【手続補正書】
【提出日】令和3年2月16日(2021.2.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性ポリペプチドで機能化されている除核赤血球系細胞を作製する方法であって、前記方法は、
（ａ）第１のクリックハンドルに共有結合をしている除核赤血球系細胞を含む活性化された細胞を提供することであって、前記活性化された細胞は、除核赤血球系細胞またはその前駆体と前記第１のクリックハンドルを含む糖と接触させることを含まない方法を用いて作製されたものであることと、
（ｂ）前記第１のクリックハンドルと反応することができる第２のクリックハンドルに共有結合をしている前記外因性ポリペプチドを含む活性化された作用剤を提供することと、
（ｃ）前記活性化された細胞と前記活性化された作用剤とを接触させ、それによって、前記外因性ポリペプチドで機能化されている前記除核赤血球系細胞を産生させることと
を含み、
前記活性化された細胞および前記外因性ポリペプチドで機能化されている前記除核赤血球系細胞のうちの一方または両方は、ソルターゼ転移シグネチャを欠いている、方法。
【請求項２】
前記外因性ポリペプチドが、約３０キロダルトン超である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外因性ポリペプチドが、約５００アミノ酸超の長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、前記外因性ポリペプチドで機能化されている前記除核赤血球系細胞の表面における内因性タンパク質のアミノ酸側鎖への前記活性化された作用剤の共有結合連結をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、除核赤血球系細胞と、第１のクリックハンドルを含む第１のカップリング試薬とを接触させ、それによって、前記活性化された細胞を産生することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、前記活性化された細胞と、前記第１のクリックハンドルと反応することができる第２のクリックハンドルと共有結合をしている第２の外因性ポリペプチドを含む活性化された作用剤とを接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、
（ｄ）前記活性化された細胞と、第３のクリックハンドルを含む第２のカップリング試薬とを接触させること、および
（ｅ）前記活性化された細胞と、前記第３のクリックハンドルと反応することができる第４のクリックハンドルに共有結合をしている第２の外因性ポリペプチドを含む第２の活性化された作用剤とを接触させること、
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記外因性ポリペプチドで機能化されている前記除核赤血球系細胞が、少なくとも５，０００コピーの前記外因性ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のクリックハンドルが、アジドまたはアルキンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のクリックハンドルが、アジドであり、前記アジドが、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステルまたは６−アジドヘキサン酸スルホ−ＮＨＳエステルを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のクリックハンドルが、アルキンを含み、前記アルキンが、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルまたはＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルキンが、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを含み、前記ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルが、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルまたはＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステルのいずれかである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のカップリング試薬が、リンカーを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が、前記外因性ポリペプチドと、前記第２のクリックハンドルを含む第２のカップリング試薬とを接触させ、それによって、前記活性化された作用剤を産生することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のクリックハンドルが、アジドまたはアルキンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２のクリックハンドルが、アジドであり、前記アジドが、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステルまたは６−アジドヘキサン酸スルホ−ＮＨＳエステルを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２のクリックハンドルが、アルキンを含み、前記アルキンが、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルまたはＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルキンが、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルを含み、前記ＤＢＣＯ−ＰＥＧ−ＮＨＳエステルが、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステルまたはＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステルのいずれかである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のカップリング試薬が、リンカーを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記外因性ポリペプチドが、酵素、抗原、抗体、抗体様分子、成長因子、輸送体、サイトカイン、ケモカイン、成長因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、ＤＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記活性化された細胞が、ソルターゼ転移シグネチャを欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記外因性ポリペプチドで機能化されている前記除核赤血球系細胞が、ソルターゼ転移シグネチャを欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化された細胞および前記外因性ポリペプチドで機能化されている前記除核赤血球系細胞の両方が、ソルターゼ転移シグネチャを欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法が、ソルタギングステップを含まない、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０５】
