【手続補正書】
【提出日】令和2年12月25日(2020.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物におけるシアル酸付加化合物を生成するための方法であって、
−  培養培地中で微生物を培養するステップであって、前記培養培地が、必要に応じて、外因性前駆体を含み、
前記微生物が、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み、
前記微生物が、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができない、ステップと、
−  ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の、前記微生物における発現を調節するステップであって、前記ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドが、
−  配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つ；
−  または前記ポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つのホモログまたは誘導体であって、参照株と比較して、シアル酸付加化合物、および／またはバイオマス生成を増大させる、ホモログまたは誘導体
を含み；
前記発現の調節が、前記発現を増大させることである、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記発現の調節が、ＨＡＤ様ポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入し、発現させることによって行われる；または前記発現の調節が、構成的プロモーターの作用によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シアル酸付加化合物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸、シアル酸付加オリゴ糖、シアル酸付加脂質、シアル酸付加タンパク質、シアル酸付加アグリコンからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
シアル酸付加オリゴ糖を生成するための方法であって、
−  培養培地中で微生物を培養するステップであって、前記培養培地が、必要に応じて、外因性前駆体を含み、
前記微生物が、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸、シアリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み、
前記微生物が、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができず；前記微生物が、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、好ましくはそれぞれＣｊＮｅｕＢまたはＮｍＮｅｕＢに由来するシアル酸合成酵素ポリペプチドをコードする核酸を含むことを特徴とする、ステップ
を含む、方法。
【請求項５】
前記微生物が、ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の調節された発現を含み、前記ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドが、
−  配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つ；
−  または前記ポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つのホモログまたは誘導体であって、参照株と比較して、シアル酸付加化合物、および／またはバイオマス生成を増大させる、ホモログまたは誘導体
を含み；前記発現の調節が、前記発現を増大させることである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記シアル酸付加化合物が、シアリルラクトース、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、シアル酸付加ラクト−Ｎ−トリオース、シアル酸付加ラクト−Ｎ−テトラオースおよびシアル酸付加ラクト−Ｎ−ネオテトラオースを含むリストから選択されるシアル酸付加オリゴ糖である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加ラクト−Ｎ−トリオース、シアル酸付加ラクト−Ｎ−テトラオースまたはシアル酸付加ラクト−Ｎ−ネオテトラオースであり、前記微生物が、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）の活性をさらに含み、好ましくは前記ガラクトシルトランスフェラーゼが、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｌａｔｔａ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙを含む群に由来する；および／または前記微生物が、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．９０）の活性を含み、好ましくは前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓを含む群に由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
好ましくは、前記微生物が、ＵＤＰ糖加水分解酵素およびガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現することができない、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物が、シアル酸付加化合物より、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％少ない細胞外Ｎ−アセチルグルコサミンおよび／またはＮ−アセチルマンノサミンを生成し、かつ／または前記微生物が、全炭水化物の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％に等しいか、もしくはそれよりも多いシアル酸付加化合物を生成する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
シアル酸付加オリゴ糖を生成するための方法であって、
ａ）請求項１から９のいずれか一項に記載の方法による微生物を培養するステップであって、前記微生物が、シアリルトランスフェラーゼを含み、前記シアリルトランスフェラーゼのドナー基質として活性化Ｎ−アセチルノイラミン酸塩を内部で生成する、ステップと、
ｂ）ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えば非限定的に、グロボ三糖（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）ガラクトースからなる群より選択される外因性前駆体を含む培養培地中で前記微生物を培養するステップであって、前記外因性前駆体の前記微生物への能動的取り込みが起こり、前記外因性前駆体が、前記シアル酸付加オリゴ糖を生成するための前記シアリルトランスフェラーゼのアクセプター基質である、ステップと
を含む、方法。
【請求項１１】
