【手続補正書】
【提出日】令和3年2月24日(2021.2.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞免疫療法用の操作された免疫細胞を調製するための方法であって、
T細胞を含む細胞の集団を提供する工程；
該T細胞のある割合中に、
（i）少なくとも1種類のNK細胞阻害物質をコードするように、選択された内在性遺伝子座に組み込まれる外来性ポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも1種類の核酸；
（ii）該選択された内在性遺伝子座を特異的に標的とする、少なくとも1種類の配列特異的試薬
を導入する工程
を含み、該外来性ポリヌクレオチド配列が、該内在性遺伝子座中への標的指向遺伝子組込みによって挿入され、かつ
該外来性ポリヌクレオチド配列は少なくとも1つの非多型性クラスI分子、例えば、HLA-GもしくはHLA-E、またはその重鎖エピトープを含むその断片をコードする配列を含む、または、少なくとも1つのウイルスエバシンまたはそのエピトープを含む断片、例えばUL16由来のものをコードする配列を含む、前記方法。
【請求項２】
前記配列特異的試薬がヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記外来性ポリヌクレオチド配列が、前記遺伝子座、例えば、MHC I構成要素、例えばβ2mを発現する遺伝子座に存在する内在性プロモーターの転写制御下に組み込まれる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記外来性配列が、HLA-GもしくはHLA-E、またはその重鎖エピトープを含むその断片をコードする配列を含み、β2m内在性遺伝子座に組み込まれた場合に、その断片のHLA-EまたはHLA-Gとβ2m断片との融合物の発現を結果としてもたらす、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
その断片のHLA-EまたはHLA-Gとβ2m断片との前記融合物が、HLA-EまたはHLA-Gの二量体または三量体の発現を結果としてもたらす、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記外来性配列の前記挿入が、前記内在性遺伝子座でのβ2m発現を不活性化する、請求項3〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記内在性遺伝子座の前記内在性プロモーターが、T細胞活性化に対して応答性であり、例えば表6から選択される1つである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記T細胞がキメラ抗原受容体（CAR）を与えられている、任意で、前記キメラ抗原受容体（CAR）をコードする外来性配列が、TCR遺伝子座に組み込まれる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記キメラ抗原受容体（CAR）をコードする前記外来性配列が、内在性TCR配列の発現を阻止する、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記内在性遺伝子座での前記内在性プロモーターの活性が、前記キメラ抗原受容体（CAR）を通した前記T細胞の活性化に対して応答性である、請求項8または9に記載の方法。
【請求項１１】
前記特異的エンドヌクレアーゼ試薬が、RNAもしくはDNAガイドエンドヌクレアーゼ、例えばCas9もしくはCpf1、RNAもしくはDNAガイド、TALエンドヌクレアーゼ、Znフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記T細胞が、初代細胞、好ましくはヒト初代T細胞である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法によって取得可能である、操作されたT細胞。
【請求項１４】
内在性遺伝子プロモーターの転写制御下に組み込まれている、NK阻害物質をコードする外来性配列を含む、操作されたT細胞であって、
該外来性配列は非多型性クラスI分子、例えば、HLA-GもしくはHLA-E、またはその重鎖エピトープを含むその断片をコードする配列を含む、または、ウイルスエバシンまたはそのエピトープを含む断片、例えばUL16由来のものをコードする配列を含む、前記操作されたT細胞。
【請求項１５】
前記外来性配列が、β2m遺伝子座に組み込まれている、請求項14に記載の操作されたT細胞。
【請求項１６】
前記T細胞がキメラ抗原受容体を与えられている、任意で、遺伝子型[TCR]陰性[β2m]陰性を有する、請求項13〜15のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
【請求項１７】
前記CARをコードする外来性配列が、TCR遺伝子座に組み込まれている、請求項16に記載の操作されたT細胞。
【請求項１８】
前記T細胞が初代細胞である、請求項13〜17のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
【請求項１９】
がんまたは感染症の処置についてのその使用のための、請求項13〜18のいずれか一項に記載の操作されたT細胞。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
本発明はまた、ベクター、ドナー鋳型、試薬、新たなNK阻害物質を特定するためのスクリーニング法、および上記の方法に属する結果として生じた操作された細胞、ならびに治療におけるそれらの使用にも関する。
[本発明1001]
細胞免疫療法用の操作された初代免疫細胞を調製するための方法であって、
T細胞を含む細胞の集団を提供する工程；
該T細胞のある割合中に、
（i）少なくとも1種類のNK細胞阻害物質をコードするように、選択された内在性遺伝子座に組み込まれる外来性ポリヌクレオチド配列を含む、少なくとも1種類の核酸；
（ii）該選択された内在性遺伝子座を特異的に標的とする、少なくとも1種類の配列特異的試薬
を導入する工程
を含み、該外来性ポリヌクレオチド配列が、該内在性遺伝子座中への標的指向遺伝子組込みによって挿入される、前記方法。
[本発明1002]
前記配列特異的試薬がヌクレアーゼである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記標的指向遺伝子組込みが、前記免疫細胞中への相同組換えまたはNHEJによって作動される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記外来性ポリヌクレオチド配列が、前記遺伝子座に存在する内在性プロモーターの転写制御下に組み込まれる、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
