【誤訳訂正書】
【提出日】令和3年7月8日(2021.7.8)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００１】
本発明は、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を含むイソブテンを製造
する方法であって、前記３−メチルクロトン酸が３−メチルクロトニル−ＣｏＡの３−メ
チルクロトン酸への酵素的変換によって得られる、または前記３−メチルクロトン酸が３
−ヒドロキシイソ吉草酸（ＨＩＶ）の３−メチルクロトン酸への酵素的変換によって得ら
れる、方法に関する。３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換は、例えば３−
メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、好ましくはＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合している(associated with)ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）またはゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）を使用することによって達成することができる。さらに、前記３−メチルクロトニル−ＣｏＡは、３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチルクロトニル−ＣｏＡへの酵素的変換によって得ることができる。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００４】
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換は脱炭酸反応である。脱炭酸は、カ
ルボキシル基を除去し、二酸化炭素（ＣＯ２）を放出する化学反応である。
３−メチルクロトン酸の脱炭酸は米国特許出願公開第２００９／００９２９７５号明細
書で既に示唆されているが、この変換に関する実験的証拠はない。米国特許出願公開第２
００９／００９２９７５号明細書では、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）から得ら
れるＰＡＤ１と呼ばれる核酸配列が記載されており、脱炭酸酵素をコードすると開示され
ている。この酵素は、組換え生物における選択的マーカーとして有用であることが示唆さ
れているが、「弱酸」を選択剤として使用できることが記載されている。中でも、潜在的
「弱酸」として、３−メチルクロトン酸が言及されている。しかしながら、実際には、上
記ＰＡＤ１がデカルボキシラーゼ活性を提供しないことが分かったのは後になってからで
あった。
実際、細菌ｕｂｉＤおよびｕｂｉＸまたは相同の真核生物ｆｄｃ１およびｐａｄ１遺伝
子は、非酸化的可逆的脱炭酸に関係している。フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（
ＰＡＤ）とフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）の組み合わせ作用が、出芽酵母（Sa
ccharomyces cerevisiae）のフェニルアクリル酸の脱炭酸に必須であると考えられている
（J. Biosci. Bioeng. 109, (2010), 564-569; AMB Express, 5:12 (2015) 1-5; ACS Che
m. Biol. 10 (2015), 1137-1144）。
近年、フェニルアクリル酸デカルボキシラーゼ（ＰＡＤ）として記載される上記酵素フ
ァミリーが、ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼとして特徴付けられ、デカルボキシラー
ゼとしてもはや特徴付けられなくなった。Ｆｄｃ１（ＰＡＤではなく）が可逆的デカルボ
キシラーゼ活性を唯一担い、新たな種類の補助因子、すなわち連合しているＵｂｉＸ（またはＰａｄ１）タンパク質によって合成されるプレニル化フラビンを要することが示された。
よって、このＰＡＤ酵素の実際の酵素活性は、（ＤＭＡＰまたはＤＭＡＰＰと呼ばれるジ
メチルアリルリン酸またはピロリン酸からの）プレニル部分によるフラビンモノヌクレオ
チド（ＦＭＮ）補助因子の変換として同定されている。
したがって、先行技術の信条と対照的に、実際のデカルボキシラーゼは、修飾ＦＭＮ（
プレニル化ＦＭＮ）と会合したフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）である。修飾ＦＭＮ（プレニル化ＦＭＮ）（ＰＡＤ酵素によって提供される）と会合したフェルラ酸デカルボキシラーゼ（ＦＤＣ）のこの機構が近年記載され、これは驚くべき酵素機構、すなわち１，３−双極子環付加を介したα，β−不飽和酸脱炭酸を含む。さらに、このＦＤＣデカルボキシラーゼの構造が近年解かれている（Nature 522 (2015), 497-501；Nature, 52
2 (2015), 502-505；Appl. Environ. Microbiol. 81 (2015), 4216- 4223）。
上記ファミリーの酵素の使用が上記の米国特許出願公開第２００９／００９２９７５号
明細書でα−β不飽和カルボン酸の末端アルケンへの変換について以前記載されている一
方で、国際公開第２０１２／０１８６２４号パンフレットは、芳香族、２，４−ペンタジ
エン酸および１，３−ブタジエンを生合成するための微生物および方法に関し、国際公開
第２０１３／０２８５１９号パンフレットは、２，４−ペンタジエン酸、ブタジエン、プ
ロピレン、１，３−ブタンジオールおよび関連アルコールを製造するための微生物および
方法に関する。
さらに、国際公開第２０１３／１８６２１５号パンフレットは、脂肪族モノ不飽和カル
ボン酸をＦｄｃ１ポリペプチドおよびＰａｄ１ポリペプチドと接触させるステップを含む
、モノ不飽和アルケンを調製する方法を記載している。しかしながら、国際公開第２０１
３／１８６２１５号パンフレットでは、Ｆｄｃ１ポリペプチドとＰａｄ１ポリペプチドの
両方がデカルボキシラーゼ活性を有する酵素として分類されている。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００８】
アセトアセチル−ＣｏＡおよび３−メチルクロトン酸を介したアセチルＣｏＡからイソブ
