【手続補正書】
【提出日】令和3年10月11日(2021.10.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０１】
本開示は以下の実施形態を含む。
［１］
植物における耐倒伏性を改変する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む、方法。
［２］
前記方法が、植物における耐倒伏性を増加させ、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む、［1］に記載の方法。
［３］
前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択される、［1］または［2］に記載の方法。
［４］
少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入して発現させることを含み、前記核酸は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体が調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。
［５］
ラッカーゼ3をコードする核酸が配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸が配列番号5または6に定義される配列もしくはその機能的バリアントもしくは相同体を含む、［4］に記載の方法。
［６］
配列番号7もしくは16に定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を導入して発現させることを含む、［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。
［７］
前記調節配列が構成的プロモーターまたは強力なプロモーターである、［4］または［6］に記載の方法。
［８］
miR528の活性が、少なくとも1つのmiR528阻害因子を使用して減少される、［2］に記載の方法。
［９］
前記miR528阻害因子が、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである、［8］に記載の方法。
［１０］
前記方法は、
少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子に少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、ここでラッカーゼポリペプチドが、miR528結合部位において少なくとも1つの突然変異を含み、および／または、
miR528および／またはbの遺伝子またはmiR528プロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含む、
［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。
［１１］
前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、前記ラッカーゼ3遺伝子が配列番号1で定義されるポリペプチドをコードし、前記ラッカーゼ5遺伝子が配列番号4で定義されるポリペプチドをコードする、［10］に記載の方法。
［１２］
少なくとも1つの突然変異が、配列番号3の位置1〜12から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号2の位置191〜211から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択される少なくとも1つの位置に導入される、［10］に記載の方法。
［１３］
前記突然変異が、標的化ゲノム修飾、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入される、［12］記載の方法。
［１４］
前記突然変異が、突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて導入される、［12］に記載の方法。
［１５］
前記方法は、植物における耐倒伏性を減少させ、前記方法が、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を減少させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を増加させることを含む、［1］に記載の方法。
［１６］
前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、前記ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1に定義されるポリペプチドをコードし、前記ラッカーゼ5遺伝子は配列番号4に定義されるポリペプチドをコードする、［15］に記載の方法。
［１７］
少なくとも1つのラッカーゼの遺伝子および／またはプロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、前記突然変異が、野生型または対照ポリペプチドと比べてラッカーゼ核酸の発現を減少させる、［15］または［16］に記載の方法。
［１８］
前記突然変異が、標的化ゲノム修飾、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入される、［17］記載の方法。
［１９］
突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて導入される、［17］に記載の方法。
［２０］
RNA干渉を用いて、少なくとも1つのラッカーゼ核酸、好ましくはラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を減少または消失させることを含む、［15］または［16］に記載の方法。
［２１］
前記方法は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入して発現させることを含み、前記核酸は配列番号10に定義されるmiR528またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、［15］または［16］に記載の方法。
