【手続補正書】
【提出日】令和3年7月12日(2021.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定され、透過処理された無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のための方法であって、前記方法は、特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることと、前記標的核酸をヒドロゲルに埋め込むことと、を含み、前記方法は、増幅法を実行して、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、前記標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、をさらに含む、方法。
【請求項２】
前記標的核酸を前記ヒドロゲルに埋め込んだ後に、前記組織の複数の細胞成分を清澄化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞成分が、脂質および／またはタンパク質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一対のプライマーが、試料と接触する前に加熱することによって変性する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、細胞の集団内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞の集団が、複数の細胞型を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｉ）前記一対のプライマーを同じ標的核酸にハイブリダイズさせること；または
（ｉｉ）異なる標的核酸に対する特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸を前記ヒドロゲルに埋め込む前に、前記組織が、前記少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記組織が、単一の溶液で固定され、透過処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的核酸がｍＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的核酸がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一対のプライマーが、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み；
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み；
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記標的核酸の第１の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、前記標的核酸の第２の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域に隣接する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、閉じた核酸環として提供される、または前記方法が、リガーゼを添加して、前記第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することを含み；
前記方法は、
（ａ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、前記第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして前記第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、
（ｂ）前記１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、
（ｃ）ライゲーションを可能にする条件下で、前記バーコード配列を有する前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、前記一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ライゲーションが、前記第３のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リガーゼがＤＮＡリガーゼである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
（ｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドが、パドロックプローブを含む、
（ｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、
（ｉｉｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、
（ｉｖ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、
（ｖ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、
（ｖｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、
（ｖｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、
（ｖｉｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端を含む、
（ｉｘ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含む、
（ｘ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域に隣接する、かつ／または
（ｘｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が、前記標的核酸の特定のためのバーコード情報を提供する、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記埋め込むことが、前記１つ以上のアンプリコンをアクリルアミドと共重合させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）前記第３のオリゴヌクレオチドが、塩基を解読するように構成されている、かつ／または
（ｉｉ）前記第４のオリゴヌクレオチドが、解読された塩基をシグナルに変換するように構成されている、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記撮像することが、共焦点顕微鏡法、広視野蛍光顕微鏡、２光子顕微鏡法、明視野顕微鏡法、無傷組織拡張顕微鏡法、超解像顕微鏡法、および／または光シート顕微鏡法を使用して前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記光シート顕微鏡法が、ＣＬＡＲＩＴＹ（商標）最適化光シート顕微鏡法（ＣＯＬＭ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記無傷組織が、５〜２０μｍの厚さを有する薄い切片組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記無傷組織が、５０〜２００μｍの厚さを有する厚い切片である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
候補薬剤をスクリーニングして、前記候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法であって、前記方法は、請求項１に記載の方法を実行して、前記無傷組織内の前記細胞における前記標的核酸の遺伝子配列決定を判定することと、
前記標的核酸の遺伝子発現のレベルを検出することであって、前記少なくとも１つの候補薬剤の不在下における前記標的核酸の発現のレベルに対する、前記少なくとも１つの候補薬剤の存在下における前記標的核酸の発現のレベルの変化が、前記少なくとも１つの候補薬剤が前記無傷組織内の前記細胞における前記核酸の遺伝子発現を調節することを示す、検出することと、
を含む、方法。
【請求項２４】
前記検出することが、フローサイトメトリー、配列決定、プローブ結合および電気化学的検出、ｐＨ変化、ＤＮＡタグに結合した酵素によって誘発される触媒作用、量子絡み、ラマン分光法、テラヘルツ波技術、顕微鏡法、走査質量分析、および／または走査電子顕微鏡法を実行することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記フローサイトメトリーが、質量サイトメトリーまたは蛍光活性化フローサイトメトリーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出することが、シグナルを判定することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記シグナルが、蛍光シグナルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
システムであって、
撮像チャンバ、流体デバイス、および請求項１に記載の方法を実行するように構成されたプロセッサユニットを含むデバイスを備える、システム。
【請求項２９】
前記流体デバイスがポンプを含む、請求項２８に記載のシステム。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本明細書に記載される方法に従って使用されるデバイスも提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法の自動化のための流体システムが提供され、連続動作を可能にする。いくつかの実施形態では、システムは、流体デバイスと、本明細書に記載される方法を実行するように構成されたプロセッサとを備える。
特定の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のための方法であって、
（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであって、
