【手続補正書】
【提出日】令和3年5月17日(2021.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、
ｂ．第１のプライマーを前記標的核酸の前記ＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１のプライマーが、（ｉ）前記ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、
ｃ．鋳型として前記標的核酸を使用して、前記第１のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記第１のプライマーの配列および前記標的核酸に相補的な配列を含む第１の伸長産物を産生するステップと、
ｄ．第２のプライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
ｅ．鋳型として前記第１の伸長産物を使用して、前記第２のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記ＰＡＭ部位、前記認識部位および前記プロモーター部位を含む第２の伸長産物を産生するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記第２のプライマーが、（ｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位、および（ｉｉ）ランダム配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ランダム配列が、約６〜約８塩基長の間である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１のプライマーが、制限酵素の制限酵素部位をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｆ．アダプタを前記第２の伸長産物にライゲーションするステップであって、前記アダプタが、制限酵素の制限酵素部位を含む、ステップと、
ｇ．前記ＰＡＭ部位および前記制限部位が、前記認識部位から切断されるように、前記制限酵素で前記第２の伸長産物を切断するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記制限酵素が、ＭｍｅＩ、ＦｏｋＩまたはＭｌｙＩを含む、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結合していない第１のプライマーまたは結合していない第２のプライマーを除去するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のプライマーを伸長させる前記ステップまたは前記第２のプライマーを伸長させる前記ステップが、標識されたヌクレオチドにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記認識部位が、約２０ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記認識部位が、約１５〜約２５ヌクレオチドの長さである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記相補的認識部位が、少なくとも１個の改変された核酸結合を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記改変された核酸結合が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記プロモーター部位を使用して、前記第２の伸長産物を転写するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、
ｂ．プライマーを前記標的核酸の前記ＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、前記プライマーが、（ｉ）前記ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、
ｃ．鋳型として前記標的核酸を使用して、前記プライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記ＰＡＭ部位、前記認識部位および前記プロモーター部位を含む伸長産物を産生するステップと、
ｄ．前記標的核酸をニッキングするステップと、
ｅ．前記ニッキングされた標的核酸を消化するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、ｂ．第１のループアダプタを前記標的核酸の両末端にライゲーションするステップであって、前記第１のループアダプタが、プロモーター部位を含む、ステップと、
ｃ．前記ＰＡＭ部位で前記標的核酸を切断するステップであって、これによって、第１の末端における前記第１のループアダプタおよび第２の末端におけるＰＡＭ部位のうち１つをそれぞれ含むＤＮＡ切断産物を産生するステップと、
ｄ．第２のループアダプタを前記切断産物の前記第２の末端にライゲーションするステップであって、前記第２のループアダプタが、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのステムループ配列に相補的な相補的ステムループ配列を含む、ステップと、
ｅ．前記切断産物を増幅し、これにより、前記プロモーター部位、認識部位および前記ステムループ配列を含む増幅産物を産生するステップであって、前記認識部位が、前記標的核酸の１つにおいて前記ＰＡＭ部位に隣接した配列を含む、ステップと
を含む方法。
【請求項２３】
核酸ガイド化ヌクレアーゼタンパク質結合配列またはその相補体を含む核酸を前記第２の伸長産物にライゲーションするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸の収集物のＰＣＲ増幅をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＡＭ部位がＮＧＧまたはＮＡＧを含む、請求項１、２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸の収集物が、少なくとも１０５個の特異な核酸を含む、請求項１、２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記認識部位が、目的のゲノムにわたって１０，０００ｂｐまたはそれ未満毎の間隔にある、請求項１、２１または２２のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本開示の組成物および方法の一部の実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的核酸は、ヒトＤＮＡを含む。一部の実施形態では、標的核酸は、真核生物ＤＮＡを含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、ｂ．第１のプライマーを前記標的核酸の前記ＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、前記第１のプライマーが、（ｉ）前記ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、
ｃ．鋳型として前記標的核酸を使用して、前記第１のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記第１のプライマーの配列および前記標的核酸に相補的な配列を含む第１の伸長産物を産生するステップと、
ｄ．第２のプライマーを前記第１の伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
ｅ．鋳型として前記第１の伸長産物を使用して、前記第２のプライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記ＰＡＭ部位、前記認識部位および前記プロモーター部位を含む第２の伸長産物を産生するステップと
を含む方法。
（項目２）
前記第２のプライマーが、（ｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位、および（ｉｉ）ランダム配列を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ランダム配列が、約６〜約８塩基長の間である、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第１のプライマーが、制限酵素の制限酵素部位をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目５）
