(57)【要約】      （修正有）【課題】ヒトｆｕｓｅｄ（ｈｆｕｓｅｄ）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡｗｐ同定し、脊椎動物ｆｕｓｅｄ分子を提供する。【解決手段】ｆｕｓｅｄの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる配列タグ（ＥＳＴ）を含む核酸配列、オリゴヌクレオチドプローブ、ポリペプチド、ベクター及びヒト及び脊椎動物ｆｕｓｅｄに対するイムノアドヘシン、アゴニスト及びアンタゴニストを発現する宿主細胞。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）図１（配列番号：２４）のアミノ酸１〜約２６０の配列を含む脊髄動物ｆｕｓｅｄポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）の補体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、ｆｕｓｅｄの生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項２】
（ａ）図１のアミノ酸１〜１３１５の配列（配列番号：２）を含むヒトｆｕｓｅｄポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
図１のアミノ酸残基１〜２６０（配列番号：２４）を有する脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
アミノ酸位置３３にリシンを有する脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９６３７のｃＤＮＡにコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸。
【請求項６】
ＡＴＣＣ寄託番号２０９６３７のｃＤＮＡの配列、又はそれに緊縮条件下でハイブリッド形成する配列をコードするヒトｆｕｓｅｄを含んでなる請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項８】
当該ベクターで形質転換された宿主細胞に認識されるコントロール配列に作用可能に結合した請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
請求項８に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項１０】
哺乳動物である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
原核生物である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞が大腸菌細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記細胞が酵母菌細胞である請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
サッカロミセスセレヴィシアエである請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
請求項９に記載の宿主細胞を、脊椎動物ｆｕｓｅｄの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から脊椎動物ｆｕｓｅｄを回収することを含んでなる脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドの製造方法。
【請求項１７】
図１のアミノ酸残基１〜１３１５を含んでなる単離された天然配列ヒトｆｕｓｅｄポリペプチド。
【請求項１８】
ＡＴＣＣ登録番号２０９６３７の下で寄託されたｆｕｓｅｄ生物学的活性を有するヌクレオチドにコードされる単離された天然配列ヒトｆｕｓｅｄポリペプチド。
【請求項１９】
異種アミノ酸配列に融合した脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項２０】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項１９に記載のキメラ分子。
【請求項２１】
前記異種アミノ酸配列が免疫グロブリンの定常領域である請求項２２に記載のキメラ分子。
【請求項２２】
Ｈｈシグナル伝達経路においてｆｕｓｅｄの正常な機能発現を阻止、防止、阻害、及び／又は、中和する脊椎動物ｆｕｓｅｄのアンタゴニスト。
【請求項２３】
生物有機化学的小分子である請求項２２に記載のアンタゴニスト。
【請求項２４】
アンチセンスヌクレオチドである請求項２２に記載のアンタゴニスト。
【請求項２５】
Ｈｈシグナル伝達経路においてｆｕｓｅｄの正常な機能発現を刺激又は促進する脊椎動物ｆｕｓｅｄのアゴニスト。
【請求項２６】
生物有機化学的小分子である請求項２５に記載のアゴニスト。
【請求項２７】
ｆｕｓｅｄ生物学的活性のアンタゴニスト又はアゴニストのためのスクリーニング方法において、
（ａ）培地中でｆｕｓｅｄ発現標的細胞を候補化合物に暴露し、そして
（ｂ）細胞溶解液を分析してリン酸化のレベルの評価及び／又は同定をするか、又は
（ｃ）処理した細胞のフェノタイプ又は機能変化を評点化し、
そして、当該結果を候補化合物に暴露していない対照細胞と比較することを含んでなる方法。
【請求項２８】
ｆｕｓｅｄ生物学的活性のアンタゴニスト又はアゴニスト分子のためのスクリーニング方法において、
（ａ）ｆｕｓｅｄ基質及びｆｕｓｅｄ生物学的活性を有する化合物を候補アンタゴニスト又はアゴニストに暴露し、そして
（ｂ）基質を分析してリン酸化のレベルの評価及び／又は同定をし、
そして、当該結果を候補分子に暴露していない対照反応と比較することを含んでなる方法。
【請求項２９】
特定の疾患がヘッジホッグシグナル伝達によって変調されるか否かを決定する診断方法において、
（ａ）試験細胞又は組織を培養し、
（ｂ）ｆｕｓｅｄ変調ヘッジホッグシグナル伝達を阻害できる化合物を投与し、そして
（ｃ）細胞溶解液におけるｆｕｓｅｄ基質に対するキナーゼ減弱の程度又は試験細胞におけるヘッジホッグ媒介フェノタイプ効果を測定することを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的にシグナル伝達分子、特に、細胞増殖及び分化に含まれるヘッジホッグ（Ｈｈ）カスケードにおけるシグナル伝達及びメディエータ分子に関する。
【０００２】
（発明の背景）
多細胞生物の発育は少なくとも部分的に、細胞、組織、又は器官のパターンの位置的上方を特定、指揮又は維持するメカニズムに依存している。種々の分泌されたシグナル伝達分子、例えばトランスフォーミング成長因子-ベータ（ＴＧＦ-β）、Ｗｎｔ、繊維芽成長因子及びヘッジホッグファミリーのメンバー等は、ショウジョウバエ及び脊椎動物における様々な細胞及び構造のパターン形成に関連している。Perrimon, Cell: 80: 517-520 (1995)。
ヘッジホッグ（Ｈｈ）は、キイロショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニングによりセグメントポラリティ遺伝子として最初に同定され、Nusslein-Volhard等, Roux. Arch. Dev. Biol. 193: 267-282 (1984)、広範な発達機能を果たす。Perrimon, 上掲。１つのショウジョウバエＨｈ遺伝子しか同定されていないが、３つのヒトＨｈ相同体：ソニックＨｈ（ＳＨｈ）、デザートＨｈ（ＤＨｈ）及びインディアンＨｈ（ＩＨｈ）が単離されている、Echelard等, 上掲；Krauss等, Cell 75, 1431-44 (1993)；Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993)。ＳＨｈは発育中の脊椎動物胚の脊索及び底板で高レベルで発現される。インビトロ外植片アッセイ並びにトランスジェニック動物におけるＳＨｈの異所性発現は、ＳＨｈが神経管パターン形成において鍵となる役割を果たすことを示している、Echelard等, 上掲, Krauss等, Cell 75, 1431-44 (1993), Riddle等, Cell 75: 1401-16 (1993), Roelink等, Cell 81: 445-5 (1995)。インビトロ外植片アッセイ並びにトランスジェニック動物におけるＳＨｈの異所性発現は、ＳＨｈが神経管パターン形成において鍵となる役割を果たすことを示している、Echelard等 (1993), 上掲, Ericson等, Cell 81: 747-56 (1995); Marti等, Nature 375: 322-5 (1995); Roelink等 (1995), 上掲; Hynes等, Neuron 19: 15-26 (1997)。また、Ｈｈは、肢（Krauss等, Cel 75: 1431-44 (1993）; Laufer等, Cell 79, 993-1003 (1994)）、体節（Fan 及びTessier-Lavigne, Cell 79, 1175-86 (1994); Johnson等, Cell 79: 1165-73 (1994)）、肺（Bellusci等, Develop. 124: 53-63 (1997)）及び皮膚（Oro等, Science 276: 817-21 (1997)）の発達においても役割を果たす。同様に、ＩＨｈ及びＤＨｈは骨、腸及び胚細胞発育に関連する、Apeqvist等, Curr. Biol. 7: 801-4 (1997); Bellusci等, Development 124: 55-63 (1997); Bitgood等, Curr. Biol. 6: 298-304 (1996); Roberts等, Development 121: 3163-74 (1995)。ＳＨｈノックアウトマウスは、ＳＨｈが脊椎動物発生の多くの面に重要であるという考えを更に強めた、Chiang等, Nature 383: 407-13 (1996)。 これらのマウスは、脊索及び底板といった中間構造における異常、神経管の腹側細胞細胞型の不存在、末端肢構造における不存在、単眼症、及び脊柱及び殆どの肋骨における不存在を示す。
【０００３】
細胞表面において、Ｈｈシグナルは、１２膜貫通ドメインタンパク質Ｐａｔｃｈｅｄ（Ｐｔｃｈ）［Hooper及びScott, Cell 59: 751-65 (1989); Nakano等, Nature 341: 508-13 (1989)］及びＧ-タンパク質結合様レセプターＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）［Alcedo等, Cell 86: 221-232 (1996); van den Heuval及びIngham, Nature 382: 547-551 (1996)］にリレーされると考えられている。遺伝子的及び生化学的証拠が、Ｐｔｃｈ及びＳｍｏが多成分レセプター複合体の一部であるレセプターモデルを支持している、Chen及びStruhl, Cell 87: 553-63 (1996); Marigo等, Nature 384: 176-9 (1996); Stone等, Nature 384: 129-34 (1996)。ＨｈのＰｔｃｈへの結合に際し、ＰｔｃｈのＳｍｏに対する平常の阻害効果が解除され、Ｓｍｏが細胞質膜を通したＨｈシグナルの伝達を可能にする。Ｐｔｃｈ遺伝子における機能変異の喪失が、基底細胞母斑症候群（ＢＣＮＳ）、多発性基底細胞癌（ＢＣＣ）を特徴とする遺伝病の患者で同定された。また、機能障害Ｐｔｃｈ遺伝子変異は、多くの割合で散在性基底細胞癌腫を伴っていた、Chidambaram等, Cancer Research 56: 459-601 (1996); Gailani等, Nature Genet. 14: 78-81 (1996); Hahn等, Cell 85: 841-51 (1996); Johnson等, Science 272: 1668-71 (1996); Unden等, Cancer Res. 56: 4561-5 (1996); Wicking等, Am. J. Hum. Genet. 60: 21-6 (1997)。Ｐｔｃｈ機能の喪失は、基底細胞癌における制御不能なＳｍｏシグナル伝達を起こすと考えられる。同様に、Ｓｍｏ変異の活性化が散在性ＢＣＣ腫瘍で同定され（Xie等, Nature 391: 90-2 (1998)）、ＳＨｈのレセプター複合体におけるシグナル伝達サブユニットとしてのＳｍｏの役割を強調している。しかしながら、ＰｔｃｈがＳｍｏを制御することによる正確な機構は未だ明らかになっておらず、Ｈｈシグナルがレセプターから下流の標的に伝達されることによるシグナル伝達機構も明確にされねばならない。ショウジョウバエにおける遺伝子上位分析は、幾つかのセグメントポラリティ遺伝子を同定し、それらはＨｈシグナル伝達経路の成分として機能することがわかった、Ingham, Curr. Opin. Genet. Dev. 5: 492-8 (1995); Perrimon, 上掲。これらは、キネシン様分子、Ｃｏｓｔａｌ-２（Ｃｏｓ-２）［Robbins等, Cell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)］、タンパク質指向性ｆｕｓｅｄ［Preat等, Genetics 135: 1047-62 (1993); Therond等, Proc. Natl. acad. Sci. USA 93: 4224-8 (1996)］、不明な機能指向性のｆｕｓｅｄのサプレッサを持つ新規な分子［Pham等, Genetics 140: 587-98 (1995); Preat, Genetics 132: 725-36 (1992)］及びＺｎフィンガータンパク質Ｃｉ．［Alexandle等, Genes De. 10: 2003-12 (1996); Dominguez等, Science 272: 1621-5 (1996); Orenic等, Genes Dev. 4: 1053-67 (1990)］を含む。Ｈｈシグナル伝達に関係する更なる成分は、転写因子ＣＢＰ［Akimaru等, Nature 386: 735-738 (1997)］、ネガティブレギュレータｓｌｉｍｂ［Jiang及びStruhl, Nature 391: 493-496 (1998)］及びＳＨｈ応答成分ＣＯＵＰ-ＴＦＩＩ［Krishnan等, Science 278: 1947-1950 (1997)］を含む。
【０００４】
Ｃｏｓ-２における変異は胚致死性であり、各セグメントの中心成分及びＨｈ応答性遺伝子の拡張ドメインの複製を含むＨｈ過剰発現に類似のフェノタイプを提示する。これに対して、ｆｕｓｅｄ及びＣｉについての変異胚は、各セグメント後部の欠失及び前部の鏡像様複製の置換及び前部の鏡像様複製の置換を含むＨｈ機能の喪失に類似のフェノタイプを示す、Busson等, Roux. Arch. Dev. Biol. 197: 221-230 (1988)。Ｃｉの分子キャラクタリゼーションは、それがＷｉｎｇｌｅｓｓ及びＤｐｐなどのＨｈ応答性遺伝子を直接活性化する転写因子であることを示唆した、Alexandre等, (1996), 上掲; Therond等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 4224-8 (1996)。Ｃｏｓ-２及びｆｕｓｅｄの推定反対機能に一致して、ｆｕｓｅｄ変異はＣｏｓ-２変異体によって、及びｆｕｓｅｄ変異体のサプレッサによって抑制される、Preat等, Genetics 135: 1047-62 (1993)。しかしながら、ｆｕｓｅｄ無しの変異及びＮ-末端キナーゼドメイン変異は、ｆｕｓｅｄ変異のサプレッサによって完全に抑制されるが、ｆｕｓｅｄのＣ-末端変異はｆｕｓｅｄのサプレッサのバックグラウンドにおいて強いＣｏｓ-２フェノタイプを表示する。このことは、ｆｕｓｅｄキナーゼドメインが、ｆｕｓｅｄのサプレッサが存在しない場合にＳＨｈシグナル伝達の構成アクチベータとして作用することを示唆している。最近の研究は、９２ｋＤａショウジョウバエｆｕｓｅｄ、Ｃｏｓ-２及びＣｉが多タンパク質複合体を伴う微小管に存在し、Ｈｈシグナル伝達が微小管からのこの複合体の解離を導くことを示した、Robbins等, Cell 90: 225-34 (1997); Sisson等, Cell 90: 235-45 (1997)。ｆｕｓｅｄ及びＣｏｓ-２の両方ともがＨｈ処理に応答してリン酸化されるが、Robbins等, 上掲; Therond等, Genetics 142: 1181-98 (1996)、この活性の原因となるキナーゼは残って特徴付けられる。今日までに、これらの成分について知られている脊椎動物相同体は、Ｇｌｉタンパク質ファミリー（例えば、Ｇｌｉ-１、Ｇｌｉ-２及びＧｌｉ-３）のみである。これらは、Ｃｉに構造的に関連するＺｎフィンガー推定転写因子である。これらの中で、Ｇｌｉ-１はＳＨｈシグナルのメディエータ候補であることが示され［Hynes等, Neuron 15: 35-44 (1995), Lee等, Development 124: 2537-52 (1997); Alexandre等, Genes Dev. 10: 2003-13 (1996)］、Ｈｈに応答する遺伝子活性化の機構がハエと脊椎動物の間で保存されることを示唆している。Ｈｈカスケードにおける他のシグナル伝達成分が進化的に保存されるか否かを決定し、生化学レベルでのＨｈシグナル伝達におけるｆｕｓｅｄの機能を試験するために、出願人はヒトｆｕｓｅｄｃＤＮＡを単離して特性決定した。マウスでの組織分布は、ｆｕｓｅｄがＳＨｈ応答性組織で発現されることを示した。生化学的研究は、ｆｕｓｅｄが機能性キナーゼであることを示した。機能的研究は、ｆｕｓｅｄがＧｌｉのアクチベータであり、ｆｕｓｅｄのドミナントネガティブ形態がアフリカツメガエル胚におけるＳＨｈシグナル伝達を阻止できるという証拠を提供する。これらのデータをまとめて、ｆｕｓｅｄがＨｈシグナル伝達に直接的に関連していることが示された。
本出願人は、ヒトｆｕｓｅｄ（ｈｆｕｓｅｄ）ポリペプチドをコードするｃＤＮＡｗｐ同定し、よって、脊椎動物ｆｕｓｅｄ分子を初めて提供するものである。
【０００５】
（発明の概要）
一実施態様では、本発明は、（ａ）図１のアミノ酸１〜２６０の配列（配列番号：２４）を含むｆｕｓｅｄポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）の補体に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有し；ｆｕｓｅｄの生物学的活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。配列同一性は、好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、最も好ましくは約９５％である。一態様において、単離された核酸は、図１のアミノ酸１〜１３１５の配列（配列番号：２）を有するポリペプチドに対して少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。好ましくは、最も高い配列同一性は、キナーゼドメイン（アミノ酸１〜約２６０（図１の配列番号：２４））内で生じる。特に好ましいのは、アミノ酸位置３３におけるリシンのコード化配列を含む核酸分子である。さらなる態様において、単離された核酸分子は、アミノ酸残基１〜約２６０（図１に示した配列番号：２４）を有するヒトｆｕｓｅｄポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる。さらに他の態様では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９６３７のｃＤＮＡ（命名：ｐＲＫ５ｔｋｎｅｏ．ｈｆｕｓｅｄ-１２７２）にコードされるのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、あるいは、ＡＴＣＣ２０９６３７の登録番号で寄託されたクローンｐＲＫ５ｔｋｎｅｏ．ｈｆｕｓｅｄ-１２７２のコード化配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸を提供する。またさらなる態様では、本発明はＡＴＣＣ寄託番号２０９６３７のｃＤＮＡ（命名：ｐＲＫ５ｔｋｎｅｏ．ｈｆｕｓｅｄ-１２７２）の配列、又はそれに緊縮条件下でハイブリッド形成する配列をコードするヒトｆｕｓｅｄを含んでなる核酸を提供する。
