【手続補正書】
【提出日】令和3年3月2日(2021.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
【図１ａ】図1a。ポリヌクレオチドカセットが標的遺伝子の3'非翻訳領域(UTR)に挿入されている一実施形態の模式図。この実施形態においては、リボスイッチのエフェクター配列は、リーダー配列に相補的な配列を含む。リガンドが存在しない場合、エフェクター配列は、リーダー配列を含むステムを形成しない。リーダー配列は、RNase Pにアクセス可能であり、RNAは切断され、標的遺伝子の分解及び発現の防止(又は低減)をもたらす。
【図１ｂ】図1b。アプタマーに結合したリガンド(◆)を伴う、図1aからのポリヌクレオチドカセットの模式図。リガンドが存在する場合、エフェクター配列は、RNase基質のリーダー配列を含むステムを形成する。リーダー配列は、もはやアクセス可能ではなく、RNase PによるRNAの切断は阻害され、標的遺伝子の発現の増大をもたらす。
【図２ａ】図2a。mascRNAのノザンブロット分析。mascRNAをコードする配列を、標的遺伝子(GFP)の3'UTRに挿入し、mRNAの切断及びタンパク質発現の低減をもたらした。示される構築物をトランスフェクトしたHeLa細胞を、トランスフェクションの24時間又は48時間後に収集し、RNA抽出した。DIG標識プローブは、ヒト及びマウスmascRNAの両方を認識する。レーン1及びレーン4は、内因性ヒトmascRNAを示し、レーン2及びレーン5は、GFPレポーター遺伝子の3'UTRに挿入されたマウスmascRNAによって生じたmascRNA発現の増大を示す。
【図２ｂ】図2b。5'UTR又は3'UTRのいずれかにおけるmascRNAの挿入は、GFP発現を減少する。HeLa細胞に、示される構築物をトランスフェクトし、トランスフェクションの48時間後にフローサイトメトリー分析に供した。GFP陽性集団の割合(%)及び平均蛍光強度(MFI:mean fluorescence intensity)をグラフで示す。3'UTR(GFP-masc)、5'UTR(masc-GFP)又は5'及び3'UTRの両方(masc-GFP-masc)のmascRNAを伴う構築物をトランスフェクトした細胞は、対照CMV-GFP構築物を有する細胞と比較して、GFP陽性細胞の割合及びMFIの両方における減少を有した。
【図２ｃ】図2c。3'UTRにおけるmascRNAの挿入は、ルシフェラーゼ標的遺伝子発現を減少する。マウスmascRNA(配列番号17)又は変異マウスmascRNA(配列番号18；本明細書においてmasc-mlpと呼ばれる)を、ルシフェラーゼ遺伝子の3'UTRに挿入した。マウスmascRNAの予測されるtRNA様二次構造を左パネル上に示し、UUCからAAGへのT-ループにおける変異を示す。右パネルは、ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。3'UTRにおけるmascRNAの挿入は、ルシフェラーゼ発現の81%の減少をもたらし(Luci-masc)、一方で、mascRNAのT-ループにおける変異を含有する構築物を有する細胞(Luci-masc-mlp)は、ルシフェラーゼ発現の20%のみの低減を示した。
【図３ａ】図3a。MG1(配列番号1)ポリヌクレオチドカセットからのmRNA転写産物の模式図。
【図３ｂ】図3b。GM1(配列番号2)ポリヌクレオチドカセットからのmRNA転写産物の模式図。
【図３ｃ】図3c。mRNAのRNase P切断のアプタマー媒介変調を通した遺伝子発現の調節。ルシフェラーゼアッセイの結果を示す。HEK293細胞に、示されるルシフェラーゼ対照構築物であるCon8、又はmascRNA及びグアニンアプタマー配列(MG1、GM1、GM2(配列番号3)及びGM3(配列番号4))の両方を含有する構築物をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、溶媒対照としてのDMSO、又はアプタマーリガンドとしてのグアノシンのいずれかで処理した。グアノシン処理の非存在下では、構築物MG1、GM1又はGM2をトランスフェクトした細胞は、対照構築物をトランスフェクトした細胞と比較して、ルシフェラーゼ発現の低減を示した。MG1、GM1又はGM2を有する細胞のグアノシン処理は、ルシフェラーゼ発現を増大したが、GM3を有する細胞のグアノシン処理は増大しなかった。ルシフェラーゼ活性は、平均値±S.D.(n=3)として表し、誘導倍率は、グアノシンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアノシンの非存在下で得た値で割った商として表した。
【図４ａ】図4a。アプタマーステムの上流(5')の局所配列における変化は、GM構築物におけるリボスイッチ活性に影響を及ぼす。示される構築物をトランスフェクトし、グアニンあり又はなしで処理したHEK293細胞において、ルシフェラーゼ活性を測定した。GM4(配列番号5)は、GM1からの3個のヌクレオチド変化を有し、アプタマーステムの5'の3個のヌクレオチドは、これらのヌクレオチドによる追加の塩基対形成の可能性を低減するように変えられている。
【図４ｂ】図4b。アプタマーとRNase P基質との間の距離は、GM構築物におけるリボスイッチ活性に影響を及ぼす。GM構築物におけるアプタマー/エフェクター領域の位置を、mascRNAと比較して1ヌクレオチド増分上流(5')に移動し、エフェクター領域(アプタマー)ステムの部分ではないリーダー配列の0〜3個のヌクレオチド(それぞれ、構築物GM5〜GM8(配列番号7〜10))を可能にした。示される構築物をトランスフェクトし、グアニンあり又はなしで処理し、(n=3)のHEK293細胞から、平均値±S.D.として表されるルシフェラーゼ活性を測定した。誘導倍率を、グアニンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアニンの非存在下で得た値で割った商として表した。2つの構造間に空間がないGM5構築物は、構築物GM4より低い基礎レベルのルシフェラーゼ発現によって示される通り、より効率的なRNase P媒介切断を有する。
【図４ｃ】図4c。MG構築物におけるRNase基質のアクセプターステムに相補的なリボスイッチエフェクター領域の長さの効果。mascRNAのアクセプターステムに相補的な、それぞれ、6〜3個のヌクレオチドを有するエフェクター領域ステムを有する構築物MG1〜MG4(各々、全部で8bpのエフェクター領域ステムを有する)を創出した。MG3(配列番号12)及びMG4(配列番号13)は、わずかにMG1より効率的なRNase P切断、及びグアニンによる処理に際してより効率的なルシフェラーゼ誘導を有する。
