【手続補正書】
【提出日】令和2年12月1日(2020.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の遺伝子モジュレーターであって、
該ＭＡＰＴ遺伝子内の配列番号１〜６、３３、および４４〜４５のいずれかの少なくとも１２個のヌクレオチドの標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン、および
転写制御ドメインまたはヌクレアーゼドメイン
を含む遺伝子モジュレーター。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬ−エフェクタードメインタンパク質（ＴＡＬＥ）、または単鎖ガイドＲＮＡを含む、請求項１に記載の遺伝子モジュレーター。
【請求項３】
前記転写制御ドメインが、抑制ドメインまたは活性化ドメインを含む、請求項１または請求項２に記載の遺伝子モジュレーター。
【請求項４】
前記遺伝子モジュレーターが、ヒト細胞内のＭＡＰＴ遺伝子を調節する、請求項１から３のいずれか一項に記載の遺伝子モジュレーター。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載の遺伝子モジュレーターをコードするポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子送達ビヒクル。
【請求項７】
ＡＡＶベクターを含む、請求項６に記載の遺伝子送達ビヒクル。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一項に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、請求項５に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、および／または請求項６または７に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項９】
前記遺伝子モジュレーターが、ヌクレアーゼドメインを含み、該遺伝子モジュレーターが、前記ＭＡＰＴ遺伝子を切断する、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
切断された前記ＭＡＰＴ遺伝子に組み込まれるドナー分子をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１から４のいずれか一項に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、請求項５に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、請求項６または７に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、および／または請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を含む単離細胞。
【請求項１２】
対象のＭＡＰＴ発現を調節するための医薬の製造のための、請求項１から４のいずれか一項に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、請求項５に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、請求項６または７に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、および／または請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
請求項１から４のいずれか一項に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、請求項５に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、請求項６または７に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物、および使用のための指示を含むキット。
【請求項１４】
対象のＭＡＰＴ発現を調節するための、請求項１から４のいずれか一項に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーターを含む組成物、請求項５に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む組成物、請求項６または７に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクルを含む組成物、および／または請求項８から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ＭＡＰＴ発現が前記対象において抑制される、請求項１４に記載の組成物または医薬組成物。
【請求項１６】
前記組成物または医薬組成物が、脳室内、髄腔内、頭蓋内、静脈内、後眼窩的、または槽内で前記対象に投与されることを特徴とする、請求項１４または１５に記載の組成物または医薬組成物。
【請求項１７】
前記対象中のＭＡＰＴ発現の抑制が、タウオパチーを処置および／または予防する、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の組成物または医薬組成物。
【請求項１８】
前記対象中のタウの量が低減される、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の組成物または医薬組成物。
【請求項１９】
前記対象がヒトである、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の組成物または医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
また、本明細書に記載のようなタウモジュレーターの成分を含むおよび／またはタウモジュレーター（またはその成分）をコードするＡＡＶタウモジュレーター（例えば、リプレッサー）および／またはポリヌクレオチドの１つまたは複数を含むキットが提供される。キットは、細胞（例えば、ニューロン）、（例えば、例えばＣＳＦにおいてタウタンパク質を検出および／または定量化するための）試薬、および／または本明細書に記載のような方法を含むその使用のための説明書をさらに含んでいてもよい。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
微小管結合タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）遺伝子の遺伝子モジュレーターであって、
該ＭＡＰＴ遺伝子の少なくとも１２個のヌクレオチドの標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン、および
転写制御ドメインまたはヌクレアーゼドメイン
を含む遺伝子モジュレーター。
（項目２）
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、ＴＡＬ−エフェクタードメインタンパク質（ＴＡＬＥ）、または単鎖ガイドＲＮＡを含む、項目１に記載の遺伝子モジュレーター。
（項目３）
前記転写制御ドメインが、抑制ドメインまたは活性化ドメインを含む、項目１または項目２に記載の遺伝子モジュレーター。
（項目４）
項目１から３のいずれかに記載の遺伝子モジュレーターをコードするポリヌクレオチド。
（項目５）