ｆ．アダプタを前記第２の伸長産物にライゲーションするステップであって、前記アダプタが、制限酵素の制限酵素部位を含む、ステップと、
ｇ．前記ＰＡＭ部位および前記制限部位が、前記認識部位から切断されるように、前記制限酵素で前記第２の伸長産物を切断するステップと
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記制限酵素が、ＭｍｅＩ、ＦｏｋＩまたはＭｌｙＩを含む、項目４または項目５に記載の方法。
（項目７）
結合していない第１のプライマーまたは結合していない第２のプライマーを除去するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記第１のプライマーを伸長させる前記ステップまたは前記第２のプライマーを伸長させる前記ステップが、標識されたヌクレオチドにより行われる、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記認識部位が、約２０ヌクレオチドの長さである、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記認識部位が、約１５〜約２５ヌクレオチドの長さである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記相補的認識部位が、少なくとも１個の改変された核酸結合を含む、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記改変された核酸結合が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）からなる群から選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記プロモーター部位を使用して、前記第２の伸長産物を転写するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目２１）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、ｂ．プライマーを前記標的核酸の前記ＰＡＭ部位にハイブリダイズさせるステップであって、前記プライマーが、（ｉ）前記ＰＡＭ部位に相補的なＭＡＰ部位、（ｉｉ）前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位に相補的な相補的認識部位、および（ｉｉｉ）プロモーター部位に相補的な相補的プロモーター部位を含む、ステップと、
ｃ．鋳型として前記標的核酸を使用して、前記プライマーを伸長させるステップであって、これによって、前記ＰＡＭ部位、前記認識部位および前記プロモーター部位を含む伸長産物を産生するステップと、
ｄ．前記標的核酸をニッキングするステップと、
ｅ．前記ニッキングされた標的核酸を消化するステップと
を含む方法。
（項目２２）
前記伸長産物に、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのステムループ配列またはその相補体を含む核酸をライゲーションするステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
互い違いになっている二本鎖ステムループを前記伸長産物に付加するステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記プロモーター部位を使用して、前記伸長産物を転写するステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
結合していないプライマーを除去するステップをさらに含む、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
前記プライマーを伸長させる前記ステップが、標識されたヌクレオチドにより行われる、項目２１に記載の方法。
（項目２７）
前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記相補的認識部位が、約２０ヌクレオチドの長さである、項目２１に記載の方法。
（項目２９）
前記相補的認識部位が、約１５〜約２５ヌクレオチドの長さである、項目２１に記載の方法。
（項目３０）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３１）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３２）
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目２１に記載の方法。
（項目３３）
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、項目２１に記載の方法。
（項目３４）
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、項目２１に記載の方法。
（項目３５）
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、項目２１に記載の方法。
（項目３６）
前記相補的認識部位が、少なくとも１個の改変された核酸結合を含む、項目２１に記載の方法。
（項目３７）
前記改変された核酸結合が、ロックド核酸（ＬＮＡ）、架橋された核酸（ＢＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ジップ核酸（ＺＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）およびホスホロチオエート（ＰＴＯ）からなる群から選択される、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位をそれぞれ含む標的核酸を得るステップと、ｂ．第１のループアダプタを前記標的核酸の両末端にライゲーションするステップであって、前記第１のループアダプタが、プロモーター部位を含む、ステップと、
ｃ．前記ＰＡＭ部位で前記標的核酸を切断するステップであって、これによって、第１の末端における前記第１のループアダプタおよび第２の末端におけるＰＡＭ部位のうち１つをそれぞれ含むＤＮＡ切断産物を産生するステップと、
ｄ．第２のループアダプタを前記切断産物の前記第２の末端にライゲーションするステップであって、前記第２のループアダプタが、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのステムループ配列に相補的な相補的ステムループ配列を含む、ステップと、
ｅ．前記切断産物を増幅し、これにより、前記プロモーター部位、認識部位および前記ステムループ配列を含む増幅産物を産生するステップであって、前記認識部位が、前記標的核酸の１つにおいて前記ＰＡＭ部位に隣接した配列を含む、ステップと
を含む方法。
（項目３９）
ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．標的核酸の配列リード配列リードを得るステップと、
ｂ．前記配列リードを少なくとも１つの参照配列にマッピングするステップと、
ｃ．前記配列リードの存在量値を決定するステップと、
ｄ．前記配列リードから認識部位を同定するステップであって、前記認識部位が、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、ステップと、
ｅ．前記存在量値に基づき前記認識部位を選別するステップと
を含む方法。
（項目４０）
前記ガイド核酸の収集物を合成するステップをさらに含み、前記ガイド核酸が、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの前記認識部位およびステムループ配列のうち１つをそれぞれ含む、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記ガイド核酸の収集物が、上位１００個の選別された認識部位、上位１０００個の選別された認識部位、または上位１０，０００個の選別された認識部位を有するガイド核酸を含む、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記認識部位が、少なくとも１００塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも５００塩基対または少なくとも１０００塩基対だけ、前記少なくとも１つの参照配列において互いに間隔をあけるように、前記認識部位をフィルタリングするステップをさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