テンへの酵素的変換の経路
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換：図１に示されるステップＩ
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を図２Ｂに模式的に示す。
本発明によると、３−メチルクロトン酸（３−メチル−２−ブテン酸または３，３−ジ
メチルアクリル酸とも呼ばれる）のイソブテン（イソブチレンまたは２−メチルプロペン
とも呼ばれる）への酵素的変換を脱炭酸によって達成することができる。「脱炭酸」は、
一般的にカルボキシル基を除去し、二酸化炭素（ＣＯ２）を放出する化学反応である。
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を、好ましくは３−メチルクロトン
酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成することができる。本発明によると、
３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼは、脱炭酸反応で３−メチルクロトン酸をイソ
ブテンに変換することができる酵素である。
好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；
または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）
からなる群から選択される。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００９】
よって、一態様によると、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換を、好ま
しくは３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成することが
でき、前記３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼはＦＭＮプレニルトランスフェラー
ゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼである。
ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼを利用する３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素的変換は、２つの酵素、すなわちＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ（３−メチルクロトン酸のイソブテンへの実際の脱炭酸を触媒する）と、それに伴う、修飾フラビン補助因子を提供する連合しているＦＭＮプレニルトランスフェラーゼによって触媒される２つの連続的ステップの反応に依拠する。フラビン補助因子は、好ましくはＦＭＮまたはＦＡＤであり得る。ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオチド；リボフラビン−５’−リン酸とも呼ばれる）は、酵素リボフラビンキナーゼによってリ
ボフラビン（ビタミンＢ２）から産生される生体分子であり、種々の反応の補欠分子族と
して機能する。ＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）は、代謝のいくつかの重要な
反応に関与する酸化還元補助因子、より具体的には補欠分子族である。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１０】
よって、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換において、第１のステップで、フ
ラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を（修飾）フラビン由来補助因子に修飾する。こ
の修飾は、前記ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼによって触媒される。ＦＭＮプレニル
トランスフェラーゼは、フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）のフラビン環を（修飾
）プレニル化フラビン補助因子にプレニル化する。この反応を図２Ａに模式的に示す。第
２のステップで、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの実際の変換が、前記ＦＭＮ依存
性デカルボキシラーゼが、連合しているＦＭＮプレニルトランスフェラーゼによって提供されたプレニル化フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を使用する、１，３−双極子環付加に基づく機構を介して前記ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼによって触媒される。この反応を図２Ｂに模式的に示す。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
上記のように、実際の脱炭酸、すなわち３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換は
、ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼが上記の連合しているＦＭＮプレニルトランスフェラーゼのいずれかによって提供されるプレニル化フラビン補助因子（ＦＭＮまたはＦＡＤ）を使用する１，３−双極子環付加に基づく機構を介してＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼによって触媒される。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
上記のように、別の態様では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、好ましく
はアコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）であり得る。このデカルボキ
シラーゼは、上記デカルボキシラーゼについて記載されているように、ＦＭＮプレニルト
ランスフェラーゼとの連合を要しないので、プレニル化補助因子の提供を要しない。
