【手続補正書】
【提出日】令和2年12月24日(2020.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1のゲノム標的配列を標的とする第1のDMDガイドRNAをコードする配列、
第2のゲノム標的配列を標的とする第2のDMDガイドRNAをコードする配列、
第1のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第1のプロモーター、および
第2のDMAガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第2のプロモーター
を含む核酸であって、
第1のDMDガイドRNAをコードする配列および第2のDMDガイドRNAをコードする配列が、同一でありかつジストロフィン遺伝子内の配列を標的とする、
前記核酸。
【請求項２】
第3のゲノム標的配列を標的とする第3のDMDガイドRNAをコードする配列と
第3のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第3のプロモーターと
をさらに含み、第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および第3のDMDガイドRNAをコードする配列が同一であり、かつジストロフィン遺伝子内の配列を標的とする、請求項1に記載の核酸。
【請求項３】
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および存在する場合は第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、ジストロフィンスプライスアクセプター部位を標的とする、請求項1または2に記載の核酸。
【請求項４】
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および存在する場合は第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、ジストロフィンスプライスドナー部位を標的とする、請求項1または2に記載の核酸。
【請求項５】
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および存在する場合は第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO. 60〜864または947のいずれか１つの配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
【請求項６】
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および存在する場合は第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO. 714の配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
【請求項７】
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および存在する場合は第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO. 762の配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
【請求項８】
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および存在する場合は第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO. 790の配列を含む、請求項1または2に記載の核酸。
【請求項９】
第1のプロモーター、第2のプロモーター、および存在する場合は第3のプロモーターのうちの少なくとも2つが同一である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１０】
第1のプロモーター、第2のプロモーター、および存在する場合は第3のプロモーターのうちの少なくとも2つが同一ではない、請求項1〜8のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１１】
ジストロフィンスプライスアクセプター部位がエクソン51の5'スプライスアクセプター部位である、請求項3に記載の核酸。
【請求項１２】
第1のプロモーター、第2のプロモーター、または存在する場合は第3のプロモーターのうちの少なくとも1つが、構成的プロモーターを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１３】
第1のプロモーター、第2のプロモーター、または存在する場合は第3のプロモーターのうちの少なくとも1つが、誘導性プロモーターを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１４】
第1のプロモーター、第2のプロモーター、または存在する場合は第3のプロモーターのうちの少なくとも1つが、細胞タイプ特異的プロモーターを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１５】
細胞タイプ特異的プロモーターが、筋肉特異的プロモーターである、請求項14に記載の核酸。
【請求項１６】
第1のプロモーター、第2のプロモーター、および存在する場合は第3のプロモーターのうちの少なくとも1つが、U6プロモーター、H1プロモーター、または7SKプロモーターから選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１７】
第1のプロモーターがU6プロモーターであり、第2のプロモーターがH1プロモーターであり、かつ第3のプロモーターが7SKプロモーターである、請求項2〜8のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１８】
(a)  第1のプロモーターがU6プロモーターであり、かつ第2のプロモーターがH1プロモーターであるか、
(b)  第1のプロモーターがU6プロモーターであり、かつ第2のプロモーターが7SKプロモーターであるか、または
(c)  第1のプロモーターがH1プロモーターであり、かつ第2のプロモーターが7SKプロモーターである、
請求項1〜10のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１９】
SEQ ID NO．714を含むDMDガイドRNA（gRNA）を含む、核酸。
【請求項２０】
gRNAがシングルガイドRNA（sgRNA）である、請求項19に記載の核酸。
【請求項２１】
DNA配列を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２２】