前記認識部位を選別する前記ステップが、前記配列リードを選別することにより行われる、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
前記認識部位が、約２０塩基を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４５）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、項目３９に記載の方法。
（項目４６）
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の５’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の５’にある、項目３９に記載の方法。
（項目４７）
前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧまたはＮＡＧを含む、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の３’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の３’にある、項目３９に記載の方法。
（項目５０）
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、項目４９に記載の方法。
（項目５１）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１系タンパク質を含む、項目５０記載の方法。
（項目５２）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、項目３９に記載の方法。
（項目５３）
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目３９に記載の方法。
（項目５４）
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、項目３９に記載の方法。
（項目５５）
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、項目３９に記載の方法。
（項目５６）
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、項目３９に記載の方法。
（項目５７）
前記ガイド核酸を基材に結合させるステップをさらに含む、項目３９に記載の方法。
（項目５８）
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
ガイド核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．標的核酸の配列リードを得るステップと、
ｂ．前記配列リードから最も高頻度の認識部位を決定するステップであって、認識部位が、核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する、ステップと、
ｃ．前記配列リードからその次に高頻度の認識部位を決定するステップと、
ｄ．条件が満たされるまでステップｃを反復するステップであって、前記条件が、（ｉ）設定された数の認識部位が決定されること、（ｉｉ）さらなる認識部位を決定することができないこと、（ｉｉｉ）設定されたパーセンテージの前記標的核酸が、前記認識部位によって網羅されること、（ｉｖ）前記認識部位におけるまたはその近傍における前記標的核酸の切断が、設定されたサイズを下回る最大断片サイズを生じること、からなる群から選択される、ステップと
を含む方法。
（項目６０）
前記設定された数の認識部位が、少なくとも約１００、少なくとも約１０００または少なくとも約１０，０００個である、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記設定されたパーセンテージが、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％である、項目５９に記載の方法。
（項目６２）
前記設定されたサイズが、多くても約１０００ｂｐ、多くても約５００ｂｐ、多くても約２００ｂｐまたは多くても約１００ｂｐである、項目５９に記載の方法。
（項目６３）
前記ガイド核酸の収集物を合成するステップをさらに含み、前記ガイド核酸が、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼの前記認識部位およびステムループ配列のうち１つをそれぞれ含む、項目５９に記載の方法。
（項目６４）
前記認識部位が、約２０塩基を含む、項目５９に記載の方法。
（項目６５）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ系タンパク質を含む、項目５９に記載の方法。
（項目６６）
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の５’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の５’にある、項目５９に記載の方法。
（項目６７）
前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧまたはＮＡＧを含む、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、項目６７に記載の方法。
（項目６９）
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の３’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の３’にある、項目５９に記載の方法。
（項目７０）
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１系タンパク質を含む、項目７０記載の方法。
（項目７２）
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目５９に記載の方法。
（項目７３）
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、項目５９に記載の方法。
（項目７４）
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、項目５９に記載の方法。
（項目７５）
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、項目５９に記載の方法。
（項目７６）
前記ガイド核酸を基材に結合させるステップをさらに含む、項目５９に記載の方法。
（項目７７）
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、項目７６に記載の方法。
（項目７８）
ガイド核酸の収集物を含む組成物であって、
各ガイド核酸が、核酸ガイド化ヌクレアーゼの認識部位およびステムループ配列を含み、各認識部位が、前記核酸ガイド化ヌクレアーゼのＰＡＭ部位に隣接する標的核酸の標的部位に相補的であり、
前記ガイド核酸の収集物の前記認識部位が相補的である前記標的部位が、約１０，０００塩基対未満の平均間隔で、前記標的核酸内に分布される、
組成物。
（項目７９）
前記平均間隔が、約５，０００塩基対未満、約２，５００塩基対未満、約１，０００塩基対未満、約５００塩基対未満、約２５０塩基対未満または約１００塩基対未満である、項目７８に記載の組成物。
（項目８０）
前記ガイド核酸の収集物が、少なくとも約１００種の異なる認識部位、少なくとも１，０００種の異なる認識部位、少なくとも１０，０００種の異なる認識部位、少なくとも１００，０００種の異なる認識部位、または少なくとも１，０００，００種の異なる認識部位を有するガイド核酸を含む、項目７８に記載の組成物。
（項目８１）
前記認識部位が、約２０塩基を含む、項目７８に記載の組成物。
（項目８２）
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の５’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の５’にある、項目７８に記載の組成物。
（項目８３）
前記ＰＡＭ部位が、ＮＧＧまたはＮＡＧを含む、項目８２に記載の組成物。
（項目８４）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９系タンパク質を含む、項目８３に記載の組成物。
（項目８５）
前記核酸の標的部位が、前記ＰＡＭ部位の３’に位置し、前記認識部位が、ステムループ配列の３’にある、項目７８に記載の組成物。
（項目８６）
