【手続補正書】
【提出日】令和2年12月31日(2020.12.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【発明の名称】ＥｒｂＢ２抗体およびその使用
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して、ＥｒｂＢ２抗体、および例えばヒト癌治療における、単独でのまたは他のＥｒｂＢ２抗体（例えば、トラスツズマブ）と組み合わせたその使用に関する。
【０００２】
《関連出願の相互参照》
本出願は、全ての目的のためにその開示全体が参照により本明細書により組み込まれる、２０１７年１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／４４３０７８号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
受容体チロシンプロテインキナーゼＥｒｂＢ−２（ＥｒｂＢ２）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーであり、該ファミリーにはＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４も含まれる（Ａｋｉｙａｍａら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２４５、５３１−６（１９８６）（非特許文献１）；ＲｕｂｉｎおよびＹａｒｄｅｎ、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．１２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ３−８２００１（２００１）（非特許文献２））。ＥｒｂＢ２はまた、しばしばヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）とも呼ばれ、科学文献で互換的に使用される。これらの４つの受容体の各々が細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン含み、細胞内ドメインはチロシンキナーゼドメインを含み、そのＣ末端は多数のシグナル伝達分子と相互作用し、リガンド依存性生理活性とリガンド非依存性生理活性の両方を示す（Ｍａｒｍｏｒら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  ５８、９０３−１３（２００４）（非特許文献３））。ＨＥＲ２は、ＥＧＦＲメンバー、すなわちＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のいずれかとヘテロ二量体化し、他のＥｒｂＢ受容体の好ましい二量体化パートナーと考えられる。トランス活性化されると、ＥｒｂＢ２は、Ｒａｓ−マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびＰＩ３Ｋ−ｍＴＯＲカスケードを含むいくつかの下流シグナル伝達カスケードを活性化して、細胞増殖を促進し、アポトーシスを回避する（Ｃｉｔｒｉら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：５０５−１６（２００６）（非特許文献４）に概説されている）。ＥｒｂＢ２は正常な成人組織では適度に発現されており、ここでは細胞増殖および分化を調節する。ＥｒｂＢ２タンパク質の遺伝子増幅および過剰発現は、乳癌、胃癌および卵巣癌の２０〜３０％で報告されている（Ｋｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９：４１８５−９１（１９８９）（非特許文献５）；Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７−８２（１９８７）（非特許文献６）；Ｋｏｅｐｐｅｎら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３８、９６〜１０４（２００１）（非特許文献７））。一般に、ｅｒｂＢ２遺伝子増幅は比較的大きな転移能および予後不良と相関する。その発現は正常組織では比較的低レベルであるので、ＥｒｂＢ２は標的療法の魅力的な標的である（Ｄｒｅｂｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９１２９−３３（１９８６）（非特許文献８））。
【０００４】
トラスツズマブ（ＣＡＳ１８０２８８−６９−１、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）は、細胞ベースアッセイにおいて高い親和性で（Ｋｄ＝５ｎＭ）、ヒトＥｒｂＢ２細胞外ドメインに選択的に結合するマウスＨＥＲ２抗体の組換えヒト化モノクローナル抗体バージョンである（Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−９（１９９２）（非特許文献９））。トラスツズマブは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイとマウス異種移植片腫瘍モデルの両方で、ＥｒｂＢ２を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されている（Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９、１１６５〜１１７２（１９８９）（非特許文献１０）；Ｌｅｗｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３７、２５５〜２６３（１９９３）（非特許文献１１））。腫瘍細胞に対する直接効果に加えて、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの免疫機構を含むいくつかの作用機序が提案されている（Ｂｅｎ−Ｋａｓｕｓら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９、１１６５〜１１７２（２００７）（非特許文献１２）に概説されている）。トラスツズマブは、広範な前の抗癌療法後に進行したＨＥＲ２陽性またはＨＥＲ２陽性転移性乳癌（ＭＢＣ（ｓ））としても知られるＥｒｂＢ２過剰発現を有する患者の治療のために１９９８年に承認された（Ｂａｓｅｌｇａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １４、７３７〜７４４（１９９６）（非特許文献１３）；Ｓｌａｍｏｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４４、７８３〜７９２（２００１）（非特許文献１４））。しかしながら、トラスツズマブ単剤療法に対する患者の反応は比較的低く（およそ１５％）、短命である（中央持続時間９か月）（Ｃｏｂｌｅｉｇｈら、Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １７：２６３９−４８（１９９９）（非特許文献１５））。一方、トラスツズマブは、おそらくはＥｒｂＢ２駆動生存経路の妨害のために、化学療法と組み合わせると、相乗効果を示すように思われる（Ａｒｔｅａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：３７５８−６５（１９９４）（非特許文献１６））。トラスツズマブは、ＨＥＲ２陽性腫瘍を有する患者に化学療法単独よりも著しく優れた結果を提供するが、事実上全ての治療患者が、最終的に利用可能な療法に進行する。ＨＥＲ２を過剰発現している癌を有する患者の結果を改善する機会が残っている。
【０００５】
抗体標的化療法への１つのアプローチは、抗原発現癌細胞に細胞傷害性薬物を特異的に送達するための抗体を利用することである。トラスツズマブに連結されたマイタンシノイドＤＭ１で構成される「免疫毒素」と呼ばれ得る抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ（ｓ））は、ＨＥＲ２過剰発現およびトラスツズマブ感受性またはトラスツズマブ耐性腫瘍細胞株、ならびにヒト乳癌の異種移植片モデルで強力な抗腫瘍活性を示す。トラスツズマブ−ＭＣＣ−ＤＭ１（Ｔ−ＤＭ１）は、その疾患がＨＥＲ２標的療法に難治性の患者に承認されている（Ｂｅｅｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  １１８、５７３３〜５７４０（２００７）（非特許文献１７））。しかしながら、Ｔ−ＤＭ１は、ＨＥＲ２＋転移性乳癌（ＭＢＣ）の患者に第一選択療法として使用した場合、トラスツズマブを超える利点を示さない。
【０００６】
代替アプローチは併用療法であり、これは、（ｉ）耐性発達の頻度を減少させる、（ｉｉ）非重複毒性および同様の治療プロファイルを有する薬物の用量を減少させ、結果として治療指数を増加させる、（ｉｉｉ）別の薬物の使用を通して、細胞をある薬物に対して感作させる、および（ｉｖ）２つの薬物による生物活性に対する相加または相乗効果を利用することによって効力増強を達成するという利点を有する（Ｐｅｇｒａｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２２４１〜２２５１（１９９９）（非特許文献１８）；Ｋｏｎｅｃｎｙら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ６７：２２３〜２３３（２００１）（非特許文献１９）；Ｐｅｇｒａｍら、Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９６（１０）：７３９〜７４９（２００４）（非特許文献２０））。
【０００７】
ＨＥＲ２二量体化阻害剤抗体およびＥＧＦＲ阻害剤は、癌に対する併用療法について報告されている（米国特許出願公開第２００７／００２０２６１号（特許文献１））。ペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ（登録商標））は単独で、ＭＢＣ患者で治療活性を有することが実証されている。さらに、ペルツズマブは、転移性疾患に対する前の抗ＥｒｂＢ２療法または化学療法も受けていないＨＥＲ２陽性転移性乳癌（ＭＢＣ）の患者の治療で、トラスツズマブおよびドセタキセルと組み合わせた使用について示されている（Ｂａｓｅｌｇａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８、１１３８〜１１４４、（２０１０）（非特許文献２１））。
【０００８】
単独でまたはトラスツズマブなどの他の治療薬と組み合わせて使用した場合に、好ましくは相乗的に、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞に対する治療効果を有する新規なＥｒｂＢ２抗体が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００７／００２０２６１号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ａｋｉｙａｍａら、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２４５、５３１−６（１９８６）
【００１１】
【非特許文献２】ＲｕｂｉｎおよびＹａｒｄｅｎ、Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．１２  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ３−８２００１（２００１）
【００１２】
【非特許文献３】Ｍａｒｍｏｒら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  ５８、９０３−１３（２００４）
【００１３】
【非特許文献４】Ｃｉｔｒｉら、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：５０５−１６（２００６）
【００１４】
【非特許文献５】Ｋｉｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９：４１８５−９１（１９８９）
【００１５】
【非特許文献６】Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：１７７−８２（１９８７）
【００１６】
【非特許文献７】Ｋｏｅｐｐｅｎら、Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３８、９６〜１０４（２００１）
【００１７】
【非特許文献８】Ｄｒｅｂｉｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：９１２９−３３（１９８６）
【００１８】
【非特許文献９】Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−９（１９９２）
【００１９】
【非特許文献１０】Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９、１１６５〜１１７２（１９８９）
【００２０】
【非特許文献１１】Ｌｅｗｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３７、２５５〜２６３（１９９３）
【００２１】
【非特許文献１２】Ｂｅｎ−Ｋａｓｕｓら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９、１１６５〜１１７２（２００７）
【００２２】
【非特許文献１３】Ｂａｓｅｌｇａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １４、７３７〜７４４（１９９６）；Ｓｌａｍｏｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４４、７８３〜７９２（２００１）
【００２３】
【非特許文献１４】Ｓｌａｍｏｎら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４４、７８３〜７９２（２００１）
【００２４】
【非特許文献１５】Ｃｏｂｌｅｉｇｈら、Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １７：２６３９−４８（１９９９）
【００２５】
【非特許文献１６】Ａｒｔｅａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：３７５８−６５（１９９４）
【００２６】
【非特許文献１７】Ｂｅｅｒａｍら、Ｃａｎｃｅｒ  １１８、５７３３〜５７４０（２００７）
【００２７】
【非特許文献１８】Ｐｅｇｒａｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８：２２４１〜２２５１（１９９９）
【００２８】
【非特許文献１９】Ｋｏｎｅｃｎｙら、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ６７：２２３〜２３３（２００１）
【００２９】
【非特許文献２０】Ｐｅｇｒａｍら、Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９６（１０）：７３９〜７４９（２００４）
【００３０】
【非特許文献２１】Ｂａｓｅｌｇａら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８、１１３８〜１１４４、（２０１０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明は、５つの抗ＨＥＲ２抗体４Ｃ９、４Ｈ２、４Ｇ６、５Ｈ１２および５Ｇ９ならびに関連する結合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクターおよび医薬組成物、ならびにその使用に関する。「ＥｒｂＢ２抗体」、「ＨＥＲ２抗体」、「抗ＥｒｂＢ２抗体」および「抗ＨＥＲ２抗体」という用語は、本明細書で互いに置換可能に使用され、ＥｒｂＢ２またはＨＥＲ２に特異的に結合する抗体を指す。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
結合タンパク質が提供される。結合タンパク質は、受容体チロシンプロテインキナーゼＥｒｂＢ−２（ＥｒｂＢ２）に特異的に結合する抗原結合フラグメントを含む。抗原結合フラグメントは、配列番号１７〜５１および５６〜１６０からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
【００３３】
抗原結合フラグメントは、配列番号１７〜５１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つの可変領域を含み得る。
【００３４】
抗原結合フラグメントは、配列番号１７および１８；配列番号１９および２０；配列番号２１および２２；配列番号２３および２４；配列番号２５および２６；配列番号２７および３２；配列番号２７および３３；配列番号２７および３４；配列番号２７および３５；配列番号２７および３６；配列番号２７および３７；配列番号２７および３８；配列番号２８および３２；配列番号２８および３３；配列番号２８および３４；配列番号２８および３５；配列番号２８および３６；配列番号２８および３７；配列番号２８および３８；配列番号２９および３２；配列番号２９および３３；配列番号２９および３４；配列番号２９および３５；配列番号２９および３６；配列番号２９および３７；配列番号２９および３８；配列番号３０および３２；配列番号３０および３３；配列番号３０および３４；配列番号３０および３５；配列番号３０および３６；配列番号３０および３７；配列番号３０および３８；配列番号３１および３２；配列番号３１および３３；配列番号３１および３４；配列番号３１および３５；配列番号３１および３６；配列番号３１および３７；配列番号３１および３８；配列番号３９および４５；配列番号３９および４６；配列番号３９および４７；配列番号３９および４８；配列番号３９および４９；配列番号３９および５０；配列番号３９および５１；配列番号４０および４５；配列番号４０および４６；配列番号４０および４７；配列番号４０および４８；配列番号４０および４９；配列番号４０および５０；配列番号４０および５１；配列番号４１および４５；配列番号４１および４６；配列番号４１および４７；配列番号４１および４８；配列番号４１および４９；配列番号４１および５０；配列番号４１および５１；配列番号４２および４５；配列番号４２および４６；配列番号４２および４７；配列番号４２および４８；配列番号４２および４９；配列番号４２および５０；配列番号４２および５１；配列番号４３および４５；配列番号４３および４６；配列番号４３および４７；配列番号４３および４８；配列番号４３および４９；配列番号４３および５０；配列番号４３および５１；配列番号４４および４５；配列番号４４および４６；配列番号４４および４７；配列番号４４および４８；配列番号４４および４９；配列番号４４および５０；および配列番号４４および５１からなる群から選択される２つの可変領域を含み得る。
【００３５】
抗原結合フラグメントは、配列番号５６〜１６０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
【００３６】
抗原結合フラグメントは３つのＣＤＲのうちの少なくとも１つのセットを含み得、少なくとも１つのＣＤＲセットは、４Ｃ９  ＶＨセット、４Ｃ９  ＶＬセット、４Ｈ２  ＶＨセット、４Ｈ２  ＶＬセット、４Ｇ６  ＶＨセット、４Ｇ６  ＶＬセット、５Ｆ１２  ＶＨセット、５Ｆ１２  ＶＬセット、５Ｇ９  ＶＨセット、５Ｇ９  ＶＬセット、５Ｆ１２．ＶＨ．Ｖ１セット、５Ｆ１２．ＶＨ．１セット、５Ｆ１２．ＶＨ．２セット、５Ｆ１２．ＶＨ．３セット、５Ｆ１２．ＶＨ．４セット、５Ｆ１２．ＶＬ．Ｖ１セット、５Ｆ１２．ＶＬ．１セット、５Ｆ１２．ＶＬ．２セット、５Ｆ１２．ＶＬ．３セット、５Ｆ１２．ＶＬ．４セット、５Ｆ１２．ＶＬ．５セット、５Ｆ１２．ＶＬ．６セット、５Ｇ９．ＶＨ．Ｖ１セット、５Ｇ９．ＶＨ．１セット、５Ｇ９．ＶＨ．２セット、５Ｇ９．ＶＨ．３セット、５Ｇ９．ＶＨ．４セット、５Ｇ９．ＶＨ．５セット、５Ｇ９．ＶＬ．Ｖ１セット、５Ｇ９．ＶＬ．１セット、５Ｇ９．ＶＬ．２セット、５Ｇ９．ＶＬ．３セット、５Ｇ９．ＶＬ．４セット、５Ｇ９．ＶＬ．５セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．６セットからなる群から選択される。
【００３７】
抗原結合フラグメントは３つのＣＤＲのうちの２つのＣＤＲセットを含み得、２つのＣＤＲセットは、４Ｃ９  ＶＨセットおよび４Ｃ９  ＶＬセット；４Ｈ２  ＶＨセットおよび４Ｈ２  ＶＬセット；４Ｇ６  ＶＨセットおよび４Ｇ６  ＶＬセット；５Ｆ１２  ＶＨセットおよび５Ｆ１２  ＶＬセット；５Ｇ９  ＶＨセットおよび５Ｇ９  ＶＬセット；５Ｆ１２．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．２セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．３セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．４セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．２セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．３セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．４セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．１セット；５Ｆ１２．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．２セット；５Ｆ１２．ＶＨ．１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．２セット；５Ｆ１２．ＶＨ．２セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．２セット；５Ｆ１２．ＶＨ．３セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．２セット；５Ｆ１２．ＶＨ．４セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．２セット；５Ｆ１２．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．３セット；５Ｆ１２．ＶＨ．１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．３セット；５Ｆ１２．ＶＨ．２セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．３セット；５Ｆ１２．ＶＨ．３セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．３セット；５Ｆ１２．ＶＨ．４セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．３セット；５Ｆ１２．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．４セット；５Ｆ１２．ＶＨ．１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．４セット；５Ｆ１２．ＶＨ．２セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．４セット；５Ｆ１２．ＶＨ．３セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．４セット；５Ｆ１２．ＶＨ．４セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．４セット；５Ｆ１２．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．５セット；５Ｆ１２．ＶＨ．１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．５セット；５Ｆ１２．ＶＨ．２セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．５セット；５Ｆ１２．ＶＨ．３セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．５セット；５Ｆ１２．ＶＨ．４セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．５セット；５Ｆ１２．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．６セット；５Ｆ１２．ＶＨ．１セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．６セット；５Ｆ１２．ＶＨ．２セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．６セット；５Ｆ１２．ＶＨ．３セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．６セット；５Ｆ１２．ＶＨ．４セットおよび５Ｆ１２．ＶＬ．６セット；５Ｇ９．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｇ９．ＶＨ．１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｇ９．ＶＨ．２セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｇ９．ＶＨ．３セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｇ９．ＶＨ．４セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｇ９．ＶＨ．５セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．Ｖ１セット；５Ｇ９．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．１セット；５Ｇ９．ＶＨ．１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．１セット；５Ｇ���．ＶＨ．２セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．１セット；５Ｇ９．ＶＨ．３セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．１セット；５Ｇ９．ＶＨ．４セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．１セット；５Ｇ９．ＶＨ．５セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．１セット；５Ｇ９．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．２セット；５Ｇ９．ＶＨ．１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．２セット；５Ｇ９．ＶＨ．２セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．２セット；５Ｇ９．ＶＨ．３セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．２セット；５Ｇ９．ＶＨ．４セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．２セット；５Ｇ９．ＶＨ．５セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．２セット；５Ｇ９．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．３セット；５Ｇ９．ＶＨ．１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．３セット；５Ｇ９．ＶＨ．２セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．３セット；５Ｇ９．ＶＨ．３セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．３セット；５Ｇ９．ＶＨ．４セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．３セット；５Ｇ９．ＶＨ．５セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．３セット；５Ｇ９．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．４セット；５Ｇ９．ＶＨ．１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．４セット；５Ｇ９．ＶＨ．２セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．４セット；５Ｇ９．ＶＨ．３セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．４セット；５Ｇ９．ＶＨ．４セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．４セット；５Ｇ９．ＶＨ．５セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．４セット；５Ｇ９．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．５セット；５Ｇ９．ＶＨ．１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．５セット；５Ｇ９．ＶＨ．２セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．５セット；５Ｇ９．ＶＨ．３セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．５セット；５Ｇ９．ＶＨ．４セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．５セット；５Ｇ９．ＶＨ．５セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．５セット；５Ｇ９．ＶＨ．Ｖ１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．６セット；５Ｇ９．ＶＨ．１セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．６セット；５Ｇ９．ＶＨ．２セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．６セット；５Ｇ９．ＶＨ．３セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．６セット；５Ｇ９．ＶＨ．４セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．６セット；および５Ｇ９．ＶＨ．５セットおよび５Ｇ９．ＶＬ．６セットからなる群から選択される。
【００３８】
