【手続補正書】
【提出日】令和3年6月11日(2021.6.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
引用非特許文献
【化３】
2020527938.tif 000001
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
ゲノム中の対象とする配列の部位特異的DNA組換えを誘導することができるDNA組換え酵素の潜在的標的部位となる配列を同定するための方法であって：
i. 該対象とする配列を含む該ゲノム又はその部分を少なくとも5 bp、最大12 bpの長さの潜在的スペーサー配列である2つの配列についてスクリーニングする工程であって、該潜在的スペーサー配列の一方が該対象とする配列の上流にあり、かつ該潜在的スペーサー配列の他方が該対象とする配列の下流にあり、かつ該2つの配列が100 kbの最大距離及び150 bpの最小距離をとる、前記工程；
ii.  各々の潜在的スペーサー配列について、それらの一方の側の隣接するヌクレオチド、好ましくは10〜20ヌクレオチドが、潜在的第1の部分部位を形成すること、及び他方の側の隣接するヌクレオチド、好ましくは10〜20ヌクレオチド、より好ましくは12〜15ヌクレオチドが、潜在的第2の部分部位を形成することを決定することによって該潜在的標的部位を同定する工程であって、ここで両方の潜在的部分部位及びそれらの間の該スペーサー配列により該潜在的標的部位が形成される、前記工程、を含み、
iii.  工程ii.で同定された該潜在的標的部位をさらにスクリーニングして、宿主ゲノム中の（どこにも）出現せず、そのために配列特異的欠失が保証される潜在的標的配列を選択する、前記方法。
（態様２） 
部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えることにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を改変することができるデザイナーDNA組換え酵素を調製するための方法であって：
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5〜12ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10〜20ヌクレオチドの第1の部分部位及び第2の部分部位を含み、態様1記載の工程を工程a)の前に、又はその部分として実施する、前記工程；
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクターを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用する工程を含み、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つの該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。
（態様３） 
前記DNA組換え酵素が欠失に好適であり、かつ前記（潜在的）スペーサー配列が同一である、態様1又は2記載の方法。
（態様４） 
前記DNA組換え酵素が置換に好適であり、かつ前記（潜在的）スペーサー配列が同一でない、態様1又は2記載の方法。
（態様５） 
部位特異的DNA組換えを誘導してゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えることにより、該ゲノム中のヌクレオチド配列を置換することができるデザイナーDNA組換え酵素を調製するための方法であって：
a) 改変すべきヌクレオチド配列の上流のヌクレオチド配列を第1の標的部位として、及び該改変すべきヌクレオチド配列の下流のヌクレオチド配列を第2の標的部位として選択する工程であって、ここで、これら標的部位の配列は同一でなく、各々の標的部位が5〜12ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた各々10〜20ヌクレオチドの第1の部分部位及び第2の部分部位を含む、前記工程
b) a)において基質として選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含むベクターを使用して、DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリに分子指向性進化法を適用する工程を含み、
ここで工程bは、ベクター及び合成配列間の組換えを選択するために該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含む該合成配列の存在下実施され、
a)で選択した該第1の標的部位及び該第2の標的部位に対し活性を有する少なくとも1つの該デザイナーDNA組換え酵素を得るまでこれを行う、前記方法。
（態様６） 
前記改変すべきヌクレオチド配列が突然変異、特に点突然変異、フレームシフト突然変異、欠失、又は挿入を含む配列である、態様1〜5のいずれか1項記載の方法。
（態様７） 
工程b)で使用する前記ベクターが前記DNA組換え酵素の少なくとも1つのライブラリをコードし、かつ前記第1及び第2の標的部位の間にあるネガティブ選択マーカー、より好ましくは制限酵素の少なくとも1つの固有の認識部位を含む、発現ベクターである、態様1〜6のいずれか1項記載の方法。
（態様８） 
前記合成配列が前記第1及び第2の標的部位の間にあるポジティブ選択マーカーを含む、置換に好適なデザイナーDNA組換え酵素を調製するための態様5〜7のいずれか1項記載の方法。
（態様９） 
工程b)を3つの副工程：
i) 前記少なくとも1つのライブラリを人工配列なしで進化させる副工程；
ii) 工程i)の結果として得られる該少なくとも1つのライブラリを、ポジティブ選択マーカーを有する人工配列を使用して進化させる副工程；
iii) 工程ii)の結果として該少なくとも1つのライブラリをポジティブ選択マーカーを有さない人工配列を用いて得る副工程、で実施する、置換に好適なデザイナーDNA組換え酵素を調製するための態様5〜8のいずれか1項記載の方法。
（態様１０） 
態様1〜9のいずれか1項記載の方法により取得することができる、デザイナーDNA組換え酵素。
（態様１１） 
