【手続補正書】
【提出日】令和3年4月2日(2021.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の二本鎖核酸分子を含む二本鎖核酸材料を提供することであって、各々の二本鎖核酸分子が、各々の鎖上の単一分子識別子配列と前記二本鎖核酸分子の５’末端および／または３’末端のうちの少なくとも１つについてのアダプター分子とを含み、各々の二本鎖核酸分子に対して、第１のアダプター配列が第１の鎖と関連し、第２のアダプター配列が前記二本鎖核酸分子の第２の鎖と関連し、
前記核酸材料を増幅することと、
前記増幅した核酸材料を、第１の試料と第２の試料とに分離することと、
（ａ）前記第１のアダプター配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）目的の標的配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチド、
の使用により
前記第１の試料中の前記第１の鎖またはそのアンプリコンを増幅して、第１の核酸産物をもたらすことであって、前記単一分子識別子配列が少なくとも前記第１の核酸産物中に維持され、
（ａ）前記第２のアダプター配列中に存在する配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチド、および、
（ｂ）目的の標的配列に少なくとも部分的に相補的である少なくとも１つの一本鎖オリゴヌクレオチド、
の使用により、
前記第２の試料中の前記第２の鎖またはそのアンプリコンを増幅して、第２の核酸産物をもたらすことであって、前記単一分子識別子配列が少なくとも前記第２の核酸産物中に維持され、
前記第１の核酸産物および第２の核酸産物の各々を配列決定することと、
前記第１の核酸産物の配列と前記第２の核酸産物の配列とを比較することと、を含む、方法。
【請求項２】
核酸材料が、二本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＲＮＡのうちの少なくとも１つであるか、またはそれを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
提供するステップが、
二本鎖核酸材料を少なくとも１つの縮重または半縮重バーコード配列にライゲートして、二本鎖核酸分子バーコード複合体を形成することを含み、前記バーコード配列が、前記単一分子識別子配列を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
単一分子識別子配列が、二本鎖核酸分子を一意的に標識する、縮重もしくは半縮重バーコード配列、前記核酸材料の１つ以上の核酸断片末端、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
単一分子識別子配列が、内因性のせん断点または前記せん断点に位置的に関連する可能性のある内因性の配列を含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
核酸材料を増幅することが、前記第１の鎖に由来する複数の増幅産物と、前記第２の鎖に由来する複数の増幅産物とを生成することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
核酸材料の少なくとも一部が損傷している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
損傷が、酸化、アルキル化、脱アミノ化、メチル化、加水分解、ヒドロキシル化、ニッキング、鎖内架橋、鎖間架橋、平滑末端鎖切断、付着末端二重鎖切断、リン酸化、脱リン酸化、ＳＵＭＯ化、グリコシル化、脱グリコシル化、プトレシニル化、カルボキシル化、ハロゲン化、ホルミル化、一本鎖ギャップ、熱による損傷、乾燥による損傷、紫外線暴露による損傷、ガンマ線による損傷、Ｘ線による損傷、電離放射線による損傷、非電離放射線による損傷、重粒子線による損傷、核崩壊による損傷、ベータ線による損傷、アルファ線による損傷、中性子線による損傷、陽子線による損傷、宇宙線による損傷、高ｐＨによる損傷、低ｐＨによる損傷、反応性酸化種による損傷、フリーラジカルによる損傷、過酸化物による損傷、次亜塩素酸塩による損傷、ホルマリンまたはホルムアルデヒドなどの組織固定による損傷、反応性鉄による損傷、低イオン状態による損傷、高イオン状態による損傷、緩衝されていない状態による損傷、ヌクレアーゼによる損傷、環境暴露による損傷、火災による損傷、機械的ストレスによる損傷、酵素分解による損傷、微生物による損傷、分取機械的せん断による損傷、分取酵素による断片化による損傷、生体内で自然に生じた損傷、核酸抽出中に生じた損傷、配列決定ライブラリーの調製中に生じた損傷、ポリメラーゼによって導入された損傷、核酸の修復中に導入された損傷、核酸の末端処理中に生じた損傷、核酸ライゲーション中に生じた損傷、配列決定中に生じた損傷、ＤＮＡの機械的取り扱いにより生じた損傷、ナノポアを通過する際に生じた損傷、生物の老化の一部として生じた損傷、個体の化学物質への暴露の結果として生じた損傷、変異原性物質により生じた損傷、発がん性物質により生じた損傷、染色体異常誘発物質により生じた損傷、酸素暴露による生体内炎症損傷により生じた損傷、１つ以上の鎖切断による損傷、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つであるか、またはそれを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸材料が、対象または生物を起源とする１つ以上の二本鎖核酸分子を含む試料により提供される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
試料が、体組織、生検、皮膚試料、血液、血清、血漿、汗、唾液、脳脊髄液、粘液、子宮洗浄液、膣スワブ、パップスメア、鼻腔スワブ、口腔スワブ、組織擦過検体、髪の毛、指紋、尿、便、硝子体液、腹膜洗浄液、唾液、気管支洗浄液、口腔洗浄液、胸膜洗浄液、胃洗浄液、胃液、胆汁、膵管洗浄液、胆管洗浄液、総胆管洗浄液、胆嚢液、滑液、感染性創傷、非感染性創傷、考古学的な試料、法医学試料、水試料、組織試料、食品試料、バイオリアクター試料、植物試料、細菌試料、原生動物のサンプル、真菌試料、動物試料、ウイルス試料、複数の生体の試料、爪擦過検体、精液、前立腺液、膣液、膣スワブ、卵管洗浄液、無細胞核酸、細胞内の核酸、メタゲノミクス試料、移植された異物の洗浄液またはスワブ、鼻洗浄液、腸液、上皮擦過検体、上皮洗浄液、組織生検、剖検試料、剖検試料、臓器試料、人物同定試料、非ヒト同定試料、人工的に産生された核酸試料、合成遺伝子試料、バンクに寄託または保管された試料、腫瘍組織、胎児試料、臓器移植試料、微生物培養試料、核ＤＮＡ試料、ミトコンドリアＤＮＡ試料、葉緑体ＤＮＡ試料、アピコプラストＤＮＡ試料、細胞小器官試料、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸材料が、実質的に均一またはほぼ均一な長さの核酸分子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