【０００６】
他の実施態様では、本発明は、脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。そのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。例えば、宿主細胞は哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）、原核生物細胞（例えば大腸菌）又は酵母細胞（例えばサッカロミセスセレヴィシアエ(Saccaromyces cerevisiae)）でよい。さらに、宿主細胞を、脊椎動物ｆｕｓｅｄの発現に適した条件下で培養し、細胞培地からそれを回収することを含んでなる脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドの製造方法も提供される。
【０００７】
さらに他の実施態様では、本発明は単離されたｆｕｓｅｄポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された天然配列ｆｕｓｅｄポリペプチドを提供し、それは一実施態様において図１の残基１〜１３１５（配列番号：２）を含んでなるアミノ酸配列を含むヒトｆｕｓｅｄである。メチオニンから開始されてもされなくてもよいヒト及び他の天然脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドが特に含まれる。また、本発明は登録番号ＡＴＣＣ２０９６３７の下で寄託された核酸にコードされる脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドを提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は、異種アミノ酸配列に融合した脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、エピトープタグ配列又は免疫グロブリンの定常領域の融合した脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドを含むキメラ分子である。
さらに他の実施態様では、本発明は、図２で２５１５６６２（配列番号：２）として同定される核酸配列を含む発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
さらに他の実施態様では、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達のｆｕｓｅｄ変調に抗するアンタゴニスト及び促進するアゴニストを生じさせる化合物及び方法を提供する。特に、生物有機化学的小分子及びアンチセンスヌクレオチドを含む、ＳＨシグナル伝達経路においてｆｕｓｅｄの正常な機能発現を阻止、防止、阻害、及び／又は、中和する脊椎動物ｆｕｓｅｄのアンタゴニストである。
【０００８】
さらに他の実施態様において、本発明は、ヒトｆｕｓｅｄの選択的スプライシングされた変異体を提供する。またさらに他の実施態様では、本発明は、ヘッジホッグシグナル伝達のｆｕｓｅｄ活性化を転調させる分子を同定するためのスクリーニング又はアッセイ方法を提供する。好ましくは、その分子は、ｆｕｓｅｄのその結合性複合体形成タンパク質との相互作用を阻止するか、複合体の分解を阻止又は阻害するかのいずれかである。このアッセイは、ｆｕｓｅｄ及び基質（例えば、Ｇｌｉ、ＣＯＵＰ-ＴＦＩＩ、ｓｌｉｍｂ、ＣＢＰ、ＭＢＰ）を含む混合物の候補分子とのインキュベーション、及び候補化合物がその基質のｆｕｓｅｄリン酸化を変調させる能力の検出を含む。スクリーニングされた分子は、好ましくは小分子薬候補である。特に、この方法はｆｕｓｅｄ生物学的活性のアンタゴニスト又はアゴニストのためのスクリーニング技術に関係し、
（ａ）培地中でｆｕｓｅｄ発現標的細胞を候補化合物に暴露し；そして
（ｂ）細胞溶解液を分析してリン酸化のレベルの評価及び／又は同定をするか；又は
（ｃ）処理した細胞のフェノタイプ又は機能変化を評点化し；
そして、当該結果を候補化合物に暴露していない対照細胞と比較することを含む。
さらに他の実施態様では、この方法は、特定の疾患がヘッジホッグシグナル伝達によって変調されるか否かを決定する診断方法に関係し、
（ａ）試験細胞又は組織を培養し；
（ｂ）ｆｕｓｅｄ変調ヘッジホッグシグナル伝達を阻害できる化合物を投与し；そして
（ｃ）細胞溶解液におけるｆｕｓｅｄ基質に対するキナーゼ減弱の程度又は試験細胞におけるヘッジホッグ媒介フェノタイプ効果を測定することを含む。
【０００９】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「脊椎動物ｆｕｓｅｄ」及び「脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチド」という用語は、天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄ及びｆｕｓｅｄの生物学的活性を有する脊椎動物ｆｕｓｅｄ変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ｆｕｓｅｄは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄ」は、天然由来の脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄ」という用語には、特に、脊椎動物ｆｕｓｅｄの自然に生じる切断形態、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及び脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。天然脊椎動物ｆｕｓｅｄは、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌなどの哺乳動物におけるｆｕｓｅｄを含み、好ましくはヒトを意味する。よって、本発明の一実施態様において、天然配列ヒト脊椎動物ｆｕｓｅｄは、図１に示す配列番号：２のアミノ酸１〜１３１５を含有する成熟又は全長天然ヒト脊椎動物ｆｕｓｅｄであり、位置１に開始メチオニンを有しても有さなくてもよい。
【００１０】
「脊椎動物ｆｕｓｅｄ変異体」とは、以下に定義されるように、（ａ）脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性な脊椎動物ｆｕｓｅｄを意味する。特別な実施態様において、脊椎動物ｆｕｓｅｄ変異体は、全長天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄについて図１に示した推定アミノ酸配列（配列番号：２）を有する脊椎動物ｆｕｓｅｄと少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有する。このような脊椎動物ｆｕｓｅｄ変異体は、これらに限られないが、図１(配列番号：２)の配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失された脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドを含む。好ましくは、核酸又はアミノ酸配列同一性は、少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％である。
【００１１】
脊椎動物ｆｕｓｅｄ配列に対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、脊椎動物ｆｕｓｅｄ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
ここで同定される脊椎動物ｆｕｓｅｄ配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、脊椎動物ｆｕｓｅｄ配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００１２】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合した脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチド、又はその一部を含んでなるキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００１３】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。イムノアドヘシンは文献に報告されており、Ｔ細胞レセプター＊［Gascoigne等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2936-2940 (1987)］；ＣＤ４＊［Capron等, Nature 337: 525-531 (1989); Traunecker等, Nature 339: 68-70 (1989); Zettmeissl等, DNA Cell Biol. USA 9: 347-353 (1990); Byrn等, Nature 344, 667-670 (1990)］；Ｌ-セレクチン（ホーミングレセプター）［Watson等, J. Cell. Biol. 110, 2221-2229 (1990); Watson等, Nature 349, 164-167 (1991)］；ＣＤ４４＊［Aruffo等, Cell 61, 1303-1313 (1990)］；ＣＤ２８＊及びＢ７＊［Linsley等, J. Exp. Med. 173, 721-730 (1991)］；ＣＴＬＡ-４＊［Lisley等, J. Exp. Med. 174, 561-569 (1991)］；ＣＤ２２＊［Stamenkovic等, Cell 66. 1133-1144 (1991)］；ＴＮＦレセプター［Ashkenazi等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-10539 (1991)］；ＮＰレセプター［Bennett等, J. Biol. Chem. 266, 23060-23067 (1991)］；ＩｇＥレセプターα鎖＊［Ridgway及びGorman, J. Ce;;. Biol. 115, 要約, 1448 (1991)］；ＨＧＦレセプター［Mark, M.R.等, 1992, 審査中］の融合物を含み、ここで星印（＊）は、レセプターが免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであることを示す。
【００１４】
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的に
プローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点（Ｔｍ）に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology (1995)を参照のこと。
ここで定義される「緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃でのホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのいフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００１５】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、脊椎動物ｆｕｓｅｄの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」脊椎動物ｆｕｓｅｄ核酸分子は、同定され、脊椎動物ｆｕｓｅｄ核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された脊椎動物ｆｕｓｅｄ核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された脊椎動物ｆｕｓｅｄ核酸分子は、天然の細胞中に存在する脊椎動物ｆｕｓｅｄ核酸分子から区別される。
【００１６】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００１７】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に単一のモノクローナル抗体(アゴニスト及びアンタゴニスト抗体を含む)、及び多エピトープ特異性を持つ抗体組成物、並びに、これらが所望の生物学的活性を示す限りにおいて抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ）を包含している。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対応する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対応する。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンで汚染されていないハイブリドーマ培地で合成されるという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、或る特定の方法による抗体生産を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler及びMilsteinによって、Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる［例えば米国特許第4,816,567号（Cabilly等）参照］。
ここで、モノクローナル抗体は特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から誘導された又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びに、それらが所望の生物学的活性を示す限りそれらの抗体の断片を含む［米国特許第4,816,567号、Cabilly等；Morrison 等, Proc. Natl. acad. Sci. U.S.A. 81: 6851-6855 (1984）］。
【００１８】
非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合性配列）である。大部分において、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、マウス、ラット、ヤギなどのヒト以外の種のＣＤＲ（ドナー抗体）に由来する所望の特異性、親和性及び容量を持つ残基で置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのＦｖ枠残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、輸入されるＣＤＲ又は枠配列にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに精密かつ最適化するために施される。一般にヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン共通配列のものである少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有するであろう。また、最適なヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含有するであろう。さらなる詳細については、Jones等, Nature 321: 522 -525 (1986)；Reichmann等, Nature 332: 323-329 (1988)；Presta, Curr. Op. struct. Biol. 2: 593 -596 (1992)及び1993年7月6日発行の米国特許第5,225,539号（Winter）を参照のこと。
【００１９】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生脊椎動物ｆｕｓｅｄの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持する脊椎動物ｆｕｓｅｄの形態を意味する。好ましい活性は、ヘッジホッグシグナル伝達に結合及び影響し、例えば阻止又はその他の変調をさせる能力である。活性は、好ましくは基底細胞癌の病原を調節することを含む。他の好ましい生物化学的活性は、Ｇｌｉのリン酸化又はリン酸化の変調をする能力である。
【００２０】
ここで用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、最も広い意味において、Ｈｈシグナル伝達におけるｆｕｓｅｄの正常な機能を阻止、防止、阻害、中和する任意の分子を含む。アンタゴニストの１つの特別な形態は、ｆｕｓｅｄとその結合又は複合体形成タンパク質との間の相互作用を阻害する分子を含む。同様に、ここで用いられる「アゴニスト」なる用語は、Ｈｈシグナル伝達経路におけるｆｕｓｅｄの正常な機能発現を促進、向上又は刺激する任意の分子を含む。ｆｕｓｅｄ及びその結合タンパク質のタンパク質−タンパク質相互作用に影響する好ましい分子は、後者の断片又は小さな生物有機分子、例えばペプチド類似物を含み、それらは正しい複合体形成の相互作用を防止又は促進するであろう。非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド類似物、製薬製剤又はその代謝物、転写及び翻訳制御配列などを含む。アンタゴニストの他の好ましい形態は、野生型fusedの正しい転写を阻害するアンチセンスヌクレオチドを含む。アンタゴニストの好ましい形態は、ｆｕｓｅｄのＡＴＰ結合部位に特異的に結合するか結合を阻止する小分子である。
【００２１】
「変調」又は「変調する」という語句は、シグナル伝達経路のアップレギュレーション又はダウンレギュレーションを意味する。私儀なる伝達の制御下での細胞プロセスは、これらに限られないが、特定遺伝子の転写；代謝、増殖、分化、接着、アポトーシス及び生存などの正常な細胞機能、並びに、形質転換、分化及び転移の阻止といった異常なプロセスを含みうる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」の技術は、ここで用いられる場合、一般に核酸、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡの特定の切片の少量が1987年7月28日発行の米国特許第4,683,195号に記載されたように増幅される方法を意味する。一般的に、対象とする領域の末端から又は利用可能の必要性を越える配列情報は、オリゴヌクレオチドプライマーの設計を可能にし；これらのプライマーは増幅されるテンプレートの反対鎖の配列と同一又は類似している。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは増幅された物質の末端と一致する。ＰＣＲ配列は、全ゲノムＤＮＡ、及び全細胞性ＲＮＡ、バクテリオファージ、又はプラスミド配列等から転写されたｃＤＮＡを形成する。一般的に、Mullis等, Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 51: 263 (1987); Erlich, Ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)を参照のこと。ここで用いられるように、ＰＣＲは、プライマーとして公知の核酸を、そして核酸の特定の切片を増幅又は生成するために核酸ポリメラーゼを使用することを含む核酸試験試料の唯一ではない一例であると考えられる。
【００２２】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．全長脊椎動物ｆｕｓｅｄ
