【手続補正書】
【提出日】令和2年12月22日(2020.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＨＣＶＲの前記ＨＣエレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、重鎖（ＨＣ）ストランド；および
ｉｉ）前記細胞由来のＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、軽鎖（ＬＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
ｂ）前記ＨＣストランドを前記ＬＣストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
【請求項２】
（ｉ）前記ＨＣエレメントが、重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、
（ｉｉ）前記ＬＣエレメントが、軽鎖可変領域配列（ＬＣＶＲＳ）またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、かつ／または
（ｉｉｉ）前記核酸配列が、発現した時、前記ＨＣエレメントおよび前記ＬＣエレメントが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップが、以下：
ａ）以下：
（ｉ）前記細胞由来の前記ＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および
（ｉｉ）前記細胞由来の前記ＬＣＶＲをコードし、捕捉支持体を生成する第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、
と結合した捕捉支持体を獲得するステップ、ならびに
ｂ）前記第１および前記第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、前記隔離された産生反応部位を維持して、以下：
前記細胞由来の前記ＨＣＶＲの前記ＨＣエレメントをコードするセグメントを含む複数個のＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および
前記細胞由来の前記ＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含む複数個のＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップ
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記捕捉支持体が、ビーズ、およびｃＤＮＡと結合する部分を含む、かつ／または前記隔離された産生反応部位が、前記第１および前記第２のｍＲＮＡから、前記細胞の前記ＨＣＶＲの前記ＨＣエレメント、をコードするセグメントを含む第１のｄｓ  ｃＤＮＡ、および前記細胞の前記ＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび前記第２のｄｓ  ｃＤＮＡが、プライマーの存在下で増幅され、前記プライマーの少なくとも１つが、第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間のヌクレオチド修飾を含み、前記ヌクレオチド修飾がＤＮＡ合成を低下させ、
必要に応じて、
（ｉ）前記ヌクレオチド修飾が、２個の隣接したヌクレオチド間のスペーサーの挿入、またはリボースへの修飾を含む、
（ｉｉ）前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第２のメンバーとアニールして、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、
（ｉｉｉ）前記プライマーの少なくとも１つのプライマーが、リン酸化されており、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む、
請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）前記ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、５’オーバーハングおよび平滑末端を含み、かつ前記ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが５’オーバーハングおよび平滑末端を含む、
（ｉｉ）前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドが、共有結合性に連結されて一本鎖核酸配列を生じ、前記ＨＣおよびＬＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、
（ｉｉｉ）前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、かつ／または
（ｉｖ）前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドが、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結され、前記スプリントオリゴヌクレオチドが、前記ＨＣストランドと前記ＬＣストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして連結部位において二重鎖領域を形成し、必要に応じて、前記スプリントオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ合成を阻害する修飾を含む、
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップであって、
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）前記細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび前記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位を獲得するステップ；ならびに
ｂ）前記細胞の溶解、ならびに前記捕捉支持体を、前記第１のｍＲＮＡおよび前記第２のｍＲＮＡと結合させて、前記ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、前記隔離された細胞反応部位を維持するステップ
を含み、前記隔離された細胞反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ
をさらに含み、
必要に応じて、ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で、前記隔離された細胞反応部位から、前記ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を放出させるステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）前記核酸配列を増幅するステップ、
（ｉｉ）前記核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップ、および／または
（ｉｉｉ）核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップ
をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記核酸配列を発現して、前記ＨＣＶＲの前記ＨＣエレメントをコードするセグメント、および前記ＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップを含み、