RNA配列を含む、請求項1〜20のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２３】
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列をさらに含む、請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項２４】
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）から単離されたまたはそれに由来する配列を含み、任意でAAVがAAV2およびAAV4またはそれらの組み合わせから選択される、請求項23に記載の核酸。
【請求項２５】
請求項1〜24のいずれか一項に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項２６】
Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列をさらに含む、請求項25に記載のベクター。
【請求項２７】
DMDガイドRNAが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンリーディングフレームのリフレーミングを誘導する、請求項26に記載のベクター。
【請求項２８】
Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列が、化膿ブドウ球菌（S. pyogenes）Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する、請求項26または27に記載のベクター。
【請求項２９】
Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列が、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する、請求項26または27に記載のベクター。
【請求項３０】
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項25〜29のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３１】
請求項1〜24のいずれか一項に記載の核酸または請求項25〜30のいずれか一項に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項３２】
請求項1〜24のいずれか一項に記載の核酸または請求項25〜30のいずれか一項に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項３３】
請求項32に記載の組成物を含む、細胞。
【請求項３４】
請求項33に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項３５】
その必要がある対象における筋ジストロフィーの処置に使用するための、請求項32または34に記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本出願を通して、別の方法で示されない限り、ヌクレオチド配列は、5'から3'への方向で列挙され、アミノ酸配列は、N末端からC末端への方向で列挙される。
[本発明1001]
第1のゲノム標的配列を標的とする第1のDMDガイドRNAをコードする配列、
第2のゲノム標的配列を標的とする第2のDMDガイドRNAをコードする配列、
第1のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第1のプロモーターをコードする配列、および
第2のDMAガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第2のプロモーターをコードする配列
を含む核酸であって、
第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列が各々、ジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、
前記核酸。
[本発明1002]
第1のプロモーターをコードする配列および第2のプロモーターをコードする配列が同一である、本発明1001の核酸。
[本発明1003]
第1のプロモーターをコードする配列および第2のプロモーターをコードする配列が同一ではない、本発明1001の核酸。
[本発明1004]
第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列が同一である、本発明1001〜1003のいずれかの核酸。
[本発明1005]
第1のゲノム標的配列および第2のゲノム標的配列が同一ではない、本発明1001〜1003のいずれかの核酸。
[本発明1006]
第3のゲノム標的配列を標的とする第3のDMDガイドRNAをコードする配列と
第3のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第3のプロモーターをコードする配列と
をさらに含み、第3のゲノム標的配列がジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、本発明1001〜1005のいずれかの核酸。
[本発明1007]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、および第3のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一である、本発明1006の核酸。
[本発明1008]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、および第3のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、本発明1006の核酸。
[本発明1009]
第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、および第3のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一である、本発明1006〜1008のいずれかの核酸。
[本発明1010]
第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、および第3のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、本発明1006〜1008のいずれかの核酸。
[本発明1011]
第4のゲノム標的配列を標的とする第4のDMDガイドRNAをコードする配列と
DMDガイドRNAをコードする第4の配列の発現を駆動する第4のプロモーターをコードする配列と