抗原結合フラグメントはＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み得、ＣＤＲ−Ｈ１は配列番号５６、６２、６８、７４、８０、８６、８９、９２、９５、９８、１２２、１２５、１２８、１３１、１３４および１３７からなる群から選択され；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５７、６３、６９、７５、８１、８７、９０、９３、９６、９９、１２３、１２６、１２９、１３２、１３５および１３８からなる群から選択され；ＣＤＲ−Ｈ３は配列番号５８、６４、７０、７６、８２、８８、９１、９４、９７、１００、１２４、１２７、１３０、１３３、１３６および１３９からなる群から選択され；ＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５９、６５、７１、７７、８３、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９、１４０、１４３、１４６、１４９、１５２、１５５および１５８からなる群から選択され；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６０、６６、７２、７８、８４、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１４１、１４４、１４７、１５０、１５３、１５６および１５９からなる群から選択され；ＣＤＲ−Ｌ３は配列番号６１、６７、７３、７９、８５、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１４２、１４５、１４８、１５１、１５４、１５７および１６０からなる群から選択される。
【００３９】
結合タンパク質はヒトアクセプターフレームワーク配列をさらに含み得る。ヒトアクセプターフレームワーク配列は、配列番号３〜１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。ヒトアクセプターフレームワーク配列は、配列番号３〜１０および１６１〜１６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。ヒトアクセプターフレームワーク配列は、主要残基における少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み得、主要残基は、ＣＤＲに隣接する残基；グリコシル化部位残基；レア残基；ヒトＥｒｂＢ２と相互作用することができる残基；ＣＤＲと相互作用することができる残基；カノニカル残基（ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅ）；重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基；Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン内の残基；およびＣｈｏｔｈｉａによって定義された可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔによって定義された第１の重鎖フレームワークとの間で重複する領域の残基からなる群から選択される。
【００４０】
結合タンパク質が、主要残基における少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含むヒトアクセプターフレームワーク配列を含む場合、結合タンパク質は、コンセンサスヒト可変領域配列をさらに含み得る。
【００４１】
ヒトアクセプターフレームワークが少なくとも１つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む場合、ヒトアクセプターフレームワークは、ヒト生殖系列アクセプターフレームワークの配列と少なくとも約６５％同一のアミノ酸配列からなり、ヒト生殖系列アクセプターフレームワークと同一の少なくとも７０個のアミノ酸残基を含み得る。結合タンパク質は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィドで連結されたＦｖ、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体、ダイアボディ、多重特異性抗体および二重特異性抗体（ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）からなる群から選択され得る。
【００４２】
結合タンパク質は抗体であり得る。抗体は、モノクローナル抗体、完全長四量体免疫グロブリン、ＩｇＧ分子、ＩｇＧ１分子、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト抗体、ヒト化抗体および親和性成熟抗体からなる群から選択され得る。一実施形態では、結合タンパク質がヒト化抗体である。別の実施形態では、抗体がモノクローナル抗体である。
【００４３】
「ＥｒｂＢ２媒介生理活性」および「ＥｒｂＢ２活性」という用語は、本明細書で互いに置換可能に使用され、細胞、組織、器官もしくは対象などの生物系、または試料においてＥｒｂＢ２によって引き起こされるまたは妨害される生物活性を指す。ＥｒｂＢ２媒介生理活性またはＥｒｂＢ２活性は、ＥｒｂＢ２を過剰発現している細胞で上方制御され得る。ＥｒｂＢ２媒介生理活性の例としては、自身とのホモ二量体化、ＥＧＦＲ、またはＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４とのヘテロ二量体化、ＥｒｂＢ２によって制御されるシグナル伝達経路、およびＥｒｂＢ２依存性細胞増殖が挙げられる。試料は対象から得ることができる。細胞は対象内にあり得る。
【００４４】
対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。対象は、ＥｒｂＢ２活性が有害である疾患または障害を患い得る。本明細書で使用される「有害」という用語は、疾患も障害も有さない対照である対象のＥｒｂＢ２活性と比較した、疾患または障害を有する対象のＥｒｂＢ２活性の変化を指す。ＥｒｂＢ２活性が疾患または障害を有する対象で有害である場合、ＥｒｂＢ２活性が、疾患も障害も有さない対照である対象のＥｒｂＢ２活性よりも、例えば少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％高くなり得る。
【００４５】
結合タンパク質はＥｒｂＢ２媒介生理活性を調節し得る。本明細書で使用される「調節する」という用語は、ＥｒｂＢ２媒介生理活性を増加または減少させることを指す。ＥｒｂＢ２媒介生理活性が変化している場合、結合タンパク質は変化したＥｒｂＢ２媒介生理活性を中和することができる。ＥｒｂＢ２媒介生理活性が上方制御されている場合、結合タンパク質は上方制御されたＥｒｂＢ２媒介生理活性を減少、阻害、遮断または拮抗することができる。結合タンパク質は、例えば試料または細胞のＥｒｂＢ２媒介生理活性の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％を調節することができる。このような結合タンパク質について、試料または細胞のＥｒｂＢ２媒介生理活性を調節する方法が提供される。本方法は、有効量の結合タンパク質を、ＥｒｂＢ２媒介生理活性を有する試料または細胞に投与する工程を含み、それによってＥｒｂＢ２媒介生理活性が、例えば少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％調節される。例えば試料、細胞または対象のＥｒｂＢ２媒介生理活性を調節するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質を薬学的に許容される担体と混合する工程を含む。
【００４６】
結合タンパク質は、ＥｒｂＢ２陽性細胞と接触すると前記細胞に内部移行され得る。本明細書で使用される「ＥｒｂＢ２陽性細胞」という用語は、ＥｒｂＢ２を発現する細胞を指す。一実施形態では、ＥｒｂＢ２陽性細胞がＥｒｂＢ２を過剰発現する。このような結合タンパク質が、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）用途に使用され得る。結合タンパク質は、少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％または約５０％の内部移行率を有し得る。結合タンパク質は、エンドサイトーシスによって内部移行され得る。結合タンパク質は、ＥｒｂＢ２との複合体で内部移行され得る。このような結合タンパク質について、結合タンパク質をＥｒｂＢ２陽性細胞に内部移行する方法が提供される。本方法は、細胞を有効量の結合タンパク質と接触させる工程を含み、それによって結合タンパク質が細胞に内部移行される。細胞は対象内にあり得る。結合タンパク質をＥｒｂＢ２陽性細胞に内部移行するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質を薬学的に許容される担体と混合する工程を含む。
【００４７】
結合タンパク質は、同時または逐次のいずれかで一緒にＥｒｂＢ２陽性細胞と接触させると、追加の薬剤の前記細胞への内部移行を増強し得る。増強は、接触後所定の期間以内、例えば、約０．５時間、約１時間、約２時間、約４時間、約６時間、約８時間、約１０時間、約１２時間、約１６時間または約２４時間以内に少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％であり得る。追加の薬剤は、ＥｒｂＢ２に結合することができるが、結合タンパク質とは異なる抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。ＥｒｂＢ２はヒトＥｒｂＢ２であり得る。追加の薬剤はトラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含み得る。結合タンパク質は、接触後２時間以内に、トラスツズマブのＥｒｂＢ２細胞への内部移行を少なくとも約２０％増強し得る。
【００４８】
結合タンパク質は、ＥｒｂＢ２陽性細胞の増殖を阻害し得る。ＥｒｂＢ２細胞の増殖が、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％阻害され得る。ＥｒｂＢ２陽性細胞はＢＴ４７４細胞であり得る。結合タンパク質は、ＢＴ４７４細胞の増殖を少なくとも約７０％阻害し得る。
【００４９】
結合タンパク質は、ＥｒｂＢ２陽性腫瘍の増殖を、場合により追加のＥｒｂＢ２抗体と相乗的に阻害し得る。ＥｒｂＢ２陽性腫瘍の増殖は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％阻害され得る。腫瘍は追加のＥｒｂＢ２抗体に耐性であり得る。同時または逐次のいずれかで一緒に使用される結合タンパク質および追加のＥｒｂＢ２抗体による腫瘍増殖の相乗阻害は、単独で使用される結合タンパク質および追加のＥｒｂＢ２抗体による相加阻害よりも少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％大きくなり得る。追加のＥｒｂＢ２抗体はトラスツズマブであり得る。結合タンパク質は、トラスツズマブと使用すると、ＥｒｂＢ２陽性およびトラスツズマブ耐性である腫瘍の増殖を、少なくとも約７０％阻害し得る。
【００５０】
結合タンパク質構築物も提供される。結合タンパク質構築物は、本発明の結合タンパク質と、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域とを含む。免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒトＩｇＧ２定常領域、ヒトＩｇＧ３定常領域、ヒトＩｇＧ４定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域およびヒトＩｇＡ定常領域からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域であり得る。免疫グロブリン定常領域は、配列番号１、配列番号２およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。結合タンパク質構築物では、結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有し得る。
【００５１】
【表１】
2020508694.tif 000001
【００５２】
結合タンパク質コンジュゲートがさらに提供される。結合タンパク質コンジュゲートは、本発明の結合タンパク質構築物と、イメージング剤、治療薬、細胞傷害剤および免疫付着分子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）からなる群から選択される薬剤とを含む。イメージング剤は、放射標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識およびビオチンからなる群から選択され得る。薬剤は、代謝拮抗薬、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生薬、有糸分裂阻害薬、アントラサイクリン、毒素およびアポトーシス剤からなる群から選択され得る。結合タンパク質コンジュゲートでは、結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを有し得る。結合タンパク質コンジュゲートは抗体コンジュゲートであり得る。
【００５３】
結合タンパク質コンジュゲートは、ＥｒｂＢ２陽性細胞と接触すると前記細胞に内部移行され得る。結合タンパク質コンジュゲートは、エンドサイトーシスによって内部移行され得る。結合タンパク質コンジュゲートは、ＥｒｂＢ２との複合体で内部移行され得る。このような結合タンパク質コンジュゲートについて、結合タンパク質コンジュゲートをＥｒｂＢ２陽性細胞に内部移行する方法が提供される。本方法は、細胞を有効量の結合タンパク質コンジュゲートと接触させる工程を含み、それによって結合タンパク質コンジュゲートが細胞に内部移行される。細胞は対象内にあり得る。結合タンパク質コンジュゲートをＥｒｂＢ２陽性細胞に内部移行するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質コンジュゲートを薬学的に許容される担体と混合する工程を含む。
【００５４】
結合タンパク質は結晶として存在し得る。結晶は無担体医薬制御放出結晶である。結合タンパク質結晶は、結合タンパク質の可溶性カウンターパートよりも長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有し得る。結合タンパク質結晶は、結合タンパク質の非結晶形態の生物活性を保持し得る。
【００５５】
結合タンパク質構築物は結晶として存在し得る。結晶は無担体医薬制御放出結晶である。結合タンパク質構築物結晶は、結合タンパク質構築物の可溶性カウンターパートよりも長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有し得る。結合タンパク質構築物結晶は、結合タンパク質構築物の非結晶形態の生物活性を保持し得る。
【００５６】
結合タンパク質コンジュゲートは結晶として存在し得る。結晶は無担体医薬制御放出結晶である。結合タンパク質コンジュゲート結晶は、結合タンパク質コンジュゲートの可溶性カウンターパートよりも長いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有し得る。結合タンパク質コンジュゲート結晶は、結合タンパク質コンジュゲートの非結晶形態の生物活性を保持し得る。
【００５７】
本発明の各結合タンパク質について、結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドを含むベクターも提供される。ベクターは、ｐｃＤＮＡ、ｐＴＴ、ｐＴＴ３、ｐＥＦＢＯＳ、ｐＢＶ、ＮＶおよびｐＢＪからなる群から選択され得る。
【００５８】
本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。宿主細胞は原核細胞であり得る。宿主細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であり得る。宿主細胞は真核細胞であり得る。真核細胞は、原生生物細胞、動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択され得る。動物細胞は、哺乳動物細胞、鳥類細胞および昆虫細胞からなる群から選択され得る。哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞またはＣＯＳ細胞であり得る。真菌細胞は出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得る。昆虫細胞はＳｆ９細胞であり得る。
【００５９】
本発明の結合タンパク質を作製する方法が提供される。本方法は、宿主細胞を、結合タンパク質を産生するのに十分な条件下、培養培地で培養する工程を含む。宿主細胞は、結合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。本発明により作製される結合タンパク質が提供される。
【００６０】
本発明の結合タンパク質を放出するための放出組成物が提供される。本組成物は、製剤と、少なくとも１つのポリマー担体とを含む。製剤は、結晶化結合タンパク質と、成分とを含む。ポリマー担体は、ポリ（アクリル酸）、ポリ（シアノアクリレート）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（デプシペプチド）、ポリ（エステル）、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）すなわちＰＬＧＡ、ポリ（ｂ−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド、ポリ［（オルガノ）ホスファゼン］、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、無水マレイン酸−アルキルビニルエーテル共重合体、プルロニック（登録商標）ポリオール、アルブミン、アルギネート、セルロースおよびセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリン、ゼラチン、ヒアルロン酸、オリゴ糖、グリカミノグリカン（ｇｌｙｃａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）、硫酸化多糖、これらのブレンドおよび共重合体からなる群から選択されるポリマーであり得る。成分は、アルブミン、スクロース、トレハロース、ラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−シクロデキストリン、メトキシポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコールからなる群から選択され得る。放出組成物から哺乳動物に結合タンパク質を放出する方法が提供される。本方法は、有効量の放出組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、それによって結合タンパク質が哺乳動物に放出される。放出組成物を製造する方法が提供される。製造方法は、製剤を少なくとも１つのポリマー担体と混合する工程を含む。
【００６１】
医薬組成物は、本発明の結合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む。医薬組成物は、ＥｒｂＢ２活性が有害である障害を治療するための少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含み得る。追加の薬剤は、治療薬；イメージング剤；抗新生物薬；化学療法薬；血管新生阻害剤；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ｃ−Ｍｅｔ抗体；抗ＥｒｂＢ３抗体；抗ＥｒｂＢ２抗体；抗ＣＤ２０抗体；アフリベルセプト；キナーゼ阻害剤；同時刺激分子遮断薬；抗Ｂ７．２抗体；ＣＴＬＡ４−Ｉｇ；接着分子遮断薬；抗Ｅセレクチン抗体；抗Ｌセレクチン抗体；抗サイトカイン抗体またはその機能的フラグメント；抗ＩＬ−１８抗体；抗ＴＮＦ抗体；抗ＩＬ−６抗体；メトトレキサート；コルチコステロイド；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；ＤＮＡアルキル化剤；シスプラチン；カルボプラチン；抗チューブリン剤；パクリタキセル；ドセタキセル；ドキソルビシン；ゲムシタビン；ジェムザール；アントラサイクリン；アドリアマイシン；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；ロイコボリン；イリノテカン；受容体チロシンキナーゼ阻害剤、アポトーシス阻害剤；Ｂｃｌ２／Ｂｃｌｘ阻害剤；エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＣＯＸ−２阻害剤、セレコキシブ、シクロスポリン；ラパマイシン；検出可能な標識またはレポーター分子；ＴＮＦアンタゴニスト；抗リウマチ薬；筋弛緩薬；麻薬；鎮痛薬；麻酔薬；鎮静薬；局所麻酔薬；神経筋遮断薬；抗微生物薬；抗乾癬薬；コルチコステロイド；アナボリックステロイド；エリスロポエチン；免疫化；免疫グロブリン；免疫抑制剤；成長ホルモン；ホルモン補充薬；放射性医薬品；抗うつ薬；統合失調症治療薬；刺激剤；喘息薬；βアゴニスト；吸入ステロイド；エピネフリン；そのエピネフリン類似体；サイトカイン；およびサイトカインアンタゴニストからなる群から選択され得る。
【００６２】
対象の疾患または障害を治療する方法が提供される。疾患または障害ではＥｒｂＢ２活性が有害である。治療方法は、有効量の本発明の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートを対象に投与する工程を含み、それによって対象のＥｒｂＢ２活性が調節される。疾患または障害は、乳癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ、ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿道癌、女性生殖系癌、男性生殖系癌、内分泌線癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼腫瘍、髄膜癌、造血器腫瘍からの固形腫瘍、腫瘍転移、眼血管新生、浮腫、関節リウマチ、動脈硬化プラーク、クローン病、炎症性腸疾患、難治性腹水、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症、敗血症、消化性潰瘍、火傷、膵炎、多嚢胞性卵巣（ＰＯＤ）、子宮内膜症、子宮類線維症、前立腺肥大症、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡ−ＳＩＬ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ファロー四徴症（ＴＯＦ）、アラジール症候群（ＡＳ）、黄斑変性および加齢性黄斑変性疾患、ならびに異常なＥｒｂＢ２活性を特徴とする他の血管新生非依存性および依存性疾患からなる群から選択され得る。疾患または障害は原発性および転移性癌であり得る。疾患または障害は乳癌であり得る。女性生殖器系癌は、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、絨毛癌および妊娠性絨毛疾患からなる群から選択される。女性生殖器系癌は卵巣癌であり得る。疾患または障害は胃癌であり得る。疾患または障害は肺癌であり得る。髄膜癌は、星状細胞腫、神経膠腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、シュワン腫および髄膜腫からなる群から選択され得る。造血器腫瘍からの固形腫瘍は、白血病、ホジキン白血病、非ホジキン白血病、リンパ腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫であり得る。眼血管新生は、糖尿病性失明、網膜症、加齢性黄斑変性およびルベオーシスからなる群から選択され得る。疾患または障害が腫瘍である場合、治療方法は、対象の腫瘍の増殖を、例えば少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％阻害する工程をさらに含む。腫瘍はＥｒｂＢ２陽性であり得る。
【００６３】
治療方法によると、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートは、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、関節内、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、体腔内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、子宮頸部内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹膜内、肋膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、関節滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、膣、直腸、頬側、舌下、鼻腔内および経皮からなる群から選択される少なくとも１つの様式によって対象に投与され得る。
【００６４】
治療方法は、１つまたは複数の追加の薬剤を同時または逐次のいずれかで投与する工程をさらに含み得る。追加の薬剤は、ＥｒｂＢ２に結合することができるが、結合タンパク質とも、結合タンパク質構築物とも、結合タンパク質コンジュゲートとも異なる抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。ＥｒｂＢ２はヒトＥｒｂＢ２であり得る。１つまたは複数の追加の薬剤は、トラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含み得る。本方法は、１つまたは複数の追加の薬剤と相乗的に、対象のＥｒｂＢ２活性を調節する工程をさらに含み得る。同時または逐次のいずれかで一緒に使用される、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと１つまたは複数の追加の薬剤の相乗効果は、単独で使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと１つまたは複数の追加の薬剤による相加効果よりも少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％大きくなり得る。
【００６５】
治療方法は、同時または逐次のいずれかで、治療上有効量の第２の薬剤を投与する工程をさらに含み得る。第２の薬剤は、メトトレキサート；ヒトＴＮＦに結合することができる抗体またはそのフラグメント；コルチコステロイド；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；放射線治療薬；抗新生物薬；化学療法薬；ＤＮＡアルキル化剤；シスプラチン；カルボプラチン；抗チューブリン剤；パクリタキセル；ドセタキセル；タキソール；ドキソルビシン；ゲムシタビン；ジェムザール；アントラサイクリン；アドリアマイシン；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；ロイコボリン；イリノテカン；受容体チロシンキナーゼ阻害剤；エルロチニブ；ゲフィチニブ；ＣＯＸ−２阻害剤；セレコキシブ；キナーゼ阻害剤；血管新生阻害剤；抗ＶＥＧＦ抗体；アフリベルセプト；同時刺激分子遮断薬；抗Ｂ７．１抗体；抗Ｂ７．２抗体；ＣＴＬＡ４−Ｉｇ；抗ＣＤ２０抗体；接着分子遮断薬；抗ＬＦＡ−１抗体；抗Ｅセレクチン抗体；および抗Ｌセレクチン抗体；小分子阻害剤；抗サイトカイン抗体またはその機能的フラグメント；抗ＩＬ−１８抗体；抗ＴＮＦ抗体；抗ＩＬ−６抗体；抗サイトカイン受容体抗体；検出可能な標識またはレポーター；ＴＮＦアンタゴニスト；抗リウマチ薬；筋弛緩薬；麻薬；鎮痛薬；麻酔薬；鎮静薬；局所麻酔薬；神経筋遮断薬；抗微生物薬；抗乾癬薬；コルチコステロイド；アナボリックステロイド；エリスロポエチン；免疫化；免疫グロブリン；免疫抑制剤；成長ホルモン；ホルモン補充薬；放射性医薬品；抗うつ薬；統合失調症治療薬；刺激剤；喘息薬；βアゴニスト；吸入ステロイド；エピネフリン；エピネフリン類似体；サイトカイン；およびサイトカインアンタゴニストからなる群から選択され得る。
【００６６】
各治療方法について、対象の疾患または障害を治療するための医薬品が提供される。疾患または障害ではＥｒｂＢ２活性が有害である。医薬品は、有効量の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品は、１つまたは複数の追加の薬剤および／または第２の薬剤をさらに含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートを、薬学的に許容される担体ならびに場合により１つまたは複数の追加の薬剤および／または第２の薬剤と混合する工程を含む。
【００６７】
ＥｒｂＢ２陽性細胞の増殖を阻害する方法が提供される。阻害方法は、細胞を有効量の本発明の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと接触させる工程を含む。ＥｒｂＢ２細胞の増殖が、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％阻害され得る。ＥｒｂＢ２陽性細胞はＢＴ４７４細胞であり得る。結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートは、ＢＴ４７４細胞の増殖を少なくとも７０％阻害し得る。阻害方法は、細胞を１つまたは複数の追加の薬剤と接触させる工程をさらに含み得る。追加の薬剤は、ＥｒｂＢ２に結合することができるが、結合タンパク質とも、結合タンパク質構築物とも、結合タンパク質コンジュゲートとも異なる抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと１つまたは複数の追加の薬剤は細胞の増殖を相乗的に阻害し得る。同時または逐次のいずれかで一緒に使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと追加のＥｒｂＢ２抗体によるＥｒｂＢ２陽性細胞の増殖の相乗阻害は、単独で使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと追加のＥｒｂＢ２抗体による相加阻害よりも少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％大きくなり得る。１つまたは複数の追加の薬剤はトラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含み得る。細胞は対象内にあり得る。対象は、ＥｒｂＢ２活性が有害である疾患または障害を患い得る。対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。各阻害方法について、対象のＥｒｂＢ２陽性細胞の増殖を阻害するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品は１つまたは複数の追加の薬剤をさらに含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートを薬学的に許容される担体および場合により１つまたは複数の追加の薬剤と混合する工程を含む。
【００６８】