必要に応じて、前記ポリペプチドは抗原とともにあり、前記ポリペプチドが前記抗原を結合するかどうかを決定する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
請求項１〜９のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含み、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のＨＣエレメントおよびＬＣエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製し、
必要に応じて、前記ライブラリーが、以下：
ａ）前記複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の固有メンバーを含む、
ｂ）前記複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、または１０８〜１０９個の固有メンバーを含む、
ｃ）前記ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、固有メンバーである、または  ｄ）前記ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、固有メンバーである、
の特性のうちの１つ、２つ、３つまたは全てを含む、
方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法により作製されたライブラリーであって、必要に応じて、前記ライブラリーがディスプレイライブラリーである、ライブラリー。
【請求項１２】
ａ）請求項１１に記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法であって、
必要に応じて、前記ポリペプチドを抗原に接触させるステップ、および前記抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収するステップをさらに含む、方法。
【請求項１３】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメントをコードするセグメントを含むα鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、α鎖（ＡＣ）ストランド；および
ｉｉ）前記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメントをコードするセグメントを含むβ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、β鎖（ＢＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＡＣストランドをＢＣストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＢＣＶＲまたはＡＣＶＲをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
【請求項１４】
前記核酸配列が、発現した時、前記ＡＣエレメントおよび前記ＢＣエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成され、必要に応じて、前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
請求項１３または１４に記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、α鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含み、前記ＡＣＶＲおよび前記ＢＣＶＲがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のＡＣエレメントおよびＢＣエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法により作製されたライブラリー。
【請求項１７】
ａ）請求項１６に記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
【請求項１８】
ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメントをコードするセグメントを含むγ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、γ鎖（ＧＣ）ストランド；および
ｉｉ）前記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメントをコードするセグメントを含むδ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、δ鎖（ＤＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＧＣストランドをＤＣストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＤＣＶＲまたはＧＣＶＲをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
【請求項１９】
前記核酸配列が、発現した時、前記ＧＣエレメントおよび前記ＤＣエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成され、必要に応じて、前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
請求項１８または１９に記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、γ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含み、前記ＧＣＶＲおよび前記ＤＣＶＲがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のＧＣエレメントおよびＤＣエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法により作製されたライブラリー。
【請求項２２】
ａ）請求項２１に記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
【請求項２３】
ａ）細胞由来のＨＣＶＲの重鎖（ＨＣ）エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＨＣストランド；
ｂ）前記細胞由来のＬＣＶＲの軽鎖（ＬＣ）エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＬＣストランド、ならびに
ｃ）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間のヌクレオチド修飾を含むプライマーであって、前記ヌクレオチド修飾がＤＮＡ合成を低下させる、プライマー
を含む、隔離された産生反応部位であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしており、かつ前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＬＣＶＲまたはＨＣＶＲをコードする核酸を含まない、隔離された産生反応部位であって、
