【手続補正書】
【提出日】令和3年1月26日(2021.1.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含み、前記ＲＴＳのうちの２つがＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている哺乳動物細胞。
【請求項２】
２つの別個のＲＴＳを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記２つの別個のＲＴＳが、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
４つの別個のＲＴＳを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記４つの別個のＲＴＳが、同じ座位において染色体に組み込まれている、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
６つの別個のＲＴＳを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項７】
少なくとも４つの別個のＲＴＳが、同じ座位において染色体に組み込まれている、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
少なくとも２つの別個のＲＴＳが、別々の座位において染色体に組み込まれている、請求項４又は６に記載の細胞。
【請求項９】
前記別々の座位がＦｅｒ１Ｌ４座位である、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ＲＴＳの少なくとも１つが、ｆｒｔ部位、ｌｏｘ部位、ｒｏｘ部位又はａｔｔ部位である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記ＲＴＳの少なくとも１つが、配列番号１〜３０からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞、ＨＥＫ細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３】
第１の目的遺伝子をさらに含み、前記第１の目的遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記第１の目的遺伝子が、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
前記治療目的遺伝子が、Ｆｃ融合タンパク質、酵素、膜受容体又はモノクローナル抗体からなる群から選択される発現困難タンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記第１の目的遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
第２の目的遺伝子をさらに含み、前記第２の目的遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
前記第１の目的遺伝子がＮＬ１座位内に位置し、前記第２の目的遺伝子がＮＬ２座位内に位置する、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
第３の目的遺伝子をさらに含み、前記第３の目的遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
ａ．前記第１の目的遺伝子、前記第２の目的遺伝子及び前記第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＬ１座位内にあり、
ｂ．前記第１の目的遺伝子、前記第２の目的遺伝子及び前記第３の目的遺伝子のうちの少なくとも１つが、ＮＬ２座位内にある、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞であって、
ａ．ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、
ｂ．（ａ）の少なくとも２つのＲＴＳの間に組み込まれている第１の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、発現困難タンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、前記第１の目的遺伝子と、
ｃ．（ａ）の座位とは別の第２の染色体座位内に組み込まれている第２の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、発現困難タンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、前記第２の目的遺伝子と
を含む、哺乳動物細胞。
【請求項２２】
少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞であって、
ａ．Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、
ｂ．ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳと、
ｃ．Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている第１の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、発現困難タンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、前記第１の目的遺伝子と、
ｄ．（ｂ）のＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている第２の目的遺伝子であって、レポーター遺伝子、発現困難タンパク質をコードする遺伝子、補助的遺伝子又はそれらの組合せを含む、前記第２の目的遺伝子と
を含む、哺乳動物細胞。
【請求項２３】
少なくとも６つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞であって、
ａ．Ｆｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第１の目的遺伝子と、
ｂ．ＮＬ１座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つの別個のＲＴＳ及び第２の目的遺伝子と、
ｃ．ＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている少なくとも２つのＲＴＳ及び第３の目的遺伝子と
を含む、哺乳動物細胞。
【請求項２４】
組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法であって、
ａ．少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、
少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ２座位内において染色体に組み込まれているか、又は少なくとも２つの別個のＲＴＳがＦｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位又はＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、