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、項目８５に記載の組成物。
（項目８７）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１系タンパク質を含む、項目８６記載の組成物。
（項目８８）
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目７８に記載の組成物。
（項目８９）
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、項目７８に記載の組成物。
（項目９０）
前記標的核酸が、宿主ＤＮＡを含む、項目７８に記載の組成物。
（項目９１）
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、項目７８に記載の組成物。
（項目９２）
前記ガイド核酸が基材に結合している、項目７８に記載の組成物。
（項目９３）
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、項目９２に記載の組成物。
（項目９４）
標的核酸を枯渇させる方法であって、
ａ．標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップと、
ｂ．前記標的核酸が、標的部位においてまたはその近傍で切断されるように、前記標的核酸を、項目７８から９１のいずれか一項に記載の収集物のガイド核酸と複合体形成した核酸ガイド化ヌクレアーゼの複合体と接触させるステップと
を含む方法。
（項目９５）
前記非標的核酸が、免疫応答シグナル核酸を含む、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記非標的核酸が、アポトーシスシグナル核酸を含む、項目９４に記載の方法。
（項目９７）
前記非標的核酸が、がん関係のアポトーシスシグナル核酸を含む、項目９４に記載の方法。
（項目９８）
核酸ガイド化ヌクレアーゼの前記複合体が、基材に結合している、項目９４に記載の方法。
（項目９９）
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
標的核酸を枯渇させる方法であって、
ａ．標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップと、
ｂ．前記標的核酸がニック部位でニッキングされるように、前記核酸を核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質−ｇＮＡ複合体と接触させるステップであって、前記ｇＮＡが、５’ステムループ配列および３’標的化配列を含む、ステップと、
ｃ．前記ニック部位でニックトランスレーションを行うステップであって、前記ニックトランスレーションが、標識されたヌクレオチドにより行われる、ステップと、
ｄ．前記標識されたヌクレオチドを有する前記標的核酸を捕捉するステップと、
ｅ．前記非標的核酸から前記標的核酸を分離するステップと
を含む方法。
（項目１０１）
前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
前記標的核酸が、基材に結合させることにより捕捉される、項目１００に記載の方法。
（項目１０３）
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記非標的核酸を解析するステップをさらに含む、項目１００に記載の方法。
（項目１０５）
前記解析ステップが、配列決定を含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記解析ステップが、ハイブリダイゼーションを含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０７）
前記標的核酸が、宿主に由来し、前記非標的核酸が、非宿主に由来する、項目１００に記載の方法。
（項目１０８）
前記非宿主が、感染病原体を含む、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質が、Ｃｐｆ１系ニッカーゼタンパク質を含む、項目１００に記載の方法。
（項目１１０）
前記Ｃｐｆ１系ニッカーゼタンパク質が、ＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａまたはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓから単離されるまたはこれに由来するＣｐｆ１系タンパク質を含む、項目１０９に記載の方法。
（項目１１１）
前記標的核酸が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目１００に記載の方法。
（項目１１２）
前記標的核酸が、ヒトＤＮＡを含む、項目１００に記載の方法。
（項目１１３）
前記標的核酸が、真核生物ＤＮＡを含む、項目１００に記載の方法。
（項目１１４）
標的核酸を枯渇させる方法であって、
ａ．標的核酸および非標的核酸を含む核酸を得るステップであって、前記核酸が、第１の末端にヘアピンループを含む、ステップと、
ｂ．ループアダプタを前記核酸の第２の末端にハイブリダイズさせるステップと、
ｃ．前記標的核酸がニッキングされるように、前記核酸を核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質と接触させるステップと、
ｄ．ニッキングされた標的核酸を消化するステップと
を含む方法。
（項目１１５）
前記非標的核酸の前記ループアダプタを切断するステップをさらに含む、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
前記切断ステップが、前記ループアダプタの制限部位で行われる、項目１１５に記載の方法。
（項目１１７）
前記切断ステップが、前記ループアダプタの核酸ガイド化ヌクレアーゼ認識部位で行われる、項目１１５に記載の方法。
（項目１１８）
前記非標的核酸を解析するステップをさらに含む、項目１１７に記載の方法。
（項目１１９）
前記解析ステップが、配列決定を含む、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記解析ステップが、ハイブリダイゼーションを含む、項目１１８に記載の方法。
（項目１２１）
前記消化ステップが、エキソヌクレアーゼにより行われる、項目１１４に記載の方法。
（項目１２２）
前記核酸ガイド化ニッカーゼタンパク質が、基材に結合している、項目１１４に記載の方法。
（項目１２３）
前記基材が、フローセル、流体チャネル、マイクロ流体チャネルまたはビーズを含む、項目１２２に記載の方法。
（項目１２４）
配列決定ライブラリーを調製する方法であって、
ａ．項目１００から１２３のいずれか一項に記載の枯渇方法、または捕捉方法を経た後に得られる、目的の部位を含むＤＮＡ分子を提供するステップと、
ｂ．３’末端をポリメラーゼによって伸長することができないように、前記ＤＮＡ分子の３’末端をブロックするステップと、
ｃ．第１のプライマーを前記ＤＮＡ分子にハイブリダイズさせるステップと、
ｄ．前記第１のプライマーを伸長させて、前記第１のプライマーの配列および前記目的の部位の配列を含む伸長産物を生じるステップと、
ｅ．第２のプライマーを前記伸長産物にハイブリダイズさせるステップと、
ｆ．前記第２のプライマーを使用して、前記伸長産物を増幅するステップと
を含む方法。
（項目１２５）
前記第２のプライマーをハイブリダイズさせる前記ステップに先立ち、テイルを前記伸長産物に付加するステップをさらに含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１２６）
前記第２のプライマーが、前記テイルにハイブリダイズされる、項目１２５に記載の方法。
（項目１２７）
ステップｄの後に、ステップｃおよびｄを反復するステップをさらに含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１２８）
前記第２のプライマーをハイブリダイズさせる前記ステップに先立ち、ハイブリダイズしていない第１のプライマーを除去するステップをさらに含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１２９）
前記除去ステップが、消化を含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３０）
前記消化が、エキソヌクレアーゼ消化を含む、項目１２９に記載の方法。
（項目１３１）
前記除去ステップが、前記伸長産物中に取り込まれた標識されたヌクレオチドを結合させるステップを含む、項目１２８に記載の方法。