本発明は、本出願においてヒト及び脊椎動物ｆｕｓｅｄと称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。（初期パラメータに設定された）ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ヒトｆｕｓｅｄの全長配列（図３に示す（配列番号：２））がショウジョウバエｆｕｓｅｄ（配列番号：２３）と２８％のアミノ酸配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるヒトｆｕｓｅｄがヘッジホッグシグナル伝達カスケードの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【００２３】
ヒト脊椎動物ｆｕｓｅｄ遺伝子の全長天然配列、又はその一部は、全長遺伝子を単離するための、又は図１（配列番号：１）に開示した脊椎動物ｆｕｓｅｄ配列と所定の配列同一性を有する更に他の脊椎動物相同遺伝子（例えば、脊椎動物ｆｕｓｅｄ又は他の種からの脊椎動物ｆｕｓｅｄの天然発生変異体をコードするもの）を単離するためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０から約５０塩基であろう。ハイブリッド形成プローブは、図１（配列番号：１）の核酸配列から、又は天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄのプロモーター、エンハンサーエレメント、及びイントロンを含むゲノム配列から誘導されうる。例えば、スクリーニング方法は、脊椎動物ｆｕｓｅｄ遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して、約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓなどの放射性ヌクレオチド、アビジン／ビオチン結合系を解してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識によって標識してよい。本発明の脊椎動物ｆｕｓｅｄ遺伝子に相補的な配列を有する標識したプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡのライブラリのスクリーニングに使用でき、それらのライブラリの何れのメンバーにプローブがハイブリッド形成するかを決定できる。
【００２４】
Ｂ．脊椎動物ｆｕｓｅｄ変異体
ここに記載した全長天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄに加えて、脊椎動物ｆｕｓｅｄ変異体も調製できると考えられる。脊椎動物ｆｕｓｅｄ変異体は、公知の脊椎動物ｆｕｓｅｄＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望の脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、適切なアミノ酸変化が脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列脊椎動物ｆｕｓｅｄ又はここに記載した脊椎動物ｆｕｓｅｄの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄと比較して脊椎動物ｆｕｓｅｄのアミノ酸配列が変化する脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸の脊椎動物ｆｕｓｅｄ一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、脊椎動物ｆｕｓｅｄの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸を類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸で置換した結果、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。
【００２５】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等のこの分野で周知の技術を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］又は他のこの分野で知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施して、脊椎動物ｆｕｓｅｄ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。中でも好ましいスキャンニングアミノ酸は、比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
図１に示したヒトｆｕｓｅｄ配列では、キナーゼドメインがアミノ酸残基１−２６０（配列番号：２４）で表され、その位置のリシン３３はＡＴＰ結合、即ち酵素活性に必要であることがわかった。
【００２６】
Ｃ．脊椎動物ｆｕｓｅｄの修飾
脊椎動物ｆｕｓｅｄの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、脊椎動物ｆｕｓｅｄの標的とするアミノ酸残基を、脊椎動物ｆｕｓｅｄの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えば脊椎動物ｆｕｓｅｄを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【００２７】
脊椎動物ｆｕｓｅｄの共有結合的修飾の他の型は、脊椎動物ｆｕｓｅｄポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。このような修飾は、哺乳動物系での循環における分子の半減期の増大が予想され；ｆｕｓｅｄ分子の半減期の延長は、ｆｕｓｅｄ変異体が治療薬として投与される場合などの或る種の状況下で有用であり得る。
また、本発明の脊椎動物ｆｕｓｅｄは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した脊椎動物ｆｕｓｅｄを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと脊椎動物ｆｕｓｅｄとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には脊椎動物ｆｕｓｅｄのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような脊椎動物ｆｕｓｅｄのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって脊椎動物ｆｕｓｅｄを容易に精製できるようにする。もう一つの実施態様において、キメラ分子は脊椎動物ｆｕｓｅｄの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ分子の二価形態では、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。
通常は、ＩＮＦ-γレセプターのリガンド-(ＩＦＮ-γ)結合ドメインの隣接アミノ酸配列のＣ-末端が、可変領域に換えて免疫グロブリン定常領域の隣接アミノ酸配列のＮ-末端に融合するが、Ｎ-末端融合も可能である。
【００２８】
典型的には、このような融合は、少なくとも免疫グロブリン重鎖の定常領域の機能的活性ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。また、融合は、定常ドメインのＦｃ部分のＣ-末端、又は重鎖のＣＨ１の直近Ｎ-末端又は軽鎖の対応する領域にもなされる。これは、通常は、適当なＤＮＡ配列を作成し、それを組換え細胞培地に暴露することにより達成される。あるいは、イムノアドヘシンが周知の方法に従って合成される。
融合がなされる正確な位置は重要ではなく；特定の位置は公知であり、免疫グロブリンの生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択されうる。
【００２９】
好ましい実施態様では、ＩＦＮ-γに対する結合部位を含む隣接アミノ酸配列のＣ-末端が、Ｎ-末端において、抗体のＣ-末端部分（特にＦｃドメイン）に融合し、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＧｌ（ＩｇＧ-ｌ）のエフェクター機能を含有する。上述したように、全重鎖定常領域を結合部位を含む配列に融合させることができる。しかしながら、より好ましくは、パパイン切断部位（ＩｇＧＦｃを化学的に定義する；残基２１６、重鎖定常領域の第１残基を１１４とする［Kobet等, 上掲］、又は他の免疫グロブリンの類似部位）の直上流のヒンジ領域で開始する配列が融合に用いられる。イムノアドヘシンにおいて異種タンパク質重鎖融合タンパク質が効率的に分泌されるには免疫グロブリン軽鎖が必要であるというのが以前の考えであったが、全ＩｇＧｌ重鎖を含むイムノアドヘシンでさえも軽鎖無しで効率的に分泌されることが見出された。軽鎖が不要であるので、本発明のイムノアドヘシンの作成に用いられる免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、軽鎖架橋部位を持たなくてもよい。これは、十分に変化する免疫グロブリンの通常は軽鎖が結合する重鎖配列成分を除去し、そのような結合がもはや不可能とすることにより達成される。よって、ＩＦＮ-γレセプター-免疫グロブリンキメラの或る実施態様では、ＣＨ１ドメインが完全に除去され得る。
【００３０】
特に好ましい実施態様では、ＩＦＮ-γレセプターの細胞外ドメインを含むアミノ酸配列がヒンジ領域及びＣＨ２、ＣＨ３；又はＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４の重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合する。典型的な作成物の作成は実施例１に記載する。
幾つかの実施態様において、ＩＦＮ-γレセプター-免疫グロブリン分子（イムノアドヘシン）は、単量体、二量体、又は多量体、特に二量体又は三量体として組み立てられる。一般的に、これらの組み立てられたイムノアドヘシンは、対応する免疫グロブリンのものに似た周知の単位構造を有する。基本的な４つの鎖構造単位（２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の二量体）は、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥが存在する形態である。４つの鎖単位は高分子量免疫グロブリンで繰り返され；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合で保持された基本的な４つの鎖単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、場合によってはＩｇＧグロブリンは、血清中で多量体形態でも存在する。多量体の場合、４つの各鎖単位は同じでも異なっていてもよい。
【００３１】
ＩＦＮ-γレセプター-免疫グロブリンキメラの全免疫グロブリン部分が同じ免疫グロブリンからである必要はない。イムノアドヘシンの特性を最適化するために、異なる免疫グロブリンの種々の部分が結合され、天然免疫グロブリンの変異体及び誘導体がＩＦＮ-γについて上述した用に作成されうる。例えば、ＩｇＧ-１のヒンジがＩｇＧ-３のものに弛緩されたイムノアドヘシン作成物が機能的であり、全ＩｇＧ-１重鎖を含むイムノアドヘシンに匹敵する薬物動態を示すことがわかった。
種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。好ましいタグはインフルエンザＨＡタグである。
【００３２】
Ｄ．脊椎動物ｆｕｓｅｄの調製
以下の説明は、主として、脊椎動物ｆｕｓｅｄ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することにより特定の脊椎動物ｆｕｓｅｄを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いて脊椎動物ｆｕｓｅｄを調製することはできると考えられる。例えば、脊椎動物ｆｕｓｅｄ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。脊椎動物ｆｕｓｅｄの種々の部分を、別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長脊椎動物ｆｕｓｅｄを生産してもよい。
【００３３】
１．脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするＤＮＡの単離
脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするＤＮＡは、脊椎動物ｆｕｓｅｄｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒト脊椎動物ｆｕｓｅｄＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。また脊椎動物ｆｕｓｅｄコード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(脊椎動物ｆｕｓｅｄに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００３４】
下記の実施例は、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の緊縮性及び高度の緊縮性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の一定の領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、相同性測定のための種々のアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、ＤＮＡｓｔａｒ、及びＩＮＨＥＲＩＴ等のコンピュータソフトウェアプログラムを用いた配列アラインメントを通して決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用することにより得られる。
【００３５】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載した脊椎動物ｆｕｓｅｄ生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００３６】
ここに記載のベクターにおいてＤＮＡをクローン化あるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするベクターのための適切なクローン化又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。
脊椎動物ｆｕｓｅｄの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75)；ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065)；及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【００３７】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母菌及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２：プラスミド開始点は酵母菌に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。好ましい複製可能なベクターは、プラスミドｐＲＫ５である。Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)。
【００３８】
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、脊椎動物ｆｕｓｅｄ核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母菌プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【００３９】
発現及びクローニングベクターは、通常、脊椎動物ｆｕｓｅｄ核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまた脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母菌宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００４０】
他の酵母菌プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの脊椎動物ｆｕｓｅｄ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物から得られるプロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【００４１】
より高等の真核生物による脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、脊椎動物ｆｕｓｅｄコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母菌、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養での脊椎動物ｆｕｓｅｄの合成に適応化するのに適切なさらに他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【００４２】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又は脊椎動物ｆｕｓｅｄＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００４３】
５．ポリペプチドの精製
脊椎動物ｆｕｓｅｄの形態は、培地又は宿主細胞の溶解液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。脊椎動物ｆｕｓｅｄの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
脊椎動物ｆｕｓｅｄを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び脊椎動物ｆｕｓｅｄのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される脊椎動物ｆｕｓｅｄの性質に依存する。
【００４４】
Ｅ．脊椎動物ｆｕｓｅｄの用途
（１）ｆｕｓｅｄは、Ｈｈシグナル伝達の汎用メディエータである
図１（配列番号：１）のヒトｆｕｓｅｄ全長分子は、ショウジョウバエｆｕｓｅｄ（１００ｋＤａ、ｄｆｕｓｅｄ（配列番号：２３））よりかなり大きな１５０ｋＤａの予測分子量を持つタンパク質をコードする。ヒトｆｕｓｅｄ（ｈｆｕｓｅｄ）は、ショウジョウバエ相同体とキナーゼドメインにおいて顕著な相同性を示すが、残りの約１０００アミノ酸においては、ｄｆｕｓｅｄ又は他の公知のタンパク質と殆ど相同ではない。キナーゼドメインは、図１（配列番号：２４及び２）に示すように、残基１からおよそ残基２６０まで伸びている。分子のＣ-末端におけるこの相違は、ショウジョウバエ分子のＣ-末端がその活性に必要であることから予想外のことである、Preat等, Nature 347: 87-9 (1990)。ＡＴＰ結合部位はおよそアミノ酸位置３３であり、キナーゼ活性に必要である。
ショウジョウバエにおける以前の研究は、Ｈｈシグナルの発生にｄｆｕｓｅｄが必要であることを示したが、ｆｕｓｅｄがこのシグナル伝達を十分に活性化するかという問題は扱っていない。実施例に示すように、本出願人はここに、Ｈｈカスケードのルシフェラーゼメディエータの前で、ＮＨＦ３βプロモーターに存在するＧｌｉＤＮＡ結合成分を用い、それはｆｕｓｅｄ単独でこの系のＧｌｉ媒介転写を活性化できることを明らかに示した。さらに、この活性化には無傷のキナーゼドメイン及び無傷のＣ-末端非触媒ドメインの両方が必要であることがわかり、このことは、ｆｕｓｅｄがキナーゼとして機能すること及びＣ-末端が基質認識又はキナーゼ活性の調節において役割を果たすことという考えを支持している。