［２２］
前記方法は、配列番号9を含むmiR528またはその機能的バリアントを導入することを含む、［15］または［16］に記載の方法。
［２３］
前記植物が、対照植物または野生型植物と比べて増加したリグニン含量を有する、［1］〜［22］のいずれかに記載の方法。
［２４］
野生型または対照植物と比べて、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベル、および／またはmiR528の発現もしくは活性が改変される、［1］〜［23］のいずれかに記載の方法。
［２５］
対照植物または野生型植物と比べて根の耐倒伏性が改変される、［1］〜［24］のいずれかに記載の方法。
［２６］
前記植物がトウモロコシである、［1］〜［25］のいずれかに記載の方法。
［２７］
収量、種子品質および茎強度のうちの少なくとも1つを向上させる方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む、方法。
［２８］
植物におけるリグニン含量を改変する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む、方法。
［２９］
少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の改変された発現もしくはレベル、および／またはmiR528の改変された発現もしくは活性によって特徴づけられる遺伝子改変植物、その一部分、または植物細胞。
［３０］
前記植物が、改変されたリグニン含量によって特徴付けられる、［29］に記載の遺伝子改変植物。
［３１］
野生型または対照植物と比べて、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の増加および／またはmiR528の発現もしくは活性の減少によって特徴づけられる、［29］または［30］に記載の遺伝子改変植物。
［３２］
前記植物は少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を発現し、前記核酸が、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体が調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、［31］に記載の遺伝子改変植物。
［３３］
ラッカーゼ3をコードする核酸が配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸が配列番号5もしくは6に定義される配列またはその機能的バリアントもしくは相同体を含む、［32］に記載の遺伝子改変植物。
［３４］
前記植物が、配列番号7もしくは16で定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を発現する、［31］に記載の遺伝子改変植物。
［３５］
前記調節配列が構成的プロモーターまたは強力なプロモーターである、［32］または［34］に記載の遺伝子改変植物。
［３６］
前記植物が少なくとも1つのmiR528阻害因子を発現する、［31］に記載の遺伝子改変植物。
［３７］
前記miR528阻害因子が、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである、［36］に記載の遺伝子改変植物。
［３８］
前記植物が、ラッカーゼ核酸をコードする少なくとも1つの核酸において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは、前記ラッカーゼ核酸がラッカーゼ3および5から選択され、かつ前記突然変異が、miR528結合部位にある、および／または、miR528および／またはb遺伝子もしくはmiR528プロモーターにおける少なくとも1つの突然変異である、［31］に記載の遺伝子改変植物。
［３９］
前記突然変異が、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENまたはCRISPR/Cas9を用いて導入されたものである、［38］に記載の遺伝子改変植物。
［４０］
前記突然変異が、突然変異誘発、好ましくはTILLINGまたはT-DNA挿入を用いて導入されたものである、［38］に記載の遺伝子改変植物。
［４１］
前記突然変異が、配列番号3の位置1〜12から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択される少なくとも1つの位置に導入されている、［38］〜［40］のいずれかに記載の遺伝子改変植物。
［４２］
前記植物が少なくとも1つのmiR528阻害因子を発現し、前記miR528阻害因子が配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである、［31］に記載の遺伝子改変植物。
［４３］
野生型または対照植物と比べて、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の減少および／またはmiR528の発現もしくは活性の増加によって特徴づけられる、［29］または［30］に記載の遺伝子改変植物。
［４４］
前記植物が、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を発現し、前記核酸が配列番号10に定義されるmiR528もしくはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードするか、または、前記植物は、配列番号9を含むmiR528もしくはその機能的バリアントを発現する、［43］に記載の遺伝子改変植物。
［４５］
前記植物が、ラッカーゼ核酸をコードする少なくとも1つの核酸において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは、前記ラッカーゼ核酸がラッカーゼ3および5から選択され、前記突然変異が、野生型または対照ポリペプチドと比べて前記ラッカーゼ核酸の発現を減少させる、［44］に記載の遺伝子改変植物。
［４６］
前記核酸が、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードする、［45］に記載の遺伝子改変植物。
［４７］