よって、１つの好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が
アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）によって触媒される。アコニッ
ト酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）は以下の反応を触媒すると記載されてい
る：
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２９】
上記のように、別の態様では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、好ましく
はメチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）であり得る。この
デカルボキシラーゼは、上記デカルボキシラーゼについて記載されているように、ＦＭＮ
プレニルトランスフェラーゼとの連合を要しないので、プレニル化補助因子の提供を要しない。
よって、１つの好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの変換が
メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）によって触媒される
。メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼは以下の反応：
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３５】
上記のように、別の態様では、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、好ましく
はゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）であり得る。このデカル
ボキシラーゼは、上記デカルボキシラーゼについて記載されているように、ＦＭＮプレニ
ルトランスフェラーゼとの連合を要しないので、プレニル化補助因子の提供を要しない。
よって、別の好ましい実施形態では、脱炭酸を介した３−メチルクロトン酸のイソブテ
ンへの変換が、ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）によって触
媒される。ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼは自然に以下の反応を触媒する：
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２０８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２０８】
３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換は、好ましくは３−メチル−３
−ブテン酸デカルボキシラーゼを使用することによって達成することができる。本発明に
よると、３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼは、３−メチル−３−ブテン酸を
イソブテンに変換することができる酵素である。
好ましい実施形態では、３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼが、
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；
または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
からなる群から選択される。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２１０】
上記の実施形態に関して、ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）、ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）、プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）、６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）、２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）および５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）について、本発明の他の方法に関連して上記と同じものを適用する。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２３２】
上で概説されるように３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡおよび３−メチル−３−ブ
テン酸を介したアセチル−ＣｏＡのイソブテンへの酵素的変換のための代替経路を要約す
ると、本発明はまた、以下の項目１〜２６によって特徴付けられる以下の実施形態に関す
る：
１．３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換を含む、イソブテンを製造す
る方法。
２．３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換が３−メチル−３−ブテン酸
デカルボキシラーゼを使用することによって達成される、項目１に記載の方法。
３．３−メチル−３−ブテン酸デカルボキシラーゼが、
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；
または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
である、項目２に記載の方法。
４．３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換に
よって、３−メチル−３−ブテン酸を提供するステップをさらに含む、項目１または２に
記載の方法。
５．３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテン酸への酵素的変換が
、
（ａ）ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．−）、好ましくはプロピオン酸：酢