ｂ．（ａ）の前記細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターとをトランスフェクトするステップと、
ｃ．ＮＬ１座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ２座位内に第２の交換可能なカセットを組み込むか、又はＦｅｒ１Ｌ４座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ１座位又はＮＬ２座位内に第２の交換可能なカセットを組み込むステップと、
ｄ．染色体に組み込まれた前記第１の交換可能なカセット及び前記第２の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
組換えタンパク質プロデューサー細胞を生産する方法であって、
ａ．少なくとも少なくとも６つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）及び部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子を含み、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＦｅｒ１Ｌ４座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ１座位内において染色体に組み込まれ、少なくとも２つの別個のＲＴＳがＮＬ２座位内において染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、
ｂ．（ａ）の前記細胞に、第１の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第１のベクターと、第２の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第２のベクターと、第３の目的遺伝子をコードする交換可能なカセットを含む第３のベクターとをトランスフェクトするステップと、
ｃ．Ｆｅｒ１Ｌ４座位内に第１の交換可能なカセットを、ＮＬ１座位内に第２の交換可能なカセットを、ＮＬ２座位内に第３の交換可能なカセットを組み込むステップと、
ｄ．染色体に組み込まれた前記第１の交換可能なカセット、前記第２の交換可能なカセット及び前記第３の交換可能なカセットを含む組換えタンパク質プロデューサー細胞を選択するステップと
を含む方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
フェーズ３：ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞株の分泌能力の増加を目的とする内因性タンパク質の発現は、生成物の力価を増加させる確立されたアプローチである。国際公開第２０１５／０１８７０３Ａ１号から同定される候補、並びに表１０、１１及び１２のそれらを、多部位ＳＳＩ細胞株において評価した。この概念を試験するため、ランディングパッドＡを標的とするエタナーセプトを発現するベクター（図１４Ａ、Ｂ及びＣ：ｐＴＣ１）を構築した。これを別々にＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主（図１４）にトランスフェクトし、プールをグルタミンフリー培地において、選択（２回）した（詳細なトランスフェクション方法は実施例２を参照）。ｐＣＭ３９からｐＣＭ４５は、ヒトサイトメガロウイルスの主要初期（ｈＣＭＶ）プロモーター（その第１イントロンＡを有する）の制御下の補助的遺伝子の発現ユニット、及び標的ランディングパッドＢを含む（図１４）（表１１及び１２）。ｐＣＭ３９−４２において、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１（Ｓｃｄ１）及びステロール制御エレメント結合タンパク質１（ＳＲＥＢＦ１）のバリアントにより、ＮＬ１座位をターゲッティングした。ｐＣＭ４３、４４及び４５において、配列ｇｂ：ＣＱ８７１８２７からのｃ−末端ＰＥＳＴ配列（配列番号３８）を有する半減期の短いＧＦＰ（又はｄｓＧＦＰ）を構築し、また３’ＵＴＲにＣＰＥＢ２Ａ（ｐＣＭ４３）、ＣＥＰＢ２Ｂ（ｐＣＭ４４）及びＳＲＰα（ｐＣＭ４５）のためのｍｉＲ標的配列を６コピー挿入した。これらのターゲッティングベクターは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥＯ）を含み、二重のｐＴＣ０１トランスフェクション済みプールに各ベクターで（ｐＭＦ４と共に）トランスフェクトした２４時間後、４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充した培地を用いて選択を行った。プール回収の成功及び少なくとも１回の継代培養の後、８バッチ培養を行った。Ｖｉｃｅｌｌセルカウンターを用い、生細胞濃度を４、６及び８日目に測定し、回収時の分泌されたｍＡｂの濃度をプロテインＡセンサーを用いたＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔにより測定した。生細胞濃度（ＩＶＣＣ）、細胞特異的生産率（回収時ｑＰ）及び分泌されたエタナーセプト濃度の全体を示す（図１５を参照）。これらのデータは、マウスＳＣＤ１（ｍＳＣＤ１）の発現及びＣＥＰＢ２Ａ（ｄｓＧＦＰ＿６ｎ  ＣＰＥＢ２Ａ）、ＣＰＥＢ２Ｂ（ｄｓＧＦＰ＿６ｎ  ＣＰＥＢ２Ｂ）及びＳＲＰα（ｄｓＧＦＰ＿６ｎ  ＳＲＰα）ｍｉＲ結合部位を３’ＵＴＲに担持するスポンジベクターによるエタナーセプトの分泌量増加を示すものであった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
【表１１】
2020511954.tif 000001
【表１２】
2020511954.tif 000002
実施例５：ＣＨＯＫ１ＳＶとＨＥＫ２９３細胞株との間の座位の転移
[00136]ＨＥＫ２９３  ＳＳＩ宿主を生成するため、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  （ＵＣＳＣ）ヒトゲノムデータベースのスタンドアロンコピー（バージョン：２００６年３月（ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８））を使用し、ＣＨＯＫ１ＳＶ由来のベクター組込み部位、及びランディングパッド位置を、ヒトゲノムに対してＢＬＡＴ検索した。ＣＨＯＫ１ＳＶ配列の少なくとも２５塩基対において、９５％（以上）の配列類似性が同定された。類似の領域を、ＩＧＶビューア（Ｂｒｏａｄ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．４）で視覚化した。社内のＣｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９デザインツールを使用して、Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９  ｇＲＮＡをデザインした。ＣＨＯＫ１ＳＶ及びＨＥＫ２９３の座位を表１にまとめる。