前記突然変異が、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENもしくはCRISPR/Cas9を用いて導入されるか、または突然変異誘発、好ましくはTILLINGもしくはT-DNA挿入を用いて導入されたものである、［45］または［46］に記載の遺伝子改変植物。
［４８］
前記植物が、野生型または対照植物と比べて少なくとも1つのラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を減少させるRNAi分子を発現する、［43］に記載の遺伝子改変植物。
［４９］
前記植物がトウモロコシである、［29］〜［48］のいずれかに記載の遺伝子改変植物。
［５０］
植物の耐倒伏性が改変された植物を作製する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む、方法。
［５１］
前記植物が、野生型または対照植物と比べて改変されたリグニン含量を有する、［50］に記載の方法。
［５２］
前記植物が、増加された耐倒伏性を有し、前記方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含む、［50］に記載の方法。
［５３］
前記方法は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入し発現させることを含み、前記核酸は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体が調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、［52］に記載の方法。
［５４］
ラッカーゼ3をコードする核酸が配列番号2もしくは3に定義される配列またはその機能的バリアントまたは相同体を含み、ラッカーゼ5をコードする核酸が配列番号5もしくは6に定義される配列またはその機能的バリアントまたは相同体を含む、［53］に記載の方法。
［５５］
配列番号7もしくは16に定義される核酸配列またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものを含む核酸構築物を導入し発現させることを含む、［50］〜［52］のいずれかに記載の方法。
［５６］
前記調節配列が構成的プロモーターまたは強力なプロモーターである、［53］または［55］に記載の方法。
［５７］
少なくとも1つのmiR528阻害因子を用いてmiR528の活性が減少される、［52］に記載の方法。
［５８］
前記miR528阻害因子が、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントである、［57］に記載の方法。
［５９］
前記方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子に少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、ラッカーゼポリペプチドが、miR528結合部位において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1に定義されるポリペプチドをコードし、ラッカーゼ5遺伝子は配列番号4に定義されるポリペプチドをコードする、［50］〜［52］のいずれかに記載の方法。
［６０］
少なくとも1つの突然変異が、配列番号3の位置1〜12から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択される少なくとも1つの位置に導入される、［59］に記載の方法。
［６１］
前記突然変異が、標的化ゲノム修飾、好ましくはZFN、TALENもしくはCRISPR/Cas9を用いて導入されるか、または突然変異誘発、好ましくはTILLINGもしくはT-DNA挿入を用いて導入される、［59］記載の方法。
［６２］
前記植物が、減少された耐倒伏性を有し、前記方法は少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を減少させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を増加させることを含む、［50］に記載の方法。
［６３］
ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3および／またはラッカーゼ5から選択され、ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1で定義されるポリペプチドをコードし、ラッカーゼ5遺伝子は配列番号4で定義されるポリペプチドをコードする、［62］に記載の方法。
［６４］
前記方法は、少なくとも1つのラッカーゼの遺伝子および／またはプロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、前記突然変異が、野生型または対照ポリペプチドと比べてラッカーゼ核酸の発現を減少させる、［62］または［63］に記載の方法。
［６５］
前記突然変異が、標的化ゲノム改変、好ましくはZFN、TALENもしくはCRISPR/Cas9を用いて導入されるか、または突然変異誘発、好ましくはTILLINGもしくはT-DNA挿入を用いて導入される、［64］記載の方法。
［６６］
RNA干渉を用いて、少なくとも1つのラッカーゼ核酸、好ましくはラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を減少または消失させることを含む、［62］記載の方法。
［６７］
前記方法は、少なくとも1つの核酸を含む核酸構築物を導入し発現させることを含み、前記核酸は、配列番号10に定義されるmiR528またはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードする、［62］に記載の方法。
［６８］
前記方法は、配列番号9を含むmiR528またはその機能的バリアントを導入することを含む、［67］に記載の方法。
［６９］
前記方法は、好ましくは対照植物または野生型植物と比較して、倒伏の変化を測定することをさらに含む、［50］〜［68］のいずれかに記載の方法。
［７０］
