【手続補正書】
【提出日】令和3年8月26日(2021.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中のＲＳＶの有無の検出のための方法であって、
ｉ）ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第１のフォワードテンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；
ｉｉ）ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第１のリバーステンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；
ｉｉｉ）少なくとも１つのニッキング酵素；及び
ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含む組成物と前記生体試料を接触させること；
核酸増幅反応で前記標的ヌクレオチド配列を増幅して増幅産物を提供すること；並びに
前記増幅産物の有無を検出すること
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのニッキング酵素が、
前記第１のフォワードテンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能であり、かつＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖内ではニッキングしない第１のニッキング酵素、並びに／又は
前記第１のリバーステンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能でありかつＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖内ではニッキングしない第２のニッキング酵素
を含み、前記第１のニッキング酵素及び前記第２のニッキング酵素が、同一であっても又は異なっていてもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が、前記ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生体試料中のＲＳＶの有無の検出のための方法であって、
ｉ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第２のフォワードテンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；
ｉｉ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第２のリバーステンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；
ｉｉｉ）少なくとも１つのニッキング酵素；及び
ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含む組成物と前記生体試料を接触させること；
核酸増幅反応で前記標的ヌクレオチド配列を増幅して増幅産物を提供すること；並びに
前記増幅産物の有無を検出すること
を含む、方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのニッキング酵素が、
前記第２のフォワードテンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能であり、かつＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖内ではニッキングしない第１のニッキング酵素、並びに／又は
前記第２のリバーステンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能でありかつ前記ヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖内ではニッキングしない第２のニッキング酵素
を含み、前記第１のニッキング酵素及び前記第２のニッキング酵素が、同一であっても又は異なっていてもよい、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
増幅が、基本的に等温条件下で行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のフォワードテンプレートの前記核酸配列が、配列番号１に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；かつ
前記第１のリバーステンプレートの前記核酸配列が、配列番号２に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜３及び７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号３に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３及び８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のフォワードテンプレートの前記核酸配列が、配列番号６に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；かつ
前記第２のリバーステンプレートの前記核酸配列が、配列番号７に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号８に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項４〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ゲオバチルス・ボアジチのＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ（巨大断片）、エクソＤＮＡポリメラーゼ、Ｍａｎｔａ  １．０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標））からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のフォワードテンプレート及び第１のリバーステンプレート前記第２のフォワードテンプレート及び第２のリバーステンプレートが、前記同じ少なくとも１つのニッキング酵素によって認識されるニッキング酵素結合部位を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのニッキング酵素が、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．ＢｐｕｌＯＩ、Ｎｔ．ＢｐｕｌＯＩ及びＮ．ＳＢｓｐＤ６１からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プローブが、検出可能な標識にコンジュゲートされる、請求項３、６、９又は１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対のメンバー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのニッキング酵素が、前記ニッキング酵素結合部位の下流でニッキングする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
増幅前に前記生体試料から核酸を抽出／単離することを含んでもよい、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が、糞便、口腔／咽喉の拭き取り検体、唾液、膿、痰、血液、及び尿から選択される、又は前記生体試料が、感染組織若しくは非感染組織からである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１のフォワードテンプレート、前記第１のリバーステンプレート、前記第２のフォワードテンプレート又は前記第２のリバーステンプレートの１以上が、１以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’修飾を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルを含む、請求項２２に記載の方法。