酸−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３．１）、酢酸ＣｏＡ−トランスフェラー
ゼ（ＥＣ２．８．３．８）またはスクシニル−ＣｏＡ：酢酸ＣｏＡ−トランスフェラーゼ
（ＥＣ２．８．３．１８）を使用することによって、３−メチル−３−ブテノイル−Ｃｏ
Ａを３−メチル−３−ブテン酸に直接変換する単一酵素反応；
（ｂ）チオエステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．−）、好ましくはアセチル−ＣｏＡ
ヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．１）、ＡＤＰ依存性短鎖アシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（
ＥＣ３．１．２．１８）またはアシル−ＣｏＡヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．２．２０）を
使用することによって、３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテン
酸に直接変換する単一酵素反応；
（ｃ）（ｉ）最初に３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを３−メチル−３−ブテノイル
リン酸エステルに酵素的に変換するステップと；
（ｉｉ）次いでこうして得られた３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルを前記３
−メチル−３−ブテン酸に酵素的に変換するステップと
を含む２つの酵素ステップ
によって達成される、項目４に記載の方法。
６．前記３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイルリン酸エス
テルへの酵素的変換がリン酸ブチリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１９）また
はリン酸アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）を使用することによって達
成され、前記３−メチル−３−ブテノイルリン酸エステルの前記３−メチル−３−ブテン
酸への酵素的変換がアクセプターとしてカルボキシ基を有するホスホトランスフェラーゼ
（ＥＣ２．７．２．−）、好ましくはプロピオン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１５）、
酢酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１）、酪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．７）または分岐
鎖脂肪酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．１４）を使用することによって達成される、項目５
（ｃ）に記載の方法。
７．３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡへの酵素的
変換によって３−メチル−３−ブテノイル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、項
目１から４のいずれか１つに記載の方法。
８．３−メチルグルタコニル−ＣｏＡの３−メチル−３−ブテニル−ＣｏＡへの酵素的変
換が、
（ａ）（ｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；また
は（ｉｉ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）、
（ｂ）リングビア・マジュスクラ（Lyngbya majuscula）多機能性タンパク質のＣｕｒＦ
のＮ末端ドメインまたは３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ、好ましく
はｌｉｕＢ遺伝子によってコードされるミキソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanth
us）の３−メチルグルタコニル−ＣｏＡデカルボキシラーゼ；または
（ｃ）４−オキサロクロトン酸デカルボキシラーゼファミリーの酵素
を使用することによって達成される、項目７に記載の方法。
９．３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−ＣｏＡ
への酵素的変換によって３−メチルグルタコニル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含
む、項目１から８のいずれか１つに記載の方法。
１０．３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡの３−メチルグルタコニル−Ｃｏ
Ａへの酵素的変換が、３−メチルグルタコニル−補酵素Ａヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１
．１８）、３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）または
エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．−）を使用することによって達成され
る、項目９に記載の方法。
１１．アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタ
リル−ＣｏＡへの酵素的縮合によって３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡを
提供するステップをさらに含む、項目１から１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．アセトアセチル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの３−ヒドロキシ−３−メチルグルタ
リル−ＣｏＡへの酵素的縮合が、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンタ
ーゼを使用することによって達成される、項目１１に記載の方法。
１３．（ａ）（ｉ）最初にアセチル−ＣｏＡをマロニル−ＣｏＡに酵素的変換するステッ