実質的に均一な長さが、約１〜約１，０００，０００塩基である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸材料が、標的化エンドヌクレアーゼによって実質的に均一またはほぼ均一の長さの核酸分子に切断されている、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
核酸材料が、１つ以上の実質的に既知のサイズ範囲内の長さを有する核酸分子を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
核酸分子が１〜約１，０００，０００塩基、約１０〜約１０，０００塩基、約１００〜約１０００塩基、約１００〜約６００塩基、約１００〜約５００塩基、またはそれらのいくつかの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
提供するステップの前に、
実質的に既知の長さの標的核酸断片が形成されるように、１つ以上の標的化エンドヌクレアーゼにより核酸材料を切断することと、
前記実質的に既知の長さに基づいて、前記標的核酸断片を単離することと、を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
１つ以上の標的化エンドヌクレアーゼが、リボ核タンパク質、Ｃａｓ酵素、Ｃａｓ９様酵素、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターベースヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、アルゴノートヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１つ以上の標的化エンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ９もしくはＣＰＦ１またはそれらの誘導体を含む、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
提供するステップの前に、アダプターを標的核酸断片にライゲートすることをさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
標的核酸断片が対象または生物を起源とする、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
標的核酸断片が少なくとも部分的に人工的に合成されている、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
核酸材料を切断することが、実質的に既知の長さの２つ以上の標的核酸断片が形成されるように、前記核酸材料を１つ以上の標的化エンドヌクレアーゼによって切断することを含む、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
標的核酸断片が異なる実質的に既知の長さである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
標的核酸断片がそれぞれ、ゲノム中の１つ以上の異なる位置からの目的のゲノム配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
標的核酸断片がそれぞれ、核酸材料内の実質的に既知の領域からの標的配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
実質的に既知の長さに基づいて標的核酸断片を単離することが、ゲル電気泳動、ゲル精製、液体クロマトグラフィー、サイズ排除精製、濾過、またはＳＰＲＩビーズ精製による前記標的核酸断片の濃縮を含む、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの増幅するステップが、少なくとも１つの非標準ヌクレオチドであるか、またはそれを含む少なくとも１つのプライマーを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つのアダプター配列が、少なくとも１つの非標準ヌクレオチドであるか、またはそれを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
非標準ヌクレオチドが、ウラシル、メチル化ヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチド、リボースヌクレオチド、８−オキソ−グアニン、ビオチン化ヌクレオチド、デスチオビオチンヌクレオチド、チオール修飾ヌクレオチド、アクリダイト修飾ヌクレオチド  ｉｓｏ−ｄＣ、ｉｓｏ  ｄＧ、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、イノシンヌクレオチド  ロックド核酸、ペプチド核酸、５メチルｄＣ、５−ブロモデオキシウリジン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリンヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、５−ニトロインドールヌクレオチド、アデニル化ヌクレオチド、アジドヌクレオチド、ジゴキシゲニンヌクレオチド、Ｉリンカー、５’ヘキシニル修飾ヌクレオチド、５−オクタジイニルｄＵ、光開裂性スペーサー、非光開裂性スペーサー、クリックケミストリー対応の修飾ヌクレオチド、蛍光色素、ビオチン、フラン、ＢｒｄＵ、フルオロ−ｄＵ、ｌｏｔｏ−ｄＵ、およびそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項２７または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
第１の核酸産物および第２の核酸産物の各々を配列決定することが、
第１の核酸産物中の複数の鎖の前記配列を比較して、第１の鎖のコンセンサス配列を決定することと、
前記第２の核酸産物中の複数の鎖の前記配列を比較して、第２の鎖のコンセンサス配列を決定することと、を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
第１の核酸産物の配列を第２の核酸産物の配列と比較することが、第１の鎖のコンセンサス配列と第２の鎖のコンセンサス配列を比較して、エラーが訂正されたコンセンサス配列を提供することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
第１の核酸産物および第２の核酸産物の各々を配列決定することが、
第１の核酸産物の鎖の少なくとも１つを配列決定して、第１の鎖の配列読取を決定することと、
第２の核酸産物の鎖の少なくとも１つを配列決定して、第２の鎖の配列読取を決定することと、