前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよび前記シアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、前記微生物で過剰発現される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよび前記シアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、前記微生物に導入され、発現される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物が、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子を欠く、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物において、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、活性が低減しており、好ましくは前記遺伝子が、欠失しているか、またはノックアウトされている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物が、ラクトースの取り込みを促進するタンパク質をさらにコードし、ラクトースを代謝する酵素を欠く、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記微生物が、細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株であり、さらにより好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５である、または前記微生物が酵母である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
外因性前駆体が、ラクトース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えばグロボ三糖（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）を含む群より選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
３シアリルラクトースまたは６シアリルラクトースを生成するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法であって、前記微生物が、炭素基質、例えばグルコースまたはグリセロールまたはスクロース上で高細胞密度で培養され、ラクトース透過酵素によって内部移行され、Ｎ−アセチルグルコサミンから内因的に産生するＣＭＰ−Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩を使用して前記組換えシアリルトランスフェラーゼによってシアル酸付加されるラクトースを供給される、方法。
【請求項１９】
前記シアル酸付加化合物が、遠心分離、濾過、精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、イオン交換、電気透析、クロマトグラフィー、疑似移動床式、蒸発、沈殿、結晶化、凍結乾燥および／または噴霧乾燥の群より選択される単位操作によって前記培養培地から単離される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記培養培地が、主要な炭素源として以下の、単糖、二糖、オリゴ糖、多糖、ポリオール、複合培地のうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記主要な炭素源が、前記微生物の増殖に必要なすべての炭素の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または１００％を提供する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記単糖が、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、リボースまたはアラビノースを含む群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記二糖が、マルトース、スクロース、ラクトース、トレハロース、セロビオースまたはキトビオースを含む群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴ糖が、マルトトリオース、フルクト−オリゴ糖、ガラクト−オリゴ糖、マンナンオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖またはグルコオリゴ糖を含む群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリオールが、グリセロールを含む群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記複合培地が、糖蜜、コーンスティープリカー、ペプトン、トリプトンまたは酵母抽出物を含む群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）請求項１に定義されるＨＡＤ様ポリペプチドをコードする核酸と、
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列の発現を駆動することができる１つまたは複数の制御配列であって、前記制御配列のうちの１つが、構成的プロモーターである、制御配列と、必要に応じて
（ｉｉｉ）転写終結配列と
を含む、構築物。
【請求項２８】
シアル酸付加化合物を生成するための方法における請求項２７に記載の構築物の使用。
【請求項２９】
食品配合物、飼料配合物、医薬配合物、美容配合物または農芸化学配合物に添加される、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物。
【請求項３０】
微生物であって、
前記微生物が、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み、
前記微生物が、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができず、
前記微生物が、ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の調節された発現を含み、前記ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドが、
−  配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つ；
−  または前記ポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つのホモログまたは誘導体であって、参照株と比較して、シアル酸付加化合物、および／またはバイオマス生成を増大させる、ホモログまたは誘導体
を含み；
前記発現の調節が、前記発現を増大させることであり；前記微生物が、シアル酸付加化合物を生成することができる、微生物。
【請求項３１】
遠心分離および／または濾過、イオン交換、蒸発またはナノ濾過による濃縮、結晶化または噴霧乾燥もしくは凍結乾燥による製剤化により精製される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物。
【請求項３２】
食品配合物、飼料配合物、医薬配合物、美容配合物または農芸化学配合物に添加される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物。
【請求項３３】
微生物であって、
−  細胞内でＮ−アセチルグルコサミン−６−リン酸をＮ−アセチルグルコサミンに、前記Ｎ−アセチルグルコサミンをＮ−アセチルマンノサミンに、そして前記Ｎ−アセチルマンノサミンをＮ−アセチル−ノイラミン酸塩に変換し；
−  ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができず；
−  シアル酸付加化合物を生成することができる、微生物。
【請求項３４】
前記微生物が、シアル酸生合成経路を含み、前記微生物の天然のシアル酸代謝経路が不能となっており、シアル酸の発酵生成の間に、炭素源として使用されていない多糖の取り込みのための、ホスホエノールピルビン酸塩：糖ホスホトランスフェラーゼ系の少なくとも１つが不能となっており、好ましくは、前記ホスホエノールピルビン酸塩：糖ホスホトランスフェラーゼ系の少なくとも１つが、ｍａｎＸ、ｍａｎＹ、ｍａｎＺ、ｎａｇＥをコードする遺伝子のリストから選択される遺伝子の少なくとも１つによってコードされ；かつ／または好ましくは前記不能なシアル酸生合成経路は、前記微生物が、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、および／またはｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができない場合に提供され、前記微生物がＮ−アセチルノイラミン酸塩（シアル酸）を生成することができる、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３５】