プと；
（ｉｉ）次いでこうして得られたマロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡを前記アセトア
セチル−ＣｏＡに酵素的に縮合するステップと
を含む２つの酵素ステップ；または
（ｂ）２分子のアセチル−ＣｏＡをアセトアセチル−ＣｏＡに直接縮合する単一酵素反応
を含む、アセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的変換によって、アセトア
セチル−ＣｏＡを提供するステップをさらに含む、項目１から１２のいずれか１つに記載
の方法。
１４．アセチル−ＣｏＡのマロニル−ＣｏＡへの酵素的変換が、アセチル−ＣｏＡカルボ
キシラーゼ（ＥＣ６．４．１．２）を使用することによって達成される、項目１３（ａ）
（ｉ）に記載の方法。
１５．マロニル−ＣｏＡとアセチル−ＣｏＡの前記アセトアセチル−ＣｏＡへの酵素的縮
合が、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（ＥＣ２．３．１．１９４）を使用することに
よって達成される、項目１３（ａ）（ｉｉ）に記載の方法。
１６．２分子のアセチル−ＣｏＡのアセトアセチル−ＣｏＡへの直接酵素的縮合が、アセ
チル−ＣｏＡ  Ｃ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．９）を使用すること
によって達成される、項目１３（ｂ）に記載の方法。
１７．（ｉ）項目１から３のいずれか１つで定義される酵素；および
（ｉｉ）項目４から６のいずれか１つで定義される酵素
を発現する組換え生物または微生物。
１８．項目７または８で定義される酵素をさらに発現する、項目１７に記載の組換え生物
または微生物。
１９．項目９または１０で定義される酵素をさらに発現する、項目１８に記載の組換え生
物または微生物。
２０．項目１１または１２で定義される酵素をさらに発現する、項目１９に記載の組換え
生物または微生物。
２１．請求項１３で定義される酵素をさらに発現する、項目２０に記載の組換え生物また
は微生物。
２２．請求項１４から１６のいずれか一項で定義される酵素をさらに発現する、項目２１
に記載の組換え生物または微生物。
２３．イソブテンを製造するための項目１７から２２のいずれか１つで定義される組換え
生物または微生物の使用。
２４．３−メチル−３−ブテン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素を発現する
、項目２３に記載の組換え生物または微生物の使用。
２５．３−メチル−３−ブテン酸からイソブテンを製造するための３−メチル−３−ブテ
ン酸のイソブテンへの酵素的変換を触媒する酵素の使用。
２６．３−メチル−３−ブテン酸および項目１７から２２のいずれか１つで定義される組
換え生物もしくは微生物；または３−メチル−３−ブテン酸および項目１から１６のいず
れか１つで定義される酵素を含む組成物。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２４５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２４５】
ステップＩおよびステップＩＩの酵素を発現し、場合によりステップＩＩＩ、ステップＩ
ＶおよびステップＶの酵素をさらに発現し、場合によりステップＸＩＩＩ、ＸＩＶおよび
ＸＶの酵素をさらに発現する組換え生物または微生物
本発明はまた、（ｉ）３−メチルクロトン酸をイソブテンに酵素的に変換する（図１に
示されるステップＩ）ことができる酵素；および（ｉｉ）３−ヒドロキシイソ吉草酸（Ｈ
ＩＶ）を３−メチルクロトン酸に酵素的に変換する（図１に示されるステップＩＩ）こと
ができる酵素を発現する組換え生物または微生物に関する。
好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換することができる酵
素が、本明細書上記で定義される３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼである。より
好ましくは、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼが、本明細書上記で定義される
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；
または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
である。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２４７】
３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．
１．６）、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）およびゲ
ラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）ならびに前記３−メチルクロ
トン酸デカルボキシラーゼ、前記プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４
．１．１．６３）、前記ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、前記連合しているＦＭＮプレニルトランスフェラーゼ、前記アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、前記メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）および前記ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）の好ましい実施形態、ならびに前記６−メチルサリチル酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．５２）、２−オキソ−３−ヘキセン二酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．７７）および５−オキソペンタ−３−エン−１，２，５−トリカルボン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６８）に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２５４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２５４】