【００４５】
本出願人は、本出願において、ｈｆｕｓｅｄがキナーゼであり、ＭＢＰなどの人工的基質をリン酸化できることを示した。しかしながら、ｈｆｕｓｅｄの生理的基質の同定は決定されずに残っている。１つの明確な候補はＧｌｉ-１自身であり、ｈｆｕｓｅｄによるＧｌｉ-１のリン酸化がインビトロで検出できる。
ヒトｆｕｓｅｄが脊椎動物におけるＨｈシグナル伝達に必須であるか否かを決定するために、ＡＴＰ結合部位（およそアミノ酸残基３３）に保持されたリシンを変えることにより変異体を作成した。典型的には、このような変異体は、基質及び／又は調節因子への接近を阻止することにより対応する野生型キナーゼの阻害剤として作用する、He等, Nature 374, 617-22 (1995)。２-細胞段階アフリカツメガエル胚において過剰発現された場合、最も顕著なフェノタイプは、注入した胚の約３０％における融合眼の存在である。幾つかの系の証拠は、このフェノタイプがＨｈシグナル伝達の阻害によると考えられることを示している。第１に、ＳＨｈノックアウトは、最近ＳＨｈ遺伝子の変異が原因とされた単眼症フェノタイプを表現する、Chiang等, Nature 383: 407-13 (1996)。第２に、ＳＨｈ発現の低下した又はＰＫＡの構成的活性形態を注入したゼブラフィッシュ胚（シクロップ(cyclop)）では、Ｈｈ経路のネガティブレギュレータはシクロップである。第３に、前索板から発したＳＨｈが、連続的眼分野の中心において眼の発達に必要な鍵となる転写因子のＰａｘ-６の発現を阻害することを示した。、Ekker等, Curr. Biol. 5: 944-55 (1995); Li等, Development 124: 603-15 (1997); Macdonald等, Development 121: 3267-78 (1995)。最後に、ｆｕｓｅｄ-ＤＮ注入したＰａｘ-６胚の染色は発現の単一分野を明らかにし、前索板から発するＳＨｈの欠如が眼分野の中心におけるＰａｘ-６発現をダウンレギュレートすることを示唆している。
【００４６】
Ｈｈシグナル伝達経路におけるｆｕｓｅｄの位置を確認するために、ｈｆｕｓｅｄ-ＤＮを注入したアフリカツメガエル胚の底板におけるＳＨｈの発現がＧｌｉ-１の同時注入によって低下しうる。このことは、ＳＨｈシグナル伝達経路においてｆｕｓｅｄがＧｌｉと関連して作用することを示唆している。
ｆｕｓｅｄの組織分布は、それがＳＨｈ応答細胞において発現されることを示す。特に、その発現パターンは、それ自身がＳＨｈシグナル伝達経路の標的遺伝子であるＨｈレセプターの結合成分であるＰｔｃｈと良く重複する。これらのデータは、ｆｕｓｅｄが異なる組織に対してＳＨｈが有する広範な効果の媒介に含まれることを示唆している。機能的には、これはカエル胚において再び観察され、そこではｆｕｓｅｄ-ＤＮが眼の発達及び底板におけるＳＨｈ発現を阻害した。
また、ｈｆｕｓｅｄ-ＤＮは、インディアンＨｈによって調節されるカエル腸などの組織の正常な発達に影響することも明らかとなった。これは、ｆｕｓｅｄが各々ＩＨｈ及びＤＨｈ作用部位である腸及び精巣で発現されるという事実と組み合わせて、ｆｕｓｅｄが、Ｈｈタンパク質ファミリーの全メンバーについてのシグナル伝達の汎用メディエータであることを示唆している。
【００４７】
非常に高いレベルのｆｕｓｅｄｍＲＮＡが胚細胞に見出され、その発達はＤＨｈによって調節されることがわかった。ＤＨｈについてのホモ接合性変異マウスは胚細胞の発達が無く、生育可能だが繁殖不能である（Bitgood等, Curr. Biol. 6: 298-304 (1996)）。しかしながら、ヘッジホッグレセプターのＰａｔｃｈｅｄは、間質ライディヒ細胞で発現され、ｆｕｓｅｄが発現される胚細胞では発現されない、Bitgood等, 上掲。この不一致は、さらなるヘッジホッグレセプターの存在を示唆している。
本出願人は、実施例において、野生型ｈｆｕｓｅｄがリポーターアッセイにおけるＧｌｉを活性化できることを示す。さらに、ｆｕｓｅｄ-ＤＮを注入したカエル胚の底板におけるＳＨｈの発現は、Ｇｌｉ-１の同時注入によって救済される。これらを考え合わせると、これらの観察は、このシグナル伝達経路においてｆｕｓｅｄがＳｍｏの下流かつＧｌｉの上流にあるという主張に合致し、今日までのショウジョウバエにおける遺伝子証拠と一致する。
【００４８】
（２）脊椎動物ｆｕｓｅｄの一般的用途
脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、脊椎動物ｆｕｓｅｄ核酸は、ここに記載される組み換え技術による脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドの調製にも有用であろう。
全長天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄ遺伝子、又はその一部は、全長遺伝子の単離又は図１（配列番号：１）に開示された脊椎動物ｆｕｓｅｄ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、脊椎動物ｆｕｓｅｄの天然発生変異体又は他の種からの脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、図１（配列番号：１）の核酸配列から、又は天然配列脊椎動物ｆｕｓｅｄのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、脊椎動物ｆｕｓｅｄ遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明の脊椎動物ｆｕｓｅｄ遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、それらのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連した脊椎動物ｆｕｓｅｄ配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
【００４９】
また、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする核酸配列は、その脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドは、究極的にヘッジホッグシグナル伝達の変調をもたらすｆｕｓｅｄとの複合体形成に含まれる他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに用いることができる。あるいは、これらの分子は、その基質のｆｕｓｅｄキナーゼリン酸化を変調させることもできる。このような方法によって、結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、脊椎動物ｆｕｓｅｄは、関連する複合体形成タンパク質の単離に使用することもできる。スクリーニングアッセイは、天然脊椎動物ｆｕｓｅｄの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために、又は脊椎動物ｆｕｓｅｄに対して基質として作用するものの発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【００５０】
脊椎動物ｆｕｓｅｄ又はその修飾形態をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を作成するのに用いることができ、言い換えると、治療的に有用な薬剤の開発及びスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（マウス又はラット等）は、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするｃＤＮＡを、確立された技術により脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。特にマウス又はラット等のトランスジェニック動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでの脊椎動物ｆｕｓｅｄ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入された脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。例えば、基底細胞癌では、ケラチン５又は１４を用いて皮膚の基底細胞においてｆｕｓｅｄが過剰発現される可能性がある。発明のこの側面においては、動物を試薬で処理し、導入遺伝子を有する未処理の動物に比べ病状の発病率が低ければ、疾患に対する治療的処置の可能性が示される。
【００５１】
脊椎動物ｆｕｓｅｄの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入された脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする変更ゲノムＤＮＡと、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードする欠陥又は変更遺伝子を有する脊椎動物ｆｕｓｅｄ「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５'と３'末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas and Capecchi, Cell, 51:503 (1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えば電気穿孔法等によって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞を選択する［例えば、Li等, Cell, 69:915 (1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入され、集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、「ノックアウト」動物を作ると言われる。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及び病理的状態の進行に対して防御する能力によって特徴付けられる。
【００５２】
ｆｕｓｅｄは、Ｈｈファミリー（ＳＨｈ、ＩＨｈ、ＤＨｈ）の全メンバーに対する汎用メディエータとして関連しているので、一般的なＨｈシグナル伝達に関係する疾患状態及び疾病もｆｕｓｅｄ及びそのアンタゴニスト及びアゴニストで治療可能であろう。例えば、ＳＨｈ活性化（例えば、ｆｕｓｅｄアゴニスト）は、最近神経系の種々の変性疾患、例えば、パーキンソン病、記憶障害、アルツハイマー病、ルー・ゲーリグ病、ハンティングトン病、精神分裂病、発作及び薬物嗜癖の治療薬として推奨されている。最近の研究は、Ｄｈｈ変異性の雄が、成熟精子への分化を完全にする精母細胞の欠失による不妊であることを示唆している、Bitgood等, Curr. Biol. 6: 298-304 (1996); Bitgood等, Dev. Biol. 172: 126-138 (1995)。さらに、ｆｕｓｅｄアゴニストは、腸疾患、骨疾患、皮膚疾患、精巣の疾患、潰瘍、肺疾患、膵臓の疾患、糖尿病、骨粗鬆症の治療にも使用できる。
タンパク質キナーゼドメインの存在は、ｆｕｓｅｄが、Ｈｈシグナル伝達においてタンパク質キナーゼファミリーのメンバーと同様に作用することを示唆している。タンパク質キナーゼは、分化して成長している細胞における調節回路の必須成分である；Preat等, Nature 347: 87-89 (1990)。これらの酵素の多くは細胞外シグナルの伝達に含まれ、一次シグナルの効果を増幅し汎発するリン酸化事象のカスケードを介して作用する。前に述べたように、ショウジョウバエｆｕｓｅｄは他の細胞内セリン／トレオニンキナーゼに対してかなりの相同性を有する。多くのセリン／トレオニンキナーゼは、酵母菌及び哺乳動物の細胞周期制御に関連する、hUNTER, cELL 5: 823-829 (1987); Dunphy & Newport, Cell 55: 925-928 (1988); Lee & Nurse, Trend. Genet. 4: 287-290 (1988)。
【００５３】
また、Ｈｈシグナル伝達の抑制又は阻害も治療方法の対象である。不活性ｆｕｓｅｄがＨｈシグナル伝達を阻害することが示されたので、ｆｕｓｅｄアンタゴニストもＨｈシグナル伝達に対してアンタゴニスト的であると予測される。Ｈｈシグナル伝達の抑制は、Ｈｈシグナル伝達を特徴付けられる疾患状態又は疾病において有用である。例えば、ＳＨｈは基底細胞癌において活性であり、ＤＨｈは精母細胞において活性である。Ｈｈシグナル伝達の阻害剤又はアンタゴニストは、各々基底細胞の治療又は雄の避妊において有効な治療薬である。
Ｈｈシグナル伝達の刺激も治療方法の対象である。Ｈｈシグナル伝達の活性化は、不活性又は不十分なＨｈシグナル伝達に特徴付けられる疾患状態又は疾病において有用である。例えば、神経系の変性疾患、例えば、パーキンソン病、記憶障害、アルツハイマー病、ルー・ゲーリグ病、ハンティングトン病、精神分裂病、発作及び薬物嗜癖である。さらに、ｆｕｓｅｄアゴニストは、腸疾患、骨疾患、皮膚疾患、精巣の疾患（不妊症を含む）、潰瘍、肺疾患、膵臓の疾患、糖尿病、骨粗鬆症の治療に使用できる。
【００５４】
Ｆ．抗脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体
本発明は、さらに抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
本発明の抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【００５５】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００５６】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性のものである。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、脊椎動物ｆｕｓｅｄに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【００５７】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００５８】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成などしない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［US. Patent No.4,816,567；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに置換するか、本発明の抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに置換し、キメラ性二価抗体を産生することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意のポイントで切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【００５９】
３．ヒト化抗体
本発明の抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【００６０】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の技術も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。
【００６１】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方は脊椎動物ｆｕｓｅｄに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【００６２】
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【００６３】
Ｇ．抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体の用途
本発明の抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体は、脊椎動物ｆｕｓｅｄの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。Hunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法を含む、抗体を検出可能な部位に抱合するためにこの分野で知られた任意の方法が用いられる。
また、抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体は、組換え細胞培養又は天然供給源からの脊椎動物ｆｕｓｅｄのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、脊椎動物ｆｕｓｅｄに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾過紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製する脊椎動物ｆｕｓｅｄを含む試料と接触させた後、固定された抗体に結合した脊椎動物ｆｕｓｅｄ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、脊椎動物ｆｕｓｅｄを抗体から離脱させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【００６４】
Ｈ．融合アンタゴニスト
本発明の融合アンタゴニスト及びアゴニスト化合物を生成させるのに幾つかの方法を好適に用いることができる。アンタゴニスト分子が細胞内部に標的化でき、野生型ｆｕｓｅｄを正常な作用から阻害又は防止する任意の方法が好ましい。例えば、実施例で同定されるドミナントネガティブ変異体等の変異体ｆｕｓｅｄを含む競合的阻害剤は、ｆｕｓｅｄのＨｈシグナル伝達に必要な他のタンパク質との正しい結合を阻止する。膜貫通輸送に適した電荷、サイズ及び疎水性等の、そのようなアンタゴニスト又はアゴニスト分子のさらなる特性は、当業者によって容易に決定される。
ｆｕｓｅｄの模倣物又は他の相同体が同定され評価される場合、細胞を試験化合物に暴露し、ヒトｆｕｓｅｄのみに暴露したポジティブ対照、化合物にも天然リガンドにも暴露していないネガティブ対照と比較する。ｆｕｓｅｄシグナル変調のアンタゴニスト又はアゴニストを同定死評価する場合は、細胞を天然リガンドの存在下で本発明の化合物に暴露し、試験化合物に暴露していない対照と比較する。
【００６５】
本発明のアンタゴニスト／アゴニスト化合物のホスファターゼ阻害／促進活性の一次スクリーニングとして検出アッセイが用いられる。このアッセイは、試験範囲の濃度、例えば１００ｍＭから１ｐＭの範囲で試験し、リン酸化又はシグナル伝達が対照に比較して５０％減少又は増加する量の濃度を計算することにより、化合物の相対的能力を評価するのみ使用することもできる。
アッセイは、ｆｕｓｅｄ基質のリン酸化に影響する化合物の同定のために実施してもよい。特に、アッセイはｆｕｓｅｄのリン酸化活性を増大させる化合物の同定のために実施でき、アッセイは、ｆｕｓｅｄ基質のリン酸化を低下させる化合物を同定するために実施できる。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ、細胞ベースのアッセイ等を含むが種々の様式で実施できる。このようなアッセイの様式は、この分野で公知である。
本発明のスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用でき、特に、小分子薬剤候補の同定に適している。
【００６６】
（１）アンタゴニスト及びアゴニスト分子