をさらに含み、第4のゲノム標的配列がジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、本発明1006〜1010のいずれかの核酸。
[本発明1012]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、および第4のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一である、本発明1011の核酸。
[本発明1013]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、および第4のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、本発明1011の核酸。
[本発明1014]
第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、および第4のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一である、本発明1011〜1013のいずれかの核酸。
[本発明1015]
第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、および第4のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、本発明1011〜1013のいずれかの核酸。
[本発明1016]
第5のゲノム標的配列を標的とする第5のDMDガイドRNAをコードする配列と
第5のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する第5のプロモーターをコードする配列と
をさらに含み、第5のゲノム標的配列がジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、本発明1011〜1015のいずれかの核酸。
[本発明1017]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一である、本発明1016の核酸。
[本発明1018]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、本発明1016の核酸。
[本発明1019]
第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、第4のゲノム標的配列、および第5のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一である、本発明1016〜1018のいずれかの核酸。
[本発明1020]
第1のゲノム標的配列、第2のゲノム標的配列、第3のゲノム標的配列、第4のゲノム標的配列、および第5のゲノム標的配列のうちの少なくとも2つが同一ではない、本発明1016〜1018のいずれかの核酸。
[本発明1021]
ゲノム標的配列を標的とする追加のDMDガイドRNAをコードする少なくとも1つの配列と
該追加のDMDガイドRNAをコードする配列の発現を駆動する少なくとも1つの追加のプロモーターと
をさらに含み、該追加のゲノム標的配列がジストロフィンスプライスアクセプター部位を含む、本発明1016〜1020のいずれかの核酸。
[本発明1022]
ジストロフィンスプライスアクセプター部位がエクソン51の5'スプライスアクセプター部位である、本発明1001〜1021のいずれかの核酸。
[本発明1023]
第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列が、構成的プロモーターをコードする配列を含む、本発明1001〜1023のいずれかの核酸。
[本発明1024]
第1のプロモーターまたは第2のプロモーターが構成的プロモーターを含む、本発明1001〜1023のいずれかの核酸。
[本発明1025]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、構成的プロモーターをコードする配列を含む、本発明1020の核酸。
[本発明1026]
第1のプロモーター、第2のプロモーター、第3のプロモーター、第4のプロモーター、および第5のプロモーターのうちの少なくとも1つが、構成的プロモーターを含む、本発明1020の核酸。
[本発明1027]
第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列が、誘導性プロモーターをコードする配列を含む、本発明1001〜1023のいずれかの核酸。
[本発明1028]
第1のプロモーター、第2のプロモーター、第3のプロモーター、第4のプロモーター、および第5のプロモーターのうちの少なくとも1つが、誘導性プロモーターを含む、本発明1020の核酸。
[本発明1029]
第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列が、細胞タイプ特異的プロモーターをコードする配列を含む、本発明1001〜1023のいずれかの核酸。
[本発明1030]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、細胞タイプ特異的プロモーターを含む、本発明1020の核酸。
[本発明1031]
細胞タイプ特異的プロモーターをコードする配列が、筋肉特異的プロモーターをコードする配列を含む、本発明1029または1030の核酸。
[本発明1032]
第1のプロモーターをコードする配列または第2のプロモーターをコードする配列が、U6プロモーター、H1プロモーター、または7SKプロモーターをコードする配列を含む、本発明1001〜1022のいずれかの核酸。
[本発明1033]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、U6プロモーターをコードする配列、H1プロモーターをコードする配列、または7SKプロモーターをコードする配列を含む、本発明1020の核酸。
[本発明1034]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、U6プロモーターをコードする配列を含む、本発明1020の核酸。
[本発明1035]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、H1プロモーターをコードする配列を含む、本発明1020の核酸。
[本発明1036]
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、第3のプロモーターをコードする配列、第4のプロモーターをコードする配列、および第5のプロモーターをコードする配列のうちの少なくとも1つが、7SKプロモーターをコードする配列を含む、本発明1020の核酸。
[本発明1037]
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および第3のDMDガイドRNAをコードする配列が同一であり、