必要に応じて、前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第２のメンバーとアニールして、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、隔離された産生反応部位。
【請求項２４】
第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間に位置したスペーサーを含む、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドであって、前記第１のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドまたは異なるオリゴヌクレオチドの前記第２のメンバーとアニールして、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造または二本鎖構造を形成する能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドであって、
必要に応じて、前記スペーサーが可撓性スペーサーまたはＰＥＧスペーサーである、オリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
ａ）細胞由来のＨＣＶＲの重鎖（ＨＣ）エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＨＣストランド；
ｂ）前記細胞由来のＬＣＶＲの軽鎖（ＬＣ）エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＬＣストランド；ならびに
ｃ）前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして、連結の部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチドを含む、隔離された連結反応部位であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしており、前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドが共有結合性に連結され、前記隔離された連結反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、隔離された連結反応部位であって、
必要に応じて、リガーゼをさらに含む、隔離された連結反応部位。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１１】
ある実施形態では、隔離された連結反応部位、例えば、連結マイクロチャンバーは、核酸を共有結合性に連結することができる試薬、例えば、リガーゼ、例えば、熱安定性リガーゼを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
抗体重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および抗体軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＨＣＶＲの前記ＨＣエレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、重鎖（ＨＣ）ストランド；および
ｉｉ）前記細胞由来のＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、軽鎖（ＬＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
ｂ）前記ＨＣストランドを前記ＬＣストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
（項目２）
前記ＨＣエレメントが、重鎖可変領域配列（ＨＣＶＲＳ）またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＬＣエレメントが、軽鎖可変領域配列（ＬＣＶＲＳ）またはその抗原結合断片を含み、またはそれからなる、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記核酸配列が、発現した時、前記ＨＣエレメントおよび前記ＬＣエレメントが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップが、以下：
ａ）以下：
（ｉ）前記細胞由来の前記ＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡに相補的であるストランドを含む第１の二本鎖ｃＤＮＡ（ｄｓ  ｃＤＮＡ）；および
（ｉｉ）前記細胞由来の前記ＬＣＶＲをコードし、捕捉支持体を生成する第２のｍＲＮＡに相補的なストランドを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡ、
と結合した捕捉支持体を獲得するステップ、ならびに
ｂ）前記第１および前記第２のｄｓ  ｃＤＮＡの増幅を可能にする条件下で、前記隔離された産生反応部位を維持して、以下：
前記細胞由来の前記ＨＣＶＲの前記ＨＣエレメントをコードするセグメントを含む複数個のＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ、および
前記細胞由来の前記ＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含む複数個のＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ
を産生する、ステップ
を含む、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記捕捉支持体が、ビーズ、およびｃＤＮＡと結合する部分を含む、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記隔離された産生反応部位が、前記第１および前記第２のｍＲＮＡから、前記細胞の前記ＨＣＶＲの前記ＨＣエレメント、をコードするセグメントを含む第１のｄｓ  ｃＤＮＡ、および前記細胞の前記ＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含む第２のｄｓ  ｃＤＮＡを産生するのに適した試薬混合物を含む、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記第１のｄｓ  ｃＤＮＡおよび前記第２のｄｓ  ｃＤＮＡが、プライマーの存在下で増幅され、前記プライマーの少なくとも１つが、第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーの間のヌクレオチド修飾を含み、前記ヌクレオチド修飾がＤＮＡ合成を低下させる、項目５〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記ヌクレオチド修飾が、２個の隣接したヌクレオチド間のスペーサーの挿入、またはリボースへの修飾を含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第２のメンバーとアニールして、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
前記プライマーの少なくとも１つのプライマーが、リン酸化されており、リンカー配列の少なくとも一部分をコードする配列、またはその相補的配列を含む、項目８〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