植物体を再生し、倒伏の変化についてスクリーニングすることをさらに含む、［50］〜［69］のいずれかに記載の方法。
［７１］
前記植物がトウモロコシである、［50］〜［70］のいずれかに記載の方法。
［７２］
［50］〜［71］のいずれかにより取得されたかまたは取得可能な、植物。
［７３］
配列番号7または16で定義されるmiR528阻害因子またはその機能的バリアントをコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
［７４］
［73］に記載の核酸構築物を含むベクター。
［７５］
配列番号8で定義されるRNA配列を有するRNA分子またはその機能的バリアントを含む、miR528阻害因子。
［７６］
［73］に記載の核酸構築物、［74］に記載のベクター、または［75］に記載のmiR528阻害因子を含む宿主細胞。
［７７］
前記宿主細胞が細菌または植物細胞である、［76］に記載の宿主細胞。
［７８］
［73］に記載の核酸構築物、［74］に記載のベクター、または［75］に記載のmiR528阻害因子を発現する、トランスジェニック植物。
［７９］
前記植物がトウモロコシである、［78］に記載のトランスジェニック植物。
［８０］
対照植物または野生型植物と比べて植物における耐倒伏性を増加させるための、［73］に記載の核酸構築物、［74］に記載のベクター、または［75］に記載のmiR528阻害因子の使用。
［８１］
対照植物または野生型植物と比べて、植物におけるリグニン合成を調節し、リグニン含量を調節し、および／またはリグニン合成を促進させるための、［73］に記載の核酸構築物、［74］に記載のベクターまたは［75］に記載のmiR528阻害因子の使用。
［８２］
［73］に記載の核酸構築物、［74］に記載のベクターまたは［75］に記載のmiR528阻害因子が、対照または野生型植物と比べて植物におけるリグニン合成を増加させ、および／またはリグニン含量を増加させる、［81］の使用。
［８３］
リグニン合成および／またはリグニン含量が、植物の茎および／または根において増加される、［81］または［82］に記載の使用。
［８４］
少なくとも1つのmiR528遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメイン、または少なくとも1つのラッカーゼ3遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメイン、または少なくとも1つのラッカーゼ5遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメインをコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
［８５］
前記核酸配列が少なくとも1つのプロトスペーサーエレメントをコードし、前記プロトスペーサーエレメントの配列が、配列番号34、37、41、44もしくは52、55、58、もしくは61から選択されるか、または配列番号34、37、41、44、52、55、58、もしくは61と少なくとも90%同一である、［84］に記載の核酸構築物。
［８６］
前記構築物が、CRISPR RNA（crRNA）配列をコードする核酸配列をさらに含み、前記crRNA配列が、プロトスペーサーエレメント配列および追加的ヌクレオチドを含む、［84］または［85］に記載の核酸構築物。
［８７］
前記構築物が、トランス活性化RNA（tracrRNA）をコードする核酸配列をさらに含み、好ましくは前記tracrRNAが配列番号31で定義されるものであるかまたはその機能的バリアントである、［84］〜［86］のいずれかに記載の核酸構築物。
［８８］
前記構築物が少なくとも1つのシングルガイドRNA（sgRNA）をコードし、前記sgRNAが前記tracrRNA配列及び前記crRNA配列を含み、前記sgRNAは、配列番号35、38、42、45もしくは53、56、58もしくは62から選択される配列またはその機能的バリアントを含むか、またはそれからなる、［84］〜［87］のいずれかに記載の核酸構築物。
［８９］
前記構築物がプロモーターによって作動可能に連結されている、［84］〜［88］のいずれかに記載の核酸構築物。
［９０］
前記プロモーターが構成的プロモーターである、［89］に記載の核酸構築物。
［９１］
前記核酸構築物が、CRISPR酵素をコードする核酸配列をさらに含む、［84］〜［90］のいずれかに記載の核酸構築物。
［９２］
前記CRISPR酵素がCasまたはCpf1タンパク質である、［91］に記載の核酸構築物。
［９３］
前記Casタンパク質がCas9またはその機能的バリアントである、［92］記載の核酸構築物。
［９４］
前記核酸構築物がTALエフェクターをコードする、［84］に記載の核酸構築物。
［９５］
前記核酸構築物が、エンドヌクレアーゼまたはそのDNA切断ドメインをコードする配列をさらに含む、［84］または［94］に記載の核酸構築物。
［９６］
前記エンドヌクレアーゼがFokIである、［95］に記載の核酸構築物。
［９７］
crRNA配列およびtracrRNA配列を含み、前記crRNA配列が、配列番号33、36、40、43から選択される少なくとも1つの配列、もしくは配列番号51、54、57もしくは60から選択される少なくとも1つの配列、またはそれらのバリアントに結合することができる、シングルガイド（sg）RNA分子。
［９８］
［84］〜［96］のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸構築物、または［97］に記載の少なくとも1つのsgRNAでトランスフェクトされた、単離された植物細胞。
［９９］
［84］〜［90］のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸構築物と第二の核酸構築物とでトランスフェクトされた、単離された植物細胞であって、前記第二の核酸構築物は、Casタンパク質、好ましくはCas9タンパク質またはその機能的バリアントをコードする核酸配列を含む、単離された植物細胞。
［１００］
前記第二の核酸構築物は、［84］〜［90］のいずれかに記載の核酸構築物の前、後、またはそれと同時にトランスフェクトされる、［99］に記載の単離された植物細胞。
［１０１］
［98］〜［100］のいずれかに記載のトランスフェクトされた細胞を含む、遺伝子組換え植物。