前記プライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記標的核酸の第１の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、前記標的核酸の第２の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域に隣接する、接触させることと、
（ｂ）リガーゼを添加して、前記第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、
（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、前記第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして前記第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、
（ｄ）前記１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、
（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、前記バーコード配列を有する前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、前記一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ライゲーションが、前記第３のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、
（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、
（ｇ）前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、前記無傷組織内の前記細胞における前記標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、を含む、方法。
（項目２）
前記一対のプライマーが、試料と接触する前に加熱することによって変性する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記細胞が、細胞の集団内に存在する、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記細胞の集団が、複数の細胞型を含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記固定され、透過処理された無傷組織を前記接触させることが、前記一対のプライマーを同じ標的核酸にハイブリダイズさせることを含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記標的核酸が、ＲＮＡである、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記標的核酸が、ＤＮＡである、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記第２のオリゴヌクレオチドが、パドロックプローブを含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、項目１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端を含む、項目１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含む、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域に隣接する、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が、前記標的核酸の特定のためのバーコード情報を提供する、項目１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記固定され、透過処理された無傷組織を前記接触させることが、異なる標的核酸に対する特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることを含む、項目１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記第２のオリゴヌクレオチドが、閉じた核酸環として提供され、リガーゼを添加する前記ステップが、省略される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が、溶液中のライゲーションを最小限に抑えるように選択される、項目１〜２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記リガーゼを添加することが、ＤＮＡリガーゼを添加することを含む、項目１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記核酸分子が、アミン修飾されたヌクレオチドを含む、項目１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記アミン修飾されたヌクレオチドが、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分修飾を含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記埋め込むことが、前記１つ以上のアンプリコンをアクリルアミドと共重合させることを含む、項目１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記埋め込むことが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを清澄化することを含み、前記標的核酸が、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンに実質的に保持される、項目１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記清澄化することが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから複数の細胞成分を実質的に除去することを含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記清澄化することが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから脂質を実質的に除去することを含む、項目２７または２８に記載の方法。
（項目３０）
前記第３のオリゴヌクレオチドが、塩基を解読するように構成されている、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
前記第４のオリゴヌクレオチドが、解読された塩基をシグナルに変換するように構成されている、項目１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記シグナルが、蛍光シグナルである、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、配列決定が進むにつれて、エラーの蓄積を排除することを含む、項目１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記撮像することが、共焦点顕微鏡法、２光子顕微鏡法、明視野顕微鏡法、無傷組織拡張顕微鏡法、および／またはＣＬＡＲＬＩＴＹ（商標）最適化光シート顕微鏡法（ＣＯＬＭ）を使用して前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像することを含む、項目１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記無傷組織が、薄い切片である、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記無傷組織が、５〜２０μｍの厚さを有する、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、４回以上生じる、項目３５または３６に記載の方法。
（項目３８）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、５回以上生じる、項目３５または３６に記載の方法。
（項目３９）
前記無傷組織が、厚い切片である、項目１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記無傷組織が、５０〜２００μｍの厚さを有する、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、６回以上生じる、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４２）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、７回以上生じる、項目３９または４０に記載の方法。
（項目４３）
候補薬剤をスクリーニングして、前記候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法であって、
（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであって、
前記プライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補領域が、前記標的核酸の第１の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補領域に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補領域に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補領域が、前記標的核酸の第２の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補領域に隣接する、接触させることと、
（ｂ）リガーゼを添加して、前記第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、
（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、前記第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして前記第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、