前記ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが、５’オーバーハングおよび平滑末端を含み、かつ前記ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡが５’オーバーハングおよび平滑末端を含む、項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１３）
前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドが、共有結合性に連結されて一本鎖核酸配列を生じ、前記ＨＣおよびＬＣストランドが、どちらもセンス鎖、またはどちらもアンチセンス鎖である、項目１〜１２のいずれかに記載の方法。
（項目１４）
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、項目１〜１３のいずれかに記載の方法。
（項目１５）
前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドが、スプリントオリゴヌクレオチドの存在下で共有結合性に連結され、前記スプリントオリゴヌクレオチドが、前記ＨＣストランドと前記ＬＣストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして連結部位において二重鎖領域を形成する、項目１〜１４のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記スプリントオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ合成を阻害する修飾を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記隔離された産生反応部位を獲得するステップの前に、ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を獲得するステップであって、
ａ）ｉ）細胞；ならびに
ｉｉ）前記細胞由来のＨＣＶＲをコードする第１のｍＲＮＡおよび前記細胞由来のＬＣＶＲをコードする第２のｍＲＮＡを結合する能力がある捕捉支持体
を含む、隔離された細胞反応部位を獲得するステップ；ならびに
ｂ）前記細胞の溶解、ならびに前記捕捉支持体を、前記第１のｍＲＮＡおよび前記第２のｍＲＮＡと結合させて、前記ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を形成することを可能にする条件下で、前記隔離された細胞反応部位を維持するステップ
を含み、前記隔離された細胞反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、ステップ
をさらに含む、項目１〜１６のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
ポリ（ｄＡ）またはポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドの存在下で、前記隔離された細胞反応部位から、前記ｍＲＮＡを担持させた捕捉支持体を放出させるステップをさらに含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記核酸配列を増幅するステップをさらに含む、項目１〜１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記核酸配列の全部または一部分をシーケンシングするステップをさらに含む、項目１〜１９のいずれかに記載の方法。
（項目２１）
核酸配列の全部または一部分をベクターへ挿入するステップをさらに含む、項目１〜２０のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記核酸配列を発現して、前記ＨＣＶＲの前記ＨＣエレメントをコードするセグメント、および前記ＬＣＶＲの前記ＬＣエレメントをコードするセグメントを含むポリペプチドを産生するステップを含む、項目１〜２１のいずれかに記載の方法。
（項目２３）
前記ポリペプチドを抗原と接触させ、前記ポリペプチドが前記抗原を結合するかどうかを決定するステップをさらに含む、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
項目１〜２３のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）の重鎖エレメント（ＨＣエレメント）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）の軽鎖エレメント（ＬＣエレメント）をコードする配列を含み、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のＨＣエレメントおよびＬＣエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
（項目２５）
前記ライブラリーが、以下：
ａ）前記複数個の固有メンバーが、少なくとも１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、または１０９個の固有メンバーを含む、
ｂ）前記複数個の固有メンバーが、１０４〜１０９個、１０４〜１０８個、１０４〜１０７個、１０４〜１０６個、１０４〜１０５個、１０８〜１０９個、１０７〜１０９個、１０６〜１０９個、１０５〜１０９個、１０５〜１０８個、１０６〜１０７個、１０４〜１０５個、１０５〜１０６個、１０６〜１０７個、１０７〜１０８個、または１０８〜１０９個の固有メンバーを含む、
ｃ）前記ライブラリーにおけるメンバーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％が、固有メンバーである、または  ｄ）前記ライブラリーにおけるメンバーの２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、固有メンバーである、
の特性のうちの１つ、２つ、３つまたは全てを含む、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
項目２５に記載の方法により作製されたライブラリー。
（項目２７）
前記ライブラリーがディスプレイライブラリーである、項目２６に記載のライブラリー。
（項目２８）
ａ）項目２６または２７に記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
（項目２９）
前記ポリペプチドを抗原に接触させるステップ、および前記抗原を結合するポリペプチドをコードする核酸を回収するステップをさらに含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびＴＣＲβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＡＣＶＲおよびＢＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＡＣＶＲのＡＣエレメントをコードするセグメントを含むα鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＡＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、α鎖（ＡＣ）ストランド；および
ｉｉ）前記細胞由来のＢＣＶＲのＢＣエレメントをコードするセグメントを含むβ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＢＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、β鎖（ＢＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＡＣストランドをＢＣストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＢＣＶＲまたはＡＣＶＲをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
