【手続補正書】
【提出日】令和3年9月21日(2021.9.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透過処理された細胞と、目的のクロマチン関連因子に特異的に結合する一次抗体または抗体断片とを接触させるステップであって、前記一次抗体または抗体断片は複数のトランスポソームにカップリングされており、前記複数のトランスポソームのそれぞれは、
少なくとも１種のトランスポザーゼ；ならびに
第１のトランスポザーゼ認識部位を含む第１のＤＮＡ分子；および
第２のトランスポザーゼ認識部位を含む第２のＤＮＡ分子
を含むトランスポゾンを含む、ステップと；
前記トランスポザーゼを活性化し、それによって、前記目的のクロマチン関連因子に結合しているＤＮＡの配列を切り出し、およびＤＮＡタグでタグ付けするステップであって、前記少なくとも１種のトランスポザーゼは、クロマチンＤＮＡに前記第１および第２のＤＮＡ分子を組み込み、それによって、クロマチンＤＮＡを切断し、ならびに前記第１および第２のＤＮＡ分子でタグ付けする、ステップと；
前記切り出されたＤＮＡを単離するステップと；
前記切り出されたＤＮＡの配列を決定し、それによって、前記細胞内のＤＮＡの１つまたは複数の配列への目的のクロマチン関連因子の結合をマッピングするステップと
を含む、細胞内のＤＮＡ配列への目的のクロマチン関連因子の結合部位を決定するためのｉｎ  ｓｉｔｕの方法。
【請求項２】
前記抗体または抗体断片が、前記少なくとも１種のトランスポザーゼに間接的にカップリングされており、必要に応じて、前記トランスポザーゼが、前記一次抗体または抗体断片に特異的に結合する特異的結合剤に連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）前記細胞と、前記一次抗体または抗体断片に特異的に結合する二次抗体または抗体断片とを接触させるステップであって、前記トランスポザーゼは、前記二次抗体または抗体断片に特異的に結合する特異的結合剤に連結されている、ステップ；あるいは
（ｂ）前記細胞と、前記一次抗体または抗体断片に特異的に結合する二次抗体または抗体断片とを接触させるステップと；
前記細胞と、前記二次抗体または抗体断片に特異的に結合する三次抗体または抗体断片とを接触させるステップであって、
前記トランスポザーゼは、前記三次抗体または抗体断片に特異的に結合する特異的結合剤に連結されている、ステップと
をさらに含み、
必要に応じて、前記特異的結合剤が、プロテインＡもしくはプロテインＧ、あるいは前記一次抗体もしくは抗体断片、前記二次抗体もしくは抗体断片、および／または前記三次抗体もしくは抗体断片に特異的に結合する三次抗体もしくは抗体断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
クロマチンＤＮＡの配列への前記目的のクロマチン関連因子の結合が直接的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（ａ）前記目的のクロマチン関連因子が転写因子である；ならびに／あるいは
（ｂ）前記細胞が固体表面に固定化されており、必要に応じて、前記固体表面が、ビーズ、またはマイクロタイタープレートの壁を構成する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）前記第１および／または第２のＤＮＡ分子がバーコードをさらに含む；
（ｂ）前記第１および／または第２のＤＮＡ分子がシーケンシングアダプターをさらに含む；ならびに／あるいは
（ｃ）前記第１および／または第２のＤＮＡ分子がユニバーサルプライミング部位をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記少なくとも１種のトランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼを含む；
（ｂ）前記少なくとも１種のトランスポザーゼがＭｕトランスポザーゼを含む；ならびに／あるいは
（ｃ）前記少なくとも１種のトランスポザーゼがＩＳ５またはＩＳ９１トランスポザーゼを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種のトランスポソームが少なくとも２つの異なるトランスポソームを含み、前記異なるトランスポソームは、前記クロマチンＤＮＡに異なるＤＮＡ配列を組み込む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
産生されたＤＮＡ断片を単離するステップをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
単離された核酸断片を分析するステップをさらに含み、前記単離された核酸断片を分析するステップが、ヌクレオチド配列を決定するステップを必要に応じて含み、前記ヌクレオチド配列が、増幅の有無にかかわらず、シーケンシングまたはハイブリダイゼーション技法を使用して必要に応じて決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）前記細胞が原核細胞である；または
（ｂ）細胞が真核細胞であり、前記細胞が必要に応じてヒト細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）前記細胞および／または前記細胞の核を、前記細胞とジギトニンとを接触させることによって透過処理する；ならびに／あるいは
（ｂ）前記方法が前記切り出されたＤＮＡを塩分画に供するステップをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）前記方法が、前記目的のクロマチン関連因子と会合した１つまたは複数のタンパク質の素性を判定するステップをさらに含む；ならびに／あるいは
（ｂ）少なくとも１つのトランスポソームのごく一部が既知の量の混入ＤＮＡを含み、前記混入ＤＮＡは較正に使用され得る、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法を含む、切り出されたクロマチンＤＮＡのライブラリーを調製するための方法。