ｆｕｓｅｄシグナル伝達のアンタゴニスト及び／又はアゴニストをスクリーニングするために、アッセイ混合物を、候補となる製薬剤の存在下であるが、ｆｕｓｅｄが参照活性でヘッジホッグシグナル伝達を誘発する条件下でインキュベートした。混合物成分は、必要なヘッジホッグ活性を与えるために任意の順序で添加できる。インキュベーションは、最適な結合を促進する任意の温度、典型的には４℃から４０℃、より通常は１５℃から４０℃で実施する。インキュベーション時間も同様に最適結合のために選択されるが、迅速で高スループットのスクリーニングを促進するために最小化され、典型的には約０．１から１０時間、好ましくは５時間未満、より好ましくは２時間未満である。インキュベーションの後、候補製薬剤のｆｕｓｅｄシグナル伝達に対する効果を任意の便利な方法で決定する。細胞無しの結合型アッセイでは、結合及び非結合成分を分離するための分離工程がしばしば用いられる。分離は、例えば、沈殿（例えばＴＣＡ沈殿、免疫沈降など）、固定化（例えば、固体基体上）によってなされ、次いで洗浄される。結合したタンパク質は、それに結合した検出可能な標識により、例えば放射活性放出、光学又は電子密度を測定することにより、あるいは、例えば抗体抱合を用いて間接的な検出により検出される。
【００６７】
例えば、ｆｕｓｅｄアンタゴニスト及び／又はアゴニストに適したスクリーニング方法は、実施例に記載するｆｕｓｅｄ活性化Ｇｌｉリポーターアッセイに存在する薬剤の適用を含みうる。このようなスクリーニングアッセイは、ｆｕｓｅｄ発現組織における候補アンタゴニスト及び／又はアゴニストの存在下又は不存在下でのインサイツハイブリッド形成を比較し、ｆｕｓｅｄ変調細胞成長の不存在を確認することができる。典型的には、これらの方法は、固定化ｆｕｓｅｄをそれに結合すると予測される分子に暴露し、分子の固定化ｆｕｓｅｄへの結合又はリン酸化を測定すること及び／又は分子がｆｕｓｅｄを活性化（又は活性化を阻止）するか否かを評価することを含む。このようなｆｕｓｅｄ結合リガンドを同定するために、ｆｕｓｅｄを細胞表面で発現させ、合成候補化合物又は（例えば、血清又は細胞などの内因性供給源からの）天然発生化合物のライブラリのスクリーニングに用いることができる。
【００６８】
ｆｕｓｅｄのタンパク質−タンパク質相互作用に影響する好適な分子及びその結合タンパク質は、後者の断片又は相互作用及び正しい複合体形成を阻害する小分子、例えばペプチド模倣物を含む。そのような小分子は、通常１０Ｋ分子量未満であり、細胞に等価しやすいので治療薬として好適であり、種々の細胞機構による分解を受けにくく、タンパク質のように免疫を生じやすくない。小分子は、これらに限られないが、合成有機又は無機化合物を含む。多くの製薬会社が、そのような分子のライブラリを有しており、それは本発明のアッセイを用いて便利にスクリーニングできる。非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ペプチド模倣物、薬理学的試薬、及びそれらの代謝物、転写及び翻訳制御配列等を含む。
ｆｕｓｅｄに結合する分子の同定に好ましい技術は、アッセイ用プレートのウェルなどの固相に結合したキメラ基質（例えば、エピトープタグｆｕｓｅｄ又はｆｕｓｅｄイムノアドヘシン）を利用する。場合によっては標識された（例えば放射性標識された）候補分子の、固定化レセプターへの結合が測定できる。あるいは、Ｇｌｉの活性化についての競合が測定できる。アンタゴニスト及び／又はアゴニストのスクリーニングにおいて、ｆｕｓｅｄはｆｕｓｅｄ基質に暴露され、次いで推定アンタゴニスト及び／又はアゴニスト、又はｆｕｓｅｄ結合タンパク質及びアンタゴニスト及び／又はアゴニストが同時に添加され、アンタゴニスト及び／又はアゴニストのｆｕｓｅｄ活性化を阻止する能力が評価される。
【００６９】
（２）検出アッセイ
ｆｕｓｅｄポリペプチドは、ｆｕｓｅｄヘッジホッグシグナル伝達を変調させる治療的活性薬のためのリード化合物を同定するアッセイにおいて有用である。特に、ｆｕｓｅｄシグナル伝達複合体を防止又は形成する、あるいはｆｕｓｅｄ変調ヘッジホッグシグナル伝達を防止又は減弱する（例えば、ｆｕｓｅｄ自身又は基質に結合する）リード化合物は、便利に同定できる。
この分野で知られた種々の方法が、本発明のｆｕｓｅｄタンパク質の活性阻害の同定、評価又は検定に使用できる。ｆｕｓｅｄは他のキナーゼと同様の方式で作用すると考えられるので、キナーゼ／ホスファターゼモジュレータの同定で用いる公知の技術を本発明に用いてもよい。一般的に、そのようなアッセイは、培地中の標的細胞を化合物に暴露し、（ａ）細胞溶解物を生化学的に分析してリン酸化のレベル及び／又は同一性を評価する；又は（ｂ）試験基質に暴露していない対照細胞に比較して処理した細胞におけるフェノタイプ又は機能変化を評点化することを含む。このようなスクリーニングアッセイは、米国特許第5,602,171号、米国特許第5,710,173号、WO 96/35124及びWO 96/40276に記載されている。
【００７０】
（ａ）生化学的検出技術
生化学的分析技術は種々の技術によって評価できる。本発明で使用できる１つの典型的なアッセイ混合物は、ｆｕｓｅｄ及び通常はｆｕｓｅｄに付随するタンパク質（例えばＧｌｉ）を、通常は単離された、部分的に純粋又は純粋な形態で含有する。これらの成分の一方又は両方は、例えばアッセイ条件下でタンパク質−タンパク質結合を提供又は促進し、安定性を向上させる他のペプチド又はポリペプチドに融合してよい。さらに、成分の一方は、通常検出可能な標識を含むかそれに結合している。標識は、放射活性、蛍光、光学又は電子密度等の測定による直接検出、あるいはエピトープタグ、酵素等の間接的検出を提供する。アッセイ混合物は候補製薬剤をさらに含み、場合によっては、結合を促進し、安定性を向上させ、非特異的又はバックグラウンド相互作用を減少させ、又はアッセイの効率又は感度を向上させる種々の他の成分、例えば塩、バッファー、担体タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等を含む。
【００７１】
以下の検出方法は、シグナル伝達基質分子及びｆｕｓｅｄを含む細胞溶解物が本発明の化合物と混合された細胞無しの系で使用できる。基質は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の添加によるキナーゼ反応の開始によりリン酸化される。化合物の活性を評価するために、反応混合物をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析してもよく、あるいは、それを固体支持体に結合した基質特異的固着抗体に添加し、分離又は捕捉した基質に上記の検出方法を実施してｐＳｅｒ／Ｔｈｒの存在又は不存在を評価してもよい。結果は、化合物を添加しない反応混合物で得られた結果と比較する。細胞無しの系は、天然リガンド又はその同定の知識を必要としない。細胞無しの系は、化合物を添加しない混合物を必要としない。細胞無しの系は、天然リガンド又はその同定の知識を必要としない。例えば、Posner等（米国特許第5,155,031号）は、パーバナデート（pervanadate）のＰＴＰ活性を阻害する能力を示すのに、基質としてのインシュリンレセプター及び標的細胞としてのラット脂肪細胞の使用を記載している。他の例、Burke等, Biochem. Biophys. Res. Comm. 204: 129-134 (1994)は、ホスホチロシル模倣物の阻害活性の評価における自己リン酸化インシュリンレセプター及び組換えＰＴＰ１Ｂの使用を記載している。
【００７２】
（ｉ）全細胞検出
共通の技術は、細胞を脊椎動物ｆｕｓｅｄ及び放射性標識リン酸塩とともにインキュベートし、溶解物からＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）技術を用いて、一次又は二次元のいすれかで細胞性タンパク質成分を分離し、Ｘ-線フィルムに暴露してリン酸化タンパク質の存在を検出することを含む。検出は、放射性標識を用いることなくなすこともできる。そのような技術において、タンパク質成分（例えば、分離されたＳＤＳ-ＰＡＧＥ）はニトロセルロース膜に移され、そこでリン酸化セリン／トレオニンの存在が抗ホスホセリン／トレオニン抗体（抗-ｐＳ／Ｔ）を用いて検出される。
あるいは、抗-ｐＳ／Ｔは、セイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素に抱合させ、次いで酵素用の比色基質を添加することにより検出される。さらなる代替法は、抗-ｐＳ／Ｔを認識する二次抗体と反応させることによる抗-ｐＳ／Ｔの検出を含み、この二次抗体は、既に述べたように放射活性又は酵素で標識されている。これらの例及び類似の技術は、Hansen等, Electrophoresis 14: 112-126 (1993); Campbell等, J. Biol. Chem. 268: 7427-7434 (1993); Donato等, Cell Growth Diff. 3: 258-268 (1992); Katagiri等, J. Immunol. 150: 585-593 (1993)に記載されている。さらに、抗-ｐＳ／Ｔは、それを放射活性物質で標識し、次いで標識ニトロセルロースをスキャンニングして放射活性又は検出するか、Ｘ-線フィルムに暴露することにより検出できる。
【００７３】
（ｉｉ）キナーゼアッセイ
ｆｕｓｅｄアンタゴニスト／アゴニストについての本発明のスクリーニング方法がエキソビボアッセイとして行われる場合、標的キナーゼ（例えばｆｕｓｅｄ）は実質的に精製されたポリペプチドでありうる。キナーゼ基質（例えば、ＭＢＰ、Ｇｌｉ）は実質的に精製された基質であり、アッセイにおいて、キナーゼに触媒される実質的に精製されたリン酸塩供給源との反応でリン酸化される。リン酸化の程度は、反応でリン酸化された基質の量を測定することにより決定される。種々の可能な基質を使用してよく、キナーゼ自身も含まれるが、その場合はアッセイで測定されるリン酸化反応は自己リン酸化である。外因性基質を用いることもでき、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）等の標準的なタンパク質基質；酵母菌タンパク質基質；合成タンパク質基質、及びポリマー基質が含まれる。これらの中で、ＭＢＰ及び他の標準的タンパク質基質が好ましいとされる（実施例１０参照）。他の基質も同定されるが、それらは、キナーゼに対する親和性、反応速度の最小の摂動、単一又は相同反応部位の保持、取扱及び反応後回収の容易さ、強いシグナル生成能力、及び試験化合物に対する耐性及び不活性によって優れている。
本発明のエキソビボアッセイでリン酸化された基質量の測定は、イムノアッセイ、ラジオアッセイ又は他の周知の方法で行うことができる。イムノアッセイ測定において、反応中に形成されるリン酸化部位に特異的な抗体（ヤギ又はマウス抗-ホスホセリン／トレオニン抗体）を使用してよい。周知のＥＬＩＳＡ技術を用いて、ホスホセリン／トレオニン抗体複合体は、測定可能なシグナル（例えば、蛍光又は放射活性標識）を発生することのできる標識に結合した更なる抗体により、それ自身検出される。さらに、ミクロタイタープレートにおけるＥＬＩＳＡ型アッセイはを精製された基質の試験に用いてもよい。Peraldi等, J. Biochem. 285: 71-78 (1992); Schaag等, Anal. Biochem. 211: 233-239 (1993); Cleavland, Anal. Biochem. 190: 259-253 (1990); Farley, Anal. Biochem. 203: 151-157 (1992)及びLozaro, Anal. Biochem. 192: 257-261 (1991)。
【００７４】
例えば、検出計画は、キナーゼ反応中の基質消費を測定することができる。最初に、リン酸塩供給源を３２Ｐ又は３３Ｐ等の同位体で放射性標識し、反応中に基質に取り込まれた放射性標識の量を決定することによりリン酸化された基質の量を測定してもよい。検出は、（ａ）フィルター又はミクロタイターウェル表面に吸着させた後、ベータカウンターを用いる市販の閃光体含有プレート及びビーズ、又は（ｂ）シンチレーション近接アッセイビーズ又は閃光体プレートに結合させた後の光度測定手段により達成される。Weernink及びKijken, J. Biochem. Biophs. Methods 31: 49, 1996; Brauwalder等, Anal. Biochem. 234: 23 (1996); Kentrup等, J. Biol. Chem. 271: 3488 (1996)及びRusken等, Meth. Enzymol. 200: 98 (1991)。
好ましくは、基質は、固体支持体表面に非特異的又は好ましくは特異的に結合させる。このような結合は、シグナル検出に先立ってリン酸化基質を非リン酸化標識リン酸塩供給源（アデノシン三リン酸など）から分離するのを可能にする。一実施態様では、基質は反応の前に、ＮｕｎｃＴＭ高タンパク質結合プレート（Hanke等, J. Biol. Chem. 271: 695 (1996)）又はＷａｌｌａｃ ＳｃｉｎｔｉＳｔｒｉｐＴＭプレート（Brauwalder等, Anal. Biochem. 234: 23 (1996)）の使用を介して物理的に固定化される。また、基質は、例えばＰ８１ホスホセルロース（塩基性ペプチド用）、ＰＥＩ／酸性モリブデン塩樹脂又はＤＥＡＥ上への捕捉、又はＷｈａｔｍａｎＴＭ３ＭＭペーパーへのＴＣＡ析出により反応後に固定化してもよい、Tiganis等, Arch. Biochem. biophys. 325: 289 (1996); Morawetz等, Mol. Gen. Genet. 250: 17 (1996); Budde等, Int. J. Pharmacognosy 33: 27 (1995)及びCasnellie, meth. Enz. 200: 115 (1991)。さらに他の可能性は、予め支持体に結合させたグルタチオン及びストレプトアビジン（各々ＧＳＴ及びビオチンの場合）等の結合パートナーで抱合することにより、あるいは同様に支持体に結合させたタグに特異的な抗体を介して支持体表面に基質を結合させる事である。
【００７５】
上記のものに適したさらなる検出方法を開発してもよい。特に、高スループットスクリーニングに関連した用途では、そのような方法は、良好な選択性及び特異性、延長された直線範囲、低いバックグラウンドシグナル、最小の変動、他の試薬との相容性、及び自動取扱システムとの相容性を示すことが予測される。
本発明の治療のインビボ有効性は、種々の齧歯類モデルにおいて化学的に誘発された腫瘍に対して実験できる。腫瘍細胞系はインビトロ細胞培地で成長させ、実験用齧歯類、例えばマウスに、例えば皮下経路での注射によって導入される。実験動物における腫瘍の化学的誘発の技術は、この分野で良く知られている。
【００７６】
（ｂ）生物学的検出技術
本発明のアンタゴニスト／アゴニスト化合物の、それ自身がヘッジホッグシグナル伝達を変調するｆｕｓｅｄの活性を変調させる能力は、リガンド結合に伴う形態又は機能変化についての評点化によって測定される。この分野で知られている定性的及び定量的技術は、ｆｕｓｅｄの制御下で起こる細胞プロセスの観察及び測定のために適用できる。また、本発明の化合物の活性は、ヘッジホッグシグナル伝達の機能不全によって生ずる又はそれに関連する疾患の実験的モデルを用いて動物で評価することもできる。例えば、マウスにおける無効なＤＨｈヘッジホッグシグナル伝達は、生存できるが繁殖できないマウスを導く。また、変異体ｆｕｓｅｄ（ｈｆｕｓｅｄ-ＤＮ）の効果も、ＩＨｈ発現によって調節される腸の発達に影響する。さらに、正しいＳＨｈシグナル伝達は、脊索及び底板、神経管、末端肢構造、脊柱及び肋骨におけるマウス胚成長に重要である。また、不正なＳＨｈシグナル伝達は単眼症に関連している。これらのフェノタイプ特性は、ｆｕｓｅｄアンタゴニスト及び／又はアゴニストについてのスクリーニングアッセイにおいて評価され定量化される。ヘッジホッグの過剰発現に伴う疾患状態は、基底細胞癌に関連するが、不活性なソニックヘッジホッグシグナル伝達は、異常な神経発達を導く。
これらの細胞培養アッセイ及び動物実験で得られたデータは、ヒトで使用するための用量範囲の処方に用いられる。本発明の化合物の用量は、毒性を殆ど又は全く持たない循環濃度の範囲内にある。用量は、採用する投与形態及び投与経路に応じてこの範囲内で変化する。
【００７７】
（２）アンチセンスヌクレオチド
アンタゴニストの他の好ましい部類は遺伝子治療技術の使用を含み、アンチセンスヌクレオチドの投与を含む。適用可能な遺伝子治療技術は、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は複数回投与を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、インビボでの或る種の遺伝子の発現を阻止するための治療薬として使用できる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に移入でき、それらは、細胞膜による制限された取り込みによって生ずる低い細胞内濃度にも関わらず阻害剤として作用する、Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 (1986)。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステル基を不荷電基で置換することにより、それらの取り込みを促進させるように修飾することができる。
【００７８】
生存細胞に核酸を導入するために知られた種々の技術がある。これらの技術は、インビボ、インビトロで培養された細胞に、又はインビボで対照とする宿主の細胞に移行されるかによって変化する。インビトロで哺乳動物細胞に核酸を移行するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用を含む。現在好ましいインビボ遺伝子移行技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルスコートタンパク質−リポソーム媒介形質移入を含む、Dzau等, Trends Biotech. 11: 205-210 (1993)。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする試薬と共に提供するのが好ましく、例えば、エンドサイトーシスを伴う細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体をターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いてもよく、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクリングで内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262: 4429-2232 (1987); Wagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)に記載されている。周知の遺伝子作成及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science 256: 808-813 (1992)を参照のこと。
一実施態様では、ｆｕｓｅｄアンタゴニスト及び／又はアゴニスト分子は細胞の内因性リガンドに結合するのに用いられ、それにより、特に細胞内のｆｕｓｅｄのレベルが正常な生理的レベルを越える場合、細胞をｆｕｓｅｄ野生型に非応答性とする。また、内因性ｆｕｓｅｄ基質、又は望ましくない細胞反応（腫瘍細胞の増殖など）を活性化する複合体形成剤に結合するのが有利であろう。
本発明のさらなる実施態様では、ｆｕｓｅｄ発現は、ｆｕｓｅｄタンパク質の発現を低下させるのに有効な量のｆｕｓｅｄアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡとともにｆｕｓｅｄ発現細胞を提供することにより低下させうる。
【００７９】
Ｉ．診断的用途
ここに記載した本発明の化合物（例えば、ヒト及び脊椎動物ｆｕｓｅｄ、脊椎動物ｆｕｓｅｄ変異体及び抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体）の他の用途は、ｆｕｓｅｄ又はヘッジホッグシグナル伝達により疾患が幾分進行したか否かの診断を助けることである。例えば、基底細胞癌細胞は活性なヘッジホッグシグナル伝達に関連する。