第1のプロモーターをコードする配列、第2のプロモーターをコードする配列、および第3のプロモーターをコードする配列が同一ではなく、かつ
5'スプライスアクセプター部位がエクソン51の5'スプライスアクセプター部位を含む、
本発明1006の核酸。
[本発明1038]
第1のプロモーターをコードする配列が、U6プロモーターをコードする配列を含み、第2のプロモーターをコードする配列が、H1プロモーターをコードする配列を含み、かつ第3のプロモーターをコードする配列が、7SKプロモーターをコードする配列を含む、本発明1037の核酸。
[本発明1039]
DNA配列を含む、本発明1001〜1038のいずれかの核酸。
[本発明1040]
RNA配列を含む、本発明1001〜1038のいずれかの核酸。
[本発明1041]
逆位末端反復（ITR）をコードする1つまたは複数の配列をさらに含む、本発明1001〜1040のいずれかの核酸。
[本発明1042]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列をさらに含む、本発明1001〜1040のいずれかの核酸。
[本発明1043]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1042の核酸。
[本発明1044]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1043の核酸。
[本発明1045]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列が、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1043の核酸。
[本発明1046]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1043の核酸。
[本発明1047]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列が、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1046の核酸。
[本発明1048]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、145ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、本発明1043〜1047のいずれかの核酸。
[本発明1049]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、115ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、本発明1043〜1047のいずれかの核酸。
[本発明1050]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、141ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、本発明1043〜1047のいずれかの核酸。
[本発明1051]
ポリアデノシン（ポリA）配列をさらに含む、本発明1001〜1050のいずれかの核酸。
[本発明1052]
ポリA配列がミニポリA配列である、本発明1051の核酸。
[本発明1053]
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、または第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO. 60〜382、706〜708、および712〜719のいずれか1つの配列を含む、本発明1006〜1052のいずれかの核酸。
[本発明1054]
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、または第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO: 714の配列を含む、本発明1006〜1052のいずれかの核酸。
[本発明1055]
第1のDMDガイドRNAをコードする配列、第2のDMDガイドRNAをコードする配列、および第3のDMDガイドRNAをコードする配列が、SEQ ID NO: 714の配列を含む、本発明1006〜1052のいずれかの核酸。
[本発明1056]
本発明1001〜1055のいずれかの核酸を含む、細胞。
[本発明1057]
本発明1001〜1055のいずれかの核酸を含む、組成物。
[本発明1058]
本発明1056の組成物を含む、細胞。
[本発明1059]
本発明1058の細胞を含む、組成物。
[本発明1060]
本発明1001〜1055のいずれかの核酸を含む、ベクター。
[本発明1061]
転位因子の逆位末端反復（ITR）をコードする配列をさらに含む、本発明1060のベクター。
[本発明1062]
転位因子がトランスポゾンである、本発明1061のベクター。
[本発明1063]
トランスポゾンがTn7トランスポゾンである、本発明1062のベクター。
[本発明1064]
T7トランスポゾンの5' ITRをコードする配列およびT7トランスポゾンの3' ITRをコードする配列をさらに含む、本発明1063のベクター。
[本発明1065]
非ウイルスベクターである、本発明1060〜1064のいずれかのベクター。
[本発明1066]
非ウイルスベクターがプラスミドである、本発明1065のベクター。
[本発明1067]
ウイルスベクターである、本発明1060〜1064のいずれかのベクター。
[本発明1068]
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、本発明1067のベクター。
[本発明1069]
AAVベクターが複製欠損型または条件付き複製欠損型である、本発明1069のベクター。
[本発明1070]
AAVベクターが組換えAAVベクターである、本発明1068または1069のベクター。
[本発明1071]
AAVベクターが、AAVベクターの血清型1（AAV1）、血清型2（AAV2）、血清型3（AAV3）、血清型4（AAV4）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型7（AAV7）、血清型8（AAV8）、血清型9（AAV9）、血清型10（AAV10）、血清型11（AAV11）、またはそれらの任意の組み合わせから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1068〜1070のいずれかのベクター。
[本発明1072]
AAVベクターが、AAVベクターの血清型9（AAV9）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1068〜1071のいずれかのベクター。