（項目１３２）
前記標識されたヌクレオチドが、ビオチン化ヌクレオチドを含む、項目１３１に記載の方法。
（項目１３３）
前記第１のプライマーおよび／または前記第２のプライマーが、配列決定アダプタ配列を含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１３４）
前記目的の部位が、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１３５）
前記目的の部位が、短いタンデム反復（ＳＴＲ）を含む、項目１２４に記載の方法。
（項目１３６）
前記ＳＴＲが、ミニＳＴＲである、項目１３５に記載の方法。
（項目１３７）
配列決定ライブラリーを調製する方法であって、
ａ．ｇＮＡ枯渇または捕捉方法に起因するＲＮＡ分子を提供するステップと、
ｂ．第１のハイブリダイゼーション部位を前記ＲＮＡ分子に付着させるステップと、
ｃ．第１のオリゴヌクレオチドを前記第１のハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズさせるステップと、
ｄ．プライマーとして前記第１のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ＲＮＡ分子の少なくとも一部を逆転写するステップであって、これによって、ｃＤＮＡを生成するステップと、
ｅ．第２のオリゴヌクレオチドを前記ｃＤＮＡのテイルにハイブリダイズさせるステップと、
ｆ．プライマーとして前記第２のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第１のオリゴヌクレオチドを使用して、前記ｃＤＮＡを増幅するステップと
を含む方法。
（項目１３８）
前記第１のハイブリダイゼーション部位が、テイルを含む、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記第１のハイブリダイゼーション部位が、ポリＡテイルを含む、項目１３７に記載の方法。
（項目１４０）
前記第１のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のバーコード配列を含む、項目１３７に記載の方法。
（項目１４１）
前記第２のオリゴヌクレオチドが、少なくとも１個のバーコード配列を含む、項目１３７に記載の方法。
（項目１４２）
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、（ｉ）所与のＲＮＡ分子に特有の、特有の分子識別子配列、および（ｉｉ）同じ供給源由来のＲＮＡ分子の間で共有される、供給源バーコード配列からなる群から選択される１個または複数のバーコード配列を含む、項目１３７に記載の方法。
（項目１４３）
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび／または前記第２のオリゴヌクレオチドが、配列決定アダプタ配列を含む、項目１３７に記載の方法。
（項目１４４）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料を制限エンドヌクレアーゼで消化して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ断片の収集物をヌクレアーゼで処理するステップと、
ｃ．第１のアダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタをコードする配列が、ＭｍｅＩ制限部位およびＦｏｋＩ制限部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｄ．前記第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｅ．第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、前記第２のアダプタのライゲーション後に、前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
（項目１４５）
前記ヌクレアーゼが、マングビーンヌクレアーゼを含む、項目１４４に記載の方法。
（項目１４６）
前記制限エンドヌクレアーゼが、ＭｓｅＩ、ＭｌｕＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＡｌｕＩ、ＤｎｐＩＩおよびＦａｔＩからなる群から選択される、項目１４４に記載の方法。
（項目１４７）
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、項目１４４に記載の方法。
（項目１４８）
前記第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、項目１４４に記載の方法。
（項目１４９）
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、項目１４４に記載の方法。
（項目１５０）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、項目１４４に記載の方法。
（項目１５１）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、項目１５０に記載の方法。
（項目１５２）
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目１４４に記載の方法。
（項目１５３）
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、項目１４４に記載の方法。
（項目１５４）
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、項目１４４に記載の方法。
（項目１５５）
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、項目１４４に記載の方法。
（項目１５６）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料における少なくとも２個の連続したアデノシンをイノシンに置き換えるステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ試料をヒトアルキルアデニンＤＮＡグリコシラーゼ（ｈＡＡＧ）で処理するステップと、
ｃ．前記ＤＮＡ試料をエンドヌクレアーゼで処理して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｄ．第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を生成するステップであって、
前記第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子および前記二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端における５’ＮＡＡ３’の一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含み、
前記第１のアダプタが、ＭｍｅＩ部位およびＦｏｋＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、前記第１のアダプタのライゲーション後に、前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｅ．前記第１のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｆ．第２のライゲーションステップにおいて、第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、前記第２のアダプタのライゲーション後に、前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
（項目１５７）
前記エンドヌクレアーゼが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩを含む、項目１５６に記載の方法。
（項目１５８）
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、項目１５６に記載の方法。
（項目１５９）
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、項目１５６に記載の方法。
（項目１６０）
前記第１のライゲーションステップが、高温リガーゼを使用して実行される、項目１５６に記載の方法。
（項目１６１）