前記内在性遺伝子座が、MHC I構成要素、例えばβ2mを発現する遺伝子座である、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記外来性配列の前記挿入が、前記内在性遺伝子座でのβ2m発現を不活性化する、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記内在性プロモーターが、免疫細胞活性化の間に活性を有しているように選択される、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記内在性遺伝子座の前記内在性プロモーターが、T細胞活性化に対して応答性であり、例えば表6から選択される1つである、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記T細胞がキメラ抗原受容体（CAR）を与えられている、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記キメラ抗原受容体（CAR）をコードする外来性配列が、TCR遺伝子座に組み込まれる、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記キメラ抗原受容体（CAR）をコードする前記外来性配列が、内在性TCR配列の発現を阻止する、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記内在性遺伝子座での前記内在性プロモーターの活性が、前記キメラ抗原受容体（CAR）を通した前記T細胞の活性化に対して応答性である、本発明1009〜1011のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記特異的エンドヌクレアーゼ試薬が、RNAもしくはDNAガイドエンドヌクレアーゼ、例えばCas9もしくはCpf1、RNAもしくはDNAガイド、TALエンドヌクレアーゼ、Znフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
NK阻害物質をコードする前記外来性配列が、非多型性クラスI分子、例えば、HLA-GもしくはHLA-E、またはその重鎖エピトープを含むその断片をコードする配列を好ましくは含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
前記外来性配列が、β2m内在性遺伝子座に組み込まれた場合に、その断片のHLA-EまたはHLA-Gとβ2m断片との融合物の発現を結果としてもたらす、本発明1005〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
その断片のHLA-EまたはHLA-Gとβ2m断片との前記融合物が、HLA-EまたはHLA-Gの二量体または三量体の発現を結果としてもたらす、本発明1015の方法。
[本発明1017]
NK阻害物質をコードする前記外来性配列が、ウイルスエバシンまたはそのエピトープを含む断片、例えばUL16（ULBP1とも呼ばれる‐Uniprot参照番号Q9BZM6）由来のものをコードする配列を好ましくは含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1018]
前記T細胞が、初代細胞、好ましくはヒト初代T細胞である、本発明1001〜1017のいずれかの方法。
[本発明1019]
本発明1001〜1018のいずれかの方法によって取得可能である、操作されたT細胞。
[本発明1020]
内在性遺伝子プロモーターの転写制御下に組み込まれている、NK阻害物質をコードする外来性配列を含む、操作されたT細胞。
[本発明1021]
前記内在性遺伝子プロモーターが、表6に列挙される1つの遺伝子座で選択される、本発明1019または1020のいずれかの操作されたT細胞。
[本発明1022]
NK阻害物質をコードする前記外来性配列が、β2m遺伝子座に組み込まれている、本発明1019〜1021のいずれかの操作されたT細胞。
[本発明1023]
前記T細胞がキメラ抗原受容体を与えられている、本発明1019〜1022のいずれかの操作されたT細胞。
[本発明1024]
遺伝子型[TCR]陰性[β2m]陰性を有する、本発明1023の操作されたT細胞。
[本発明1025]
前記CARをコードする外来性配列が、TCR遺伝子座に組み込まれている、本発明1023または1024の操作されたT細胞。
[本発明1026]
前記T細胞が初代細胞である、本発明1019〜1025のいずれかの操作されたT細胞。
[本発明1027]
がんまたは感染症の処置についてのその使用のための、本発明1019〜1026のいずれかの操作されたT細胞。
[本発明1028]
少なくとも30％、好ましくは50％、より好ましくは80％の、本発明1019〜1027のいずれかの操作されたT細胞を含む、治療上有効な免疫細胞の集団。
[本発明1029]
少なくとも30％、好ましくは50％、より好ましくは80％の細胞が、ドナー、好ましくは1人の単一ドナーを起源とする、本発明1028の治療上有効な免疫細胞の集団。
[本発明1030]
50％超の前記免疫細胞が、TCR陰性T細胞である、本発明1029の初代免疫細胞の集団。
[本発明1031]
50％超の前記免疫細胞が、CAR陽性細胞である、本発明1028〜1030のいずれかの初代免疫細胞の集団。
[本発明1032]
本発明1028〜1031のいずれかの操作された免疫細胞集団を含む、薬学的組成物。
[本発明1033]
以下の工程を含む、その必要がある患者を処置するための方法：
本発明1028〜1032のいずれかの操作された初代免疫細胞の集団を調製する工程；
任意で、該操作された初代免疫細胞を精製または選別する工程；
該操作された初代免疫細胞の集団を、該細胞の該患者中への注入時または注入後に活性化する工程。
[本発明1034]
前記患者が、がんについて処置される、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記患者が、感染症について処置される、本発明1033の方法。
[本発明1036]
少なくとも以下の工程を含む、T細胞において発現可能なNK阻害物質をコードする適切な配列を特定するための方法：
TCRおよびβ2mの発現が両方とも抑えられているおよび/または不活性化されているT細胞を提供する工程；
推定のNK阻害物質をコードする候補配列を、該T細胞における内在性プロモーターの制御下の内在性遺伝子座に組み込む工程；
結果として生じた操作されたT細胞を、NK細胞の存在下で培養する工程。
[本発明1037]
少なくとも以下の工程を含む、T細胞において発現可能なNK阻害物質をコードする適切な配列を特定するための方法：
TCR発現が抑えられているかまたは不活性化されているT細胞を提供する工程；
推定のNK阻害物質をコードする候補配列をβ2m遺伝子座に組み込むことによって、該T細胞においてβ2m発現を不活性化する工程であって、該推定のNK阻害物質の発現が、該β2m遺伝子座の内在性プロモーターの転写制御下に置かれる、工程；
結果として生じた操作されたT細胞を、NK細胞の存在下で培養する工程。
[本発明1038]
前記T細胞にキメラ抗原受容体を与える工程
をさらに含む、本発明1036または1037の方法。
[本発明1039]
前記結果として生じた操作されたT細胞の生存を、前記候補配列を発現しない同じものと比較する工程；
任意で、NK細胞に対してより耐性である操作された細胞を選択する工程
をさらに含む、本発明1036〜1038のいずれかの方法。