[本発明1073]
AAVベクターが、AAVベクターの血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1068〜1072のいずれかのベクター。
[本発明1074]
AAVベクターが、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む、本発明1068〜1073のいずれかのベクター。
[本発明1075]
AAVベクターが、AAVベクターの血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1068〜1072のいずれかのベクター。
[本発明1076]
AAVベクターが、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む、本発明1068〜1072または1075のいずれかのベクター。
[本発明1077]
哺乳動物細胞における発現のために最適化されている、本発明1060〜1076のいずれかのベクター。
[本発明1078]
ヒト細胞における発現のために最適化されている、本発明1060〜1077のいずれかのベクター。
[本発明1079]
SEQ ID NO. 914、SEQ ID NO. 915、SEQ ID NO. 916、またはSEQ ID NO. 917の核酸配列を含む、本発明1060〜1078のいずれかのベクター。
[本発明1080]
本発明1060〜1079のいずれかのベクターを含む、組成物。
[本発明1081]
薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明1080の組成物。
[本発明1082]
本発明1080または1081の組成物を含む、細胞。
[本発明1083]
ヒト細胞である、本発明1082の細胞。
[本発明1084]
筋細胞または衛星細胞である、本発明1082または1083の細胞。
[本発明1085]
人工多能性幹（iPS）細胞である、本発明1082または1083の細胞。
[本発明1086]
本発明1082〜1085のいずれかの細胞を含む、組成物。
[本発明1087]
プロモーターをコードする配列と、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列とを含む核酸であって、
該プロモーターをコードする配列が、筋肉特異的プロモーターをコードする配列を含む、
前記核酸。
[本発明1088]
筋肉特異的プロモーターをコードする配列が、CK8プロモーターをコードする配列を含む、本発明1087の核酸。
[本発明1089]
筋肉特異的プロモーターをコードする配列が、CK8eプロモーターをコードする配列を含む、本発明1087または1088の核酸。
[本発明1090]
Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列が、化膿ブドウ球菌（S. pyogenes）Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する、本発明1087〜1089のいずれかの核酸。
[本発明1091]
Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインが、黄色ブドウ球菌（S. aureus）Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列から単離されているか、またはそれに由来する。
[本発明1092]
Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列が、哺乳動物における発現のためにコドン最適化されている、本発明1087〜1091のいずれかの核酸。
[本発明1093]
Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列が、ヒトにおける発現のためにコドン最適化されている、本発明1087〜1091のいずれかの核酸。
[本発明1094]
ポリA配列をさらに含む、本発明1087〜1093のいずれかの核酸。
[本発明1095]
ポリA配列がミニポリA配列である、本発明1094の核酸。
[本発明1096]
逆位末端反復（ITR）をコードする1つまたは複数の配列をさらに含む、本発明1001〜1094のいずれかの核酸。
[本発明1097]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列をさらに含む、本発明1001〜1094のいずれかの核酸。
[本発明1098]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1097の核酸。
[本発明1099]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1098の核酸。
[本発明1100]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列が、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1099の核酸。
[本発明1101]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、アデノ随伴ウイルス（AAV）の血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1098の核酸。
[本発明1102]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列および3' ITRをコードする配列が、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1046の核酸。
[本発明1103]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、145ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、本発明1096〜1102のいずれかの核酸。
[本発明1104]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、115ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、本発明1096〜1102のいずれかの核酸。
[本発明1105]
5'逆位末端反復（ITR）をコードする配列または3' ITRをコードする配列が、141ヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、本発明1096〜1102のいずれかの核酸。
[本発明1106]
核局在化シグナルをさらに含む、本発明1001〜1055または1087〜1105のいずれかの核酸。