［１０２］
sgRNAをコードする核酸および／またはCasタンパク質をコードする核酸が安定な形態で組み込まれている、［101］に記載の遺伝子組換え植物。
［１０３］
植物における耐倒伏性を増加させる方法であって、前記方法は、［84］〜［96］のいずれかに記載の核酸構築物または［97］に記載のsgRNAを植物に導入して発現させることを含み、好ましくは、前記増加が対照または野生型植物と比べた増加である、方法。
［１０４］
［103］に記載の方法によって取得されたかまたは取得可能な、植物。
［１０５］
植物における耐倒伏性を増加させるための、［84］〜［96］のいずれかに記載の核酸構築物または［97］に記載のsgRNAの使用。
［１０６］
前記核酸構築物またはsgRNAが、植物におけるmiRNA528の発現および／または活性を減少させる、［105］に記載の使用。
［１０７］
［31］に記載の遺伝子組換え植物を取得する方法であって、
(a) 植物の一部分を選定すること；
(b) 前記(a) の植物の一部分の少なくとも1つの細胞を、［84］〜［96］のいずれかに記載の核酸構築物または［97］に記載のsgRNA分子でトランスフェクトすること；
(c) 前記トランスフェクトされた細胞（複数可）に由来する少なくとも1つの植物を再生すること；
(d) 前記植物において少なくとも1つのmiRNA528核酸の発現の減少を示す、前記(c)に従って得られた1つ以上の植物の選択すること
を含む、方法。
［１０８］
好ましくは野生型または対照植物と比べて、増加された耐倒伏性を有する植物を同定および／または選択する方法であって、
前記方法は、
植物または植物生殖質において、ラッカーゼ3の遺伝子および／またはプロモーター、ラッカーゼ5の遺伝子および／またはプロモーター、または、miR528 aおよび／またはbの遺伝子および／またはプロモーターにおける少なくとも1つの多型または突然変異を検出することと、
前記植物またはその子孫を選択すること
を含み、
前記多型または突然変異は、前記突然変異を伴わない植物と比べてラッカーゼ3および／または5の発現の増加および／またはmiR528の発現／活性の減少をもたらす、
方法。
以上の開示は、本発明の範囲内に包含される主題の一般的な説明を提供し、本発明を製造および使用する方法およびその最良の態様を含むが、当業者が本発明をさらに実施できるようにし、書面によるその完全な説明を提供するために、以下の実施例が提供される。しかし、当業者であれば、これらの実施例の詳細は本発明を限定するものと解釈すべきではなく、本発明の範囲は本開示に添付された特許請求の範囲およびその均等物から理解されるべきであることを理解するであろう。本開示を考慮すれば、本発明の種々のさらなる態様および実施形態が当業者には明らかであろう。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物における耐倒伏性を改変する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む、方法。
【請求項２】
植物の耐倒伏性が改変された植物を作製する方法であって、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現もしくはレベルを改変すること、および／またはmiR528の発現もしくは活性を改変することを含む、方法。
【請求項３】
前記方法が、植物における耐倒伏性を増加させ、ここで前記方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現を増加させることおよび／またはmiR528の発現もしくは活性を減少させることを含み、好ましくは、
（ａ）前記方法は少なくとも1つの核酸配列を含む核酸構築物を導入して発現させることを含み、前記核酸配列は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードし、前記核酸配列は調節配列に動作可能に連結されているか、または
（ｂ）前記方法は少なくとも1つのmiR528阻害因子を使用してmiR528の活性を減少させることを含み、前記miR528阻害因子が、配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントであるか、または、配列番号7もしくは16に定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含む核酸構築物を導入して発現させることによりmiR528の活性を減少させることを含み、前記核酸配列は調節配列に動作可能に連結されているか、または
（ｃ）前記方法は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子に少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、好ましくは前記少なくとも1つの突然変異がmiR528結合部位におけるものであり、および／または、miR528 aおよび／またはbの遺伝子またはmiR528プロモーターに少なくとも1つの突然変異を導入することを含み、ここで好ましくは前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、前記ラッカーゼ3遺伝子が配列番号1で定義されるポリペプチドをコードし、前記ラッカーゼ5遺伝子が配列番号4で定義されるポリペプチドをコードし、ここでより好ましくは、前記少なくとも1つの突然変異が、配列番号3の位置1〜12から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号2の位置191〜211から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択される少なくとも1つの位置に導入され、前記突然変異が、標的化ゲノム修飾を用いて導入される、
請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記植物がトウモロコシである、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の改変された発現もしくはレベル、および／またはmiR528の改変された発現もしくは活性によって特徴づけられる遺伝子改変植物、その一部分、または植物細胞。