（ｄ）前記１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、
（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、前記バーコード配列を有する前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、前記一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ライゲーションが、前記第３のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、
（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、
（ｇ）前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、前記無傷組織内の前記細胞における前記標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、
（ｈ）前記標的核酸の遺伝子の発現のレベルを検出することであって、前記少なくとも１つの候補薬剤の不在下における前記標的核酸の発現のレベルに対する、前記少なくとも１つの候補薬剤の存在下における前記標的核酸の発現のレベルの変化が、前記少なくとも１つの候補薬剤が前記無傷組織内の前記細胞における前記核酸の遺伝子発現を調節することを示す、検出することと、を含む、方法。
（項目４４）
前記一対のプライマーが、前記試料と接触する前に加熱することによって変性する、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記細胞が、細胞の集団内に存在する、項目４３または４４に記載の方法。
（項目４６）
前記細胞の集団が、複数の細胞型を含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記固定され、透過処理された無傷組織を前記接触させることが、前記一対のプライマーを同じ標的核酸にハイブリダイズさせることを含む、項目４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記標的核酸が、ＲＮＡである、項目４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記標的核酸が、ＤＮＡである、項目４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記第２のオリゴヌクレオチドが、パドロックプローブを含む、項目４３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、項目４３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、項目４３〜５２のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、項目４３〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、項目４３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、項目４３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、項目４３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端を含む、項目４３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含む、項目４３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域に隣接する、項目４３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が、前記標的核酸の特定のためのバーコード情報を提供する、項目４３〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記固定され、透過処理された無傷組織を前記接触させることが、異なる標的核酸に対する特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることを含む、項目４３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記第２のオリゴヌクレオチドが、閉じた核酸環として提供され、リガーゼを添加する前記ステップが、省略される、項目４３に記載の方法。
（項目６４）
オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が、溶液中のライゲーションを最小限に抑えるように選択される、項目４３〜６３のいずれかに記載の方法。
（項目６５）
前記リガーゼを添加することが、ＤＮＡリガーゼを添加することを含む、項目４３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記核酸分子が、アミン修飾されたヌクレオチドを含む、項目４３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記アミン修飾されたヌクレオチドが、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分修飾を含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記埋め込むことが、前記１つ以上のアンプリコンをアクリルアミドと共重合させることを含む、項目４３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記埋め込むことが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを清澄化することを含み、前記標的核酸が、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンに実質的に保持される、項目４３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記清澄化することが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから複数の細胞成分を実質的に除去することを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記清澄化することが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから脂質を実質的に除去することを含む、項目６９または７０に記載の方法。
（項目７２）
前記第３のオリゴヌクレオチドが、塩基を解読するように構成されている、項目４３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目７３）
前記第４のオリゴヌクレオチドが、解読された塩基をシグナルに変換するように構成されている、項目４３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
（項目７４）
前記シグナルが、蛍光シグナルである、項目７３に記載の方法。
（項目７５）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、配列決定が進むにつれて、エラーの蓄積を排除することを含む、項目４３〜７４のいずれか一項に記載の方法。
（項目７６）
前記撮像することが、共焦点顕微鏡法、２光子顕微鏡法、明視野顕微鏡法、無傷組織拡張顕微鏡法、および／またはＣＬＡＲＩＴＹ（商標）最適化光シート顕微鏡法（ＣＯＬＭ）を使用して前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像することを含む、項目４３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７７）
前記無傷組織が、薄い切片である、項目４３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目７８）
前記無傷組織が、５〜２０μｍの厚さを有する、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、４回以上生じる、項目７７または７８に記載の方法。
（項目８０）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、５回以上生じる、項目７７または７８に記載の方法。
（項目８１）
前記無傷組織が、厚い切片である、項目４３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８２）
前記無傷組織が、５０〜２００μｍの厚さを有する、項目８１に記載の方法。
（項目８３）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、６回以上生じる、項目８１または８２に記載の方法。
（項目８４）
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、７回以上生じる、項目８１または８２に記載の方法。
（項目８５）
前記検出することが、フローサイトメトリー、配列決定、プローブ結合および電気化学的検出、ｐＨ変化、ＤＮＡタグに結合した酵素によって誘発される触媒作用、量子絡み、ラマン分光法、テラヘルツ波技術、および／または走査電子顕微鏡法を実行することを含む、項目４３〜８４のいずれか一項に記載の方法。
（項目８６）
前記フローサイトメトリーが、質量サイトメトリーまたは蛍光活性化フローサイトメトリーである、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記検出することが、顕微鏡法、走査質量分析、または他の撮像技術を実行することを含む、項目４３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８８）
前記検出することが、シグナルを判定することを含む、項目４３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
（項目８９）
前記シグナルが、蛍光シグナルである、項目８８に記載の方法。
（項目９０）
システムであって、
撮像チャンバおよびポンプを含むデバイスと、
項目１〜４２のうちのいずれか１つを実行するように構成されたプロセッサユニットと、を備える、システム。