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、項目１５６に記載の方法。
（項目１６２）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、項目１５６に記載の方法。
（項目１６３）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目１５６に記載の方法。
（項目１６５）
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、項目１５６に記載の方法。
（項目１６６）
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、項目１５６に記載の方法。
（項目１６７）
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、項目１５６に記載の方法。
（項目１６８）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料における少なくとも１個のチミジンをウラシルに置き換えて、少なくとも１個の塩基対ミスマッチを含むＤＮＡ試料を産生するステップと、
ｂ．少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素により前記少なくとも１個のウラシルを切除して、少なくとも１塩基対の少なくとも１個の一本鎖領域を有するＤＮＡ試料を産生するステップと、
ｃ．前記ＤＮＡ試料をヌクレアーゼで処理して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｄ．第１のライゲーションステップにおいて前記ＤＮＡ断片の収集物に第１のアダプタをライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタが、ＭｍｅＩ部位およびＦｏｋＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｅ．前記第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｆ．第２のライゲーションステップにおいて、第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
（項目１６９）
（ｂ）前記少なくとも１個のウラシルを切除するステップの後、かつ（ｃ）前記ヌクレアーゼで処理するステップの前に、前記ＤＮＡ試料をホスファターゼで処理するステップをさらに含む、項目１６８に記載の方法。
（項目１７０）
少なくとも１個のｄｄＴＴＰを、前記ＤＮＡ試料における少なくとも１塩基対の前記少なくとも１個の一本鎖領域の５’にある二本鎖ＤＮＡ領域の３’末端に付加するステップをさらに含む、項目１６９に記載の方法。
（項目１７１）
前記ヌクレアーゼが、マングビーンヌクレアーゼを含む、項目１６８または１６９に記載の方法。
（項目１７２）
前記少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを含む、項目１６８から１７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７３）
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、項目１６８に記載の方法。
（項目１７４）
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、項目１６８に記載の方法。
（項目１７５）
前記第１のライゲーションステップが、高温リガーゼを使用して実行される、項目１６８に記載の方法。
（項目１７６）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、項目１６８に記載の方法。
（項目１７７）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、項目１７６に記載の方法。
（項目１７８）
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目１６９に記載の方法。
（項目１７９）
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、項目１６８に記載の方法。
（項目１８０）
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、項目１６８に記載の方法。
（項目１８１）
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、項目１６８に記載の方法。
（項目１８２）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに断片化して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．第１のライゲーションステップにおいて、第１のアダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第１のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子および前記二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端における５’ＮＡＡ３’の一本鎖ＤＮＡオーバーハングを含み、
前記第１のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｃ．前記第１のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｄ．第２のライゲーションステップにおいて、第２のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第２のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
（項目１８３）
前記ＤＮＡが、非特異的ニッカーゼおよびエンドヌクレアーゼによりランダムに断片化される、項目１８２に記載の方法。
（項目１８４）
前記エンドヌクレアーゼが、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩである、項目１８３に記載の方法。
（項目１８５）
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、項目１８２に記載の方法。
（項目１８６）
前記第２のアダプタが、二本鎖ＤＮＡアダプタである、項目１８２に記載の方法。
（項目１８７）
前記第１のライゲーションステップが、高温リガーゼを使用して実行される、項目１８２に記載の方法。
（項目１８８）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、項目１８２に記載の方法。
（項目１８９）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、項目１８８に記載の方法。
（項目１９０）
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目１８２に記載の方法。
（項目１９１）
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、項目１８２に記載の方法。
（項目１９２）
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、項目１８２に記載の方法。
（項目１９３）
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、項目１８２に記載の方法。
（項目１９４）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ断片をメチラーゼでメチル化するステップと、
ｃ．前記ＤＮＡ断片の収集物を末端修復して、平滑末端化されたＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｄ．第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを前記平滑末端化されたＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタが、５’から３’に、ＮｔＢｓｔＮＢＩ制限部位、前記第１のアダプタのリン酸骨格における改変された切断抵抗性結合、およびＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、
ｅ．前記第１のアダプタＤＮＡ断片を制限酵素およびＮｔＢｓｔＮＢＩで消化するステップと、