【請求項６】
野生型または対照植物と比べて、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の増加および／またはmiR528の発現もしくは活性の減少によって特徴づけられる、請求項5に記載の遺伝子改変植物であって、
ａ．前記植物は少なくとも1つの核酸配列を含む核酸構築物を発現し、前記核酸配列が、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードし、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードし、前記核酸配列は調節配列に動作可能に連結されているか、または
ｂ．前記植物は少なくとも1つのmiR528阻害因子を発現し、好ましくは前記miR528阻害因子は配列番号8に定義されるRNA配列を含むRNA分子またはその機能的バリアントであるか、または前記miR528阻害因子は配列番号7もしくは16で定義される核酸配列またはその機能的バリアントを含む核酸構築物であり、前記核酸配列は調節配列に動作可能に連結されているか、または
ｃ．前記植物は、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは前記少なくとも1つの突然変異がmiR528結合部位にあり、および／または、前記少なくとも1つの突然変異がmiR528 aおよび／またはb遺伝子またはmiR528プロモーターにあり、好ましくは前記ラッカーゼ遺伝子がラッカーゼ3およびラッカーゼ5から選択され、前記ラッカーゼ3遺伝子は配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドをコードし、前記ラッカーゼ5遺伝子は配列番号4に定義されるポリペプチドをコードし、より好ましくは前記少なくとも1つ突然変異が、配列番号3の位置1〜12から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号2の位置191〜211から選択される少なくとも1つの位置、または配列番号6の位置48〜68から選択される少なくとも1つの位置にある、
Ｗ遺伝子改変植物。
【請求項７】
野生型または対照植物と比べて、少なくとも1つのラッカーゼ遺伝子の発現の減少および／またはmiR528の発現もしくは活性の増加によって特徴づけられる、請求項5に記載の遺伝子改変植物。
【請求項８】
前記植物が、少なくとも1つの核酸配列を含む核酸構築物を発現し、前記核酸配列が配列番号10に定義されるmiR528もしくはその機能的バリアントが調節配列に動作可能に連結されたものをコードするか、または、前記植物は、配列番号9を含むmiR528もしくはその機能的バリアントを発現するか、または
前記植物が、ラッカーゼ核酸をコードする少なくとも1つの遺伝子において少なくとも1つの突然変異を含み、好ましくは、前記ラッカーゼ核酸がラッカーゼ3および5から選択され、前記突然変異が、野生型または対照ポリペプチドと比べて前記ラッカーゼ核酸の発現を減少させ、好ましくは前記核酸は、配列番号1に定義されるラッカーゼ3ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードし、および／または配列番号4に定義されるラッカーゼ5ポリペプチドもしくはその機能的バリアントもしくは相同体をコードするか、または
前記植物が、野生型または対照植物と比べて少なくとも1つのラッカーゼ3および／または5の核酸の発現を減少させるRNAi分子を発現する、
請求項5に記載の遺伝子改変植物。
【請求項９】
前記植物がトウモロコシである、請求項5〜8のいずれかに記載の遺伝子改変植物。
【請求項１０】
前記遺伝子改変植物の一部分が種子である。請求項5〜9のいずれかに記載の遺伝子改変植物の一部。
【請求項１１】
配列番号7または16で定義されるmiR528阻害因子またはその機能的バリアントをコードする核酸配列を含む核酸構築物であるか、または配列番号8で定義されるRNA配列を有するRNA分子またはその機能的バリアントである、miR528阻害因子。
【請求項１２】
少なくとも1つのmiR528遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメイン、または少なくとも1つのラッカーゼ3遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメイン、または少なくとも1つのラッカーゼ5遺伝子に結合することができる少なくとも1つのDNA結合ドメインをコードする核酸配列を含む、核酸構築物であって、好ましくは前記核酸配列が少なくとも1つのプロトスペーサーエレメントをコードし、前記プロトスペーサーエレメントの配列が、配列番号34、37、41、44もしくは52、55、58、もしくは61から選択されるか、または配列番号34、37、41、44、52、55、58、もしくは61に対して少なくとも90%の同一性を有する配列である、核酸構築物。
【請求項１３】
crRNA配列およびtracrRNA配列を含み、前記crRNA配列が、配列番号33、36、40、43から選択される少なくとも1つの配列、もしくは配列番号51、54、57もしくは60から選択される少なくとも1つの配列、またはそれらのバリアントに結合することができる、シングルガイド（sg）RNA分子。
【請求項１４】
請求項11もしくは12に記載の核酸または請求項13に記載のsgRNAを含む、遺伝子組換え植物であって、好ましくは前記核酸またはsgRNAをコードする核酸が安定な形態で組み込まれている、遺伝子組換え植物。
【請求項１５】
好ましくは野生型または対照植物と比べて、増加された耐倒伏性を有する植物を同定および／または選択する方法であって、
前記方法は、
植物または植物生殖質において、ラッカーゼ3の遺伝子および／またはプロモーター、ラッカーゼ5の遺伝子および／またはプロモーター、または、miR528 aおよび／またはbの遺伝子および／またはプロモーターにおける少なくとも1つの多型または突然変異を検出することと、
前記植物またはその子孫を選択すること
を含み、
前記多型または突然変異は、前記突然変異を伴わない植物と比べてラッカーゼ3および／または5の発現の増加および／またはmiR528の発現／活性の減少をもたらす、
方法。