ＥｒｂＢ２陽性腫瘍の増殖を阻害する方法が提供される。阻害方法は、腫瘍を有効量の本発明の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと接触させる工程を含む。腫瘍の増殖が少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％または約９９％阻害され得る。阻害方法は、腫瘍を１つまたは複数の追加の薬剤と接触させる工程をさらに含み得る。追加の薬剤は、ＥｒｂＢ２に結合することができるが、結合タンパク質とも、結合タンパク質構築物とも、結合タンパク質コンジュゲートとも異なる抗体またはその抗原結合フラグメントであり得る。結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと１つまたは複数の追加の薬剤は腫瘍の増殖を相乗的に阻害し得る。同時または逐次のいずれかで一緒に使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと追加のＥｒｂＢ２抗体による腫瘍増殖の相乗阻害は、単独で使用される結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと追加のＥｒｂＢ２抗体による相加阻害よりも少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％大きくなり得る。１つまたは複数の追加の薬剤はトラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含み得る。腫瘍はトラスツズマブ耐性であり得る。追加のＥｒｂＢ２抗体がトラスツズマブであり、腫瘍がトラスツズマブ耐性である場合、トラスツズマブと組み合わせて使用すると、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートによって、腫瘍の増殖が少なくとも約７０％阻害され得る。細胞は対象内にあり得る。対象は、ＥｒｂＢ２活性が有害である疾患または障害を患い得る。対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。各阻害方法について、対象のＥｒｂＢ２陽性細胞の増殖を阻害するための医薬品が提供される。医薬品は、有効量の結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含み得る。医薬品は１つまたは複数の追加の薬剤をさらに含み得る。医薬品を製造する方法が提供される。製造方法は、結合タンパク質、結合タンパク質構築物または結合タンパク質コンジュゲートを薬学的に許容される担体および場合により１つまたは複数の追加の薬剤と混合する工程を含む。
【発明の効果】
【００６９】
本発明は、ヒトＥｒｂＢ２に特異的に結合し、場合によりトラスツズマブの抗腫瘍有効性を相乗的に増強する（例えば、ＥｒｂＢ２発現、活性および／またはシグナル伝達を阻害、拮抗、調節する）結合タンパク質を提供する。本発明は、細胞ベース機能的アッセイを使用することによる大規模なトラスツズマブベース相乗有効性スクリーニングから、トラスツズマブと使用した場合に、ペルツズマブよりも強力な相乗有効性を有するとものとして同定された５つの新規な抗体の発見に基づく。トラスツズマブとペルツズマブの併用処置と具体的に比較して、トラスツズマブとこれらの抗体のいずれか１つの組み合わせは、ＥｒｂＢ２陽性細胞または腫瘍、例えばＥｒｂＢ２陽性およびトラスツズマブ耐性腫瘍の増殖の阻害について有意に高い有効性結果をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明によって単離された還元ＩｇＧ分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。注：１レーン−分子量マーカー；２レーン−ＩｇＧ  ４Ｃ９；３レーン−ＩｇＧ  ４Ｈ２；４レーン−ＩｇＧ  ４Ｇ６；５レーン−ＩｇＧ  ５Ｆ１２；６レーン−ＩｇＧ  ５Ｇ９。
【図２Ａ】ＢＴ４７４乳癌細胞株の細胞増殖の阻害における本発明の５つの抗体および組み合わせの用量−反応曲線を示す図である。ＢＴ４７４細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。実験は１０％ウシ胎児血清を含有する培地で行った。抗ＥｒｂＢ２抗体、抗体混合物または対照ＩｇＧを添加し、細胞を３７℃で１４４時間インキュベートした。５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｇ７５７３）を１０分間添加して、製造業者の指示に従って、発光シグナルを測定した。試料セットは、ｈＩｇＧ＋ｍＩｇＧ（×）、ｈＩｇＧ＋トラスツズマブ（□）、ｈＩｇＧ＋ペルツズマブ（○）、トラスツズマブ＋ペルツズマブ（□の中に●）、トラスツズマブ＋本発明のｍＡｂ（▲）、およびｈＩｇＧ＋本発明のｍＡｂ（▼）を含む。「本発明のｍＡｂ」は４Ｃ９を表す。注：Ｔ−ｍＡｂはトラスツズマブを表し、Ｐ−ｍＡｂはペルツズマブを表す。
【図２Ｂ】ＢＴ４７４乳癌細胞株の細胞増殖の阻害における本発明の５つの抗体および組み合わせの用量−反応曲線を示す図である。ＢＴ４７４細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。実験は１０％ウシ胎児血清を含有する培地で行った。抗ＥｒｂＢ２抗体、抗体混合物または対照ＩｇＧを添加し、細胞を３７℃で１４４時間インキュベートした。５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｇ７５７３）を１０分間添加して、製造業者の指示に従って、発光シグナルを測定した。試料セットは、ｈＩｇＧ＋ｍＩｇＧ（×）、ｈＩｇＧ＋トラスツズマブ（□）、ｈＩｇＧ＋ペルツズマブ（○）、トラスツズマブ＋ペルツズマブ（□の中に●）、トラスツズマブ＋本発明のｍＡｂ（▲）、およびｈＩｇＧ＋本発明のｍＡｂ（▼）を含む。「本発明のｍＡｂ」は４Ｈ２を表す。注：Ｔ−ｍＡｂはトラスツズマブを表し、Ｐ−ｍＡｂはペルツズマブを表す。
【図２Ｃ】ＢＴ４７４乳癌細胞株の細胞増殖の阻害における本発明の５つの抗体および組み合わせの用量−反応曲線を示す図である。ＢＴ４７４細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。実験は１０％ウシ胎児血清を含有する培地で行った。抗ＥｒｂＢ２抗体、抗体混合物または対照ＩｇＧを添加し、細胞を３７℃で１４４時間インキュベートした。５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｇ７５７３）を１０分間添加して、製造業者の指示に従って、発光シグナルを測定した。試料セットは、ｈＩｇＧ＋ｍＩｇＧ（×）、ｈＩｇＧ＋トラスツズマブ（□）、ｈＩｇＧ＋ペルツズマブ（○）、トラスツズマブ＋ペルツズマブ（□の中に●）、トラスツズマブ＋本発明のｍＡｂ（▲）、およびｈＩｇＧ＋本発明のｍＡｂ（▼）を含む。「本発明のｍＡｂ」は４Ｇ６を表す。注：Ｔ−ｍＡｂはトラスツズマブを表し、Ｐ−ｍＡｂはペルツズマブを表す。
【図２Ｄ】ＢＴ４７４乳癌細胞株の細胞増殖の阻害における本発明の５つの抗体および組み合わせの用量−反応曲線を示す図である。ＢＴ４７４細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。実験は１０％ウシ胎児血清を含有する培地で行った。抗ＥｒｂＢ２抗体、抗体混合物または対照ＩｇＧを添加し、細胞を３７℃で１４４時間インキュベートした。５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｇ７５７３）を１０分間添加して、製造業者の指示に従って、発光シグナルを測定した。試料セットは、ｈＩｇＧ＋ｍＩｇＧ（×）、ｈＩｇＧ＋トラスツズマブ（□）、ｈＩｇＧ＋ペルツズマブ（○）、トラスツズマブ＋ペルツズマブ（□の中に●）、トラスツズマブ＋本発明のｍＡｂ（▲）、およびｈＩｇＧ＋本発明のｍＡｂ（▼）を含む。「本発明のｍＡｂ」は５Ｆ１２を表す。注：Ｔ−ｍＡｂはトラスツズマブを表し、Ｐ−ｍＡｂはペルツズマブを表す。
【図２Ｅ】ＢＴ４７４乳癌細胞株の細胞増殖の阻害における本発明の５つの抗体および組み合わせの用量−反応曲線を示す図である。ＢＴ４７４細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。実験は１０％ウシ胎児血清を含有する培地で行った。抗ＥｒｂＢ２抗体、抗体混合物または対照ＩｇＧを添加し、細胞を３７℃で１４４時間インキュベートした。５０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＰＲＯＭＥＧＡ、Ｇ７５７３）を１０分間添加して、製造業者の指示に従って、発光シグナルを測定した。試料セットは、ｈＩｇＧ＋ｍＩｇＧ（×）、ｈＩｇＧ＋トラスツズマブ（□）、ｈＩｇＧ＋ペルツズマブ（○）、トラスツズマブ＋ペルツズマブ（□の中に●）、トラスツズマブ＋本発明のｍＡｂ（▲）、およびｈＩｇＧ＋本発明のｍＡｂ（▼）を含む。「本発明のｍＡｂ」は５Ｇ９を表す。注：Ｔ−ｍＡｂはトラスツズマブを表し、Ｐ−ｍＡｂはペルツズマブを表す。
【図３Ａ】ＢＴ４７４乳癌異種移植片モデルにおけるＰＢＳ（◆）、トラスツズマブ単独（■）、トラスツズマブ／４Ｃ９（▲）、トラスツズマブ／４Ｈ２（×）、トラスツズマブ／４Ｇ６（＊）、トラスツズマブ／５Ｆ１２（●）、トラスツズマブ／５Ｇ９（ｌ）およびトラスツズマブ／ペルツズマブ（−）処置の反応（腫瘍容積）を示す図である。注：Ｔ−ｍＡｂはトラスツズマブを表し、Ｐ−ｍＡｂはペルツズマブを表す。
【図３Ｂ】ＢＴ４７４乳癌異種移植片モデルにおけるＰＢＳ（◆）、トラスツズマブ単独（■）、トラスツズマブ／４Ｃ９（▲）、トラスツズマブ／４Ｈ２（×）、トラスツズマブ／４Ｇ６（＊）、トラスツズマブ／５Ｆ１２（●）、トラスツズマブ／５Ｇ９（ｌ）およびトラスツズマブ／ペルツズマブ（−）処置の反応（体重）を示す図である。注：Ｔ−ｍＡｂはトラスツズマブを表し、Ｐ−ｍＡｂはペルツズマブを表す。
【図４Ａ】ＰＤＸトラスツズマブ耐性胃モデルにおけるＰＢＳ（◆）、トラスツズマブ単独（■）、トラスツズマブ＋ペルツズマブ（▲）、トラスツズマブ＋５Ｆ１２（●）およびトラスツズマブ＋５Ｇ９（ｌ）およびトラスツズマブ／ペルツズマブ（−）処置の反応（腫瘍容積）を示す図である。注：Ｔ−ｍＡｂはトラスツズマブを表し、Ｐ−ｍＡｂはペルツズマブを表す。
【図４Ｂ】ＰＤＸトラスツズマブ耐性胃モデルにおけるＰＢＳ（◆）、トラスツズマブ単独（■）、トラスツズマブ＋ペルツズマブ（▲）、トラスツズマブ＋５Ｆ１２（●）およびトラスツズマブ＋５Ｇ９（ｌ）およびトラスツズマブ／ペルツズマブ（−）処置の反応（体重）を示す図である。注：Ｔ−ｍＡｂはトラスツズマブを表し、Ｐ−ｍＡｂはペルツズマブを表す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｃ９、４Ｈ２、４Ｇ６、５Ｈ１２および５Ｇ９、ならびにこれらのキメラおよびヒト化変異体を含む、ＥｒｂＢ２に特異的に結合する結合タンパク質が提供される。一実施形態では、結合タンパク質が、これらの抗体のいずれか１つの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む。別の実施形態では、これらの抗体のいずれか１つの重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含む結合タンパク質が提供される。さらに別の実施形態では、これらの抗体のいずれか１つの重鎖可変領域配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列およびこれらの抗体のいずれか１つの軽鎖可変領域配列と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含む結合タンパク質が提供される。
【００７２】
本発明の結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子が提供される。このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。
【００７３】
本発明の結合タンパク質を作製する方法が提供される。
【００７４】
トラスツズマブと本発明の結合タンパク質とを含む組成物が提供される。結合タンパク質は、トラスツズマブによって結合されるエピトープともペルツズマブによって結合されるエピトープとも異なる別個のエピトープに結合し得る。結合タンパク質は、トラスツズマブなどの別のＥｒｂＢ２抗体の内部移行を有意に改善し得る、ならびに／あるいはトラスツズマブなどの別のＥｒｂＢ２抗体と相乗的に、ＥｒｂＢ２媒介生理活性、例えば下流シグナル伝達経路のリン酸化および細胞増殖を調節し得る。
【００７５】
本発明の結合タンパク質と、抗癌剤とを含む結合タンパク質コンジュゲートが提供される。結合タンパク質コンジュゲートは、免疫毒性であり得る。結合タンパク質コンジュゲートと、トラスツズマブなどの別のＥｒｂＢ２抗体と、免疫毒性であり得る結合タンパク質コンジュゲートとを含む組成物も提供される。
【００７６】
本発明の結合タンパク質または組成物の有効量を対象に投与する工程を含む、対象の疾患または障害を治療する方法。対象は哺乳動物、例えばヒトであり得る。本方法は、トラスツズマブなどの別のＥｒｂＢ２抗体を対象に投与する工程をさらに含み得る。対象（例えば、ヒト）の疾患または障害（例えば、癌）を治療するための、結合タンパク質と、場合によりトラスツズマブなどの別のＥｒｂＢ２抗体とを含む医薬品も提供される。
【００７７】
トラスツズマブなどの別のＥｒｂＢ２抗体のＥｒｂＢ２陽性への内部移行を増強する方法が提供される。本方法は、細胞を本発明の結合タンパク質または組成物と接触させる工程を含む。
【００７８】
Ａ．定義
「抗体」という用語は、広義の意味で使用され、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含み、具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を網羅する。抗体（Ａｂ）および免疫グロブリン（Ｉｇ）は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特異的標的に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と、標的特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。天然抗体および免疫グロブリンは通常、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、一端に、可変領域（ＶＨ）、引き続いていくつかの定常領域を有する。各軽鎖は、一端に、可変領域（ＶＬ）および他端に定常領域を有する。さらに、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、完全抗体と、タンパク質に特異的に結合することができる抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなど）の両方を含むことを意図している。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全抗体のＦｃフラグメントを欠き、動物または植物の循環からより迅速になくなり、完全抗体よりも非特異的組織結合が少なくなり得る（Ｗａｈｌら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２４：３１６（１９８３））。
【００７９】
「キメラ抗体」は、広義の意味で、ある抗体の１つまたは複数の領域と、１つまたは複数の他の抗体の１つまたは複数の領域とを含む抗体を指す。本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」は一般に、部分的にヒト起源であり、部分的に非ヒト起源である、すなわち一部はマウスまたはラットなどの非ヒト動物に由来する抗体である。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１（１９８９）を参照されたい。
【００８０】
「Ｋａｂａｔナンバリング」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基よりも可変性（すなわち、超可変性）のアミノ酸残基を番号付けするシステムを指す（Ｋａｂａｔら、Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、１９０：３８２〜３９１（１９７１）およびＫａｂａｔら  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２（１９９１））。重鎖可変領域（ＶＨ）については、超可変領域は、ＣＤＲ１のアミノ酸３１〜３５位、ＣＤＲ２のアミノ酸５０〜６６位およびＣＤＲ３のアミノ酸９５〜１０２位の範囲である。軽鎖可変領域（ＶＬ）については、超可変領域は、ＣＤＲ１のアミノ酸２４〜３４位、ＣＤＲ２のアミノ酸５０〜５６位およびＣＤＲ３のアミノ酸８９〜９７位の範囲である。
【００８１】
「ＣＤＲグラフト抗体」という用語は、ある種からの重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つまたは複数の配列が別の種のＣＤＲ配列で置き換えられている抗体、例えばマウスＣＤＲの１つまたは複数（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置き換えられている、マウス重鎖可変領および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。
【００８２】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス）の重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬ配列の少なくとも一部がより「ヒト様」、すなわちヒト生殖系列可変配列に類似であるように改変された抗体を指す。「ヒト化抗体」は、目的の抗原に特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク（ＦＲ）領域と、非ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有する相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む抗体またはその変異体、誘導体、類似体もしくはフラグメントである。本明細書で使用する場合、ＣＤＲの文脈における「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％同一のアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「アクセプター」および「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域（ＦＲ）の１つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％を提供またはコードする抗体または核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、「アクセプター」という用語が、定常領域を提供またはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。さらに別の実施形態では、「アクセプター」という用語が、フレームワーク領域および定常領域の１つまたは複数を提供またはコードする抗体アミノ酸または核酸配列を指す。具体的な実施形態では、「アクセプター」という用語が、フレームワーク領域の１つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または１００％を提供またはコードするヒト抗体アミノ酸または核酸配列を指す。この実施形態によると、アクセプターは、ヒト抗体の１つまたは複数の特定の位置に生じない少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも１０個のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域および／またはアクセプター定常領域は、例えば、生殖系列抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能的抗体（例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体または市販の抗体）から誘導するまたは得ることができる。
【００８４】
「可変」という用語は、可変領域の一定の部分が抗体間で配列が広く異なり、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は抗体の可変領域にわたって均一に分布しているわけではない。可変性は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の両方の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮されている。可変領域のより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、βシート構造を接続、ある場合にはβシート構造の一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって接続されたβシート配置を大いに採用する４つのＦＲを含む。各鎖の超可変領域がＦＲによって他の鎖の超可変領域と極めて接近して結合しており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１）参照）。定常領域は抗体と抗原の結合に直接的には関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。
【００８５】
「超可変領域」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）と重鎖可変領域の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））および／または「超可変ループ」の残基（例えば、軽鎖可変領域の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）と重鎖可変領域の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９６：９０１〜９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」すなわち「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変領域残基である。
【００８６】
抗体のパパイン消化により、それぞれ単一抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、およびその名称が容易に結晶化することができることを反映している残留「Ｆｃ」フラグメントが得られる。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、まだ抗原と架橋を形成することができるＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。
【００８７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。この領域は、密で非共有結合的に会合した１つの重鎖可変領域および１つの軽鎖可変領域の二量体からなる。各可変領域の３つの超可変領域が相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定するのがこの配置である。まとめると、６個の超可変領域が抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、結合部位全体よりは親和性が低いが、単一可変領域（または抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえ抗原を認識し、これに結合する能力を有する。
【００８８】
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常領域および重鎖の第１の定常領域（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の１個または複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の数個の残基の付加によってＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常領域のシステイン残基が少なくとも１個の遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本明細書での名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントのペアとして作製された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも知られている。
【００８９】
脊椎動物種の抗体の「軽鎖」は、その定常領域のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類の一方に割り当てることができる。
【００９０】
「単鎖Ｆｖ」すなわち「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成するのを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、２６９〜３１５頁（１９９４）を参照されたい。ＥｒｂＢ２抗体ｓｃＦｖフラグメントは、国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；および米国特許第５５８７４５８号に記載されている。
【００９１】
「免疫グロブリン」という用語は、血液または血清中に見られる抗体の混合物の総称として一般的に使用されるが、他の供給源に由来する抗体の混合物を示すためにも使用され得る。
【００９２】
「同族ＶＨおよびＶＬコードペア」という用語は、同じ抗体産生細胞内に含まれるまたは同じ抗体産生細胞に由来するＶＨコード配列とＶＬコード配列の元のペアを記載するものである。よって、同族ＶＨおよびＶＬペアは、このような細胞が得られたドナー中に元々存在するＶＨおよびＶＬペアリングを表す。「ＶＨおよびＶＬコードペアから発現される抗体」という用語は、抗体または抗体フラグメントが、ベクター、プラスミドまたはＶＨおよびＶＬコード配列を含む他のポリヌクレオチドから産生されることを示す。同族ＶＨおよびＶＬコードペアが、完全な抗体としてまたはその安定なフラグメントとして発現される場合、これらは、それらが得られた細胞から元々発現される抗体の結合親和性および特異性を保つ。同族ペアのライブラリーは同族ペアのレパートリーまたはコレクションとも呼ばれ、個別に保持され得るまたはプールされ得る。「組換え抗体」という用語は、抗体のコード配列（前記コード配列は自然には細胞に関連していない）を含む発現ベクター（または場合により２つ以上の発現ベクター、典型的には２つの発現ベクター）でトランスフェクトされた細胞または細胞株から発現される抗体を指す。
【００９３】
本明細書で使用する場合、「カノニカル」残基という用語は、Ｃｈｏｔｈｉａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９〜８１７（１９９２））によって定義される特定のカノニカルＣＤＲ構造を規定するＣＤＲまたはフレームワーク中の残基を指す。Ｃｈｏｔｈｉａらによると、多くの抗体のＣＤＲの重要な部分は、アミノ酸配列レベルでは多様性が大きいにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造を有する。各カノニカル構造は、主に、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントに対するペプチド骨格ねじれ角のセットを指定する。
【００９４】
本明細書で使用する場合、「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、可変領域からＣＤＲを減じた残りの配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は様々なシステム（例えば、上記参照）によって決定され得るので、それに対応してフレームワーク配列の意味は様々な解釈を受ける。６つのＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２およびＬ３と重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３）はまた、軽鎖および重鎖上のフレームワーク領域を各鎖上の４つの部分領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）に分け、ＣＤＲ１はＦＲ１とＦＲ２との間に、ＣＤＲ２はＦＲ２とＦＲ３との間に、ＣＤＲ３はＦＲ３とＦＲ４との間に位置する。特定の部分領域をＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定せず、他によって言及されるフレームワーク領域は、単一の、天然の免疫グロブリン鎖の可変領域内に結合したＦＲを表す。本明細書で使用する場合、１つのＦＲは４つの部分領域の１つを表し、複数のＦＲはフレームワーク領域を構成する４つの部分領域のうちの２つ以上を表す。
【００９５】
当技術分野で公知の技術を使用して非ヒト抗体をヒト化するために重鎖および軽鎖「アクセプター」フレームワーク配列（または単に、「アクセプター」配列）として使用され得るヒト重鎖および軽鎖フレームワーク（ＦＲ）配列が当技術分野で公知である。本発明の一実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列が、公的に入手可能なデータベース、例えばＶベース（ハイパーテキスト転送プロトコル：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）または国際ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ（登録商標）（ＩＭＧＴ（登録商標））情報システム（ハイパーテキスト転送プロトコル：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／ｔｅｘｔｓ／ＩＭＧＴｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ／ＬｏｃｕｓＧｅｎｅｓ／）に列挙されているフレームワーク配列から選択される。
【００９６】
以下の表２は、当技術分野で公知のヒト重鎖アクセプター配列の例の非限定的なリストを提供する。
【００９７】
【表２】
2020508694.tif 000002
【００９８】
以下の表３は、当技術分野で公知のヒト軽鎖アクセプター配列の例の非限定的なリストを提供する。
【００９９】
【表３】
2020508694.tif 000003
【０１００】
本発明の一実施形態では、ヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列が以下の表２および表３に記載のアミノ酸配列から選択されるが、表２および表３に列挙されていない他のヒト重鎖および軽鎖アクセプター配列も本発明による抗体をヒト化するために使用することができる。
【０１０１】
