡＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＡＨ）株と命名し、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９９６として、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託した。
なお、プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを用いて、同様に、ｒ２２株の形質転換を行い、得られた１株をｐＨＹ３００ＰＬＫ／ｒ２２株とした。
【０１０６】
（３）納豆試作・柔らかさの評価
上記のＳＯＦＡＨ株及びｐＨＹ３００ＰＬＫ／ｒ２２株について、それぞれ胞子形成培地を用いて胞子液を作製し、常法に従い納豆を製造した。ＳＯＦＡＨ株を用いて製造した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検査の結果、外観、糸引きの強さ、ともに、ｐＨＹ３００ＰＬＫ／ｒ２２株を用いて作製した対照と同等のものであった
【０１０７】
ＳＯＦＡＨ株が納豆発酵中にプラスミドｐＳＯＦＡ２を保持していることは、以下の方法で確認した。すなわち、発酵中の納豆に０．８５％滅菌食塩水を加えて懸濁した液を適当に希釈し、ＬＢ寒天プレート及びテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート上に塗布して、３７℃で終夜培養した後にコロニー数が両プレートでほぼ同数であることを確認した。
【０１０８】
次に、納豆の硬さを実施例１と同様にして測定した。納豆の評価に際しては、同じ条件で蒸煮した発酵前の煮豆、及び同じ蒸煮条件、発酵条件でｐＨＹ３００ＰＬＫ／ｒ２２株を用いて製造した納豆を対照とした。表２に硬度を示す。
【０１０９】
【表２】
2010057422.tif 000003
【０１１０】
ＳＯＦＡＨ株で煮豆を発酵すると、ｒ２２株で製造した場合に比べ、柔らかい納豆が製造できた。このことから、ｓｏｆＡ遺伝子のコピー数を増大させて、ｓｏｆＡがコードするタンパク質の発現を増強させることにより、柔らかい納豆を製造する能力を有する納豆菌を育種できることが確認された。
【０１１１】
（実施例３）
（１）ｓｏｆＢ増強株の調製
ｓｏｆＢ増強株は、ｓｏｆＢ全長の約３８０塩基、その上流の約５７０塩基、及びその下流の約１４０塩基を保有するベクターを構築し、該ベクターを以下の方法で納豆菌に導入して作製した。
【０１１２】
ｉ）ベクター構築
プライマー１９（５´−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＧＧＧＡＴＡＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡＡＣ−３´、配列表の配列番号２３及び図２５参照）及びプライマー２０（５´−ＴＣＣＣＣＣＧＧＧＡＣＡＣＴＣＣＣＡＡＡＡＡＣＡＴＡＡＡＴＡＴＴＡ−３´、配列表の配列番号２４及び図２６参照）の２種のオリゴＤＮＡを調製した後、これらをプライマーとして用い、ｒ２２株の全ＤＮＡを鋳型に用いて、常法どおりＰＣＲを行い、ｓｏｆＢのオープンリーディングフレーム全長（３８４塩基）、その上流域(５６９塩基)、及びその下流域（１４４塩基）を増幅すると共に、下線部で示した位置に制限酵素ＸｂａＩ及びＳｍａＩの認識サイトをそれぞれ導入した。
【０１１３】
この増幅したＤＮＡをクローニングベクターｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングし、ｐＳＯＦＢ１を得た。ｐＳＯＦＢ１を制限酵素ＸｂａＩ及びＳｍａＩで切断後、アガロース電気泳動して生じた２本のバンドのうち、短いほうのバンド（約１１００塩基）をアガロースから回収し、ＸｂａＩ及びＳｍａＩで切断した枯草菌の多コピー数ベクターであるｐＨＹ３００ＰＬＫに挿入した。得られたプラスミドをｐＳＯＦＢ２と命名し、以下の実験に供した。
【０１１４】
ｉｉ）形質転換
大腸菌ＤＨ５αを宿主として用いて調製したプラスミドｐＳＯＦＢ２を、納豆菌ｒ２２株に、常法どおりプロトプラスト法により形質転換した。形質転換株の選択は、テトラサイクリン耐性を指標に行った。複数得られた形質転換株からプラスミドを回収してｐＳＯＦＢ２が保持されていることを確認し、これらのうちの１株をＳＯＦＢＨ株とした。
【０１１５】
ＳＯＦＢＨ株をテトラサイクリンを含むＬＢ培地で３０℃、１５０ｓｐｍでＯＤ６６０が０．４となるまで培養した後に、常法どおりプラスミドを回収し、制限酵素ＳｍａＩで切断後、２６０及び２８０ｎｍの各波長の吸光度から核酸濃度、純度を測定し、ｐＳＯＦＢ２が多コピー存在することを確認した。
【０１１６】
ＳＯＦＢＨ株及びｒ２２株をテトラサイクリンを含む、又は含まないＬＢ培地で３７℃、１５０ｓｐｍでＯＤ６６０が０．４となるまで培養した後に、常法どおりＲＮＡを抽出した後、ｓｏｆＢの内部配列をターゲットとするＲＴ−ＰＣＲを行い、電気泳動時のバンド強度を比較することにより、ＳＯＦＢＨ株がｒ２２株に比べてｓｏｆＢを高発現していることを確認した。
【０１１７】
ここに得られたＳＯＦＢＨ株を、バシラス・サチリスＳＯＦＢＨ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＯＦＢＨ）株と命名し、ＦＥＲＭ  ＡＢＰ−１０９９７として、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託した。