ヘッジホッグシグナル伝達によって特定の疾患が導かれるか否かを決定する診断アッセイは以下の工程を用いて実施される：（１）細胞又は組織の培養；（２）ｆｕｓｅｄ変調ヘッジホッグシグナル伝達を阻害できる化合物の投与；及び（３）細胞溶解物中のｆｕｓｅｄ基質又は試験細胞におけるヘッジホッグ媒介フェノタイプ効果に対するキナーゼ減弱の程度の測定。工程は、この開示に照らして標準的な技術を用いて実施できる。例えば、細胞又は組織の単離及び培養又はインビボに標準的な技術を使用できる。
【００８０】
選択性の程度が変化した化合物類は、ｆｕｓｅｄの役割を診断するのに有用である。例えば、他の形態のキナーゼに加えてｆｕｓｅｄを阻害する化合物は、幾つかのセリン／トレオニンキナーゼが疾患を導くか否かを決定する最初の試験化合物として使用できる。選択的化合物は、次いで、疾患の誘導における他のセリン／トレオニンキナーゼの可能な役割をさらに評価するのに使用できる。試験化合物は、細胞毒性効果の発揮よりも、セリン／トレオニンキナーゼ活性の阻害において有力であるべきである（例えば、ＩＣ５０／ＩＤ５０が１より大きい）。ＩＣ５０及びＩＤ５０は、ＭＴＴアッセイ等の標準的技術、又はＬＤＨ放出量の測定により測定できる。化合物のＩＣ５０／ＩＤ５０の程度は、診断アッセイの評価を考慮すべきである。一般的に、比率が大きくなると情報がより相対的になる。適切な対照は、化合物の起こりうる毒性効果を考慮し、例えば、増殖疾患を伴わない細胞（例えば対照細胞）の試験化合物での処理は、診断アッセイの一部として用いることができる。本発明の診断方法は、ｆｕｓｅｄのヘッジホッグシグナル伝達に対する効果を変調させる試薬についてのスクリーニングを含む。例示的な検出技術は、放射性標識及び免疫沈降を含む（米国特許第5,385,915号）。
【００８１】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
（実施例）
実施例で言及されている全ての他の市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランドである。
【００８２】
実施例１
ヒトｆｕｓｅｄｃＤＮＡクローンの単離
発現された配列タグ（ＥＳＴ）データベース（LIFESEQＴＭ、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を、ショウジョウバエのセグメントポラリティ遺伝子ｆｕｓｅｄ（配列番号：２６）（Preat等, Nature 347: 87-9 (1990)）のヒト相同体について検索した。ＥＳＴIncyte #2525662（図２）（配列番号：３）を潜在的な候補として同定した。ヒトｆｕｓｅｄクローンを含むヒトｃＤＮＡライブラリを同定するために、ｐＲＫ５におけるヒトｃＤＮＡライブラリを以下のプライマーを用いたＰＣＲによって最初にスクリーニングした：
h-FUSED.f(配列番号：８)5'-CAATACAATGGTGCTGACATCCATCAAAGGCA-3'
h-FUSED.r(配列番号：９)5'-GAAGGGAGGGGTGCCTACTGCCA-3'。
胎児肺ライブラリを選択し、加熱開始した後に添加した１０μｌの１０ｘＰＣＲバッファ（Perkin Elmer）、１μｌのｄＮＴＰ（２０ｍＭ）、１μｌのライブラリＤＮＡ（２００ｎｇ）、０．５ｍｌのプライマー、８６．５μｌのＨ２Ｏ及び１μｌのAmplitaq(登録商標)（Perkin Elmer）を含む反応においてｈ-ＦＵＳＥＤ．ｆプライマー（配列番号：８）を用いてｄｕｇ／ｂｕｎｇ宿主で成長させたプラスミドライブラリから一本鎖ＤＮＡを発現させることによりｆｕｓｅｄｃＤＮＡクローンを富化した。反応は９５℃で１分間変性させ、６０℃で１分間アニールし、次いで７２℃で２０分間伸展させた。ＤＮＡをフェノール／ＣＨＣｌ３で抽出し、エタノール沈殿させ、次いでエレクトロポレーションによりＤＨ１０Ｂ宿主細菌に移行させた。各形質転換体からのクローンをプレートしてナイロン膜上に載せ、以下の配列のＥＳＴ配列から誘導されたオリゴプローブでスクリーニングした：
h-FUSED.p(配列番号：１０)5'-CTCCAGCTCTGGAGACATATAGAGTGGTGTGCCTTTGA-3'。
オリゴプローブを、［γ-３２Ｐ］-ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識した。フィルターは、４２℃において、５０％のホルミアミド、５ｘＳＳＣ、１０ｘデンハード、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌの超音波処理サケ精子ＤＮＡ中でハイブリッド形成した。次いでフィルターを２ｘＳＳＣでリンスし、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄し、次にKodak(登録商標)Ｘ線フィルムに暴露した。約５ｋｂの挿入物を含む２つの陽性クローン（ＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）及びＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）−図４及び５）を単離して配列決定した。クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）は位置１１６に潜在的な開始メチオニン、次いで１９４４ｂｐのオープンリーディングフレームを含む（図４）。しかしながら、このオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ショウジョウバエｆｕｓｅｄの７９５アミノ酸配列より若干短い６４８アミノ酸長のタンパク質をコードする。興味深いことに、第２のオープンリーディングフレームは、ｃＤＮＡの３’領域、ヌクレオチド２２９５から４３４９に存在し（図４）、ｃＤＮＡが不正にスプライシングされ、イントロンが２つのＯＲＦ間に残り、ｆｕｓｅｄの選択的にスプライシングされた変異体に対応することを示唆している。クローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）の配列は極めて類似している。クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）とクローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）との間には１ヌクレオチドの相違があり、それはクローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）の位置１８６３の第１のＯＲＦに位置し（Ａ対Ｇ）、コード化配列を位置５８３においてＧｌｎからＡｒｇに変化させる（図４）。この変化は、対立遺伝子変異によると思われる。クローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）の第１のオープンリーディングフレームは、残基１１５で開始し、６４７アミノ酸長のオープンリーディングフレームが続く。配列は、上記の位置５８３における１つの変化及び第１のオープンリーディングフレームにおける少なくとも９残基を除いて一致している。
【００８３】
実施例２
ｆｕｓｅｄクローンの発現
クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）及びクローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）に対応するｃＤＮＡから発現されるタンパク質のサイズを決定するために、ＨＡエピトープタグをタンパク質のＮ-末端に以下のプライマーを用いたＰＣＲによって挿入した：
Hfus.Cla-Ha.F:(配列番号：１１)
5'-CCATCGATGTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTGAAAAGTACCACGTGTTGGAGATG-3'
及びhFus.Xba.R:(配列番号：１２)
5'-GCTCTAGACTAAGGGGCAGGTCCTGTGTTCTG-3'。
ＰＣＲ産物を精製し、ＣｌａＩ-ＳｍａＩで消化し、クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）及びクローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）を含むｐＲＫ５プラスミドにサブクローニングした。各作成物からのＤＮＡを、ＣａＰＯ４法（Sambrook等, 上掲; Ausuble等, 上掲）を用いて２９３細胞に終夜形質移入した。形質移入の約２４時間から４８時間後、細胞を回収し、細胞ペレットを１ｍｌのリシンバッファー（５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮＰ４０、アプロチニン、ロイペプチン、-ＰＭＳＦ、１ｍＭのＮａＦ及び１ｍＭのバナジン酸ナトリウム）に４０℃で２０分間溶解させた。抽出物を１０分間１０Ｋでスピンし、次いで上清を新たな管に移して２０μｌのプロテインＡセファロースがで１時間プレクリアした。プロテインＡセファロースをスピンダウンし、１μｌの抗-ＨＡ抗体（５μｇ、Boehringer）を各管に添加した。４℃で終夜インキュベートした後、３０μｌのプロテインＧセファロースＴＭがを添加し、管を４℃で１時間インキュベートした。次いでプロテインＧセファロースビーズを１分間スピンダウンし、溶解バッファーで３回洗浄し、２０μｌのｌａｅｍｌｉバッファーにベータ-メルカプトエタノールの存在下で再懸濁した。試料を１００℃で５分間変性させ、次いで６％ポリアクリルアミドゲルに負荷した。次いでタンパク質をニトロセルロースに移し、終夜１μｇ／ｍｌ阻止バッファー（ＰＢＳ、０．５％のTween(登録商標)、５％の脱脂粉乳、３％のヤギ抗体）中で同じ抗-ＨＡ抗体を用いたウェスタンブロットにより、次いで抗-マウスＨＲＰにより分析した。検出にＥＣＬを用い、膜をＸ-線フィルムに９０秒間暴露した。クローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）に対応する作成物で形質移入した細胞の細胞ペレットにおいて１５０ｋＤａの特異的バンドを検出し、クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）については約１００ｋＤａの特異的バンドを検出した（図６）。これらのバンドは、偽形質移入の対照物では存在しなかった。１５０ｋＤａのバンドが存在することは、ＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）の２つのオープンリーディングフレームが共にスプライシングされ、１５０ｋＤａの大きなタンパク質の合成を指向していることを示唆している。ＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）にこのバンドが無いことは、こｎクローンが明らかに正しくスプライシングされ得ないことを示唆している。ｆｕｓｅｄ遺伝子の選択的なスプライシングは、幾つかの異なる生成物の生成を導くと思われ、それがｆｕｓｅｄ活性の機構又は調節となりうる。ショウジョウバエｆｕｓｅｄタンパク質のＣ-末端の特定領域は分子の活性に必要であることが知られている、Therond等, Genetics 142: 1181-1198 (1996); Robbins等, Cell 90: 225-234 (1997)。従って、Ｃ-末端において切断される短いｆｕｓｅｄ分子は、分子の不活性又はドミナントネガティブ形態に相当するかもしれない。
【００８４】
実施例３
ノーザンブロット
より大きなｆｕｓｅｄｃＤＮＡを単離し、全長１５０ｋＤａのｆｕｓｅｄ分子をコードする転写物を同定するのに最良の組織を決定するために、Clontechからのヒトの複数組織のノーザンブロットＩ、ＩＩ及び胎児ブロットを、ランダムプライミングによって標識したクローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）から誘導された１．６ｋｂ、ＣｌａＩ-ＡｃｃＩ断片でプローブした。ブロットは、５０％のホルムアミド、５ｘＳＳＣ、１０ｘデンハード、０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍｇ／ｍｌ超音波処理サケ精子ＤＮＡ中、全てを１ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌの３２Ｐ標識プローブの存在下、４２℃で終夜ハイブリッド形成した。ブロットを２ｘＳＳＣで室温において１０分間洗浄し、０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃で３０分間洗浄し、次いでＸ-線フィルムに終夜暴露した。図７は、ｆｕｓｅｄメッセージが精巣では高レベルで、胎児組織を含む他の殆どの組織では低レベルで発現されたことを示している（図７）。
【００８５】
実施例４
正しくスプライシングされた形態を同定するための異なる組織に対するＰＣＲ
２つの潜在的なＯＲＦが共に正しくスプライシングされたｃＤＮＡを単離するために、
我々は以下の潜在的なイントロンに隣接するプライマーを設計し、ヒト胎児脳、脳、ケラチノサイト、精巣、卵巣、胎児肝臓、及び肺テンプレートを含む種々の組織を増幅した。
F1(配列番号：１３) 5'-CTGACGACACAGCAGGTTGTC-3'
R4(配列番号：１４) 5'-CAGATGCTTCAGGATGGACAT-3'
各ｃＤＮＡライブラリ２マイクロリットルをテンプレートとして用い、Klentaq(登録商標)ポリメラーゼでＰＣＲを行った。ＰＣＲは、９４℃での１分間の変性、５５℃での１分間のアニーリング、及び６８℃での２分間の伸展を具備する４５サイクルの増幅で実施した。反応の五分の一を１％アガロースゲルに負荷してサザンブロットをした。ブロットを、ノーザンブロットについて記載したようなランダムプライミングにより標識した全長fusedプローブで終夜ハイブリッド形成した。
１ｋｂのＰＣＲ断片を、胎児脳、精巣及び卵巣で同定した。この断片をゲル精製し、上記で同定したＦ１及びＲ４プライマー（配列番号：１３及び１４）の両方及び以下のプライマーを用いた直接ＰＣＲ配列決定法を施した：
hf16(配列番号：１５) 5'-AGAGTAGCAACGTCACTGC-3'
hf8(配列番号：１６) 5'-CCTCACTGACAAGGCAGCAGG-3'
hf19(配列番号：１７) 5'-CCCGAGGAGGCATCTGCACAG-3'。
【００８６】
この１ｋｂの断片の配列決定は、イントロン配列が存在せず、２つのＯＲＦが同じ読み枠において互いに結合されているをとを明らかにした。正しくスプライシングされた配列の配列は図１（配列番号：１）に示す。開始剤ＡＴＰは位置１６１に存在し、３９４５ヌクレオチドのＯＲＦが続き、それは１３１５アミノ酸長の１４４ｋＤａの推定分子量を持つタンパク質をコードする。
ショウジョウバエｆｕｓｅｄ（配列番号：２３）との全体的類似性は２８％である（図２）。キナーゼドメインを含むタンパク質のＮ-末端２６３アミノ酸ドメインは、ショウジョウバエｆｕｓｅｄキナーゼドメインに５５％相同性である。タンパク質の残りの１０５２アミノ酸部分は、他の知られたタンパク質と感知できる程の相同性はなく、興味深いことに、ショウジョウバエｆｕｓｅｄの対応領域とも相同ではない。興味深いことに、非相同性のこの領域は、活性に必要とされることがわかったハエタンパク質のＣ-末端近傍を含む、Robbins等, Cel 90: 225-34 (1997); Therond等, Genetics 142: 1181-98 (1996)。上記の不正にスプライシングされたｃＤＮＡは、切断されたＣ-末端を持つ分子の精製を導き、ｆｕｓｅｄ活性の調節機構となりうるｆｕｓｅｄ遺伝子の選択的スプライシングを反映している。
【００８７】
実施例５
正しくスプライシングされた全長ヒトｆｕｓｅｄの再構成
ｆｕｓｅｄクローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）をｐＲＫ５ＢプラスミドからｐＲＫ５．ｔｋｎｅｏにＣｌａＩ-ＨｉｎｄＩＩＩを用いてサブクローニングした。ＰＣＲは、テンプレートとしてのヒト精巣ｃＤＮＡ及びプライマーｈｆ３（配列番号：１８）（CAGAACTTCAGGTCCTAAAGG）及びＲ４（上記の配列、実施例４）を用いて実施した。ＰＣＲ条件は、（９４℃、１分間、４６℃〜６８℃の温度勾配アニーリング１分間、及び６８℃、４分間）の４５サイクルであった。ＰＣＲ断片をＡｃｃＩで消化し、ｐＲＫ５．ｔｋｎｅｏ．ｆｕｓｅｄプラスミドに結合し、イントロンを含む領域を正しくスプライシングした形態に置換するためにＡｃｃＩで切断した。２つのサブクローンは、２つのＡｃｃＩ部位の間に配列し、同じ正しい配列を有していた。
【００８８】
実施例６
インサイツハイブリッド形成
Ｅ１１．３及びＥ１３．５マウス胚を、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で終夜浸漬固定し、１５％スクロース中で終夜凍結保存し、Ｏ．Ｔ．Ｃ．に包埋し、そして液体窒素で凍結させた。成熟マウス脳を新たに粉末ドライアイスで凍結させた。Ｐ１マウス脳、成熟マウス精巣及び成熟ラット脊髄をＯ．Ｔ．Ｃ．に包埋し、液体窒素で凍結させた。断面は１６ｍｍで切断し、Phillips等, Science 250: 290-294 (1990)の方法によりｆｕｓｅｄについてインサイツハイブリッド形成のために加工した。ＲＮＡプローブは、Melton等, Nucleic Acids Res. 12: 7035-7052 (1984)に記載されたように３３Ｐ-ＵＴＰで標識した。センス及びアンチセンスプローブを、ヒト配列のアミノ酸残基３１７−４８６のコード化領域に対応する、各々Ｔ３及びＴ７を用いてマウスｆｕｓｅｄＤＮＡ断片から合成した。
図８は、マウスｆｕｓｅｄｍＲＮＡが、神経管、前体節中胚葉、体節、発達中の肢芽及び皮膚を含むＳＨｈ応答性組織に広範に分布していることを示す。ｆｕｓｅｄの転写物は、胚性長、精巣、軟骨及び筋肉−Ｈｈタンパク質ファミリーの他のメンバー：デザート及びインディアンに暴露される組織において見出された。Ｅ１１．５マウス神経系において、高レベルのｆｕｓｅｄ転写物が、前脳、中脳、後脳及び脊髄に渡って検出された。これらの高レベルの発現は、１３．５の胚日数でも残っていた。胚日数１１．５及び１３．５の両方において、ｆｕｓｅｄｍＲＮＡは主に神経管の腹側側面、腹側正中線誘導ＳＨｈに暴露されると思われる領域で検出された。出生後１日まで、ｆｕｓｅｄの脳に渡って広く拡散した発現が維持され、高レベルの転写物が皮質、海馬、上衣及び脈絡叢で検出された。成熟体において、脳全体にｆｕｓｅｄの低レベル発現が検出され、より高いレベルは上衣で確認された。
【００８９】
ｆｕｓｅｄ及びＨｈレセプター成分、Ｓｍｏ及びＰｔｃｈの組織分布はかなりの重複を示した。これらは全て最初神経管並びに他のＨｈ応答性組織に渡って発現された。しかしながら、ＳｍｏｍＲＮＡが背側−腹側軸に沿って均一に分布しているのに対し、Ｐｔｃｈ及びｆｕｓｅｄｍＲＮＡは腹側で高レベルに見出され、それらがＨｈによってアップレギュレートされることを示唆している。さらにＥ１２日まで、Ｓｍｏ及びＰｔｃｈの発現が主に腹側ゾーンの極めて近傍の細胞で見出されるが、ｆｕｓｅｄｍＲＮＡは未だに広く発現され、そのレベルは後になってのみ減少する。Ｓｍｏ及びｆｕｓｅｄの成熟体発現は、神経形成が続いている上衣で確認された。
成熟精巣でのｆｕｓｅｄ発現の詳細な分析は、インサイツハイブリド形成によって実施された（図９）。ｆｕｓｅｄは、精細管におけるＩ及びＩＩ期胚細胞において極めて高レベルで発現されることが見出された。ｆｕｓｅｄのレベルは、異なる精細管において変化し、その発現が分化の胚性細胞期に従って調節されることを示唆している。
【００９０】
実施例７
Ｇｌｉルシフェラーゼアッセイ
ｄｆｕｓｅｄとｈｆｕｓｅｄとの低い相同性が与えられたので、実際に単離されたｈｆｕｓｅｄが確かにＨｈシグナル伝達のメディエータであるか否かを決定するのが賢明である。以下のアッセイは、ショウジョウバエキュービタツインターラプタス（Ｃｉ）の哺乳類相同体である転写因子ＧＬＩの活性化を測定するために開発された。ＧＬＩは、細胞のＳＨｈ刺激時に活性化される転写因子であることが示された。