[本発明1107]
哺乳動物細胞における発現のために最適化されている、本発明1087〜1106のいずれかの核酸。
[本発明1108]
ヒト細胞における発現のために最適化されている、本発明1087〜1107のいずれかの核酸。
[本発明1109]
本発明1087〜1108のいずれかの核酸を含む、組成物。
[本発明1110]
本発明1087〜1108のいずれかの核酸を含む、細胞。
[本発明1111]
本発明1109の組成物を含む、細胞。
[本発明1112]
本発明1110または1111の細胞を含む、組成物。
[本発明1113]
本発明1087〜1108のいずれかの核酸を含む、ベクター。
[本発明1114]
転位因子の逆位末端反復（ITR）をコードする配列をさらに含む、本発明1113のベクター。
[本発明1115]
転位因子がトランスポゾンである、本発明1114のベクター。
[本発明1116]
トランスポゾンがTn7トランスポゾンである、本発明1115のベクター。
[本発明1117]
T7トランスポゾンの5' ITRをコードする配列およびT7トランスポゾンの3' ITRをコードする配列をさらに含む、本発明1116のベクター。
[本発明1118]
非ウイルスベクターである、本発明1113〜1117のいずれかのベクター。
[本発明1119]
非ウイルスベクターがプラスミドである、本発明1118のベクター。
[本発明1120]
ウイルスベクターである、本発明1113〜1117のいずれかのベクター。
[本発明1121]
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、本発明1120のベクター。
[本発明1122]
AAVベクターが複製欠損型または条件付き複製欠損型である、本発明1121のベクター。
[本発明1123]
AAVベクターが組換えAAVベクターである、本発明1121または1122のベクター。
[本発明1124]
AAVベクターが、AAVベクターの血清型1（AAV1）、血清型2（AAV2）、血清型3（AAV3）、血清型4（AAV4）、血清型5（AAV5）、血清型6（AAV6）、血清型7（AAV7）、血清型8（AAV8）、血清型9（AAV9）、血清型10（AAV10）、血清型11（AAV11）、またはそれらの任意の組み合わせから単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1121〜1123のいずれかのベクター。
[本発明1125]
AAVベクターが、AAVベクターの血清型9（AAV9）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1121〜1124のいずれかのベクター。
[本発明1126]
AAVベクターが、AAVベクターの血清型2（AAV2）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1121〜1125のいずれかのベクター。
[本発明1127]
AAVベクターが、AAV2から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む、本発明1121〜1126のいずれかのベクター。
[本発明1128]
AAVベクターが、AAVベクターの血清型4（AAV4）から単離されたまたはそれに由来する配列を含む、本発明1121〜1125のいずれかのベクター。
[本発明1129]
AAVベクターが、AAV4から単離されたまたはそれに由来する配列と、AAV9から単離されたまたはそれに由来する配列とを含む、本発明1121〜1125または1128のいずれかのベクター。
[本発明1130]
哺乳動物細胞における発現のために最適化されている、本発明1121〜1129のいずれかのベクター。
[本発明1131]
ヒト細胞における発現のために最適化されている、本発明1121〜1130のいずれかのベクター。
[本発明1132]
SEQ ID NO. 899、SEQ ID NO. 900、SEQ ID NO. 901、またはSEQ ID NO. 902の核酸配列を含む、本発明1113〜1132のいずれかのベクター。
[本発明1133]
本発明1113〜1132のいずれかのベクターを含む、組成物。
[本発明1134]
薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明1133の組成物。
[本発明1135]
本発明1133または1134の組成物を含む、細胞。
[本発明1136]
本発明1113〜1132のいずれかのベクターを含む、細胞。
[本発明1137]
ヒト細胞である、本発明1135または1136の細胞。
[本発明1138]
筋細胞または衛星細胞である、本発明1135〜1137のいずれかの細胞。
[本発明1139]
iPSまたはiCM細胞である、本発明1135〜1137のいずれかの細胞。
[本発明1140]
本発明1135〜1139のいずれかの細胞を含む、組成物。
[本発明1141]
本発明1001〜1055のいずれかの核酸配列を含む第1の核酸配列と
本発明1087〜1108のいずれかの核酸配列を含む第2の核酸配列と
を含む、組成物。
[本発明1142]
本発明1001〜1055のいずれかの核酸配列を含む第1のベクターと
本発明1087〜1108のいずれかの核酸配列を含む第2のベクターと
を含む、組成物。
[本発明1143]
本発明1060〜1079のいずれかのベクターと
本発明1113〜1132のいずれかのベクターと
を含む、組成物。
[本発明1144]
薬学的に許容される担体をさらに含む、本発明1141〜1143のいずれかの組成物。
[本発明1145]
ジストロフィン欠損を修正するための方法であって、
細胞と本発明1141〜1144のいずれかの組成物とを、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、
第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導する、
前記方法。
[本発明1146]
ジストロフィン欠損を修正するための方法であって、
細胞と本発明1141〜1144のいずれかの組成物とを、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、
第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンリーディングフレームのリフレーミングを誘導する、
前記方法。
[本発明1147]
ジストロフィンリーディングフレームのリフレーミングが挿入を誘導する、本発明1146の方法。
[本発明1148]
前記挿入が、単一のアデノシンヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、本発明1147の方法。
[本発明1149]
DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導するための方法であって、