ｆ．第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタを前記消化された第１のアダプタＤＮＡ断片にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第２のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｇ．前記第２のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｈ．第３のライゲーション反応において、第３のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第３のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列をコードする配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
（項目１９５）
前記ランダム剪断ステップが、機械的、酵素的または化学的剪断を含む、項目１９４に記載の方法。
（項目１９６）
前記メチラーゼが、ＥｃｏＧＩＩ  ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを含む、項目１９４に記載の方法。
（項目１９７）
前記改変された切断抵抗性結合が、ホスホロチオエート結合を含む、項目１９４に記載の方法。
（項目１９８）
前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、項目１９４に記載の方法。
（項目１９９）
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮを含み、前記制限酵素が、ＭｌｕＣＩまたはＭｓｅＩを含む、項目１９４に記載の方法。
（項目２００）
前記ＰＡＭ部位が、ＴＣＮを含み、前記制限酵素が、ＤｐｎＩＩを含む、項目１９４に記載の方法。
（項目２０１）
前記ＰＡＭ部位が、ＴＧＮを含み、前記制限酵素が、ＦａｔＩを含む、項目１９４に記載の方法。
（項目２０２）
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、項目１９４に記載の方法。
（項目２０３）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、項目１９４に記載の方法。
（項目２０４）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、項目２０３に記載の方法。
（項目２０５）
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目１９４に記載の方法。
（項目２０６）
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、項目１９４に記載の方法。
（項目２０７）
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、項目１９４に記載の方法。
（項目２０８）
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、項目１９４に記載の方法。
（項目２０９）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ断片の収集物を末端修復して、平滑末端化されたＤＮＡ断片を産生するステップと、
ｃ．第１のライゲーションステップにおいて第１のアダプタを前記平滑末端化されたＤＮＡ断片にライゲーションして、第１のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第１のアダプタが、５’から３’に、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ制限部位、およびＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、
ｄ．前記第１のアダプタＤＮＡ断片をＮｔ．ＢｓｔＮＢＩでニッキングするステップと、ｅ．前記ニックから５’末端へと、３’から５’への方向で、前記第１のアダプタＤＮＡ断片のトップ鎖を分解するステップと、
ｆ．第２のライゲーションステップにおいて第２のアダプタを前記分解された第１のアダプタＤＮＡ断片にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第２のアダプタが、５’から３’の向きで、ＭｌｙＩ配列、前記ＰＡＭ配列に相補的な配列、および前記ＰＡＭ配列を含む、ステップと、
ｇ．前記第２のアダプタ断片をＭｌｙＩで消化するステップと、
ｈ．第３のライゲーションステップにおいて第３のアダプタを前記ＭｌｙＩ消化された第２のアダプタライゲーションされた断片にライゲーションして、第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第３のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｉ．前記第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｊ．第４のライゲーション反応において、第４のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第４のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
（項目２１０）
前記第２のアダプタが、一本鎖ＤＮＡ分子である、項目２０９に記載の方法。
（項目２１１）
前記第３のアダプタが、二本鎖ＤＮＡ分子である、項目２０９に記載の方法。
（項目２１２）
（ｆ）の前記ライゲーションステップの後、かつＭｌｙＩ消化（ｇ）の前に、前記第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物のＰＣＲ増幅をさらに含む、項目２０９に記載の方法。
（項目２１３）
前記ランダム剪断ステップが、機械的、酵素的または化学的剪断を含む、項目２０９に記載の方法。
（項目２１４）
エキソヌクレアーゼ３が、（ｅ）において前記トップ鎖を分解する、項目２０９に記載の方法。
（項目２１５）
前記第２のライゲーションステップが、高温リガーゼにより実行される、項目２０９に記載の方法。
（項目２１６）
前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、項目２０９に記載の方法。
（項目２１７）
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、項目２０９に記載の方法。
（項目２１８）
前記プロモーター配列が、Ｔ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列およびＴ３プロモーター配列からなる群から選択される、項目２０９に記載の方法。
（項目２１９）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、項目２０９に記載の方法。
（項目２２０）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、項目２１９に記載の方法。
（項目２２１）
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目２０９に記載の方法。
（項目２２２）
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、項目２０９に記載の方法。
（項目２２３）
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、項目２０９に記載の方法。
（項目２２４）
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、項目２０９に記載の方法。
（項目２２５）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．第１のライゲーション反応において環状アダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、環状アダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記環状アダプタが、ＰＡＭ配列に相補的な配列を含む、ステップと、
ｃ．前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物をメチラーゼでメチル化するステップと、
