【手続補正書】
【提出日】令和3年5月7日(2021.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスフェクションマスターミックスを調製する方法であって、
（１）ＤＮＡ溶液およびトランスフェクション試薬溶液を混合容器に導入して、トランスフェクションマスターミックスを作製するステップと、
（２）前記トランスフェクションマスターミックス中のＤＮＡが定常状態濃度に達するのに十分な時間、機械的揺動デバイスにより前記混合容器を揺動させるステップと、
（３）インキュベーション時間の間、前記トランスフェクションマスターミックスをインキュベートするステップであって、前記インキュベーション時間の間、前記トランスフェクションマスターミックスが実質的に静止している、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記インキュベーション時間が、５〜１８０分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合容器が、単回使用の使い捨て容器、あらかじめ無菌化した容器、プラスチックバッグ、または単回使用の細胞培養バッグである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記バッグが、膨張させたものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記バッグが、完全に、または部分的に膨張させたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスフェクション試薬溶液が、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、活性化デンドリマー、およびカチオン性脂質からなる群より選択される化学的トランスフェクション試薬を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスフェクション試薬溶液が、カチオン性ポリマーを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミンである、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリエチレンイミンが、１ｋＤａ〜１６０ｋＤａの間、または４ｋＤａ〜４０ｋＤａの間の平均分子量を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ溶液および／または前記トランスフェクション試薬が、無菌である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ溶液を前記混合容器に導入する前に前記ＤＮＡ溶液を無菌化するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡ溶液が、濾過滅菌により無菌化される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トランスフェクション試薬溶液を前記混合容器に導入する前に前記トランスフェクション試薬溶液を無菌化するステップをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記トランスフェクション試薬溶液が、濾過滅菌により無菌化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記機械的揺動デバイスが、揺動プラットフォームを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記混合容器が、前記揺動ステップにおいて前記揺動プラットフォームの上部に配置される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記揺動させるステップが、
ｉ．１自由度におけるものである、かつ／または
ｉｉ．前記トランスフェクションマスターミックスにおいて波動運動を誘導するのに十分である、
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記揺動させるステップが、５〜１５度の範囲、約１２度、または約５度の所定の角度におけるものである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記揺動させるステップが、所定の速度におけるものである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記所定の速度が、１〜３０ｒｐｍの間、５〜２５ｒｐｍの間、約１０ｒｐｍ、約１２ｒｐｍ、または約１５ｒｐｍである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、（ａ）１Ｌもしくはそれよりも大きい、３Ｌもしくはそれよりも大きい、１２Ｌもしくはそれよりも大きい、１５Ｌもしくはそれよりも大きい、２５Ｌもしくはそれよりも大きい、５０Ｌもしくはそれよりも大きい、または１００Ｌもしくはそれよりも大きい、あるいは（ｂ）１Ｌ〜１００Ｌの間である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１Ｌ、３Ｌ、１２Ｌ、１５Ｌ、２５Ｌ、または２９Ｌである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
揺動時間が、５分もしくはそれ未満、約２分、または約１分である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記インキュベーション時間が、１０〜６０分の間、２０〜３０分の間、または１０〜２０分の間である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、４Ｌであり、前記所定の角度が、７度であり、前記所定の速度が、１０ｒｐｍであり、揺動持続時間が、１〜２分である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１２Ｌであり、前記所定の角度が、１２度であり、前記所定の速度が、１５ｒｐｍであり、揺動持続時間が、１〜２分である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ溶液が、プラスミドＤＮＡから本質的になるＤＮＡを含む、かつ／または前記ＤＮＡ溶液が、ｃｉｓプラスミド、ｔｒａｎｓ−ｒｅｐ−ｃａｐプラスミド、およびヘルパープラスミドの群から選択されるプラスミドを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ溶液および前記トランスフェクション試薬溶液を前記混合容器に導入するステップが、無菌的に達成される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
複数の細胞をトランスフェクトする方法であって、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法により生成されたトランスフェクションマスターミックスと前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
【請求項３０】
前記細胞が、バイオリアクターに配置され、前記方法が、前記マスターミックスを前記バイオリアクターに無菌的に導入するステップをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記マスターミックスが、ポンプ、または１バッチもしくは複数バッチを伴う重力送りにより前記バイオリアクターに導入される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生成する方法であって、ｒＡＡＶを生成可能な細胞に、請求項２７に記載の方法により生成されたトランスフェクションマスターミックスをトランスフェクトするステップを含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
均等物
本発明は、その趣旨または本質的特徴から逸脱することなく、特定の他の形態において実施することができる。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載の発明を制限するのではなく、あらゆる点で例示的であると考えられる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく、添付の特許請求の範囲により示され、本特許請求の範囲の均等性の意義および範囲において生じるすべての変更は、その特許請求の範囲に包含することを意図する。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
トランスフェクションマスターミックスを調製する方法であって、
（１）ＤＮＡ溶液およびトランスフェクション試薬溶液を混合容器に導入して、トランスフェクションマスターミックスを作製するステップと、
（２）前記トランスフェクションマスターミックス中のＤＮＡが定常状態濃度に達するのに十分な時間、機械的揺動デバイスにより前記混合容器を揺動させるステップと、
（３）インキュベーション時間の間、前記トランスフェクションマスターミックスをインキュベートするステップであって、前記インキュベーション時間の間、前記トランスフェクションマスターミックスが実質的に静止している、ステップと
を含む、方法。
（項目２）
前記インキュベーション時間が、５〜１８０分である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記混合容器が、単回使用の使い捨て容器である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記混合容器が、あらかじめ無菌化したものである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記混合容器が、プラスチックバッグである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記混合容器が、単回使用の細胞培養バッグである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記バッグが、膨張させたものである、項目４または５に記載の方法。
（項目８）
前記バッグが、完全に膨張させたものである、項目６に記載の方法。
（項目９）
前記バッグが、部分的に膨張させたものである、項目６に記載の方法。
（項目１０）