細胞と本発明1141〜1144のいずれかの組成物とを、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、
第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、DMDエクソンの選択的スキッピングを誘導する、
前記方法。
[本発明1150]
ジストロフィンリーディングフレームにおいてリフレーミング事象を誘導するための方法であって、
細胞と本発明1141〜1144のいずれかの組成物とを、第1のDMDガイドRNA、第2のDMDガイドRNA、およびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適している条件下で接触させる工程を含み、
第1のDMDガイドRNAまたは第2のDMDガイドRNAのうちの少なくとも1つが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体を形成し、該少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、ジストロフィンリーディングフレームのリフレーミングを誘導する、
前記方法。
[本発明1151]
前記少なくとも1つのDMDガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を破壊し、ヒトDMD遺伝子のエクソン51の選択的スキッピングを誘導する、本発明1145〜1150のいずれかの方法。
[本発明1152]
本発明1145〜1151のいずれかの方法によって作製される、細胞。
[本発明1153]
本発明1141〜1144のいずれかの組成物の治療的有効量を対象に投与する工程を含む、その必要がある対象において筋ジストロフィーを処置する方法。
[本発明1154]
前記組成物が局所投与される、本発明1153の方法。
[本発明1155]
前記組成物が筋組織に直接投与される、本発明1153または1154の方法。
[本発明1156]
前記組成物が筋肉内注入または注射によって投与される、本発明1153〜1155のいずれかの方法。
[本発明1157]
前記筋組織が、前脛骨筋組織、四頭筋組織、ヒラメ筋組織、横隔膜組織、または心臓組織を含む、本発明1155または1156の方法。
[本発明1158]
前記組成物が心臓内注射によって投与される、本発明1153〜1157のいずれかの方法。
[本発明1159]
前記組成物が全身投与される、本発明1153の方法。
[本発明1160]
前記組成物が静脈内注入または注射によって投与される、本発明1159の方法。
[本発明1161]
組成物の投与後に、対象が、正常なジストロフィン陽性筋線維、および中心核を含有するモザイク状ジストロフィン陽性筋線維、またはそれらの組み合わせを呈する、本発明1153〜1160のいずれかの方法。
[本発明1162]
組成物の投与前の正常なジストロフィン陽性筋線維の欠如または存在量レベルと比較した時に、組成物の投与後に、対象が、正常なジストロフィン陽性筋線維の出現または存在量レベルの増加を呈する、本発明1153〜1161のいずれかの方法。
[本発明1163]
組成物の投与前の中心核を含有するモザイク状ジストロフィン陽性筋線維の欠如または存在量レベルと比較した時に、組成物の投与後に、対象が、中心核を含有するモザイク状ジストロフィン陽性筋線維の出現または存在量レベルの増加を呈する、本発明1153〜1162のいずれかの方法。
[本発明1164]
組成物の投与前の血清CKレベルと比較した時に、組成物の投与後に、対象が、減少した血清CKレベルを呈する、本発明1153〜1163のいずれかの方法。
[本発明1165]
組成物の投与前の握力と比較した時に、組成物の投与後に、対象が、改善された握力を呈する、本発明1153〜1164のいずれかの方法。
[本発明1166]
前記対象が、新生児、乳児、小児、若年成人、または成人である、本発明1153〜1165のいずれかの方法。
[本発明1167]
前記対象が筋ジストロフィーを有する、本発明1153〜1166のいずれかの方法。
[本発明1168]
前記対象が、筋ジストロフィーについての遺伝的保因者である、本発明1153〜1167のいずれかの方法。
[本発明1169]
前記対象が男性である、本発明1153〜1168のいずれかの方法。
[本発明1170]
前記対象が女性である、本発明1153〜1168のいずれかの方法。
[本発明1171]
前記対象が無症候性であるように見え、遺伝子診断により、DMD遺伝子産物の機能を損なうDMD遺伝子の一方または両方のコピーにおける変異が明らかになる、本発明1153〜1170のいずれかの方法。
[本発明1172]
前記対象が筋ジストロフィーの初期の徴候または症状を示す、本発明1153〜1171のいずれかの方法。
[本発明1173]
筋ジストロフィーの初期の徴候または症状が、筋肉量の損失または近位筋衰弱を含む、本発明1172の方法。
[本発明1174]
筋肉量の損失または近位筋衰弱が、一方または両方の脚および/または骨盤において起こり、その後1つまたは複数の上体筋肉において起こる、本発明1173の方法。
[本発明1175]
筋ジストロフィーの初期の徴候または症状が、仮性肥大、低持久力、起立困難、歩行困難、階段上行困難、またはそれらの組み合わせをさらに含む、本発明1174の方法。
[本発明1176]
前記対象が筋ジストロフィーの進行性の徴候または症状を示す、本発明1153〜1175のいずれかの方法。
[本発明1177]
筋ジストロフィーの進行性の徴候または症状が、筋組織消耗、筋組織が脂肪で置き換えられること、または筋組織が線維組織で置き換えられることを含む、本発明1176の方法。
[本発明1178]
前記対象が筋ジストロフィーの後期の徴候または症状を示す、本発明1153〜1177のいずれかの方法。
[本発明1179]
筋ジストロフィーの後期の徴候または症状が、異常な骨発生、脊柱の彎曲、運動の消失、および麻痺を含む、本発明1178の方法。
[本発明1180]
前記対象が筋ジストロフィーの神経学的な徴候または症状を示す、本発明1153〜1179のいずれかの方法。
[本発明1181]
筋ジストロフィーの神経学的な徴候または症状が、知的障害および麻痺を含む、本発明1180の方法。
[本発明1182]
筋ジストロフィーの進行性の、後期の、または神経学的な徴候または症状の1つまたは複数を対象が示す前に、組成物の投与が行われる、本発明1153〜1181のいずれかの方法。
[本発明1183]
前記対象が10歳未満である、本発明1153〜1182のいずれかの方法。
[本発明1184]
前記対象が5歳未満である、本発明1183の方法。
[本発明1185]
前記対象が2歳未満である、本発明1184の方法。
[本発明1186]
その必要がある対象において筋ジストロフィーを処置するための、本発明1141〜1144のいずれかの組成物の治療的有効量の使用。