ＮＨＦ３βエンハンサーに存在するＧＬＩ結合部位の９つのコピー（Sasaki等, Development 124: 1313-1322 (1997））を、ｐＧＬ３プラスミド（Promega）のルシフェラーゼリポーター遺伝子を制御するチミジンキナーゼ最小プロモーターの前に導入した。ＧＬＩ結合配列は：TCGACAAGCAGGGAACACCCAAGTAGAAGCTC（ｐ９ＸＧｌｉＬｕｃ）（配列番号：１９）であり、ネガティブ対照配列は：TCGACAAGCAGGGAAGTGGGAAGTAGAAGCTC（ｐ９ＸｍＧｌｉＬｕｃ）（配列番号：２０）であった。これらの作成物を全長ｆｕｓｅｄ作成物、又はＦ１２、ＤＭＥＭ（50:50）、１０％のＦＣＳ熱不活性化中で成長させたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞中のソニックヘッジホッグと同時形質移入した。形質移入の前日に、ウェル当たり１ｘ１０５細胞を６ウェルプレートに２ｍｌ培地中で播種した。次の日に、１μｇの各作成物を、０．０２５ｍｇのｐｔｋＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼプラスミドで、１００μｌのＯｐｔｉＭｅｍ（GlutaMaxを含む）中のリポフェクタミン（Gibco-BRL）を用い、製造者の指示に従って３７℃で３時間再度同時形質移入した。次いで血清（２０％、１ｍｌ）を各ウェルに添加し、細胞を３７℃でさらに３時間インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次に３７℃で４８時間２ｍｌの培地中でインキュベートした。次いで各ウェルをＰＢＳで洗浄し、細胞を０．５ｍｌの受動的溶解バッファー（Promega）で１５分間室温で振盪装置上で溶解させた。溶解物を氷上のエッペンドルフ管に移し、冷却遠心機で３０秒間スピンし、上清を氷上で保存した。各測定について、２０μｌの細胞溶解物をポリプロピレン管内のＬＡＲＩＩ（ルシフェラーゼアッセイ試薬、Promega）の１００μｌに添加し、利子Ｆｅラーゼ光活性を測定した。停止及びグローバッファーの添加により反応を停止し、３から５回ピペット上下することにより混合し、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ光活性を照度計で測定した。
【００９１】
図６に示すように、ｆｕｓｅｄは、ＳＨｈ（５．５倍）と同様にしてＧＬＩ活性を誘発できる（９．５倍）。この結果は、単離されたｆｕｓｅｄ遺伝子がＳＨｈシグナル伝達のメディエータであることを示唆している。無関係なセリン-トレオニンキナーゼであるＡｋｔは、このアッセイで不活性であった（データは示さず）。ｆｕｓｅｄ活性は無傷のキナーゼドメインに依存し、この領域を欠く分子（ｆｕｓｅｄC-末端）（配列番号：２７）又はＡＴＰ結合部位のおよそアミノ酸位置３３に保存されたリシンの変異体（ｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５））はＧＬＩを活性化できなかった。同様に、キナーゼドメインのみはこのアッセイで活性でなかったので（ｆｕｓｅｄＫＤ）（配列番号：２４）、タンパク質のＣ-末端尾部がこの活性に必要である。各タンパク質の発現は、分子のＮ-末端に挿入されたＨＡタグを用いたウェスタンブロットによって確認された（データは示さず）。これらの結果は、本出願人によって単離されたｄｆｕｓｅｄの相同体が確かにｈｆｕｓｅｄであるという結論を立証する。さらに、これらの結果は、ｆｕｓｅｄがＳＨｈシグナル伝達の主要な標的であるＧｌｉの活性化が可能及び十分であり、よって脊椎動物におけるＳＨｈシグナル伝達の直接的メディエータであると思われる。
【００９２】
実施例８
カエル胚における誘発単眼症
序論：
ヒトｆｕｓｅｄ遺伝子が脊椎動物におけるＳＨｈシグナル伝達が可能であるばかりでなくそれに必要であることを示すために、ＡＴＰ結合部位の位置３３にあるリシンの変異を有するｆｕｓｅｄ-ＤＮ（ドミナントネガティブ）として知られるｆｕｓｅｄの変異体を生成した（配列番号：２５）。この残基は全てのキナーゼで保存され、キナーゼ活性に必須であり（Hanks等, Methods Enzymol. 200: 38-62 (1991)）、その他の残基への変換は殆どの場合ドミナントネガティブ変異体をもたらす。
【００９３】
方法：
プラスミド作成：
カルボキシ末端に挿入されたＨＡタグを持つ野生型ｆｕｓｅｄｃＤＮＡ（配列番号：１）をｐＲＫ５にサブクローニングし、位置３３のリシンをアルギニンに変換してドミナントネガティブ形態を生成させた。高次コイルプラスミドＤＮＡをQiagenにより調製し、アフリカツメガエル胚への注入に使用した。
アフリカツメガエル胚の操作：
成熟雌カエルを２００Ｉ．Ｕ．の妊娠雌血清で使用の３日前に、そして８００Ｉ．Ｕ．のヒト絨毛性ゴナドトロピンで注入の前夜にブースとした。次の朝に新鮮な卵母細胞を雌カエルから搾り出し、卵母細胞を犠牲にした雄カエルからの細かくした精子と混合することにより卵母細胞のインビトロ受精を実施した。発生胚を維持し、Nieuwkoop及びFaber, Normal Table of Xenopus laevis, N.-H.P.Co.,編集(Amsterdam. 1967)に従って段階分けした。
受精卵を２％のシステイン（ｐＨ７．８）で１０分間脱ジェリーし、蒸留水で１回洗浄し、５％フィコールを含む０．１ｘＭＢＳに移した。受精卵を５％フィコールを含む０．１ｘＭＢＳ中で注入トレーに並べた。２細胞期の発育中のアフリカツメガエル胚に、野生型ｆｕｓｅｄ（ＷＴ（配列番号：１））又はドミナントネガティブｆｕｓｅｄ（ＤＮ（配列バッｂ号：２５））を含むｐＲＫ５のいずれか２００ｐｇを注入した。注入した胚をトレー上にさらに６時間維持し、その後それらを５０ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含む０．１ｘＭＢＳに移し、眼の発育が完了するＮｉｅｕｋｗｌｏｏｐ段階３５に到達するまで３日間であった。
【００９４】
結果：
ヒトｆｕｓｅｄ遺伝子がヘッジホッグシグナル伝達のシグナルトランスデューサとして作用するか否かを試験するために、我々は野生型又はドミナントネガティブ形態のヒトｆｕｓｅｄを発育中のカエル胚に注入した。１２０ｐｇのＤＮＡを注入した胚は胞胚段階に正常に分割して正常に原腸胚形成した。野生型ｆｕｓｅｄ（配列番号２）注入及び偽注入した胚では眼の発育は正常であったが、ｆｕｓｅｄ-ＤＮ注入した胚の約３０％（表１）は、融合した眼構造又は幾分着色された網膜組織でつながった２つの眼を示した（図１１Ａ）。表１において、２００ｐｇのプラスミドＤＮＡは、２細胞段階胚の動物極に運ばれた。各試料は、少なくとも３つの独立した実験の結果を示す。胚は単眼症欠陥について目視で評点化した。
2010183906.tif 000002
【００９５】
観察された単眼症フェノタイプは、ＳＨｈに欠陥のあるマウス胚（Chiang等, Nature 383: 407-13 (1996)）及びＳＨｈシグナル伝達が構造的活性ＰＫＡの過剰発現で阻止されたゼブラフィッシュ胚の一つに極めて類似している、Hammerschmidt等, Genes Dev. 10: 647-58 (1996); Unger及びMoon, Dev. Biol. 178: 186-91 (1996)。さらに、脳（前脳）及び腸発達の両方が、ｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）注入胚で、後のオタマジャクシ発達段階において正常であることがわかった（図１１Ｂ）。これに対して、野生型ｆｕｓｅｄ（配列番号：２）又はＮ末端又はＣ-末端切断変異体（各々配列番号：２７及び２４）を過剰発現している胚は如何なる以上も示さなかった。
アフリカツメガエルの眼の正常な発達の間に、ショウジョウバエ無眼の脊椎動物相同体である転写因子Ｐａｘ-６の単一分野発現として眼原基が開始される、Li等, Development, 124: 603-15 (1997)。神経胚段階で、この眼分野は脊索前方の中胚葉からのシグナル阻害により２つの眼原基に別れる。ＳＨｈが脊索前方の中胚葉に誘導されるシグナルであり、それは眼分野の正中線にｐけるＰａｘ-６発現の阻害の原因となることが更に示された。
ｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）の過剰発現がどのようにしてアフリカツメガエル胚における融合眼を誘発するかをさらに理解するために、注入胚におけるＰａｘ-６の発現パターンを決定するための全量インサイツハイブリッド形成を実施した。図１１Ｃに示すように、ｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）を注入した胚におけるＰａｘ-６発現は単一の分野を保持している。よって、ｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）は、眼分野の正中線におけるＰａｘ-６発現の阻害からＳＨｈを妨げることにより単眼症フェノタイプを誘発すると考えるのが最も妥当である。
【００９６】
実施例９
ｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）注入アフリカツメガエル胚のＧｌｉによる救済
初期底板細胞におけるＳＨｈ発現は、脊索によって生成されるＳＨｈにより誘発される。底板におけるＳＨｈ発現もＳＨｈシグナル伝達が阻止された場合に阻害されるか否かを試験するために、ｆｕｓｅｄ-ＤＮ又は野生型作成物を注入した初期神経胚段階胚をＳＨｈ発現について染色した（方法については実施例８参照）。底板細胞又は初期神経胚段階胚におけるＳＨｈ発現は、変異ｆｕｓｅｄが過剰発現した場合には２８注入胚のうち２６で完全に抑制されたが（表２、図１１Ｃ左側の胚）、対照胚ではＳＨｈの発現に影響は無かった（図６Ｅ、右側の胚）。表２は、３つの独立した実験からの評点化したデータを示す。１００ｐｇのｆｕｓｅｄ-ＤＮ、１００ｐｇのｆｕｓｅｄ-ｗｔ又は５０ｐｇのＧｌｉ-１プラスミドを２細胞段階の胚に注入した。胚は初期神経胚段階でＳＨｈ染色のために回収した。
2010183906.tif 000003
【００９７】
このフェノタイプが底板におけるＳＨｈシグナル伝達経路の特異的阻害によることを確認するために、我々は、ｗｔｆｕｓｅＲＮＡとｆｕｓｅｄ-ＤＮＲＮＡとを１：１比率で同時注入することによりフェノタイプを救済することを試みた。表２は、ｗｔｆｕｓｅｄ及びｆｕｓｅｄ-ＤＮＲＮＡを同時注入した胚の８０％以上が底板において正常なＳＨｈシグナル伝達を示すことを示している。このことは、ｆｕｓｅｄ-ＤＮ注入胚におけるＳＨｈ発現が内因性ｆｕｓｅｄ活性の阻害により特異的に阻止されることを示している。
さらに、観察されたｆｕｓｅｄ-ＤＮのフェノタイプがＳＨｈシグナルカスケードによることを示し、ｈｆｕｓｅｄがこの経路でＧｌｉの上流で作用することを確認するために、我々は、Ｇｌｉの過剰発現もｆｕｓｅｄ-ＤＮ注入アフリカツメガエル胚のフェノタイプを救済できるのではないかと考えた。表２に示すように、ｆｕｓｅｄ-ＤＮ注入胚の底板におけるＳＨｈ発現は、Ｇｌｉが過剰発現されたときに完全に救済された。以上より、これらの発見は、脊椎動物ｆｕｓｅｄがＳＨｈ経路で機能し、ＳＨｈシグナル伝達経路においてＧｌｉの上流で作用する必須のメディエータであるという本出願人の仮説と一致する。
【００９８】
実施例１０
免疫沈降及びインビトロキナーゼアッセイ
ｈｆｕｓｅｄがキナーゼ活性を有することを直接決定するために、ｆｕｓｅｄ（配列番号：２）、ｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）およびｆｕｓｅｄ-ｋｄ（配列番号：２４）ｃＤＮＡをインフルエンザＨＡエピトープタグでタグ付けし、２９３細胞に一過性形質移入した。キナーゼ活性について、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）及び［γ３２Ｐ］-ＡＴＰの存在下で免疫沈降を試験した。ＭＢＰへの３２Ｐ取り込み量はＳＤＳ-ＰＡＧＥの後に測定し、対照に比較して、ｆｕｓｅｄ-ＫＤ（配列番号：２４）では３倍高く、ｗｔｆｕｓｅｄ（配列番号：２）含有抽出物では２倍高いが、Ｌｙｓ３３のＡｒｇへの変異体（ｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５））では活性が中和されることがわかった（図１２）。
免疫沈降実験のために、ヒト胚腎臓２９３細胞を種々の発現プラスミドで一過性形質移入した。２４時間後、形質移入した細胞を回収し、１ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフッ化ナトリウム、１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭのＰＭＳＦ及び１％のＮＰ-４０、０．５％のデオキシコール酸を含むプロテアーゼ阻害剤（Complete、Boehringer Mannhein）中、４℃で２０分間溶解させた。１０，０００ｒｐｍでの１０分間の遠心分離で細胞断片を除去し、細胞溶解物の塩化ナトリウム濃度を２５０ｍＭまで上昇させた。上清を２０μｌのプロテインＡセファロース（Pharmacia）で１時間プレクリアした。溶解物を抗-ＨＡ抗体、次いでプロテインＡセファロースを用いて免疫沈降させた。ビーズを２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む溶解バッファーで２回、１Ｍの塩化ナトリウムを含む溶解バッファーで２回、次いでキナーゼアッセイバッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＮａＦ及び１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム）で２回洗浄した。最後の洗浄の後、ビーズを、１０ｍＣｉ［γ３２Ｐ］-ＡＴＰ、２０ｍＭのβ-グリセロホスフェート、２０ｍＭのＰＮＰＰ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２，１ｍＭのＥＧＴＡ、１００μＭの冷ＡＴＰ及び０．５ｍｇ／ｍｌのミエリン塩基性タンパク質（Sigma）を添加した２０μｌのキナーゼアッセイバッファーに再懸濁し、３７℃で２０分間インキュベートした。２０μｌのＳＤＳ-試料バッファーで反応を停止し、４−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上を走らせ、ホスホイメージャー(phosphoimager)で分析した。
【００９９】
実施例１１：大腸菌におけるｆｕｓｅｄの発現
ヒトｆｕｓｅｄをコードするＤＮＡ配列を、選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いでベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、脊椎動物ｆｕｓｅｄコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、Sambrook等, 上掲に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列決定で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化脊椎動物ｆｕｓｅｄタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製した。
【０１００】
実施例１２：哺乳動物細胞におけるｆｕｓｅｄの発現
発現ベクターとしてベクターｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、脊椎動物ｆｕｓｅｄＤＮＡを選択した制限酵素でｐＲＫ５に結合させ、Sambrook等,上掲に記載されたような結合方法を用いて脊椎動物ｆｕｓｅｄＤＮＡの挿入を行う。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ｆｕｓｅｄと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ｆｕｓｅｄＤＮＡを約１μｇのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス-ＨＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．２２７ＭのＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
【０１０１】
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムに暴露した。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、脊椎動物ｆｕｓｅｄは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ｆｕｓｅｄＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現された脊椎動物ｆｕｓｅｄを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
【０１０２】
他の実施態様では、脊椎動物ｆｕｓｅｄをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＳＵｉ-ｆｕｓｅｄは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。脊椎動物ｆｕｓｅｄポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現された脊椎動物ｆｕｓｅｄを含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
また、エピトープタグ脊椎動物ｆｕｓｅｄは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。脊椎動物ｆｕｓｅｄはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ脊椎動物ｆｕｓｅｄ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ脊椎動物ｆｕｓｅｄを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【０１０３】
実施例１３：酵母菌での脊椎動物ｆｕｓｅｄの発現
以下の方法は、酵母菌中での脊椎動物ｆｕｓｅｄの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからの脊椎動物ｆｕｓｅｄの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするＤＮＡ、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入して脊椎動物ｆｕｓｅｄの細胞内発現を指示する。分泌のために、脊椎動物ｆｕｓｅｄをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）脊椎動物ｆｕｓｅｄの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、１０％トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換え脊椎動物ｆｕｓｅｄは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。脊椎動物ｆｕｓｅｄを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
【０１０４】
実施例１４：バキュロウイルス感染昆虫細胞での脊椎動物ｆｕｓｅｄの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中における脊椎動物ｆｕｓｅｄの組換え発現を記載する。
脊椎動物ｆｕｓｅｄは、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、脊椎動物ｆｕｓｅｄ又は脊椎動物ｆｕｓｅｄの所定部分（膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など）が、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldＴＭウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。２８℃で４−５日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