【図５】図5。RNase P基質としてのヒトtRNAArgを通して媒介されるXpt-グアニンアプタマー変調RNase P切断。対照構築物Con8、GM1(mascRNAを含有する)又はGArg(配列番号14)(ヒトtRNAArgを含有する)をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞をグアニンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、グアニンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアニンの非存在下で得た値で割った商として表した。
【図６ａ】図6a。テオフィリンアプタマーを有するリボスイッチは、mascRNA-RNase P媒介mRNA切断を変調した。対照構築物Con8、又はテオフィリンアプタマー及びmascRNAを含有する構築物TheoM(配列番号16)をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞を、3mMテオフィリンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、アプタマーリガンドの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、アプタマーリガンドの非存在下で得た値で割った商として表した。
【図６ｂ】図6b。アデニンアプタマーを有するリボスイッチは、mascRNA-RNase P媒介mRNA切断を変調した。対照構築物Con8、又はydhl-Aアデニンアプタマー及びmascRNAを含有する構築物YM(配列番号15)をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞を、1mMアデニンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、アプタマーリガンドの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、アプタマーリガンドの非存在下で得た値で割った商として表した。
【図７ａ】図7a。標的遺伝子発現のより厳格な調節を達成するためのRNase P基質ベースのリボスイッチと第2のリボスイッチとの組合せ使用。構築物G15又はGM1-G15をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞を500μMグアニンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、グアニンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアニンの非存在下で得た値で割った商として表した。
【図７ｂ】図7b。標的遺伝子発現のより厳格な調節を達成するためのRNase P基質ベースのリボスイッチと第2のリボスイッチとの組合せ使用。構築物G17又はGM1-G17をトランスフェクトしたHEK293細胞から、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクトした細胞を500μMグアニンあり又はなしで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定し、平均値±S.D.(n=3)として表した。誘導倍率を、グアニンの存在下で得たルシフェラーゼ活性を、グアニンの非存在下で得た値で割った商として表した。
【図７ｃ】図7c。Epo標的遺伝子発現のより厳格な調節を達成するためのRNase P基質ベースのリボスイッチと第2のリボスイッチとの組合せ使用。構築物G17_2IR3又は構築物GM1-G17_2IR3をトランスフェクトしたHEK293細胞から収集した上清から、ELISAを使用してマウスEpoタンパク質の発現を測定した。Epoの濃度を、平均値±S.D.(n=3)として表し、誘導倍率を、グアニンの存在下で得たEpo濃度を、グアニンの非存在下で得たEpo濃度で割った商として表した。
【図８−１】本明細書において説明する構築物の配列。標的遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ)コード配列の3'末端は、大文字であり;mascRNA又はtRNAArg配列は、イタリック体の小文字で、灰色で網掛けしており;アプタマー配列は、波下線を引いている。エフェクター領域ステムを形成する配列は、二重下線を引いている。
【図８−２】本明細書において説明する構築物の配列。標的遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ)コード配列の3'末端は、大文字であり;mascRNA又はtRNAArg配列は、イタリック体の小文字で、灰色で網掛けしており;アプタマー配列は、波下線を引いている。エフェクター領域ステムを形成する配列は、二重下線を引いている。
【図８−３】本明細書において説明する構築物の配列。標的遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ)コード配列の3'末端は、大文字であり;mascRNA又はtRNAArg配列は、イタリック体の小文字で、灰色で網掛けしており;アプタマー配列は、波下線を引いている。エフェクター領域ステムを形成する配列は、二重下線を引いている。
【図８−４】本明細書において説明する構築物の配列。標的遺伝子(例えばホタルルシフェラーゼ)コード配列の3'末端は、大文字であり;mascRNA又はtRNAArg配列は、イタリック体の小文字で、灰色で網掛けしており;アプタマー配列は、波下線を引いている。エフェクター領域ステムを形成する配列は、二重下線を引いている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
ノザンブロット分析:ヒト及びマウスmascRNAの両方を検出する配列tggaaaccaggagtgcca(配列番号19)を含有するロックド核酸(LNA:Locked Nucleic Acid)-修飾オリゴヌクレオチドを設計し、Exiqon社によって合成し、DIG Oligonucleotide Tailing Kit(Roche社)を使用してジゴキシゲニンで標識した。公開されているプロトコール(Kim, S. W.ら  A sensitive non-radioactive northern blot method to detect small RNAs. Nucleic Acids Res. 38、e98(2010))に従って、非放射性ノザンブロットを行った。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020508680000001.app