一実施形態では、本発明によるＥｒｂＢ２に結合するヒト化抗体を作製するのに使用するための表２の重鎖ヒトアクセプターフレームワーク配列が、ｈＩＧＨＶ１−６９  ＦＲ１；ｈＩＧＨＶ１−６９  ＦＲ２；ｈＩＧＨＶ１−６９  ＦＲ３；および、ｈＩＧＨＪ４  ＦＲ４；のアクセプター配列からなるセット；ｈＩＧＨＶ１−４６  ＦＲ１；ｈＩＧＨＶ１−４６  ＦＲ２；ｈＩＧＨＶ１−４６  ＦＲ３；および、ｈＩＧＨＪ４  ＦＲ４；のアクセプター配列からなるセットを含む。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明によるＥｒｂＢ２に結合するヒト化抗体を作製するのに使用するための表３の軽鎖ヒトアクセプターフレームワーク配列が、ｈＩＧＫＶ１−３３  ＦＲ１；ｈＩＧＫＶ１−３３  ＦＲ２；ｈＩＧＫＶ１−３３  ＦＲ３；および、ｈＩＧＫＪ１  ＦＲ４；のアクセプター配列からなるセットと、ｈＩＧＫＶ１−２７  ＦＲ１；ｈＩＧＫＶ１−２７  ＦＲ２；ｈＩＧＫＶ１−２７  ＦＲ３；および、ｈＩＧＫＪ１  ＦＲ４；のアクセプター配列からなるセットを含む。
【０１０３】
さらに別の実施形態では、本発明によるＥｒｂＢ２に結合するヒト化抗体を作製するのに使用するためのヒトアクセプターフレームワーク配列のセットが、
重鎖フレームワーク−１（Ｈ−ＦＲ１）：
Ｑ−Ｖ−Ｑ−Ｌ−Ｖ−Ｑ−Ｓ−Ｇ−Ａ−Ｅ−Ｖ−Ｋ−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｖ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｘ２４−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｆ−Ｘ３０（配列番号５２）（式中、Ｘ２４はＡまたはＴであり、Ｘ３０はＳまたはＴである）；
重鎖フレームワーク−２（Ｈ−ＦＲ２）：Ｗ−Ｖ−Ｒ−Ｑ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｌ−Ｅ−Ｗ−Ｍ−Ｇ（配列番号４）；
重鎖フレームワーク−３（Ｈ−ＦＲ３）：
Ｒ−Ｘ６７−Ｔ−Ｉ−Ｔ−Ａ−Ｄ−Ｘ７３−Ｓ−Ｔ−Ｘ７６−Ｔ−Ａ−Ｙ−Ｍ−Ｅ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｒ−Ｓ−Ｅ−Ｄ−Ｔ−Ａ−Ｖ−Ｙ−Ｙ−Ｃ−Ａ−Ｒ（配列番号５３）（式中、Ｘ６７はＡまたはＶであり、Ｘ７３はＫまたはＱであり、Ｘ７６はＳまたはＮである）
重鎖フレームワーク−４（Ｈ−ＦＲ４）：Ｗ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｌ−Ｖ−Ｔ−Ｖ−Ｓ−Ｓ（配列番号６）
軽鎖フレームワーク−１（Ｌ−ＦＲ１）：
Ｄ−Ｉ−Ｑ−Ｍ−Ｔ−Ｑ−Ｓ−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｓ−Ａ−Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｄ−Ｒ−Ｖ−Ｔ−Ｉ−Ｔ−Ｃ（配列番号７）；
軽鎖フレームワーク−２（Ｌ−ＦＲ２）：Ｗ−Ｙ−Ｑ−Ｘ３８−Ｋ−Ｐ−Ｇ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｋ−Ｌ−Ｌ−Ｉ−Ｘ４９（配列番号５４）（式中、Ｘ３８はＱまたはＨであり、Ｘ４９はＹまたはＨである）、
軽鎖フレームワーク−３（Ｌ−ＦＲ３）：
Ｇ−Ｘ５８−Ｐ−Ｓ−Ｒ−Ｆ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｓ−Ｇ−Ｘ６９−Ｄ−Ｘ７１−Ｔ−Ｘ７３−Ｔ−Ｉ−Ｓ−Ｓ−Ｌ−Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ａ−Ｔ−Ｙ−Ｙ−Ｃ（配列番号５５）（式中、Ｘ５８はＩまたはＶであり、Ｘ６９はＫ、ＴまたはＲであり、Ｘ７１はＹまたはＦであり、Ｘ７３はＬまたはＦである）；
軽鎖フレームワーク−４（Ｌ−ＦＲ４）：Ｆ−Ｇ−Ｑ−Ｇ−Ｔ−Ｋ−Ｖ−Ｅ−Ｉ−Ｋ（配列番号１０）
からなる群から選択されるアクセプターフレームワーク配列の１つまたは複数（例えば、結合ドメイン１つ当たりいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つまたは８つ）を含む。
【０１０４】
好ましい実施形態では、本発明によるＥｒｂＢ２抗体に結合する抗体が、上記のＨ−ＦＲ１、Ｈ−ＦＲ２、Ｈ−ＦＲ３、Ｈ−ＦＲ４、Ｌ−ＦＲ１、Ｌ−ＦＲ２、Ｌ−ＦＲ３およびＬ−ＦＲ４アクセプター配列からなるヒトアクセプター配列のセットを使用してヒト化される。
【０１０５】
「抗体の組み合わせ」または「抗体組み合わせ」または「抗体混合物」という用語は、異なるＣＤＲ配列を有する少なくとも２つの別個の抗体を指す。
【０１０６】
本明細書で使用される「相乗」という用語は、２つ以上のモノクローナル抗体の相加効果よりも有効な抗体組み合わせを指す。薬物組み合わせの相乗作用についての実験設計はＣｈｏｕ（Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ  ５８：６２１〜６８１、２００６）によって記載された。本発明によって提供される組み合わせはいくつかのアッセイシステムで評価され、抗癌剤間の相乗作用、相加作用（ａｄｄｉｔｉｖｉｓｍ）および拮抗作用を定量化するための標準的なプログラムを利用してデータを分析することができる。併用療法は、「相乗作用」を提供し、「相乗的」であると分かることがある、すなわち、有効成分を、同時または逐次のいずれかで一緒に使用した場合に達成される効果が、化合物を単独で使用して得られる効果の和よりも大きい。相乗効果は、２つ以上の抗体を（１）同時に処方して投与する、もしくは組み合わせ製剤で同時に送達する；（２）別々の製剤として交互に送達する場合、または（３）二重特異性ＩｇＧフォーマットなどのある他のレジメンによって達成され得る。
【０１０７】
「中和」という用語は、抗体が抗原に特異的に結合する場合に、抗原の生物活性に対抗することを指す。一実施形態では、中和抗体が抗原に結合し、その生物活性を少なくとも約２０％、約４０％、約６０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％またはそれ以上中和する。
【０１０８】
「別個のエピトープ」という用語は、本発明の２つの異なる抗体が別個のエピトープに結合する場合に、好ましくは抗原結合についての競合が８０％未満、より好ましくは抗原結合についての競合が５０％未満、最も好ましくは競合が可能な限り少ない、例えば抗原結合についての競合が約２５％未満であるという事実を指す。同じ抗原への結合について互いに競合することができる抗体は、同じもしくは重複するエピトープに結合し得る、または互いに密接した結合部位を有し得、結果として競合が主に立体障害によって引き起こされるので、「同じエピトープ」という用語は、本発明の２つの異なる抗体が同じエピトープに結合する場合に、好ましくは抗原結合についての競合が８０％超、より好ましくは抗原結合についての競合が８５％超、より好ましくは抗原結合についての競合が９０％超、最も好ましくは抗原結合についての競合が９５％超であるという事実を指す。抗体ペアの「別個のエピトープ」または「同じエピトープ」についての分析は、当技術分野で公知の方法、例えば、ＥｒｂＢ２を発現する細胞および個々の蛍光標識抗体に対するＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）もしくは他のフローサイトメトリー分析を使用した飽和抗体条件下での結合実験によって、またはフローセル表面に捕捉もしくはコンジュゲートしたＥｒｂＢ２抗原を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行うことができる。ＳＰＲを使用した抗体間の競合を決定する方法を実施例で記載する。
【０１０９】
「抗体コンジュゲート」という用語は、治療薬または細胞傷害剤などの第２の化学部分に化学的に連結された抗体を指す。「剤」という用語は、本明細書において、化合物、化合物の混合物、生体高分子または生物材料から作製された抽出物を示すために使用される。好ましくは、治療薬または細胞傷害剤には、それだけに限らないが、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロンミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、ｌ−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにこれらの類似体またはホモログが含まれる。
【０１１０】
Ｂ．トラスツズマブ相乗抗ＥｒｂＢ２抗体の作製
本発明の一態様は、トラスツズマブ相乗中和能力を有するＥｒｂＢ２に結合する単離マウスモノクローナル抗体を提供する。本発明の別の態様は、ＥｒｂＢ２に結合するキメラ抗体を提供する。本発明の別の態様は、ＥｒｂＢ２に結合するＣＤＲグラフト抗体またはその抗原結合部分を提供する。本発明の別の態様は、ＥｒｂＢ２に結合するヒト化抗体またはその抗原結合部分を提供する。一実施形態では、抗体またはその部分が単離抗体またはその単離部分である。別の実施形態では、本発明の抗体またはその抗原結合部分が中和抗ＥｒｂＢ２抗体である。有利には、このようなＥｒｂＢ２に結合する抗体またはその抗原結合部分が、個体（ヒトまたは他の哺乳動物）へ投与され得るトラスツズマブ機能的相乗パートナーとしての用途を見出す。好ましくは、本発明の抗体またはその抗原結合部分が、トラスツズマブと組み合わせると、ＥｒｂＢ２陽性癌細胞の増殖を相乗的に阻害する。
【０１１１】
本発明により使用される抗体を作製するための代表的な技術に関しての説明は以下の通りである。抗体を作製するために使用されるＥｒｂＢ２抗原は、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメインの可溶性形態であり得る。あるいは、細胞表面でＥｒｂＢ２を発現している細胞（例えば、ＳＫＢＲ３細胞などの癌細胞株、Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら  ＰＮＡＳ（米国）８８：８６９１〜８６９５（１９９１）参照）を使用して抗体を作製することができる。
【０１１２】
（ｉ）ハイブリドーマ技術を使用した抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体
ハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組み合わせの使用を含む多種多様な当技術分野で公知の技術を使用して、モノクローナル抗体を調製することができる。例えば、当技術分野で公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８８）に教示されている技術を含むハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を作製することができる。
【０１１３】
マウスをＥｒｂＢ２抗原またはＥｒｂＢ２過剰発現癌細胞で免疫化した後、抗体および／または抗体産生細胞を動物から得ることができる。抗ＥｒｂＢ２抗体含有血清を、動物から採血するまたは動物を屠殺することによって動物から得る。血清は動物から得られた状態のままで使用してもよいし、または抗ＥｒｂＢ２抗体を血清から精製してもよい。
【０１１４】
いったんマウス血清で免疫反応が検出されたら（例えば、抗原ＥｒｂＢ２に特異的な抗体）、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離する。次いで、脾細胞を周知の技術によって任意の適切な骨髄腫細胞、例えばアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．、米国）から入手可能な細胞株ＳＰ２／０の細胞に融合する。次いで、ハイブリドーマクローンを、ＥｒｂＢ２に結合することができる抗体を分泌する細胞について当技術分野で公知の方法によって分析する。陽性ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローニングする。マウスに陽性ハイブリドーマクローンを接種することによって、一般に高レベルの抗体を含有する腹水液を作製することができる。
【０１１５】
（ｉｉ）トラスツズマブ相乗抗腫瘍生理活性を有する抗体のスクリーニング
抗体を作製するための技術を上で説明してきた。本発明はさらに、相乗生理活性（細胞増殖阻害活性など）を含む抗体組み合わせを単離する方法を提供する。本発明の抗体組み合わせは、以下の所望の特性を有する少なくとも２つ以上のモノクローナル抗体を含む：＜１＞抗体がＥｒｂＢ２上に存在する別個の非重複エピトープに結合する；＜２＞抗体が新規な抗体であるまたは組み合わせの一部が新規な抗体である；＜３＞抗体組み合わせ（本発明の任意の抗体＋トラスツズマブ）の有効性が、各個々の成分の有効性または各個々の有効性の和よりも強力である。好ましくは、本発明は、一方が本発明の５つのモノクローナル抗体で、他方がトラスツズマブである２つのモノクローナル抗体の相乗組み合わせを提供した。このような二抗体組み合わせの抗腫瘍活性は、いずれかの成分の抗腫瘍活性または各個々の有効性の和よりも強力である。
【０１１６】
好ましくは、ＥｒｂＢ２陽性細胞の細胞増殖の阻害においてトラスツズマブと協同することができる抗体を同定するために、以下の手順に従うことができる：（ａ）ＥＬＩＳＡまたは細胞ベース結合を行って、目的の抗体の特異的ＥｒｂＢ２結合活性を確認する。抗体が組換えヒトＥｒｂＢ２およびヒトＥｒｂＢ２を発現している細胞に結合する能力を測定することができる。（ｂ）細胞増殖スクリーニングのトラスツズマブベース相乗阻害を行う。例えば、以下の実施例４に記載されるＢＴ４７４ベース細胞増殖阻害アッセイを使用して、個々の抗ＥｒｂＢ２抗体および／または抗体組み合わせによるＢＴ４７４細胞増殖の阻害を行うことができる。抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体または抗体組み合わせを各ウェルに添加し、約１４４時間インキュベートすることができる。用量反応曲線を作成し、目的の抗体または目的の抗体組み合わせについてのＩＣ５０値を計算することができる。一実施形態では、増殖阻害性抗体組み合わせが、約０．５〜２０μｇ／ｍＬの濃度で、ＢＴ４７４細胞の増殖を、各個々の抗体よりも約２０〜８０％高く阻害することができる。
【０１１７】
このような優れた相乗抗腫瘍活性の仮定される機序は、それだけに限らないが、以下の可能性の１つであり得るだろう：（ａ）標的（例えば、ＥｒｂＢ２）の２つ以上の機能的エピトープを遮断することによる相乗交差増強、および／または（ｂ）２つ以上のモノクローナル抗体の標的（例えば、ＥｒｂＢ２）に対する結合活性もしくは相乗結合親和性が、単一モノクローナル抗体の親和性よりもはるかに高いこと、および／または（ｃ）単一モノクローナル抗体の抗体−抗原三量体形成とは異なり、別個のエピトープを有する２つ以上のモノクローナル抗体によって媒介される抗体−抗原凝集体の形成は、はるかに大きく、クリアランスおよび／または細胞エンドサイトーシスのために免疫系が検出するのが容易となり得ること。上記機序のうちの１つもしくは上記全ての組み合わせ、または他の考えられる機序に基づいて、抗ＥｒｂＢ２相乗抗体組み合わせをＥｒｂＢ２陽性癌の予防または治療に使用することができる。好ましくは、本発明の抗体をトラスツズマブとの組み合わせとして使用して、ＥｒｂＢ２陽性癌またはトラスツズマブ耐性ＥｒｂＢ２陽性癌を治療することができる。
【０１１８】
（ｉｉｉ）組換えＥｒｂＢ２抗体の作製
本発明の抗体は、当技術分野で公知のいくつかの技術のいずれかによって作製することができる。例えば、宿主細胞からの発現、ここでは重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」という用語の種々の形態は、外因性ＤＮＡを真核宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図している。本発明の組換え抗体を発現するための代表的な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９：１〜６２１（１９８２）に記載されるＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、７７：４２１６〜４２２０（１９８０）に記載されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が含まれる。抗体をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞中での抗体の発現、またはより好ましくは宿主細胞が増殖される培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体を産生させる。標準的なタンパク質精製法を使用して、抗体を培養培地から回収することができる。
【０１１９】
宿主細胞を使用して、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子などの機能的抗体フラグメントを作製することもできる。上記手順に対する変形が本発明の範囲内にあることが理解されるだろう。例えば、宿主細胞を、本発明の抗体の軽鎖および／または重鎖の機能的フラグメントをコードするＤＮＡでトランスフェクトすることが望ましいだろう。組換えＤＮＡ技術を使用して、目的の抗原に結合するために必要ではない軽鎖と重鎖のいずれかまたは両方をコードするＤＮＡのいくらかまたは全てを除去することもできる。このような切断ＤＮＡ分子から発現される分子も本発明の抗体に包含される。さらに、標準的な化学的架橋法によって、本発明の抗体を第２の抗体と架橋することによって、一方の重鎖および一方の軽鎖が本発明の抗体であり（すなわち、ヒトＥｒｂＢ２に結合する）、他方の重鎖および軽鎖がヒトＥｒｂＢ２以外の抗原に特異的である二機能性抗体を作製することができる。
【０１２０】
本発明の抗体またはその抗原結合部分の組換え発現のための好ましいシステムでは、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖および軽鎖遺伝子がそれぞれ、ＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントと作動可能に連結して、高レベルの遺伝子転写を駆動する。組換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子を有し、これにより、メトトレキサート選択／増幅を使用した、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択が可能になる。選択された形質転換体宿主細胞を培養して抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にし、培養培地から完全抗体を回収する。標準的な分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。なおさらに、本発明は、本発明の組換え抗体が合成されるまで、本発明の宿主細胞を適切な培養培地で培養することによって、本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。本方法は、培養培地から組換え抗体を単離する工程をさらに含むことができる。
【０１２１】
１．抗ＥｒｂＢ２抗体
ヒトＥｒｂＢ２に結合する単離マウスモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列を、表１３Ａ及び表１３Ｂでクローン４Ｃ９、４Ｈ２、４Ｇ６、５Ｆ１２および５Ｇ９について示す（以下の実施例参照）。本明細書に記載される単離抗ＥｒｂＢ２抗体ＣＤＲ配列は、本発明によって単離され、そこから誘導されたＣＤＲ配列を含むポリペプチドを含むＥｒｂＢ２抗体のファミリーを確立する。モノクローナル抗体およびそのヒト化抗体誘導体の可変領域およびＣＤＲの配列を表１３Ａ、表１３Ｂ、表１７Ａ、表１７Ｂ、表２０Ａおよび表２０Ｂに列挙する。本発明による抗体について、ヒトＥｒｂＢ２に関して好ましいＥｒｂＢ２結合および／または中和活性を有するＣＤＲを作製および選択するために、それだけに限らないが、本明細書に具体的に記載されるものを含む、本発明の抗体を作製し、これらの抗体のＥｒｂＢ２結合および／または中和特性を評価するための当技術分野で公知の標準的な方法を使用することができる。
【０１２２】
本明細書に記載される抗ＥｒｂＢ２抗体クローンの重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲのアミノ酸配列のアラインメントに基づいて、本発明は、ヒトＥｒｂＢ２に結合することができる抗原結合ドメインを含むＥｒｂＢ２抗体を提供し、前記抗原結合ドメインは以下に定義される６つのＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の少なくとも１つまたは複数を含む：
ＣＤＲ−Ｈ１は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１１）（式中、
Ｘ１はＳであり、
Ｘ２はＹであり、
Ｘ３はＴまたはＹであり、
Ｘ４はＭまたはＩであり、
Ｘ５はＨである）
４Ｃ９  ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１７）の残基３１〜３５
４Ｈ２  ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号１９）の残基３１〜３５
４Ｇ６  ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号２１）の残基３１〜３５
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号２３）の残基３１〜３５
４Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号２５）の残基３１〜３５
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．Ｖ１（配列番号２７）の残基３１〜３５
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．１（配列番号２８）の残基３１〜３５
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．２（配列番号２９）の残基３１〜３５
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．３（配列番号３０）の残基３１〜３５
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．４（配列番号３１）の残基３１〜３５
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．Ｖ１（配列番号３９）の残基３１〜３５
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．１（配列番号４０）の残基３１〜３５
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．２（配列番号４１）の残基３１〜３５
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．３（配列番号４２）の残基３１〜３５
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．４（配列番号４３）の残基３１〜３５
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．５（配列番号４４）の残基３１〜３５
からなる群から選択され、
ＣＤＲ−Ｈ２は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（配列番号１２）（式中、
Ｘ１はＹであり、
Ｘ２はＩであり、
Ｘ３はＮであり、
Ｘ４はＰであり、
Ｘ５はＳであり、
Ｘ６はＳであり、
Ｘ７はＳまたはＤであり、
Ｘ８はＹであり、
Ｘ９はＴであり、
Ｘ１０はＡまたはＮであり、
Ｘ１１はＹであり、
Ｘ１２はＮであり、
Ｘ１３はＱであり、
Ｘ１４はＫまたはＮであり、
Ｘ１５はＦであり、
Ｘ１６はＫまたはＲであり、
Ｘ１７はＤである）
４Ｃ９  ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１７）の残基５０〜６６
４Ｈ２  ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号１９）の残基５０〜６６
４Ｇ６  ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２１）の残基５０〜６６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２３）の残基５０〜６６
４Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号２５）の残基５０〜６６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．Ｖ１（配列番号２７）の残基５０〜６６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．１（配列番号２８）の残基５０〜６６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．２（配列番号２９）の残基５０〜６６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．３（配列番号３０）の残基５０〜６６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．４（配列番号３１）の残基５０〜６６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．Ｖ１（配列番号３９）の残基５０〜６６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．１（配列番号４０）の残基５０〜６６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．２（配列番号４１）の残基５０〜６６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．３（配列番号４２）の残基５０〜６６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．４（配列番号４３）の残基５０〜６６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ２ＶＨ．５（配列番号４４）の残基５０〜６６
からなる群から選択され、
ＣＤＲ−Ｈ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１３）（式中、
Ｘ１はＡであり、
Ｘ２はＳであり、
Ｘ３はＡまたはＳであり、
Ｘ４はＦであり、
Ｘ５はＳであり、
Ｘ６はＬであり、
Ｘ７はＤであり、
Ｘ８はＦであり、
Ｘ９はＷである）
４Ｃ９  ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１７）の残基９５〜１０３
４Ｈ２  ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号１９）の残基９５〜１０３
４Ｇ６  ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号２１）の残基９５〜１０３
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号２３）の残基９５〜１０３
４Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号２５）の残基９５〜１０３
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．Ｖ１（配列番号２７）の残基９５〜１０３
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．１（配列番号２８）の残基９５〜１０３
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．２（配列番号２９）の残基９５〜１０３
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．３（配列番号３０）の残基９５〜１０３
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．４（配列番号３１）の残基９５〜１０３
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ１  ＶＨ．Ｖ１（配列番号３９）の残基９５〜１０３
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．１（配列番号４０）の残基９５〜１０３
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．２（配列番号４１）の残基９５〜１０３
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．３（配列番号４２）の残基９５〜１０３
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．４（配列番号４３）の残基９５〜１０３
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｈ３ＶＨ．５（配列番号４４）の残基９５〜１０３
からなる群から選択され、
ＣＤＲ−Ｌ１は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１４）（式中、
Ｘ１はＫであり、
Ｘ２はＡであり、
Ｘ３はＳであり、
Ｘ４はＨまたはＱであり、
Ｘ５はＤであり、
Ｘ６はＩであり、
Ｘ７はＮであり、
Ｘ８はＫであり、
Ｘ９はＹであり、
Ｘ１０はＩであり、
Ｘ１１はＡである）
４Ｃ９  ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１８）の残基２４〜３４
４Ｈ２  ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号２０）の残基２４〜３４
４Ｇ６  ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号２２）の残基２４〜３４
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号２４）の残基２４〜３４
４Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号２６）の残基２４〜３４
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．Ｖ１（配列番号３２）の残基２４〜３４
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．１（配列番号３３）の残基２４〜３４
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．２（配列番号３４）の残基２４〜３４
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．３（配列番号３５）の残基２４〜３４
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．４（配列番号３６）の残基２４〜３４
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．５（配列番号３７）の残基２４〜３４