項目４に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子送達ビヒクル。
（項目６）
ＡＡＶベクターを含む、項目５に記載の遺伝子送達ビヒクル。
（項目７）
項目１から３に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、項目４に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、および／または項目５または６に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクルを含む医薬組成物。
（項目８）
前記遺伝子モジュレーターが、ヌクレアーゼドメインを含み、該遺伝子モジュレーターが、前記ＭＡＰＴ遺伝子を切断する、項目７に記載の医薬組成物。
（項目９）
切断された前記ＭＡＰＴ遺伝子に組み込まれるドナー分子をさらに含む、項目８に記載の医薬組成物。
（項目１０）
項目１から３に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、項目４に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、項目５または６に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、および／または項目７から９のいずれかに記載の医薬組成物を含む単離細胞。
（項目１１）
対象のＭＡＰＴ発現を調節するための、項目１から３に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、項目４に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、項目５または６に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、および／または項目７から９のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
（項目１２）
ＭＡＰＴ発現が抑制される、項目１１に記載の使用。
（項目１３）
前記対象への投与が、脳室内、髄腔内、頭蓋内、静脈内、後眼窩的、または槽内である、項目１１または１２に記載の使用。
（項目１４）
前記対象中のＭＡＰＴ発現の抑制が、タウオパチーを処置および／または予防する、項目１１から１３のいずれかに記載の使用。
（項目１５）
前記対象中のタウの量が低減される、項目１１から１４のいずれかに記載の使用。
（項目１６）
項目１から３に記載の１つまたは複数の遺伝子モジュレーター、項目４に記載の１つまたは複数のポリヌクレオチド、項目５または６に記載の１つまたは複数の遺伝子送達ビヒクル、項目７から９のいずれかに記載の医薬組成物、および／または使用のための指示を含むキット。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
【図７ＡＢ】図７Ａ〜７Ｄは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンでのｍＲＮＡ（ヒトタウおよびＺＦＰ）レベルを示す。図７Ａは、ヒトおよびマウスＭＡＰＴ標的部位（それぞれ左から右へ、配列番号３１、３２、および４８〜５１）の部分配列を示す模式図である。図７Ｂは、ＡＡＶベクターにより運搬される表示リプレッサーを表示投薬量で投与した１８日後のｉＰＳＣでのｍＲＮＡ発現を示すグラフを示す。図７Ｃは、表示プロモーターを有するＡＡＶベクターにより運搬される表示リプレッサー（５２３６６）を投与した１８日後のｉＰＳＣでのｍＲＮＡ発現を示すグラフを示す。図７Ｄは、ヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいて例示的なＺＦＰ  ＴＦを使用した一連のマイクロアレイプロットであり、ＺＦＰ  ＴＦが高度に特異的であることを示す。細胞を、分析前に１９日間にわたって、ＺＦＰ−ＴＦドナーを含む１Ｅ５のＡＡＶ６に曝露した。
【図７Ｃ】同上。
【図７Ｄ】同上。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
（実施例１）
ＭＡＰＴリプレッサー
本質的に米国特許第６，５３４，２６１号、米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号、第２０１１／００８２０９３号、第２０１３／０２５３０４０号、および第２０１５／０３３５７０８号に記載のように遺伝子操作されたおよそ１８５個のジンクフィンガータンパク質のスクリーニングを実施し、ＺＦＰをそれらのＭＡＰＴ標的部位に結合させた。マウスＭＡＰＴを標的とするジンクフィンガータンパク質５２２８８、５２３２２、５２３６４、５２３６６、５２３８９、５７８８０、５７８９０、および６５８８８（下記の表１〜３を参照）を、さらなる研究のために選択した。６５８８８に関して列挙されているホスフェート接触突然変異体は、以前に記載されている（例えば、米国特許出願第１５／６８５，５８０号を参照）。表１は、これらＺＦＰのＤＮＡ結合ドメインの認識ヘリックスおよびこれらＺＦＰの標的配列を示す。また、１セットのＺＦＰを、マウスおよびヒト遺伝子間で共有されるＭＡＰＴ配列を標的とするように製作した。それらは表２に示されている。表３は、親ＺＦＰ  ＴＦ、および潜在的な非特異的ホスフェート接触を除去するためにＺＦＰ骨格を表示位置で突然変異させた誘導体ＺＦＰ  ＴＦを示す。ＺＦＰは、標準的ＳＥＬＥＸ分析により評価したところ、それらの標的部位に結合することが示された。
表１：マウスＭＡＰＴ特異的リプレッサー設計
【表１】
2020500526.tif 000001
表２：ヒト／マウスＭＡＰＴ特異的リプレッサー設計
【表２】
2020500526.tif 000002
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
骨格領域に突然変異を含むＺＦＰ−ＴＦタウリプレッサーを遺伝子操作した。表３には、例示的ＺＦＰ−ＴＦリプレッサー（およびそれらの親化合物）が表されている。こうした最適化されたＺＦＰ  ＴＦでの結果（例えば、６５８８８〜５７８８０を比較して示した例示的な結果）によると、初代ニューロンでは、活性に影響を及ぼさずに特異性が劇的に（１０倍よりも大きく）向上したことが実証された（タウ抑制、図１Ｂを参照）。さらに、５７８８０親の２つの誘導体６５８８７および６５８８８を、ＢＯＤ１およびＭＯＳＰＤ１オフターゲットの抑制活性について、Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞で試験したところ（図１Ｄを参照）、ＺＦＰ骨格にホスフェート接触突然変異を含むタンパク質では、オフターゲット抑制が低減された。米国特許出願第１５／６８５，５８０号も参照されたい。
【表３−１】
2020500526.tif 000003
【表３−２】
2020500526.tif 000004
（実施例２）
マウスニューロンでのタウ抑制
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】
本明細書に記載のすべてのＺＦＰの標準的ＳＥＬＥＸ特異性分析に基づき、表２および３に列挙されているＺＦＰは、ヒトＭＡＰＴ配列の１つ（ＳＢＳ＃５７８９０およびＳＢＳ＃５２３６６の場合）または２つ（ＳＢＳ＃５７８８０の場合）の非保存的位置でのミスマッチを許容することが予測された（図７Ａ、それぞれ左から右へ、配列番号３１および３２、および４８〜５１を参照）。