前記トランスフェクション試薬溶液が、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、活性化デンドリマー、およびカチオン性脂質からなる群より選択される化学的トランスフェクション試薬を含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記トランスフェクション試薬溶液が、カチオン性ポリマーを含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（項目１２）
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミンである、項目１０または１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ポリエチレンイミンが、１ｋＤａ〜１６０ｋＤａの間の平均分子量を有する、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ポリエチレンイミンが、４ｋＤａ〜４０ｋＤａの間の平均分子量を有する、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記ＤＮＡ溶液が、無菌である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１６）
前記トランスフェクション試薬溶液が、無菌である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１７）
前記ＤＮＡ溶液を前記混合容器に導入する前に前記ＤＮＡ溶液を無菌化するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目１８）
前記ＤＮＡ溶液が、濾過滅菌により無菌化される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記トランスフェクション試薬溶液を前記混合容器に導入する前に前記トランスフェクション試薬溶液を無菌化するステップをさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記トランスフェクション試薬溶液が、濾過滅菌により無菌化される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記機械的揺動デバイスが、揺動プラットフォームを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２２）
前記混合容器が、前記揺動ステップにおいて前記揺動プラットフォームの上部に配置される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記揺動させるステップが、１自由度におけるものである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２４）
前記揺動させるステップが、前記トランスフェクションマスターミックスにおいて波動運動を誘導するのに十分である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２５）
前記揺動させるステップが、５〜１５度の範囲の所定の角度におけるものである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２６）
前記揺動させるステップが、約１２度の所定の角度におけるものである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記揺動させるステップが、約５度の所定の角度におけるものである、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
前記揺動させるステップが、所定の速度におけるものである、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目２９）
前記所定の速度が、１〜３０ｒｐｍの間である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記所定の速度が、５〜２５ｒｐｍの間である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記所定の速度が、約１０ｒｐｍである、項目２８に記載の方法。
（項目３２）
前記所定の速度が、約１２ｒｐｍである、項目２８に記載の方法。
（項目３３）
前記所定の速度が、約１５ｒｐｍである、項目２８に記載の方法。
（項目３４）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１Ｌまたはそれよりも大きい、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３５）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、３Ｌまたはそれよりも大きい、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３６）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１２Ｌまたはそれよりも大きい、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１５Ｌまたはそれよりも大きい、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３８）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、２５Ｌまたはそれよりも大きい、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３９）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、５０Ｌまたはそれよりも大きい、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４０）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１００Ｌまたはそれよりも大きい、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４１）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１Ｌ〜１００Ｌの間である、項目１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
（項目４２）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１Ｌである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、３Ｌである、項目４１に記載の方法。
（項目４４）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１２Ｌである、項目４１に記載の方法。
（項目４５）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１５Ｌである、項目４１に記載の方法。
（項目４６）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、２５Ｌである、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、２９Ｌである、項目４１に記載の方法。
（項目４８）
揺動時間が、５分またはそれ未満である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目４９）
前記揺動時間が、約２分である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記揺動時間が、約１分である、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記インキュベーション時間が、１０〜６０分の間である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５２）
前記インキュベーション時間が、２０〜３０分の間である、項目５１に記載の方法。
（項目５３）
前記インキュベーション時間が、１０〜２０分の間である、項目５１に記載の方法。
（項目５４）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、４Ｌであり、前記所定の角度が、７度であり、前記所定の速度が、１０ｒｐｍであり、揺動持続時間が、１〜２分である、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５５）
前記トランスフェクションマスターミックスの容量が、１２Ｌであり、前記所定の角度が、１２度であり、前記所定の速度が、１５ｒｐｍであり、揺動持続時間が、１〜２分である、項目１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
（項目５６）
前記ＤＮＡ溶液が、プラスミドＤＮＡから本質的になるＤＮＡを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５７）
前記ＤＮＡ溶液が、ｃｉｓプラスミド、ｔｒａｎｓ−ｒｅｐ−ｃａｐプラスミド、およびヘルパープラスミドの群から選択されるプラスミドを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５８）
前記ＤＮＡ溶液および前記トランスフェクション試薬溶液を前記混合容器に導入するステップが、無菌的に達成される、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目５９）
複数の細胞をトランスフェクトする方法であって、前記項目のいずれかに記載の方法により生成されたトランスフェクションマスターミックスと前記細胞を接触させるステップを含む、方法。
（項目６０）
前記細胞が、バイオリアクターに配置され、前記方法が、前記マスターミックスを前記バイオリアクターに無菌的に導入するステップをさらに含む、項目５９に記載の方法。
（項目６１）
前記マスターミックスが、ポンプ、または１バッチもしくは複数バッチを伴う重力送りにより前記バイオリアクターに導入される、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生成する方法であって、ｒＡＡＶを生成可能な細胞に、項目５７に記載の方法により生成されたトランスフェクションマスターミックスをトランスフェクトするステップを含む、方法。