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．６（配列番号３８）の残基２４〜３４
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．Ｖ１（配列番号４５）の残基２４〜３４
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．１（配列番号４６）の残基２４〜３４
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．２（配列番号４７）の残基２４〜３４
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．３（配列番号４８）の残基２４〜３４
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．４（配列番号４９）の残基２４〜３４
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．５（配列番号５０）の残基２４〜３４
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ１ＶＬ．６（配列番号５１）の残基２４〜３４
からなる群から選択され、
ＣＤＲ−Ｌ２は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７（配列番号１５）（式中、
Ｘ１はＹまたはＳであり、
Ｘ２はＴであり、
Ｘ３はＳであり、
Ｘ４はＴであり、
Ｘ５はＬであり、
Ｘ６はＱまたはＹであり、
Ｘ７はＰである）
４Ｃ９  ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１８）の残基５０〜５６
４Ｈ２  ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号２０）の残基５０〜５６
４Ｇ６  ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号２２）の残基５０〜５６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号２４）の残基５０〜５６
４Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号２６）の残基５０〜５６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．Ｖ１（配列番号３２）の残基５０〜５６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．１（配列番号３３）の残基５０〜５６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．２（配列番号３４）の残基５０〜５６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．３（配列番号３５）の残基５０〜５６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．４（配列番号３６）の残基５０〜５６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．５（配列番号３７）の残基５０〜５６
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．６（配列番号３８）の残基５０〜５６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．Ｖ１（配列番号４５）の残基５０〜５６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．１（配列番号４６）の残基５０〜５６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．２（配列番号４７）の残基５０〜５６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．３（配列番号４８）の残基５０〜５６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．４（配列番号４９）の残基５０〜５６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．５（配列番号５０）の残基５０〜５６
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ２ＶＬ．６（配列番号５１）の残基５０〜５６
からなる群から選択され、
ＣＤＲ−Ｌ３は、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９（配列番号１６）（式中、
Ｘ１はＬであり、
Ｘ２はＱまたはＮであり、
Ｘ３はＹであり、
Ｘ４はＤであり、
Ｘ５はＮであり、
Ｘ６はＬであり、
Ｘ７はＬであり、
Ｘ８はＷであり、
Ｘ９はＴである）
４Ｃ９  ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１８）の残基８９〜９７
４Ｈ２  ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２０）の残基８９〜９７
４Ｇ６  ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２２）の残基８９〜９７
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２４）の残基８９〜９７
４Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号２６）の残基８９〜９７
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．Ｖ１（配列番号３２）の残基８９〜９７
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．１（配列番号３３）の残基８９〜９７
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．２（配列番号３４）の残基８９〜９７
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．３（配列番号３５）の残基８９〜９７
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．４（配列番号３６）の残基８９〜９７
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．５（配列番号３７）の残基８９〜９７
５Ｆ１２  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．６（配列番号３８）の残基８９〜９７
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．Ｖ１（配列番号４５）の残基８９〜９７
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．１（配列番号４６）の残基８９〜９７
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．２（配列番号４７）の残基８９〜９７
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．３（配列番号４８）の残基８９〜９７
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．４（配列番号４９）の残基８９〜９７
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．５（配列番号５０）の残基８９〜９７
５Ｇ９  ＣＤＲ−Ｌ３ＶＬ．６（配列番号５１）の残基８９〜９７
からなる群から選択される。
【０１２３】
好ましくは、ＥｒｂＢ２抗体は、上記の少なくとも１つのＣＤＲ、より好ましくは上記の任意の２つのＣＤＲ、より好ましくは上記の任意の３つのＣＤＲ、さらにより好ましくは上記の任意の４つのＣＤＲ、さらにより好ましくは上記の任意の５つのＣＤＲ、最も好ましくは上記の任意の６つのＣＤＲ（すなわち、上記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３）を含む。３つのＣＤＲを含む特に好ましいＥｒｂＢ２は、上記のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【０１２４】
２．抗ＥｒｂＢ２キメラ抗体
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来する分子、例えばマウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９  １２０２〜１２０７（１９８５）；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１〜２０２（１９８９）  米国特許第５８０７７１５号；同第４８１６５６７号；および同第４８１６３９７号を参照されたい。さらに、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と合わせて、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」を作製するために開発された技術を使用することができる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  米国、８１：６８５１〜６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６０４〜６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２〜４５４（１９８５）を参照されたい。
【０１２５】
３．抗ＥｒｂＢ２  ＣＤＲグラフト抗体
本発明の単離抗ＥｒｂＢ２抗体ＣＤＲ配列を使用してＣＤＲグラフト抗体を作製して元の抗体の特性を調節することができる。このような特性には、それだけに限らないが、結合速度論、親和性、生物活性、種交差反応性、分子交差反応性、エピトープ、物理化学特性、薬物動態特性、薬力学特性または薬理学特性が含まれる。ＣＤＲグラフト抗体はヒト抗体または非ヒト霊長類抗体の重鎖および軽鎖可変領域配列を含み、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つまたは複数が元の抗ＥｒｂＢ２抗体のＣＤＲ配列で置き換えられている。任意のヒトまたは非ヒト霊長類抗体のフレームワーク配列が、ＣＤＲグラフトのための鋳型として働き得る。しかしながら、このようなフレームワーク上での直鎖置換はしばしば、抗原に対する結合親和性のいくらかの喪失をもたらす。ヒトまたは他の種の抗体が相同性になればなるほど、ＣＤＲと新たなヒトフレームワークまたは非ヒト霊長類フレームワークを組み合わせることによって、親和性または他の特性を減少させ得るような歪みがＣＤＲに導入される可能性が少なくなる。そのため、ＣＤＲから離れたヒト可変領域フレームワークを置き換えるように選択される可変フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも３０％の配列同一性を有することが好ましい。ＣＤＲから離れたヒト可変領域フレームワークを置き換えるように選択される可変領域フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも４０％の配列同一性を有することがより好ましい。ＣＤＲから離れたヒト可変フレームワークを置き換えるように選択される可変領域フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも５０％の配列同一性を有することがより好ましい。ＣＤＲから離れたヒト可変フレームワークを置き換えるように選択される可変領域フレームワークが、ヒト抗体可変領域フレームワークと少なくとも６０％の配列同一性を有することがより好ましい。新たなヒトまたは非ヒト霊長類可変領域フレームワークとＣＤＲから離れた元のヒト可変領域フレームワークが、少なくとも７０％の配列同一性を有することがより好ましい。新たなヒトまたは非ヒト霊長類可変領域フレームワークとＣＤＲから離れた元のヒト可変領域フレームワークが、少なくとも７５％の配列同一性を有することがさらにより好ましい。新たなヒトまたは非ヒト霊長類可変領域フレームワークとＣＤＲから離れた元のヒト可変領域フレームワークが、少なくとも８０％の配列同一性を有することが最も好ましい。高度に相同性のヒトまたは非ヒト霊長類フレームワークを使用して元のヒト抗ＥｒｂＢ２抗体のＣＤＲをグラフトする場合でさえ、得られるグラフト抗体はなお、抗原に対する結合親和性をある程度喪失し得る。この場合、親和性を回復するために、新たにグラフトされた抗体の対応する部分に元の抗体の少なくとも１つまたは複数のキーフレームワーク残基置換を含めることが必要である。このような主要残基は、
ＣＤＲに隣接する残基；
グリコシル化部位残基；
レア残基；
ヒトＥｒｂＢ２と相互作用することができる残基；
カノニカル残基；
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基；
Ｖｅｒｎｉｅｒゾーン内の残基；および
Ｃｈｏｔｈｉａによって定義された可変重鎖ＣＤＲ１とＫａｂａｔによって定義された第１の重鎖フレームワークとの間で重複する領域の残基
からなる群から選択され得る。
【０１２６】
４．抗ＥｒｂＢ２ヒト化抗体
本発明の組成物はヒト化抗体を作製する必要を排除するが、本発明の組成物を使用して、ヒト化ＥｒｂＢ２抗体を調製することができる。ヒト化抗体は、１つまたは複数の非ヒト種の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子のフレームワーク領域を有する、所望の抗原に結合する非ヒト種抗体の抗体分子である。公知のヒトＩｇ配列は、ワールドワイドウェブ（ｗｗｗ．）を介して入手可能なウェブサイト、例えばｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ／；ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／；ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕＬａｂｏｕｔ．ｐｅｄｒｏ−／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｍｇｅｎ．ｕｎｉｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／ＳＤ／ＩＴ／ＩＴ．ｈｔｍｌ；ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｌｉｂｒａｒｙ．ｔｈｉｎｋｑｕｅｓｔ．ｏｒｇ／１２４２９／Ｉｍｍｕｎｅ／Ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｈｔｍｌ；ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／ｌ９９６／ｖｌａｂ／；ｐａｔｈ．−ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃＶ／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ−／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ；ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ／；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕＬａｂｏｕｔ．ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｂｉｏ−ｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／．ａｂｏｕｔ．ｈｃｌ／；ｐｅｂｉｏ．ｃｏｍ／ｐａ／３４０９１３−／３４０９１３．ｈｔｍｌ；ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ／；ｍ．ｅｈｉｍｅｕ．ａｃｊｐ／．ａｂｏｕｔ．ｙａｓｕｈｉｔｏ−／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ／ｔａｂｌｅ．ａｓｐ；ｉｃｎｅｔ．ｕｋ／ａｘｐ／ｆａｃｓ／ｄａｖｉｅｓ／ｌｉｎ−ｋｓ．ｈｔｍｌ；ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ−／．ａｂｏｕｔ．ｆｃｃｌ／ｐｒｏｔｏｃｏｌ．ｈｔｍｌ；ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｉｔｅｓ＿ｇｅｏ．ｈｔｍｌ；ａｘｉｍｔｌ．ｉｍｔ．ｕｎｉ−ｍａｒｂｕｒｇ．ｄｅ／．ａｂｏｕｔ．ｒｅｋ／ＡＥＰ−Ｓｔａｒｔ．ｈｔｍｌ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／．ａｂｏｕｔ．ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓｌ．ｈｔｍｌ；ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／；ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ；ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／−ｖｉｒＮ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｉｍｇｔ．ｃｎｕｓｃ．ｆｒ：８１０４／；ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍａｒｔｉｎ／ａｂｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ａｎｔｉ−ｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ／；ａｂｇｅｎ．ｃｖｍ．ｔａｍｕ．ｅｄｕ／ｌａｂ／ｗｗｗａｂｇｅｎ．ｈｔｍｌ；ｕｎｉｚｈ．ｃｈ／．ａｂｏｕｔ．ｈｏｎｅｇｇｅｒ／ＡＨＯ−ｓｅｍｉｎａｒ／Ｓｌｉｄｅ０１．ｈｔｍｌ；ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／ａｂｏｕｔ．ｕｂｃｇＯＶｓ／；ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍ；ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｍｒｃＶ／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．−ｈｔｍｌ；ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｃｒｙｓｔ．ｂｉｏｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／．ａｂｏｕｔ．ｆｍｏｌｉｎａ／Ｗｅｂｐａｇｅｓ−／Ｐｅｐｔ／ｓｐｏｔｔｅｃｈ．ｈｔｍｌ；ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ／ｆｒｒｏｄｕｃｔｓ．ｈｔｍ；ｐａｔｅｎｔｓ．ｉｂｍ．ｃｏｍ／ｉｂｍ．ｈｔｍｌ．  Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ（１９８３）で開示されている。このようなインポート配列を使用して、免疫原性を減少させる、結合、親和性、結合速度、解離速度、結合活性、特異性、半減期または当技術分野で公知の任意の他の適切な特性を増強または改変することができる。
【０１２７】
ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体の対応する残基で置換して、抗原結合を変化させる、好ましくは改善することができる。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば特定の位置の異常なフレームワーク残基を同定するための抗原結合および配列比較に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用のモデル化によって、同定される（例えば、米国特許第５５８５０８９号（Ｑｕｅｅｎら）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）参照）。三次元免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性が高い三次元コンフォメーション構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の精査によって、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、標的抗原に対する増加した親和性などの所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサス配列およびインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基が、抗原結合に直接的かつ最も実質的に関与している。それだけに限らないが、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）；Ｓｉｍｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１：２２９６〜２３０８（１９９３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜９１７（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、８９：４２８５〜４２８９（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１：２６２３〜２６３２（１９９３）；Ｐａｄｌａｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２８（４／５）：４８９〜４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７（６）：８０５〜８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、９１：９６９〜９７３（１９９４）；ＰＣＴ公開番号：国際公開第９１／０９９６７号、国際公開第９９／０６８３４号（ＰＣＴ／ＵＳ９８／１６２８０）、国際公開第９７／２００３２号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１８９７８）、国際公開第９２／１１２７２号（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０９６３０）、国際公開第９２／０３４６１号（ＰＣＴ／ＵＳ９１／０５９３９）、国際公開第９４／１８２１９号（ＰＣＴ／ＵＳ９４／０１２３４）、国際公開第９２／０１０４７号（ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４）、国際公開第９３／０６２１３号（ＰＣＴ／ＧＢ９２／０１７５５）、国際公開第９０／１４４４３号、国際公開第９０／１４４２４号および国際公開第９０／１４４３０号；欧州公開番号  欧州特許第０５９２１０６号  欧州特許第０５１９５９６号および欧州特許第０２３９４００号；米国特許第５５６５３３２号：同第５７２３３２３号；同第５９７６８６２号；同第５８２４５１４号；同第５８��７４８３号；同第５８１４４７６号：同第５７６３１９２号；同第５７２３３２３号；同第５７６６８８６号；同第５７１４３５２号；同第６２０４０２３号：同第６１８０３７０号；同第５６９３７６２号；同第５５３０１０１号；同第５５８５０８９号；同第５２２５５３９号；および同第４８１６５６７号に記載されている技術などの、当技術分野で公知の種々の技術を使用して、抗体をヒト化することができる。
【０１２８】
Ｃ．抗体および抗体産生細胞株の作製
好ましくは、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体は、例えば当技術分野で公知のいくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのいずれか１つによって評価されるように、トラスツズマブと組み合わせると、ＥｒｂＢ２陽性腫瘍増殖活性を阻害する高い能力を示す。例えば、トラスツズマブ＋本発明のこれらの抗体のいずれか１つの組み合わせのＩＣ５０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞増殖阻害アッセイ（表１１）および／またはｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデル（表２４）および同じｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースバイオアッセイでの各個々の抗体のＩＣ５０の約５０％であり、トラスツズマブ＋本発明のこれらの抗体のいずれか１つの組み合わせの最大阻害能力は８１％〜９５％の範囲にあり、これに対して、各個々の抗体の最大阻害能力は１３％〜７０％の範囲にある。
【０１２９】
一定の実施形態では、抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、抗体は、軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域またはλ軽鎖定常領域のいずれかを含むことができる。好ましくは、抗体がκ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分が、例えばＦａｂフラグメントまたは単鎖Ｆｖフラグメントであり得る。
【０１３０】
一実施形態は、本発明の抗体または抗体部分が誘導体化されているかまたは別の機能的分子（例えば、別のペプチドもしくはタンパク質）に連結されている標識抗体を提供する。例えば、本発明の標識抗体は、（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的会合などによって）本発明の抗体または抗体部分を別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出可能薬剤、細胞傷害剤、医薬品および／または抗体もしくは抗体部分と別の分子の会合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチド（ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグなど）などの１つまたは複数の他の分子実体と機能的に連結させることによって、得ることができる。
【０１３１】
本発明の抗体または抗体部分を誘導体化することができる有用な検出可能薬剤には、蛍光化合物が含まれる。代表的な蛍光検出可能薬剤には、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが含まれる。抗体を、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能酵素で誘導体化することもできる。抗体を検出可能酵素で誘導体化する場合、酵素が検出可能反応生成物を産生するために使用する追加の試薬を添加することによって、抗体を検出する。例えば、検出可能薬剤西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加によって、検出可能な着色反応生成物がもたらされる。抗体をビオチンで誘導体化し、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定を通して検出することもできる。
【０１３２】
Ｄ．ＥｒｂＢ２抗体の使用
（ｉ）モノクローナル抗体
ヒトＥｒｂＢ２抗体に結合する能力を考慮すると、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学などの当技術分野で公知の従来の免疫測定法のいずれかを使用して、抗体およびその部分を含む、本明細書に記載されるＥｒｂＢ２抗体を使用して試料（例えば、混合物、溶液または生体試料、例えば血液、血清または血漿）中のＥｒｂＢ２を検出または測定することができる。
【０１３３】
本発明は、試料をＥｒｂＢ２抗体と接触させる工程と、ヒトＥｒｂＢ２に結合したＥｒｂＢ２抗体または未結合抗体を検出することによって試料中のヒトＥｒｂＢ２を検出する工程とを含む、試料中のヒトＥｒｂＢ２を検出する方法を提供する。本明細書に記載されるＥｒｂＢ２抗体を検出可能物質で直接的または間接的に標識して、結合または未結合ＥｒｂＢ２抗体の検出を容易にすることができる。適切な検出可能物質には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が含まれる。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、Ｐ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；適切な放射性物質の例としては、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏまたは１５３Ｓｍが挙げられる。
【０１３４】
ＥｒｂＢ２について分析することができる生体試料には、尿、糞便、血液、血清、血漿、汗、唾液、口腔拭き取り検体（頬、舌、咽頭）、膣拭き取り検体、直腸拭き取り検体、皮膚拭き取り検体、皮膚切屑、組織生検ならびに当技術分野で利用可能な方法によって得ることができる任意の他の組織試料が含まれる。
【０１３５】
抗体を標識する代わりに、検出可能物質で標識した組換えヒト（ｒｈ）ＥｒｂＢ２（ｒｈＥｒｂＢ２）標準および本明細書に記載される非標識ＥｒｂＢ２抗体を利用した競合免疫測定法によって、生体体液中のヒトＥｒｂＢ２を分析することができる。このアッセイでは、生体試料、標識（ｒｈＥｒｂＢ２）標準およびＥｒｂＢ２抗体を組み合わせ、非標識抗体に結合した標識ＥｒｂＢ２標準の量を測定する。生体試料中のヒトＥｒｂＢ２の量は、ＥｒｂＢ２抗体に結合した標識ｒｈＥＲＢＢ２標準の量に反比例する。同様に、検出可能物質で標識したｒｈＥｒｂＢ２標準および本明細書に記載される非標識ＥｒｂＢ２抗体を利用した競合免疫測定法によって、生体体液中のヒトＥｒｂＢ２を分析することもできる。
【０１３６】
本発明のＥｒｂＢ２抗体は、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、ＥｒｂＢ２活性、特にヒトＥｒｂＢ２活性を中和することができる。したがって、本発明のこのような抗体を使用して、例えばヒト対象または本発明の抗体が交差反応するＥｒｂＢ２を発現する他の哺乳動物対象において、ＥｒｂＢ２を含有する細胞培養物のＥｒｂＢ２活性を阻害することができる。一実施形態では、本発明は、ＥｒｂＢ２活性を阻害する方法であって、ＥｒｂＢ２活性が阻害されるように、ＥｒｂＢ２を本発明のＥｒｂＢ２抗体または抗体部分と接触させる工程を含む方法を提供する。例えば、ＥｒｂＢ２を含有するまたは含有することが疑われる細胞培養物で、本発明の抗体または抗体部分を培養培地に添加して、培養物のＥｒｂＢ２活性を阻害することができる。
【０１３７】