【請求項１５】
架橋されていない透過処理された細胞と、目的のクロマチン関連因子を特異的に認識する特異的結合剤とを接触させるステップであって、前記特異的結合剤は、不活性状態にあるヌクレアーゼまたはトランスポザーゼに連結されている、ステップと；
前記ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼを活性化し、それによって、前記目的のクロマチン関連因子に結合しているＤＮＡを切り出すステップと；
前記細胞から拡散する前記切り出されたＤＮＡを単離するステップと；
前記切り出されたＤＮＡの配列を決定し、それによって、前記細胞内のＤＮＡの配列への目的のクロマチン関連因子の結合をマッピングするステップと
を含む、細胞内のクロマチンＤＮＡの配列への目的のクロマチン関連因子の結合を検出するための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８３】
本明細書において開示される方法における使用のための適切な試料には、植物、動物、細菌などの生物またはその一部から獲得された任意の従来の生体試料が含まれる（健常なもしくは見かけ上健常なヒト対象由来、またはがんなど、診断されるもしくは検査されるべき状態もしくは疾患の影響を受けたヒト患者由来の試料を含めた、植物または動物など）。試料は、任意の臓器もしくは組織（腫瘍生検など、生検または剖検検体を含む）から獲得された試料でもあり得る、または細胞（初代細胞か培養細胞かにかかわらず）、組織、もしくは臓器を含み得る。例示的な試料としては、限定されることなく、細胞、組織生検（例えば、腫瘍生検）、細針吸引物、ならびに／または組織切片（例えば、クリオスタット組織切片および／もしくはパラフィン包埋組織切片）が挙げられる。他の例において、試料には、循環腫瘍細胞（細胞表面マーカーによって同定され得る）が含まれる。特定の例において、試料は直接使用される（例えば、新鮮なまたは凍結した）、または例えば固定（例えば、ホルマリンを使用した）および／もしくはワックス中に包埋すること（ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料など）によって、使用前に操作され得る。対象から組織を獲得する任意の方法が利用され得ること、および使用される方法の選択は、組織のタイプ、対象の年齢、または実践者に利用可能な手順など、様々な因子に依存するであろうことが解されるであろう。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
透過処理された細胞と、目的のクロマチン関連因子に特異的に結合する一次抗体とを接触させるステップであって、前記一次抗体は複数のトランスポソームにカップリングされており、前記複数のトランスポソームのそれぞれは、
少なくとも１種のトランスポザーゼ；ならびに
第１のトランスポザーゼ認識部位を含む第１のＤＮＡ分子；および
第２のトランスポザーゼ認識部位を含む第２のＤＮＡ分子
を含むトランスポゾンを含む、ステップと；
前記トランスポザーゼを活性化し、それによって、前記目的のクロマチン関連因子に結合しているＤＮＡの配列を切り出し、およびＤＮＡタグでタグ付けするステップであって、前記少なくとも１種のトランスポザーゼは、クロマチンＤＮＡに前記第１および第２のＤＮＡ分子を組み込み、それによって、クロマチンＤＮＡを切断し、ならびに前記第１および第２のＤＮＡ分子でタグ付けする、ステップと；
前記切り出されたＤＮＡを単離するステップと；
前記切り出されたＤＮＡの配列を決定し、それによって、前記細胞内のＤＮＡの１つまたは複数の配列への目的のクロマチン関連因子の結合をマッピングするステップと
を含む、細胞内のＤＮＡ配列への目的のクロマチン関連因子の結合部位を決定するためのｉｎ  ｓｉｔｕの方法。
（項目２）
前記抗体が、前記少なくとも１種のトランスポザーゼに間接的にカップリングされている、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記トランスポザーゼが、前記一次抗体に特異的に結合する特異的結合剤に連結されている、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記細胞と、前記一次抗体に特異的に結合する二次抗体とを接触させるステップであって、前記トランスポザーゼは、前記二次抗体に特異的に結合する特異的結合剤に連結されている、ステップ
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記細胞と、前記一次抗体に特異的に結合する二次抗体とを接触させるステップと；
前記細胞と、前記二次抗体に特異的に結合する三次抗体とを接触させるステップであって、
前記トランスポザーゼは、前記三次抗体に特異的に結合する特異的結合剤に連結されている、ステップと
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記特異的結合剤が、プロテインＡもしくはプロテインＧ、または前記一次抗体、前記二次抗体、および／もしくは前記三次抗体に特異的に結合する三次抗体を含む、項目３から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