【０１１８】
（３）納豆試作・柔らかさの評価
上記のＳＯＦＢＨ株及びｐＨＹ３００ＰＬＫ／ｒ２２株について、それぞれ胞子形成培地を用いて胞子液を作製し、常法に従い納豆を製造した。ＳＯＦＢＨ株を用いて製造した納豆の品質は、専門のパネラーによる官能検査の結果、外観、糸引きの強さ、ともに、ｐＨＹ３００ＰＬＫ／ｒ２２株を用いて作製した対照と同等のものであった。
【０１１９】
ＳＯＦＢＨ株が納豆発酵中にプラスミドｐＳＯＦＢ２を保持していることは、以下の方法で確認した。すなわち、発酵中の納豆に０．８５％滅菌食塩水を加えて懸濁した液を適当に希釈し、ＬＢ寒天プレート及びテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレート上に塗布して、３７℃で終夜培養した後にコロニー数が両プレートでほぼ同数であることを確認した。
【０１２０】
次に、納豆の硬さを実施例１と同様にして測定した。納豆の評価に際しては、同じ条件で蒸煮した発酵前の煮豆、及び同じ蒸煮条件、発酵条件でｐＨＹ３００ＰＬＫ／ｒ２２株を用いて製造した納豆を対照とした。表３に硬度を示す。
【０１２１】
【表３】
2010057422.tif 000004
【０１２２】
ＳＯＦＢＨ株で煮豆を発酵すると、ｒ２２株で製造した場合に比べ、柔らかい納豆が製造できた。このことから、ｓｏｆＢ遺伝子のコピー数を増大させて、ｓｏｆＢがコードするタンパク質の発現を増強させることにより、柔らかい納豆を製造する能力を有する納豆菌を育種できることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】ｓｏｆＡ遺伝子を含む領域の塩基配列を示す図である。
【図２】図１に続く塩基配列を示す図である。
【図３】ｓｏｆＡ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図４】ｓｏｆＢ遺伝子を含む領域の塩基配列を示す図である。
【図５】図４に続く塩基配列を示す図である。
【図６】ｓｏｆＢ遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】プライマー１の塩基配列を示す図である。
【図８】プライマー２の塩基配列を示す図である。
【図９】プライマー３の塩基配列を示す図である。
【図１０】プライマー４の塩基配列を示す図である。
【図１１】プライマー５の塩基配列を示す図である。
【図１２】プライマー６の塩基配列を示す図である。
【図１３】プライマー７の塩基配列を示す図である。
【図１４】プライマー８の塩基配列を示す図である。
【図１５】プライマー９の塩基配列を示す図である。
【図１６】プライマー１０の塩基配列を示す図である。
【図１７】プライマー１１の塩基配列を示す図である。
【図１８】プライマー１２の塩基配列を示す図である。
【図１９】プライマー１３の塩基配列を示す図である。
【図２０】プライマー１４の塩基配列を示す図である。
【図２１】プライマー１５の塩基配列を示す図である。
【図２２】プライマー１６の塩基配列を示す図である。
【図２３】プライマー１７の塩基配列を示す図である。
【図２４】プライマー１８の塩基配列を示す図である。
【図２５】プライマー１９の塩基配列を示す図である。
【図２６】プライマー２０の塩基配列を示す図である。
【図２７】ｓｏｆＡ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片調製の概略を示す図である。
【図２８】ｓｏｆＢ遺伝子欠損用ＤＮＡ断片調製の概略を示す図である。
【図１】
2010057422.tif 000005
【図２】
2010057422.tif 000006
【図３】
2010057422.tif 000007
【図４】
2010057422.tif 000008
【図５】
2010057422.tif 000009
【図６】
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【図７】
2010057422.tif 000011
【図８】
2010057422.tif 000012
【図９】
2010057422.tif 000013
【図１０】
2010057422.tif 000014
【図１１】
2010057422.tif 000015
【図１２】
2010057422.tif 000016
【図１３】
2010057422.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2010057422.tif 000021
【図１８】
2010057422.tif 000022
【図１９】
2010057422.tif 000023
【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2010057422.tif 000026
【図２３】
2010057422.tif 000027
【図２４】
2010057422.tif 000028
【図２５】
2010057422.tif 000029
【図２６】
2010057422.tif 000030
【図２７】
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【図２８】
2010057422.tif 000032
【配列表】
2010057422000001.app