別の実施形態では、本発明は、有利にはＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ２活性が有害である疾患または障害を患っている対象から、対象のＥｒｂＢ２活性を中和する方法を提供する。本発明は、このような疾患または障害を患っている対象のＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ２活性を中和する方法であって、対象のＥｒｂＢ２またはＥｒｂＢ２活性が中和されるように、本発明のＥｒｂＢ２抗体を対象に投与する工程を含む方法を提供する。好ましくは、ＥｒｂＢ２がヒトＥｒｂＢ２であり、対象がヒト対象である。あるいは、対象が、本発明のＥｒｂＢ２抗体が結合することができるＥｒｂＢ２を発現している哺乳動物であり得る。なおさらに、対象が、（例えば、ＥｒｂＢ２の投与によってまたはＥｒｂＢ２導入遺伝子の発現によって）ＥｒｂＢ２が導入された哺乳動物であり得る。本発明の抗体または他のＥｒｂＢ２抗体を治療目的でヒト対象に投与することができる。さらに、本発明のＥｒｂＢ２抗体を、獣医学目的でまたはヒト疾患の動物モデルとして、抗体が結合することができるＥｒｂＢ２を発現している非ヒト哺乳動物に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体および他のＥｒｂＢ２抗体の治療有効性を評価するのに有用であり得る（例えば、投与量および投与時間経過の試験）。
【０１３８】
（ｉｉ）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。代表的な二重特異性抗体はＥｒｂＢ２タンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得る。他のこのような抗体は、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３および／またはＥｒｂＢ４についてＥｒｂＢ２結合部位を組み合わせ得る。あるいは、抗ＥｒｂＢ２アームを、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２もしくはＣＤ３）などの白血球、またはＩｇＧのためのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）、例えばＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）上の誘因分子に結合するアームと組み合わせて、細胞防御機構をＥｒｂＢ２発現細胞に集中させることができる。二重特異性抗体を使用して、細胞傷害剤を、ＥｒｂＢ２を発現している細胞に局在化させることもできる。これらの抗体は、ＥｒｂＢ２結合アームと、細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームとを有する。二重結合性抗体は、完全長抗体または抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。国際公開第９６／１６６７３号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載しており、米国特許第５８３７２３４号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示している。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は国際公開第９８／０２４６３号に示されている。米国特許第５８２１３３７号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示している。
【０１３９】
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な作製は、２本の鎖が異なる特異性を有する２本の免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの同時発現に基づく（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダム組み合わせのために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、そのうちの１つのみが正確な二重特異性構造を有する１０種の異なる抗体分子の潜在的な混合物をもたらす。通常はアフィニティクロマトグラフィー工程によって行われる正しい分子の精製はかなり厄介であり、生成物収率が低い。同様の手順が国際公開第９３／０８８２９号およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９（１９９１）に開示されている。
【０１４０】
異なるアプローチによると、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変領域を免疫グロブリン定常領域配列に融合する。融合は、好ましくはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とである。融合体の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望であれば、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを別個の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物にコトランスフェクトさせる。これにより、構築物に使用される不均等な比の３本のポリペプチド鎖が最適な収率をもたらす実施形態で、３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調整において大きな柔軟性が提供される。しかしながら、等しい比の少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合または比が特に重要でない場合、２本または全３本のポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１４１】
このアプローチの好ましい実施形態では、二重特異性抗体が、一方のアームの第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペア（第２の結合特異性を提供する）とで構成される。二重特異性分子の２分の１のみの免疫グロブリン軽鎖の存在が容易な分離方法を提供するので、この非対称構造が、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖組み合わせから分離するのを容易にすることが分かった。このアプローチは国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体の作製のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０（１９８６）を参照されたい。米国特許第５７３１１６８号に記載されている別のアプローチによると、抗体分子のペア間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化することができる。好ましい界面は、抗体定常領域のＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖が大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換えられている。大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えば、アラニンまたはトレオニン）で置き換えることによって、大きな側鎖と同一または同様のサイズの代償的「空洞」が第２の抗体分子の界面に作り出される。これにより、ホモ二量体などの他の不要な最終生成物に対してヘテロ二量体の収率を増加させる機序が提供される。
【０１４２】
二重特異性抗体には、架橋または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方をアビジンにカップリングさせ、他方をビオチンにカップリングさせることができる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に標的化させるため（米国特許第４６７６９８０号）およびＨＩＶ感染症を治療するため（国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号および欧州特許第０３０８９号）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は当技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。抗体フラグメントから二重特異性抗体を作製する技術も文献に記載されている。例えば、化学的な連結を使用して、二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：８１（１９８５）は、完全抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する手順を記載している。これらのフラグメントを、ジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して隣接ジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防ぐ。次いで、作製されたＦａｂ’フラグメントをチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをメルカプトエチルアミンによる還元によってＦａｂ’−チオールに再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体を、酵素を選択的に固定化するための薬剤として使用することができる。
【０１４３】
近年の進歩により、化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成することができる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＦａｂ’−ＳＨフラグメントの直接回収が容易になった。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７５：２１７〜２２５（１９９２）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の作製を記載している。各Ｆａｂ’フラグメントを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から別々に分泌させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの指示された化学カップリングに供して二重特異性抗体を形成した。こうして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現している細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができると同時に、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を誘因することができた。
【０１４４】
組換え細胞培養物から直接二重特異性抗体フラグメントを作製および単離するための種々の技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを使用して作製されてきた。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８（５）：１５４７〜１５５３（１９９２）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させた。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次いで、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法を抗体ホモ二量体の作製に利用することもできる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）によって記載される「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作製するための代替機序を提供した。フラグメントは、同鎖上の２つのドメイン間でのペアリングを可能にするには短すぎるリンカーによって軽鎖可変領域（ＶＬ）に結合した重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。したがって、一方のフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインを、別のフラグメントの相補的ＶＬおよびＶＨドメインとペアリングさせ、それによって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することにより二重特異性抗体フラグメントを作製する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい。３以上の結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１４５】
（ｉｉｉ）イムノコンジュゲート
本発明の抗体および組成物の治療的使用の別の選択肢は、イムノコンジュゲート、すなわち、１つまたは複数の抗癌剤にコンジュゲートした抗体の形態にある。特に、別個のＥｒｂＢ２エピトープに結合する２つ以上の本発明の個々の抗体を含む組成物の場合、これにより、細胞表面上に架橋した抗体−受容体格子が生成され、それによって単一モノクローナル抗体の使用と比較して増加したレベルの受容体内部移行が潜在的に得られると考えられる。そのため、このような組成物の個々の抗体の１つまたは複数と１つまたは複数の抗癌剤のコンジュゲーションは、コンジュゲートした抗癌剤を腫瘍細胞の内側に特異的かつ有効に送達し、それによって、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体の、改善された腫瘍細胞死滅活性を提供するとの効果を増強する。
【０１４６】
細胞傷害剤（従来の化学療法薬および他の小分子抗癌剤を含む）、サイトカイン（この場合、コンジュゲートが「免疫サイトカイン」と呼ばれ得る）、毒素（この場合、コンジュゲートが「免疫毒素」と呼ばれ得る）および放射性核種を含む種々のタイプの抗癌剤が、本発明の抗体にコンジュゲートしていてもよく、数種のイムノコンジュゲートが既に臨床使用について承認されている。これらには、ＺＥＶＡＬＩＮ（登録商標）（９０Ｙにコンジュゲートしたマウス抗ＣＤ２０抗体）、ＢＥＸＸＡＲ（登録商標）（１３１Ｉにコンジュゲートしたマウス抗ＣＤ２０抗体）およびＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（カリチアマイシンにコンジュゲートしたヒト化抗ＣＤ３３抗体）が含まれる。臨床試験で試験されている他のイムノコンジュゲートには、例えばドキソルビシンまたはマイタンシノイド化合物にコンジュゲートした抗体が含まれる。臨床試験で試験されている免疫毒素には、切断されたシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａにコンジュゲートした数種の抗体が含まれる。ＩＬ−２にコンジュゲートしたヒト化ＥｐＣＡＭ抗体を含む免疫サイトカインも試験されている。
【０１４７】
細胞傷害剤にコンジュゲートした本発明の抗体の場合、これらは、例えば、アルキル化剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキサート、カペシタビン、ゲムシタビン）、アントラサイクリン（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、マイトマイシンＣ）および植物アルカロイド（例えば、ドセタキセルおよびパクリタキセルなどのタキサン、ならびにビンブラスチン、ビンクリスチンおよびビノレルビンなどのビンカアルカロイド）を含む化学療法薬の主要なクラスのいずれかに属し得る。イムノコンジュゲートの使用は、抗癌剤を腫瘍、特に内部移行後に腫瘍細胞の内部に特異的に向けるので、本発明の抗ＥｒｂＢ２抗体に基づくイムノコンジュゲートは、有利にはカリチアマイシンもしくはマイタンシノイド誘導体などの高度細胞傷害剤、または細菌毒素（例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ、ジフテリア毒素）もしくは植物毒素（例えば、リシン）などの毒素に基づき得る。イムノコンジュゲート中のコンジュゲートした抗癌剤は一般的に、血清中で比較的安定であるが、イムノコンジュゲートが標的細胞に内部移行すると薬剤の放出を可能にする不安定リンカーによって抗体に連結されている。適切なリンカーには、例えば、血清中の中性ｐＨで安定であるが、内部移行後にリソソーム内の弱酸性条件下で酸加水分解を受ける化学リンカー、細胞内チオールによって切断されるジスルフィドリンカー、および血清中で安定であるが、細胞内区画で酵素切断を受けるペプチドリンカーが含まれる。
【０１４８】
種々のコンジュゲーションの配置が本発明の２つ以上の抗体を含有する組成物で想起され得る。例えば、２つの抗体では、抗体を２種以上の異なる抗癌剤とコンジュゲートする、または一方の抗体を他方の抗体にコンジュゲートした酵素などの薬剤によって活性化されるプロドラッグとコンジュゲートすることが可能であると予想される。プロドラッグがｍＡＢ−酵素コンジュゲートによって腫瘍に標的化された酵素によって活性化される、抗体指向性酵素プロドラッグ療法（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｙ）（ＡＤＥＰＴ）の一般的概念がモノクローナル抗体について記載されているが、本発明はこのアプローチを特定の状態に適合させる機会を提供し得る。よって、正常な組織への損傷を避けるまたは減少させながら、腫瘍細胞死滅を特異的に増加させることが可能となり得る。
【０１４９】
抗癌イムノコンジュゲートについてのさらなる情報については、Ｗｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１３７〜１１４６；Ｓｃｈｒａｍａら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５：１４７〜１５９；およびＲｏｈｒｅｒ（２００９）ｃｈｉｍｉｃａ  ｏｇｇｉ／Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２７（５）：５６〜６０を参照されたい。
【０１５０】
（ｉｖｉ）用量および投与経路
本発明の抗体および組成物は、当の状態を治療するのに有効な量で、すなわち、所望の結果を達成するのに必要な投与量および期間で投与される。治療上有効量は、治療される特定の状態、患者の年齢、性別および体重、ならびに抗ＥｒｂＢ２抗体が単独治療として投与されているのか、１つまたは複数の追加の抗癌治療と組み合わせて投与されているのかどうかなどの因子によって変化し得る。
【０１５１】
腫瘍療法のために有効量は、例えば腫瘍サイズを縮小させることによって、患者の疾患進行を安定化する、および／または症状を改善する、および好ましくは疾患進行を逆行させる能力によって測定され得る。本発明の抗体または組成物が癌を阻害する能力は、例えば実施例に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、ならびにヒト腫瘍における有効性を予測する適切な動物モデルで評価され得る。各特定の状況で最適な治療反応を提供するために適切な投与レジメンが選択され、例えば各症例の緊急性によって指示される投与量の可能な調節をして単一ボーラスとしてまたは持続注入として投与される。
【０１５２】
本発明による抗体についての具体的な用量はまだ決定されていないが、治療的使用について承認されている同様の製品（抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体）との比較を通して、一定の用量検討を決定することができる。よって、本発明の抗体組成物の適切な投与量は、抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））についての推奨投与量と同様であると考えられる。特定の状況に応じて、トラスツズマブは、初期用量４ｍｇ／ｋｇおよびその後毎週用量２ｍｇ／ｋｇ、または初期用量８ｍｇ／ｋｇおよびその後の用量３週間毎に６ｍｇ／ｋｇのいずれかで、乳癌を治療するために（点滴によって）投与される。
【０１５３】
本発明の抗体組成物の適切な用量は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇまたは約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲にあると考えられる。抗体組成物を、少なくとも０．２５、０．５、１、１．５、２、３、４もしくは５ｍｇ／ｋｇ；および／または最大約５０、３０、２０もしくは１５ｍｇ／ｋｇの投与量で投与することができる。投与は通常、適切な間隔で、例えば毎週１回、２週間に１回、３週間に１回または４週間に１回、必要に応じて投与量を場合により増加または減少させることができる担当医師によって適切と考えられる間繰り返される。
【０１５４】
３つの別個の送達アプローチが本発明の抗体を送達するために企図される。従来の静脈内送達が、おそらくは大部分の腫瘍のための標準的な送達技術となる。しかしながら、腹腔内の腫瘍、例えば卵巣、胆管、他の管などの腫瘍に関しては、腹腔内投与が、腫瘍部位で高い抗体用量を得て、抗体クリアランスを最小化するために好ましいと分かるだろう。同様に、一定の固形腫瘍は局所灌流に適した血管系を有する。局所灌流により、腫瘍部位で高い抗体用量を得て、抗体の短期クリアランスを最小化することが可能になり得る。
【０１５５】
任意のタンパク質または抗体点滴ベース治療製品と同様に、安全性への懸念は、主に（ｉ）サイトカイン放出症候群、すなわち低血圧、発熱、身震い、悪寒、（ｉｉ）タンパク質に対する免疫原性応答の発達（すなわち、組換え抗体製品に対する患者によるヒト抗体の発達）、および（ｉｉｉ）ＥｒｂＢ２受容体を発現する正常細胞、例えば多くの上皮細胞に対する毒性に関する。標準的な試験およびフォローアップ手順を利用してこのような安全性への懸念を監視する。
【０１５６】
このような変動は適切であるので、量、百分率などの測定可能な値に言及する場合に本明細書で使用される「約」という用語は、指定される値から±２０％、または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、なおさらにより好ましくは±０．１％の変動を包含することを意図している。
【実施例】
【０１５７】
《実施例１》
［１−１］ハイブリドーマ技術を使用したマウス抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体の作製
マウスを当技術分野で公知の方法に従って免疫した（例えば、Ｅ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄ．Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９９８））。
【０１５８】
ヒトＨＥＲ２陽性細胞株ＢＴ４７４ならびに組換えヒトＥｒｂＢ２細胞外ドメイン（ＥｒｂＢ２−ＥＣＤ）タンパク質を免疫原として使用した。高レベルのヒトＥｒｂＢ２（ＳＫ−ＢＲ３細胞）または低レベルのヒトＥｒｂＢ２（ＭＣＦ７）を発現しているヒト細胞株を、抗血清を決定するためおよび抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。
【０１５９】
免疫化投与量は、一次免疫と追加免疫の両方について１×１０６個のＢＴ４７４細胞／マウス／注射を含有していた。マウスＥｒｂＢ２に対する免疫応答を増加させるために、マウスを、不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、米国）を用いたエマルジョン形態の組換えマウスＥｒｂＢ２−ＥＣＤでさらに追加免疫した。手短に言えば、ボルテックスを使用してバイアル中でアジュバントを穏やかに混合することによって、アジュバント−抗原混合物を調製した。所望の量のアジュバントをバイアルから取り出し、オートクレーブ処理した１．５ｍＬ微量遠心管に入れた。抗原を０．５〜１．０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でＰＢＳまたは生理食塩水中で調製した。次いで、計算した量の抗原を、アジュバントを含む微量遠心管に添加し、２分間穏やかにボルテックスすることによって溶液を混合して油中水型エマルジョンを生成した。次いで、アジュバント−抗原溶液を動物注射のために適切な注射器に引き込んだ。合計５０μｇの抗原を５０〜１００μＬ容量で注射した。各動物を免疫し、次いで、その力価に応じて２〜３回追加免疫した。
【０１６０】
優れた力価（３００００倍超の希釈）を有する動物に、融合前にヒトＥｒｂＢ２を発現しているＢＴ４７４または２５μｇの組換えヒトＥｒｂＢ２−ＥＣＤによる最終的な皮下追加免疫を与えた。
【０１６１】
［１−２］ハイブリドーマ融合およびＥＬＩＳＡスクリーニング
ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８１）を培養して融合直前に対数期段階に到達させた。当技術分野で公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７（１９７５））に従って、免疫化マウス脾細胞を無菌的に調製し、ＳＰ２／０細胞と融合した。その後、融合した「ハイブリッド細胞」をＤＭＥＭ／２０％ＦＣＳ／ＨＡＴ培地中９６ウェルプレートに分注した。融合７〜１０日後に生存ハイブリドーマコロニーを顕微鏡下で観察し、その後、各ウェルの上清を以下の手順に従ってＥＬＩＳＡフォーマットを使用してハイブリドーマスクリーニングに供した：＜１＞ＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩、５０μＬのヒトＥｒｂＢ２（ＰＢＳ中２．０μｇ／ｍＬ）でコーティングした；＜２＞プレートを２５０μＬのＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、２００μＬのブロッキング緩衝液（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中２％ＢＳＡ）でブロッキングした；＜３＞希釈血清またはハイブリドーマ上清（１００μＬ）を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした；＜４＞次いで、プレートをＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰを検出に使用し、結合ＯＤを４５０ｎｍで観察した。次いで、組換えヒトＥｒｂＢ２−ＥＣＤに結合する抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、その後の細胞ベース結合スクリーニングのために新たな９６ウェルプレートに移した。本発明の融合によって、約３００００〜４００００個のＨＡＴ耐性生存ハイブリドーマが生成され、１４１５個の組換えヒトＥｒｂＢ２−ＥＣＤタンパク質に特異的に結合する陽性ハイブリドーマが得られた。このようなハイブリドーマスクリーニングの１つのプレートを、陽性ハイブリドーマに下線を付し、イタリック体にして、以下の表４として例示する。
【０１６２】
【表４】
2020508694.tif 000004
【０１６３】
《実施例２》高比率の細胞膜ＥｒｂＢ２に対する差次的結合活性を有する抗体の細胞ベーススクリーニング
実施例１のＥＬＩＳＡスクリーニングが完了したら、ＥｒｂＢ陽性ハイブリドーマを新たな６９ウェルプレートに移し、ＨＡＴ選択しないで新鮮なＤＭＥＭ培地を供給し、３〜５日後、ハイブリドーマ培地を細胞結合スクリーニングに供した。手短に言えば、ＳＫ−ＢＲ３細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３０、高レベルＥｒｂＢ２）またはＭＣＦ７細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−３０、低レベルＥｒｂＢ２）を、１〜５×１０５個細胞／ウェルで９６ウェル（丸底）プレートに分注し、４℃で１時間、ハイブリドーマ上清（５０μＬ）とインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ  ｐＨ７．２）で３回洗浄し、１００μＬのヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆ（ａｂ）２−Ａｌｅｘａ（ＪＩＲ番号：１１５−５４５−００６）に再懸濁した。次いで、４℃で１時間インキュベートした後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ＰＢＳを含むＰＢＳ  ｐＨ７．２）で３回洗浄し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、引き続いてＦＡＣＳ機器（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって結合シグナル収集および分析を行った。ＳＫ−ＢＲ３細胞およびＭＣＦ７細胞に対する同じハイブリドーマ上清の結合シグナルを計算し、ＳＫ−ＢＲ３結合／ＭＣＦ７結合の比をさらに計算した。上記ＥＬＩＳＡスクリーニングの１４１５個の陽性ハイブリドーマの中から、高比率のＳＫ−ＢＲ３結合／ＭＣＦ７結合クローン（クローンＡ２、クローンＡ７、クローンＡ１１、クローンＢ２、クローンＢ５、クローンＢ７、クローンＢ９など）を含む上位６７２のハイブリドーマを、細胞バンキングおよびその後の機能的スクリーニングのために陽性クローンとして単離した。このような細胞結合スクリーニングの１つのプレートを以下の表５として例示する。
【０１６４】
【表５】
2020508694.tif 000005
【０１６５】
細胞ベーススクリーニングが完了したら、高ランキング比率のＳＫ−ＢＲ３／ＭＣＦ７を含む上位６７２のハイブリドーマを新たな９６ウェルプレートに移した。３〜５日間培養した後、各ウェルのハイブリドーマ培地をその後のエピトープグループ分けおよび細胞ベース機能的スクリーニングのために回収し、対応する細胞を液体窒素で長期間保存用に凍結した。
【０１６６】
《実施例３》トラスツズマブとの競合に基づくハイブリドーマ上清のエピトープグループ分け