好ましい実施形態では、３−メチルクロトン酸をイソブテンに変換することができる酵
素が、３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、好ましくは本明細書上記で定義される
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；
または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
である。
３−メチルクロトン酸デカルボキシラーゼ、ＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ、連合しているＦＭＮプレニルトランスフェラーゼ、アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）、メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）、（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）およびゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）ならびに前記酵素の好ましい実施形態に関して、本発明による方法について上記と同じものを組換え生物または微生物に適用する。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２６３】
好ましい実施形態では、３−メチル−３−ブテン酸をイソブテンに酵素的に変換するこ
とができる酵素が、本明細書上記で記載される３−メチル−３−ブテン酸カルボキシラー
ゼ、より好ましくは本明細書上記で記載される
（ｉ）ＦＭＮプレニルトランスフェラーゼと連合しているＦＭＮ依存性デカルボキシラーゼ；
または
（ｉｉ）アコニット酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６）；または
（ｉｉｉ）メチルクロトニル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．４）；または
（ｉｖ）ゲラノイル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＥＣ６．４．１．５）；または
（ｖ）プロトカテク酸（ＰＣＡ）デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．６３）
である。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０２９７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０２９７】
ＵｂｉＸタンパク質を含む溶解物と精製ＵｂｉＤタンパク質との連合によって触媒された３−メチルクロトン酸のイソブテンへのインビトロ脱炭酸
３−メチルクロトン酸の０．５Ｍストック溶液を水中で調製し、ＮａＯＨの１０Ｍ溶液
でｐＨ７．０に調整した。
２つのＵｂｉＤタンパク質（表Ｃ）を実施例１に記載される手順によって精製した。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３１１】
大腸菌（Escherichia coli）のＵｂｉＸタンパク質と出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質との連合によって触媒される３−メチルクロトン酸のイソブテンへのインビボ脱炭酸
出芽酵母（S. cerevisiae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｑ０３０３４）のＵｂｉＤタ
ンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌（E. coli）中での発現のためにコドン最適化し
、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成し
た。次いで、この試験遺伝子を、ＮｃｏＩ制限部位を有する順方向プライマーおよびＢａ
ｍＨＩ制限部位を含む逆方向プライマーを用いて、ｐＭＫ−ＲＱベクター（ＧｅｎｅＡｒ
ｔによって提供されるマスタープラスミド）からＰＣＲ増幅した。大腸菌（E. coli）（
Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号：Ｐ０ＡＧ０３）のＵｂｉＸタンパク質をコードする遺伝子を、
ＮｄｅＩ制限部位を含む順方向プライマーおよびＫｐｎＩ制限部位を含む逆方向プライマ
ーを用いて、ＰＣＲによって増幅した。以前記載したｐＣＡＮベクター（実施例１）がこ
のＰＣＲステップのための鋳型として働いた。これらの２つの得られたＰＣＲ産物（Ｕｂ
ｉＤタンパク質およびＵｂｉＸタンパク質）をｐＥＤｕｅｔ（商標）−１同時発現ベクタ
ー（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングした。構築した組換えプラスミドを配列決定によっ
て検証した。コンピテント大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ
）を、標準的な熱ショック手順によってこのベクターで形質転換し、アンピシリン（０．
１ｍｇ／ｍｌ）を補足したＬＢ寒天プレート上に播いた（「菌株Ａ」と呼ぶ）。
出芽酵母（S. cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質の遺伝子のみを有するｐＥＴ−２５
ｂ（＋）ベクターで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）菌株もこの試験に使用した（「菌株
Ｂ」と呼ぶ）。空のｐＥＴ−２５ｂ（＋）ベクターで形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）菌
株をその後のアッセイで陰性対照として使用した（「菌株Ｃ」と呼ぶ）。
単一形質転換体を使用してアンピシリンを補足したＬＢ培地に接種し、引き続いて３０
℃で一晩インキュベートした。この一晩培養液１ｍｌを使用してＺＹＭ−５０５２自動誘
導培地３００ｍｌに接種した（Studier FW (2005)、局所的引用）。培養液を３０℃で２