【０１０５】
次いで、発現されたｐｏｌｙ-ｈｉｓタグ脊椎動物ｆｕｓｅｄは、例えば、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより以下のように精製される。抽出物は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；１０％のグリセロール；０．１％のＮＰ-４０；０．４ＭのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で２回２０秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（５０ｍＭのリン酸塩、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍希釈し、０．４５μｍフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋-ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を５ｍＬの総容積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分０．５ｍＬでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（５０ｍＭのリン酸塩；３００ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で０から５００ｍＭのイミダゾール勾配で展開した。１ｍＬの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋-ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグ脊椎動物ｆｕｓｅｄを含む分画をプールし、負荷バッファーで透析した。あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）脊椎動物ｆｕｓｅｄの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【０１０６】
実施例１５：脊椎動物ｆｕｓｅｄに結合する抗体の調製
この実施例は、脊椎動物ｆｕｓｅｄに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製脊椎動物ｆｕｓｅｄ、脊椎動物ｆｕｓｅｄを含む融合タンパク質、細胞表面に組換え脊椎動物ｆｕｓｅｄを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に１−１００マイクログラムで注入した脊椎動物ｆｕｓｅｄ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで１０から１２日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。脊椎動物ｆｕｓｅｄ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
【０１０７】
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、脊椎動物ｆｕｓｅｄ静脈内注射の最後の注入をすることができる。３から４日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（３５％ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む９６ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、脊椎動物ｆｕｓｅｄに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。所望の脊椎動物ｆｕｓｅｄに対するモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-脊椎動物ｆｕｓｅｄモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０１０８】
材料の寄託
次の細胞系をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, １２３０１  パークローンドライブ、ロックビル、メリーランド、米国(12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA)(ＡＴＣＣ)に寄託した：
材料                   ATCC寄託番号     寄託日
pRK5tkneo.hFused-1272   209637             1998年2月19日
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
【０１０９】
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１Ａ−１Ｅ】ヒトｆｕｓｅｄポリペプチドの天然配列の核酸配列（配列番号：１）及び誘導アミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。キナーゼドメイン（残基１〜約２６０）（配列番号：２４）及びおよそアミノ酸位置３３のＡＴＰ結合部位を含む。
【図２】ヒト全長配列のクローン化に用いられたＥＳＴ２５１５６６２（配列番号：３）を示す図である。
【図３Ａ−３Ｂ】ヒト及びショウジョウバエｆｕｓｅｄ（配列番号：２及び２３）の間の比較を示す図である。最適なアラインメントのために導入されたギャップはダッシュで示した。同一のアミノ酸はボックスで囲んだ。ｆｕｓｅｄ-ＤＮで変異されたリシン（ドミナントネガティブ、アミノ酸位置３３のリシン）は星印で示す。
【図４Ａ−４Ｅ】胎児肺ライブラリから単離されたヒトｆｕｓｅｄの不正にスプライシングされた変異体であるＤＮＡ２８４９４の配列（配列番号：６）を示す図である。このクローンは、位置１１６に潜在的開始メチオニンを含み、１９４４ｂｐのオープンリーディングフレームが続く。第２のオープンリーディングフレームは、およそ２２９５〜４３４９の位置に存在する。クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）とクローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）との間には、クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）の位置１８６３にある第１のＯＲＦ内に位置する１つのヌクレオチドの相違（Ａ対Ｇ）があり、位置５８３におけるコード化配列をＧｌｎからＡｒｇに変える。ＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）の第１のオープンリーディングフレームは、残基１１５で開始されて６３０アミノ酸長のオープンリーディングフレームが続く。
【図５Ａ−５Ｅ】胎児肺ライブラリから単離されたヒトｆｕｓｅｄの不正にスプライシングされた他の変異体であるＤＮＡ２８４９４の配列（配列番号：６）を示す図である。
【図６】ＤＮＡ２８４９５（配列番号：５及び２１）及びＤＮＡ２８４９４（配列番号：７及び２２）のエピトープタグのＰＣＲ産物のウェスタンブロットを示す図である。クローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）に対応する作成物で形質移入した細胞の細胞ペレットにおいて１５０ｋＤａの特異的バンドが検出され、クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）については約１００ｋＤａの特異的バンドが検出された（図６）。これらのバンドは偽形質移入の対照物には存在しなかった。１００ｋＤａバンドの存在は、ＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）の２つのオープンリーディングフレームが、ともにスプライシングして１５０ｋＤａの大きなタンパク質の合成を指示できることを示唆している。このバンドがＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）に無いことは、このクローンが明らかに正しくスプライシングされ得ないことを示唆している。
【図７】ヒトｆｕｓｅｄ（配列番号：１）のノーザンブロット分析を示す図である。複数のヒト胎児及び成人組織ノーザンブロットはヒトｆｕｓｅｄｃＤＮＡプローブでプローブされた。
【図８Ａ−８Ｆ】胚及び成人組織のｆｕｓｅｄ（配列番号：１）でのインサイツハイブリッド形成を示す写真である。Ｅ１１．５（図８Ａ）及びＥ１３．５（図８Ｂ）マウス胚の矢状切片。Ｐ１（図８Ｅ）から成人（図８Ｆ）マウスの矢状切片。Ｃｐ、脈絡叢 ；ｈｂ、後脳；ｈｉｐ、海馬体；ｈｔ、心臓；ｈｙ、視床下部；ｋｄ、腎臓；ｌｇ、肺；ｍｂ、中脳；ｍｄ、中腸；ｍｎｄ、第１の鰓弓の下顎成分；ｓｃ、脊髄；ｓｔ、胃；ｔｅｃ、中脳蓋；ｖｈ、脊髄の前角；ｖｍ、腹側中脳。スケールバー：図８Ａ、１．０ｍｍ；図８Ｂ、１．６２ｍ；図８Ｃ、０．１４ｍｍ；図８Ｄ、０．１７ｍｍ；図８Ｅ、２．０ｍｍ；図８Ｆ、３．１ｍｍ。
【図９Ａ−９Ｃ】ｆｕｓｅｄｍＲＮＡの成人マウス精巣における高レベルでの存在を示すインサイツハイブリッド形成を示す写真である（図９Ａ）。高倍率では精細管内での発現レベルの違いがわかる（図９Ｃ）。ｆｕｓｅｄに対するセンス鎖対照プローブでの精巣のハイブリッド形成では、ハイブリッド形成を与えなかった（図９Ｂ）。
【図１０Ａ−１０Ｂ】ｆｕｓｅｄによるＧｌｉの活性化を示す棒グラフである。（図１０Ａ）：Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、ｐ９ＸＧｌｉＬｕｓ、ｐｔｋＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びｆｕｓｅｄ又は種々のｆｕｓｅｄ変異体で同時形質移入した。細胞を形質移入後４８時間に回収し、ルシフェラーゼ活性を実施例７に記載したようにアッセイした。（図１０Ｂ）：Ｇｌｉリポーター作成物のｆｕｓｅｄトランス活性化。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、ｐ９ＸＧｌｉＬｕｃリポーター作成物、ｐｔｋＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びｆｕｓｅｄ又は種々のｆｕｓｅｄ変異体のためのＣＭＶ制御発現ベクターで同時形質移入した。細胞を形質移入後４８時間に回収し、ルシフェラーゼ活性を実施例に記載したようにアッセイした。データは２回の測定の平均を示す。
【図１１Ａ−１１Ｅ】アフリカツメガエル発生初期においてｆｕｓｅ-ＤＮ（配列番号：２５）がＳＨｈシグナル伝達を阻害することを示す写真である。（図１１Ａ）オタマジャクシ段階胚の背側図である。表示したのは、上側の胚はｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）注入であり、下側の胚は対照である；（図１１Ｂ）オタマジャクシ段階胚の側面図である。上側の胚はｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）注入であり、下側の胚は対照である；（図１１Ｃ及び１１Ｄ）各々対照ＤＮＡ及びｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）を注入した１６神経胚段階のＰａｘ-６染色；（図１１Ｅ）対照胚（左側）及びｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）注入胚（右側）の神経胚の底板のおけるＳＨｈ発現である。
【図１２】ｆｕｓｅｄ（配列番号：２）のキナーゼ活性及びそのＧｌｉ活性化を確認する写真である。表示したのは、実施例１０に示したようにＨＡタグｆｕｓｅｄ作成物で形質移入し、抗-ＨＡ抗体及びプロテインＡセファロースで免疫沈降させた２９３細胞である。プロテインＡビーズは、ＭＢＰ存在下で実施例１０に記載したようにキナーゼアッセイを施した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
2010183906000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成22年4月16日(2010.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
【図１Ａ−１Ｆ】ヒトｆｕｓｅｄポリペプチドの天然配列の核酸配列（配列番号：１）及び誘導アミノ酸配列（配列番号：２）を示す図である。キナーゼドメイン（残基１〜約２６０）（配列番号：２４）及びおよそアミノ酸位置３３のＡＴＰ結合部位を含む。
【図２】ヒト全長配列のクローン化に用いられたＥＳＴ２５１５６６２（配列番号：３）を示す図である。
【図３Ａ−３Ｆ】ヒト及びショウジョウバエｆｕｓｅｄ（配列番号：２及び２３）の間の比較を示す図である。最適なアラインメントのために導入されたギャップはダッシュで示した。同一のアミノ酸はボックスで囲んだ。ｆｕｓｅｄ-ＤＮで変異されたリシン（ドミナントネガティブ、アミノ酸位置３３のリシン）は星印で示す。
【図４Ａ−４Ｆ】胎児肺ライブラリから単離されたヒトｆｕｓｅｄの不正にスプライシングされた変異体であるＤＮＡ２８４９４の配列（配列番号：６）を示す図である。このクローンは、位置１１６に潜在的開始メチオニンを含み、１９４４ｂｐのオープンリーディングフレームが続く。第２のオープンリーディングフレームは、およそ２２９５〜４３４９の位置に存在する。クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）とクローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）との間には、クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）の位置１８６３にある第１のＯＲＦ内に位置する１つのヌクレオチドの相違（Ａ対Ｇ）があり、位置５８３におけるコード化配列をＧｌｎからＡｒｇに変える。ＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）の第１のオープンリーディングフレームは、残基１１５で開始されて６３０アミノ酸長のオープンリーディングフレームが続く。
【図５Ａ−５Ｆ】胎児肺ライブラリから単離されたヒトｆｕｓｅｄの不正にスプライシングされた他の変異体であるＤＮＡ２８４９４の配列（配列番号：６）を示す図である。
【図６】ＤＮＡ２８４９５（配列番号：５及び２１）及びＤＮＡ２８４９４（配列番号：７及び２２）のエピトープタグのＰＣＲ産物のウェスタンブロットを示す図である。クローンＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）に対応する作成物で形質移入した細胞の細胞ペレットにおいて１５０ｋＤａの特異的バンドが検出され、クローンＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）については約１００ｋＤａの特異的バンドが検出された（図６）。これらのバンドは偽形質移入の対照物には存在しなかった。１００ｋＤａバンドの存在は、ＤＮＡ２８４９４（配列番号：６）の２つのオープンリーディングフレームが、ともにスプライシングして１５０ｋＤａの大きなタンパク質の合成を指示できることを示唆している。このバンドがＤＮＡ２８４９５（配列番号：４）に無いことは、このクローンが明らかに正しくスプライシングされ得ないことを示唆している。
【図７】ヒトｆｕｓｅｄ（配列番号：１）のノーザンブロット分析を示す図である。複数のヒト胎児及び成人組織ノーザンブロットはヒトｆｕｓｅｄｃＤＮＡプローブでプローブされた。
【図８Ａ−８Ｆ】胚及び成人組織のｆｕｓｅｄ（配列番号：１）でのインサイツハイブリッド形成を示す写真である。Ｅ１１．５（図８Ａ）及びＥ１３．５（図８Ｂ）マウス胚の矢状切片。Ｐ１（図８Ｅ）から成人（図８Ｆ）マウスの矢状切片。Ｃｐ、脈絡叢 ；ｈｂ、後脳；ｈｉｐ、海馬体；ｈｔ、心臓；ｈｙ、視床下部；ｋｄ、腎臓；ｌｇ、肺；ｍｂ、中脳；ｍｄ、中腸；ｍｎｄ、第１の鰓弓の下顎成分；ｓｃ、脊髄；ｓｔ、胃；ｔｅｃ、中脳蓋；ｖｈ、脊髄の前角；ｖｍ、腹側中脳。スケールバー：図８Ａ、１．０ｍｍ；図８Ｂ、１．６２ｍ；図８Ｃ、０．１４ｍｍ；図８Ｄ、０．１７ｍｍ；図８Ｅ、２．０ｍｍ；図８Ｆ、３．１ｍｍ。
【図９Ａ−９Ｃ】ｆｕｓｅｄｍＲＮＡの成人マウス精巣における高レベルでの存在を示すインサイツハイブリッド形成を示す写真である（図９Ａ）。高倍率では精細管内での発現レベルの違いがわかる（図９Ｃ）。ｆｕｓｅｄに対するセンス鎖対照プローブでの精巣のハイブリッド形成では、ハイブリッド形成を与えなかった（図９Ｂ）。
【図１０Ａ−１０Ｂ】ｆｕｓｅｄによるＧｌｉの活性化を示す棒グラフである。（図１０Ａ）：Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、ｐ９ＸＧｌｉＬｕｓ、ｐｔｋＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びｆｕｓｅｄ又は種々のｆｕｓｅｄ変異体で同時形質移入した。細胞を形質移入後４８時間に回収し、ルシフェラーゼ活性を実施例７に記載したようにアッセイした。（図１０Ｂ）：Ｇｌｉリポーター作成物のｆｕｓｅｄトランス活性化。Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞は、ｐ９ＸＧｌｉＬｕｃリポーター作成物、ｐｔｋＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びｆｕｓｅｄ又は種々のｆｕｓｅｄ変異体のためのＣＭＶ制御発現ベクターで同時形質移入した。細胞を形質移入後４８時間に回収し、ルシフェラーゼ活性を実施例に記載したようにアッセイした。データは２回の測定の平均を示す。
【図１１Ａ−１１Ｅ】アフリカツメガエル発生初期においてｆｕｓｅ-ＤＮ（配列番号：２５）がＳＨｈシグナル伝達を阻害することを示す写真である。（図１１Ａ）オタマジャクシ段階胚の背側図である。表示したのは、上側の胚はｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）注入であり、下側の胚は対照である；（図１１Ｂ）オタマジャクシ段階胚の側面図である。上側の胚はｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）注入であり、下側の胚は対照である；（図１１Ｃ及び１１Ｄ）各々対照ＤＮＡ及びｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）を注入した１６神経胚段階のＰａｘ-６染色；（図１１Ｅ）対照胚（左側）及びｆｕｓｅｄ-ＤＮ（配列番号：２５）注入胚（右側）の神経胚の底板のおけるＳＨｈ発現である。
【図１２】ｆｕｓｅｄ（配列番号：２）のキナーゼ活性及びそのＧｌｉ活性化を確認する写真である。表示したのは、実施例１０に示したようにＨＡタグｆｕｓｅｄ作成物で形質移入し、抗-ＨＡ抗体及びプロテインＡセファロースで免疫沈降させた２９３細胞である。プロテインＡビーズは、ＭＢＰ存在下で実施例１０に記載したようにキナーゼアッセイを施した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
2010183906.tif 000036
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
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【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１１】
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【外国語明細書】
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2010183906000002.pdf
2010183906000003.pdf
2010183906000004.pdf