実施例２の細胞結合スクリーニングからの陽性ハイブリドーマ細胞に基づいて、各細胞株のハイブリドーマ上清をベンチマーク抗体（例えば、トラスツズマブおよび／またはペルツズマブ）に基づくエピトープグループ分けでさらに評価して、本発明の抗体をベンチマーク競合群とベンチマーク非競合群の２つのカテゴリーに分けた。手短に言えば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを組換えヒトＥｒｂＢ２−ＥＣＤ（０．１μｇ／ｍＬ）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。濾紙上に穏やかに捨て、軽くたたくことによってコーティング溶液を除去し、２００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、３７℃で２時間インキュベートする。５０μＬの目的の抗体を添加し、３７℃で３０分間インキュベートし、引き続いて５０μＬの０．０３μｇ／ｍＬビオチン標識ベンチマーク抗体（例えば、ビオチン−トラスツズマブまたはビオチン−ペルツズマブ）を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートし、次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ＨＲＰ（１：５０００）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＳＴで３回洗浄する。１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質を添加し、室温で１５分間インキュベートする。５０μＬ／ウェルの１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応を終了させる。４５０ｎｍでＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒによってプレートを読み取る。以下の表６は、トラスツズマブ競合ＥＬＩＳＡ結果を例示している。表６中、Ｆ７ウェルは正常なヒトＩｇＧ（対照として）であり、Ｇ７ウェルは正常なマウスＩｇＧ（対照として）であり、Ｈ７ウェルはベンチマーク対照（すなわち、トラスツズマブ、５μｇ／ｍＬ）である。表６に示されるように、トラスツズマブはビオチン−トラスツズマブのＥｒｂＢ２−ＥＣＤ結合能力を遮断するが、ヒトＩｇＧもマウスＩｇＧも遮断しない。同様に、試料Ｃ６、Ｃ７、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４およびＨ１〜Ｈ６（太字、イタリックおよび下線）は一定の阻害活性を示し、これらがトラスツズマブエピトープと同じまたは重複するエピトープに結合することを示している。このプレートの残りの試料（Ａ１〜Ａ７など）は、組換えヒトＥｒｂＢ２−ＥＣＤに対するトラスツズマブ結合活性を阻害せず、これらの抗体がトラスツズマブエピトープとは別個のエピトープに結合することを示している。トラスツズマブエピトープ競合グループ分けに基づいて、本発明は、トラスツズマブ結合エピトープと別個のエピトープに結合するＥｒｂＢ２抗体を同定するのに成功した。
【０１６７】
【表６】
2020508694.tif 000006
【０１６８】
《実施例４》相乗生理活性を有する抗体のトラスツズマブベーススクリーニング
標準的なアプローチとは異なり、本発明は、初期段階での大規模なトラスツズマブベース相乗生理活性スクリーニングを行った。実施例２から単離された抗原陽性ハイブリドーマについて、各ハイブリドーマの細胞培養上清を、ＢＴ４７４乳癌細胞および／またはＭＤＡ−ＭＢ−ＶＩＩ１７５細胞の細胞増殖を阻害するトラスツズマブ相乗効力についてさらにスクリーニングした。手短に言えば、細胞を、２０００個細胞／ウェルで１００μＬ培地を含むプレートに播種する。細胞播種の翌日、４０μＬの細胞培養培地を吸引し、引き続いてベンチマーク抗体（トラスツズマブ、ペルツズマブおよびトラスツズマブ＋ペルツズマブの組み合わせ）、実施例２からの個々のハイブリドーマ上清、およびトラスツズマブと実施例２からの各個々のハイブリドーマ上清の組み合わせを含む６０μＬ抗体試料を添加する。１２０〜１４４時間細胞を培養し続ける。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏを１０分間添加する。試験細胞培養プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーによって分析した。好ましくは、トラスツズマブの細胞増殖阻害を相乗的に促進するハイブリドーマ上清を明らかにするために、目的の試料のセットは、（ａ）トラスツズマブ単独活性群（ＨＯＡ）；ペルツズマブ単独活性群（ＰＯＡ）；（ｃ）トラスツズマブ／ペルツズマブ（５０％トラスツズマブ／５０％ペルツズマブ）組み合わせ群（ＨＰＣ）；（ｄ）Ｍａｂ非依存性活性群（ＭＩＡ）：試験中のハイブリドーマ上清試料；（ｅ）トラスツズマブ相乗活性群（ＨＳＡ）：トラスツズマブ＋試験中のハイブリドーマ上清試料；（ｆ）陰性対照群（ＮＣ）：ヒトＩｇＧ＋マウスＩｇＧを含む。トラスツズマブ相乗候補を選択するための基準は以下に基づく：同じ条件下で、ＨＳＡの細胞増殖阻害活性がＨＯＡまたはＭＩＡよりも高く、ＨＯＡ＋ＭＩＡの和の５０％よりも高い場合、試験中の試料は細胞増殖阻害アッセイでトラスツズマブ相乗生理活性を含む。好ましくは、同じ細胞培養条件下で、ＨＳＡの細胞増殖阻害活性がＨＰＣ（トラスツズマブ／ペルツズマブ群）よりも高い場合、試験中の試料はペルツズマブよりも高いトラスツズマブ相乗生理活性を示すと考えられる。上記スクリーニング後、上位６７２の実施例２からのハイブリドーマ上清を細胞増殖阻害のトラスツズマブ相乗生理活性について評価およびランク付けし、上位１５の候補を限界希釈によってサブクローニングして各細胞株のクローン性を確保した。その中でも、実施例としての５つのハイブリドーマ細胞株（４Ｃ９、４Ｈ２、４Ｇ６、５Ｆ１２および５Ｇ９）を抗体産生のために使用し、対応する精製ＩｇＧを上記プロトコルに従ってトラスツズマブ相乗生理活性についてさらに確認した。結果を実施例５および表１１に要約する。
【０１６９】
《実施例５》本発明に係る抗体の生化学的特性
［５−１］本発明の精製ＩｇＧのＥｒｂＢ２結合活性確認
本発明の５つの抗体の対応する精製ＩｇＧをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に供し、結果を図１に示した。全５つの抗体を、組換えＥｒｂＢ２−ＥＣＤおよびＥｒｂＢ２陽性細胞に結合することができるＩｇＧ１／κであるとしてアイソタイピングする（以下の表７参照）。
【０１７０】
【表７】
2020508694.tif 000007
【０１７１】
［５−２］本発明に係る抗体のＥｒｂＢ２結合ＥＣ５０
本発明の５つの抗体の対応する精製ＩｇＧも、捕捉ＥＬＩＳＡによって組換えヒトＥｒｂｂ２に対する結合活性について評価した。手順を以下のように手短に記載する：９６ウェルプレートを０．５μｇ／ｍＬの抗ＥｒｂＢ２抗体で一晩コーティングし、３７℃で１時間、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡによってブロッキングした。１：５系列希釈で、２μｇ／ｍＬで開始するビオチン−ヒトＥｒｂＢ２−ＥＣＤの系列希釈試料を添加する。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：５０００）を各ウェルに添加する。３７℃でさらに４０分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢを添加して、室温で１５分間展開し、引き続いて５０μＬの１Ｎ  ＨＣｌでクエンチする。ＯＤ値について４５０ｎｍでプレートを読み取る。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用することによって結合ＥＣ５０を計算し、結果は以下の表８にある。
【０１７２】
【表８】
2020508694.tif 000008
【０１７３】
［５−３］様々な種に由来するＥｒｂＢ２に対する本発明に係る抗体の結合能力
実施例１に記載される間接ＥＬＩＳＡ法を使用して、マウス、ラット、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、カニクイザル（Ｍａｃａｃｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）およびヒトなどの様々な種に由来する組換えＥｒｂＢ２−ＥＣＤに対する本発明の抗体の結合活性を調査した。手短に言えば、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１００μＬ／ウェルで１μｇ／ｍＬの様々な種の組換えＥｒｂＢ２−ＥＣＤでコーティングし、４℃で一晩インキュベートする。濾紙上に穏やかに捨て、軽くたたくことによってコーティング溶液を除去する。２００μＬ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。本発明の精製抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ  １００μＬ／ウェルを添加し、３７℃で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１５分後に１００μＬ／ウェルのＴＭＢを添加し、５０μＬ／ウェルの１Ｎ  ＨＣｌを添加する。４５０ｎｍ波長でＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒを用いてプレートを読み取る。本発明の５つの抗体はアカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、カニクイザル（Ｍａｃａｃｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）に由来する組換えＥｒｂＢ２に交差反応性であるが、ラットおよびマウス対応物には交差反応性ではないことを示す結果を以下の表９に要約する。
【０１７４】
【表９】
2020508694.tif 000009
【０１７５】
［５−４］本発明に係る精製抗体のエピトープグループ分け
実施例３に記載される方法とは異なり、精製抗体のエピトープグループ分けを競合ＥＬＩＳＡ後の捕捉ＥＬＩＳＡによって評価した。＜１＞捕捉ＥＬＩＳＡを行って、ビオチン標識組換えＥｒｂＢ２−ＥＣＤの結合ＥＣ８０の濃度を決定した。手短に言えば、９６ウェルプレートを０．５μｇ／ｍＬの抗ＥｒｂＢ２抗体で一晩コーティングし、３７℃で１時間、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡによってブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：５０００）を各ウェルに添加する。３７℃でさらに４０分間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢを添加して、室温で１５分間展開させ、引き続いて５０μＬ  １Ｎ  ＨＣｌでクエンチする。ＯＤ値について４５０ｎｍでプレートを読み取って、各試験抗体に対するビオチン標識組換えＥｒｂＢ２−ＥＣＤのＥＣ８０濃度を得た；＜２＞競合ＥＬＩＳＡを行って、２つの抗体が別個のエピトープに結合するのか、同じエピトープに結合するのかを決定する。抗原に結合する２つの抗体の交差競合能力が高ければ高いほど、２つの抗体のエピトープがより同じになる（２つの試験抗体の別個のエピトープの可能性が少なくなる）。手短に言えば、上記と同じ手順後に９６ウェルプレートをコーティングした。ＥＣ８０の濃度のＥｒｂＢ２−ＥＣＤ−ビオチンと１０μｇ／ｍＬの試験抗体のプレインキュベート混合物をプレートに添加し、１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ−ストレプトアビジン（１：５０００）を各ウェルに添加する。３７℃でさらに４０分間インキュベートする。上記の捕捉ＥＬＩＳＡと同じ手順に従って、ＯＤ４５０値を得て、交差競合能力を計算する。交差競合能力が８０％以上である場合に、２つの抗体を同じエピトープに結合するとみなす。表１０に示すように、４Ｃ９、４Ｈ２、４Ｇ６、５Ｆ１２および５Ｇ９は互いに強力な交差競合性能力を示すが、ＥｒｂＢ２−ＥＣＤとの結合においてトラスツズマブともペルツズマブとも競合せず、本発明の抗体が同じエピトープまたは高度に重複するエピトープに結合するが、トラスツズマブエピトープともペルツズマブエピトープとも別個のエピトープに結合することを示す。
【０１７６】
【表１０】
2020508694.tif 000010
【０１７７】
［５−５］本発明に係る抗体のトラスツズマブ相乗生理活性
実施例４に記載される方法を使用することによって、本発明によって単離した精製抗体（４Ｃ９、４Ｈ２、４Ｇ６、５Ｆ１２および５Ｇ９）のトラスツズマブ相乗生理活性を、ＢＴ４７４細胞増殖阻害アッセイによって評価した。結果（図２Ａ〜図２Ｅおよび表１１参照）は、本発明の抗体が、細胞増殖の一定の阻害活性を示すが、トラスツズマブと組み合わせると強力な相乗阻害活性を示すことを実証した。トラスツズマブ＋本発明の抗体の細胞増殖阻害活性は、診療所で使用される公知の組み合わせであるトラスツズマブとペルツズマブの活性よりも高い。
【０１７８】
【表１１】
2020508694.tif 000011
【０１７９】
《実施例６》ＤＮＡクローニングおよび配列決定による抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体の可変領域タンパク質配列の演繹法
以下のプロトコルを使用して、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５５９６）を使用して、全ＲＮＡをハイブリドーマ細胞ペレットから抽出した。１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ試薬を添加して細胞（ＤＰＢＳ中で調製したおよそ１×１０７個細胞）を破壊し、室温で５分間インキュベートした。２００μＬのクロロホルムを添加する。１５秒間激しく振盪する。室温で３分間インキュベートする。４℃で１５分間、１２０００×ｇで遠心分する。水相を新たな１．５ｍＬ遠心管に移す。５００μＬのイソプロピルアルコールを添加する。室温で１０分間インキュベートする。４℃で１０分間、１２０００×ｇで遠心分離する。１ｍＬの７５％エタノールで洗浄する。４℃で５分間、７５００ｒｐｍで遠心分離する。１０分間風乾する。４０μＬのＤＥＰＣ処理水に再懸濁する。５５℃で１０分間インキュベートする。ＮａｎｏｄｒｏｐでＡ２６０を測定する。
【０１８０】
その後、以下のプロトコルに従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８０８０−４００）を使用して、２μｇの全ＲＮＡを使用して第１の鎖ｃＤＮＡを合成した：
【０１８１】
【表１２】
2020508694.tif 000012
【０１８２】
６５℃、５分間、サーマルサイクラーを用いてインキュベートし、次いで、直ちに氷上に２分間置く。以下を氷上チューブに添加する：１０μＬの２×Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘおよび２μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＲ  ＩＩＩ／ＲＮアーゼ  ＯＵＴ（商標）Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ。ボルテックスによって試料を混合し、引き続いて手短に遠心分離する。５０℃で５０分間インキュベートする。８５℃で５分間の反応を終了させる。氷上で冷却する。次いで、得られたｃＤＮＡを抗体の可変領域のＰＣＲ増幅用の鋳型として使用した。第１の鎖ｃＤＮＡ、マウスＩｇ−プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９８３１−３）からのプライマーおよびＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１３０４）を使用してＰＣＲを行った。重鎖可変領域を増幅するために、ＰＣＲ試料を以下の通りに組み立てた：２７μＬのＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ＋１μＬの逆方向プライマーＭｕＩｇＧ  ＶＨ３’−２＋１μＬのｃＤＮＡ＋１μＬのＭｕＩｇ−５’リーダープライマー。軽鎖可変領域を増幅するために、ＰＣＲ試料を以下の通りに組み立てた：２７μＬのＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒ  Ｍｉｘ＋０．２５μＬの逆方向プライマーＭｕＩｇＫ  ＶＬ３’−１＋１μＬのｃＤＮＡ＋１μＬのＭｕＩｇ−５’リーダープライマー。
【０１８３】
リーダープライマーＶＨ−Ａ、ＶＨ−Ｂ、ＶＬ−ＡおよびＶＬ−Ｂとの反応のために、以下のＰＣＲサイクルを使用する：工程１−９４℃で２分間変性；工程２−９４℃で３０秒間変性；工程３−５０℃で３０秒間アニーリング；工程４−７２℃で１分間伸長；工程２〜４を３５サイクル；工程５−７２℃で５分間、最後の伸長；工程６−４℃で永久的に冷却。
【０１８４】
リーダープライマーＶＨ−Ｃ〜ＶＨ−ＦおよびＶＬ−Ｃ〜ＶＬ−Ｇとの反応のために、以下のＰＣＲサイクルを使用する：工程１−９４℃で２分間変性；工程２−９４℃で３０秒間変性；工程３−６０℃で３０秒間アニーリング；工程４−７２℃で１分間伸長；工程２〜４を３５サイクル；工程５−７２℃で５分間、最後の伸長；工程６−４℃で永久的に冷却。
【０１８５】
ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル上に泳動させ、予想されるサイズ（４００〜５００ｂｐ）で移動するバンドをＤＮＡ抽出用に切り出した。以下のプロトコルに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２８７０４）を使用してＤＮＡを精製した：ゲル切片を秤量した。１容量のゲルに対して３倍容量の緩衝液ＱＧを各ゲル切片に添加した。ゲル切片が完全に溶解するまで、２〜３分毎に混合して、試料を５０℃で１０分間インキュベートした。次いで、１ゲル容量のイソプロパノールを各試料に添加し、混合した。次いで、試料をＱＩＡｑｕｉｃｋカラムにアプライし、１３０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。洗浄するために、７５０μＬの緩衝液ＰＥを試料に添加し、１３０００ｒｐｍで１分間スピンさせた。次いで、カラムを１３０００ｒｐｍでさらに１分間遠心分離して残留エタノールを完全に除去した。３０μＬのＨ２Ｏを各カラムに添加し、１３０００ｒｐｍで１分間スピンさせることによってＤＮＡを溶出した。次いで、精製ＰＣＲ産物を配列決定して可変領域配列を同定した（以下の表１３Ａおよび表１３Ｂ）。
【０１８６】
【表１３Ａ】
2020508694.tif 000013
【０１８７】
【表１３Ｂ】
2020508694.tif 000014
【０１８８】
《実施例７》キメラ抗体の作製および特性評価
抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体（上記の表１３Ａおよび表１３Ｂ）の重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれヒトＩｇＧ１重鎖およびκ軽鎖定常領域にインフレームでクローニングした。得られたキメラ抗体の活性を捕捉ＥＬＩＳＡアッセイ（以下の表１４）で確認したら、その親マウスモノクローナル抗体に匹敵していた。
【０１８９】
【表１４】
2020508694.tif 000015
【０１９０】
実施例５に記載されるのと同じ方法に従って、マウス、ラット、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  Ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉ）およびヒトなどの様々な種に由来する組換えＥｒｂＢ２−ＥＣＤとの結合について本発明のキメラ抗体の結合活性を調査した。結果を以下の表１５に示した。
【０１９１】
【表１５】
2020508694.tif 000016
【０１９２】
キメラ抗体のトラスツズマブ相乗生理活性の確認
実施例５に記載されるのと同じ手順に従って、ＢＴ４７４乳癌細胞の細胞増殖を阻害するトラスツズマブ相乗効力について、対応するキメラ抗体を評価した。結果を表１６に要約する。
【０１９３】
【表１６】
2020508694.tif 000017
【０１９４】
《実施例８》抗ＥｒｂＢ２マウスモノクローナル抗体５Ｆ１２のヒト化
５Ｆ１２マウス抗ＥｒｂＢ２抗体（上記の表１３Ａおよび表１３Ｂ）をヒト化した。ヒト化変異体アミノ酸配列ＶＨ．ｖ１、ＶＨ．１、ＶＨ．２、ＶＨ．３、ＶＨ．４、ＶＬ．ｖ１、ＶＬ．１、ＶＬ．２、ＶＬ．３、ＶＬ．４、ＶＬ．５、ＶＬ．６（以下の表１７Ａおよび表１７Ｂ）を、最も相同性の高いヒト生殖系列に基づいてＤＮＡ配列に変換し、合成した。重鎖変異体については、ヒト生殖系列重鎖アクセプター配列ｈＩＧＨＶ１−４６  ＦＲ１、ｈＩＧＨＶ１−４６  ＦＲ２、ｈＩＧＨＶ１−４６  ＦＲ３およびｈＩＧＨＪ４  ＦＲ４を使用した（上記の表２参照）。軽鎖変異体ＶＬ．１、ＶＬ．１ａおよびＶＬ．１ｂについては、ヒト生殖系列軽鎖アクセプター配列ｈＩＧＫＶ１−３３  ＦＲ１、ｈＩＧＫＶ１−３３  ＦＲ２、ｈＩＧＫＶ１−３３  ＦＲ３およびｈＩＧＫＪ１  ＦＲ４を使用した（上記の表３参照）。個々の構築物を配列検証して正確性をチェックした。次いで、陽性変異体を２５０ｍｉｓ  Ｌｕｒｉａブロス＋アンピシリンに接種し、３７℃で一晩培養した。Ｑｉａｇｅｎ  ｍａｘｉ  ｐｒｅｐキットを使用して、変異体培養物からＤＮＡを抽出した。
【０１９５】
【表１７Ａ】
2020508694.tif 000018
【０１９６】
【表１７Ｂ】
2020508694.tif 000019
【０１９７】
合計３５個の変異体について、ＶＨ．ｖ１、ＶＨ．１、ＶＨ．２、ＶＨ．３またはＶＨ．４の各重鎖変異体をＶＬ．ｖ１、ＶＬ．１、ＶＬ．２、ＶＬ．３、ＶＬ．４、ＶＬ．５およびＶＬ．６の各軽鎖変異体と組み合わせることによって、ヒト化抗体を作製した（以下の表１８）。
【０１９８】
【表１８】
2020508694.tif 000020
【０１９９】
中でも、最小逆突然変異を有する１１個の変異体を抗体産生および精製のために選択し、捕捉ＥＬＩＳＡによってそのＥｒｂＢ２結合ＥＣ５０について評価した。結果（以下の表１９参照）は、１個を除く１１個の変異体が５Ｆ１２キメラ抗体と比較して同等のＥｒｂＢ２結合ＥＣ５０を示すことを示している。
【０２００】
【表１９】
2020508694.tif 000021
【０２０１】
《実施例９》抗ＥｒｂＢ２マウスモノクローナル抗体５Ｇ９のヒト化
５Ｇ９マウス抗ＥｒｂＢ２抗体（上記の表１３Ａおよび表１３Ｂ）をヒト化した。ヒト化変異体アミノ酸配列ＶＨ．ｖ１、ＶＨ．１、ＶＨ．２、ＶＨ．３、ＶＨ．４、ＶＬ．ｖ１、ＶＬ．１、ＶＬ．２、ＶＬ．３、ＶＬ．４、ＶＬ．５、ＶＬ．６（以下の表２０Ａおよび表２０Ｂ）を、最も相同性の高いヒト生殖系列に基づいてＤＮＡ配列に変換し、合成した。重鎖変異体については、ヒト生殖系列重鎖アクセプター配列ｈＩＧＨＶ１−６９  ＦＲ１、ｈＩＧＨＶ１−６９  ＦＲ２、ｈＩＧＨＶ１−６９  ＦＲ３およびｈＩＧＨＪ１  ＦＲ４を使用した（上記の表２参照）。軽鎖変異体ＶＬ．ｖ１、ＶＬ．１、ＶＬ．２、ＶＬ．３、ＶＬ．４、ＶＬ．５、ＶＬ．６については、ヒト生殖系列軽鎖アクセプター配列ｈＩＧＫＶ１−２７  ＦＲ１、ｈＩＧＫＶ１−２７  ＦＲ２、ｈＩＧＫＶ１−２７  ＦＲ３およびｈＩＧＫＪ１  ＦＲ４を使用した（上記の表３参照）。個々の構築物を配列検証して正確性をチェックした。次いで、陽性変異体を２５０ｍＬ  Ｌｕｒｉａブロス＋アンピシリンに接種し、３７℃で一晩培養した。Ｑｉａｇｅｎ  ｍａｘｉ  ｐｒｅｐキットを使用して、変異体培養物からＤＮＡを抽出した。
【０２０２】
【表２０Ａ】
2020508694.tif 000022
【０２０３】
【表２０Ｂ】
2020508694.tif 000023
【０２０４】
合計４２個の変異体について、ＶＨ．ｖ１、ＶＨ．１、ＶＨ．２、ＶＨ．３、ＶＨ．４およびＶＨ５の各重鎖変異体をＶＬ．ｖ１、ＶＬ．１、ＶＬ．２、ＶＬ．３、ＶＬ．４、ＶＬ．５およびＶＬ．６の各軽鎖変異体と組み合わせることによって、ヒト化抗体を作製した（以下の表２１）。
【０２０５】
【表２１】
2020508694.tif 000024
【０２０６】
中でも、最小逆突然変異を有する１２個の変異体を抗体産生および精製のために選択し、捕捉ＥＬＩＳＡによってそのＥｒｂＢ２結合ＥＣ５０について評価した。結果（以下の表２２参照）は、６／１２個の変異体が５Ｇ９キメラ抗体と比較して低いＥｒｂＢ２結合ＥＣ５０を示すことを示している。
【０２０７】
【表２２】
2020508694.tif 000025
【０２０８】
《実施例１０》ＢＴ４７４異種移植片モデルにおける抗ＥｒｂＢ２抗体混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ＢＴ４７４乳癌異種移植片腫瘍モデルのｉｎ  ｖｉｖｏ試験を、契約番号Ｅ０６２７−Ｔ１４０１でＣｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって商業的に行った。本試験は、（ａ）トラスツズマブ単独での処置；（ｂ）トラスツズマブと本発明によって単離された抗体のいずれか１つの組み合わせ；（ｃ）トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせの抗腫瘍活性を調査した。
【０２０９】
雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス、６〜８週齢；体重１７．７〜２６．０ｇ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  ＨＦＫ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．中国）を、１２時間明／１２時間暗の日周期、室温２１．９〜２３．８℃、湿度４０〜４５％で、特定病原体除去条件下で維持する。到着後、動物を、動物施設の隔離部分に１週間収容して、新たな環境に観察のために馴らす。定期的に連続的な健康モニタリングを行う。規定食餌（放射性同位体６０Ｃｏによって照射）および水を自由に与える。
【０２１０】
ヒト乳癌細胞株ＢＴ４７４を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで培養した。細胞増殖が対数期段階に到達したら、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、その後、適切な濃度に希釈した。再構成基底膜（Ｍａｔｒｉｇｅｌ；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ．）と１：１容量比で混合した後、細胞（１×１０７個細胞／マウス）をマウス乳腺パッドに接種した。移植した腫瘍の容量が約１５１ｍｍ３に到達したら、マウスを、（ａ）１群：ＰＢＳ（ビヒクル対照）；（ｂ）２群：ＰＣ（トラスツズマブ単独、３ｍｇ／ｋｇ）；（ｃ）３群：トラスツズマブ＋４Ｃ９の組み合わせ（１．５ｍｇ／ｋｇ＋１．５ｍｇ／ｋｇ）；（ｄ）４群：トラスツズマブ＋４Ｈ２の組み合わせ（１．５ｍｇ／ｋｇ＋１．５ｍｇ／ｋｇ）；（ｅ）５群：トラスツズマブ＋４Ｇ６の組み合わせ（１．５ｍｇ／ｋｇ＋１．５ｍｇ／ｋｇ）；（ｆ）６群：トラスツズマブ＋５Ｆ１２の組み合わせ（１．５ｍｇ／ｋｇ＋１．５ｍｇ／ｋｇ）；（ｇ）７群：トラスツズマブ＋５Ｇ９の組み合わせ（１．５ｍｇ／ｋｇ＋１．５ｍｇ／ｋｇ）；（ｈ）８群：トラスツズマブ＋ペルツズマブの組み合わせ（１．５ｍｇ／ｋｇ＋１．５ｍｇ／ｋｇ）を含む８つの群（６匹のマウス／群）にランダムに分けた。マウスを最初の２週間は１週間に１回処置し、引き続いて後の２週間は１週間に２回処置し、合計７回投与した。試験抗体は尾静脈注射によって投与した。
【０２１１】
この試験では、ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズが処置開始後３２日目で１０６４ｍｍ３に到達した。ＰＣ群処置（トラスツズマブ単独、３ｍｇ／ｋｇ）は、残留抗腫瘍活性を示し、３２日目で９６５ｍｍ３の平均腫瘍量が得られ、Ｔ／Ｃ値９５％で、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して小さいが、有意な差は観察されず（Ｐ＝０．２４）、トラスツズマブが３ｍｇ／ｋｇの低投与量で抗腫瘍活性をほとんど有さないことを示した。逆に、同じ投与スケジュール下で、トラスツズマブと本発明によって単離された抗体のいずれか１つまたはペルツズマブの組み合わせは、ビヒクル対照と比較して中等度〜有意に強力な抗腫瘍活性を示す。好ましくは、同じ投与処置下で、トラスツズマブ＋５Ｆ１２またはトラスツズマブ＋５Ｇ９の組み合わせが、Ｔ／Ｃ値４７％または５３％（それぞれｐ＜０．０３またはｐ＜０．００１）で腫瘍増殖を阻害し、５Ｆ１２または５Ｇ９がトラスツズマブ処置の抗腫瘍有効性を有意に増強することができることを実証している。より好ましくは、５Ｆ１２および５Ｇ９は、診療所で現在使用されている公知の薬物であるペルツズマブよりも有意に高いトラスツズマブ媒介抗腫瘍有効性に対する相乗活性を実証した（それぞれｐ＜０．０７およびｐ＜０．００６）。トラスツズマブ＋本発明によって単離された抗体の組み合わせの抗腫瘍有効性の結果を図３Ａ〜図３Ｂおよび表２３に示した。
【０２１２】
【表２３】
2020508694.tif 000026
【０２１３】
《実施例１１》ＮＣＩ−Ｎ８７胃モデルにおける抗ＥｒｂＢ２抗体混合物のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性（５Ｇ９、５Ｆ１２）
ＮＣＩ−Ｎ８７異種移植片モデルを使用して、トラスツズマブと組み合わせた本発明の抗体の相乗有効性をさらに評価した。この試験の手順を以下のように手短に要約する：＜１＞ＮＣＩ−Ｎ８７細胞を対数期に培養し、回収した；＜２＞ＮＣＩ−Ｎ８７細胞をＰＢＳに再懸濁し、細胞密度を８×１０７個細胞／ｍＬに調節し、その後、１００μＬまたは８×１０７個細胞を胸腺欠損ヌード雌マウスの左側腹領域に皮下注射した；＜３＞マウスを群にランダム化する前に、腫瘍をおよそ１００〜２００ｍｍ３のサイズに増殖させた；＜４＞動物に、１週間に２回、指示される用量で抗体の腹腔内投与を受けさせ、腫瘍サイズならびに体重を１週間に２回測定した。腫瘍量（ＴＶ）を、式ＴＶ＝１／２×ａ×ｂ２（式中、「ａ」は大きい腫瘍直径を表し、「ｂ２」は最も小さい腫瘍直径を表す）を使用して計算した。
【０２１４】
ＮＣＩ−Ｎ８７腫瘍増殖に対するトラスツズマブと５Ｇ９、５Ｆ１２またはペルツズマブの組み合わせのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の試験設計を表２４に示す。この試験の段階１は、様々な投与量（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび１５ｍｇ／ｋｇ）での５Ｇ９、５Ｅ１２およびこれらのトラスツズマブとの組み合わせの有効性を評価することを目的とする。この試験の段階２は、２つの側面に特に焦点を当てている：＜１＞２６日目から開始し、低投与量（５ｍｇ／ｋｇ）での５Ｇ９および５Ｆ１２の単一処置へのトラスツズマブ（５ｍｇ／ｋｇ）の追加が、トラスツズマブ高投与量群（１５ｍｇ／ｋｇ）と比較して相乗有効性を再構成することができるかどうか。＜２＞２６日目から開始し、さらなる処置なしで同じ投与量（５ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇ）下で、トラスツズマブと５Ｇ９または５Ｅ１２の組み合わせが、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせと比較してその抗腫瘍有効性を維持することができるかどうか。
【０２１５】
【表２４】
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【０２１６】