少なくとも2つの異なる単量体を含み、ここで前記酵素が前記ゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組換えることにより宿主生物の該ゲノム中での前記部位特異的DNA組換えを誘導することができ、前記標的部位の配列が同一でなく、好ましくは態様1〜9のいずれか1項記載の方法によって取得することができる、好ましくは態様10記載のデザイナーDNA組換え酵素。
（態様１２） 
単量体が配列番号：1（Rec F9-1）による配列、あるいは配列番号1、又は好ましくは配列番号：28、配列番号：3、若しくは配列番号：5と少なくとも95%の配列同一性、好ましくは98%の配列同一性を有する配列を含み、かつ単量体が配列番号：2（Rec F9-2）による配列、あるいは配列番号：2、又は好ましくは配列番号：29、配列番号：4、若しくは配列番号：6と少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98%の配列同一性を有する配列を含む、態様10又は11記載のデザイナーDNA組換え酵素。 
（態様１３） 
配列番号：1（Rec F9-1）、及び/若しくは配列番号：2（Rec F9-2）、若しくは配列番号：36（Rec F9-3）、若しくは配列番号：46（Hex-R-#7）、及び/若しくは配列番号：47（Hex-L-#7）、若しくは配列番号：48（Hex-R-#30）、及び/若しくは配列番号：49（Hex-L-#30）による配列、配列番号：1及び/若しくは2、若しくは配列番号：36、若しくは配列番号：46、及び/若しくは配列番号：47、若しくは配列番号：48、及び/若しくは配列番号：49と、又は好ましくは配列番号：28、29、若しくは3〜6から選択される少なくとも1つの配列と、少なくとも90%の配列同一性、好ましくは95%の配列同一性、より好ましくは98%の配列同一性を有する配列を含む、デザイナーDNA組換え酵素。
（態様１４） 
対象とするヌクレオチド配列を改変するための部位特異的DNA組換えが、第1の標的部位及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中で誘導され、両方の標的部位が該ゲノム中に天然に出現し、かつそれらが前記デザイナーDNA組換え酵素又は該DNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一とはならず、ここで該標的部位が前記対象とする配列を縁取っており、各々の標的部位が5〜12ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた10〜20ヌクレオチドの第1の部分部位及び第2の部分部位を含む、医薬における使用のための態様10〜13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素、態様9〜11のいずれか1項記載のDNA組換え酵素をコードする医薬における使用のための核酸又はベクター。
（態様１５） 
両方の標的部位が同一のスペーサー配列を含み、組換えにより前記対象とする配列が欠失する、態様14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え酵素又は核酸又はベクター。
（態様１６） 
両方の標的部位が同一でないスペーサー配列を含み、さらに所望の配列を縁取る両方の標的部位を含む合成ドナー配列を提供し、組換えにより前記対象とする配列が該所望の配列によって置換される、態様14記載の医薬における使用のためのデザイナーDNA組換え酵素又は核酸又はベクター。
（態様１７） 
態様10〜13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素をコードする核酸又はベクター。
（態様１８） 
配列番号：7（loxF9a）及び配列番号：8（loxF9b）、配列番号：7若しくは8との少なくとも90%の配列同一性を有する配列、又はこれらに逆相補的な核酸配列から選択される核酸。
（態様１９） 
態様17若しくは18記載の核酸若しくはベクターを含む宿主細胞、宿主臓器、若しくは非ヒト宿主生物、及び/又は態様10〜13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素。
（態様２０） 
第1の標的部位及び第2の標的部位を組換えることによりゲノム中の対象とするヌクレオチド配列を改変し、ここで両方の標的部位は該ゲノム中に天然に出現し、かつそれらが態様10〜13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様10〜13のいずれか1項記載のDNA組換え酵素をコードする核酸若しくはベクターを導入することにより同一とはならない、前記部位特異的DNA組換えを誘導する方法。
（態様２１） 
そのスペーサー配列が異なる前記第1及び第2の標的部位を選択すること、及び該第1の標的部位及び該第2の標的部位を含む合成配列をさらに提供することにより前記対象とするヌクレオチド配列の置換を誘導し、ここで該第1及び第2の標的部位が所望の配列を縁取っており、又は同一のスペーサー配列を含む該第1及び第2の標的部位を選択することによって該対象とするヌクレオチド配列の欠失を誘導する、態様20記載の方法。
（態様２２） 
ゲノム中に天然に出現する2つの標的配列を組み換えることによる、部位特異的DNA組換えにより、該ゲノム中の対象とする配列を置換するためのキットであって：
―態様10〜13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様17若しくは18記載の核酸若しくはベクター；
―前記第1の標的部位及び前記第2の標的部位に隣接する前記対象とする配列と置換する、所望の配列を含む合成配列、を含む、前記キット。
（態様２３） 
2つの認識部位の間の部位特異的DNA組換えを触媒する、態様10〜13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素の使用。
（態様２４）
前記対象とする配列をノックアウトされ、又は改変された配列を有する細胞又は多細胞生物を作製する、態様23記載の使用。
（態様２５）
前記標的部位が配列番号：7（loxF9a）及び配列番号：8（loxF9b）と同一であるか、又はこれらに逆相補的である配列から選択される、態様23記載の使用。
（態様２６） 
態様10〜13のいずれか1項記載のデザイナーDNA組換え酵素又は態様9記載の核酸若しくはベクターを含む、医薬組成物。