【手続補正書】
【提出日】平成16年12月24日(2004.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
請求項１に記載のピリミジン特異的５’−ヌクレオチダーゼまたは請求項２に記載のポリペプチドの５’−ヌクレオチダーゼ活性を阻害することにより、ピリミジン系薬剤の薬効を回復する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
【従来の技術】
従来、真菌や悪性腫瘍細胞の増殖に対して阻害効果を示す多くのピリミジン系の薬剤が知られている。例えば、フルシトシン（５−ＦＣ）は、真菌の臓器感染症に対し有効性を示すことが確認されている数少ない抗真菌剤の一つである。また、フルオロウラシル（５−ＦＵ）やその類縁体であるテガフール（ＴＧＦ）、ドキシフルリジン（５’−ＤＦＵＲ）といった薬剤は、種々の癌に対し臨床的に著明な効果を奏する。しかしながら、これらの薬剤に関しては耐性菌あるいは耐性細胞が容易に出現し、薬効が低下することが問題となっている（Ｍａｄｅｒ  Ｒ．，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃ．３１，６６１−６６６（１９９８）、Ｂｏｓｓｃｈｅ  Ｈ．，ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２，３９３−４００（１９９４））。特にフルシトシンに関しては、薬剤耐性菌の出現が主原因となりその使用が制限されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明において、ピリミジン系の薬剤とは、ピリミジン環をその構造内に保持する、微生物等の増殖を阻害する薬効を有する薬剤を意味する。例えば、ピリミジン系の抗真菌剤として広く臨床で使用されているフルシトシン（５−ＦＣ）が挙げられる。また、臨床では用いられてはいないが、６−アザウラシル（６−ＡＵ）もピリミジン系抗真菌剤の一例である。あるいは、ピリミジン系抗悪性腫瘍剤として、臨床にて用いられている、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール、テガフール・ウラシル配合剤、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤、カルモフール、ドキシフルリジン（５’−ＤＦＵＲ）等もピリミジン系薬剤の一例である。あるいは、抗ウィルス剤であるラミブジン、ザルシタビン（ジデオキシシチジン）等のヌクレオシドアナログもピリミジン系薬剤に含まれる。これらの薬剤は、生体にとって不都合な真菌、悪性腫瘍細胞あるいはウィルス等の増殖を阻害することにより、それら不都合な増殖により誘引された疾患を治療する目的で医薬品として使用される。あるいは、防腐剤としても利用できる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
（薬剤感受性試験方法）
上記ＳＤＴ１過剰発現株および野生株（ベクターのみを遺伝子導入した、ＢＹ４７２７酵母）、それぞれの各薬剤に対する感受性は、微量培養希釈法（Ｅｓｐｉｎｅｌ−Ｉｎｇｒｏｆｆ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２９，１０８９−１０９４（１９９１））を用いて検定した。９６ウェルプレート中、ウェルあたり約２０００の酵母（０．０００１ＯＤｕｎｉｔｓ）を、１００μｇ／ｍｌリジン、２５０μｇ／ｍｌロイシン、薬剤、および１％ＤＭＳＯを含んだ２００μｌのＳＤ培地（アミノ酸非含有０．６７％ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ及び２％  グルコースを含む）に播種した。３０℃で４０時間培養後、波長５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて測定することにより、各薬剤の酵母の増殖に与える影響を検討した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
上記の方法により精製された組換えＳＤＴ１の分子量は、緩衝液２（２０ｍＭ  トリス塩酸  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＵＭＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ  １２カラム（Aｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用し、ウシ血清アルブミン（分子量＝６７０００）、β−ラクトグロブリン（分子量＝３５０００）、およびシトクローム  Ｃ（分子量＝１２４００）を標準蛋白としたゲルろ過により決定した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
（組換えＳＤＴ１の分子量の推定）
これまでに報告されているヌクレオチダーゼの多くはオリゴマーを形成することが知られている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２８５，３４５−３６５（１９９２））。今回上記の方法により発現、精製したＨｉｓ−Ｔａｇ融合組換えＳＤＴ１の分子量は、ゲルろ過法により約３３０００と推察された。これは、アミノ酸配列より推定したＳＤＴ１の分子量３２０００とほぼ等しかったことにより、ＳＤＴ１は既知の多くのヌクレオチダーゼとは異なり、溶液中では単量体で存在することが推察された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
（速度量論の算出）
組換えＳＤＴ１について、見掛けＫｍ値および相対Ｖｍａｘを、Lineweaver-Burkプロットから求めた。精製組み換えＳＤＴ１のＫｍは５’−ＵＭＰおよび５’−ＣＭＰについてそれぞれ１．２ｍＭおよび２．３ｍＭであった。５’−ＵＭＰおよび５’−ＣＭＰについてのＶｍａｘはそれぞれ２３μｍｏｌ／分／ｍｇおよび２０μｍｏｌ／分／ｍｇであった。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
（組換えＳＤＴ１の基質特異性の検討）
次に、上記方法で精製した組換えＳＤＴ１を用いて、ＳＤＴ１の基質特異性について検討した。活性測定は実施例1に記載した方法に従って、表２に記載したヌクレオチドを基質として用いて行った。活性値は、５’−ＵＭＰを基質とした時の加水分解活性を１００とした比活性で示した。表２に示すように、ＳＤＴ１は５’−ＵＭＰおよび５’−ＣＭＰを特異的に脱リン酸化することが明らかとなった。プリンヌクレオチド、２’−ＵＭＰ、３’−ＵＭＰ、デオキシヌクレオシド一リン酸、ヌクレオシド二リン酸、ヌクレオシド三リン酸、オロチジン−５’−リン酸あるいはＰＮＰＰに対しては、脱リン酸活性を示さなかった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
現在までに様々な基質特異性を示す５’−ヌクレオチダーゼが知られている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ  Ｈ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２８５，３４５−３６５（１９９２）、Ａｍｉｃｉ  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０４，９８７−９９２（１９９４）、Ｒａｍｏａｚｚｏ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，５４０９−５４１５（２０００）等）。そのなかにはピリミジンヌクレオチドを特異的に加水分解する活性を示すものがある。しかしながら、それらの酵素は、ピリミジンリボヌクレオチドと同様にピリミジンデオキシリボヌクレオチドについても良好なヌクレオチダーゼ活性を示す。したがって、ＳＤＴ１はこれらの現在までに知られているピリミジン特異的ヌクレオチダーゼとは異なる基質特異性を示すヌクレオチダーゼであることが判明した。