この試験の段階１の結果を表２５に要約する。試験結果を以下のように要約する：＜１＞５ｍｇ／ｋｇ投与量でのトラスツズマブ処置は強力な抗腫瘍活性を示し、２２日目で２２７ｍｍ３の平均腫瘍サイズが得られ、ＴＧＩ値（すなわち、ＴＧＩ＝（１−平均処置腫瘍量／平均対照腫瘍量）×１００％）が４３．５９％であり、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して統計学的に有意な差が観察された（２群対１群、Ｐ＜０．０１）。しかしながら、トラスツズマブ処置の３倍増加（１５ｍｇ／ｋｇ）は、その有効性を有意には増強することができず（３群対２群、Ｐ＞０．０５）、トラスツズマブの抗腫瘍有効性が、５ｍｇ／ｋｇなどの一定投与量に到達した後は改善されないことを実証している；＜２＞しかしながら、より低い投与量（５ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇ）でのトラスツズマブと５Ｇ９または５Ｆ１２の組み合わせは、高投与量（１５ｍｇ／ｋｇ）での５Ｇ９、５Ｆ１２またはトラスツズマブの単一処置よりもはるかに高い抗腫瘍有効性を示す。腫瘍量に関して、２２日目で、組み合わせ処置（８、１０群）と単一処置（５、７および３群）との間で大いに有意な差が観察され（８または１０群対５、７または３群、Ｐ＜０．０１）、トラスツズマブと５Ｇ９または５Ｆ１２の組み合わせが強力な相乗抗腫瘍有効性を示すという証拠を提供している；＜３＞同じ投与量処置（５ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ）下では、トラスツズマブと５Ｇ９の組み合わせは、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせよりもはるかに高い抗腫瘍活性を示し、２２日目で平均腫瘍サイズ８．７５ｍｍ３または７．２３ｍｍ３が得られ、ＴＧＩ値が９８．３１％または９８．６１％であった。トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ対照群と比較して、大いに有意な差が観察された（２２日目で４６．８３ｍｍ３または２１．４１ｍｍ３、ＴＧＩ値９０．９７％または９５．８７％、Ｐ＜０．０５またはＰ＜０．０１）。これらの結果は、ペルツズマブとは異なり、５Ｇ９が、トラスツズマブと組み合わせた場合に特有の相乗活性を有することを示している；＜３＞同じ投与量処置（１５＋１５ｍｇ／ｋｇ）下で、トラスツズマブと５Ｇ１２の組み合わせは、トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせよりも大いに高い抗腫瘍活性を示し、２２日目で平均腫瘍サイズ１．４５ｍｍ３が得られ、ＴＧＩ値が９９．７２％であった。トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ対照群と比較すると、大いに有意な差が観察された（２２日目で２１．４１ｍｍ３、ＴＧＩ値９５．８７％、Ｐ＜０．０１）。この結果は、ペルツズマブと異なり、５Ｆ１２が、トラスツズマブと組み合わせた場合に特有の相乗活性を有することを実証している。
【０２１７】
【表２５】
2020508694.tif 000028
【０２１８】
５Ｇ９または５Ｆ１２の既存の単一処置にトラスツズマブを加えることによって相乗有効性が再構成されるかどうかを調査するために、５Ｇ９（５ｍｇ／ｋｇ）または５Ｆ１２（５ｍｇ／ｋｇ）の単一処置を、段階１試験後〜段階２の最後に５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ投与量とさらに組み合わせた。表２６に示すように、５ｍｇ／ｋｇ投与量の５Ｇ９または５Ｆ１２の単一処置は１５ｍｇ／ｋｇ投与量のトラスツズマブの処置よりも有意に低い抗腫瘍活性を示し、それぞれ２６日目で平均腫瘍サイズ４２４．５７ｍｍ３または３８６．９２ｍｍ３であり、ＴＧＩ値が５４．２３％または２５．４１％であった一方、１５ｍｇ／ｋｇ投与量でのトラスツズマブ処置は２６日目で平均腫瘍サイズ１９０．７５ｍｍ３であり、ＴＧＩ値が６３．２３％であった（４または６群対３群、Ｐ＝０．００３＜０．０１またはＰ＝０．０１２＜０．０５）。しかしながら、２６日目から開始して５ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇ投与量でさえ、５Ｇ９または５Ｆ１２の単一処置にトラスツズマブを加えると、併用処置は、トラスツズマブ高用量単独処置の有効性に追いつく相乗抗腫瘍有効性を再構成することができ、５７日目で最終腫瘍平均サイズ１３０５．１１ｍｍ３または８７９．９ｍｍ３が得られ、ＴＧＩ値が３９．１１％または５８．９５％となり、５７日目で平均腫瘍サイズ８８８．５７ｍｍ３でＴＧＩ値が５８．５５％である１５ｍｇ／ｋｇ投与量でのトラスツズマブ処置との統計学的に有意な差はない（４または６群対３群、それぞれＰ＝０．１６５＞０．０５またはＰ＝０．４９１＞０．０５）。同様に、５ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇ投与量での５Ｇ９＋トラスツズマブまたは５Ｆ１２＋トラスツズマブの併用処置の腫瘍量進行速度は、１５ｍｇ／ｋｇの高投与量でのトラスツズマブ処置の腫瘍量進行速度よりもはるかに低く、トラスツズマブ単独処置について２９２．９２％に対して、５Ｇ９／トラスツズマブ組み合わせまたは５Ｆ１２／トラスツズマブ組み合わせについて１９２．６０％または１３０．９７％が得られた一方、５ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇ投与量での５Ｇ９＋トラスツズマブまたは５Ｆ１２＋トラスツズマブの併用処置のＴＧＩの進行速度は、１５ｍｇ／ｋｇの高投与量でのトラスツズマブ処置の進行速度よりもはるかに高く、トラスツズマブ単独処置について−７．７１に対して５Ｇ９／トラスツズマブ組み合わせまたは５Ｆ１２／トラスツズマブ組み合わせについて３９．９３％または５３．５２％が得られる。まとめると、結果は、５Ｇ９または５Ｆ１２とトラスツズマブの組み合わせが強力な相乗抗腫瘍有効性を示すことを示している。
【０２１９】
【表２６】
2020508694.tif 000029
【０２２０】
トラスツズマブと５Ｇ９または５Ｅ１２の組み合わせがトラスツズマブ／ペルツズマブ組み合わせよりも優れた抗腫瘍有効性を維持することができるかどうかを調査するために、全３つの組み合わせ（トラスツズマブ／５Ｇ９、トラスツズマブ／５Ｆ１２およびトラスツズマブ／ペルツズマブ）の高投与量処置が２２日目までに腫瘍のほぼ完全な除去をもたらしたので、より低投与量（５ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇ）処置をこの評価に使用した。表２７に示すように、処置を停止した後、トラスツズマブ／５Ｇ９群またはトラスツズマブ／５Ｆ１２群のいずれの腫瘍進行も極めて遅く、腫瘍進行速度はトラスツズマブ／５Ｇ９群またはトラスツズマブ／５Ｆ１２群についてそれぞれ９３．５５％または１２５．８１％であるが、トラスツズマブ／ペルツズマブ群については３５１．８５％である。５７日目に対する２６日目の腫瘍量に関して、トラスツズマブ／５Ｇ９群（Ｐ＝０．２７８＞０．０５）についてもトラスツズマブ／５Ｆ１２群（Ｐ＝０．０６４＞０．０５）についても統計学的に有意な差は観察されなかった。対照的に、５７日目に対する２６日目の腫瘍量に関して、トラスツズマブ／ペルツズマブ処置群については統計学的に有意な差が観察された（Ｐ＝０．０３＜０．０５）。さらに、トラスツズマブ／５Ｇ９群またはトラスツズマブ／５Ｆ１２群のＴＧＩは２６日目と５７日目の間で高度に維持されたが、トラスツズマブ／ペルツズマブ群ではわずかに減少した。まとめると、これらの結果は、トラスツズマブ／５Ｇ９またはトラスツズマブ／５Ｆ１２の併用処置がトラスツズマブ／ペルツズマブ群よりも有意に優れた有効性を有することを示している。
【０２２１】
【表２７】
2020508694.tif 000030
【０２２２】
《実施例１２》本発明の抗体およびその組み合わせの細胞ベース内部移行速度
その内部移行速度に対する二抗体組み合わせの相乗効果を調査するために、細胞ベースエンドサイトーシスアッセイを行った。手短な手順は以下の通りである：＜１＞ＳＫＢＲ３細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、３７℃で約２分間、トリプシンで消化した。細胞を冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、３×１０６個細胞／ｍＬに調節した；＜２＞１ｍＬの細胞懸濁液をＦＡＣＳ管に添加し、ここに最終濃度２μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲートまたはＡＰＣコンジュゲート抗体（トラスツズマブ、またはペルツズマブ、または本発明の抗体）またはその組み合わせを添加した。細胞を氷上で１時間インキュベートした。次いで、細胞を１０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離し、上清をデカントした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。２×２００μＬの細胞懸濁液をそれぞれ０分で対照および試料として取った。細胞の残りを１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を除去した；＜３＞細胞を培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ＰＳ）に再懸濁し、内部移行のために３７℃でインキュベートした。次いで、２００μＬの試料を３０分および２時間でそれぞれ取った。試料を氷上で５分間冷却し、１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を除去し、次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した；＜４＞２５０μＬのストリップ緩衝液を細胞に添加し、室温で７分間インキュベートした。次いで、細胞を１０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した；＜５＞２００μＬの固定緩衝液を細胞に添加し、４℃で少なくとも３０分間インキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメーターによって分析した；＜６＞工程２で取った０分での対照および試料について、一方を固定緩衝液で直接固定し（工程５）、もう一方を工程４および工程５で処理した（ストリップ緩衝液および固定緩衝液を使用）；＜７＞抗体または抗体組み合わせの内部移行速度を以下のように計算した：平均変化率＝［内部移行群（ＭＦＩ−ＭＦＩブランク）］／［結合親和性群（ＭＦＩ−ＭＦＩブランク）］。
【０２２３】
表２８に示すように、全ての試験抗体（トラスツズマブ、ペルツズマブ、４Ｃ９、４Ｈ２、４Ｇ６、５Ｆ１２および４Ｇ９）がＳＫＢＲ３細胞で抗原−抗体内部移行現象を示す。トラスツズマブおよびペルツズマブとは異なり、本発明の各個々の抗体（４Ｃ９、４Ｈ２、４Ｇ６、５Ｆ１２および４Ｇ９）がトラスツズマブまたはペルツズマブよりもはるかに高い内部移行速度を示す。中でも、４Ｃ９および５Ｆ１２がトラスツズマブよりも大いに有意に高い内部移行速度を示し（Ｐ＜０．０５）、本発明の抗体（特に、４Ｃ９、５Ｆ１２および４Ｇ９）が抗体薬物コンジュゲート用途のためのより優れた候補となることができることを支持している。
【０２２４】
【表２８】
2020508694.tif 000031
【０２２５】
表２９に示すように、本発明の抗体と組み合わせると、トラスツズマブの内部移行速度はトラスツズマブ単独よりも大いに有意に高くなり（Ｐ＜０．０１）、本発明の抗体がトラスツズマブの内部移行速度を有意に増強することができ、結果としてトラスツズマブ−薬物コンジュゲート（すなわち、Ｔ−ＤＭ１）の処置の有効性を改善することができることを実証している。
【０２２６】
【表２９】
2020508694.tif 000032
【０２２７】
《実施例１３》ＰＤＸ  ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ耐性胃モデル−ＨＵＰＲＩＭＥ（登録商標）胃癌異種移植片モデルにおける抗ＥｒｂＢ２抗体組み合わせのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｉｎｃ．の確立され、検証されたＰＤＸモデルとして、６９歳女性アジア人患者由来のＨＵＰＲＩＭＥ（登録商標）胃癌異種移植片モデルＧＡ００６０をこの有効性試験に選択する。Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスにおけるＨＵＰＲＩＭＥ（登録商標）胃癌異種移植片モデルＧＡ００６０の処置での抗ＥｒｂＢ２抗体組み合わせのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験を、契約番号Ｅ０６２７−Ｔ１５０１／Ｔ１５０２で、Ｃｒｏｗｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｉｊｉｎｇ）によって行った。手短に言えば、選択された原発ヒト胃癌組織を接種したストックマウスからの腫瘍断片を採取し、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスへの接種に使用した。各マウスに、腫瘍発達のために、原発ヒト胃癌モデルＧＡ００６０断片（Ｐ７、直径２〜４ｍｍ）を右側腹部に皮下接種した。平均腫瘍サイズが約２００ｍｍ３に到達したら、処置を開始した。マウスを、１群当たり６匹で、その腫瘍サイズに従って、１２の実験群にランダムに割り当てた。その日を０日目として示した。試験物を、以下の表３０に示される所定のレジメンに従って、０日目〜２８日目に腫瘍保有マウスに投与した。
【０２２８】
【表３０】
2020508694.tif 000033
【０２２９】
この試験の結果を表３１および図４Ａ〜図４Ｂに要約する。ビヒクル処置マウスの平均腫瘍サイズは、処置開始後３５日目で１２０１．１ｍｍ３に到達した。同じ試験下で、＜１＞トラスツズマブ単独処置は微量の抗腫瘍活性を示し、３５日目で平均腫瘍サイズ９３２．７ｍｍ３が得られ、Ｔ／Ｃ値が７７．７％であり、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して、有意な差は観察されなかった（Ｐ＝０．１６１＞０．０５）；＜２＞トラスツズマブとペルツズマブの組み合わせ処置は、トラスツズマブ単独処置と比較してさらに少ない抗腫瘍有効性を示し、３５日目で平均腫瘍サイズ９９４．６ｍｍ３が得られ、Ｔ／Ｃ値が８２．８％であり、ビヒクル対照と比較して、有意な差は観察されなかった（Ｐ＝０．２１７＞０．０５）；＜３＞トラスツズマブと５Ｆ１２の組み合わせ処置は、トラスツズマブ単独処置よりも強力な有効性を示し、３５日目で平均腫瘍サイズ６９１．６ｍｍ３が得られ、Ｔ／Ｃ値が５７．６％であり、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して、大いに有意な差が観察された（Ｐ＝０．００４＜０．０１）；＜４＞トラスツズマブと５Ｇ９の組み合わせ処置は、トラスツズマブ単独処置よりも強力な有効性を示し、３５日目で平均腫瘍サイズ６０８．８ｍｍ３が得られ、Ｔ／Ｃ値が５０．７％であり、腫瘍量に関して、ビヒクル対照と比較して、大いに有意な差が観察された（Ｐ＝０．００４＜０．０１）。
【０２３０】
【表３１】
2020508694.tif 000034
【０２３１】
本明細書に引用される全ての文献、本、マニュアル、論文、特許、公開された特許出願、手引き、抄録および／または他の参考文献は、全体が参照により組み込まれる。本発明の他の実施形態は、明細書の検討および本明細書に開示される本発明の実施から当業者に明らかとなる。本発明の真の範囲および精神は以下の特許請求の範囲によって示されており、明細書および実施例は単なる例示とみなされるべきであることを意図している。
【０２３２】
【表３２Ａ】
2020508694.tif 000035
【０２３３】
【表３２Ｂ】
2020508694.tif 000036
【０２３４】
【表３２Ｃ】
2020508694.tif 000037
【０２３５】
【表３２Ｄ】
2020508694.tif 000038
【０２３６】
【表３２Ｅ】
2020508694.tif 000039
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体チロシンプロテインキナーゼＥｒｂＢ−２（ＥｒｂＢ２）に特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントを含む結合タンパク質であって、前記抗体または前記抗原結合フラグメントがＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含み、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３は、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）のいずれかである、前記結合タンパク質；
（ａ）それぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の残基３１?３５を含有し、ＣＤＲ−Ｈ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の残基５０?６６を含有し、ＣＤＲ−Ｈ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５の残基９９?１０６を含有し、ＣＤＲ−Ｌ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６の残基２４?３４を含有し、ＣＤＲ−Ｌ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６の残基５０?５６を含有し、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６の残基８９?９７を含有する；
（ｂ）それぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の残基３１?３５を含有し、ＣＤＲ−Ｈ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の残基５０?６６を含有し、ＣＤＲ−Ｈ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３の残基９９?１０６を含有し、ＣＤＲ−Ｌ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４の残基２４?３４を含有し、ＣＤＲ−Ｌ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４の残基５０?５６を含有し、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４の残基８９?９７を含有する；
（ｃ）それぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の残基３１?３５を含有し、ＣＤＲ−Ｈ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の残基５０?６６を含有し、ＣＤＲ−Ｈ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７の残基９９?１０６を含有し、ＣＤＲ−Ｌ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の残基２４?３４を含有し、ＣＤＲ−Ｌ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の残基５０?５６を含有し、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８の残基８９?９７を含有する；
（ｄ）それぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の残基３１?３５を含有し、ＣＤＲ−Ｈ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の残基５０?６６を含有し、ＣＤＲ−Ｈ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の残基９９?１０６を含有し、ＣＤＲ−Ｌ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の残基２４?３４を含有し、ＣＤＲ−Ｌ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の残基５０?５６を含有し、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０の残基８９?９７を含有する；
（ｅ）それぞれ、ＣＤＲ−Ｈ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の残基３１?３５を含有し、ＣＤＲ−Ｈ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の残基５０?６６を含有し、ＣＤＲ−Ｈ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１の残基９９?１０６を含有し、ＣＤＲ−Ｌ１がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の残基２４?３４を含有し、ＣＤＲ−Ｌ２がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の残基５０?５６を含有し、かつ、ＣＤＲ−Ｌ３がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２の残基８９?９７を含有する。
【請求項２】
請求項１に記載の結合タンパク質であって、前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、配列番号１７〜５１からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる少なくとも１つの可変領域を含む、前記結合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の結合タンパク質であって、前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、配列番号１７および１８；配列番号１９および２０；配列番号２１および２２；配列番号２３および２４；配列番号２５および２６；配列番号２７および３２；配列番号２７および３３；配列番号２７および３４；配列番号２７および３５；配列番号２７および３６；配列番号２７および３７；配列番号２７および３８；配列番号２８および３２；配列番号２８および３３；配列番号２８および３４；配列番号２８および３５；配列番号２８および３６；配列番号２８および３７；配列番号２８および３８；配列番号２９および３２；配列番号２９および３３；配列番号２９および３４；配列番号２９および３５；配列番号２９および３６；配列番号２９および３７；配列番号２９および３８；配列番号３０および３２；配列番号３０および３３；配列番号３０および３４；配列番号３０および３５；配列番号３０および３６；配列番号３０および３７；配列番号３０および３８；配列番号３１および３２；配列番号３１および３３；配列番号３１および３４；配列番号３１および３５；配列番号３１および３６；配列番号３１および３７；配列番号３１および３８；配列番号３９および４５；配列番号３９および４６；配列番号３９および４７；配列番号３９および４８；配列番号３９および４９；配列番号３９および５０；配列番号３９および５１；配列番号４０および４５；配列番号４０および４６；配列番号４０および４７；配列番号４０および４８；配列番号４０および４９；配列番号４０および５０；配列番号４０および５１；配列番号４１および４５；配列番号４１および４６；配列番号４１および４７；配列番号４１および４８；配列番号４１および４９；配列番号４１および５０；配列番号４１および５１；配列番号４２および４５；配列番号４２および４６；配列番号４２および４７；配列番号４２および４８；配列番号４２および４９；配列番号４２および５０；配列番号４２および５１；配列番号４３および４５；配列番号４３および４６；配列番号４３および４７；配列番号４３および４８；配列番号４３および４９；配列番号４３および５０；配列番号４３および５１；配列番号４４および４５；配列番号４４および４６；配列番号４４および４７；配列番号４４および４８；配列番号４４および４９；配列番号４４および５０；および配列番号４４および５１からなる群から選択される２つの可変領域を含む、前記結合タンパク質。
【請求項４】
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の結合タンパク質であって、前記抗体または前記抗原結合フラグメントが、マウスモノクローナル抗体、マウス抗体由来抗原結合フラグメント、キメラ抗体、キメラ抗原結合フラグメント、ヒト化抗体およびヒト化抗原結合フラグメントからなる群から選択される抗体または抗原結合フラグメントである、前記結合タンパク質。
【請求項５】
請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の結合タンパク質であって、ｉ）ＥｒｂＢ２媒介生理活性を調節する；ｉｉ）ＥｒｂＢ２陽性細胞と接触すると前記細胞に内部移行される；ｉｉｉ）ＥｒｂＢ２陽性細胞の増殖を阻害する；および／または、ｉｖ）ＥｒｂＢ２陽性腫瘍およびトラスツズマブ耐性腫瘍の増殖をトラスツズマブと相乗的に阻害する、前記結合タンパク質。
【請求項６】
請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の結合タンパク質であって、単独で、または、トラスツズマブと組み合わせて、ＥｒｂＢ２陽性腫瘍およびトラスツズマブ耐性腫瘍の増殖を少なくとも７０％阻害する、前記結合タンパク質。
【請求項７】
請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の結合タンパク質と、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常領域と、薬剤とを含む結合タンパク質コンジュゲートであって、前記薬剤がイメージング剤、治療薬、細胞傷害剤および免疫付着分子からなる群から選択される、結合タンパク質コンジュゲート。
【請求項８】
請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
ｉ）請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項７に記載のの結合タンパク質コンジュゲート、請求項８のポリヌクレオチドまたは請求項９に記載のベクターの、治療上有効量と、ｉｉ）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物であって、ＥｒｂＢ２活性が有害である障害を治療するための少なくとも１つの追加の薬剤をさらに含む、前記医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも１つの追加の薬剤が、治療薬；イメージング剤；抗新生物薬；化学療法薬；血管新生阻害剤；抗ＶＥＧＦ抗体；抗ＥＧＦＲ抗体；抗ｃ−Ｍｅｔ抗体；抗ＥｒｂＢ３抗体；抗ＥｒｂＢ２抗体；抗ＣＤ２０抗体；アフリベルセプト；キナーゼ阻害剤；同時刺激分子遮断薬；抗Ｂ７．２抗体；ＣＴＬＡ４−Ｉｇ；接着分子遮断薬；抗Ｅセレクチン抗体；抗Ｌセレクチン抗体；抗サイトカイン抗体またはその機能的フラグメント；抗ＩＬ−１８抗体；抗ＴＮＦ抗体；抗ＩＬ−６抗体；メトトレキサート；コルチコステロイド；シクロスポリン；ラパマイシン；ＦＫ５０６；ＤＮＡアルキル化剤；シスプラチン；カルボプラチン；抗チューブリン剤；パクリタキセル；ドセタキセル；ドキソルビシン；ゲムシタビン；ジェムザール；アントラサイクリン；アドリアマイシン；トポイソメラーゼＩ阻害剤；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；ロイコボリン；イリノテカン；受容体チロシンキナーゼ阻害剤、アポトーシス阻害剤；Ｂｃｌ２／Ｂｃｌｘ阻害剤；エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＣＯＸ−２阻害剤、セレコキシブ、シクロスポリン；ラパマイシン；検出可能な標識またはレポーター分子；ＴＮＦアンタゴニスト；抗リウマチ薬；筋弛緩薬；麻薬；鎮痛薬；麻酔薬；鎮静薬；局所麻酔薬；神経筋遮断薬；抗微生物薬；抗乾癬薬；コルチコステロイド；アナボリックステロイド；エリスロポエチン；免疫化；免疫グロブリン；免疫抑制剤；成長ホルモン；ホルモン補充薬；放射性医薬品；抗うつ薬；統合失調症治療薬；刺激剤；喘息薬；βアゴニスト；吸入ステロイド；エピネフリン；そのエピネフリン類似体；サイトカイン；およびサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つの追加の薬剤である、前記医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも１つの追加の薬剤が、ＥｒｂＢ２に結合することができる抗体または抗原結合フラグメントである、前記医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１１から請求項１３のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、前記少なくとも１つの追加の薬剤が、トラスツズマブ、ペルツズマブまたはこれらの組み合わせを含む少なくとも１つの追加の薬剤である、前記医薬組成物。
【請求項１５】
対象の疾患または障害の治療に用いるための、請求項１０から請求項１４のいずれか一項に記載の医薬組成物であって、ＥｒｂＢ２活性が前記疾患または前記障害において有害である、前記医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の医薬組成物であって、前記疾患または障害が、乳癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸癌、直腸癌、肺癌、中咽頭癌、下咽頭癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌、肝臓癌、胆嚢癌、胆管癌、小腸癌、尿道癌、女性生殖系癌、男性生殖系癌、内分泌線癌、皮膚癌、血管腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍、神経癌、眼腫瘍、髄膜癌、造血器腫瘍からの固形腫瘍、腫瘍転移、眼血管新生、浮腫、関節リウマチ、動脈硬化プラーク、クローン病、炎症性腸疾患、難治性腹水、乾癬、サルコイドーシス、動脈硬化症、敗血症、消化性潰瘍、火傷、膵炎、多嚢胞性卵巣（ＰＯＤ）、子宮内膜症、子宮類線維症、良性前立腺肥大症、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、皮質下梗塞と白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡ−ＳＩＬ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ファロー四徴症（ＴＯＦ）、アラジール症候群（ＡＳ）、黄斑変性および加齢性黄斑変性疾患、ならびに異常なＥｒｂＢ２活性を特徴とする他の血管新生非依存性および依存性疾患からなる群から選択される疾患または障害である、前記医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の医薬組成物であって、前記疾患または障害が、乳癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）および肺癌からなる群から選択される疾患または障害である、前記医薬組成物。
【請求項１８】
ＥｒｂＢ２陽性細胞の増殖を阻害するのに用いるための、請求項１０から請求項１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。