本明細書に記載されているものと同様または同等である方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を下記で記載する。本明細書において記述する全ての公開資料、特許出願、特許、および他の参照文献（例えば、配列データベース参照番号）は、その全体が参照により組み込まれている。例えば、本明細書において、例えば、本明細書における任意の表において言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＮＣＢＩ、およびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれている。他に特定しない限り、本明細書における任意の表を含めた本明細書において特定する配列受託番号は、２０１７年８月７日時点で最新のものであるデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受託番号を参照するとき、配列バリアントの全てが包含される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞表面におけるタンパク質のアミノ酸側鎖を介して前記細胞表面に共有結合的に連結している外因性ポリペプチド剤を含む除核赤血球系細胞であって、前記クリックシグネチャは、クリック反応の生成物として形成されたか、またはクリックシグネチャの構造を有する、除核赤血球系細胞。
（項目２）
除核赤血球系細胞であって、
複数の外因性ポリペプチド剤を含み、前記複数の各外因性ポリペプチド剤は、クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞表面に共有結合的に連結しており、
ここで、前記細胞上の外因性ポリペプチド剤の少なくとも１０％は、アミノ酸側鎖を介して前記細胞表面におけるタンパク質に連結しており、
ここで、前記クリックシグネチャは、クリック反応の生成物として形成されたか、またはクリックシグネチャの構造を有する、除核赤血球系細胞。
（項目３）
前記細胞上の外因性ポリペプチド剤の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、アミノ酸側鎖を介して前記細胞表面におけるタンパク質に連結している、項目２に記載の除核赤血球系細胞。
（項目４）
遺伝子操作されていない、項目１〜３のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目５）
非天然のアミノ酸を含まない、項目１〜４のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目６）
前記外因性ポリペプチド剤が、π−クランプを含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目７）
前記外因性ポリペプチド剤が、前記π−クランプを介して前記除核赤血球系細胞に共有結合的に連結している、項目６に記載の除核赤血球系細胞。
（項目８）
前記外因性ポリペプチド剤が、非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）を含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目９）
前記外因性ポリペプチド剤が、前記ｎｃＡＡを介して前記除核赤血球系細胞に共有結合的に連結している、項目８に記載の除核赤血球系細胞。
（項目１０）
ソルターゼ転移シグネチャを欠いている、項目１〜９のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目１１）
前記外因性ポリペプチド剤が、アルファ４ベータ７抗体、ＩＬ１０、酵素、例えば、アスパラギナーゼ、または凝固因子、例えば、第Ｘａ因子から選択される、項目１〜１０のいずれか一項に記載の除除核赤血球系細胞。
（項目１２）
少なくとも約５，０００コピー、約１０，０００コピー、約５０，０００コピー、約１００，０００コピー、もしくは約２００，０００コピーの前記外因性ポリペプチド剤、または５，０００〜１０，０００コピー、１０，０００〜５０，０００コピー、５０，０００〜１００，０００コピー、もしくは１００，０００〜２００，０００コピーの前記外因性ポリペプチド剤を含む、項目１〜１１のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目１３）
前記外因性ポリペプチド剤が、結合パートナーを結合するペプチドリガンドである、項目１〜１２のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目１４）
クリアランス速度を有し、ここで、作用剤の少なくとも２０％が、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日に亘り対象の循環器系中に留まる、項目１〜１３のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目１５）
前記細胞上のカップリング試薬の１０％未満が、未反応のカップリング試薬である、項目１〜１４のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目１６）
第２の外因性ポリペプチド剤をさらに含み、例えば、ここで、前記第２の外因性ポリペプチド剤が、クリックシグネチャを含む第２の残留リンカーによって前記細胞表面に共有結合的に連結している、項目１〜１５のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目１７）
第３の外因性ポリペプチド剤をさらに含み、例えば、ここで、前記第３の外因性ポリペプチド剤が、クリックシグネチャを含む第２の残留リンカーによって前記細胞表面に共有結合的に連結している、項目１６に記載の除核赤血球系細胞。
（項目１８）
前記外因性ポリペプチド剤の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、事前選択された配向を伴って前記細胞表面に共有結合的に連結しており、例えば、前記外因性ポリペプチド剤の同じ部分（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または特定の残基、例えば、システイン）によって付着している、項目１〜１７のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目１９）
前記外因性ポリペプチド剤が、前記細胞の内因性分子、例えば、前記細胞表面における内因性ポリペプチドに共有結合的に連結している、項目１〜１８のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
（項目２０）
少なくとも１０１０個、１０１１個、または１０１２個の項目１〜１９のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞を含む、調製物。
（項目２１）
前記調製物中の前記除核赤血球系細胞の少なくとも７０％が、前記作用剤を含む、項目２０に記載の調製物。
（項目２２）
前記調製物中の前記除核赤血球系細胞の少なくとも７０％が、例えば、実施例６のフローサイトメトリーアッセイにおいて、リガンドを結合する外因性ポリペプチド剤を含む、項目２０または２１に記載の調製物。
（項目２３）
前記調製物中の前記外因性ポリペプチド剤の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、事前選択された配向を伴って除核赤血球系細胞表面に共有結合的に連結しており、例えば、前記外因性ポリペプチド剤の同じ部分（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または特定の残基、例えば、システイン）によって付着している、項目２０〜２２のいずれか一項に記載の調製物。
（項目２４）
作用剤で機能化されている除核赤血球系細胞を作製する方法であって、
（ａ）第１のクリックハンドルに共有結合をしている細胞を含む活性化された細胞を提供することと、
（ｂ）前記第１のクリックハンドルと反応することができる第２のクリックハンドルに共有結合をしている作用剤（例えば、外因性ポリペプチド）を含む活性化された作用剤を提供することと、
（ｃ）前記活性化された細胞と前記活性化された作用剤とを接触させ、それによって、前記作用剤で機能化されている細胞を産生させることと
を含む、方法。
（項目２５）
項目２４に記載の方法によって産生される、除核赤血球系細胞。
（項目２６）
ヒト対象に作用剤を投与する方法であって、有効数の項目１〜１９のいずれか一項に記載の細胞を前記ヒト対象に投与し、それによって、前記作用剤を前記ヒト対象に投与することを含む、方法。
（項目２７）
医薬として使用するための、項目１〜１９のいずれか一項に記載の細胞。