前記第１の鎖の配列読取と前記第２の鎖の配列読取とを比較して、エラーが訂正された配列読取を生成することと、を含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
エラーが訂正された配列読取が、第１の鎖の配列読取と第２の鎖の配列読取との間で一致するヌクレオチド塩基を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
エラーが訂正された配列読取の特定の位置で生じる変動が真のバリアントとして同定される、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第１の鎖の配列読取または前記第２の鎖の配列読取の一方のみの特定の位置で生じる変動が潜在的なアーティファクトとして同定される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
エラーが訂正された配列読取が、二本鎖標的核酸分子が由来する生物または対象における、がん、がんリスク、がん変異、がんの代謝状態、ミューテーターの表現型、発がん物質への暴露、毒素暴露、慢性炎症暴露、年齢、神経変性疾患、病原体、薬剤耐性バリアント、胎児分子、法医学に関連する分子、免疫学的に関連する分子、変異したＴ細胞受容体、変異したＢ細胞受容体、変異した免疫グロブリン遺伝子座、ゲノムのカタエギス部位、ゲノムの超変異部位、低頻度バリアント、サブクローンバリアント、少数の分子集団、混入源、核酸合成エラー、酵素修飾エラー、化学修飾エラー、遺伝子編集エラー、遺伝子治療エラー、核酸情報ストレージの断片、微生物の準種、ウイルスの準種、臓器移植、臓器移植拒絶、がん再発、治療後の残存がん、前がん状態、異形成状態、マイクロキメリズム状態、幹細胞移植状態、細胞療法状態、別の分子に付着した核酸標識、またはそれらの組み合わせを同定または特性評価するために使用される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
エラーが訂正された配列読取が、変異原性化合物または曝露を同定するために使用される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
エラーが訂正された配列読取が、発がん性化合物または曝露を同定するために使用される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
核酸材料が法医学試料に由来し、前記エラーが訂正された配列読取が法医学分析で使用される、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも１つの増幅するステップがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
最大でも１０００ｎｇの核酸材料が最初に提供される、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
最大でも１０ｎｇの核酸材料が最初に提供される、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
第１の試料中の核酸材料を増幅することが、分離するステップの後、および前記第１の試料を増幅することの前に、前記核酸材料上に見られる第２のアダプター配列を破壊または崩壊することをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
第２の試料中の核酸材料を増幅することが、分離するステップの後、および前記第２の試料を増幅することの前に、前記核酸材料上に見られる第１のアダプター配列を破壊または崩壊することをさらに含む、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
破壊することが、酵素消化、少なくとも１つの複製阻害分子の含有、酵素的切断、一方の鎖の酵素的切断、両方の鎖の酵素的切断、切断または一方もしくは両方の鎖をもたらす酵素処理が後に続く修飾された核酸の取り込み、複製阻止ヌクレオチドの組み込み、連鎖停止剤の組み込み、光切断可能なリンカーの取り込み、ウラシルの取り込み、リボース塩基の取り込み、８−オキソ−グアニン付加物の組み込み、制限エンドヌクレアーゼの使用、標的化ヌクレアーゼの使用、およびそれらの任意の組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
増幅することが、ローリングサークル増幅、多置換増幅、等温増幅、ブリッジ増幅、または表面結合増幅を含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
核酸材料を増幅することが、目的の配列に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチド、および前記アダプターの領域に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含む、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
核酸材料が、核酸材料の各々の鎖の５’末端および３’末端の各々にアダプターを含む、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
核酸材料を増幅することが、第１のアダプター配列および前記第２のアダプター配列の領域に少なくとも部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドの使用を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
アダプターが、少なくとも部分的に非相補的であるか、または少なくとも１つの非標準塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチド位置を含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
アダプターが、約５個以上の自己相補型ヌクレオチドによって形成される単一の「Ｕ字型」オリゴヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
核酸材料が、２つ以上の供給源に由来する核酸材料を含む、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
エラー訂正コンセンサス配列が第１の鎖のコンセンサス配列と第２の鎖のコンセンサス配列で一致するヌクレオチドを含む、請求項３１記載の方法。
【請求項５４】
エラー訂正コンセンサス配列中の特定の位置で生じる変動が真のバリアントとして同定される、請求項３１記載の方法。
【請求項５５】
第１の鎖のコンセンサス配列または第２の鎖のコンセンサス配列の一方のみの特定の位置で生じる変動が潜在的なアーティファクトとして同定される、請求項３１記載の方法。