（項目３１）
前記核酸配列が、発現した時、前記ＡＣエレメントおよび前記ＢＣエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
項目３０〜３２のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、α鎖可変領域（ＡＣＶＲ）のα鎖エレメント（ＡＣエレメント）およびβ鎖可変領域（ＢＣＶＲ）のβ鎖エレメント（ＢＣエレメント）をコードする配列を含み、前記ＡＣＶＲおよび前記ＢＣＶＲがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のＡＣエレメントおよびＢＣエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
（項目３４）
項目３３に記載の方法により作製されたライブラリー。
（項目３５）
ａ）項目３４に記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップを含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
（項目３６）
ＴＣＲγ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびＴＣＲδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含む核酸配列であって、ＧＣＶＲおよびＤＣＶＲがマッチしている、核酸配列を作製する方法であって、方法が、以下：
ａ）以下：
ｉ）細胞由来のＧＣＶＲのＧＣエレメントをコードするセグメントを含むγ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＧＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、γ鎖（ＧＣ）ストランド；および
ｉｉ）前記細胞由来のＤＣＶＲのＤＣエレメントをコードするセグメントを含むδ鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＤＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドである、δ鎖（ＤＣ）ストランド、
を含む、隔離された産生反応部位を獲得するステップ、ならびに
ｂ）ＧＣストランドをＤＣストランドへ共有結合性に連結するステップ
を含み、前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＤＣＶＲまたはＧＣＶＲをコードする核酸を含まず、
それにより、前記核酸配列を作製する、
方法。
（項目３７）
前記核酸配列が、発現した時、前記ＧＣエレメントおよび前記ＤＣエレメントが、機能性抗原結合分子を形成するように、構成される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記共有結合性連結が、リガーゼを含む隔離された連結反応部位において起こる、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
複数個の固有メンバーを含むライブラリーを作製する方法であって、方法が、
項目３６〜３８のいずれかに記載の方法によって前記複数個のメンバーを作製するステップであって、メンバーのそれぞれが、γ鎖可変領域（ＧＣＶＲ）のγ鎖エレメント（ＧＣエレメント）およびδ鎖可変領域（ＤＣＶＲ）のδ鎖エレメント（ＤＣエレメント）をコードする配列を含み、前記ＧＣＶＲおよび前記ＤＣＶＲがマッチしている、ステップを含み、前記複数個のそれぞれの固有核酸配列が、異なる固有の細胞由来のＧＣエレメントおよびＤＣエレメントを含み、
それにより、ライブラリーを作製する、
方法。
（項目４０）
項目３９に記載の方法により作製されたライブラリー。
（項目４１）
ａ）項目４０に記載のライブラリーを獲得するステップ；および
ｂ）前記ライブラリーの固有核酸によりコードされるポリペプチドを発現するステップ
を含む、結合ポリペプチドを作製する方法。
（項目４２）
ａ）細胞由来のＨＣＶＲの重鎖（ＨＣ）エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＨＣストランド；ならびに  ｂ）前記細胞由来のＬＣＶＲの軽鎖（ＬＣ）エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＬＣストランド、
ｃ）第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間のヌクレオチド修飾を含むプライマーであって、前記ヌクレオチド修飾がＤＮＡ合成を低下させる、プライマー
を含む、隔離された産生反応部位であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしており、かつ前記隔離された産生反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＬＣＶＲまたはＨＣＶＲをコードする核酸を含まない、隔離された産生反応部位。
（項目４３）
前記第１のメンバーが、同じプライマーまたは異なるプライマー内の前記第２のメンバーとアニールして、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖構造を形成する能力がある、項目４２に記載の隔離された産生反応部位。
（項目４４）
第１のメンバー、第２のメンバー、および前記第１のメンバーと前記第２のメンバーとの間に位置したスペーサーを含む、自己アニーリング性オリゴヌクレオチドであって、前記第１のメンバーが、同じオリゴヌクレオチドまたは異なるオリゴヌクレオチドの前記第２のメンバーとアニールして、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれより多い塩基対の二重鎖領域を含むヘアピン構造または二本鎖構造を形成する能力がある、自己アニーリング性オリゴヌクレオチド。
（項目４５）
前記スペーサーが可撓性スペーサーまたはＰＥＧスペーサーである、項目４４に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目４６）
ａ）細胞由来のＨＣＶＲの重鎖（ＨＣ）エレメントをコードするセグメントを含む重鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＨＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＨＣストランド；
ｂ）前記細胞由来のＬＣＶＲの軽鎖（ＬＣ）エレメントをコードするセグメントを含む軽鎖二本鎖ｃＤＮＡ（ＬＣ  ｄｓ  ｃＤＮＡ）のストランドであるＬＣストランド；ならびに
ｃ）前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドの接合部を含む配列にハイブリダイズして、連結の部位に二重鎖領域を形成する能力があるスプリントオリゴヌクレオチドを含む、隔離された連結反応部位であって、前記ＨＣＶＲおよび前記ＬＣＶＲがマッチしており、前記ＨＣストランドおよび前記ＬＣストランドが共有結合性に連結され、前記隔離された連結反応部位が、前記細胞以外の細胞由来のＨＣＶＲまたはＬＣＶＲをコードする核酸を含まない、隔離された連結反応部位。
（項目４７）
リガーゼをさらに含む、項目４６に記載の隔離された連結反応部位。