前記微生物が、外因性炭素源の獲得のためのホスホエノールピルビン酸塩：糖ホスホトランスフェラーゼ系を使用せずに、発酵槽中に唯一の炭素源として存在する前記外因性炭素源を、利用することができ、好ましくは前記炭素源がスクロース、グルコース、マルトース、グリセロールである、請求項３４に記載の微生物。
【請求項３６】
前記微生物が、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸、シアリルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み；前記微生物が、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、好ましくはそれぞれＣｊＮｅｕＢまたはＮｍＮｅｕＢに由来するシアル酸合成酵素ポリペプチドをコードする核酸を含むことを特徴とし、前記微生物が、シアル酸付加オリゴ糖を生成することができる、請求項３３に記載の微生物。
【請求項３７】
前記微生物が、ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の調節された発現をさらに含み、前記ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドが、
−  配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つ；
−  または前記ポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つのホモログまたは誘導体であって、参照株と比較して、シアル酸付加化合物、および／またはバイオマス生成を増大させる、ホモログまたは誘導体
を含み；前記発現の調節が、前記発現を増大させることである、請求項３６に記載の微生物。
【請求項３８】
前記シアル酸付加化合物が、シアリルラクトース、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、シアル酸付加ラクト−Ｎ−トリオース、シアル酸付加ラクト−Ｎ−テトラオースおよびシアル酸付加ラクト−Ｎ−ネオテトラオースを含むリストから選択されるシアル酸付加オリゴ糖である、請求項３３、３６または３７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項３９】
前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加ラクト−Ｎ−トリオース、シアル酸付加ラクト−Ｎ−テトラオースまたはシアル酸付加ラクト−Ｎ−ネオテトラオースであり、前記微生物が、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）の活性をさらに含み、好ましくは前記ガラクトシルトランスフェラーゼが、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｌａｔｔａ、Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ、Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉおよびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙを含む群に由来する；および／または前記微生物が、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．９０）の活性を含み、好ましくは前記Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼが、Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓおよびＭｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓを含む群に由来する、請求項３８に記載の微生物。
【請求項４０】
前記微生物が、ＵＤＰ糖加水分解酵素およびガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現することができない、請求項３９に記載の微生物。
【請求項４１】
前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよび前記シアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、前記微生物で過剰発現される、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４２】
前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよび前記シアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、前記微生物に導入され、発現される、請求項３３から４０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４３】
前記微生物が、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子を欠く、請求項３３から４２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４４】
前記微生物において、以下の酵素ｉ）Ｎ−アセチルグリコサミン−６−リン酸デアセチラーゼ、ｉｉ）Ｎ−アセチルグルコサミンキナーゼおよびｉｉｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼをコードする遺伝子は、活性が低減しており、好ましくは前記遺伝子が、欠失しているか、またはノックアウトされている、請求項３３から４２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４５】
前記微生物が、ラクトースの取り込みを促進するタンパク質をさらにコードし、ラクトースを代謝する酵素を欠く、請求項３３から４４のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４６】
前記微生物が、細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株であり、さらにより好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５である、または前記微生物が酵母である、請求項３３から４５のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項４７】
シアル酸付加化合物を生成するための方法における構築物の使用であって、前記構築物が、
（ｉ）請求項１に定義されるＨＡＤ様ポリペプチドをコードする核酸と、
（ｉｉ）（ａ）の核酸配列の発現を駆動することができる１つまたは複数の制御配列であって、必要に応じて、前記制御配列のうちの１つが、構成的プロモーターである、制御配列と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）転写終結配列と
を含む、使用。
【請求項４８】
前駆体としてのラクトースと、請求項３８から４６のいずれか一項に記載の微生物とを含む、細胞培養培地。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
別のさらなる実施形態において、上記方法はまた、代謝経路の遺伝子の構成的発現と組み合わせると、生成工程中の副産物形成を低減する代謝経路のより優れた調整を可能にする。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
微生物におけるシアル酸付加化合物を生成するための方法であって、
−  培養培地中で微生物を培養するステップであって、前記培養培地が、必要に応じて、外因性前駆体を含み、
