【手続補正書】
【提出日】令和3年4月15日(2021.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞（ＰＳＣ）を改変し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、それによりＣＡＲ−ＰＳＣを生成することと；
（ｂ）前記ＣＡＲ−ＰＳＣをＣＤ３４+造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化させることと、
（ｃ）前記ＣＤ３４+ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞にさらに分化させることと；
（ｄ）前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を拡大させることであって、拡大させることが、抗原特異的標的細胞と共培養し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成することを含むことと
を含み、
ステップ（ｂ）が、
（ｂａ）ブレビスタチン、ＧＳＫ−３阻害剤、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦの存在下で胚様体（ＥＢ）を生成することと；
（ｂｂ）中胚葉誘導を誘導させるため、前記ＥＢをＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２と接触させることと；
（ｂｃ）Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＳＣＦ、及びＴＰＯの存在下で前記ＥＢを分化させ、それによりＨＰＣを生成することと、
を含む指向された分化誘導を実施することを含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前記ＰＳＣが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｉＰＳＣが、Ｔ細胞からリプログラミングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂｃ）の分化させることが、ＢＭＰ４が本質的に不在であるか、又はステップ（ｂｃ）の分化させることが、ＢＭＰ４が不在であるか、又はステップ（ｂｃ）の分化させることが、ＩＬ−１１、ｃＡＭＰ、及び／又はＶＥＧＦの存在をさらに含む、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂｃ）の分化させることが、ＩＬ−１１、ｃＡＭＰ、及びＶＥＧＦの存在をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＳＫ−３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＳＣが、導入遺伝子を含まない、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＳＣがヒトである、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、又はγδＴ細胞である、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）の前記ＰＳＣが、単一の誘導性プロモーターの制御下でＥＲＧ／ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を発現するようにさらに改変される、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）が、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、及びＨＯＸＡ４を発現するように、前記ＰＳＣを改変することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
規定されたフィーダーフリー条件下で前記細胞を培養することを含む、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）が、ＣＤ３４及びＣＤ４３を発現する細胞について、抗原特異的Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化させる前に選択することをさらに含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
選択することが、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を実施することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ３４及びＣＤ４３を発現する前記細胞が、前記全細胞集団の少なくとも３５パーセントを含むか、又はＣＤ３４及びＣＤ４３を発現する前記細胞が、前記全細胞集団の少なくとも６５パーセントを含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＨＰＣの少なくとも５パーセントが前記ＣＡＲを発現するか、又は前記ＨＰＣの少なくとも１０パーセントが前記ＣＡＲを発現するか、又は前記ＨＰＣの少なくとも１５パーセントが前記ＣＡＲを発現する、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）の分化させることが、前記ＨＰＣを、低酸素条件下、アスコルビン酸及びニコチンアミドの存在下、レトロネクチン及びノッチＤＬＬ−４でコーティングされた表面上で培養することを含む、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養物が、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯ、及びＩＬ７をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記培養物が、ＧＳＫ−３阻害剤、ＩＬ−２、及び／又はＩＬ−１２をさらに含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養物が、ＧＳＫ−３阻害剤、ＩＬ−２、及びＩＬ−１２をさらに含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記分化されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも１．５パーセントが、ＣＤ３+ＣＡＲ+Ｔ細胞であるか、又は前記分化されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも２パーセントが、ＣＤ３+ＣＡＲ+ＮＫ細胞であるか、又は前記拡大されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも１０パーセントが、ＣＤ３+ＣＡＲ+ＮＫ細胞である、請求項１７から２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｄ）の拡大させることが、前記抗原特異的Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、及びＩＬ−１５の存在下で培養することをさらに含む、請求項１から２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記拡大されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも２パーセントが、ＣＤ３+ＣＡＲ+ＮＫ細胞であるか、又は
ステップ（ｄ）の拡大させることが、前記抗原特異的Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の存在下で培養することをさらに含むか、又は
ステップ（ｄ）の拡大させることが、前記抗原特異的Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、ＦＬＴ３リガンド、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１の存在下で培養することをさらに含むか、又は
ステップ（ｄ）の拡大させることが、ＳＣＦ及びＴＰＯからなる群から選択される１つ又は２つの追加的な成分をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＡＲ及び前記抗原特異的標的細胞が、前記同じ抗原に特異的である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原がＣＤ１９であるか、又は前記抗原特異的標的細胞が腫瘍細胞であるか、又は  前記抗原特異的標的細胞がヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原特異的標的細胞がＨＬＡクラスＩ陰性である、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原特異的エフェクターＴ細胞の少なくとも５パーセントが、標的細胞に対する細胞傷害性活性を示すか、又は前記抗原特異的エフェクターＮＫ細胞の少なくとも４０パーセントが、標的細胞に対する細胞傷害性活性を示す、請求項２４から２６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＡＲが、前記ＰＳＣの前記ゲノムに組み込まれたＤＮＡによってコードされるか、又は前記ＣＡＲが、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む、請求項１から２７の何れか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８を含むか、又は前記抗原結合領域が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＳＣがＨＬＡホモ接合性である、請求項１から２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣが、遺伝子座対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱの１つ以上においてホモ接合性であるか、又は前記ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣが、前記遺伝子座対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱの２つにおいてホモ接合性である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣが、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂにおいてホモ接合性であるか、又は前記ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃにおいてホモ接合性である、請求項３０又は３１に記載の方法。