０時間、１６０ｒｐｍで振盪して増殖させた。
ＯＤ６００＝３０に相当する体積の培養物を取り出し、遠心分離した。ペレットを、グ
ルコース（４５ｇ／Ｌ）およびＭｇＳＯ４（１ｍＭ）を含み、１０ｍＭ  ３−メチルクロ
トン酸を補足したＭＳ培地３０ｍｌ（Richaud C., Mengin-Leucreulx D., Pochet S., Jo
hnson EJ., Cohen GN. and Marliere P, The Journal of Biological Chemistry, 268, (
1993), 26827-26835）に再懸濁した。次いで、これらの培養液を、ねじ口で密封した１６
０ｍｌボトル中、３０℃で２２時間振盪してインキュベートした。３０％ＮＨ４ＯＨを用
いて、インキュベーションの８時間後に培養液のｐＨ値を８．５に調整した。
インキュベーション期間後、ヘッドスペースに生成されたイソブテンを、水素炎イオン
化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析した。ヘッド
スペース気相１ｍｌを分離し、実施例２に記載される方法によって分析した。
空のベクターを有する対照菌株Ｃではイソブテンが形成されなかった。両遺伝子、出芽
酵母（S. cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質と大腸菌（E. coli）のＵｂｉＸタンパク質
を過剰発現する菌株Ａで最高のイソブテン生成が観察された。ＵｂｉＤタンパク質のみを
過剰発現する菌株Ｂでは有意なイソブテン生成が観察された。よって、大腸菌（E. coli
）の内因性ＵｂｉＸが出芽酵母（S. cerevisiae）のＵｂｉＤタンパク質を活性化するの
におそらく寄与し得る（図３８）。 
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３１２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３１２】
枯草菌（Bacillus subtilis）のホスホトランスブチリラーゼ、ゲオバチルス属（Geobaci
llus）種の酪酸キナーゼおよび出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤタンパ
ク質の連合によって触媒される３−メチルクロトニル−ＣｏＡからのイソブテンのワンポット酵素合成
出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０３０３４）のＵ
ｂｉＤ遺伝子および大腸菌（Escherichia coli）（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０ＡＧ０３
）のＵｂｉＸ遺伝子を有するｐＥＴＤｕｅｔ（商標）−１同時発現ベクター（実施例６）
を使用して、実施例１に記載されるプロトコルによってＵｂｉＤタンパク質を製造および
精製した。枯草菌（Bacillus subtilis）のホスホトランスブチリラーゼおよびゲオバチ
ルス属（Geobacillus）種の酪酸キナーゼを実施例４に記載されるように精製した。
酵素アッセイを０．３ｍｌの総反応体積で行った。
標準反応混合物は以下を含んでいた：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ３−メチルクロトニル−ＣｏＡ
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５
１０ｍＭ  ＡＤＰ
０．０２ｍｇ／ｍｌの精製した枯草菌（Bacillus subtilis）のホスホトランスブチリラ
ーゼ
０．０２ｍｇ／ｍｌの精製したゲオバチルス属（Geobacillus）種の酪酸キナーゼ
１ｍｇ／ｍｌの精製した出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のＵｂｉＤ
触媒作用を３０℃で１８時間行った。 
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３１８】
ＵｂｉＸタンパク質を含む溶解物の存在下で精製デカルボキシラーゼを用いて触媒される
３−メチルクロトン酸のイソブテンへの酵素脱炭酸
３−メチルクロトン酸の０．５Ｍストック溶液を水中で調製し、ＮａＯＨの１０Ｍ溶液
でｐＨ７．０に調整した。
ａｒｏＹ遺伝子によってコードされるタンパク質およびＵｂｉＤタンパク質としてアノ
テーションを付与された１つのタンパク質を実施例１に記載される手順にしたがって製造
した。
酵素アッセイを以下の条件下、２ｍｌガラスバイアル（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）中で行っ
た：
５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５
２０ｍＭ  ＮａＣｌ
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５ｍＭ  ＤＴＴ
５０ｍＭ  ３−メチルクロトン酸
１ｍｇ／ｍｌの精製したＡｒｏＹまたはＵｂｉＤタンパク質
５０μｌのＵｂｉＸタンパク質を含む溶解物
アッセイの総体積は３００μｌであった。
一連の対照アッセイを並行して行った（表Ｈ）。
バイアルを密封し、３０℃で１２０分間インキュベートした。８０℃で２分間インキュ
ベートすることによってアッセイを停止し、反応ヘッドスペースに形成したイソブテンを
、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分
析した。
ＧＣ分析のために、ヘッドスペースガス１ｍｌを、１３０℃の等温モードを使用してＧ
Ｓ−アルミナカラム（３０ｍ×０．５３ｍｍ）（Ａｇｉｌｅｎｔ）を備えたＢｒｕｋｅｒ
ＧＣ−４５０システムで分離した。窒素を６ｍｌ／分の流量でキャリアガスとして使用
した。
酵素反応生成物をイソブテン標準との比較によって同定した。これらのＧＣ条件下で、
イソブテンの保持時間は２．４２分であった。組み合わせたアッセイ（ＡｒｏＹまたはＵ
ｂｉＤタンパク質＋ＵｂｉＸタンパク質）では３−メチルクロトン酸からの有意なイソブ
テン生成が観察された。ＵｂｉＸタンパク質のみを含む溶解物のインキュベーションはイ
ソブテン生成をもたらさなかった。これらのデータは、ａｒｏＹ遺伝子によってコードさ
れるタンパク質がＵｂｉＸタンパク質と連合して、３−メチルクロトン酸のイソブテンへの脱炭酸を触媒できることを示している。