前記微生物が、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み、
前記微生物が、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができない、ステップと、
−  ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の、前記微生物における発現を調節するステップであって、前記ＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドが、
−  以下のモチーフ：
モチーフ１：ｈＤｘＤｘ［ＴＶ］（配列番号７３）、もしくは
モチーフ２：［ＧＳＴＤＥ］［ＤＳＥＮ］ｘ（１−２）［ｈＰ］ｘ（１−２）［ＤＧＴＳ］（配列番号７４、７５、７６、７７）（ｈは、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｐ、Ｇ）を意味し、ｘは、任意の別個のアミノ酸であり得る）
のうちの少なくとも１つ、
−  または前記ポリペプチドと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の全体的な配列同一性を有する配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つのホモログまたは誘導体
を含む、ステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記ＨＡＤ様ポリペプチドが、配列番号４３、４４、４５、４７、４８、５０、５１、５２、５４、５５または５７のいずれか１つを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記発現の調節が、ＨＡＤ様ポリペプチドをコードする核酸を微生物に導入し、発現させることによって行われる、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記発現の調節が、構成的プロモーターの作用によって行われる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記シアル酸付加化合物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸、シアル酸付加オリゴ糖、シアル酸付加脂質、シアル酸付加タンパク質、シアル酸付加アグリコンからなる群より選択される、前記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加オリゴ糖である、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記シアル酸付加オリゴ糖が、シアリルラクトースである、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記シアル酸付加オリゴ糖が、ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースである、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記シアル酸付加化合物が、Ｎ−アセチルノイラミン酸である、項目５に記載の方法。
（項目１０）
前記シアル酸付加化合物が、シアル酸付加ラクト−Ｎ−トリオース、ラクト−Ｎ−テトラオースまたはラクト−Ｎ−ネオテトラオースであり、前記微生物が、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．３８）の活性をさらに含む、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記微生物が、ＵＤＰ糖加水分解酵素およびガラクトース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を発現することができない、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記微生物が、シアル酸付加化合物より、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％少ない細胞外Ｎ−アセチルグルコサミンを生成する、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
シアル酸付加オリゴ糖を生成するための方法であって、
ａ）項目１から１２のいずれか一項に記載の方法による微生物を培養するステップであって、前記微生物が、シアリルトランスフェラーゼのドナー基質として活性化Ｎ−アセチルノイラミン酸塩を内部で生成する、ステップと、
ｂ）ラクトース、Ｎ−アセチルラクトサミン、ラクト−Ｎ−ビオース、ガラクトース、ベータ−ガラクトシドおよびアルファ−ガラクトシド、例えば非限定的に、グロボ三糖（Ｇａｌ−アルファ−１，４Ｇａｌ−ベータ−１，４Ｇｌｃ）ガラクトースからなる群より選択される外因性前駆体を含む培養培地中で前記微生物を培養するステップであって、前記外因性前駆体の前記微生物への能動的取り込みが起こり、前記外因性前駆体が、前記シアル酸付加オリゴ糖を生成するための前記シアリルトランスフェラーゼのアクセプター基質である、ステップと
を含む、方法。
（項目１４）
前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよび前記シアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、前記微生物で過剰発現される、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼおよび前記シアル酸合成酵素のうちのいずれか１つまたは複数が、前記微生物に導入され、発現される、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記微生物が、細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株、より好ましくはＫ１２株であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株であり、さらにより好ましくは前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５である、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記微生物が、酵母である、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
ＨＡＤ様ポリペプチドをコードする組換え核酸を含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる微生物。
（項目１９）
シアル酸付加化合物を生成するための微生物であって、ホスファターゼをコードする少なくとも１つの核酸、Ｎ−アセチルマンノサミンエピメラーゼをコードする少なくとも１つの核酸およびシアル酸合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸を含み、ｉ）Ｎ−アセチルグルコサミン−６−Ｐをグルコサミン−６−Ｐに変換すること、ｉｉ）Ｎ−アセチル−グルコサミンをＮ−アセチル−グルコサミン−６−Ｐに変換すること、およびｉｉｉ）Ｎ−アセチル−ノイラミン酸塩をＮ−アセチル−マンノサミンに変換することができず、項目１または２に定義されるＨＡＤ様ホスファターゼポリペプチドをコードする核酸の調節された発現を含むことを特徴とする、微生物。
（項目２０）
（ｉ）項目１または２に定義されるＨＡＤ様ポリペプチドをコードする核酸と、
（ｉｉ）（ａ）の核酸配列の発現を駆動することができる１つまたは複数の制御配列と、必要に応じて、
（ｉｉｉ）転写終結配列と
を含む、構築物。
（項目２１）
前記制御配列のうちの１つが、構成的プロモーターである、項目２０に記載の構築物。
（項目２２）
シアル酸付加化合物を生成するための方法における項目２０または２１に記載の構築物の使用。
（項目２３）
食品配合物、飼料配合物、医薬配合物、美容配合物または農芸化学配合物に添加される、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法により生成されるシアル酸付加化合物。