【手続補正書】
【提出日】令和3年8月18日(2021.8.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象における生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのための方法であって、
（a）対象の媒精からある期間後に、該対象から生殖器を分離または取得する工程；
（b）該生殖器にヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を導入する工程；および
（c）該生殖器にエレクトロポレーションを行う工程
を含み、
該対象が非ヒト動物である、前記方法。
【請求項２】
前記期間が0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記期間が約0.7日（16.8時間）である、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
前記試薬組成物が一本鎖（ssDNA）修復テンプレートをさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生殖器に、NEPA21エレクトロポレーターを使用して、次のパラメータ：ポアーリングパルス：50V、5msパルス、50msパルス間隔、3パルス、10％減衰（±パルス方向）、およびトランスファーパルス：10V、50msパルス、50msパルス間隔、3パルス、40％減衰（±パルス方向）のエレクトロポレーションを行う、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生殖器に、CUY21EDIT IIエレクトロポレーターを使用して、次のパラメータ：矩形（mA）、（＋/−）、Pd V：60Vまたは80V、Pd A：150mA、Pdオン：5.00ms、Pdオフ：50ms、Pd N：3、減衰：10％、減衰タイプ：Logのエレクトロポレーションを行う、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記対象の媒精が該対象を別の対象と交配することによって行われる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象がマウスまたはラットである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生殖器が卵管である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬組成物が、該試薬組成物を卵管の内腔に注入することによって卵管に導入される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
対象の媒精後からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器であって、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を含み、該対象が非ヒト動物である、生殖器。
【請求項１５】
前記期間が0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）である、請求項14に記載の生殖器。
【請求項１６】
前記期間が約0.7日（16.8時間）である、請求項15に記載の生殖器。
【請求項１７】
前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載の生殖器。
【請求項１８】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、請求項17に記載の生殖器。
【請求項１９】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、請求項17に記載の生殖器。
【請求項２０】
前記試薬組成物が一本鎖（ssDNA）修復テンプレートをさらに含む、請求項14〜19のいずれか一項に記載の生殖器。
【請求項２１】
前記対象がマウスまたはラットである、請求項14〜20のいずれか一項に記載の生殖器。
【請求項２２】
前記生殖器が卵管である、請求項14〜21のいずれか一項に記載の生殖器。
【請求項２３】
ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器に導入するための、エレクトロポレーターの使用であって、該対象が非ヒト動物である、使用。
【請求項２４】
前記期間が0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）である、請求項23に記載の使用。
【請求項２５】
前記期間が約0.7日（16.8時間）である、請求項24に記載の使用。
【請求項２６】
前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２７】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、請求項26に記載の使用。
【請求項２８】
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、請求項26に記載の使用。
【請求項２９】
前記試薬組成物が一本鎖（ssDNA）修復テンプレートをさらに含む、請求項23〜28のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記対象がマウスまたはラットである、請求項23〜29のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前記生殖器が卵管である、請求項23〜30のいずれか一項に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
さらに別の局面では、本発明は、エレクトロポレーターの使用に関する。この使用には、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器に導入するための、エレクトロポレーターの使用が含まれる。
[本発明1001]
受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象における生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのための方法であって、
（a）対象の媒精からある期間後に、該対象から生殖器を分離または取得する工程；
（b）該生殖器にヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を導入する工程；および
（c）該生殖器にエレクトロポレーションを行う工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記期間が0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記期間が約0.7日（16.8時間）である、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、本発明1004の方法。
[本発明1007]
前記試薬組成物が一本鎖（ssDNA）修復テンプレートをさらに含む、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記生殖器に、NEPA21エレクトロポレーターを使用して、次のパラメータ：ポアーリングパルス：50V、5msパルス、50msパルス間隔、3パルス、10％減衰（±パルス方向）、およびトランスファーパルス：10V、50msパルス、50msパルス間隔、3パルス、40％減衰（±パルス方向）のエレクトロポレーションを行う、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記生殖器に、CUY21EDIT IIエレクトロポレーターを使用して、次のパラメータ：矩形（mA）、（＋/−）、Pd V：60Vまたは80V、Pd A：150mA、Pdオン：5.00ms、Pdオフ：50ms、Pd N：3、減衰：10％、減衰タイプ：Logのエレクトロポレーションを行う、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記対象の媒精が該対象を別の対象と交配することによって行われる、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記対象がマウスまたはラットである、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記生殖器が卵管である、前記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記試薬組成物が、該試薬組成物を卵管の内腔に注入することによって卵管に導入される、本発明1012の方法。
[本発明1014]
対象の媒精後からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器であって、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を含む生殖器。
[本発明1015]
前記期間が0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）である、本発明1014の生殖器。
[本発明1016]
前記期間が約0.7日（16.8時間）である、本発明1015の生殖器。
[本発明1017]
前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、本発明1014〜1016のいずれかの生殖器。
[本発明1018]
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、本発明1017の生殖器。
[本発明1019]
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、本発明1017の生殖器。
[本発明1020]
前記試薬組成物が一本鎖（ssDNA）修復テンプレートをさらに含む、本発明1014〜1019のいずれかの生殖器。
[本発明1021]
前記対象がマウスまたはラットである、本発明1014〜1020のいずれかの生殖器。
[本発明1022]
前記生殖器が卵管である、本発明1014〜1021のいずれかの生殖器。
[本発明1023]
ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器に導入するための、エレクトロポレーターの使用。
[本発明1024]
前記期間が0.5日（12時間）〜1.4日（33.6時間）である、本発明1023の使用。
[本発明1025]
前記期間が約0.7日（16.8時間）である、本発明1024の使用。
[本発明1026]
前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、本発明1023〜1025のいずれかの使用。
[本発明1027]
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、本発明1026の使用。
[本発明1028]
前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、本発明1026の使用。
[本発明1029]
前記試薬組成物が一本鎖（ssDNA）修復テンプレートをさらに含む、本発明1023〜1028のいずれかの使用。
[本発明1030]
前記対象がマウスまたはラットである、本発明1023〜1029のいずれかの使用。
[本発明1031]
前記生殖器が卵管である、本発明1023〜1030のいずれかの使用。