クロマチンＤＮＡの配列への前記目的のクロマチン関連因子の結合が直接的である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記目的のクロマチン関連因子が転写因子である、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記細胞が固体表面に固定化されている、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記固体表面が、ビーズ、またはマイクロタイタープレートの壁を構成する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記第１および／または第２のＤＮＡ分子がバーコードをさらに含む、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記第１および／または第２のＤＮＡ分子がシーケンシングアダプターをさらに含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第１および／または第２のＤＮＡ分子がユニバーサルプライミング部位をさらに含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記少なくとも１種のトランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼを含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記少なくとも１種のトランスポザーゼがＭｕトランスポザーゼを含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記少なくとも１種のトランスポザーゼがＩＳ５またはＩＳ９１トランスポザーゼを含む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記少なくとも１種のトランスポソームが少なくとも２つの異なるトランスポソームを含み、前記異なるトランスポソームは、前記クロマチンＤＮＡに異なるＤＮＡ配列を組み込む、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
産生されたＤＮＡ断片を単離するステップをさらに含む、項目１から１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
単離された核酸断片を分析するステップをさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記単離された核酸断片を分析するステップが、ヌクレオチド配列を決定するステップを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記ヌクレオチド配列が、増幅の有無にかかわらず、シーケンシングまたはハイブリダイゼーション技法を使用して決定される、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞が原核細胞である、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
細胞が真核細胞である、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記細胞がヒト細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記細胞および／または前記細胞の核を、前記細胞とジギトニンとを接触させることによって透過処理する、項目１から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記切り出されたＤＮＡを塩分画に供するステップをさらに含む、項目１から２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記目的のクロマチン関連因子と会合した１つまたは複数のタンパク質の素性を判定するステップをさらに含む、項目１から２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
少なくとも１つのトランスポソームのごく一部が既知の量の混入ＤＮＡを含み、前記混入ＤＮＡは較正に使用され得る、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
項目１から２８のいずれか一項に記載の方法を含む、切り出されたクロマチンＤＮＡのライブラリーを調製するための方法。
（項目３０）
架橋されていない透過処理された細胞と、目的のクロマチン関連因子を特異的に認識する特異的結合剤とを接触させるステップであって、前記特異的結合剤は、不活性状態にあるヌクレアーゼまたはトランスポザーゼに連結されている、ステップと；
前記ヌクレアーゼまたはトランスポザーゼを活性化し、それによって、前記目的のクロマチン関連因子に結合しているＤＮＡを切り出すステップと；
前記細胞から拡散する前記切り出されたＤＮＡを単離するステップと；
前記切り出されたＤＮＡの配列を決定し、それによって、前記細胞内のＤＮＡの配列への目的のクロマチン関連因子の結合をマッピングするステップと
を含む、細胞内のクロマチンＤＮＡの配列への目的のクロマチン関連因子の結合を検出するための方法。
（項目３１）
前記クロマチンＤＮＡの配列への前記目的のクロマチン関連因子の結合が間接的である、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記クロマチンＤＮＡの配列への前記目的のクロマチン関連因子の結合が直接的である、項目３０に記載の方法。
（項目３３）
前記目的のクロマチン関連因子が転写因子である、項目３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
前記細胞が固体表面に固定化されている、項目３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記固体表面が、ビーズ、またはマイクロタイタープレートの壁を構成する、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記切り出されたクロマチンＤＮＡを核酸タグでタグ付けするステップをさらに含む、項目３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記核酸タグがシーケンシングアダプターを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記核酸タグがバーコードを含む、項目３６または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記核酸タグがユニバーサルプライミング部位を含む、項目３