ｄ．前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物をエキソヌクレアーゼで消化するステップと、ｅ．前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物を制限酵素で消化するステップと、
ｆ．第２のライゲーション反応において第２のアダプタを前記環状アダプタＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第２のアダプタが、５’から３’に、ＰＡＭ部位に相補的な配列、ＰＡＭ部位、およびＭｌｙＩ部位を含む、ステップと、
ｇ．前記第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物をＰＣＲ増幅するステップであって、
ＰＣＲプライマーが、前記第２のアダプタの配列または前記第２のアダプタの配列に相補的な配列を含み、ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｈ．前記ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物をＭｌｙＩで消化するステップと、
ｉ．第３のライゲーション反応において第３のアダプタを前記ＰＣＲ増幅された第２のアダプタＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、第３のアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップであって、
前記第３のアダプタが、ＦｏｋＩ部位およびＭｍｅＩ部位を含み、
前記ＭｍｅＩ部位が、ライゲーション後に前記ＦｏｋＩ部位および前記ＤＮＡ断片の間に位置する、ステップと、
ｊ．前記第３のアダプタライゲーションされた断片の収集物を、第１にＭｍｅＩで、第２にＦｏｋＩで消化して、Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｋ．第４のライゲーション反応において、第４のアダプタを前記Ｎ２０  ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションするステップであって、
前記第４のアダプタをコードする配列が、プロモーター配列および核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列を含み、
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ライゲーション後に前記Ｎ２０配列および前記プロモーターの間に位置する、ステップと
を含む方法。
（項目２２６）
前記ランダム剪断ステップが、機械的、酵素的または化学的剪断を含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２２７）
前記エキソヌクレアーゼが、ラムダエキソヌクレアーゼを含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２２８）
前記メチラーゼが、ＥｃｏＧＩＩメチルトランスフェラーゼを含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２２９）
前記第２のライゲーションステップが、高温リガーゼを含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２３０）
前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２３１）
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２３２）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、項目２２５に記載の方法。
（項目２３３）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、項目２３２に記載の方法。
（項目２３４）
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目２２６に記載の方法。
（項目２３５）
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２３６）
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２３７）
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、項目２２５に記載の方法。
（項目２３８）
核酸の収集物を作製する方法であって、
ａ．ＤＮＡ試料をランダムに剪断して、ＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｂ．前記ＤＮＡ断片の収集物をＴ７エキソヌクレアーゼで消化するステップと、
ｃ．前記ＤＮＡ断片の収集物にアダプタをアニールするステップであって、
前記アダプタが、５’から３’に、５’リン酸、１２塩基対ランダム配列、プロモーター配列、核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列、ＦｏｋＩ制限部位、ＦｏｋＩ制限部位に相補的な配列、ＰＡＭ配列、および８塩基対ランダム配列を含む、ステップと、
ｄ．前記アダプタを前記ＤＮＡ断片の収集物にライゲーションして、アダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｅ．前記アダプタＤＮＡ断片の収集物をＤＮＡエキソヌクレアーゼで処理するステップと、
ｆ．前記アダプタＤＮＡ断片の収集物に、前記ＦｏｋＩ部位の配列および前記ＦｏｋＩ部位に相補的な配列に相補的な配列を含む一本鎖ＤＮＡをアニールするステップと、
ｇ．ＦｏｋＩで消化して、ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片の収集物を産生するステップと、
ｈ．前記ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片をリガーゼで自己環状化するステップと
を含む方法。
（項目２３９）
ＰＣＲ増幅をさらに含む、項目２３８に記載の方法。
（項目２４０）
前記ＰＣＲ増幅が、ローリングサークルＰＣＲ反応を含む、項目２３９に記載の方法。
（項目２４１）
前記ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片を線状にするステップをさらに含む、項目２３８に記載の方法。
（項目２４２）
前記ＦｏｋＩ消化されたアダプタＤＮＡ断片が、少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素により直鎖化される、項目２４１に記載の方法。
（項目２４３）
前記少なくとも１種のＤＮＡ修復酵素が、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）およびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを含む、項目２４２に記載の方法。
（項目２４４）
ＰＣＲ増幅をさらに含む、項目２４２または２４３に記載の方法。
（項目２４５）
前記ＰＡＭ部位が、Ｃｐｆ１系タンパク質と適合性であるＰＡＭ部位を含む、項目２３８に記載の方法。
（項目２４６）
前記ＰＡＭ部位が、ＴＴＮ、ＴＣＮまたはＴＧＮを含む、項目２３８に記載の方法。
（項目２４７）
前記リガーゼが、ＨｉＦｉｄｅｌｉｔｙ  Ｔａｑリガーゼを含む、項目２３８に記載の方法。
（項目２４８）
前記ＤＮＡエキソヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼ１、エキソヌクレアーゼ３、またはそれらの組合せを含む、項目２３８に記載の方法。
（項目２４９）
前記核酸ガイド化ヌクレアーゼ系タンパク質結合配列が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質と適合性である、項目２３８に記載の方法。
（項目２５０）
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系タンパク質が、Ｃｐｆ１系タンパク質である、項目２４９に記載の方法。
（項目２５１）
前記ＤＮＡ試料が、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目２３８に記載の方法。
（項目２５２）
前記ＤＮＡ試料が、ヒトＤＮＡを含む、項目２３８に記載の方法。
（項目２５３）
前記ＤＮＡ試料が、宿主ＤＮＡを含む、項目２３８に記載の方法。
（項目２５４）
前記ＤＮＡ試料が、真核生物ＤＮＡを含む、項目２３８に記載の方法。