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記ヌクレアーゼが、活性化された場合、前記クロマチン関連因子の結合部位のいずれかの側でＤＮＡ配列を切断する、項目３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記ヌクレアーゼが２価カチオンの添加によって活性化可能である、項目３０から４０のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記ヌクレアーゼがＭＮａｓｅである、項目３０から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記ヌクレアーゼがＣａ２＋イオンによって活性化される、項目３０から４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目４４）
前記ヌクレアーゼ活性がキレート剤の添加によってクエンチされる、項目３０から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
トランスポソームが、
少なくとも１種のトランスポザーゼ；ならびに
第１のトランスポザーゼ認識部位を含む第１のＤＮＡ分子；および
第２のトランスポザーゼ認識部位を含む第２のＤＮＡ分子
を含むトランスポゾンを含み、前記少なくとも１種のトランスポザーゼは、クロマチンＤＮＡに前記第１および第２のＤＮＡ分子を組み込み、それによって、クロマチンＤＮＡを切断し、ならびに前記第１および第２のＤＮＡ分子でタグ付けする、
項目３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４６）
前記第１および／または第２のＤＮＡ分子がバーコードをさらに含む、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記第１および／または第２のＤＮＡ分子がシーケンシングアダプターをさらに含む、項目４５または４６に記載の方法。
（項目４８）
前記第１および／または第２のＤＮＡ分子がユニバーサルプライミング部位をさらに含む、項目４５から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記少なくとも１種のトランスポザーゼが、Ｔｎ５トランスポザーゼ、Ｍｕトランスポザーゼ、ＩＳ５もしくはＩＳ９１トランスポザーゼ、またはそれらの組合せを含む、項目４５から４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記特異的結合剤が抗体である、項目３０から４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
産生されたＤＮＡ断片を単離するステップをさらに含む、項目３０から５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記ＤＮＡ断片がサイズに基づいて単離される、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
単離された核酸断片を分析するステップをさらに含む、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
前記単離された核酸断片を分析するステップが、ヌクレオチド配列を決定するステップを含む、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記ヌクレオチド配列が、増幅の有無にかかわらず、シーケンシングまたはハイブリダイゼーション技法を使用して決定される、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記ヌクレアーゼまたは前記トランスポザーゼが融合タンパク質の一部である、項目３０から５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記ヌクレアーゼまたは前記トランスポザーゼが、リンカーを用いて前記特異的結合剤に連結されている、項目３０から５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記細胞が原核細胞である、項目３０から５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記細胞が真核細胞である、項目３０から５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記細胞がヒト細胞である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記細胞および／または前記細胞の核を、前記細胞とジギトニンとを接触させることによって透過処理する、項目３０から６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記切り出されたＤＮＡを塩分画に供するステップをさらに含む、項目３０から６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
上清をＣｈＩＰ−ｓｅｑに供するステップをさらに含む、項目３０から６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記目的のクロマチン関連因子と会合した１つまたは複数のタンパク質の素性を判定するステップをさらに含む、項目３０から６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目６５）
前記タンパク質の前記素性を決定するステップが抗体の使用を含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
前記タンパク質の前記素性を決定するステップが質量分析を含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
項目３０から６６のいずれか一項に記載の方法を含む、切り出されたクロマチンＤＮＡのライブラリーを調製するための方法。